EP1499728A2 - Für eine mannitol-2-dehydrogenase codierende nukleotidsequenz sowie verfahren zur herstellung von d-mannitol - Google Patents

Für eine mannitol-2-dehydrogenase codierende nukleotidsequenz sowie verfahren zur herstellung von d-mannitol

Info

Publication number
EP1499728A2
EP1499728A2 EP03737872A EP03737872A EP1499728A2 EP 1499728 A2 EP1499728 A2 EP 1499728A2 EP 03737872 A EP03737872 A EP 03737872A EP 03737872 A EP03737872 A EP 03737872A EP 1499728 A2 EP1499728 A2 EP 1499728A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleotide sequence
mannitol
mdh
microorganisms
dehydrogenase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP03737872A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hermann Sahm
Gerald Hahn
Stephanie Bringer-Meyer
Björn KAUP
Claudia Hemmerling
Martin Walter
Dieter Wullbrandt
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Innosweet GmbH
Forschungszentrum Juelich GmbH
Original Assignee
Forschungszentrum Juelich GmbH
Nordzucker Innocenter GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Forschungszentrum Juelich GmbH, Nordzucker Innocenter GmbH filed Critical Forschungszentrum Juelich GmbH
Publication of EP1499728A2 publication Critical patent/EP1499728A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric

Definitions

  • the invention relates to a nucleotide sequence coding for mannitol -2-dehydrogenase and a method for producing D-mannitol.
  • D-mannitol sugar alcohol D-mannitol
  • the worldwide annual requirement for sugar alcohol D-mannitol (D-mannitol) amounts to 30,000 tons per year.
  • D-mannitol is used in the food sector as a tooth-preserving sweetener, in medicine as a plasma expander and vasodilator (hexanitro derivative), and in the pharmaceutical industry for the production of tablets.
  • D-mannitol The large-scale production of D-mannitol has hitherto been carried out by catalytic hydrogenation on metal catalysts of glucose / fructose mixtures of sucrose as starting materials. Due to the lack of stereo-specificity of the catalytic hydrogenation, the yield of D-mannitol is only 25-30% with a triple excess of D-sorbitol (42, 21, 43). D-mannitol and D-sorbitol differ only in their configuration at the carbon atom C-2.
  • An alternative is the production of D-mannitol by the enzymatic hydrogenation of D-fructose in a microbial biotransformation process. Enzymes catalyze their reactions stereospecifically. In Slatner et al.
  • (47) describes, for example, an enzymatic process in which a recombinant mannitol Dehydrogenase is isolated from Pseudo onas fluorescens and is incubated together with a formate dehydrogenase from Candi-da boidinii and NAD in a membrane reactor.
  • formate dehydrogenase creates a reduction-oxidation cycle for NADH, which is retained by the membrane in the reaction vessel.
  • 70-90% of the fructose could be converted into D-mannitol.
  • the authors report the lack of stability of mannitol dehydrogenase (50 h half-life; after stabilization with
  • Dithiothreitol 100h
  • sensitivity to high temperatures> 30 ° C and to shear forces stated as a disadvantage of the method.
  • the reduction equivalents required for the reduction of fructose to D-mannitol came from the oxidation of glucose to organic acids (36). In addition to the problem of only 85% conversion of the substrate fructose to D-mannitol is the
  • mannitol -2-dehydrogenase The key enzyme for the enzyme-catalyzed reduction reaction from D-fructose to D-mannitol is mannitol -2-dehydrogenase.
  • Three mannitol-2-dehydrogenases are known from the literature and are also described with regard to their biochemical properties and nucleotide / amino acid sequences. These include mannitol - 2 dehydrogenase from Pseudomonas fluorescens DSM 50106 (4, 34), from Rhodobacter sphaeroides Si4 (32) and from Agaricus bisporus (11, 38,). The first two belong to the group of the long-chain dehydrogenase / reductase protein family (LDR), the latter to the
  • SDR short chain dehydrogenase / reductase protein family
  • D-mannitol is also to be understood below as D-mannitol.
  • all nucleotide sequences which code for a mannitol-2 dehydrogenase are summarized below under the name "md gene sequence”.
  • the enzyme mannitol -2-dehydrogenase is summarized below under the name "MDH”.
  • ii) comprises at least one nucleotide sequence which corresponds to the nucleotide sequence (i) within the range of the degeneration of the genetic code;
  • iii) comprises at least one nucleotide sequence which hybridizes with a nucleotide sequence which is complementary to the nucleotide sequence (i) or (ii), and if appropriate
  • function-neutral meaning mutations means the exchange of chemically similar amino acids, such as. B. glycine by alanine or serine by threonine.
  • nucleotide sequences according to the invention are distinguished by the fact that they are from the family Lactobacteri - aceae, preferably from the genus Leuconostoc, particularly preferably from Leuconostoc pseudomesenteroides, are particularly preferably isolated from Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291.
  • a nucleotide sequence, a nucleic acid or a nucleic acid fragment is to be understood as a polymer made from RNA or DNA, which can be single or double-stranded and optionally contain natural, chemically synthesized, modified or artificial nucleotides.
  • the term DNA polymer also includes genomic DNA, cDNA or mixtures thereof.
  • the (5 "or upstream) and / or subsequent (3" or downstream) sequence regions preceding the coding regions are also included.
  • this includes sequence areas with a regulatory function. You can influence the transcription, the RNA stability or the RNA processing as well as the translation. Examples of regulatory sequences include a. Promoters, enhancers, operators, terminators or translation enhancers.
  • the invention furthermore relates to a gene structure comprising at least one of the nucleotide sequences described above coding for MDH and also with regulatory sequences operatively linked thereto which express the expression of the coding sequences in the Control the host cell.
  • An operative link is understood to mean the sequential arrangement of, for example, the promoter, coding sequence, terminator and, if appropriate, further regulatory elements in such a way that each of the regulatory elements can perform its function as intended in the expression of the coding sequence.
  • a promoter that can be induced by IPTG (isopropyl- ⁇ -thiogalactoside) is mentioned here as an example.
  • a gene structure is produced by fusing a suitable promoter with at least one nucleotide sequence according to the invention using common recombination and cloning techniques as described, for example, in (24).
  • the present invention relates to a vector containing at least one nucleotide sequence of the type described above coding for an MDH, with the regulatory nucleotide sequences operatively linked to it and additional nucleotide sequences for selecting transformed host cells, for replication within the host cell or for integration into the corresponding host cell genome ,
  • the vector according to the invention can contain a gene structure of the aforementioned type.
  • Suitable vectors are those that are replicated in the host cells
  • probes or primers can be synthesized and used for this purpose, for example with the help of the PCR technique, analogous genes from others Microorganisms, preferably from the genus Leuconostoc, to be amplified and isolated.
  • the present invention thus also relates to a probe for identifying and / or isolating genes coding for proteins involved in the biosynthesis of D-mannitol, this probe being produced on the basis of the nucleotide sequences of the type described above and a label suitable for detection contains.
  • the probe can be a partial section of the sequence according to the invention, for example from a conserved area, which can hybridize specifically with homologous nucleotide sequences under stringent conditions. Suitable markings are well known from the literature. The person skilled in the art can find instructions for this in the following references (8, 18, 28).
  • the object of the invention is an MDH, encoded by a nucleotide sequence according to the invention, according to SEQ ID No
  • this activity is measured photometrically via the decrease in the NADH concentration for the reduction reaction: D-fructose + NADH + H + -
  • the present invention also relates to an MDH with an amino acid sequence selected from the sequence according to SEQ ID No 2 or a modified form of this polypeptide sequence or isoform thereof or mixtures thereof.
  • the polypeptides according to the invention are distinguished by the fact that they come from the Lactobacteriaceae family, preferably from the Leuconostoc genus, particularly preferably from the Leuconostoc pseudomesenteroides species, very particularly preferably from Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291.
  • Isoforms are to be understood as enzymes with the same or comparable substrate and activity specificity, but which have a different primary structure.
  • modified forms are understood to mean enzymes in which there are changes in the sequence, for example at the N- and / or C-terminus of the polypeptide or in the region of conserved amino acids, but without impairing the function of the enzyme. These changes can be made in the form of amino acid exchanges using known methods.
  • microorganisms containing, in replicable form, at least one nucleic acid according to the invention of the type described above, which is more strongly expressed than the correspondingly non-genetically modified microorganism and / or whose number of copies is increased.
  • the present invention also includes a genetically modified microorganism containing, in replicable form, a gene structure or a vector of the type described above.
  • the present invention furthermore relates to a genetically modified microorganism containing at least one Polypeptide according to the invention with the function of an MDH of the type described above, which has an increased activity compared to the correspondingly non-genetically modified microorganism.
  • the microorganisms according to the invention can originate from the genus Bacillus, Lactobacillus, Leuconostoc, Enterobacteriaceae or methylotrophic yeasts, fungi and from all microorganisms also used in the food industry.
  • the following suitable microorganisms may be mentioned by way of example: Achromobacter parvolus, Methylobacterium organophilum, Mycobacterium formicum, Pseudomonas spec. 101, Pseudomonas oxalaticus, Moraxella sp., Agrobacterium sp. , Paracoccus sp.
  • Ancylobacter aquaticus Pseudomonas fluorescens, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulatus, Lactobacillus sp. , Lactobacillus brevis, Leuconostoc pseudomesenteroides, Gluconobacter oxydans, Candida boidinii, Candida methylica or also Hansenula polymorpha, Aspergillus nidulans or Neurospora crassa or Escherichia coli.
  • the nucleotide sequence is introduced into a host cell using genetic engineering methods.
  • the preferred method here is the transformation and particularly preferably the transfer of DNA by electroporation.
  • the copy number of the corresponding genes can be increased.
  • the promoter and / or regulatory region and / or the ribosome binding site, which is located upstream of the structural gene can be changed accordingly so that expression takes place at an increased rate.
  • Expression cassettes which are installed upstream of the structural gene act in the same way. Inducible promoters also make it possible to increase expression in the course of microbial D-mannitol production. Expression is also improved by measures to extend the life of the mRNA.
  • genes or gene constructs can either be present in plasmids with different copy numbers or can be integrated and amplified in the chromosome. Furthermore, the activity of the enzyme itself can also be increased or increased by preventing the breakdown of the enzyme protein. Alternatively, overexpression of the genes in question can also be achieved by changing the media composition and culture management.
  • a host system is to be understood as microorganisms, all of which can be transformed with foreign DNA. According to the invention, this includes microorganisms into which the nucleotide sequence according to the invention is introduced and / or amplified and is accordingly expressed. Microorganisms which already have a nucleotide sequence coding for an MDH or the nucleotide sequence according to the invention, such as, for. B. Leuconostoc pseudomesenteroides, are therefore also to be understood as a host system.
  • a suitable host system into which the nucleotide sequence according to the invention is introduced is the bacterium Escherichia coli and preferably the strain E. coli JM109 (DE3), which can be cultivated under standard conditions.
  • a complex medium such as e.g. B. LB medium (24) or a mineral - salt medium (15) suitable.
  • the bacterial suspension can be harvested and used for further investigation, for example for the transformation or for the isolation of nucleic acids by conventional methods.
  • Lactobacillus or Enterobacteriacea and methylotrophic yeast preferred.
  • Some preferred microorganisms are listed below by way of example: Achromobacter parvolus, Methylobacterium organophilum, Mycobacterium formicum, Pseudomonas spec. 101, Pseudomonas oxalaticus, Moraxella sp., Agrobacterium sp. , Paracoccus sp., Ancylobacter aquaticus or Pseudomonas fluorescens, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulatus, Lactobacillus sp.
  • Lactobacillus brevis Lactobacillus brevis, Leuconostoc pseudomesenteroides, Gluconobacter oxydans or methylotrophic yeasts such as Candida boidinii, Candida methylica or also Hansenula polymorpha, fungi such as Aspergillus nidulans and Neurospora crassa and all of them in the
  • the present invention also includes strains of bacteria which are distinguished as D-mannitol-producing mutants or production strains. These can e.g. B. based on wild-type strains by classic (chemical or physical) or genetic engineering methods.
  • the genetically modified microorganisms produced according to the invention can be cultured continuously or discontinuously in the batch process (batch cultivation) or in the fed batch (feed process) or repeated fed batch process (repetitive feed process) for the purpose of producing D-mannitol.
  • batch cultivation or in the fed batch (feed process) or repeated fed batch process (repetitive feed process) for the purpose of producing D-mannitol.
  • the culture medium to be used must meet the requirements of the respective strains in a suitable manner. Descriptions of culture media of various microorganisms are contained in the manual "Manual of Methods for General Bacteriology" (1).
  • Can as a carbon source Sugar and carbohydrates such as B. glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose can be used. These substances can be used individually or as a mixture.
  • Organic nitrogen-containing compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate can be used as the nitrogen source.
  • the nitrogen sources can be used individually or as a mixture.
  • Phosphoric acid, potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts can be used as the source of phosphorus.
  • the culture medium must also contain salts of metals such.
  • essential growth substances such as amino acids and vitamins can be used in addition to the substances mentioned above.
  • Suitable precursors can also be added to the culture medium.
  • the feedstocks mentioned can be added to the culture in the form of a single batch or can be added in a suitable manner during the cultivation.
  • the addition of Zn 2+ to the medium in particular has proven to be advantageous since the cells are better supplied with the metal ion essential for MDH.
  • Basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or ammonia water or acidic compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid are used in a suitable manner to control the pH of the culture.
  • anti foaming agents such as B. fatty acid polyglycol esters.
  • suitable selectively acting substances z.
  • B. Antibiotics can be added.
  • oxygen or oxygen-containing gas mixtures such as e.g. B. Air entered into the culture.
  • the temperature of the culture is usually 20 ° C to 40 ° C and preferably 30 ° C to 37 ° C.
  • the culture is continued until a maximum of D-mannitol has formed. This goal is usually achieved within 12 hours to 50 hours.
  • the analysis of the D-mannitol concentration can be carried out enzymatically / photometrically using the method of K. Horikoshi
  • a considerable increase in the yield or the conversion rate of the substrate in mannitol is made possible by creating a cofactor regeneration system. It is no longer the substrate for the preparation of the necessary for the reduction of fructose to mannitol
  • Reduction equivalents consumed, but provided by a second enzyme system As a result, the substrate is increasingly available for conversion to mannitol.
  • One of the most frequently used systems is regeneration with a formate dehydrogenase, e.g. B. from Candida boidinii (46).
  • a formate dehydrogenase e.g. B. from Candida boidinii (46).
  • MDH preferably from Leuconostoc pseudomesenteroi- of or also from Rhodobacter sphaeroides
  • formate acts as an electron donor and D-fructose as an electron acceptor.
  • the enzyme formate dehydrogenase catalyzes the oxidation of formate to C0 2 and the enzyme MDH the reduction of D-fructose to D-mannitol (see Fig. 1).
  • the intracellular nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) pool serves as an electron shuttle between the two enzymes.
  • the oxidation of formate to C0 2 is thermodynamically favorable, since the free standard formation energy ⁇ G ° "for C0 2 is clearly negative and the C0 2 is removed from the reaction equilibrium by outgassing.
  • D-glucose is used as a substrate for the microbial production
  • Enzyme D-glucose / xylose isomerase (EC 5.3.1.5) can be converted to D-fructose (2) .Extra-cellular conversion is also possible, but intracellular is preferred.
  • D-glucose as a substrate in a microbial process for the production of D-mannitol improves the economy of the process, since di e Cost of D-glucose is only about a quarter of the price of D-fructose.
  • microorganisms into which a formate dehydrogenase and an MDH are introduced and / or strengthened suitable for the process described but also microorganisms which already have a formate dehydrogenase, such as, for. B. Achromobacter parvolus, Methylobacterium organophilum, Mycobacterium formicum, Pseudomonas spec.
  • Pseudomonas oxalaticus Moraxellas.
  • Agrobacterium sp. Paracoccus sp.
  • Ancylobacter aquaticus or also have an MDH.
  • microorganisms such as Pseudomonas fluorescens,
  • Rhodobacter sphaeroides Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulatus, Lactobacillus sp., Lactobacillus brevis, Gluconobacter oxydans and preferably also Leuconostoc pseudomesenteroides or microorganisms, which already have both enzymes and are each enhanced in their activity.
  • methylotrophic yeasts such as Candida boidinii, Candida methylica or Hansenula polymorpha
  • fungi such as Aspergillus nidulans and Neurospora crassa and all microorganisms also used in the food industry.
  • the object is achieved according to the invention with the features specified in the characterizing part of claim 1. Furthermore, based on the preamble of claim 4, the object is achieved according to the invention with the features specified in the characterizing part of claim 4. The object is also achieved on the basis of the preambles of claims 5, 6, 7, 8, 9, 12, 17 and 20 according to the invention with those in the characterizing part of claims 5, 6, 7, 8, 9, 12, 17 and 20 specified characteristics.
  • the nucleic acid according to the invention and the method it is now possible to achieve an improved conversion of the substrate into the product D-mannitol. Compared to previously known methods, increased productivity is achieved, in particular by amplifying the nucleotide sequence according to the invention, and an increased yield of D-mannitol.
  • Fig. 1 Oxidoreduction cycle with formate dehydrogenase and MDH
  • Fig. 2 Derivation of a degenerate 24 base oligonucleotide probe from the N-terminal amino acid sequence of the MDH subunit of Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291.
  • Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291 was used as the source for the isolation of the MDH.
  • E. coli JM 109 (DE 3) (Promega) served as the host organism for the production of a plasmid bank for the isolation of the genomic DNA from Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291.
  • a part of the plasmid bank was obtained by ligation of a 4.0-4.5 kb Eco RI fragment of genomic DNA made from Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291 in pUC18. b) Cultivation conditions
  • E. coli JM109 (DE 3) was run at 170 rpm at 37 ° C in Luria-Bertani medium with the addition of ampicillin (100 ⁇ g / ml) or carbenicillin (50 ⁇ g / ml) cultured.
  • the enzyme activity is determined photometrically via the decrease in the NADH concentration for the reduction reaction D-fructose + NADH + H + -> D-mannitol + NAD + .
  • the approach for measuring the activity of the MDH contained 200 ⁇ M NADH and 200 mM D-fructose in 100 mM potassium phosphate buffer at pH 6.5.
  • the specific activities of the crude extracts and the partially purified enzyme isolates are expressed as units per milligram of protein
  • the native molecular weight of the MDH was determined to be 177 kDa by size exclusion chromatography.
  • the isoelectric point of the enzyme is at pH 4.3-4.4.
  • the mdh gene from this fragment was amplified with suitable primers, ligated into the vector pET24a (+) and transformed and expressed in E. coli BL21 (DE3).
  • Cell extracts from E. coli BL21 (DE3) pET24a (+) Lmdh showed a strong overexpression band at 55.2 kDa and a specific activity of the mannitol -2-dehydrogenase of 102.23 U / mg protein, during induction in SDS polyacrylic electrophoresis the controls (cells without plasmid, cells with empty plasmid) showed no activity.
  • nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence of the mdh gene from L. pseudomesenteroides ATCC 12291 is shown in sequence ID no. 1 and No. 2 shown.
  • the strains E. coli BL21 (DE3) Gold (Stratagene) and E. coli JM109 (DE3) (Promega) were used.
  • the vectors used were pET-28a (+) Rsp / ndhNC (10) coding for the ORF of mannitol -2 dehydrogenase from Rhodobacter sphaeroides Si4 and pBTac2FDH coding for the formate dehydrogenase from Candida boidinii (35).
  • E. coli BL21 (DE 3) gold was co-transformed with pET28a (+) RspmdhNC and pBTac2FDH and selected on LB agar plates with 50 ⁇ g / ml carbenicillin and 30 ⁇ g / ml kanamycin.
  • E. coli BL21 (DE 3) gold was further transformed with either pET-- 28a (+) Rsp-md.NC or pBTac2FDH alone.
  • the transformants were selected on LB agar plates with either 50 ⁇ g / ml carbenicillin (pBTac2FDH) or with 30 ⁇ g / ml kanamycin (pET-28a (+) Rspmd NC.
  • pBTac2FDH carbenicillin
  • pET-28a (+) Rspmd NC kanamycin
  • LB agar plates for E. coli BL21 (DE 3) gold transformed with pET-28a (+) RspmdhNC additionally contained 1% (v / v)
  • Enzymatic activities of formate dehydrogenase and MDH in the cell-free extract were measured photometrically 340 nm measured.
  • the test batch for the formate dehydrogenase contained 2 mM NAD + and 200 mM sodium formate in 100 mM potassium phosphate buffer with pH 6.5. These high coenzy and substrate concentrations were necessary to achieve the maximum speed due to the high K m values of formate dehydrogenase (35).
  • the pH corresponded to the conditions of the biotransformation.
  • the approach for measuring the activity of the MDH was as described under Ic). Both determinations were carried out at 30 ° C. After measuring the basal activity without substrate for 2 min, the enzyme-specific activity was measured for a further 2 min after addition of the substrate.
  • the biotransformation of D-fructose to D-mannitol shown above with a mannitol-2 dehydrogenase from Rhodobacter spaeroides can also be carried out in a comparable manner for the mannitol -2 dehydrogenase from Leuconostoc pseudomesenteroides.
  • the nucleotide sequence according to the invention can be introduced into the corresponding host organism using methods known to those skilled in the art. BE coli are transformed and expressed and this is then used for the microbial production of D-mannitol. literature
  • Storhas bioreactors and peripheral devices, Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, (1994))

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft eine für die Mannitol-2-Dehydro­genase codierende Nukleotidsequenz sowie ein Verfahren zur Herstellung von D-Mannitol. Bisher bekannte biokatalytische Verfahren zur Herstel­lung von D-Mannnitol weisen nur geringe Produktionsra­ten auf Grund geringer spezifischer Aktivitäten der Mannitol-2-Dehydrogenasen für die Umsetzung von D-Fructose zu D-Mannitol auf. Durch Bereitstellung einer Nukleotidsequenz, die für eine Mannitol-2-Dehydrogenase mit einer höheren spezi­fischen Aktivität codiert, kann eine verbesserte D-Mannitolproduktion erreicht werden. Durch Schaffung eines Regenerationssystems für Redukti­onsäquivalente durch Einbringen und/oder Verstärken einer Formiatdehydrogenase in einen Mikroorganismus, kann in besonderer Weise eine erhöhte Mannitol Produk­tion erreicht werden.

Description

Be s chre ibung
Für eine Mannitol -2 -Dehydrogenase codierende Nukleotidsequenz sowie Verfahren zur Herstellung von
D-Mannitol
Die Erfindung betrifft eine für die Mannitol -2 -Dehydrogenase codierende Nukleotidsequenz sowie ein Verfahren zur Herstellung von D-Mannitol .
Der weltweite Jahresbedarf am Zuckeralkohol D-Mannitol (D-Mannit) beläuft sich auf 30.000 Tonnen im Jahr. D-Mannitol findet Verwendung im Lebensmittelbereich als zahnschonender Süßstoff, in der Medizin als Plasmaexpander und Vasodilator (Hexanitroderivat ) , sowie in der pharmazeutischen Industrie zur Produktion von Tabletten.
Die großtechnische Produktion von D-Mannitol erfolgt bisher über die katalytische Hydrierung an Metallkata- lysatoren von Glucose/Fructose-Gemischen aus Saccharose als Ausgangsmaterialien. Aufgrund der fehlenden Stereo- spezifität der katalytischen Hydrierung beträgt die Ausbeute an D-Mannitol nur 25-30% mit einem dreifachen Überschuß an D-Sorbitol (42, 21, 43) . D-Mannitol und D-Sorbitol unterscheiden sich nur durch ihre Konfiguration am Kohlenstoffatom C-2. Eine Alternative bietet die Herstellung von D-Mannitol durch en- zymatische Hydrierung von D-Fructose in einem mikro- biellen Biotransformationsverfahren. Enzyme katalysie- ren ihre Reaktionen stereospezifisch. Bei Slatner et al . (47) wird beispielsweise ein enzymatisches Verfahren beschrieben, bei dem eine rekombinante Mannitol- Dehydrogenase aus Pseudo onas fluorescens isoliert wird und zusammen mit einer Formiat-Dehydrogenase aus Candi - da boidinii und NAD in einem Membranreaktor inkubiert wird. Durch den Einsatz der Formiat -Dehydrogenase wird ein Reduktions-Oxidationszyklus für NADH geschaffen, welches durch die Membran im Reaktionsgefäß zurückgehalten wird. Hier konnte 70-90% der Fructose in D-Mannitol umgewandelt werden. Von den Autoren wird jedoch die mangelnde Stabilität der Mannitol -Dehydro- genäse (50 h Halbwertszeit; nach Stabilisierung mit
Dithiothreitol : 100h), Empfindlichkeit gegenüber hohen Temperaturen >30°C sowie gegenüber Scherkräften, als ein Nachteil des Verfahrens angegeben. Ein weiterer großer Nachteil liegt jedoch darin, dass Membranreakto- ren auf Grund der hohen Kosten für isolierte Enzyme, benötigte Cofaktoren und Membranen für eine großtechnische Produktion ungeeignet sind.
Eine weitere Möglichkeit der D-Mannitol Produktion kann durch fermentative Verfahren erfolgen. Bereits 1991 er- zielten Soetaert et al . (36) durch fermentative
D-Mannitol Herstellung Ausbeuten von 85% unter Einsatz von D-Fructose/D-Glucose-Gemischen als Substrate. Dabei verwendeten sie das heterofermentative Milchsäurebakte- rium Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291 als ka- talysierenden Organismus in einer Fermentation mit wachsenden Zellen. Die für die Reduktion von Fructose zu D-Mannitol notwendigen Reduktionsäquivalente stammten hierbei aus der Oxidation von Glucose zu organischen Säuren (36) . Neben dem Problem der nur 85%igen Umsetzung des Substrates Fructose zu D-Mannitol ist der
Einsatz von D-Glucose als Elektronenlieferant kostenaufwendig. Weiterhin stellt die Kontamination des Ziel- produktes mit organischen Säuren während der Fermenta- tion einen weiteren Nachteil dar, da diese organischen Säuren durch aufwendige Prozeßschritte entfernt werden müssen. Soetaert et al . schlugen hierfür eine Elektro- dialyse vor (36, 37). Bei Fermentationen mit wachsenden Zellen kann keine 100%ige Umsetzung des Substrates zum Produkt erzielt werden, da ein Teil des Substrates zum Zellaufbau bzw. zur Neubildung von Biomasse verbraucht wird.
Das Schlüsselenzym für die enzymkatalysierte Reduktionsreaktion von D-Fructose zu D-Mannitol ist die Manni- tol -2 -Dehydrogenase . Aus der Literatur sind drei Manni- tol-2-Dehydrogenasen bekannt und auch hinsichtlich ihrer biochemischen Eigenschaften und Nukleotid-/Amino- säuresequenzen beschrieben. Hierzu gehört die Mannitol - 2 -Dehydrogenase aus Pseudomonas fluorescens DSM 50106 (4, 34), aus Rhodobacter sphaeroides Si4 (32) sowie aus Agaricus bisporus (11, 38,). Die beiden Erstgenannten gehören zur Gruppe der langkettigen Dehydrogenase/Re- duktase Protein Familie (LDR) , die letztgenannte zur
Gruppe der kurzkettigen Dehydrogenase/Reduktase Protein Familie (SDR) . Die spezifische Aktivität dieser Enzyme bei der Reduktion von D-Fructose zu D-Mannitol liegt jedoch nur bei rund 40 bis 90 U/mg.
Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein System zur Verfügung zu stellen, welches die zuvor genannten Nachteile nicht mehr aufweist sowie neue Maßnahmen zur verbesserten mikrobiellen Herstellung von D-Mannitol bereit- zustellen.
Unter der Bezeichnung D- Mannitol soll im folgenden auch D-Mannit verstanden werden. Im Rahmen dieser Erfindung werden im Folgenden alle Nukleotidsequenzen, die für eine Mannitol-2 -Dehydrogenase codieren unter der Bezeichnung "md -Gensequenz" zusammengefasst . Das Enzym Mannitol -2 -Dehydrogenase wird im Folgenden unter der Bezeichnung „MDH" zusammengefasst .
Es ist Aufgabe der Erfindung eine Nukleotidsequenz kodierend für eine MDH bereitzustellen, enthaltend
i) eine Nukleotidsequenz, dargestellt in SEQ ID No. 1, oder
ii) mindestens eine Nukleotidsequenz umfasst, die der Nukleotidsequenz (i) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes ent- spricht; oder
iii) mindestens eine Nukleotidsequenz umfasst, die mit einer zur Nukleotidsequenz (i) oder (ii) komplemetären Nukleotidsequenz hybridisiert, und gegebenenfal1s
iiii) funktionsneutrale Sinnmutationen in (i) umfasst. Dabei bedeutet der Begriff funktionsneutrale Sinnmutationen den Austausch chemisch ähnlicher Aminosäuren, wie z. B. Glycin durch Alanin oder Serin durch Threonin.
Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen zeichnen sich dadurch aus, dass sie aus der Familie der Lactobacteri - aceae, bevorzugt der Gattung Leuconostoc besonders bevorzugt aus Leuconostoc pseudomesenteroides, ganz be- sonders bevorzugt aus Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291 isoliert werden.
Bei der DSMZ wurde gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrages die erfindungsgemäße md- -Gensequenz am
20.02.2002 als Plasmid-DNA (pQE80L-md ) unter folgendem Aktenzeichen hinterlegt: DSM 14824
Unter einer Nukleotidsequenz, einer Nukleinsäure oder einem Nukleinsäurefragment ist erfindungsgemäß ein Polymer aus RNA oder DNA zu verstehen, das einzel- oder doppelsträngig sein kann und optional natürliche, chemisch synthetisierte, modifizierte oder artifizielle Nukleotide enthalten kann. Der Begriff DNA-Polymer schließt hierbei auch genomische DNA, cDNA oder Mischungen davon ein.
Erfindungsgemäß sind auch die den kodierenden Bereichen (Strukturgenen) vorausgehenden (5" -oder upstream) und/oder nachfolgenden (3"-oder downstream) Sequenzbereiche eingeschlossen. Insbesondere sind hierin Sequenzbereiche mit regulatorischer Funktion inbegriffen. Sie können die Transkription, die RNA-Stabilität oder das RNA Processing sowie die Translation beeinflussen. Beispiele für regulatorische Sequenzen sind u. a. Promotoren, Enhancer, Operatoren, Teminatoren oder Translationsverstärker .
Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Genstruktur, enthaltend wenigstens eine der zuvor beschriebenen Nukleotidsequenzen codierend für eine MDH sowie mit diesen operativ verknüpfte regulatorische Sequenzen, welche die Expression der codierenden Sequenzen in der Wirtszelle steuern. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequentielle Anordnung beispielsweise von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulatorischer Elemente derart, dass jedes der regulatorischen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Beispielhaft sei hier ein durch IPTG (Isopropyl-ß-thiogalactosid) induzierbarer Promotor genannt .
Die Herstellung einer Genstruktur erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit wenigstens einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz nach gängigen Rekombina- tions- und Klonierungstechniken wie beispielsweise in (24) beschrieben.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung einen Vektor enthaltend wenigstens eine Nukleotidsequenz der zuvor beschriebenen Art kodierend für eine MDH, mit diesen operativ verknüpfte regulative Nukleotidsequenzen sowie zusätzliche Nukleotidsequenzen zur Selektion transformierter Wirtszellen, für die Replikation innerhalb der Wirtszelle oder zur Integration in das entsprechende Wirtszell-Genom. Ferner kann der erfindungs- gemäße Vektor eine Genstruktur der vorgenannten Art enthalten.
Als Vektoren eignen sich solche, die in den Wirtszellen repliziert werden
Unter Ausnutzung der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen können entsprechende Sonden oder auch Primer synthetisiert und dazu verwendet werden, beispielsweise mit Hilfe der PCR-Technik analoge Gene aus anderen Mikroorganismen, bevorzugt aus der Gattung Leuconostoc zu amplifizieren und isolieren.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit auch eine Sonde zur Identifizierung und/oder Isolierung von Genen, kodierend für an der Biosynthese von D-Mannitol beteiligte Proteine, wobei diese Sonde ausgehend von den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen der zuvor beschriebenen Art hergestellt wird und eine zur Detektion geeignete Markierung enthält . Bei der Sonde kann es sich um einen Teilausschnitt der erfindungsgemäßen Sequenz, beispielsweise aus einem konservierten Bereich handeln der unter stringenten Bedingungen spezifisch mit homologen Nukleotidsequenzen hybridisieren kann. Geeignete Markierungen sind aus der Literatur zahlreich bekannt. Anleitungen hierzu findet der Fachmann beispielsweise in folgenden Literaturstellen (8, 18, 28) .
Es ist Aufgabe der Erfindung eine MDH, kodiert durch eine erfindungsgemäße Nukleotidsequenz, gemäß SEQ ID No
1 oder deren Variationen der zuvor beschriebenen Art, mit einer gegenüber bisher bekannten MDHs verbesserten
Aktivität in der Fructose-Reduktion bereitzustellen.
Diese Aktivität wird in der vorliegenden Erfindung pho- tometrisch über die Abnahme der NADH-Konzentration für die Reduktionsreaktion: D-Fructose + NADH + H+ -
D-Mannitol + NAD+ bestimmt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso eine MDH mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Sequenz gemäß SEQ ID No 2 oder einer modifizierten Form dieser Polypeptidsequenz oder Isoform davon oder Mischungen daraus . Die erfindungsgemäßen Polypeptide zeichnen sich dadurch aus, dass sie aus der Familie der Lactobacteriaceae, bevorzugt aus der Gattung Leuconostoc, besonders bevor- zugt der Art Leuconostoc pseudomesenteroides, ganz besonders bevorzugt aus Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291, stammen.
Unter Isoformen sind Enzyme mit gleicher oder ver- gleichbarer Substrat- und Wirkungsspezifität zu verstehen, die jedoch eine unterschiedliche Primärstruktur aufweisen.
Unter modifizierten Formen sind erfindungsgemäß Enzyme zu verstehen, bei denen Änderungen in der Sequenz, beispielsweise am N- und/oder C-Teminus des Polypeptids oder im Bereich konservierter Aminosäuren vorliegen, ohne jedoch die Funktion des Enzyms zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können in Form von Aminosäureaus- tauschen nach bekannten Methoden vorgenommen werden.
Weiterhin ist es Aufgabe der Erfindung, Mikroorganismen, enthaltend in replizierbarer Form wenigstens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure der zuvor beschriebenen Art, welche im Vergleich zu dem entsprechend nicht genetisch veränderten Mikroorganismus verstärkt expri- miert wird und/oder deren Kopienzahl erhöht ist, bereitzustellen. Ebenso umfasst die vorliegende Erfindung einen genetisch veränderten Mikroorganismus enthaltend in replizierbarer Form eine Genstruktur oder einen Vektor der zuvor beschriebenen Art. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist darüber hinaus, ein genetisch veränderter Mikroorganismus enthaltend wenigstens ein er- findungsgemäßes Polypeptid mit der Funktion einer MDH der zuvor beschriebenen Art, welche eine im Vergleich zu dem entsprechend nicht genetisch veränderten Mikroorganismus erhöhte Aktivität aufweist. Die erfindungs- gemäßen Mikroorganismen können aus der Gattung Bacil- lus, Lactobacillus, Leuconostoc, den Enterobakteriaceae oder methylotrophen Hefen, Pilzen sowie aus allen auch in der Lebensmittelindustrie verwendeten Mikroorganismen stammen. Beispielhaft seien folgende geeignete Mik- roorganismen genannt: Achromobacter parvolus, Methylo- bacterium organophilum, Mycobacterium formicum, Pseudomonas spec. 101, Pseudomonas oxalaticus, Moraxella sp., Agrobacterium sp . , Paracoccus sp . , Ancylobacter aquati- cus, Pseudomonas fluorescens, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulatus, Lactobacillus sp . , Lactobacillus brevis, Leuconostoc pseudomesenteroides, Glucono- bacter oxydans, Candida boidinii, Candida methylica oder auch Hansenula polymorpha, Aspergillus nidulans oder Neurospora crassa oder Escherichia coli.
Es besteht weiterhin die Aufgabe ein Verfahren zur Produktion von D-Mannitol zu schaffen, mit dem verbesserte Ausbeuten und höhere Produktivitäten erzielt werden können. Dies umfaßt sowohl das Einbringen der erfin- dungsgemäßen Nukleotidsequenzen oder eines Teils davon, kodierend für eine MDH, ein Allel, Homolog oder Derivat davon in ein Wirtssystem als auch die Verstärkung einer bereits in einem Mikroorganismus vorhandenen Nukleotidsequenz codierend für eine MDH, wobei die Genexpression und/oder die Aktivität des entsprechend kodierten Poly- peptids gegenüber dem entsprechend nicht genetisch veränderten Mikroorganismus erhöht ist, dieser genetisch veränderte Mikroorganismus zur mikrobiellen Herstellung von D-Mannitol eingesetzt wird und das entsprechend gebildete D-Mannitol aus dem Kulturmedium und/oder den Zellen isoliert wird.
Das Einbringen der Nukleotidsequenz in eine Wirtzelle erfolgt nach gentechnischen Methoden. Als bevorzugtes Verfahren sei hier die Transformation und besonders bevorzugt die Übertragung von DNA durch Elektroporation genannt . Zur Erzielung einer Verstärkung der mdh-Gensequenz bzw. einer erhöhten Genexpression (Überexpression) kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden. Ferner kann die Promotor- und/oder Regulationsregion und/oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, entsprechend so verändert werden, daß die Expression mit erhöhter Rate erfolgt. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich die Expression im Verlaufe der mikrobiellen D-Mannitol Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der mRNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Weiterhin kann auch die Aktivität des Enzyms selbst erhöht sein oder durch die Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins verstärkt werden. Alternativ kann ferner eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kultur- führung erreicht werden.
Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al . (25), bei Guerrero et al . (9), Tsu- chiya und Morinaga (41), bei Eikmanns et al . (7), bei Schwarzer und Pühler (33), bei Reinscheid et al . (27), bei LaBarre et al . (16), bei Malumbres et al . (23), bei Jensen und Hammer (13) , bei Makrides (22) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.
Unter einem Wirtssystem sind Mikroorganismen zu verstehen, die alle mit fremder DNA transformierbar sind. Erfindungsgemäß sind hierunter Mikroorganismen zu verstehen, in die die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz ein- gebracht wird und/oder verstärkt wird und entsprechend zur Ausprägung gebracht wird. Mikroorganismen, die bereits eine für eine MDH codierende Nukleotidsequenz oder die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz aufweisen, wie z. B. Leuconostoc pseudomesenteroides, sind daher ebenfalls als Wirtssystem zu verstehen. Stellvertretend für ein geeignetes Wirtssystem, in das die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz eingebracht wird, sei das Bak- terium Escherichia coli und bevorzugt der Stamm E. coli JM109(DE3) genannt, welcher unter Standardbedingungen kultiviert werden kann.
Als Kulturmedium ist je nach Anforderungen ein Komplexmedium wie z. B. LB-Medium (24) oder auch ein Mineral - salzmedium (15) geeignet. Nach entsprechender Kultivierung kann die Bakteriensuspension geerntet und zur wei- teren Untersuchung, beispielsweise zur Transformation oder zur Isolierung von Nukleinsäuren nach gängigen Methoden eingesetzt werden.
Diese Vorgehensweise kann analog auch auf andere Bakterienstämme angewendet werden. Dabei werden als Wirts- Systeme Bakterien der Gattungen Leuconostoc, Bacillus,
Lactobacillus, oder Enterobacteriacea und methylotrophe Hefe bevorzugt. Im folgenden werden beispielhaft einige bevorzugte Mikroorganismen aufgelistet: Achromobacter parvolus, Methylobacterium organophilum, Mycobacterium formicum, Pseudomonas spec . 101, Pseudomonas oxalati- cus, Moraxella sp., Agrobacterium sp . , Paracoccus sp., Ancylobacter aquaticus oder auch Pseudomonas fluores- cens, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulatus, Lactobacillus sp . , Lactobacillus brevis, Leuconostoc pseudomesenteroides, Gluconobacter oxydans oder methy- lotrophe Hefen wie Candida boidinii, Candida methylica oder auch Hansenula polymorpha, Pilze wie Aspergillus nidulans und Neurospora crassa sowie alle auch in der
Lebensmittelindustrie verwendeten Mikroorganismen. Darüber hinaus schließt die vorliegende Erfindung auch Bakterienstämme ein, die sich als D-Mannitol produzierende Mutanten oder Produktionsstamme auszeichnen. Die- se können z. B. ausgehend von Wildtypstämmen durch klassische (chemische oder physikalische) oder gentechnische Methoden hergestellt werden.
Die erfindungsgemäß hergestellten genetisch veränderten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch - Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von D-Mannitol kultiviert werden. Eine Zu- sammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (5) oder im Lehrbuch von Storhas (39) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedenener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacte- riology" (1) enthalten. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlenhydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellu- lose verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammonium- nitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphos- phat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kul- turmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzu gegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden. In der vorliegenden Erfindung hat sich insbe- sondere der Zusatz von Zn2+ zum Medium als vorteilhaft erwiesen, da die Zellen besser mit dem für die MDH essentiellen Metallion versorgt werden.
Zur pH - Kontrolle der Kultur werden basische Verbin- düngen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Anti- schaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten werden Sauerstoff oder Sauerstoff haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 40°C und vorzugsweise bei 30 °C bis 37 °C. Die Kultur wird solange fortgesetzt bis sich ein Maximum an D- Mannitol gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 12 Stunden bis 50 Stunden erreicht.
Die Analyse der D-Mannitol -Konzentration kann enzyma- tisch/photometrisch nach der Methode von K. Horikoshi
(12) , oder durch Hochdruck-Flüssigkeits Chromatographie (HPLC) erfolgen so wie bei Lindroth et al . (19) beschrieben.
In einer vorteilhaften Ausführung des Verfahrens wird eine erhebliche Steigerung der Ausbeute bzw. der Umsatzrate des Substrates in Mannitol durch Schaffung eines Cofaktor-Regenerationssystems ermöglicht. Dabei wird nicht mehr das Substrat für die Bereitstellung der für die Reduktion von Fructose zu Mannitol notwendigen
Reduktionsäquivalente verbraucht, sondern durch ein zweites Enzymsystem bereitgestellt. Folglich steht das Substrat in erhöhtem Maße für die Umsetzung zu Mannitol zur Verfügung. Eines der am häufigsten eingesetzten Systeme ist die Regenerierung mit einer Formiatdehydro- genase, z. B. aus Candida boidinii (46) . Durch die Überexpression dieses Enzyms, zusammen mit einer beliebigen MDH, bevorzugt aus Leuconostoc pseudomesenteroi- des oder auch aus Rhodobacter sphaeroides, im Mikroorganismus, wird ein Oxidations-Reduktionszyklus geschaffen. Die Expression der Enzyme kann in den für den je¬ weiligen Wirtsorganismus geeigenten Vektorsystemen er- folgen. In dem so geschaffenen Oxidations-Reduktionszyklus fungiert Formiat als Elektronendonator und D-Fructose als Elektronenakzeptor. Dabei katalysiert das Enzym Formiat-Dehydrogenase die Oxidation von Formiat zu C02 und das Enzym MDH die Reduktion von D-Fructose zu D-Mannitol (s. Fig. 1). Der intrazellure Nicotinsäureamid-Adenin-Dinucleotid (NAD) -Pool dient als Elektronen-Shuttle zwischen beiden Enzymen. Die Oxidation von Formiat zu C02 ist thermodynamisch günstig, da die freie Standardbildungsenergie ΔG°" für C02 deutlich negativ ist und das C02 durch Ausgasen aus dem Reaktionsgleichgewicht entfernt wird. Die erhöhte intrazelluläre NADH-Konzentration, resultierend aus der Formiatoxidation, steigert die Reduktionskraft für die Reduktion von D-Fructose zu D-Mannitol, katalysiert durch MDH. In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens wird neben den bereits genannten Kohlenstoffquellen als Substrat für die mikrobielle Herstellung D-Glucose eingesetzt. D-Glucose kann durch intrazelluläre Umwandlung mit dem Enzym D-Glucose /Xylose-Isomerase (EC 5.3.1.5) zu D-Fructose umgewandelt werden (2) . Eine extrazelluläre Umwandlung ist ebenfalls möglich, wobei die intrazelluläre jedoch bevorzugt ist. Der Einsatz von D-Glucose als Substrat in einem mikrobiellen Verfahren zur Produktion von D-Mannitol bewirkt eine Verbesserung der Wirtschaftlichkeit des Verfahrens, da die Kosten für D-Glucose nur etwa ein Viertel des Preises für D-Fructose betragen. Für das beschriebene Verfahren eignen sich nicht nur Mikroorganismen, in die eine Formiatdehydrogenase und eine MDH eingebracht und/oder verstärkt wird, sondern auch Mikroorganismen, die bereits über eine Formiatde- hydrogenase verfügen, wie z. B. Achromobacter parvolus, Methylobacterium organophilum, Mycobacterium formicum, Pseudomonas spec . 101, Pseudomonas oxalaticus, Moraxel- la s . , Agrobacterium sp . , Paracoccus sp . , Ancylobacter aquaticus, oder auch über eine MDH verfügen. Dazu gehö- ren Mikroorganismen wie z.B. Pseudomonas fluorescens,
Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulatus, Lactobacillus sp., Lactobacillus brevis, Gluconobacter oxy- dans sowie bevorzugt auch Leuconostoc pseudomesenteroides oder Mikrooganismen, die bereits über beide Enzyme verfügen und jeweils in ihrer Aktivität verstärkt werden. Weiterhin geeignet sind beispielsweise auch methy- lotrophe Hefen wie Candida boidinii, Candida methylica oder auch Hansenula polymorpha, Pilze wie Aspergillus nidulans und Neurospora crassa sowie alle auch in der Lebensmittelindustrie verwendeten Mikroorganismen.
Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen. Weiterhin wird die Aufgabe ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 4 erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 4 angegebenen Merkmalen. Die Aufgabe wird weiterhin ausgehend von den Oberbegriffen der Ansprüche 5, 6, 7, 8, 9, 12, 17 und 20 erfindungs- gemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil der Ansprüche 5, 6, 7, 8, 9, 12, 17 und 20 angegebenen Merkmalen. Mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäure und dem Verfahren ist es nunmehr möglich, eine verbesserte Umsetzung des Substrates in das Produkt D-Mannitol zu erreichen. Es wird gegenüber bisher bekannten Verfahren eine er- höhte Produktivität, insbesondere durch die Verstärkung der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz, sowie eine erhöhte Ausbeute an D-Mannitol erreicht . So wird eine großtechnisch rentable Herstellung von D-Mannitol ermöglicht. Durch die Schaffung des Regenerationssystems mit Hilfe der Formiat Dehydrogenase kann für die NADH verbrauchende MDH in erhöhtem Maße ohne eine nachteilige Bildung von stoffwechselbedingten Nebenprodukten mit ruhenden Zellen eine erhöhte Umsetzung des Substrates in das Produkt D-Mannitol ermöglicht werden. Da Formiat als Elektronendonor weitaus billiger ist als Glucose, ergibt sich für das erfindungsgemäße Verfahren eine vorteilhafte Kostensenkung.
Weitere vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unter- ansprüchen angegeben.
Die Zeichnungen zeigen beispielhaft Ergebnisse des erfindungsgemäßen Verfahrens sowie eine schematische Darstellung der wichtigsten Stoffwechselwege, die für das Verfahren eine Rolle spielen.
Es zeigt :
Fig. 1: Oxidoreduktionszyklus mit Formiat -Dehydrogenase und MDH Fig. 2: Ableitung einer degenerierten 24 Basen-Oligo- nukleotid-Sonde von der N-terminalen Amino- säuresequenz der MDH Untereinheit von Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291.
Fig. 3: Genkarte des 4,191 bp Eco RI Fragments isoliert aus der genomischen DNA-Plasmidbank von Leuco- nostoc pseudomesenteroides ATCC 12291 nach Immuno-Screeening des md -Gens. Die Pfeile zeigen die Richtung der Translation des mdh ORF sowie 4 ORFs an.
Im folgenden soll die Erfindung beispielhaft beschrie- ben werden.
Ausführungsbesipiele :
I) Mannitol-2 -Dehydrogenase aus Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291: Reinigung und Charakterisierung des Enzyms; Klonierung und funktionelle Expression des mdh-Gens in Escherichia coli
a) Bakterienstämme und Plasmide
Als Quelle für die Isolierung der MDH wurde Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291 eingesetzt. E. coli JM 109 (DE 3) (Promega) diente als Wirtsorganismus zur Herstellung einer Plasmidbank für die Isolierung der genomischen DNA aus Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291. Ein Teil der Plasmidbank wurde durch Liga- tion eines 4.0 - 4.5 kb Eco RI Fragments genomischer DNA aus Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291 in pUC18 hergestellt. b) Kultivierungsbedingungen
Zur Kultivierung von Leuconostoc pseudomensenteroides ATCC 12291 wurde folgendes Kultivierungsmedium verwendet:
Trypton 10 g/1, Hefeextrakt 10 g/1, K2HP04 10 g/1, D- Fructose 20 g/1, D-Glucose 10 g/1, Vitamin / Mineral- Lösung 10 ml/1, in destilliertem Wasser; pH-Wert auf 7,5 unter Verwendung von Ortho-Phosphorsäure .
Zur Subklonierung und Präparation der Plasmidbank der genomischen Leuconostoc DNA, wurde E. coli JM109(DE 3) mit 170 Upm bei 37°C in Luria-Bertani Medium unter Zusatz von Ampicillin (100 μg/ml) oder Carbenicillin (50 μg/ml) kultiviert.
c) Bestimmung der Aktivität von MDH aus Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291
Die Enzymaktivität wird in der vorliegenden Erfindung photometrisch über die Abnahme der NADH-Konzentration für die Reduktionsreaktion D-Fructose + NADH + H+ -> D-Mannitol + NAD+ bestimmt. Der Ansatz zur Messung der Aktivität der MDH enthielt 200 μM NADH und 200 mM D-Fructose in 100 mM Kaliumphosphat-Puffer bei pH 6,5. Die spezifischen Aktivitäten der Rohextrakte und der partiell gereinigten Enzymisolate werden als Units pro Milligramm Protein
(U/mg) angegeben, wobei 1 U als 1 μmol Substratabnahme pro Minute definiert wird (20) . d) Bestimmung der Proteinkonzentrationen
Alle Proteinkonzentrationsbestimmungen wurden nach der Methode von Bradford (3) durchgeführt.
e) Auftrennung von Proteinen mittels Polyacrylamidgele- lektrophorese
Reinheitsanalysen von Rohextrakten und partiell gereinigten Enzymisolaten, sowie Präparationen vorbereitend auf Western-Blots wurden elektrophoretisch in diskonti- nuierlichen 12 %igen SDS-Polyacrylamidgelen durchgeführt nach der Methode von Lämmli (17) .
f) Isolierung der Mannitol -2 -Dehydrogenase aus Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291 Zur Isolierung der Mannitol -2 -Dehydrogenase wurde nach einem dem Fachmann bekannten Zellaufschluß (20) folgende Verfahrensschritte durchgeführt: Ammoniumsulfat- Präzipitation, Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) , Anionentauscherchromatographie I (IEC I) , Anio- nentauscherchromatographie II (IEC II) , Größenaus- Schlusschromatographie (SEC) , sowie ein Chromato- focusing pH 5 - 4. Diese Methoden sind dem Fachmann allgemein bekannt und können beispielsweise aus (20) entnommen werden. Die spezifische Aktivität der MDH betrug bei pH = 5,35 für die Reduktion von D-Fructose zu D-Mannitol 450 U/mg
Proben der Reinigungsschritte wurden zur Analyse einer SDS-PAGE unterzogen. Es zeigte sich eine homogene Bande bei 43 kDa nach dem letzten Schritt. g) Charakterisierung der Mannitol -2 -Dehydrogenase aus Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291
Das native Molekulargewicht der MDH wurde durch Size Exclusion Chromatographie zu 177 kDa bestimmt Der isoe- lektrischen Punkt des Enzyms ist bei pH 4,3-4,4. Diese Bestimmungen wurden nach dem Fachmann allgemein bekannten Methoden durchgeführt und können beispielsweise aus Lottspeich und Zorbas (20) entnommen werden.
Die Ergebnisse hinsichtlich des Molekulargewichts des nativen und des dissoziierten Enzyms lassen darauf schließen, dass die Mannitol -2 -Dehydrogenase aus L. pseudomesenteroides ATCC 12291 ein homotetrameres Enzym ist .
h) Molekulargenetische Methoden
Die Isolierung von genomischer DNA aus Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291, die Isolierung von DNA- Fragmenten aus Agarosegelen, die Markierung von DNA- Sonden mit Digoxigenin modifiziertem dUTP und immunologische Detektion und DNA-DNA-Hybridisierung (Southern Blot) wurden nach dem Fachmann geläufigen Methoden durchgeführt (24) . Die aminoterminale Ansequenzierung der 43 kDa-Enzym- Untereinheit mittels Edman-Abbau und anschließender HPLC-Analyse ergab die oktamere Aminosäureabfolge MEALVLTG. Unter Verwendung einer Codon usage-Statistik für Leuconostoc pseudomesenteroides (14), wurde eine 2048fach degenerierte Oligonukleotid-Sonde zur Detekti- on des Mannitol -2 -Dehydrogenase-Gens an genomischer DNA von Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291 abgeleitet (siehe Fig. 2) . Die 24 bp-DNA-Sonde wurde mit einem Digoxigenin-11-dUTP-Schwanz am 3' -Ende versehen und diente zum Immuno-Screening von partiellen Plasmidban- ken genomischer DNA von L. pseudomesenteroides ATCC 12291. Auf diesem Wege wurde ein 4,2 kb-DNA-Fragment isoliert (Fig. 3) . Mit geeigneten Primern wurde das mdh-Gen von diesem Fragment amplifiziert , in den Vektor pET24a (+) ligiert und in E. coli BL21(DE3) transformiert und exprimiert . Zellextrakte von E. coli BL21 (DE3)pET24a (+) Lmdh zeigten nach Induktion in der SDS-Polyacrylelektrophorese eine starke Überexpressionsbande bei 55,2 kDa und eine spezifische Aktivität der Mannitol -2 -Dehydrogenase von 102,23 U/mg Protein, während die Kontrollen (Zellen ohne Plasmid, Zellen mit leerem Plasmid) keine Aktivität zeigten.
Die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des mdh Gens aus L. pseudomesenteroides ATCC 12291 ist in Sequenz ID No. 1 bzw. Nr. 2 gezeigt.
II) Biotransformation von D-Fructose zu D-Mannitol mit einem rekombinanten E. coli-Stamm
In einem rekombinanten E. coli-Stamm wurden die Enzyme Formiat-Dehydrogenase (EC 1.2.1.2) und Mannitol-2-
Dehydrogenase (EC 1.1.1.67) überexprimiert , um in den Zellen einen Oxidations-Reduktionszyklus zu etablieren. In diesem Oxidations-Reduktionszyklus wird Wasserstoff von Formiat über zelluläres NAD+ auf D-Fructose über- tragen, wobei D-Fructose zu D- Mannitol reduziert wird (s. Fig. 1) . (a) Stämme und Vektoren
Es wurden die Stämme E. coli BL21 (DE3) Gold (Stratage- ne) und E.coli JM109 (DE3) (Promega) verwendet. Als Vektoren wurden pET-28a ( +) Rsp/ndhNC (10) kodierend für den ORF der Mannitol -2 -Dehydrogenase aus Rhodobacter sphaeroides Si4 und pBTac2FDH kodierend für die Formiat -Dehydrogenase aus Candida boidinii (35) eingesetzt.
Für die Biotransformation wurden chemisch kompetente E. coli BL21 (DE 3) Gold mit pET28a (+) RspmdhNC und pBTac2FDH kotransformiert und auf LB-Agarplatten mit 50 μg/ml Carbenicillin und 30 μg/ml Kanamycin selektiert. Zum Vergleich des Expressionslevels der Enzyme wurden E. coli BL21 (DE 3) Gold desweiteren entweder mit pET-- 28a ( + )Rsp-md.NC oder pBTac2FDH allein transformiert. Die Selektion der Transformanten erfolgte auf LB-Agarplatten mit entweder 50 μg/ml Carbenicillin (pBTac2FDH) oder mit 30 μg/ml Kanamycin (pET-28a (+) Rspmd NC. LB- Agarplatten für E. coli BL21 (DE 3) Gold transformiert mit pET-28a (+) RspmdhNC enthielten zusätzlich 1% (v/v)
D-Glucose zur Verminderung der Basalexpression der Mannitol -2 -Dehydrogenase .
(b) Kultivierung und Expression Zur Expression der Enzyme wurde eine einzelne Kolonie der Transformanten in LB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika über Nacht bei 30°C und 170 Upm Schuttlung vorkultiviert und in frisches LB-Medium mit 1% (v/v) D-Glucose und entsprechenden Antibiotika überimpft. Die Enzymexpression wurde mit 1 mM IPTG Endkonzentration induziert und die Kulturen für weitere 5 h bei 27°C gezogen. Die Zellmasse aus 2/5 des Kulturvolumens wurde für enzymatische Bestimmungen verwendet, die Zellmasse aus 3/5 des Kulturvolumens wurde für die Biotransformation verwendet. Die Zellernte erfolgte bei 4000g für 5 min (Beckmann JA- 10) .
(c) Biotransformation
Nach der Überexpression von Formiat-Dehydrogenase und MDH in E. coli, werden nichtwachsende Zellen in einer Biotransformation eingesetzt. Je 2,2 g induzierte Zel- len von E. coli BL21 (DE 3) Gold pET-28a (+) Rspmd-hNC / pBTac2FDH wurden mit 100 mM Kaliumphosphat-Puffer pH 6,5 gewaschen und in 200 ml Reaktionslösung mit 500 mM D-Fructose und 500 mM Natriumformiat in 100 mM Kaliumphosphat-Puffer pH 6,5 resuspendiert. Die Ansätze wur- den in 300 ml-Kolben ohne Schikane bei 100 - 120 Upm und 30°C für 48 h geschüttelt. Zu den Zeitpunkten 0, 3, 13, 20, 27, 38, 45 und 48 h nach Reaktionsstart wurden 5 ml -Proben des Überstandes genommen zur Messung der Konzentrationen von Formiat, D-Fructose und D-Mannitol. Die Proben wurden bei 5000g für 15 min zentrifugiert
(Heraeus 3360), der Überstand 0,2 μm-filtriert und bis zur Messung durch HPLC bei -20°C gelagert. Als Kontrolle wurden 5,5 g nichtinduzierte Zellen von E. coli BL21 (DE 3) Gold pET-28a(+)Rspmd NC/pBTac2FDH in gleicher Weise in der Biotransformation eingesetzt.
Die Konzentrationbestimmungen von Formiat, D-Fructose und D-Mannitol im Reaktionsüberstand und im zellfreien Rohextrakt wurden mit einer HPLC-Anlage (Merck/Hitachi) durchgeführt. Tabelle 1 zeigt beispielhaft Ergebnisse, die mit transformierten Mikroorganismen erreicht werden konnten.
Tabelle 1: Produktion von D-Mannitol und Verbrauch von D-Fructose und Natriumformiat während einer Biotransformation
Es konnte gezeigt werden, dass die parallele Überexpression der Formiat-Dehydrogenase und der Mannitol -2 -Dehydrogenase in E. coli zu einer Produktion von D-Mannitol durch diese Zellen in einem Reaktionsmedium mit D-Fructose und Formiat führt.
(d) Enzymatische Bestimmungen
Enzymatische Aktivitäten der Formiat-Dehydrogenase und MDH im zellfreien Extrakt wurden photometrisch bei 340 nm gemessen. Der Testansatz für die Formiat -Dehydro-genase enthielt 2 mM NAD+ und 200 mM Natri- umformiat in 100 mM Kaliumphosphat-Puffer mit pH 6,5. Diese hohen Coenzy - und Substratkonzentrationen waren aufgrund der hohen Km-Werte der Formiat-Dehydrogenase zum Erreichen der Maximalgeschwindigkeit notwendig (35) . Der pH-Wert entsprach den Bedingungen der Biotransformation. Der Ansatz zur Messung der Aktivität der MDH war wie unter Ic) beschrieben. Beide Bestimmun- gen wurden bei 30°C durchgeführt. Nach 2 min Messung der Basalaktivität ohne Substrat wurde die enzymspezifische Aktivität nach Zugabe des Substrats für weitere 2 min gemessen. Zur Berechnung der Aktivität wurde der spezifische Absorbtions-Koeffizient von NAD bei 340 nm E = 6220 M"1cm"1, verwendet. Eine Unit wurde definiert als die Reduktion oder Oxidation von 1 μmol NAD pro min bei pH 6,5 und 30°C.
Die spezifische Aktivität der Formiat -Dehydrogenase im zellfreien Rohextrakt von E. coli BL21 (DE 3) Gold pET- 28a (+) RspmdhNC / pBTac2FDH lag bei 0,14 U/mg. Slusarc- zyk et al . maßen für die spezifische Aktivität der gereinigten Formiat-Dehydrogenase 6,5 U/mg (35). Unter Verwendung dieses Wertes berechnet sich der Anteil der Formiat-Dehydrogenase am löslichen Zellprotein im indu- zierten E. coli BL21 (DE 3) Gold pET-28a (+) RspmdhNC / pBTac2FDH auf 2,2%.
Hinsichtlich der Stabilität der MDH konnte auch 48 h nach Reaktionsstart keine Verminderung der spezifischen Aktivität im zellfreien Rohextrakt festgestellt werden (Tabelle 2) . Die spezifische Aktivität der MDH im zellfreien Rohextrakt erwies sich mit 10 - 12 U/mg als konstant hoch. Die parallele Expression der Formiat -Dehydrogenase in E. coli BL21 (DE 3) Gold pET28a (+) RspmdhNC / pBTac2FDH erbrachte keine Minderung der spezifischen Aktivität der MDH im zellfreien Rohextrakt.
Tabelle 2 : Spezifische Enzymaktivitäten der MDH und der Formiat Dehydrogenase
Die oben gezeigte Biotransformation von D-Fructose zu D-Mannitol mit einer Mannitol-2 -Dehydrogenase aus Rhodobacter spaeroides kann in vergleichbarer Weise auch für die Mannitol -2 -Dehydrogenase aus Leuconostoc pseudomesenteroides durchgeführt werden. Die erfindungsge- mäße Nukleotidsequenz kann mit für den Fachmann bekannten Methoden in den entsprechenden Wirtsorganismus z. B. E. coli transformiert und exprimiert werden und dieser dann zur mikrobiellen Herstellung von D-Mannitol eingesetzt werden. Literatur
1. American Society for Bacteriology : Manual of Methode for General Bacteriology", Washington D.C., USA, (1981)
2. Bhosale, S.H., Rao M.B., Deshpande V.V. (1996) Mi- crobiol . Rev. 60: 280-300
3. Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram auntities of protein utilizing the principles of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254)
4. Brünker P, Altenbuchner J, Mattes R (1998) Struc- ture and function of the genes involved in mannitol, arabitol and glucitol utilization from Pseudomonas fluorescens DSM 50106. Gene 206: 117- 126. 5. Chmiel : Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, (1991) 6. Dubbendorff JW, Studier FW (1991) Controlling ba- sal expression in an inducible T7 expression System by blocking the target T7 promoter with lac repressor. J MoL Biol . 219: 45-59.) 7. Eikmanns et al . (1991) Gene 102, 93-98 8. Gait : Oligonukleotide synthesis: a practical ap- proach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994) 9. Guerrero et al . (1994) Gene 138, 35-41 10. Hahn G. (2000) Entwicklung eines mikrobiellen Verfahrens zur Herstellung von D-Mannitol, Diplomarbeit, Universität Düsseldorf 11. Hörer S, Stoop J, Mooibroeck H, Baumann U, Sassoon J (2001) The chrystallographic structure of mannitol -2 -dehydrogenase NADP+ binary complex from Agaricus bisporus . J. Biol . Chem. 276: 27555 - 27561.
12. Horikoshi K. (1963) Meth. Enzym. Analysis, 3rd ed. Vol .6. H. U. Bergmeyer, Hrsg., Verlag Chemie, Weinheim,
13. Jensen und Hammer (1998) Biotechnology and Bioen- gineering 58, 191-195
14. Kazusa Research Institute, Chiba, Japan: Codon Usage Database
15. Keilhauer, C. et al (1993) J. Bacteriol . , 175:5593-5603 16. LaBarre et al . (1993) Journal of Bacteriology 175,
1001-1007 17. Lämmli U. K. (1970) Cleavage of structural pro- teins during assembly of the head of bacteriophage
T4. Nature 19: 680-685. 18. Liebl et al . (International Journal of Systematic
Bacteriology (1991) 41: 255-260) .
19. Lindroth et al . (1979) Analytical Chemistry 51: 1167-1174)
20. Lottspeich, F. und Zorbas, H., Hrsg., (1998) Bio- analytik, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg, Berlin) .
21. Makkee M, Kieboom APG, Van Bekkum H (1985), Production methods of D-mannitol. Starch/ Stärke 37: 136-140. 22. Makrides (1996) Microbiological Reviews 60:512-538
23. Malumbres et al . (1993) Gene 134, 15 - 24
24. Maniatis, T . ; Fritsch E. F.; und Sambrook J. Mo- lecular Cloning: A Laboratory manual , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)
25. Martin et al . (1987) Bio/Technology 5, 137-146
26. Morton N, Dickerson AG, Hammond JBW (1985) Mannitol metabolism in Agaricus bisporus : purification and properties of mannitol dehydrogenase. J. Gen . Microbiol . 131: 2885 - 2890) .
27. Reinscheid et al . (1994) Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132
28. Röche Diagnostics (Mannheim, Deutschland) "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization"
29. Rosenberg AH, Lade BN, Chul D, Lin S, Dünn JJ, Studier FW (1987) Vectors for selective expresion of cloned DNAs by T7 RNA Polymerase . Gene 56: 125-135.
30. Sakai S, Yamanaka K (1968) Crystalline D- mannitol:NAD oxidoreductase from Leuconostoc pseudomesenteroides. Agric. Biol . Chem. 32:894-898. 31. Sakai S, Yamanaka K. (1968) Cristalline D- mannitol :NAD+ oxidoreductase from Leuconostoc pseudomesenteroides. Biochem. Biophys . Acta 151:684-686
32. Schneider KH, Giffhorn F, Kaplan S (1993) Cloning, nucleotide sequence and characterization of the mannitol dehydrogenase gene from Rhodobacter sphaeroides . J. Gen . Microbiology 139: 2475-2484
33. Schwarzer und Pühler (1991) Bio/Technology 9, 84-87 34. Slatner M, Nidetzky B, Kulbe KD (1999) Kinetic studies of catalytic mechanism of mannitol dehydrogenase from Pseudomonas fluorescens . Biochemistry 38: 10489-10498 35. Slusaczyk, H.; Felber, S . ; Kula, M. R. ; Pohl, M. Stabilization of NAD-dependent formate dehydrogenase from Candida boidinii by site-directed mutag- nesis of cystein residues. Eur. J. Biochem. 267: 1280-1289
36. Soetaert (1991) Synthesis of D-mannitol and L- sorbose by microbial hydrogenation and dehydroge- nation of monosaccharides . PhD Thesis, University of Gent) 37. Soetaert W, Buchholz K, Vandamme EJ (1995), Production of D-mannitol and D-lactic acid by fermen- tation with Leuconostoc pseudomesenteroides . Agro- Food-Industry Hi -Tech 6(1) : 41-44.)
38. Stoop JM, Mooibroeck H (1998) Cloning and characterization of NADP-mannitol dehydrogenase cDNA from the button mushroom Agaricus bi sporus, and its expression in response to NaCl stress . Appl . Environ . Microbiol . 64: 4689 - 4696.
39. Storhas: Bioreaktoren und periphere Einrichtungen, Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, (1994) )
40. Studier FW, Rosenberg AH, Dünn JJ, Dubbendorff JW (1990) Use of T7 RNA Polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol . 185: 45-59.
41. Tsuchiya und Morinaga (1988) BioTechnology 6, 428-430
42. Wisniak J, Simon R (1979) Hydrogenation of glu- cose, fructose and their mixture . Ind . Eng. Chem . Prod . Res . Dev. 18: 50-57.
43. Wright LW (1974) Sorbitol and mannitol. Chemtech Jan 1974: 42-46. ) .
44. Yamanaka K (1975) D-mannitol dehydrogenase from Leuconostoc pseudomesenteroides. Meth. Enzymol. 41:138-142 45. Yamanaka K, Izawa K, Tenmizu K (1977) Physicoche- mical properties of cristalline D-mannitol dehydrogenase of Leuconostoc pseudomesenteroides. Agric. Biol . Chem. 41:1695-1699 46. Seelbach, K.,Riebel, B., Hummel, W., Kula, M.-R., Tishkov,V., Egorov, A. , Wandrey, C. and Kragl , U. (1996) A novel, efficient regenerating method of NADPH using a new formate dehydrogenase Tetrahedron Lett. 37, 1377-1380 47. Slatner, M. et al . (1998) Biotransf. 16: 351-363

Claims

Pat ent ansprüche
1. Nukleotidsequenz kodierend für eine MDH, enthaltend (i) eine Nukleotidsequenz gezeigt in SEQ ID No. 1 (ii) mindestens eine Nukleotidsequenz, die der
Nukleotidsequenz (i) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes entspricht, oder
(iii) mindestens eine Nukleotidsequenz, die mit der zur Nukleotidsequenz (i) oder (ii) komplementären Nukleotidsequenz hybridisiert, und gegebenenfalls
(iiii) funktionsneutrale Sinnmutationen in (i) .
2. Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus aus der Familie der Lactobacteriaceae isoliert wird.
3. Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus Leuconostoc pseudomensenteroides isoliert wird.
4. Plasmid pQE80Lmd , hinterlegt bei der DSMZ unter der Bezeichnung DSM 14824.
5. Genstruktur enthaltend wenigstens eine Nukleotidsequenz gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 sowie mit diesen operativ verknüpfte regulatorische Sequenzen.
6. Vektor, enthaltend wenigstens eine Nukleotidsequenz gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 oder eine Genstruktur gemäß Anspruch 5 sowie zusätzliche Nukleotidsequenzen zur Selektion, zur Replikation in der Wirtszel- le oder zur Integration in das Wirtszell-Genom.
7. Sonde zur Identifizierung und/oder Isolierung von Genen, kodierend für eine MDH gekennzeichnet dadurch, dass sie ausgehend von einer Nukleotidsequenz gemäß ei- nem der Ansprüche 1 bis 3 hergestellt wird und eine zur Detektion geeignete Markierung enthält.
8. MDH oder ein Teil davon, kodiert durch eine Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3.
9. MDH mit einer Aminosäuresequenz abgeleitet aus der Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1, dargestellt in der Seq-ID-NO. 2 oder einer modifizierten Form dieser Polypeptidsequenz oder Isoform davon oder Mischungen daraus .
10. Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 8 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es aus der Familie der Lactobacteriaceae stammt.
11. Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 8 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass es aus Leuconostoc pseudomesenteroides stammt.
12. Mikroorganismus enthaltend in replizierbarer Form eine Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, welcher im Vergleich zum entsprechend nicht genetisch veränderten Mikroorganismus verstärkt ist und/oder dessen Kopienzahl erhöht ist .
13. Mikroorganismus gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , dass er eine Genstruktur gemäß Anspruch 5 oder einen
Vektor gemäß Anspruch 6 oder ein Plasmid gemäß Anspruch 4 enthält .
14. Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 12 bis 13, enthaltend wenigstens ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11, welcher eine im Vergleich zu dem entsprechend nicht genetisch veränderten Mikroorganismus erhöhte Aktivität aufweist.
15. Mikroorganismus gemäß Anspruch 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass er aus der Gattung Bacillus, Lactobacillus, Leuconostoc, den Enterobakteriaceae oder methylotrophen Hefen, Pilzen sowie aus allen auch in der Lebensmittelindustrie verwendeten Mikroorganismen stammt.
16. Mikroorgansimus gemäß Anspruch 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass er aus der Gruppe Achromobacter parvolus, Methylo- bacterium organophilum, Mycobacterium formicum, Pseudomonas spec . 101, Pseudomonas oxalaticus, Mo- raxella sp., Agrobacterium sp., Paracoccus sp., An- cylobacter aquaticus, Pseudomonas fluorescens, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulatus, Lactobacillus sp., Lactobacillus brevis, Leuconostoc pseudomesenteroides, Gluconobacter oxydans, Candida boidinii, Candida methylica oder auch Hansenula po- lymorpha, Aspergillus nidulans oder Neurospora crassa oder Escherichia coli stammt.
17. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von D-Mannitol, dadurch gekennzeichnet, dass man Mikroorganismen einsetzt, in denen man die für die MDH codierende Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1 bis 3 einbringt und/oder verstärkt.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass man einen mit einem oder mehreren Plasmidvektoren transformierten Mikrorganismus einsetzt, der einen Plasmidvektor für die MDH codierende Nukleotidsequenz trägt .
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass mit dem Plasmidvektor pQEδOLmd , hinterlegt unter der Nummer DSM 14824, transformierte Mikroorganismen eingesetzt werden.
20. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von D- Mannitol , dadurch gekennzeichnet, dass man Mikroorganismen einsetzt, in die eine für eine MDH sowie eine für eine Formiat-Dehydrogenase co- dierende Nukleotidsequenz eingebracht und/oder verstärkt wird.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass man Mikroorganismen einsetzt, in die eine für die MDH codierende Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1 bis 3 eingebracht und/oder verstärkt wird.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass man Mikroorganismen einsetzt, in denen man eine für eine Formiat-Dehydrogenase codierende Nukleotidsequenz isoliert aus Candida boidinii einbringt und/oder verstärkt .
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass man einen mit einem oder mehreren Plasmidvektoren transformierten Mikrorganismus einsetzt, der einen Plasmidvektor für die MDH sowie für die Formiat- Dehydrogenase codierende Nukleotidsequenz trägt.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass man Mikroorganismen der Gattung Bacillus, Lactobacillus, Leuconostoc, den Enterobakteriaceae oder methylotrophen Hefen, Pilze sowie Mikroorganismen, die in der Lebensmittelindustrie verwendeten werden, einsetzt.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass Mikroorganismen aus der Gruppe Achromobacter parvo- lus, Methylobacterium organophilum, Mycobacterium formicum, Pseudomonas spec . 101, Pseudomonas oxala- ticus, Moraxella sp., Agrobacterium sp., Paracoccus sp . , Ancylobacter aquaticus, Pseudomonas fluores- cens, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsula- tus, Lactobacillus sp . , Lactobacillus brevis, Leu- conostoc pseudomesenteroides, Gluconobacter oxydans, Candida boidinii, Candida methylica oder auch Hansenula polymorpha, Aspergillus nidulans oder Neurospora crassa oder Escherichia coli eingesetzt werden.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass als Kohlenstoffquelle Fructose oder Glucose eingesetzt wird.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte durchführt :
a) Mikrobielle Herstellung von D-Mannitol unter Verwendung von Mikroorganismen, in die die für eine MDH kodierende Nuleotidsequenz sowie eine für eine Formiat -Dehydrogenase kodierende Nukleotidsequenz eingebracht und/oder verstärkt wird
b) Anreicherung des D-Mannitol im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen und
c) Isolieren des D-Mannitol.
28. Verfahren nach Ansprüche 27, dadurch gekennzeichnet, dass man Mikroorganismen verwendet, in die die für die MDH kodierende Nuleotidsequenz gemäß Anspruch 1 bis 3 eingebracht und/oder verstärkt wird.
EP03737872A 2002-05-08 2003-05-06 Für eine mannitol-2-dehydrogenase codierende nukleotidsequenz sowie verfahren zur herstellung von d-mannitol Withdrawn EP1499728A2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10220848A DE10220848A1 (de) 2002-05-08 2002-05-08 Für eine Mannitol-2-Dehydrogenase codierende Nukleotidsequenz sowie Verfahren zur Herstellung von D-Mannitol
DE10220848 2002-05-08
PCT/DE2003/001456 WO2003095635A2 (de) 2002-05-08 2003-05-06 Für eine mannitol-2-dehydrogenase codierende nukleotidsequenz sowie verfahren zur herstellung von d-mannitol

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP1499728A2 true EP1499728A2 (de) 2005-01-26

Family

ID=29413731

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP03737872A Withdrawn EP1499728A2 (de) 2002-05-08 2003-05-06 Für eine mannitol-2-dehydrogenase codierende nukleotidsequenz sowie verfahren zur herstellung von d-mannitol

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20050239180A1 (de)
EP (1) EP1499728A2 (de)
JP (1) JP2005528098A (de)
AU (1) AU2003245816A1 (de)
CA (1) CA2485489A1 (de)
DE (1) DE10220848A1 (de)
WO (1) WO2003095635A2 (de)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10247147A1 (de) * 2002-10-09 2004-04-22 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren sowie Mikroorganismus zur Herstellung von D-Mannitol
US8642297B2 (en) 2005-08-10 2014-02-04 Zuchem, Inc. Production of L-ribose and other rare sugars
CN107109443B (zh) * 2014-11-06 2021-11-02 庆尚大学校产学协力团 阿洛酮糖的制备方法
CN112680482B (zh) * 2021-01-12 2022-12-20 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种甘露醇的生物制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO03095635A2 *

Also Published As

Publication number Publication date
DE10220848A1 (de) 2003-12-04
JP2005528098A (ja) 2005-09-22
WO2003095635A3 (de) 2004-04-22
US20050239180A1 (en) 2005-10-27
WO2003095635A2 (de) 2003-11-20
AU2003245816A1 (en) 2003-11-11
CA2485489A1 (en) 2003-11-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4451393B2 (ja) コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるジカルボン酸の製造方法
EP2201122B1 (de) Enantioselektive enzymatische reduktion von ketoverbindungen
JPH10229885A (ja) 新規アルコールアルデヒド脱水素酵素
KR20120038030A (ko) 아라비노스 대사경로가 도입된 자일리톨 생산균주 및 이를 이용한 자일리톨 생산방법
EP1498484B1 (de) Beta-untereinheit von glucosedehydrogenase und diese kodierende dna
EP2357222B1 (de) Scyllo-inositol-produzierende zelle und verfahren zur scyllo-inositol-produktion anhand dieser zellen
EP1499728A2 (de) Für eine mannitol-2-dehydrogenase codierende nukleotidsequenz sowie verfahren zur herstellung von d-mannitol
US6630341B2 (en) Phosphohexuloisomerase and gene therefor
JP5000189B2 (ja) コリネ型細菌形質転換体による高効率な有機化合物の製造方法
CN113913399B (zh) 来源于Candida maltosa Xu316的酮基泛解酸内酯还原酶
DE10247147A1 (de) Verfahren sowie Mikroorganismus zur Herstellung von D-Mannitol
DE60202227T2 (de) Neue Enon Reduktasen isoliert aus Kluyveromyces lactis, Methoden zu deren Herstellung und Methoden zur selektiven Reduzierung von Kohlenstoff-Kohlenstoff Doppelbindungen von Alpha, Beta-ungesättigten Ketonen unter Verwendung der Reduktasen
JP6461793B2 (ja) ムコール属由来のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法
EP1762621A1 (de) Neue glycerin-dehydrogenase, gen dafür sowie verfahren zur nutzung davon
JP5175845B2 (ja) 光学活性１，２−ジオール類の製造に用いられる不斉酸化酵素
KR102291199B1 (ko) (ｒ)-3-퀴누클리디놀의 생체촉매적 제조방법
US5804423A (en) Microbiological method of making 5-ketogluconate
JP2011229544A (ja) コリネ型細菌形質転換体による高効率な有機化合物の製造方法
RU2486239C2 (ru) Полипептиды для энантиоселективного ферментативного восстановления промежуточных соединений
JP2011205921A (ja) ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌組換体及びそれを用いた光学活性（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造方法
EA013412B1 (ru) Новый ген sms 27
DE102004010786A1 (de) Mikroorganismus und Verfahren zur Herstellung von Weinsäure
WO2007134817A1 (de) Biokatalysatoren und verfahren zur herstellung von organischen verbindungen
EP2205726A1 (de) Verfahren zur oxidation von methylgruppen in aliphatischen kohlenwasserstoffen unter verwendung eines enzymsystems mit der aktivität einer monooxygenase

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20041116

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LI LU MC NL PT RO SE SI SK TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: AL LT LV MK

17Q First examination report despatched

Effective date: 20050504

DAX Request for extension of the european patent (deleted)
RAP1 Party data changed (applicant data changed or rights of an application transferred)

Owner name: INNOSWEET GMBH

Owner name: FORSCHUNGSZENTRUM JUELICH GMBH

17Q First examination report despatched

Effective date: 20050504

GRAP Despatch of communication of intention to grant a patent

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNIGR1

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20110201