EP1317281A1 - Use of lipopeptides for immunotherapy of hiv-positive subjects - Google Patents

Use of lipopeptides for immunotherapy of hiv-positive subjects

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EP1317281A1
EP1317281A1 EP01967441A EP01967441A EP1317281A1 EP 1317281 A1 EP1317281 A1 EP 1317281A1 EP 01967441 A EP01967441 A EP 01967441A EP 01967441 A EP01967441 A EP 01967441A EP 1317281 A1 EP1317281 A1 EP 1317281A1
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EP
European Patent Office
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hiv
lipopeptides
present
viral
chain
Prior art date
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Ceased
Application number
EP01967441A
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German (de)
French (fr)
Inventor
Pierre Caudrelier
Rapha[Lle El Habib
Michel Klein
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Sanofi Pasteur SA
Original Assignee
Aventis Pasteur SA
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Publication date
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Priority claimed from FR0102846A external-priority patent/FR2821556B1/en
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    • C12N2740/16334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention describes a method of treating subjects infected with HIV and relates more particularly to the use of lipopeptides in immunotherapy in subjects HIV + under anti-retroviral therapy.
  • HIV envelope glycoprotein the poxviruses expressing epitopes derived from HIV structural or regulatory proteins as well as lipopeptides.
  • lipopeptides comprising a peptide part having between 10 and 40 amino acids approximately and comprising at least one antigenic determinant, said lipopeptide also comprising one or more chains derived from fatty acids comprising from 10 to 20 carbon atoms, and / or one or more steroid groups modified and coupled to ⁇ f ⁇ IH2 or ⁇ NH2 functions of said amino acids. Based on an experiment carried out in mice, the authors indicate that said lipopeptides can be used to induce CTL against any antigenic determinant of any pathogenic agent including HIV.
  • lipopeptides according to the invention can be used to control at least temporarily the viremia in HIV + subjects on anti-retroviral therapy after stopping anti-retroviral treatment as described below. .
  • HIV-related infections Several methods of treating HIV have been proposed to date.
  • the only method of treating HIV-related infections that is currently used is a method based on the administration of a combination anti-retroviral medication known as HAART.
  • HAART a combination anti-retroviral medication
  • antiretroviral therapy is far from an ideal solution.
  • this type of therapy requires a degree of patient involvement which is often difficult to obtain. Failure to adhere to treatment results in treatment failure and can facilitate the emergence of viruses resistant to antiviral products.
  • the present invention therefore relates to the use of lipopeptides for the preparation of a vaccine for the control of viral rebound after stopping antiretroviral therapy in HIV + subjects with a viral load less than or equal to 10,000 copies per ml of plasma and a CD4 + level greater than or equal to 300 cells per mm 3 , in which the lipopeptides consist of a peptide chain of 7 to 100 amino acids comprising at least one CTL epitope of an HIV protein, linked by covalent bond to a lipid chain comprising from 8 to 20 carbon atoms.
  • the HIV + subjects have a viral load less than or equal to 50 copies per ml of plasma and a CD4 count greater than or equal to 500 cells per mm3.
  • the lipopeptides consist of a lipid chain comprising 16 carbon atoms. According to another embodiment, the lipopeptides correspond to a mixture comprising 5 different lipopeptides having CTL epitopes derived from the Nef, Gag and Pol proteins of HIV.
  • VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLK ⁇ (Palm) -NH2 HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKLK ⁇ (P I m) - N H 2 EKIRLRPGGKKKYKLKVIHK ⁇ (Palm) -NH2 NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDK ⁇ (Palm) -NH 2
  • the mixture further comprises a lipopeptide whose peptide chain consists of a ubiquitous helper epitope.
  • the lipopeptides are administered intramuscularly at a dose of 50 ⁇ g to 3 mg of total lipopeptides, preferably in 4 doses respectively on D0, 1 month, 2 months and 3 months.
  • the lipopeptides are co-administered with a recombinant attenuated virus vaccine.
  • Said recombinant attenuated virus is preferably an ALVAC and in particular an ALVAC vCP1452 or vCP1433.
  • an immunomodulator preferably TIL2 is administered sequentially or simultaneously.
  • FIG. 1 gives a schematic representation of the lipopeptides constituting a mixture according to the invention.
  • ⁇ (Palm) -NH2 means that a palmitic acid is linked to the ⁇ NH2 function of lysine, the COOH-terminal end of the lipid is therefore amidated.
  • Lysine is located at the C-terminus of the peptide chain.
  • the peptide chain is represented according to the one-letter code in which:
  • A Ala; D: Asp; E: Glu; F: Phe: G: Gly; H: His; I: Ile; K: Lys: L: Leu; M: Met; N: Asn; P: Pro; Q: Gin; A: Arg; S: Ser; T: Thr; V: Val; W: Trp; Y: Tyr.
  • the vaccination method according to the present invention is useful for the treatment of subjects infected with HIV subjected to antiretroviral therapy and having a viral load less than 10,000, preferably less than 5,000, in particular less than 1,000 viral copies / ml of plasma and a cell count T CD4 + greater than 300 cells / ml, preferably greater than 500 cells / ml. Patients preferably have a viral load of less than 50 viral copies / ml and a CD4 + count greater than 500.
  • the concentrations of HIV RNA in the plasma can be quantified either by amplification of the targets (e.g. quantitative polymerase chain reaction [RT-PCR], Amplicor HIV Monitor test, Roche Molecular Systems), or by l amplification of nucleic acid sequences, [NASBA®], NucliSens TM HIV-1 QT assay, Organon Teknika).
  • targets e.g. quantitative polymerase chain reaction [RT-PCR], Amplicor HIV Monitor test, Roche Molecular Systems
  • NASBA® NucliSens TM HIV-1 QT assay, Organon Teknika
  • the test which has been used in the context of the present invention is the Amplicor HIV Monitor test, Roche Molecular Systems.
  • HIV + subjects who have lost their CD4 + and / or CD8 + cellular responses against HIV antigens can also be vaccinated by the method according to the invention.
  • the vaccination method according to the present invention makes it possible to control the viral rebound in patients infected with HIV after stopping antiretroviral therapy.
  • Control of viral rebound means in the context of the present invention that after stopping antiretroviral therapy, the viral rebound which appears is delayed, absent, or that the viral load present after the viral rebound ("post -rebound set point ”) is checked.
  • the viral rebound appears more than 2 months and in particular more than
  • the post-rebound set point represents the plasma viral load which is present in the absence of antiretroviral therapy after the viral rebound.
  • the post-rebound viral load is considered to be controlled when it is maintained at values lower than the resumption values of antiretroviral therapy as defined in the official recommendations published in the different countries and this for a period of at least 1 month, preferably at least 2 months, in particular at least 6 months.
  • These resumption values for anti-retroviral therapy are typically 10,000 to 50,000 copies of RNA / ml of plasma.
  • the post-rebound viral load is maintained at values lower than 10 000 viral copies / ml, preferably lower than 5000 viral copies / ml in particular lower than 1000 viral copies / ml of plasma.
  • the present invention therefore provides a method which has the advantage of allowing at least temporary, and preferably permanent, cessation of antiretroviral therapy in HIV + subjects by allowing control of the phenomenon of viral rebound generally associated with such a stoppage.
  • CD4 + response is understood to mean the capacity of CD4 + T cells to be stimulated or activated by the vaccine according to the invention.
  • CD4 + responses can be measured by the various methods well known to those skilled in the art which have been described above.
  • lipopeptide in the context of the present invention means at least one compound consisting of a peptide chain comprising from 7 to 100 amino acids, preferably from 10 to 50 amino acids and more particularly from 20 to 35 amino acids and a lipid chain comprising from 8 to 20 carbon atoms, preferably from 14 to 18 carbon atoms and in particular 16 carbon atoms.
  • the lipopeptides according to the present invention preferably correspond to a mixture of at least two different lipopeptides.
  • the peptide chain of the lipopeptides according to the present invention comprises at least one CTL epitope of an HIV protein and may also include one or more T helper epitopes of an HIV protein. Polyepitopic peptide chains comprising several CTL epitopes are particularly suitable.
  • CTL epitope of an HIV protein is understood to mean, in the context of the present invention, the sequences derived from HIV structural and regulatory proteins which induce a response mediated by CD8 + cells of the immune system, such as epitopes. from the proteins Env, Gag, Pol, Tat and Nef. Any CTL epitope of HIV as defined above can be used in the context of the present invention. Such epitopes can be identified by using the algorithms described to do this in the literature. As non-limiting examples of CTL epitopes which can be used in the lipopeptides according to the invention, mention may be made of the epitopes listed in Table 4 of application WO99 / 27954.
  • the epitopes present in the lipopeptides according to the invention can come from a single strain of HIV or preferably from different strains of HIV, preferably from strains of primary isolates. These epitopes are in the case of the use of a single strain originating from the conserved regions of the HIV genome.
  • helper T epitope of HIV is intended to mean the sequences derived from proteins of structure and regulation of HIV that induce an auxiliary response mediated by CD4 cells of the immune system. Any auxiliary T epitope corresponding to the above definition can be used in the context of the present invention.
  • the lipid chain is saturated or unsaturated, linear or branched, and contains from 8 to 20 carbon atoms. It is preferably linear and saturated.
  • the lipid chain is a palmitic acid.
  • the lipid chain is linked by covalent bond at the C-terminal or at the N-terminal of the peptic chain directly or via one or more amino acid (s) selected preferably from the group consisting of lysine, lysineamide, cysteine, serine, threonine. Preferably via a single amino acid corresponding to a lysine, a lysineamide or a cysteine.
  • the COOH function of the fatty acid can be linked directly to the ⁇ NH2 or ⁇ NH2 function at the N-terminal of the peptide chain by an amide bond.
  • the lipid chain is linked via an amino acid, preferably an N-terminal or C-terminal lysine of the peptide chain by amide bonds.
  • an amino acid preferably an N-terminal or C-terminal lysine of the peptide chain by amide bonds.
  • said link is advantageously carried out via a lysineamide residue, which simplifies the process of peptide synthesis.
  • the lipid chain derives from an alkyl halide as defined above, its bonding to the peptide chain can be carried out in C-terminal or in N-terminal, preferably via a cysteine by a thioether bond.
  • the present invention therefore relates to the administration of a composition comprising at least the lipopeptide as defined above and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.
  • the composition administered comprises at least two different lipopeptides and in particular at least 5 different lipopeptides.
  • the lipopeptides contained in such a mixture differ in their peptide chain, each lipopeptide comprising at least one CTL epitope which is different from the CTL epitope (s) present on the other lipopeptides of the mixture.
  • the lipopeptides present in the mixture can also differ in their lipid chain.
  • all the lipopeptides consist of the same lipid chain.
  • the lipid chain is a C16 chain.
  • the lipid chain derives from a palmitic acid which is linked via a lysine or lysineamide residue on one of the ends of the peptide chain.
  • the lipopeptides according to the present invention can be administered by any conventional route usually used in the field of vaccines, such as the parenteral route (intradermal, intramuscular, subcutaneous, etc.).
  • the lipopeptides according to the invention are preferably administered by the intramuscular route.
  • the administration can be carried out by the injection of a single dose or of repeated doses, for example and preferably in 4 doses on D0, at 1 month, at 2 months and 3 months.
  • Booster injections may be given preferably every three months.
  • any plasmid vector containing regulatory elements of eukaryotic viruses can be used as a eukaryotic expression vector.
  • Any vector can be used which allows the expression of proteins under the control of the SV40 “early” or “late” promoter, the metallothionein promoter, the human cytomegalovirus, the murine mammary tumor virus, the Rous sarcoma virus, from the promoter of the polyhedrine, or other promoters effective for expression in eukaryotic cells.
  • the ALVAC vCP 1433 or 1452 will preferably be used.
  • the structure of these two ALVACs as well as their manufacturing process are described in detail in patent US5990091, which will be referred to for a complete description of these.
  • Anti-retroviral therapy is preferably stopped about 4 weeks after the last lipopeptide injection. If the immunotherapy by administration of lipopeptides is followed by a treatment with NL2, preferably a treatment comprising 5 courses, the anti-retroviral therapy is stopped approximately 8 weeks after the last course, or approximately 28 weeks after the last lipopeptide injection in the case of a dosage regimen comprising 4 injections (D0, 1 month, 2 months and 3 months).
  • the solution is reconstituted by adding 1 ml of a 5% glucose solution (W / V) and buffered or not.
  • composition thus obtained comprises 2.5 mg of total lipopeptides per ml.
  • the lipopeptide TT830-846 consists of a C16 lipid chain derived from a palmitic acid, linked at the C-Terminal of the peptide chain and synthesized according to the synthesis method described above for the other lipopeptides.
  • the N-terminal end is acetylated, this in order to avoid the cyclization of glutamine (Q) into pyroGlu.
  • the induction of an HIV-specific cytotoxic response is demonstrated by a method for measuring intracellular INFgamma (in FACS) or secreted (ELISPOT).
  • the proliferation of CD4 + T lymphocytes against HIV is measured by culturing the cells in the presence of HIV antigens and by measuring the incorporation of tritiated thymidine after 7 days of culture.
  • the CD4 cells are purified on magnetic beads and the proliferation test is carried out on this subpopulation thus purified.

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Abstract

The invention concerns the use of lipopeptides for preparing a vaccine for controlling viral rebound in HIV-positive subjects undergoing anti-retroviral therapy exhibiting a viral load of not more than 10000 copies per ml of plasma and a rate of CD4+ not less than 300 cells per mm3, wherein the lipopeptides consist of a peptide chain of 7 to 100 amino acids comprising at least a CTL epitope of a HIV protein, covalently bound to a lipid chain comprising 8 to 20 carbon atoms.

Description

Utilisation de lipopeptides pour l'immunothérapie des sujets VIH+ Use of lipopeptides for immunotherapy of HIV + subjects
La présente invention décrit une méthode de traitement des sujets infectés par le VIH et concerne plus particulièrement l'utilisation de lipopeptides en immunothérapie chez les sujets VIH+ sous thérapie anti-rétrovirale.The present invention describes a method of treating subjects infected with HIV and relates more particularly to the use of lipopeptides in immunotherapy in subjects HIV + under anti-retroviral therapy.
Ces travaux ont été cofinancés par l'ANRS.This work was co-financed by the ANRS.
La grande majorité des études réalisées sur le SIDA a pour objet de mettre au point une méthode prophylactique visant à protéger les individus contre une infection par le VIH. De nombreux antigènes ont été proposés à cette fin. On peut citer à titre d'exemple: la glycoprotéine d'enveloppe du VIH, les poxvirus exprimant des épitopes dérivant de protéines de structure ou de régulation du VIH ainsi que des lipopeptides.The vast majority of studies done on AIDS are aimed at developing a prophylactic method aimed at protecting individuals against HIV infection. Many antigens have been proposed for this purpose. By way of example, mention may be made of: the HIV envelope glycoprotein, the poxviruses expressing epitopes derived from HIV structural or regulatory proteins as well as lipopeptides.
L'utilisation de lipopeptides a été proposée comme stratégie anti-SIDA en particulier dans FR9015870. Ce document décrit des lipopeptides comprenant une partie peptidique ayant entre 10 et 40 acides aminés environ et comportant au moins un déterminant antigénique, ledit lipopeptide comprenant également une ou plusieurs chaînes dérivées d'acides gras comportant de 10 à 20 atomes de carbone, et/ou un ou plusieurs groupements stéroïdes modifiés et couplés sur des fonctions αf\IH2 ou εNH2 desdits acides aminés. Sur la base d'une expérience réalisée chez la souris, les auteurs indiquent que lesdits lipopeptides peuvent être utilisés pour induire des CTL contre tout déterminant antigénique de tout agent pathogène incluant le VIH.The use of lipopeptides has been proposed as an anti-AIDS strategy, in particular in FR9015870. This document describes lipopeptides comprising a peptide part having between 10 and 40 amino acids approximately and comprising at least one antigenic determinant, said lipopeptide also comprising one or more chains derived from fatty acids comprising from 10 to 20 carbon atoms, and / or one or more steroid groups modified and coupled to αf \ IH2 or εNH2 functions of said amino acids. Based on an experiment carried out in mice, the authors indicate that said lipopeptides can be used to induce CTL against any antigenic determinant of any pathogenic agent including HIV.
La fabrication de micelles mixtes ou micro-agrégats contenant au moins deux lipopeptides, l'un comprenant un épitope CTL, le deuxième comprenant un épitope T auxiliaire et leur utilisation pour induire une réponse immunitaire est décrite dans WO99/27954. Selon ce document, cette formulation permet d'induire une réponse de meilleure qualité par l'adjonction d'une réponse T auxiliaire.The manufacture of mixed micelles or micro-aggregates containing at least two lipopeptides, one comprising a CTL epitope, the second comprising a helper T epitope and their use for inducing an immune response is described in WO99 / 27954. According to this document, this formulation makes it possible to induce a better quality response by adding an auxiliary T response.
Aucun de ces deux documents ne décrit ni ne suggère que les lipopeptides selon l'invention peuvent être utilisés pour contrôler au moins temporairement la virémie chez les sujets VIH+ sous thérapie anti-rétrovirale après arrêt du traitement anti-rétroviral comme cela est décrit ci-dessous.Neither of these two documents describes or suggests that the lipopeptides according to the invention can be used to control at least temporarily the viremia in HIV + subjects on anti-retroviral therapy after stopping anti-retroviral treatment as described below. .
Plusieurs méthodes de traitement du VIH ont été proposées à ce jour. La seule méthode de traitement des infections liées au VIH qui est utilisée à l'heure actuelle correspond à une méthode basée sur l'administration d'une association de médicaments anti-rétroviraux connue sous le nom de multithérapie anti- rétrovirale. Bien que représentant une avancée considérable dans le traitement du SIDA, la thérapie anti-rétrovirale est loin d'être une solution idéale. Outre les effets secondaires qui sont importants, ce type de thérapie nécessite un degré de participation du malade qu'il est souvent difficile d'obtenir. La non adhérence au traitement se traduit par un échec du traitement et peut faciliter l'émergence de virus résistant aux produits antiviraux.Several methods of treating HIV have been proposed to date. The only method of treating HIV-related infections that is currently used is a method based on the administration of a combination anti-retroviral medication known as HAART. Although it represents a considerable advance in the treatment of AIDS, antiretroviral therapy is far from an ideal solution. In addition to the side effects which are important, this type of therapy requires a degree of patient involvement which is often difficult to obtain. Failure to adhere to treatment results in treatment failure and can facilitate the emergence of viruses resistant to antiviral products.
Différentes stratégies thérapeutiques ont donc été développées comprenant des interruptions intermittentes de la thérapie anti-rétrovirale ainsi que l'utilisation d'immunomodulateurs de type IL2.Different therapeutic strategies have therefore been developed including intermittent interruptions of anti-retroviral therapy as well as the use of IL2-type immunomodulators.
Aucune des stratégies proposées à ce jour n'a apportée de solution satisfaisante. Il existe donc un besoin de mise en place d'une méthode de traitement des sujets VIH+ qui ne présente pas les inconvénients des méthodes proposées jusqu'à présent. De plus, toute stratégie thérapeutique qui permettrait de limiter la durée de la thérapie anti-rétrovirale est hautement souhaitable.None of the strategies proposed to date have provided a satisfactory solution. There is therefore a need to set up a method for treating HIV + subjects which does not have the drawbacks of the methods proposed so far. In addition, any therapeutic strategy that would limit the duration of antiretroviral therapy is highly desirable.
Le déposant a mis en évidence de façon surprenante que après l'infection par le VIH, la thérapie anti-rétrovirale peut être stoppée par l'administration de lipopeptides tels que définis ci-dessous qui induisent des réponses cellulaires CD4+ et CD8+ spécifiques du VIH. Ces réponses cellulaires maintiennent la charge virale à des valeurs faibles et contrôlent le rebond viral après l'arrêt de la thérapie anti-rétrovirale.The applicant has surprisingly demonstrated that after HIV infection, antiretroviral therapy can be stopped by the administration of lipopeptides as defined below which induce cellular CD4 + and CD8 + responses specific to HIV. These cellular responses keep the viral load at low values and control the viral rebound after stopping antiretroviral therapy.
La présente invention a donc pour objet l'utilisation de lipopeptides pour la préparation d'un vaccin pour le contrôle du rebond viral après arrêt de la thérapie anti-rétrovirale chez les sujets VIH+ présentant une charge virale inférieure ou égale à 10000 copies par ml de plasma et un taux de CD4+ supérieur ou égal à 300 cellules par mm3, dans laquelle les lipopeptides sont constitués d'une chaîne peptidique de 7 à 100 acides aminés comprenant au moins un épitope CTL d'une protéine du VIH, liée par liaison covalente à une chaîne lipidique comprenant de 8 à 20 atomes de carbone. Selon un autre mode de réalisation, les sujets VIH+ présentent une charge virale inférieure ou égale à 50 copies par ml de plasma et un taux de CD4 supérieur ou égal à 500 cellules par mm3.The present invention therefore relates to the use of lipopeptides for the preparation of a vaccine for the control of viral rebound after stopping antiretroviral therapy in HIV + subjects with a viral load less than or equal to 10,000 copies per ml of plasma and a CD4 + level greater than or equal to 300 cells per mm 3 , in which the lipopeptides consist of a peptide chain of 7 to 100 amino acids comprising at least one CTL epitope of an HIV protein, linked by covalent bond to a lipid chain comprising from 8 to 20 carbon atoms. According to another embodiment, the HIV + subjects have a viral load less than or equal to 50 copies per ml of plasma and a CD4 count greater than or equal to 500 cells per mm3.
Selon un mode de réalisation les lipopeptides sont constitués d'une chaîne lipidique comprenant 16 atomes de carbone. Selon un autre mode de réalisation, les lipopeptides correspondent à un mélange comprenant 5 lipopeptides différents présentant des épitopes CTL issus des protéines Nef, Gag et Pol du VIH.According to one embodiment, the lipopeptides consist of a lipid chain comprising 16 carbon atoms. According to another embodiment, the lipopeptides correspond to a mixture comprising 5 different lipopeptides having CTL epitopes derived from the Nef, Gag and Pol proteins of HIV.
Selon un mode de réalisation spécifique, le mélange de lipopeptides comprend les lipopeptides suivants:According to a specific embodiment, the mixture of lipopeptides comprises the following lipopeptides:
VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLKε(Palm)-NH2 HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKLKε( P a I m ) - N H 2 EKIRLRPGGKKKYKLKVIHKε(Palm)-NH2 NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDKε(Palm)-NH2 A l F Q S S M T K I L E P F R K Q N P D I V I Y Q Y M D D L Y K ε (Palm)-NH2.VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLKε (Palm) -NH2 HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKLKε (P I m) - N H 2 EKIRLRPGGKKKYKLKVIHKε (Palm) -NH2 NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDKε (Palm) -NH 2 A l F Q S S M T K I L E P F R K Q N P D I V I Y Q Y M D D L Y K ε (Palm) -NH2.
Selon un mode de réalisation spécifique le mélange comprend en outre un lipopeptide dont la chaîne peptidique est constituée d'un épitope helper ubiquitaire.According to a specific embodiment, the mixture further comprises a lipopeptide whose peptide chain consists of a ubiquitous helper epitope.
Selon un mode de réalisation les lipopeptides sont administrés par voie intramusculaire à une dose de 50 μg à 3 mg de lipopeptides totaux, de préférence en 4 doses respectivement à J0, 1 mois, 2 mois et 3 mois.According to one embodiment, the lipopeptides are administered intramuscularly at a dose of 50 μg to 3 mg of total lipopeptides, preferably in 4 doses respectively on D0, 1 month, 2 months and 3 months.
Selon un autre mode de réalisation, les lipopeptides sont co-administrés avec un vaccin à virus atténué recombinant. Ledit virus atténué recombinant est de préférence un ALVAC et en particulier un ALVAC vCP1452 ou vCP1433.According to another embodiment, the lipopeptides are co-administered with a recombinant attenuated virus vaccine. Said recombinant attenuated virus is preferably an ALVAC and in particular an ALVAC vCP1452 or vCP1433.
Selon un autre mode de réalisation, un immunomodulateur, de préférence de TIL2 est administré de façon séquentielle ou simultanée.According to another embodiment, an immunomodulator, preferably TIL2, is administered sequentially or simultaneously.
Les autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront dans la description détaillée qui suit par référence à la figure 1 qui donne une représentation schématique des lipopeptides constitutifs d'un mélange selon l'invention. Dans la figure 1 ε(Palm)-NH2 signifie qu'un acide palmitique est lié sur la fonction εNH2 de la lysine, l'extrémité COOH-terminale du lipide est donc amidée. La lysine est située à l'extrémité C-terminale de la chaîne peptidique. La chaîne peptidique est représentée selon le code à une lettre dans lequel :The other characteristics and advantages of the present invention will appear in the detailed description which follows with reference to FIG. 1 which gives a schematic representation of the lipopeptides constituting a mixture according to the invention. In Figure 1 ε (Palm) -NH2 means that a palmitic acid is linked to the εNH2 function of lysine, the COOH-terminal end of the lipid is therefore amidated. Lysine is located at the C-terminus of the peptide chain. The peptide chain is represented according to the one-letter code in which:
A : Ala ; D : Asp ; E : Glu ; F : Phe : G : Gly ; H : His ; I : Ile ; K : Lys : L : Leu ; M : Met ; N : Asn ; P : Pro ; Q : Gin ; R : Arg ; S : Ser ; T : Thr ; V : Val ; W : Trp ; Y : Tyr.A: Ala; D: Asp; E: Glu; F: Phe: G: Gly; H: His; I: Ile; K: Lys: L: Leu; M: Met; N: Asn; P: Pro; Q: Gin; A: Arg; S: Ser; T: Thr; V: Val; W: Trp; Y: Tyr.
La méthode de vaccination selon la présente invention est utile pour le traitement des sujets infectés par le HIV soumis à une thérapie anti-rétrovirale et ayant une charge virale inférieure à 10000, de préférence inférieure à 5000, en particulier inférieure à 1000 copies virales/ml de plasma et un taux de cellules T CD4+ supérieur à 300 cellules/ml, de préférence supérieur à 500 cellules/ml. Les patients présentent de préférence une charge virale inférieure à 50 copies virales/ml et un taux de CD4+ supérieur à 500.The vaccination method according to the present invention is useful for the treatment of subjects infected with HIV subjected to antiretroviral therapy and having a viral load less than 10,000, preferably less than 5,000, in particular less than 1,000 viral copies / ml of plasma and a cell count T CD4 + greater than 300 cells / ml, preferably greater than 500 cells / ml. Patients preferably have a viral load of less than 50 viral copies / ml and a CD4 + count greater than 500.
La charge virale exprimée par le nombre de copies d'ARN/ml de plasma représente la quantité de virus présente dans le sang. Elle est désignée aussi sous les termes de titre viral ou viremie. De nombreuses techniques sont utilisables pour mesurer la charge virale d'un patient. Une revue de l'état de l'art se trouve dans « Report of the NIH To Define Principles of Therapy of VIH Infection » publié dans the Morbidity and Mortality Weekly Reports, April 24, 1998, Vol. 47, No. RR-5, révisé le 17/6/98 auquel on pourra se référer pour un descriptif des techniques. On sait que les taux de réplication du VIH chez les personnes infectées peuvent être mesurés de façon précise par la mesure du VIH dans le plasma. L'ARN du VIH dans le plasma est contenu dans des particules circulaires de virus ou virion, chaque virion contenant 2 copies de l'ARN génomique du VIH. On peut quantifier les concentrations d'ARN de VIH dans le plasma soit par amplification des cibles (e.gf., réaction en chaîne quantitative de la polymerase [RT-PCR], test Amplicor VIH Monitor, Roche Molecular Systems), soit par l'amplification des séquences d'acides nucléiques, [NASBA®], NucliSens™ VIH-1 QT assay, Organon Teknika). Le test qui a été utilisé dans le cadre de la présente invention est le test Amplicor VIH Monitor, Roche Molecular Systems.The viral load expressed by the number of copies of RNA / ml of plasma represents the amount of virus present in the blood. It is also referred to as viral or viral title. Many techniques can be used to measure a patient's viral load. A state-of-the-art review can be found in "Report of the NIH To Define Principles of Therapy of HIV Infection" published in the Morbidity and Mortality Weekly Reports, April 24, 1998, Vol. 47, No. RR-5, revised on 17/6/98 to which reference may be made for a description of the techniques. It is known that HIV replication rates in infected people can be measured precisely by measuring HIV in plasma. HIV RNA in plasma is contained in circular particles of virus or virion, each virion containing 2 copies of HIV genomic RNA. The concentrations of HIV RNA in the plasma can be quantified either by amplification of the targets (e.g. quantitative polymerase chain reaction [RT-PCR], Amplicor HIV Monitor test, Roche Molecular Systems), or by l amplification of nucleic acid sequences, [NASBA®], NucliSens ™ HIV-1 QT assay, Organon Teknika). The test which has been used in the context of the present invention is the Amplicor HIV Monitor test, Roche Molecular Systems.
Le taux de cellules T CD4+ correspond au nombre total de cellules exprimant le marqueur CD4 par mm3 de sang. Ce taux est déterminé selon les recommandations décrites dans The Morbidity and Mortality Weekly Report, 46(RR-02) Jan,10 1997. Centers for Disease Control. En résumé, le nombre absolu de CD4+ dans le sang entier est mesuré par un processus à trois phases. Le comptage des CD4+ est le fruit de trois techniques de laboratoire : le comptage des cellules sanguines blanches (WBC) ; la détermination du pourcentage de WBCs qui sont des lymphocytes (différentiel) ; et la détermination du pourcentage de lymphocytes qui sont des cellules T CD4+ par « immunophenotypage par flux cytometrique » par exemple par utilisation du système FACSCount de Becton Dickinson.The level of CD4 + T cells corresponds to the total number of cells expressing the CD4 marker per mm 3 of blood. This rate is determined according to the recommendations described in The Morbidity and Mortality Weekly Report, 46 (RR-02) Jan, 10 1997. Centers for Disease Control. In summary, the absolute number of CD4 + in whole blood is measured by a three-phase process. CD4 + counting is the result of three laboratory techniques: white blood cell (WBC) counting; determining the percentage of WBCs that are lymphocytes (differential); and determining the percentage of lymphocytes which are CD4 + T cells by "cytometric flow immunophenotyping" for example by using the FACSCount system of Becton Dickinson.
On entend par « thérapie anti-rétrovirale » un traitement comprenant une combinaison efficace d'agents anti-rétroviraux. La thérapie anti-rétrovirale implique l'utilisation de deux grandes catégories de médicaments e. les inhibiteurs de la transcriptase inverse et les inhibiteurs de protéase. Les inhibiteurs de la transcriptase inverse peuvent être de nature nucléosidique, tels que : AZT, ddl, ddC, d4T et 3TC en combinaison avec AZT et Combivir, ou de nature non nucléosidique tels que Delavirdine et Nevirapine. Une revue des inhibiteurs non nucléosidiques est donnée dans Clinical Care (10197) Vol. 9, No 10, p 75. De préférence la thérapie anti-rétrovirale correspond à une thérapie hautement active (HAART) Le ; une combinaison d'un inhibiteur de protéase, d'un inhibiteur non nucléosidique de la transcriptase inverse et d'un inhibiteur nucléosidique de la transcriptase inverse, ou une combinaison de deux inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse et d'un inhibiteur nucléosidique de la transcriptase inverse.“Anti-retroviral therapy” is understood to mean a treatment comprising an effective combination of anti-retroviral agents. Anti-retroviral therapy involves the use of two broad categories of drugs e. inhibitors reverse transcriptase and protease inhibitors. Reverse transcriptase inhibitors can be of nucleoside nature, such as: AZT, ddl, ddC, d4T and 3TC in combination with AZT and Combivir, or of non-nucleoside nature such as Delavirdine and Nevirapine. A review of non-nucleoside inhibitors is given in Clinical Care (10197) Vol. 9, No 10, p 75. Preferably anti-retroviral therapy corresponds to a highly active therapy (HAART) Le; a combination of a protease inhibitor, a non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor and a nucleoside reverse transcriptase inhibitor, or a combination of two non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors and a nucleoside reverse transcriptase inhibitor reverse transcriptase.
Les patients pouvant être traités par la méthode selon l'invention sont donc les personnes infectées par le VIH qui sont soumise à une thérapie anti-rétrovirale précocement après l'infection Le. dans les 3 mois suivant l'infection ainsi que les personnes infectées et traitées plus de 3 mois après l'infection, ces dernières étant désignées dans le cadre de la présente invention personnes infectées chroniques.The patients who can be treated by the method according to the invention are therefore people infected with HIV who are subjected to anti-retroviral therapy early after the Le infection. within 3 months of infection as well as those infected and treated more than 3 months after infection, the latter being designated in the context of the present invention chronically infected persons.
La méthode selon l'invention permet donc le traitement des personnes nouvellement infectées (Le. infectées depuis 90 jours ou moins) qui* sont placées sous thérapie anti-rétrovirale quelques mois après l'infection par le VIH et présentent donc une virémie contrôlée. Ces personnes ont la particularité de présenter un Western Blot incomplet. La méthode selon la présente invention permet également le traitement des patients infectés chroniques sous thérapie anti-rétrovirale. La virémie est contrôlée lorsque la charge virale est maintenue à une valeur inférieure à 10000 copies virales par ml de plasma. Les sujets HIV+ qui présentent des réponses cellulaires CD4+ et CD8+ contre les antigènes du HIV, en particulier ceux qui présentent des réponses cellulaires prolifératives contre les épitopes de l'enveloppe (par exemple gp120) sont préférés. Les sujets qui présentent aussi des réponses cellulaires contre les épitopes de Gag (par exemple p24) sont plus particulièrement préférés. Les sujets HIV+ qui ont perdu leurs réponses cellulaires CD4+ et/ou CD8+ contre les antigènes du VIH peuvent également être vaccinés par la méthode selon l'invention. La méthode de vaccination selon la présente invention permet le contrôle du rebond viral chez les patients infectés par le HIV après l'arrêt de la thérapie anti- rétrovirale.The method according to the invention therefore allows the treatment of newly infected persons (Le. Infected for 90 days or less) who * are placed on anti-retroviral therapy a few months after infection with HIV and therefore have a controlled viremia. These people have the distinction of presenting an incomplete Western Blot. The method according to the present invention also allows the treatment of chronically infected patients under anti-retroviral therapy. Viremia is controlled when the viral load is kept below 10,000 viral copies per ml of plasma. HIV + subjects who exhibit CD4 + and CD8 + cellular responses against HIV antigens, in particular those who exhibit proliferative cellular responses against envelope epitopes (eg gp120) are preferred. Those subjects who also exhibit cellular responses against Gag epitopes (eg p24) are more particularly preferred. HIV + subjects who have lost their CD4 + and / or CD8 + cellular responses against HIV antigens can also be vaccinated by the method according to the invention. The vaccination method according to the present invention makes it possible to control the viral rebound in patients infected with HIV after stopping antiretroviral therapy.
Le « contrôle du rebond viral » signifie dans le cadre de la présente invention que après l'arrêt de la thérapie anti-rétrovirale, le rebond viral qui apparaît est retardé, absent, ou que la charge virale présente après le rebond viral (« post-rebound set point ») est contrôlée."Control of viral rebound" means in the context of the present invention that after stopping antiretroviral therapy, the viral rebound which appears is delayed, absent, or that the viral load present after the viral rebound ("post -rebound set point ”) is checked.
Le rebond viral est observé généralement dans les 1 à 3 semaines qui suivent l'arrêt de la thérapie anti-rétrovirale. Le rebond viral est considéré comme retardé lorsqu'il apparaît plus d'un mois après l'arrêt de la thérapie anti-rétrovirale.The viral rebound is generally observed within 1 to 3 weeks after stopping antiretroviral therapy. The viral rebound is considered delayed when it appears more than a month after stopping antiretroviral therapy.
De préférence le rebond viral apparaît plus de 2 mois et en particulier plus dePreferably the viral rebound appears more than 2 months and in particular more than
6 mois après l'arrêt de la thérapie anti-rétrovirale.6 months after stopping anti-retroviral therapy.
La charge virale post-rebond (« post-rebound set point ») représente la charge virale plasmatique qui est présente en l'absence de thérapie anti-rétrovirale après le rebond viral. La charge virale post rebond est considérée comme étant contrôlée lorsqu'elle est maintenue à des valeurs inférieures aux valeurs de reprise de la thérapie anti-rétrovirale telles que définies dans les recommandations officielles publiées dans les différents pays et ce pendant une durée d'au moins 1 mois, de préférence d'au moins 2 mois, en particulier d'au moins 6 mois. Ces valeurs de reprise de la thérapie anti-rétrovirale sont typiquement de 10000 à 50000 copies d'ARN/ml de plasma. De préférence la charge virale post rebond est maintenue à des valeurs inférieures à 10000 copies virales/ml, de préférence inférieures à 5000 copies virales/ml en particulier inférieures à 1000 copies virales/ml de plasma. La présente invention fournit donc une méthode qui a l'avantage de permettre l'arrêt au moins temporaire, et de préférence définitif de la thérapie anti- rétrovirale des sujets VIH+ en permettant le contrôle du phénomène de rebond viral généralement associé à un tel arrêt.The post-rebound set point represents the plasma viral load which is present in the absence of antiretroviral therapy after the viral rebound. The post-rebound viral load is considered to be controlled when it is maintained at values lower than the resumption values of antiretroviral therapy as defined in the official recommendations published in the different countries and this for a period of at least 1 month, preferably at least 2 months, in particular at least 6 months. These resumption values for anti-retroviral therapy are typically 10,000 to 50,000 copies of RNA / ml of plasma. Preferably, the post-rebound viral load is maintained at values lower than 10 000 viral copies / ml, preferably lower than 5000 viral copies / ml in particular lower than 1000 viral copies / ml of plasma. The present invention therefore provides a method which has the advantage of allowing at least temporary, and preferably permanent, cessation of antiretroviral therapy in HIV + subjects by allowing control of the phenomenon of viral rebound generally associated with such a stoppage.
Un tel contrôle du rebond viral est obtenu par administration des lipopeptides selon l'invention qui induisent des réponses cellulaires CD4+ et CD8+ spécifiques du VIH.Such control of the viral rebound is obtained by administration of the lipopeptides according to the invention which induce cellular CD4 + and CD8 + responses specific to HIV.
On entend par « réponse CD8+ » la capacité des cellules T cytotoxiques à reconnaître et à tuer les cellules exprimant des peptides du VIH dans le contexte des molécules du MHC classe I. Une telle réponse peut être mesurée par différentes méthodes bien connues de l'homme de l'art telles que par exemple par la technique des tétramères sur des PBMC frais ou en culture, par des tests Elispot de l'INFgamma, ou des tests de cytotoxicité fonctionnelle.“CD8 + response” is understood to mean the capacity of cytotoxic T cells to recognize and kill cells expressing HIV peptides in the context of MHC class I molecules. Such a response can be measured by various methods well known to those skilled in the art such as, for example, the tetramer technique on fresh or cultured PBMCs, by Elispot tests for INFgamma, or functional cytotoxicity tests.
On entend par « réponse CD4+ » la capacité des cellules T CD4+ à être stimulées ou activées par le vaccin selon l'invention. Les réponses CD4+ peuvent être mesurées par les diverses méthodes bien connues de l'homme de l'art qui ont été décrites ci-dessus.“CD4 + response” is understood to mean the capacity of CD4 + T cells to be stimulated or activated by the vaccine according to the invention. CD4 + responses can be measured by the various methods well known to those skilled in the art which have been described above.
On entend par « lipopeptide » dans le cadre de la présente invention, au moins un composé constitué une chaîne peptidique comprenant de 7 à 100 acides aminés, de préférence de 10 à 50 acides aminés et plus particulièrement de 20 à 35 acides aminés et d'une chaîne lipidique comprenant de 8 à 20 atomes de carbone, de préférence de 14 à 18 atomes de carbone et en particulier 16 atomes de carbone. Les lipopeptides selon la présente invention correspondent de préférence à un mélange d'au moins deux lipopeptides différents. La chaîne peptidique des lipopeptides selon la présente invention comprend au moins un épitope CTL d'une protéine du VIH et peut également inclure un ou plusieurs épitopes T auxiliaire d'une protéine du VIH. Les chaînes peptidiques polyépitopiques comprenant plusieurs épitopes CTL sont particulièrement appropriées. On entend par « épitope CTL d'une protéine du VIH » dans le cadre de la présente invention, les séquences dérivées des protéines de structure et de régulation du VIH qui induisent une réponse médiée par les cellules CD8+ du système immunitaire, telles que les épitopes issus des protéines Env, Gag, Pol, Tat et Nef. Tout épitope CTL du VIH tel que défini ci-dessus peut être utilisé dans le cadre de la présente invention. De tels épitopes peuvent être identifiés par utilisation des algorithmes décrit pour ce faire dans la littérature. On peut citer à titre d'exemple non limitatifs d'épitopes CTL utilisables dans les lipopeptides selon l'invention les épitopes listés dans le tableau 4 de la demande W099/27954. Les épitopes présents dans les lipopeptides selon l'invention peuvent être issus d'une seule souche de VIH ou de préférence de différentes souches de VIH, de préférence de souches d'isolats primaires. Ces épitopes sont dans le cas de l'utilisation d'une souche unique issus des régions conservées du génome du VIH.The term “lipopeptide” in the context of the present invention means at least one compound consisting of a peptide chain comprising from 7 to 100 amino acids, preferably from 10 to 50 amino acids and more particularly from 20 to 35 amino acids and a lipid chain comprising from 8 to 20 carbon atoms, preferably from 14 to 18 carbon atoms and in particular 16 carbon atoms. The lipopeptides according to the present invention preferably correspond to a mixture of at least two different lipopeptides. The peptide chain of the lipopeptides according to the present invention comprises at least one CTL epitope of an HIV protein and may also include one or more T helper epitopes of an HIV protein. Polyepitopic peptide chains comprising several CTL epitopes are particularly suitable. The term “CTL epitope of an HIV protein” is understood to mean, in the context of the present invention, the sequences derived from HIV structural and regulatory proteins which induce a response mediated by CD8 + cells of the immune system, such as epitopes. from the proteins Env, Gag, Pol, Tat and Nef. Any CTL epitope of HIV as defined above can be used in the context of the present invention. Such epitopes can be identified by using the algorithms described to do this in the literature. As non-limiting examples of CTL epitopes which can be used in the lipopeptides according to the invention, mention may be made of the epitopes listed in Table 4 of application WO99 / 27954. The epitopes present in the lipopeptides according to the invention can come from a single strain of HIV or preferably from different strains of HIV, preferably from strains of primary isolates. These epitopes are in the case of the use of a single strain originating from the conserved regions of the HIV genome.
On entend par « épitope T auxiliaire du VIH » dans le cadre de la présente invention, les séquences dérivées des protéines de structure et de régulation du VIH qui induisent une réponse auxiliaire médiée par les cellules CD4 du système immunitaire. Tout épitope T auxiliaire répondant à la définition ci-dessus peut être utilisé dans le cadre de la présente invention.In the context of the present invention, the term “helper T epitope of HIV” is intended to mean the sequences derived from proteins of structure and regulation of HIV that induce an auxiliary response mediated by CD4 cells of the immune system. Any auxiliary T epitope corresponding to the above definition can be used in the context of the present invention.
Selon un mode de réalisation préféré le lipopeptide selon l'invention correspond à un mélange dans lequel les chaînes peptidiques sont issues des protéines Env, Gag, Pol et Nef du VIH, et en particulier sont issues de Gag, Pol et Nef.According to a preferred embodiment, the lipopeptide according to the invention corresponds to a mixture in which the peptide chains come from the Env, Gag, Pol and Nef proteins of HIV, and in particular come from Gag, Pol and Nef.
La chaîne lipidique est saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée, et comprend de 8 à 20 atomes de carbone. Elle est de préférence linéaire et saturée. La chaîne lipidique dérive de préférence d'un acide gras de formule COOH- (CH2)n-CH3 avec n=12-16, en particulier n=14, ou d'un halogénure d'alkyle de formule CH2X-(CH2)m-CH3 avec X= Br ou Cl et m=12-16, de préférence avec m=14. Selon un mode particulièrement avantageux, la chaîne lipidique est un acide palmitique. La chaîne lipidique est liée par liaison covalente en C-terminal ou en N- terminal de la chaîne peptique directement ou via un ou plusieurs acide(s) aminé(s) sélectionné(s) de préférence dans le groupe consistant en lysine, lysineamide, cystéine, serine, thréonine. De préférence via un seul acide aminé correspondant à une lysine, une lysineamide ou une cystéine. Lorsque la chaîne lipidique dérive d'un acide gras la fonction COOH de l'acide gras peut être liée directement sur la fonction αNH2 ou εNH2 en N-terminal de la chaîne peptidique par une liaison amide. De préférence, la chaîne lipidique est liée via un acide aminé, de préférence une lysine en N-terminal ou en C- terminal de la chaîne peptidique par des liaisons amide. Dans le cas d'une liaison en C-terminal de la chaîne peptidique, ladite liaison est réalisée avantageusement via un résidu lysineamide, ce qui permet de simplifier le procédé de synthèse peptidique.The lipid chain is saturated or unsaturated, linear or branched, and contains from 8 to 20 carbon atoms. It is preferably linear and saturated. The lipid chain preferably derives from a fatty acid of formula COOH- (CH2) n-CH3 with n = 12-16, in particular n = 14, or from an alkyl halide of formula CH2X- (CH2) m -CH3 with X = Br or Cl and m = 12-16, preferably with m = 14. According to a particularly advantageous mode, the lipid chain is a palmitic acid. The lipid chain is linked by covalent bond at the C-terminal or at the N-terminal of the peptic chain directly or via one or more amino acid (s) selected preferably from the group consisting of lysine, lysineamide, cysteine, serine, threonine. Preferably via a single amino acid corresponding to a lysine, a lysineamide or a cysteine. When the lipid chain derives from a fatty acid, the COOH function of the fatty acid can be linked directly to the αNH2 or εNH2 function at the N-terminal of the peptide chain by an amide bond. Preferably, the lipid chain is linked via an amino acid, preferably an N-terminal or C-terminal lysine of the peptide chain by amide bonds. In the case of a C-terminal link of the peptide chain, said link is advantageously carried out via a lysineamide residue, which simplifies the process of peptide synthesis.
Lorsque la chaîne lipidique dérive d'un halogénure d'alkyle tel que défini ci- dessus, sa liaison sur la chaîne peptidique peut être réalisée en C-terminal ou en N-terminal, de préférence via une cystéine par une liaison thioéther.When the lipid chain derives from an alkyl halide as defined above, its bonding to the peptide chain can be carried out in C-terminal or in N-terminal, preferably via a cysteine by a thioether bond.
Les lipopeptides selon la présente invention peuvent être synthétisés par toute méthode classique. Des méthodes utilisables dans le cadre de la présente invention sont décrites en particulier dans les documents US5019383, FR9015870, US5993823 et W099/27954 auxquels on pourra se référer pour un descriptif complet des procédés de synthèse. , Des méthodes de synthèse des lipopeptides selon la présente invention sont également décrites dans les références suivantes : « Yeast binding protein famesyltransferase. Binding of S-alkyl peptides and related analogs ». Rozema et al in Organic Letters 1 (5), 815-817 (1999) ; « Angiotensin analogues palmitoylated in position 1 and 4 » Maletinska et al in J. Med. Chem.40, 3271-3279 (1997) ; « Synthetic peptide vaccines : palmitoylation of peptide antigens by a thioesther bond increases immunogenicity » Beekman et al in J. Pept. Res. 50, 357-364 (1997) ; et « Synthesis and structural characterization of human-identical lung surfactant SP-C protein » Mayer-Fligge et al. in J. Peptide Sci 4, 355-363 (1998) auxquelles on pourra se référer pour un descriptif des techniques.The lipopeptides according to the present invention can be synthesized by any conventional method. Methods that can be used in the context of the present invention are described in particular in documents US5019383, FR9015870, US5993823 and WO99 / 27954 to which reference may be made for a description. complete synthesis processes. , Methods of synthesis of lipopeptides according to the present invention are also described in the following references: “Yeast binding protein famesyltransferase. Binding of S-alkyl peptides and related analogs ”. Rozema et al in Organic Letters 1 (5), 815-817 (1999); "Angiotensin analogs palmitoylated in position 1 and 4" Maletinska et al in J. Med. Chem. 40, 3271-3279 (1997); "Synthetic peptide vaccines: palmitoylation of peptide antigens by a thioesther bond increases immunogenicity" Beekman et al in J. Pept. Res. 50, 357-364 (1997); and "Synthesis and structural characterization of human-identical lung surfactant SP-C protein" Mayer-Fligge et al. in J. Peptide Sci 4, 355-363 (1998) to which reference may be made for a description of the techniques.
La présente invention a donc pour objet l'administration d'une composition comprenant au moins au lipopeptide tel que défini ci-dessus et un support ou diluant pharmaceutiquement acceptable. De préférence, la composition administrée comprend au moins deux lipopeptides différents et en particulier au moins 5 lipopeptides différents. Les lipopeptides contenus dans un tel mélange diffèrent par leur chaîne peptidique, chaque lipopeptide comportant au moins un épitope CTL qui est différent du ou des épitope(s) CTL présent(s) sur les autres lipopeptides du mélange. Les lipopeptides présents dans le mélange peuvent également différer par leur chaîne lipidique. De préférence tous les lipopeptides sont constitués de la même chaîne lipidique. Selon un aspect préféré de l'invention, la chaîne lipidique est une chaîne en C16. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, la chaîne lipidique dérive d'un acide palmitique qui est lié via un résidu lysine ou lysineamide sur l'une des extrémités de la chaîne peptidique.The present invention therefore relates to the administration of a composition comprising at least the lipopeptide as defined above and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. Preferably, the composition administered comprises at least two different lipopeptides and in particular at least 5 different lipopeptides. The lipopeptides contained in such a mixture differ in their peptide chain, each lipopeptide comprising at least one CTL epitope which is different from the CTL epitope (s) present on the other lipopeptides of the mixture. The lipopeptides present in the mixture can also differ in their lipid chain. Preferably, all the lipopeptides consist of the same lipid chain. According to a preferred aspect of the invention, the lipid chain is a C16 chain. According to a particularly preferred embodiment, the lipid chain derives from a palmitic acid which is linked via a lysine or lysineamide residue on one of the ends of the peptide chain.
Selon un mode de réalisation préféré, le mélange selon la présente invention est constitué des lipopeptides tels que définis à la figure 1. Le déposant a mis en évidence de façon surprenante que les lipopeptides selon l'invention sont efficaces en l'absence de tout lipopeptide contenant un épitope T helper universel tel que décrit dans WO99/27954.According to a preferred embodiment, the mixture according to the present invention consists of the lipopeptides as defined in FIG. 1. The applicant has surprisingly demonstrated that the lipopeptides according to the invention are effective in the absence of any lipopeptide containing a universal T helper epitope as described in WO99 / 27954.
Les lipopeptides sont présents dans le mélange en des quantités équipondérales, de préférence en des quantités équimolaires.The lipopeptides are present in the mixture in equiponderal amounts, preferably in equimolar amounts.
Le mélange de lipopeptides est préparé à partir des lipopeptides individuels sous forme lyophilisée de la façon suivante. On solubilise les lipopeptides dans de l'acide acétique pur et on les mélange selon un ordre défini Le. en partant du moins hydrophobe et en finissant par le plus hydrophobe. Un exemple de préparation d'un mélange selon l'invention est donné dans les exemples qui suivent. Le terme « support ou diluant pharmaceutiquement acceptable » est utilisé dans son sens classique et peut par exemple représenter pour une solution injectable, telle que de l'eau, une solution saline tamponnée ou une solution glucosée. Le support ou diluant pharmaceutiquement acceptable va être sélectionné en fonction de la forme galénique choisie, du mode et de la voie d'administration ainsi que de la pratique pharmaceutique. Les supports ou diluants appropriés ainsi que les exigences en matière de formulation pharmaceutique sont décrits en détails dans Remington's Phamaceutical Sciences, représentant un ouvrage de référence dans ce domaine.The lipopeptide mixture is prepared from the individual lipopeptides in lyophilized form as follows. The lipopeptides are solubilized in pure acetic acid and they are mixed in a defined order Le. starting from the least hydrophobic and ending with the most hydrophobic. An example of preparation of a mixture according to the invention is given in the examples which follow. The term "pharmaceutically acceptable carrier or diluent" is used in its conventional sense and can for example represent for an injectable solution, such as water, a buffered saline solution or a glucose solution. The pharmaceutically acceptable carrier or diluent will be selected according to the galenical form chosen, the mode and the route of administration as well as pharmaceutical practice. The appropriate carriers or diluents as well as the pharmaceutical formulation requirements are described in detail in Remington's Phamaceutical Sciences, which represents a reference work in this field.
Les lipopeptides selon la présente invention peuvent être administrés par toute voie classique habituellement utilisée dans le domaine des vaccins, telle que la voie parentérale (intradermique, intramusculaire, sous-cutanée, etc.). On administre de préférence les lipopeptides selon l'invention par voie intramusculaire. L'administration peut être réalisée par l'injection d'une dose unique ou de doses répétées, par exemple et de préférence en 4 doses à J0, à 1 mois, à 2 mois et 3 mois. Des injections de rappel peuvent éventuellement être administrées de préférence tous les trois mois.The lipopeptides according to the present invention can be administered by any conventional route usually used in the field of vaccines, such as the parenteral route (intradermal, intramuscular, subcutaneous, etc.). The lipopeptides according to the invention are preferably administered by the intramuscular route. The administration can be carried out by the injection of a single dose or of repeated doses, for example and preferably in 4 doses on D0, at 1 month, at 2 months and 3 months. Booster injections may be given preferably every three months.
On administre les lipopeptides selon l'invention à raison de 50 microgrammes à 3 milligrammes de lipopeptides totaux et ce pour les quatre injections ainsi que pour les injections de rappel. Dans le cadre de la présente invention on peut avantageusement administrer les lipopeptides de façon simultanée ou séquentielle avec un vaccin ADN ou un vaccin à virus recombinant atténué.The lipopeptides according to the invention are administered in an amount of 50 micrograms to 3 milligrams of total lipopeptides and this for the four injections as well as for the booster injections. In the context of the present invention, the lipopeptides can advantageously be administered simultaneously or sequentially with a DNA vaccine or an attenuated recombinant virus vaccine.
Dans le cas du vaccin ADN, tout vecteur plasmidique contenant des éléments régulateurs de virus eucaryotes peut être utilisé comme vecteur d'expression eucaryote. On peut utiliser tout vecteur permettant l'expression de protéines sous le contrôle du promoteur « précoce » ou « tardif » SV40, du promoteur de la metallothionéine, du cytomegalovirus humain, du virus de la tumeur mammaire murine, du virus du sarcome de Rous, du promoteur de la polyhedrine, ou d'autres promoteurs efficaces pour l'expression en cellule eucaryote.In the case of the DNA vaccine, any plasmid vector containing regulatory elements of eukaryotic viruses can be used as a eukaryotic expression vector. Any vector can be used which allows the expression of proteins under the control of the SV40 “early” or “late” promoter, the metallothionein promoter, the human cytomegalovirus, the murine mammary tumor virus, the Rous sarcoma virus, from the promoter of the polyhedrine, or other promoters effective for expression in eukaryotic cells.
Les quantités thérapeutiques d'ADN plasmidique peuvent être produites par fermentation en E. coli, suivie d'une purification. Des aliquotes de la banque cellulaire de travail sont utilisés pour inoculer le milieu de croissance et sont cultivés jusqu'à saturation dans des flacons sous agitation ou en bioréacteur selon des techniques bien connues. L'ADN plasmidique peut être purifié en utilisant une méthode de bioséparation standard telle que une résine d'échangeuse d'anions en phase solide de QIAGEN, Inc. (Valencia, Califomia). Si nécessaire, l'ADN superenroulé peut être isolé des formes ouvertes circulaires ou linéaires par un gel d'électrophorèse ou toute autre méthode appropriée pour ce faire.Therapeutic amounts of plasmid DNA can be produced by fermentation in E. coli, followed by purification. Aliquots from the working cell bank are used to inoculate the growth medium and are cultured until saturation in flasks with shaking or in a bioreactor according to well known techniques. Plasmid DNA can be purified using a standard bioseparation method such as a solid phase anion exchange resin from QIAGEN, Inc. (Valencia, Califomia). If necessary, the supercoiled DNA can be isolated from the open circular or linear forms by an electrophoresis gel or any other suitable method for this.
L'ADN plasmidique purifié peut être préparé pour les injections en utilisant des formulations variées. Le plus simple est la reconstitution de l'ADN lyophilisé en tampon phosphate stérile (PBS). Cette méthode nommée "ADN nu" est utilisée de préférence pour des administrations intramusculaires (IM) dans le cadre de la présente invention.Purified plasmid DNA can be prepared for injections using a variety of formulations. The simplest is the reconstitution of freeze-dried DNA in sterile phosphate buffer (PBS). This method called "naked DNA" is preferably used for intramuscular (IM) administration in the context of the present invention.
Dans le cadre de la présente invention, le vecteur plasmidique contient des séquences codant un ou plusieurs peptides ou protéines contenant des épitopes dont au moins certains sont communs avec ceux présents dans le ou les lipopeptides administrés.In the context of the present invention, the plasmid vector contains sequences encoding one or more peptides or proteins containing epitopes, at least some of which are common with those present in the lipopeptide (s) administered.
Pour maximiser les effets immunothérapeutiques des vaccins à minigène ADN, il peut être souhaitable d'employer une autre méthode pour formuler l'ADN plasmidique purifié. On peut par exemple utiliser des lipides cationiques dans la formulation comme cela est décrit dans WO 93/24640. De plus, des glycolipides, des liposomes fusogéniques, des peptides et des composés mentionnés comme globalement protecteurs, interactifs, qui ne condensent pas, peuvent aussi être mélangés à l'ADN plasmidique pour agir sur des variables comme la stabilité, la dispersion intramusculaire, ou le ciblage d'organes ou de cellules spécifiques.To maximize the immunotherapeutic effects of DNA minigene vaccines, it may be desirable to employ another method for formulating purified plasmid DNA. One can for example use cationic lipids in the formulation as described in WO 93/24640. In addition, glycolipids, fusogenic liposomes, peptides and compounds mentioned as globally protective, interactive, which do not condense, can also be mixed with plasmid DNA to act on variables like stability, intramuscular dispersion, or targeting specific organs or cells.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, les lipopeptides selon la présente invention sont administrés de façon séquentielle ou simultanée avec un vaccin à virus recombinant atténué. De préférence les lipopeptides et le vaccin à virus recombinant atténué sont administrés soit simultanément soit séquentiellement selon une méthode de primovaccination-rappel (prime-boost) dans laquelle le virus recombinant atténué est administré en primovaccination. On entend par « vaccin à virus recombinant atténué » une composition comprenant un virus recombinant atténué et un support ou diluant pharmaceutiquement acceptable.According to a particularly advantageous embodiment, the lipopeptides according to the present invention are administered sequentially or simultaneously with an attenuated recombinant virus vaccine. Preferably, the lipopeptides and the vaccine with recombinant attenuated virus are administered either simultaneously or sequentially according to a method of primovaccination-booster (prime-boost) in which the recombinant attenuated virus is administered in primovaccination. The term “attenuated recombinant virus vaccine” is understood to mean a composition comprising a recombinant attenuated virus and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.
Un « virus recombinant atténué » dans le cadre de la présente invention est un virus qui a été génétiquement modifié par des techniques modernes de biologie moléculaire, par ex. des endonucléases de restriction et un traitement par des ligases, et qui a ainsi été rendu moins virulent que le virus sauvage par délétion de certains gènes ou qui a été atténué par passages en série sur une lignée cellulaire issue d'un hôte qui n'est pas l'hôte naturel, ou sur des cellules permissives primaires ou à basse température.A "recombinant attenuated virus" in the context of the present invention is a virus which has been genetically modified by modern molecular biology techniques, eg. restriction endonucleases and ligase treatment, which has thus been made less virulent than the wild virus by deletion of certain genes or which has been attenuated by serial passages on a cell line originating from a host which is not not the natural host, or on primary permissive cells or at low temperatures.
Les virus recombinants atténués selon la présente invention expriment au moins un épitope CTL d'une protéine du VIH, et au moins un épitope T helper de préférence spécifique du VIH. Les virus expriment de préférence les protéines Gag, Env et protéase et des épitopes CTL de Pol et Nef. Parmi les virus recombinant atténués utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer à titre d'exemple non limitatif les adénovirus, les virus adéno-associés, les alphavirus et les poxvirus.The attenuated recombinant viruses according to the present invention express at least one CTL epitope of an HIV protein, and at least one T helper epitope preferably specific for HIV. The viruses preferably express the Gag, Env and protease proteins and CTL epitopes of Pol and Nef. Among the attenuated recombinant viruses which can be used in the context of the present invention, non-limiting examples include adenoviruses, adeno-associated viruses, alphaviruses and poxviruses.
Le virus atténué agit comme un vecteur pour une protéine rétrovirale immunogène grâce à la capacité du virus de coder pour l'ADN étranger. Le virus induit de préférence une réponse helper et une réponse cytotoxique contre les cellules infectées par le VIH.The attenuated virus acts as a vector for an immunogenic retroviral protein through the ability of the virus to code for foreign DNA. The virus preferably induces a helper response and a cytotoxic response against cells infected with HIV.
Le virus est ensuite introduit dans le corps humain par des méthodes ordinaires de vaccination avec un virus vivant. Un vaccin à virus vivant peut par exemple être administré à environ 104-108 particules/dose, ou de 105 à 109 pfu par dose. Le dosage réel d'un tel vaccin peut facilement être déterminé par un test ordinaire de vaccinologie.The virus is then introduced into the human body by ordinary methods of vaccination with a live virus. A live virus vaccine can for example be administered at about 10 4 -10 8 particles / dose, or from 10 5 to 10 9 pfu per dose. The actual dosage of such a vaccine can easily be determined by an ordinary vaccinology test.
On utilise de préférence dans le cadre de la présente invention des poxvirus. Une revue détaillée sur ces vecteurs est fournie dans le brevet US5863542 auquel on pourra se référer pour un descriptif complet de ces derniers. Un exemple représentatif de poxvirus recombinant est l'ALVAC.In the context of the present invention, poxviruses are preferably used. A detailed review of these vectors is provided in patent US5863542 to which reference may be made for a complete description of these. A representative example of a recombinant poxvirus is ALVAC.
L'ADN inséré dans ces vecteurs code pour les antigènes du VIH qui comprennent au moins l'un des épitopes suivants : VIH-I Gag(+ protéase)(LAI), gp120(MN)(+ la partie transmembranaire de gp41 ), Nef(BRU)CTL, Pol(LAI)CTL De préférence l'ALVAC comprend au moins un épitope CTL de Nef et au moins un épitope CTL de Pol (Transcriptase Inverse). Les épitopes CTL de Nef et de Pol sont de préférence les épitopes CTL Nefl , Nef2, PoM , Pol2 et Pol3. De plus des séquences codant pour Tat et/ou Rev peuvent avantageusement être ajoutées. Dans la liste ci-dessus, sont mises entre parenthèses les souches virales dont dérivent les antigènes.The DNA inserted into these vectors encodes the HIV antigens which comprise at least one of the following epitopes: HIV-I Gag (+ protease) (LAI), gp120 (MN) (+ the transmembrane part of gp41), Nef (BRU) CTL, Pol (LAI) CTL Preferably the ALVAC comprises at least one CTL epitope of Nef and at least one CTL epitope of Pol (Inverse Transcriptase). The CTL epitopes of Nef and Pol are preferably the CTL epitopes Nefl, Nef2, PoM, Pol2 and Pol3. In addition, sequences coding for Tat and / or Rev can advantageously be added. In the above list, the viral strains from which the antigens are derived are put in brackets.
Les séquences d'ADN codant pour les antigènes du VIH tels que définis ci-dessus peuvent dériver de toute souche connue du VIH (VIH1 et VIH2, de préférence VIH1), incluant les souches de laboratoire et les isolats primaires. Les séquences des épitopes CTL de Nef et de Pol identifiés ci-dessus sont décrites dans le brevet US5990091 et correspondent aux séquences suivantes :The DNA sequences encoding the HIV antigens as defined above can be derived from any known strain of HIV (HIV1 and HIV2, preferably HIV1), including laboratory strains and primary isolates. The sequences of the CTL epitopes of Nef and Pol identified above are described in patent US5990091 and correspond to the following sequences:
MPLTEEAELE LAENREILKE PVHGVYYDPS KDLIAEIQKQ GQGQWTYQIYMPLTEEAELE LAENREILKE PVHGVYYDPS KDLIAEIQKQ GQGQWTYQIY
QEPFKNLKTG : épitope CTL Pol-3 (60 aa)QEPFKNLKTG: CTL Pol-3 epitope (60 aa)
MEWRFDSRLA FHHVARELHP EYFKNC: épitope CTL Nef-2 (26 aa)MEWRFDSRLA FHHVARELHP EYFKNC: CTL Nef-2 epitope (26 aa)
MA IFQSSMTKIL EPFRKQNPDI VIYQYMDDLY VGSDLEIGQH RTKIEELRQH LLRWGLTT : épitope CTL Pol-2 (60 aa)MA IFQSSMTKIL EPFRKQNPDI VIYQYMDDLY VGSDLEIGQH RTKIEELRQH LLRWGLTT: CTL Pol-2 epitope (60 aa)
MV GFPVTPQVPL RPMTYKAAVD LSHFLKEKGG LEGLIHSQRR QDILDLWIYHMV GFPVTPQVPL RPMTYKAAVD LSHFLKEKGG LEGLIHSQRR QDILDLWIYH
TQGYFPDWQN YTPGPGVRYP LTFGWCYKLV P : épitope CTL Nef-1 (83 aa)TQGYFPDWQN YTPGPGVRYP LTFGWCYKLV P: CTL epitope Nef-1 (83 aa)
MIETVPVKL KPGMDGPKVK QWPLTEEKIK ALVEICTEME KEGKISKIGP : épitope CTL Pol-1 (49 aa) Dans le cadre de la présente invention on utilisera de préférence l'ALVAC vCP 1433 ou 1452. La structure de ces deux ALVAC ainsi que leur procédé de fabrication sont décrits en détails dans le brevet US5990091 , auquel on se référera pour un descriptif complet de ces derniers.MIETVPVKL KPGMDGPKVK QWPLTEEKIK ALVEICTEME KEGKISKIGP: CTL Pol-1 epitope (49 aa) In the context of the present invention, the ALVAC vCP 1433 or 1452 will preferably be used. The structure of these two ALVACs as well as their manufacturing process are described in detail in patent US5990091, which will be referred to for a complete description of these.
Selon un autre mode de réalisation, un immunomodulateur, de préférence de l'IL2, est administré de façon séquentielle ou simultanée. L'IL2 est de préférence administré après le traitement par les lipopeptides et de préférence en 5 cures de 5 jours à raison de 4,5 millions d'unités deux fois par jour.According to another embodiment, an immunomodulator, preferably IL2, is administered sequentially or simultaneously. The IL2 is preferably administered after the lipopeptide treatment and preferably in 5 courses of 5 days at a rate of 4.5 million units twice a day.
La thérapie anti-rétrovirale est de préférence stoppée environ 4 semaines après la dernière injection de lipopeptides. Si l'immunothérapie par administration de lipopeptides est suivie d'un traitement par de NL2, de préférence d'un traitement comprenant 5 cures, la thérapie anti-rétrovirale est stoppée environ 8 semaines après la dernière cure,, soit environ 28 semaines après la dernière injection de lipopeptides dans le cas d'un schéma posologique comprenant 4 injections (J0, 1 mois, 2 mois et 3 mois).Anti-retroviral therapy is preferably stopped about 4 weeks after the last lipopeptide injection. If the immunotherapy by administration of lipopeptides is followed by a treatment with NL2, preferably a treatment comprising 5 courses, the anti-retroviral therapy is stopped approximately 8 weeks after the last course, or approximately 28 weeks after the last lipopeptide injection in the case of a dosage regimen comprising 4 injections (D0, 1 month, 2 months and 3 months).
La présente invention va être décrite de façon plus détaillée dans les exemples qui suivent. Les exemples décrits ci-dessous sont donnés à titre purement illustratif de l'invention et ne peuvent en aucun cas être considérés comme limitant la portée de cette dernière.The present invention will be described in more detail in the following examples. The examples described below are given purely by way of illustration of the invention and can in no way be regarded as limiting the scope of the latter.
Exemple 1 : préparation d'une composition de lipopeptides selon l'invention. Un mélange comprenant 5 lipopeptides comprenant des séquences peptidiques issues des protéines Nef, Gag et Pol de la souche LAI du virus VIH correspondant aux séquences Nef 66-97, Nef116-145, gag17-35, gag253-284 et pol325-355 est préparé selon le procédé décrit ci-dessous. Pour chaque lipopeptide, une lysine a été ajoutée à l'extrémité C-terminale du peptide et un acide palmitique a été greffé sur la chaîne latérale de cette lysine (liaison amide). La synthèse est réalisée sur phase solide (résine de type polystyrène comportant des substituants amides tricycliques) en utilisant la stratégie Fmoc. Les acides aminés sont ajoutés de l'extrémité C-terminale à l'extrémité N-terminale. En fin de synthèse, le peptide est détaché de la résine et les chaînes latérales sont déprotégées par un traitement à l'acide trifluoroacétique. Le peptide est purifié par HPLC en utilisant deux systèmes de solvants différents. Le peptide pur est ensuite soumis à une chromatographie échangeuse d'ions de façon à permuter les ions trifluoroacétate par des ions acétate. Le peptide est filtré (0,22 μm) et réparti en flacons de 100 mg et lyophilisé.Example 1: preparation of a composition of lipopeptides according to the invention. A mixture comprising 5 lipopeptides comprising peptide sequences derived from the Nef, Gag and Pol proteins of the LAI strain of the HIV virus corresponding to the sequences Nef 66-97, Nef116-145, gag17-35, gag253-284 and pol325-355 is prepared according to the process described below. For each lipopeptide, a lysine was added to the C-terminal end of the peptide and a palmitic acid was grafted on the side chain of this lysine (amide bond). The synthesis is carried out on a solid phase (polystyrene type resin comprising tricyclic amide substituents) using the Fmoc strategy. Amino acids are added from the C-terminus to the N-terminus. At the end of the synthesis, the peptide is detached from the resin and the side chains are deprotected by treatment with trifluoroacetic acid. The peptide is purified by HPLC using two different solvent systems. The pure peptide is then subjected to ion exchange chromatography so as to permute the trifluoroacetate ions with acetate ions. The peptide is filtered (0.22 μm) and distributed in 100 mg vials and lyophilized.
Chaque lipopeptide est ensuite solubilisé par addition d'acide acétique pur jusqu'à une concentration de 12,5 mg net / ml. Les lipopeptides Nef66, Nef116 et Gag17 sont solubles dans l'acide acétique pur. Les lipopeptides Gag253 et Pol325 ne sont pas solubles dans l'acide acétique pur. Il est donc nécessaire d'introduire une étape de sonication pour faciliter la solubilisation de ces deux derniers. Si les agrégats ne sont pas dissociés, on continue la sonication en espaçant chaque période de sonication (30 s) par des arrêts de 30 s, pendant lesquels les flacons sont agités manuellement. A la fin de l'étape de sonication, les suspensions doivent être homogènes (mais ne seront pas limpides). Chaque lipopeptide est ensuite dilué par addition d'eau pour préparation injectable. Si la solution obtenue n'est pas totalement limpide, on peut effectuer des étapes de chauffage au bain- marie (à 40°C±2°C) et sonication (1 min maximum) en espaçant par des arrêts de 30 s. La préparation finale est obtenue en mélangeant les lipopeptides en quantités équipondérales en les ajoutant dans l'ordre suivant (lipopeptides les plus hydrophiles aux plus hydrophobes) : Nef66 ; Nefl 16 ; Gag17 ; Pol325 ; Gag253Each lipopeptide is then dissolved by adding pure acetic acid to a concentration of 12.5 mg net / ml. The lipopeptides Nef66, Nef116 and Gag17 are soluble in pure acetic acid. The lipopeptides Gag253 and Pol325 are not soluble in pure acetic acid. It is therefore necessary to introduce a sonication step to facilitate the solubilization of the latter two. If the aggregates are not dissociated, the sonication is continued, spacing each sonication period (30 s) with stops of 30 s, during which the bottles are shaken manually. At the end of the sonication stage, the suspensions must be homogeneous (but will not be clear). Each lipopeptide is then diluted by adding water for injection. If the solution obtained is not completely clear, it is possible to carry out steps of heating in a bath. blend (at 40 ° C ± 2 ° C) and sonication (1 min maximum), spacing with stops of 30 s. The final preparation is obtained by mixing the lipopeptides in equiponderal quantities by adding them in the following order (most hydrophilic to most hydrophobic lipopeptides): Nef66; Nefl 16; Gag17; Pol325; Gag253
Le mélange est maintenu sous agitation (à l'aide d'un barreau aimenté) pendant les additions des différents lipopeptides. Le mélange à filtrer doit être limpide. Il est préférable de le passer au bain-marie à 40°C±2°C (5 minutes maximum) jusqu'à obtention d'un mélange parfaitement liquide et limpide. Ne pas dépasser 10 min. Le mélange est alors filtré puis réparti en flacon à raison de 500 μg de chaque lipopeptide par flacon, puis lyophilisé.The mixture is kept under stirring (using a magnetized bar) during the additions of the various lipopeptides. The mixture to be filtered must be clear. It is best to pass it in a water bath at 40 ° C ± 2 ° C (5 minutes maximum) until a perfectly liquid and clear mixture is obtained. Do not exceed 10 min. The mixture is then filtered and then distributed in a bottle at the rate of 500 μg of each lipopeptide per bottle, then lyophilized.
Pour préparer la composition selon l'invention, on reconstitue la solution par addition de 1ml d'une solution glucosée à 5% (P/V) et tamponnée ou non.To prepare the composition according to the invention, the solution is reconstituted by adding 1 ml of a 5% glucose solution (W / V) and buffered or not.
La composition ainsi obtenue comprend 2.5 mg de lipopeptides totaux par ml.The composition thus obtained comprises 2.5 mg of total lipopeptides per ml.
Exemple 2 : Préparation d'une composition selon l'inventionExample 2: Preparation of a composition according to the invention
On prépare selon le procédé décrit dans l'exemple 1 une composition comprenant outre les lipopeptides mentionnés dans l'exemple 1 , un lipopeptideA composition is prepared according to the method described in Example 1 comprising, in addition to the lipopeptides mentioned in Example 1, a lipopeptide
TT830-846 dans lequel la chaîne peptidique est constituée de l'épitope 830-846 de la toxine tétanique. Cet épitope est décrit dans la littérature comme étant un épitope T-helper universel.TT830-846 in which the peptide chain consists of the epitope 830-846 of tetanus toxin. This epitope is described in the literature as being a universal T-helper epitope.
Le lipopeptide TT830-846 est constitué d'une chaîne lipidique en C16 dérivée d'un acide palmitique, liée en C-Terminal de la chaîne peptidique et synthétisé selon le procédé de synthèse décrit ci-dessus pour les autres lipopeptides. Dans le cas du lipopeptide TT830-846, l'extrémité N-terminale est acétylée, ceci afin d'éviter la cyclisation de la glutamine (Q) en pyroGlu.The lipopeptide TT830-846 consists of a C16 lipid chain derived from a palmitic acid, linked at the C-Terminal of the peptide chain and synthesized according to the synthesis method described above for the other lipopeptides. In the case of the lipopeptide TT830-846, the N-terminal end is acetylated, this in order to avoid the cyclization of glutamine (Q) into pyroGlu.
Le lipopeptide TT830-846 est ajouté dans la préparation finale après le lipopeptide GAG17.Lipopeptide TT830-846 is added to the final preparation after lipopeptide GAG17.
La composition ainsi obtenue comprend 3,0 mg de lipopeptides totaux par ml.The composition thus obtained comprises 3.0 mg of total lipopeptides per ml.
Exemple 3 : Immunothérapie de sujets VIH+EXAMPLE 3 Immunotherapy of HIV + Subjects
Des sujets VIH+ primo-infectés et infectés chroniques présentant une charge virale inférieure ou égale à 1000 copies par ml de plasma et un taux de CD4+ supérieur ou égal à 300 cellules par mm3 ont été soumis à une méthode d'immunothérapie selon la présente invention.HIV + primo-infected and chronically infected subjects with a viral load less than or equal to 1000 copies per ml of plasma and a rate of CD4 + greater than or equal to 300 cells per mm 3 were subjected to an immunotherapy method according to the present invention.
Le schéma posologique suivant a été utilisé :The following dosing schedule was used:
Injection à J0, 1 mois, 2 mois et 3 mois par voie intramusculaire de 1 ml de la composition de l'exemple 1 ou de 1 ml de la composition de l'exemple 2.Injection at D0, 1 month, 2 months and 3 months intramuscularly of 1 ml of the composition of example 1 or of 1 ml of the composition of example 2.
L'ALVAC-HIV (vCP1433) est co-administré par voie intramusculaire à une dose de 106,5 TCID50, cette même dose étant utilisée pour les 4 injections.ALVAC-HIV (vCP1433) is co-administered intramuscularly at a dose of 10 6.5 TCID50, this same dose being used for the 4 injections.
Une partie des sujets sont soumis après l'immunothérapie à un traitement par de l'IL2 en 3 cures ou 5 cures de 5 jours à raison de 4,5 millions d'unités deux fois par jour.Part of the subjects are subjected after immunotherapy to treatment with IL2 in 3 courses or 5 courses of 5 days at the rate of 4.5 million units twice a day.
La thérapie anti-rétrovirale est arrêtée 4 semaines après la dernière injection de lipopeptides ou, quand celle ci est suivie d'un traitement par IL2 par exemple en 5 cures, 8 semaines après la dernière cure, soit 28 semaines après la dernière vaccination. L'efficacité de l'immunothérapie, mise en évidence par le contrôle au moins temporaire de la virémie, est déterminée par la mesure de la charge virale selon la méthode décrite ci-dessus.Anti-retroviral therapy is stopped 4 weeks after the last lipopeptide injection or, when this is followed by treatment with IL2, for example in 5 courses, 8 weeks after the last course, or 28 weeks after the last vaccination. The effectiveness of immunotherapy, demonstrated by at least temporary control of viremia, is determined by measuring the viral load according to the method described above.
L'induction d'une réponse cytotoxique spécifique du HIV' est mise en évidence par une méthode de mesure de l'INFgamma intracellulaire (en FACS) ou sécrété (ELISPOT).The induction of an HIV-specific cytotoxic response is demonstrated by a method for measuring intracellular INFgamma (in FACS) or secreted (ELISPOT).
L'induction d'une réponse spécifique du HIV médiée par les cellules CD4 est mise en évidence par la méthode de lymphoprolifération en présence d'antigène du VIH.The induction of a specific HIV response mediated by CD4 cells is demonstrated by the lymphoproliferation method in the presence of HIV antigen.
La prolifération des lymphocytes T CD4+ vis-à-vis du VIH est mesurée en cultivant les cellules en présence d'antigènes du VIH et en mesurant l'incorporation de thymidine tritiée après 7 jours de culture.The proliferation of CD4 + T lymphocytes against HIV is measured by culturing the cells in the presence of HIV antigens and by measuring the incorporation of tritiated thymidine after 7 days of culture.
La capacité des cellules mononucléées du sang à proliférer est vérifiée en cultivant les cellules avec un mitogène ou un antigène témoin (tétanique par exemple).The capacity of mononuclear cells of the blood to proliferate is checked by culturing the cells with a mitogen or a control antigen (tetanus for example).
Pour connaître la sous-population responsable de la prolifération, les cellules CD4 sont purifiées sur des billes magnétiques et le test de prolifération est effectué sur cette sous-population ainsi purifiée. To find out the subpopulation responsible for proliferation, the CD4 cells are purified on magnetic beads and the proliferation test is carried out on this subpopulation thus purified.
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003092479A2 (en) * 2002-05-03 2003-11-13 Luc Montagnier Treatments and methods for the treatment, diagnosis and prophylaxis
TWI428135B (en) * 2007-03-26 2014-03-01 Hirofumi Takeuchi And a carrier composition for quick-acting nucleic acid delivery
CN101301478A (en) * 2007-05-10 2008-11-12 贝勒医学院 G-tetrad oligonucleotide using hypoxia inducible factor 1-alpha (HIFI alpha) as target
WO2009002719A1 (en) * 2007-06-22 2008-12-31 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Liposomal inhibitory nucleic acid against stat proteins
US8222225B2 (en) * 2008-05-21 2012-07-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Method of treating pneumoconiosis with oligodeoxynucleotides
US8053422B2 (en) 2008-12-04 2011-11-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Anti-cancer oligodeoxynucleotides
WO2011109677A2 (en) * 2010-03-04 2011-09-09 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Methods of increasing macropinocytosis in cancer cells

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5831066A (en) * 1988-12-22 1998-11-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Regulation of bcl-2 gene expression
US6288042B1 (en) * 1993-04-23 2001-09-11 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-viral guanosine-rich tetrad forming oligonucleotides
US5419900A (en) * 1993-05-19 1995-05-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Of Health And Human Services Immunologic enhancement with intermittent interleukin-2 therapy
IT1277025B1 (en) * 1995-12-04 1997-11-04 Cooperativa Centro Ricerche Po CLASS OF PHOSPHODIESTERIC OLIGONUCLEOTIDES WITH CYTOTOXIC ACTIVITY PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS THAT CONTAIN THEM AND THEIR USE
US5990091A (en) * 1997-03-12 1999-11-23 Virogenetics Corporation Vectors having enhanced expression, and methods of making and uses thereof
FR2771640B1 (en) * 1997-12-03 2000-02-11 Inst Nat Sante Rech Med MIXED MICELLES OF LIPOPEPTIDES FOR INDUCING AN IMMUNE RESPONSE AND THEIR USES FOR THERAPEUTIC PURPOSES

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
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