EP1446441A1 - Verfahren zur behandlung von materialien biologischen ursprungs und kollagen-elastin-produkt - Google Patents

Verfahren zur behandlung von materialien biologischen ursprungs und kollagen-elastin-produkt

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Publication number
EP1446441A1
EP1446441A1 EP02787383A EP02787383A EP1446441A1 EP 1446441 A1 EP1446441 A1 EP 1446441A1 EP 02787383 A EP02787383 A EP 02787383A EP 02787383 A EP02787383 A EP 02787383A EP 1446441 A1 EP1446441 A1 EP 1446441A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
collagen
materials
solution
elastin
accompanying substances
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02787383A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Leon Olde Damink
Ingo Heschel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Matricel GmbH
Original Assignee
Matricel GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Matricel GmbH filed Critical Matricel GmbH
Publication of EP1446441A1 publication Critical patent/EP1446441A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/24—Collagen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L31/00—Materials for other surgical articles, e.g. stents, stent-grafts, shunts, surgical drapes, guide wires, materials for adhesion prevention, occluding devices, surgical gloves, tissue fixation devices
    • A61L31/005—Ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L31/00—Materials for other surgical articles, e.g. stents, stent-grafts, shunts, surgical drapes, guide wires, materials for adhesion prevention, occluding devices, surgical gloves, tissue fixation devices
    • A61L31/04—Macromolecular materials
    • A61L31/043—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof
    • A61L31/044—Collagen

Definitions

  • the invention relates to a method for treating materials of biological origin, such as membranes, skins, vessels, heart valves, tendons, and ligaments, in which hydrophobic accompanying substances are chemically removed, and an elastin product.
  • the invention relates to a processing method for collagen materials that can be used in a largely unchanged starting structure or that can be further processed into other structures.
  • collagen materials used in this invention is a simplified term for the materials of biological origin consisting in part of several structural proteins and supporting proteins.
  • elastin in particular may also be present in a considerable amount in some cases and may be desirable for certain applications
  • These collagen materials are obtained from animal membranes such as the intestine, fascia lata, pericardium, peritoneum, omentum or dura mater.
  • Other options are the processing of heart valves or blood vessels.
  • hides, ligaments such as ligamentum nuchae, ligamentum cruciatum and tendons such as Achilles tendons can be processed into collagen fibers which are either used directly or used to produce wound dressings, sponges, cell support structures and the like.
  • non-collagenic accompanying substances Before the collagen structures can be used in or on a patient's body, all cells and non-collagenic accompanying substances must first be removed in order to ensure a safe tissue reaction and to avoid immune reactions.
  • non-collagenous accompanying substances are non-structural proteins, proteoglycans, which consist of proteins and glycosaminoglycans, and lipids.
  • proteoglycans which consist of proteins and glycosaminoglycans
  • lipids A distinction can be made between lipids composed of fatty acids and steroid-like lipids. When removing these accompanying substances, it must be ensured that the collagen is carefully removed from the accompanying substances without the helical collagen structure being impaired.
  • the starting materials are mechanically degreased in a first process step and treated with strong alkali until the amide nitrogen is 0.35 mmol / g or less.
  • the materials are then treated with strong acid and possibly enzymes, which is intended to clean the collagen raw material from accompanying impurities.
  • WO 90/03811 describes a method in which pericardial membranes are degreased mechanically, treated with a basic solution and sodium chloride solution as well as a complexing agent and an acidic buffer system. Only in the last process step are the membranes degreased with acetone. According to WO 95/18638, membranes are cleaned by a sequence of alkaline solution wash, acid solution wash, water wash and subsequent drying and degreased in the last process step.
  • the middle step of removing cells and other accompanying substances takes place in an aqueous environment and it is very important in this process step that the aqueous phase penetrates into the collagen structures not only on a macroscopic but also on a microscopic and molecular level in order to ensure complete and guarantee deep cleaning of the collagen structures.
  • this is only insufficiently possible with the known methods.
  • the invention is based on the problem that there is a significant amount of lipids in the deeper collagen structures. These lipids are water-repellent and therefore prevent water from entering at the molecular level. Although in some of the known processes a part of the lipids is mechanically removed before the aqueous process steps are started, it can never be guaranteed that the mechanical removal of the lipids is sufficient to provide a good cleaning. There can even be an unfavorable case in which the lipids are inadvertently lubricated into the collagen structures during the mechanical removal. There is also the risk that excessive mechanical degreasing in some tissues will destroy the sensitive collagen structures
  • This procedure describes an effective method for removing lipids and hydrophobic substances from tissue structures.
  • the lipids can be removed completely without the lipids first having to be chemically changed.
  • aqueous cleaning can take place without the risk of parts the collagen structure is not accessible to aqueous solutions due to the remaining hydrophobic substances It is advantageous if the collagen materials are disinfected before the hydrophobic accompanying substances are removed.
  • hydrophobic accompanying substances are removed by washing with a water-miscible organic solvent, such as, for example, alcohols or acetone. This enables the lipids to be removed without chemical modification of the lipids. Mixtures of water-miscible solvents with each other or with water also lead to positive process results.
  • a water-miscible organic solvent such as, for example, alcohols or acetone.
  • surfactants Another possibility of removing hydrophobic accompanying substances is washing with surfactants.
  • biologically harmless anionic or cationic or non-ionic surfactants are preferably used.
  • surfactants are Triton X-100, tripolyphosphate or surfactants from the Tween® series, such as Tween® 20 (polyoxyethylene sorbitan monooleate).
  • Non-hydrophobic accompanying substances can be removed with a solution which removes hydrogen-bonded substances, in particular a urea solution.
  • non-hydrophobic accompanying substances can be removed with an aqueous solution of inorganic salts, in particular with a buffered sodium, potassium or calcium chloride solution, which preferably contains enzyme inhibitors.
  • non-hydrophobic accompanying substances are removed with an alkaline solution, such as, for example, sodium, potassium or calcium hydroxide solution.
  • non-hydrophobic accompanying substances are removed with an acidic solution, such as, for example, hydrochloric acid, sulfuric acid or acetic acid.
  • the materials of biological origin are made up into cleaned membranes, heart valves or vessels or are further processed into collagen solutions, collagen fibers, collagen fiber braids, collagen fiber tissues or KoUagen sponges.
  • Packaging is understood to mean, for example, cutting, expanding or chemically crosslinking the treated materials.
  • nativity of the materials of biological origin is set to a value below 95%, in many applications, such as in particular for cartilage regeneration, better cell culture results are shown than with membranes whose nativity is significantly higher.
  • the method according to the invention makes it possible to colonize the treated collagen materials with cells because of the high reproducibility. For example, collagen materials treated in this way have been populated with various skin cells, nerve cells and in particular cartilage cells. The materials of biological origin treated in this way and also the further processed and assembled materials can be used for controlled tissue regeneration.
  • the problem on which the invention is based is also solved with a collagen-elastin product from insoluble collagen, the product having insoluble elastin.
  • the tendency to calcification of such collagen-elastin products in vivo is significantly reduced.
  • the addition of insoluble elastin can increase the elasticity and improve the strength of the product. If the elastin is already contained in the biological starting material, the advantage of working up the material according to the invention arises almost automatically.
  • the elastin is processed in such a way that at least 20% elastin fibers have the originally existing fibrillin structure.
  • the elastin fibers with the originally existing fibrillin structure can be detected microscopically or histologically.
  • the invented The advantage of the addition of elastin according to the invention becomes less and less with further processing and is practically completely lost when admixing soluble elastin.
  • pericardial membranes 10 kg are inactivated and disinfected for one hour in 50 liters of 1.0 N sodium hydroxide solution.
  • the lye bath temperature is 20 ° C.
  • a hydrochloric acid solution is added for neutralization (pH between 6.0 and 8.0).
  • the membranes are washed 3 times with water to remove neutralization residues. Then the membranes are degreased in three stages, each with 50 liters of acetone.
  • the membranes are washed 3 times with water.
  • the membranes are cleaned with sodium hydroxide solution 0.05 N - 0.1 N for about 1 to 21 days.
  • the pH of the lye is between 12 and 14 during this time.
  • a hydrochloric acid solution is added for neutralization.
  • the membranes are washed 3 times with water.
  • the membranes are dewatered with acetone and then air dried.
  • the dried product consists of a collagen fiber braid in which the natural fiber arrangement is still present.
  • the membranes can be used as support and implant material for surgical operations, as a membrane for controlled tissue regeneration or as a carrier for cell cultures. If necessary, the Strength and the rate of degradation of the membranes can be specifically optimized by chemical crosslinking. Conventional crosslinking methods with glutaraldehyde, hexamethylene diisocyanate, carbodiimide or polyepoxide can be used for this.
  • peritoneum membranes 10 kg are inactivated and disinfected in 50 liters of 1.0 N sodium hydroxide solution for one hour.
  • the bath temperature should be 20 ° C.
  • Sodium chloride can be added to suppress excessive swelling.
  • a hydrochloric acid solution is added for neutralization, so that a pH between 6.0 and 8.0 is reached.
  • the peritoneum membranes are washed 3 times with water.
  • the membranes are degreased with 3 x 50 liters of acetone.
  • the membranes are washed 3 times with water.
  • the membranes are washed with buffered sodium chloride solutions that contain enzyme inhibitors such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) or N-ethylmaleimide (NEM).
  • enzyme inhibitors such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) or N-ethylmaleimide (NEM).
  • the membranes are washed 3 times with water to remove salt residues.
  • the membranes are washed with a 4 M urea solution.
  • the membranes are washed 3 times with water to remove residual urea.
  • the membranes are cleaned with sodium hydroxide solution 0.05 N - 0.1 N for about 1 to 21 days.
  • the pH of the lye is between 12 and 14 during this time.
  • a hydrochloric acid solution is added for neutralization.
  • the membranes are washed 3 times with water.
  • the membranes are dewatered with 3 x 50 liters of acetone for about 30 to 60 minutes and then dried.
  • the dried product consists of a collagen elastin fiber braid in which the natural fiber arrangement is still present.
  • the elastin fibers still contain the naturally existing fibrillin structures.
  • the membranes can be used as support and implant material for surgical operations, as a membrane for controlled tissue regeneration or as a carrier for cell cultures. If necessary, the strength and rate of degradation of the membranes can be specifically optimized by chemical crosslinking. Conventional crosslinking methods with glutaraldehyde, hexamethylene diisocyanate, carbodiimide or polyepoxide can be used for this.
  • the tendons are crushed to optimize the degreasing process.
  • the tendons are degreased with 3 x 50 liters of acetone.
  • the tendons are washed 3 times with water to remove acetone residues.
  • the tendons are washed with buffered sodium chloride solutions containing enzyme inhibitors such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) or N-ethylmaleimide (NEM).
  • enzyme inhibitors such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) or N-ethylmaleimide (NEM).
  • the tendons are washed 3 times with water.
  • the tendons are treated with a 4 M urea solution.
  • the tendons are washed 3 times with water to remove residual urea.
  • the tendons are about 0.05 N - 0.1 N (0.2% - 0.4%) with caustic soda solution Cleaned for 1 to 21 days.
  • the pH of the lye is between 12 and 14 during this time.
  • a hydrochloric acid solution is added for neutralization.
  • the tendons are washed 3 times with water.
  • the tendons are cleaned with a hydrochloric acid solution 0.05 N - 1.0 N for about 1 hour to 7 days.
  • the pH of the solution is between 0 and 3 during this time.
  • a lye is added for neutralization.
  • the tendons are washed 3 times with water.
  • the tendons are dried with acetone or by freeze-drying.
  • cleaned collagen fibers are produced, which are used for the production of fiber fabrics, fiber braids, sponges or as a coating material for e.g. B. synthetic vascular prostheses can be used.
  • the strength and degradation rate of these products can be specifically optimized by chemical crosslinking.
  • Common cross-linking methods with glutaraldehyde, hexamethylene diisocyanate, carbodiimide or polyepoxide can be used for this.
  • neck straps e.g. Ligamentum Nuchea
  • the bath temperature should be 20 ° C.
  • the neck bands are crushed to optimize the degreasing process.
  • the neck straps are degreased with 3 x 50 liters of acetone.
  • the neck bands are washed 3 times with water to remove the acetone.
  • the neck straps are washed with buffered sodium chloride solutions containing enzyme inhibitors such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) or N-ethylmaleinimide (NEM).
  • enzyme inhibitors such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) or N-ethylmaleinimide (NEM).
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • NEM N-ethylmaleinimide
  • Ethylendiamine tetraacetic acid (EDTA) or N-ethylmaleimide (NEM) contain.
  • the neck straps are washed 3 times with water.
  • the neck straps are washed with 4 M urea solution.
  • the neck bands are washed with 3 x 50 liters of water for about 30 to 60 minutes to remove residual urea.
  • the neck straps are cleaned with caustic soda solution 0.05 N - 0.1 N (0.2% - 0.4%) for about 1 to 21 days.
  • the pH of the lye is between 12 and 14 during this time.
  • a hydrochloric acid solution is added for neutralization (pH between 6.0 and 8.0).
  • the neck straps are washed 3 times with water.
  • the neck bands are cleaned with a hydrochloric acid solution 0.05 N - 1.0 N for about 1 hour to 7 days.
  • the pH of the solution is between 0 and 3 during this time.
  • a lye is added for neutralization.
  • the neck straps are washed 3 times with water.
  • the neck tape fibers are dried by dewatering with acetone or by freeze-drying.
  • an optimal mixture of cleaned Contain elastin fibers and purified collagen fibers By working up the neck band, an optimal mixture of cleaned Contain elastin fibers and purified collagen fibers.
  • the elastin fibers still contain the naturally existing fibrillin structures.
  • This mixture can be used for the production of fiber fabrics, fiber braids, sponges or as a coating material for synthetic vascular prostheses.
  • this mixture can also be used after the addition of collagen fibers from Example 3 for the production of fiber fabrics, fiber braids, sponges or as a coating material for synthetic vascular prostheses.
  • the neck tape fibers can be used to make fiber fabrics, braids or sponges. If necessary, the strength and rate of degradation of the products can be optimized by chemical crosslinking as described above.
  • the mass fraction of the lipids is typically still between 15% and 20% even after the cleaning step with an acid has been completed.
  • the mass fraction of the lipids is typically less than 0.5%, so that optimal accessibility of the collagen membranes is guaranteed for the subsequent aqueous cleaning processes.
  • Ash value 0.1 - 0.2% (w / w)
  • Lipid content ⁇ 0.5% (w / w)
  • nativity of the membranes was determined according to the method developed by Bank, which is described in detail in: Bank R.A. et al: A simplified measurement of degraded collagen in tissues: Application in healthy, fibrillated and osteoarthritic cartilage, Matrix Biology 16, 233-243 (1997).
  • the purity of collagen structures can be directly related to the remaining amounts of glucosamine and galactosamine in the material. These two substances are characteristic marker molecules for the presence of glucosaminoglycans, that is to say of non-collagen molecules which are to be removed in the course of the cleaning process.
  • glucosamine and galactosamine contents of freshly obtained collagen membranes from the slaughterhouse are compared to the values of commercially available collagen membranes that were not chemically degreased before the aqueous cleaning steps and collagen membranes produced according to the invention.
  • the glucosamine and galactosamine contents were determined by an amino acid analysis following acid hydrolysis of the starting material. terials determined with 6 M hydrochloric acid, the contents being expressed as the number of molecules per 1000 molecules (n / lOOOn).
  • the cultivability of commercial and collagen membranes produced according to the invention with biological cells was investigated using the example of colonization with chondrocytes.
  • the following table shows the results of the cell numbers and cell vitality following a three-day cell cultivation. All membranes were populated with an identical number of starting cells, the cells being taken from the same cell suspension and then cultivated under the same conditions.

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Abstract

Um eine reproduzierbare Behandlung von Materialien biologischen Ursprungs wie beispielsweise von Membranen, Häuten, Gefässen, Herzklappen, Sehnen, und Bändern zu erzielen, werden zunächst hydrophobe Begleitsubstanzen chemisch entfernt, ohne dass diese Begleitsubstanzen chemisch verändert werden. Anschliessend werden nicht-hydrophobe Begleitsubstanzen entfernt. Die derart behandelten Materialien werden zu Membranen, Herzklappen oder Gefässen konfektioniert oder zu Lösungen, Fasern, Fasergeflechten, Fasergeweben oder Schwämmen weiterverarbeitet und ggf. auch mit Zellen besiedelt und/oder zur gesteuerten Geweberegeneration eingesetzt.

Description

VERFAHREN ZUR BEHANDLUNG VON MATERIALIEN BIOLOGISCHEN URSPRUNGS UND KOLLAGEN-ELASTIN-PRODUKT
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von Materialien biologischen Ursprungs wie beispielsweise von Membranen, Häuten, Gefäßen, Herzklappen, Sehnen, und Bändern, bei dem hydrophobe Begleitsubstanzen chemisch entfernt werden, und ein Elastin-Produkt.
Genauer gesagt betrifft die Erfindung ein Aufarbeitungsverfahren für Kollagenmaterialien, die in einer weitgehend unveränderten Ausgangsstruktur verwendet werden können oder zu anderen Strukturen weiterverarbeitet werden. Der in dieser Erfindung verwendete Begriff „Kollagenmaterialien" ist eine vereinfachende Bezeichnung für die aus teilweise mehreren strukturellen Proteinen und Stützproteinen bestehenden Materialien biologischen Ursprungs. So kann zusätzlich zum Kollagen auch insbesondere Elastin in teilweise beträchtlicher Menge enthalten sein und für bestimmte Anwendungen erwünscht sein. Üblicherweise werden diese Kollagenmaterialien aus tierischen Membranen wie beispielsweise Darm, Fascia Lata, Perikard, Peritoneum, Omentum oder Dura Mater gewonnen. Andere Möglichkeiten sind die Aufarbeitung von Herzklappen oder Blutgefäßen. Auch Häute, Bänder wie beispielsweise Ligamentum nuchae, Ligamentum crucia- tum und Sehnen wie beispielsweise Achillessehnen können zu Kollagen-Fasern aufgearbeitet werden. Diese Fasern werden entweder direkt weiterverwendet oder zur Herstellung von Wundverbänden, Schwämmen, Zellträgerstrukturen und dergleichen eingesetzt.
Ein Verfahren zur Behandlung von Kollagenmaterialien wird in der Doktorarbeit von A. Ghofrani, Entwicklung eines Äquivalenz für autogene Spalthaut, Dissertation RWTH Aachen, 27. April 1998, Shaker-Nerlag, Aachen, beschrieben. Bei der dort beschriebenen Norgehensweise ergab sich das Problem einer für praktische Anwendungen inakzeptabel geringen Reproduzierbarkeit von Besiedelungs- und Biokompatibilitätsexperimenten sowie eine zu geringe Resistenz mancher Produktionschargen gegenüber dem enzymati- schen Abbau. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die tierischen und humanen Gewebe, die als Grundstoffe verwendet werden, nur zu einem großen Teil aus Kollagen bestehen. Sie enthalten auch verschiedene andere Substanzen, wie beispielsweise Zellen und nicht- kollagene Begleitstoffe. Bevor die Kollagenstrukturen im oder am Körper eines Patienten zur Anwendung kommen können, müssen zuerst alle Zellen und nicht-kollagenen Begleitstoffe entfernt werden, um eine unbedenkliche Gewebereaktion zu gewährleisten und Immunreaktionen zu vermeiden. Beispiele von nicht-kollagenen Begleitstoffen sind nichtstrukturelle Proteine, Proteoglykane, die aus Proteinen und Glycosaminoglykanen bestehen, sowie Lipide. Bei den Lipiden können aus Fettsäuren aufgebaute Lipide und steroid- ähnliche Lipide unterschieden werden. Bei der Entfernung dieser Begleitstoffe ist darauf zu achten, dass das Kollagen schonend von den Begleitstoffen befreit wird, ohne dass die helikale Kollagenstruktur beeinträchtigt wird.
Gemäß dem US-Patent 5,028,695 werden in einem ersten Prozessschritt die Ausgangsmaterialien mechanisch entfettet und mit starkem Alkali behandelt bis der Amidstickstoff 0,35 mmol/g oder weniger beträgt. Anschließend werden die Materialien mit starker Säure und ggf. Enzymen behandelt, wodurch der Kollagenrohstoff von begleitenden Verunreinigungen gereinigt werden soll.
Die WO 90/03811 beschreibt ein Verfahren, bei dem Perikardmembranen mechanisch entfettet werden, mit basischer Lösung und Νatriumchloridlösung sowie einem Komple- xierungsmittel und einem sauren Puffersystem behandelt werden. Erst im letzten Prozessschritt werden die Membranen mit Azeton entfettet. Gemäß der WO 95/18638 werden Membranen durch eine Abfolge von alkalischer Lösungswäsche, saurer Lösungswäsche, Wasserwäsche und anschließender Trocknung gereinigt und im letzten Prozessschritt entfettet.
Alle beschriebenen Verfahren basieren darauf, dass die zellulären Bestandteile und die nicht-kollagenen Begleitstoffe im wässrigen Milieu entfernt oder aufgelöst werden. Dies gilt sowohl für die Verfahren, in denen die Zeil- und Begleitstoffe durch chemisches Einarbeiten entfernt werden als auch für die Verfahren, die auf enzymatischen Reaktionen beruhen. Den bekannten Verfahren liegen jeweils drei Prozessschritte zugrunde: Zunächst wird das Ausgangsmaterial mechanisch oder wässrig ggf. nach partieller alkalischer Hydrolyse entfettet. Anschließend werden Zellen und weitere Begleitstoffe entfernt und letztlich wird das Material getrocknet und ggf. bei oder nach der Trocknung nochmals entfettet.
Der mittlere Schritt der Entfernung von Zellen und weiteren Begleitstoffen läuft im wässrigen Milieu ab und es ist bei diesem Verfahrensschritt sehr wichtig, dass die wässrige Phase nicht nur auf makroskopischer, sondern auch auf mikroskopischer und molekularer Ebene in die Kollagen- Strukturen eindringt, um eine vollständige und in die Tiefe der Kollagen- Strukturen reichende Reinigung garantieren zu können. Dies ist mit den bekannten Verfahren jedoch nur unzureichend möglich.
Daher liegt der Erfindung das Problem zugrunde, dass sich eine signifikante Menge an Lipiden in den tiefer liegenden Kollagen- Strukturen befinden. Diese Lipide sind wasserabstoßend und verhindern deshalb das Eindringen von Wasser auf Molekularebene. Obwohl in manchen der bekannten Verfahren ein Teil der Lipide mechanisch entfernt wird, bevor die wässrigen Verfahrensschritte begonnen werden, kann nie garantiert werden, dass die mechanische Entfernung der Lipide ausreicht, um eine gute Reinigung zu schaffen. Es kann sogar der ungünstige Fall eintreten, dass die Lipide während der mechanischen Entfernung unbeabsichtigt in die Kollagen- Strukturen hineingeschmiert werden. Zudem besteht die Gefahr, dass eine zu weitgehende mechanische Entfettung in manchen Geweben die empfindlichen Kollagen- Strukturen zerstört
Es wurde auch vorgeschlagen, alkalische Konditionen wahrend der Reinigung zu verwenden, um die Lipide zu hydrolisieren und danach mit Wasser zu entfernen Dies funktioniert jedoch nur bei Fettsaurelipiden, nicht jedoch für steroid-ahnliche Lipide Hinzu kommt, dass die Fettsaurehydrolyse bei den alkalischen Reinigungsverfahren für Kollagen-Strukturen sehr langsam verlauft und niemals eine vollständige Entfernung der Lipide gewährleistet werden kann
Dies führt dazu, dass bei den herkömmlichen Verfahren der Reinigungsgrad der Kollagen-Strukturen von unbeeinflussbaren Begleiterscheinungen abhangt, so dass die Reproduzierbarkeit der rein mechanischen Entfettung und alkalischen Behandlung schlecht ist Als logische Konsequenz sind derartig präparierte Kollagen-Strukturen für die Zellbesie- delung und die Geweberegeneration nur bedingt geeignet und insbesondere ist eine ausreichende Reproduzierbarkeit für die Zellkultivierung nicht gegeben
Das der Erfindung zugrunde liegende Problem wird mit einem Verfahren gelost, bei dem hydrophobe Begleitsubstanzen chemisch entfernt werden, ohne dass diese Begleitsubstanzen chemisch verändert werden und danach nicht-hydrophobe Begleitsubstanzen entfernt werden
Diese Vorgehensweise beschreibt ein effektives Verfahren zur Entfernung von Lipiden und hydrophoben Substanzen aus Gewebestrukturen Bei dem ersten Schritt können die Lipide vollständig entfernt werden, ohne dass die Lipide zuerst chemisch verändert werden müssen Danach kann eine wässrige Reinigung stattfinden, ohne dass die Gefahr besteht, dass Teile der Kollagen- Struktur durch verbleibende hydrophobe Substanzen nicht zuganglich für wässrige Losungen sind Vorteilhaft ist es, wenn die Kollagenmaterialien vor dem Entfernen der hydrophoben Begleitsubstanzen desinfiziert werden.
Eine Verfahrensvariante sieht vor, dass die hydrophoben Begleitsubstanzen durch eine Wäsche mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel wie zum Beispiel Alkohole oder Azeton entfernt werden. Dies ermöglicht eine Entfernung der Lipide ohne chemische Veränderung der Lipide. Auch Mischungen von wassermischbaren Lösungsmitteln untereinander oder mit Wasser fuhren zu positiven Verfahrensergebnissen.
Vorteilhaft ist es, wenn sich der Behandlung mit wassermischbaren organischen Lösungsmitteln eine Behandlung mit nicht-wassermischbaren organischen Lösungsmitteln wie Hexan, Diethylether, Chloroform oder Petroleumbenzin anschließt.
Eine weitere Möglichkeit der Entfernung hydrophober Begleitsubstanzen ist eine Wäsche mit Tensiden. Hierbei werden vorzugsweise biologisch unbedenkliche anionische bzw. kationische oder nicht-ionische Tenside angewandt. Beispiele für derartige Tenside sind Triton X-100, Tripolyphosphat oder Tenside aus der Tween®-Reihe, wie zum Beispiel Tween® 20 (Polyoxyethylensorbitanmonooleat).
Auch Kombinationen von wassermischbaren organischen Lösungsmitteln (wie zum Beispiel Azeton) mit Tensiden sind möglich. Vorteilhaft ist eine Lösung von 1,0 % Tween® 20 in 50 volumenprozentiger Azeton- Wasser-Lösung.
Nicht-hydrophobe Begleitsubstanzen können mit einer Lösung, die wasserstoffbrücken- gebundene Stoffe entfernt, wie insbesondere eine Harnstofflösung, entfernt werden.
Außerdem können nicht-hydrophobe Begleitsubstanzen mit einer wässrigen Lösung anorganischer Salze wie insbesondere mit einer gepufferten Natrium-, Kalium- oder Kalziumchloridlösung, die vorzugsweise Enzymhemmer enthält, entfernt werden. Darüber hinaus wird vorgeschlagen, dass nicht-hydrophobe Begleitsubstanzen mit einer alkalischen Lösung, wie zum Beispiel Natrium-, Kalium- oder Kalziumhydroxidlösung, entfernt werden.
Ferner wird vorgeschlagen, dass nicht-hydrophobe Begleitsubstanzen mit einer sauren Lösung, wie zum Beispiel Salzsäure, Schwefelsäure oder Essigsäure, entfernt werden.
Besonders gute Ergebnisse wurden durch eine Kombination folgender Schritte erzielt: Behandlung mit einer Lösung, die wasserstoffbrücken-gebundene Stoffe entfernt, nachfolgend eine Behandlung mit einer Lösung, die alkalisch-hydrolytisch empfindliche Stoffe entfernt und letztlich eine Behandlung mit einer Lösung, die säureempfindliche Stoffe entfernt. Diese kombinierte Behandlungsmethode kann genauso effektiv bei einer anderen Reihenfolge der einzelnen Reinigungsschritte erfolgen. Es kann unter Umständen auch auf einzelne Prozessschritte verzichtet werden.
Vorteilhaft ist es, wenn die Materialien biologischen Ursprungs zu gereinigten Membranen, Herzklappen oder Gefäßen konfektioniert werden oder zu Kollagenlösungen, Kollagenfasern, Kollagenfasergeflechten, Kollagenfasergeweben oder KoUagenschwämmen weiterverarbeitet werden. Unter einer Konfektionierung wird beispielsweise das Zuschneiden, Aufweiten oder chemische Vernetzen der behandelten Materialien verstanden.
Wenn die Nativität der Materialien biologischen Ursprungs auf einen Wert unter 95 % eingestellt wird, zeigen sich in vielen Anwendungsfällen, wie insbesondere für die Knorpelregeneration, bessere Zellkulturergebnisse als bei Membranen, deren Nativität deutlich höher liegt. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es, aufgrund der hohen Reproduzierbarkeit die behandelten Kollagenmaterialien auch mit Zellen zu besiedeln. Beispielsweise wurden derartig behandelte Kollagenmaterialien mit verschiedenen Hautzellen, Nervenzellen und insbesondere Knorpelzellen besiedelt. Die derart behandelten Materialien biologischen Ursprungs und auch die weiter verarbeiteten und konfektionierten Materialien können zur gesteuerten Geweberegeneration verwendet werden. Insbesondere im Bereich der Gelenkknorpelregeneration durch die ACI- oder MACI®-Techniken (Autologe Chondrozyten Implantation bzw. Matrix-gekoppelte Autologe Chondrozyten-Implantation) wurde die besondere Eignung der erfindungsgemäß hergestellten Kollagenmaterialien in Zellkulturversuchen und tierexperimentellen Studien nachgewiesen.
Das der Erfindung zu Grunde liegende Problem wird auch mit einem Kollagen-Elastin- Produkt aus unlöslichem Kollagen gelöst, wobei das Produkt unlösliches Elastin aufweist. Durch die Zugabe des unlöslichen Elastins beispielsweise zu Schwämmen wird einerseits die Resorption deutlich verlangsamt und somit die Resistenz des aufgearbeiteten Materials gesteigert. Andererseits ist die Kalzifizierungsneigung von derartigen Kollagen-Elastin-Produkten in vivo wesentlich reduziert. Schließlich läßt sich durch die Zugabe von unlöslichem Elastin die Elastizität erhöhen und die Festigkeit des Produkts verbessern. Ist das Elastin bereits im biologischen Ausgangsmaterial enthalten, so ergibt sich der Vorteil bei der erfindungsgemäßen Aufarbeitung des Materials nahezu von selbst.
Die Erzielung der erfindungsgemäßen Vorteile ist vor allem dann zu erreichen, wenn das Elastin in unlöslicher Form beigemischt wird. Ansonsten wird es zu schnell resorbiert und die dauerhafte Verbesserung der Festigkeitseigenschaften ist nicht möglich.
Besonders vorteilhaft ist es, wenn man das Elastin so verarbeitet, dass mindestens 20 % Elastinfasern die ursprünglich vorhandene Fibrillinstruktur aufweisen. In diesem Kollagen-Elastin-Produkt sind die Elastinfasern mit der ursprünglich vorhandenen Fibrillinstruktur mikroskopisch oder histologisch nachweisbar.
Wird das Elastin weiter aufgearbeitet, um die Fibrillinstruktur zu entfernen, so verliert es immer mehr von seinen ursprünglich positiven Eigenschaften. Daher wird der erfin- dungsgemäße Vorteil der Elastinbeimischung bei weiterer Aufarbeitung immer geringer und ist bei der Beimischung von löslichem Elastin praktisch vollkommen verloren.
Ausführungsbeispiele für die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und die besonderen Vorteile dieser Prozeßführung werden im folgenden beschrieben:
Beispiel 1
10 kg Perikard-Membranen werden eine Stunde in 50 Liter 1.0 N Natronlauge-Lösung inaktiviert und desinfiziert. Die Laugenbadtemperatur beträgt 20 °C.
Nach einer Stunde wird eine Salzsäure-Lösung zur Neutralisation zugegeben (pH- Wert zwischen 6.0 und 8.0). Die Membranen werden 3 x mit Wasser gewaschen um Neutralisationsreste zu entfernen. Dann werden die Membranen in drei Stufen mit jeweils 50 Liter Azeton entfettet.
Um das Azeton zu entfernen, werden die Membranen 3 x mit Wasser gewaschen.
Die Membranen werden etwa 1 bis 21 Tage mit Natronlauge-Lösung 0.05 N - 0.1 N gereinigt. Der pH- Wert der Lauge liegt während dieser Zeit zwischen 12 und 14.
Es wird eine Salzsäure-Lösung zur Neutralisation zugegeben. Die Membranen werden 3 x mit Wasser gewaschen.
Schließlich werden die Membranen mit Azeton entwässert und danach luftgetrocknet.
Das getrocknete Produkt besteht aus einem Kollagenfasergeflecht, in dem die natürliche Faseranordnung noch vorhanden ist.
Nach dem Konfektionieren und Sterilisieren können die Membranen als Stütz- und Implantatmaterial für chirurgische Operationen, als Membran für die gesteuerte Geweberegeneration oder als Träger für Zellkulturen angewendet werden. Gegebenenfalls kann die Festigkeit und die Abbaugeschwindigkeit der Membranen durch chemisches Vernetzen spezifisch optimiert werden. Dafür können übliche Vernetzungsmethoden mit Glutaral- dehyd, Hexamethylendiisocyanat, Carbodiimidoder Polyepoxid verwendet werden.
Beispiel 2:
10 kg Peritoneum-Membranen werden eine Stunde in 50 Liter 1.0 N Natronlauge- Lösung inaktiviert und desinfiziert. Die Laugenbadtemperatur soll 20 °C betragen. Natriumchlorid kann zugefügt werden, um eine zu starke Quellung zu unterdrücken.
Nach einer Stunde wird eine Salzsäure-Lösung zur Neutralisation zugegeben, sodass ein pH-Wert zwischen 6.0 und 8.0 erreicht wird. Die Peritoneum-Membranen werden 3 x mit Wasser gewaschen.
Dann werden die Membranen mit 3 x 50 Liter Azeton entfettet.
Um das Azeton zu entfernen, werden die Membranen 3 x mit Wasser gewaschen.
Die Membranen werden mit gepufferten Natriumchlorid-Lösungen gewaschen, die En- zymhemmer wie Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder N-Ethylmaleinimid (NEM) enthalten.
Die Membranen werden 3 x mit Wasser gewaschen, um Salzreste zu entfernen.
Die Membranen werden mit einer 4 M Harnstoff-Lösung gewaschen.
Die Membranen werden 3 x mit Wasser gewaschen, um Harnstoffreste zu entfernen.
Die Membranen werden mit Natronlauge-Lösung 0.05 N - 0.1 N über etwa 1 bis 21 Tage gereinigt. Der pH- Wert der Lauge liegt während dieser Zeit zwischen 12 und 14.
Es wird eine Salzsäure-Lösung zur Neutralisation zugegeben. Die Membranen werden 3 x mit Wasser gewaschen.
Die Membranen werden mit 3 x 50 Liter Azeton etwa 30 bis 60 Minuten entwässert und danach getrocknet. Das getrocknete Produkt besteht aus einem Kollagen-Elastinfasergeflecht, in dem die natürliche Faseranordnung noch vorhanden ist. Die Elastinfasern enthalten noch immer die natürlich vorhandenen Fibrillinstrukturen.
Nach dem Konfektionieren und Sterilisieren können die Membranen als Stütz- und Implantatmaterial für chirurgische Operationen, als Membran für die gesteuerte Geweberegeneration oder als Träger für Zellkulturen angewendet werden. Gegebenenfalls kann die Festigkeit und die Abbaugeschwindigkeit der Membranen durch chemisches Vernetzen spezifisch optimiert werden. Dafür können übliche Vernetzungsmethoden mit Glutaral- dehyd, Hexamethylendiisocyanat, Carbodiimidoder Polyepoxid verwendet werden.
Beispiel 3:
10 kg Sehnen werden in 50 Liter 1.0 N Natronlauge Lösung etwa eine Stunde inaktiviert und desinfiziert. Die Laugenbadtemperatur soll 20 °C betragen.
Nach einer Stunde wird zur Neutralisation eine Salzsäure-Lösung zugegeben. Die Sehnen werden 3 x mit Wasser gewaschen bis alle Neutralisationsreste entfernt sind.
Die Sehnen werden zerkleinert, um den Entfettungsvorgang zu optimieren.
Die Sehnen werden mit 3 x 50 Liter Azeton entfettet.
Die Sehnen werden 3 x mit Wasser gewaschen, um Azetonrückstände zu entfernen.
Die Sehnen werden mit gepufferten Natriumchlorid-Lösungen gewaschen, die Enzymhemmer wie Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder N-Ethylmaleinimid (NEM) enthalten.
Die Sehnen werden 3 x mit Wasser gewaschen.
Die Sehnen werden mit einer 4 M Harnstoff-Lösung behandelt.
Die Sehnen werden 3 x mit Wasser gewaschen, um Harnstofϊreste zu entfernen.
Die Sehnen werden mit Natronlauge-Lösung 0.05 N - 0.1 N (0.2 % - 0.4 %) über etwa 1 bis 21 Tage gereinigt. Der pH- Wert der Lauge liegt während dieser Zeit zwischen 12 und 14.
Es wird eine Salzsäure Lösung zur Neutralisation zugegeben. Die Sehnen werden 3 x mit Wasser gewaschen.
Die Sehnen werden mit einer Salzsäure Lösung 0.05 N - 1.0 N über etwa 1 Stunde bis 7 Tage gereinigt. Der pH- Wert der Lösung liegt während dieser Zeit zwischen 0 und 3.
Es wird eine Lauge zur Neutralisation zugegeben. Die Sehnen werden 3 x mit Wasser gewaschen.
Die Sehnen werden schließlich mit Azeton oder durch Gefriertrocknung getrocknet.
Durch dieses Aufarbeitungsverfahren der Sehnen werden gereinigte Kollagenfasern erzeugt, die zur Herstellung von Fasergeweben, Fasergeflechten, Schwämmen oder als Beschichtungsmaterial für z. B. synthetische Gefäßprothesen verwendet werden können.
Gegebenenfalls kann die Festigkeit und die Abbaugeschwindigkeit dieser Produkte durch chemisches Vernetzen spezifisch optimiert werden. Dafür können übliche Vernetzungsmethoden mit Glutaraldehyd, Hexamethylendiisocyanat, Carbodiimidoder Polyepoxid verwendet werden.
Anwendungsmöglichkeiten für diese Produkte liegen im Hämostasebereich, als Dermi- sersatz im Bereich der Heilung chronischer und akuter Wunden und als generelle Trägerstruktur für Tissue Engineering- nwendungen.
Beispiel 4:
10 kg Nackenbänder (beispielsweise Ligamentum Nuchea) werden in 50 Liter 1.0 N Natronlauge Lösung etwa eine Stunde inaktiviert und desinfiziert. Die Laugenbadtemperatur soll 20 °C betragen.
Nach einer Stunde wird zur Neutralisation eine Salzsäure-Lösung zugegeben. Die Na- ckenbänder werden 3 x mit Wasser gewaschen bis alle Neutralisationsreste entfernt sind.
Die Nackenbänder werden zerkleinert, um den Entfettungsvorgang zu optimieren.
Die Nackenbänder werden mit 3 x 50 Liter Azeton entfettet.
Die Nackenbänder werden 3 x mit Wasser gewaschen, um das Azeton zu entfernen.
Die Nackenbänder werden mit gepufferten Natriumchlorid-Lösungen gewaschen, die Enzymhemmer wie Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder N-Ethylmaleinimid (NEM) enthalten. Ethyleendiamintetraessigsäure (EDTA) oder N-ethylmaleimide (NEM) enthalten.
Die Nackenbänder werden 3 x mit Wasser gewaschen.
Die Nackenbänder werden mit 4 M Harnstoff Lösung gewaschen.
Die Nackenbänder werden mit 3 x 50 Liter Wasser etwa 30 bis 60 Minuten gewaschen, um Harnstoffreste zu entfernen.
Die Nackenbänder werden mit Natronlauge-Lösung 0.05 N - 0.1 N (0.2 % - 0.4 %) für etwa 1 bis 21 Tage gereinigt. Der pH- Wert der Lauge liegt während dieser Zeit zwischen 12 und 14.
Es wird eine Salzsäure-Lösung zur Neutralisation (pH- Wert zwischen 6.0 und 8.0) zugegeben. Die Nackenbänder werden 3 x mit Wasser gewaschen.
Die Nackenbänder werden mit eine Salzsäure Lösung 0.05 N - 1.0 N über etwa 1 Stunde bis 7 Tage gereinigt. Der pH- Wert der Lösung liegt während dieser Zeit zwischen 0 und 3.
Es wird eine Lauge zur Neutralisation zugegeben. Die Nackenbänder werden 3 x mit Wasser gewaschen.
Die Nackenbandfasern werden getrocknet durch Entwässern mit Azeton oder durch Gefriertrocknung.
Durch dieses Aufarbeiten des Nackenbandes wird ein optimales Gemisch von gereinigten Elastinfasern und gereinigten Kollagenfasern enthalten. Die Elastinfasern enthalten noch immer die natürlich vorhandenen Fibrillinstrukturen. Dieses Gemisch kann zur Herstellung von Fasergeweben, Fasergeflechten, Schwämmen oder als Beschichtungsmaterial für synthetische Gefäßprothesen verwendet werden. Zusätzlich kann dieses Gemisch auch nach Zugabe von Kollagenfasern aus Beispiel 3 zur Herstellung von Fasergeweben, Fasergeflechten, Schwämmen oder als Beschichtungsmaterial für synthetische Gefäßprothesen verwendet werden.
Die Nackenbandfasern können zur Herstellung von Fasergeweben, Fasergeflechten oder Schwämmen verwendet werden. Gegebenfalls kann die Festigkeit und die Abbaugeschwindigkeit der Produkte durch chemisches Vernetzen wie oben beschrieben optimiert werden.
Anwendungsmöglichkeiten für auf diesem Material basierende Produkte sind insbesondere dort gegeben, wo eine Kombination aus Elastin und Kollagen vorteilhaft ist. Dies ist insbesondere im Bereich der Wundbehandlung als Dermisersatz gegeben und zur Förderung der Neovaskularisation oder Erhöhung der Elastizität im gesamten Bereich des Tis- sue-Engineering. Auf diesem Aufarbeitungsverfahren basierende Produkte können zu verschiedensten Trägerstrukturen für Tissue-Engineering-Anwendungen weiterverarbeitet werden.
Die Vorteile der erfmdungsgemäß hergestellten Materialien biologischen Ursprungs nach einem der vorgenannten Beispiele werden nachfolgend exemplarisch anhand von Analyseergebnissen und Zellkultivierungsstudien dargestellt.
Bei der Aufarbeitung von Kollagenmembranen ohne die erfindungsgemäße Entfernung hydrophober Begleitsubstanzen vor der Entfernung nicht-hydrophober Begleitsubstanzen wurde nachgewiesen, daß der Massenanteil der Lipide selbst nach Abschluß des Reinigungsschrittes mit einer Säure typischerweise immer noch zwischen 15 % und 20 % beträgt. Bei der erfindungsgemäßen Prozeßführung mit 3 aufeinanderfolgenden Aceton- Wäschen hingegen beträgt der Massenanteil der Lipide typischerweise weniger als 0,5 %, so daß eine optimale Zugänglichkeit der Kollagenmembranen für die nachfolgenden wäßrigen Reinigungsprozesse gewährleistet ist.
Die nachfolgende Tabelle charakterisiert die typische Zusammensetzung von erfindungsgemäß hergestellten Kollagenmembranen:
Denaturierungstemperatur: 45 - 47 °C Nativität: 78 - 82 %*
Aschwert: 0.1 - 0.2 % (w/w)
Feuchtigkeitsgehalt: 10 - 15 % Stickstoffamid-Gehalt: 0.29 - 0.32 mmol/g
Lipid-Gehalt: < 0.5 % (w/w)
Die Nativität der Membranen wurde gemäß der von Bank entwickelten Methode bestimmt, die detailliert beschrieben ist in: Bank R.A. et al: A simplified measurement of degraded Collagen in tissues: Application in healthy, fibrillated and osteoarthritic cartila- ge, Matrix Biology 16, 233-243 (1997).
Die Reinheit von Kollagenstrukturen kann direkt in Beziehung gebracht werden mit den im Material verbliebenen Restmengen von Glucosamin und Galactosamin. Diese beiden Stoffe sind charakteristische Markermoleküle für die Anwesenheit von Glucosaminogly- kanen, also von nicht-kollagenen Molekülen, die im Verlaufe des Reinigungsprozesses entfernt werden sollen. In der nachfolgenden Tabelle sind die Glucosamin- und Galacto- samin-Gehalte von frisch gewonnenen Kollagenmembranen aus dem Schlachthof den Werten von kommerziell erhältlichen Kollagenmembranen, die vor den wäßrigen Reinigungsschritten nicht chemisch entfettet wurden und erfindungsgemäß hergestellten Kollagenmembranen gegenübergestellt. Die Glucosamin- und Galactosamin-Gehalte wurden durch eine Aminosäurenanalyse im Anschluß an eine saure Hydrolyse des Ausgangsma- terials mit 6 M Salzsäure ermittelt, wobei die Gehalte ausgedrückt sind als Anzahl Moleküle pro 1000 Moleküle (n/lOOOn).
Die Kultivierbarkeit von kommerziellen und erfindungsgemäß hergestellten Kollagenmembranen mit biologischen Zellen wurde am Beispiel der Besiedlung mit Chondrozyten vergleichend untersucht. Die nachfolgende Tabelle zeigt die Ergebnisse der Zellzahlen und Zellvitalitäten im Anschluß an eine dreitägige Zellkultivierung. Alle Membranen wurden mit identischer Ausgangszellzahl besiedelt, wobei die Zellen derselben Zellsuspension entnommen wurden und anschließend unter gleichen Bedingungen kultiviert.
Man erkennt deutlich, daß die Zellzahl auf den erfindungsgemäß hergestellten Membranen deutlich höher ist als auf den kommerziellen Membranen. Die Zellvitalitäten sind dabei vergleichbar.
Im Zusammenhang mit Zellkultivierungsstudien zeigt sich zudem, daß es für die Zellkul- tivierbarkeit und damit auch für die klinische Anwendung im Rahmen der gesteuerten Geweberegeneration vorteilhaft sein kann, wenn die Nativität der erfindungsgemäß hergestellten Materialien geringer ist als technisch durch das gesamte Herstellverfahren möglich. Hierdurch ergibt sich die nicht a priori zu erwartende Feststellung, daß Membranen mit den oben aufgeführten Nativitätswerten bessere Zellkulturergebnisse zeigen als Membranen, deren Nativität deutlich höher ist. Insbesondere für die Gelenkknorpelregeneration mittels autologer Chondrozyten auf erfindungsgemäß hergestellten Kollagenmembranen kann es daher vorteilhaft sein, geringere Nativitätswerte einzustellen als maximal beim Herstellungsprozeß möglich.

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Behandlung von Materialien biologischen Ursprungs wie beispielsweise von Membranen, Häuten, Gefäßen, Herzklappen, Sehnen und Bändern, und insbesondere Kollagenmaterialien, bei dem hydrophobe Begleitsubstanzen chemisch entfernt werden, ohne dass diese Begleitsubstanzen chemisch verändert werden, und danach nicht-hydrophobe Begleitsubstanzen entfernt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Materialien biologischen Ursprungs vor dem Entfernen der hydrophoben Begleitsubstanzen desinfiziert werden.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass hydrophobe Begleitsubstanzen durch eine Wäsche mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, wie z. B. Ethylalkohol oder Azeton entfernt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass sich der Behandlung mit wassermischbaren organischen Lösungsmitteln eine Behandlung mit nicht- wassermischbaren organischen Lösungsmitteln wie beispielsweise Hexan, Diethy- lether, Chloroform oder Petroleumbenzin anschließt.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass hydrophobe Begleitsubstanzen durch eine Wäsche mit Tensiden entfernt werden.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass nicht-hydrophobe Begleitsubstanzen mit einer Lösung, die wasserstofϊbrü- ckengebundene Stoffe entfernt, wie insbesondere eine Harnstofflösung, entfernt werden.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass nicht-hydrophobe Begleitsubstanzen mit einer wässrigen Lösung anorganischer Salze, wie insbesondere mit einer gepufferten Natrium-, Kalium- oder Kalziumchloridlösung, die vorzugsweise Enzymhemmer enthält, entfernt werden.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass nicht-hydrophobe Begleitsubstanzen mit einer alkalischen Lösung, wie z. B. Natrium-, Kalium- oder Kalziumhydroxidlösung, entfernt werden.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass nicht-hydrophobe Begleitsubstanzen mit einer sauren Lösung, wie zum Beispiel Salzsäure, Schwefelsäure oder Essigsäure, entfernt werden.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Begleitsubstanzen durch eine beliebige Kombination folgender Schritte entfernt werden:
a. Behandlung mit einer Lösung, die wasserstoffbrückengebundene Stoffe entfernt,
b. Behandlung mit einer Lösung, die alkalisch empfindliche Stoffe entfernt,
c. Behandlung mit einer Lösung, die säureempfindliche Stoffe entfernt.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Materialien biologischen Ursprungs zu gereinigten Membranen, Herzklappen oder Gefäßen konfektioniert werden.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nativität der Materialien biologischen Ursprungs auf einen Wert unter 95 % eingestellt wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Materialien biologischen Ursprungs zu Kollagenlösungen, Kollagenfasern, Kollagenfasergeflechten, Kollagenfasergeweben oder KoUagenschwämmen weiterverarbeitet werden.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Materialien biologischen Ursprungs zu Kollagen-Elastin-Lösungen, Kollagen- Elastin-Fasern, Kollagen-Elastin-Fasergeflechten, Kollagen-Elastin-Fasergeweben oder Kollagen-Elastin-Schwämmen weiterverarbeitet werden.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die behandelten Materialien biologischen Ursprungs mit Zellen besiedelt werden.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die behandelten Materialien biologischen Ursprungs zur gesteuerten Geweberegeneration eingesetzt werden.
17. Kollagen-Elastin-Produkt, dadurch gekennzeichnet, dass das Produkt aus unlöslichem Kollagen unlösliches Elastin aufweist.
18. Kollagen-Elastin-Produkt nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Produkt mindestens 20 % vorzugsweise 60 % der Elastinfasern die ursprünglich vorhandene Fibrillinstruktur aufweisen.
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