EP1084407A1 - Method for detecting primary signals during the communication of cells of the immune system - Google Patents

Abstract

The invention relates to a method for detecting primary signals of cellular communication of mammal (including human) cells outside an organism. According to said method polymer beads with a diameter of between 5 and 100 mu m which are loaded with at least one antibody specific to these primary signals are mixed with mammal (including human) cells capable of transmitting these primary signals and incubated under physiological conditions in a cell culture. The cells are stimulated by an external stimulus into emitting the primary signal and polymer beads capture the emitted primary signals which are then rendered measurable with the aid of a further antibody to which a molecule is coupled which permits detection.

Description

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VERFAHREN ZUM ERFASSEN VON PRIMÄRSIGNALEN BEI DER ZELLKOMMUNIKATION VONMETHOD FOR DETECTING PRIMARY SIGNALS IN CELL COMMUNICATION OF

ZELLEN DES IMMUNSYSTEMSCELLS OF THE IMMUNE SYSTEM

Die vorliegende Erfindung betrifft ein außerhalb eines Organismus durch- führbares Verfahren zur qualitativen und quantitativen Erfassung von Signalen, die bei der Kommunikation von Zellen des menschlichen oder tierischen Immunsystems ausgesendet werden, sowie die für dieses Verfahren verwendeten spezifisch beladenen Polymerkügelchen.The present invention relates to a method which can be carried out outside an organism for the qualitative and quantitative detection of signals which are emitted in the communication of cells of the human or animal immune system, and to the specifically loaded polymer beads used for this method.

Eukaryotische Zellen sind auf vielerlei Arten in der Lage anderen Zellen Informationen zu übermitteln. Dafür können sie, müssen aber nicht notwendigerweise miteinander in Kontakt treten. Eine Möglichkeit beispielsweise ist die Abgabe bestimmter Substanzen durch eine Zelle, die von einer anderen Zelle als Signal erkannt werden können. Eine bekannte Gruppe von solchen in der Zellkommunikation verwendeten Molekülen ist die der sogenannten "Cytokine". Sie werden unter anderem bei der Kommunikation der Zellen des Immunsystems verwendet. Zur Familie der Cytokine gehören alle bekannten Interleukine, wie auch die Interferone (IFN α, ß und Tumor-Nekrose-Faktoren (TNF) und viele weitere Gruppen. Die be- sondere Eigenschaft dieser Stoffe besteht darin, daß sie auch in geringen Dosen sehr stark wirksam sind und daß ihre Wirkung die Zielzellen stark modifiziert. So können Cytokine in der Zielzelle z.B. deren Pro- liferation bewirken, die Proteinexpression beeinflussen und die Zelldif- ferenzierung steuern. Weil die Cytokine diese enormen Auswirkungen auf ihre Zielzellen haben, müssen sie extrem streng reguliert werden. Das Immunsystem reagiert auf einen Fremdkörper oder einen anderen auslösenden Faktor in den meisten Fällen mit einer lokal sehr eng begrenzten Antwort, wobei nur die Zellen involviert sind, die sich in nächster Nähe des auslösenden Faktors befinden. Auch scheinen die Zellen, die den Fremdkörper erkannt haben, vor allem dann Cytokine abzugeben, wenn sich Zielzellen in deren unmittelbarer Nähe befinden, die dann nach ihrer Aktivierung den Fremdkörper angreifen und beseitigen. Um auch nur diese Zellen in "Alarmbereitschaft" zu versetzen und dadurch die Immunantwort 2 auszulösen, werden die Cytokine sehr schnell nach ihrer Abgabe in das Blut daraus wieder entfernt. Dies geschieht entweder durch sehr schnellen Abbau, durch Wiederaufnahme der Cytokine (entweder in die Ursprungs- zelle oder in die Zielzelle) oder durch "Abfangen" der Cytokine durch bluteigene Stoffe. Diese extreme zeitliche sowie lokale Begrenzung der Cytokine auf die unmittelbare Nachbarschaft der sie produzierenden Zellen hat zur Folge, daß sich die in der Immunantwort verwendeten Primärsignale nur sehr schwer erfassen und quantitativ messen lassen.Eukaryotic cells are able to transmit information to other cells in many ways. For this they can, but do not necessarily have to come into contact with each other. One possibility, for example, is the delivery of certain substances by a cell that can be recognized as a signal by another cell. A known group of such molecules used in cell communication is that of the so-called "cytokines". Among other things, they are used in the communication of the cells of the immune system. The cytokine family includes all known interleukins, as well as the interferons (IFN α, β and tumor necrosis factors (TNF) and many other groups. The special property of these substances is that they are very strong even in small doses The cytokines in the target cell can, for example, promote their proliferation, influence protein expression and control cell differentiation, and because the cytokines have such enormous effects on their target cells, they have to be regulated extremely strictly In most cases, the immune system responds to a foreign body or other triggering factor with a locally very narrowly limited response, involving only the cells that are in close proximity to the triggering factor have recognized to release cytokines especially when target cells are in their immediate vicinity which then attack and remove the foreign body after their activation. To put even these cells on "alert" and thereby the immune response 2 trigger, the cytokines are removed from them very quickly after their release into the blood. This occurs either through very rapid breakdown, through resumption of the cytokines (either into the original cell or into the target cell) or by "trapping" the cytokines by the blood's own substances. This extreme temporal and local limitation of the cytokines to the immediate vicinity of the cells producing them has the consequence that the primary signals used in the immune response are very difficult to detect and measure quantitatively.

Eine allgemein bekannte Methode zur Erkennung von Molekülen ist die sogenannte ELISA-Methode (Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay). Hierbei wird zunächst ein spezifischer primärer Antikörper gegen das zu detek- tierende Molekül ("Antigen") eingesetzt, der dieses Molekül hochspezifisch erkennt und bindet. Diese Bindung ist allerdings diffusionskon- troll iert und somit konzentrationsabhängig. Der entstehende Antigen- Antikörper-Kolex muß nach der Bindung immobil sein, d.h. entweder wird ein freies Antigen durch einen verankerten Antikörper gebunden oder ein an eine Oberfläche gekoppeltes Antigen durch einen freien Antikörper erkannt. Nach einer gewissen Inkubationszeit wird ein zweiter Antikörper zugegeben, der spezifisch entweder gegen den Komplex erster Antikörper- Antigen oder gegen einen anderen Bereich des Antigens (der nach der Bindung an den primären Antikörper noch zugänglich ist) gerichtet ist. An diesen zweiten Antikörper ist ein Enzym gekoppelt, das eine Reaktion katalysiert, die eine Analyse der entstandenen Komplexe erlaubt. Der zweite Antikörper wird in so hohem Überschuß zugesetzt, daß alle primären Antikörper-Antigen-Komplexe erkannt werden. Nach einem Waschschritt, der überschüssigen zweiten Antikörper entfernt, wird dem Ansatz ein Substrat zugegeben, das durch das an den zweiten Antikörper gekoppelte Enzym zu einem leicht meßbaren Produkt umgesetzt wird, meistens einem Farbstoff. 3A generally known method for recognizing molecules is the so-called ELISA method (enzyme-linked immunosorbent assay). Here, a specific primary antibody against the molecule to be detected ("antigen") is first used, which recognizes and binds this molecule in a highly specific manner. However, this binding is diffusion-controlled and therefore dependent on the concentration. The resulting antigen-antibody colex must be immobile after binding, ie either a free antigen is bound by an anchored antibody or an antigen coupled to a surface is recognized by a free antibody. After a certain incubation period, a second antibody is added which is specifically directed either against the complex of first antibody-antigen or against another area of the antigen (which is still accessible after binding to the primary antibody). An enzyme is coupled to this second antibody, which catalyzes a reaction which allows an analysis of the complexes formed. The second antibody is added in such a large excess that all primary antibody-antigen complexes are recognized. After a washing step that removes excess second antibody, a substrate is added to the mixture, which is converted into an easily measurable product, usually a dye, by the enzyme coupled to the second antibody. 3

Eine andere Methode der angewandten Zellbiologie ist das Markieren bestimmter Oberflächenmoleküle von Zellen, z.B. um deren Vorkommen auf bestimmten Zellen nachzuweisen, Zellen bestimmter Eigenschaften voneinander zu trennen, einzelne Zellen zu betrachten, die Verteilung bestimm- ter Merkmale zu untersuchen oder ähnliches. Für diese Markierung von Zellen sind kleine Kügelchen bekannt, die aus Polymeren wie z.B. Polystyrol oder ähnlichen inerten Materialien hergestellt und mit Antikörpern beladen sind, die spezifisch gegen das gewünschte Oberflächenmole- kül gerichtet sind. Diese Kügelchen, in der Literatur als "Beads" be- kannt, sind üblicherweise darüberhinaus mit einem Farbstoff beladen, so daß sie nach der Bindung an das Oberflächenmolekül als Farbpunkte auf der ZeilOberfl che der Zielzelle zu erkennen sind. Meistens handelt es sich hierbei um einen fluoreszierenden Farbstoff, der schnell und leicht identifiziert werden kann. So markierte Zellen können mittels einer bekannten Methode, der sogenannten Flow Cytometry leicht quantitativ detektiert werden.Another method of applied cell biology is the labeling of certain surface molecules of cells, e.g. to detect their occurrence on certain cells, to separate cells of certain properties from each other, to look at individual cells, to investigate the distribution of certain features or the like. Small beads are known for this labeling of cells, which are made of polymers such as e.g. Polystyrene or similar inert materials are produced and loaded with antibodies that are specifically directed against the desired surface molecule. These beads, known in the literature as "beads", are usually additionally loaded with a dye, so that after binding to the surface molecule they can be recognized as color dots on the cell surface of the target cell. Most often this is a fluorescent dye that can be identified quickly and easily. Cells labeled in this way can easily be quantitatively detected using a known method, the so-called flow cytometry.

Es besteht auch die Möglichkeit, die Beads magnetisch zu beladen. Zellen, die mit solchen magnetischen Beads markiert sind, können sehr leicht von anderen Zellpopulationen abgetrennt werden, indem sie in ein magnetisches Feld gebracht werden. Diese Methode, bekannt als MACS (Ma- gnetic activated Cell Sorting), ist mittlerweile eine der gängigsten Methoden zum Abtrennen von Zellen, von denen das Muster der Oberflächen- moleküle bekannt ist.It is also possible to load the beads magnetically. Cells labeled with such magnetic beads can be easily separated from other cell populations by placing them in a magnetic field. This method, known as MACS (Magnetic Activated Cell Sorting), has become one of the most common methods for separating cells, from which the pattern of the surface molecules is known.

Beads, die für solche Markierungen verwendet werden, sind deutlich kleiner als die damit markierten Zellen, damit sie fest an der ZeilOberfläche haften bleiben. Der übliche Durchmesser bei dieser Verwendung liegt im Bereich von 50 nm.Beads that are used for such markings are significantly smaller than the cells marked with them so that they adhere firmly to the cell surface. The usual diameter for this use is in the range of 50 nm.

Es ist verständlich, daß sich die Methodik des ELISA auch anwenden läßt, indem man den immobilen Anteil - nämlich das Antigen bzw. den primären 4It is understandable that the methodology of the ELISA can also be applied by the immobile part - namely the antigen or the primary 4

Antikörper - anstatt an eine Plastikoberfläche auch an solche inerten Polymerkügelchen binden kann, die sich durch Zentrifugation aus dem Inkubationsansatz entfernen lassen. Bei dieser Anwendung von Beads werden - entgegen dem zuvor Beschriebenen - sogenannte "Macrobeads" verwen- det, die wesentlich größer als eukaryotische Zellen sind, nämlich mit Durchmessern im m-Bereich. Diese lassen sich nach dem ersten Inkubationsschritt leicht auch von Zellen wieder trennen. In diesem Fall ersetzt also das Bead die Plastikoberfläche des Reaktionsgefäßes.Antibodies - instead of binding to a plastic surface to those inert polymer beads that can be removed from the incubation mixture by centrifugation. In this application of beads, contrary to what has been described above, so-called "macrobeads" are used which are much larger than eukaryotic cells, namely with diameters in the m range. These can also be easily separated from cells after the first incubation step. In this case, the bead replaces the plastic surface of the reaction vessel.

Das Prinzip des ELISA - in der Sonderform des ELISpot - wird in der Veröffentlichung von J. Rönnelid & L. Klareskog (J. Immunol . Meth. 200 (1997); 17-26) für die Untersuchung der Produktion von Interferon-γ (IFN-γ) in humanen Immunzellen (sogenannten PBMC, Peripheral Blood Mono- nuclear Cells) beschrieben. Hier werden Anti- IFN-γ-Antikörper an die Böden von Plastik-ELISA-Platten gebunden und darauf eine Suspension von Zellen gegeben, die zuvor mit Hilfe von Mitogenen, die die Fremdkörper- Wirkung nachahmen, zur Cytokinabgabe stimuliert wurden. Nach einer gewissen Inkubationszeit werden die Zellen wieder entfernt und der zweite Antikörper zugegeben. Die Analyse erfolgt hier mit Hilfe der Avidin- Alkalischen Phosphatase, die einen Farbstoff erzeugt. Bei diesem Ansatz wird durch Auszählen der einzelnen Farbspots unter dem Mikroskop ermittelt, wieviel Prozent der Zellen IFN-γ bilden. Dabei gibt die Größe der Farbspots die relative Stärke der IFN-γ-Bildung wieder.The principle of the ELISA - in the special form of the ELISpot - is described in the publication by J. Rönnelid & L. Klareskog (J. Immunol. Meth. 200 (1997); 17-26) for the investigation of the production of interferon-γ (IFN -γ) in human immune cells (so-called PBMC, Peripheral Blood Mononuclear Cells). Here, anti-IFN-γ antibodies are bound to the bottoms of plastic ELISA plates and a suspension of cells is added to them, which have previously been stimulated to release cytokine with the help of mitogens that mimic the foreign body effect. After a certain incubation period, the cells are removed and the second antibody is added. The analysis is carried out here with the help of avidin-alkaline phosphatase, which produces a dye. In this approach, counting the individual color spots under the microscope determines what percentage of the cells form IFN-γ. The size of the color spots reflects the relative strength of the IFN-γ formation.

In einer Veröffentlichung von T. M. McHugh et al . in J. Immunol. Meth. 116 (1989); 213 - 219 wird die Anwendung von Beads verschiedener Größe zur Diskriminierung unterschiedlicher Antikörper in humanem Serum beschrieben. Hierbei werden Beads mit drei verschiedenen Durchmessern im μm-Bereich verwendet. Jeweils Beads einer bestimmten Größe werden mit einer bestimmten Präparation eines humaninfektiösen Pilzes (Candida albicans) beladen. Durch die verschiedene Präparation entsteht jeweils ein spezifisches Antigen-Gemisch, so daß später in Korrelation zu der 5In a publication by TM McHugh et al. in J. Immunol. Meth. 116 (1989); 213-219 describes the use of beads of different sizes to discriminate different antibodies in human serum. Beads with three different diameters in the μm range are used. Beads of a certain size are loaded with a certain preparation of a human-infectious fungus (Candida albicans). The different preparation results in a specific antigen mixture, so that later in correlation to the 5

Beadgröße unterschieden werden kann, ob im menschlichen Serum Antikörper gegen Zellwandbestandteile der Pilzzellen, gegen cytosolische Bestandteile oder gegen Gesamtzellextrakt vorhanden sind. Mit diesem Ansatz ist eine frühere oder akute Pilzinfektion nachweisbar, da ausschließlich das seit der Infektionsabwehr bestehende Vorhandensein von Antikörpern gegen einen oder mehrere Bestandteile der Pilzzellen im menschlichen Serum nachgewiesen wird. Hier ist ein Abtrennen der Beads aus dem Reaktionsansatz nicht nötig, da sich im Serum keine Blutzellen befinden.Bead size can be differentiated whether antibodies are present in human serum against cell wall components of the fungal cells, against cytosolic components or against total cell extract. With this approach, an earlier or acute fungal infection can be detected, since only the presence of antibodies against one or more components of the fungal cells in human serum that have existed since the defense against infection is detected. It is not necessary to separate the beads from the reaction mixture here, since there are no blood cells in the serum.

A.C. Akdis et al . beschreiben in ihrem Artikel in J. Immun. Meth. 182 (1995); 251 - 261 ein Testverfahren, bei dem Macrobeads mit einem Durchmesser von 6,35 mm, beladen mit Anti -IFN-γ-Antikörpern für die Detektion von IFN-γ eingesetzt werden. Der Nachweis erfolgt mit einem zweiten, freien Antikörper, der ebenfalls gegen IFN-γ gerichtet ist, jedoch gegen den nicht vom ersten Antikörper gebundenen Bereich. Der zweite Antikörper ist mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert, der eine Auswertung des Tests in einem Flow Cytometer zuläßt. Es sind drei Ansatzmöglichkeiten für den Test beschrieben: 1. Die Macrobeads werden direkt einer Zellkul- tur von Immunzellen (PBMC oder T-Lymphozyten) zugegeben, die Zellen durch Mitogene zur IFN-γ Abgabe stimuliert, und anschließend wird freier (zweiter) Antikörper zugegeben, 2. es wird zunächst mit dem freien Antikörper das durch Stimulation abgegebene Signal gebunden und anschließend Macrobeads mit dem gebundenen Antikörper zugegeben, 3. beide Antikörper - gebundener und freier - befinden sich von Anfang an in der Zellkultur. Bei diesem Testverfahren gemäß dem ELISA dienen die Macrobeads lediglich dem Ersatz der Plastikoberfläche zur Bindung des Antikörpers. Es wird beschrieben, daß sie keinerlei Einfluß auf die Zellen nehmen, weder die Stimulierung noch die produzierte Menge des IFN-γ verändern und auch keine Zellproliferation bewirken. Auch der freie Antikörper hat keinen Einfluß auf die von der Zelle freigesetzte IFN-γ-Menge oder die Proliferation. Wie zuvor beschrieben wird ein Cytokin sehr schnell von der es abgebenden Zelle oder der Zielzelle wieder aufgenommen, oder durch Abbau 6 zerstört. Ist das IFN-γ an einen der beiden Antikörper gebunden, ist es vor diesen Einflüssen bewahrt. Das sogenannte "Trapping", nämlich das Einfangen des von der Zelle freigesetzten IFN-γ, bevor es wieder aus dem Medium entfernt wird, hilft somit die Bestimmung der freigesetzten Menge im Zellkultur-Medium zu verbessern. In dieser Veröffentlichung wird in einer PBMC-Kultur, also einer Mischkultur verschiedener Zellen des Immunsystems ein maximaler Trapping-Faktor von 24,7 erreicht, d.h. es kann ca. die 20-fache Menge an IFN-γ nach der Stimulation durch ein Mitogen nachgewiesen werden verglichen zu einer Kultur, bei der stimuliert, aber nicht "getrappt" wird. In einer Kultur von gereinigten T-Lymphozyten, also nach Entfernung der Zielzellen für das abgegebene Cytokin verringert sich dieser Faktor auf 3,3. Dies zeigt, daß nicht allein die mitogene Stimulierung die abgegebene Menge an Cytokin bestimmt, sondern vermutlich auch die Wechselwirkung zwischen einer stimulierten Zelle und einer Zielzelle.AC Akdis et al. describe in their article in J. Immun. Meth. 182 (1995); 251-261 a test method in which macrobeads with a diameter of 6.35 mm, loaded with anti-IFN-γ antibodies, are used for the detection of IFN-γ. Detection is carried out with a second, free antibody, which is also directed against IFN-γ, but against the region not bound by the first antibody. The second antibody is labeled with a fluorescent dye, which allows the test to be evaluated in a flow cytometer. There are three possible approaches for the test: 1. The macrobeads are added directly to a cell culture of immune cells (PBMC or T lymphocytes), the cells are stimulated to release IFN-γ by mitogens, and then free (second) antibody is added 2. The signal released by stimulation is first bound with the free antibody and then macrobeads are added with the bound antibody. 3. Both antibodies - bound and free - are in the cell culture from the start. In this test procedure according to the ELISA, the macrobeads only serve to replace the plastic surface for binding the antibody. It is described that they have no influence on the cells, do not change the stimulation or the amount of IFN-γ produced, and do not cause cell proliferation. The free antibody also has no influence on the amount of IFN-γ released by the cell or the proliferation. As previously described, a cytokine is very quickly resumed by the donating cell or target cell, or by degradation 6 destroyed. If the IFN-γ is bound to one of the two antibodies, it is protected from these influences. The so-called "trapping", namely the capture of the IFN-γ released by the cell before it is removed from the medium, thus helps to improve the determination of the amount released in the cell culture medium. In this publication, a maximum trapping factor of 24.7 is achieved in a PBMC culture, that is to say a mixed culture of different cells of the immune system, ie approximately 20 times the amount of IFN-γ can be detected after stimulation by a mitogen compared to a culture that stimulates but does not "trap". In a culture of purified T lymphocytes, i.e. after removing the target cells for the released cytokine, this factor decreases to 3.3. This shows that not only mitogenic stimulation determines the amount of cytokine released, but presumably also the interaction between a stimulated cell and a target cell.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Primärsignale der Zellkommu- nikation, vor allem die Cytokin-Freisetzung von Zellen des Immunsystems außerhalb eines Gesamtorganismus zu erfassen, und sie stabil qualitativ und quantitativ meßbar zu machen.The object of the present invention is to detect primary signals of cell communication, especially the cytokine release of cells of the immune system outside an entire organism, and to make them stable qualitatively and quantitatively measurable.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zum Erfassen von Primärsignalen der Zellkommunikation von menschlichen und Säugetierzellen außerhalb eines Organismus, wobei Polymerkügelchen mit einem Durchmesser von 5 bis 100 μm, die mindestens mit einem für diese Primärsignale spezifischen Antikörper beladen sind, mit menschlichen oder Säugetierzellen, die Primärsignale aussenden können, gemischt und in Zellkultur unter physiologischen Bedingungen inkubiert werden, worin die Zellen durch einen externen Reiz zur Abgabe des Primärsignals stimuliert werden und die Polymerkügelchen die abgegebenen Primärsignale auffangen, welche anschließend mit Hilfe eines weiteren Antikörpers, an den ein die Detek- tion zulassendes Molekül gekoppelt ist, meßbar gemacht werden. Die in dem Verfahren verwendeten Polymerkügelchen werden im Folgenden als "Beads" bezeichnet, wobei die Verwendung von "Beads" und "Polymerkügelchen" als Synonym zu verstehen ist. Die von den Zellen abgegebenen und mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahren erfaßten Primärsignäle sind vor allem Cytokine, auf die weiter unten näher eingegangen wird.This object is achieved by a method for detecting primary signals of cell communication from human and mammalian cells outside an organism, polymer beads with a diameter of 5 to 100 μm, which are loaded with at least one antibody specific for these primary signals, with human or mammalian cells Primary signals can be sent out, mixed and incubated in cell culture under physiological conditions, in which the cells are stimulated by an external stimulus to deliver the primary signal and the polymer beads capture the primary signals which are then released with the aid of another antibody to which the detection occurs permitting molecule is coupled, made measurable. The polymer beads used in the process are referred to below as "beads", the use of "beads" and "polymer beads" being understood as a synonym. The primary signals emitted by the cells and recorded with the aid of the method according to the invention are, above all, cytokines, which are discussed in more detail below.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden bevorzugt Zellen des Immunsystems mit Polymerkügelchen der Größe 5 bis 100 μm, besser 5 bis 30 μm, bevorzugt 6 bis 10 μm, im Idealfall - für die Adaption am FIowcytometer - 7 μm, die mit Antikörpern gegen ein oder mehrere Cytokin(e) beladen sind in unmittelbare Nähe gebracht, so daß ein direkter Kontakt zwischen den Kügelchen und den Zellen erfolgen kann. Die von der Zelle abgegebenen Signale werden somit von den auf den Kügelchen verankerten spezifi- sehen Antikörpern in unmittelbarer Nähe der Zelle aufgefangen, und anschließend mit Hilfe eines zweiten Antikörpers, an den ein die Detektion der Cytokin-Antikörper-Komplexe erlaubendes Molekül gebunden ist, quantitativ ausgewertet, wobei mit größer werdendem Beaddurchmesser die Qualität des Primärsignal zu messen geringer wird, d.h. die Konzentra- tionen, die gemessen werden können, kleiner werden.In the method according to the invention, cells of the immune system with polymer beads with a size of 5 to 100 μm, better 5 to 30 μm, preferably 6 to 10 μm, are ideally used - for adaptation to the flow cytometer - 7 μm, which are provided with antibodies against one or more cytokines (e) loaded are brought in close proximity so that there can be direct contact between the beads and the cells. The signals emitted by the cell are thus captured by the specific antibodies anchored on the beads in the immediate vicinity of the cell, and then quantitatively with the aid of a second antibody to which a molecule which allows the detection of the cytokine-antibody complexes is bound evaluated, the quality of the primary signal to be measured decreases with increasing bead diameter, ie the concentrations that can be measured decrease.

Bevorzugte Ausführungsformen sind den Unteransprüchen zu entnehmen.Preferred embodiments can be found in the subclaims.

Bei der hier beschriebenen Erfindung wird ein Verfahren vorgestellt, mit dessen Hilfe sich außerhalb eines Organismus Primärsignale von Zellen des Immunsystems erfassen lassen und quantitativ ausgewertet werden können.In the case of the invention described here, a method is presented by means of which primary signals from cells of the immune system can be detected outside an organism and can be evaluated quantitatively.

Das Immunsystem von Menschen und Säugetieren ist in ständiger Bereit- schaft, um körperfremde Stoffe sofort beim Auffinden zu eliminieren. Vor allem die weißen Blutkörperchen (Leukozyten) spielen eine äußerst wichtige Rolle bei der Immunantwort. Ununterbrochen findet eine Kontrolle 8 aller Partikel statt, auf die die patrouillierenden weißen Blutkörperchen treffen. Hierfür ist auch die Antigen-Präsentation wichtig, die vor allem durch aktivierte Makrophagen, B-Lymphozyten aber auch durch bestimmte Gewebezellen erfolgt. Wird ein Antigen präsentiert, das als körperfremd erkannt wird, tritt eine sofortige Immunantwort ein. Diese Wechselwirkung zwischen den einzelnen Zellen des Immunsystems bedarf einer sehr genau abgestimmten Kommunikation, um eine falsche Immunantwort zu vermeiden.The immune system of humans and mammals is on standby to eliminate foreign substances as soon as they are found. The white blood cells (leukocytes) in particular play an extremely important role in the immune response. There is a constant check 8 of all the particles that the patrolling white blood cells encounter. For this, the antigen presentation is also important, which occurs primarily through activated macrophages, B-lymphocytes but also through certain tissue cells. If an antigen is presented that is recognized as foreign to the body, an immediate immune response occurs. This interaction between the individual cells of the immune system requires very precisely coordinated communication in order to avoid a wrong immune response.

Die an der Immunantwort beteiligte Zellen sind, geordnet nach Zeiltyp, Zellart und Hauptfunktion:The cells involved in the immune response are sorted by cell type, cell type and main function:

1. weiße Blutkörperchen (Leukozyten) 1.1. Granulozyten a) Neutrophile: phagocytosieren und zerstören Bakterien b) Eosinophole: zerstören größere Parasiten und modulieren al1ergisehe Entzündungsreaktionen c) Basophile: setzen bei Immunantworten Histamin und Serotonin frei 1.2. Monozyten a) Makrophagen: phagocytosieren Mikroorganismen, Fremdkörper und alte Zelle1. white blood cells (leukocytes) 1.1. Granulocytes a) Neutrophils: phagocytose and destroy bacteria b) Eosinophols: destroy larger parasites and modulate allergic inflammatory reactions c) Basophils: release histamine and serotonin in immune responses 1.2. Monocytes a) Macrophages: phagocytose microorganisms, foreign bodies and old cells

1.3. Lymphozyten a) B-Zellen: produzieren und sezernieren Antikörper b) T-Zellen (T-Helfer-Zellen, Supressor-T-Zellen, Killer-T-1.3. Lymphocytes a) B cells: produce and secrete antibodies b) T cells (T helper cells, suppressor T cells, killer T cells

Zellen): töten Virus-infizierte Zellen und regulieren die Aktivität anderer LeukozytenCells): kill virus-infected cells and regulate the activity of other leukocytes

1.4. natürliche Killerzellen: töten Virus-infizierte Zellen und einige Tumorzellen 2. Gewebezel1en1.4. natural killer cells: kill virus-infected cells and some tumor cells 2. tissue cells

2.1. dentritische Zellen (lyphoide Organe): Antigen-Präsentation2.1. dentritic cells (lyphoid organs): antigen presentation

2.2. Langerhans^'sehe Zellen (Haut): Antigen-Präsentation 92.2. Langerhans ^' see cells (skin): antigen presentation 9

2.3. Thymus-Epithelzellen: Antigen-Präsentation2.3. Thymic epithelial cells: antigen presentation

2.4. Makrophagen (Bindegewebe): Antigen-Präsentation und Phagocytose von Fremdkörpern2.4. Macrophages (connective tissue): antigen presentation and phagocytosis of foreign bodies

Vor allem sind es die T-Lymphozyten, die regulierend in die Immunantwort eingreifen. T-Lymphozyten können dabei eine Zelle zur Zerstörung der Fremdkörper aktivieren - dies erfolgt vor allem durch die T-Helfer- Zellen - aber auch eine überschießende Immunantwort hemmen (Supressor-T- Zellen). Die Immunantwort ist eine extrem fein abgestimmte Reaktion der beteiligten Zellen aufeinander. Um diese feine Abstimmung zu erreichen, bedarf es einer schnellen, hochspezifischen und effektiven Kommunikation, d.h. dem Aussenden und Empfangen wirksamer und genau regulierbarer Signale. Die für diese Kommunikation verwendeten Cytokine entsprechen genau den für eine solche Feinabstimmung benötigten Signalen: sie sind sehr schnell sezernierbar, da sie in den Zellen fertig synthetisiert gespeichert werden, hochspezifisch und leicht und schnell wieder aus dem Blut zu entfernen. Beispiele für solche Cytokine sind wie folgenden Tabelle 1 angegeben, wobei dies keine erschöpfende Auflistung darstellt. Above all, it is the T lymphocytes that regulate the immune response. T lymphocytes can activate a cell to destroy the foreign bodies - this is done primarily by the T helper cells - but they can also inhibit an excessive immune response (suppressor T cells). The immune response is an extremely fine-tuned reaction between the cells involved. In order to achieve this fine coordination, fast, highly specific and effective communication is required, ie the transmission and reception of effective and precisely controllable signals. The cytokines used for this communication correspond exactly to the signals required for such fine tuning: they can be secreted very quickly because they are stored in the cells in a fully synthesized form, highly specific and easy and quick to remove from the blood. Examples of such cytokines are given as Table 1 below, but this is not an exhaustive list.

Tabelle 1: Cytokine, Beispiele SB SO tΛTable 1: Cytokines, examples SB SO tΛ

OsOs

Cytokin zellul rer Ursprung (-0Cytokine cellular origin (-0

Zielzel le WirkungTarget effect

IL-1 Antigen-präsenT- Hel fer -Zel len, T-Zell- und B-Zell -Aktivierung tierende Zellen B-Zel lenIL-1 antigen presenting T helper cells, T cell and B cell activation cells B cells

IL-2 bestimmte T-Helfer- aktivierte stimuliert Proliferation Zel1en T-Zel lenIL-2 specific T-helper-activated stimulates proliferation cells T-cells

IL-3 bestimmte T-Helfer- best, hämatopoetische stimuliert Proliferation und Differenzierung Zellen, Mastzellen Zel lenIL-3 certain T-helper-best, hematopoietic stimulates proliferation and differentiation cells, mast cell cells

IL-4 bestimmte T-Helfer- B-Zel len, stimuliert Proliferation, Erhöhung der Anitgen- Zellen T-Zel len, Mastzel len Präsentation auf B-ZellenIL-4 determined T helper B cells, stimulates proliferation, increases the number of anti-T cell cells, mast cell presentation on B cells

IL-5 bestimmte T-Helfer- B-Zel len, Eosinophile Erhöhung der Proliferation, Differenzierung ZellenIL-5 determined T helper B cells, eosinophils increase proliferation, differentiation cells

IL-6 bestimmte T-Helfer- aktivierte T-Zell -Aktivierung, Differenzierung von B-Zellen zu Zellen, Monozyten, B-Zel len, Plasmazellen Makrophagen T-Zel len "o0IL-6 determined T helper-activated T cell activation, differentiation of B cells into cells, monocytes, B cells, plasma cells, macrophages T cells

HH

IL-7 Stroma-Zellen des bestimmte Prä-B-Zellen stimuliert Proliferation, Differenzierung von B-Zellen W Knochenmarks und SD o Thymus -4 IL-7 stroma cells of certain pre-B cells stimulated proliferation, differentiation of B cells W bone marrow and SD o thymus -4

Cytokin zellulärer Ursprung Zielzelle Wirkung SD SBCytokine cellular origin target cell effect SD SB

ΪΛ -4 IΛΪΛ -4 IΛ

Os WOs W

IL-8 Endothelzellen Neutrophile Neutrophilen-Aktivierung zur ChemotaxisIL-8 endothelial neutrophil activation for chemotaxis

IL-9 bestimmte T-Helfer- T-Zellen Unterstützt die Proliferation ZellenIL-9 specific T helper T cells Supports proliferation cells

IL-10 T-Helfer-Zellen Makrophagen Blockierung der Produktion und Freisetzung andererIL-10 T helper macrophage cells blocking the production and release of others

CytokineCytokines

IL-11 Stroma-Zellen des Plas azellen, Prä-B DifferenzierungIL-11 stroma cells of the plasma cells, pre-B differentiation

Knochenmarks Zel1enBone marrow cells

IL-12 Makrophagen, B- aktivierte T-Zellen Differenzierung von Lymphozyten zu T-Helfer-Zellen Zellen, dendritische ZellenIL-12 macrophages, B-activated T cells Differentiation of lymphocytes to T helper cells, dendritic cells

IL-13 bestimmte T-Helfer- Makrophagen Inhibierung der Freisetzung inflammatorischer Cytokine ZellenIL-13 certain T helper macrophages inhibit the release of inflammatory cytokine cells

IL-15 Endothelzellen, EpitT-Zellen T-Zell -Aktivierung helzellenIL-15 endothelial cells, epitT cells, T cell activation hel cells

IL-16 CD8⁺ T-Zellen Monozyten, Eosinoph Anregung von Eosinophilen und Monozyten zur Chemotaxis nIL-16 CD8 ⁺ T cell monocytes, eosinoph excitation of eosinophils and monocytes for chemotaxis

HH

IL-17IL-17

SD IL-18 23 o SD IL-18 23 o

Cytokin zellulärer Ursprung Zielzelle WirkungCytokine cellular origin target cell effect

Di -J IΛ o\ wDi -J IΛ o \ w

IFN- bestimmte Makrophagen, B-Zellen, unterstützt verschiedene Zellreaktionen bei der Im¬IFN-specific macrophages, B cells, support various cell reactions during Im¬

T-Helfer-Zellen T-Zellen, diverse munantwort TNF-α Makrophagen Tumor-Zellen, Entzün- verhindert ZeilWachstum, cytotoxischer Effekt, dungszellenT helper cells T cells, diverse munesponse TNF-α macrophages tumor cells, inflammation prevents cell growth, cytotoxic effect, dung cells

TNF-ß T-Zellen Tumor-Zellen, MakrophaCytotoxischer Effekt auf Tumorzellen, verstärkt Pha- gen, Neutrophile gocytoseTNF-ß T cells tumor cells, macropha-cytotoxic effect on tumor cells, increased phages, neutrophil gocytosis

TGF-ß Macrophagen, LymphoMonozyten, Makrophagen Induziert und verstärkt die IL-1 Produktion zytenTGF-ß Macrophages, LymphoMonocytes, Macrophages Induces and enhances the IL-1 production

Abkürzungen: IL = Interleukin, IFN = Interferon, TNF = Tumor-Nekrose-Faktor, TGF = Transforming growth factorAbbreviations: IL = interleukin, IFN = interferon, TNF = tumor necrosis factor, TGF = transforming growth factor

oO

H o w o-α H ow o-α

1313

Bevorzugt soll mit dem erfindungsgemäßen Testverfahren ein Primärsignal in Form eines Cytokins untersucht werden, das von einer Zelle ausgesendet wird, die an der Immunantwort beteiligt ist.The test method according to the invention is preferably intended to examine a primary signal in the form of a cytokine which is emitted by a cell which is involved in the immune response.

Für das Einfangen der Primärsignale werden Polymerkügelchen verwendet, die mit einem spezifischen Antikörper gegen das zu detektierende Cytokin beladen sind. Es wurde überraschend festgestellt, daß mit Polymerkügelchen mit einem Durchmesser von 5 - 100 μm ein sehr viel stärkeres Signal und somit eine sehr viel höhere Signalquälitat erhalten werden konnte, als aus bisherigen Untersuchungen zu erwarten gewesen war.Polymer spheres loaded with a specific antibody against the cytokine to be detected are used to capture the primary signals. It was surprisingly found that with polymer beads with a diameter of 5-100 μm, a much stronger signal and thus a much higher signal quality could be obtained than was to be expected from previous studies.

Diese Größe der Polymerkügelchen ist vermutlich deswegen geeignet, da sie in etwa der Größe von Zellen des Immunsystems entspricht, und Beads dieser Größe mit den Zellen in direkten Kontakt treten können und dabei die größtmögliche Oberfläche bieten. Zellen des Immunsystems sind, wie schon zuvor beschrieben, bei der Kommunikation auf unmittelbare Nähe, bzw. auf direkten Kontakt angewiesen. Polymerkügelchen der erfindungsgemäß bevorzugten Größe können mit den Zellen in diesen direkten Kontakt treten und scheinen eine Zielzelle des Immunsystems nachzuahmen, so daß die Zelle, deren Primärsignal untersucht werden soll zur Abgabe dieses Signals in voller Stärke angeregt wird. Kleinere Kügelchen (Durchmesser von etwa 0,5 - 3 μm) können phagocytosierende Zellen des Immunsystems zur Phagocytose anregen, d.h. sie werden als Fremdkörper betrachtet. Noch kleinere Kügelchen, wie sie beispielsweise für die Markierung der Zel 1oberf1äche verwendet werden, können die Zeil -Zeil -Wechselwirkung nicht mehr nachahmen. Auch bei der Verwendung größerer Beads werden diese nicht als "Nachbarzelle" angesehen, sondern - wie z.B. in herkömmlichen ELISA-Tests gezeigt - wie eine Oberfläche betrachtet. Aus diesen Gründen ist die bevorzugte Größe der in dem erfindungsgemäßen Testver- fahren verwendeten Polymerkügelchen im Größenordnungsbereich einer Blut- zelle des Immunsystems. 14This size of the polymer beads is probably suitable because it corresponds approximately to the size of cells of the immune system, and beads of this size can come into direct contact with the cells and thereby offer the largest possible surface. As already described, cells of the immune system rely on immediate proximity or direct contact for communication. Polymer beads of the size preferred according to the invention can come into direct contact with the cells and appear to mimic a target cell of the immune system, so that the cell whose primary signal is to be examined is stimulated to deliver this signal at full strength. Smaller spheres (diameter of about 0.5 - 3 μm) can stimulate phagocytosing cells of the immune system to phagocytose, ie they are regarded as foreign bodies. Even smaller spheres, such as those used for marking the cell surface, can no longer mimic the cell-cell interaction. Even when using larger beads, they are not viewed as "neighboring cells", but - as shown in conventional ELISA tests - viewed as a surface. For these reasons, the preferred size of the polymer beads used in the test method according to the invention is in the order of magnitude of a blood cell of the immune system. 14

Das verwendete Polymer zur Herstellung der Beads muß aus einer Gruppe von inerten, biokompatiblen Substanzen ausgewählt werden. Beispiele hierfür sind Homo- oder Copolymere aus Styrol , Methylstyrol , Acryla- mid/N,N, -Bisacrylamid, 2-Hydroxyethyl -Methacryl at, Methacrylsäure und ähnliche. Diese können mit weiteren Reagenzien gemischt werden, um die spezifischen Eigenschaften der Beads zu erhalten. Die Herstellung solcher unbeladenen Beads ist z.B. in US-A-4,918,004 Spalte 11, Zeilen 35 bis 59 und US-A-4,828,984 Spalte 8, Zeilen 25 bis 44, sowie in "Flow Cytometry and Sorting", second edition, in dem Artikel von Lea et al . auf Seite 369, rechte Spalte, zweiter Absatz beschrieben. Das erfindungsgemäße Verfahren ist jedoch nicht auf Beads der dort beschriebenen Herstellungsweisen beschränkt, sondern es können Beads jedes bioinerten Materials verwendet werden, die ansonsten der hier vorliegenden Beschreibung entsprechen.The polymer used to produce the beads must be selected from a group of inert, biocompatible substances. Examples include homopolymers or copolymers of styrene, methylstyrene, acrylamide / N, N, -bisacrylamide, 2-hydroxyethyl methacrylate, methacrylic acid and the like. These can be mixed with other reagents to maintain the specific properties of the beads. The production of such unloaded beads is e.g. in US-A-4,918,004 column 11, lines 35 to 59 and US-A-4,828,984 column 8, lines 25 to 44, and in "Flow Cytometry and Sorting", second edition, in the article by Lea et al. on page 369, right column, second paragraph described. However, the method according to the invention is not limited to beads of the production methods described there, but beads of any bioinert material can be used which otherwise correspond to the description here.

Auf der Oberfläche der Beads stehen chemische Gruppen für eine effiziente Kopplung von Proteinen zur Verfügung, bevorzugt sind dies Hydroxyl-, Amino-, Carboxy- , Epoxy- oder Mercaptogruppen. Die Proteine werden nach einer Aktivierung der Beads mittels beispielsweise Bromcyan oder Sul- fonylchlorid an diese Gruppen gekoppelt. Auch eine Kopplung über einen oder mehrere Linker oder Quervernetzer ist möglich, wie z.B. die Verwendung von Carbodiimiden, Glutardialdehyd oder N-Succinimidyl-3-(2- pyridyldithio)propionat (SPDP). Auch Biotin, Avidin, Streptavidin und ähnliche Linker können für die Kopplung verwendet werden. Bevorzugt werden die Proteine kovalent an die Beads gebunden, indem zunächst eine auf der Oberfläche befindliche Carboxylgruppe mit Hilfe eines wasserlöslichen Carbodiimids aktiviert wird, z.B. [l-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)carbodiimid-HCl] in einem 0,05 M HEPES-Puffer bei pH 4,5 (HEPES = 2-[4-(Hydroxyethyl)-l-Piperazinyl]-Ethansulfonsäure). Die anschließende Beladung mit dem gewünschten Protein oder Proteingemisch erfolgt nach einem Waschschritt durch Suspension der Beads in 0,05 M HEPES-Puffer, worin die Proteine in der gewünschten Menge gelöst sind 15Chemical groups are available on the surface of the beads for an efficient coupling of proteins; these are preferably hydroxyl, amino, carboxy, epoxy or mercapto groups. After activation of the beads, the proteins are coupled to these groups using, for example, bromine cyanide or sulfonyl chloride. Coupling via one or more linkers or crosslinkers is also possible, such as the use of carbodiimides, glutardialdehyde or N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP). Biotin, avidin, streptavidin and similar linkers can also be used for the coupling. The proteins are preferably covalently bound to the beads by first activating a carboxyl group on the surface with the aid of a water-soluble carbodiimide, for example [1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide HCl] in a 0.05 M HEPES -Buffer at pH 4.5 (HEPES = 2- [4- (hydroxyethyl) -l-piperazinyl] -ethanesulfonic acid). The subsequent loading with the desired protein or protein mixture takes place after a washing step by suspension of the beads in 0.05 M HEPES buffer, in which the proteins are dissolved in the desired amount 15

(z.B. 0,01 - 1 mg/ml, möglich jedoch bis zur Lösungs-Sättigung). Die Suspension wird für mindestens 12 Stunden inkubiert und anschließend die Beladungsdichte kontrolliert.(e.g. 0.01 - 1 mg / ml, but possible until solution saturation). The suspension is incubated for at least 12 hours and then the loading density is checked.

Diese Beladungsmethode stellt ein Beispiel dar. Andere Möglichkeiten der Beladung der Beads sind dem Fachmann bekannt. Ein anderes Vorgehen beim Beladen schließt die entstehenden Beads nicht von der Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren aus.This loading method represents an example. Other possibilities for loading the beads are known to the person skilled in the art. Another procedure during loading does not exclude the resulting beads from being used in the method according to the invention.

Die Polymeroberfläche ist vorzugsweise glatt, um eine möglichst gleichmäßige Beladung der darauf gebundenen Antikörper zu bewerkstelligen. Poröse Oberflächen bieten die unerwünschte Möglichkeit, daß auch in den Poren Antikörper haften bleiben, die dann nur erschwert für die Bindung des Signals zur Verfügung stehen. Die Oberfläche kann geladen oder unge- laden sein, hydrophil oder hydrophob, jedoch ist eine negativ geladene, weitgehend hydrophile Oberfläche zu bevorzugen. Diese Art der Oberfläche ist nicht nur einer ZeilOberfläche relativ ähnlich, was die Fremdkörper- Wirkung verringert, sondern verhindert auch eine unspezifische Bindung der Beads an eine Zelle, da diese ebenfalls üblicherweise eine negativ geladenen hydrophile Oberfläche aufweist. Der einfachste Weg um eine solche Oberfläche zu erhalten ist das Ankoppeln von hydrophilen Komponenten wie z.B. Zuckern oder unreaktiven Proteinen. Auch diese kommen auf natürlichen ZeilOberflächen vor und wirken nicht als Fremdkörper.The polymer surface is preferably smooth in order to achieve the most uniform possible loading of the antibodies bound thereon. Porous surfaces offer the undesirable possibility that antibodies also adhere to the pores, which are then only available with difficulty for binding the signal. The surface can be charged or unloaded, hydrophilic or hydrophobic, but a negatively charged, largely hydrophilic surface is preferred. This type of surface is not only relatively similar to a cell surface, which reduces the foreign body effect, but also prevents unspecific binding of the beads to a cell, since this also usually has a negatively charged hydrophilic surface. The easiest way to obtain such a surface is to couple hydrophilic components such as e.g. Sugars or unreactive proteins. These also occur on natural cell surfaces and do not act as foreign bodies.

Die Beads werden bevorzugt mit Proteinen, besonders bevorzugt mit Antikörpern beladen, die für das jeweils zu erfassende Signal spezifisch sind. Die Antikörper können monoklonal oder polyklonal sein, und die Beladung mit Antikörpern schließt eine gleichzeitige Beladung mit einer anderen Substanz nicht aus, insbesondere nicht die gleichzeitige Bela- düng mit einem Agens, das die Immunzellen zur Cytokin-Abgabe anregt. Jede Art von Antikörper (Ig-D-Typ, Ig-M-Typ oder Ig-G-Typ) kann für die 16The beads are preferably loaded with proteins, particularly preferably with antibodies, which are specific for the signal to be detected in each case. The antibodies can be monoclonal or polyclonal, and loading with antibodies does not preclude simultaneous loading with another substance, especially not simultaneous loading with an agent that stimulates the immune cells to release cytokine. Any type of antibody (Ig-D type, Ig-M type or Ig-G type) can be used for the 16

Beladung verwendet werden, jedoch werden Antikörper vom Ig-G-Typ bevorzugt.Loading may be used, however Ig-G type antibodies are preferred.

Die Beladungsdichte der Antikörper auf den Kügelchen ist in jedem Falle so, daß sie nicht limitierend für die Quantität des erfaßten Signals wirkt. Bevorzugt wird die Dichte in einem Bereich von 10³ bis 10⁶ Antikörper pro Bead eingestellt. Die Verteilung der Proteine auf der Oberfläche ist vollkommen gleichmäßig und wird nicht durch ebenfalls auf der Oberfläche gekoppelte andere Moleküle beeinträchtigt.In any case, the loading density of the antibodies on the beads is such that it does not limit the quantity of the detected signal. The density is preferably set in a range from 10 ³ to 10 ⁶ antibodies per bead. The distribution of the proteins on the surface is completely uniform and is not affected by other molecules that are also coupled to the surface.

Bevorzugt werden in dem erfindungsgemäßen Verfahren Polymerkügelchen aus einem bioinerten Material mit einem Durchmesser von 5 bis 100 μm mit einer glatten, negativ geladenen, hydrophilen Oberfläche, wobei diese Oberfläche durch das Ankoppeln geladener Komponenten und hydrophiler Komponenten an das Polymer erzeugt werden kann, beladen mit Antikörpern gegen ein Cytokin mit einer Beladungsdichte von 10³ bis 10⁶ Antikörpern pro Kügelchen eingesetzt.Polymer beads made of a bioinert material with a diameter of 5 to 100 μm with a smooth, negatively charged, hydrophilic surface are preferred in the process according to the invention, this surface being able to be produced by coupling charged components and hydrophilic components to the polymer, loaded with antibodies against a cytokine with a loading density of 10 ³ to 10 ⁶ antibodies per bead.

Für den Nachweis der Bindung des Primärsignals an die gebundenen Anti- körper werden freie, also lösliche Antikörper verwendet, an die ein Molekül gekoppelt ist, mit dessen Hilfe ein quantitativ meßbares Signal erhalten werden kann. Die freien Antikörper können ebenfalls monoklonal oder polyklonal sein und von jeden beliebigen I munglobulin-Typ. Diese Antikörper können entweder ebenfalls spezifisch für das zu detektierende Signal olekül oder aber spezifisch für den primär entstehenden Antigen- Antikörper-Komplex sein. Auch ein Gemisch dieser beiden Varianten kann Anwendung finden. Das an den löslichen Antikörper gekoppelte Molekül, mit dessen Hilfe ein meßbares Signal erzeugt wird, kann ein niedermolekulares Molekül sein, das von selbst oder nach Anregung Strahlung eines bestimmten Wellenlängenbereichs abgibt oder absorbiert, oder ein Enzym, das eine Reaktion katalysiert, die zu einem meßbaren Signal führt. Beispiele für solche niedermolekularen Moleküle können Farbstoffe sein, die 17 im sichtbaren Wellenlängenbereich absorbieren, unter UV-Licht oder nach Anregung fluoreszieren oder phosphoreszieren, aber auch Moleküle, die radioaktive Strahlung abgeben. Häufige Anwendung finden für solche Untersuchungen Fluorescein, Rhodamine, Hydrochinone, AMCA (Fluorochrom), Quantum Red, Cy3, Cy5 (Fluorochrom der Firma Coulter), Texas Red, PerCP (Fluorochrom der Firma Becton Dickinson), R-Phycoerythrin (PE), C- Phycocyanin, Allophycocyanin (APC). Als gekoppeltes Molekül kommt außerdem jedes Enzym in Frage, das eine Reaktion katalysiert, die zu einem quantitativ meßbaren Signal führt. Hier sind vor allem die alkalische Phosphatase, Peroxidase, ß-Galaktosidase und ähnliche Farbstoff entwik- kelnde Enzyme gebräuchlich. Bevorzugt findet in dem erfindungsgemäßen Verfahren ein monoklonaler Ig-G-Antikörper Anwendung, der spezifisch für das zu detektierende Cytokin ist und an den Fluorescein gekoppelt ist.For the detection of the binding of the primary signal to the bound antibodies free, ie soluble antibodies are used, to which a molecule is coupled, with the aid of which a quantitatively measurable signal can be obtained. The free antibodies can also be monoclonal or polyclonal and of any immunoglobulin type. These antibodies can either also be specific for the signal to be detected, or they can be specific for the primary antigen-antibody complex. A mixture of these two variants can also be used. The molecule coupled to the soluble antibody, which is used to generate a measurable signal, can be a low molecular weight molecule that emits or absorbs radiation of a certain wavelength range by itself or after excitation, or an enzyme that catalyzes a reaction that leads to a measurable one Signal leads. Examples of such low molecular weight molecules can be dyes that 17 absorb in the visible wavelength range, fluoresce or phosphoresce under UV light or after excitation, but also molecules that emit radioactive radiation. Fluorescein, rhodamine, hydroquinones, AMCA (fluorochrome), Quantum Red, Cy3, Cy5 (fluorochrome from Coulter), Texas Red, PerCP (fluorochrome from Becton Dickinson), R-phycoerythrin (PE), C - Phycocyanin, Allophycocyanin (APC). Any enzyme that catalyzes a reaction that leads to a quantifiable signal can also be used as a coupled molecule. The enzymes which develop the alkaline phosphatase, peroxidase, β-galactosidase and similar dyestuff are particularly common here. A monoclonal Ig-G antibody which is specific for the cytokine to be detected and which is coupled to the fluorescein is preferably used in the method according to the invention.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird zur Ermittlung der nach einer Stimulation von den Immunzellen abgegebenen Primärsignale eine homogene Mischung von Immunzellen mit den mit Antikörpern beladenen Polymerkügelchen (Beads) hergestellt und in Form einer Suspensionskultur bei vorzugsweise 37 °C und einem pH-Wert im physiologischen Bereich inkubiert. Dabei verteilen sich die Zellen und die Beads gleichmäßig in Form eines Monolayers auf dem Boden des Kulturgefäßes. Bevorzugt werden nach unten gewölbte Kulturgefäße genommen, um ein hohe Zel 1-Bead-Dichte zu gewährleisten. Aber auch adhärente Zellkulturen, rührende Suspensionskulturen oder jede andere Art von Kulturhaltung ist für die Anwendung des erfin- dungsgemäßen Verfahrens möglich.In the method according to the invention, to determine the primary signals emitted by the immune cells after stimulation, a homogeneous mixture of immune cells with the antibody-loaded polymer beads is prepared and incubated in the form of a suspension culture at preferably 37 ° C. and a pH in the physiological range . The cells and beads are distributed evenly in the form of a monolayer on the bottom of the culture vessel. Culture vessels arched downward are preferably used in order to ensure a high Zel 1 bead density. Adherent cell cultures, stirring suspension cultures or any other type of culture are also possible for the use of the method according to the invention.

Als Kulturmedien können alle gängigen Medien für Säugetierzellen Verwendung finden, wie zum Beispiel RPMI, DMEM, William's Medium, MEM-Alpha, Leibovitz^'s L-15 Medium oder auch verschiedene Minium Essential Media. Solche Medien sind käuflich zu erwerben und dem Fachmann bekannt. 18All common media for mammalian cells can be used as culture media, for example RPMI, DMEM, William's Medium, MEM-Alpha, Leibovitz ^'s L-15 Medium or various Minium Essential Media. Such media are commercially available and known to the person skilled in the art. 18th

Die Stimulation der Zellen zur Signal abgäbe kann sowohl durch Antigene wie Anti -CD 3, Anti -CD 28 oder Cytokine erfolgen, wie auch durch andere Wirkstoffe, die von der Zelle als schädigend erkannt werden, wie z.B. Ionophore wie Ionomycin, Phytohemagglutinin (PHA), 12-0-Tetra-Dekanoyl- Phorbol-13-Acetat (TPA) und Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) oder auch durch elektrische Spannung. Bevorzugt werden die Zellen jeweils mit einer Kombination von PMA / Ionomycin oder Anti -CD 3 / IL-2 oder Ionomycin / TPA stimuliert. Die Konzentration der stimulierenden Agenzien und die Verhältnisse der beiden Stimulus-Partner hängt jeweils von den zu stimulierenden Zelltypen ab und wird für jeden Typ optimiert. Auch können die Beads direkt mit einem oder mehreren dieser Stimulantien beschichtet sein.The stimulation of the cells for signal delivery can take place both through antigens such as anti-CD 3, anti-CD 28 or cytokines, as well as through other active substances which are recognized by the cell as harmful, e.g. Ionophores such as ionomycin, phytohemagglutinin (PHA), 12-0-tetra-decanoyl-phorbol-13-acetate (TPA) and phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) or also by electrical voltage. The cells are preferably stimulated in each case with a combination of PMA / ionomycin or anti-CD 3 / IL-2 or ionomycin / TPA. The concentration of the stimulating agents and the ratios of the two stimulus partners depend on the cell types to be stimulated and are optimized for each type. The beads can also be coated directly with one or more of these stimulants.

Das Verhältnis der Zellen zu den Beads kann stark variieren und ist für zu untersuchende Zusammensetzungen von Zellpopulationen zu optimieren. Das Verhältnis von einer einzelnen Signal -abgebenden Zelle zu einem einzelnen Bead kann dabei 0,5:1 bis 2:1 betragen, ist jedoch bevorzugt in einem Mischungsverhältnis von ungefähr 1:1 einzustellen. Beispielsweise ist das optimale Verhältnis bei PBMC^'s (Zelle:Bead) 1:2, bei poly- klonalen T-Zellen (Zelle:Bead) 1:1 bis 2:1. Bei diesem Mischungsverhältnis ist der Kontakt der Zellen mit den Beads besonders gut gewährleistet, und das Erfassen des abgegebenen Primärsignals erfolgt in nächster Nähe. Die Zellen werden in Kultur durch einen Reiz dazu angeregt, ein Primärsignal abzugeben, das durch die an den Beads gebundenen Antikörper abgefangen wird, weitestgehend vollständig und weitestgehend bevor es durch Wiederaufnahme oder Abbau degradiert wird. "Weitestgehend" bedeutet hier, daß die Reizstärke im Versuchsansatz einer derarten Antikörperbeladung der Beads gegenübersteht, daß nicht aufgrund von Sättigung des Signalepfängers ein Anteil des Signals verloren geht. "Weitestge- hend" heißt auch, daß die Beads den Zellen so nahe kommen, ohne als Fremdkörper erkannt zu werden, daß sie das abgegebene Signal in der Stärke empfangen können, wie es für die natürliche Zielzelle bestimmt 19 gewesen wäre. Aufgrund der Größe und der Beladung der Beads wird darüberhinaus das Signal von der entsendenden Zelle auch in der Stärke abgegeben, in der es an eine natürliche Zielzelle abgegeben worden wäre, da das Bead eine solche natürliche Zelle nachzuahmen scheint. Wie oben beschrieben ist gerade der unmittelbare Kontakt für die Kommunikation von Immunzellen nötig, um das Signal in der vollen Stärke von der entsendenden Zelle zu erhalten. Durch das "Einfangen" der Signalmoleküle mit Hilfe der Antikörper sind diese vor einer Degradation geschützt. Die Zellkultur wird zusammen mit den beladenen Beads vorzugsweise bis zu 36 Stunden nach dem Signal -auslösenden Reiz vorzugsweise bei 37 °C inkubiertThe ratio of the cells to the beads can vary widely and is to be optimized for compositions of cell populations to be examined. The ratio of a single signal-emitting cell to a single bead can be 0.5: 1 to 2: 1, but should preferably be set in a mixing ratio of approximately 1: 1. For example, the optimal ratio for PBMC ^'s (cell: bead) is 1: 2, for polyclonal T cells (cell: bead) 1: 1 to 2: 1. With this mixing ratio, the contact of the cells with the beads is ensured particularly well, and the primary signal emitted is recorded in close proximity. The cells are stimulated in culture by a stimulus to emit a primary signal, which is captured by the antibodies bound to the beads, largely completely and largely before it is degraded by resumption or degradation. "Largely" here means that the strength of the stimulus in the test batch is opposed to such an antibody loading of the beads that a portion of the signal is not lost due to the saturation of the signal receiver. "Largely" also means that the beads come so close to the cells without being recognized as a foreign body that they can receive the emitted signal with the strength as determined for the natural target cell 19 would have been. Due to the size and loading of the beads, the signal from the sending cell is also emitted to the extent that it would have been released to a natural target cell, since the bead appears to mimic such a natural cell. As described above, direct contact is essential for the communication of immune cells in order to receive the signal in full strength from the sending cell. By "capturing" the signaling molecules with the help of the antibodies, they are protected against degradation. The cell culture is preferably incubated together with the loaded beads up to 36 hours after the signal-triggering stimulus, preferably at 37 ° C.

Der lösliche Antikörper mit dem gekoppelten Molekül zur Detektion kann, muß aber nicht, ebenfalls von Anfang an in der Zellkultur vorliegen. Der lösliche Antikörper wird dem Ansatz in so hohem Überschuß zugegeben, daß alle Antigen-Anitkörper-Bead-Komplexe vollständig quantitativ erkannt werden. Dies heißt, daß der lösliche Antikörper in mindestens 10- bis 100-fächern Überschuß gegenüber der Anzahl des gebundenen Antikörpers vorliegt.The soluble antibody with the coupled molecule for detection can, but need not, also be present in the cell culture from the beginning. The soluble antibody is added to the mixture in such a large excess that all antigen-antibody-body complexes are recognized completely quantitatively. This means that the soluble antibody is present in at least a 10 to 100-fold excess over the number of bound antibodies.

Bevorzugt wird der lösliche Antikörper erst zu den Beads gegeben, nachdem die Zellen zusammen mit den Beads aus der Zellkultur durch Zentrifu- gation abgetrennt wurden, anschließend zweimal mit einer Pufferlösung mit einem pH-Wert im physiologischen Bereich, bevorzugt PBS, gewaschen und in einem geeigneten Medium resuspendiert wurden. Auch hier gilt die Zugabe des löslichen Antikörpers im entsprechenden Überschuß. Als Medium bietet sich entweder eines der gängigen Zellkulturmedien, oder eine Pufferlösung an, bevorzugt wird ein Phosphatpuffer verwendet. Der pH- Bereich zur weiteren Inkubation liegt im physiologischen Bereich, also etwa zwischen pH 6,5 und 8, bevorzugt bei pH 7,4 bis 7,6. Der lösliche Antikörper wird vorzugsweise bei 4°C zusammen mit den Beads im Dunkeln 20 gehalten und üblicherweise bis zu 4 Stunden inkubiert. Die bevorzugte Inkubationsdauer beträgt üblicherweise 30 min bis 1 Stunde.The soluble antibody is preferably only added to the beads after the cells have been separated from the cell culture together with the beads by centrifugation, then washed twice with a buffer solution with a pH in the physiological range, preferably PBS, and in a suitable one Medium were resuspended. The addition of the soluble antibody in a corresponding excess also applies here. Either one of the common cell culture media or a buffer solution is suitable as the medium; a phosphate buffer is preferably used. The pH range for further incubation is in the physiological range, that is to say approximately between pH 6.5 and 8, preferably at pH 7.4 to 7.6. The soluble antibody is preferably at 4 ° C together with the beads in the dark Held for 20 and usually incubated for up to 4 hours. The preferred incubation period is usually 30 minutes to 1 hour.

Durch anschließende Waschschritte mit einer geeigneten Pufferlösung wird überschüssiger löslicher Antikörper entfernt, die entstandenen Bead- Antikörper-Antigen-Antikörper-Komplexe in einem definierten Volumen eines geeigneten Mediums aufgenommen und anschließend einer quantitativen Meßmethode zugeführt. Die bevorzugte Meßmethode des erfindungsgemäßen Verfahrens ist bei der Verwendung von Fluorescein als gekoppeltem Molekül die Flow Cytoetrie, jedoch ist jede andere quantitativ auswertbare Meßmethode ebenfalls denkbar. Die verwendete Meßmethode ist vor allem von der Möglichkeit abhängig, die das an den löslichen Antikörper gekoppelte Molekül bietet.Subsequent washing steps with a suitable buffer solution remove excess soluble antibody, the bead-antibody-antigen-antibody complexes formed are taken up in a defined volume of a suitable medium and then fed to a quantitative measurement method. When using fluorescein as the coupled molecule, the preferred measuring method of the method according to the invention is flow cytoetry, but any other quantitatively evaluable measuring method is also conceivable. The measurement method used is primarily dependent on the possibility offered by the molecule coupled to the soluble antibody.

Als geeignete Pufferlösungen für die durchzuführenden Waschschritte können vor allem Puffer verwendet werden, deren höchste Pufferkapazität im physiologischen Bereich liegt, bevorzugt wird PBS ("Phosphat Buffered Saline") oder andere Phosphatpuffer verwendet, deren Herstellung dem Fachmann bekannt, bzw. in der Fachliteratur nachzulesen sind. Es können auch modifizierte Puffer wie Hank^'s Puffer, Dulbecco^'s PBS, Earle^'s Buffered Saline (EBSS) oder HEPES-Puffer verwendet werden. Den Puffern können weitere Zusätze beigefügt werden, die stabilisierend (z.B. BSA ("Bovine Serum Albumine")) oder destabilisierend (z.B. Natriumazid) wirken können, je nach gewünschter Anwendung.Suitable buffer solutions for the washing steps to be carried out are, above all, buffers whose maximum buffering capacity is in the physiological range, PBS ("Phosphate Buffered Saline") or other phosphate buffers are preferably used, the preparation of which is known to the person skilled in the art or can be found in the specialist literature . Modified buffers such as Hank ^'s buffer, Dulbecco ^'s PBS, Earle ^'s Buffered Saline (EBSS) or HEPES buffer can also be used. Additional additives can be added to the buffers, which can have a stabilizing effect (eg BSA ("Bovine Serum Albumine")) or a destabilizing effect (eg sodium azide), depending on the desired application.

Die bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Testansatz, bei dem wie folgt verfahren wird:The preferred embodiment of the method according to the invention is a test approach in which the procedure is as follows:

Zellen des Immunsystems von Menschen oder Säugetieren werden mit Beads des Durchmessers 7 μm , die mit für ein Cytokin spezifischen Antikörpern beladen sind in einem Mischungsverhältnis von 1:2 bis 2:1 in homogeneCells of the immune system of humans or mammals are homogenized with beads with a diameter of 7 μm which are loaded with antibodies specific for a cytokine in a mixing ratio of 1: 2 to 2: 1

Suspension gebracht, in dieser Suspension durch Stimulation mittels 21 eines Reizes zur Abgabe von Primärsignalen in Form von Cytokinen angeregt und 1 - 36 Stunden bei 37°C in RPMI-1640 Medium mit pH 7,4 inkubiert. Anschließend wird die Suspension zweimal mit einem Phosphatpuffer (PBS) mit pH 7,4 gewaschen und in einem definierten Volumen desselben Phosphatpuffers aufgenommen. Nach 1 Stunde Inkubation bei 4 °C und anschließendem dreimaligem Waschen mit Phosphatpuffer pH 7,4, werden lösliche Antikörper in deutlichem Überschuß zum gebundenen Antikörper gegeben, die ebenfalls gegen das zu detektierende Cytokin gerichtet sind. An diese löslichen Antikörper ist Fluorescein gekoppelt. Nach 1 Stunde Inkubation bei 37°C werden überschüssige lösliche Antikörper entfernt und die meßbare Fluoreszenz des Komplexes: Bead-gebundener Antikörper- Cytokin-Antikörper im Flow Cytometer quantitativ bestimmt.Brought suspension in this suspension by stimulation by means of 21 of a stimulus to release primary signals in the form of cytokines and incubated for 1-36 hours at 37 ° C. in RPMI-1640 medium with pH 7.4. The suspension is then washed twice with a phosphate buffer (PBS) at pH 7.4 and taken up in a defined volume of the same phosphate buffer. After 1 hour of incubation at 4 ° C. and then washing three times with phosphate buffer pH 7.4, soluble antibodies are added to the bound antibody in a clear excess, which are likewise directed against the cytokine to be detected. Fluorescein is coupled to these soluble antibodies. After 1 hour of incubation at 37 ° C., excess soluble antibodies are removed and the measurable fluorescence of the complex: bead-bound antibody-cytokine-antibody is quantified in the flow cytometer.

Die Zellen lassen sich außerdem parallel dazu mittels Antikörpern bei entsprechender Vor- und Nachbehandlung färben.The cells can also be stained in parallel using antibodies with appropriate pre- and post-treatment.

Mit diesem Ansatz werden "Trapping-Faktoren" von bis zu 30.000 erreicht. Das bedeutet, daß eine 30.000-fach höhere Konzentration an Cytokin als Primärsignal von Zellen erfaßt wird, als sie ohne die Nähe der Zellen und der Beads und ohne das "Einfangen" zu messen wäre. Dieser hohe Verstärkungsfaktor bei Verwendung von Beads der erfindungsgemäßen Größe war nicht vorherzusehen, da mit bisherigen Meßmethoden maximal ein Faktor 20 erreicht werden konnte. Durch das "Einfangen" des Cytokins durch die an die Beads gebundenen Antikörper wird dieses so stabilisiert, daß es nicht wie in anderen Verfahren zu einem so starken Signalverlust kommt. Darüberhinaus erfolgt aufgrund der erfindungsgemäßen Wahl der Beadgröße und -beladung eine Signalstärke, die von Immunzellen nur bei direktem Zeil -ZelIkontakt abgegeben wird. Somit wird mit diesem Ansatz weitestgehend ein physiologischer Zustand der Immunantwort nachgeahmt, der zu einer maximalen Ausbeute sowohl bei der Abgabe der Primärsignals von der Zelle, als auch bei der Detektion des Signals mittels der Antikörper- beladenen Beads führt. Es war überraschend und nicht vorherzusehen, daß 22 sich mit Beads der erfindungsgemäßen Größe und Beladung der physiologische Zustand von kommunizierenden Zellen des Immunsystems so gut nachahmen lassen würde.With this approach, "trapping factors" of up to 30,000 are achieved. This means that a 30,000-fold higher concentration of cytokine is detected as the primary signal of cells than would be measured without the proximity of the cells and the beads and without the "trapping". This high amplification factor when using beads of the size according to the invention could not be predicted, since a maximum of a factor of 20 could be achieved with previous measuring methods. By "capturing" the cytokine by the antibodies bound to the beads, it is stabilized in such a way that there is no such strong signal loss as in other methods. In addition, due to the choice of bead size and loading according to the invention, there is a signal strength that is only released by immune cells when there is direct cell-cell contact. This approach thus largely mimics a physiological state of the immune response, which leads to a maximum yield both in the delivery of the primary signal from the cell and in the detection of the signal by means of the antibody-loaded beads. It was surprising and unpredictable that 22 the beads of the size and load according to the invention would allow the physiological state of communicating cells of the immune system to be imitated so well.

Das hier vorgestellte erfindungsgemäße Verfahren hat außerdem den besonderen Vorteil, daß es leicht durchführbare Arbeitsschritte mit standardisierten Meßmethoden vereint, so daß ein Verfahren entsteht, das in bisher bestehenden Laboratorien und Arbeitsanordnungen durchführbar ist, dabei allerdings in einem in-vitro-Ansatz physiologische Gegebenheiten nachahmt und somit bisher nur rudimentär zugängliche Parameter der Zel1 - kommunikation, nämlich die Abgabe von Primärsignalen, meßbar macht.The method according to the invention presented here also has the particular advantage that it combines work steps which can be carried out easily with standardized measuring methods, so that a process is created which can be carried out in previously existing laboratories and work arrangements, but which mimics physiological conditions in an in vitro approach and Thus, until now only rudimentary parameters of cell communication, namely the delivery of primary signals, can be measured.

Die Bestandteile und Reagenzien, die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden, können einzeln oder in verschiedener Kombination mit- einander angeboten werden, wie beispielsweise in Form eines Sets oder Kits, das/der wenigstens eine der für das erfindungsgemäße Verfahren wesentlichen Komponenten enthält. Dies sind vor allem die mit Antikörper beladenen Beads wie oben beschrieben und der zweite, freie Antikörper, an den ein Marker-Molekül gekoppelt ist.The constituents and reagents which are used for the method according to the invention can be offered individually or in various combinations with one another, for example in the form of a set or kit which contains at least one of the components essential for the method according to the invention. These are primarily the beads loaded with antibody as described above and the second, free antibody to which a marker molecule is coupled.

Beispiele:Examples:

Beispiel 1: Ermittlung des Meßbereichs, Genauigkeit: Um den optimalen Meßbereich und die Genauigkeit der Konzentrationsbe- Stimmung mittels der verwendeten Beads im Flow Cytometer zu bestimmen, wird eine Kalibrierungsreihe mit rekombinantem IFN-γ vermessen.Example 1: Determination of the measuring range, accuracy: In order to determine the optimal measuring range and the accuracy of the concentration determination by means of the beads used in the flow cytometer, a calibration series with recombinant IFN-γ is measured.

Ansatz:Approach:

Für die Konzentrationsbestimmung werden Lösungen definierter Konzentra- tion von rekombinant hergestelltem IFN-γ in PBS hergestellt. In diese Lösungen werden die Beads in einer Menge von 20.000 Beads/lOOμl zugegeben. Die Ansätze werden 24 Stunden inkubiert Die Beads werden durch 23For the concentration determination, solutions of a defined concentration of recombinantly produced IFN-γ in PBS are produced. The beads are added to these solutions in an amount of 20,000 beads / 100 μl. The batches are incubated for 24 hours 23

Zentrifugation aus der Lösung zurückgewonnen, zweimal mit je 200 μl PBS oder Hank's Puffer, 0,1 X NaN₃, 0,1 % BSA gewaschen und anschließend mit dem mit Fluorescein markierten 2. Antikörper versetzt (10 μg/ml). Nach 30 min Inkubation bei 4°C im Dunkeln werden die Beads nochmals dreimal mit dem oben beschriebenen Puffer gewaschen, in einem geeigneten Volumen dieses Puffers aufgenommen (z.B. 500 μl) und anschließend im Flow Cytometer ausgemessen.Centrifugation recovered from the solution, washed twice with 200 μl PBS or Hank's buffer, 0.1 X NaN ₃ , 0.1% BSA and then mixed with the second antibody labeled with fluorescein (10 μg / ml). After 30 min incubation at 4 ° C in the dark, the beads are washed three more times with the buffer described above, taken up in a suitable volume of this buffer (for example 500 μl) and then measured in a flow cytometer.

Die abzüglich eines internen Korrekturfaktors bestimmten Konzentrationen sind der folgenden Tabelle 2 zu entnehmen The concentrations determined minus an internal correction factor are shown in Table 2 below

2424

Tabelle 2: eingesetzte Konz. rekomb. IFN-γ ermittelte Konz. an IFN-γ abzüg-Table 2: Recomb. IFN-γ determined concentration on IFN-γ deducted

(ng/ml) lieh Korrektur (ng/ l)(ng / ml) loan correction (ng / l)

1,25 0,731.25 0.73

5 5,045 5.04

10 9,0310 9.03

100 125,1100 125.1

Tabelle 2 zeigt die Genauigkeit der Konzentrationsbestimmung des IFN-γ im Meßbereich zwischen 1 und 100 ng/ml.Table 2 shows the accuracy of the determination of the concentration of IFN-γ in the measuring range between 1 and 100 ng / ml.

Beispiel 2: Bestimmung der IFN-γ Abgabe von stimulierten T-Zellen: 20.000 T-Zellen werden zusammen mit 20.000 Beads der Größe 7 μm, beladen mit Anti-IFN-γ-Antikörper, in ein Kulturgefäß (96er Mikrotiterplatte) gegeben und darin 24 Stunden bei 37 °C mit der Kombination PMA / Ionomycin in den Konzentrationen PMA 1-10 ng/ml, Ionomycin 0,5-1 μM stimuliert. Anschließend werden die Beads aus der Kultur durch 2 min Zentri- fugation bei 1000 Umdrehungen pro Minute (upm) isoliert und zweimal mit je 200 μl Waschpuffer gewaschen, d.h. jeweils in dem angegebenen Volumen suspendiert und erneut mit 1000 upm 2 min zentrifugiert. Die Beads werden in 200 μl des Waschpuffers aufgenommen, und mit 10 μl einer 10 μg/ml Lösung des mit Fluorescein markierten 2. Antikörpers versetzt. Nach 30 min Inkubation bei 4°C im Dunkeln werden die Beads durch Zentrifugation wie oben isoliert, dreimal mit Waschpuffer gewaschen und anschließend im Flow Cytometer vermessen. Der verwendete Waschpuffer ist PBS oder Hank^'s Puffer unter Zusatz von 0,1* NaN₃ und 0,1* BSA.Example 2: Determination of the IFN-γ release of stimulated T cells: 20,000 T cells together with 20,000 beads of size 7 μm, loaded with anti-IFN-γ antibody, are placed in a culture vessel (96-well microtiter plate) and 24 in it Hours stimulated at 37 ° C with the combination PMA / ionomycin in the concentrations PMA 1-10 ng / ml, ionomycin 0.5-1 μM. The beads are then isolated from the culture by 2 min centrifugation at 1000 revolutions per minute (rpm) and washed twice with 200 μl wash buffer, ie suspended in the volume indicated and centrifuged again at 1000 rpm for 2 min. The beads are taken up in 200 μl of the washing buffer, and 10 μl of a 10 μg / ml solution of the second antibody labeled with fluorescein are added. After 30 min incubation at 4 ° C in the dark, the beads are isolated by centrifugation as above, washed three times with washing buffer and then measured in the flow cytometer. The washing buffer used is PBS or Hank ^'s buffer with the addition of 0.1 * NaN ₃ and 0.1 * BSA.

Das in Form von IFN-γ abgegebene Signal durch die stimulierten T-Zellen wurde mit dieser Methode bestimmt. Die Konzentration von IFN-γ betrug in diesem Ansatz 83,34 ng/ml. 25The signal given in the form of IFN-γ by the stimulated T cells was determined using this method. The concentration of IFN-γ in this approach was 83.34 ng / ml. 25th

Beispiel 3: Trapping Assay, optimales Verhältnis von Beads zu Zeilzahl bei polyklonalen T-Zellen:Example 3: Trapping assay, optimal ratio of beads to number of lines in polyclonal T cells:

Ansatz: Polyklonale T-Zellen werden zusammen mit Beads der Größe 7 μm, beladen mit Anti-IFN-γ-Antikörpern, 24 Stunden mit OKT 3 (= Anti CD 3 der Firma DAKO) und rekombinantem IL-2 in den Konzentrationen OKT 34-5 μg/ml und IL-240 U/ml stimuliert. Die Anzahl der Beads wird konstant bei 100.000 gehalten, die Zeilzahl variiert. Die Konzentration an abgegebenem IFN-γ wird wie in Bsp. 2 ermittelt. Tabelle 3 gibt die IFN-γ-Konzentrationen wieder.Approach: Polyclonal T cells are mixed with beads of size 7 μm, loaded with anti-IFN-γ antibodies, for 24 hours with OKT 3 (= Anti CD 3 from DAKO) and recombinant IL-2 in the concentrations OKT 34- 5 μg / ml and IL-240 U / ml stimulated. The number of beads is kept constant at 100,000, the number of rows varies. The concentration of IFN-γ released is determined as in Example 2. Table 3 shows the IFN-γ concentrations.

al le 3:all 3:

Zei l zahl polyklonale T-Zel len IFN-γ -Konz [ng/ml ]Number of polyclonal T-cells IFN-γ concentration [ng / ml]

25.000 1,5925,000 1.59

50.000 3,0150,000 3.01

100.000 6,03 200.000 9,34100,000 6.03 200,000 9.34

Wie in Tabelle 3 zu sehen, ist die Konzentrationsbestimmung in einem Verhältnisbereich der Zellen:Beads von 0,25:1 bis 2:1 linear, d.h. nur abhängig von der Menge der Signal -produzierenden Zellen.As can be seen in Table 3, the concentration determination in a ratio range of cells: beads from 0.25: 1 to 2: 1 is linear, i.e. only depending on the amount of signal-producing cells.

Beispiel 4: Kinetik der Abgabe von IFN-γ durch polyklonale T-Zellen: A. Jeweils 200.000 polyklonale T-Zellen werden mit je 100.000 Beads der Größe 7 μm, beladen mit Anti -IFN-γ-Antikörper, unter Stimulation von OKT 3 und IL-2 in den Konzentrationen OKT 34-5 μg/ml und IL-240 U/ml jeweils einmal 2, 3, 4 bzw. 5 Stunden inkubiert, und die IFN-γ Abgabe wie oben beschrieben bestimmt. Parallel dazu wird IFN-γ intrazellulär be- stimmt. Die intrazelluläre Bestimmung erfolgt in einem Parallelansatz ohne Beads: zunächst erfolgt die Stimulation mit Monensin in der Konzentration 1-3 μM. Die Zellen werden anschließend gewaschen und dann mit 4* 26Example 4: Kinetics of the delivery of IFN-γ by polyclonal T cells: A. 200,000 polyclonal T cells are each loaded with 100,000 beads of size 7 μm, loaded with anti-IFN-γ antibodies, with stimulation of OKT 3 and IL-2 in the concentrations OKT 34-5 μg / ml and IL-240 U / ml incubated once for 2, 3, 4 and 5 hours, respectively, and the IFN-γ release determined as described above. In parallel, IFN-γ is determined intracellularly. The intracellular determination is carried out in a parallel approach without beads: first, stimulation with monensin is carried out in a concentration of 1-3 μM. The cells are then washed and then with 4 * 26

Paraformaldehyd fixiert, durch 0,1* Saponin permeabilisiert und mit dem gleichen zweiten fluoreszenzmarkierten Antikörper gefärbt. Die Färbung geht auch im selben Ansatz, wobei 1 Sunde vor Ablauf der Stimulations- dauer Monensin zugegeben wird. Monensin verhindert die Freisetzung des gebildeten Cytokins. Die anschließende Fixierung und Permeabilisierung kann ebenfalls im selben Ansatz erfolgen. Der Anteil der Zellen, in denen intrazellulär das Cytokin nachgewiesen wird, wird als Prozentanteil der Geasamtzellen angegeben.Fixed paraformaldehyde, permeabilized by 0.1 * saponin and stained with the same second fluorescence-labeled antibody. The staining is also carried out in the same approach, with Monensin added 1 hour before the end of the stimulation period. Monensin prevents the release of the cytokine formed. The subsequent fixation and permeabilization can also take place in the same approach. The proportion of cells in which the cytokine is detected intracellularly is given as a percentage of the total cells.

Tabelle 4 zeigt einerseits den Prozentanteil an Zellen mit intrazellulär gespeichertem IFN-γ, andererseits die abgegebenen IFN-γ-Konzentrationen, die durch "Trapping", d.h. mit Hilfe der Beads ermittelt wurden, bzw. die mit Hilfe eines standartisierten ELISA-Tests (von Pharmingen, gemäß mitgeliefertem Standardprotokoll ) ermittelte IFN-γ-Konzentration im Überstand derselben Zellkultur.Table 4 shows on the one hand the percentage of cells with intracellularly stored IFN-γ, on the other hand the released IFN-γ concentrations, which can be determined by "trapping", i.e. were determined with the aid of the beads, or the IFN-γ concentration in the supernatant of the same cell culture, determined using a standardized ELISA test (from Pharmingen, in accordance with the standard protocol provided).

Tabelle 4:Table 4:

Stimulationsdauer intrazell . IFN-γ Trapping, Überst . im ELISADuration of stimulation intracell. IFN-γ Trapping, Rev. in the ELISA

[*] Konz [pg/ml] Konz [pg/ml ][*] Conc. [Pg / ml] conc. [Pg / ml]

2 Stunden 2,25 580 6182 hours 2.25 580 618

3 Stunden 2,25 540 2823 hours 2.25 540 282

4 Stunden 3,8 560 45 5 Stunden 2,44 1170 04 hours 3.8 560 45 5 hours 2.44 1170 0

B. Jeweils 200.000 polyklonale T-Zellen werden mit je 100.000 Beads der Größe 7 μm, beladen mit Anti -IFN-γ-Antikörper, unter Stimulation von Anti -CD 3 (OKT 3) und IL-2 jeweils einmal 2, 3, 4 bzw. 5 Stunden inkubiert. OKT 3 und IL-2 wurden in den Konzentrationen 4-5 μg/ml und bzw. 40 U/ml eingesetzt. Auch hier wird parallel dazu IFN-γ wie oben beschrieben intrazellulär gemessen. Tabelle 5: 27 Stimulationsdauer intrazell . IFN-γ Trapping, Uberst . im ELISAB. 200,000 polyclonal T cells are each loaded with 100,000 beads of size 7 μm, loaded with anti-IFN-γ antibodies, with stimulation of anti-CD 3 (OKT 3) and IL-2 once each 2, 3, 4 or incubated for 5 hours. OKT 3 and IL-2 were used in the concentrations 4-5 μg / ml and 40 U / ml respectively. Here, too, IFN-γ is measured intracellularly in parallel, as described above. Table 5: 27 Intracellular stimulation duration. IFN-γ trapping, Uberst. in the ELISA

[*] Konz [ng/ml] Konz [pg/ml ][*] Conc. [Ng / ml] conc. [Pg / ml]

2 Stunden 2,25 14,63 6182 hours 2.25 14.63 618

3 Stunden 2,25 14.02 2823 hours 2.25 Feb 14 282

4 Stunden 3,88 16.65 454 hours 3.88 16.65 45

5 Stunden 2,44 30.48 05 hours 2.44 30.48 0

Die Tabellen 4 und 5 zeigen, daß das Signal im Trapping-Ansatz über mehrere Stunden quantitativ erfaßt wird, während es im ELISA-Ansatz bei längerer Inkubationszeit verloren geht. Der Trapping-Ansatz fängt das abgegebene Signal auf und hält es stabil, während der ELISA nur die Menge an Signalmolekülen erfaßt, die nach der Zeil -Zeil -Wechselwirkung "übrig bleibt".Tables 4 and 5 show that the signal is recorded quantitatively over several hours in the trapping approach, whereas it is lost in the ELISA approach with a longer incubation time. The trapping approach catches the signal emitted and keeps it stable, while the ELISA only detects the amount of signal molecules that "remains" after the cell-cell interaction.

Beispiel 5: Kinetik der Abgabe von IFN-γ durch stimulierte PBMC^'s: 50.000 PBMC^SS werden mit 100.000 Beads der Größe 7 μm, beladen mit Anti- IFN-γ-Antikörpern, zusammengegeben und durch 10 ng/ml TPA und 0,5-1 μM Ionomycin einmal 2 Stunden, einmal 3 Stunden und einmal 4 Stunden in Kultur bei 37°C stimuliert. Die Bestimmung des abgegebenen IFN-γ wird wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt. Daneben wird wie oben be- schrieben der Prozentanteil an intrazellulär IFN-γ positiven Zellen ermittelt.EXAMPLE 5 Kinetics of the Delivery of IFN-γ by Stimulated PBMC ^'s : 50,000 PBMC ^S S are combined with 100,000 beads of size 7 μm, loaded with anti-IFN-γ antibodies, and combined with 10 ng / ml TPA and 0, 5-1 μM ionomycin stimulated once for 2 hours, once for 3 hours and once for 4 hours in culture at 37 ° C. The determination of the released IFN-γ is carried out as described in Example 4. In addition, the percentage of intracellular IFN-γ positive cells is determined as described above.

Tabelle 6:Table 6:

Stimulationsdauer intrazell. IFN-γ Trapping, Überst . im ELISADuration of stimulation intracell. IFN-γ Trapping, Rev. in the ELISA

*-Zellanteil Konz. [pg/ml] Konz. • [pg/ml]* Cell fraction conc. [Pg / ml] conc. • [pg / ml]

2 Stunden 24.19 3080 17642 hours 24.19 3080 1764

3 Stunden 11.26 2090 282 4 Stunden 11.56 4090 0 283 hours 11.26 2090 282 4 hours 11:56 4090 0 28

Beispiel 6: Nachweis des "Einfangens" des IFN-γ durch die in der Kultur befindlichen Beads:Example 6: Detection of the "capture" of IFN-γ by the beads in the culture:

Um zu zeigen, daß das von den Zellen abgegebene Signal (IFN-γ) von den Beads eingefangen wird, werden Zellen mit und ohne Beads in Kultur sti- muliert, und anschließend die IFN-γ-Konzentration im Überstand gemessen.In order to show that the signal emitted by the cells (IFN-γ) is captured by the beads, cells with and without beads are stimulated in culture, and the IFN-γ concentration in the supernatant is then measured.

A. Messung nach Stimulation von T-Zellen:A. Measurement after stimulation of T cells:

Es werden jeweils 200.000 Zellen einmal mit 100.000 Beads, einmal ohne Beads in Kultur mit 4-5 μg/ml Anti -CD 3 und 40 U/ml IL-2 stimuliert, und anschließend mit Hilfe des ELISA-Tests (Pharmingen, Standardprotokoll) die IFN-γ-Konzentration im Überstand bestimmt.200,000 cells each are stimulated once with 100,000 beads, once without beads in culture with 4-5 μg / ml anti-CD 3 and 40 U / ml IL-2, and then using the ELISA test (Pharmingen, standard protocol) IFN-γ concentration determined in the supernatant.

B. Messung nach Stimulation von PBMC's:B. Measurement after stimulation of PBMC's:

Jeweils 50.000 PBMC^'s werden einmal mit 100.000 Beads, einmal ohne Beads in Kultur durch 0,5-1 μM Ionomycin und 1-10 ng/ml PMA stimuliert, und wie unter A. die Konzentration von IFN-γ im Überstand bestimmt.50,000 each ^PBMC's are washed once with 100,000 beads, once stimulated without beads in culture by 0.5-1 uM ionomycin and 1-10 ng / ml PMA, and as described in A. the concentration of IFN-γ in the supernatant was determined.

Tabelle 7 zeigt die ermittelte IFN-γ-Konzentration im Überstand der stimulierten Zellen. Es ist deutlich zu sehen, daß die Beads das IFN-γ in allen Ansätzen fast vollständig "eingefangen" haben, da praktisch kein IFN-γ mehr im Überstand zu messen ist.Table 7 shows the determined IFN-γ concentration in the supernatant of the stimulated cells. It can be clearly seen that the beads have almost completely "captured" the IFN-γ in all batches, since practically no more IFN-γ can be measured in the supernatant.

Tabelle 7:Table 7:

Stimulations- T-Zellen T-Zellen PBMC's PBMC's dauer mit Beads ohne Beads mit Beads ohne BeadsStimulation T cells T cells PBMC's PBMC's duration with beads without beads with beads without beads

2 Stunden 45 618 45 17642 hours 45 618 45 1764

3 Stunden 0 282 0 2823 hours 0 282 0 282

4 Stunden 0 45 0 0 5 Stunden 45 0 n.g. n.g.4 hours 0 45 0 0 5 hours 45 0 ngng

Abkürzungen: PBMC^'s = Peripheral Blood Mononuclear Cells, n.g. = nicht gemessen 29Abbreviations: PBMC ^' s = Peripheral Blood Mononuclear Cells, ng = not measured 29

Zusammenfassung der Vorteile des Bead-Trappinα-Assavs:Summary of the advantages of the Bead Trappinα Assav:

• Der Trappingassay mißt die Gesamtmenge des Cytokins, das gebildet wird, der ELISA jeweils nur die Menge an Cytokin, die nach mehrmaligem Signalaustausch übrig bleibt. • Schon ab 2 Stunden ist die Kinetik von IFN-γ quantitativ auswertbar.• The trapping assay measures the total amount of cytokine that is formed, the ELISA only the amount of cytokine that remains after repeated signal exchange. • The kinetics of IFN-γ can be evaluated quantitatively from just 2 hours.

• Es wird nur eine relativ geringe Zellzahl für die Messung des Signals benötigt, nämlich 2 x 10⁴ bis 2 x 10⁵ pro Ansatz.• Only a relatively small number of cells is required for the measurement of the signal, namely 2 x 10 ⁴ to 2 x 10 ⁵ per batch.

• Es ist eine physiologische Stimulation der lebenden I munzellen möglich, z.B. mit Anti -CD 3, IL-2 oder Antigenen. • Die Zellen können lebend weiter untersucht werden. Physiological stimulation of the living immune cells is possible, e.g. with anti-CD 3, IL-2 or antigens. • The cells can be examined further live.

Claims

30 PATENTANSPRÜCHE 30 PATENT CLAIMS

1. Verfahren zum Erfassen von Primärsignalen der Zellkommunikation von menschlichen und Säugetierzellen außerhalb eines Organismus. wobei Polymerkügelchen mit einem Durchmesser von 5 bis 100 μm, die mindestens mit einem für diese Primärsignale spezifischen Antikörper beladen sind, mit menschlichen oder Säugetierzellen, die Primärsignale aussenden können, gemischt und in Zellkultur unter physiologischen Bedingungen inkubiert werden, worin die Zellen durch einen externen Reiz zur Abgabe des Primärsignals stimuliert werden und die Polymerkügelchen die abgegebenen Primärsignale auffangen, welche anschließend mit Hilfe eines weiteren Antikörpers, an den ein die Detektion zulassendes Molekül gekoppelt ist, meßbar gemacht werden.1. Method for detecting primary signals of cell communication from human and mammalian cells outside an organism. wherein polymer beads with a diameter of 5 to 100 microns, which are loaded with at least one antibody specific for these primary signals, mixed with human or mammalian cells that can send primary signals, and incubated in cell culture under physiological conditions, wherein the cells by an external stimulus stimulated to emit the primary signal and the polymer beads capture the emitted primary signals, which are then made measurable with the aid of another antibody to which a molecule that allows detection is coupled.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die erfaßten Primärsignale Cytokinabgaben von Immunzellen sind.2. The method according to claim 1, characterized in that the detected primary signals are cytokine releases from immune cells.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das abgege- bene Cytokin aus Interleukinen (IL), Interferonen (IFN), Tumor-3. The method according to claim 2, characterized in that the cytokine released from interleukins (IL), interferons (IFN), tumor

Nekrose-Faktoren (TNF) oder Transforming Growth Factoren (TGF) ausgewählt ist.Necrosis Factors (TNF) or Transforming Growth Factors (TGF) is selected.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das abgege- bene Cytokin Interferon-γ ist.4. The method according to claim 3, characterized in that the cytokine released is interferon-γ.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Polymerkügelchen einen Durchmesser von 5 bis 30 μm haben. 315. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the polymer beads used have a diameter of 5 to 30 microns. 31

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Polymerkügelchen einen Durchmesser von 6 bis 10 μm haben.6. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the polymer beads used have a diameter of 6 to 10 microns.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Polymerkügelchen einen Durchmesser von 7 μm haben.7. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the polymer beads used have a diameter of 7 microns.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeich- net, daß die Polymerkügelchen und die Signalabgebenden Zellen in einem Mischungsverhältnis von 0,5 : 1 bis 2 : 1 zusammengegeben werden.8. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the polymer beads and the signal-emitting cells are combined in a mixing ratio of 0.5: 1 to 2: 1.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeich- net, daß die Polymerkügelchen mit den Signalabgebenden Zellen in einem Mischungsverhältnis von 1 : 1 zusammengegeben werden.9. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the polymer beads are combined with the signal-emitting cells in a mixing ratio of 1: 1.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerkügelchen mit den Zellen in direkten Kontakt treten können.10. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that the polymer beads can come into direct contact with the cells.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Antikörper spezifisch den Komplex von erstem Antikörper mit dem gebundenen Cytokin erkennt.11. The method according to any one of claims 1 to 10, characterized in that the second antibody specifically recognizes the complex of the first antibody with the bound cytokine.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Antikörper spezifisch ein Cytokin erkennt.12. The method according to any one of claims 1 to 10, characterized in that the second antibody specifically recognizes a cytokine.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeich- net, daß an den zweiten Antikörper ein niedermolekulares, leicht zu detektierendes Farbstoffmolekül gekoppelt ist. 3213. The method according to any one of claims 1 to 12, characterized in that a low molecular weight, easily detectable dye molecule is coupled to the second antibody. 32

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Farb- stoffmolekül Fluorescein ist.14. The method according to claim 13, characterized in that the dye molecule is fluorescein.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeich- net, daß verwendete Medien und Pufferlösungen einen pH zwischen15. The method according to any one of claims 1 to 14, characterized in that the media and buffer solutions used have a pH between

6,5 und 8 haben.6.5 and 8.

16. Polymerkügelchen aus einem bioinerten Material mit einem Durchmesser von 5 bis 100 μm mit einer glatten, negativ geladenen, hydro- philen Oberfläche, wobei diese Oberfläche durch das Ankoppeln geladener Komponenten und hydrophiler Komponenten an das Polymer erzeugt werden kann, beladen mit Antikörpern gegen ein Cytokin mit einer Beladungsdichte von 10³ bis 10⁶ Antikörpern pro Kügelchen.16. Polymer beads made of a bio-inert material with a diameter of 5 to 100 μm with a smooth, negatively charged, hydrophilic surface, this surface being able to be produced by coupling charged components and hydrophilic components to the polymer, loaded with antibodies against Cytokine with a loading density of 10 ³ to 10 ⁶ antibodies per bead.

17. Polymerkügelchen nach Anspruch 16, mit einem Durchmesser von 5 bis 30 μm.17. Polymer beads according to claim 16, with a diameter of 5 to 30 microns.

18. Pol merkügelchen nach Anspruch 17, mit einem Durchmesser von 6 bis 10 μm.18. Pole beads according to claim 17, with a diameter of 6 to 10 microns.

19. Polymerkügelchen nach Anspruch 18, mit einem Durchmesser von 7 μm.19. Polymer beads according to claim 18, with a diameter of 7 microns.

20. Set oder Kit. enthaltend Polymerkügelchen gemäß einem der Ansprüche 16 bis 19 und freien Antikörper, an den ein Marker-Molekül ge- koppelt ist, geeignet zur Verwendung für das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15. 20. Set or kit. containing polymer beads according to one of claims 16 to 19 and free antibody to which a marker molecule is coupled, suitable for use for the method according to one of claims 1 to 15.