EP1430122A2 - Nicht-menschliches tiermodell zur untersuchung der entstehung und der therapie von organfibrose - Google Patents

Nicht-menschliches tiermodell zur untersuchung der entstehung und der therapie von organfibrose

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EP1430122A2
EP1430122A2 EP02777251A EP02777251A EP1430122A2 EP 1430122 A2 EP1430122 A2 EP 1430122A2 EP 02777251 A EP02777251 A EP 02777251A EP 02777251 A EP02777251 A EP 02777251A EP 1430122 A2 EP1430122 A2 EP 1430122A2
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EP
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transgenic
transgenic animal
organ
expression
animal according
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Rolf Gebhardt
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
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    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
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    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases

Definitions

  • the present invention relates to a non-human animal model for examining the development and therapy of organ fibrosis.
  • the animal model comprises a double-transgenic, non-human animal with the ability to condition and organ-specific development of a fibrosis phenotype.
  • fibrosis denotes the pathological multiplication of the connective tissue, which is often also referred to as sclerosis and is characterized by the deposition of large amounts of extracellular matrix and connective tissue-like material in organs.
  • the increase in connective tissue leads to considerable damage to the cells of the surrounding tissue.
  • the surrounding tissue experiences a kind of scarring process in response to the fibrosis.
  • fibrosis can be reversible and even disappear completely. Often, however, fibrotic tissue tends to develop into an even more serious lesion that can lead to organ failure and even death of the affected patient. This is especially the case if the damaging circumstances that favor the development of fibrosis, e.g. Alcohol abuse, intoxications, viral infections (hepatitis) persist.
  • Liver cirrhosis the end stage of many liver diseases associated with liver fibrosis, is a common cause of death worldwide. It is still the fifth leading cause of death in the United States under the age of 65 in the United States. Estimated annual medical costs for cirrhotic patients range from $ 6 to $ 8 trillion in the United States alone.
  • liver fibrosis and anti-fibrogenic agents include liver damage induced by carbon tetrachloride (McLean EK et al., Br J Exp Pathol 1969; 50: 502-506) and ligation or obstruction of the bile duct (Gerling B. et al., J. Hepatol. 1996; 25: 79-84).
  • the fibrosis is triggered by the continuous destruction of (pericentral) hepatocytes
  • the second case by the continuous damage to hepatocytes as a result of the drastically increasing concentrations of bile acids. Due to the unpredictable course of the disease (high early mortality) and the differences in the course of time and the extent of organ damage, these animal models have many disadvantages (Gebhardt R. and Reichen J., J. Hepatology 1994, 20: 684-691).
  • transgenic animal models have been established that take advantage of the property that TGF-ß is one of the most important cytokines that induces and supports fibrogenesis.
  • these transgenic models also have disadvantages.
  • the expression of the cytokine under the control of the albumin promoter (Sanderson N. et al., PNAS USA 1995, 92: 2572-2576) for early and continuous TGF-ß production, which, due to the early development of fatal nephropathy ( Bisgaard HC and Thorgeirsson S., Clin Lab Med 1996, 16: 325-339) have a short lifespan for the transgenic animals.
  • Another transgenic model which is based on the CRP promoter which can be induced by lipopolysaccharides, failed to produce a continuous fibrotic process, since tolerance to LPS quickly developed in the animals (Kanzler S. et al., Am J Physiol 1999, 276: 61059 to 61068).
  • Another disadvantage of this system is that LPS itself has a pathogenic effect on the liver (Heller J. et al., J Hepatol 2000; 33: 376-381; Hiraoka E. et al., Liver 1995; 15: 35- 38) thus interacting unfavorably with the fibrotic process.
  • transgenic and non-transgenic animal models known from the prior art are only insufficiently suitable for examining the formation mechanisms of the fibrosis and possible therapeutic methods. There is therefore a need for a transgenic animal model which enables the controlled induction of fibrosis by cytokines without, however, interfering with the organism in any other harmful way.
  • this transgenic animal model should offer the possibility of specifically investigating the mechanism of formation of the fibrosis in the organ of interest.
  • the present invention relates to a non-human animal model for organ fibrosis, which model comprises a double transgenic non-human animal.
  • the invention relates to a transgenic, non-human animal which contains a first recombinant gene which is stably integrated in the genome and which codes for a cytokine, the cytokine being expressed conditionally and organ-specifically and this expression leading to organ fibrosis.
  • “Conditional” means the dependence on a stimulus or a signal. “Conditional expression” means the expression in dependence on a stimulus or a signal.
  • the preferred stimulus in the present invention is doxycycline.
  • “Organ-specific expression” is the expression that is limited to defined organs (usually only one organ).
  • organ-specific promoter denotes a promoter that is transcribed only in defined organs (usually only one organ) and thus leads to organ-specific expression.
  • regulatory promoter denotes a promoter region that is regulated by transcription factors (enhancers or silencers) , Restricted is understood to mean that in the absence of e.g. expression of a corresponding enhancer is not possible, d. H. the promoter shows no basal activity.
  • Partial expression means the expression rate of a gene which is below the expression rate of the wild type.
  • the expression rate is preferably a maximum of 99%, a maximum of 95%, a maximum of 75%, an expression rate of a maximum of 50% is preferred, more preferably a maximum 25% of the wild-type expression rate.
  • Microinjection means injection with a very fine cannula into a tiny object, for example a cell or the cell nucleus.
  • a "reproductive pregnant” mouse is a reproductive female mouse in whom pregnancy was initiated after intercourse with a sterile male. In the sense of the invention, this refers to a female mouse 2.5 days after coitus, in which manipulated blastocysts are inserted into the uterus.
  • the present invention relates to a non-human animal model for organ fibrosis, which model comprises a double-transgenic non-human animal.
  • the invention relates to a transgenic, non-human animal which contains a first recombinant gene which is stably integrated in the genome and which codes for a cytokine, the cytokine being expressed conditionally and organ-specifically and this expression leading to organ fibrosis.
  • the expression of the first recombinant gene is controlled by a first regulatable promoter, the first regulatable promoter preferably comprising a tet operator sequence.
  • the first recombinant gene codes for a cytokine.
  • cytokine refers to messenger substances that control the functions of the immune system and are therefore of great importance for the immune system. Most cytokines exert their effects via a receptor on the cell.
  • An overview of cytokines which can be used according to the invention can be found in Molecular Biology and Biotechnology - A Comprehensive Desk Reference; edited by Robert A. Meyers, VCH Publisher Inc., 1995, pages 200-204.
  • cytokines are the interleukins which, depending on the type of interleukin, are secreted by T, B cells and by macrophages.
  • the first recombinant gene therefore codes for a cytokine selected from the group of pro-inflammatory cytokines, e.g. TGF- ⁇ , IL-1, IL-2 and IL-13.
  • a cytokine selected from the group of pro-inflammatory cytokines, e.g. TGF- ⁇ , IL-1, IL-2 and IL-13.
  • the non-human transgenic animal is further characterized in that it contains a second recombinant gene which is stably integrated in the genome and which codes for a regulatable transactivator protein (tTA).
  • tTA has the ability to control the activity of the first regulatable promoter, and thus the expression of the cytokine.
  • the first promoter comprises a Tet operator sequence.
  • tTA denotes the “tetracycline-dependent transactivator protein” (Triezenberg SJ et al., Genes Dev 1988, 2 (6): 718-29; Gossen M. et al., Science 1995, 268 (5218): 1766-9 ), which consists of the E. coli tet repressor, which is bound to the transcription-activating domain of the Herpes Simplex Virus VP16 protein.
  • the resulting protein binds with high affinity to the Tet operator sequence contained in the first regulatable promoter and stimulates the expression of the first recombinant gene, ie the cytokine.
  • the affinity of the tTA for the tet operator sequence is lost, tTA detaches from the tet operator sequence and the transcription of the cytokine is switched off.
  • the transcription of the cytokine is switched off by doxycycline (DOX).
  • DOX doxycycline
  • tTA is expressed in an organ-specific manner. This is ensured by the fact that tTA is expressed under the control of a second, regulatable, tissue-specific promoter.
  • the expression of the tTA is limited to hepatocytes.
  • a particularly preferred embodiment of the invention is therefore characterized in that the second regulatable promoter is LAP (liver enriched activator protein).
  • LAP liver enriched activator protein
  • the transthyretin promoter, the insulin-like growth factor promoter or the promoters of various cytochrome P450 genes are also possible as second regulatable promoters.
  • organ fibrosis can be triggered more intensely if short intervals of the absence (4-10 days) and presence (2-5 days) of cyclic successions follow each other (interval treatment). Deviating from this, it is also possible to regulate the strength of TGF-ß production by constant administration of low concentrations of DOX (0.2 to 10 ⁇ g / ml) and thus to achieve a partial expression of the cytokine.
  • the present invention further comprises a method for producing the non-human, double-transgenic animal.
  • two expression vectors are first constructed according to the present invention.
  • One of the expression vectors comprises a nucleic acid sequence which codes for a cytokine under the control of the Tet operator, while the other vector contains a nucleic acid sequence which codes for tTA under the control of an organ-specific promoter.
  • embryonic stem cells preferably non-human embryonic stem cells, particularly preferably mouse embryonic stem cells
  • those stem cells are selected which each contain one of the vectors.
  • the selected embryonic stem cells are then microinjected into blastocysts and transplanted into a sham pregnant animal.
  • transgenic lines Two different transgenic lines are initially established: one line is transgenic for the cytokine under the control of the Tet operator, the other line is transgenic for the tTA under the control of an organ-specific promoter. The offspring of both lines will be then mated to obtain double-transgenic animals capable of conditionally and organ-specifically developing a fibrosis phenotype.
  • the expression of the cytokine is inhibited during the embryonic development of the transgenic animals by adding doxycycline.
  • Rodents especially mice and rats, are preferably used to generate the transgenic animals.
  • the reverse regulatable transactivator protein (rtTA) can also be used.
  • rtTA reverse regulatable transactivator protein
  • all other constructions and steps for generating the double-transgenic mice remain the same, except that the fibrogenesis deviates in the absence of DOX and is induced by the addition of DOX (i.e. the triggering in relation to DOX is reversed).
  • the double-transgenic non-human animals generated by the method according to the invention provide an excellent animal model which enables the controlled induction of the fibrosis by cytokines, but without interfering with the organism in any other harmful way.
  • the double-transgenic system uses the tTA system to control the organ and development-specific expression of cytokines.
  • a surprising finding of the present invention is that a massive and at the same time reversible fibrosis can be induced in the double transgenic animals by switching the TGF- ⁇ expression on and off.
  • TGF-ß expression is switched on and off by the presence or absence of doxycycline. There are no detectable TGF-ß concentrations in animals which are kept in the presence of DOX. After DOX withdrawal, fibrogenesis sets in quickly, which is characterized by high TGF-ß production and a considerably increased serum level of this cytokine.
  • the animal model of the present invention also offers the possibility of analyzing the development of the fibrosis depending on the organ concerned and the age of the animal.
  • Organ-specific expression depends on the selection of the second, regulatable organ-specific promoter that controls the expression of the tTA.
  • the approach chosen here is also for fibrogenesis of other organs, e.g. of the heart if the second regulatable promoters selected are those which are specifically expressed in cardiac muscle cells.
  • the present model is not only suitable for Investigation of the formation of the fibrosis, but in particular also to study the mechanisms that contribute to the regeneration of the fibrotic organs. These include, for example, the apoptosis of myofibroblasts and hepatic star cells, the breakdown of extracellular matrix proteins, the increased proliferation of parenchyma cells and others.
  • the animal model of the present invention thus also opens up the possibility of screening for drugs which support and guide the regeneration process.
  • the animal model can also be used to study the induction of fibrosis depending on different cytokines. This enables the differentiation between different pathologies and mechanisms that are involved in the development of fibrosis.
  • Age-related induction of fibrosis can also provide further opportunities to study other types of liver disease.
  • Figure 1 Crossmon-trichrome staining for extracellular matrix proteins in liver sections from (A) a double-transgenic TGF-ß mouse 8 weeks after the start of interval treatment by DOX withdrawal and (B) a control mouse (without TGF-ß expression).
  • the blue color shows the massive deposition of extracellular matrix proteins in the initiated mouse (A), which extends from the periportal areas to the central areas.
  • FIG. 2 Steady-state level of the mRNA of procollagen I (alpha 1).
  • the mRNA steady-state levels were administered in control animals (T-LAP2) and double-transgenic TGF-ß mice after induction with 10 interval cycles (on) or after a further 6 (off-6d) or 21 days (off-21d) determined by DOX and are given in attog / ⁇ g total RNA.
  • the values represent mean values + standard deviation of 4 determinations.
  • the TGF- ⁇ 1 expression vector was constructed by cloning a mutant swine TGF- ⁇ 1 minimal cDNA (Brunner AM et al., J Biol Chem 1989, 264: 13660-13664) into the HindIII / Eco RV interface of the TET cloning vector pBI-5 (CVU 89934) (Baron U. et al., Nucleic Acids Res 1997, 25: 2723-2729). Prokaryotic sequences were then eliminated using Ase I / Xmn I double digestion.
  • Transgenic mouse lines were produced in the usual way (standard techniques) by microinjection.
  • the DNA from mouse tails was isolated using the Dneasy kit (Qiagen).
  • PCR and Southern blotting were carried out using TGF- ⁇ 1 and luciferase-specific primers and corresponding DIG-labeled probes.
  • the regulability of the transgene served as a further selection criterion.
  • primary ear fibroblasts of the transgenic mice were transfected with the tTA plasmid (pUHD-15.1) and the expression of the luciferase in the presence and absence of doxycycline hydrochloride in the culture medium was determined.
  • founder animals i.e. Animals of the F1 generation, whose transgene was easy to regulate, were mated to Black-6 mice (C57BL / 6NCRLBR, Charles River Laboratories) in order to generate a stable and defined genetic background.
  • the TGF- ⁇ 1-transgenic animals were represented with representatives of the transactivator lines TA LAP 1 / L7 and TA LAP 2 / L7 (Kistner A. et al., Proc. Soc. Natl. Acad Sei, USA, 1996; 93: 10933-10938), which express the tTA under the control of the LAP (Liver enriched Activator Protein).
  • doxycycline hydrochloride 50 mg / l in 5% sucrose solution
  • the drinking water was changed every two days. Even after birth, the doxycycline was left in the drinking water.
  • the induction of TGF- ⁇ 1 expression was initiated at any time by removing the doxycycline.
  • the serum levels of TGF-ßl were determined by ELISA (Pharmingen) according to the manufacturer's instructions. The serum samples were acidified before performing the ELISA. The serum values of TGF-ß measured in a time interval of up to five days ranged between 250-1200 ng / ml.
  • Luciferase activity was measured in a conventional manner in liver and kidney homogenates (prepared with phosphate buffer, pH 7.4) (Gaunitz F. et al., Biochem Biophys Res Commun 2001, 284: 377-383).
  • a typical induction scheme started 80 days after the mice were born. DOX was withdrawn for 5 to a maximum of 10 days and then added again for 2 to 3 days. The first signs of fibrosis appeared after 2 weeks. The fibrosis was already well developed within 2 months (Fig. 1). If the interval treatment is continued, the fibrosis increases up to cirrhosis of the liver.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein nicht-menschliches Tiermodell zur Untersuchung der Entstehung und der Therapie von Organfibrose. Das Tiermodell umfasst ein doppelt-transgenes, nicht-menschliches Tier mit der Fähigkeit zur konditionalen und organspezifischen Entwicklung eines Fibrose-Phänotyps. Die Erfindung umfasst ausserdem ein Verfahren zur Herstellung des doppelt-transgenen, nicht-menschlichen Tiers.

Description

Nicht-menschliches Tiermodell zur Untersuchung der Entstehung und der Therapie von Organfibrose
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein nicht-menschliches Tiermodell zur Untersuchung der Entstehung und der Therapie von Organfibrose. Das Tiermodell umfasst ein doppelt- transgenes, nicht-menschliches Tier mit der Fähigkeit zur konditionalen und organspezifischen Entwicklung eines Fibrose-Phänotyps.
Hintergrund der Erfindung
Der Begriff Fibröse bezeichnet die häufig auch als Sklerose bezeichnete krankhafte Vermehrung des Bindegewebes, die durch die Ablagerung großer Mengen extrazellulärer Matrix und bindegewebsartigem Material in Organen gekennzeichnet ist. Die Vermehrung des Bindegewebes führt zu einer beträchtlichen Schädigung der Zellen des umliegenden Gewebes. Das umliegende Gewebe erfährt als Reaktion auf die Fibröse eine Art Vernarbungsprozess.
Je nach dem Schweregrad der Vernarbung des betroffenen Gewebes kann die Fibröse reversibel sein und sogar wieder ganz verschwinden. Häufig jedoch tendiert fibrotisches Gewebe dazu, sich zu einer noch schwerwiegenderen Läsion zu entwickeln, die zu Organversagen und sogar zum Tod des betroffenen Patienten führen kann. Dies ist vor allem dann der Fall, wenn die schädigenden Umstände, welche die Fibroseentstehung begünstigen, wie z.B. Alkoholabusus, Intoxikationen, virale Infektionen (Hepatitiden), bestehen bleiben.
Die Leberzirrhose, das Endstadium vieler mit Leberfibrose assoziierten Lebererkrankungen, ist weltweit eine häufige Todesursache. In den USA stellt sie immer noch die fünfthäufigste Todesursache bei Personen unter 65 Jahren dar. Die geschätzten jährlichen medizinischen Kosten für an Zirrhose leidende Patienten betragen zwischen 6 bis 8 Billionen Dollar allein in den USA.
Viele der Faktoren, die bei der Fibroseentstehung eine Rolle spielen, sind bereits bekannt. Trotzdem stehen bisher weder Arzneimittel noch Strategien bereit, um den Prozess der Fibröse wirksam zu verhindern oder zumindest zu verlangsamen. Die gegenwärtige Situation ist daher wenig zufriedenstellend und wird außerdem noch durch die Tatsache verschlechtert, dass Einzelheiten über die vielschichtigen Mechanismen, die am regenerativen Prozess teilhaben, noch weniger bekannt sind.
Arzneistoffe mit Fibrose-verhindernder Wirkung stellen daher bei der Unterstützung der Organregeneration nicht per se das Mittel der Wahl dar. Da Fibrosepatienten üblicherweise erst dann einen Arzt aufsuchen, wenn die Fibröse bereits entstanden ist, sind die Heilungschancen geringer als bei anderen Krankheiten.
Gegenwärtig verwendete Tiermodelle zur Untersuchung von Leber-Fibrose und von anti- fibrogenen Stoffen umfassen durch Tetrachlorkohlenstoff induzierten Leberschaden (McLean E.K. et al., Br J Exp Pathol 1969; 50:502-506) und Ligation oder Obstruktion des Gallengangs (Gerling B. et al., J. Hepatol. 1996;25:79-84). Im ersten Fall wird die Fibröse durch fortlaufende Zerstörung von (perizentralen) Hepatozyten ausgelöst, im zweiten Fall durch die kontinuierliche Schädigung von Hepatozyten als Folge der drastisch ansteigenden Konzentrationen der Gallensäuren. Aufgrund des nicht vorhersehbaren Krankheitsverlaufs (hohe Frühmortalität) und den Unterschieden im Zeitverlauf und im Ausmaß der Organschädigung besitzen diese Tiermodelle jedoch sehr viele Nachteile (Gebhardt R. und Reichen J., J. Hepatology 1994, 20:684-691).
Weiterhin wurden transgene Tiermodelle etabliert, die sich die Eigenschaft zunutze machen, dass TGF-ß eines der wichtigsten Cytokine ist, das die Fibrogenese induziert und unterstützt. Auch diese transgenen Modelle sind jedoch mit Nachteilen behaftet. So führt z.B. die Expression des Zytokins unter der Kontrolle des Albumin-Promotors (Sanderson N. et al., PNAS USA 1995, 92:2572-2576) zu einer frühen und kontinuierlichen TGF-ß Produktion, welche, bedingt durch die frühe Entstehung einer fatalen Nephropathie (Bisgaard H.C. und Thorgeirsson S., Clin Lab Med 1996, 16:325-339) nur eine kurze Lebenszeit der transgenen Tiere zur Folge hat.
Bei einem anderen transgenen Modell, welches auf dem durch Lipopolysaccharide induzierbaren CRP-Promotor beruht, blieb die Entstehung eines kontinuierlichen fibrotischen Prozesses aus, da sich bei den Tieren schnell eine Toleranz gegenüber LPS herausbildete (Kanzler S. et al., Am J Physiol 1999, 276:61059-61068). Ein weiterer Nachteil dieses Systems ' besteht außerdem darin, dass LPS selbst pathogen auf die Leber wirkt (Heller J. et al., J Hepatol 2000;33:376-381; Hiraoka E. et al., Liver 1995;15:35-38) und so auf ungünstige Weise mit dem fibrotischen Prozess interagiert.
Aufgrund der vorstehend genannten Nachteile sind die aus dem Stand der Technik bekannten transgenen und nicht-transgenen Tiermodelle nur unzureichend geeignet, die Entstehungsmechanismen der Fibröse und mögliche Therapieverfahren zu untersuchen. Es besteht daher ein Bedarf nach einem transgenen Tiermodell, welches die kontrollierte Induktion der Fibröse durch Cytokine ermöglicht, ohne jedoch auf andere schädigende Weise in den Organismus einzugreifen.
Weiterhin sollte dieses transgene Tiermodell die Möglichkeit bieten, in dem interessierenden Organ gezielt den Entstehungsmechanismus der Fibröse zu untersuchen.
Diese Probleme werden durch den Gegenstand der Ansprüche der vorliegenden Erfindung gelöst.
Beschreibung der Erfindung Die vorliegende Erfindung betrifft ein nicht-menschliches Tiermodell für Organfibrose, wobei dieses Modell ein doppelt-transgenes nicht-menschliches Tier umfasst.
In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung ein transgenes, nicht-menschliches Tier, welches stabil im Genom integriert ein erstes rekombinantes Gen enthält, welches für ein Cytokin kodiert, wobei das Cytokin konditional und organspezifisch exprimiert wird und wobei diese Expression zu Organfibrose führt.
Unter „konditional" wird die Abhängigkeit von einem Stimulus oder einem Signal verstanden. Als „konditionale Expression" ist die Expression in Abhängigkeit von einem Stimulus oder einem Signal zu verstehen. Der bevorzugte Stimulus in der vorliegenden Erfindung ist Doxycyclin. „Organspezifische Expression" ist die Expression, die auf definierte Organe (meist nur ein Organ) beschränkt ist.
Der Begriff „organspezifischer Promotor" bezeichnet einen Promotor, der nur in definierten Organen (meist nur ein Organ) transkribiert wird und damit zur organspezifischen Expression führt. Der Begriff „regulierbarer Promotor" bezeichnet einen Promotorbereich, der durch Transkriptionsfaktoren (Enhancer oder Silencer) reguliert wird. Eingeschränkt wird darunter verstanden, daß in Abwesenheit z.B. eines entsprechenden Enhancers keine Expression möglich ist, d. h. der Promotor also keine Basalaktivität zeigt.
Unter „partieller Expression" ist die Expressionrate eines Gens zu verstehen, die unter der Expressionsrate des Wildtyps liegt. Vorzugsweise beträgt die Expressionsrate maximal 99%, maximal 95%, maximal 75%, bevorzugt ist eine Expressionsrate von maximal 50%, weiter bevorzugt von maximal 25% der Expressionsrate des Wildtyps.
Unter „Mikroinjektion" wird die Injektion mit einer sehr feinen Kanüle in ein winziges Objekt, z.B. eine Zelle oder den Zellkern, verstanden. Als „scheinschwanger" wird eine reproduktionsfähige weibliche Maus bezeichnet, bei der nach Geschlechtsverkehr mit einem sterilen Männchen die Schwangerschaft eingeleitet wurde. Im erfindungsgemäßen Sinn bezeichnet dies eine weibliche Maus 2,5 Tage nach dem Koitus, in deren Gebärmutter manipulierte Blastozysten eingesetzt werden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Wie vorstehend ausgeführt betrifft die vorliegende Erfindung ein nicht-menschliches Tiermodell für Organfibrose, wobei dieses Modell ein doppelt-transgenes nicht-menschliches Tier umfasst.
In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung ein transgenes, nicht-menschliches Tier, welches stabil im Genom integriert ein erstes rekombinantes Gen enthält, welches für ein Cytokin kodiert, wobei das Cytokin konditional und organspezifisch exprimiert wird und wobei diese Expression zu Organfibrose führt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Expression des ersten rekombinanten Gens durch einen ersten regulierbaren Promotor kontrolliert, wobei der erste regulierbare Promotor bevorzugt eine Tet-Operatorsequenz umfasst.
Das erste rekombinante Gen kodiert für ein Cytokin. Der Begriff Cytokin bezeichnet Botenstoffe, die die Funktionen des Immunsystems steuern und somit von großer Bedeutung für die Immunabwehr sind. Die meisten Cytokine entfalten ihre Wirkung über einen Rezeptor auf der Zelle. Eine Übersicht über Cytokine, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können, findet sich in Molecular Biology and Biotechnology - A Comprehensive Desk Reference; edited by Robert A. Meyers, VCH Publisher Inc., 1995, Seiten 200-204.
Beispiele für Cytokine sind die Interleukine, die je nach Typ des Interleukins von T-, B- Zellen und von Makrophagen sezerniert werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kodiert das erste rekombinante Gen daher für ein Cytokin, ausgewählt aus der Gruppe der proinflammatorischen Cytokine, z.B. TGF-ß, lL-1, lL-2 und lL-13.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das nicht-menschliche transgene Tier weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass es stabil im Genom integriert ein zweites rekombinantes Gen enthält, welches für ein regulierbares Transaktivatorprotein (tTA) kodiert. tTA besitzt die Fähigkeit, die Aktivität des ersten regulierbaren Promotors, und damit die Expression des Cytokins, zu kontrollieren. Der erste Promotor umfasst, wie bereits oben beschrieben, eine Tet-Operatorsequenz.
Der Begriff tTA bezeichnet das „tetracycline-dependent transactivator protein" (Triezenberg S.J. et al., Genes Dev 1988, 2(6):718-29; Gossen M. et al., Science 1995, 268(5218): 1766-9), welches aus dem E.coli tet Repressor besteht, der an die Transkriptions-aktivierende Domäne des Herpes Simplex Virus VP16-Proteins gebunden ist. Wenn tTA exprimiert wird, bindet das resultierende Protein mit hoher Affinität an die Tet- Operatorsequenz, die im ersten regulierbaren Promotor enthalten ist, und stimuliert die Expression des ersten rekombinanten Gens, d.h. des Cytokins. Durch Zugabe von Tetracyclin oder Doxycyclin geht die Affinität des tTA für die Tet-Operatorsequenz verloren, tTA löst sich von der Tet-Operatorsequenz ab und die Transkription des Cytokins wird abgeschaltet.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Transkription des Cytokins durch Doxycyclin (DOX) abgeschaltet. in einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird tTA organspezifisch exprimiert. Dies wird dadurch gewährleistet, dass tTA unter der Kontrolle eines zweiten regulierbaren, gewebespezifischen Promotors exprimiert wird.
Besonders bevorzugt ist es dabei, wenn die Expression des tTA auf Hepatozyten beschränkt ist. Deshalb ist eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass der zweite regulierbare Promotor LAP (liver enriched activator protein) ist. Für eine leberspezifische Expression sind als zweite regulierbare Promotoren beispielsweise auch der Transthyretin-Promotor, der Insulin-like-Growth-Factor-Promotor oder die Promotoren von verschiedenen Cytochrom P450-Genen möglich.
In Abhängigkeit von der Stärke der TGF-ß Produktion kann die Organfibrose verstärkt ausgelöst werden, wenn kurze Intervalle der Ab- (4-10 Tage) und Anwesenheit (2-5 Tage) von DOX zyklisch aufeinander folgen (Intervallbehandlung). Abweichend hiervon ist es auch möglich, die Stärke der TGF-ß Produktion durch konstante Gabe von niedrigen Konzentrationen von DOX (0,2 bis 10 μg/ml) zu regulieren und so eine partielle Expression des Cytokins zu erreichen.
Weiterhin umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des nichtmenschlichen, doppelt-transgenen Tiers. Dazu werden gemäss der vorliegenden Erfindung zunächst zwei Expressionsvektoren konstruiert. Einer der Expressionsvektoren umfasst eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Cytokin unter der Kontrolle des Tet-Operators kodiert, während der andere Vektor eine Nukleinsäuresequenz enthält, die für tTA unter der Kontrolle eines organspezifischen Promotors kodiert.
Gemäß der Erfindung werden embryonale Stammzellen, vorzugsweise nicht-menschliche embryonale Stammzellen, insbesondere bevorzugt embryonale Stammzellen der Maus, getrennt mit den Vektoren transfiziert und anschließend diejenigen Stammzellen selektiert, die jeweils einen der Vektoren enthalten. Nachfolgend werden die selektierten embryonalen Stammzellen in Blastozysten mikroinjiziert und diese in ein scheinschwangeres Tier transplantiert.
Dabei werden zunächst zwei verschiedene transgene Linien etabliert: eine Linie ist transgen für das Cytokin unter der Kontrolle des Tet-Operators, die andere Linie ist transgen für den tTA unter der Kontrolle eines organspezifischen Promotors. Die Nachkommen beider Linien werden anschließend verpaart, um doppelt-transgene Tiere mit der Fähigkeit zur konditionalen und organspezifischen Entwicklung eines Fibrose-Phänotyps zu erhalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird die Expression des Cytokins während der Embryonalentwicklung der transgenen Tiere durch Zugabe von Doxycyclin gehemmt.
Zur Generierung der transgenen Tiere werden bevorzugt Nager verwendet, insbesondere Mäuse und Ratten.
Anstelle des regulierbaren Transaktivatorproteins (tTA) kann auch das reverse regulierbare Transaktivatorprotein (rtTA) verwendet werden. In diesem Fall bleiben alle übrigen Konstruktionen und Schritte zur Generierung der doppelt-transgenen Mäuse dieselben, nur dass die Fibrogenese abweichend in Abwesenheit von DOX ausbleibt und durch Zugabe von DOX induziert wird (also die Auslösung in Bezug auf DOX revers ist).
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass die durch das erfindungsgemäße Verfahren generierten doppelt-transgenen nicht-menschlichen Tiere ein hervorragendes Tiermodell bereitstellen, welches die kontrollierte Induktion der Fibröse durch Cytokine ermöglicht, ohne jedoch auf andere schädigende Weise in den Organismus einzugreifen. Dabei macht sich das doppelt-transgene System wie vorstehend beschrieben das tTA-System zur Kontrolle der organ- und entwicklungsspezifischen Expression von Cytokinen zu Nutze.
Ein überraschender Befund der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass in den doppelt- transgenen Tieren durch das An- und Abschalten der TGF-ß-Expression eine massive und zugleich jedoch reversible Fibröse induziert werden kann.
Das An- und Abschalten der TGF-ß- Expression wird durch die Ab- bzw. Anwesenheit von Doxycyclin gewährleistet. In Tieren, die in Anwesenheit von DOX gehalten werden, liegen keine nachweisbaren TGF-ß Konzentrationen vor. Nach DOX-Entzug setzt rasch die Fibrogenese ein, die durch eine hohe TGF-ß Produktion und einen in beträchtlichem Ausmaß erhöhten Serumspiegel dieses Cytokins gekennzeichnet ist.
Das Tiermodell der vorliegenden Erfindung bietet ausserdem die Möglichkeit, die Entstehung der Fibröse in Abhängigkeit vom betroffenen Organ und vom Alter des Tieres zu analysieren. Die organspezifische Expression hängt von der Auswahl des zweiten, regulierbaren organspezifischen Promotors ab, der die Expression des tTA kontrolliert.
Der hier gewählte Ansatz ist auch auf die Fibrogenese anderer Organe, wie z.B. des Herzens anwendbar, wenn als zweite regulierbare Promotoren solche gewählt werden, die spezifisch in Herzmuskelzellen exprimiert werden. Analog gilt dies für die Niere und andere Organe.
Weiterhin konnte gezeigt werden, dass in den doppelt-transgenen Tieren der vorliegenden Erfindung die Fibrogenese und andere, an diesem Prozess beteiligte zelluläre Reaktionen vollständig reversibel sind. Dadurch eignet sich das vorliegende Modell nicht nur zur Untersuchung der Entstehung der Fibröse, sondern insbesondere auch zur Untersuchung der Mechanismen, die zur Regeneration der fibrotischen Organe beitragen. Hierzu zählen beispielsweise die Apoptose von Myofibroblasten und hepatischen Sternzellen, der Abbau extrazellulärer Matrixproteine, die verstärkte Proliferation von Parenchymzellen und andere. Damit eröffnet das Tiermodell der vorliegenden Erfindung auch die Möglichkeit eines Screening auf Arzneistoffe, die den Regenerationsprozess unterstützen und lenken.
Das Tiermodell kann ausserdem dazu verwendet werden, die Induktion der Fibröse in Abhängigkeit von unterschiedlichen Cytokinen zu untersuchen. Dies ermöglicht die Unterscheidung zwischen verschiedenen Pathologien und Mechanismen, die an der Fibroseentstehung beteiligt sind.
Die altersabhängige Induktion von Fibröse kann ebenfalls weitere Möglichkeiten zur Untersuchung anderer Arten von Lebererkrankungen bereitstellen.
Abbildungen Die Erfindung wird weiterhin durch die folgende Abbildung erläutert:
Abbildung 1 : Crossmon-trichrome Färbung für extrazelluläre Matrix-Proteine in Leberschnitten von (A) einer doppelt-transgenen TGF-ß Maus 8 Wochen nach Beginn der Intervallbehandlung durch DOX-Entzug und (B) einer Kontrollmaus (ohne TGF-ß Expression). Die blaue Färbung zeigt die massive Ablagerung von extrazellulären Matrix-Proteinen in der initiierten Maus (A), die sich von den periportalen Arealen bis in die zentralen Areale erstreckt.
Abbildung 2: Steady-state Spiegel der mRNA von Prokollagen I (alpha 1). Die mRNA steady- state Spiegel wurden in Kontrolltieren (T-LAP2) und doppelt-transgenen TGF-ß Mäusen nach Induktion mit 10 Intervallzyklen (on) bzw. nach weiteren 6 (off-6d) oder 21 Tagen (off-21d) mit Gabe von DOX bestimmt und sind in attog/μg Gesamt-RNA angegeben. Die Werte stellen Mittelwerte + Standardabweichung von 4 Bestimmungen dar.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird weiterhin durch die folgenden Beispiele in nicht-beschränkender Weise veranschaulicht. Beispiel 1
Generierung der TGF-ß 1 -transgenen Mäuse
Die Konstruktion des TGF-ß1 Expressionsvektors erfolgte durch Klonierung einer mutierten Schweine TGF-ß1 Minimal cDNA (Brunner A.M. et al., J Biol Chem 1989, 264:13660-13664) in die Hindlll/Eco RV Schnittstelle des TET-Klonierungsvektors pBI-5(CVU 89934) (Baron U. et al., Nucleic Acids Res 1997, 25:2723-2729). Prokaryotische Sequenzen wurden anschließend über Ase I/Xmn I Doppelverdau eliminiert.
Transgene Mauslinien wurden auf übliche Weise (Standardtechniken) durch Mikroinjektion hergestellt. Für das Screening transgener Tiere wurde die DNA aus Mäuseschwänzen mit dem Dneasy-Kit (Qiagen) isoliert. PCR und Southern-Blotting erfolgte mittels TGF-ß1- und Luciferase-spezifischen Primern und entsprechenden DIG-markierten Sonden.
Als weiteres Auswahlkriterium diente die Regulierbarkeit des Transgens. Hierzu wurden primäre Ohr-Fibroblasten der transgenen Mäuse mit dem tTA Plasmid (pUHD-15.1) transfiziert und die Expression der Luciferase in Gegenwart und Abwesenheit von Doxycyclin Hydrochlorid im Kulturmedium bestimmt.
Founder-Tiere, d.h. Tiere der F1 -Generation, deren Transgen gut regulierbar war, wurden mit Black-6 Mäusen (C57BL/6NCRLBR, Charles River Laboratories) verpaart, um einen stabilen und definierten genetischen Hintergrund zu erzeugen.
Beispiel 2
Generierung der doppelt-transgenen Mäuse
Für die Herstellung der doppelt-transgenen Mäuse wurden die TGF-ß1 -transgenen Tiere mit Vertretern der zuvor hergestellten Transaktivator-Linien TALAP1/L7 und TALAP2/L7 (Kistner A. et al., Proc. Soc. Natl. Acad. Sei, USA, 1996;93:10933-10938) gekreuzt, die den tTA unter der Kontrolle des LAP (Liver enriched Activator Protein) exprimieren.
Um die Expression von TGF-ß1 während der Embryonalentwicklung zu hemmen, wurde dem Trinkwasser der trächtigen Weibchen Doxycyclin-Hydrochlorid (50 mg/l in 5% Sucroselösung) zugesetzt. Das Trinkwasser wurde alle zwei Tage gewechselt. Auch nach der Geburt wurde das Doxycyclin im Trinkwasser belassen. Die Induktion der TGF-ß1 Expression wurde zu beliebigen Zeitpunkten durch Entfernen des Doxycyclins eingeleitet. Beispiel 3
Analyse der TGF-ß Expression
Die Serumspiegel von TGF-ßl wurden mittels ELISA (Pharmingen) nach den Herstellerangaben bestimmt. Vor Durchführung des ELISA wurden die Serumproben angesäuert. Die in einem Zeitintervall bis zu fünf Tagen gemessenen Serumwerte von TGF-ß bewegten sich im Bereich zwischen 250-1200 ng/ml.
Beispiel 4 Messung der Luciferase-Aktivität
Die Luciferase-Aktivität wurde in Homogenaten von Leber und Niere (hergestellt mit Phosphat- Puffer, pH 7.4) in üblicher Weise gemessen (Gaunitz F. et al., Biochem Biophys Res Commun 2001 , 284:377-383).
Die Luciferase-Aktivität wurde nach den Angaben von Gaunitz und Papke, Gene transfer and Expression. In: Methods in Molecular Biology 107 (Phillips IR, Shephard EA, eds.), pp. 361-370. Humana Press, Totowa, NJ, 1997, gemessen. In Anwesenheit von DOX waren die Aktivitäten unter der Nachweisgrenze. In Abwesenheit von DOX wurden Luciferase-Aktivitäten bis zu 10.000 rlu/μg Protein gemessen (rlu = relative Lichteinheiten).
Beispiel 5
Induktion der Fibröse
Ein typisches Induktionsschema begann 80 Tage nach der Geburt der Mäuse. DOX wurde für 5 bis maximal 10 Tage entzogen und dann wieder für 2 bis 3 Tage zugegeben. Die ersten Fibroseanzeichen zeigten sich bereits nach 2 Wochen. Innerhalb von 2 Monaten war die Fibröse bereits stark ausgebildet (Abb. 1). Wird die Intervallbehandlung fortgeführt, verstärkt sich die Fibrosierung bis hin zur Leberzirrhose.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Transgenes, nicht-menschliches Tier, wobei das transgene Tier stabil im Genom integriert ein erstes rekombinantes Gen enthält, welches für ein Cytokin kodiert, wobei das Cytokin konditional und organspezifisch exprimiert wird und wobei diese Expression zu Organfibrose führt.
2. Transgenes Tier gemäss Anspruch 1, wobei die Expression des ersten rekombinanten Gens durch einen ersten regulierbaren Promotor kontrolliert wird.
Transgenes Tier gemäss Anspruch 2, wobei der erste regulierbare Promotor eine Tet- Operatorsequenz umfasst.
4. Transgenes Tier gemäss den Ansprüchen 1-3, wobei das Cytokin ausgewählt ist aus der Gruppe proinflammatorischer Cytokine, insbesondere TGF-ß, IL-4 und IL-10.
5. Transgenes Tier gemäss den Ansprüchen 1-4, wobei das Cytokin selektiv in Hepatozyten exprimiert wird.
Transgenes Tier gemäss den Ansprüchen 1-5, wobei die Organfibrose Leber, Herz, Niere, Lunge oder Pankreas betrifft.
7. Transgenes Tier gemäss den Ansprüchen 1-6, wobei das Tier ein Nager ist.
8. Transgenes Tier gemäss Anspruch 7, wobei das Tier eine Maus oder eine Ratte ist.
9. Transgenes Tier gemäss den Ansprüchen 1-8, weiter umfassend stabil im Genom integriert ein zweites rekombinantes Gen, welches für ein regulierbares Transaktivatorprotein (tTA) oder ein Transaktivatorprotein (rTA) kodiert, wobei tTA oder rtA den ersten regulierbaren Promotor kontrolliert.
10. Transgenes Tier gemäss Anspruch 9, wobei tTA oder rTA durch Doxycyclin reguliert wird.
11. Transgenes Tier gemäss Anspruch 1-10, wobei die Stärke der TGF-ß Produktion durch konstante Gabe von 0,2 - 10 μg/ ml Doxycyclin regulierbar ist und eine partielle Expression des Cytokins erreicht wird.
12. Transgenes Tier gemäss Anspruch 1-11, wobei die Organfibrose in Abhängigkeit von der stärke der TGF-ß Produktion verstärkt ausgelöst werden kann, wenn kurze Intervalle der Ab- (4-10 Tage) und Anwesenheit (2-5 Tage) von Doxycyclin zyklisch aufeinander folgen.
13. Transgenes Tier gemäss den Ansprüchen 9 und 10, wobei die organspezifische Expression des tTA oder rTA durch einen zweiten regulierbaren Promotor kontrolliert wird.
14. Transgenes Tier gemäss Anspruch 13, wobei der zweite regulierbare Promotor die Expression des tTA oder rTA in Hepatozyten kontrolliert.
15. Transgenes Tier gemäss Anspruch 14, wobei der zweite regulierbare Promotor LAP (liver enriched activator protein) ist.
16. Ein Verfahren zur Herstellung eines nicht-menschlichen transgenen Tiers gemäss den Ansprüchen 1-15, umfassend die folgenden Schritte: a-ι) Konstruktion eines Expressionsvektors, der ein Cytokin unter der Kontrolle des Tet-Promotors exprimiert, a2) Konstruktion eines Expressionsvektors, der tTA oder rTA unter der Kontrolle eines organspezifischen Promotors exprimiert, b) getrenntes Einbringen der in a^ und a2) erhaltenen Vektoren in nicht-menschliche embryonale Stammzellen, c) Selektion der embryonalen Stammzellen, die jeweils einen der in a-ι) und a2) erhaltenen Vektoren enthalten, d) Mikroinjektion der selektierten embryonalen Stammzellen in Blastozysten, e) Transplantation der Blastozysten in ein scheinschwangeres Tier, ft) Generierung transgener Tiere, die den in a^ erhaltenen Vektor als Transgen enthalten, f2) Generierung transgener Tiere, die den in a2) erhaltenen Vektor als Transgen enthalten, und, g) Verpaaren der in f-i) und f2) erhaltenen transgenen Tiere, um doppelt-transgene Tiere mit der Fähigkeit zur konditionalen und organspezifischen Entwicklung eines Fibrose-Phänotyps zu erhalten.
17. Ein Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die Expression des Cytokins während der Embryonalentwicklung der transgenen Tiere durch Zugabe von Doxycyclin gehemmt wird.
18. Verwendung eines transgenen, nicht-menschlichen Tiers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 als Modellsystem zur Untersuchung der Entstehung und der Therapie von Organfibrose.
19. Verwendung gemäss Anspruch 18, wobei die Organfibrose Leber, Herz, Niere, Lunge oder Pankreas betrifft.
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