EP0767840A2 - Method for introducing foreign matter into higher eukaryotic cells - Google Patents

Method for introducing foreign matter into higher eukaryotic cells

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EP0767840A2
EP0767840A2 EP95920887A EP95920887A EP0767840A2 EP 0767840 A2 EP0767840 A2 EP 0767840A2 EP 95920887 A EP95920887 A EP 95920887A EP 95920887 A EP95920887 A EP 95920887A EP 0767840 A2 EP0767840 A2 EP 0767840A2
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EP
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dna
cells
cell
gene
adenovirus
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP95920887A
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German (de)
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Matthew Cotten
Adam Baker
Susanna Chiocca
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Boehringer Ingelheim International GmbH
Original Assignee
Boehringer Ingelheim International GmbH
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    • C12N2710/10011—Adenoviridae
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    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a
  • Standard methods for transfecting cells include Calcium phosphate (for in vitro applications), cationic lipids (Feigner et al., 1993) or liposomes.
  • Vector systems for the transfer of genes into the cell (Wilson et al., 1990; Kasid et al., 1990, WO 93/03769).
  • Adenoviruses or fusogenic peptides are used to increase the efficiency of the gene transfer by breaking down the DNA complexes internalized into the cell in the
  • Lysosomes are avoided (Curiel et al., 1991; Curiel et al., 1992a; Zatloukal et al., 1992; Cotten et al., 1992; Wagner et al., 1992; Curiel et al., 1992b;
  • Adenovirus-polylysine conjugates can be conjugated with transferrin-polylysine conjugates with DNA
  • Adenovirus mutants suggest that host responses are very early, possibly even before viral gene expression.
  • One component of this host response is one
  • interferon responsive genes genes that respond to interferon
  • ISGF3 interferon responsive transcription factor
  • Binding sites are located upstream of a series of genes responsive to interferon.
  • One of the activated genes is the protein kinase p68, which is activated by double-stranded RNA.
  • p68 is synthesized in an inactive form and is autocatalytic in the presence of dsRNA
  • NF-KB has also been reported to be activated by dsRNA
  • p68 may directly phosphorylate IKB and activate NF- ⁇ B.
  • the type C adenoviruses have two strong mechanisms to address this translation arrest by the host
  • the Ela gene products can directly interfere with the activation of ISGF3 (Gutch and Reich, 1991; Ackrill et al., 1991).
  • a second, more direct-acting mechanism uses the VA1 genes.
  • the gene product forms a stable secondary structure which can bind to the p68 kinase without activating the kinase and which can prevent binding and activation by the actual activators (Manche et al., 1992;
  • Another inflammatory reaction mechanism as a result of the entry of virus is likely to be the activation of the inflammatory transcription factor NF-IL-6 and the secretion of the inflammatory cytokine IL-6 (Sehgal et al., 1988; Kishimoto et al., 1992).
  • This factor in turn, often in conjunction with NF- ⁇ B, activates the IL-6 gene itself as well as a number of other inflammatory response genes such as TNF and IL-1.
  • IRF 1 Interferon Response Factor 1
  • Adenovirus ensures the triggering of the virus gene expression cascade.
  • Another line of defense of the host cell is the apoptotic response. It has long been known that mutations that map in the EIB 19K region for the deg phenotype, an enhanced cytopathic effect that is accompanied by degradation of the host's chromosomal DNA (D'Halluin et al., 1979; Ezoe et al., 1981; Lai Fatt and Mak, 1982; Pilder et al., 1984; Subramanian et al., 1984; Takemori et al., 1984; White et al., 1984). Younger ones
  • Virus infection can be (Levine et al., 1993): In the absence of Bcl-2, the cell undergoes apoptosis, which limits virus production to a short, acute phase. Chronic virus production takes place in the presence of Bei-2 expression because the apoptotic response to the acute phase infection is absent. Anti-apoptotic activities were also undertaken in the Epstein-Barr virus (the BHER1 gene; Pearson et al.,, 1987), in the baculovirus (the p35 gene; Sugimoto et al., 1994) and in the African swine fever virus (the LMW5-HL gene; Neilan et al ., 1993). This indicates that the apoptotic response to the virus infection occurs in many cases and virus strategies have been developed to block this response.
  • the viral capsid acts only as a reagent that breaks the endosomes, which is a function of the surface proteins of the viral capsid. Inactivation methods have been developed which
  • LPS lipopolysaccharide
  • the object of the present invention was to elucidate the mechanisms involved in the
  • the present invention relates to a method for treating higher eukaryotic cells
  • a) introduces one or more nucleic acid molecules, in particular DNA molecules, into the cells, the expression products of which by introducing the
  • Block at least partially apoptosis of the host cell triggered by foreign material, and / or that b) at least partially inhibit the inflammatory response of the cells by
  • the cells are treated externally with one or more anti-inflammatory substance (s) and / or
  • DNA molecules encoding nucleic acid, especially DNA molecules.
  • the DNA molecules defined in a) are referred to below as “anti-apoptosis genes” or as “DNA molecules with anti-apoptosis activity”.
  • the cells in addition to components a) and optionally b) ii)
  • apoptosis encompasses all toxic effects which are attributable to a) direct activation of the apoptotic response; b) activation of reactive oxygen metabolites which directly or indirectly induce apoptosis; c) Activation of the secretion of TNF, IL-6 or another cytokine, which the
  • Adenovirus that is introduced into the cell. This
  • Toxicity effects occur are applied, in particular to gene transfer methods, e.g. when using recombinant adenovirus vectors.
  • gene transfer methods are used in vitro and in gene therapy both in vivo and ex vivo, in particular in fibroblasts, hematopoietic cells, endothelial cells or lung epithelial cells.
  • the use of the method according to the invention can also include all applications in the treatment of eukaryotic cells in which one
  • the transplanting cells can prevent apoptosis.
  • the anti-apoptosis gene is the human Bcl-2 gene (Seto et al., 1988).
  • the anti-apoptosis gene is the EIB 19K gene of adenovirus type 2 or 5 (White and Cipriani, 1990).
  • Anti-apoptosis genes suitable for the invention are the BHRF1 gene of the Epstein-Barr virus (Pearson et al., 1987), the baculovirus genes p35 (Sugimoto et al., 1994) and iap (Clem and Miller, 1994), the LMW5- HL gene from Epstein-Barr virus (Pearson et al., 1987), the baculovirus genes p35 (Sugimoto et al., 1994) and iap (Clem and Miller, 1994), the LMW5- HL gene from Epstein-Barr virus (Pearson et al., 1987), the baculovirus genes p35 (Sugimoto et al., 1994) and iap (Clem and Miller, 1994), the LMW5- HL gene from Epstein-Barr virus (Pearson et al., 1987), the baculovirus genes p35 (Sugimoto et al., 1994) and ia
  • African swine fever virus (Neilan et al., 1993) and the ced-9 gene from Caenorhabditis elegans (Sugimoto et al .; 1994).
  • proteases involved proteins similar to Bei-2 and Bei-2 are believed to block activation of the proteases designated ICE or ICE-like. Since these protease (s) obviously have a crucial function for apoptosis, their blocking also plays a crucial role.
  • a component which acts further upstream in the apoptosis signal transmission path is, for example, p53, the activation of which triggers one of the signal transmission paths which lead to apoptosis.
  • genes that inactivate p53 are EIB 55K from adenovirus type 2 or type 5 (White and Cipriani, 1989) or El functions from other strains of adenovirus, e.g. Adenovirus 12 or from CELO virus (Chick Embryo Lethal Orphan Virus), the E6 gene from human
  • Papillomavirus-16 (Levine, 1990), SV 40's large T antigen (McCarthy et al., 1994), the mdm-2 gene
  • Mammalian cells e.g. Fibroblasts, with a
  • Reporter plasmid e.g. a luciferase plasmid to transfect and monitor expression of the reporter gene over a period of time.
  • test DNA e.g. genomic virus DNA fragments or DNA molecules from a cDNA library
  • suitable expression vectors e.g.
  • the cells are optionally additionally transfected with a DNA sequence which is known to be the
  • the anti-apoptotic effect of a test DNA sequence is shown by the fact that when the cells are co-transfected with it Sequence the expression of the reporter gene is higher than when transfecting the cells with the reporter gene alone.
  • the effect of the test gene can be compared with that of the known gene.
  • an anti-apoptotic DNA molecule of the chicken adenovirus type I was first used in the context of the present invention
  • CELO Chicken Embryo Lethal Orphan
  • This DNA molecule lies on a Smal / Hindlll fragment which is located in the CELO virus genome in the range between approximately 84.3 to approximately 88.7 mapping units.
  • the nucleotide sequence shown in FIG. 14 was determined from the Smal / HindiII fragment isolated in the context of the present invention (SEQ ID NO: 1).
  • the Smal / HindiII fragment was obtained from an EcoRI fragment called 9R1, which ranged from 81.2 to 92.7 mapping units
  • all of the CELO virus fragments obtained which have the anti-apoptotic effect such as e.g. the
  • the EcoRI fragment 9R1 of which the Smal / HindIII fragment is a partial sequence, can be used as a whole.
  • a further possibility consists in the HindiII fragment of the located between mapping units 77.8 and 88.7 on the CELO virus genome
  • Fragments 9R1 and 7H3 have an 80% overlap area that
  • the size of the DNA molecule in the area or in the vicinity of the specified fragment areas is not critical.
  • the DNA which essentially consists only of the open reading frame, is preferably used.
  • This DNA can optionally be shortened to the sections responsible for the anti-apoptotic function, or mutants can be constructed with a view to enhancing the activity.
  • the selection of suitable mutants can be carried out by testing correspondingly mutated DNA sequences, as described in the examples, for their ability to increase gene expression.
  • Reading frame is by screening the mutated DNA sections for anti-apoptotic effects. A number of deletion mutants were constructed for this. It turned out that all those constructions by which
  • GAM-1 the amino acid sequence is given in SEQ ID NO: 2 also showed a series of seven leucine residues. This motif is known to fold into a structure (called “leucine zipper”) that is often a site of protein-protein interactions (Busch and Sassone-Corsi, 1990; Lumb and Kim, 1995) assumed that the
  • Leucine-zipper dimersization domain works as an alpha-helical structure, the introduction of amino acids such as proline, which destroy alpha-helices, can thus impair zipper dimerization. It was
  • GAM-1 therefore either functions as a homodimer or there are other binding partners for GAM-1.
  • GAM-1 has no homologies with any of the known anti-apoptical proteins, including members of the Bcl-2 family, adenovirus 5 EIB 19K, the Bax family, the baculovirus IAP family, the
  • Nematode protein Ced-3 (Furthermore, the complete sequence of the CELO virus genome showed that the CELO virus has no genes that are homologous to the Ad2 / 5 EIB 19K region. It could therefore be that the CELO virus has no EIB 19K region and hence the GAM-1 gene function used as an anti-apoptotic gene.)
  • the invention thus relates to a DNA molecule containing the ones in FIG. 14 or SEQ ID NO: 1 shown nucleotide sequence or a partial sequence thereof coding for a functional gene product with anti-apoptotic effect.
  • a DNA molecule with the sequence of the open one shown in FIG. 14 or SEQ ID N0: 1 is preferred
  • Reading frame including degenerate variants of it, or mutants for a functional
  • the invention relates to those derived from the DNA molecules according to the invention
  • Polypeptides in particular the protein of the designation GAM-1 (SEQ ID NO: 2) encoded by the open reading frame, and functional derivatives thereof.
  • Mechanism may be one
  • Fibroblasts were transfected on the one hand with a luciferase reporter gene and on the other hand with test plasmids which contained different fragments of GAM-1. Two days later, the cells were trypsinized and a defined number of cells were plated on polyHEMA-coated cell culture plates. Seven days later, the adherent and non-adherent cells were harvested and examined for luciferase activity. It was found that the
  • Plasmid encoding EIB 19 K, Bcl-2 or GAM-1 transfected Two days after the transfection, a defined number of cells were placed on a series of cell culture plates with a PolyHEMA coating
  • Bei-2 should have a stronger effect than EIB 19 K or GAM-1; the one obtained without PolyHEMA
  • Luciferase expression remained unchanged at Bei-2 even at the highest PolyHEMA concentrations.
  • Identified DNA molecules coding for GAM-1 can also be mutated if the mutations either do not result in a change in the amino acid sequence or the changes do not affect any amino acids which are essential for the function.
  • Transfer infection is based on the anti-apoptosis gene simply in the form of a plasmid together with the plasmid containing the DNA sequence, the expression of which in the cell is said to achieve the desired effect (hereinafter referred to as "effective DNA”), for example a
  • Adenovirus polylysine The molar ratio of active gene and anti-apoptosis gene can be determined using
  • Titration can be determined by measuring the expression of the active gene at different proportions of the anti-apoptosis gene under otherwise identical conditions over a longer period of time. In the context of the present invention, a ratio of 5: 1 was chosen, which has proven to be favorable. Since the gene products of some anti-apoptosis genes show a very strong effect, smaller proportions can also be used. An upper limit due to any toxicity can also be determined by titration.
  • the molar ratio of the two genes is 1: 1 if they are each present on the plasmid in a copy .
  • transcription factors namely NF-IL-6 and NF- ⁇ B. This created the prerequisite for activating these transcription factors in response to the occurrence of adenovirus or
  • Substances come, for example, treatment with retinoic acid ("Retinoic acid”) or other retinoids, which have been reported to inhibit IL-1-induced IL-6 production by lung fibroblasts (Gross et al., 1993; Zitnik et al., 1994).
  • Retinoic acid retinoic acid
  • other retinoids which have been reported to inhibit IL-1-induced IL-6 production by lung fibroblasts (Gross et al., 1993; Zitnik et al., 1994).
  • Mode of action of this class of substances is likely to be that they control the concentration of the IL-6 mRNA.
  • Another class of substances for inhibiting the inflammatory host response are:
  • Glucocorticoids that have been shown to inhibit the production of IL-6 and / or IL-8 in response to inflammatory stimuli (Ray et al., 1990; Barber et al., 1993; Wertheim et al., 1993).
  • Dexamethasone acts on the activation of the enzyme
  • This enzyme is used in response to numerous other organs.
  • Another group of anti-inflammatory substances that can be used in the context of the present invention are inhibitors of arachidonic acid metabolism.
  • Arachidonic acid is metabolized to proinflammatory prostaglandins and thromboxanes via the cyclooxygenase pathway. This path, which is shown schematically in Fig. 12, can be done by the
  • Cyclooxygenase inhibitors aspirin acetylsalicylic acid
  • Ibuprofen acetylsalicylic acid
  • indomethacin Flower et al., 1985
  • Arachidonic acid runs through the 5-lipoxygenase processing, whereby leukotrienes are formed.
  • 5-Lipoxygenase can be obtained by NDGA (Nordihydroguaiaretic Acid; Burkart and Kolb, 1993; Cifone et al., 1993;
  • the cells can also be treated with anti-inflammatory polypeptides such as IL-10 or TGF- ⁇ .
  • anti-inflammatory polypeptides such as IL-10 or TGF- ⁇ .
  • the anti-inflammatory substance is expediently added to the medium.
  • step b) ii) the anti-inflammatory substance as such or in a preferred one
  • Embodiment in the form of the DNA coding therefor introduced into the cell e.g. in the form of a plasmid which contains a sequence coding for an anti-inflammatory protein such as IL-10 (Moore et al., 1990) or TGF- ⁇ (Massague et al., 1987).
  • an anti-inflammatory protein such as IL-10 (Moore et al., 1990) or TGF- ⁇ (Massague et al., 1987).
  • a preferred anti-inflammatory substance used in the context of the present invention is VA1.
  • Adenovirus VA1-RNA is a small RNA molecule synthesized by RNA polymerase III, which is necessary for the efficient expression of the virus genome
  • Transfection can be used to modulate the activation of NF- ⁇ B that is triggered by the transfection process.
  • VA1 expression inhibits the activation of inflammatory cytokines may be due to a phenomenon that is independent of the increase in the stability of the mRNA or its amount, as reported for the calcium phosphate method. Inhibition of p68 kinase activation may play a key role in this phenomenon.
  • the VA1 can be imported into the cell as an RNA molecule or, in a preferred embodiment, in the form of the VA1 DNA.
  • Transfection complexes are integrated. It is also possible to combine two of the three sequences, or all three, on a single plasmid.
  • a DNA containing the factor VIII sequence as therapeutically effective DNA an anti-apoptosis gene such as in-2 or EIB 19K and the VA1 DNA.
  • genes can be used which have an effect corresponding to VA1, e.g. EBER of the Epstein Barr virus (Clarke et al., 1990; Clarke et al., 1991) or the TAR-RNA from the HIV virus (Gunnery et al., 1990).
  • the invention relates to a transfection complex containing a nucleic acid molecule to be expressed in the cell, which is complexed with a polycation, optionally conjugated with a ligand for the target cell, and
  • Adenovirus or an adenovirus-polycation conjugate wherein the complex also contains a DNA molecule with anti-apoptosis activity and / or a DNA molecule coding for a substance with anti-inflammatory activity.
  • the invention also relates to a
  • compositions containing such a transfection complex in which the nucleic acid molecule to be expressed in the cell is a therapeutically or gene-therapeutically effective DNA molecule.
  • the pharmaceutical preparation contains the usual additives, such as nutrients, etc., for use on cells.
  • Fig. 1 Time course of activation of NF-IL-6 and
  • Fig. 2 Blocking the activation of NF-KB by
  • Fig. 3 Blocking the activation of the IL-6 promoter by expression of VA1
  • FIG. 6 Influence of the expression of Bcl-2, EIB 19K, EIA and EIA 13S on the long-term gene expression.
  • FIG. 7 Influence of the transfection on the morphology of fibroblasts
  • Fig. 8 Inhibition of adenovirus or LPS
  • Fig. 11 Effect of dexamethasone, ibuprofen or
  • Fig. 12 Comparison of the enhancement of gene expression by different inhibitors of
  • Fig. 13 Restriction map of the CELO virus genome
  • Fig. 16 Anti-apoptotic effect of various CELO virus fragments
  • Fig. 17 Open reading frame of the EcoRI fragment from
  • Fig. 18 Assignment of the anti-apoptotic effect to the correct reading frame. Comparison of different
  • Fig. 19 Influence of the mutation of the leucine zipper on the anti-apoptotic effect
  • Fig. 20 Effect of the CELO virus gene on the
  • Fig. 21 Comparison of the effect of different anti-apoptotic genes on the
  • Fig. 22 Effect of combinations of different genes with anti-apoptotic effects
  • adenovirus type 5 (nucleotide 1-5778) was obtained by digesting the adenovirus dll014 DNA (Bridge and Ketner, 1989) with Xhol plus Asel. This fragment was made with Klenow Polymerase treated and in the Smal site of the
  • Plasmids pAALM obtained from pSP64 (Boehringer
  • the VA1 expression plasmid pXVAH was constructed by inserting the 5324 bp HindII fragment (nucleotide 6241-11656) of the adenovirus DNA into the HindIII site of pAALM to obtain pHVAH. pHVAH was then cleaved with XBal and religated to obtain pXVAH (this made a large piece from the XBal site in pAALM to the XBal site
  • the clone pXVAH obtained contained the adenovirus sequence of nucleotide 10589-11565. ii) Luciferase reporter plasmid pNF- ⁇ B-Luc
  • the plasmid pNF- ⁇ B-Luc responsive to NF- ⁇ B was developed as a derivative of that described by Boehmelt et al., 1992,
  • plasmid pTK3kbB described constructed. To do this, pTK3kbB was cut with Xhol and Ncol to remove most of the sequence coding for CAT with
  • pCMVE1A The expression plasmids named pCMVE1A, pCMVE1B and pCMV19K were from White and
  • the expression plasmid designated pCMV-Bcl-2, was prepared by the human Bcl-2 cDNA, flanked by two EcoRI sites (Seto et al., 1988), downstream from a CMV immediate early promoter in the
  • Plasmid DNA pCMVL The construction of the plasmid is described in WO 93/07283. viii) plasmid DNA pCMVßgal
  • the E4-deficient adenovirus 5, dll014 (Bridge and Ketner, 1989) was grown in the complementing cell line W162 (Weinberg and Ketner, 1983). Pellets from infected cells became 2 ml / 2 x 10 7 cells in 20 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM PMSF
  • the opalescent virus bands (either 1.31 g / cm 3 immature or 1.34 g / cm 3 mature) were harvested. The biotinylation of the obtained
  • Glycerin was carried out as described in WO 93/07283 or by Wagner et al., 1992, and Cotten et al., 1992, described.
  • the virus samples were quantitatively determined via the protein concentration (Biorad Bradford assay with BSA as standard), the
  • Samples of biotinylated, psoralen / UV inactivated adenovirus d11014 (8 ⁇ l, 1 ⁇ 10 12 particles / ml) were diluted in 150 ⁇ l HBS and mixed with 1 ⁇ g StpL in 150 ⁇ g HBS for 30 min at room temperature. Aliquots of 6 ⁇ g plasmid DNA (in the case of mixtures of pCMVL-DNA and another plasmid the ratio was 5: 1) were diluted in 100 ⁇ l HBS and then with the
  • the human lung carcinoma cell line A549 (ATCC CCL 185) was used for the production of the clonal cell lines containing the reporter plasmid pNF- ⁇ B-Luc or pIL-6-Luc.
  • the plasmids were co-transfected with the neomycin phosphotransferase expression plasmid called pMuatt (a pUCl9 plasmid containing the TKneo sequence; Grosveld et al., 1982) using the Transfeetam method (Behr et al., 1989) selected for cells that are resistant to 400 ⁇ g / ml G418 (Sigma). Clonal derivatives that expressed luciferase after induction by PMA were identified and expanded.
  • A549 cells containing the expression plasmid for Bcl-2 and EIB 19K were obtained in a similar manner, with the difference that the
  • Neomycin phosphotransferase plasmid pSVneo (Clontech) instead of pMuatt and that pools of G418-resistant clones were used instead of pure populations.
  • pSVneo Neomycin phosphotransferase plasmid pSVneo
  • Glutamine and antibiotics were added and the culture placed in a 37oC incubator. After 10 days it was Medium replaced by DMEM containing 10% FCS. Then the medium was continued twice a week
  • An alternative, preferred method was to transfer the pieces of skin into fresh medium after comminution and to wash them with medium once or twice as required.
  • 5 to 10 pieces of tissue were placed in a T25 tissue culture bottle, the surface of which had been wetted with DMEM plus 10% FCS, and distributed evenly, whereupon the bottle was turned over. This caused the biopsies to hang ("hanging drop configuration"; this method was described by Jones, 1989).
  • the bottles were turned over again and filled with 1 to 2 ml of medium. Fixed biopsies were filled up to 5 ml after 24 h; otherwise the process was repeated.
  • the first fibroblasts grew out after 6 to 10 days, from this point on the medium was changed once a week. Once the cells were confluent, they were placed in a T75 bottle
  • the plates were coated with PolyHEMA (poly (2-hydroxyethyl methacrylate) by adding 200 ⁇ l of a PolyHEMA solution (Sigma, Cat. No. P-3932; 10 mg / ml in 95%
  • Culture plates used were prepared by a method similar to that described by Folkman and Moscona, 1978. For this purpose, normal tissue culture plates (24-well plates) with 200 ⁇ l per well were used
  • the IL-6 ELISA was obtained from R&D Systems, the IL-8 ELISA from Bender MedSystems. k) LPS preparation
  • the preparation was dissolved in 10 mg / ml in LPS-free water and sonicated in LPS-free water for 5 minutes before making serial dilutions (SONOREX bath,
  • Lung epithelial carcinoma cell line A549 generated which as a reporter gene construct pNF-KB-luc or pIL-6-luc
  • Adenovirus / pL / DNA as a stimulus were the A549 NF- ⁇ B cells with 20 ⁇ l transfection complex (4 ⁇ 10 8)
  • Virus particles corresponding to 10 4 viruses / cell and the A549 IL-6 cells with 200 ⁇ l transfection complex treated, which is also 10 4 viruses per cell
  • the time course of the induction is shown in FIG. 1: The IL-6 promoter is fully activated after 12 h and then quickly returns to its initial level while the NF- ⁇ B promoter is activated and
  • Adenovirus / polylysine / DNA is triggered blocked. For this, 4 x 10 4 A549 NF- ⁇ B test cells per
  • Adenovirus VA1 gene (caused by incorporation of the DNA coding for VA1 in the
  • Transfection complex 500 ⁇ l contained 6 ⁇ g pXVAH activation to approx. 1.5 times the basic value (FIG. 2; complex means pSP65, complex / EIB means pCMVE1B, complex / VA1 means pXVAH).
  • the promoter for the human IL-6 gene contains
  • NF-IL-6-luc Contained luciferase gene under the control of the IL-6 promoter (NF-IL-6-luc) (each sample was in a well of a 6-well plate, each containing 4 ⁇ 10 5 cells. Duplicate determinations were made
  • the cells were contained in 200 ⁇ l with PMA (phorbol myristyl acetate; 10 -8 M; sample 2), 10 4 adenovirus particles
  • Transferrin-polylysine / DNA complex which contained pSP65 as DNA (sample 3) or with 10 4 virus particles,
  • Luciferase activity measured as a measure of IL-6 activation. The result of the tests is shown in Fig. 3.
  • Psoralen / UV inactivated adenovirus d11014 particles treated per cell incorporated in StpL / TfpL / DNA transfection complexes (this corresponded to 2 ⁇ l or 6 ⁇ l transfection complex, the DNA used being either an empty plasmid (pSP65; Boehringer Mannheim) or the plasmid with the designation pXVAH, which is the adenovirus VA1
  • the cells were washed with the transfection complexes in 2% for 4 h
  • Fibroblasts were applied (50 ⁇ l of complex, corresponding to 2.5 ⁇ 10 4 virus particles per cell, were applied to 2 ⁇ 10 4 cells per well of a 24-well plate, whereby triple determinations were carried out.
  • “minus” means pSP65; Test DNA is labeled).
  • Luciferase activity was 48 to 72 h after
  • the E1 region contains two main gene functions, EIA and E1B.
  • the E1A products have the effect of separating E2F from the Rb protein, on the other hand they modulate the transcription activity of many cellular and adenovirus promoters
  • the main transcriptional transactivator function is contained in the 13S gene product.
  • the 1B gene codes for two main functions: the EIB 55K gene product binds p53 and changes its function.
  • the 19K E1B gene product is believed to act below p53 to block the apoptotic response.)
  • the co-expression of plasmids which carried either the complete EIA or the complete E1B region under the control of the CMV promoter was tested.
  • the E1B plasmid showed a 7-fold amplification of the
  • the 19K E1B gene also caused an increase in gene expression (8.6-fold).
  • the E1B 19K protein has recently been shown to be a potent analog of the anti-apoptotic gene Bcl-2 (Rao et al., 1992). Bcl-2 was therefore also tested and found to be a
  • Gene expression is due to a non-specific toxicity caused by the high virus / cell ratio (the experiments were carried out with approximately 50,000 virus particles per cell).
  • transfection complexes containing pCMVL plus the plasmid pSP65, or the plasmids which contained the sequence for Bcl-2, E1A or E1B 19K (the amounts of reporter plasmid pCMVL and respective
  • Test plasmid were, as in the previous example, 5 ⁇ g and 1 ⁇ g, for virus particle numbers of 3 ⁇ 10 4 (FIG. 5A), 10 4 (FIG. 5B) or 3 ⁇ 10 3 (FIG. 5C) per cell on primary Fibroblasts applied and the
  • Luciferase activity measured over time. The transfections were carried out as in the previous examples described, the cells 6, 18 and 60 ul transfection complex per
  • Enhancement in 19K or Bcl-2-treated cells was found, regardless of the virus dose used.
  • Transfection complexes containing 5 ⁇ g pCMVL plus 1 ⁇ g pSP65 or 1 ⁇ g of a plasmid containing E1A, E1A 13S, E1B 19K or Bcl-2 were used. (In these experiments, the cells in one well received 18 ⁇ l transfection complex.) From day 10, the culture medium was replaced with fresh medium daily; This measure was based on the consideration that changing the medium would lower the concentrations of the toxins. The result of these tests is shown in FIG. 6: It showed yourself that the chosen approach is the
  • Reporter plasmid pCMVßgal plus pSP65 or plus pCMV19K transfected (2 x 10 4 fibroblasts per well of a 24-well plate received 18 ⁇ l transfection complex; 500 ⁇ l complex contained either 4 ⁇ g pCMVL plus 2 ⁇ g pSP65 or 4 ⁇ g pCMVL plus 2 ⁇ g pCMV19K. 48 hours after the transfection, the cells were stained with X-gal, as described in WO 93/07283, to determine the morphology of the cells that successfully transfected the DNA
  • Apoptosis trigger LPS with the anti-apoptosis gene Bcl-2 would block cell death. It was found that there was no reduction in toxicity
  • A549 cells were used as control cells as well as A549 19K cells and A549-Bcl-2 cells
  • control cells which were exposed to the adenovirus / pL / DNA complexes were sacrificed as a function of increasing LPS content in the sample (cf. sample 1: no LPS, with samples 2 and 3: 10 and 100 ng LPS / 6 ⁇ g DNA).
  • sample 1 no LPS
  • samples 2 and 3 10 and 100 ng LPS / 6 ⁇ g DNA.
  • samples 2 and 3 10 and 100 ng LPS / 6 ⁇ g DNA.
  • samples expressing either 19K or Bei-2 there was a decrease in toxicity to 39% (sample 2) or 77 or 60% (samples 5 or 8; 19K or Bcl-2).
  • Populations of 19K or Bcl-2 expressing cells are expected to have a higher protective effect (up to 100%).
  • pCMVL / pSP65 or pCMVL / pCMV19K was used in a ratio of 5: 1 each. 4 hours after the transfection, the samples were placed in fresh 10% FCS / DMEM medium or transferred to 10% FCS / DMEM medium containing 3 ⁇ M dexamethasone (Sigma). 24 hours after the transfection, the samples (double determination) were harvested and the
  • Luciferase activity determined. The presence of dexamethasone in the absence of pCMV19K was shown to increase luciferase expression by a factor of 1.65. In the presence of both dexamethasone and pCMV19K, the 5,8,11-eicosatriynonic acid enhancement was 2.71-fold (Table 3).
  • Adenovirus / polylysine / DNA complexes that the
  • luciferase genes transfected with and without co-transfection of the E1B 19K gene, and luciferase activity was monitored over time.
  • the DNA contained 5.5 ⁇ g pCMVL and 0.5 ⁇ g pSP65 (control) or pCMV19K). 2 h after the transfection, the cells were placed in standard medium (DMEM plus 10% FCS)
  • Dexamethasone which indicates that the inhibition of cyclooxygenase is not sufficient to prevent the decline in gene expression. Both substances showed a synergistic effect with the EIB 19K gene in increasing gene expression.
  • CELO Chicken Adenovirus CELO (Chicken Embryo Lethal Orphan) a) Isolation and cloning of CELO virus genome fragments
  • the CELO virus adenovirus type 1 (ATCC VR-432) was used as starting material.
  • the virus was purified after growth in chicken embryos as described by Cotten et al., 1993.
  • the DNA was prepared from the virus by the proteinase K
  • the entire 42.8 kb CELO virus genome obtained was digested on the one hand with EcoRI and on the other hand with HindIII.
  • the mixture of fragments obtained was separated in a 0.8% agarose gel and purified on 3 mm Whatman paper and then on a Sephadex G-50 column.
  • the restriction map of CELO virus is shown in the upper part of Fig. 13; it is based on the
  • mapping units one
  • Mapping unit is 428 base pairs). The nomenclature of the expression clones and the position of fragments 7H3 (HindIII D fragment) and 9R1 (EcoRI D fragment) are also shown. These are fragments those that showed a positive effect in the gene transfer experiments (cf. the experiments described in b).
  • the fragments obtained were cloned in the expression vector pX described by Superti-Furga et al., 1991, downstream of the CMV immediate early promoter, each fragment being isolated and characterized in both orientations. b) testing of the isolated gene fragments for anti-apoptotic effects
  • Example 5 Transfection experiments were carried out as indicated in Example 5, the test plasmids containing the various CELO virus fragments shown in FIG. 16.
  • the amount of transfection complexes was 15 ⁇ l per 20,000 cells containing 5 ⁇ g luciferase reporter plasmid and 1 ⁇ g of the respective test plasmid (in most cases, clones were containing the fragment in both
  • Expression of the control. 16 shows the relative expression (average value of 3 samples) of the test samples (5 ⁇ g luciferase reporter plasmid and 1 ⁇ g Plasmid pXCELO) against the control samples (5 ⁇ g luciferase reporter plasmid pCMVL and 1 ⁇ g empty vector) on day 14.
  • a protective effect three to eightfold increase in luciferase expression could only be observed with the plasmids which contained the 7H3 and 9R1 fragments ; these two fragments originate from the same region of the CELO virus genome and have an overlapping region of approximately 80% in their sequence (see that shown in FIG. 13)
  • GAM-1 is underlined, encoding, beginning with nucleotide 577, for a protein with 283 amino acids.
  • the corresponding gene product was named GAM-1.
  • Gene expression is not a function of the VA gene. c) Time course of gene expression in the presence of the
  • transfections with the 9R1 fragment, the 7H3 fragment and the Smal / HindIII fragment of 9R1 were carried out and the luciferase expression was monitored over a longer period of time.
  • BssHII cuts above the open reading frame from which the activity was suspected. Cutting with BssHII, treatment with Klenow / T4 DNA polymerase to remove the overhanging nucleotides and religion
  • GAM-1 mutant # 6 L258P, L265P
  • luciferase reporter plasmid was, as in the previous examples, with a luciferase reporter plasmid and either with the empty vector pSP65 (control) or with the various test plasmids (pXCELO), which each contained the fragment shown in FIG. 20 (5 ⁇ g pCMVL plus 1 ⁇ g of the respective test plasmid) transfected. 2 days after the transfection, the cells were trypsinized, counted, and a defined number of cells (20,000 per well) were (3-fold) in 24-well plates which had been coated with PolyHEMA according to Method A. 7 days after plating, the luciferase activity of the entire cell population (non-adherent plus adherent cells) was measured. Each of the values shown in Fig. 20 represents the
  • Primary human fibroblasts were, as in the previous examples, with a luciferase reporter plasmid and either with the empty vector pSP65 (control) or with the various test plasmids shown in FIG. 22 (5 ⁇ g pCMVL plus 1 ⁇ g of the respective test plasmid in samples 1- 4, in samples 5 and 6 the mixture contained 0.5 .mu.g each of the
  • Test plasmids transfected. 22 is the
  • Luciferase expression was shown 22 days after transfection, with each value averaging 3

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Abstract

The toxicity problems arising when foreign matter is introduced into higher eukaryotic cells, especially with transfection with DNA, are obviated by expression in the cell of gene products that block the apoptosis induced by the transfection process and/or by treating the cells with anti-inflammatory substances. Preferred anti-apoptosis genes are Bcl-2, E1B 19K or an anti-apoptotic gene of the CELO avian adenovirus; used as preferred anti-inflammatory substance in the adenovirus VA1, which is introduced into the cell in the form of VA1 DNA. These measures help to achieve a long-lasting gene expression.

Description

Verfahren zum Einbringen von Fremdmaterial in höhere eukaryotische Zellen Process for introducing foreign material into higher eukaryotic cells
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein The present invention relates to a
Verfahren zum Behandeln von höheren eukaryotischen Zellen, insbesondere zum Einbringen von Fremdmaterial, wie DNA, in die Zellen. Process for treating higher eukaryotic cells, in particular for introducing foreign material, such as DNA, into the cells.
Bedarf an einem effizienten System für das Einführen von Fremdmaterial, insbesondere Nukleinsäure in lebende Zellen besteht vor allem im Rahmen der Gentherapie. Dabei werden Gene in Zellen eingeschleust, um in vivo die Synthese therapeutisch wirksamer Genprodukte zu erzielen. There is a need for an efficient system for the introduction of foreign material, in particular nucleic acid into living cells, especially in the context of gene therapy. Genes are introduced into cells to achieve the synthesis of therapeutically effective gene products in vivo.
Standardmethoden für die Transfektion von Zellen verwenden u.a. Calciumphosphat (für Anwendungen in vitro), kationische Lipide (Feigner et al., 1993) oder Liposomen. Standard methods for transfecting cells include Calcium phosphate (for in vitro applications), cationic lipids (Feigner et al., 1993) or liposomes.
Die bisher am weitesten fortgeschrittenen Technologien im Rahmen der Gentherapie benutzen rekombinante The most advanced gene therapy technologies to date use recombinant
Vektorsysteme (Retroviren oder Adenoviren) für den Transfer von Genen in die Zelle (Wilson et al., 1990; Kasid et al., 1990, WO 93/03769). Vector systems (retroviruses or adenoviruses) for the transfer of genes into the cell (Wilson et al., 1990; Kasid et al., 1990, WO 93/03769).
Alternativen Strategien für den Gentransfer liegen Mechanismen zugrunde, deren sich die Zelle für den Transport von Makromolekülen bedient. Ein Beispiel dafür ist der Import von Genen in die Zelle über den Weg der Rezeptor-vermittelten Endozytose (z.B. Wu und Wu, 1987, Wagner et al., 1990, und EP-AI 0388 758). Alternative strategies for gene transfer are based on mechanisms that the cell uses for the transport of macromolecules. An example of this is the import of genes into the cell via the pathway of receptor-mediated endocytosis (e.g. Wu and Wu, 1987, Wagner et al., 1990, and EP-AI 0388 758).
Übersichten über die Gentherapie im allgemeinen und über nicht-virale Gentransfermethoden im besonderen werden von Mulligan, 1993, bzw. von Cotten und Wagner, 1993, gegeben. Overviews of gene therapy in general and non-viral gene transfer methods in particular are given by Mulligan, 1993, and by Cotten and Wagner, 1993, respectively.
Für den Gentransfer mit DNA/Polykation-Komplexen mittels Rezeptor-vermittelter Endozytose wurde eine Verbesserung vorgeschlagen, die den Einsatz von An improvement has been proposed for gene transfer with DNA / polycation complexes by means of receptor-mediated endocytosis, which requires the use of
Komponenten aufgrund ihrer Fähigkeit vorsieht, den Inhalt von Endosomen freisetzen zu können, z.B. Provides components because of their ability to release the content of endosomes, e.g.
Adenoviren oder fusogene Peptide. Der Einsatz der endosomolytischen Komponenten bewirkt eine Steigerung der Effizienz des Gentransfers, indem der Abbau der in die Zelle internalisierten DNA-Komplexe in den Adenoviruses or fusogenic peptides. The use of the endosomolytic components increases the efficiency of the gene transfer by breaking down the DNA complexes internalized into the cell in the
Lysosomen vermieden wird (Curiel et al., 1991; Curiel et al., 1992a; Zatloukal et al., 1992; Cotten et al., 1992; Wagner et al., 1992; Curiel et al., 1992b; Lysosomes are avoided (Curiel et al., 1991; Curiel et al., 1992a; Zatloukal et al., 1992; Cotten et al., 1992; Wagner et al., 1992; Curiel et al., 1992b;
WO 93/07283). U.a. wurde vorgeschlagen, die Adenoviren durch Bindung an Polylysin zu modifizieren. Die WO 93/07283). Et al it has been proposed to modify the adenoviruses by binding them to polylysine. The
Adenovirus-Polylysin-Konjugate können zusammen mit Konjugaten aus Transferrin-Polylysin mit DNA Adenovirus-polylysine conjugates can be conjugated with transferrin-polylysine conjugates with DNA
komplexiert werden, wobei ternäre Transferrin- Polylysin/Adenovirus-Polylysin/DNA-Komplexe entstehen (Wagner et al., 1992). Die Komplexe binden an be complexed, whereby ternary transferrin-polylysine / adenovirus-polylysine / DNA complexes arise (Wagner et al., 1992). The complexes bind
Transferrin- und Adenovirusrezeptoren auf den Transferrin and adenovirus receptors on the
Zielzellen. Nach der Endozytose bewirkt das Adenovirus den Aufbruch von Endosomen, das hat die Freisetzung des Materials vom Endosom ins Zytoplasma zur Folge. Diese Technik, die auch als "TransferrInfektion" bezeichnet wird, weist gegenüber konventionellen viralen Techniken eine erhöhte Sicherheit auf (Cotten et al., 1992). Target cells. After endocytosis, the adenovirus breaks open endosomes, which results in the release of the material from the endosome into the cytoplasm. This technique, which is also referred to as "transfer infection", is more secure than conventional viral techniques (Cotten et al., 1992).
Mit dem Adenovirus-unterstützten Gentransfer auf der Grundlage der Rezeptor-vermittelten Endozytose wurden zwar transient hohe Expressionswerte erreicht, es ist jedoch bisher aufgrund toxischer Effekte in einigen Zelltypen nicht gelungen, eine Expression über einen längeren Zeitraum zu erhalten. Diese toxischen Effekte sind auf verschiedene Abwehrantworten der Wirtszelle, bald nach Eintritt des Virus in die Zelle, Transiently high expression values have been achieved with adenovirus-assisted gene transfer based on receptor-mediated endocytosis, but it has so far not been possible to obtain expression over a longer period of time due to toxic effects in some cell types. These toxic effects are on various host cell defense responses soon after the virus enters the cell,
zurückzuführen. Die Mechanismen, welche die Aktivierung dieser Antworten regeln, sind noch nicht aufgeklärt, Untersuchungen mit replikationsdefizienten attributed. The mechanisms that regulate the activation of these responses have not yet been elucidated, studies with replication-deficient
Adenovirusmutanten lassen vermuten, daß die Antworten des Wirts sehr früh stattfinden, möglicherweise sogar vor der Virusgenexpression. Adenovirus mutants suggest that host responses are very early, possibly even before viral gene expression.
Eine Komponente dieser Wirtsantwort ist eine One component of this host response is one
Aktivierung der "Interferon Responsive Genes" (Gene, die auf Interferon ansprechen), höchstwahrscheinlich durch Aktivierung von ISGF3, eines auf Interferon ansprechenden Transkriptionsfaktors, dessen Activation of the "interferon responsive genes" (genes that respond to interferon), most likely by activation of ISGF3, an interferon responsive transcription factor, the
Bindungsstellen sich stromaufwärts einer Reihe von auf Interferon ansprechenden Gene befinden. Eines der aktivierten Gene ist die Proteinkinase p68, welche durch doppelsträngige RNA aktiviert wird. p68 wird in einer inaktiven Form synthetisiert und unterliegt in Gegenwart von dsRNA einer autokatalytischen Binding sites are located upstream of a series of genes responsive to interferon. One of the activated genes is the protein kinase p68, which is activated by double-stranded RNA. p68 is synthesized in an inactive form and is autocatalytic in the presence of dsRNA
Phosphorylierung, welche die Kinase aktiviert, was zur Phosphorylierung und Inaktivierung des Translations- Initiationsfaktors eIF2a führt, wodurch die Initiierung der Proteintranslation blockiert wird. Außerdem wurde berichtet, daß NF-KB durch dsRNA aktiviert wird Phosphorylation, which activates the kinase, which leads to phosphorylation and inactivation of the translation initiation factor eIF2a, which blocks the initiation of protein translation. NF-KB has also been reported to be activated by dsRNA
(Visvanathan und Goodbourn, 1989), was darauf (Visvanathan and Goodbourn, 1989) what on it
hindeutet, daß p68 vielleicht direkt IKB phosphoryliert und NF-κB aktiviert. suggests that p68 may directly phosphorylate IKB and activate NF-κB.
Die Typ C-Adenoviren besitzen zwei starke Mechanismen, um diesen Translationsarrest durch den Wirt zu The type C adenoviruses have two strong mechanisms to address this translation arrest by the host
verhindern: prevent:
Die Ela-Genprodukte können die Aktivierung von ISGF3 direkt stören (Gutch und Reich, 1991; Ackrill et al., 1991). Ein zweiter, noch direkter wirkender Mechanismus benutzt die VA1-Gene. Das Genprodukt bildet eine stabile Sekundärstruktur, welche an die p68-Kinase binden kann, ohne die Kinase zu aktivieren, und welche die Bindung und Aktivierung durch die eigentlichen Aktivatoren verhindern kann (Manche et al., 1992; The Ela gene products can directly interfere with the activation of ISGF3 (Gutch and Reich, 1991; Ackrill et al., 1991). A second, more direct-acting mechanism uses the VA1 genes. The gene product forms a stable secondary structure which can bind to the p68 kinase without activating the kinase and which can prevent binding and activation by the actual activators (Manche et al., 1992;
Mathews und Shenk, 1991). Mathews and Shenk, 1991).
Ein weiterer inflammatorischer Reaktionsmechanismus als Folge des Eintritts von Virus dürfte in der Aktivierung des inflammatorischen Transkriptionsfaktors NF-IL-6 und der Sekretion des inflammatorischen Zytokins IL-6 bestehen (Sehgal et al., 1988; Kishimoto et al., 1992). Dieser Faktor wiederum aktiviert, oft im Zusammenwirken mit NF-κB, das IL-6-Gen selbst wie auch eine Anzahl weiterer inflammatorischer Response-Gene wie TNF und IL-1. Kürzlich wurde berichtet, daß IL-6 seinerseits den auf Interferon ansprechenden Transkriptionsfaktor IRF 1 ("Interferon Response Factor 1") aktivieren kann (Harroch et al., 1994). Dies dürfte entweder für die Interferon-Response auf den Eintritt von Adenovirus verantwortlich sein oder diese verstärken. Da die meisten der frühen Gene von Adenovirus Typ C Another inflammatory reaction mechanism as a result of the entry of virus is likely to be the activation of the inflammatory transcription factor NF-IL-6 and the secretion of the inflammatory cytokine IL-6 (Sehgal et al., 1988; Kishimoto et al., 1992). This factor in turn, often in conjunction with NF-κB, activates the IL-6 gene itself as well as a number of other inflammatory response genes such as TNF and IL-1. Recently it has been reported that IL-6 in turn can activate the interferon-responsive transcription factor IRF 1 ("Interferon Response Factor 1") (Harroch et al., 1994). This should either be responsible for the interferon response to the occurrence of adenovirus or increase it. Since most of the early genes of adenovirus type C
Bindungsstellen für NF-IL-6 enthalten, könnte man annehmen, daß die Aktivierung von NF-IL-6 durch Containing binding sites for NF-IL-6, one could assume that the activation of NF-IL-6 by
Adenovirus die Auslösung der Virusgen- Expressionskaskade gewährleistet. Adenovirus ensures the triggering of the virus gene expression cascade.
Eine andere Verteidigungslinie der Wirtszelle dürfte die apoptotischen Antwort sein. Es ist lange bekannt, daß Mutationen, die in der EIB 19K-Region kartieren, für den deg-Phänotyp, einen verstärkten zytopathischen Effekt, der vom Abbau der chromosomalen DNA des Wirts begleitet ist (D'Halluin et al., 1979; Ezoe et al., 1981; Lai Fatt und Mak, 1982; Pilder et al., 1984; Subramanian et al., 1984; Takemori et al., 1984; White et al., 1984), verantwortlich sind. Jüngere Another line of defense of the host cell is the apoptotic response. It has long been known that mutations that map in the EIB 19K region for the deg phenotype, an enhanced cytopathic effect that is accompanied by degradation of the host's chromosomal DNA (D'Halluin et al., 1979; Ezoe et al., 1981; Lai Fatt and Mak, 1982; Pilder et al., 1984; Subramanian et al., 1984; Takemori et al., 1984; White et al., 1984). Younger ones
Untersuchungen haben eine Apoptose identifiziert, die durch Expression eines EIA-Wachstumssignals in Studies have identified apoptosis by expressing an EIA growth signal in
Abwesenheit von EIB hervorgerufen wird (White und Absence of EIB (White and
Stillman, 1987; White et al., 1994; Rao et al., 1992); an dieser Apoptose dürfte die durch E1A ausgelöste Freisetzung des Transkriptionsfaktors E2F vom Rb- Protein beteiligt sein (Wu und Levine, 1994). Es wurde gezeigt, daß das EIB 19K-Protein als stark wirksames Analoges des die Apoptose blockierenden Wirtsgens Bei-2 fungieren kann (Rao et al., 1992; Debbas und White, 1993). Die Expression jedes dieser Proteine kann eine durch verschiedene Signale ausgelöste Apoptose Stillman, 1987; White et al., 1994; Rao et al., 1992); the release of the transcription factor E2F from the Rb protein caused by E1A is likely to be involved in this apoptosis (Wu and Levine, 1994). It has been shown that the EIB 19K protein can act as a potent analog of the apoptosis-blocking host gene Bei-2 (Rao et al., 1992; Debbas and White, 1993). The expression of each of these proteins can result in apoptosis triggered by various signals
blockieren. Im Zusammenhang mit den Untersuchungen mit Myc wurde festgestellt, daß Wachstumssignale eine Zelle entweder für die Proliferation, wenn die geeigneten Verstärkungssignale, z.B. Ras oder Src, zur Verfügung stehen, oder für die Apoptose, wenn die Myc-Signale allein vorhanden sind (Evan et al., 1992), To block. In connection with the studies with Myc it was found that growth signals either a cell for proliferation when the appropriate amplification signals, e.g. Ras or Src, or for apoptosis when the Myc signals are present alone (Evan et al., 1992),
determinieren. Ein ähnliches Modell für die durch determine. A similar model for that through
Adenovirus El induzierte Transformation wird durch Versuche gestützt, die zeigen, daß die Apoptose durch EIA-Expression in Abwesenheit von EIB 19K ausgelöst wird (White und Stillman, 1987; Rao et al., 1992; Adenovirus El induced transformation is supported by experiments showing that apoptosis is triggered by EIA expression in the absence of EIB 19K (White and Stillman, 1987; Rao et al., 1992;
Debbas und White, 1993). Eine kürzlich durchgeführte Untersuchung der Sindbisvirusinfektion hat gezeigt, daß die Expression von Bcl-2 in der Wirtszelle ein Debbas and White, 1993). A recent study of Sindbis virus infection has shown that the expression of Bcl-2 in the host cell
ausschlaggebender Faktor für den Ausgang einer decisive factor for the outcome of a
Virusinfektion sein kann (Levine et al., 1993): Beim Fehlen von Bcl-2 macht die Zelle eine Apoptose durch, womit die Virusproduktion auf eine kurze akute Phase beschränkt wird. In Gegenwart von Bei-2-Expression findet eine chronische Virusproduktion statt, weil die apoptotische Antwort auf die Akutphaseninfektion ausbleibt. Anti-apoptotische Aktivitäten wurden ferner im Epstein-Barr Virus (das BHERl-Gen; Pearson et al., , 1987), im Baculovirus (das p35-Gen; Sugimoto et al., 1994) und im afrikanischen Schweinefiebervirus (das LMW5-HL-Gen; Neilan et al., 1993) identifiziert. Dies deutet darauf hin, daß die apoptotische Antwort auf die Virusinfektion in vielen Fällen eintritt und Viren Strategien entwickelt haben, um diese Antwort zu blockieren. Virus infection can be (Levine et al., 1993): In the absence of Bcl-2, the cell undergoes apoptosis, which limits virus production to a short, acute phase. Chronic virus production takes place in the presence of Bei-2 expression because the apoptotic response to the acute phase infection is absent. Anti-apoptotic activities were also undertaken in the Epstein-Barr virus (the BHER1 gene; Pearson et al.,, 1987), in the baculovirus (the p35 gene; Sugimoto et al., 1994) and in the African swine fever virus (the LMW5-HL gene; Neilan et al ., 1993). This indicates that the apoptotic response to the virus infection occurs in many cases and virus strategies have been developed to block this response.
Die mit inaktivierten Adenovirus-Kapsiden für den Those with inactivated adenovirus capsids for
Gentransfer mittels Rezeptor-vermittelter Endozytose durchgeführten Versuche beruhten zunächst auf der Gene transfer using receptor-mediated endocytosis was initially based on the
Annahme, daß das Viruskapsid nur als ein die Endosomen aufbrechendes Reagens wirkt, was eine Funktion der Oberflächenproteine des Viruskapsids ist. Es wurden Inaktivierungsmethoden entwickelt, die die Assumption that the viral capsid acts only as a reagent that breaks the endosomes, which is a function of the surface proteins of the viral capsid. Inactivation methods have been developed which
Virustranskription und -replikation blockieren, ohne die endosomolytische Aktivität des Kapsids zu verändern (Cotten et al., 1994). Im Zuge weiterer Versuche mit Adenovirus-unterstützten Transfektionen wurde die Block virus transcription and replication without changing the capsid's endosomolytic activity (Cotten et al., 1994). In the course of further experiments with adenovirus-assisted transfections, the
Kontamination mit Lipopolysaccharid (LPS) als eine Quelle für die Toxizität in Primärzelltransfektionen identifiziert. Diesem Toxizitätsproblem konnte durch sorgfältige Entfernung von LPS von der DNA leicht abgeholfen werden. Obwohl die Inaktivierung des Virus und die Entfernung von LPS zwei Formen von Virus- assoziierter Toxizität beseitigten, gelang nicht in allen Zelltypen Langzeit-Genexpression, auch nicht mit Psoralen/UV-inaktiviertem humanem Adenovirus in Contamination with lipopolysaccharide (LPS) identified as a source of toxicity in primary cell transfections. This toxicity problem was easily remedied by carefully removing LPS from the DNA. Although inactivation of the virus and removal of LPS eliminated two forms of virus-associated toxicity, long-term gene expression was not successful in all cell types, not even with psoralen / UV-inactivated human adenovirus in
Gegenwart von LPS-freier DNA. Presence of LPS-free DNA.
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, die Mechanismen aufzuklären, die bei den bei The object of the present invention was to elucidate the mechanisms involved in the
Transfektionen beobachteten Toxizitätseffekten Transfections observed toxicity effects
auftreten, um auf der Grundlage der gewonnenen occur to based on the won
Erkenntnisse ein neues, verbessertes Verfahren für die Behandlung von eukaryotischen Zellen, insbesondere das Einführen von Fremdmaterial, wie Nukleinsäuren, in die Zellen bereitzustellen. Findings a new, improved process for the To provide treatment of eukaryotic cells, in particular the introduction of foreign material, such as nucleic acids, into the cells.
Bisherige Bestrebungen zur Verbesserung der Previous efforts to improve
Gentransfermethoden konzentrierten sich auf die Gene transfer methods focused on the
Verstärkung der Genexpression. So wurde z.B. berichtet, daß die VA1-Expression die Genexpression von co- transfizierten Genen verstärkt, indem sie die Enhance gene expression. For example, reports that VA1 expression enhances gene expression of co-transfected genes by increasing the
Stabilität mRNA oder deren Menge erhöht (Svensson und Akusjärvi, 1984; Stijker et al., 1989; Svensson und Akusjärvi, 1990; Mathews und Shenk, 1991). Der dafür verantwortliche Mechanismus ist auf molekularer Ebene noch nicht aufgeklärt; ein Zusammenhang mit Stability mRNA or its amount increased (Svensson and Akusjärvi, 1984; Stijker et al., 1989; Svensson and Akusjärvi, 1990; Mathews and Shenk, 1991). The mechanism responsible for this has not yet been elucidated at the molecular level; a connection with
Toxizitätsproblemen dürfte nicht gegeben sein. There should be no toxicity problems.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Behandeln von höheren eukaryotischen Zellen, The present invention relates to a method for treating higher eukaryotic cells,
insbesondere zum Einbringen von Fremdmaterial, wie Nukleinsäure, in die Zellen, wobei man außer dem in particular for introducing foreign material, such as nucleic acid, into the cells
Fremdmaterial und den Transfektionskomponenten Foreign material and the transfection components
a) in die Zellen ein oder mehrere Nukleinsäure- Moleküle, insbesondere DNA-Moleküle, einbringt, deren Expressionsprodukte die durch das Einbringen des a) introduces one or more nucleic acid molecules, in particular DNA molecules, into the cells, the expression products of which by introducing the
Fremdmaterials ausgelöste Apoptose der Wirtszelle zumindest teilweise blockieren, und/oder daß man b) die inflammatorische Antwort der Zellen zumindest teilweise inhibiert, indem man Block at least partially apoptosis of the host cell triggered by foreign material, and / or that b) at least partially inhibit the inflammatory response of the cells by
i) die Zellen äußerlich mit einer oder mehreren anti- inflammatorisch wirkenden Substanz(en) behandelt und/oder i) the cells are treated externally with one or more anti-inflammatory substance (s) and / or
ii) in die Zellen eine oder mehrere anti- inflammatorische Substanz(en) oder die dafür ii) in the cells one or more anti-inflammatory substance (s) or the same
kodierenden Nukleinsäure-, insbesondere DNA-Moleküle einbringt. Die in a) definierten DNA-Moleküle werden im folgenden als "anti-Apoptose-Gene" oder als "DNA-Moleküle mit anti-Apoptose-Wirkung" bezeichnet. encoding nucleic acid, especially DNA molecules. The DNA molecules defined in a) are referred to below as "anti-apoptosis genes" or as "DNA molecules with anti-apoptosis activity".
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in seiner In the inventive method in its
bevorzugten Ausführungsform werden in die Zellen außer den Komponenten a) und gegebenenfalls b) ii) das preferred embodiment, the cells in addition to components a) and optionally b) ii)
Fremdmaterial und die Transfektionskomponenten Foreign material and the transfection components
eingebracht. brought in.
Die Definition des Begriffs "Apoptose" umfaßt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sämtliche toxischen Effekte, die zurückzuführen sind auf a) direkte Aktivierung der apoptotischen Antwort; b) Aktivierung von reaktiven Sauerstoffmetaboliten, welche direkt oder indirekt Apoptose induzieren; c) Aktivierung der Sekretion von TNF, IL-6 oder eines anderen Zytokins, welche die In the context of the present invention, the definition of the term “apoptosis” encompasses all toxic effects which are attributable to a) direct activation of the apoptotic response; b) activation of reactive oxygen metabolites which directly or indirectly induce apoptosis; c) Activation of the secretion of TNF, IL-6 or another cytokine, which the
Lebensfähigkeit der transduzierten Zellen Viability of the transduced cells
beeinträchtigt; d) überschüssige Aktivierung von NF-κB; e) überschüssige Aktivierung von p53. impaired; d) excess activation of NF-κB; e) excess activation of p53.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das In a preferred embodiment, the
erfindungsgemäße Verfahren auf die oben angeführte, von Curiel et al., 1991; Curiel et al., 1992a; Zatloukal et al., 1992; Cotten et al., 1992; Wagner et al., 1992; Curiel et al., 1992b sowie in der WO 93/07283 inventive method to the above, by Curiel et al., 1991; Curiel et al., 1992a; Zatloukal et al., 1992; Cotten et al., 1992; Wagner et al., 1992; Curiel et al., 1992b and in WO 93/07283
beschriebene Gentransfermethode angewendet, bei der DNA mit Hilfe von Konjugaten aus einem Liganden für die Zielzelle und einem Polykation unter Mitwirkung von, gegebenenfalls mit einem Polykation konjugierten, described gene transfer method applied, in which DNA with the aid of conjugates of a ligand for the target cell and a polycation with the participation of, optionally conjugated with a polycation,
Adenovirus, in die Zelle eingebracht wird. Diese Adenovirus that is introduced into the cell. This
Veröffentlichungen werden ausdrücklich in die Publications are expressly included in the
Offenbarung der vorliegenden Erfindung miteinbezogen. (Diese Methode wird im folgenden als "Adenovirus- unterstützte Transferrinfektion" bezeichnet.) Das der Anwendung der vorliegenden Erfindung auf dieses GentransferSystem zugrundeliegende Prinzip besteht darin, ein transkriptions- und replikationsfreies Disclosure of the present invention included. (This method is referred to below as "adenovirus-assisted transfer infection".) The principle underlying the application of the present invention to this gene transfer system is that it is transcription and replication-free
Adenovirus einzusetzen, das in seinen genetischen To use adenovirus in its genetic
Funktionen weitgehend auf seine, für die Steigerung der Genexpresssion vorteilhaften, endosomolytischen Functions largely on its endosomolytic, which is beneficial for increasing gene expression
Eigenschaften reduziert ist, und die übrigen für den Gentransfer notwendigen bzw. nützlichen Genfunktionen des Adenovirus auf kontrollierte Weise nachträglich wieder hinzuzufügen. Properties is reduced, and the remaining adenovirus gene functions necessary or useful for gene transfer can be added again in a controlled manner.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann jedoch auf However, the method according to the invention can be based on
sämtliche Methoden zum Einbringen von Fremdmaterial in die Zelle, bei denen die oben dargelegten all methods of introducing foreign material into the cell, in which the methods outlined above
Toxizitätseffekte auftreten, angewendet werden, insbesondere auf Gentransfermethoden, z.B. bei der Verwendung rekombinanter Adenovirusvektoren. Derartige Gentransfermethoden finden Anwendung in vitro sowie bei der Gentherapie sowohl in vivo als auch ex vivo, insbesondere in Fibroblasten, hämatopoetisehen Zellen, Endothelzellen oder Lungenepithelzellen. Toxicity effects occur, are applied, in particular to gene transfer methods, e.g. when using recombinant adenovirus vectors. Such gene transfer methods are used in vitro and in gene therapy both in vivo and ex vivo, in particular in fibroblasts, hematopoietic cells, endothelial cells or lung epithelial cells.
Der Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens kann außerdem bei der Behandlung eukaryotischer Zellen sämtliche Anwendungen umfassen, bei denen eine The use of the method according to the invention can also include all applications in the treatment of eukaryotic cells in which one
Blockierung einer apoptotischen und/oder Blocking an apoptotic and / or
inflammatorischen Antwort der Zelle erforderlich oder vorteilhaft ist. Ein Beispiel für eine solche inflammatory response of the cell is necessary or beneficial. An example of one
erweiterte Anwendung ist die Transplantation von fremden Zellen, Geweben oder Organen, bei der aufgrund der Immunerkennung eine apoptotische Reaktion der extended application is the transplantation of foreign cells, tissues or organs, in which an apoptotic reaction of the immune recognition
Zellen stattfindet. Durch die Expression von anti- apoptotisch wirksamen Genen in den zu Cells takes place. Through the expression of anti-apoptotic genes in the to
transplantierenden Zellen kann die Apoptose verhindert werden. In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung ist das anti-Apoptose-Gen das humane Bcl-2-Gen (Seto et al., 1988). transplanting cells can prevent apoptosis. In a preferred embodiment of the invention, the anti-apoptosis gene is the human Bcl-2 gene (Seto et al., 1988).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das anti-Apoptose-Gen das EIB 19K-Gen von Adenovirus Typ 2 oder 5 (White und Cipriani, 1990). In a further preferred embodiment, the anti-apoptosis gene is the EIB 19K gene of adenovirus type 2 or 5 (White and Cipriani, 1990).
Weitere Beispiele für im Rahmen der vorliegenden Further examples for the present
Erfindung geeignete anti-Apoptose-Gene sind das BHRF1- Gen des Epstein-Barr Virus (Pearson et al., 1987), die Baculovirusgene p35 (Sugimoto et al., 1994) und iap (Clem und Miller, 1994), das LMW5-HL-Gen vom Anti-apoptosis genes suitable for the invention are the BHRF1 gene of the Epstein-Barr virus (Pearson et al., 1987), the baculovirus genes p35 (Sugimoto et al., 1994) and iap (Clem and Miller, 1994), the LMW5- HL gene from
afrikanischen Schweinefiebervirus (Neilan et al., 1993) und das ced-9-Gen von Caenorhabditis elegans (Sugimoto et al.; 1994). African swine fever virus (Neilan et al., 1993) and the ced-9 gene from Caenorhabditis elegans (Sugimoto et al .; 1994).
Diese Genprodukte wirken im Apoptose- Signalübertragungsweg relativ weit stromabwärts, d.h. nahe an den an den Abbauprozessen unmittelbar These gene products act relatively far downstream in the apoptosis signaling pathway, i.e. close to those at the mining processes immediately
beteiligten Proteasen. So wird z.B. von Bei-2 und Bei-2 ähnlichen Proteinen angenommen, daß sie die Aktivierung der als ICE oder ICE-ähnlich bezeichneten Proteasen blockieren. Da diese Protease(n) offenbar eine ganz entscheidende Funktion für die Apoptose haben, kommt auch ihrer Blockierung eine entscheidende Rolle zu. proteases involved. For example, proteins similar to Bei-2 and Bei-2 are believed to block activation of the proteases designated ICE or ICE-like. Since these protease (s) obviously have a crucial function for apoptosis, their blocking also plays a crucial role.
Außer den Substanzen mit einem Bcl-2 ähnlichen anti- Apoptosemechanismus kommen auch solche in Betracht, die eine Komponente, die weiter stromaufwärts im Apoptose- Signalübertragungsweg wirkt, blockieren. Eine solche Komponente ist z.B. p53, dessen Aktivierung einen der Signalübertragungswege auslöst, die zur Apoptose führen. Wenn somit die durch den Transfektionsvorgang ausgelöste Apoptose über die Aktivierung von p53 läuft, könnten Substanzen, die p53 inaktivieren, für die Blockierung der Apoptose eingesetzt werden, wobei einerseits zu beachten ist, daß die Blockierung nicht durch einen anderen Signalübertragung, der ebenfalls zur Apoptose führt, umgangen wird, andererseits, daß die Inaktivierung von p53 in dem jeweiligen Zelltyp nicht einen transformierten Zustand hervorruft. In addition to the substances with a Bcl-2-like anti-apoptosis mechanism, there are also those which block a component which acts further upstream in the apoptosis signal transmission path. Such a component is, for example, p53, the activation of which triggers one of the signal transmission paths which lead to apoptosis. Thus, if the apoptosis triggered by the transfection process proceeds via the activation of p53, substances that inactivate p53 could be for the Blocking of apoptosis are used, whereby it must be noted on the one hand that the blocking is not circumvented by another signal transmission which also leads to apoptosis, and on the other hand that the inactivation of p53 does not cause a transformed state in the respective cell type.
Beispiele für Gene, die p53 inaktivieren, sind EIB 55K von Adenovirus Typ 2 oder Typ5 (White und Cipriani, 1989) oder El-Funktionen von anderen Adenovirusstämmen, z.B. Adenovirus 12 oder vom CELO-Virus (Chick Embryo Lethal Orphan Virus), das E6-Gen vom humanen Examples of genes that inactivate p53 are EIB 55K from adenovirus type 2 or type 5 (White and Cipriani, 1989) or El functions from other strains of adenovirus, e.g. Adenovirus 12 or from CELO virus (Chick Embryo Lethal Orphan Virus), the E6 gene from human
Papillomavirus-16 (Levine, 1990), das große T-Antigen von SV 40 (McCarthy et al., 1994), das mdm-2-Gen Papillomavirus-16 (Levine, 1990), SV 40's large T antigen (McCarthy et al., 1994), the mdm-2 gene
(Momand et al., 1992; Oliner et al., 1993; Chen et al., 1994). (Momand et al., 1992; Oliner et al., 1993; Chen et al., 1994).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde eine Within the scope of the present invention, a
Screening-Methode entwickelt, mit der auf einfache Weise Gene mit anti-apoptotischer Wirkung identifziert werden können. Die Methode besteht darin, Screening method developed with which genes with an anti-apoptotic effect can be easily identified. The method is
Säugetierzellen, z.B. Fibroblasten, mit einem Mammalian cells, e.g. Fibroblasts, with a
Reporterplasmid, z.B. einem Luciferase-Plasmid, zu transfizieren und die Expression des Reportergens über einen bestimmten Zeitraum zu verfolgen. In Reporter plasmid, e.g. a luciferase plasmid to transfect and monitor expression of the reporter gene over a period of time. In
Parallelversuchen werden die Zellen unter identischen Bedingungen zusätzlich mit Test-DNA, z.B. genomischen Virus-DNA Fragmenten oder DNA-Molekülen aus einer cDNA- Bibliothek, in geeigneten Expressionsvektoren In parallel experiments, the cells are additionally tested under identical conditions with test DNA, e.g. genomic virus DNA fragments or DNA molecules from a cDNA library, in suitable expression vectors
transfiziert. Gegebenenfalls werden die Zellen in einem weiteren Ansatz zusätzlich mit einer DNA-Sequenz transfiziert, von der bekannt ist, daß sie die transfected. In a further approach, the cells are optionally additionally transfected with a DNA sequence which is known to be the
gewünschte anti-apoptotische Wirkung hat, z.B. mit EIB 19K oder Bcl-2. In derartigen Versuchen zeigt sich die anti-apoptotische Wirkung einer Test-DNA-Sequenz dadurch, daß bei Co-Transfektion der Zellen mit dieser Sequenz die Expression des Reportergens höher ist als bei Transfektion der Zellen mit dem Reportergen allein. Bei Co-Transfektion mit einem Gen bekannter anti- apoptotischer Wirkung kann die Wirkung des Testgens mit der des bekannten Gens verglichen werden. has the desired anti-apoptotic effect, for example with EIB 19K or Bcl-2. In such experiments, the anti-apoptotic effect of a test DNA sequence is shown by the fact that when the cells are co-transfected with it Sequence the expression of the reporter gene is higher than when transfecting the cells with the reporter gene alone. In the case of co-transfection with a gene of known anti-apoptotic effect, the effect of the test gene can be compared with that of the known gene.
Mit Hilfe dieser Screening-Methode wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung zunächst ein anti-apoptotisch wirkendes DNA-Molekül des Hühner-Adenovirus Typ I With the help of this screening method, an anti-apoptotic DNA molecule of the chicken adenovirus type I was first used in the context of the present invention
(CELO = Chicken Embryo Lethal Orphan) identifiziert. (CELO = Chicken Embryo Lethal Orphan).
Dieses DNA-Molekül liegt auf einem Smal/Hindlll- Fragment, das im CELO-Virusgenom im Bereich zwischen ca. 84.3 bis ca. 88.7 Kartierungseinheiten lokalisiert ist. Von dem im Rahmen der vorliegenden Erfindung isolierten Smal/HindiII-Fragment wurde die in Fig. 14 dargestellte Nukleotidsequenz ermittelt (SEQ ID NO: 1). This DNA molecule lies on a Smal / Hindlll fragment which is located in the CELO virus genome in the range between approximately 84.3 to approximately 88.7 mapping units. The nucleotide sequence shown in FIG. 14 was determined from the Smal / HindiII fragment isolated in the context of the present invention (SEQ ID NO: 1).
Das Smal/HindiII-Fragment wurde aus einem EcoRI- Fragment der Bezeichnung 9R1 erhalten, das im Bereich zwischen 81.2 bis 92.7 Kartierungseinheiten The Smal / HindiII fragment was obtained from an EcoRI fragment called 9R1, which ranged from 81.2 to 92.7 mapping units
lokalisiert ist (s. Fig. 13). is located (see Fig. 13).
Im erfindungsgemäßen Verfahren können sämtliche der erhaltenen CELO-Virus-Fragmente, die die anti- apoptotische Wirkung aufweisen, wie z.B. das In the method according to the invention, all of the CELO virus fragments obtained which have the anti-apoptotic effect, such as e.g. the
Smal/Hindlll-Fragment als solches, eingesetzt werden. Smal / Hindlll fragment as such can be used.
Alternativ kann das EcoRI-Fragment 9R1, von dem das Smal/Hindlll-Fragment eine Teilsequenz darstellt, als ganzes eingesetzt werden. Alternatively, the EcoRI fragment 9R1, of which the Smal / HindIII fragment is a partial sequence, can be used as a whole.
Eine weitere Möglichkeit besteht darin, das zwischen Kartierungseinheiten 77.8 und 88.7 auf dem CELO- Virusgenom lokalisierte HindiII-Fragment der A further possibility consists in the HindiII fragment of the located between mapping units 77.8 and 88.7 on the CELO virus genome
Bezeichnung 7H3 einzusetzen. Die Fragmente 9R1 und 7H3 haben einen Überlappungsbereich von 80%, das Use designation 7H3. Fragments 9R1 and 7H3 have an 80% overlap area that
Smal/Hindlll-Fragment ist den beiden Fragmenten Smal / Hindlll fragment is the two fragments
gemeinsam, es enthält den einzigen großen offenen together, it contains the only large open one
Leserahmen dieses Bereichs. Reading frame of this area.
Die Größe des DNA-Moleküls im Bereich bzw. der Umgebung der angegebenen Fragmentbereiche ist nicht kritisch. The size of the DNA molecule in the area or in the vicinity of the specified fragment areas is not critical.
Bevorzugt wird die DNA, die im wesentlichen nur aus dem offenen Leserahmen besteht, eingesetzt. Diese DNA kann gegebenenfalls noch auf die für die anti-apoptotische Funktion verantwortlichen Abschnitte verkürzt oder es können Mutanten im Hinblick auf eine Verstärkung der Aktivität konstruiert werden. Die Auswahl geeigneter Mutanten kann erfolgen, indem entsprechend mutierte DNA-Sequenzen, wie in den Beispielen beschrieben, auf ihre Fähigkeit zur Verstärkung der Genexpression getestet werden. The DNA, which essentially consists only of the open reading frame, is preferably used. This DNA can optionally be shortened to the sections responsible for the anti-apoptotic function, or mutants can be constructed with a view to enhancing the activity. The selection of suitable mutants can be carried out by testing correspondingly mutated DNA sequences, as described in the examples, for their ability to increase gene expression.
In den im Rahmen der vorliegenden Erfindung In the context of the present invention
durchgeführten Versuchen wurde die definitive Zuordnung eines anti-apoptotisch wirksamen Gens zu dem offenen Leserahmen mittels gerichteter in vitro ("site The definitive assignment of an anti-apoptotic gene to the open reading frame was carried out by means of directed in vitro ("site
specific") Mutagenese vorgenommen, auf diese Weise konnte auch festgestellt werden, welcher der für die anti-apoptotische Aktivität minimal erforderliche specific ") mutagenesis, in this way it was also possible to determine which of the minimally required for the anti-apoptotic activity
Leserahmen ist, indem die mutierten DNA-Abschnitte auf anti-apoptotische Wirkung gescreent werden. Dazu wurde eine Reihe von Deletionsmutanten konstruiert. Es zeigte sich, daß alle jene Konstruktionen, durch die Reading frame is by screening the mutated DNA sections for anti-apoptotic effects. A number of deletion mutants were constructed for this. It turned out that all those constructions by which
Stopcodons innerhalb des vermuteten Leserahmens Stop codons within the presumed reading frame
eingeführt wurden und die daher die erhaltenen Proteine in der Nähe der jeweiligen Restriktionsstellen were introduced and therefore the proteins obtained in the vicinity of the respective restriction sites
verkürzten, die anti-apoptotische Schutzwirkung shortened the anti-apoptotic protective effect
beseitigten, während die Einführung von Stopcodons außerhalb des offenen Leserahmens diese Aktivität nicht beeinträchtigte. eliminated during the introduction of stop codons outside of the open reading frame, this activity did not interfere.
Die Analyse der Proteinsequenz des vermuteten offenen Leserahmens (das entsprechende Protein wird im Analysis of the protein sequence of the suspected open reading frame (the corresponding protein is published in
folgenden als "GAM-1" bezeichnet, die Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 2 angegeben) zeigte außerdem eine Serie von sieben Leucinresten. Von diesem Motiv ist bekannt, daß es in eine Struktur (sog. "Leucin-Zipper) faltet, die häufig eine Stelle von Protein-Protein- Wechselwirkungen ist (Busch und Sassone-Corsi, 1990; Lumb und Kim, 1995). Es wird angenommen, daß die hereinafter referred to as "GAM-1", the amino acid sequence is given in SEQ ID NO: 2) also showed a series of seven leucine residues. This motif is known to fold into a structure (called "leucine zipper") that is often a site of protein-protein interactions (Busch and Sassone-Corsi, 1990; Lumb and Kim, 1995) assumed that the
Leucin-Zipper-Dimersisierungsdomäne als alpha-helikale Struktur funktioniert, die Einführung von Aminosäuren wie Prolin, die alpha-Helices zerstören, kann somit die Zipper-Dimerisierung beeinträchtigen. Es wurde Leucine-zipper dimersization domain works as an alpha-helical structure, the introduction of amino acids such as proline, which destroy alpha-helices, can thus impair zipper dimerization. It was
festgestellt, daß die Einführung von Punktmutationen im Leucin-Zipper die Schutzwirkung von GAM-1 zerstört, was darauf hinweist, daß der GAM-1-Leucin-Zipper wichtig für die Funktion des Proteins ist. GAM-1 funktioniert daher entweder als Homodimer oder es existieren andere Bindungspartner für GAM-1. found that the introduction of point mutations in the leucine zipper destroys the protective effect of GAM-1, which indicates that the GAM-1 leucine zipper is important for the function of the protein. GAM-1 therefore either functions as a homodimer or there are other binding partners for GAM-1.
GAM-1 weist keine Homologien mit irgendeinem der bekannten anti-apoptischen Proteine auf, einschließlich Mitgliedern der Bcl-2 Familie, Adenovirus 5 EIB 19K, der Bax-Familie, der Baculovirus-IAP-Familie, dem GAM-1 has no homologies with any of the known anti-apoptical proteins, including members of the Bcl-2 family, adenovirus 5 EIB 19K, the Bax family, the baculovirus IAP family, the
Nematoden-Protein Ced-3. (Darüberhinaus zeigte die vollständige Sequenz des CELO-Virusgenoms, daß das CELO-Virus keine Gene besitzt, die Homologie mit der Ad2/5 EIB 19K-Region aufweisen. Es könnte daher sein, daß das CELO-Virus keine EIB 19K-Region hat und daher die GAM-1-Genfunktion als anti-Apoptosegen verwendet.) Nematode protein Ced-3. (Furthermore, the complete sequence of the CELO virus genome showed that the CELO virus has no genes that are homologous to the Ad2 / 5 EIB 19K region. It could therefore be that the CELO virus has no EIB 19K region and hence the GAM-1 gene function used as an anti-apoptotic gene.)
Die Erfindung betrifft somit in einem weiteren Aspekt ein DNA-Molekül, enthaltend die in Fig. 14 bzw. SEQ ID NO: 1 dargestellte Nukleotidsequenz oder eine für ein funktionelles Genprodukt mit anti-apoptotischer Wirkung kodierende Teilsequenz davon. In a further aspect, the invention thus relates to a DNA molecule containing the ones in FIG. 14 or SEQ ID NO: 1 shown nucleotide sequence or a partial sequence thereof coding for a functional gene product with anti-apoptotic effect.
Bevorzugt ist ein DNA-Molekül mit der Sequenz des in Fig. 14 bzw. SEQ ID N0:1 dargestellten offenen A DNA molecule with the sequence of the open one shown in FIG. 14 or SEQ ID N0: 1 is preferred
Leserahmens, einschließlich degenerierter Varianten davon, oder Mutanten, die für ein funktionelles Reading frame, including degenerate variants of it, or mutants for a functional
Genprodukt mit anti-apopotischer Wirkung kodieren. Code gene product with anti-apopotic effect.
Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt die von den erfindungsgemäßen DNA-Molekülen abgeleiteten In a further aspect, the invention relates to those derived from the DNA molecules according to the invention
Polypeptide, insbesondere das vom offenen Leserahmen kodierte Protein der Bezeichnung GAM-1 (SEQ ID NO:2) sowie funktionelle Derivate davon. Polypeptides, in particular the protein of the designation GAM-1 (SEQ ID NO: 2) encoded by the open reading frame, and functional derivatives thereof.
Obwohl die Genprodukte von EIB 19K, Bcl-2 und GAM-1 eine ähnliche Schutzwirkung haben, könnte es sein, daß sie an verschiedenen Stellen des Apoptose-Weges wirken. Um dies festzustellen, wurden im Rahmen der Although the gene products from EIB 19K, Bcl-2 and GAM-1 have a similar protective effect, they may be active at different points in the apoptosis pathway. To determine this, the
vorliegenden Erfindung verschiedene Kombinationen von EIB 19K mit GAM-1 oder Bcl-2 mit GAM-1 mit einem different combinations of EIB 19K with GAM-1 or Bcl-2 with GAM-1 with one
Luciferase-Reportergen co-transfiziert und das Luciferase reporter gene co-transfected and that
Überleben der Zellen anhand der Luciferaseexpression im Vergleich zu Zellen, die mit den jeweiligen Genen allein behandelt wurden, bestimmt. Es wurde Cell survival was determined based on luciferase expression compared to cells treated with the respective genes alone. It was
festgestellt, daß die Kombination des GAM-1-9R1- Fragments mit EIB 19K gegenüber der Wirkung der found that the combination of the GAM-1-9R1 fragment with EIB 19K compared to the effect of
Einzelgene einen verstärkten Schutzeffekt hat, und zwar sowohl vier Tage (s. Fig. 19, Spalten 2, 3, und 4) als auch 22 Tage (s. Fig. 22, Spuren 3, 4 und 6) nach der Transfektion. Für Bcl-2 und GAM-1 wurde am Tag 22 ein Synergismus beobachtet. Individual genes have an enhanced protective effect, namely four days (see FIG. 19, columns 2, 3 and 4) and 22 days (see FIG. 22, lanes 3, 4 and 6) after the transfection. Synergism was observed for Bcl-2 and GAM-1 on day 22.
Es kann eine Signalübermittlung von der extrazellulären Matrix zur Zelle auftreten. Es hat sich gezeigt, daß die geeignete extrazelluläre Umgebung entscheidend für das Überleben der Zelle ist und daß das Fehlen einer solchen Umgebung ein Todesprogramm aktivieren kann (Meredith et al., 1993; Brooks et al., 1994; Übersicht von Ruoslahti und Reed, 1994). Dieser Mechanismus könnte dafür entscheidend sein, die richtige Lage der Zelle innerhalb des Organismus festzulegen und zu erhalten. Es wurde gezeigt, daß die Verhinderung des Anhaftens von Epithelzellen an das Substrat mittels PolyHEMA (=poly(2-hydroxy-ethyl-Methacrylat; Folkman und Moscona, 1978) zur Apoptose führt und daß die Signal transmission from the extracellular matrix to the cell can occur. It has been shown that the appropriate extracellular environment is critical to cell survival and that the absence of such an environment can activate a death program (Meredith et al., 1993; Brooks et al., 1994; review by Ruoslahti and Reed, 1994). This mechanism could be crucial for determining and maintaining the correct position of the cell within the organism. It has been shown that the prevention of epithelial cells adhering to the substrate by means of PolyHEMA (= poly (2-hydroxy-ethyl methacrylate; Folkman and Moscona, 1978) leads to apoptosis and that
Expression von Bcl-2 diesbezüglich eine Schutzwirkung ausüben kann. Die nach der Transferrinfektion Expression of Bcl-2 can have a protective effect in this regard. The one after the transfer infection
beobachtete Abnahme der Genexpression ist observed decrease in gene expression
möglicherweise auf eine veränderte Assoziation der Matrix zurückzuführen; der durch GAM-1 ausgelöste possibly due to a changed association of the matrix; the one triggered by GAM-1
Mechanismus besteht möglicherweise in einer Mechanism may be one
Verhinderung des Zelltodes, der infolge des Loslösens der Zellen von der Unterlage ("detachment-induced apoptosis") eintritt. Um diese Frage zu untersuchen, wurden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Prevention of cell death that occurs as a result of detachment of the cells from the surface ("detachment-induced apoptosis"). To investigate this question, within the scope of the present invention
Fibroblasten einerseits mit einem Luciferase- Reportergen, andererseits mit Testplasmiden, die unterschiedliche Fragmente von GAM-1 enthielten, transfiziert. Zwei Tage danach wurden die Zellen trypsinisiert und eine definierte Anzahl von Zellen auf PolyHEMA-beschichtete Zellkulturplatten ausplattiert. Sieben Tage später wurden die haftenden und die nicht- haftenden Zellen geerntet und auf Luciferaseaktivität untersucht. Es wurde festgestellt, daß die Fibroblasts were transfected on the one hand with a luciferase reporter gene and on the other hand with test plasmids which contained different fragments of GAM-1. Two days later, the cells were trypsinized and a defined number of cells were plated on polyHEMA-coated cell culture plates. Seven days later, the adherent and non-adherent cells were harvested and examined for luciferase activity. It was found that the
Schutzwirkung innerhalb der 7H3- und 9R1-Fragmente liegt. Protective action lies within the 7H3 and 9R1 fragments.
Außerdem wurde ein Vergleich zwischen dem von 9R1 kodierten GAM-1 einerseits und EIB 19 K bzw. Bcl-2 andererseits durchgeführt. Dazu wurden Zellen entweder mit dem Luciferase-Plasmid allein oder mit einem A comparison was also made between the GAM-1 encoded by 9R1 on the one hand and the EIB 19 K and Bcl-2 on the other. To do this, cells were either with the luciferase plasmid alone or with one
Plasmid, das für EIB 19 K, Bcl-2 oder GAM-1 kodiert, transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurde eine definierte Anzahl von Zellen auf eine Serie von Zellkulturplatten mit einem PolyHEMA-Überzug Plasmid encoding EIB 19 K, Bcl-2 or GAM-1 transfected. Two days after the transfection, a defined number of cells were placed on a series of cell culture plates with a PolyHEMA coating
abgestufter Konzentration gegeben und nach sieben Tagen die überlebende Zellpopulation durch Messung der verbleibenden Luciferaseexpression bestimmt. Es wurde durch Vergleich mit Kontrollzellen, die nur das given graded concentration and after seven days the surviving cell population was determined by measuring the remaining luciferase expression. It was compared to control cells that only the
Luciferasegen exprimierten, eine Abnahme der Expressed luciferase genes, a decrease in
Luciferaseexpression um das 20fache festgestellt, wenn die Zellen auf Platten mit steigenden PolyHEMA- Konzentrationen aufgebracht wurden. Dabei wurde Luciferase expression was determined 20 times when the cells were applied to plates with increasing PolyHEMA concentrations. It was
beobachtet, daß die Oberflächen, die mit den höchsten PolyHEMA-Konzentrationen überzogen waren, eine observed that the surfaces coated with the highest concentrations of PolyHEMA had a
vollständige Ablösung der Zellpopulation hervorriefen. Bei-2 dürfte eine stärkere Wirkung haben als EIB 19 K oder GAM-1; die ohne PolyHEMA erhaltene cause complete detachment of the cell population. Bei-2 should have a stronger effect than EIB 19 K or GAM-1; the one obtained without PolyHEMA
Luciferaseexpression blieb mit Bei-2 auch bei den höchsten PolyHEMA-Konzentration unverändert. Luciferase expression remained unchanged at Bei-2 even at the highest PolyHEMA concentrations.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde Within the scope of the present invention
festgestellt, daß EIB 19K, Bcl-2 und GAM-1 eine found that EIB 19K, Bcl-2 and GAM-1 were a
Schutzwirkung gegen die durch das Loslösen der Zellen von einer Unterlage ausgelöste Apoptose aufweisen. Protect against the apoptosis caused by the detachment of the cells from a support.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung The within the scope of the present invention
identifizierten, für GAM-1 kodierenden DNA-Moleküle können auch mutiert werden, sofern die Mutationen entweder keine Änderung der Aminosäuresequenz zur Folge haben bzw. die Änderungen keine für die Funktion essentiellen Aminosäuren betreffen. Identified DNA molecules coding for GAM-1 can also be mutated if the mutations either do not result in a change in the amino acid sequence or the changes do not affect any amino acids which are essential for the function.
In der bevorzugten Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf die Adenovirus-unterstützte In the preferred application of the method according to the invention to the adenovirus-assisted
Transferrinfektion wird das anti-Apoptose-Gen auf einfache Weise in Form eines Plasmids zusammen mit dem Plasmid, das die DNA-Sequenz enthält, deren Expression in der Zelle den erwünschten Effekt erzielen soll ( im folgenden "wirksame DNA" bezeichnet), z.B. ein Transfer infection is based on the anti-apoptosis gene simply in the form of a plasmid together with the plasmid containing the DNA sequence, the expression of which in the cell is said to achieve the desired effect (hereinafter referred to as "effective DNA"), for example a
therapeutisch wirksames Gen, in die therapeutically effective gene in which
Transfektionskomplexe eingebaut. Es liegt dann Transfection complexes built in. Then it lies
gemeinsam mit dem Plasmid, das die wirksame DNA trägt, komplexiert, z.B. mit Transferrin-Polylysin und complexed together with the plasmid carrying the effective DNA, e.g. with transferrin polylysine and
Adenovirus-Polylysin, vor. Das molare Verhältnis von wirksamem Gen und anti-Apoptose-Gen kann mittels Adenovirus polylysine. The molar ratio of active gene and anti-apoptosis gene can be determined using
Titration bestimmt werden, indem unter ansonsten identischen Bedingungen über einen längeren Zeitraum die Expression des wirksamen Gens bei verschiedenen Anteilen von anti-Apoptose-Gen gemessen wird. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde ein Verhältnis von 5: 1 gewählt, das sich als günstig erwiesen hat. Da die Genprodukte einiger anti-Apoptose-Gene sehr starke Wirkung zeigen, können auch geringere Anteile verwendet werden. Eine durch eine allfällige Toxizität bedingte Obergrenze kann ebenfalls durch Titration ermittelt werden. Titration can be determined by measuring the expression of the active gene at different proportions of the anti-apoptosis gene under otherwise identical conditions over a longer period of time. In the context of the present invention, a ratio of 5: 1 was chosen, which has proven to be favorable. Since the gene products of some anti-apoptosis genes show a very strong effect, smaller proportions can also be used. An upper limit due to any toxicity can also be determined by titration.
Es ist auch möglich, die therapeutisch wirksame DNA- Sequenz und das anti-Apoptose-Gen gemeinsam in ein einziges Plasmid zu integrieren, in diesem Fall beträgt das molare Verhältnis der beiden Gene 1:1, wenn sie in jeweils einer Kopie auf dem Plasmid vorliegen. It is also possible to integrate the therapeutically effective DNA sequence and the anti-apoptosis gene together into a single plasmid, in this case the molar ratio of the two genes is 1: 1 if they are each present on the plasmid in a copy .
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde Within the scope of the present invention
festgestellt, daß der Zelltod durch den Eintritt von Adenovirus, und zwar auch in Abwesenheit von viraler Genexpression ausgelöst wird. Die gleichzeitige found that cell death is caused by the onset of adenovirus, even in the absence of viral gene expression. The simultaneous
Einführung einer aktiven Adenovirus-E1-Region sorgte für eine Erleichterung von der Apoptose; Versuche mit Plasmiden, die einzelne El-Gene trugen, identifizierten EIB 19K als das für die Schutzwirkung verantwortliche Gen. Ferner konnte beim Apoptosis-Phänotyp gezeigt werden, daß die gleichzeitige Einführung des Bei-2-Gens ebenfalls die Toxizität blockieren kann. Introduction of an active adenovirus E1 region provided relief from apoptosis; Experiments with plasmids carrying individual El genes identified EIB 19K as the one responsible for the protective effect Gene. Furthermore, it could be shown in the apoptosis phenotype that the simultaneous introduction of the Bei-2 gene can also block toxicity.
Um die Aktivierung der inflammatorischen Antwort auf den Eintritt von Adenovirus zu untersuchen, wurden im Rahmen der vorliegenden Erfindung zwei Zellinien hergestellt, die das Luciferasegen unter der Kontrolle von Promotoren enthalten, die auf zwei der wichtigsten während der Entzündung aktivierten In order to investigate the activation of the inflammatory response to the onset of adenovirus, two cell lines were produced within the scope of the present invention which contain the luciferase gene under the control of promoters which activated two of the most important during the inflammation
Transkriptionsfaktoren ansprechen, nämlich NF-IL-6 und NF-κB. Damit wurde die Voraussetzung geschaffen, die Aktivierung dieser Transkriptionsfaktoren als Antwort auf den Eintritt von Adenovirus oder des  Addressing transcription factors, namely NF-IL-6 and NF-κB. This created the prerequisite for activating these transcription factors in response to the occurrence of adenovirus or
Transfektionskomplexes rasch zu untersuchen. Um die Aktivierung von NF-KB zu testen, wurde ein Konstrukt eingesetzt, das das Luciferasegen unter der Kontrolle einer einfachen TATA-Box und drei NF-κB- Bindungselementen enthält. Ferner wurde ein auf To examine the transfection complex quickly. In order to test the activation of NF-KB, a construct was used which contains the luciferase gene under the control of a simple TATA box and three NF-κB binding elements. Furthermore, an on
NF-IL-6/NF-κB ansprechendes, vom IL-6-Promotor NF-IL-6 / NF-κB responsive, from the IL-6 promoter
getriebenes Luciferasekonstrukt verwendet. Das driven luciferase construct used. The
Aktivierungsverhalten der beiden Reporterzellinien bestätigte, daß die Promotoren außer auf ihre bereits früher charakterisierten Aktivatoren LPS und PMA auch auf Adenovirus, und zwar sowohl auf nicht-inaktiviertes auch auf Psoralen/UV-inaktiviertes, ansprechen (Tabelle 1). Es zeigte sich, daß die Aktivierung durch Psoralen- inaktiviertes Virus im selben Ausmaß wie mit nicht- inaktiviertem Virus stattfand. Dies stützt die Theorie, daß es nicht die frühe Virusgenexpression ist, die diese Faktoren aktiviert, sondern eher die Bindung und der Eintritt von Adenovirus. Activation behavior of the two reporter cell lines confirmed that the promoters responded not only to their previously characterized activators LPS and PMA but also to adenovirus, both to non-inactivated and to psoralen / UV-inactivated (Table 1). It was shown that the activation by psoralen-inactivated virus took place to the same extent as with the non-inactivated virus. This supports the theory that it is not early viral gene expression that activates these factors, but rather the binding and entry of adenovirus.
Für die in Schritt b) unter i) definierte Maßnahme der äußerlichen Behandlung mit anti-inflammatorischen For the measure of external treatment with anti-inflammatory treatment defined in step b) under i)
Substanzen kommt z.B. die Behandlung mit Retinsäure ("Retinoic acid") oder anderen Retinoiden, in Betracht, von denen berichtet wurde, daß sie die IL-1-induzierte Produktion von IL-6 durch Lungenfibroblasten inhibieren (Gross et al., 1993; Zitnik et al., 1994). Die Substances come, for example, treatment with retinoic acid ("Retinoic acid") or other retinoids, which have been reported to inhibit IL-1-induced IL-6 production by lung fibroblasts (Gross et al., 1993; Zitnik et al., 1994). The
Wirkungsweise dieser Substanzklasse dürfte darin bestehen, daß sie die Konzentration der IL-6-mRNA steuern. Mode of action of this class of substances is likely to be that they control the concentration of the IL-6 mRNA.
Eine weitere Substanzklasse für die Inhibierung der inflammatorischen Wirtsantwort sind die Another class of substances for inhibiting the inflammatory host response are
Glucocorticoide, von denen gezeigt wurde, daß sie die Produktion von IL-6 und/oder IL-8 als Antwort auf inflammatorische Stimuli inhibieren (Ray et al., 1990; Barber et al., 1993; Wertheim et al., 1993). Glucocorticoids that have been shown to inhibit the production of IL-6 and / or IL-8 in response to inflammatory stimuli (Ray et al., 1990; Barber et al., 1993; Wertheim et al., 1993).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, daß das Glucocorticoid Dexamethason die In the context of the present invention it could be shown that the glucocorticoid dexamethasone
Genexpression sowohl allein als auch im Zusammenwirken mit dem anti-Apoptose-Gen EIB 19K verstärkt. Gene expression both alone and in cooperation with the anti-apoptosis gene EIB 19K increased.
Dexamethason wirkt auf die Aktivierung des Enzyms Dexamethasone acts on the activation of the enzyme
Phosopholipase A2, die als eine der Folgen einer Phosopholipase A2, which is one of the consequences of a
Entzündung (Barnes und Adcock, 1993) stattfindet. Inflammation (Barnes and Adcock, 1993) takes place.
Dieses Enzym wird als Reaktion auf zahlreiche This enzyme is used in response to numerous
inflammatorische Signale aktiviert und führt zur inflammatory signals activated and leads to
Freisetzung von Arachidonsäure. Arachidonic acid release.
Eine weitere im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbare Gruppe anti-inflammatorischer Substanzen sind Inhibitoren des Arachidonsäure-Metabolismus. Another group of anti-inflammatory substances that can be used in the context of the present invention are inhibitors of arachidonic acid metabolism.
Arachidonsäure wird über den Cyclooxygenaseweg zu proinflammatorischen Prostaglandinen und Thromboxanen metabolisiert. Dieser Weg, der schematisch in Fig. 12 dargestellt ist, kann durch die Arachidonic acid is metabolized to proinflammatory prostaglandins and thromboxanes via the cyclooxygenase pathway. This path, which is shown schematically in Fig. 12, can be done by the
Cyclooxygenaseinhibitoren Aspirin (Acetylsalicylsäure), Ibuprofen oder Indomethacin (Flower et al., 1985) inhibiert werden. Eine weitere Aktivierung durch Cyclooxygenase inhibitors aspirin (acetylsalicylic acid), Ibuprofen or indomethacin (Flower et al., 1985) can be inhibited. Another activation by
Arachidonsäure läuft über die 5-Lipoxygenase- Prozessierung, wobei Leukotriene gebildet werden. Arachidonic acid runs through the 5-lipoxygenase processing, whereby leukotrienes are formed.
5-Lipoxygenase kann durch NDGA (Nordihydroguaiaretic Acid; Burkart und Kolb, 1993; Cifone et al., 1993; 5-Lipoxygenase can be obtained by NDGA (Nordihydroguaiaretic Acid; Burkart and Kolb, 1993; Cifone et al., 1993;
Conti et al., 1993; Pasquale et al., 1993; Rao et al., 1993) oder durch 5,8,11-Eicosatriynonsäure (5,8,11- Eicosatriynoic Acid; Pace et al., 1993) inhibiert werden. Weitere Inhibitoren der 5-Lipoxygenase wurden von McMillan und Walker, 1992, beschrieben. Conti et al., 1993; Pasquale et al., 1993; Rao et al., 1993) or by 5,8,11-eicosatriynoic acid (5,8,11-eicosatriynoic acid; Pace et al., 1993). Additional 5-lipoxygenase inhibitors have been described by McMillan and Walker, 1992.
Außer durch die genannten anti-inflammatorisch Except through the anti-inflammatory mentioned
wirkenden Substanzen kann die Behandlung der Zellen auch mit anti-inflammatorisch wirkenden Polypeptiden, wie IL-10 oder TGF-ß erfolgen. active substances, the cells can also be treated with anti-inflammatory polypeptides such as IL-10 or TGF-β.
Für die äußerliche Behandlung der Zellen wird die anti- inflammatorisch wirkende Substanz zweckmäßig dem Medium beigegeben. For the external treatment of the cells, the anti-inflammatory substance is expediently added to the medium.
Gemäß Schritt b) ii) wird die anti-inflammatorische Substanz als solche bzw. in einer bevorzugten According to step b) ii), the anti-inflammatory substance as such or in a preferred one
Ausführungsform in Form der dafür kodierenden DNA in die Zelle eingeführt, z.B. in Form eines Plasmids, das eine für ein anti-inflammatorisches Protein wie IL-10 (Moore et al., 1990) oder TGF-ß (Massague et al., 1987) kodierende Sequenz enthält. Embodiment in the form of the DNA coding therefor introduced into the cell, e.g. in the form of a plasmid which contains a sequence coding for an anti-inflammatory protein such as IL-10 (Moore et al., 1990) or TGF-β (Massague et al., 1987).
Eine im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt verwendete anti-inflammatorisch wirkende Substanz ist VA1. Adenovirus VA1-RNA ist ein kleines, von RNA- Polymerase III synthetisiertes RNA-Molekül, welches für die effiziente Expression des Virusgenoms A preferred anti-inflammatory substance used in the context of the present invention is VA1. Adenovirus VA1-RNA is a small RNA molecule synthesized by RNA polymerase III, which is necessary for the efficient expression of the virus genome
verantwortlich ist. Angesichts von Berichten, daß doppelsträngige RNA NF-κB aktiviert (Visvanathan und Goodbourn, 1989) und der bekannten Wirkung VA1-RNA, die Aktivierung der dsRNA- aktivierten Kinase p68 zu blockieren, wurde untersucht, ob die Einführung eines VA1-Gens die Aktivierung von NF-κB, die durch den Eintritt von responsible for. In light of reports that double-stranded RNA activates NF-κB (Visvanathan and Goodbourn, 1989) and the known effect of VA1-RNA to block the activation of dsRNA-activated kinase p68, it was examined whether the introduction of a VA1 gene activated the activation of NF-κB caused by the entry of
Transfektionskomplexen aus Adenovirus/Polylysin/DNA ausgelöst wird, blockiert.  Blocked transfection complexes from adenovirus / polylysine / DNA.
Es wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung It was within the scope of the present invention
festgestellt, daß die Expression des Adenovirus-VA1- Gens (hervorgerufen durch Inkorporierung der für VA1 kodierenden DNA in den Transfektionskomplex) die found that the expression of the adenovirus VA1 gene (caused by incorporation of the DNA coding for VA1 into the transfection complex)
Aktivierung von NF-KB durch Adenovirus auf das 1.5fache des Grundwerts verringerte. Es kann somit die Activation of NF-KB by adenovirus reduced to 1.5 times the baseline. It can therefore
Expression des Adenovirus VA1-Gens während der Expression of the adenovirus VA1 gene during the
Transfektion dazu benutzt werden, die Aktivierung von NF-κB, die durch den Transfektionsprozeß ausgelöst wird, zu modulieren. Transfection can be used to modulate the activation of NF-κB that is triggered by the transfection process.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung gemachte The made within the scope of the present invention
Beobachtung, daß die VA1-Expression die Aktivierung inflammatorischer Zytokine hemmt, dürfte auf ein von der Erhöhung der Stabilität der mRNA oder deren Menge, wie sie für die Calciumphosphatmethode berichtet wurde, unabhängiges Phänomen zurückzuführen sein. An diesem Phänomen ist möglicherweise die Inhibierung der p68- Kinase-Aktivierung entscheidend beteiligt. Observation that VA1 expression inhibits the activation of inflammatory cytokines may be due to a phenomenon that is independent of the increase in the stability of the mRNA or its amount, as reported for the calcium phosphate method. Inhibition of p68 kinase activation may play a key role in this phenomenon.
Die VA1 kann als RNA-Molekül oder, in einer bevorzugten Ausführungsform, in Form der VA1-DNA in die Zelle importiert werden. Dabei kann ein Plasmid, das die VA1- Sequenz, gegebenenfalls in Mehrfachkopie, enthält, gemeinsam mit dem Plasmid mit der wirksamen DNA und dem Plasmid mit dem anti-Apoptose-Gen in The VA1 can be imported into the cell as an RNA molecule or, in a preferred embodiment, in the form of the VA1 DNA. A plasmid which contains the VA1 sequence, optionally in a multiple copy, together with the plasmid with the active DNA and the plasmid with the anti-apoptosis gene in
Transfektionskomplexe integriert werden. Es ist auch möglich, zwei der drei Sequenzen, oder auch alle drei, auf einem einzigen Plasmid zu vereinigen. Transfection complexes are integrated. It is also possible to combine two of the three sequences, or all three, on a single plasmid.
Ein Beispiel für eine im Rahmen der Gentherapie An example of one in the context of gene therapy
anwendbare Dreierkombination wäre eine Kombination aus einer DNA, enthaltend die Faktor VIII-Sequenz als therapeutisch wirksame DNA, einem anti-Apoptose-Gen wie bei-2 oder EIB 19K und der VA1-DNA. applicable combination of three would be a combination of a DNA containing the factor VIII sequence as therapeutically effective DNA, an anti-apoptosis gene such as in-2 or EIB 19K and the VA1 DNA.
Alternativ zu VA1-DNA können Gene verwendet werden, die eine VA1 entsprechende Wirkung haben, z.B. EBER des Epstein Barr Virus (Clarke et al., 1990; Clarke et al., 1991) oder die TAR-RNA vom HIV-Virus (Gunnery et al., 1990). As an alternative to VA1 DNA, genes can be used which have an effect corresponding to VA1, e.g. EBER of the Epstein Barr virus (Clarke et al., 1990; Clarke et al., 1991) or the TAR-RNA from the HIV virus (Gunnery et al., 1990).
Die Erfindung bezieht sich in einem weiteren Aspekt auf einen Transfektionskomplex, enthaltend ein in der Zelle zu exprimierendes Nukleinsäuremolekül, das mit einem, gegebenenfalls mit einem Liganden für die Zielzelle konjugierten, Polykation komplexiert ist, sowie In a further aspect, the invention relates to a transfection complex containing a nucleic acid molecule to be expressed in the cell, which is complexed with a polycation, optionally conjugated with a ligand for the target cell, and
Adenovirus oder ein Adenovirus-Polykation-Konjugat, wobei der Komplex außerdem ein DNA-Molekül mit Anti- Apoptose-Wirkung und/oder ein DNA-Molekül, kodierend für eine Substanz mit anti-inflammatorischer Wirkung, enthält. Adenovirus or an adenovirus-polycation conjugate, wherein the complex also contains a DNA molecule with anti-apoptosis activity and / or a DNA molecule coding for a substance with anti-inflammatory activity.
Die Erfindung bezieht sich außerdem auf eine The invention also relates to a
pharmazeutische Zubereitung, enthaltend einen solchen Transfektionskomplex, in dem das in der Zelle zu exprimierende Nukleinsäuremolekül ein therapeutisch oder gentherapeutisch wirksames DNA-Molekül ist. Neben dem Transfektionskomplex enthält die pharmazeutische Zubereitung die für die Anwendung auf Zellen üblichen Zusätze, wie Nährstoffe, etc. Figurenübersicht Pharmaceutical preparation containing such a transfection complex in which the nucleic acid molecule to be expressed in the cell is a therapeutically or gene-therapeutically effective DNA molecule. In addition to the transfection complex, the pharmaceutical preparation contains the usual additives, such as nutrients, etc., for use on cells. Figure overview
Fig. 1: Zeitverlauf der Aktivierung von NF-IL-6 und Fig. 1: Time course of activation of NF-IL-6 and
NF-κB  NF-κB
Fig. 2: Blockierung der Aktivierung von NF-KB durch Fig. 2: Blocking the activation of NF-KB by
Expression von VA1  Expression of VA1
Fig. 3: Blockierung der Aktivierung des IL-6-Promotors durch Expression von VA1 Fig. 3: Blocking the activation of the IL-6 promoter by expression of VA1
Fig. 4: Einfluß der Expression von EIA, EIA 13S, EIB, 4: Influence of the expression of EIA, EIA 13S, EIB,
EIB 19K und Bcl-2 auf die Genexpression  EIB 19K and Bcl-2 on gene expression
Fig. 5: Einfluß der Expression von EIB 19K, EIA und Fig. 5: Influence of the expression of EIB 19K, EIA and
Bei-2 auf die Genexpression bei verschiedenen At-2 on gene expression at various
Virusdosen Virus doses
Fig. 6: Einfluß der Expression von Bcl-2, EIB 19K, EIA und EIA 13S auf die Langzeitgenexpression Fig. 7: Einfluß der Transfektion auf die Morphologie von Fibroblasten 6: Influence of the expression of Bcl-2, EIB 19K, EIA and EIA 13S on the long-term gene expression. FIG. 7: Influence of the transfection on the morphology of fibroblasts
Fig. 8: Inhibierung der durch Adenovirus bzw. LPS Fig. 8: Inhibition of adenovirus or LPS
hervorgerufenen Toxizität durch Prä-Expression von EIB 19K und Bcl-2  toxicity caused by pre-expression of EIB 19K and Bcl-2
Fig. 9: Verstärkung des Gentransfers durch Fig. 9: Enhancement of gene transfer by
Dexamethason allein oder in Kombination mit Dexamethasone alone or in combination with
EIB 19K EIB 19K
Fig. 10: Verstärkung des Gentransfers durch Fig. 10: Enhancement of gene transfer by
Dexamethason oder Aspirin allein oder in  Dexamethasone or aspirin alone or in
Kombination mit EIB 19K  Combination with EIB 19K
Fig. 11: Wirkung von Dexamethason, Ibuprofen oder Fig. 11: Effect of dexamethasone, ibuprofen or
5,8,11-Eicosatriynonsäure allein oder in  5,8,11-eicosatriynonic acid alone or in
Gegenwart von EIB 19K  Presence of EIB 19K
Fig. 12: Vergleich der Verstärkung der Genexpression durch verschiedene Inhibitoren von Fig. 12: Comparison of the enhancement of gene expression by different inhibitors of
Arachidonsäure-Metaboliten  Arachidonic acid metabolites
Fig. 13: Restriktionskarte des CELO-Virusgenoms und Fig. 13: Restriction map of the CELO virus genome and
Karte der offenen Leserahmen des EcoRI- Map of the open reading frames of the EcoRI
Fragments 9R1 Fig. 14: Sequenz des CELO-Virus-Smal/Hindlll-Fragments von 9R1 (9R1S/H3) Fragments 9R1 14: Sequence of the CELO virus Smal / Hindlll fragment of 9R1 (9R1S / H3)
Fig. 15: Genexpression in Gegenwart der Fragmente 7H3, 15: gene expression in the presence of fragments 7H3,
9R1 und 9R1S/H3  9R1 and 9R1S / H3
Fig. 16: Anti-apoptotische Wirkung verschiedener CELO- Virus-Fragmente Fig. 16: Anti-apoptotic effect of various CELO virus fragments
Fig. 17: Offene Leserahmen des EcoRI-Fragments von Fig. 17: Open reading frame of the EcoRI fragment from
CELO-Virus  CELO virus
Fig. 18: Zuordnung der anti-apoptotischen Wirkung zum richtigen Leserahmen. Vergleich verschiedenderFig. 18: Assignment of the anti-apoptotic effect to the correct reading frame. Comparison of different
Mutanten Mutants
Fig. 19: Einfluß der Mutation des Leucin-Zippers auf die anti-apoptotische Wirkung Fig. 19: Influence of the mutation of the leucine zipper on the anti-apoptotic effect
Fig. 20: Wirkung des CELO-Virus-Gens auf die durch Fig. 20: Effect of the CELO virus gene on the
Loslösen der Zellen von der Unterlage ausgelöste Apoptose  Detachment of the cells from the substrate triggered apoptosis
Fig. 21: Vergleich der Wirkung verschiedener anti- apoptotisch wirkender Gene auf die durch Fig. 21: Comparison of the effect of different anti-apoptotic genes on the
Loslösen der Zellen von der Unterlage ausgelöste Apoptose  Detachment of the cells from the substrate triggered apoptosis
Fig. 22: Wirkung der Kombinationen verschiedener Gene mit anti-apoptotischer Wirkung Fig. 22: Effect of combinations of different genes with anti-apoptotic effects
In den folgenden Beispielen wurden, wenn nicht anders angegeben, die folgenden Materialien und Methoden verwendet: a) DNA-Plasmide i) Expressionsplasmid für die Adenovirus-VA1-Sequenz Unless otherwise stated, the following materials and methods were used in the following examples: a) DNA plasmids i) expression plasmid for the adenovirus VA1 sequence
Zunächst wurde die gesamte El-Region von Adenovirus Typ 5 (Nukleotid 1-5778) erhalten, indem die Adenovirus dll014-DNA (Bridge und Ketner, 1989) mit Xhol plus Asel verdaut wurde. Dieses Fragment wurde mit Klenow- Polymerase behandelt und in die Smal-Stelle des First, the entire El region of adenovirus type 5 (nucleotide 1-5778) was obtained by digesting the adenovirus dll014 DNA (Bridge and Ketner, 1989) with Xhol plus Asel. This fragment was made with Klenow Polymerase treated and in the Smal site of the
Plasmids pAALM (erhalten aus pSP64 (Boehringer Plasmids pAALM (obtained from pSP64 (Boehringer
Mannheim), indem dessen kleines EcoRI/PvuII-Fragment (bp 53 - bp 232) ersetzt wurde durch das EcoRI/PvuII- Fragment (bp 59 - bp 104) von pSPT18 (Boehringer Mannheim), by replacing its small EcoRI / PvuII fragment (bp 53 - bp 232) with the EcoRI / PvuII fragment (bp 59 - bp 104) from pSPT18 (Boehringer
Mannheim)) ligiert, wodurch pElpaalm erhalten wurde. Das VA1-Expressionsplasmid pXVAH wurde konstruiert, indem das 5324 bp HindiII-Fragment (Nukleotid 6241- 11656) der Adenovirus-DNA in die Hindlll-Stelle von pAALM inseriert wurde, um pHVAH zu erhalten. pHVAH wurde daraufhin mit XBal gespalten und religiert, um pXVAH zu erhalten (dadurch wurde ein großes Stück, von der XBal-Stelle in pAALM bis zur XBal-Stelle bei Mannheim)) ligated, whereby pElpaalm was obtained. The VA1 expression plasmid pXVAH was constructed by inserting the 5324 bp HindII fragment (nucleotide 6241-11656) of the adenovirus DNA into the HindIII site of pAALM to obtain pHVAH. pHVAH was then cleaved with XBal and religated to obtain pXVAH (this made a large piece from the XBal site in pAALM to the XBal site
Position 10589 in der Adenovirussequenz, entfernt). Der erhaltene Klon pXVAH enthielt die Adenovirussequenz von Nukleotid 10589-11565. ii) Luciferasereporterplasmid pNF-κB-Luc Position 10589 in the adenovirus sequence, removed). The clone pXVAH obtained contained the adenovirus sequence of nucleotide 10589-11565. ii) Luciferase reporter plasmid pNF-κB-Luc
Das auf NF-κB ansprechende Plasmid pNF-κB-Luc wurde als ein Derivat des von Boehmelt et al., 1992, The plasmid pNF-κB-Luc responsive to NF-κB was developed as a derivative of that described by Boehmelt et al., 1992,
beschriebenen Plasmids pTK3kbB konstruiert. Dazu wurde pTK3kbB mit Xhol und Ncol geschnitten, um das meiste der für CAT kodierenden Sequenz zu entfernen, mit plasmid pTK3kbB described constructed. To do this, pTK3kbB was cut with Xhol and Ncol to remove most of the sequence coding for CAT with
Klenow-Enzym behandelt und ligiert mit einem Klenow- behandelten Hindlll/Sspl-Fragment von pRSVL, enthaltend die Luciferasesequenz (De Wet et al., 1987). Dies ergab das Plasmid p3K-Luc, welches eine Klenow enzyme treated and ligated with a Klenow-treated HindIII / Sspl fragment of pRSVL containing the luciferase sequence (De Wet et al., 1987). This resulted in the plasmid p3K-Luc, which is a
Dreifachbindungsstelle für den Transkriptionsfaktor NF-κB plus die Luciferasesequenz, getrieben von einer Thymidinkinase (TK) TATA-Box, enthält. iii) Luciferasekonstrukt pIL-6-Luc Es wurde das von Matsusaka et al., 1993, beschriebene Konstrukt, das die vom IL-6-Promotor getriebene Triple binding site for the transcription factor NF-κB plus the luciferase sequence, driven by a thymidine kinase (TK) TATA box, contains. iii) Luciferase construct pIL-6-Luc It became the construct described by Matsusaka et al., 1993, that driven by the IL-6 promoter
Luciferasesequenz enthält, verwendet. iv) Expressionsplasmid für EIA 13S Contains luciferase sequence used. iv) Expression plasmid for EIA 13S
Es wurde das von Kedinger et al., 1984, beschriebene Expressionsplasmid der Bezeichnung pl3S, das den endogenen EIA-Promotor verwendet, um die EIA 13S-CDNA zu treiben, verwendet. v) Expressionsplasmide für EIA, EIB und EIB 19K The pl3S expression plasmid described by Kedinger et al., 1984, using the endogenous EIA promoter to drive the EIA 13S CDNA was used. v) Expression plasmids for EIA, EIB and EIB 19K
Die verwendeten Expressionsplasmide der Bezeichnung pCMVE1A, pCMVE1B und pCMV19K wurden von White und The expression plasmids named pCMVE1A, pCMVE1B and pCMV19K were from White and
Cipriani, 1989 und 1990, beschrieben. vi) Expressionsplasmid für Bel-2 Cipriani, 1989 and 1990. vi) Expression plasmid for Bel-2
Das Expressionsplasmid der Bezeichnung pCMV-Bcl-2 wurde hergestellt, indem die humane Bcl-2 cDNA, flankiert von zwei EcoRI-Stellen (Seto et al., 1988), stromabwärts von einem CMV-Immediate-early-Promotor in das The expression plasmid, designated pCMV-Bcl-2, was prepared by the human Bcl-2 cDNA, flanked by two EcoRI sites (Seto et al., 1988), downstream from a CMV immediate early promoter in the
Expressionsplasmid pBK-CMV (Stratagene) kloniert wurde. vii) Plasmid-DNA pCMVL ie Konstruktion des Plasmids ist in der WO 93/07283 beschrieben. viii) Plasmid-DNA pCMVßgal Expression plasmid pBK-CMV (Stratagene) was cloned. vii) Plasmid DNA pCMVL The construction of the plasmid is described in WO 93/07283. viii) plasmid DNA pCMVßgal
Es wurde das von Lim und Chae, 1989, beschriebene It was described by Lim and Chae, 1989
Plasmid verwendet. b) Adenovirus d11014 DNA-Präparation Plasmid used. b) Adenovirus d11014 DNA preparation
Das E4-defiziente Adenovirus 5, dll014 (Bridge und Ketner, 1989) wurde in der komplementierenden Zellinie W162 (Weinberg und Ketner, 1983) gezüchtet. Pellets von infizierten Zellen wurden zu 2 ml/2 x 107 Zellen in 20 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM PMSF The E4-deficient adenovirus 5, dll014 (Bridge and Ketner, 1989) was grown in the complementing cell line W162 (Weinberg and Ketner, 1983). Pellets from infected cells became 2 ml / 2 x 10 7 cells in 20 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM PMSF
(Phenylmethylsulfonylfluorid) suspendiert und drei Gefrier-/Auftauzyklen (flüssiger Stickstoff, 37ºC) unterworfen. Die Suspension wurde dann mit einem gleichen Volumen Freon, im Vortex gemischt und 10 min lang bei 3.000 rpm (Heraeus Sepatech, 2705 Rotor) zentrifugiert. Die wäßrige (obere) Phase wurde  (Phenylmethylsulfonyl fluoride) and subjected to three freeze / thaw cycles (liquid nitrogen, 37 ° C). The suspension was then vortexed with an equal volume of freon and centrifuged for 10 minutes at 3,000 rpm (Heraeus Sepatech, 2705 rotor). The aqueous (upper) phase became
aufgehoben, und die Freonphase wurde mit 1/5 Volumen 20 mM HEPES, pH 7.4 im Vortex behandelt und nochmals zentrifugiert. Die wäßrigen Phasen wurden vereinigt, in ein Beckman VT150 Zentrifugenröhrchen (15 ml/Röhrchen) überführt und mit 15 ml 1.2 g/cm3 CsCl/20 mM HEPES, pH 7.4 und 7 ml 1.45 g/cm3 CsCl, 20 mM HEPES pH 7.4 unterschichtet. Die Proben wurden 40 min lang bei 20ºC in einem Beckman VTi50 Rotor bei 49.000 rpm canceled, and the freon phase was treated with 1/5 volume 20 mM HEPES, pH 7.4 in the vortex and centrifuged again. The aqueous phases were combined, transferred to a Beckman VT150 centrifuge tube (15 ml / tube) and with 15 ml 1.2 g / cm 3 CsCl / 20 mM HEPES, pH 7.4 and 7 ml 1.45 g / cm 3 CsCl, 20 mM HEPES pH 7.4 sub-layered. The samples were run at 20 ° C for 40 minutes in a Beckman VTi50 rotor at 49,000 rpm
zentrifugiert. Die untere opaleszierende Bande von reifen Viruspartikeln bei 1.34 bis 1.35 g/cm3 (gemessen mittels Brechungsindex) und die obere Bande (unreife Teilchen bei 1.31 bis 1.32 g/cm3) wurden getrennt gesammelt und einer Gleichgewichtszentrifugation (mehr als 4 h) bei 63.000 rpm in einem VT165 Rotor centrifuged. The lower opalescent band of mature virus particles at 1.34 to 1.35 g / cm 3 (measured by refractive index) and the upper band (immature particles at 1.31 to 1.32 g / cm 3 ) were collected separately and an equilibrium centrifugation (more than 4 h) at 63,000 rpm in a VT165 rotor
unterworfen. Die opaleszenten Virusbanden (entweder 1.31 g/cm3 unreife oder 1.34 g/cm3 reife) wurden geerntet. Die Biotinylierung der erhaltenen subject. The opalescent virus bands (either 1.31 g / cm 3 immature or 1.34 g / cm 3 mature) were harvested. The biotinylation of the obtained
Viruspartikel mit N-hydroxysuccinimid-Biotin (Pierce), die Inaktivierung mit 8-Methoxypsoralen/UVA und die Reinigung mittels Gelfiltration unter Verwendung einer Pharmacia PD10-Säule, equilibriert mit HBS/40 % Virus particles with N-hydroxysuccinimide biotin (Pierce), inactivation with 8-methoxypsoralen / UVA and purification by gel filtration using a Pharmacia PD10 column, equilibrated with HBS / 40%
Glyzerin wurden durchgeführt, wie in der WO 93/07283 bzw. von Wagner et al., 1992, und Cotten et al., 1992, beschrieben. Die Virusproben wurden quantitativ über die Proteinkonzentration bestimmt (Biorad Bradford Assay mit BSA als Standard) analysiert, wobei die Glycerin was carried out as described in WO 93/07283 or by Wagner et al., 1992, and Cotten et al., 1992, described. The virus samples were quantitatively determined via the protein concentration (Biorad Bradford assay with BSA as standard), the
Beziehung 1 mg/ml Protein = 3.4 x 1012 Relationship 1 mg / ml protein = 3.4 x 10 12
Adenoviruspartikel/ml (Lemay et al., 1980) verwendet wurde. c) Transferrin-Polylysin-Konjugate (TfpL) Adenovirus particles / ml (Lemay et al., 1980) was used. c) Transferrin-polylysine conjugates (TfpL)
Zur Synthese von Konjugaten aus Transferrin und For the synthesis of conjugates from transferrin and
Polylysin mit einer Kettenlänge von 290 Lysinresten wurde die Wagner et al., 1991, beschriebene Methode eingesetzt. d) Streptavidin-Polylysin-Konjugate (StpL) Polylysine with a chain length of 290 lysine residues was used the method described in Wagner et al., 1991. d) Streptavidin-polylysine conjugates (StpL)
Die Konjugate wurden hergestellt, wie in der WO The conjugates were prepared as in WO
93/07283 beschrieben, wobei Polylysin 250 verwendet wurde. e) Adenovirus/DNA-Komplexe 93/07283, using polylysine 250. e) Adenovirus / DNA complexes
Proben von biotinyliertem, Psoralen/UV-inaktiviertem Adenovirus d11014 (8 μl, 1 x 1012 Partikel/ml) wurden in 150 μl HBS verdünnt und mit 1 μg StpL in 150 μg HBS 30 min bei Raumtemperatur gemischt. Aliquots von 6 μg Plasmid-DNA (im Falle von Mischungen von pCMVL-DNA und einem anderen Plasmid betrug das Verhältnis 5:1) wurden in 100 μl HBS verdünnt und dann mit der Samples of biotinylated, psoralen / UV inactivated adenovirus d11014 (8 μl, 1 × 10 12 particles / ml) were diluted in 150 μl HBS and mixed with 1 μg StpL in 150 μg HBS for 30 min at room temperature. Aliquots of 6 μg plasmid DNA (in the case of mixtures of pCMVL-DNA and another plasmid the ratio was 5: 1) were diluted in 100 μl HBS and then with the
Adenovirus/StpL-Lösung 30 min bei Raumtemperatur gemischt. Abschließend wurde ein 100 μl Aliquot von HBS, enthaltend 5 μg TfpL, jeder Probe beigegeben, gefolgt von 30 minütiger Inkubation bei Raumtemperatur. Aliquots dieser Transfektionskomplexe wurden dann, wie in den jeweiligen Beispielen einzeln beschrieben, auf die Zellen aufgegeben (im allgemeinen 10 bis 30 Adenovirus / StpL solution mixed for 30 min at room temperature. Finally, a 100 µl aliquot of HBS containing 5 µg TfpL was added to each sample, followed by incubation at room temperature for 30 minutes. Aliquots of these transfection complexes were then made up as described individually in the respective examples the cells abandoned (generally 10 to 30
μl/20.000 Zellen). f) Reporterzellinien μl / 20,000 cells). f) reporter cell lines
Für die Herstellung der klonalen Zellinien, enthaltend das Reporterplasmid pNF-κB-Luc oder pIL-6-Luc, wurde von der humanen Lungenkarzinomzellinie A549 (ATCC CCL 185) ausgegangen. Die Plasmide wurden mit dem Neomycin- Phosphotransferase-Expressionsplasmid der Bezeichnung pMuatt (ein pUCl9-Plasmid, enthaltend die TKneo- Sequenz; Grosveld et al., 1982) unter Verwendung der Transfeetam-Methode (Behr et al., 1989) co-transfiziert und auf Zellen, die resistent gegen 400 μg/ml G418 (Sigma) sind, selektioniert. Klonale Derivate, die Luciferase nach Induktion durch PMA exprimierten, wurden identifiziert und expandiert. The human lung carcinoma cell line A549 (ATCC CCL 185) was used for the production of the clonal cell lines containing the reporter plasmid pNF-κB-Luc or pIL-6-Luc. The plasmids were co-transfected with the neomycin phosphotransferase expression plasmid called pMuatt (a pUCl9 plasmid containing the TKneo sequence; Grosveld et al., 1982) using the Transfeetam method (Behr et al., 1989) selected for cells that are resistant to 400 μg / ml G418 (Sigma). Clonal derivatives that expressed luciferase after induction by PMA were identified and expanded.
Auf ähnliche Weise wurden A549-Zellen erhalten, die das Expressionsplasmid für Bcl-2 bzw. EIB 19K enthalten, mit dem Unterschied, daß das A549 cells containing the expression plasmid for Bcl-2 and EIB 19K were obtained in a similar manner, with the difference that the
Neomycinphosphotransferase-Plasmid pSVneo (Clontech) statt pMuatt und daß statt reinen Populationen Pools von G418-resistenten Klonen verwendet wurden. g) Humanfibroblasten  Neomycin phosphotransferase plasmid pSVneo (Clontech) instead of pMuatt and that pools of G418-resistant clones were used instead of pure populations. g) human fibroblasts
Nach der chirurgischen Entfernung wurden Hautbiopsien in 4ºC DMEM, enthaltend 10 % hitzeinaktiviertes FCS, 2 mM Glutamin und Gentamycin, gegeben. Die Biopsien wurden in einer Gewebekultureinrichtung ausgiebig mit Pinzette und chirurgischem Messer im laminaren After surgical removal, skin biopsies were placed in 4 ° C DMEM containing 10% heat inactivated FCS, 2 mM glutamine and gentamycin. The biopsies were extensively performed in a tissue culture facility using tweezers and a surgical knife in the laminar
Luftstrom in sterilen 6 cm Plastikschalen zerkleinert. Dann wurden 3 ml DMEM, enthaltend 20 % FCS, 2 mM Airflow crushed in sterile 6 cm plastic dishes. Then 3 ml of DMEM containing 20% FCS, 2 mM
Glutamin und Antibiotika beigegeben, und die Kultur in einen 37ºC Brutschrank gegeben. Nach 10 Tagen wurde das Medium durch DMEM, enthaltend 10 % FCS, ausgetauscht. Dann wurde das Medium weiter 2 x wöchentlich Glutamine and antibiotics were added and the culture placed in a 37ºC incubator. After 10 days it was Medium replaced by DMEM containing 10% FCS. Then the medium was continued twice a week
gewechselt. 4 Wochen nach Beginn der Kultur wurden die Zellen, die aus den Gewebsfragmenten herausgewachsen waren, trypsinisiert und für die Transfektion in neue Kulturschalen ausplattiert. changed. 4 weeks after the start of the culture, the cells that had grown out of the tissue fragments were trypsinized and plated out for new culture dishes for transfection.
Eine alternative, bevorzugte Methode bestand darin, die Hautstücke nach der Zerkleinerung in frisches Medium zu überführen und nach Bedarf 1 bis 2 x mit Medium zu waschen. 5 bis 10 Gewebestücke wurden in eine T25- Gewebekulturflasche, deren Oberfläche mit DMEM plus 10 % FCS benetzt worden war, gegeben und gleichmäßig verteilt, worauf die Flasche umgedreht wurde. Dies bewirkte, daß die Biopsien herunterhängen ( "hanging drop configuration"; diese Methode wurde von Jones, 1989, beschrieben). Nach 1 bis 3 h im Brutschrank wurden die Flaschen wieder umgedreht und mit 1 bis 2 ml Medium befüllt. Festsitzende Biopsien wurden nach 24 h auf 5 ml aufgefüllt; andernfalls wurde der Vorgang wiederholt. Nach 6 bis 10 Tagen wuchsen die ersten Fibroblasten aus, von diesem Zeitpunkt an wurde einmal wöchentlich das Medium gewechselt. Sobald die Zellen konfluent waren, wurden sie in eine T75-Flasche An alternative, preferred method was to transfer the pieces of skin into fresh medium after comminution and to wash them with medium once or twice as required. 5 to 10 pieces of tissue were placed in a T25 tissue culture bottle, the surface of which had been wetted with DMEM plus 10% FCS, and distributed evenly, whereupon the bottle was turned over. This caused the biopsies to hang ("hanging drop configuration"; this method was described by Jones, 1989). After 1 to 3 hours in the incubator, the bottles were turned over again and filled with 1 to 2 ml of medium. Fixed biopsies were filled up to 5 ml after 24 h; otherwise the process was repeated. The first fibroblasts grew out after 6 to 10 days, from this point on the medium was changed once a week. Once the cells were confluent, they were placed in a T75 bottle
passagiert. h) Kultur von Fibroblasten auf PolyHEMA-überzogenen Zellkulturplatten passaged. h) Culture of fibroblasts on polyHEMA-coated cell culture plates
Die Platten wurden mit PolyHEMA (poly(2-hydroxy-ethyl- Methacrylat) überzogen, indem 200 μl einer PolyHEMA- Lösung (Sigma, Kat.Nr. P-3932; 10 mg/ml in 95 % The plates were coated with PolyHEMA (poly (2-hydroxyethyl methacrylate) by adding 200 μl of a PolyHEMA solution (Sigma, Cat. No. P-3932; 10 mg / ml in 95%
Ethanol) pro Vertiefung einer 24-Lochplatte gegeben wurden. Der Alkohol wurde über Nacht bei 37ºC Ethanol) per well of a 24-hole plate. The alcohol was at 37 ° C overnight
verdampfen gelassen, dieser Vorgang wurde einmal wiederholt. Nach dem Trocknen des zweiten Überzugs wurden die Platten zweimal mit HBS und einmal mit allowed to evaporate, this process was repeated once. After the second coat has dried the plates were twice with HBS and once with
Medium gewaschen, bevor die Zellen aufgebracht wurden (Methode A). Medium washed before cells were applied (Method A).
Die für die in Fig. 6 dargestellten Versuche The tests shown in Fig. 6
verwendeten Kulturplatten wurden nach einer Methode hergestellt, ähnlich wie von Folkman und Moscona, 1978, beschrieben. Dazu wurden normale Gewebekulturplatten (24-Lochplatten) mit 200 μl pro Vertiefung mit Culture plates used were prepared by a method similar to that described by Folkman and Moscona, 1978. For this purpose, normal tissue culture plates (24-well plates) with 200 μl per well were used
PolyHEMA-Lösung in Alkohol überzogen. Nach Verdampfen des Alkohols über Nacht bei 37ºC wurde der Vorgang wiederholt. Die in der Fig. angegebenen Werte (10-1, 10-2, 10-3) geben die Verdünnungen der ursprünglichen PolyHEMA-Stammlösung (6 g PolyHEMA in 50 ml 95 % PolyHEMA solution coated in alcohol. After evaporating the alcohol overnight at 37 ° C, the process was repeated. The values given in the figure (10 -1 , 10 -2 , 10 -3 ) indicate the dilutions of the original PolyHEMA stock solution (6 g PolyHEMA in 50 ml 95%
Ethanol) an (Methode B). i) Luciferase-Assay Ethanol) (method B). i) Luciferase assay
Die Bestimmung der Luciferaseaktivität wurde The determination of luciferase activity was made
durchgeführt, wie in der WO 93/07283 beschrieben. j) Zytokin-ELISAs carried out as described in WO 93/07283. j) Cytokine ELISAs
Der IL-6-ELISA wurde von R&D Systems, der IL-8-ELISA von Bender MedSystems bezogen. k) LPS-Präparat The IL-6 ELISA was obtained from R&D Systems, the IL-8 ELISA from Bender MedSystems. k) LPS preparation
Es wurde ein kommerziell erhältliches LPS-Präparat aus Escherichia coli (0111:B4, Sigma) verwendet. Das A commercially available LPS preparation from Escherichia coli (0111: B4, Sigma) was used. The
Präparat wurde zu 10 mg/ml in LPS-freiem Wasser gelöst und vor der Herstellung von Serienverdünnungen in LPS- freiem Wasser 5 min lang sonikiert (SONOREX-Bad, The preparation was dissolved in 10 mg / ml in LPS-free water and sonicated in LPS-free water for 5 minutes before making serial dilutions (SONOREX bath,
360 W). Die endgültigen Verdünnungen wurden vor der Verwendung 5 min lang sonikiert. Beispiel 1 360 W). The final dilutions were sonicated for 5 minutes before use. example 1
Aktivierung von NF-IL-6 und NF-κB durch den Eintritt von Adenovirus Activation of NF-IL-6 and NF-κB by the entry of adenovirus
Es wurden stabile Klone der Stable clones of the
Lungenepithelkarzinomzellinie A549 erzeugt, die als Reportergenkonstrukt pNF-KB-luc bzw. pIL-6-luc  Lung epithelial carcinoma cell line A549 generated which as a reporter gene construct pNF-KB-luc or pIL-6-luc
enthielten. Mit diesen beiden Zellinien (im folgenden auch als "A549 NF-κB-Zellen" oder "A549 IL-6-Zellen" bezeichnet) wurde das stimulatorische Verhalten contained. With these two cell lines (hereinafter also referred to as "A549 NF-κB cells" or "A549 IL-6 cells") the stimulatory behavior
verschiedener Agentien auf die folgende Weise getestet: Eine definierte Anzahl von Zellen wurde jeweils different agents tested in the following way: A defined number of cells was tested each
ausplattiert (4 x 104 Zellen pro Vertiefung einer plated (4 x 10 4 cells per well of one
Platte mit 24 Vertiefungen für die A549-NF-κB-Zellen; 4 x 105 Zellen pro Vertiefung einer Platte mit 6 24-well plate for the A549-NF-κB cells; 4 x 10 5 cells per well of a plate with 6
Vertiefungen für die A549-IL-6-Zellen) und 24 bis 48 h später den Testagentien 4 h lang in 2 % Wells for the A549-IL-6 cells) and 24 to 48 h later the test agents for 4 h in 2%
Pferdeserum/DMEM ausgesetzt. Die Zellen wurden dann in frisches Medium gegeben (10 % FCS/DMEM) und für die Luciferaseanalyse (Dreifachbestimmung) zu den in Horse serum / DMEM exposed. The cells were then placed in fresh medium (10% FCS / DMEM) and added to those shown in luciferase analysis (triplicate)
Tabelle 1 angegebenen Zeiten geerntet (Inhalt von 2 bis 3 Vertiefungen pro Probe). Die Kontrollzellen, zu denselben Zeitpunkten geerntet, wurden denselben Harvested times indicated in Table 1 (content of 2 to 3 wells per sample). The control cells, harvested at the same times, were the same
Mediumwechseln ausgesetzt mit dem Unterschied, daß die Testagentien fehlten. Media change exposed with the difference that the test agents were missing.
Das Aktivierungsverhalten jeder dieser Reporterzellen sowie die Konzentration der Testsubstanzen ist in The activation behavior of each of these reporter cells and the concentration of the test substances is in
Tabelle 1 dargestellt (bei der Behandlung mit Table 1 shown (when treated with
Adenovirus/pL/DNA als Stimulus wurden die A549 NF-κB- Zellen mit 20 μl Transfektionskomplex (4 x 108 Adenovirus / pL / DNA as a stimulus were the A549 NF-κB cells with 20 μl transfection complex (4 × 10 8
Viruspartikel entsprechend 104 Viren/Zelle) und die A549 IL-6-Zellen mit 200 μl Transfektionskomplex behandelt, was ebenfalls 104 Viren pro Zelle Virus particles corresponding to 10 4 viruses / cell) and the A549 IL-6 cells with 200 μl transfection complex treated, which is also 10 4 viruses per cell
entsprach). corresponded).
Um den Zeitverlauf der NF-IL-6- und NF-κB-Aktivierung zu bestimmen, wurden die Zellen der beiden Zellinien, die sich in den oben angegebenen Mengen in einer 24- Well-Platte bzw. 6-Well-Platte befanden, wurden mit jeweils 104 Adenovirus dll014 Viruspartikeln pro Zelle behandelt (das entsprach 4 x 108 Viruspartikeln für jede Vertiefung der A549 NF-κB-Zellen bzw. 4 x 109 Viruspartikeln für jede Vertiefung der A549 IL-6- Zellen). Der Zeitverlauf der Induktion ist in Fig. 1 gezeigt: Der IL-6-Promotor ist nach 12 h voll aktiviert und kehrt dann rasch auf sein Ausgangsniveau zurück, während der NF-κB-Promotor aktiviert wird und In order to determine the time course of NF-IL-6 and NF-κB activation, the cells of the two cell lines which were in the amounts indicated above in a 24-well plate and 6-well plate, respectively, were treated with 10 4 adenovirus dll014 virus particles per cell (this corresponded to 4 x 10 8 virus particles for each well of the A549 NF-κB cells or 4 x 10 9 virus particles for each well of the A549 IL-6 cells). The time course of the induction is shown in FIG. 1: The IL-6 promoter is fully activated after 12 h and then quickly returns to its initial level while the NF-κB promoter is activated and
wenigstens 50 h lang aktiv bleibt. Letzterer Befund steht im Gegensatz zum publizierten Aktivierungsprofil von NF-κB selbst, welcher, nach seiner Aktivierung, nach 6 bis 12 h aufgrund der Aktivierung der IKB- Synthese auf das Ausgangsniveau zurückkehrt (Sun et al., 1993; Scott et al., 1993; Chiao et al., 1994). (Eine dafür mögliche Erklärung ist, daß dem verwendeten synthetischen NF-κB-Promotor die geeigneten remains active for at least 50 h. The latter finding is in contrast to the published activation profile of NF-κB itself, which, after its activation, returns to the initial level after 6 to 12 h due to the activation of IKB synthesis (Sun et al., 1993; Scott et al., 1993 ; Chiao et al., 1994). (One possible explanation for this is that the synthetic NF-κB promoter used is the most suitable
inhibitorischen Elemente fehlen, die die inhibitory elements that lack the
Herunterregulierung gewährleisten, während der IL-6- Promotor, eine natürliche Sequenz, die Sequenzen besitzt, die das Funktionieren der normalen Downregulation ensure, while the IL-6 promoter, is a natural sequence that has sequences that function normally
Kontrollfunktionen zulassen.) Allow control functions.)
Beispiel 2 Example 2
Blockierung der Aktivierung von NF-κB durch Expression von VA1 In diesem Beispiel wurde untersucht, ob die Einführung eines VA1-Gens die Aktivierung von NF-κB, die durch den Eintritt von Transfektionskomplexen aus Blocking the activation of NF-κB by expression of VA1 This example investigated whether the introduction of a VA1 gene activated the activation of NF-κB by the entry of transfection complexes
Adenovirus/Polylysin/DNA ausgelöst wird, blockiert. Dazu wurden 4 x 104 A549 NF-κB Testzellen pro Adenovirus / polylysine / DNA is triggered blocked. For this, 4 x 10 4 A549 NF-κB test cells per
Vertiefung einer 24-Well-Platte mit 4 x 108 Deepening a 24-well plate with 4 x 10 8
Psoralen/UV-inaktivierten Adenoviren dl1014, Psoralen / UV-inactivated adenovirus dl1014,
entsprechend 104 Viruspartikeln pro Zelle, oder mit der entsprechenden Anzahl von Viren als Bestandteil der Transfektionskomplexe, entsprechend 20 μl corresponding to 10 4 virus particles per cell, or with the corresponding number of viruses as part of the transfection complexes, corresponding to 20 μl
Transfektionskomplex, behandelt und gefunden, daß eine ähnliche Aktivierung von NF-KB hervorgerufen wird (bis zu 6 bis 7fach nach 72 h). Der Einbau einer für E1B kodierenden DNA in den Transfektionskomplex (500 μl der Komplexmischung enthielten 6 μg pCMVElB-DNA) hatte keine Wirkung auf die Inaktivierung von NF-κB. Im Transfection complex, treated and found that a similar activation of NF-KB is caused (up to 6 to 7 times after 72 h). The incorporation of a DNA coding for E1B into the transfection complex (500 μl of the complex mixture contained 6 μg pCMVElB-DNA) had no effect on the inactivation of NF-κB. in the
Gegensatz dazu verringerte die Expression des In contrast, the expression of the
Adenovirus-VA1-Gens (hervorgerufen durch Inkorporierung der für VA1 kodierenden DNA in den Adenovirus VA1 gene (caused by incorporation of the DNA coding for VA1 in the
Transfektionskomplex; 500 μl enthielten 6 μg pXVAH) die Aktivierung auf das ca. 1.5fache des Grundwertes (Fig. 2; Komplex bedeutet pSP65, Komplex/EIB bedeutet pCMVE1B, Komplex/VA1 bedeutet pXVAH).  Transfection complex; 500 μl contained 6 μg pXVAH) activation to approx. 1.5 times the basic value (FIG. 2; complex means pSP65, complex / EIB means pCMVE1B, complex / VA1 means pXVAH).
Beispiel 3 Example 3
Blockierung der Aktivierung des IL-6-Promotors durch Expression von VA1 Blocking activation of the IL-6 promoter by expression of VA1
Der Promotor für das humane IL-6-Gen enthält The promoter for the human IL-6 gene contains
Bindungssequenzen für die Transkriptionsfaktoren NF-IL- 6 und NF-κB, welche bei der Aktivierung dieses Binding sequences for the transcription factors NF-IL-6 and NF-κB, which upon activation of this
Promotors zusammenwirken (Matsusaka et al., 1993; Betts et al., 1993). Es wurden A549 IL-6 Zellen verwendet, die das Promotors interact (Matsusaka et al., 1993; Betts et al., 1993). A549 IL-6 cells were used
Luciferasegen unter der Kontrolle des IL-6-Promotors (NF-IL-6-luc) enthalten (jede Probe befand sich in einer Vertiefung einer 6-Well-Platte, enthaltend je 4 x 105 Zellen. Es wurden Doppelbestimmungen Contained luciferase gene under the control of the IL-6 promoter (NF-IL-6-luc) (each sample was in a well of a 6-well plate, each containing 4 × 10 5 cells. Duplicate determinations were made
durchgeführt). Außer den Kontrollproben, bei denen nur Mediumwechsel vorgenommen wurden (Probe 1 ) wurden die Zellen mit PMA (Phorbolmyristylacetat; 10-8M; Probe 2), 104 Adenoviruspartikeln, enthalten in 200 μl carried out). In addition to the control samples, in which only medium changes were made (sample 1), the cells were contained in 200 μl with PMA (phorbol myristyl acetate; 10 -8 M; sample 2), 10 4 adenovirus particles
Transferrin-Polylysin/DNA-Komplex, der als DNA pSP65 enthielt (Probe 3), oder mit 104 Virusteilchen, Transferrin-polylysine / DNA complex which contained pSP65 as DNA (sample 3) or with 10 4 virus particles,
enthalten in 200 μl TfpL/DNA-Komplex, der als DNA pXVAH enthielt (Probe 4), behandelt und nach 10 h die contained in 200 ul TfpL / DNA complex, which contained pXVAH as DNA (sample 4), treated and after 10 h the
Luciferaseaktivität als Maß für die IL-6-Aktivierung gemessen. Das Ergebnis der Versuche ist in Fig. 3 dargestellt. Luciferase activity measured as a measure of IL-6 activation. The result of the tests is shown in Fig. 3.
Beispiel 4 Example 4
Teilweise Inhibierung der durch den Eintritt von Partial inhibition of the onset of
Adenovirus stimulierten Sekretion von IL-6 und IL-8 in humanen Hautfibroblasten durch Expression von VA1 Adenovirus stimulated secretion of IL-6 and IL-8 in human skin fibroblasts by expression of VA1
Nachdem sich gezeigt hatte, daß der Eintritt von Virus sowohl einen auf NF-κB ansprechenden Promotor als auch den auf NF-KB/NF-IL-6 ansprechenden IL-6 Promotor stimuliert (Tabelle 1, Fig. 1, 2 und 3), wurde die Produktion von IL-6 bzw. IL-8 durch transfizierte primäre Fibroblasten als ein Maß für die Aktivierung der beiden endogenen Gene, die auf NF-KB/NF-IL-6 ansprechen, analysiert. After the entry of virus was shown to stimulate both a NF-κB-responsive promoter and the NF-KB / NF-IL-6-responsive IL-6 promoter (Table 1, Figures 1, 2 and 3), the production of IL-6 and IL-8 by transfected primary fibroblasts was analyzed as a measure of the activation of the two endogenous genes that respond to NF-KB / NF-IL-6.
Dazu wurden primäre humane Fibroblasten (2 x 104 Zellen pro Vertiefung) entweder mit 103 oder 3 x 103 For this purpose, primary human fibroblasts (2 x 10 4 cells per well) with either 10 3 or 3 x 10 3
Psoralen/UV-inaktivierten Adenovirus d11014-Partikeln pro Zelle, eingebaut in StpL/TfpL/DNA- Transfektionskomplexe, behandelt (dies entsprach 2 μl oder 6 μl Transfektionskomplex, wobei die verwendete DNA entweder ein leeres Plasmid war (pSP65; Boehringer Mannheim) oder das Plasmid der Bezeichnung pXVAH, das die Adenovirus VA1-Sequenz enthält. Die Zellen wurden 4 h mit den Transfektionskomplexen in 2 % Psoralen / UV inactivated adenovirus d11014 particles treated per cell, incorporated in StpL / TfpL / DNA transfection complexes (this corresponded to 2 μl or 6 μl transfection complex, the DNA used being either an empty plasmid (pSP65; Boehringer Mannheim) or the plasmid with the designation pXVAH, which is the adenovirus VA1 The cells were washed with the transfection complexes in 2% for 4 h
Pferdeserum/DMEM behandelt, danach wurde das Medium entfernt und durch 10 % FCS/DMEM ersetzt. Nach 24 h (für IL-6) bzw. 48 h (für IL-8) wurden Aliquots des Mediums entfernt und mittels ELISA auf ihren Gehalt an IL-6 bzw. IL-8 untersucht. Es wurde gefunden, daß die Behandlung mit den Transfektionskomplexen sowohl die IL-6- als auch die IL-8-Sekretion durch diese Zellen stimuliert (Tabelle 2). In allen Fällen verringerte der Einbau des VA1-Gens in die Transfektionskomp axe die Menge an produziertem Zytokin um ca. 35 %. Die Horse serum / DMEM treated, then the medium was removed and replaced with 10% FCS / DMEM. After 24 h (for IL-6) and 48 h (for IL-8), aliquots of the medium were removed and their content of IL-6 and IL-8 was examined by ELISA. Treatment with the transfection complexes was found to stimulate both IL-6 and IL-8 secretion by these cells (Table 2). In all cases, the incorporation of the VA1 gene into the transfection complex reduced the amount of cytokine produced by approximately 35%. The
anfängliche Stimulation der Zytokinproduktion initial stimulation of cytokine production
(Viruseintritt) muß stattfinden, bevor das Gen mit der Schutzwirkung eingeführt wird und in aktive RNA (Virus entry) must take place before the gene with the protective effect is introduced and into active RNA
transkribiert wird. Daher wurden Messungen der is transcribed. Therefore measurements of the
Zytokinproduktion zu späteren Zeitpunkten nach der Transfektion durchgeführt, um zu bestimmen, ob die VA1-transfizierten Zellen zu späteren Zeitpunkten, wenn höhere Konzentrationen von VA1-RNA gebildet worden sind, eine ausgeprägtere Unterdrückung der Cytokine production at later times after transfection was performed to determine whether the VA1-transfected cells had a more pronounced suppression of the later times when higher concentrations of VA1-RNA were formed
Zytokinproduktion zeigen. Show cytokine production.
Beispiel 5 Example 5
Abnahme der Genexpression durch Expression der Decrease in gene expression through expression of
Adenovirusgene EIA und E1A13S. Verstärkung des Adenovirus genes EIA and E1A13S. Reinforcement of
Gentransfers durch Expression von EIB, EIB 19K und Bei-2 Zunächst wurde eine Reihe von Versuchen durchgeführt, mit denen festgestellt werden sollte, ob die Expression bestimmter Adenovirusgene dazu geeignet ist, die Gene transfers through expression of EIB, EIB 19K and Bei-2 Initially, a number of experiments were carried out to determine whether the expression of certain adenovirus genes is suitable for the
Genexpression nach Transferrinfektion zu verstärken. Eine definierte Menge des Luciferase- Expressionsplasmids pCMVL (5 μg) wurde mit Enhance gene expression after transfer infection. A defined amount of the luciferase expression plasmid pCMVL (5 μg) was included
verschiedener Plasmid-DNA (jeweils 1 μg) gemischt, in TfpL/StpL/Adenovirus-Transfektionskomplexe eingebaut (Gesamtvolumen 500 μl) und auf primäre humane different plasmid DNA (1 μg each) mixed, incorporated in TfpL / StpL / adenovirus transfection complexes (total volume 500 μl) and on primary human
Fibroblasten aufgebracht (es wurden auf 2 x 104 Zellen pro Vertiefung einer 24-Well-Platte 50 μl Komplex, entsprechend 2.5 x 104 Virusteilchen pro Zelle, aufgebracht, wobei Dreifachbestimmungen vorgenommen wurden. In Fig. 4 bedeutet "minus" pSP65; die Test-DNA ist jeweils bezeichnet). Die erhaltene Fibroblasts were applied (50 μl of complex, corresponding to 2.5 × 10 4 virus particles per cell, were applied to 2 × 10 4 cells per well of a 24-well plate, whereby triple determinations were carried out. In FIG. 4, “minus” means pSP65; Test DNA is labeled). The received
Luciferaseaktivität wurde 48 bis 72 h nach der Luciferase activity was 48 to 72 h after
Transfektion gemessen. Der Einbau gereinigter Gesamt- DNA des E4-negativen, El-positiven Adenovirus d11014 erzeugte eine zweifache Verstärkung der Genexpression (Fig. 4). Es wurde angenommen, daß die Verstärkung auf die E1-Expression zurückzuführen ist. Daraufhin wurde ein E1-Expressionsplasmid (pE1pAALM) gemeinsam mit dem Reporterplasmid in die Zellen eingebracht und gefunden, daß auch dieses eine Steigerung der Genexpression Transfection measured. Incorporation of purified total DNA from the E4-negative, El-positive adenovirus d11014 produced a two-fold increase in gene expression (FIG. 4). The enhancement was thought to be due to E1 expression. Thereupon an E1 expression plasmid (pE1pAALM) was introduced into the cells together with the reporter plasmid and found that this also increased the gene expression
(3fach) hervorruft. Die E1-Region enthält zwei Haupt- Genfunktionen, EIA und E1B. (Die E1A-Produkte haben die Wirkung, E2F vom Rb-Protein abzutrennen, andererseits modulieren sie die Transkriptionsaktivität vieler zellulärer und Adenovirus-Promotoren. Die (3 times). The E1 region contains two main gene functions, EIA and E1B. (The E1A products have the effect of separating E2F from the Rb protein, on the other hand they modulate the transcription activity of many cellular and adenovirus promoters
hauptsächliche Transkriptions-Transaktivatorfunktion ist im 13S-Genprodukt enthalten. Das 1B-Gen kodiert für zwei Hauptfunktionen: das EIB 55K-Genprodukt bindet p53 und ändert dessen Funktion. Vom 19K E1B-Genprodukt wird angenommen, daß es unterhalb von p53 wirkt, um die apoptotische Antwort zu blockieren.) Es wurde die Co-Expression von Plasmiden getestet, die entweder die komplette EIA- oder die komplette E1B- Region unter der Kontrolle des CMV-Promotors trugen. Das E1B-Plasmid ergab eine 7fache Verstärkung der main transcriptional transactivator function is contained in the 13S gene product. The 1B gene codes for two main functions: the EIB 55K gene product binds p53 and changes its function. The 19K E1B gene product is believed to act below p53 to block the apoptotic response.) The co-expression of plasmids which carried either the complete EIA or the complete E1B region under the control of the CMV promoter was tested. The E1B plasmid showed a 7-fold amplification of the
Genexpression. Im Gegensatz dazu erzeugte das E1A- Plasmid eine Inhibierung der Genexpression (das Gene expression. In contrast, the E1A plasmid produced an inhibition of gene expression (the
0.3fache der Kontrollprobe). Auch das 19K E1B-Gen rief eine Verstärkung der Genexpression hervor (8.6fach). 0.3 times the control sample). The 19K E1B gene also caused an increase in gene expression (8.6-fold).
Vom E1B 19K-Protein wurde kürzlich gezeigt, daß es ein stark wirksames Analoges des anti-apoptotischen Gens Bcl-2 ist (Rao et al., 1992). Es wurde daher Bcl-2 ebenfalls getestet und festgestellt, daß es eine The E1B 19K protein has recently been shown to be a potent analog of the anti-apoptotic gene Bcl-2 (Rao et al., 1992). Bcl-2 was therefore also tested and found to be a
5.5fache Verstärkung der Genexpression hervorruft. 5.5-fold increase in gene expression.
Beispiel 6 Example 6
Untersuchung der Toxizität auf Spezifität Examination of toxicity for specificity
Als nächstes wurde getestet, ob die Abnahme der The next step was to test whether the decrease in
Genexpression auf eine nicht-spezifische Toxizität, die durch die hohen Virus/Zell-Verhältnisse verursacht wird, zurückzuführen ist (die Versuche wurden mit ca. 50.000 Viruspartikeln pro Zelle durchgeführt). Gene expression is due to a non-specific toxicity caused by the high virus / cell ratio (the experiments were carried out with approximately 50,000 virus particles per cell).
Dazu wurden Transfektionskomplexe, enthaltend pCMVL plus das Plasmid pSP65, bzw. die Plasmide, die die Sequenz für Bcl-2, E1A oder E1B 19K enthielten (die Mengen an Reporterplasmid pCMVL und jeweiligen For this purpose, transfection complexes containing pCMVL plus the plasmid pSP65, or the plasmids which contained the sequence for Bcl-2, E1A or E1B 19K (the amounts of reporter plasmid pCMVL and respective
Testplasmid betrugen, wie im vorigen Beissiel, 5 μg bzw. 1 μg), bei Viruspartikelzahlen von 3 x 104 (Fig. 5A), 104 (Fig. 5B) oder 3 x 103 (Fig. 5C) pro Zelle auf primäre Fibroblasten aufgebracht und die Test plasmid were, as in the previous example, 5 μg and 1 μg, for virus particle numbers of 3 × 10 4 (FIG. 5A), 10 4 (FIG. 5B) or 3 × 10 3 (FIG. 5C) per cell on primary Fibroblasts applied and the
Luciferaseaktivität über einige Zeit gemessen. Die Transfektionen wurden durchgeführt, wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben, wobei den Zellen 6, 18 bzw. 60 μl Transfektionskomplex pro Luciferase activity measured over time. The transfections were carried out as in the previous examples described, the cells 6, 18 and 60 ul transfection complex per
Vertiefung, die 2 x 104 Fibroblasten enthielt, Well containing 2 x 10 4 fibroblasts,
aufgegeben wurde. Das Ergebnis der Versuche ist in Fig. 5 dargestellt: Es wurden ähnliche was abandoned. The result of the tests is shown in Fig. 5: Similar ones were found
Genexpressionsmuster wie in den vorangegangenen Gene expression patterns as in previous ones
Beispielen (Abnahme bei ElA-behandelten Zellen, Examples (decrease in ElA-treated cells,
Verstärkung bei 19K- bzw. Bcl-2-behandelten Zellen) festgestellt, und zwar unabhängig von der verwendeten Virusdosis. Enhancement in 19K or Bcl-2-treated cells) was found, regardless of the virus dose used.
Im vorangegangenen Beispiel hat sich sogar bei den mit 19K oder Bcl-2 transfizierten Zellen ein Verlust an Expressionsaktivität zu späteren Zeitpunkten, In the previous example, even the cells transfected with 19K or Bcl-2 lost expression activity at later times,
insbesondere nach 6 Tagen, gezeigt. Es wurde daher in Betracht gezogen, ob nicht ein zweites Phänomen, das in Beziehung mit der inflammatorischen Antwort steht, wie sie sich im vorangegangenen Beispiel gezeigt hat, die Gesundheit der transfizierten Kultur beeinträchtigt. Wenn die transfizierten Zellen aufgrund des especially after 6 days. It was therefore considered whether a second phenomenon related to the inflammatory response as shown in the previous example does not affect the health of the transfected culture. If the transfected cells due to the
Transfektionsvorganges eine Aktivierung der Transfection process an activation of the
Immunantwort zeigen, könnte die Sekretion von Zytokinen oder Toxinen von den Zellen die Lebenserwartung der Kultur beschränken. Showing immune response, the secretion of cytokines or toxins from the cells could limit the life expectancy of the culture.
Um dieses Phänomen zu untersuchen, wurden Versuche zum Zeitverlauf der Transfektion aufgestellt, indem To investigate this phenomenon, experiments on the time course of the transfection were set up by
Transfektionskomplexe, enthaltend 5 μg pCMVL plus 1 μg pSP65 oder 1 μg eines Plasmids, enthaltend E1A, E1A 13S, E1B 19K oder Bcl-2, verwendet wurden. (In diesen Versuchen erhielten die Zellen einer Vertiefung 18 μl Transfektionskomplex.) Ab Tag 10 wurde das Kulturmedium täglich durch frisches Medium ersetzt; dieser Maßnahme lag die Überlegung zugrunde, daß der Mediumwechsel die Konzentrationen der Toxine senken würde. Das Ergebnis dieser Versuche ist in Fig. 6 dargestellt: Es zeigte sich, daß die gewählte Vorgehensweise die Transfection complexes containing 5 μg pCMVL plus 1 μg pSP65 or 1 μg of a plasmid containing E1A, E1A 13S, E1B 19K or Bcl-2 were used. (In these experiments, the cells in one well received 18 μl transfection complex.) From day 10, the culture medium was replaced with fresh medium daily; This measure was based on the consideration that changing the medium would lower the concentrations of the toxins. The result of these tests is shown in FIG. 6: It showed yourself that the chosen approach is the
Langzeitgenexpression der Kulturen verstärkte, wenn pSP65, Bcl-2- oder 19K-Plasmide verwendet wurden. Im Gegensatz dazu nahm die Expression der E1A- und E1A 13S-Kulturen in ähnlichem Maß ab wie bei den nicht- gewaschenen Kulturen der vorangegangenen Experimente. Die Gegenwart von 19K zeigte noch nach 21 Tagen eine Verbesserung der Genexpression um eine Zehnerpotenz, was auf eine Rolle der Apoptose hinweist. Long-term gene expression of the cultures increased when pSP65, Bcl-2 or 19K plasmids were used. In contrast, the expression of the E1A and E1A 13S cultures decreased to a similar extent as in the non-washed cultures of the previous experiments. The presence of 19K showed an improvement in gene expression by a power of ten even after 21 days, which indicates the role of apoptosis.
Beispiel 7 Example 7
Untersuchung der Morphologie von transfizierten Zellen Investigation of the morphology of transfected cells
Primäre humane Fibroblasten wurden mit dem Primary human fibroblasts were identified with the
Reporterplasmid pCMVßgal plus pSP65 oder plus pCMV19K transfiziert (2 x 104 Fibroblasten pro Vertiefung einer 24-Well-Platte erhielten 18 μl Transfektionskomplex; 500 μl Komplex enthielten entweder 4 μg pCMVL plus 2 μg pSP65 oder 4 μg pCMVL plus 2 μg pCMV19K). 48 h nach der Transfektion wurden die Zellen mit X-gal gefärbt, wie in der WO 93/07283 beschrieben, um die Morphologie der Zellen, die die transfizierte DNA mit Erfolg Reporter plasmid pCMVßgal plus pSP65 or plus pCMV19K transfected (2 x 10 4 fibroblasts per well of a 24-well plate received 18 μl transfection complex; 500 μl complex contained either 4 μg pCMVL plus 2 μg pSP65 or 4 μg pCMVL plus 2 μg pCMV19K. 48 hours after the transfection, the cells were stained with X-gal, as described in WO 93/07283, to determine the morphology of the cells that successfully transfected the DNA
aufgenommen und exprimiert hatten, zu untersuchen. Es zeigte sich, daß zu diesem frühen Zeitpunkt nach der Transfektion die beiden Zellpopulationen die had been recorded and expressed. It was found that at this early point in time after the transfection, the two cell populations
transfizierten Zellen innerhalb einer Größenordnung exprimieren. Während jedoch die β-gal exprimierenden Zellen in Abwesenheit von pCMV19K eine vorwiegend abgerundete und teilweise abgelöste Morphologie zeigen (Fig. 7, linke Tafel), die mit einem apoptotischen Phänotyp übereinstimmt, zeigten die mit pCMV19K co- transfizierten Zellen eine vorwiegend flache und adhärente Morphologie (Fig. 7, rechte Tafel). Die veränderte Morphologie dürfte auf die ausgedehntere und verstärkte Genexpression, die mit 19K erhalten wird, zusammenhängen. express transfected cells within an order of magnitude. However, while the cells expressing β-gal in the absence of pCMV19K show a predominantly rounded and partially detached morphology (FIG. 7, left panel), which corresponds to an apoptotic phenotype, the cells co-transfected with pCMV19K showed a predominantly flat and adherent morphology (Fig. 7, right panel). The changed morphology is likely to be more extensive and enhanced gene expression obtained with 19K are related.
Beispiel 8 Example 8
Inhibierung der durch Adenovirus bzw. LPS Inhibition of adenovirus or LPS
hervorgerufenen Toxizität durch Prä-Expression von E1B 19K und Bcl -2 toxicity caused by pre-expression of E1B 19K and Bcl -2
Im Zuge von Vorversuchen, in denen die Zellen LPS in Gegenwart von Adenovirus ausgesetzt worden waren, wurde festgestellt, daß die rasch auftretende Toxizität in diesen Zellen eine Morphologie der sterbenden Zellen hervorruft, die der Apoptose ähnlich ist (z.B. Preliminary experiments in which the cells had been exposed to LPS in the presence of adenovirus found that the rapidly occurring toxicity in these cells causes a dying cell morphology similar to apoptosis (e.g.
fragmentierte Kerne, Kondensation). Darauf wurde angenommen, daß das Eindringen von LPS in die Zelle während des Eintritts von Adenovirus eine apoptotische Antwort hervorruft. fragmented nuclei, condensation). Thereupon, it was believed that LPS entry into the cell during adenovirus entry elicited an apoptotic response.
Um dieses Phänomen zu untersuchen, wurden To investigate this phenomenon,
Transfektionskomplexe mit einem Gehalt an LPS plus entweder E1B 19K-Gen oder Bcl-2-Gen hergestellt, um festzustellen, ob die gesamte Einführung des Transfection complexes containing LPS plus either the E1B 19K gene or Bcl-2 gene were prepared to determine whether the entire introduction of the
Apoptoseauslösers LPS mit dem anti-Apoptosegen Bcl-2 den Zelltod blockieren würden. Es wurde festgestellt, daß keine Verringerung der Toxizität eintritt, Apoptosis trigger LPS with the anti-apoptosis gene Bcl-2 would block cell death. It was found that there was no reduction in toxicity
vermutlich weil die Geschwindigkeit der toxischen probably because of the speed of the toxic
Antwort, die 4 h nach der Behandlung bemerkbar wird, es nicht zuläßt, daß genügend 19K- oder Bei-2-Genprodukt akkumuliert wird. Aufgrund dieser Beobachtung wurde eine alternative Methode zur Feststellung, ob 19K oder Bcl-2 einen Schutz gegen die LPS-induzierte Toxizität gewähren können, entwickelt: Es wurden stabile Response that becomes noticeable 4 hours after treatment does not allow enough 19K or Bei-2 gene product to be accumulated. Based on this observation, an alternative method to determine whether 19K or Bcl-2 could provide protection against LPS-induced toxicity was developed: stable ones
Zellinien, die entweder das 19K- oder das Bcl-2-Gen trugen, mit den LPS/Adenovirus-Komplexen in Berührung gebracht. Dazu wurden A549-Zellen als Kontrollzellen sowie A549 19K-Zellen und A549-Bcl-2-Zellen zu je Cell lines carrying either the 19K or the Bcl-2 gene are in contact with the LPS / adenovirus complexes brought. For this purpose, A549 cells were used as control cells as well as A549 19K cells and A549-Bcl-2 cells
4 x 104 Zellen pro Vertiefung einer 24-Well-Platte ausplattiert und mit 50 μl Transfektionskomplex, enthaltend 6 μg pCMVL pro 100 μl Komplex und entweder 0, 10 oder 100 ng LPS pro 6 μg DNA, behandelt. Die Erwartung, daß die vorangehende Expression jedes dieser Proteine einen Schutzeffekt haben sollte, wurde 4 x 10 4 cells per well of a 24-well plate were plated out and treated with 50 μl transfection complex containing 6 μg pCMVL per 100 μl complex and either 0, 10 or 100 ng LPS per 6 μg DNA. The expectation that the previous expression of each of these proteins should have a protective effect has been raised
erfüllt: Wie in Fig. 8 gezeigt, wurden Kontrollzellen, die den Adenovirus/pL/DNA-Komplexen ausgesetzt waren, als Funktion von zunehmendem LPS-Gehalt in der Probe getötet (vgl. Probe 1: kein LPS, mit Proben 2 und 3: 10 und 100 ng LPS/6μg DNA). In Zellen, die entweder 19K oder Bei-2 exprimieren, trat eine Verringerung in der Toxizität auf 39 % (Probe 2) bzw. 77 oder 60 % auf (Proben 5 oder 8; 19K oder Bcl-2). Bei der Bewertung dieser Ergebnisse ist zu beachten, daß die in diesem Versuch ausgewerteten Zellen noch Pools von stabil exprimierenden Zellen darstellten; von reinen fulfilled: As shown in FIG. 8, control cells which were exposed to the adenovirus / pL / DNA complexes were sacrificed as a function of increasing LPS content in the sample (cf. sample 1: no LPS, with samples 2 and 3: 10 and 100 ng LPS / 6μg DNA). In cells expressing either 19K or Bei-2 there was a decrease in toxicity to 39% (sample 2) or 77 or 60% (samples 5 or 8; 19K or Bcl-2). When evaluating these results, it should be noted that the cells evaluated in this experiment were still pools of stably expressing cells; from pure
Populationen von 19K oder Bcl-2 exprimierenden Zellen ist zu erwarten, daß ein höherer Schutzeffekt (bis zu 100 %) erhalten wird. Populations of 19K or Bcl-2 expressing cells are expected to have a higher protective effect (up to 100%).
Beispiel 9 Example 9
Verstärkung des Gentransfers durch das Glucocorticoid Dexamethason allein oder in Kombination mit einem anti- Apoptose-Gen Enhancement of gene transfer by the glucocorticoid dexamethasone alone or in combination with an anti-apoptosis gene
Primäre humane Fibroblasten wurden mit Primary human fibroblasts were identified
Adenovirus/Polylysin/DNA-Komplexen transfiziert, wie in Beispiel 5 beschrieben, wobei als DNA entweder  Adenovirus / polylysine / DNA complexes transfected as described in Example 5, using either DNA
pCMVL/pSP65 oder pCMVL/pCMV19K im Verhältnis von jeweils 5:1 eingesetzt wurde. 4 h nach der Transfektion wurden die Proben in frisches 10 % FCS/DMEM-Medium oder in 10 % FCS/DMEM-Medium, enthaltend 3 μM Dexamethason (Sigma), überführt. 24 h nach der Transfektion wurden die Proben (Doppelbestimmung) geerntet und die pCMVL / pSP65 or pCMVL / pCMV19K was used in a ratio of 5: 1 each. 4 hours after the transfection, the samples were placed in fresh 10% FCS / DMEM medium or transferred to 10% FCS / DMEM medium containing 3 μM dexamethasone (Sigma). 24 hours after the transfection, the samples (double determination) were harvested and the
Luciferaseaktivitat bestimmt. Es zeigte sich, daß die Gegenwart von Dexamethason in Abwesenheit von pCMV19K die Luciferaseexpression um einen Faktor 1.65 erhöht. In Gegenwart von sowohl Dexamethason als auch pCMV19K war die Verstärkung 5,8,11-Eicosatriynonsäure 2.71fach (Tabelle 3). Luciferase activity determined. The presence of dexamethasone in the absence of pCMV19K was shown to increase luciferase expression by a factor of 1.65. In the presence of both dexamethasone and pCMV19K, the 5,8,11-eicosatriynonic acid enhancement was 2.71-fold (Table 3).
Der weitere Zeitverlauf über 7 Tage ist in Fig. 9 dargestellt; das Dexamethason enthaltende Medium wurde jeden zweiten Tag gewechselt. Zu jedem der angegebenen Zeitpunkte wurden Doppelbestimmungen der The further course of time over 7 days is shown in FIG. 9; the medium containing dexamethasone was changed every other day. Duplicate determinations of the
Luciferaseaktivitat vorgenommen. Luciferase activity made.
Beispiel 10 Example 10
Untersuchung des Einflusses von Inhibitoren von Investigation of the influence of inhibitors of
Arachidonsäure-Metaboliten auf die Genexpression Arachidonic acid metabolites on gene expression
Um festzustellen, ob Arachidonsäure-Metaboliten an der Verringerung der Genexpression in transfizierten Zellen beteiligt sind, wurden, wie in den vorigen Beispielen beschrieben, primäre Hautfibroblasten mit In order to determine whether arachidonic acid metabolites are involved in the reduction of gene expression in transfected cells, primary skin fibroblasts were used as described in the previous examples
Adenovirus/Polylysin/DNA-Komplexen, die das Adenovirus / polylysine / DNA complexes that the
Luciferasegen enthielten, transfiziert, und zwar mit und ohne Co-Transfektion des E1B 19K-Gens, und es wurde die Luciferaseaktivität über die Zeit verfolgt. (Die DNA enthielt 5.5μg pCMVL und 0.5μg pSP65 (Kontrolle) oder pCMV19K). 2 h nach der Transfektion wurden die Zellen in Standardmedium (DMEM plus 10 % FCS) Contained luciferase genes, transfected with and without co-transfection of the E1B 19K gene, and luciferase activity was monitored over time. (The DNA contained 5.5μg pCMVL and 0.5μg pSP65 (control) or pCMV19K). 2 h after the transfection, the cells were placed in standard medium (DMEM plus 10% FCS)
enthaltend, wo in Fig. 10 angegeben, 10 uM Dexamethason oder 2 mM Aspirin, überführt. Es wurden containing 10 µM dexamethasone or 2 mM aspirin where indicated in Figure 10. There were
Dreifachbestimmungen durchgeführt. Das Ergebnis dieser Versuche ist in Fig. 10 dargestellt. Es zeigte sich, daß sowohl Dexamethason als auch Aspirin eine Zunahme der Genexpression sowohl in Gegenwart als auch bei Abwesenheit von EIB 19K bewirken. Die Wirkung von Triple determinations carried out. The result of this Experiments are shown in Fig. 10. Both dexamethasone and aspirin were shown to increase gene expression both in the presence and absence of EIB 19K. The effect of
Aspirin war weniger ausgeprägt als die von Aspirin was less pronounced than that of
Dexamethason, was darauf hindeutet, daß die Inhibierung der Cyklooxygenase nicht ausreicht, den Abfall der Genexpression zu verhindern. Beide Substanzen zeigten hinsichtlich der Steigerung der Genexpression einen synergistischen Effekt mit dem EIB 19K-Gen. Dexamethasone, which indicates that the inhibition of cyclooxygenase is not sufficient to prevent the decline in gene expression. Both substances showed a synergistic effect with the EIB 19K gene in increasing gene expression.
Beispiel 11 Example 11
Vergleich der Wirkung von Dexamethason, Ibuprofen und 5,8,11-Eicosatriynonsäure in Gegenwart oder bei Comparison of the effects of dexamethasone, ibuprofen and 5,8,11-eicosatriynonic acid in the presence or with
Abwesenheit von EIB 19K Absence of EIB 19K
Analog wie im vorigen Beispiel beschrieben, wurden Transfektionen vorgenommen und die Luciferaseexpression gemessen. 2 h nach der Transfektion wurden die Zellen auch in diesem Versuch in Standardmedium gegeben, das, wo in Fig. 11 angegeben, 10 uM Dexamethason, den Analogous to that described in the previous example, transfections were carried out and the luciferase expression was measured. 2 h after the transfection, the cells were also placed in this medium in standard medium, which, where indicated in FIG. 11, 10 μM dexamethasone
Cyclooxygenaseinhibitor Ibuprofen (100 μM) oder den 5- Lipoxygenaseinhibitor 5,8, 11-Eicosatriynonsäure (30 μM) enthielt; die optimalen Konzentrationen der Inhibitoren waren jeweils durch Titration in Vorversuchen ermittelt worden. Das Ergebnis dieser Versuche ist in Fig. 11 dargestellt. Es zeigte sich, daß von den drei Cyclooxygenase inhibitor ibuprofen (100 μM) or the 5-lipoxygenase inhibitor 5,8, 11-eicosatriynonic acid (30 μM); the optimal concentrations of the inhibitors were determined by titration in preliminary experiments. The result of these tests is shown in Fig. 11. It turned out that of the three
untersuchten anti-inflammatorischen Substanzen nur Dexamethason eine wesentliche Verbesserung der Anti-inflammatory substances only examined a significant improvement in dexamethasone
Genexpression in Abwesenheit von EIB 19K bewirkt. In Gegenwart von EIB 19K zeigte sich ein synergistischer Effekt von Dexamethason und 5,8,11-Eicosatriynonsäure. Beispiel 12 Gene expression in the absence of EIB 19K causes. In the presence of EIB 19K, a synergistic effect of dexamethasone and 5,8,11-eicosatriynonic acid was shown. Example 12
Vergleich der Verstärkung der Genexpression durch verschiedene Inhibitoren von Arachidonsäure-Metaboliten Comparison of the enhancement of gene expression by different inhibitors of arachidonic acid metabolites
Analog wie in den vorigen Beispielen beschrieben, wurden Transfektionen vorgenommen und die Analogous to that described in the previous examples, transfections were carried out and the
Luciferaseexpression gemessen. Als Inhibitoren wurden Dexamethason (10 μM), 5, 8, 11-Eicosatriynonsäure Luciferase expression measured. Dexamethasone (10 μM), 5, 8, 11-eicosatriynonic acid were used as inhibitors
(30 μM), NDGA (10 μM), Ibuprofen (30 uM) und Aspirin (2 mM) verwendet. In Fig. 12 sind links der (30 µM), NDGA (10 µM), ibuprofen (30 µM) and aspirin (2 mM). In Fig. 12 are the left
Arachidonsäureweg eingezeichnet, in der Mitte die Arachidonic acid path, in the middle the
Inhibitoren an den jeweiligen Stellen ihrer Wirkung und rechts die erhaltenen Expressionswerte. Während alle untersuchten Inhibitoren eine gewisse Verbesserung der Genexpression zeigten, die möglicherweise auf eine Verbesserung des Zustandes der Zellen insgesamt Inhibitors at the respective points of their action and the expression values obtained on the right. While all of the inhibitors studied showed some improvement in gene expression, which may indicate an improvement in the overall condition of the cells
zurückzuführen ist, konnte die deutlichste Verbesserung bei der Dexamethasonbehandlung festgestellt werden. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, daß dieses Glucocorticoid an mehreren Stellen angreift is the most significant improvement in dexamethasone treatment. This could be due to the fact that this glucocorticoid attacks in several places
(Dexamethason kann die Genexpression von (Dexamethasone can cause gene expression from
inflammatorischen Zytokinen blockieren, indem es als negativer Transkriptionsmodulator wirkt (z.B. um das IL-6-Gen zu blockieren); es kann auch wirken, indem es die Phospholipase mRNA-Konzentration verringert oder die Lipocortinkonzentrationen erhöht (Barnes und block inflammatory cytokines by acting as a negative transcription modulator (e.g. to block the IL-6 gene); it can also work by reducing the phospholipase mRNA concentration or increasing the lipocortin concentrations (Barnes and
Adcock, 1993). Adcock, 1993).
Beispiel 13 Example 13
Identifizierung eines anti-apoptotischen Gens von Identification of an anti-apoptotic gene from
Hühner Adenovirus CELO (Chicken Embryo Lethal Orphan) a) Isolierung und Klonierung von CELO-Virus- Genomfragmenten Chicken Adenovirus CELO (Chicken Embryo Lethal Orphan) a) Isolation and cloning of CELO virus genome fragments
Als Ausgangsmaterial wurde das CELO Virus Adenovirus Typ 1 (ATCC VR-432) verwendet. Das Virus wurde nach Wachstum in Hühnerembryos gereinigt, wie von Cotten et al., 1993, beschrieben. Die DNA wurde aus dem Virus präpariert, indem das Virus mit Proteinase K The CELO virus adenovirus type 1 (ATCC VR-432) was used as starting material. The virus was purified after growth in chicken embryos as described by Cotten et al., 1993. The DNA was prepared from the virus by the proteinase K
(0.3 mg/ml) in HBS/0.1 % SDS 45 min lang bei 56 ºC inkubiert wurde. Dann wurde CsCl beigegeben (0.3 mg / ml) in HBS / 0.1% SDS for 45 min at 56 ° C. Then CsCl was added
(28.5 g/26 ml Lösung), daraufhin Ethidiumbromid (28.5 g / 26 ml solution), then ethidium bromide
(0.1 mg/ml), und die Probe wurde 18 h lang in einem Vti 65 Rotor (Beckman, 20ºC) zentrifugiert. Die DNA (deutlich sichtbare gefärbte Bande) wurde gesammelt, das Ethidiumbromid durch Extraktion mit CsCl- gesättigtem Isopropanol bis zum Verschwinden der (0.1 mg / ml) and the sample was centrifuged in a Vti 65 rotor (Beckman, 20 ° C) for 18 hours. The DNA (clearly visible colored band) was collected, the ethidium bromide by extraction with CsCl-saturated isopropanol until the disappearance
Rosafärbung extrahiert und das CsCl mittels Pink color extracted and the CsCl using
Gelfiltration entfernt. Gel filtration removed.
Das erhaltene gesamte 42.8 kb große CELO-Virusgenom wurde einerseits mit EcoRI, andererseits mit Hindlll verdaut. Die erhaltene Mischung von Fragmenten wurde in einem 0.8 % Agarosegel aufgetrennt und auf einem 3 mm Whatmanpapier und anschließend über eine Sephadex G-50 Säule gereinigt. The entire 42.8 kb CELO virus genome obtained was digested on the one hand with EcoRI and on the other hand with HindIII. The mixture of fragments obtained was separated in a 0.8% agarose gel and purified on 3 mm Whatman paper and then on a Sephadex G-50 column.
Die Restriktionskarte von CELO-Virus ist im oberen Teil von Fig.13 dargestellt; sie basiert auf den The restriction map of CELO virus is shown in the upper part of Fig. 13; it is based on the
Restriktionskartierungen von Cai und Weber, 1993; Restriction mapping by Cai and Weber, 1993;
Aleström et al., 1982, und Li et al., 1984. In der Fig. ist die Lage der Hindlll- und der EcoRI-Stellen Aleström et al., 1982, and Li et al., 1984. In the figure is the location of the HindIII and EcoRI sites
angegeben (in Kartierungseinheiten, wobei eine specified (in mapping units, one
Kartierungseinheit 428 Basenpaare beträgt). Ferner sind die Nomenklatur der Expressionsklone sowie die Lage der Fragmente 7H3 (Hindlll D-Fragment) und 9R1 (EcoRI D- Fragment) eingezeichnet. Diese Fragmente sind diejenigen, die in den Gentransferexperimenten einen positiven Effekt zeigten (vgl. die in b) beschriebenen Versuche). Mapping unit is 428 base pairs). The nomenclature of the expression clones and the position of fragments 7H3 (HindIII D fragment) and 9R1 (EcoRI D fragment) are also shown. These are fragments those that showed a positive effect in the gene transfer experiments (cf. the experiments described in b).
Die erhaltenen Fragmente wurden in den von Superti- Furga et al., 1991, beschriebenen Expressionsvektor pX stromabwärts vom CMV Immediate Early Promotor kloniert, wobei jedes Fragment in beiden Orientierungen isoliert und charakterisiert wurde. b) Testung der isolierten Genfragmente auf anti- apoptotische Wirkung The fragments obtained were cloned in the expression vector pX described by Superti-Furga et al., 1991, downstream of the CMV immediate early promoter, each fragment being isolated and characterized in both orientations. b) testing of the isolated gene fragments for anti-apoptotic effects
Um festzustellen, ob die Expression der erhaltenen Genfragmente dazu geeignet ist, die bei der To determine whether the expression of the gene fragments obtained is suitable for the purposes of
Transferrinfektion auftretende Abnahme der Decrease in transfer infection occurring
Genexpression zu verringern, wurden Have been found to decrease gene expression
Transfektionsversuche durchgeführt, wie in Beispiel 5 angegeben, wobei die Testplasmide die diversen, in Fig. 16 angegebenen CELO-Virusfragmente enthielten. Die Menge an Transfektionskomplexen betrug 15 μl pro 20.000 Zellen, enthaltend 5 μg Luciferase-Reporterplasmid und 1 μg des jeweiligen Testplasmids (in den meisten Fällen wurden Klone, enhaltend das Fragment in beiden  Transfection experiments were carried out as indicated in Example 5, the test plasmids containing the various CELO virus fragments shown in FIG. 16. The amount of transfection complexes was 15 μl per 20,000 cells containing 5 μg luciferase reporter plasmid and 1 μg of the respective test plasmid (in most cases, clones were containing the fragment in both
Richtungen relativ zum Promotor, getestet). Die für die diversen Klone erhaltenen Werte für die Genexpression (es wurde nach 24 h und dann an den Tagen 4, 7, 14 und 21 gemessen ) im Verhältnis zum Kontrollwert sind in Fig. 16 angegeben, wobei die HindIII-Fragmente mit "H3" und die EcoRI-Fragmente mit "Rl" bezeichnet sind. Directions relative to the promoter, tested). The gene expression values obtained for the various clones (it was measured after 24 h and then on days 4, 7, 14 and 21) in relation to the control value are given in FIG. 16, the HindIII fragments being denoted by "H3" and the EcoRI fragments are labeled "R1".
In allen Fällen war die Luciferaseexpression nach 24 h ähnlich; am 4. Tag zeigte sich eine Abnahme der In all cases, luciferase expression was similar after 24 h; on the 4th day there was a decrease in the
Expression der Kontrolle. Fig. 16 zeigt die relative Expression (Durchschnittswert von 3 Proben) der Test- Proben (5 μg Luciferase-Reporterplasmid und 1 μg Plasmid pXCELO) gegenüber den Kontrollproben ( 5 μg Luciferase-Reporterplasmid pCMVL und 1 μg Leervektor) am Tag 14. Eine Schutzwirkung (drei- bis achtfache Verstärkung der Luciferaseexpression) konnte nur bei den Plasmiden beobachtet werden, die die 7H3- und 9R1- Fragmente enthielten; diese beiden Fragmente stammen aus derselben Region des CELO-Virusgenoms und weisen in ihrer Sequenz einen überlappenden Bereich von etwa 80 % auf (siehe die in Fig. 13 dargestellte Expression of the control. 16 shows the relative expression (average value of 3 samples) of the test samples (5 μg luciferase reporter plasmid and 1 μg Plasmid pXCELO) against the control samples (5 μg luciferase reporter plasmid pCMVL and 1 μg empty vector) on day 14. A protective effect (three to eightfold increase in luciferase expression) could only be observed with the plasmids which contained the 7H3 and 9R1 fragments ; these two fragments originate from the same region of the CELO virus genome and have an overlapping region of approximately 80% in their sequence (see that shown in FIG. 13)
Restriktionskarte). Restriction map).
Die DNA-Sequenzen der Fragmente 9R1 und 7H3, die eine Schutzwirkung gezeigt hatten, wurden nach The DNA sequences of the fragments 9R1 and 7H3, which had shown a protective effect, were after
Standardmethoden bestimmt. Dazu wurden DNA-Fragmente in pBSII (Stratagene) subkloniert, durch die Kombination von Exo III- und Sl-Nukleasen Deletionen von einer Richtung aus vorgenommen, Klone isoliert und unter Anwendung des "Taq-Dye-Deoxy Terminator Cycle Standard methods determined. For this purpose, DNA fragments were subcloned into pBSII (Stratagene), deletions were carried out from one direction by the combination of Exo III and SI nucleases, clones were isolated and using the "Taq-Dye-Deoxy Terminator Cycle
Sequencing" Systems (ABI) auf einem ABI 373- Sequenzanalysegeräts sequenziert. Klone in umgekehrter Orientierung wurden unter Verwendung synthetisierter Primer sequenziert. Sequencing Systems (ABI) sequenced on an ABI 373 sequence analyzer. Clones in reverse orientation were sequenced using synthesized primers.
Die Analyse der von den beiden Fragmenten 9R1 und 7H3 kodierten offenen Leserahmen ergab einen einzigen größeren offenen Leserahmen, der den beiden Fragmenten gemeinsam ist (in Fig. 13 unten dargestellt; der mit * bezeichnete offene Leserahmen bezeichnet den 9R1 und 7H3 gemeinsamen großen offenen Leserahmen). Dieser offene Leserahmen, dessen Sequenz in Fig. 14 Analysis of the open reading frames encoded by the two fragments 9R1 and 7H3 revealed a single larger open reading frame that is common to the two fragments (shown in Fig. 13 below; the open reading frame denoted by * denotes the large open reading frame common to 9R1 and 7H3) . This open reading frame, the sequence of which is shown in Fig. 14
unterstrichen ist, kodiert, beginnend beim Nukleotid 577, für ein für Protein mit 283 Aminosäuren. Das entsprechende Genprodukt wurde als GAM-1 bezeichnet. is underlined, encoding, beginning with nucleotide 577, for a protein with 283 amino acids. The corresponding gene product was named GAM-1.
Fig. 17 zeigt die nach Sequenzananalyse mittels 17 shows that after sequence analysis by means of
automatischer Fluoreszenz-Didesoxy-Methode ermittelten offenen Leserahmen, die größer als 200 Basenpaare sind, als schwarze Balken; vom Smal/HindIII-Fragment, von dem die relvanten, nur einmal vorkommenden automatic fluorescence dideoxy method determined open reading frames that are larger than 200 base pairs as black bars; from the Smal / HindIII fragment, of which the relevant, occurring only once
Restriktionsstellen dargestellt sind, erwies sich in den im folgenden Beispiel dargestellten Versuchen, daß es volle Aktivität aufwies). Restriction sites are shown in the experiments shown in the following example that it had full activity).
Von Larson et al., 1986, wurde im CELO-Virus ein VA-Gen im Genfragment zwischen den Kartierungseinheiten 88.7 und 92.7 identifiziert. Von diesem VA-Gen (in der 9R1- Sequenz von Nukleotid 4286-4184) wurde berichtet, daß es in geringem Ausmaß die Genexpression von cotransfizierten Genen verstärkt. Da dieses Gen zwar im 9R1-Fragment enthalten ist, jedoch außerhalb des 7H3- Fragments liegt, ist nicht anzunehmen, daß es zu der in den vorliegenden Versuchen beobachteten, in dieser Region gelegenen verstärkenden Wirkung auf die Larson et al., 1986, identified a VA gene in the gene fragment between the mapping units 88.7 and 92.7 in the CELO virus. This VA gene (in the 9R1 sequence of nucleotide 4286-4184) has been reported to slightly increase gene expression from cotransfected genes. Since this gene is contained in the 9R1 fragment, but lies outside the 7H3 fragment, it cannot be assumed that it has the reinforcing effect on the region which is observed in the present experiments and is located in this region
Genexpression beiträgt. Um festzustellen, ob diese Verstärkerwirkung eine neue Funktion des offenen Gene expression contributes. To determine if this amplifier effect is a new function of the open
Leserahmens von 9R1 ist und nicht im Zusammenhang mit der vorbeschriebenen VA-Funktion steht, wurde ein Reading frame of 9R1 and is not related to the VA function described above, has been a
Smal/HindiII-Restriktionsfragment von 9R1 hergestellt, das den offenen Leserahmen von 9R1, nicht jedoch das VA-Gen besitzt. Es wurden daher analog den Smal / HindiII restriction fragment of 9R1, which has the open reading frame of 9R1, but not the VA gene. It was therefore analogous to
Transfektionen mit den 7H3- und den 9R1-Fragmenten auch Transfektionen mit diesem Restriktionsfragment Transfections with the 7H3 and 9R1 fragments also transfections with this restriction fragment
(9R1S/H3) durchgeführt, das ebenfalls in den pX Vektor kloniert worden war. Die Ergebnisse dieser (9R1S / H3), which had also been cloned into the pX vector. The results of this
Transfektionen zeigten, daß die festgestellte Transfections showed that the observed
verstärkende Wirkung des Fragments auf die reinforcing effect of the fragment on the
Genexpression nicht eine Funktion des VA-Gens ist. c) Zeitverlauf der Genexpression in Gegenwart der Gene expression is not a function of the VA gene. c) Time course of gene expression in the presence of the
Fragmente 7H3, 9R1 und 9R1S/H3 Um eine genauere Untersuchung der Fragments 7H3, 9R1 and 9R1S / H3 To have a closer look at the
Genexpressionsverstärkung durchzuführen, wurden Gene expression enhancement were
Transfektionen mit dem 9R1-Fragment, dem 7H3-Fragment und dem Smal/HindIII-Fragment von 9R1 durchgeführt und die Luciferaseexpression über einen längeren Zeitraum verfolgt. (Die Transfektionskomplexe enthielten 5 μg pCMVL und entweder 1 μg pSP65 als Kontrolle oder 1 μg des Vektors pX mit dem jeweiligen Fragment). Es wurde gefunden, daß die Aufrechterhaltung der Genexpression mit den Fragmenten 9R1, 7H3 und dem 9RlS/H3-Konstrukt vergleichbar ist, was darauf schließen läßt, daß die Schutzwirkung von 9R1 und 7H3 zur Gänze in dem Transfections with the 9R1 fragment, the 7H3 fragment and the Smal / HindIII fragment of 9R1 were carried out and the luciferase expression was monitored over a longer period of time. (The transfection complexes contained 5 μg pCMVL and either 1 μg pSP65 as a control or 1 μg of the vector pX with the respective fragment). The maintenance of gene expression was found to be comparable to fragments 9R1, 7H3 and the 9RI / H3 construct, suggesting that the protective effect of 9R1 and 7H3 was entirely in the
Smal/Hindlll-Fragment von 9R1 enthalten ist. Diese Versuche deuten darauf hin, daß das aktive Gen durch den offenen Leserahmen dieser Region definiert wird. Das Ergebnis dieser Versuche ist in Fig. 15 Smal / Hindlll fragment of 9R1 is included. These attempts suggest that the active gene is defined by the open reading frame of this region. The result of these experiments is in Fig. 15
dargestellt. d) Auswirkung von Mutationen auf die anti-apoptotische Wirkung von GAM-1 shown. d) Effect of mutations on the anti-apoptotic effect of GAM-1
Es wurden primäre humane Fibroblasten, wie in den vorigen Beispielen beschrieben, transfiziert, und zwar mit einem Luciferase-Plasmid und dem Leervektor pX (Kontrolle) oder den verschiedenen Testplasmiden Primary human fibroblasts, as described in the previous examples, were transfected with a luciferase plasmid and the empty vector pX (control) or the various test plasmids
(5.5 μg pCMVL plus 0.5 μg Testplasmid), wobei die (5.5 μg pCMVL plus 0.5 μg test plasmid), the
Testplasmide die jeweils mutierten Sequenzen Test plasmids the mutated sequences
enthielten. contained.
Aufgrund der Restriktionskarte des 9R1-Fragments und aufgrund der Beobachtung, daß die expressionssteigernde Aktivität sowohl bei 9R1 und 7H3 auftritt, war Based on the restriction map of the 9R1 fragment and on the observation that the expression-increasing activity occurs with both 9R1 and 7H3
anzunehmen, daß diese Aktivität links von der einzigen Hindlll-Stelle des 9R1-Fragments gelegen sein muß. Ein Smal/Hindlll-Restriktionsfragment enthält den größten offenen Leserahmen links von der Hindlll-Stelle. Als dieses Fragment in einen Vektor subkloniert wurde, zeigte sich, daß es die volle Aktivität des 9R1- Fragments aufweist (Fig. 18, Spalte 4). assume that this activity must be to the left of the only HindIII site of the 9R1 fragment. A Smal / Hindlll restriction fragment contains the largest open reading frame to the left of the Hindlll site. When this fragment was subcloned into a vector, it was found to have the full activity of the 9R1 fragment (Fig. 18, column 4).
BssHII schneidet oberhalb des offenen Leserahmens, von dem die Aktivität vermutet wurde. Schneiden mit BssHII, Behandlung mit Klenow/T4-DNA-Polymerase zum Entfernen der überhängenden Nukleotide und Religieren des BssHII cuts above the open reading frame from which the activity was suspected. Cutting with BssHII, treatment with Klenow / T4 DNA polymerase to remove the overhanging nucleotides and religion
Smal/Hindlll-Fragments führt ein Stopcodon oberhalb dieses Leserahmens ein und sollte daher die Aktivität des erhaltenen Gens nicht verändern. Diese Annahme wurde bestätigt (Fig. 18, Spalte 4); somit liegt die Aktivität offensichtlich außerhalb der BssHII-Region. Ähnliche Behandlungen (Restriktionsverdau/Klenow/T4- DNA-Polymerase und Religieren) an drei anderen Smal / Hindlll fragment introduces a stop codon above this reading frame and should therefore not change the activity of the gene obtained. This assumption was confirmed (Fig. 18, column 4); thus the activity is obviously outside the BssHII region. Similar treatments (restriction digestion / Klenow / T4 DNA polymerase and religion) on three others
Restriktionsstellen (SacII, SphI und Bglll) des Restriction sites (SacII, SphI and Bglll) des
vermuteten offen Leserahmens zerstörten die assumed open reading frames destroyed the
Schutzwirkung (Fig. 18, Spalten 5, 6, 7): sämtliche dieser Behandlungen führen Stopcodons innerhalb des vermuteten Leserahmens ein und würden daher die Protective effect (Fig. 18, columns 5, 6, 7): all of these treatments introduce stop codons within the presumed reading frame and would therefore be the
erhaltenen Proteine in der Nähe der jeweiligen obtained proteins in the vicinity of each
Restriktionsstellen verkürzen (die genauen Shorten restriction places (the exact
Proteinsequenzen (im Einbuchstabencode) und die Protein sequences (in single letter code) and the
Aktivität der Mutanten sind in Tabelle 4 angegeben). Activity of the mutants are given in Table 4).
Um die Auswirkung von Mutationen im Leucin-Zipper zu testen, wurden zwei der Leucinreste im GAM-1-Zipper mittels PCR in Prolinreste mutiert (GAM-1-Mutante #6; L258P, L265P). Primäre humane Fibroblasten wurden wiederum transfiziert, wie oben beschrieben, und zwar mit 5 μg pCMVL plus 1 μg des in Fig. 19 angegebenen Testplasmids, außer bei Probe 4, wo je 0.5 μg EIB 19 K und 0.5 μg p9Rl S/H3 (= Smal/Hindlll-Fragment von 9R1) verwendet wurden. Die Luciferaseexpression wurde 4 Tage nach der Transfektion gemessen. Es zeigte sich, daß die Einführung dieser Punktmutationen die Schutzwirkung von GAM-1 zerstört (Fig. 19, Spalte 5). To test the effect of mutations in the leucine zipper, two of the leucine residues in the GAM-1 zipper were mutated into proline residues by means of PCR (GAM-1 mutant # 6; L258P, L265P). Primary human fibroblasts were again transfected as described above, namely with 5 μg pCMVL plus 1 μg of the test plasmid shown in FIG. 19, except for sample 4, where 0.5 μg EIB 19 K and 0.5 μg p9RI S / H3 (= Smal / Hindlll fragment of 9R1) were used. Luciferase expression was measured 4 days after transfection. It turned out that the Introduction of these point mutations destroys the protective effect of GAM-1 (Fig. 19, column 5).
Beispiel 14 Example 14
Wirkung von GAM-1 auf den durch Ablösung der Zellen von der Unterlage bewirkten Zelltod ("detachment-induced apoptosis") a) Wirkung verschiedener GAM-1-Fragmente Effect of GAM-1 on cell death caused by detachment of the cells from the support ("detachment-induced apoptosis") a) Effect of various GAM-1 fragments
Primäre humane Fibroblasten wurden, wie in den vorigen Beispielen, mit einem Luciferase-Reporterplasmid sowie entweder mit dem Leervektor pSP65 (Kontrolle) oder mit den verschiedenen Testplasmiden (pXCELO), die das jeweils in Fig.20 angegebene Fragment enthielten, (5 μg pCMVL plus 1 μg des jeweiligen Testplasmids) transfiziert. 2 Tage nach der Transfektion wurden die Zellen trypsinisiert, gezählt, und eine definierte Zellzahl (20.000 pro Vertiefung) wurden (3fach) in 24- Lochplatten, die nach Methode A mit PolyHEMA überzogen worden waren. 7 Tage nach dem Ausplattieren wurde die Luciferaseaktivität der gesamten Zellpopulation (nicht anhaftende plus anhaftende Zellen) gemessen. Jeder der in Fig. 20 dargestellten Werte stellt den Primary human fibroblasts were, as in the previous examples, with a luciferase reporter plasmid and either with the empty vector pSP65 (control) or with the various test plasmids (pXCELO), which each contained the fragment shown in FIG. 20 (5 μg pCMVL plus 1 μg of the respective test plasmid) transfected. 2 days after the transfection, the cells were trypsinized, counted, and a defined number of cells (20,000 per well) were (3-fold) in 24-well plates which had been coated with PolyHEMA according to Method A. 7 days after plating, the luciferase activity of the entire cell population (non-adherent plus adherent cells) was measured. Each of the values shown in Fig. 20 represents the
Durchschnittswert von 3 Transfektionen dar. b) Vergleich der Wirkung von GAM-1 mit EIB 19 K und Bei-2 Average value of 3 transfections. B) Comparison of the effects of GAM-1 with EIB 19 K and Bei-2
Primäre humane Fibroblasten wurden, wie in den vorigen Beispielen, mit einem Luciferase-Reporterplasmid sowie entweder mit dem Leervektor pSP65 (Kontrolle) oder mit den verschiedenen Testplasmiden (5 μg pCMVL plus 1 μg pSP65 oder pElB 19K, pBCL-2 oder p9R1 S/H3 ) transfiziert. 2 Tage nach der Transfektion wurden die Zellen trypsinisiert, gezählt und und eine definierte Zellzahl (20.000 pro Vertiefung) wurden (3fach) entweder in normale 24-Lochplatten oder in nach Methode B mit PolyHEMA überzogenen 24-Lochplatten ausplattiert. Fig. 21 gibt die Verdünnung des für die Beschichtung verwendeten PolyHEMA an. 7 Tage nach dem Ausplattieren wurde die Luciferaseaktivität der gesamten Primary human fibroblasts were, as in the previous examples, with a luciferase reporter plasmid and either with the empty vector pSP65 (control) or with the various test plasmids (5 μg pCMVL plus 1 μg pSP65 or pElB 19K, pBCL-2 or p9R1 S / H3 ) transfected. 2 days after the transfection, the cells were trypsinized, counted and and a defined number of cells (20,000 per well) were plated (3-fold) either in normal 24-hole plates or in 24-hole plates coated with Method B with PolyHEMA. Figure 21 shows the dilution of the PolyHEMA used for the coating. 7 days after plating, the luciferase activity was stopped
Zellpopulation (nicht anhaftende plus anhaftende Cell population (non-adherent plus adherent
Zellen) gemessen. Jeder der in Fig. 21 dargestellten Werte stellt den Durchschnittswert von 3 Transfektionen dar. Cells). Each of the values shown in Fig. 21 represents the average of 3 transfections.
Beispiel 15 Example 15
Wirkung der Kombination von GAM-1 mit EIB 19K oder mit Bei-2 Effect of the combination of GAM-1 with EIB 19K or with Bei-2
Primäre humane Fibroblasten wurden, wie in den vorigen Beispielen, mit einem Luciferase-Reporterplasmid sowie entweder mit dem Leervektor pSP65 (Kontrolle) oder mit den verschiedenen in Fig.22 angegebenen Testplasmiden (5 μg pCMVL plus 1 μg des jeweiligen Testplasmids in den Proben 1-4, in den Proben 5 und 6 enthielt die Mischung neben dem Reporterplasmid je 0.5 μg des Primary human fibroblasts were, as in the previous examples, with a luciferase reporter plasmid and either with the empty vector pSP65 (control) or with the various test plasmids shown in FIG. 22 (5 μg pCMVL plus 1 μg of the respective test plasmid in samples 1- 4, in samples 5 and 6 the mixture contained 0.5 .mu.g each of the
Testplasmids) transfiziert. In Fig. 22 ist die Test plasmids) transfected. 22 is the
Luciferaseexpression 22 Tage nach der Transfektion gezeigt, wobei jeder Wert den Durchschnitt von 3 Luciferase expression was shown 22 days after transfection, with each value averaging 3
Transfektionen darstellt. Represents transfections.
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J. Immunol. 152, 1419-1427. J. Immunol. 152, 1419-1427.

Claims

Patentansprüche Claims
1. Verfahren zum Behandeln von höheren eukaryotischen Zellen, insbesondere zum Einbringen von 1. Method for treating higher eukaryotic cells, in particular for the introduction of
Fremdmaterial, wie Nukleinsäure, in die Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß man außer dem  Foreign material, such as nucleic acid, in the cells, characterized in that in addition to the
Fremdmaterial und den Transfektionskomponenten a) in die Zelle ein oder mehrere Nukleinsäure- Moleküle, insbesondere DNA-Moleküle, einbringt, deren Expressionsprodukte die durch das Einbringen des Fremdmaterials ausgelöste Apoptose der  Foreign material and the transfection components a) introduces one or more nucleic acid molecules, in particular DNA molecules, whose expression products are the apoptosis of the foreign material triggered by the introduction of the foreign material
Wirtszelle zumindest teilweise blockieren,  Block the host cell at least partially,
und/oder daß man  and / or that one
b) die inflammatorische Antwort der Zellen  b) the inflammatory response of the cells
zumindest teilweise inhibiert, indem man  at least partially inhibited by
i) die Zellen äußerlich mit einer oder mehreren anti-inflammatorisch wirkenden Substanz(en) behandelt und/oder  i) treating the cells externally with one or more anti-inflammatory substance (s) and / or
ii) in die Zellen eine oder mehrere anti- inflammatorische Substanz(en) oder die dafür kodierenden Nukleinsäure-, insbesondere DNA- Moleküle einbringt.  ii) introduces one or more anti-inflammatory substance (s) or the nucleic acid, in particular DNA molecules coding for them into the cells.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Fremdmaterial DNA ist, die mit einem, gegebenenfalls mit einem Liganden für die 2. The method according to claim 1, characterized in that the foreign material is DNA with one, optionally with a ligand for
Zielzelle konjugierten, Polykation komplexiert ist, und daß der DNA-Komplex in Gegenwart von Adenovirus oder Adenovirus-Polykation-Konjugat in die Zellen eingebracht wird.  Target cell conjugated, polycation is complexed, and that the DNA complex is introduced into the cells in the presence of adenovirus or adenovirus-polycation conjugate.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch 3. The method according to claim 1 or 2, characterized
gekennzeichnet, daß das in a) definierte DNA- Molekül mit anti-Apoptose-Wirkung für humanes Bcl- 2 kodiert. characterized in that the DNA molecule defined in a) with anti-apoptosis effect codes for human Bcl-2.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch 4. The method according to claim 1 or 2, characterized
gekennzeichnet, daß das in a) definierte DNA- Molekül mit anti-Apoptose-Wirkung für Adenovirus EIB 19K kodiert.  characterized in that the DNA molecule defined in a) codes for anti-apoptosis activity for adenovirus EIB 19K.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch 5. The method according to claim 1 or 2, characterized
gekennzeichnet, daß das DNA-Molekül mit anti- Apoptose-Wirkung für ein Genprodukt kodiert, das p53 inaktiviert.  characterized in that the DNA molecule with anti-apoptosis effect codes for a gene product which inactivates p53.
6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch 6. The method according to claim 1 or 2, characterized
gekennzeichnet, daß das in a) definierte DNA- Molekül ein Smal/Hindlll-Fragment des CELO- Virusgenoms ist, das im Bereich zwischen ca. 84.3 bis 88.7 Kartierungseinheiten lokalisiert ist, oder eine DNA-Sequenz, die dieses Fragment  characterized in that the DNA molecule defined in a) is a Smal / Hindlll fragment of the CELO virus genome, which is located in the range between approximately 84.3 to 88.7 mapping units, or a DNA sequence which this fragment
enthält.  contains.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-Molekül die in SEQ ID NO: 1 7. The method according to claim 6, characterized in that the DNA molecule in SEQ ID NO: 1
dargestellte Nukleotidsequenz oder eine  nucleotide sequence shown or a
Teilsequenz davon aufweist.  Has partial sequence thereof.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-Molekül ein EcoRI-Fragment des CELO- Virusgenoms ist, das im Bereich zwischen den 8. The method according to claim 6, characterized in that the DNA molecule is an EcoRI fragment of the CELO virus genome, which in the area between the
Kartierungseinheiten 81.2 bis 92.7 lokalisiert ist.  Mapping units 81.2 to 92.7 is localized.
9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-Molekül ein HindIII-Fragment ist, das im Bereich zwischen den Kartierungseinheiten 77.8 und 88.7 lokalisiert ist. 9. The method according to claim 6, characterized in that the DNA molecule is a HindIII fragment which is located in the region between the mapping units 77.8 and 88.7.
10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-Molekül den in der Sequenz gemäß SEQ ID NO:1 enthaltenen offenen Leserahmen aufweist oder für ein Genprodukt kodiert, das ein 10. The method according to claim 6, characterized in that the DNA molecule in the sequence according to SEQ ID NO: 1 contained open reading frame or codes for a gene product that a
funktionelles Derivat des durch diesen Leserahmen definierten Genprodukts ist.  is a functional derivative of the gene product defined by this reading frame.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 10, 11. The method according to any one of claims 2 to 10,
dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-Molekül mit anti-Apoptose-Wirkung gemeinsam mit der in die Zelle einzubringenden DNA als Bestandteil eines DNA-Polykation-Komplexes vorliegt.  characterized in that the DNA molecule with anti-apoptosis effect is present together with the DNA to be introduced into the cell as part of a DNA-polycation complex.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch 12. The method according to claim 11, characterized
gekennzeichnet, daß die in die Zelle  characterized that in the cell
einzubringende DNA und das DNA-Molekül mit anti- Apoptose-Wirkung auf getrennten Plasmiden  DNA to be introduced and the DNA molecule with anti-apoptosis effect on separate plasmids
vorliegen.  available.
13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch 13. The method according to claim 11, characterized
gekennzeichnet, daß die in die Zelle  characterized that in the cell
einzubringende DNA und das DNA-Molekül mit anti- Apoptose-Wirkung gemeinsam auf einem Plasmid vorliegen.  DNA to be introduced and the DNA molecule with anti-apoptosis effect are present together on one plasmid.
14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die anti-inflammatorische Substanz Adenovirus VA1 ist. 14. The method according to claim 1, characterized in that the anti-inflammatory substance is adenovirus VA1.
15. Verfahren nach Anspruch 1 oder 14, dadurch 15. The method according to claim 1 or 14, characterized
gekennzeichnet, daß die anti-inflammatorische Substanz in Form der dafür kodierenden DNA in die Zelle eingeführt wird.  characterized in that the anti-inflammatory substance is introduced into the cell in the form of the DNA coding therefor.
16. Verfahren nach Anspruch 2, 14 und 15, dadurch 16. The method according to claim 2, 14 and 15, characterized
gekennzeichnet, daß die VA1-DNA gemeinsam mit der in die Zelle einzubringenden DNA als Bestandteil eines DNA-Polykation-Komplexes vorliegt. characterized in that the VA1-DNA is present together with the DNA to be introduced into the cell as part of a DNA-polycation complex.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch 17. The method according to claim 16, characterized
gekennzeichnet, daß der Komplex außerdem das in a) definierte DNA-Molekül enthält.  characterized in that the complex also contains the DNA molecule defined in a).
18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, daß die beiden bzw. die drei DNA-Moleküle auf getrennten 18. The method according to claim 16 or 17, that the two or the three DNA molecules on separate
Plasmiden vorliegen.  Plasmids are present.
19. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, daß die beiden bzw. die drei DNA-Moleküle gemeinsam auf einem Plasmid vorliegen. 19. The method according to claim 16 or 17, that the two or the three DNA molecules are present together on a plasmid.
20. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in die Zelle ein DNA-Molekül mit anti- Apoptose-Wirkung einbringt und die Zellen 20. The method according to claim 1, characterized in that a DNA molecule with anti-apoptosis effect is introduced into the cell and the cells
äußerlich mit einer anti-inflammatorisch wirkenden Substanz behandelt.  treated externally with an anti-inflammatory substance.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch 21. The method according to claim 20, characterized
gekennzeichnet, daß die anti-inflammatorisch wirkende Substanz die Aktivierung von  characterized in that the anti-inflammatory substance activating
Phospholipase A2 inhibiert.  Phospholipase A2 inhibited.
22. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch 22. The method according to claim 15, characterized
gekennzeichnet, daß die anti-inflammatorische Substanz ein Glucocorticoid ist.  characterized in that the anti-inflammatory substance is a glucocorticoid.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch 23. The method according to claim 22, characterized
gekennzeichnet, daß das Glucocorticoid  characterized that the glucocorticoid
Dexamethason ist.  Dexamethasone is.
24. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch 24. The method according to claim 20, characterized
gekennzeichnet, daß die anti-inflammatorische Substanz einen Metaboliten der Arachidonsäure inhibiert. characterized in that the anti-inflammatory substance inhibits a metabolite of arachidonic acid.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch 25. The method according to claim 24, characterized
gekennzeichnet, daß die anti-inflammatorische Substanz Ibuprofen ist.  characterized in that the anti-inflammatory substance is ibuprofen.
26. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch 26. The method according to claim 24, characterized
gekennzeichnet, daß die anti-inflammatorische Substanz Acetylsalicylsäure ist.  characterized in that the anti-inflammatory substance is acetylsalicylic acid.
27. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch 27. The method according to claim 24, characterized
gekennzeichnet, daß die anti-inflammatorische Substanz Nordihydroguaiaretinsäure (NDGA) ist.  characterized in that the anti-inflammatory substance is Nordihydroguaiaretinsäure (NDGA).
28. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch 28. The method according to claim 24, characterized
gekennzeichnet, daß die anti-inflammatorische Substanz 5,8,11-Eicosatriynonsäure ist.  characterized in that the anti-inflammatory substance is 5,8,11-eicosatriynonic acid.
29. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch 29. The method according to claim 24, characterized
gekennzeichnet, daß die anti-inflammatorische Substanz Indomethacin ist.  characterized in that the anti-inflammatory substance is indomethacin.
30. DNA-Molekül, enthaltend die in SEQ ID NO: 1 30. DNA molecule containing those in SEQ ID NO: 1
dargestellte Nukleotidsequenz oder eine für ein funktionelles Genprodukt mit anti-apoptotischer Wirkung kodierende Teilsequenz davon.  nucleotide sequence shown or a partial sequence thereof coding for a functional gene product with anti-apoptotic effect.
31. DNA-Molekül nach Anspruch 30, dadurch 31. DNA molecule according to claim 30, characterized
gekennzeichnet, daß es den in der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 enthaltenen offenen Leserahmen  characterized in that it is the open reading frame contained in the sequence according to SEQ ID NO: 1
aufweist, einschließlich degenerierter Varianten, oder Mutanten, die für ein funktionelles  has, including degenerate variants, or mutants that are functional
Genprodukt mit anti-apopotischer Wirkung kodieren.  Code gene product with anti-apopotic effect.
32. Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es die in SEQ ID NO:2 dargestellte Aminosäuresequenz 32. Polypeptide, characterized in that it has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
aufweist. having.
33. Transfektionskomplex, enthaltend ein in der Zelle zu exprimierendes Nukleinsäuremolekül, das mit einem, gegebenenfalls mit einem Liganden für die Zielzelle konjugierten, Polykation komplexiert ist, sowie Adenovirus oder ein Adenovirus- Polykation-Konjugat, dadurch gekennzeichnet, daß er außerdem ein DNA-Molekül mit Anti-Apoptose- Wirkung und/oder ein DNA-Molekül, kodierend für eine Substanz mit anti-inflammatorischer Wirkung, enthält. 33. Transfection complex containing a nucleic acid molecule to be expressed in the cell, which is complexed with a polycation, optionally conjugated with a ligand for the target cell, and adenovirus or an adenovirus-polycation conjugate, characterized in that it also contains a DNA molecule with anti-apoptosis effect and / or a DNA molecule, coding for a substance with anti-inflammatory effect, contains.
34. Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend einen 34. Pharmaceutical preparation containing one
Transfektionskomplex nach Anspruch 33, in dem das in der Zelle zu exprimierende Nukleinsäuremolekül ein therapeutisch oder gentherapeutisch wirksames DNA-Molekül ist.  A transfection complex according to claim 33, in which the nucleic acid molecule to be expressed in the cell is a therapeutically or gene-therapeutically active DNA molecule.
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