EP0941243A1 - Polypeptides comprenant des domaines de la proteine gax, impliques dans la repression de transcription et/ou interagissant avec d'autres proteines, acides nucleiques correspondants et leurs utilisations - Google Patents
Polypeptides comprenant des domaines de la proteine gax, impliques dans la repression de transcription et/ou interagissant avec d'autres proteines, acides nucleiques correspondants et leurs utilisationsInfo
- Publication number
- EP0941243A1 EP0941243A1 EP97911277A EP97911277A EP0941243A1 EP 0941243 A1 EP0941243 A1 EP 0941243A1 EP 97911277 A EP97911277 A EP 97911277A EP 97911277 A EP97911277 A EP 97911277A EP 0941243 A1 EP0941243 A1 EP 0941243A1
- Authority
- EP
- European Patent Office
- Prior art keywords
- gax
- protein
- polypeptide
- fragment
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S977/00—Nanotechnology
- Y10S977/70—Nanostructure
- Y10S977/788—Of specified organic or carbon-based composition
- Y10S977/797—Lipid particle
- Y10S977/798—Lipid particle having internalized material
- Y10S977/799—Containing biological material
- Y10S977/80—Nucleic acid, e.g. DNA or RNA
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S977/00—Nanotechnology
- Y10S977/902—Specified use of nanostructure
- Y10S977/904—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis
- Y10S977/915—Therapeutic or pharmaceutical composition
Definitions
- the present invention relates to the therapeutic field. It relates more particularly to new therapeutic molecules and their use for the treatment of cardiovascular pathologies.
- Post-angioplasty restenosis is a localized hyperproliferative disorder that develops as a result of non-surgical intervention in the atherosclerotic plaque.
- the treatment of an atherosclerotic lesion by angioplasty very frequently (up to 50% of cases in some studies) results in restenosis following mechanical injury to the arterial wall.
- CML smooth muscle cells
- gax Growth-Arrest-Specific Homeobox
- the gax gene was initially identified from an aorta cDNA library. rat. It codes for a protein of 303 amino acids. His streak was characterized and his cDNA clone (Gorski et al., Mol.Cell.Biol. 1993, 6, 3722-3733). The human gax gene has also been cloned and sequenced (David F. Le Page et al., Genomics 1994,24,535-540). It codes for a protein of 302 amino acids.
- the gax gene has certain properties similar to the gas and Gadd genes since it also seems to control the G0 / G1 transition of the cell cycle.
- the levels of gax mRNA are reduced in rat LVMC by a factor of 10 after two hours of exposure to PDGF (Gorski et al., Mol.Cell.Biol. 1993, 6, 3722-3733).
- the expression of the gax gene is therefore repressed during the mitogenic response of CMLV.
- Another characteristic of the gax gene lies in its specificity of expression. Indeed, in the adult rat, the gax gene is mainly expressed in the cardiovascular system (aorta, heart). The presence of gax mRNA has not been demonstrated by Northern Blot in the liver, brain, stomach and skeletal muscle.
- the gax gene belongs to the family of homeotic genes. These genes code for transcriptional factors which contain consensus (or homeodomain) sequences recognizing specific regions of DNA (or homeoboxes) (review: Gehring et al. Cell, 78: 211-223, 1994). The homeodomain of the rat gax protein is between amino acids 185 and 245. Interestingly, the homeotic genes identified to date are involved in the control of cell differentiation / growth during embryogenesis, which reinforces the therapeutic potential of the gax gene (review: Lawrence and Morata Cell 78: 181-189, 1994; Krumlauf, Cell 78: 191-201, 1994).
- GAX One of the characteristics of GAX is that it undergoes down regulation as soon as CML proliferate, whether in vitro in response to growth factors or in vivo following damage to the endothelium of the vascular wall. This repression is reversible because when the SMCs are made quiescent by deprivation in serum, in vitro, the expression of GAX resumes.
- Work in our laboratory has recently shown that overexpression of GAX in SMCs by an adenoviral vector blocks their proliferation FR 95/04234 (ST95022).
- the Ki antigen is a protein of around 32 KDa. It was identified for the first time as a nuclear autoantigen recognized by sera from lupus erythematosus patients (Nikaido et al 1989, Clin. Exp. Immunol 1990, 79, 209-214) Recent work has shown that Ki is overexpressed in proliferating cells or transformed by an oncogene (Nikaido et al 1989, Exp .
- GAX acts essentially as a transcription repressor This repression activity is linked more particularly to the first 32 amino acids of GAX
- this repressor domain is localized in the region (1- 222) of GAX required for interaction with Ki in yeast.
- Another aspect of the invention relates to areas of GAX involved in the biological activity of GAX. These may include areas involved in the interaction of GAX with other molecules or areas responsible for biological activity.
- the invention also relates to chimeric molecules comprising a functional domain of GAX. It also relates to the use of GAX to suppress gene expression, as well as the use of compounds inhibiting the interaction of GAX with certain cellular partners to modulate the activity of GAX. It also relates to a method for screening and / or identifying GAX cellular partners
- the gax gene has particularly advantageous properties for gene therapy applications of hyperproliferative disorders, in particular restenosis or other pathologies associated with a proliferation of CML II was demonstrated in application FR95 / 04234 ( ST95022) that the transfer of the gax gene in vivo makes it possible to considerably reduce the proliferation of CMLs, and thus, to inhibit the reduction in luminal diameter II was also shown in application FR 95/12871 (ST95057) that the gax gene, expressed in tumor cells, allowed to oppose the cell transformation process
- the present application now describes the identification of functional domains of GAX, the construction of GAX derivatives exhibiting a biological activity, the identification of partners of the GAX protein and the development of methods allowing the search for other partners and the 'identification of compounds capable of interacting on the activity of these partners More specifically, the applicant has now shown that the GAX protein is endowed with transcription repressor activity. It also showed that this activity was carried by certain regions of the GAX protein, in particular the N-terminal region.
- Ki II is known in the literature Ki interacts with PCNA (Takeushi et al abstract 1995 Juntendo University, Tokyo, Japan) and that this is a cofactor essential for DNA polymerase for DNA replication (Fukuda et al. 1995, J. Biol. Chem. 270, 22527-22534). It has been demonstrated in the examples that Gax interacts with PCNA, thus it is conceivable that GAX can also be involved in replicative complexes in the cell.
- a first object of the invention relates more particularly to a polypeptide characterized in that it is all or part of a fragment of the GAX protein having an activity of repressor of transcription and / or positively or negatively affecting replication DNA.
- the polypeptide according to the invention comprises at least residues 1 to 32 of the human GAX protein.
- the polypeptide according to the invention comprises at least residues 104 to 230 of the human GAX protein.
- polypeptides comprising fragments 1-32, 33-302 and 1-104 of the human GAX protein.
- the examples presented below show that such polypeptides are capable of inhibiting the transcription of genes and therefore retain the transcriptional repressor properties of GAX.
- this polypeptide comprises, in addition to a fragment of the GAX protein in accordance with the present invention, a fragment of different origin.
- fragment of different origin is meant a polypeptide fragment not derived from the GAX protein. It can be a synthetic, artificial fragment, a protein fragment, etc. This fragment of different origin can have different functions.
- Such a marker can for example constitute a marker making it possible to detect the polypeptide and optionally to trace it in vivo.
- a marker can for example be an epitope recognized by a monoclonal antibody.
- various labeling sequences called Tag sequences, have been described in the literature and are usually used. We can mention the tag-myc sequence.
- This fragment can also be a fragment having the property of stabilizing the polypeptide.
- it may be all or part of a protein having a high plasma half-life.
- it can also be a targeting element, allowing the polypeptide to reach specific cellular compartments more quickly and / or more specifically.
- it is a nuclear localization signal (NLS), the polypeptide mainly exercising its activity in the nucleus of cells
- NLS signals have been described in the literature, for example that of the T antigen of the SV40 virus, that of p53, etc.
- the fragment of different origin can also confer on the polypeptide an additional biological function or promote the activity of the repressor domain.
- a protein domain capable of specifically binding DNA This type chimeric molecule thus makes it possible to bind DNA into particular regions and to inhibit the transcription of genes located at the level of these regions.
- the DNA binding domain of the GAL4 protein of yeast Such constructs are described in the examples. They can be used to regulate the expression of genes in yeast or of genes placed under the control of an expression signal comprising the binding site of the GAL4 protein.
- DNA binding proteins can be for example Lex A, the DNA binding domain of a nuclear receptor such as the estrogen receptor es or any other member of this family, etc.
- It may also be a peptide allowing on the one hand the secretion of all or part of GAX, as well as its targeting towards membrane receptors allowing its internalization and thus increasing the diffusibility and the field of activity of GAX by a "Bystander" type effect.
- it is more particularly possible to use all or part of the transferrin or fragments of the molecule of the extracellular matrix capable of recognizing integrins on the surface of CML
- polypeptides according to the invention are particularly advantageous from the therapeutic point of view and from that of applied research.
- the therapeutic activity of the claimed polypeptides is linked more particularly to their ability to repress transcription or to affect DNA replication, by analogy with the GAX protein and therefore to give them a power to regulate the expression of other proteins.
- the present invention also relates to the use of the GAX protein or of a fragment as claimed for suppressing gene transcription and / or positively or negatively affecting DNA replication.
- these fragments can advantageously be substituted for it in its function of transcription repressor. Furthermore, taking into account the fact that they only comprise the GAX protein that all or part of its domain involved in repression of transcription, it is possible to think that they will be less sensitive to the various alterations to which the GAX protein is subject. These polypeptides as such or derivatives can therefore manifest a repressor character of the increased transcription compared to that of the natural GAX protein.
- the present invention also relates to a method for the screening and / or identification of polypeptides interacting with the GAX protein or a GAX domain characterized in that it implements a polypeptide according to the invention. More preferentially, this polypeptide is chosen from there fragments 32 and 33 to 302 of the GAX protein.
- Ki is an autoantigen that appears in autoimmune diseases such as lupus erythematosus. It is described as a nuclear molecule whose expression increases during cell proliferation as well as in fibroblasts transformed by an oncogene.
- the recombinant protein Ki specifically recognizes GAX transferred to a nitrocellulose filter from a denaturing polyacrylamide gel.
- the present invention also specifically relates to a polypeptide characterized in that it is a fragment of the GAX protein capable of interacting with the Ki protein. More preferably, it is fragment 1 to 32 or 104 to 223 of the GAX protein.
- the Applicant has also very unexpectedly shown that a domain of the GAX protein can interact in a specific manner with the proliferation marker PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen). This factor is essential for DNA replication and also plays a role in DNA repair phenomena.
- the present invention therefore relates to a polypeptide characterized in that it is a fragment of the GAX protein, capable of interacting with PCNA.
- Ki exists in the form of a complex with PCNA. Ki can therefore interact with both GAX and PCNA by forming an at least bipartite complex with one or other of these proteins and preferably a tripartite complex. The formation of these complexes has an important role in the progression of the cell cycle (activation or inhibition).
- the present invention also relates to a polypeptide characterized in that it is a fragment of the GAX protein capable of interacting with Ki and / or PCNA and of forming an at least bipartite or at least tripartite complex with these proteins.
- nucleic acid coding for a polypeptide may be sequences of natural or artificial origin, and in particular genomic DNA, cDNA, mRNA, hybrid sequences or synthetic or semi-synthetic sequences.
- This nucleic acid can be of human, animal, plant, bacterial, viral, etc. origin. It can be obtained by any technique known to those skilled in the art, and in particular by screening of banks, by chemical synthesis, or also by mixed methods including chemical or enzymatic modification of sequences obtained by screening of banks. They can also be incorporated into vectors, such as plasmid vectors.
- the nucleic acid according to the invention is a cDNA.
- nucleic acids of the invention can be used for the production of probes or antisense molecules making it possible, by hybridization, to detect the presence or the expression of nucleic acids coding for polypeptides carrying a repressor domain according to the invention, or of inhibiting the expression of such polypeptides.
- probes these preferably comprise more than 10 bases and, advantageously, from 10 to 300 bases.
- nucleic acids of the invention can be used for the expression and / or production of polypeptides in vitro, in vivo or ex vivo, in gene or cell therapy approaches.
- the present invention relates to expression cassettes containing a nucleic acid as defined above, under the control of a promoter allowing its expression.
- Different promoters can be used in the context of the invention. These are sequences allowing the expression of a nucleic acid in a mammalian cell.
- the promoter is advantageously chosen from functional promoters in human cells. More preferably, it is a promoter allowing the expression of a nucleic acid sequence in a hyperproliferative cell (cancerous, restenosis, etc.). In this regard, different promoters can be used. It can thus be any promoter or derived sequence stimulating or repressing the transcription of a gene in a specific way or not, inducible or not, strong or weak. Mention may in particular be made of the promoter sequences of eukaryotic or viral genes. For example, they may be promoter sequences derived from the genome of the target cell.
- ubiquitous promoters can be used in particular (promoter of the ITPRT, PGK genes, alpha-actin, tubulin, DFfFR, etc.), promoters of intermediate filaments (promoter of the GFAP genes, desmin, vimentin, neurofilaments, keratin, etc), promoters of therapeutic genes (for example the promoter of the MDR, CFTR genes, Factor VIII, ApoAI, etc.), tissue-specific promoters (promoter of the pyruvate kinase gene, villin, intestinal fatty acid binding protein, alpha smooth muscle actin, etc.), promoters of specific cells of the dividing cell type such as cancer cells or of promoters responding to a stimulus (steroid hormone receptor, retinoic acid receptor, glucocorticoid receptor, etc.) or so-called inducible.
- promoters of specific cells of the dividing cell type such as cancer cells or of promoters responding to a stimulus (steroid hormone receptor, retinoi
- promoter sequences originating from the genome of a virus such as for example the promoters of the El A and MLP genes of adenovirus, the early promoter of CMV, or the promoter of the LTR of RSV, etc.
- these promoter regions can be modified by adding activation or regulatory sequences, or allowing tissue-specific or majority expression.
- the present invention now provides new therapeutic agents making it possible, by their ability to repress transcription, to interfere with numerous cellular dysfunctions.
- the nucleic acids or cassettes according to the invention can be injected as such at the site to treat or incubate directly with the cells to be destroyed or treat It has in fact been described that naked nucleic acids can penetrate cells without any particular vector Nevertheless, it is preferred in the context of the present invention to use an administration vector, allowing improve (i) the efficiency of cell penetration, (ii) targeting and (iii) extra- and intracellular stability
- the nucleic acid or the cassette is incorporated into an expression vector.
- the vector used can be of chemical origin (liposome, nanoparticle, peptide complex, lipids or cationic polymers, etc. retrovirus, adenovirus, herpes virus, AAV, vaccinia virus, etc.) or plasmid
- viral vectors are based on the natural properties of transfection of viruses. It is thus possible to use, for example, adenoviruses, herpes viruses, retroviruses and associated adeno viruses. These vectors prove to be particularly effective in terms of transfection
- a preferred object according to the invention resides in a defective recombinant retrovirus whose genome comprises a nucleic acid as defined above.
- Another particular object of the invention resides in a defective recombinant adenovirus whose genome comprises a nucleic acid as defined above
- the vector according to the invention may also be a non-viral agent capable of promoting the transfer and expression of nucleic acids in eukaryotic cells.
- the chemical or biochemical vectors, synthetic or natural represent an interesting alternative to natural viruses, in particular for for reasons of convenience, safety and also by the absence of a theoretical limit as regards the size of the DNA to be transfected.
- These synthetic vectors have two main functions, compacting the nucleic acid to be transfected and promoting its cellular fixation as well as its passage through the plasma membrane and, where appropriate, the two nuclear membranes To compensate for the polyanionic nature of nucleic acids, the non-viral vectors all have polycationic charges
- the nucleic acid or vector used in the present invention can be formulated for topical, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, etc. administration.
- the nucleic acid or the vector is used in an injectable form II can therefore be mixed with any pharmaceutically acceptable vehicle for an injectable formulation, in particular for a direct injection at the site to be treated II can be in particular sterile, isotonic solutions, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition as the case may be of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes
- the doses of nucleic acid used can be adapted according to different parameters, and in particular according to the gene , the vector, the method of administration used, the pathology concerned or the duration of u treatment sought
- the invention also relates to any pharmaceutical composition comprising at least one nucleic acid as defined above
- composition comprising at least one vector as defined above
- the pharmaceutical compositions according to the invention are very particularly suitable for the treatment of hyperproliferative disorders, such as in particular cancers and restenosis.
- the present invention thus provides a particularly effective method for the destruction of cells, in particular of hyperproliferative cells It is thus applicable to the destruction of tumor cells or smooth muscle cells of the vascular wall (restenosis) It is very particularly suitable for the treatment of cancers
- colon adenocarcinomas cancers thyroid, lung carcinoma, myeloid leukemia, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, gastric cancer, esophageal cancer, B lymphoma, ovarian cancer, cancer bladder, glioblastomas, hepatocarcinomas, bone cancer, skin, pancreas or again kidney and prostate cancer, esophageal cancer, larynx cancer, head and neck cancer, HPV positive anogenital cancer, EBV positive nasopharyngeal cancer, etc.
- the present invention further extends to any use of compounds which inhibit the activity of the Ki protein and or of PCNA for inhibiting the proliferation of smooth muscle cells.
- the present invention also relates to the use of compounds according to the invention for the formation of a two- or three-partite complex with the proteins Ki and / or PCNA to positively or negatively affect the progression of the cell cycle
- FIG. 1 Northern blotting analysis of Ki protein expression from mRNAs extracted from different tissues
- Figure 4 A Representation of the construction of the Reporter gene expressing bacterial chloramphenicol acetyl transferase (CAT) under the control of an artificial promoter
- strain YCM79 of the genus S.cerevisiae (MATa, ⁇ ra3-52, h ⁇ s3-200, ade2-101, lys 2- 801, trpl-901, Ieu2-3, 112, canl, gal-f-542, ga / 80- 538, metI6 :: URA3-pGALl 10- LacZ, HIS3:: GAL7BLE) was used as a screening tool for the lung fusion bank by the two hybrid system
- This medium was made solid by the addition of 20 g / l of agar (Difco)
- This medium can be made solid by adding 20g / l of agar (Difco)
- the Escheriehia coli strain TG1 of genotype supE, hsdD5, thi, D (lac-proAB), F'ftra D36 pro AB lacP lacZDM15] was used as a means of amplification and isolation of the recombinant plasmids used
- the E coli bacteria used are BL-21 obtained from Pharmacia E coli They have the F " ompT hsdS b (r h .m h ) gai dcm (DE3) genotype.
- BL-21 is a strain of choice for the production of recombinant proteins because it has no protease and its membrane is fragile, easy to break by simple sonication
- E coli BL-21 has a repression system for T7 RNA polymerase This repression can be raised by IPTG which allows the control of genes placed downstream of the T7 RNA polymerase binding site
- the bacteria are cultured in 2 ml of LB medium (NaCl 5 g / 1, Tryptone 10 g / 1 , Yeast extract 5 g / 1) in a shaker at 37 ° C overnight 1 ml of this preculture is re-cultured in 50 ml of 2xYT medium (NaCl 5 g / 1, Tryptone 16 g / 1, Yeast extract 10 g 1) at 37 ° C until the bacteria reach an optical density (OD) of 0.4 to 600 nm (exponential growth phase)
- the culture of the bacteria is cooled on ice They are centrifuge
- the E Coli bacteria competent for the production of recombinant proteins, are prepared by the calcium chloride method. To do this, the bacteria are dissolved in 5 ml of 0.1 M CaCL2 (1/10 of the culture). They are centrifuged again at 3300 rpm for 10 min. They are redissolved in 1 ml of 0.1 M CaCl 2 containing 17.5% glycerol They are aliquoted and stored at -80 ° C.
- the plasmids used are
- the vectors of the pGBT and pAS series (Clontech), shuttle plasmids which have an origin of bacterial and yeast replication allowing them to replicate at high copy number in these two microorganisms
- These plasmids contain a multiple cloning site located downstream of the sequence coding for the DNA binding domain of GAL4 and upstream of a eur terminal to form a fusion protein They also contain the TRP 1 gene of S. cerevisiae which makes it possible to complement the yeasts of trpl genotype in order to select them on a minimum medium containing no tryptophan
- These vectors carry the resistance gene with ampicillin which makes it possible to select the bacteria possessing them on a medium containing ampicillin.
- the vectors of the pGAD series, (Clontech) vectors which allow the expression in yeast of fusion proteins between the GAL4 transactivating domain and a protein of interest or encoded by the cDNA originating from a lung bank, inserted at an EcoRI Xhol site.
- the vectors of the Bluescript series (Strata gene) of the vectors making it possible to carry out cloning as well as the series of pIC (J Lawrence Marsh et al Gene, 1984, 32, 481-485) and pMTL (Steve P Chambers et al, Gene, 1998, 68, 139-149)
- the plasmid pGEX-2T-hGAX is the plasmid used for the transformation of E Coli BL-21 This plasmid was obtained from the plasmid pGEX-2T and was supplied by the Doctor K Walsh of St Elizabeth's Medical Center in Boston
- the basic plasmid pGEX-2T (Pharmacia) makes it possible to produce the protein GAX fused with Glutathione-S-Transferase (GST), protein which has a strong affinity for Glutathione GST fusion -GAX will facilitate the purification of GAX by affinity on agarose beads coupled to Gluthation
- GST Glutathione-S-Transferas
- IPTG isopropyl- ⁇ -D- thiogalactoside
- the piasmid pET-29 produces the protein fused to the epitope called S-Tag which allows the purification of KI by affinity on agarose beads coupled to S-protein.
- the SmycKI chimera is under the control of the T7 promoter and 1 lac operator.
- the BL-21s are transformed by the plasmid pET-29-mycKI As for the GST-GAX protein, they are cultured up to an OD of 0.7 at 600 nm. Then, the expression of SmycKI is induced by 0.1 mM IPTG and by T7 RNA polymerase produced by BL-21.
- the bacteria are sonicated.
- the supernatant is then purified by the following method.
- the purification of SmycKI is done by affinity on agarose beads coupled to the S-protein.
- the method is the same as for GST-GAX except that the resin is washed in a solution containing 20 mM Tris pH 7.5, 0.15 M NaCl and 0.1% Triton X-100 Elution and dialysis are the same as for GST-GAX
- This system is a method of cloning by interaction in vivo in Saccharomyces cerevisiae, the principle of which is based on the modular structure of the yeast transcription factor GAL4 (7)
- the GAL4 transcription activator has two independent domains with different functions
- the binding domain DNA (GALDB for GAL DNA Binding) allows GAL4 to bind to a specific DNA sequence at the promoter region of a GAL4 gene is then sterically close to the transcriptional machinery and thanks to its transactivator domain (GALTA), it increases the frequency with which transcription is initiated on the adjacent gene, probably by interactions with RNA polymerase or associated proteins.
- GALTA transactivator domain
- the principle of the double-hybrid system consists in fusing GALDB and GALTA separately with two X proteins. and different Y which, when they interact, reconstitute an active transcriptional complex 2) Screening of yeasts by the PCR (Polymerase Chain Reaction) technique
- Tween 20 acts as a protective agent for Taq DNA polymerase.
- the yeast suspension is completed to a final volume of 20 ⁇ l containing the following final quantities or concentrations: 10 picomoles of primer 1, 10 picomoles of primer 2, 1 unit of Taq DNA polymerase, 75 mM of Tris pH9, 20 mM of (NH4) 2SO4, 0.01% of Tween 20, 2.5 mM of MgC12 and 125 ⁇ M of each of the 4 deoxyribonucleotides (dATP, dTTP, dGTP and dCTP).
- dATP, dTTP, dGTP and dCTP deoxyribonucleotides
- DNA Small amounts of DNA are prepared as follows: the bacteria containing the plasmid are cultured for at least 4 hours in 2 ml of LB medium in a shaker shaker. They are then centrifuged for 2 minutes at 14,000 rpm in Ependorf tubes, then the pellet is resuspended in 100 ⁇ l of solution I (50 mM of glucose, 25 mM of Tris HCl buffer pH8, 10 mM EDTA pH8), lysed with 200 ⁇ l of the solution II (0.2M NaOH, 1% SDS). The lysis solution is then neutralized with 150 ⁇ l of solution III (3M of potassium acetate, 1 1.5% (v / v) of glacial acetic acid).
- solution I 50 mM of glucose, 25 mM of Tris HCl buffer pH8, 10 mM EDTA pH8
- the lysis solution is then neutralized with 150 ⁇ l of solution III (3M of potassium acetate, 1 1.5% (v / v) of glacial acetic
- RNAse 10mM Tris-HCl solution and EDTA ImM with 50 ⁇ g / ml RNAse).
- PCR reactions are carried out in a final volume of 100 ⁇ l in the presence of the DNA matrix, dNTP (0.2 mM), PCR buffer (Tris-HCL pH 8.5 10 mM, MgCl2 ImM, KC1 5 mM, 0.01% gelatin), 0.5 ⁇ g of each of the oligonucleotides and 2.5 IU of Amplifier Taq DNA polymerase (Perkin Elmer) with or without formamide (5%) The mixture is covered with 2 drops of oil of paraffin to limit evaporation of the sample The device used is the "Crocodile II" from App gene
- the fragments obtained by PCR, used for cloning are systematically resequenced once cloned, so as to verify the absence of any mutation which appeared during amplification.
- the oligodeoxynucleotides are chemically synthesized according to the phosphoramidite method using ⁇ -cyanoethyl protective groups (Sinha 1984) After synthesis, the protective groups are removed by treatment with ammonia and two precipitations with butanol make it possible to purify and concentrate the oligodeoxynucleotides ( Sawadogo, 1991)
- the DNA concentration is determined by measuring the optical density at 260 nm
- All ligation reactions are carried out at + 14 ° C overnight in a final volume of 10 ⁇ l in the presence of 100 to 200 ng of vector, 0 5 to 2 ⁇ g of insert, 40 IU of T4 DNA ligase enzyme ( Biolabs) and a ligation buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.8, 10 mM MgC * i2, 10 mM DTT, 1 mM ATP)
- the negative control consists of ligation of the vector in the absence of insert
- the filling of the prominent 5 ′ ends is carried out if necessary before ligation with the Klenow fragment of the DNA Polymerase I of £. coli (Biolabs) according to the supplier's specifications
- the destruction of the protruding 3 'ends is carried out in the presence of DNA polymerase from phage T4 (Biolabs) used according to the manufacturer's recommendations
- the transformation of the bacteria with a plasmid is carried out according to the following protocol.
- the entire volume of ligation (10 ⁇ l) is used to transform the TGl bacteria made competent by the method of Chung et al, (PNAS, 1988 86, 2172-2175).
- the TGl bacteria are cultured in a liquid LB medium for a few hours in a stirring oven at 37 ° C., until an OD of 0.6 to 600 nm is obtained. The medium is then centrifuged at 6000 rpm for 10 min.
- the bacteria are made competent by taking up the bacterial pellet with a volume of TSB (LB medium + 100 g / 1 of PEG 4000, 5% of DMSO, 10 mM of MgCl2, 10 mM of MgSO / Q corresponding to 1/10 of the volume of the medium of the initial culture After incubation at 4 ° C for 30 to 60 minutes, 200 ⁇ l of bacteria are brought into contact with the ligation products for 15 minutes on ice After adding 200 ⁇ l of LB, the bacteria are incubated for 30 minutes at 37 ° C. then spread on LB + ampicillin medium
- the DNA is separated according to their size by electrophoresis. To do this, different gels are used depending on the size of the fragments to be separated.
- Any migration on agarose gel or on polyacrylamide gel is carried out in a TBE buffer and in the presence of a molecular weight marker (1Kb ladder, Gibco BRL)
- the DNA is mixed with 1/10 of the volume of the deposition blue (200g / l of Ficoll,
- the extraction of DNA from the band of an agarose gel is carried out by electroelution as follows:
- the piece of gel containing the DNA fragment is cut with a scalpel and placed in a dialysis rod closed by two forceps and containing 100 to 500 ⁇ l of TBE.
- the whole is placed in an electrophoresis tank where it undergoes an electric field of 100 volts.
- the DNA after having left the gel, is then purified by two extractions with phenol / chloroform followed by two extractions with chloroform, then precipitated in the presence 0.3M sodium acetate and 2.5 volumes of absolute ethanol After centrifugation (5 min at 14,000 rpm) the DNA pellet is dried and then taken up in 20 ⁇ l of water
- the sequencing is done according to the Sanger method using 4 dideoxyribonucleotides having a different fluorescent marker The incorporation of one of these dideoxyribonucleotides produces a stop in the replication by Taq polymerase of the DNA to be sequenced This reaction will give fragments of 'DNA of different sizes, all terminated in 3' by one of the 4 dideoxyribonucleotides
- One ⁇ g of a plasmid and 4 picomoles of a primer are added to 9.5 ⁇ l of a "premix" supplied by Applied Biosystems under the name Prism
- the final volume must be 20 ⁇ l to carry out a PCR for 25 cycles, decomposing into a denaturation step at 96 ° C for 30 seconds, a hybridization step at 50 ° C for 15 seconds and an elongation step at 60 ° C for 4 minutes
- the DNA fragments, obtained after amplification, are purified on an exclusion column (Chromaspin-30 from Clontech), and are then dried with Speed Vac. The whole is taken up in 5 ⁇ l of a mixture formed of 24 ⁇ l of EDTA ( 50mM) and 120 ⁇ l of deionized formamide After denaturation at 96 ° C for 3 minutes, 3 to 5 ⁇ l are deposited on an electrophoresis gel.
- the different DNA fragments are separated according to their size and will pass successively in front of a laser reader of the 370 DNA sequencer device (Applied Biosystems) where the different fluorescences will be detected
- the lung cDNA fusion library is sold as bacteria. This library comes from the cloning, at the EcoRI-Xhol site of the plasmid pGAD424 (Materials and Methods), of cDNA corresponding to the total RNA of human lung cells.
- the yeasts previously cultivated in 100 ml of liquid medium are harvested after centrifugation at 3000 rpm for 3 minutes and suspended in 1 ml of sterile water. After centrifugation at 3000 rpm for 3 minutes, the cell pellet is resuspended in 1 ml of sterile water and then centrifuged again. This operation is repeated again in order to eliminate all traces of the culture medium.
- the yeasts are then taken up in 1 ml of the transformation solution I (0.1A LiAc, Tris-HCl pH 7.5 lOmM, EDTA ImM). then centrifuged at 3000 rpm for 3 minutes. The cell pellet is taken up again in 1 ml of the transformation solution I.
- a transformation solution II 0.1 M LiAc, Tris-HCl pH 7.5 10 mM, EDTA ImM in 40% PEG40OO
- a thermal shock is then applied to the transformation mixture in a water bath at 40 ° C for 15 minutes and then the whole is centrifuged at 15,000 rpm for 1 minute in order to collect the cell pellet.
- This pellet is taken up in 200 ⁇ l of water and then spread over a minimum agar medium which does not contain the amino acids corresponding to the markers provided by the transforming plasmid.
- the yeasts are then placed in culture for 72 hours at 28 ° C.
- the procedure is as follows.
- the yeast used contains the plasmid pGAL4DB-GAX expressing the GAX protein in the form fused to the DNA binding domain of GAL4. It is cultivated in
- a thermal shock is carried out on this transformation mixture at 42 ° C for 20 minutes. Centrifugation (3000 rpm for 5 minutes) is repeated 3 times in succession, each time taking up the pellet with 10 ml of sterile water. The third time the pellet is taken up with 2.5 ml of PB S. Thus the toxic PEG for the cells has been eliminated.
- 2.4 ml of this suspension are used to inoculate 250 ml of minimum medium containing the amino acids His, Lys, Met and the bases Ura and Ade and cultured overnight in a shaker at 28 ° C. The remaining 100 ⁇ l of this suspension is used to verify the efficiency of the transformation; for this dilutions of 10 -2, 10 -3 and 10 -4 of this suspcffsion were made.
- the overnight culture is centrifuged (30 ° -pm for 5 min) and washed with sterile water twice in succession. The residue is then taken up in 2.5 ml of water. 2.4 ml, the volume of which is brought to 10 ml in sterile water, are used to inoculate 10 boxes of 435 cm 2 containing a medium
- the value of an average loop of a yeast clone is put in 200 ⁇ l of a TELT solution (Triton XI 00 2%, SDS 1%, NaCl lOOmM, Tris pH8 lOmM, EDTA ImM), in the presence of 3g of beads of glass 450 ⁇ m in diameter and 200 ⁇ l of phenol / chloroform. This mixture is vorified for 15 minutes, then centrifuged for 2 minutes at 14,000 rpm. The supernatant is collected without removing the protein cake and the DNA contained in this phase is precipitated with 2.5 volumes of absolute ethanol.
- a TELT solution Triton XI 00 2%, SDS 1%, NaCl lOOmM, Tris pH8 lOmM, EDTA ImM
- a nitrocellulose sheet is previously deposited on the Petri dish containing the individualized yeast clones. Thanks to the adsorption phenomenon, a faithful image of the location of the clones is obtained.
- This sheet is then immersed in liquid nitrogen for 30 seconds in order to burst the yeasts and thus release the ⁇ -galactosidase activity After thawing, the nitrocellulose sheet is deposited, colonies upwards, in another petri dish containing Whatman paper previously soaked in 1.5 ml of PB S solution ( Na2HPO4 60mM, NaH2P ⁇ 4 40mM, KC1 10MM, MgS ⁇ 4 ImM, pH7) and from 10 to 30 ⁇ l of X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indoyl-bD- galactoside) at 50mg / ml in N, N- dimethylformamide
- the box is then placed in an oven at 37 ° C with the lid closed to prevent drying.
- the time of appearance of the blue color
- the estrogen receptor (ER) cDNA is obtained by reverse transcription (RT) using a commercial kit (first strand cDNA synthesis Kit from Pharmacia), from total RNA extracted from mouse uterus, followed PCR amplification
- RT reverse transcription
- a commercial kit first strand cDNA synthesis Kit from Pharmacia
- PCR amplification We used a pair of specific primers which hybridize, in 5 'with the first 20 nucleotides of ER and introducing an EcoR I site just upstream of the first codon (5'- gagcg ⁇ t / cATGACCATGACCCTTCACAC SEQ ID N ° 6, the nucleotides in italics represent the EcoR I site and in capitals underlined the first codon), on the 3 ′ side the back primer begins at the stop codon of ER and also introducing an EcoR I site (5′- gagcgaattc ACTGATCGTGTTGGGGAAGC SEQ ID No.
- pG5CAT Chloramphenicol Acetyl Transferase
- This adapter oligonucleotide has in 5 'a protruding Xhol site and 3 'an Xbal site which allowed cloning into the Xho I and Xba I sites of pG5CAT
- This reporter gene (pEREGICAT, Fig 4, example 1 1)) is based on the fact that ER is a transcriptional activator possessing, in the case of murine ER, a constitutive activity which increases in response to its natural ligand, the oestradiol 17- ⁇
- This system was used by Matinez et al to study the synergy between ER and a second transcriptional factor, NFl, whose transcription activating domain has been fused to the DNA binding domain of the yeast protein GAL4 (GALDB)
- GAL4 yeast protein GAL4
- This system therefore allows us to study the transcriptional activity of all or part of the GAX protein fused to GALDB (Fig 5,6 and examples 12, 13)
- a plasmid expressing the luciferase gene under the control of the CMV promoter (pCMV-Luc) was constructed. This construction was obtained after cloning of a PCR fragment (flanked in 5 'and 3' from a BamHI site) containing the CMV promoter of the vector pCDNA3 (Invitrogen), in the BglII site of the vector pGL3 -Basic (Promega ). This plasmid will serve as an internal standard in all of the transient transfection experiments that follow.
- DMEM murine embryonic fibroblasts NIH-3T3
- ATCC murine embryonic fibroblasts NIH-3T3
- DMEM fetal calf serum
- the NIH-3T3 are seeded at a density of 100,000 cells per well of a 24-well culture plate (Falcon), in a volume of 1 ml of DMEM-GPS / SVF 16 at 20 hours later. , after attaching and spreading the cells, the cells are washed with 0.5 ml of DMEM-GPS (without SVF) and then put back into 0.5 ml of DMEM-GPS 50 ⁇ l of a transfection mixture are then added per well. Culture This mixture is obtained as summarized in Table 3 below
- the cells are brought into contact with the various transfection mixtures for 4 hours at 37 ° C. under standard culture conditions.
- the DMEM-GPS, with the transfection mixture, is then replaced with 1 ml of DMEM-GPS / SVF then the cells are kept in culture for 24 hours
- Each transfection is carried out on at least 4 wells
- the cells are washed with 0.5 ml of Dulbecco's PBS (GIBCO) and then harvested in 0.5 ml of a 0.2% trypsin solution in PBS (GIBCO) Trypsin is neutralized with 10 ⁇ l of FCS
- This cell suspension is centrifuged for 2 min at 10,000 g, the supernatant is removed and the cells are resuspended in 150 ⁇ l of 0.25 M Tris-HCl at pH 7.8 50 ⁇ l of this suspension are used to assay luciferase activity according to the Kit "luciferase Assay System" (Promega) and using the luminometer LUMAT LB 9501 (EG&G Berthold)
- the cytosolic proteins of the cells in the remaining 150 ⁇ l are extracted by 5 cycles of freezing / thawing (liquid nitrogen / 37
- the Far Western Blotting method While Western Blotting consists of an electrophoretic separation of proteins on a denaturing gel followed by an electrotransfer of proteins on a nitrocellulose membrane and a direct or indirect immunodetection, the Far - Western Blotting is a Western Blotting to which is added a protein-protein interaction step between a target immobilized on the nitrocellulose membrane and a factor in solution a) Electrophoresis
- the samples are heated for 10 minutes at 95 ° C. in a protein denaturation buffer containing 50 mM Tris pH 6.8, 2% SDS (Sodium Dodecyl Sulfate), 10%> glycerol, 300 mM b-mercaptoethanol and 0 , 1% bromophenol blue 10 ml of the samples are deposited on a Tris-Glycine 14% Acrylamide gel (Tris-Glycine Gels, Novex) Migration takes place for 1 hour at a constant voltage of 120 V in a separation buffer for proteins (35 mM SDS, 1.92 M Glycine and 85 mM Tris pH 8.3) The molecular weight of proteins will be determined by the parallel migration of a colored and transferable molecular weight standard (MultiMarkTM Multi-Colored Standard , Novex) This gel is made in duplicate to be able to color one of the two with Coomassie blue (Methanol 30%, water 60%, Acetic acid 10%, Coomassie blue 0, 1%) The color is 1 hour Discoloration
- the membrane is saturated for 30 minutes with stirring and at room temperature in PBS containing 5% (w / v) of skimmed milk powder (Gloria) and 0.2% (v / v) of Tween 20 Then it is immersed for 1 hour with stirring and at room temperature in 5 ml of PBS containing 5% (w / v) of skimmed milk powder (Gloria), 0.2% (v / v) of Tween 20 and 75 ⁇ g of KI L ' Incubation completed, the membrane is washed 3 times for 10 minutes in PBS containing 0.2% (v / v) of Tween 20 In order to visualize the interaction between GST-GAX immobilized on the nitrocellulose membrane and mycKi, this is reveal as for GST-GAX using a monoclonal antibody mouse directed against the myc epitope (Santa Cruz) and a polyclonal rabbit antibody coupled, with peroxidase, directed against mouse IgG (Nordic Immunology)
- EXAMPLE 1 Construction of a vector allowing the expression of a fusion protein between GAX and the DNA-binding domain of GAL4
- the screening of a library using the double hybrid system requires that the GAX protein be fused to the DNA binding domain of the GAL4 transactivating protein.
- the expression of this fusion protein is carried out using the vector pGBTIO (cf. materials and methods ), in which we have introduced, in the same reading frame as the sequence corresponding to the DNA binding domain of GAL4 (GAL4DB), a fragment coding for all or part of the GAX protein A particular fragment comprises the EcoRl fragment -Sall from phGAX, which is inserted at the EcoRl-Sall site of pGBTIO to give the plasmid pCM199
- the screening of a fusion library makes it possible to identify clones producing proteins fused to the GAL4 transactivating domain, which can interact with the GAX protein or domains thereof. This interaction makes it possible to reconstitute a transactivator which will then be capable of induce the expression of the reporter genes URA3, BLE and LacZ in the strain YCM79
- a fusion library produced from cDNA originating from human lung
- this library was supplied to us in the form of bacteria, the plasmid DNA of the bank was first purified
- the batch of plasmid DNA that we have assembled was obtained from a number of isolated bacterial colonies corresponding to a little more than three times the representativeness of the bank, i.e. 25 10 colonies
- yeast For this we have chosen a yeast transformation protocol giving an efficiency of 10 cells transformed by ⁇ g of DNA
- yeast transformation protocol giving an efficiency of 10 cells transformed by ⁇ g of DNA
- EXAMPLE 3 Identification of the inserts of the selected plasmids: Demonstration of an interaction with Ki
- the plasmids are extracted from the yeast, introduced into the bacteria and then prepared as described in the materials and methods section.
- the sequencing was carried out from 1 oligonucleotide CTATTCGATGATGAAGATACCCC (SEQ ID No. 1) complementary to the GAL4TA region near the insertion site of the lung cDNA bank, at 52 bpd from the EcoRI site.
- EXAMPLE 4 Construction of Vectors allowing the Expression in Yeast of a Fusion Protein Between Different Deletants of GAX and the DNA Binding Domain of GAL4
- This example describes the construction of vectors coding for different variants of the Gax protein, which can be used to determine the structure / function of this protein and in particular, to highlight the active domains and the domains responsible for the interaction with the Ki protein.
- the deletion of the 153 C-terminal amino acids is obtained by digesting the plasmid pCM199 by Eagl-Sall, then the small fragment is eliminated, the ends are made blunt by treatment with klenow and religated
- the plasmid thus obtained is called pCM238 II code for a protein with residues 1-104 of GAX
- Total digestion with Bgl2 and SalI of pCM199 makes it possible to isolate a fragment of approximately 270 bp and 572 bp.
- the first fragment is cloned in pGBTl 1 at the Bamhl-SalI site to obtain the plasmid pCM245 which allows the fusion of the 79 amino acids C-ter GAL4DB
- the second fragment is cloned into pGBTIO at the Bamhl site to obtain the plasmid pCM246 which allows the fusion of amino acids 33 to 222 with GAL4DB
- the plasmid pCM280 is obtained by digesting pCM246 with Dra3 and pstl After treatment with T4 polymerase the plasmid is closed on itself II codes for a protein comprising residues 33-63 of GAX
- the plasmid pCM199 is digested with NdeI and Pst1
- the insert is cloned into the plasmid pAS 1 to give the plasmids pCM301
- This plasmid allows the expression of the GAX protein deleted from these first 32 amino acids fused to GAL4DB II codes for a protein comprising the GAX residues 33-302
- the yeast strain yCM79 is transformed by the different vectors described in examples 1 and 4 at the same time as pCM282 or that pGAD424
- the Betalgal activity is revealed as described in the material and methods The results obtained are presented in Table 2 below
- Ki gene seems to be ubiquitous as suggested by the analysis by northern blotting (Figure 1) of its expression from mRNA extracted from different tissues (human Multiple Tissue Northern Blots, Clontech) entertaining an mRNA of approximately 3 kb
- Figure 1 of its expression from mRNA extracted from different tissues (human Multiple Tissue Northern Blots, Clontech) entertaining an mRNA of approximately 3 kb
- the construction of a vector allowing the expression of the Ki protein fused to the HA tag in mammalian cells was carried out as follows: the Nco l -Xho l fragment of the plasmid pCM282 is inserted into the plasmid pAS l at the level of Nco l -Xho l sites to obtain the plasmid pCM322 Then the EcoRl -Dra l fragment of the plasmid pCM322 is inserted into the expression vector pCDNA3 at the EcoRl-EcoRV sites The plasmid obtained, pCM323 allows the expression of the protein ki fused to the HA tag in mammalian cells
- KiHA has a nuclear localization in cells transfected with this chimera ( Figure 2)
- EXAMPLE 7 Expression and purification of the Ki protein fused to the S tag and yc tag The following oligos are hybridized together, phospho ⁇ les then ligated with pET29B previously digested with Nco 1
- the plasmid obtained is named pCM320
- the gene coding for the protein Ki is amplified by PCR with the oligos CGCGGATCCCATGGCCTCGTTGCTG (SEQ ID No. 4) and GTAGAGCTCGAGTCAGTACAGAGTCTCTGC (SEQ ID No.
- Colonies of BL-21 transformed with the plasmid pGEX-2T-h-GAX are placed in preculture in 30 ml of LB with ampicillin (50 ⁇ g / ml) at 37 ° C overnight 5 ml of this preculture are returned to culture in 500 ml of LB with ampicillin at 37 ° C up to an optical density of 0.7 at 600 nm
- the expression of GST-GAX is induced by 0.1 mM IPTG for 2 hours at 30 ° C.
- the culture is centrifuged at 6000 rpm for 10 min
- the bacteria pellets are redissolved in 10 ml of cold PBS and then distributed in 10 eppendorf tubes
- the bacterial proteins are extracted by sonication for 10 minutes with 12-second cycles and 24-second breaks followed centrifugation at 15,000 rpm for 15 minutes
- the supernatants are combined and constitute the soluble fraction which will be used for purification
- the remaining pellets represent the insoluble fraction up to an optical density of 0.7 to 600 nm.
- the expression of GST-GAX is induced by 0.1 mM IPTG for 2 hours at 30 ° C.
- the culture is centrifuged at 6000 rpm for 10 min.
- the bacteria pellets are redissolved in 10 ml of cold PBS and then distributed in 10 eppendorf tubes. Bacterial proteins are extracted by sonication for 10 minutes with 12-second cycles and 24-second pauses followed by centrifugation at 15,000 rpm for 15 minutes. The supernatants are combined and constitute the soluble fraction which will be used for the purification. The remaining pellets represent the insoluble fraction.
- the purification of GAX is done by affinity of GST on agarose beads coupled to Glutathione.
- the supernatant obtained after sonication of the bacteria is incubated with the resin for one hour on a rotary shaker at room temperature. Then, the resin on which the protein is bound is centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes. The supernatant removed, the resin is washed 3 times with 50 ml of PBS containing 1% Triton X-100 for 20 minutes on 1 rotary shaker. GST-GAX can be eluted from the resin with guanidine thiocyanate. Elution is carried out by 1.5 times the volume of resin of 2M guanidine thiocyanate, 20 mM Tris pH 7.5, 0.15 M NaCl and 0.1% Triton X-100 on a rotary shaker during 30 minutes.
- the eluate is dialyzed against PBS overnight to remove the guanidine thiocyanate.
- the protein is stored in PBS at 4 ° C.
- a cocktail of protease inhibitors of equal quantity (Leupeptine lmg / ml, Pepstatin lmg / ml, Aprotinin l mg / ml. Benzamidine 500 mM) is added to the 1/200 th to the protein preparation.
- GST-GAX was purified on a resin coupled to glutathione thanks to the catalytic site of glutathione S-transferase (GST); SmycKi carrying a myc epitope and the S epitope allowing purification on a resin coupled to protein S.
- the proteins were transferred to a nitrocellulose membrane from a gel identical to that at A.
- the membrane was successively incubated in the presence of SmycKi, in a solution containing a mouse monoclonal antibody directed against the myc epitope (Santa Cruz) and finally in a solution for the detection of the anti-myc antibody.
- EXAMPLE 10 Construction of Vectors Permitting the Expression in Mammalian Cells of a Fusion Protein Between Different Deletants of GAX and the DNA Binding Domain of GAL4
- the plasmids pCM199 and pCM301 are digested with HindIII.
- the inserts are cloned in the correct orientation into pCDNA3 (invitrogen) at the HindIII site to give the plasmids pCM291 and pCM327 respectively, allowing expression of fusions in mammalian cells.
- the plasmids pCM238, pCM244, pCM301, pCM246, and pCM280 are digested with HindIII and Nael.
- the inserts are cloned in the correct orientation in pCDNA3 (invitrogen) at the HindIII-EcoRV site to give the plasmids pCM292, pCM326, pCM327, pCM294 and ⁇ CM295, respectively, allowing the expression of fusions in mammalian cells.
- the invention resides in the construction and the use of viral vectors allowing the transfer and the expression in vivo of nucleic acids as defined above.
- adenoviruses various serotypes, whose structure and properties vary somewhat, have been characterized.
- serotypes it is preferred to use, in the context of the present invention, human adenoviruses of type 2 or 5 (Ad 2 or Ad 5) or adenoviruses of animal origin (see application WO94 / 26914).
- adenoviruses of animal origin which can be used in the context of the present invention, mention may be made of adenoviruses of canine, bovine, murine origin (example: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine , avian or even simian (example: after-sales service).
- the adenovirus of animal origin is a canine adenovirus, more preferably a CAV2 adenovirus [Manhattan strain or A26 / 61 (ATCC VR-800) for example].
- adenoviruses of human or canine or mixed origin are used.
- the defective adenoviruses of the invention comprise ITRs, a sequence allowing the packaging and a nucleic acid according to the invention.
- the region E 1 at least is non-functional.
- the viral gene considered can be made non-functional by any technique known to those skilled in the art, and in particular by total suppression, substitution, partial deletion, or addition of one or more bases in the gene or genes considered. Such modifications can be obtained in vitro (on isolated DNA) or in situ, for example, by means of genetic engineering techniques, or by treatment with mutagenic agents.
- the adenovirus according to the invention comprises a deletion in the regions E1 and E4.
- it comprises a deletion in region E1 at the level of which the region E4 and the nucleic sequence of the invention are inserted (Cf FR94 13355).
- the deletion in the E1 region preferably extends from nucleotides 455 to 3329 on the sequence of the adenovirus Ad5.
- the defective recombinant adenoviruses according to the invention can be prepared by any technique known to a person skilled in the art (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185,573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). In particular, they can be prepared by homologous recombination between an adenovirus and a plasmid carrying inter alia a nucleic sequence or a combination of nucleic sequences of the invention. Homologous recombination occurs after co-transfection of said adenovirus and plasmid in an appropriate cell line.
- the cell line used must preferably (i) be transformable by said elements, and (ii), contain the sequences capable of complementing the part of the genome of the defective adenovirus, preferably in integrated form to avoid the risks of recombination.
- a line mention may be made of the human embryonic kidney line 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) which contains in particular, integrated into its genome, the left part of the genome an Ad5 adenovirus (12%) or lines capable of complementing the E1 and E4 functions as described in particular in applications No. WO 94/26914 and WO95 / 02697 or in Yeh et al., J. Virol. 70 (1996) 559. Then, the adenoviruses which have multiplied are recovered and purified according to conventional techniques of molecular biology.
- AAV adeno-associated viruses
- the rest of the genome is divided into 2 essential regions carrying the packaging functions: the left part of the genome, which contains the rep gene involved in viral replication and the expression of viral genes; the right part of the genome, which contains the cap gene coding for the capsid proteins of the virus.
- the use of vectors derived from AAVs for gene transfer in vitro and in vivo has been described in the literature (see in particular WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US5, 139,941, EP 488,528).
- AAVs in which the rep and / or cap genes are deleted and replaced by a gene of interest, and their use for transferring in vitro (onto cells in culture) or in vivo (directly into an organism ) said gene of interest.
- the defective recombinant AAVs according to the invention can be prepared by cotransfection, in a cell line infected with a human helper virus (for example an adenovirus), of a plasmid containing a nucleic sequence or a combination of nucleic sequences of the invention bordered by two inverted repeat regions (ITRs) of AAV, and of a plasmid carrying the packaging genes (rep and cap genes) of AAV.
- a human helper virus for example an adenovirus
- a usable cell line is, for example, line 293.
- Other production systems are described, for example, in applications WO95 / 14771; W095 / 13365; WO95 / 13392 or WO95 / 06743.
- the recombinant AAVs produced are then purified by conventional techniques.
- retroviruses are integrative viruses, selectively infecting dividing cells. They therefore constitute vectors of interest for cancer applications.
- the genome of retroviruses essentially comprises two LTRs, an encapsidation sequence and three coding regions (gag, pol and env).
- vectors derived from retroviruses the gag, pol and env genes are generally deleted, in whole or in part, and replaced by a heterologous nucleic acid sequence of interest.
- retroviruses can be produced from different types of retroviruses such as in particular MoMuLV ("murine Moloney leukemia virus”; also designated MoMLV), MSV ("murine Moloney sarcoma virus”), HaSV ("Harvey sarcoma virus”) ; SNV (“spleen necrosis virus”); RSV (“Rous sarcoma virus”) or the Friend virus.
- a plasmid comprising in particular the LTRs
- the packaging sequence and said nucleic sequence is constructed, then used to transfect a line so-called packaging cell, capable of providing trans retroviral functions deficient in the plasmid.
- the packaging lines are therefore capable of expressing the gag, pol and env genes.
- Such packaging lines have been described in the prior art, and in particular the line PA317 (US4,861,719); the PsiCRIP line (WO90 / 02806) and the GP + envAm-12 line (WO89 / 07150).
- recombinant retroviruses may include modifications to the LTRs to suppress transcriptional activity, as well as packaging sequences. extended, comprising part of the gag gene (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). The recombinant retroviruses produced are then purified by conventional techniques.
- nucleic acids or the plasmid expression vectors described in the preceding examples can be administered as they are in vivo or ex vivo. It has indeed been shown that naked nucleic acids can transfect cells. However, to improve the transfer efficiency, it is preferred to use, within the framework of the invention, a transfer vector. It can be a viral vector (example 9.2.) Or a synthetic transfection agent.
- cationic polymers of polylysine type (LKLK) n, (LKKL) n, (PCT / FR / 00098) polyethylene imine (WO96 / 02655) and DEAE dextran or cationic or lipofectant lipids. They have the property of condensing DNA and promoting its association with the cell membrane. Among these, mention may be made of lipopolyamines (lipofectamine, transfectam, etc.), different cationic or neutral lipids (DOTMA, DOGS, DOPE, etc.) as well as peptides of nuclear origin.
- lipopolyamines lipofectamine, transfectam, etc.
- DOTMA cationic or neutral lipids
- DOGS DOGS
- DOPE DOPE
- the concept of targeted transfection has been developed, mediated by a receptor, which takes advantage of the principle of condensing DNA thanks to the cationic polymer while directing the binding of the complex to the membrane thanks to a chemical coupling between the cationic polymer and the ligand of a membrane receptor, present on the surface of the cell type that is to be grafted.
- the targeting of the transferrin, insulin receptor or the hepatocyte asialoglycoprotein receptor has thus been described.
- the preparation of a composition according to the invention using such a chemical vector is carried out according to any technique known to those skilled in the art, generally by simple contacting of the various components.
- a transient transfection system to study the transcriptional activity specific to GALDB-GAX fusions as well as their effect on transcriptional activators such as the estrogen receptor (ER) or the domain. activation of protein VP16 from the Herpes simplex virus fused to GALDB.
- a target gene Reporter
- CAT bacterial chloramphenicol acetyl transferase
- This promoter contains a TATA box, originating from the E1B gene of the adenovirus Ad2 (E1B TATA), upstream from the site of initiation of the transcription of the CAT gene (FIG. 4 A).
- a TBP protein from the TFIID complex recognizes the TATA box and positions the preinitiation complex (TFIID + TFII A, B, E, F) which recruits RNA polymerase type II (PolII) which will initiate the transcription of the CAT gene.
- TFIID + TFII A, B, E, F preinitiation complex
- PolyII RNA polymerase type II
- Upstream of this basic promoter we have inserted a GALDB binding site (17 mer) which will be recognized by the chimeras GALDB-GAX or GALDB-VP16.
- GALDB binding site 17 mer
- GALDB-GAX GALDB-VP16
- EAE estrogen response element upstream of the 17th sea on which ER binds to activate transcription.
- This reporter will allow us to study the different schematic combinations, activation or repression of transcription will result in a change in the amount of CAT in a cell.
- the " assay of CAT enzyme activity in cell extracts after transfection is used to measure
- ER and GAL4-VPÎ6 s ⁇ nLdes ⁇ very strong transcriptional activators.
- the CAT activity is increased by more than 100 times by ER and approximately 85 times by GAL4-VP16.
- the coexpression of ER and GAL4-VP16 results in a CAT activity of more than 300 times that of the unactivated reporter and greater than the sum of the two activators expressed individually. This suggests that ER and GAL4-VP16, despite steric hindrance, can occupy and activate the same promoter ( Figure 4B).
- the GAX gene codes for a protein of 302 amino acids in humans. The primary structure of this protein has different domains whose function remains unknown. GAX belongs to a family of genes called homeoboite (HOMEOBOX). Homeobox is necessary for the recognition and binding of these proteins on specific DNA sequences present on the promoter of the target genes whose control the expression. To date, no DNA sequence recognized by GAX has been identified. GAX has a region rich in Histidine residues (HIS) in its N-terminal part whose function is unknown.
- HES Histidine residues
- the different GAL-GAX chimeras were expressed alone or in the presence of ER to study their effect respectively on the basal transcription or on the transcriptional activity of ER.
- GAL-GAX 1 -302 and ER results in a CAT activity more than 25 times lower than that obtained with ER alone.
- This repression as in A is due to the first 32 amino acids of GAX (compare GAL-GAX1-302, GAL-GAX33-302 and GAL-GAX33-222).
- GAL-GAX 1-32 decrease the activity of ER only by 2 times (compare GAL-GAX 1-32, GAL-GAX 1 - 104) and require at least the presence of residues 33 to 222 for maximum activity (Figure 6B).
- the sequences making lose the activity when they are absent are sought, allowing to conclude that they are necessary for the interaction but not sufficient.
- results presented show that GAX represses transcription of the reporter gene used. This repression is essentially due to an N-terminal peptide (1 to 32) whose optimal activity requires the presence of the region 33 to 222 of GAX and preferably the presence of the region 33-104 of Gax.
- PCNA Human Proliferating Cell Nuclear Antigen
- the cloning of the PCNA cDNA is carried out by reverse transcription and PCR.
- the first reverse transcription (RT) step is carried out with the "First Strand cDNA synthesis" kit from Pharmacia.
- Total RNA is extracted from human smooth muscle cells in primary culture (Clonetics) according to the method described by P. Chomczynski and N. Sacchi (Anal. Biochem. 1987, 162: 156-159).
- RNA 10 ⁇ g of this total RNA is taken up in 20 ⁇ l of water are heated for 10 minutes to 65 ° C., cooled on ice and then mixed with 11 ⁇ l of "Bulk First Strand reaction mix" from the RT kit (Cloned, FPLCpwre®, Murine Reverse Transcriptase, RNase / DNase-Free BSA, dATP, dCTP, dGTP, and dTTP), 1 ⁇ l of DTT and 1 ⁇ l of pD (N) primers 6 .
- the RT reaction is incubated for 1 hour at 37 ° C.
- the reaction is stopped by heating for 5 minutes at 90 ° C. and then cooled on ice.
- the second step consists in PCR amplification of the PCNA cDNA.
- the primers used for the PCR reaction are the following:
- the two primers introduce an EcoRI site (lowercase underlined).
- the PCNA amino acids contained in the primers are represented by their code (capital letters) below the corresponding codons. * represents the stop codon of PCNA.
- 8 ⁇ l of the RT reaction, described above, are completed to a final volume of 50 ⁇ l containing the following final quantities or concentrations: 50 picomoles of primer 1, 50 picomoles of primer 2, one unit of Taq DNA polymerase (Perkin Elmer), 5 ⁇ l of MgC12 (25 mM), 2 ⁇ l of a 200 mM mixture of the 4 deoxynucleotides (dATP, dTTP, dGTP and dCTP) and 5 ⁇ l of the 10-fold concentrated PCR buffer (Perkin Elmer).
- the PCR amplification is carried out in Micoamp TM tubes (Perkin Elmer) using a PTC-100 TM thermocycler (MJ Research, Inc.).
- This amplification consists of a denaturation step at 95 ° C for 2 min followed by 30 cycles including a denaturation step of 15 sec at 95 ° C, a hybridization step of 30 sec at 55 ° C and an extension step 1 min at 72 ° C. These thirty cycles are followed by an additional extension of 5 min, then the PCR reactions are stored at 10 ° C.
- the recombinant clones (white colonies) are taken up in 10 ⁇ l of water and confirmed under the same conditions as the PCR after the RT reaction described above except that of triton X-100 at a final concentration of 0.01% v / v is added to the reaction.
- Several positive clones are used to make DNA mini-preparations, those in which the 5 ′ part of the PCNA insert is positioned downstream of the EcoRV site of pCRII are sequenced and selected for the next cloning step.
- PCNA EcoRV-Hind III fragment derived from PCRII-PCNA is inserted at the EcoRV-Hind III site of pET-29.
- This plasmid is then used for the production of the chimeric recombinant protein S-PCNA.
- the stages of transformation, production and purification of S-PCNA are identical to those used for the production of the Ki antigen fused to the myc epitope.
- Figure 7 shows a weak interaction between GST and PCNA only at high doses of GST (500 and 750 ng).
- the affinity of GST-GAX for PCNA is very much higher than that with GST.
- This specific interaction between GAX and PCNA suggests that the antiproliferative activity of GAX is mediated by PCNA sequestration.
- Ki can interact both with GAX and with PCNA is in favor of the formation of bi or tripartite complexes which could play an important role (activation or inhibition) in the progression of the cell cycle.
- CTCCAG TATAACTGGA TTCGAAGCCC AGCCTCATGA CAGGAGGCTG ACGGTATACAGATC
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
La présente invention concerne des polynucléotides comprenant des domaines de GAX impliqués dans l'activité biologique de GAX. Il peut s'agir notamment de domaines impliqués dans l'interaction de GAX avec d'autres molécules ou de domaines responsable d'une activité biologique. L'invention concerne également des molécules chimeriques comprenant un domaine fonctionnel de GAX. Elle concerne également l'utilisation de GAX pour réprimer l'expression de gènes, ainsi que l'utilisation de composés inhibant l'interaction de GAX avec certains partenaires cellulaires pour moduler l'activité de GAX. Elle concerne également une méthode pour le criblage et/ou l'identification de partenaires cellulaires de GAX.
Description
POLYPEPTIDES COMPRENANT DES DOMAINES DE LA PROTEINE GAX, IMPLIQUES
DANS LA REPRESSION DE TRANSCRIPTION ET/OU INTERAGISSANT AVEC D'AUTRES
PROTEINES, ACIDES NUCLEIQUES CORRESPONDANTS ET LEURS UTILISATIONS.
La présente invention concerne le domaine thérapeutique. Elle concerne plus particulièrement de nouvelles molécules thérapeutiques et leur utilisation pour le traitement de pathologies cardio-vasculaires.
La resténose post-angioplastie est un désordre hyperprolifératif localisé qui se développe consécutivement à une intervention non chirurgicale au niveau de la plaque d'athérosclérose. Ainsi, le traitement d'une lésion athéroscléreuse par angioplastie résulte de façon très fréquente (jusqu'à 50% des cas dans certaines études) en une resténose consécutive à la blessure mécanique de la paroi artérielle.
La prolifération des cellules musculaires lisses (CML) dans la paroi vasculaire est un événement clé dans le développement de l'athérosclérose, dans la resténose après angioplastie ainsi que dans l'échec des pontages coronariens. Les CML sont normalement quiescentes dans la paroi vasculaire mais, à la suite d'une lésion détruisant l'endothélium vasculaire, elles se retrouvent au contact des facteurs de croissance sanguins. Contrairement aux cardiomyocites et aux cellules du muscle squelettique, les CML peuvent, en réponse à divers facteurs de croissance, se dédifférencier et réenclencher de nouveau leur cycle prolifératif. Ces modifications phéiiot iques es CML iésukeπi de profonds changements au niveau de 'l'expression de nombreux gènes. A titre d'exemple l'expression de gènes précoces, impliqués dans la prolifération cellulaire tels que c-fos ou c-myc, se voit remarquablement augmentée alors que l'expression d'autres gènes de structure tel que l'alpha-actine muscle lisse spécifique ainsi que certains isoformes de la myosine subit une régulation négative. Bien qu'il soit clairement établi que la différenciation terminale des cellules musculaires squelettiques est régulée par des facteurs transcriptionnels dits myogéniques tels que Myo-D, très peu de facteurs impliqués dans la différenciation réversible des CML sont connus à ce jour. Des études récentes ont révélé l'existence de facteurs transcriptionnels possédant une homéo-boite dans différents tissus du système cardio-vasculaire De tels facteurs, reconnaissent grâce à leur homéo-boite, des séquences d'ADN spécifiques dans les régions promotrices de leur gènes cible et interviennent ainsi dans la régulation de la différenciation, de la prolifération ou de la migration cellulaire. L'un de ces facteurs gax (Growth-Arrest-Specific Homeobox) est exprimé dans différents tissus cardio-vasculaires dont les CML de la paroi vasculaire Le gène gax a été initialement identifié à partir d'une banque d'ADNc d'aorte de rat. Il code pour une protéine de 303 acides aminés. Sa séquence a été caractérisée et son
cDNA clone (Gorski et al., Mol.Cell.Biol. 1993, 6, 3722-3733). Le gène gax humain a également été clone et séquence (David F. Le Page et al.,Genomics 1994,24,535- 540). Il code pour une protéine de 302 acide aminés. Le gène gax possède certaines propriétés similaires aux gènes gas et Gadd puisqu'il semble également contrôler la transition G0/G1 du cycle cellulaire. Ainsi les niveaux d'ARNm de gax sont réduits dans les CMLV de rat d'un facteur 10 après deux heures d'exposition au PDGF (Gorski et al., Mol.Cell.Biol. 1993, 6, 3722-3733). L'expression du gène gax est donc réprimée au cours de la réponse mitogénique des CMLV. Une autre caractéristique du gène gax réside dans sa spécificité d'expression. En effet, chez le rat adulte, le gène gax est essentiellement exprimé dans le système cardiovasculaire (aorte, coeur). La présence d'ARNm de gax n'a pas été mise en évidence par Northern Blot dans le foie, le cerveau, l'estomac et le muscle squelettique. Par ailleurs, le gène gax appartient à la famille des gènes homéotiques. Ces gènes codent pour des facteurs transcriptionnels qui contiennent des séquences consensus (ou homéodomaines) reconnaissant des régions spécifiques de l'ADN (ou homéoboîtes) (revue : Gehring et al. Cell, 78 : 211- 223, 1994). L'homéodomaine de la protéine gax de rat est compris entre les acides aminés 185 et 245. De manière intéressante, les gènes homéotiques identifiés à ce jour sont impliqués dans le contrôle de la différenciation/croissance cellulaire au cours de l'embryogenèse ce qui renforce le potentiel thérapeutique du gène gax (revue : Lawrence et Morata Cell 78 : 181-189, 1994; Krumlauf, Cell 78 : 191-201, 1994).
L'une des caractéristique de GAX est qu il subit une régulation négative dès que les CML prolifèrent que ce soit in vitro en réponse à des facteurs de croissance ou in vivo à la suite d'une lésion de l'endothélium de la paroi vasculaire. Cette répression est réversible car lorsque les CML sont rendues quiescentes par déprivation en sérum, in vitro, l'expression de GAX reprend. Des travaux de notre laboratoire ont récemment montré que la surexpression de GAX dans des CML par un vecteur adénoviral bloque leur prolifération FR 95/04234(ST95022).
La resténose post-angioplastie consécutive à la blessure mécanique représente le facteur d échec le plus fréquent (50% des cas dans certaines études). La prolifération des CML étant un élément clé de ce phénomène, connaissant son rôle régulateur de la prolifération de GAX, ce dernier apparait comme un gène thérapeutique de choix pour le traitement préventif de a paroi vasculaire après angioplastie FR 95/04234(ST95022).
Toutefois, le mécanisme d'action de GAX demeure, cependant, très peu documenté. Il demeure à identifier des séquences d'ADN cibles de l'homéo-boite de
GAX. De plus une étude de la fonction des différents domaines de GAX n a pas, à ce jour, été réalisée L'identification de partenaires fonctionnels de GAX constitue enfin une facette importante qui permettra de définir la cascade moléculaire dont dépend GAX ou dont il est à la source La présente invention a précisément pour intérêt d'apporter des informations sur ces points
Au cours de ce travail , différentes approches analytiques ont été adopté pour identifier des molécules interagissant avec GAX, pour déterminer le domaine de GAX nécessaire à cette interaction et pour étudier l'importance des différents domaines dans la fonction de GAX Pour ce faire, le système double hybride a été utilisé afin de caractériser des protéines interagissant avec GAX à partir d'une banque de poumon humain
Cette approche a permis d'identifier différentes molécules dont une, l'antigène Ki, est particulièrement intéressante L'antigène Ki est une protéine d'environ 32 KDa Elle a été identifié pour la première fois comme un autoantigène nucléaire reconnu par des sera provenant de patients atteints de lupus érythémateux (Nikaido et al 1989, Clin. Exp. Immunol 1990, 79, 209-214) Des travaux récents ont montré que Ki est surexprimée dans des cellules en prolifération ou transformées par un oncogène (Nikaido et al 1989, Exp. Cell Res 1989, 182,284-289) Des expériences de coimmunoprécipitation ( Takeushi et al abstract 1995 Juntendo University, Tokyo, Japan) ont montré que Ki existe sous forme d'un complexe avec PCNA un marqueur de prolifération (Almendral et al 1987, Proc Natl Acad Sci USA , 84, 1575-1579)
La fonction de GAX a été également étudiée dans des expériences de transfection transitoire de cellules de mammifères en utilisant GAX fusionnée à un domaine de liaison à l'ADN hétérologue et un système de gène reporter permettant de renseigner sur l'activité transcriptionnelle de GAX après délétion de différentes régions de la molécule II a ainsi été montré que GAX agit essentiellement comme un répresseur de la transcription Cette activité de répression est liée plus particulièrement aux 32 premiers acides aminés de GAX De plus, ce domaine répresseur est localisé dans la région (1-222) de GAX requise pour l'interaction avec Ki dans la levure Les applications potentielles du caractère répresseur de GAX et de son interaction avec Ki seront développées ci-après
Un premier aspect de l'invention concerne donc des fragments de la protéine GAX douées de propriétés biologiques
Un autre aspect de l'invention concerne des domaines de GAX impliqués dans l'activité biologique de GAX. Il peut s'agir notamment de domaines impliqués dans l'interaction de GAX avec d'autres molécules ou de domaines responsables d'une activité biologique. L'invention concerne également des molécules chimériques comprenant un domaine fonctionnel de GAX. Elle concerne également l'utilisation de GAX pour réprimer l'expression de gènes, ainsi que l'utilisation de composés inhibant l'interaction de GAX avec certains partenaires cellulaires pour moduler l'activité de GAX. Elle concerne également une méthode pour le criblage et/ou l'identification de partenaires cellulaires de GAX
Comme indiqué ci-avant, le gène gax possède des propriétés particulièrement avantageuses pour des applications de thérapie génique des désordres hyperprolifératifs, notamment de la resténose ou d'autres pathologies associées a une prolifération des CML II a été démontré dans la demande FR95/04234 (ST95022) que le transfert du gène gax in vivo permet de réduire considérablement la prolifération des CML, et ainsi, d'inhiber la réduction du diamètre luminal II a également été montré dans la demande FR 95/12871 (ST95057) que le gène gax, exprimé dans des cellules tumorales, permettait de s'opposer au processus de transformation cellulaire Ces différents éléments démontrent le potentiel du gène gax pour des approches thérapeutiques
La présente demande décrit maintenant l'identification de domaines fonctionnels de GAX, la construction de dérivés de GAX présentant une activité biologique, l'identification de partenaires de la protéine GAX et la mise au point de méthodes permettant la recherche d'autres partenaires et l'identification de composés capables d'interagir sur l'activité de ces partenaires Plus précisément, la demanderesse a maintenant montré que la protéine GAX était douée d'activité répresseur de la transcription. Elle a également montré que cette activité était portée par certaines régions de la protéine GAX, en particulier la région N-terminale Les résultats présentés dans les exemples montrent en outre que les domaines fonctionnels de GAX sont également impliqués dans l'interaction de GAX avec une protéine cellulaire, Ki II est connu dans la littérature Ki intéragit avec PCNA (Takeushi et al abstract 1995 Juntendo University, Tokyo, Japan) et que celui ci est un cofacteur
indispensable à l'ADN polymérase pour la réplication de l'ADN (Fukuda et al. 1995, J. Biol. Chem. 270, 22527-22534).Il a été démontré dans les exemples que Gax interagit avec PCNA, ainsi il est envisageable que GAX puisse également être impliquée dans des complexes réplicatifs dans la cellule.
Un premier objet de l'invention concerne plus particulièrement un polypeptide caractérisé en ce qu'il s'agit en tout ou partie d'un fragment de la protéine GAX possédant une activité de répresseur de la transcription et/ou affectant positivement ou négativement la réplication de l'ADN.
Plus preferentiellement, le polypeptide selon l'invention comprend au moins les résidus 1 à 32 de la protéine GAX humaine.
Selon une autre mode de réalisation, le polypeptide selon l'invention comprend au moins les résidus 104 à 230 de la protéine GAX humaine.
A titre d'exemples particuliers de polypeptides selon l'invention, on peut citer les polypeptides comprenant les fragments 1-32, 33-302 et 1-104 de la protéine GAX humaine. Les exemples présentés plus loin montrent que de tels polypeptides sont capables d'inhiber la transcription de gènes et conservent donc les propriétés de répresseur transcriptionnel de GAX.
Plus preferentiellement, ce polypeptide comprend, outre un fragment de la protéine GAX conforme à la présente invention, un fragment d'origine différente. On entend par fragment d'origine différente un fragment polypeptidique non-issu de la protéine GAX. Il peut s'agir d'un fragment synthétique, artificiel, d'un fragment de protéine, etc. Ce fragment d'origine différente peut avoir différentes fonctions.
Il peut par exemple constituer un marqueur permettant de détecter le polypeptide et éventuellement de le tracer in vivo. Un tel marqueur peut être par exemple un épitope reconnu par un anticorps monoclonal. A cet égard, différentes séquences de marquage, dites séquences Tag, ont été décrites dans la littérature et sont habituellement utilisées. On peut mentionner la séquence tag-myc.
Ce fragment peut également être un fragment ayant la propriété de stabiliser le polypeptide. Il peut s'agir à cet effet de tout ou partie d'une protéine ayant une demi- vie plasmatique élevée.
Enfin, il peut également s'agir d'un élément de ciblage, permettant au polypeptide d'atteindre plus rapidement et/ou plus spécifiquement des compartiments cellulaires particuliers Avantageusement, il s'agit d'un signal de localisation nucléaire (NLS), le polypeptide exerçant principalement son activité dans le noyau des cellules Différents signaux NLS ont été décrits dans la littérature comme par exemple celui de l'antigène T du virus SV40, celui de p53 etc
Le fragment d'origine différente peut en outre conférer au polypeptide une fonction biologique supplémentaire ou favoriser l'activité du domaine répresseur A titre d'exemple tout particulièrement avantageux, on peut citer un domaine protéique capable de lier l'ADN de manière spécifique Ce type de molécule chimérique permet ainsi de lier l'ADN en des régions particulières et d'inhiber la transcription de gènes localisés au niveau de ces régions A titre d'exemple spécifiques on peut citer le domaine de liaison a l'ADN de la protéine GAL4 de levure De telles constructions sont décrites dans les exemples Elles peuvent être utilisées pour réguler l'expression de gènes chez la levure ou de gènes placés sous le contrôle d'un signal d'expression comprenant le site de liaison de la protéine GAL4 D'autres domaines protéiques de liaison à l'ADN peuvent être par exemple Lex A, le domaine de liaison à l'ADN d'un récepteur nucléaire comme le récepteur aux oestrogènes ou tout autre membre de cette famille, etc II peut également s'agir d'un peptide permettant d'une part la sécrétion de tout ou partie de GAX, ainsi que son ciblage vers des récepteurs membranaires permettant son internalisation et augmentant ainsi la diffusibilité et le domaine d'activité de GAX par un effet de type "Bystander" A ce titre on peut plus particulièrement utiliser tout ou partie de la transferrine ou des fragment de molécule de la matrice extracellulaire pouvant reconnaître des intégrines à la surface des CML
Les polypeptides selon l'invention sont particulièrement intéressants sur le plan thérapeutique et celui de la recherche appliquée
L'activité thérapeutique des polypeptides revendiqués est liée plus particulièrement à leur aptitude à réprimer la transcription ou à affecter la réplication de l'ADN, par analogie avec la protéine GAX et donc à leur conférer un pouvoir de réguler l'expression d'autres protéines
Dans cette perspective, la présente invention vise également l'utilisation de la protéine GAX ou d'un fragment tel que revendiqué pour réprimer la transcription de gène et/ou affecter positivement ou négativement la réplication de l'ADN.
En raison de cette analogie de comportement avec la protéine GAX, ces fragments peuvent avantageusement lui être substitué dans sa fonction de répresseur de transcription. Par ailleurs, compte-tenu du fait qu'ils ne comprennent de la protéine GAX que tout ou partie de son domaine impliquée dans la répression de transcription, on peut penser qu'ils seront moins sensibles aux différentes altérations auxquelles est sujette la protéine GAX. Ces polypeptides en tant que tels ou des dérivés peuvent donc manifester un caractère répresseur de la transcription accrue comparativement à celui de la protéine GAX naturelle.
On peut également envisager de les utiliser afin d'identifier de nouveaux partenaires de la protéine GAX. A cet égard la présente invention a également pour objet un procédé pour le criblage et/ou l'identification de polypeptides interagissant avec la protéine GAX ou un domaine de GAX caractérisé en ce qu'il met en oeuvre un polypeptide selon l'invention. Plus preferentiellement ce polypeptide est choisi parmi les fragments là 32 et 33 à 302 de la protéine GAX.
A ce titre, la demanderesse a montré de manière inattendue qu'un domaine de la protéine GAX pouvait interagir de manière spécifique avec une autre protéine cellulaire, la protéine Ki. Comme explicité précédemment, Ki est un autoantigène qui apparaît lors de maladies auto-immune comme le lupus érythémateux. Elle est décrite comme une molécule nucléaire dont l'expression augmente au cours de la prolifération cellulaire ainsi que dans des fibroblastes transformés par un oncogène.
Nous avons pu montrer que, dans la levure, la partie N-terminale de GAX est nécessaire pour l'interaction avec Ki. La protéine recombinante Ki reconnaît spécifiquement GAX transféré sur un filtre de nitrocellulose à partir d'un gel de polyacrylamide dénaturant.
La présente invention vise également précisément un polypeptide caractérisé en ce qu'il s'agit d'un fragment de la protéine GAX capable d'interagir avec la protéine Ki.
Plus preferentiellement, il s'agit du fragment 1 à 32 ou 104 à 223 de la protéine GAX.
La demanderesse a également montré de manière très inattendue qu'un domaine de la protéine GAX pouvait interagir de manière spécifique avec le marqueur de prolifération PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen). Ce facteur est indispensable à la réplication de l'ADN et joue également un rôle dans les phénomènes de réparation de l'ADN. La présente invention concerne donc un polypeptide caractérisé en ce qu'il s'agit d'un fragment de la protéine GAX, capable d'interagir avec PCNA.
Par ailleurs, il a été décrit dans la littéraure que Ki existait sous forme d'un complexe avec PCNA. Ki peut donc interaragir à la fois avec GAX et PCNA en formant un complexe au moins bipartite avec l'une ou l'autre de ces protéines et de préférence un complexe tripartite. La formation de ces complexes a un rôle important dans la progression du cycle cellulaire (activation ou inhibition).
Ainsi, la présente invention vise également un polypeptide caractérisé en ce qu'il s'agit d'un fragment de la protéine GAX capable d'interagir avec Ki et/ou PCNA et de former un complexe au moins bipartite ou au moins tripartite avec ces protéines.
Un autre objet de la présente invention concerne tout acide nucléique codant pour un polypeptide tel que défini ci-avant. Il peut s'agir de séquences d'origine naturelle ou artificielle, et notamment d'ADN génomique, d'ADNc, d'ARNm, de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Cet acide nucléique peut être d'origine humaine, animale, végétale, bactérienne, virale, etc. Il peut être obtenu par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par criblage de banques, par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. Ils peuvent par ailleurs être incorporés dans des vecteurs, tels que des vecteurs plasmidiques.
Avantageusement, l'acide nucléique selon l'invention est un ADNc.
Les acides nucléiques de l'invention peuvent être utilises pour la production de sondes ou de molécules antisens permettant, par hybridation, de détecter la présence
ou l'expression d'acides nucléiques codant pour des polypeptides portant un domaine répresseur selon l'invention, ou d'inhiber l'expression de tels polypeptides. S'agissant de sondes, celles-ci comportent preferentiellement plus de 10 bases et, avantageusement, de 10 a 300 bases.
Les acides nucléiques de l'invention peuvent être utilisés pour l'expression et/ou la production de polypeptides in vitro, in vivo ou ex vivo, dans des approches de thérapie génique ou cellulaire.
A cet effet, la présente invention concerne des cassettes d'expression contenant un acide nucléique tel que défini ci-dessus, sous contrôle d'un promoteur permettant son expression.
Différents promoteurs peuvent être utilises dans le cadre de l'invention. Il s'agit de séquences permettant l'expression d'un acide nucléique dans une cellule mammifère.
Le promoteur est avantageusement choisi parmi les promoteurs fonctionnels dans les cellules humaines. Plus preferentiellement, il s'agit d'un promoteur permettant l'expression d'une séquence d'acide nucléique dans une cellule hyperproliférative (cancéreuse, resténose, etc). A cet égard, différents promoteurs peuvent être utilisés. Il peut ainsi s'agir de tout promoteur ou séquence dérivée stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de façon spécifique ou non, inductible ou non, forte ou faible. On peut citer notamment les séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule cible. Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut utiliser en particulier de promoteurs ubiquitaires (promoteur des gènes ITPRT, PGK, alpha-actine, tubuline, DFfFR etc), de promoteurs des filaments intermédiaires (promoteur des gènes GFAP, desmine, vimentine, neurofilaments, kératine, etc), de promoteurs de gènes thérapeutiques (par exemple le promoteur des gènes MDR, CFTR, Facteur VIII, ApoAI, etc), de promoteurs spécifiques de tissus (promoteur du gène pyruvate kinase, villine, protéine intestinale de liaison des acides gras, alpha-actine du muscle lisse, etc), des promoteurs cellules spécifiques de type cellules en division comme les cellules cancéreuses ou encore de promoteurs répondant à un stimulus (récepteur des hormones stéroïdes, récepteur de l'acide rétinoïque, récepteur de glucocorticoïdes, etc) ou dits inductibles. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, tel que
par exemple les promoteurs des gènes El A et MLP d'adénovirus, le promoteur précoce du CMV, ou encore le promoteur du LTR du RSV, etc. En outre, ces régions promotrices peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique ou majoritaire
La présente invention fournit maintenant de nouveaux agents thérapeutiques permettant, par leur aptitude à réprimer la transcription, d'interférer avec de nombreux dysfonctionnements cellulaires Dans ce but, les acides nucléiques ou cassettes selon l'invention peuvent être injectés tels quels au niveau du site à traiter, ou incubés directement avec les cellules à détruire ou traiter II a en effet été décrit que les acides nucléiques nus pouvaient pénétrer dans les cellules sans vecteur particulier Néanmoins, on préfère dans le cadre de la présente invention utiliser un vecteur d'administration, permettant d'améliorer (i) l'efficacité de la pénétration cellulaire, (ii) le ciblage et (iii) la stabilité extra- et intracellulaires
Dans un mode de mise en oeuvre particulièrement préféré de la présente invention l'acide nucléique ou la cassette est incorporé(e) dans un vecteur d'expression Le vecteur utilisé peut être d'origine chimique (liposome, nanoparticule, complexe peptidique, lipides ou polymères cationiques, etcj viraie retrovirus, Adénovirus, virus de l'herpès, AAV, virus de la vaccine, etc) ou plasmidique
L'utilisation de vecteurs viraux repose sur les propriétés naturelles de transfection des virus II est ainsi possible d'utiliser par exemple les adénovirus, les herpès virus, les retrovirus et les virus adéno associés Ces vecteurs s'avèrent particulièrement performants sur le plan de la transfection A cet égard, un objet préféré selon l'invention réside dans un retrovirus recombinant défectif dont le génome comprend un acide nucléique tel que défini ci-avant Un autre objet particulier de l'invention réside dans un adénovirus recombinant défectif dont le génome comprend un acide nucléique tel que défini ci-avant
Le vecteur selon l'invention peut également être un agent non viral capable de promouvoir le transfert et l'expression d'acides nucléiques dans des cellules eucaryotes Les vecteurs chimiques ou biochimiques, synthétiques ou naturels, représentent une alternative intéressante aux virus naturels en particulier pour des raisons de commodité, de sécurité et également par l'absence de limite théorique en ce qui concerne la taille de l'ADN à transfecter Ces vecteurs synthétiques ont deux
fonctions principales, compacter l'acide nucléique à transfecter et promouvoir sa fixation cellulaire ainsi que son passage à travers la membrane plasmique et, le cas échéant, les deux membranes nucléaires Pour pallier à la nature polyanionique des acides nucléiques, les vecteurs non viraux possèdent tous des charges polycationiques
L'acide nucléique ou le vecteur utilisé dans la présente invention peut être formulé en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc De préférence, l'acide nucléique ou le vecteur est utilisé sous une forme injectable II peut donc être mélangé à tout véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau du site à traiter II peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables Les doses d'acide nucléique utilisées peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du gène, du vecteur, du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée
L'invention concerne également toute composition pharmaceutique comprenant au moins un acide nucléique tel que défini ci-avant
Elle concerne également toute composition pharmaceutique comprenant au moins un vecteur tel que défini ci-avant
En raison de leurs propriétés antiprolifératives, les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont tout particulièrement adaptées pour le traitement des désordres hyperprolifératifs, tels que notamment les cancers et la resténose La présente invention fournit ainsi une méthode particulièrement efficace pour la destruction de cellules, notamment de cellules hyperprolifératives Elle est ainsi applicable à la destruction des cellules tumorales ou des cellules de muscle lisse de la paroi vasculaire (resténose) Elle est tout particulièrement appropriée au traitement des cancers A titre d'exemple, on peut citer les adénocarcinomes du colon, les cancers de la thyroïde, les carcinomes du poumon, les leucémies myéloides, les cancers colorectaux, les cancers du sein, les cancers du poumon, les cancers gastriques, les cancers de l'oesophage, les lymphômes B, les cancers ovariens, les cancers de la vessie, les glioblastomes, les hépatocarcinomes, les cancers des os, de la peau, du pancréas ou
encore les cancers du rein et de la prostate, les cancers de l'oesophage, les cancers du larynx, les cancers tête et cou, les cancers ano-génitaux HPV positifs, les cancers du nasopharynx EBV positifs, etc
Par ailleurs, la présente invention s'étend en outre à toute utilisation de composés inhibant l'activité de la protéine Ki et ou de PCNA pour inhiber la prolifération de cellules musculaires lisses
La présente invention concerne également l'utilisation de composés selon l'invention pour la formation d'un complexe bi- ou tri-partite avec les protéines Ki et/ou PCNA pour affecter positivement ou négativement la progression du cycle cellulaire
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples et figures qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs
LEGENDE DES FIGURES
Figure 1 Analyse par northern blotting de l' expression de la protéine Ki a partir des mARNs extraits de différents tissus
Figure 2 Localisation nucléaire de KiHA dans des cellules transfectées par la méthode d'immunofluorescence
Figures 3 Interaction in vitro entre les protéines Ki et GAX
A) bleu de coomassie
B) Far Westren Blotting
Figure 4 A) Représentation de la construction du gène Reporter exprimant la chloramphenicol acétyle transférase bactérienne (CAT) sous le contrôle d'un promoteur artificiel
B) Dosage de l'activité enzymatique CAT dans des extraits cellulaires après transfection avec des vecteurs d'expression incorporant respectivement ER, GAL VP16 et ER-G L V 16
Figure 5 Comparaison de constructions de différents mutants de délétion de GAX par rapport à la protéine GAX en entier 1-302
Figures 6. Dosage de l'activité enzymatique CAT avec différentes chimères GAL-GAX
A) Sans activateur ER
B) en présence d'activateur ER
Figure 7 • Interaction entre GST-GAX et PCNA
MATERIEL et METHODES
A) MATERIEL
1) Souche de levure utilisée
La souche YCM79 du genre S.cerevisiae (MATa, ιιra3-52, hιs3-200, ade2-101, lys 2- 801, trpl-901, Ieu2-3, 112, canl, gal-f-542, ga/80-538, metI6::URA3-pGALl 10- LacZ, HIS3: :GAL7BLE) a été utilisée comme outil de criblage de la banque de fusion de poumon par le système deux hybrides
Elle est cultivée sur les milieux de culture suivants Milieu YPD complet -Extrait de levures (10g/l) (Difco) -Bactopeptone (2ûg/l) (Difco) -Glucose (20g/l) (Merck)
Ce milieu a été rendu solide par addition de 20g/l d'agar (Difco)
Milieu YNB minimum -Yeast Nitrogen Base (sans acides aminés) (6,7g/l) (Difco)
- Glucose (20g/l) (Merck) Ce milieu peut être rendu solide par addition de 20g/l d'agar (Difco)
Pour permettre la croissance des levures auxotrophes sur ce milieu, il est nécessaire d'y ajouter les acides aminés ou les bases azotées, pour lesquelles elles sont dépendantes à 50mg/ml
2) Souches de bactéries utilisées
La souche TG1 d'Escheriehia coli de génotype supE, hsdD5, thi, D(lac-proAB), F'ftra D36 pro A B lacP lacZDM15] a été employée comme moyen d'amplification et d'isolement de plasmides recombinants utilisés
Pour la production de protéines recombinantes, les bactéries E coli utilisées sont les BL-21 obtenues chez Pharmacia E coli Elles possèdent le génotype F" ompT hsdSb (rh.mh) gai dcm (DE3).
BL-21 est une souche de choix pour la production de protéines recombinantes car elle ne possède pas de protéase et sa membrane est fragile, facile à casser par simple sonication E coli BL-21 possède un système de répression de la T7 ARN polymérase Cette répression peut être levée par l'IPTG ce qui permet le contrôle de gènes placés en aval du site de liaison de la T7 ARN polymérase Les bactéries sont mises en culture dans 2 ml du milieu LB (NaCl 5 g/1, Tryptone 10 g/1, Extrait de levure 5 g/1) dans un agitateur à 37°C toute la nuit 1 ml de cette préculture est remis en culture dans 50 ml du milieu 2xYT (NaCl 5 g/1, Tryptone 16 g/1, Extrait de levure 10 g 1) a 37°C jusqu a ce que les bactéries atteignent une densité optique (D O ) de 0,4 à 600 nm (phase exponentielle de croissance) La culture des bactéries est refroidie sur la glace Elles sont centrifugées à 3300 rpm pendant 20 mn
Les bactéries E Coli, compétentes pour la production des protéines recombinantes, sont préparées par la méthode du chlorure de calcium Pour ce faire, les bactéries sont mises en solutioa dans 5 ml de CaCL2 à 0, 1 M (1/10 de la culture) Elles sont centrifugées a nouveau à 3300 rpm pendant 10 mn Elles sont remises en solution dans 1 ml de CaC12 0, 1 M contenant 17,5 % de glycerol Elles sont aliquotées et conservées a - 80°C
3) Plasmides mis en oeuyre
Les plasmides mis en oeuvre sont
Les vecteurs de la série pGBT et pAS, (Clontech),des plasmides navettes qui possèdent une origine de réplication bactérienne et de levure leur permettant de se répliquer a haut nombre de copies chez ces deux micro-organismes Ces plasmides contiennent un site multiple de clonage situé en aval de la séquence codant pour le domaine de liaison à l'ADN de GAL4 et en amont d'un terminât eur pour former une protéine de fusion Ils contiennent également le gène TRP 1 de S. cerevisiae qui permet de complémenter les levures de génotype trpl afin de les sélectionner sur un milieu minimum ne contenant pas de tryptophane Ces vecteurs portent le gène de résistance
à l'ampicilline qui permet de sélectionner les bactéries les possédant sur un milieu contenant de l'ampicilline.
. Les vecteurs de la série pGAD, (Clontech) des vecteurs qui permettent l'expression chez la levure de protéines de fusion entre le domaine transactivateur de GAL4 et une protéine d'intérêt ou codée par l'ADNc provenant d'une banque de poumon, inséré au niveau d'un site EcoRI Xhol.
Les vecteurs de la série pET29 (Novagen) des vecteurs qui permettent l'expression de protéines recombinantes chez coli en fusion avec le tagS
Les vecteurs de la série pGEX (Pharmacia) des vecteurs qui permettent l'expression de protéines recombinantes chez coli en fusion avec La Glutathione S-Transférase (GST)
Les vecteurs de la série Bluescript (Strata gène) des vecteurs permettant d'effectuer les clonages de même que la série des pIC (J Lawrence Marsh et al Gène, 1984, 32, 481-485) et pMTL(Steve P Chambers et al , Gène, 1998, 68, 139- 149) Le plasmide pGEX-2T-hGAX est le plasmide mis en oeuvre pour la transformation des E Coli BL-21 Ce plasmide a été obtenu à partir du plasmide pGEX-2T et a été fourni par le Docteur K Walsh de St Elizabeth's Médical Center à Boston Le plasmide pGEX-2T de base (Pharmacia) permet de produire la protéine GAX fusionnée a la Glutathion-S-Transférase (GST), protéine qui a une forte affinité pour le Glutathion La fusion GST-GAX facilitera la purification de GAX par affinité sur des billes d'agarose couplées au Gluthation De plus, il existe un site de coupure par la thrombine qui permet ultérieurement de scinder la chimère entre GST et GAX L'ADNc hGAX est insère sous le contrôle du promoteur hybride tac et de l'opérateur lac Le répresseur lad en se fixant sur l'operateur lac. empêche F ARN polymérase d'avancer Cette repression est levée par un analogue du lactose. l'isopropyl-β-D- thiogalactoside ( IPTG) qui s'associe a\ec lad Le complexe lacI-IPTG ne peut plus se fixer sur l'operateur lac l' -YRN pokmerase n a donc plus d'obstacle
4) Protéine Ki Production et purification
Nous avons clone le gène de la protéine Ki fusionne a un épitope myc dans le plasmide pET-29 (
contenu dans la levure Le piasmide
pET-29 produit la protéine fusionnée à l'épitope appelé S-Tag qui permet la purification de KI par affinité sur des billes d'agarose couplées à la S-protéine . La chimère SmycKI est sous le contrôle du promoteur T7 et de 1 opérateur lac. Les BL- 21 sont transformées par le plasmide pET-29- mycKI Comme pour la protéine GST- GAX, elles sont mises en culture jusqu'à une D.O. de 0,7 à 600 nm. Puis, l'expression de SmycKI est induite par 0, 1 mM d'IPTG et par la T7 ARN polymérase produite par les BL-21. Les bactéries sont soniquées Le surnageant est ensuite purifié par la méthode suivante La purification de SmycKI se fait par affinité sur des billes d'agarose couplées à la S-protéine. La méthode est la même que pour GST-GAX excepté que la résine est lavée dans une solution contenant 20 mM de Tris pH7,5, 0, 15 M de NaCl et 0, 1% de Triton X-100 L'élution et la dialyse sont les mêmes que pour GST-GAX
B) METHODES
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire sont bien connues de l'homme de métier et sont abondamment décrites dans la littérature [Maniatis T et coli , "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, N Y , 1982, Ausubel F M et coli (eds), "Current Protocols in
Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987]
1). Le système double-hybride
Ce système est une méthode de clonage par interaction in vivo chez Saccharomyces cerevisiae dont le principe est fondé sur la structure modulaire du facteur transcriptionnel de levure GAL4 (7) L'activateur de transcription GAL4 a deux domaines indépendants ayant des fonctions différentes Le domaine de liaison à l'ADN (GALDB pour GAL DNA Binding) permet à GAL4 de se fixer sur une séquence spécifique d'ADN au niveau de la région promotrice d'un gène GAL4 se trouve alors stériquement proche de la machinerie transcriptionnelle et grâce à son domaine transactivateur (GALTA), il augmente la fréquence avec laquelle la transcription est initiée sur le gène adjacent, probablement par des interactions avec l'ARN polymérase ou des protéines associées Le principe du système double-hybride consiste à fusionner séparément GALDB et GALTA à deux protéines X et Y différentes qui, lorsqu'elles interagissent, reconstituent un complexe transcriptionnel actif
2) Criblage des levures par la technique PCR (Polymérase Chain Reaction)
Le criblage a été fait directement sur les levures. Chaque colonie de levures est mise en solution dans 10 μl d'eau contenant 0,08% de Tween 20. Le Tween est un détergent non ionique qui permet d'augmenter la lyse des levures lors de la première étape de chauffage à 95°C. Pour les étapes ultérieures, le Tween 20 agit comme un agent protecteur de la Taq ADN polymérase. La suspension de levures est complétée à un volume final de 20 μl contenant les quantités ou les concentrations finales suivantes : 10 picomoles d'amorce 1, 10 picomoles d'amorce 2, 1 unité de Taq ADN polymérase, 75 mM de Tris pH9, 20 mM de (NH4)2SO4, 0,01% de Tween 20, 2,5 mM de MgC12 et 125 μM de chacun des 4 désoxyribonucléotides (dATP, dTTP, dGTP et dCTP). A l'issue de la PCR, une fraction du mélange est analysée sur un gel d'agarose. On peut ainsi savoir, pour un couple donné d'amorces et pour chaque clone de levure, s'il s'agit d'une séquence d'ADN déjà identifiée.
3) Préparation des ADNs plasmidiques.
Les grandes quantités d'ADN sont préparées en utilisant le Kit de préparation rapide d'ADN de Proméga.
Les petites quantités d'ADN sont préparées de la manière suivante: les bactéries contenant le plasmide sont cultivées pendant au moins 4 heures dans 2ml de milieu LB dans un shaker à agitation. Elles sont ensuite centrifugées pendant 2 minutes à 14000 rpm dans des tubes Ependorf, puis le culot est remis en suspension dans lOOμl de la solution I (50mM de glucose, 25mM de tampon Tris HCl pH8, lOmM EDTA pH8), lysées par 200μl de la solution II (0.2M de NaOH, 1% de SDS). La solution de lyse est ensuite neutralisée par 150μl de la solution III (3M d'acétate de potassium, 1 1.5% (v/v) d'acide acétique glacial). Après agitation des tubes jusqu'à obtenir un précipité floconneux, 150μl d'un mélange de phénol/Chloroforme (50% de phénol et 50% de chloroforme saturés en eau) sont ajoutés, et l'ensemble est agité 30 secondes. La phase aqueuse contenant l'ADN est récupérée après centrifugation pendant 2 minutes à 14000 rpm. L'ADN est ensuite précipité par addition de 0,5 volume d'isopropanol puis centrifugé 5 minutes à 14000 rpm et séché à l'air pour enfin être repris dans 20μl
de TE RNAse (solution de Tris-HCl lOmM et d'EDTA ImM avec 50μg/ml de RNAse).
4) Synthèse et Amplification enzymatique d'ADN ou PCR (Polymérase Chain Reaction)
Les réactions de PCR sont effectuées dans un volume final de lOOμl en présence de la matrice d'ADN, de dNTP (0,2mM), de tampon PCR (Tris-HCL pH 8,5 10 mM, MgCl2 ImM, KC1 5 mM, gélatine 0,01%), de 0,5 μg de chacun des oligonucléotides et de 2,5 UI d'Ampli Taq DNA polymérase (Perkin Elmer) avec ou sans formamide (5%) Le mélange est recouvert de 2 gouttes d'huile de paraffine pour limiter l'évaporation de l'échantillon L'appareil utilisé est le "Crocodile II" d'Appli gène
Nous avons utilisé une température de dénaturation de la matrice de 90°C, une température d'hybridation des oligonucléotides à la matrice inférieure de 5 à 10 degrés à la température de séparation des oligonucléotides et une température d'élongation par l'enzyme à 72°C
Les fragments obtenus par PCR, servant pour des clonages sont systématiquement resequencé une fois clone, de manière à vérifier l'absence d'éventuelle mutation apparue lors de l'amplification
Les oligodeoxynucléotides sont synthétises chimiquement selon la méthode des phosphoramidites en utilisant des groupements protecteurs β-cyanoéthyles (Sinha 1984) Apres synthèse, les groupements protecteurs sont éliminés par traitement à l'ammoniaque et deux précipitations au butanol permettent de purifier et de concentrer les oligodeoxynucléotides (Sawadogo, 1991) La concentration en ADN est déterminée par mesure de la densité optique à 260 nm
5) Ligatures
Toutes les réactions de ligature sont effectuées à +14°C pendant une nuit dans un volume final de 10 μl en présence de 100 à 200 ng de vecteur, 0 5 à 2 μg d'insert, 40 UI d'enzyme T4 DNA ligase (Biolabs) et un tampon de ligature (Tris-HCl 50 mM pH 7,8, MgC*i2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM) Le témoin négatif est constitué par la ligature du vecteur en l'absence d'insert
Le remplissage des extrémités 5' proéminentes est effectué le cas échéant avant ligature par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'£. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant
6) Transformation des bactéries
La transformation des bactéries par un plasmide est effectuée selon le protocole suivant La totalité du volume de ligature (lOμl) est utilisée pour transformer les bactéries TGl rendues compétentes par la méthode de Chung et al, ( PNAS, 1988 86, 2172-2175).
Les bactéries TGl sont mises en culture dans un milieu LB liquide pendant quelques heures dans une étuve à agitation à 37°C, jusqu'à obtenir une DO de 0,6 à 600nm Le milieu est ensuite centrifugé à 6000 rpm pendant 10 mn Les bactéries sont rendues compétentes en reprenant le culot bactérien avec un volume de TSB (milieu LB + 100 g/1 de PEG 4000, 5% de DMSO, 10 mM de MgCl2, 10 mM de MgSO/Q correspondant à 1/10 du volume du milieu de la culture initiale Après incubation à 4°C pendant 30 à 60 minutes, 200μl de bactéries sont mises au contact des produits de ligature pendant 15 minutes sur la glace Apres addition de 200μl de LB, les bactéries sont incubées 30 mn à 37°C puis étalées sur un milieu LB + ampicilline
7) Séparation et extraction des ADN
La séparation des ADN est réalisée en fonction de leur taille par électrophorese Pour ce faire, différents gels sont utilisés en fonction de la taille des fragments à séparer
-gel d'agarose à 1% (Gibco BRL) dans un tampon TBE (Tris base 90mM,
Borate 90mM, EDTA 2mM) pour la séparation de grands fragments d'ADN (supérieurs à 500pdb)
-gel d'agarose NuSieve à 2% (FMC Bioproducts) dans un tampon TBE pour la séparation de petits fragments (inférieurs à 500 pdb)
Toute migration sur gel d'agarose ou sur gel de polyacrylamide est réalisée dans un tampon TBE et en présence d'un marqueur de poids moléculaire (1Kb ladder, Gibco BRL) L'ADN est mélangé avec 1/10 du volume du bleu de dépôt (200g/l de Ficoll,
0,5g l de bleu de bromophénol, 50mM d'EDTA) avant d'être déposé sur gel Après
migration à 100 Volts et coloration au bromure d'éthydium (concentration 0.5μg/ml de gel), les bandes sont visualisées sous la lampe à UV
L'extraction de l'ADN de la bande d'un gel d'agarose est réalisée par électroélution comme suit: Le morceau de gel contenant le fragment d'ADN est découpé au scalpel et mis dans un boudin de dialyse fermé par deux pinces et contenant de 100 à 500μl de TBE. L'ensemble est mis dans une cuve à électrophorèse ou il subit un champ électrique de 100 Volts L'ADN, après être sorti du gel, est ensuite purifié par deux extractions au phénol/chloroforme suivies de deux extractions au chloroforme, puis précipité en présence d'acétate de sodium 0,3M et de 2,5 volume d'éthanol absolu Après centrifugation (5 mn à 14000 rpm) le culot d'ADN est séché puis repris dans 20μl l'eau
8) Séquençage fluorescent des ADN plasmidiques
Le séquençage est fait suivant le méthode de Sanger en utilisant 4 didéoxyribonucléotides possédant un marqueur fluorescent différent L'incorporation de l'un de ces didéoxyribonucléotides produit un arrêt dans la réplication par la Taq polymérase de l'ADN à séquencer Cette réaction donnera des fragments d'ADN de tailles différentes, tous terminés en 3 ' par un des 4 didéoxyribonucléotides Un μg d'un plasmide et 4 picomoles d'un primer sont ajoutés à 9,5μl d'un "prémix" fourni par Applied Biosystems sous le nom de Prism Le volume final doit être de 20μl pour effectuer une PCR pendant 25 cycles se décomposant en une étape de dénaturation à 96°C pendant 30 secondes, une étape d'hybridation à 50°C pendant 15 secondes et une étape d'élongation a 60°C pendant 4 minutes
Les fragments d'ADN, obtenus après amplification, sont purifiés sur colonne d'exclusion (Chromaspin-30 de Clontech), et sont ensuite séchés au Speed Vac L'ensemble est repris par 5μl d'un mélange formé de 24μl d'EDTA (50mM) et 120μl de formamide désionisée Après dénaturation à 96°C pendant 3 minutes, 3 à 5μl sont déposés sur un gel d' électrophorèse Les différents fragments d'ADN sont séparés suivant leur taille et vont passer successivement devant un lecteur laser de l'Appareil 370 DNA séquencer (Applied Biosystems) où les différentes fluorescences vont être détectées
9) Préparation de plasmides de la banque de poumon (Clontech®)
La banque de fusion d'ADNc de poumon est vendue sous forme de bactéries. Cette banque provient du clonage, au niveau du site EcoRI-Xhol du plasmide pGAD424 (Matériel et Méthodes), d'ADNc correspondant aux ARN totaux de cellules de poumon humaines.
Après vérification du titre de la banque, 2μl de bactéries de la banque de fusion de poumon, mises au préalablement dans 8 ml de LB, sont étalées de façon non confluente sur un milieu solide afin de garder la représentativité de cette banque. Nous
2 avons ainsi étalé 16 boites de 770 cm contenant un milieu LB+ampicilline. Les colonies apparues sont reprises pour chacune des boites avec 30ml de LB+ampicilline liquide. Les suspensions obtenues sont ensuite mises dans un Erlen et mises à incuber dans un shaker à 37°C pendant 3 heures. L'ADN est ensuite extrait de ces souches par la technique de la Maxiprep. La concentration en ADN sera déterminée à 260nm.
10) Transformation de la levure par un plasmide.
Les levures préalablement cultivées dans 100ml de milieu liquide sont récoltées après centrifugation à 3000 rpm pendant 3 minutes et mises en suspension dans 1ml d'eau stérile. Après centrifugation à 3000 rpm pendant 3 minutes le culot cellulaire est remis en suspension dans 1 ml d'eau stérile puis centrifugé à nouveau. Cette opération est répétée une nouvelle fois afin d'éliminer toute trace du milieu de culture. Les levures sont ensuite reprises par 1 ml de la solution I de transformation (LiAc 0.1M, Tris-HCl pH 7,5 lOmM, EDTA ImM). puis centrifugées à 3000 rpm pendant 3 minutes. Le culot cellulaire est repris à nouveau dans 1 ml de la solution I de transformation. 50μl de cette suspension de levures sont mis en présence de 50μg d'ADN de sperme de saumon et de 1 à 5 μg d'ADN plasmidique. 300μl d'une solution II de transformation (LiAc 0.1 M, Tris-HCl pH 7,5 lOmM, EDTA ImM dans du PEG40OO 40%) sont ensuite ajoutés, puis l'ensemble est mis à incuber à 28°C pendant 30 minutes. Un choc thermique est ensuite appliqué sur le mélange de transformation dans un bain-marie à 40°C pendant 15 minutes puis l'ensemble est centrifugé à 15000 rpm pendant 1 mn afin de récolter le culot cellulaire. Ce culot est repris dans 200μl d'eau puis étalé sur un milieu minimum gélose ne contenant pas les acides aminés correspondant aux marqueurs apportés par le plasmide transformant. Les levures sont ensuite mises à cultiver pendant 72 heures à 28°C.
Dans le cas particulier de la tranformation de la levure par la banque d'ADNc de poumon, on procède comme suit.
La levure utilisée contient le plasmide pGAL4DB-GAX exprimant la protéine GAX sous forme fusionnée au domaine de liaison à l'ADN de GAL4. Elle est cultivée dans
7 250ml de milieu minimum YPG à 28°C sous agitation jusqu'à une densité de 10 cellules/ml. Les cellules sont récoltées par centrifugation à 3000rpm pendant 10 minutes et reprises dans 250ml d'eau. Après une nouvelle centrifugation le culot cellulaire est repris dans 100ml d'eau et à nouveau centrifugé. Le culot est alors repris dans 10ml de la solution I de transformation et incubé pendant 1 heure à 28°C sous agitation. Après centrifugation les cellules sont à nouveau reprises dans 2,5 ml de la solution I de transformation, de 100 μl de la banque d'ADNc de poumon et de 20 ml de la solution II de transformation, puis incubées pendant 1 heure à 28°C sous agitation. Un choc thermique est effectué sur ce mélange de transformation à 42°C pendant 20 minutes. Une centrifugation (3000 rpm pendant 5mn) est répétée 3 fois de suite, en reprenant à chaque fois le culot avec 10 ml d'eau stérile. La troisième fois le culot est repris avec 2,5 ml de PB S. Ainsi le PEG toxique pour les cellules a été éliminé. 2,4 ml de cette suspension sont utilisés pour ensemmencer 250 ml de milieu minimum contenant les acides aminés His, Lys,Met et les bases Ura et Ade et cultivés durant une nuit dans un shaker à 28°C. Les 100 μl de cette suspension restants servent à vérifier l'efficacité de la transformation; pour cela des dilutions de 10 -2 , 10 -3 et 10 -4 de cette suspcffsion ont été réalisées. La culture" de nuit est centrifugée (30ÔO- rpm pendant 5 mn) et lavée à l'eau stérile deux fois de suite. Le culot est ensuite repris dans 2,5 ml d'eau. 2,4 ml, dont le volume est amené à 10ml dans de l'eau stérile, sont utilisés pour ensemencer 10 boites de 435 cm 2 contenant un milieu
YNB+Lys+Met+His+Ade, et mis à incuber pendant 3 jours. Les 100 μl restants sont utilisés pour effectuer les mêmes opérations que lors de la détermination du taux de transformation, afin de déterminer le taux d'amplification du nombre de colonies au cours d'une nuit de culture.
11) Préparation de L'ADN (génomique et plasmidique) de levure
La valeur d'une anse moyenne d'un clone de levure est mise dans 200μl d'une solution TELT (Triton XI 00 2%, SDS 1%, NaCl lOOmM, Tris pH8 lOmM, EDTA ImM), en présence de 3g de billes de verre de 450 μm de diamètre et de 200μl de phénol/chloroforme. Ce mélange est vorîcxc pendant 15 minutes, puis centrifugé pendant 2 minutes à 14000 rpm. Le surnageant est collecté sans prélever la galette protéique et l'ADN contenu dans cette phase est précipité avec 2,5 volumes d'éthanol absolu. Après centrifugation pendant 2 minutes à 14000 rpm, le culot d'ADN est
séché et repris dans 20μl de TE-RNAse Cette solution d'ADN, qui correspond à un mélange d'ADN génomique et plasmidique, sert directement à transformer des bactéries. Seul l'ADN plasmidique est capable de se répliquer dans les bactéries et peut être analysé par la technique de miniprep
12) Test d'activité de la β-galactosidase
Une feuille de nitrocellulose est préalablement déposée sur la boite de Pétri contenant les clones de levure individualisés Grâce au phénomène d'adsorption on obtient une image fidèle de l'emplacement des clones Cette feuille est ensuite plongée dans l'azote liquide pendant 30 secondes afin de faire éclater les levures et de libérer ainsi l'activité β-galactosidase Après décongélation, la feuille de nitrocellulose est déposée, colonies vers le haut, dans une autre boite de Pétri contenant un papier Whatman préalablement imbibé de 1,5ml de solution PB S (Na2HPO4 60mM, NaH2PÛ4 40mM, KC1 lOmM, MgSθ4 ImM, pH7) et de 10 à 30μl de X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indoyl-b-D- galactoside) à 50mg/ml dans du N,N-diméthylformamide La boite est ensuite placée dans une étuve à 37°C couvercle fermé pour éviter le dessèchement Le temps d'apparition de la couleur bleue peut être très variable, de quelques minutes à plusieurs heures Ce test doit toujours se faire en présence d'un témoin positif dont l'interaction est connue et vire rapidement au bleu
13) Construction des vecteurs d'expression et du gène reporter a) Vecteurs d'expression
Le cDNA du récepteur aux oestrogènes (ER) est obtenu par transcription inverse (RT) à l'aide d'un kit commercial (first strand cDNA synthesis Kit de Pharmacia), à partir d'ARN total extrait d'utérus de souris, suivie d'une amplification par PCR Nous avons utilisé un couple d'amorces spécifiques s'hybridant, en 5' avec les 20 premiers nucleotides de ER et introduisant un site EcoR I juste en amont du premier codon (5'- gagcgααt/cATGACCATGACCCTTCACAC SEQ ID N°6, les nucleotides en italique représentent le site EcoR I et en capitales soulignées le premier codon), du côté 3' l'amorce retour débute au codon stop de ER et introduisant également un site EcoR I (5'- gagcgaattc ACTGATCGTGTTGGGGAAGC SEQ ID N°7, les nucleotides en italique représentent le site EcoR 1 et en capitales soulignées le codon stop) Le fragment PCR obtenu a été purifié, digéré par EcoRI puis clone au même site dans le vecteur d'expression pCDNA 3 (Invitrogen) Ce vecteur est appelé pCMV-ER. Les
différents mutants de délétions de GAX fusionnés au domaine de liaisons à l'ADN de GAL4 (pCMV-GALDB/GAX, voir exemple 9) ont également été clones dans le vecteur pCDNA 3
b) Gène reporter
Le gène reporter a été construit selon la stratégie décrite par Martinez et al (Martinez et al 1991, o/. Cell. Bwl. 1 1,2937-2945) excepté que le vecteur de clonage utilisé est le pG5CAT (Clontech, CAT = Chloramphenicol Acetyl Transférase). Nous avons synthétisé un oligonucléotide double brin ( ci dessous) contenant deux sites spécifiques (en caractères gras) l'un reconnu par le domaine de liaison à l'ADN de GAL4 (Gal- 17mer, Carey et al 1989, J. Mol. Bwl. 209,423-432) et l'autre est une séquence consensus du "Estrogen Responsive Elément" (ERE, Beato M 1989, Cell 56,335- 344) qui lie le récepteur aux oestrogènes Cet oligonucléotide adaptateur possède en 5' un site Xhol protrusif et en 3' un site Xbal qui ont permis le clonage dans les sites Xho I et Xba I de pG5CAT
SEQ ID N°8
tcgagAGGTCATATTGACCTaagcttCGGGTCGGAGTACTGTCCTCCGACTGCcatatgt cTCCAGTATAACTGGAttcgaaGCCCAGCCTCATGACAGGAGGCTGACGgtatacagatc Xhol ERE Ga.l-17mex Xba. I
Le principe de ce gène reporter (pEREGICAT, Fig 4, exemple 1 1)) repose sur le fait que ER est un activateur transcriptionnel possédant, dans le cas du ER murin, une activité constitutive qui augmente en réponse à son ligand naturel, l'oestradiol 17-β Ce système a été utilisé par Matinez et al pour étudier la synergie entre ER et un second facteur transcriptionnel, NFl, dont le domaine activateur de la transcription a été fusionné au domaine de liaison à l'ADN de la protéine de levure GAL4 (GALDB) Ce reporter permet, ainsi, de rendre compte du taux de transcription dû uniquement a l'un ou l'autre des facteurs transcriptionnels ou de leur coopération sans interférence due à des molécules endogènes Ce système nous permet donc d'étudier l'activité transcriptionnelle de toute ou partie de la protéine GAX fusionnée au GALDB (Fig 5,6 et exemples 12, 13)
Un plasmide exprimant le gène de la luciférase sous le contrôle du promoteur CMV (pCMV-Luc) a été construit. Cette construction a été obtenue après clonage d'un fragment de PCR (flanqué en 5' et en 3' d'un site BamHI) contenant le promoteur CMV du vecteur pCDNA3 (Invitrogen), dans le site BglII du vecteur pGL3 -Basic (Promega). Ce plasmide servira de standard interne dans toutes les expériences de transfection transitoire qui suivent.
14) Expériences de cotransfection transitoire
Toutes les études ont été réalisées dans les fibroblastes embryonnaire murins NIH-3T3 (ATCC) Ces cellules ont été entretenues en routine dans du DMEM (GIBCO) supplémenté avec 100 U/ml de pénicilline (GIBCO), 100 μg/ml de streptomycine (GBCO), 2 mM L-glutamine (GBCO) et 10% de sérum de veau foetal (SVF,GIBCO) Ce milieu sera désigné par l'abbréviation DMEM-GPS/SVF.
Pour les expériences de transfection transitoire les NIH-3T3 sont ensemencées à une densité de 100000 cellules par puit d'une plaque de culture de 24 puits (Falcon), dans un volume de 1ml de DMEM-GPS/SVF 16 à 20 heures plus tard, après attachement et étalement des cellules, les ceiiuies sont lavées avec 0,5 mi de DMEM-GPS (sans SVF) puis remises dans 0,5 ml de DMEM-GPS 50 μl d'un mélange de transfection sont ensuite ajoutés par puit de culture Ce mélange est obtenu comme le résume le tableau 3 ci dessous
Tableau 3 *Les différents mélanges, numérotés de 1 à 4, sont conçus pour étudier respectivement, l'activité basale du promoteur EREGICAT, l'activité de ER ou de GADB/GAX seuls et enfin l'effet simultané de ER et de GALDB/GAX.
** pCDNA3 est utilisé pour compléter chaque mélange à 10 μg total
*** La lipofectamine à 2 μg/μl (gibco) est utilisée à un rapport de 8/1
(lipofectamie/ADN)
Les cellules sont mises en contact avec les différents mélanges de transfection pendant 4 heures à 37°C dans les conditions standard de culture Le DMEM-GPS, avec le mélange de transfection, est ensuite remplacé par 1 ml de DMEM-GPS/SVF puis les cellules sont maintenues en culture pendant 24 heures Chaque transfection est effectuée sur au minimum 4 puits
A la fin de la période de 24 heures, les cellules sont lavées avec 0,5 ml de Dulbecco's PBS (GIBCO) puis récoltées dans 0,5 ml d'une solution de trypsine 0,2% dans du PBS (GIBCO) La trypsine est neutralisée par 10 μl de SVF Cette suspension cellulaire est centrifugée pendant 2 min à 10000 g, le surnageant est retiré puis les cellules sont resuspendues dans 150 μl de Tris-HCl 0,25 M à pH 7,8 50 μl de cette suspension sont utilisés pour doser l'activité luciférase selon le Kit "luciferase Assay System" (Promega) et à l'aide du luminometre LUMAT LB 9501 (EG&G Berthold) Les protéines cytosoliques des cellules dans les 150 μl restants sont extraites par 5 cycles de congélations/décongélation (azote liquide/37 |C) Ces extraits, normalisés par rapport à l'activité luciférase, sont ensuite utilisés pour doser l'activité CAT selon la méthode précédemment décrite par Gorman et al (Gorman et al 1982, Mol. Cell. Bwl. 5, 1044-1051)
15) Interaction in vitro entre les protéines Ki et GAX
Elle est réalisée par la méthode du Far- Western Blotting Alors que le Western Blotting consiste en une séparation électrophorétique de protéines sur un gel dénaturant suivi d'un électrotransfert des protéines sur une membrane de nitrocellulose et d'une immunodétection directe ou indirecte, le Far- Western Blotting est un Western Blotting auquel est ajouté une étape d'interaction protéine-protéine entre une cible immobilisée sur la membrane de nitrocellulose et un facteur en solution
a) Electrophorèse
Les échantillons sont chauffés 10 minutes à 95°C dans un tampon de dénaturation pour protéines contenant 50 mM de Tris pH6,8, 2% de SDS (Sodium Dodécyl Sulfate), 10%> de glycérol, 300 mM de b-mercaptoéthanol et 0,1% de bleu de bromophénol 10 ml des échantillons sont déposés sur un gel Tris-Glycine 14% Acrylamide (Tris-Glycine Gels, Novex) La migration se fait pendant 1 heure à un voltage constant de 120 V dans un tampon de séparation pour protéines (35 mM de SDS, 1,92 M de Glycine et 85 mM de Tris pH8,3) Le poids moléculaire des protéines sera déterminé par la migration en parallèle d'un standard de poids moléculaire coloré et transférable (MultiMarkTM Multi-Colored Standard, Novex) Ce gel est fait en double pour pouvoir en parallèle colorer l'un des deux au bleu de Coomassie (Méthanol 30%, eau 60%, Acide acétique 10%, Bleu de Coomassie 0, 1%) La coloration est de 1 heure La décoloration s'effectue, pendant plusieurs heures, en changeant plusieurs fois la solution décolorante (Méthanol 30%, Acide acétique 10%, eau 60%) La limite de détection de cette méthode est de 50 ng de protéines Ce gel coloré nous permet donc de visualiser toutes les protéines déposées L'autre gel est utilisé pour le "Far- Western Blotting"
b)Transfert semi-sec sur une membrane de nitrocellulose La membrane de nitrocellulose (Hybond C de Amersham) et le gel sont pris entre 3 épaisseurs de papier Whatman préalablement immergé dans le tampon de transfert (Glycine 150 mM, Tris 25 mM, Méthanol 20%, eau qsp 1 litre, pH8,3) Le transfert s'effectue pendant 40 minutes à 2,5 mA/cm2 de gel (appareil MilliblotTM-Graphite Electroblotter II, Millipore)
c) Interaction protéine-protéine
La membrane est saturée pendant 30 minutes sous agitation et à température ambiante dans du PBS contenant 5% (p/v) de lait écrémé en poudre (Gloria) et 0,2% (v/v) de Tween 20 Ensuite, elle est immergée pendant 1 heure sous agitation et à température ambiante dans 5 ml de PBS contenant 5% (p/v) de lait écrémé en poudre (Gloria), 0,2% (v/v) de Tween 20 et 75 μg de KI L'incubation terminée, la membrane est lavée 3 fois pendant 10 minutes dans du PBS contenant 0,2% (v/v) de Tween 20 Afin de viualiser l'interaction entre GST-GAX immobilisé sur la membrane de nitrocellulose et mycKi, celui ci est révéler comme pour GST-GAX à l'aide d'un anticorps monoclonal
de souris dirigé contre l'épitope myc (Santa Cruz) et d'un anticorps polyclonal de lapin couplé, à la peroxidase, dirigé contre les IgG de souris (Nordic Immunology)
EXEMPLES
EXEMPLE 1: Construction d'un vecteur permettant l'expression d'une protéine de fusion entre GAX et le domaine de liaison à ['ADN de GAL4
Le criblage d'une banque utilisant le système double hybride nécessite que la protéine GAX soit fusionnée au domaine de liaison à l'ADN de la protéine transactivatrice GAL4 L'expression de cette protéine de fusion est réalisée grâce au vecteur pGBTIO (cf matériels et méthodes), dans lequel nous avons introduit, dans le même cadre de lecture que la séquence correspondant au domaine de liaison à l'ADN de GAL4 (GAL4DB), un fragment codant pour tout ou partie de la protéine GAX Un fragment particulier comprend le fragment EcoRl-Sall issu de phGAX, qui est inséré au niveau du site EcoRl-Sall de pGBTIO pour donner le plasmide pCM199
La construction a été séquencée ce qui permet de vérifier que la protéine GAX est bien dans la même phase ouverte de lecture que celle du fragment correspondant au GAL4DB
EXEMPLE 2: Criblage de la Banque de fusion de poumon.
Le criblage d'une banque de fusion permet d'identifier des clones produisant des protéines fusionnées au domaine transactivateur de GAL4, pouvant interagir avec la protéine GAX ou des domaines de celle-ci Cette interaction permet de reconstituer un transactivateur qui va alors être capable d'induire l'expression des gènes rapporteurs URA3, BLE et LacZ dans la souche YCM79 Pour effectuer ce criblage nous avons choisi une banque de fusion réalisée à partir d'ADNc provenant de poumon humain Comme cette banque nous a été fournie sous forme de bactéries, l'ADN plasmidique de la banque a tout d'abord été purifié
2 1 ) Préparation de l'ADN plasmidique d'une banque de fusion
L'ADN plasmidique de la banque d'ADNc de poumon a été extrait suivant le protocole Clontech (voir matériels et méthodes, § 10) Lors de cette préparation il était important de préserver la représentativité de la banque, c'est à dire, conserver le nombre de plasmides indépendants qui la constitue et qui sont au nombre de 7 10 plasmides
Afin de nous préserver de la perte de plasmides de la banque au cours de cette préparation, le lot d'ADN plasmidique que nous avons constitué a été obtenu à partir d'un nombre de colonies bactériennes isolées correspondant à un peu plus de trois fois la représentativité de la banque soit 25 10 colonies
2 2) Transformation par banque de poumon et sélection par le test d'activité beta- galactosidase
Lors du criblage il est nécessaire de préserver la probabilité que chaque plasmide indépendant de la banque de fusion soit présent dans au moins une levure en même temps que le plasmide GAL4DB-GAX Pour préserver cette probabilité il est important d'avoir une bonne efficacité de transformation de la levure Pour cela nous avons choisi un protocole de transformation de la levure donnant une efficacité de 10 cellules transformées par μg d'ADN De plus comme la cotransformation de la levure par deux plasmides différents réduit cette efficacité, nous avons préféré utiliser une levure préalablement transformée par le plasmide pGAL4DB-GAX Cette souche de levure a été transformée par l OOμg d'ADN plasmidique de la banque de fusion Cette quantité d'ADN nous a permis d'obtenir après estimation (voir matériels et méthodes) 4,2 10 cellules transformées, ce qui correspond à un nombre supérieur au nombre de plasmides indépendants que constitue la banque D'après ce résultat nous pouvons penser que la quasi totalité des plasmides de la banque a servi à transformer les levures La sélection des cellules transformées, capables de reconstituer un transactivateur GAL4 fonctionnel, a été faite sur un milieu YNB+Lys+Met+His+Ade A l'issu de cette sélection 190 clones avec un phénotype Ura+ et bGal+ ont été obtenus
EXEMPLE 3: Identification des inserts des plasmides sélectionnes : Mise en évidence d'une interaction avec Ki
Les plasmides sont extraits de la levure, introduits dans la bactérie puis préparés comme décrit dans la partie matériels et méthodes. Le séquençage a été réalisé à partir de 1 Oligonucléotide CTATTCGATGATGAAGATACCCC (SEQ ID N°l) complémentaire de la région de GAL4TA à proximité du site d'insertion de la banque de cDNA de poumon, à 52 pdb du site EcoRI.
La comparaison des séquences avec les séquences contenues dans les banques de données GENBank et EMBL (European Molecular Biology Lab) a montré qu'un des plasmides ainsi identifiés comporte un ADNc identique au facteur Ki, identifié chez des patients atteints de lupus comme autoanti gène. Ce plasmide est baptisé pCM282 Ce plasmide, quand il est cotransformé dans la levure avec pCM199, est bien capable d'activer les gènes rapporteurs de celle-ci comme le montre le Tableau 1 ci-dessous Ce Tableau montre en outre que l'activation est spécifique, ce qui indique que Ki est capable d'interagir de manière spécifique avec GAX
Tableau 1
EXEMPLE 4: Construction de vecteurs permettant l'expression dans la levure d'une protéine de fusion entre différents délétants de GAX et le domaine de liaison à l'ADN de GAL4
Cet exemple décrit la construction de vecteurs codant pour différents variants de la protéine Gax, utilisables pour déterminer la structure/fonction de cette protéine et notamment, mettre en évidence les domaines actifs et les domaines responsables de l'interaction avec la protéine Ki
La délétion des 153 aminoacides C-terminaux est obtenue en digérant le plasmide pCM199 par Eagl-Sall, puis le petit fragment est éliminé, les extrémités sont rendues blunt par traitement à la klenow et religuées Le plasmide ainsi obtenu est appelé pCM238 II code pour une protéine comportant les résidus 1-104 de GAX
La digestion totale par Bgl2 et Sali de pCM199 puis la religation du vecteur après traitement à la klenow permet de conserver les 32 premiers aminoacides de GAX. Le plasmide ainsi obtenu est appelle pCM244 II code pour une protéine comportant les résidus 1-32 de GAX
La digestion totale par Bgl2 et Sali de pCM199 permet d'isoler un fragment d'environ 270pb et 572pb Le premier fragment est clone dans pGBTl l au site Bamhl-Sall pour obtenir le plasmide pCM245 qui permet la fusion des 79 aminoacides C-ter avec le GAL4DB Le second fragment est clone dans pGBTIO au site Bamhl pour obtenir le plasmide pCM246 qui permet la fusion des aminoacides 33 à 222 avec le GAL4DB
Le plasmide pCM280 est obtenu en digérant pCM246 par Dra3 et pstl Apres traitement a la T4 polymérase le plasmide est refermé sur lui même II code pour une protéine comportant les résidus 33-63 de GAX
Le plasmide pCM199 est digéré par Ndel et Pstl L'insert est clone dans le plasmide pAS l pour donné le plasmides pCM301 Ce plasmide permet l'expression de la protéine GAX délétée de ces 32 premiers aminoacides fusionnée au GAL4DB II code pour une protéine comportant les résidus 33-302 de GAX
La structure de la protéine de fusion exprimée par ces différents vecteurs est représentée sur la figure 1
EXEMPLE 5: Localisation de la zone d'interaction de GAX avec KL
La souche de levure yCM79 est transformée par les différents vecteurs décrits dans les exemples 1 et 4 en même temps que pCM282 ou que pGAD424 L'activité Beta- gal est révélée comme décrit dans le matériel et méthodes Les résultats obtenus sont présentes dans le Tableau 2 ci-dessous
Tableau 2
Ces résultats permettent de révéler la région de GAX qui interagit avec le facteur Ki (Tableau 2) En effet, les régions faisant perdre l'activité par leur absence permettent de conclure qu'elles sont nécessaires à l'interaction mais non suffisantes Ainsi les régions 1 a 32 et 104 a 223 semblent importantes pour l'interaction avec Ki Le fait que pCM238 ne donne pas de signal positif en Beta-gal, suggère qu'il existe une région C-Term 104-302 de Gax nécessaire à l'interaction en levure
EXEMPLE 6 : Profil d'expression de l'ARNm dans différents tissus et localisation nucléaire de la protéine exprimée transitoirement:
Afin d'identifier des partenaires de GAX nous avons transformer notre souche de levure double hybride, possédant déjà le plasmide permettant l'expression de la fusion GAL-GAX (1-302) comme appât, par une banque d'ADNc de poumon fusionnée au GAL4 TA, disponible au laboratoire (exemple 2) Nous avons pu obtenir avant amplification plus de 41 millions de clones indépendants et seulement 190 clones dans lesquels les trois gènes de sélection (î e le gène URA3, le gène LacZ et le gène BLE) sont exprimes 9 ADNc codant pour des protéines différentes ont pu être identifies parmi ces 190 clones Nous nous sommes plus particulièrement interesses a celui codant pour l'antigène Ki
Le gène Ki semble ubiquitaire comme le suggère l'analyse par northern blotting (Figure 1 ) de son expression a partir des mRNA extrait de différents tissus (human Multiple Tissu Northern Blots, Clontech) ievelant un mRNA d'environ 3 kb On peut noter la présence d'une forme de mRNA subissant une maturation différente ( 1 ,4 kb) dans le coeur et les muscles squelettiques
La construction d'un vecteur permettant l'expression de la protéine Ki fusionnée au tag HA dans les cellules de mammifère a ete réalise de la manière suivante le fragment Nco l -Xho l du plasmide pCM282 est insère dans le plasmide pAS l au niveau des sites Nco l -Xho l pour obtenir le plasmide pCM322 Puis le fragment EcoRl -Dra l du plasmide pCM322 est insère dans le vecteur d'expression pCDNA3 au niveau des sites EcoRl-EcoRV Le plasmide obtenu, pCM323 permet l'expression de la protéine ki fusionnée au tag HA dans les cellules de mammifère
Par îmmunofluorescence indirecte il est montre que KiHA a une localisation nucléaire dans des cellules transfectees par cette chimère (Figure 2)
EXEMPLE 7: Expression et purification de la protéine Ki fusionnée au tag S et tag yc
Les oligos suivants sont hybrides ensemble, phosphoπles puis ligues avec pET29B préalablement digère par Nco 1
CATCAAGCTTATGGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGCAGCTTC (SEQ ID N°2) et CATGGATCCACGTGCAGGTCCTCCTCGGAGATCAGCTTCTGCTCCATAAGC
TT (SEQ ID N°3)
Le plasmide obtenu est nomme pCM320 Le gène codant pour la protéine Ki est amplifie par PCR avec les oligos CGCGGATCCCATGGCCTCGTTGCTG (SEQ ID N°4) et GTAGAGCTCGAGTCAGTACAGAGTCTCTGC (SEQ ID N°5) Le fragment obtenu est digère par Bamhl Xhol puis introduit, après ligation, aux sites bamHl-Xhol du plasmide pBCks pour donner le plasmide pCM305 Ce dernier est ensuite digère par Bamhl Xhol L'insert ainsi libère est ligue au site Bamhl et Xhol de pCM320 pour donner le plasmide pCM321 L'expression et la purification de la protéine recombinante sont réalisées suivant les indications du fournisseur (Novagen) a partir de pCM321
EXEMPLE 8: Expression et purification de la protéine GAX fusionné à la GST
Des colonies de BL-21 transformées par le plasmide pGEX-2T-h-GAX sont mises en preculture dans 30 ml de LB avec ampicilline (50 μg/ml) a 37°C toute la nuit 5 ml de cette preculture sont remis en culture dans 500 ml de LB avec ampicilline a 37°C jusqu a une densité optique de 0,7 a 600 nm L'expression de GST-GAX est induite par 0, 1 mM d'IPTG pendant 2 heures a 30°C La culture est centrifugée a 6000 rpm pendant 10 mn Les culots de bactéries sont remis en solution dans 10 ml de PBS froid puis repartis dans 10 tubes eppendorf Les protéines bactériennes sont extraites par sonication pendant 10 minutes avec des cycles de 12 secondes et des pauses de 24 secondes suivi d'une centrifugation de 15000 rpm pendant 15 minutes Les surnageants sont regroupes et constituent la fraction soluble qui sera utilisée pour la purification Les culots restant représentent la fraction insoluble
jusqu à une densité optique de 0,7 à 600 nm. L'expression de GST-GAX est induite par 0,1 mM d'IPTG pendant 2 heures à 30°C. La culture est centrifugée à 6000 rpm pendant 10 mn. Les culots de bactéries sont remis en solution dans 10 ml de PBS froid puis répartis dans 10 tubes eppendorf. Les protéines bactériennes sont extraites par sonication pendant 10 minutes avec des cycles de 12 secondes et des pauses de 24 secondes suivi d'une centrifugation de 15000 rpm pendant 15 minutes. Les surnageants sont regroupés et constituent la fraction soluble qui sera utilisée pour la purification. Les culots restant représentent la fraction insoluble.
La purification de GAX se fait par affinité de la GST sur des billes d'agarose couplées au Glutathion.
Le surnageant obtenu après sonication des bactéries est incubé avec la résine pendant une heure sur un agitateur rotatif à température ambiante. Ensuite, la résine sur laquelle la protéine s'est liée est centrifugée à 1000 rpm pendant 10 minutes. Le surnageant éliminé, la résine est lavée 3 fois par 50 ml de PBS contenant 1 % de Triton X-100 pendant 20 minutes sur 1 agitateur rotatif. GST-GAX peut être élue de la résine par de la guanidine thiocyanate. L élution se fait par 1,5 fois le volume de résine de 2M de guanidine thiocyanate, de 20 mM de Tris pH7,5, de 0, 15 M de NaCl et de 0, 1 % de Triton X-100 sur un agitateur rotatif pendant 30 minutes. L'éluat est dialyse contre du PBS toute la nuit pour éliminer la guanidine thiocyanate. La protéine est conservée dans du PBS à 4°C. Un cocktail d inhibiteurs de protéases à quantité égale (Leupeptine lmg/ml, Pepstatine lmg/ml, Aprotinine l mg/ml. Benzamidine 500 mM) est ajouté au 1/200 ème à la préparation protéique.
EXEMPLE 9 : Interaction in vitro entre les protéines Ki et GAX
Pour étudier l'interaction de GAX et de Ki in vitro, nous avons produits deux protéines recombinantes chimériques dans Escherichia Coli. GST-GAX a été purifiée sur une résine couplée au glutathion grâce au site catalytique de la glutathione S- transférase (GST); SmycKi portant un épitope myc et l'épitope S permettant la purification sur une résine couplée à la protéine S.
Les quantités indiquées d'albumine bovine, de la protéine GST ou de GST-GAX après digestion par la thrombine (site créé entre GST et GAX),, ainsi que des
quantités croissantes de GST-GAX, ont été séparées sur un gel dénaturant de polyacrylamide puis colorées au bleu de coomassie (Figure 3 A).
Les protéines ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose à partir d'un gel identique à celui en A. La membrane a été incubée successivement en présence de SmycKi, dans une solution contenant un anticorps monoclonal de souris dirigé contre l'épitope myc (Santa Cruz) et finalement dans une solution pour la détection de l'anticorps anti-myc.
Nos résultats montrent clairement que Ki reconnaît spécifiquement GST-GAX et de manière dose dépendente, alors qu'aucune réaction n'est observée avec l'albumine bovine ou GST. Noter qu'après digestion par la thrombine Ki interagit toujours avec GAX (Figure 3 B).
EXEMPLE 10 : Construction de vecteurs permettant l'expression dans les cellules de mammifère d'une protéine de fusion entre différents délétants de GAX et le domaine de liaison à l'ADN de GAL4
10.1. Construction de vecteurs plasmidiques
Les plasmides pCM199 et pCM301 sont digérés par HindIII. Les inserts sont clones dans la correcte orientation dans pCDNA3 (invitrogen) au site HindIII pour donner respectivement les plasmides pCM291 et pCM327, permettant l'expression des fusions dans des cellules de mammifère.
Les plasmides pCM238, pCM244, pCM301, pCM246, et pCM280 sont digérés par HindIII et Nael. Les inserts sont clones dans la correcte orientation dans pCDNA3 (invitrogen) au site HindlII-EcoRV pour donner respectivement les plasmides pCM292, pCM326, pCM327, pCM294 et ρCM295, permettant l'expression des fusions dans des cellules de mammifère.
10.2. Construction de vecteurs viraux
Selon un mode particulier, l'invention réside dans la construction et l'utilisation de vecteurs viraux permettant le transfert et l'expression in vivo des acides nucléiques tels que définis ci-avant.
S'agissant plus particulièrement d'adénovirus, différents sérotypes, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, ont été caractérisés. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande W094/26914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus preferentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.
Preferentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprennent les ITR, une séquence permettant l'encapsidation et un acide nucléique selon l'invention. Encore plus preferentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, la région E 1 au moins est non fonctionnelle. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. D'autres régions peuvent également être modifiées, et notamment la région E3 (WO95/02697), E2 (W094/28938), E4 (WO94/28152, W094/12649, WO95/02697) et L5 (WO95/02697). Selon un mode préféré de mise en oeuvre, l'adénovirus selon l'invention comprend une délétion dans les régions El et E4. Selon un autre mode de réalisation préféré, il comprend une délétion dans région El au niveau de laquelle sont insérés la région E4 et la séquence nucléique de l'invention (Cf FR94 13355). Dans les virus de l'invention, la délétion dans la région El s'étend preferentiellement des nucleotides 455 à 3329 sur !a séquence de l'adénovirus Ad5.
Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., gène 101 (1991) 195,
EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre une séquence nucléique ou une combinaison de séquences nucléiques de l'invention. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %) ou des lignées capables de complémenter les fonctions El et E4 telles que décrites notamment dans les demandes n° WO 94/26914 et WO95/02697 ou dans Yeh et al., J. Virol. 70 ( 1996) 559. Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire.
Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des AAV a été clone, séquence et caractérisé. Il comprend environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation : la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus. L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US5, 139,941, EP 488 528). Ces demandes décrivent différentes constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep et/ou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt.
Les AAV recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par co- transfection, dans un lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain (par exemple un adénovirus), d'un plasmide contenant une séquence nucléique ou une combinaison de séquences nucléiques de l'invention bordée de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV, et d'un plasmide portant les gènes d'encapsidation (gènes rep et cap) d'AAV. Une lignée cellulaire utilisable est par exemple la lignée 293. D'autres systèmes de production sont décrits par exemple dans les demandes W095/ 14771 ; W095/13365; WO95/13392 ou WO95/06743. Les AAV recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
Concernant les virus de l'herpès et les retrovirus, la construction de vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature : voir notamment Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EPI 78220, Bernstein et al. gènet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc. En particulier, les retrovirus sont des virus intégratifs, infectant sélectivement les cellules en division. Ils constituent donc des vecteurs d'intérêt pour des applications cancer. Le génome des retrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'encapsidation et trois régions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs recombinants dérivés des retrovirus; les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurs peuvent être réalisés à partir de différents types de retrovirus tels que notamment le MoMuLV ("murine Moloney leukemia virus"; encore désigné MoMLV), le MSV ("murine Moloney sarcoma virus"), le HaSV ("Harvey sarcoma virus"); le SNV ("spleen necrosis virus"); le RSV ("Rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend. Pour construire des retrovirus recombinants selon l'invention comportant une séquence nucléique nucléique ou une combinaison de séquences nucléiques selon l'invention, un plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidation et ladite séquence nucléique est construit, puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétrovirales déficientes dans le plasmide. Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée PA317 (US4,861,719); la lignée PsiCRIP (WO90/02806) et la lignée GP+envAm-12 (WO89/07150). Par ailleurs, les retrovirus recombinants peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer l'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation
étendues, comportant une partie du gène gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Les retrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
10.3 - Vecteurs chimiques
Les acides nucléiques ou les vecteurs d'expression plasmidiques décrits les exemples précédents peuvent être administres tels quels in vivo ou ex vivo. Il a en effet ete montre que les acides nucléiques nus pouvaient transfecter les cellules. Cependant, pour améliorer l'efficacité de transfert, on préfère utiliser dans le cadre de l'invention un vecteur de transfert. Il peut s'agir d'un vecteur viral (exemple 9.2.) ou d'un agent de transfection synthétique.
Parmi les vecteurs synthétiques développés, on préfère utiliser dans le cadre de l'invention les polymères cationiques de type polylysine, (LKLK)n, (LKKL)n, (PCT/FR/00098) polyéthylène imine (WO96/02655) et DEAE dextran ou encore les lipides cationiques ou lipofectants. Ils possèdent la propriété de condenser l'ADN et de promouvoir son association avec la membrane cellulaire. Parmi ces derniers, on peut citer les lipopolyamines (lipofectamine, transfectam, etc) différents lipides cationiques ou neutres (DOTMA, DOGS, DOPE, etc) ainsi que des peptides d'origine nucléaire. En outre, le concept de la transfection ciblée a été développé, médiée par un récepteur, qui met à profit le principe de condenser l'ADN grâce au polymère cationique tout en dirigeant la fixation du complexe à la membrane grâce à un couplage chimique entre le polymère cationique et le ligand d'un récepteur membranaire, présent à la surface du type cellulaire que l'on veut greffer. Le ciblage du récepteur à la transferrine, à l'insuline ou du récepteur des asialoglycoprotéines des hépatocytes a ainsi été décrit. La préparation d'un composition selon l'invention utilisant un tel vecteur chimique est réalisée selon toute technique connue de l'homme du métier, généralement par simple mise en contact des différents composants.
EXEMPLE 11 : Mise au point d'une méthode permettant l'étude de l'activité transcriptionnelle de GAX
Nous avons utilisé un système de transfection transitoire pour étudier l'activité transcriptionnelle propre aux fusions GALDB-GAX ainsi que leur effet sur des activateurs transcriptionnels comme le récepteur aux oestrogènes (ER) ou le domaine
d'activation acide de la protéine VP16 du virus Herpès simplex fusionné à GALDB. Afin de quantifier l'activité transcriptionnelle de chacun ou de la combinaison de plusieurs facteurs, nous avons construit un gène cible (Reporter) exprimant la chloramphenicol acétyle transférase bactérienne (CAT) sous le contrôle d'un promoteur artificiel. Ce promoteur contient une boite TATA, provenant du gène E1B de l'adénovirus Ad2 (E1B TATA), en amont du site d'initiation de la transcription du gène CAT (Figure 4 A). Une protéine TBP du complexe TFIID, reconnaît la boite TATA et positionne le complexe de preinitiation (TFIID + TFII A,B,E,F) lequel recrute l'ARN polymérase de type II (PolII) qui va initier la transcription du gène CAT. En amont de ce promoteur basai nous avons inséré un site de liaison GALDB (17mer) qui sera reconnu par les chimères GALDB-GAX ou GALDB-VP16. Nous avons également clone en amont du 17 mer un élément de réponse aux oestrogènes (ERE) sur lequel ER se lie pour activer la transcription. Ce reporter nous permettra d'étudier les différentes combinaisons schématisées, une activation ou une repression de la transcription se traduira par une modification de la quantité de CAT dans une cellule. Le" dosage de l'activité enzymatique CAT dans les extraits cellulaires après transfection est utilisée pour mesurer l'effet transcriptionnel.
ER et GAL4-VPÎ6 sυnLdes~activateuτs transcriptionnels très forts. L'activité CAT est augmentée de plus de 100 fois par ER et environ 85 fois par GAL4-VP16. La coexpression de ER et GAL4-VP16 résulte en une activité CAT de plus de 300 fois celle du reporter non activé et supérieure à la somme des deux activateurs exprimés individuellement. Ceci suggère que ER et GAL4-VP16, malgré l'encombrement sterique, peuvent occuper et activer le même promoteur (Figure 4 B).
EXEMPLE 12 : Etude de l'activité transcriptionnelle des fusions GALDB-GAX et identification d'un domaine répresseur de la transcription
Le gène GAX code pour une protéine de 302 acides aminés chez l'homme. La structure primaire de cette protéine présente différents domaines dont la fonction reste inconnue. GAX appartient à une famille de gènes dite à homeoboite (HOMEOBOX). l'Homeobox est nécessaire à la reconnaissance et à la liaison de ces protéines sur des séquences d'ADN spécifiques présentes sur le promoteur des gènes cibles dont ils
contrôlent l'expression. A ce jour aucune séquence d'ADN reconnue par GAX n'a été identifiée. GAX possède une région riche en résidus Histidine (HIS) dans sa partie N- terminale dont la fonction est inconnue.
Pour comprendre la fonction de GAX différentes régions du gène GAX humain ont été délétées pour produire des protéines tronquées aussi bien dans leur partie N- terminale que C-terminale, les nombres indiquent la position du premier et du dernier acide aminé de chaque mutant de délétion par rapport à GAX entier 1-302 (Figure 5). Ne connaissant pas de séquence d'ADN reconnue naturellement par GAX, nous avons créés des chimères entre les différents mutants de délétion et un domaine de liaison à l'ADN hétérologue (fusionné à leur partie N-terminale) provenant du facteur transcriptionnel de levure GAL4 (GALDB). Des vecteurs d'expression ont été construits pour exprimer transitoirement les différentes chimères dans des cellules de mammifère en culture
Les différentes chimères GAL-GAX ont été exprimées seules ou en présence de ER pour étudier leur effet respectivement sur la transcription basale ou sur l'activité transcriptionnelle de ER.
GAX entier . dans le contexte de la fusion GAL-GAX 1 -302, diminue de plus de 8 fois l'activité CAT par rapport au reporter non activé. Cette répression est faiblement affectée lorsque les 32 acides aminés N-terminaux de GAX sont absents (GAL- GAX33-302) mais elle est totalement levée lorsqu'une délétion supplémentaire supprime la partie C-terminale de GAX (GAL-GAX33-222). Ces 32 acides aminés suffisent dans le contexte de GAL-GAX 1-32 pour diminuer l'activité CAT (Figure 6 A).
La coexpression de GAL-GAX 1 -302 et de ER résulte en une activité CAT plus 25 fois inférieure à celle obtenue avec ER seul. Cette répression comme en A est due au 32 premiers acides aminés de GAX (comparer GAL-GAX1-302, GAL-GAX33-302 et GAL-GAX33-222). Ces 32 acides aminés N-terminaux (GAL-GAX 1-32) diminuent l'activité de ER seulement de 2 fois (comparer GAL-GAX 1-32, GAL-GAX 1 - 104) et nécessitent au minimum la présence des résidus 33 à 222 pour une activité maximale (Figure 6 B).
Les séquences faisant perdre l'activité lorsqu'elles sont absentes sont recherchées, permettant de conclure qu'elles sont nécessaires à l'interaction mais non suffisantes.
Les résultats présentés, montrent que GAX réprime la transcription du gène reporter utilisé. Cette répression est essentiellement due à un peptide N-terminal (1 à 32) dont l'activité optimale nécessite la présence de la région 33 à 222 de GAX et de préférence la présence de la région 33-104 de Gax.
En utilisant les différentes délétions de GAX fusionnés au domaine de liaison à l'ADN de GAL4, nous avons pu identifier dans la levure ( par le système double hybride, Exemple 5) les régions de GAX importantes pour l'interaction avec Ki. Il s'agit de la partie N-terminal jusqu'au résidu 222. Cette région comprend, comme nous l'avons montré plus haut, le domaine répresseur de GAX.
EXEMPLE 13 : Interaction in vitro entre GAX et PCNA
13.1 Clonage de l'ADNc du "Proliferating Cell Nuclear Antigen" humain (PCNA) et production d'une protéine recombinante
Le clonage de l'ADNc de PCNA est effectué par transcription reverse et PCR. La première étape de transcription reverse (RT) est réalisée avec le kit "First Strand cDNA synthesis" de Pharmacia. L'ARN total est extrait de cellules musculaires lisses humaines en culture primaire (Clonetics) selon la méthode décrite par P. Chomczynski et N. Sacchi (Anal. Biochem. 1987, 162: 156-159). 10 μg de cet ARN total est repris dans 20 μl d'eau sont chauffés 10 minutes à 65°C , refroidit sur glace puis mélangés à 1 1 μl de "Bulk First Strand reaction mix" du kit de RT (Cloned, FPLCpwre®,Murine Reverse Transcriptase, RNase/DNase-Free BSA,dATP,dCTP,dGTP, and dTTP), 1 μl de DTT et 1 μl d'amorces pD(N)6. La réaction de RT est incubée 1 heure à 37°C. La réaction est arrêtée en chauffant 5 minutes à 90°C puis refroidie sur glace.
La deuxième étape consiste en une amplification par PCR de l'ADNc PCNA. Les amorces utilisées pour la réaction PCR sont les suivantes :
- CGCGαaattcTGTTCGAGGCGCGCCTGGTCCAGG- 3 F E A R L V Q G
2 5 ' - GGTCσaattcTAAGATCCTTCTTCATCCTCGATC - 3 ' * S G E E D E I K
Les deux amorces introduisent un site EcoRI (minuscules soulignées). Les acides aminés de PCNA contenus dans les amorces sont représentés par leur code
(majuscules) en dessous des codons correspondants. * représente le codon stop de PCNA.
8 μl de la réaction RT , décrite ci-dessus, sont complétés à un volume final de 50 μl contenant les quantités ou les concentrations finales suivantes : 50 picomoles d'amorce 1, 50 picomoles d'amorce 2, une unité de Taq ADN polymérase (Perkin Elmer), 5 μl de MgC12 (25 mM), 2 μl d'un mélange 200 mM des 4 désoxynucléotides (dATP, dTTP, dGTP et dCTP) et 5 μl du tampon PCR concentré 10 fois (Perkin Elmer). L'amplification PCR est réalisée dans des tubes Micoamp™ (Perkin Elmer) à l'aide d'un thermocycleur PTC- 100™ (MJ Research, Inc.). Cette amplification consiste en une étape de dénaturation à 95°C pendant 2 min suivie de 30 cycles comprenant une étape de dénaturation de 15 sec à 95°C, une étape d'hybridation de 30 sec à 55°C et une étape d'extension de 1 min à 72°C. Ces trentes cycles sont suivis d'une extension supplémentaire de 5 min puis les réations PCR sont conservées à 10°C.
La réalisation pratique du clonage de PCNA dans le vecteur PCRII (Invitrogen) s'effectue avec le "Original TA Cloning® Kit" (Invitrogen). 3 μl de produit de PCR, 1 μl de tampon de ligature 10X, 2 μl de vecteur pCRII (25 ng/μl), 3 μl d'eau et 1 μl de T4 ADN ligase sont incubés à 16 °C pendant 16 heures.
2 ml de cette réaction de ligature sont utilisés pour transformer des bactéries TGl compétentes comme précédemment décrit. Les bactéries sont ensuites cultivées à 37°c pendant 16 heures sur milieu solide LB contenant 1,5% d' Agar , 100 μg/ml d'ampicilîine en présence de X-gal pour la sélection bleu blanc des clones recombinants (alpha complémentation de la β-galactosidase).
Les clones recombinants (colonies blanches) sont repris dans 10 μl d'eau et confirmés dans les mêmes conditions que la PCR après la réaction de RT décrite ci-dessus excepté que du triton X-100 à une concentration finale de 0,01% v/v est ajouté à la réaction. Plusieurs clones positifs sont utilisés pour faire des mini-préparations d'ADN, ceux dont la partie 5' de l'insert PCNA est positionné en aval du site EcoRV de pCRII sont séquences et retenus pour l'étape de clonage suivante.
Clonage de PCNA dans le plasmide pET29 est réalisé de la façon suivante : le fragment PCNA EcoRV- Hind III issu de PCRII-PCNA est inséré au niveau du site EcoRV-Hind III de pET-29. Ce plasmide est alors utilisé pour la production de la protéine recombinante chimère S-PCNA. Les étapes de transformation, de production et de purification de S-PCNA sont identiques à celles utilisées pour la production de l'antigène Ki fusionné à l'épitope myc.
13.2 Etude de l'interaction in vitro de GAX avec PCNA
Cette étude a été réalisée en suivant la même méthode utilisée dans l'exemple 9 pour étudier l'interaction entre les protéines recombinantes GST-GAX et SmycKi.
Des quantités croissantes de GST recombinante et de la chimère GST-GAX (50, 250, 500 et 750 ng) ont été séparées sur un gel de polyacrylamide à 14% dénaturant (Novex). Les protéines sont transférées du gel sur une membrane de nitrocellulose, laquelle est ensuite incubée dans une solution contenant la protéine recombinante S- PCNA suivie d'un immunomarquage de PCNA à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-PCNA (santa Cruz).
La figure 7 montre une faible interaction entre GST et PCNA uniquement aux hautes doses de GST (500 et 750 ng). L'affinité de GST-GAX pour PCNA est très nettement supérieure a celle avec GST. Cette interaction spécifique entre GAX et PCNA suggère que l'activité antiproliférative de GAX est mediée par une séquestration de PCNA. Le fait que Ki puisse interagir à la fois avec GAX et avec PCNA est en faveur de la formation de complexes bi ou tripartite qui pourraient jouer un rôle important (activation ou inhibition) dans la progression du cycle cellulaire.
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE:
(î) DEPOSANT: (A) NOM: RHONE-POULENC RORER S.A.
(B) RUE: 20, avenue Raymond ARON
(C) VILLE: ANTONY
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165 (n) TITRE DE L' INVENTION : Polypeptides comprenant des domaines de la protéine GAX impliqués dans la répression de la transcription et/ou interagissant avec d'autres protéines, acides nucléiques correspondants et leurs utilisations.
(in ) NOMBRE DE SEQUENCES: 8 (IV) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (OEB)
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 23 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ni) HYPOTHETIQUE: NON (lll) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
CTATTCGATG ATGAAGATAC CCC 23
2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2: (1) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 50 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (il) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(m) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
CATCAAGCTT ATGGAGCAGA AGCTGATCTC CGAGGAGGAC CTGCAGCTTC 50
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(î) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 53 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(m) HYPOTHETIQUE: NON
(m) ANTI SENS: NON
(xi ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 3:
CATGGATCCA CGTGCAGGTC CTCCTCGGAG ATCAGCTTCT GCTCCATAAG CTT 53
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc (m) HYPOTHETIQUE: NON (m) ANTI SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
CGCGGATCCC ATGGCCTCGT TGCTG 25
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: Simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(m) HYPOTHETIQUE: NON
(m) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
GTAGAGCTCG AGTCAGTACA GAGTCTCTGC 30
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 6:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(m) HYPOTHETIQUE: NON
(m) ANTI SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 6.
GAGCGAATTC ATGACCATGA CCCTTCACAC 30
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7:
(î) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc (m) HYPOTHETIQUE: NON (m) ANTI SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 7:
GAGCGAATTC ACTGATCGTG TTGGGGAAGC 30
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 60 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI -SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N°8:
TCGAGAGGTC ATATTGACCT AAGCTTCGGG TCGGAGTACT GTCCTCCGAC TGCCATATGT
CTCCAG TATAACTGGA TTCGAAGCCC AGCCTCATGA CAGGAGGCTG ACGGTATACAGATC
Claims
1. Polypeptide caractérise en ce qu'il s'agit en tout ou partie d'un fragment de la protéine GAX possédant une activité de répresseur de la transcription et/ou affectant positivement ou négativement la réplication de l'ADN.
2. Polypeptide selon la revendication 1 caractérise en ce qu'il comprend au moins les résidus 1 à 32 de la protéine GAX humaine.
3. Polypeptide selon la revendication 1 ou 2 caractérise en ce qu'il comprend au moins les résidus 140 à 230 de la protéine GAX humaine.
4. Polypeptide caractérise en ce qu'il comprend au moins un fragment choisi parmi les fragments 1-32, 33-302 et 1-104 de la protéine GAX humaine.
5. Polypeptide caractérise en ce qu'il s'agit d'un fragment de la protéine GAX capable d'interagir avec la protéine Ki.
6. Polypeptide selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il s'agit du fragment 1 à 32 ou 104 à 223 de la protéine GAX.
7. Polypeptide caractérisé en ce qu'il s'agit d'un fragment de la protéine GAX, capable d'interagir avec PCNA.
8. Polypeptide caractérisé en ce qu'il s'agit d'un fragment de la protéine GAX capable d'interagir avec Ki et/ou PCNA et de former un complexe au moins bipartite ou au moins tripartite avec ces protéines.
9. Polypeptide caractérise en ce qu'il comprend outre un fragment de la protéine GAX possédant une activité de répresseur de la transcription, au moins un fragment d'origine différente.
10. Polypeptide selon la revendication 9 caractérisé en ce que ce fragment d'origine différente est doté d'une activité biologique, est un marqueur ou un élément de ciblage.
1 1. Acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 9.
12. Acide nucléique selon la revendication 1 1 caractérise en ce qu'il s'agit d'un ADNc.
13. Cassette d'expression comprenant un acide nucléique selon la revendication 1 1 ou 12 sous contrôle d'un promoteur.
14. Vecteur d'expression comprenant un acide nucléique selon la revendication 1 1 ou 12 ou une cassette d'expression selon la revendication 13.
15. Vecteur selon la revendication 14 caractérisé en qu'il s'agit d'un vecteur viral.
16. Vecteur selon la revendication 15 caractérisé en qu'il s'agit d'un adénovirus.
17. Vecteur selon la revendication 15 caractérisé en qu'il s'agit d'un retrovirus.
18. Utilisation de la protéine GAX ou d'un polypeptide selon la revendication 1 à 9 pour reprimer la transcription de gènes et/ou affecter positivement ou négativement la réplication de l'ADN..
19. Utilisation de composes inhibant l'activité de la protéine Ki et ou de PCNA pour inhiber la prolifération de cellules musculaires lisses.
20. Utilisation de composés pour la formation d'un complexe bi- ou tri-partite avec les protéines Ki et/ou PCNA pour affecter positivement ou négativement la progression du cycle cellualaire.
21. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 9 ou un vecteur selon l'une des revendications 14 à 17.
22. Procédé pour le criblage et/ou l'identification de polypeptides interagissant avec la protéine GAX ou un domaine de GAX caractérisé en ce qu'il met en oeuvre un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 9.
> 23. Procédé selon la revendication 22 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide choisi parmi les fragments là 32 et 33 à 302 de la protéine GAX
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR9612730 | 1996-10-18 | ||
FR9612730A FR2754822B1 (fr) | 1996-10-18 | 1996-10-18 | Polypeptides comprenant des domaines de la proteine gax, impliques dans la repression de transcription et/ou interagissant avec d'autres proteines, acides nucleiques correspondants et leurs utilisations |
PCT/FR1997/001850 WO1998017686A1 (fr) | 1996-10-18 | 1997-10-16 | Polypeptides comprenant des domaines de la proteine gax, impliques dans la repression de transcription et/ou interagissant avec d'autres proteines, acides nucleiques correspondants et leurs utilisations |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EP0941243A1 true EP0941243A1 (fr) | 1999-09-15 |
Family
ID=9496803
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EP97911277A Withdrawn EP0941243A1 (fr) | 1996-10-18 | 1997-10-16 | Polypeptides comprenant des domaines de la proteine gax, impliques dans la repression de transcription et/ou interagissant avec d'autres proteines, acides nucleiques correspondants et leurs utilisations |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6121005A (fr) |
EP (1) | EP0941243A1 (fr) |
JP (1) | JP2001503615A (fr) |
KR (1) | KR20000049249A (fr) |
CN (1) | CN1237980A (fr) |
AP (1) | AP9901510A0 (fr) |
AU (1) | AU741586B2 (fr) |
BG (1) | BG63548B1 (fr) |
BR (1) | BR9711947A (fr) |
CA (1) | CA2268045A1 (fr) |
CZ (1) | CZ131899A3 (fr) |
EA (1) | EA003694B1 (fr) |
FR (1) | FR2754822B1 (fr) |
HU (1) | HUP9903956A3 (fr) |
IL (1) | IL129478A0 (fr) |
NO (1) | NO991830L (fr) |
NZ (1) | NZ335283A (fr) |
OA (1) | OA11034A (fr) |
PL (1) | PL332874A1 (fr) |
SK (1) | SK51199A3 (fr) |
WO (1) | WO1998017686A1 (fr) |
ZA (1) | ZA979390B (fr) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002000241A2 (fr) * | 2000-06-28 | 2002-01-03 | Aventis Pharma S.A. | Compositions et procedes pour reguler le cycle cellulaire |
US8124598B2 (en) | 2006-09-14 | 2012-02-28 | Sharon Sageman | 7-keto DHEA for psychiatric use |
US20100160274A1 (en) * | 2007-09-07 | 2010-06-24 | Sharon Sageman | 7-KETO DHEA for Psychiatric Use |
JP2013522169A (ja) * | 2010-02-24 | 2013-06-13 | アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル | 炎症および好中球減少症の処置のための化合物 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5856121A (en) * | 1994-02-24 | 1999-01-05 | Case Western Reserve University | Growth arrest homebox gene |
US5554181A (en) * | 1994-05-04 | 1996-09-10 | Regents Of The University Of Minnesota | Stent |
GB9422175D0 (en) * | 1994-11-03 | 1994-12-21 | Univ Dundee | Indentification of the p21 waf1-pcna interaction site and therapeutic applications thereof |
FR2732357B1 (fr) * | 1995-03-31 | 1997-04-30 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Vecteurs viraux et utilisation pour le traitement des desordres hyperproliferatifs, notamment de la restenose |
FR2740344B1 (fr) * | 1995-10-31 | 1997-11-21 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Application de la proteine gax au traitement de cancers |
-
1996
- 1996-10-18 FR FR9612730A patent/FR2754822B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-10-15 US US08/950,860 patent/US6121005A/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-10-16 JP JP51902498A patent/JP2001503615A/ja active Pending
- 1997-10-16 CZ CZ991318A patent/CZ131899A3/cs unknown
- 1997-10-16 HU HU9903956A patent/HUP9903956A3/hu unknown
- 1997-10-16 NZ NZ335283A patent/NZ335283A/en unknown
- 1997-10-16 PL PL97332874A patent/PL332874A1/xx unknown
- 1997-10-16 KR KR1019990703354A patent/KR20000049249A/ko not_active Application Discontinuation
- 1997-10-16 WO PCT/FR1997/001850 patent/WO1998017686A1/fr not_active Application Discontinuation
- 1997-10-16 CN CN97199823A patent/CN1237980A/zh active Pending
- 1997-10-16 EP EP97911277A patent/EP0941243A1/fr not_active Withdrawn
- 1997-10-16 CA CA002268045A patent/CA2268045A1/fr not_active Abandoned
- 1997-10-16 AU AU48713/97A patent/AU741586B2/en not_active Ceased
- 1997-10-16 BR BR9711947A patent/BR9711947A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-10-16 IL IL12947897A patent/IL129478A0/xx unknown
- 1997-10-16 SK SK511-99A patent/SK51199A3/sk unknown
- 1997-10-16 AP APAP/P/1999/001510A patent/AP9901510A0/en unknown
- 1997-10-16 EA EA199900387A patent/EA003694B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-10-20 ZA ZA9709390A patent/ZA979390B/xx unknown
-
1999
- 1999-04-16 OA OA9900083A patent/OA11034A/fr unknown
- 1999-04-16 NO NO991830A patent/NO991830L/no not_active Application Discontinuation
- 1999-04-16 BG BG103342A patent/BG63548B1/bg unknown
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
See references of WO9817686A1 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NZ335283A (en) | 2001-02-23 |
SK51199A3 (en) | 2000-04-10 |
BR9711947A (pt) | 1999-08-24 |
HUP9903956A3 (en) | 2002-01-28 |
CN1237980A (zh) | 1999-12-08 |
AP9901510A0 (en) | 1999-06-30 |
EA199900387A1 (ru) | 1999-10-28 |
WO1998017686A1 (fr) | 1998-04-30 |
EA003694B1 (ru) | 2003-08-28 |
CA2268045A1 (fr) | 1998-04-30 |
AU741586B2 (en) | 2001-12-06 |
CZ131899A3 (cs) | 1999-07-14 |
US6121005A (en) | 2000-09-19 |
OA11034A (fr) | 2003-03-06 |
IL129478A0 (en) | 2000-02-29 |
AU4871397A (en) | 1998-05-15 |
NO991830L (no) | 1999-06-16 |
NO991830D0 (no) | 1999-04-16 |
ZA979390B (en) | 1998-05-12 |
FR2754822A1 (fr) | 1998-04-24 |
BG63548B1 (bg) | 2002-04-30 |
KR20000049249A (ko) | 2000-07-25 |
FR2754822B1 (fr) | 1998-11-27 |
HUP9903956A2 (hu) | 2000-03-28 |
PL332874A1 (en) | 1999-10-25 |
BG103342A (en) | 2000-05-31 |
JP2001503615A (ja) | 2001-03-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
FR2732357A1 (fr) | Vecteurs viraux et utilisation pour le traitement des desordres hyperproliferatifs, notamment de la restenose | |
CA2224468C (fr) | Variants de la proteine p53 et utilisations therapeutiques | |
KR20080036015A (ko) | 글루코오스 유도성 인슐린 발현 및 당뇨병 치료 방법 | |
KR20220044811A (ko) | Crispr/cas13을 사용하는 표적화된 트랜스-이어맞추기 | |
JPH11510389A (ja) | 細胞タンパク質の機能を不活性化するためのタンパク質−タンパク質相互作用表面の拡張 | |
US6300484B1 (en) | DNA encoding DP. 75 and a process for its use | |
CA2214451A1 (fr) | Systeme d'expression conditionnel | |
CA2268865C (fr) | Fragments d'anticorps a chaine unique anti-p53 et utilisations | |
EP0941243A1 (fr) | Polypeptides comprenant des domaines de la proteine gax, impliques dans la repression de transcription et/ou interagissant avec d'autres proteines, acides nucleiques correspondants et leurs utilisations | |
FR2740454A1 (fr) | Peptides capables d'inhiber l'endocytose de l'app et sequences nucleotidiques correspondantes | |
CA2250099A1 (fr) | Sequences en amont du gene sm22, vecteurs les contenant et leurs utilisations therapeutiques, notamment dans le traitement des maladies vasculaires | |
WO1997035974A9 (fr) | Sequences en amont du gene sm22, vecteurs les contenant et leurs utilisations therapeutiques, notamment dans le traitement des maladies vasculaires | |
EP0941319A1 (fr) | Peptides capables d'inhiber l'endocytose de l'app et sequences nucleotidiques correspondantes | |
WO1996038556A2 (fr) | Deltap62, ses variants, sequences d'acides nucleiques les codant, et leurs utilisations en therapie genique anti-cancereuse | |
MX2009000976A (es) | Composicion y metodo para el tratamiento de tumores. | |
CN116322742A (zh) | 用于治疗同种异体移植物血管病、烟雾病、烟雾病综合征和内膜增殖的组合物和方法 | |
MXPA99003470A (en) | Polypeptides comprising gax protein domains, involved in repressing transcription and/or interacting with other proteins, corresponding nucleic acids and their use | |
EP0895542A1 (fr) | Systeme d'expression derive du gene de la tyrosine hydroxylase | |
FR2786501A1 (fr) | PROTEINE PARTENAIRE DE LA TOPOISOMERASE IIIa HUMAINE | |
CA2343922A1 (fr) | Utilisation de promoteurs specifiques hybrides pour controler l'expression tissulaire |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PUAI | Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase |
Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012 |
|
17P | Request for examination filed |
Effective date: 19990412 |
|
AK | Designated contracting states |
Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FI FR GB GR IE IT LI LU NL PT SE |
|
AX | Request for extension of the european patent |
Free format text: RO PAYMENT 19990412;SI PAYMENT 19990412 |
|
17Q | First examination report despatched |
Effective date: 20030716 |
|
STAA | Information on the status of an ep patent application or granted ep patent |
Free format text: STATUS: THE APPLICATION HAS BEEN WITHDRAWN |
|
18W | Application withdrawn |
Effective date: 20040226 |