EP0188485A1 - Sonde et procede pour le diagnostic du sexe d'un embryon humain - Google Patents

Sonde et procede pour le diagnostic du sexe d'un embryon humain

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Publication number
EP0188485A1
EP0188485A1 EP85903297A EP85903297A EP0188485A1 EP 0188485 A1 EP0188485 A1 EP 0188485A1 EP 85903297 A EP85903297 A EP 85903297A EP 85903297 A EP85903297 A EP 85903297A EP 0188485 A1 EP0188485 A1 EP 0188485A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
probe
dna
hybridization
cells
sex
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP85903297A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Gilles Vergnaud
Liliana Kaplan
Jean Weissenbach
Pierre Tiollais
Georges Guellaen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Pasteur de Lille
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Pasteur de Lille
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut Pasteur de Lille, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP0188485A1 publication Critical patent/EP0188485A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6879—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for sex determination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the invention relates to a probe comprising a nucleic acid sequence specific for the human Y chromosome and to a method for diagnosing the sex of a human embryo.
  • the object of the invention is to provide an even more specific probe for the Y chromosome and an in vitro diagnostic method capable of being implemented on a total genomic DNA, without prior separation of any of its constituents.
  • the invention therefore aims to combine the earliness of the diagnosis, the speed and reliability of its implementation.
  • the invention stems from a research project, certain results of which were the subject of first publications. This is more particularly the article by CE.BISHOP et al. titled “Sinqle-Copy DNA Specified Sequences for the Human Y Chromosome", (Nature Vol. 303, N ° 5 920, on. 831 - 832, June 30, 1983 ) and the article by C. BISHOP et al. entitled “Extensive Sequence Homologies Between Y And-Other Human- Chromosomes” (J. Mol. Biol. [1984] 173, 403-417).
  • the second article describes more particularly the conditions under which the amplified cosmids containing exclusively inserts of human origin were obtained, how the latter were further sorted, by digestion with the restriction enzyme EcoRI and subcloning of the fragments obtained in pBR 322, to finally obtain 45 probes containing inserts originating from the human Y chromosome and probably unrelated to each other.
  • These probes were further characterized by hybridization experiments under strict conditions with series of fragments obtained from genomic DNA treated by complete digestion with the restriction enzyme EcoRI, then separated by electrophoresis in gels. of agarose, before being transferred to a nitro-cellulose filter or a similar paper, known under the initials DBM (ALWINE, JC [1977] Proc.Nat.Acad. SCi.
  • the invention follows from the discovery that one of these EcoRI fragments, called “Probe 49 F” was capable not only of giving rise to selective hybridization with a particular DNA fragment obtained from series of EcoRI fragments transferred as indicated above and obtained from Y chromosomes, but also to give rise to an equally selective hybridization when this is carried out on a single spot of DNA originating from human male embryo, if necessary previously fragmented, this spot having been obtained for example by filtration of a solution of total genomic DNA through a nitrocellulose filter pad, according to the so-called "Dot-Blot” technique.
  • the above-mentioned prior fragmentation can be carried out by simple ultrasonic treatment (sonication) of the DNA preparation to be tested.
  • the invention relates more generally to any DNA containing a hybridizable fragment under the strict conditions recalled below, with the EcoRI fragment of 2.8 kb obtained from the euchromatic region located between the centromere and the heterochromatin (when the latter is present) of the large arm of a Y chromosome, this fragment having been deposited on 06/29/1984 at the National Collection of Cultures of Microorganisms of the INSTITUT PASTEUR of Paris (CNCM) under N ° 1- 312.
  • CNCM National Collection of Cultures of Microorganisms of the INSTITUT PASTEUR of Paris
  • any fragment of chromosome Y which forms stable hybrids with the above-mentioned EcoRI fragment deposited at the CNCM in the presence of a solution of 0.1 SSC at 65-68oC, more particularly at 68 ° C.
  • This condition of stability of the hybrid can be verified in particular during the washing of the hybrid previously formed on a suitable support / such as a nitrocellulose filter or the like, with a solution of 0.1 ⁇ SSC (SSC being a 0.5 M NaCl solution; 0.15 M sodium citrate at pH 7.0 at 65 - 68 ° C, more particularly 68 ° C).
  • SSC being a 0.5 M NaCl solution; 0.15 M sodium citrate at pH 7.0 at 65 - 68 ° C, more particularly 68 ° C.
  • the invention relates to any plasmid or other vector containing an insert corresponding to the above definition.
  • hybridization stability conditions which have been defined above are strict with regard to the selectivity of the hybridization.
  • the ion content of the 0.1 SSC solution being low, the hybridization remains stable only to the extent that the two chains involved in the constitution of the hybrid have a very high degree of complementarity. The selectivity of this probe even with respect to,.
  • the DNA preparation required for the implementation of the diagnosis according to the invention can consist of any cells of the embryo capable of being obtained at a very early stage of gestation, in particular between the 6th and 8th week, for example from tr ⁇ phoblasts (ie from chorionic cells) or from chorionic villi. Examples of implementation of the method according to the invention will be described below.
  • the invention therefore also relates to a nrocedé oour the in vitro diagnosis of sex, orocé35 characterized nar the contacting of a DNA containing all or part of the hybridizable fraqment above-defined with the practically total DNA coming from cells taken from the fetus whose sex must be determined, this total DNA having been previously extracted from said cells or simply made accessible to the probe, or for example by lysis of. cells, and by bringing the hybrid formed into contact, whether already during or after the hybridization (especially during washes) with a solution with low ionic strength and at a temperature favoring together highly selective hybridizations of the probe with a sequence of complementary DNA present in the chromatin of the human Y chromosome.
  • the aforesaid brought into contact is aerated with a 0.1 SSC solution at a temperature of 65 - 68 ° C, more particularly 68 ° C.
  • the probes are radioactively marked.
  • the invention is not limited to this method of marking.
  • the probes can be modified by a single group allowing their coupling, direct or indirect, for example with an enzyme whose presence can be revealed by its action with respect to a specific substrate, preferably a chromogenic substrate, or with a fluorescent or luminescent molecule. Coupling modes of this type have been envisaged, for example, in French patents 78 10975 and 81 27631 or in published European patent application 0063 879.
  • a preferred embodiment of the method according to the invention for the detection of sex on cells originating from a fetus or. human embryo will include:
  • nucleic acids thus fixed or made accessible into contact with the labeled probe according to the invention under conditions allowing effective hybridization to be carried out, when the DNAs studied comprise a Y chromosome;
  • kits or "kits” containing a probe in accordance with the invention and, where appropriate, control chromosomal preparations (originating from male and / or female embryos) and any other reagents necessary for the production of a in vitro diagnostic test.
  • the DNA analysis was carried out on cells belonging to the chorionic villi or to blood cells taken from the embryos studied. The technique known as "Dot blot" was used. The tests can be carried out on quantities of DNA less than 3 ⁇ ig. The trials only last two days. Cell samples
  • the blood samples were provided by hospitals. Trophoblast samples were obtained from placental biopsies performed after the first 6 to 8 weeks of gestation. In a number of cases, biopsies have been taken in women before abortion and after having obtained their informed consent. A 1.7 mm diameter DYONIC biopsy forceps was introduced cross-cervically into the uterine cavity using a real-time ultrasound guide according to the methods described by SIMONI G. et al. (Hum. Genêt. [1983]; 63 349-57) and WARD R.H.T. et al. (Brit.Med. H. 1983: 1542-4).
  • trophoblast villi i.e., chorion
  • the tissues were washed in an isotonic and sterile saline solution and then examined immediately under a dissecting microscope. All maternal decidual cells have been carefully separated from the villi using appropriate tweezers. From 10 to 50 mg of trophoblast villi were then used for the analysis of their nucleic acids. The products of conception were used for karyotype or chromatin studies Trophoblast villi have also been used. In seven cases, small parts of these villi were obtained by dissection from placental cotyledons obtained after cesarean sections.
  • Fibroblasts obtained from embryos were cultured in vitro according to standard procedures (RPMI 1640 fetal calf serum, antibiotics, in an atmosphere containing 5% CO 2 ).
  • the karyotypes were established after in vitro cultures for 12-20 days (second or third pass) using standard techniques. Giemsa stains and molecular weight separation techniques (C Banding techniques: CBG) were used. Two to ten mitoses were analyzed.
  • the chromatins of the chromosomes involved in the constitution of sex were studied on cells at the interphase level supplied from cultures of fibroblasts stained with toluidine blue. From 100 to 200 nuclei were counted.
  • Preparation of the nucleic acids and analysis A) Preparation of the DNA obtained from blood cells: 10 ml of blood were collected in a ml of 5% EDTA. The serum was removed by centrifugation. The red blood cells were lysed in 0.17 M NH 4 Cl and the leukocytes were collected by centrifugation. They were lysed in a solution containing 7 M urea, 2% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.2 M NaCl, 10 mM Tris at pH 8 and 1 mM EDTA. The solution was extracted twice with an equal volume mixture of phenol and chloroform, then twice with chloroform before being precipitated with ethanol.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the precipitate was taken up, dissolved in a 10 mM Tris solution, 1 mM EDTA and containing ribonuclease A (50 ⁇ g / ml). The solution was incubated at 37 ° C for one hour, then supplemented with the following products to finally obtain a concentration in 1% SDS, 10 mM EDTA and proteinase K 100 ⁇ g / ml. The solution was then incubated for two hours. The solution was then extracted once with chloroform, dyalized in a 10 mM Tris solution pH 8, 1 mM EDTA overnight, before being precipitated again with ethanol.
  • the DNAs were treated with ultrasound, denatured in a 0.4M NaOH solution and 1 M NaCl at 4 ° C for half an hour.
  • the solution was neutralized just before filtration through a nitrocellulose filter in a 1.5 M Tris-NaCl solution, pH 7. Before filtration the nitrocellulose filter had been washed in a 6 x SSC solution. After filtration the filter was dried at 80 ° C for two hours, then hybridized in 6 x SSC, 1 x DENHARDT, for
  • the probe according to the invention (which essentially contains a single sequence, as opposed to earlier probes essentially consisting of repetitive sequences) perfectly discriminates the male and female chromosomes, even when these have the following anomalies: in the case of male chromosomes, loss of part or all of the heterochromatin and in the case of female chromosomes, translocation into the X chromosome of certain fragments of heterochromatin normally considered to belong to the heterochromatin of group Y of the male chromosomes .

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Abstract

Une sonde et un procédé pour la détection in vitro du sexe d'un embryon humain par hybridation de la sonde avec les acides nucléiques de cellules provenant de cet embryon. Le procédé est mis en oeuvre avec une sonde contenant un fragment d'ADN hybridable avec le fragment EcoRI de 2,8 kb obtenu à partir de la région euchromatique du grand bras d'un chromosome Y et déposé le 29/06/1984 à la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes sous le No I-312, cette hybridation étant réalisable ou maintenue en présence d'une solution 0,1 x SSC, à 65 - 68oC, plus particulièrement 68oC.

Description

Sonde et procédé pour le diagnostic du sexe d'un embryon humain ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
L'invention concerne une sonde comportant une séquence d'acide nucléique spécifique du chromosome Y humain et un procédé pour le diagnostic du sexe d'un embryon humain.
On sait l'importance que peut revêtir la détermination aussi précoce que possible du sexe d'un foetus humain, notamment dans des épreuves de diagnostic prénatal de certaines maladies récessives liées aux chromosomes X. Les méthodes actuelles sont essentiellement basées sur les techniques d'amniocentèse réalisées à partir de la dixhuitième semaine de la gestation et sur le diagnostic réalisé sur les cellules amniotiques. Ce diagnostic est couramment effectué en mettant en oeuvre des techniques de fluorescence. Il a été récemment proposé des méthodes mettant en jeu des hybridations de l'ADN de ces cellules amniotiques avec des sondes contenant des séquences répétitives d'ADN considérées comme spécifiques du chromosome Y (LAU Y.F.et coll [1984] Lancet.; i:14-16). Ces méthodes certes efficaces présentent cependant l'inconvénient de n' être oas suffisamment précoces.
Plus récemment il a été proposé de réaliser ces épreuves de diagnostic sur des biopsies de trophoblast, ces épreuves comprenant alors un caryotype direct effectué sur les villosités chorionales (SIMONI G. et coll [1983] Hum. Genet.; 63:349 - 57) ou au niveau moléculaire avec des sondes d'ADN présentées comme spécifiques du chromosome Y. La réalisation de caryotypes directs sur les villosités chorionales peut cependant être perturbée par un nombre réduit de mitoses, dont le développement peut être difficile à analyser. C'est oourquoi GOSDEN et coll.[1982]Lancet.;i i : 1416 - 1419) ont récemment développé une méthode pour la détection prénatale rapide du sexe qui met en oeuvre une préparation d'acides nucléiques extraite des villosstés chorionales par hydrolyse de restriction, transfert sur filtre de nitrocellulose ou analogue et hybridation selon la méthode de SOUTHERN avec un ADN de satellite III de mâle. Cette méthode est d'une mise en oeuvre plus rapide. Ceci étant, le traitement de l'ADN extrait des villosités chorionales par des enzymes de restriction constitue toujours encore un facteur de ralentissement de la mise en oeuvre du procédé. En outre la sonde utilisée, qui détedte plus particulièrement une région du chromosome contenant un fragment HaelII de 3 ,4 (kb) reconnaît également d'autres séquences présentes aussi bien dans des ADN mâles que femelles. Cette méthode de diagnostic in vitro ne présente donc pas encore une fiabilité absolue. Elle n'est pas encore non plus suffisamment rapide et commode pour la réalisation de diagonstics vraiment précoces et aisés du sexe d'un foetus.
L'invention a pour but de fournir une sonde plus spécifique encore du chromosome Y et un procédé de diagnostic in vitro susceptibles d'être mis en oeuvre sur un ADN génomique total, sans séparation préalable d'aucun de ses constituants. L'invention a donc pour but d'allier la précocité du diagnostic, la rapidité et la fiabilité de sa mise en oeuvre.
L'invention découle d'un projet de recherches dont certains résultats ont fait 1' objet de premières publications. Il s'agit plus particulièrement de l'article de CE.BISHOP et coll. intitulé "Sinqle-Copy DNA Séquences Spécifie for the Human Y Chromosome" (Séquences d'ADN à copie unique spécifiques pour le chromoscîrie Y humain), (Nature Vol. 303, N° 5 920, on. 831 - 832, 30 juin 1983) et de l'article de C. BISHOP et coll.intitulé "Extensive Séquence Homologies Between Y And-Other Human- Chromosomes" (homplogies importantes de séquences entre le chromosome Y et d'autres chromosomes humains) (J. Mol. Biol. [1984] 173,403-417). Ces auteurs préoarèrent en effet une banque de fragments d'ADN appartenant à un chromosane Y humain (et obtenus à partir d'une cellule somatique hybride contenant exclusivement le chromosome Y humain associé avec d'autres acides nucléiques tous originaires de la souris). L'ADN de cet hybride a été soumis à une restriction partielle avec l'enzyme de restriction Mbol dans des conditions permettant d'obtenir des fragments de 35 - 50 kb , lesquels ont été clones dans Escherichia coli par l'intermédiaire du cosmide pJB 8. Le second article décrit plus particulièrement les conditions dans lesquelles les cosmides amplifiés contenant exclusivement des insérats d'origine humaine ont été obtenus, comment ces derniers ont été encore triés, par digestion avec l'enzyme de restricion EcoRI et sous-clonage des fragments obtenus dans pBR 322, pour finalement obtenir 45 sondes contenant des insérats originaires du chromosome Y humain et vraisemblablement non- apparentés entre eux. Ces sondes ont été davantage encore caractérisées grâce à des expériences d'hybridation dans des conditions déterminées strictes avec des séries de fragments obtenus à partir d'ADN génomique traité par digestion complète avec l'enzyme de restriction EcoRI, puis séparés par électrophorèse dans des gels d'agarose, avant d'être transférés sur filtre de nitro-cellulose ou un papier analogue, connu sous les initiales DBM (ALWINE, J.C. [1977] Proc.Nat.Acad. SCi. USA 74, 5 350 - 5354). Ces ensembles de fragments transférés sur filtres de nitrocellulose ou analogues étaient désignés par l'expression anglaise "Genomic Blots". Ces auteurs devaient ainsi isoler 9 sondes hybridables avec le chromosome Y humain , mais non-hybridables avec chromosome X humain ou avec d'autres chromosomes (autosomes) humains.
L'invention découle de la découverte que l'un de ces fragments EcoRI, dénommé "Sonde 49 F" était capable non seulement de donner lieu à une hybridation sélective avec un fragment particulier d'ADN obtenu à partir de séries de fragments EcoRI transférés comme indiqué plus haut et obtenus à partir de chromosomes Y, mais encore de donner lieu à une hybridation toute aussi sélective lorsque celleci est réalisée sur une tache unique d'un ADN originaire d'embryon masculin humain, le cas échéant fragmenté au préalable, cette tache ayant été obtenue par exemple par filtration d'une solution de l'ADN génomique total à travers une pastille de filtre de nitrocellulose, selon la technique dite du "Dot-Blot". La susdite fragmentation préalable peut être réalisée par simple traitement aux ultrasons (sonication) de la préparation d'ADN à tester. L'invention concerne plus généralement tout ADN contenant un fragment hybridable dans les conditions strictes rappelées ci-après, avec le fragment EcoRI de 2,8 kb obtenu à partir de la région euchromatique située entre le centromère et l'hétérochromatine (lorsque celle-ci est présente) du grand bras d,'un chromosome Y, ce fragment ayant été déposé le 29/06 /198'4 à la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes de l'INSTITUT PASTEUR de Paris (C.N.C.M) sous le N° 1-312 . En particulier doit être considéré comme faisant partie de l'invention tout fragment de chromosome Y qui forme des hybrides stables avec le susdit fragment EcoRI déposé à la C.N.C.M. en présence d'une solution de 0,1 SSC à 65-68ºC, plus particulièrement à 68°C. Cette condition de stabilité de l'hybride peut être vérifiée notamment à l'occasion du lavage de l'hybride préalablement formé sur un support approprié/tel que filtre de nitrocellulose ou analogue, avec une solution de 0,1 x SSC (SSC étant une solution de NaCl 0,5 M; citrate de sodium 0,15 M à pH 7,0 à 65 - 68°C, plus particulièrement 68°C). En particulier l'invention concerne tout plasmide ou autre vecteur contenant un insérât répondant à la susdite définition.
On remarquera que les conditions de stabilité d'hybridation qui ont été définies ci-dessus sont strictes eu égard à la sélectivité de l'hybridation. En effet la teneur en ions de la solution 0,1 SSC étant faible, l'hybridation ne reste stable que dans la mesure où les deux chaînes intervenant dans la constitution de l'hybride présentent un très haut degré de complémentarité. La sélectivité de cette sonde même à l'égard, du. génome total de cellules obtenues à partir d'embryons est d'autant plus remarquable que des essais extensifs ont montré σue cette sonde hybridait avec des chromosomes "mini Y", c'est à dire des chromosomes Y humains pratiquement dépourvus d'hétérochromatine (anomalie qui se rencontre chez un certain nombre d'individus masculins) ou avec des chromosomes Y dont avaient au préalable été délétés l'hétérochromatine et qu'elle n'hybridait jamais avec des chromosomes X contenant des fragments d'hétérochromâtine Y résultant d'une translocation du type de celles que l'on rencontre chez 1 femme sur 3.000. La préparation d'ADN requise pour la mise en oeuvre du diagnostic selon l'invention peut être constituée par toutes cellules de l'embryon susceptibles d'être obtenus à un stade très précoce de la gestation, notamment entre la 6ème et la 8ème semaine, par exemple à partir dé trσphoblastes (c'est à dire de cellules chorioniques) ou de villosités chorionales. Des exemples de mise en oeuvre du procédé selon l'invention seront décrites ci-après.
L'invention concerne donc également un nrocëdé oour le diagnostic in vitro du sexe, orocédé caractérisé nar la mise en contact d'un ADN contenant tout ou partie du fraqment hybridable sus-défini avec l'ADN pratiquement total provenant de cellules prélevées sur le foetus dont le sexe doit être déterminé, cet ADN total ayant au préalable été extrait desdites cellules ou simplement rendu accessible à la sonde, oar exemple par lyse des. cellules, et par mise en contact de l'hybride formé, que ce soit déjà au cours de l'hybridation ou postérieurement à celle-ci (notamment à l'occasion de lavages) avec une solution à faible force ioniαue et à une température favorisant conjointement des hybridations hautement sélectives de la sonde avec une séσuence d'ADN complémentaire présente dans l'eu chromatine du chromosome Y humain. De préférence la susdite mise en contact est onérée avec une solution 0,1 SSC à une température de 65 - 68°C, plus narticulièreπent de 68°C.
Il est remarquable σue l'on puisse dans ces conditions, et en présence de l'ADN qéncmique total, obtenir des hybridations à ce point sélectives et détectables - lorsque la sonde est convenablement marquée - par un signal aisément décelable. Dans les essais dont la description suit les sondes sont marquées radio-activement. Bien entendu l'invention n'est pas limitée à ce mode de marquage. De façon en soi connue, les sondes peuvent être modifiées par un groupe unique permettant leur couplage, direct ou indirect, par exemple avec une enzyme dont la présence peut être révélée jrar son action à l'égard d'un substrat spécifique, de préférence un substrat chromogène, ou encore avec une molécule fluorescente ou luminescente. Les modes de couplage de ce type ont, été envisagés par exemple dans les brevets français 78 10975 et 81 27631 ou dans la demande de brevet européen publiée 0063 879.
Un mode de mise en oeuvre préféré du procédé selon l'invention pour la détection du sexe sur des cellules originaires d'un foetus ou. embryon humain comprendra notamment :
- le dépôt et la fixation de l'acide nucléique des cellules à analyser (ou de ces dernières préalablement traitées de façon à permettre l'accès de leurs acides nucléiques à la sonde) sur un filtre approprié?
- la mise en contact des acides nucléiques ainsi fixés ou rendus accessibles avec la sonde marquée selon l'invention dans des conditions permettant la réalisation d'une hybridation effective, lorsque les ADN étudiés comportent un chromosome Y;
- l'élimination, notamment par lavages, de toute sonde non hybridée, et ce, en particulier, avec une solution
0,1 SSC à une température de l'ordre de 68°C et
- la détection des sondes d'ADN retenues par hybridation sur le support.
L'invention concerne naturellement également les nécessaires ou "kits" contenant une sonde conforme à l'invention et le cas échéant des préparations chromosomiques témoins (originaires d'embryons mâles et/ou femelles) et tous autres réactifs nécessaires à la réalisation d'un essai de diagnostic in vitro.
Des caractéristiques supplémentaires de l'invention apparaîtront encore au cours de la description qui suit des conditions dans lesquelles la sonde selon l'invention a été utilisée, des résultats qui ont été obtenus, ces essais étant représentatifs de ceux qui, dans la pratique, peuvent être mis en oeuvre au cours des essais de diagnostic in vitro du sexe d'un embryon.
L'analyse des ADN a été effectuée sur des cellules appartenant aux villosités chorionales ou à des cellules sanguines prélevées sur les embryons étudiés. La technique dite du "Dot blot" a été utilisée. Les essais peuvent être réalisés sur des quantités d'ADN inférieures à 3 Λig. Les essais ne durent que deux jours. Les échantillons cellulaires
Les échantillons sanguins ont été fournis par des hôpitaux. Des échantillons de trophoblastes ont été obtenus à partir de biopsies placentaires réalisées au bout des 6 à 8 premières semaines de la gestation. Dans un certain nombre de cas des biopsies ont été effectuées chez des femmes avant avortement et après avoir obtenu leur consentement en toute connaissance de cause. Un forceps à biopsie DYONIC de 1,7 mm de diamètre a été introduit trans- cervicalement dans la cavité utérine en mettant en oeuvre un guide à ultrasons sous temps réel selon les méthodes décrites par SIMONI G . et coll. (Hum. Genêt.[1983]; 63 349-57) et WARD R.H.T.et coll. (Brit.Med. H. 1983 : 1542 - 4).
Des petits échantillons de villosités de trophoblaste (c'est-à-dire de chorion) ont été prélevés sur le côté du frondosum chorionique du placenta. Les tissus ont été lavés dans une solution saline isotonique et stérile puis examinés immédiatement sous un microscope à dissection. Toute cellule déciduale maternelle a été soigneusement séparée des villosités à l'aide de pincettes appropriées. De 10 à 50 mg d e villosités de trophoblaste ont alors été utilisées pour l'analyse de leur acides nucléiques. Les produits de la conception ont été utilisés pour des études de karyotype ou de chromatine Des villosités de trophoblaste ont également été utilisées. Dans sept cas, des petites parties de ces villosités ont été obtenues par dissection à partir de cotylédons placentaires obtenus à l'issue de césariennes. Un certain nombre d'essais classiques de détermination de karyotypes et de chromatine ont été réalisés à des fins de comparaison. Des fibroblastes obtenus à partir des embryons ont été mis en culture in vitro selon des procédures standards (RPMI 1640 sérum foetal de veau, antibiotiques, dans une atmosphère contenant 5 % de CO2). Les karyotypes ont été établis après des cultures in vitro pendant 12 - 20 jours (second ou troisième passage) en utilisant des techniques classiques. Des colorations au Giemsa et des techniques de séparation par poids moléculaire (C Banding techniques: CBG) ont été utilisées. De deux à dix mitoses ont été analysées. Les chromatines des chromosomes intervenant dans la constitution du sexe ont été étudiées sur des cellules au niveau de l'interphase fournies à partir de cultures de fibroblastes colorées au bleu de toluidine. De 100 à 200 noyaux ont été comptés.
Préparation des acides nucléiques et analyse A) Préparation de l' ADN obtenu à partir de cellules du sang : 10 ml de sang ont été collectés dans un ml d'EDTA à 5%. Le sérum a été éliminé par centrifugation. Les globules rouges ont été lysés dans NH4Cl 0,17 M et les leucocytes ont été collectés par centrifugation. Ils ont été lysés dans une solution contenant de l'urée 7 M, du dodécylsulfate de sodium (SDS) à 2 %, NaCl 0,2 M, Tris 10mM à pH 8 et EDTA 1 mM. La solution a été soumise à extraction deux fois avec un mélange à volumes égaux de phénol et de chloroforme, puis deux fois avec du chloroforme avant d'être précipitée avec l'éthanol. Le précipité a été repris, dissous dans une solution Tris 10 mM , EDTA 1 mM et contenant de la ribonucléase A (50 ug/ml). La solution a été incubée à 37°C pendant une heure, puis complétée avec les produits qui suivent pour obtenir finalement une concentra en SDS à 1 %, EDTA 10 mM et protéinase K 100 μg/ml. La solution a ensuite été incubée pendant deux heures. La solution a été ensuite extraite une fois avec du chloroforme, dyalisée dans une solution Tris 10 mM pH 8, EDTA 1 mM pendant la nuit, avant d'être précipitée à nouveau par l'éthanol. Le précipité final a été dissous dans 200 jul d'une solution Tris 10 mM pK 8, EDTA 1 mM B) Préparation d' ADN à partir des échantillonsde trophoblastes Les échantillons ont été incubés dans une solution contenant NaCl 10mM , Tris 10 mM pH 8, EDTA 10 mM, SDS 0,5%, protéinase K 100 μg/ml, dans un tube plastique de EPPENDORF à 37°C pendant 3 heures sous agitation, puis extraits une fois avec un mélange contenant des volumes égaux de phénol et de chloroforme, puis une fois avec du chloroforme, avant d'être précipités et dissous dans 100 μl d'une solution Tris 10 mM, pH 8, EDTA 8, 1 mM . C) Analyse des ADN
Les ADN ont été traités par des ultrasons, dénaturés dans une solution NaOH 0, 4M et NaCl 1 M à 4°C pendant une demi-heure. La solution a été neutralisée juste avant sa filtration sur un filtre de nitrocellulose dans une solution de Tris-NaCl 1,5 M, pH 7. Avant la filtration le filtre de nitrocellulose avait été lavé dans une solution 6 x SSC. Après filtration le filtre a été séché à 80°C pendant deux heures, puis hybride dans 6 x SSC,1 x DENHARDT, pendant
1 heure à 68°C. L'hybridation a été rélisée pendant le nuit avec la sonde radioactive (20 x 106 dpm/μg) dans 1 x DENHARDT, 2 x SSC, SDS 0,5 %, EDTA 2 mM et NaH2PO4 25 mM à 68°C. Les filtres ont ensuite été lavés deux fois à 68°C dans 0,1.x SSC, SDS 0,1 % pendant une heure puis exposés pendant la nuit à -70°C. Pour obtenir des résultats interprétables les taches d'ADN sur le filtre devraient en contenir au moins 0,1 μg, de préférence de l'ordre de 1 μg. La sonde selon l'invention utilisée dans ces conditions conduit à des signaux extrêmement nets permettant d'apprécier sans hésitation le caractère masculin ou féminin de l'embryon étudié. Dans le tableau qui suit figurent les résultats comparatifs réalisés au moins en partie sur des échantillons de même origine avec les techniques classiques dont question plus haut. Le tableau qui suit contient les résultats de détermination de sexe sur 12 embryons. Dans le haut du tableau sont indiquées les natures des tests mis en oeuvre. Dans la colonne "échantillons" ,C.S fait référence à des villosités chorionales obtenues après césarienne; C.B. fait référence à une biopsie chorionale obtenue avant la fin du premier trimestre de la gestation. Les " âges" correspondent naturellement à ceux des mères. Les lettres MF se rapportent auc sexes respectivement masculin et féminin des embryons testés.
Il résulte du tableau qui précède une remarquable corrélation entre les résultats obtenus avec la sonde selon l'invention et les autres méthodes. Des essais réalisés sur des ADN obtenus à partir de différents groupes ethniques ont démontré l'universalité du système. Le sexe de l'embryon a été prédit avec une sécurité à 100 % sur 30 échantillons de sang obtenus à partir d'embryons de parents africains, européens et asiatiques.
La sonde selon l'invention (laquelle contient pour l'essentiel une séquence unique, par opposition à des sondes antérieures essentiellement constituées de séquences répétitives) discrimine parfaitement les chromosomes masculins et féminins, même lorsque ceux-ci présentent les anomalies suivantes : dans le cas de chromosomes masculins, perte d'une partie ou de la totalité de 1 'hétérochromatine et dans le cas de chromosomes féminins, translocation dans le chromosome X de certains fragments d' hétérochromatine normalement considérée comme appartenant à l'hétérochromatine du groupe Y des chromosomes masculins.
Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été spécialement envisagés; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes.

Claims

REVENDICATIONS
1 - Fragment d'ADN hybridable avec le fragment EcoRI de 2,8 kb obtenu à partir de la région euchromatique du grand bras d'un chromosome Y et déposé le 29 juin 1984 à la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes de 1' INSTITUT PASTEUR de Paris (C.N.C.M) sous le Nº 1-312, cette hybridation étant réalisable ou maintenue en présence d'une solution 0, 1 x SSC, à 65 - 68°C, plus particulièrement 68°C.
2 - Fragment selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un recombinant contenant le susdit fragment hybridable.
3 - Procédé pour le diagnostic in vitro du sexe, caractérisé par la mise en contact d'un ADN contenant tout ou partie du fragment conforme à la revendication 1 ou à la revendication 2 avec l'ADN pratiquement total provenant de cellules prélevées sur le foetus dont le sexe doit être déterminé, cet ADN total ayant au préalable été extrait desdites cellules ou simplement rendu accessible à la sonde, par exemple par lyse des cellules , et par mise en contact de l'hybride formé, que ce soit déjà au cours de l'hybridation ou postérieurement à celle-ci (notamment à l'occasion de lavages) avec une solution à faible force ionique et à une température favorisant conjointement des hybridations hautement sélectives de la sonde avec une séquence d'ADN complémentaire présente dans la chromatine des chromosomes Y humains.
4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la susdite mise en contact est opérée avec une solution 0,-1 SSC à une température de 65 - 68°C, plus particulièrement de 68°C.
5 - Procédé selon la revendication 3 ou la reven dication 4, caractérisé en ce qu'il comprend notamment :
- le dépôt et la fixation de l'acide nucléique des cellules à analyser (ou de ces dernières préalablement traitées de façon à permettre l'accès de leurs acides nucléiques à la sonde) sur un filtre approprié;
- la mise en contact des acides nucléiques ainsi fixés ou rendus accessibles avec la sonde marquée selon l'invention dans des conditions permettant la réalisation d'une hybridation effective, lorsque les ADN étudiés comportent un chromosome Y;
- l'élimination, notamment par lavages, de toute sonde non hybridee, et 'ce, en particulier, avec une solution 0,1 SSC à une température de l'ordre de 68°C et
- la détection des sondes d'ADN retenues par hybridation sur le support.
6 - Nécessaire ou "kit" contenant une sonde conforme à la revendication 1 ou à la revendication 2 et, le cas échéant, des préparations chromosomiques témoins (originaires d'embryons mâles et/ou femelles) et tous autres réactifs nécessaires à la réalisation d'un essai de diagnostic in vitro .
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