EP1326962A2 - Method for producing vital, biological substitute tissue in vitro using cell cultures and a support - Google Patents

Method for producing vital, biological substitute tissue in vitro using cell cultures and a support

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EP1326962A2
EP1326962A2 EP01987795A EP01987795A EP1326962A2 EP 1326962 A2 EP1326962 A2 EP 1326962A2 EP 01987795 A EP01987795 A EP 01987795A EP 01987795 A EP01987795 A EP 01987795A EP 1326962 A2 EP1326962 A2 EP 1326962A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cell
tissue construct
tissue
cell culture
bioreactor
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01987795A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Ralf Sodian
Thees Lembke
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Deutsches Herzzentrum Berlin
Original Assignee
Deutsches Herzzentrum Berlin
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Filing date
Publication date
Application filed by Deutsches Herzzentrum Berlin filed Critical Deutsches Herzzentrum Berlin
Publication of EP1326962A2 publication Critical patent/EP1326962A2/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/04—Mechanical means, e.g. sonic waves, stretching forces, pressure or shear stimuli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture

Definitions

  • the invention relates to a method for the in vitro production of vital, biological replacement tissue using cell cultures and a carrier material, and to an apparatus for carrying out the method.
  • tissue engineering for the production of artificial connective and epithelial tissues and neuronal organoids on the basis of cultivated cells and with the aid of various biomatrices outside the body “in vitro” and then to implant the cultivated cells.
  • Tissue engineering combines findings from medicine and biology with methods of engineering science, and enables spatially defined tissues and organoid structures to be built up for implantation.
  • tissue engineering is to apply the body's own cells to suitable matrices, to control their multiplication and to direct their three-dimensional spread in order to produce a vital and functional tissue replacement.
  • the body's own cells are anchored on a carrier material, in particular on individually selected filter pads, fleeces, biodegradable scaffolding materials or sponge-like matrices and in culture containers with nutrients and others Additives supplied.
  • the body's own cells which are increased in accordance with tissue differentiation and consolidated in vitro to a stable structure, theoretically lead to a vital replacement tissue suitable for implantation.
  • tissue engineering In addition to tissue-typical differentiation and optimal cell anchoring, easy handling, high functional reliability with the least possible expenditure on equipment and the guarantee of sterile conditions during the production of the biological replacement tissue are important for the application of tissue engineering.
  • the object of the present invention is therefore to provide a method for the in vitro production of vital, biological replacement tissue using cell cultures and a carrier material, with which in particular a flat, so-called patch tissue can be produced in vitro, which has a high and controllable line multiplication rate while maintaining the desired cell properties, which is easy to handle and functionally reliable, and can be used with little outlay on equipment while ensuring sterile conditions.
  • This object is achieved by a method for the in vitro production of vital, biological replacement tissue using cell cultures and a carrier material, in which a cell-tissue construct formed from the carrier material and the cell cultures is exposed to a changing mechanical stress.
  • the solution according to the invention ensures the production of a vital, stable and fractional replacement tissue, in particular a flat patch tissue in vitro, which enables a high and controllable cell multiplication rate while maintaining the desired cell properties and which is easy to handle and functionally reliable and with little equipment and under the protection of sterile conditions is applicable.
  • the method according to the invention is particularly suitable for the production of sheet-like tissue pieces for cardiovascular structures.
  • the cell-tissue construct is preferably subjected to a periodically changing mechanical stress, in particular a pulsating pressure stress, exposed.
  • the cell-tissue construct is exposed to a tissue-stimulating flow of the cell culture medium by a combination of a pulsating flow and a pulsating movement of the cell-tissue construct on the Cell-tissue construct acts.
  • the pulsating movement acting on the cell-tissue construct is preferably carried out alternately on both sides of the cell-tissue construct, in particular in the case of a horizontally arranged cell-tissue construct, by raising and lowering the cell-tissue construct.
  • a particularly suitable carrier material has proven to be an absorbable or biodegradable tissue scaffold, in particular a resorbable scaffold material, for optimal cell anchoring and thus for maintaining tissue-typical properties.
  • the amplitude of the pulsating movement preferably directed perpendicular to the surface of the cell-tissue construct, and the flow rate of the cell culture medium can be changed, ie the amount of liquid pumped can be varied as desired by setting the frequency and the pump volume • of an appropriate drive unit for the cell culture medium.
  • An advantageous embodiment of the method according to the invention for the production of vital and functional replacement tissue pieces (patch tissue) according to the principle of tissue engineering using a resorbable carrier material that colonizes with vascular cells and in vitro to form a cell-tissue construct to form an adequate, Conditioned extracellular matrix, in particular for the reconstruction of cardiovascular structures, is characterized in that the cell-tissue construct is a pulsating moving the cell-tissue construct in alternating directions pulsatile flow of a cell culture fluid is exposed.
  • the pulsatile flow preferably acts on the cell-tissue construct both perpendicularly and essentially parallel to the surface of the cell-tissue construct.
  • a direction of flow of the cell culture fluid moving past the cell-tissue construct is preferably specified.
  • the Zeil-tissue is. Constructed mechanically in such a way that the cell culture fluid flows along one surface of the cell-tissue construct, while the other surface of the cell-tissue construct or the tissue structure is moistened with cell culture fluid.
  • This cell culture fluid which moistens the tissue structure, is aspirated and exchanged at predetermined intervals.
  • a device is suitable for carrying out the method according to the invention, which comprises a bioreactor for receiving the cell-tissue construct, a drive unit connected to the bioreactor and acting on the cell culture medium, and a container for the bioreactor connected via a supply and an outlet line Cell culture medium exists.
  • Such a device enables a compact structure and a maximum degree of sterility in the production of a vital replacement tissue as well as simple handling and optimal influence on the control mechanisms during the growth of the vital replacement tissue.
  • the drive unit is designed so that it directly or indirectly changes the pressure on the cell-tissue construct and on the cell culture medium to produce a mechanical alternating movement of the cell-tissue construct and one pulsatile flow of the cell waist medium.
  • the drive unit can act directly on the cell-tissue construct, for example, in such a way that the carrier material populated with cell cultures and contained in a cell culture fluid is moved mechanically and, in addition to a mechanical alternating movement, also causes a flow movement of the cell culture fluid, which is caused by appropriate control means is converted into a pulsatile flow.
  • the drive unit preferably consists of a membrane pump arranged essentially parallel to the alignment of the cell-tissue construct, between which and the cell-tissue construct the cell culture medium is located.
  • a holding device of the bioreactor which clamps the cell-tissue construct at its edge region, is used, so that both surfaces of the cell-tissue construct can be suitably loaded with the cell culture medium.
  • An advantageous embodiment of the bioreactor according to the invention is characterized in that it has a plurality of chambers arranged one above the other, of which a lower chamber forms the membrane pump, a middle chamber from the lower chamber through the membrane of the membrane pump and from an upper chamber through the cell tissue.
  • the construct is separated and connected to the reservoir for the cell culture medium via the feed and drain line and thus contains cell culture medium and that the upper chamber contains the holding device which clamps the cell-tissue construct and cell culture medium.
  • the middle chamber has two diametrically arranged hose connections and lead from the hose connections to the cell-tissue construct
  • a check valve is arranged in bores and at least in the feed or drain line.
  • a mechanical load and a pulsatile flow Membrane pump consisting of the membrane separating the lower chamber from the middle chamber and a respirator connected to the lower chamber via a pressure line, an infusion pump or the like for periodically generating an overpressure and underpressure in the lower chamber.
  • the holding device provided for fixing the cell-tissue construct preferably consists of a cylindrical stamp, the circular base of which presses the cell-tissue construct against an upper edge of the middle chamber, a support cover which is connected to a housing part of the bioreactor, and one Adjusting element which supports the cover surface opposite the circular base surface of the cylindrical stamp on the support cover.
  • the top surface of the cylindrical plunger and the support cover have at least one hole and a cylindrical or pot-shaped cover which extends over the support cover and can be connected to the housing part of the bioreactor closes off the upper chamber.
  • the bioreactor advantageously consists of a transparent material, preferably of acrylic.
  • the bioreactor, the reservoir for the cell culture medium and the connecting lines are arranged in an incubator and the bioreactor is connected via the pressure line to the ventilator, the infusion pump or the like arranged outside the incubator ,
  • FIG. 5 shows a section through a bioreactor which is particularly suitable for producing a vital patch tissue
  • FIG. 6 shows a section through the bioreactor according to FIG. 5 along the line VI-VI;
  • Fig. 7 - a section through the bioreactor according to FIG. 5 along the line VII-VII and
  • Fig. 8 - a schematic representation of an experimental setup for the production of biologically functional replacement tissue.
  • FIGS. 1 and 2 are intended to explain the principles of the new flow system for the production of a patch tissue in vitro by a combined mechanical stress of a cell-tissue construct in connection with a tissue-stimulating flow to induce an adequate extracellular matrix formation.
  • the cell-tissue construct 1 clamped in a holding device 7 preferably consists of a carrier material in the form of a resorbable tissue framework, which is populated, for example, with vascular cells.
  • the cell-tissue construct 1 is subjected to an overpressure P j from the underside, so that the cell-tissue construct 1 is arched upwards.
  • a tissue-stimulating flow F is generated, which flows from an inlet line 41 to an outlet line 42 and thereby flows along the underside of the cell-tissue construct 1.
  • the cell-tissue construct 1 is exposed both to a pulsatile flow F and to a changing pressure Pi or P 2 and thus to a mechanical stress.
  • An example of the generation of this changing, mechanical stress on the cell-tissue construct 1 is explained in more detail below in connection with the description of a bioreactor according to FIG. 5.
  • FIG. 3 shows a typical course of the pressure loading of the cell-tissue construct with an overpressure and underpressure acting alternately after a sinus function on the cell-tissue construct.
  • FIG. 3 illustrates that the overpressure acting on the cell-tissue construct reaches higher pressure values than the negative pressure acting on the cell-tissue construct.
  • FIG. 4 shows a temporal representation of the pulsatile flow acting on the cell-tissue construct, the flow velocity of which also increases sinusoidally with increasing overpressure acting on the cell-tissue construct, while it essentially increases with negative pressure acting on the cell-tissue construct drops to zero, the vibrations shown being caused by the systemic friction due to the laminar flow of the cell culture fluid and the movement of the cell-tissue construct.
  • FIG. 5 shows a section through a bioreactor 2 for producing a patch tissue in vitro, with the aid of which the cell-tissue construct is subjected to both mechanical stress and a tissue-stimulating, pulsatile flow in order to induce adequate extracellular matrix formation.
  • the bioreactor 2 has a lower chamber 3, which is delimited by a first housing part 30 and a silicone membrane 6.
  • the lower chamber 3 is filled with air or a suitable gas and has a hose connection 31 to which one is connected
  • Hose a drive unit, for example in the form of a ventilator, an infusion pump or the like is connected.
  • a corresponding drive unit can consist, for example, of a so-called “dual phase control fan” or an infusion pump which can be found in WO 96/25963.
  • a middle chamber 4 which is delimited by a second housing part 40, the silicone membrane 6 and by the cell-tissue construct 1.
  • cell culture liquid with a volume of, for example, 370 ml.
  • two bores 41, 42 which communicate with hose connections 43, 44 which are fastened to the second housing part 40 of the bioreactor 2 , The two bores 41, 42 are arranged diametrically to one another and directed towards the underside of the cell-tissue construct 1.
  • the two tube connections 43, 44 are connected to a reservoir 15 for cell culture fluid via silicone tubes.
  • An upper chamber 5 is delimited by a third housing part 50, a cover 10 which closes and seals the bioreactor 2 at the top and on its underside by the cell-tissue construct 1.
  • a holding device for fixing the cell-tissue construct 1 which consists of a cylindrical stamp 7 and a clamping device 8, 9.
  • a knurled screw 9 which presses the top surface 71 of the cylindrical stamp 7 against one on the third housing part 50 of the bioreactor 2 supported support cover 8 biased.
  • a lock nut 90 is provided, which secures the position of the knurled nut 9.
  • cell culture liquid with a volume of, for example, 40 ml, the accessibility of which is through bores 72 to 74 or 81-83 (FIGS. 6 and 7) in the top surface 71 of the cylindrical stamp 7 or in the support cover
  • the sealing of the interior of the bioreactor 2 to maintain sterile conditions for the cell-tissue construct 1 is achieved by a silicone O-ring 11 on the abutting end faces of the second housing part 40 and the third housing part 50, which are the middle chamber 4 and the upper chamber 5 limit and guaranteed by the silicone membrane 6.
  • Acrylic is used as the material for the housing parts 30, 40, 50 and for the pot-shaped cover 10, and the connection connections and connections of the housing parts are effected using stainless steel screws.
  • FIGS. 6 and 7 are top views of the support cover 8 and the top surface 71 of the cylindrical stamp 7 with the bores 72 to 74 and 81 to 83 arranged therein for the exchange of cell culture fluid.
  • FIG. 8 shows a schematic diagram of an experimental setup with the bioreactor 2, which is arranged in an incubator 12 together with the reservoir 15 for cell culture fluid and a ring line 16 made of silicone tubes for supplying and draining cell culture fluid.
  • the bioreactor 2 is connected via a pressure line 17 to a respirator 11 as the drive unit, which is arranged outside the incubator 12.
  • check valves 13, 14 are arranged, which prescribe a direction of flow of the cell culture fluid.
  • the bioreactor 2 has the following functions:
  • the silicone membrane 6 In the idle state, the silicone membrane 6 is arched downward, ie into the lower chamber 3, due to the force of gravity and the cell culture liquid located in the middle chamber 4. If the drive unit 12 generates an overpressure in the lower chamber 3, this overpressure causes a movement of the membrane pump Silicone membrane 6 upwards, ie into the middle chamber 4 and thus a volume reduction of the middle chamber 4 filled with cell culture liquid. According to FIG. 1, this curvature of the silicone membrane 6 causes a pressure on the cell from the middle chamber 4 to the upper chamber 5 Tissue construct 1 exerted so that the cell-tissue construct 1 bulges into the upper chamber 5.
  • a negative pressure is generated in the lower chamber 3 by means of the drive unit 12 and the silicone membrane 6 is thereby drawn into the lower chamber 3.
  • the resulting increase in volume in the middle chamber 4 ensures that cell culture fluid is drawn in from the reservoir 15 via one of the two bores 41, 42.
  • Cell culture fluid flows along the underside of the cell-tissue construct 1 or patch tissue through the predetermined flow direction and the bores 41, 42 directed towards the underside of the cell-tissue construct 1 and bulges the cell-tissue construct downwards the middle chamber 4 according to FIG. 2 by.
  • the cycle starts again when the drive unit 12 again generates an overpressure in the lower chamber 3 and as a result causes the silicone membrane 6 to bulge into the middle chamber 4.
  • the cell-tissue construct 1 bulges into the upper chamber 5 or middle chamber 4 and is exposed in parallel to a pulsatile flow of the cell culture liquid which, as a result of the non-return flaps 13, 14 according to FIG Cell tissue construct 1 flows along. In this way, the cell-tissue construct is exposed to both mechanical (pressure) stress and a pulsatile flow.
  • the cell culture liquid located in the upper chamber 5 serves to moisten the carrier material and is at certain intervals via the bores 72 to 74 and 81 sucked up to 83 in the support cover 8 or in the cover surface 71 of the cylindrical stamp 7 and exchanged.

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Abstract

The invention relates to a method for producing vital, biological substitute tissue in vitro using cell cultures and a support. The inventive method is characterized in that a cell-tissue construct produced from the support and the cell cultures is subjected to a changing mechanical stress, especially a combination of a pulsating flow of a cell culture medium and a pulsating movement of the cell-tissue construct.

Description

Verfahren zur In-vitro-Herstellung von vitalem, biologischem Ersatzgewebe unter Verwendung von Zellkulturen und einem Trägermaterial Process for the in vitro production of vital, biological replacement tissue using cell cultures and a carrier material
Beschreibungdescription
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur In-vitro-Herstellung von vitalem, biologischem Ersatzgewebe unter Verwendung von Zellkulturen und einem Trägermaterial sowie auf eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.The invention relates to a method for the in vitro production of vital, biological replacement tissue using cell cultures and a carrier material, and to an apparatus for carrying out the method.
Es ist bekannt, sogenanntes "Tissue Engineering" zur Herstellung künstlicher Binde- und Epithelgewebe sowie neuronaler Organoide auf der Basis von kultivierten Zellen und mit Hilfe verschiedenster Biomatrices außerhalb des Körpers "in vitro" herzustellen und die kultivierten Zellen dann zu implantieren. Das Tissue Engineering kombiniert Erkenntnisse aus der Medizin und Biologie mit Methoden der Ingenieurswissenschafiten, und ermöglicht es, räumlich definierte Gewebe und organoide Strukturen für eine Implantation aufzubauen.It is known to produce so-called "tissue engineering" for the production of artificial connective and epithelial tissues and neuronal organoids on the basis of cultivated cells and with the aid of various biomatrices outside the body "in vitro" and then to implant the cultivated cells. Tissue engineering combines findings from medicine and biology with methods of engineering science, and enables spatially defined tissues and organoid structures to be built up for implantation.
Das Konzept des Tissue Engineerings besteht darin, körpereigene Zellen auf geeignete Matrices aufzubringen, ihre Vermehrung zu steuern und ihre dreidimensionale Ausbreitung zu lenken, um einen vitalen und funktionalen Gewebeersatz zu fertigen. Zu diesem Zweck werden die körpereigenen Zellen auf einem Trägermaterial, insbesondere auf individuell ausgesuchten Filterunterlagen, Vliesen, bioabbaubaren Gerüstmaterialen oder schwammartigen Matrices verankert und in Kulturcontainern mit Nährstoffen und anderen Zusätzen versorgt. Die unter Einhaltung der Gewebedifferenzierung vermehrte und in vitro zu einer stabilen Struktur gefestigten, körpereigenen Zellen führen theoretisch zu einem vitalen, für Implantationen geeigneten Ersatzgewebe.The concept of tissue engineering is to apply the body's own cells to suitable matrices, to control their multiplication and to direct their three-dimensional spread in order to produce a vital and functional tissue replacement. For this purpose, the body's own cells are anchored on a carrier material, in particular on individually selected filter pads, fleeces, biodegradable scaffolding materials or sponge-like matrices and in culture containers with nutrients and others Additives supplied. The body's own cells, which are increased in accordance with tissue differentiation and consolidated in vitro to a stable structure, theoretically lead to a vital replacement tissue suitable for implantation.
Neben einer gewebetypischen Differenzierung und optimalen Zellverankerung ist für die Anwendung des Tissue Engineerings eine leichte Handhabbarkeit, hohe Funktionssicherheit bei möglichst geringem apparativen Aufwand und die Gewährleistung steriler Bedingungen bei der Herstellung des biologischen Ersatzgewebes von Bedeutung.In addition to tissue-typical differentiation and optimal cell anchoring, easy handling, high functional reliability with the least possible expenditure on equipment and the guarantee of sterile conditions during the production of the biological replacement tissue are important for the application of tissue engineering.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher, ein Verfahren zur In-vitro-Herstellung von vitalem, biologischem Ersatzgewebe unter Verwendung von Zellkulturen und einem Trägermaterial anzugeben, mit dem insbesondere ein flächenformiges, sogenanntes Patch- Gewebe in vitro herstellbar ist, das eine hohe und steuerbare Zeilvermehrungsrate unter Beibehaltung der gewünschten Zelleigenschaften ermöglicht, das einfach handhabbar und funktionssicher sowie mit geringem apparativen Aufwand unter Gewährleistung steriler Bedingungen anwendbar ist.The object of the present invention is therefore to provide a method for the in vitro production of vital, biological replacement tissue using cell cultures and a carrier material, with which in particular a flat, so-called patch tissue can be produced in vitro, which has a high and controllable line multiplication rate while maintaining the desired cell properties, which is easy to handle and functionally reliable, and can be used with little outlay on equipment while ensuring sterile conditions.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur In-vitro-Herstellung von vitalem, biologischem Ersatzgewebe unter Verwendung von Zellkulturen und einem Trägermaterial gelöst, bei dem ein aus dem Trägermaterial und den Zellkulturen gebildetes Zell-Gewebe- Konstrukt einer sich ändernden mechanischen Beanspruchung ausgesetzt wird.This object is achieved by a method for the in vitro production of vital, biological replacement tissue using cell cultures and a carrier material, in which a cell-tissue construct formed from the carrier material and the cell cultures is exposed to a changing mechanical stress.
Die erfindungsgemäße Lösung gewährleistet die Herstellung eines vitalen, stabilen und fraktionellen Ersatzgewebes, insbesondere eines flächenförmigen Patch-Gewebes in vitro, das eine hohe und steuerbare Zeilvermehrungsrate unter Beibehaltung der gewünschten Zelleigenschaften ermöglicht und das einfach handhabbar sowie funktionssicher und mit geringem apparativen Aufwand unter Sicherstellung steriler Bedingungen anwendbar ist.The solution according to the invention ensures the production of a vital, stable and fractional replacement tissue, in particular a flat patch tissue in vitro, which enables a high and controllable cell multiplication rate while maintaining the desired cell properties and which is easy to handle and functionally reliable and with little equipment and under the protection of sterile conditions is applicable.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zur Herstellung von flächenförmigen Gewebestücken für kardiovaskuläre Strukturen.The method according to the invention is particularly suitable for the production of sheet-like tissue pieces for cardiovascular structures.
Vorzugsweise wird das Zell-Gewebe-Konstrukt einer sich periodisch ändernden mechanischen Beanspruchung, insbesondere einer pulsierenden Druckbeanspruchung, ausgesetzt.The cell-tissue construct is preferably subjected to a periodically changing mechanical stress, in particular a pulsating pressure stress, exposed.
Um eine adäquate extrazelluläre Matrixbildung zur Herstellung eines lebendigen Patch- Gewebes in vitro zu induzieren, wird das Zell-Gewebe-Konstrukt einem gewebestimulierenden Fluss des Zellkulturmediums ausgesetzt, indem eine Kombination aus einer pulsierenden Strömung und einer pulsierenden Bewegung des Zell-Gewebe- Konstrukts auf das Zell-Gewebe-Konstrukt einwirkt.In order to induce adequate extracellular matrix formation for the production of a living patch tissue in vitro, the cell-tissue construct is exposed to a tissue-stimulating flow of the cell culture medium by a combination of a pulsating flow and a pulsating movement of the cell-tissue construct on the Cell-tissue construct acts.
Vorzugsweise erfolgt die auf das Zell-Gewebe-Konstrukt einwirkende pulsierende Bewegung abwechselnd nach beiden Seiten des Zell-Gewebe-Konstrukts, insbesondere bei einem waagerecht angeordneten Zell-Gewebe-Konstrukt durch Heben und Senken des Zell- Gewebe-Konstrukts.The pulsating movement acting on the cell-tissue construct is preferably carried out alternately on both sides of the cell-tissue construct, in particular in the case of a horizontally arranged cell-tissue construct, by raising and lowering the cell-tissue construct.
Als besonders geeignetes Trägermaterial hat sich ein resorbierbares bzw. bioabbaubares Gewebegerüst, insbesondere ein resorbierbares Gerüstmaterial, zur optimalen Zellverankerung und damit zum Erhalt von gewebetypischen Eigenschaften erwiesen.A particularly suitable carrier material has proven to be an absorbable or biodegradable tissue scaffold, in particular a resorbable scaffold material, for optimal cell anchoring and thus for maintaining tissue-typical properties.
Zur Wachstumssteuerung des vitalen Ersatzgewebes unter Wahrung der Zellverankerung im Trägermaterial und damit der biologischen und funktionalen Eigenschaften des Patches sind in einer Ausfuhrungsform der erfindungsgemäßen Lösung die Amplitude der vorzugsweise senkrecht zur Oberfläche des Zell-Gewebe-Konstrukts gerichteten pulsierenden Bewegung und die Strömungsgeschwindigkeit des Zellkulturmediums veränderbar, d.h. die gepumpte Flüssigkeitsmenge kann durch Einstellung der Frequenz und des Pumpvolumens • eines entsprechenden Antriebsaggregates für das Zellkulturmedium beliebig variiert werden.To control the growth of the vital replacement tissue while maintaining the cell anchoring in the carrier material and thus the biological and functional properties of the patch, in one embodiment of the solution according to the invention the amplitude of the pulsating movement, preferably directed perpendicular to the surface of the cell-tissue construct, and the flow rate of the cell culture medium can be changed, ie the amount of liquid pumped can be varied as desired by setting the frequency and the pump volume • of an appropriate drive unit for the cell culture medium.
Eine vorteilhafte Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung vitaler und funktionaler Ersatzgewebestücke (Patch-Gewebe) nach dem Prinzip des Tissue- Engineerings unter Verwendung eines resorbierbaren Trägermaterials, das mit vaskulären Zellen besiedelt und in vitro zu einem Zell-Gewebe-Konstrukt zur Bildung einer adäquaten, extrazellulären Matrix konditioniert wird, insbesondere zur Rekonstruktion kardiovaskulärer Strukturen, ist dadurch gekennzeichnet, dass das Zell-Gewebe-Konstrukt einem das Zell-Gewebe-Konstrukt in wechselnde Richtung pulsierend bewegenden pulsatilen Fluss einer Zellkulturflüssigkeit ausgesetzt wird.An advantageous embodiment of the method according to the invention for the production of vital and functional replacement tissue pieces (patch tissue) according to the principle of tissue engineering using a resorbable carrier material that colonizes with vascular cells and in vitro to form a cell-tissue construct to form an adequate, Conditioned extracellular matrix, in particular for the reconstruction of cardiovascular structures, is characterized in that the cell-tissue construct is a pulsating moving the cell-tissue construct in alternating directions pulsatile flow of a cell culture fluid is exposed.
Vorzugsweise wirkt der pulsatile Fluss sowohl senkrecht als auch im wesentlichen parallel zur Oberfläche des Zell-Gewebe-Konstrukts auf das Zell-Gewebe-Konstrukt ein. Dabei wird durch Ausüben eines wechselnden Druckes auf die das Zell-Gewebe-Konstrukt umgebende Zellkulturflüssigkeit sowohl eine Bewegung des Zell-Gewebe-Konstrukts senkrecht zu dessen Oberfläche als auch eine Strömungsbewegung der Zellkulturflüssigkeit entlang der Oberfläche des Zell-Gewebe-Konstrukts erzeugt.The pulsatile flow preferably acts on the cell-tissue construct both perpendicularly and essentially parallel to the surface of the cell-tissue construct. By exerting an alternating pressure on the cell culture tissue surrounding the cell tissue construct, both a movement of the cell tissue construct perpendicular to its surface and a flow movement of the cell culture liquid along the surface of the cell tissue construct are generated.
Vorzugsweise wird eine Strömungsrichtung der am Zell-Gewebe-Konstrukt vorbeibewegten Zellkulturflüssigkeit vorgegeben.A direction of flow of the cell culture fluid moving past the cell-tissue construct is preferably specified.
Zur Optimierung der Herstellung des vitalen Ersatzgewebes wird das Zeil-Gewebe- . Konstrukt in der Weise mechanisch beaufschlagt, dass die Zellkulturflüssigkeit an der einen Oberfläche des Zell-Gewebe-Konstrukts entlangströmt, während die andere Oberfläche des Zell-Gewebe-Konstrukts bzw. das Gewebegerüst mit Zellkulturflüssigkeit befeuchtet wird. Diese das Gewebegerüst befeuchtende Zellkulturflüssigkeit wird in vorgegebenen Intervallen abgesaugt und ausgetauscht.To optimize the production of vital replacement tissue, the Zeil-tissue is. Constructed mechanically in such a way that the cell culture fluid flows along one surface of the cell-tissue construct, while the other surface of the cell-tissue construct or the tissue structure is moistened with cell culture fluid. This cell culture fluid, which moistens the tissue structure, is aspirated and exchanged at predetermined intervals.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist eine Vorrichtung geeignet, die aus einem Bioreaktor zur Aufnahme des Zell-Gewebe-Konstrukts, einem mit dem Bioreaktor verbundenen und auf das Zellkulturmedium einwirkenden Antriebsaggregat und einem mit dem Bioreaktor über eine Zufuhr- und eine Abflussleitung verbundenen Behälter für das Zellkulturmedium besteht.A device is suitable for carrying out the method according to the invention, which comprises a bioreactor for receiving the cell-tissue construct, a drive unit connected to the bioreactor and acting on the cell culture medium, and a container for the bioreactor connected via a supply and an outlet line Cell culture medium exists.
Eine derartige Vorrichtung ermöglicht einen kompakten Aufbau sowie ein Höchstmaß an Sterilität bei der Erzeugung eines vitalen Ersatzgewebes sowie eine einfache Handhabung und optimale Einflussnahme auf die Steuerungsmechanismen beim Wachstum des vitalen Ersatzgewebes.Such a device enables a compact structure and a maximum degree of sterility in the production of a vital replacement tissue as well as simple handling and optimal influence on the control mechanisms during the growth of the vital replacement tissue.
Das Antriebsaggregat ist so beschaffen, dass es mittelbar oder unmittelbar einen wechselnden Druck auf das Zell-Gewebe-Konstrukt sowie auf das Zellkulturmedium zur Erzeugung einer mechanischen Wechselbewegung des Zell-Gewebe-Konstrukts und eines pulsatilen Flusses des Zelltailturmediiims ausübt. Eine unmittelbare Einwirkung des Antriebsaggregates auf das Zell-Gewebe-Konstrukt kann beispielsweise in der Weise erfolgen, dass das mit Zellkulturen besiedelte und in einer Zellkulturflüssigkeit befindliche Trägermaterial mechanisch bewegt wird und dabei neben einer mechanischen Wechselbewegung auch eine Fließbewegung der Zellkulturflüssigkeit hervorruft, die durch entsprechende Steuerimgsmittel in einen pulsatilen Fluss umgesetzt wird.The drive unit is designed so that it directly or indirectly changes the pressure on the cell-tissue construct and on the cell culture medium to produce a mechanical alternating movement of the cell-tissue construct and one pulsatile flow of the cell waist medium. The drive unit can act directly on the cell-tissue construct, for example, in such a way that the carrier material populated with cell cultures and contained in a cell culture fluid is moved mechanically and, in addition to a mechanical alternating movement, also causes a flow movement of the cell culture fluid, which is caused by appropriate control means is converted into a pulsatile flow.
Vorzugsweise besteht das Antriebsaggregat jedoch aus einer im wesentlichen parallel zur Ausrichtung des Zell-Gewebe-Konstrukts angeordneten Membranpumpe, zwischen der und dem Zell-Gewebe-Konstrukt sich das Zellkulturmedium befindet.However, the drive unit preferably consists of a membrane pump arranged essentially parallel to the alignment of the cell-tissue construct, between which and the cell-tissue construct the cell culture medium is located.
Zum Fixieren des Zell-Gewebe-Konstrukts im Bioreaktor dient eine das Zell-Gewebe- Konstrukt an seinem Randbereich einspannende Haltevorrichtung des Bioreaktors, so dass beide Oberflächen des Zell-Gewebe-Konstrukts in geeigneter Weise mit dem Zellkulturmedium beaufschlagt werden können.To fix the cell-tissue construct in the bioreactor, a holding device of the bioreactor, which clamps the cell-tissue construct at its edge region, is used, so that both surfaces of the cell-tissue construct can be suitably loaded with the cell culture medium.
Eine vorteilhafte Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Bioreaktors ist dadurch gekennzeichnet, dass dieser mehrere übereinander angeordnete Kammern aufweist, von denen eine untere Kammer die Membranpumpe bildet, eine mittlere Kammer von der unteren Kammer durch die Membran der Membranpumpe und von einer oberen Kammer durch das Zell-Gewebe-Konstrukt getrennt und über die Zufuhr- und Abflussleitung mit dem Reservoir für das Zellkulturmedium verbunden ist und damit Zellkulturmedium enthält und dass die obere Kammer die das Zell-Gewebe-Konstrukt einspannende Haltevorrichtung sowie Zellkulturmedium enthält.An advantageous embodiment of the bioreactor according to the invention is characterized in that it has a plurality of chambers arranged one above the other, of which a lower chamber forms the membrane pump, a middle chamber from the lower chamber through the membrane of the membrane pump and from an upper chamber through the cell tissue. The construct is separated and connected to the reservoir for the cell culture medium via the feed and drain line and thus contains cell culture medium and that the upper chamber contains the holding device which clamps the cell-tissue construct and cell culture medium.
Zur Versorgung des Zell-Gewebe-Konstrukts mit dem Zellmedium bzw. mit Zellkulturflüssigkeit und zur mechanischen Beanspruchung des Zell-Gewebe-Konstrukts durch eine gerichtete Flüssigkeitsströmung weist die mittlere Kammer zwei diametral zueinander angeordnete Schlauchanschlüsse auf und von den Schlauchanschlüssen zu dem Zell-Gewebe-Konstruktführen Bohrungen und zumindest in der Zufuhr- oder der Abflussleitung ist ein Rückschlagventil angeordnet.To supply the cell-tissue construct with the cell medium or with cell culture fluid and for mechanical stress on the cell-tissue construct by a directed liquid flow, the middle chamber has two diametrically arranged hose connections and lead from the hose connections to the cell-tissue construct A check valve is arranged in bores and at least in the feed or drain line.
Zur mechanischen Beanspruchung und zur Erzeugung eines pulsatilen Flusses besteht die Membranpumpe aus der die untere Kammer von der mittleren Kammer trennenden Membran und einem mit der unteren Kammer über eine Druckleitung verbundenen Beatmungsgerät, einer Infusionspumpe oder dergleichen zur periodischen Erzeugung eines Über- und Unterdrucks in der unteren Kammer.There is a mechanical load and a pulsatile flow Membrane pump consisting of the membrane separating the lower chamber from the middle chamber and a respirator connected to the lower chamber via a pressure line, an infusion pump or the like for periodically generating an overpressure and underpressure in the lower chamber.
Die zum Fixieren des Zell-Gewebe-Konstrukts vorgesehene Haltevorrichtung besteht vorzugsweise aus einem zylindrischen Stempel, dessen kreisförmige Grundfläche das Zell- Gewebe-Konstrukt gegen einen oberen Rand der mittleren Kammer drückt, einem Stützdeckel, der mit einem Gehäuseteil des Bioreaktors verbunden ist, und einem Stellelement, das die der kreisförmigen Grundfläche des zylindrischen Stempels entgegengesetzte Deckfläche am Stützdeckel abstützt.The holding device provided for fixing the cell-tissue construct preferably consists of a cylindrical stamp, the circular base of which presses the cell-tissue construct against an upper edge of the middle chamber, a support cover which is connected to a housing part of the bioreactor, and one Adjusting element which supports the cover surface opposite the circular base surface of the cylindrical stamp on the support cover.
Zum Austausch von Zellkulturflüssigkeit und zur sterilen Abdichtung des Bioreaktors weisen die Deckfläche des zylindrischen Stempels und der Stützdeckel mindestens eine Bohrung auf und ein über den Stützdeckel greifender und mit dem Gehäuseteil des Bioreaktors verbindbarer zylinder- oder topfförmiger Deckel schließt die obere Kammer ab.For the exchange of cell culture fluid and for sterile sealing of the bioreactor, the top surface of the cylindrical plunger and the support cover have at least one hole and a cylindrical or pot-shaped cover which extends over the support cover and can be connected to the housing part of the bioreactor closes off the upper chamber.
Zur Erleichterung der im Bioreaktor ablaufenden Prozesse und zur Kontrolle der einzelnen Funktionen des Bioreaktors besteht dieser vorteilhafterweise aus einem durchsichtigen Material, vorzugsweise aus Acryl.To facilitate the processes taking place in the bioreactor and to control the individual functions of the bioreactor, the bioreactor advantageously consists of a transparent material, preferably of acrylic.
Zur Einhaltung optimaler Randbedingungen bei der Herstellung von biologischem Ersatzgewebe in- vitro sind der Bioreaktor, das Reservoir für das Zellkulturmedium und die Verbindungsleitungen in einem Inkubator angeordnet und der Bioreaktor ist über die Druckleitung mit dem außerhalb des Inkubators angeordneten Beatmungsgerät, der Infusionspumpe oder dgl. verbunden.To maintain optimal boundary conditions in the production of biological replacement tissue in vitro, the bioreactor, the reservoir for the cell culture medium and the connecting lines are arranged in an incubator and the bioreactor is connected via the pressure line to the ventilator, the infusion pump or the like arranged outside the incubator ,
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von vitalem Ersatzgewebe und insbesondere eines vitalen Patch-Gewebes in vitro sowie ein Ausführungsbeispiel für eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sollen anhand der Zeichnungsfiguren dargestellt werden. Es zeigen: Fig. 1 und 2 - eine schematische Darstellung der mechanischen Beanspruchung eines Zell-Gewebe-Konstrukts in verschiedenen Bewegungsphasen;The method according to the invention for the production of vital replacement tissue and in particular a vital patch tissue in vitro as well as an exemplary embodiment for a device for carrying out the method according to the invention are to be illustrated using the drawing figures. Show it: 1 and 2 - a schematic representation of the mechanical stress of a cell-tissue construct in different phases of movement;
Fig. 3 und 4 - zeitliche Darstellungen des auf das Zell-Gewebe-Konstrukt einwirkenden Druckes und der Strömungsgeschwindigkeit eines Zellkulturmediums;3 and 4 - temporal representations of the pressure acting on the cell-tissue construct and the flow rate of a cell culture medium;
Fig. 5 - einen Schnitt durch einen insbesondere zur Herstellung eines vitalen Patch-Gewebes geeigneten Bioreaktors;5 shows a section through a bioreactor which is particularly suitable for producing a vital patch tissue;
Fig. 6 - einen Schnitt durch den Bioreaktor gemäß Fig. 5 entlang der Linie VI- VI;6 shows a section through the bioreactor according to FIG. 5 along the line VI-VI;
Fig. 7 - einen Schnitt durch den Bioreaktor gemäß Fig. 5 entlang der Linie VII- VII undFig. 7 - a section through the bioreactor according to FIG. 5 along the line VII-VII and
Fig. 8 - eine schematische Darstellung eines Versuchsaufbaus für die Herstellung von biologisch-funktionalem Ersatzgewebe.Fig. 8 - a schematic representation of an experimental setup for the production of biologically functional replacement tissue.
Die schematischen Darstellungen der Fig. 1 und 2 sollen die Prinzipien des neuen Flusssystems zur Herstellung eines Patch-Gewebes in vitro durch eine kombinierte mechanische Beanspruchung eines Zell-Gewebe-Konstrukts in Verbindung mit einem gewebestimulierenden Fluss zur Induzierung einer adäquaten extrazellulären Matrixbildung erläutern.The schematic representations of FIGS. 1 and 2 are intended to explain the principles of the new flow system for the production of a patch tissue in vitro by a combined mechanical stress of a cell-tissue construct in connection with a tissue-stimulating flow to induce an adequate extracellular matrix formation.
Das in einer Haltevorrichtung 7 eingespannte Zell-Gewebe-Konstrukt 1 besteht vorzugsweise aus einem Trägermaterial in Form eines resorbierbaren Gewebegerüsts, das beispielsweise mit vaskulären Zellen besiedelt ist. Das Zell-Gewebe-Konstrukt 1 wird in einer ersten Phase gemäß Fig. 1 von der Unterseite her mit einem Überdruck Pj beaufschlagt, so dass das Zell-Gewebe-Konstrukt 1 nach oben gewölbt wird. Gleichzeitig wird ein gewebestimulierender Fluss F erzeugt, der von einer Einlassleitung 41 zu einer Auslassleitimg 42 fließt und dabei an der Unterseite des Zell-Gewebe-Konstrukts 1 entlangströmt.The cell-tissue construct 1 clamped in a holding device 7 preferably consists of a carrier material in the form of a resorbable tissue framework, which is populated, for example, with vascular cells. In a first phase according to FIG. 1, the cell-tissue construct 1 is subjected to an overpressure P j from the underside, so that the cell-tissue construct 1 is arched upwards. At the same time, a tissue-stimulating flow F is generated, which flows from an inlet line 41 to an outlet line 42 and thereby flows along the underside of the cell-tissue construct 1.
In einer zweiten Bewegungsphase gemäß Fig. 2 wird unterhalb des Zeil-Gewebe- Konstrukts 1 anstelle eines Überdrucks ein Unterdruck P2 erzeugt, der das Zell-Gewebe- Konstrukt 1 nach unten ablenkt. In dieser Bewegungsphase ist die Strömung des Zellkulturmediums unterbrochen.In a second movement phase according to FIG. 2, below the cell tissue Constructs 1 instead of an overpressure generates a negative pressure P 2 , which deflects the cell-tissue construct 1 downwards. The flow of the cell culture medium is interrupted in this movement phase.
Durch diese kombinierte Bewegung wird das Zell-Gewebe-Konstrukt 1 sowohl einem pulsatilen Fluss F als auch einem wechselnden Druck Pi bzw. P2 und damit einer mechanischen Beanspruchung ausgesetzt. Ein Beispiel für die Erzeugung dieser wechselnden, mechanischen Beanspruchung des Zell-Gewebe-Konstrukts 1 wird nachstehend in Verbindung mit der Beschreibung eines Bioreaktors gemäß Fig. 5 näher erläutert.As a result of this combined movement, the cell-tissue construct 1 is exposed both to a pulsatile flow F and to a changing pressure Pi or P 2 and thus to a mechanical stress. An example of the generation of this changing, mechanical stress on the cell-tissue construct 1 is explained in more detail below in connection with the description of a bioreactor according to FIG. 5.
Fig. 3 zeigt einen typischen Verlauf der Druckbeanspruchung des Zell-Gewebe-Konstrukts mit einem abwechselnd nach einer Sinusfunktion auf das Zell-Gewebe-Konstrukt einwirkendem Überdruck und Unterdruck. Fig. 3 verdeutlicht, dass der auf das Zell- Gewebe-Konstrukt einwirkende Überdruck größere Druckwerte erreicht als der auf das Zell-Gewebe-Konstrukt einwirkende Unterdruck.3 shows a typical course of the pressure loading of the cell-tissue construct with an overpressure and underpressure acting alternately after a sinus function on the cell-tissue construct. FIG. 3 illustrates that the overpressure acting on the cell-tissue construct reaches higher pressure values than the negative pressure acting on the cell-tissue construct.
Fig. 4 zeigt eine zeitliche Darstellung des auf das Zell-Gewebe-Konstrukt einwirkenden pulsatilen Flusses, dessen Strömungsgeschwindigkeit bei zunehmendem, auf das Zell- Gewebe-Konstrukt einwirkendem Überdruck ebenfalls sinusförmig zunimmt, während er bei auf das Zell-Gewebe-Konstrukteinwirkendem Unterdruck im wesentlichen auf Null absinkt, wobei die dargestellten Schwingungen durch die systembedingte Reibung infolge der laminaren Strömung der Zellkulturflüssigkeit und die Bewegung des Zell-Gewebe- Konstrukts bedingt sind.FIG. 4 shows a temporal representation of the pulsatile flow acting on the cell-tissue construct, the flow velocity of which also increases sinusoidally with increasing overpressure acting on the cell-tissue construct, while it essentially increases with negative pressure acting on the cell-tissue construct drops to zero, the vibrations shown being caused by the systemic friction due to the laminar flow of the cell culture fluid and the movement of the cell-tissue construct.
Fig. 5 zeigt einen Schnitt durch einen Bioreaktor 2 zur Herstellung eines Patch-Gewebes in vitro, mit dessen Hilfe das Zell-Gewebe-Konstrukt sowohl einer mechanischen Beanspruchung als auch einem gewebestimulierenden, pulsatilen Fluss ausgesetzt wird, um eine adäquate extrazelluläre Matrixbildung zu induzieren.FIG. 5 shows a section through a bioreactor 2 for producing a patch tissue in vitro, with the aid of which the cell-tissue construct is subjected to both mechanical stress and a tissue-stimulating, pulsatile flow in order to induce adequate extracellular matrix formation.
Der Bioreaktor 2 weist eine untere Kammer 3 auf, die durch ein erstes Gehäuseteil 30 und eine Silikonmembran 6 abgegrenzt wird. Die untere Kammer 3 ist mit Luft oder einem geeigneten Gas gefüllt und weist einen Schlauchanschluss 31 auf, an den über einen Schlauch ein Antriebsaggregat, beispielsweise in Form eines Beatmungsgerätes, einer Infusionspumpe oder dergleichen angeschlossen wird. Ein entsprechendes Antriebsaggregat kann beispielsweise aus einem sogenannten "dual phase control Ventilator" oder einer der WO 96/25963 zu entnehmenden Infusionspumpe bestehen.The bioreactor 2 has a lower chamber 3, which is delimited by a first housing part 30 and a silicone membrane 6. The lower chamber 3 is filled with air or a suitable gas and has a hose connection 31 to which one is connected Hose a drive unit, for example in the form of a ventilator, an infusion pump or the like is connected. A corresponding drive unit can consist, for example, of a so-called "dual phase control fan" or an infusion pump which can be found in WO 96/25963.
Oberhalb der Silikonmembran 6 befindet sich eine mittlere Kammer 4, die durch ein zweites Gehäuseteil 40, die Silikonmembran 6 und durch das Zell-Gewebe-Konstrukt 1 begrenzt wird. In der mittleren Kammer 4 befindet sich Zellkulturflüssigkeit mit einem Volumen von beispielsweise 370 ml. Unterhalb des Zell-Gewebe-Konstrukts 1 befinden sich zwei Bohrungen 41, 42, die mit Schlauchanschlüssen 43, 44 kommunizieren, die am zweiten Gehäuseteil 40 des Bioreaktors 2 befestigt sind. Die beiden Bohrungen 41, 42 sind diametral zueinander angeordnet und auf die Unterseite des Zell-Gewebe-Konstrukts 1 gerichtet.Above the silicone membrane 6 is a middle chamber 4, which is delimited by a second housing part 40, the silicone membrane 6 and by the cell-tissue construct 1. In the middle chamber 4 there is cell culture liquid with a volume of, for example, 370 ml. Below the cell-tissue construct 1 there are two bores 41, 42 which communicate with hose connections 43, 44 which are fastened to the second housing part 40 of the bioreactor 2 , The two bores 41, 42 are arranged diametrically to one another and directed towards the underside of the cell-tissue construct 1.
Die beiden Schlauchanschlüsse 43, 44 sind gemäß Fig. 8 über Silikonschläuche mit einem Reservoir 15 für Zellkulturflüssigkeit verbunden.8, the two tube connections 43, 44 are connected to a reservoir 15 for cell culture fluid via silicone tubes.
Eine obere Kammer 5 wird durch ein drittes Gehäuseteil 50, einen den Bioreaktor 2 zur Oberseite abschließenden und abdichtenden Deckel 10 und an seiner Unterseite durch das Zell-Gewebe-Konstrukt 1 abgegrenzt. Innerhalb der oberen Kammer 5 ist eine Haltevorrichtung zum Fixieren des Zell-Gewebe-Konstrukts 1 angeordnet, die aus einem zylindrischen Stempel 7 und einer Spannvorrichtung 8, 9 besteht. Der zylindrische StempelAn upper chamber 5 is delimited by a third housing part 50, a cover 10 which closes and seals the bioreactor 2 at the top and on its underside by the cell-tissue construct 1. Arranged within the upper chamber 5 is a holding device for fixing the cell-tissue construct 1, which consists of a cylindrical stamp 7 and a clamping device 8, 9. The cylindrical stamp
7 presst mit seiner kreisförmigen Grundfläche das Zell-Gewebe-Konstrukt 1 gegen den oberen Rand des zweiten Gehäuseteils 40. Der hierfür erforderliche Stempeldruck wird durch eine Rändelschraube 9 erzeugt, die die Deckfläche 71 des zylindrischen Stempels 7 gegen einen am dritten Gehäuseteil 50 des Bioreaktors 2 abgestützten Stützdeckel 8 vorspannt. Zum Fixieren des Anpressdruckes ist eine Kontermutter 90 vorgesehen, die die Stellung der Rändelmutter 9 sichert.7, with its circular base, presses the cell-tissue construct 1 against the upper edge of the second housing part 40. The stamp pressure required for this is generated by a knurled screw 9, which presses the top surface 71 of the cylindrical stamp 7 against one on the third housing part 50 of the bioreactor 2 supported support cover 8 biased. To fix the contact pressure, a lock nut 90 is provided, which secures the position of the knurled nut 9.
In der oberen Kammer 5 befindet sich ebenfalls Zellkulturflüssigkeit mit einem Volumen von beispielsweise 40 ml, deren Zugänglichkeit durch Bohrungen 72 bis 74 bzw. 81 - 83 (Fig. 6 und 7) in der Deckfläche 71 des zylindrischen Stempels 7 bzw. in dem StützdeckelIn the upper chamber 5 there is also cell culture liquid with a volume of, for example, 40 ml, the accessibility of which is through bores 72 to 74 or 81-83 (FIGS. 6 and 7) in the top surface 71 of the cylindrical stamp 7 or in the support cover
8 sowie den vom dritten Gehäuseteil 50 lösbaren, topfförmigen Deckel 10 gewährleistet ist. Die Abdichtung des Innenraums des Bioreaktors 2 zur Einhaltung steriler Bedingungen für das Zell-Gewebe-Konstrukt 1 wird durch einen Silikon-O-Ring 11 an den aufeinanderstoßenden Stirnflächen des zweiten Gehäuseteils 40 und des dritten Gehäuseteils 50, die die mittlere Kammer 4 und obere Kammer 5 begrenzen sowie durch die Silikonmembran 6 gewährleistet.8 and the pot-shaped cover 10 which can be detached from the third housing part 50 is ensured. The sealing of the interior of the bioreactor 2 to maintain sterile conditions for the cell-tissue construct 1 is achieved by a silicone O-ring 11 on the abutting end faces of the second housing part 40 and the third housing part 50, which are the middle chamber 4 and the upper chamber 5 limit and guaranteed by the silicone membrane 6.
Für die Gehäuseteile 30, 40, 50 sowie für den topfförmigen Deckel 10 wird Acryl als Material verwendet und die Anschlussverbindungen sowie Verbindungen der Gehäuseteile werden über Edelstahlschrauben bewirkt.Acrylic is used as the material for the housing parts 30, 40, 50 and for the pot-shaped cover 10, and the connection connections and connections of the housing parts are effected using stainless steel screws.
In die Fig. 6 und 7 sind Draufsichten auf den Stützdeckel 8 sowie die Deckfläche 71 des zylindrischen Stempels 7 mit den darin angeordneten Bohrungen 72 bis 74 bzw. 81 bis 83 zum Austausch von Zellkulturflüssigkeit dargestellt.6 and 7 are top views of the support cover 8 and the top surface 71 of the cylindrical stamp 7 with the bores 72 to 74 and 81 to 83 arranged therein for the exchange of cell culture fluid.
Fig. 8 zeigt einen Versuchsaufbau in schematischer Darstellung mit dem Bioreaktor 2, der zusammen mit dem Reservoir 15 für Zellkulturflüssigkeit und einer Ringleitung 16 aus Silikonschläuchen zur Zufuhr und zum Abfluss von Zellkulturflüssigkeit in einem Inkubator 12 angeordnet sind. Über eine Druckleitung 17 ist der Bioreaktor 2 mit einem Beatmungsgerät 11 als Antriebsaggregat verbunden, das außerhalb des Inkubators 12 angeordnet ist.8 shows a schematic diagram of an experimental setup with the bioreactor 2, which is arranged in an incubator 12 together with the reservoir 15 for cell culture fluid and a ring line 16 made of silicone tubes for supplying and draining cell culture fluid. The bioreactor 2 is connected via a pressure line 17 to a respirator 11 as the drive unit, which is arranged outside the incubator 12.
In die Ringleitung 16, d.h. in den das Reservoir 15 für Zellkulturflüssigkeit mit den Schlauchanschlüssen 43, 44 der mittleren Kammer 4 verbindenden Silikonschläuchen sind Rückschlagventile 13, 14 angeordnet, die eine Fließrichtung der Zellkulturflüssigkeit vorgeben.In the ring line 16, i.e. In the silicone tubes connecting the reservoir 15 for cell culture fluid with the tube connections 43, 44 of the middle chamber 4, check valves 13, 14 are arranged, which prescribe a direction of flow of the cell culture fluid.
In Betrieb weist der Bioreaktor 2 folgende Funktionen auf:In operation, the bioreactor 2 has the following functions:
Im Ruhezustand ist die Silikonmembran 6 infolge der Schwerkraft und der in der mittleren Kammer 4 befindlichen Zellkulturflüssigkeit nach unten, d.h. in die untere Kammer 3 durchgewölbt. Erzeugt das Antriebsaggregat 12 einen Überdruck in der unteren Kammer 3, so bewirkt dieser Überdruck nach dem Prinzip einer Membranpumpe eine Bewegung der Silikonmembran 6 nach oben, d.h. in die mittlere Kammer 4 hinein und damit eine Volumenverkleinerung der mit Zellkulturflüssigkeit gefüllten mittleren Kammer 4. Durch diese Wölbung der Silikonmembran 6 wird gemäß Fig. 1 ein von der mittleren Kammer 4 zur oberen Kammer 5 gerichteter Druck auf das Zell-Gewebe-Konstrukt 1 ausgeübt, so dass sich das Zell-Gewebe-Konstrukt 1 in die obere Kammer 5 hineinwölbt.In the idle state, the silicone membrane 6 is arched downward, ie into the lower chamber 3, due to the force of gravity and the cell culture liquid located in the middle chamber 4. If the drive unit 12 generates an overpressure in the lower chamber 3, this overpressure causes a movement of the membrane pump Silicone membrane 6 upwards, ie into the middle chamber 4 and thus a volume reduction of the middle chamber 4 filled with cell culture liquid. According to FIG. 1, this curvature of the silicone membrane 6 causes a pressure on the cell from the middle chamber 4 to the upper chamber 5 Tissue construct 1 exerted so that the cell-tissue construct 1 bulges into the upper chamber 5.
Gleichzeitig fließt durch den in der mittleren Kammer 4 erzeugten Überdruck überschüssige Zellkulturflüssigkeit über eine der beiden diametral zueinander angeordneten Bohrungen 41, 42 sowie einen der beiden den Bohrungen 41, 42 zugeordneten Schlauchanschlüsse 43, 44 und die daran angeschlossenen Silikonschläuche der Ringleitung 16 in das Reservoir 15 für Zellkulturflüssigkeit ab.At the same time, excess cell culture fluid flows through the excess pressure generated in the middle chamber 4 through one of the two diametrically arranged bores 41, 42 and one of the two tube connections 43, 44 assigned to the bores 41, 42 and the silicone tubes of the ring line 16 connected to them into the reservoir 15 for cell culture fluid.
In der zweiten Pumpphase wird mittels des Antriebsaggregats 12 ein Unterdruck in der unteren Kammer 3 erzeugt und dadurch die Silikonmembran 6 in die untere Kammer 3 hineingezogen. Die dadurch in der mittleren Kammer 4 bewirkte Volumenvergrößerung sorgt dafür, dass Zellkulturflüssigkeit aus dem Reservoir 15 über eine der beiden Bohrungen 41, 42 angesaugt wird. Durch die vorgegebene Flussrichtung und die auf die Unterseite des Zell-Gewebe-Konstrukts 1 gerichteten Bohrungen 41, 42 strömt Zellkulturflüssigkeit an der Unterseite des Zell-Gewebe-Konstrukts 1 bzw. Patch-Gewebes entlang und wölbt das Zell-Gewebe-Konstrukt nach unten in die mittlere Kammer 4 gemäß Fig. 2 durch.In the second pumping phase, a negative pressure is generated in the lower chamber 3 by means of the drive unit 12 and the silicone membrane 6 is thereby drawn into the lower chamber 3. The resulting increase in volume in the middle chamber 4 ensures that cell culture fluid is drawn in from the reservoir 15 via one of the two bores 41, 42. Cell culture fluid flows along the underside of the cell-tissue construct 1 or patch tissue through the predetermined flow direction and the bores 41, 42 directed towards the underside of the cell-tissue construct 1 and bulges the cell-tissue construct downwards the middle chamber 4 according to FIG. 2 by.
Der Zyklus beginnt von neuem, wenn das Antriebsaggregat 12 wieder einen Überdruck in der unteren Kammer 3 erzeugt und dadurch bedingt die Silikonmembran 6 sich in die mittlere Kammer 4 hineinwölbt. Bei diesen Vorgängen wölbt sich das Zell-Gewebe- Konstrukt 1 jeweils in die obere Kammer 5 oder mittlere Kammer 4 durch und wird parallel dazu einem pulsatilen Fluss der Zellkulturflüssigkeit ausgesetzt, die infolge der Rückschlagklappen 13, 14 gemäß Fig. 8 gerichtet an der Unterseite des Zell-Gewebe- Konstrukts 1 entlangströmt. Auf diese Weise wird das Zell-Gewebe-Konstrukt sowohl einer mechanischen (Druck-) Beanspruchung als auch einem pulsatilen Fluss ausgesetzt.The cycle starts again when the drive unit 12 again generates an overpressure in the lower chamber 3 and as a result causes the silicone membrane 6 to bulge into the middle chamber 4. In these processes, the cell-tissue construct 1 bulges into the upper chamber 5 or middle chamber 4 and is exposed in parallel to a pulsatile flow of the cell culture liquid which, as a result of the non-return flaps 13, 14 according to FIG Cell tissue construct 1 flows along. In this way, the cell-tissue construct is exposed to both mechanical (pressure) stress and a pulsatile flow.
Die in der oberen Kammer 5 befindliche Zellkulturflüssigkeit dient der Befeuchtung des Trägermaterials und wird in bestimmten Intervallen über die Bohrungen 72 bis 74 und 81 bis 83 im Stützdeckel 8 bzw. in der Deckfläche 71 des zylindrischen Stempels 7 abgesaugt und ausgetauscht.The cell culture liquid located in the upper chamber 5 serves to moisten the carrier material and is at certain intervals via the bores 72 to 74 and 81 sucked up to 83 in the support cover 8 or in the cover surface 71 of the cylindrical stamp 7 and exchanged.
Durch Einstellung der Frequenz und des Pumpvolumens des Beatmungsgeräts 12 kann die gepumpte Flüssigkeitsmenge der Zellkulturflüssigkeit beliebig variiert werden. φ ^ ^ ^ 4: By adjusting the frequency and the pump volume of the ventilator 12, the amount of fluid pumped into the cell culture fluid can be varied as desired. φ ^ ^ ^ 4:

Claims

Ansprüche Expectations
1. Verfahren zur In-vitro-Herstellung von vitalem, biologischem Ersatzgewebe unter Verwendung von Zellkulturen und einem Trägermaterial,1. Process for the in vitro production of vital, biological replacement tissue using cell cultures and a carrier material,
dadurch gekennzeichnet,characterized,
dass ein aus dem Trägermaterial und den Zellkulturen gebildetes Zell-Gewebe- Konstrukt (1) einer sich ändernden mechanischen Beanspruchung ausgesetzt wird.that a cell-tissue construct (1) formed from the carrier material and the cell cultures is exposed to changing mechanical stress.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Zell-Gewebe- Konstrukt (1) einer sich periodisch ändernden mechanischen Beanspruchung ausgesetzt wird.2. The method according to claim 1, characterized in that the cell-tissue construct (1) is exposed to a periodically changing mechanical stress.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Zell- Gewebe-Konstrukt (1) einer pulsierenden Druckbeanspruchung ausgesetzt wird.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the cell-tissue construct (1) is exposed to a pulsating pressure load.
4. Verfahren nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Zell-Gewebe-Konstrukt (1) der Kombination einer pulsierenden Strömung eines Zellkulturmediums und einer pulsierenden Bewegung ausgesetzt wird.4. The method according to at least one of the preceding claims, characterized in that the cell-tissue construct (1) is exposed to the combination of a pulsating flow of a cell culture medium and a pulsating movement.
5. Verfahren nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die pulsierende Bewegung abwechselnd nach beiden Seiten des Zell-Gewebe-Konstrukts (1) erfolgt. 5. The method according to at least one of the preceding claims, characterized in that the pulsating movement takes place alternately on both sides of the cell-tissue construct (1).
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das waagerecht eingespannte Zell-Gewebe-Konstrukt (1) angehoben und abgesenkt wird. A method according to claim 5, characterized in that the horizontally clamped cell-tissue construct (1) is raised and lowered.
Verfahren nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplitude der vorzugsweise senkrecht zur Oberfläche des Zell-Gewebe-Konstrukts (1) gerichteten pulsierenden Bewegung und die Strömungsgeschwindigkeit des Zellkulturmediums veränderbar sind.Method according to at least one of the preceding claims, characterized in that the amplitude of the pulsating movement, which is preferably directed perpendicular to the surface of the cell-tissue construct (1), and the flow rate of the cell culture medium can be changed.
Verfahren nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche zur Herstellung vitaler und funktionaler Ersatzgewebestücke (Patch-Gewebe) nach dem Prinzip des Tissue-Engineerings unter Verwendung eines resorbierbaren Trägermaterials, das mit vaskulären Zellen besiedelt und in vitro zu einem Zell-Gewebe-Konstrukt zur Bildung einer adäquaten, extrazellulären Matrix konditioniert wird, insbesondere zur Rekonstruktion kardiovaskulärer Strukturen, dadurch gekennzeichnet, dass das Zell-Gewebe-Konstrukt (1) einem das Zell-Gewebe-Konstrukt (1) in wechselnde Richtung pulsierend bewegenden pulsatilen Fluss einer Zellkulturflüssigkeit ausgesetzt wird.Method according to at least one of the preceding claims for the production of vital and functional replacement tissue pieces (patch tissue) according to the principle of tissue engineering using a resorbable carrier material that colonizes with vascular cells and in vitro to form a cell tissue construct to form an adequate one , extracellular matrix is conditioned, in particular for the reconstruction of cardiovascular structures, characterized in that the cell-tissue construct (1) is exposed to a pulsating, pulsating flow of a cell culture fluid that moves the cell-tissue construct (1) in alternating directions.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der pulsatile Fluss sowohl senkrecht als auch im wesentlichen parallel zur Oberfläche des Zell-Gewebe- Konstrukts (1) auf das Zell-Gewebe-Konstrukt (1) einwirkt.A method according to claim 8, characterized in that the pulsatile flow acts both perpendicularly and essentially parallel to the surface of the cell-tissue construct (1) on the cell-tissue construct (1).
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass durch Ausüben eines wechselnden Druckes auf die das Zell-Gewebe-Konstrukt (1) umgebende Zellkulturflüssigkeit sowohl eine Bewegung des Zell-Gewebe-Konstrukts (1) senkrecht zu dessen Oberfläche als auch eine Strömungsbewegung der Zellkulturflüssigkeit entlang der Oberfläche des Zell-Gewebe-Konstrukts (1) erzeugt wird. 10. The method according to claim 8 or 9, characterized in that by exerting an alternating pressure on the cell-tissue construct (1) surrounding cell culture fluid, both a movement of the cell-tissue construct (1) perpendicular to its surface and one Flow movement of the cell culture fluid along the surface of the cell-tissue construct (1) is generated.
11. Verfahren nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass eine Strömungsrichtung der am Zell-Gewebe-Konstrukt (1) vorbeibewegten Zellkulturflüssigkeit vorgegeben wird.11. The method according to at least one of the preceding claims 8 to 10, characterized in that a flow direction of the cell-tissue construct (1) moving past cell culture fluid is specified.
12. Verfahren nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellkulturflüssigkeit an der einen Oberfläche des Zell- Gewebe-Konstrukts (1) entlangströmt und dass die andere Oberfläche des Zell- Gewebe-Konstrukts (1) bzw. das Gewebegerüst mit Zellkulturflüssigkeit befeuchtet wird.12. The method according to at least one of the preceding claims, characterized in that the cell culture fluid flows along one surface of the cell-tissue construct (1) and that the other surface of the cell-tissue construct (1) or the tissue structure with cell culture fluid is moistened.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die das Gewebegerüst befeuchtende Zellkulturflüssigkeit in vorgebbaren Intervallen abgesaugt und ausgetauscht wird.13. The method according to claim 12, characterized in that the tissue tissue moistening cell culture liquid is aspirated and exchanged at predetermined intervals.
14. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch einen Bioreaktor (2) zur Aufnahme des Zell-Gewebe-Konstrukts (1), ein mit dem Bioreaktor (2) verbundenes und auf das Zellkulturmedium einwirkendes Antriebsaggregat (6, 12) und ein mit dem Bioreaktor (2) über eine Zufuhr- und eine Abflussleitung (16,17) verbundenes Reservoir (15) für das Zellkulturmedium.14. Device for carrying out the method according to at least one of the preceding claims, characterized by a bioreactor (2) for receiving the cell-tissue construct (1), a drive unit (6) connected to the bioreactor (2) and acting on the cell culture medium. 12) and a reservoir (15) for the cell culture medium which is connected to the bioreactor (2) via a feed and an outlet line (16, 17).
15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Antriebsaggregat (6, 12) mittelbar oder unmittelbar einen wechselnden Druck auf das Zell-Gewebe-Konstrukt (1) sowie auf das Zellkulturmedium zur Erzeugung einer mechanischen Wechselbewegung des Zell-Gewebe-Konstrukts (1) und eines pulsatilen Flusses des Zellkulturmediums ausübt. 15. The apparatus according to claim 14, characterized in that the drive unit (6, 12) indirectly or directly an alternating pressure on the cell-tissue construct (1) and on the cell culture medium to produce a mechanical alternating movement of the cell-tissue construct ( 1) and a pulsatile flow of the cell culture medium.
16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Antriebsaggregat aus einer im wesentlichen parallel zur Ausrichtung des Zell- Gewebe-Konstrukts (1) angeordneten Membranpumpe (6, 12) besteht, wobei sich zwischen der Oberfläche des Zell-Gewebe-Konstrukts (1) und der Membranpumpe das Zellkulturmedium befindet.16. The apparatus according to claim 15, characterized in that the drive unit consists of a substantially parallel to the alignment of the cell-tissue construct (1) arranged membrane pump (6, 12), wherein between the surface of the cell-tissue construct ( 1) and the membrane pump is the cell culture medium.
17. Vorrichtung nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche 14 bis 16, gekennzeichnet durch eine das Zell-Gewebe-Konstrukt (1) an seinem Randbereich einspannende Haltevorrichtung (7, 8) des Bioreaktors (2) und eine beidseitige Beaufschlagung des Zell-Gewebe-Konstrukts (1) mit dem Zellkulturmedium.17. The device according to at least one of the preceding claims 14 to 16, characterized by a holding device (7, 8) of the bioreactor (2) which clamps the cell-tissue construct (1) at its edge region and a loading on both sides of the cell-tissue construct (1) with the cell culture medium.
18. Vorrichtung nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Bioreaktor (2) mehrere übereinander angeordnete Kammern (3, 4, 5) aufweist, von denen eine untere Kammer (3) die Membranpumpe (6, 12) bildet, eine mittlere Kammer (4) von der unteren Kammer (3) durch die Membran (6) der Membranpumpe (6, 12) und von einer oberen Kammer (5) durch das Zell-Gewebe-Konstrukt (1) getrennt und über die Zufuhr- und Abflussleitung (16, 17) mit dem Reservoir (15) für das Zellkulturmedium verbunden ist und dass die obere Kammer (5) die das Zell-Gewebe-Konstrukt (1) einspannende Haltevorrichtung (7, 8) sowie Zellkulturmedium enthält.18. The device according to at least one of the preceding claims 14 to 17, characterized in that the bioreactor (2) has a plurality of chambers (3, 4, 5) arranged one above the other, of which a lower chamber (3) the membrane pump (6, 12) forms a middle chamber (4) from the lower chamber (3) through the membrane (6) of the membrane pump (6, 12) and from an upper chamber (5) through the cell-tissue construct (1) and separated by the The supply and drain line (16, 17) is connected to the reservoir (15) for the cell culture medium and that the upper chamber (5) contains the holding device (7, 8) that clamps the cell-tissue construct (1) and cell culture medium.
19. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die mittlere Klammer (4) zwei diametral zueinander angeordnete Schlauchanschlüsse (43, 44) aufweist, dass Bohrungen (41, 42) von den Schlauchanschlüssen (43, 44) zu dem Zell-Gewebe-Konstrukt (1) führen und dass zumindest in der Zufuhr- oder der Abflussleitung (16, 17) ein Rückschlagventil (13, 14) angeordnet ist.19. The device according to claim 18, characterized in that the middle clamp (4) has two diametrically arranged hose connections (43, 44), that bores (41, 42) from the hose connections (43, 44) to the cell tissue. Construct (1) and that a check valve (13, 14) is arranged at least in the supply or drain line (16, 17).
20. Vorrichtung nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche 14 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Membranpumpe (6, 12) aus der die untere Kammer (3) von der mittleren Kammer (4) trennenden Membran (6) und einem mit der unteren Kammer (3) über eine Druckleitung (19) verbundenen Beatmungsgerät (12), einer Infusionspumpe oder dergleichen zur periodischen Erzeugung eines Über- und Unterdrucks in der unteren Kammer (3) besteht.20. The device according to at least one of the preceding claims 14 to 19, characterized in that the diaphragm pump (6, 12) consists of the diaphragm (6) separating the lower chamber (3) from the middle chamber (4) and a respirator (12) connected to the lower chamber (3) via a pressure line (19) ), an infusion pump or the like for periodically generating an overpressure and underpressure in the lower chamber (3).
21. Vorrichtung nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche 14 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Haltevorrichtung (7, 8) aus einem zylindrischen Stempel (7), dessen kreisförmige Grundfläche (70) das Zell-Gewebe-Konstrukt (1) gegen einen oberen Rand der mittleren Kammer (4) drückt, einem Stützdeckel (8), der mit einem Gehäuseteil (50) des Bioreaktors (2) verbunden ist, und einem Stellelement (9) besteht, das die der kreisförmigen Grundfläche (70) des zylindrischen Stempels (7) entgegengesetzte Deckfläche (71) am Stützdeckel (8) abstützt.21. The device according to at least one of the preceding claims 14 to 20, characterized in that the holding device (7, 8) from a cylindrical stamp (7), the circular base (70) of the cell-tissue construct (1) against an upper Presses edge of the middle chamber (4), a support cover (8), which is connected to a housing part (50) of the bioreactor (2), and an actuating element (9), which the circular base (70) of the cylindrical punch ( 7) supports the opposite cover surface (71) on the support cover (8).
22. Vorrichtung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Deckfläche (71) des zylindrischen Stempels (7) und der Stützdeckel (8) mindestens eine Bohrung (72 -74; 81 - 83) aufweisen und dass ein über den Stützdeckel (8) greifender und mit dem Gehäuseteil (50) des Bioreaktors (2) verbindbarer zylinder- oder topfförmiger Deckel (10) die obere Kammer (5) abschließt.22. The apparatus according to claim 21, characterized in that the cover surface (71) of the cylindrical plunger (7) and the support cover (8) have at least one bore (72-74; 81-83) and that one over the support cover (8) gripping and with the housing part (50) of the bioreactor (2) connectable cylindrical or pot-shaped cover (10) closes the upper chamber (5).
23. Vorrichtung nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche 14 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass der Bioreaktor (2) aus einem durchsichtigen Material, vorzugsweise aus Acryl, besteht.23. The device according to at least one of the preceding claims 14 to 22, characterized in that the bioreactor (2) consists of a transparent material, preferably of acrylic.
24. Vorrichtung nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche 14 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran als Silikonmembran (6) ausgebildet ist. 24. The device according to at least one of the preceding claims 14 to 23, characterized in that the membrane is designed as a silicone membrane (6).
25. Vorrichtung nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche 14 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass der Bioreaktor (2), das Reservoir (15) für das Zellkulturmedium und die Verbindungsleitungen (16, 17) steril abgedichtet sind.25. The device according to at least one of the preceding claims 14 to 24, characterized in that the bioreactor (2), the reservoir (15) for the cell culture medium and the connecting lines (16, 17) are sterile sealed.
26. Vorrichtung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass der Bioreaktor (2), das Reservoir (15) für das Zellkulturmedium und die Verbindungsleitungen (16, 17) in einem Inkubator (18) angeordnet und der Bioreaktor (2) über die Druckleitung (19) mit dem außerhalb des Inkubators (18) angeordneten Beatmungsgerät (12), der Infusionspumpe oder dgl. verbunden ist. 26. The device according to claim 25, characterized in that the bioreactor (2), the reservoir (15) for the cell culture medium and the connecting lines (16, 17) are arranged in an incubator (18) and the bioreactor (2) via the pressure line ( 19) is connected to the ventilator (12) arranged outside the incubator (18), the infusion pump or the like.
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