EP0041019B1 - Products prepared from the thymic series factor or from its analogues and derivatives, process for preparation thereof, these products for use as medicines, radioactive tracers obtained from these products and use of these radioactive tracers in dosage processes - Google Patents
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- EP0041019B1 EP0041019B1 EP19810400807 EP81400807A EP0041019B1 EP 0041019 B1 EP0041019 B1 EP 0041019B1 EP 19810400807 EP19810400807 EP 19810400807 EP 81400807 A EP81400807 A EP 81400807A EP 0041019 B1 EP0041019 B1 EP 0041019B1
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- the symbol ND signifies not determined
- the symbol R signifies that the compound corresponding to a delayed activity, that is to say one which extends over time.
- composition used in the present invention contains in aqueous solution a sufficient amount of the agent of the invention to be therapeutically effective.
- the doses to be administered depend to a large extent on the condition of the subject being treated and his weight.
- the dosing process is illustrated by the following example:
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Description
La présente invention concerne de nouveaux produits préparés à partir du Facteur Thymique Sérique (FTS) ou de ses analogues et dérivés, un procédé pour leur préparation, et ces produits pour utilisation comme médicaments.The present invention relates to new products prepared from Serum Thymic Factor (FTS) or its analogs and derivatives, a process for their preparation, and these products for use as medicaments.
Elle concerne également des traceurs radioactifs obtenus à partir de ces nouveaux produits et l'utilisation de ces traceurs dans un procédé de dosage radlolmmunologlque du FTS dans un échantillon.It also relates to radioactive tracers obtained from these new products and to the use of these tracers in a method for the radiological determination of FTS in a sample.
Le FTS est un nonapeptide isolé à partir du sérum de porc et présent dons le thymus et le sérum normal de diverses espèces.FTS is a nonapeptide isolated from pig serum and present in thymus and normal serum from various species.
L'origine thymique du FTS, suggérée par la disparition du FTS du sérum après thymectomle, a été récemment directement démontrée par la localisatlon par Immunofluorosoence dans l'épithélium thymique d'anticorps purifiés produits contre le FTS de synthèse.The thymic origin of FTS, suggested by the disappearance of FTS from serum after thymectomle, has recently been directly demonstrated by the localization by Immunofluorosoence in the thymic epithelium of purified antibodies produced against synthetic FTS.
Le FTS possède de nombreuses activités biologiques ln vitro et In vivo Incluant en particuler l'induction de l'antigène thêta caractéristique de lymphocytes T chez la souris, sur des cellules theta- négatives formant des rosettes obtenues à partir de la moelle osseuse et de la rate de souris thymectomisées.The FTS has numerous biological activities in vitro and in vivo Including in particular the induction of the theta antigen characteristic of T lymphocytes in mice, on theta-negative cells forming rosettes obtained from the bone marrow and the spleen of thymectomized mice.
Le FTS a été charactérisé par un test biologique, communément appelé "test de rosettes", fondé sur l'induction de la sensibilité à i'azathloprine de cellules formant des rosettes de la rate de souris thymectomisées. Le test de rosettes a été décrit par J. F. Bach et M. Dardenne dans Immunology, 25, 353 (1973).The FTS was characterized by a biological test, commonly called "rosette test", based on the induction of azathloprine sensitivity of rosette forming cells of the spleen of thymectomized mice. The rosette test has been described by J. F. Bach and M. Dardenne in Immunology, 25, 353 (1973).
Ce test est fondé sur l'aptitude du FTS à rendre thêta-positives et senalbles à l'azathloprlne les cellules thêta-négatives formant des rosettes, obtenues à partlr de la rate de souris adultes thymectomisées. L'azathioprine est un analogue de la purlne qui, pomme ia sérum antl-thêta, Inhlbe la formation de cellules formant des rosettes qui dépendent du thymus. Chez la souris normale, la formation de rosettes est inhibée par 1 µg/ml d'azathloprine, alors que chex la souris adulte thymectomisée, 50 à 100 µg/ml de ce composé sont néceaselres pour inhlber la formation de rosettes, Le FTS, sinsi qui les extraits thymiques, confèrent aux cellules formant des rosettes de sourlo adultes thymectomisées, après incubation de 90 minutes à 37°C, une sensibilité à l'azathloprine ldentique à celle des cellules formant des rosettes de souris normales, ce qui permet de servir de base à un test biologique in vitro et in vivo, quantitatif et reproductible.This test is based on the ability of the FTS to make theta-positive and azathloprln-sensitive theta-negative rosette-forming cells obtained from the spleen of thymectomized adult mice. Azathioprine is a purlin analogue which, as an apple and anti-theta serum, inhibits the formation of rosette-forming cells which depend on the thymus. In normal mice, rosette formation is inhibited by 1 µg / ml of azathloprine, whereas in adult thymectomized mice, 50 to 100 µg / ml of this compound are necessary to inhibit the formation of rosettes, FTS, so which the thymic extracts, confer to the cells forming rosettes of sourlo adults thymectomized, after incubation of 90 minutes at 37 ° C, a sensitivity to azathloprine ldentique to that of the cells forming rosettes of normal mice, which allows to serve based on a quantitative and reproducible in vitro and in vivo biological test.
Selon ,le test de rosettes, on détermine l'activité thymique d'un échantillon (FTS ou extrait thymique ou échantillon de sérum) en le mettant en Incubation dans un tube à hémolyse avec 3x106 cellules de la rate provenant de souris C 57/BL 6 adultes (fournies par le Centre d'Elevage des Animaux de Laboratoire du C.N.R.S. 45 Orléans, La Source) thymectomisées 10 à 20 jours plus tôt. La méthode de thymectomie est décrite par M. Dardenne, et J. F. Bach dans lmmunology-25, 343 (1973) à la page 344, le contenu de cet artlcle étant incoporé à tltre de référenceAccording to the rosette test, the thymic activity of a sample (FTS or thymic extract or serum sample) is determined by incubating it in a hemolysis tube with 3 × 10 6 spleen cells from C 57 / BL 6 adults (supplied by the CNRS Laboratory Animal Breeding Center 45 Orléans, La Source) thymectomized 10 to 20 days earlier. The thymectomy method is described by M. Dardenne, and JF Bach in immunology-25, 343 (1973) at page 344, the contents of this article being incorporated for reference.
L'incubation est effectuée pendant 90 minutes à 37°C en présence d'azathlcprlne (Az) à à une concentration de 10 µg/ml.The incubation is carried out for 90 minutes at 37 ° C. in the presence of azathlcprlne (Az) at a concentration of 10 μg / ml.
Cette concentration est intermédiaire entre la concentration mlnlmale de Azt Inhibant 50% des cellules de la rate formant des rosettes (RFC) provenant de sourls normales (1 µg/ml), et celle inhlbant les cellules formant les rosettes provenant d'animaux thymectomlser (50 µg/ml). A la fin de l'incubation, 12x106 cellules rouges de sang de mouton (SRBC) sont ajoutées aux tubes contenant les cellules et l'échantillon. Les cellules et l'échantlilon sont sont centrifugées pendant 8 mlnutes à 1400 tours/minute et remis en suspension doucement et avec précaution par protection sur un agitateur rotatif (10 cm de diamètre) à petite vitesse (10 tours par mlnute). On compte les RFC dans un hématocymètre. En l'absence d'activité thymique, le nombre de RFC est de 1210/106 cellules ±120(ácart type BD), En présence d'activité thymique, la quantité de RFC est réduite à un nlveau de 200 à 400/106 cellules. En l'absence de Az,le FTS ne provoque pas d'lnhlbltion des RFC.This concentration is intermediate between the mlnlmale concentration of Azt Inhibiting 50% of the cells of the spleen forming rosettes (RFC) coming from normal mice (1 µg / ml), and that inhlbant the cells forming rosettes coming from animals thymectomlser (50 µg / ml). At the end of the incubation, 12x10 6 red sheep blood cells (SRBC) are added to the tubes containing the cells and the sample. The cells and the sample are centrifuged for 8 ml at 1400 rpm and resuspended gently and carefully by protection on a rotary shaker (10 cm in diameter) at low speed (10 rpm). The RFCs are counted in a hematocymeter. In the absence of thymic activity, the number of RFC is 1210/10 6 cells ± 120 (apart BD type), In the presence of thymic activity, the amount of RFC is reduced to a level of 200 to 400/10 6 cells. In the absence of Az, the FTS does not cause any RFCs to be filtered.
Test de rosettes in vitro: l'activité thymlque est définle comme la concentration mlnlmale de l'échantillon qui Induit l'lnhlbition de plus de 50% de cellules formant des rosettes de rate de souris adultes thymectomisées en présence de 10 µg/ml d'azathloprlne.In vitro rosette test: the thymic activity is defined as the minimal concentration of the sample which induces the inhibition of more than 50% of cells forming rosettes of spleen of adult thymectomized mice in the presence of 10 μg / ml of azathloprlne.
In vivo: a) l'activité du sérum est exprimée sous forme de taux de facteur thymlque (détermlné par le test de rosettes décrit cl-dessue) présent dans le sérum de souris a adultea thymectomls, recue 2 ou 4 heures après injection de 0,1 ng ou de 1 ng d'échantillon absorbé sur carboxyméthylcellulose ou injecté seul: l'activité du sérum est exprimée par la plus forte dilution du sérum permettant l'lnhlbltion de 50% des cellules formant les rosettes.In vivo: a) the activity of the serum is expressed in the form of a thyml factor factor (determined by the rosette test described above) present in the serum of mice with adultea thymectomls, received 2 or 4 hours after injection of 0 , 1 ng or 1 ng of sample absorbed on carboxymethylcellulose or injected alone: the activity of the serum is expressed by the highest dilution of the serum allowing the lnhlbltion of 50% of the cells forming the rosettes.
b) l'activité des cellules de la rate est exprimée par la sensiblilté à l'azathloprlne de ces cellules de souris adultes thymectomisées, isolées 24 heures après injection de 0,1 à 1 ng de l'échantlilon abaorbé sur carboxyméthylcellulose ou injecté seul.b) the activity of the spleen cells is expressed by the sensitivity to azathloprlne of these cells of thymectomized adult mice, isolated 24 hours after injection of 0.1 to 1 ng of the sample abaorbed on carboxymethylcellulose or injected alone.
Le Demandeur a maintenant trouvé qu'll n'y avait pas toujours corrélatlori antre les actlvltés mises en évidence dans les tests ln vitro et in vlvo et qu'll était posslble d'obtenir des produits encore plus actifs que ceux obtenus à ce Jour, partlcullèrement in vivo.The Applicant has now found that there was not always a correlation between the activities highlighted in the in vitro and in vitro tests and that it was possible to obtain products even more active than those obtained to date, partly in vivo.
Le Demandeur a montré que, sulvant les technlques employées, la synthèse chimique du FTS pouvait éventuellement aboutir à un produit présentant une activité biologique in vitro et in vivo quantitativement inférieure (jusqu'à 100 et 1000 fois) à celle observée avec le FTS· d'origine naturelle.The Applicant has shown that, depending on the techniques used, the chemical synthesis of the FTS could eventually lead to a product with a biological activity in vitro and in vivo quantitatively lower (up to 100 and 1000 times) than that observed with FTS · of natural origin.
D'autre part, le Demandeur a découvert que le traitement du FTS synthétique par un agent susceptible de chélater les métaux, tel qu'une résine chélatante donnait un produit ayant totalement perdu son activité biologique in vitro et in vivo.On the other hand, the Applicant has discovered that the treatment of synthetic FTS with an agent capable of chelating metals, such as a chelating resin gave a product which has completely lost its biological activity in vitro and in vivo.
Le Demandeur a pu mettre en évidence, au moyen d'une analyse en spectrométrie d'absorption atomique des différents lots de FTS, que les lots actifs contenaient de faibles quantités de métaux lourds, et en particulier du zinc, les lots inactifs en étant totalement dépourvus.The Applicant was able to demonstrate, by means of an atomic absorption spectrometry analysis of the various batches of FTS, that the active batches contained small amounts of heavy metals, and in particular of zinc, the inactive batches being completely devoid.
Le but essentiel de l'invention est de préparer de nouveaux produits à partir du FTS ou de ses analogues et dérivés afin d'obtenir des produits de qualité constante, pourvant être utilisés soit comme médicament, soit à la préparation de traceurs pour des procédés de dosage radioimmunologique.The essential aim of the invention is to prepare new products from FTS or its analogues and derivatives in order to obtain products of constant quality, providing that they can be used either as a medicament or for the preparation of tracers for methods of radioimmunoassay.
L'invention concerne plus particulièrement de nouveaux produits caractérisés par le fait que le FTS ou l'un de ses analogues ou dérivés est lié à un métal susceptible de former un complexe de coordination IV ayant une configuration tétraédrique.The invention relates more particularly to new products characterized in that the FTS or one of its analogs or derivatives is linked to a metal capable of forming an IV coordination complex having a tetrahedral configuration.
Le métal impliqué peut être un métal divalent comme le zinc ou le cuivre ou un métal trivalent comme l'aluminium, le zinc étant toutfois le métal préféré.The metal involved can be a divalent metal such as zinc or copper or a trivalent metal such as aluminum, however zinc is the preferred metal.
La quantité de métal présente dans les complexes de l'invention, telle que déterminée par spectrométrie atomique, doit être telle que le rapport en poids de métal au complexe soit supérieure à 1/200.The amount of metal present in the complexes of the invention, as determined by atomic spectrometry, must be such that the weight ratio of metal to the complex is greater than 1/200.
Les produits de l'invention présentent une activité thymique in vivo dans le test de rosettes Indiqués précédemment, qui est multipliée par un facteur d'au moins 10 et même le plus souvent d'au moins 100 par rapport à l'activité du FTS de référence (FTS d'origine naturelle ou synthétique, tel qu'obtenu auparavant).The products of the invention exhibit a thymic activity in vivo in the rosette test indicated above, which is multiplied by a factor of at least 10 and even more often than not at least 100 relative to the activity of the FTS of reference (FTS of natural or synthetic origin, as obtained before).
C'est ainsi que le produit de l'invention dans lequel le métal est le zinc, injecté à la dose de 0,1 ng par souris, présente une activité in vivo dans le test de rosettes 10 fois supérieure à celle obtenue pour le FTS de référence injecté à la dose de 1 ng par souris.Thus, the product of the invention in which the metal is zinc, injected at a dose of 0.1 ng per mouse, has an in vivo activity in the rosette test 10 times greater than that obtained for the FTS. standard injected at a dose of 1 ng per mouse.
L'invention concerne également un procédé de préparation de nouveaux produits préparés à partir du FTS ou de ses analogues ou dérivés, consistant à traiter le FTS ou l'un de ses analogues ou dérivés avec un métal ou une substance protéique contenant un métal, ce métal étant susceptible de se lier au FTS ou son analogue ou dérivé et de former un complexe de coordination IV de configuration tétraédrique.The invention also relates to a process for preparing new products prepared from FTS or its analogs or derivatives, comprising treating the FTS or one of its analogs or derivatives with a metal or a protein substance containing a metal, such as metal being capable of binding to the FTS or its analog or derivative and of forming an IV coordination complex of tetrahedral configuration.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le FTS ou l'un de ses analogues ou dérivés est mls en contact avec le métal ou l'un de ses sels, à un pH compris entre 7 et 9, pendant 10 à 30 minutes, et à la température ambiante, par exemple de 20 à 37°C.In a preferred embodiment of the invention, the FTS or one of its analogs or derivatives is mls in contact with the metal or one of its salts, at a pH between 7 and 9, for 10 to 30 minutes, and at room temperature, for example 20 to 37 ° C.
Dans ce mode de réalisation, on utilise avantageusement une proportion de 1 mole de FTS ou d'analogue ou dérivé de FTS pour 0,1 à 10 moles du métal ou d'un de ses sels, de préférence 1 mole du métal ou d'un de ses sels.In this embodiment, a proportion of 1 mole of FTS or of analog or derivative of FTS is advantageously used for 0.1 to 10 moles of the metal or of a salt thereof, preferably 1 mole of the metal or of one of its salts.
Dans un autre mode de réallsation du procédé de l'invention, on prépare les nouveaux produits par traitement du FTS ou l'un de ses analogues ou dérivés avec une substance protéique contenant un métal.In another embodiment of the process of the invention, the new products are prepared by treatment of FTS or one of its analogs or derivatives with a protein substance containing a metal.
Cette substance protéique contenant un métal peut être par exemple, un fraction de sérum ou une fraction d'un extrait thymlque.This metal-containing protein substance can be, for example, a fraction of serum or a fraction of a thyml extract.
A titra d'exemple, on peut utlilser comme substance protéïque contenant un métal, une fraction de la Thymosine Fraction 5, que l'on appellera ci-après "fraction activatrice" en raison de ses propriétés activatrices à l'égard du FTS ou des ses analogues et dérivés.As an example, it is possible to use as a metal-containing protein substance, a fraction of Thymosine Fraction 5, which will be called hereinafter "activating fraction" because of its activating properties with respect to FTS or its analogs and derivatives.
A. L, Goldsteln et coll, ont Isolé en 1965 à partir de thymus de veau, une préparation peu purifiée qu'ils ont appelée Thymosine Fraction 5 et qui est un mélange de nombreux polypeptides ayant des activités biologiques variées.A. L, Goldsteln et al, Isolated in 1965 from calf thymus, a poorly purified preparation which they called Thymosine Fraction 5 and which is a mixture of many polypeptides with varied biological activities.
Cette préparation a été utlilsée chez l'homme dans des essais cliniques de Phases 1 et 2 avec des résultats non concluents concluants, mals prometteurs.This preparation has been used in humans in clinical trials of
Plus récomment, A. L. Goldstein a publié la séquence de certains peptides contenus dans la fraction 5, à savlir les thymoslnes α1, β1,... mais aucun de ces peptides ne s'est révélé avoir d'homologle de struacture avec la FTS.More recently, AL Goldstein published the sequence of certain peptides contained in fraction 5, to break down the thymoslnes α1, β 1 , ... but none of these peptides has been found to have a struacture homolog with FTS.
Pas études préalables effectuées par le Demandeur ont montré que la Thymosine fraction 5 contenalt une ou des substances actives dans le test des rosettes cité plus haut, et ayant des propriétés physlques ou chimiques comparables à celles du FTS (poids moléculaire, charge électrique, composition an acldes aminés),No prior studies carried out by the Applicant have shown that Thymosin fraction 5 contains one or more active substances in the rosette test mentioned above, and having physical or chemical properties comparable to those of FTS (molecular weight, electrical charge, composition an amino acids),
La fraction aotlvatrlce mentionnée ci-dessus est préparée par fractionnement de Thymosine Fraction B dans une colonne de G-100 (Pharmacia 0,9 cm×100 cm) en tampon phosphate 0,2 M pH 7,3 afin d'éliminer la (les) molécule (s) semblable (s) au FTS, les fractions éluées avec des volumes d'elution compris entre 15 et 22 ml étant saules conservées.The aotlvatrlce fraction mentioned above is prepared by fractionation of Thymosine Fraction B in a G-100 column (Pharmacia 0.9 cm × 100 cm) in 0.2 M phosphate buffer pH 7.3 in order to remove the ) molecule (s) similar to FTS, the fractions eluted with elution volumes of between 15 and 22 ml being willows preserved.
Cette fraction contlerit des molécules de poids moléculaire compris entre 7 500 et 12 500 (traceurs utlilsés: IGG, albumine bovlne, Cytochrome Cet FTS tritié).This fraction contlerit of molecules of molecular weight between 7500 and 1 2 5 00 (Reference tracers utlilsés: IGG, bovlne albumin, Cytochrome This tritiated FTS).
Catte fraction est sensible à la chaleur: son activité est détruite par chauffage à 60°C en moins de 15 minutes et à 100°C en moins de 5 minutes.This fraction is sensitive to heat: its activity is destroyed by heating to 60 ° C in less than 15 minutes and to 100 ° C in less than 5 minutes.
Cette fraction, qui est elle-même dépourvue d'activité dans le test des rosettes, présente des propriétés activatrices à l'égard du FTS ou de ses analogues et dérivés en ce sens qu'elle permet d'augmenter d'un facteur d'environ 103 l'activité biologique de ces derniers.This fraction, which is itself devoid of activity in the rosette test, has activating properties with respect to FTS or its analogs and derivatives in the sense that it makes it possible to increase by a factor of about 10 3 the biological activity of the latter.
Le procédé de préparation des nouveaux produits à partir de la fraction activatrice provenant de la Thymosine Fraction 5 est caractérisé par le fait que l'on fait incuber le FTS ou l'un de ses analogues ou dérivés avec cette fraction activatrice, on fractionne le mélange obtenu après incubation, et on sélectionne la fraction la plus active dans le test des rosettes.The process for preparing new products from the activating fraction from Thymosine Fraction 5 is characterized by the fact that the FTS or one of its analogs or derivatives is incubated with this activating fraction, the mixture is fractionated obtained after incubation, and the most active fraction is selected in the rosette test.
Dans ce procédé de préparation selon l'invention, la température d'incubation est comprise entre 30 et 40°C, la durée de l'incubation est comprise entré 10 minutes et 1 heure et l'incubation est conduite à un pH compris entre 6 et 8.In this preparation process according to the invention, the incubation temperature is between 30 and 40 ° C, the duration of the incubation is between 10 minutes and 1 hour and the incubation is carried out at a pH between 6 and 8.
Les conditions spécialement préférentielles consistent à conduire l'incubation à une température d'environ 37°C pendant 20 minutes à pH 7,3.The especially preferential conditions consist in carrying out the incubation at a temperature of approximately 37 ° C. for 20 minutes at pH 7.3.
Quel que soit le procédé de préparation utilisé (traitement avec un métal ou sel de métal, ou traitement avec une substance protéïque contenant un métal) il est préférable d'éliminer au préalable toute trace de métal éventuellement présente dans la préparation du FTS ou d'un de ses analogues ou dérivés au moyen d'un agent de chélation capable de chélater les métaux, comme par exemple une chromatographie sur une colonne de résin chélatante du type "Chelex 100®". Ceci permet d'obtenir un produit chimiquement homogène qui est biologiquement inactif et qui, après traitement avec le métal ou l'un de ses sels, donnera un produit homogène avec des résultats reproductibles, et donc acceptable pour une utilisation pharmaceutique.Whatever the preparation process used (treatment with a metal or metal salt, or treatment with a proteinaceous substance containing a metal) it is preferable to remove beforehand any trace of metal possibly present in the preparation of the FTS or of one of its analogs or derivatives by means of a chelating agent capable of chelating metals, such as for example chromatography on a column of chelating resin of the "Chelex 100®" type. This makes it possible to obtain a chemically homogeneous product which is biologically inactive and which, after treatment with the metal or one of its salts, will give a homogeneous product with reproducible results, and therefore acceptable for pharmaceutical use.
Le FTS ou les analogues ou dérivés du FTS utilisées dans l'invention sont ceux qui ont été synthétisés en phase liquide selon la méthodologie décrite par Bricas, E., Martinez, J., Blanot, D., Auger, G., Dardenne, M., Pleau, J. M. et Bach, J. F. 5th Intern. Peptide Symposium, La Jolla, Californie, E.U.A. Juin 1977, et ceux revendiqués dans la demande de brevet français 77 15963 du 25 Mai 1977 et son addition 78 11870 du 21 Avril 1978.The FTS or the analogs or derivatives of the FTS used in the invention are those which have been synthesized in the liquid phase according to the methodology described by Bricas, E., Martinez, J., Blanot, D., Auger, G., Dardenne, M., Pleau, JM and Bach, JF 5th Intern. Peptide Symposium, La Jolla, California, E.U.A. June 1977, and those claimed in French patent application 77 15963 of May 25, 1977 and its addition 78 11870 of April 21, 1978.
Le FTS est un nonapeptide de séquence p Glu-ALa-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn et les analogues et dérivés du FTS dont il est fait référence ici dérivent de cette séquence de la façon indiquée dans la demande de brevet français et l'addition indiqués ci-dessus.FTS is a nonapeptide of sequence p Glu-ALa-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn and the analogs and derivatives of FTS referred to here are derived from this sequence as indicated in the application for French patent and the addition indicated above.
La Thymosine Fraction 5 utilisée pour la préparation de la fraction activatrice de l'invention a été obtenue selon la méthode de A. L. Goldstein (Goldstein A. L. Salter, F. D and White A., 1966, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 56, 1010-1017, et Goldstein, A. L., Guha, A., Zatz, M. M., Hardy, M., White, A., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 69, 1800-1803).The Thymosine Fraction 5 used for the preparation of the activating fraction of the invention was obtained according to the method of AL Goldstein (Goldstein AL Salter, F. D and White A., 1966, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 56, 1010-1017, and Goldstein, AL, Guha, A., Zatz, MM, Hardy, M., White, A., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 69, 1800-1803).
D'autres caractéristiques de l'invention seront maintenant décrits en référence aux exemples suivants.Other characteristics of the invention will now be described with reference to the following examples.
La Thymosine Fraction 5, préparée selon la méthode ci-dessus, a, dans un premier temps, été fractionnée dans une colonne de G-100 (Pharmacia 0,9 cmx 100 cm) en tampon phosphate 0,2 M pH 7,3 afin d'éliminer la (les) molécule (s) citée (s) plus haut et semblable (s) ou identique (s) au FTS.The Thymosine Fraction 5, prepared according to the above method, was first fractionated in a column of G-100 (Pharmacia 0.9 cm × 100 cm) in 0.2 M phosphate buffer pH 7.3 in order to to eliminate the molecule (s) mentioned above and similar or identical to FTS.
Les fractions éluées avec des volumes d'élution compris entre 15 et 22 ml sont seules conservées et utilisées pour les expériences décrites. Ces fractions qui seront désignées désormais comme "fractions activatrices" contiennent des molécules de poids moléculaire compris entre 7500 et 12 500 et sont dépourvues d'activité dans le test des rosettes.Only the fractions eluted with elution volumes of between 15 and 22 ml are kept and used for the experiments described. These fractions which will henceforth be designated as "activating fractions" contain molecules of molecular weight between 7500 and 12,500 and are devoid of activity in the rosette test.
Les quantités de fractions activatrices utilisées seront exprimées dans ce qui suit, en équivalent Fraction 5 (EqF 5) c'est-à-dire en équivalent de la quantité de Fraction 5 utilisée pour la préparer.The amounts of activating fractions used will be expressed in the following, in Fraction 5 equivalent (EqF 5), that is to say in equivalent of the amount of Fraction 5 used to prepare it.
Un mg de FTS répondant à la formule p Glu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn, synthétisé en phase liquide selon la méthodologie indiquée ci-dessus, est incubé avec 50 mg (EqF 5) de la fraction activatrice de l'Exemple 1, dans un tube en matière plastique pendant 20 minutes à 37°C en tampon phosphate 0,2 M pH 7,3.One mg of FTS corresponding to the formula p Glu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn, synthesized in the liquid phase according to the methodology indicated above, is incubated with 50 mg (EqF 5) of the activating fraction of Example 1, in a plastic tube for 20 minutes at 37 ° C in 0.2 M phosphate buffer pH 7.3.
Au terme de cette incubation, le mélange est appliqué sur une colonne de Sephadex G-25@ et la fraction active, détectée par le test des rosettes, est récupérée dans les fractions ayant un volume d'élution compris entre 1,8 et 2,2 Vo.At the end of this incubation, the mixture is applied to a column of Sephadex G-25 @ and the active fraction, detected by the rosette test, is recovered in the fractions having an elution volume of between 1.8 and 2, 2 Vo.
Cette fraction est dessalée par filtration à sec sur une membrane Amicon UM 2@ puis reprise dans un tampon phosphate 0,02 M pH 6,1 et appliquée sur une colonne de carboxyméthylcellulose (Whatman), équilibrée par le même tampon phosphate.This fraction is desalted by dry filtration on an Amicon UM 2 @ membrane then taken up in a 0.02 M phosphate buffer pH 6.1 and applied to a column of carboxymethylcellulose (Whatman), equilibrated with the same phosphate buffer.
Un gradient de NaCi est appliqué après passage de 50 ml du tampon initial. Les fractions actives dans le test des rosettes sont retrouvées dans les fractions contenant 0,12 M de NaCI.An NaCl gradient is applied after passing 50 ml of the initial buffer. The active fractions in the rosette test are found in the fractions containing 0.12 M NaCl.
Les fractions obtenues au terme de l'incubation avec la fraction activatrice sont 102 à 103 plus actives que la préparation initiale de FTS.The fractions obtained at the end of the incubation with the activating fraction are 10 2 to 10 3 more active than the initial preparation of FTS.
Ces fractions actives sont ensuite dessalées par filtration à sec sur membrane Amicon UM 2@ puis soumises à une analyse d'acides aminés.These active fractions are then desalted by dry filtration on an Amicon UM 2 @ membrane and then subjected to an amino acid analysis.
Les résultats de cette analyse montrent que la fraction ainsi récupérée a une activité biologique élevée et a une composition en acides aminés compatible avec celle du FTS initiai.The results of this analysis show that the fraction thus recovered has a high biological activity and has an amino acid composition compatible with that of the initial FTS.
Il en résulte que l'incubation du FTS avec la fraction activatrice de l'invention, issue d'un extrait thymique, mais dépourvue elle-même d'activité biologique dans le test des rosettes, augmente d'un facteur 103 l'activité biologique de FTS de synthèse.As a result, the incubation of FTS with the activating fraction of the invention, derived from a thymic extract, but itself lacking in biological activity in the rosette test, increases by a factor of 10 3 the activity biological of synthetic FTS.
L'analyse d'acides aminés et le comportement sur Sephadex G-25® et carboxyméthylcellulose de la préparation "activée" confirment qu'il s'agit du FTS de synthèse, lui-même,, activé.The analysis of amino acids and the behavior on Sephadex G-25® and carboxymethylcellulose of the "activated" preparation confirm that it is the synthetic FTS, itself, activated.
En présence de la fraction activatrice (distincte du FTS), le FTS est transformé au terme de 20 minutes à 37°C et cette transformation augmente de façon très significative son activité biologique.In the presence of the activating fraction (distinct from the FTS), the FTS is transformed after 20 minutes at 37 ° C. and this transformation significantly increases its biological activity.
Cette transformation implique, comme dans le cas du traitement par un métal ou un sel de métal, une fixation d'un métal sur le produit de départ:
- On a pu démontrer que ce métal provient effectivement de la fraction activatrice. En effet, ces fractions activatrices perdent, après passage sur une agent de chélation des métaux (par exemple Chelex 100@), leur pouvoir d'activer le FTS ou ses analogues et dérivés.
- It has been shown that this metal does indeed come from the activating fraction. Indeed, these activating fractions lose, after passing over a metal chelating agent (for example Chelex 100 @), their power to activate the FTS or its analogs and derivatives.
Le FTS de synthèse a été préparé selon la méthode indiquée ci-dessus. Le FTS marqué au tritium a été obtenu par tritiation d'un analogue du FTS contenant une lysine possédant une liaison acétylénique (Sasaki A. N., Morgat J. L., et E. Bricas 16° Symposium Européen des Peptides. Elsinger, Danemark, Septembre 1980 K. Brungeldt ed. p. 224).The synthetic FTS was prepared according to the method indicated above. The tritium-labeled FTS was obtained by tritiation of an analog of the FTS containing a lysine having an acetylenic bond (Sasaki AN, Morgat JL, and E. Bricas 16th European Symposium of Peptides. Elsinger, Denmark, September 1980 K. Brungeldt ed. p. 224).
Le zinc a été utilisé sous forme de chlorure éventuellement radiomarqué (65ZnCl2).Zinc was used in the form of possibly radiolabelled chloride ( 65 ZnCl 2 ).
Le traitement par Chelex 100@ (Biorad Lab.) a été réalisé en mélangeant 0,2 ml de la solution contenant le produit étudié avec 0,2 ml de suspension de Chelex@ à 50 mg/ml. La chromatographie sur Biogei P-2@ a été faite en utilisant des colonnes de plastique (60x0,9 cm).The treatment with Chelex 100 @ (Biorad Lab.) Was carried out by mixing 0.2 ml of the solution containing the test product with 0.2 ml of Chelex @ suspension at 50 mg / ml. The chromatography on Biogei P-2 @ was carried out using plastic columns (60x0.9 cm).
Les cellules spléniques de souris C57BL/6 thymectomisées à l'âge de six semaines sont résistantes à l'azathioprine (10 µg/ml). Les extraits thymiques ou le FTS ou les sérums qui le contiennent leur confèrent la sensibilité à l'azathioprine. Les résultats de l'essai sont exprimés par la concentration minimale de FTS ou la dilution maximale de sérum inhibitrice.The spleen cells of C57BL / 6 mice thymectomized at the age of six weeks are resistant to azathioprine (10 μg / ml). Thymic extracts or FTS or the sera that contain it give them sensitivity to azathioprine. The results of the test are expressed by the minimum concentration of FTS or the maximum dilution of inhibitory serum.
Une solution aqueuse de FTS de synthèse est mise en contact avec la résine Chelex 100®.Le FTS non retenu par la résine est testé dans l'essai des rosettes. Le Tableau 1 ci-dessous montre que le FTS a perdu après ce traitement l'essentiel de son activité in vitro et in vivo. Des résultats analogues sont observés avec du FTS naturel (ultrafiltrat de sérum normal de souris) traité dans les mêmes conditions.An aqueous solution of synthetic FTS is brought into contact with the Chelex 100® resin. The FTS not retained by the resin is tested in the rosette test. Table 1 below shows that the FTS has lost most of its activity in vitro and in vivo after this treatment. Similar results are observed with natural FTS (ultrafiltrate of normal mouse serum) treated under the same conditions.
L'addition de 10 ng de Cl2Zn à 100 ng de FTS (synthétique ou naturel) prétraité par passage sur Chelex 100@, suivie d'une incubation de 10 minutes à 20°C, entraîne non seulement la restauration complète de l'activité biologique in vivo et in vitro, mais même un important accroissement de cette activité par rapport à celle observée initialement avant tout traitement (Tableau 1). Le chlorure de zinc est inactif par lui-même dans l'essai des rosettes in vitro et in vivo. L'activation du FTS est optimale à pH neutre (ou légèrement alcalin). La nécessité d'un contact entre le zinc et le FTS est démontrée par l'absence de réapparition de l'activité biologique observée dans les expériences in vivo lorsque le FTS passé sur Chelex 100@ et le chlorure de zinc sont injectés à une minute d'intervalle. D'autres métaux que le zinc peuvent activer le FTS: l'aluminium (aussi actif que le zinc), le cuivre, le manganèse, le chrome, le fer et le nickel (nettement moins actifs que le zinc) alors que l'indium, le thallium, le cadmium, le plomb, le cobalt et l'étain restent sand effet.The addition of 10 ng of Cl 2 Zn to 100 ng of FTS (synthetic or natural) pretreated by passage over Chelex 100 @, followed by an incubation of 10 minutes at 20 ° C., not only results in complete restoration of the biological activity in vivo and in vitro, but even a significant increase in this activity compared to that observed initially before any treatment (Table 1). Zinc chloride is inactive by itself in the rosette test in vitro and in vivo. FTS activation is optimal at neutral pH (or slightly alkaline). The need for contact between zinc and FTS is demonstrated by the absence of reappearance of the biological activity observed in in vivo experiments when the FTS passed over Chelex 100 @ and the zinc chloride are injected at one minute d 'interval. Other metals than zinc can activate FTS: aluminum (as active as zinc), copper, manganese, chromium, iron and nickel (significantly less active than zinc) while indium , thallium, cadmium, lead, cobalt and tin remain in effect.
Le FTS tritié est élué à l'eau distillée d'une colonne de Biogel P-2@ en un seul pic (fractions 10-14, Ve/Vo:1,3) qui recouvre l'activité biologique dont le niveau est plus élevé dans les toutes premières fractions (10―12). Appliqué sur la même colonne, le 65ZnCl2 est élué avec un Ve/Vo dé 2,2 (fractions 19―22). Lorsqu'un mélange de 0,1 µg de FTS tritié (préalablement passé sur Chelex 100®) et de 10 à 30 ng de 65ZnCl2 est appliqué sur la colonne de Biogel P-2®, la radio activité correspondant à 65Zn apparaît en deux pics: le premier, le plus important, correspond très précisément à l'activité biologique et à la première moitié du pic de radioactivé du FTS tritié (Fractions 9-12), le second à celui du zinc libre (fractions 19 à 23). Ce résultat montre qu'un pourcentage d'environ 10% de zinc s'est fixée sur le FTS.The tritiated FTS is eluted with distilled water from a column of Biogel P-2 @ in a single peak (fractions 10-14, Ve / Vo: 1.3) which covers the higher level of biological activity in the very first fractions (10―12). Applied to the same column, the 65 ZnCl 2 is eluted with a Ve / Vo of 2.2 (fractions 19―22). When a mixture of 0.1 µg of tritiated FTS (previously passed over Chelex 100®) and 10 to 30 ng of 65 ZnCl 2 is applied to the Biogel P-2® column, the radio activity corresponding to 65 Zn appears in two peaks: the first, the most important, corresponds very precisely to the biological activity and at the first half of the radioactive peak of tritiated FTS (Fractions 9-12), the second to that of free zinc (fractions 19 to 23). This result shows that a percentage of approximately 10% of zinc is fixed on the FTS.
Ces expériences montrent que le FTS perd son activité après passage sur une résine chelatant les métaux, et la retrouve intégralement après addition de divers sels métalliques tels que ceux du zinc ou de l'aluminium et partiellement après addition de certains autres. Le zinc se fixe sur le FTS avec une constante d'affinité suffisante pour permettre une séparation sur Biogel P-2@ du zinc libre. Ainsi le FTS n'est actif qu'après avoir capté certains métaux et plus particulièrement le zinc.These experiments show that the FTS loses its activity after passing over a metal-chelating resin, and finds it completely after the addition of various metal salts such as those of zinc or aluminum and partially after the addition of certain others. The zinc is fixed on the FTS with a sufficient affinity constant to allow separation on Biogel P-2 @ of the free zinc. Thus the FTS is only active after having captured certain metals and more particularly zinc.
La présence de l'activité biologique et de la fixation du zinc dans les toutes premières fractions du pic de FTS élué sur Biogel P-2@ indique l'existence de deux formes de FTS. Seule la première d'entre elles ayant lié le zinc est biologiquement active dans l'essai des rosettes. D'autres résultats indiquent que ces deux formes diffèrent également par leur antigénicité.The presence of biological activity and of zinc fixation in the very first fractions of the FTS peak eluted on Biogel P-2 @ indicates the existence of two forms of FTS. Only the first of them to have linked zinc is biologically active in the rosette test. Other results indicate that these two forms also differ in their antigenicity.
Le tableau I rassemble les résultats des tests in vivo et in vitro et montre l'augmentation de l'activité biologique des produits activés de l'invention obtenus par traitement du FTS soit avec un mètal, soit avec la fraction activatrice issue de la Thymosine Fraction 5.
Le tableau I montre que le FTS prétraité par passage sur Chelex 100® retrouve ensuite une activité biologique largement accrue in vitro et encore plus in vivo après traitement par un métal ou par la fraction activatrice, ce métal et cette fraction activatrice étant eux-mêmes dépourvus d'activité biologique dans le test des rosettes.Table I shows that the FTS pretreated by passage over Chelex 100® then finds a biological activity which is greatly increased in vitro and even more in vivo after treatment with a metal or with the activating fraction, this metal and this activating fraction being themselves devoid of of biological activity in the rosette test.
Il ressort également du tableau 1 que certains produits de l'invention se sont révélés actifs à des concentrations inférieures à 10-9 ng/ml.It also appears from Table 1 that certain products of the invention have been found to be active at concentrations below 10 -9 ng / ml.
Pour les tests in vivo,For in vivo testing,
les dérivés activés de l'invention ont été injectés à des souris thymectomisées à l'âge de six semaines et utilisées huit semaines après la thymectomie. Ils entraînent l'apparition à partir de la 30ème minute dans le sérum d'une activité biologique 10 à 100 fois supérieure à celle obtenue avec le FTS natural convérant à des cellules spléniques formant des rosettes la sensibilité à l'azathioprine.the activated derivatives of the invention were injected into thymectomized mice at the age of six weeks and used eight weeks after the thymectomy. They cause the appearance from the 30th minute in the serum of a biological activity 10 to 100 times greater than that obtained with the natural FTS suitable for spleen cells forming rosettes sensitivity to azathioprine.
Cette augmentation de l'activité biologique est bien montrée sur la figure 1 qui compare l'activité biologique du FTS, passé sur une résine chélatante puis traité par le sulfate de zinc a pH 7 et injecté à la dose de 0,1 ng par souris (courbe I), à l'activité du FTS uniquement passé sur la résine puis injecté à la dose de 1 ng par souris (courbe II) et à l'activité du FTS de référence injecté à la dose de 1 ng par souris (courbe III).This increase in biological activity is clearly shown in FIG. 1 which compares the biological activity of FTS, passed over a chelating resin then treated with zinc sulphate at pH 7 and injected at a dose of 0.1 ng per mouse (curve I), to the activity of the FTS only passed over the resin and then injected at a dose of 1 ng per mouse (curve II) and to the activity of the reference FTS injected at the dose of 1 ng per mouse (curve III).
Les courbes de la figure 1, de même que celles des figures 2 à 6, expriment la variation de l'activité du produit injecté dans le sérum, exprimée par la dilution active de sérum en fonction du temps écoulé après l'injection. Les coubres de la figure 1 comparent l'activité du FTS de référence injecté à la souris l'activité du FTS traité par une résine chélante et injecté à la souris et l'activité d'un produit selon l'invention injecté à la souris, ce dernier étant beaucoup plus actif.The curves in FIG. 1, as well as those in FIGS. 2 to 6, express the variation in the activity of the product injected into the serum, expressed by the active dilution of serum as a function of the time elapsed after the injection. The diagrams of FIG. 1 compare the activity of the reference FTS injected into the mouse the activity of the FTS treated with a chelating resin and injected into the mouse and the activity of a product according to the invention injected into the mouse, the latter being much more active.
La figure 2 montre l'activation obtenue in vivo par les FTS passé sur résine chélatante puis traité par le sulfate de zinc pour des rapports pondéraux Zn/FTS différents [0,01 (courbe la); 0,1 (courbe Ib); 1 (courbe Ic)] et injecté à la souris par comparaison avec le FTS uniquement passé sur résine chélatante, et injecté à la souris (courbe 11).FIG. 2 shows the activation obtained in vivo by the FTS passed over a chelating resin and then treated with zinc sulphate for different Zn / FTS weight ratios [0.01 (curve la); 0.1 (curve Ib); 1 (curve Ic)] and injected into the mouse by comparison with the FTS only passed over chelating resin, and injected into the mouse (curve 11).
La meilleure activation est obtenue pour les rapports pondéraux de 0,1 à 10.The best activation is obtained for the weight ratios from 0.1 to 10.
Les figures 3 et 4 comparent les activités obtenues in vivo par les FTS passé sur résine chélatante puis traité par différents métaux, à savoir les sels métalliques suivants:
- Sulfate de zinc (courbe Id)
- Sulfate de cuivre (courbe le)
- Sulfate ferreux (courbe If)
- Chlorure de cobalt (courbe Ig)
- Chlorure de nickel (courbe lh)
- Chlorure de chrome (courbe li)
- Chlorure de manganèse (courbe Ij)
- Nitrate d'aluminium (courbe Ik)
et injecte à la souris, à l'activité obtenue avec le FTS uniquement passé sur résine chélatante et injecté à la souris (courbe II).Figures 3 and 4 compare the activities obtained in vivo by FTS passed on chelating resin and then treated with different metals, namely the following metal salts:
- Zinc sulfate (curve Id)
- Copper sulphate (curve le)
- Ferrous sulfate (If curve)
- Cobalt chloride (curve Ig)
- Nickel chloride (curve lh)
- Chromium chloride (curve li)
- Manganese chloride (curve Ij)
- Aluminum nitrate (Ik curve)
and injects into the mouse, the activity obtained with the FTS only passed over chelating resin and injected into the mouse (curve II).
La figure 5 montre l'activité obtenue in vivo par le FTS passé sur résine chélatante puis traité par le sulfate de zinc pendant soit 10 minutes à 20°C (courbe II) soit 10 minutes à 37°C (courbe lm), et injecté à la souris par comparaison au FTS uniquement passé sur résine chélatante et injecté à la souris. Cette figure montre qu'il n'y a pas de différences d'activation significatives entre le traitement effectué à 20°C et celui effectué à 37°C.FIG. 5 shows the activity obtained in vivo by the FTS passed on chelating resin then treated with zinc sulphate for either 10 minutes at 20 ° C (curve II) or 10 minutes at 37 ° C (curve lm), and injected with the mouse compared to the FTS only passed on chelating resin and injected with the mouse. This figure shows that there are no significant activation differences between the treatment carried out at 20 ° C and that carried out at 37 ° C.
La figure 6 montre l'activité obtenue in vivo par le FTS passé sur résine chélatante puis traité par le zinc pour différentes doses d'injection à la souris: 0,001 ng (courbe In), 0,01 ng (courbe lo), 0,1 ng (courbe Ip) et 1 ng (courbe IqY.FIG. 6 shows the activity obtained in vivo by the FTS passed on chelating resin then treated with zinc for different doses of injection to the mouse: 0.001 ng (curve In), 0.01 ng (curve lo), 0, 1 ng (Ip curve) and 1 ng (IqY curve.
Parallèlement, le traitement in vivo de souris thymectomisées par les produits de l'invention restaure totalement la sensibilité à l'azathioprine et au sérum anti-thêta des cellules formant les rosettes de la rate de ces souris, comme le montrent les résultats du tableau Il ci-après.
Ces expériences ont été répétées à différentes doses de produits: 1 à 100 pg, ce qui a permis de démontrer une relation dose-effet et montrer l'absence de toxicité aiguë, que le produit soit injecté seul (dans du sérum physiologique) ou absorbé sur de la carboxyméthyl cellulose.These experiments were repeated at different doses of products: 1 to 100 pg, which made it possible to demonstrate a dose-effect relationship and to show the absence of acute toxicity, whether the product is injected alone (in physiological saline) or absorbed on carboxymethyl cellulose.
Ces résultats montrent qu'in vivo une activation importante est obtenue par le zinc et à un moindre degré par d'autres métaux.These results show that in vivo significant activation is obtained by zinc and to a lesser extent by other metals.
Les produits activés de l'invention présentent les mêmes propriétés pharmacologiques et les mêmes applications thérapeutiques que le FTS ou les analogues ou dérivés du FTS dont ils dérivent.The activated products of the invention have the same pharmacological properties and the same therapeutic applications as FTS or the analogs or derivatives of FTS from which they are derived.
II a déjà été indiqué dans les publications citées plus haut et relatives aux analogues et dérivés du FTS que ces composées peuvent présenter soit la même activité thymique que le FTS soit une activité inhibitrice ou antagoniste de cette activité thymique.It has already been indicated in the publications cited above and relating to analogs and derivatives of FTS that these compounds can exhibit either the same thymic activity as FTS is an inhibitory or antagonistic activity of this thymic activity.
Les composés actifs dans le test des rosettes présentent tous la même activité thymique que le FTS, alors que certains composés inactifs dans le test des rosettes possèdent une action inhibitrice ou antagoniste de l'activité thymique.The compounds active in the rosette test all have the same thymic activity as the FTS, while certain inactive compounds in the rosette test have an inhibiting or antagonistic action on thymic activity.
Dans tous les cas ces dérivés sont utiles comme médicaments pour le traitement de maladies consécutives à un déséquilibre des lymphocytes T, notamment des maladies auto-immunes correspondant à un effondrement des lymphocytes suppresseurs; des maladies virales correspondant à une biasse des lymphocytes "helpers"; des maladies tumorales dues à un déficit en lymphocytes' "killers".In all cases, these derivatives are useful as medicaments for the treatment of diseases consecutive to an imbalance of the T lymphocytes, in particular autoimmune diseases corresponding to a collapse of the suppressor lymphocytes; viral diseases corresponding to a bypass of "helper" lymphocytes; tumor diseases due to a deficit in "killer" lymphocytes.
Le tableau III ci-dessous montre l'effet du traitement par le zinc de certains analogues et dérivés du FTS vis-à-vis de leur activité biologique.
II est important de remarquer que certains peptides (peptides n° 37, 38, 47, 45, 60, 63, 84, 96) qui sont inactifs ou peu actifs dans le test des rosettes deviennent actifs après traitement par le zinc.It is important to note that certain peptides (peptides no. 37, 38, 47, 45, 60, 63, 84, 96) which are inactive or not very active in the rosette test become active after treatment with zinc.
Dans le tableau III, le symbole ND signifie non déterminé, le symbole R signifie que le composé correspondant à une activité retard, c'est-à-dire qui se prolonge dans le temps.In Table III, the symbol ND signifies not determined, the symbol R signifies that the compound corresponding to a delayed activity, that is to say one which extends over time.
D'autre part les numéros de peptides correspondent aux peptides suivants:
- Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (36)
- Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (37)
- Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (38)
- PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser (42)
- Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (18)
- PyroGlu-D-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (47)
- D-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (45)
- PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asp (53)
- PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ala-Asn (59)
- PyroGlu-Ala-Lys-Ala-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (60)
- Z Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (34)
- PyroGlu-Ala-D-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (61)
- PyroGlu-Ala-Lys(N6-acetyl)-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (62)
- PyroGlu-Ala-Orn-Ser- Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (63)
- PyroGlu-Ala-Lys-(N-methyl)Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (64)
- PyroGlu-Ala-Lys-D-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (66)
- PyroGlu-Ala-Lys-Ser-D-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (71)
- PyroGlu-Ala(2,6-diaminohexynoyl)-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (77)
- PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Gln (79)
- Lys(N6 acétyl)-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (82)
- D-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (83)
- Orn-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (84)
- Nx Z-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (85)
- PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-β-Ala-NH2 (86)
- Lys-Ser-Gln-D-Ala-Gly-Ser-Asn (88)
- PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-D-Ala-Gly-Ser-Asn (89)
- PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-D-Asn (90)
- PyroGlu-Ala-Hep-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (91)
- PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH2 (93)
- PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Asn-Gly-Gly-Ser-Asn (96)
- PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Nva-Gly-Gly-Ser-Asn (97)
- Z-Ala-Lys Ser-Gln-Gly-Ser-Asn (105)
- D-PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (106)
- D-Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (107)
- Pro-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (109)
- PyroGlu-Ala-Arg-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (111)
- PyroGlu-Ala-Har-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Asn (112)
- PyroGlu-Ala-Lys(N6-acétyl)-Ser-Gln-D-Ala-Gly-Ser-Asn (113)
- Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (36)
- Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (37)
- Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (38)
- PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser (42)
- Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (18)
- PyroGlu-D-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (47)
- D-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (45)
- PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asp (53)
- PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ala-Asn (59)
- PyroGlu-Ala-Lys-Ala-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (60)
- Z Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (34)
- PyroGlu-Ala-D-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (61)
- PyroGlu-Ala-Lys (N 6- acetyl) -Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (62)
- PyroGlu-Ala-Orn-Ser- Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (63)
- PyroGlu-Ala-Lys- (N-methyl) Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (64)
- PyroGlu-Ala-Lys-D-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (66)
- PyroGlu-Ala-Lys-Ser-D-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (71)
- PyroGlu-Ala (2,6-diaminohexynoyl) -Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (77)
- PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Gln (79)
- Lys (N 6 acetyl) -Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (82)
- D-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (83)
- Orn-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (84)
- Nx Z-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (85)
- PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-β-Ala-NH 2 (86)
- Lys-Ser-Gln-D-Ala-Gly-Ser-Asn (88)
- PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-D-Ala-Gly-Ser-Asn (89)
- PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-D-Asn (90)
- PyroGlu-Ala-Hep-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (91)
- PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH 2 (93)
- PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Asn-Gly-Gly-Ser-Asn (96)
- PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Nva-Gly-Gly-Ser-Asn (97)
- Z-Ala-Lys Ser-Gln-Gly-Ser-Asn (105)
- D-PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (106)
- D-Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (107)
- Pro-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (109)
- PyroGlu-Ala-Arg-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (111)
- PyroGlu-Ala-Har-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Asn (112)
- PyroGlu-Ala-Lys (N 6- acetyl) -Ser-Gln-D-Ala-Gly-Ser-Asn (113)
Dans les peptides ci-dessus, les acides aminés sont désignés sous leurs abréviations habituelles. De plus Z désigne le groupe benzyloxycarbonyle.In the above peptides, the amino acids are designated by their usual abbreviations. In addition Z denotes the benzyloxycarbonyl group.
Comme indiqué plus haut, les produits activés de l'invention sont utiles dans le traitement de maladies consécutives à un déséquilibre des lymphocytes T, notamment correspondant à:
- - un effondrement des lymphocytes T suppresseurs: maladies auto-immunes telles que Lupus, en particulier Lupus érythémateux, sclérose en plaque, polyarthrites rhumatoïdes;
- -une baisse des lymphocytes "helpers": infections bactériennes et virales, en particulier herpès récidivant, zona, varicelle;
- - un déficit en lymphocytes "killers": maladies tumorales, en particulier cancers naso-pharyngiens, cancer épidermoïde du poumon, cancer infiltrant de la vessie, mélanomes, néoplasies.
- - a collapse of suppressor T lymphocytes: autoimmune diseases such as Lupus, in particular Lupus erythematosus, multiple sclerosis, rheumatoid arthritis;
- -a decrease in "helper" lymphocytes: bacterial and viral infections, in particular recurrent herpes, shingles, chickenpox;
- - a deficit in "killer" lymphocytes: tumor diseases, in particular nasopharyngeal cancers, epidermoid lung cancer, infiltrating bladder cancer, melanomas, neoplasias.
Les produits de la présente invention peuvent être administrés par voie intraveineuse ou intramusculaire, par voie de suppositoires, par voie d'aérosols ou par voie orale sous forme protégée, des véhicules appropriés qui peuvent être utilisés dans la composition comprennent, par exemple, des liquides stériles comme l'eau ou un soluté physiologique ou des substances susceptibles de conférer un effet retard ou encore des préparations permettant l'administration par voie de suppositoires, par voie d'aérosols ou par voie sublinguale. En plus d'un véhicule, les présentes compositions peuvent aussi comprendre d'autres ingrédients tels que des stabilisateurs, des antioxydants, des agents de suspension ou des agents de conservation comme du phénol ou du chlorobutanol et des agents du même genre. La solution finie peut être stérilisée facilement par des techniques classiques de filtration.The products of the present invention can be administered intravenously or intramuscularly, by suppositories, by aerosols or orally in protected form, suitable vehicles which can be used in the composition include, for example, liquids sterile such as water or a physiological solution or substances liable to give a delayed effect or preparations allowing administration by suppositories, by aerosols or by sublingual route. In addition to a vehicle, the present compositions may also include other ingredients such as stabilizers, antioxidants, suspending agents or preservatives such as phenol or chlorobutanol and the like. The finished solution can be easily sterilized by conventional filtration techniques.
La composition utilisée dans la présente invention contient en solution aqueuse une quantité suffisante de l'agent de l'invention pour être thérapeutiquement efficace. Les doses à administrer dépendent dans une large mesure de l'état du sujet que l'on traite et de son poids.The composition used in the present invention contains in aqueous solution a sufficient amount of the agent of the invention to be therapeutically effective. The doses to be administered depend to a large extent on the condition of the subject being treated and his weight.
A titre d'exemple, on mentionnera une posologie de 100 à 5000 Ilg par injection, de préférence 500 Ilg par injection répétée trois fois par semaine. Ceci correspond à une dose approximative de 10 y/kg chez l'homme.As an example may be mentioned a dosage of 100 to 5000 g It injection, preferably 500 g per injection It repeated three times per week. This corresponds to an approximate dose of 10 y / kg in humans.
Les produits activés de l'invention trouvent aussi une application à la préparation de traceurs radioactifs utilisables dans des procédés de dosage radioimmunologique pour doser le taux de FTS présent dans le sérum.The activated products of the invention also find application in the preparation of radioactive tracers which can be used in radioimmunoassay methods for determining the level of FTS present in the serum.
Le test des rosettes a permis de démontrer que le taux sérique de FTS est modifié dans certaines situations pathologiques immunitaires, telles que le lupus et les myasthénies (J. F. Bach et Coll., Ann. N.Y. Acad. Sci. 249 (1975) page 186).The rosette test has shown that the serum FTS level is modified in certain immune pathological situations, such as lupus and myasthenia gravis (JF Bach et al., Ann. NY Acad. Sci. 249 (1975) page 186) .
Toutefois, étant donné que le test des rosettes est un essai semi-quantitatif, le besoin s'est fait sentir de mettre au point un procédé de dosage quantitatif, suffisamment sensible pour permettre un dosage direct du FTS dans le sang.However, since the rosette test is a semi-quantitative test, there has been a need to develop a quantitative assay method, sensitive enough to allow direct determination of FTS in the blood.
Le procédé de dosage du FTS dans un échantillon consiste à mettre en présence une quantitié déterminée de cet échantillon avec une quantité déterminée de traceur et une quantité déterminée d'anticorps anti-FTS de manière à provoquer une réaction de compétition entre le traceur et le FTS de l'échantillon dans leur liaison avec l'anticoprs anti-FTS, à déterminer après équilibre de la réaction la quantité de traceur marque, soit libre, soit lié à l'anticorps, et à comparer cette valeur à celles obtenues pour des quantitiés connues et croissantes de FTS.The method for assaying FTS in a sample consists in bringing together a determined quantity of this sample with a determined quantity of tracer and a determined quantity of anti-FTS antibodies so as to cause a competition reaction between the tracer and FTS of the sample in their binding with the anti-FTS anticoprs, to determine after equilibrium of the reaction the quantity of labeled tracer, either free or bound to the antibody, and to compare this value with those obtained for known quantities and growing of FTS.
L'anticorps anti-FTS est préparé en fixant le FTS ou l'un des ses analogues et dérivés sur un support pour obtenir un immunogène, en injectant l'immunogène à un animal et en recueillant ultérieurement le sérum de l'audinal.The anti-FTS antibody is prepared by fixing the FTS or one of its analogs and derivatives on a support to obtain an immunogen, by injecting the immunogen into an animal and subsequently collecting the audinal serum.
Le traceur est obtenu par marquage par un isotope radioactif, de préférence en introduisant une molécule iodable sur un produit activé selon l'invention et en iodant ensuite le dérivé iodable ainsi obtenu.The tracer is obtained by labeling with a radioactive isotope, preferably by introducing an iodizable molecule onto an activated product according to the invention and then iodizing the iodizable derivative thus obtained.
Pour mettre en oeuvre le procédé de dosage on pourra prévoir un coffret de réactifs contenant essentiellement le traceur et l'anticorps nécessaires du dosage.To carry out the assay method, it is possible to provide a set of reagents essentially containing the tracer and the antibody required for the assay.
Le procédé de dosage est illustré par l'exemple suivant:The dosing process is illustrated by the following example:
Le FTS de synthèse a été préparé selon la méthode indiquée plus haut.The synthetic FTS was prepared according to the method indicated above.
Un analogue synthétique du FTS, par exemple le P-amino benzoyl Glnl-FTS, préparé par E. Bricas (Université de Paris Sud Orsay) est marqué à l'lode 125 en présence de chloramine T (le p-amino benzoyl Gln 1-FTS ne constitue qu'une exemple parmi d'autres des analogues ou dérivés du FTS pouvant être utilisés pour la préparation du traceur radioactif). Le FTS-1251 est séparé de l'iode libre par filtration sur gel de Sephadex G-25@ élué en tampon Tris HCI 0,1 M, pH 7,6. Des fractions aliquotes de FTS-125I (environ 5×106 cpm) sont mélangées à une suspension de Chelex 100 (50 mg/ml) puis incubées 30 minutes en présence de 100 ng de chlorure de zinc. Le mélange est ensuite chromatographié sur Biogel P2@, élué avec du tampon Tris HCI 0,1 M, pH 7,6 contentant 1% de gélatine. Le pic correspondant au FTS-Zn est récupéré et utilisé pour le dosage radioimmunologique.A synthetic analog of FTS, for example P-amino benzoyl Glnl-FTS, prepared by E. Bricas (University of Paris Sud Orsay) is labeled with lode 125 in the presence of chloramine T (p-amino benzoyl Gln 1- FTS is only one example among others of analogs or derivatives of FTS which can be used for the preparation of the radioactive tracer). FTS-1251 is separated from free iodine by filtration on Sephadex G-25 @ gel eluted in 0.1 M Tris HCI buffer, pH 7.6. Aliquots of FTS- 125 I (approximately 5 × 10 6 cpm) are mixed with a suspension of Chelex 100 (50 mg / ml) and then incubated for 30 minutes in the presence of 100 ng of zinc chloride. The mixture is then chromatographed on Biogel P2 @, eluted with 0.1 M Tris HCI buffer, pH 7.6 containing 1% gelatin. The peak corresponding to FTS-Zn is recovered and used for the radioimmunoassay.
Le FTS est rendu immunogénique en le couplant à la sérum albumine bovine en présence de glutaraldéhyde (6). L'immunogène ainsi obtenu est injecté, incorporé dans de l'adjuvant complet de Freund, à des lapins (1 mg per lapin). Une injection de rappel (également de 1 mg) est administrée un mois après la première injection et les ainmaux sont saignés 15 jours après l'injection de rappel.The FTS is made immunogenic by coupling it to bovine serum albumin in the presence of glutaraldehyde (6). The immunogen thus obtained is injected, incorporated into complete Freund's adjuvant, into rabbits (1 mg per rabbit). A booster injection (also 1 mg) is given one month after the first injection and the pains are bled 15 days after the booster injection.
Des sérums frais de souris normales et thymectomisées sont ultrafiltrés sur Amicon CF50@ et utilisés extemporanément.Fresh sera from normal and thymectomized mice are ultrafiltered through Amicon CF50 @ and used extemporaneously.
L'antisérum obtenu par immunisation contre le FTS de synthèse lie les deux traceurs étudiés (FTS 125I et FTS-Zn 125I). Défini comme la dilution maximale de l'antisérum donnant lieu à une liaison de 40% du traceur radioactif, le titre de l'antisérum est de 1/50 000 pour le FTS125I et de 1/20 000 pour le FTS-Zn' 25 1. The antiserum obtained by immunization against synthetic FTS binds the two tracers studied (FTS 125 I and FTS-Zn 125 I). Defined as the maximum dilution of the antiserum giving rise to a binding of 40% of the radioactive tracer, the titer of the antiserum is 1: 50,000 for FTS 125 I and 1: 20,000 for FTS-Z n '25 1.
Le FTS de synthèse inhibe la liaison des dux traceurs à l'anticorps, l'inhibition atteignant 80% aux plus fortes concentrations du peptide. La sensibilité du'dosage exprimée par la dose d'hormone inhibant 50% de la liaison est de 10 pg pour le FTS1251 et 60―80 pg pour le FTS-Zn125I.The synthetic FTS inhibits the binding of the tracer duxes to the antibody, the inhibition reaching 80% at the highest concentrations of the peptide. The sensitivity of the dosage expressed by the dose of hormone inhibiting 50% of the binding is 10 pg for
Dix échantillons de sérum de souris normales et dix échantillons de sérums de souris thymectomisées ont été comparés pour leur capacité de déplacer la liaison des deux traceurs décrits plus haut à l'antisérum de lapin. Aucune différence significative n'est observée avec le FTS'251 entre les sérums provenant d'animaux normaux et thymectomisés. Par contre, alors que les dix échantillons de souris normales déplacent tous la liaison du FTS Zn125I, aucun des sérums de souris thymectomisées (même utilisés non dilués) ne modifie la liaison. Le déplacement obtenu avec les sérums normaux (dilués au 1/2) varie de 40 à 60% selon les échantillons. Le déplacement est encore significatif quand les sérums sont dilués au 1/8ème.Ten normal mouse serum samples and ten thymectomized mouse serum samples were compared for their ability to disrupt the binding of the two tracers described above to rabbit antiserum. No significant difference is observed with FTS'251 between the sera from normal and thymectomized animals. On the other hand, while the ten samples of normal mice all displace the binding of FTS Zn 125 I, none of the sera of thymectomized mice (even used undiluted) changes the binding. The displacement obtained with normal sera (diluted 1/2) varies from 40 to 60% depending on the samples. The displacement is still significant when the sera are diluted 1 / 8th.
Les résultats ci-dessus montrent que les anticorps obtenus chez le lapin après immunisation contre le FTS de synthèse lient à la fois les traceurs FTS et FTS-Zn, avec cependant un titre moins élevé pour FTS-Zn. Le FTS de synthèse déplace la liaison des deux traceurs à l'antisérum. Par contre, dans les conditions de ces expériences le FTS d'origine biologique, présent dans les sérums des souris normales, inhibe seulement la liaison du traceur FTS-Zn, la spécificité de l'inhibition étant démontrée par l'absence totale de déplacement obaservée avec les sérums de souris thymectomisées.The above results show that the antibodies obtained in rabbits after immunization against synthetic FTS bind both the FTS and FTS-Zn tracers, with however a lower titer for FTS-Zn. The synthetic FTS displaces the binding of the two tracers to the antiserum. On the other hand, under the conditions of these experiments, the FTS of biological origin, present in the sera of normal mice, only inhibits the binding of the tracer FTS-Zn, the specificity of the inhibition being demonstrated by the total absence of displacement obaservated with thymectomized mouse sera.
Ces résultats confirment l'existence de deux formes de FTS, l'une ayant capté un -métal en l'occurrence le zonc, biologiquement active et antigéniquement proche de l'hormone naturelle, l'autre dépourvue de métal, biologiquement inactive et antigéniquement distincte de l'hormone thymique. Le FTS de synthèse, non passé sur Chelex 100@, qui est probablement biologiquement actif grâce aux traces de zinc qu'il contient (8) inclut à l'évidence, du FTS dépourvu de zinc. Son contenu en FTS-Zn ou en complexe de FTS avec d'autres métaux n'a pas été déterminé.These results confirm the existence of two forms of FTS, one having captured a metal, in this case the zonc, biologically active and antigenically close to the natural hormone, the other devoid of metal, biologically inactive and antigenically distinct. thymic hormone. Synthetic FTS, not passed over Chelex 100 @, which is probably biologically active thanks to the traces of zinc it contains (8) obviously includes FTS devoid of zinc. Its content in FTS-Zn or in FTS complex with other metals has not been determined.
Il est encore difficile de dire si les lapins immunisés par le FTS de synthèse ont produit deux familles d'anticorps reconnaissant chacune une forme du peptide (avec ou sans zinc) ou plutôt essentiellement un anticorps donnant lieu à une réaction croisée contre le FTS et le FTS-Zn (mais reconnaissant le FTS avec une plus grande affinité que le FTS-Zn). Cette dernière hypothèse est compatible avec l'important (50%) déplacement de la liaison du traceur FTS-Zn observé à la fois avec le FTS de synthèse et le FTS naturel. Elle implique que le FTS naturel déplace seulement le traceur FTS-Zn dont il est plus proche structuralement que du FTS dépourvu de zinc et reste sans effet sur la liaison du traceur FTS dépourvu de zinc vis-à-vis duquel l'anticorps de lapin a une plus grande affinité.It is still difficult to say whether rabbits immunized with synthetic FTS produced two families of antibodies, each recognizing a form of the peptide (with or without zinc) or rather essentially an antibody giving rise to a cross-reaction against FTS and FTS-Zn (but recognizing the FTS with greater affinity than the FTS-Zn). This last hypothesis is compatible with the large (50%) displacement of the FTS-Zn tracer bond observed with both synthetic FTS and natural FTS. It implies that the natural FTS displaces only the FTS-Zn tracer which it is structurally closer to than the zinc-free FTS and remains without effect on the binding of the zinc-free FTS tracer vis-à-vis which the rabbit antibody has greater affinity.
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