EP1303566A1 - Superparamagnetic pearl polymers - Google Patents

Superparamagnetic pearl polymers

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Publication number
EP1303566A1
EP1303566A1 EP01960401A EP01960401A EP1303566A1 EP 1303566 A1 EP1303566 A1 EP 1303566A1 EP 01960401 A EP01960401 A EP 01960401A EP 01960401 A EP01960401 A EP 01960401A EP 1303566 A1 EP1303566 A1 EP 1303566A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
meth
bead polymers
polymers according
acrylate
amino
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01960401A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Kamelia Karlou-Eyrisch
Wolfgang Podszun
Rainer Neumann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer AG
Original Assignee
Bayer AG
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Filing date
Publication date
Application filed by Bayer AG filed Critical Bayer AG
Publication of EP1303566A1 publication Critical patent/EP1303566A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08K—Use of inorganic or non-macromolecular organic substances as compounding ingredients
    • C08K9/00—Use of pretreated ingredients
    • C08K9/08—Ingredients agglomerated by treatment with a binding agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08K—Use of inorganic or non-macromolecular organic substances as compounding ingredients
    • C08K9/00—Use of pretreated ingredients
    • C08K9/10—Encapsulated ingredients
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G01N33/5434—Magnetic particles using magnetic particle immunoreagent carriers which constitute new materials per se
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2446/00—Magnetic particle immunoreagent carriers
    • G01N2446/10—Magnetic particle immunoreagent carriers the magnetic material being used to coat a pre-existing polymer particle but not being present in the particle core
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    • Y10T428/32—Composite [nonstructural laminate] of inorganic material having metal-compound-containing layer and having defined magnetic layer

Definitions

  • the invention relates to crosslinked bead polymers doped with superparamagnetic iron oxide, a process for producing the bead polymers, and their use in nucleic acid diagnostics.
  • Genetic diagnostics has found its way into the diagnostics of human diseases (e.g. detection of infectious agents, detection of mutations in the genome,
  • EP 0 707 077 describes a method for isolating nucleic acids from biological material using soluble, weakly basic polymer.
  • a precipitate is generated from the soluble, weakly basic polymer and the nucleic acid in an acidic pH range, the precipitate from the unprecipitated components of the biological material is separated and washed and the nucleic acid is released from the precipitate by adjusting a basic pH.
  • a disadvantage of the method according to EP 0707 077 is that the handling, in particular the separation and purification of the precipitation product is difficult and very time-consuming. This method can also not be carried out or only under difficult conditions with the aid of automated analysis devices.
  • US 4339337 and US 5356713 describe methods for producing magnetic beads from vinyl aromatic polymer using magnetic particles.
  • these bead polymers do not contain any functional groups for binding nucleic acids.
  • the beads show a clear residual magnetism (remanence), which makes their dispersibility more difficult.
  • WO 8303920 describes a method for producing magnetic polymer particles, in which polymer particles are treated with solutions of, for example, iron salt, the iron being precipitated in the form of iron hydroxide. In this method, the precipitated iron compound is found both in the polymer particles and on the surface of the polymer particles.
  • US 5206159 discloses a process for producing superparamagnetic polyacrylamide supports. However, these supports are unsuitable for the separation of nucleic acids.
  • a method for binding DNA to magnetic microparticles is known from US 5705628.
  • the magnetic microparticles preferably have a particle size of 1 ⁇ m and have a surface coated with carboxyl groups.
  • special salt con- concentration are used and polyethylene glycol is added in a defined concentration and with a special molecular weight.
  • the invention relates to crosslinked bead polymers doped with superparamagnetic iron oxide and containing basic amino groups, which are characterized in that the bead polymers receive copolymerized units of hydrophilic (meth) acrylate and amino (meth) acrylates.
  • (meth) acrylate means the derivatives of acrylic acid and methacrylic acid.
  • Hydropile (meth) acrylates are those whose homopolymers are more than 2.5% soluble in water at 25 ° C. Examples are mentioned. 2-hydroxyethyl methacrylate, 2-hydroxypropyl methacrylate, 2-hydroxyethyl acrylate, 2-hydroxypropyl acrylate, triethylene glycol monomethacrylate, tetraethylene glycol monomethacrylate,
  • Glycerol monomethacrylate acrylamide, methacrylamide and N, N-dimethylacrylamide.
  • Acrylamide is preferred.
  • Amino (meth) acrylates in the context of the present invention are derivatives of acrylic acid and methacrylic acid with preferably secondary and tertiary amino groups.
  • the amino groups can also be part of a cycloaliphatic or aromatic ring.
  • Suitable amino (meth) acrylates are, for example, N- (3-aminopropyl) methacrylamide, N- (3-imidazoylpropyl) methacrylamide, N- (2-imidazoyl-ethyl) methacrylamide, N- (3-aminopropyl) acrylamide, N- (3-imidazoylpropyl) acrylamide, N- (2-imidazoylethyl) acrylamide, N- (l, l-dimethyl-3-imidazoylpropyl) methacrylamide, N- (l, 1-dimethyl-3-imidazoylpropyl) acrylamide, N- (3-benzimidazole zoylpropyl)
  • Preferred amino (meth) acrylates are aminoalkyl (meth) acrylates, such as, for example, N, N-dimethylaminoethyl methacrylate, N, N-dimethylaminopropyl methacrylate, N, N-dimethylaminoethyl acrylate, and N-tert-butylaminopropyl methacrylate.
  • N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and N, N-dimethylaminopropyl methacrylate are particularly preferred.
  • the amino groups in the bead polymers according to the invention can be wholly or partly in protonated form, for example as hydrochlorides.
  • crosslinkers are: ethylene glycol, butanediol dimethacrylate, hexanediol, Pentaerytritoldimethacrylat, 1,2-glycerol, 1,3-glycerol, triethylene, tetra etylenglycoldimethacrylat trimethacrylate, Pentaerytritoltrimeth- acrylate, Pentaerytritoltetramethacrylat, ethylene glycol, butanediol, Pentaerytritoldiacrylat, 1,3-glycerol diacrylate, triethylene glycol diacrylate, trimethylol propane triacrylate, pentaerytritol triacrylate, pentaerytritol tetraacrylate, allyl methacrylate,
  • the amount of hydrophilic (meth) acrylate is 30 to 89% by weight, preferably 40 to 75% by weight, the amount and amino (meth) acrylates 10 to 69% by weight, preferably 20 to 50% by weight and the amount of Crosslinker 1 to 25% by weight, based in each case on the sum of hydrophilic (meth) acrylate, amino (meth) acrylates and crosslinker.
  • the iron oxide content in the superparamagnetic bead polymers according to the invention is 2 to 80% by weight, preferably 4 to 50% by weight, particularly preferably 5 to 35% by weight, based on the weight of the unswollen bead polymers.
  • the bead polymers according to the invention are superparamagnetic, that is to say they have a low residual magnetization (remanence) and a small coercive force. Their magnetic saturation is high, they are strongly attracted to an inhomogeneous magnetic field. After switching off the magnetic field, they can be easily and completely dispersed in water or aqueous buffer solutions.
  • the particle size of the superparamagnetic bead polymers according to the invention is 1 to 200 ⁇ m, preferably 5 to 100, particularly preferably 10 to 50 ⁇ m. Microscopic image analysis is well suited for determining the average particle size (0) and the particle size distribution.
  • Invention mean D ⁇ Dz ⁇ 2.5, preferably D ⁇ / Dz 2 2, particularly preferably D ⁇ / Dz
  • bead polymers according to the invention with a narrow particle size distribution are particularly well suited for the isolation of nucleic acids and, in the case of amplification processes, give particularly well reproducible results on the surface of the bead polymers.
  • the bead polymers according to the invention have a swellability in water. They have a swelling index of 1.25 to 8, preferably 2 to 6 (measured at
  • the quotient of the volume of the swollen bead polymer and the volume of the non-swollen bead polymer is defined as the swelling index.
  • Another object of the present invention is a process for the preparation of crosslinked bead polymers, which is characterized in that a monomer mixture of hydrophilic (meth) acrylate, amino (meth) acrylate, crosslinking agent and, if appropriate, further monomer is polymerized to beads by reverse suspension polymerization and then polymerized doped with superparamagnetic iron oxide by an aftertreatment with iron salt solution.
  • Reverse suspension polymerization in the sense of the invention is understood to mean a process in which the monomer mixture of hydrophilic (meth) acrylate, amino (meth) acrylate, crosslinking agent and, if appropriate, further monomer is activated with a radical generator which is soluble in the monomer mixture, and the activated monomer mixture is activated under Addition of a dispersing agent is emulsified into droplets in a non-aqueous solvent and then the droplets formed are cured by increasing the temperature.
  • the hydrophilic (meth) acrylate, the amino (meth) acrylate and the crosslinking agent correspond to the compounds mentioned above.
  • the amino (meth) acrylate can advantageously be used at least partially in the ammonium form, for example as the hydrochloride.
  • As a further monomer in amounts of up to about 25% by weight, based on the total monomer mixture for example N-vinylpyrrolidone, vinylimidazole, styrene, alfa-methylstyrene, chloromethylstyrene, acrylonitrile, vinyl acetate and maleic anhydride are suitable. It is convenient to dilute the monomer mixture with water or water-alcohol mixtures. Suitable amounts of diluent are, for example, 10 to 200% by weight, preferably 50 to 150% by weight, based on the monomer mixture.
  • Azo compounds and peroxy compounds are suitable as radical formers.
  • radical formers are the azo compounds, such as 2,2'-azobis [2- (2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride and 2,2'-azobis (2-amidino-propane) dihydrochloride.
  • the radical generator is used in amounts of 0.02 to 2.5% by weight, preferably 0.1 to 1% by weight, based on the total monomer mixture.
  • the non-aqueous solvent used is primarily hydrocarbons and halogenated hydrocarbons, and also low-viscosity silicone oils.
  • Linear, branched and cyclic aliphatic hydrocarbons are preferred. Examples include hexane, heptane, n-octane, iso-octane, iso-dodecane and cyclohexane. Of course, mixtures of different hydrocarbons can also be used.
  • Oil-soluble polymers with a molecular weight of 2,000 to 1,000,000 are suitable as dispersants.
  • Polymers with a proportion of polymerized units of C 6 -C 22 -alkyl (meth) acrylates and / or vinyl esters of C 6 -C 22 -carboxylic acids are preferred.
  • Polymers with polymerized units of stearyl methacrylate, lauryl methacrylate and vinyl stearate may be mentioned as examples.
  • Copolymers of C 6 -C 2 -alkyl- are particularly well suited
  • hydrophilic monomers are understood as meaning polymerizable olefinically unsaturated compounds which are wholly or partly soluble in water (more than 2.5% by weight > at 20 ° C.). Examples include: acrylic acid and its alkali and ammonium salts, methacrylic acid and its
  • Alkali and ammonium salts hydroxyethyl methacrylate, hydroxyethyl acrylate, diethylene glycol monoacrylate, diethylene glycol monomethacrylate, triethylene glycol monoacrylate, triethylene glycol monomethacrylate, tetraethylene glycol monoacrylate, tetraethylene glycol monomethacrylate, amininoethyl amide methacrylate, aminomethyl acrylamide, methacrylate, methacrylate, methacrylate, methacrylate, methacrylate, methacrylate, methacrylate, methacrylate Hydroxyethyl methacrylate, aminoethyl methacrylate, N, N-dimethylaminoethyl methacrylate, acrylamide, methacrylamide, vinyl pyrolidone and vinyl imidazole.
  • Particularly preferred dispersing aids are copolymers of
  • hydrophilic monomer from the group of hydroxyethyl methacrylate, aminoethyl methacrylate, N, N-dimethylaminoethyl methacrylate, acrylic amide, methacrylamide, vinyl pyrolidone and vinyl imidazole.
  • the amount of dispersant used is generally 0.1 to 8, preferably 0.5 to 5% by weight, based on the non-aqueous solvent.
  • the stirring speed during the polymerization is important for the adjustment of the
  • the size of the bead polymers obtained decreases with increasing stirrer speed.
  • the exact stirring speed for setting a certain predetermined bead size depends in individual cases on the reactor size, the reactor geometry and the stirrer geometry. It has proven to be expedient to determine the necessary stirring speed experimentally.
  • Laboratory reactors with a reaction volume of 0.51, which are equipped with a lattice stirrer, are generally obtained with the use of copolymers of methacrylic acid co-ester and hydroxyethyl methacrylic as dispersing agents with a bead diameter of 10 to 25 ⁇ m at speeds of 800 to 1000 rpm.
  • the polymerization temperature depends on the decomposition temperature of the initiator used and the boiling temperature of the non-aqueous solvent. It is generally between 50 to 150 ° C, preferably between 55 and 100 ° C. The polymerization takes 0.5 to a few hours (for example 10 hours). After the polymerization, the polymer can be isolated using customary methods, for example by filtration or decanting, and optionally dried after one or more washing processes. It is possible to fractionate the resulting polymer by physical methods in order to set a narrower particle size distribution. Suitable fractionation methods are, for example, sieving, sedimentation and air classification.
  • the aftertreatment for doping with superparamagnetic iron oxide is carried out using mixtures of aqueous Fe 2+ and Fe 3+ salt solutions.
  • the corresponding chlorides are particularly suitable.
  • the molar ratio of Fe 2+ : Fe 3+ should be 2: 1 to 1: 2. It is possible to start from iron salt solutions with a different Fe 2+ : Fe 3+ ratio and to set the optimal ratio of Fe 2+ : Fe 3+ by using oxidizing or reducing agents.
  • oxidizing agents are peroxo and nitro compounds, for example sodium bisulfite is suitable as reducing agent.
  • concentration of the iron salt solutions is generally
  • the iron salt solution is preferably brought into contact with dried, water-free bead polymer. It is particularly advantageous if the entire iron salt solution swells into the bead polymer and no excess iron salt solution remains in the interstices of the beads or on the surface of the beads.
  • the iron salts swollen in the bead polymer are converted into the corresponding iron hydroxides by adding bases.
  • Alkaline are well suited
  • the bead polymer is heated to convert the iron hydroxide into iron oxide (dehydration).
  • the heat treatment can be carried out in a simple manner aqueous suspension at 65 to 100 ° C. Suitable times for heating are 0.5 to 5 hours.
  • the conversion of iron hydroxide to iron oxide can be recognized by a change in color from light brown to dark brown to black.
  • the bead polymer is then separated off and dried.
  • the dried bead polymers doped with superparamagnetic iron oxide can be treated again in the manner described above, the content of superparamagnetic iron oxide being increased. In this way it is possible to set iron oxide contents of more than 50% by weight.
  • the present invention further provides a method for isolating nucleic acids from a sample, comprising the following steps
  • the bead polymer is doped with superparamagnetic iron oxide and contains polymerized units of hydrophilic (meth) acrylate and amino (meth) acrylates.
  • the method according to the invention is used to isolate and / or purify nucleic acids of different origins, for example from cells, tissue materials, Blood or infectious agents.
  • the material to be examined is digested by techniques known per se, such as digestion by protease digestion, a sample suitable for the further steps A to C, a lysate, being obtained. If necessary, the biological material is lysed in an intermediate step after process step A). Further suitable digestion processes have been described in DE-A-4 333 805.
  • the sample is mixed with the bead polymer according to the invention at a pH of 7 or less, preferably in the range from 2 to 6, particularly preferably in the range from 2 to 3 at room temperature.
  • Bead polymers are made using a magnetic field.
  • the complex of nucleic acid and bead polymer thus obtained can now be cleaned by washing with suitable buffers.
  • the pH of the complex is then adjusted to pH values above 7, preferably from 8 to 14, particularly preferably in the range from 12 to 14.
  • the bead polymers according to the invention provide higher adsorption and re-release rates than the soluble polymers according to EP-A-0 707 077.
  • the isolation is easier, i.e. perform with fewer steps and in shorter times.
  • the purity of the isolated nucleic acids is higher, in particular they contain fewer inhibiting by-products, so that the nucleic acids can be amplified particularly well, for example by means of the so-called "PCR reaction” and "RT-PCR”.
  • the method according to the invention is also superior to the method described in EP-A-0 707 077 with regard to digestion of the nucleic acids obtained by means of restriction enzymes.
  • the bead polymers according to the invention are also well suited for strengthening the adsorbed nucleic acids, for example by means of the so-called Perform "Taqman PCR reaction" directly on the bead polymers (ie without step C).
  • This reaction mixture was mixed with 0.063 g of potassium peroxydisulfate, dissolved in a mixture of 4.25 g of water and 2 g of methanol, and flushed with nitrogen gas at 450 rpm for 10 minutes. The stirring speed was then increased to 1000 rpm and the
  • the bead polymer treated with iron salt solution was mixed with 300 ml of water and stirred under a stream of air for 30 minutes and then heated to 72.degree.
  • the pH was adjusted to 9 throughout the process by adding ammonia solution. Then the solution was 0.155 g
  • This reaction mixture was mixed with 0.313 g of 2,2'-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride, dissolved in a mixture of 4.25 g of water and 2 g of methanol, and flushed with nitrogen gas at 450 rpm for 10 minutes. The temperature was then raised to 60 ° C. at 800 rpm within 1 hour and allowed to react at this temperature for 10 hours. After cooling, the resulting polymer was separated from the reaction solution by decanting and cleaned three times each with cyclohexane, water and methanol and dried at 40 ° C. in a vacuum drying cabinet. 15 g of dried polymer beads with an average particle size of 20 ⁇ m and a swelling index of 5 at 25 ° C. in water were obtained.

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Abstract

The invention relates to cross-linked pearl polymers doped with superparamagnetic iron oxide, to a method for producing said pearl polymers, and to their use in nucleic acid diagnostics.

Description

Superparamagnetische PerlpolymerisateSuperparamagnetic polymer beads
Die Erfindung betrifft vernetzte Perlpolymerisate dotiert mit superparamagnetischen Eisenoxid, ein Verfahren zur Herstellung der Perlpolymerisate, sowie deren Verwen- düng in der Nucleinsäuren Diagnostik.The invention relates to crosslinked bead polymers doped with superparamagnetic iron oxide, a process for producing the bead polymers, and their use in nucleic acid diagnostics.
In jüngster Zeit gewinnt die sogenannte Gen-Diagnostik zunehmend an Bedeutung.In recent times, so-called gene diagnostics has become increasingly important.
Die Gen-Diagnostik hat Eingang gefunden in die Diagnostik humaner Erkrankungen (u.a. Nachweis von Infektionserregern, Nachweis von Mutationen des Genoms,Genetic diagnostics has found its way into the diagnostics of human diseases (e.g. detection of infectious agents, detection of mutations in the genome,
Entdeckung von zirkulierenden Tumorzellen und Identifizierung von Risikofaktoren für die Prädisposition einer Erkrankung). Aber auch in der Veterinärmedizin, derDiscovery of circulating tumor cells and identification of risk factors for the predisposition of a disease). But also in veterinary medicine, the
Umweltanalytik und Nahrungsmitteltestung findet die Gen-Diagnostik mittlerweile ihre Anwendung. Ein weiteres Anwendungsgebiet stellen Untersuchungen an patho- logischen-/zytologischen Instituten oder im Rahmen forensischer Fragestellungen dar. Aber auch im Rahmen der Qualtitätskontrolle (z.B. Untersuchungen vonIn the meantime, genetic diagnostics are used in environmental analysis and food testing. Another area of application is investigations at pathological / cytological institutes or in the context of forensic questions. But also in the context of quality control (e.g. investigations of
Blutproben auf Infektionserrger-Freiheit) wird die Gen-Diagnostik mittlerweile eingesetzt und der Gesetzgeber plant, solche Testungen per Gesetz in Zukunft anzuordnen. Methoden, die auch bei der Gen-Diagnostik zum Einsatz kommen (wie z.B. Hybridisierungs- oder Amplifikationstechniken wie die PCR, bDNA oderGenetic diagnostics are now used and the legislator plans to order such tests by law in the future. Methods that are also used in gene diagnostics (such as hybridization or amplification techniques such as PCR, bDNA or
NASBA Technologie) gehören auch bei wissenschaftlichen Grundlagenarbeiten zu den Routineverfahren.NASBA technology) are also routine procedures for basic scientific work.
Bei der Gen-Diagnostik ist die Gewinnung von Gen-Proben aus biologischem Material, wie Zellen, Blut, Serum oder Urin ein wichtiger Teilschritt.In gene diagnostics, the extraction of gene samples from biological material such as cells, blood, serum or urine is an important sub-step.
In der EP 0 707 077 wird eine Methode zur Isolierung von Nucleinsäuren aus biologischem Material unter Verwendung von löslichem, schwach basischem Polymer beschrieben. Bei dieser Methode wird in einem sauren pH-Bereich einen Fällungsprodukt aus dem löslichen, schwach basischen Polymer und der Nuclein- säure erzeugt, das Fällungsprodukt von den nicht gefällten Bestandteilen des biologischen Materials abgetrennt und gewaschen und die Nucleinsäure aus dem Fällungsprodukt durch Einstellung eines basischen pH- Wertes wieder freigesetzt.EP 0 707 077 describes a method for isolating nucleic acids from biological material using soluble, weakly basic polymer. In this method, a precipitate is generated from the soluble, weakly basic polymer and the nucleic acid in an acidic pH range, the precipitate from the unprecipitated components of the biological material is separated and washed and the nucleic acid is released from the precipitate by adjusting a basic pH.
Ein Nachteil der Methode nach EP 0707 077 besteht darin, dass die Handhabung, insbesondere die Abtrennung und Reinigung des Fällungsproduktes schwierig und sehr zeitaufwendig ist. Diese Methode lässt sich auch nicht bzw. nur unter erschwerten Bedingungen mit Hilfe automatisierter Analysegeräte ausfuhren.A disadvantage of the method according to EP 0707 077 is that the handling, in particular the separation and purification of the precipitation product is difficult and very time-consuming. This method can also not be carried out or only under difficult conditions with the aid of automated analysis devices.
Die US 4339337 und US 5356713 beschreiben Methoden zur Herstellung von magnetischen Beads aus vinylaromatischen Polymer unter Verwendung von magnetischen Partikeln. Diese Perlpolymerisate enthalten allerdings keine mnktionellen Gruppen zur Anbindung von Nucleinsäuren. Außerdem zeigen die Beads einen deutlichen Restmagnetismus (Remanenz), wodurch ihre Dispergierbarkeit erschwert wird.US 4339337 and US 5356713 describe methods for producing magnetic beads from vinyl aromatic polymer using magnetic particles. However, these bead polymers do not contain any functional groups for binding nucleic acids. In addition, the beads show a clear residual magnetism (remanence), which makes their dispersibility more difficult.
In der WO 8303920 wird eine Methode zur Herstellung von magnetischen Polymerpartikeln beschrieben, bei der Polymerpartikel mit Lösungen aus beispielsweise Eisensalz behandelt werden, wobei das Eisen in Form von Eisenhydroxid ausgefällt wird. Bei dieser Methode befindet sich die ausgefällte Eisenverbindung sowohl in den Polymerpartikeln als auch an der Oberfläche der Polymerpartikel. Für einigeWO 8303920 describes a method for producing magnetic polymer particles, in which polymer particles are treated with solutions of, for example, iron salt, the iron being precipitated in the form of iron hydroxide. In this method, the precipitated iron compound is found both in the polymer particles and on the surface of the polymer particles. For some
Anwendungen, beispielsweise für die Amplifikation von Nucleinsäuren durch Taqman-PCR kann die Eisenverbindung an der Oberfläche stören.Applications, for example for the amplification of nucleic acids by Taqman PCR, can disrupt the surface iron compound.
Die US 5206159 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von superparamagnetischen Polyacrylamid-Trägern. Allerdings sind diese Träger zur Abtrennung von Nucleinsäuren ungeeignet.US 5206159 discloses a process for producing superparamagnetic polyacrylamide supports. However, these supports are unsuitable for the separation of nucleic acids.
Aus der US 5705628 ist eine Methode zur Bindung von DNA an magnetische Micropartikel bekannt. Die magnetischen Mikropartikel haben vorzugsweise eine Teilchen- große von 1 μm und besitzen eine mit Carboxylgruppen beschichtete Oberfläche. Um eine Anbindung der DNA an die Partikel zu erreichen müssen spezielle Salzkon- zentration angewendet werden und Polyethylenglycol in definierter Konzentration und mit speziellem Molekulargewicht zugesetzt werden.A method for binding DNA to magnetic microparticles is known from US 5705628. The magnetic microparticles preferably have a particle size of 1 μm and have a surface coated with carboxyl groups. In order to connect the DNA to the particles, special salt con- concentration are used and polyethylene glycol is added in a defined concentration and with a special molecular weight.
Es wurde nun gefunden, dass bestimmte vernetzte Perlpolymerisate, die mit super- paramagnetischen Eisenoxid dotiert sind und basische Aminogruppen enthalten, in hervorragender Weise zur direkten und automatisierten Isolierung von Nucleinsäuren geeignet sind.It has now been found that certain crosslinked bead polymers which are doped with super-paramagnetic iron oxide and contain basic amino groups are outstandingly suitable for the direct and automated isolation of nucleic acids.
Gegenstand der Erfindung sind vernetzte Perlpolymerisate dotiert mit superpara- magnetischen Eisenoxid und enthaltend basische Aminogruppen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Perlpolymerisate einpolymerisierte Einheiten aus hydrophilem (Meth)acrylat und Amino(meth)acrylate erhalten.The invention relates to crosslinked bead polymers doped with superparamagnetic iron oxide and containing basic amino groups, which are characterized in that the bead polymers receive copolymerized units of hydrophilic (meth) acrylate and amino (meth) acrylates.
Unter der Bezeichnung (Meth)acrylat werden die Derivate der Acrylsäure und Meth- acrylsäure verstanden.The term (meth) acrylate means the derivatives of acrylic acid and methacrylic acid.
Hydropile (Meth)acrylate sind solche, deren Homopolymerisate in Wasser bei 25°C zu mehr als 2,5 % löslich sind. Beispielhaft seien genannt. 2-Hydroxyethylmeth- acrylat, 2-Hydroxypropylmethacrylat, 2-Hydroxyethylacrylat, 2-Hydroxypropyl- acrylat, Triethylenglycolmonomethacrylat, Tetraethylenglycolmonomethacrylat,Hydropile (meth) acrylates are those whose homopolymers are more than 2.5% soluble in water at 25 ° C. Examples are mentioned. 2-hydroxyethyl methacrylate, 2-hydroxypropyl methacrylate, 2-hydroxyethyl acrylate, 2-hydroxypropyl acrylate, triethylene glycol monomethacrylate, tetraethylene glycol monomethacrylate,
Glycerinmonomethacrylat, Acrylamid, Methacrylamid und N,N-Dimethylacrylamid. Acrylamid ist bevorzugt.Glycerol monomethacrylate, acrylamide, methacrylamide and N, N-dimethylacrylamide. Acrylamide is preferred.
Amino(meth)acrylate im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Derivate der Acrylsäure und Methacrylsäure mit vorzugsweise sekundären und tertiären Aminogruppen. Die Aminogruppen können auch Teil eines cycloaliphatischen oder aromatischen Rings sein. Geeignete Amino(meth)acrylate sind z.B. N-(3-Amino- propyl)methacrylamid, N-(3 -Imidazoylpropyl)methacrylamid, N-(2-Imidazoyl- ethyl)methacrylamid, N-(3-Aminopropyl)acrylamid, N-(3-Imidazoylpropyl)- acrylamid, N-(2-Imidazoylethyl)acrylamid, N-(l,l-Dimethyl-3-Imidazoylpropyl)- methacrylamid, N-(l , 1 -Dimethyl-3-Imidazoylpropyl)acrylamid, N-(3-Benzimida- zoylpropyl)-methacrylamid und (3-Benzimidazoylpropyl)acrylamid. Bevorzugte Amino(meth)acrylate sind Aminoalkyl(meth)acrylate, wie z.B. N,N-Dimethyl- aminoethylmethacrylat, N,N-Dimethylaminopropylmethacrylat, N,N-Dimethyl- aminoethylacrylat, und N-tert.-Butylaminopropylmethacrylat. N,N-Dimethylamino- ethylmethacrylat und N,N-Dimethylaminopropylmethacrylat sind besonders bevorzugt. Die Aminogruppen können in den erfindungsgemäßen Perlpolymerisaten ganz oder teilweise in protonierter Form, z.B. als Hydrochloride vorliegen.Amino (meth) acrylates in the context of the present invention are derivatives of acrylic acid and methacrylic acid with preferably secondary and tertiary amino groups. The amino groups can also be part of a cycloaliphatic or aromatic ring. Suitable amino (meth) acrylates are, for example, N- (3-aminopropyl) methacrylamide, N- (3-imidazoylpropyl) methacrylamide, N- (2-imidazoyl-ethyl) methacrylamide, N- (3-aminopropyl) acrylamide, N- (3-imidazoylpropyl) acrylamide, N- (2-imidazoylethyl) acrylamide, N- (l, l-dimethyl-3-imidazoylpropyl) methacrylamide, N- (l, 1-dimethyl-3-imidazoylpropyl) acrylamide, N- (3-benzimidazole zoylpropyl) methacrylamide and (3-benzimidazoylpropyl) acrylamide. Preferred amino (meth) acrylates are aminoalkyl (meth) acrylates, such as, for example, N, N-dimethylaminoethyl methacrylate, N, N-dimethylaminopropyl methacrylate, N, N-dimethylaminoethyl acrylate, and N-tert-butylaminopropyl methacrylate. N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and N, N-dimethylaminopropyl methacrylate are particularly preferred. The amino groups in the bead polymers according to the invention can be wholly or partly in protonated form, for example as hydrochlorides.
Als Vernetzer kommen in Frage: Ethylenglycoldimethacrylat, Butandiol- dimethacrylat, Hexandioldimethacrylat, Pentaerytritoldimethacrylat, 1,2-Glycerin- dimethacrylat, 1,3-Glycerindimethacrylat, Triethylenglycoldimethacrylat, Tetra- etylenglycoldimethacrylat, Trimethylolpropantrimethacrylat, Pentaerytritoltrimeth- acrylat, Pentaerytritoltetramethacrylat, Ethylenglycoldiacrylat, Butandioldiacrylat, Pentaerytritoldiacrylat, 1,3-Glycerindiacrylat, Triethylenglycoldiacrylat, Trimethylol- propantriacrylat, Pentaerytritoltriacrylat, Pentaerytritoltetraacrylat, Allylmethacrylat,As crosslinkers are: ethylene glycol, butanediol dimethacrylate, hexanediol, Pentaerytritoldimethacrylat, 1,2-glycerol, 1,3-glycerol, triethylene, tetra etylenglycoldimethacrylat trimethacrylate, Pentaerytritoltrimeth- acrylate, Pentaerytritoltetramethacrylat, ethylene glycol, butanediol, Pentaerytritoldiacrylat, 1,3-glycerol diacrylate, triethylene glycol diacrylate, trimethylol propane triacrylate, pentaerytritol triacrylate, pentaerytritol tetraacrylate, allyl methacrylate,
Allylacrylat, Diethylenglycoldivinylether und Methylen-N,N'-bisacrylamid. Methylen-N,N'-bisacrylamid ist bevorzugt.Allyl acrylate, diethylene glycol divinyl ether and methylene-N, N'-bisacrylamide. Methylene-N, N'-bisacrylamide is preferred.
Die Menge an hydrophilem (Meth)acrylat beträgt 30 bis 89 Gew.%, vorzugsweise 40 bis 75 Gew.%, die Menge und Amino(meth)acrylate 10 bis 69 Gew.%, vorzugsweise 20 bis 50 Gew.% und die Menge an Vernetzer 1 bis 25 Gew.%, jeweils bezogen auf die Summe aus hydrophilem (Meth)acrylat, Amino(meth)acrylate und Vernetzer.The amount of hydrophilic (meth) acrylate is 30 to 89% by weight, preferably 40 to 75% by weight, the amount and amino (meth) acrylates 10 to 69% by weight, preferably 20 to 50% by weight and the amount of Crosslinker 1 to 25% by weight, based in each case on the sum of hydrophilic (meth) acrylate, amino (meth) acrylates and crosslinker.
Der Gehalt an Eisenoxid in den erfindungsgemäßen superparamagnetischen Perlpolymerisaten beträgt 2 bis 80 Gew.%, vorzugsweise 4 bis 50 Gew.%, besonders bevorzugt 5 bis 35 Gew.%, bezogen auf das Gewicht der ungequollenen Perlpolymerisate.The iron oxide content in the superparamagnetic bead polymers according to the invention is 2 to 80% by weight, preferably 4 to 50% by weight, particularly preferably 5 to 35% by weight, based on the weight of the unswollen bead polymers.
Die erfindungsgemäßen Perlpolymerisate sind superparamagnetisch, das heißt sie besitzen eine niedrige Restmagentisierung (Remanenz) und eine kleine Koerzitiv- kraft. Ihre magnetische Sättigung ist hoch, sie werden von einem inhomogenen Magnetfeld stark angezogen. Nach Ausschalten des Magnetfeldes lassen sie sich leicht und vollständig in Wasser oder wässrigen Pufferlösungen dispergieren.The bead polymers according to the invention are superparamagnetic, that is to say they have a low residual magnetization (remanence) and a small coercive force. Their magnetic saturation is high, they are strongly attracted to an inhomogeneous magnetic field. After switching off the magnetic field, they can be easily and completely dispersed in water or aqueous buffer solutions.
Die Teilchengröße der erfindungsgemäßen superparamagnetischen Perlpolymerisate beträgt 1 bis 200 μm, vorzugsweise 5 bis 100, besonders bevorzugt 10 bis 50 μm. Zur Bestimmung der mittleren Teilchengröße (0) und der Teilchengrößenverteilung ist die mikroskopische Bildanalyse gut geeignet.The particle size of the superparamagnetic bead polymers according to the invention is 1 to 200 μm, preferably 5 to 100, particularly preferably 10 to 50 μm. Microscopic image analysis is well suited for determining the average particle size (0) and the particle size distribution.
Als Maß für die Breite der Teilchengrößenverteilung der Perlpolymerisate wird dasThis is used as a measure of the width of the particle size distribution of the bead polymers
Verhältnis aus dem Mittelwert der Volumenverteilung (Dv) und dem Mittelwert derRatio of the mean of the volume distribution (Dv) and the mean of the
Anzahlverteilung (Dz) gebildet. Enge Teilchengrößenverteilungen im Sinne derNumber distribution (Dz) formed. Narrow particle size distributions in the sense of
Erfindung bedeuten DγDz < 2,5, bevorzugt Dγ/Dz ≤ 2, besonders bevorzugt Dγ/DzInvention mean DγDz <2.5, preferably Dγ / Dz 2 2, particularly preferably Dγ / Dz
< 1,5. Es wurde gefunden, dass erfindungsgemäße Perlpolymerisate mit enger Teilchengrößenverteilung besonders gut zur Isolierung von Nucleinsäuren geeignet sind und bei Amplifikationsverfahren an der Oberfläche der Perlpolymerisate besonders gut reproduzierbare Ergebnisse liefern.<1.5. It has been found that bead polymers according to the invention with a narrow particle size distribution are particularly well suited for the isolation of nucleic acids and, in the case of amplification processes, give particularly well reproducible results on the surface of the bead polymers.
Die erfmdungsgemäßen Perlpolymerisate besitzen eine Quellbarkeit in Wasser. Sie besitzen einen Quellungsindex von 1,25 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 (gemessen beiThe bead polymers according to the invention have a swellability in water. They have a swelling index of 1.25 to 8, preferably 2 to 6 (measured at
25°C). Als Quellungsindex ist der Quotient aus dem Volumen des gequollenen Perlpolymerisates und dem Volumen des nicht gequollenen Perlpolymerisates definiert.25 ° C). The quotient of the volume of the swollen bead polymer and the volume of the non-swollen bead polymer is defined as the swelling index.
Zur experimentellen Bestimmung des Quellungsindex werden 10 ml getrocknetes, gesiebtes Perlpolymerisat in einem 100 ml-Standzylinder eingewogen. Der Quotient aus dem Volumen der Schüttung (V0) und der eingewogener Menge (m) ergibt das Schüttvolumen (Vsc}j). Der Standzylinder wird mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt und 10 bis 20 h bei 25° stehen gelassen. Dabei wurde öfter geschüttelt und darauf geachtet, dass eventuell auftretende Luftblasen entweichen können. Das Volumen der gequollenen Schüttung wird abgelesen und ergibt Vj. Der Quotient aus Vj und VQ ist der Quellungsindex.For the experimental determination of the swelling index, 10 ml of dried, sieved bead polymer are weighed into a 100 ml standing cylinder. The quotient of the volume of the bed (V 0 ) and the weighed quantity (m) gives the bed volume (V sc} j ). The standing cylinder is made up to 100 ml with water and left to stand at 25 ° for 10 to 20 h. This was shaken more often and care was taken to ensure that any air bubbles that might occur could escape. The volume of the swollen fill is read and gives Vj. The quotient of Vj and V Q is the swelling index.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung vernetzter Perlpolymerisate, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man ein Monomergemisch aus hydrophilem (Meth)acrylat, Amino(meth)acrylat, Vernetzer und gegebenfalls weiterem Monomer zu Perlen durch umgekehrte Suspensionspolymerisation polymerisiert und diese anschließend durch eine Nachbehandlung mit Eisensalz-Lösung mit superparamagnetischen Eisenoxid dotiert.Another object of the present invention is a process for the preparation of crosslinked bead polymers, which is characterized in that a monomer mixture of hydrophilic (meth) acrylate, amino (meth) acrylate, crosslinking agent and, if appropriate, further monomer is polymerized to beads by reverse suspension polymerization and then polymerized doped with superparamagnetic iron oxide by an aftertreatment with iron salt solution.
Unter umgekehrter Suspensionspolymerisation im Sinne der Erfindung wird ein Verfahren verstanden, bei dem das Monomergemisch aus hydrophilem (Meth)- acrylat, Amino(meth)acrylat, Vernetzer und gegebenfalls weiterem Monomer mit einem im Monomergemisch löslichen Radikalbildner aktiviert wird und das akti- vierte Monomergemisch unter Zusatz eines Dispergierhilfsmittels in einem nicht wässrigem Lösungsmittel zu Tröpfchen emulgiert wird und dann die gebildeten Tröpfchen durch Temperaturerhöhung ausgehärtet werden.Reverse suspension polymerization in the sense of the invention is understood to mean a process in which the monomer mixture of hydrophilic (meth) acrylate, amino (meth) acrylate, crosslinking agent and, if appropriate, further monomer is activated with a radical generator which is soluble in the monomer mixture, and the activated monomer mixture is activated under Addition of a dispersing agent is emulsified into droplets in a non-aqueous solvent and then the droplets formed are cured by increasing the temperature.
Das hydrophile (Meth)acrylat, das Amino(meth)acrylat und der Vernetzer ent- sprechen den oben genannten Verbindungen. Das Amino(meth)acrylat kann dabei in vorteilhafter Weise zumindest teilweise in der Ammoniumform, beispielsweise als Hydrochlorid eingesetzt werden. Als weiteres Monomer kommen in Mengen von bis zu ca. 25 Gew.% bezogen auf das Gesamtmonomergemisch beispielsweise N- Vinylpyrrolidon, Vinylimidazol, Styrol, alfa-Methylstyrol, Chlormethylstyrol, Acryl- nitril, Vinylacetat und Maleinsäureanhydrid in Frage. Es ist günstig, das Monomergemisch mit Wasser oder Wasser-Alkoholgemischen zu verdünnen. Geeignete Mengen an Verdünnungsmittel sind beispielsweise 10 bis 200 Gew.%, vorzugsweise 50 bis 150 Gew.%o bezogen auf das Monomergemisch.The hydrophilic (meth) acrylate, the amino (meth) acrylate and the crosslinking agent correspond to the compounds mentioned above. The amino (meth) acrylate can advantageously be used at least partially in the ammonium form, for example as the hydrochloride. As a further monomer in amounts of up to about 25% by weight, based on the total monomer mixture, for example N-vinylpyrrolidone, vinylimidazole, styrene, alfa-methylstyrene, chloromethylstyrene, acrylonitrile, vinyl acetate and maleic anhydride are suitable. It is convenient to dilute the monomer mixture with water or water-alcohol mixtures. Suitable amounts of diluent are, for example, 10 to 200% by weight, preferably 50 to 150% by weight, based on the monomer mixture.
Als Radikalbildner sind Azoverbindungen und Peroxiverbindungen geeignet. BeiAzo compounds and peroxy compounds are suitable as radical formers. at
Verwendung von Wasser als Verdünnungsmittel ist Kaliumperoxodisulfat und Natriumperoxodisulfat, auch in Kombination mit Bisulfit oder Hydogensulfit, gut geeignet. Weitere bevorzugte Radikalbildner sind die Azoverbindungen, wie 2,2'- Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane]dihydrochlorid und 2,2 '- Azobis(2-amidino- propan)dihydrochlorid. Der Radikalbildner wird in Mengen von 0,02 bis 2,5 Gew.%, vorzugsweise von 0,1 bis 1 Gew.% bezogen auf Gesamtmonomergemisch verwendet.Use of water as a diluent is potassium peroxodisulfate and Sodium peroxodisulfate, also in combination with bisulfite or hydrogen sulfite, is well suited. Further preferred radical formers are the azo compounds, such as 2,2'-azobis [2- (2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride and 2,2'-azobis (2-amidino-propane) dihydrochloride. The radical generator is used in amounts of 0.02 to 2.5% by weight, preferably 0.1 to 1% by weight, based on the total monomer mixture.
Als nicht wässriges Lösungsmittel im Sinne der vorliegenden Erfindung sind in erster Linie Kohlenwasserstoffe und Halogenkohlenwasserstoffe, sowie niedrig vis- kose Siliconöle geeignet. Bevorzugt sind lineare, verzweigte und cyclische alipha- tische Kohlenwasserstoffe. Beispielhaft sei erwähnt Hexan, Heptan, n-Octan, iso- Octan, iso-Dodecan und Cyclohexan. Natürlich können auch Mischungen aus unterschiedlichen Kohlenwasserstoffe verwendet werden.For the purposes of the present invention, the non-aqueous solvent used is primarily hydrocarbons and halogenated hydrocarbons, and also low-viscosity silicone oils. Linear, branched and cyclic aliphatic hydrocarbons are preferred. Examples include hexane, heptane, n-octane, iso-octane, iso-dodecane and cyclohexane. Of course, mixtures of different hydrocarbons can also be used.
Als Dispergierhilfsmittel sind öllösliche Polymerisate mit einem Molekulargewicht von 2000 bis 1 000 000 geeignet. Bevorzugt sind Polymerisate mit einem Anteil von einpolymerisierten Einheiten von C6- bis C22-Alkyl(meth)acrylaten und/oder Vinyl- ester von C6- bis C22-Carbonsäuren. Beispielhaft seien Polymerisate mit einpolymerisierten Einheiten von Stearylmethacrylat, Laurylmethacrylat und Vinylstearat genannt. Besonders gut geeignet sind Copolymerisate aus C6- bis C 2-Alkyl-Oil-soluble polymers with a molecular weight of 2,000 to 1,000,000 are suitable as dispersants. Polymers with a proportion of polymerized units of C 6 -C 22 -alkyl (meth) acrylates and / or vinyl esters of C 6 -C 22 -carboxylic acids are preferred. Polymers with polymerized units of stearyl methacrylate, lauryl methacrylate and vinyl stearate may be mentioned as examples. Copolymers of C 6 -C 2 -alkyl- are particularly well suited
(meth)acrylaten bzw. Vinylester von C6- bis C22-Carbonsäuren und hydrophilen Monomeren. Unter hydrophilen Monomeren werden in diesem Zusammenhang poly- merisierbare olefinisch ungesättigte Verbindungen, die ganz oder teilweise (zu mehr als 2,5 Gew.-%> bei 20 °C) in Wasser löslich sind, verstanden. Als Beispiele seien genannt: Acrylsäure und ihre Alkali- und Ammoniumsalze, Methacrylsäure und ihre(meth) acrylates or vinyl esters of C 6 to C 22 carboxylic acids and hydrophilic monomers. In this context, hydrophilic monomers are understood as meaning polymerizable olefinically unsaturated compounds which are wholly or partly soluble in water (more than 2.5% by weight > at 20 ° C.). Examples include: acrylic acid and its alkali and ammonium salts, methacrylic acid and its
Alkali- und Ammoniumsalze, Hydroxyethylmethacrylat, Hydroxyethylacrylat, Diethylenglykolmonoacrylat, Diethylenglykolmonomethacrylat, Triethylenglykol- monoacrylat, Triethylenglykolmonomethacrylat, Tetraethylenglykolmonoacrylat, Tetraethylenglykolmonomethacrylat, Glycerinmonoacrylat, Aminoethylmethacrylat, N,N-Dimethylaminoethylmethacrylat, Acrylamid, Methacrylamid, Vinylpyrolidon und Vinylimidazol. Bevorzugt werden Hydroxyethylmethacrylat, Aminoethyl- methacrylat, N,N-Dimethylaminoethylmethacrylat, Acrylamid, Methacrylamid, Vinylpyrolidon und Vinylimidazol.Alkali and ammonium salts, hydroxyethyl methacrylate, hydroxyethyl acrylate, diethylene glycol monoacrylate, diethylene glycol monomethacrylate, triethylene glycol monoacrylate, triethylene glycol monomethacrylate, tetraethylene glycol monoacrylate, tetraethylene glycol monomethacrylate, amininoethyl amide methacrylate, aminomethyl acrylamide, methacrylate, methacrylate, methacrylate, methacrylate, methacrylate, methacrylate, methacrylate, methacrylate Hydroxyethyl methacrylate, aminoethyl methacrylate, N, N-dimethylaminoethyl methacrylate, acrylamide, methacrylamide, vinyl pyrolidone and vinyl imidazole.
Besonders bevorzugte Dispergierhilfsmittel sind Copolymerisate ausParticularly preferred dispersing aids are copolymers of
75 bis 99 Gew.%» C6- bis C2 -Alkyl(meth)acrylat und/oder Vinylester von C6- bis C22-Carbonsäuren und75 to 99 wt.% »C 6 - to C 2 alkyl (meth) acrylate and / or vinyl esters of C 6 - to C 22 carboxylic acids and
1 bis 25 Gew.% hydrophiles Monomer aus der Gruppe Hydroxyethylmethacrylat, Aminoethylmethacrylat, N,N-Dimethylaminoethylmethacrylat, Acryl- amid, Methacrylamid, Vinylpyrolidon und Vinylimidazol.1 to 25% by weight of hydrophilic monomer from the group of hydroxyethyl methacrylate, aminoethyl methacrylate, N, N-dimethylaminoethyl methacrylate, acrylic amide, methacrylamide, vinyl pyrolidone and vinyl imidazole.
Die Einsatzmenge des Dispergierhilfsmittels beträgt im allgemeinen 0,1 bis 8, vorzugsweise 0,5 bis 5 Gew.-%, bezogen auf das nicht wässrige Lösungsmittel.The amount of dispersant used is generally 0.1 to 8, preferably 0.5 to 5% by weight, based on the non-aqueous solvent.
Die Rührgeschwindigkeit bei der Polymerisation ist wichtig für die Einstellung derThe stirring speed during the polymerization is important for the adjustment of the
Teilchengröße. Beim erfindungsgemäßen Verfahren nimmt die Größe der erhaltenen Perlpolymerisate mit zunehmender Rührerdrehzahl ab. Die exakte Rührdrehzahl zur Einstellung einer bestimmten vorgegebenen Perlgröße hängt im Einzelfall stark von der Reaktorgröße, der Reaktorgeometrie und der Rührergeometrie ab. Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, die notwendige Rührdrehzahl experimentell zu ermitteln. FürParticle size. In the process according to the invention, the size of the bead polymers obtained decreases with increasing stirrer speed. The exact stirring speed for setting a certain predetermined bead size depends in individual cases on the reactor size, the reactor geometry and the stirrer geometry. It has proven to be expedient to determine the necessary stirring speed experimentally. For
Läborreaktoren mit 0,51-Reaktionsvolumen, die mit Gitterrühr ausgestattet sind, werden bei Verwendung von Copolymerisaten aus Methacrylsäure-Co-Ester und Hydroxyethylmethacryl als Dispergierhilfsmittel im allgemeinen Perldurchmesser von 10 bis 25 μm bei Drehzahlen von 800 bis 1000 Upm erreicht.Laboratory reactors with a reaction volume of 0.51, which are equipped with a lattice stirrer, are generally obtained with the use of copolymers of methacrylic acid co-ester and hydroxyethyl methacrylic as dispersing agents with a bead diameter of 10 to 25 μm at speeds of 800 to 1000 rpm.
Die Polymerisationstemperatur richtet sich nach der Zerfallstemperatur des eingesetzten Initiators und der Siedetemperatur des nicht wässrigen Lösungsmittels. Sie liegt im allgemeinen zwischen 50 bis 150 °C, vorzugsweise zwischen 55 und 100 °C. Die Polymerisation dauert 0.5 bis einige Stunden (beispielsweise 10 Stunden). Nach der Polymerisation kann das Polymerisat mit üblichen Methoden, z.B. durch Filtrieren oder Dekantieren, isoliert und gegebenenfalls nach ein oder mehreren Waschvorgängen getrocknet werden. Es ist möglich, das erhaltene Perpolymerisat durch physikalischen Methoden zu fraktionieren, um eine engere Teilchen- größenverteilung einzustellen. Geeignete Fraktionierungsmethoden sind beispielsweise Sieben, Sedimentieren und Windsichten.The polymerization temperature depends on the decomposition temperature of the initiator used and the boiling temperature of the non-aqueous solvent. It is generally between 50 to 150 ° C, preferably between 55 and 100 ° C. The polymerization takes 0.5 to a few hours (for example 10 hours). After the polymerization, the polymer can be isolated using customary methods, for example by filtration or decanting, and optionally dried after one or more washing processes. It is possible to fractionate the resulting polymer by physical methods in order to set a narrower particle size distribution. Suitable fractionation methods are, for example, sieving, sedimentation and air classification.
Die Nachbehandlung zur Dotierung mit superparamagnetischen Eisenoxid erfolgt mit Mischungen aus wässrigen Fe2+- und Fe3+-salz-Lösungen. Gut geeignet sind die ent- sprechende Chloride. Das molare Verhältnis von Fe2+: Fe3+ soll dabei 2:1 bis 1:2 betragen. Dabei ist es möglich von Eisensalzlösungen mit einem anderen Fe2+: Fe3+- Verhältnis auszugehen und das optimale Verhältnis von Fe2+: Fe3+ durch Verwendung von Oxidations- bzw. Reduktionsmitteln einzustellen. Beispiele für Oxidations- mittel sind Peroxo- und Nitroverbindungen, als Reduktionsmittel ist z.B. Natrium- bisulfit geeignet. Die Konzentration der Eisensalzlösungen beträgt im allgemeinenThe aftertreatment for doping with superparamagnetic iron oxide is carried out using mixtures of aqueous Fe 2+ and Fe 3+ salt solutions. The corresponding chlorides are particularly suitable. The molar ratio of Fe 2+ : Fe 3+ should be 2: 1 to 1: 2. It is possible to start from iron salt solutions with a different Fe 2+ : Fe 3+ ratio and to set the optimal ratio of Fe 2+ : Fe 3+ by using oxidizing or reducing agents. Examples of oxidizing agents are peroxo and nitro compounds, for example sodium bisulfite is suitable as reducing agent. The concentration of the iron salt solutions is generally
10 bis 50 Gew.%), vorzugsweise 20 bis 40 Gew.%>.10 to 50 wt.%), Preferably 20 to 40 wt.%>.
Die Eisensalzlösung wird vorzugsweise mit getrocknetem, wasserfreien Perlpoly- merisat in Kontakt gebracht. Dabei ist es besonders vorteilhaft, wenn die gesamte Eisensalzlösung in das Perlpolymerisat einquillt und keine überschüssige Eisensalzlösung in den Zwischenräumen der Perlen oder an der Oberfläche der Perlen verbleibt.The iron salt solution is preferably brought into contact with dried, water-free bead polymer. It is particularly advantageous if the entire iron salt solution swells into the bead polymer and no excess iron salt solution remains in the interstices of the beads or on the surface of the beads.
Die in das Perlpolymerisat eingequollenen Eisensalze werden durch Zusatz von Basen in die entsprechende Eisenhydroxide überfuhrt. Gut geeignet sind alkalischeThe iron salts swollen in the bead polymer are converted into the corresponding iron hydroxides by adding bases. Alkaline are well suited
Lösungen aus Natriumhydroxid, Natriumcarbonat oder Ammoniak. Ammoniak ist bevorzugt, da ein Überschuss leicht durch Abdampfen entfernt werden kann. Gebildete Ammoniumsalze werden durch gründliches Waschen mit Wasser entfernt.Solutions made from sodium hydroxide, sodium carbonate or ammonia. Ammonia is preferred because excess can be easily removed by evaporation. The ammonium salts formed are removed by washing them thoroughly with water.
Zur Überführung des Eisenhydroxids in Eisenoxid (Dehydratisierung) wird das Perlpolymerisat erhitzt. Die Wärmebehandlung kann dabei in einfacher Weise in wässriger Suspension bei 65 bis 100°C erfolgen. Geeigtete Zeiten für die Erhitzung sind 0,5 bis 5 Stunden. Die Umwandlung des Eisenhydroxids in Eisenoxid ist an einen Wechsel der Farbe von hell braun nach dunkelbraun bis schwarz erkennbar. Danach wird das Perlpolymerisat abgetrennt und getrocknet.The bead polymer is heated to convert the iron hydroxide into iron oxide (dehydration). The heat treatment can be carried out in a simple manner aqueous suspension at 65 to 100 ° C. Suitable times for heating are 0.5 to 5 hours. The conversion of iron hydroxide to iron oxide can be recognized by a change in color from light brown to dark brown to black. The bead polymer is then separated off and dried.
Falls gewünscht können die so erhaltenen getrockneten mit superparamagnetischen Eisenoxid dotierten Perlpolymerisate ein weiteres Mal in der oben beschriebenen Weise behandelt werden, wobei der Gehalt an superparamagnetischen Eisenoxid gesteigert wird. Auf diese Weise gelingt es Eisenoxidgehalte von mehr als 50 Gew.% einzustellen.If desired, the dried bead polymers doped with superparamagnetic iron oxide can be treated again in the manner described above, the content of superparamagnetic iron oxide being increased. In this way it is possible to set iron oxide contents of more than 50% by weight.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren aus einer Probe, umfassend die nachfolgenden SchritteThe present invention further provides a method for isolating nucleic acids from a sample, comprising the following steps
A) Vermischen der Probe mit einem Perlpolymerisat bei einem pH- Wert von 7 oder weniger, wobei die Nucleinsäuren adsorbiert werden,A) Mixing the sample with a bead polymer at a pH of 7 or less, the nucleic acids being adsorbed,
B) Abtrennen des Perlpolymerisates einschließlich der adsorbierten Nukleinsäuren unter Anwendung eines MagnetfeldesB) separation of the bead polymer including the adsorbed nucleic acids using a magnetic field
undand
C) Vermischen des Perlpolymerisates mit einer wässrigen Phase mit einem pH- Wert von größer 7, wobei die adsorbierten Nucleinsäuren freigesetzt werden,C) mixing the bead polymer with an aqueous phase with a pH greater than 7, the adsorbed nucleic acids being released,
welches dadurch gekennzeichnet ist, dass das Perlpolymerisat mit superparamagnetischen Eisenoxid dotiert ist und einpolymerisierte Einheiten aus hydrophilem (Meth)acrylat und Amino(meth)acrylate enthält.which is characterized in that the bead polymer is doped with superparamagnetic iron oxide and contains polymerized units of hydrophilic (meth) acrylate and amino (meth) acrylates.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist zur Isolierung und/oder Reinigung von Nucleinsäuren unterschiedlicher Herkunft, beispielsweise aus Zellen, Gewebematerialien, Blut oder Infektionserregern geeignet. Vor der Isolierung der Nucleinsäuren wird das zu untersuchende Material durch an sich bekannte Techniken, wie z.B. Aufschluss durch Proteaseverdau aufgeschlossen, wobei eine für die weiteren Schritte A bis C geeignete Probe, ein Lysat, erhalten wird. Gegebenenfalls erfolgt in einem Zwischen- schritt nach Verfahrensschritt A) die Lyse des biologischen Materials. Weitere geeignete Aufschlussverfahren sind in DE-A-4 333 805 beschrieben worden.The method according to the invention is used to isolate and / or purify nucleic acids of different origins, for example from cells, tissue materials, Blood or infectious agents. Before the nucleic acids are isolated, the material to be examined is digested by techniques known per se, such as digestion by protease digestion, a sample suitable for the further steps A to C, a lysate, being obtained. If necessary, the biological material is lysed in an intermediate step after process step A). Further suitable digestion processes have been described in DE-A-4 333 805.
Es erfolgt das Vermischen der Probe mit dem erfindungsgemäßen Perlpolymerisat bei einem pH-wert von 7 oder weniger, vorzugsweise im Bereich von 2 bis 6, besonders bevorzugt im Bereich von 2 bis 3 bei Raumtemperatur. Das Abtrennen desThe sample is mixed with the bead polymer according to the invention at a pH of 7 or less, preferably in the range from 2 to 6, particularly preferably in the range from 2 to 3 at room temperature. The separation of the
Perlpolymerisates erfolgt mit Hilfe eines Magnetfeldes. Der so gewonnene Komplex aus Nucleinsäure und Perlpolymerisat kann nun durch Waschen mit geeigneten Puffern gereinigt werden.Bead polymers are made using a magnetic field. The complex of nucleic acid and bead polymer thus obtained can now be cleaned by washing with suitable buffers.
Zur Freisetzung der gebundenen Nucleinsäuren aus dem Komplex erfolgt nun die pH-Einstellung des Komplexes auf pH- Werte oberhalb von 7, vorzugsweise von 8 bis 14, besonders bevorzugt im Bereich 12 bis 14.To release the bound nucleic acids from the complex, the pH of the complex is then adjusted to pH values above 7, preferably from 8 to 14, particularly preferably in the range from 12 to 14.
Die erfindungsgemäßen Perlpolymerisate liefern höhere Adsorption- und Wiederfrei- setzungsraten als die löslichen Polymerisate gemäß EP-A-0 707 077. Die Isolierung lässt sich leichter, d.h. mit weniger Arbeitsschritten und in kürzeren Zeiten durchfuhren. Die Reinheit der isolierten Nucleinsäuren ist höher, insbesondere enthalten sie weniger inhibierende Nebenprodukte, so dass eine Verstärkung der Nucleinsäuren, beispielsweise durch die sogenannte "PCR-Reaktion" und die "RT-PCR" besonders gut gelingt. Auch in Bezug auf Verdau der gewonnenen Nucleinsäuren mittels Restriktionsenzymen ist das erfindungsgemäße Verfahren der in der EP-A-0 707 077 beschriebenen Methode überlegen.The bead polymers according to the invention provide higher adsorption and re-release rates than the soluble polymers according to EP-A-0 707 077. The isolation is easier, i.e. perform with fewer steps and in shorter times. The purity of the isolated nucleic acids is higher, in particular they contain fewer inhibiting by-products, so that the nucleic acids can be amplified particularly well, for example by means of the so-called "PCR reaction" and "RT-PCR". The method according to the invention is also superior to the method described in EP-A-0 707 077 with regard to digestion of the nucleic acids obtained by means of restriction enzymes.
Die erfindungsgemäßen Perlpolymerisate sind auch gut geeignet, um eine Ver- Stärkung der adsorbierten Nukleinsäuren beispielsweise durch die sogenannte „Taqman-PCR-Reaktion" direkt auf den Perlpolymerisaten (d.h. ohne Teilschritt C) durch zuführen. The bead polymers according to the invention are also well suited for strengthening the adsorbed nucleic acids, for example by means of the so-called Perform "Taqman PCR reaction" directly on the bead polymers (ie without step C).
Beispiel 1example 1
Herstellung eines erfindungsgemäßen PerlpolymerisatesProduction of a bead polymer according to the invention
la) Herstellung eines Dispergierhilfsmittelsla) preparation of a dispersing aid
In einem 4 1-Reaktionsgefäß mit Gitterrührer, Gaseinlass- und Gasauslassrohr wurde unter Stickstoffbegasung eine Lösung aus 1324 g Cyclohexan, 511 g Methacrylsäure- C13-Ester, 57 g Hydroxyethylmethacrylat und 3,8 g Dibenzoylperoxyd innerhalb von 2 h bei 300 Upm auf 78°C erhitzt, 10 h bei dieser Temperatur belassen, anschließend auf 90°C erhitzt und weitere 1,5 h bei dieser Temperatur belassen. Danach wurde aufA solution of 1324 g of cyclohexane, 511 g of methacrylic acid C 13 ester, 57 g of hydroxyethyl methacrylate and 3.8 g of dibenzoyl peroxide was brought to 78 within 2 h at 300 rpm in a 4 1 reaction vessel with a grid stirrer, gas inlet and gas outlet tube, while gassing with nitrogen ° C heated, left at this temperature for 10 h, then heated to 90 ° C and left at this temperature for a further 1.5 h. After that was on
25°C abgekühlt. Man erhielt 1835 g einer 30,5 gew.-%igen Lösung eines Dispergiermittels. Der Staudinger-Index, gemessen mit Ubbelohde-Viskosimeter bei 25°C, betrug 72,6 ml/g.Cooled to 25 ° C. 1835 g of a 30.5% strength by weight solution of a dispersant were obtained. The Staudinger index, measured with an Ubbelohde viscometer at 25 ° C, was 72.6 ml / g.
lb) Herstellung eines vernetzten Perlpolymerisateslb) preparation of a crosslinked bead polymer
In einem 0,5 Liter-Reaktionsgefäß mit Gitterrührer, Rückflusskühler und Thermo- fühler wurden 41,25 g Dispergiermittel-Lösung aus la) und 240 g Cyclohexan vorgelegt und gerührt. 9,38 g N,N-Dimethylaminoethylmethacrylat wurde mit 13,3 g Wasser und 5,89 g 37 %iger Salzsäure 5 Minuten gerührt und mit 0,6 g In NaOH neutralisiert. Anschließend wurde diese Lösung in das Reaktionsgefäß gegeben. Zu dieser Mischung wurden 20,31 g Acrylamid und 1,56 g Methylen-N,N'-bisacryl- amid, gelöst in 8 g Methanol, zugegeben. Diese Reaktionsmischung wurde mit 0,063 g Kaliumperoxidisulfat, gelöst in einer Mischung aus 4,25 g Wasser und 2 g Methanol, versetzt und bei 450 Upm 10 Minuten mit Stickstoffgas gespült. Anschließend wurde die Rührgeschwindigkeit auf 1000 Upm gesteigert und die41.25 g of dispersant solution from 1a) and 240 g of cyclohexane were placed in a 0.5 liter reaction vessel with a grid stirrer, reflux condenser and thermal sensor and stirred. 9.38 g of N, N-dimethylaminoethyl methacrylate was stirred with 13.3 g of water and 5.89 g of 37% hydrochloric acid for 5 minutes and neutralized with 0.6 g in NaOH. This solution was then added to the reaction vessel. 20.31 g of acrylamide and 1.56 g of methylene-N, N'-bisacrylamide, dissolved in 8 g of methanol, were added to this mixture. This reaction mixture was mixed with 0.063 g of potassium peroxydisulfate, dissolved in a mixture of 4.25 g of water and 2 g of methanol, and flushed with nitrogen gas at 450 rpm for 10 minutes. The stirring speed was then increased to 1000 rpm and the
Temperatur innerhalb von 1 Stunde auf 60 °C erhöht und 10 Stunden bei dieser Temperatur belassen. Nach dem Abkühlen wurde das entstandene Polymerisat durch Dekantieren von der Reaktionslösung abgetrennt und je dreimal mit Cyclohexan, Wasser und Methanol gereinigt und bei 40°C im Vakuumtrockenschrank getrocknet. Man erhielt 14,7 g getrocknetes Perlpolymerisat mit einer mittleren Teilchengröße von 12 μm und einem Quelllungsindex von 6 bei 25°C in Wasser. lc) Dotierung des Perlpolymerisates mit EisenoxidTemperature increased to 60 ° C within 1 hour and left at this temperature for 10 hours. After cooling, the resulting polymer was separated from the reaction solution by decanting and cleaned three times each with cyclohexane, water and methanol and dried at 40 ° C. in a vacuum drying cabinet. 14.7 g of dried polymer beads with an average particle size of 12 μm and a swelling index of 6 at 25 ° C. in water were obtained. lc) doping of the bead polymer with iron oxide
In einem Rührgefäß mit einem Magnetrührer und Thermometer wurden 3,625 g Eisen(II)chlorid-Tetrahydrat, 1,5 g Eisen (III) )chlorid (wasserfrei) und 0,3 g Natriumbisulfit in 5,75 ml Wasser gelöst.In a stirred vessel with a magnetic stirrer and thermometer, 3.625 g of iron (II) chloride tetrahydrate, 1.5 g of iron (III)) chloride (anhydrous) and 0.3 g of sodium bisulfite were dissolved in 5.75 ml of water.
In einem 100 ml Dreihalskolben wurden 5 g getrocknetes Perlpolymerisat (lb) vorgelegt und extern mit Eis gekühlt und anschließend mit der oben beschriebenen Eisensalzlösung versetzt. Die entstehende Suspension wurde 35 Minuten gerührt und anschließend mit kochendem Wasser extern erwärmt bis aus der Suspension eine feste Mischung entstanden war. Anschließend wurde das Perlpolymerisat in einem anderen 500 ml Kolben mit einer alkalischen Lösung aus 67,5 ml Wasser und 8,5 ml 26%>iger Ammoniak-Lösung (pH = 9) 1 Stunde gerührt und mit 250 ml Wasser verdünnt. Nach dem Abdekantieren der Lösung wurde dieser Vorgang mehrfach wiederholt.5 g of dried bead polymer (Ib) were placed in a 100 ml three-necked flask and cooled externally with ice and then mixed with the iron salt solution described above. The resulting suspension was stirred for 35 minutes and then heated externally with boiling water until a solid mixture had formed from the suspension. The bead polymer was then stirred in another 500 ml flask with an alkaline solution of 67.5 ml of water and 8.5 ml of 26% strength ammonia solution (pH = 9) for 1 hour and diluted with 250 ml of water. After decanting the solution, this process was repeated several times.
Das mit Eisensalzlösung behandelte Perlpolymerisat wurden mit 300 ml Wasser versetzt und unter Luftstrom 30 Minuten gerührt und anschließend auf 72°C erwärmt. Der pH- Wert wurde während des gesamten Vorgangs durch Zugabe von Ammoniaklösung auf 9 eingestellt. Anschließend wurde die Lösung mit 0,155 gThe bead polymer treated with iron salt solution was mixed with 300 ml of water and stirred under a stream of air for 30 minutes and then heated to 72.degree. The pH was adjusted to 9 throughout the process by adding ammonia solution. Then the solution was 0.155 g
Kaliumperoxodisulfat versetzt und weitere 2,5 Stunden bei 72°C erwärmt. Nach dem Abdekantieren der Flüssigkeit wurde der Feststoff fünfmal mit Wasser gewaschen und dabei mit Ultraschall behandelt. Man erhielt 5,1 g schwarzes Perlpolymerisat mit einem Eisengehalt von 6 Gew.%, welches von einem inhomogenen Magnetfeld stark angezogen wird. Beispiel 2Potassium peroxodisulfate added and heated at 72 ° C for a further 2.5 hours. After decanting the liquid, the solid was washed five times with water and treated with ultrasound. 5.1 g of black polymer beads with an iron content of 6% by weight were obtained, which is strongly attracted to an inhomogeneous magnetic field. Example 2
Herstellung eines erfindungsgemäßen PerlpolymerisatesProduction of a bead polymer according to the invention
2a) Herstellung eines vernetzten Perlpolymerisates In einem 0,5 Liter-Reaktionsgefaß mit Gitterrührer, Rückflusskühler und Thermo- fühler wurden 41 g Dispergierhilfsmittel-Lösung aus la) und 240 g Cyclohexan vorgelegt und gerührt. 9,38 g N,N-Dimethylaminoethylmethacrylat wurde mit 13,3 g Wasser und 6 g 37 %ige Salzsäure 5 Minuten gerührt. Anschließend wurde diese Lösung in das Reaktionsgefäß gegeben. Zu dieser Mischung wurde 18,75 g Acryl- amid und 3,13 g Methylen-N,N'-bisacrylamid, gelöst in 8 g Methanol, zugegeben.2a) Preparation of a Crosslinked Bead Polymer 41 g of dispersing aid solution from 1a) and 240 g of cyclohexane were placed in a 0.5 liter reaction vessel with a grid stirrer, reflux condenser and thermal sensor and stirred. 9.38 g of N, N-dimethylaminoethyl methacrylate was stirred with 13.3 g of water and 6 g of 37% hydrochloric acid for 5 minutes. This solution was then added to the reaction vessel. 18.75 g of acrylamide and 3.13 g of methylene-N, N'-bisacrylamide, dissolved in 8 g of methanol, were added to this mixture.
Diese Reaktionsmischung wurde mit 0,313 g 2,2'-Azobis(2-amidinopropan)- dihydrochlorid, gelöst in einer Mischung aus 4,25 g Wasser und 2 g Methanol, versetzt und bei 450 Upm 10 Minuten mit Stickstoffgas gespült. Anschließend wurde die Temperatur innerhalb von 1 Stunde bei 800 Upm auf 60°C erhöht und 10 Stunden bei dieser Temperatur reagieren lassen. Nach dem Abkühlen wurde das entstandene Polymerisat durch dekantieren von der Reaktionslösung abgetrennt und je dreimal mit Cyclohexan, Wasser und Methanol gereinigt und bei 40°C im Vakuumtrockenschrank getrocknet. Man erhielt 15 g getrocknetes Perlpolymerisat mit einer mittleren Teilchengröße von 20 μm und einem Quelllungsindex von 5 bei 25°C in Wasser.This reaction mixture was mixed with 0.313 g of 2,2'-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride, dissolved in a mixture of 4.25 g of water and 2 g of methanol, and flushed with nitrogen gas at 450 rpm for 10 minutes. The temperature was then raised to 60 ° C. at 800 rpm within 1 hour and allowed to react at this temperature for 10 hours. After cooling, the resulting polymer was separated from the reaction solution by decanting and cleaned three times each with cyclohexane, water and methanol and dried at 40 ° C. in a vacuum drying cabinet. 15 g of dried polymer beads with an average particle size of 20 μm and a swelling index of 5 at 25 ° C. in water were obtained.
2b) Dotierung des Perlpolymerisates mit Eisenoxid2b) doping the bead polymer with iron oxide
5 g des Perlpolymerisates aus 2a) wurde wie unter ld) beschrieben mit Eisenoxid dotiert. Dabei wurde der gesamte Vorgang zweifach durchgeführt. Man erhielt 5,4 g schwarzes Perlpolymerisat mit einem Eisengehalt von 8,3 Gew.%, welches von einem inhomogenen Magnetfeld stark angezogen wird. 5 g of the bead polymer from 2a) was doped with iron oxide as described under ld). The entire process was carried out twice. 5.4 g of black bead polymer with an iron content of 8.3% by weight were obtained, which is strongly attracted to an inhomogeneous magnetic field.

Claims

Patentansprflche Patentansprflche
1. Vernetzte Perlpolymerisate dotiert mit superparamagnetischen Eisenoxid und enthaltend basische Aminogruppen, dadurch gekennzeichnet, dass die Perl- polymerisate einpolymerisierte Einheiten aus hydrophilem Meth)acrylat und1. Crosslinked bead polymers doped with superparamagnetic iron oxide and containing basic amino groups, characterized in that the bead polymers are polymerized units of hydrophilic meth) acrylate and
Amino(meth)acrylate erhalten.Amino (meth) acrylates obtained.
2. Vernetzte Perlpolymerisate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das hydrophile (Meth)acrylat (Meth)acrylamid ist.2. Crosslinked bead polymers according to claim 1, characterized in that the hydrophilic (meth) acrylate is (meth) acrylamide.
3. Vernetzte Perlpolymerisate nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Amino(meth)acrylat ein Aminoalkylmethacrylat ist.3. Crosslinked bead polymers according to claim 1 or 2, characterized in that the amino (meth) acrylate is an aminoalkyl methacrylate.
4. Vernetzte Perlpolymerisate nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Perlpolymerisate einpolymerisierte Einheiten aus (Meth)acrylamid und4. Crosslinked bead polymers according to claim 3, characterized in that the bead polymers copolymerized units of (meth) acrylamide and
Dialkylaminoalkyl(meth)acrylate und Methylenbis(meth)acrylamid als Vernetzer enthalten.Dialkylaminoalkyl (meth) acrylates and methylenebis (meth) acrylamide as crosslinkers.
5. Vernetzte Perlpolymerisate nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Teilchengröße von 5 bis 100 μm besitzen.5. Crosslinked bead polymers according to claim 1 to 4, characterized in that they have a particle size of 5 to 100 microns.
6. Vernetzte Perlpolymerisate nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchengrößenverteilung Dγ/Dz kleiner als 2,5 ist.6. Crosslinked bead polymers according to claim 5, characterized in that the particle size distribution Dγ / Dz is less than 2.5.
7. Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren unter Verwendung der Perlpolymerisaten gemäß Anspruch 1 bis 6.7. A method for isolating nucleic acids using the bead polymers according to claims 1 to 6.
8. Verfahren zur Herstellung vernetzter Perlpolymerisate, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Monomergemisch aus hydrophilem (Meth)acrylat, Amino(meth)acrylate, Vernetzer und gegebenfalls weiteren Monomeren zu8. A process for the preparation of crosslinked bead polymers, characterized in that a monomer mixture composed of hydrophilic (meth) acrylate, amino (meth) acrylates, crosslinking agent and, if appropriate, further monomers
Perlen durch umgekehrte Suspensionspolymerisation polymerisiert und diese durch eine Nachbehandlung mit Eisensalzlösung mit superparamagnetischen Eisenoxid dotiert.Pearls polymerized by reverse suspension polymerization and this doped with superparamagnetic iron oxide by post-treatment with iron salt solution.
9. Verfahren zur Herstellung vernetzter Perlpolymerisate nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass Amino(meth)acrylate teilweise oder ganz in9. A process for the preparation of crosslinked bead polymers according to claim 8, characterized in that amino (meth) acrylates are partially or wholly in
Form eines Ammoniumsalzes eingesetzt wird.Form of an ammonium salt is used.
10. Verfahren zur Amplifikation von Nucleinsäuren durch PCR, insbesondere Taqman PCR auf der Oberfläche von Partikeln, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel Perlpolymerisate gemäß Anspruch 1 bis 6 sind. 10. A method for the amplification of nucleic acids by PCR, in particular Taqman PCR on the surface of particles, characterized in that the particles are bead polymers according to claims 1 to 6.
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