EP0839194A1 - Variants de la proteine p53 et utilisations therapeutiques - Google Patents

Variants de la proteine p53 et utilisations therapeutiques

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EP0839194A1
EP0839194A1 EP96925799A EP96925799A EP0839194A1 EP 0839194 A1 EP0839194 A1 EP 0839194A1 EP 96925799 A EP96925799 A EP 96925799A EP 96925799 A EP96925799 A EP 96925799A EP 0839194 A1 EP0839194 A1 EP 0839194A1
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Definitions

  • the present invention relates to proteins derived from the p53 tumor suppressor gene product, having improved functions for therapeutic use. It advantageously relates to proteins having tumor suppressor and programmed cell death inducer functions superior to that of the wild-type p53 protein, more particularly in pathological proliferation contexts in which the wild-type p53 protein is inactivated. It also relates to the nucleic acids coding for these molecules, the vectors containing them and their therapeutic uses, in particular in gene therapy. The products of the invention are particularly suitable for restoring p53 functions in pathological contexts such as in particular cancers.
  • the wild-type p53 protein is involved in regulating the cell cycle and in maintaining the integrity of the cell genome.
  • This protein the main function of which is to activate the transcription of certain genes, is capable, by a process not yet well defined, of blocking the cell in the G1 phase of the cell cycle during the appearance of mutations during of genome replication, and to initiate a number of DNA repair processes.
  • this protein is capable of inducing the phenomenon of programmed cell death, called apoptosis.
  • the p53 protein acts as a tumor suppressor, eliminating cells that are abnormally differentiated or whose genome has been damaged.
  • This main function of p53 depends on its transcription factor function, that is to say in other words its double capacity to recognize specific sequences at the level of genomic DNA and to recruit the general transcription machinery.
  • the p53 protein contains 393 amino acids, which define 5 functional domains (see Figure 1):
  • the transcription activator domain consisting of amino acids 1 to 73, capable of binding certain factors of the general transcription machinery such as the TBP protein.
  • This area is also the site of a number of post-translational modifications. It is also the site of numerous interactions of the p53 protein with many other proteins and in particular with the cellular protein mdm2 or the EBNA5 protein of Epstein-Barr virus (EBV), capable of blocking the function of the wild protein.
  • this domain has amino acid sequences called PESTs of susceptibility to proteolytic degradation.
  • oligomerization domain consisting of amino acids 325 to 355. This region 325 to 355 forms a type structure; ⁇ sheet (326-
  • the functioning of the p53 protein can be disrupted in different ways.
  • the mutations in the p53 gene listed in cancer cells affect a very large part of the gene coding for this protein, and result in variable modifications of the functioning of this protein. It can however be noted that these mutations are for the most part localized in the central part of the p53 protein which is known to be the region of contact with the specific genomic sequences of the p53 protein.
  • mutants of the p53 protein have the main characteristic of no longer being able to bind to the DNA sequences recognized by the wild-type protein and thus of no longer being able to exercise their role as transcription factor.
  • certain mutants seem to have acquired new functions such as the activation of certain genes at the transcriptional level.
  • mutants the product of which is a non-functional protein, which, in the case of a mutation in only one of the two alleles, does not affect the functioning of the wild protein encoded by the other allele.
  • the main representatives of this category are the mutants H273 and W248, the latter being specific for familial Li-Fraumeni syndrome of hypersensitivity to cancerous conditions.
  • mutant G281 The main representative of this category is the mutant G281.
  • the dominant-oncogenic mutants the product of which is a protein which is capable on the one hand of blocking the function of the wild protein like the mutants of the preceding category, and on the other hand, of promoting by mechanisms little known the tumor development, thus presenting a gain in function.
  • the main representative of this category is the mutant H 175.
  • the wild-type p53 gene Given its anti-tumor and apoptotic properties and its involvement in numerous hyperproliferative pathologies, the wild-type p53 gene has been used in gene and cell therapy approaches. It has in particular been proposed to treat certain hyperproliferative pathologies, and in particular cancers, by administration in vivo of the wild-type p53 gene, by restoration of the functions of p53. Administration can preferably be carried out by viral and in particular adenoviral (WO94 / 24297) or retroviral (WO94 / 06910) vectors.
  • a cellular partner inactivating p53 such as for example mdm2
  • Hupp et al. (Cell Vol 71 (1992) 875) described a p53 derivative comprising a deletion of the 30 C-terminal residues (p53 ⁇ C-ter30). However, if this protein retains an ability to bind DNA, its apoptotic properties have not been demonstrated. In addition, it is not resistant to inactivation by dominant negative mutants.
  • Pietenpol et al (PNAS 91 (1994) 1998) described chimeric molecules derived from the p53 protein, in particular a VP16-p53 (80-343) -GCN4 protein.
  • this molecule has a significantly reduced DNA binding and transactivation capacity compared to the wild-type p53 protein (40%). Furthermore, it has a non-selective oligomerization region, which risks interacting with other cellular components and thus to induce a non-specific cellular response. Furthermore, its properties of resistance to inactivation mechanisms are not indicated.
  • the present invention describes novel variants of the p53 protein with improved therapeutic properties. It describes in particular variants suitable for use in gene therapy, in particular anti-cancer therapy.
  • the variants of the invention are derived from the p53 protein by structural modification (s), retain p53-like activity and, expressed in hyperproliferative cells, exhibit at least one increased property compared to the p53 protein. It may in particular be anti-proliferative and / or apoptotic activity.
  • the variants of the invention advantageously have an increased anti-proliferative and / or apoptotic activity, or more specific for hyperproliferative cells, or less sensitive to the various alterations to which wild p53 is subject.
  • a first object of the invention relates more particularly to a variant of the p53 protein in which all or part of the oligomerization domain is deleted and replaced by an artificial leucine zipper domain.
  • the p53 protein is inactivated by certain mutants, and in particular the dominant-negative and oncogenic mutants, encountered in tumor cells. This inactivation is the result of the formation of mixed non-active oligomers between the wild-type p53 protein and the mutant, which can no longer bind to the specific sequences recognized by the wild-type p53 protein.
  • the present invention now describes variants of the p53 protein resistant to the dominant negative effect of certain mutants, that is to say variants active in a cellular context having one or two mutated alleles, which is the case closely. 90% of p53 dependent human cancers.
  • all or part of the natural oligomerization domain of the protein which does not distinguish between the wild and mutant forms, is thus replaced by an equivalent domain having a specific oligomerization capacity.
  • This modification is carried out using an artificial leucine-zipper optimized to form a dimer.
  • the molecules according to the invention comprising such an artificial leucine-zipper are particularly advantageous since they form oligomers only with other molecules carrying the same leucine-zipper. They therefore do not form oligomers with the dominant negative or oncogenic mutants of the p53 protein, capable of inactivating them. They also do not form oligomers with other cellular proteins carrying oligomerization domains, which may also inactivate them or induce undesirable effects. They can only form homo-oligomers and therefore have significant selectivity, ensuring better activity in the context of hyperproliferative pathology.
  • the artificial leucine zipper domain is therefore advantageously a domain not present in the natural state, ensuring a selectivity for oligomerization.
  • the oligomerization domain is represented by the sequence SEQ ID No. 1.
  • the variants comprise a deletion of all or part of the oligomerization domain and of all or part of the regulatory domain.
  • the oligomerization domain is located between residues 325-355 inclusive and the regulatory domain between residues 365-393 inclusive.
  • This type of variant is entirely advantageous since it lacks all or part of the negative regulatory effects exerted through the C-terminal part (aa 365-393).
  • These variants constitute potentially constitutively active proteins, exhibiting non-modular and possibly increased activity.
  • the regulatory region is advantageously eliminated in its entirety.
  • the preferred variants according to the invention comprise a deletion of the C-terminal part of the p53 protein, from residue 326 or 337 inclusive. Examples of intermediates used for the construction of these variants are in particular:
  • pEC107 (75-325-lz) having a deletion of the C-terminal part of the p53 protein, from residue 326, substituted by an artificial oligomerization domain of sequence SEQ ID No. 1.
  • pEC110 (75-336-lz) having a deletion of the C-terminal part of the p53 protein, from residue 337, substituted by an artificial oligomerization domain of sequence SEQ ID No. 1.
  • the cysteine residue at position 182 of the p53 protein is replaced by a histidine.
  • This mutation advantageously makes it possible to increase the affinity of the variant for the specific nucleotide binding sequences.
  • the introduction of this additional modification therefore makes it possible to obtain a molecule having in addition an increased transactivating potential.
  • pEC139 (75-325 (H182) -lz) having a deletion of the C-terminal part of the protein p53, from residue 326, substituted by an artificial oligomerization domain with sequence SEQ ID No. 1, and a histidine in position 182.
  • pEC140 75-336 (H182) -lz) having a deletion of the C-terminal part of the p53 protein, from residue 337, substituted by an artificial oligomerization domain of sequence SEQ ID No. 1, and a histidine in position 182.
  • all or part of the transactivating domain is also deleted and replaced by a domain heterologous transactivator. It has been indicated above that the transactivating functions of p53 are essential for its activity as a tumor suppressor or inducer of apoptosis. In order to increase the therapeutic potential of the variants according to the invention, it is particularly advantageous to substitute the natural transactivating domain with a powerful heterologous transactivating domain.
  • These variants thus have numerous advantages. They obviously have a high transactivating activity. But they are also rendered insensitive to the negative regulatory effects exerted through the N-terminal part (aa 1-73). Indeed this region contains the PEST sequences responsible for its proteolytic degradation.
  • the transactivating domain is deleted by deletion of residues 1 to 74.
  • the intermediate constructions used for the production of such molecules are in particular pEC107 (75-325-lz), pEC110 (75-336- lz), pEC139 (75-
  • the heterologous transactivating domain is the transactivating domain of VP16. It advantageously consists of residues 411 to 490 of VP16, the sequence of which is given SEQ ID No. 2. Specific examples of variants according to the invention combining these different modifications are in particular:
  • pEC114 (VP16-75-325-lz) having a deletion of the N-terminal part of the p53 protein comprising residues 1-74, substituted by the transactivating domain of VP16 of sequence SEQ ID No. 2 and a deletion of the C-terminal part of the p53 protein, from residue 326, substituted by an artificial oligomerization domain of sequence SEQ ID No. 1.
  • the complete sequence of the pEC114 variant is shown in SEQ ID No. 25.
  • pEC116 (VP16-75-336-lz) having a deletion of the N-terminal part of the protein p53 comprising residues 1-74, substituted by the transactivating domain of VP16 of sequence SEQ ID No. 2 and a deletion of the C-terminal part of the p53 protein, from residue 337, substituted with an artificial oligomerization domain of sequence SEQ ID No. 1.
  • the complete sequence of the variant pEC116 is shown in SEQ ID No. 26.
  • pEC147 (VP16-75-325 (H182) -lz) having a deletion of the N-terminal part of the protein p53 comprising residues 1-74, substituted by the transactivating domain of VP16 of sequence SEQ ID No. 2; a deletion of the C-terminal part of the p53 protein, from residue 326, substituted by an artificial oligomerization domain of sequence SEQ ID No. 1, and a histidine at position 182.
  • pEC149 (VP16-75-336 (H182) -lz) having a deletion of the N-terminal part of the protein p53 comprising residues 1-74, substituted by the transactivating domain of VP16 of sequence SEQ ID No. 2; a deletion of the C-terminal part of the p53 protein, from residue 337, substituted by an artificial oligomerization domain of sequence SEQ ID No. 1, and a histidine at position 182.
  • the variants of the invention also have 'killer' properties, which are cycle stopping. cell enhancement and apoptosis potentially improved.
  • the combination of the modifications mentioned, including the presence of a selective oligomerization domain and an improved transactivating power by substitution of the original domain and by the presence of a histidine at 182 indeed give the variants of the invention potentialities. markedly improved therapeutics.
  • the variants according to the invention make it possible to avoid the appearance of certain mutants (dominant oncogenic).
  • the gains in function of certain p53 mutants are still poorly defined both in terms of their mechanisms and in terms of the domains of the p53 protein involved. It is very likely that some of these new functions will depend on the association with certain cellular effector partners.
  • the variants of the invention due to the suppression of certain domains of p53 essential for the attachment of certain molecules inhibiting its function, the variants of the invention also exhibit a higher and more stable therapeutic activity.
  • the existence of foreign motifs in the various constructions of the invention is capable of triggering an immune reaction upon the death of the transfected cells and the release into the extracellular environment of these different fragments, thereby increasing the ability of the immune system to fight against tumor cells.
  • the heterologous transactivating domain is a transactivating domain which is active preferably in the transformed cells and not in the neighboring healthy cells.
  • the present invention indeed also describes molecules whose function is mainly exercised in transformed cells and not in neighboring healthy cells.
  • Another object of the invention thus relates to a variant of the p53 protein preferably active in transformed cells, in which at least one of the functional domains of p53 is deleted in whole or in part and is substituted by a heterologous domain preferably active in transformed cells.
  • the functional domain of p53 concerned is the transactivating domain.
  • a particularly preferred object of the invention relates to a variant of the p53 protein preferably active in transformed cells, in which the natural transactivating domain is deleted in whole or in part and is substituted by a transactivating domain preferentially active in transformed cells.
  • the natural transactivating domain is deleted by deleting residues 1-74 inclusive of p53.
  • the invention relates more particularly to variants of p53 which are functional specifically in the presence of a Ras protein. oncogenic or a mutant of p53. These molecules are obtained in particular by replacing the transactivator domain of the wild-type p53 protein with a protein domain capable of specifically binding a transactivator or a transactivator complex present in a transformed cell.
  • the protein domain capable of specifically binding the transcriptional transactivator or the transcriptional transactivator complex present in the molecules of the invention can be of different types. It may in particular be an oligomerization domain in the case where the targeted transactivator or transactivator complex also includes such a domain. It can also be any synthetic or natural domain known to interact with said transactivator or transactivator complex. It may also be an antibody or a fragment or derivative of an antibody directed against the transactivator or transactivator complex.
  • the heterologous domain consists of an antibody or a fragment or derivative of antibodies.
  • the fragments or derivatives of antibodies are for example the Fab or F (ab) ′ 2 fragments, the VH or VL regions of an antibody or also single chain antibodies (ScFv) comprising a VH region linked to a VL region by a arms.
  • ScFv single chain antibodies
  • a preferred construct according to the present invention comprises an ScFv directed against a mutant of the p53 protein. These mutants appear in transformed cells and have a transactivating domain.
  • ScFv is directed against a transactivating complex, that is to say a complex between a target molecule selectively present in the transformed cells, but devoid of transcriptional transactivating activity (for example an oncogenic ras), and a molecule carrying a transactivating domain.
  • the latter advantageously comprises a transactivating domain and a selective binding domain to said cell molecule (for example an anti-ras ScFv). The binding of this molecule allows the formation of a transcriptional transactivating binary complex, which complex is then recruited by the variant of the invention.
  • These selective variants advantageously include additional modifications in the C-terminal part as indicated above to further improve their properties.
  • they advantageously comprise a deletion of all or part of the oligomerization domain, which can be replaced by any heterologous oligomerization domain. It is more preferably an artificial oligomerization domain, as defined above.
  • variants according to the invention preferably active in the transformed cells are in particular:
  • ScFv.antip53 * -75-325-lz having a deletion of the N-terminal part of the p53 protein comprising residues 1-74, substituted by a protein domain capable of specifically binding a mutant of the p53 protein present in a cell transformed, and a deletion of the C-terminal part of the p53 protein, from residue 326, substituted by an artificial oligomerization domain of sequence SEQ ID No. 1.
  • ScFv.antip53 * -75-325 (H182) -lz additionally comprising a His182 mutation.
  • ScFv.antip53 * -75-336-lz having a deletion of the N-terminal part of the p53 protein comprising residues 1-74, substituted by a protein domain capable of specifically binding a mutant of the p53 protein present in a cell transformed, and a deletion of the C-terminal part of the p53 protein, from residue 337, substituted by an artificial oligomerization domain of sequence SEQ ID No. 1.
  • active preferably indicates that these variants exert their activity essentially when they are expressed in transformed cells. Residual activity may, however, exist in untransformed cells, but less than that observed in transformed cells.
  • Another object of the present invention relates to a variant of the p53 protein comprising a deletion of the C-terminal part, from residue 367, fused to the sequence SEQ ID No. 3 (AS).
  • This sequence corresponds to the last 19 amino acids of the alternative murine p53 protein splicing product.
  • This variant therefore has a modification of the oligomerization domain based on a protein described in mice as an alternative splicing variant of the wild protein in which the 27 C-terminal amino acids are replaced by 19 different amino acids.
  • This variant has a potentially increased affinity for specific DNA binding sequences.
  • transactivating domain advantageously comprises a deletion of all or part of the transactivating domain, which can be replaced by any heterologous transactivating domain. It is more preferably the transactivator domain derived from the VP16 protein or a protein domain capable of specifically binding a transactivator or a transactivator complex present in a transformed cell.
  • the residue 182 of the p53 protein is advantageously replaced by a histidine.
  • pEC143 (VP16-75-AS), having a deletion of the N-terminal part of the p53 protein comprising residues 1-74, substituted by the transactivating domain of VP16 of sequence SEQ ID No. 2; and a deletion of the C-terminal part, from residue 367, added with the 19 amino acids of sequence SEQ ID No. 3.
  • the complete sequence of the variant pEC143 is represented SEQ ID No. 28.
  • pEC153 (VP16-75-AS (H182)), corresponds to pEC143 with a histidine at position 182.
  • the invention relates to any chimeric protein comprising a transactivating domain, a DNA binding domain, a nucleus addressing domain and an oligomerization domain, in which the binding domains DNA and nucleus addressing consist of amino acids 75 to 325 of the human wild-type p53 protein (SEQ ID No. 4).
  • SEQ ID No. 4 human wild-type p53 protein
  • the DNA binding and nucleus addressing domains consist of amino acids 75 to 336 of the human wild-type p53 protein (SEQ ID No. 5).
  • the chimeric proteins according to the invention can comprise different types of transactivating domains. It can be the transactivating domain of the p53 protein. Preferably, it is a heterologous transactivating domain, chosen for example from the VP16 transactivating domain or a protein domain capable of specifically binding a transactivator or a transactivating complex present in a transformed cell.
  • the oligomerization domain it is preferably an artificial domain, and therefore specific, such as for example an artificial leucine zipper, in particular of sequence SEQ ID No. 1.
  • the chimeric proteins according to the invention may also contain a histidine residue at position 182.
  • chimeric proteins as described in the present application are in particular pEC114, pEC116, pEC147 and pEC149.
  • the present invention also relates to any nucleic acid coding for a variant or a chimeric protein as defined above.
  • the nucleic acid according to the invention can be a ribonucleic acid (RNA) or deoxyribonucleic acid (DNA). In addition, it may be a complementary DNA (cDNA) optionally comprising one or more introns of the p53 gene. It can be of human, animal, viral, synthetic or semi-synthetic origin. It can be obtained in different ways and in particular by chemical synthesis using the sequences presented in the application and for example a nucleic acid synthesizer. It can also be obtained by screening banks using specific probes, in particular as described in the application. It can also be obtained by mixed techniques including chemical modification (elongation, deletion, substitution, etc.) of sequences screened from libraries. In general, Nucleic acids of the invention can be prepared according to any technique known to those skilled in the art.
  • the nucleic acid according to the invention is a cDNA or an RNA.
  • the Applicant has now constructed new nucleic acid sequences coding for variant p53 polypeptides, having quite remarkable antiproliferative and apoptotic properties.
  • These nucleic acids can be used as therapeutic agents to produce in cells derivatives according to the invention capable of destroying or correcting cellular dysfunctions.
  • the present invention also relates to any expression cassette comprising a nucleic acid as defined above, a promoter allowing its expression and a transcription termination signal.
  • the promoter is advantageously chosen from functional promoters in mammalian cells, preferably human. More preferably, it is a promoter allowing the expression of a nucleic acid in a hyperproliferative cell (cancerous, restenosis, etc.).
  • promoters can be used. It can be for example the own promoter of the p53 gene. it can also be regions of different origin (responsible for the expression of other proteins, or even synthetic). It can thus be any promoter or derived sequence stimulating or repressing the transcription of a gene in a specific way or not, inducible or not, strong or weak. Mention may in particular be made of the promoter sequences of eukaryotic or viral genes. For example, they may be promoter sequences originating from the genome of the target cell.
  • ubiquitous promoters can be used in particular (promoter of the HPRT, PGK genes, a-actin, tubulin, etc.), promoters of intermediate filaments (promoter of the GFAP genes, desmin, vimentin, neurofilaments, keratin, etc. ), promoters of therapeutic genes (for example the promoter of the MDR, CFTR, Factor VIII, ApoAl genes, etc.), tissue-specific promoters (promoter of the pyruvate kinase gene, villin, intestinal fatty acid binding protein, a- smooth muscle actin, etc.) or promoters responding to a stimulus (steroid hormone receptor, retinoic acid receptor, etc.).
  • promoter sequences originating from the genome of a virus such as for example the promoters of the E1 A and MLP genes of adenovirus, the early promoter of CMV, or also the promoter of the RSV LTR, etc.
  • these promoter regions can be modified by adding activation or regulatory sequences, or allowing tissue-specific or majority expression.
  • the present invention now provides new therapeutic agents which, by their antiproliferative and / or apoptotic properties, can interfere with numerous cellular dysfunctions.
  • the nucleic acids or cassettes according to the invention can be injected as such at the site to be treated, or incubated directly with the cells to be destroyed or treated. It has in fact been described that naked nucleic acids can penetrate cells without any particular vector. However, it is preferred in the context of the The present invention uses an administration vector, making it possible to improve (i) the efficiency of cell penetration, (ii) targeting (iii) extra- and intracellular stability.
  • the nucleic acid or the cassette is incorporated into a vector.
  • the vector used can be of chemical origin (liposome, nanoparticle, peptide complex, cationic lipids or polymers, etc.) viral (retrovirus, Adenovirus, herpes virus, AAV, vaccinia virus, etc.) or plasmid.
  • viral vectors are based on the natural properties of transfection of viruses. It is thus possible to use, for example, adenoviruses, herpes viruses, retroviruses and associated adeno viruses. These vectors are particularly effective in terms of transfection.
  • a preferred object according to the invention resides in a defective recombinant retrovirus whose genome comprises a nucleic acid as defined above.
  • Another particular object of the invention resides in a defective recombinant adenovirus whose genome comprises a nucleic acid as defined above.
  • the vector according to the invention can also be a non-viral agent capable of promoting the transfer and expression of nucleic acids in eukaryotic cells.
  • Chemical or biochemical vectors, synthetic or natural represent an interesting alternative to natural viruses in particular for reasons of convenience, security and also by the absence of theoretical limit as regards the size of the DNA to be transfected.
  • These synthetic vectors have two main functions, to compact the nucleic acid to be transfected and to promote its cellular fixation as well as its passage through the plasma membrane and, where appropriate, the two nuclear membranes.
  • non-viral vectors all have polycationic charges.
  • the nucleic acid or vector used in the present invention can be formulated for topical, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, etc. administration.
  • the nucleic acid or the vector is used in an injectable form. It can therefore be mixed with any pharmaceutically acceptable vehicle for an injectable formulation, in particular for a direct injection at the site to be treated. They may in particular be sterile, isotonic solutions, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition as appropriate of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes.
  • a direct injection of the nucleic acid into the patient's tumor is advantageous because it allows the therapeutic effect to be concentrated in the affected tissues.
  • the doses of nucleic acid used can be adapted according to different parameters, and in particular according to the gene, the vector, the mode of administration used, the pathology concerned or even the duration of the treatment sought.
  • the invention also relates to any pharmaceutical composition comprising at least one nucleic acid as defined above.
  • composition comprising at least one vector as defined above.
  • composition comprising at least one variant of p53 as defined above.
  • the pharmaceutical compositions according to the invention are very particularly suitable for the treatment of hyperproliferative disorders, such as in particular cancers and restenosis.
  • the present invention thus provides a particularly effective method for the destruction of cells, in particular hyperproliferative cells. It can be used in vitro or ex vivo. Ex vivo, it essentially consists in incubating the cells in the presence of one or more nucleic acids (or of a vector, or cassette or directly of the derivative). In vivo, it consists in administering to the organism an active quantity of a vector (or of a cassette) according to the invention, preferably directly at the level of the site to be treated (tumor in particular).
  • the subject of the invention is also a method of destroying hyperproliferative cells comprising bringing said cells or a part of them into contact with a nucleic acid as defined above.
  • the present invention is advantageously used in vivo for the destruction of cells in hyperproliferation (i.e. in abnormal proliferation). It is thus applicable to the destruction of tumor cells or smooth muscle cells of the vascular wall (restenosis). It is particularly suitable for the treatment of cancers in which a p53 mutant is observed.
  • colon adenocarcinomas thyroid cancers, lung carcinomas, myeloid leukemias, colorectal cancers, breast cancers, lung cancers, gastric cancers, cancer of the lungs esophagus, B lymphomas, ovarian cancer, bladder cancer, glioblastoma, hepatocarcinoma, bone, skin, pancreatic cancer, kidney and prostate cancer, cancer esophagus, cancers of the larynx, cancers of the head and neck, anogenital cancers HPV positive, cancers of the nasopharynx EBV positive, cancers in which the cellular protein mdm2 is overexpressed, etc.
  • the variants of the invention are particularly effective for the treatment of cancers in which the MDM2 protein is also overexpressed, as well as cancers linked to the HPV virus such as HPV positive anogenital cancers.
  • Figure 1 Functional domains of the wild-type p53 protein.
  • TA Transcription activator domain DNB: DNA binding domain
  • NLS nuclear localization signal
  • OL domain of oligomerization
  • REG regulatory area Functional domains of the wild-type p53 protein.
  • Figure 2 Construction of a cDNA encoding the AS form of p53.
  • Figure 3 Cloning of cDNAs coding for the constructions pEC104, pEC106, pEC131, pEC132 and pEC133 and for their variant H182.
  • Figure 4 Construction of the variants pEC107, pEC110, pEC139 and pEC140 by fusion with the artificial oligomerization domain.
  • Figure 5 Construction of the variants pEC114, pEC116, pEC141, pEC143, pEC145, pEC147, pEC149, pEC151, pEC153 and pEC155.
  • Figure 6 Recognition of specific double-stranded DNA sequences by the hybrid molecules of the invention.
  • Gel delay experience competition between HisV325 and wild-type p53.
  • column 1 incubation in the absence of HisV325 and wild-type p53
  • column 2 30 ng wild-type p53
  • column 3 same as 2 + pAb421,
  • column 4 30 ng HisV325,
  • column 5 same as 4 + pAb421,
  • column 6 30 ng HisV325 + 30 ng wild p53
  • column 7 same as 6 + pAb421,
  • column 8 30 ng HisV325 + 15 ng wild p53
  • column 9 same as 8 + pAb421
  • column 10 30 ng HisV325 + 7.5 ng wild p53
  • column 11 idem 10 + pAb421
  • column 12 30 ng HisV325 + 4.5 ng wild p53
  • column 13 same as 12 + pAb421,
  • column 14 30 ng HisV325
  • Figure 7 Transactivating activity of the wild-type p53 protein and of the AS, V-325 and V-336 variants.
  • Figure 8 Transactivating activity of the wild-type p53 protein and variants V-325, V-336 and V-343.
  • Figure 10 Induction of the hdm2 and WAF1 genes in EB, EB-1 and EB-V325 cells
  • Figure 12 Effect of the E6 protein on the transactivating function of the p53 protein and variants of the invention in HeLa cells.
  • Figure 13 Sensitivity of the wild-type p53 protein and variants of the invention to the degradation induced by the E6 protein.
  • Figure 16 Effect of the wild-type p53 and V-325 proteins on the growth of cells overexpressing the hdm2 protein.
  • Figure 17 Induction of apoptosis by the wild-type p53 and V-325 proteins.
  • Figure 18 Kinetics of induction of apoptosis in EB, EB-1 and EB-V325 cells
  • Example A Construction of different nucleotide fragments necessary for the production of the genes coding for the variants of the p53 protein
  • the human p53 gene was cloned by amplification chain reaction (PCR) on DNA from a human placenta bank (Clontech) using oligonucleotides 5'-1 and 3'-393.
  • PCR amplification chain reaction
  • Oligonucleotide 5'-1 (SEQ ID No. 6): ATGGAGGAGCCCCGCAG
  • Oligonucleotide 3'-393 (SEQ ID No. 7):
  • the AS form of p53 comprises a fragment coding for amino acids 1 to 366 of the human p53 protein supplemented with the last 19 amino acids of the alternative splicing product of the murine p53 protein.
  • the AS form of p53 was obtained in two stages: amplification by PCR of a fragment coding for amino acids 1 to 367 of the protein p53 using the oligonucleotides 5'-1 (see example A1) and 3'-367.
  • Oligonucleotide 3'-367 (SEQ ID No. 8): GGCGGCCGCGATATCGATTCATCAGCTCGAGTGAGC
  • the PCR fragment thus obtained was then cloned into the vector pCRI1 (Invitrogen).
  • the fragment thus cloned has a recognition site for the restriction enzyme Xho I (fragment 1-367).
  • the oligonucleotides 5'-AS1, 5'-AS2, 3'-AS1 and 3'-AS2 were phosphorylated and then hybridized together to constitute the fragment coding for the last 19 amino acids of the alternative splicing product of the murine p53 protein .
  • the gene thus constructed codes for the human variant of the alternative splicing product of the murine p53 protein (AS).
  • the protein sequence thus modified is as follows:
  • This example describes the construction of different cDNAs coding for different fragments of the human p53 protein, carrying all or part of the DNA binding domain of p53. These fragments are then used in the construction of the p53 variants. These fragments were obtained by polymerase amplification reaction on the matrices described in examples A1 and A2 by means of different oligonucleotides. The amplification reactions were carried out under the conditions described in Example A4.1.
  • This example describes the construction of a cDNA coding for amino acids 75 to 325 of the wild-type human p53 protein (75-325).
  • This cDNA was obtained by amplification chain reaction (PCR) on the p53 DNA (described in Example A1) with the following oligonucleotides 5'-75 and 3'-325:
  • This example describes the construction of a cDNA coding for amino acids 75 to 336 of the wild-type human p53 protein (75-336).
  • This cDNA was obtained by amplification chain reaction (PCR) on the p53 DNA (described in Example A1) with the oligonucleotides 5'-75 (SEQ ID No. 13) and 3'-336 as follows:
  • This example describes the construction of a cDNA coding for amino acids 75 to 343 of the wild-type human p53 protein (75-343).
  • This cDNA was obtained by amplification chain reaction (PCR) on the p53 DNA (described in Example A1) with the oligonucleotides 5'-75 (SEQ ID No. 13) and 3'-343 as follows:
  • This example describes the construction of a cDNA coding for amino acids 75 to 367 of the wild-type human p53 protein (75-367).
  • This fragment was obtained by amplification chain reaction (PCR) on the p53 DNA described in Example A1 with the oligonucleotides 5'-75 (SEQ ID No. 13) and 3'-367 (SEQ ID n ° 8).
  • the fragment thus obtained includes a recognition site by the endonuclease Xhol (75-367).
  • A3.5 - Construction of a cDNA coding for the 75-AS fragment and its derivative H 182 This example describes the construction of a cDNA coding for amino acids 75 to 366 of the wild human p53 protein (75-366) added with the last 19 amino acids of the alternative splicing product of the murine p53 protein.
  • This fragment was obtained by amplification chain reaction (PCR) on the DNA of the AS fragment described in Example A2 with the oligonucleotides 5'-75 (SEQ ID No. 13) and 3'-AS2 (SEQ ID n ° 12).
  • This example describes the construction of a cDNA coding for amino acids 75 to 393 of the human p53 protein (75-393). This fragment was obtained by amplification chain reaction (PCR) on the p53 DNA described in Example A1 with the oligonucleotides 5'-75 (SEQ ID No. 13) and 3'-393 (SEQ ID No. 7).
  • PCR amplification chain reaction
  • the different fragments were obtained by polymerase amplification reaction on different matrices using different oligonucleotides.
  • the amplification reactions were carried out under the following conditions: Amplitaq DNA polymerase enzyme (Perkin-Elmer) in the buffer supplied by the supplier, with a dNTP concentration of 0.2 mM, 100 ng of matrix and 500 ng of each of the two oligonucleotides.
  • This example describes the construction of a cDNA coding for amino acids 411-490 of the viral protein VP16 (VP16 TA). This region carries the transactivating domain of this protein.
  • the transactivating fragment derived from the viral protein VP16 (411-490) of the herpes simplex virus was obtained by amplification chain reaction (PCR) using the conditions defined above (Cf A4.1) and the oligonucleotides 5 '-VP16 and 3'-VP16 following:
  • the fragment thus obtained comprises 334 base pairs whose sequence is given SEQ ID No. 2. It comprises in its N-terminal part a methionine residue provided by the transcription initiation site (ATG), added during the PCR cloning step.
  • ATG transcription initiation site
  • This example describes the construction of a cDNA coding for a single chain antibody capable of binding the p53 protein (ScFv 421). This construction, expressed at the intracellular level, must be able to fix an endogenous wild-type or mutant p53 protein to recruit its transactivating domain.
  • the cDNA coding for ScFv 421 can be extracted in the form of an Nco I / Not I fragment which comprises a translation initiation site (ATG) and no sequence d translation stopped.
  • the fragment thus obtained comprises 766 base pairs whose sequence is given SEQ ID No. 36.
  • A4.2.2 - Construction of a cDNA coding for the region 325-360 of the wild-type p53 protein (325-360) This example describes the construction of a cDNA coding for amino acids 325-360 of the wild-type p53 protein (325-360). This region carries the domain of oligomerization of this protein. This construction, expressed at the intracellular level, must be able to fix an endogenous wild-type or mutant p53 protein in order to recruit its transactivating domain.
  • This oligomerization domain derived from the human wild-type p53 protein (325-360) was obtained by amplification chain reaction (PCR) using the conditions defined above (Cf A4.1) and the oligonucleotides 5'-325 and 3'-360 following:
  • the fragment thus obtained comprises 141 base pairs whose sequence is given SEQ ID No. 39. It comprises in its N-terminal part a methionine residue provided by the translation initiation site (ATG), added during the PCR cloning step and no translation stop sequence.
  • ATG translation initiation site
  • This example describes the construction of a cDNA coding for amino acids 325-393 of the wild-type p53 protein (325-393).
  • This region carries the domain of oligomerization of this protein.
  • This construction expressed at the intracellular level, must be able to fix an endogenous wild-type or mutant p53 protein in order to recruit its transactivating domain.
  • This oligomerization domain derived from the human wild-type p53 protein (325-360) was obtained by amplification chain reaction (PCR) using the conditions defined above (Cf A4.1) and the oligonucleotides 5'-325 ( SEQ ID No. 37) and 3'-393.2 following:
  • the fragment thus obtained comprises 243 base pairs, the sequence of which is given SEQ ID No. 41. It comprises in its N-terminal part a methionine residue provided by the translation initiation site (ATG), added during the PCR cloning step and no translation stop sequence.
  • ATG translation initiation site
  • This example describes the construction of different cDNAs encoding different fragments carrying an oligomerization domain. These fragments are then used in the construction of the p53 variants. These fragments were obtained by polymerase amplification reaction on different matrices (p53 for the homologous domain and matrices of different origin for the heterologous, in particular artificial oligomerization domains) using different oligonucleotides. The amplification reactions were carried out under the conditions described in A4.1 above.
  • This example describes the construction of a cDNA comprising an artificial oligomerization domain, consisting of an artificial leucine zipper. This cDNA is then used for the construction of variants from the fragments 75-325 (example A3.1) and 75-336 (example A3.2.) Of the human p53 protein and their derivatives modified at the level of cysteine 182.
  • This cDNA was constructed from the following 6 oligonucleotides.
  • oligonucleotides were synthesized using an automatic DNA synthesizer, using phosphoramidite chemistry. These six oligonucleotides have two by two complementarities (lz1-57lz1-3 ', lz2-57lz2-3', lz3-5 '/ lz3-3') and overlapping complementarities (Iz1-37lz2- 5 ', lz2-37lz3- 5 ') allowing the oligomerization domain to be obtained by simple hybridization and ligation.
  • the resulting LZ sequence is given SEQ ID No. 1.
  • A5.2 - Construction of a cDNA comprising the natural oligomerization domain of human p53 This example describes the construction of a cDNA comprising the natural oligomerization domain of human p53.
  • This cDNA is represented by the fragment coding for amino acids 325 to 356 of p53 contained in the constructions 75-367 (example A3.4), 75-AS (example A3.5), 75-393 (example A3.6) and their derivatives modified at the level of cysteine 182.
  • oligonucleotides constituting the leucine-zipper (lz1-5 ', lz1-3', lz2-5 ', lz2-3', lz3-5 'and lz3-3') were phosphorylated using T4 kinase, then hybrids all together and inserted into the pEC vectors 104, 106, 134 and
  • the activating domain of the transcription derived from VP16 described in Example A3 was prepared by enzymatic digestion of the PCR products with the restriction enzymes Hind III and Sal I.
  • activator domain / p53 The possible combinations (activator domain / p53) were formed and inserted simultaneously into the vector pBC SK + (Stratagene) previously digested with the restriction enzymes Hind III and Not I.
  • the products containing the 325-360 domain of p53 in replacement of the transactivating domain (1-74) can be added a synthetic separator (Hinge) obtained by insertion at the Sal I site of a DNA fragment obtained by hybridization of the pair of the following complementary Hinge-up and Hinge-down synthetic oligonucleotides:
  • Hinge-up (SEQ ID # 42) TCGAGGAGGTGGTGGCTCTGGAGGCGGAGGATCCGGCGGTGGA GGTTC
  • the resulting Hinge double stranded DNA sequence is as follows
  • the vector pSV2 described in DNA Cloning, A practical approach Vol.2, D.M. Glover (Ed) IRL Press, Oxford, Washington DC, 1985.
  • This vector is a eukaryotic expression vector.
  • the nucleic acids encoding the variants were inserted into this vector in the form of Hpal-EcoRV fragments. They are thus placed under the control of the promoter of the enhancer of the SV40 virus.
  • the vector pCDNA3 (Invitrogen). It is also a eukaryotic expression vector. The nucleic acids coding for the variants of the invention are thus placed, in this vector, under the control of the CMV early promoter. All the constructions described in Example B3 were introduced into this vector in the form of a Hind III / Not I fragment to be tested in the various in vivo evaluation systems.
  • the invention resides in the construction and the use of viral vectors allowing the transfer and the expression in vivo of nucleic acids as defined above.
  • adenoviruses various serotypes, whose structure and properties vary somewhat, have been characterized.
  • serotypes it is preferred to use, in the context of the present invention, human adenoviruses of type 2 or 5 (Ad 2 or Ad 5) or adenoviruses of animal origin (see application WO94 / 26914).
  • adenoviruses of animal origin which can be used in the context of the present invention, mention may be made of adenoviruses of canine, bovine, murine origin (example: Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine , avian or even simian (example: after-sales service).
  • the adenovirus of animal origin is a canine adenovirus, more preferably a CAV2 adenovirus [Manhattan strain or A26 / 61 (ATCC VR-800) for example].
  • adenoviruses of human or canine or mixed origin are used.
  • the defective adenoviruses of the invention comprise ITRs, a sequence allowing the encapsidation and a nucleic acid according to the invention.
  • the E1 region at least is non-functional.
  • the viral gene considered can be made non-functional by any technique known to those skilled in the art, and in particular by total suppression, substitution, partial deletion, or addition of one or more bases in the gene or genes considered. Such modifications can be obtained in vitro (on isolated DNA) or in situ, for example, by means of genetic engineering techniques, or by treatment with mutagenic agents.
  • the adenovirus according to the invention comprises a deletion in the E1 and E4 regions.
  • it comprises a deletion in region E1 at the level of which the region E4 and the nucleic acid of the invention are inserted (Cf FR94 13355).
  • the deletion in the E1 region preferably extends from nucleotides 455 to 3329 on the sequence of the adenovirus Ad5.
  • the defective recombinant adenoviruses according to the invention can be prepared by any technique known to those skilled in the art (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). In particular, they can be prepared by homologous recombination between an adenovirus and a plasmid carrying inter alia the DNA sequence of interest. Homologous recombination occurs after co-transfection of said adenovirus and plasmid in an appropriate cell line.
  • the cell line used must preferably (i) be transformable by said elements, and (ii), contain the sequences capable of complementing the part of the genome of the defective adenovirus, preferably in integrated form to avoid the risks of recombination.
  • a line mention may be made of the human embryonic kidney line 203 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) which contains in particular, integrated into its genome, the left part of the genome an Ad5 adenovirus (12%) or lines capable of complementing the E1 and E4 functions as described in particular in applications No. WO 94/26914 and WO95 / 02697.
  • the adenoviruses which have multiplied are recovered and purified according to conventional techniques of molecular biology, as illustrated in the examples.
  • AAV adeno-associated viruses
  • the rest of the genome is divided into 2 essential regions carrying the packaging functions: the left part of the genome, which contains the rep gene involved in viral replication and the expression of viral genes; the right part of the genome, which contains the cap gene coding for the capsid proteins of the virus.
  • the use of vectors derived from AAVs for the transfer of genes in vitro and in vivo has been described in the literature (see in particular WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488,528).
  • the defective recombinant AAVs according to the invention can be prepared by cotransfection, in a cell line infected with a human helper virus (for example an adenovirus), of a plasmid containing a nucleic sequence of the invention of interest bordered by two inverted repeat regions (ITR) of AAV, and of a plasmid carrying the packaging genes (rep and cap genes) of AAV.
  • a usable cell line is, for example, line 293.
  • the recombinant AAVs produced are then purified by conventional techniques.
  • retroviruses are integrative viruses, selectively infecting dividing cells. They therefore constitute vectors of interest for cancer applications.
  • the genome of retroviruses essentially comprises two LTRs, an encapsidation sequence and three coding regions (gag, pol and env).
  • the gag, pol and env genes are generally deleted, in whole or in part, and replaced by a heterologous nucleic acid sequence of interest.
  • These vectors can be produced from different types of retroviruses such as in particular MoMuLV ("murine moloney leukemia virus”; also designated MoMLV), MSV ("murine moloney sarcoma virus"), HaSV ("harvey sarcoma virus “); SNV (“ spleen necrosis virus “); RSV (" rous sarcoma virus ”) or even Friend's virus.
  • a plasmid comprising in particular the LTRs, the encapsidation sequence and said nucleic acid is constructed, then used to transfect a cell line known as encapsidation, capable to bring in trans retroviral functions deficient in the plasmid.
  • the packaging lines are therefore capable of expressing the gag, pol and env genes.
  • Such packaging lines have been described in the prior art, and in particular the line PA317 (US4,861,719); the PsiCRIP line (WO90 / 02806) and the GP + envAm-12 line (WO89 / 07150).
  • the recombinant retroviruses may include modifications at the level of the LTRs to suppress transcriptional activity, as well as extended packaging sequences, comprising a part of the gag gene (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639).
  • the recombinant retroviruses produced are then purified by conventional techniques.
  • a defective recombinant adenovirus or retrovirus indeed have properties which are particularly advantageous for the transfer of genes into tumor cells.
  • cationic polymers of polylysine type (LKLK) n, (LKKL) n, polyethylene immine and DEAE dextran or alternatively cationic or lipofectant lipids. They have the property of condensing DNA and promoting its association with the cell membrane.
  • lipopolyamines lipofectamine, transfectam, etc.
  • DOTMA cationic or neutral lipids
  • DOGS DOGS
  • DOPE DOPE
  • the concept of targeted transfection has been developed, mediated by a receptor, which takes advantage of the principle of condensing DNA thanks to the cationic polymer while directing the binding of the complex to the membrane thanks to a chemical coupling between the cationic polymer and the ligand of a membrane receptor, present on the surface of the cell type that is to be grafted.
  • the targeting of the transferrin, insulin or hepatocyte asialoglycoprotein receptor has thus been described.
  • the preparation of a composition according to the invention using such a chemical vector is carried out according to any technique known to those skilled in the art, generally by simple contacting of the various components.
  • the p53 variants according to the invention were evaluated in cell test for the following criteria:
  • constructs used more particularly for this evaluation are constructs V-325, V-336, V-343 and AS described in Example B.
  • baculoviruses were produced and purified according to the manufacturers' instructions (Invitrogen, Pharmingen).
  • the two proteins were homogeneously purified from nuclear extracts of SF9 insect cells infected with their respective baculovirus, the nuclear extracts being obtained by following the procedure described by Delphin et al. (C. Delphin, Eur. J. Biochem., 223, 683-692, 1994).
  • Wild-type p53 is purified by immunoaffinity on the monoclonal antibody pAb421 (Oncogene Sciences, Ab-1) according to the following protocol: the nuclear extract of the infected cells is incubated for 3 h at 4 ° C. with a protein A gel. agarose on which the antibody pAb421 has been covalently coupled.
  • the p53 protein is eluted by the peptide corresponding to the epitope recognized by this antibody on p53
  • the eluted p53 is separated from the peptide and purified to homogeneity by gel permeation on a Superose 6 HR10 / 30 column equilibrated with 50 mM TrisHCI pH 7.5, 0.2 M NaCl, 0.1 mM EGTA,
  • the V325 protein labeled in N-terminal by a peptide sequence containing inter alia a sequence of 6 histidine residues now called HisV325 was purified by a procedure adapted from Hochuli et al. (Bio / Technology Vol 6 (1988) 1321).
  • the nuclear extract of the infected cells is desalted on a PD10 column (Pharmacia) balanced in 50 mM sodium phosphate buffer pH 8 containing 5 mM ⁇ -mercaptoethanol, 0.1 % NP-40 and a cocktail of protease inhibitors. Incubation of the nuclear extract with Nickel-NTA agarose gel was carried out in this buffer for 1 h at 4 ° C.
  • the HisV325 protein is eluted with 0.3 M imidazole in the latter buffer after washing the gel with 0.1 M imidazole.
  • the fractions containing HisV325 are aliquoted and immediately frozen at -80 ° C. until use.
  • the specific double-stranded DNA sequence used in this experiment consists of two synthetic oligonucleotides, the sequence of which is as follows:
  • Oligo 5569 (SEQ ID # 46): AGCTTCAACATGTTGGGACATGGTCG
  • the DNA binding reaction is carried out in 25 ⁇ l of reaction medium (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 5 mM MgCI 2 , 0.05 mM ZnCI 2 , 5 mM dithiotreitol, 0.1 mg / ml BSA , 10% glycerol, 1% Nonidet P-40, 0.1 M NaCl, 2 ⁇ g / ml aprotinin, 2 ⁇ g / ml E-64, 2 ⁇ g / ml leupeptine, 2 ⁇ g / ml pepstatin) by addition of the WAF sequence -RE (2.4 10 '9 M) prepared according to the previous example, of 1, 2 10 6 M of the cold competing oligonucleotide AP2 (Promega) used to eliminate non-specific binding and of 30 ng of hybrid molecules to test
  • the transactivating function of the constructs was evaluated in an in vivo transactivation system in SAOS-2 cells (human osteosarcoma) deficient for the two alleles of the p53 protein (cells accessible to ATCC under the number HTB85) and in lines. H358 tumors (Maxwell & Roth, Oncogene 8 (1993), 3421) and HeLa (ATCC CCL 2).
  • This system is based on the use of a reporter gene which can be assayed enzymatically and placed under the dependence of a promoter containing the nucleotide motifs for specific recognition by the wild form of p53 (see experimental protocols).
  • the reporter gene is the CAT (chloramphenicol-acetyl transferase) gene and the recognition sequence by p53 is the consensus sequence (p53RE) defined by Funk et al. (Mol. Cell. Biol. 12 (1992) 2866) .
  • the cells (3.5 ⁇ 10 5 ) are seeded in 6 cm diameter petri dishes containing 3 ml of DMEM medium (Gibco BRL) added with 10% of heat-inactivated fetal calf serum, and cultured overnight in a CO2 incubator (5%) at 37 ° C.
  • the different constructs are then transfected using lipofectAMINE (Gibco BRL) as transfection agent as follows: 3 ⁇ g of total plasmid are incubated (including 0.5 ⁇ g of the reporter plasmid) with 10 ⁇ l of lipofectAMINE for 30 min with 3 ml of Opti-MEM medium (Gibco BRL) without serum (transfection mixture).
  • the cells are rinsed twice with PBS and then incubated for 4 h at 37 ° C. with the transfection mixture, after which the latter is aspirated and replaced with 3 ml of DMEM medium added with 10% of fetal calf serum. heat inactivated and cells returned to grow for 48 h at 37 ° C.
  • the cells are washed once in PBS and then scoured and recovered in 100 ⁇ l of 0.25 M Tris buffer pH 8 and lysed by three cycles of freezing - thawing in an ethanol / dry ice bath.
  • the total cell extract thus obtained is centrifuged for 15 min at 10,000 ⁇ m and the supernatant recovered for the assay of the activity. This is carried out by adding 20 ⁇ l of cell extract to 130 ⁇ l of a reaction mixture, the final composition of which is as follows:
  • reaction products are extracted with 250 ⁇ l of ethyl acetate, 20 ⁇ l of which are deposited on a silica plate (thin layer chromatography) put to migrate in a mixture containing 95% chloroform and 5% methanol.
  • the chromatography plate thus obtained is finally revealed using an instantimager (Packard instruments) which makes it possible to calculate the ratio of the different acetylation products, a ratio which reflects the activity of the enzyme Chloramphenicol-Acetyl-Transferase and therefore the transactivating activity of the different constructions.
  • the p53 protein has a dose-dependent activity which tends towards saturation for high doses (from 100 ng of plasmid). This saturation may reflect the need for cofactors which would be limiting under these conditions.
  • V-325, V-336 and V-343 exhibit, like the protein p53, a transactivating activity which does not seem saturable at high doses. It is therefore possible that this apparent lack of saturation could lead to an overall increase in activity. It also appears that the V-325 construct is more active than its V-336 and V-343 counterparts, which suggests that the chimeric proteins carrying the region 75-325 are particularly advantageous.
  • Table 1 Transactivating activity in cells of the H 358 tumor line.
  • the level of expression of the wild-type p53 protein and of the V-325 variants, V-336 and V-343 was analyzed in SAOS-2 cells. To do this, the cells are transfected with 3 ⁇ g of each of the plasmids used in the previous experiment, and recovered 24 hours and 48 hours after transfection. After two washes in PBS buffer (Gibco BRL), the cells are lysed for 15 minutes at 4 ° C.
  • RIPA buffer (10 mM Tris-Hcl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1%, Nonidet- P40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate) added with 2 mM PMSF, 20 ⁇ g / ml aprotinin, 2 ⁇ g / ml E64, 2 ⁇ g / ml leupeptine and 2 ⁇ g / ml pepstatin.
  • the proteins are transferred onto a PVDF membrane (NEN Research Products) using the NOVEX semi-dry transfer system according to the manufacturer's recommendations, and revealed using the monoclonal antibody pAb 240 (Oncogene Sciences, Ab-3) and a secondary antibody (anti-mouse rabbit) coupled to peroxidase (Nordic Immunology) using the ECL kit (Amersham).
  • WAF1 normally induced by the p53 protein.
  • the EB cells (3.5 ⁇ 10 5 cells) were transfected with 1.3 ⁇ g of the plasmid pmlMTI i-V325 and 200 ng of the plasmid pcDNA3 according to the protocol previously described and the stable clones were selected after transfection by growth in a medium containing 800 ⁇ g / ml of geneticin.
  • a clone expressing V-325 inducibly at a level comparable to the expression of the protein p53 in the clone EB-1 was selected (clone EB-V325).
  • the clones EB-1 and EB-V325 as well as the parental cells EB OO 6 cells) were subjected to a treatment with ZnCI 2 (200 ⁇ M) and cell extracts were carried out at different times and subjected to electrophoresis and transfer to membrane as described above.
  • the transferred proteins were revealed by three different antibodies; the monoclonal antibody pAb240 directed against the protein p53, and two polyclonal antibodies directed one against the protein hdm2 and the other against the protein WAF1.
  • V-325 results in the induction of the expression of genes normally induced by the wild-type p53 protein, and that this variant does indeed exhibit increased activity in a physiological context compared with the wild-type p53 protein.
  • the activity of p53 decreases as the concentration of E6 is increased, this decrease being very probably the reflection of the degradation of p53 induced by E6.
  • V-336 has an absence of sensitivity to E6.
  • V-325 the protein V-325 seems to be able to be slightly activated by E6.
  • the V-325 protein is still, and in all the situations observed, more active than p53.
  • the transactivating activity of the V-325 and V-336 constructs in HPV18 positive (HeLa) cells and therefore expressing the E6 protein was tested and compared with that of wild p53.
  • results presented in FIG. 12 show a very clear transcriptional activity of the two constructs V-325 and V-336, in a context where the wild-type p53 protein is very little active, suggesting once again that these two constructs are insensitive to E6 unlike with wild protein.
  • the hybrid molecules of the invention V-325 and V-336 as well as the wild-type p53 protein are produced by translation in vitro in the presence of 44 ⁇ Ci of ⁇ S-methionine (Amersham) (1175 Ci / mmol) for generate these radioactive labeled hybrid molecules.
  • the protein E6 HPV18, when it is produced under the same conditions but in the absence of ⁇ S-methionine.
  • each of the radiolabelled products (p53, V-325 and V-336) are incubated at 30 ° C. with 2 ⁇ l of non-radiolabelled E6 protein and 10 ⁇ l of reticulocyte lysate in a final volume of 40 ⁇ l of 25 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5, 100 mM NaCl, 3 mM DTT.
  • the reaction is then stopped at different times by taking 7.5 ⁇ l of the reaction medium and adding 7.5 ⁇ l of migration buffer (Laemmli UK, Nature, 227, 680-685, 1970) and the samples thus prepared are submitted electrophoresis on 10% polyacrylamide gel in denaturing medium at 200 V according to the protocol previously described (Laemmli UK, Nature, 227, 680-685, 1970).
  • the gel is then dried and revealed using an instantimager (Packard instruments) which makes it possible to estimate the amounts of variants of the invention which have not been degraded during the reaction.
  • the various constructs as well as the H175 mutant were placed under the control of the CMV promoter (pCDNA3). Each of the constructs was co-transfected with increasing concentrations of the plasmid expressing the mutant H175.
  • the AS protein has an increased sensitivity to the dominant negative effect of the H 175 mutant, since it is sensitive to lower concentrations of the latter.
  • the proteins V-325 and V-336 are not only no longer sensitive to the dominant-negative effect but even see their activity increased in a dose-dependent manner in the presence of the mutant form H175. Again, in this trial the protein V-325 has an increased effect compared to the protein V-336 confirming it a little more in its possible super-wild status. D2.4 - Effect of the protein hdm2 on the transactivating function
  • the activity of the protein p53 decreases as the concentration of hdm2 is increased, which corresponds well to a physiological situation.
  • the cells are scraped and transferred to Petri dishes 10 cm in diameter and put back to growing with 10 ml of DMEM medium added with 10% of heat-inactivated fetal calf serum and containing 400 ⁇ g / ml of geneticin (G418). Following a selection of 15 days in the presence of G418, the number of Neo R colonies is determined by counting after staining with fuchsin.
  • V-325 and V-336 have the capacity to block cell growth in a manner at least as effective as the wild-type p53 protein in cellular contexts where it can function normally (wild-type p53 or double deletion) , but above all that they retain this activity even in cellular contexts where the wild-type p53 protein is very little active (HeLa cells expressing the E6 protein of HPV18 and OsA-CL cells exhibiting an overexpression of the hdm2 protein). This property gives the variants of the invention considerable therapeutic advantages.
  • the apoptotic activity of the variants of the invention was studied using the EB, EB-1 and EB-V325 cells and the induction conditions previously described (example D1).
  • the cells thus induced OO 6 cells are fixed and permeabilized by an incubation of 40 minutes in 1 ml of Permeafix (Ortho Diagnostic Systems Inc.), then washed twice in buffer A (PBS (Gibco BRL) supplemented with 0.5% Tween 20), before being resuspended and incubated for one hour at room temperature in 100 ⁇ l of buffer A supplemented with 2 % BSA (PBS-BSA) and 1 ⁇ g of monoclonal antibody pAb240.
  • the cells are incubated for 1 hour at room temperature in 100 ⁇ l of the same buffer added with 1 ⁇ g of a secondary polyclonal antibody coupled to fiuorescein (GAM-FITC (Immunotech)). Then, the cells are washed twice in buffer A, resuspended in 1 ml of the same buffer containing 5 ⁇ g of propidium iodide and 1 mg of RNase (DNase-free), and incubated for 30 min at room temperature before being analyzed by flow cytometry.
  • GAM-FITC secondary polyclonal antibody coupled to fiuorescein
  • NAME RHONE POULENC RORER S.A.
  • CTGGCCCCTC CTCAGCATCT TATCCGAGTG GAAGGAAATT TGCGTGTGGA GTATTTGGAT 420
  • GACTGTACCA CCATCCACTA CAACTACATG TGTAACAGTT CCTGCATGGG CGGCATGAAC 540 CGGAGGCCCA TCCTCACCAT CATCACACTG GAAGACTCCA GTGGTAATCT ACTGGGACGG 600
  • REPLACEMENT ISLAND (RULE 26) CCTGCCCTCA ACAAGATGTT TTGCCAACTG GCCAAGACCT GCCCTGTGCA GCTGTGGGTT 240 GATTCCACAC CCCCGCCCGG CACCCGCGTC CGCGCCATGG CCATCTACAA GCAGTCACAG 300
  • CTGGCCCCTC CTCAGCATCT TATCCGAGTG GAAGGAAATT TGCGTGTGGA GTATTTGGAT 420 GACAGAAACA CTTTTCGACA TAGTGTGGTG GTGCCCTATG AGCCGCCTGA GGTTGGCTCT 480
  • GAG ATG TTC CGA GAG CTG AAT GAG GCC TTG GAA CTC AAG GAT GCC CAG 720 Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gin 605 610 615 GCT GGG AAG GAG CCA GGG GGG AGC AGG GCT CAC TCG AGC TGA TGA 765
  • SEQ ID NO: 29 ATG TCC ACG GCC CCC CCG ACC GAT GTC AGC CTG GGG GAC GAG CTC CAC 48 Met Ser Thr Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu Leu His 275 280 285
  • SEQ ID NO: 30 ATG GCC ACG GCC CCC CCG ACC GAT GTC AGC CTG GGG GAC GAG CTC CAC 48 Met Ala Thr Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu Leu His
  • SEQ ID NO: 31 ATG GCC CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCA GGG GCA GAG CTT GTG GGG TCA 48 MET ALA GLN VAL GLN LEU GLN GLU SER GLY ALA GLU LEU VAL GLY SER 1 5 10 15 GGG GCC TCA GTC AAG TTG TCC TGC ACA GCT TCT GGC TTC AAC ATT AAA 96 GLY ALA SER VAL LYS LEU SER CYS THR ALA SER GLY PHE ASN ILE LYS 20 25 30

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Abstract

La présente invention concerne des protéines dérivées du produit du gène suppresseur de tumeurs p53, possédant des fonctions améliorées en vue d'une utilisation thérapeutique. Elle concerne avantageusement des protéines possédant des fonctions suppresseur de tumeurs et inducteur de mort cellulaire programmée améliorées, plus particulièrement dans des contextes pathologiques de prolifération dans lesquels la protéine p53 de type sauvage est inactivée. Elle concerne également les acides nucléiques codant pour ces molécules, les vecteurs les contenant et leurs utilisations thérapeutiques, notamment en thérapie génique.

Description

VARIANTS DE LA PROTEINE P53 ET UΗLISAΗONS THERAPEUTIQUES
La présente invention concerne des protéines dérivées du produit du gène suppresseur de tumeurs p53, possédant des fonctions améliorées en vue d'une utilisation thérapeutique. Elle concerne avantageusement des protéines possédant des fonctions suppresseur de tumeurs et inducteur de mort cellulaire programmée supérieures à celle de la protéine p53 de type sauvage, plus particulièrement dans des contextes pathologiques de prolifération dans lesquels la protéine p53 de type sauvage est inactivée. Elle concerne également les acides nucléiques codant pour ces molécules, les vecteurs les contenant et leurs utilisations thérapeutiques, notamment en thérapie génique. Les produits de l'invention sont particulièrement adaptés à la restauration des fonctions de p53 dans des contextes pathologiques tels que notamment les cancers.
La protéine p53 sauvage intervient dans la régulation du cycle cellulaire et dans le maintien de l'intégrité du génome de la cellule. Cette protéine, dont la fonction principale est d'être un activateur de la transcription de certains gènes, est susceptible, par un processus non encore bien défini, de bloquer la cellule en phase G1 du cycle cellulaire lors de l'apparition de mutations au cours de la réplication du génome, et d'enclencher un certains nombre de processus de réparation de l'ADN. De plus, en cas de mauvais fonctionnement de ces processus de réparation ou en cas d'apparition d'événements mutationnels trop nombreux pour être corrigés, cette protéine est capable d'induire le phénomène de mort cellulaire programmée, appelé apoptose.
De cette façon, la protéine p53 agit comme un supresseur de tumeur, en éliminant les cellules anormalement différenciées ou dont le génome a été endommagé. Cette principale fonction de la p53 dépend de sa fonction de facteur de transcription, soit en d'autre termes de sa double capacité à reconnaître des séquences spécifiques au niveau de l'ADN génomique et à recruter la machinerie générale de transcription.
La protéine p53 comporte 393 acides aminés, qui définissent 5 domaines fonctionnels (voir Figure 1 ) :
- le domaine activateur de la transcription, constitué par les acides aminés 1 à 73, capable de lier certains facteurs de la machinerie générale de transcription comme la protéine TBP. Ce domaine est aussi le siège d'un certain nombre de modifications post-traductionnelles. Il est également le siège d'interactions nombreuses de la protéine p53 avec de nombreuses autres protéines et notamment avec la protéine cellulaire mdm2 ou la protéine EBNA5 du virus d'Epstein-Barr (EBV), capables de bloquer la fonction de la protéine sauvage. De plus, ce domaine possède des séquences d'acides aminés dites PEST de susceptibilité à la dégradation protéolytique.
- le domaine de liaison à l'ADN, localisé entre les acides aminés 73 et 315. La conformation de ce domaine central de p53 régule la reconnaissance de séquences d'ADN spécifiques de la protéine p53. Ce domaine est le siège de deux types d'altérations affectant la fonction de la protéine sauvage :
(i) l'interaction avec des protéines bloquant la fonction de la p53 comme l'antigène 'grand T' du virus SV40 ou les protéines virales E6 des virus HPV16 et HPV18 capables de provoquer sa dégradation par le système de l'ubiquitine. Cette dernière interaction ne peut se faire qu'en présence de la protéine cellulaire E6ap (enzyme E3 de la cascade de l'ubiquitinilation).
(ii) les mutations ponctuelles qui affectent la fonction de la p53 et dont ia quasi-totalité sont localisées dans cette région. - le signal de localisation nucléaire, constitué des acides aminés 315 à 325, indispensable au bon adressage de ia protéine dans le compartiment où elle va exercer sa principale fonction.
- le domaine d'oligomérisation, constitué des acides aminés 325 à 355. Cette région 325 à 355 forme une structure de type; feuillet β (326-
334)-coude (335-336)-hélice α (337-355). Les altérations de fonctions localisées dans cette région sont essentiellement dues à l'interaction de la protéine sauvage avec les différentes formes mutantes qui peuvent conduire à des effets variables sur la fonction de la protéine sauvage.
- le domaine de régulation, constitué des acides aminés 365 à
393, qui est le siège d'un certain nombre de modifications post- traductionnelles (glycosylations, phosphorylations, fixation d'ARN,...) qui modulent la fonction de la protéine p53 de façon positive ou négative. Ce domaine joue un rôle extrêmement important dans la modulation de l'activité de la protéine sauvage.
Le fonctionnement de la protéine p53 peut être perturbé de différentes façons.
- blocage de sa fonction par un certain nombre de facteurs comme par exemple l'antigène 'grand T du virus SV40, la protéine EBNA5 du virus d'Epstein-Barr, ou la protéine cellulaire mdm2.
- déstabilisation de la protéine par augmentation de sa susceptibilité à la protéolyse, notamment par interaction avec la protéine E6 des virus du papillome humain HPV16 et HPV18, qui favorise l'entrée de la p53 dans le cycle d'ubiquitinilation. Dans ce cas l'interaction entre ces deux protéines ne peut se faire que par la fixation préalable d'une protéine cellulaire, la protéine E6ap dont le site de fixation est mal connu.
- mutations ponctuelles au niveau du gène de la p53. - délétion d'un ou des deux allèles de la p53
Les deux derniers types de modifications sont retrouvés dans environ 50% des différents types de cancer. A cet égard, les mutations du gène de la p53 répertoriées dans les cellules cancéreuses touchent une très grande partie du gène codant pour cette protéine, et ont pour résultats des modifications variables du fonctionnement de cette protéine. On peut cependant noter que ces mutations sont en grande majorité localisées dans la partie centrale de la protéine p53 dont on sait qu'elle est la région de contact avec les séquences génomiques spécifiques de la protéine p53.
Ceci explique pourquoi la plupart des mutants de la protéine p53 ont comme principale caractéristique de ne plus pouvoir se fixer aux séquences d'ADN que reconnaît la protéine sauvage et ainsi de ne plus pouvoir exercer leur rôle de facteur de transcription. Par ailleurs, certains mutants semblent avoir acquis de nouvelles fonctions telles que l'activation de certains gènes au niveau transcriptionnel.
On regroupe actuellement l'ensemble de ces modifications dans trois catégories:
- les mutants dits faibles, dont le produit est une protéine non- fonctionnelle, qui, dans le cas de mutation sur un seul des deux allèles, n'affecte pas le fonctionnement de la protéine sauvage codée par l'autre allèle. Les principaux représentants de cette catégorie sont les mutants H273 et W248, ce dernier étant spécifique du syndrome familial de Li-Fraumeni d'hypersensibilité aux affections cancéreuses.
- les mutants dominant-négatifs, dont le produit est une protéine non-fonctionnelle, qui, dans le cas de mutation sur un seul des deux allèles et par interaction avec la protéine sauvage, est capable de bloquer le fonctionnement de celle-ci par formation d'oligomères mixtes non-actifs qui ne peuvent plus se fixer aux séquences d'ADN spécifiques de la protéine sauvage. Le principal représentant de cette catégorie est le mutant G281.
- les mutants dominant-oncogéniques, dont le produit est une protéine qui est capable d'une part de bloquer la fonction de la protéine sauvage comme les mutants de la catégorie précédente, et d'autre part, de favoriser par des mécanismes mal connus le développement tumoral, présentant ainsi un gain de fonction. Le principal représentant de cette catégorie est le mutant H 175.
Compte tenu de ses propriétés anti-tumorales et apoptotiques et de son implication dans nombreuses pathologies de type hyperprolifératives, le gène p53 sauvage a été utilisé dans des approches de thérapie génique et cellulaire. Il a en particulier été proposé de traiter certaines pathologies hyperprolifératives, et notament des cancers, par administration in vivo du gène p53 sauvage, par restauration des fonctions de p53. L'administration peut être réalisée préférentiellement par des vecteurs viraux et notamment adénoviraux (WO94/24297) ou rétroviraux (WO94/06910).
Il a ainsi été montré que l'introduction d'un acide nucléique codant pour la protéine p53 sauvage permettait de restaurer partiellement une régulation normale de la croissance cellulaire. Cependant, si ces résultats sont encourageants, l'efficacité de ces approches est limitée par l'efficacité thérapeutique de la protéine p53 après transfert et expression in vivo dans les cellules hyperprolifératives. En effet, les situations pathologiques hyperproliférative telles que les cancers proviennent du dérèglement de l'équilibre qui s'établit dans un réseau de contrôles négatifs et positifs de la croissance cellulaire. L'inactivation du contrôle négatif exercé par la protéine p53 sauvage par l'apparition d'un mutant p53 dominant négatif à partir de l'un des deux allèles, la surexpression d'un partenaire cellulaire inactivant p53 comme par exemple mdm2, voir la présence d'un inactivateur viral suite à une infection, constituent un contexte non favorable pour une thérapie basée sur la réintroduction d'une protéine p53 sauvage qui risque fort d'être également inactivée.
Il est donc particulièrement important de pouvoir disposer de protéines de type p53 ayant des propriétés thérapeutiques accrues. Notamment, il serait particulièrement avantageux de disposer de molécules p53 actives constitutivement et non sensibles aux effets inactivateurs des mutants dominant-négatifs et oncogéniques ou d'autres protéines cellulaires ou virales telles que E6 de HPV18 et HPV16, MDM2, EBNA5 de EBV, etc rencontrés dans les cellules tumorales.
Certaines modifications de la protéine p53 ont été décrites dans l'art antérieur. Ainsi, la demande WO95/06661 décrit des modifications sur certains résidus des régions homologues de la protéine p53, c'est-à-dire dans les régions 343-351 , 372-380 et 381-393. Cependant, ces modifications sont très mineures et ne permettent pas aux produits résultant d'échapper aux mécanismes d'inactivation de la protéine p53 in vivo. De plus, ces protéines ne semblent pas présenter d'activité améliorée par rapport à la protéine p53 sauvage.
Hupp et al. (Cell Vol 71 (1992) 875) ont décrit un dérivé de p53 comprenant une délétion des 30 résidus C-terminaux (p53ΔC-ter30). Toutefois, si cette protéine conserve une capacité à lier l'ADN, ses propriétés apoptotiques ne sont pas démontrées. De plus, elle n'est pas résistante à l'inactivation par les mutants dominants négatifs.
Pietenpol et al (PNAS 91 (1994) 1998) ont décrit des molécules chimériques dérivées de la protéine p53, notamment une protéine VP16-p53 (80-343)-GCN4. Cependant, cette molécule possède une capacité de liaison à l'ADN et de transactivation nettement diminuées par rapport à la protéine p53 sauvage (40%). Par ailleurs, elle possède une région d'oligomérisation non sélective, risquant d'interagir avec d'autres composant cellulaires et ainsi d'induire une réponse cellulaire non spécifique. Par ailleurs, ses propriétés de résistance aux mécanismes d'inactivation ne sont pas indiquées.
La présente invention décrit de nouveaux variants de la protéine p53 présentant des propriétés thérapeutiques améliorées. Elle décrit en particulier des variants adaptés à une utilisation en thérapie génique, notamment anti-cancéreuse. Les variants de l'invention dérivent de la protéine p53 par modification(s) structurale(s), conservent une activité de type p53 et, exprimés dans des cellules hyperprolifératives, présentent au moins une propriété accrue par rapport à la protéine p53. Il peut s'agir en particulier de l'activité anti-proliférative et/ou apoptotique. Les variants de l'invention possèdent avantageusement une activité anti-proliférative et/ou apoptotique accrue, ou plus spécifique des cellules hyperprolifératives, ou moins sensible aux différentes altérations auxquelles est sujette la p53 sauvage.
Un premier objet de l'invention concerne plus particulièrement un variant de la protéine p53 dans lequel tout ou partie du domaine d'oligomérisation est délété et remplacé par un domaine leucine zipper artificiel. Comme indiqué ci-avant, la protéine p53 est inactivée par certains mutants, et notamment les mutants dominant-négatifs et oncogéniques, rencontrés dans les cellules tumorales. Cette inactivation est le résultat de la formation d'oligomères mixtes non actifs entre la protéine p53 sauvage et le mutant, qui ne peuvent plus se fixer aux séquences spécifiques reconnues par la protéine p53 sauvage. La présente invention décrit maintenant des variants de la protéine p53 résistant à l'effet dominant négatif de certains mutants, c'est-à-dire des variants actifs dans un contexte cellulaire présentant un ou deux allèles mutés, ce qui est le cas de près de 90% des cancers humains p53 dépendants.
Dans les variants selon l'invention, tout ou partie du domaine d'oligomérisation naturel de la protéine, qui ne fait pas la distinction entre les formes sauvage et mutante, est ainsi remplacé par un domaine équivalent possédant une capacité d'oligomérisation spécifique. Cette modification est effectuée en utilisant un leucine-zipper artificiel optimisé pour former un dimère. Les molécules selon l'invention comportant un tel leucine-zipper artificiel sont particulièrement avantageuses car forment des oligomères uniquement avec d'autres molécules portant le même leucine-zipper. Elles ne forment donc pas d'oligomères avec les mutants dominant négatifs ou oncogéniques de la protéine p53, susceptibles de les inactiver. Elles ne forment pas non plus d'oligomères avec d'autres protéines cellulaires portant des domaines d'oligomérisation, susceptibles également de les inactiver ou d'induire des effets indésirables. Elles ne peuvent former que des homo- oligomères et possèdent donc une sélectivité importante, assurant une meilleure activité dans un contexte de pathologie hyperproliférative.
Selon la présente invention, le domaine leucine zipper artificiel est donc avantageusement un domaine non présent à l'état naturel, assurant une sélectivité d'oligomérisation. Tout préférentiellement, le domaine d'oligomérisation est représenté par la séquence SEQ ID n° 1.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les variants comportent une délétion de tout ou partie du domaine d'oligomérisation et de tout ou partie du domaine de régulation. Comme indiqué précédemment, le domaine d'oligomérisation est localisé entre les résidus 325-355 inclus et le domaine de régulation entre les résidus 365-393 inclus. Ce type de variant est tout à fait avantageux car est dépourvu de tout ou partie des effets de régulation négative exercée par l'intermédiaire de la partie C-terminale (aa 365-393). Ces variants constituent des protéines potentiellement constitutivement actives, présentant une activité non modulable et éventuellement accrue. La région de régulation est avantageusement supprimée dans sa totalité. Les variants préférés selon l'invention comportent une délétion de la partie C-terminale de la protéine p53, à partir du résidu 326 ou 337 inclus. Des exemples d'intermédiaires utilisés pour la construction de ces variants sont notamment :
. pEC107 (75-325-lz) possédant une délétion de la partie C-terminale de la protéine p53, à partir du résidu 326, substituée par un domaine d'oligomérisation artificiel de séquence SEQ ID n°1.
. pEC110 (75-336-lz) possédant une délétion de la partie C-terminale de la protéine p53, à partir du résidu 337, substituée par un domaine d'oligomérisation artificiel de séquence SEQ ID n°1.
Selon un mode de réalisation avantageux, dans les variants de l'invention, le résidu cystéine en position 182 de la protéine p53 est remplacé par une histidine. Cette mutation permet avantageusement d'augmenter l'affinité du variant pour les séquences nucléotidiques spécifiques de liaison. L'introduction de cette modification supplémentaire permet donc d'obtenir une molécule ayant en plus un potentiel transactivateur augmenté.
Des exemples précis de constructions intermédiaires pour la préparation de variants selon l'invention combinant ces différentes modifications sont notamment :
pEC139 (75-325(H182)-lz) possédant une délétion de la partie C- terminale de la protéine p53, à partir du résidu 326, substituée par un domaine d'oligomérisation artificiel de séquence SEQ ID n°1 , et une histidine en position 182.
pEC140 (75-336(H182)-lz) possédant une délétion de la partie C- terminale de la protéine p53, à partir du résidu 337, substituée par un domaine d'oligomérisation artificiel de séquence SEQ ID n°1 , et une histidine en position 182.
Avantageusement, dans les variants selon l'invention, tout ou partie du domaine transactivateur est également délété et remplacé par un domaine transactivateur hétérologue. Il a été indiqué ci-avant que les fonctions transactivatrices de p53 sont essentielles à son activité de suppresseur de tumeur ou d'inducteur d'apoptose. De manière à augmenter le potentiel thérapeutique des variants selon l'invention, ii est particulièrement avantageux de substituer le domaine transactivateur naturel par un domaine transactivateur hétérologue puissant. Ces variants présentent ainsi de nombreux avantages. Ils possèdent bien entendu une activité transactivateur élevée. Mais ils sont également rendus insensibles aux effets de régulation négative exercés par l'intermédiaire de la partie N-terminale (aa 1-73). En effet cette région contient les séquence PEST responsables de sa dégradation protéolytique. La substitution de cette région par un domaine transactivateur hétérologue dépourvu de séquences PEST permet de diminuer cette régulation négative. Ces variants sont également caractérisés par la diminution, voire la suppression, de toute interaction avec la protéine E6 du virus du papillome humain (HPV) qui est susceptible d'induire leur dégradation. Ils sont également moins sensibles aux interactions avec d'autres protéines cellulaires telles que MDM2 et EBNA qui affectent l'activité de la protéine p53 sauvage. Les variants ainsi obtenus possèdent donc une stabilité accrue. La suppression des domaines sensibles à une régulation négative (domaines régulateur et transactivateur) conduit de manière particulièrement avantageuse à des molécules qui ne sont plus la cible de protéines induisant leur protéolyse ou leur inactivation.
Avantageusement, dans les variants de l'invention, le domaine transactivateur est supprimé par délétion des résidus 1 à 74. Les constructions intermédiaires utilisées pour la réalisation de telles molécules sont notamment pEC107 (75-325-lz), pEC110 (75-336-lz), pEC139 (75-
325(H182)-lz) et pEC140 (75-336(H182)-lz).
Selon un premier mode de réalisation, le domaine transactivateur hétérologue est le domaine transactivateur de VP16. Il est avantageusement constitué des résidus 411 à 490 de VP16, dont la séquence est donnée SEQ ID n° 2. Des exemples précis de variants selon l'invention combinant ces différents modifications sont notamment :
=> pEC114 (VP16-75-325-lz) possédant une délétion de la partie N- terminale de la protéine p53 comprenant les résidus 1-74, substituée par le domaine transactivateur de VP16 de séquence SEQ ID n° 2 et une délétion de la partie C-terminale de la protéine p53, à partir du résidu 326, substituée par un domaine d'oligomérisation artificiel de séquence SEQ ID n°1. La séquence complète du variant pEC114 est représentée SEQ ID n° 25.
=> pEC116 (VP16-75-336-lz) possédant une délétion de la partie N- terminale de la protéine p53 comprenant les résidus 1-74, substituée par le domaine transactivateur de VP16 de séquence SEQ ID n° 2 et une délétion de la partie C-terminale de la protéine p53, à partir du résidu 337, substituée par un domaine d'oligomérisation artificiel de séquence SEQ ID n°1. La séquence complète du variant pEC116 est représentée SEQ ID n° 26.
=> pEC147 (VP16-75-325(H182)-lz) possédant une délétion de la partie N-terminale de la protéine p53 comprenant les résidus 1-74, substituée par le domaine transactivateur de VP16 de séquence SEQ ID n° 2; une délétion de la partie C-terminale de la protéine p53, à partir du résidu 326, substituée par un domaine d'oligomérisation artificiel de séquence SEQ ID n°1 , et une histidine en position 182.
=> pEC149 (VP16-75-336(H182)-lz) possédant une délétion de la partie N-terminale de la protéine p53 comprenant les résidus 1-74, substituée par le domaine transactivateur de VP16 de séquence SEQ ID n° 2; une délétion de la partie C-terminale de la protéine p53, à partir du résidu 337, substituée par un domaine d'oligomérisation artificiel de séquence SEQ ID n°1 , et une histidine en position 182.
En raison des modifications mentionnées ci-avant, les variants de l'invention ont également des propriétés 'tueuses' que sont l'arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose potentiellement améliorées. La combinaison des modification mentionnées, incluant la présence d'un domaine d'oligomérisation sélectif et un pouvoir transactivateur amélioré par substitution du domaine d'origine et par la présence d'une histidine en 182 confèrent en effet aux variants de l'invention des potentialités thérapeutiques nettement améliorées. En outre, les variants selon l'invention permettent d'éviter l'apparition de certains mutants (dominants oncogéniques). Les gains de fonction de certains mutants de p53 sont encore mal définis tant au niveau de leur mécanismes qu'au niveau des domaines de la protéine p53 impliqués. Il est fort probable que certaines de ces nouvelles fonctions vont dépendre de l'association à certains partenaires cellulaires effecteurs. L'élimination des domaines impliqués dans ces interactions, et dont les propriétés transformantes ont été mises en évidence, au sein des molécules décrites dans la présente demande sont de nature à empêcher l'apparition de ces gains de fonctions oncogéniques. Ainsi les mutations qui apparaîtraient de façon aléatoire lors de la préparation des lots cliniques de plasmides codant pour les polypeptides décrits ou lors de la production de lots cliniques de vecteurs viraux ou chimiques codant pour ces mêmes polypeptides ne créeraient pas une sous-population de molécules oncogéniques.
Par ailleurs, en raison de la suppression de certains domaines de p53 indispensables pour la fixation de certaines molécules inhibitrices de sa fonction, les variants de l'invention présentent également une activité thérapeutique plus élevée et plus stable. Finalement, l'existence de motifs étrangers dans les différentes constructions de l'invention (protéine AS murine par exemple, domaine d'oligomérisation artificiel, etc) est susceptible de déclencher une réaction immunitaire lors de la mort des cellules transfectées et du relargage dans le milieu extracellulaire des ces différents fragments, augmentant ainsi la capacité du système immunitaire à lutter contre les cellules tumorales. Selon un autre mode de réalisation, le domaine transactivateur hétérologue est un domaine transactivateur actif préférentiellement dans les cellules transformées et non dans les cellules saines avoisinantes. La présente invention décrit en effet également des molécules dont la fonction s'exerce essentiellement dans des cellules transformées et non dans les cellules saines avoisinantes. Bien qu'il semble que l'expression exogène d'une p53 sauvage au sein d une cellule différenciée comportant de la p53 sauvage endogène ait peu ou pas d'effet sur la viabilité, il est néanmoins avantageux de pouvoir disposer d'une protéine qui ne serait fonctionnelle qu'au sein de la cellule ciblée. Cette spécificité de la cellule tumorale versus la cellule normale est actuellement beaucoup travaillée au niveau de la spécificité du ciblage du vecteur viral ou de la conception de systèmes d'expression spécifiques. La présente invention décrit maintenant des dérivés de p53 dont un des domaines fonctionnels est éteint en l'absence d'un activateur cellulaire présent essentiellement dans les cellules transformées.
Ainsi, un autre objet de l'invention concerne un variant de la protéine p53 actif préférentiellement dans les cellules transformées, dans lequel un au moins des domaines fonctionnels de p53 est délété en tout ou en partie et est substitué par un domaine hétérologue actif préférentiellement dans les cellules transformées. Préférentiellement, le domaine fonctionnel de p53 concerné est le domaine transactivateur. Ainsi, un objet particulièrement préféré de l'invention concerne un variant de la protéine p53 actif préférentiellement dans les cellules transformées, dans lequel le domaine transactivateur naturel est délété en tout ou en partie et est substitué par un domaine transactivateur actif préférentiellement dans les cellules transformées. Avantageusement, le domaine transactivateur naturel est délété par suppression des résidus 1-74 inclus de p53.
L'invention concerne plus particulièrement des variants de p53 qui sont fonctionnels spécifiquement en présence d'une protéine Ras oncogénique ou d'un mutant de p53. Ces molécules sont obtenues notamment par remplacement du domaine transactivateur de la protéine p53 sauvage par un domaine protéique capable de lier spécifiquement un transactivateur ou un complexe transactivateur présent dans une cellule transformée.
Le domaine protéique capable de lier spécifiquement le transactivateur transcriptionnel ou le complexe transactivateur transcriptionnel présent dans les molécules de l'invention peut être de différents types. Il peut s'agir en particulier d'un domaine d'oligomérisation dans le cas où le transactivateur ou le complexe transactivateur ciblé comporte également un tel domaine. Il peut également s'agir de tout domaine synthétique ou naturel connu pour interagir avec ledit transactivateur ou complexe transactivateur. Il peut encore s'agir d'un anticorps ou d'un fragment ou dérivé d'un anticorps dirigé contre le transactivateur ou complexe transactivateur.
Avantageusement, le domaine hétérologue est constitué par un anticorps ou un fragment ou dérivé d'anticorps. Les fragments ou dérivés d'anticorps sont par exemple les fragments Fab ou F(ab)'2, les régions VH ou VL d'un anticorps ou encore des anticorps simple chaîne (ScFv) comprenant une région VH liée à une région VL par un bras. La construction de séquences d'acides nucléiques codant pour de tels anticorps modifiés selon l'invention a été décrite par exemple dans le brevet US4,946,778 ou dans les demandes WO94/02610, WO94/29446.
Une construction préférée selon la présente invention comprend un ScFv dirigé contre un mutant de la protéine p53. Ces mutants apparaissent dans les cellules transformées et possèdent un domaine transactivateur.
Leur recrutement par un variant selon l'invention crée une molécule chimère active sélectivement dans les cellules transformées. Selon un autre mode préféré, le ScFv est dirigé contre un complexe transactivateur, c'est à dire un complexe entre une molécule cible présente sélectivement dans les cellules transformées, mais dépourvue d'activité transactivateur transcriptionnel (par exemple un ras oncogénique), et une molécule portant un domaine transactivateur. Cette dernière comporte avantageusement un domaine transactivateur et un domaine de liaison sélectif à ladite molécule cellulaire (par exemple un ScFv anti-ras). La fixation de cette molécule permet la formation d'un complexe binaire transactivateur transcriptionnel, lequel complexe étant alors recruté par le variant de l'invention.
Tout autre type de modification conduisant à cette spécificité d'activité peut bien entendu être utilisée dans le cadre de la présente invention, telle que notamment tout domaine transactivateur spécifique d'un type de cellule.
Ces variants sélectifs comportent avantageusement des modifications supplémentaires dans la partie C-terminale comme indiqué ci-avant pour améliorer encore leurs propriétés. Ainsi, ils comportent avantageusement une délétion de tout ou partie du domaine d'oligomérisation, qui peut être remplacé par tout domaine d'oligomérisation hétérologue. Il s'agit plus préférentiellement d'un domaine d'oligomérisation artificiel, tel que défini ci- avant.
Des exemples précis de variants selon l'invention actifs préférentiellement dans les cellules transformées sont notamment :
ScFv.antip53*-75-325-lz, possédant une délétion de la partie N- terminale de la protéine p53 comprenant les résidus 1-74, substituée par un domaine protéique capable de lier spécifiquement un mutant de la protéine p53 présent dans une cellule transformée, et une délétion de la partie C- terminale de la protéine p53, à partir du résidu 326, substituée par un domaine d'oligomérisation artificiel de séquence SEQ ID n°1. ScFv.antip53*-75-325(H182)-lz, comprenant en plus une mutation His182.
ScFv.antip53*-75-336-lz, possédant une délétion de la partie N- terminale de la protéine p53 comprenant les résidus 1-74, substituée par un domaine protéique capable de lier spécifiquement un mutant de la protéine p53 présent dans une cellule transformée, et une délétion de la partie C- terminale de la protéine p53, à partir du résidu 337, substituée par un domaine d'oligomérisation artificiel de séquence SEQ ID n°1.
ScFv.antip53*-75-336(H182)-lz, comprenant en plus une mutation His182.
- ScFv.antip53*-75-393, possédant une délétion de la partie N- terminale de la protéine p53 comprenant les résidus 1-74, substituée par un domaine protéique capable de lier spécifiquement un mutant de la protéine p53 présent dans une cellule transformée.
- ScFv.antip53*-75-393(H182), comprenant en plus une histidine en position 182.
- ScFv.antip53*-75-367, possédant une délétion de la partie N- terminale de la protéine p53 comprenant les résidus 1-74, substituée par un domaine protéique capable de lier spécifiquement un mutant de la protéine p53 présent dans une cellule transformée; et une délétion de la partie C- terminale, à partir du résidu 368.
- ScFv.antip53*-75-367(H182), comprenant en plus une histidine en position 182,
- ScFv.antip53*-75-AS, possédant une délétion de la partie N- terminale de la protéine p53 comprenant les résidus 1-74, substituée par un domaine protéique capable de lier spécifiquement un mutant de la protéine p53 présent dans une cellule transformée; et une délétion de la partie C- terminale, à partir du résidu 367, additionnée des 19 acides aminés de séquence SEQ ID n° 3.
- ScFv.antip53*-75-AS(H182), comprenant en plus une histidine en position 182,
En outre, le terme actif préférentiellement indique que ces variants exercent leur activité essentiellement lorsqu'ils sont exprimés dans des cellules transformées. Une activité résiduelle peut toutefois exister dans les cellules non transformées, mais inférieure à celle observée dans les cellules transformées.
Un autre objet de la présente invention concerne un variant de la protéine p53 comprenant une délétion de la partie C-terminale, à partir du résidu 367, fusionné à la séquence SEQ ID n° 3 (AS). Cette séquence correspond aux 19 derniers acides aminés du produit d'épissage alternatif de la protéine p53 murine. Ce variant présente donc une modification du domaine d'oligomérisation basée sur une protéine décrite chez la souris comme un variant d'épissage alternatif de la protéine sauvage dans laquelle les 27 acides aminés C-terminaux sont remplacés par 19 acides aminés différents. Ce variant possède une affinité pour les séquences spécifique de liaison à l'ADN potentiellement accrue.
Ce variant comporte avantageusement des modification dans la partie
N-terminale comme indiqué ci-avant pour améliorer encore ses propriétés. Ainsi, il comporte avantageusement une délétion de tout ou partie du domaine transactivateur, qui peut être remplacé par tout domaine transactivateur hétérologue. Il s'agit plus préférentiellement du domaine transactivateur dérivé de la protéine VP16 ou d'un domaine protéique capable de lier spécifiquement un transactivateur ou un complexe transactivateur présent dans une cellule transformée. En outre, le résidu 182 de la protéine p53 est avantageusement remplacé par une histidine. Des exemples précis de ce type de variants selon l'invention sont notamment :
. ScFv.antip53*-75-AS, décrit ci-avant,
. pEC143 (VP16-75-AS), possédant une délétion de la partie N- terminale de la protéine p53 comprenant les résidus 1-74, substituée par le domaine transactivateur de VP16 de séquence SEQ ID n° 2; et une délétion de la partie C-terminale, à partir du résidu 367, additionnée des 19 acides aminés de séquence SEQ ID n° 3. La séquence complète du variant pEC143 est représentée SEQ ID n° 28.
. ScFv.antip53*-75-AS(H182), décrit ci-avant,
. pEC153 (VP16-75-AS(H182)), correspond à pEC143 avec une histidine en position 182.
Selon une manière plus générale, l'invention concerne toute protéine chimère comprenant un domaine transactivateur, un domaine de liaison à l'ADN, un domaine d'adressage au noyau et un domaine d'oligomérisation, dans laquelle les domaines de liaison à l'ADN et d'adressage au noyau sont constitués par les acides aminés 75 à 325 de la protéine p53 sauvage humaine (SEQ ID n° 4). La demanderesse a en effet montré que cette région de la protéine p53, couplée à des domaines transactivateur et d'oligomérisation appropriés, permet la création de molécules de type p53 ayant des propriétés particulièrement avantageuses en terme de stabilité, de résistance aux effets négatifs des mutants de p53 et de sensibilité à l'inactivation par certains facteurs cellulaires.
Selon une variante, les domaines de liaison à l'ADN et d'adressage au noyau sont constitués par les acides aminés 75 à 336 de la protéine p53 sauvage humaine (SEQ ID n° 5). Les protéines chimères selon l'invention peuvent comporter différents types de domaines transactivateur. II peut s'agir du domaine transactivateur de la protéine p53. Préférentiellement, il s'agit d'un domaine transactivateur hétérologue, choisi par exemple parmi le domaine transactivateur de VP16 ou un domaine protéique capable de lier spécifiquement un transactivateur ou un complexe transactivateur présent dans une cellule transformée.
Concernant le domaine d'oligomérisation, il s'agit préférentiellement d'un domaine artificiel, et donc spécifique, tel que par exemple un leucine zipper artificiel, en particulier de séquence SEQ ID n° 1.
Les protéines chimères selon l'invention peuvent en outre comporter un résidu histidine en position 182.
Des exemples précis de protéines chimères telles que décrites dans la présente demande sont notamment pEC114, pEC116, pEC147 et pEC149.
La présente invention a également pour objet tout acide nucléique codant pour un variant ou une protéine chimère tel que défini ci-avant.
L'acide nucléique selon l'invention peut être un acide ribonucléique (ARN) ou désoxyribonucléique (ADN). En outre, il peut s'agir d'un ADN complémentaire (ADNc) éventuellement comprenant un ou plusieurs introns du gène p53. Il peut être d'origine humaine, animale, virale, synthétique ou semi-synthétique. Il peut être obtenu de différentes manières et notamment par synthèse chimique en utilisant les séquences présentées dans la demande et par exemple un synthétiseur d'acides nucléiques. Il peut également être obtenu par criblage de banques au moyen de sondes spécifiques, notamment telles que décrites dans la demande. Il peut encore être obtenu par des techniques mixtes incluant la modification chimique (élongation, délétion, substitution, etc) de séquences criblées à partir de banques. D'une manière générale, les acides nucléiques de l'invention peuvent être préparés selon toute technique connue de l'homme du métier.
Préférentiellement, l'acide nucléique selon l'invention est un ADNc ou un ARN.
L'acide nucléique selon l'invention est avantageusement choisi parmi :
(a) tout ou partie des séquences SEQ ID n° 25, 26,27,28,29, 31 , 32, 33 et 34 ou de leur brin complémentaire,
(b) toute séquence hybridant avec les séquences (a) et codant pour un dérivé selon l'invention,
(c) les variants de (a) et (b) résultant de la dégénérescence du code génétique.
Comme indiqué précédemment, la demanderesse a maintenant construit de nouvelles séquences d'acide nucléique codant pour des polypeptides variants de p53, ayant des propriétés antiprolifératives et apoptotiques tout à fait remarquables. Ces acides nucléiques peuvent être utilisés comme agents thérapeutiques pour produire dans les cellules des dérivés selon l'invention capables de détruire ou de corriger des dysfonctionnements cellulaires. A cet effet, la présente invention concerne également toute cassette d'expression comprenant un acide nucléique tel que défini ci-avant, un promoteur permettant son expression et un signal de terminaison de la transcription. Le promoteur est avantageusement choisi parmi les promoteurs fonctionnels dans les cellules mammifères, de préférence humaines. Plus préférentiellement, il s'agit d'un promoteur permettant l'expression d'un acide nucléique dans une cellule hyperproliférative (cancéreuse, resténose, etc). A cet égard, différents promoteurs peuvent être utilisés. Il peut s'agir par exemple du propre promoteur du gène p53. il peut également s'agir de régions d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Il peut ainsi s'agir de tout promoteur ou séquence dérivée stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de façon spécifique ou non, inductible ou non, forte ou faible. On peut citer notamment les séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule cible. Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut utiliser en particulier de promoteurs ubiquitaires (promoteur des gènes HPRT, PGK, a-actine, tubuline, etc), de promoteurs des filaments intermédiaires (promoteur des gènes GFAP, desmine, vimentine, neurofilaments, kératine, etc), de promoteurs de gènes thérapeutiques (par exemple le promoteur des gènes MDR, CFTR, Facteur VIII, ApoAl, etc), de promoteurs spécifiques de tissus (promoteur du gène pyruvate kinase, villine, protéine intestinale de liaison des acides gras, a-actine du muscle lisse, etc) ou encore de promoteurs répondant à un stimulus (récepteur des hormones stéroïdes, récepteur de l'acide rétinoïque, etc). De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, tel que par exemple les promoteurs des gènes E1 A et MLP d'adénovirus, le promoteur précoce du CMV, ou encore le promoteur du LTR du RSV, etc. En outre, ces régions promotrices peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique ou majoritaire.
La présente invention fournit maintenant de nouveaux agents thérapeutiques permettant, par leurs propriétés antiprolifératives et/ou apoptotiques d'interférer avec de nombreux dysfonctionnements cellulaires. Dans ce but, les acides nucléiques ou cassettes selon l'invention peuvent être injectés tels quels au niveau du site à traiter, ou incubés directement avec les cellules à détruire ou traiter. Il a en effet été décrit que les acides nucléiques nus pouvaient pénétrer dans les cellules sans vecteur particulier. Néanmoins, on préfère dans le cadre de la présente invention utiliser un vecteur d'administration, permettant d'améliorer (i) l'efficacité de la pénétration cellulaire, (ii) le ciblage (iii) la stabilité extra- et intracellulaires.
Dans un mode de mise en oeuvre particulièrement préféré de la présente invention l'acide nucléique ou la cassette est incorporé dans un vecteur. Le vecteur utilisé peut être d'origine chimique (liposome, nanoparticule, complexe peptidique, lipides ou polymères cationiques, etc) virale (rétrovirus, Adénovirus, virus de l'herpès, AAV, virus de la vaccine, etc) ou plasmidique.
L'utilisation de vecteurs viraux repose sur les propriétés naturelles de transfection des virus. Il est ainsi possible d'utiliser par exemple les adénovirus, les herpès virus, les rétrovirus et les virus adéno associés. Ces vecteurs s'avèrent particulièrement performants sur le plan de la transfection. A cet égard, un objet préféré selon l'invention réside dans un rétrovirus recombinant défectif dont le génome comprend un acide nucléique tel que défini ci-avant. Un autre objet particulier de l'invention réside dans un adénovirus recombinant défectif dont le génome comprend un acide nucléique tel que défini ci-avant.
Le vecteur selon l'invention peut également être un agent non viral capable de promouvoir le transfert et l'expression d'acides nucléiques dans des cellules eucaryotes. Les vecteurs chimiques ou biochimiques, synthétiques ou naturels, représentent une alternative intéressante aux virus naturels en particulier pour des raisons de commodité, de sécurité et également par l'absence de limite théorique en ce qui concerne la taille de l'ADN à transfecter. Ces vecteurs synthétiques ont deux fonctions principales, compacter l'acide nucléique à transfecter et promouvoir sa fixation cellulaire ainsi que son passage à travers la membrane plasmique et, le cas échéant, les deux membranes nucléaires. Pour pallier à la nature polyanionique des acides nucléiques, les vecteurs non viraux possèdent tous des charges polycationiques.
L'acide nucléique ou le vecteur utilisé dans la présente invention peut être formulé en vue d'administrations par voie topique, orale, parenterale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De préférence, l'acide nucléique ou le vecteur est utilisé sous une forme injectable. Il peut donc être mélangé à tout véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau du site à traiter. II peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Une injection directe de l'acide nucléique dans la tumeur du patient est intéressante car elle permet de concentrer l'effet thérapeutique au niveau des tissus affectés. Les doses d'acide nucléique utilisées peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du gène, du vecteur, du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée.
L'invention concerne également toute composition pharmaceutique comprenant au moins un acide nucléique tel que défini ci-avant.
Elle concerne également toute composition pharmaceutique comprenant au moins un vecteur tel que défini ci-avant.
Elle concerne aussi toute composition pharmaceutique comprenant au moins un variant de p53 tel que défini ci-avant.
En raison de leurs propriétés antiprolifératives, les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont tout particulièrement adaptées pour le traitement des désordres hyperprolifératifs, tels que notamment les cancers et la resténose. La présente invention fournit ainsi une méthode particulièrement efficace pour la destruction de cellules, notamment de cellules hyperprolifératives. Elle peut être utilisée in vitro ou ex vivo. Ex vivo, elle consiste essentiellement à incuber les cellules en présence d'un ou plusieurs acides nucléiques (ou d'un vecteur, ou cassette ou directement du dérivé). In vivo, elle consiste à administrer à l'organisme une quantité active d'un vecteur (ou d'une cassette) selon l'invention, de préférence directement au niveau du site à traiter (tumeur notamment). A cet égard, l'invention a également pour objet une méthode de destruction de cellules hyperprolifératives comprenant la mise en contact desdites cellules ou d'une partie d'entre-elles avec un acide nucléique tel que défini ci-avant.
La présente invention est avantageusement utilisée in vivo pour la destruction de cellules en hyperprolifération (i.e. en prolifération anormale). Elle est ainsi applicable à la destruction des cellules tumorales ou des cellules de muscle lisse de la paroi vasculaire (resténose). Elle est tout particulièrement appropriée au traitement des cancers dans lesquels un mutant de p53 est observé. A titre d'exemple, on peut citer les adénocarcinomes du colon, les cancers de la thyroïde, les carcinomes du poumon, les leucémies myéloïdes, les cancers colorectaux, les cancers du sein, les cancers du poumon, les cancers gastriques, les cancers de l'oesophage, les lymphômes B, les cancers ovariens, les cancers de la vessie, les glioblastomes, les hépatocarcinomes, les cancers des os, de la peau, du pancréas ou encore les cancers du rein et de la prostate, les cancers de l'oesophage, les cancers du larynx, les cancers tête et cou, les cancers ano-génitaux HPV positifs, les cancers du nasopharynx EBV positifs, les cancers dans lesquels la protéine cellulaire mdm2 est surexprimée, etc.
Les variants de l'invention sont particulièrement efficaces pour le traitement des cancers dans lesquels la protéine MDM2 est en outre surexprimée, ainsi que des cancers liés au virus HPV tels que les cancers ano-génitaux HPV positifs.
La présente invention est décrite plus en détail dans les exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Légende des Figures
Figure 1 : Domaines fonctionnels de la protéine p53 sauvage. TA Domaine activateur de la transcription; DNB : domaine de liaison à l'ADN NLS : signal de localisation nucléaire; OL : domaine d'oligomérisation; REG domaine de régulation.
Figure 2 : Construction d'un ADNc codant pour la forme AS de la p53.
Figure 3 : Clonage des ADNc codant pour les constructions pEC104, pEC106, pEC131 , pEC132 et pEC133 et pour leur variant H182.
Figure 4 : Construction des variants pEC107, pEC110, pEC139 et pEC140 par fusion avec le domaine d'oligomérisation artificiel.
Figure 5 : Construction des variants pEC114, pEC116, pEC141 , pEC143, pEC145, pEC147, pEC149, pEC151 , pEC153 et pEC155.
Figure 6 : Reconnaissance de séquences d'ADN double brin spécifiques par les molécules hybrides de l'invention. Expérience de retard sur gel: compétition entre HisV325 et p53 sauvage. colonne 1 : incubation en l'absence de HisV325 et p53 sauvage, colonne 2: 30 ng p53 sauvage, colonne 3: idem 2 + pAb421 , colonne 4: 30 ng HisV325, colonne 5: idem 4 + pAb421 , colonne 6: 30 ng HisV325 + 30 ng p53 sauvage, colonne 7: idem 6 + pAb421 , colonne 8: 30 ng HisV325 + 15 ng p53 sauvage, colonne 9: idem 8 + pAb421 , colonne 10: 30 ng HisV325 + 7.5 ng p53 sauvage, colonne 11 : idem 10 + pAb421 , colonne 12: 30 ng HisV325 + 4.5 ng p53 sauvage, colonne 13: idem 12 + pAb421 , colonne 14: 30 ng HisV325 + 3 ng p53 sauvage, colonne 15: idem 14 + pAb421
Figure 7 : Activité transactivatrice de la protéine p53 sauvage et des variants AS, V-325 et V-336.
Figure 8 : Activité transactivatrice de la protéine p53 sauvage et des variants V-325, V-336 et V-343.
Figure 9 : Expression des variants de l'invention dans les cellules SAOS-2
Figure 10 : Induction des gènes hdm2 et WAF1 dans les cellules EB, EB-1 et EB-V325
Figure 11 : Effet de la protéine E6 sur la fonction transactivatrice de la protéine p53 et des variants de l'invention dans les cellules SAOS-2. Quantité des vecteurs CMV-construction = 10Ong
Figure 12 : Effet de la protéine E6 sur la fonction transactivatrice de la protéine p53 et des variants de l'invention dans les cellules HeLa.
Figure 13: Sensibilité de la protéine p53 sauvage et des variants de l'invention à la dégradation induite par la protéine E6.
Figure 14 : Effet du mutant dominant-négatif de p53 H 175 sur la fonction transactivatrice des variants de l'invention. Quantité des vecteurs CMV-construction = 100ng
Figure 15 : Effet de la protéine hdm2 sur la fonction transactivatrice de la protéine p53 et des variants de l'invention dans les cellules SAOS-2. Quantité des vecteurs CMV-construction = 100ng
Figure 16 : Effet des protéines p53 sauvage et V-325 sur la croissance de cellules surexprimant la protéine hdm2. Figure 17 : Induction de l'apoptose par les protéines p53 sauvage et V-325.
Figure 18 : Cinétique d'induction de l'apoptose dans les cellules EB, EB-1 et EB-V325
Exemples
Exemple A. Construction de différents fragments nucleotidiques nécessaires a la réalisation des gènes codant pour les variants de ia protéine p53
A1. Construction du cDNA codant pour la p53 sauvage humaine
Le gène de la p53 humaine a été clone par réaction d'amplification en chaîne (PCR) sur de l'ADN d'une banque de placenta humain (Clontech) en utilisant les oligonucléotides 5'-1 et 3'-393.
Oligonucléotide 5'-1 (SEQ ID n° 6) : ATGGAGGAGCCGCAG
Oligonucléotide 3'-393 (SEQ ID n° 7) :
GGCGGCCGCGATATCGATTCATCAGTCTGAGTCAGGCCCTTC
Ce produit a ensuite été clone directement après PCR dans le vecteur pCRIl (Invitrogène).
A2 - Construction d'un ADNc codant pour la forme AS de la p53
La forme AS de la p53 comprend un fragment codant pour les acides aminés 1 à 366 de la protéine p53 humaine additionné des 19 derniers acides aminés du produit d'épissage alternatif de la protéine p53 murine.
La forme AS de la p53 a été obtenue en deux étapes: - amplification par PCR d'un fragment codant pour les acides aminés 1 à 367 de la protéine p53 en utilisant les oligonucléotides 5'-1 (Cf exemple A1) et 3'-367.
Oligonucléotide 3'-367 (SEQ ID n° 8) : GGCGGCCGCGATATCGATTCATCAGCTCGAGTGAGC
Le fragment PCR ainsi obtenu a ensuite été clone dans le vecteur pCRIl (Invitrogène). Le fragment ainsi clone possède un site de reconnaissance pour l'enzyme de restriction Xho I (fragment 1-367).
- les oligonucléotides 5'-AS1 , 5'-AS2, 3'-AS1 et 3'-AS2 ont été phosphorylés puis hybrides ensemble pour constituer le fragment codant pour les 19 derniers acides aminés du produit d'épissage alternatif de la protéine p53 murine.
5'-AS1 (SEQ ID n° 9) : TCGAGCCTGCAGCCTAGAGCCTTCCAAGCCCTCATGAAGGAGG
5'-AS2 (SEQ ID n° 10) :
AAAGCCCAAACTGCTGATGAATCGATATCGC
3'-AS1 (SEQ ID n° 11) :
TGAGGGCTTGGAAGGCTCTAGGCTGCAGGC
3'-AS2 (SEQ ID n° 12) : GGCCGCGATATCGATTCATCAGCAGTTTGGGCTTTCCTCCTTCA
Ce fragment a ensuite été inséré au niveau du site Xho I du fragment 1-367 (voir figure 2). Le gène ainsi construit code pour le variant humain du produit d'épissage alternatif de la protéine p53 murine (AS). La séquence protéique ainsi modifiée est la suivante:
364 367 386
393
I I I i p53:- A H S S H L K S K K G Q S T S R H K K L M F K T E G P D S D Z
AS: - A H S S L Q P R A F Q A L M K E E S P N C Z Z 367:- A H S S Z Z
A3 - Construction d'ADNc codant pour différents fragments de la protéine p53 portant le domaine de liaison à l'ADN.
Cet exemple décrit la construction de différents ADNc codant pour différents fragments de la protéine p53 humaine, portant tout ou partie du domaine de liaison à l'ADN de p53. Ces fragments sont ensuite utilisés dans la construction des variants de p53. Ces fragments ont été obtenus par réaction d'amplification par la polymérase sur les matrices décrites dans les exemples A1 et A2 au moyen de différents oligonucléotides. Les réactions d'amplification ont été réalisées dans les conditions décrites dans l'exemple A4.1.
A3.1 - Construction d'un ADNc codant pour la région 75-325 de p53 et de son dérivé H 182
Cet exemple décrit la construction d'un ADNc codant pour les acides aminés 75 à 325 de la protéine p53 humaine sauvage (75-325).
Cet ADNc a été obtenu par réaction d'amplification en chaine (PCR) sur l'ADN de p53 (décrit dans l'exemple A1) avec les oligonucléotides 5'-75 et 3'-325 suivants :
5'-75(SEQIDn°13):
GGGAAGCTTGGGCCGGGTCGACCTGCACCAGCAGCTCCT 3'-325 (SEQ ID n° 14) :
GGCGGCCGCGGATCCCCATCCAGTGGTTTCTT
Un dérivé de ce fragment portant une mutation ponctuelle sur l'acide aminé 182 de la protéine p53 humaine (cystéine -> Histidine) a été obtenu par mutagénèse dirigée au moyen du kit Amersham, en utilisant l'oligonucléotide H182 de séquence :
Oligonucléotide H182 3' (SEQ ID n° 15) : ATCTGAATGGCGCTC
Ce fragment a été désigné 75-325(H182).
A3.2 - Construction d'un ADNc codant pour la région 75-336 de p53 et de son dérivé H 182
Cet exemple décrit la construction d'un ADNc codant pour les acides aminés 75 à 336 de la protéine p53 humaine sauvage (75-336).
Cet ADNc a été obtenu par réaction d'amplification en chaine (PCR) sur l'ADN de p53 (décrit dans l'exemple A1) avec les oligonucléotides 5'-75 (SEQ ID n° 13) et 3'-336 suivant :
3'-336 (SEQ ID n° 16) :
GGCGGCCGCGGATCCTCACGCCCACGGATCTG
Un dérivé de ce fragment portant une mutation ponctuelle sur l'acide aminé 182 de la protéine p53 humaine (cystéine -> Histidine) a été obtenu par mutagénèse dirigée au moyen du kit Amersham, en utilisant l'oligonucléotide H182 (SEQ ID n° 15). Ce fragment a été désigné 75-
336(H182). A3.3 - Construction d'un ADNc codant pour la région 75-343 de p53
Cet exemple décrit la construction d'un ADNc codant pour les acides aminés 75 à 343 de la protéine p53 humaine sauvage (75-343).
Cet ADNc a été obtenu par réaction d'amplification en chaine (PCR) sur l'ADN de p53 (décrit dans l'exemple A1) avec les oligonucléotides 5'-75 (SEQ ID n°13) et 3'-343 suivant :
3'-343 (SEQ ID n° 35) :
CGGATCCTCTCGGAACATCTCGAA
A3.4 - Construction d'un ADNc codant pour la région 75-367 de p53 et de son dérivé H 182
Cet exemple décrit la construction d'un ADNc codant pour les acides aminés 75 à 367 de la protéine p53 humaine sauvage (75-367).
Ce fragment a été obtenu par réaction d'amplification en chaine (PCR) sur l'ADN de p53 décrit dans l'exemple A1 avec les oligonucléotides 5'-75 (SEQ ID n° 13) et 3'-367 (SEQ ID n° 8).
Le fragment ainsi obtenu inclut un site de reconnaissance par l'endonucléase Xhol (75-367).
Un dérivé de ce fragment portant une mutation ponctuelle sur l'acide aminé 182 de la protéine p53 humaine (cystéine -> Histidine) a été obtenu par mutagénèse dirigée au moyen du kit Amersham, en utilisant l'oligonucléotide H182 (SEQ ID n° 15). Ce fragment a été désigné 75-
367(H182).
A3.5 - Construction d'un ADNc codant pour le fragment 75-AS et de son dérivé H 182 Cet exemple décrit la construction d'un ADNc codant pour les acides aminés 75 à 366 de la protéine p53 humaine sauvage (75-366) additioné des 19 derniers acides aminés du produit de splicing alternatif de la protéine p53 murine.
Ce fragment a été obtenu par réaction d'amplification en chaine (PCR) sur l'ADN du fragment AS décrit dans l'exemple A2 avec les oligonucléotides 5'-75 (SEQ ID n° 13) et 3'-AS2 (SEQ ID n°12).
Un dérivé de ce fragment portant une mutation ponctuelle sur l'acide aminé 182 de la protéine p53 humaine (cystéine -> Histidine) a été obtenu par mutagénèse dirigée au moyen du kit Amersham, en utilisant l'oligonucléotide H182 (SEQ ID n° 15). Ce fragment a été désigné 75-
AS(H182).
A3.6 - Construction d'un ADNc codant pour le fragment 75-393 de p53 et de son dérivé H 182
Cet exemple décrit la construction d'un ADNc codant pour les acides aminés 75 à 393 de la protéine p53 humaine (75-393). Ce fragment a été obtenu par réaction d'amplification en chaine (PCR) sur l'ADN p53 décrit dans l'exemple A1 avec les oligonucléotides 5'-75 (SEQ ID n° 13) et 3'-393 (SEQ ID n° 7).
Un dérivé de ce fragment portant une mutation ponctuelle sur l'acide aminé 182 de la protéine p53 humaine (cystéine -> Histidine) a été obtenu par mutagénèse dirigée au moyen du kit Amersham, en utilisant l'oligonucléotide H182 (SEQ ID n° 15). Ce fragment a été désigné 75- 393(H182).
A4 - Construction d'ADNc codant pour différents fragments portant un domaine activateur de la transcription (domaine transactivateur). Cet exemple décrit la construction de différents ADNc codant pour différents fragments portant un domaine transactivateur. Ces fragments sont ensuite utilisés dans la construction des variants de p53.
A4.1 - Réactions de PCR
Les différents fragments ont été obtenus par réaction d'amplification par la polymérase sur différentes matrices au moyen de différents oligonucléotides. Les réactions d'amplification ont été réalisées dans les conditions suivantes : Enzyme Amplitaq DNA polymérase (Perkin-Elmer) dans le tampon fourni par le fournisseur, avec une concentration de dNTP de 0,2 mM, 100 ng de matrice et 500 ng de chacun des deux oligonucléotides.
- cycle: 2 min à 91 °C
- cycles: 1 min à 91 °C
1 min à 55°C
1 min à 72°C - cycle: 5 min à 72°C
A4.2 - Construction d'un ADNc codant pour la région 411-490 de la protéine virale VP16 (VP16 TA)
Cet exemple décrit la construction d'un ADNc codant pour les acides aminés 411-490 de la protéine virale VP16 (VP16 TA). Cette région porte le domaine transactivateur de cette protéine.
Le fragment transactivateur dérivé de la protéine virale VP16 (411- 490) du virus de l'herpès simplex a été obtenu par réaction d'amplification en chaine (PCR) en utilisant les conditions précédemment définies (Cf A4.1) et les oligonucléotides 5'-VP16 et 3'-VP16 suivants:
5'-VP16 (SEQ ID n° 17):
AAGCTTGAATTCGTTAACATGTCCACGGCCCCCCCGACC 3'-VP16 (SEQ ID n° 18) :
GGTCGACCACCGTACTCGTCAAT
et 100 ng du plasmide pUHD15-1 (Gossen & Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 5547)
Le fragment ainsi obtenu comprend 334 paires de bases dont la séquence est donnée SEQ ID n° 2. Il comprend dans sa partie N-terminale un résidu méthionine apporté par le site d'initiation de la transcription (ATG), ajouté lors de l'étape de clonage par PCR.
A4.2 - Construction d'ADNc codant pour différents fragments capables de recruter le domaine activateur de la transcription (domaine transactivateur) d'une protéine p53 endogène.
A4.2.1 - Construction d'un ADNc codant pour un anticorps simple chaine capable de lier le protéine p53 (ScFv 421)
Cet exemple décrit la construction d'un ADNc codant pour un anticorps simple chaine capable de lier la protéine p53 (ScFv 421). Cette construction exprimée au niveau intracellulaire, doit être capable de fixer une protéine p53 endogène sauvage ou mutante pour recruter son domaine transactivateur.
Le cDNA codant pour le ScFv 421 (demande de brevet PCT/FR96/00477) peut-être extrait sous la forme d'un fragment Nco I / Not I qui comprend un site d'initiation de la traduction (ATG) et aucune séquence d'arrêt de la traduction.
Le fragment ainsi obtenu comprend 766 paires de bases dont la séquence est donnée SEQ ID n° 36.
A4.2.2 - Construction d'un ADNc codant pour la région 325-360 de la protéine p53 sauvage (325-360) Cet exemple décrit la construction d'un ADNc codant pour les acides aminés 325-360 de la protéine p53 sauvage (325-360). Cette région porte le domaine d'oligomérisation de cette protéine. Cette construction exprimée au niveau intracellulaire, doit être capable de fixer une protéine p53 endogène sauvage ou mutante pour recruter son domaine transactivateur.
Ce domaine d'oligomérisation dérivé de la protéine p53 sauvage humaine (325-360) a été obtenu par réaction d'amplification en chaine (PCR) en utilisant les conditions précédemment définies (Cf A4.1) et les oligonucléotides 5'-325 et 3'-360 suivants:
5'-325 (SEQ ID n° 37):
AAGCTTGAATTCGTTAACGCCACCATGGGAGAATATTTCAC CCTT
3'-360 (SEQ ID n° 38) :
GGGTCGACCTGGCTCCTTCCCAGC
sur 100 ng de l'ADN de p53 (décrit dans l'exemple A1).
Le fragment ainsi obtenu comprend 141 paires de bases dont la séquence est donnée SEQ ID n° 39. Il comprend dans sa partie N-terminale un résidu méthionine apporté par le site d'initiation de la traduction (ATG), ajouté lors de l'étape de clonage par PCR et aucune séquence d'arrêt de la traduction.
A4.2.3 - Construction d'un ADNc codant pour la région 325-393 de la protéine p53 sauvage (325-393)
Cet exemple décrit la construction d'un ADNc codant pour les acides aminés 325-393 de la protéine p53 sauvage (325-393). Cette région porte le domaine d'oligomérisation de cette protéine. Cette construction exprimée au niveau intracellulaire, doit être capable de fixer une protéine p53 endogène sauvage ou mutante pour recruter son domaine transactivateur. Ce domaine d'oligomérisation dérivé de la protéine p53 sauvage humaine (325-360) a été obtenu par réaction d'amplification en chaine (PCR) en utilisant les conditions précédemment définies (Cf A4.1) et les oligonucléotides 5'-325 (SEQ ID n° 37) et 3'-393.2 suivant:
3'-393.2 (SEQ ID n° 40) :
GGGTCGACCGTCTGAGTCAGGCCCTTC
sur 100 ng de l'ADN de p53 (décrit dans l'exemple A1).
Le fragment ainsi obtenu comprend 243 paires de bases dont la séquence est donnée SEQ ID n° 41. Il comprend dans sa partie N-terminale un résidu méthionine apporté par le site d'initiation de la traduction (ATG), ajouté lors de l'étape de clonage par PCR et aucune séquence d'arrêt de la traduction.
A5 - Construction d'ADNc codant pour différents fragments portant un domaine d'oligomérisation.
Cet exemple décrit la construction de différents ADNc codant pour différents fragments portant un domaine d'oligomérisation. Ces fragments sont ensuite utilisés dans la construction des variants de p53. Ces fragments ont été obtenus par réaction d'amplification par la polymérase sur différentes matrices (p53 pour le domaine homologue et matrices d'origine différentes pour les domaines d'oligomérisation hétérologues, notamment artificiels) au moyen de différents oligonucléotides. Les réactions d'amplification ont été réalisées dans les conditions décrites en A4.1 ci-dessus.
A5.1 - Construction d'un ADNc comprenant un domaine d'oligoméri¬ sation artificiel.
Cet exemple décrit la construction d'un ADNc comprenant un domaine d'oligomérisation artificiel, constitué d'un leucine zipper artificiel. Cet ADNc est ensuite utilisé pour la construction de variants à partir des fragments 75-325 (exemple A3.1) et 75-336 (exemple A3.2.) de la protéine p53 humaine et de leurs dérivés modifiés au niveau de la cystéine 182.
Cet ADNc a été construit à partir des 6 oligonucléotides suivants.
lz1-5' (SEQ ID n° 19) : GATCTGAAGGCCCTCAAGGAGAAGCTGAAGGCC
lz2-5' (SEQ ID n° 20) :
CTGGAGGAGAAGCTGAAGGCCCTGGAGGAGAAGCTG
lz3-5' (SEQ ID n° 21) :
AAGGCACTAGTGGGGGAGCGATGATGAATCGATATCGC
lz1-3' (SEQ ID n° 22) :
CTCCTCCAGGGCCTTCAGCTTCTCCTTGAGGGCCTTCA
lz2-3' (SEQ ID n° 23) :
TAGTGCCTTCAGCTTCTCCTCCAGGGCCTTCAGCTT
lz3-3' (SEQ ID n° 24) : GGCCGCGATATCGATTCATCATCGCTCCCCCAC
Ces oligonucléotides ont été synthétisés au moyen d'un synthétiseur automatique d'ADN, en utilisant la chimie des phosphoramidites. Ces six oligonucléotides présentent des complémentarités deux à deux (lz1-57lz1-3', lz2-57lz2-3', lz3-5'/lz3-3') et des complémentarités chevauchantes (Iz1-37lz2- 5', lz2-37lz3-5') permettant l'obtention du domaine d'oligomérisation par simple hybridation et ligation. La séquence LZ résultante est donnée SEQ ID n° 1.
A5.2 - Construction d'un ADNc comprenant le domaine d'oligomérisation naturel de la p53 humaine. Cet exemple décrit la construction d'un ADNc comprenant le domaine d'oligomérisation naturel de la p53 humaine. Cet ADNc est représenté par le fragment codant pour les acides aminés 325 à 356 de p53 contenu dans les constructions 75-367 (exemple A3.4), 75- AS (exemple A3.5), 75-393 (exemple A3.6) et de leurs dérivés modifiés au niveau de la cystéine 182.
Exemple B - Construction des gènes codant pour différents variants de la protéine p53
B1 - Clonage des différents fragments de p53
Chacun des différents fragments obtenus par PCR décrit dans l'exemple A a été clone après PCR dans le vecteur pBC SK+ (Stratagène) en utilisant les sites de reconnaissance par les enzymes de restriction Hind III et Not I (Figure 3).
Les produits de ces constructions portent les numéros suivants:
75-325 --> pEC 104
75-336 --> pEC 106
75-343 -> pEC 171
75-367 -> pEC 131
75-AS -> pEC 132
75-393 --> pEC 133
A partir de ces produits et par mutagénèse dirigée en utilisant l'oligonucleotide-directed in vitro mutagenesis system (Amersham) et l'oligonucléotide H182, ont été obtenues les constructions correspondantes portant une histidine en position 182. Ces constructions portent les numéros suivants:
75-325(H182) ~> pEC 134
75-336(H182) ~> pEC 135 75-367(H182) «> pEC 136
75-AS(H182) --> pEC 137
75-393(H182) --> pEC 138
B2 - Fusion du leucine-zipper aux fragment 75-325Λ 75-336 et 75-343 et à leur variant H 182
Les oligonucléotides constituant le leucine-zipper (lz1-5', lz1-3', lz2-5', lz2-3', lz3-5' et lz3-3') ont été phosphorylés à l'aide de la T4 kinase, puis hybrides tous ensemble et insérés dans les vecteurs pEC 104, 106, 134 et
135 et 171 préalablement digérés par les enzymes de restriction BamHI et Notl (Figure 4).
Les produits de ces constructions portent les numéros suivants:
75-325-lz ~> pEC 107
75-336-lz -> pEC 110
75-343-lz -> pEC 174 75-325(H182)-lz -> pEC 139
75-336(H182)-lz --> pEC 140
B3 - Fusion du domaine activateur de la transcription à l'ensemble des fragments p53
Les produits finaux ont été obtenus par une ligation à trois partenaires effectuée de la façon suivante (Figure 5):
Le domaine activateur de la transcription dérivé de VP16 décrit dans l'exemple A3 a été préparé par digestion enzymatique des produits de PCR par les enzymes de restriction Hind III et Sal I.
Les différents fragments p53 précédement obtenus (75-325-lz, 75-336-lz, 75-343-lz, 75-AS, 75-367, 75-393 et leurs variants H182) ont été isolés après digestion enzymatique des plasmides les contenant par les enzymes de restriction Sali et Notl.
Les combinaisons possibles (domaine activateur/p53) ont été constituées et insérées simultanément dans le vecteur pBC SK+ (Stratagène) préalablement digéré par les enzymes de restriction Hind III et Not I.
Les produits de ces constructions portent les numéros suivants:
VP16-75-325-lz V-325 ->pEC114(SEQIDn°25)
VP16-75-336-lz V-336 ->pEC116(SEQIDn°26)
VP16-75-367 V-367 ->pEC141 (SEQIDn°27) V VPP1166--7755--AASS V V--AASS -> pEC 143 (SEQ ID n°28)
VP16-75-393 V-393 -->pEC145(SEQIDn°29)
VP16-75-343-lz V-343 «>pEC175(SEQIDn°30)
VP16-75-325(H182)-lz V-325H --> pEC 147
VP16-75-336(H182)-lz V-336H --> pEC 149 V VPP1166--7755--336677((HH118822)) V V--336677HH ->pEC151
VP16-75-AS(H182) V-ASH ->pEC153
VP16-75-393(H182) V-393H ~>pEC155
Les produits correspondants portant un domaine liant spécifiquement un transactivateur ou un complexe transactivateur à la place du domaine VP16 sont construits de la même façon. Ces constructions sont désignées ci- dessous :
ScFv-75-325-lz S-325 --> pEC 176 (SEQ ID n° 31 )
ScFv-75-336-lz S-336
ScFv-75-367 S-367 ScFv-75-AS S-AS
ScFv-75-393 S-393
ScFv-75-325(H 182)-lz S-325H
ScFv-75-336(H182)-lz S-336H ScFv-75-367(H182) S-367H
ScFv-75-AS(H182) S-ASH
ScFv-75-393(H 182) S-393H
(325-393)-75-325-lz 393-325 --> pEC 177 (SEQ ID n° 32) (325-393)-75-336-lz 393-336
(325-393)-75-367 393-367
(325-393)-75-AS 393-AS
(325-393)-75-393 393-393
(325-393)-75-325(H 182)-lz 393-325H (325-393)-75-336(H182)-lz 393-336H
(325-393)-75-367(H182) 393-367H
(325-393)-75-AS(H182) 393-ASH
(325-393)-75-393(H182) 393-393H
(325-360)-75-325-lz 360-325 --> pEC 178 (SEQ ID n° 33) (325-360)-75-336-lz 360-336
(325-360)-75-367 360-367
(325-360)-75-AS 360-AS
(325-360)-75-393 360-393
(325-360)-75-325(H 182)-lz 360-325H (325-360)-75-336(H182)-lz 360-336H
(325-360)-75-367(H 182) 360-367H
(325-360)-75-AS(H182) 360-ASH
(325-360)-75-393(H 182) 360-393H
Les produits contenant le domaine 325-360 de la p53 en remplacement du domaine transactivateur (1-74) peuvent se voir additionner un séparateur synthétique (Hinge) obtenu par insertion au site Sal I d'un fragment d'ADN obtenu par hybridation de la paire d'oligonucléotides synthétiques complémentaires Hinge-up et Hinge-down suivants:
Hinge-up (SEQ ID n° 42) TCGAGGAGGTGGTGGCTCTGGAGGCGGAGGATCCGGCGGTGGA GGTTC
Hinge-down (SEQ ID n° 43) :
TCGAGAACCCCTACCGCCGGATCCTCCGCCTCCAGAGCCACCAC CTCC
La séquence d'ADN double brin Hinge résultante est la suivante
TCGAGGAGGTGGTGGCTCTGGAGGCGGAGGATCCGGCGGTGGAGGTTC CCTCCACCACCGAGACCTCCGCCTCCTAGGCCGCCATCCCCAAGAGCT et la séquence protéique correspondante est (SEQ ID n° 44): Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser
Les produits correspondants sont désignées ci-dessous :
(325-360)-Hinge-75-325-lz 360h-325-> pEC 179 (SEQ ID n° 34)
(325-360)-Hinge-75-336-lz 360h-336
(325-360)-Hinge-75-367 360h-367 (325-360)-Hinge-75-AS 360h-AS
(325-360)-Hinge-75-393 360h-393
(325-360)-Hinge-75-325(H182)-lz 360h-325H
(325-360)-Hinge-75-336(H182)-lz 360h-336H
(325-360)-Hinge-75-367(H182) 360h-367H (325-360)-Hinge-75-AS(H182) 360h-ASH
(325-360)-H inge-75-393(H 182) 360h-393H
Exemple C - Construction de vecteurs d'expression des variants de p53
Cet exemple décrit la construction de vecteurs utilisable pour le transfert des acides nucléiques de l'invention in vitro ou in vivo. C1 - Construction de vecteurs piasmidiques
Pour la construction de vecteurs piasmidiques, 2 types de vecteurs ont été utilisés.
- Le vecteur pSV2, décrit dans DNA Cloning, A practical approach Vol.2, D.M. Glover (Ed) IRL Press, Oxford, Washington DC, 1985. Ce vecteur est un vecteur d'expression eucaryote. Les acides nucléiques codant pour les variants ont été insérés dans ce vecteur sous forme de fragments Hpal-EcoRV. Ils sont ainsi placés sous le contrôle du promoteur de l'enhancer du virus SV40.
- Le vecteur pCDNA3 (Invitrogen). Il s'agit également d'un vecteur d'expression eucaryote. Les acides nucléiques codant pour les variants de l'invention sont ainsi placés, dans ce vecteur, sous le contrôle du promoteur précoce du CMV. Toutes les constructions décrites dans l'exemple B3 ont été introduites dans ce vecteur sous forme d'un fragment Hind III / Not I pour être testées dans les différents systèmes d'évaluation in vivo.
C2 - Construction de vecteurs viraux
Selon un mode particulier, l'invention réside dans la construction et l'utilisation de vecteurs viraux permettant le transfert et l'expression in vivo des acides nucléiques tels que définis ci-avant.
S'agissant plus particulièrement d'adénovirus, différents sérotypes, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, ont été caractérisés. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande W094/26914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mav1 , Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.
Préférentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprenent les ITR, une séquence permettant l'encapsidation et un acide nucléique selon l'invention. Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, la région E1 au moins est non fonctionnelle. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. D'autres régions peuvent également être modifiées, et notamment la région E3 (WO95/02697), E2 (W094/28938), E4 (W094/28152, W094/12649, WO95/02697) et L5 (WO95/02697). Selon un mode préféré de mise en oeuvre, l'adénovirus selon l'invention comprend une délétion dans les régions E1 et E4. Selon un autre mode de réalisation préféré, il comprend une délétion dans région E1 au niveau de laquelle sont insérés la région E4 et l'acide nucléique de l'invention (Cf FR94 13355). Dans les virus de l'invention, la délétion dans la région E1 s'étend préférentiellement des nucléotides 455 à 3329 sur la séquence de l'adénovirus Ad5.
Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gène 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre la séquence d'ADN d'intérêt. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 203 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %) ou des lignées capables de complémenter les fonctions E1 et E4 telles que décrites notamment dans les demandes n° WO 94/26914 et WO95/02697.
Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.
Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des AAV a été clone, séquence et caractérisé. Il comprend environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation : la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus. L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US5.139.941, EP 488 528). Ces demandes décrivent différentes constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep et/ou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt. Les AAV recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par co- transfection, dans un lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain (par exemple un adénovirus), d'un plasmide contenant une séquence nucléique de l'invention d'intérêt bordée de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV, et d'un plasmide portant les gènes d'encapsidation (gènes rep et cap) d'AAV. Une lignée cellulaire utilisable est par exemple la lignée 293. Les AAV recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
Concernant les virus de l'herpès et les rétrovirus, la construction de vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature : voir notamment Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP178220, Bernstein et al. Genêt. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc. En particulier, les rétrovirus sont des virus intégratifs, infectant sélectivement les cellules en division. Ils constituent donc des vecteurs d'intérêt pour des applications cancer. Le génome des rétrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'encapsidation et trois régions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs recombinants dérivés des rétrovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurs peuvent être réalisés à partir de différents types de rétrovirus tels que notamment le MoMuLV ("murine moloney leukemia virus"; encore désigné MoMLV), le MSV ("murine moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus"); le SNV ("spleen necrosis virus"); le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend.
Pour construire des rétrovirus recombinants selon l'invention comportant un acide nucléique selon l'invention, un plasmide comportant notamment les LTR, ia séquence d'encapsidation et ledit acide nucléique est construit, puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétrovirales déficientes dans le plasmide. Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée PA317 (US4.861.719); la lignée PsiCRIP (WO90/02806) et la lignée GP+envAm-12 (WO89/07150). Par ailleurs, les rétrovirus recombinants peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer l'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation étendues, comportant une partie du gène gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Les rétrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
Pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus ou un rétrovirus recombinant défectif. Ces vecteurs possèdent en effet des propriétés particulièrement intéressantes pour le transfert de gènes dans les cellules tumorales.
C3 - Vecteurs chimiques
Parmi les vecteurs synthétiques développés, on préfère utiliser dans le cadre de l'invention les polymères cationiques de type polylysine, (LKLK)n, (LKKL)n, polyethylene immine et DEAE dextran ou encore les lipides cationiques ou lipofectants. Ils possèdent la propriété de condenser l'ADN et de promouvoir son association avec la membrane cellulaire. Parmi ces derniers, on peut citer les lipopolyamines (lipofectamine, transfectam, etc) différents lipides cationiques ou neutres (DOTMA, DOGS, DOPE, etc) ainsi que des peptides d'origine nucléaire. En outre, le concept de la transfection ciblée a été développé, médiée par un récepteur, qui met à profit ie principe de condenser l'ADN grâce au polymère cationique tout en dirigeant la fixation du complexe à la membrane grâce à un couplage chimique entre le polymère cationique et le ligand d'un récepteur membranaire, présent à la surface du type cellulaire que l'on veut greffer. Le ciblage du récepteur à la transferrine, à l'insuline ou du récepteur des asialoglycoprotéines des hépatocytes a ainsi été décrit. La préparation d'un composition selon l'invention utilisant un tel vecteur chimique est réalisée selon toute technique connue de l'homme du métier, généralement par simple mise en contact des différents composants.
Exemple D - Evaluation fonctionnelle des variants de p53
Les variants de p53 selon l'invention ont été évalués en test cellulaire pour les critères suivants:
- liaison à une séquence d'ADN double brin spécifique
- fonction transactivatrice
- activité antiproliférative - activité apoptotique
- potentiel oncogénique associé à certaines mutations de p53
Les constructions utilisées plus particulièrement pour cette évaluation sont les constructions V-325, V-336 , V-343 et AS décrites dans l'exemple B.
D1 Reconnaissance de séquences d'ADN double brin spécifiques par les molécules hybrides de l'invention
D1.1 Production des molécules hybrides Le cDNA de la p53 sauvage a été clone dans le vecteur pBlueBaclll (Invitrogen) au site BamHI. Par insertion dans ie plasmide pAcHLT-A (Pharmingen) du fragment contenant le cDNA de V325 obtenu par digestion du plasmide pEC114 par les enzymes EcoR I et Not I a été généré un vecteur permettant l'obtention d'un baculovirus recombinant ayant pour but l'expression d'une protéine V325 étiquetée en N-terminale par une séquence peptidique contenant entre autres un enchaînement de 6 résidus histidine. A partir de ces vecteurs, des baculovirus recombinants ont été produits et purifiés suivant les instructions des fabricants (Invitrogen, Pharmingen). Les deux protéines ont été purifiées à homogénéité à partir d'extraits nucléaires de cellules d'insectes SF9 infectées par leur baculovirus respectif, les extraits nucléaires étant obtenus en suivant la procédure décrite par Delphin et al. (C. Delphin, Eur. J. Biochem., 223, 683-692, 1994).
La p53 sauvage est purifiée par immuno-affinité sur l'anticorps monoclonal pAb421 (Oncogene Sciences, Ab-1) suivant le protocole suivant: l'extrait nucléaire des cellules infectées est incubé 3 h à 4 °C avec un gel de protéine A-agarose sur lequel a été couplé covalemment l'anticorps pAb421.
Après lavage extensif du gel par un tampon 50 mM TrisHCI pH 7,8 contenant
1 M KCI et des inhibiteurs de protéases, la protéine p53 est éluée par le peptide correspondant à l'épitope reconnu par cet anticorps sur p53
(KKGQSTSRHK), ce peptide étant utilisé à une concentration de 5 mg/ml dans la solution utilisée pour le lavage. Après concentration sur Centricon-30
(Amicon Grâce), la p53 éluée est séparée du peptide et purifiée à homogénéité par perméation sur gel sur une colonne de Superose 6 HR10/30 équilibrée par 50 mM TrisHCI pH 7.5, 0,2 M NaCl, 0,1 mM EGTA,
0,1 mM ZnCI2 , 10 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 0,1 % NP-40, 5 % Glycérol. Les fractions contenant p53 sont aliquotées et immédiatement congelées à - 80
°C jusqu'à utilisation.
La protéine V325 étiquetée en N-terminale par une séquence peptidique contenant entre autres un enchaînement de 6 résidus histidine appelée désormais HisV325 a été purifiée par une procédure adaptée de Hochuli et al. (Bio/Technology Vol 6 (1988) 1321). Avant d'être appliquée sur le gel de Nickel-NTA agarose, l'extrait nucléaire des cellules infectées est dessalé sur une colonne PD10 (Pharmacia) équilibrée en tampon 50 mM phosphate de sodium pH 8 contenant 5 mM β-mercaptoéthanol, 0,1 % NP-40 et un cocktail d'inhibiteurs de protéases. L'incubation de l'extrait nucléaire avec le gel de Nickel-NTA agarose a été réalisée dans ce tampon pendant 1 h à 4 °C sous agitation. Le gel est ensuite lavé extensivement par le même tampon à pH 6. La protéine HisV325 est éluée par 0,3 M imidazole dans ce dernier tampon après lavage du gel en 0,1 M imidazole. Les fractions contenant HisV325 sont aliquotées et immédiatement congelées à - 80 °C jusqu'à utilisation.
D1.2 Construction de la séquence d'ADN double brin spécifique
La séquence d'ADN double brin spécifique utilisée dans cette expérience est constituée de deux oligonucléotides de synthèse dont la séquence est la suivante:
Oligo 5568 (SEQ ID n°45):
GATCCGAACATGTCCCAACATGTTGA
Oligo 5569 (SEQ ID n°46): AGCTTCAACATGTTGGGACATGGTCG
Ces deux oligonucléotides de synthèse ont été marqués au phosphore 33 par incubation de 30min à 37°C de 5 pmoles de chaque oligonucléotide dans 20 μl du milieu réactionnel suivant:
Tris-HCl pH7,6 50 mM
MgCI2 10 mM dithiothréitol 5 mM
Spermidine 100 μM EDTA 100 μM
ATP-γ-∞P (Amersham) 50μ Ci (1000-3000 Ci/mmole)
T4 kinase (Boehringer) 10 U
Puis les deux oligonucléotides ainsi marqués ont été hybrides en présence de 100 mM NaCl pour reconstituer la séquence double brin WAF- RE suivante contenant la séquence spécifique reconnue par p53 dans la région promotrice du gène WAF-1 (W.S. El-Deiry, Cell Vol75 (1993) 817): GATCCGAACATGTCCCAACATGTTGA
GCTTGTACAGGGTTGTACAACTTCGA
D1.3 Reconnaissance de la séquence double brin WAF-RE par les molécules hybrides de l'invention.
Pour mettre en évidence une reconnaissance spécifique de la séquence double brin WAF-RE par les molécules hybrides de l'invention, des expériences de retard sur gel ont été réalisées sur le principe décrit ci-après. La réaction de liaison à l'ADN est effectuée dans 25 μl de milieu réactionnel (Tris-HCl 20 mM pH 7,5, 5 mM MgCI2, 0,05 mM ZnCI2, 5 mM dithiotreitol, 0,1 mg/ml BSA, 10 % glycérol, 1% Nonidet P-40, 0,1 M NaCl, 2 μg/ml aprotinine, 2 μg/ml E-64, 2 μg/ml leupeptine, 2 μg/ml pepstatine) par addition de la séquence WAF-RE (2,4 10'9M) préparé selon l'exemple précédent, de 1 ,2 10 6 M de l'oligonucléotide compétiteur froid AP2 (Promega) utilisé pour éliminer la fixation non spécifique et de 30 ng de molécules hybrides à tester en présence ou non de p53 sauvage (entre 3 et 30 ng), la p53 sauvage pouvant être activée pour son activité de fixation spécifique à l'ADN par 300 ng d'anticorps pAb421 (T. R. Hupp, Cell Vol 71 (1992) 875). Les mélanges réactionnels sont incubés 30 minutes sur glace et les mélanges finaux sont soumis à une électrophorèse native sur gel de polyacrylamide à 4 % avec migration à 200V et 16°C . Le gel est ensuite séché et autoradiographié. Le résultat d'une expérience représentative de compétition entre p53 sauvage et HisV325 en retard sur gel est présenté sur la Figure 6. Ce résultat montre que His-V325 reconnaît la séquence double brin WAF-RE avec une affinité comparable à celle de la p53 sauvage. On notera que HisV325 donne une bande majoritaire en gel retard qui migre plus vite que celle obtenue avec la p53 sauvage. Ceci pourrait indiquer que HisV325 se fixe sous forme de dimère. De plus, comme attendu, cette bande n'est ni déplacée, ni amplifiée par la présence de pAb421. Enfin, en l'absence de pAb421, la p53 sauvage fixe beaucoup moins de RE-WAF que ne le fait V325.
D2 - Evaluation de la fonction transactivatrice
La fonction transactivatrice des constructions a été évaluée dans un système de transactivation in vivo dans les cellules SAOS-2 (ostéosarcome humain) déficientes pour les deux allèles de la protéine p53 (cellules accessibles à l'ATCC sous le numéro HTB85) et dans des lignées tumorales H358 (Maxwell & Roth, Oncogene 8 (1993), 3421) et HeLa (ATCC CCL 2). Ce sytème repose sur l'utilisation d'un gène rapporteur dosable enzymatiquement et placé sous la dépendance d'un promoteur contenant les motifs nucléotidiques de reconnaissance spécifique par la forme sauvage de la p53 (cf protocoles expérimentaux).
Dans ce test, le gène rapporteur est le gène CAT (chloramphénicol- acétyl transférase) et la séquence de reconnaissance par la p53 est la séquence consensus (p53RE) définie par Funk et collaborateurs (Mol. Cell. Biol. 12 (1992) 2866).
L'évaluation de cette fonction a été effectuée en comparaison avec celle de la protéine sauvage pour trois types de critères différents. D2.1 - Activité transactivatrice en dose réponse
Les cellules ( 3,5 105) sont ensemencées dans des boites de Pétri de 6 cm de diamètre contenant 3 ml de milieu DMEM (Gibco BRL) additioné de 10% de sérum de veau foetal inactivé à la chaleur, et cultivées sur la nuit dans un incubateur à CO2 (5%) à 37°C. Les différentes constructions sont alors transfectées en utilisant la lipofectAMINE (Gibco BRL) comme agent de transfection de la façon suivante: 3 μg de plasmide total sont incubés (dont 0,5 μg du plasmide reporter) avec 10 μl de lipofectAMINE pendant 30 min avec 3 ml de milieu Opti-MEM (Gibco BRL) sans sérum (mélange de transfection). Pendant ce temps, les cellules sont rincées deux fois au PBS puis incubées 4 h à 37°C avec le mélange de transfection, après quoi celui-ci est aspiré et remplacé par 3 ml de milieu DMEM additioné de 10% de sérum de veau foetal inactivé à la chaleur et les cellules remises à pousser pendant 48 h à 37°C.
Protocole de dosage de l'activité CAT
48h après la transfection, les cellules sont lavées une fois en PBS puis gratées et récupérées dans 100 μl de tampon Tris 0,25 M pH 8 et à lysées par trois cycles de congélation - décongélation dans un bain éthanol/carboglace. L'extrait cellulaire total ainsi obtenu est mis à centrifuger 15 min à 10000 φm et le surnageant récupéré pour le dosage de l'activité. Celui-ci est effectué en additionnant 20 μl d'extrait cellulaire à 130 μl d'un mélange réactionnel dont la composition finale est la suivante:
- Acétyl-Coenzyme A 0,4 mM
- Chloramphénicol, D-thréo-(dichloroacétyl-1 ,2-14C) 23 μM (200 nCi) - Tris 0,18 M pH 8
Après 1 heure d'incubation à 37°C, les produits de la réaction sont extraits par 250 μl d'acétate d'éthyle dont 20 μl sont déposés sur une plaque de silice (chromatographie en couche mince) mise à migrer dans un mélange contenant 95% de chloroforme et 5% de méthanol. La plaque de chromatographie ainsi obtenue est enfin révélée à l'aide d'un instantimager (Packard instruments) qui permet de calculer le rapport des différents produits d'acétylation, rapport qui reflète l'activité de l'enzyme Chloramphénicol-Acétyl-Transférase et donc l'activité transactivatrice des différentes constructions.
Les résultats obtenus dans la lignée SAOS-2 avec les constructions placées sous contrôle du promoteur CMV (pCDNA3) et présentés dans les Figures 7 et 8 montrent les propriétés suivantes pour chacune des constructions:
- la protéine p53 présente une activité dose-dépendante qui tend vers la saturation pour des doses élevées (à partir de 100ng de plasmide). Cette saturation peut traduire la nécessité de cofacteurs qui seraient limitants dans ces conditions.
- la protéine AS conserve la capacité d'activer la transcription de la protéine sauvage
- les protéines V-325, V-336 et V-343 présentent, tout comme la protéine p53, une activité transactivatrice qui ne semble pas quant à elle saturable aux fortes doses. Il est donc possible que cette absence apparente de saturation puisse conduire à une augmentation globale de l'activité. Il apparaît en outre que la construction V-325 est plus active que ses homologues V-336 et V-343, ce qui suggère que les protéines chimères portant la région 75-325 sont particulièrement avantageuses.
Dans le but de confirmer ces propriétés une expérience similaire a été effectuée dans la lignée tumorale H 358 qui est tout comme la lignée SAOS-
2, déficiente pour les deux allèles du gène p53. Dans cette expérience, chaque transfection a été effectuée avec 50 ng de chacune des construction placée sous dépendance du promoteur CMV. Les résultats présentés sur le Tableau 1 montrent clairement que les deux variants V-325 et V-336 présentent une activité transactivatrice améliorée par rapport à celle de la protéine p53 sauvage, avec de nouveau une meilleure activité du variant V- 325.
Tableau 1 : Activité transactivatrice dans les cellules de la lignée tumorale H 358.
Ces deux essais confirment que les variants de l'invention possèdent au moins une des propriétés de la p53 améliorée.
Afin de vérifier que cette différence d'activité n'est pas due à une différence d'expression mais bien à une activité accrue des variants de l'invention, le niveau d'expression de la protéine p53 sauvage et des variants V-325, V-336 et V-343 a été analysé dans les cellules SAOS-2. Pour ce faire les cellules sont transfectées par 3μg de chacun des plasmides utilisés dans l'expérience précédente, et récupérées 24 heures et 48 heures après la transfection. Après deux lavages en tampon PBS (Gibco BRL), les cellules sont lysées 15 minutes à 4°C dans 50μl de tampon RIPA (Tris-Hcl 10 mM pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 %,Nonidet-P40, 1 % déoxycholate de sodium, 0,1 % dodécyl sulfate de sodium) additionné de 2 mM PMSF, 20 μg/ml aprotinine, 2 μg/ml E64, 2 μg/ml leupeptine et 2 μg/ml pepstatine. Après 15 min de centrifugation à 15000 rpm, les surnageants sont prélevés, additionnés de tampon de migration (Laemmli U.K., Nature, 227, 680-685, 1970) et soumis à électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 10% en milieu dénaturant à 200V suivant le protocole précédemment décrit (Laemmli U.K., Nature, 227, 680-685, 1970). Puis les protéines sont transférées sur membrane de PVDF (NEN Research Products) en utilisant le système de transfert semi-sec NOVEX suivant les recommandations du frabiquant, et révélées à l'aide de l'anticorps monoclonal pAb 240 (Oncogene Sciences, Ab-3) et d'un anticorps secondaire (lapin anti-souris) couplé à la peroxydase (Nordic Immunology) en utilisant le kit ECL (Amersham).
Le résultat de cette expérience présenté dans la Figure 9 montre que les variants V-325 et V-336 sont exprimés à un niveau comparable à celui de la protéine p53 sauvage et que le variant V-343 semble légèrement mieux exprimé que les précédents. De plus la comparaison des niveaux d'expression à 24 et 48 heures semble indiquer que la stabilité relative de chacune des constructions est similaire. Ce résultat montre donc que l'activité accrue des variants de l'invention V-325 et V-336 n'est pas due à une meilleure expression mais probablement à un potentiel d'activateur transcriptionnel accru, contrairement au variant V-343.
Par la suite, et dans le but de confirmer cette capacité des variants de l'invention d'activer un gène placé sous la dépendance d'un élément de reconnaissance de la p53 sauvage, l'étude de l'activation de gènes endogènes a été effectuée en regardant l'expression des gènes hdm2 et
WAF1 , normalement induits par la protéine p53.
Cette expérience a été effectuée dans la lignée cellulaire EB (cancer du colon) déficiente pour les deux allèles codant pour la protéine p53 (Shaw et al., PNAS 89 (1992) 4495). Un clone stable exprimant la protéine p53 sous contrôle du promoteur inductible de la métallothionéine a été construit à partir de cette lignée (clone EB-1 (Shaw et al., PNAS 89 (1992) 4495)). De la même façon un autre clone stable exprimant la protéine V-325 sous contrôle du promoteur inductible de la métallothionéine a été construit en utilisant un plasmide dérivé du vecteur pmlMTIi (obtenu de P. Shaw) par insertion du cDNA codant pour la protéine V-325 aux sites EcoR I - Not I (pmlMTI i-V325). Pour ce faire, les cellules EB (3.5 105 cellules) ont été transfectées par 1 ,3 μg du plasmide pmlMTI i-V325 et 200 ng de plasmide pcDNA3 suivant le protocole précédement décrit et les clones stables ont été sélectionés après transfection par croissance dans un milieu contenant 800μg/ml de généticine. Un clone exprimant V-325 de façon inductible à un niveau comparable à l'expression de la protéine p53 dans le clone EB-1 a été sélectioné (clone EB-V325).
Les clones EB-1 et EB-V325 ainsi que les cellules parentales EB OO6 cellules) ont été soumis à un traitement au ZnCI2 (200 μM) et des extraits cellulaires ont été effectués à différents temps et soumis à électrophorèse et transfert sur membrane comme décrit précédement. Les protéines transférées ont été révélées par trois anticorps différents; l'anticorps monoclonal pAb240 dirigé contre la protéine p53, et deux anticorps polyclonaux dirigés l'un contre la protéine hdm2 et l'autre contre la protéine WAF1. Les résultats de cette expérience présentés dans la Figure 10, montrent que: 1) ia protéine p53, absente dans les cellules EB, EB-V325 et EB-1 en l'absence d'induction, est exprimée dans le clone EB-1 dès 4 heures après le début du traitement au zinc, et le variant V-325 est exprimé de la même façon dans le clone EB-V325, 2) la protéine WAF1 dont l'expression semble être induite dans les cellules EB par le traitement au zinc 4 heures après le début de celui-ci, voit son expression prolongée jusqu'à 16 heures dans les clones EB-1 et EB-V325, et 3) l'induction de ia protéine hdm2 n'est observable que dans les clones EB-1 et EB-V325, avec une expression accrue dans le clone EB-V325.
Ces résultats montrent que l'activation de la transcription par le variant
V-325 se traduit par l'induction de l'expression de gènes normalement induits par la protéine p53 sauvage, et que ce variant présente bien une activité accrue dans un contexte physiologique par rapport à la protéine p53 sauvage.
D2.2 - Effet de la protéine E6 (HPV18) sur la fonction transactivatrice
Les protocoles utilisés sont identiques à ceux décrits dans l'exemple D1.1. Dans cette expérience de transfection, les constructions placées sous contrôle du promoteur CMV (pCDNA3) ont été co-transfectées avec des concentrations croissantes d'un plasmide exprimant E6 sous contrôle du promoteur SV40 (pSV2). Les résultats obtenus dans la lignée SAOS-2 et présentés dans la Figure 11 montrent les propriétés suivantes pour chacune des constructions:
- l'activité de la p53 décroît au fur et à mesure que l'on augmente ia concentration de E6, cette décroissance étant très probablement le reflet de la dégradation de la p53 induite par E6.
- la protéine V-336 présente une absence de sensibilité à E6.
- la protéine V-325 semble pouvoir être légèrement activée par E6. La protéine V-325 est toujours, et dans toutes les situations observées, plus active que la p53. Pour confirmer cette différence de comportement vis-à-vis de la protéine E6, l'activité transactivatrice des constructions V-325 et V-336 dans des cellules HPV18 positives (HeLa) et donc exprimant la protéine E6, a été testée et comparée à celle de la p53 sauvage.
Dans cette expérience de transfection effectuée selon le protocole décrit précédemment, les différentes constructions ont été placées sous contrôle du promoteur CMV (pCDNA3).
Les résultats présentés dans la Figure 12 montrent une très nette activité transcriptionnelle des deux constructions V-325 et V-336, dans un contexte ou ia protéine p53 sauvage est très peu active, laissant supposer à nouveau que ces deux constructions sont insensibles à E6 contrairement à la protéine sauvage.
Pour tester si cette absence de sensibilité à la protéine E6 est le reflet d'une meilleure stabilité en réponse à la dégradation induite par cette protéine, une expérience de dégradation in vitro a été effectuée.
Les différentes molécules utilisées dans cette expérience ont été obtenues par traduction in vitro en lysat de réticulocytes des molécules décrites dans l'exemple C1 (vecteur pcDNA3) en utilisant le kit TNT Coupled Reticulocyte lysate Systems (Promega) suivant le protocole expérimental décrit par le fournisseur pour un volume réactionnel total de 50 μl.
Pour cette expérience, les molécules hybrides de l'invention V-325 et V-336 ainsi que la protéine p53 sauvage sont produites par traduction in vitro en présence de 44 μCi de ^S-methionine (Amersham) (1175 Ci/mmole) pour générer ces molécules hybrides radioactivement marquées. La protéine E6 (HPV18), quand à elle est produite dans les mêmes conditions mais en absence de ^S-methionine.
Puis 2 μl de chacun des produits radiomarqués (p53, V-325 et V-336) sont mis à incuber à 30°C avec 2 μl de protéine E6 non radiomarquée et 10 μl de lysat de reticulocyte dans un volume final de 40 μl de tampon Tris-HCl 25mM, pH 7,5, 100 mM NaCl, 3 mM DTT. La réaction est ensuite arrêtée à différents temps par prélèvement de 7,5 μl du milieu réactionnel et addition de 7,5 μl de tampon de migration (Laemmli U.K., Nature, 227, 680-685, 1970) et les échantillons ainsi préparés sont soumis à électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 10% en milieu dénaturant à 200 V suivant le protocole précédemment décrit (Laemmli U.K., Nature, 227, 680-685, 1970). Le gel est ensuite séché et révélé à l'aide d'un instantimager (Packard instruments) qui permet d'estimer les quantités de variants de l'invention n'ayant pas été dégradés au cours de la réaction.
Le résultat de cette expérience présenté sur la figure 13 montre clairement que les variants V-325 et V-336 sont beaucoup plus résistants que la protéine p53 sauvage à la dégradation induite par E6, avec de nouveau de meilleures propriétés pour le variant V-325 en terme de résistance à la dégradation. Ces résultats reflètent bien les différences de sensibilité de la protéine p53 sauvage et des variants V-325 et V-336 à la protéine E6 observés au niveau de l'activité transcriptionnelle dans les expériences précédentes (Figures 11 et 12). Ce comportement fait de ces deux constructions des candidats super- sauvage particulièrement avantageux pour le traitement de pathologies liées à l'infection par HPV16 ou HPV18.
D2.3 - Effet d'un mutant p53 dominant-négatif sur la fonction transactivatrice
Dans cette expérience, le mutant H 175, décrit comme dominant oncogénique et dominant négatif vis à vis de la protéine p53 sauvage, a été utilisé. Dans cette expérience de transfection effectuée selon le protocole décrit précédemment, les différentes constructions ainsi que le mutant H175 ont été placés sous contrôle du promoteur CMV (pCDNA3). Chacune des constructions a été co-transfectée avec des concentrations croissantes du plasmide exprimant le mutant H175.
Les résultats présentés dans la Figure 14 montrent les propriétés suivantes pour chacune des constructions:
- la protéine p53 voit son activité transactivatrice diminuer lorsqu'elle est en présence d'un excès de forme mutée H175, ce qui correspond bien à une situation physiologique puisque l'on sait que ce type de forme mutante est beaucoup plus stable que la p53 sauvage et donc toujours en excès. On mesure donc bien là l'effet dominant-négatif de ce mutant.
- la protéine AS présente une sensibilité accrue à l'effet dominant négatif du mutant H 175, puisque sensible à des concentrations plus faibles de celui-ci.
- au contraire, les protéines V-325 et V-336 ne sont non seulement plus sensibles à l'effet dominant-négatif mais voient même leur activité augmentée de façon dose-dépendante en présence de la forme mutante H175. De nouveau, dans cet essai la protéine V-325 présente un effet accru par rapport à la protéine V-336 la confirmant un peu plus dans son possible statut de super-sauvage. D2.4 - Effet de la protéine hdm2 sur la fonction transactivatrice
Les protocoles utilisés sont identiques à ceux décrits dans l'exemple D1.1. Dans cette expérience de transfection, les constructions placées sous contrôle du promoteur CMV (pcDNA3) sont co-transfectées avec des concentrations croissantes d'un plasmide exprimant hdm2 (fragment 1-134) sous contrôle du promoteur CMV (pcDNA3). Les résultats obtenus dans la lignée SAOS-2 et présentés dans la Figure 15 montrent les propriétés suivantes pour chacune des constructions:
- l'activité de la protéine p53 décroit au fur et à mesure que l'on augmente la concentration de hdm2, ce qui correspond bien à une situation physiologique.
- la protéine V-325 semble être insensible à cette inhibition par hdm2.
Ce comportement fait de la protéine V-325 un candidat super-sauvage particulièrement avantageux pour le traitement de pathologies liées à a surexpression de hdm2, et plus particulièrement, au traitement des pathologies liées à la surexpression de protéines cellulaires interagissant avec le domaine N-terminal de la protéine p53.
Les résultats de ces quatre expériences montrent clairement que les variants selon l'invention, notamment les variants contenant la région 75-325-lz ou 75-336-lz, présentent 1) une activité transactivatrice accrue, 2) une sensibilité moindre à l'effet de ia protéine E6 de HPV18, 3) l'absence de sensibilité à l'effet dominant-négatif de certains mutants de la p53 et même l'accroissement de son activité dans un tel contexte, et 4) une absence de sensibilité à la protéine hdm2. Ces différentes propriétés sont tout à fait remarquables et inattendues et confèrent aux variants de l'invention des avantages thérapeutiques considérables.
D3 - Effet sur la croissance cellulaire L'effet des constructions V-325 et V-336 sur la croissance cellulaire a été testé en parallèle avec la p53 sur différents types de lignées cellulaires dans une expérience de formation de colonies résistantes à la néomycine suite à la transfection par des plasmides exprimant ces trois protéines.
Dans cette expérience de transfection effectuée selon le protocole décrit précédemment, les différentes constructions ont été placées sous contrôle du promoteur CMV (pCDNA3).
Protocole de formation de colonies résistantes à la néomycine
48h après transfection, les cellules sont gratées et transférées dans des boites de Pétri de 10 cm de diamètre et remises à pousser avec 10 ml de milieu DMEM additioné de 10% de sérum de veau foetal inactivé à la chaleur et contenant 400 μg/ml de généticine (G418). Suite à une sélection de 15 jours en présence de G418, le nombre de colonies NeoR est déterminé par comptage après coloration à la fuchsine.
Cette expérience a été effectuée sur différents types cellulaires dont le statut des protéines p53 et Ras est présenté dans le Tableau 2
Tableau 2: Statut des lignées cellulaires utilisées dans le test de formation de colonies NéoR
(*) Putnam et al., Surg. Oncol., 1 (1993), 49
(**) Oliner et al., Nature, 358, (1992), 80
Les résultats de ces expériences sont présentés dans le Tableau 3 et sur ia Figure 16.
Tableau 3: Formation de colonies NéoR
Ces résultats montrent que les constructions V-325 et V-336 possèdent la capacité de bloquer la croissance cellulaire de façon au moins aussi efficace que la protéine p53 sauvage dans des contextes cellulaire où celle-ci peu fonctionner normalement (p53 sauvage ou double délétant), mais surtout qu'elles conservent cette activité même dans des contextes cellulaires ou la protéine p53 sauvage est très peu active (cellules HeLa exprimant la protéine E6 de HPV18 et cellules OsA-CL présentant une surexpression de la protéine hdm2). Cette propriété confère aux variants de l'invention des avantages thérapeutiques considérables.
D4 - Activité apoptotique des variants de l'invention
L'activité apoptotique des variants de l'invention a été étudiée en utilisant les cellules EB, EB-1 et EB-V325 et les conditions d'induction précédement décrites (exemple D1).
Les cellules ainsi induites OO6 cellules) sont fixées et perméabilisées par une incubation de 40 minutes dans 1 ml de Permeafix (Ortho Diagnostic Systems Inc.), puis lavées deux fois en tampon A (PBS (Gibco BRL) additionné de 0,5% de Tween 20), avant d'être resuspendues et incubées une heure à température ambiante dans 100 μl de tampon A additionné de 2% BSA (PBS-BSA) et 1 μg de l'anticoφs monoclonal pAb240. Après deux nouveaux lavages en tampon PBS-BSA, les cellules sont incubées 1 heure à température ambiante dans 100 μl du même tampon additioné de 1 μg d'un anticorps polyclonal secondaire couplé à la fiuorescéine (GAM-FITC (Immunotech)). Puis, les cellules sont lavées deux fois dans le tampon A, resuspendues dans 1 ml du même tampon contenant 5 μg d'iodure de propidium et 1 mg de RNase (DNase-free), et incubées 30 min à température ambiante avant d'être analysées par cytométrie de flux.
Les résultats d'une expérience d'induction de 24 et 48 heures effectuée sur les cellules EB-1 et EB-V325 sont présentés dans la Figure 17. Dans ces conditions les cellules exprimant la protéine p53 sauvage ou son variant V-325 (détectés par l'anticorps pAb240) sont majoritairement réparties en phase G1 et sub-G1 (apoptose) après 24 heures d'induction, puis essentiellement en sub-G1 après 48 heures. Ce résultat indique clairement que la protéine V-325 est capable, tout comme la protéine p53 sauvage, d'induire l'apoptose.
Les résultats d'une expérience cinétique d'induction effectuée sur les cellules EB et les clones EB-1 et EB-V325 présentés dans la figure 18 montrent que le variant V-325 semble induire plus rapidement et plus massivement l'apoptose que la protéine p53 sauvage. En tenant compte du fait que les deux protéines semblent être exprimées à des niveaux comparables dans ces clones (cf § D1), ce résultat conforte l'idée d'une activité améliorée du variant V-325 par rapport à celle de la protéine p53 sauvage. LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE POULENC RORER S.A.
(B) RUE: 20, AVENUE RAYMOND ARON (C) VILLE: ANTONY
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165
(G) TELEPHONE: (1) 40.91.69.22 (H) TELECOPIE: (1) 40.91.72.91
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Variants de la protéine p53 et utilisations thérapeutiques
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 46
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 112 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
AGATCTGAAG GCCCTCAAGG AGAAGCTGAA GGCCCTGGAG GAGAAGCTGA AGGCCCTGGA 60 GGAGAAGCTG AAGGCACTAG TGGGGGAGCG ATGATGAATC GATATCGCGG CC 112
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 266 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
AAGCTTGAAT TCGTTAACAT GTCCACGGCC CCCCCGACCG ATGTCAGCCT GGGGGACGAG 60 CTCCACTTAG ACGGCGAGGA CGTGGCGATG GCGCATGCCG ACGCGCTAGA CGATTTCGAT 120
CTGGACATGT TGGGGGACGG GGATTCCCCG GGGCCGGGAT TTACCCCCCA CGACTCCGCC 180
CCCTACGGCG CTCTGGATAT GGCCGACTTC GAGTTTGAGC AGATGTTTAC CGATGCCCTT 240 GGAATTGACG AGTACGGTGG TCGACC 266
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 76 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
TCGAGCCTGC AGCCTAGAGC CTTCCAAGCC CTCATGAAGG AGGAAAGCCC AAACTGCTAG 60 TGAGGATCCG CGGCCG 76
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 788 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
GGGAAGCTTG GGCCGGGTCG ACCTGCACCA GCAGCTCCTA CACCGGCGGC CCCTGCACCA 60
GCCCCCTCCT GGCCCCTGTC ATCTTCTGTC CCTTCCCAGA AAACCTACCA GGGCAGCTAC 120
GGTTTCCGTC TGGGCTTCTT GCATTCTGGG ACAGCCAAGT CTGTGACTTG CACGTACTCC 180
CCTGCCCTCA ACAAGATGTT TTGCCAACTG GCCAAGACCT GCCCTGTGCA GCTGTGGGTT 240 GATTCCACAC CCCCGCCCGG CACCCGCGTC CGCGCCATGG CCATCTACAA GCAGTCACAG 300
CACATGACGG AGGTTGTGAG GCGCTGCCCC CACCATGAGC GCTGCTCAGA TAGCGATGGT 360
CTGGCCCCTC CTCAGCATCT TATCCGAGTG GAAGGAAATT TGCGTGTGGA GTATTTGGAT 420
GACAGAAACA CTTTTCGACA TAGTGTGGTG GTGCCCTATG AGCCGCCTGA GGTTGGCTCT 480
GACTGTACCA CCATCCACTA CAACTACATG TGTAACAGTT CCTGCATGGG CGGCATGAAC 540 CGGAGGCCCA TCCTCACCAT CATCACACTG GAAGACTCCA GTGGTAATCT ACTGGGACGG 600
AACAGCTTTG AGGTGCGTGT TTGTGCCTGT CCTGGGAGAG ACCGGCGCAC AGAGGAAGAG 660
AATCTCCGCA AGAAAGGGGA GCCTCACCAC GAGCTGCCCC CAGGGAGCAC TAAGCGAGCA 720
CTGCCCAACA ACACCAGCTC CTCTCCCCAG CCAAAGAAGA AACCACTGGA TGGGGATCCG 780
CGGCCGCC 788
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 821 paires de bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: GGGAAGCTTG GGCCGGGTCG ACCTGCACCA GCAGCTCCTA CACCGGCGGC CCCTGCACCA 60
GCCCCCTCCT GGCCCCTGTC ATCTTCTGTC CCTTCCCAGA AAACCTACCA GGGCAGCTAC 120
GGTTTCCGTC TGGGCTTCTT GCATTCTGGG ACAGCCAAGT CTGTGACTTG CACGTACTCC 180
ILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) CCTGCCCTCA ACAAGATGTT TTGCCAACTG GCCAAGACCT GCCCTGTGCA GCTGTGGGTT 240 GATTCCACAC CCCCGCCCGG CACCCGCGTC CGCGCCATGG CCATCTACAA GCAGTCACAG 300
CACATGACGG AGGTTGTGAG GCGCTGCCCC CACCATGAGC GCTGCTCAGA TAGCGATGGT 360
CTGGCCCCTC CTCAGCATCT TATCCGAGTG GAAGGAAATT TGCGTGTGGA GTATTTGGAT 420 GACAGAAACA CTTTTCGACA TAGTGTGGTG GTGCCCTATG AGCCGCCTGA GGTTGGCTCT 480
GACTGTACCA CCATCCACTA CAACTACATG TGTAACAGTT CCTGCATGGG CGGCATGAAC 540
CGGAGGCCCA TCCTCACCAT CATCACACTG GAAGACTCCA GTGGTAATCT ACTGGGACGG 600
AACAGCTTTG AGGTGCGTGT TTGTGCCTGT CCTGGGAGAG ACCGGCGCAC AGAGGAAGAG 660
AATCTCCGCA AGAAAGGGGA GCCTCACCAC GAGCTGCCCC CAGGGAGCAC TAAGCGAGCA 720 CTGCCCAACA ACACCAGCTC CTCTCCCCAG CCAAAGAAGA AACCACTGGA TGGAGAATAT 780
TTCACCCTTC AGATCCGTGG GCGTGAGGAT CCGCGGCCGC C 821
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: ATGGAGGAGC CGCAG 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 42 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
GGCGGCCGCG ATATCGATTC ATCAGTCTGA GTCAGGCCCT TC 42
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 36 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8: GGCGGCCGCG ATATCGATTC ATCAGCTCGA GTGAGC 36
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 43 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9: TCGAGCCTGC AGCCTAGAGC CTTCCAAGCC CTCATGAAGG AGG 43
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 31 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10: AAAGCCCAAA CTGCTGATGA ATCGATATCG C 31
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11: TGAGGGCTTG GAAGGCTCTA GGCTGCAGGC 30
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 44 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12: GGCCGCGATA TCGATTCATC AGCAGTTTGG GCTTTCCTCC TTCA 44
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 39 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13: GGGAAGCTTG GGCCGGGTCG ACCTGCACCA GCAGCTCCT 39
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 32 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:
GGCGGCCGCG GATCCCCATC CAGTGGTTTC TT 32
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15: ATCTGAATGG CGCTC 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 32 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16:
GGCGGCCGCG GATCCTCACG CCCACGGATC TG 32
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 17:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 39 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17: AAGCTTGAAT TCGTTAACAT GTCCACGGCC CCCCCGACC 39
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 18:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 23 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18:
GGTCGACCAC CGTACTCGTC AAT 23
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 19:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 33 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 19: GATCTGAAGG CCCTCAAGGA GAAGCTGAAG GCC 33
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 20:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 36 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 20: CTGGAGGAGA AGCTGAAGGC CCTGGAGGAG AAGCTG 36
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 21:
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 38 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 21: AAGGCACTAG TGGGGGAGCG ATGATGAATC GATATCGC 38
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 22:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 42 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 22: AAGGCACTAG TGGGGGAGCG ATGATGAATC GATATCGC 38
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 23:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 42 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 23: TAGTGCCTTC AGCTTCTCCT CCAGGGCCTT CAGCTT 36
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 24:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 33 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 24: GGCCGCGATA TCGATTCATC ATCGCTCCCC CAC 33
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 25:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1095 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:!..1095
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 25:
ATG TCC ACG GCC CCC CCG ACC GAT GTC AGC CTG GGG GAC GAG CTC CAC 48 Met Ser Thr Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu Leu His 1 5 10 15 TTA GAC GGC GAG GAC GTG GCG ATG GCG CAT GCC GAC GCG CTA GAC GAT 96 Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp Ala Leu Asp Asp 20 25 30
TTC GAT CTG GAC ATG TTG GGG GAC GGG GAT TCC CCG GGG CCG GGA TTT 144
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly Pro Gly Phe 35 40 45
ACC CCC CAC GAC TCC GCC CCC TAC GGC GCT CTG GAT ATG GCC GAC TTC 192 Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe 50 55 60
GAG TTT GAG CAG ATG TTT ACC GAT GCC CTT GGA ATT GAC GAG TAC GGT 240 Glu Phe Glu Gin Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly Ile Asp Glu Tyr Gly 65 70 75 80
GGT CGA CCT GCA CCA GCA GCT CCT ACA CCG GCG GCC CCT GCA CCA GCC 288 Gly Arg Pro Ala Pro Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala 85 90 95
CCC TCC TGG CCC CTG TCA TCT TCT GTC CCT TCC CAG AAA ACC TAC CAG 336 Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val Pro Ser Gin Lys Thr Tyr Gin 100 105 110 GGC AGC TAC GGT TTC CGT CTG GGC TTC TTG CAT TCT GGG ACA GCC AAG 384 Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys 115 120 125
TCT GTG ACT TGC ACG TAC TCC CCT GCC CTC AAC AAG ATG TTT TGC CAA 432 Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gin 130 135 140
CTG GCC AAG ACC TGC CCT GTG CAG CTG TGG GTT GAT TCC ACA CCC CCG 480 Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gin Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro 145 150 155 160
CCC GGC ACC CGC GTC CGC GCC ATG GCC ATC TAC AAG CAG TCA CAG CAC 528 Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met Ala Ile Tyr Lys Gin Ser Gin His 165 170 175
ATG ACG GAG GTT GTG AGG CGC TGC CCC CAC CAT GAG CGC TGC TCA GAT 576 Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp 180 185 190 AGC GAT GGT CTG GCC CCT CCT CAG CAT CTT ATC CGA GTG GAA GGA AAT 624 Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gin His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn 195 200 205
TTG CGT GTG GAG TAT TTG GAT GAC AGA AAC ACT TTT CGA CAT AGT GTG 672 Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val 210 215 220
GTG GTG CCC TAT GAG CCG CCT GAG GTT GGC TCT GAC TGT ACC ACC ATC 720 Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile 225 230 235 240
CAC TAC AAC TAC ATG TGT AAC AGT TCC TGC ATG GGC GGC ATG AAC CGG 768 His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg 245 250 255
AGG CCC ATC CTC ACC ATC ATC ACA CTG GAA GAC TCC AGT GGT AAT CTA 816 Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu 260 265 270 CTG GGA CGG AAC AGC TTT GAG GTG CGT GTT TGT GCC TGT CCT GGG AGA 864 Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg 275 280 285 GAC CGG CGC ACA GAG GAA GAG AAT CTC CGC AAG AAA GGG GAG CCT CAC 912 Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His 290 295 300
CAC GAG CTG CCC CCA GGG AGC ACT AAG CGA GCA CTG CCC AAC AAC ACC 960 His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr 305 310 315 320
AGC TCC TCT CCC CAG CCA AAG AAG AAA CCA CTG GAT GGG GAT CTG AAG 1008 Ser Ser Ser Pro Gin Pro Lys Lys Lys Pro Leu Asp Gly Asp Leu Lys 325 330 335
GCC CTC AAG GAG AAG CTG AAG GCC CTG GAG GAG AAG CTG AAG GCC CTG 1056 Ala Leu Lys Glu Lys Leu Lys Ala Leu Glu Glu Lys Leu Lys Ala Leu 340 345 350
GAG GAG AAG CTG AAG GCA CTA GTG GGG GAG CGA TGA TGA 1095 Glu Glu Lys Leu Lys Ala Leu Val Gly Glu Arg * * 355 360 365
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 26:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1128 paires de bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:!..1128
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 26:
ATG TCC ACG GCC CCC CCG ACC GAT GTC AGC CTG GGG GAC GAG CTC CAC 48 Met Ser Thr Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu Leu His 370 375 380
TTA GAC GGC GAG GAC GTG GCG ATG GCG CAT GCC GAC GCG CTA GAC GAT 96
Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp Ala Leu Asp Asp
385 390 395
TTC GAT CTG GAC ATG TTG GGG GAC GGG GAT TCC CCG GGG CCG GGA TTT 144
Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly Pro Gly Phe 400 405 410
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) ACC CCC CAC GAC TCC GCC CCC TAC GGC GCT CTG GAT ATG GCC GAC TTC 192
Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe
415 420 425 GAG TTT GAG CAG ATG TTT ACC GAT GCC CTT GGA ATT GAC GAG TAC GGT 240
Glu Phe Glu Gin Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly Ile Asp Glu Tyr Gly
430 435 440 445
GGT CGA CCT GCA CCA GCA GCT CCT ACA CCG GCG GCC CCT GCA CCA GCC 288 Gly Arg Pro Ala Pro Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
450 455 460
CCC TCC TGG CCC CTG TCA TCT TCT GTC CCT TCC CAG AAA ACC TAC CAG 336
Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val Pro Ser Gin Lys Thr Tyr Gin 465 470 475
GGC AGC TAC GGT TTC CGT CTG GGC TTC TTG CAT TCT GGG ACA GCC AAG 384
Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys
480 485 490
TCT GTG ACT TGC ACG TAC TCC CCT GCC CTC AAC AAG ATG TTT TGC CAA 432
Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gin
495 500 505 CTG GCC AAG ACC TGC CCT GTG CAG CTG TGG GTT GAT TCC ACA CCC CCG 480
Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gin Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro
510 515 520 525
CCC GGC ACC CGC GTC CGC GCC ATG GCC ATC TAC AAG CAG TCA CAG CAC 528 Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met Ala Ile Tyr Lys Gin Ser Gin His
530 535 540
ATG ACG GAG GTT GTG AGG CGC TGC CCC CAC CAT GAG CGC TGC TCA GAT 576
Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp 545 550 555
AGC GAT GGT CTG GCC CCT CCT CAG CAT CTT ATC CGA GTG GAA GGA AAT 624
Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gin His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn
560 565 570
TTG CGT GTG GAG TAT TTG GAT GAC AGA AAC ACT TTT CGA CAT AGT GTG 672
Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val
575 580 585 GTG GTG CCC TAT GAG CCG CCT GAG GTT GGC TCT GAC TGT ACC ACC ATC 720
Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile
590 595 600 605
CAC TAC AAC TAC ATG TGT AAC AGT TCC TGC ATG GGC GGC ATG AAC CGG 768 His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg
610 615 620
AGG CCC ATC CTC ACC ATC ATC ACA CTG GAA GAC TCC AGT GGT AAT CTA 816
Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu 625 630 635
CTG GGA CGG AAC AGC TTT GAG GTG CGT GTT TGT GCC TGT CCT GGG AGA 864
Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg
640 645 650
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) GAC CGG CGC ACA GAG GAA GAG AAT CTC CGC AAG AAA GGG GAG CCT CAC 912 Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His 655 660 665
CAC GAG CTG CCC CCA GGG AGC ACT AAG CGA GCA CTG CCC AAC AAC ACC 960 His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr 670 675 680 685 AGC TCC TCT CCC CAG CCA AAG AAG AAA CCA CTG GAT GGA GAA TAT TTC 1008 Ser Ser Ser Pro Gin Pro Lys Lys Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe 690 695 700
ACC CTT CAG ATC CGT GGG CGT GAG GAT CTG AAG GCC CTC AAG GAG AAG 1056 Thr Leu Gin Ile Arg Gly Arg Glu Asp Leu Lys Ala Leu Lys Glu Lys 705 710 715
CTG AAG GCC CTG GAG GAG AAG CTG AAG GCC CTG GAG GAG AAG CTG AAG 1104 Leu Lys Ala Leu Glu Glu Lys Leu Lys Ala Leu Glu Glu Lys Leu Lys 720 725 730
GCA CTA GTG GGG GAG CGA TGA TGA 1128
Ala Leu Val Gly Glu Arg * * 735 740
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 27:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 765 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..765
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 27:
ATG TCC ACG GCC CCC CCG ACC GAT GTC AGC CTG GGG GAC GAG CTC CAC 48 Met Ser Thr Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu Leu His 380 385 390
TTA GAC GGC GAG GAC GTG GCG ATG GCG CAT GCC GAC GCG CTA GAC GAT 96 Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp Ala Leu Asp Asp 395 400 405
TTC GAT CTG GAC ATG TTG GGG GAC GGG GAT TCC CCG GGG CCG GGA TTT 144 Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly Pro Gly Phe 410 415 420 ACC CCC CAC GAC TCC GCC CCC TAC GGC GCT CTG GAT ATG GCC GAC TTC 192 Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe 425 430 435 440
GAG TTT GAG CAG ATG TTT ACC GAT GCC CTT GGA ATT GAC GAG TAC GGT 240 Glu Phe Glu Gin Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly Ile Asp Glu Tyr Gly 445 450 455 GGT CGA CCT GCA CCA GCA GCT CCT ACA CCG GCG GCC CCT GCA CCA GCC 288 Gly Arg Pro Ala Pro Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala 460 465 470
CCC TCC TGG CCC CTG TCA TCT TCT GTC CCT TCC CAG AAA ACC TAC CAG 336 Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val Pro Ser Gin Lys Thr Tyr Gin 475 480 485
GGC AGC TAC GGT TTC CGT CTG GGC TTC TTG CAT TCT GGG ACA GCC AAG 384 Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys 490 495 500
TCT GTG ACT TGC ACG TAC TCC CCT GCC CTC AAC AAG ATG TTT TGC CAA 432 Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gin 505 510 515 520
CTG GCC AAG ACC TGC CCT GTG CAG CTG TGG GTT GAT TCC ACA CCC CCG 480
Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gin Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro 525 530 535 CCC GGC ACC CGC GTC CGC GCC ATG GCC ATC TAC AAG CAG TCA CAG CAC 528
Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met Ala Ile Tyr Lys Gin Ser Gin His 540 545 550
ATG ACG GAG GTT GTG AGG CGC TGC CCC CAC CAT GAG CGC TGC TCA GAT 576 Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp
555 560 565
AGC GAT GGT CTG GCC CCT CCT CAG CAT CTT ATC CGA GTG GAA GGA AAT 624
Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gin His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn 570 575 580
TTG CGT GTG GAG TAT TTC ACC CTT CAG ATC CGT GGG CGT GAG CGC TTC 672
Leu Arg Val Glu Tyr Phe Thr Leu Gin Ile Arg Gly Arg Glu Arg Phe 585 590 595 600
GAG ATG TTC CGA GAG CTG AAT GAG GCC TTG GAA CTC AAG GAT GCC CAG 720 Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gin 605 610 615 GCT GGG AAG GAG CCA GGG GGG AGC AGG GCT CAC TCG AGC TGA TGA 765
Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser * * 620 625 630
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 28:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 816 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:!..816
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 28:
ATG TCC ACG GCC CCC CCG ACC GAT GTC AGC CTG GGG GAC GAG CTC CAC 48 Met Ser Thr Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu Leu His 260 265 270
TTA GAC GGC GAG GAC GTG GCG ATG GCG CAT GCC GAC GCG CTA GAC GAT 96 Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp Ala Leu Asp Asp 275 280 285
TTC GAT CTG GAC ATG TTG GGG GAC GGG GAT TCC CCG GGG CCG GGA TTT 144 Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly Pro Gly Phe 290 295 300 ACC CCC CAC GAC TCC GCC CCC TAC GGC GCT CTG GAT ATG GCC GAC TTC 192 Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe 305 310 315
GAG TTT GAG CAG ATG TTT ACC GAT GCC CTT GGA ATT GAC GAG TAC GGT 240 Glu Phe Glu Gin Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly Ile Asp Glu Tyr Gly 320 325 330 335
GGT CGA CCT GCA CCA GCA GCT CCT ACA CCG GCG GCC CCT GCA CCA GCC 288 Gly Arg Pro Ala Pro Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala 340 345 350
CCC TCC TGG CCC CTG TCA TCT TCT GTC CCT TCC CAG AAA ACC TAC CAG 336 Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val Pro Ser Gin Lys Thr Tyr Gin 355 360 365
GGC AGC TAC GGT TTC CGT CTG GGC TTC TTG CAT TCT GGG ACA GCC AAG 384 Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys 370 375 380 TCT GTG ACT TGC ACG TAC TCC CCT GCC CTC AAC AAG ATG TTT TGC CAA 432 Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gin 385 390 395
CTG GCC AAG ACC TGC CCT GTG CAG CTG TGG GTT GAT TCC ACA CCC CCG 480 Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gin Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro 400 405 410 415
CCC GGC ACC CGC GTC CGC GCC ATG GCC ATC TAC AAG CAG TCA CAG CAC 528 Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met Ala Ile Tyr Lys Gin Ser Gin His
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) 420 425 430
ATG ACG GAG GTT GTG AGG CGC TGC CCC CAC CAT GAG CGC TGC TCA GAT 576 Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp 435 440 445
AGC GAT GGT CTG GCC CCT CCT CAG CAT CTT ATC CGA GTG GAA GGA AAT 624 Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gin His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn 450 455 460
TTG CGT GTG GAG TAT TTC ACC CTT CAG ATC CGT GGG CGT GAG CGC TTC 672 Leu Arg Val Glu Tyr Phe Thr Leu Gin Ile Arg Gly Arg Glu Arg Phe 465 470 475 GAG ATG TTC CGA GAG CTG AAT GAG GCC TTG GAA CTC AAG GAT GCC CAG 720 Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gin 480 485 490 495
GCT GGG AAG GAG CCA GGG GGG AGC AGG GCT CAC TCG AGC CTG CAG CCT 768 Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser Leu Gin Pro
500 505 510
AGA GCC TTC CAA GCC CTC ATG AAG GAG GAA AGC CCA AAC TGC TGA TGA 816 Arg Ala Phe Gin Ala Leu Met Lys Glu Glu Ser Pro Asn Cys * * 515 520 525
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 29: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1209 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc (in) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT: 1..1209
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 29: ATG TCC ACG GCC CCC CCG ACC GAT GTC AGC CTG GGG GAC GAG CTC CAC 48 Met Ser Thr Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu Leu His 275 280 285
TTA GAC GGC GAG GAC GTG GCG ATG GCG CAT GCC GAC GCG CTA GAC GAT 96 Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp Ala Leu Asp Asp 290 295 300
TTC GAT CTG GAC ATG TTG GGG GAC GGG GAT TCC CCG GGG CCG GGA TTT 144 Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly Pro Gly Phe
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) 305 310 315 320
ACC CCC CAC GAC TCC GCC CCC TAC GGC GCT CTG GAT ATG GCC GAC TTC 192
Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe
325 330 335
GAG TTT GAG CAG ATG TTT ACC GAT GCC CTT GGA ATT GAC GAG TAC GGT 240
Glu Phe Glu Gin Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly Ile Asp Glu Tyr Gly
340 345 350
GGT CGA CCT GCA CCA GCA GCT CCT ACA CCG GCG GCC CCT GCA CCA GCC 288
Gly Arg Pro Ala Pro Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
355 360 365 CCC TCC TGG CCC CTG TCA TCT TCT GTC CCT TCC CAG AAA ACC TAC CAG 336
Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val Pro Ser Gin Lys Thr Tyr Gin 370 375 380
GGC AGC TAC GGT TTC CGT CTG GGC TTC TTG CAT TCT GGG ACA GCC AAG 384 Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys 385 390 395 400
TCT GTG ACT TGC ACG TAC TCC CCT GCC CTC AAC AAG ATG TTT TGC CAA 432
Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gin 405 410 415
CTG GCC AAG ACC TGC CCT GTG CAG CTG TGG GTT GAT TCC ACA CCC CCG 480
Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gin Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro
420 425 430
CCC GGC ACC CGC GTC CGC GCC ATG GCC ATC TAC AAG CAG TCA CAG CAC 528
Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met Ala Ile Tyr Lys Gin Ser Gin His
435 440 445 ATG ACG GAG GTT GTG AGG CGC TGC CCC CAC CAT GAG CGC TGC TCA GAT 576
Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp 450 455 460
AGC GAT GGT CTG GCC CCT CCT CAG CAT CTT ATC CGA GTG GAA GGA AAT 624 Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gin His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn 465 470 475 480
TTG CGT GTG GAG TAT TTG GAT GAC AGA AAC ACT TTT CGA CAT AGT GTG 672
Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val 485 490 495
GTG GTG CCC TAT GAG CCG CCT GAG GTT GGC TCT GAC TGT ACC ACC ATC 720
Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile
500 505 510
CAC TAC AAC TAC ATG TGT AAC AGT TCC TGC ATG GGC GGC ATG AAC CGG 768 His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg 515 520 525 AGG CCC ATC CTC ACC ATC ATC ACA CTG GAA GAC TCC AGT GGT AAT CTA 816 Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu 530 535 540
CTG GGA CGG AAC AGC TTT GAG GTG CGT GTT TGT GCC TGT CCT GGG AGA 864
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg 545 550 555 560
GAC CGG CGC ACA GAG GAA GAG AAT CTC CGC AAG AAA GGG GAG CCT CAC 912 Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His
565 570 575
CAC GAG CTG CCC CCA GGG AGC ACT AAG CGA GCA CTG CCC AAC AAC ACC 960 His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr 580 585 590
AGC TCC TCT CCC CAG CCA AAG AAG AAA CCA CTG GAT GGA GAA TAT TTC 1008 Ser Ser Ser Pro Gin Pro Lys Lys Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe 595 600 605
ACC CTT CAG ATC CGT GGG CGT GAG CGC TTC GAG ATG TTC CGA GAG CTG 1056 Thr Leu Gin Ile Arg Gly Arg Glu Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu 610 615 620 AAT GAG GCC TTG GAA CTC AAG GAT GCC CAG GCT GGG AAG GAG CCA GGG 1104 Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gin Ala Gly Lys Glu Pro Gly 625 630 635 640
GGG AGC AGG GCT CAC TCC AGC CAC CTG AAG TCC AAA AAG GGT CAG TCT 1152 Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gin Ser
645 650 655
ACC TCC CGC CAT AAA AAA CTC ATG TTC AAG ACA GAA GGG CCT GAC TCA 1200 Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser 660 665 670
GAC TGA TGA 1209
Asp * * 675
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 30:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1149 paires de bases
(B) TYPE: nucl,otide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: lin, aire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:!..1149
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 30: ATG GCC ACG GCC CCC CCG ACC GAT GTC AGC CTG GGG GAC GAG CTC CAC 48 Met Ala Thr Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu Leu His
1 5 10 15
TTA GAC GGC GAG GAC GTG GCG ATG GCG CAT GCC GAC GCG CTA GAC GAT 96 Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp Ala Leu Asp Asp
20 25 30
TTC GAT CTG GAC ATG TTG GGG GAC GGG GAT TCC CCG GGG CCG GGA TTT 144
Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly Pro Gly Phe 35 40 45
ACC CCC CAC GAC TCC GCC CCC TAC GGC GCT CTG GAT ATG GCC GAC TTC 192
Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe
50 55 60
GAG TTT GAG CAG ATG TTT ACC GAT GCC CTT GGA ATT GAC GAG TAC GGT 240
Glu Phe Glu Gin Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly Ile Asp Glu Tyr Gly
65 70 75 80 GGT CGA CCT GCA CCA GCA GCT CCT ACA CCG GCG GCC CCT GCA CCA GCC 288
Gly Arg Pro Ala Pro Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
85 90 95
CCC TCC TGG CCC CTG TCA TCT TCT GTC CCT TCC CAG AAA ACC TAC CAG 336 Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val Pro Ser Gin Lys Thr Tyr Gin
100 105 110
GGC AGC TAC GGT TTC CGT CTG GGC TTC TTG CAT TCT GGG ACA GCC AAG 384
Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys 115 120 125
TCT GTG ACT TGC ACG TAC TCC CCT GCC CTC AAC AAG ATG TTT TGC CAA 432
Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gin
130 135 140
CTG GCC AAG ACC TGC CCT GTG CAG CTG TGG GTT GAT TCC ACA CCC CCG 480
Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gin Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro
145 150 155 160 CCC GGC ACC CGC GTC CGC GCC ATG GCC ATC TAC AAG CAG TCA CAG CAC 528
Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met Ala Ile Tyr Lys Gin Ser Gin His
165 170 175
ATG ACG GAG GTT GTG AGG CGC TGC CCC CAC CAT GAG CGC TGC TCA GAT 576 Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp
180 185 190
AGC GAT GGT CTG GCC CCT CCT CAG CAT CTT ATC CGA GTG GAA GGA AAT 624
Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gin His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn 195 200 205
TTG CGT GTG GAG TAT TTG GAT GAC AGA AAC ACT TTT CGA CAT AGT GTG 672
Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val
210 215 220
GTG GTG CCC TAT GAG CCG CCT GAG GTT GGC TCT GAC TGT ACC ACC ATC 720 Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile 225 230 235 240 CAC TAC AAC TAC ATG TGT AAC AGT TCC TGC ATG GGC GGC ATG AAC CGG 768 His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg 245 250 255 AGG CCC ATC CTC ACC ATC ATC ACA CTG GAA GAC TCC AGT GGT AAT CTA 816 Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu 260 265 270
CTG GGA CGG AAC AGC TTT GAG GTG CGT GTT TGT GCC TGT CCT GGG AGA 864 Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg 275 280 285
GAC CGG CGC ACA GAG GAA GAG AAT CTC CGC AAG AAA GGG GAG CCT CAC 912 Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His 290 295 300
CAC GAG CTG CCC CCA GGG AGC ACT AAG CGA GCA CTG CCC AAC AAC ACC 960 His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr 305 310 315 320
AGC TCC TCT CCC CAG CCA AAG AAG AAA CCA CTG GAT GGA GAA TAT TTC 1008 Ser Ser Ser Pro Gin Pro Lys Lys Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe 325 330 335 ACC CTT CAG ATC CGT GGG CGT GAG CGC TTC GAG ATG TTC CGA GAG GAT 1056
Thr Leu Gin Ile Arg Gly Arg Glu Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Asp 340 345 350
CTG AAG GCC CTC AAG GAG AAG CTG AAG GCC CTG GAG GAG AAG CTG AAG 1104 Leu Lys Ala Leu Lys Glu Lys Leu Lys Ala Leu Glu Glu Lys Leu Lys
355 360 365
GCC CTG GAG GAG AAG CTG AAG GCA CTA GTG GGG GAG CGA TGA TGA 1149
Ala Leu Glu Glu Lys Leu Lys Ala Leu Val Gly Glu Arg * * 370 375 380
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 31: (I) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1611 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(II) TYPE DE MOLECULE: ADNC (III) HYPOTHETIQUE: NON (IV) ANTI-SENS: NON
(IX) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:!..1611
(XI) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 31: ATG GCC CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCA GGG GCA GAG CTT GTG GGG TCA 48 MET ALA GLN VAL GLN LEU GLN GLU SER GLY ALA GLU LEU VAL GLY SER 1 5 10 15 GGG GCC TCA GTC AAG TTG TCC TGC ACA GCT TCT GGC TTC AAC ATT AAA 96 GLY ALA SER VAL LYS LEU SER CYS THR ALA SER GLY PHE ASN ILE LYS 20 25 30
GAC TAC TAT ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGG CCT GAA CAG GGC CTG GAG 144 ASP TYR TYR MET HIS TRP VAL LYS GLN ARG PRO GLU GLN GLY LEU GLU 35 40 45
TGG ATT GGA TGG ATT GAT CCT GAG AAT GGT GAT ACT GAA TAT GCC CCG 192 TRP ILE GLY TRP ILE ASP PRO GLU ASN GLY ASP THR GLU TYR ALA PRO 50 55 60
AAG TTC CAG GGC AAG GCC ACT ATG ACT GCA GAC ACA TCC TCC AAT ACA 240 LYS PHE GLN GLY LYS ALA THR MET THR ALA ASP THR SER SER ASN THR 65 70 75 80
GCC TAC CTG CAG CTC AGC AGC CTG GCA TCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT 288 ALA TYR LEU GLN LEU SER SER LEU ALA SER GLU ASP THR ALA VAL TYR 85 90 95 TAT TGT AAT TTT TAC GGG GAT GCT TTG GAC TAC TGG GGC CAA GGG ACC 336 TYR CYS ASN PHE TYR GLY ASP ALA LEU ASP TYR TRP GLY GLN GLY THR 100 105 110
ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT 384 THR VAL THR VAL SER SER GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY SER 115 120 125
GGC GGT GGC GGA TCG GAT GTT TTG ATG ACC CAA ACT CCA CTC ACT TTG 432 GLY GLY GLY GLY SER ASP VAL LEU MET THR GLN THR PRO LEU THR LEU 130 135 140
TCG GTT ACC ATT GGA CAA CCA GCC TCC ATC TCT TGC AAG TCA AGT CAG 480 SER VAL THR ILE GLY GLN PRO ALA SER ILE SER CYS LYS SER SER GLN 145 150 155 160
AGC CTC TTG GAT AGT GAT GGA AAG ACA TAT TTG AAT TGG TTG TTA CAG 528 SER LEU LEU ASP SER ASP GLY LYS THR TYR LEU ASN TRP LEU LEU GLN 165 170 175 AGG CCA GGC CAG TCT CCA AAG CGC CTA ATC TAT CTG GTG TCT AAA CTG 576 ARG PRO GLY GLN SER PRO LYS ARG LEU ILE TYR LEU VAL SER LYS LEU 180 185 190
GAC TCT GGA GTC CCT GAC AGG TTC ACT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT 624 ASP SER GLY VAL PRO ASP ARG PHE THR GLY SER GLY SER GLY THR ASP 195 200 205
TTC ACA CTG AAA ATC AAC AGA GTG GAG GCT GAG GAT TTG GGA GTT TAT 672 PHE THR LEU LYS ILE ASN ARG VAL GLU ALA GLU ASP LEU GLY VAL TYR 210 215 220
TAT TGC TGG CAA GGT ACA CAT TCT CCG CTC ACG TTC GGT GCT GGG ACC 720 TYR CYS TRP GLN GLY THR HIS SER PRO LEU THR PHE GLY ALA GLY THR 225 230 235 240 AAG CTG GAG CTG AAA CGG GCG GCC GCA TTG CAG ACG CGT CGA CCT GCA 768 LYS LEU GLU LEU LYS ARG ALA ALA ALA LEU GLN THR ARG ARG PRO ALA 245 250 255
CCA GCA GCT CCT ACA CCG GCG GCC CCT GCA CCA GCC CCC TCC TGG CCC 816 PRO ALA ALA PRO THR PRO ALA ALA PRO ALA PRO ALA PRO SER TRP PRO 260 265 270 CTG TCA TCT TCT GTC CCT TCC CAG AAA ACC TAC CAG GGC AGC TAC GGT 864 LEU SER SER SER VAL PRO SER GLN LYS THR TYR GLN GLY SER TYR GLY 275 280 285
TTC CGT CTG GGC TTC TTG CAT TCT GGG ACA GCC AAG TCT GTG ACT TGC 912 PHE ARG LEU GLY PHE LEU HIS SER GLY THR ALA LYS SER VAL THR CYS 290 295 300
ACG TAC TCC CCT GCC CTC AAC AAG ATG TTT TGC CAA CTG GCC AAG ACC 960 THR TYR SER PRO ALA LEU ASN LYS MET PHE CYS GLN LEU ALA LYS THR 305 310 315 320
TGC CCT GTG CAG CTG TGG GTT GAT TCC ACA CCC CCG CCC GGC ACC CGC 1008 CYS PRO VAL GLN LEU TRP VAL ASP SER THR PRO PRO PRO GLY THR ARG 325 330 335
GTC CGC GCC ATG GCC ATC TAC AAG CAG TCA CAG CAC ATG ACG GAG GTT 1056 VAL ARG ALA MET ALA ILE TYR LYS GLN SER GLN HIS MET THR GLU VAL 340 345 350 GTG AGG CGC TGC CCC CAC CAT GAG CGC TGC TCA GAT AGC GAT GGT CTG 1104 VAL ARG ARG CYS PRO HIS HIS GLU ARG CYS SER ASP SER ASP GLY LEU 355 360 365
GCC CCT CCT CAG CAT CTT ATC CGA GTG GAA GGA AAT TTG CGT GTG GAG 1152 ALA PRO PRO GLN HIS LEU ILE ARG VAL GLU GLY ASN LEU ARG VAL GLU 370 375 380
TAT TTG GAT GAC AGA AAC ACT TTT CGA CAT AGT GTG GTG GTG CCC TAT 1200 TYR LEU ASP ASP ARG ASN THR PHE ARG HIS SER VAL VAL VAL PRO TYR 385 390 395 400
GAG CCG CCT GAG GTT GGC TCT GAC TGT ACC ACC ATC CAC TAC AAC TAC 1248 GLU PRO PRO GLU VAL GLY SER ASP CYS THR THR ILE HIS TYR ASN TYR 405 410 415
ATG TGT AAC AGT TCC TGC ATG GGC GGC ATG AAC CGG AGG CCC ATC CTC 1296 MET CYS ASN SER SER CYS MET GLY GLY MET ASN ARG ARG PRO ILE LEU 420 425 430 ACC ATC ATC ACA CTG GAA GAC TCC AGT GGT AAT CTA CTG GGA CGG AAC 1344 THR ILE ILE THR LEU GLU ASP SER SER GLY ASN LEU LEU GLY ARG ASN 435 440 445
AGC TTT GAG GTG CGT GTT TGT GCC TGT CCT GGG AGA GAC CGG CGC ACA 1392 SER PHE GLU VAL ARG VAL CYS ALA CYS PRO GLY ARG ASP ARG ARG THR 450 455 460
GAG GAA GAG AAT CTC CGC AAG AAA GGG GAG CCT CAC CAC GAG CTG CCC 1440 GLU GLU GLU ASN LEU ARG LYS LYS GLY GLU PRO HIS HIS GLU LEU PRO
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) 465 470 475 480
CCA GGG AGC ACT AAG CGA GCA CTG CCC AAC AAC ACC AGC TCC TCT CCC 1488 PRO GLY SER THR LYS ARG ALA LEU PRO ASN ASN THR SER SER SER PRO 485 490 495
CAG CCA AAG AAG AAA CCA CTG GAT GGG GAT CTG AAG GCC CTC AAG GAG 1536 GLN PRO LYS LYS LYS PRO LEU ASP GLY ASP LEU LYS ALA LEU LYS GLU 500 505 510
AAG CTG AAG GCC CTG GAG GAG AAG CTG AAG GCC CTG GAG GAG AAG CTG 1584 LYS LEU LYS ALA LEU GLU GLU LYS LEU LYS ALA LEU GLU GLU LYS LEU 515 520 525 AAG GCA CTA GTG GGG GAG CGA TGA TGA 1611
LYS ALA LEU VAL GLY GLU ARG * * 530 535
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 32:
(I) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1065 paires de baseS
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(II) TYPE DE MOLECULE: ADNC (III) HYPOTHETIQUE: NON
(IV) ANTI-SENS: NON
(IX) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..1065
(XI) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 32:
ATG GGA GAA TAT TTC ACC CTT CAG ATC CGT GGG CGT GAG CGC TTC GAG 48 MET GLY GLU TYR PHE THR LEU GLN ILE ARG GLY ARG GLU ARG PHE GLU 1 5 10 15
ATG TTC CGA GAG CTG AAT GAG GCC TTG GAA CTC AAG GAT GCC CAG GCT 96 MET PHE ARG GLU LEU ASN GLU ALA LEU GLU LEU LYS ASP ALA GLN ALA 20 25 30 GGG AAG GAG CCA GGG GGG AGC AGG GCT CAC TCC AGC CAC CTG AAG TCC 144 GLY LYS GLU PRO GLY GLY SER ARG ALA HIS SER SER HIS LEU LYS SER 35 40 45
AAA AAG GGT CAG TCT ACC TCC CGC CAT AAA AAA CTC ATG TTC AAG ACA 192 LYS LYS GLY GLN SER THR SER ARG HIS LYS LYS LEU MET PHE LYS THR 50 55 60
GAA GGG CCT GAC TCA GAC GGT CGA CCT GCA CCA GCA GCT CCT ACA CCG 240 GLU GLY PRO ASP SER ASP GLY ARG PRO ALA PRO ALA ALA PRO THR PRO
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) 65 70 75 80
GCG GCC CCT GCA CCA GCC CCC TCC TGG CCC CTG TCA TCT TCT GTC CCT 288 ALA ALA PRO ALA PRO ALA PRO SER TRP PRO LEU SER SER SER VAL PRO 85 90 95
TCC CAG AAA ACC TAC CAG GGC AGC TAC GGT TTC CGT CTG GGC TTC TTG 336 SER GLN LYS THR TYR GLN GLY SER TYR GLY PHE ARG LEU GLY PHE LEU 100 105 110
CAT TCT GGG ACA GCC AAG TCT GTG ACT TGC ACG TAC TCC CCT GCC CTC 384 HIS SER GLY THR ALA LYS SER VAL THR CYS THR TYR SER PRO ALA LEU 115 120 125 AAC AAG ATG TTT TGC CAA CTG GCC AAG ACC TGC CCT GTG CAG CTG TGG 432 ASN LYS MET PHE CYS GLN LEU ALA LYS THR CYS PRO VAL GLN LEU TRP 130 135 140
GTT GAT TCC ACA CCC CCG CCC GGC ACC CGC GTC CGC GCC ATG GCC ATC 480 VAL ASP SER THR PRO PRO PRO GLY THR ARG VAL ARG ALA MET ALA ILE 145 150 155 160
TAC AAG CAG TCA CAG CAC ATG ACG GAG GTT GTG AGG CGC TGC CCC CAC 528 TYR LYS GLN SER GLN HIS MET THR GLU VAL VAL ARG ARG CYS PRO HIS 165 170 175
CAT GAG CGC TGC TCA GAT AGC GAT GGT CTG GCC CCT CCT CAG CAT CTT 576 HIS GLU ARG CYS SER ASP SER ASP GLY LEU ALA PRO PRO GLN HIS LEU 180 185 190
ATC CGA GTG GAA GGA AAT TTG CGT GTG GAG TAT TTG GAT GAC AGA AAC 624 ILE ARG VAL GLU GLY ASN LEU ARG VAL GLU TYR LEU ASP ASP ARG ASN 195 200 205 ACT TTT CGA CAT AGT GTG GTG GTG CCC TAT GAG CCG CCT GAG GTT GGC 672 THR PHE ARG HIS SER VAL VAL VAL PRO TYR GLU PRO PRO GLU VAL GLY 210 215 220
TCT GAC TGT ACC ACC ATC CAC TAC AAC TAC ATG TGT AAC AGT TCC TGC 720 SER ASP CYS THR THR ILE HIS TYR ASN TYR MET CYS ASN SER SER CYS 225 230 235 240
ATG GGC GGC ATG AAC CGG AGG CCC ATC CTC ACC ATC ATC ACA CTG GAA 768 MET GLY GLY MET ASN ARG ARG PRO ILE LEU THR ILE ILE THR LEU GLU 245 250 255
GAC TCC AGT GGT AAT CTA CTG GGA CGG AAC AGC TTT GAG GTG CGT GTT 816
ASP SER SER GLY ASN LEU LEU GLY ARG ASN SER PHE GLU VAL ARG VAL 260 265 270
TGT GCC TGT CCT GGG AGA GAC CGG CGC ACA GAG GAA GAG AAT CTC CGC 864 CYS ALA CYS PRO GLY ARG ASP ARG ARG THR GLU GLU GLU ASN LEU ARG 275 280 285 AAG AAA GGG GAG CCT CAC CAC GAG CTG CCC CCA GGG AGC ACT AAG CGA 912 LYS LYS GLY GLU PRO HIS HIS GLU LEU PRO PRO GLY SER THR LYS ARG 290 295 300
GCA CTG CCC AAC AAC ACC AGC TCC TCT CCC CAG CCA AAG AAG AAA CCA 960
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) ALA LEU PRO ASN ASN THR SER SER SER PRO GLN PRO LYS LYS LYS PRO 305 310 315 320
CTG GAT GGG GAT CTG AAG GCC CTC AAG GAG AAG CTG AAG GCC CTG GAG 1008 LEU ASP GLY ASP LEU LYS ALA LEU LYS GLU LYS LEU LYS ALA LEU GLU
325 330 335
GAG AAG CTG AAG GCC CTG GAG GAG AAG CTG AAG GCA CTA GTG GGG GAG 1056 GLU LYS LEU LYS ALA LEU GLU GLU LYS LEU LYS ALA LEU VAL GLY GLU 340 345 350
CGA TGA TGA 1065
ARG * * 355
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 33:
(I) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 963 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (II) TYPE DE MOLECULE: ADNC (III) HYPOTHETIQUE: NON (IV) ANTI-SENS: NON
(IX) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..963
(XI) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 33:
ATG GGA GAA TAT TTC ACC CTT CAG ATC CGT GGG CGT GAG CGC TTC GAG 48 MET GLY GLU TYR PHE THR LEU GLN ILE ARG GLY ARG GLU ARG PHE GLU 1 5 10 15
ATG TTC CGA GAG CTG AAT GAG GCC TTG GAA CTC AAG GAT GCC CAG GCT 96 MET PHE ARG GLU LEU ASN GLU ALA LEU GLU LEU LYS ASP ALA GLN ALA 20 25 30
GGG AAG GAG CCA GGT CGA CCT GCA CCA GCA GCT CCT ACA CCG GCG GCC 144 GLY LYS GLU PRO GLY ARG PRO ALA PRO ALA ALA PRO THR PRO ALA ALA 35 40 45
CCT GCA CCA GCC CCC TCC TGG CCC CTG TCA TCT TCT GTC CCT TCC CAG 192
PRO ALA PRO ALA PRO SER TRP PRO LEU SER SER SER VAL PRO SER GLN 50 55 60 AAA ACC TAC CAG GGC AGC TAC GGT TTC CGT CTG GGC TTC TTG CAT TCT 240
LYS THR TYR GLN GLY SER TYR GLY PHE ARG LEU GLY PHE LEU HIS SER 65 70 75 80
GGG ACA GCC AAG TCT GTG ACT TGC ACG TAC TCC CCT GCC CTC AAC AAG 288
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) GLY THR ALA LYS SER VAL THR CYS THR TYR SER PRO ALA LEU ASN LYS 85 90 95
ATG TTT TGC CAA CTG GCC AAG ACC TGC CCT GTG CAG CTG TGG GTT GAT 336 MET PHE CYS GLN LEU ALA LYS THR CYS PRO VAL GLN LEU TRP VAL ASP 100 105 110
TCC ACA CCC CCG CCC GGC ACC CGC GTC CGC GCC ATG GCC ATC TAC AAG 384 SER THR PRO PRO PRO GLY THR ARG VAL ARG ALA MET ALA ILE TYR LYS 115 120 125
CAG TCA CAG CAC ATG ACG GAG GTT GTG AGG CGC TGC CCC CAC CAT GAG 432 GLN SER GLN HIS MET THR GLU VAL VAL ARG ARG CYS PRO HIS HIS GLU 130 135 140
CGC TGC TCA GAT AGC GAT GGT CTG GCC CCT CCT CAG CAT CTT ATC CGA 480 ARG CYS SER ASP SER ASP GLY LEU ALA PRO PRO GLN HIS LEU ILE ARG 145 150 155 160 GTG GAA GGA AAT TTG CGT GTG GAG TAT TTG GAT GAC AGA AAC ACT TTT 528 VAL GLU GLY ASN LEU ARG VAL GLU TYR LEU ASP ASP ARG ASN THR PHE 165 170 175
CGA CAT AGT GTG GTG GTG CCC TAT GAG CCG CCT GAG GTT GGC TCT GAC 576 ARG HIS SER VAL VAL VAL PRO TYR GLU PRO PRO GLU VAL GLY SER ASP 180 185 190
TGT ACC ACC ATC CAC TAC AAC TAC ATG TGT AAC AGT TCC TGC ATG GGC 624 CYS THR THR ILE HIS TYR ASN TYR MET CYS ASN SER SER CYS MET GLY 195 200 205
GGC ATG AAC CGG AGG CCC ATC CTC ACC ATC ATC ACA CTG GAA GAC TCC 672 GLY MET ASN ARG ARG PRO ILE LEU THR ILE ILE THR LEU GLU ASP SER 210 215 220
AGT GGT AAT CTA CTG GGA CGG AAC AGC TTT GAG GTG CGT GTT TGT GCC 720 SER GLY ASN LEU LEU GLY ARG ASN SER PHE GLU VAL ARG VAL CYS ALA 225 230 235 240 TGT CCT GGG AGA GAC CGG CGC ACA GAG GAA GAG AAT CTC CGC AAG AAA 768 CYS PRO GLY ARG ASP ARG ARG THR GLU GLU GLU ASN LEU ARG LYS LYS 245 250 255
GGG GAG CCT CAC CAC GAG CTG CCC CCA GGG AGC ACT AAG CGA GCA CTG 816 GLY GLU PRO HIS HIS GLU LEU PRO PRO GLY SER THR LYS ARG ALA LEU 260 265 270
CCC AAC AAC ACC AGC TCC TCT CCC CAG CCA AAG AAG AAA CCA CTG GAT 864 PRO ASN ASN THR SER SER SER PRO GLN PRO LYS LYS LYS PRO LEU ASP 275 280 285
GGG GAT CTG AAG GCC CTC AAG GAG AAG CTG AAG GCC CTG GAG GAG AAG 912 GLY ASP LEU LYS ALA LEU LYS GLU LYS LEU LYS ALA LEU GLU GLU LYS 290 295 300
CTG AAG GCC CTG GAG GAG AAG CTG AAG GCA CTA GTG GGG GAG CGA TGA 960 LEU LYS ALA LEU GLU GLU LYS LEU LYS ALA LEU VAL GLY GLU ARG * 305 310 315 320 TGA 963
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 34:
(I) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1011 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(II) TYPE DE MOLECULE: ADNC (III) HYPOTHETIQUE: NON (IV) ANTI-SENS: NON
(IX) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:!..1011
(XI) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 34:
ATG GGA GAA TAT TTC ACC CTT CAG ATC CGT GGG CGT GAG CGC TTC GAG 48
MET GLY GLU TYR PHE THR LEU GLN ILE ARG GLY ARG GLU ARG PHE GLU
1 5 10 15
ATG TTC CGA GAG CTG AAT GAG GCC TTG GAA CTC AAG GAT GCC CAG GCT 96
MET PHE ARG GLU LEU ASN GLU ALA LEU GLU LEU LYS ASP ALA GLN ALA 20 25 30
GGG AAG GAG CCA GGT CGA GGA GGT GGT GGC TCT GGA GGC GGA GGA TCC 144
GLY LYS GLU PRO GLY ARG GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY SER 35 40 45
GGC GGT GGA GGT TCT CGA CCT GCA CCA GCA GCT CCT ACA CCG GCG GCC 192
GLY GLY GLY GLY SER ARG PRO ALA PRO ALA ALA PRO THR PRO ALA ALA 50 55 60
CCT GCA CCA GCC CCC TCC TGG CCC CTG TCA TCT TCT GTC CCT TCC CAG 240 PRO ALA PRO ALA PRO SER TRP PRO LEU SER SER SER VAL PRO SER GLN
65 70 75 80
AAA ACC TAC CAG GGC AGC TAC GGT TTC CGT CTG GGC TTC TTG CAT TCT 288 LYS THR TYR GLN GLY SER TYR GLY PHE ARG LEU GLY PHE LEU HIS SER 85 90 95
GGG ACA GCC AAG TCT GTG ACT TGC ACG TAC TCC CCT GCC CTC AAC AAG 336 GLY THR ALA LYS SER VAL THR CYS THR TYR SER PRO ALA LEU ASN LYS 100 105 110
ATG TTT TGC CAA CTG GCC AAG ACC TGC CCT GTG CAG CTG TGG GTT GAT 384 MET PHE CYS GLN LEU ALA LYS THR CYS PRO VAL GLN LEU TRP VAL ASP 115 120 125
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) TCC ACA CCC CCG CCC GGC ACC CGC GTC CGC GCC ATG GCC ATC TAC AAG 432 SER THR PRO PRO PRO GLY THR ARG VAL ARG ALA MET ALA ILE TYR LYS 130 135 140 CAG TCA CAG CAC ATG ACG GAG GTT GTG AGG CGC TGC CCC CAC CAT GAG 480 GLN SER GLN HIS MET THR GLU VAL VAL ARG ARG CYS PRO HIS HIS GLU 145 150 155 160
CGC TGC TCA GAT AGC GAT GGT CTG GCC CCT CCT CAG CAT CTT ATC CGA 528 ARG CYS SER ASP SER ASP GLY LEU ALA PRO PRO GLN HIS LEU ILE ARG
165 170 175
GTG GAA GGA AAT TTG CGT GTG GAG TAT TTG GAT GAC AGA AAC ACT TTT 576 VAL GLU GLY ASN LEU ARG VAL GLU TYR LEU ASP ASP ARG ASN THR PHE 180 185 190
CGA CAT AGT GTG GTG GTG CCC TAT GAG CCG CCT GAG GTT GGC TCT GAC 624 ARG HIS SER VAL VAL VAL PRO TYR GLU PRO PRO GLU VAL GLY SER ASP 195 200 205
TGT ACC ACC ATC CAC TAC AAC TAC ATG TGT AAC AGT TCC TGC ATG GGC 672 CYS THR THR ILE HIS TYR ASN TYR MET CYS ASN SER SER CYS MET GLY 210 215 220 GGC ATG AAC CGG AGG CCC ATC CTC ACC ATC ATC ACA CTG GAA GAC TCC 720 GLY MET ASN ARG ARG PRO ILE LEU THR ILE ILE THR LEU GLU ASP SER 225 230 235 240
AGT GGT AAT CTA CTG GGA CGG AAC AGC TTT GAG GTG CGT GTT TGT GCC 768 SER GLY ASN LEU LEU GLY ARG ASN SER PHE GLU VAL ARG VAL CYS ALA
245 250 255
TGT CCT GGG AGA GAC CGG CGC ACA GAG GAA GAG AAT CTC CGC AAG AAA 816 CYS PRO GLY ARG ASP ARG ARG THR GLU GLU GLU ASN LEU ARG LYS LYS 260 265 270
GGG GAG CCT CAC CAC GAG CTG CCC CCA GGG AGC ACT AAG CGA GCA CTG 864
GLY GLU PRO HIS HIS GLU LEU PRO PRO GLY SER THR LYS ARG ALA LEU
275 280 285
CCC AAC AAC ACC AGC TCC TCT CCC CAG CCA AAG AAG AAA CCA CTG GAT 912 PRO ASN ASN THR SER SER SER PRO GLN PRO LYS LYS LYS PRO LEU ASP 290 295 300 GGG GAT CTG AAG GCC CTC AAG GAG AAG CTG AAG GCC CTG GAG GAG AAG 960 GLY ASP LEU LYS ALA LEU LYS GLU LYS LEU LYS ALA LEU GLU GLU LYS 305 310 315 320
CTG AAG GCC CTG GAG GAG AAG CTG AAG GCA CTA GTG GGG GAG CGA TGA 1008 LEU LYS ALA LEU GLU GLU LYS LEU LYS ALA LEU VAL GLY GLU ARG *
325 330 335
TGA 1011
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 35:
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) (I) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(II) TYPE DE MOLECULE: ADNC (III) HYPOTHETIQUE: NON (IV) ANTI-SENS: NON
(XI) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 35: CGGATCCTCT CGGAACATCT CGAA 24
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 36:
(I) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 749 paires de bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(II) TYPE DE MOLECULE: ADNC (III) HYPOTHETIQUE: NON (IV) ANTI-SENS: NON
(XI) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 36: GCCATGGCCC AGGTGCAGCT GCAGGAGTCA GGGGCAGAGC TTGTGGGGTC AGGGGCCTCA 60
GTCAAGTTGT CCTGCACAGC TTCTGGCTTC AACATTAAAG ACTACTATAT GCACTGGGTG 120
AAGCAGAGGC CTGAACAGGG CCTGGAGTGG ATTGGATGGA TTGATCCTGA GAATGGTGAT 180
ACTGAATATG CCCCGAAGTT CCAGGGCAAG GCCACTATGA CTGCAGACAC ATCCTCCAAT 240
ACAGCCTACC TGCAGCTCAG CAGCCTGGCA TCTGAGGACA CTGCCGTCTA TTATTGTAAT 300 TTTTÀCGGGG ATGCTTTGGA CTACTGGGGC CAAGGGACCA CGGTCACCGT CTCCTCAGGT 360
GGAGGCGGTT CAGGCGGAGG TGGCTCTGGC GGTGGCGGAT CGGATGTTTT GATGACCCAA 420
ACTCCACTCA CTTTGTCGGT TACCATTGGA CAACCAGCCT CCATCTCTTG CAAGTCAAGT 480
CAGAGCCTCT TGGATAGTGA TGGAAAGACA TATTTGAATT GGTTGTTACA GAGGCCAGGC 540
CAGTCTCCAA AGCGCCTAAT CTATCTGGTG TCTAAACTGG ACTCTGGAGT CCCTGACAGG 600 TTCACTGGCA GTGGATCAGG GACAGATTTC ACACTGAAAA TCAACAGAGT GGAGGCTGAG 660
GATTTGGGAG TTTATTATTG CTGGCAAGGT ACACATTCTC CGCTCACGTT CGGTGCTGGG 720 ACCAAGCTGG AGCTGAAACG GGCGGCCGC 749
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 37: (I) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 45 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(II) TYPE DE MOLECULE: ADNC (III) HYPOTHETIQUE: NON (IV) ANTI-SENS: NON
(XI) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 37:
AAGCTTGAAT TCGTTAACGC CACCATGGGA GAATATTTCA CCCTT 45
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 38:
(I) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(II) TYPE DE MOLECULE: ADNC (III) HYPOTHETIQUE: NON
(IV) ANTI-SENS: NON
(XI) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 38: GGGTCGACCT GGCTCCTTCC CAGC 24
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 39:
(I) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 749 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (II) TYPE DE MOLECULE: ADNC (III) HYPOTHETIQUE: NON (IV) ANTI-SENS: NON
(XI) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 39:
AAGCTTGAAT TCGTTAACGC CACCATGGGA GAATATTTCA CCCTTCAGAT CCGTGGGCGT 60 GAGCGCTTCG AGATGTTCCG AGAGCTGAAT GAGGCCTTGG AACTCAAGGA TGCCCAGGCT 120
GGGAAGGAGC CAGGTCGACC C 141
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 40:
(I) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(II) TYPE DE MOLECULE: ADNC (III) HYPOTHETIQUE: NON
(IV) ANTI-SENS: NON
(XI) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 40: GGGTCGACCG TCTGAGTCAG GCCCTTC 27
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 41:
(I) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 749 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(II) TYPE DE MOLECULE: ADNC (III) HYPOTHETIQUE: NON (IV) ANTI-SENS: NON
(XI) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 41:
nUlllξ DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) AAGCTTGAAT TCGTTAACGC CACCATGGGA GAATATTTCA CCCTTCAGAT CCGTGGGCGT 60
GAGCGCTTCG AGATGTTCCG AGAGCTGAAT GAGGCCTTGG AACTCAAGGA TGCCCAGGCT 120
GGGAAGGAGC CAGGGGGGAG CAGGGCTCAC TCCAGCCACC TGAAGTCCAA AAAGGGTCAG 180
TCTACCTCCC GCCATAAAAA ACTCATGTTC AAGACAGAAG GGCCTGACTC AGACGGTCGA 240
CCC 243
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 42:
(I) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 48 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(II) TYPE DE MOLECULE: ADNC (III) HYPOTHETIQUE: NON (IV) ANTI-SENS: NON
(XI) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 42: TCGAGGAGGT GGTGGCTCTG GAGGCGGAGG ATCCGGCGGT GGAGGTTC 48
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 43:
(I) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 48 paires de bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(II) TYPE DE MOLECULE: ADNC (III) HYPOTHETIQUE: NON (IV) ANTI-SENS: NON
(XI) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 43: TCGAGAACCC CTACCGCCGG ATCCTCCGCC TCCAGAGCCA CCACCTCC 48
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 44: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETIQUE: non
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 44:
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 45:
(I) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 26 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: lin, aire
(II) TYPE DE MOLECULE: ADNC (III) HYPOTHETIQUE: NON (IV) ANTI-SENS: NON
(XI) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 45: GATCCGAACA TGTCCCAACA TGTTGA 26
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 46:
(I) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 26 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(II) TYPE DE MOLECULE: ADNC (III) HYPOTHETIQUE: NON (IV) ANTI-SENS: NON
(XI) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 46: AGCTTCAACA TGTTGGGACA TGGTCG 26
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26)

Claims

REVENDICATIONS
1. Variant de la protéine p53 dans lequel tout ou partie du domaine d'oligomérisation est délété et remplacé par un domaine leucine zipper artificiel.
2. Variant selon la revendication 1 caractérisé en ce que la délétion comprend également tout ou partie du domaine de régulation.
3. Variant selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'il comporte une délétion de la partie C-terminale, à partir du résidu 326.
4. Variant selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'il comporte une délétion de la partie C-terminale, à partir du résidu 337.
5. Variant selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le domaine leucine zipper artificiel est un domaine non présent à l'état naturel assurant une sélectivité d'oligomérisation.
6. Variant selon la revendication 5 caractérisé en ce que le domaine leucine zipper possède la séquence SEQ ID n° 1.
7. Variant selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que le résidu arginine en position 182 de la protéine p53 est remplacé par une histidine.
8. Variant selon l'une des revendications précédentes dans lequel tout ou partie du domaine transactivateur est délété et remplacé par un domaine transactivateur hétérologue.
9. Variant selon la revendication 8 caractérisé en ce qu'il comporte une délétion des résidus 1 à 74.
10. Variant selon la revendication 8 ou 9 caractérisé en ce que le domaine transactivateur hétérologue est le domaine transactivateur de VP16.
11. Variant selon la revendication 10 caractérisé en ce que le domaine transactivateur comporte la séquence SEQ ID n° 2.
12. Variant selon la revendication 8 ou 9 caractérisé en ce que le domaine transactivateur hétérologue est un domaine transactivateur spécifique des cellules transformées.
13. Variant selon la revendication 12 caractérisé en ce que le domaine transactivateur est composé d'un domaine protéique capable de lier sélectivement un transactivateur ou un complexe transactivateur présent dans une cellule transformée.
14. Variant de la protéine p53 actif préférentiellement dans les cellules transformées dans lequel un au moins des domaines fonctionnels de p53 est délété en tout ou en partie et est substitué par un domaine hétérologue actif préférentiellement dans les cellules transformées.
15. Variant selon la revendication 14 caractérisé en ce que le domaine fonctionnels de p53 délété et substitué est le domaine transactivateur.
16. Variant selon la revendication 15 comprenant un domaine transactivateur actif préférentiellement dans les cellules contenant une protéine ras oncogénique ou un mutant de p53.
17. Variant selon la revendication 16 caractérisé en ce que le domaine transactivateur est un domaine protéique capable de lier sélectivement un transactivateur ou un complexe transactivateur présent dans une cellule transformée.
18. Variant selon la revendication 17 caractérisé en ce que le domaine protéique comprend un fragment ou un dérivé d'anticorps, de préférence un Fab ou un ScFv.
19. Variant selon la revendication 18 caractérisé en ce que le domaine protéique comprend un ScFv dirigé contre un mutant de la protéine p53.
20. Variant selon l'une des revendications 15 à 19 caractérisé en ce que le domaine transactivateur naturel est délété par suppression des résidus 1 à 74.
21. Variant de la protéine p53 comprenant une délétion de la partie C-terminale, à partir du résidu 366, fusionné à la séquence SEQ ID n° 3 (AS).
22. Variant selon la revendication 21 dans lequel tout ou partie du domaine transactivateur est délété et remplacé par un domaine transactivateur hétérologue.
23. Variant selon la revendication 21 ou 22 caractérisé en ce que le résidu arginine en position 182 de la protéine p53 est remplacé par une histidine.
24. Protéine chimère comprenant un domaine transactivateur, un domaine de liaison à l'ADN, un domaine d'adressage au noyau et un domaine d'oligomérisation, caractérisé en ce que les domaines de liaison à l'ADN et d'adressage au noyau sont constitués par les acides aminés 75 à 325 de la protéine p53 sauvage humaine (SEQ ID n° 4).
25. Protéine chimère comprenant un domaine transactivateur, un domaine de liaison à l'ADN, un domaine d'adressage au noyau et un domaine d'oligomérisation, caractérisé en ce que les domaines de liaison à l'ADN et d'adressage au noyau sont constitués par les acides aminés 75 à 336 de la protéine p53 sauvage humaine (SEQ ID n° 5).
26. Protéine chimère selon la revendication 24 ou 25 caractérisée en ce que le résidu arginine en position 182 de la protéine p53 est remplacé par une histidine.
27. Protéine chimère selon l'une des revendications 24 à 26 caractérisée en ce que le domaine transactivateur est constitué par le domaine transactivateur de VP16.
28. Protéine chimère selon l'une des revendications 24 à 27 caractérisée en ce que le domaine transactivateur est constitué par un domaine protéique capable de lier sélectivement un transactivateur ou un complexe transactivateur présent dans une cellule transformée.
29. Protéine chimère selon l'une des revendications 24 à 28 caractérisée en ce que le domaine d'oligomérisation est constitué par un leucine zipper artificiel.
30. Composé V-325 de séquence SEQ ID n° 25 et son variant V-325H comportant une histidine en position 182 de la p53.
31. Composé V-336 de séquence SEQ ID n° 26 et son variant V-336H comportant une histidine en position 182 de la p53.
32. Composé V-367 de séquence SEQ ID n° 27 et son variant V-367H comportant une histidine en position 182 de la p53.
33. Composé V-AS de séquence SEQ ID n° 28 et son variant V-ASH comportant une histidine en position 182 de la p53.
34. Composé V-393 de séquence SEQ ID n° 29 et son variant V-393H comportant une histidine en position 182 de la p53.
35. Composé V-343 de séquence SEQ ID n° 30et son variant V-343H comportant une histidine en position 182 de la p53.
36. Composé S-325 de séquence SEQ ID n° 31 et son variant S-325H comportant une histidine en position 182 de la p53.
37. Composé 393-325 de séquence SEQ ID n° 32 et son variant 393-325H comportant une histidine en position 182 de ia p53.
38. Composé 360-325 de séquence SEQ ID n° 33 et son variant 360-325H comportant une histidine en position 182 de la p53.
39. Composé 360h-325 de séquence SEQ ID n° 34 et son variant 360h-325H comportant une histidine en position 182 de la p53.
40. Acide nucléique codant pour un variant ou une protéine chimère selon l'une des revendications 1 à 39.
41. Acide nucléique selon la revendication 40 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un ADNc, d'un ARN, d'un acide synthétique ou semi-synthétique.
42. Acide nucléique selon la revendication 40 caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les acides nucléiques de séquence SEQ ID n° 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 32, 33 et 34
43. Cassette d'expression comprenant un acide nucléique selon la revendication 40, un promoteur permettant son expression et un signal de terminaison de la transcription.
44. Vecteur comprenant un acide nucléique selon la revendication 40 ou une cassette selon la revendication 43.
45. Vecteur selon selon la revendication 44 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur viral.
46. Vecteur selon selon la revendication 45 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un adénovirus recombinant défectif.
47. Vecteur selon selon la revendication 45 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un rétrovirus recombinant défectif.
48. Vecteur selon selon la revendication 45 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un AAV recombinant défectif.
49. Vecteur selon selon la revendication 45 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un HSV recombinant défectif.
50. Vecteur selon selon la revendication 44 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur chimique ou biochimique.
51 Composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique et ou un vecteur selon l'une des revendications 35 à 50.
52. Composition pharmaceutique comprenant un variant ou une protéine chimère selon l'une des revendications 1 à 39.
53. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 51 ou 52 pour le traitement des désordres hyperprolifératifs.
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