EP1000087A2 - Ancrod spezifische monoklonale antikörper, antikörperfragmente, deren mischungen oder derivate und deren verwendung - Google Patents

Ancrod spezifische monoklonale antikörper, antikörperfragmente, deren mischungen oder derivate und deren verwendung

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EP1000087A2
EP1000087A2 EP98936383A EP98936383A EP1000087A2 EP 1000087 A2 EP1000087 A2 EP 1000087A2 EP 98936383 A EP98936383 A EP 98936383A EP 98936383 A EP98936383 A EP 98936383A EP 1000087 A2 EP1000087 A2 EP 1000087A2
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EP
European Patent Office
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ancrod
mixtures
antibodies
antibody
derivatives
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP98936383A
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Thomas Subkowski
Wilfried Hornberger
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BASF SE
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Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
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    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)

Definitions

  • the invention relates to ancrod-specific monoclonal antibodies, antibody fragments, their mixtures or derivatives and their use in pharmaceutical preparations or in 1_0 diagnostics, and pharmaceutical preparations containing them
  • Antibodies antibody fragments, their mixtures or derivatives.
  • the invention further relates to cells which express these antibodies, 15 antibody fragments, their mixtures or derivatives.
  • Ancrod (trade name: Arwin ® , Arvin ® ) is an enzyme from the poison of the Malayan pit viper (Agkistrodon rhodostoma). It is a highly glycosylated serine protease with an average MW of about 20 38000, which has anticoagulant properties and the ability to dissolve blood clots.
  • thrombin cleaves the fibrinopeptides A and B from the fibrinogen molecule 25 and thus leads to fibrin formation (EP-B-0 556 906), the main constituent of thrombi in addition to, for example, red blood cells or platelets.
  • fibrin formation EP-B-0 556 906
  • Ancrod only cleaves the arginine-glycine bond in the ⁇ - ("A") chain of the fibrinogen molecule and thereby releases the fibrinopeptides A, AP and AY (Cole et al., J. Vascular. Surgery, Vol 17, 1993: 288-292).
  • Ancrod reduces the fibrinogen concentration in the blood depending on the dose.
  • the therapeutically induced and controlled hypofibrinogenaemia reduces the plasma viscosity and tendency of the erythrocytes to aggregate to such an extent that the flow properties of the blood are decisively improved. This is the prerequisite for increased blood flow to stenosed vessels.
  • Ancrod is currently used to treat chronic peripheral arterial circulatory disorders, for example, and to conduct phase III clinical studies on stroke.
  • Ancrod is advantageously injected subcutaneously. Treatment can be carried out on an inpatient basis or, if the regular fibrinogen concentration control required to monitor the therapy is ensured, on an outpatient basis. Ancrod can be administered intravenously, but should only be given in exceptional cases and under hospital observation.
  • Ancrod should always be dosed individually.
  • the fibrinogen concentration must be set to values within this range throughout the treatment period.
  • the flow properties of the blood are sufficiently good under these conditions.
  • the duration of therapy is usually 3-4 weeks, but can be extended beyond this period if necessary.
  • 70 I.U. International units, 1 ml
  • 70 - 140 IU. administered. If the fibrinogen concentration is in the therapeutic range, 210-280 IU is administered 2-3 times a week. injected at once.
  • the initial half-life of Ancrod in the circulation is about 3-5 hours, but slows down as the concentration decreases, so that after about 4 days, within which 90% of the administered Ancrod is generally eliminated, the half-life is extended to 9-12 days is.
  • Warfarin minor problems with nonspecific bleeding occur during treatment (see ZS Latallo, "Retrospective Study on Complications and Adverse Effects of Treatment with Thrombin-Like Enzymes - A Multicenter Trial", Thromb. Haemosta ⁇ is, 50, pp. 604 - 609, 1983) , is a targeted
  • Contraindications to treatment with Ancrod include, for example, hemorrhagic diathesis, risk of bleeding from injuries, after operations and deliveries, from ulcerative intestinal diseases, neoplasms, difficult to adjust high pressure, acute cerebral infarction and active pulmonary tuberculosis, functional disorders of the RES and disorders of the clot breakdown, e.g. in highly febrile conditions, e.g. in highly febrile conditions , severe liver disease, manifest and imminent shock or pregnancy.
  • the risk of bleeding with Ancrod is relatively low if the fibrinogen concentration is slowly lowered and adjusted to 70-100 mg / 100 ml during the therapy period.
  • Patients with a latent tendency to bleed e.g. in the case of kidney stones or renal insufficiency, should be monitored particularly carefully. Avoid arterial punctures and intramuscular injections of other drugs.
  • a warning is given against the simultaneous administration of RES-blocking and ulcerogenic drugs, anticoagulants, antifibrinolytics, thrombolytics and drugs that inhibit platelet aggregation, as well as against intramuscular administration of Ancrod.
  • Absorption from the muscle depot is generally very rapid, so that too many Des "A" fibrin monomers flood and there is a risk of thromboembolic complications.
  • An antidote based on an immunoglobulin preparation from goat serum is currently used to neutralize the enzymatic activity of the ancrod (company publication of Knoll AG, June 1983, title Arwin ® ).
  • This antidote which consists of polyclonal antibodies, is used for severe bleeding complications or increased bleeding risk, for example in the case of accident injuries or because of a sudden indication for surgery.
  • 4-5 g human fibrinogen should be administered. If human fibrinogen, plasma or blood is applied without an neutralization of Ancrod by an antidote, there is a risk of acute disseminated coagulation.
  • a disadvantage of the goat polyclonal antibodies used as an ancrod antidote is, for example, that they consist of a mixture of antibodies, many of which have no ancrod-neutralizing effect. This multitude of different antibodies can lead to a rapid immune response and also leads to a relatively low ancrod neutralization capacity.
  • the antidote contains antibodies of different affinity for Ancrod. Because they are derived from animals, polyclonal antibodies are difficult to standardize, which means that there are fluctuations in the different production batches.
  • the object of the present invention was to develop an antidote against ancrod which does not have the disadvantages mentioned above and which can be easily produced industrially.
  • the antibodies according to the invention used as an ancrod antidote are advantageously distinguished by a number of improved properties. For example, they form a homogeneous, well-characterized product of an antibody or an anti ⁇ Mechsubt having no fluctuations within the different production batches. They can be produced in any quantity and, since they are not produced in animals, do not pose any risk of viral or bacterial contamination during their production.
  • the antibodies according to the invention are advantageously distinguished by a number of improved properties. For example, they form a homogeneous, well-characterized product of an antibody or an anti ⁇ Congress having no fluctuations within the different production batches. They can be produced in any quantity and, since they are not produced in animals, do not pose any risk of viral or bacterial contamination during their production.
  • Antibody fragments, their mixtures or derivatives are epitope-specific and have a high binding and neutralizing activity. They can therefore be administered in small amounts during treatment.
  • the homogeneity of the product together with the lower application rates due to the high binding and neutralization activity mean that the risk of an immune reaction in the patient is significantly reduced. Fluctuations there is no binding and neutralization activity within the various antibodies, antibody fragments or derivatives as in polyclonal antibodies. By mixing different monoclonal antibodies, antibody fragments or derivatives with binding activity against different epitopes of the Ancrod, this can be neutralized very efficiently.
  • the antibodies, antibody fragments, their mixtures or derivatives according to the invention advantageously have a binding affinity for Ancrod in a range from 1 x 10 -7 to 1 x 10 ⁇ 12 M, preferably from 1 x 10 ⁇ 8 to 1 x 10 "11 , particularly preferably from 1 x 10 ⁇ 9 to 5 x 10 " 10 sts.
  • the antidote according to the invention has an ancrod-neutralizing effect which is improved by at least 100% in vivo, preferably a 250%, particularly preferably a 500% improved effect.
  • the monoclonal antibodies also show a significantly better effect in vitro than the polyclonal antibodies.
  • Monoclonal antibodies according to the invention or their fragments are in principle to be understood as meaning all immunoglobulin classes such as IgM, IgG, IgD, IgE, IgA or their subclasses such as the subclasses of IgG or their mixtures.
  • IgG and its subclasses such as IgGi, IgG 2 , IgG 2a / IgG 2 b IgG 3 or IgG M are preferred.
  • the IgG subtypes IgG ⁇ / ⁇ or IgG 2 b / are particularly preferred.
  • Fragments are all shortened or modified antibody fragments with one or two binding sites complementary to the antigen, which have a high binding and neutralizing activity towards Ancrod, like antibody parts with a lighter and heavier one corresponding to the antibody
  • Chain-formed binding site such as Fv, Fab or F (ab ') 2 fragments or single-strand fragments.
  • Shortened double-strand fragments such as Fv, Fab or F (ab ') 2 are preferred.
  • These fragments can be obtained, for example, enzymatically by cleaving off the Fc part of the antibodies with enzymes such as papain or pepsin, by chemical oxidation or by genetic engineering manipulation of the antibody genes. Genetically manipulated, unabridged fragments can also be used advantageously.
  • the antibodies or fragments can be used alone or in mixtures.
  • the antibody genes for the genetic engineering manipulations can be known, for example, from the person skilled in the art
  • Isolate hybridoma cells For this purpose, antibody-producing cells are attracted and the mRNA with sufficient optical density the cells are known to be isolated from the cells by cell lysis with guanidinium thiocyanate, acidification with sodium acetate, extraction with phenol, chloroform / isoamyl alcohol, precipitation with isopropanol and washing with ethanol. Then the reverse transcriptase is used to synthesize cDNA from the mRNA.
  • the synthesized cDNA can be inserted directly or after genetic manipulation, for example by "site directed mutagenesis", introduction of insertions, inversions, deletions or base exchanges into suitable animal, fungal, bacterial or viral vectors and expressed in the corresponding host organisms.
  • Bacterial or yeast vectors such as pBR322, pUC18 / 19, pACYC184, lambda or yeast mu vectors are preferred for cloning the genes and for expression in bacteria such as E. coli or in yeast such as Saccharomyces cerevisiae.
  • Another object of the invention are cells that synthesize the antibodies of the invention. After transformation, as mentioned above, these can be animal, fungal, bacterial or yeast cells.
  • these hybridoma cells or trioma cells preferably hybridoma cells.
  • These hybridoma cells can be obtained, for example, from animals known to be immunized with Ancrod and their antibody-producing B cells, by selecting these cells for Ancrod-binding antibodies and then fusing them
  • Myeloma cells human lymphoblastoid cells or heterohybridoma cells (Koehler et al., Nature 256, 1975: 496) or by
  • Hybridoma cell lines particularly preferred are mouse hybridoma cell lines, very particularly preferred are hybridoma cell lines which secrete the antibodies MAK 1-2, MAK 2-29 / 3 or MAK 3-27 and which are available from the DSMZ (German Collection for Microorganisms and
  • DSM ACC2318 and DSM ACC2319 were deposited.
  • the above-mentioned hybridoma cell lines secrete particularly preferred IgG-type antibodies.
  • the antibodies MAK 1-2, MAK 2-29 / 3 and MAK 3-27 formed are the following IgG subtypes IgG ⁇ / ⁇ , IgG 2b / ⁇ and IgG ⁇ / ⁇ . These preferred antibodies bind to different epitopes of the ancrod molecule, as tests for competitive binding of the antibodies with one another have shown.
  • the binding of the particularly preferred antibody MAK 1-2 to its epitope leads to the strongest neutralization of the ancrod molecule, which means that the smallest amounts of antibody are required to neutralize the enzymatic action.
  • the monoclonal antibodies show a significantly higher neutralizing effect than the antidote commonly used in the treatment of bleeding based on polyclonal antibodies, which are obtained from the goat and sold by Knoll AG (Ludwigshafen) as an antidote.
  • peptides, peptidomimetics which are derived from the antigen-binding regions of the antibodies, to solid or liquid carriers such as polyethylene glycol, glass, synthetic polymers such as polyacrylamide, polystyrene, polypropylene, polyethylene or natural poly such as cellulose, Sepharose or agarose bound antibodies, fragments or peptides or conjugates with enzymes, toxins or radioactive or non-radioactive markers such as 3H, 1231, 1251, 1311, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 36C1, 57Co, 55Fe, 59Fe, 90Y , 99mTc, 75Se, fluorescent / chemiluminescent markers such as rhodamine, fluorescein, isothiocyanate, phycoerythrin, phycocyanin, fluorescamine, metal chelates, avidin, streptavidin or biotin covalently bound antibodies, fragments
  • the antibodies, antibody fragments, their mixtures and derivatives according to the invention can be used directly, after drying, for example freeze-drying, after binding to the abovementioned carriers or after formulation with other active pharmaceutical ingredients and auxiliaries for the preparation of pharmaceutical preparations.
  • active substances and auxiliaries are further antibodies, antimicrobial substances which have a microbiocidal or microbiostatic effect, such as antibiotics in general or sulfonamides, antitumor agents, water, buffers, salines, alcohols, fats, waxes, inert carriers or other substances customary for parenterals, such as amino acids, thickeners or called sugar.
  • These pharmaceutical preparations are used in the control of diseases, preferably in the control of coagulation disorders, advantageously disorders of the peripheral blood system or in the event of a stroke.
  • the antidote according to the invention can be administered orally or parenterally - subcutaneously, intramuscularly, intravenously or interperitoneally; intramuscular or intravenous administration is preferred.
  • the antibodies, antibody fragments, their mixtures or derivatives according to the invention can be used in diagnostics directly or after coupling to solid or liquid carriers, enzymes, toxins, radioactive or non-radioactive markers or to fluorescence / chemiluminescence markers, as described above.
  • Ancrod can be detected in a wide variety of body fluids from a wide variety of organisms such as humans or animals or in a wide variety of fluids such as culture media from yeast, bacteria, fungi or human or animal cell cultures. Examples:
  • the immunization, fusion, selection and characterization were carried out using techniques described in the literature (e.g. JH Peters; monoclonal antibodies, production and characterization; Springer Verlag; AM Campbell; Monoclonal Antibody and Immunosensor Technology; Verlag Elsevier, Chapters 2 to 7 and 8, 1991) carried out.
  • mice Female Balb / c mice were immunized intraperitoneally with 100 ⁇ g Ancrod, which was inactivated by cross-linking with regard to the enzymatic activity, in a 2-3 week rhythm according to the following administration schedule:
  • PEG solution polyethylene glycol solution
  • PBS phosphate buffered saline
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • FCS fetal calf serum
  • Condimed Hl Boehringer Mannheim
  • HAT supplement hypoxanthine, aminopterin, thymidine supplement
  • ITS supplement insulin, transferrin, selenite supplement
  • Pyruvate Glutamine; Streptomycin / penicillin
  • Hybridomas which secrete specific anti-Ancrod antibodies were identified as follows using a specific ELISA in a microtiter plate:
  • Peroxidase substrate Mix 0.1 ml TMB solution (42 mM tetramethylbenzidin in DMSO) and 10 ml substrate buffer (0.1 M Na acetate pH 4.9); then addition of 14.7 ⁇ l H 2 0.
  • Hybridomas with a positive antibody response were isolated by subcloning and the individual clones tested again. Antibodies with the highest reactivity were used in the in vitro neutralization assay. In this way, a large number of positive hybridomas, ie cells that produce antibodies against Ancrod, could be isolated.
  • the monoclonal antibodies were purified from serum-free cell culture supernatants.
  • a serum-free cell culture medium such as SF-3 ( Cytogen), PFHM-II (Gibco), HL-1 (Bio Whittaker), Ultra Doma PF (Bio Whittaker) or the like.
  • the non-specifically bound proteins were washed away with 3 M NaCl / 1.5 M glycine pH 8.9; the anti-Ancrod-anti-body activity was eluted with 500 mM NaCl / 0.59% acetic acid.
  • the antibody subtype was determined analogously to the ELISA described above, but using the following biotinylated subtype-specific antibodies instead of the biotinylated anti-mouse IgG antibody: anti-mouse IgGi, anti-mouse IgM, anti-mouse IgG 2a / anti-mouse ⁇ , anti-mouse IgG 2 b / anti-mouse ⁇ and anti-mouse IgG 3 .
  • the antibody types and subtypes of the isolated hybridoma cell lines MAK 1-2, MAK 2-29 / 3 and MAK 3-27 were each determined as follows: IgG ⁇ / ⁇ , IgG 2b / ⁇ and IgG ⁇ / ⁇ .
  • the affinity constants of the monoclonal antibodies were determined by various techniques known from the literature, such as e.g. Equilibrium dialysis, immunoprecipitation or ELISA (e.g. J.H. Peters; monoclonal antibodies, production and characterization; Springer Verlag; A.M. Campbell; Monoclonal Antibody and Immunosensor Technology; Verlag Elsevier, section 11, 1991).
  • the neutralization capacity of the antibodies was quantified based on the Ancrod-induced fibrin turbidity.
  • the antibody MAK 1-2 was particularly effective, as it led to complete neutralization even at higher ancrod concentrations (Table II, OD corresponds to the blank value).
  • the blank in Table II contained all ingredients except Ancrod. The highest OD values were measured in each case with the various ancrods (50, 25 and 12.5 ng / ml ancrod) without addition of the different monoclonal antibodies (Table II).
  • the MAK's 2-29 and 3-27 have similarly good or better affinities for Ancrod than MAK 1-2 (Table I), but the antibody-antigen binding only led to a neutralization of the enzymatic activity with higher amounts of antibody in relation to the amount of Ancrod.
  • the in vitro neutralization efficiency of the 5 purified monoclonal antibodies could be assessed by comparing the 50% neutralization values in the fibrin turbidity assay.
  • the 50% neutralization value was as follows:
  • Negative control no ancrod addition (no fibrin formation)
  • Positive control ancrod + fibrinogen (maximum fibrin formation)
  • 35 2 hours preincubation is about a factor of 4 better than the goat-based antidote based on polyclonal antibodies.
  • Placebo - administered as an intravenous bolus at 1 ml / kg body weight Blood samples (8 vol. Blood + 2 vol. Anticoagulant 0.11 M citrate) were taken from the carotid artery before or 30 and 60 minutes after the start of ancrodine infusion. The plasma was obtained from the citrate blood by centrifugation and the fibrinogen content was determined using the Clauss coagulation method (calibration curve by adding defined amounts of rat fibrinogen to defibrinogenated rat plasma).
  • Tabel le IV Measurement of the fibrinogen concentration with the different antibodies

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Abstract

Die Erfindung betrifft Ancrod spezifische monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, deren Mischungen oder Derivate und deren Verwendung in pharmazeutischen Zubereitungen oder in der Diagnostik. Weiterhin betrifft die Erfindung Zellen, die diese Antikörper, Antikörperfragmente, deren Mischungen oder Derivate exprimieren.

Description

Ancrod spezifische monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, deren Mischungen oder Derivate und deren Verwendung
5 Beschreibung
Die Erfindung betrifft Ancrod spezifische monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, deren Mischungen oder Derivate und deren Verwendung in pharmazeutischen Zubereitungen oder in der 1_0 Diagnostik sowie pharmazeutische Zubereitungen, die diese
Antikörper, Antikörperfragmente, deren Mischungen oder Derivate enthalten.
Weiterhin betrifft die Erfindung Zellen, die diese Antikörper, 15 Antikörperfragmente, deren Mischungen oder Derivate exprimieren.
Ancrod (Handelsname: Arwin®, Arvin®) ist ein Enzym aus dem Gift der Malaiischen Grubenotter (Agkistrodon rhodostoma) . Es ist eine hochglycosylierte Serinprotease mit einem mittleren MW von etwa 20 38000, die antikoagulierende Eigenschaften sowie die Fähigkeit zur Auflösung von Blutgerinnseln besitzt.
Die normale Blutgerinnung erfolgt durch Thrombin, indem Thrombin die Fibrinopeptide A und B aus dem Fibrinogenmolekül abspaltet 25 und so zur Fibrinbildung führt (EP-B-0 556 906) , dem Hauptbestandteil von Thromben neben beispielsweise roten Blutkörperchen oder Plättchen. Ancrod spaltet im Gegensatz zu Thrombin nur die Arginin-Glycin Bindung in der α- ( "A" ) -Kette des Fibrinogenmole- küls und setzt dabei die Fibrinopeptide A, AP und AY frei (Cole et al., J. Vascular. Surgery, Vol 17, 1993: 288 - 292). Die
30 ß- (B) -Kette des Fibrinogenmoleküls wird durch Ancrod nicht angegriffen und damit nicht freigesetzt. Die nach der durch Ancrod verursachten Abspaltung der Fibrinopeptide entstehenden Bruchstücke (Des-"A"-Fibrinmonomere) können schließlich zu dünnen Filamenten polymerisieren. Das entstehende atypische, lösliche
35 Fibrin wird durch körpereigenes Plasmin lysiert und/oder durch das Retikuloendotheliale System (= RES, Monozyten-Makrophagen- System) entfernt. Eine weitere Spaltung des Des-"A"-Fibrinogen- moleküls durch Thrombin zu natürlichen Fibrin erfolgt nicht mehr, da das entstandene Molekül kein Substrat des Thrombins ist.
40
Ancrod senkt dosisabhängig die Fibrinogenkonzentration im Blut. Durch die therapeutisch induzierte und gesteuerte Hypofibrino- genämie werden Plasmaviskosität und Aggregationsneigung der Erythrozyten so weit vermindert, daß die Fließeigenschaften des 5 Blutes entscheidend verbessert werden. Damit ist die Voraussetzung für eine stärkere Durchblutung stenosierter Gefäße gegeben. Mit Ancrod werden zur Zeit beispielsweise chronische periphere arterielle Durchblutungsstörungen behandelt, sowie klinische Phase III-Studien zum Schlaganfall unternommen.
Ancrod wird vorteilhafterweise subkutan injiziert. Die Behandlung kann stationär oder, falls die regelmäßige, zur Überwachung der Therapie erforderliche Kontrolle der Fibrinogenkonzentration sichergestellt ist, auch ambulant durchgeführt werden. Die intravenöse Gabe von Ancrod ist möglich, sollte aber nur in Ausnahme- fällen und unter stationärer Beobachtung erfolgen.
Ancrod ist grundsätzlich individuell zu dosieren . Maßgebend ist das Verhalten der Fibrinogenkonzentration in Abhängigkeit von der Ancrodgabe. Sie ist langsam auf 70-100 mg/100 ml Plasma zu senken (= therapeutischer Bereich) . Während der gesamten Behandlungs- zeit ist die Fibrinogenkonzentration auf Werte innerhalb dieses Bereiches einzustellen. Die Fließeigenschaften des Blutes sind unter diesen Bedingungen ausreichend gut. Die Therapiedauer beträgt in der Regel 3-4 Wochen, kann jedoch, falls erforderlich, über diesen Zeitraum hinaus verlängert werden.
Bei subkutaner Anwendung werden in den ersten 4 Tagen täglich 70 I.E. (= Internationale Einheiten, 1 ml) und ab dem 5. Tag, je nach Verhalten der Fibrinogenkonzentration, 70 - 140 I.E. verabreicht. Liegt die Fibrinogenkonzentration im therapeutischen Bereich, werden 2-3mal wöchentlich 210-280 I.E. auf einmal injiziert.
Intravenös werden initial 2-3 I.E. /kg Körpergewicht innerhalb von acht Stunden infundiert. Anschließend wird Ancrod abhängig von der erreichten Fibrinogenkonzentration nachdosiert. Im allgemeinen reicht es aus, alle 12 Stunden weitere je 1 I.E. /kg Körpergewicht langsam zu injizieren.
Die initiale Halbwertszeit von Ancrod in der Zirkulation beträgt etwa 3-5 Stunden, verlangsamt sich aber mit fallender Konzentration, so daß nach etwa 4 Tagen, innerhalb dieser Zeit werden im allgemeinen 90% des verabreichten Ancrods eliminiert, die Halbwertszeit auf 9-12 Tage verlängert ist.
obwohl mit Ancrod im Gegensatz zu beispielsweise Heparin und
Warfarin geringere Probleme mit unspezifischen Blutungen während der Behandlung auftauchen (siehe Z.S. Latallo, "Retrospective Study on Complications and Adverse Effects of Treatment with Thrombin-Like Enzymes - A Multicenter Trial", Thromb . Haemostaεis, 50, pp. 604 - 609, 1983), ist eine gezielte
Behandlung solcher Blutungen erforderlich und wünschenswert. Kontraindikationen bei der Behandlung mit Ancrod sind beispielsweise hämorrhagische Diathese, Blutungsgefahr bei Verletzungen, nach Operationen und Entbindungen, bei ulzerösen Intestinaler- krankungen, Neoplasmen, schlecht einstellbarem Hochdruck, akutem Hirninfarkt und aktiver Lungentuberkulose, Funktionsstörungen des RES und Störungen des Gerinnselabbaus, z.B. bei hochfieberhaften Zuständen, schweren Lebererkrankungen, manifesten und drohenden Schockzuständen oder Schwangerschaft.
Wie oben beschrieben ist das Risiko einer Blutung mit Ancrod relativ gering, wenn die Fibrinogenkonzentration langsam gesenkt und während der Therapiedauer auf 70-100 mg/100 ml eingestellt wird. Patienten, bei denen eine latente Blutungsneigung besteht, z.B. bei Nierensteinen oder Niereninsuffizienz, sollten besonders sorgfältig überwacht werden. Arterienpunktionen und intramuskuläre Injektionen anderer Arzneimittel sind zu vermeiden. Gewarnt wird vor der gleichzeitigen Gabe von RES-blockierenden sowie ulzerogenen Arzneimitteln, Antikoagulantien, Antifibrino- lytika, Thrombolytika und Medikamente, welche die Plättchen- aggregation hemmen, sowie vor der intramuskulären Gabe von Ancrod. Die Resorption aus dem Muskeldepot erfolgt im allgemeinen sehr rasch, so daß zu viele Des-"A"-Fibrinmonomere abfluten und die Gefahr thromboembolischer Komplikationen gegeben ist.
In einer Studie mit 429 Patienten (Crit. Rev. Oncol. Hematol. .15. (1993) 23-33), denen Ancrod ohne vorherige thrombolytische Therapie verabreicht wurde, lag die Gesamtinzidenz für Blutungen bei 9,8% (4,2% interne Blutungen; 5,6% externe Blutungen).
Zur Zeit wird zur Neutralisation der enzymatischen Aktivität des Ancrods ein Antidot verwendet, das auf einer Immunglobulin- zubereitung aus Ziegenserum basiert (Firmenschrift der Knoll AG, Juni 1983, Titel Arwin®) . Dieses aus polyklonalen Antikörpern bestehende Antidot wird bei schweren Blutungskomplikationen oder erhöhter Blutungsgefahr, z.B. bei Unfallverletzungen oder wegen plötzlicher Indikationsstellung zur Operation, angewendet. Im Anschluß an die Neutralisation von Ancrod sollten 4-5 g human- Fibrinogen verabreicht werden. Wird human-Fibrinogen, Plasma oder Blut ohne vorherige Neutralisation von Ancrod durch ein Antidot appliziert, so besteht die Gefahr einer akuten disseminierten Gerinnung.
Stocker et al (Thrombosis Research, Vol. 6, 1975: 189 - 194) untersuchten die Thrombenbildung in Gegenwart von Arwin® allein und in Gegenwart des polyklonalen Antidots und konnten die Antidotwirkung belegen. Neben dieser Verwendung von polyklonalen Antikörpern aus Ziegen werden in EP-B-0 395 375, EP-B-0 556 906 und Burkhardt et al (FEBS, Vol 297, No. 3, 1992: 297 - 301) monoklonale oder poly- klonale Antikörpern zur Detektion der Expression von Ancrodgenen, dem Nachweis von Fibrinogen im Blut mit Hilfe von Ancrod und Ancrodantikörpern oder die Aufreinigung des Ancrods mit Hilfe von Antikörpern beschrieben.
Von Nachteil bei den als Ancrod-Antidot verwendeten polyklonalen Antikörpern aus Ziegen ist beispielsweise, daß sie aus einem Gemisch von Antikörpern bestehen, von denen viele keine Ancrod- neutralisierende Wirkung haben. Diese Vielzahl unterschiedlicher Antikörper kann zu einer raschen Immunreaktion führen und führt außerdem zu einer relativ niedrigen Ancrodneutralisationskapa- zität. Darüberhinaus sind im Antidot Antikörper unterschiedlicher Affinität gegenüber Ancrod enthalten. Polyklonale Antikörper lassen sich, da sie aus dem Tier gewonnen werden, nur schlecht standardisieren, daß heißt es gibt Schwankungen in den unterschiedlichen ProduktionsChargen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es ein Antidot gegenüber Ancrod zu entwickeln, das die oben genannten Nachteile nicht aufweist und sich einfach technisch produzieren läßt.
Diese Aufgabe wurde durch die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper, Antikörperfragmente, deren Mischungen oder Derivate, die an Ancrod binden und dessen Aktivität inhibieren, wobei die Bindungsaffinität in einem Bereich von 1 x 10-7 bis 1 x 10-12 M liegt und Neutalisationswirkung gegenüber polyklonalen Antikörpern aus Ziegen in vivo um mindestens 100 % verbessert ist, gelöst.
Die erfindungsgemäßen als Ancrod-Antidot verwendeten Antikörper zeichnen sich vorteilhafterweise durch eine Reihe verbesserter Eigenschaften aus. Sie bilden beispielsweise ein homogenes, gut charakterisiertes Produkt aus einem Antikörper oder einer Anti¬ körpersubklasse, das keine Schwankungen innerhalb der unterschiedlichen Produktionschargen aufweist. Sie sind in beliebiger Menge herstellbar und bergen, da sie nicht im Tier hergestellt werden, bei ihrer Produktion nicht das Risiko einer viralen oder bakteriellen Kontamination. Die erfindungsgemäßen Antikörper,
Antikörperfragmente, deren Mischungen oder Derivate sind Epitop- spezifisch und weisen eine hohe Bindungs- und Neutralisations- aktivität aus. Sie können deshalb in geringen Mengen bei der Behandlung verabreicht werden. Die Homogenität des Produkts zu- sammen mit den geringeren Aufwandmengen durch die hohe Bindungsund Neutralisationsaktivität führen dazu, daß das Risiko einer Immunreaktion im Patienten deutlich reduziert wird. Schwankungen in der Bindungs- und Neutralisationsaktivität innerhalb der verschiedenen Antikörper, Antikörperfragmente oder Derivate wie bei polyklonalen Antikörpern kommen nicht vor. Durch Mischung verschiedener monoklonaler Antikörper, Antikörperfragmente oder Derivate mit Bindungsaktivität gegen unterschiedliche Epitope des Ancrod, läßt sich dieses sehr effizient neutralisieren.
Die erfindungsgemäßen Antikörper, Antikörperfragmente, deren Mischungen oder Derivate haben vorteilhafterweise eine Bindungs- affinität gegenüber Ancrod in einem Bereich von 1 x 10-7 bis 1 x 10~12 M, bevorzugt von 1 x 10~8 bis 1 x lO"11, besonders bevorzugt von 1 x 10~9 bis 5 x 10"10 M.
Das erfindungsgemäße Antidot hat gegenüber polyklonalen Anti- körpern aus der Ziege in vivo eine um mindestens 100 % verbesserte Ancrod-neutralisierende Wirkung, bevorzugt eine um 250 %, besonders bevorzugt eine um 500 % verbesserte Wirkung. Auch in vitro zeigen die monoklonalen Antikörper eine deutlich bessere Wirkung als die polyklonalen Antikörper.
Unter erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern oder deren Fragmente sind prinzipiell alle Immunoglobulinklassen wie IgM, IgG, IgD, IgE, IgA oder ihre Subklassen wie die Subklassen des IgG oder deren Mischungen zu verstehen. Bevorzugt sind IgG und seine Subklassen wie beispielsweise IgGi, IgG2, IgG2a/ IgG2b IgG3 oder IgGM. Besonders bevorzugt sind die IgG Subtypen IgGι/κ oder IgG2b/ . Als Fragmente seien alle verkürzten oder veränderten Antikörperfragmente mit einer oder zwei dem Antigen-komplementären Bindungsstellen, die eine hohe Bindungs- und Neutralisations- aktivität gegenüber Ancrod aufweisen wie Antikörperteile mit einer den Antikörper entsprechenden von leichter und schwerer
Kette gebildeten Bindungsstelle wie Fv-, Fab- oder F (ab' ) 2-Frag- mente oder Einzelstrangfragmente, genannt. Bevorzugt sind verkürzte Doppelstrangfragmente wie Fv-, Fab- oder F(ab')2. Diese Fragmente können beispielsweise auf enzymatischem Wege durch Abspaltung des Fc-Teils der Antikörper mit Enzymen wie Papain oder Pepsin, durch chemische Oxidation oder durch gentechnische Manipulation der Antikörpergene erhalten werden. Auch genmanipulierte nichtverkürzte Fragmente können vorteilhaft verwendet werden .
Die Antikörper oder Fragmente können allein oder in Mischungen verwendet werden.
Die Antikörpergene für die gentechnischen Manipulationen lassen sich in dem Fachmann bekannterweise beispielsweise aus den
Hybridomzellen isolieren. Dazu werden Antikörper-produzierende Zellen angezogen und die mRNA bei ausreichender optischer Dichte der Zellen über Zellyse mit Guanidiniumthiocyanat, Ansäuern mit Natriumacetat, Extraktion mit Phenol, Chloroform/Isoamylalkohol, Fällungen mit Isopropanol und Waschen mit Ethanol aus den Zellen in bekannterweise isoliert. Anschließend wird mit Hilfe der Reversen Transcriptase cDNA aus der mRNA synthetisiert. Die synthetisierte cDNA kann direkt oder nach genetischer Manipulation beispielsweise durch "site directed mutagenesis" , Einführung von Insertionen, Inversionen, Deletionen oder Basenaustausche in geeignete tierische, pilzliche, bakterielle oder virale Vektoren inseriert und in den entsprechenden Wirtsorganismen exprimiert werden. Bevorzugt werden bakterielle oder Hefe Vektoren wie pBR322, pUC18/19, pACYC184, Lambda oder Hefe-mu-Vektoren zur Klonierung der Gene und die Expression in Bakterien wie E. coli bzw. in der Hefe wie Saccharomyces cerevisiae.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand sind Zellen, die die erfindungsgemäßen Antikörper synthetisieren. Dies können nach Transformation wie oben erwähnt tierische, pilzliche, bakterielle Zellen oder Hefezellen sein. Vorteilhafterweise handelt es sich um Hybridomzellen oder Triomazellen, bevorzugt um Hybridomzellen. Diese Hybridomzellen lassen sich beispielsweise in bekannterweise aus mit Ancrod immunisierten Tieren und Isolierung deren Antikörper produzierenden B-Zellen, durch Selektion dieser Zellen auf Ancrod bindende Antikörper und anschließender Fusion dieser
Zellen mit beispielsweise menschlichen oder tierischen z.B. Maus-
Myelomzellen, humanen Lymphoblastoidzellen oder Heterohybridoma- zellen (Koehler et al., Nature 256, 1975: 496) oder durch
Infektion dieser Zellen mit entsprechenden Viren zu unsterblichen
Zellen, herstellen. Bevorzugt werden durch Fusion hergestellte
Hybridomazellinien, besonders bevorzugt werden Maus-Hybrido- mazellinien, ganz besonders bevorzugt werden Hybridomazellinien, die die Antikörper MAK 1-2, MAK 2-29/3 oder MAK 3-27 sezernieren und die bei der DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und
Zellkulturen in Braunschweig) unter den Nummern DSM ACC2317,
DSM ACC2318 und DSM ACC2319 hinterlegt wurden.
Die oben genannten Hybridomazellinien sezernieren besonders bevorzugte Antikörper vom IgG-Typ. Bei den gebildeten Antikörpern MAK 1-2, MAK 2-29/3 und MAK 3-27 handelt es sich um folgende IgG- Subtypen IgGι/κ , IgG2b/κ und IgGι/κ. Diese bevorzugten Antikörper binden an unterschiedliche Epitope des Ancrodmoleküls, wie Tests auf kompetitive Bindung der Antikörper untereinander zeigten. Die Bindung des besonders bevorzugten Antikörper MAK 1-2 an sein Epitop führt zur stärksten Neutralisation des Ancrodmoleküls, dadurch werden für die Neutralisation der enzymatischen Wirkung die geringsten Antikörpermengen benötigt. Die monoklonalen Antikörper zeigen eine deutlich höhere neutralisierende Wirkung als das üblicherweise bei der Behandlung von Blutungen verwendete Antidot auf Basis polyklonaler Antikörper, die aus der Ziege gewonnen werden und von der Knoll AG (Ludwigshafen) als Antidot vertrieben werden .
Als Derivate der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern seien hier Peptide, Peptidomimetika, die sich von den Antigen-bindenden Bereichen der Antikörper ableiten, an feste oder flüssige Träger wie Polyethylenglycol, Glas, synthetische Polymere wie Polyacryl - amid, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen oder natürliche Poly- mere wie Cellulose, Sepharose oder Agarose gebundene Antikörper, Fragmente oder Peptide oder Konjugate mit Enzymen, Toxinen oder radioaktiven oder nichtradioaktiven Markern wie 3H, 1231, 1251, 1311, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 36C1, 57Co, 55Fe, 59Fe, 90Y, 99mTc, 75Se, Fluoreszenz-/Chemilumineszenzmarkern wie Rhodamin, Fluores- cein, Isothiocyanat, Phycoerythrin, Phycocyanin, Fluorescamin, Metallchelaten, Avidin, Streptavidin oder Biotin kovalent gebundene Antikörper, Fragmente, oder Peptide genannt.
Die erfindungsgemäßen Antikörper, Antikörperfragmente, deren Mischungen und Derivate können direkt, nach Trocknung beispielsweise Gefriertrocknung, nach Anbindung an die oben genannten Träger oder nach Formulierung mit anderen pharmazeutischen Wirk- und Hilfsstoffen zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen verwendet werden. Als Wirk- und Hilfsstoffe seien beispielsweise weitere Antikörper, antimikrobielle Wirkstoffe, die mikrobiozid oder mikrobiostatisch wirken wie Antibiotika allgemein oder Sulfonamide, Antitumormittel, Wasser, Puffer, Saline, Alkohole, Fette, Wachse, inerte Träger oder sonstige für Parenteralia übliche Stoffe wie Aminosäuren, Verdicker oder Zucker genannt. Diese pharmazeutischen Zubereitungen werden bei der Bekämpfung von Krankheiten, bevorzugt bei der Bekämpfung von Gerinnungsstörungen vorteilhafterweise Störungen des peripheren Blutsystems oder bei Schlaganfall, verwendet.
Das erfindungsgemäße Antidot kann oral oder parenteral - subcu- tan, intramuskulär, intravenös oder interperitoneal - verabreicht werden, bevorzugt wird die intramuskuläre oder intravenöse Gabe.
Die erfindungsgemäßen Antikörper, Antikörperfragmente, deren Mischungen oder Derivate können direkt oder nach Kopplung an feste oder flüssige Träger, Enzymen, Toxinen, radioaktiven oder nichtradioaktiven Marker oder an Fluoreszenz-/Chemilumineszenz - markern, wie oben beschrieben, in der Diagnostik verwandt werden. Wobei Ancrod in den verschiedensten Körperflüssigkeiten aus den verschiedensten Organismen wie Mensch oder Tier oder den unter - schiedlichsten Flüssigkeiten wie beispielsweise Kulturmedien von Hefen, Bakterien, Pilzen oder humanen oder tierischen Zell- kulturen nachgewiesen werden kann. Beispi ele :
1. Herstellung der Hybridomzellinien
Die Immunisierung, Fusion, Selektion und Charakterisierung wurde nach Literatur-beschriebenen Techniken (z.B. J.H. Peters; Monoklonale Antikörper, Herstellung und Charakterisierung; Springer Verlag; A.M. Campbell; Monoclonal Antibody and Immunosensor Technology; Verlag Elsevier, Kapitel 2 bis 7 und 8, 1991) durchgeführt.
Weibliche Balb/c-Mäuse wurden mit 100 μg Ancrod, das durch Quervernetzung bezüglich der enzymatischen Aktivität inaktiviert wurde, intraperitoneal im 2-3 Wochen Rhythmus nach folgender Verabreichungsschema immunisiert:
1. in 100 μl PBS + 100 μl komplettes Freundsches Adjuvans
2. in 100 μl PBS + 100 μl inkomplettes Freundsches Adjuvans
3.-5. in 200 μl PBS
Drei Tage nach der letzten Antigenapplikation wurde die Milz entnommen, die Zellen gewaschen, vereinzelt und die Lymphozyten mit der Myelomzellinie SP2/0-Agl4 (= ATCC CRL 1581) fusioniert. Dazu wurden sie im Verhältnis 5:1 gemischt, mit 1,5 ml PEG-Lösung (= Polyethylenglykollösung) 1 min. bei 37°C inkubiert und mit PBS (= phosphatgepufferte Saline) versetzt (1 ml während 30 sec, 3 ml während 30 sec, 16 ml während 60 sec). Nach einem Wasch- schritt wurden die Zellen im Selektionsmedium [DMEM (= Dulbecco's Modified Eagle Medium) ; 10% FCS (= Fötales Kälberserum) ; 10% Condimed Hl (Boehringer Mannheim) ; HAT-Supplement (= Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin-Supplement) ; ITS-Supplement (= Insulin, Transferrin, Selenit-Supplement) ; Pyruvat; Glutamin; Strepto- mycin/Penicillin] bei 37°C / 7 , 5% C02 kultiviert.
Die Identifizierung von Hybridomen, die spezifische anti-Ancrod- Antikörper sezernieren, erfolgte wie folgt mittels einem spezifi sehen ELISA in einer Mikrotiterplatte :
Mikrotiterplatten beschichten mit 0,1 ml/well Ancrod bzw. Referenzproteinen zur Bestimmung der Spezifität (1 μg/ml 0,05 M NaHC03 pH 9,2) während 16 h/4°C
Absättigen mit 0,3 ml/well 1 % BSA/PBS während 0,5-1 h/23°C (h = Stunde) 3x Waschen mit PBS/0,05% Tween® 20
Inkubation mit Zellkulturüberständen (50 μl verdünnt mit 50 μl PBS/0,1% BSA [= Rinderserumalbumin) /0 , 05 % Tween® 20) während 2-4 h/23°C
Waschen wie oben
Inkubation mit 0,1 ml/well biotinyliertem anti-Maus-IgG Antikörper in 0,1 % BSA/PBS während 2-4 h/23°C
Waschen wie oben
Inkubation mit 0,1 ml/well Streptavidin-Peroxidase-Komplex in 0,1 % BSA/PBS während 0,5 h/23°C
Waschen wie oben
0,1 ml/well Peroxidasesubstrat
Reaktion stoppen mit 0,1 ml/well 2 M H2SO4
Messung der Absorption bei 450 nm
Peroxidasesubstrat: 0,1 ml TMB-Lösung (42 mM Tetramethylbenz idin in DMSO) und 10 ml Substratpuffer (0,1 M Na-Acetat pH 4,9) mischen; dann Zusatz von 14,7 μl H20 .
Hybridome mit einer positiven Antikörperreaktion wurden durch Subklonierung vereinzelt und die Einzelklone erneut getestet. Antikörper mit der höchsten Reaktivität wurden im in vitro Neutralisationsassay eingesetzt. Auf diesem Weg konnte eine Vielzahl von positiven Hybridomen, das heißt Zellen die Antikörper gegen Ancrod bilden, isoliert werden.
Produktion und Charakterisierung der monoklonalen Antikörper
Die Aufreinigung der monoklonalen Antikörper erfolgte aus serumfreien Zellkulturüberständen. Dazu wurden die Hybridome schritt- weise vom DMEM/HAT/10% FCS-Medium über DMEM/HT/10% FCS und DMEM/10% FCS auf ein serumfreies Zellkulturmedium (HT = Hypo- xanthin, Aminopterin) wie z.B. SF-3 (Cytogen) , PFHM-II (Gibco) , HL-1 (Bio Whittaker) , Ultra Doma PF (Bio Whittaker) oder ähnliche überführt. Für die anschließende Aufreinigung über Affinitäts¬ chromatographie wurden Protein A- bzw. Protein G-Sepharose ver¬ wendet . Nach dem Auftragen der Zellkulturüberstände auf die Chromatographiesäulen wurden die unspezifisch gebundenen Proteine mit 3 M NaCl/1,5 M Glycin pH 8,9 weggewaschen; die anti-Ancrod-Anti - körperaktivität wurde mit 500 mM NaCl/0,59% Essigsäure eluiert.
Die Bestimmung des Antikörpersubtyps erfolgte analog zum oben beschriebenen ELISA, wobei jedoch anstelle des biotinylierten anti- Maus-IgG-Antikörpers folgende biotinylierten Subtyp-spezifischen Antikörper verwendet wurden: anti-Maus-IgGi, anti-Maus-IgM, anti- Maus-IgG2a/ anti-Maus-κ, anti-Maus-IgG2b/ anti-Maus-λund anti- Maus-lgG3.
Die Antikörpertypen und -subtypen der isolierten Hybridom- zellinien MAK 1-2, MAK 2-29/3 und MAK 3-27 (siehe Beispiel 1) wurden jeweils wie folgt bestimmt IgGι/κ, IgG2b/κund IgGι/κ.
Die Affinitätskonstanten der monoklonalen Antikörper wurden durch verschiedene, literaturbekannte Techniken ermittelt, wie beispielsweise z.B. Gleichgewichtsdialyse, Immunpräzipitation oder ELISA (z.B. J.H. Peters; Monoklonale Antikörper, Herstellung und Charakterisierung; Springer Verlag; A.M. Campbell; Monoclonal Antibody and Immunosensor Technology; Verlag Elsevier, Kapitel 11, 1991) .
Nach der ELISA-Methode (J. Immunol . Methods 77. (1985) 305-319) ergaben sich folgende Affinitäten gegenüber dem natürlichen Ancrod (Tabelle I) :
Tabelle I: Affinitäten der monoklonalen Antikörper gegenüber Ancrod
"in vitro" Neutralisation von Ancrod durch monoklonale Antikörper (= MAK) - Zellkulturüberstände -
Die Neutralisationskapazität der Antikörper wurde anhand der Ancrod-induzierten Fibrintrübung quantifiziert. Dazu wurden in BSA-abgesättigte Mikrotiterplatten verschiedene Konzentrations - Verhältnisse Ancrod zu Antikörper (Zellkulturüberstände bzw. gereinigte Antikörper) bei 37°C inkubiert und anschließend mit human-Fibrinogen (1,5 mg) versetzt. Nach Inkubation bei 37°C wurde das entstandene Fibrin bei 340 nm quantifiziert (= optische Dichte = OD) .
Mit zunehmender Menge an neutralisierenden Antikörpern konnte die Ancrodaktivität neutralisiert werden. Dies zeigte sich an den verringerten Optischen Dichten (= OD, Tabelle II) .
Besonders effektiv wirkte der Antikörper MAK 1-2, der auch bei höheren Ancrodkonzentrationen zu einer vollständigen Neutrali - sation führte (Tabelle II, OD entspricht dem Leerwert) . Der Leer- wert in der Tabelle II enthielt alle Bestandteile außer Ancrod. Die höchsten OD-Werte wurden jeweils mit den verschiedenen Ancrodgaben (50, 25 und 12,5 ng/ml Ancrod) ohne Zugabe der unterschiedlichen monoklonalen Antikörper gemessen (Tabelle II) .
Die MAK's 2-29 und 3-27 haben ähnlich gute oder bessere Affinitäten zu Ancrod als MAK 1-2 (Tabelle I) , die Antikörper-Antigen- Bindung führte jedoch erst bei höheren Antikörpergaben bezogen auf die Ancrodmenge zu einer Neutralisation der enzymatischen Aktivität.
Tabelle II: Neutralisation von Ancrod durch Zellkulturüberstände der MAK's:
4. "in vitro" Neutralisation von Ancrod durch gereinigte monoklonale Antikörper
Eine Bewertung der in vitro Neutralisationseffizienz der 5 gereinigten monoklonalen Antikörper konnte durch Vergleich der 50 % Neutralisationswerte im Fibrintrübungsassay vorgenommen werden.
Der 50% Neutralisationswert ergab sich folgendermaßen :
10
OD Negativkontrolle + (OD Positivkontrolle - OD Negativkontrolle) /2
Negativkontrolle: keine Ancrodzugabe (keine Fibrinbildung) Positivkontrolle: Ancrod + Fibrinogen (maximale Fibrinbildung)
15
Durch unterschiedliche Verhältnisse Antikörper/Ancrod ergaben sich variierende OD-Werte, wobei der 50% Neutralisationspunkt bei folgenden Antikörperkonzentrationen lag:
20
25
30
Aus den Verhältnissen der zu einer 50%igen Neutralisation benötigten Antikörpermenge konnte man ableiten, daß unter den gewählten in vitro Bedingungen der monoklonale Antikörper MAK 1-2 bei 1 Stunde Vorinkubation mindestens um den Faktor 2, bei
35 2 Stunden Vorinkubation etwa um den Faktor 4 besser ist als das Antidot auf Basis polyklonaler Antikörper aus der Ziege.
5. Quantifizierung von Ancrod mittels eines "Sandwich-ELISA"
Λ Q Die Bestimmung von Ancrod in Proben zu diagnostischen Zwecken, z.B. verschiedenen Körperflüssigkeiten, wurde durch Kombination von zwei Antikörpern mittels sandwich-ELISA nach folgendem Schema vorgenommen werden :
5 Beschichtung der Microtiterplatten mit 5 μg/ml MAK 1-2 bzw. MAK 3-27 in 100 μl/well, verdünnt in 0,05 M NaHC03, pH 9,2; über Nacht/ °C
- Waschen der Microtiterplatten mit PBS/0,05% Tween® 20; 200 μl/well
Absättigen mit 300 μl/well 1%BSA/PBS; 0,5 h/23°C
- Waschen wie oben
11 Standardverdünnungen in 2er Schritten von Ancrod, angefangen mit 50 ng/ml in PBS/0,1 % BSA/0,05% Tween® 20; 100 μl/ well; die Proben werden parallel dazu in unterschiedlichen Verdünnungen eingesetzt; Inkubation 2 h/23°C
Waschen wie oben
Inkubation mit MAK 2-29; lμg/ml verdünnt in PBS/0,1 % BSA/0,05% Tween® 20; 100 μl/well; 2 h/23°C
Waschen wie oben
Inkubation mit biotinyliertem anti-Maus IgGb; 1:10000 ver- dünnt in PBS/0,1 % BSA/0,05% Tween® 20; 100 μl/well; 2 h/23°C
Waschen wie oben
Inkubation mit Streptavidin-Peroxidase-Komplex, 1:10000 verdünnt in PBS/0,1% BSA/0,05 % Tween® 20; 100 μl/well; 0,5 h/23°C
Waschen wie oben
- Zugabe von 100 μl/well Peroxidasesubstrat: (10 ml Substratpuffer (0,1 M Natriumacetat pH 4,9) mischen mit 100 μl TMB- Lösung (42 mM Tetramethylbenzidin in DMSO) und Zugabe von 14,7 μl H202 3 %)
- die Reaktion wird mit 100 μl/well 2 M H2S0 abgestoppt
Messung der Absorption bei 450 nm
Für beide monoklonalen Antikörper MAK 1-2 bzw. MAK 3-27 und die verwendeten Kombinationen zeigte es sich, daß sich Ancrod in einem Konzentrationsbereich von etwa 3000 bis 100 pg/ml quanti- fizieren und nachweisen läßt. Die absolute Nachweisgrenze liegt noch unter diesen quantifizierbaren Werten (Figur 1) .
6. Kompetitiver ELISA
Zur Charakterisierung der relativen Lage der MAK-Bindungsepitope auf dem Ancrod wurde ein kompetitiver ELISA durchgeführt:
Beschichtung der Microtiterplatten mit 1 μg/ml Ancrod 100 μl/well, verdünnt in 0,05 M NaHC03, pH 9,2; über Nacht/4°C
Waschen der Microtiterplatten mit PBS/0,05 % Tween® 20; 200 μl/well
- Absättigen mit 300 μl/well 1 % BSA/PBS; 0,5 h/23°C
Waschen wie oben
In die so vorbereiteten Mikrotiterplatten wurden in verschie- denen Ansätzen je 10 ng/ml der monoklonalen biotinylierten, Antikörper MAK 1-2-Biotin, MAK 2-29/3-Biotin und MAK 3-27-Biotin gegeben und an Ancrod gebunden, anschließend wurden je nach vorgelegtem Antikörper variable Konzentrationen (1 μg/ml - 1 ng/ml) je eines anderen Antikörpers (MAK 1-2, MAK 2-29/3 oder MAK 3-27) zu den Ansätzen gegeben, so daß alle möglichen Antikörperkombinationen bezüglich ihrer möglichen überlappenden Bindungsstellen getestet wurden. Die Ansätze mit den unterschiedlichen Antikörperkombinationen wurden in PBS/0,1 % BSA/0,05 % Tween® 20 zwei Stunden bei 23°C inkubiert und anschließend wie folgt weiter behandelt:
Waschen wie oben
Inkubation mit Streptavidin-Peroxidase-Komplex, 1:10000 ver- dünnt in PBS/0,1 %, BSA/0,05 % Tween® 20; 100 μl/well; 0,5 h/23 °C
Waschen wie oben
- Zugabe von 100 μl/well Peroxidasesubstrat: (10 ml Substratpuffer (0,1 M Natriumacetat pH 4,9) mischen mit 100 μl TMB-Lösung
(42 mM Tetramethylbenzidin in DMSO) und Zugabe von 14,7 μl H202 3 %) die Reaktion wird mit 100 μl/well 2 M H2Sθ4 abgestoppt
Messung der Absorption bei 450 nm
In keiner der eingesetzten Antikörperkombinationen war eine Abnahme der OD zu beobachten, das heißt die verschiedenen monoklonalen Antikörper verdrängten sich nicht bei der Bindung an Ancrod. Sie binden an unterschiedliche Epitope des Ancrodmoleküls. Es können deshalb mehrere der Antikörper gleichzeitig mit Ancrod wechselwirken. Für eine rasche optimale Neutralisation der Ancrodwirkung können die verschiedenen erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper deshalb falls erforderlich und gewünscht in Kombination verwendet werden.
4. "in vivo" Neutralisation von Ancrod
Ancrod wurde anästhesierten Ratten über 30 Minuten als Infusion von 10 IU/kg Körpergewicht in der Schwanzvene verabreicht. 10 Minuten nach dem Start der Ancrodinfusion wurden die verschiedenen Testsubstanzen - monoklonaler , polyklonaler Antikörper oder
Placebo - als intravenöser Bolus mit 1 ml/kg Körpergewicht verabreicht. Blutproben (8 Vol. Blut + 2 Vol. Antikoagulanz 0,11 M Citrat) wurden aus der Carotisarterie vor bzw. 30 und 60 Minuten nach dem Beginn der Ancrodinfusion abgenommen. Das Plasma wurde aus dem Citratblut durch Zentrifugation gewonnen und der Fibrino- gengehalt nach der Claussgerinnungsmethode bestimmt (Eichkurve durch Zugabe definierter Mengen an Rattenfibrinogen zu defibrino- geniertem Rattenplasma) .
Es wurden jeweils 6 Ratten pro Gruppe (Testsubstanz) eingesetzt (Tabelle III) .
Tabelle III: Testsubstanzen sowie eingesetzte Mengen:
Tabel le IV : Messung der Fibrinogenkonzentration mit den verschieden Antikörpern
Es zeigte sich, daß MAK 1-2 in der verwendeten Konzentration von 1,435 mg/kg Körpergewicht in der Lage war ein weiteres Absinken des Fibrinogenlevels 30 Minuten nach Beginn der Ancrodinfusion zu stoppen. Vom polyklonalen Antikörper aus Ziege werden für den gleichen Effekt 8,6 mg/kg Körpergewicht benötigt. In einer Konzentration von 1,5 mg/kg Körpergewicht, also vergleichbar der Konzentration des MAK 1-2, zeigte das Antidot auf der Basis polyklonaler Antikörper keinen Effekt (siehe Kontrolle Tabelle IV) .
Aufgrund der nach 60 Minuten resultierenden Fibrinogenkonzentra- tionen konnte abgeleitet werden, daß in vivo der MAK 1-2 unter den getesteten Bedingungen etwa um den Faktor 6 besser neutralisierte, als das polyklonale Antidot. Vermutlich ist die neutrali- sierende Wirkung des MAK 1-2 noch deutlich höher.

Claims

Patentansprüche
1. Monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, deren Mischungen oder Derivate, die an Ancrod binden und dessen Aktivität inhibieren, wobei die Bindungsaffinität in einem Bereich von 1 x 10"7 bis 1 x 10-12 M liegt und Neutralisationswirkung gegenüber polyklonalen Antikörpern aus Ziegen um mindestens 100 % verbessert ist.
2. Monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, deren Mischungen oder Derivate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Antikörper des IgG-Typs handelt.
3. Monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, deren Mischungen oder Derivate nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um die Antikörper MAK 1-2, MAK 2-29/3 oder MAK 3-27 oder deren Mischungen handelt.
4. Zellen, die einen monoklonalen Antikörper, Antikörperfrag - mente, deren Mischungen oder Derivate gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 exprimieren.
5. Zellen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Hybridomzellinie handelt.
6. Zellen nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um die Hybridomzellinien DSM ACC2317, DSM ACC2318 und DSM ACC2319 handelt.
7. Pharmazeutische Zubereitungen enthaltend einen monoklonalen Antikörper, Antikörperfragmente, deren Mischungen oder Derivate gemäß den Ansprüchen 1 bis 3.
8. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, Antikörperfrag- ments, deren Mischungen oder Derivate gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 in pharmazeutischen Zubereitungen.
9. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, Antikörperfragments, deren Mischungen oder Derivate gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 zur Herstellung von Mitteln zur Behandlung von Gerinnungsstörungen.
10. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, Antikörperfragments, deren Mischungen oder Derivate gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 in der Diagnostik. Ancrod spezifische monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, deren Mischungen oder Derivate und deren Verwendung
Zusammenfassung
Die Erfindung betrifft Ancrod spezifische monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, deren Mischungen oder Derivate und deren Verwendung in pharmazeutischen Zubereitungen oder in der Diagnostik.
Weiterhin betrifft die Erfindung Zellen, die diese Antikörper, Antikörperfragmente, deren Mischungen oder Derivate exprimieren.
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