EP1312680A1 - Verfahren zur Synthese von all-D-Peptiden und Peptidnukleinsäuren - Google Patents

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EP1312680A1
EP1312680A1 EP01127237A EP01127237A EP1312680A1 EP 1312680 A1 EP1312680 A1 EP 1312680A1 EP 01127237 A EP01127237 A EP 01127237A EP 01127237 A EP01127237 A EP 01127237A EP 1312680 A1 EP1312680 A1 EP 1312680A1
Authority
EP
European Patent Office
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component
amino
carboxy
leaving group
enzyme
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01127237A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Sven Dr. Klussmann
Frank Dr. Bordusa
Jens Dr. Burmeister
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
TME Pharma AG
Original Assignee
Noxxon Pharma AG
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Filing date
Publication date
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Priority to PCT/EP2002/012904 priority patent/WO2003047743A2/de
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Priority to DE10295581T priority patent/DE10295581D2/de
Publication of EP1312680A1 publication Critical patent/EP1312680A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C07K14/003—Peptide-nucleic acids (PNAs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
    • C07K1/023—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution using racemisation inhibiting agents

Definitions

  • the invention relates to methods of synthesizing an all-D polypeptide using of an enzyme, the use of enzymes for the synthesis of all-D polypeptides and the Use of leaving groups for the synthesis of all-D polypeptides.
  • D polypeptides In addition to the use of D polypeptides as therapeutic agents, these are becoming increasingly important as molecular biological tools.
  • D polypeptides also referred to herein as all-D polypeptides, is the production of so-called Spiegelmeres. These are single-stranded nucleic acids that bind to the target molecule in a highly affine and highly specific manner. The procedure is such that the respective target molecule against which a Spiegelmer is to be generated is synthesized in its all-D form, and then a D-nucleic acid library, which typically contains about 10 15 different sequences, is used to extract from identify and isolate this library to the all-D polypeptide-binding D-nucleic acids.
  • a D-nucleic acid library which typically contains about 10 15 different sequences
  • the binding D-nucleic acid (s) is / are then converted into their L-enantiomers and, owing to the chiral reciprocity, bind to the target molecule, in the event that the target molecule is a protein, to the corresponding all L protein.
  • intein-mediated protein ligation ( expressed protein ligation , EPL; based on this principle) cannot be used for all-D peptides; see, inter alia, TW Muir et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 6705; GJ Cotton et al., J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 1100), in which the thioester grouping of the carboxy component consists of a recombinant protein which is fused to a cleavage-competent intein and is formed by thiolytic cleavage.
  • Catalytic processes offer the advantage of greater flexibility with regard to the peptide bond to be synthesized, although at least so far no universal peptide ligase with preparative relevance is known from nature.
  • Catalytic antibodies see, inter alia, PG Schultz, RA Lerner, Science 1995, 269, 1835; G. MacBeath, D. Hilvert, Chem. Biol . 1996 , 3, 433; DB Smithrub et al., J. Am. Chem Soc. 1997 , 119, 278) CN ligase activity, as well as synthetic peptide ligases based on a coiled-coil motif of GCN4 (K.
  • the carboxy component was always only present as a single amino acid component, ie as a D-amino acid and not as an all-D peptide.
  • Bordusa et al. Biol. Chem. 1997, 378, 1193; F. Bordusa, H.-D. Jakubke, Bioorg. Med. Chem. 1998, 6, 1775; M. Thormann et al., Biochemistry 1999, 38, 6056; R. Günther et al., Eur. J. Biochem. 2000, 267, 3496).
  • the present invention has for its object a method for enzymatic To provide synthesis of all-D polypeptides, which has the disadvantages of the prior art Technique described overcomes. Furthermore, it is the task of the present Invention to provide a method in which sequence independent synthesis, especially ligation of an all-D polypeptide.
  • the enzyme is selected from the Group comprising proteases, peptidases and hydrolases.
  • the enzyme is selected from the group that includes cysteine proteases and serine proteases.
  • the enzyme is clostripain, in particular clostripain from Clostridium histolyticum .
  • the enzyme is a prolyl endopeptidase, in particular a prolyl endopeptidase from Flavobacterium meningoseptum .
  • the leaving group is selected from the Group, the 4-guanidinophenyl ester, 4-amidinophenyl ester, 4-guanidinophenyl thioester and 4-amidinophenylthioesters and structural homologues thereof.
  • the carboxy component containing the leaving group has the following structure: Y- (D-Xaa) n -R
  • Y an N-terminal protective group, in particular benzoyl
  • Xaa any ⁇ -amino acid, ⁇ -amino acid or a derivative thereof
  • R is a leaving group, in particular is a leaving group selected from the group comprising 4-guanidinophenyl ester, 4-amidinophenyl ester, 4-guanidinophenyl thioester, 4-amidinophenyl thioester and structural homologues thereof
  • n an integer, preferably from 1 to 100.
  • N ⁇ -amino function of the amino component is unprotected, N ⁇ -amino function reacting with the carboxy function of the carboxy component.
  • the object is achieved according to the invention through the use of an enzyme for the synthesis of an all-D polypeptide.
  • the all-D polypeptide by ligation of a Amino component and a carboxy component is produced and the Carboxy component comprises a leaving group.
  • the leaving group on a PNA strand is present and the PNA strand carrying the leaving group as Carboxy component with a PNA monomer or with a second PNA strand as Amino component is reacted using an enzyme.
  • the leaving group is selected is from the group, the 4-guanidinophenyl esters, 4-amidinophenyl esters, 4-guanidinophenyl thioesters and 4-amidinophenylthioesters and structural homologues thereof includes.
  • the object is achieved by using a Leaving group, which is selected from the group consisting of 4-guanidinophenyl esters, 4-amidinophenyl esters, 4-guanidinophenylthioester and 4-amidinophenylthioester and Structural homologues thereof are used to synthesize an all-D polypeptide of an enzyme.
  • a Leaving group which is selected from the group consisting of 4-guanidinophenyl esters, 4-amidinophenyl esters, 4-guanidinophenylthioester and 4-amidinophenylthioester and Structural homologues thereof are used to synthesize an all-D polypeptide of an enzyme.
  • the leaving group on an all-D polypeptide is present and the all-D polypeptide carrying the leaving group as a carboxy component with a D-amino acid or with an all-D polypeptide as the amino component below Using an enzyme is implemented.
  • the enzyme is clostripain, in particular clostripain from Clostridium histolyticum .
  • the enzyme is prolyl endopeptidase, in particular prolyl endopeptidase from Flavobacterium meningoseptum .
  • both the back and the back reaction of enzymes ie in the case of proteases and peptidases and generally hydrolases, both the hydrolysis activity and the ligase activity are subject to the same specificity criteria
  • the present invention was surprisingly aware of the present invention based on the fact that it is possible to remove these specificity criteria with a carboxy component provided with a leaving group, the carboxy component being a D component.
  • a ligase reaction can take place, but not the cleavage reaction in the sense of hydrolysis of an all-D polypeptide produced from a D-amino component and a D-carboxy component.
  • the D-carboxy component is typically provided with the leaving group by linking the leaving group in ester or amide fashion to the C-terminal carboxyl function of the carboxy component.
  • the method according to the invention is further based on the surprising finding that, despite the pronounced stereospecificity of enzymes such as proteases and peptidases for L-configured amino acids and L-polypeptides constructed therefrom, an enzyme-catalyzed ligation of both a D-configured carboxy and a D- configured amino component is possible, although this was formally excluded according to the understanding of the experts in the field (see H.-D. Jakubke, Peptides: Chemistry and Biology, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, Oxford, 1996).
  • cysteine protease clostripain as well as the serine protease Prolylendopeptidase show the behavior described above and thus in the context of Process according to the invention for the synthesis of all-D polypeptides can be used can.
  • Other suitable enzymes can be found in screening processes Use appropriate model reactions based on those disclosed herein technical teaching can be carried out.
  • the procedure is such that the general acceptance of D-configured peptide amino components by proteases is investigated using synthetic model reactions.
  • a carboxy component consisting of an amino acid (conventional carboxy components or substrate mimetic) with a D-configured amino component, in the simplest case an amide of a D-amino acid, but preferably an all-D peptide, and that too testing protease incubated.
  • the acceptance of D-configured amino components is determined by Product formation displayed during the subsequent incubation phase.
  • the Product formation itself can be done for example by means of HPLC or other chromatographic Separation methods are analyzed.
  • screening can also be based on Splitting experiments are carried out.
  • the peptide substrate to be cleaved exists in such cases both from L and D amino acids.
  • the cleavage of the peptide bond between one L-amino acid and a D-amino acid can be D-configured as acceptance Amino components are evaluated.
  • to analyze the Cleavage reactions the same methods, albeit partially in known to those skilled in the art modified form, as for the above synthetic screening approach.
  • the enzyme does not usually act on the ligation of Carboxy components with a specific sequence, but rather any Carboxy components, i.e. H. in the case of all-D polypeptides, with any Amino acid sequence can be used.
  • N-terminal protective groups into the Carboxy component, which is particularly necessary when the N-terminal sequence the carboxy component has a higher specificity for the enzyme than the N-terminal Sequence of the amino component.
  • chemical methods practically no restrictions on the sequence of the in Reacting reactants.
  • amino component and carboxy component as used herein are defined relative to the all-D polypeptide to be synthesized.
  • the designates Term of the amino component a chemical compound that an amino group to Provides that with a carboxy group or a derivative thereof, for example Carboxy group derivatized with a leaving group, another compound, i.e. the carboxy component, reacting to form a peptide bond.
  • the Amino component is preferably a D-amino acid, more preferably a D polypeptide.
  • the polypeptide has both Amino end as well as a carboxy end. The carboxy end is either unprotected or protected from.
  • the carboxyl group of the amino component is typically unactivated Form before.
  • the carboxy component is preferably a D-amino acid or, more preferably, a D polypeptide.
  • an all-D polypeptide By linking the An amino component and the carboxy component form an all-D polypeptide, wherein the C-terminal end of the amino component the C-terminal end of the all-D polypeptide corresponds and the amino-terminal end of the carboxy component corresponds to the amino end of the corresponds to all-D polypeptide ligated under the influence of the enzyme.
  • glycine is also regarded as a D-amino acid. in this respect is an all-D polypeptide in the context of the present invention in particular also one that contains one or more glycine molecules in addition to D-amino acids.
  • the length of the all-D polypeptide is at least two amino acids. Typically the length of the all-D polypeptide produced according to the invention has a size of 1 to 1000, more preferably Way 30 to 1000, more preferably 50 to 600 and most preferably 100 to 300 exhibit.
  • PNA amino component and / or carboxy component
  • PNA is an all-D polypeptide and the single monomer from PNA a D-amino acid in the sense of the present invention.
  • the different Embodiments of the aspects of the invention described herein also apply to PNA and especially for the synthesis of PNA.
  • PNA is a class of substances, the structural elements of nucleic acids and peptides or proteins combined.
  • Nucleic acids contain PNA bases (adenine, guanine, uracil, thymine, cytosine, or inosine other pyrimidine and purine modifications), but not with a phosphodiester backbone as with ribonucleic acids or deoxyribonucleic acids, but with a backbone of 2-aminoethyl-glycine are linked. While the bases of the PNA are able to Hybridizing antiparallel strands of DNA and RNA shows the 2-aminoethyl-glycine backbone peptide properties. This is also how the synthesis of PNAs Standard chemistry of peptide synthesis used.
  • the amino component is PNA or a PNA-building monomer and the carboxy component comprises a leaving group and consists of at least one D-amino acid, preferably an all-D polypeptide, the amino component from at least one D-amino acid, preferably an all-D polypeptide exists and the carboxy component comprises a leaving group and from at least one monomer of PNA, preferably a PNA polymer, also herein referred to as the PNA strand.
  • the size of the amino component can be as little as a (D) amino acid.
  • An upper limit on the length of the amino component is not necessarily given, but will ultimately, if at all, be determined by the specificity of the enzyme used and reaction kinetic considerations such as the rate of diffusion of the amino component.
  • Typical sizes of the amino component are 1 to 60 amino acids, preferably 10 to 50 amino acids and preferably 30 to 40 amino acids.
  • the length of the amino component or carboxy component is significantly greater, in particular in those embodiments of the method according to the invention in which a sequential protease-catalyzed all-D peptide fragment ligation takes place on the polymeric support.
  • the length is then preferably a multiple of the above-mentioned length ranges, expressed as n, where n is preferably an integer from 1 to 20.
  • n is preferably an integer from 1 to 20.
  • the amino component is made larger, equal or smaller than the carboxy component, the criterion for this is generally the number of (D) -amino acids forming the amino component or the carboxy component.
  • the amino component and the carboxy component will preferably have approximately the same length of amino acids.
  • the leaving group is typically present as an ester or amide, more preferably Way as an ester or amide on the C-terminal carboxyl group of the carboxy component.
  • the specific identification of the leaving group ultimately the enzymatic activity of the enzyme was changed such that all-D peptide fragments instead of the L fragments are linked by the protease.
  • arginine-specific Proteases e.g. Clostripain
  • the reaction is preferably carried out in aqueous media or in solution or Suspension, which may contain proportions of organic solvents and / or buffer substances.
  • the synthesis of the carboxy components with the preferably enzyme-specific leaving group can be carried out in solution by condensation of the peptide or the respective C-terminal amino acid with the respective leaving group (or suitable precursors) or on the polymeric carrier, for example by using sulfamylbutyrylaminomethyl safety catch Resins (see R. Ingenito et al., J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 11369) or oxime resins (see V. Cerovsky, F. Bordusa, J. Peptide Res. 2000, 55, 325; V. Cerovsky et al., ChemBioChem 2000, 2, 126) with synchronous ester or amide generation and peptide cleavage.
  • the corresponding alcohol, phenol, naphthol, indole, amide or thiol component itself, as well as pre-prepared N ⁇ -protected amino acid esters or amides or suitable precursors, are used as the releasing nucleophile.
  • the synthesis of the all-D peptide fragments used as amino components is routinely possible in solution or by using conventional Fmoc or Boc synthesis protocols on the polymeric support.
  • the synthesis on the polymeric carrier is usually preferable to a more complex solution synthesis because of the advantages in the purification of the individual intermediates.
  • the all-D peptides or all-D proteins obtained can be obtained using customary methods of peptide and Protein chemistry can be separated and purified. Possibly. existing protection groups can be removed by methods known in the art.
  • the Use according to the invention of enzymes and in particular proteases and peptidases a high synthesis rate, flexibility, synthesis efficiency and ease of use reached. It is within the scope of the present invention that the in the inventive Process used amino component (s) and / or carboxy component (s) with one of the methods according to the invention can in turn be produced and thus a gradual ligation of the ultimately desired all-D polypeptide different individual fragments can be achieved. It is part of the Present invention that even with this specific embodiment of the an immobilization of the amino component or Carboxy component is provided.
  • the amino component is preferably attached to a immobilized solid matrix so that the terminal amino group for reaction with the Carboxy component is available.
  • fragment condensation In the simplified kinetic scheme of a protease-catalyzed synthesis of all-D polypeptides by condensation, also referred to herein as fragment condensation, shown in FIG. 1, using a carboxy component which comprises a leaving group and an amino component.
  • A shows the enzyme E with the binding sites S 3 , S 2 , S 1 , S '1 , S ' 2 and S '3 .
  • the carboxy component consists of three individual D-amino acids which carry a leaving group, which is shown as a triangle.
  • the carboxy component carrying the leaving group binds to the enzyme E (B) with two amino acids in the present case, the leaving group interacting specifically with the binding site S 1 on the enzyme.
  • step (C) the leaving group is split off, whereupon the carboxy component rearranges at the binding site and the D polypeptide is accepted as a substrate.
  • step (D) the amino component from three D-amino acids binds to the binding sites S '1 , S ' 2 and S '3 , whereupon a peptide bond is formed between the carboxy component and the amino component.
  • step (E) the all-D polypeptide thus obtained dissociates from the enzyme.
  • FIG. 3 shows the MALDI spectrum of the method according to the invention prepared and described in Example 5.
  • the stated molecular weight of 891 corresponds to half of the (M + 2H) signal from 1782.
  • the molecular weight of the peptide is 1780. By double ionization, the signal appears at half the molecular weight and is correct consequently with the spectrum shown.
  • Fig. 4 shows a reaction scheme for the sequential protease-catalyzed all-D peptide fragment ligation on a polymeric support.
  • an amino component in the present case an all-D peptide (all-D-peptide 1)
  • a Carboxy component implemented.
  • the Carboxy component an all-D peptide, referred to as all-D peptide 2, which on its terminal carboxy group carries a leaving group R, which as an acid ester, acid amide or rampurethioester is formed.
  • a further carboxy group can then be provided, which is a same or a different leaving group compared to that of all-D peptide 2 can have.
  • the all-D peptide serves as the amino component in this reaction mixture 2 extended all-D peptide coupled to the solid matrix 1.
  • 5A shows a synthesis for the carboxy component, particularly the introduction of the enzyme-specific leaving group.
  • a sulfamylbuterylaminomethyl safety catch resin commercially available from, for example, Calbiochem-Novabiochem AG
  • a leaving group for example present as a thio, hydroxy or amine derivative, the acid amide bond between the peptide and the solid matrix cleaved while simultaneously linking the carboxy group of peptide 1 with the Leaving group, which can then be present, for example, as a thioester, ester or amide.
  • 5 B shows an alternative for the synthesis of the carboxy component.
  • the enzyme-specific leaving group is introduced in solution by using a fully protected peptide as a precursor or precursor molecule. More specifically, after solid-phase synthesis of peptide 1 has taken place, it is split off from the solid matrix to form a carboxy group, which is then condensed with the leaving group present as an HS, HO or H 2 N derivative and thus the carboxy component provided with a leaving group provides that can be used in the inventive method.
  • Example 1 Condensation of Bz-D-Ala-OGp (Bz, Benzoyl; OGp, 4-guanidinophenyl ester) with selected D-amino acid amides or all-D peptides with clostripain.
  • Bz-D-Ala-OGp was synthesized analogously to the synthesis protocol of M. Thormann et al., Biochemistry 1999, 38, 6056. The amino components are commercially available products. Clostripain was purchased from Amano (Japan) or Fluka (Switzerland).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthese eines all-D-Polypeptids unter Verwendung eines Enzyms umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen einer Aminokomponente, wobei die Aminokomponente aus mindestens einer D-Aminosäure, bevorzugter Weise einem all-D-Polypeptid besteht, (b) Bereitstellen der Carboxykomponente, wobei die Carboxykomponente eine Abgangsgruppe umfasst und aus mindestens einer D-Aminosäure, bevorzugter Weise einem all-D-Polypeptid besteht, und (c) Umsetzen der Aminokomponente und der Carboxykomponente mit dem Enzym unter Ausbildung einer Peptidbindung zwischen der Aminokomponente und der Carboxykomponente und unter Abspaltung der Abgangsgruppe von der Carboxykomponente, wobei das all-D-Polypeptid erhalten wird. <IMAGE>

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Synthese eines all-D-Polypeptids unter Verwendung eines Enzyms, die Verwendung von Enzymen zur Synthese von all-D-Polypeptiden sowie die Verwendung von Abgangsgruppen zur Synthese von all-D-Polypeptiden.
Die Synthese von Peptiden und Proteinen besitzt zunehmende Bedeutung für das systematische Studium von Struktur-Funktionsbeziehungen der Polypeptide als funktionelle Genprodukte und trägt entscheidend zur Entdeckung neuer wirksamer Therapeutika bei (vgl. H.-D. Jakubke, Peptide: Chemie und Biologie, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, Oxford, 1996). Ein wesentliches Problem bei der therapeutischen Anwendung dieser Biopolymere ist jedoch deren inhärente Instabilität in biologischen Medien. Die Spiegelung der Konfiguration (Austausch der codierten L-Aminoäuren gegen analoge D-Aminosäuren) führt zu einer deutlichen Stabilitätserhöhung der resultierenden funktionalen spiegelbildlichen Proteine gegenüber proteolytischem Abbau und einhergehender Inaktivierung.
Neben der Verwendung von D-Polypeptiden als Therapeutika werden diese als molekularbiologische Werkzeuge zunehmend bedeutsamer. Eine Anwendung der D-Polypeptide, hierin auch als all-D-Polypeptide bezeichnet, ist die Herstellung von sogenannten Spiegelmeren. Dabei handelt es sich um einzelsträngige Nukleinsäuren, die hochaffin und hochspezifisch an das Zielmolekül binden. Dabei wird so vorgegangen, dass das jeweilige Zielmolekül, gegen das ein Spiegelmer erzeugt werden soll, in seiner all-D-Form synthetisiert wird, sodann eine D-Nukleinsäure-Bibliothek, die typischerweise etwa 1015 verschiedene Sequenzen enthält, verwendet wird, um aus dieser Bibliothek an das all-D-Polypeptid bindende D-Nukleinsäuren zu identifizieren und zu isolieren. Die bindende(n) D-Nukleinsäure(n) wird/werden sodann in ihre L-Enantiomere überführt und binden infolge der chiralen Reziprozität an das Zielmolekül, in dem Falle, dass es sich bei dem Zielmolekül um ein Protein handelt, an das entsprechende all-L-Protein. (S. Klußmann et al., Nat. Biotechnol. 1996, 14, 1112; A. Nolte et al., Nat. Biotechnol. 1996, 14, 1116).
Grundsätzlich lassen sich die für die Synthese von all-L-Polypeptiden entwickelten chemischen Methoden, aufgrund ihrer fehlenden Stereoselektivität, auch auf die Darstellung ihrer all-D-Analoga übertragen. Aufgrund vergleichbarer Reaktivitäten der zur Synthese eingesetzten vollgeschützten D-Aminosäurebausteine resultieren daher zugleich ähnliche Limitationen wie für die Synthese von all-L-Polypeptiden. Während Peptide mit einer durchschnittlichen Kettenlänge von 50-60 Aminosäuren direkt durch Festphasenpeptidsynthese zugänglich sind, führt eine weitere Kettenverlängerung wegen der nicht in jedem Fall quantitativen Kupplungsausbeuten häufig zur Akkumulation einer Vielzahl von Nebenprodukten, die sowohl zu einer Verringerung der Syntheseausbeuten führen wie auch die Reinigung des gewünschten Produktes erschweren bzw. verhindern. Gegenwärtige Methoden beruhen daher auf der Kondensation von synthetisch bereitgestellten Peptidfragmenten, wobei jedoch die Verknüpfung vollgeschützter Peptidfragmente wegen der häufig sehr geringen Löslichkeit der Edukte nur in Ausnahmefällen möglich ist.
Die basierend auf dem erstmals 1953 vorgeschlagenen Konzept der Molekülklammer für chemische CN-Ligationen von ungeschützten Peptidfragmenten (T. Wieland et al., Annalen 1953, 583, 129; M. Brenner et al., Helv. Chim. Acta 1957, 40, 1497) entwickelten Methoden des Amin- und Thioleinfangs (D.S. Kemp et al., J. Org. Chem. 1975, 40, 3465; N. Fotouhi et al., J. Org. Chem. 1989, 54, 2803), der natürlichen chemischen Ligation (M. Schnölzer, S.B.H. Kent, Science 1992, 256,221; P.E. Dawson et al., Science 1994, 266, 776) oder auch der Aldehyd-Methode (C.-F. Liu, J.P. Tam, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 6584) verlaufen zwar selektiv, erfordern aber für deren Realisierung ganz bestimmte N- bzw. C-terminale Aminosäurereste, so daß ihre Anwendbarkeit sequenzspezifischen Voraussetzungen unterliegt. Bei der z.Z. favorisierten nativen chemischen Ligation erfolgt die Verknüpfung eines synthetischen Peptids mit einer C-terminalen Thioestergruppierung mit einem zweiten Peptid oder Protein, das einen N-terminalen Cysteinrest enthalten muß. Für all-D-Peptide nicht anwendbar ist hingegen die auf diesem Prinzip basierende Intein-vermittelten Protein-Ligation (expressed protein ligation, EPL; vgl. u. a. T.W. Muir et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 6705; G.J. Cotton et al., J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 1100), bei der die Thioestergruppierung der Carboxykomponente aus einem rekombinanten Protein, das mit einem spaltungskompetenten Intein fusioniert ist und durch thiolytische Spaltung gebildet wird. Neben der Notwendigkeit eines Cysteinrestes am N-Terminus der Aminokomponente liegt ein weiterer genereller Nachteil in der nicht auszuschließenden partiellen Epimerisierung des C-terminalen Aminosäurerestes, da der sich bildende Thioester (zumindest bei Einsatz von Thiophenol als Katalysator) nicht nur erst nach der Umesterung, sondern auch direkt von der terminalen α-Aminogruppe der zugesetzten Aminokomponente nukleophil angegriffen werden kann.
Katalytische Verfahren bieten den Vorteil einer höheren Flexibilität hinsichtlich der zu synthetisierenden Peptidbindung, obgleich aus der Natur zumindest bislang keine universelle Peptidligase mit präparativer Relevanz bekannt ist. So zeigen katalytische Antikörper (vgl. u.a. P.G. Schultz, R.A. Lerner, Science 1995, 269, 1835; G. MacBeath, D. Hilvert, Chem. Biol. 1996, 3, 433; D.B. Smithrub et al., J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 278) CN-Ligaseaktivität, ebenso wie synthetische Peptidligasen basierend auf einem coiled-coil-Motif von GCN4 (K. Severin et al., Nature 1997, 389, 706) bzw. auf einer Peptidmatrize bestehend aus einem stark sauren coiled-coil-Peptid (S. Yao, J. Chmielewski, Biopolymers 1999, 51, 370). Bei allen diesen Fällen handelt es sich zweifelsohne um interessante Ansatzpunkte für das Design von Peptidligasen, die für Ligationen allerdings spezielle Voraussetzungen erfordern und deren allgemeine Anwendbarkeit folglich sehr stark limitiert ist. Die Nutzung des reversen Katalysepotentials von Peptidasen (vgl. u.a. W. Kullmann, Enzymatic Peptide Synthesis, CRC Press, Boca Raton, 1987; H.-D. Jakubke, Enzymatic Peptide Synthesis, in: The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 9, (Eds.: S. Udenfriend, J. Meienhofer), Academic Press, New York, 1987, Chapter 3) bietet zwar die prinzipielle Möglichkeit, Peptidsegmente unter speziellen Voraussetzungen enzymatisch zu verknüpfen, doch beschränken sich die beschriebenen Beispiele wie bei den zuvor genannten biokatalytischen Verfahren auf die Kondensation von all-L-Peptiden bzw. die Knüpfung von entweder D-konfigurierten Aminokomponenten oder D-Carboxykomponenten, wobei in keinem Falle eine all-D-Aminokomponente mit einer all-D-Carboxykomponente verknüpft wurde. Im übrigen lag die Carboxykomponente immer nur als einzelner Aminosäurebaustein, d. h. als D-Aminosäure vor und nicht als all-D-Peptid. (vgl. u.a. Bordusa et al., Biol. Chem. 1997, 378, 1193; F. Bordusa, H.-D. Jakubke, Bioorg. Med. Chem. 1998, 6, 1775; M. Thormann et al., Biochemistry 1999, 38, 6056; R. Günther et al., Eur. J. Biochem. 2000, 267, 3496).
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur enzymatischen Synthese von all-D-Polypeptiden bereitzustellen, welches die Nachteile der im Stand der Technik beschriebenen Verfahren überwindet. Weiterhin ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, bei dem eine sequenzunabhängige Synthese, insbesondere Ligation, eines all-D-Polypeptids erfolgt.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß in einem ersten Aspekt gelöst durch ein Verfahren zur Synthese eines all-D-Polypeptids unter Verwendung eines Enzyms umfassend die Schritte
  • a) Bereitstellen einer Aminokomponente, wobei die Aminokomponente aus mindestens einer D-Aminosäure, bevorzugter Weise einem all-D-Polypeptid besteht,
  • b) Bereitstellen der Carboxykomponente, wobei die Carboxykomponente eine Abgangsgruppe umfasst und die Carboxykomponente aus mindestens einer D-Aminosäure, bevorzugter Weise einem all-D-Polypeptid, besteht, und
  • c) Umsetzen der Aminokomponente und der Carboxykomponente mit dem Enzym unter Ausbildung einer Peptidbindung zwischen der Aminokomponente und der Carboxykomponente unter Abspaltung der Abgangsgruppe von der Carboxykomponente, wobei das all-D-Polypeptid erhalten wird.
    • In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das erfindungsgemäße Verfahren weiter den Schritt umfasst:
  • (a) Isolieren des all-D-Polypeptids.
    • In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe, die Proteasen, Peptidasen und Hydrolasen umfasst.
    In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe, die Cysteinproteasen und Serinproteasen umfasst.
    Schließlich ist in einer Ausführugnsform vorgesehen, dass das Enzym Clostripain, insbesondere Clostripain aus Clostridium histolyticum ist.
    In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Enzym eine Prolylendopeptidase, insbesondere eine Prolylendopeptidase aus Flavobacterium meningoseptum ist.
    In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Abgangsgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, die 4-Guanidinophenylester , 4-Amidinophenylester, 4-Guanidinophenylthioester und 4-Amidinophenylthioester und Strukturhomologe davon umfasst.
    In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die die Abgangsgruppe enthaltende Carboxykomponente die folgende Struktur aufweist: Y-(D-Xaa)n-R    wobei Y = eine N-terminale Schutzgruppe, insbesondere Benzoyl ist,
       Xaa = eine beliebige α-Aminosäure, β-Aminosäure oder ein Derivat derselben ist
       R = eine Abgangsgruppe ist, insbesondere eine Abgangsgruppe ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die 4-Guanidinophenylester, 4-Amidinophenylester, 4-Guanidinophenylthioester, 4-Amidinophenylthioester und Strukturhomologe davon umfasst
       n = eine ganze Zahl, bevorzugter Weise von 1 bis 100.
    Schließlich ist in einer Ausführungsform vorgesehen, dass die Nα-Aminofunktion der Aminokomponente ungeschützt vorliegt, wobei Nα-Aminofunktion mit der Carboxyfunktion der Carboxykomponente reagiert.
    Weiterhin wird die Aufgabe in einem zweiten Aspekt gelöst durch ein Verfahren zur Synthese eines all-D-Polypeptids unter Verwendung eines Enzyms umfassend die Schritte
  • a) Bereitstellen einer Aminokomponente, wobei die Aminokomponente aus mindestens einer D-Aminosäure, bevorzugter Weise einem all-D-Polypeptid besteht,
  • (b) Bereitstellen der Carboxykomponente, wobei die Carboxykomponente eine Abgangsgruppe umfasst und die Carboxykomponente aus mindestens einer D-Aminosäure, bevorzugter Weise aus einem all-D-Polypeptid besteht, und
  • c) Umsetzen der Aminokomponente und der Carboxykomponente mit dem Enzym unter Ausbildung einer Peptidbindung zwischen der Aminokomponente und der Carboxykomponente und Abspalten der Abgangsgruppe von der Carboxykomponente, wobei das all-D-Polypeptid erhalten wird,
    • wobei die Aminokomponente nach einem Verfahren gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung hergestellt wird oder ist.
    Weiterhin wird die Aufgabe in einem dritten Aspekt gelöst durch ein Verfahren zur Synthese eines all-D-Polypeptids unter Verwendung eines Enzyms, wobei es sich bevorzugter Weise um ein Verfahren gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung handelt, umfassend die Schritte
  • a) Bereitstellen einer Aminokomponente, wobei die Aminokomponente aus mindestens einer D-Aminosäure, bevorzugter Weise einem all-D-Polypeptid besteht,
  • (b) Bereitstellen der Carboxykomponente, wobei die Carboxykomponente eine Abgangsgruppe umfasst und die Carboxykomponente aus mindestens einer D-Aminosäure, bevorzugter Weise aus einem all-D-Polypeptid besteht, und
  • c) Umsetzen der Aminokomponente und der Carboxykomponente mit dem Enzym unter Ausbildung einer Peptidbindung zwischen der Aminokomponente und der Carboxykomponente und Abspalten der Abgangsgruppe von der Carboxykomponente, wobei das all-D-Polypeptid erhalten wird,
    • wobei die Carboxykomponete nach einem Verfahren gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung hergestellt wird oder ist.
    In einem vierten Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung eines Enzyms zur Synthese eines all-D-Polypeptids.
    In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das all-D-Polypeptid durch Ligation einer Aminokomponente und einer Carboxykomponente hergestellt wird und die Carboxykomponente eine Abgangsgruppe umfasst.
    In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Abgangsgruppe an einem PNA-Strang vorhanden ist und der die Abgangsgruppe tragende PNA-Strang als Carboxykomponente mit einem PNA-Monomer oder mit einem zweiten PNA-Strang als Aminokomponente unter Verwendung eines Enzyms umgesetzt wird.
    In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Abgangsgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, die 4- Guanidinophenylester, 4-Amidinophenylester, 4-Guanidinophenylthioester und 4-Amidinophenylthioester und Strukturhomologe davon umfasst.
    In einem fünften Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe gelöst durch die Verwendung einer Abgangsgruppe, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die 4-Guanidinophenylester, 4-Amidinophenylester, 4-Guanidinophenylthioester und 4-Amidinophenylthioester und Strukturhomologe davon umfasst, zur Synthese eines all-D-Polypeptids unter Verwendung eines Enzyms.
    In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Abgangsgruppe an einem all-D-Polypeptid vorhanden ist und das die Abgangsgruppe tragende all-D-Polypeptid als Carboxykomponente mit einer D-Aminosäure oder mit einem all-D-Polypeptid als Aminokomponente unter Verwendung eines Enzyms umgesetzt wird.
    In Ausführungsformen des vierten und fünften Aspekts der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass das Enzym Clostripain, insbesondere Clostripain aus Clostridium histolyticum ist.
    In weiteren Ausführungsformen des vierten und fünften Aspekts der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen dass das Enzym Prolylendopeptidase, insbesondere Prolylendopeptidase aus Flavobacterium meningoseptum ist.
    In einem sechsten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Synthese von PNA unter Verwendung eines Enzyms umfassend die Schritte:
  • (a) Bereitstellen einer Aminokomponente, wobei die Aminokomponente aus mindestens einem PNA-Monomer, bevorzugter Weise einem ersten PNA-Strang besteht,
  • (b) Bereitstellen einer Carboxykomponente, wobei die Carboxykomponente eine Abgangsgruppe umfasst und die Carboxykomponente aus mindestens einem PNA-Monomer, bevorzugter Weise einem zweiten PNA-Strang besteht, und
  • (c) Umsetzen der Aminokomponente und der Carboxykomponente mit dem Enzym unter Ausbildung einer Peptidbindung zwischen der Aminokomponente und der Carboxykomponente unter Abspaltung der Abgangsgruppe von der Carboxykomponente, wobei ein ligierter PNA-Strang erhalten wird.
    • In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Verfahren als weiteren Schritt umfasst:
  • (d) Isolieren des ligierten PNA-Stranges.
    • In einem siebten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Synthese von PNA unter Verwendung eines Enzyms umfassend die Schritte
  • (a) Bereitstellen einer Aminokomponente, wobei die Aminokomponente aus mindestens einem PNA-Monomer, bevorzugter Weise einem ersten PNA-Strang besteht,
  • (b) Bereitstellen einer Carboxykomponente, wobei die Carboxykomponente eine Abgangsgruppe umfasst und die Carboxykomponente aus mindestens einem PNA-Monomer, bevorzugter Weise aus einem zweiten PNA-Strang besteht, und
  • (c) Umsetzen der Aminokomponente und der Carboxykomponente mit dem Enzym unter Ausbildung einer Peptidbindung zwischen der Aminokomponente und der Carboxykomponente und Abspalten der Abgangsgruppe von der Carboxykomponente,
    • wobei die Aminokomponente hergestellt ist nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren.
    In einem achten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Synthese von PNA unter Verwendung eines Enzyms umfassend die Schritte
  • (a) Bereitstellen einer Aminokomponente, wobei die Aminokomponente aus mindestens einem PNA-Monomer, bevorzugter Weise einem ersten PNA-Strang besteht,
  • (b) Bereitstellen einer Carboxykomponente, wobei die Carboxykomponente eine Abgangsgruppe umfasst und die Carboxykomponente aus mindestens einem PNA-Monomer, bevorzugter Weise aus einem zweiten PNA-Strang besteht, und
  • (c) Umsetzen der Aminokomponente und der Carboxykomponente mit dem Enzym unter Ausbildung einer Peptidbindung zwischen der Aminokomponente und der Carboxykomponente und Abspalten der Abgangsgruppe von der Carboxykomponente,
    •    wobei die Carboxykomponente hergestellt ist nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren.
    Ausgehend von dem bisher im Stand der Technik anerkannten Dogma, dass sowohl die Hinwie auch die Rückreaktion von Enzymen, d. h. im Falle von Proteasen und Peptidasen und allgemein Hydrolasen sowohl die Hydrolyseaktivität wie auch die Ligaseaktivität, denselben Spezifitätskriterien unterliegt, lag der vorliegenden Erfindung die überraschende Erkenntnis zugrunde, dass es möglich ist, mit einer mit einer Abgangsgruppe versehenen Carboxykomponenten, wobei die Carboxykomponente eine D-Komponente darstellt, diese Spezifitätskriterien aufzuheben. Mit anderen Worten, indem die D-Carboxykomponente mit einer Abgangsgruppe versehen wird, kann eine Ligasereaktion erfolgen, nicht jedoch die Spaltungsreaktion im Sinne einer Hydrolyse eines aus einer D-Aminokomponente und einer D-Carboxykomponente hergestellten all-D-Polypeptids. Die D-Carboxykomponente wird mit der Abgangsgruppe typischerweise dadurch versehen, daß die Abgangsgruppe ester- oder amidartig mit der C-terminalen Carboxylfunktion der Carboxykomponente verknüpft wird. Dem erfindungsgemäßen Verfahren liegt des weiteren die überraschende Erkenntnis zugrunde, dass trotz der ausgeprägten Stereospezifität von Enzymen wie Proteasen und Peptidasen für L-konfigurierte Aminosäuren und daraus aufgebauter L-Polypeptide eine Enzym-katalysierte Ligation einer sowohl D-konfigurierten Carboxy- wie auch einer D-konfigurierten Aminokomponente möglich ist, obwohl diese nach dem Verständnis der Fachleute auf dem Gebiet formal auszuschließen war (vgl. H.-D. Jakubke, Peptide: Chemie und Biologie, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, Oxford, 1996).
    Man hat gefunden, dass die Cysteinprotease Clostripain sowie die Serinprotease Prolylendopeptidase das vorstehend beschriebene Verhalten zeigen und somit im Rahmen der erfindungsgemäßen Verfahren zur Synthese von all-D-Polypeptiden verwendet werden können. Weitere geeignete Enzyme können im Rahmen von Screening-Prozessen unter Verwendung geeigneter Modellreaktionen, wie sie auf der Grundlage der hierin offenbarten technischen Lehre durchgeführt werden können, erhalten werden.
    Im Rahmen eines derartigen Screening-Prozesses wird dabei so vorgegangen, daß die generelle Akzeptanz D-konfigurierter peptidischer Aminokomponenten durch Proteasen mittels synthetischer Modellreaktionen untersucht wird. Hierzu wird im einfachsten Fall eine aus einer Aminosäure bestehende Carboxykomponente (herkömmliche Carboxykomponenten oder Substratmimetikum) mit einer D-konfigurierten Aminokomponenten, im einfachsten Fall ein Amid einer D-Aminosäure, bevorzugter Weise aber einem all-D-Peptid, und der zu testenden Protease inkubiert. Die Akzeptanz D-konfigurierter Aminokomponenten wird durch Produktbildung im Verlauf der nachfolgenden Inkubationsphase angezeigt. Die Produktbildung selbst kann beispielsweise mittels HPLC oder anderer chromatographischer Trennmethoden analysiert werden. Alternativ kann durch Anbringen geeigneter quenchender Fluoreszenzdonor und -akzeptor-Paare an die Carboxy- bzw. Aminokomponente (z.B. 2-Aminobenzoesäure an die Carboxykomponente und 2-Nitro-Tyrosin an die Aminokomponente) durch Abnahme der Fluoreszenzintensität auf eine Produktbildung und demzufolge auf eine Akzeptanz D-konfigurierter Aminokomponenten geschlossen werden. Daneben erlauben auch ELISA-Techniken unter Verwendung produktspezifischer Antikörper wie auch massenspektroskopische Verfahren die Detektion von gebildetem Ligationsprodukt aus Carboxy- und Aminokomponente.
    Aufgrund der Reversibilität der katalysierten Reaktion (zumindest bei Verwendung herkömmlicher Carboxykomponenten) kann ein Screening auch basierend auf Spaltungsexperimenten erfolgen. Das zu spaltende Peptidsubstrat besteht in solchen Fällen sowohl aus L- wie auch aus D-Aminosäuren. Die Spaltung der Peptidbindung zwischen einer L-Aminosäure und einer D-Aminosäuren kann als Akzeptanz D-konfigurierter Aminokomponenten gewertet werden. Grundsätzlich sind zur Analyse der Spaltungsreaktionen die gleichen Methoden, wenn auch z.T. in für den Fachmann bekannter modifizierter Form, wie für den o.g. synthetischen Screening-Ansatz einsetzbar.
    Ohne im folgenden darauf festgelegt sein zu wollen, scheint die überraschend festgestellte Verwendungsmöglichkeit von Enzymen, insbesondere von Proteasen, Peptidasen und Hydrolasen, zur Synthese eines all-D-Polypeptids ausgehend von einer D-konfigurierten Aminokomponente sowie einer D-konfigurierten Carboxykomponente darin begründet zu liegen, dass infolge der an der D-konfigurierten Carboxykomponente vorhandenen Abgangsgruppe die native Spezifität des eingesetzten Enzyms dahingehend ausgestaltet oder geändert wird, dass das Enzym nun auch die vorstehend genannten D-konfigurierten Komponenten als Substrate akzeptiert und diese in einer katalytischen Reaktion mit dem Ergebnis ligiert, dass ein all-D-Polypeptid erhalten wird, welches eine Gesamtstruktur bestehend aus der Aminokomponente sowie der Carboxykomponente aufweist. Es ist beachtlich, dass das Enzym dabei in der Regel nicht auf die Ligation von Carboxykomponenten mit einer spezifischen Sequenz abstellt, sondern vielmehr beliebige Carboxykomponenten, d. h. im Falle von all-D-Polypeptiden, mit einer beliebigen Aminosäuresequenz, verwendet werden können.
    Infolge des vorstehend beschriebenen Auseinanderfallens der Spezifität der von dem Enzym katalysierten enzymatischen Reaktionen, d. h. Ligation und Hydrolyse, durch Vorhandensein der Abgangsgruppe an der Carboxykomponente am C-terminalen Ende ist das Enzym nach wie vor proteolytisch inaktiv gegenüber all-D-Polypeptiden, so dass hier proteolytische Nebenreaktionen unterbleiben, die ansonsten zu einer Verringerung der Ausbeute des Syntheseverfahrens führen würden. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Verfahren gründet sich auf der Regiospezifität der verwendeten Enzyme und des nichtvorhandenen Racemisierungsrisikos gegenüber den meisten chemischen Verfahren. Dies ist insoweit vorteilhaft, als dass Edukte mit chiralen Zentren und anderen acylierbaren Funktionen ohne experimentell aufwendige und zu zusätzlichen Nebenreaktionen führenden temporären und selektiven Blockierungsmaßnahmen eingesetzt werden können. Ausnahmen sind lediglich die in einigen Fällen notwendige Einführung N-terminaler Schutzgruppen in die Carboxykomponente, die insbesondere dann erforderlich wird, wenn die N-terminale Sequenz der Carboxykomponente eine höhere Spezifität zum Enzym aufweist als die N-terminale Sequenz der Aminokomponente. Darüber hinaus existieren im Gegensatz zu den selektiven chemischen Methoden praktisch keine Beschränkungen hinsichtlich der Sequenz der in Reaktion tretenden Edukte.
    Die Begriffe Aminokomponente und Carboxykomponente, wie sie hierin verwendet werden, werden relativ zu dem zu synthetisierenden all-D-Polypeptid definiert. Dabei bezeichnet der Begriff der Aminokomponente eine chemische Verbindung, die eine Aminogruppe zur Verfügung stellt, die mit einer Carboxygruppe oder einem Derivat davon, bspw. einer Carboxygruppe, die mit einer Abgangsgruppe derivatisiert ist, einer weiteren Verbindung, d.h. der Carboxykomponente, unter Ausbildung einer Peptidbindung reagiert. Bei der Aminokomponente handelt es sich bevorzugter Weise um eine D-Aminosäure, bevorzugtererweise um ein D-Polypeptid. Im letzteren Falle weist das Polypeptid sowohl ein Amino-Ende als auch ein Carboxy-Ende auf. Das Carboxy-Ende liegt dabei entweder ungeschützt oder geschützt vor. Zur Vermeidung einer Reaktion mit einer anderen reaktiven Gruppe, wie beispielsweise der Aminogruppe eines weiteren Moleküls der Aminokomponente, liegt die Carboxylgruppe der Aminokomponente typischerweise in nichtaktivierter Form vor. Bei der Carboxykomponente handelt es sich bevorzugter Weise um eine D-Aminosäure oder, bevorzugterer Weise, um ein D-Polypeptid. Dabei ist die Carboxylfunktion oder -gruppe der Carboxykomponente, die mit der Aminogruppe, in der Regel der N-terminalen Aminogruppe, der Aminokomponente unter Ausbildung einer Peptidbindung reagiert, typischerweise aktiviert. Durch die Verknüpfung der Aminokomponente und der Carboxykomponente wird ein all-D-Polypeptid gebildet, wobei das C-terminale Ende der Aminokomponente dem C-terminalen Ende des all-D-Polypeptids entspricht und das Amino-terminale Ende der Carboxykomponente dem Amino-Ende des unter dem Einfluss des Enzyms ligierten all-D-Polypeptids entspricht.
    Der Begriff all-D-Polypeptid beschreibt ein Polypeptid, welches ausschließlich aus D-Aminosäuren zusammengesetzt ist. Als D-Aminosäuren werden dabei sowohl die D-Enantiomere der natürlichen oder proteinogenen L-Aminosäuren wie auch nicht-natürliche bzw. nicht proteinogene D-Aminosäuren verwendet. Als nicht-natürliche bzw. nichtproteinogene D-Aminosäuren sind hier beispielsweise genannt:
  • 1) D-4-Hydroxyprolin
  • 2) 3,4-Dehydro-D-Prolin
  • 3) D-Thiazolidin-4-Carbonsäure
  • 4) D-Ornithin
  • 5) D-Citrullin
  • 6) D-Norleucin
  • 7) D-Homoserin (und alle anderen Homo-Analoga)
  • 8) D-δ-Hydroxylysin
  • 9) D-Phenylglycin
  • 10) D-Pyroglutaminsäure
    • Infolge der chemischen Struktur von Glycin weist dieses kein asymmetrisches Kohlenstoffatom auf, so daß eine Unterscheidung in D- und L-Glycin nicht möglich ist. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird Glycin auch als D-Aminosäure betrachtet. Insoweit ist ein all-D-Polypeptid im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere auch ein solches, welches neben D-Aminosäuren ein oder mehrere Glycin-Moleküle enthält. Die Länge des all-D-Polypeptids beträgt mindestens zwei Aminosäuren. Typischerweise wird die Länge des erfindungsgemäß hergestellten all-D-Polypeptids eine Größe von 1 bis 1000, bevorzugter Weise 30 bis 1000, bevorzugterer Weise 50 bis 600 und am bevorzugtesten 100 bis 300 aufweisen.
    Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass bei dem erfindungsgemäßen Verfahren als Aminokomponente und/oder Carboxykomponente PNA, peptide nucleic acid, wie beispielsweise beschrieben in Ray A et al., the FASEB Journal Vol. 14, Juni 2000, Seiten 1041-1060, beschrieben. Insoweit ist PNA ein all-D-Polypeptid und das einzelne Monomer von PNA eine D-Aminosäure im Sinne der vorliegenden Erfindung. Die verschiedenen Ausführungsformen der hierin beschriebenen Aspekte der Erfindung gelten auch für PNA und insbesondere für die Synthese von PNA. PNA ist eine Substanzklasse, die Strukturelemente von Nukleinsäuren und Peptiden bzw. Proteinen miteinander vereint. Ebenso wie bei Nukleinsäuren enthält PNA Basen (Adenin, Guanin, Uracil, Thymin, Cytosin, Inosin oder andere Pyrimidin- und Purinmodifikationen), die aber nicht mit einem Phosphodiesterrückgrat wie bei Ribonukleinsäuren oder Desoxyribonukleinsäuren, sondern mit einem Rückrat aus 2-Aminoethyl-Glycin verknüpft sind. Während die Basen der PNA in der Lage sind, mit antiparallelen Strängen von DNA und RNA zu hybridisieren, zeigt das 2-Aminoethyl-Glycin-Rückgrat peptidische Eigenschaften. So wird für die Synthese von PNAs auch die Standardchemie der Peptidsynthese eingesetzt. Auch für die PNA-Synthese gilt, dass mit zunehmender Kettenlänge die Ausbeuten an Endprodukt abnehmen, so dass das erfindungsgemäße Verfahren auch auf diese Substanzklasse mit Erfolg angewandt werden kann. Dabei ist es auch im Rahmen der Erfindung, dass die Aminokomponente PNA oder ein PNA aufbauendes Monomer ist und die Carboxykomponente eine Abgangsgruppe umfasst und aus mindestens einer D-Aminosäure, bevorzugter Weise einem all-D-Polypeptid besteht, die Aminokomponente aus mindestens einer D-Aminosäure, bevorzugter Weise einem all-D-Polypeptid besteht und die Carboxykomponente eine Abgangsgruppe umfasst und aus wenigstens einem Monomer von PNA, bevorzugter Weise einem PNA-Polymer, hierin auch als PNA-Strang bezeichnet, besteht.
    Die Größe der Aminokomponente kann sowenig wie eine (D)-Aminosäure betragen. Eine obere Grenze der Länge der Aminokomponente ist nicht notwendigerweise gegeben, wird jedoch letzten Endes, wenn überhaupt, durch die Spezifität des verwendeten Enzyms sowie reaktionskinetischen Betrachtungen, wie beispielsweise Diffusionsgeschwindigkeit der Aminokomponente, bestimmt werden. Typische Größen der Aminokomponente sind dabei 1 bis 60 Aminosäuren, bevorzugter Weise 10 bis 50 Aminosäuren und bevorzugtererweise 30 bis 40 Aminosäuren. Gleiches gilt grundsätzlich für die Carboxykomponente. Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Länge der Aminokomponente bzw. Carboxykomponente deutlich größer ist, insbesondere bei solchen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei denen eine sequenzielle Protease-katalysierte all-D-Peptidfragmentligation am polymeren Träger erfolgt. Die Länge beträgt dann bevorzugter Weise ein Vielfaches der vorstehend genannten Längenbereiche, ausgedrückt als n, wobei n eine ganze Zahl bevorzugter Weise von 1 bis 20 ist. [AKB: Hier mein Vorschlag. Vernünftig?] Dabei ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Aminokomponente größer, gleich oder kleiner als die Carboxykomponente ausgebildet ist,
    wobei als Kriterium hierzu in der Regel die Anzahl der die Aminokomponente bzw. die Carboxykomponente ausbildenden (D)-Aminosäuren herangezogen wird. Bevorzugter Weise werden die Aminokomponente sowie die Carboxykomponente in etwa die gleiche Länge von Aminosäuren aufweisen.
    Bei den erfindungsgemäßen Verfahren ist bevorzugter Weise vorgesehen, dass als Aminokomponente N-terminal ungeschützte Peptide eingesetzt werden. Bei der Carboxygruppe liegt die Abgangsgruppe typischerweise als Ester oder Amid vor, bevorzugter Weise als Ester oder Amid an der C-terminalen Carboxylgruppe der Carboxykomponente. Wie bereits ausgeführt, wird durch die spezifische Erkennung der Abgangsgruppe letztendlich die enzymatische Aktivität des Enzyms dergestalt abgeändert, dass auch all-D-Peptidfragmente anstelle der L-Fragmente durch die Protease verknüpft werden. Für Argininspezifische Proteasen, wie z.B. Clostripain, wurde für die 4-Guanidinophenylester-Abgangsgruppe eine derartige spezifitätsvermittelnde Wirkung festgestellt. Eine analoge Funktion ist auch für Amidinophenylester zu beobachten. Darüber hinaus besitzen aufgrund der Strukturhomolgie die 4-Guanidinophenylthioester- und 4-Amidinophenylthioester-Analoga eine ähnliche Wirkung und weisen zudem Vorteile bei der chemischen Synthese auf. Strukturhomologe dieser Verbindungen kommen ebenfalls als spezifitätsvermittelnde Abgangsgruppen in Betracht. Als strukturhomologe Verbindungen gelten solche mit einer basischen Gruppierung, wie beispielsweise Amino-, Amidino-, Guanidino- und Iminogruppierungen, die mit spezifitätsbestimmenden Aminosäureresten der Protease wechselwirken, d.h. insbesondere solchen Aminosäureresten, die direkt oder indirekt mit dem Substrat in Wechselwirkung treten bzw. solchen, die die katalytische Reaktion beeinflussen, und einem aliphatischen oder aromatischen Grundkörper mit z. B. einer Kettenlänge zwischen einer und sechs Methyleneinheiten bzw. Benzol-, Naphthalin- oder Indol-Grundkörpern zwischen der spezifischen basischen Gruppierung und der Ester- bzw. Amidfunktion als verknüpfendes Element zwischen der Carboxykomponente und der Abgangsgruppe. Die gesamte weitere Verfahrensweise, d.h. die Wahl der Edukte, des Puffers, des Mediums, der Reaktionszeit bzw. -Temperatur etc., ist verhältnismäßig unkritisch und kann vom Fachmann für biokatalytische Transformationen ermittelt werden.
    Die Reaktion erfolgt bevorzugter Weise in wässrigen Medien oder in Lösung oder Suspension, die ggf. Anteile organischer Lösungsmittel und/oder Puffersubstanzen enthält.
    Die Synthese der Carboxykomponenten mit der bevorzugter Weise Enzym-spezifischen Abgangsgruppe kann in Lösung durch Kondensation des Peptides oder der jeweiligen C-terminalen Aminosäure mit der jeweiligen Abgangsgruppe (oder geeigneten Vorstufen) oder aber am polymeren Träger, z.B. durch Verwendung von Sulfamylbutyrylaminomethyl-Safety-Catch-Harzen (vgl. R. Ingenito et al., J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 11369) oder Oxim-Harzen (vgl. V. Cerovsky, F. Bordusa, J. Peptide Res. 2000, 55, 325; V. Cerovsky et al., ChemBioChem 2000, 2, 126) mit synchroner Ester- bzw. Amid-Generierung und Peptidabspaltung erfolgen. Als ablösendes Nukleophil kommt die entsprechende Alkohol-, Phenol-, Naphthol-, Indol-, Amid- oder Thiol-Komponente selbst, wie auch bereits vorgefertigte N α-ungeschützte Aminosäureester bzw. -amide oder geeignete Vorstufen zum Einsatz. Die Synthese der als Aminokomponenten eingesetzen all-D-Peptidfragmente ist in Lösung oder durch Verwendung konventioneller Fmoc- oder Boc-Syntheseprotokolle am polymeren Träger routinemäßig möglich. Üblicherweise ist die Synthese am polymeren Träger wegen der Vorteile bei der Aufreinigung der einzelnen Zwischenprodukte einer aufwendigeren Lösungssynthese vorzuziehen.
    Die erhaltenen all-D-Peptide bzw. all-D-Proteine können mit üblichen Methoden der Peptidund Proteinchemie separiert und gereinigt werden. Ggf. vorhandene Schutzgruppen können nach im Stand der Technik bekannten Verfahren entfernt werden.
    Im Gegensatz zu anderen potentiell verwendbaren biokatalytischen Verfahren wird durch die erfindungsgemäße Verwendung von Enzymen und insbesondere Proteasen und Peptidasen eine hohe Syntheserate, Flexibilität, Syntheseeffizienz und Einfachheit in der Handhabung erreicht. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Aminokomponente(n) und bzw. oder Carboxykomponente(n) mit einem der erfindungsgemäßen Verfahren wiederum selbst hergestellt werden können und damit eine schrittweise Ligation des letzten Endes erwünschten all-D-Polypeptids aus verschiedenen Einzelfragmenten erreicht werden kann. Dabei ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass auch bei dieser spezifischen Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Immobilisierung der Aminokomponente bzw. Carboxykomponente vorgesehen ist. Bevorzugter Weise wird die Aminokomponente an eine feste Matrix immobilisiert, so dass die terminale Aminogruppe für die Reaktion mit der Carboxykomponente zur Verfügung steht. In Folge dieser Immobilisierung eines der Reaktionspartner und damit auch des Ligationsproduktes aus Aminokomponente und Carboxykomponente ergeben sich Vorteile hinsichtlich der Aufreinigung der einzelnen Zwischenprodukte, die beispielsweise durch einfaches Waschen möglich wird, wodurch die Effizienz der Synthese, insbesondere bei mehreren Ligationsschritten, erhöht wird. Bei den erfindungsgemäßen Verfahren werden, sofern üblich, die im Bereich der Synthese von Polypeptiden üblichen Schutzgruppen verwendet, wobei diese jedoch infolge der Spezifität der enzymatischen Reaktion bei einer Vielzahl von Reaktionen und Reaktionsbedingungen entfallen können. Andererseits ist es sehr wohl möglich, dass eine Entfernung der Schutzgruppen vor oder nach der Ligation der Carboxy- und/oder Aminokomponente vollständig oder teilweise erfolgt.
    Die vorliegende Erfindung wird anhand der Zeichnungen und Beispiele veranschaulicht, aus denen sich weitere Merkmale, Ausführungsformen und Vorteile der Erfindung ergeben. Dabei zeigt
    Fig. 1
    ein kinetisches Schema einer Protease-katalysierten Synthese von all-D-Polypeptiden,
    Fig. 2
    ein Reaktionsschema zur Synthese eines all-D-Polypeptids umfassend 15 D-Aminosäuren ausgehend von einer sechs D-Aminosäuren umfassenden Carboxykomponente und einer neun D-Aminosäuren umfassenden Aminokomponente ;
    Fig.3
    ein MALDI-Spektrum des unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellten Peptids;
    Fig. 4
    eine schematische Darstellung der sequentiellen Protease-katalysierten all-D-Peptidfragmentligation am polymeren Träger;
    Fig. 5A
    ein Verfahren zur Einführung einer Enzym-spezifischen Abgangsgruppe synchron zur Peptidspaltung vom polymeren Träger; und
    Fig. 5B
    ein Verfahren zur Einführung einer Enzym-spezifischen Abgangsgruppe in Lösung durch Verwendung eines vollgeschützten Peptids als Vorläufer-Molekül.
    Bei dem in Fig. 1 gezeigten vereinfachten kinetischen Schema einer Protease-katalysierten Synthese von all-D-Polypeptiden durch Kondensation, hierin auch als Fragmentkondensation bezeichnet, unter Verwendung einer Carboxykomponente, welche eine Abgangsgruppe umfasst und einer Aminokomponente. Dabei zeigt (A) das Enzym E mit den Bindungsstellen S3, S2, S1, S'1, S'2 und S'3. Im vorliegenden Fall besteht die Carboxykomponente aus drei individuellen D-Aminosäuren, die eine Abgangsgruppe tragen, die als Dreieck dargestellt ist. Die die Abgangsgruppe tragende Carboxykomponente bindet mit im vorliegenden Falle zwei Aminosäuren an das Enzym E (B), wobei die Abgangsgruppe spezifisch mit der Bindungsstelle S1 am Enzym in Wechselwirkung tritt. In einem weiteren Schritt (C) kommt es zur Abspaltung der Abgangsgruppe, woraufhin sich die Carboxykomponente an der Bindungsstelle umlagert und das D-Polypeptid als Substrat akzeptiert wird. Im folgenden Schritt (D) bindet die Aminokomponente aus im vorliegenden Falle drei D-Aminosäuren an die Bindungsstellen S'1, S'2 und S'3, woraufhin eine Peptidbindung zwischen der Carboxykomponente und der Aminokomponente ausgebildet wird. In einem weiteren Schritt (E) dissoziiert das solchermaßen erhaltene all-D-Polypeptid vom Enzym ab.
    Bei der in Fig. 2 dargestellten Synthese wird ausgehend von einem mit verschiedenen Schutzgruppen wie beispielsweise Benzoyl (Bz) oder Benzyl (OBzl) versehenes Pentapeptid, welches an ein Oximharz gebunden ist, mittels Trifluoressigsäure und einem mit OGp und einer Benzoxycarbonyl-Schutzgruppe versehenem D-Alanin zu einem Hexamer umgesetzt, von welchem anschließend unter Verwendung von Palladium die beiden Z-Schutzgruppen der Guanidinofunktion der Enzym-spezifischen Abgangsgruppe werden. Das solchermaßen erhaltene Hexamer weist an seinem Carboxylende die Abgangsgruppe 4-Guanidinophenylester (OGp) auf, die sodann mit dem dargestellten Nonamer als Aminokomponente unter Verwendung von Clostripain umgesetzt wird.
    Fig. 3 zeigt das MALDI-Spektrum des gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten und in Beispiel 5 beschriebenen Peptids. Die angegebene Molmasse von 891 entspricht der Hälfte des (M+2H) Signals von 1782. Die Molmasse des Peptids beträt 1780. Durch zweifache Ionisierung erscheint das Signal bei der halben Molmasse und stimmt demzufolge mit dem dargestellten Spektrum überein.
    Fig. 4 zeigt ein Reaktionsschema für die sequentielle Protease-katalysierte all-D-Peptidfragmentligation an einem polymeren Träger. Dabei wird ausgehend von einem polymeren Träger, an den eine Aminokomponente, im vorliegenden Falle ein all-D-Peptid (all-D-Peptid 1), über seine Carboxygruppe an den Träger gebunden ist, mit einer Carboxykomponente umgesetzt. In dem konkret dargestellten Beispiel ist die Carboxykomponente ein all-D-Peptid, als all-D-Peptid 2 bezeichnet, welches an seiner terminalen Carboxygruppe eine Abgangsgruppe R trägt, die als Säureester, Säureamid oder Säurethioester ausgebildet ist. Unter dem Einfluss der Protease Clostripain kommt es zu einer Ligation der Amino- und Carboxykomponente und Freisetzung der Abgangsgruppe. In einem weiteren Schritt kann sodann eine weitere Carboxygruppe bereitgestellt werden, die eine gleiche oder eine verschiedene Abgangsgruppe verglichen mit derjenigen von all-D-Peptid 2 aufweisen kann. Als Aminokomponente in diesem Reaktionsansatz dient das um all-D-Peptid 2 verlängerte, an die feste Matrix gekoppelte all-D-Peptid 1. Nach Ligation mittels Clostripain wird ein im vorliegenden Fall insgesamt 3 Peptidteile oder -fragmente umfassendes all-D-Peptid erhalten, welches an die feste Matrix gebunden ist. In Folge der Immobilisierung einer der Ausgangskomponenten sowie des Ligationsproduktes ergeben sich besondere Vorteile bei der Aufreinigung der Zwischenprodukte analog zur konventionellen Festphasen-Peptidsynthese.
    Fig. 5A zeigt eine Synthese für die Carboxykomponente, insbesondere die Einführung der Enzym-spezifischen Abgangsgruppe. Ausgehend von beispielsweise einem Sulfamylbuterylaminomethyl-Safety-Catch-Harz (kommerziell erhältlich von beispielsweise Calbiochem-Novabiochem AG) und ein daran gebundenes Peptid, hierin als Peptid 1 bezeichnet, wird entweder unter Verwendung von Jodacetonitril/DIPEA mit R'=CN oder Trimethylsilyldiazomethan mit R'=Si(CH3)3 ein Derivat hergestellt und nach Zusetzen einer Abgangsgruppe, beispielsweise vorliegend als Thio-, Hydroxy- oder Amin-Derivat, die Säureamidbindung zwischen dem Peptid und der festen Matrix gespalten unter gleichzeitiger Verknüpfung der Carboxygruppe von Peptid 1 mit der Abgangsgruppe, die beispielsweise sodann als Thioester, Ester oder Amid vorliegen kann.
    In Fig. 5 B ist eine Alternative für die Synthese der Carboxykomponente dargestellt. Hier erfolgt die Einführung der Enzym-spezifischen Abgangsgruppe in Lösung durch Verwendung eines vollgeschützten Peptids als precursor oder Vorläufermolekül. Genauer gesagt wird nach erfolgter Festphasen-Synthese von Peptid 1 dieses von der festen Matrix abgespalten unter Ausbildung einer Carboxygruppe, die dann mit der als HS-, HO- oder H2N-Derivat vorliegenden Abgangsgruppe kondensiert wird und so die mit einer Abgangsgruppe versehene Carboxykomponente bereitstellt, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann.
    Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielreaktionen näher ausgeführt.
    Beispiel 1 - Kondensation von Bz-D-Ala-OGp (Bz, Benzoyl; OGp, 4-Guanidinophenylester) mit ausgewählten D-Aminosäureamiden bzw. all-D-Peptiden mit Clostripain.
    1 ml 0,1 M Hepes-Puffer, pH 8,0, enthaltend 0,2 M NaCl, 0,02 M CaCl2, 5% Methanol, 2 mM Bz-D-Ala-OGp, 10 mM Aminokomponente und 15 µM Clostripain werden bei 25 °C unter pH-Kontrolle gerührt. Nach 10-60 min wird die Reaktionslösung mit 1 proz. Trifluoressigsäure in Methanol/Wasser (1:1, v/v) auf pH 2 gebracht. Die Ausbeuten werden HPLC analytisch bestimmt und sind in der nachfolgenden Tabelle 1 aufgeführt.
    Die Synthese von Bz-D-Ala-OGp erfolgte analog des Syntheseprotokolles von M. Thormann et al., Biochemistry 1999, 38, 6056. Die Aminokomponenten sind kommerziell erhältliche Produkte. Clostripain wurde von Amano (Japan) oder Fluka (Schweiz) bezogen.
    Carboxykomponente Aminokomponente all-D-Peptidprodukt Ausbeute [%]
    Bz-D-Ala-OGp H-D-Phe-NH2 Bz-D-Ala-D-Phe-NH2 90,5
    H-D-Leu-NH2 Bz-D-Ala-D-Leu-NH2 89,7
    H-D-Pro-NH2 Bz-D-Ala-D-Pro-NH2 60,7
    H-(D-Leu)2-OH Bz-D-Ala-(D-Leu)2-OH 55,2
    H-(D-Met)2-OH Bz-D-Ala-(D-Met)2-OH 43,1
    H-(D-Ala)3-OH Bz-D-Ala-(D-Ala)3-OH 64,8
    Beispiel 2 - Kondensation von Bz-D-Leu-OGp (Bz, Benzoyl; OGp, 4-Guanidinophenylester) mit ausgewählten D-Aminosäureamiden bzw. all-D-Peptiden mit Clostripain.
    Die Reaktionsbedingungen entsprechen denjenigen von Beispiel 1. Die verschiedenen Aminokomponenten, die mit Bz-D-Leu-OGp umgesetzt werden, die Reaktionsprodukte sowie die Ausbeuten sind in Tabelle 2 dargestellt.
    Carboxykomponente Aminokomponente all-D-Peptidprodukt Ausbeute [%]
    Bz-D-Leu-OGp H-D-Phe-NH2 Bz-D-Leu-D-Phe-NH2 66,3
    H-D-Leu-NH2 Bz-D-Leu-D-Leu-NH2 65,7
    H-D-Pro-NH2 Bz-D-Leu-D-Pro-NH2 46,2
    H-(D-Leu)2-OH Bz-D-Leu-(D-Leu)2-OH 41,9
    H-(D-Met)2-OH Bz-D-Leu-(D-Met)2-OH 37,3
    H-(D-Ala)3-OH Bz-D-Leu-(D-Ala)3-OH 45,8
    Beispiel 3 - Kondensation von Bz-D-Phe-OGp (Bz, Benzoyl; OGp, 4-Guanidinophenylester) mit ausgewählten D-Aminosäureamiden bzw. all-D-Peptiden mit Clostripain.
    Die Reaktionsbedingungen entsprechen denjenigen von Beispiel 1. Die verschiedenen Aminokomponenten, die mit Bz-D-Phe-OGp umgesetzt werden, die Reaktionsprodukte sowie die Ausbeuten sind in Tabelle 3 dargestellt.
    Carboxykomponente Aminokomponente all-D-Peptidprodukt Ausbeute [%]
    Bz-D-Phe-OGp H-D-Phe-NH2 Bz-D-Phe-D-Phe-NH2 67,4
    H-D-Leu-NH2 Bz-D-Phe-D-Leu-NH2 61,9
    H-D-Pro-NH2 Bz-D-Phe-D-Pro-NH2 44,0
    H-(D-Leu)2-OH Bz-D-Phe-(D-Leu)2-OH 41,6
    H-(D-Met)2-OH Bz-D-Phe-(D-Met)2-OH 38,1
    H-(D-Ala)3-OH Bz-D-Phe-(D-Ala)3-OH 46,6
    Beispiel 4 - Kondensation von Bz-Gly-OGp (Bz, Benzoyl; OGp, 4-Guanidinophenylester) mit ausgewählten D-Aminosäureamiden bzw. all-D-Peptiden mit Clostripain.
    Die Reaktionsbedingungen entsprechen denjenigen von Beispiel 1. Die verschiedenen Aminokomponenten, die mit Bz-D-Gly-OGp umgesetzt werden, die Reaktionsprodukte sowie die Ausbeuten sind in Tabelle 4 dargestellt.
    Carboxykomponente Aminokomponente all-D-Peptidprodukt Ausbeute [%]
    Bz-Gly-OGp H-D-Phe-NH2 Bz-Gly-D-Phe-NH2 98,4
    H-D-Leu-NH2 Bz-Gly-D-Leu-NH2 99,1
    H-D-Pro-NH2 Bz-Gly-D-Pro-NH2 72,6
    H-(D-Leu)2-OH Bz-Gly-(D-Leu)2-OH 45,8
    H-(D-Met)2-OH Bz-Gly-(D-Met)2-OH 43,6
    H-(D-Ala)3-OH Bz-Gly-(D-Ala)3-OH 62,4
    Beispiel 5 - Kondensation von Bz-D-Leu-D-Ile-D-Glu-D-Glu-D-Ala-D-Ala-OGp (Bz, Benzoyl; OGp, 4-Guanidinophenylester) mit H-D-Ile-D-Val-D-Asp-D-Ala-D-Val-D-Ile-D-Glu-D-Gln-D-Tyr-OH mit Clostripain.
    Die diesem Beispiel zugrundeliegende Reaktion ist in Fig. 1 dargestellt.
    0,32 ml des in DMSO (Dimethylsulfoxid) gelösten Hexapeptidesters Bz-D-Leu-D-Ile-D-Glu-D-Glu-D-Ala-D-Ala-OGp (0.01 mmol) werden zu der Aminokomponente H-D-Ile-D-Val-D-Asp-D-Ala-D-Val-D-Ile-D-Glu-D-Gln-D-Tyr-OH, gelöst in 0,465 ml 0,2 M Veronal-Puffer (pH 8,5) gegeben und auf 25 °C temperiert. Durch Zugabe von Clostripain (15 µM im Reaktionsansatz) wird die Reaktion gestartet und für weitere 1,5 Stunden bei 25 °C gerührt. Durch Zugabe einer 2 proz. Trifluoressigsäure in Methanol/Wasser (1:1, v/v) Lösung wird der pH-Wert auf 2 verringert und die Reaktion dadurch beendet. Die Ausbeute wurden HPLCchromatographisch bestimmt und betrug 65,5%. Die Identität des Syntheseproduktes wurde mittels MALDI-MS verifiziert. Das Ergebnis ist in Fig. 3 dargestellt.
    Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen sowie den Zeichnungen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebigen Kombinationen für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.

    Claims (23)

    1. Verfahren zur Synthese eines all-D-Polypeptids unter Verwendung eines Enzyms umfassend die Schritte:
      (a) Bereitstellen einer Aminokomponente, wobei die Aminokomponente aus mindestens einer D-Aminosäure, bevorzugter Weise einem all-D-Polypeptid besteht,
      (b) Bereitstellen der Carboxykomponente, wobei die Carboxykomponente eine Abgangsgruppe umfasst und aus mindestens einer D-Aminosäure, bevorzugter Weise einem all-D-Polypeptid besteht, und
      (c) Umsetzen der Aminokomponente und der Carboxykomponente mit dem Enzym unter Ausbildung einer Peptidbindung zwischen der Aminokomponente und der Carboxykomponente und unter Abspaltung der Abgangsgruppe von der Carboxykomponente, wobei das all-D-Polypeptid erhalten wird.
    2. Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend als Schritt:
      (d) Isolieren des all-D-Polypeptids.
    3. Verfahren zur Synthese von PNA unter Verwendung eines Enzyms umfassend die Schritte:
      (a) Bereitstellen einer Aminokomponente, wobei die Aminokomponente aus mindestens einem PNA-Monomer, bevorzugter Weise einem ersten PNA-Strang besteht,
      (b) Bereitstellen einer Carboxykomponente, wobei die Carboxykomponente eine Abgangsgruppe umfasst und die Carboxykomponente aus mindestens einem PNA-Monomer, bevorzugter Weise einem zweiten PNA-Strang besteht, und
      (c) Umsetzen der Aminokomponente und der Carboxykomponente mit dem Enzym unter Ausbildung einer Peptidbindung zwischen der Aminokomponente und der Carboxykomponente unter Abspaltung der Abgangsgruppe von der Carboxykomponente, wobei ein ligierter PNA-Strang erhalten wird.
    4. Verfahren nach Anspruch 3, weiter umfassend als Schritt:
      (d) Isolieren des ligierten PNA-Stranges.
    5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe, die Proteasen, Peptidasen und Hydrolasen umfasst.
    6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe, die Cysteinproteasen und Serinproteasen umfasst.
    7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym Clostripain, insbesondere Clostripain aus Clostridium histolyticum ist.
    8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine Prolylendopeptidase, insbesondere eine Prolylendopeptidase aus Flavobacterium meningoseptum ist.
    9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Abgangsgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, die 4-Guanidinophenylester , 4-Amidinophenylester, 4-Guanidinophenylthioester und 4-Amidinophenylthioester und Strukturhomologe davon umfasst.
    10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die die Abgangsgruppe enthaltende Carboxykomponente die folgende Struktur aufweist: Y-(D-Xaa)n-R    wobei Y = eine N-terminale Schutzgruppe, insbesondere Benzoyl ist,
         Xaa = eine beliebige α-Aminosäure, β-Aminosäure oder ein Derivat derselben ist
         R = eine Abgangsgruppe ist, insbesondere eine Abgangsgruppe ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die 4-Guanidinophenylester, 4-Amidinophenylester, 4-Guanidinophenylthioester, 4-Amidinophenylthioester und Strukturhomologe davon umfasst
         n = eine ganze Zahl von 1 bis 100
    11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Nα-Aminofunktion der Aminokomponente ungeschützt vorliegt, wobei Nα-Aminofunktion mit der Carboxyfunktion der Carboxykomponente reagiert.
    12. Verfahren zur Synthese eines all-D-Polypeptids unter Verwendung eines Enzyms umfassend die Schritte
      (a) Bereitstellen einer Aminokomponente, wobei die Aminokomponente aus mindestens einer D-Aminosäure, bevorzugter Weise einem all-D-Polypeptid besteht,
      (b) Bereitstellen der Carboxykomponente, wobei die Carboxykomponente eine Abgangsgruppe umfasst und die Carboxykomponente aus mindestens einer D-Aminosäure, bevorzugter Weise aus einem all-D-Polypeptid besteht, und
      (c) Umsetzen der Aminokomponente und der Carboxykomponente mit dem Enzym unter Ausbildung einer Peptidbindung zwischen der Aminokomponente und der Carboxykomponente und Abspalten der Abgangsgruppe von der Carboxykomponente, wobei das all-D-Polypeptid erhalten wird,
      wobei die Aminokomponente hergestellt ist nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11.
    13. Verfahren zur Synthese von PNA unter Verwendung eines Enzyms umfassend die Schritte
      (a) Bereitstellen einer Aminokomponente, wobei die Aminokomponente aus mindestens einem PNA-Monomer, bevorzugter Weise einem ersten PNA-Strang besteht,
      (b) Bereitstellen einer Carboxykomponente, wobei die Carboxykomponente eine Abgangsgruppe umfasst und die Carboxykomponente aus mindestens einem PNA-Monomer, bevorzugter Weise aus einem zweiten PNA-Strang besteht, und
      (c) Umsetzen der Aminokomponente und der Carboxykomponente mit dem Enzym unter Ausbildung einer Peptidbindung zwischen der Aminokomponente und der Carboxykomponente und Abspalten der Abgangsgruppe von der Carboxykomponente,
      wobei die Aminokomponente hergestellt ist nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11.
    14. Verfahren zur Synthese eines all-D-Polypeptids unter Verwendung eines Enzyms, insbesondere nach Anspruch 12, umfassend die Schritte
      (a) Bereitstellen einer Aminokomponente, wobei die Aminokomponente aus mindestens einer D-Aminosäure, bevorzugter Weise einem all-D-Polypeptid besteht,
      (b) Bereitstellen der Carboxykomponente, wobei die Carboxykomponente eine Abgangsgruppe umfasst und die Carboxykomponente aus mindestens einer D-Aminosäure, bevorzugter Weise aus einem all-D-Polypeptid besteht, und
      (c) Umsetzen der Aminokomponente und der Carboxykomponente mit dem Enzym unter Ausbildung einer Peptidbindung zwischen der Aminokomponente und der Carboxykomponente und Abspalten der Abgangsgruppe von der Carboxykomponente, wobei das all-D-Polypeptid erhalten wird,
      wobei die Carboxykomponente hergestellt ist nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11.
    15. Verfahren zur Synthese von PNA unter Verwendung eines Enzyms umfassend die Schritte
      (a) Bereitstellen einer Aminokomponente, wobei die Aminokomponente aus mindestens einem PNA-Monomer, bevorzugter Weise einem ersten PNA-Strang besteht,
      (b) Bereitstellen einer Carboxykomponente, wobei die Carboxykomponente eine Abgangsgruppe umfasst und die Carboxykomponente aus mindestens einem PNA-Monomer, bevorzugter Weise aus einem zweiten PNA-Strang besteht, und
      (c) Umsetzen der Aminokomponente und der Carboxykomponente mit dem Enzym unter Ausbildung einer Peptidbindung zwischen der Aminokomponente und der Carboxykomponente und Abspalten der Abgangsgruppe von der Carboxykomponente,
         wobei die Carboxykomponente hergestellt ist nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11.
    16. Verwendung eines Enzyms zur Synthese eines all-D-Polypeptids und/oder von PNA
    17. Verwendung nach Anspruch 16, wobei das all-D-Polypeptid und/oder die PNA durch Ligation einer Aminokomponente und einer Carboxykomponente hergestellt wird und die Carboxykomponente eine Abgangsgruppe umfasst.
    18. Verwendung nach Anspruch 12 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Abgangsgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, die 4- Guanidinophenylester, 4-Amidinophenylester, 4-Guanidinophenylthioester und 4-Amidinophenylthioester und Strukturhomologe davon umfasst.
    19. Verwendung einer Abgangsgruppe, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die 4-Guanidinophenylester, 4-Amidinophenylester, 4-Guanidinophenylthioester und 4-Amidinophenylthioester und Strukturhomologe davon umfasst, zur Synthese eines all-D-Polypeptids und/oder von PNA unter Verwendung eines Enzyms.
    20. Verwendung nach Anspruch 19 dadurch gekennzeichnet, dass die Abgangsgruppe an einem all-D-Polypeptid vorhanden ist und das die Abgangsgruppe tragende all-D-Polypeptid als Carboxykomponente mit einer D-Aminosäure oder mit einem all-D-Polypeptid als Aminokomponente unter Verwendung eines Enzyms umgesetzt wird.
    21. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Abgangsgruppe an einem PNA-Strang vorhanden ist und der die Abgangsgruppe tragende PNA-Strang als Carboxykomponente mit einem PNA-Monomer oder mit einem zweiten PNA-Strang als Aminokomponente unter Verwendung eines Enzyms umgesetzt wird.
    22. Verwendung nach einem der Ansprüche 16 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym Clostripain, insbesondere Clostripain aus Clostridium histolyticum ist.
    23. Verwendung nach einem der Ansprüche 16 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym Prolylendopeptidase, insbesondere Prolylendopeptidase aus Flavobacterium meningoseptum ist.
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