EP1268772A2 - Peptide and nucleic acid coding therefor for the detection, diagnosis and therapy of diseases of the nervous system - Google Patents

Peptide and nucleic acid coding therefor for the detection, diagnosis and therapy of diseases of the nervous system

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Publication number
EP1268772A2
EP1268772A2 EP01917008A EP01917008A EP1268772A2 EP 1268772 A2 EP1268772 A2 EP 1268772A2 EP 01917008 A EP01917008 A EP 01917008A EP 01917008 A EP01917008 A EP 01917008A EP 1268772 A2 EP1268772 A2 EP 1268772A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
peptide
polypeptide
nucleic acid
specific
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01917008A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Heinrich Brinkmeier
Reinhard Rüdel
Peter Schneider
Andrea Dankwardt
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sension Biologische Detektions- und Schnelltestsysteme GmbH
Original Assignee
Sension Biologische Detektions- und Schnelltestsysteme GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sension Biologische Detektions- und Schnelltestsysteme GmbH filed Critical Sension Biologische Detektions- und Schnelltestsysteme GmbH
Publication of EP1268772A2 publication Critical patent/EP1268772A2/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P23/00—Anaesthetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • Peptide and nucleic acid coding therefor for the determination, diagnosis and therapy of diseases of the nervous system
  • the invention relates to a new peptide, the peptide-containing polypeptides and fusion proteins, test kits and methods for the detection of the peptide, nucleic acids coding therefor and pharmaceutical compositions containing the peptide or the coding nucleic acid.
  • the invention further relates to various uses of the peptide, processes for its preparation and antibodies directed against the peptide.
  • GNS Guillain-Barre syndrome
  • the progressive limb weakness to complete paralysis is a main characteristic of the disease.
  • paraesthesia, loss of sensory perception and disorders of the autonomic nervous system are often observed.
  • the maximum manifestation of the symptoms is reached within one to two weeks, in rare cases within four weeks. Symptoms usually resolve within months, with approximately 80% of patients showing no or only weak deficits that do not restrict movement.
  • CIDP chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy
  • the process of demyelination, particularly in the area of the nerve roots, is currently considered to be the crucial mechanism in the development of the nerve conduction block.
  • One thesis is based on a disruption of the blood / cerebrospinal fluid (CSF) barrier as an earlier, important step in the development of the disease.
  • Another thesis claims that as a result of the disease, leaks in the blood / CSF barrier develop and cause the increased protein content in the CSF.
  • non-specific serum components could enter the CSF from the blood without direct relation to the immune system, cause neuronal or glial dysfunction and / or change the neuronal activity.
  • An alternative mechanism is a reduced flow rate of the CSF, which could explain the increased protein content of the CSF.
  • MS multiple sclerosis
  • the diagnosis today is based on clinical electrophysiological data, imaging NMR analyzes of the brain and general, less disease-specific, liquid diagnostic tests.
  • Anti-inflammatory corticosteroids can be used successfully in acute episodes.
  • immunosuppressants and immunomodulators e.g. interferon-ß
  • Interferon-ß seems to reduce the substrates in relapsing MS.
  • physical therapy ie targeted training of the muscles and training of movement sequences, has also proven to be beneficial for improving the quality of life of MS patients. The earlier the diagnosis is made and the treatment is started, the more favorable the prognosis, because damage caused by active sources of inflammation cannot be completely reversed.
  • the present invention is therefore based on the object of providing means and ways which can be used specifically for the diagnosis and / or treatment of inflammatory and / or anti-irritant processes and diseases of the nervous system, in particular in the case of demyelinating diseases.
  • a further object of the invention is to provide means and methods which permit the earliest possible diagnosis and thus early therapy.
  • a peptide with the sequence Gln-Tyr-Asn-Ala-Asp (SEQ ID No: 1) and derivatives thereof, the derivatives being characterized by the addition, substitution, inversion, insertion and / or deletion of one or several amino acid (s) differ from the original sequence and have at least 10% of the sodium ion channel binding ability of the peptide (SEQ ID NO: 1) and / or at least 50% of the neuroinhibitory activity, or salts or esters thereof.
  • polypeptide as used in the description below includes peptides or proteins composed of 6 or more amino acids.
  • Neuroinhibito activity here means the ability of a substance to block sodium ion channels.
  • neuroinhibitory activity can be measured by inhibiting sodium ion currents through voltage-dependent sodium ion channels.
  • the experimental conditions for measuring the neuroinhibitory activity are given, for example, in Brinkmeier et al., Muscle and Nerve 19 (1996), 54-62.
  • the neuroinhibitory activity can be determined using differentiated NH15-CA2 [Neuroblastoma x Glioma] cells (Hamprecht et al., Meth. Enzymol. 109 (1985), 316-41; Brinkmeier et al., Muscle Nerve 19 (1996), 54- 62) can be determined.
  • Example 8 shows the measurement of the neuroinhibitory activity.
  • Sodium ion channel binding ability here means the ability of substances to bind to sodium ion channels, in particular voltage-dependent sodium ion channels.
  • the sodium ion channel binding ability can be determined, for example, as indicated in Trainer et al., J. Biol. Chem. 271 (1996), 11261-11267.
  • Example 9 shows an example of the measurement of the sodium ion channel binding ability.
  • homology denotes the degree of relationship between two or more peptides or polypeptides, which is determined by the agreement between the sequences by means of known methods, e.g. B. the computer-aided sequence comparisons (Basic local alignment search tool, S.F. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410) can be determined.
  • the percentage of "homology” results from the percentage of identical regions in two or more sequences, taking into account gaps or other sequence peculiarities. As a rule, special computer programs with algorithms are used, which take the special requirements into account.
  • GCG program package including GAP (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (12): 387 (1984); Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (WI)); BLASTP, BLASTN, and FASTA (Altschul, S. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410) (1999)).
  • the BLASTX program can be obtained from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and other sources (BLAST Handbook, Altschul S., et al., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul, S., et al., Mol. Biol 215: 403-410 (1990)).
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • the well-known Smith Waterman algorithm can also be used to determine homologies.
  • Preferred parameters for amino acid sequence comparison include the following:
  • the GAP program is also suitable for use with the above parameters.
  • the above parameters are the error parameters (default parameters) for amino acid sequence comparisons, with gaps at the ends not reducing the homology value. In the case of very short sequences compared to the reference sequence, it may also be necessary to increase the expectation value up to 100,000 (expectation value) and, if necessary, to reduce the word length to up to 2.
  • gap opening penalties including those mentioned in the Program Guide, Wisconsin Package, Version 9, September 1997, may be used.
  • the selection will depend on the comparison to be performed and also on whether the comparison is carried out between pairs of sequences, GAP or Best Fit being preferred, or between a sequence and an extensive sequence database, with FASTA or BLAST being preferred.
  • Recombinant expression in a suitable host cell should be understood to mean all expression methods known in the prior art in known expression systems which could be used here, but not all are described in detail because they are a matter of course for the skilled worker.
  • a peptide with the sequence Gln-Tyr-Asn-Ala-Asp (SEQ ID NO: 1) occurs in the cerebrospinal fluid of patients with multiple sclerosis and Guillain-Barre syndrome.
  • the peptide binds to sodium ion channels and blocks their sodium currents.
  • the electrophysiological effect of a 10 ⁇ M solution of the peptide according to the invention corresponds to the effect of a 50 ⁇ M lidocaine solution on neuronal sodium channels.
  • the peptide advantageously has a saturation of the neuroinhibitory effect at a concentration of 100 ⁇ M, so that even in the case of an overdose in the context of a therapeutic use, normalization of the axonal activity but no blocking is to be expected.
  • the peptide occurs in a concentration range of 8 to 25 ⁇ M in the cerebrospinal fluid samples from GBS and MS patients, but was not observed in the controls of healthy individuals. Without being bound by theory, the peptide could further aggravate the neurological symptoms of demyelinating diseases by binding to the sodium ion channels in Ranvier's laces and increased inhibition of impulse conduction, especially in neurons that are already affected by demyelination ,
  • Antibodies were also found in the serum of a GBS patient that bind specifically to the peptide. No peptide-specific antibodies could be detected in sera from healthy controls. The peptide thus has a high potential for the diagnosis of neurological diseases.
  • the invention thus relates to a peptide with the sequence Gln-Tyr-Asn-Ala-Asp (SEQ ID NO: 1) and derivatives thereof, which are characterized by the addition, substitution, inversion, insertion and / or deletion of one or more amino acids ⁇ ) differ from the original sequence and at least 10%, preferably 50%, particularly preferably 90% of the sodium ion binding capacity of the peptide (SEQ ID NO: 1) and / or at least 50%, preferably 80%, particularly preferably 90% of the neuroinhibitory activity exhibit.
  • Derivatives that have increased neuroinhibitory activity are of interest as effective anesthetics.
  • derivatives are suitable as neuroprotective agents because of their property of damping the electrical excitability of axons and nerve cells.
  • derivatives with neuroprotective properties are provided for the treatment of polyneuropathies, in particular diabetic polyneuropathy, multiple sclerosis (MS), stroke and pain conditions.
  • the derivative is at least 60% homologous, preferably at least 80% and particularly preferably at least 90% homologous to the original sequence (SEQ ID NO: 1).
  • the derivative is particularly preferably obtained by conservative substitution of at least one or more amino acid (s) of the peptide (SEQ ID NO: 1). It is further preferred that aspartic acid or glutamic acid is provided as the C-terminal amino acid.
  • Conservative modifications are understood to mean those which are based on the exchange of amino acids and exert as little influence as possible on the (spatial) structure of the peptide.
  • the group of basic amino acids includes arginine, lysine and histidine.
  • the group of acidic amino acids includes glutamic acid and aspartic acid.
  • the uncharged / polar amino acids include glutamine, asparagine, serine, threonine and tyrosine.
  • the non-polar amino acids include phenylalanine, tryptophan, cysteine, glycine, alanine, valine, isoleucine, leucine and proline.
  • conservative substitution means the exchange of a given non-acid by an amino acid belonging to the same physico-chemical group.
  • Particularly preferred derivatives of the peptide are selected from: NYNAD (SEQ ID NO: 5), SYNAD (SEQ ID NO: 6), TYNAD (SEQ ID NO: 7), YYNAD (SEQ ID NO: 8), QQNAD (SEQ ID NO : 9), QNNAD (SEQ ID NO: 10), QSNAD (SEQ ID NO: 11), QTNAD (SEQ ID NO: 12), QYQAD (SEQ ID NO: 13), QYSAD (SEQ ID NO: 14), QYTAD (SEQ ID NO: 15), QYYAD (SEQ ID NO: 16), QYNGD (SEQ ID NO: 17), QYNVD (SEQ ID NO: 18), QYNID (SEQ ID NO: 19), QYNLD (SEQ ID NO: 20), and QYNAE (SEQ ID NO: 21).
  • the peptide is further modified at least on an N-terminal, internal and / or C-terminal amino acid.
  • modifications can be such that the peptide structure is extended or modified on the C-terminal group and / or is extended or modified on the N-terminal group and / or has corresponding extensions and / or modifications on both groups.
  • modifications can be naturally occurring modifications in the cerebrospinal fluid or serum; however, the peptide can also be modified synthetically so that it is, for example, functionally adapted to a diagnostic system.
  • amino acids or other chemical structures act as spacers in order to be able to be optimally recognized by an antibody in a diagnostic test system after coupling to a carrier molecule, or if they are particularly suitable for recognizing the peptide when presented as an antigen exhibit.
  • lo groups and / or C-terninal carboxy groups Further modifications include conventional N-terminal protective groups, such as the benzyloxycarbonyl group, and / or C-terminal protective groups.
  • the salts of the peptide are provided according to the invention.
  • physiologically acceptable salts such as. B. sodium salts, potassium salts, magnesium salts, bicarbonate salts, acetates, citrates and chlorides are preferred.
  • esters of the peptide according to the invention are also included according to the invention, preference being given to esters which can be cleaved under physiological conditions. Such esters can have advantages in galenical preparation and have an increased shelf life.
  • the invention provides a polypeptide which comprises at least one peptide according to the invention.
  • the polypeptide is preferably the natural precursor protein from which the peptide according to the invention with the sequence Gln-Tyr-Asn-Ala-Asp is obtained by post-translational modification, in particular processing operations.
  • the invention provides a polypeptide selected from polypeptides having a molecular weight of about 25 kDa, about 35 kDa, about 50 kDa, about 60 kDa, about 80 kDa and about 150 kDa according to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis under reducing conditions, wherein the polypeptide specifically reacts with a QYNAD-specific antiserum.
  • the size information relativized by "approximately" means that depending on the buffer system and selected size markers, deviations of 0-5%, maximum 10%, can result.
  • polypeptide of approximately 35 kDa the polypeptides were found in samples from MS and GBS patients, and to a lesser extent also in samples from healthy controls. The 25 and 35 kDa polypeptides were found in individual but not all patient sera.
  • each of the polypeptides is obtainable from human cerebrospinal fluid or serum.
  • the CSF or the serum particularly preferably comes from a GBS or MS patient.
  • the polypeptides can be purified in a manner known per se, including chromatographic techniques such as gel filtration, ion exchange, hydrophobic interaction and affinity chromatography.
  • chromatographic techniques such as gel filtration, ion exchange, hydrophobic interaction and affinity chromatography.
  • the use of antibodies is particularly suitable for affinity chromatography.
  • polyclonal antibodies, which specifically recognize the peptide QYNAD, for the purification of the polypeptides is possible, but the use of monoclonal antibodies is preferred.
  • the polypeptides can be separated depending on their size.
  • the sequence analysis of the purified polypeptides can be carried out using commercially available automatic protein sequencers.
  • the invention provides derivatives of the polypeptides, the derivatives differing from the polypeptide by the addition, substitution, inversion, insertion and / or deletion of one or more amino acids.
  • the derivatives bind to a QYNAD-specific antiserum.
  • the antiserum can be produced in a manner known per se by immunizing experimental animals such as mice or rabbits. Binding of the derivative of the polypeptide to the QYNAD-specific antiserum can be demonstrated, for example, in an ELISA.
  • derivatives are included which differ from the original sequence by the addition, substitution, inversion, insertion and / or deletion of one or more amino acids ⁇ ) and which have at least 50%, preferably 80%, in particular 90%, of the binding ability of the polypeptide to QYNAD- have specific antiserum.
  • the derivative of the polypeptide is at least 80% homologous to the polypeptide.
  • the derivative is obtained by conservative substitution of one or more amino acid (s) of the polypeptide.
  • the precursor protein (s) can also be obtained by screening a human cDNA library from the brain, spinal cord, lymphocytes, macrophages, oligodendrocytes or glial cells with a probe which was produced on the basis of the sequence according to the invention.
  • Suitable cDNA banks are commercially available; their manufacture is also part of the general specialist knowledge; see. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989.
  • the sequence of the oligonucleotide, which is suitable as a probe for screening the cDNA library results from the universal genetic code. However, oligonucleotide sequences which correspond to the frequency of human codon use are preferred.
  • the amino acid glutamine is generally encoded by the codons CAA or CAG, preferably due to the human codon use by CAG.
  • the amino acid tyrosine is generally encoded by TAT or TAC, preferably by TAC.
  • the amino acid asparagine is encoded by AAT, AAC, preferably by AAC.
  • the amino acid alanine is encoded by GCT, GCC, GCA or GCG, preferably by GCC.
  • the amino acid aspartic acid is encoded by GAT or GAC, preferably by GAC.
  • the codon use reproduced in this context can be found, for example, in the following references: Grantham, R. et al., Nucleic Acids Res. 8 (1980), r49-r62; the current internet address FTP: // ftp. it. embnet.org/pub/databases/codonusage/hum. cod.
  • the probe suitable for searching the cDNA bank has the general sequence: CARTAYAAYGCNGAY (SEQ ID NO: 3).
  • R here denotes A or G; Y represents T or C; and N means A, G, C or T.
  • the probe has the sequence CAGTACAACGCCGAC (SEQ ID NO: 4).
  • the opposite strand of the above-mentioned sequences is also suitable for searching the cDNA bank.
  • the oligonucleotide can be made using known solid phase synthesis techniques. To be used as a probe, the oligonucleotide is labeled radioactive or non-radioactive (e.g. fluorescence) using known methods.
  • the probe is contacted with the cDNA library according to methods known to those skilled in the art (Maniatis et al., Supra).
  • the contacting is preferably carried out under stringent conditions; stringent conditions in this context are an incubation at 68 ° C. overnight in 0.5 ⁇ SSC; 1% blocking reagent (Boehringer Mannheim), 0.1% Nat umlauryl sarcosinate, followed by washing with 2 x SSC, 0.1% SDS.
  • the cDNA clones thus obtained are isolated and sequenced using known methods.
  • the amino acid sequence of the precursor protein can be derived directly from the nucleotide sequence in a manner known to those skilled in the art.
  • the polypeptide or precursor protein according to the invention can be produced by chemical and / or enzymatic synthesis or by genetic engineering methods, in particular recombinant expression, in heterologous expression systems.
  • variants of the precursor protein which in this context are also referred to as polypeptides, are also provided which have neuroinhibito activity and / or bind to a sodium ion channel.
  • the sodium ion channel is preferably a voltage-dependent sodium ion channel.
  • the neuroinhibitory activity is preferably the inhibition of a sodium ion channel. The determination of the binding to a sodium ion channel or the neuroinhibitory activity can be carried out as above for the peptide according to the invention.
  • the polypeptides according to the invention have 10%, preferably 50%, particularly preferably 90% of the sodium ion channel binding ability of the peptide with the sequence (SEQ ID NO: 1) and / or at least 50%, preferably 80% and particularly preferably 90% of the neuroinhibitory activity.
  • the invention provides a fusion protein which contains at least one peptide and / or polypeptide according to the invention and at least one biologically active polypeptide or an active fragment thereof.
  • biologically active polypeptide is intended to mean all peptides or proteins with biological activity. It is preferred that the biological activity is an activity involved in the development and regeneration of cells, tissues and organs of the human and animal body. It is preferred that biological activity affect the development and differentiation of phepheric and central nervous system cells and their supply cells.
  • the fusion protein according to the invention fulfills the task of increasing the local concentration of the biologically active polypeptide in the vicinity of sodium ion channels, preferably voltage-dependent sodium ion channels, on the basis of the peptide or polypeptide sequence according to the invention also contained in the fusion protein.
  • biologically active polypeptides which themselves have only a low or medium binding capacity for these sodium ion channels, are significantly increased in their binding capacity.
  • Preferred fusion proteins include ciliary neurotrophic factor (CNTF), brain-de ved neurotrophic factor (BDNF), neurotrophin-3 (NT-3), neurotrophin 4/5 (NT-4/5) and glial-derived neurotrophic factor (GDNF), in each case in connection with the peptide according to the invention.
  • fusion protein in this context means that at least one peptide and / or polypeptide according to the invention is added to the amino acid sequence of the biologically active polypeptide or an active fragment thereof, and / or is inserted into the amino acid sequence of the biologically active polypeptide, and / or at least one oligopeptide sequence naturally occurring in the amino acid sequence of the biologically active polypeptide is substituted by a peptide or polypeptide according to the invention.
  • the peptide, polypeptide or fusion protein according to the invention further comprises a sequence relevant for recombinant expression at the N-terminus, the sequence relevant for recombinant expression being M or MX, and M being methionine and X being any one or more amino acids
  • MX can represent, for example, a signal sequence which is known to the person skilled in the art for numerous prokaryotic and eukaryotic proteins.
  • X comprises 1 to 40, preferably 5 to 30 or 15 to 25 amino acids.
  • the invention also provides nucleic acid molecules which comprise a nucleic acid coding for a peptide, polypeptide or fusion protein according to the invention.
  • the nucleic acid contained in the nucleic acid molecule according to the invention can be genomic DNA or synthetic DNA, synthetic DNA also being understood to mean those which contain modified internucleoside bonds.
  • the nucleic acids can be RNA molecules. B. may be required for expression by means of recombinant RNA vector systems.
  • nucleic acid molecule which comprises a nucleic acid which is selected from:
  • nucleic acid which hybridizes with a nucleic acid according to (i) or (ii) and codes for a polypeptide which binds to a sodium ion channel and / or has neuroinhibitory activity.
  • the nucleic acids according to (iii) can be obtained, for example, by using a detectably labeled probe which corresponds to a nucleic acid according to (i) or (ii) to search for cDNA or genomic DNA libraries.
  • cDNA / genomic DNA banks from vertebrates, preferably from mammals and particularly preferably from humans, can be used here.
  • the mRNA on which the cDNA bank is based can preferably be obtained from the brain, spinal cord, lymphocytes, macrophages, oligodendrocytes or glial cells. Positive cDNA / genomic DNA clones are identified using standard procedures; see. Maniatis et al., Supra.
  • the hybridization indicated under (iii) is carried out under stringent conditions.
  • Stringent hybridization conditions are e.g. B. incubation at 68 ° C overnight in 0.5 x SSC; 1% blocking reagent (Boehringer Mannheim); 0.1% sodium lauryl sarcosinate, followed by washing with 2 x SSC; 0.1% SDS.
  • the nucleic acid molecule according to the invention comprises a promoter suitable for expression, the nucleic acid sequence being under the control of the promoter.
  • the choice of promoter depends on the expression system used for expression. In general, constitutive promoters are preferred, but inducible promoters such as e.g. B. the metallothionein promoter possible.
  • vectors are provided which contain the nucleic acid molecule according to the invention.
  • Numerous cloning and expression vectors are known in the prior art, cf. Recombinant Gene Expression Protocols, Meth. Mol. Biol. Vol. 62, Humana Press, New Jersey, USA.
  • the vector used should contain an origin of replication and possibly further regulatory regions.
  • the vector can be selected from bacterial ophages such as ⁇ derivatives, adenoviruses, vaccinia viruses, baculoviruses, SV40 virus, retroviruses; Plasmids such as Agrobacte um tumefaciens Ti plasmids, YAC vectors and BAC vectors.
  • the invention further provides host lines which contain the nucleic acid molecule or the vector and which are suitable for the expression of the nucleic acid molecule.
  • host lines which contain the nucleic acid molecule or the vector and which are suitable for the expression of the nucleic acid molecule.
  • Numerous prokaryotic and eukaryotic expression systems are known in the prior art, the host cells being selected, for example, from prokaryotic cells such as E. coli or B. subtilis, from eukaryotic cells such as yeast cells, plant cells, insect cells and mammalian cells, e.g. B. CHO cells, COS cells or HeLa cells, and derivatives thereof.
  • certain CHO production lines are known whose glycosylation patterns have changed compared to CHO cells.
  • the present invention further relates to a method for producing the peptide, polypeptide or fusion protein, which comprises culturing a host cell under conditions suitable for expression and optionally purifying the expressed peptide, polypeptide or fusion protein.
  • the peptides, polypeptides and fusion proteins according to the invention can also be obtained by chemical and enzymatic synthesis, such as, for example, Merrifield synthesis, and / or fragment condensation. Combinations of chemical, enzymatic and recombining production processes can also be considered here.
  • the invention also provides reagents which are specific for the peptides and / or polypeptides according to the invention.
  • specific reagents are antibodies, antibody fragments, for example Fv, Fab or F (ab) 2 fragments or antibody derivatives.
  • the antibodies, antibody fragments, for example Fv, Fab or F (ab) 2 fragments or antibody derivatives can be of monoclonal or polyclonal origin.
  • specific antibodies are available by testing animals, such as. B. mice or rabbits, with the peptides or polypeptides according to the invention, which are preferably on suitable
  • High molecular carrier molecules (often proteins) are coupled, or fusion proteins are immunized. Immunization can be facilitated by adding suitable adjuvants known in the art. Monoclonal antibodies are usually obtainable by fusing spleen cells, which have been removed from an immunized mouse, with tumor cells and selecting the hybridomas formed in the process. Those hybridomas that efficiently secrete specific antibodies can be determined by screening the supernatant. Alternatively, antibodies can be produced recombinantly; in the production of recombinant antibodies, the mRNA is isolated from hybridoma cells or B-lymphocytes, which acts as the basis for the synthesis of the corresponding cDNA and is amplified via PCR.
  • the antibody After ligation into a suitable vector and introduction into a suitable host cell culture, the antibody can be obtained from the cell culture supernatants or the cell lysates. Recombinant antibodies allow "humanization" of the antibody and are therefore less immunogenic. The relevant methods are known in the prior art.
  • Further reagents which are specific for a peptide or polypeptide according to the invention are sodium ion channel proteins, preferably voltage-dependent sodium ion channel proteins and peptide and / or polypeptide-specific fragments thereof.
  • Voltage-controlled human sodium channels are e.g. B. CIN1JHUMAN, P35498, CIN2JHUMAN, P99250, CIN4_HUMAN, P35499, CIN5_HUMAN, P14524, CIN6 HUMAN, P01118 from the database at http://www.expasy.ch/sprot-top.html.
  • the invention also provides test kits containing peptide or polypeptide specific reagents.
  • the test kit can furthermore contain components which are necessary for carrying out detection methods or buffer substances for appropriate dilution and pH adjustment of the peptide- and / or polypeptide-specific reagent.
  • the test kit is particularly suitable for diagnostic purposes.
  • the test kit according to the invention is particularly suitable for diagnostic purposes.
  • the invention further includes the use of the reagents specific for a peptide or polypeptide according to the invention in methods for the detection of the peptide and / or polypeptide in a body fluid.
  • the body fluid is preferably selected from cerebrospinal fluid or blood or blood products or blood components.
  • a method for detecting the peptide and / or polypeptide according to the invention comprises performing at least one chromatographic method, such as high-performance liquid chromatography (HPLC) and / or affinity chromatography.
  • HPLC high-performance liquid chromatography
  • affinity chromatography is ideal for separating relatively short peptides or polypeptides.
  • the use of columns with a small diameter is particularly advantageous here.
  • Affinity chromatography is performed using the above-mentioned antibody that is specific for the peptide and / or polypeptide. Affinity chromatography is characterized by its particularly high specificity.
  • the invention further provides test kits which are suitable for detecting an antibody which is specific for the peptide and / or polypeptide according to the invention, the test kit comprising at least one peptide and / or polypeptide according to the invention.
  • the test kit can furthermore contain buffer substances known in the prior art which are suitable for use of the test kit in determination and diagnostic methods.
  • the invention further encompasses the use of the peptide and / or polypeptide in methods for determining peptide and / or polypeptide-specific autoantibodies in a body fluid.
  • the body fluid is preferably selected from cerebrospinal fluid or blood or blood products.
  • the detection of autoantibodies in the body fluids mentioned is of particular interest since it can be used as a marker for the demyelinating diseases presumably mediated by the peptide.
  • Methods which are advantageous for determination purposes are immunoassays, ELISA, RIA, membrane-bound test strips, receptor binding tests or biosensory determinations, the implementation of which is known to the person skilled in the art.
  • the peptide, the polypeptide or suitable peptide conjugates should preferably be used for the specific binding of the autoantibodies.
  • the peptide would be immobilized on a microtiter plate.
  • the specific autoantibodies bind and are then converted into a signal by correspondingly labeled anti-immunoglobulin antibodies using known methods.
  • the invention also provides test kits for detecting the nucleic acid encoding the peptides and / or polypeptides according to the invention.
  • the test kits comprise at least one nucleic acid molecule according to the invention, preferably the nucleic acid molecule comprises the sequence (SEQ ID NO: 3) and particularly preferably the sequence (SEQ ID NO: 4).
  • the nucleic acid molecules are used in methods for detecting a nucleic acid encoding the peptide and / or polypeptide according to the invention in a biological sample, the method comprising contacting the sample with a nucleic acid molecule bearing a detectable label and detecting the label.
  • Hybridization methods and, if appropriate, Northern blot and Southern blot methods can also be used.
  • a radioactive labeling of the nucleic acid molecule can be detected in a simple manner by autoradiography.
  • the invention provides wide r toward provides a method of peptide or polypeptide from a body fluid removal.
  • the peptide or polypeptide can generally be removed based on knowledge of its molecular structure by physical, chemical or biological methods. These methods can be ultra or diafiltration, for example.
  • the method comprises contacting the body fluid with a reagent specific for the peptide or polypeptide and removing the complex containing the peptide or polypeptide and the specific reagent.
  • Preferred specific reagents are antibodies or sodium ion proteins and their specific fragments. It is particularly preferred that the peptide or polypeptide-specific reagent is bound to a solid matrix and that the method comprises adsorbing the peptide or polypeptide onto the matrix.
  • immunoadsorption methods which are characterized by a high efficiency of removal.
  • compositions which contain at least one peptide, polypeptide and / or fusion protein according to the invention and optionally a pharmacologically acceptable carrier and / or diluent. Suitable carriers and / or diluents are known in the prior art.
  • the pharmaceutical compositions are preferably suitable for intravenous, subcutaneous or intramuscular administration.
  • the pharmaceutical composition can be in the form of an aerosol using suitable erosol stabilizing compounds.
  • axons and entire nerve cells For axons and entire nerve cells, it can be neuroprotective in crisis situations, such as are present in demyelination, if their electrical excitability is damped. In crisis situations, depolarization of neurons or axons often occurs. This can result in an influx of sodium and, secondarily, calcium. Increased intracellular calcium accumulation is known to be neurotoxic.
  • the peptide QYNAD brings about a normalization of the cation influx by inhibiting the sodium ion influx.
  • the saturation of the peptide effect was experimentally at a concentration of 100 ⁇ M, which is advantageous for therapeutic use, since it normalizes the axonal activity, but does not have a blocking effect.
  • polyneuropathies in particular diabetic polyneuropathy.
  • Polyneuropathies are damage to the pehpheric nerves.
  • MS multiple sclerosis
  • the peptide could penetrate into the foci of demyelination via the vascular system and have protective effects there on the axons.
  • the peptide is intended to treat the effects of a stroke.
  • the neuroprotective property of the peptide should weaken the neurodegenerative processes in the vicinity of the primarily affected tissue.
  • the neuroprotective property normalizes the function of overactive afferent neurons.
  • the peptide according to the invention was observed in the cerebrospinal fluid of MS patients and GBS patients, but not in healthy volunteers.
  • the two diseases mentioned belong to the demyelinating diseases, which are characterized by the dissolution of the myelin sheaths that surround the nerve cells.
  • Some symptoms of MS suggest that MS is an autoimmune disease.
  • Peptides and polypeptides according to the invention which have an increased binding capacity for sodium ion channels, but have no or only slight neuroinhibitory activity, are effective as antagonists with respect to the naturally occurring pentapeptide with the sequence SEQ ID NO: 1.
  • compositions containing these peptides and / or polypeptides are thus proposed according to the invention for the treatment of demyelinating diseases and in general for the treatment of autoimmune diseases.
  • Other areas of application would be the diagnosis and therapy of neurodegenerative diseases, Alzheimer's disease and amyotrophic lateral sclerosis.
  • both agonists and antagonists of the peptide with the sequence are of therapeutic interest in the treatment of diseases mediated by lymphocytes, preferably autoimmune diseases and allergies.
  • the voltage-dependent sodium ion channels are encoded by a Multigen family.
  • the different isoforms of voltage-dependent sodium ion channels are heterotrimeric proteins, which consist of a large, strongly glycosylated ⁇ subunit and one or two small ⁇ subunits.
  • eight different genes SCN1A to SCN8A are known which code for the ⁇ subunit, most of which are expressed in the brain, phepheric nervous system and muscle. It is also known that certain hereditary diseases are associated with certain genes encoding the sodium ion channel. It was found that hyperkalemic periodic paralysis, an inherited human muscle disease, is associated with SCN4A.
  • SCN4A The inherited diseases Paramyotonia congenita and potassium-enhanced Myotonia are also associated with SCN4A.
  • Hereditary cardiac arrhythmia is associated with SCN5A.
  • Motor endplate disease is associated with SCN8A in the mouse.
  • agonists or antagonists with respect to the peptide of the sequence can be used for the treatment of hereditary muscle diseases and cardiac arrhythmias.
  • the pharmaceutical compositions contain fusion proteins, their use depends on the further biologically active polypeptide on which the fusion protein is based.
  • the biologically active polypeptide is preferably one which influences the development and / or differentiation of cells of the phepheric or central nervous system or of the cells supplying them, such as, for. B. Nerve Growth Factor (NGF).
  • NGF Nerve Growth Factor
  • CNTF ciliary neurotrophic factor
  • BDNF "brain-de ved" neurotrophic factor
  • NT-3 neurotrophin-3
  • NT-4/5 neurotrophin-4/5
  • GDNF glial cell-derived neurotrophic factor.
  • these pharmaceutical compositions are useful for the treatment of neurodegenerative diseases in which the biologically active polypeptides have only a low affinity for neuronal structures and the concentration of which can thus be significantly increased by increasing the neuronal affinity.
  • the biologically active polypeptides have only a low affinity for neuronal structures and the concentration of which can thus be significantly increased by increasing
  • Menhang is of particular interest in the treatment of Alzheimer's disease, which is characterized by a progressive degeneration of neuronal structures.
  • the invention further provides pharmaceutical compositions which contain at least one reagent which is specific for a peptide and / or polypeptide according to the invention, and optionally a pharmacologically acceptable carrier and / or diluent.
  • Such specific reagents are preferably selected from specific antibodies and sodium ion channel proteins or binding fragments thereof.
  • Pharmacologically acceptable carriers and / or diluents are known in the prior art.
  • Peptide and / or polypeptide specific reagents that block the binding of the peptide or polypeptide to the sodium ion channel can be used to treat demyelinating and neurodegenerative diseases.
  • the pharmaceutical compositions can be used as diagnostics. These diagnostics can also be used in NMR or magnetic resonance imaging methods.
  • the invention further provides pharmaceutical compositions which contain at least one nucleic acid molecule according to the invention and optionally a pharmacologically acceptable carrier and / or diluent.
  • These pharmaceutical compositions are suitable for use in both diagnostic and therapeutic procedures.
  • the diagnostic methods include in situ hybridization.
  • the invention considers somatic gene therapy, which means the suppression of the expression of a disease-mediating gene or the replacement of a defective gene by a correct copy.
  • the methods used here include anti-sense and sense therapy, suitable vectors and methods being known to the person skilled in the art. (Weiss et al., Cell Mol. Life Sei 55 (1999), 334-358).
  • Fig. 2 shows a Western blot.
  • GBS lanes marked with
  • MS liquor samples from an MS patient were applied.
  • a molecular weight standard (14, 22, 31, 45, 66, 97 and 200 kDa) was plotted in the right lane.
  • Example 1 Application of detection methods of the peptide and its modifications for diagnostics
  • the peptide and modifications or derivatives thereof are used according to the invention as markers for the medical diagnosis of diseases, preferably diseases of the nervous system, such as GBS or MS in humans. In this function it can also be used for therapy control. Veterinary applications are also possible.
  • the peptide is preferably used as a marker in customary diagnostic methods, such as blotting methods, immunoassays, biosensory methods or comparable methods.
  • the peptide or its modifications and derivatives are used in appropriate binding tests, for example used in immunoassays.
  • the peptide can also, preferably via its C-terminus, its N-terminus or other suitable functional units, be coupled or bound to carrier or marker proteins, in particular also enzymes, or also colloids using known methods, preferably covalently or adsorptively , These conjugates can also be used in the diagnostic methods and form part of the invention.
  • antibodies By coupling the peptide or its derived structure to proteins or other carrier structures and subsequent immunization with these conjugates, antibodies can be obtained which specifically recognize the peptide structure and can thus be used for the diagnostic determination of the peptide, for example in immunoassays.
  • These antibodies which are obtained by immunizing with the aid of the peptide, its conjugates or structures derived therefrom, also fall within the scope of the invention.
  • antibodies directed against the peptide are immobilized, for example, on adsorbing microtiter plates using established methods.
  • the free peptide structure from the CSF or serum sample competes with a constant amount of added, for example enzyme-labeled, peptide for the binding sites of the antibodies, whereby a quantifiable signal for the quantitative determination of the peptide is finally achieved.
  • the peptide is usually modified in such a way, usually by introducing a spacer arm to the carrier protein, that an optimal presentation of the peptide is ensured as efficiently as possible.
  • Other conceivable assays with different markers or strategies for presenting the peptide in the diagnostic system are also part of the invention.
  • the peptide can also be used for therapy control.
  • the first mentioned diagnosis is indicated for the various types of demyelinating diseases such as GBS and multiple sclerosis.
  • demyelinating diseases such as GBS and multiple sclerosis.
  • the structures to be analyzed in the corresponding body fluids preferably cerebrospinal fluid or serum, which either relates to the peptide itself or relates to structures which may be endogenously present in the body fluids and bind specifically to the peptide, such as, for example, receptors or autoantibodies enables diagnostic statements regarding possible diseases. These statements can be related to the diagnosis for the identification of diseases or, for example, can also be used to monitor the course of the diseases in question.
  • the second-mentioned diagnosis relates to applications of the methods related to the peptide structure for research purposes, in particular the elucidation of molecular processes in connection with physiological processes, particularly from a pathophysiological point of view.
  • the structure disclosed can also be used as a diagnostic marker in evaluations in connection with the development of medicinal products.
  • Example 2 Obtaining antibodies against the peptide for use in immunological test (diaqnostics) methods
  • the antibodies are obtained by using the peptide or structures derived therefrom, preferably protein-peptide conjugates, for the immunization.
  • the peptide or its derivatives are usually modified, for example with spacers, before they are coupled to carrier structures (carrier protein) in order to promote better recognition by the immune system and thus to obtain more efficient antibodies.
  • Antibodies often form the basis of a diagnostic procedure that enables the routine detection of peptide structures in diagnostic tests. As a matrix
  • human cerebrospinal fluid samples in particular serve this purpose, but also human serum or other body fluids of human or animal origin.
  • Example 3 Detection of autoantibodies directed against the peptide for the diagnosis of autoimmune diseases
  • the peptide and its derived structures are also used according to the invention to detect autoantibodies that are directed against the peptide structure in body fluids.
  • they serve as a marker structure for autoimmune diseases and are used as target antigens in diagnostic procedures.
  • the diagnostic use of molecules specifically binding the peptide, for example of receptor structures is also recorded according to the invention.
  • the peptide is immobilized, preferably after covalent coupling to a macromolecular carrier, or directly covalently, for example on activated and commercially available microtiter plates.
  • the CSF or serum samples to be determined are incubated on these surfaces, for example in microtiter plates. Any existing autoantibodies directed against the peptide are bound and can then be detected and quantified, for example, by enzyme-labeled anti-human antibodies.
  • Example 4 Applications of the peptide for diagnostic purposes with therapeutic objectives
  • Example 5 Applications of the peptide in therapy
  • the objectives are also to specifically eliminate the peptide from the corresponding body fluids by using suitable techniques (for example, by targeted CSF filtration or the therapeutic use of peptide-specific antibodies).
  • Knowledge of the peptide serves as the basis for its targeted elimination by physical, chemical or biological methods for targeted removal from the biological matrix or for preventing the biological effectiveness of the peptide, for example by binding to other molecules, for example to antibodies or receptor molecules whose effectiveness is limited or completely prevented.
  • Another possibility is to displace the peptide from the target structures, for example by using structurally related peptides in therapy.
  • nucleic acid encoding the peptide or its derivatives can also be used for diagnostic and therapeutic purposes.
  • Established methods for the selective determination of certain nucleic acid sequences, such as DNA probes, are used for diagnostics that go beyond peptide analysis.
  • the performance of peptide and nucleic acid diagnostics is used depending on the specific test requirements.
  • Example 7 Application of the coding DNA in the therapy of diseases of the nervous system
  • Therapeutic options are also conceivable based on knowledge of the nucleic acid sequence. These therapeutic options are, for example, using the anti-sense sequences at the level of
  • 3z encoded RNA is necessary and can therefore represent a future approach in gene therapy.
  • the neuroinhibitory activity was determined by the inhibition of sodium ion channels using differentiated NH15-CA2 neuroblastoma-x-glioma cells.
  • the culture conditions, morphological and physiological parameters of the differentiation of these cells are known (Hamprecht et al., Meth. Enzymol. 109 (1985), 316-41).
  • the cells were transferred to a hydrophobic test dish which was filled with standard external liquid (140 mM NaCl; 3.5 mM KCI; 1.0 mM CaCl 2 ; 1.0 mM MgCl 2 ; 2 mM HEPES, pH 7.4 ) was filled.
  • the dish was placed on the tray of an inverted microscope to observe the cells while they were being treated with pipettes containing internal solution (140 mM CsCI; 1, 4 mM MgCl 2 ; 10 mM EGTA and 10 mM HEPES (peak resistances: 300 up to 500 k ⁇ )) were filled.
  • the sodium currents were triggered and recorded in whole-cell mode.
  • the determination of the maximum current amplitude in response to repetitive 8-ms rectangular pulses from -85 to -20 mV can be used before, during and after the administration of the test solution.
  • the decrease in current was registered in three to five cells and the mean values were determined.
  • a similar program was used for the voltage dependency of the inactivation, consisting of a fixed 100 ms conditioning pulse to -135 mV, a variable 32 ms prepulse in the course of -135 to -19 mV in 4 mV steps, and a constant test pulse which depolarized the cells to -20 mV.
  • the magnitude of the left shift of the h-curve in the presence of test solutions was used as a measure of the inhibition of the sodium ion channels.
  • the neuroinhibitory activity of the synthetic peptide with the sequence was determined by the inhibition of the sodium currents by ion channels, which were induced by 1 Hz rectangular pulses from 85 to -10 mV. 1 shows the result of seven measurements which were carried out on NH15-CA2 neuroblastoma-x-glioma cells. The mean value is shown with the standard deviation. It was found that a peptide concentration of less than 10 ⁇ M half-maximally inhibited the Nathum ion currents. Peptide-mediated blocking of the ion channel was quick and reversible.
  • the sodium ion channel binding ability of a given peptide, polypeptide or fusion protein can generally be determined by competition with tritylated batrachotoxinin A 20- ⁇ -benzoate, [benzoyl-2,5-] [ 3 H] BTXB on purified and reconstituted sodium Ion channels can be determined (Trainer et al., J. Biol. Chem. 271 (1996), 11261-11267). The binding reactions are started with a four-fold dilution of 50 ⁇ l of purified and reconstituted sodium ion channels (5-10 pmol) in standard binding medium (Sharkey et al., Mol. Pharmacol. 31 (1986), 273-278). The reconstituted channels are incubated at 25 ° C.
  • the peptide was covalently coupled to BSA (bovine serum albumin) at the C-terminal.
  • BSA bovine serum albumin
  • This conjugate QYNAD-BSA was immobilized on a microtiter plate. The microtiter plate was washed. Subsequently, the serum sample of a GBS patient or the controls were incubated with the immobilized conjugate. The microtiter plate was washed. To detect the binding, the bound human IgG was visualized in a secondary reaction (color reaction) by incubation with a labeled anti-human IgG-specific antibody and reading out the plate.
  • a QYNAD-specific antiserum was produced by immunizing rabbits and subsequent serum collection in a manner known per se. To purify the IgG fraction, the antiserum was incubated with protein A and the IgG-type antibodies bound to it were eluted.
  • the samples were applied to a 12% SDS polyacryamide gel.
  • the separation was separated in a Tris / Glycine running buffer system (biorad chamber, mini gel) at a constant current of 20 mA in the separating gel.
  • the Multiphor II TM chamber (Amersham / Pharmacia Biotech) was used for the electrical transmission according to the semi-dry transmission method (semi-dry blotting). The transfer took place on nitrocellulose membranes (0.45 ⁇ m, Protean BA 85, Schleicher and Schuell). A discontinuous buffer system of the following composition was used:
  • Anode I 0.3 M tris
  • Anode II 0.1 M tris
  • Cathode 0.1 M aminocaproic acid, 0.01% (w / v) SDS
  • the transfer was carried out at 0.8 mA / cm 2 for 60 minutes at room temperature.
  • nitrocellulose membranes were blocked against non-specific binding by incubation with 5% powdered micron in TBS buffer. Then the QYNAD specific purified rabbit antibody was added in a dilution of 1: 2500 and incubated for one hour at room temperature. The nitrocellulose membranes were washed several times with TTBS buffer (0.05% (v / v) Tween 20 TM). A biotinylated anti-rabbit IgG-specific antibody (Biorad) was used as the secondary antibody. This was incubated in a dilution of 1: 3000 for one hour at room temperature with the nitrocellulose membranes.
  • nitrocellulose membranes were subsequently incubated with a streptavidin-alkaline phosphatase conjugate.
  • the nitrocellulose membranes were incubated with BCIP / NBT substrate (Biorad), which is converted into an insoluble color complex depending on the amount of the bound enzyme.

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Abstract

The invention relates to a novel peptide, fusion proteins and polypeptides containing said peptide, test kits and a method for detecting the peptide, coding nucleic acids and pharmaceutical compositions which contain the peptide or are based on the coding nucleic acid. The peptide serves as a marker for diagnostically detecting inflammatory and/or excitation-inhibitory processes and diseases of the nervous system and as a basis for pharmaceutical compositions for treating diseases of the nervous system or for pharmaceutical compositions having an anaesthetic effect.

Description

Peptid und dafür kodierende Nukleinsäure zur Bestimmung, Diagnostik und Therapie von Erkrankungen des Nervensystems Peptide and nucleic acid coding therefor for the determination, diagnosis and therapy of diseases of the nervous system
Die Erfindung betrifft ein neues Peptid, das Peptid enthaltende Polypeptide und Fusionsproteine, Test-Kits und Verfahren zum Nachweis des Peptids, dafür kodierende Nukleinsäuren und pharmazeutische Zusammensetzungen, die das Peptid oder die kodierende Nukleinsäure enthalten. Die Erfindung betrifft weiter verschiedene Verwendungen des Peptids, Verfahren zu seiner Herstellung und gegen das Peptid gerichtete Antikörper.The invention relates to a new peptide, the peptide-containing polypeptides and fusion proteins, test kits and methods for the detection of the peptide, nucleic acids coding therefor and pharmaceutical compositions containing the peptide or the coding nucleic acid. The invention further relates to various uses of the peptide, processes for its preparation and antibodies directed against the peptide.
Das Guillain-Barre-Syndrom (GBS) wird als eine Autoimmunerkrankung des peripheren Nervensystems angesehen. Die fortschreitende Gliedmaßenschwäche bis hin zur vollständigen Paralyse stellt ein Hauptmerkmal der Krankheit dar. Weiterhin werden oftmals Parästhesie, der Verlust der sensorischen Wahrnehmung und Störungen des autonomen Nervensystems beobachtet. Die maximale Ausprägung der Symptome wird innerhalb von ein bis zwei Wochen, in seltenen Fällen innerhalb von vier Wochen erreicht. Meist erfolgt die Rückbildung der Symptome innerhalb von Monaten, wobei ungefähr 80% der Patienten keine oder nur schwache, nicht bewegungseinschränkende Defizite aufweisen.Guillain-Barre syndrome (GBS) is considered an autoimmune disease of the peripheral nervous system. The progressive limb weakness to complete paralysis is a main characteristic of the disease. Furthermore, paraesthesia, loss of sensory perception and disorders of the autonomic nervous system are often observed. The maximum manifestation of the symptoms is reached within one to two weeks, in rare cases within four weeks. Symptoms usually resolve within months, with approximately 80% of patients showing no or only weak deficits that do not restrict movement.
Eine dem GBS ähnelnde Krankheit, die jedoch durch einen chronischen Verlauf gekennzeichnet ist, wird als chronische inflammatorische demyelinisieren- de Polyradiculoneuropathie (CIDP) bezeichnet. Bisher gibt es keine allgemein gültige Definition für CIDP mit Ausnahme der Beobachtung, daß im Gegensatz zum GBS die progressive Phase länger als vier Wochen, oftmals länger als sechs Monate andauert, und daß häufig Defizite bei dem Patienten zurückbleiben. Der Mechanismus, der die schwere Parese bei GBS und CIDP verursacht, umfaßt möglicherweise eine T-Lymphozyten-vermittelte Immunreaktion und Entzündung, der eine Demyelinisierung peripherer Neuronen folgt. Diese Annahme wird bestätigt durch erhöhte Mengen an Komplement-Verbindungen und Cytokinen, die im Serum und der Cerebrospinalflüssigkeit von GBS- Patienten beobachtet wird. Gegenwärtig wird der Vorgang der Demyelinisierung, insbesondere im Bereich der Nervenwurzeln, als der entscheidende Mechanismus bei der Entwicklung des Nervenleitungsblockes betrachtet. Eine These geht von einer Störung der Blut-/Cerebrospinalflüssigkeits(CSF)- Schranke als früherem, wichtigen Schritt der Krankheitsentstehung aus. Eine weitere These behauptet, daß sich als Folge der Krankheit Lecks der Blut- /CSF-Schranke ausbilden und den erhöhten Proteingehalt in der CSF verursachen. In jedem Falle könnten unspezifische Serum-Bestandteile ohne direkten Bezug zum Immunsystem aus dem Blut in die CSF eindringen, neuronale oder gliale Dysfunktionen verursachen und/oder die neuronale Aktivität verändern. Ein alternativer Mechanismus ist eine verringerte Flußrate der CSF, die den erhöhten Proteingehalt der CSF erklären könnte. Diese Interpretation erfordert keine Beeinträchtigung oder veränderte Selektivität der BlutJCSF-Schranke. Obwohl sämtliche erwähnten Effekte für den Verlauf von GBS und CIDP von Bedeutung sein könnten, ist ihr tatsächlicher Beitrag zu den Symptomen bisher nicht geklärt. Es konnte kein Zusammenhang hergestellt werden zwischen den erhöhten Protein-Konzentrationen in der CSF und spezifischen elektrophysio- logischen Befunden oder dem klinischen Bild. Kürzlich wurden Faktoren in der CSF von GBS-Patienten und Multiple Sklerose-Patienten beschrieben, die mit spannungsabhängigen Natrium-Kanälen wechselwirken (Würz et al., Muscle and Nerve 18 (1995), 772-781 ). Brinkmeier et al., (Muscle and Nerve 19, (1996), 54-62) beschreiben, daß die Faktoren ein Molekulargewicht von weniger als drei kDa, unter stringenteren Testbedingungen von weniger als einem kDa, aufweisen. Aufgrund dieser Beobachtung und der Tatsache, daß die Wirksamkeit der Faktoren auch nach Inkubation von CSF mit Proteasen nicht wesentlich verringert wurde, schlössen die Autoren, daß es sich bei den Faktoren weder um Antikörper noch um Cytokine handelt. Die Stabilität der Faktoren gegenüber einer Hitzebehandlung legt nahe, daß diese keine Proteine sind. Ebenso konnten Hitze-labile und Komplement-abhängige antiexzitatorische Faktoren, die z. B. in Seren von Patienten mit Multiple Sklerose gefunden werden, ausgeschlossen werc en.A disease similar to GBS but characterized by a chronic course is called chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy (CIDP). So far, there is no generally applicable definition for CIDP except for the observation that, in contrast to the GBS, the progressive phase lasts longer than four weeks, often longer than six months, and that deficits often remain in the patient. The mechanism that causes severe paresis in GBS and CIDP may include a T-lymphocyte-mediated immune response and Inflammation followed by demyelination of peripheral neurons. This assumption is confirmed by increased amounts of complement compounds and cytokines that are observed in the serum and cerebrospinal fluid of GBS patients. The process of demyelination, particularly in the area of the nerve roots, is currently considered to be the crucial mechanism in the development of the nerve conduction block. One thesis is based on a disruption of the blood / cerebrospinal fluid (CSF) barrier as an earlier, important step in the development of the disease. Another thesis claims that as a result of the disease, leaks in the blood / CSF barrier develop and cause the increased protein content in the CSF. In any case, non-specific serum components could enter the CSF from the blood without direct relation to the immune system, cause neuronal or glial dysfunction and / or change the neuronal activity. An alternative mechanism is a reduced flow rate of the CSF, which could explain the increased protein content of the CSF. This interpretation does not require impairment or altered selectivity of the blood JCSF barrier. Although all of the effects mentioned could be important for the course of GBS and CIDP, their actual contribution to the symptoms has not yet been clarified. No connection could be made between the increased protein concentrations in the CSF and specific electrophysiological findings or the clinical picture. Recently, factors in the CSF of GBS patients and multiple sclerosis patients have been described which interact with voltage-dependent sodium channels (Würz et al., Muscle and Nerve 18 (1995), 772-781). Brinkmeier et al., (Muscle and Nerve 19, (1996), 54-62) describe that the factors have a molecular weight of less than three kDa under more stringent test conditions of less than one kDa. Based on this observation and the fact that the efficacy of the factors was not significantly reduced even after incubation of CSF with proteases, the authors concluded that the factors are neither antibodies nor cytokines. The stability of the factors to heat treatment suggests that they are not proteins. Likewise, heat-labile and complement-dependent anti-excitatory could Factors such. B. can be found in sera from patients with multiple sclerosis, excluded.
Alle bisher bekannten Forschungsergebnisse lassen keinen eindeutigen Rückschluß auf die Pathogenese der beiden genannten Erkrankungen zu. Genauso wenig wie für das GBS und die CIDP kann für die bekannteste durch Demyeli- nisierung gekennzeichnete Erkrankung, die Multiple Sklerose (MS), eine einzelne Ursache benannt werden. Auch MS gilt als eine Autoimmunerkrankung des Nervensystems.All previously known research results do not allow any clear conclusions to be drawn about the pathogenesis of the two diseases mentioned. Just as for the GBS and the CIDP, a single cause cannot be named for the most well-known disease characterized by demyelination, multiple sclerosis (MS). MS is also considered an autoimmune disease of the nervous system.
Bei der Multiplen Sklerose gelten Immunreaktionen gegen Bestandteile der Myelinscheide als Ursache für die neurologischen Symptome. Zwar sind die genauen auslösenden Faktoren für die MS weiterhin ungeklärt, jedoch besteht Übereinstimmung, daß im Entzündungsherd Autoimmunreaktionen gegen Myelinproteine zur Ablösung des Myelins von den Axonen und zur Zerstörung Myelin-bildender Zellen führen. Dadurch kommt es zu einer Beeinträchtigung der Impulsweiterleitung, zu axonalen Schäden und zum Verlust von Axonen und Nervenzellen.In multiple sclerosis, immune reactions against components of the myelin sheath are considered to be the cause of the neurological symptoms. Although the exact triggering factors for MS remain unclear, there is agreement that autoimmune reactions against myelin proteins in the focus of inflammation lead to the detachment of myelin from the axons and the destruction of myelin-forming cells. This leads to impaired impulse transmission, axonal damage and loss of axons and nerve cells.
Die Diagnose beruht heute auf klinisch-elektrophysiologischen Daten, bildgebenden NMR-Analysen des Gehirns und allgemeinen wenig krankheitsspezifischen liquordiagnostischen Untersuchungen.The diagnosis today is based on clinical electrophysiological data, imaging NMR analyzes of the brain and general, less disease-specific, liquid diagnostic tests.
Die Multiple Sklerose kann heute nicht geheilt werden, jedoch gibt es verschiedene Möglichkeiten, ihren Verlauf abzumildern. Im akuten Schub können entzündungshemmende Cortikosteroide erfolgreich eingesetzt werden. Weiterhin wirken sich Immunsuppressiva und Immunmodulatoren (z. B. Interferon-ß) günstig auf den Verlauf der Erkrankung aus. Interferon-ß scheint die Substrate bei der schubförmig verlaufenden MS zu verringern. Neben den pharmakothera- peutischen Ansätzen erweist sich auch die physikalische Therapie, d.h. gezieltes Training der Muskulatur und Training von Bewegungsabläufen als günstig zur Verbesserung der Lebensqualität von MS-Patienten. Je früher die Diagnose gestellt und mit der Behandlung begonnen wird, desto günstiger für die Prognose, denn Schädigungen, welche durch aktive Entzündungsherde entstehen, lassen sich nicht vollständig revertieren.Multiple sclerosis cannot be cured today, but there are various ways to mitigate its course. Anti-inflammatory corticosteroids can be used successfully in acute episodes. Furthermore, immunosuppressants and immunomodulators (e.g. interferon-ß) have a favorable effect on the course of the disease. Interferon-ß seems to reduce the substrates in relapsing MS. In addition to the pharmacotherapeutic approaches, physical therapy, ie targeted training of the muscles and training of movement sequences, has also proven to be beneficial for improving the quality of life of MS patients. The earlier the diagnosis is made and the treatment is started, the more favorable the prognosis, because damage caused by active sources of inflammation cannot be completely reversed.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Mittel und Wege zur Verfügung zu stellen, die gezielt zur Diagnostik und/oder Behandlung entzündlicher und/oder erregungshemmender Prozesse und Erkrankungen des Nervensystems, insbesondere bei demyelinsierenden Erkrankungen eingesetzt werden können. Weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Mitteln und Verfahren, die eine möglichst frühzeitige Diagnose und damit frühzeitige Therapie erlauben.The present invention is therefore based on the object of providing means and ways which can be used specifically for the diagnosis and / or treatment of inflammatory and / or anti-irritant processes and diseases of the nervous system, in particular in the case of demyelinating diseases. A further object of the invention is to provide means and methods which permit the earliest possible diagnosis and thus early therapy.
Diese Aufgaben werden erfindungsgemäß gelöst durch ein Peptid mit der Sequenz Gln-Tyr-Asn-Ala-Asp (SEQ ID No:1 ) sowie Derivate davon, wobei die Derivate sich durch die Addition, Substitution, Inversion, Insertion und/oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäure(n) von der ursprünglichen Sequenz unterscheiden und wenigstens 10 % der Natrium-Ionenkanal-Bindungsfähigkeit des Peptides (SEQ ID NO:1 ) und/oder wenigstens 50 % der neuroinhibitori- schen Aktivität aufweisen, oder Salze oder Ester davon.These objects are achieved according to the invention by a peptide with the sequence Gln-Tyr-Asn-Ala-Asp (SEQ ID No: 1) and derivatives thereof, the derivatives being characterized by the addition, substitution, inversion, insertion and / or deletion of one or several amino acid (s) differ from the original sequence and have at least 10% of the sodium ion channel binding ability of the peptide (SEQ ID NO: 1) and / or at least 50% of the neuroinhibitory activity, or salts or esters thereof.
Im folgenden werden einige Begriffe erläutert, um klarzustellen, wie sie im Zusammenhang der vorliegenden Anmeldung verstanden werden sollen.Some terms are explained below in order to clarify how they are to be understood in the context of the present application.
Der Begriff "Polypeptid", so, wie er nachfolgend in der Beschreibung verwendet wird, umfaßt aus 6 oder mehr Aminosäuren zusammengesetzte Peptide oder Proteine.The term "polypeptide" as used in the description below includes peptides or proteins composed of 6 or more amino acids.
"Neuroinhibito sche Aktivität" bedeutet hier die Fähigkeit einer Substanz, Natrium-Ionenkanäle zu blockieren. Die neuroinhibitorische Aktivität kann in diesem Zusammenhang durch die Hemmung von Natrium-Ionenströmen durch spannungsabhängige Natrium-Ionenkanäle gemessen werden. (Übersichtsarti- kel Lehmann-Horn et al. in Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 128; (1996), 198-268). Die experimentellen Bedingungen für die Messung der neuroinhibito- rischen Aktivität sind beispielsweise angegeben in Brinkmeier et al., Muscle and Nerve 19 (1996), 54-62. Die neuroinhibitorische Aktivität kann unter Verwendung von differenzierten NH15-CA2 [Neuroblastoma x Glioma] Zellen (Hamprecht et al., Meth. Enzymol. 109 (1985), 316-41 ; Brinkmeier et al., Muscle Nerve 19 (1996), 54-62) bestimmt werden. Beispiel 8 zeigt die Messung der neuroinhibitorischen Aktivität."Neuroinhibito activity" here means the ability of a substance to block sodium ion channels. In this context, neuroinhibitory activity can be measured by inhibiting sodium ion currents through voltage-dependent sodium ion channels. (Übersichtsarti- Kel Lehmann-Horn et al. in Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 128; (1996), 198-268). The experimental conditions for measuring the neuroinhibitory activity are given, for example, in Brinkmeier et al., Muscle and Nerve 19 (1996), 54-62. The neuroinhibitory activity can be determined using differentiated NH15-CA2 [Neuroblastoma x Glioma] cells (Hamprecht et al., Meth. Enzymol. 109 (1985), 316-41; Brinkmeier et al., Muscle Nerve 19 (1996), 54- 62) can be determined. Example 8 shows the measurement of the neuroinhibitory activity.
"Natrium-Ionenkanal-Bindungsfähigkeit" bedeutet hier die Fähigkeit von Substanzen, an Natrium-Ionenkanäle, insbesondere spannungsabhängige Natrium-Ionenkanäle, zu binden. Die Natrium-Ionenkanal-Bindungsfähigkeit kann beispielsweise bestimmt werden, wie in Trainer et al., J. Biol. Chem. 271 (1996), 11261-11267, angegeben. Beispiel 9 zeigt exemplarisch die Messung der Natrium-Ionenkanal-Bindungsfähigkeit.“Sodium ion channel binding ability” here means the ability of substances to bind to sodium ion channels, in particular voltage-dependent sodium ion channels. The sodium ion channel binding ability can be determined, for example, as indicated in Trainer et al., J. Biol. Chem. 271 (1996), 11261-11267. Example 9 shows an example of the measurement of the sodium ion channel binding ability.
Der dem Fachmann bekannte Ausdruck "Homologie" bezeichnet den Grad der Verwandtschaft zwischen zwei oder mehr Peptiden oder Polypeptiden, der durch die Übereinstimmung zwischen den Sequenzen mittels bekannter Verfahren, z. B. der computergestützten Sequenzvergleiche (Basic local alignment search tool, S.F. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410), bestimmt werden kann. Der Prozentsatz der "Homologie" ergibt sich aus dem Prozentsatz identischer Bereiche in zwei oder mehr Sequenzen unter Berücksichtigung von Lücken oder anderen Sequenzbesonderheiten. In der Regel werden spezielle Computerprogramme mit Algorithmen eingesetzt, die den besonderen Anforderungen Rechnung tragen.The term "homology" known to the person skilled in the art denotes the degree of relationship between two or more peptides or polypeptides, which is determined by the agreement between the sequences by means of known methods, e.g. B. the computer-aided sequence comparisons (Basic local alignment search tool, S.F. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410) can be determined. The percentage of "homology" results from the percentage of identical regions in two or more sequences, taking into account gaps or other sequence peculiarities. As a rule, special computer programs with algorithms are used, which take the special requirements into account.
Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der Homologie erzeugen zunächst die größte Übereinstimmung zwischen den untersuchten Sequenzen. Computerprogramme zur Bestimmung der Homologie zwischen zwei Sequenzen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf das GCG Programmpaket, einschließlich GAP (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (12) : 387 (1984); Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (Wl)); BLASTP, BLASTN, und FASTA (Altschul, S. et al., J. Mol. Biol. 215:403-410) (1999)). Das BLASTX Programm kann vom National Centre for Biotechnology Information (NCBI) und aus weiteren Quellen bezogen werden (BLAST Handbuch, Altschul S., et al., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul, S., et al., Mol. Biol. 215:403-410 (1990)). Auch der bekannte Smith Waterman-Algorithmus kann zur Bestimmung von Homologien verwendet werden.Preferred methods for determining homology initially produce the greatest agreement between the sequences examined. Computer programs for determining homology between two sequences include, but are not limited to, the GCG program package, including GAP (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (12): 387 (1984); Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (WI)); BLASTP, BLASTN, and FASTA (Altschul, S. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410) (1999)). The BLASTX program can be obtained from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and other sources (BLAST Handbook, Altschul S., et al., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul, S., et al., Mol. Biol 215: 403-410 (1990)). The well-known Smith Waterman algorithm can also be used to determine homologies.
Bevorzugte Parameter für den Aminosäuresequenz-Vergleich umfassen die nachstehenden:Preferred parameters for amino acid sequence comparison include the following:
Algorithmus: Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol 48:443-453Algorithm: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol 48: 443-453
(1970)(1970)
Vergleichsmatrix: BLOSUM 62 aus Henikoff und Henikoff, PNAS USAComparison matrix: BLOSUM 62 from Henikoff and Henikoff, PNAS USA
89(1992), 10915-1091989: 10915-10919 (1992)
Lücken-Wert (Gap Penalty): 12Gap Penalty: 12
Lückenlängen-Wert:Gap length value:
(Gap Length Penalty): 4(Gap Length Penalty): 4
Homologie-Schwellenwert (Threshold of Similarity): 0Homology threshold (Threshold of Similarity): 0
Das GAP-Programm ist auch zur Verwendung mit den vorstehenden Parametern geeignet. Die vorstehenden Parameter sind die Fehler-Parameter (default Parameters) für Aminosäuresequenz-Vergleiche, wobei Lücken an den Enden den Homologie-Wert nicht verringern. Bei sehr kurzen Sequenzen im Vergleich zur Referenz- Sequenz kann es weiterhin notwendig sein, den Erwartungswert auf bis zu 100.000 (expectation value) zu erhöhen und gegebenenfalls die Wortlänge (word size) auf bis zu 2 zu verkleinern.The GAP program is also suitable for use with the above parameters. The above parameters are the error parameters (default parameters) for amino acid sequence comparisons, with gaps at the ends not reducing the homology value. In the case of very short sequences compared to the reference sequence, it may also be necessary to increase the expectation value up to 100,000 (expectation value) and, if necessary, to reduce the word length to up to 2.
Weitere beispielhafte Algorithmen, Lücken-Öffnungs-Werte (gap opening penalties), Lückenausdehnungs-Werte (gap extension penalties), Vergleichsmatrizen einschließlich der im Programm-Handbuch, Wisconsin-Paket, Version 9, September 1997, genannten können verwendet werden. Die Auswahl wird von dem durchzuführenden Vergleich abhängen und weiterhin davon, ob der Vergleich zwischen Sequenzpaaren, wobei GAP oder Best Fit bevorzugt sind, oder zwischen einer Sequenz und einer umfangreichen Sequenz-Datenbank, wobei FASTA oder BLAST bevorzugt sind, durchgeführt wird.Further exemplary algorithms, gap opening penalties, gap extension penalties, comparison matrices including those mentioned in the Program Guide, Wisconsin Package, Version 9, September 1997, may be used. The selection will depend on the comparison to be performed and also on whether the comparison is carried out between pairs of sequences, GAP or Best Fit being preferred, or between a sequence and an extensive sequence database, with FASTA or BLAST being preferred.
Eine mit dem oben genannten Algorithmus ermittelte Übereinstimmung von 60 % wird im Rahmen dieser Anmeldung als 60 % Homologie bezeichnet. Entsprechendes gilt für höhere Homologiegrade.A 60% agreement determined with the above-mentioned algorithm is referred to as 60% homology in the context of this application. The same applies to higher degrees of homology.
"Klonierung" soll alle im Stand der Technik bekannten Klonierungsmethoden umfassen, die hier zum Einsatz kommen könnten, die jedoch nicht alle im einzelnen beschrieben werden, weil sie zum selbstverständlichen Handwerkszeug des Fachmanns gehören."Cloning" is intended to encompass all cloning methods known in the prior art which could be used here, but which are not all described in detail because they are a matter of course for the skilled worker.
Unter "Rekombinanter Expression in einer geeigneten Wirtszelle" sollen alle im Stand der Technik bekannten Expressionsmethoden in bekannten Expressionssystemen verstanden werden, die hier zum Einsatz kommen könnten, jedoch nicht alle im einzelnen beschrieben werden, weil sie zum selbstverständlichen Handwerkszeug des Fachmanns gehören."Recombinant expression in a suitable host cell" should be understood to mean all expression methods known in the prior art in known expression systems which could be used here, but not all are described in detail because they are a matter of course for the skilled worker.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß ein Peptid mit der Sequenz Gln-Tyr-Asn-Ala-Asp (SEQ ID NO:1 ) in der cerebrospinalen Flüssigkeit von Patienten mit Multipler Sklerose und Guillain-Barre-Syndrom vorkommt. Das Peptid bindet an Natrium-Ionenkanäle und blockiert deren Natrium-Ströme. Im Vergleich zu dem bekannten Lokalanästhetikum Lidocain zeigt sich, daß die elektrophysiologische Wirkung einer 10 μM Lösung des erfindungsgemäßen Peptides der Wirkung einer 50 μM Lidocain-Lösung auf neuronale Natrium- Kanäle entsprechen. Die Bedeutung funktionierender Natrium-Ionenkanäle bei der MS zeigt sich auch darin, daß die Verabreichung geringer Dosen Lidocain an MS-Patienten mit subklinischen demyelinisierenden Läsionen neurologische Symptome bei Plasmaspiegeln von 2,7 μg/ml (10 μM) verursacht (Sakurai et al., Neurology 42 (1992), 2088-2093). Somit ist das Peptid ein deutlich potenteres Lokalanästhetikum als das bisher therapeutisch verwendete Lidocain.Surprisingly, it has now been found that a peptide with the sequence Gln-Tyr-Asn-Ala-Asp (SEQ ID NO: 1) occurs in the cerebrospinal fluid of patients with multiple sclerosis and Guillain-Barre syndrome. The peptide binds to sodium ion channels and blocks their sodium currents. In comparison to the known local anesthetic lidocaine, it can be seen that the electrophysiological effect of a 10 μM solution of the peptide according to the invention corresponds to the effect of a 50 μM lidocaine solution on neuronal sodium channels. The importance of functioning sodium ion channels in MS is also evident in the fact that the administration of small doses of lidocaine to MS patients with subclinical demyelinating lesions is neurological Symptoms caused at plasma levels of 2.7 μg / ml (10 μM) (Sakurai et al., Neurology 42 (1992), 2088-2093). The peptide is thus a significantly more potent local anesthetic than the lidocaine that has been used therapeutically to date.
Vorteilhafterweise weist das Peptid eine Sättigung des neuroinhibitorischen Effektes bei einer Konzentration von 100 μM auf, so dass selbst im Fall der Überdosierung im Rahmen einer therapeutischen Verwendung eine Normalisierung der axonalen Aktivität, jedoch keine Blockierung zu erwarten ist.The peptide advantageously has a saturation of the neuroinhibitory effect at a concentration of 100 μM, so that even in the case of an overdose in the context of a therapeutic use, normalization of the axonal activity but no blocking is to be expected.
Ferner wurde festgestellt, daß das Peptid in einem Konzentrationsbereich von 8 bis 25 μM in den cerebrospinalen Flüssigkeitsproben aus GBS- und MS- Patienten vorkommt, jedoch in den Kontrollen gesunder Individuen nicht zu beobachten war. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, könnte das Peptid die neurologischen Symptome demyelinisierender Erkrankungen durch seine Bindung an die Natrium-Ionenkanäle in den Ranvier'schen Schnürringen und eine verstärkte Hemmung der Impulsleitung weiter verschlimmern, insbesondere bei Neuronen, die bereits von der Demyelinisierung betroffen sind.It was also found that the peptide occurs in a concentration range of 8 to 25 μM in the cerebrospinal fluid samples from GBS and MS patients, but was not observed in the controls of healthy individuals. Without being bound by theory, the peptide could further aggravate the neurological symptoms of demyelinating diseases by binding to the sodium ion channels in Ranvier's laces and increased inhibition of impulse conduction, especially in neurons that are already affected by demyelination ,
Weiterhin wurden im Serum eines GBS-Patienten Antikörper gefunden, die spezifisch an das Peptid binden. In Seren von gesunden Kontrollpersonen konnten keine Peptid-spezifischen Antikörper nachgewiesen werden. Somit weist das Peptid ein hohes Potential für die Diagnose neurologischer Erkrankungen auf.Antibodies were also found in the serum of a GBS patient that bind specifically to the peptide. No peptide-specific antibodies could be detected in sera from healthy controls. The peptide thus has a high potential for the diagnosis of neurological diseases.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Peptid mit der Sequenz Gln-Tyr-Asn- Ala-Asp (SEQ ID NO:1 ) sowie Derivate davon, die sich durch die Addition, Substitution, Inversion, Insertioπ und/oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäure^) von der ursprünglichen Sequenz unterscheiden und wenigstens 10%, vorzugsweise 50%, besonders bevorzugt 90% der Natrium- Ionenbindungsfähigkeit des Peptides (SEQ ID NO:1 ) und/oder wenigstens 50%, vorzugsweise 80%, besonders bevorzugt 90% der neuroinhibitorischen Aktivität aufweisen. Derivate, die eine erhöhte neuroinhibitorische Aktivität aufweisen, sind als wirksame Anästhetika von Interesse. Ferner sind diese Derivate aufgrund ihrer Eigenschaft, die elektrische Erregbarkeit von Axonen und Nervenzellen zu dämpfen, als Neuroprotektiva geeignet. Derivate mit neuro- protektiven Eigenschaften werden gemäß einer bevorzugten Ausführungsform zur Behandlung von Polyneuropathien, insbesondere der Diabetischen Poly- neuropathie, von Multipler Sklerose (MS), Schlaganfall und Schmerzzuständen bereitgestellt.The invention thus relates to a peptide with the sequence Gln-Tyr-Asn-Ala-Asp (SEQ ID NO: 1) and derivatives thereof, which are characterized by the addition, substitution, inversion, insertion and / or deletion of one or more amino acids ^ ) differ from the original sequence and at least 10%, preferably 50%, particularly preferably 90% of the sodium ion binding capacity of the peptide (SEQ ID NO: 1) and / or at least 50%, preferably 80%, particularly preferably 90% of the neuroinhibitory activity exhibit. Derivatives that have increased neuroinhibitory activity are of interest as effective anesthetics. Furthermore, these derivatives are suitable as neuroprotective agents because of their property of damping the electrical excitability of axons and nerve cells. According to a preferred embodiment, derivatives with neuroprotective properties are provided for the treatment of polyneuropathies, in particular diabetic polyneuropathy, multiple sclerosis (MS), stroke and pain conditions.
Derivate, die an Natrium-Ionenkanäle binden, aber keine oder nur eine geringe neuroinhibitorische Aktivität aufweisen, wirken als Antagonisten des in der ce- rebrospinalen Flüssigkeit vorkommenden Peptides bzgl. des Natrium- lonenkanals und sind somit von großer therapeutischer Bedeutung.Derivatives that bind to sodium ion channels, but have little or no neuroinhibitory activity, act as antagonists of the peptide found in the cerebrospinal fluid with respect to the sodium ion channel and are therefore of great therapeutic importance.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Derivat wenigstens 60% homolog, vorzugsweise wenigstens 80% und besonders bevorzugt wenigstens 90% homolog zu der ursprünglichen Sequenz (SEQ ID NO:1 ). Besonders bevorzugt wird das Derivat durch konservative Substitution mindestens einer oder mehrerer Aminosäure(n) des Peptides (SEQ ID NO:1 ) erhalten. Dabei ist es weiter bevorzugt, dass als C-terminale Aminosäure Asparaginsäure oder Glutaminsäure vorgesehen ist.In a preferred embodiment, the derivative is at least 60% homologous, preferably at least 80% and particularly preferably at least 90% homologous to the original sequence (SEQ ID NO: 1). The derivative is particularly preferably obtained by conservative substitution of at least one or more amino acid (s) of the peptide (SEQ ID NO: 1). It is further preferred that aspartic acid or glutamic acid is provided as the C-terminal amino acid.
Unter konservativen Modifikationen werden solche verstanden, die auf dem Austausch von Aminosäuren beruhen und einen möglichst geringen Einfluß auf die (räumliche) Struktur des Peptids ausüben. Grundsätzlich werden vier phy- siko-chemische Gruppen unterschieden, in die die natürlicherweise vorkommenden Aminosäuren eingeteilt werden. Zur Gruppe der basischen Aminosäuren gehören Arginin, Lysin und Histidin. Zur Gruppe der sauren Aminosäuren gehören Glutaminsäure und Asparaginsäure. Die ungeladenen/polaren Aminosäuren umfassen Glutamin, Asparagin, Serin, Threonin und Tyrosin. Die nichtpolaren Aminosäuren umfassen Phenylalanin, Tryptophan, Cystein, Glycin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin und Prolin. Eine konservative Substitution bedeutet in diesem Zusammenhang den Austausch einer gegebenen Ami- nosäure durch eine Aminosäure, die zur gleichen physiko-chemischen Gruppe gehört.Conservative modifications are understood to mean those which are based on the exchange of amino acids and exert as little influence as possible on the (spatial) structure of the peptide. A basic distinction is made between four physico-chemical groups into which the naturally occurring amino acids are divided. The group of basic amino acids includes arginine, lysine and histidine. The group of acidic amino acids includes glutamic acid and aspartic acid. The uncharged / polar amino acids include glutamine, asparagine, serine, threonine and tyrosine. The non-polar amino acids include phenylalanine, tryptophan, cysteine, glycine, alanine, valine, isoleucine, leucine and proline. In this context, conservative substitution means the exchange of a given non-acid by an amino acid belonging to the same physico-chemical group.
Besonders bevorzugte Derivate des Peptides sind ausgewählt aus: NYNAD (SEQ ID NO: 5), SYNAD (SEQ ID NO: 6), TYNAD (SEQ ID NO: 7), YYNAD (SEQ ID NO: 8), QQNAD (SEQ ID NO: 9), QNNAD (SEQ ID NO: 10), QSNAD (SEQ ID NO: 11 ), QTNAD (SEQ ID NO: 12), QYQAD (SEQ ID NO: 13), QYSAD (SEQ ID NO: 14), QYTAD (SEQ ID NO: 15), QYYAD (SEQ ID NO: 16), QYNGD (SEQ ID NO: 17), QYNVD (SEQ ID NO: 18), QYNID (SEQ ID NO: 19), QYNLD (SEQ ID NO: 20), und QYNAE (SEQ ID NO: 21 ).Particularly preferred derivatives of the peptide are selected from: NYNAD (SEQ ID NO: 5), SYNAD (SEQ ID NO: 6), TYNAD (SEQ ID NO: 7), YYNAD (SEQ ID NO: 8), QQNAD (SEQ ID NO : 9), QNNAD (SEQ ID NO: 10), QSNAD (SEQ ID NO: 11), QTNAD (SEQ ID NO: 12), QYQAD (SEQ ID NO: 13), QYSAD (SEQ ID NO: 14), QYTAD (SEQ ID NO: 15), QYYAD (SEQ ID NO: 16), QYNGD (SEQ ID NO: 17), QYNVD (SEQ ID NO: 18), QYNID (SEQ ID NO: 19), QYNLD (SEQ ID NO: 20), and QYNAE (SEQ ID NO: 21).
Diese Derivate sind durch konservative Substitution einer Aminosäure von der Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:1 ) des erfindungsgemäßen Peptides abgeleitet und weisen daher agonistische Eigenschaften auf.These derivatives are derived from the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of the peptide according to the invention by conservative substitution of an amino acid and therefore have agonistic properties.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Peptid ferner wenigstens an einer N-terminal, intern und/oder C-terminal gelegenen Aminosäure modifiziert. Solche Modifikationen können dergestalt sein, daß die Pep- tidstruktur an der C-terminalen Gruppe verlängert oder modifiziert ist und/oder an der N-terminalen Gruppe verlängert oder modifiziert ist und/oder an beiden Gruppen entsprechende Verlängerungen und/oder Modifikationen besitzt. Diese Modifikationen können im Liquor oder Serum natürlicherweise vorkommende Modifikationen sein; das Peptid jedoch auch synthetisch modifiziert werden, damit es beispielsweise funktioneil an ein diagnostisches System angepaßt ist. Dies ist beispielsweise dann der Fall, wenn Aminosäuren oder andere chemische Strukturen als Spacer fungieren, um nach der Kopplung an ein Trägermolekül möglichst in einem diagnostischen Testsystem optimal durch einen Antikörper erkannt werden zu können oder eine besondere Eignung zur Erkennung des Peptids bei der Präsentation als Antigen aufzuweisen.In a further preferred embodiment, the peptide is further modified at least on an N-terminal, internal and / or C-terminal amino acid. Such modifications can be such that the peptide structure is extended or modified on the C-terminal group and / or is extended or modified on the N-terminal group and / or has corresponding extensions and / or modifications on both groups. These modifications can be naturally occurring modifications in the cerebrospinal fluid or serum; however, the peptide can also be modified synthetically so that it is, for example, functionally adapted to a diagnostic system. This is the case, for example, when amino acids or other chemical structures act as spacers in order to be able to be optimally recognized by an antibody in a diagnostic test system after coupling to a carrier molecule, or if they are particularly suitable for recognizing the peptide when presented as an antigen exhibit.
Weitere erfindungsgemäße Modifikationen umfassen Acetylierung, Glykosylie- rung und/oder Amidierung von N-terminalen Amino-Gruppen, Seitenketten-Further modifications according to the invention include acetylation, glycosylation and / or amidation of N-terminal amino groups, side chain
lo gruppen und/oder C-terninalen Carboxy-Gruppen. Weitere Modifikationen umfassen übliche N-terminale Schutzgruppen, wie die Benzyloxycarbonylgrup- pe, und/oder C-terminale Schutzgruppen.lo groups and / or C-terninal carboxy groups. Further modifications include conventional N-terminal protective groups, such as the benzyloxycarbonyl group, and / or C-terminal protective groups.
Weiterhin werden erfindungsgemäß die Salze des Peptides bereitgestellt. Hierbei sind physiologisch verträgliche Salze, wie z. B. Natriumsalze, Kaliumsalze, Magnesiumsalze, Bicarbonatsalze, Acetate, Citrate und Chloride bevorzugt. Ferner werden erfindungsgemäß auch die Ester des erfindungsgemäßen Peptides umfaßt, wobei Ester bevorzugt sind, die unter physiologischen Bedingungen spaltbar sind. Solche Ester können Vorteile bei der galenischen Zubereitung und eine erhöhte Lagerstabilität aufweisen.Furthermore, the salts of the peptide are provided according to the invention. Here are physiologically acceptable salts, such as. B. sodium salts, potassium salts, magnesium salts, bicarbonate salts, acetates, citrates and chlorides are preferred. Furthermore, the esters of the peptide according to the invention are also included according to the invention, preference being given to esters which can be cleaved under physiological conditions. Such esters can have advantages in galenical preparation and have an increased shelf life.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Polypeptid bereit, das wenigstens ein erfindungsgemäßes Peptid umfaßt. Hierunter fallen sowohl natürlicherweise vorkommende Polypeptide, besonders bevorzugt das Vorläuferprotein, aus dem durch Spaltung das erfindungsgemäße Peptid hervorgeht, als auch nicht natürlicherweise vorkommende Polypeptide, die durch chemische und/oder enzymatische Synthese bzw. durch gentechnologische Verfahren erhalten werden können. Sofern gentechnologische Verfahren zur Herstellung des Polypeptides verwendet werden, können sämtliche dem Fachmann bekannte Aufreinigungsverfahren einschließlich chromatographischer Verfahren, wie Ionenaustauscher-, hydrophobe Interaktions-, Geifiltrations- und Affinitäts-Chromatographie verwendet werden.In a further embodiment, the invention provides a polypeptide which comprises at least one peptide according to the invention. This includes both naturally occurring polypeptides, particularly preferably the precursor protein from which the peptide according to the invention is obtained by cleavage, and non-naturally occurring polypeptides which can be obtained by chemical and / or enzymatic synthesis or by genetic engineering processes. If genetic engineering methods are used to produce the polypeptide, all purification methods known to the person skilled in the art, including chromatographic methods, such as ion exchange, hydrophobic interaction, geifiltration and affinity chromatography, can be used.
Experimentell wurde festgestellt, daß ein Peptid mit der Sequenz Gln-Tyr-Asn- Asp-Ala (SEQ ID NO:2), welches somit eine Inversion der letzten beiden Aminosäuren gegenüber dem erfindungsgemäßen Peptid aufweist, keine neuroin- hibitorische Aktivität in Bezug auf Natrium-Ionenkanäle aufweist. Daraus ergibt sich, daß möglicherweise die beiden terminalen Carboxy-Gruppen der Aminosäure Asparaginsäure für die neuroinhibitorische Aktivität des Peptides essentiell sind. Somit sind gemäß einer Ausführungsform solche Polypeptide be-It was found experimentally that a peptide with the sequence Gln-Tyr-Asn-Asp-Ala (SEQ ID NO: 2), which thus has an inversion of the last two amino acids with respect to the peptide according to the invention, has no neuroinhibitory activity with respect to sodium Has ion channels. It follows from this that the two terminal carboxy groups of the amino acid aspartic acid may be essential for the neuroinhibitory activity of the peptide. According to one embodiment, such polypeptides are thus
I I vorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß das Peptid den C-Terminus des Polypeptids bildet.II preferred, which are characterized in that the peptide forms the C-terminus of the polypeptide.
Vorzugsweise ist das Polypeptid das natürliche Vorläuferprotein, aus dem durch posttranslationale Modifikation, insbesondere Prozessierungsvorgänge, das erfindungsgemäße Peptid mit der Sequenz Gln-Tyr-Asn-Ala-Asp hervorgeht.The polypeptide is preferably the natural precursor protein from which the peptide according to the invention with the sequence Gln-Tyr-Asn-Ala-Asp is obtained by post-translational modification, in particular processing operations.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Polypeptid, ausgewählt aus Polypeptiden mit einem Molekulargewicht von etwa 25 kDa, etwa 35 kDa, etwa 50 kDa, etwa 60 kDa, etwa 80 kDa und etwa 150 kDa nach SDS- Polyacrylamid Gelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen, wobei das Polypeptid spezifisch mit einem QYNAD-spezifischen Antiserum reagiert, bereit. Die durch „etwa" relativierte Größenangabe bedeutet dabei, dass sich in Abhängigkeit von Puffersystem und gewählten Größenmarkern, Abweichungen von 0-5 %, maximal 10 % ergeben können.In another aspect, the invention provides a polypeptide selected from polypeptides having a molecular weight of about 25 kDa, about 35 kDa, about 50 kDa, about 60 kDa, about 80 kDa and about 150 kDa according to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis under reducing conditions, wherein the polypeptide specifically reacts with a QYNAD-specific antiserum. The size information relativized by "approximately" means that depending on the buffer system and selected size markers, deviations of 0-5%, maximum 10%, can result.
Experimentell wurden durch Western Blot-Analyse von Serum- bzw. Liquor- Proben aus GBS- und MS-Patienten sechs Proteinbanden mit Molekulargewichten von etwa 25 kDa, etwa 35 kDa, etwa 50 kDa, etwa 60 kDa, etwa 80 kDa und etwa 150 kDa identifiziert, die eine spezifische Reaktion mit einem Peptid (SEQ ID No:11 )-spezifischen Antiserum aus Kaninchen zeigten. Es ist anzunehmen, dass die Polypeptide im Serum und Liquor gelöst vorliegen, wobei in Serum eine höhere Konzentration als im Liquor beobachtet wird. Mit Ausnahme des Polypeptids von etwa 35 kDa wurden die Polypeptide in Proben von MS- und GBS-Patienten, in geringerer Konzentration auch in Proben von gesunden Kontrollen gefunden. Das 25 und das 35 kDa-Polypeptid wurde in einzelnen, aber nicht allen, Patientenseren gefunden.Six protein bands with molecular weights of approximately 25 kDa, approximately 35 kDa, approximately 50 kDa, approximately 60 kDa, approximately 80 kDa and approximately 150 kDa were experimentally determined by Western blot analysis of serum and CSF samples from GBS and MS patients identified that showed a specific reaction with a peptide (SEQ ID No: 11) -specific antiserum from rabbits. It can be assumed that the polypeptides are dissolved in the serum and cerebrospinal fluid, with a higher concentration being observed in serum than in the cerebrospinal fluid. With the exception of the polypeptide of approximately 35 kDa, the polypeptides were found in samples from MS and GBS patients, and to a lesser extent also in samples from healthy controls. The 25 and 35 kDa polypeptides were found in individual but not all patient sera.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist jedes der Polypeptide erhältlich aus humanem Liquor oder Serum. Besonders bevorzugt stammt der Liquor oder das Serum aus einem GBS- oder MS-Patienten.In a preferred embodiment, each of the polypeptides is obtainable from human cerebrospinal fluid or serum. The CSF or the serum particularly preferably comes from a GBS or MS patient.
11 Die Aufreinigung der Polypeptide kann in an sich bekannter Weise einschließlich chromatographischer Techniken wie Gelfiltration, Ionenaustauscher-, hydrophobe Interaktions- und Affinitätschromatographie erfolgen. Zur Affinitätschromatographie ist insbesondere die Verwendung von Antikörpern geeignet. Die Verwendung polyklonaler Antikörper, die spezifisch das Peptid QYNAD erkennen, zur Aufreinigung der Polypeptide ist möglich, die Verwendung monoklonaler Antikörper ist jedoch bevorzugt. Nach der Immunaffinitätschro- matographie kann eine Auftrennung der Polypeptide in Abhängigkeit von ihrer Größe erfolgen. Die Sequenzanalyse der aufgereinigten Polypeptide kann mit kommerziell erhältlichen, automatischen Protein-Sequenzierautomaten durchgeführt werden.11 The polypeptides can be purified in a manner known per se, including chromatographic techniques such as gel filtration, ion exchange, hydrophobic interaction and affinity chromatography. The use of antibodies is particularly suitable for affinity chromatography. The use of polyclonal antibodies, which specifically recognize the peptide QYNAD, for the purification of the polypeptides is possible, but the use of monoclonal antibodies is preferred. After immunoaffinity chromatography, the polypeptides can be separated depending on their size. The sequence analysis of the purified polypeptides can be carried out using commercially available automatic protein sequencers.
Ferner stellt die Erfindung Derivate der Polypeptide bereit, wobei die Derivate sich durch die Addition, Substitution, Inversion, Insertion und/oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäure(n) von dem Polypeptid unterscheiden.Furthermore, the invention provides derivatives of the polypeptides, the derivatives differing from the polypeptide by the addition, substitution, inversion, insertion and / or deletion of one or more amino acids.
In einer bevorzugten Ausführungsform binden die Derivate an ein QYNAD- spezifisches Antiserum. Das Antiserum kann hierbei in an sich bekannter Weise durch Immunisieren von Versuchstieren wie Mäusen oder Kaninchen hergestellt werden. Der Nachweis der Bindung des Derivates des Polypeptides an das QYNAD-spezifische Antiserum kann beispielsweise im ELISA erfolgen. Erfindungsgemäß werden Derivate umfaßt, die sich durch die Addition, Substitution, Inversion, Insertion und/oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäure^) von der ursprünglichen Sequenz unterscheiden und wenigstens 50 %, vorzugsweise 80 %, insbesondere 90 % der Bindungsfähigkeit des Polypeptides an QYNAD-spezifisches Antiserum aufweisen.In a preferred embodiment, the derivatives bind to a QYNAD-specific antiserum. The antiserum can be produced in a manner known per se by immunizing experimental animals such as mice or rabbits. Binding of the derivative of the polypeptide to the QYNAD-specific antiserum can be demonstrated, for example, in an ELISA. According to the invention, derivatives are included which differ from the original sequence by the addition, substitution, inversion, insertion and / or deletion of one or more amino acids ^) and which have at least 50%, preferably 80%, in particular 90%, of the binding ability of the polypeptide to QYNAD- have specific antiserum.
Vorzugsweise ist das Derivat des Polypeptides wenigstens 80 % homolog zu dem Polypeptid.Preferably the derivative of the polypeptide is at least 80% homologous to the polypeptide.
U Weiterhin ist bevorzugt, dass das Derivat durch konservative Substitution einer oder mehrerer Aminosäure(n) des Polypeptides erhalten wird.U It is further preferred that the derivative is obtained by conservative substitution of one or more amino acid (s) of the polypeptide.
Die Bestimmung der Homologie und die Definition konservativer Substitutionen wird hierbei wie vorstehend beschrieben ausgeführt.The determination of the homology and the definition of conservative substitutions is carried out as described above.
Das oder die Vorläuferprotein(e) ist/sind weiterhin erhältlich durch Absuchen einer humanen cDNA-Bank aus Gehirn, Rückenmark, Lymphozyten, Makro- phagen, Oligodendrocyten oder Gliazellen mit einer Sonde, die auf der Grundlage der erfindungsgemäßen Sequenz hergestellt wurde. Geeignete cDNA- Banken sind kommerziell erhältlich; ihre Herstellung gehört darüber hinaus zum allgemeinen Fachwissen; vgl. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989. Die Sequenz des Oligonukleotides, das als Sonde zum Absuchen der cDNA-Bank geeignet ist, ergibt sich aufgrund des universellen genetischen Codes. Hierbei sind jedoch Oligonukleotidsequenzen bevorzugt, die der Häufigkeit des humanen Codon-Gebrauchs entsprechen.The precursor protein (s) can also be obtained by screening a human cDNA library from the brain, spinal cord, lymphocytes, macrophages, oligodendrocytes or glial cells with a probe which was produced on the basis of the sequence according to the invention. Suitable cDNA banks are commercially available; their manufacture is also part of the general specialist knowledge; see. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989. The sequence of the oligonucleotide, which is suitable as a probe for screening the cDNA library, results from the universal genetic code. However, oligonucleotide sequences which correspond to the frequency of human codon use are preferred.
Die Aminosäure Glutamin wird allgemein durch die Codons CAA bzw. CAG, vorzugsweise aufgrund des humanen Codon-Gebrauchs durch CAG codiert. Die Aminosäure Tyrosin wird allgemein durch TAT oder TAC, vorzugsweise durch TAC codiert. Die Aminosäure Asparagin wird durch AAT, AAC, vorzugsweise durch AAC codiert. Die Aminosäure Alanin wird durch GCT, GCC, GCA bzw. GCG, vorzugsweise durch GCC codiert. Die Aminosäure Asparaginsäure wird durch GAT oder GAC, vorzugsweise durch GAC codiert. Der in diesem Zusammenhang wiedergegebene Codon-Gebrauch kann beispielsweise folgenden Literaturstellen entnommen werden: Grantham, R. et al., Nucleic Acids Res. 8 (1980), r49-r62; der gegenwärtigen Internetadresse FTP://ftp. es. embnet.org/pub/databases/codonusage/hum. cod.The amino acid glutamine is generally encoded by the codons CAA or CAG, preferably due to the human codon use by CAG. The amino acid tyrosine is generally encoded by TAT or TAC, preferably by TAC. The amino acid asparagine is encoded by AAT, AAC, preferably by AAC. The amino acid alanine is encoded by GCT, GCC, GCA or GCG, preferably by GCC. The amino acid aspartic acid is encoded by GAT or GAC, preferably by GAC. The codon use reproduced in this context can be found, for example, in the following references: Grantham, R. et al., Nucleic Acids Res. 8 (1980), r49-r62; the current internet address FTP: // ftp. it. embnet.org/pub/databases/codonusage/hum. cod.
Somit ergibt sich, daß die zum Absuchen der cDNA-Bank geeignete Sonde die allgemeine Sequenz aufweist: CARTAYAAYGCNGAY (SEQ ID NO: 3). R bedeutet hierbei A oder G; Y bedeutet T oder C; und N bedeutet A, G, C oder T. Vorzugsweise hat die Sonde die Sequenz CAGTACAACGCCGAC (SEQ ID NO: 4). Zum Absuchen dar cDNA-Bank ist ebenfalls der Gegenstrang der vorstehend genannten Sequenzen geeignet. Das Oligonukleotid kann mit Hilfe bekannter Festphasen-Synthesetechniken hergestellt werden. Um als Sonde verwendet zu werden, wird das Oligonukleotid mit Hilfe bekannter Verfahren radioaktiv oder nicht-radioaktiv (z. B. Fluoreszenz) markiert. Die Sonde wird gemäß dem Fachmann bekannter Verfahren (Maniatis et al., supra) mit der cDNA-Bank in Kontakt gebracht. Das Inkontaktbringen wird vorzugsweise unter stringenten Bedingungen durchgeführt; stringente Bedingungen sind in diesem Zusammenhang eine Inkubation bei 68°C über Nacht in 0,5 x SSC; 1 % Blockierungsreagenz (Boehringer Mannheim), 0,1 % Nat umlaurylsarkosinat, gefolgt von Waschen mit 2 x SSC, 0,1 % SDS. Die auf diese Weise erhaltenen cDNA- Klone werden unter Verwendung bekannter Verfahren isoliert und sequenziert. Die Aminosäuresequenz des Vorläuferproteins läßt sich direkt aus der Nukleo- tidsequenz in dem Fachmann bekannter Weise ableiten. Das erfindungsgemäße Polypeptid bzw. Vorläuferprotein kann durch chemische und/oder enzymati- sche Synthese oder durch gentechnologische Verfahren, insbesondere rekom- binante Expression, in heterologen Expressionssystemen hergestellt werden.It follows that the probe suitable for searching the cDNA bank has the general sequence: CARTAYAAYGCNGAY (SEQ ID NO: 3). R here denotes A or G; Y represents T or C; and N means A, G, C or T. Preferably the probe has the sequence CAGTACAACGCCGAC (SEQ ID NO: 4). The opposite strand of the above-mentioned sequences is also suitable for searching the cDNA bank. The oligonucleotide can be made using known solid phase synthesis techniques. To be used as a probe, the oligonucleotide is labeled radioactive or non-radioactive (e.g. fluorescence) using known methods. The probe is contacted with the cDNA library according to methods known to those skilled in the art (Maniatis et al., Supra). The contacting is preferably carried out under stringent conditions; stringent conditions in this context are an incubation at 68 ° C. overnight in 0.5 × SSC; 1% blocking reagent (Boehringer Mannheim), 0.1% Nat umlauryl sarcosinate, followed by washing with 2 x SSC, 0.1% SDS. The cDNA clones thus obtained are isolated and sequenced using known methods. The amino acid sequence of the precursor protein can be derived directly from the nucleotide sequence in a manner known to those skilled in the art. The polypeptide or precursor protein according to the invention can be produced by chemical and / or enzymatic synthesis or by genetic engineering methods, in particular recombinant expression, in heterologous expression systems.
In einer weiteren Ausführungsform werden ferner Varianten des Vorläuferproteins, die in diesem Zusammenhang auch als Polypeptide bezeichnet werden, bereitgestellt, die neuroinhibito sche Aktivität aufweisen und/oder an einen Natrium-Ionenkanal binden. Vorzugsweise ist der Natrium-Ionenkanal ein Spannungs-abhängiger Natrium-Ionenkanal. Die neuroinhibitohsche Aktivität ist bevorzugt die Hemmung eines Natrium-Ionenkanals. Die Bestimmung der Bindung an einen Natrium-Ionenkanal bzw. der neuroinhibitorischen Aktivität kann wie vorstehend für das erfindungsgemäße Peptid durchgeführt werden. Die erfindungsgemäßen Polypeptide weisen in einer bevorzugten Ausführungsform 10%, vorzugsweise 50%, besonders bevorzugt 90% der Natrium- lonenkanal-Bindungsfähigkeit des Peptides mit der Sequenz (SEQ ID NO:1 ) auf und/oder wenigstens 50%, vorzugsweise 80% und besonders bevorzugt 90% der neuroinhibitorischen Aktivität.In a further embodiment, variants of the precursor protein, which in this context are also referred to as polypeptides, are also provided which have neuroinhibito activity and / or bind to a sodium ion channel. The sodium ion channel is preferably a voltage-dependent sodium ion channel. The neuroinhibitory activity is preferably the inhibition of a sodium ion channel. The determination of the binding to a sodium ion channel or the neuroinhibitory activity can be carried out as above for the peptide according to the invention. In a preferred embodiment, the polypeptides according to the invention have 10%, preferably 50%, particularly preferably 90% of the sodium ion channel binding ability of the peptide with the sequence (SEQ ID NO: 1) and / or at least 50%, preferably 80% and particularly preferably 90% of the neuroinhibitory activity.
/ r In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Fusionsprotein bereit, das wenigstens ein erfindungsgemäßes Peptid und/oder Polypeptid und wenigstens ein biologisch aktives Polypeptid oder ein aktives Fragment davon enthält. In diesem Zusammenhang soll der Ausdruck "biologisch aktives Polypeptid" sämtliche Peptide oder Proteine mit biologischer Aktivität bedeuten. Es ist bevorzugt, daß die biologische Aktivität eine Aktivität ist, die an der Entwicklung und Regeneration von Zellen, Geweben und Organen des menschlichen und tierischen Körpers beteiligt ist. Es ist bevorzugt, daß die biologische Aktivität die Entwicklung und Differenzierung von Zellen des pehpheren und zentralen Nervensystems und deren Versorgungszellen beeinflußt. Das erfindungsgemäße Fusionsprotein erfüllt hierbei die Aufgabe, die lokale Konzentration des biologisch aktiven Polypeptides in der Nähe von Natrium- Ionenkanälen, vorzugsweise spannungsabhängigen Natrium-Ionenkanälen aufgrund der in dem Fusionsprotein ferner enthaltenen erfindungsgemäßen Peptid oder Polypeptidsequenz zu erhöhen. Dies hat zur Folge, daß biologisch aktive Polypeptide, die selbst nur eine geringe oder mittlere Bindungsfähigkeit für diese Natrium-Ionenkanäle aufweisen, in ihrer Bindungsfähigkeit deutlich erhöht sind. Bevorzugte Fusionsproteine umfassen Ciliären neurotrophen Faktor (CNTF), "Brain-de ved" neurotrophen Faktor (BDNF), Neurotrophin-3 (NT-3), Neurotrophin 4/5 (NT-4/5) und Gliazellenabgeleiteten neurotrophen Faktor (GDNF), jeweils in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Peptid./ r In a further embodiment, the invention provides a fusion protein which contains at least one peptide and / or polypeptide according to the invention and at least one biologically active polypeptide or an active fragment thereof. In this context, the term "biologically active polypeptide" is intended to mean all peptides or proteins with biological activity. It is preferred that the biological activity is an activity involved in the development and regeneration of cells, tissues and organs of the human and animal body. It is preferred that biological activity affect the development and differentiation of phepheric and central nervous system cells and their supply cells. The fusion protein according to the invention fulfills the task of increasing the local concentration of the biologically active polypeptide in the vicinity of sodium ion channels, preferably voltage-dependent sodium ion channels, on the basis of the peptide or polypeptide sequence according to the invention also contained in the fusion protein. The consequence of this is that biologically active polypeptides, which themselves have only a low or medium binding capacity for these sodium ion channels, are significantly increased in their binding capacity. Preferred fusion proteins include ciliary neurotrophic factor (CNTF), brain-de ved neurotrophic factor (BDNF), neurotrophin-3 (NT-3), neurotrophin 4/5 (NT-4/5) and glial-derived neurotrophic factor (GDNF), in each case in connection with the peptide according to the invention.
Der Ausdruck "Fusionsprotein" bedeutet in diesem Zusammenhang, daß wenigstens ein erfindungsgemäßes Peptid und/oder Polypeptid an die Aminosäuresequenz des biologisch aktiven Polypeptides oder ein aktives Fragment davon addiert ist, und/oder in die Aminosäuresequenz des biologisch aktiven Polypeptides inseriert ist, und/oder wenigstens eine natürlicherweise in der Aminosäuresequenz des biologisch aktiven Polypeptides vorkommende Oligopep- tidsequenz durch ein erfindungsgemäßes Peptid oder Polypeptid substituiert ist. Weiterhin ist bevorzugt, daß das erfindungsgemäße Peptid, Polypeptid oder Fusionsprotein ferner eine für die rekombinante Expression relevante Sequenz am N-Terminus umfaßt, wobei die für die rekombinante Expression relevante Sequenz M oder MX ist, und M Methionin und X eine oder mehrere beliebige Aminosäuren bedeutet. MX kann beispielsweise eine Signalsequenz darstellen, die dem Fachmann für zahlreiche prokaryontische und eukaryontische Proteine bekannt ist. X umfaßt 1 bis 40, bevorzugt 5 bis 30 oder 15 bis 25 Aminosäuren.The term "fusion protein" in this context means that at least one peptide and / or polypeptide according to the invention is added to the amino acid sequence of the biologically active polypeptide or an active fragment thereof, and / or is inserted into the amino acid sequence of the biologically active polypeptide, and / or at least one oligopeptide sequence naturally occurring in the amino acid sequence of the biologically active polypeptide is substituted by a peptide or polypeptide according to the invention. It is further preferred that the peptide, polypeptide or fusion protein according to the invention further comprises a sequence relevant for recombinant expression at the N-terminus, the sequence relevant for recombinant expression being M or MX, and M being methionine and X being any one or more amino acids , MX can represent, for example, a signal sequence which is known to the person skilled in the art for numerous prokaryotic and eukaryotic proteins. X comprises 1 to 40, preferably 5 to 30 or 15 to 25 amino acids.
Die Erfindung stellt ferner Nukleinsäuremoleküle bereit, die eine für ein erfindungsgemäßes Peptid, Polypeptid oder Fusionsprotein kodierende Nukleinsäure umfassen.The invention also provides nucleic acid molecules which comprise a nucleic acid coding for a peptide, polypeptide or fusion protein according to the invention.
Die im erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül enthaltene Nukleinsäure kann genomische DNA oder synthetische DNA sein, wobei unter synthetischer DNA auch solche verstanden werden, die modifizierte Internukleosid-Bindungen enthalten. Weiterhin kann es sich bei den Nukleinsäuren um RNA-Moleküle handeln, was z. B. für die Expression mittels rekombinanter RNA- Vektorsysteme erforderlich sein kann.The nucleic acid contained in the nucleic acid molecule according to the invention can be genomic DNA or synthetic DNA, synthetic DNA also being understood to mean those which contain modified internucleoside bonds. Furthermore, the nucleic acids can be RNA molecules. B. may be required for expression by means of recombinant RNA vector systems.
Erfindungsgemäß wird ein Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, das eine Nukleinsäure umfaßt, die ausgewählt ist aus:According to the invention, a nucleic acid molecule is provided which comprises a nucleic acid which is selected from:
(i) einer für ein erfindungsgemäßes Peptid, Polypeptid oder Fusionsprotein kodierenden Nukleinsäure;(i) a nucleic acid coding for a peptide, polypeptide or fusion protein according to the invention;
(ii) einer zu der Nukleinsäure nach (i) komplementären Nukleinsäure; und(ii) a nucleic acid complementary to the nucleic acid according to (i); and
(iii) einer Nukleinsäure, die mit einer Nukleinsäure nach (i) oder (ii) hybridisiert und für ein Polypeptid kodiert, das an einen Natrium-Ionenkanal bindet und/oder neuroinhibitorische Aktivität aufweist.(iii) a nucleic acid which hybridizes with a nucleic acid according to (i) or (ii) and codes for a polypeptide which binds to a sodium ion channel and / or has neuroinhibitory activity.
n Die Nukleinsäuren gemäß (iii) sind beispielsweise erhältlich durch Verwenden einer nachweisbar markierten Sonde, die einer Nukleinsäure gemäß (i) oder (ii) entspricht, zum Absuchen von cDNA- oder genomischen DNA-Bibliotheken. Hierbei sind allgemein cDNA-/genomische DNA-Banken aus Vertebraten, vorzugsweise aus Säugern und besonders bevorzugt aus Menschen verwendbar. Die der cDNA-Bank zugrunde liegende mRNA ist vorzugsweise aus Gehirn, Rückenmark, Lymphozyten, Makrophagen, Oligodendrocyten oder Gliazellen zu erhalten. Die Identifizierung positiver cDNA-/genomischer DNA-Klone erfolgt gemäß Standardverfahren; vgl. Maniatis et al., supra.n The nucleic acids according to (iii) can be obtained, for example, by using a detectably labeled probe which corresponds to a nucleic acid according to (i) or (ii) to search for cDNA or genomic DNA libraries. In general, cDNA / genomic DNA banks from vertebrates, preferably from mammals and particularly preferably from humans, can be used here. The mRNA on which the cDNA bank is based can preferably be obtained from the brain, spinal cord, lymphocytes, macrophages, oligodendrocytes or glial cells. Positive cDNA / genomic DNA clones are identified using standard procedures; see. Maniatis et al., Supra.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die unter (iii) angegebene Hybridisierung unter stringenten Bedingungen durchgeführt. Stringente Hybridisie- rungsbedingungen sind z. B. eine Inkubation bei 68°C über Nacht in 0,5 x SSC; 1 % Blockierungsreagenz (Boehringer Mannheim); 0,1 % Natriumlaurylsarkosi- nat, gefolgt von Waschen mit 2 x SSC; 0,1 % SDS.In a preferred embodiment, the hybridization indicated under (iii) is carried out under stringent conditions. Stringent hybridization conditions are e.g. B. incubation at 68 ° C overnight in 0.5 x SSC; 1% blocking reagent (Boehringer Mannheim); 0.1% sodium lauryl sarcosinate, followed by washing with 2 x SSC; 0.1% SDS.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül einen zur Expression geeigneten Promotor, wobei die Nuklein- säuresequenz unter der Kontrolle des Promotors steht. Die Wahl des Promotors hängt vom zur Expression verwendeten Expressionssystem ab. Generell sind konstitutive Promotoren bevorzugt, jedoch sind auch induzierbare Promotoren, wie z. B. der Metallothionein-Promotor, möglich.In a preferred embodiment, the nucleic acid molecule according to the invention comprises a promoter suitable for expression, the nucleic acid sequence being under the control of the promoter. The choice of promoter depends on the expression system used for expression. In general, constitutive promoters are preferred, but inducible promoters such as e.g. B. the metallothionein promoter possible.
In einer weiteren Ausführungsform werden Vektoren bereitgestellt, die das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül enthalten. Im Stand der Technik sind zahlreiche Klonierungs- und Expressions-Vektoren bekannt, vgl. Recombinant Gene Expression Protocols, Meth. Mol. Biol. Vol. 62, Humana Press, New Jersey, USA. Der verwendete Vektor sollte einen Replikationsursprung und gegebenenfalls weitere regulatorische Regionen enthalten. Der Vektor kann ausgewählt sein aus Bakte ophagen wie λ-Derivaten, Adenoviren, Vacciniaviren, Baculoviren, SV40-Virus, Retroviren; Plasmiden, wie Ti-Plasmide von Agrobacte um tumefaciens, YAC-Vektoren und BAC-Vektoren. Ferner stellt die Erfindung Wirtszeilen bereit, die das Nukleinsäuremolekül oder den Vektor enthalte i und die zur Expression des Nukleinsäuremoleküls geeignet sind. Im Stand der Technik sind zahlreiche prokaryontische und euka- ryontische Expressionssysteme bekannt, wobei die Wirtszellen beispielsweise ausgewählt sind aus prokaryontischen Zellen, wie E. coli oder B. subtilis, aus eukaryontischen Zellen, wie Hefezellen, Pflanzenzellen, Insektenzellen und Säugerzellen, z. B. CHO-Zellen, COS-Zellen oder HeLa-Zellen, sowie Derivaten davon. Im Stand der Technik sind beispielsweise bestimmte CHO- Produktionslinien bekannt, deren Glykosylierungsmuster im Vergleich zu CHO- Zellen verändert sind.In a further embodiment, vectors are provided which contain the nucleic acid molecule according to the invention. Numerous cloning and expression vectors are known in the prior art, cf. Recombinant Gene Expression Protocols, Meth. Mol. Biol. Vol. 62, Humana Press, New Jersey, USA. The vector used should contain an origin of replication and possibly further regulatory regions. The vector can be selected from bacterial ophages such as λ derivatives, adenoviruses, vaccinia viruses, baculoviruses, SV40 virus, retroviruses; Plasmids such as Agrobacte um tumefaciens Ti plasmids, YAC vectors and BAC vectors. The invention further provides host lines which contain the nucleic acid molecule or the vector and which are suitable for the expression of the nucleic acid molecule. Numerous prokaryotic and eukaryotic expression systems are known in the prior art, the host cells being selected, for example, from prokaryotic cells such as E. coli or B. subtilis, from eukaryotic cells such as yeast cells, plant cells, insect cells and mammalian cells, e.g. B. CHO cells, COS cells or HeLa cells, and derivatives thereof. In the prior art, for example, certain CHO production lines are known whose glycosylation patterns have changed compared to CHO cells.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zum Herstellen des Peptides, Polypeptides oder Fusionsproteins, das das Kultivieren einer Wirtszelle unter zur Expression geeigneten Bedingungen und gegebenenfalls das Aufreinigen des exprimierten Peptides, Polypeptides oder Fusionsproteins umfaßt.The present invention further relates to a method for producing the peptide, polypeptide or fusion protein, which comprises culturing a host cell under conditions suitable for expression and optionally purifying the expressed peptide, polypeptide or fusion protein.
Alternativ können die erfindungsgemäßen Peptide, Polypeptide und Fusionsproteine auch durch chemische und enzymatische Synthese, wie beispielsweise Merrifield-Synthese, und/oder Fragmentkondensation erhalten werden. Hierbei können auch Kombinationen von chemischen, enzymatischen und re- kombinanten Herstellungsverfahren in Betracht kommen.Alternatively, the peptides, polypeptides and fusion proteins according to the invention can also be obtained by chemical and enzymatic synthesis, such as, for example, Merrifield synthesis, and / or fragment condensation. Combinations of chemical, enzymatic and recombining production processes can also be considered here.
Die Erfindung stellt weiterhin Reagenzien bereit, die für die erfindungsgemäßen Peptide und/oder Polypeptide spezifisch sind. Ein Beispiel solcher spezifischen Reagenzien sind Antikörper, Antikörperfragmente, z.B. Fv-, Fab- oder F(ab)2-Fragmente oder Antikörperderivate. Die Antikörper, Antikörperfragmente, z.B. Fv-, Fab oder F(ab)2-Fragmente oder Antikörperderivate können mono- klonalen oder polyklonalen Ursprungs sein. Allgemein sind spezifische Antikörper erhältlich, indem Versuchstiere, wie z. B. Mäuse oder Kaninchen, mit den erfindungsgemäßen Peptiden oder Polypeptiden, die vorzugsweise an geeig-The invention also provides reagents which are specific for the peptides and / or polypeptides according to the invention. An example of such specific reagents are antibodies, antibody fragments, for example Fv, Fab or F (ab) 2 fragments or antibody derivatives. The antibodies, antibody fragments, for example Fv, Fab or F (ab) 2 fragments or antibody derivatives can be of monoclonal or polyclonal origin. In general, specific antibodies are available by testing animals, such as. B. mice or rabbits, with the peptides or polypeptides according to the invention, which are preferably on suitable
/9 nete hochmolekulare Trägermoleküle (häufig Proteine) gekoppelt sind, oder Fusionsproteinen immunisiert werden. Das Immunisieren kann hierbei durch den Zusatz geeigneter Adjuvanzien erleichtert werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Monoklonale Antikörper sind üblicherweise durch Fusionieren von Milzzellen, die aus einer immunisierten Maus entnommen wurden, mit Tumorzellen und Selektionieren der dabei entstehenen Hybridome erhältlich. Diejenigen Hybridome, die effizient spezifische Antikörper sezernieren, können hierbei durch Absuchen des Überstandes bestimmt werden. Alternativ können Antikörper rekombinant hergestellt werden; bei der Herstellung rekombinanter Antikörper wird die mRNA aus Hybridomazellen oder B-Lymphozyten isoliert, die als Grundlage für die Synthese der entsprechenden cDNA fungiert und über PCR amplifiziert wird. Nach der Ligation in einen geeigneten Vektor und der Einführung in eine geeignete Wirtszellkultur läßt sich der Antikörper aus den Zellkulturüberständen oder den Zellysaten gewinnen. Rekombinante Antikörper erlauben eine "Humanisierung" des Antikörpers und sind dadurch weniger immunogen. Die diesbezüglichen Verfahren sind im Stand der Technik bekannt./ 9 Nete high molecular carrier molecules (often proteins) are coupled, or fusion proteins are immunized. Immunization can be facilitated by adding suitable adjuvants known in the art. Monoclonal antibodies are usually obtainable by fusing spleen cells, which have been removed from an immunized mouse, with tumor cells and selecting the hybridomas formed in the process. Those hybridomas that efficiently secrete specific antibodies can be determined by screening the supernatant. Alternatively, antibodies can be produced recombinantly; in the production of recombinant antibodies, the mRNA is isolated from hybridoma cells or B-lymphocytes, which acts as the basis for the synthesis of the corresponding cDNA and is amplified via PCR. After ligation into a suitable vector and introduction into a suitable host cell culture, the antibody can be obtained from the cell culture supernatants or the cell lysates. Recombinant antibodies allow "humanization" of the antibody and are therefore less immunogenic. The relevant methods are known in the prior art.
Weitere Reagenzien, die für ein erfindungsgemäßes Peptid oder Polypeptid spezifisch sind, sind Natrium-Ionenkanal-Proteine, bevorzugt spannungsabhängige Nat um-Ionenkanal-Proteine und Peptid- und/oder Polypeptid- spezifische Fragmente davon. Spannungsgesteuerte humane Natriumkanäle sind z. B. CIN1JHUMAN, P35498, CIN2JHUMAN, P99250, CIN4_HUMAN, P35499, CIN5_HUMAN, P14524, CIN6 HUMAN, P01118 aus der Datenbank unter der Internetadresse http://www.expasy.ch/sprot-top.html.Further reagents which are specific for a peptide or polypeptide according to the invention are sodium ion channel proteins, preferably voltage-dependent sodium ion channel proteins and peptide and / or polypeptide-specific fragments thereof. Voltage-controlled human sodium channels are e.g. B. CIN1JHUMAN, P35498, CIN2JHUMAN, P99250, CIN4_HUMAN, P35499, CIN5_HUMAN, P14524, CIN6 HUMAN, P01118 from the database at http://www.expasy.ch/sprot-top.html.
Die Erfindung stellt ferner Test-Kits bereit, die Peptid- oder Polypeptid- spezifische Reagenzien enthalten. Der Test-Kit kann weiterhin Komponenten enthalten, die notwendig sind zur Durchführung von Nachweis-Verfahren oder Puffersubstanzen zur entsprechenden Verdünnung und pH-Einstellung des Peptid- und/oder Polypeptid-spezifischen Reagenzes. Der Test-Kit ist insbesondere für diagnostische Zwecke geeignet. Der erfindungsgemäße Test-KitThe invention also provides test kits containing peptide or polypeptide specific reagents. The test kit can furthermore contain components which are necessary for carrying out detection methods or buffer substances for appropriate dilution and pH adjustment of the peptide- and / or polypeptide-specific reagent. The test kit is particularly suitable for diagnostic purposes. The test kit according to the invention
2o wird zur Bestimmung des erfindungsgemäßen Peptids oder Polypeptids vorzugsweise in einer aus dem menschlichen Körper stammenden Körperflüssigkeit verwendet. Es können jedoch auch Bestimmungen mit aus einem tierischem Körper stammender Körperflüssigkeit für diagnostische Zwecke durchgeführt werden.2o is used to determine the peptide or polypeptide according to the invention preferably in a body fluid originating from the human body. However, determinations with body fluid originating from an animal body can also be carried out for diagnostic purposes.
Die Erfindung umfaßt ferner die Verwendung der Reagenzien, die für ein erfindungsgemäßes Peptid oder Polypeptid spezifisch sind, in Verfahren zum Nachweisen des Peptides und/oder Polypeptides in einer Körperflüssigkeit. Vorzugsweise ist die Körperflüssigkeit aus cerebrospinaler Flüssigkeit oder Blut bzw. Blutprodukten oder Blutbestandteilen ausgewählt.The invention further includes the use of the reagents specific for a peptide or polypeptide according to the invention in methods for the detection of the peptide and / or polypeptide in a body fluid. The body fluid is preferably selected from cerebrospinal fluid or blood or blood products or blood components.
Ferner wird ein Verfahren zum Nachweisen des erfindungsgemäßen Peptides und/oder Polypeptides bereitgestellt, daß das Durchführen wenigstens eines chromatographischen Verfahrens, wie Hochleistungsflüssigkeitschromatogra- phie (HPLC) und/oder Affinitätschromatographie umfaßt. Die Hochleistungs- flüssigkeitschromatographie, insbesondere bei Verwendung von Umkehrphasen, ist hervorragend geeignet zum Abtrennen relativ kurzer Peptide oder Polypeptide. Die Verwendung von Säulen mit geringem Durchmesser ist hierbei besonders vorteilhaft. Die Affinitätschromatographie wird unter Verwendung des vorstehend erwähnten Antikörpers durchgeführt, der spezifisch für das Peptid und/oder Polypeptid ist. Die Affinitätschromatographie zeichnet sich durch ihre besonders hohe Spezifität aus.Furthermore, a method for detecting the peptide and / or polypeptide according to the invention is provided which comprises performing at least one chromatographic method, such as high-performance liquid chromatography (HPLC) and / or affinity chromatography. High-performance liquid chromatography, especially when using reverse phases, is ideal for separating relatively short peptides or polypeptides. The use of columns with a small diameter is particularly advantageous here. Affinity chromatography is performed using the above-mentioned antibody that is specific for the peptide and / or polypeptide. Affinity chromatography is characterized by its particularly high specificity.
Die Erfindung stellt ferner Test-Kits bereit, die zum Nachweisen eines Antikörpers geeignet sind, der spezifisch für das erfindungsgemäße Peptid und/oder Polypeptid ist, wobei der Test-Kit wenigstens ein erfindungsgemäßes Peptid und/oder Polypeptid umfaßt. Der Test-Kit kann ferner im Stand der Technik bekannte Puffersubstanzen enthalten, die zur Verwendung des Test-Kits in Bestimmungs- und diagnostischen Verfahren geeignet sind. Die Erfindung umfaßt ferner die Verwendung des Peptides und/oder Polypeptides in Verfahren zum Bestimmen von Peptid- und/oder Polypeptid-spezifischen Autoantikörpern in einer Körperflüssigkeit. Vorzugsweise ist die Körperflüssigkeit aus cerebrospinaler Flüssigkeit oder Blut bzw. Blutprodukten ausgewählt. Der Nachweis der Autoantikörper in den genannten Körperflüssigkeiten ist von besonderem Interesse, da er als Marker für die vermutlich durch das Peptid vermittelten demyelinisierenden Erkrankungen verwendbar ist. Für Bestimmungszwecke vorteilhafte Verfahren sind hierbei Immunoassays, ELISA, RIA, Membrangebundene Teststreifen, Rezeptorbindungtests oder biosensorische Bestimmungen, deren Durchführung dem Fachmann bekannt sind. Beim Nachweis von Autoantikörpern sollen vorzugsweise das Peptid, das Polypeptid oder geeignete Peptid-Konjugate zur spezifischen Bindung der Autoantikörper herangezogen werden. In einem ELISA-Nachweis würde beispielsweise das Peptid auf einer Mikrotiterplatte immobilisiert werden. Im Test binden die spezifischen Autoantikörper und werden dann durch entsprechend markierte Anti- Immunglobulin-Antikörper durch bekannte Verfahren in ein Signal umgesetzt.The invention further provides test kits which are suitable for detecting an antibody which is specific for the peptide and / or polypeptide according to the invention, the test kit comprising at least one peptide and / or polypeptide according to the invention. The test kit can furthermore contain buffer substances known in the prior art which are suitable for use of the test kit in determination and diagnostic methods. The invention further encompasses the use of the peptide and / or polypeptide in methods for determining peptide and / or polypeptide-specific autoantibodies in a body fluid. The body fluid is preferably selected from cerebrospinal fluid or blood or blood products. The detection of autoantibodies in the body fluids mentioned is of particular interest since it can be used as a marker for the demyelinating diseases presumably mediated by the peptide. Methods which are advantageous for determination purposes are immunoassays, ELISA, RIA, membrane-bound test strips, receptor binding tests or biosensory determinations, the implementation of which is known to the person skilled in the art. In the detection of autoantibodies, the peptide, the polypeptide or suitable peptide conjugates should preferably be used for the specific binding of the autoantibodies. In an ELISA detection, for example, the peptide would be immobilized on a microtiter plate. In the test, the specific autoantibodies bind and are then converted into a signal by correspondingly labeled anti-immunoglobulin antibodies using known methods.
Die Erfindung stellt ferner Test-Kits zum Nachweisen der die erfindungsgemäßen Peptide und/oder Polypeptide kodierenden Nukleinsäure bereit. Die Test- Kits umfassen in diesem Falle wenigstens ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül, vorzugsweise umfaßt das Nukleinsäuremolekül die Sequenz (SEQ ID NO: 3) und besonders bevorzugt die Sequenz (SEQ ID NO: 4).The invention also provides test kits for detecting the nucleic acid encoding the peptides and / or polypeptides according to the invention. In this case, the test kits comprise at least one nucleic acid molecule according to the invention, preferably the nucleic acid molecule comprises the sequence (SEQ ID NO: 3) and particularly preferably the sequence (SEQ ID NO: 4).
Erfindungsgemäß werden die Nukleinsäuremoleküle in Verfahren zum Nachweisen einer das erfindungsgemäße Peptid und/oder Polypeptid kodierenden Nukleinsäure in einer biologischen Probe verwendet, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen der Probe mit einem eine nachweisbare Markierung tragenden Nukleinsäuremolekül und das Nachweisen der Markierung umfaßt. Zum Einsatz können hierbei Hybridisierungsverfahren, und ferner gegebenenfalls Northern Blot- und Southern Blot-Verfahren kommen. Das Nachweisen einer radioaktiven Markierung des Nukleinsäuremoleküls kann hierbei in einfacher Weise durch Autoradiographie erfolgen.According to the invention, the nucleic acid molecules are used in methods for detecting a nucleic acid encoding the peptide and / or polypeptide according to the invention in a biological sample, the method comprising contacting the sample with a nucleic acid molecule bearing a detectable label and detecting the label. Hybridization methods and, if appropriate, Northern blot and Southern blot methods can also be used. A radioactive labeling of the nucleic acid molecule can be detected in a simple manner by autoradiography.
2Z Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Entfernen des Peptides oder Polypeptides aus einer Körperflüssigkeit bereit. Das Peptid oder Polypeptid kann allgemein aufgrund der Kenntnis seiner molekularen Struktur durch physikalische, chemische oder biologische Verfahren entfernt werden. Diese Verfahren können beispielswweise Ultra- bzw. Diafiltration sein. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Verfahren das Inkontaktbringen der Körperflüssigkeit mit einem Reagenz, das spezifisch für das Peptid oder Polypeptid ist und das Entfernen des Komplexes, der das Peptid oder Polypeptid und das spezifische Reagenz enthält. Bevorzugte spezifische Reagenzien sind hierbei Antikörper oder Natrium-Ionenproteine und deren spezifische Fragmente. Besonders bevorzugt ist, daß das Peptid- oder Polypeptid-spezifische Reagenz an eine feste Matrix gebunden ist, und daß das Verfahren das Adsorbieren des Peptides oder Polypeptides an die Matrix umfaßt. Hierbei sind insbesondere Immunadsorptionsverfahren von Interesse, die durch eine hohe Effizienz des Entfemens charakterisiert sind.2Z The invention provides wide r toward provides a method of peptide or polypeptide from a body fluid removal. The peptide or polypeptide can generally be removed based on knowledge of its molecular structure by physical, chemical or biological methods. These methods can be ultra or diafiltration, for example. In a preferred embodiment, the method comprises contacting the body fluid with a reagent specific for the peptide or polypeptide and removing the complex containing the peptide or polypeptide and the specific reagent. Preferred specific reagents are antibodies or sodium ion proteins and their specific fragments. It is particularly preferred that the peptide or polypeptide-specific reagent is bound to a solid matrix and that the method comprises adsorbing the peptide or polypeptide onto the matrix. Of particular interest here are immunoadsorption methods which are characterized by a high efficiency of removal.
In einer weiteren Ausführungsform werden pharmazeutische Zusammensetzungen bereitgestellt, die mindestens ein erfindungsgemäßes Peptid, Polypeptid und/oder Fusionsprotein und gegebenenfalls einen pharmakologisch verträglichen Träger und/oder Verdünnungsmittel enthalten. Geeignete Träger und/oder Verdünnungsmittel sind im Stand der Technik bekannt. Bevorzugt sind die pharmazeutischen Zusammensetzungen zur intravenösen, subkutanen oder intramuskulären Verabreichung geeignet. Alternativ kann die pharmazeutische Zusammensetzung in Form eines Aerosols unter Verwendung geeigneter Erosolstabilisierender Verbindungen vorliegen.In a further embodiment, pharmaceutical compositions are provided which contain at least one peptide, polypeptide and / or fusion protein according to the invention and optionally a pharmacologically acceptable carrier and / or diluent. Suitable carriers and / or diluents are known in the prior art. The pharmaceutical compositions are preferably suitable for intravenous, subcutaneous or intramuscular administration. Alternatively, the pharmaceutical composition can be in the form of an aerosol using suitable erosol stabilizing compounds.
In Test-Versuchen zeigte sich, daß das Peptid eine starke neuroinhibitohsche Aktivität aufweist. Die beobachtete neuroinhibitorische Aktivität war deutlich höher als die neuroinhibitorische Aktivität des allgemein verwendeten Loka- lanästhetikums Lidocain. Somit wird erfindungsgemäß auch die Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzungen als Anästhetikum vorgeschlagen.Test experiments have shown that the peptide has a strong neuroinhibitory activity. The observed neuroinhibitory activity was significantly higher than the neuroinhibitory activity of the commonly used local anesthetic lidocaine. Thus, the use of the pharmaceutical compositions as an anesthetic is also proposed according to the invention.
Für Axone und ganze Nervenzellen kann es in Krisensituationen, wie sie bei der Demyelinisierung vorliegen, neuroprotektiv sein, wenn ihre elektrische Erregbarkeit gedämpft wird. In Krisensituationen kommt es häufig zur Depolarisa- tion von Neuronen oder Axonen. Dies kann einen Einstrom von Natrium und sekundär auch von Kalzium zur Folge haben. Eine erhöhte intrazelluläre Kalzium-Akkumulation wirkt sich bekanntermaßen neurotoxisch aus.For axons and entire nerve cells, it can be neuroprotective in crisis situations, such as are present in demyelination, if their electrical excitability is damped. In crisis situations, depolarization of neurons or axons often occurs. This can result in an influx of sodium and, secondarily, calcium. Increased intracellular calcium accumulation is known to be neurotoxic.
Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, könnte der beobachtete Anstieg der QYNAD-Konzentration bei MS und GBS Patienten eine Schutzfunktioπ für Axone und damit auch Neurone haben.Without being bound by theory, the observed increase in QYNAD concentration in MS and GBS patients could have a protective function for axons and thus also neurons.
Das Peptid QYNAD bewirkt hierbei durch die Hemmung des Natrium- loneneinstroms eine Normalisierung des Kationeneinstroms.The peptide QYNAD brings about a normalization of the cation influx by inhibiting the sodium ion influx.
Die Sättigung des Peptid-Effektes lag experimentell bei einer Konzentration von 100 μM, welches für die therapeutische Verwendung vorteilhaft ist, da es die axonale Aktivität normalisiert, jedoch nicht blockierend wirkt.The saturation of the peptide effect was experimentally at a concentration of 100 μM, which is advantageous for therapeutic use, since it normalizes the axonal activity, but does not have a blocking effect.
Erfindungsgemäß wird somit die Verwendung des Peptides zur Neuroprotekti- on vorgeschlagen.The use of the peptide for neuroprotection is thus proposed according to the invention.
Erfindungsgemäß wird die Verwendung des Peptides zur Behandlung von Po- lyneuropathien, insbesondere der Diabetischen Polyneuropathie, vorgeschlagen. Polyneuropathien sind Schädigungen der pehpheren Nerven.According to the invention, the use of the peptide for the treatment of polyneuropathies, in particular diabetic polyneuropathy, is proposed. Polyneuropathies are damage to the pehpheric nerves.
Ferner wird die Verwendung des Peptides zur Behandlung von Multipler Sklerose (MS) vorgeschlagen. Der mögliche Mechanismus könnte hierbei die Hemmung der axonalen Degeneration sein, wie sie bei einem Teil der MS-The use of the peptide for the treatment of multiple sclerosis (MS) is also proposed. The possible mechanism here could be the inhibition of axonal degeneration, as is the case in part of MS
Z Patienten auftritt. Das Peptid könnte über das Gefäßsystem in Demyelinisie- rungsherde eindringen und dort protektive Wirkungen auf die Axone ausüben.Z Patient occurs. The peptide could penetrate into the foci of demyelination via the vascular system and have protective effects there on the axons.
Das Peptid ist zur Behandlung der Folgen eines Schlaganfalls vorgesehen. Die neuroprotektive Eigenschaft des Peptides sollte hier die neurodegenerativen Prozesse in der Umgebung des primär betroffenen Gewebes abschwächen.The peptide is intended to treat the effects of a stroke. The neuroprotective property of the peptide should weaken the neurodegenerative processes in the vicinity of the primarily affected tissue.
Ferner wird die Verwendung zur Behandlung von Schmerzzuständen vorgeschlagen. Die neuroprotektive Eigenschaft normalisiert hierbei die Funktion überaktiver afferenter Neurone.Furthermore, the use for the treatment of pain conditions is proposed. The neuroprotective property normalizes the function of overactive afferent neurons.
Wie vorstehend ausgeführt, wurde das erfindungsgemäße Peptid im Liquor von MS-Patienten und GBS-Patienten, jedoch nicht bei gesunden Probanden beobachtet. Die beiden genannten Erkrankungen gehören zu den demyelinisie- renden Erkrankungen, die durch eine Auflösung der Myelin-Scheiden, die die Nervenzellen umgeben, charakterisiert sind. Einige Symptome der MS deuten darauf hin, daß MS als Autoimmunerkrankung zu betrachten ist. Erfindungsgemäße Peptide und Polypeptide, die eine erhöhte Bindungsfähigkeit für Natrium-Ionenkanäle, jedoch keine oder nur geringe neuroinhibitorische Aktivität aufweisen, sind als Antagonisten bzgl. des natürlicherweise vorkommenden Pentapeptides mit der Sequenz SEQ ID NO:1 wirksam. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Peptide und/oder Polypeptide enthalten, werden somit erfindungsgemäß zum Behandeln von demyelinisierenden Erkrankungen und allgemein zum Behandeln von Autoimmunerkrankungen vorgeschlagen. Weitere Anwendungsgebiete wären die Diagnostik und Therapie von neurodegenerativen Erkrankungen, Alzheimerscher Erkrankung und amyotropher Lateralsklerose.As stated above, the peptide according to the invention was observed in the cerebrospinal fluid of MS patients and GBS patients, but not in healthy volunteers. The two diseases mentioned belong to the demyelinating diseases, which are characterized by the dissolution of the myelin sheaths that surround the nerve cells. Some symptoms of MS suggest that MS is an autoimmune disease. Peptides and polypeptides according to the invention which have an increased binding capacity for sodium ion channels, but have no or only slight neuroinhibitory activity, are effective as antagonists with respect to the naturally occurring pentapeptide with the sequence SEQ ID NO: 1. Pharmaceutical compositions containing these peptides and / or polypeptides are thus proposed according to the invention for the treatment of demyelinating diseases and in general for the treatment of autoimmune diseases. Other areas of application would be the diagnosis and therapy of neurodegenerative diseases, Alzheimer's disease and amyotrophic lateral sclerosis.
Erfindungsgemäß sind somit sowohl Agonisten als auch Antagonisten des Peptides mit der Sequenz (SEQ ID No: 1 ) von therapeutischen Interesse bei der Behandlung von Krankheiten, die durch Lymphozyten vermittelt werden, vorzugsweise Autoimmunkrankheiten und Allergien.According to the invention, both agonists and antagonists of the peptide with the sequence (SEQ ID No: 1) are of therapeutic interest in the treatment of diseases mediated by lymphocytes, preferably autoimmune diseases and allergies.
2 Die spannungsabhängigen Natrium-Ionenkanäle werden von einer Multigen- Familie codiert. Die verschiedenen Isoformen von spannungs-abhängigen Natrium-Ionenkanälen sind heterotrimere Proteine, die aus einer großen, stark glycosylierten α-Untereinheit und einer oder zwei kleinen ß-Untereinheiten bestehen. Bisher sind acht unterschiedliche Gene (SCN1A bis SCN8A) bekannt, die für die α-Untereinheit kodieren, wobei die meisten von ihnen im Gehirn, pehpheren Nervensystem und Muskel exprimimiert werden. Es ist ferner bekannt, daß bestimmte Erbkrankheiten mit bestimmten Natrium-Ionenkanal kodierenden Genen assoziiert sind. So wurde befunden, daß die hyperkalämi- sche periodische Paralyse, eine erbliche humane Muskelerkrankung mit SCN4A assoziiert ist. Die erblichen Erkrankungen Paramyotonia congenita und Kalium-verstärkte Myotonia sind ebenfalls mit SCN4A assoziiert. Die erbliche Herz-Arrhythmie zeigt eine Assoziierung mit SCN5A. Die "motorische Endplatten-Krankheit" ist in der Maus mit SCN8A assoziiert. Somit können Agonisten bzw. Antagonisten bzgl. des Peptides der Sequenz (SEQ ID No: 1 ) zur Behandlung von erblichen Muskelerkrankungen und Herz-Arrhythmien verwendet werden.2 The voltage-dependent sodium ion channels are encoded by a Multigen family. The different isoforms of voltage-dependent sodium ion channels are heterotrimeric proteins, which consist of a large, strongly glycosylated α subunit and one or two small β subunits. So far, eight different genes (SCN1A to SCN8A) are known which code for the α subunit, most of which are expressed in the brain, phepheric nervous system and muscle. It is also known that certain hereditary diseases are associated with certain genes encoding the sodium ion channel. It was found that hyperkalemic periodic paralysis, an inherited human muscle disease, is associated with SCN4A. The inherited diseases Paramyotonia congenita and potassium-enhanced Myotonia are also associated with SCN4A. Hereditary cardiac arrhythmia is associated with SCN5A. "Motor endplate disease" is associated with SCN8A in the mouse. Thus, agonists or antagonists with respect to the peptide of the sequence (SEQ ID No: 1) can be used for the treatment of hereditary muscle diseases and cardiac arrhythmias.
Sofern die pharmazeutischen Zusammensetzungen Fusionsproteiπe enthalten, ist deren Verwendung abhängig von dem dem Fusionsprotein zugrunde liegenden weiteren biologisch aktiven Polypeptid. Vorzugsweise ist das biologisch aktive Polypeptid ein solches, das die Entwicklung und/oder Differenzierung von Zellen des pehpheren bzw. zentralen Nervensystems oder der sie versorgenden Zellen beeinflußt, wie z. B. Nervenwachstumsfaktor (NGF). CNTF, Ciliärer neurotropher FaKtor, BDNF, "brain-de ved" neurotropher Faktor, NT-3, Neurotrophin-3, NT-4/5, Neurotrophin-4/5, GDNF, Gliazellen abgeleiteter neurotropher Faktor. Generell sind diese pharmazeutischen Zusammensetzungen sinnvoll zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, bei denen die biologisch aktiven Polypeptide nur eine geringe Affinität für neuronale Strukturen aufweisen und deren Konzentration durch die Erhöhung der neuronalen Affinität somit deutlich erhöht werden kann. In diesem Zusam-If the pharmaceutical compositions contain fusion proteins, their use depends on the further biologically active polypeptide on which the fusion protein is based. The biologically active polypeptide is preferably one which influences the development and / or differentiation of cells of the phepheric or central nervous system or of the cells supplying them, such as, for. B. Nerve Growth Factor (NGF). CNTF, ciliary neurotrophic factor, BDNF, "brain-de ved" neurotrophic factor, NT-3, neurotrophin-3, NT-4/5, neurotrophin-4/5, GDNF, glial cell-derived neurotrophic factor. In general, these pharmaceutical compositions are useful for the treatment of neurodegenerative diseases in which the biologically active polypeptides have only a low affinity for neuronal structures and the concentration of which can thus be significantly increased by increasing the neuronal affinity. In this context
2 menhang ist besonders cie Behandlung der Alzheimer'schen Erkrankung von Interesse, die durch eine fortschreitende Degeneration neuronaler Strukturen charakterisiert ist.2 Menhang is of particular interest in the treatment of Alzheimer's disease, which is characterized by a progressive degeneration of neuronal structures.
Die Erfindung stellt ferner pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die mindestens ein Reagenz enthalten, das für ein erfindungsgemäßes Peptid und/oder Polypeptid spezifisch ist, und gegebenenfalls einen pharmakologisch verträglichen Träger und/oder Verdünnungsmittel. Solche spezifischen Reagenzien sind vorzugsweise ausgewählt aus spezifischen Antikörpern und Natrium-Ionenkanal Proteinen bzw. bindenden Fragmenten davon. Pharmakologisch verträgliche Träger und/oder Verdünnungsmittel sind im Stand der Technik bekannt. Peptid- und/oder Polypeptid-spezifische Reagenzien, die die Bindung des Peptides oder Polypeptides an den Natrium-Ionenkanal blockieren, sind zur Behandlung von demyelinisierenden und neurodegenerativen Erkrankungen verwendbar. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen sind bei geeigneter Markierung der spezifischen Reagenzien, beispielsweise radioaktiv oder nicht-radioaktiv, als Diagnostika verwendbar. Diese Diagnostika sind auch in NMR- oder Kernspintomographie-Verfahren verwendbar.The invention further provides pharmaceutical compositions which contain at least one reagent which is specific for a peptide and / or polypeptide according to the invention, and optionally a pharmacologically acceptable carrier and / or diluent. Such specific reagents are preferably selected from specific antibodies and sodium ion channel proteins or binding fragments thereof. Pharmacologically acceptable carriers and / or diluents are known in the prior art. Peptide and / or polypeptide specific reagents that block the binding of the peptide or polypeptide to the sodium ion channel can be used to treat demyelinating and neurodegenerative diseases. With suitable labeling of the specific reagents, for example radioactive or non-radioactive, the pharmaceutical compositions can be used as diagnostics. These diagnostics can also be used in NMR or magnetic resonance imaging methods.
Ferner stellt die Erfindung pharmazeutischen Zusammensetzungen bereit, die mindestens ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül und gegebenenfalls einen pharmakologisch verträglichen Träger und/oder Verdünnungsmittel enthalten. Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen sind sowohl zur Verwendung in diagnostischen als auch in therapeutischen Verfahren geeignet. Die diagnostischen Verfahren umfassen hierbei die in situ-Hybridisierung. Die Erfindung zieht als mögliche therapeutischen Anwendungen die somatische Gentherapie in Betracht, die die Unterdrückung der Expression eines Krank- heits-vermittelnden Gens bzw. den Ersatz eines defekten Gens durch eine korrekte Kopie bedeutet. Die hierbei zum Einsatz kommenden Verfahren sind unter anderem die Anti-sense- und Sense-Therapie, wobei geeignete Vektoren und Verfahren dem Fachmann bekannt sind. (Weiss et al., Cell Mol. Life Sei 55 (1999), 334-358).The invention further provides pharmaceutical compositions which contain at least one nucleic acid molecule according to the invention and optionally a pharmacologically acceptable carrier and / or diluent. These pharmaceutical compositions are suitable for use in both diagnostic and therapeutic procedures. The diagnostic methods include in situ hybridization. As possible therapeutic applications, the invention considers somatic gene therapy, which means the suppression of the expression of a disease-mediating gene or the replacement of a defective gene by a correct copy. The methods used here include anti-sense and sense therapy, suitable vectors and methods being known to the person skilled in the art. (Weiss et al., Cell Mol. Life Sei 55 (1999), 334-358).
21 Es ist beabsichtigt, mit den nachfolgenden Beispielen die Erfindung zu erläutern, diese jedoch in keiner Weise einzuschränken. Dem Fachmann sind aufgrund der Beschreibung der Beispiele weitere Ausführungsformen zugänglich, die ebenfalls umfaßt sind.21 The following examples are intended to illustrate the invention, but not to limit it in any way. Based on the description of the examples, further embodiments are accessible to the person skilled in the art, which are also included.
Fig. 1 zeigt die Dosis/Wirkungskurve des synthetischen Peptides Gln-Tyr-Asn- Ala-Asp (SEQ ID No: 1 ) auf die "steady-state"-lnaktivierungskurven. Die Figur zeigt die durchschnittliche Links-Verschiebung der h oo-Kurve, die gegen die Peptid-Konzentration aufgetragen ist.1 shows the dose / activity curve of the synthetic peptide Gln-Tyr-Asn-Ala-Asp (SEQ ID No: 1) on the "steady-state" inactivation curves. The figure shows the average left shift of the h oo curve, which is plotted against the peptide concentration.
Fig. 2 zeigt einen Western Blot. In den mit (GBS) markierten Spuren wurden Liquor-Proben von 3 GBS-Patienten, in der mit (MS) markierten Spur wurde die Liquor-Probe eines MS-Patienten aufgetragen. In die mit (contr.) gekennzeichnete Spur wurde eine Probe eines gesunden Individuums aufgetragen. In der rechten Spur wurde ein Molekulargewichtsstandard aufgetragen (14, 22, 31 , 45, 66, 97 bzw. 200 kDa).Fig. 2 shows a Western blot. In the lanes marked with (GBS) liquor samples from 3 GBS patients were applied, in the lane marked with (MS) the liquor samples from an MS patient were applied. A sample of a healthy individual was applied to the track marked (contr.). A molecular weight standard (14, 22, 31, 45, 66, 97 and 200 kDa) was plotted in the right lane.
Beispiele:Examples:
Beispiel 1 : Anwendung von Nachweisverfahren des Peptides und dessen Modifikationen zur DiagnostikExample 1: Application of detection methods of the peptide and its modifications for diagnostics
Das Peptid sowie Modifikationen oder Derivate davon werden erfindungsgemäß als Marker zur medizinischen Diagnostik von Erkrankungen, vorzugsweise von Erkrankungen des Nervensystems, wie beispielsweise GBS oder MS beim Menschen angewendet. Es kann in dieser Funktion auch zur Therapiekontrolle eingesetzt werden. Veterinärmedizinische Anwendungen sind ebenfalls möglich.The peptide and modifications or derivatives thereof are used according to the invention as markers for the medical diagnosis of diseases, preferably diseases of the nervous system, such as GBS or MS in humans. In this function it can also be used for therapy control. Veterinary applications are also possible.
Der Einsatz des Peptides als Marker erfolgt vorzugsweise in üblichen diagnostischen Verfahren, wie Blotting-Verfahren, Immunoassays, biosensorischen Verfahren oder vergleichbaren Verfahren. Dabei wird das Peptid oder dessen Modifikationen und Derivate in entsprechenden Bindungstests, beispielsweise in Immunoassays, eingesetzt. Hierbei kann das Peptid auch, vorzugsweise über seinen C-Terminus, seinen N-Terminus oder andere geeignete funktioneile Einheiten an Träger- oder Markerproteine, insbesondere auch Enzyme, oder auch Kolloide mit Hilfe bekannter Verfahren, vorzugsweise kovalent oder adsorptiv, gekoppelt bzw. gebunden werden. Diese Konjugate können in den diagnostischen Verfahren ebenfalls verwendet werden und stellen einen Bestandteil der Erfindung dar.The peptide is preferably used as a marker in customary diagnostic methods, such as blotting methods, immunoassays, biosensory methods or comparable methods. The peptide or its modifications and derivatives are used in appropriate binding tests, for example used in immunoassays. Here, the peptide can also, preferably via its C-terminus, its N-terminus or other suitable functional units, be coupled or bound to carrier or marker proteins, in particular also enzymes, or also colloids using known methods, preferably covalently or adsorptively , These conjugates can also be used in the diagnostic methods and form part of the invention.
Durch Kopplung des Peptids oder dessen abgeleiteter Struktur an Proteine oder andere Trägerstrukturen und anschließende Immunisierung mit diesen Konjugaten lassen sich Antikörper gewinnen, die die Peptidstruktur spezifisch erkennen und somit zur diagnostischen Bestimmung des Peptids, beispielsweise in Immunoassays, eingesetzt werden können. Auch diese Antikörper, die durch Immunisieren mit Hilfe des Peptids, dessen Konjugaten oder davon abgeleiteten Strukturen gewonnen werden, fallen in den Bereich der Erfindung. In einem vorzugsweise verwendeten diagnostischen System werden vorzugsweise gegen das Peptid gerichtete Antikörper beispielsweise auf adsorbierenden Mikrotiterplatten nach etablierten Verfahren immobilisiert. In einem kompetiti- ven Immunoassay konkurriert die freie Peptidstruktur aus der Liquor- oder Serumprobe mit einer konstanten Menge zugegebenen, beispielsweise enzymmarkierten Peptids um die Bindungsstellen der Antikörper, wodurch schließlich ein quantifizierbares Signal zur quantitativen Bestimmung des Peptides erzielt wird. Bei der Herstellung der Peptid-Protein bzw. Peptid-Enzym- Konjugate, wird das Peptid üblicherweise so modifiziert, meist durch Einbringung eines Spacerarms zum Trägerprotein, daß eine optimale Präsentation des Peptids möglichst effizient gewährleistet ist. Auch andere denkbare Assays mit unterschiedlichen Markern oder Strategien zur Präsentation des Peptids im diagnostischen System sind Bestandteil der Erfindung.By coupling the peptide or its derived structure to proteins or other carrier structures and subsequent immunization with these conjugates, antibodies can be obtained which specifically recognize the peptide structure and can thus be used for the diagnostic determination of the peptide, for example in immunoassays. These antibodies, which are obtained by immunizing with the aid of the peptide, its conjugates or structures derived therefrom, also fall within the scope of the invention. In a diagnostic system that is preferably used, antibodies directed against the peptide are immobilized, for example, on adsorbing microtiter plates using established methods. In a competitive immunoassay, the free peptide structure from the CSF or serum sample competes with a constant amount of added, for example enzyme-labeled, peptide for the binding sites of the antibodies, whereby a quantifiable signal for the quantitative determination of the peptide is finally achieved. In the production of the peptide-protein or peptide-enzyme conjugates, the peptide is usually modified in such a way, usually by introducing a spacer arm to the carrier protein, that an optimal presentation of the peptide is ensured as efficiently as possible. Other conceivable assays with different markers or strategies for presenting the peptide in the diagnostic system are also part of the invention.
Das Peptid kann in dieser Funktion auch zur Therapiekontrolle eingesetzt werden.In this function, the peptide can also be used for therapy control.
2 $ Die erstgenannte Diagnostik ist bei den verschiedenen Arten demyelinisieren- der Erkrankungen wie GBS und Multipler Sklerose indiziert. Durch die Bestimmung der zu analysierenden Strukturen in den entsprechenden Körperflüssigkeiten, vorzugsweise cerebrospinaler Flüssigkeit oder Serum, die entweder das Peptid selbst betrifft oder Strukturen betrifft, die endogen in den Körperflüssigkeiten vorhanden sein können und spezifisch an das Peptid binden, wie beispielsweise Rezeptoren oder Autoantikörper, werden diagnostische Aussagen in Bezug auf mögliche Erkrankungen ermöglicht. Diese Aussagen können im Zusammenhang mit der Diagnostik zur Identifizierung von Erkrankungen stehen oder beispielsweise auch zur Verlaufskontrolle der betreffenden Erkrankungen herangezogen werden.$ 2 The first mentioned diagnosis is indicated for the various types of demyelinating diseases such as GBS and multiple sclerosis. By determining the structures to be analyzed in the corresponding body fluids, preferably cerebrospinal fluid or serum, which either relates to the peptide itself or relates to structures which may be endogenously present in the body fluids and bind specifically to the peptide, such as, for example, receptors or autoantibodies enables diagnostic statements regarding possible diseases. These statements can be related to the diagnosis for the identification of diseases or, for example, can also be used to monitor the course of the diseases in question.
Die zweitgenannte Diagnostik betrifft Applikationen der mit der Peptidstruktur in Zusammenhang stehenden Methoden zu Forschungszwecken, wobei insbesondere die Aufklärung molekularer Abläufe im Zusammenhang mit physiologischen Vorgängen besonders unter pathophysiologischen Gesichtspunkten betroffen sind. Auch bei der Evaluierung im Zusammenhang mit der Entwicklung von Arzneimitteln kann die offenbarte Struktur als diagnostischer Marker zur Anwendung kommen.The second-mentioned diagnosis relates to applications of the methods related to the peptide structure for research purposes, in particular the elucidation of molecular processes in connection with physiological processes, particularly from a pathophysiological point of view. The structure disclosed can also be used as a diagnostic marker in evaluations in connection with the development of medicinal products.
Beispiel 2: Gewinnung von Antikörpern gegen das Peptid für die Anwendung in immunologischen Test (Diaqnostik)-VerfahrenExample 2: Obtaining antibodies against the peptide for use in immunological test (diaqnostics) methods
Die Antikörper werden dadurch gewonnen, daß das Peptid oder davon abgeleitete Strukturen, vorzugsweise Protein-Peptid-Konjugate, zur Immunisierung herangezogen werden. Üblicherweise werden das Peptid oder dessen Derivate vor deren Kopplung an Trägerstrukturen (Trägerprotein) beispielsweise mit Spacern modifiziert, um eine bessere Erkennung durch das Immunsystem zu fördern und damit effizientere Antikörper zu gewinnen. Antikörper bilden häufig die Grundlage zu einem diagnostischen Verfahren, das die routinemäßige Erfassung von Peptidstrukturen in diagnostischen Tests ermöglicht. Als MatrixThe antibodies are obtained by using the peptide or structures derived therefrom, preferably protein-peptide conjugates, for the immunization. The peptide or its derivatives are usually modified, for example with spacers, before they are coupled to carrier structures (carrier protein) in order to promote better recognition by the immune system and thus to obtain more efficient antibodies. Antibodies often form the basis of a diagnostic procedure that enables the routine detection of peptide structures in diagnostic tests. As a matrix
3 o hierfür dienen insbesondere humane Liquorproben, aber auch humanes Serum oder andere Körperflüssigl.eiten humanen oder tierischen Ursprungs.3 o human cerebrospinal fluid samples in particular serve this purpose, but also human serum or other body fluids of human or animal origin.
Beispiel 3: Nachweis von Autoantikörpern, die gegen das Peptid gerichtet sind, zur Diagnostik von AutoimmunerkrankungenExample 3: Detection of autoantibodies directed against the peptide for the diagnosis of autoimmune diseases
Das Peptid und dessen abgeleitete Strukturen werden erfindungsgemäß auch herangezogen, um Autoantikörper, die gegen die Peptidstruktur gerichtet sind, in Körperflüssigkeiten nachzuweisen. Sie dienen insofern als Markerstruktur für autoimmune Erkrankungen, und werden als Zielantigen in diagnostischen Verfahren eingesetzt. Darüber hinaus wird erfindungsgemäß auch der diagnostische Einsatz das Peptid spezifisch bindender Moleküle, beispielsweise von Rezeptorstrukturen, erfaßt. Hierfür wird das Peptid, vorzugsweise nach kova- lenter Kopplung an einen makromolekularen Träger adsorptiv, oder direkt kovalent, beispielsweise an aktivierten und kommerziell verfügbaren Mikrotiter- platten immobilisiert. Auf diesen Oberflächen, beispielsweise in Mikrotiterplat- ten werden die zu bestimmenden Liquor- oder Serumproben inkubiert. Eventuell vorhandene, gegen das Peptid gerichtete Autoantikörper werden gebunden und können dann beispielsweise durch enzymmarkierte Anti-human-Antikörper detektiert und quantifiziert werden.The peptide and its derived structures are also used according to the invention to detect autoantibodies that are directed against the peptide structure in body fluids. In this respect they serve as a marker structure for autoimmune diseases and are used as target antigens in diagnostic procedures. In addition, the diagnostic use of molecules specifically binding the peptide, for example of receptor structures, is also recorded according to the invention. For this purpose, the peptide is immobilized, preferably after covalent coupling to a macromolecular carrier, or directly covalently, for example on activated and commercially available microtiter plates. The CSF or serum samples to be determined are incubated on these surfaces, for example in microtiter plates. Any existing autoantibodies directed against the peptide are bound and can then be detected and quantified, for example, by enzyme-labeled anti-human antibodies.
Beispiel 4: Anwendungen des Peptids für diagnostische Zwecke mit therapeutischen ZielsetzungenExample 4: Applications of the peptide for diagnostic purposes with therapeutic objectives
Anwendungsmöglichkeiten bestehen beispielsweise bei der Evaluierung von Arzneimitteln, wobei beispielsweise im Rahmen der Wirkstoffevaluierung oder in klinischen Studien neuer Therapeutika, der Krankheitsverlauf mittels auf dem Peptid beruhender diagnostischen Maßnahmen bestimmt werden kann.There are possible applications, for example, in the evaluation of medicinal products, the course of the disease being able to be determined by means of diagnostic measures based on the peptide, for example as part of the evaluation of active substances or in clinical studies of new therapeutic agents.
Beispiel 5: Anwendungen des Peptids in der Therapie Zielsetzungen bestehen auch darin, das Peptid gezielt durch den Einsatz geeigneter Techniken (beispielsweise durch gezielte Liquorfiltration oder den therapeutischen Einsatz von peptidspezifischen Antikörpern) aus den entsprechenden Körperflüssigkeiten zu eliminieren. Die Kenntnis des Peptids dient als Grundlage für dessen gezielte Eliminierung durch physikalische, chemische oder biologische Verfahren zur gezielten Entfernung aus der biologischen Matrix oder zur Unterbindung der biologischen Wirksamkeit des Peptids, beispielsweise dadurch, daß durch die Bindung an andere Moleküle, beispielsweise an Antikörper oder Rezeptormoleküle, dessen Wirksamkeit eingeschränkt oder gänzlich unterbunden wird.Example 5: Applications of the peptide in therapy The objectives are also to specifically eliminate the peptide from the corresponding body fluids by using suitable techniques (for example, by targeted CSF filtration or the therapeutic use of peptide-specific antibodies). Knowledge of the peptide serves as the basis for its targeted elimination by physical, chemical or biological methods for targeted removal from the biological matrix or for preventing the biological effectiveness of the peptide, for example by binding to other molecules, for example to antibodies or receptor molecules whose effectiveness is limited or completely prevented.
Eine weitere Möglichkeit besteht in der Verdrängung des Peptids von den Zielstrukturen beispielsweise durch den Einsatz strukturverwandter Peptide in der Therapie.Another possibility is to displace the peptide from the target structures, for example by using structurally related peptides in therapy.
Beispiel 6: Anwendung der kodierenden DNA in der medizinischenExample 6: Application of the coding DNA in medical
Diagnostik von Erkrankungen des NervensystemsDiagnostics of diseases of the nervous system
Für diagnostische und therapeutische Zwecke kann auch die das Peptid bzw. dessen Derivate kodierende Nukleinsäure herangezogen werden. Etablierte Methoden zur selektiven Bestimmung bestimmter Nukleinsäuresequenzen, wie DNA-Sonden, dienen einer über die Peptidanalytik hinausgehende Diagnostik. Die Leistungsfähigkeit der Peptid- und der Nukleinsäurediagnostik werden in Abhängigkeit von den jeweils spezifischen Testanforderungen eingesetzt.The nucleic acid encoding the peptide or its derivatives can also be used for diagnostic and therapeutic purposes. Established methods for the selective determination of certain nucleic acid sequences, such as DNA probes, are used for diagnostics that go beyond peptide analysis. The performance of peptide and nucleic acid diagnostics is used depending on the specific test requirements.
Beispiel 7: Anwendung der kodierenden DNA in der Therapie von Erkrankungen des NervensystemsExample 7: Application of the coding DNA in the therapy of diseases of the nervous system
Auch therapeutische Möglichkeiten sind auf der Grundlage der Kenntnis der Nukleinsäuresequenz denkbar. Diese therapeutischen Möglichkeiten sind beispielsweise unter Anwendung der Anti-Sense-Sequenzen auf der Ebene derTherapeutic options are also conceivable based on knowledge of the nucleic acid sequence. These therapeutic options are, for example, using the anti-sense sequences at the level of
3z kodierten RNA nötig und können somit einen künftigen Ansatz in der Gentherapie darstellen.3z encoded RNA is necessary and can therefore represent a future approach in gene therapy.
Beispiel 8: Neuroinhibitorischer AssavExample 8: Neuroinhibitory Assav
Bestimmung der neuroinhibitorischen AktivitätDetermination of neuroinhibitory activity
Die neuroinhibitorische Aktivität wurde durch die Hemmung von Natrium- Ionenkanälen unter Verwendung von differenzierten NH15-CA2 Neuroblasto- ma-x-Glioma-Zellen bestimmt. Die Kulturbedingungen, morphologischen und physiologischen Parameter der Differenzierung dieser Zellen sind bekannt (Hamprecht et al., Meth. Enzymol. 109 (1985), 316-41 ). Für den Assay wurden die Zellen in eine hydrophobe Testschale überführt, die mit Standard- Außenflüssigkeit (140 mM NaCI; 3,5 mM KCI; 1 ,0 mM CaCI2; 1 ,0 mM MgCI2; 2 mM HEPES, pH 7,4) gefüllt war. Die Schale befand sich auf der Ablage eines invertierten Mikroskops zur Beobachtung der Zellen, während diese mit Pipetten behandelt wurden, die mit Innen-Lösung (140 mM CsCI; 1 ,4 mM MgCI2; 10 mM EGTA und 10 mM HEPES (Spitzenwiderstände: 300 bis 500 kΩ)) gefüllt waren. Die Natrium-Ströme wurden ausgelöst und im Ganzzell-(whole-cell)- Modus aufgezeichnet. Als Schnelltest für die neuroinhibitorische Aktivität kann die Bestimmung der maximalen Stromamplitude als Antwort auf repetitive 8-ms dauernde Rechteckpulse von -85 nach -20 mV vor, während und nach der Verabreichung der Testlösung verwendet werden. Die Abnahme des Stroms wurde in drei bis fünf Zellen registriert und die Mittelwerte bestimmt. Ein ausgedehnter Test bestand in der Bestimmung der "steady-state"-Aktivierungs- und Inaktivie- rungs-Parameter von Natrium-Ionenkanälen. Um die Spannungs-Abhängigkeit der Aktivierung zu bestimmen, wurde ein zyklisches Pulsprogramm verwendet, das aus Präpulsen bestand, die die Zellen von einem HP (Haltepotential) von - 85 mV bis -135 mV über 100 ms, und nachfolgende Variable Testpulse, die 8 ms in 4 mV-Schritten von -65 bis +31 mV depolarisierte. Für die Spannungs- Abhängigkeit der Inaktivierung wurde ein ähnliches Programm verwendet, das aus einem festen 100 ms-konditionierenden Puls auf -135 mV, einem variablen 32 ms Präpuls im Verlauf von -135 auf -19 mV in 4 mV-Schritten, und einen konstanten Testpuls, der die Zellen auf -20 mV depolarisierte, bestand. Die Größe der Links-Verschiebung der h-Kurve bei Vorhandensein von Testlösungen wurde als Maß für die Hemmung der Natrium-Ionenkanäle verwendet.The neuroinhibitory activity was determined by the inhibition of sodium ion channels using differentiated NH15-CA2 neuroblastoma-x-glioma cells. The culture conditions, morphological and physiological parameters of the differentiation of these cells are known (Hamprecht et al., Meth. Enzymol. 109 (1985), 316-41). For the assay, the cells were transferred to a hydrophobic test dish which was filled with standard external liquid (140 mM NaCl; 3.5 mM KCI; 1.0 mM CaCl 2 ; 1.0 mM MgCl 2 ; 2 mM HEPES, pH 7.4 ) was filled. The dish was placed on the tray of an inverted microscope to observe the cells while they were being treated with pipettes containing internal solution (140 mM CsCI; 1, 4 mM MgCl 2 ; 10 mM EGTA and 10 mM HEPES (peak resistances: 300 up to 500 kΩ)) were filled. The sodium currents were triggered and recorded in whole-cell mode. As a rapid test for neuroinhibitory activity, the determination of the maximum current amplitude in response to repetitive 8-ms rectangular pulses from -85 to -20 mV can be used before, during and after the administration of the test solution. The decrease in current was registered in three to five cells and the mean values were determined. An extensive test consisted of determining the "steady-state" activation and inactivation parameters of sodium ion channels. In order to determine the voltage dependency of the activation, a cyclic pulse program was used, which consisted of prepulses that took the cells from an HP (holding potential) of -85 mV to -135 mV over 100 ms, and subsequent variable test pulses that were 8 ms Depolarized in 4 mV steps from -65 to +31 mV. A similar program was used for the voltage dependency of the inactivation, consisting of a fixed 100 ms conditioning pulse to -135 mV, a variable 32 ms prepulse in the course of -135 to -19 mV in 4 mV steps, and a constant test pulse which depolarized the cells to -20 mV. The magnitude of the left shift of the h-curve in the presence of test solutions was used as a measure of the inhibition of the sodium ion channels.
Die neuroinhibitorische Aktivität des synthetischen Peptides mit der Sequenz (SEQ ID No: 1 ) wurde bestimmt durch die Hemmung der Natrium-Ströme durch lonenkanäle, die durch 1 -Hz-Rechteckpulse von 85 nach - 10 mV induziert wurden. Fig. 1 zeigt das Ergebnis von sieben Messungen, die an NH15-CA2 Neuroblastoma-x-Glioma-Zellen durchgeführt wurden. Es ist jeweils der Mittelwert mit der Standardabweichung wiedergegeben. Es zeigte sich, daß eine Peptidkonzentration von weniger als 10 μM die Nathum-Ionenströme halbmaximal hemmte. Die Peptid-vermittelte Blockierung des lonenkanals war rasch und reversibel.The neuroinhibitory activity of the synthetic peptide with the sequence (SEQ ID No: 1) was determined by the inhibition of the sodium currents by ion channels, which were induced by 1 Hz rectangular pulses from 85 to -10 mV. 1 shows the result of seven measurements which were carried out on NH15-CA2 neuroblastoma-x-glioma cells. The mean value is shown with the standard deviation. It was found that a peptide concentration of less than 10 μM half-maximally inhibited the Nathum ion currents. Peptide-mediated blocking of the ion channel was quick and reversible.
Beispiel 9 Bestimmung der Natrium-Ionenkanal-BindungsfähigkeitExample 9 Determination of Sodium Ion Channel Binding Ability
Die Natrium-Ionenkanal-Bindungsfähigkeit eines gegebenen Peptides, Polypeptides oder Fusionsproteins kann allgemein durch die Kompetition mit trity- liertem Batrachotoxinin-A 20-α-benzoat, [benzoyl-2,5-] [3H] BTXB an aufgereinigten und rekonstituierten Natrium-Ionenkanälen bestimmt werden (Trainer et al., J. Biol. Chem. 271 (1996), 11261-11267). Die Bindungsreaktionen werden mit einer vier-fachen Verdünnung von 50 μl aufgereinigten und rekonstituierten Natrium-Ionenkanälen (5-10 pmol) in Standard-Bindungsmedium gestartet (Sharkey et al., Mol. Pharmacol. 31 (1986), 273-278). Die rekonstituierten Kanäle werden bei 25°C über 16 Stunden mit [3H] BTXB und gegebenenfalls den erfindungsgemäßen Peptiden, Polypeptiden oder Fusionsproteinen inkubiert. Die Bindungsreaktionen werden durch Zusatz von Cholin-Waschmedium gestoppt. Die Proben werden durch GF/F-Filter filtriert (Tamkon et al., J. Biol. Chem. 259 (1984), 1676-1688). Die unspezifische Bindung wird in Gegenwart von 300 μM Veratridin bestimmt.The sodium ion channel binding ability of a given peptide, polypeptide or fusion protein can generally be determined by competition with tritylated batrachotoxinin A 20-α-benzoate, [benzoyl-2,5-] [ 3 H] BTXB on purified and reconstituted sodium Ion channels can be determined (Trainer et al., J. Biol. Chem. 271 (1996), 11261-11267). The binding reactions are started with a four-fold dilution of 50 μl of purified and reconstituted sodium ion channels (5-10 pmol) in standard binding medium (Sharkey et al., Mol. Pharmacol. 31 (1986), 273-278). The reconstituted channels are incubated at 25 ° C. for 16 hours with [ 3 H] BTXB and optionally the peptides, polypeptides or fusion proteins according to the invention. The binding reactions are stopped by adding choline washing medium. The samples are filtered through GF / F filters (Tamkon et al., J. Biol. Chem. 259 (1984), 1676-1688). The non-specific binding is determined in the presence of 300 μM veratridine.
2 Beispiel 10 Nachweis von QYNAD-spezifischen Antikörpern in Patienten2 Example 10 Detection of QYNAD-specific antibodies in patients
Um zu untersuchen, ob im Serum von GBS-Patienten Antikörper gegen das Peptid QYNAD (SEQ ID NO: 1 ) vorkommen, wurde das Peptid C-terminal kovalent an BSA (Rinderserum-Albumin) gekoppelt. Dieses Konjugat (QYNAD- BSA) wurde auf einer Mikrotiterplatte immobilisiert. Die Mikrotiterplatte wurde gewaschen. Nachfolgend wurde die Serum-Probe eines GBS-Patienten bzw. die Kontrollen mit dem immobilisierten Konjugat inkubiert. Die Mikrotiterplatte wurde gewaschen. Zum Nachweis der Bindung wurde das gebundene humane IgG in einer Sekundärreaktion (Farbreaktion) durch Inkubation mit einem markierten anti-human IgG-spezifischen Antikörper und Auslesen der Platte sichtbar gemacht.In order to investigate whether antibodies against the peptide QYNAD (SEQ ID NO: 1) are present in the serum of GBS patients, the peptide was covalently coupled to BSA (bovine serum albumin) at the C-terminal. This conjugate (QYNAD-BSA) was immobilized on a microtiter plate. The microtiter plate was washed. Subsequently, the serum sample of a GBS patient or the controls were incubated with the immobilized conjugate. The microtiter plate was washed. To detect the binding, the bound human IgG was visualized in a secondary reaction (color reaction) by incubation with a labeled anti-human IgG-specific antibody and reading out the plate.
Hier zeigte sich eine reproduzierbare und klar positive Reaktion, d.h. dass das Patientenserum Peptid-spezifische Antikörper enthielt.This showed a reproducible and clearly positive reaction, i.e. that the patient serum contained peptide-specific antibodies.
Kontrollen: Keine Reaktion zeigte sich mit Kontrollseren von 15 gesunden Blutspendern. Als weitere Spezifitätskontrolle wurde anstelle von QYNAD-BSA nur der Träger BSA an die Mikrotiterplatte immobilisiert. Der Test wurde ansonsten wie vorstehend beschrieben ausgeführt. Die Verwendung von BSA allein zeigte bei Inkubation mit dem Patientenserum keine Reaktion. Daraus ergibt sich eine Spezifität des Patientenserums für das Peptid QYNAD.Controls: No reaction was seen with control sera from 15 healthy blood donors. As a further specificity control, only the carrier BSA was immobilized on the microtiter plate instead of QYNAD-BSA. The test was otherwise carried out as described above. The use of BSA alone showed no response when incubated with patient serum. This results in a specificity of the patient serum for the peptide QYNAD.
Beispiel 11 Isolierung und Charakterisierung des VorläuferproteinsExample 11 Isolation and Characterization of the Precursor Protein
a) Herstellung eines QYNAD-spezifischen Kaninchen-Antiserums und Aufreinigung der IgG-Fraktiona) Preparation of a QYNAD-specific rabbit antiserum and purification of the IgG fraction
Ein QYNAD-spezifisches Antiserum wurde durch Immunisieren von Kaninchen und nachfolgende Serumgewinnung in an sich bekannter Weise hergestellt. Zur Aufreinigung der IgG-Fraktion wurde das Antiserum mit Protein A inkubiert und die daran gebundenen Antikörper vom IgG-Typ eluiert.A QYNAD-specific antiserum was produced by immunizing rabbits and subsequent serum collection in a manner known per se. To purify the IgG fraction, the antiserum was incubated with protein A and the IgG-type antibodies bound to it were eluted.
ii" b) Vorbereitung der Probenii " b) Preparation of the samples
Alle Patientenliquores wurden durch Ultrafiltration nach der Größe vorgereinigt und die > 3000 Da Fraktion zur Vorläuferproteinsuche weiterverwendet.All patient liquids were pre-cleaned by size by ultrafiltration and the> 3000 Da fraction was used to search for precursor proteins.
c) SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophoresec) SDS polyacrylamide gel electrophoresis
Jeweils 10 μg Liquorprotein wurden in einem Laemmli-Probenpuffer (70 mM SDS, 0,1 mM DTT, pH 6,8) reduziert und durch Erhitzen bei 95°C über 5 Minuten denaturiert.In each case 10 μg CSF protein were reduced in a Laemmli sample buffer (70 mM SDS, 0.1 mM DTT, pH 6.8) and denatured by heating at 95 ° C. for 5 minutes.
Die Proben wurden auf ein 12% SDS-Polyacryamid-Gel aufgetragen. Die Trennung wurde in einem Tris/Glycin Laufpuffersystem (Bioradkammer, Minigel) bei einer konstanten Stromstärke von 20 mA im Trenngel aufgetrennt.The samples were applied to a 12% SDS polyacryamide gel. The separation was separated in a Tris / Glycine running buffer system (biorad chamber, mini gel) at a constant current of 20 mA in the separating gel.
d) Elektro-Übertragung (Western Blot)d) Electrical transmission (Western blot)
Zur Elektro-Übertragung nach dem Halb-Trocken-Übertragungsverfahren (Se- mi-Dry-Blotting) wurde die Multiphor Il™-Kammer (Amersham/Pharmacia Biotech) verwendet. Die Übertragung erfolgte auf Nitrocellulosemembranen (0.45 μm, Protean BA 85, Schleicher und Schuell). Es wurde ein diskontinuierliches Puffersystem der folgenden Zusammensetzung verwendet:The Multiphor II ™ chamber (Amersham / Pharmacia Biotech) was used for the electrical transmission according to the semi-dry transmission method (semi-dry blotting). The transfer took place on nitrocellulose membranes (0.45 μm, Protean BA 85, Schleicher and Schuell). A discontinuous buffer system of the following composition was used:
Anode I: 0.3 M TrisAnode I: 0.3 M tris
Anode II: 0.1 M TrisAnode II: 0.1 M tris
Kathode: 0.1 M Aminocapronsäure, 0.01 % (w/v) SDSCathode: 0.1 M aminocaproic acid, 0.01% (w / v) SDS
Die Übertragung wurde bei 0.8 mA/cm2 über 60 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt.The transfer was carried out at 0.8 mA / cm 2 for 60 minutes at room temperature.
e) Immunnachweise) immune detection
SL Die Nitrocellulosemembranen wurden durch Inkubation mit 5% Michpulver in TBS-Puffer gegen unspezifische Bindung blockiert. Sodann wurde der QYNAD spezifische aufgereinigte Kaninchen-Antikörper in einer Verdünnung von 1 :2500 zugegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Nitrocellulosemembranen wurden mehrfach mit TTBS-Puffer (0,05 % (v/v) Tween 20™) gewaschen. Als sekundärer Antikörper wurde ein biotinylierter AntiKaninchen IgG-spezifischer Antikörpers (Biorad) verwendet. Dieser wurde in einer Verdünnung von 1 :3000 eine Stunde bei Raumtemperatur mit den Nitrocellulosemembranen inkubiert. Die Nitrocellulosemembranen wurden nachfolgend mit einem Streptavidin-Alkalische Phosphatase-Konjugat inkubiert. Zur Detektion wurden die Nitrocellulosemembranen mit BCIP/NBT-Substrat (Biorad) inkubiert, das in Abhängigkeit von der Menge des gebundenen Enzyms zu einem unlöslichen Farbkomplex umgesetzt wird.SL The nitrocellulose membranes were blocked against non-specific binding by incubation with 5% powdered micron in TBS buffer. Then the QYNAD specific purified rabbit antibody was added in a dilution of 1: 2500 and incubated for one hour at room temperature. The nitrocellulose membranes were washed several times with TTBS buffer (0.05% (v / v) Tween 20 ™). A biotinylated anti-rabbit IgG-specific antibody (Biorad) was used as the secondary antibody. This was incubated in a dilution of 1: 3000 for one hour at room temperature with the nitrocellulose membranes. The nitrocellulose membranes were subsequently incubated with a streptavidin-alkaline phosphatase conjugate. For detection, the nitrocellulose membranes were incubated with BCIP / NBT substrate (Biorad), which is converted into an insoluble color complex depending on the amount of the bound enzyme.
Die Ergebnisse sind in Figur 2 dargestellt. Hierbei bedeutet (GBS) bzw. (MS) die Auftragung von Liquor-Proben aus GBS- bzw. MS-Patienten. (contr.) bedeutet die Auftragung eines Liquors von einem gesunden Spender. In der rechten Spur wurde ein Molekulargewichtsstandard aufgetragen.The results are shown in Figure 2. Here (GBS) or (MS) means the application of CSF samples from GBS or MS patients. (contr.) means the application of a liquor from a healthy donor. A molecular weight standard was plotted in the right lane.
Hierbei zeigten sich mehrere positive Banden im Molekulargewichts-Bereich von etwa 150 kDa (A), etwa 80 kDa (B), etwa 60 kDa (C) und etwa 50 kDa (D) sowohl in den GBS- bzw. MS-Patienten-Liquores als auch im Liquor eines gesunden Spenders; vgl. Spuren 1 bis 5. In einem Fall trat eine starke Bande bei 35 kDa (F) auf. Das Kontrollexperiment (Test-Durchführung ohne 1. Antikörper) war negativ.Several positive bands in the molecular weight range of approximately 150 kDa (A), approximately 80 kDa (B), approximately 60 kDa (C) and approximately 50 kDa (D) were found in both the GBS and MS patient liquids as well as in the CSF of a healthy donor; see. Lanes 1 through 5. In one case a strong band appeared at 35 kDa (F). The control experiment (test run without 1st antibody) was negative.
In einigen weiteren getesteten GBS-Liquores (Daten nicht gezeigt) wurde eine zusätzliche Bande im Molekulargewichts-Bereich von 25 kDa (E) beobachtet.An additional band in the molecular weight range of 25 kDa (E) was observed in some further GBS liquids tested (data not shown).
Die Banden A, B, C und D wurden ferner in einem Serum eines gesunden Spenders und in einem GBS-Serum beobachtet (Daten nicht gezeigt).Bands A, B, C and D were also observed in healthy donor serum and GBS serum (data not shown).
3? Diese Daten belegen die Annahme, dass es sich bei dem Vorläuferprotein um ein natürlicherweise in menschlichem Serum und Liquor gelöstes Protein handelt.3? These data support the assumption that the precursor protein is a protein that is naturally dissolved in human serum and cerebrospinal fluid.
3Θ 3Θ

Claims

Patentansprüche claims
1. Peptid mit der Sequenz GIn-Tyr-Asn-Ala-Asp (SEQ ID NO:1 ) sowie Derivate davon, wobei die Derivate sich durch die Addition, Substitution, Inversion, Insertion und/oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäure(n) von der ursprünglichen Sequenz unterscheiden und wenigstens 10 % der Natrium-Ionenkanal-Bindungsfähigkeit des Peptides (SEQ ID NO:1 ) und/oder wenigstens 50 % der neuroinhibitorischen Aktivität aufweisen, oder Salze oder Ester davon.1. peptide with the sequence GIn-Tyr-Asn-Ala-Asp (SEQ ID NO: 1) and derivatives thereof, the derivatives being characterized by the addition, substitution, inversion, insertion and / or deletion of one or more amino acids differ from the original sequence and have at least 10% of the sodium ion channel binding ability of the peptide (SEQ ID NO: 1) and / or at least 50% of the neuroinhibitory activity, or salts or esters thereof.
2. Peptid gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß das Derivat wenigstens 80 % homolog zu der ursprünglichen Sequenz (SEQ ID NO:1 ) ist.2. Peptide according to claim 1, characterized in that the derivative is at least 80% homologous to the original sequence (SEQ ID NO: 1).
3. Peptid gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Derivat durch konservative Substitution einer oder mehrerer Aminosäure^) des Peptides (SEQ ID NO: 1 ) erhalten wird.3. Peptide according to claim 1 or 2, characterized in that the derivative is obtained by conservative substitution of one or more amino acid ^) of the peptide (SEQ ID NO: 1).
4. Peptid gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Derivat eine Aminosäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist aus SEQ ID No:5 bis SEQ ID No:21.4. Peptide according to claim 3, characterized in that the derivative has an amino acid sequence which is selected from SEQ ID No: 5 to SEQ ID No: 21.
5. Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid ferner wenigstens an einer N-terminal, intern und/oder C-terminal gelegenen Aminosäure modifiziert ist.5. Peptide according to one of claims 1 to 4, characterized in that the peptide is further modified at least on an N-terminal, internal and / or C-terminal amino acid.
6. Peptid gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Modifikation eine Acetylierung, Glykosylierung und/oder Amidierung ist.6. Peptide according to claim 5, characterized in that the modification is acetylation, glycosylation and / or amidation.
7. Polypeptid, umfassend wenigstens ein Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6. 7. A polypeptide comprising at least one peptide according to one of claims 1 to 6.
8. Polypeptid gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid am C-Terminus des Polypeptides liegt.8. Polypeptide according to claim 7, characterized in that the peptide is located at the C-terminus of the polypeptide.
9. Polypeptid gemäß Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid an einen Natrium-Ionenkanal bindet und/oder neuroinhibitorische Aktivität aufweist.9. Polypeptide according to claim 7 or 8, characterized in that the polypeptide binds to a sodium ion channel and / or has neuroinhibitory activity.
10. Polypeptid gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die neuroinhibitorische Aktivität die Hemmung eines Nathum-Ionenkanals ist.10. Polypeptide according to claim 9, characterized in that the neuroinhibitory activity is the inhibition of a Nathum ion channel.
11. Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 9 oder 10 , dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid wenigstens 10 % der Natrium-Ionenkanal- Binduπgsfähigkeit des Peptides (SEQ ID NO:1 ) und/oder wenigstens 50 % der neuroinhibitorischen Aktivität aufweist.11. Polypeptide according to one of claims 9 or 10, characterized in that the polypeptide has at least 10% of the sodium ion channel binding ability of the peptide (SEQ ID NO: 1) and / or at least 50% of the neuroinhibitory activity.
12. Polypeptid ausgewählt aus Polypeptiden mit einem Molekulargewicht von etwa 25 kDa, etwa 35 kDa, etwa 50 kDa, etwa 60 kDa, etwa 80 kDa und etwa 150 kDa nach SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen, wobei das Polypeptid spezifisch mit einem QYNAD-spezifischen Antiserum reagiert; und Derivate davon, die sich durch die Addition, Substitution, Inversion, Insertion und/oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäure(n) von der ursprünglichen Sequenz unterscheiden und wenigstens 50 % der Bindungsfähigkeit des Polypeptides an QYNAD-spezifisches Antiserum aufweisen.12. Polypeptide selected from polypeptides with a molecular weight of approximately 25 kDa, approximately 35 kDa, approximately 50 kDa, approximately 60 kDa, approximately 80 kDa and approximately 150 kDa according to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis under reducing conditions, the polypeptide specifically using a QYNAD- specific antiserum responds; and derivatives thereof which differ from the original sequence by the addition, substitution, inversion, insertion and / or deletion of one or more amino acids and which have at least 50% of the binding ability of the polypeptide to QYNAD-specific antiserum.
13. Polypeptid gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid aus humanem Liquor oder Serum erhältlich ist.13. Polypeptide according to claim 12, characterized in that the polypeptide is obtainable from human cerebrospinal fluid or serum.
14. Polypeptid gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Liquor oder das Serum von einem GBS- oder MS-Patienten stammt.14. A polypeptide according to claim 13, characterized in that the cerebrospinal fluid or serum is from a GBS or MS patient.
Ho Ho
15. Polypeptid gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Derivat wenigstens 80 % homolog zu der ursprünglichen Sequenz ist.15. Polypeptide according to claim 12, characterized in that the derivative is at least 80% homologous to the original sequence.
16. Polypeptid gemäß Anspruch 12 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Derivat durch konservative Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren des Polypeptides erhalten wird.16. Polypeptide according to claim 12 or 15, characterized in that the derivative is obtained by conservative substitution of one or more amino acids of the polypeptide.
17. Fusionsprotein, umfassend wenigstens ein Peptid oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 und wenigstens ein biologisch aktives Polypeptid, oder ein aktives Fragment davon.17. A fusion protein comprising at least one peptide or polypeptide according to one of claims 1 to 16 and at least one biologically active polypeptide, or an active fragment thereof.
18. Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Nukleinsäure ausgewählt aus:18. A nucleic acid molecule comprising a nucleic acid selected from:
(i) einer für ein Peptid oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 kodierenden Nukleinsäure;(i) a nucleic acid encoding a peptide or polypeptide according to any one of claims 1 to 11;
(ii) einer zu der Nukleinsäure nach (i) komplementären Nukleinsäure; und(ii) a nucleic acid complementary to the nucleic acid according to (i); and
(iii) einer Nukleinsäure, die mit einer Nukleinsäure nach (i) oder (ii) hybridisiert und für ein Polypeptid kodiert, das an einen Natrium- Ionenkanal bindet und/oder neuroinhibitorische Aktivität aufweist.(iii) a nucleic acid which hybridizes with a nucleic acid according to (i) or (ii) and codes for a polypeptide which binds to a sodium ion channel and / or has neuroinhibitory activity.
19. Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridisierung nach (iii) unter stringenten Bedingungen durchgeführt wird.19. Nucleic acid molecule according to claim 18, characterized in that the hybridization according to (iii) is carried out under stringent conditions.
20. Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß stringente Bedingungen 0,5 x SSC bei 68°C sind.20. Nucleic acid molecule according to claim 19, characterized in that stringent conditions are 0.5 x SSC at 68 ° C.
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21. Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure genomische DNA, cDNA, synthetische DNA oder RNA ist.21. Nucleic acid molecule according to one of claims 18 to 20, characterized in that the nucleic acid is genomic DNA, cDNA, synthetic DNA or RNA.
22. Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 18 bis 21 , weiterhin umfassend einen zur Expressionskontrolle geeigneten Promotor, wobei die für ein Peptid oder Polypeptid kodierende Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Promotors steht.22. The nucleic acid molecule according to claim 18, further comprising a promoter suitable for expression control, the nucleic acid coding for a peptide or polypeptide being under the control of a promoter.
23. Vektor, umfassend ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 18 bis 22.23. A vector comprising a nucleic acid molecule according to any one of claims 18 to 22.
24. Wirtszelle, enthaltend ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 18 bis 22 und/oder einen Vektor gemäß Anspruch 24, wobei die Wirtszelle eine zur Expression des Nukleinsäuremoleküls geeignete prokaryontische oder eukaryontische Zelle ist.24. A host cell containing a nucleic acid molecule according to one of claims 18 to 22 and / or a vector according to claim 24, wherein the host cell is a prokaryotic or eukaryotic cell suitable for expression of the nucleic acid molecule.
25. Verfahren zum Herstellen eines Peptides und/oder Polypeptides gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle gemäß Anspruch 24 unter zur Expression geeigneten Bedingungen und gegebenenfalls das Aufreinigen des exprimierten Peptides oder Polypeptides.25. A method for producing a peptide and / or polypeptide according to any one of claims 1 to 16, comprising culturing a host cell according to claim 24 under conditions suitable for expression and optionally purifying the expressed peptide or polypeptide.
26. Antikörper, der für ein Peptid oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 spezifisch ist.26. Antibody specific for a peptide or polypeptide according to any one of claims 1 to 16.
27. Antikörper gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper, das Antikörperfragment oder Antikörperderivat monoklonal, po- lyklonal oder rekombinant ist.27. Antibody according to claim 26, characterized in that the antibody, the antibody fragment or antibody derivative is monoclonal, polyclonal or recombinant.
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28. Test-Kit zum Nachweisen eines Peptides oder Polypeptides gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, umfassend wenigstens ein Reagenz, das für das Peptid und/cder Polypeptid spezifisch ist.28. A test kit for detecting a peptide or polypeptide according to any one of claims 1 to 16, comprising at least one reagent which is specific for the peptide and / or the polypeptide.
29. Test-Kit gemäß Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid- und/oder Polypeptid-spezifische Reagenz ausgewählt ist aus einem Antikörper gemäß Anspruch 26 oder 27, einem Natrium- lonenkanalprotein, und Peptid- und/oder Polypeptid-spezifischen Fragmenten davon.29. Test kit according to claim 28, characterized in that the peptide and / or polypeptide-specific reagent is selected from an antibody according to claim 26 or 27, a sodium ion channel protein, and peptide and / or polypeptide-specific fragments thereof ,
30. In vitro-Verfahren zum Nachweisen eines Peptides und/oder Polypeptides gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 in einer biologischen Probe, umfassend das Inkontaktbringen der Probe mit einem für das Peptid- und/oder Polypeptid-spezifischen Reagenz und das Nachweisen der Bindung.30. In vitro method for detecting a peptide and / or polypeptide according to any one of claims 1 to 16 in a biological sample, comprising contacting the sample with a peptide and / or polypeptide-specific reagent and detecting the binding.
31. Verfahren zum Nachweisen eines Peptides und/oder Polypeptides gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, umfassend das Durchführen wenigstens eines chromatographischen Verfahrens wie Hochleistungsflüssig- keitschromatographie (HPLC) und/oder Affinitätschromatographie.31. A method for detecting a peptide and / or polypeptide according to any one of claims 1 to 16, comprising performing at least one chromatographic method such as high performance liquid chromatography (HPLC) and / or affinity chromatography.
32. Verwendung eines für ein Peptid- und/oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 spezifischen Reagenzes zum Bestimmen des Peptides und/oder Polypeptides in einer Körperflüssigkeit.32. Use of a reagent specific for a peptide and / or polypeptide according to one of claims 1 to 16 for determining the peptide and / or polypeptide in a body fluid.
33. Verwendung gemäß Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die33. Use according to claim 32, characterized in that the
Körperflüssigkeit ausgewählt ist aus cerebrospinaler Flüssigkeit, Blut bzw. Blutprodukten oder Blutbestandteilen.Body fluid is selected from cerebrospinal fluid, blood or blood products or blood components.
34. Verfahren zum Entfernen eines Peptides oder Polypeptides gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 aus einer Körperflüssigkeit, umfassend das Inkontaktbringen mit einem für das Peptid- oder Polypeptid spezifischen Reagenz und das Entfernen des gebildeten Komplexes.34. A method for removing a peptide or polypeptide according to any one of claims 1 to 16 from a body fluid, comprising the Contacting with a reagent specific for the peptide or polypeptide and removing the complex formed.
35. Verfahren gemäß Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid- oder Polypeptid spezifische Reagenz an eine feste Matrix gebunden ist und das Verfahren das Absorbieren des Peptides oder Polypeptides umfaßt.35. The method according to claim 34, characterized in that the peptide- or polypeptide-specific reagent is bound to a solid matrix and the method comprises absorbing the peptide or polypeptide.
36. Test-Kit zum Nachweisen eines für das Peptid- und/oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 spezifischen Antikörpers, umfassend wenigstens ein Peptid und/oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16.36. Test kit for detecting an antibody specific for the peptide and / or polypeptide according to one of claims 1 to 16, comprising at least one peptide and / or polypeptide according to one of claims 1 to 16.
37. In vitro-Verfahren zum Nachweisen eines für das Peptid- und/oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 spezifischen Antikörpers in einer biologischen Probe, umfassend das Inkontaktbringen der Probe mit einem Peptid und/oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, das eine nachweisbare Markerung trägt, und das Nachweisen der Markierung.37. In vitro method for detecting an antibody specific for the peptide and / or polypeptide according to one of claims 1 to 16 in a biological sample, comprising contacting the sample with a peptide and / or polypeptide according to one of claims 1 to 16 , which has a detectable marking, and the detection of the marking.
38. Verwendung des Peptides und/oder Polypeptides gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 zum Bestimmen von Peptid- und/oder Polypeptid- spezifischen Autoantikörpern in einer Körperflüssigkeit.38. Use of the peptide and / or polypeptide according to one of claims 1 to 16 for determining peptide and / or polypeptide-specific autoantibodies in a body fluid.
39. Verwendung nach Anspruch 38 zur Bestimmung von Autoantikörpern, dadurch gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeit ausgewählt ist aus cerebrospinaler Flüssigkeit, Blut bzw. Blutprodukten.39. Use according to claim 38 for the determination of autoantibodies, characterized in that the body fluid is selected from cerebrospinal fluid, blood or blood products.
40. Test-Kit zum Nachweis einer für ein Peptid- und/oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 kodierenden Nukleinsäure, umfassend wenigstens ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 18 bis 22. 40. Test kit for detecting a nucleic acid coding for a peptide and / or polypeptide according to one of claims 1 to 16, comprising at least one nucleic acid molecule according to one of claims 18 to 22.
41. In vitro-Verfahren zum Nachweis einer ein Peptid und/oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 kodierenden Nukleinsäure in einer biologischen Probe, umfassend das Inkontaktbringen der Probe mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 18 bis 22, das eine nachweisbare Markierung trägt; und das Nachweisen der Markierung.41. In vitro method for the detection of a nucleic acid encoding a peptide and / or polypeptide according to one of claims 1 to 16 in a biological sample, comprising contacting the sample with a nucleic acid molecule according to one of claims 18 to 22, which carries a detectable label ; and detecting the mark.
42. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß einem der Ansprüche 18 bis 22 als Sonde zum Nachweisen einer ein Peptid und/oder Polypeptid gemäß einem der 1 bis 16 kodierenden Nukleinsäure in einer biologischen Probe.42. Use of a nucleic acid molecule according to one of claims 18 to 22 as a probe for detecting a nucleic acid encoding a peptide and / or polypeptide according to one of the 1 to 16 in a biological sample.
43. Pharmazeutische Zusammensetzung, gekennzeichnet durch mindestens ein Peptid und/oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 16 und gegebenenfalls einem pharmakologisch verträglichen Träger und/oder Verdünnungsmittel.43. Pharmaceutical composition, characterized by at least one peptide and / or polypeptide according to one of claims 1 to 16 and optionally a pharmacologically acceptable carrier and / or diluent.
44. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 43 zur therapeutischen Anwendung als Anästhetikum.44. Pharmaceutical composition according to claim 43 for therapeutic use as an anesthetic.
45. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 43 zur Neuro- protektion.45. Pharmaceutical composition according to claim 43 for neuroprotection.
46. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 45 zur Behandlung einer Krankheit ausgewählt aus Polyneuropathien, insbesondere Diabetischer Polyneuropathie, und Multipler Sklerose.46. Pharmaceutical composition according to claim 45 for the treatment of a disease selected from polyneuropathies, in particular diabetic polyneuropathy, and multiple sclerosis.
47. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 45 zur Behandlung der Folgen eines Schlaganfalls oder von Schmerzzuständen.47. Pharmaceutical composition according to claim 45 for the treatment of the consequences of a stroke or of painful conditions.
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48. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 43 zur therapeutischen Anwendung bei demyelinisierenden Erkrankungen oder neurodegenerativen Erkrankungen.48. Pharmaceutical composition according to claim 43 for therapeutic use in demyelinating diseases or neurodegenerative diseases.
49. Pharmazeutische Zusammensetzung, gekennzeichnet durch mindestens ein für ein Peptid und/oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 16 spezifisches Reagenz und gegebenenfalls einen pharmakologisch verträglichen Träger und/oder Verdünnungsmittel.49. Pharmaceutical composition, characterized by at least one reagent specific for a peptide and / or polypeptide according to one of claims 1 to 16 and optionally a pharmacologically acceptable carrier and / or diluent.
50. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 49 zur diagnostischen oder therapeutischen Anwendung bei demyelinisierenden oder neurodegenerativen Erkrankungen.50. Pharmaceutical composition according to claim 49 for diagnostic or therapeutic use in demyelinating or neurodegenerative diseases.
51. Pharmazeutische Zusammensetzung, gekennzeichnet durch mindestens ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 18 bis 22 und gegebenenfalls einen pharmakologisch verträglichen Träger und/oder Verdünnungsmittel.51. Pharmaceutical composition, characterized by at least one nucleic acid molecule according to one of claims 18 to 22 and optionally a pharmacologically acceptable carrier and / or diluent.
52. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 51 zur diagnostischen oder therapeutischen Anwendung bei demyelinisierenden oder neurodegenerativen Erkrankungen.52. Pharmaceutical composition according to claim 51 for diagnostic or therapeutic use in demyelinating or neurodegenerative diseases.
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