EP1224308A1 - Nouvelle classe de proteines et leurs applications a la resistance de plantes a divers agents pathogenes - Google Patents
Nouvelle classe de proteines et leurs applications a la resistance de plantes a divers agents pathogenesInfo
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- EP1224308A1 EP1224308A1 EP00964380A EP00964380A EP1224308A1 EP 1224308 A1 EP1224308 A1 EP 1224308A1 EP 00964380 A EP00964380 A EP 00964380A EP 00964380 A EP00964380 A EP 00964380A EP 1224308 A1 EP1224308 A1 EP 1224308A1
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- EP
- European Patent Office
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- nucleic acid
- nucleotide
- rrs1
- polypeptide
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Classifications
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8281—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for bacterial resistance
Definitions
- the present invention relates to a new class of proteins having an N-terminal part comprising motifs characteristic of a plant protein for resistance to pathogens and a C-terminal part comprising a DNA-binding domain.
- the invention also relates to the nucleic acids coding for such proteins involved in the resistance of plants to various pathogens as well as to means for detecting these proteins and these nucleic acids, such as antibodies or probes and primers. nucleotide.
- the invention also relates to recombinant vectors comprising a nucleic acid coding for a polypeptide belonging to this new class of proteins, to host cells transformed by a nucleic acid or a recombinant vector according to the invention, as well as to plants transgenics of which a part or all of the cells are transformed with a nucleic acid or a recombinant vector according to the invention.
- the invention also relates to means intended to increase or on the contrary to inhibit the expression of a nucleic acid coding for a protein according to the invention in plants, with the aim of increasing the resistance of said plants to various pathogens. .
- the invention also relates to methods of screening for candidate substances which bind to a polypeptide according to the invention, as well as to the candidate substances obtained according to such methods.
- Bacterial wilt is one of the most widespread pathologies affecting plants of agronomic interest. It is one of the most important phytobacteriosis in the world which is caused in particular by the bacteria Ralstonia solanacearum.
- This vascular pathogen of telluric origin, affects nearly 200 plant species such as tomatoes, tobacco, potatoes and bananas, mainly in tropical and subtropical zones.
- the results of the study suggest that the locus of interest located on chromosome V carries one or more genes, these genes being able either to confer the phenotype of resistance, or on the contrary to confer the phenotype of sensitivity to Ralstonia solanacearum, although the genetic basis for resistance and / or susceptibility to this pathogen has not been identified in Arabidopsis thaliana.
- DESLANDES et al. (1998) also observe that the chromosomal region of interest of Arabidopsis thaliana was known to contain many other genetic determinants involved in recognition of pathogens. The applicant has now identified a genetic determinant which is capable of conferring resistance to Ralstonia solanacearum in Arabidopsis thaliana.
- This new class of proteins identified according to the invention is characterized in that it has an N-terminal part having structural motifs in common with several known resistance genes and a C-terminal part having structural motifs in common with proteins transactivators having a DNA binding domain, in particular designated under the name of WRKY proteins or else WRKY transcription factors.
- the subject of the invention is therefore a nucleic acid comprising at least 15 consecutive nucleotides of a nucleotide sequence coding for a protein for resistance of a plant to a pathogen, said protein comprising: a) an N-terminal part comprising at least one amino acid sequence rich in leucine and at least one nucleotide binding site; and b) a C-terminal part comprising a DNA binding domain, said binding domain comprising the amino acid sequence "WRKYGQK".
- the N-terminal part of this protein also comprises at least one TIR domain (TOLL / IL-1 R), such a TIR domain being defined in particular by its sequence homology with the cytoplasmic domains of the TOLL protein from Drosophila as well that with the mammalian interleukin-1 receptor protein, the consensus sequence of which is described by HAMMOND-KOSACK et al. (1997).
- TIR domain such a TIR domain being defined in particular by its sequence homology with the cytoplasmic domains of the TOLL protein from Drosophila as well that with the mammalian interleukin-1 receptor protein, the consensus sequence of which is described by HAMMOND-KOSACK et al. (1997).
- the N-terminal part of this protein will also comprise a P loop (P-LOOP), which is a peptide segment forming a loop and capable of binding a phosphate, which is found in protein kinases.
- P-LOOP P loop
- Such a TIR domain will preferably have the amino acid sequence
- Such a P loop will preferably have the amino acid sequence "CVGIWGMPGIGKTTLAKAV".
- the N-terminal part also comprises a domain of the NB-ARC type, which is a conserved domain and characteristic of proteins for resistance to pathogens as well as to proteins involved in the mechanisms of apoptosis.
- this NB-ARC domain has the amino acid sequence represented in bold and underlined in FIGS. 1 and 2.
- the N-terminal part preferably comprises a nuclear signaling site of the NLS type.
- such an NLS domain has the amino acid sequence "KKKLSEMETAFLKLKRRPP".
- the C-terminal part of a protein encoded by a nucleic acid according to the invention comprises a WRKY domain characteristic of certain transactivating proteins, in particular certain transcription factors and characterized in that it comprises the acid sequence "WRKYGQK" amines.
- this WRKY domain comprises the following amino acid sequence:
- the C-terminal part preferably comprises a domain rich in leucine.
- the C-terminal part preferably also comprises a domain characteristic of a nuclear signaling site (NLS), said nuclear signaling domain preferably having the amino acid sequence "NFHCWAPGKWPKVRKD".
- the C-terminal part also comprises a motif of the “leucine zipper” type, characteristic of a protein binding site, which preferably has the amino acid sequence “LRVSYDDLQEMDKVLFLYIASL”.
- a nucleic acid according to the invention codes for a polypeptide comprising, from the N-terminal to the C-terminal end, (i) a TIR domain, (ii) a P-LOOP motif , (iii) a NB-ARC motif, (iv) an NLS domain, (v) a first region rich in leucine, (vi) a second region rich in leucine,
- Also part of the invention is a nucleic acid of complementary sequence.
- a nucleic acid according to the invention is in an isolated and / or purified form.
- isolated within the meaning of the present invention designates a biological material (nucleic acid or protein) which has been removed from its original environment (the environment in which it is naturally located).
- a polynucleotide naturally occurring in a plant or animal is not isolated.
- the same polynucleotide separated from Adjacent nucleic acids within which it is naturally inserted into the genome of the plant or animal is considered to be "isolated”.
- Such a polynucleotide may be included in a vector and / or such a polynucleotide may be included in a composition and nevertheless remain in an isolated state since the vector or the composition does not constitute its natural environment.
- purified does not require that the material be present in a form of absolute purity, exclusive of the presence of other compounds. Rather, it is a relative definition.
- a polynucleotide is in the “purified” state after purification of the starting material or of the natural material of at least one order of magnitude, preferably 2 or 3 and preferably 4 or 5 orders of magnitude.
- nucleotide sequence can be used to denote either a polynucleotide or a nucleic acid.
- nucleotide sequence encompasses the genetic material itself and is therefore not limited to information regarding its sequence.
- nucleic acid refers to any organic acid
- polynucleotide refers to any organic compound
- RNA, DNA, cDNA or hybrid sequences include RNA, DNA, cDNA or hybrid sequences
- RNA / DNA of more than one nucleotide either in the single chain form or in the form of duplex.
- nucleotide designates both natural nucleotides (A, T, G, C) as well as modified nucleotides which comprise at least one modification such as (1).
- a first polynucleotide is considered to be “complementary” to a second polynucleotide when each base of the first nucleotide is paired with the base complementary to the second polynucleotide whose orientation is reversed.
- the complementary bases are A and T (or A and U), or C and G.
- the inventors believe that the different patterns characteristic of the class of proteins according to the invention are such as to confer on it its biological function which results in the observation of a phenotype of resistance towards plant pathogens, in particular towards the bacteria R. solanacearum.
- the N-terminal part which includes the TIR, NB-ARC domains and one or more regions rich in leucine, are characteristic of many pathogen resistance proteins in plants (R proteins), these proteins being supposed to activate metabolic pathways. cascade signaling systems that coordinate the plant's initial defense responses preventing pathogens from progressing.
- the WRKY domain of the C-terminal part of a protein according to the invention could have a binding function to regulatory sequences located near or inside promoter regions of plant genes, the binding of a protein according to the invention.
- he invention of DNA is thus capable of modulating the activity of other genes potentially involved in the resistance of plants to pathogens, and more particularly to R. solanacearum.
- the applicant has isolated and characterized a nucleic acid coding for a polypeptide belonging to the class of proteins for resistance to plant pathogens defined above, the protein RRS1-R. More specifically, the applicant isolated, from the genome of a plant of Arabidopsis thaliana resistant to R. solanacearum, the gene RRS1 -R which is capable of conferring on a plant a phenotype of resistance to R.solanacearum, such a nucleic acid constituting the sequence SEQ ID No. 1.
- the invention relates to a nucleic acid comprising at least 15 consecutive nucleotides of a nucleotide sequence having at least 40% nucleotide identity with a polynucleotide of sequence SEQ ID No. 1, as well as a nucleic acid of complementary sequence.
- a first nucleic acid having at least 40% identity with a second reference nucleic acid will have at least 60%, preferably at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% or 99.5% of nucleotide identity with this second reference polynucleotide, the percentage of identity between two sequences being determined as described below.
- the “percentage of identity” between two nucleotide or amino acid sequences, within the meaning of the present invention, can be determined by comparing two optimally aligned sequences, through a comparison window.
- the part of the nucleotide or polypeptide sequence in the comparison window can thus include additions or deletions (for example “gaps”) with respect to the reference sequence (which does not include these additions or these deletions) so as to obtain an optimal alignment of the two sequences.
- the percentage is calculated by determining the number of positions at which an identical nucleic base or amino acid residue is observed for the two sequences (nucleic or peptide) compared, then by dividing the number of positions at which there is identity between the two bases or amino acid residues by the total number of positions in the comparison window, then multiplying the result by one hundred to obtain the percentage of sequence identity.
- the optimal alignment of the sequences for the comparison can be achieved by computer using known algorithms contained in the software tool of the company WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor, Madison, Wisconsin.
- the percentage of identity between two sequences is carried out using BLAST software (BLAST version 2.06 of September 1998), using exclusively the default parameters (SF ALTSCHUL et al., (1990) ; SF ALTSCHUL et al., 1997).
- the genomic sequence of the RRS1 -R gene is referenced as the sequence SEQ ID No. 1.
- nucleic acid which comprises or consists of the sequence SEQ ID No. 1.
- the invention also relates to a nucleic acid comprising at least 15 consecutive nucleotides of the polynucleotide of sequence SEQ ID No. 1.
- genomic nucleic acids according to the present invention can be easily obtained by a person skilled in the art who knows its nucleotide sequence disclosed in the present description. Those skilled in the art can also reproduce any of the genomic nucleic acids according to the invention by constructing, on the basis of the sequences disclosed in the present description, oligonucleotide primers capable of amplifying all or part of these nucleic acids from a plant genome, preferably a genome of Arabidopsis thaliana, or even from a vector bank (YACS, BACS, cosmids) containing genomic inserts of a plant, and preferably Arabidopsis thaliana.
- YACS YACS, BACS, cosmids
- the different amplified nucleic acids are then subjected to a ligation step in a plasmid vector in order to obtain the desired genomic nucleic acid, according to techniques well known to those skilled in the art. .
- the isolation of the DNA fragment containing the desired genomic insert can be obtained by subcloning from a library (YACS, BACS, cosmids) containing genomic inserts from a plant, and preferably from Arabidopsis thaliana.
- a library YACS, BACS, cosmids
- the RRS1-R gene sequence includes seven exons and six introns, as well as potentially regulatory regions located respectively on the 5 'side of the first exon and the 3' side of the last exon, the structural characteristics of these exons and introns being detailed in the Tables 1 and 2 below.
- the invention also relates to a nucleic acid comprising at least 15 consecutive nucleotides of an exonic polynucleotide of the RRSI-R gene, such as the polynucleotides 1 to 7 described in table 1 above, which are all included in the nucleic acid with sequence SEQ ID No. 1.
- a nucleic acid having at least 15 consecutive nucleotides of a sequence according to the invention advantageously has at least 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 , 1000, 2000, 3000, 4000 consecutive nucleotides of the reference sequence, the length of consecutive nucleotides being naturally limited by the length of the reference sequence.
- Such a nucleic acid codes for at least part of the RRS1-R polypeptide and can in particular be inserted into a recombinant vector intended for the expression of the corresponding translation product in a host cell or in a plant transformed with this recombinant vector.
- Such a nucleic acid can also be used for the synthesis of probes and nucleotide primers intended for the detection or the amplification of nucleotide sequences included in the RRS1-R gene in a sample, if necessary of sequences of the RRS1- genes.
- R carrying one or more mutations, preferably one or more mutations such as to modify the phenotype of a plant carrying such a mutated RRS1-R gene, for example by modifying the regulation of the mechanisms of resistance to pathogens, and preferably the mechanisms of resistance to R. solanacearum.
- the invention also relates to a nucleic acid comprising at least 15 consecutive nucleotides of an intronic polynucleotide of the gene
- RRS1-R such as polynucleotides 1 to 6 described in Table 2 above, which are all included in the nucleic acid of sequence SEQ ID NO: 1
- Such a nucleic acid can be used as a probe or oligonucleotide primer to detect the presence of at least one copy of the gene
- RRS1-R in a sample, or to amplify a target sequence determined within the RRS1-R gene.
- No. 1 includes an ATG codon starting at the nucleotide at position 260 (1 st
- the nucleic acid of the RRS1-R gene of sequence SEQ ID No. 1 comprises regulatory sequences located respectively on the 5 'side of exon 1 and on the 3' side of exon 7.
- the 5 'regulatory region of the RRS1-R gene comprises the nucleotide sequence SEQ ID No. 2.
- the polynucleotide of sequence SEQ ID No. 2 is located between the nucleotide in position 1 and the nucleotide in position 259 of the sequence SEQ
- the 3 ′ regulatory sequence of the RRSI-R gene comprises the nucleotide sequence SEQ ID No. 3.
- the polynucleotide of sequence SEQ ID No. 3 is located between the nucleotide at position 6533 and the nucleotide at position 7936 of the nucleotide sequence SEQ ID No. 1.
- the polynucleotide derived from the regulatory regions of the above RRS1-R gene is useful for detecting the presence of at least one copy of this gene in a sample.
- the invention also relates to a nucleic acid comprising at least 15 consecutive nucleotides of a polynucleotide of sequence SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 3.
- the invention also relates to a nucleic acid comprising a polynucleotide having at least 80% identity in nucleotides with a polynucleotide of sequence SEQ ID No 2 or SEQ ID No 3, advantageously at least 90% , 95%, 98%, 99%, 99.5% and very preferably 99.8% of nucleotide identity with a polynucleotide chosen from the sequences SEQ ID No. 2 and SEQ ID No. 3, or a biologically active fragment of the latter.
- Preferred fragments of the nucleotide sequences SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 3 advantageously have a length of between 500, 100, 150, 200 to 300, 400, 600, 1000 or 2000 bases.
- biologically active fragment of a polynucleotide of sequence SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 3 means a polynucleotide comprising or consisting of a polynucleotide capable of regulating the expression of a nucleic acid placed near the latter, in a recombinant host cell.
- a nucleic acid constitutes a “functional” regulatory region for expressing a nucleic acid placed close to the latter, for example a nucleic acid coding for a polypeptide or a polynucleotide of interest, if this regulatory polynucleotide contains the nucleotide sequences containing signals for regulating transcription and / or translation, and if the sequences are localized so as to effectively induce or increase the transcription or translation of said polypeptide or polynucleotide of interest.
- a person skilled in the art can advantageously refer to the work by SAMBROOK et al. (1989) which describes the use of a recombinant vector carrying a marker gene (for example ⁇ -galactosidase, chloranphenicol acetyltransferase, etc.) the expression of which is detected by placing the sequence of the marker gene under the control of polynucleotide fragments biologically active sequences SEQ ID N ° 2 or SEQ ID N ° 3.
- a marker gene for example ⁇ -galactosidase, chloranphenicol acetyltransferase, etc.
- the genomic sequences located upstream of the first exon of the RRS1-R gene are cloned into an appropriate vector containing a marker gene, such as the GUS gene (Jefferson et al., 1987).
- SEQ ID NO: 3 can be prepared from any of the sequences SEQ ID No 1, SEQ ID No 2 and SEQ ID No 3 by cleavage using the appropriate restriction endonucleases, as described for example in the work of SAMBROOK et al. (1989) cited above.
- the fragments of the regulatory polynucleotides according to the invention can also be prepared by digestion of any of the sequences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 and SEQ ID No. 3 with an exonuclease enzyme, such as for example Bal31 as described by WABIKO et al.
- an exonuclease enzyme such as for example Bal31 as described by WABIKO et al.
- regulatory polynucleotides can also be prepared by chemical synthesis of nucleic acids according to techniques well known to those skilled in the art, such as the abovementioned phosphoramidite techniques.
- the activity level and the tissue specificity of the regulatory sequences, in particular the promoter sequences of the RRS1-R gene according to the invention can be determined by measuring the expression levels of a detectable polynucleotide placed under the control of the latter in different types of plant cells and tissues.
- the detectable polynucleotide can be either a polynucleotide which specifically hybridizes with an oligonucleotide probe of predetermined sequence, or a polynucleotide encoding a detectable protein, including the RRS1-R polypeptide or a fragment thereof.
- a test allowing such verification is well known to those skilled in the art and is described in particular in US patents No. 5,502,176 and US No. 5, 266,488, incorporated herein by reference.
- the invention therefore also relates to a nucleic acid comprising: a) a nucleic acid comprising a nucleotide regulatory sequence of at least 50 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 3 or of a sequence having at least 80% of nucleotide identity with the sequence SEQ ID No. 2; b) a polynucleotide encoding a polypeptide of interest or a polynucleotide of interest whose transcription and / or translation is placed under the control of the regulatory nucleic acid a); c) where appropriate, a regulatory nucleic acid comprising at least 50 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 3 or of a sequence having at least 80% nucleotide identity with the sequence SEQ ID No. 3.
- the polypeptide of interest encoded by the nucleic acid b) above can be of varied nature and origin; it may be a protein of eukaryotic or prokaryotic origin.
- the polypeptides of interest are toxic polypeptides, such as, for example, elicitins, for plant cells, their expression being such as to induce the death of the cell in which they are expressed and consequently a containment of the pathogens having infected the plant. , thereby preventing the spread of the pathogen to all organs of the plant.
- toxic polypeptides such as, for example, elicitins
- the nucleic acid of interest mentioned in b) above can be complementary to a target polynucleotide, for example a polynucleotide located in the coding region of the RRS1-R gene, and can thus be advantageously used as an antisense polynucleotide.
- a target polynucleotide for example a polynucleotide located in the coding region of the RRS1-R gene, and can thus be advantageously used as an antisense polynucleotide.
- the RRS1-R gene is transcribed in the form of a messenger RNA which has been isolated and characterized.
- This messenger RNA comprises a unique open reading frame coding for the protein RRS1-R with a length of 1378 amino acids.
- the messenger RNA of the RRS1-R gene and the corresponding cDNA can be easily obtained by a person skilled in the art, for example by screening a cDNA band using an appropriate probe or by rapid amplification cDNA ends (PCR, RACE-PCR). Those skilled in the art can again obtain the cDNA for the RRS1-R gene using the techniques described in Example 6, or also by direct chemical synthesis.
- nucleic acid according to the invention can also reproduce a nucleic acid according to the invention by direct chemical synthesis, such as the phosphodiester method described by NARANG et al. (1979), the phosphodiester method described by BROWN et al. (1979), the diethylphosphoramidite method described by BEAUCAGE et al. (1981), as well as the method on solid support described in European patent application EP 0 707 592, the content of these documents being incorporated here by reference.
- this messenger RNA respectively comprises a 5 'untranslated region (5'-UTR) and a 3' untranslated region (3'-UTR).
- the cDNA resulting from the transcription of the RRS1-R gene is referenced as the sequence SEQ ID No. 4.
- the 5'-UTR sequence of the messenger RNA transcribed by the RRS1-R gene consists of the sequence going from the nucleotide in position 1 to the nucleotide in position 81 of the sequence SEQ ID No. 4.
- the 3'-UTR sequence of the messenger RNA transcribed by the RRS1-R gene consists of the sequence going from the nucleotide at position 4219 to the last nucleotide at the 3 'end of the sequence SEQ ID No. 4.
- the invention also relates to a nucleic acid comprising at least 15 consecutive nucleotides of a polynucleotide chosen from the 5'-UTR and 3'-UTR sequences of the messenger RNA of the RRS1-R gene described above, a polynucleotide having at at least 80% nucleotide identity with such a nucleic acid as well as a nucleic acid of sequence complementary to said nucleic acids or to said polynucleotides. Also part of the invention is a nucleic acid which comprises, or which consists of the nucleotide sequence SEQ ID No. 4.
- the 5'-UTR and 3'-UTR regions of the messenger RNA of the RRS1-R gene are capable of containing elements for regulating the transcription and / or translation of this gene, such as one or more sites of binding to the ribosome, one or more polyadenylation sites, the sequences allowing the stability of messenger RNA or even all or part of the promoter region of transcription.
- the applicant also isolated and characterized, from an ecotype of Arabidopsis thaliana sensitive to the pathogen R. solanacearum, the gene corresponding to the RRS1-R gene, comprising, relative to the sequence of the RRS1-R gene, several additions and substitutions of nucleotides, the mutated gene found in the sensitive ecotype of Arabidopsis thaliana being designated RRS1-S for the purposes of this description.
- the RRS1-S gene comprises a first mutation in the part coding for the C-terminal region of the protein, leading to the replacement of the amino acid sequence "SEASKLERL" going from the amino acid in position 704 to the amino acid in position 712 of the polypeptide encoded by the RRS1-R gene of sequence SEQ ID No.
- a second mutation consists in the insertion of an early stop codon found in the coding region of the RRS1-S gene, leading to a deletion of the 90 amino acids located at the C-terminal end of the RRS1-R protein, the polypeptide encoded by the RRS1-S gene being accordingly 1288 amino acids.
- the applicant believes that the various mutations carried by the RRS1-S gene identified in the Col-5 ecotype of Arabidopsise thaliana, which is sensitive to the pathogen R. solanacearum, are responsible for the phenotype of sensitivity to R. solanacearum observed in this ecotype.
- the nucleotide sequence of the RRS1-S gene found in the Colid-5 ecotype of Arabidopsis thaliana is useful in particular for the development of various means of specific detection of the RRS1-S gene, such means of detection allowing those skilled in the art to determine whether a plant of interest contains in its genome the RRS1-S gene and is consequently sensitive to the bacterial pathogen R. solanacearum.
- the genomic sequence of the RRS1-S gene is referenced as the sequence SEQ ID No. 5.
- Another subject of the invention is a nucleic acid which comprises where is made up of the sequence SEQ ID No. 5.
- the invention also relates to a nucleic acid comprising at least 15 consecutive nucleotides of a polynucleotide of sequence SEQ ID No. 5.
- the invention also relates to a nucleic acid having at least 40% nucleotide identity with the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1
- nucleotide sequence SEQ ID No. 5 or with a polynucleotide comprising at least 15 consecutive nucleotides of the nucleotide sequence SEQ ID No. 5, as well as a nucleic acid of complementary sequence.
- the RRS1-S gene sequence comprises 7 exons and 6 introns, the structural characteristics of which are detailed in Tables 3 and 4 respectively.
- the invention also relates to a nucleic acid comprising at least 15 consecutive nucleotides of an exonic polynucleotide of the RRS1-S gene, such as the polynucleotides 1 to 7 described in table 3 above, which are all included in the nucleic acid with sequence SEQ ID No. 5.
- a nucleic acid codes for at least part of the RRS1-S polypeptide and can in particular be inserted into a recombinant vector intended for the expression of the corresponding translation product in a host cell or in a plant transformed with this recombinant vector.
- Such a nucleic acid can also be used for the synthesis of nucleotide probes and primers intended for the detection or the amplification of nucleotide sequences included in the RRS1-S gene in a sample.
- the invention also relates to a nucleic acid comprising at least 15 consecutive nucleotides of an intronic polynucleotide of the RRS1-S gene, such as the polynucleotides 1 to 7 described in table 4 above, which are all included in the nucleic acid with sequence SEQ ID No. 5.
- Such a nucleic acid can be used as a probe or oligonucleotide primer to detect the presence of at least one copy of the RRS1-S gene in a sample, or alternatively to amplify a target sequence determined within the RRS1-S gene.
- probes are constructed so as to specifically hybridize with the regions of the RRS1-S gene which comprise one or more basic substitutions, additions or deletions with respect to the nucleotide sequence of the RRS1-R gene of sequence SEQ ID N 1.
- such primers make it possible to amplify the regions of the RRS1 -S gene comprising one or more basic substitutions, additions or deletions with respect to the nucleotide sequence of the RRS1-R gene of sequence SEQ ID No. 1.
- the applicant has also isolated and characterized the non-transcribed nucleotide sequences located respectively on the 5 'side and on the 3' side of the coding regions of the RRS1-S gene.
- These non-transcribed 5 'and 3' sequences are capable of carrying signals for regulating the transcription and / or translation of the RRS1-S gene and are also part of the invention, and are respectively referenced as sequences SEQ ID N ° 6 and SEQ ID N ° 7.
- the invention therefore therefore also relates to a nucleic acid comprising at least 50 consecutive nucleotides of a polynucleotide regulating the RRS1-S gene chosen from the nucleotide sequences SEQ ID No. 6 and SEQ ID No.
- the invention also relates to a nucleic acid comprising: a) a 5 'regulatory polynucleotide of the RRS1-S gene as defined above; b) a polynucleotide encoding a polypeptide or a polynucleotide of interest; c) where appropriate, a 3 ′ regulatory polynucleotide of the RRS1-S gene as defined above,
- nucleic acid coding for the polypeptide or polynucleotide of interest being placed under the control of the regulatory polynucleotide 5 'of the RRS1-S gene and, if appropriate, also under the control of the polynucleotide 3' of the RRS1-S gene.
- the applicant has shown that the RRS1-S gene is transcribed in the form of a messenger RNA which has been isolated and characterized.
- This messenger RNA comprises a unique open reading frame coding for the protein RRS1-S with a length of 1288 amino acids.
- this messenger RNA respectively comprises a 5 'untranslated region (5'-UTR) and a 3' untranslated region (3'UTR).
- the cDNA of the RRS1-S gene is referenced as the sequence SEQ ID No. 8.
- the 5'-UTR sequence of the messenger RNA transcribed by the RRS1-S gene consists of the sequence going from the nucleotide in position 1 to the nucleotide in position 81 of the sequence SEQ ID No. 8.
- the 3'-UTR sequence of the messenger RNA transcribed by the RRS1-S gene consists of the sequence going from the nucleotide at position 3949 to the last nucleotide at the 3 'end of the sequence SEQ ID No. 8.
- the invention also relates to a nucleic acid comprising at least 15 consecutive nucleotides of a polynucleotide of sequence SEQ ID NO: 1
- nucleic acids according to the invention and in particular the nucleotide sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 8, their fragments of at least 15 nucleotides, the sequences having at least 40% identity in nucleotides with at least part of the sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 8, as well as the nucleic acids of complementary sequences, are useful for detecting the presence of at least one copy of a nucleotide sequence of the RRS1-R gene or RRS1-S or a fragment or an allelic variant of the latter in a sample.
- nucleotide probes and primers hybridizing, under high stringency hybridization conditions, with a nucleic acid chosen from the sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 8.
- hybridization conditions within the meaning of the invention means the following hybridization conditions:
- the membranes are washed with a 5 x SSC buffer (1 x SSC and corresponds to 0.15 M NaCl + 0.015 M sodium citrate), then the membranes are treated with UV at 312 nm for 3 minutes, then prehybridized for at least 4 hours at 65 ° C in a hybridization buffer (6 x SSC, 5 x Denhardt's, 100 ⁇ g of single-stranded DNA of calf thymus / ml and 0.5% SDS [weight / volume]).
- the probes are added to the membranes and incubated at 65 ° C overnight. After the hybridization step, the membranes are washed in 500 ml of a 2 ⁇ SSC, 1% SDS (weight / volume) buffer at laboratory temperature for 30 minutes;
- a second washing is carried out in 500 ml of a 0.1 x SSC, 0.1% SDS (weight / volume) buffer for 15 minutes at 42 ° C.
- hybridization conditions described above are suitable for hybridization under conditions of high stringency, a nucleic acid molecule with a length of 300 to 400 nucleotides. It goes without saying that the hybridization conditions described above can be adapted as a function of the length of the nucleic acid for which hybridization is sought or of the type of labeling chosen, according to techniques known to those skilled in the art. .
- the suitable hybridization conditions can for example be adapted according to the teaching contained in the work of HAMES and HIGGINS (1985) or even in the work of AUSUBEL et al; (1989).
- the nucleotide probes or primers according to the invention comprise at least 15 consecutive nucleotides of a nucleic acid according to the invention, in particular of a nucleic acid of sequence SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 8 or of its sequence complementary, of a nucleic acid having at least 40% nucleotide identity with a sequence chosen from the sequences SEQ ID N ° 1 to SEQ ID N ° 8 or of its complementary sequence or of a hybridizing nucleic acid, in high stringency hybridization conditions, with a sequence chosen from the sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 8 or its complementary sequence.
- nucleotide probes or primers according to the invention have a length of at least 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 or 500 consecutive nucleotides of a nucleic acid according to the invention, in particular a nucleic acid of nucleotide sequence chosen from the sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 8, or of a nucleic acid of complementary sequence.
- a probe or a primer of the nucleotide according to the invention will consist and / or include fragments with a length of 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300 , 400 or 500 nucleotides consecutive of a nucleic acid according to the invention, more particularly of a nucleic acid chosen from the sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 8, or of a nucleic acid of complementary sequences.
- primers and of pairs of primers making it possible to amplify different regions of the RRS1-R gene are, for example, the sequences SEQ ID No. 11 to SEQ ID No. 61 shown in Table 6.
- a primer or a nucleotide probe according to the invention can be prepared by any suitable method well known to those skilled in the art, including by cloning and action of restriction enzymes or also by direct chemical synthesis according to techniques such as methods of phosphodiester from Narang et al. (1979) or Brown et al. (1979) cited above.
- Each of the nucleic acids according to the invention can be labeled, if desired, by incorporating a label detectable by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or even chemical means.
- markers can consist of radioactive isotopes ( 32 P, 3 H, 35 S), fluorescent molecules (5-bromodeoxyuridine, fluorescein, acetylaminofluorene, digoxigenin) or also ligands such as biotin.
- radioactive isotopes 32 P, 3 H, 35 S
- fluorescent molecules 5-bromodeoxyuridine, fluorescein, acetylaminofluorene, digoxigenin
- ligands such as biotin.
- the labeling of a nucleic acid is preferably carried out by incorporating labeled molecules within these nucleotides by extension of primers, or else by adding to the 5 ′ or 3 ′ ends.
- the probes according to the invention can have structural characteristics such as to allow amplification of the signal, such as the probes described by URDEA et al; (1991) or in European patent No. EP 0 225 807 (Chiron).
- oligonucleotide probes according to the invention can be used in particular in Southern type hybridizations with genomic DNA, or in hybridizations with gene messenger RNA RRS1-R and RRS1-S, when the expression of the corresponding transcript is sought in a sample.
- the probes according to the invention can also be used for the detection of PCR amplification products or even for the detection of mismatches.
- Nucleotide probes or primers according to the invention can be immobilized on a solid support.
- solid supports are well known to those skilled in the art and include surfaces of the microtiter plate wells, polystyrene beads, magnetic beads, nitrocellulose strips or even microparticles such as latex particles.
- the present invention also relates to a method for detecting the presence of a nucleic acid of the RRS1-R or RRS1-S gene in a sample, said method comprising the steps of:
- the oligonucleotide probe (s) are immobilized on a support.
- the oligonucleotide probes include a detectable marker.
- the invention further relates to a kit or kit for detecting the presence of a nucleic acid of the RRS1-R or RRS1-S gene in a sample, said kit comprising:
- nucleotide probes as described above;
- the detection kit or kit is characterized in that the probe or probes are immobilized on a support.
- the detection kit or kit is characterized in that the oligonucleotide probes comprise a detectable marker.
- such a kit will comprise a plurality of oligonucleotide probes in accordance with the invention which can be used to detect target sequences of interest of the RRS1-R or RRS1-S gene or else to detect mutations in the coding regions or the non-coding regions of the RRS1 -R gene, more particularly of the nucleic acids of the sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 8 where the nucleic acids of complementary sequences.
- the nucleotide primers according to the invention can be used to amplify any nucleotide fragment (gDNA, cDNA, mRNA) of RRS1-R or RRS1-S, and more particularly all or part of a nucleic acid of sequence SEQ ID No. 1 to SEQ ID N ° 8.
- Another subject of the invention relates to a method for the amplification of a nucleic acid of the RRS1 -R or RRS1-S gene, and more particularly a nucleic acid of sequence SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 8 or a fragment or a nucleic acid of sequence complementary to the latter, contained in a sample, said method comprising the steps of:
- At least one amplification cycle of the nucleic acid contained in the sample is carried out. prior to the detection of the optionally amplified nucleic acid, preferably at least 10, and very preferably at least 20, amplification cycles.
- the subject of the invention is also a kit or kit for the amplification of a nucleic acid of the RRS1-R or RRS1-S gene according to the invention, and more particularly all or part of a nucleic acid of sequence SEQ ID N ° 1 to SEQ ID N ° 8, said kit or kit comprising:
- a pair of nucleotide primers in accordance with the invention the hybridization position of which is located respectively on the 5 ′ side and on the 3 ′ side of the target nucleic acid of the RRS1-R or RRS1-S gene, the amplification is sought;
- Such an amplification kit or kit will advantageously comprise at least one pair of nucleotide primers as previously described.
- primers according to the invention comprise all or part of a polynucleotide chosen from nucleotide sequences SEQ ID No. 11 to SEQ ID No. 61.
- plants carrying the RRS1 -R gene have a resistance to R. solanacearum phenotype.
- the applicant has also shown that the insertion of the RRS1-R gene or even the cDNA of the RRS1-R gene into the genome of a plant initially sensitive to R. solanacearum gives this plant a phenotype of resistance to this pathogen.
- the invention also relates to methods and means intended to inhibit or block the expression of the RRS1-S gene found in plants sensitive to R. solanacearum, in particular with a view to increasing their resistance to different pathogens and this by any technique known to those skilled in the art.
- the invention also relates to an antisense polynucleotide, capable of specifically hybridizing to a determined region of the gene
- Such a polynucleotide has the general structure which has been defined above for the probes and primers according to the invention.
- an antisense polynucleotide according to the invention hybridized with a sequence corresponding to a sequence localized in the region of the 5 ′ end of the messenger RNA RRS1-S, and very preferably close to the codon of initiation of translation (ATG) of the RRS1-S gene.
- an antisense polynucleotide according to the invention comprises a sequence corresponding to one of the sequences located at the exon / intron junctions of the RRS1-S gene and preferably sequences corresponding to a splicing site, which can be determined according to techniques well known to those skilled in the art, on the basis of the description of the sequences of the RRS1-S gene of the present description.
- the antisense polynucleotides must have a sufficient length and melting temperature to allow the formation of an intracellular duplex hybrid having sufficient stability to inhibit the expression of RRS1-S mRNA.
- an antisense polynucleotide according to the invention has a length of 15 to 4000 nucleotides.
- An antisense polynucleotide of the invention preferably has a length ranging from 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 or 50 to 75, 100, 200, 500, 1000, 2000, 3000 or 4000 nucleotides.
- antisense polynucleotides those having a length of approximately 300 nucleotides or a length of approximately 4000 nucleotides are preferred respectively.
- each of the antisense polynucleotides hybridizing with a distinct region of the RRS1-S gene or of its messenger RNA.
- the antisense polynucleotides according to the invention are defined in such a way that they hybridize with a region of the RRS1-S gene having, with respect to the corresponding sequence of the RRS1-R gene, one or more substitutions, deletions, additions of at least one base.
- Another strategy for inhibiting or blocking the expression of the RRS1-S gene consists in using polynucleotides capable of forming a triple DNA helix with the genomic region of double stranded DNA carrying the RRS1-S gene.
- homopurine sequences are considered to be most useful in this type of strategy, although homopyrimidine sequences may also be used.
- Those skilled in the art can advantageously refer to the genomic sequence SEQ ID No. 5 of RRS1-S in order to select from this sequence sequences of homopurine or homopyrimidine 10 to 20 nucleotides long, which will be capable of inhibit expression of the RRS1-S gene.
- Methods of inhibiting the expression of a gene by the triple helix technique are for example described by GRIFFIN et al. (1989)
- the invention therefore also relates to the use of an antisense polynucleotide or a homopyrimidine polynucleotide, as defined above, or of a recombinant vector comprising such a polynucleotide, for inhibiting or blocking the expression of the RRS1 gene -S in a plant cell or in a whole plant.
- the invention also relates to a recombinant vector comprising a nucleic acid according to the invention.
- such a recombinant vector comprises a nucleic acid chosen from the following nucleic acids:
- a nucleic acid comprising at least 15 consecutive nucleotides of a nucleotide sequence coding for a protein for resistance of a plant to a pathogen, said protein comprising: (i) an N-terminal part comprising at least one amino acid sequence rich in leucine and at least one nucleotide binding site; and
- nucleic acid comprising a sequence having at least 40% nucleotide identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 1, as well as a nucleic acid of complementary sequence;
- nucleic acid comprising a sequence having at least 40% nucleotide identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 5;
- nucleic acid comprising at least 15 consecutive nucleotides of a polynucleotide consisting of one of exons 1 to 7 of the RRS1-R gene or of the RRS1-S gene, as defined above;
- nucleic acid comprising a polynucleotide of at least 15 consecutive nucleotides of a polynucleotide consisting of one of introns 1 to 7 of the RRS1-R or RRS1-S gene, as defined above;
- nucleic acid having at least 15 consecutive nucleotides of a polynucleotide regulating the RRS1-R or RRS1-S gene as defined above;
- vector in the sense of the present invention, is meant a circular or linear DNA or RNA molecule which is either in the form of single strand or double strand.
- a recombinant vector according to the invention is either a cloning vector, an expression vector, or more specifically an insertion vector, a transformation vector or an integration vector.
- a recombinant vector according to the invention is used for the purpose of amplifying the nucleic acid which is inserted therein after transfection transformation of the desired cellular host.
- it is an expression vector comprising, in addition to a nucleic acid coding for a polypeptide in accordance with the invention, in particular the polypeptides coded by the RRS1-R and RRS1-S genes, regulatory sequences for directing transcription and / or translation.
- a recombinant vector according to the invention will comprise in particular the following elements: 1) elements for regulating the expression of the nucleic acid of the RRS1-R gene or of the RRS1-S gene to be inserted, such as promoters and activator sequences ("enhancers");
- the recombinant vectors according to the invention may include one or more origins of replication in cellular hosts in which their amplification or expression is sought as well as selection markers.
- a recombinant vector according to the invention comprises an antisense polynucleotide or a homopurine or homopyridine polynucleotide, as defined above, if necessary placed under the control of appropriate regulatory sequences making it possible to ensure expression thereof. in a selected host cell or plant.
- Such a recombinant vector is preferably used to inhibit the expression of the RRS1-S gene in the cell or in the plant.
- a recombinant vector according to the invention comprises a polynucleotide encoding the RRS1-R polypeptide or a polypeptide having at least 40% amino acid identity with the latter and retaining the biological activity of RRS1 -R, placed under the control of regulatory sequence (s) allowing high level expression of RRS1-R or its homolog in a host cell or in a chosen plant.
- regulatory sequence s
- Such a recombinant vector is useful for allowing a high level of expression of RRS1-R in a plant.
- such a recombinant vector is an integrative vector allowing the insertion of multiple copies of the coding sequence of RRS1-R into the genome of a plant.
- the bacterial promoters could be the Lacl, LacZ promoters, the RNA polymerase promoters of bacteriophage T3 or T7, the PR or PL promoters of phage lambda.
- Promoters for the expression of a nucleic acid of RRS1-R or RRS1-S according to the invention in plants are the CaMV 35 S promoter of the cauliflower mosaic virus Odell et al., (1985) or still the promoter of the lactin 1 gene of rice McEIroy et al. (1990).
- the preferred bacterial vectors according to the invention are for example the vectors pBR 322 (ATCC No. 37017) or also vectors such as pAA223-3 (Pharmacia Uppsala, Sweden) and pGEM1 (Promega Biotech, Madison, WU, USA) and pUC19 ( marketed by Boehringer Mannheim, Germany).
- vectors pQE70, pQE60, pQE9 Qiagen, psuX 174, pBluescript SA, pNH8A, pMH16A, pMH18A, pMH46A, pWLNEO, pSG2CAT, pOG44,
- vectors specially adapted for the expression of sequence of interest in plant cells such as the following vectors:
- these vectors must be introduced into a host cell.
- the introduction of the polynucleotides according to the invention into a host cell can be carried out in vitro, according to techniques well known to those skilled in the art for transforming or transfecting cells, either in primary culture or in the form of cell lines.
- the invention further relates to a host cell transformed with a nucleic acid or with a recombinant vector according to the invention.
- Such a transformed host cell is preferably of prokaryotic or eukaryotic origin, in particular bacterial, fungal or vegetable origin.
- bacteria cells of different from E. coli or from Agrobacterium tumefaciens can in particular be used.
- the transformed host cell is a plant cell or also a plant protoplast.
- it is a cell or a protoplast of rapeseed, tobacco, corn, tomato, potato or Arabidopsis thaliana.
- the invention also relates to a transformed multicellular plant organism, characterized in that it comprises a transformed host cell or a plurality of host cells transformed with a nucleic acid of the RRS1-R or RRS1-S gene or with a recombinant vector according to the invention.
- the plant multicellular organism is transformed with one or more antisense nucleotides and / or one or more homopurine or homopyrimidine polynucleotides in order to inhibit or block the expression of the RRS1-S gene in this organism.
- the plant multicellular organism is transformed with one or more copies of a polynucleotides encoding the RRS1-R protein or for a polypeptide having at least 40% amino acid identity with the RRS1-R polypeptide and retaining the biological activity making it possible to confer a resistance phenotype on R. solanacearum on the transformed organism.
- the subject of the invention is also a transgenic plant, that is to say a transformed plant comprising, preferably in a form integrated into its genome, a nucleic acid of the RRS1-R or RRS1 -S gene and preferably an antisense polynucleotide or a homopurine or homopyrimidine polynucleotide or a nucleic acid coding for the RRS1-S polypeptide or a homologous polypeptide, said nucleic acid having been inserted into the genome of the plant by transformation with a nucleic aid of RRS1-R or RRS1-S or a recombinant vector according to the invention.
- a plant transformed according to the invention is rapeseed, tobacco, corn, tomato, potato or Arabidopsis thaliana.
- the transgenic plants as defined above have a reduced expression, an undetectable expression or an absence of expression of the RRS1-S gene and are therefore capable of exhibiting increased resistance to pathogens such as
- the transgenic plants as defined above have the property of strongly expressing the RRS1- polypeptide
- the subject of the invention is also a process for obtaining a transgenic plant transformed with a nucleic acid according to the invention, characterized in that it comprises the following steps:
- step c) selection of the plants obtained in step b) having integrated the nucleic acid of the RRS1-R or RRS1-S gene of interest.
- the invention also relates to a process for obtaining a transgenic plant, transformed with a nucleic acid according to the invention, characterized in that it comprises the following steps:
- step b) regenerating an entire plant from transformed plant cells obtained in step a); c) select the plants having integrated the nucleic acid of the RRS1-R or RRS1-S gene of interest.
- the invention also relates to a process for obtaining a transformed plant, characterized in that it comprises the following steps:
- Any of the methods for obtaining a transgenic plant described above can also comprise the following additional steps:
- step c) crossing between them of the two transformed plants as obtained in step c);
- any of the methods described above may further comprise the following steps:
- step f) crossing a transformed plant obtained in step c) with a plant of the same species;
- step d) selection of the plants resulting from the crossing of step d) having conserved the transgene.
- a person skilled in the art is capable of implementing numerous methods of the state of the art in order to obtain plants transformed with a nucleic acid of the RRS1-R or RRS1-S gene according to the invention.
- the techniques used in other types of vectors can also be used such as the techniques described by BOUCHEZ et al. (1993) or by HORSCH et al. (1984).
- the invention further relates to a transformed plant as obtained according to any one of the production methods described above.
- the invention also relates to a plant seed, the constituent cells of which comprise a nucleic acid of the RRS1-R gene or of the RRS1-S gene according to the invention which has been artificially inserted into their genome.
- the invention also relates to a seed of a transgenic plant as defined above.
- Another subject of the invention consists in the use of a nucleic acid of the RRS1 -R gene or of the RRS1-S gene according to the invention for the expression in vitro or in vivo, preferably in planta of the protein RRS1 -R or RRS1-S or a peptide fragment thereof.
- the invention also relates to the use of an antisense nucleic acid, or of a homopurine or homopyrimidine nucleic acid according to the invention for inhibiting or blocking the expression of the gene coding for the protein RRS1-R or RRS1 -S.
- the above uses are characterized in that it is an expression in vivo in a plant transformed with such a nucleic acid.
- the RRS1-R gene codes for a polypeptide of 1378 amino acids in length.
- the RRS1-R polypeptide has the structural characteristics defined previously in the description, namely the characteristic presence of functional domains found in combination for the first time in the amino acid sequence of a polypeptide, which gives the protein RRS1-R the quality of first known member of a new class of proteins defined most generally as proteins comprising:
- an N-terminal part comprising at least one amino acid sequence rich in leucine and at least one nucleotide binding site
- the RRS1-R polypeptide is referenced as the sequence SEQ ID No. 9.
- RRS1-R polypeptide could lead to a protein lacking the biological activity of the wild protein RRS1-R, the expression of the mutated protein in a plant no longer making it possible to observe a phenotype of resistance to certain pathogens, such as R. solanacearum.
- a polypeptide representative of the mutated RRS1-R polypeptides altered in their biological function is the RRS1-S polypeptide, the amino acid sequence of which is referenced as the sequence SEQ ID No. 10.
- the invention also relates to a polypeptide encoded by a nucleic acid of the RRS1-R gene or of the RRS1-S gene, and preferably a polypeptide comprising at least 5 consecutive amino acids of a protein chosen from RRS1-R and RRS1-S.
- such a polypeptide comprises at least 10, 15, 20,
- the invention also relates to a polypeptide comprising the amino acid sequences having at least 40% amino acid identity with the sequence of the RRS1-R SEQ ID No. 9 polypeptide, with the sequence of the RRS1-S SEQ ID No. 10 polypeptide, or to a peptide fragment thereof.
- part of the invention is a polypeptide having at least 60%, 80%, 85%, 90%, 95% or 99% of amino acid identity with the sequence of the RRS1-R polypeptide of SEQ ID No. 9 , with the sequence of the RRS1-S SEQ ID NO: 10 polypeptide, or a peptide fragment thereof.
- the polypeptides according to the invention are in an isolated or purified form.
- the invention also relates to a process for the production of the RRS1-R polypeptide of sequence SEQ ID No. 9, the RRS1-S polypeptide of sequence SEQ ID No. 10 or a peptide fragment thereof, the method comprising Steps :
- RRS1-S or a peptide fragment thereof, in an appropriate vector
- step b) cultivating, in an appropriate culture medium, a host cell previously transformed or transfected with the recombinant vector of step a);
- step c) separating and purifying from the culture medium or from the cell lysates obtained in step c), said polypeptide;
- the peptides according to the invention can be characterized by attachment to an immunoaffinity chromatography column on which the antibodies directed against these polypeptides in which a fragment or a variant of the latter have been immobilized beforehand.
- a recombinant polypeptide according to the invention can be purified by passage through a chromatography column according to the methods known to those skilled in the art and described for example by AUSUBEL F. et al. (1989) cited above.
- a polypeptide according to the invention can also be prepared by conventional techniques of chemical synthesis either in homogeneous solution or in solid phase.
- a polypeptide according to the invention may be prepared by the technique in homogeneous solution described by HOUBEN WEYL (1974) or also the solid phase synthesis technique described by MERRIFIELD (1965a, 1965b).
- homologous polypeptides to the RRS1-R or RRS1-S polypeptides, or their fragments.
- homologous polypeptides have amino acid sequences having one or more substitutions of an amino acid with an equivalent amino acid, relative to the reference polypeptide.
- the equivalent amino acids according to the present invention will be understood, for example the replacement of a residue in the L form with a residue in the D form or else the replacement of a glutamic acid (E) by a pyro-glutamic acid according to techniques well known to those skilled in the art.
- two amino acids belonging to the same class are also considered to be equivalent amino acids, that is to say two amino acids, basic, non-polar or even uncharged polar.
- polypeptide comprising amino acid modifications of 1, 2, 3, 4, 5, 10 to 20 substitutions, additions or deletions of an amino acid with respect to the amino acid sequence of the RRS1-R polypeptide or RRS1-S polypeptide according to the invention.
- polypeptides according to the invention comprising one or more additions, deletions, substitutions of at least one amino acid retain their ability to induce resistance to various pathogens, especially R. solanacearum
- polypeptides according to the invention comprising one or more additions, deletions, substitutions of at least one amino acid retain their ability to be recognized by antibodies directed against the RRS1-R polypeptides or
- a polypeptide derived from the RRS1-R protein or from the RRS1-S protein is useful in particular for the preparation of antibodies intended for the detection of the presence of one or other of these polypeptides or of a peptide fragment of these in a sample.
- antibodies directed against these polypeptides are used to quantify the synthesis of RRS1-R or RRS1-S, for example in the cells of a plant, and thus determine the capacity of this plant to resist certain pathogens, and more particularly to R. solanacearum.
- Preferred antibodies according to the invention are the antibodies specifically recognizing the amino acid sequence ranging from the amino acid in position 704 to the amino acid in position 712 of the sequence of the RRS1-R polypeptide of SEQ ID No. 9.
- a second class of preferred antibodies according to the invention are the antibodies specifically recognizing the amino acid sequence ranging from the amino acid at position 704 to the amino acid at position 710 of the sequence of the RRS1-S polypeptide of SEQ ID # 10.
- a third class of preferred antibodies according to the invention are the antibodies specifically recognizing the amino acid sequence ranging from the amino acid at position 1291 to the amino acid at position 1378 of the RRS1-R polypeptide of sequence SEQ ID No. 9.
- antibody within the meaning of the present invention, is meant in particular polyclonal or monoclonal antibodies or fragments (for example fragments F (ab) ′ 21 F (ab) or also any polypeptide comprising a domain of the initial antibody recognizing the target polypeptide or fragment of the polypeptide according to the invention.
- Monoclonal antibodies can be prepared from hybridomas using the technique described by KOHLER and MILSTEIN (1975).
- the present invention also relates to antibodies directed against a polypeptide as described above or a fragment or a variant thereof, as produced in the triome technique or also the hybridoma technique described by KOZBOR et al. (1983).
- the invention also relates to fragments of single chain Fv antibody (ScFv) as described in US Patent No. 4,946,768 or by MARTINEAU et al. (1998).
- the antibodies according to the invention also include fragments of antibodies obtained using phage libraries (RIDDER et al., 1995), REINMANN K.A. et al., 1997).
- the antibody preparations according to the invention are useful in immunological detection tests intended for the identification of the presence and / or the amount of the protein RRS1-R or RRS1-S or also of a peptide fragment of l one of these proteins, present in a sample.
- An antibody according to the invention may also comprise an isotopic or non-isotopic detectable marker, for example fluorescent, or else be coupled to a molecule such as biotin, according to techniques well known to those skilled in the art.
- an isotopic or non-isotopic detectable marker for example fluorescent
- a molecule such as biotin
- the subject of the invention is also a method for detecting the presence of an RRS1-R polypeptide, an RRS1-S polypeptide or also a peptide fragment of one of these polypeptides in accordance with the invention , in a sample, said method comprising the steps of:
- the invention also relates to a diagnostic kit or kit for detecting the presence of a polypeptide according to the invention in a sample, said kit comprising:
- the invention also relates to fusion proteins comprising an amino acid sequence of one of the two C-terminal or N-terminal functional domains of a polypeptide according to the invention, on the one hand, and, on the other hand, all or part of the amino acid sequence of a heterologous polypeptide.
- heterologous polypeptide is meant for the purposes of this description an amino acid sequence which is not naturally present in the amino acid sequence of the N-terminal or C-terminal polypeptide fragment or fragment according to the invention with which this "heterologous" amino acid sequence is covalently linked, preferably by a peptide bond.
- a fusion protein, or chimera according to the invention comprises (1) the N-terminal domain of a first polypeptide belonging to the new class of proteins of resistance to plant pathogens according to the invention, linked to covalently, preferably by a normal peptide bond, to a second polypeptide comprising the C-terminal domain of a second protein also belonging to the class of proteins for resistance to plant pathogens according to the invention.
- the N-terminal domain of the first polypeptide and the C-terminal domain of the second polypeptide can be linked directly to each other by a peptide bond.
- the N-terminal domain of the first polypeptide and the C-terminal domain of the second polypeptide can be separated, within the fusion protein, by a spacer amino acid sequence which can be of any kind.
- Such a chimeric protein therefore comprises an N-terminal domain comprising the motifs characteristic of a protein for resistance to pathogens, covalently linked to a C-terminal domain comprising a nucleotide binding site capable of having a specificity different from that of the C-terminal domain which is found naturally present within the amino acid sequence of the natural polypeptide from which the N-terminal domain of the chimeric protein originates.
- Such chimeric proteins constitute new means making it possible, by choosing the N-terminal domain, to confer in a plant resistance to a determined pathogen.
- a fusion protein according to the invention consists of (1) the amino acid sequence of all or part of a protein whose mechanisms of induction of synthesis in a plant are known and ( 2) (i) either the complete amino acid sequence of a pathogen resistance polypeptide according to the invention, or (i.) The amino acid sequence of the C-terminal domain comprising a nucleotide binding site of a polypeptide according to the invention.
- the synthesis of such a chimeric protein is inducible by stress signals from the plant, such as stress due to a sudden change in the temperature of the environment.
- the invention also relates to a nucleic acid coding for a chimeric protein as defined above.
- such a nucleic acid comprises, near and advantageously upstream of the coding region, a constitutive promoter or an inducible promoter.
- a nucleic acid comprises, from the 5 ′ to the 3 ′ end a plant heat shock protein promoter, (2) a nucleotide sequence coding for the N-terminal part of the heat shock protein the synthesis of which is naturally regulated by the promoter (1), (3) the nucleotide sequence coding for a polypeptide of resistance to plant pathogens having retained its function of transcription factor (functional WRKY domain) according to the invention.
- preferred promoters are those which are inducible by: - Heat (Athsp 17.6; Prandl et al., 1995);
- a chimeric protein according to the invention can be obtained according to the technique described in Example 7.
- a polypeptide for resistance to plant pathogens has, both in the N-terminal domain and in the C-terminal domain, characteristic patterns of binding to proteins.
- Proteins interacting with a polypeptide according to the invention therefore also represent means involved in the resistance of plants to infection by certain pathogens, in particular by R.solanacearum.
- the invention also relates to methods and means intended for screening for candidate substances or molecules capable of binding with a polypeptide according to the invention.
- the invention therefore relates to a method for screening a candidate substance which binds to a polypeptide according to the invention, and very particularly an RRS1-R or RRS1-S polypeptide, characterized in that it comprises the steps of:
- step c) bringing the polypeptide of step a) into contact with the candidate substance of step b);
- a polypeptide according to the invention is immobilized by adsorption or by covalent bonding on a suitable surface, the surface of a well of a plate of microtiter.
- the immobilized polypeptide of the invention is then brought into contact with the candidate substance or molecule to be tested.
- the detection of the binding of the candidate molecule to the immobilized polypeptide of the invention can then be carried out for example with an antibody specifically recognizing the candidate molecule to be tested, said antibody optionally comprising a detectable marker.
- the candidate substance or molecule is immobilized beforehand on the surface of a support before being brought into contact with a polypeptide according to the invention.
- the detection of the complex possibly formed between the polypeptide according to the invention and the candidate molecule immobilized on the support can then be carried out using an antibody specifically recognizing a polypeptide according to the invention, said antibody being optionally labeled.
- the invention also relates to a kit or kit for screening a candidate substance which binds to a polypeptide of the invention, such a kit or kit comprising:
- a method of screening for molecules interacting with a polypeptide according to the invention can also be carried out using double hybrid techniques.
- Double-hybrid type screening techniques are used to study protein-protein interactions in vivo and are based on the fusion of a “bait” protein to the DNA binding domain of the yeast protein Gal4.
- the double hybrid technique is described in particular in US Pat. Nos. 5,667,973 and US Pat. No. 5,283,173, the technical teaching of these two patents here being incorporated by reference.
- the screening of cDNA bands containing inserts encoding translation products potentially interacting with a polypeptide according to the invention or a peptide fragment containing a protein binding domain of a polypeptide according to the invention can be carried out as described by HARPER et al. (1993), by CHO et al. (1998), or by FROMONT-RACINE et al. (1997).
- the invention also relates to a method for screening a candidate substance which binds to a polypeptide according to the invention, and very particularly to the RRS1-R or RRS1-S polypeptide, said method comprising the steps of:
- nucleic acids a), b) and c) being inserted into suitable vectors; and d) co-transfected yeast cells simultaneously with said vectors; e) detecting the expression of the nucleotide sequence coding for the detectable marker.
- the above screening method may also comprise an additional step f) during which the nucleotide sequence and / or the amino acid sequence of the “prey” nucleic acid inducing the expression of the detectable marker is characterized.
- the invention also relates to a kit or kit for screening a candidate substance which binds to a polypeptide according to the invention, and very particularly the RRS1-R or RRS1-S polypeptide, said kit or kit comprising:
- a second nucleic acid comprising a nucleotide sequence coding for a detectable marker, placed under the control of a regulatory sequence recognized by the transactivating protein such as Gal4;
- a third nucleic acid coding for a fusion protein comprising the candidate substance fused to the transcription domain of a transactivating protein such as Gal4.
- the invention also relates to a substance capable of binding to a polypeptide of the invention, preferably to the RRS1 -R or RRS1 -S polypeptide, this substance being characterized in that it is capable of being obtained by a method of screening as defined above.
- a screening technique using a double hybrid type system can be easily performed by a person skilled in the art, in particular in accordance with the teaching of Example 8.
- a polypeptide according to the invention comprises several nucleotide binding domains both in its N-terminal part and in its C-terminal part.
- the nucleotide sequences to which these different nucleotide binding domains bind are therefore of decisive importance in the mechanisms of resistance of plants to various pathogens, and more particularly to R. solanacearum.
- the isolation and characterization of the polypeptides of resistance to plant pathogens according to the invention now allows a person skilled in the art to determine these nucleotide sequences involved in the induction of a phenotype of resistance to pathogens in a plant.
- the invention also relates to a method of screening for a nucleic acid interacting with a polypeptide according to the invention, said screening method comprising the steps of:
- step b) bringing the population of nucleic acids of step a) into contact with a polypeptide according to the invention
- nucleic acids 20 to 50 nucleotides in length and preferably 20 to 30 nucleotides in length, the nucleotide sequence of which is random, each of the acids synthesized nucleic acids being further covalently linked, at their 5 ′ or 3 ′ end, to a single and known nucleotide sequence.
- nucleic acids forming a statistical population of nucleic acids described above are then brought into contact with a polypeptide according to the invention, said polypeptide possibly having been immobilized beforehand on a support.
- the polypeptide / nucleic acid complexes are brought into contact with an oligonucleotide primer which hybridizes specifically, under determined hybridization conditions, with the unique and known nucleotide sequence common to all of the nucleic acids of the above statistical population, then at least one amplification cycle is carried out using the primer hybridizing the unique and known nucleotide sequence of l 'acid nucleic acid retained by the polypeptide of the invention, for example an amplification by PCR.
- the nucleic acids thus amplified and isolated are again brought into contact with a polypeptide according to the invention, then the nucleic acid or the plurality of nucleic acids having formed a complex with said polypeptide are again hybridized with the nucleotide primer hybridizing with the single and known nucleotide sequence and a new amplification cycle (s) is carried out.
- the screening method as defined above comprises from 1 to 10, and very preferably from 1 to 5 cycles of bringing into contact / amplification of the nucleic acids attached to the polypeptide of the invention.
- nucleic acids selected for their specific binding to a polypeptide according to the invention are then characterized, preferably by sequencing.
- the invention further relates to a kit or kit for the screening of a nucleic acid interacting with a polypeptide according to the invention, comprising:
- Figure 1 illustrates the amino acid sequence of the RRS1-R polypeptide. The different characteristic areas are represented.
- FIG. 2 illustrates the amino acid sequence of the RRS1-S polypeptide. The different characteristic areas are represented.
- FIG. 3 illustrates the representation and the localization of the YACS, BACS and cosmid clones covering the genomic region of interest of A.thaliana.
- Genomic DNA was isolated from the leaves of Arabidopsis plants or seedlings according to the technique described by Desieris et al. (1998). Southern type experiments are carried out as described by Sambrook et al. (1989) using 2 ⁇ g of genomic DNA.
- the extraction of DNA from BAC and TAC clones was carried out according to a modification of the protocol provided by the CARL.
- 25 mL of a 12 hour culture of a BAC clone in the appropriate antibiotic are centrifuged for 5 min at 6000 rpm.
- the pellet is resuspended in 4 ml of a buffer containing: 50 mM Glucose, 10 mM EDTA, 25 mM Tris, pH 8.0, 5 mg / ml of lyzozyme. After 5 min of incubation at room temperature, the cells are lysed by addition of 8 ml of 0.2 N NaOH, 1% SDS.
- DNA extraction from A. tumefaciens was performed according to a protocol developed in the laboratory. 2 mL of a 12 hour culture in medium L supplemented with the appropriate antibiotics are centrifuged for 4 min at 13000 rpm. The pellet is resuspended in 700 ⁇ l of CTAB buffer (100 mM Tris HCI, pH 8, 1.4M NaCI, 20 mM EDTA, pH 8, 2% w / v CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide) to which 0.07N of B-mercaptoethanol is added immediately The mixture incubated for 10 min at 65 ° C.
- CTAB buffer 100 mM Tris HCI, pH 8, 1.4M NaCI, 20 mM EDTA, pH 8, 2% w / v CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide)
- the BLAST research program (Altschul et al. 1990, 1997) was used for sequence analysis and comparison in Genbank, EMBL and Swissprot databases as well as in Arabidopsis databases (AatDB Database Arabidopsis ).
- Chromosome built by the Japanese consortium in charge of the V chromosome sequencing program of Arabidopsis thaliana
- RFLP markers showing a polymorphism between the parental ecotypes Col-5 and Nd-1 were generated from the left and right ends of the inserts of the YACs clones according to the protocol of Schmidt et al (1996).
- EW7G12LE L, Left End: generated from the left end of the YAC insert
- 11 H2RE RE, Right End: generated from the right end of the YAC insert
- 11 H2LE 4H11 RE
- T43968 cDNA clone positioned on the YAC CIC4E12 and obtained from the CARL
- T43968 and EW7G12LE were found to be polymorphic on the parental ecotypes and made it possible to restrict the region containing the RRS1 locus to a region of approximately 600 kb.
- markers generated from the ends of the YACs clones were used to screen a TAMU bank (Texas A & M University) of BACs (Bacterial Artificial Chromosome), a bank obtained through the CARL. This screening carried out according to the conditions provided by the CARL led to the isolation of a large number of BAC clones. Markers were then generated from the ends of some of these BACs by the techniques of "plasmid rescue" and reverse PCR (Woo et al., 1994).
- BACs The markers corresponding to the ends of BACs were then used as RFLP markers on the 11 RIL lines as well as on the 15 F3 families.
- the subcloning of BACs and cosmids by different restriction enzymes has also made it possible to generate other RFLP markers (Table 5).
- Table 5 RFLP markers used to map the RRS1 locus on 15 F3 families from the Col-5 and Nd-1 crossing.
- T43968 marker obtained from the CARL (Ohio, USA).
- Cosmic contigs covering all of the 2 BACs were obtained by partial digestion with the BamHI enzyme and subcloning of the DNA of the 2 BACs into the cosmid vector SLJ75515 (gift from Dr. J. Jones, The Sainsbury Laboratory ).
- the use of these cosmids and subclones of these cosmids obtained by digestion with the enzyme HindIII and insertion into the vector pBlueScript made it possible to locate RRS1 on a cosmid of 18 Kb, the cosmid B1 derived from the clone BAC T29K4.
- a cDNA library of the Col-0 ecotype prepared in the IZAP vector gift from B.
- a cosmid bank prepared from DNA of the Nd- ecotype prepared from DNA of the Nd- ecotype
- the sequence of the RRS1-S gene being known, it was possible to generate oligonucleotide primers which made it possible to determine the nucleotide sequence of the region corresponding to RRS1 of cosmid H.
- the determination of the nucleotide sequence was carried out on a Perkin sequencer -Elmer 373 (Dye Terminator kit) and the different sequences were assembled using the "Staden” sequence assembly programs, available on UNIX stations (Roger Staden, MRC, Cambridge, UK).
- the different primers used are the primers of the "K" series, ie all the primers whose name begins with the letter "K” (see Table 6).
- the cosmid vector SLJ 75515 of clones H and B1 has the advantage of being directly transferable to Agrobacterium tumefaciens.
- This transfer of cosmids from E. coli (strain XLI Blue for cosmid B1 and strain DH12S for cosmid H) in A. tumefaciens (strain GV3101 containing the helper plasmid pMP90) is carried out by triparental conjugation using a third strain, pRK2013 (E. coli ) according to the Tolmasky et al. (1984). The colonies of A.
- tumefaciens containing the cosmids H or B1 are selected on an L agar medium supplemented with tetracycline (10 ⁇ g / ml) and gentamycin (25 ⁇ g / ml). The dishes are then incubated at 28 ° C for 3 days.
- cosmid DNA is checked by PCR amplification using primers specific to the inserts of clones H and B1 (pair
- cosmid B1 was cloned using the enzyme BamHI which generates two fragments: 9.68 and 8.03 kb.
- BamHI For cosmid H, 2 BamHI fragments of size comparable to those of cosmid B1 were obtained.
- the BamHI site is present only once in the genomic sequences of RRS1-R and RRS1-S.
- Each of the 2 subfragments from cosmids B1 and H was introduced into the binary vector pDHB321.1 provided by Dr. Bouchez (INRA Victoria). After transformation into a strain of E. coli (XLI BlueMR, Stratagene, USA), the plasmid DNA is extracted (Maniatis 1978). The strain of A.
- tumefaciens GV3101 is then transformed by the thermal shock method (Holsters et al., 1978).
- the colonies of A. tumefaciens containing the subclones of cosmids B1 and H are then selected on medium L agar containing gentamycin (25 ⁇ g / ml) and Kanamycin (50 ⁇ g / ml).
- the dishes are then incubated at 28 ° C for 48 h.
- the terrines are then placed for 4 days in the dark at 4 ° C, then transferred in the condition of long days (16h of day / 8h of night). After about 10 days, the resistant plants are selected and transplanted individually.
- the T2 progeny of each T1 transgenic plant obtained by self-fertilization is used for inoculation experiments with the pathogenic agent.
- the RRS1-R gene confers resistance to the GMI1000 strain of Ralstonia solanacearum.
- the RRS1-R gene confers resistance to different strains of Ralstonia solanacearum.
- R. solanacearum strains provoke responses (disease or absence of symptoms) identical to that of the strain GMI1000 on the Nd-1 and Col-5 ecotypes. These strains isolated from very diverse host plants (see table) come from different regions of the globe. The ability of the RRS1-R gene to confer resistance to these different strains was therefore tested. The Col-5 transgenic plants containing the RRS1-R gene were therefore infected with these different strains. While control plants (Col-5) withered 7 days after inoculation with the pathogen, the transgenic plants containing the RRS1-R allele Nd-1 showed no symptoms of wilting. This result indicates that the RRS1-R gene is capable of conferring resistance to different strains of R. solanacearum.
- Nd-1 plants transformed with the RRS1-S gene of the sensitive Col-5 ecotype was tested.
- 104 plants were selected for their resistance to BASTA (B1.1 to B1 .104) and self-fertilized. These transgenic plants were inoculated with the GMI1000 strain. Only one transgenic line (B1.3) developed symptoms of wilting while the other lines showed no symptoms under conditions causing total wilting of control plants Col-5.
- a Sphl digestion of the cosmid B1 made it possible to obtain a fragment of 9393 bp (fragment going from base 6557 to base 15950, according to the numbering of the sequence of the clone BAC K9E15 published by the consortium Japanese) covering the entire RRS1-S gene (promoter, introns / exons, polyadenylation signal sequence).
- This Sphl fragment was ligated into a plasmid pUC19 digested with the enzyme Sphl and dephosphorylated. This construction was then introduced into the DH5 ⁇ strain of E. coli.
- This clone is defined as the genomic clone RRS1 and is called B1puc3.
- the binary vector pDHB321.1 was digested with the enzyme BamHI (single cloning site).
- BamHI single cloning site.
- the ligation of the inserts (Sphl / Sphl) of the clones B1 puc3 and Hpuc2 (from a Sphl digestion) in the binary vector (BamHI / BamHI) therefore required the use of an adapter in order to ligate the BamHI and Sphl ends between them.
- oligonucleotide primers Two oligonucleotide primers are involved in the synthesis of this adapter: it consists of an equimolar mixture (5 ⁇ M) of the primers noted “BamSph” (5 '-GAT CGC GGC CGC CAT G- 3') and "Not” (5 ' -GCG GCC GC -3 '). The mixture is subjected to a temperature of 95 ° C for 3 minutes. The return to ambient temperature then takes place naturally.
- the DNA of clones B1puc3 and Hpuc2 is digested with the enzyme Sphl. After inactivation of the enzyme at 65 ° C for 20 minutes, an aliquot of each digestion (approximately 100 ng) is used to carry out a ligation with the vector pDHB321.1 + adapter.
- These constructions are then introduced into the strain DH5 ⁇ of E. coli and selected on an L agar medium containing 50 ⁇ g / ml of kanamycin (resistance conferred by the binary vector): the clones which contain the insert originating from clones B1 and H (approximately 9400 bp) are called B1 MT9 and HMTB respectively.
- the plasmid DNA extracted from these clones is then used to transform the GV3101 strain of A. tumefaciens by thermal shock.
- the colonies are selected on an agar medium L containing 25 ⁇ g / ml of gentamycin (resistance conferred by the helper plasmid pMP90) and 50 ⁇ g / ml of kanamycin.
- the colonies of A. tumefaciens transformed by the DNA of clones B1 MT9 and HMTB are called B1 T9.1 and HMTB2 respectively.
- the expression of the RRS1-S and RRS1-R genes was studied in plants not infected by Northern type experiments.
- the polyadenylated RNAs were purified by using the Dynabeads Kit (Dynal, USA). After dosing at 260 nm, the mRNAs were deposited on a gel in a denaturing condition (Marco et al. 1990), then transferred to a nitrocellulose membrane (Hybond N +, Amersham Pharmacia Biotech). The hybridization was carried out according to the protocol given by the supplier.
- the 5 'and 3' ends of the cDNA clones were generated by RACE PCR using the "Smart Race cDNA Amplification" kit (Clontech, USA).
- the total RNAs were extracted from seedlings of the Col-5 and Nd-1 ecotypes two weeks old according to the protocol of Lummerzheim et al. (1993).
- the reverse transcriptase reactions were carried out on 1 ⁇ g of total RNA according to the conditions provided by the manufacturer.
- the first strands of the cDNAs were synthesized using the following primers:
- oligonucleotide primers used for the amplification of the 5 ′ end of the RRS1 (Col-5) and rrsl (Nd-1) cDNAs are:
- oligonucleotide primers used for the amplification of the 3 'end of the RRS1 (Col-5) and rrsl (Nd-1) cDNAs are:
- the size of the amplification products for the 5 ′ and 3 ′ ends is: 3708 bp and 1230 bp for Col-5; 3714 and 1231 bp for Nd-1 respectively.
- These PCR products were cloned into the vector pGemT-easy (Promega).
- the sequencing of these clones made it possible to precisely determine the start (5 ') and the end (3') of the untranslated transcribed region of the cDNA clones originating from the ecotypes Col-5 and Nd-1.
- the size of the full-length cDNA clones from the Col-5 and Nd-1 plants is 4336 and 4343 bp, respectively.
- Full-size cDNA clones were generated (i.e. 4336 and 4343 bp) by carrying out a double digestion BamHI (single site) and NotI (site present at the level of the multiple cloning site of the vector pGemT-easy) on a mixture of 2 plasmids in order to excise the corresponding inserts at the 5 'and 3' ends.
- BamHI single site
- NotI site present at the level of the multiple cloning site of the vector pGemT-easy
- the positive clones containing the full-size cDNA clone were selected by carrying out PCR screening on colonies using primers K3.5 and RT2 (see Table 6) which are specific for each of the 5 'and 3' ends respectively.
- a second RACE PCR experiment was carried out on the first strands of cDNAs from the reverse transcriptase reaction described above with the aim of introducing two SalI restriction sites, one being located just upstream from the ATG initiator codon. (translation initiation point), the other being located after the polyadenylation signal.
- the two pairs of primers used to amplify the 5 'and 3' ends are 5'RRSall / RT8 and 3'RRSall / RT7 respectively.
- the amplification conditions, the cloning of the PCR products as well as the method for obtaining the full length cDNA clones are the same as those described above except that the single restriction site common to the 5 'and 3 ends 'is an Aflll site.
- the purpose of introducing SalI sites on either side of the sequence of the cDNA clone is to facilitate its cloning in different types of vectors.
- Example 7 Domain Exchange Experiment by Obtaining Chimeric RRS1 -S / RRS1-R Clones
- the plasmid DNA used to carry out the domain exchange experiments comes from the genomic clones B1 puc3 and Hpuc2 described above. These two plasmids were digested with the enzyme BamHI whose restriction site is located in the region with similarities to a resistance gene (exon 5 ⁇ eme).
- This digest generates two fragments, one of 4881 bp (clone B1 puc3 RRS1 containing the S-gene) containing the 5 'portion of the genomic clone (promoter and coding portion of the gene RRS1-S to the level of 5 ⁇ eme exon) and a fragment of 7180 bp (clone B1 puc3) containing the 3 'part of the genomic clone (4512 bp containing the end of the region showing similarities with the resistance gene, the region similar to the gene encoding a WRKY-type transcription factor and the 3 'region transcribed untranslated; 2668 bp of plasmid vector pUC19).
- the size of the fragments generated by the BamHI digestion of the plasmid Hpuc2 is of the same order of magnitude as that of the fragments obtained by BamHI digestion of the plasmid B1 puc3.
- each plasmid was purified, digested with Sphl, an enzyme allowing the excision of genes in their entirety.
- the inserts were then ligated into the plasmid vector pDHB321.1 digested with the enzyme BamHI and the ends of which were made compatible with Sphl ends by virtue of the presence of an adapter (cf. above).
- the first consists of a 299 bp fragment (position 3642 to 3941 of the sequence SEQ ID No. 8) fragment corresponding to the WRKY domain of the protein RRS1-1.
- PCR primers B1AS5 'and B1AS3' which allow the introduction of an Ncol and SalI site respectively
- the amplification was carried out on single-stranded cDNAs resulting from the "reverse transcription" of total RNA from leaves of 2-week-old Col-5 plants.
- the polymerase used is Deep Vent (Biolabs, New England) and the amplification conditions are those described by the manufacturer.
- the amplification product B1AS57B1AS3 is digested by the Ncol and Sali enzymes and the digestion product deposited on gel and purified (Kit Jetsorb, Quantum Appligene). This DNA fragment is then ligated into the vector PA1 proterm 2 (gift from Pr. Lescure, our institute) digested with the enzymes Ncol and Sali. This construction was introduced into the DH5 ⁇ strain of E. coli.
- the corresponding plasmid DNA has been purified and digested with the BamHI enzyme, which allows excision of an insert comprising the promoter of the EF1 ⁇ gene, the 299 bp of the RRS1-S gene in antisense orientation as well as the gene terminator.
- the second antisense construct was carried out by excising an EcoRI fragment from the insert of the full-length cDNA clone RRS1-R (sequence SEQ ID No. 4).
- the DNA fragment thus generated (size of approximately 3930 bp) was introduced into the vector pKMB (Mylne and Botella, 1998) digested with EcoRI.
- This vector contains the promoter 35S of the cauliflower mosaic virus (CaMV 35S) as well as the corresponding terminator.
- This construction was successively introduced into the DH5 ⁇ strains of E coli and GV3101 of A. tumefaciens by triparental conjugation.
- the strains of A. tumefaciens obtained (29B1ASMT2: fragment of 299 bp and J1: fragment of 3930 bp) allowed the transformation of the ecotypes Nd-1 and Col-5.
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Abstract
La présente invention concerne une nouvelle classe de protéines ayant une partie N-terminale comprenant des motifs caractéristiques d'une protéine végétale de résistance à des agents pathogènes et une partie C-terminale comprenant un domaine de liaison à l'ADN. L'invention concerne aussi les acides nucléiques codant pour de telles protéines impliquées dans la résistance de plantes à divers pathogènes ainsi qu'à des moyens de détection de ces protéines et de ces acides nucléiques, tels que des anticorps ou encore des sondes et des amorces nucléotidiques.
Description
Nouvelle classe de protéines et leurs applications à la résistance de plantes à divers agents pathogènes
La présente invention concerne une nouvelle classe de protéines ayant une partie N-terminale comprenant des motifs caractéristiques d'une protéine végétale de résistance à des agents pathogènes et une partie C- terminale comprenant un domaine de liaison à .'ADN. L'invention concerne aussi les acides nucléiques codant pour de telles protéines impliquées dans la résistance de plantes à divers pathogènes ainsi qu'à des moyens de détection de ces protéines et de ces acides nucléiques, tels que des anticorps ou encore des sondes et des amorces nucléotidiques. L'invention est également relative à des vecteurs recombinants comprenant un acide nucléique codant pour un polypeptide appartenant à cette nouvelle classe de protéines, à des cellules hôtes transformées par un acide nucléique ou un vecteur recombinant selon l'invention, ainsi qu'à des plantes transgéniques dont une partie ou la totalité des cellules sont transformées avec un acide nucléique ou un vecteur recombinant selon l'invention.
L'invention a également trait à des moyens destinés à augmenter ou au contraire à inhiber l'expression d'un acide nucléique codant pour une protéine selon l'invention dans des plantes, dans le but d'augmenter la résistance desdites plantes à divers pathogènes.
L'invention concerne encore des procédés de criblage de substances candidates se fixant sur un polypeptide selon l'invention, ainsi que les substances candidates obtenues selon de tels procédés.
L'amélioration de la résistance des plantes, et tout particulièrement des plantes d'intérêt agronomique, à différents pathogènes fait l'objet de recherches intenses en vue de combler les besoins techniques d'un secteur industriel agricole qui a recours de plus en plus systématiquement à des pratiques de culture intensive.
L'identification de nouveaux gènes ou de nouvelles protéines capables de conférer à des plantes une résistance accrue à diverses bactéries, champignons ou virus revêt un intérêt économique important dans l'agriculture d'aujourd'hui, en permettant de mettre au point des végétaux de grande culture capables de résister naturellement à ces pathogènes et ne nécessitant en conséquence pas un apport massif en produits
phytosanitaires, en particulier pesticides, qui présentent de nombreux inconvénients pour l'environnement.
Le flétrissement bactérien est l'une des pathologies les plus répandues affectant les plantes d'intérêt agronomique. Il s'agit de l'une des phytobactérioses les plus importantes dans le monde qui est notamment provoquée par la bactérie Ralstonia solanacearum .
Ce pathogène vasculaire, d'origine tellurique, affecte près de 200 espèces végétales telles que la tomate, le tabac, la pomme de terre ou encore le bananier, principalement dans les zones tropicales et sub- tropicales.
Récemment, en Europe, différentes souches de cet agent pathogène ont été détectées. Chez la tomate, l'étude de la résistance à Ralstonia solanacearum est rendue complexe de par sa nature polygénique. Plusieurs gènes impliqués dans l'établissement de la résistance ont été mis en évidence.
Récemment, une étude de DESLANDES et al. (1998) a permis d'identifier, chez la plante Arabidopsis thaliana un locus chromosomique portant un déterminant génétique impliqué dans la résistance à Ralstonia solanacearum. Ainsi, des lignées d'Arabidopsis thaliana, constituant la génération Fg, obtenues par croisement de lignées d'Arabidopsis thaliana respectivement sensibles et résistantes à Ralstonia solanacearum, ont été utilisées pour l'étude de la co-ségrégation de marqueurs de type RLFP avec l'expression du phénotype de résistance à ce pathogène responsable du flétrissement. Ces auteurs ont ainsi montré qu'un déterminant génétique de la résistance à Ralstonia solanacearum était localisé, sur le chromosome V d'Arabidopsis thaliana, entre les marqueurs RFLP mi83 et mi61 , c'est-à-dire dans une région d'environ 6,8 cM (approximativement 1 ,7 à 3,4 Mb) de ce chromosome. Selon ces auteurs, les résultats de l'étude suggèrent que le locus d'intérêt localisé sur le chromosome V porte un ou plusieurs gènes, ces gènes pouvant soit conférer le phénotype de résistance, soit au contraire conférer le phénotype de sensibilité à Ralstonia solanacearum, bien que les bases génétiques de la résistance et/ou de la sensibilité à ce pathogène n'aient pas été identifiées chez Arabidopsis thaliana.
En outre, DESLANDES et al. (1998) observent encore que la région chromosomique d'intérêt d'Arabidopsis thaliana était connue pour contenir de nombreux autres déterminants génétiques impliqués dans la reconnaissance à des pathogènes. Le demandeur a désormais identifié un déterminant génétique qui est capable de conférer la résistance à Ralstonia solanacearum chez Arabidopsis thaliana.
Il s'agit d'un gène unique codant pour un polypeptide appartenant à une nouvelle classe structurale de protéines. Cette nouvelle classe de protéines identifiée selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle possède une partie N-terminale ayant des motifs structuraux en commun avec plusieurs gènes de résistance connus et une partie C-terminale possédant des motifs structuraux en commun avec des protéines transactivatrices possédant un domaine de liaison à l'ADN, notamment désignées sous le nom de protéines WRKY ou encore facteurs de transcription WRKY.
Il a ainsi été montré selon l'invention, que la transformation d'une plante Arabidopsis thaliana sensible à Ralstonia solanacearum avec un acide nucléique codant pour une protéine telle que définie ci-dessus était capable de conférer à la plante transformée une résistance à différentes souches de cet agent pathogène.
L'invention a donc pour objet un acide nucléique comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'une séquence nucléotidique codant pour une protéine de résistance d'une plante à un pathogène, ladite protéine comprenant: a) une partie N-terminale comprenant au moins une séquence d'acides aminés riche en leucine et au moins un site de liaison aux nucléotides; et b) une partie C-terminale comprenant un domaine de liaison à l'ADN, ledit domaine de liaison comprenant la séquence d'acides aminés « WRKYGQK ».
Préférentiellement, la partie N-terminale de cette protéine comprend en outre au moins un domaine TIR(TOLL/IL-1 R), un tel domaine TIR étant notamment défini par son homologie de séquence avec les domaines cytoplasmiques de la protéine TOLL de drosophile ainsi qu'avec la
protéine récepteur de l'lnterleukine-1 de mammifère, dont la séquence consensus est décrite par HAMMOND-KOSACK et al. (1997).
De manière préférée, la partie N-terminale de cette protéine comprendra également une boucle P(P-LOOP), qui est un segment peptidique formant une boucle et capable de fixer un phosphate, que l'on retrouve dans les protéines kinases.
Un tel domaine TIR aura préférentiellement la séquence en acides aminés
« DEEFVCISCVEEVRYSFVSHLSEALRRKGINNVWDVDIDDLLFKESQAKI EKAGVSVMVLPGNCDPSEVWLDKFAKVLECQRNNKDQAWSVLYGDSLL RDQWLSELDFRGLSRIHQSRKECSDSILVEEIVRDVYET »
Une telle boucle P aura préférentiellement la séquence en acides aminés « CVGIWGMPGIGKTTLAKAV ».
Préférentiellement, la partie N-terminale comprend également un domaine de type NB-ARC, qui est un domaine conservé et caractéristique des protéines de résistance à des pathogènes ainsi qu'à des protéines impliquées dans les mécanismes d'apoptose. De manière préférée, ce domaine NB-ARC a la séquence en acides aminés représentée en gras et soulignée dans les figures 1 et 2.
En outre, la partie N-terminale comprend préférentiellement un site de signalisation nucléaire de type NLS.
De manière préférée, un tel domaine NLS a la séquence en acides aminés « KKKLSEMETAFLKLKRRPP ».
Comme déjà indiqué, la partie C-terminale d'une protéine codée par un acide nucléique selon l'invention comprend un domaine WRKY caractéristique de certaines protéines transactivatrices, en particulier certains facteurs de transcription et caractérisé en ce qu'il comprend la séquence en acides aminés « WRKYGQK ».
Préférentiellement, ce domaine WRKY comprend la séquence en acides aminés suivante:
«DXXXWRKYGQKXIXGXXXPRXYYXCXXXXXXXCXXXKXXXXXEXXXXXXX XXYXSXHXH »,
dans laquelle X représente l'un quelconque des 20 acides aminés naturels.
En outre, la partie C-terminale comprend préférentiellement un domaine riche en leucine. La partie C-terminale comprend de préférence également un domaine caractéristique d'un site de signalisation nucléaire (NLS), ledit domaine de signalisation nucléaire ayant préférentiellement la séquence en acides aminés «NFHCWAPGKWPKVRKD ».
De manière préférée, la partie C-terminale comprend aussi un motif de type « leucine zipper », caractéristique d'un site de liaison aux protéines, qui a préférentiellement la séquence en acides aminés « LRVSYDDLQEMDKVLFLYIASL ».
De manière tout à fait préférée, un acide nucléique selon l'invention code pour un polypeptide comportant, de l'extrémité N-terminale à l'extrémité C-terminale, (i) un domaine TIR, (ii) un motif P-LOOP, (iii) un motif NB-ARC, (iv) un domaine NLS, (v) une première région riche en leucine, (vi) une seconde région riche en leucine,
(vii) un domaine NLS, (viii) un motif de type leucine zipper, (ix) un domaine WRKY, les domaines (i) à (ix) étant tels que définis précédemment.
Fait également partie de l'invention un acide nucléique de séquence complémentaire.
De manière préférée, un acide nucléique selon l'invention se présente sous une forme isolée et/ou purifiée. Le terme « isolé » au sens de la présente invention, désigne un matériel biologique (acide nucléique ou protéine) qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement).
Par exemple, un polynucléotide présent à l'état naturel dans une plante ou un animal n'est pas isolé. Le même polynucléotide séparé des
acides nucléiques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de la plante ou de l'animal est considéré comme « isolé ».
Un tel polynucléotide peut être inclus dans un vecteur et/ou un tel polynucléotide peut être inclus dans une composition et demeurer néanmoins à l'état isolé du fait que le vecteur ou la composition ne constitue pas son environnement naturel.
Le terme « purifié » ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusive de la présence d'autres composés. Il s'agit plutôt d'une définition relative. Un polynucléotide est à l'état « purifié » après purification du matériel de départ ou du matériel naturel d'au moins un ordre de grandeur, de préférence 2 ou 3 et préférentiellement 4 ou 5 ordres de grandeur.
Aux fins de la présente invention, l'expression « séquence nucléotidique » peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression « séquence nucléotidique » englobe le matériel génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.
Les termes « acide nucléique », « polynucléotide »,
« oligonucléotide » ou encore « séquence nucléotidique » englobent des séquences d'ARN, d'ADN , d'ADNc ou encore des séquences hybrides
ARN/ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous la forme simple chaîne ou sous la forme de duplex.
Le terme « nucléotide » désigne à la fois les nucléotides naturels (A, T, G, C) ainsi que des nucléotides modifiés qui comprennent au moins une modification telle que (1). Un analogue d'une purine, (2) un analogue d'une pyrimidine, ou (3) un sucre analogue, des exemples de tels nucléotides modifiés étant décrits par exemple dans la demande PCT N°WO 95/04 064.
Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré comme étant « complémentaire » d'un second polynucléotide lorsque chaque base du premier nucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation est inversée.
Les bases complémentaires sont A et T (ou A et U), ou C et G.
Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, les inventeurs pensent que les différents motifs caractéristiques de la classe de protéines
selon l'invention sont de nature à lui conférer sa fonction biologique qui se traduit par l'observation d'un phénotype de résistance envers des pathogènes de plantes, en particulier envers la bactérie R. solanacearum.
Ainsi, la partie N-terminale, qui comprend les domaines TIR, NB- ARC et une ou plusieurs régions riches en leucine sont caractéristiques de nombreuses protéines de résistance aux pathogènes chez les plantes (protéines R), ces protéines étant supposées activer des voies métaboliques de signalisation en cascade qui coordonnent les réponses initiales de défense de la plante empêchant la progression des pathogènes. Le domaine WRKY de la partie C-terminale d'une protéine selon l'invention pourrait avoir une fonction de liaison à des séquences régulatrices localisées à proximité ou à l'intérieur de régions promotrices de gènes végétaux, la fixation d'une protéine selon l'invention à l'ADN étant ainsi susceptible de moduler l'activité d'autres gènes potentiellement impliqués dans la résistance des plantes aux pathogènes, et tout particulièrement à R. solanacearum.
Le demandeur a isolé et caractérisé un acide nucléique codant pour un polypeptide appartenant à la classe de protéines de résistance aux pathogènes végétaux définie plus haut, la protéine RRS1-R. Plus précisément, le demandeur a isolé, à partir du génome d'une plante d'Arabidopsis thaliana résistant à R. solanacearum, le gène RRS1 -R qui est capable de conférer chez une plante un phénotype de résistance à R.solanacearum, un tel acide nucléique constituant la séquence SEQ ID N°1 . L'invention concerne un acide nucléique comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'une séquence nucléotidique possédant au moins 40% d'identité en nucléotides avec un polynucléotide de séquence SEQ ID N°1 , ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.
Selon l'invention, un premier acide nucléique ayant au moins 40% d'identité avec un second acide nucléique de référence, possédera au moins 60%, de préférence au moins 8O%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 99,5% d'identité en nucléotides avec ce second polynucléotide de référence, le pourcentage d'identité entre deux séquences étant déterminé comme décrit ci-après.
Le « pourcentage d'identité » entre deux séquences de nucléotides ou d'acides aminés, au sens de la présente invention, peut être déterminé en comparant deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison. La partie de la séquence nucléotidique ou polypeptidique dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des « gaps») par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal des deux séquences. Le pourcentage est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique ou un résidu d'aminoacide identique est observé pour les deux séquences (nucléique ou peptidique) comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux bases ou résidus d'aminoacides par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité de séquence.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus contenus dans l'outil logiciel de la Société WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor, Madison, Wisconsin.
De manière tout à fait préférée, le pourcentage d'identité entre deux séquences est effectué à l'aide du logiciel BLAST (version BLAST 2.06 de Septembre 1998), en utilisant exclusivement les paramètres par défaut (S. F. ALTSCHUL et al., (1990); SF ALTSCHUL et al., 1997).
La séquence génomique du gène RRS1 -R est référencée comme la séquence SEQ ID N°1.
Un autre objet de l'invention est un acide nucléique qui comprend ou est constitué de la séquence SEQ ID N°1. L'invention est aussi relative à un acide nucléique comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs du polynucléotide de séquence SEQ ID N°1 .
Chacun des acides nucléiques génomiques selon la présente invention peut être aisément obtenu par l'homme du métier qui en connaît sa séquence nucléotidique divulguée dans la présente description.
L'homme du métier peut également reproduire un quelconque des acides nucléiques génomiques selon l'invention en construisant, sur la base des séquences divulguées dans la présente description, des amorces oligonucléotidiques capables d'amplifier tout ou partie de ces acides nucléiques à partir d'un génome de plante, préférence d'un génome d'Arabidopsis thaliana, ou encore à partir d'une banque de vecteurs (YACS, BACS, cosmides) contenant des inserts génomiques d'une plante, et préférentiellement d'Arabidopsis thaliana.
Après amplification à l'aide des amorces appropriées, les différents acides nucléiques amplifiés sont alors soumis à une étape de ligation dans un vecteur plasmidique en vue d'obtenir l'acide nucléique génomique désiré, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
Par ailleurs, l'isolement du fragment d'ADN contenant l'insert génomique désiré peut être obtenu par sous-clonage à partir d'une banque (YACS, BACS, cosmides) contenant des inserts génomiques d'une plante, et préférentiellement d'Arabidopsis thaliana.
La séquence du gène RRS1-R comprend sept exons et six introns, ainsi que des régions potentiellement régulatrices localisées respectivement du côté 5' du premier exon et du côté 3' du dernier exon, les caractéristiques structurales de ces exons et introns étant détaillées dans les tableaux 1 et 2 ci-après.
TABLEAU 1 : Séquence des exons du gène RRSI-R
L'invention est également relative à un acide nucléique comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide exonique du gène RRSI-R, tels que les polynucléotides 1 à 7 décrits dans le tableau 1 ci- dessus, qui sont tous inclus dans l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°1.
De manière générale, un acide nucléique ayant au moins 15 nucléotides consécutifs d'une séquence selon l'invention possède avantageusement au moins 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000, 3000, 4000 nucléotides consécutifs de la séquence de référence, la longueur de nucléotides consécutifs étant naturellement limitée par la longueur de la séquence de référence.
Un tel acide nucléique code pour au moins une partie du polypeptide RRS1-R et peut notamment être inséré dans un vecteur recombinant destiné à l'expression du produit de traduction correspondant dans une cellule hôte ou dans une plante transformée avec ce vecteur recombinant.
Un tel acide nucléique peut aussi être utilisé pour la synthèse de sondes et d'amorces nucléotidiques destinées à la détection ou à l'amplification de séquences nucléotidiques comprises dans le gène RRS1-R dans un échantillon, le cas échéant de séquences des gènes RRS1-R portant une ou plusieurs mutations, préférentiellement une ou plusieurs mutations de nature à modifier le phénotype d'une plante portant un tel gène RRS1-R muté, par exemple en modifiant la régulation des mécanismes de résistance à des pathogènes, et préférentiellement des mécanismes de résistance à R. solanacearum.
TABLEAU 2
Séquences régulatrices et introniques du gène RRS-IR
L'invention est également relative à un acide nucléique comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide intronique du gène
RRS1-R, tels que les polynucléotides 1 à 6 décrits dans le tableau 2 ci- dessus, qui sont tous inclus dans l'acide nucléique de séquence SEQ ID
N°1.
Un tel acide nucléique peut être utilisé comme sonde ou amorce oligonucléotidique pour détecter la présence d'au moins une copie du gène
RRS1-R dans un échantillon, ou encore pour amplifier une séquence cible déterminée au sein du gène RRS1-R.
En outre, l'acide nucléique du gène RRS1 -R de séquence SEQ ID
N°1 comprend un codon ATG débutant au nucléotide en position 260 (1 er
Exon) et un signal de polyadénylation comprise entre les nucléotides en positions 6642 et 6647 comprises. L'acide nucléique du gène RRS1-R de séquence SEQ ID N°1 comprend des séquences régulatrices localisées respectivement du côté 5' de l'exon 1 et du côté 3' de l'exon 7.
La région régulatrice 5' du gène RRS1-R comprend la séquence nucléotidique SEQ ID N°2. Le polynucléotide de séquence SEQ ID N°2 est localisé entre le nucléotide en position 1 et le nucléotide en position 259 de la séquence SEQ
ID N°1.
La séquence régulatrice 3' du gène RRSI-R comprend la séquence nucléotidique SEQ ID N°3.
Le polynucléotide de séquence SEQ ID N°3 est localisé entre le nucléotide en position 6533 et le nucléotide en position 7936 de la séquence nucléotidique SEQ ID N°1.
Le polynucléotide dérivé des régions régulatrices du gène RRS1-R ci-dessus est utile pour détecter la présence d'au moins une copie de ce gène dans un échantillon.
L'invention concerne également un acide nucléique comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide de séquence SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3.
Selon un autre aspect, l'invention est également relative à un acide nucléique comprenant un polynucléotide ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un polynucléotide de séquence SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3, avantageusement au moins 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5% et de manière tout à fait préférée 99,8% d'identité en nucléotide avec un polynucléotide choisi parmi les séquences SEQ ID N°2 et SEQ ID N°3, ou un fragment biologiquement actif de ce dernier.
Des fragments préférés des séquences nucléotidiques SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3 ont avantageusement une longueur comprise entre 500, 100, 150, 200 à 300, 400, 600, 1000 ou 2000 bases.
Par fragment « biologiquement actif » d'un polynucléotide de séquence SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3 selon l'invention, on entend un polynucléotide comprenant ou consistant en un polynucléotide capable de réguler l'expression d'un acide nucléique placé à proximité de ce dernier, dans une cellule hôte recombinante.
Aux fins de la présente invention, un acide nucléique constitue une région régulatrice « fonctionnelle » pour exprimer un acide nucléique placé à proximité de ce dernier, par exemple un acide nucléique codant pour un polypeptide ou un polynucléotide d'intérêt, si ce polynucléotide régulateur contient les séquences nucléotidiques contenant des signaux de régulation de la transcriptions et/ou de la traduction, et si les séquences sont localisées de telle manière à induire ou augmenter de manière effective la transcription ou la traduction dudit polypeptide ou polynucléotide d'intérêt.
Afin d'identifier les fragments « biologiquement actifs » des polynucléotides de séquence SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3, l'homme du métier peut se référer avantageusement à l'ouvrage de SAMBROOK et al. (1989) qui décrit l'utilisation d'un vecteur recombinant portant un gène marqueur (par exemple β-galactosidase, chloranphenicol acétyltransférase, etc..) dont l'expression est détectée en plaçant la séquence du gène marqueur sous le contrôle de fragments polynucléotidiques biologiquement actifs des séquences SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3.
Les séquences génomiques localisées en amont du premier exon du gène RRS1-R sont clonées dans un vecteur approprié contenant un gène marqueur, tel que le gène GUS (Jefferson et al., 1987).
Les fragments des polynucléotides de séquence SEQ ID N°2 ou
SEQ ID N°3 selon l'invention peuvent être préparés à partir de l'une quelconque des séquences SEQ ID N°1 , SEQ ID N°2 et SEQ ID N°3 par clivage à l'aide des endonucleases de restriction appropriées, comme décrit par exemple dans l'ouvrage de SAMBROOK et al. (1989) précité.
Les fragments des polynucléotides régulateurs selon l'invention peuvent également être préparés par digestion de l'une quelconque des séquences SEQ ID N°1 , SEQ ID N°2 et SEQ ID N°3 par une enzyme exonucléase, telle que par exemple Bal31 comme décrit par WABIKO et al.
(1986) , WABIKO H. et al., 1986, DNA, volume 5 (4) : 305-314.
De tels polynucléotides régulateurs peuvent également être préparés par synthèse chimique d'acides nucléiques selon des techniques bien connues de l'homme du métier, telles que les techniques au phosphoramidite précitées.
Le niveau d'activité et la spécificité tissulaire des séquences régulatrices, en particulier les séquences promotrices du gène RRS1-R selon l'invention peuvent être déterminées par mesure des niveaux d'expression d'un polynucléotide détectable placé sous le contrôle de ces dernières dans différents types de cellules et tissus végétaux. Le polynucléotide détectable peut être indifféremment un polynucléotide qui hybride spécifiquement avec une sonde oligonucléotidique de séquence prédéterminée, ou un polynucléotide codant une protéine détectable, y compris le polypeptide RRS1-R ou un fragment de ce dernier.
Un test permettant une telle vérification est bien connu de l'homme du métier et est notamment décrit dans les brevets US N°5,502,176 et US n°5, 266,488, incorporés ici par référence.
L'invention a donc également trait à un acide nucléique comprenant: a) un acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique régulatrice d'au moins 50 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°3 ou d'une séquence possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec la séquence SEQ ID N°2; b) un polynucléotide codant un polypeptide d'intérêt ou un polynucléotide d'intérêt dont la transcription et/ou la traduction est placée sous le contrôle de l'acide nucléique régulateur a); c) le cas échéant, un acide nucléique régulateur comprenant au moins 50 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°3 ou d'une séquence ayant au moins 80% d'identité en nucléotide avec la séquence SEQ ID N°3.
Le polypeptide d'intérêt codé par l'acide nucléique b) ci-dessus peut être de nature et d'origine variée ; il peut s'agit de protéine d'origine eucaryote ou procaryote. Font partie des polypeptides d'intérêt les polypeptides toxiques, comme par exemple les élicitines, pour les cellules végétales, leur expression étant de nature à induire la mort de la cellule dans laquelle ils sont exprimés et en conséquence un confinement des pathogènes ayant infecté la plante, prévenant ainsi la propagation du pathogène à tous les organes de la plante . Par exemple, il est possible de générer des tabacs transgéniques présentant un niveau de résistance élevée à des pathogènes en exprimant des élicitines, petits peptides toxiques produits par un champignon phytopathogène selon la technique décrite par Keller et al. (1999). L'acide nucléique d'intérêt mentionné au b) ci-dessus, généralement une molécule d'ARN, peut être complémentaire d'un polynucléotide cible, par exemple d'un polynucléotide localisé dans la région codante du gène RRS1-R, et peut être ainsi avantageusement utilisé comme polynucléotide antisens.
Il a été montré selon l'invention que le gène RRS1-R est transcrit sous la forme d'un ARN messager qui a été isolé et caractérisé. Cet ARN messager comporte un cadre de lecture ouvert unique codant pour la protéine RRS1-R d'une longueur de 1378 acides aminés. L'ARN messager du gène RRS1-R et l'ADNc correspondants, peuvent être aisément obtenus par l'homme du métier, par exemple par criblage d'une bande d'ADNc à l'aide d'une sonde adéquate ou par amplification rapide des extrémités de l'ADNc (PCR, RACE-PCR). L'homme du métier peut obtenir à nouveau l'ADNc du gène RRS1-R en utilisant les techniques décrites à l'exemple 6, ou encore par synthèse chimique directe.
L'homme du métier peut aussi reproduire un acide nucléique selon l'invention par synthèse chimique directe, telle que la méthode au phosphodiester décrite par NARANG et al. (1979), la méthode au phosphodiester décrite par BROWN et al. (1979), la méthode au diéthylphosphoramidite décrite par BEAUCAGE et al. (1981), ainsi que la méthode sur support solide décrite dans la demande de brevet européen EP 0 707 592, le contenu de ces documents étant ici incorporé par référence.
De part et d'autre du cadre ouvert de lecture, cet ARN messager comprend respectivement une région 5' non traduite (5'-UTR) et une région 3' non traduite (3'-UTR).
L'ADNc résultant de la transcription du gène RRS1-R est référencé comme la séquence SEQ ID N°4.
La séquence 5'-UTR de l'ARN messager transcrit par le gène RRS1-R est constituée de la séquence allant du nucléotide en position 1 au nucléotide en position 81 de la séquence SEQ ID N°4.
La séquence 3'-UTR de l'ARN messager transcrit par le gène RRS1-R est constituée de la séquence allant du nucléotide en position 4219 au dernier nucléotide à l'extrémité 3' de la séquence SEQ ID N°4.
L'invention concerne aussi un acide nucléique comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi parmi les séquences 5'-UTR et 3'-UTR de l'ARN messager du gène RRS1-R décrites ci-dessus, un polynucléotide ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un tel acide nucléique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire auxdits acides nucléiques ou auxdits polynucléotides.
Fait également partie de l'invention un acide nucléique qui comprend, ou qui est constitué de la séquence nucléotidique SEQ ID N°4.
Les régions 5'-UTR et 3'-UTR de l'ARN messager du gène RRS1-R sont susceptibles de contenir des éléments de régulation de la transcription et/ou de la traduction de ce gène, tels qu'un ou plusieurs sites de liaison au ribosome, un ou plusieurs sites de polyadénylation, les séquences permettant la stabilité de TARN messager ou encore tout ou partie de la région promotrice de la transcription.
Le demandeur a également isolé et caractérisé, chez un écotype d'Arabidopsis thaliana sensible au pathogène R. solanacearum le gène correspondant au gène RRS1-R, comportant, par rapport à la séquence du gène RRS1-R, plusieurs additions et substitutions de nucléotides, le gène muté retrouvé chez l'écotype sensible d'Arabidopsis thaliana étant désigné RRS1-S aux fins de la présente description. Le gène RRS1-S comprend une première mutation dans la partie codant pour la région C-terminale de la protéine, conduisant au remplacement de la séquence en acides aminés « SEASKLERL » allant de l'acide aminé en position 704 à l'acide aminé en position 712 du polypeptide codé par le gène RRS1-R de séquence SEQ ID N°1 par la séquence en acides aminés « SEELERL » allant de l'acide aminé en position 704 à l'acide aminé en position 710 du polypeptide codé par le gène RRS1-S. Cette mutation conduit ainsi, d'une part, à la substitution du résidu alanine en position 706 de la protéine codée par le gène RRS1-R par un résidu d'acide glutamique en position 706 de la protéine codée par le gène RRS1-S et, d'autre part, à la déletion des acides aminés serine et lysine respectivement en position 707 et 708 de la séquence en acides aminés de la protéine codée par le gène RRS1-R de séquence SEQ ID N°1.
Une seconde mutation consiste en l'insertion d'un codon stop précoce retrouvé dans la région codante du gène RRS1-S, conduisant à une déletion des 90 acides aminés localisés à l'extrémité C-terminale de la protéine RRS1-R, le polypeptide codé par le gène RRS1-S étant en conséquence de 1288 acides aminés.
Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, le demandeur pense que les différentes mutations portées par le gène RRS1-S identifié chez l'écotype Col-5 d' Arabidopsise thaliana, qui est sensible au pathogène
R. solanacearum, sont responsables du phénotype de sensibilité à R. solanacearum observé dans cet écotype.
Il en résulte que les différentes modifications observées dans la séquence nucléotidique du gène RRS1-S par rapport à la séquence nucléotidique du gène RRS1-R sont de nature à altérer significativement l'activité biologique du polypeptide résultant.
En conséquence, la séquence nucléotidique du gène RRS1-S retrouvée chez l'écotype Col-5 d'Arabidopsis thaliana est utile notamment pour la mise au point de divers moyens de détection spécifiques du gène RRS1-S, de tels moyens de détection permettant à l'homme du métier de déterminer si une plante d'intérêt contient dans son génome le gène RRS1-S et est en conséquence sensible au pathogène bactérien R. solanacearum.
La séquence génomique du gène RRS1-S est référencée comme la séquence SEQ ID N°5. Un autre objet de l'invention est un acide nucléique qui comprend où est constitué de la séquence SEQ ID N°5.
L'invention est aussi relative à un acide nucléique comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide de séquence SEQ ID N°5.
L'invention concerne encore un acide nucléique possédant au moins 40% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID
N°5 ou encore avec un polynucléotide comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs de la séquence nucléotidique SEQ ID N°5, ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.
La séquence du gène RRS1-S comprend 7 exons et 6 introns, dont les caractéristiques structurales sont détaillées respectivement dans les tableaux 3 et 4 ci-après.
TABLEAU 3 SEQUENCES EXONIQUES DU GENE RRS1-S
L'invention est également relative à un acide nucléique comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide exonique du gène RRS1-S, tels que les polynucléotides 1 à 7 décrits dans le tableau 3 ci- dessus, qui sont tous inclus dans l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°5. Un tel acide nucléique code pour au moins une partie du polypeptide RRS1-S et peut notamment être inséré dans un vecteur recombinant destiné à l'expression du produit de traduction correspondant dans une cellule hôte ou dans une plante transformée avec ce vecteur recombinant. Un tel acide nucléique peut aussi être utilisé pour la synthèse de sondes et d'amorces nucléotidiques destinées à la détection ou à l'amplification de séquences nucléotidiques comprises dans le gène RRS1-S dans un échantillon.
TABLEAU 4 SEQUENCES 1NTRONIQUES DU GENE RRS1-S
L'invention est également relative à un acide nucléique comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide intronique du gène RRS1-S, tels que les polynucléotides 1 à 7 décrits dans le tableau 4 ci- dessus, qui sont tous inclus dans l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°5.
Un tel acide nucléique peut être utilisé comme sonde ou amorce oligonucléotidique pour détecter la présence d'au moins une copie du gène RRS1-S dans un échantillon, ou encore pour amplifier une séquence cible déterminée au sein du gène RRS1-S. De manière préférentielle, de telles sondes sont construites de manière à hybrider spécifiquement avec les régions du gène RRS1-S qui comprennent une ou plusieurs substitutions, additions ou délétions de base par rapport à la séquence nucléotidique du gène RRS1-R de séquence SEQ ID N°1. Préférentiellement, de telles amorces permettent d'amplifier les régions du gène RRS1 -S comportant une ou plusieurs substitutions, additions ou délétions de base par rapport à la séquence nucléotidique du gène RRS1-R de séquence SEQ ID N°1.
Le demandeur a également isolé et caractérisé les séquences nucléotidiques non transcrites localisées respectivement du côté 5' et du côté 3' des régions codantes du gène RRS1-S.
Ces séquences 5' et 3' non transcrites sont susceptibles de porter des signaux de régulation de la transcription et/ou de la traduction du gène RRS1-S et font également partie de l'invention, et sont respectivement référencées en tant que séquences SEQ ID N°6 et SEQ ID N°7. L'invention concerne donc également un acide nucléique comportant au moins 50 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide régulateur du gène RRS1-S choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID N°6 et SEQ ID N°7 et les séquences ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec l'une des séquences SEQ ID N°6 et SEQ ID N°7, ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire auxdits acides nucléiques auxdits polynucléotides.
L'invention concerne également un acide nucléique comprenant: a) un polynucléotide régulateur 5' du gène RRS1-S tel que défini ci- dessus; b) un polynucléotide codant pour un polypeptide ou un polynucléotide d'intérêt; c) le cas échéant, un polynucléotide régulateur 3' du gène RRS1-S tel que défini ci-dessus,
l'acide nucléique codant pour le polypeptide ou le polynucléotide d'intérêt étant placé sous le contrôle du polynucléotide régulateur 5' du gène RRS1-S et, le cas échéant, également sous le contrôle du polynucléotide 3' du gène RRS1-S.
Le demandeur a montré que le gène RRS1-S est transcrit sous la forme d'un ARN messager qui a été isolé et caractérisé. Cet ARN messager comporte un cadre de lecture ouvert unique codant pour la protéine RRS1-S d'une longueur de 1288 acides aminés.
De part et d'autre du cadre ouvert de lecture, cet ARN messager comprend respectivement une région 5' non traduite (5'-UTR) et une région 3' non traduite (3'UTR).
L'ADNc du gène RRS1-S est référencé comme la séquence SEQ ID N°8.
La séquence 5'-UTR de l'ARN messager transcrit par le gène RRS1-S est constituée de la séquence allant du nucléotide en position 1 au nucléotide en position 81 de la séquence SEQ ID N°8.
La séquence 3'-UTR de l'ARN messager transcrit par le gène RRS1-S est constituée de la séquence allant du nucléotide en position 3949 au dernier nucléotide à l'extrémité 3' de la séquence SEQ ID N°8.
L'invention concerne aussi un acide nucléique comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide de séquence SEQ ID
N°8 ou 15 nucléotides consécutifs d'une séquence ayant au moins 40% d'identité en nucléotides avec la séquence SEQ ID N°8, ainsi qu'une séquence complémentaire dudit acide nucléique.
Les acides nucléiques selon l'invention, et en particulier les séquences nucléotidiques SEQ ID N° 1 à SEQ ID N°8, leurs fragments d'au moins 15 nucléotides, les séquences ayant au moins 40% d'identité en nucléotides avec au moins une partie des séquences SEQ ID N° 1 à SEQ ID N°8, ainsi que les acides nucléiques de séquences complémentaires, sont utiles pour la détection de la présence d'au moins une copie d'une séquence nucléotidique du gène RRS1-R ou RRS1-S ou encore d'un fragment ou d'un variant allélique de ces dernières dans un échantillon.
Font également partie de l'invention les sondes et amorces nucléotidiques hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°8.
Par conditions d'hybridation de forte stringence au sens de l'invention, on entend les conditions d'hybridation suivantes:
- l'ADN à tester est immobilisé sur des membranes de type Hybond- N+ (Amersham, Buckingamshire, Royaume-Uni) selon les instructions du fabriquant, en présence de 0,4 M NaOH pendant une nuit;
- les membranes sont lavées avec un tampon 5 x SSC (1 x SSC et correspond à 0,15 M NaCI + 0,015 M citrate de sodium), puis les membranes sont traitées aux UV à 312 nm pendant 3 minutes, puis préhybridées pendant au moins 4 heures à 65°C dans un tampon d'hybridation (6 x SSC, 5 x Denhardt's, 100 μg d'ADN simple brin de thymus de veau/ml et 0,5% de SDS [poids/volume]).
Les sondes sont ajoutées aux membranes et incubées à 65°C pendant une nuit.
Après l'étape d'hybridation, les membranes sont lavées dans 500 ml d'un tampon 2 x SSC, 1 % SDS (poids/volume) à température du laboratoire pendant 30 minutes;
- un second lavage est opéré dans 500 ml d'un tampon 0,1 x SSC, 0,1 % SDS (poids/volume) pendant 15 minutes à 42°C
Les conditions d'hybridation décrites ci-dessus sont adaptées à l'hybridation dans des conditions de forte stringence, une molécule d'acide nucléique d'une longueur de 300 à 400 nucléotides. II va sans dire que les conditions d'hybridation ci-dessus décrites peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon des techniques connues de l'homme du métier.
Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES et HIGGINS (1985) ou encore dans l'ouvrage de AUSUBEL et al; (1989).
Les sondes ou les amorces nucléotidiques selon l'invention comprennent au moins 15 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, en particulier d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N°1 à SEQ ID N°8 ou de sa séquence complémentaire, d'un acide nucléique ayant au moins 40% d'identité en nucléotide avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°8 ou de sa séquence complémentaire ou encore d'un acide nucléique hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°8 ou de sa séquence complémentaire.
De préférence, des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention ont une longueur d'au moins 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 ou 500 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, en particulier d'un acide nucléique de séquence nucléotidique choisi parmi les séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°8, ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire.
Selon un autre aspect une sonde ou une amorce du nucléotidique selon l'invention consistera et/ou comprendra des fragments d'une longueur de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 ou 500 nucléotides
consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, plus particulièrement d'un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°8, ou d'un acide nucléique de séquences complémentaires.
Des exemples d'amorces et de couples d'amorces permettant d'amplifier différentes régions du gène RRS1-R sont par exemple les séquences SEQ ID N°11 à SEQ ID N°61 représentées au tableau 6.
Une amorce ou une sonde nucléotidique selon l'invention peut être préparée par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du métier, y compris par clonage et action d'enzymes de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon les techniques telles que les méthodes de phosphodiester de Narang et al. (1979) ou de Brown et al. (1979) précitées.
Chacun des acides nucléiques selon l'invention, y compris des sondes et amorces oligonucléotidiques décrites ci-dessus, peuvent être marquées , si désiré, en incorporant un marqueur détectable par des moyens spectroscopiques, photochimiques, biochimiques, immunochimiques ou encore chimiques.
Par exemple, de tels marqueurs peuvent consister en des isotopes radioactifs (32P,3H,35S), des molécules fluorescentes (5-bromodéoxyuridine, fluorescéine, acétylaminofluorène, digoxigènine) ou encore des ligands tels que la biotine.
Le marquage d'un acide nucléique est réalisé de préférence par incorporation de molécules marquées au sein de ces nucléotides par extension d'amorces, ou bien par ajout sur les extrémités 5' ou 3'.
Des exemples de marquage non radioactif de fragments d'acides nucléiques sont décrits notamment dans le brevet FR 78 19 175 ou encore dans les articles de URDEA et al. (1988), ou SANCHEZ-PESCADOR et al. (1988).
De manière avantageuse, les sondes selon l'invention peuvent avoir des caractéristiques structurelles de nature à permettre une amplification du signal, telles que les sondes décrites par URDEA et al; (1991) ou encore dans le brevet européen n° EP 0 225 807 (Chiron).
Les sondes oligonucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées notamment dans des hybridations de type Southern à l'ADN génomique, ou encore dans des hybridations à l'ARN messager des gènes
RRS1-R et RRS1-S, lorsque l'expression du transcrit correspondant est recherchée dans un échantillon.
Les sondes selon l'invention peuvent aussi être utilisées pour la détection de produits d'amplification PCR ou encore pour la détection de mésappariements.
Des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être immobilisées sur un support solide. De tels supports solides sont bien connus de l'homme du métier et comprennent des surfaces des puits de plaque de microtitration, des billes de polystyrène, des billes magnétiques, des bandes de nitrocellulose ou encore des microparticules telles que des particules de latex.
La présente invention concerne également un procédé de détection de la présence d'un acide nucléique du gène RRS1-R ou RRS1-S dans un échantillon, ladite méthode comprenant les étapes de:
- mettre en contact une sonde ou une pluralité de sondes nucléotidiques selon l'invention avec l'échantillon à tester;
- détecter le complexe éventuellement formé entre la ou les sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon.
Selon un mode de réalisation particulier du procédé de détection selon l'invention, la ou les sondes oligonucléotidiques sont immobilisées sur un support. Selon un autre aspect, les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.
L'invention concerne en outre un nécessaire ou kit pour la détection de la présence d'un acide nucléique du gène RRS1-R ou RRS1-S dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant:
a) une ou plusieurs sondes nucléotidiques, telles que décrites ci- dessus;
b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'hybridation.
Selon un premier aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support.
Selon un second aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que les sondes oligonucléotides comprennent un marqueur détectable.
Selon un mode de réalisation particulier du kit de détection décrit ci- dessus, un tel kit comprendra une pluralité de sondes oligonucléotidiques conformes à l'invention qui pourront être utilisées pour détecter des séquences cibles d'intérêt du gène RRS1-R ou RRS1-S ou encore détecter des mutations dans les régions codantes ou les régions non codantes du gène RRS1 -R, plus particulièrement des acides nucléiques des séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°8 où les acides nucléiques de séquences complémentaires.
Les amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées pour amplifier un fragment nucléotidique quelconque (ADNg, ADNc, ARNm) de RRS1-R ou RRS1-S, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N°1 à SEQ ID N°8.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé pour l'amplification d'un acide nucléique du gène RRS1 -R ou RRS1-S, et plus particulièrement un acide nucléique de séquence SEQ ID N°1 à SEQ ID N°8 ou un fragment ou encore un acide nucléique de séquence complémentaire à ce dernier, contenu dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de :
a) mettre en contact l'échantillon dans lequel la présence de l'acide nucléique cible est suspectée avec une paire d'amorces nucléotidiques dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de la région de l'acide nucléique cible de RRS1-R ou RRS1 -S dont l'amplification est recherchée, en présence des réactifs nécessaires à la réaction d'amplification et;
b) détection de l'acide nucléique éventuellement amplifié.
Selon le procédé d'amplification ci-dessus, on réalise au moins un cycle d'amplification de l'acide nucléique contenu dans l'échantillon
préalablement à la détection de l'acide nucléique éventuellement amplifié, de préférence au moins 10, et de manière tout à fait préférée au moins 20, cycles d'amplification.
Pour mettre en oeuvre le procédé d'amplification ci-dessus, on aura avantageusement recours à l'une quelconque des amorces nucléotidiques précédemment décrites.
L'invention a en outre pour objet un nécessaire ou kit pour l'amplification d'un acide nucléique du gène RRS1-R ou RRS1-S selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N°1 à SEQ ID N°8, ledit nécessaire ou kit comprenant:
a) un couple d'amorces nucléotidiques conformes à l'invention, dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du coté 3' de l'acide nucléique cible du gène RRS1-R ou RRS1-S dont l'amplification est recherchée;
b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification.
Un tel nécessaire ou kit d'amplification comprendra avantageusement au moins une paire d'amorces nucléotidiques telle que précédemment décrite.
Selon un mode de réalisation préféré, des amorces selon l'invention comprennent tout ou partie d'un polynucléotide choisi parmi des séquences nucléotidiques SEQ ID N°11 à SEQ ID N°61.
Le demandeur a montré que les plantes portant le gène RRS1 -R présentaient un phénotype de résistance à R. solanacearum. En outre, le demandeur a également montré que l'insertion du gène RRS1-R ou encore de l'ADNc du gène RRS1-R dans le génome d'une plante initialement sensible à R. solanacearum confère à cette plante un phénotype de résistance à ce pathogène.
L'invention a également trait à des procédés et des moyens destinés à inhiber ou bloquer l'expression du gène RRS1-S retrouvée chez les plantes sensibles à R. solanacearum, notamment en vue d'accroître leur
résistance à différents pathogènes et ceci par toute technique connue de l'homme du métier.
Afin d'inhiber ou de bloquer l'expression du gène RRS1-S chez une plante, l'homme du métier pourra recourir à l'utilisation de polynucléotides antisens.
Ainsi, l'invention concerne aussi un polynucléotide antisens, capable de s'hybrider spécifiquement à une région déterminée du gène
RRS1-S et capable d'inhiber ou de bloquer sa transcription et/ou sa traduction. Un tel polynucléotide a la structure générale qui a été définie précédemment pour les sondes et les amorces selon l'invention.
De préférence, un polynucléotide antisens selon l'invention hybride avec une séquence correspondant à une séquence localisée dans la région de l'extrémité 5' de l'ARN messager RRS1-S, et de manière tout à fait préférée à proximité du codon d'initiation de la traduction (ATG) du gène RRS1-S.
Selon un seconde mode de réalisation préférentiel, un polynucléotide antisens selon l'invention comprend une séquence correspondant à une des séquences localisées au niveau des jonctions exon/intron du gène RRS1-S et de manière préférée des séquences correspondant à un site d'épissage, qui peuvent être déterminées selon des techniques bien connues de l'homme du métier, sur la base de la description des séquences du gène RRS1-S de la présente description.
Pour synthétiser des polynucléotides antisens tels que définis ci- dessus, l'homme du métier pourra se référer aux tableaux 3 et 4 dans lesquels sont détaillées les positions des différents exons et introns du gène RRS1-S dans la séquence SEQ ID N°5.
De manière générale, les polynucléotides antisens doivent avoir une longueur et une température de fusion suffisantes pour permettre la formation d'un hybride duplex intracellulaire ayant une stabilité suffisante pour inhiber l'expression de l'ARNm de RRS1-S.
Des stratégies pour construire des polynucléotides antisens sont notamment décrites par GREEN et al. (1986) et IZANT et WEINTRAIB (1984), le contenu de ces deux articles étant ici incorporé par référence.
Des méthodes de construction de polynucléotides antisens sont également décrites par ROSSI et al. (1991) ainsi que dans les demandes
PCT n°WO 94/23 026, WO 95/04141 , WO 92/18522 et dans la demande de brevet européen n° EP 0 572 287, le contenu de ces documents étant incorporé par référence.
Avantageusement, un polynucléotide antisens selon l'invention a une longueur de 15 à 4000 nucléotides. Un polynucléotide antisens de l'invention a préférentiellement une longueur allant de 15 , 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 à 75, 100, 200, 500, 1000, 2000, 3000 ou 4000 nucléotides.
Parmi les polynucléotides antisens selon l'invention, sont préférés ceux ayant respectivement une longueur d'environ 300 nucléotides ou une longueur d'environ 4000 nucléotides.
Afin d'inhiber ou de bloquer l'expression du gène RRS1-S, on peut aussi avoir recours simultanément à une pluralité de polynucléotides antisens telle que définis ci-dessus, chacun des polynucléotides antisens hybridant avec une région distincte du gène RRS1-S ou de son ARN messager.
De manière tout à fait préférée, les polynucléotides antisens selon l'invention sont définis de telle manière à ce qu'ils hybrident avec une région du gène RRS1-S présentant, par rapport à la séquence correspondante du gène RRS1-R, une ou plusieurs substitutions, délétions, additions d'au moins une base.
D'autres méthodes de mise en oeuvre des polynucléotides antisens sont par exemple celles décrites par SCZAKIEL et al. (1995).
Une autre stratégie pour inhiber ou bloquer l'expression du gène RRS1-S consiste à utiliser des polynucléotides capables de former une triple hélice d'ADN avec la région génomique d'ADN double brin portant le gène RRS1-S.
En général, des séquences d'homopurine sont considérées comme les plus utiles dans ce type de stratégie, bien que des séquences d'homopyrimidine puissent aussi être employées. L'homme du métier peut avantageusement se référer à la séquence génomique SEQ ID N°5 de RRS1-S afin de sélectionner dans cette séquence des séquences d'homopurine ou d'homopyrimidine de 10 à 20 nucléotides de long, qui seront capables d'inhiber l'expression du gène RRS1-S.
Des méthodes d'inhibition de l'expression d'un gène par la technique triple hélice sont par exemple décrites par GRIFFIN et al. (1989)
L'invention a donc également pour objet l'utilisation d'un polynucléotide antisens ou d'un polynucléotide homopyrimidine, tel que défini précédemment, ou d'un vecteur recombinant comprenant un tel polynucléotide, pour inhiber ou pour bloquer l'expression du gène RRS1 -S dans une cellule de plante ou dans une plante entière.
Comme déjà rappelé, des expériences de complémentation de plantes d'Arabidopsis thaliana appartenant à un écotype sensible à R. solanacearum par un vecteur recombinant contenant la séquence génomique ou la séquence de l'ADNc du gène RRS1-R a permis d'observer, chez la plante ainsi transformée, l'apparition d'un phénotype de résistance à R. solanacearum.
Afin de stimuler la résistance d'une plante à différents pathogènes, et plus particulièrement à R. solanacearum, il sera donc avantageux, soit d'introduire ou d'augmenter le nombre de copies du gène RRS1-R chez cette plante ou , soit de favoriser l'expression du gène RRS1-R, ces deux méthodes étant susceptibles d'empêcher le développement d'un tel pathogène. Une forte expression du gène RRS1-R chez une plante peut être atteinte soit par la surexpression du gène RRS1-R, soit par l'insertion de multiples copies d'un polynucléotide codant pour la protéine RRS1-R dans la plante, soit encore par une combinaison de ces deux stratégies. Pour l'insertion de multiples copies d'un polynucléotide codant pour la protéine RRS1-R dans le génome d'une plante, on aura avantageusement recours à un vecteur recombinant selon l'invention.
L'invention est également relative à un vecteur recombinant comprenant un acide nucléique selon l'invention.
Avantageusement, un tel vecteur recombinant comprend un acide nucléique choisi parmi les acides nucléiques suivants:
• un acide nucléique comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'une séquence nucléotidique codant pour une protéine de résistance d'une plante à un pathogène, ladite protéine comprenant:
(i) une partie N-terminale comprenant au moins une séquence d'acides aminés riche en leucine et au moins un site de liaison aux nucléotides; et
(ii) une partie C-terminale comprenant un domaine de liaison à l'ADN comprenant la séquence d'acides aminés « WRKYGQK », ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire;
b) un acide nucléique comprenant une séquence ayant au moins 40% d'identité en nucléotide avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°1 , ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire;
c) un acide nucléique comprenant une séquence possédant au moins 40% d'identité en nucléotide avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°5;
d) un acide nucléique comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide constitué de l'un des exons 1 à 7 du gène RRS1-R ou du gène RRS1-S, tels que définis ci-avant;
e) un acide nucléique comprenant un polynucléotide d'au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide constitué de l'un des introns 1 à 7 du gène RRS1-R ou RRS1-S, tels que définis plus haut;
f) un acide nucléique ayant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide régulateur du gène RRS1-R ou RRS1-S tels que définis plus haut;
g) un polynucléotide antisens ou un polynucléotide homopurine ou homopyrimidine, tel que défini plus haut, utile pour inhiber l'expression du gène RRS1-S;
Par « vecteur » au sens de la présente invention, on entendra une molécule d'ADN ou d'ARN circulaire ou linéaire qui est indifféremment sous forme de simple brin ou double brin.
Un vecteur recombinant selon l'invention est indifféremment un vecteur de clonage, un vecteur d'expression, ou plus spécifiquement un vecteur d'insertion, un vecteur de transformation ou un vecteur d'intégration.
Il peut s'agir d'un vecteur d'origine bactérienne ou virale. Selon un premier mode de réalisation, un vecteur recombinant selon l'invention est utilisé dans le but d'amplifier l'acide nucléique qui y est inséré après transformation de transfection de l'hôte cellulaire désiré.
Selon un second mode de réalisation, il s'agit d'un vecteur d'expression comprenant, outre un acide nucléique codant pour un polypeptide conforme à l'invention, en particulier les polypeptides codés par les gènes RRS1-R et RRS1-S, des séquences régulatrices permettant d'en diriger la transcription et/ou la traduction.
Selon un mode de réalisation avantageux, un vecteur recombinant selon l'invention comprendra notamment les éléments suivants: 1) des éléments de régulation de l'expression de l'acide nucléique du gène RRS1-R ou du gène RRS1-S à insérer, tels que des promoteurs et des séquences activatrices («enhancers »);
2) la séquence comprise dans l'acide nucléique du gène RRS1-R ou RRS1-S conforme à l'invention à insérer dans un tel vecteur, ladite séquence étant placée sous le contrôle des signaux de régulation décrits en (1) ; et
3) des séquences d'initiation et d'arrêt de la transcription appropriée.
En outre, les vecteurs recombinants selon l'invention pourront inclure une ou plusieurs origines de réplication chez les hôtes cellulaires dans lesquels leur amplification ou leur expression est recherchée ainsi que des marqueurs de sélection.
Dans un mode de réalisation particulier, un vecteur recombinant selon l'invention comprend un polynucléotide antisens ou un polynucléotide homopurine ou homopyridine, tel que défini précédemment, le cas échéant placé sous le contrôle des séquences de régulation appropriées permettant d'en assurer l'expression dans une cellule hôte ou une plante choisie. Un tel vecteur recombinant est utilisé de préférence pour inhiber l'expression du gène RRS1-S dans la cellule ou dans la plante.
Selon un autre mode de réalisation particulier, un vecteur recombinant selon l'invention comprend un polynucléotide codant pour le polypeptide RRS1-R ou un polypeptide ayant au moins 40% d'identité en acide aminé avec ce dernier et conservant l'activité biologique de RRS1-R, placé sous le contrôle de séquence(s) de régulation permettant une expression à haut niveau de RRS1-R ou de son homologue dans une cellule hôte ou dans une plante choisie. Un tel vecteur recombinant est utile pour permettre un haut niveau d'expression de RRS1-R chez une plante .
Selon un aspect avantageux, un tel vecteur recombinant est un vecteur intégratif permettant l'insertion de multiples copies de la séquence codante de RRS1-R dans le génome d'une plante.
A titre d'exemple, les promoteurs bactériens pourront être les promoteurs Lacl, LacZ, les promoteurs de l'ARN polymérase du bactériophage T3 ou T7, les promoteurs PR, ou PL du phage lambda. Des promoteurs pour l'expression d'un acide nucléique de RRS1-R ou RRS1-S selon l'invention dans les plantes sont le promoteur CaMV 35 S du virus de la mosaïque du chou-fleur Odell et al., (1985) ou encore le promoteur du gène de lactine 1 du riz McEIroy et al. (1990).
D'autres promoteurs utiles pour l'expression d'un polynucléotide d'intérêt dans les plantes sont décrits dans les brevets n°US 5,750,866 et US n°5,633,363, incorporés ici par référence.
De manière générale, pour le choix d'un promoteur adapté, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de Sambrook et al. (1989) précité ou encore aux techniques décrites par Fuller et al. (1996), et Ausubel et al. (1989).
Les vecteurs bactériens préférés selon l'invention sont par exemple les vecteurs pBR 322 (ATCC N°37017) ou encore des vecteurs tels pAA223- 3 (Pharmacia Uppsala, Suède) et pGEM1 (Promega Biotech, Madison, WU, USA) et pUC19 (commercialisé par Boehringer Mannheim, Germany). On peut encore citer d'autres vecteurs commercialisés tels que les vecteurs pQE70, pQE60, pQE9 (Qiagen, psuX 174, pBluescript SA, pNH8A, pMH16A, pMH18A, pMH46A, pWLNEO, pSG2CAT, pOG44, pXTI, pSG (Stratagene).
Il peut s'agir également de vecteurs de type baculovirus tel que le vecteur pVL1392/1393 (Pharmingen) utilisé pour transfecter les cellules de la lignée Sf9 (ATC N°CRL 1711) dérivée de Spodoptera frugidera.
Préférentiellement, on aura recours à des vecteurs spécialement adaptés pour l'expression de séquence d'intérêt dans des cellules de plantes, tels que les vecteurs suivants:
• vecteur pBIN19 (Bevan et al., Nucleic Acids Research, Vol.12:8711-8721 , commercialisé par la Société Clotench , Palo Alto, Californie, USA);
• vecteur pB101 (Jefferson 1987, Plant Molecular Biology Reporter, vol. 5: 387-405, commercialisé par la Société Clotench);
• vecteur pBI121 (Jefferson et al. 1987, Plant Molecular Biology
Reporter, vol. 5:387:405, commercialisé par la Société Clotench);
• vecteur pEGFP (Cormack BP et al. , 1996, commercialisé par la Société Clotench);
• vecteurs SLJ75515 et SLJ75516 (don du Dr. J. Jones, The Sainsbury Laboratory, Norwich, UK);
• vecteurs pDHB321 (don du Dr. Bouchez, INRA Versailles, France).
• vecteurs pAOV, pOV2, pSOV, pSOV2, pkMB et pSMB (Mylne et al., 1996).
Pour permettre l'expression des polynucléotides selon l'invention, ces vecteurs doivent être introduits dans une cellule hôte. L'introduction des polynucléotides selon l'invention dans une cellule hôte peut être réalisée in vitro, selon les techniques bien connues de l'homme du métier pour transformer ou transfecter des cellules, soit en culture primaire, soit sous la forme de lignées cellulaires.
L'invention a en outre pour objet une cellule hôte transformée avec un acide nucléique ou par un vecteur recombinant selon l'invention.
Une telle cellule hôte transformée est préférentiellement d'origine procaryote ou eucaryote, notamment bactérienne, fongique ou végétale. Ainsi, peuvent être notamment utilisées des cellules bactériennes de différentes de E. coli ou encore d'Agrobacterium tumefaciens.
De manière préférée, la cellule hôte transformée est une cellule de plante ou encore un protoplaste de plante.
De manière tout à fait préférée, il s'agit d'une cellule ou d'un protoplaste de colza, de tabac, de maïs, de tomate, de pomme de terre ou d'Arabidopsis thaliana.
L'invention concerne aussi un organisme multicellulaire végétal transformé, caractérisé en ce qu'il comprend une cellule hôte transformée ou une pluralité de cellules hôtes transformées avec un acide nucléique du gène RRS1-R ou RRS1-S ou avec un vecteur recombinant selon l'invention.
Selon un premier aspect, l'organisme multicellulaire végétal est transformé avec un ou plusieurs nucléotides antisens et/ou un plusieurs polynucléotides homopurine ou homopyrimidine afin d'inhiber ou de bloquer l'expression du gène RRS1-S chez cet organisme. Selon un second aspect, l'organisme multicellulaire végétal est transformé avec une ou plusieurs copies d'un polynucléotides codant pour la protéine RRS1-R ou pour un polypeptide ayant au moins 40% d'identité en acide aminé avec le polypeptide RRS1-R et conservant l'activité biologique permettant de conférer un phénotype de résistance à R. solanacearum à l'organisme transformé.
L'invention a encore pour objet une plante transgénique, c'est-à- dire une plante transformée comprenant, préférentiellement sous une forme intégrée dans son génome, un acide nucléique du gène RRS1-R ou RRS1 -S et préférentiellement un polynucléotide antisens ou un polynucléotide homopurine ou homopyrimidine ou encore un acide nucléique codant pour le polypeptide RRS1-S ou un polypeptide homologue, ledit acide nucléique ayant été inséré dans le génome de la plante par transformation avec un aide nucléique de RRS1-R ou RRS1-S ou un vecteur recombinant selon l'invention.
Préférentiellement, une plante transformée selon l'invention est un colza, un tabac, un maïs, une tomate, une pomme de terre ou Arabidopsis thaliana.
Selon un premier aspect, les plantes transgéniques telles que définies ci-dessus présentent une expression réduite, une expression indétectable ou une absence d'expression du gène RRS1-S et sont ainsi susceptibles de présenter une résistance accrue à des pathogènes tels que
R.solanacearum.
Selon un second aspect, les plantes transgéniques telles que définies ci-dessus ont la propriété d'exprimer fortement le polypeptide RRS1-
R et de posséder en conséquence un phénotype de résistance à différents pathogènes, et tout particulièrement à des pathogènes bactériens tels que
R. solanacearum.
L'invention a en outre pour objet un procédé d'obtention d'une plante transgénique transformée avec un acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
a) obtention d'une cellule hôte recombinante végétale telle que définie ci-dessus;
b) régénération d'une plante entière à partir de la cellule hôte végétale transformée obtenue à l'étape a);
c) sélection des plantes obtenues à l'étape b) ayant intégré l'acide nucléique du gène RRS1-R ou RRS1-S d'intérêt.
L'invention est également relative à un procédé d'obtention d'une plante transgénique, transformée avec un acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
a) transformer une cellule de plante avec un acide nucléique du gène RRS1-R ou RRS1-S ou avec un vecteur recombinant selon l'invention;
b) régénérer une plante entière à partir de cellules de plantes transformées obtenues à l'étape a);
c) sélectionner les plantes ayant intégré l'acide nucléique du gène RRS1-R ou RRS1-S d'intérêt.
L'invention concerne aussi un procédé d'obtention d'une plante transformée, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
a) obtention d'une cellule hôte d'Agrobacte um tumefaciens transformée avec un acide nucléique ou un vecteur recombinant selon l'invention;
b) transformation de la plante choisie par infection avec des cellules d'Agrobactehum tumefaciens obtenues à l'étape a);
c) sélection des plantes ayant intégré l'acide nucléique selon l'invention.
L'un quelconque des procédés d'obtention d'une plante transgénique ci-dessus décrit peut en outre comporter les étapes additionnelles suivantes:
d) croisement entre elles des deux plantes transformées telles qu'obtenues à l'étape c);
e) sélection des plantes homozygotes pour le transgène.
Selon un autre aspect, l'un quelconque des procédés ci-dessus décrits pourra en outre comprendre les étapes suivantes:
f) croisement d'une plante transformée obtenue à l'étape c) avec une plante de la même espèce;
g) sélection des plantes issues du croisement de l'étape d) ayant conservé le transgène.
L'homme du métier est capable de mettre en oeuvre de nombreux procédés de l'état de la technique afin d'obtenir des plantes transformées avec un acide nucléique du gène RRS1-R ou RRS1-S selon l'invention.
L'homme du métier pourra se référer avantageusement à la technique décrite par BECHTOLD et al. (1993) afin de transformer une plante à l'aide de la bactérie Agrobacterium tumefaciens.
Les techniques utilisées dans d'autres types de vecteurs peuvent également être utilisées telles que les techniques décrites par BOUCHEZ et al. (1993) ou encore par HORSCH et al. (1984). L'invention a en outre pour objet une plante transformée telle qu'obtenue selon l'un quelconque des procédés d'obtention décrits ci- dessus.
L'invention concerne également une semence de plante dont les cellules constitutives comprennent un acide nucléique du gène RRS1-R ou du gène RRS1-S selon l'invention qui a été artificiellement insérée dans leur génome.
L'invention a encore pour objet une semence d'une plante transgénique telle que définie ci-avant.
Un autre objet de l'invention consiste en l'utilisation d'un acide nucléique du gène RRS1 -R ou du gène RRS1-S selon l'invention pour l'expression in vitro ou in vivo, de préférence in planta de la protéine RRS1-R ou RRS1-S ou d'un fragment peptidique de celle-ci.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un acide nucléique antisens, ou d'un acide nucléique homopurine ou homopyrimidine selon l'invention pour inhiber ou pour bloquer l'expression du gène codant pour la protéine RRS1-R ou RRS1 -S.
De manière préférée, les utilisations ci-dessus sont caractérisées en ce qu'il s'agit d'une expression in vivo chez une plante transformée avec un tel acide nucléique. Comme déjà mentionné précédemment, le gène RRS1-R code pour un polypeptide de 1378 acides aminés de longueur.
En outre, le polypeptide RRS1-R présente les caractéristiques structurales définies précédemment dans la description, à savoir la présence caractéristique de domaines fonctionnels retrouvés en combinaison pour la première fois dans la séquence en acides aminés d'un polypeptide, ce qui
confère à la protéine RRS1-R la qualité de premier membre connu d'une nouvelle classe de protéines définie de la manière la plus générale comme des protéines comprenant:
a) une partie N-terminale comprenant au moins une séquence d'acides aminés riche en leucine et au moins un site de liaison aux nucléotides; et
b) une partie C-terminale comprenant un domaine de liaison à l'ADN comprenant la séquence d'acides aminés « WRKYGQK ».
Le polypeptide RRS1-R est référencé comme la séquence SEQ ID N°9.
Comme déjà rappelé, le demandeur a montré que des mutations dans la séquence d'acides aminés du polypeptide RRS1-R pouvaient conduire à une protéine dépourvue de l'activité biologique de la protéine sauvage RRS1-R, l'expression de la protéine mutée chez une plante ne permettant plus d'observer de phénotype de résistance à certains pathogènes, tels que R. solanacearum. Un polypeptide représentatif des polypeptides mutés de RRS1-R altérés dans leur fonction biologique est le polypeptide RRS1-S dont la séquence d'acides aminés est référencée comme la séquence SEQ ID N°10.
Selon un autre aspect l'invention concerne également un polypeptide codé par un acide nucléique du gène RRS1-R ou du gène RRS1-S, et de préférence un polypeptide comprenant au moins 5 acides aminés consécutifs d'une protéine choisie parmi RRS1-R et RRS1-S.
De préférence, un tel polypeptide comprend au moins 10, 15, 20,
25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500,
600, 700, 1200 acides aminés consécutifs du polypeptide RRS1-R de séquence en acides aminés SEQ ID N°9 ou du polypeptide RRS1-S de séquence en acides aminés SEQ ID N°10.
. L'invention est également relative à un polypeptide comprenant les séquences en acides aminés ayant au moins 40% d'identité en acides aminés avec la séquence du polypeptide RRS1-R SEQ ID N°9, avec la
séquence du polypeptide RRS1-S SEQ ID N°10, ou à un fragment peptidique de ces derniers.
Avantageusement, fait partie de l'invention un polypeptide ayant au moins 60%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% d'identité en acides aminés avec la séquence du polypeptide RRS1-R de SEQ ID N°9, avec la séquence du polypeptide RRS1-S SEQ ID N°10, ou un fragment peptidique de ces derniers.
De manière générale, les polypeptides selon l'invention se présentent sous une forme isolée ou purifiée. L'invention est également relative à un procédé pour la production du polypeptide RRS1-R de séquence SEQ ID N°9, du polypeptide RRS1-S de séquence SEQ ID N°10 ou d'un fragment peptidique de ces derniers, la méthode comprenant les étapes :
a) insérer un acide nucléique codant pour le polypeptide RRS1-R,
RRS1-S ou un fragment peptidique de ces derniers, dans un vecteur approprié;
b) cultiver, dans un milieu de culture approprié, une cellule hôte préalablement transformée ou transfectee avec le vecteur recombinant de l'étape a);
c) récupérer le milieu de culture conditionné ou lysé la cellule hôte transformée, par exemple par sonication ou par choc cosmétique;
d) séparer et purifier à partir du milieu de culture ou encore à partir des lysats cellulaires obtenus à l'étape c), ledit polypeptide;
e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant produit.
Les peptides selon l'invention peuvent être caractérisés par fixation sur une colonne de chromatographie d'immunoaffinité sur laquelle les anticorps dirigés contre ces polypeptides où un fragment ou un variant de ces derniers ont été préalablement immobilisés.
Selon un autre aspect, un polypeptide recombinant selon l'invention peut être purifié par passage sur une colonne de chromatographie selon les méthodes connues de l'homme de l'art et décrites par exemple par AUSUBEL F. et al. (1989) précité. Un polypeptide selon l'invention peut être également préparé par les techniques classiques de synthèse chimique indifféremment en solution homogène ou en phase solide.
A titre illustratif, un polypeptide selon l'invention pourra être préparé par la technique en solution homogène décrite par HOUBEN WEYL (1974) ou encore la technique de synthèse en phase solide décrite par MERRIFIELD (1965a, 1965b).
Font également partie de l'invention des polypeptides dits « homologues » aux polypeptides RRS1-R ou RRS1-S , ou de leurs fragments. De tels polypeptides homologues ont des séquences d'acides aminés possédant une ou plusieurs substitutions d'un acide aminé par un acide aminé équivalent, par rapport au polypeptide de référence.
On entendra par acides aminés équivalents selon la présente invention, par exemple le remplacement d'un résidu sous la forme L par un résidu sous la forme D ou encore le remplacement d'un acide glutamique (E) par un acide pyro-glutamique selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
A titre illustratif, la synthèse de peptides contenant au moins un résidu sous la forme D est décrite par KOCH et al. (1977). Selon un autre aspect, sont également considérés comme des acides aminés équivalents deux acides aminés appartenant à la même classe, c'est-à-dire deux acides aminés acide, basique, non polaire ou encore polaire non chargé.
Fait également partie de l'invention un polypeptide comprenant des modifications d'acides aminés de 1 , 2, 3, 4, 5, 10 à 20 substitutions, additions ou délétions d'un acide aminé par rapport à la séquence d'acides aminés du polypeptide RRS1-R ou du polypeptide RRS1-S selon l'invention.
De préférence, les polypeptides selon l'invention comprenant une ou plusieurs additions, délétions, substitutions d'au moins un acide aminé
conservent leur capacité à induire la résistance à divers pathogènes, et tout particulièrement à R. solanacearum
Selon un autre mode préférentiel de réalisation, les polypeptides selon l'invention comprenant une ou plusieurs additions, délétions, substitutions d'au moins un acide aminé conservent leur capacité à être reconnus par des anticorps dirigés contre les polypeptides RRS1-R ou
RRS1-S non modifiés.
Un polypeptide dérivé de la protéine RRS1-R ou de la protéine RRS1-S est utile notamment pour la préparation d'anticorps destinés à la détection de la présence de l'un ou l'autre de ces polypeptides ou encore d'un fragment peptidique de ces derniers dans un échantillon.
Outre la détection de la présence du polypeptide RRS1-R ou RRS1-S ou encore d'un fragment peptidique de ces derniers dans un échantillon, des anticorps dirigés contre ces polypeptides sont utilisés pour quantifier la synthèse de RRS1-R ou RRS1-S, par exemple dans les cellules d'une plante, et déterminer ainsi la capacité de cette plante à résister à certains pathogènes, et tout particulièrement à R. solanacearum.
Des anticorps préférés selon l'invention sont les anticorps reconnaissant spécifiquement la séquence d'acides aminés allant de l'acide aminé en position 704 à l'acide aminé en position 712 de la séquence du polypeptide RRS1-R de SEQ ID N°9.
Une seconde classe d'anticorps préférés selon l'invention sont les anticorps reconnaissant spécifiquement la séquence d'acides aminés allant de l'acide aminé en position 704 à l'acide aminé en position 710 de la séquence du polypeptide RRS1-S de SEQ ID N°10.
Une troisième classe d'anticorps préférés selon l'invention sont les anticorps reconnaissant spécifiquement la séquence d'acides aminés allant de l'acide aminé en position 1291 à l'acide aminé en position 1378 du polypeptide RRS1-R de séquence SEQ ID N°9. Par « anticorps » au sens de la présente invention, on entendra notamment des anticorps polyclonaux ou monoclonaux ou des fragments (par exemple des fragments F(ab)'2l F(ab) ou encore tout polypeptide comprenant un domaine de l'anticorps initial reconnaissant le polypeptide ou le fragment de polypeptide cible selon l'invention.
Les anticorps monoclonaux peuvent être préparés à partir d'hybridomes selon la technique décrite par KOHLER et MILSTEIN (1975).
La présente invention concerne également des anticorps dirigés contre un polypeptide tel que décrit ci-dessus ou un fragment ou un variant de ce dernier, tel que produit dans la technique du triome ou encore la technique d'hybridome décrit par KOZBOR et al. (1983).
L'invention a également trait à des fragments d'anticorps simple chaîne Fv (ScFv) tels que décrits dans le brevet US N°4,946,768 ou encore par MARTINEAU et al. (1998). Les anticorps selon l'invention comprennent également des fragments d'anticorps obtenus à l'aide de banques de phages (RIDDER et al., 1995), REINMANN K.A. et al., 1997).
Les préparations d'anticorps selon l'invention sont utiles dans des tests de détection immunologiques destinés à l'identification de la présence et/ou de la quantité de la protéine RRS1-R ou RRS1-S ou encore d'un fragment peptidique de l'une de ces protéines, présent dans un échantillon.
Un anticorps selon l'invention pourra comprendre en outre un marqueur détectable isotopique ou non isotopique, par exemple fluorescent, ou encore être couplé à une molécule telle que la biotine, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
Ainsi, l'invention a en outre pour objet un procédé pour détecter la présence d'un polypeptide RRS1-R, d'un polypeptide RRS1-S ou encore d'un fragment peptidique de l'un de ces polypeptides conformes à l'invention, dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de :
a) mettre en contact l'échantillon à tester avec un anticorps tel que défini ci-dessus;
b) détecter le complexe antigène/anticorps formé.
L'invention est également relative à un nécessaire ou kit de diagnostic pour la détection de la présence d'un polypeptide conforme à l'invention dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant:
a) un anticorps tel que défini ci-dessus;
b) le cas échéant, un réactif permettant la détection des complexes antigène/anticorps formés.
L'invention est également relative à des protéines de fusion comprenant une séquence en acides aminés de l'un des deux domaines fonctionnels C-terminal ou N-terminal d'un polypeptide selon l'invention, d'une part, et , d'autre part, tout ou partie de la séquence en acides aminés d'un polypeptide hétérologue. Par « polypeptide hétérologue », on entend aux fins de la présente description une séquence d'acides aminés qui n'est pas naturellement présente dans la séquence en acides aminés du polypeptide ou du fragment de polypeptide N-terminal ou C-terminal selon l'invention avec lequel cette séquence d'acides aminés « hétérologue » est liée covalemment, de préférence par une liaison peptidique.
Selon un premier aspect, une protéine de fusion, ou chimère selon l'invention comprend (1) le domaine N-terminal d'un premier polypeptide appartenant à la nouvelle classe de protéines de résistance à des pathogènes végétaux selon l'invention, lié de manière covalente, préférentiellement par une liaison peptidique normale, à un second polypeptide comprenant le domaine C-terminal d'une seconde protéine appartenant également à la classe des protéines de résistance aux pathogènes végétaux selon l'invention.
Le domaine N-terminal du premier polypeptide et le domaine C- terminal du second polypeptide peuvent être liés directement l'un à l'autre par une liaison peptidique.
Selon un second aspect, le domaine N-terminal du premier polypeptide et le domaine C-terminal du second polypeptide peuvent être séparés, au sein de la protéine de fusion, par une séquence d'acides aminés espaceur qui peut être de toute nature.
Une telle protéine chimère comprend donc un domaine N-terminal comprenant les motifs caractéristiques d'une protéine de résistance aux pathogènes, liée de manière covalente à un domaine C-terminal comprenant un site de liaison aux nucléotides susceptible d'avoir une spécificité différente de celle du domaine C-terminal que l'on retrouve naturellement
présent au sein de la séquence d'acides aminés du polypeptide naturel duquel provient le domaine N-terminal de la protéine chimère.
De telles protéines chimères constituent de nouveaux moyens permettant , par le choix du domaine N-terminal, de conférer chez une plante une résistance à un pathogène déterminé.
En outre, le choix du domaine C-terminal de liaison aux nucléotides permet à l'homme du métier de cibler spécifiquement les séquences de régulation qui sont activées par une telle protéine chimère et de maîtriser ainsi à la fois le type et le niveau de résistance désirés. Selon un second mode de réalisation, une protéine de fusion selon l'invention est constituée de (1) la séquence en acides aminés de tout ou partie d'une protéine dont les mécanismes d'induction de la synthèse chez une plante est connue et (2) (i) soit la séquence en acides aminés complète d'un polypeptide de résistance aux pathogènes selon l'invention, soit (i.) la séquence en acides aminés du domaine C-terminal comprenant un site de liaison aux nucléotides d'un polypeptide selon l'invention.
De manière tout à fait préférée, la synthèse d'une telle protéine chimère est inductible par des signaux de stress de la plante, tels qu'un stress dû à une modification brutale de la température de l'environnement. L'invention est également relative à un acide nucléique codant pour une protéine chimère telle que définie ci-dessus.
Selon un mode de réalisation préféré, un tel acide nucléique comprend , à proximité, et avantageusement en amont de la région codante, un promoteur constitutif ou un promoteur inductible. A titre illustratif, un tel acide nucléique comprend, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3' un promoteur de protéine de choc thermique végétal, (2) une séquence nucléotidique codant pour la partie N-terminale de la protéine de choc thermique dont la synthèse est naturellement régulée par le promoteur (1), (3) la séquence nucléotidique codant un polypeptide de résistance aux pathogènes végétaux ayant conservé sa fonction de facteur de transcription (domaine WRKY fonctionnel) selon l'invention.
A titre d'exemple, des promoteurs préférés sont ceux qui sont inductibles par :
- La chaleur (Athsp 17.6; Prandl et al., 1995);
- H202, auxine, acide salicylique (GST6; Chen et al., 1996);
- l'acide salicylique (PR1 ; Lebel et al., 1998).
Une protéine chimère selon l'invention peut être obtenue selon la technique décrite à l'exemple 7.
Comme cela a été décrit précédemment un polypeptide de résistance à des pathogènes végétaux selon l'invention, possède, à la fois dans le domaine N-terminal et dans le domaine C-terminal des motifs caractéristiques de liaison à des protéines.
Des protéines interagissant avec un polypeptide selon l'invention représentent donc également des moyens impliqués dans la résistance des plantes à l'infection par certains pathogènes, notamment par R.solanacearum. L'invention a également pour objet des procédés et des moyens destinés au criblage de substances ou molécules candidates susceptibles de se lier avec un polypeptide selon l'invention.
L'invention concerne donc un procédé pour cribler une substance candidate se fixant sur un polypeptide selon l'invention, et tout particulièrement un polypeptide RRS1-R ou RRS1-S, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de :
a) préparer un polypeptide selon l'invention;
b) obtenir une substance candidate à tester;
c) mettre en contact le polypeptide de l'étape a) avec la substance candidate de l'étape b);
d) détecter le complexe éventuellement formé entre le polypeptide de l'invention et la substance candidate.
A titre illustratif, d'un procédé de criblage tel que défini ci-dessus, un polypeptide selon l'invention est immobilisé par adsorption ou par liaison covalente sur une surface appropriée, la surface d'un puits d'une plaque de
microtitration. Le polypeptide de l'invention immobilisé est ensuite mis en contact avec la substance ou molécule candidate à tester.
La détection de la fixation de la molécule candidate sur le polypeptide de l'invention immobilisé peut ensuite être réalisé par exemple avec un anticorps reconnaissant spécifiquement la molécule candidate à tester, ledit anticorps comprenant le cas échéant un marqueur détectable .
Selon un autre mode de réalisation d'un procédé de criblage tel que défini ci-dessus, la substance ou molécule candidate est préalablement immobilisée sur la surface d'un support avant d'être mise en contact avec un polypeptide selon l'invention.
La détection du complexe éventuellement formé entre le polypeptide selon l'invention et la molécule candidate immobilisée sur le support peut alors être réalisée à l'aide d'un anticorps reconnaissant spécifiquement un polypeptide selon l'invention, ledit anticorps étant éventuellement marqué.
Pour réaliser un tel procédé de criblage, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à la mise des techniques d'immunodétection de type ELISA.
L'invention concerne aussi un kit ou nécessaire pour cribler une substance candidate se fixant sur un polypeptide de l'invention, un tel kit ou nécessaire comprenant:
a) un polypeptide selon l'invention;
b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la détection des complexes formés entre le polypeptide de l'invention et la substance candidate à tester.
Un procédé de criblage de molécules interagissant avec un polypeptide selon l'invention peut également être réalisé selon les techniques de double hybride. Des techniques de criblage de type double- hybride sont utilisées pour étudier les interactions protéines-protéines in vivo et reposent sur la fusion d'une protéine « appât » au domaine de liaison à l'ADN de la protéine de levure Gal4.
La technique de double hybride est notamment décrite dans les brevets US N°US 5,667,973 et US N°5,283 173, l'enseignement technique de ces deux brevets étant ici incorporé par référence.
Le criblage de bandes d'ADNc contenant des inserts codant pour des produits de traduction interagissant potentiellement avec un polypeptide selon l'invention ou un fragment peptidique contenant un domaine de liaison aux protéines d'un polypeptide selon l'invention peut être réalisé comme décrit par HARPER et al. (1993), par CHO et al. (1998), ou encore par FROMONT-RACINE et al. (1997). L'invention est également relative à un procédé de criblage d'une substance candidate se fixant sur un polypeptide selon l'invention, et tout particulièrement sur le polypeptide RRS1-R ou RRS1-S, ledit procédé comprenant les étapes de:
a) obtenir un premier acide nucléique codant pour une protéine de fusion comprenant une partie du polypeptide d'intérêt fusionné au domaine de liaison à l'ADN d'une protéine transactivatrice telle que Gal4;
b) obtenir un second acide nucléique codant pour une protéine de fusion comprenant la substance candidate fusionnée au domaine de transcription d'une protéine transactivatrice telle que Gal4;
c) fournir un acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique codant pour un marqueur détectable, placé sous le contrôle d'une séquence de régulation reconnue par la protéine transactivatrice telle que Gal4.
Les acides nucléiques a), b) et c) étant insérés dans des vecteurs appropriés; et d) co-transfectées des cellules de levure simultanément avec lesdits vecteurs; e) détecter l'expression de la séquence nucléotidique codant pour le marqueur détectable.
Le procédé de criblage ci-dessus peut comporter en outre une étape supplémentaire f) au cours de laquelle la séquence nucléotidique et/ou
la séquence en acides aminés de l'acide nucléique « proie » induisant l'expression du marqueur détectable est caractérisée.
L'invention concerne aussi un kit ou nécessaire pour le criblage d'une substance candidate se fixant sur un polypeptide selon l'invention, et tout particulièrement le polypeptide RRS1-R ou RRS1-S, ledit kit ou nécessaire comprenant :
a) un premier acide nucléique codant pour une protéine de fusion comprenant une partie du polypeptide d'intérêt fusionné au domaine de liaison à l'ADN d'une protéine transactivatrice telle que Gal4;
b) le cas échéant, un second acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique codant pour un marqueur détectable, placé sous le contrôle d'une séquence de régulation reconnue par la protéine transactivatrice telle que Gal4;
c) un troisième acide nucléique codant pour une protéine de fusion comprenant la substance candidate fusionnée au domaine de transcription d'une protéine transactivatrice telle que Gal4.
L'invention concerne aussi une substance capable de se fixer sur un polypeptide de l'invention, préférentiellement sur le polypeptide RRS1 -R ou RRS1 -S, cette substance étant caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue par un procédé de criblage tel que défini ci-dessus. Une technique de criblage ayant recours à un système de type double hybride peut être aisément réalisée par l'homme du métier, notamment conformément à l'enseignement de l'exemple 8.
Comme déjà décrit précédemment, un polypeptide selon l'invention comprend plusieurs domaines de liaison aux nucléotides à la fois dans sa partie N-terminale et dans sa partie C-terminale. Les séquences nucléotidiques auxquelles se lient ces différents domaines de liaison aux nucléotides revêtent donc une importance déterminante dans les mécanismes de résistance des plantes à différents pathogènes, et plus particulièrement à R. solanacearum.
L'isolement et la caractérisation des polypeptides de résistance aux pathogènes végétaux selon l'invention permet désormais à l'homme du métier de déterminer ces séquences nucléotidiques impliquées dans l'induction d'un phénotype de résistance aux pathogènes chez une plante. L'invention a également trait à un procédé de criblage d'un acide nucléique interagissant avec un polypeptide selon l'invention, ledit procédé de criblage comprenant les étapes de :
a) obtenir une population statistique d'acides nucléiques de 20 à 50 nucléotides de longueur;
b) mettre en contact la population d'acides nucléiques de l'étape a) avec un polypeptide selon l'invention;
c) caractériser l'acide nucléique ou la pluralité d'acides nucléiques interagissant avec ledit polypeptide.
Selon un tel procédé, il est d'abord préparé, par exemple par synthèse chimique directe, des acides nucléiques de 20 à 50 nucléotides de longueur, et de préférence de 20 à 30 nucléotides de longueur dont la séquence nucléotidique est statistique, chacun des acides nucléiques synthétisés étant en outre lié covalemment, à leur extrémité 5' ou 3', à une séquence nucléotidique unique et connue.
Les acides nucléiques formant une population statistique d'acides nucléiques décrits plus haut sont ensuite mis en contact avec un polypeptide selon l'invention, ledit polypeptide pouvant avoir été préalablement immobilisé sur un support.
Après une étape permettant d'éliminer les acides nucléiques n'ayant pas interagi avec le polypeptide selon l'invention, les complexes polypeptides/acides nucléiques sont mis en contact avec une amorce oligonucléotidique hybridant spécifiquement, dans des conditions d'hybridation déterminées, avec la séquence nucléotidique unique et connue commune à l'ensemble des acides nucléiques de la population statistique ci- avant, puis il est procédé à au moins un cycle d'amplification à l'aide de l'amorce hybridant la séquence nucléotidique unique et connue de l'acide
nucléique retenu par le polypeptide de l'invention, par exemple une amplification par PCR.
Selon un mode de réalisation particulier de ce procédé de criblage, les acides nucléiques ainsi amplifiés et isolés sont à nouveau mis en contact avec un polypeptide selon l'invention, puis l'acide nucléique ou la pluralité d'acides nucléiques ayant formé un complexe avec ledit polypeptide sont à nouveau hybrides avec l'amorce nucléotidique hybridant avec la séquence nucléotidique unique et connue et un nouveau cycle d'amplification(s) est réalisé. Préférentiellement, le procédé de criblage tel que défini ci-dessus comporte de 1 à 10, et de manière tout à fait préférée de 1 à 5 cycles de mise en contact/amplification des acides nucléiques fixés sur le polypeptide de l'invention.
Les acides nucléiques sélectionnés pour leur fixation spécifique à un polypeptide selon l'invention sont ensuite caractérisés, préférentiellement par séquençage.
L'invention concerne en outre un kit ou nécessaire pour le criblage d'un acide nucléique interagissant avec un polypeptide selon l'invention, comprenant :
a) un polypeptide selon l'invention;
b) le cas échéant, une population statistique d'acides nucléiques de 20 à 50 nucléotides de longueur.
L'invention est en outre illustrée, sans pour autant pour être limitée, par les figures et les exemples.
La figure 1 illustre la séquence en acides aminés du polypeptide RRS1-R. Les différents domaines caractéristiques sont représentés.
La figure 2 illustre la séquence en acides aminés du polypeptide RRS1-S. Les différentes domaines caractéristiques sont représentés.
La figure 3 illustre la représentation et la localisation des clones YACS, BACS et cosmides couvrant la région génomique d'intérêt de A.thaliana.
Matériel et Méthodes
a. Analyse par Southern Blot
L'ADN génomique a été isolé de feuilles de plantes ou de plantules d'Arabidopsis selon la technique décrite par Deslandes et al. (1998). Les expériences de type Southern sont réalisées comme décrit par Sambrook et al. (1989) en utilisant 2 μg d'ADN génomique.
b. Extraction de l'ADN de clones BAC, YAC, TAC, cosmidigues, et d'A. tumefaciens
L'extraction d'ADN de clones BAC et TAC a été réalisée suivant une modification du protocole fourni par l'ABRC. 25 mL d'une culture de 12 heures d'un clone BAC dans l'antibiotique approprié sont centrifugés pendant 5 min à 6000 rpm. Le culot est resuspendu dans 4 mL d'un tampon contenant : 50 mM Glucose, 10 mM EDTA, 25 mM Tris, pH 8.0, 5 mg/mL de lyzozyme. Après 5 min d'incubation à température ambiante, les cellules sont lysées par addition de 8 mL de 0,2 N NaOH, 1% SDS. Une nouvelle incubation de 5 min à température ambiante est suivie par l'addition de 6 mL d'acétate de Potassium 3M, pH 4.8. Le mélange est incubé à 0°C pendant 10 min. puis centrifugé 15 min à 13000 rpm. Le surnageant est récupéré, précipité par addition de 0.7 volume d'isopropanol, puis centrifugé 15 min à 13000 rpm. Le culot obtenu est lavé par de l'éthanol 70%, séché 15 min à température ambiante puis resuspendu dans 0.6 mL de tampon TE (10mM tris, pH 8, 1 mM EDTA).
La purification d'ADN de cosmide a été effectuée suivant le protocole de Sambrook et al (1989).
L'extraction d'ADN d'A. tumefaciens a été réalisée suivant un protocole mis au point au laboratoire. 2 mL d'une culture de 12 heures dans du milieu L supplémente par les antibiotiques appropriés sont centrifugés
pendant 4 min à 13000 rpm. Le culot est resuspendu dans 700 μl de tampon CTAB (100 mM Tris HCI, pH 8, 1.4M NaCI, 20 mM EDTA, pH 8, 2 % w/v CTAB (hexadecyltriméthylammonium bromide) auquel est rajouté extemporanément 0.07N de B-mercaptoéthanol. Le mélange incubé pendant 10 min à 65°C est ensuite extrait 2 fois par un volume égal de phénol/chloroforme (1V/1V) suivi par une extraction au chloroforme. La phase aqueuse est ensuite précipitée par 0.7 volume d'isopropanol, le mélange centrifugé pendant 10 min à 13000 rpm et le culot obtenu est resuspendu dans 50 μL d'eau distillée.
c. Matériel végétal et protocole d'inoculation d'Arabidopsis par R. solanacearum
La croissance de plantes d'Arabidopsis ainsi que les conditions d'inoculation de ces plantes par les différentes souches de R. solanacearum ont été décrites par Deslandes et al. (1998).
d. Analyse des séquences d'ADN
Le programme de recherche BLAST (Altschul et al. 1990, 1997) a été utilisé pour l'analyse de séquence et la comparaison dans des bases de données de Genbank, EMBL et Swissprot ainsi que dans des base de données sur Arabidopsis (AatDB Database Arabidopsis).
Exemple 1) Clonage positionne! de RRS1
Ce clonage a été effectué sur l'écotype sensible Col-5 qui contient l'allèle RRS1. La résistance à la souche GMI1000 de Ralstonia solanacearum est, quant à elle, conférée par l'allèle rrsl de l'écotype résistant Nd-1.
Une série de clones YACs chevauchants (Yeast Artificial
Chromosome) construit par le consortium japonais en charge du programme de séquençage du chromosome V d'Arabidopsis thaliana
(http://www.kazusa.or.jp/arabi/chr5/pmap/P1_map_16.html) a été obtenu auprès de l'ABRC (Arabidopsis Biological Resource Center, Ohio State
University, USA). Des marqueurs RFLP présentant un polymorphisme entre les écotypes parentaux Col-5 et Nd-1 ont été générés à partir des extrémités gauches et droites des inserts des clones YACs suivant le protocole de Schmidt et al (1996). Ces différents marqueurs, EW7G12LE (LE, Left End : généré à partir de l'extrémité gauche de l'insert du YAC), 11 H2RE (RE, Right End : généré à partir de l'extrémité droite de l'insert du YAC), 11 H2LE, 4H11 RE ainsi qu'un marqueur T43968 (clone d'ADNc positionné sur le YAC CIC4E12 et obtenu de l'ABRC) ont été utilisés comme marqueurs RFLP afin de localiser plus précisément le locus RRS1. Deux de ces marqueurs (T43968 et EW7G12LE) se sont révélés polymorphes sur les écotypes parentaux et ont permis de restreindre la région contenant le locus RRS1 à une région d'environ 600 kb. Sur les 18 plantes recombinantes restantes, seules 11 lignées présentaient encore un événement de recombinaison entre ces 2 marqueurs et le locus RRS1. Par ailleurs, les marqueurs générés à partir des extrémités des clones YACs ont été utilisés pour réaliser le criblage d'une banque TAMU (Texas A & M University) de BACs (Bacterial Artificial Chromosome), banque obtenue par le biais de l'ABRC. Ce criblage réalisé suivant les conditions fournies par l'ABRC a conduit à l'isolement d'un nombre important de clones BACs. Des marqueurs ont ensuite été générés à partir des extrémités de certains de ces BACs par les techniques de " plasmid rescue " et de PCR inverse (Woo et al., 1994). Ces marqueurs, 1 H19LE, 2G14LE, 21 F10LE , 9N23LE, 27P17LE et 29D23LE ont servi à positionner les différents BACs sélectionnés les uns par rapport aux autres (par digestion de l'ADN des différents BACs et hybridation avec chacune des extrémités isolées). Ces données ont permis de construire une série de clones BACs chevauchants. Ultérieurement, nous avons d'autre part tiré parti de l'existence d'une série de clones TACs chevauchants (Transformation Artificial Chromosome) généré par le consortium japonais. Les clones TACs correspondants (K9E15, K18C1 , K15I22, K2N11) et le clone MFC19 (banque P1, Liu et al., 1995) ont été obtenus par l'ABRC.
Parallèlement à ces études, le nombre de lignées présentant un événement de recombinaison étant relativement faible, 650 plantes F2 issues d'un croisement entre les 2 écotypes parentaux ont été testées afin de caractériser d'autres lignées présentant un tel événement entre les
marqueurs T43968 et EW7G12LE et le locus RRS1. Dans ce but, l'ADN de quelques feuilles de chaque plante F2 a été extrait (Deslandes et al., 1998), digéré par l'enzyme de restriction Bglll qui permet d'observer un polymorphisme avec les marqueurs T43968 et EW7G12LE sur les 2 génotypes parentaux. Les plantes F2 ainsi sélectionnés ont ensuite été autofécondées et les graines obtenues (F3) semées. Le phénotype de ces plantes de troisième génération a été ensuite déterminé par inoculation de la souche GMI1000. Cette approche a permis l'obtention de 15 familles F3 recombinantes entre les marqueurs T43968 et EW7G12LE.
Les marqueurs correspondant aux extrémités de BACs ont ensuite été utilisés comme marqueurs RFLP sur les 11 lignées RILs ainsi que sur les 15 familles F3. Le sous-clonage de BACs et de cosmides par différentes enzymes de restriction a par ailleurs permis de générer d'autres marqueurs RFLP (Tableau 5).
Tableau 5 : Marqueurs RFLP utilisés pour cartographier le locus RRS1 sur 15 familles F3 issues du croisement Col-5 et Nd-1.
Pour chaque famille F3, le génotype révélé par l'utilisation des différents marqueurs RFLP est indiqué dans ce tableau (A : génotype Col-5, B : Génotype Nd-1 , AB : génotype hétérozygote).
• T43968 : marqueur obtenu auprès de l'ABRC (Ohio, USA).
• 1 H19 n°1 , , 9N23 N°2, 9N23 N°18 . fragments des clones BACs T1 H19 et T9N23 (digestion BamHI-Xhol) clones dans le vecteur pKS (Stratagene, USA).
• #419, B1 : cosmides issus des clones K18C1 et T29K4 respectivement. • MFC5, MFC61 et MFC14 : cosmides issus d'une digestion partielle
BamHI du clone MFC19.
• #6.1 : phagemide issus d'une banque de phages Col-0 (zap, Stratagene, don du Pr Lescure).
• B1 n°4 : sous-clone du cosmide B1 • EW7G12LE : extrémité gauche de l'insert du clone YAC EW7G12 (don de W. Gassman).
Ces expériences ont permis de localiser le gène RRS1 sur 3 clones BACs chevauchants (T29K4 , T25P9 et MFC19), couvrant une région d'environ 170 kb (Figure 3).
Des contigs de cosmides couvrant l'ensemble des 2 BACs ont été obtenus par digestion partielle par l'enzyme BamHI et sous-clonage de l'ADN des 2 BACs dans le vecteur cosmidique SLJ75515 (don du Dr. J. Jones, The Sainsbury Laboratory). L'utilisation de ces cosmides et de sous- clones de ces cosmides obtenus par digestion avec l'enzyme HindIII et insertion dans le vecteur pBlueScript a permis de localiser RRS1 sur un cosmide de 18 Kb, le cosmide B1 issu du clone BAC T29K4. Une banque d'ADNc de l'écotype Col-0 préparé dans le vecteur IZAP (don de B. Lescure dans notre institut) a ensuite été criblée avec l'ADN de l'insert du cosmide B1 et a permis d'isoler plusieurs clones d'ADNc dont la séquence nucléotidique a été déterminée. Dans le même temps, la séquence nucléotidique d'un clone TAC, K9E15 qui recouvre le cosmide B1 , a été délivrée dans les banques de données par le consortium japonais. Certains clones d'ADNc dont la séquence nucléotidique était connue, ont ainsi pu être localisés sur le cosmide B1. L'un deux, noté #6.1 , utilisé comme marqueurs RFLP ainsi
qu'un marqueur CAPS, B69.1 , ont permis de délimiter une région d'environ 10 kb du cosmide B1 contenant le locus RRS1. Connaissant la séquence du cosmide B1 , il a été possible de générer plusieurs couples d'amorce afin d'identifier des marqueurs PCR de type CAPS. Deux plantes F3 recombinantes, 324 et 566, présentant un événement de recombinaison au sein du cosmide B1 ont permis d'identifier le gène RRS1 .
Exemple 2) Isolement et caractérisation de RRS1
Une banque de cosmides préparée à partir d'ADN de l'écotype Nd-
1 a été construite dans le vecteur SLJ75515 dans le groupe de J. Beynon (Horticultural Research International, Wellesbourne, GB). Cette banque nous a été gracieusement donnée et son criblage a été réalisé (selon les conditions d'hybridations de type Southern décrites par Deslandes et al., 1998) à l'aide de l'ADN du clone T1 H19 qui contient le locus RRS1. Plusieurs clones cosmidiques ont été isolés et caractérisés. L'un d'entre eux, le clone H, a été sélectionné car il présente un profil de restriction identique à celui de B1 , cosmide sur lequel RRS1-S a été localisé par clonage positionnel. La séquence du gène RRS1-S étant connue, il a été possible de générer des amorces oligonucléotidiques qui ont permis de déterminer la séquence nucléotidique de la région correspondant à RRS1 du cosmide H. La détermination de la séquence nucléotidique a été réalisée sur un séquenceur Perkin-Elmer 373 (kit Dye Terminator) et les différentes séquences ont été assemblées en utilisant les programmes " Staden " d'assemblages de séquences, disponibles sur station UNIX (Roger Staden, MRC, Cambridge, UK). Les différentes amorces utilisées sont les amorces de la série " K " soit toutes les amorces dont le nom commence par la lettre " K " (voir Tableau 6 ).
Exemple 3) Complémentation des écotypes sensibles et résistants par RRS1-R et RRS1-S a. Constructions
Le vecteur cosmidique SLJ 75515 des clones H et B1 présente l'avantage d'être directement transférable chez Agrobacterium tumefaciens.
Ce transfert de cosmides d'E. coli (souche XLI Blue pour le cosmide B1 et souche DH12S pour le cosmide H) dans A. tumefaciens (souche GV3101 contenant le plasmide helper pMP90) est réalisée par conjugaison triparentale à l'aide d'une troisième souche, pRK2013 (E. coli) d'après le protocole Tolmasky et al. (1984). Les colonies d'A. tumefaciens contenant les cosmides H ou B1 sont sélectionnées sur un milieu L gélose supplémente par de la tétracycline (10μg/ml ) et de la gentamycine (25μg/ml). Les boîtes sont ensuite incubées à 28°C pendant 3 jours.
La présence de l'ADN cosmidique est contrôlée par amplification PCR à l'aide d'amorces spécifiques des inserts des clones H et B1 (couple
RT1/RT2 par exemple). Par ailleurs, des expériences de type Southern permettent de vérifier la stabilité des ADN cosmidiques dans A. tumefaciens
Par ailleurs, l'insert du cosmide B1 a été sous clone à l'aide de l'enzyme BamHI qui génère deux fragments : 9.68 et 8.03 kb. Pour le cosmide H, 2 fragments BamHI de taille comparable à ceux du cosmide B1 ont été obtenus. Le site BamHI n'est présent qu'une seule fois dans les séquences génomiques de RRS1-R et RRS1-S. Chacun des 2 sous- fragments issus des cosmides B1 et H a été introduit dans le vecteur binaire pDHB321.1 fourni par le Dr. Bouchez (INRA Versailles). Après transformation dans une souche d'E. coli (XLI BlueMR, Stratagene, USA), l'ADN plasmidique est extrait (Maniatis 1978). La souche d'A. tumefaciens GV3101 est ensuite transformée par la méthode du choc thermique (Holsters et al., 1978). Les colonies d'A. tumefaciens contenant les sous- clones des cosmides B1 et H sont ensuite sélectionnées sur milieu L gélose contenant de la gentamycine (25μg/ml) et de la Kanamycine (50μg/ml). Les boîtes sont ensuite incubées à 28°C pendant 48 h.
La présence de l'ADN plasmidique est contrôlée par amplification PCR à l'aide d'amorces spécifiques des 2 sous-fragments des clones H et B1. Par ailleurs, des expériences de type Southern permettent de vérifier la stabilité des ADN plasmidiques dans A. tumefaciens. Ces constructions sont ensuite introduites dans le génome des plantes Col-5 et Nd-1.
b. Transformation des écotypes Nd-1 et Col-5 par Agrobacterium tumefaciens
Afin de démontrer la fonction des gènes candidats, des expériences de complémentation des phénotypes sensibles et résistants par les cosmides H et B1 ont été réalisées. Les techniques classiques de transformation d'Arabidopsis par A. tumefaciens (Clough et Bent 1999) ont été utilisées pour générer les plantes transgéniques décrites dans ce travail. Les graines des plantes transformées par A. tumefaciens (génération T1 ) sont déposées dans des terrines contenant une couche de perlite (environ 2cm) recouverte d'une couche de sable de même épaisseur imbibées d'une solution de l'herbicide gluphosinate (nom commercial : BASTA) à une concentration de 15 mg/L. Les terrines sont ensuite placées pendant 4 jours dans l'obscurité à 4°C, puis transférées en condition de jours longs (16h de jour/ 8h de nuit). Après environ 10 jours, les plantes résistantes sont sélectionnées et repiquées individuellement. La descendance T2 de chaque plante transgénique T1 obtenue par autofécondation est utilisée pour des expériences d'inoculation par l'agent pathogène.
c. Résultats obtenus
c.1 Le gène RRS1-R confère la résistance à la souche GMI1000 de Ralstonia solanacearum.
Des expériences de complémentation réalisées à l'aide du cosmide H contenant l'allèle RRS1-R introduites dans l'écotype Col-5 ont été effectuées. Après sélection par l'herbicide BASTA, 12 plantes transgéniques ont pu être isolées (lignées notées CH1.1 à CH1.12). Ces plantes ont été autofécondées afin d'obtenir la descendance T2 de chacune d'elle. et 24 individus de chaque lignée transgénique obtenue ont été inoculés par la souche GMI1000 de R. solanacearum. Alors que des plantes témoins (Col-5) ont flétri 7 jours après inoculation par le pathogène, les plantes transgéniques contenant l'allèle RRS1-R de Nd-1 n'ont quant à elles présenté aucun symptôme de flétrissement. Ces résultats indiquent donc que le gène RRS1-R peut conférer la résistance à la souche GMI1000 de R. solanacearum dans des plantes de fond génétique Col-5. L'expression de
RRS1-R peut entraîner une diminution de la multiplication bactérienne dans la plante infectée, ce qui pourrait expliquer l'absence de symptômes.
c.2 Le gène RRS1-R confère la résistance à différentes souches de Ralstonia solanacearum.
Un certain nombre de souches de R. solanacearum provoque des réponses (maladie ou absence de symptômes) identiques à celle de la souche GMI1000 sur les écotypes Nd-1 et Col-5. Ces souches isolées de plantes-hôtes très diverses (cf tableau) proviennent de différentes régions du globe. La capacité du gène RRS1-R à conférer la résistance à ces différentes souches a donc été testée. Les plantes transgéniques Col-5 contenant le gène RRS1-R ont donc été infectées par ces différentes souches Alors que des plantes témoins (Col-5) ont flétri 7 jours après inoculation par le pathogène, les plantes transgéniques contenant l'allèle RRS1-R de Nd-1 n'ont quant à elles présenté aucun symptôme de flétrissement. Ce résultat indique que le gène RRS1-R est capable de conférer la résistance à différentes souches de R. solanacearum.
c.3 Le gène RRS1-S confère-t-il la sensibilité à la souche GMI1000 de
R. solanacearum .
La réponse de plantes Nd-1 transformées par le gène RRS1-S de l'écotype sensible Col-5 a été testée. 104 plantes ont été sélectionnées pour leur résistante au BASTA (B1.1 à B1 .104) et autofécondées. Ces plantes transgéniques ont été inoculées par la souche GMI1000. Une seule lignée transgénique (B1.3) a développé des symptômes de flétrissement alors que les autres lignées n'ont présenté aucun symptôme dans des conditions provoquant le flétrissement total de plantes témoins Col-5.
Exemple 4) Expériences de complémentation par des clones génomigues RRS1-S et RRS1-R.
Une digestion Sphl du cosmide B1 a permis d'obtenir un fragment de 9393 pb (fragment allant de la base 6557 à la base 15950, d'après la numérotation de la séquence du clone BAC K9E15 publiée par le consortium
japonais) couvrant la totalité du gène RRS1-S (promoteur, introns/exons, séquence de signal de polyadénylation). Ce fragment Sphl a été ligaturé dans un plasmide pUC19 digéré par l'enzyme Sphl et déphosphorylé. Cette construction a ensuite été introduite dans la souche DH5α d'E. coli. Ce clone est défini comme étant le clone génomique RRS1 et est appelé B1puc3.
Le même type d'expérience a été réalisé à partir du cosmide H. Le clone génomique obtenu est appelé Hpuc2.
En parallèle, le vecteur binaire pDHB321.1 a été digéré par l'enzyme BamHI (site unique de clonage). La ligature des inserts (Sphl/Sphl) des clones B1 puc3 et Hpuc2 (issus d'une digestion Sphl) dans le vecteur binaire (BamHI/BamHI) a donc nécessité l'utilisation d'un adaptateur afin de ligaturer les extrémités BamHI et Sphl entre elles. Deux amorces oligonucléotidiques interviennent dans la synthèse de cet adaptateur : il est constitué d'un mélange équimolaire (5 μM) des amorces notées " BamSph " (5' -GAT CGC GGC CGC CAT G- 3') et " Not " (5' -GCG GCC GC -3'). Le mélange est soumis à une température de 95°C pendant 3 minutes. Le retour à une température ambiante s'effectue ensuite naturellement.
A 100 ng de vecteur pDHB321.1 digéré par l'enzyme BamHI, 1 μl de la solution d'adaptateur à 5 μM est ajouté. La ligature du vecteur linéarisé et de l'adaptateur s'effectue dans un volume final de 10 μl pendant 12 heures à 4°C. La réaction est alors arrêtée par dilution (ajout de 20 μl d'eau). L'excès d'adaptateur est par la suite éliminé par un passage du mélange de ligature sur une colonne microspin S400 (Pharmacia, ref).
L'ADN des clones B1puc3 et Hpuc2 est digéré par l'enzyme Sphl. Après inactivation de l'enzyme à 65°C pendant 20 minutes, un aliquote de chaque digestion (environ 100 ng) est utilisé pour réaliser une ligature avec le vecteur pDHB321.1+adaptateur. Ces constructions sont alors introduites dans la souche DH5α d'E. coli et sélectionnés sur un milieu L gélose contenant 50 μg/ml de kanamycine (résistance conférée par le vecteur binaire) : les clones qui contiennent l'insert provenant des clones B1 et H (environ 9400 pb) sont appelés B1 MT9 et HMTB respectivement. L'ADN plasmidique extrait de ces clones est ensuite utilisé pour transformer la souche GV3101 d'A. tumefaciens par choc thermique. Les colonies sont sélectionnées sur un milieu L gélose contenant 25 μg/ml de gentamycine (résistance conférée par le plasmide helper pMP90) et 50 μg/ml de
kanamycine. Les colonies d'A. tumefaciens transformées par l'ADN des clones B1 MT9 et HMTB sont appelées B1 T9.1 et HMTB2 respectivement.
Exemple 5) Expression des gènes RRS1-S et RRS1-R par des expériences de type Northern
L'expression des gènes RRS1-S et RRS1-R a été étudiée dans des plantes non infectées par des expériences de type Northern. Après extraction de l'ARN total par la technique décrite par Lummerzheim (1993), les ARNs polyadénylés ont été purifiés par utilisation du Kit Dynabeads (Dynal, USA). Après dosage à 260 nm, les ARNms ont été déposés sur gel en condition dénaturante (Marco et al. 1990), puis transférés sur une membrane de nitrocellulose (Hybond N+, Amersham Pharmacia Biotech). L'hybridation a été réalisée suivant le protocole donné par le fournisseur.
Exemple 6) Obtention des clones d'ADNc pleine longueur par RACE PCR
L'obtention de clones d'ADNc pleine longueur a nécessité l'utilisation d'un kit de RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) PCR. Les détails des protocoles expérimentaux présentés ci dessous sont valables pour les clones d'ADNc issus des écotype Col-5 et Nd-1.
a. RACE PCR (amplification rapide des extrémités d'ADNc)
Les extrémités 5' et 3' des clones d'ADNc ont été générés par RACE PCR en utilisant le kit " Smart Race cDNA Amplification " (Clontech, USA). Les ARN totaux ont été extraits à partir de plantules des écotypes Col- 5 et Nd-1 âgées de deux semaines suivant le protocole de Lummerzheim et al. (1993). Les réactions de transcriptase reverse ont été réalisées sur 1 μg d'ARN totaux d'après les conditions fournies par le fabricant. Les premiers brins des ADNc ont été synthétisés grâce aux amorces suivantes :
- 5'CDS et SMART II oligo (Clontech) pour l'obtention des extrémités 5'.
- 3'CDS (Clontech) pour l'obtention des extrémités 3'.
Les amorces oligonucléotidiques utilisées pour l'amplification de l'extrémité 5' des ADNc RRS1 (Col-5) et rrsl (Nd-1) sont:
- l'amorce universelle UPM (Universal Primer Mix, kit Smart Race) - l'amorce anti-sens RT4, spécifique des ADNc RRS1-S/RRS1-R (voir tableau 2).
Les amorces oligonucléotidiques utilisées pour l'amplification de l'extrémité 3' des ADNc RRS1 (Col-5) et rrsl (Nd-1) sont:
- l'amorce universelle UPM (Universal Primer Mix, kit Smart Race) - l'amorce RT6, spécifique des ADNc RRS1-S/RRS1-R (voir tableau 2). Les amorces RT4 et RT6 ont été choisies de sorte que les produits d'amplification des extrémités 5' et 3' aient en commun une région de 500 pb contenant un site unique de restriction BamHI. Les conditions d'amplifications des extrémités 5' et 3'sont les suivantes :
-5 cycles (94°C pendant 30 secondes, 72°C pendant 5 minutes) -5 cycles (94°C pendant 30 secondes, 70°C pendant 30 secondes, 72°C pendant 5 minutes) -30 cycles (94°C pendant 30 secondes, 68°C pendant 30 secondes, 72°C pendant 5 minutes)
La taille des produits d'amplification des extrémités 5' et 3' est de : 3708 pb et 1230 pb pour Col-5 ; 3714 et 1231 pb pour Nd-1 respectivement. Ces produits PCR ont été clones dans le vecteur pGemT-easy (Promega). Le séquençage de ces clones a permis de déterminer précisément le début (5') et la fin (3') de la région transcrite non traduite des clones d'ADNc issus des écotypes Col-5 et Nd-1. La taille des clones d'ADNc pleine longueur issus des plantes Col-5 et Nd-1 est respectivement de 4336 et 4343 pb.
b. Obtention des clones d'ADNc pleine taille
Des clones d'ADNc pleine taille ont été générés (soit 4336 et 4343 pb) en réalisant une double digestion BamHI (site unique) et Notl (site présent au niveau du site multiple de clonage du vecteur pGemT-easy) sur un mélange de 2 plasmides dans le but d'exciser les inserts correspondants
aux extrémités 5' et 3'. Les inserts 5' et 3' ont alors été ligaturés ensemble dans le plasmide pGemT-easy digéré par Notl et déphosphorylé. Après transformation de bactéries DH5α avec le mélange de ligature et étalement sur milieu sélectif (milieu L+ampicilline 50 μg/mL+ 0.5 mM IPTG + 80 μg/mL X-Gal), les clones positifs contenant le clone d'ADNc pleine taille ont été sélectionnés en réalisant un criblage PCR sur colonies à l'aide des amorces K3.5 et RT2 (voir tableau 6) qui sont spécifiques de chacune des extrémités 5' et 3' respectivement.
Une seconde expérience de RACE PCR a été réalisée sur les premiers brins des ADNc issus de la réaction de transcriptase reverse décrite ci-dessus dans le but d'introduire deux sites de restriction Sali, l'un étant situé juste en amont du codon initiateur ATG (point d'initiation de la traduction), l'autre étant situé après le signal de polyadénylation. Les deux couples d'amorces utilisés pour amplifier les extrémités 5' et 3' sont 5'RRSall/ RT8 et 3'RRSall/ RT7 respectivement.
Les conditions d'amplification, le clonage des produits PCR ainsi que la méthode d'obtention des clones d'ADNc pleine longueur sont les mêmes que celles décrites précédemment si ce n'est que le site unique de restriction commun aux extrémités 5' et 3' est un site Aflll. L'introduction de sites Sali de part et d'autre de la séquence du clone d'ADNc a pour but de faciliter son clonage dans différents types de vecteurs.
Exemple 7) Expérience d'échange de domaine par obtention de clones chimères RRS1 -S/RRS1-R L'ADN plasmidique utilisé pour réaliser les expériences d'échange de domaine provient des clones génomiques B1 puc3 et Hpuc2 décrits précédemment. Ces 2 plasmides sont digérés par l'enzyme BamHI dont le site de restriction est localisé dans la région présentant des similitudes avec un gène de résistance (5ιeme exon). Cette digestion génère 2 fragments, l'un de 4881 pb (clone B1 puc3 contenant le gène RRS1-S) contenant la partie 5' du clone génomique (promoteur et partie codante du gène RRS1-S jusqu'au niveau du 5ιeme exon) et un fragment de 7180 pb (clone B1 puc3) contenant quant à lui la partie 3' du clone génomique (4512 pb contenant la fin de la région présentant des similitudes avec le gène de résistance, la région
similaire au gène codant un facteur de transcription de type WRKY et la région 3' transcrite non traduite ; 2668 pb de vecteur plasmidique pUC19).
La taille des fragments générés par la digestion BamHI du plasmide Hpuc2 est du même ordre de grandeur que celle des fragments obtenus par digestion BamHI du plasmide B1 puc3.
Après digestion par l'enzyme BamHI, un aliquote de chacun des fragments d'ADN générés est déphosphorylé. Le reste est déposé sur gel afin de purifier les fragments correspondant à la partie 5' de chaque clone génomique. Le fragment d'ADN correspondant à la partie 5' du gène RRS1- S est ensuite ligaturé avec la partie 3' du gène RRS1-R. De même, le fragment d'ADN correspondant à la partie 5' du gène RRS1-R est ligaturé avec la partie 3' du gène RRS1-S. Ces constructions sont ensuite introduites chez E. coli (souche DH5α) et ont été respectivement appelées 3BH (5'RRS1-S/3'RRS1-R) et 6HB (5'RRS1-R 3'RRS1-S). Des amorces spécifiques des régions 5' et 3' des gènes RRS1-S et RRS1-R ont permis de vérifier les constructions. L'ADN de chaque plasmide a été purifié, digéré par Sphl, enzyme permettant l'excision des gènes dans leur intégralité. Les inserts ont ensuite été ligaturés dans le vecteur plasmidique pDHB321.1 digéré par l'enzyme BamHI et dont les extrémités ont été rendues compatibles avec des extrémités Sphl grâce à la présence d'un adaptateur (cf. plus haut). Ces constructions ont été successivement introduites dans la souche DH5α (les clones sont appelés 3BHMT7 (5'RRS1-S/3'RRS1-R) et 6HBMT2 (5'RRS1-R/3'RRS1-S)) puis dans la souche GV3101 d'A. tumefaciens (clones appelés 3BHMT7. 1 et 6HBMT2.1).
Exemple 8) Recherche de protéines interagissant avec les protéines rrsl et RRS1 par la technigue de double hybride chez la levure
Afin d'identifier des protéines interagissant avec les protéines RRS1-S et RRS1-R, le système de double hybride chez la levure sera utilisé (kit Clontech, Matchmaker Gal4 Two-Hybrid System 3). Les clones d'ADNc entiers correspondant aux gènes RRS1-S et RRS1-R ainsi que des sous- fragments correspondant à certains domaines particuliers de ces gènes (domaines TIR, NBS, LRR,WRKY) seront utilisés pour cribler des banques d'ADNc dans le but d'isoler des gènes dont les produits interagissent avec les produits de ces fragments d'ADN.
Exemple 9) Modulation de l'expression des gènes RRS1-S et RRS1-R par approches sens et antisens
En ce qui concerne les approches antisens, deux constructions différentes ont été réalisées.
La première consiste en un fragment de 299 pb (position 3642 à 3941 de la séquence SEQ ID N°8) fragment correspondant au domaine WRKY de la protéine RRS1-1. Des amorces PCR (B1AS5' et B1AS3' qui permettent l'introduction d'un site Ncol et Sali respectivement) ont été générées pour amplifier ce fragment d'ADN. L'amplification a été réalisée sur des ADNc simple brin résultant de la " transcription reverse " d'ARN total de feuilles de plantes Col-5 âgées de 2 semaines. La polymérase utilisée est la Deep Vent (Biolabs, New England) et les conditions d'amplification sont celles décrites par le fabricant. Le produit d'amplification B1AS57B1AS3'est digéré par les enzymes Ncol et Sali et le produit de digestion déposé sur gel et purifié (Kit Jetsorb, Quantum Appligene). Ce fragment d'ADN est ensuite ligaturé dans le vecteur PA1 proterm 2 (don du Pr. Lescure, notre institut) digéré par les enzymes Ncol et Sali. Cette construction a été introduite dans la souche DH5α d'E. coli. L'ADN plasmidique correspondant a été purifié, digéré par l'enzyme BamHI, ce qui permet l'excision d'un insert comprenant le promoteur du gène EF1α, les 299 pb du gène RRS1-S en orientation antisens ainsi que le terminateur du gène EF1a (Axelos et al., 1989). Ce fragment BamHI a ensuite été inséré par ligature dans le vecteur binaire pDHB321.1 digéré par BamHI. Cette nouvelle construction a été introduite dans la souche DH5α d'E. coli . L'ADN plasmidique purifié a servi à transformer la souche GV3101 d'A. tumefaciens.
La seconde construction antisens a été réalisée en excisant un fragment EcoRI de l'insert du clone d'ADNc pleine longueur RRS1-R (séquence SEQ ID N°4). Le fragment d'ADN ainsi généré (taille d'environ 3930 pb) a été introduit dans le vecteur pKMB (Mylne et Botella, 1998) digéré par EcoRI. Ce vecteur contient quant à lui le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou fleur (CaMV 35S) ainsi que le terminateur correspondant. Cette construction a été successivement introduite dans les souches DH5α d'E coli et GV3101 d'A. tumefaciens par conjugaison triparentale.
Les souches d'A. tumefaciens obtenues (29B1ASMT2 : fragment de 299 pb et J1 : fragment de 3930 pb) ont permis la transformation des écotypes Nd-1 et Col-5.
Tableau 6 :
TABLEAU 6 suite:
Références Bibliographiques
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Claims
1. Acide nucléique comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'une séquence nucléotidique codant pour une protéine de résistance d'une plante à un pathogène, ladite protéine comprenant :
a) une partie N-terminale comprenant au moins une séquence d'acides aminés riche en leucine et au moins un site de liaison aux nucléotides ; et
b) une partie C-terminale comprenant un domaine de liaison à l'ADN comprenant la séquence d'acides aminés " WRKYGQK ", ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.
2. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il possède au moins 40%, avantageusement 60%, préférentiellement 80% et de manière tout à fait préférée 90%, d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°1 , ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.
3. Acide nucléique selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il possède au moins 40%, avantageusement 60%, préférentiellement 80% et de manière tout à fait préférée 90%, d'identité en nucléotides avec une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences suivantes :
a) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 260 au nucléotide en position 636 de l'acide nucléique SEQ ID N° 1.
b) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 746 au nucléotide en position 1856 de l'acide nucléique SEQ ID N° 1.
c) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 1937 au nucléotide en position 2236 de l'acide nucléique SEQ ID N° 1. d) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 2326 au nucléotide en position 3249 de l'acide nucléique SEQ ID N° 1.
e) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 3438 au nucléotide en position 4291 de l'acide nucléique SEQ ID N° 1.
f) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 5377 au nucléotide en position 5499 de l'acide nucléique SEQ ID N° 1.
g) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 6085 au nucléotide en position 6532 de l'acide nucléique SEQ ID N° 1.
ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.
4. Acide nucléique selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il possède au moins 40%, avantageusement 60%, préférentiellement 80% et de manière tout à fait préférée 90%, d'identité en nucléotides avec une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences suivantes :
a) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 637 au nucléotide en position 745 de l'acide nucléique SEQ ID N° 1.
b) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 1857 au nucléotide en position 1936 de l'acide nucléique SEQ ID N° 1;
c) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 2237 au nucléotide en position 2325 de l'acide nucléique SEQ ID N° 1 ;
d) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 3250 au nucléotide en position 3437 de l'acide nucléique SEQ ID N° 1 ;
e) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 4292 au nucléotide en position 5376 de l'acide nucléique SEQ ID N° 1 ; f) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 5500 au nucléotide en position 6084 de l'acide nucléique SEQ ID N° 1.
ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.
5. Acide nucléique selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il comprend au moins 15 nucléotides consécutifs de la séquence nucléotidique SEQ ID N°4, ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.
6. Acide nucléique selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il possède au moins 40%, avantageusement 60%, préférentiellement 80% et de manière tout à fait préférée 90%, d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°5, ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.
7. Acide nucléique selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il possède au moins 40%, avantageusement 60%, préférentiellement 80% et de manière tout à fait préférée 90%, d'identité en nucléotides avec une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences suivantes :
a) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 1184 au nucléotide en position 1560 de l'acide nucléique SEQ ID N°5.
b) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 1670 au nucléotide en position 278 de l'acide nucléique SEQ ID N°5.;
c) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 2861 au nucléotide en position 3160 de l'acide nucléique SEQ ID N°5;
d) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 3254 au nucléotide en position 4171 de l'acide nucléique SEQ ID N°5;
e) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 4360 au nucléotide en position 5213 de l'acide nucléique SEQ ID N°5: f) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 6302 au nucléotide en position 6424 de l'acide nucléique SEQ ID Nc5;
g) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 6953 au nucléotide en position 7136 de l'acide nucléique SEQ ID N°5.
ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.
8. Acide nucléique selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il possède au moins 40%, avantageusement 60%, préférentiellement 80% et de manière tout à fait préférée 90%, d'identité en nucléotides avec une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences suivantes :
a) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 1561 au nucléotide en position 1669 l'acide nucléique SEQ ID N° 5;
b) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 2781 nucléotide en position 2860 l'acide nucléique SEQ ID N°5. ;
c) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 3161 nucléotide en position 3253 'acide nucléique SEQ ID N°5;
d) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 4172 nucléotide en position 4359 l'acide nucléique SEQ ID N°5;
e) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 5214 nucléotide en position 6301 l'acide nucléique SEQ ID N°5;
f) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 6425 nucléotide en position 6592 l'acide nucléique SEQ ID N°5.
ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.
9. Acide nucléique selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il comprend au moins 15 nucléotides consécutifs de la séquence nucléotidique SEQ ID N°8, ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.
10. Acide nucléique hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique selon l'une quelconques des revendications 1 à 9.
11. Sonde nucléotidique hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence avec un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.
12. Amorce nucléotidique hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence avec un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.
13. Acide nucléique selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les polynucléotides de séquences SEQ ID N°1 1 à 61 .
14. Séquence nucléotidique anti-sens comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.
15. Vecteur recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 10.
16. Vecteur recombinant selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur d'expression fonctionnel dans un cellule hôte végétale.
17. Vecteur recombinant selon l'une des revendications 15 et 16, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur d'origine fongique, bactérienne ou virale.
18. Cellule hôte transformée avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 10 ou avec un vecteur recombinant selon l'une des revendications 15 à 17
19. Cellule hôte transformée selon la revendication 18, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule d'origine procaryote ou eucaryote..
20. Cellule hôte transformée selon la revendication 19, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule d'Agrobactehum tumefaciens.
21. Cellule hôte transformée selon la revendication 19, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule végétale d'Arabidopsis thaliana, de colza, de maïs ou de tabac.
22. Organisme multicellulaire végétal recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une cellule hôte transformée selon l'une des revendications 18 à 21.
23. Plante transformée avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 10, une séquence nucléotidique selon la revendication 13 ou un vecteur recombinant selon l'une des revendications 15 à 17.
24. Plante transformée comprenant, sous une forme intégrée dans son génome, un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 10, une séquence nucléotidique selon la revendication 13 ou un vecteur recombinant selon l'une des revendications 15 à 17
25. Procédé d'obtention d'une plante transformée, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
a) Obtention d'une cellule hôte transformée végétale selon l'une des revendications 19 ou 21 ;
b) Régénération d'une plante entière à partir de la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a) ; c) Sélection des plantes obtenues à l'étape b) ayant intégré un polynucléotide d'intérêt choisi parmi les acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 10.
26. Procédé d'obtention d'une plante transformée, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
a) obtention d'une cellule hôte d'Agrobactehum tumefaciens selon la revendication 20 ;
b) transformation de la plante par infection avec des cellules d'Agrobactehum tumefaciens obtenues à l'étape a) ;
c) sélection des plantes ayant intégré un polynucléotide d'intérêt choisi parmi les acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 10.
27. Procédé d'obtention d'une plante transformée, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
a) transfecter une cellule de plante avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 10 ou un vecteur recombinant selon l 'une des revendications 15 à 17 ;
b) régénérer une plante entière à partir des cellules de plante recombinantes obtenues à l'étape a) ;
c) sélectionner les plantes ayant intégré l'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 10 ou le vecteur recombinant selon l 'une des revendications 15 à 17.
28. Procédé d'obtention d'une plante transformée selon l'une des revendications 25 à 27, caractériser en ce qu'il comporte en outre les étapes de : d) croisement entre elles de deux plantes transformées telles qu'obtenues à l'étape c) ;
e) sélection des plantes homozygotes pour l'acide nucléique d'intérêt.
29. Procédé d'obtention d'une plante transformée selon l'une des revendications 25 à 27, caractérisé en ce qu'il comprend en outre les étapes de :
d) croisement d'une plante transformée obtenue à l'étape c) avec une plante de la même espèce ;
e) sélection des plantes issues du croisement de l'étape d) ayant conservé l'acide nucléique d'intérêt.
30. Plante transformée telle qu'obtenue selon le procédé selon l'une quelconque des revendications 25 à 29.
31. Semence d'une plante transformée selon l'une quelconque des revendications 23, 24 et 29.
32. Semence de plante dont les cellules constitutives comprennent dans leur génome un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 10.
33. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 10 pour l'expression in vitro ou in vivo d'un protéine choisie parmi la protéine RRS1-S RRS1-R d'un fragment peptidique de celle-ci.
34. Utilisation selon la revendication 32, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une expression in vivo chez une plante transformée avec un tel acide nucléique.
35. Utilisation d'une séquence nucléotidique selon la revendication 14, ou d'un vecteur recombinant comprenant une séquence nucléotidique selon la revendication 14, pour inhiber ou pour bloquer l'expression du gène codant pour la protéine RRS1-S ou pour la protéine RRS1-R.
36. Procédé de détection d'un acide nucléique constitutif du gène RRS1-S ou RRS1-R dans un échantillon, comprenant les étapes de :
a) mettre en contact une sonde ou une pluralité de sondes selon la revendication 11 avec l'acide nucléique susceptible d'être contenu dans l'échantillon ;
b) détecter l'hybride éventuellement formé entre l'acide nucléique de l'échantillon et la ou les sondes.
37. Kit ou nécessaire de détection d'un acide nucléique constitutif du gène RRS1-S ou RRS1-R dans un échantillon, comprenant :
a) une sonde ou une pluralité de sondes selon la revendication 11 ;
b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'hybridation.
38. Procédé pour amplifier un acide constitutif du gène RRS1-S ou RRS1-R dans un échantillon, comprenant les étapes de :
a) mettre en contact un couple d'amorces selon l'une des revendications 12 et 13 avec l'acide nucléique susceptible d'être contenu dans l'échantillon ;
b) réaliser au moins un cycle d'amplification de l'acide nucléique contenu dans l'échantillon ;
c) détecter l'acide nucléique éventuellement amplifié.
39. Kit ou nécessaire pour l'amplification d'un acide nucléique dans un échantillon, comprenant : a) un couple d'amorces selon l'une des revendications 12 et 13;
b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réalisation de la réaction d'amplification.
40. Polypeptide codé par un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.
41. Polypeptide selon la revendication 40, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence en acides aminés SEQ ID N° 9 ou un polypeptide ayant au moins 40% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N°9.
42. Polypeptide selon la revendication 40, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence en acides aminés SEQ ID N° 10 ou un polypeptide ayant au moins 40% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N°10.
43. Polypeptide comprenant des modifications d'acides aminés de
1 , 2, 3, 4, 5, 10 à 20 substitutions, additions ou délétions d'un acide aminé par rapport à la séquence d'acides aminés d'un polypeptide selon l'une des revendications 41 et 42.
44. Polypeptide comprenant au moins 5 acides aminés consécutifs d'un polypeptide selon l'une des revendications 40 à 43.
45. Polypeptide de fusion, caractérisé en ce qu'il comprend le partie N-terminale du polypeptide RRS1-S fusionnée avec la partie C-terminale du polypeptide RRS1-R.
46. Polypeptide de fusion, caractérisé en ce qu'il comprend la partie N-terminale du polypeptide RRS1-R fusionnée avec la partie C-terminale du polypeptide RRS1 -S.
47. Acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 45 et 46.
48. Anticorps dirigé contre un polypeptide selon l'une des revendications 40 à 46.
49. Procédé pour détecter la présence d'un polypeptide selon l'une des revendications 40 à 44 dans un échantillon, comprenant les étapes de :
a) mettre en contact l'échantillon avec un anticorps selon la revendication 45 ;
b) détecter le complexe antigène/anticorps éventuellement formé.
50. Kit ou nécessaire de diagnostic pour la détection de la présence d'un polypeptide selon l'une des revendications 40 à 44 dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend :
a) un anticorps selon la revendication 48;
b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la détection des complexes antigène/anticorps formés.
51 . Procédé pour cribler une substance candidate se fixant sur un polypeptide RRS1-S ou RRS1-R, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de :
a) préparer un polypeptide selon l'une des revendications 40 à 44 ;
b) obtenir une substance candidate à tester
c) mettre en contact le polypeptide de l'étape a) avec la substance candidate de l'étape b) ; d) détecter le complexe éventuellement formé entre le polypeptide et la substance candidate.
52. Kit ou nécessaire pour cribler une substance candidate se fixant sur un polypeptide RRS1-S ou RRS1-R, comprenant :
a) un polypeptide selon l'une des revendications 40 à 44.
b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la détection des complexes formés entre le polypeptide et une substance candidate à tester.
53. Procédé de criblage d'une substance candidate se fixant sur le polypeptide RRS1-S ou RRS1-R, comprenant les étapes de :
a) obtenir un premier acide nucléique codant pour une protéine de fusion comprenant une partie du polypeptide d'intérêt fusionné au domaine de liaison à l'ADN d'une protéine transactivatrice telle que Gal4 ;
b) obtenir un second acide nucléique codant pour une protéine de fusion comprenant la substance candidate fusionnée au domaine de transcription d'une protéine transactivatrice telle que Gal4 ;
c) fournir un acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique codant pour un marqueur détectable, placée sous le contrôle d'une séquence de régulation reconnue par la protéine transactivatrice telle que Gal4;
les acides nucléiques a), b) et c) étant insérés dans des vecteurs appropriés ; et
d) co-transfecter des cellules de levure simultanément avec lesdits vecteurs :
e) détecter l'expression de la séquence nucléotidique codant pour le marqueur détectable.
54. Kit ou nécessaire pour le criblage d'une substance candidate se fixant sur le polypeptide RRS1-S ou RRS1-R, comprenant :
a) un premier acide nucléique codant pour une protéine de fusion comprenant une partie du polypeptide d'intérêt fusionné au domaine de liaison à l'ADN d'une protéine transactivatrice telle que Gal4 ;
b) le cas échéant, un second acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique codant pour un marqueur détectable, placée sous le contrôle d'une séquence de régulation reconnue par la protéine transactivatrice telle que Gal4 ;
c) un troisième acide nucléique codant pour une protéine de fusion comprenant la substance candidate fusionnée au domaine de transcription d'une protéine transactivatrice telle que Gal4 ;
55. Substance capable de se fixer sur le polypeptide RRS1-S ou RRS1-R, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue par une procédé selon l'une des revendications 48 et 50.
56. Procédé de criblage d'un acide nucléique interagissant avec un polypeptide selon l'une des revendications 40 à 44, comprenant les étapes de : a) obtenir une population statistique d'acides nucléiques de 20 à 50 nucléotides de longueur;
b) mettre en contact la population d'acides nucléiques de l'étape a) avec un polypeptide selon l'une des revendications 40 à 44;
c) caractériser l'acide nucléique ou la pluralité d'acides nucléiques interagissant avec ledit polypeptide.
57. Kit ou nécessaire pour le criblage d'un acide nucléique interagissant avec un polypeptide selon l'une des revendications 40 à 44, comprenant : a) un polypeptide selon l'une des revendications 40 à 44;
b) le cas échéant, une population statistique d'acides nucléiques de 20 à 50 nucléotides de longueur.
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