EA046350B1 - ANTI-INTERLEUKIN-17A ANTIBODY, PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND THEIR APPLICATION - Google Patents
ANTI-INTERLEUKIN-17A ANTIBODY, PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND THEIR APPLICATION Download PDFInfo
- Publication number
- EA046350B1 EA046350B1 EA202092844 EA046350B1 EA 046350 B1 EA046350 B1 EA 046350B1 EA 202092844 EA202092844 EA 202092844 EA 046350 B1 EA046350 B1 EA 046350B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- seq
- antigen
- monoclonal antibody
- variable region
- antibody
- Prior art date
Links
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 122
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 114
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 114
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 113
- 102000013691 Interleukin-17 Human genes 0.000 claims description 107
- 108050003558 Interleukin-17 Proteins 0.000 claims description 107
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 68
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 66
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 52
- 229960004540 secukinumab Drugs 0.000 claims description 52
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims description 37
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 34
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 32
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 31
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 29
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 25
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 22
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 22
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 22
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 20
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 claims description 19
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 17
- 201000001263 Psoriatic Arthritis Diseases 0.000 claims description 16
- 208000036824 Psoriatic arthropathy Diseases 0.000 claims description 16
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 claims description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 13
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 11
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 claims description 7
- 101000998146 Homo sapiens Interleukin-17A Proteins 0.000 claims description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 102000053162 human IL17A Human genes 0.000 claims description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 claims description 3
- 102100033461 Interleukin-17A Human genes 0.000 claims description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000004088 simulation Methods 0.000 claims 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims 1
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 44
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 37
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 35
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 28
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 26
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 26
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 26
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 26
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 25
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 22
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 22
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 description 22
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 19
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 18
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 18
- 102100035018 Interleukin-17 receptor A Human genes 0.000 description 14
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 14
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 13
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 12
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 12
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 11
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 10
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 10
- 101710186083 Interleukin-17 receptor A Proteins 0.000 description 10
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 10
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 8
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 8
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 6
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 6
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 101001019598 Homo sapiens Interleukin-17 receptor A Proteins 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 5
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 5
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 5
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 108010017525 Interleukin-17 Receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000004554 Interleukin-17 Receptors Human genes 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 4
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 108010028006 B-Cell Activating Factor Proteins 0.000 description 2
- 208000006386 Bone Resorption Diseases 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 208000009386 Experimental Arthritis Diseases 0.000 description 2
- 101000840257 Homo sapiens Immunoglobulin kappa constant Proteins 0.000 description 2
- 101001106322 Homo sapiens Rho GTPase-activating protein 7 Proteins 0.000 description 2
- 101710138871 Ig gamma-1 chain C region Proteins 0.000 description 2
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 2
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 102100039345 Immunoglobulin heavy constant gamma 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100029572 Immunoglobulin kappa constant Human genes 0.000 description 2
- 101710186068 Interleukin-17 receptor C Proteins 0.000 description 2
- 102100035012 Interleukin-17 receptor C Human genes 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 102000014128 RANK Ligand Human genes 0.000 description 2
- 108010025832 RANK Ligand Proteins 0.000 description 2
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 2
- 102100021446 Rho GTPase-activating protein 7 Human genes 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 102100036922 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 13B Human genes 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000024279 bone resorption Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000004182 chemical digestion Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000009266 disease activity Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000001185 psoriatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 230000003844 B-cell-activation Effects 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 206010065687 Bone loss Diseases 0.000 description 1
- 206010007710 Cartilage injury Diseases 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 201000008370 Discitis Diseases 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 208000012661 Dyskinesia Diseases 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000998181 Homo sapiens Interleukin-17B Proteins 0.000 description 1
- 101000998151 Homo sapiens Interleukin-17F Proteins 0.000 description 1
- 102000039989 IL-17 family Human genes 0.000 description 1
- 108091069193 IL-17 family Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101710186071 Interleukin-17 receptor B Proteins 0.000 description 1
- 102100035014 Interleukin-17 receptor B Human genes 0.000 description 1
- 101710186062 Interleukin-17 receptor D Proteins 0.000 description 1
- 102100035015 Interleukin-17 receptor D Human genes 0.000 description 1
- 101710186076 Interleukin-17 receptor E Proteins 0.000 description 1
- 102100035016 Interleukin-17 receptor E Human genes 0.000 description 1
- 102100033101 Interleukin-17B Human genes 0.000 description 1
- 102100033096 Interleukin-17D Human genes 0.000 description 1
- 102100033454 Interleukin-17F Human genes 0.000 description 1
- 108010066979 Interleukin-27 Proteins 0.000 description 1
- 208000012659 Joint disease Diseases 0.000 description 1
- 206010023230 Joint stiffness Diseases 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 206010039361 Sacroiliitis Diseases 0.000 description 1
- 208000032023 Signs and Symptoms Diseases 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 201000002661 Spondylitis Diseases 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 108010076818 TEV protease Proteins 0.000 description 1
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 description 1
- 210000000068 Th17 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 208000038016 acute inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006022 acute inflammation Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 208000037896 autoimmune cutaneous disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000037182 bone density Effects 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 230000036569 collagen breakdown Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 229940010466 cosentyx Drugs 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 210000005175 epidermal keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003090 exacerbative effect Effects 0.000 description 1
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 102000043448 human IL17RA Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000012482 interaction analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008407 joint function Effects 0.000 description 1
- 208000018937 joint inflammation Diseases 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229940125645 monoclonal antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000022632 negative regulation of interleukin-6 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003131 sacroiliac joint Anatomy 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 1
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 210000002437 synoviocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Description
Область техники, к которой относится изобретениеField of technology to which the invention relates
Настоящее изобретение относится к области молекулярной иммунологии и касается антитела к интерлейкину-17А, фармацевтической композиции на основе этих антител и их применению. В частности, настоящее изобретение относится к анти-интерлейкин-17А моноклональному антителу.The present invention relates to the field of molecular immunology and concerns an antibody to interleukin-17A, a pharmaceutical composition based on these antibodies and their use. In particular, the present invention relates to an anti-interleukin-17A monoclonal antibody.
Уровень техникиState of the art
Интерлейкин-17А (сокращенно IL-17A или IL 17А) является членом семейства цитокинов IL-17, которое состоит из 6 членов, т.е. IL-17A (IL-17A был обнаружен первым, он также называется IL-17), IL17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E (также называемый IL-25) и IL-17F (Shi Peiqing et al., Chinese Journal of Cell Biology 33:345-357 (2011)). IL-17F имеет примерно 50% гомологию с IL-17A, кодирующие гены которых расположены в одном и том же сегменте хромосомы 6р12 (Gaffen et al., Nat Rev Immunol 9:556-67 (2009)). IL-17A и IL-17F могут существовать в форме гомодимеров, таких как IL-17A/IL-17A и IL-17F/IL17F, а также в виде гетеродимера IL-17A/IL-17F. Биологические эффекты IL-17A и IL-17F проявляются при их связывании с рецепторами (Wright et al., J Immunol 181:2799-805 (2008)).Interleukin-17A (abbreviated IL-17A or IL 17A) is a member of the IL-17 family of cytokines, which consists of 6 members, i.e. IL-17A (IL-17A was discovered first, also called IL-17), IL17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E (also called IL-25), and IL-17F (Shi Peiqing et al., Chinese Journal of Cell Biology 33:345-357 (2011)). IL-17F has approximately 50% homology with IL-17A, the coding genes of which are located on the same segment of chromosome 6p12 (Gaffen et al., Nat Rev Immunol 9:556-67 (2009)). IL-17A and IL-17F can exist in the form of homodimers, such as IL-17A/IL-17A and IL-17F/IL17F, and also as an IL-17A/IL-17F heterodimer. The biological effects of IL-17A and IL-17F occur when they bind to receptors (Wright et al., J Immunol 181:2799-805 (2008)).
Семейство рецепторов IL-17 (IL-17R) состоит из 5 членов, т.е. IL-17RA, IL-17RB, IL-17RC, IL-17RD и IL-17RE. Члены семейства рецепторов IL-17 могут образовывать разные рецепторные комплексы, и среди них IL-17RA, самая крупная молекула, обнаруженная на сегодняшний день в этом семействе, является общей субъединицей, передающей сигналы для по меньшей мере четырех лигандов, и обеспечивает основные биологические эффекты (Gaffen et al., Nat Rev Immunol 9:556-67 (2009)). Комплекс IL17RA и IL-17RC опосредует клеточные ответы на IL-17A и IL-17F (Toy et al., J Immunol 177:36-9 (2006)).The IL-17 receptor (IL-17R) family consists of 5 members, i.e. IL-17RA, IL-17RB, IL-17RC, IL-17RD and IL-17RE. Members of the IL-17 receptor family can form different receptor complexes, and among them, IL-17RA, the largest molecule discovered to date in this family, is a common subunit that transmits signals for at least four ligands and mediates major biological effects ( Gaffen et al., Nat Rev Immunol 9:556-67 (2009)). The complex of IL17RA and IL-17RC mediates cellular responses to IL-17A and IL-17F (Toy et al., J Immunol 177:36-9 (2006)).
В аутоиммунном воспалительном ответе IL-17A играет более важную роль, чем IL-17F по причине того, что сродство IL17RA к IL-17A в сто раз превосходит его сродство к IL-17F (Ely et al., Nat Immunol 10 1245-51 (2009)), и клеточный ответ на IL-17A в 10 раз сильнее, чем на IL-17F (Dubin et al., Immunity 30:9-11 (2009)). Ahtu-IL-17A антитело или антитело к рецептору IL-17 можно использовать для блокирования связывания IL-17A с его рецептором, тем самым блокируя биологическую активность IL-17A.In the autoimmune inflammatory response, IL-17A plays a more important role than IL-17F due to the fact that the affinity of IL17RA for IL-17A is one hundred times greater than its affinity for IL-17F (Ely et al., Nat Immunol 10 1245-51 ( 2009)), and the cellular response to IL-17A is 10 times stronger than to IL-17F (Dubin et al., Immunity 30:9-11 (2009)). Ahtu-IL-17A antibody or anti-IL-17 receptor antibody can be used to block the binding of IL-17A to its receptor, thereby blocking the biological activity of IL-17A.
IL-17A играет важную роль при некоторых аутоиммунных заболеваниях (например, псориазе, псориатическом артрите, ревматоидном артрите, анкилозирующем спондилите, системной красной волчанке и т.д.). Ahtu-IL-17A моноклональное антитело Секукинумаб одобрено Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) и Европейским агентством по лекарственным средствам (ЕМА) для лечения бляшечного псориаза от умеренной до тяжелой степени, псориатического артрита и анкилозирующего спондилита.IL-17A plays an important role in several autoimmune diseases (eg, psoriasis, psoriatic arthritis, rheumatoid arthritis, ankylosing spondylitis, systemic lupus erythematosus, etc.). Ahtu-IL-17A monoclonal antibody Secukinumab is approved by the Food and Drug Administration (FDA) and the European Medicines Agency (EMA) for the treatment of moderate to severe plaque psoriasis, psoriatic arthritis and ankylosing spondylitis.
Псориаз, также известный как порша (чешуйка), является хроническим аутоиммунным заболеванием кожи. Гистологические характеристики кожи при псориазе включают гиперпролиферацию эпидермальных кератиноцитов, ангиогенез, а также инфильтрацию дендритных клеток, макрофагов, нейтрофилов и Т-клеток. (Nestle et al., N Engl J. Med., 361:496-509 (2009)). Псориаз имеет различные проявления, среди которых наиболее распространенным типом является бляшечный псориаз, на который приходится более 90% всех пациентов, страдающих псориазом. Псориатический артрит (ПсА) является особым типом псориаза, для которого характерна псориатическая сыпь, а также боль, отек, болезненность, жесткость и дискинезия суставов и окружающих мягких тканей. У некоторых пациентов может наблюдаться сакроилеит и(или) спондилит с длительным течением, легким рецидивом и скованностью суставов на поздней стадии, приводящей к инвалидности. Наличие псориаза является важным отличием псориатического артрита от других воспалительных заболеваний суставов, где тяжесть поражения кожи не связана напрямую со степенью воспаления суставов (Tan Zhen et al., Chinese Journal of Rheumatology 20:354-357 (2016)).Psoriasis, also known as poriasis (scaly), is a chronic autoimmune skin disease. Histological characteristics of psoriasis skin include hyperproliferation of epidermal keratinocytes, angiogenesis, and infiltration of dendritic cells, macrophages, neutrophils, and T cells. (Nestle et al., N Engl J. Med., 361:496-509 (2009)). Psoriasis has various manifestations, of which the most common type is plaque psoriasis, which accounts for more than 90% of all psoriasis patients. Psoriatic arthritis (PsA) is a special type of psoriasis characterized by a psoriatic rash, as well as pain, swelling, tenderness, stiffness and dyskinesia of the joints and surrounding soft tissue. Some patients may experience sacroiliitis and/or spondylitis with a long course, mild recurrence and late-stage joint stiffness leading to disability. The presence of psoriasis is an important difference between psoriatic arthritis and other inflammatory joint diseases, where the severity of skin lesions is not directly related to the degree of joint inflammation (Tan Zhen et al., Chinese Journal of Rheumatology 20:354-357 (2016)).
В кожных тканях, пораженных псориазом, уровень экспрессии IL-17A существенно увеличен, и это увеличение тесно связано с активностью псориатического заболевания (Johansen et al., Brit J Dermatol, 160:319-24 (2009); Lowes et al. J Invest Dermatol 128:1207-11 (2008)). Было показано, что анти-Ш-17А моноклональное антитело Секукинумаб является очень эффективным у пациентов, страдающих псориазом, и может значительно снизить активность заболевания у таких пациентов и уменьшить площадь псориатических бляшек (Langley et al., N Engl J Med, 371:326-38 (2014)). Секукинумаб также может существенно уменьшить симптомы артрита и улучшить функциональную активность суставов у пациентов с псориатическим артритом (Gottlieb et al., J Drugs Dermatol, 14821-33 (2015)). Секукинумаб одобрен FDA для лечения бляшечного псориаза от умеренной до тяжелой степени и псориатического артрита.In skin tissues affected by psoriasis, IL-17A expression is significantly increased, and this increase is closely associated with psoriatic disease activity (Johansen et al., Brit J Dermatol, 160:319-24 (2009); Lowes et al. J Invest Dermatol 128:1207-11 (2008)). The anti-III-17A monoclonal antibody Secukinumab has been shown to be very effective in patients suffering from psoriasis and can significantly reduce disease activity in such patients and reduce the area of psoriatic plaques (Langley et al., N Engl J Med, 371:326- 38 (2014)). Secukinumab can also significantly reduce arthritis symptoms and improve joint function in patients with psoriatic arthritis (Gottlieb et al., J Drugs Dermatol, 14821-33 (2015)). Secukinumab is FDA approved for the treatment of moderate to severe plaque psoriasis and psoriatic arthritis.
Ревматоидный артрит (РА) в основном характеризуется воспалительной пролиферацией в суставах синовиальных фибробластов, повреждением суставов и хрящей, инфильтрацией CD4+ хелперных Тклеток и плазматических клеток, продуцирующих аутоантитела. IL-17A может вызывать как воспаление, так и повреждение костей при ревматоидном артрите. IL-17A имеет высокие уровни экспрессии в ревматоидных синовиальных моноцитах пациентов с ревматоидным артритом по сравнению со здоровыми людьми или пациентами с остеоартритом (Sarkar et al., Clin Exp Immunol. 177:652-61 (2014)). В цитологических исследованиях было показано, что LL-17A может стимулировать резорбцию костей и разрушение коллагена (Kitami et al., Biochimie, 92:398-404 (2010)). IL-17A может инициировать секрецию провоспалительных цитокинов, таких как TNFa, LL-1b и IL-6 в хрящах, синовиальных клетках, макрофагах и остеобластах, и оказывать биологическое воздействие. Эти провоспалительные цитокины вызываютRheumatoid arthritis (RA) is mainly characterized by inflammatory proliferation of synovial fibroblasts in the joints, joint and cartilage damage, and infiltration of CD4+ helper T cells and autoantibody-producing plasma cells. IL-17A may cause both inflammation and bone damage in rheumatoid arthritis. IL-17A has high expression levels in rheumatoid synovial monocytes of patients with rheumatoid arthritis compared to healthy individuals or patients with osteoarthritis (Sarkar et al., Clin Exp Immunol. 177:652-61 (2014)). Cytological studies have shown that LL-17A can stimulate bone resorption and collagen breakdown (Kitami et al., Biochimie, 92:398-404 (2010)). IL-17A can initiate the secretion of pro-inflammatory cytokines such as TNFa, LL-1b and IL-6 in cartilage, synovial cells, macrophages and osteoblasts and have biological effects. These pro-inflammatory cytokines cause
- 1 046350 внезапное начало ревматоидного артрита и могут поддерживать количество клеток ТН17 посредством IL-6, индуцированного IL-17A, тем самым формируя положительную обратную связь и действуя синергетически, усиливая их воспалительные эффекты и вызывая хроническое воспалительное состояние (Ogura et al. др., Immunity 29:628-36 (2008)). Антагонистическое воздействие на IL-17A может эффективно облегчить симптомы ревматоидного артрита. В модели мышей с коллаген-индуцированным артритом нейтрализация IL-17A или его рецептора позволила устранить симптомы ревматоидного артрита (Chao et al., Autoimmunity. 2011 May; 44(3):243-52). Дефицит IL-17 позволяет защитить мышь-хозяина от коллаген-индуцированного артрита (Nakae et al., J Immunol, 171:6173-7 (2003)), в то время как сверхэкспрессия IL-17A может усугублять такие состояния (Lubberts et al., Inflamm Res 51:102-4 (2002)).- 1 046350 sudden onset of rheumatoid arthritis and can maintain the number of TH17 cells through IL-6 induced IL-17A, thereby forming a positive feedback loop and acting synergistically to enhance their inflammatory effects and induce a chronic inflammatory state (Ogura et al., Immunity 29:628-36 (2008)). Antagonizing IL-17A can effectively alleviate the symptoms of rheumatoid arthritis. In a mouse model of collagen-induced arthritis, neutralization of IL-17A or its receptor eliminated symptoms of rheumatoid arthritis (Chao et al., Autoimmunity. 2011 May; 44(3):243-52). IL-17 deficiency protects the mouse host from collagen-induced arthritis (Nakae et al., J Immunol, 171:6173-7 (2003)), while overexpression of IL-17A can exacerbate such conditions (Lubberts et al. , Inflamm Res 51:102-4 (2002)).
Анкилозирующий спондилит (АС) является хроническим аутоиммунным заболеванием. Ранними патологическими признаками АС являются острые или хронические воспаления в местах прикрепления костей крестцово-подвздошных суставов, сухожилий и связок, в результате чего на более поздней стадии могут развиться дисцит и фасеточный артрит; и у всех пациентов с АС наблюдается снижение плотности костей. Исследования показали, что как количество клеток Th17, секретирующих IL-17A, в периферической крови, так и концентрация IL-17A у пациентов с АС значительно выше, чем у здоровых людей (Gracey et al., Arthritis Rheumatol. 68:679-89. (2016)). IL-17A может активировать различные клетки, такие как макрофаги, дендритные клетки, эндотелиальные клетки, фибробласты, хондроциты и остеобласты, которые могут продуцировать большое количество воспалительных деструктивных факторов (Ogura et al., Immunity 29:628-36 (2008)). В костных тканях IL-17A индуцирует в остеобластах экспрессию активатора рецептора лиганда ядерного фактора-кВ (RANKL), активирует остеокласты, тем самым индуцируя резорбцию костей, кумулятивно усугубляя потерю костной массы и непосредственно или опосредованно вызывая разрушение костей (Gaffen, Curr Rheumatol Rep 11:365-370 (2009)). У пациентов с АС анти-IL17А моноклональное антитело Секукинумаб продемонстрировало отличную эффективность, которое позволяет существенно облегчить симптомы и признаки анкилозирующего спондилита (Baeten et al., N Engl J Med, 373:2534-48 (2015)). На основании этих результатов Секукинумаб одобрен FDA для лечения анкилозирующего спондилита.Ankylosing spondylitis (AS) is a chronic autoimmune disease. Early pathological signs of AS are acute or chronic inflammation at the attachment sites of the bones of the sacroiliac joints, tendons and ligaments, as a result of which discitis and facet arthritis may develop at a later stage; and all patients with AS experience decreased bone density. Studies have shown that both the number of Th17 cells secreting IL-17A in the peripheral blood and the concentration of IL-17A in patients with AS are significantly higher than in healthy controls (Gracey et al., Arthritis Rheumatol. 68:679-89. (2016)). IL-17A can activate various cells, such as macrophages, dendritic cells, endothelial cells, fibroblasts, chondrocytes and osteoblasts, which can produce a large number of inflammatory destructive factors (Ogura et al., Immunity 29:628-36 (2008)). In bone tissue, IL-17A induces expression of receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL) in osteoblasts, activates osteoclasts, thereby inducing bone resorption, cumulatively exacerbating bone loss, and directly or indirectly causing bone destruction (Gaffen, Curr Rheumatol Rep 11: 365-370 (2009)). In patients with AS, the anti-IL17A monoclonal antibody Secukinumab has demonstrated excellent efficacy in significantly improving the symptoms and signs of ankylosing spondylitis (Baeten et al., N Engl J Med, 373:2534-48 (2015)). Based on these results, secukinumab is approved by the FDA for the treatment of ankylosing spondylitis.
Системная красная волчанка (СКВ) представляет собой аутоиммунное заболевание, поражающее несколько систем. В частности, в организме пациентов появляются антитела против собственных аутоантигенов, которые непосредственно или опосредованно атакуют различные ткани или органы, при этом наиболее часто поражаются участки кожи, суставы и почки. Исследования показали, что IL-17A играет роль в СКВ. Соотношение клеток, продуцирующих IL-17A, в периферической крови пациентов с СКВ повышено, а уровень IL-17A в сыворотке пациентов является аномально высоким (Chen et al., J Clin Immunol, 30:221-5 (2010). Мононуклеарные клетки периферической крови пациентов с СКВ, которая сопровождается повреждением почек, могут продуцировать более высокие уровни общего IgG, антидцДНК IgG и IL-6 при культивировании с IL-17, что указывает на возможное участие IL-17 в активации В-клеток (Dong et al., Chin Med J (англ.), 116:543-8 (2003)). Также недавно было обнаружено, что IL-17A может взаимодействовать с BAFF (фактором активации В-клеток) для защиты В-клеток от апоптоза, тем самым увеличивая количество клеток, продуцирующих аутоантитела (Onishi et al., Immunology 129:31121 (2010)).Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease that affects multiple systems. In particular, antibodies appear in the body of patients against their own autoantigens, which directly or indirectly attack various tissues or organs, with the skin, joints and kidneys most often affected. Studies have shown that IL-17A plays a role in SLE. The proportion of IL-17A-producing cells in the peripheral blood of SLE patients is increased, and the level of IL-17A in the serum of patients is abnormally high (Chen et al., J Clin Immunol, 30:221-5 (2010). Peripheral blood mononuclear cells patients with SLE associated with kidney damage may produce higher levels of total IgG, anti-dsDNA IgG, and IL-6 when cultured with IL-17, indicating the possible involvement of IL-17 in B cell activation (Dong et al., Chin Med J 116:543-8 (2003) It has also recently been discovered that IL-17A can interact with BAFF (B cell activating factor) to protect B cells from apoptosis, thereby increasing cell number , producing autoantibodies (Onishi et al., Immunology 129:31121 (2010)).
Сущность изобретенияThe essence of the invention
В результате интенсивных исследований с приложением творческих усилий авторам изобретения удалось применить системы экспрессии клеток млекопитающих для экспрессии рекомбинантного IL-17A (24-155) в качестве антигена для иммунизации мышей, в результате чего было получено большое количество образцов клеток гибридом в результате слияния мышиных клеток селезенки и миеломы. В результате скрининга большого количества образцов были выделены следующие две гибридомные клеточные линии:Through intensive research and creativity, the inventors were able to use mammalian cell expression systems to express recombinant IL-17A (24-155) as an antigen for immunization of mice, resulting in a large number of hybridoma cell samples obtained from the fusion of mouse spleen cells and myelomas. As a result of screening a large number of samples, the following two hybridoma cell lines were isolated:
гибридомная клеточная линия LT006 (IL-17A-13E9), депонированная в Китайском центре коллекций типовых культур (China Center for Type Culture Collection, CCTCC) 12 сентября 2017 г. с номером доступа CCTCC: C2017102; и гибридомная клеточная линия LT007 (IL-17A-2G2), депонированная в Китайском центре коллекций типовых культур (ССТСС) 12 сентября 2017 г. с номером доступа CCTCC: C2017165.hybridoma cell line LT006 (IL-17A-13E9), deposited in the China Center for Type Culture Collection (CCTCC) on September 12, 2017 with CCTCC accession number: C2017102; and hybridoma cell line LT007 (IL-17A-2G2) deposited in China Type Culture Collection Center (CCTCC) on September 12, 2017 with CCTCC accession number: C2017165.
Неожиданно было обнаружено, что:Unexpectedly, it was discovered that:
гибридомная клеточная линия LT006 может секретировать и продуцировать специфическое моноклональное антитело (названное 13Е9), которое специфически связывается с IL-17A, и это моноклональное антитело может очень эффективно блокировать связывание IL-17A с IL-17RA;the hybridoma cell line LT006 can secrete and produce a specific monoclonal antibody (named 13E9) that specifically binds to IL-17A, and this monoclonal antibody can very effectively block the binding of IL-17A to IL-17RA;
гибридомная клеточная линия LT007 может секретировать и продуцировать специфическое моноклональное антитело (названное 2G2), которое специфически связывается с IL-17A, и это моноклональное антитело может очень эффективно блокировать связывание IL-17A с IL-17RA;the hybridoma cell line LT007 can secrete and produce a specific monoclonal antibody (named 2G2) that specifically binds to IL-17A, and this monoclonal antibody can very effectively block the binding of IL-17A to IL-17RA;
кроме того, были получены гуманизированные анти-ГЕ-17А антитела (названные 13Е9 H1L1, 13Е9 H2L2, 13Е9 H3L2; и 2G2 H1L1, 2G2 H2L2, 2G2 H3L3, соответственно), которые способны эффективно связываться с человеческим IL-17A, блокировать связывание IL-17A с рецепторами IL-17A и ингибировать активацию расположенных ниже сигнальных путей рецептора IL-17A;In addition, humanized anti-HE-17A antibodies were obtained (named 13E9 H1L1, 13E9 H2L2, 13E9 H3L2; and 2G2 H1L1, 2G2 H2L2, 2G2 H3L3, respectively), which can effectively bind to human IL-17A and block the binding of IL-17A. 17A with IL-17A receptors and inhibit the activation of downstream IL-17A receptor signaling pathways;
- 2 046350 антитело по настоящему изобретению можно использовать для изготовления лекарственного средства для профилактики и/или лечения аутоиммунных заболеваний, таких как псориаз, ревматоидный артрит, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит и системная красная волчанка.- 2046350 The antibody of the present invention can be used for the manufacture of a medicament for the prevention and/or treatment of autoimmune diseases such as psoriasis, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, ankylosing spondylitis and systemic lupus erythematosus.
Таким образом, настоящее изобретение относится к следующему:Thus, the present invention relates to the following:
в одном из аспектов настоящего изобретения представлено моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, в котором вариабельная область тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела содержит: HCDR1-HCDR3 с аминокислотными последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 31-33, соответственно, или HCDR1-HCDR3 с аминокислотными последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 37-39, соответственно; и вариабельная область легкой цепи (VL) моноклонального антитела содержит: LCDR1-LCDR3 с аминокислотными последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 34-36, соответственно, или LCDR1-LCDR3 с аминокислотными последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 40-42, соответственно.in one aspect of the present invention there is provided a monoclonal antibody or an antigen binding fragment thereof, wherein the heavy chain variable region (VH) of the monoclonal antibody comprises: HCDR1-HCDR3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 31-33, respectively, or HCDR1-HCDR3 with the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 37-39, respectively; and the light chain variable region (VL) of the monoclonal antibody comprises: LCDR1-LCDR3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 34-36, respectively, or LCDR1-LCDR3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 40-42, respectively .
Вариабельные области легкой и тяжелой цепей отвечают за связывание антигена; вариабельная область каждой цепи содержит три гипервариабельные области, а именно определяющие комплементарность области (CDR) (CDR тяжелой (Н) цепи включают HCDR1, HCDR2, HCDR3, и CDR легкой (L) цепи включают LCDR1, LCDR2, LCDR3; определенные по Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition (1991), Volumes 1-3, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md).The variable regions of the light and heavy chains are responsible for antigen binding; the variable region of each chain contains three hypervariable regions, namely complementarity determining regions (CDRs) (heavy (H) chain CDRs include HCDR1, HCDR2, HCDR3, and light (L) chain CDRs include LCDR1, LCDR2, LCDR3; defined by Kabat et al ., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition (1991), Volumes 1-3, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md.).
Анализ аминокислотных последовательностей областей CDR моноклонального антитела, указанных выше в пп.(1), (2), выполняют техническими средствами, хорошо известными специалистам в данной области, например, с помощью базы данных VBASE2:Analysis of the amino acid sequences of the CDR regions of the monoclonal antibody specified in paragraphs (1), (2) above is performed by technical means well known to specialists in this field, for example, using the VBASE2 database:
антитела 13Е9, 13Е9 H1L1, 13Е9 H2L2 и 13Е9 H3L2 по настоящему изобретению имеют одинаковые CDR:antibodies 13E9, 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 and 13E9 H3L2 of the present invention have the same CDR:
аминокислотные последовательности трех участков CDR вариабельной области тяжелой цепи являются следующими:The amino acid sequences of the three CDR regions of the heavy chain variable region are as follows:
HCDR1: SYSFTSDYA (SEQ ГО NO: 31),HCDR1: SYSFTSDYA (SEQ GO NO: 31),
HCDR2: ITYSGVT (SEQ ID NO: 32),HCDR2: ITYSGVT (SEQ ID NO: 32),
HCDR3: ARADYDSYYTMDY (SEQ ID NO: 33); и аминокислотные последовательности трех участков CDR вариабельной области легкой цепи являются следующими:HCDR3: ARADYDSYYTMDY (SEQ ID NO: 33); and the amino acid sequences of the three CDR regions of the light chain variable region are as follows:
LCDR1: QSLVHSNGNTY (SEQ ID NO: 34),LCDR1: QSLVHSNGNTY (SEQ ID NO: 34),
LCDR2: KVS (SEQ ID NO: 35),LCDR2: KVS (SEQ ID NO: 35),
LCDR3: SQSTHFWT (SEQ ID NO: 36).LCDR3: SQSTHFWT (SEQ ID NO: 36).
Антитела 2G2, 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 и 2G2 H3L3 по настоящему изобретению имеют одинаковые CDR:Antibodies 2G2, 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 and 2G2 H3L3 of the present invention have the same CDR:
аминокислотные последовательности трех участков CDR вариабельной области тяжелой цепи являются следующими:The amino acid sequences of the three CDR regions of the heavy chain variable region are as follows:
HCDR1: SEVFPIAD (SEQ ID NO: 37),HCDR1: SEVFPIAD (SEQ ID NO: 37),
HCDR2: ILPSFGRT (SEQ ID NO: 38),HCDR2: ILPSFGRT (SEQ ID NO: 38),
HCDR3: ARGNYGFAY (SEQ ID NO: 39); и аминокислотные последовательности трех участков CDR вариабельной области легкой цепи являются следующими:HCDR3: ARGNYGFAY (SEQ ID NO: 39); and the amino acid sequences of the three CDR regions of the light chain variable region are as follows:
LCDR1: QSLLNSDGKTY (SEQ ID NO: 40),LCDR1: QSLLNSDGKTY (SEQ ID NO: 40),
LCDR2: LVS (SEQ ID NO: 41),LCDR2: LVS (SEQ ID NO: 41),
LCDR3: WQGSHFPQT (SEQ ID NO: 42).LCDR3: WQGSHFPQT (SEQ ID NO: 42).
В одном или более вариантах осуществления настоящего изобретения представлено моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, в котором вариабельная область тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела содержит HCDR1-HCDR3 с аминокислотными последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 31-33, соответственно, и вариабельная область легкой цепи (VL) моноклонального антитела содержит LCDR1-LCDR3 с аминокислотными последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 34-36, соответственно.In one or more embodiments, the present invention provides a monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof, wherein the heavy chain variable region (VH) of the monoclonal antibody comprises HCDR1-HCDR3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 31-33, respectively, and the variable region The light chain (VL) of the monoclonal antibody contains LCDR1-LCDR3 with the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 34-36, respectively.
В одном или более вариантах осуществления настоящего изобретения представлено моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, в котором вариабельная область тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела содержит HCDR1-HCDR3 с аминокислотными последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 37-39, соответственно, и вариабельная область легкой цепи (VL) моноклонального антитела содержит LCDR1-LCDR3 с аминокислотными последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 40-42, соответственно.In one or more embodiments, the present invention provides a monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof, wherein the heavy chain variable region (VH) of the monoclonal antibody comprises HCDR1-HCDR3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 37-39, respectively, and the variable region The light chain (VL) of the monoclonal antibody contains LCDR1-LCDR3 with the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 40-42, respectively.
- 3 046350- 3 046350
В одном или более вариантах осуществления настоящего изобретения представлено моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, в котором аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи выбрано из: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 28; и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи выбрано из: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 30.In one or more embodiments, the present invention provides a monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof, wherein the amino acid sequence of the heavy chain variable region is selected from: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14 , SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 28; and the amino acid sequence of the light chain variable region is selected from: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: thirty.
В одном или более вариантах осуществления настоящего изобретения представлено моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, в котором аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи выбрано из: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 14, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи выбрано из: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 12; или аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи выбрано из: SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 28, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи выбрано из: SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 30.In one or more embodiments, the present invention provides a monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof, wherein the amino acid sequence of the heavy chain variable region is selected from: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 14 , and the amino acid sequence of the light chain variable region is selected from: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 12; or a heavy chain variable region amino acid sequence selected from: SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 28, and a light chain variable region amino acid sequence selected from: SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 30.
В одном или более вариантах осуществления настоящего изобретения представлено моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, в котором вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи выбрано из любого из следующих пп.(1)-(8):In one or more embodiments, the present invention provides a monoclonal antibody or an antigen binding fragment thereof, wherein the heavy chain variable region and the light chain variable region are selected from any of the following (1) to (8):
(1) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2, и вариабельной области легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 4;(1) a heavy chain variable region containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and a light chain variable region containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4;
(2) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 6, и вариабельной области легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 8;(2) a heavy chain variable region containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and a light chain variable region containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8;
(3) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 10, и вариабельной области легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 12;(3) a heavy chain variable region containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, and a light chain variable region containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12;
(4) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 14, и вариабельной области легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 12;(4) a heavy chain variable region containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 and a light chain variable region containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12;
(5) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 16, и вариабельной области легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 18;(5) a heavy chain variable region containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 and a light chain variable region containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18;
(6) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 20, и вариабельной области цепи, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 22;(6) a heavy chain variable region containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20, and a heavy chain variable region containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22;
(7) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 24, и вариабельной области легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 26; и (8) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 28, и вариабельной области легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 30.(7) a heavy chain variable region containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24 and a light chain variable region containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26; and (8) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 28 and a light chain variable region containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 30.
В одном или более вариантах осуществления настоящего изобретения представлено моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент выбрано из Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, фрагмента определяющей комплементарность области, одноцепочечного антитела, гуманизированного антитела, химерного антитела и диатела.In one or more embodiments, the present invention provides a monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof, wherein the monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof is selected from Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, complementarity determining region fragment, single chain antibody , humanized antibody, chimeric antibody and diabody.
В одном или более вариантах осуществления настоящего изобретения представлено моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где моноклональное антитело связывается с белком IL-17A с ЕС50 менее примерно 100 нМ, например менее примерно 10 нМ, 5 нМ, 4 нМ, 3 нМ, 2,5 нМ, 2 нМ или менее; предпочтительно ЕС50 измеряют конкурентным ELISA.In one or more embodiments, the present invention provides a monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof, wherein the monoclonal antibody binds to the IL-17A protein with an EC50 of less than about 100 nM, such as less than about 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2.5 nM, 2 nM or less; preferably the EC50 is measured by a competitive ELISA.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представлено моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где моноклональное антитело связывается с белком IL-17A с KD менее примерно 10-5 М, например менее примерно 10-6 М, 10-7 М, 10-8 М, 10-9 М, 10-10 М или менее; предпочтительно KD измеряют с помощью прибора для анализа молекулярных взаимодействий Fortebio.In some embodiments, the present invention provides a monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof, wherein the monoclonal antibody binds to the IL-17A protein with a K D of less than about 10 -5 M, such as less than about 10 -6 M, 10 -7 M, 10 -8 M , 10 -9 M, 10 -10 M or less; preferably K D is measured using a Fortebio Molecular Interaction Analysis Instrument.
- 4 046350- 4 046350
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представлено моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где моноклональное антитело связывается с белком IL17A с ЕС50 менее примерно 100 нМ, например менее примерно 10 нМ, 1 нМ, 0,9 нМ, 0,8 нМ, 0,7 нМ, 0,6 нМ, 0,5 нМ, 0,4 нМ, 0,3 нМ, 0,2 нМ, 0,1 нМ или менее; в частности, ЕС50 измеряют методом непрямого ELISA.In some embodiments, the present invention provides a monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof, wherein the monoclonal antibody binds to the IL17A protein with an EC50 of less than about 100 nM, such as less than about 10 nM, 1 nM, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, 0.1 nM or less; in particular, EC 50 is measured by indirect ELISA.
В одном или более вариантах осуществления настоящего изобретения моноклональное антитело содержит области, не являющиеся CDR, где области, не являющиеся CDR, относятся к видам, отличным от мышей, например, к человеческому антителу.In one or more embodiments of the present invention, the monoclonal antibody comprises non-CDR regions, wherein the non-CDR regions are from a non-mouse species, such as a human antibody.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения константная область иммуноглобулина является гуманизированной, например, в константных областях тяжелой цепи используют Собласть цепи гамма-1 Ig, номер доступа: Р01857; и в константных областях легкой цепи используют Собласть каппа-цепи Ig, номер доступа: Р01834.In some embodiments of the present invention, the immunoglobulin constant region is humanized, for example, the heavy chain constant regions use Ig gamma-1 chain region, accession number: P01857; and in the light chain constant regions, the Ig kappa chain region is used, accession number: P01834.
В одном или более вариантах осуществления настоящего изобретения представлено моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где моноклональное антитело продуцируется гибридомной клеточной линией LT006, депонированной в Китайском центре коллекции типовых культур (ССТСС) с номером доступа ССТСС: С2017102; или моноклональное антитело продуцируется гибридомной клеточной линией LT007, депонированной в Китайском центре коллекции типовых культур (ССТСС) с номером доступа ССТСС: С2017165.In one or more embodiments, the present invention provides a monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof, wherein the monoclonal antibody is produced by the hybridoma cell line LT006 deposited in the China Type Culture Collection Center (CCCC) with CCCC accession number: C2017102; or the monoclonal antibody is produced by the hybridoma cell line LT007 deposited in the China Type Culture Collection Center (CCTCC) with CCCC accession number: C2017165.
В одном или более вариантах осуществления настоящего изобретения моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент используют для профилактики и/или лечения опухолей или аутоиммунных заболеваний или для диагностики аутоиммунных заболеваний; предпочтительно аутоиммунное заболевание выбрано из псориаза, ревматоидного артрита, псориатического артрита, анкилозирующего спондилита и системной красной волчанки; предпочтительно псориаз представляет собой бляшечный псориаз от умеренной до тяжелой степени.In one or more embodiments of the present invention, a monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof is used for the prevention and/or treatment of tumors or autoimmune diseases or for the diagnosis of autoimmune diseases; preferably the autoimmune disease is selected from psoriasis, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, ankylosing spondylitis and systemic lupus erythematosus; preferably the psoriasis is moderate to severe plaque psoriasis.
В одном или более вариантах осуществления настоящего изобретения моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент используют для блокирования связывания IL-17A с IL-17RA, регуляции (например, снижения) активности или уровня IL-17A, или подавления экспрессии IL-6 в клетках.In one or more embodiments of the present invention, a monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof is used to block the binding of IL-17A to IL-17RA, regulate (eg, reduce) the activity or level of IL-17A, or suppress the expression of IL-6 in cells.
Другой аспект настоящего изобретения относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидные последовательности, кодирующие вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи любого из моноклональных антител, представленных в настоящем изобретении.Another aspect of the present invention relates to an isolated nucleic acid molecule containing nucleotide sequences encoding a heavy chain variable region and a light chain variable region of any of the monoclonal antibodies provided in the present invention.
В одном или более вариантах осуществления настоящего изобретения выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидные последовательности, выбранные из любого из следующих пп.(1)-(8):In one or more embodiments of the present invention, the isolated nucleic acid molecule contains nucleotide sequences selected from any of the following paragraphs (1) to (8):
(l)SEQIDNO: 1, SEQIDNO:3;(l)SEQIDNO: 1, SEQIDNO:3;
(2) SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7;(2) SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7;
(3) SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11;(3) SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11;
(4) SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 11;(4) SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 11;
(5) SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17;(5) SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17;
(6) SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21;(6) SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21;
(7) SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25; и (8) SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29.(7) SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25; and (8) SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29.
Другой аспект настоящего изобретения относится к рекомбинантному вектору, содержащему выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. Предпочтительно рекомбинантный вектор представляет собой рекомбинантный вектор экспрессии, такой как прокариотический рекомбинантный вектор экспрессии или эукариотической рекомбинантный вектор экспрессии.Another aspect of the present invention relates to a recombinant vector containing an isolated nucleic acid molecule of the present invention. Preferably, the recombinant vector is a recombinant expression vector, such as a prokaryotic recombinant expression vector or a eukaryotic recombinant expression vector.
Другой аспект настоящего изобретения относится к клетке-хозяину, содержащей рекомбинантный вектор по настоящему изобретению.Another aspect of the present invention relates to a host cell containing a recombinant vector of the present invention.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения любого из моноклональных антител или их антигенсвязывающих фрагментов, представленных в настоящем изобретении, включающему этапы культивирования клетки-хозяина в соответствии с настоящим изобретением в соответствующих условиях и выделения моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из клеточных культур.Another aspect of the present invention relates to a method for producing any of the monoclonal antibodies or antigen binding fragments thereof provided in the present invention, comprising the steps of culturing a host cell in accordance with the present invention under appropriate conditions and isolating the monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof from the cell cultures.
Другой аспект настоящего изобретения относится к гибридомной клеточной линии, выбранной из гибридомной клеточной линии LT006, депонированной в Китайском центре коллекции типовых культур (ССТСС) с номером доступа ССТСС: С2017102; иAnother aspect of the present invention relates to a hybridoma cell line selected from the hybridoma cell line LT006 deposited in the China Type Culture Collection Center (CCCC) with CCCC accession number: C2017102; And
- 5 046350 гибридомной клеточной линии LT007, депонированной в Китайском центре коллекции типовых культур (ССТСС) с номером доступа ССТСС: С2017165.- 5 046350 hybridoma cell line LT007, deposited in the China Type Culture Collection Center (CCTCC) with CCTCC accession number: C2017165.
Другой аспект настоящего изобретения относится к конъюгату, содержащему моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и конъюгированную часть, где моноклональное антитело представляет собой любое из моноклональных антител или их антигенсвязывающих фрагментов, представленных в настоящем изобретении, и конъюгированная часть представляет собой детектируемую метку; предпочтительно детектируемая метка представляет собой радиоактивный изотоп, люминесцентное вещество, такое как флуоресцентное вещество, окрашенное вещество или фермент.Another aspect of the present invention relates to a conjugate comprising a monoclonal antibody or an antigen binding fragment thereof and a conjugated portion, wherein the monoclonal antibody is any of the monoclonal antibodies or antigen binding fragments thereof provided herein and the conjugated portion is a detectable label; preferably the detectable label is a radioactive isotope, a luminescent substance such as a fluorescent substance, a colored substance or an enzyme.
Другой аспект настоящего изобретения относится к набору, содержащему любое из моноклональных антител или их антигенсвязывающих фрагментов, представленных в настоящем изобретении, или содержащему конъюгат по настоящему изобретению;Another aspect of the present invention relates to a kit containing any of the monoclonal antibodies or antigen binding fragments thereof provided in the present invention, or containing a conjugate of the present invention;
предпочтительно, набор дополнительно содержит второе антитело, которое специфически распознает моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент; второе антитело необязательно дополнительно содержит детектируемую метку; предпочтительно детектируемая метка представляет собой радиоактивный изотоп, люминесцентное вещество, такое как флуоресцентное вещество, окрашенное вещество или фермент.preferably, the kit further contains a second antibody that specifically recognizes the monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof; the second antibody optionally further contains a detectable label; preferably the detectable label is a radioactive isotope, a luminescent substance such as a fluorescent substance, a colored substance or an enzyme.
Другой аспект настоящего изобретения относится к применению любого из моноклональных антител или их антигенсвязывающих фрагментов, представленных в настоящем изобретении, или конъюгата по настоящему изобретению при приготовлении набора для качественного или количественного определения IL-17A. Качественное обнаружение относится к обнаружению в тестируемом образце наличия IL17A, а количественное обнаружение относится к определению в тестируемом образце концентрации или содержания IL-17A.Another aspect of the present invention relates to the use of any of the monoclonal antibodies or antigen binding fragments thereof provided in the present invention, or a conjugate of the present invention, in the preparation of a kit for the qualitative or quantitative determination of IL-17A. Qualitative detection refers to the detection of the presence of IL17A in a test sample, and quantitative detection refers to the determination of the concentration or content of IL-17A in a test sample.
Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей любое из моноклональных антител или их антигенсвязывающих фрагментов, представленных в настоящем изобретении, или конъюгату по настоящему изобретению; фармацевтическая композиция необязательно дополнительно содержит фармацевтически приемлемые носители или наполнители.Another aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition containing any of the monoclonal antibodies or antigen binding fragments thereof provided in the present invention, or a conjugate of the present invention; the pharmaceutical composition optionally further contains pharmaceutically acceptable carriers or excipients.
Другой аспект настоящего изобретения относится к применению любого из моноклональных антител или их антигенсвязывающих фрагментов, представленных в настоящем изобретении, или конъюгата по настоящему изобретению в приготовлении лекарственного средства для профилактики и/или лечения опухолей или аутоиммунных заболеваний или к применению при приготовлении лекарственного средства для диагностики аутоиммунных заболеваний; предпочтительно аутоиммунное заболевание выбрано из псориаза, ревматоидного артрита, псориатического артрита, анкилозирующего спондилита и системной красной волчанки; предпочтительно псориаз представляет собой бляшечный псориаз от умеренной до тяжелой степени.Another aspect of the present invention relates to the use of any of the monoclonal antibodies or antigen binding fragments thereof provided in the present invention or a conjugate of the present invention in the preparation of a medicament for the prevention and/or treatment of tumors or autoimmune diseases or for use in the preparation of a medicament for the diagnosis of autoimmune diseases. diseases; preferably the autoimmune disease is selected from psoriasis, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, ankylosing spondylitis and systemic lupus erythematosus; preferably the psoriasis is moderate to severe plaque psoriasis.
В частности, авторы изобретения обнаружили в экспериментах на животных (пример 11), что 13E9H3L2 может эффективно подавлять увеличение толщины эпидермиса в модели мышей C57BL/6 с псориазом, где было показано, что лекарственное средство на основе антитела 13E9H3L2 может в значительной степени ингибировать у мыши вызванное IL-17A увеличение толщины эпидермиса путем подкожной инъекции с эффективностью, эквивалентной эффективности коммерчески доступного лекарственного средства на основе моноклонального антитела Секукинумаб, используемого с той же целью.In particular, the inventors found in animal experiments (Example 11) that 13E9H3L2 could effectively inhibit the increase in epidermal thickness in the C57BL/6 mouse model of psoriasis, where it was shown that the 13E9H3L2 antibody drug could significantly inhibit in mice IL-17A-induced increase in epidermal thickness by subcutaneous injection with efficacy equivalent to that of the commercially available monoclonal antibody drug Secukinumab used for the same purpose.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения аутоиммунные заболевания (например, псориаз, такой как бляшечный псориаз от умеренной до тяжелой степени, ревматоидный артрит, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит или системная красная волчанка) вызваны повышенным уровнем экспрессии IL-17A. Раскрытый в настоящем описании повышенный уровень экспрессии относится к уровню экспрессии, более высокому, чем у здоровых людей, который достиг патогенного уровня.In some embodiments of the present invention, autoimmune diseases (eg, psoriasis, such as moderate to severe plaque psoriasis, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, ankylosing spondylitis, or systemic lupus erythematosus) are caused by increased expression of IL-17A. An elevated expression level as disclosed herein refers to an expression level higher than that found in healthy individuals that has reached a pathogenic level.
Другой аспект настоящего изобретения относится к применению любого из моноклональных антител или их антигенсвязывающих фрагментов, представленных в настоящем изобретении, или к конъюгату по настоящему изобретению при приготовлении следующих лекарственных средств:Another aspect of the present invention relates to the use of any of the monoclonal antibodies or antigen binding fragments thereof provided in the present invention, or a conjugate of the present invention in the preparation of the following drugs:
лекарственных средств, блокирующих связывание IL-17A с IL-17RA, лекарственных средств, регулирующих (например, снижающих) активность или уровень IL-17A, или лекарственных средств, подавляющих экспрессию IL-6 в клетках.drugs that block the binding of IL-17A to IL-17RA, drugs that regulate (eg, reduce) the activity or level of IL-17A, or drugs that inhibit the expression of IL-6 in cells.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу in vivo или in vitro, включающему этап введения в клетку или больному эффективного количества любого из моноклональных антител или их антигенсвязывающих фрагментов, подставленных в настоящем изобретении, или конъюгата по настоящему изобретению, где способ выбрано из следующего:Another aspect of the present invention relates to a method in vivo or in vitro, comprising the step of introducing into a cell or patient an effective amount of any of the monoclonal antibodies or antigen binding fragments thereof provided in the present invention, or a conjugate of the present invention, where the method is selected from the following:
способа блокирования связывания IL-17A с IL-17RA, способа регуляции (например, снижения) активности или уровня IL-17A, или способа подавления экспрессии IL-6 в фибробластах.a method of blocking the binding of IL-17A to IL-17RA, a method of regulating (eg, reducing) the activity or level of IL-17A, or a method of inhibiting the expression of IL-6 in fibroblasts.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения способ in vitro не является терапевтическим и/или диагностическим.In a particular embodiment of the present invention, the in vitro method is not therapeutic and/or diagnostic.
- 6 046350- 6 046350
Интерлейкин 6 (сокращенно IL-6 или IL6) может продуцироваться фибробластами, моноцитами/макрофагами, Т-лимфоцитами, В-лимфоцитами, эпителиальными клетками, кератиноцитами и различными опухолевыми клетками. Интерлейкин 6 является важным фактором, регулирующим иммунный ответ, и IL-6 и IL-1 могут синергетически способствовать пролиферации Т-клеток, стимулировать дифференцировку В-клеток и участвовать в воспалительных реакциях организма (Schoenborn et al. Advances in Immunology 96:41-101 (2007)). Эксперимент in vitro (пример 10) по настоящему изобретению показывает, что анти-П.-17А антитело может существенно снижать секрецию IL-6 и ингибировать опосредованный IL-6 иммунный ответ.Interleukin 6 (abbreviated IL-6 or IL6) can be produced by fibroblasts, monocytes/macrophages, T lymphocytes, B lymphocytes, epithelial cells, keratinocytes and various tumor cells. Interleukin 6 is an important factor regulating the immune response, and IL-6 and IL-1 can synergistically promote T cell proliferation, stimulate B cell differentiation, and participate in host inflammatory responses (Schoenborn et al. Advances in Immunology 96:41-101 (2007)). The in vitro experiment (Example 10) of the present invention shows that the anti-P.-17A antibody can significantly reduce the secretion of IL-6 and inhibit the IL-6-mediated immune response.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу лечения и/или профилактики опухолей или аутоиммунных заболеваний, где способ включает этап введения больному эффективного количества любого из моноклональных антител или их антигенсвязывающих фрагментов, представленных в настоящем изобретении, или конъюгата по настоящему изобретению; предпочтительно аутоиммунное заболевание выбрано из псориаза, ревматоидного артрита, псориатического артрита, анкилозирующего спондилита и системной красной волчанки; предпочтительно псориаз представляет собой бляшечный псориаз от умеренной до тяжелой степени.Another aspect of the present invention relates to a method of treating and/or preventing tumors or autoimmune diseases, where the method includes the step of administering to a patient an effective amount of any of the monoclonal antibodies or antigen binding fragments thereof provided in the present invention, or a conjugate of the present invention; preferably the autoimmune disease is selected from psoriasis, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, ankylosing spondylitis and systemic lupus erythematosus; preferably the psoriasis is moderate to severe plaque psoriasis.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу диагностики аутоиммунных заболеваний, где способ включает этап нанесения предназначенного для тестирования образца (такого как образец ткани, образец клеток или образец крови) или введения больному эффективного количества любого из моноклональных антител или их антигенсвязывающих фрагментов, представленных в настоящем изобретении, или конъюгата по настоящему изобретению; предпочтительно аутоиммунное заболевание выбрано из псориаза, ревматоидного артрита, псориатического артрита, анкилозирующего спондилита и системной красной волчанки; предпочтительно псориаз представляет собой бляшечный псориаз от умеренной до тяжелой степени.Another aspect of the present invention relates to a method for diagnosing autoimmune diseases, where the method includes the step of applying a sample to be tested (such as a tissue sample, a cell sample, or a blood sample) or administering to a patient an effective amount of any of the monoclonal antibodies or antigen binding fragments thereof provided in the present invention , or a conjugate of the present invention; preferably the autoimmune disease is selected from psoriasis, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, ankylosing spondylitis and systemic lupus erythematosus; preferably the psoriasis is moderate to severe plaque psoriasis.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, учитывая, что аутоиммунные заболевания (например, псориаз, такой как бляшечный псориаз от умеренной до тяжелой степени, ревматоидный артрит, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит или системная красная волчанка) вызваны повышенным уровнем экспрессии I.-17A, диагностика может быть выполнена путем определения уровня экспрессии I.-17A с использованием любого из моноклональных антител или их антигенсвязывающих фрагментов, представленных в настоящем изобретении, или конъюгата по настоящему изобретению. Если уровень экспрессии IL-17A выше, чем у здоровых людей, и достиг патогенного уровня, диагноз считается положительным; в противном случае диагноз является отрицательным.In some embodiments of the present invention, given that autoimmune diseases (eg, psoriasis, such as moderate to severe plaque psoriasis, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, ankylosing spondylitis, or systemic lupus erythematosus) are caused by increased expression of I.-17A, diagnosis can be performed by determining the expression level of I.-17A using any of the monoclonal antibodies or antigen binding fragments thereof provided in the present invention, or a conjugate of the present invention. If the expression level of IL-17A is higher than in healthy individuals and has reached pathogenic levels, the diagnosis is considered positive; otherwise the diagnosis is negative.
В настоящем изобретении, если не указано иное, используемые в настоящем описании научные и технические термины имеют значения, в которых их обычно понимают специалисты в данной области. Кроме того, используемые в настоящем описании лабораторные методы культивирования клеток, молекулярной генетики, химии нуклеиновых кислот и иммунологии являются рутинными операциями, широко используемыми в соответствующих областях. Между тем, для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены определения и пояснения соответствующих терминов.In the present invention, unless otherwise indicated, scientific and technical terms used herein have the meanings in which they are commonly understood by those skilled in the art. In addition, the laboratory techniques of cell culture, molecular genetics, nucleic acid chemistry and immunology used herein are routine operations widely used in their respective fields. Meanwhile, for a better understanding of the present invention, definitions and explanations of relevant terms are provided below.
В контексте настоящего описания, при упоминании аминокислотной последовательности белка IL17A (интерлейкина-17А), эта последовательность относится к полноразмерному белку IL-17A; а также слитому белку IL-17A, такому как фрагмент, слитый с Fc-фрагментом IgG мыши или человека (mFc или hFc). Однако специалисты в данной области поймут, что аминокислотная последовательность белка IL17A может содержать мутации или изменения (включая, без ограничения, замены, делеции и/или добавления), полученные естественным образом или введенные искусственно, не влияющие на биологическую функцию этого белка. Следовательно, в настоящем изобретении термин белок IL-17A включает все такие последовательности, включая их естественные или искусственные варианты. Кроме того, при описании фрагмента последовательности белка I.-17A, белок I.-17A также включает соответствующие фрагменты последовательности его естественных или искусственных вариантов.As used herein, when the amino acid sequence of the IL17A (interleukin-17A) protein is mentioned, this sequence refers to the full-length IL-17A protein; as well as an IL-17A fusion protein, such as a fragment fused to the Fc fragment of mouse or human IgG (mFc or hFc). However, those skilled in the art will appreciate that the amino acid sequence of the IL17A protein may contain mutations or changes (including, without limitation, substitutions, deletions and/or additions), naturally occurring or artificially introduced, that do not affect the biological function of the protein. Therefore, in the present invention, the term IL-17A protein includes all such sequences, including natural or artificial variants thereof. In addition, when describing a sequence fragment of the I.-17A protein, the I.-17A protein also includes corresponding sequence fragments of its natural or artificial variants.
Полноразмерная последовательность (155аа) IL-17A является следующей (последовательность сигнального пептида (23аа) подчеркнута):The full length sequence (155aa) of IL-17A is as follows (signal peptide sequence (23aa) is underlined):
MTPGKTSLVSLLLLLSLEAIVKAGITIPRNPGCPNSEDKNFPRTVMVNLNIHNRNTMTPGKTSLVSLLLLLSLEAIVKAGITIPRNPGCPNSEDKNFPRTVMVNLNIHNRNT
NTNPKRSSDYYNRSTSPWNLHRNEDPERYPSVIWEAKCRHLGCINADGNVDYHMNSVP IQQEILVLRREPPHCPNSFRLEKILVSVGCTCVTPIVHHVA (SEQ ID NO: 43)NTNPKRSSDYYNRSTSPWNLHRNEDPERYPSVIWEAKCRHLGCINADGNVDYHMNSVP IQQEILVLRREPPHCPNSFRLEKILVSVGCTCVTPIVHHVA (SEQ ID NO: 43)
В данном контексте, если не указано иное, IL-17R представляет собой IL-17RA; его специфическая белковая последовательность представляет собой последовательность, известную в предшествующем уровне техники, которая описана в существующем документе или которую можно найти в GenBank. Например, IL-17RA (CD217, идентификатор гена NCBI: NP_055154.3).As used herein, unless otherwise stated, IL-17R is IL-17RA; its specific protein sequence is a sequence known in the prior art, which is described in an existing document or which can be found in GenBank. For example, IL-17RA (CD217, NCBI gene ID: NP_055154.3).
В контексте настоящего описания термин ЕС50 относится к концентрации, обеспечивающей 50% максимального эффекта, т.е., к концентрации, которая может вызывать 50% от максимального эффекта.As used herein, the term EC 50 refers to a concentration that produces 50% of the maximum effect, i.e., a concentration that can produce 50% of the maximum effect.
В контексте настоящего изобретения термин антитело относится к молекуле иммуноглобулина, которая обычно состоит из двух пар полипептидных цепей (каждая пара с одной легкой (.) цепью и одной тяжелой (Н) цепью). В общем смысле тяжелую цепь можно интерпретировать как полипептидIn the context of the present invention, the term antibody refers to an immunoglobulin molecule that typically consists of two pairs of polypeptide chains (each pair with one light (.) chain and one heavy (H) chain). In a general sense, the heavy chain can be interpreted as a polypeptide
- 7 046350 ную цепь с большей молекулярной массой в антителе, а легкая цепь относится к полипептидной цепи с меньшей молекулярной массой в антителе. Легкие цепи классифицируются как легкие цепи к и λ. Тяжелые цепи обычно классифицируются как μ, δ, γ, α или ε, a изотипы антител определяются как IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, соответственно. В легких цепях и тяжелых цепях вариабельная область и константная область связаны областью J из примерно 12 или более аминокислот, и тяжелая цепь также включает область D из примерно 3 или более аминокислот. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области тяжелой цепи (CH). Константная область тяжелой цепи состоит из 3 доменов (CH1, CH2 и CH3). Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи (CL). Константная область легкой цепи состоит из одного домена CL. Константная область антитела может опосредовать связывание иммуноглобулинов с тканями или факторами хозяина, включая связывание различных клеток иммунной системы (например, эффекторных клеток) с первым компонентом (C1q) классической системы комплемента. Области VH и VL могут быть дополнительно подразделены на сильно вариабельные области (называемые определяющими комплементарность областями (CDR)), между которыми распределены консервативные области, называемые каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из 3 CDR и 4 FR, расположенных от аминоконца к карбоксильному концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области (VH и VL) каждой пары тяжелая цепь/легкая цепь образуют участок связывания антитела, соответственно. Отнесение аминокислот к каждой области или домену выполняют в соответствии с определением Кабат: Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987 и 1991)) или Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342:878883. В частности, тяжелая цепь также может содержать более 3 CDR, например, 6, 9 или 12. Например, в биспецифическом антителе по настоящему изобретению тяжелая цепь может представлять собой ScFv с С-концом тяжелой цепи антитела IgG, связанного с другим антителом, и в этом случае тяжелая цепь содержит 9 CDR. Термин антитело не ограничено каким-либо конкретным способом получения антитела. Например, антитело включает, в частности, рекомбинантное антитело, моноклональное антитело или поликлональное антитело. Антитела могут относиться к разным изотипам, таким как антитела IgG (например, подтипы IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM.- 7 046350 ly chain with higher molecular weight in the antibody, and light chain refers to the polypeptide chain with lower molecular weight in the antibody. Light chains are classified as k and λ light chains. Heavy chains are usually classified as μ, δ, γ, α or ε, and antibody isotypes are defined as IgM, IgD, IgG, IgA and IgE, respectively. In light chains and heavy chains, the variable region and constant region are linked by a J region of about 12 or more amino acids, and the heavy chain also includes a D region of about 3 or more amino acids. Each heavy chain consists of a heavy chain variable region ( VH ) and a heavy chain constant region (CH). The heavy chain constant region consists of 3 domains ( CH1 , CH2 and CH3). Each light chain consists of a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL). The light chain constant region consists of a single C L domain. The antibody constant region can mediate the binding of immunoglobulins to host tissues or factors, including the binding of various cells of the immune system (eg, effector cells) to the first component (C1q) of the classical complement system. The VH and VL regions can be further subdivided into highly variable regions (called complementarity determining regions (CDRs)), between which are distributed conserved regions called framework regions (FRs). Each VH and VL consists of 3 CDRs and 4 FRs, located from the amino terminus to the carboxyl terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. The variable regions (VH and VL) of each heavy chain/light chain pair form the binding site of the antibody, respectively. The assignment of amino acids to each region or domain is performed in accordance with the definition of Kabat: Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987 and 1991)) or Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342:878883. In particular, the heavy chain may also contain more than 3 CDRs, for example 6, 9 or 12. For example, in the bispecific antibody of the present invention, the heavy chain may be ScFv with the C-terminus of the heavy chain of an IgG antibody linked to another antibody, and in In this case, the heavy chain contains 9 CDRs. The term antibody is not limited to any particular method of producing an antibody. For example, an antibody includes, but is not limited to, a recombinant antibody, a monoclonal antibody, or a polyclonal antibody. Antibodies can be of different isotypes, such as IgG antibodies (eg, IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 subtypes), IgA1, IgA2, IgD, IgE, or IgM.
В контексте настоящего описания термин антигенсвязывающий фрагмент относится к полипептиду, содержащему фрагмент полноразмерного антитела, который сохраняет способность специфически связываться с тем же антигеном, с которым связывается полноразмерное антитело, и/или конкурирует с полноразмерным антителом за специфическое связывание с антигеном, и этот фрагмент также называется антигенсвязывающей частью. См. в общем, Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd edition, Raven Press, N.Y. (1989), которая полностью включена в настоящее описание посредством ссылки для всех целей. Антигенсвязывающий фрагмент антитела может быть получен с помощью технологии рекомбинантной ДНК или ферментативного или химического расщепления интактных антител. В некоторых случаях антигенсвязывающий фрагмент включает Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, фрагмент определяющей комплементарность области (CDR) и одноцепочечный фрагмент антитела (например, scFv), химерное антитело, диатело и полипептид, который содержит по меньшей мере часть антитела, достаточную для придания полипептиду способности специфически связываться с антигеном.As used herein, the term antigen-binding fragment refers to a polypeptide containing a fragment of a full-length antibody that retains the ability to specifically bind to the same antigen to which the full-length antibody binds and/or competes with the full-length antibody for specific binding to the antigen, and this fragment is also called antigen-binding part. See generally, Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd edition, Raven Press, NY (1989), which is incorporated herein by reference in its entirety for all purposes. The antigen binding fragment of an antibody can be produced by recombinant DNA technology or by enzymatic or chemical digestion of intact In some cases, the antigen binding fragment includes Fab, Fab', F(ab') 2 , Fd, Fv, dAb, complementarity determining region (CDR) fragment and single chain antibody fragment (eg, scFv), chimeric antibody, diabody and polypeptide, which contains at least a portion of an antibody sufficient to confer on the polypeptide the ability to specifically bind an antigen.
В контексте настоящего описания термин Fd фрагмент относится к фрагменту антитела, состоящему из доменов VH и CH1; термин Fv фрагмент относится к фрагменту антитела, состоящему из доменов VL и VH одного плеча антитела; термин фрагмент dAb относится к фрагменту антитела, состоящему из домена VH (Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)); термин Fab-фрагмент относится к фрагменту антитела, состоящему из доменов VL, VH, CL и CH1; и термин фрагмент F(ab')2 относится к фрагменту антитела, содержащему из двух Fab-фрагментов, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области.As used herein, the term Fd fragment refers to an antibody fragment consisting of the VH and CH1 domains; the term Fv fragment refers to an antibody fragment consisting of the VL and VH domains of one arm of the antibody; the term dAb fragment refers to an antibody fragment consisting of a V H domain (Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)); the term Fab fragment refers to an antibody fragment consisting of V L , V H , C L and CH1 domains; and the term F(ab') 2 fragment refers to an antibody fragment comprising two Fab fragments linked by a disulfide bridge at the hinge region.
В некоторых случаях антигенсвязывающий фрагмент антитела представляет собой одноцепочечное антитело (например, scFv), в котором домены VL и Vh спарены через линкер, который позволяет продуцировать единую полипептидную цепь, с образованием одновалентной молекулы (см., например, Bird et al., Science 242:423-426 (1988) и Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)). Такие молекулы scFv могут иметь общую структуру: NH2-VL-линкер-VH-СООН или NH2-VH-линкер-VL-СООН. Подходящий линкер предшествующего уровня техники состоит из повторяющейся аминокислотной последовательности GGGGS или ее варианта. Например, можно использовать линкер, имеющий аминокислотную последовательность (GGGGS)4, но также можно использовать его варианты (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448). Другие линкеры, которые можно использовать в настоящем изобретении, описаны Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 и Roovers et al. (2001), Cancer Immunol.In some cases, the antigen binding fragment of an antibody is a single chain antibody (eg, scFv) in which the VL and Vh domains are paired through a linker that allows the production of a single polypeptide chain to form a monovalent molecule (see, for example, Bird et al., Science 242 :423-426 (1988) and Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)). Such scFv molecules may have the general structure: NH 2 -V L -linker-V H -COOH or NH 2 -V H -linker-V L -COOH. A suitable prior art linker consists of the repeating amino acid sequence GGGGS or a variant thereof. For example, a linker having the amino acid sequence (GGGGS)4 can be used, but variants thereof can also be used (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448). Other linkers that can be used in the present invention are described by Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 and Roovers et al. (2001), Cancer Immunol.
В некоторых случаях антигенсвязывающий фрагмент антитела представляет собой диатело, т.е., двухвалентное антитело, в котором домены VH и VL экспрессируются в одной полипептидной цепи. Однако используемый линкер слишком короткий, чтобы позволить спаривание двух доменов в одной цепи,In some cases, the antigen binding fragment of an antibody is a diabody, that is, a divalent antibody in which the VH and VL domains are expressed on the same polypeptide chain. However, the linker used is too short to allow pairing of two domains on the same chain,
- 8 046350 поэтому домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи, с образованием двух антигенсвязывающих участков (см., например, Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:64446448 (1993) и Poljak RJ et al., Structure 2:1121-1123 (1994)).- 8 046350 therefore the domains are forced to pair with complementary domains of the other chain, forming two antigen-binding sites (see, for example, Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:64446448 (1993) and Poljak RJ et al., Structure 2:1121–1123 (1994)).
Антигенсвязывающие фрагменты (например, вышеупомянутые фрагменты антител) антител могут быть получены из данных антител обычными методами, известными специалистам в данной области (например, методом рекомбинантной ДНК или ферментативного или химического расщепления), затем антигенсвязывающие фрагменты антитела проверяют на специфичность так же, как интактные антитела.Antigen-binding fragments (e.g., the above-mentioned antibody fragments) of antibodies can be prepared from these antibodies by conventional methods known to those skilled in the art (e.g., recombinant DNA or enzymatic or chemical digestion), and the antigen-binding antibody fragments are then tested for specificity in the same way as intact antibodies. .
В контексте настоящего описания, если иное в явном виде не следует из контекста, термин антитело включает не только интактные антитела, но также антигенсвязывающие фрагменты антител.As used herein, unless the context clearly indicates otherwise, the term antibody includes not only intact antibodies, but also antigen-binding fragments of antibodies.
В контексте настоящего описания термины mAb и моноклональное антитело относятся к антителу или фрагменту антитела, происходящему из группы высокогомологичных антител, т.е., группы идентичных молекул антител, за исключением естественных мутаций, которые могут происходить спонтанно. Моноклональное антитело обладает высокой специфичностью в отношении одного эпитопа на антигене. Поликлональное антитело, отличие от моноклонального антитела, обычно содержит по меньшей мере два или более разных антител, которые обычно распознают разные эпитопы на антигене. Моноклональные антитела как правило можно получить с помощью гибридомной технологии, о которой впервые сообщили Kohler et al. (Nature, 256:495, 1975), но они также могут быть получены с помощью технологии рекомбинантной ДНК (например, см. патент США 4816567).As used herein, the terms mAb and monoclonal antibody refer to an antibody or antibody fragment derived from a group of highly homologous antibodies, i.e., a group of identical antibody molecules, excluding natural mutations that may occur spontaneously. A monoclonal antibody is highly specific for a single epitope on an antigen. A polyclonal antibody, unlike a monoclonal antibody, typically contains at least two or more different antibodies that typically recognize different epitopes on an antigen. Monoclonal antibodies can generally be produced using hybridoma technology, which was first reported by Kohler et al. (Nature, 256:495, 1975), but they can also be produced using recombinant DNA technology (for example, see US Pat. No. 4,816,567).
В контексте настоящего описания термин химерное антитело относится к антителу, часть легкой и/или тяжелой цепи которого происходит от некоторого антитела (которое может быть получено из конкретного вида или принадлежать к конкретному классу или подклассу антител), а другая часть легкой и/или тяжелой цепи происходит от другого антитела (которое может быть получено из того же или другого вида или принадлежать к тому же или другому классу или подклассу антител). Но в любом случае оно сохраняет активность связывания с целевым антигеном (USP 4816567, Cabilly et al.; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 6855 (1984)).As used herein, the term chimeric antibody refers to an antibody, part of the light and/or heavy chain of which is derived from an antibody (which may be derived from a particular species or belong to a particular class or subclass of antibodies) and the other part of the light and/or heavy chain is derived from another antibody (which may be derived from the same or a different species or belong to the same or a different class or subclass of antibodies). But in any case, it retains binding activity to the target antigen (USP 4816567, Cabilly et al.; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 6855 (1984)).
В контексте настоящего описания термин гуманизированное антитело относится к антителу или фрагменту антитела, которое получается, когда все или часть областей CDR человеческого иммуноглобулина (рецепторного антитела) заменена областями CDR нечеловеческого антитела (донорного антитела), где донорное антитело может быть нечеловеческим (например, мышиным, крысиным или кроличьим) антителом с требуемой специфичностью, сродством или реактивностью. Кроме того, некоторые аминокислотные остатки в каркасных областях (FR) рецепторного антитела также могут быть заменены аминокислотными остатками соответствующих нечеловеческих антител или аминокислотными остатками других антител для дальнейшего улучшения или оптимизации работы антитела. Подробнее о гуманизированных антителах см., например, Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); Presta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992); и Clark, Immunol. Today 21:397-402 (2000).As used herein, the term humanized antibody refers to an antibody or antibody fragment that is produced when all or part of the CDR regions of a human immunoglobulin (receptor antibody) are replaced with the CDR regions of a non-human antibody (donor antibody), where the donor antibody may be non-human (e.g., murine, rat or rabbit) antibody with the required specificity, affinity or reactivity. In addition, certain amino acid residues in framework regions (FR) of a receptor antibody may also be replaced by amino acid residues of corresponding non-human antibodies or amino acid residues of other antibodies to further improve or optimize the performance of the antibody. For more information on humanized antibodies, see, for example, Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); Presta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992); and Clark, Immunol. Today 21:397-402 (2000).
В контексте настоящего описания термин эпитоп относится к участку антигена, с которым специфически связывается иммуноглобулин или антитело. Эпитоп также называется в данной области антигенной детерминантой. Эпитоп или антигенная детерминанта обычно состоит из химически активных поверхностных групп молекулы, таких как аминокислоты, углеводы или боковые цепи сахара, и обычно имеет специфические трехмерные структурные характеристики и специфические характеристики заряда. Например, эпитоп обычно включает по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 последовательных или непоследовательных аминокислот в уникальной пространственной конформации, и может быть линейным или конформационным. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996). В линейном эпитопе все точки взаимодействия между белком и взаимодействующей молекулой (например, антителом) расположены линейно вдоль первичной аминокислотной последовательности белка. В конформационном эпитопе точки взаимодействия расположены между аминокислотными остатками белка, которые отделены друг от друга.As used herein, the term epitope refers to the region of an antigen to which an immunoglobulin or antibody specifically binds. An epitope is also called an antigenic determinant in the art. An epitope or antigenic determinant usually consists of chemically active surface groups of a molecule, such as amino acids, carbohydrates, or sugar side chains, and usually has specific three-dimensional structural characteristics and specific charge characteristics. For example, an epitope typically comprises at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, or 15 consecutive or non-sequential amino acids in a unique spatial conformation, and may be linear or conformational. See, for example, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996). In a linear epitope, all points of interaction between the protein and the interacting molecule (such as an antibody) are located linearly along the primary amino acid sequence of the protein. In a conformational epitope, the interaction points are located between amino acid residues of the protein that are separated from each other.
В контексте настоящего описания термин выделенный относится к получению с помощью искусственных средств из естественного состояния. Если в природе появляется некоторое выделенное вещество или компонент, это может быть связано с изменением в его естественной среде или он может быть изолирован от окружающей среды, или возможно и то, и другое. Например, некоторый невыделенный полинуклеотид или полипептид существует в природе в определенном живом животном, и тот же самый полинуклеотид или полипептид, выделенный с высокой чистотой из своего естественного состояния, называется выделенным полинуклеотидом или полипептидом. Термин выделенный не исключает наличия искусственных или синтетических веществ или других примесей, которые не влияют на активность вещества.As used herein, the term emphasized refers to being obtained by artificial means from a natural state. If some isolated substance or component appears in nature, it may be due to a change in its natural environment or it may be isolated from the environment, or perhaps both. For example, some unisolated polynucleotide or polypeptide exists naturally in a particular living animal, and the same polynucleotide or polypeptide isolated with high purity from its natural state is called an isolated polynucleotide or polypeptide. The term isolated does not exclude the presence of artificial or synthetic substances or other impurities that do not affect the activity of the substance.
В контексте настоящего описания термин экспрессионная система Е. coli относится к экспрессионной системе, состоящей из Е. coli (штамма) и вектора, где Е. coli (штамм) происходит из коммерчески доступного штамма, такого как, без ограничения GI698, ER2566, BL21 (DE3), В834 (DE3) и BLR (DE3).As used herein, the term E. coli expression system refers to an expression system consisting of an E. coli (strain) and a vector, where the E. coli (strain) is derived from a commercially available strain such as, but not limited to, GI698, ER2566, BL21 ( DE3), B834 (DE3) and BLR (DE3).
В контексте настоящего описания термин вектор относится к носителю нуклеиновой кислоты, в который может быть вставлен полинуклеотид. Когда вектор обеспечивает экспрессию белка, кодируемоAs used herein, the term vector refers to a nucleic acid carrier into which a polynucleotide can be inserted. When a vector expresses a protein encoded
- 9 046350 го вставленным полинуклеотидом, вектор называется вектором экспрессии. Вектор может быть введен в клетку-хозяина путем трансформации, трансдукции или трансфекции, обеспечивая экспрессию элементов генетического вещества, перенесенного вектором, в клетке-хозяине. Векторы хорошо известны специалистам в данной области, включая, без ограничения, плазмиды; фагемиды; космиды; искусственные хромосомы, такие как искусственные хромосомы дрожжей (YAC), бактериальные искусственные хромосомы (ВАС) или искусственные хромосомы на основе Р1 (РАС); фаги, такие как лямбда-фаги или фаги М13, и вирусы животных и т.д. Вирусы животных, которые могут использоваться в качестве векторов, включают, без ограничения, ретровирусы (включая лентивирусы), аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, вирусы герпеса (такие как вирус простого герпеса), поксвирусы, бакуловирусы, папилломавирусы и паповавирусы (например, SV40). Вектор может содержать несколько элементов, контролирующих экспрессию, включая, помимо прочего, промоторные последовательности, последовательности инициации транскрипции, энхансерные последовательности, элементы отбора и репортерные гены. Кроме того, вектор может дополнительно содержать сайт инициации репликации.- 9 046350 of the inserted polynucleotide, the vector is called an expression vector. The vector can be introduced into a host cell by transformation, transduction, or transfection, causing elements of the genetic material carried by the vector to be expressed in the host cell. Vectors are well known to those skilled in the art, including, but not limited to, plasmids; phagemids; cosmids; artificial chromosomes such as yeast artificial chromosomes (YAC), bacterial artificial chromosomes (BAC) or P1-based artificial chromosomes (PAC); phages such as lambda phages or M13 phages, and animal viruses, etc. Animal viruses that can be used as vectors include, but are not limited to, retroviruses (including lentiviruses), adenoviruses, adeno-associated viruses, herpes viruses (such as herpes simplex virus), poxviruses, baculoviruses, papillomaviruses, and papovaviruses (eg, SV40). The vector may contain several expression control elements, including, but not limited to, promoter sequences, transcription initiation sequences, enhancer sequences, selection elements, and reporter genes. In addition, the vector may further comprise an origin of replication.
В контексте настоящего описания термин клетка-хозяин относится к клеткам, которые можно использовать для введения векторов, включая, без ограничения, прокариотические клетки, такие как Е. coli или Bacillus subtilis, клетки грибов, такие как клетки дрожжей или аспергилл, клетки насекомых, такие как клетки дрозофилы S2 или Sf9, или клетки животных, такие как фибробласты, клетки СНО, клетки COS, клетки NSO, клетки HeLa, клетки ВНК, клетки НЕК 293 или клетки человека.As used herein, the term host cell refers to cells that can be used to administer vectors, including, but not limited to, prokaryotic cells such as E. coli or Bacillus subtilis, fungal cells such as yeast or aspergillus cells, insect cells such such as Drosophila S2 or Sf9 cells, or animal cells such as fibroblasts, CHO cells, COS cells, NSO cells, HeLa cells, BHK cells, HEK 293 cells or human cells.
В контексте настоящего описания термин KD относится к константе равновесной диссоциации, характеризующей специфическое взаимодействие антитело-антиген, которая используется для описания сродства связывания между антителом и антигеном. Чем меньше константа равновесной диссоциации, тем сильнее связывание антитело-антиген и тем выше сродство между антителом и антигеном. Обычно антитела связываются с антигенами с константой равновесной диссоциации (KD) менее примерно 10-5 М, например менее примерно 10-6 М, 10-7 М, 10-8 М, 10-9 М, 10-10 М или менее, и константа равновесной диссоциации может быть измерена, например, с помощью прибора для анализа молекулярных взаимодействий Fortebio.As used herein, the term K D refers to the equilibrium dissociation constant of a specific antibody-antigen interaction, which is used to describe the binding affinity between antibody and antigen. The lower the equilibrium dissociation constant, the stronger the antibody-antigen binding and the higher the affinity between antibody and antigen. Typically, antibodies bind to antigens with an equilibrium dissociation constant ( KD ) of less than about 10 -5 M, such as less than about 10 -6 M, 10 -7 M, 10 -8 M, 10 -9 M, 10 -10 M or less, and the equilibrium dissociation constant can be measured, for example, using a Fortebio molecular interaction analyzer.
В контексте настоящего описания термины моноклональное антитело и mAb имеют одинаковое значение и могут использоваться взаимозаменяемо; термины поликлональное антитело и PcAb имеют одинаковое значение и могут использоваться взаимозаменяемо; термины полипептид и белок имеют одинаковое значение и могут использоваться взаимозаменяемо. И в настоящем изобретении аминокислоты обычно представлены однобуквенными и трехбуквенными сокращениями, известными в данной области. Например, аланин может быть представлен буквой А или Ala.As used herein, the terms monoclonal antibody and mAb have the same meaning and may be used interchangeably; the terms polyclonal antibody and PcAb have the same meaning and can be used interchangeably; the terms polypeptide and protein have the same meaning and can be used interchangeably. And in the present invention, amino acids are generally represented by one-letter and three-letter abbreviations known in the art. For example, alanine can be represented by the letter A or Ala.
В контексте настоящего описания термины гибридома и гибридомная клеточная линия могут использоваться взаимозаменяемо, и при упоминании терминов гибридома и гибридомная клеточная линия, они также включают субклоны и клетки-потомки гибридомы. Например, когда речь идет о гибридомной клеточной линии LT006 или LT007, это также относится к субклонам и клеткам-потомкам гибридомной клеточной линии LT006 или LT007.As used herein, the terms hybridoma and hybridoma cell line may be used interchangeably, and when the terms hybridoma and hybridoma cell line are referred to, they also include subclones and progeny cells of the hybridoma. For example, when referring to the hybridoma cell line LT006 or LT007, this also refers to subclones and progeny cells of the hybridoma cell line LT006 or LT007.
В контексте настоящего описания термин фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель относится к носителю и/или наполнителю, фармакологически и/или физиологически совместимому с индивидом и активным ингредиентом, и этот термин хорошо известен в данной области (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, под редакцией Gennaro A.R., Edited by Gennaro A.R., 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995) и включает, помимо прочего, регуляторы рН, поверхностноактивные вещества, адъюванты и усилители ионной силы. Например, регуляторы рН включают, без ограничения, фосфатный буфер; поверхностно-активные вещества включают, без ограничения, катионные, анионные или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как Твин-80; и усилители ионной силы включают, без ограничения, хлорид натрия.As used herein, the term pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient refers to a carrier and/or excipient that is pharmacologically and/or physiologically compatible with the individual and the active ingredient, and this term is well known in the art (see, e.g., Remington's Pharmaceutical Sciences, edited by Gennaro A.R., Edited by Gennaro A.R., 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995) and includes, but is not limited to, pH adjusters, surfactants, adjuvants, and ionic strength enhancers. For example, pH adjusters include, but are not limited to, phosphate buffer; surfactants include, but are not limited to, cationic, anionic or nonionic surfactants such as Tween-80; and ionic strength enhancers include, but are not limited to, sodium chloride.
В контексте настоящего описания термин адъювант относится к неспецифическому иммунному усилителю, который может усиливать иммунный ответ организма на антигены или изменять тип иммунного ответа при доставке в организм вместе с антигенами или доставке в организм заблаговременно. Существуют различные адъюванты, включая, помимо прочего, алюминиевый адъювант (например, гидроксид алюминия), адъювант Фрейнда (например, полный адъювант Фрейнда и неполный адъювант Фрейнда), липополисахарид Corynebacterium parvum, цитокин и т.д. Адъювант Фрейнда является наиболее часто используемым адъювантом в экспериментах на животных. Адъювант гидроксид алюминия чаще используется в клинических испытаниях.As used herein, the term adjuvant refers to a non-specific immune enhancer that can enhance the body's immune response to antigens or change the type of immune response when delivered to the body along with antigens or delivered to the body in advance. There are various adjuvants including, but not limited to, aluminum adjuvant (eg, aluminum hydroxide), Freund's adjuvant (eg, complete Freund's adjuvant and incomplete Freund's adjuvant), Corynebacterium parvum lipopolysaccharide, cytokine, etc. Freund's adjuvant is the most commonly used adjuvant in animal experiments. The adjuvant aluminum hydroxide is more commonly used in clinical trials.
В контексте настоящего описания термин эффективное количество относится к количеству, достаточному для получения или по меньшей мере частичного получения требуемого эффекта. Например, эффективное количество для профилактики заболеваний (например, заболеваний, связанных со связыванием IL-17A с рецептором IL-17A или чрезмерной активностью IL-17A, таких как аутоиммунные заболевания), является количеством, достаточным для профилактики, купирования или отсрочки начала заболевания (например, заболеваний, связанных со связыванием IL-17A с рецептором IL-17A или чрезмерной активностью IL-17A, таких как аутоиммунные заболевания); терапевтически эффективное количество является количеством, достаточным для излечения или по меньшей мере частичной остановки развиAs used herein, the term effective amount refers to an amount sufficient to obtain, or at least partially obtain, the desired effect. For example, an effective amount for the prevention of diseases (e.g., diseases associated with binding of IL-17A to the IL-17A receptor or excessive activity of IL-17A, such as autoimmune diseases) is an amount sufficient to prevent, reverse, or delay the onset of a disease (e.g. , diseases associated with the binding of IL-17A to the IL-17A receptor or excessive activity of IL-17A, such as autoimmune diseases); a therapeutically effective amount is an amount sufficient to cure or at least partially arrest the development of
- 10 046350 тия заболевания и его осложнений у пациентов, которые уже страдают от этого заболевания. Специалисты в данной области способны определить такое эффективное количество. Например, количество, эффективное для терапевтического применения, будет зависеть от тяжести заболевания, подлежащего лечению, общего состояния иммунной системы пациента, общего состояния пациента, такого как возраст, вес и пол, способа введения лекарственного вещества, и других видов лечения, применяемых одновременно, и т.д.- 10 046350 disease and its complications in patients who already suffer from this disease. Those skilled in the art will be able to determine such an effective amount. For example, the amount effective for therapeutic use will depend on the severity of the disease being treated, the general condition of the patient's immune system, the general condition of the patient such as age, weight and sex, the route of administration of the drug substance, and other treatments administered concurrently, and etc.
Благоприятные эффекты изобретения.Beneficial effects of the invention.
Настоящее изобретение обеспечивает по меньшей мере один из следующих технических эффектов:The present invention provides at least one of the following technical effects:
(1) все моноклональные антитела по настоящему изобретению, такие как 13Е9 H1L1, 13Е9 H2L2, 13Е9 H3L2 и 2G2 H1L1, 2G2 H2L2, 2G2 H3L3, способны связываться с IL-17A с высокой специфичностью и могут эффективно блокировать связывание IL-17A с лигандом IL-17A, и специфически снижают секрецию IL-6 в Ш-17А-опосредованных фибробластах;(1) all monoclonal antibodies of the present invention, such as 13E9 H1L1, 13E9 H2L2, 13E9 H3L2 and 2G2 H1L1, 2G2 H2L2, 2G2 H3L3, are capable of binding to IL-17A with high specificity and can effectively block the binding of IL-17A to IL ligand -17A, and specifically reduce the secretion of IL-6 in III-17A-mediated fibroblasts;
(2) моноклональные антитела по настоящему изобретению, особенно 13Е9 H2L2, демонстрируют такой же эффект, как и коммерчески доступный лекарственный препарат Секукинумаб, в отношении той же мишени при ингибировании секреции IL-6;(2) the monoclonal antibodies of the present invention, especially 13E9 H2L2, show the same effect as the commercially available drug Secukinumab on the same target in inhibiting IL-6 secretion;
(3) моноклональные антитела по настоящему изобретению потенциально могут применяться для лечения и/или профилактики антиаутоиммунных заболеваний, таких как псориаз, ревматоидный артрит, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит или системная красная волчанка.(3) the monoclonal antibodies of the present invention can potentially be used for the treatment and/or prevention of anti-autoimmune diseases such as psoriasis, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, ankylosing spondylitis or systemic lupus erythematosus.
Краткое описание чертежейBrief description of drawings
Фиг. 1 - результаты детектирования моноклонального мышиного антитела 13Е9 в SDS-PAGE. Образцы из четырех полос слева направо и соответствующие вводимые количества представляют собой: антитело в загрузочном буфере для электрофореза белков в нередуцирующих условиях, 1 мкг; антитело в загрузочном буфере для электрофореза белков в редуцирующих условиях, 1 мкг; маркер, 5 мкл; BSA, 1 мкг.Fig. 1 - results of detection of monoclonal mouse antibody 13E9 in SDS-PAGE. The four lane samples from left to right and the corresponding input amounts are: antibody in non-reducing protein electrophoresis loading buffer, 1 μg; antibody in loading buffer for protein electrophoresis under reducing conditions, 1 μg; marker, 5 µl; BSA, 1 mcg.
Фиг. 2 - результаты детектирования моноклонального мышиного антитела 2G2 в SDS-PAGE. Образцы из четырех полос слева направо и соответствующие вводимые количества представляют собой: антитело в загрузочном буфере для электрофореза белков в нередуцирующих условиях, 1 мкг; антитело в загрузочном буфере для электрофореза белков в редуцирующих условиях, 1 мкг; маркер, 5 мкл; BSA, 1 мкг.Fig. 2 - results of detection of monoclonal mouse antibody 2G2 in SDS-PAGE. The four lane samples from left to right and the corresponding input amounts are: antibody in non-reducing protein electrophoresis loading buffer, 1 μg; antibody in loading buffer for protein electrophoresis under reducing conditions, 1 μg; marker, 5 µl; BSA, 1 mcg.
Фиг. 3 - результаты детектирования моноклонального гуманизированного антитела 13Е9 H3L2 в SDS-PAGE. Образцы трех полос слева направо и соответствующие вводимые количества: BSA, 1 мкг; маркер, 5 мкл; антитело в загрузочном буфере для электрофореза белков в нередуцирующих условиях, 1 мкг; антитело в загрузочном буфере для электрофореза белков в редуцирующих условиях, 1 мкг.Fig. 3 - results of detection of monoclonal humanized antibody 13E9 H3L2 in SDS-PAGE. Samples of the three bands from left to right and corresponding amounts administered: BSA, 1 μg; marker, 5 µl; antibody in loading buffer for protein electrophoresis under non-reducing conditions, 1 μg; antibody in loading buffer for protein electrophoresis under reducing conditions, 1 μg.
Фиг. 4 - результаты детектирования кинетических характеристических параметров антитела 13Е9 H1L1. На чертеже по оси ординат отложено значение сигнала в нм в качестве единицы измерения; по оси абсцисс отложено время в сек в качестве единицы измерения.Fig. 4 - results of detection of kinetic characteristic parameters of the 13E9 H1L1 antibody. In the drawing, the ordinate axis shows the signal value in nm as a unit of measurement; The x-axis represents time in seconds as a unit of measurement.
Фиг. 5 - результаты детектирования кинетических характеристических параметров антитела 13Е9 H2L2. На чертеже по оси ординат отложено значение сигнала в нм в качестве единицы измерения; по оси абсцисс отложено время в сек в качестве единицы измерения.Fig. 5 - results of detection of kinetic characteristic parameters of the antibody 13E9 H2L2. In the drawing, the ordinate axis shows the signal value in nm as a unit of measurement; The x-axis represents time in seconds as a unit of measurement.
Фиг. 6 - результаты детектирования кинетических характеристических параметров антитела 13Е9 H3L2. На чертеже по оси ординат отложено значение сигнала в нм в качестве единицы измерения; по оси абсцисс отложено время в сек в качестве единицы измерения.Fig. 6 - results of detection of kinetic characteristic parameters of the 13E9 H3L2 antibody. In the drawing, the ordinate axis shows the signal value in nm as a unit of measurement; The x-axis represents time in seconds as a unit of measurement.
Фиг. 7 - результаты детектирования кинетических характеристических параметров антитела Секукинумаб. На чертеже по оси ординат отложено значение сигнала в нм в качестве единицы измерения; по оси абсцисс отложено время в сек в качестве единицы измерения.Fig. 7 - results of detection of kinetic characteristic parameters of the antibody Secukinumab. In the drawing, the ordinate axis shows the signal value in nm as a unit of measurement; The x-axis represents time in seconds as a unit of measurement.
Фиг. 8 - результаты детектирования кинетических характеристических параметров антитела 2G2 H1L1. На чертеже по оси ординат отложено значение сигнала в нм в качестве единицы измерения; по оси абсцисс отложено время в сек в качестве единицы измерения.Fig. 8 - results of detection of kinetic characteristic parameters of the 2G2 H1L1 antibody. In the drawing, the ordinate axis shows the signal value in nm as a unit of measurement; The x-axis represents time in seconds as a unit of measurement.
Фиг. 9 - результаты детектирования кинетических характеристических параметров антитела 2G2 H2L2. На чертеже по оси ординат отложено значение сигнала в нм в качестве единицы измерения; по оси абсцисс отложено время в сек в качестве единицы измерения.Fig. 9 - results of detection of kinetic characteristic parameters of the antibody 2G2 H2L2. In the drawing, the ordinate axis shows the signal value in nm as a unit of measurement; The x-axis represents time in seconds as a unit of measurement.
Фиг. 10 - результаты детектирования кинетических характеристических параметров антитела 2G2 H3L3. На чертеже по оси ординат отложено значение сигнала в нм в качестве единицы измерения; по оси абсцисс отложено время в сек в качестве единицы измерения.Fig. 10 - results of detection of kinetic characteristic parameters of the 2G2 H3L3 antibody. In the drawing, the ordinate axis shows the signal value in nm as a unit of measurement; The x-axis represents time in seconds as a unit of measurement.
Фиг. 11 - результаты детектирования кинетических характеристических параметров антитела Секукинумаб. На чертеже по оси ординат отложено значение сигнала в нм в качестве единицы измерения; по оси абсцисс отложено время в сек в качестве единицы измерения.Fig. 11 - results of detection of kinetic characteristic parameters of the antibody Secukinumab. In the drawing, the ordinate axis shows the signal value in nm as a unit of measurement; The x-axis represents time in seconds as a unit of measurement.
Фиг. 12 - детектирование активности связывания антител 13Е9 H1L1 и 13Е9 H2L2 с антигеном IL17A-His методом непрямого ELISA. Коммерчески доступный препарат Секукинумаб используется в качестве положительного контроля.Fig. 12 - detection of binding activity of antibodies 13E9 H1L1 and 13E9 H2L2 with the IL17A-His antigen by indirect ELISA. The commercially available drug Secukinumab is used as a positive control.
Фиг. 13 - детектирование активности связывания антитела 13Е9 H3L2 с антигеном IL17A-His методом непрямого ELISA. Коммерчески доступный препарат Секукинумаб используется в качестве положительного контроля.Fig. 13 - detection of binding activity of the 13E9 H3L2 antibody to the IL17A-His antigen by indirect ELISA. The commercially available drug Secukinumab is used as a positive control.
- 11 046350- 11 046350
Фиг. 14 - детектирование активности антител 13Е9 H1L1 и 13Е9 H2L2, конкурирующих с рецептором IL17RA-His (биотин) за связывание, методом конкурентного ELISA. Коммерчески доступный препарат Секукинумаб используется в качестве положительного контроля.Fig. 14 - detection of the activity of antibodies 13E9 H1L1 and 13E9 H2L2, competing with the receptor IL17RA-His (biotin) for binding, by competitive ELISA. The commercially available drug Secukinumab is used as a positive control.
Фиг. 15 - детектирование активности антитела 13Е9 H3L2, конкурирующего с рецептором IL17RAHis (биотин) за связывание, методом конкурентного ELISA. Коммерчески доступный на рынок лекарственный препарат Секукинумаб используется в качестве положительного контроля.Fig. 15 - detection of the activity of the 13E9 H3L2 antibody, which competes with the IL17RAHis receptor (biotin) for binding, by competitive ELISA. The commercially available drug Secukinumab is used as a positive control.
Фиг. 16 - детектирование активности связывания антител 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 и 2G2 H3L3 с антигеном IL17A-His методом непрямого ELISA. Коммерчески доступный препарат Секукинумаб используется в качестве положительного контроля.Fig. 16 - detection of binding activity of antibodies 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 and 2G2 H3L3 with the IL17A-His antigen by indirect ELISA. The commercially available drug Secukinumab is used as a positive control.
Фиг. 17 - детектирование активности антител 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 и 2G2 H3L3, конкурирующих с рецептором IL17A-His (биотин) за связывание с антигеном IL17A-His, методом конкурентного ELISA. Коммерчески доступный препарат Секукинумаб используется в качестве положительного контроля.Fig. 17 - detection of the activity of antibodies 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 and 2G2 H3L3, competing with the IL17A-His receptor (biotin) for binding to the IL17A-His antigen, by competitive ELISA. The commercially available drug Secukinumab is used as a positive control.
Фиг. 18 - влияние антител 13Е9 H1L1, 13Е9 H2L2 и 13Е9 H3L2, а также 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 и 2G2 H3L3 на секрецию цитокина IL-6 в реакции смешанной культуры лимфоцитов.Fig. 18 - the effect of antibodies 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 and 13E9 H3L2, as well as 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 and 2G2 H3L3 on the secretion of the cytokine IL-6 in the reaction of a mixed culture of lymphocytes.
Фиг. 19 - влияние лекарственного вещества на основе антитела 13Е9 H3L2 на толщину эпидермиса в модели мышей C57BL/6 с псориазом.Fig. 19 - the effect of a drug based on the 13E9 H3L2 antibody on the thickness of the epidermis in the C57BL/6 mouse model with psoriasis.
Примечание относительно сохранения биологических материалов:Note regarding preservation of biological materials:
гибридомная клеточная линия LT006 (IL7A-13E9), депонированная в Китайском центре коллекции типовых культур (ССТСС) 12 сентября 2017 г. с номером доступа ССТСС: С2017102 в Уханьском университете, Ухань, Китай, 430072.hybridoma cell line LT006 (IL7A-13E9), deposited in the China Type Culture Collection Center (CTCC) on September 12, 2017 with CCCC accession number: C2017102 at Wuhan University, Wuhan, China 430072.
гибридомная клеточная линия LT007 (IL17A-2G2), депонированная в Китайском центре коллекции типовых культур (ССТСС) 12 сентября 2017 г. с номером доступа ССТСС: С2017165 в Уханьском университете, Ухань, Китай, 430072.hybridoma cell line LT007 (IL17A-2G2), deposited in the China Type Culture Collection Center (CTCC) on September 12, 2017 with CCCC accession number: C2017165 at Wuhan University, Wuhan, China 430072.
Подробное описаниеDetailed description
Варианты осуществления настоящего изобретения подробно описаны ниже со ссылкой на примеры. Специалисты в данной области поймут, что приведенные ниже примеры используются только для иллюстрации настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения. Пример выполнен в соответствии со способами или условиями, описанными в данной области (например, см. Guide to Molecular Cloning Experiments, авт. J. Sambrook et al., перевод Huang Peitang et al., третье изд., Science Press) или в соответствии с руководством по продукту, если в нем не указаны конкретные способы или условия. Все используемые реагенты или инструменты являются коммерчески доступными обычными продуктами, если не указаны их производители.Embodiments of the present invention are described in detail below with reference to examples. Those skilled in the art will understand that the following examples are used to illustrate the present invention only and should not be construed as limiting the scope of the present invention. The example is performed in accordance with methods or conditions described in the art (for example, see Guide to Molecular Cloning Experiments, by J. Sambrook et al., translated by Huang Peitang et al., third ed., Science Press) or in accordance with with the product manual unless specific methods or conditions are specified therein. All reagents or instruments used are commercially available conventional products unless their manufacturers are indicated.
В приведенных ниже примерах использованных мышей BALB/C приобретали в Центре лабораторных животных провинции Гуандун; использованных мышей C57BL/6 приобретали в Nanjing Galaxy Biopharma Co., Ltd.; использованные клетки MRC5 получали из шанхайского центра клеток IBS в Фудане; используемое моноклональное антитело Секукинумаб (Cosentyx®) приобретали в Novartis Corporation.In the examples below, the BALB/C mice used were purchased from the Guangdong Laboratory Animal Center; used C57BL/6 mice were purchased from Nanjing Galaxy Biopharma Co., Ltd.; MRC5 cells used were obtained from Shanghai Fudan IBS Cell Center; The monoclonal antibody used, Secukinumab (Cosentyx®), was purchased from Novartis Corporation.
Пример 1. Получение анти-IL-17A антител 13Е9 и 2G2.Example 1. Preparation of anti-IL-17A antibodies 13E9 and 2G2.
1. Получение гибридомных клеточных линий LT006 и LT007.1. Preparation of hybridoma cell lines LT006 and LT007.
Антиген IL-17A (24-155)-His, используемый для создания ГЬ-анти-17А антитела, представляет собой слитый белок зрелого пептида человеческого IL-17A (GenBank ID: Q16552) и His-метки. Выполняли слияние клеток селезенки из иммунизированных мышей BALB/C (приобретенных в Медицинском лабораторном центре животных провинции Гуандун) и клеток мышиной миеломы с получением гибридом, используя хорошо известные методы (см. например, Monoclonal Antibody Production in Basic Methods in Antibody Production and Characterization, Eds. G.C. Howard and D.R. Bethell, Boca Raton: CRC Press, 2000).The IL-17A (24-155)-His antigen used to generate the IL-anti-17A antibody is a fusion protein of the mature human IL-17A peptide (GenBank ID: Q16552) and a His tag. Fusion of spleen cells from immunized BALB/C mice (purchased from the Guangdong Animal Medical Laboratory Center) and mouse myeloma cells to produce hybridomas was performed using well-known methods (see, for example, Monoclonal Antibody Production in Basic Methods in Antibody Production and Characterization, Eds G. C. Howard and D. R. Bethell, Boca Raton: CRC Press, 2000).
Слитый белок IL17A-His ферментативно расщепляли протеазой TEV и очищали на колонке с получением белка IL-17A (24-155). Скрининг, используя непрямой ELISA выполняли в микропланшетах, покрытых белком IL-17A (24-155) в качестве антигена, для получения клеток гибридомы, которые секретируют новые антитела, специфически связывающиеся с IL-17A (24-155).The IL17A-His fusion protein was enzymatically digested with TEV protease and column purified to yield IL-17A protein (24-155). Screening using indirect ELISA was performed in microplates coated with IL-17A(24-155) protein as the antigen to obtain hybridoma cells that secrete novel antibodies that specifically bind to IL-17A(24-155).
Клетки гибридомы, полученные в результате скрининга непрямым ELISA подвергали скринингу, используя конкурентный ELISA для получения гибридомных клеточных линий, способных секретировать моноклональное антитело, которое конкурирует с рецептором IL-17RA (CD217, NCBI Gene ID: NP_055154.3) за связывание с IL-17A, и методом серийных разведений получали две стабильные гибридомные клеточные линии.Hybridoma cells obtained from the indirect ELISA screen were screened using a competitive ELISA to generate hybridoma cell lines capable of secreting a monoclonal antibody that competes with the IL-17RA receptor (CD217, NCBI Gene ID: NP_055154.3) for binding to IL-17A , and two stable hybridoma cell lines were obtained by serial dilution.
Гибридомную клеточную линию LT006 (IL17A-13E9) депонировали в Китайском центре коллекции типовых культур (ССТСС) в субботу, 12 сентября 2015 г., под номером доступа ССТСС: С2017102, в Уханьском университете (Ухань, Китай, 430072). Моноклональное антитело, секретируемое гибридомной клеточной линией LT006, названо 13Е9.The hybridoma cell line LT006 (IL17A-13E9) was deposited in the China Type Culture Collection Center (CTCCC) on Saturday, September 12, 2015, under CCTCC accession number: C2017102, Wuhan University (Wuhan, China, 430072). The monoclonal antibody secreted by the hybridoma cell line LT006 is named 13E9.
Гибридомную клеточную линию LT007 (IL17A-2G2) депонировали в Китайском центре коллекции типовых культур (ССТСС) 12 сентября 2017 г. под номером доступа ССТСС: С2017165 в Уханьском университете (Ухань, Китай, 430072). Моноклональное антитело, секретируемое гибридомной клеточной линии LT007, названо 2G2.The hybridoma cell line LT007 (IL17A-2G2) was deposited in the China Type Culture Collection Center (CTCCC) on September 12, 2017 under CCTCC accession number: C2017165 at Wuhan University (Wuhan, China 430072). The monoclonal antibody secreted by the hybridoma cell line LT007 is named 2G2.
- 12 046350- 12 046350
2. Получение aHmu-1L-17A антитела 13 Е9.2. Preparation of aHmu-1L-17A antibody 13 E9.
Полученную выше клеточную линию LT006 культивировали (1x10 клеток на лунку) в бессывороточной среде для гибридом (дополненной 1% пенициллин-стрептомицин и 4% глутамакс, в инкубаторе для клеток при 37°С, 5% СО2), и супернатант клеточной культуры собирали через 7 дней культивирования, когда выживаемость составила примерно 20%, и затем подвергали высокоскоростному центрифугированию, вакуумной фильтрации через микропористую мембрану и очистке на колонке HiTrap HP с белком А с получением антитела 13Е9. Обнаружение очищенных образцов 13Е9 выполняли с помощью SDS-PAGE электрофореза, результаты которого показаны на фиг. 1.The above LT006 cell line was cultured (1x10 cells/well) in serum-free hybridoma medium (supplemented with 1% penicillin-streptomycin and 4% glutamax, in a cell incubator at 37°C, 5% CO 2 ), and the cell culture supernatant was collected via 7 days of culture where survival was approximately 20% and then subjected to high speed centrifugation, vacuum filtration through a microporous membrane and purification on a HiTrap HP Protein A column to yield antibody 13E9. Detection of purified 13E9 samples was performed by SDS-PAGE electrophoresis, the results of which are shown in FIG. 1.
3. Получение анти-П.-17А антитела 2G2.3. Obtaining anti-P.-17A antibody 2G2.
Полученную выше клеточную линию LT007 культивировали (1x10 клеток на лунку) в бессывороточной средой для гибридом (дополненной 1% пенициллин-стрептомицин и 4% глутамакс, в инкубаторе для клеток при 37°С, 5% СО2), и супернатант клеточной культуры собирали через 7 дней культивирования, когда выживаемость составила примерно 20%, и затем подвергали высокоскоростному центрифугированию, вакуумной фильтрации через микропористую мембрану и очистке на колонке HiTrap HP с белком А с получением антитела 2G2. Обнаружение очищенных образцов 2G2 выполняли с помощью SDSPAGE электрофореза, результаты которого показаны на фиг. 2.The above LT007 cell line was cultured (1x10 cells per well) in serum-free hybridoma medium (supplemented with 1% penicillin-streptomycin and 4% glutamax, in a cell incubator at 37°C, 5% CO 2 ), and the cell culture supernatant was collected through 7 days of culture where survival was approximately 20% and then subjected to high speed centrifugation, vacuum filtration through a microporous membrane and purification on a HiTrap HP Protein A column to yield antibody 2G2. Detection of purified 2G2 samples was performed using SDSPAGE electrophoresis, the results of which are shown in FIG. 2.
Пример 2. Анализ последовательности антитела 13Е9.Example 2. Sequence analysis of antibody 13E9.
Клетки LT006 культивировали в соответствии со способом, описанным на этапе 2 примера 1.LT006 cells were cultured according to the method described in step 2 of example 1.
Используя набор для экстракции клеточной/бактериальной общей РНК (Tiangen, артикул DP430), мРНК экстрагировали из культивированных клеток LT006 в соответствии с методом, описанным в руководстве к набору.Using a Cellular/Bacterial Total RNA Extraction Kit (Tiangen, part number DP430), mRNA was extracted from cultured LT006 cells according to the method described in the kit manual.
кДНК синтезировали в соответствии с руководством к набору ОТ-ПЦР системы синтеза первой цепи Invitrogen Superscript® III и амплифицировали методом ПЦР.cDNA was synthesized according to the Invitrogen Superscript® III First Strand Synthesis System RT-PCR kit manual and amplified by PCR.
Продукты, амплифицированные с помощью ПЦР, непосредственно подвергали прямому ТАклонированию, и для выполнения конкретных операций использовали руководство по применению набора pEASY-T1 Cloning Kit (Transgen CT101).PCR amplified products were directly subjected to direct TA cloning and the pEASY-T1 Cloning Kit (Transgen CT101) manual was used for specific operations.
ТА-клонированные продукты непосредственно секвенировали; результаты секвенирования были следующими:TA-cloned products were directly sequenced; The sequencing results were as follows:
нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи: (360 п.н.)nucleotide sequence of the heavy chain variable region: (360 bp)
GAAGTAAAGCTGCAGGAGTCGGGACCTGGCCTGGTGAAACCTTCTCAGTCTCGAAGTAAAGCTGCAGGAGTCGGGACCTGGCCTGGTGAAACCTTCTCAGTCTC
TGTCCCTCACCTGCACTGTCACTAGCTACTCATTCACCAGTGATTATGCCTGGAGCTGTGTCCCTCACCTGCACTGTCACTAGCTACTCATTCACCAGTGATTATGCCTGGAGCTG
GATCCGGCAGTTTCCAGGAATCAAACTGGAGTGGATGGGCTACATAACCTACAGTG GTGTCACTAGCTACAACCCCTCTCTCAAAAGTCGAATCTCTATCACTCGAGACACAT CCAAGAACCAGTTCTTCCTACAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACGGCCACAT ATTACTGTGCAAGGGCAGACTATGATAGCTACTATACTATGGACTACTGGGGTCAAG GAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 1) кодируемая ею аминокислотная последовательность: (120 а.к.)GATCCGGCAGTTTCCAGGAATCAAACTGGAGTGGATGGGCTACATAACCTACAGTG GTGTCACTAGCTACAACCCCTCTCTCAAAAGTCGAATCTCTATCACTCGAGACACAT CCAAGAACCAGTTCTTCCTACAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACGGCCACAT ATTACTGTGCAAGGGCAGACTATGATAGCTACTATACTATGGACTACTGGGGTCAAG GAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 1) amino acid sequence it encodes: (120 aa)
EVKLOESGPGLVKPSOSLSLTCTVTSYSFTSDYAWSWIROFPGIKLEWMGYITYSEVKLOESGPGLVKPSOSLSLTCTVTSYSFTSDYAWSWIROFPGIKLEWMGYITYS
GVTSYNPSLKSRISITRDTSKNOFFLQLNSVTTEDTATYYCARADYDSYYTMDYWGOGTGVTSYNPSLKSRISITRDTSKNOFFLQLNSVTTEDTATYYCARADYDSYYTMDYWGOGT
SVTVSS (SEQ ID NO: 2) нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи: (333 п.н.)SVTVSS (SEQ ID NO: 2) light chain variable region nucleotide sequence: (333 bp)
GACATCCAGCTGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAGACATCCAGCTGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCA
AGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTA
TTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAGGCTCCTGATCTACAAAGT TTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAG ATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCT CTCAAAGTACACATTTTTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: 3) кодируемая ею аминокислотная последовательность: (111 а.к.)TTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAGGCTCCTGATCTACAAAGT TTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAG ATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCT CTCAAAGTACACATTTTTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: 3) amino acid sequence encoded by it: (111 aa)
DIOLTOSPLSLPVSLGDOASISCRSSOSLVHSNGNTYLHWYLOKPGOSPRLLIYKVDIOLTOSPLSLPVSLGDOASISCRSSOSLVHSNGNTYLHWYLOKPGOSPRLLIYKV
SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHFWTFGGGTKLEIK (SEQSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHFWTFGGGTKLEIK (SEQ
ID NO: 4)ID NO: 4)
CDR области подчеркнуты.CDR areas are underlined.
Пример. Разработка, получение и детектирование гуманизированных анти-Ш-17А антител 13Е9 H1L1. 13Е9 H2L2 и 13Е9 H3L2.Example. Development, production and detection of humanized anti-III-17A antibodies 13E9 H1L1. 13E9 H2L2 and 13E9 H3L2.
1. Разработка последовательностей легкой и тяжелой цепей гуманизированных анти-Ш-17А антител 13Е9 H1L1, 13Е9 H2L2 и 13Е9 H3L2.1. Development of light and heavy chain sequences of humanized anti-III-17A antibodies 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 and 13E9 H3L2.
На основе трехмерной кристаллической структуры белка IL-17A (EMBO J. (2001) 20, р. 5332-41) иBased on the three-dimensional crystal structure of the IL-17A protein (EMBO J. (2001) 20, p. 5332-41) and
- 13 046350 последовательности антитела 13Е9, полученной в примере 2, с помощью компьютера была смоделирована модель антитела, и вычислены мутации в соответствии с моделью с получением последовательностей вариабельной области антител 13Е9 H1L1, 13Е9 H2L2 и 13Е9 H3L2 (последовательности константной области антитела взяты из базы данных NCBI, в которой константной областью тяжелой цепи является С-область цепи гамма-1 Ig, номер доступа: Р01857, и константной областью легкой цепи является Собласть каппа-цепи Ig, номер доступа: Р01834).- 13 046350 sequence of the antibody 13E9 obtained in example 2, using a computer, a model of the antibody was modeled, and mutations were calculated in accordance with the model, obtaining sequences of the variable region of antibodies 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 and 13E9 H3L2 (sequences of the constant region of the antibody were taken from the database NCBI, in which the heavy chain constant region is the Ig gamma-1 chain C region, accession number: P01857, and the light chain constant region is the Ig kappa chain region, accession number: P01834).
Разработанные последовательности вариабельных областей являются следующими:The developed sequences of the variable regions are as follows:
(1) последовательности тяжелой и легкой цепей гуманизированного моноклонального антитела 13Е9 H1L1:(1) sequences of the heavy and light chains of the humanized monoclonal antibody 13E9 H1L1:
нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи: (360 п.н.)nucleotide sequence of the heavy chain variable region: (360 bp)
GATGTGCAGCTGCAGGAAAGCGGACCAGGACTGGTGAAGCCTAGCCAGACCGATGTGCAGCTGCAGGAAAGCGGACCAGGACTGGTGAAGCCTAGCCAGACC
CTGAGCCTGACTTGCACCGTGTCCAGCTACAGCTTCACCAGCGACTACGCTTGGTCT TGGATCAGACAGTTCCCAGGAATTGGCCTCGAGTGGATGGGCTACATCACCTACAG CGGCGTGACCAGCTACAACCCCAGCCTGAAGAGCAGGATCACCATCAGCCGGGACA CCAGCAAGAACCAGTTCTTCCTGCAGCTGAACAGCGTGACAGCAGCCGATACCGCA GTGTACTATTGCGCCAGGGCCGACTACGACAGCTACTACACCATGGACTATTGGGGC CAGGGAACCAGCGTGACAGTGTCTAGC (SEQ ID NO: 5) кодируемая ею аминокислотная последовательность: (120 а.к.)CTGAGCCTGACTTGCACCGTGTCCAGCTACAGCTTCACCAGCGACTACGCTTGGTCT TGGATCAGACAGTTCCCAGGAATTGGCCTCGAGTGGATGGGCTACATCACCTACAG CGGCGTGACCAGCTACAACCCCAGCCTGAAGAGCAGGATCACCATCAGCCGGGACA CCAGCAAGAACCAGTTCTTCCTGCAGCTGAACAGCGTGACAGCAGCCGATACCGCA GTGTACTATTGCGCC AGGGCCGACTACGACAGCTACTACACCATGGACTATTGGGGC CAGGGAACCAGCGTGACAGTGTCTAGC (SEQ ID NO: 5) amino acid sequence it encodes: (120 aa)
DVOLOESGPGLVKPSOTLSLTCTVSSYSFTSDYAWSWIROFPGIGLEWMGYITYSDVOLOESGPGLVKPSOTLSLTCTVSSYSFTSDYAWSWIROFPGIGLEWMGYITYS
GVTSYNPSLKSRITISRDTSKNOFFLQLNSVT ААРТА VYYCARADYDSYYTMDYWGOGGVTSYNPSLKSRITIISRDTSKNOFFLQLNSVT AARTA VYYCARADYDSYYTMDYWGOG
TSVTVSS (SEQ ГО NO: 6)TSVTVSS (SEQ GO NO: 6)
CDR области подчеркнуты, нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи: (333 п.н.)CDR regions are underlined, nucleotide sequence of the light chain variable region: (333 bp)
GATGTCGTGATGACCCAGACCCCTCTGTCTCTGCCAGTGACACTGGGACAGCGATGTCGTGATGACCCAGACCCCTCTGTCTCTGCCAGTGACACTGGGACAGC
AGGCTAGCATCTCTTGCAGAAGCAGCCAGAGCCTGGTGCACAGCAACGGCAACACC TACCTGCATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTAGACTGCTGATCTACAAG GTGTCCAACCGGTTCAGCGGCGTGCCAGATAGATTCAGCGGAAGCGGAAGCGGCAC CGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGATCTGGGAGTGTACTTCT GCAGCCAGAGCACCCACTTTTGGACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAGATCAAG (SEQ ID NO: 7) кодируемая ею аминокислотная последовательность: (111 а.к.)AGGCTAGCATCTCTTGCAGAAGCAGCCAGAGCCTGGTGCACAGCAACGGCAACACC TACCTGCATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTAGACTGCTGATCTACAAG GTGTCCAACCGGTTCAGCGGCGTGCCAGATAGATTCAGCGGAAGCGGAAGCGGCAC CGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGATCTGGAGTGTACTTCT GCAGCCAGAGCAC CCACTTTTGGACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAGATCAAG (SEQ ID NO: 7) amino acid sequence it encodes: (111 aa)
DVVMTOTPLSLPVTLGOOASISCRSSOSLVHSNGNTYLHWYLQKPGOSPRLLIYKDVVMTOPLSLPVTLGOOASISCRSSOSLVHSNGNTYLHWYLQKPGOSPRLLIYK
VSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHFWTFGGGTKLEIK (SEQVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHFWTFGGGTKLEIK (SEQ
ID NO: 8)ID NO: 8)
CDR области подчеркнуты;CDR areas are underlined;
(2) последовательности тяжелой и легкой цепей гуманизированного моноклонального антитела 13Е9 H2L2:(2) sequences of the heavy and light chains of the humanized monoclonal antibody 13E9 H2L2:
нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи: (360 п.н.)nucleotide sequence of the heavy chain variable region: (360 bp)
GATGTGCAGCTGCAGGAAAGCGGACCAGGACTGGTGAAGCCTAGCCAGACCGATGTGCAGCTGCAGGAAAGCGGACCAGGACTGGTGAAGCCTAGCCAGACC
CTGAGCCTGACTTGCACCGTGTCCAGCTACAGCTTCACCAGCGACTACGCTTGGTCT TGGATCAGACAGCCACCAGGAAAGGGACTCGAGTGGATCGGCTACATCACCTACAG CGGCGTGACCAGCTACAACCCCAGCCTGAAGAGCAGGATCACCATCAGCCGGGACA CCAGCAAGAACCAGTTCTTCCTGCAGCTGTCTAGCGTGACAGCAGCCGATACCGCA GTGTACTATTGCGCCAGGGCCGACTACGACAGCTACTACACCATGGACTATTGGGGC CAGGGAACCAGCGTGACAGTGTCTAGC (SEQ ID NO: 9) кодируемая ею аминокислотная последовательность: (120 а.к.)CTGAGCCTGACTTGCACCGTGTCCAGCTACAGCTTCACCAGCGACTACGCTTGGTCT TGGATCAGACAGCCACCAGGAAAGGGACTCGAGTGGATCGGCTACATCACCTACAG CGGCGTGACCAGCTACAACCCCAGCCTGAAGAGCAGGATCACCATCAGCCGGGACA CCAGCAAGAACCAGTTCTTCCTGCAGCTGTCTAGCGTGACAGCAGCCGATACCGCA GTGTACTATTGCGCC AGGGCCGACTACGACAGCTACTACACCATGGACTATTGGGGC CAGGGAACCAGCGTGACAGTGTCTAGC (SEQ ID NO: 9) amino acid sequence it encodes: (120 aa)
DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSSYSFTSDYAWSWIRQPPGKGLEWIGYITYSDVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSSYSFTSDYAWSWIRQPPGKGLEWIGYITYS
GVTSYNPSLKSRITISRDTSKNQFFLQLSSVTAADTA VYYCARADYDSYYTMDYWGOGGVTSYNPSLKSRITIISRDTSKNQFFLQLSSVTAADTA VYYCARADYDSYYTMDYWGOG
TSVTVSS (SEQ ГО NO: 10)TSVTVSS (SEQ GO NO: 10)
CDR области подчеркнуты,CDR areas are underlined,
- 14 046350 нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи: (333 п.н.)- 14 046350 nucleotide sequence of the light chain variable region: (333 bp)
GATGTCGTGATGACCCAGACCCCTCTGTCTCTGCCAGTGACACTGGGACAGCGATGTCGTGATGACCCAGACCCCTCTGTCTCTGCCAGTGACACTGGGACAGC
CAGCTAGCATCTCTTGCAGAAGCAGCCAGAGCCTGGTGCACAGCAACGGCAACACC TACCTGCATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTAGACTGCTGATCTACAAG GTGTCCAACCGGTTCAGCGGCGTGCCAGATAGATTCAGCGGAAGCGGAAGCGGCAC CGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGATCTGGGAGTGTACTACT GCAGCCAGAGCACCCACTTTTGGACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAGATCAAG (SEQIDNO: 11) кодируемая ею аминокислотная последовательность: (111 а.к.)CAGCTAGCATCTCTTGCAGAAGCAGCCAGAGCCTGGTGCAGCAACGGCAACACC TACCTGCATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTAGACTGCTGATCTACAAG GTGTCCAACCGGTTCAGCGGCGTGCCAGATAGATTCAGCGGAAGCGGAAGCGGCAC CGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGATCTGGAGTGTACTACT GCAGCCAGAGCACCC ACTTTTGGACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAGATCAAG (SEQIDNO: 11) amino acid sequence it encodes: (111 aa)
DVVMTOTPLSLPVTLGOPASISCRSSOSLVHSNGNTYLHWYLQKPGOSPRLLIYK VSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCSQSTHFWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 12)DVVMTOPLSLPVTLGOPASISCRSSOSLVHSNGNTYLHWYLQKPGOSPRLLIYK VSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCSQSTHFWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 12)
CDR области подчеркнуты;CDR areas are underlined;
(3) последовательности тяжелой и легкой цепей гуманизированного моноклонального антитела 13Е9 H3L2 нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи: (360 п.н.) GATGTGCAGCTGCAGGAAAGCGGACCAGGACTGGTGAAGCCTAGCCAGACC(3) sequences of the heavy and light chains of the humanized monoclonal antibody 13E9 H3L2 nucleotide sequence of the heavy chain variable region: (360 bp) GATGTGCAGCTGCAGGAAAGCGGACCAGGACTGGTGAAGCCTAGCCAGACC
CTGAGCCTGACTTGCACCGTGTCCAGCTACAGCTTCACCAGCGACTACGCTTGGTCT TGGATCAGACAGCCACCAGGAAAGGGACTCGAGTGGATCGGCTACATCACCTACAG CGGCGTGACCAGCTACAACCCTAGCCTGAAGAGCCGCGTGACCATTAGCGTGGACA CCAGCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACAGCCGCCGATACAGCA GTGTACTATTGCGCCCGGGCCGATTACGACAGCTACTACACCATGGACTATTGGGGC CAGGGAACCAGCGTGACAGTGTCTAGC (SEQ ID NO: 13) кодируемая ею аминокислотная последовательность: (120 а.к.)CTGAGCCTGACTTGCACCGTGTCCAGCTACAGCTTCACCAGCGACTACGCTTGGTCT TGGATCAGACAGCCACCAGGAAAGGGACTCGAGTGGATCGGCTACATCACCTACAG CGGCGTGACCAGCTACAACCCTAGCCTGAAGAGCCGCGTGACCATTAGCGTGGACA CCAGCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACAGCCGCCGATACAGCA GTGTACTATTGCGCCCG GGCCGATTACGACAGCTACTACACCATGGACTATTGGGGC CAGGGAACCAGCGTGACAGTGTCTAGC (SEQ ID NO: 13) amino acid sequence it encodes: (120 aa)
DVOLOESGPGLVKPSOTLSLTCTVSSYSFTSDYAWSWIROPPGKGLEWIGYITYSDVOLOESGPGLVKPSOTLSLTCTVSSYSFTSDYAWSWIROPPGKGLEWIGYITYS
GVTSYNPSLKSRVTISVDTSKNOFSLKLSSVTAADTAVYYCARADYDSYYTMDYWGOGGVTSYNPSLKSRVTISVDTSKNOFSLKLSSVTAADTAVYYCARADYDSYYTMDYWGOG
TSVTVSS (SEQ ГО NO: 14)TSVTVSS (SEQ GO NO: 14)
CDR области подчеркнуты.CDR areas are underlined.
Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи такая же, как нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела 13Е9 H2L2, приведенная в SEQ ID NO: 11.The nucleotide sequence of the light chain variable region is the same as the nucleotide sequence of the light chain variable region of the 13E9 H2L2 antibody shown in SEQ ID NO: 11.
Кодируемая аминокислотная последовательность антитела также совпадает с аминокислотной последовательностью вариабельной области легкой цепи антитела 13Е9 H2L2, приведенной в SEQ ID NO: 12.The encoded amino acid sequence of the antibody also matches the amino acid sequence of the light chain variable region of the 13E9 H2L2 antibody set forth in SEQ ID NO: 12.
2. Получение гуманизированных антител 13Е9 H1L1, 13Е9 H2L2 и 13Е9 H3L2.2. Preparation of humanized antibodies 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 and 13E9 H3L2.
Все константные области тяжелой цепи содержат С-область цепи гамма-1 Ig, номер доступа: Р01857; константные области легкой цепи содержат С-область каппа-цепи Ig, номер доступа: Р01834.All heavy chain constant regions contain the Ig gamma-1 chain C region, accession number: P01857; light chain constant regions contain the Ig kappa chain C region, accession number: P01834.
кДНК тяжелой цепи и кДНК легкой цепи 13Е9 H1L1, кДНК тяжелой цепи и кДНК легкой цепи 13Е9 H2L2 и кДНК тяжелой цепи и кДНК легкой цепи 13Е9 H3L2 клонировали в векторы pUC57simple (предоставленные Genscript), соответственно, с получением pUC57simple-13E9H1, pUC57simple-13E9Ll, pUC57simple-13E9H2, pUC57simple-13E9L2 и pUC57simple-13E9H3, соответственно, и фрагменты, содержащие соответствующие тяжелые цепи, и фрагменты, содержащие соответствующие легкие цепи, субклонировали в векторы pcDNA3.1, соответственно, с получением рекомбинантных плазмид pcDNA3.1-13E9H1, pcDNA3.1-13E9L1, pcDNA3.113E9H2, pcDNA3.1-13E9L2, pcDNA3.1-13E9H3 и pcDNA3.1-13E9L2. Затем соответствующие рекомбинантные плазмиды легкой цепи и рекомбинантные плазмиды тяжелой цепи (pcDNA3.1-13E9H1 и pcDNA3.1-13E9Ll; pcDNA3.1-13E9H2 и pcDNA3.1-13E9L2; pcDNA3.1-13E9H3 и pcDNA3.1-13E9L2) котрансфицировали в клетки 293F, культуру клеток собирали и очищали с получением гуманизированных антител 13Е9 H1L1, 13Е9 H2L2 и 13Е9 H3L2, соответственно. Обнаружение очищенного образца 13Е9 H3L2 выполняли с помощью SDS-PAGE электрофореза, результаты которого показаны на фиг. 3.The 13E9 H1L1 heavy chain cDNA and light chain cDNA, the 13E9 H2L2 heavy chain cDNA and light chain cDNA, and the 13E9 H3L2 heavy chain cDNA and light chain cDNA were cloned into pUC57simple vectors (provided by Genscript), respectively, yielding pUC57simple-13E9H1, pUC57simple-13E9Ll, pUC57simple-13E9H2, pUC57simple-13E9L2 and pUC57simple-13E9H3, respectively, and fragments containing the corresponding heavy chains and fragments containing the corresponding light chains were subcloned into the pcDNA3.1 vectors, respectively, to obtain the recombinant plasmids pcDNA3.1-13E9H1, pcDNA3 .1-13E9L1, pcDNA3.113E9H2, pcDNA3.1-13E9L2, pcDNA3.1-13E9H3 and pcDNA3.1-13E9L2. The corresponding light chain recombinant plasmids and heavy chain recombinant plasmids (pcDNA3.1-13E9H1 and pcDNA3.1-13E9Ll; pcDNA3.1-13E9H2 and pcDNA3.1-13E9L2; pcDNA3.1-13E9H3 and pcDNA3.1-13E9L2) were then cotransfected into 293F cells, the cell culture was collected and purified to obtain humanized antibodies 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 and 13E9 H3L2, respectively. Detection of purified 13E9 H3L2 sample was performed by SDS-PAGE electrophoresis, the results of which are shown in FIG. 3.
Пример 4. Анализ последовательности антитела 2G2.Example 4 Sequence analysis of the 2G2 antibody.
Клетки LT007 культивировали в соответствии со способом, описанным на этапе 3 примера 1.LT007 cells were cultured according to the method described in step 3 of example 1.
Используя набор для экстракции клеточной/бактериальной общей РНК (Tiangen, артикул DP430), мРНК экстрагировали из культивированных клеток LT007 в соответствии с методом, описанным в руководстве к набору.Using a Cellular/Bacterial Total RNA Extraction Kit (Tiangen, part number DP430), mRNA was extracted from cultured LT007 cells according to the method described in the kit manual.
кДНК синтезировали в соответствии с руководством к набору ОТ-ПЦР системы синтеза первой цепи Invitrogen Superscript® III и амплифицировали методом ПЦР.cDNA was synthesized according to the Invitrogen Superscript® III First Strand Synthesis System RT-PCR kit manual and amplified by PCR.
Продукты, амплифицированные с помощью ПЦР, непосредственно подвергали прямому ТАклонированию, и для выполнения конкретных операций использовали руководство по применению набора pEASY-T1 Cloning Kit (Transgen CT101).PCR amplified products were directly subjected to direct TA cloning and the pEASY-T1 Cloning Kit (Transgen CT101) manual was used for specific operations.
- 15 046350- 15 046350
ТА-клонированные продукты непосредственно секвенировали; результаты секвенирования были следующими:TA-cloned products were directly sequenced; The sequencing results were as follows:
нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи: (351 п.н.)nucleotide sequence of the heavy chain variable region: (351 bp)
GAGGTTCAGCTGGAGCAGTCTGGTTCTGAACTGAGGAGTCCTGGATCTTCAG TAAAGCTTTCATGCAAGGATTTTGATTCAGAAGTCTTCCCTATTGCTGATATGAGTTG GGTTAGGCAGAAGCCTGGGCATGGATTTGAATGGATTGGAGACATACTCCCAAGTT TTGGTAGAACAATCTATGGAGAGAAGTTTGAGGACAAAGCCAAAGTGGATGCAGAC ACAGTGTCCAACACAGCCTACTTGGAACTCAACAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCT ATCTACTACTGTGCAAGGGGTAACTACGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTG GTCACTGTCTCTGCA (SEQ ID NO: 15) кодируемая ею аминокислотная последовательность: (117 а.к.)GAGGTTCAGCTGGAGCAGTCTGGTTCTGAACTGAGGAGTCCTGGATCTTCAG TAAAGCTTTCATGCAAGGATTTTGATTCAGAAGTCTTCCCTATTGCTGATATGAGTTG GGTTAGGCAGAAGCCTGGGCATGGATTTGAATGGATTGGAGACATACTCCCAAGTT TTGGTAGAACAATCTATGGAGAGAAGTTTGAGGACAAAGCCAAAGTGGATGCAGAC ACAGTGTCCAACACAGC CTACTTGGAACTCAACAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCT ATCTACTACTGTGCAAGGGGTAACTACGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTG GTCACTGTCTCTGCA (SEQ ID NO: 15) amino acid sequence it encodes: (117 aa)
EVOLEOSGSELRSPGSSVKLSCKDFDSEVFPIADMSWVROKPGHGFEWIGDILPSF GRTIYGEKFEDKAKVDADTVSNTAYLELNSLTSEDSAIYYCARGNYGFAYWGOGTLVT VSA (SEQ ID NO: 16) CDR области подчеркнуты, нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи: (336 п.н.)EVOLEOSGSELRSPGSSVKLSCKDFDSEVFPIADMSWVROKPGHGFEWIGDILPSF GRTIYGEKFEDKAKVDADTVSNTAYLELNSLTSEDSAIYYCARGNYGFAYWGOGTLVT VSA (SEQ ID NO: 16) CDR regions are underlined, nucleotide sequence of light chain variable region: (336 bp)
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCACTTTGTCGGTTATCATTGGACAACC AGCCTCCATCTCTTGCAAGCCAAGTCAGAGCCTCTTAAATAGTGATGGAAAGACATA TTTGAATTGGTTGTTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGT GTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAG ATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTATTGCT GGCAAGGTTCACATTTTCCTCAGACGTTCGGTGGAGGCACAAAGTTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: 17) кодируемая ею аминокислотная последовательность: (112 а.к.)GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCACTTTGTCGGTTATCATTGGACAACC AGCCTCCATCTCTTGCAAGCCAAGTCAGAGCCTCTTAAATAGTGATGGAAAGACATA TTTGAATTGGTTGTTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGT GTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAG ATTTCACACTGAAAATCAG CAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTATTGCT GGCAAGGTTCACATTTTCCTCAGACGTTCGGTGGAGGCACAAAGTTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: 17) amino acid sequence it encodes: (112 aa)
DVLMTOTPLTLSVIIGOPASISCKPSOSLLNSDGKTYLNWLLORPGOSPKRLIYLVDVLMTOTPLTLSVIIGOPASISCKPSOSLLNSDGKTYLNWLLORRPGOSPKRLIYLV
SKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGSHFPQTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 18)SKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGSHFPQTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 18)
CDR области подчеркнуты.CDR areas are underlined.
Пример 5. Разработка, получение и детектирование гуманизированных апи-11.-17А антител 2G2 H1L1. 2G2 H2L2 и 2G2 H3L3.Example 5. Development, production and detection of humanized api-11.-17A antibodies 2G2 H1L1. 2G2 H2L2 and 2G2 H3L3.
(1) последовательности тяжелой и легкой цепей гуманизированного моноклонального антитела 2G2 H1L1:(1) sequences of the heavy and light chains of the humanized monoclonal antibody 2G2 H1L1:
нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи: (348 п.н.)nucleotide sequence of the heavy chain variable region: (348 bp)
GTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAAGCGAACTGAGAAAGCCAGGCTCCAGCGTG AAGCTGTCTTGCAAGGACTTCGACAGCGAGGTGTTCCCCATCGCCGATATGTCTTGG GTCCGACAGGCTCCAGGCCAGGGATTCGAGTGGATCGGTGACATTCTGCCCAGCTTC GGAAGAACCAACTACGCCCAGAAGTTCGAGGGCAAGGCCAAGGTGGACGCAGACA AGAGCACCAACACCGCCTACCTGGAGCTGAACAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCC ATCTACTATTGCGCCAGGGGCAACTACGGATTCGCCTATTGGGGCCAGGGAACACT GGTGACAGTGTCCGCC (SEQ ID NO: 19) кодируемая ею аминокислотная последовательность: (116 а.к.)GTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAAGCGAACTGAGAAAGCCAGGCTCCAGCGTG AAGCTGTCTTGCAAGGACTTCGACAGCGAGGTGTTCCCCATCGCCGATATGTCTTGG GTCCGACAGGCTCCAGGCCAGGGATTCGAGTGGATCGGTGACATTCTGCCCAGCTTC GGAAGAACCAACTACGCCCAGAAGTTCGAGGGCAAGGCCAAGGTGGACGCAGACA AGAGCACCAACACCGCCTACCTG GAGCTGAACAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCC ATCTACTATTGCGCCAGGGCAACTACGGATTCGCCTATTGGGGCCAGGGAACACT GGTGACAGTGTCCGCC (SEQ ID NO: 19) amino acid sequence it encodes: (116 aa)
VOLVQSGSELRKPGSSVKLSCKDFDSEVFPIADMSWVROAPGOGFEWIGDILPSF GRTNYAQKFEGKAKVDADKSTNTAYLELNSLRSEDTAIYYCARGNYGFAYWGOGTLV TVSA (SEQ ID NO: 20) CDR области подчеркнуты, нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи: (336 п.н.)VOLVQSGSELRKPGSSVKLSCKDFDSEVFPIADMSWVROAPGOGFEWIGDILPSF GRTNYAQKFEGKAKVDADKSTNTAYLELNSLRSEDTAIYYCARGNYGFAYWGOGTLV TVSA (SEQ ID NO: 20) CDR regions are underlined, nucleotide sequence of light chain variable region: (336 bp)
GATGTCGTGATGACCCAGACCCCTCTGTCTCTGAGCGTGACACTGGGACAGC CAGCTAGCATCAGCTGCAGAAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCGACGGCAAGACC TACCTGAATTGGCTGCTGCAGAGACCAGGCCAGTCTCCTAGAAGGCTGATCTACCTG GTGTCCAAGCTGGACAGCGGCGTGCCAGATAGATTCAGCGGAAGCGGAAGCGGCAC CGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGATCTGGGAGTGTACTACT GTTGGCAGGGCAGCCACTTCCCTCAGACATTCGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATC AAG (SEQ ID NO: 21)GATGTCGTGATGACCCAGACCCCTCTGTCTCTGAGCGTGACACTGGGACAGC CAGCTAGCATCAGCTGCAGAAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCGACGGCAAGACC TACCTGAATTGGCTGCTGCAGAGACCAGGCCAGTCTCCTAGAAGGCTGATCTACCTG GTGTCCAAGCTGGACAGCGGCGTGCCAGATAGATTCAGCGGAAGCGGAAGCGGCAC CGACTTCACCCCTGAAGATCA GCAGAGTGGAGGCCGAGGATCTGGGAGTGTACTACT GTTGGCAGGGCAGCCACTTCCCTCAGACATTCGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATC AAG (SEQ ID NO: 21)
- 16 046350 кодируемая ею аминокислотная последовательность: (112 а.к.)- 16 046350 amino acid sequence encoded by it: (112 aa)
DVVMTOTPLSLSVTLGOPASISCRSSOSLLNSDGKTYLNWLLQRPGOSPRRLIYL VSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWOGSHFPQTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 22) CDR области подчеркнуты.DVVMTOTPLSLSVTLGOPASISCRSSOSLLNSDGKTYLNWLLQRPGOSPRRLIYL VSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWOGSHFPQTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 22) CDR regions are underlined.
(2) Последовательности тяжелой и легкой цепей гуманизированного моноклонального антитела 2G2 H2L2:(2) Sequences of the heavy and light chains of the humanized monoclonal antibody 2G2 H2L2:
нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи: (348 п.н.)nucleotide sequence of the heavy chain variable region: (348 bp)
GTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAAGTGAAGAAGCCAGGCTCCAGCGTG AAGCTGTCTTGCAAGGACTTCGACAGCGAGGTGTTCCCCATCGCCGATATGTCTTGG GTCCGACAGGCTCCAGGCCAGGGATTCGAGTGGATCGGTGACATTCTGCCCAGCTTC GGGAGAACCAATTACGCCCAGAAGTTCCAGGGCAGAGTGACCGTGACCGCAGACAA GAGCACCAACACCGCCTACCTGGAGCTGAACAGCCTGAGGAGCGAGGATACCGCCG TGTACTATTGCGCCAGGGGCAACTACGGCTTCGCCTATTGGGGACAGGGAACACTG GTGACAGTGTCCGCC (SEQ ID NO: 23) кодируемая ею аминокислотная последовательность: (116 а.к.)GTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAAGTGAAGAAGCCAGGCTCCAGCGTG AAGCTGTCTTGCAAGGACTTCGACAGCGAGGTGTTCCCCATCGCCGATATGTCTTGG GTCCGACAGGCTCCAGGCCAGGGATTCGAGTGGATCGGTGACATTCTGCCCAGCTTC GGGAGAACCAATTACGCCCAGAAGTTCCAGGGCAGAGTGACCGTGACCGCAGACAA GAGCACCAACACCGCCTAC CTGGAGCTGAACAGCCTGAGGAGCGAGGATACCGCCG TGTACTATTGCGCCAGGGCAACTACGGCTTCGCCTATTGGGGACAGGGAACACTG GTGACAGTGTCCGCC (SEQ ID NO: 23) amino acid sequence it encodes: (116 aa)
VOLVOSGAEVKKPGSSVKLSCKDFDSEVFPIADMSWVROAPGOGFEWIGDILPSF GRTNYAOKFOGRVTVTADKSTNTAYLELNSLRSEDTAVYYCARGNYGFAYWGOGTLV TVSA (SEQ ID NO: 24) CDR области подчеркнуты, нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи: (336 п.н.)VOLVOSGAEVKKPGSSVKLSCKDFDSEVFPIADMSWVROAPGOGFEWIGDILPSF GRTNYAOKFOGRVTVTADKSTNTAYLELNSLRSEDTAVYYCARGNYGFAYWGOGTLV TVSA (SEQ ID NO: 24) CDR regions are underlined, nucleotide sequence of light chain variable region: (336 bp)
GATGTCGTGATGACCCAGACCCCTCTGTCTCTGAGCGTGACACTGGGACAGC CAGCTAGCATCAGCTGCAGAAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCGACGGCAAGACC TACCTGAATTGGCTGCTGCAGAGACCAGGCCAGTCTCCTAGAAGGCTGATCTACCTG GTGTCCAACCTGGACAGCGGCGTGCCAGATAGATTCAGCGGAAGCGGAAGCGGCAC CGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGAGTGTACTACT GTTGGCAGGGCAGCCACTTCCCTCAGACATTCGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATC AAG (SEQ ID NO: 25) кодируемая ею аминокислотная последовательность: (112 а.к.)GATGTCGTGATGACCCAGACCCCTCTGTCTCTGAGCGTGACACTGGGACAGC CAGCTAGCATCAGCTGCAGAAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCGACGGCAAGACC TACCTGAATTGGCTGCTGCAGAGACCAGGCCAGTCTCCTAGAAGGCTGATCTACCTG GTGTCCAACCTGGACAGCGGCGTGCCAGATAGATTCAGCGGAAGCGGAAGCGGCAC CGACTTCACCCCTGAAGATCA GCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGAGTGTACTACT GTTGGCAGGGCAGCCACTTCCCTCAGACATTCGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATC AAG (SEQ ID NO: 25) amino acid sequence it encodes: (112 aa)
DVVMTOTPLSLSVTLGOPASISCRSSOSLLNSDGKTYLNWLLQRPGOSPRRLIYL VSNLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWOGSHFPQTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 26)DVVMTOTPLSLSVTLGOPASISCRSSOSLLNSDGKTYLNWLLQRPGOSPRRLIYL VSNLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWOGSHFPQTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 26)
CDR области подчеркнуты;CDR areas are underlined;
(3) Последовательности тяжелой и легкой цепей гуманизированного моноклонального антитела 2G2 H3L3:(3) Sequences of the heavy and light chains of the humanized monoclonal antibody 2G2 H3L3:
нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи: (348 п.н.)nucleotide sequence of the heavy chain variable region: (348 bp)
GTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAAGTGAAGAAGCCAGGCAGCAGCGTG AAGGTGTCTTGCAAGGACTTCAGCAGCGAGGTGTTCCCCATCGCCGATATGTCTTGG GTCCGACAGGCTCCAGGCCAGGGACTGGAGTGGATCGGTGACATTCTGCCCAGCTT CGGGAGAACCAATTACGCCCAGAAGTTCCAGGGCAGAGTGACCGTGACCGCAGACA AGAGCACCAACACCGCCTACCTGGAGCTGTCTAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCC GTGTACTATTGCGCCAGGGGCAACTACGGCTTCGCCTATTGGGGACAGGGAACACT GGTGACAGTGTCCGCC (SEQ ID NO: 27) кодируемая ею аминокислотная последовательность: (116 а.к.)GTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAAGTGAAGAAGCCAGGCAGCAGCGTG AAGGTGTCTTGCAAGGACTTCAGCAGCGAGGTGTTCCCCATCGCCGATATGTCTTGG GTCCGACAGGCTCCAGGCCAGGACTGGAGTGGATCGGTGACATTCTGCCCAGCTT CGGGAGAACCAATTACGCCCAGAAGTTCCAGGGCAGAGTGACCGTGACCGCAGACA AGAGCACCAACACCGCCTACCTG GAGCTGTCTAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCC GTGTACTATTGCGCCAGGGCAACTACGGCTTCGCCTATTGGGGACAGGGAACACT GGTGACAGTGTCCGCC (SEQ ID NO: 27) amino acid sequence it encodes: (116 aa)
VOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKDFSSEVFPIADMSWVROAPGOGLEWIGDILPSF GRTNYAOKFOGRVTVTADKSTNTAYLELSSLRSEDTAVYYCARGNYGFAYWGOGTLV TVSA (SEQ ID NO: 28)VOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKDFSSEVFPIADMSWVROAPGOGLEWIGDILPSF GRTNYAOKFOGRVTVTADKSTNTAYLELSSLRSEDTAVYYCARGNYGFAYWGOGTLV TVSA (SEQ ID NO: 28)
CDR области подчеркнуты,CDR areas are underlined,
- 17 046350 нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи: (336 п.н.)- 17 046350 nucleotide sequence of the light chain variable region: (336 bp)
GATGTCGTGATGACCCAGACCCCTCTGTCTCTGAGCGTGACACTGGGACAGCGATGTCGTGATGACCCAGACCCCTCTGTCTCTGAGCGTGACACTGGGACAGC
CAGCTAGCATCAGCTGCAGAAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCGACGGCAAGACC TACCTGAATTGGTTCCTGCAGAGACCAGGCCAGTCTCCTAGAAGGCTGATCTACCTG GTGTCCAACCTGGACAGCGGCGTGCCAGATAGATTCAGCGGAAGCGGAAGCGGCAC CGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGAGTGTACTACT GTTGGCAGGGCAGCCACTTCCCTCAGACATTCGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCCAGCTAGCATCAGCTGCAGAAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCGACGGCAAGACC TACCTGAATTGGTTCCTGCAGAGACCAGGCCAGTCTCCTAGAAGGCTGATCTACCTG GTGTCCAACCTGGACAGCGGCGTGCCAGATAGATTCAGCGGAAGCGGAAGCGGCAC CGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGAGTGTACTACT GTTGGCAGGGCAGCC ACTTCCCTCAGACATTCGGCGGCGGCACAAAAGCTGGAGATC
AAG (SEQ ID NO: 29) кодируемая ею аминокислотная последовательность: (116 а.к.)AAG (SEQ ID NO: 29) amino acid sequence it encodes: (116 aa)
DVVMTOTPLSLSVTLGOPASISCRSSOSLLNSDGKTYLNWFLQRPGOSPRRLIYLDVVMTOTPLSLSVTLGOPASISCRSSOSLLNSDGKTYLNWFLQRPGOSPRRLIYL
VSNLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWOGSHFPOTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 30)VSNLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWOGSHFPOTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 30)
CDR области подчеркнуты.CDR areas are underlined.
2. Получение и детектирование с помощью SDS-PAGE электрофореза гуманизированных антител 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 и 2G2 H3L3.2. Preparation and detection by SDS-PAGE electrophoresis of humanized antibodies 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 and 2G2 H3L3.
Для константных областей тяжелой цепи использовали С-область цепи гамма-1 Ig, номер доступа: Р01857; для константных областей легкой цепи использовали С-область каппа-цепи Ig, номер доступа: Р01834.For the heavy chain constant regions, Ig gamma 1 chain C region was used, accession number: P01857; for light chain constant regions, the Ig kappa chain C region was used, accession number: P01834.
кДНК тяжелой цепи и кДНК легкой цепи 2G2 H1L1, кДНК тяжелой цепи и кДНК легкой цепи 2G2 H2L2, и кДНК тяжелой цепи и кДНК легкой цепи 2G2 H3L3 клонировали в векторы pUC57simple (предоставленные Genscript), соответственно, с получением pUC57simple-2G2H1, pUC57simple-2G2L1; pUC57simple-2G2H2, pUC57simple-2G2L2; и pUC57simple-2G2H3, pUC57simple-2G2L3, соответственно. Затем нуклеотидные фрагменты, содержащие соответствующие тяжелые цепи, и нуклеотидные фрагменты, содержащие соответствующие легкие цепи, субклонировали в векторы pcDNA3.1, соответственно, с получением рекомбинантных плазмид pcDNA3.1-2G2H1, pcDNA3.1-2G2L1, pcDNA3.1-2G2H2, pcDNA3.1-2G2L2, pcDNA3.1-2G2H3 и pcDNA3.1-2G2L3. После этого соответствующие рекомбинантные плазмиды легкой цепи и рекомбинантные плазмиды тяжелой цепи (pcDNA3.1-2G2H1 и pcDNA3.12G2L1; pcDNA3.1-2G2H2 и pcDNA3.1-2G2L2; pcDNA3.1-2G2H3 и pcDNA3.1-2G2L3) котрансфицировали в клетки 293F, культуру клеток собирали и очищали с получением гуманизированных антител 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 и 2G2 H3L3, соответственно. Очищенные образцы детектировали с помощью SDSPAGE электрофореза.H1L1 heavy chain cDNA and light chain cDNA 2G2, H2L2 heavy chain cDNA and light chain cDNA 2G2, and H3L3 heavy chain cDNA and light chain 2G2 cDNA were cloned into pUC57simple vectors (provided by Genscript), respectively, yielding pUC57simple-2G2H1, pUC57simple-2G2L1 ; pUC57simple-2G2H2, pUC57simple-2G2L2; and pUC57simple-2G2H3, pUC57simple-2G2L3, respectively. Then, the nucleotide fragments containing the corresponding heavy chains and the nucleotide fragments containing the corresponding light chains were subcloned into the pcDNA3.1 vectors, respectively, to obtain the recombinant plasmids pcDNA3.1-2G2H1, pcDNA3.1-2G2L1, pcDNA3.1-2G2H2, pcDNA3 .1-2G2L2, pcDNA3.1-2G2H3 and pcDNA3.1-2G2L3. Thereafter, the corresponding recombinant light chain plasmids and recombinant heavy chain plasmids (pcDNA3.1-2G2H1 and pcDNA3.12G2L1; pcDNA3.1-2G2H2 and pcDNA3.1-2G2L2; pcDNA3.1-2G2H3 and pcDNA3.1-2G2L3) were cotransfected into the cells 293F, the cell culture was harvested and purified to obtain humanized antibodies 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 and 2G2 H3L3, respectively. Purified samples were detected using SDSPAGE electrophoresis.
Пример 6. Измерение кинетических параметров связывания 13Е9 H1L1, 13E9 H2L2 и 13Е9 H3L2 с белком-антигеном IL-17A (24-155).Example 6. Measurement of kinetic parameters of binding of 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 and 13E9 H3L2 to the IL-17A (24-155) antigen protein.
Кинетические параметры связывания гуманизированных антител 13Е9 H1L1, 13Е9 H2L2 и 13Е9 H3L2 с антигеном IL-17A (24-155) измеряли с помощью прибора для анализа молекулярных взаимодействий Fortebio.Binding kinetics of humanized antibodies 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 and 13E9 H3L2 to IL-17A (24-155) antigen were measured using a Fortebio molecular interaction assay.
Сенсор AR2G активировали с помощью EDC/NHS, и на активированный сенсор AR2G иммобилизовали антитело посредством аминового связывания, затем сенсор блокировали 1М этаноламином (рН 8,5). После уравновешивания сенсора в PBST в течение 300 с выполняли связывание антитела, иммобилизованного на сенсоре, с белком-антигеном IL-17A (24-155) (таким же, как антиген, использованный в примере 1) при концентрации антигена 6,25-400 нМ (двойное градиентное разведение), время связывания составляло 420 с, затем выполняли диссоциацию комплекса антиген-антитело в PBST в течение 600 с.The AR2G sensor was activated using EDC/NHS, and antibody was immobilized onto the activated AR2G sensor via amine coupling, then the sensor was blocked with 1 M ethanolamine (pH 8.5). After equilibrating the sensor in PBST for 300 s, binding of the antibody immobilized on the sensor to the IL-17A (24-155) antigen protein (same as the antigen used in Example 1) was performed at an antigen concentration of 6.25-400 nM (double gradient dilution), binding time was 420 s, followed by dissociation of the antigen-antibody complex in PBST for 600 s.
Кинетические параметры антител 13Е9 H1L1, 13Е9 H2L2, 13Е9 H3L2 и Секукинумаба показаны в табл. 1, а результаты определения кинетических характеристик показаны на фиг. 4, 5, 6 и 7, соответственно.The kinetic parameters of antibodies 13E9 H1L1, 13E9 H2L2, 13E9 H3L2 and Secukinumab are shown in table. 1, and the results of determining the kinetic characteristics are shown in Fig. 4, 5, 6 and 7, respectively.
Таблица 1Table 1
Кинетические параметры гуманизированного антитела 13Е9Kinetic parameters of the humanized antibody 13E9
KD - константа сродства; Kon - скорость связывания антигена с антителом; Kdis -скорость диссоциации антигена и антитела; KD=Kon/Kdis.KD - affinity constant; Kon is the rate of binding of antigen to antibody; Kdis - rate of dissociation of antigen and antibody; K D =Kon/Kdis.
- 18 046350- 18 046350
Результаты показывают, что все 13Е9 H1L1, 13Е9 H2L2 и 13Е9 H3L2 имеют хорошее сродство к антигену IL-17A (24-155), и это сродство эквивалентно сродству контрольного антитела Секукинумаб.The results show that 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 and 13E9 H3L2 all have good affinity for the IL-17A (24-155) antigen, and this affinity is equivalent to that of the control antibody Secukinumab.
Пример 7. Измерение кинетических параметров связывания 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 и 2G2 H3L3 с антигеном IL-17A (24-155).Example 7. Measurement of kinetic parameters of binding of 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 and 2G2 H3L3 to the IL-17A (24-155) antigen.
Кинетические параметры связывания гуманизированных антител 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 и 2G2 H3L3 с антигеном IL-17A (24-155) измеряли с помощью прибора для анализа молекулярных взаимодействий Fortebio.Binding kinetics of humanized antibodies 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 and 2G2 H3L3 to IL-17A (24-155) antigen were measured using a Fortebio molecular interaction assay.
Сенсор AR2G активировали с помощью EDC/NHS, и на активированный сенсор AR2G иммобилизовали антитело посредством аминового связывания, и сенсор блокировали 1М этаноламином (рН 8,5). После уравновешивания сенсора в PBST в течение 300 с выполняли связывание антитела, иммобилизованного на сенсоре, с антигеном IL-17A (24-155) при концентрации антигена 6,25-400 нМ (двойное градиентное разведение), и время связывания составляло 420 с, затем выполняли диссоциацию комплекса антиген-антитело в PBST в течение 600 с.The AR2G sensor was activated using EDC/NHS, and antibody was immobilized onto the activated AR2G sensor via amine coupling, and the sensor was blocked with 1 M ethanolamine (pH 8.5). After equilibrating the sensor in PBST for 300 s, the antibody immobilized on the sensor was bound to the IL-17A (24-155) antigen at an antigen concentration of 6.25-400 nM (double gradient dilution), and the binding time was 420 s, then dissociation of the antigen-antibody complex was performed in PBST for 600 s.
Кинетические параметры антител 2G2 H1L1, 2G2 H2L2, 2G2 H3L3 и Секукинумаба показаны в табл. 2, и результаты определения кинетических характеристик показаны на фиг. 8, 9, 10 и 11, соответственно.The kinetic parameters of antibodies 2G2 H1L1, 2G2 H2L2, 2G2 H3L3 and Secukinumab are shown in table. 2, and the results of determining the kinetic characteristics are shown in FIG. 8, 9, 10 and 11, respectively.
Таблица 2table 2
Кинетические параметры 2G2 H1L1, 2G2 H2L2, 2G2 H3L3 и секукинумабаKinetic parameters of 2G2 H1L1, 2G2 H2L2, 2G2 H3L3 and secukinumab
KD - константа сродства; Kon - скорость связывания антигена с антителом; Kdis - скорость диссоциации антигена и антитела; KD=Kon/Kdis.K D - affinity constant; Kon is the rate of binding of antigen to antibody; Kdis - rate of dissociation of antigen and antibody; K D =Kon/Kdis.
Результаты показывают, что по сравнению с контрольным антителом Секукинумаб, 2G2 H2L2 имеет более высокое сродство к антигену IL-17A (24-155); сродство 2G2 H1L1 и 2G2 H3L3 эквивалентно сродству контрольного антитела Секукинумаб.The results show that compared to the control antibody Secukinumab, 2G2 H2L2 has higher affinity for the IL-17A (24-155) antigen; the affinity of 2G2 H1L1 and 2G2 H3L3 is equivalent to that of the control antibody Secukinumab.
Пример 8. Определение активности связывания антител 13Е9 H1LL1, 13E9 H2L2 и 13Е9 H3L2 с антигеном методом ELISA.Example 8. Determination of the binding activity of antibodies 13E9 H1LL1, 13E9 H2L2 and 13E9 H3L2 to antigen by ELISA.
1. Активность связывания антител 13Е9 H1L1, 13Е9 H2L2 и 13Е9 H3L2 с антигеном IL17A-His определяли с помощью непрямого ELISA и сравнивали с коммерчески доступным лекарственным средством Секукинумаб, используемым для той же цели.1. The binding activity of antibodies 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 and 13E9 H3L2 to the IL17A-His antigen was determined using an indirect ELISA and compared with the commercially available drug Secukinumab, used for the same purpose.
IL17A-His можно получить, используя опубликованные последовательности и традиционные технические средства или с помощью следующих этапов.IL17A-His can be obtained using published sequences and conventional techniques or using the following steps.
Получение IL17A-His: полноразмерную последовательность белка человеческого IL-17A получали из NCBI базы данных белков и выполняли слияние с используемой для очистки меткой His*6. Синтез нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, осуществляли в компании Genscript в Нанкине и, пользуясь стандартными методами, описанными в Guide to Molecular Cloning Experiments (второе издание), и стандартными методами молекулярного клонирования, такими как ПЦР, ферментативное расщепление, извлечение с помощью геля, лигирование, ПЦР для обработки колоний или идентификация методом ферментативного расщепления, субклонировали целевой ген в векторы экспрессии в клетках млекопитающих, и затем целевой ген с рекомбинантными векторами экспрессии секвенировали и анализировали. После проверки правильности последовательности получали среднее и большое количество экспрессионных плазмид, свободных от эндотоксина, и осуществляли временную трансфекцию клеток HEK293 для экспрессии белка. Через 7 дней культуральную жидкость собирали и очищали с помощью аффинной хроматографии на колонке с Ni-сефарозой (GE), и качество полученных образцов белка определяли стандартными аналитическими методами SDS-PAGE и SEC-ВЭЖХ на соответствие стандарту.Preparation of IL17A-His: The full-length human IL-17A protein sequence was obtained from the NCBI Protein Database and fused to the His*6 tag used for purification. The synthesis of the nucleic acid encoding the fusion protein was carried out at Genscript in Nanjing and using standard methods described in the Guide to Molecular Cloning Experiments (second edition) and standard molecular cloning methods such as PCR, enzymatic digestion, gel extraction, ligation, colony PCR, or enzymatic digestion identification, the target gene was subcloned into expression vectors in mammalian cells, and then the target gene with recombinant expression vectors was sequenced and analyzed. After sequence verification, medium to high endotoxin-free expression plasmids were prepared and transiently transfected into HEK293 cells for protein expression. After 7 days, the culture liquid was collected and purified by affinity chromatography on a Ni-Sepharose (GE) column, and the quality of the resulting protein samples was determined by standard analytical methods SDS-PAGE and SEC-HPLC for compliance with the standard.
ELISA: в микропланшет добавляли IL17A-His и инкубировали при 4°С в течение ночи; после блокирования 1% BSA в PBS при 37°С в течение 2 ч, соответственно, добавляли антитела и инкубировали при 37°С в течение 30 мин; добавляли козьи антитела к человеческому IgG(H+L)-HRP (Jackson, 109-035088) и инкубировали при 37°С в течение 30 мин; и затем выполняли цветную реакцию с ТМВ (Neogen, 308177) в течение 5 мин, и на микропланшетном ридере определяли оптическую плотность при 450 нм. Полученные экспериментальные данные анализировали и обрабатывали с помощью программного обеспечения SoftMax Pro 6.2.1, затем для анализа строили кривую, аппроксимированную 4параметрической функцией, откладывая по оси абсцисс концентрацию антител, а по оси ординат - значение поглощения.ELISA: IL17A-His was added to the microplate and incubated at 4°C overnight; after blocking with 1% BSA in PBS at 37°C for 2 h, antibodies were added accordingly and incubated at 37°C for 30 min; goat anti-human IgG(H+L)-HRP antibodies (Jackson, 109-035088) were added and incubated at 37°C for 30 min; and then a color reaction was performed with TMB (Neogen, 308177) for 5 min, and the absorbance was determined on a microplate reader at 450 nm. The obtained experimental data were analyzed and processed using SoftMax Pro 6.2.1 software, then a curve approximated by a 4-parameter function was plotted for analysis, plotting the antibody concentration on the abscissa axis, and the absorption value on the ordinate axis.
- 19 046350- 19 046350
Результаты экспериментов показаны на фиг. 12, 13, и в табл. 3 и 4 ниже.The experimental results are shown in Fig. 12, 13, and in table. 3 and 4 below.
Таблица 3Table 3
Результаты детектирования активности связывания 13Е9 H1L1 и 13Е9 H2L2 с антигеном IL17A-HisResults of detection of binding activity of 13E9 H1L1 and 13E9 H2L2 with IL17A-His antigen
Таблица 4Table 4
Результаты детектирования активности связывания 13Е9 H3L2 с антигеном IL17A-HisResults of detecting the binding activity of 13E9 H3L2 with the IL17A-His antigen
Результаты экспериментов показывают, что антитела 13Е9 H1L1, 13Е9 H2L2 и 13Е9 H3L2 могут эффективно связываться с антигеном IL17A-His, и их эффективность связывания зависит от дозы. В тех же экспериментальных условиях значение ЕС50 связывания 13Е9 H1L1 составило 0,044 нМ, значение ЕС50 связывания 13Е9 H2L2 составило 0,048 нМ, и значение ЕС50 коммерчески доступного лекарственного средства Секукинумаб составило 0,082 нМ (фиг. 12, табл. 3); в тех же экспериментальных условиях значение ЕС50 связывания 13Е9 H3L2 составило 0,043 нМ, и значение ЕС50 коммерчески доступного лекарственного средства Секукинумаб составило 0,078 нМ (фиг. 13, табл. 4).The experimental results show that the antibodies 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 and 13E9 H3L2 can effectively bind to the IL17A-His antigen, and their binding efficiency is dose dependent. Under the same experimental conditions, the EC50 value of 13E9 H1L1 binding was 0.044 nM, the EC50 value of 13E9 H2L2 binding was 0.048 nM, and the EC50 value of the commercially available drug Secukinumab was 0.082 nM (Fig. 12, Table 3); under the same experimental conditions, the EC 50 value of 13E9 H3L2 binding was 0.043 nM, and the EC 50 value of the commercially available drug Secukinumab was 0.078 nM (Fig. 13, Table 4).
Приведенные выше экспериментальные результаты показывают, что в одинаковых экспериментальных условиях значения EC50 антител 13Е9 H1L1, 13Е9 H2L2 и 13Е9 H3L2 меньше, чем значение связывания с той же мишенью, наблюдаемое у препарата положительного контроля Секукинумаб, что указывает на улучшенную связывающую активность антител 13Е9 H1L1, 13Е9 H2L2 и 13Е9 H3L2 к IL17AHis по сравнению с коммерчески доступным Секукинумабом, использованным в качестве контроля.The above experimental results show that under the same experimental conditions, the EC50 values of antibodies 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 and 13E9 H3L2 are less than the same target binding value observed for the positive control drug Secukinumab, indicating improved binding activity of antibodies 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 and 13E9 H3L2 to IL17AHis compared with commercially available Secukinumab used as a control.
2. Активность антител 13Е9 H1L1, 13Е9 H2L2 и 13Е9 H3L2, блокирующих связывание IL17RA-His (биотин) с антигеном IL17A-His детектировали с помощью конкурентного ELISA.2. The activity of antibodies 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 and 13E9 H3L2, which block the binding of IL17RA-His (biotin) to the IL17A-His antigen, was detected using a competitive ELISA.
IL17RA-His (биотин) можно получить, используя опубликованные последовательности и традиционные технические средства или путем выполнения следующих этапов.IL17RA-His (biotin) can be obtained using published sequences and conventional techniques or by performing the following steps.
Получение IL17RA-His (биотин): последовательность внеклеточного домена человеческого IL17RA получали из NCBI базы данных белков и выполняли слияние с используемой для очистки меткой His*6. Синтез нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, выполняли в компании Genscript в Нанкине и, пользуясь стандартными методами, описанными в Guide to Molecular Cloning Experiments (второе издание), и стандартными методами молекулярного клонирования, такими как ПЦР, ферментативное расщепление, извлечение с помощью геля, лигирование, ПЦР для обработки колоний или идентификация методом ферментативного расщепления, субклонировали целевой ген в векторы экспрессии в клетках млекопитающих, затем целевой ген с рекомбинантными векторами экспрессии секвенировали и анализировали. После проверки правильности последовательности получали среднее и большое количество экспрессионных плазмид, свободных от эндотоксина, и выполняли временную трансфекцию клетокPreparation of IL17RA-His (biotin): The human IL17RA extracellular domain sequence was obtained from the NCBI Protein Database and fused to the His*6 tag used for purification. Synthesis of the nucleic acid encoding the fusion protein was performed at Genscript in Nanjing and using standard methods described in the Guide to Molecular Cloning Experiments (second edition) and standard molecular cloning methods such as PCR, enzymatic digestion, gel extraction, ligation, colony PCR, or enzymatic digestion identification, subcloned the target gene into expression vectors in mammalian cells, then the target gene with recombinant expression vectors was sequenced and analyzed. After checking the correctness of the sequence, medium and large quantities of endotoxin-free expression plasmids were prepared and cells were transiently transfected
- 20 046350- 20 046350
HEK293 для экспрессии белка. Через 7 дней культуральную жидкость собирали и очищали с помощью аффинной хроматографии на колонке с Ni-сефарозой (GE), и качество полученных образцов белка определяли стандартными аналитическими методами SDS-PAGE и SEC-ВЭЖХ на соответствие стандарту. После завершения определения качества образцы биотинилированного человеческого белка IL-17RA-His метили с помощью коммерческого набора EZ-Lmk®Sulfo-NHS-LC-Biotmylation от Thermo Scientific, и в соответствии с инструкциями производителя выполняли конкретный метод получения.HEK293 for protein expression. After 7 days, the culture liquid was collected and purified by affinity chromatography on a Ni-Sepharose (GE) column, and the quality of the resulting protein samples was determined by standard SDS-PAGE and SEC-HPLC analytical methods for compliance with the standard. Once quality determination was completed, biotinylated human IL-17RA-His protein samples were labeled using the commercial EZ-Lmk®Sulfo-NHS-LC-Biotmylation kit from Thermo Scientific and the specific preparation method was performed according to the manufacturer's instructions.
ELISA: в микропланшет добавляли IL17A-His и инкубировали при 4°С в течение ночи; после блокирования 1% BSA в PBST при 37°С в течение 2 ч добавляли антитела, соответственно, и обеспечивали взаимодействие антигена с антителом при комнатной температуре в течение 10 мин; затем добавляли рецептор IL17RA-His (биотин), хорошо перемешивали с антителом в объемном соотношении 1:1 и инкубировали при 37°С в течение 30 мин; добавляли SA-HRP (KPL, 14-30-00) и инкубировали при 37°С в течение 30 мин; и затем выполняли цветную реакцию с ТМВ (Neogen, 308177) в течение 5 мин, после этого на микропланшетном ридере определяли оптическую плотность при 450 нм. Полученные экспериментальные данные анализировали и обрабатывали с помощью программного обеспечения SoftMax Pro 6.2.1, затем для анализа строили кривую, аппроксимированную 4-параметрической функцией, откладывая по оси абсцисс концентрацию антител, а по оси ординат - значение поглощения. Результаты экспериментов показаны на фиг. 14, 15 и в табл. 5 и 6 ниже.ELISA: IL17A-His was added to the microplate and incubated at 4°C overnight; after blocking with 1% BSA in PBST at 37°C for 2 hours, antibodies were added accordingly, and antigen-antibody interaction was allowed at room temperature for 10 minutes; then the IL17RA-His receptor (biotin) was added, mixed well with the antibody in a volume ratio of 1:1 and incubated at 37°C for 30 min; SA-HRP (KPL, 14-30-00) was added and incubated at 37°C for 30 min; and then performed a color reaction with TMB (Neogen, 308177) for 5 min, after which the absorbance was determined on a microplate reader at 450 nm. The obtained experimental data were analyzed and processed using SoftMax Pro 6.2.1 software, then a curve approximated by a 4-parameter function was plotted for analysis, plotting the antibody concentration on the abscissa axis and the absorption value on the ordinate axis. The experimental results are shown in Fig. 14, 15 and in table. 5 and 6 below.
Таблица 5Table 5
Результаты детектирования активности 13Е9 H1L1 и 13Е9 H2L2, конкурирующих с рецептором IL17RA-His (биотин) за связывание с антигеном IL17A-HisResults of detection of the activity of 13E9 H1L1 and 13E9 H2L2, competing with the IL17RA-His receptor (biotin) for binding to the IL17A-His antigen
Таблица 6Table 6
Результаты детектирования активности 13Е9 H3L2, конкурирующего с рецептором IL17RA-His (биотин) за связывание с антигеном IL17A-HisResults of detecting the activity of 13E9 H3L2, which competes with the IL17RA-His receptor (biotin) for binding to the IL17A-His antigen
Результаты экспериментов показывают, что антитела 13Е9 H1L1, 13Е9 H2L2 и 13Е9 H3L2 могут эффективно блокировать связывание рецептора IL17RA-His (биотина) с антигеном IL17A-His, и эффективность блокирования зависит от дозы. В тех же экспериментальных условиях значение ЕС50 13E9The experimental results show that the antibodies 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 and 13E9 H3L2 can effectively block the binding of the IL17RA-His receptor (biotin) to the IL17A-His antigen, and the blocking efficiency is dose dependent. Under the same experimental conditions, the EC value is 50 13E9
- 21 046350- 21 046350
H1L1, конкурирующего с IL17AR-His (биотин) за связывание с IL17A-His, составило 1,437 нМ, значение ЕС50 13E9 H2L2, конкурирующего с IL17AR-His (биотин) за связывание с IL17A-His, составило 1,281 нМ, и значение EC50 положительного контрольного препарата Секукинумаб, конкурирующего с IL17ARHis (биотин) за связывание с той же мишенью, IL17A-His, составило 1,807 нМ (табл. 5, фиг. 14); значение ЕС50 13E9 H3L2, конкурирующего с IL17AR-His (биотин) за связывание с IL17A-His, составило 0,805 нМ, и значение ЕС50 коммерчески доступного препарата Секукинумаб, конкурирующего с IL17AR-His (биотин) за связывание с той же мишенью, IL17A-His, составило 1,580 нМ (табл. 6, фиг. 15).H1L1 competing with IL17AR-His (biotin) for binding to IL17A-His was 1.437 nM, EC50 value of 13E9 H2L2 competing with IL17AR-His (biotin) for binding to IL17A-His was 1.281 nM, and EC50 value of positive control the drug Secukinumab, which competes with IL17ARHis (biotin) for binding to the same target, IL17A-His, was 1.807 nM (Table 5, Fig. 14); the EC50 value of 13E9 H3L2 competing with IL17AR-His (biotin) for binding to IL17A-His was 0.805 nM, and the EC50 value of the commercially available drug Secukinumab competing with IL17AR-His (biotin) for binding to the same target, IL17A- His was 1,580 nM (Table 6, Fig. 15).
Приведенные выше экспериментальные результаты показывают, что в одинаковых экспериментальных условиях все значения ЕС50 антител 13Е9 H1L1, 13Е9 H2L2 и 13Е9 H3L2, конкурирующих с IL17AR-His (биотином) за связывание с IL17A-His, меньше, чем у коммерчески доступного препарата Секукинумаб, используемого в качестве контроля, указывая на улучшенную активность антител 13Е9 H1L1, 13Е9 H2L2 и 13Е9 H3L2, конкурирующих с IL17AR-His (биотин) за связывание с IL17A-His, по сравнению с коммерчески доступным лекарственным средством Секукинумаб.The above experimental results show that under the same experimental conditions, all EC 50 values of antibodies 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 and 13E9 H3L2 competing with IL17AR-His (biotin) for binding to IL17A-His are less than those of the commercially available drug Secukinumab used as a control, indicating improved activity of antibodies 13E9 H1L1, 13E9 H2L2 and 13E9 H3L2, which compete with IL17AR-His (biotin) for binding to IL17A-His, compared to the commercially available drug Secukinumab.
Пример 9. Определение методом ELISA активности связывания антител 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 и 2G2 H3L3 с антигеном.Example 9. Determination by ELISA of the binding activity of antibodies 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 and 2G2 H3L3 to antigen.
1. Активность связывания антител 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 и 2G2 H3L3 с антигеном IL17A-His определяли непрямым ELISA.1. The binding activity of antibodies 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 and 2G2 H3L3 to the IL17A-His antigen was determined by indirect ELISA.
Этапы эксперимента: в микропланшет добавляли IL17A-His и инкубировали при 4°С в течение ночи; после блокирования 1% BSA в PBS при 37°С в течение 2 ч, соответственно, добавляли антитела и инкубировали при 37°С в течение 30 мин; добавляли козьи антител к человеческому IgG (H+L)-HRP (Jackson, 109-035-088) и инкубировали при 37°С в течение 30 мин; затем выполняли цветную реакцию с ТМВ (Neogen, 308177) в течение 5 мин, и с помощью микропланшетного ридера определяли оптическую плотность при 450 нм. Полученные экспериментальные данные анализировали и обрабатывали с помощью программного обеспечения SoftMax Pro 6.2.1, затем для анализа строили кривую, аппроксимированную 4-параметрической функцией, откладывая по оси абсцисс концентрацию антител, а по оси ординат - значение поглощения.Experimental steps: IL17A-His was added to the microplate and incubated at 4°C overnight; after blocking with 1% BSA in PBS at 37°C for 2 h, antibodies were added accordingly and incubated at 37°C for 30 min; goat anti-human IgG (H+L)-HRP (Jackson, 109-035-088) was added and incubated at 37°C for 30 min; then a color reaction was performed with TMB (Neogen, 308177) for 5 min, and the absorbance at 450 nm was determined using a microplate reader. The obtained experimental data were analyzed and processed using SoftMax Pro 6.2.1 software, then a curve approximated by a 4-parameter function was plotted for analysis, plotting the antibody concentration on the abscissa axis and the absorption value on the ordinate axis.
Результаты экспериментов показаны на фиг. 16 и в табл. 7 ниже. При этом значение ЕС50 связывания 2G2 H1L1 составило 0,177 нМ, значение ЕС50 связывания 2G2 H2L2 составило 0,372 нМ, и значение ЕС50 связывания 2G2 H3L3 составило 0,421 нМ.The experimental results are shown in Fig. 16 and in table. 7 below. The EC 50 value of 2G2 H1L1 binding was 0.177 nM, the EC 50 value of 2G2 H2L2 binding was 0.372 nM, and the EC 50 value of 2G2 H3L3 binding was 0.421 nM.
Таблица 7Table 7
Результаты детектирования связывания 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 и 2G2 H3L3 с антигеном IL17 A-HisResults of detection of binding of 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 and 2G2 H3L3 to the IL17 A-His antigen
Результаты экспериментов показывают, что антитела 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 и 2G2 H3L3 могут эффективно связываться с антигеном IL17A-His, и их эффективность связывания зависит от дозы.The experimental results show that the antibodies 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 and 2G2 H3L3 can effectively bind to the IL17A-His antigen, and their binding efficiency is dose dependent.
2. Активность антител 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 и 2G2 H3L3, конкурирующих с рецептором IL17A-His (биотин) за связывание с антигеном IL17A-His, детектировали с помощью конкурентного ELISA.2. The activity of antibodies 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 and 2G2 H3L3, which compete with the IL17A-His receptor (biotin) for binding to the IL17A-His antigen, was detected using a competitive ELISA.
Этапы эксперимента: в микропланшет добавляли IL17A-His и инкубировали при 4°С в течение ночи; после блокирования 1% BSA в PBST при 37°С в течение 2 ч, соответственно, добавляли антитела, и обеспечивали взаимодействие антигена с антителом при комнатной температуре в течение 10 мин; затем добавляли рецептор IL17RA-His (биотин), хорошо перемешивали с антителом в объемном соотношении 1:1 и инкубировали при 37°С в течение 30 мин; добавляли SA-HRP (KPL, 14-30-00) и инкубировали при 37°С в течение 30 мин; затем выполняли цветную реакцию с ТМВ (Neogen, 308177) в течение 5 мин, и с помощью микропланшетного ридера определяли оптическую плотность при 450 нм. Полученные экспеExperimental steps: IL17A-His was added to the microplate and incubated at 4°C overnight; after blocking with 1% BSA in PBST at 37°C for 2 hours, antibodies were added accordingly, and antigen-antibody interaction was allowed at room temperature for 10 minutes; then the IL17RA-His receptor (biotin) was added, mixed well with the antibody in a volume ratio of 1:1 and incubated at 37°C for 30 min; SA-HRP (KPL, 14-30-00) was added and incubated at 37°C for 30 min; then a color reaction was performed with TMB (Neogen, 308177) for 5 min, and the absorbance at 450 nm was determined using a microplate reader. Expe received
- 22 046350 риментальные данные анализировали и обрабатывали с помощью программного обеспечения SoftMax Pro 6.2.1, затем для анализа строили кривую, аппроксимированную 4-параметрической функцией, откладывая по оси абсцисс концентрацию антител, а по оси ординат - значение поглощения.- 22 046350 The experimental data were analyzed and processed using SoftMax Pro 6.2.1 software, then a curve approximated by a 4-parameter function was plotted for analysis, plotting the antibody concentration on the abscissa axis and the absorbance value on the ordinate axis.
Результаты экспериментов показаны на фиг. 17 и в табл. 8 ниже. При этом значение EC50 блокирования 2G2 H1L1 составило 2,264 нМ, значение EC50 блокирования 2G2 H2L2 составило 5,408 нМ, и значение EC50 блокирования 2G2 H3L3 составило 5,911 нМ (фиг. 17, табл. 8).The experimental results are shown in Fig. 17 and in table. 8 below. The EC50 value of 2G2 H1L1 blocking was 2.264 nM, the EC50 value of 2G2 H2L2 blocking was 5.408 nM, and the EC50 value of 2G2 H3L3 blocking was 5.911 nM (Fig. 17, Table 8).
Таблица 8Table 8
Результаты детектирования активности 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 и 2G2 H3L3, конкурирующих с рецептором IL17RA-His (биотин) за связывание с антигеном IL17A-HisResults of detection of the activity of 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 and 2G2 H3L3, competing with the IL17RA-His receptor (biotin) for binding to the IL17A-His antigen
Результаты экспериментов показывают, что антитела 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 и 2G2 H3L3 могут эффективно блокировать связывание рецептора IL17RA-His (биотина) с антигеном IL17A-His, и эффективность блокирования зависит от дозы.The experimental results show that the antibodies 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 and 2G2 H3L3 can effectively block the binding of the IL17RA-His receptor (biotin) to the IL17A-His antigen, and the blocking efficiency is dose dependent.
Пример 10. Реакция смешанной культуры эмбриональных фибробластов человека: секреция цитокина IL-6.Example 10. Reaction of a mixed culture of human embryonic fibroblasts: secretion of the cytokine IL-6.
Клетки MRC 5 (приобретенные в Центре клеток Китайской академии наук) помещали в 96луночный планшет в концентрации 5000 клеток/лунку и культивировали в течение ночи. Смесь IL-17 и антитела (hIgG в качестве контроля) инкубировали при 37°С в течение 20 мин, добавляли к клеткам MRC 5 и культивировали в течение 48 часов. После 48 ч культивирования супернатант клеток собирали, и количество секретируемого IL-6 определяли с помощью набора для ELISA (приобретенного у Dakewe Corporation).MRC 5 cells (purchased from the Cell Center of the Chinese Academy of Sciences) were plated in a 96-well plate at a concentration of 5000 cells/well and cultured overnight. A mixture of IL-17 and antibody (hIgG as control) was incubated at 37°C for 20 minutes, added to MRC 5 cells and cultured for 48 hours. After 48 h of culture, the cell supernatant was collected, and the amount of secreted IL-6 was determined using an ELISA kit (purchased from Dakewe Corporation).
Клетки MRC 5 смешивали и культивировали с 13Е9 H1L1, 13Е9 H2L2, 13Е9 H3L2, 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 или 2G2 H3L3 (1 нМ, 10 нМ, 100 нМ) и секукинумабом (1 нМ, 10 нМ, 100 нМ), соответственно. Результаты детектирования секретируемого IL-6 показаны на фиг. 18.MRC 5 cells were mixed and cultured with 13E9 H1L1, 13E9 H2L2, 13E9 H3L2, 2G2 H1L1, 2G2 H2L2 or 2G2 H3L3 (1 nM, 10 nM, 100 nM) and secukinumab (1 nM, 10 nM, 100 nM), respectively. The detection results of secreted IL-6 are shown in FIG. 18.
Из фиг. 18 видно, что 13Е9 H1L1, 13Е9 H2L2, 13Е9 H3L2 и 2G2 H2L2 могут эффективно уменьшать секрецию IL-6 в клетках MRC 5, индуцированную IL-17, при этом:From fig. 18 shows that 13E9 H1L1, 13E9 H2L2, 13E9 H3L2 and 2G2 H2L2 can effectively reduce the secretion of IL-6 in MRC 5 cells induced by IL-17, while:
влияние антитела 13Е9 H1L1 на ингибирование секреции IL-6 при концентрации 100 нМ сильнее, чем у контрольного антитела Секукинумаба в той же дозе, и ингибирующий эффект на секрецию IL-6 при концентрации 10 нМ эквивалентен эффекту контрольного антитела Секукинумаб при концентрации 100 нМ;the effect of the 13E9 H1L1 antibody on inhibiting IL-6 secretion at a concentration of 100 nM is greater than that of the control antibody Secukinumab at the same dose, and the inhibitory effect on IL-6 secretion at a concentration of 10 nM is equivalent to the effect of the control antibody Secukinumab at a concentration of 100 nM;
влияние антитела 13Е9 H2L2 на ингибирование секреции IL-6 при концентрациях 1 нМ, 10 нМ и 100 нМ эквивалентно влиянию контрольного антитела Секукинумаб в тех же дозах;the effect of the 13E9 H2L2 antibody on inhibition of IL-6 secretion at concentrations of 1 nM, 10 nM and 100 nM is equivalent to the effect of the control antibody Secukinumab at the same doses;
ингибирующие эффекты антитела 13Е9 H3L2 на секрецию IL-6 в концентрациях 10 нМ и 100 нМ сильнее, чем у контрольного антитела Секукинумаб в тех же дозах, и эффект при концентрации 1 нМ эквивалентен эффекту контрольное антитело Секукинумаб;the inhibitory effects of the 13E9 H3L2 antibody on IL-6 secretion at concentrations of 10 nM and 100 nM are greater than those of the control antibody Secukinumab at the same doses, and the effect at a concentration of 1 nM is equivalent to the effect of the control antibody Secukinumab;
влияние антитела 2G2 H2L2 на ингибирование секреции IL-6 при концентрациях 1 нМ и 100 нМ эквивалентно таковому у контрольного антитела Секукинумаб;the effect of the 2G2 H2L2 antibody on inhibiting IL-6 secretion at concentrations of 1 nM and 100 nM is equivalent to that of the control antibody Secukinumab;
влияние антитела 2G2 H3L3 на ингибирование секреции IL-6 при концентрации 1 нМ сильнее, чем у контрольного антитела Секукинумаб в той же дозе.the effect of the 2G2 H3L3 antibody on inhibiting IL-6 secretion at a concentration of 1 nM is stronger than that of the control antibody Secukinumab at the same dose.
Приведенные выше результаты показывают, что в реакции смешанной культуры эмбриональных фибробластов человека in vitro биологическая активность антител по настоящему изобретению в отношении блокирования опосредованной IL-17A секреции IL-6 выше или по меньшей мере эквивалентна активности коммерчески доступного препарата Секукинумаб.The above results indicate that in an in vitro mixed culture reaction of human embryonic fibroblasts, the biological activity of the antibodies of the present invention in blocking IL-17A-mediated IL-6 secretion is superior to or at least equivalent to that of the commercially available drug Secukinumab.
--
Claims (24)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810539405.0 | 2018-05-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA046350B1 true EA046350B1 (en) | 2024-03-04 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6783886B2 (en) | Anti-CTLA4 monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof, pharmaceutical composition and use | |
| US20210122815A1 (en) | Anti-interleukin-17a antibody, pharmaceutical composition thereof and use thereof | |
| WO2017071625A1 (en) | Anti-pd-1 monoclonal antibody, and pharmaceutical composition and use thereof | |
| JP7215759B2 (en) | 4-1BB antibody and its production method and use | |
| KR101584416B1 (en) | Antibodies against human tweak and uses thereof | |
| US20230295312A1 (en) | Antibody against human il-4ra and use thereof | |
| KR20200143471A (en) | Monoclonal antibodies against nerve growth factor, and coding genes and uses thereof | |
| KR102531577B1 (en) | PCSK9 Antibodies and Pharmaceutical Compositions and Uses Thereof | |
| AU2020286889A1 (en) | Antibody capable of binding to thymic stromal lymphopoietin and use thereof | |
| CN114206929A (en) | anti-TIGIT (tungsten inert gas) immunosuppressant and application thereof | |
| CN111196849B (en) | Anti-sclerostin antibodies, antigen-binding fragments thereof, and medical uses thereof | |
| KR20190026766A (en) | Anti-IL-22R antibody | |
| JP2021533770A (en) | Anti-IL-1β antibody and pharmaceutical compositions thereof and their use | |
| KR20230004659A (en) | Anti-Human Nerve Growth Factor Antibodies | |
| CN113383016B (en) | Antibodies that bind human IL-1beta, methods of making, and uses thereof | |
| CN111201242A (en) | Asymmetric heterodimeric FC-SCFV fusion anti-GLOBO H and anti-CD 3 bispecific antibodies and uses thereof in cancer therapy | |
| CN110606892A (en) | LAG-3 antibody with high affinity and high biological activity and application thereof | |
| JP2023549150A (en) | Anti-human thymic stromal lymphopoietic factor antibody and its production method and use | |
| EA046350B1 (en) | ANTI-INTERLEUKIN-17A ANTIBODY, PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND THEIR APPLICATION | |
| WO2024012513A1 (en) | Antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof | |
| RU2779649C1 (en) | Antibody binding human il-4r, antigen-binding fragment thereof, and medical application thereof | |
| WO2024012434A1 (en) | Antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof | |
| US20190389972A1 (en) | Modified ck and ch1 domains | |
| CN116133684A (en) | Anti-human NR1 antibody derivatives | |
| CN115558024A (en) | anti-B7-H3 monoclonal antibody and application thereof |