EP1055003A1 - METHODS FOR CHARACTERISING mRNA MOLECULES - Google Patents

METHODS FOR CHARACTERISING mRNA MOLECULES

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Publication number
EP1055003A1
EP1055003A1 EP99908907A EP99908907A EP1055003A1 EP 1055003 A1 EP1055003 A1 EP 1055003A1 EP 99908907 A EP99908907 A EP 99908907A EP 99908907 A EP99908907 A EP 99908907A EP 1055003 A1 EP1055003 A1 EP 1055003A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cdna
alternative
nucleotides
pcr
amplification
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP99908907A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Ralf Hoffmann
Hermann LÜBBERT
Stefan Zwilling
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biofrontera Bioscience GmbH
Original Assignee
Novartis Erfindungen Verwaltungs GmbH
Biofrontera Pharmaceuticals GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis Erfindungen Verwaltungs GmbH, Biofrontera Pharmaceuticals GmbH filed Critical Novartis Erfindungen Verwaltungs GmbH
Publication of EP1055003A1 publication Critical patent/EP1055003A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C12Q1/6855—Ligating adaptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection

Definitions

  • the present invention relates to methods for the qualitative and quantitative detection of differentially expressed mRNA molecules.
  • the technology on which the invention is based is briefly referred to below as DEPD (Digital Expression Pattern Display).
  • the genome of higher organisms comprises around 100,000 different genes, of which only a comparatively small number are expressed in every cell of an organism and thus converted into polypeptides and proteins. It is assumed that to a large extent all processes and metabolic performance in the area of living matter depend on which genes are switched on and off at what time in soft tissues. Numerous findings indicate that cellular processes such as homeostasis, reactions to allergies, regulation of the cell cycle, aging and the entry of cells into programmed cell death (apoptosis) are based on, or are related to, the differential expression of certain genes. Both the course of normal development and that of diseases such as Cancer-causing pathological phenomena are essentially due to changes in gene expression.
  • the method according to the invention is used, in particular, to record as much as possible of all mRNA molecules present in a cell or in a tissue and to compare them with other rows of tissues or with specific conditions (disease or development stages) or treatment phases thereof, preferably both in qualitative and in terms of treatment in quantitative terms.
  • the method according to the invention thus allows, for example, the creation of a comprehensive image of the various mRNA molecules present in a defined mRNA population and the subsequent use of the preferably digital information obtained in the context of - 2 -
  • the present method therefore allows the holistic detection and characterization of cellular processes that are reflected in specific expression patterns at the level of the mRNA populations. In this way, for example, changes in the expression pattern of individual genes involved in a specific process can be identified quickly and reliably. In this way, new active substances for active pharmaceutical ingredients can be defined.
  • the information obtained can also be used to establish the causal relationship between known target genes and target proteins via traceable biochemical signaling or synthetic routes.
  • P. Liang and AB Pardee describe a method for the separation of individual mRNAs by means of polymerase chain reaction (PCR) (P. Liang & AB Pardee 1992 Science 257, 967-971). This method was used to compare the mRNA populations expressed by two related cell types.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the products were separated on sequencing gels and 50-100 bands in the size range of 100-500 nucleotides were observed.
  • the bands resulted from the amplification of cDNAs corresponding to the 3 ' ends of mRNAs containing the complement of the 3' anchor primer and the arbitrarily chosen 5 'oligomer.
  • the patterns of the bands amplified from both cDNAs were similar for each pair of primers, the intensities of approximately 80% of the bands being indistinguishable. Certain bands appeared in one or the other PCR - 3 -
  • WO 95/13369 discloses a method (TOGA - TOtal Gene Expression Analysis) for the simultaneous identification of differentially expressed mRNAs and for measuring their relative concentrations.
  • the method is based on the generation of double-stranded cDNA from isolated mRNA using a specific set of oligo (dT) primers.
  • a mixture of 12 anchor primers with the following structure is used: starting from 5 ', a "stuffer” or “heel” fragment of 4-40 bases is followed by a recognition sequence for a restriction endonuclease (typically NotI), 7-40 dT nucleotides and finally two “anchor bases” V, N at the 3 'end of the primer.
  • V denotes a deoxyribonucleotide from group dA, dC or dG
  • N defines the deoxyribonucleotides dA, dC, dG and dT.
  • the cDNA obtained in this way is then completely digested with a restriction enzyme which recognizes 4 bases as the sequence for the cleavage (eg Mspl), cut with NotI and cloned into a correspondingly treated plasmid vector.
  • the orientation of the insert is "antisense" relative to a vector-encoded, bacteriophage-specific promoter (typically T3).
  • the ions are transformed into an E.coii strain, which generates cDNA banks.
  • the plasmid DNA of these cDNA libraries is isolated and linearized using combination digests by 6 different restriction enzymes, which are different from those used above.
  • the linearized cDNA is translated into cRNA by the T3 polymerase and then transcribed into 16 sub-fractions of single-stranded cDNA.
  • a thermostable reverse transcriptase at high temperature and one of 16 different cRNA primers, the two 3'-nucleotides of which consist of a complete permutation of the 4 possible deoxyribonucleotides dA, dC, dG and dT, are used.
  • the products of the 16 cDNA fractions are used as templates for PCR using a 3'-oligonucleotide, which is one Vector sequence corresponds to the cloning site of the insert, and a 5 ' oligomer which corresponds to one of the 16 cDNA synthesis primers with an additional two 3 ' nucleotides of the complete permutation of the 4 possible deoxyribonucleotides dA, dC, dG and dT.
  • up to 256 different pools are generated, whose radiolabelled bands (35S-dATP or 32P-dCTP) are analyzed on polyacrylamide gels.
  • radiolabelled bands 35S-dATP or 32P-dCTP
  • thermostable reverse transcriptase for the permuted primers which are used for the second cDNA synthesis, since the selectivity of the reverse transcriptase in the case of base mismatch is generally approx. 10-1,000 times (for AMV-RT) below the selectivity the Taq polymerase (LN. Mendelman et al. 1990, J. Biol. Chem. 265, 2338-2346);
  • double-stranded cDNA is generated using an oligonucleotide of the structure "Heel-dT (13)", "Heel” being a sequence of 12 bases.
  • the cDNA is completely digested by a restriction enzyme with a 4-base recognition sequence (Rsal) and ligated with a "pseudo double-strand adapter".
  • This molecule consists of a longer (39 bases) and a shorter (12 bases complementary to the 3 ' end of the longer) oligomer, which are hybridized against one another under suitable conditions.
  • the 5 'ends of the oligonucleotides are not phosphorylated.
  • the cDNA synthesis primer with an additional two 3'-nucleotides of the complete permutation of all four deoxyribonucleotides dA, dC, dG and dT and a primer which is the 3 ' end of the longer adapter oligomer with an additional two 3' nucleotides the complete permutation of all four deoxyribonucleotides dA, dC, dG and dT is used.
  • an artificial mismatch was introduced into the oligonucleotide at position -4 relative to the 3 'end of the primer.
  • Y. Prashar and S. Weissman (1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 659-663) describe a process in which double-stranded cDNA is produced by means of 12 oligonucleotides which have the following structure: one starting from 5 'follows one "Heel” structure is a sequence of 18 dT nucleotides and two "anchor bases" V, N at the 3 ' end of the primer.
  • V denotes a deoxyribonucleotide of the group dA, dC or dG
  • N defines the deoxyribonucleotides dA, dC, dG and dT.
  • the cDNA synthesis takes place at a temperature of 50 ° C and should enable the complex mixture to be divided into 12 different pools.
  • the resulting DNA fragments are provided with an adapter, which has the structure of a letter.
  • an oligonucleotide is used as the 5 ' primer, the binding site of which lies in the outer region of the Ypsilon adapter and which only arises when the complementary strand to this region is formed in a first synthesis. All fragments that have a Ypsiion adapter on both sides cannot be amplified.
  • WO 97/2921 1 describes the 'restriction display (RD-PCR)' technique, in which double-stranded cDNA is produced using 12 oligonucleotides.
  • These primers have the following structure: starting from 5 ', a "heel” structure is followed by two deoxynucleotides of the complete permutation of all four deoxyribonucleotides dA, dC, dG and dT, a sequence of 17 dT nucleotides and two "anchor bases" V, N am 3 'end of the primer.
  • V denotes a deoxyribonucleotide from group dA, dC or dG, while N denotes - 7 -
  • Deoxyribonucleotides dA, dC, dG and dT defined. After complete digestion of the cDNA with one or more restriction endonucleases, an adapter molecule is ligated to the cDNA fragments. In a subsequent PCR, a 3'-primer is used which binds selectively to the "heel" structure of the cDNA and additionally has two 3'-nucleotides V, N at the 3 ' end of the primer.
  • V denotes a deoxyribonucleotide from group dA, dC or dG, while N defines the deoxyribonucleotides dA, dC, dG and dT.
  • oligonucleotide corresponding to the 3 'sequence of the adapter primer is used as the 5' primer, which additionally contains a 3 'nucleotide or two 3' nucleotides or three 3 'nucleotides for the complete permutation of all four deoxyribonucleotides dA, dC, dG and dT.
  • the PCR is carried out with different permutation combinations in such a way that in a first PCR (or in the first 10-25 PCR cycles) 5 'primers with only one permutation and then in a second PCR (or in the remaining PCR Cycles) 5 'primers with only two or three permutations can be used. This is said to significantly increase the selectivity for the various 5'-primer permuations.
  • Kato describes a method ('molecular indexing' - 1995, Nucl. Acids Res., Vol. 23, 3685-90 and 1996, Nucl. Acids Res., Vol. 24, 394-95), which is based on the digestion of the double-stranded cDNA with restriction endonucleases of class IIS. These generate 5 'overhangs of the cDNA of unknown sequence.
  • 64 biotinylated adapters, the nucleotides of which 2-4 (relative to the 5 'end) of their 5' overhangs are complementary to a 64 step of the entire cDNA pool, are then ligated with DNA ligase from E. coli.
  • the respective 5 'nucleotide of the adapter overhangs remains undefined.
  • the cDNA fragments ligated in this way are purified by binding to streptavidin-coupled magnetic particles.
  • the adapter-ligated 3 'ends of the cDNA are removed using an adapter oligonucleotide and an oligo (dT) oligomer which is attached to the 3' - 8th -
  • a method for identifying and characterizing mRNA molecules comprises the following steps:
  • step (b) wherein for the 1st and 2nd alternatives in step (b) the synthesis of the first strand cDNA molecules takes place by reverse transcription using an anchored oligo-dT nucleotide which has a 3'-extension of 2 bases, the first base dA , dC or dG, and the second base is dA, dC, dG or dT, and which has a 5 'extension of 5-15, preferably 6-15, bases which are suitable for the - 10 -
  • step (b) Encoding a restriction endonuclease site with the cleavage characteristic 16/14 'downstream' of the recognition sequence; or wherein for the third alternative in step (b) the cDNA first strand molecules are synthesized by reverse transcription using an anchored oligo-dT nucleotide which has a 3'-extension of 2 bases, the first base dA, dC or dG, and the second base is dA, dC, dG or dT, and which has a 5 'extension of 5-15 bases of any sequence.
  • Enzymes with the cleavage characteristic 16/14 "downstream" of the recognition sequence are known to the person skilled in the art. Examples are Eco571 and Bsg1 (see, for example, A. Janulaitis et al., Nucleic Acids Res. 20 (1992), pp. 6043-6049; Petrusyte et al., Gene 74 (1988), pp. 89-
  • the oligo-dT nucleotide is preferably completely substituted by 2'-O-methylated ribonucleotides.
  • the oligo-dT nucleotide can consist of standard deoxyribonucleotides.
  • the oligo-dT nucleotide is provided with a biotin residue at its free 5 'end and / or at internal dT nucleotides via a C9 spacer.
  • a preferred embodiment relates to a method according to the invention, wherein in step (h) of the second alternative or in step (e) of the third alternative, the mismatches at positions -3, or -3 and -4, or -4 and -5 compared to the complementary strand determined by the adapter molecules.
  • a further preferred embodiment of the method according to the invention is characterized in that a restriction enzyme of class IIS is used in step (c) which has 5 nucleotides as the recognition sequence and one of 2-4, in particular 4, nucleotides which are not part of the recognition sequence, existing overhang of the cut cDNA fragments generated.
  • a restriction enzyme of class IIS is used in step (c) which has 5 nucleotides as the recognition sequence and one of 2-4, in particular 4, nucleotides which are not part of the recognition sequence, existing overhang of the cut cDNA fragments generated.
  • a further preferred embodiment of the method according to the invention is characterized in that in step (f) of the 1st alternative or in step (e) of the 2nd alternative the - 11 -
  • step (g) of the 1st alternative or in step (f) of the 2nd alternative of the method according to the invention a restriction enzyme of class IIS is used.
  • step (d) or from step (h) of the first alternative or from step (g) of the second alternative of the method according to the invention prior to the amplification according to step (i) with a nuclease, selected from the group, are further preferred from T4 endonuclease VII, S1 nuclease, and mung bean nuclease.
  • the method according to the invention is preferably characterized in that in step (i) of the first alternative or in step (h) of the second alternative or in step (e) of the third alternative, the cDNA fragments are amplified using oligonucleotides, that hybridize to the complementary strand of the sense oligomer of the ligated adapter molecules.
  • the method according to the invention is further preferably characterized in that in step (k) of the first alternative or in step (j) of the second alternative or in step (g) of the third alternative, the analysis is based on the different lengths of the products and in knowledge of the by manipulation known base sequence of 9 or 10 nucleotides.
  • a further preferred embodiment relates to the use of the method according to the invention according to one of the preceding claims for possibly computer-aided identification and isolation and analysis of new genes.
  • the method DEPD according to the invention was developed in order to significantly reduce the error rate in the identification of some nucleotides of the cDNA fragments, which in turn permit the identification of the encoded gene in a suitable database.
  • the improved performance of the method according to the invention results from the use of specific ligation techniques in a suitable combination with permutation-specific mismatch PCR. After selective purification of the 3 'ends of the cDNAs, an adapter molecule is ligated to the 5' and 3 'ends of the fragments. In the following - 12 -
  • PCR primers are used which preferably each have two bases as permutation.
  • the permutation specificity of the PCR primers can be significantly increased at a high annealing temperature and preferably with the simultaneous introduction of artificial template mismatches at selective oligonucleotide sites.
  • an error-correcting effect is obtained by using permutation primers on both sides of the cDNA template, since such amplification products, which were erroneously created in one of the first rounds of PCR by means of an oligomer, in their further propagation can be suppressed if the counter-primer only amplifies the correct permutation.
  • the suitable, combined use of ligation and PCR permutation technology in the DEPD method makes it possible to define 9 or 10 nucleotides and the length of an amplified fragment. This information should also be sufficient for the reliable identification of a gene, preferably by means of database analysis, if there should be an error in determining the base sequence of the cDNA fragment.
  • the use of the DEPD method according to the invention enables, among other things, a comprehensive analysis of the interaction of all genes involved in a defined system and / or in a defined situation at the level of the mRNA expression pattern, with only small amounts of tissue or cells being required for specific and reproducible results become.
  • the method can be used in a variety of applications. This includes, for example, the comparison of organs, tissues, tissue parts, or diseased tissues or tissue parts with appropriate healthy material, possibly also in the context of a comparative investigation using active pharmaceutical ingredients against corresponding controls - 13 -
  • the method according to the invention enables a comparison of defined states in animal models, with comparative analyzes of organs, tissues, tissue parts or diseased tissues or tissue parts being preferred over corresponding healthy material. Further areas of application concern the analysis of transgenic animals, which also include so-called ' knock-out ' animals, as well as the phenotypic evaluation of the use of antibodies, antisense and ribozyme oligonucleotides and comparable agents, which are used in the context of functional approaches to elucidate the relevance certain genes are used.
  • Another aspect of the present invention is its preferred use in the context of a database-oriented gene expression analysis method.
  • the method according to the invention represents a surprisingly simple and inexpensive alternative to the known methods of the type described above in terms of quality is clearly superior.
  • RNA isolation and purification of total RNA from tissues to be examined, tissue parts, biopsy samples, cells etc. is carried out according to the standard methods described.
  • an enzymatic digestion is carried out with DNasel (Boehringer Mannheim, Germany).
  • the polyA + mRNA is then purified from the total RNA by means of oligo (dT) -coupled magnetic particles (Oligo (dT) magnetic beads, Promega, Wl, USA).
  • Double-stranded cDNA is synthesized from mRNA using a mixture of 12 anchor primers with the following structure: starting from 5 'is followed by a "HeeP" fragment (5 "extension) of 5-15 bases, for example 5 or 6 bases Detection sequence for one of the restriction enzymes Bsgl or Eco57l. This is followed by a sequence of 14 dT nucleotides and the two anchor nucleotides V, N at the 3 'end of the primer.
  • V denotes a deoxyribonucleotide of the group dA, dC or dG
  • N defines the deoxyribonucleotides dA, dC, dG and dT
  • the deoxyribonucleotides of the dT sequence possibly also of the "Heel" fragment, are completely substituted by 2'-O-methylated ribonucleotides 5'-end and / or on one or more internal dT nucleotides with a biotin residue (C9 spacer).
  • cDNA synthesis can be carried out with a mixture of 12 unmodified, i.e. anchor primers consisting of deoxyribonucleotides are carried out.
  • First adapter ligation a) The enzyme digestion creates a 5 'overhang of four unknown nucleotides in the cDNA. Sixteen adapter molecules consisting of two oligomers (not 5 ' - phosphorylated, "pseudo double-stranded" adapters) are ligated to the cDNA after restriction digestion has taken place.
  • the adapter typically consists of two oligonucleotides of different lengths, the longer of 25-35, the shorter (complementary to the 3 ' end of the longer) of 8-25 bases, in particular 8-12 bases.
  • the adapter is created by hybridizing the two oligonucleotides against each other under suitable conditions and forms a 4-nucleotide overhang, with nucleotide 3 or 4 ('inner' nucleotides - relative to the 5 'end of the antisense oligomer) one of the four possible deoxyribonucleotides dA, dC, dG and dT can be, while the 'outer' nucleotides 1 and 2 (relative to the 5 'end of the antisense oligomer) remain undefined, ie they always consist of a mixture of all four deoxyribonucleotides.
  • the ligation batches are subsequently incubated with a nuclease selected from the group consisting of T4 endonuclease VII, S1 nuciease and mung bean nuclease.
  • the 16 permuted adapter molecules are ligated at 4-37 ° C., 1-16 hours, 0-150 mM Na acetate, 1-5 units of T4 DNA ligase (or Taq DNA ligase or E. coli DNA ligase) in a suitable buffer. After purification, each of the 16 ligation batches is used as a template in a PCR (see (8a)).
  • coli DNA ligase is able to discriminate the first three bases of the adapter overhang in the ligation. This takes place under the conditions already described above. To ensure the correct adapter ligation, the ligation approaches are subsequently selected with a nuclease from the - 16 -
  • T4 endonuclease VII Group consisting of T4 endonuclease VII, S1 nuclease, and mung bean nuclease.
  • the 5 overhangs of the cDNA are successively filled with deoxyribonucleotides using Kienow DNA polymerase. This is possible through the use of dideoxyribonucleotides (ddNTP) and competitive adapter molecules.
  • ddNTP dideoxyribonucleotides
  • competitive adapter molecules the 3 'ends of the cDNA are not eluted from the magnetic particles in order to be able to remove the nucleotides used after each step.
  • the cDNA is first incubated with ddC nucleotides in order to block all overhangs which begin with a dG. After removal of the didesxoribonucleotides, the cDNA is incubated with dA nucleotides. This is followed by the ligation of an adapter moiecule, which has a 'biunt' and a 'sticky' end, to those cNDAs which have until then a filled 5 'overhang. Two competitive adapter molecules are ligated in the same step.
  • the 3 'ends of the cDNA can preferably be selectively purified from the cDNA mixture with the aid of magnetic particles (magnetic beads) which are coupled to streptavidin (see also Biomagnetic Techniques in Molecular Biology, Dynal, N-0212 Oslo, Norway). This type of purification ensures that in the subsequent PCR there is no unspecific amplification of internal (ie non-3 ' ends) cDNA fragments.
  • the cDNA is eluted from the magnetic particles either by extraction with organic solvents at high temperature - 17 -
  • the adapter typically consists of two oligonucleotides of different lengths, the longer of 25-35, the shorter (complementary to the 3 ' end of the longer, 5'-phosphorylated) consisting of 22-30 bases.
  • the adapter is created by hybridizing the two oligonucleotides against each other under suitable conditions and forms a 2-nucleotide overhang, the 'outer' 3 'nucleotide being one of the four deoxyribonucleotides dA, dC, dG or dT, while the' inner 'nucleotide is defined from a mixture of the three bases dA, dC or dG.
  • the 'outer' 3 'nucleotide of the adapter overhang thus determines the specificity of the ligation.
  • the ligation conditions are as described above. Each of the 256 ligation batches is used as a template after purification in a PCR (see (8b)).
  • the cDNA synthesis primer (mixture of 12 anchor primers) which is completely substituted by 2'-O-methylated ribonucleotides is used as the 3 'primer. Due to the increased dissociation temperature of the modified bases of the oligonucleotide, a significantly higher (up to 40%, see for example LL Cummins 1995, Nucl.Acids Res., 23, 2019-2024) annealing temperature can be used in the PCR than with a unsubstituted primer.
  • ⁇ rei 3 ' nucleotides correspond to the complete permutation of all four deoxyribonucleotides dA, dC, dG and dT.
  • the primer permutations used here correspond to bases 3 - 4 or 2 - 4 of the adapter overhangs defined in the ligation approaches under (4a).
  • a further 16 or 64 PCRs are carried out for each first PCR with the same 3 'primer and 16 5' oligonucleotides each with a length of 18-27 bases, which correspond to the 5 'primer of the first PCR, however, two or three 5 'nucleotides of complete permutation of all four deoxyribonucleotides dA, dC, dG and dT are extended.
  • selective PCR primers are used, which can contain several artificially introduced fenipaires compared to the template DNA. These mismatches can be located anywhere on the oligomer, with 2 mismatches at positions -2 and -3 or 1 match at position -1 relative to the 3 ' end of the primer (position 0) preferred.
  • the PCR profile is typically: 3 min, 95 S C followed by 20-40 cycles with 45 sec, 95 S C, 45 sec, 65 e C, 60 sec, 72 S C and a final extension for 60 sec at 72 ⁇ C, and is carried out with the aid of radioactive or fluorescent labeled PCR primers.
  • the PCR is carried out as described under 8a), but using an unmodified cDNA synthesis primer (mixture of 12 anchor primers), which consists of standard deoxyribonucleotides.
  • oligonucleotides with a length of 18-27 bases corresponding to the 3 ' end of the sense oligonucleotide of the second ligated adapter molecule (see (7)) are used as the 3' primer. - 19 -
  • the PCR profile is typically: 3 min, 95 e C followed by 20-40 cycles with 45 sec, 95 e C, 45 sec, 65 e C, 60 sec, 72 S C and a final extension for 60 sec at 72 S C, and is carried out with the aid of radioactive or fluorescently labeled PCR primers.
  • a 5 'primer with a length of 18-27 bases is inserted, which corresponds to the 3' end of the sense oligonucleotide of the ligated adapter molecule.
  • the cDNA synthesis oligonucleotide is used as the 3 'primer.
  • the PCR profile is typically: 3 min, 95 S C followed by 20-40 cycles with 45 sec, 95 Q C, 45 sec, 65 Q C, 60 sec, 72 Q C and a final extension for 60 sec at 72 e C, and is carried out in the presence of radioactively labeled nucleotides.
  • the PCR fragments are typically analyzed on 6% polyacrylamide gels
  • PAA gels with 7-8 M urea or by capillary electrophoresis.
  • the results show that the selectivity for the amplification of the correct 5'-nucleotides of the cDNA for the 5'-primers of the TOGA method is not sufficient, in particular if the aim is to carry out a computer-assisted database analysis of the results .
  • the error rate when using the 5 'primers according to the invention is 5 5%.
  • the error rate can be further reduced to approximately 0% using the liagtion method described above. In view of this extremely low error rate, the establishment of an automated data analysis is also made possible.

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Abstract

The invention relates to methods for the qualitative and quantitative determination of differentially expressed mRNA molecules. Said methods are used especially to determine if possible all mRNA molecules present in a cell or a tissue, and to compare them with other cells or tissues or with other conditions (stages of disease or development) or stages of treatment for same. The method provided for in the invention therefore makes it possible, for example, to establish a comprehensive map of the different mRNA molecules present in a defined mRNA population and subsequently to use the preferably digital information obtained in this way in data base analyses.

Description

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Verfahren zur Charakterisierung von mRNA-MolekülenMethod for characterizing mRNA molecules
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur qualitativen und quantitativen Erfassung differentiell exprimierter mRNA-Moleküle. Die der Erfindung zugrundeliegende Technik wird nachfolgend kurz mit DEPD (Digital Expression Pattern Display) bezeichnet.The present invention relates to methods for the qualitative and quantitative detection of differentially expressed mRNA molecules. The technology on which the invention is based is briefly referred to below as DEPD (Digital Expression Pattern Display).
Das Genom höherer Organismen umfasst nach gegenwärtigen Schätzungen etwa 100.000 verschiedene Gene, von denen jedoch nur eine vergleichsweise kleine Anzahl in jeder Zelle eines Organismus exprimiert und damit in Polypeptide und Proteine umgesetzt wird. Es wird davon ausgegangen, dass weitgehend alle Prozesse und Stoffwechselleistungen im Bereich der lebenden Materie davon abhängen, welche Gene zu welchem Zeitpunkt in weichen Gewecen an- bzw. abgeschaltet werden. So weisen zahlreiche Befunde darauf hin, dass zelluläre Prozesse wie beispielsweise Homöostase, Reaktionen auf Allergien, Regulation des Zellzykius, Altern und das Eintreten von Zellen in den programmierten Zelltod (Apoptose) auf der differentiellen Expression bestimmter Gene basieren oder hiermit im Zusammenhang stehen. Sowohl der Verlauf einer normalen Entwicklung als auch die zu Erkrankungen wie z.B. Krebs fünrenden pathologischen Erscheinungen beruhen im wesentlichen auf Veränderungen in der Genexpression.According to current estimates, the genome of higher organisms comprises around 100,000 different genes, of which only a comparatively small number are expressed in every cell of an organism and thus converted into polypeptides and proteins. It is assumed that to a large extent all processes and metabolic performance in the area of living matter depend on which genes are switched on and off at what time in soft tissues. Numerous findings indicate that cellular processes such as homeostasis, reactions to allergies, regulation of the cell cycle, aging and the entry of cells into programmed cell death (apoptosis) are based on, or are related to, the differential expression of certain genes. Both the course of normal development and that of diseases such as Cancer-causing pathological phenomena are essentially due to changes in gene expression.
Dementsprechend besteht Bedarf an spezifischen Verfahren zur Erfassung unterschiedlich bzw. differentiell exprimierter mRNA-Moleküle, um Unterschiede in der Genexpression im Vergleich zu geeigneten Kontrollen zu identifizieren. Derartige Verfahren wären sowohl diagnostisch als auch im Wege der Evaluierung therapeutischer Targets von grosser Bedeutung.Accordingly, there is a need for specific methods for detecting differently or differentially expressed mRNA molecules in order to identify differences in gene expression compared to suitable controls. Such methods would be of great importance both diagnostically and by evaluating therapeutic targets.
Das erfindungsgemässe Verfahren dient insbesondere der Erfassung möglichst aller in einer Zelle oder in einem Gewebe vorliegenden mRNA-Moleküle sowie deren Vergleich mit anαeren Zeilen oαer Geweben oder mit bestimmten Zuständen (Krankheits- oder Ξntwicklungsstadien) oder Behandlungsphasen derselben, und zwar vorzugsweise sowohl in qualitativer als auch in quantitativer Hinsicht. Das erfindungsgemässe Verfahren erlaubt somit z.B. die Erstellung eines umfassenden Abbildes der in einer definierten mRNA- Population vorliegenden verschiedenen mRNA-Moleküle sowie die anschliessende Verwendung der hierbei erhaltenen, vorzugsweise digitalen Information im Rahmen von - 2 -The method according to the invention is used, in particular, to record as much as possible of all mRNA molecules present in a cell or in a tissue and to compare them with other rows of tissues or with specific conditions (disease or development stages) or treatment phases thereof, preferably both in qualitative and in terms of treatment in quantitative terms. The method according to the invention thus allows, for example, the creation of a comprehensive image of the various mRNA molecules present in a defined mRNA population and the subsequent use of the preferably digital information obtained in the context of - 2 -
Datenbankanaiysen. Es ist davon auszugehen, dass in naher Zukunft alle humanen Gensequenzen in entsprechenden Datenbanken zur Verfügung stehen werden. Das vorliegende Verfahren erlaubt deshalb die gesamtheitliche Erfassung und Charakterisierung von zellulären Vorgängen, die sich in spezifischen Expressionsmustern auf der Ebene der mRNA-Populationen wiederspiegein. Hierdurch können beispielsweise Veränderungen im Expressionsmuster einzelner, an einem spezifischen Prozess beteiligter Gene schnell und verlässlich identifiziert werden. Dadurch lassen sich auch neue Substanzwirkzieie für pharmazeutische Wirkstoffe definieren. Die erhaltenen Informationen können auch eingesetzt werden, um über nachvollziehbare biochemische Signal- bzw. Synthesewege den kausalen Zusammenhang zwischen bekannten Zielgenen und Zielproteinen herzustellen.Database analysis. It can be assumed that in the near future all human gene sequences will be available in corresponding databases. The present method therefore allows the holistic detection and characterization of cellular processes that are reflected in specific expression patterns at the level of the mRNA populations. In this way, for example, changes in the expression pattern of individual genes involved in a specific process can be identified quickly and reliably. In this way, new active substances for active pharmaceutical ingredients can be defined. The information obtained can also be used to establish the causal relationship between known target genes and target proteins via traceable biochemical signaling or synthetic routes.
Dem Fachmann auf dem betreffenden Gebiet ist die oben dargelegte Aufgabenstellung bekannt. Im Stand der Technik sind zur Lösung der gestellten Aufgabe verschiedene Wege beschriften worden.The task set out above is known to the person skilled in the art in the field in question. Various ways have been described in the prior art to solve the problem.
Beispielsweise beschreiben P. Liang und A.B. Pardee ein Verfahren zur Tennung individueller mRNAs mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (P. Liang & A.B. Pardee 1992 Science 257, 967-971). Dieses Verfahren wurde angewendet, um die von zwei verwandten Zelltypen exprimierten mRNA-Populationen zu vergleichen. Eine Auftrennung der komplexen Mischung aus mRNA-Molekülen in Fraktionen, jeweils bestehend aus 50- 100 Genen der totalen Population, wurde erreicht durch: 1) reverse Transkription der mRNA in einzelsträngige cDNA mit 12 sogenannten 3 '-Anker-Primern der Form TnVN (wobei Tn= elf aufeinanderfolgende T's, V = A, C, G; N = A, C, G, T); 2) PCR-Amplifikation jeder einzelnen cDNA-Fraktion mit dem entsprechenden 3'-Ankerprimer und einem willkürlich gewählten 10 Nukleotide umfassenden 5'-Oligomer in Gegenwart von radioaktiv markierten Desoxyribonukleotiden. Die Produkte wurden auf Sequenziergelen aufgetrennt und es wurden 50-100 Banden im Grössenbereich von 100-500 Nukleotiden beobachtet. Die Banden resultierten aus der Amplifikation von cDNAs, die mit den 3 '-Enden von mRNAs korrespondieren, welche das Komplement des 3'-Ankerprimers sowie des willkürlich gewählten 5'-Oligomers enthielten. Für jedes Primerpaar waren die Muster der aus beiden cDNAs amplifizierten Banden ähnlich, wobei die Intensitäten von etwa 80 % der Banden nicht unterscheidbar waren. Bestimmte Banden traten in dem einen oder anderen PCR- - 3 -For example, P. Liang and AB Pardee describe a method for the separation of individual mRNAs by means of polymerase chain reaction (PCR) (P. Liang & AB Pardee 1992 Science 257, 967-971). This method was used to compare the mRNA populations expressed by two related cell types. The complex mixture of mRNA molecules was separated into fractions, each consisting of 50-100 genes from the total population, by: 1) reverse transcription of the mRNA into single-stranded cDNA with 12 so-called 3 ' anchor primers of the form TnVN (where Tn = eleven consecutive T's, V = A, C, G; N = A, C, G, T); 2) PCR amplification of each individual cDNA fraction with the corresponding 3'-anchor primer and an arbitrarily selected 10-nucleotide 5'-oligomer in the presence of radioactively labeled deoxyribonucleotides. The products were separated on sequencing gels and 50-100 bands in the size range of 100-500 nucleotides were observed. The bands resulted from the amplification of cDNAs corresponding to the 3 ' ends of mRNAs containing the complement of the 3' anchor primer and the arbitrarily chosen 5 'oligomer. The patterns of the bands amplified from both cDNAs were similar for each pair of primers, the intensities of approximately 80% of the bands being indistinguishable. Certain bands appeared in one or the other PCR - 3 -
Ansatz stärker in Erscheinung, während einige lediglich in einem der beiden Ansätze nachweisbar waren.Approach more evident, while some were only detectable in one of the two approaches.
Wenn sämtliche der für Säugetiere erwarteten 50.000-100.000 verschiedenen mRNAs mit den willkürlich gewählten 5'-Primem (abitrary primer) erfassbar wären, dann wäre eine Anzahl von 80-95 solcher Oligonukleotide und ca. 1.000 PCRs notwendig, um mit hoher Wahrscheinlichkeit etwa zwei Drittel dieser mRNAs zu detektieren. Aus zahlreichen Untersuchen der letzten Jahre hat sich gezeigt, dass das oben dargestellte Verfahren zu einer hohen Rate (bis 90 %) von falsch-positiven Signalen führt.If all of the 50,000-100,000 different mRNAs expected for mammals could be detected with the arbitrarily chosen 5 'primers (abitrary primer), then a number of 80-95 such oligonucleotides and approx. 1,000 PCRs would be necessary, with a high probability of around two thirds to detect these mRNAs. Numerous studies in recent years have shown that the method described above leads to a high rate (up to 90%) of false positive signals.
Die WO 95/13369 offenbart ein Verfahren (TOGA - TOtal Gene Expression Analysis) zur gleichzeitigen Identifizierung differentiell exprimierter mRNAs und zur Messung deren relativer Konzentrationen. Das Verfahren basiert auf der Erstellung doppelsträngiger cDNA aus isolierter mRNA unter der Verwendung eines spezifischen Sets an Oligo (dT)-Primern. Dabei wird eine Mischung aus 12 Ankerprimem mit der folgenden Struktur eingesetzt: von 5' beginnend folgt einem "Stuffer"- oder "Heel"-Fragment von 4-40 Basen eine Erkennungssequenz für eine Restriktionsendonuklease (typischerweise Notl), 7-40 dT- Nukleotide und schliesslich zwei "Ankerbasen" V, N am 3'-Ende des Primers. Dabei bezeichnet V ein Desoxyribonukleotid der Gruppe dA, dC oder dG, während N die Desoxyribonukleotide dA, dC, dG und dT definiert. Die auf diese Weise erhaltene cDNA wird anschliessend mit einem Restriktionsenzym, welches 4 Basen als Sequenz für die Schnittstelle erkennt (z.B. Mspl), vollständig verdaut, mit Notl geschnitten und in einen entsprechend behandelten Plasmid-Vektor kioniert. Die Orientierung des Inserts ist dabei "antisense" relativ zu einem Vektor-kodierten, Bakteriophagen-spezifischen Promotor (typischerweise T3). Die ügationen werden in einen E.coii-Stamm transformiert, wodurch cDNA-Banken generiert werden. Die Plasmid-DNA dieser cDNA-Bibliotheken wird isoliert und mit Hilfe von Kombinations-Verdaus durch 6 unterschiedliche Restriktionsenzyme, die von den oben verwendeten verschieden sind, linearisiert. Die linearisierte cDNA wird durch die T3-Polymerase in cRNA übersetzt und anschliessend in 16 Sub-Fraktionen einzelsträngiger cDNA transkribiert. Dabei wird eine thermostabile reverse Transkriptase bei hoher Temperatur und je einer von 16 verschiedenen cRNA-Primern, dessen beiden 3'- Nukleotide aus einer vollständigen Permutation der 4 möglichen Desoxyribonukleotide dA, dC, dG und dT besteht, verwendet. Die Produkte der 16 cDNA-Fraktionen werden als Template für PCR eingesetzt unter Verwendung eines 3'-Oligonukleotides, welches einer Vektor-Sequenz nahe der Klonierungsstelle des Inserts entspricht, und einem 5'-Oligomer, das einem der 16 cDNA-Synthese-Primer mit zusätzlich zwei 3'-Nukleotiden der vollständigen Permutation der 4 möglichen Desoxyribonukleotide dA, dC, dG und dT entspricht. So werden bis zu 256 verschiedene Pools generiert, deren radioaktiv markierte Banden (35S-dATP oder 32P-dCTP) auf Polyacrylamid-Gelen analysiert werden. Aufgrund der erhaltenen Information über die Länge und Zusammensetzung der 8 identifizierten Basen einer markierten Bande soll es theoretisch möglich sein, ohne Klonierungs- und Sequenzierungsschritte auf die Identifikation des zugehörigen Gens in einer kompletten Datenbank zu schiiessen.WO 95/13369 discloses a method (TOGA - TOtal Gene Expression Analysis) for the simultaneous identification of differentially expressed mRNAs and for measuring their relative concentrations. The method is based on the generation of double-stranded cDNA from isolated mRNA using a specific set of oligo (dT) primers. A mixture of 12 anchor primers with the following structure is used: starting from 5 ', a "stuffer" or "heel" fragment of 4-40 bases is followed by a recognition sequence for a restriction endonuclease (typically NotI), 7-40 dT nucleotides and finally two "anchor bases" V, N at the 3 'end of the primer. V denotes a deoxyribonucleotide from group dA, dC or dG, while N defines the deoxyribonucleotides dA, dC, dG and dT. The cDNA obtained in this way is then completely digested with a restriction enzyme which recognizes 4 bases as the sequence for the cleavage (eg Mspl), cut with NotI and cloned into a correspondingly treated plasmid vector. The orientation of the insert is "antisense" relative to a vector-encoded, bacteriophage-specific promoter (typically T3). The ions are transformed into an E.coii strain, which generates cDNA banks. The plasmid DNA of these cDNA libraries is isolated and linearized using combination digests by 6 different restriction enzymes, which are different from those used above. The linearized cDNA is translated into cRNA by the T3 polymerase and then transcribed into 16 sub-fractions of single-stranded cDNA. A thermostable reverse transcriptase at high temperature and one of 16 different cRNA primers, the two 3'-nucleotides of which consist of a complete permutation of the 4 possible deoxyribonucleotides dA, dC, dG and dT, are used. The products of the 16 cDNA fractions are used as templates for PCR using a 3'-oligonucleotide, which is one Vector sequence corresponds to the cloning site of the insert, and a 5 ' oligomer which corresponds to one of the 16 cDNA synthesis primers with an additional two 3 ' nucleotides of the complete permutation of the 4 possible deoxyribonucleotides dA, dC, dG and dT. In this way, up to 256 different pools are generated, whose radiolabelled bands (35S-dATP or 32P-dCTP) are analyzed on polyacrylamide gels. On the basis of the information received about the length and composition of the 8 identified bases of a labeled band, it should theoretically be possible to deduce the identification of the associated gene in a complete database without cloning and sequencing steps.
Die oben dargelegte Methodik wirft folgende Probleme im Zusammenhang mit der erfindungsgemäss angestrebten hohen Spezifität, Selektivität und Reproduzierbarkeit auf:The methodology set out above poses the following problems in connection with the high specificity, selectivity and reproducibility sought according to the invention:
1) potentieller Verlust von cDNA-Sequenzen durch Notl-Verdau;1) potential loss of cDNA sequences by NotI digestion;
2) potentieller Verlust von cDNA-Sequenzen durch Vektor-Ligation;2) potential loss of cDNA sequences by vector ligation;
3) potentieller Verlust von cDNA-Sequenzen durch Transformation in E.coli und unterschiedliche Amplifikationsraten für verschiedene cDNA-lnserts;3) potential loss of cDNA sequences by transformation into E. coli and different amplification rates for different cDNA inserts;
4) Kontamination der PCR-Templates mit bakterieller genomischer DNA nach Plasmid- Amplifikation und Reinigung aus E.coli;4) contamination of the PCR templates with bacterial genomic DNA after plasmid amplification and purification from E. coli;
5) Kontamination der Templates für die T3-RNA-Polymerase-Reaktion mit Insert-freier Plasmid-DNA;5) contamination of the templates for the T3 RNA polymerase reaction with insert-free plasmid DNA;
6) Verlust von cDNA-lnserts durch kombinierte Linearisierungs-Verdaus mit 6 unterschiedlichen Restriktionsendonukteasen;6) loss of cDNA inserts by combined linearization digests with 6 different restriction endonucteases;
7) Verlust von cDNA-Sequenzen durch cRNA-Synthese-Amplifikation;7) loss of cDNA sequences by cRNA synthesis amplification;
8) Verlust von cDNA-Sequenzen durch die zweite cDNA-Synthese-Amplifikation ;8) loss of cDNA sequences by the second cDNA synthesis amplification;
9) Fragliche Spezifität der thermostabilen reversen Transkriptase für die permutierten Primer, die für die zweite cDNA-Synthese eingesetzt werden, da die Selektivität der reversen Transkriptase bei Basen-Misspaarung im allgemeinen ca 10-1.000-fach (für AMV- RT) unterhalb der Selektivität der Taq-Polymerase liegt (LN. Mendelman et al. 1990, J. Biol. Chem. 265, 2338-2346);9) Questionable specificity of the thermostable reverse transcriptase for the permuted primers which are used for the second cDNA synthesis, since the selectivity of the reverse transcriptase in the case of base mismatch is generally approx. 10-1,000 times (for AMV-RT) below the selectivity the Taq polymerase (LN. Mendelman et al. 1990, J. Biol. Chem. 265, 2338-2346);
10) Fragliche Selektivität der Taq-Polymerase für die verwendeten permutierten 5'- Oligomere in der PCR unter den beschriebenen Bedingungen, da Basenmisspaarungen bei den eingesetzten Primern toleriert werden. Die korrekte Analyse der Informationen ist deshalb nicht gewährleistet. U. Matz et al. beschreiben ein weiteres Verfahren (ODD - ordered differential dispiay - 1997, Nucl. Acid. Res. 25, 2541 -2542) zur Identifizierung differentiell exprimierter Gene, weiches auf der PCR-Amplifikation durch Adaptor-spezifische Oligonukleotide und dem Effekt der PCR-Suppression beruht. Hierbei wird doppelsträngige cDNA unter Verwendung eines Oligonukieotides der Struktur "Heel-dT(13)" erzeugt, wobei "Heel" eine Folge von 12 Basen darstellt. Die cDNA wird von einem Restriktionsenzym mit einer 4 Basen umfassenden Erkennungssequenz (Rsal) vollständig verdaut und mit einem "Pseudo- Doppelstrang-Adaptor" ligiert. Dieses Molekül besteht aus einem längeren (39 Basen) und einem kürzeren (12 Basen komplementär zum 3'-Ende des längeren) Oiigomer, welche unter geeigneten Bedingungen gegeneinander hybridisiert werden. Die 5'-Enden der Oligonukleotide sind dabei nicht phosphoryliert. Theoretisch ist so in einer 1 . PCR die spezifische Amplifikation der 3 '-Enden der cDNA mit Hilfe des cDNA-Synthese-Primers und eines Primers, der dem 5'-Ende des längeren Adaptor-Oligomers entspricht, bei hoher Aπneaiing-Temperatur in der PCR (65°C) möglich. Eine Auftrennung der komplexen cDNA in unterschiedliche Fraktionen wird in einer 2. PCR erreicht. Dabei wird der cDNA-Synthese- Primer mit zusätzlich zwei 3'-Nukieotiden der vollständigen Permutation aller vier Desoxyribonukleotide dA, dC, dG und dT und ein Primer, welcher dem 3'-Ende des längeren Adaptor-Oligomers mit zusätzlich zwei 3'-Nukleotiden der vollständigen Permutation aller vier Desoxyribonukleotide dA, dC, dG und dT entspricht, verwendet. Für eine erhöhte Spezifität des Adaptor-Primers wurde eine artifizielle Misspaarung (Mismatch) in das Oligonukleotid an der Position -4 relativ zum 3'-Ende des Primers eingeführt.10) Questionable selectivity of the Taq polymerase for the permuted 5 ' oligomers used in the PCR under the conditions described, since base mismatches are tolerated in the primers used. The correct analysis of the information is therefore not guaranteed. U. Matz et al. describe a further method (ODD - ordered differential dispiay - 1997, Nucl. Acid. Res. 25, 2541 -2542) for the identification of differentially expressed genes, which is based on the PCR amplification by adapter-specific oligonucleotides and the effect of the PCR suppression . Here, double-stranded cDNA is generated using an oligonucleotide of the structure "Heel-dT (13)", "Heel" being a sequence of 12 bases. The cDNA is completely digested by a restriction enzyme with a 4-base recognition sequence (Rsal) and ligated with a "pseudo double-strand adapter". This molecule consists of a longer (39 bases) and a shorter (12 bases complementary to the 3 ' end of the longer) oligomer, which are hybridized against one another under suitable conditions. The 5 'ends of the oligonucleotides are not phosphorylated. Theoretically, this is in a 1st PCR, the specific amplification of the 3 ' ends of the cDNA is possible with the aid of the cDNA synthesis primer and a primer which corresponds to the 5 ' end of the longer adapter oligomer at high adaptation temperature in the PCR (65 ° C.) . The complex cDNA is separated into different fractions in a second PCR. The cDNA synthesis primer with an additional two 3'-nucleotides of the complete permutation of all four deoxyribonucleotides dA, dC, dG and dT and a primer which is the 3 ' end of the longer adapter oligomer with an additional two 3' nucleotides the complete permutation of all four deoxyribonucleotides dA, dC, dG and dT is used. To increase the specificity of the adapter primer, an artificial mismatch was introduced into the oligonucleotide at position -4 relative to the 3 'end of the primer.
Die oben dargelegte Methodik wirft folgende Probleme im Zusammenhang mit der erfindungsgemäss angestrebten hohen Spezifität, Selektivität und Reproduzierbarkeit auf:The methodology set out above poses the following problems in connection with the high specificity, selectivity and reproducibility sought according to the invention:
1 ) Die Verwendung eines nicht-geankerten cDNA-Synthese-Primers erlaubt keine Garantie der Reproduzierbarkeit der gefundenen Fragmentlängen;1) The use of a non-anchored cDNA synthesis primer does not guarantee the reproducibility of the fragment lengths found;
2) Die Amplifikation der 3 '-Enden der cDNA unter Verwendung eines Oligomers der Struktur "Heel-dT(13)" bei hohen Annealing-Temperaturen in der PCR ist nicht reproduzierbar;2) The amplification of the 3 ' ends of the cDNA using an oligomer of the structure "Heel-dT (13)" at high annealing temperatures in the PCR is not reproducible;
3) Die selektive Amplifikation der 3'-Enden der cDNA durch Verwendung eines "Pseudo- Doppeistrang-Adaptors" ist nicht gesichert;3) The selective amplification of the 3 'ends of the cDNA by using a "pseudo double stranded adapter" is not ensured;
4) Die erhöhte Spezifität in der 2. PCR für die permutierten 5'-Oligonukleotide durch die Einführung eines artifiziellen Mismatches ist unbefriedigend; - 6 -4) The increased specificity in the 2nd PCR for the permuted 5'-oligonucleotides due to the introduction of an artificial mismatch is unsatisfactory; - 6 -
5) Die in der 2. PCR eingesetzten 3'-Oligomere enthalten keinen artifiziellen Mismatch und sind daher nicht ausreichend selektiv für die Primer-Permutation;5) The 3 ' oligomers used in the 2nd PCR do not contain an artificial mismatch and are therefore not sufficiently selective for the primer permutation;
6) Durch die spezielle Anordnung der PCR ist die aus der Gel-Analyse erhaltene Information über die einzelnen DNA-Fragmente (Fragmentlänge und 6 bekannte Nukleotide) ohne zusätzliche Klonierungs- bzw. Sequenzierungschritte nicht ausreichend.6) Due to the special arrangement of the PCR, the information about the individual DNA fragments (fragment length and 6 known nucleotides) obtained from the gel analysis is not sufficient without additional cloning or sequencing steps.
Y. Prashar und S. Weissman (1996, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93, 659-663) beschreiben ein Verfahren, bei welchem doppelsträngige cDNA mittels 12 Oligonukleotiden hergestellt wird, die folgende Struktur aufweisen: von 5' beginnend folgt einer "Heel"-Struktur eine Folge von 18 dT-Nukleotiden und zwei "Ankerbasen" V, N am 3'-Ende des Primers. Dabei Dezeichnet V ein Desoxyribonukleotid der Gruppe dA, dC oder dG, während N die Desoxyribonukleotide dA, dC, dG und dT definiert. Die cDNA-Synthese erfolgt bei einer Temperatur von 50°C und soll eine Aufteilung der komplexen Mischung in 12 unterschiedliche Pools ermöglichen. Nach vollständigem Verdau der cDNA mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen, welche sechs Nukleotide als Sequenz für die Schnittstelle erkennen, werden die entstandenen DNA-Fragmente mit einem Adaptor versehen, welcher die Struktur eines Ypsilons aufweist. In der nachfolgenden PCR wird ein 3 '-Primer verwendet, der an die "Heel"-Struktur der cDNA bindet. Als 5 '-Primer wird ein Oligonukleotid eingesetzt, dessen Bindungsstelle in der äusseren Region des Ypsilon- Adaptors liegt und die erst entsteht, wenn in einer ersten Synthese der komplementäre Strang zu dieser Region gebildet wird. Alle Fragmente, welche auf beiden Seiten einen Ypsiion-Adaptor besitzen, können nicht amplifiziert werden.Y. Prashar and S. Weissman (1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 659-663) describe a process in which double-stranded cDNA is produced by means of 12 oligonucleotides which have the following structure: one starting from 5 'follows one "Heel" structure is a sequence of 18 dT nucleotides and two "anchor bases" V, N at the 3 ' end of the primer. V denotes a deoxyribonucleotide of the group dA, dC or dG, while N defines the deoxyribonucleotides dA, dC, dG and dT. The cDNA synthesis takes place at a temperature of 50 ° C and should enable the complex mixture to be divided into 12 different pools. After complete digestion of the cDNA with various restriction endonucleases, which recognize six nucleotides as the sequence for the interface, the resulting DNA fragments are provided with an adapter, which has the structure of a letter. In the subsequent PCR a 3 ' primer is used which binds to the "heel" structure of the cDNA. An oligonucleotide is used as the 5 ' primer, the binding site of which lies in the outer region of the Ypsilon adapter and which only arises when the complementary strand to this region is formed in a first synthesis. All fragments that have a Ypsiion adapter on both sides cannot be amplified.
Die von den Autoren behauptete Auftrennung der cDNA-Produkte in unterschiedliche Fraktionen ist durch die verwendeten, am 3'-Ende permutierten cDNA-Synthese-Primer nicht reproduzierbar. Zudem können durch die Verwendung der speziellen Adaptor-Struktur keine permutierten PCR-5'-Primer eingesetzt werden.The separation of the cDNA products into different fractions, as claimed by the authors, is not reproducible due to the cDNA synthesis primers permuted at the 3 'end. In addition, the use of the special adapter structure means that no permuted PCR 5 ' primers can be used.
Die WO 97/2921 1 beschreibt die Technik 'Restriction Display (RD-PCR)', bei welcher doppelsträngige cDNA mittels 12 Oligonukleotiden hergestellt wird. Diese Primer weisen folgende Struktur auf: von 5' beginnend folgen einer "Heel"-Struktur zwei Desoxynukleotide der vollständigen Permutation aller vier Desoxyribonukleotide dA, dC, dG und dT, eine Folge von 17 dT-Nukleotiden und zwei "Ankerbasen" V, N am 3'-Ende des Primers. Dabei bezeichnet V ein Desoxyribonukleotid der Gruppe dA, dC oder dG, während N die - 7 -WO 97/2921 1 describes the 'restriction display (RD-PCR)' technique, in which double-stranded cDNA is produced using 12 oligonucleotides. These primers have the following structure: starting from 5 ', a "heel" structure is followed by two deoxynucleotides of the complete permutation of all four deoxyribonucleotides dA, dC, dG and dT, a sequence of 17 dT nucleotides and two "anchor bases" V, N am 3 'end of the primer. V denotes a deoxyribonucleotide from group dA, dC or dG, while N denotes - 7 -
Desoxyribonukleotide dA, dC, dG und dT definiert. Nach vollständigem Verdau der cDNA mit einem oder mehreren Restriktions-Endonukleasen wird ein Adaptor-Molekül an die cDNA-Fragmente ligiert. In einer sich anschliessenden PCR wird ein 3'-Primer verwendet, der selektiv an die "Heel"-Struktur der cDNA bindet und zusätzlich zwei 3'-Nukleotide V, N am 3'-Ende des Primers besitzt. Dabei bezeichnet V ein Desoxyribonukleotid der Gruppe dA, dC oder dG, während N die Desoxyribonukleotide dA, dC, dG und dT definiert. Als 5'- Primer wird ein der 3'-Sequenz des Adaptor-Primers entsprechendes Oligonukleotid eingesetzt, welches zusätzlich ein 3'-Nukleotid oder zwei 3'-Nukleotide oder drei 3'- Nukleotide der vollständigen Permutation aller vier Desoxyribonukleotide dA, dC, dG und dT aufweist. Die PCR wird dabei mit unterschiedlichen Permutations-Kombinationen derart durchgeführt, dass in einer ersten PCR (oder in den ersten 10-25 PCR-Zyklen) 5'-Primer mit nur einer Permutation und anschliessend in einer zweiten PCR (oder in den restlichen PCR- Zyklen) 5'-Primer mit nur zwei oder drei Permutationen eingesetzt werden. Hierdurch soll die Seiektivität für die verschiedenen 5'-Primer-Permuationen deutlich erhöht werden.Deoxyribonucleotides dA, dC, dG and dT defined. After complete digestion of the cDNA with one or more restriction endonucleases, an adapter molecule is ligated to the cDNA fragments. In a subsequent PCR, a 3'-primer is used which binds selectively to the "heel" structure of the cDNA and additionally has two 3'-nucleotides V, N at the 3 ' end of the primer. V denotes a deoxyribonucleotide from group dA, dC or dG, while N defines the deoxyribonucleotides dA, dC, dG and dT. An oligonucleotide corresponding to the 3 'sequence of the adapter primer is used as the 5' primer, which additionally contains a 3 'nucleotide or two 3' nucleotides or three 3 'nucleotides for the complete permutation of all four deoxyribonucleotides dA, dC, dG and dT. The PCR is carried out with different permutation combinations in such a way that in a first PCR (or in the first 10-25 PCR cycles) 5 'primers with only one permutation and then in a second PCR (or in the remaining PCR Cycles) 5 'primers with only two or three permutations can be used. This is said to significantly increase the selectivity for the various 5'-primer permuations.
Die oben dargelegte Methodik wirft folgende Probleme im Zusammenhang mit der erfindungsgemäss angestrebten hohen Spezifität, Seiektivität und Reproduzierbarkeit auf:The methodology set out above poses the following problems in connection with the high specificity, selectivity and reproducibility sought according to the invention:
1) Die Verwendung von verschiedenen cDNA-Synthese-Primem mit 3'-Permutationen ist nicht selektiv und erlaubt daher keine Garantie der Reproduzierbarkeit der Methode;1) The use of different cDNA synthesis primers with 3'-permutations is not selective and therefore does not guarantee the reproducibility of the method;
2) Die Aufteilung des Amplifikationsschrittes in mehrere PCR-Runden mit 5'-Primern, welche eine unterschiedliche Anzahl an 3'-Permutationen aufweisen, ist allein für sich nicht Sequenz-selektiv genug, um die Technik z.B. in einer Datenbank-orientierten Gen- Expressions-Anaiyse einzusetzen.2) The division of the amplification step into several PCR rounds with 5'-primers, which have a different number of 3'-permutations, is by itself not sequence-selective enough to e.g. used in a database-oriented gene expression analysis.
Kato beschreibt ein Verfahren ('molecular indexing' - 1995, Nucl. Acids Res., Vol. 23, 3685- 90 und 1996, Nucl. Acids Res., Vol. 24, 394-95), das auf dem Verdau der doppelsträngigen cDNA mit Restriktionsendonukleasen der Klasse IIS beruht. Diese generieren 5'-Überhänge der cDNA von unbekannter Sequenz. Es werden dann 64 biotinylierte Adaptoren, deren Nukleotide 2-4 (relativ zum 5'-Ende) ihrer 5'-Überhänge komplementär zu je einem 64-stei des gesamten cDNA-Poois sind, mit DNA-Ligase aus E.coli ligiert. Das jeweilige 5'- Nukleotid der Adaptoren-Überhänge bleibt Undefiniert. Die dabei ligierten cDNA-Fragmente werden über die Bindung an Streptavidin-gekoppelte magnetische Partikel gereinigt. In einer sich anschliessenden PCR werden die Adaptor-Iigierten 3'-Enden der cDNA unter Verwendung eines Adaptor-Oligonukleotids und eines Oligo-(dT)-Oligomers, welches am 3'- - 8 -Kato describes a method ('molecular indexing' - 1995, Nucl. Acids Res., Vol. 23, 3685-90 and 1996, Nucl. Acids Res., Vol. 24, 394-95), which is based on the digestion of the double-stranded cDNA with restriction endonucleases of class IIS. These generate 5 'overhangs of the cDNA of unknown sequence. 64 biotinylated adapters, the nucleotides of which 2-4 (relative to the 5 'end) of their 5' overhangs are complementary to a 64 step of the entire cDNA pool, are then ligated with DNA ligase from E. coli. The respective 5 'nucleotide of the adapter overhangs remains undefined. The cDNA fragments ligated in this way are purified by binding to streptavidin-coupled magnetic particles. In a subsequent PCR, the adapter-ligated 3 'ends of the cDNA are removed using an adapter oligonucleotide and an oligo (dT) oligomer which is attached to the 3' - 8th -
Ende um eines der drei Nukleotide dA, dC oder dG verlängert ist, bei geringer Anneaiing- Temperatur amplifiziert. Die cDNA wird derart in 192 unterschiedliche Pools aufgetrennt. Auch diese Methodik wirft folgende Probleme im Zusammenhang mit der erfindungsgemass angestrebten hohen Spezifität, Selektivität und Reproduzierbarkeit auf:Extended by one of the three nucleotides dA, dC or dG, amplified at a low annealing temperature. The cDNA is separated into 192 different pools. This methodology also poses the following problems in connection with the high specificity, selectivity and reproducibility desired according to the invention:
1 ) Die Ligation von Adaptoren mit vier Nukleotiden als 5'-Überhang ist ohne weitere Nachbehandlung nicht Permutations-spezifisch genug, um mit Sicherheit die ersten drei oder vier Basen des cDNA-lnserts bestimmen zu können;1) The ligation of adapters with four nucleotides as a 5 'overhang is not permutation-specific enough without further after-treatment in order to be able to determine with certainty the first three or four bases of the cDNA insert;
2) Um eine möglichst hohe Ligationsspezifität zu erreichen, wird nur eine sehr geringe Menge an Adaptor-Molekül in die Ligation eingesetzt, was jedoch zu deutlich verringerter Ligations-Effizienz führt. Dies wiederum hat zur Folge, dass die Sensitivität der gesamten Methode reduziert wird;2) In order to achieve the highest possible ligation specificity, only a very small amount of adapter molecule is used in the ligation, but this leads to significantly reduced ligation efficiency. This in turn means that the sensitivity of the entire method is reduced;
3) Die Aufteilung der cDNA in Pools unter Verwendung von geankerten Oligo-(dT)-Primern bei geringer Annealing-Temperatur in der PCR ist nicht erfolgreich durchführbar.3) The division of the cDNA into pools using anchored oligo (dT) primers at a low annealing temperature in the PCR cannot be carried out successfully.
Aufgrund der geschilderten Nachteile der oben dargestellten Techniken des Standes der Technik, insbesondere in Bezug auf die mangelnde oder nur geringe Reproduzierbarkeit und Sequenz-Spezifität während der PCR-Amplifikation der 3 '-Enden der cDNA, ergibt sich die Notwendigkeit der Entwicklung und Etablierung eines Verfahrens, welches den bekannten Verfahren bezüglich Spezifität, Seiektivität, Sensitivität und verlässlicher Reproduzierbarkeit sowie reduzierter Fehlerrate der erhaltenen Ergebnisse deutlich überlegen ist. Diese Kriterien sind insbesondere dann erforderlich, wenn z.B. eine Datenbank-gestützte Anaiyse zur differentiellen Gen-Expression mittels digitalem Display durchgeführt werden soll.Because of the disadvantages of the prior art techniques described above, in particular with regard to the lack of or only low reproducibility and sequence specificity during the PCR amplification of the 3 'ends of the cDNA, there is a need to develop and establish a method , which is clearly superior to the known methods with regard to specificity, selectivity, sensitivity and reliable reproducibility as well as a reduced error rate of the results obtained. These criteria are particularly necessary if e.g. a database-based analysis for differential gene expression is to be carried out using a digital display.
Erfindungsgemass wird daher ein Verfahren zur Identifikation und Charakterisierung von mRNA-Molekülen bereitgestellt, welches die folgenden Schritte umfasst:According to the invention, a method for identifying and characterizing mRNA molecules is therefore provided, which comprises the following steps:
(a) Isolierung und Reinigung von PolyA+-RNA aus Geweoeproben;(a) Isolation and purification of polyA + RNA from tissue samples;
(b) Synthese von doppelsträngiger cDNA aus den mRNA-Molekülen;(b) synthesis of double-stranded cDNA from the mRNA molecules;
(c) Verkürzen der cDNA durch enzymatischen Verdau mit Restriktionsendonukleasen;(c) shortening the cDNA by enzymatic digestion with restriction endonucleases;
(d) Hybridisierung und Ligation von Adaptor-Molekülen an die geschnittene cDNA; und entweder, in einer 1. Alternative, - 9 -(d) hybridization and ligation of adapter molecules to the cut cDNA; and either, in a 1st alternative, - 9 -
(e) Auffüllen der 5'-Überhänge der cDNA mit Desoxyribonukleotiden und Klenow-DNA- Polymerase;(e) filling the 5 'overhangs of the cDNA with deoxyribonucleotides and Klenow DNA polymerase;
(f) selektive Aufreinigung der 3'-Enden der cDNA;(f) selective purification of the 3 'ends of the cDNA;
(g) Abtrennung der 3'-ständigen Poly-dA-Nukleotide der cDNA durch enzymatischen Verdau mit einer Restriktionsendonuklease;(g) separation of the 3'-standing poly-dA nucleotides of the cDNA by enzymatic digestion with a restriction endonuclease;
(h) Hybridisierung und Ligation von Adaptor-Molekülen an die geschnittene cDNA; (i) Amplifizierung der cDNA-Fragmente durch PCR (polymerase chain reaction); (j) Auftrennung der Amplifikationsprodukte nach ihrer Länge; (k) Analyse der Amplifikationsprodukte; oder, in einer 2. Alternative,(h) hybridization and ligation of adapter molecules to the cut cDNA; (i) amplification of the cDNA fragments by PCR (polymerase chain reaction); (j) separation of the amplification products according to their length; (k) analysis of the amplification products; or, in a second alternative,
(e) selektive Aufreinigung der 3'-Enden der cDNA;(e) selective purification of the 3 'ends of the cDNA;
(f) Abtrennung der 3'-ständigen Poly-dA-Nukleotide der cDNA durch enzymatischen Verdau mit einer Restriktionsendonuklease;(f) separation of the 3'-position poly-dA nucleotides of the cDNA by enzymatic digestion with a restriction endonuclease;
(g) Hybridisierung und Ligation von Adaptor-Molekülen an die geschnittene cDNA;(g) hybridization and ligation of adapter molecules to the cut cDNA;
(h) Amplifizierung der cDNA-Fragmente durch PCR (polymerase chain reaction), wobei 5'-Primer verwendet werden, die zwei oder drei Permutationen am 3'-Ende aufweisen, und die eine oder zwei artifizielle Fehlpaarungen im Vergleich zum durch die Adaptermoleküle bestimmten komplementären Strang enthalten; (i) Auftrennung der Amplifikationsprodukte nach ihrer Länge; (j) Analyse der Amplifikationsprodukte; oder, in einer dritten Alternative,(h) Amplification of the cDNA fragments by PCR (polymerase chain reaction) using 5 'primers which have two or three permutations at the 3' end and which have one or two artificial mismatches compared to that determined by the adapter molecules complementary strand included; (i) separation of the amplification products according to their length; (j) analysis of the amplification products; or, in a third alternative,
(e) Amplifizierung der cDNA-Fragmente durch PCR (polymerase chain reaction), wobei 5'-Primer verwendet werden, die zwei oder drei Permutationen am 3'-Ende aufweisen, und die eine oder zwei artifizielle Fehlpaarungen im Vergleich zum durch die Adaptermoleküle bestimmten komplementären Strang enthalten;(e) amplification of the cDNA fragments by PCR (polymerase chain reaction), using 5 'primers which have two or three permutations at the 3' end and which have one or two artificial mismatches compared to that determined by the adapter molecules complementary strand included;
(f) Auftrennung der Amplifikationsprodukte nach ihrer Länge;(f) separation of the amplification products according to their length;
(g) Analyse der Amplifikationsprodukte;(g) analysis of the amplification products;
wobei für die 1. und 2. Alternative in Schritt (b) die Synthese der cDNA- Erststrangmoleküle durch reverse Transkription unter Verwendung eines geankerten Oligo-dT-Nukieotids erfolgt, welches eine 3'-Extension von 2 Basen aufweist, wobei die erste Base dA, dC oder dG, und die zweite Base dA, dC, dG oder dT ist, und welches eine 5'-Extension von 5-15, bevorzugt von 6-15, Basen aufweist, die für die - 10 -wherein for the 1st and 2nd alternatives in step (b) the synthesis of the first strand cDNA molecules takes place by reverse transcription using an anchored oligo-dT nucleotide which has a 3'-extension of 2 bases, the first base dA , dC or dG, and the second base is dA, dC, dG or dT, and which has a 5 'extension of 5-15, preferably 6-15, bases which are suitable for the - 10 -
Schnittstelle einer Restriktionsendonuklease mit der Spalt-Charakteristik 16/14 'downstream' der Erkennungssequenz kodiert; oder wobei für die 3. Alternative in Schritt (b) die Synthese der cDNA-Erststrangmoleküle durch reverse Transkription unter Verwendung eines geankerten Oligo-dT-Nukleotids erfolgt, welches eine 3'-Extension von 2 Basen aufweist, wobei die erste Base dA, dC oder dG, und die zweite Base dA, dC, dG oder dT ist, und weiches eine 5'-Extension von 5-15 Basen einer beliebigen Sequenz aufweist.Encoding a restriction endonuclease site with the cleavage characteristic 16/14 'downstream' of the recognition sequence; or wherein for the third alternative in step (b) the cDNA first strand molecules are synthesized by reverse transcription using an anchored oligo-dT nucleotide which has a 3'-extension of 2 bases, the first base dA, dC or dG, and the second base is dA, dC, dG or dT, and which has a 5 'extension of 5-15 bases of any sequence.
Enzyme mit der Spaltcharakteristik 16/14 "downstream" der Erkennungssequenz sind dem Fachmann bekannt. Beispiel sind Eco571 und Bsg1 (siehe beispielsweise A. Janulaitis et al., Nucleic Acids Res. 20 (1992), S. 6043-6049; Petrusyte et al., Gene 74 (1988), S. 89-Enzymes with the cleavage characteristic 16/14 "downstream" of the recognition sequence are known to the person skilled in the art. Examples are Eco571 and Bsg1 (see, for example, A. Janulaitis et al., Nucleic Acids Res. 20 (1992), pp. 6043-6049; Petrusyte et al., Gene 74 (1988), pp. 89-
91 ).91).
Bevorzugt ist in dem erfindungsgemässen Verfahren das Oligo-dT-Nukleotid vollständig durch 2'-O-methyiierte Ribonukleotide substituiert. Alternativ kann das Oligo-dT-Nukleotid aus Standard-Desoxyribonukleotiden bestehen.In the method according to the invention, the oligo-dT nucleotide is preferably completely substituted by 2'-O-methylated ribonucleotides. Alternatively, the oligo-dT nucleotide can consist of standard deoxyribonucleotides.
Weiter bevorzugt ist in dem erfindungsgemässen Verfahren, dass das Oligo-dT-Nukleotid an seinem freien 5'-Ende und/oder an internen dT-Nukleotiden mit einem Biotinrest über einen C9-Spacer versehen wird.It is further preferred in the method according to the invention that the oligo-dT nucleotide is provided with a biotin residue at its free 5 'end and / or at internal dT nucleotides via a C9 spacer.
Eine bevorzugte Ausführungsform betrifft ein erfindungsgemässes Verfahren, wobei in Schritt (h) der 2. Alternative oder in Schritt (e) der 3. Alternative sich die Fehlpaarungen an den Positionen -3, oder -3 und -4, oder -4 und -5 im Vergleich zum durch die Adaptermoleküle bestimmten komplementären Strang befinden.A preferred embodiment relates to a method according to the invention, wherein in step (h) of the second alternative or in step (e) of the third alternative, the mismatches at positions -3, or -3 and -4, or -4 and -5 compared to the complementary strand determined by the adapter molecules.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (c) ein Restriktionsenzym der Klasse IIS verwendet wird, welches 5 Nukleotide als Erkennungssequenz besitzt und einen aus 2 - 4, insbesondere 4, Nukleotiden, die nicht Teil der Erkennungssequenz sind, bestehenden Überhang der geschnittenen cDNA-Fragmente generiert.A further preferred embodiment of the method according to the invention is characterized in that a restriction enzyme of class IIS is used in step (c) which has 5 nucleotides as the recognition sequence and one of 2-4, in particular 4, nucleotides which are not part of the recognition sequence, existing overhang of the cut cDNA fragments generated.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (f) der 1. Alternative oder in Schritt (e) der 2. Alternative die - 11 -A further preferred embodiment of the method according to the invention is characterized in that in step (f) of the 1st alternative or in step (e) of the 2nd alternative the - 11 -
selektive Aufreinigung der 3'-Enden der cDNA unter Verwendung von paramagnetischen 'beads' erfolgt, die das Biotin-bindende Molekül Streptavidin gekoppelt haben.Selective purification of the 3 'ends of the cDNA is carried out using paramagnetic beads which have coupled the biotin-binding molecule streptavidin.
Bevorzugt wird in Schritt (g) der 1. Alternative oder in Schritt (f) der 2. Alternative des erfindungsgemässen Verfahrens ein Restriktionsenzym der Klasse IIS verwendet wird.In step (g) of the 1st alternative or in step (f) of the 2nd alternative of the method according to the invention, a restriction enzyme of class IIS is used.
Weiter bevorzugt werden die Produkte aus Schritt (d) oder aus Schritt (h) der 1. Alternative oder aus Schritt (g) der 2. Alternative des erfindungsgemässen Verfahrens vor der Amplifizierung gemass Schritt (i) mit einer Nuklease, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus T4-Endonuclease VII, S1 -Nuclease, und Mung Bean Nuclease, inkubiert werden.The products from step (d) or from step (h) of the first alternative or from step (g) of the second alternative of the method according to the invention prior to the amplification according to step (i) with a nuclease, selected from the group, are further preferred from T4 endonuclease VII, S1 nuclease, and mung bean nuclease.
Ferner ist das erfindungsgemässe Verfahren bevorzugterweise dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (i) der ersten Alternative oder in Schritt (h) der 2. Alternative oder in Schritt (e) der 3. Alternative die Amplifizierung der cDNA-Fragmente unter Verwendung von Oligonukleotiden erfolgt, die an den komplementären Strang des 'sense'-Oligomers der ligierten Adaptor-Moleküle hybridisieren.Furthermore, the method according to the invention is preferably characterized in that in step (i) of the first alternative or in step (h) of the second alternative or in step (e) of the third alternative, the cDNA fragments are amplified using oligonucleotides, that hybridize to the complementary strand of the sense oligomer of the ligated adapter molecules.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist weiter bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (k) der ersten Alternative oder in Schritt (j) der 2. Alternative oder in Schritt (g) der 3. Alternative die Analyse anhand der unterschiedlichen Längen der Produkte sowie in Kenntnis der durch die Manipulation bekannten Basensequenz von 9 oder 10 Nukleotiden erfolgt.The method according to the invention is further preferably characterized in that in step (k) of the first alternative or in step (j) of the second alternative or in step (g) of the third alternative, the analysis is based on the different lengths of the products and in knowledge of the by manipulation known base sequence of 9 or 10 nucleotides.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform betrifft die Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur gegebenenfalls rechnergestützten Identifizierung und Isolierung sowie Analyse neuer Gene.A further preferred embodiment relates to the use of the method according to the invention according to one of the preceding claims for possibly computer-aided identification and isolation and analysis of new genes.
Das erfindungsgemässe Verfahren DEPD wurde entwickelt, um die Fehlerrate bei der Identifizierung einiger Nukleotide der cDNA-Fragmente, welche wiederum die Identifizierung des kodierten Gens in einer geeigneten Datenbank zulassen, deutlich zu reduzieren. Die verbesserte Leistungsfähigkeit des erfindungsgemässen Verfahrens ergibt sich aus der Anwendung spezifischer Ligations-Techniken in geeigneter Kombination mit permutations- spezifischer Mismatch-PCR. Dabei wird nach selektiver Aufreinigung der 3'-Enden der cDNAs an das 5'- und 3'-Ende der Fragmente ein Adaptor-Molekül ligiert. In der folgenden - 12 -The method DEPD according to the invention was developed in order to significantly reduce the error rate in the identification of some nucleotides of the cDNA fragments, which in turn permit the identification of the encoded gene in a suitable database. The improved performance of the method according to the invention results from the use of specific ligation techniques in a suitable combination with permutation-specific mismatch PCR. After selective purification of the 3 'ends of the cDNAs, an adapter molecule is ligated to the 5' and 3 'ends of the fragments. In the following - 12 -
PCR werden Primer eingesetzt, die vorzugsweise je zwei Basen als Permutation aufweisen. Die Permutations-Spezifität der PCR-Primer kann bei hoher Annealing-Temperatur und vorzugsweise bei gleichzeitiger Einführung von artifiziellen Template-Fehipaarungen an selektive Oligonukleotid-Stellen deutlich erhöht werden.PCR primers are used which preferably each have two bases as permutation. The permutation specificity of the PCR primers can be significantly increased at a high annealing temperature and preferably with the simultaneous introduction of artificial template mismatches at selective oligonucleotide sites.
Durch die erfindungsgemässe Kombination mehrerer Einzelschritte, welche zur Bestimmung von Nukleotid-Sequenzen mittels PCR eingesetzt werden, zeigt sich ein Synergie-Effekt was die Spezifität der Technik betrifft. Es ergibt sich eine Art Kontroll- Mechanismus für die einzelnen Prozeduren, da jeder Fehler, der z.B. in der Ligation erfolgt, durch die selektive PCR mittels Mismatch-Primern korrigiert werden kann. Die Permutations-Selektivität αer PCR wurde durch die bevorzugte Einführung von definierten Template-Fehlpaarungen deutlich gesteigert.The combination of several individual steps according to the invention, which are used for the determination of nucleotide sequences by means of PCR, shows a synergy effect as regards the specificity of the technology. There is a kind of control mechanism for the individual procedures, since every error, e.g. in the ligation, which can be used to correct selective PCR using mismatch primers. The permutation selectivity of PCR was significantly increased by the preferred introduction of defined template mismatches.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erhält man durch die Verwendung von Permutations-Primern auf beiden Seiten des cDNA-Tempiates einen Fehler-korrigierenden Effekt, da solche Amplifikations-Produkte, weiche fälschlicherweise mittels eines Oligomers in einer der ersten PCR-Runden erstellt wurden, in ihrer weiteren Vermehrung supprimiert werden können, falls der Gegen-Primer nur die korrekte Permutation amplifiziert. Ferner ist es gemass einer weiteren bevorzugten Ausführungsform durch den geeigneten, kombinierten Einsatz von Ligations- und PCR-Permutations-Technik bei der DEPD-Methode möglich, 9 oder 10 Nukleotide und die Länge eines amplifizierten Fragmentes zu definieren. Diese Information sollte zur sicheren Identifikation eines Gens, vorzugsweise mittels Datenbank-Analyse, auch dann hinreichend sein, falls sich ein Fehler bei der Bestimmung der Basen-Sequenz des cDNA-Fragmentes ergeben sollte.According to a further preferred embodiment, an error-correcting effect is obtained by using permutation primers on both sides of the cDNA template, since such amplification products, which were erroneously created in one of the first rounds of PCR by means of an oligomer, in their further propagation can be suppressed if the counter-primer only amplifies the correct permutation. Furthermore, according to a further preferred embodiment, the suitable, combined use of ligation and PCR permutation technology in the DEPD method makes it possible to define 9 or 10 nucleotides and the length of an amplified fragment. This information should also be sufficient for the reliable identification of a gene, preferably by means of database analysis, if there should be an error in determining the base sequence of the cDNA fragment.
Die Anwendung des erfindungsgemässen DEPD-Verfahrens ermöglicht u.a. eine umfassende Analyse des Zusammenspiels aller in einem definierten System und/oder in einer definierten Situation involvierten Gene auf der Ebene der mRNA-Expressionsmuster, wobei für spezifische und reproduzierbare Ergebnisse iediglich geringe Mengen an Gewebe oder Zellen benötigt werden. Das Verfahren kann in einer Vielzahl von Anwendungsbereichen eingesetzt werden. Hierzu zählen z.B. der Vergleich von Organen, Geweben, Gewebeteilen, oder von erkrankten Geweben oder Gewebeteilen mit entsprechendem gesunden Material, ggfs. auch im Rahmen einer vergleichenden Untersuchung unter Verwendung von pharmazeutischen Wirkstoffen gegenüber entsprechenden Kontrollen - 13 -The use of the DEPD method according to the invention enables, among other things, a comprehensive analysis of the interaction of all genes involved in a defined system and / or in a defined situation at the level of the mRNA expression pattern, with only small amounts of tissue or cells being required for specific and reproducible results become. The method can be used in a variety of applications. This includes, for example, the comparison of organs, tissues, tissue parts, or diseased tissues or tissue parts with appropriate healthy material, possibly also in the context of a comparative investigation using active pharmaceutical ingredients against corresponding controls - 13 -
ohne WirKstoffapplikation. Ferner ermöglicht das erfindungsgemässe Verfahren einen Vergleich von definierten Zuständen in Tiermodellen, wobei hier insbesondere vergleichende Analysen von Organen, Geweben, Gewebeteilen oder erkrankten Geweben bzw. Gewebeteilen gegenüber entsprechendem gesunden Material bevorzugt sind. Weitere Anwendungsgebiete betreffen die Analyse transgener Tiere, welcne auch sog. 'knock-out'- Tiere einschiiessen, sowie αie phänotypische Evaluierung des Einsatzes von Antikörpern, Antisense- unα Ribozym-Oligonukleotiden und vergleichbarer Mittel, die im Rahmen von funktioneilen Ansätzen zur Aufklärung der Relevanz bestimmter Gene eingesetzt werden.without drug application. Furthermore, the method according to the invention enables a comparison of defined states in animal models, with comparative analyzes of organs, tissues, tissue parts or diseased tissues or tissue parts being preferred over corresponding healthy material. Further areas of application concern the analysis of transgenic animals, which also include so-called ' knock-out ' animals, as well as the phenotypic evaluation of the use of antibodies, antisense and ribozyme oligonucleotides and comparable agents, which are used in the context of functional approaches to elucidate the relevance certain genes are used.
Der Einsatz einer solchen Technik erlaubt es, die Screening-Geschwindigkeit von zu untersuchendem Material αeutlich zu erhöhen, da eine Isolierung differentiell exprimierter Gene mit anschliessender Klonierung und Sequenzierung nicht mehr notwendig ist. Es ist daher möglich, eine viel grössere Zahl an Proben, bzw. weitaus mehr verschiedene Stadien einer Probe (z.B. zeitliche Verläufe von Veränderungen der Genexpression über mehrere Stunden/Tage etc.) zu untersuchen. Dies ist nicht nur im Hinblick auf die Entdeckung neuer möglicher 'drug targets' wichtig, sondern auch besonders unter dem Aspekt der Aufklärung von Wirkmechanismen potentieller therapeutischer Substanzen, da hier bei detailierter Untersuchung besonders viel Proben material anfallen kann.The use of such a technique allows the screening speed of the material to be examined to be significantly increased, since isolation of differentially expressed genes with subsequent cloning and sequencing is no longer necessary. It is therefore possible to examine a much larger number of samples, or far more different stages of a sample (e.g. temporal courses of changes in gene expression over several hours / days etc.). This is important not only with regard to the discovery of new possible drug targets, but also particularly with regard to the elucidation of the mechanisms of action of potential therapeutic substances, since a particularly large amount of sample material can be obtained in a detailed examination.
Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ist deren bevorzugte Anwendung im Rahmen eines Datenbank-orientierten Gen-Expressions-Anaiyse-Verfahrens. im Gegensatz zum enormen technischen Aufwand bereits etablierter Verfahren mit ähnlich hoher Leistungsfähigkeit wie z.B. der Chip-Hybridisierungs-Technoiogie (z.B. Affymetrix, USA), von der Chip-Herstellung über die Auswertungstechnik der Chip-Hybridisierung bis zur automatisierten Datenanalyse, stellt das erfindungsgemässe Verfahren eine überraschend einfache und kostengünstige Alternative dar, welche bekannten Verfahren des eingangs geschilderten Typs qualitativ deutlich überlegen ist.Another aspect of the present invention is its preferred use in the context of a database-oriented gene expression analysis method. in contrast to the enormous technical effort already established procedures with a similarly high performance such as the chip hybridization technology (e.g. Affymetrix, USA), from chip manufacture to the evaluation technique of chip hybridization to automated data analysis, the method according to the invention represents a surprisingly simple and inexpensive alternative to the known methods of the type described above in terms of quality is clearly superior.
Nachfolgend wird das erfindungsgemässe Verfahren sowie bevorzugte Ausführungsformen desselben im Detail beschrieben. Hinsichtlich detaillierter Angaben zu etablierten Standard- Verfanren wird z.B. verwiesen auf J. Sambrook et al. 1989: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Coid Spring Harbor Laooratory Press, Cold Spring Harbor, New York. - 14 -The method according to the invention and preferred embodiments thereof are described in detail below. With regard to detailed information on established standard methods, reference is made, for example, to J. Sambrook et al. 1989: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Coid Spring Harbor Laooratory Press, Cold Spring Harbor, New York. - 14 -
BeispieleExamples
1) mRNA-lsolation1) mRNA isolation
Die Isolierung und Aufreinigung von Gesamt-RNA aus zu untersuchenden Geweben, Gewebeteilen, Biopsieproben, Zellen etc. erfolgt nach beschriebenen Standard-Verfahren. Zur vollständigen Abtrennung von eventuellen Kontaminationen der isolierten RNA mit genomischer DNA wird ein enzymatischer Verdau mit DNasel (Boehringer Mannheim, Deutschland) durchgeführt. Es folgt dann die Reinigung von PolyA+-mRNA aus der totalen RNA mittels Oligo(dT)-gekoppelter magnetischer Partikel (Oligo(dT) magnetic beads, Promega, Wl, USA).The isolation and purification of total RNA from tissues to be examined, tissue parts, biopsy samples, cells etc. is carried out according to the standard methods described. To completely separate any contamination of the isolated RNA with genomic DNA, an enzymatic digestion is carried out with DNasel (Boehringer Mannheim, Germany). The polyA + mRNA is then purified from the total RNA by means of oligo (dT) -coupled magnetic particles (Oligo (dT) magnetic beads, Promega, Wl, USA).
2^ cDNA-Svnthese2 ^ cDNA synthesis
Doppelsträngige cDNA wird aus mRNA synthetisiert unter Verwendung einer Mischung aus 12 Anker-Primern mit folgender Struktur: von 5' beginnend folgt auf ein "HeeP'-Fragment (5'-Extension) aus 5-15 Basen, beispielsweise 5 oder 6 Basen, eine Erkennungssequenz für eines der Restriktions-Enzyme Bsgl oder Eco57l. Anschliessend folgt eine Abfolge von 14 dT-Nukleotiden und die zwei Anker-Nukleotide V, N am 3'-Ende des Primers. Dabei bezeichnet V ein Desoxyribonukleotid der Gruppe dA, dC oder dG, während N die Desoxyribonukleotide dA, dC, dG und dT definiert. Die Desoxyribonukleotide der dT-Folge, gegebenenfalls auch des "Heel"-Fragmentes, sind hierbei komplett substituiert durch 2'-O- methyiierte Ribonukleotide. Der cDNA-Synthese-Primer ist am 5'-Ende und/oder an einem oder mehreren internen dT-Nukleotiden mit einem Biotin-Rest (C9-Spacer) versehen.Double-stranded cDNA is synthesized from mRNA using a mixture of 12 anchor primers with the following structure: starting from 5 'is followed by a "HeeP" fragment (5 "extension) of 5-15 bases, for example 5 or 6 bases Detection sequence for one of the restriction enzymes Bsgl or Eco57l. This is followed by a sequence of 14 dT nucleotides and the two anchor nucleotides V, N at the 3 'end of the primer. V denotes a deoxyribonucleotide of the group dA, dC or dG, while N defines the deoxyribonucleotides dA, dC, dG and dT The deoxyribonucleotides of the dT sequence, possibly also of the "Heel" fragment, are completely substituted by 2'-O-methylated ribonucleotides 5'-end and / or on one or more internal dT nucleotides with a biotin residue (C9 spacer).
Alternativ kann die cDNA-Synthese, statt mit 2'-O-methylierten Ribonukleotiden, mit einer Mischung aus 12 nicht-modifizierten, d.h. aus Desoxyribonukleotiden bestehenden, Anker- Primern durchgeführt werden.Alternatively, instead of using 2'-O-methylated ribonucleotides, cDNA synthesis can be carried out with a mixture of 12 unmodified, i.e. anchor primers consisting of deoxyribonucleotides are carried out.
3) Erster Verdau der cDNA mit Restriktionsendonukleasen3) First digestion of the cDNA with restriction endonucleases
Vollständiger Verdau der cDNA mit einem Restriktionsenzym des Typs IIS, welches 5 Basen als Sequenz für die Schnittstelle erkennt (z.B.: FokI, Bsm AI, Bsm FI oder Bbv I) und zwei bis vier unbekannte Nukleotide als Überhang der cDNA generiert. In den weiteren Ausführungen werden beispielhaft Enzyme angeführt, die einen Nukleotid-Ueberhang von 4 Basen generieren. Bei kürzeren Ueberhängen müssen die zu ligierenden Adaptoren entsprechend verkürzt werden. - 15 -Complete digestion of the cDNA with a restriction enzyme of the type IIS, which recognizes 5 bases as sequence for the interface (eg: FokI, Bsm AI, Bsm FI or Bbv I) and generates two to four unknown nucleotides as an overhang of the cDNA. Enzymes which generate a nucleotide overhang of 4 bases are given as examples in the further explanations. In the case of shorter overhangs, the adapters to be ligated must be shortened accordingly. - 15 -
4) Erste Adaptoren-Ligation a) Durch den Enzym-Verdau entsteht ein 5'-Überhang von vier unbekannten Nukleotiden in der cDNA. Sechzehn Adaptor-Moleküle, bestehend aus zwei Oligomeren (nicht 5'- phosphoryliert, "Pseudo-Doppelstrang"-Adaptoren) werden nach erfolgtem Restriktions- Verdau mit der cDNA ligiert. Typischerweise besteht der Adaptor aus zwei unterschiedlich langen Oligonukleotiden, wobei das längere aus 25-35, das kürzere (komplementär zum 3'- Ende des längeren) aus 8-25 Basen, insbesondere 8-12 Basen, besteht. Der Adaptor entsteht durch Hybridisierung der beiden Oligonukleotide gegeneinander unter geeigneten Bedingungen und bildet einen 4-Nukleotid-Überhang, wobei das Nukleotid 3 bzw. 4 ('innere' Nukleotide - relativ zum 5'-Ende des antisense-Oligomers) eines der vier möglichen Desoxyribonukleotide dA, dC, dG und dT sein kann, während die 'äusseren' Nukleotide 1 bzw. 2 (relativ zum 5'-Ende des antisense-Oligomers) Undefiniert bleiben, d.h. immer als Mischung aus der vollständigen Kombination aller vier Desoxyribonukleotide bestehen. So entstehen 16 permutierte Adaptoren, deren 'innere' beiden Nukleotide die Spezifität der Ligation bestimmen. Zur Sicherstellung der korrekten Adaptoren-Ligation werden die Ligations-Ansätze nachträglich mit einer Nuklease, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus T4-Endonuclease VII, S1-Nuciease, und Mung Bean Nuklease, inkubiert.4) First adapter ligation a) The enzyme digestion creates a 5 'overhang of four unknown nucleotides in the cDNA. Sixteen adapter molecules consisting of two oligomers (not 5 ' - phosphorylated, "pseudo double-stranded" adapters) are ligated to the cDNA after restriction digestion has taken place. The adapter typically consists of two oligonucleotides of different lengths, the longer of 25-35, the shorter (complementary to the 3 ' end of the longer) of 8-25 bases, in particular 8-12 bases. The adapter is created by hybridizing the two oligonucleotides against each other under suitable conditions and forms a 4-nucleotide overhang, with nucleotide 3 or 4 ('inner' nucleotides - relative to the 5 'end of the antisense oligomer) one of the four possible deoxyribonucleotides dA, dC, dG and dT can be, while the 'outer' nucleotides 1 and 2 (relative to the 5 'end of the antisense oligomer) remain undefined, ie they always consist of a mixture of all four deoxyribonucleotides. This results in 16 permuted adapters, the 'inner' two nucleotides of which determine the specificity of the ligation. To ensure the correct adapter ligation, the ligation batches are subsequently incubated with a nuclease selected from the group consisting of T4 endonuclease VII, S1 nuciease and mung bean nuclease.
Die Ligation der 16 permutierten Adaptor-Moleküle erfolgt bei 4-37°C, 1-16 Stunden, 0-150 mM Na-Acetat, 1 -5 Einheiten T4-DNA-Ligase (oder Taq-DNA-Ligase oder E.coli-DNA- Ligase) in geeignetem Puffer. Jeder der 16 Ligationsansätze wird nach Aufreinigung in einer PCR als Template eingesetzt (siehe (8a)).The 16 permuted adapter molecules are ligated at 4-37 ° C., 1-16 hours, 0-150 mM Na acetate, 1-5 units of T4 DNA ligase (or Taq DNA ligase or E. coli DNA ligase) in a suitable buffer. After purification, each of the 16 ligation batches is used as a template in a PCR (see (8a)).
b) Alternativ werden statt 16 schliesslich 64 verschiedene "Pseudo-Doppelstrang"- Adaptoren, welche einen 4-Nukleotid-Überhang bilden, mit der cDNA ligiert. Dabei setzen sich die 64 Adaptoren-Überhänge aus allen Desoxyribonukleotid-Kombinationen der Basen 2-4 (relativ zum 5'-Ende des antisense-Oligomers) zusammen, während das 'äussere' Nukleotid (relativ zum 5'-Ende des antisense-Oligomers) als Mischung aller vier Nukleotide eingesetzt wird. Damit bestimmen die 'inneren' drei Nukleotide die Spezifität der Ligation. Dieses Verfahren beruht auf der Erkenntnis, dass die DNA-Ligase aus E.coli die drei ersten Basen des Adaptor-Überhangs in der Ligation zu diskriminieren vermag. Diese erfolgt unter den bereits oben beschriebenen Bedingungen. Zur Sicherstellung der korrekten Adaptoren- Ligation werden die Ligations-Ansätze nachträglich mit einer Nuklease, ausgewählt aus der - 16 -b) Alternatively, instead of 16, 64 different "pseudo double-stranded" adapters, which form a 4-nucleotide overhang, are finally ligated with the cDNA. The 64 adapter overhangs consist of all deoxyribonucleotide combinations of bases 2-4 (relative to the 5 'end of the antisense oligomer), while the' outer 'nucleotide (relative to the 5' end of the antisense oligomer) is used as a mixture of all four nucleotides. The 'inner' three nucleotides thus determine the specificity of the ligation. This method is based on the finding that the E. coli DNA ligase is able to discriminate the first three bases of the adapter overhang in the ligation. This takes place under the conditions already described above. To ensure the correct adapter ligation, the ligation approaches are subsequently selected with a nuclease from the - 16 -
Gruppe bestehend aus T4-Endonuclease VII, S1-Nuclease, und Mung Bean Nuklease, inkubiert.Group consisting of T4 endonuclease VII, S1 nuclease, and mung bean nuclease.
c) Alternativ werden statt der Ligation von 16 oder 64 verschiedenen "Pseudo- Doppelstrang"-Adaptoren die 5-Überhänge der cDNA sukzessive mit Desoxyribonukleotiden unter Verwendung von Kienow-DNA-Polymerase aufgefüllt. Dies ist möglich durch den Einsatz von Didesoxyribonukleotiden (ddNTP) und kompetitiven Adaptor-Molekülen. Zudem werden die 3'-Enden der cDNA nicht von den magnetischen Partikeln eluiert, um die eingesetzten Nukleotide nach jedem Schritt entfernen zu können. Soll beispielsweise der Basen-Überhang 5'-GGTT-3' aufgefüllt werden, wird die cDNA zuerst mit ddC-Nukleotiden inkubiert, um alle Überhänge, welche mit einem dG beginnen zu blockieren. Nach Entfernung der Didesxoribonukleotide wird die cDNA mit dA-Nukleotiden inkubiert. Danach erfolgt die Ligation eines Adaptor-Moieküls, das ein 'biunt' und ein 'sticky'-Ende besitzt, an diejenigen cNDAs, die bis dahin einen aufgefüllten 5'-Überhang aufweisen. Im gleichen Schritt werden zwei kompetitive Adaptor-Moleküle ligiert. Diese weisen ebenfalls ein 'sticky'- Ende auf und einen 5'-Überhang, der aus einem dC- bzw. drei dC-Molekülen besteht. Diese blockieren die cDNA-5'-Überhänge 5'-GTTT-3' bzw. 5'-GGGT-3'. Es folgt eine weitere Aufreinigung der Streptavidin-gebundenen cDNA-Fragmente, die dann mit dC-Nukleotiden inkubiert wird. Anschliessend erfolgt die Ligation eines Adaptor-Moieküls mit einem 'blunf- Ende, welcher nur an die vollständig und korrekt aufgefüllte cDNA ligieren kann. Auf die Art und Weise wird jeder der 256 möglichen cDNA-5'-Überhänge mit DNA-Polymerase komplett aufgefüllt und anschliessend in eine PCR eingesetzt.c) Alternatively, instead of the ligation of 16 or 64 different "pseudo double-stranded" adapters, the 5 overhangs of the cDNA are successively filled with deoxyribonucleotides using Kienow DNA polymerase. This is possible through the use of dideoxyribonucleotides (ddNTP) and competitive adapter molecules. In addition, the 3 'ends of the cDNA are not eluted from the magnetic particles in order to be able to remove the nucleotides used after each step. For example, if the base overhang 5'-GGTT-3 'is to be filled in, the cDNA is first incubated with ddC nucleotides in order to block all overhangs which begin with a dG. After removal of the didesxoribonucleotides, the cDNA is incubated with dA nucleotides. This is followed by the ligation of an adapter moiecule, which has a 'biunt' and a 'sticky' end, to those cNDAs which have until then a filled 5 'overhang. Two competitive adapter molecules are ligated in the same step. These also have a 'sticky' end and a 5 'overhang, which consists of one dC or three dC molecules. These block the cDNA-5 'overhangs 5'-GTTT-3' and 5'-GGGT-3 '. A further purification of the streptavidin-bound cDNA fragments follows, which is then incubated with dC nucleotides. This is followed by the ligation of an adapter molecule with a 'blunf end, which can only ligate to the completely and correctly filled-in cDNA. In this way, each of the 256 possible cDNA-5 'overhangs is completely filled with DNA polymerase and then used in a PCR.
5) Selektive Aufreinigunq der 3'-Enden der cDNA5) Selective purification of the 3 'ends of the cDNA
Zur Gewährleistung der selektiven Amplifikation der 3'-Enden der cDNA wird die spezifische Aufreinigung dieser Fragmente aus dem Gesamt-Pool der komplexen cDNA durchgeführt. Die 3 '-Enden der cDNA können vorzugsweise mit Hilfe von magnetischen Partikeln (magnetic beads), welche an Streptavidin gekoppelt sind, aus dem cDNA- Gemisch selektiv aufgereinigt werden (s. auch Biomagnetic Techniques in Molecular Biology, Dynal, N-0212 Oslo, Norwegen). Diese Art der Aufreinigung stellt sicher, dass in der nachfolgenden PCR keine unspezifische Amplifikation von internen (d.h. Nicht-3'- Enden) cDNA-Fragmenten erfolgt. Die Elution der cDNA von den magnetischen Partikeln erfolgt entweder durch die Extraktion mit organischen Lösungsmitteln bei hoher Temperatur - 17 -To ensure the selective amplification of the 3 ' ends of the cDNA, the specific purification of these fragments from the total pool of the complex cDNA is carried out. The 3 'ends of the cDNA can preferably be selectively purified from the cDNA mixture with the aid of magnetic particles (magnetic beads) which are coupled to streptavidin (see also Biomagnetic Techniques in Molecular Biology, Dynal, N-0212 Oslo, Norway). This type of purification ensures that in the subsequent PCR there is no unspecific amplification of internal (ie non-3 ' ends) cDNA fragments. The cDNA is eluted from the magnetic particles either by extraction with organic solvents at high temperature - 17 -
(65°C) oder durch enzymatischen Verdau mit einer der Restriktionsendonukleasen Bsgl oder Eco57l (s.u.).(65 ° C) or by enzymatic digestion with one of the restriction endonucleases Bsgl or Eco57l (see below).
6) Zweiter Verdau der cDNA mit Restriktionsendonukleasen für die Alternative (4b) Vollständiger Verdau der ligierten cDNA mit einem der Restriktionsenzyme Bsgl oder Eco57l. Dabei werden die Oligo-dT-Nukleotide des 3'-Endes der cDNA komplett abgespalten und ein 2-Nukleotid-Überhang der letzten beiden 3 '-Basen (V, N) der cDNA, welche 5' relativ zum Poly-dA-Stretch der mRNA liegen, generiert.6) Second digestion of the cDNA with restriction endonucleases for the alternative (4b) Complete digestion of the ligated cDNA with one of the restriction enzymes Bsgl or Eco57l. The oligo-dT nucleotides of the 3 'end of the cDNA are completely cleaved and a 2-nucleotide overhang of the last two 3' bases (V, N) of the cDNA, which is 5 'relative to the poly-dA stretch of the mRNA are generated.
7) Zweite Adaptoren-Ligation für die Alternative (4b)7 ) Second adapter ligation for the alternative (4b)
Je vier Adaptoren-Moleküle, bestehend aus zwei Oligomeren, werden nach erfolgtem Restriktions-Verdau mit je einem Ligations-Ansatz aus (4b) ligiert. Typischerweise besteht der Adaptor aus zwei unterschiedlich langen Oligonukleotiden, wobei das längere aus 25- 35, das kürzere (komplementär zum 3'-Ende des längeren, 5'-phosphoryliert) aus 22-30 Basen besteht. Der Adaptor entsteht durch Hybridisierung der beiden Oligonukleotide gegeneinander unter geeigneten Bedingungen und bildet ein 2-Nukleotid-Überhang, wobei das 'äussere' 3'-Nukleotid eines der vier Desoxyribonukleotide dA, dC, dG oder dT sein kann, während das 'innere' Nukleotid aus einer Mischung der drei Basen dA, dC oder dG definiert ist. Somit bestimmt das 'äussere' 3'-Nukleotid des Adaptor-Überhangs die Spezifität der Ligation. Die Ligations-Bedingungen sind wie oben beschrieben. Jeder der 256 Ligationsansätze wird nach Aufreinigung in eine PCR als Template eingesetzt (siehe (8b)).Four adapter molecules each, consisting of two oligomers, are ligated with a ligation approach from (4b) after restriction digestion has taken place. The adapter typically consists of two oligonucleotides of different lengths, the longer of 25-35, the shorter (complementary to the 3 ' end of the longer, 5'-phosphorylated) consisting of 22-30 bases. The adapter is created by hybridizing the two oligonucleotides against each other under suitable conditions and forms a 2-nucleotide overhang, the 'outer' 3 'nucleotide being one of the four deoxyribonucleotides dA, dC, dG or dT, while the' inner 'nucleotide is defined from a mixture of the three bases dA, dC or dG. The 'outer' 3 'nucleotide of the adapter overhang thus determines the specificity of the ligation. The ligation conditions are as described above. Each of the 256 ligation batches is used as a template after purification in a PCR (see (8b)).
8a) PCR für die Alternative (4a)8a) PCR for the alternative (4a)
In insgesamt 256 - 1024 PCRs wird als 3'-Primer der komplett durch 2'-O-methylierte Ribonukieotide substituierte cDNA-Synthese-Primer (Mischung aus 12 Anker-Primern) verwendet. Dabei kann durch die erhöhte Dissoziations-Temperatur der modifizierten Basen des Oligonukleotides eine deutlich höhere (bis zu 40 %, s. z.B. L.L. Cummins 1995, Nucl. Acids Res., 23, 2019-2024) Annealing-Temperatur in der PCR verwendet werden als mit einem nicht-substituierten Primer.In a total of 256-1024 PCRs, the cDNA synthesis primer (mixture of 12 anchor primers) which is completely substituted by 2'-O-methylated ribonucleotides is used as the 3 'primer. Due to the increased dissociation temperature of the modified bases of the oligonucleotide, a significantly higher (up to 40%, see for example LL Cummins 1995, Nucl.Acids Res., 23, 2019-2024) annealing temperature can be used in the PCR than with a unsubstituted primer.
Ein Aliquot der unter Punkt (4a) generierten Ligations-Ansätze wird in der PCR eingesetzt. Als 5'-Primer werden entweder in einer ersten PCR-Runde 16 - 64 Oligomere der Länge 18- 27 Basen, die dem 3 '-Ende des Sense-Adaptor-Oligonukleotids mit zusätzlich zwei oder - 18 -An aliquot of the ligation batches generated under point (4a) is used in the PCR. In a first round of PCR, 16-64 oligomers with a length of 18-27 bases are added as 5'-primers, which have an additional two or three at the 3 ' end of the sense adapter oligonucleotide - 18 -
αrei 3'-Nukieotioen der vollständigen Permutation aller vier Desoxyribonukleotide dA, dC, dG und dT entsprechen, verwendet. Die hier eingesetzten Primer-Permutationen entsprechen dabei den in den Ligations-Ansätzen unter (4a) definierten Basen 3 - 4 oder 2 - 4 der Adaptoren-Überhänge. In einer zweiten sich anschliessenden PCR-Runde werden pro erste PCR weitere 16 oder 64 PCRs durchgef ührt mit demselben 3'-Primer und je 16 5'- Oligonukleotiden der Länge 18-27 Basen, die dem 5'-Primer der ersten PCR entsprechen, jedoch um zwei oder drei 5'-Nukleotide der vollständigen Permutation aller vier Desoxyribonukleotide dA, dC, dG und dT verlängert sind.αrei 3 ' nucleotides correspond to the complete permutation of all four deoxyribonucleotides dA, dC, dG and dT. The primer permutations used here correspond to bases 3 - 4 or 2 - 4 of the adapter overhangs defined in the ligation approaches under (4a). In a second subsequent PCR round, a further 16 or 64 PCRs are carried out for each first PCR with the same 3 'primer and 16 5' oligonucleotides each with a length of 18-27 bases, which correspond to the 5 'primer of the first PCR, however, two or three 5 'nucleotides of complete permutation of all four deoxyribonucleotides dA, dC, dG and dT are extended.
Zur Gewährleistung der Spezifität der Amplifikation der verschiedenen Permutationen in der PCR werden selektive PCR-Primer verwendet, welche mehrere artifiziell eingeführte Fenipaarungen gegenüber oer Template-DNA enthalten können. Diese Mismatches können sich an irgendeiner Stelle des Oligomers befinden, wobei 2 Mismatches an den Positionen - 2 und -3 oder 1 Mis atch an oer Position -1 relativ zum 3'-Ende des Primers (Position 0) bevorzugt sind.To ensure the specificity of the amplification of the various permutations in the PCR, selective PCR primers are used, which can contain several artificially introduced fenipaires compared to the template DNA. These mismatches can be located anywhere on the oligomer, with 2 mismatches at positions -2 and -3 or 1 match at position -1 relative to the 3 ' end of the primer (position 0) preferred.
Das PCR-Profil ist typischerweise: 3 min, 95SC gefolgt von 20-40 Zyklen mit 45 sec, 95SC, 45 sec, 65eC, 60 sec, 72SC und einer abschiiessenden Extension für 60 sec bei 72δC, und wird mit Hiife von radioaktiv oder fluoreszierend markierten PCR-Primern durchgeführt.The PCR profile is typically: 3 min, 95 S C followed by 20-40 cycles with 45 sec, 95 S C, 45 sec, 65 e C, 60 sec, 72 S C and a final extension for 60 sec at 72 δ C, and is carried out with the aid of radioactive or fluorescent labeled PCR primers.
8b) Weitere Möglichkeit einer PCR für die Alternative (4a)8b) Another possibility of a PCR for the alternative (4a)
Alternativ wird die PCR wie unter 8a) besenrieben durchgeführt, wobei jedoch ein nicht- modifizierter cDNA-Synthese-Primer (Mischung aus 12 Anker-Primern), welcher aus Standard-Desoxyribonukleotiden besteht, eingesetzt.Alternatively, the PCR is carried out as described under 8a), but using an unmodified cDNA synthesis primer (mixture of 12 anchor primers), which consists of standard deoxyribonucleotides.
8c) PCR für die Alternative (4b)8c) PCR for the alternative (4b)
In insgesamt 256 PCRs werden 64 5'-Primer der Länge 18-27 Basen, die dem 3'-Ende des Sense-Oligonukleotids des ersten ligierten Adaptor-Moieküls (s. (4b)) mit zusätzlich drei 3'- Nukieotiden der vollständigen Permutation aller vier Desoxyribo-nukleotide dA, dC, dG und dT entsprechen, verwendet. Die hier eingesetzten Primer-Permutationen entsprechen dabei den in den Ligations-Ansätzen unter (4b) definierten Basen 2-4 der Adaptoren-Überhänge. Als 3'-Primer werden vier Oligonukleotide der Länge 18-27 Basen, die dem 3'-Ende des Sense-Oligonukleotids des zweiten ligierten Adaptor-Moieküls (s. (7)) entsprechen, eingesetzt. - 19 -In a total of 256 PCRs, 64 5 'primers with a length of 18-27 bases are added, which correspond to the 3 ' end of the sense oligonucleotide of the first ligated adapter molecule (see (4b)) with an additional three 3 ' nucleotides of the complete permutation all four deoxyribonucleotides correspond to dA, dC, dG and dT. The primer permutations used here correspond to bases 2-4 of the adapter overhangs defined in the ligation approaches under (4b). Four oligonucleotides with a length of 18-27 bases corresponding to the 3 ' end of the sense oligonucleotide of the second ligated adapter molecule (see (7)) are used as the 3' primer. - 19 -
Das PCR-Profil ist typischerweise: 3 min, 95eC gefolgt von 20-40 Zyklen mit 45 sec, 95eC, 45 sec, 65eC, 60 sec, 72SC und einer abschiiessenden Extension für 60 sec bei 72SC, und wird mit Hilfe von radioaktiv oder fluoreszierend markierten PCR-Primem durchgeführt.The PCR profile is typically: 3 min, 95 e C followed by 20-40 cycles with 45 sec, 95 e C, 45 sec, 65 e C, 60 sec, 72 S C and a final extension for 60 sec at 72 S C, and is carried out with the aid of radioactive or fluorescently labeled PCR primers.
8d) PCR für die Alternative (4c)8d) PCR for the alternative (4c)
In insgesamt 256 PCRs (für jede 'Auffüllreaktion' eine PCR) wird ein 5'-Primer der Länge 18-27 Basen, die dem 3'-Ende des Sense-Oligonukleotids des ligierten Adaptor-Moieküls entspricht, eingestzt. Als 3'-Primer wird das cDNA-Synthese-Oligonukleotid verwendet. Das PCR-Profil ist typischerweise: 3 min, 95SC gefolgt von 20-40 Zyklen mit 45 sec, 95QC, 45 sec, 65QC, 60 sec, 72QC und einer abschiiessenden Extension für 60 sec bei 72eC, und wird in Gegenwart von radioaktiv markierten Nukleotiden durchgeführt.In a total of 256 PCRs (one PCR for each 'replenishment reaction'), a 5 'primer with a length of 18-27 bases is inserted, which corresponds to the 3' end of the sense oligonucleotide of the ligated adapter molecule. The cDNA synthesis oligonucleotide is used as the 3 'primer. The PCR profile is typically: 3 min, 95 S C followed by 20-40 cycles with 45 sec, 95 Q C, 45 sec, 65 Q C, 60 sec, 72 Q C and a final extension for 60 sec at 72 e C, and is carried out in the presence of radioactively labeled nucleotides.
9) PCR-Analvse9 ) PCR analysis
Die Analyse der PCR-Fragmente erfolgt typischerweise auf 6 %-igen PolyacrylamidgelenThe PCR fragments are typically analyzed on 6% polyacrylamide gels
(PAA-Gelen) mit 7-8 M Harnstoff oder durch Kapillar-Elektrophorese.(PAA gels) with 7-8 M urea or by capillary electrophoresis.
Aus den Ergebnissen zeigt sich, dass die Selektivität für die Amplifikation der korrekten 5'- Nukleotide der cDNA für die 5'-Primer der TOGA-Methode nicht hinreichend gegeben ist, insbesondere wenn die Durchführung einer Computer-gestützten Datenbank-Analyse der Resultate angestrebt wird. Die Fehler-Rate bei der erfindungsgemässen Verwendung der 5'-Primer beträgt ≤ 5 %. Die Fehler-Rate lässt sich durch die oben beschriebene Liagtions- Methode weiter reduzieren auf annähernd 0 %. Angesichts dieser extrem niedrigen Fehler- Rate wird auch die Etablierung einer automatisierten Daten-Analyse ermöglicht. The results show that the selectivity for the amplification of the correct 5'-nucleotides of the cDNA for the 5'-primers of the TOGA method is not sufficient, in particular if the aim is to carry out a computer-assisted database analysis of the results . The error rate when using the 5 'primers according to the invention is 5 5%. The error rate can be further reduced to approximately 0% using the liagtion method described above. In view of this extremely low error rate, the establishment of an automated data analysis is also made possible.

Claims

- 20 -Patentansprüche - 20 patent claims
1. Verfahren zur Identifikation und Charakterisierung von mRNA-Molekülen, welches die folgenden Schritte umfasst:1. A method for identifying and characterizing mRNA molecules, which comprises the following steps:
(a) Isolierung und Reinigung von PolyA+-RNA aus Gewebeproben;(a) Isolation and purification of polyA + RNA from tissue samples;
(b) Synthese von doppelsträngiger cDNA aus den mRNA-Molekülen;(b) synthesis of double-stranded cDNA from the mRNA molecules;
(c) Verkürzen der cDNA durch enzymatischen Verdau mit Restriktionsendonukleasen;(c) shortening the cDNA by enzymatic digestion with restriction endonucleases;
(d) Hybridisierung und Ligation von Adaptor-Molekülen an die geschnittene cDNA; und entweder, in einer 1. Alternative,(d) hybridization and ligation of adapter molecules to the cut cDNA; and either, in a 1st alternative,
(e) Auffüllen der 5'-Überhänge der cDNA mit Desoxyribonukleotiden und Klenow-DNA- Polymerase;(e) filling the 5 'overhangs of the cDNA with deoxyribonucleotides and Klenow DNA polymerase;
(f) selektive Aufreinigung der 3'-Enden der cDNA;(f) selective purification of the 3 'ends of the cDNA;
(g) Abtrennung der 3'-ständigen Poly-dA-Nukleotide der cDNA durch enzymatischen Verdau mit einer Restriktionsendonuklease;(g) separation of the 3'-standing poly-dA nucleotides of the cDNA by enzymatic digestion with a restriction endonuclease;
(h) Hybridisierung und Ligation von Adaptor-Molekülen an die geschnittene cDNA; (i) Amplifizierung der cDNA-Fragmente durch PCR (polymerase chain reaction); (j) Auftrennung der Amplifikationsprodukte nach ihrer Länge; (k) Analyse der Amplifikationsprodukte; oder, in einer 2. Alternative,(h) hybridization and ligation of adapter molecules to the cut cDNA; (i) amplification of the cDNA fragments by PCR (polymerase chain reaction); (j) separation of the amplification products according to their length; (k) analysis of the amplification products; or, in a second alternative,
(e) selektive Aufreinigung der 3'-Enden der cDNA;(e) selective purification of the 3 'ends of the cDNA;
(f) Abtrennung der 3'-ständigen Poly-dA-Nukleotide der cDNA durch enzymatischen Verdau mit einer Restriktionsendonuklease;(f) separation of the 3'-position poly-dA nucleotides of the cDNA by enzymatic digestion with a restriction endonuclease;
(g) Hybridisierung und Ligation von Adaptor-Molekülen an die geschnittene cDNA;(g) hybridization and ligation of adapter molecules to the cut cDNA;
(h) Amplifizierung der cDNA-Fragmente durch PCR (polymerase chain reaction), wobei 5'-Primer verwendet werden, die zwei oder drei Permutationen am 3'-Ende aufweisen, und die eine oder zwei artifizielle Fehlpaarungen im Vergleich zum durch die Adaptermoleküle bestimmten komplementären Strang enthalten;(h) Amplification of the cDNA fragments by PCR (polymerase chain reaction) using 5 'primers which have two or three permutations at the 3' end and which have one or two artificial mismatches compared to that determined by the adapter molecules complementary strand included;
(i) Auftrennung der Amplifikationsprodukte nach ihrer Länge;(i) separation of the amplification products according to their length;
(j) Analyse der Amplifikationsprodukte; oder, in einer dritten Alternative,(j) analysis of the amplification products; or, in a third alternative,
(e) Amplifizierung der cDNA-Fragmente durch PCR (polymerase chain reaction), wobei 5'-Primer verwendet werden, die zwei oder drei Permutationen am 3'-Ende - 21 -(e) Amplification of the cDNA fragments by PCR (polymerase chain reaction) using 5 'primers, the two or three permutations at the 3' end - 21 -
aufweisen, und die eine oder zwei artifizielle Fehlpaarungen im Vergleich zum durch die Adaptermoleküle bestimmten komplementären Strang enthalten;and which contain one or two artificial mismatches in comparison to the complementary strand determined by the adapter molecules;
(f) Auftrennung der Amplifikationsprodukte nach ihrer Länge;(f) separation of the amplification products according to their length;
(g) Analyse der Amplifikationsprodukte;(g) analysis of the amplification products;
wobei für die 1. und 2. Alternative in Schritt (b) die Synthese der cDNA- Erststrangmoleküle durch reverse Transkription unter Verwendung eines geankerten Oligo-dT-Nukleotids erfolgt, welches eine 3'-Extension von 2 Basen aufweist, wobei die erste Base dA, dC oder dG, und die zweite Base dA, dC, dG oder dT ist, und welches eine 5'-Extension von 5-15 Basen aufweist, die für die Schnittstelle einer Restriktionsendonuklease mit der Spalt-Charakteristik 16/14 'downstream' der Erkennungssequenz kodiert; oder wobei für die 3. Alternative in Schritt (b) die Synthese der cDNA-Erststrangmoleküle durch reverse Transkription unter Verwendung eines geankerten Oligo-dT-Nukleotids erfolgt, welches eine 3'-Extensicn von 2 Basen aufweist, wobei die erste Base dA, dC oder dG, und die zweite Base dA, dC, dG oder dT ist, und welches eine 5'-Extension von 5-15 Basen einer beliebigen Sequenz aufweist.wherein for the 1st and 2nd alternative in step (b) the synthesis of the first strand cDNA molecules takes place by reverse transcription using an anchored oligo-dT nucleotide which has a 3 'extension of 2 bases, the first base dA , dC or dG, and the second base is dA, dC, dG or dT, and which has a 5 'extension of 5-15 bases, which is necessary for the cleavage of a restriction endonuclease with the cleavage characteristic 16/14' downstream 'of the Coded recognition sequence; or wherein for the third alternative in step (b) the synthesis of the first strand cDNA molecules takes place by reverse transcription using an anchored oligo-dT nucleotide which has a 3 'extensin of 2 bases, the first base dA, dC or dG, and the second base is dA, dC, dG or dT, and which has a 5 'extension of 5-15 bases of any sequence.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Oligo-dT-Nukleotid vollständig durch 2'-O-methyiierte Ribonukleotide substituiert wird.2. The method according to claim 1, characterized in that the oligo-dT nucleotide is completely substituted by 2'-O-methylated ribonucleotides.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligo-dT- Nukleotid an seinem freien 5'-Ende und/oder an internen dT-Nukleotiden mit einem Biotinrest über einen C9-Spacer versehen wird.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the oligo-dT nucleotide is provided at its free 5 'end and / or on internal dT nucleotides with a biotin residue via a C9 spacer.
4. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei in Schritt (h) der 2. Alternative oder in Schritt (e) der 3. Alternative sich die Fehlpaarungen an den Positionen -3, oder -3 und -4, oder - 4 und -5 im Vergleich zum durch die Adaptermoleküle bestimmten komplementären Strang befinden.4. The method of claim 1, wherein in step (h) of the second alternative or in step (e) of the third alternative, the mismatches at positions -3, or -3 and -4, or - 4 and -5 im Comparison to the complementary strand determined by the adapter molecules.
5. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (c) ein Restriktionsenzym der Klasse IIS verwendet wird, welches 5 Nukleotide als Erkennungssequenz besitzt und einen aus 2 - 4 Nukleotiden, die nicht Teil der - 22 -5. The method according to claim 1, characterized in that a restriction enzyme of class IIS is used in step (c), which has 5 nucleotides as a recognition sequence and one of 2-4 nucleotides that are not part of the - 22 -
Erkennungssequenz sind, bestehenden Überhang der geschnittenen cDNA- Fragmente generiert.Recognition sequence are generated, existing overhang of the cut cDNA fragments.
6. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (f) der 1. Alternative oder in Schritt (e) der zweiten Alternative die selektive Aufreinigung der 3'- Enden der cDNA unter Verwendung von paramagnetischen 'beads' erfolgt, die das Biotin-bindende Molekül Streptavidin gekoppelt haben.6. The method according to claim 1, characterized in that in step (f) of the 1st alternative or in step (e) of the second alternative, the selective purification of the 3 'ends of the cDNA is carried out using paramagnetic' beads' which Biotin-binding molecule coupled streptavidin.
7. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (g) der 1. Alternative oder in Schritt (f) der 2. Alternative ein Restriktionsenzym der Klasse IIS verwendet wird.7. The method according to claim 1, characterized in that a restriction enzyme of class IIS is used in step (g) of the 1st alternative or in step (f) of the 2nd alternative.
8. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Produkte aus Schritt (d) oder aus Schritt (h) der 1. Alternative oder aus Schritt (g) der 2. Alternative vor der Amplifizierung gemass Schritt (i) mit einer Nuklease, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus T4-Endonuciease VII, S1 -Nuclease, und Mung Bean Nuclease, inkubiert werden.8. The method according to claim 1, characterized in that the products from step (d) or from step (h) of the 1st alternative or from step (g) of the 2nd alternative before the amplification according to step (i) with a nuclease, selected from the group consisting of T4 endonuciease VII, S1 nuclease, and mung bean nuclease.
9. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (i) der ersten Alternative oder in Schritt (h) der 2. Alternative oder in Schritt (e) der 3. Alternative die Amplifizierung der cDNA-Fragmente unter Verwendung von Oligonukleotiden erfolgt, die an den kompiementären Strang des 'sense'-Oiigomers der ligierten Adaptor- Moleküle hybridisieren.9. The method according to claim 1, characterized in that in step (i) of the first alternative or in step (h) of the second alternative or in step (e) of the third alternative, the cDNA fragments are amplified using oligonucleotides that hybridize to the complementary strand of the sense oligomer of the ligated adapter molecules.
10. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (k) der ersten Alternative oder in Schritt (j) der 2. Alternative oder in Schritt (g) der 3. Alternative die Analyse anhand der unterschiedlichen Längen der Produkte sowie in Kenntnis der durch die Manipulation bekannten Basensequenz von 9 oder 10 Nukleotiden erfolgt.10. The method according to claim 1, characterized in that in step (k) of the first alternative or in step (j) of the second alternative or in step (g) of the third alternative, the analysis based on the different lengths of the products and in knowledge the base sequence of 9 or 10 nucleotides known from the manipulation takes place.
11. Anwendung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur gegebenenfalls rechnergestützten Identifizierung und Isolierung sowie Analyse neuer Gene. 11. Application of the method according to any one of the preceding claims for possibly computer-aided identification and isolation and analysis of new genes.
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