EA046272B1

EA046272B1 - METHODS FOR PRODUCING HETERODIMERIC ANTIBODIES AND OBTAINED HETERODIMERIC ANTIBODIES

Info

Publication number: EA046272B1
Application number: EA201491908
Authority: EA
Inventors: Крэйф Корнелис Адриан Де; Линда Йоханна Алейда Хендрикс; Тон ЛОГТЕНБЕРГ
Original assignee: Мерюс Н.В.
Priority date: 2012-04-20
Filing date: 2013-04-19
Publication date: 2024-02-21

Description

Область изобретенияField of invention

Изобретение относится к области молекулярной биологии, медицины и биологических терапевтических средств. В частности, оно относится к области терапевтических антител для лечения различных заболеваний.The invention relates to the field of molecular biology, medicine and biological therapeutic agents. In particular, it relates to the field of therapeutic antibodies for the treatment of various diseases.

Уровень техникиState of the art

Многие в настоящее время используемые биологические лекарственные средства представляют собой выделенные рекомбинантные, человеческие или гуманизированные моноклональные антитела, которые усиливают способность иммунной системы организма нейтрализовывать или элиминировать клетки и/или молекулы, вовлеченные в процесс заболевания или уничтожать вторгшиеся патогены или инфекционные агенты. Моноклональные антитела связываются с одной конкретной областью или эпитопом антигена, и для применения в терапии их часто выбирают вследствие желаемого функционального свойства, например такого, как уничтожение опухолевых клеток, блокирование взаимодействий рецепторлиганд или нейтрализация вируса. В настоящее время существует приблизительно 30 одобренных FDA моноклональных антител, которые, как правило, производятся в больших количествах, и их биофизические и биохимических характеристики могут быть детально проанализированы, чтобы обеспечить однородность характеристик от партии к партии, что повышает соответствия нормативным требованиям. Несмотря на эти благоприятные характеристики, моноклональные антитела имеют несколько недостатков, некоторые из которых связаны с их моноспецифической природой и комплексностью заболеваний. Процесс заболевания часто имеет многофакторную природу и вовлекает избыточное или синергическое действие медиаторов заболевания или активацию различных рецепторов, включая перекрестное взаимодействие между их сетями передачи сигнала. Следовательно, блокада множества различных факторов и каскадов, вовлеченных в патологию, может приводить к увеличению терапевтической эффективности. Вследствие их моноспецифичности, моноклональные антитела могут препятствовать только одной стадии комплексного процесса заболевания, что часто не обеспечивает оптимального эффекта. В дополнение к неполному контролю множества аспектов процесса заболевания, стало очевидным, что нацеливание на один эпитоп на единичном клеточном или растворимом белке или патогене часто не является достаточным для эффективного лечения заболевания, поскольку эпитоп-мишень может быть более недоступен для связывания моноклонального антитела и обеспечения желаемого эффекта. В качестве примера, опухолевые клетки часто ускользают от терапии моноклональным антителом посредством подавления, мутации или экранирования эпитопа-мишени, присутствующего на рецепторе фактора роста. Посредством активации альтернативных рецепторов и/или их лигандов, опухолевые клетки могут использовать другой путь, ведущий к продолжению роста и метастазирования. Аналогично вирусы и другие патогены часто могут мутировать и утрачивать или экранировать их эпитоп-мишень, тем самым ускользая от обработки моноклональным антителом. Моноклональные антитела, которые связываются с одним эпитопом, часто не привлекают полный спектр эффекторных механизмов, индуцированных поликлональными антителами, включая, среди прочего, опсонизацию (усиление фагоцитоза антигенов), пространственное препятствование (предотвращается связывание антигенов, покрытых антителами, с клетками-хозяевами или поверхностями слизистых оболочек), нейтрализацию токсинов, агглютинацию или преципитацию (антитела, связывающие несколько растворимых антигенов, вызывают агрегацию и последующее выведение), активацию комплемента и антителозависимую клеточную цитотоксичность (антитела обеспечивают уничтожение клеток-мишеней естественными киллерными клетками и нейтрофилами).Many currently used biological drugs are isolated recombinant, human or humanized monoclonal antibodies that enhance the ability of the body's immune system to neutralize or eliminate cells and/or molecules involved in the disease process or to destroy invading pathogens or infectious agents. Monoclonal antibodies bind to one specific region or epitope of an antigen and are often selected for use in therapy because of a desired functional property, such as killing tumor cells, blocking receptor ligand interactions, or neutralizing a virus. There are currently approximately 30 FDA-approved monoclonal antibodies that are typically produced in large quantities and their biophysical and biochemical characteristics can be analyzed in detail to ensure batch-to-batch consistency of performance, increasing regulatory compliance. Despite these favorable characteristics, monoclonal antibodies have several disadvantages, some of which are related to their monospecific nature and disease complexity. The disease process is often multifactorial in nature and involves redundant or synergistic action of disease mediators or activation of different receptors, including crosstalk between their signal transduction networks. Therefore, blockade of many different factors and cascades involved in pathology may lead to increased therapeutic efficacy. Due to their monospecificity, monoclonal antibodies can interfere with only one stage of a complex disease process, which often does not provide optimal effect. In addition to the incomplete control of multiple aspects of the disease process, it has become apparent that targeting a single epitope on a single cellular or soluble protein or pathogen is often not sufficient to effectively treat the disease because the target epitope may no longer be available for the monoclonal antibody to bind and achieve the desired effect. effect. As an example, tumor cells often escape monoclonal antibody therapy by suppressing, mutating, or shielding the target epitope present on the growth factor receptor. By activating alternative receptors and/or their ligands, tumor cells can use a different pathway leading to continued growth and metastasis. Likewise, viruses and other pathogens can often mutate and lose or shield their target epitope, thereby evading monoclonal antibody treatment. Monoclonal antibodies that bind to a single epitope often do not engage the full range of effector mechanisms induced by polyclonal antibodies, including, but not limited to, opsonization (increasing phagocytosis of antigens), steric interference (preventing antibody-coated antigens from binding to host cells or mucosal surfaces). membranes), neutralization of toxins, agglutination or precipitation (antibodies that bind multiple soluble antigens, causing aggregation and subsequent clearance), complement activation and antibody-dependent cellular cytotoxicity (antibodies ensure the destruction of target cells by natural killer cells and neutrophils).

Поликлональные антитела для терапевтических применений можно получать из объединенной сыворотки человека. Такие происходящие из сыворотки терапевтические поликлональные антитела, можно использовать, например, для лечения или предупреждения инфекций, вызванных вирусами, такими как вирус бешенства, цитомегаловирус и респираторно-синцитиальный вирус, для нейтрализации токсинов, таких как столбнячный токсин и ботулотоксин, или для предупреждения иммунизации аллотрансплантатом с резус-фактором D. Более широкому применению происходящих из сыворотки препаратов поликлональных антител препятствует тот факт, что источник плазмы доступен только для ограниченного диапазона мишеней, таких как инфекционные заболевания и токсины. Более того, продукты в высокой степени зависят от доступности донорской крови, как с точки зрения количества, так и с точки зрения пригодности, что приводит к значительному варьированию между партиями. Кроме того, технологии скрининга не поспевают за постоянно эволюционирующими вирусами, таким образом, иммуноглобулиновые продукты несут в себе потенциальный риск передачи инфекционного заболевания. Наконец, длительные процессы взятия крови, скрининга и происходящие из плазмы иммуноглобулины, полученные способами очистки иммуноглобулинов, являются дорогостоящими.Polyclonal antibodies for therapeutic applications can be obtained from pooled human serum. Such serum-derived therapeutic polyclonal antibodies may be used, for example, to treat or prevent infections caused by viruses such as rabies virus, cytomegalovirus and respiratory syncytial virus, to neutralize toxins such as tetanus toxin and botulinum toxin, or to prevent allograft immunization with Rh factor D. Wider use of serum-derived polyclonal antibody preparations has been hampered by the fact that the plasma source is only available for a limited range of targets, such as infectious diseases and toxins. Moreover, the products are highly dependent on the availability of donated blood, both in terms of quantity and suitability, resulting in significant variation between batches. In addition, screening technologies have not kept pace with constantly evolving viruses, so immunoglobulin products carry a potential risk of infectious disease transmission. Finally, the lengthy processes of blood collection, screening, and plasma-derived immunoglobulins produced by immunoglobulin purification methods are expensive.

Смеси моноклональных антител могут увеличить эффективность моноклональных антител, одновременно избегая ограничений, обусловленных происходящими из сыворотки поликлональными антителами. В данной области комбинации двух антител человека или гуманизированных моноклональных антител исследовали в доклинических моделях и клинических испытаниях (например, смеси 2 моноклональных антител против рецептора HER2, смеси 2 антител против рецептора EGFR и 2 моноклональных антител против вируса бешенства).Monoclonal antibody mixtures can increase the effectiveness of monoclonal antibodies while avoiding the limitations of serum-derived polyclonal antibodies. In the art, combinations of two human antibodies or humanized monoclonal antibodies have been studied in preclinical models and clinical trials (eg, a mixture of 2 anti-HER2 receptor monoclonal antibodies, a mixture of 2 anti-EGFR receptor antibodies and 2 anti-rabies virus monoclonal antibodies).

В данной области было показано, что комбинации 2 моноклональных антител могут иметь аддиIt has been shown in the art that combinations of 2 monoclonal antibodies can have additive

- 1 046272 тивные или синергические эффекты и привлекают эффекторные механизмы, которые не ассоциированы с каким-либо антителом отдельно. Например, было показано, что смеси 2 моноклональных антител против EGFR или HER2 более эффективно уничтожают опухолевые клетки на основе комбинации видов активности, включающих усиленную интернализацию рецепторов, увеличенную блокаду каскадов передачи сигнала от рецепторов, а также усиленную опосредуемую иммунными эффекторами цитотоксичность. Для комбинированной терапии на основе 2 моноклональных антител составляющие антитела можно получать по отдельности и комбинировать на уровне белка. Недостатком этого подхода является непомерно высокая стоимость разработки 2 антител по отдельности в клинических испытаниях и (частично) повторение этого процесса для комбинации. Это может привести к неприемлемой стоимости лечения на основе комбинаций антител. Альтернативно 2 рекомбинантных клеточных линии, продуцирующих составляющие моноклональные антитела, можно смешивать в ферментере и полученную смесь антител можно очищать в качестве единого препарата (WO 2004/061104). Недостатком этого подхода является низкий контроль композиции и, таким образом, воспроизводимости полученного препарата рекомбинантных поликлональных антител, особенно с учетом того, что такие композиции могут изменяться с течением времени по мере культивирования клеток.- 1 046272 tive or synergistic effects and attract effector mechanisms that are not associated with any antibody alone. For example, mixtures of 2 monoclonal antibodies against EGFR or HER2 have been shown to more effectively kill tumor cells based on a combination of activities including enhanced receptor internalization, increased blockade of receptor signaling cascades, and enhanced immune effector-mediated cytotoxicity. For combination therapy based on 2 monoclonal antibodies, the component antibodies can be produced separately and combined at the protein level. The disadvantage of this approach is the prohibitive cost of developing the 2 antibodies separately in clinical trials and (partially) repeating this process for the combination. This may result in unacceptable costs for treatments based on antibody combinations. Alternatively, the 2 recombinant cell lines producing the constituent monoclonal antibodies can be mixed in a fermenter and the resulting antibody mixture can be purified as a single preparation (WO 2004/061104). A disadvantage of this approach is the low control over the composition and thus the reproducibility of the resulting recombinant polyclonal antibody preparation, especially since such compositions may change over time as cells are cultured.

В ходе последнего десятилетия биспецифические антитела выступили в качестве альтернативы применению комбинаций 2 антител. В то время как комбинация 2 антител соответствует смеси 2 различных молекул иммуноглобулинов, которые связываются с различными эпитопами на одной и той же или на различных мишенях, в биспецифическом антителе это обеспечивается с помощью одной молекулы иммуноглобулина. Вследствие связывания с 2 эпитопами на одной и той же или на различных мишенях, биспецифические антитела могут иметь сходные эффекты по сравнению с комбинацией из 2 антител, связывающихся с теми же эпитопами. Более того, поскольку биспецифические антитела IgG-формата сочетают в себе 2 различных одновалентных связывающих области в одной молекуле и смеси 2 IgG-антител сочетают в себе 2 различных двухвалентных связывающих молекулы в одном препарате, также наблюдают различные эффекты этих форматов. С технологической и нормативной точки зрения, это делает разработку единого биспецифического антитела менее трудной, поскольку изготовление, доклиническое и клиническое исследование вовлекает одну молекулу. Таким образом, в пользу способов терапии на основе одного биспецифического антитела выступает менее трудный и экономичный процесс разработки лекарственного средства, при одновременном обеспечении более эффективной терапии на основе антител.Over the past decade, bispecific antibodies have emerged as an alternative to the use of combinations of two antibodies. While a combination of 2 antibodies corresponds to a mixture of 2 different immunoglobulin molecules that bind to different epitopes on the same or different targets, in a bispecific antibody this is achieved by a single immunoglobulin molecule. Due to binding to 2 epitopes on the same or different targets, bispecific antibodies may have similar effects compared to a combination of 2 antibodies binding to the same epitopes. Moreover, since bispecific antibodies of the IgG format combine 2 different monovalent binding regions in one molecule and mixtures of 2 IgG antibodies combine 2 different divalent binding molecules in one preparation, different effects of these formats are also observed. From a technological and regulatory perspective, this makes the development of a single bispecific antibody less difficult since manufacturing, preclinical and clinical development all involve a single molecule. Thus, the benefit of single bispecific antibody therapeutics is a less arduous and cost-effective drug development process while providing more effective antibody therapeutics.

Биспецифические антитела на основе IgG-формата, состоящие из 2 тяжелых и двух легких цепей, получают различными способами. Например, биспецифические антитела можно получать путем слияния двух секретирующих антитела клеточных линий с получением новой клеточной линии или путем экспрессии двух антител в одной клетке с использованием технологии рекомбинантных ДНК. Эти подходы обеспечили множество типов антител, поскольку соответствующие тяжелые цепи из каждого антитела могут образовывать моноспецифические димеры (также называемые гомодимерами), которые содержат две идентичных образовавших пару тяжелых цепи с одинаковой специфичностью, и биспецифические димеры (также называемые гетеродимерами), которые содержат две различных образовавших пару тяжелых цепи с различной специфичностью. Кроме того, легкие цепи и тяжелые цепи из каждого антитела могут случайным образом образовывать пару с образованием непригодных нефункциональных комбинаций. Эта проблема, известная как неправильное спаривание тяжелых и легких цепей, может быть решена путем выбора антител, которые имеют общую легкую цепь, для экспрессии в качестве биспецифических. Однако даже когда используют общую легкую цепь, экспрессия двух тяжелых цепей и одной общей легкой цепи в одной клетке приведет к 3 различным типам антител, т.е. двум моноспецифическим родительским антителам и биспецифическому антителу, так что представляющее интерес биспецифическое антитело необходимо очищать из полученной смеси антител. Хотя используют технологии дальнейшего увеличения процента биспецифических антител в смесях родительских и биспецифических антител и уменьшения процента неправильно спаренных тяжелых и легких цепей, остается потребность в биспецифических форматах, которые устраняют или минимизируют некоторые из недостатков, упомянутых выше.Bispecific antibodies based on IgG format, consisting of 2 heavy and two light chains, are obtained in various ways. For example, bispecific antibodies can be produced by fusing two antibody-secreting cell lines to create a new cell line, or by expressing two antibodies in a single cell using recombinant DNA technology. These approaches have provided a variety of antibody types because the corresponding heavy chains from each antibody can form monospecific dimers (also called homodimers), which contain two identical paired heavy chains with the same specificity, and bispecific dimers (also called heterodimers), which contain two different paired heavy chains. a pair of heavy chains with different specificities. In addition, light chains and heavy chains from each antibody may randomly pair to form unusable, non-functional combinations. This problem, known as heavy-light chain mispairing, can be solved by selecting antibodies that share a common light chain for expression as bispecifics. However, even when a common light chain is used, expression of two heavy chains and one common light chain in one cell will result in 3 different types of antibodies, i.e. two monospecific parent antibodies and a bispecific antibody, so that the bispecific antibody of interest must be purified from the resulting antibody mixture. Although technologies are being used to further increase the percentage of bispecific antibodies in mixtures of parent and bispecific antibodies and reduce the percentage of mispaired heavy and light chains, there remains a need for bispecific formats that eliminate or minimize some of the disadvantages mentioned above.

В целом, уровень техники обеспечивает множество технологий и способов получения моноклональных антител, биспецифических антител, смесей моноклональных антител или смесей моноспецифических и биспецифических антител, которые впоследствии можно использовать для терапевтического применения у пациентов. Однако, как рассмотрено выше, каждая из этих существующих технологий и способов имеет недостатки и ограничения.In general, the prior art provides a variety of technologies and methods for producing monoclonal antibodies, bispecific antibodies, mixtures of monoclonal antibodies, or mixtures of monospecific and bispecific antibodies, which can subsequently be used for therapeutic use in patients. However, as discussed above, each of these existing technologies and methods has disadvantages and limitations.

Таким образом, существует потребность в усовершенствованных и/или альтернативных технологиях для получения биологических лекарственных средств в форме смесей, или биспецифических подходах для нацеливания на несколько модифицирующих заболевание молекул.Thus, there is a need for improved and/or alternative technologies to produce biological drugs in the form of mixtures, or bispecific approaches to target multiple disease-modifying molecules.

Описание изобретенияDescription of the invention

Изобретение относится к способам и средствам для усовершенствованных и/или альтернативных технологий получения биологических лекарственных средств в форме смесей или к биспецифическим подходам для нацеливания на несколько модифицирующих заболевание молекул, а также к продуктам и применениям в результате этих способов и средств.The invention relates to methods and means for improved and/or alternative technologies for producing biological drugs in the form of mixtures or bispecific approaches for targeting multiple disease-modifying molecules, as well as products and applications resulting from these methods and means.

- 2 046272- 2 046272

В данной области описаны различные подходы для способствования образованию определенного представляющего интерес биспецифического антитела, тем самым уменьшая содержание нежелательных антител в полученной смеси.Various approaches have been described in the art to promote the formation of a particular bispecific antibody of interest, thereby reducing the amount of undesired antibodies in the resulting mixture.

Для антител хорошо известно, что взаимодействие CH3-CH3 является основной движущей силой для димеризации Fc (Ellerson J.R. et al., J. Immunol., 1976(116)510-517; Deisenhofer J. Biochemistry, 1981(20)2361-2370). Более того, хорошо известно, что, когда два CH3-домена взаимодействуют друг с другом, они встречаются на поверхности контакта белок-белок, которая содержит контактные остатки (также называемые контактными аминокислотами, остатками поверхности контакта или аминокислотами поверхности контакта). Контактные аминокислоты первого CH3-домена взаимодействуют с одной или несколькими контактными аминокислотами второго CH3-домена. Контактные аминокислоты, как правило, находятся в пределах 5,5 А (предпочтительно в пределах 4,5 А) друг от друга в трехмерной структуре антитела. Взаимодействие между контактными остатками из одного СНЗ-домена и контактными остатками из другого СНЗ-домена может осуществляться, например, через ван-дер-ваальсовы силы, водородные связи, опосредуемые водой водородные связи, солевые мостики или другие электростатические силы, силы притяжения между ароматическими боковыми цепями, дисульфидные связи или другие силы, известные специалисту в данной области. Ранее было показано, что приблизительно треть боковых цепей контактных аминокислот на поверхности контакта СНЗ-домена IgG1 человека может обуславливать основной вклад в сворачивание и ассоциацию домена. Кроме того, предполагалось, что другие (соседние) аминокислотные остатки могут влиять на взаимодействия на поверхности контакта белок-белок.For antibodies, it is well known that the CH3-CH3 interaction is the main driving force for Fc dimerization (Ellerson J.R. et al., J. Immunol., 1976(116)510-517; Deisenhofer J. Biochemistry, 1981(20)2361-2370) . Moreover, it is well known that when two CH3 domains interact with each other, they meet at a protein-protein interface that contains contact residues (also called contact amino acids, interface residues or interface amino acids). The contact amino acids of the first CH3 domain interact with one or more contact amino acids of the second CH3 domain. Contact amino acids are typically within 5.5 A (preferably within 4.5 A) of each other in the three-dimensional structure of the antibody. The interaction between contact residues from one CH3 domain and contact residues from another CH3 domain can occur, for example, through van der Waals forces, hydrogen bonds, water-mediated hydrogen bonds, salt bridges or other electrostatic forces, attractive forces between aromatic side chains chains, disulfide bonds or other forces known to one skilled in the art. It has previously been shown that approximately one-third of the contact amino acid side chains at the CHC domain interface of human IgG1 may be a major contributor to domain folding and association. In addition, it has been suggested that other (neighboring) amino acid residues may influence interactions at the protein-protein interface.

В данной области используют подходы, препятствующие димеризации тяжелых цепей антител. Использовали определенную модификацию способами инженерии СНЗ-доменов, чтобы способствовать гетеродимеризации относительно гомодимеризации. Примеры такой модификации способами инженерии поверхности контакта СНЗ-СНЗ включают внесение мутаций, обеспечивающих комплементарные выступы и полости, также известное как подходы выступ-в-полости, как описано, например, в WO 1998/050431; Ridgeway et al., 1996; и Merchant et al., 1998.In this area, approaches are used that prevent the dimerization of antibody heavy chains. Certain modifications by CH3 domain engineering methods have been used to promote heterodimerization relative to homodimerization. Examples of such modification by CNC-CNC interface engineering methods include introducing mutations to provide complementary protrusions and cavities, also known as protrusion-in-cavity approaches, as described, for example, in WO 1998/050431; Ridgeway et al., 1996; and Merchant et al., 1998.

Как правило, способ вовлекает внесение выпуклости на поверхности контакта первого полипептида и соответствующего углубления на поверхности контакта второго полипептида, так чтобы выступ мог располагаться в полости, обеспечивая образование гетеромультимера и препятствуя образованию гомомультимера. Выпуклости или выступы конструируют путем замены небольших боковых цепей аминокислот на поверхности контакта первого полипептида более крупными боковыми цепями (например, тирозин или триптофан). На поверхности контакта второго полипептида создают компенсирующие углубления или полости идентичного или сходного размера с выпуклостями путем замены крупных боковых цепей аминокислот меньшими (например, аланин или треонин). Выпуклость и углубление можно вносить способами синтеза, такими как изменение нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептиды, или пептидный синтез.Typically, the method involves introducing a protrusion on the contact surface of the first polypeptide and a corresponding depression on the contact surface of the second polypeptide so that the protrusion can be located in the cavity, allowing the formation of a heteromultimer and preventing the formation of a homomultimer. Bumps or protrusions are constructed by replacing small amino acid side chains at the interface of the first polypeptide with larger side chains (eg, tyrosine or tryptophan). Compensating depressions or cavities of identical or similar size to the protuberances are created on the contact surface of the second polypeptide by replacing large amino acid side chains with smaller ones (for example, alanine or threonine). The protuberance and depression can be introduced by synthetic methods such as alteration of the nucleic acid encoding the polypeptides or peptide synthesis.

При использовании технологии выступ-в-полости отдельно доля представляющего интерес биспецифического антитела составляет в наилучшем случае 87% смеси 2 родительских и биспецифических антител. Merchant et al. успешно увеличили долю биспецифических антител до 95% смеси путем внесения дополнительной дисульфидной связи между двумя доменами СН3 на поверхности контакта СН3СНЗ. Тем не менее, чтобы использовать такое биспецифическое антитело в качестве лекарственного средства, биспецифическое антитело необходимо очистить (отделить) от гомодимеров и составить в фармацевтически приемлемом разбавителе или эксципиенте. Очистка гетеродимеров из таких смесей является главной проблемой, вследствие сходства физико-химических свойств гомодимеров и гетеродимеров. Задачей настоящего изобретение является предоставление способов получения биспецифического антитела из клона единичной клетки с еще более увеличенной долей биспецифического антитела в смеси. Таким образом, в соответствии с изобретением, технологию выступ-в-полости можно использовать в качестве одного из средств, отдельно или вместе с другими средствами, для достижения указанного дальнейшего повышения доли биспецифического антитела в смеси.When using protrusion-in-cavity technology alone, the proportion of bispecific antibody of interest is at best 87% of the mixture of 2 parent and bispecific antibodies. Merchant et al. successfully increased the proportion of bispecific antibodies to 95% of the mixture by introducing an additional disulfide bond between two CH3 domains at the CH3CH3 interface. However, in order to use such a bispecific antibody as a drug, the bispecific antibody must be purified (separated) from homodimers and formulated in a pharmaceutically acceptable diluent or excipient. Purification of heterodimers from such mixtures is a major challenge due to the similarity in physicochemical properties of homodimers and heterodimers. It is an object of the present invention to provide methods for producing a bispecific antibody from a single cell clone with an even more increased proportion of bispecific antibody in the mixture. Thus, in accordance with the invention, projection-in-cavity technology can be used as one of the means, alone or together with other means, to achieve this further increase in the proportion of bispecific antibodies in the mixture.

Другим примером такой модификации способами инженерии поверхности контакта СНЗ-СНЗ является технология гетеродимерных Fc, которая способствует конструированию биспецифических и асимметричных слитых белков посредством разработки гетеродимеров СНЗ с модифицированным способом инженерии доменом с обменом цепями (SEED). Эти гетеродимеры СНЗ SEED являются производными доменов СНЗ IgG и IgA человека, которые состоят из чередующихся сегментов последовательностей СНЗ IgA и IgG человека, которые приводят к парам комплементарных гетеродимеров СНЗ SEED человека, так называемым SEED-тельцам (Davis J.H et al., Protein Engineering, Design & Selection, 2010(2З)195-202; WO 2007/110205).Another example of such modification by CH3-CHZ interface engineering is the heterodimeric Fc technology, which facilitates the construction of bispecific and asymmetric fusion proteins through the development of CHZ heterodimers with modified strand exchange domain engineering (SEED). These SEED CH3 heterodimers are derived from the human IgG and IgA CH3 domains, which consist of alternating segments of human IgA and human IgG CH3 sequences that result in pairs of complementary human SEED CH3 heterodimers, so-called SEED bodies (Davis J.H et al., Protein Engineering, Design & Selection, 2010(2З)195-202; WO 2007/110205).

Другой подход для получения данного представляющего интерес биспецифического антитела основан на электростатической модификации способами инженерии контактных остатков на поверхности контакта СНЗ-СНЗ, которые заряжены естественным образом, например, как описано в ЕР 01870459; или US 2010/00151ЗЗ; WO 2007/147901; WO 2010/129З04; Gunasekaran et al. (2010); и WO 2009/089004. В этих публикациях описаны мутации в доменах СНЗ тяжелых цепей, где встречающиеся в природе заряAnother approach for producing this bispecific antibody of interest is based on electrostatic modification by engineering contact residues at the CHC-CHC interface that are naturally charged, for example, as described in EP 01870459; or US 2010/00151ЗЗ; WO 2007/147901; WO 2010/129З04; Gunasekaran et al. (2010); and WO 2009/089004. These publications describe mutations in the CH3 domains of heavy chains, where naturally occurring

- З 046272 женные контактные аминокислотные остатки заменены аминокислотными остатками противоположного заряда (т.е. стратегия обращения заряда). Это обеспечивает измененную полярность заряда на поверхности контакта димера Fc так, что коэкспрессия электростатически соответствующих Fc-цепей способствует благоприятным силам притяжения, тем самым стимулируя образование желаемого гетеродимера Fc, в то время как неблагоприятный отталкивающий заряд подавляет образование нежелательного гомодимера Fc.- 3046272 female contact amino acid residues are replaced by amino acid residues of opposite charge (i.e. charge reversal strategy). This provides an altered charge polarity at the Fc dimer interface such that coexpression of electrostatically matched Fc chains promotes favorable attractive forces, thereby promoting the formation of the desired Fc heterodimer, while an unfavorable repulsive charge suppresses the formation of the undesired Fc homodimer.

Было описано, что на поверхности контакта CH3-CH3 четыре уникальных пары заряженных остатков вовлечены во взаимодействие домен-домен. Они представляют собой D356/K439', Е357/К37О', K392/D399' и D399/K409' (нумерация в соответствии с Kabat (1991), где остатки в первой цепи отделены от остатков во второй цепи с помощью ' /' и где штрих (') указывает на нумерацию остатка во второй цепи). Поскольку поверхность контакта CH3-CH3 обладает симметрией 2-го порядка, каждая уникальная пара зарядов представлена дважды в интактном IgG (т.е. также на поверхностях контакта присутствуют зарядовые взаимодействия K439/D356', К370/Е357', D399/K392' и K409/D399'). Учитывая эту симметрию второго порядка, было продемонстрировано, что однократное обращение заряда, например, K409D в первой цепи или D399'K во второй цепи, приводило к уменьшенному образованию гомодимера вследствие отталкивания идентичных зарядов. Комбинирование различных обращений заряда далее усилило этот эффект отталкивания. Было продемонстрировано, что экспрессия различных доменов CH3, содержащих различные комплементарные обращения заряда, может способствовать гетеродимеризации, что приводит к увеличенной доле биспецифических типов молекул в смеси.At the CH3-CH3 interface, four unique pairs of charged residues have been described to be involved in domain-domain interactions. They are D356/K439', E357/K37O', K392/D399' and D399/K409' (numbering according to Kabat (1991), where residues in the first chain are separated from residues in the second chain by ' /' and where the prime (') indicates the numbering of the residue in the second chain). Since the CH3-CH3 contact surface has 2nd order symmetry, each unique charge pair is represented twice in intact IgG (i.e., charge interactions K439/D356', K370/E357', D399/K392' and K409 are also present on the contact surfaces /D399'). Given this second-order symmetry, it was demonstrated that a single charge reversal, such as K409D in the first chain or D399'K in the second chain, resulted in reduced homodimer formation due to the repulsion of identical charges. Combining different charge reversals further enhanced this repulsive effect. It has been demonstrated that expression of different CH3 domains containing different complementary charge reversals can promote heterodimerization, resulting in an increased proportion of bispecific molecule types in the mixture.

С использованием подхода, описанного выше, можно получить биспецифическое антитело в одной клетке с содержанием в диапазоне от приблизительно 76% до приблизительно 96%. Задачей настоящего изобретения является предоставление способов получения биспецифического антитела в единичной клетке с еще более увеличенным процентом желаемых биспецифических антител. В соответствии с настоящим изобретением, в качестве одного из средств можно использовать технологию инженерии электростатического заряда, отдельно или вместе с другими средствами, например, подходами выступ-вполости, для достижения указанных еще более увеличенных процентов желаемых (биспецифических) антител.Using the approach described above, it is possible to obtain bispecific antibody per cell at levels ranging from about 76% to about 96%. It is an object of the present invention to provide methods for producing a bispecific antibody in a single cell with an even more increased percentage of the desired bispecific antibodies. In accordance with the present invention, electrostatic charge engineering technology can be used as one means, alone or in conjunction with other means, such as protrusion-hollow approaches, to achieve these even higher percentages of desired (bispecific) antibodies.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения по меньшей мере двух различных Ig-подобных молекул из одной клетки-хозяина, где каждая из двух указанных Ig-подобных молекул содержит два СНЗ-домена, которые способны образовывать поверхность контакта, причем указанный способ включает предоставление в указанной клеткеIn one aspect, the present invention relates to a method for producing at least two different Ig-like molecules from a single host cell, wherein each of the two Ig-like molecules contains two CH3 domains that are capable of forming a contact surface, the method comprising providing in the specified cell

а) первой молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей 1-ю содержащую СНЗ-домен полипептидную цепь;a) the first nucleic acid molecule encoding the 1st polypeptide chain containing the CH3 domain;

b) второй молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей 2-ю содержащую СНЗ-домен полипептидную цепь;b) a second nucleic acid molecule encoding a 2nd CH3 domain-containing polypeptide chain;

с) третьей молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей 3-ю содержащую СНЗ-домен полипептидную цепь; иc) a third nucleic acid molecule encoding a 3rd CH3 domain-containing polypeptide chain; And

d) четвертой молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей 4-ю содержащую СНЗ-домен полипептидную цепь, где по меньшей мере две из указанных молекул нуклеиновой кислоты предоставлены с помощью средств для предпочтительного спаривания указанных 1- и 2-го содержащих СНЗ-домен полипептидов и указанных 3- и 4-го содержащих СНЗ-домен полипептидов, причем указанный способ, кроме того, включает стадии культивирования клетки-хозяина, и обеспечения экспрессии указанных по меньшей мере четырех молекул нуклеиновой кислоты, и сбора указанных по меньшей мере двух различных Ig-подобных молекул из культуры.d) a fourth nucleic acid molecule encoding a 4th CH3 domain-containing polypeptide chain, wherein at least two of said nucleic acid molecules are provided by means for preferential pairing of said 1st and 2nd CH3 domain-containing polypeptides and said 3 - and a 4th CH3 domain-containing polypeptide, said method further comprising the steps of culturing a host cell, and causing expression of said at least four nucleic acid molecules, and collecting said at least two different Ig-like molecules from culture.

Часто является желательным получение более одного (биспецифического) антитела, например, для более эффективного препятствования множеству биологических каскадов, вовлеченных в процесс заболевания, или инвазии, репликации и/или распространению патогена.It is often desirable to obtain more than one (bispecific) antibody, for example, to more effectively interfere with multiple biological cascades involved in the disease process, or invasion, replication and/or spread of the pathogen.

Смесь более одного биспецифического антитела также является особенно пригодной для лечения определенных заболеваний. Например, опухолевые клетки используют множество различных стратегий для развития устойчивости во время лечения антителами или низкомолекулярными лекарственными средствами. Устойчивость может вовлекать несколько рецепторов клеточной поверхности и растворимых молекул, и считается полезной разработка способов лечения на основе антител от злокачественных опухолей, которые направлены на множество таких ассоциированных с заболеванием и ускользанием молекул одновременно. В случае когда вовлечено более 2 связанных с заболеванием и ускользанием молекул или эпитопов, смесь биспецифических антител обеспечивает инновационный и перспективный терапевтический формат. Предпочтительно такие смеси биспецифических антител продуцируются одной клеткой, чтобы обеспечить процесс разработки лекарственного средства, который является менее трудным с нормативной точки зрения и экономичным и осуществимым с точки зрения производства и клинической разработки лекарственного средства. В подходе на основе единичных клеток является желательным использование способов, которые обеспечивают контролируемое и эффективное получение биспецифических антител, таким образом, снижая или даже полностью устраняя необходимость в отделении желаемой смеси биспецифических IgG-молекул от нежелательных моноспецифических IgG-молекул. На уровне техA mixture of more than one bispecific antibody is also particularly useful for the treatment of certain diseases. For example, tumor cells use many different strategies to develop resistance during treatment with antibodies or small molecule drugs. Resistance may involve multiple cell surface receptors and soluble molecules, and the development of antibody-based therapies for cancers that target multiple such disease-associated and escape molecules simultaneously is considered beneficial. When more than 2 disease- and escape-related molecules or epitopes are involved, a mixture of bispecific antibodies provides an innovative and promising therapeutic format. Preferably, such mixtures of bispecific antibodies are produced from a single cell to provide a drug development process that is less regulatory burdensome and economical and feasible from a drug manufacturing and clinical development standpoint. In a single cell approach, it is desirable to use methods that provide controlled and efficient production of bispecific antibodies, thereby reducing or even eliminating the need to separate the desired mixture of bispecific IgG molecules from undesired monospecific IgG molecules. At the technical level

- 4 046272 ники смеси моноспецифических и биспецифических антител продуцировали из единичной клетки (WO 2004/009618), однако эти смеси отражают комплексные совокупности нескольких различных биспецифических и моноспецифических типов антител. Следующей задачей настоящего изобретения является предоставление средств и способов для получения определенных смесей биспецифических антител в единичных клетках. Предпочтительно предусматриваются способы, которые приводят к смесям (биспецифических) антител с долей по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97% или даже более 99% димерных IgG-молекул, безотносительно количества мономерных побочных продуктов, см. в настоящем описании ниже. Как правило, в клетке, где продуцируется множество интактных IgG-молекул, могут присутствовать половинные молекулы (мономерные побочные продукты), которые могут быть просто удалены с помощью эксклюзионной хроматографии, известной в данной области.- 4 046272 mixtures of monospecific and bispecific antibodies have been produced from a single cell (WO 2004/009618), but these mixtures reflect complex aggregates of several different bispecific and monospecific antibody types. A further object of the present invention is to provide means and methods for producing specific mixtures of bispecific antibodies in single cells. Preferably, methods are provided that result in mixtures of (bispecific) antibodies with a proportion of at least 95%, at least 97% or even more than 99% dimeric IgG molecules, regardless of the amount of monomeric by-products, see the present description below. Typically, in a cell where many intact IgG molecules are produced, half-molecules (monomeric by-products) may be present, which can simply be removed using size exclusion chromatography known in the art.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам получения смеси с определенным составом из по меньшей мере двух различных Ig-подобных молекул в единичных клетках вместо одного (биспецифического) представляющего интерес антитела, где образование других нежелательных димерных типов антител снижено или даже отсутствует. Полученная смесь имеет точно определенный состав, и этот состав контролируют путем конструирования мутантов CH3-домена. Более того, регуляция уровней экспрессии и/или различные соотношения при трансфекции, используемые для экспрессии, влияют на состав смеси. В способе по изобретению первая молекула нуклеиновой кислоты кодирует CH3-домен, который предпочтительно образует пару с CH3-доменом, кодируемым второй молекулой нуклеиновой кислоты, и третья нуклеиновая кислота молекулы кодирует CH3-домен, который предпочтительно образует пару с CH3-доменом, кодируемым четвертой молекулой нуклеиновой кислоты. Настоящее изобретение также относится к смесям по меньшей мере двух различных Ig-подобных молекул, получаемых способами по изобретению.In one embodiment, the present invention provides methods for producing a compositionally defined mixture of at least two different Ig-like molecules in single cells instead of a single (bispecific) antibody of interest, where the formation of other undesired dimeric antibody types is reduced or even eliminated. The resulting mixture has a precisely defined composition, and this composition is controlled by constructing CH3 domain mutants. Moreover, regulation of expression levels and/or different transfection ratios used for expression influence the composition of the mixture. In the method of the invention, the first nucleic acid molecule encodes a CH3 domain that preferably pairs with a CH3 domain encoded by a second nucleic acid molecule, and the third nucleic acid molecule encodes a CH3 domain that preferably pairs with a CH3 domain encoded by a fourth molecule nucleic acid. The present invention also relates to mixtures of at least two different Ig-like molecules obtained by the methods of the invention.

Как используют в рамках изобретения, термин предпочтительное образование пар между указанными 1- и 2-м содержащими CH3-домен полипептидами означает, что по существу все из полученных димеров, содержащих 1-й содержащий CH3-домен полипептид и/или 2-й содержащий CH3-домен полипептид, представляют собой димеры, состоящие из одного 1-го содержащего CH3-домен полипептида, образовавшего пару с одним 2-м содержащим CH3-домен полипептидом. Аналогично термин предпочтительное образование пар указанных 3- и 4-го содержащих CH3-домен полипептидов означает, что по существу все из полученных димеров, содержащих 3-ий содержащий CH3-домен полипептид и/или 4-й содержащий CH3-домен полипептид, представляют собой димеры, состоящие из одного 3-го содержащего CH3-домен полипептида, образовавшего пару с 4-ым содержащим CH3-домен полипептидом. В результате, когда молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие четыре различных (А, В, С, D) содержащих CH3-домен полипептида, вводят в единичную клетку вместо смеси 10 различных Ig-подобных димеров (АА, АВ, AC, AD, ВВ, ВС, BD, CC, CD и DD), образуется смесь в преимущественно двух конкретных Ig-подобных молекул.As used herein, the term preferential pairing between said 1st and 2nd CH3 domain-containing polypeptides means that substantially all of the resulting dimers containing a 1st CH3 domain-containing polypeptide and/or a 2nd CH3 domain-containing polypeptide -domain polypeptides are dimers consisting of one 1st CH3 domain-containing polypeptide paired with one 2nd CH3 domain-containing polypeptide. Likewise, the term preferential pairing of said 3rd and 4th CH3 domain-containing polypeptides means that substantially all of the resulting dimers containing a 3rd CH3 domain-containing polypeptide and/or a 4th CH3 domain-containing polypeptide are dimers consisting of one 3rd CH3 domain-containing polypeptide paired with a 4th CH3 domain-containing polypeptide. As a result, when nucleic acid molecules encoding four different (A, B, C, D) CH3 domain-containing polypeptides are introduced into a single cell instead of a mixture of 10 different Ig-like dimers (AA, AB, AC, AD, BB, BC , BD, CC, CD and DD), a mixture of predominantly two specific Ig-like molecules is formed.

Как более подробно объяснено в настоящем описании ниже, в предпочтительном варианте осуществления указанная первая содержащая CH3-домен полипептидная цепь содержит аминокислотную замену T366K, и указанная вторая содержащая CH3-домен полипептидная цепь содержит аминокислотную замену L351D. Эти аминокислотные замены являются предпочтительными средствами для преимущественного образования пар между указанными первой и второй содержащими CH3-домен полипептидными цепями. Указанная первая содержащая CH3-домен полипептидная цепь предпочтительно дополнительно содержит аминокислотную замену L351K. Более того, указанная вторая содержащая CH3-домен полипептидная цепь предпочтительно дополнительно содержит аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из Y349E, Y349D и L368E, наиболее предпочтительно L368E. В другом предпочтительном варианте осуществления указанная третья содержащая CH3-домен полипептидная цепь содержит аминокислотные замены Е356К и D399K, и указанная четвертая содержащая CH3-домен полипептидная цепь содержит аминокислотные замены K392D и K409D.As explained in more detail below herein, in a preferred embodiment, said first CH3 domain-containing polypeptide chain contains the T366K amino acid substitution, and said second CH3 domain-containing polypeptide chain contains the L351D amino acid substitution. These amino acid substitutions are a preferred means of preferentially pairing between said first and second CH3 domain-containing polypeptide chains. Said first CH3 domain-containing polypeptide chain preferably further comprises an L351K amino acid substitution. Moreover, said second CH3 domain-containing polypeptide chain preferably further comprises an amino acid substitution selected from the group consisting of Y349E, Y349D and L368E, most preferably L368E. In another preferred embodiment, said third CH3 domain-containing polypeptide chain contains amino acid substitutions E356K and D399K, and said fourth CH3 domain-containing polypeptide chain contains amino acid substitutions K392D and K409D.

В способе в соответствии с настоящим изобретением каждая из содержащих CH3-домен полипептидных цепей дополнительно содержит вариабельную область, распознающую эпитоп-мишень. Вариабельные области, которые являются частью содержащих CH3-домен полипептидных цепей, предпочтительно имеют общую легкую цепь. В этом случае только VH вариабельных областей различаются, в то время как VL во всех вариабельных областях являются по существу одинаковыми. Таким образом, в предпочтительном аспекте предусматривается способ по изобретению, который дополнительно включает предоставление указанной клетке-хозяину молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей общую легкую цепь. В одном особенно предпочтительном варианте осуществления каждая из указанных 4 вариабельных областей 4 содержащих CH3-домен полипептидных цепей распознает отличающийся эпитопмишень. Например, если первая молекула нуклеиновой кислоты кодирует тяжелую цепь, которая дополнительно содержит вариабельный домен, обладающий специфичностью к антигену А, вторая молекула нуклеиновой кислоты кодирует тяжелую цепь, которая дополнительно содержит вариабельный домен, обладающий специфичностью к антигену В, третья молекула нуклеиновой кислоты кодирует тяжелую цепь, которая дополнительно содержит вариабельный домен, обладающий специфичностью к антигену С, и четвертая молекула нуклеиновой кислоты кодирует тяжелую цепь, которая дополнительно содержит вариаIn the method of the present invention, each of the CH3 domain-containing polypeptide chains further comprises a variable region recognizing a target epitope. Variable regions that are part of CH3 domain-containing polypeptide chains preferably share a common light chain. In this case, only the VH of the variable regions are different, while the VL in all variable regions are essentially the same. Thus, in a preferred aspect, a method of the invention is provided which further comprises providing said host cell with a nucleic acid molecule encoding a common light chain. In one particularly preferred embodiment, each of said 4 variable regions of 4 CH3 domain-containing polypeptide chains recognizes a different target epitope. For example, if the first nucleic acid molecule encodes a heavy chain that further contains a variable domain having specificity for antigen A, the second nucleic acid molecule encodes a heavy chain that further contains a variable domain having specificity for antigen B, the third nucleic acid molecule encodes a heavy chain , which further contains a variable domain having specificity for the C antigen, and the fourth nucleic acid molecule encodes a heavy chain, which further contains a variable

- 5 046272 бельный домен, обладающий специфичностью к антигену D, то будет получена смесь, содержащая биспецифические Ig-подобные молекулы, которые являются специфичными к АВ, и биспецифические Igподобные молекулы, которые являются специфичными к CD. Образование моноспецифических антител (со специфичностью к АА, ВВ, СС или DD) или биспецифических антител со специфичностью к AC, AD, ВС или BD снижается или даже отсутствует с помощью средств для предпочтительного образования пар указанных 1- и 2-го содержащих CH3-домен полипептидов и указанных 3- и 4-го содержащих CH3-домен полипептидов. Безусловно, можно использовать дополнительные молекулы нуклеиновой кислоты, например кодирующие 5- и 6-й содержащие CH3-домен полипептиды, для получения определенных смесей, содержащих более двух различных Ig-подобных молекул.- 5 046272 white domain having specificity for the D antigen, a mixture will be obtained containing bispecific Ig-like molecules that are specific for AB and bispecific Ig-like molecules that are specific for CD. The formation of monospecific antibodies (with specificity for AA, BB, CC or DD) or bispecific antibodies with specificity for AC, AD, BC or BD is reduced or even eliminated by means of preferential pairing of said 1- and 2-containing CH3 domains polypeptides and said 3- and 4-CH3 domain-containing polypeptides. It is of course possible to use additional nucleic acid molecules, such as those encoding the 5th and 6th CH3 domain containing polypeptides, to produce certain mixtures containing more than two different Ig-like molecules.

Следует отметить, что соотношение нуклеиновых кислот, используемых в способе по изобретению, не должно составлять 1:1:1:1, и соотношение полученных Ig-подобных молекул, которые экспрессируются, не должно составлять 1:1. Возможно использовать средства, известные в данной области, для получения смесей антител с оптимизированными соотношениями. Например, уровни экспрессии молекул нуклеиновой кислоты и, таким образом, соотношения полученных Ig-подобных молекул, можно регулировать с использованием различных генетических элементов, таких как промоторы, энхансеры и репрессоры, или посредством контроля участка встраивания в геном или количества копий конструкций ДНК, кодирующих антитела.It should be noted that the ratio of nucleic acids used in the method of the invention should not be 1:1:1:1, and the ratio of the resulting Ig-like molecules that are expressed should not be 1:1. It is possible to use means known in the art to obtain mixtures of antibodies with optimized ratios. For example, the expression levels of nucleic acid molecules, and thus the ratio of Ig-like molecules produced, can be controlled using various genetic elements such as promoters, enhancers and repressors, or by controlling the genomic insertion site or copy number of DNA constructs encoding antibodies .

Указанные средства для преимущественного образования пар предпочтительно могут включать внесенные способами инженерии комплементарные мутации выступ-в-полости, дисульфидные мостики, мутации заряда, включая мутации с обращением заряда, или их комбинации. Квалифицированному специалисту будет понятно, что указанные средства для преимущественного образования пар могут быть выбраны из определенного типа мутаций, т.е. все из по меньшей мере 4 молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих содержащие CH3-домен полипептидные цепи, могут, например, содержать мутации заряда в качестве средств предпочтительного образования пар. Кроме того, также в определенных случаях можно использовать не модифицированный способами инженерии CH3 дикого типа для преимущественного образования пар между двумя содержащими СН3-домен полипептидными цепями дикого типа. В особенно предпочтительном варианте осуществления указанное средство для преимущественного образования пар включает по меньшей мере одну мутацию CH3, выбранную из табл. В, как объяснено в настоящей заявке. Таким образом, один предпочтительный вариант осуществления относится к способу в соответствии с настоящим изобретением, где все 4 из указанных молекул нуклеиновой кислоты предоставлены со средствами для преимущественного образования пар между указанными 1- и 2-м содержащими CH3-домен полипептидами и указанными 3- и 4-м содержащими СН3-домен полипептидами, где указанное средство для преимущественного образования пар между указанными 1- и 2-м содержащими CH3-домен полипептидами отличаются от средств для преимущественного образования пар между указанным 3 и 4-м содержащими СН3-домен полипептидами.These preferential pairing agents may preferably include engineered complementary protrusion-in-cavity mutations, disulfide bridges, charge mutations, including charge reversal mutations, or combinations thereof. One skilled in the art will appreciate that said means for preferential pairing may be selected from a particular type of mutation, i.e. all of the at least 4 nucleic acid molecules encoding CH3 domain-containing polypeptide chains may, for example, contain charge mutations as means of preferential pairing. In addition, it is also possible in certain cases to use unengineered wild-type CH3 to preferentially pair between two wild-type CH3 domain-containing polypeptide chains. In a particularly preferred embodiment, said preferential pairing agent comprises at least one CH3 mutation selected from Table 1. B, as explained herein. Thus, one preferred embodiment relates to the method in accordance with the present invention, wherein all 4 of said nucleic acid molecules are provided with means for preferentially pairing between said 1 and 2 CH3 domain containing polypeptides and said 3 and 4 -m CH3 domain-containing polypeptides, wherein the means for preferential pairing between said 1 and 2 CH3 domain-containing polypeptides is different from the means for preferential pairing between said 3 and 4 CH3 domain-containing polypeptides.

Один аспект настоящего изобретения относится к способу по изобретению, где указанное средство для преимущественного образования пар между указанными 1- и 2-м содержащими СН3-домен полипептидами отличается от указанных средств для преимущественного образования пар между указанными 3- и 4-м содержащими СНЗ-домен полипептидами. Под отличающимся подразумевают, что средства для преимущественного образования пар между указанными 1- и 2-м содержащими СН3-домен полипептидами сконструированы так, чтобы способствовать преимущественному образованию пар между 1- и 2-й цепями. Конструкция является такой, чтобы по существу не происходило взаимодействия между 1- и 3и/или 4-й содержащими СН3-домен полипептидными цепями. Иными словами, димеризация между указанным 1-м содержащим СН3-домен полипептидом и указанным 3- или 4-м полипептидом снижается по существу до нуля и т.п. 3- и 4-й Содержащие СН3-домен полипептиды либо могут представлять собой полипептиды дикого типа, либо могут содержать средства для преимущественного образования пар, которые отличаются от средств для преимущественного образования пар между 1- и 2-м СН3-доменами. Современные исследования были сфокусированы на продуцировании одного биспецифического антитела с использованием, например, технологии выступ-в-полости или мутаций (реверсий) заряженных контактных аминокислот, присутствующих в СН3-доменах. Однако получение определенных смесей по меньшей мере двух (биспецифических) Ig-подобных молекул без значительного дополнительного продуцирования других димерных побочных продуктов не было осуществлено до настоящего изобретения.One aspect of the present invention relates to a method of the invention, wherein said means for preferential pairing between said 1 and 2 CH3 domain containing polypeptides is different from said means for preferential pairing between said 3 and 4 CH3 domain containing polypeptides. polypeptides. By different is meant that the means for preferential pairing between said 1 and 2 CH3 domain-containing polypeptides are designed to promote preferential pairing between the 1 and 2 chains. The design is such that there is essentially no interaction between the 1- and 3- and/or 4-CH3 domain-containing polypeptide chains. In other words, dimerization between said 1st CH3 domain-containing polypeptide and said 3rd or 4th polypeptide is reduced to substantially zero, and the like. The 3rd and 4th CH3 domain-containing polypeptides may either be wild-type polypeptides or may contain preferential pairing agents that are different from the preferential pairing agents between the 1st and 2nd CH3 domains. Current research has focused on the production of a single bispecific antibody using, for example, projection-in-cavity technology or mutations (reversions) of charged contact amino acids present in the CH3 domains. However, the production of defined mixtures of at least two (bispecific) Ig-like molecules without significant additional production of other dimeric by-products has not been accomplished prior to the present invention.

Настоящее изобретение относится к способам эффективного и контролируемого получения смеси Ig-подобных молекул с точно определенным составом, содержащей высокую долею биспецифических молекул в смеси. В системе, в которой являются желательными две биспецифических молекулы, достигают даже доли (двух) биспецифических соединений по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97% или более. Это означает, что получают только не более 5%, не более 3% или менее моноспецифических двухвалентных побочных продуктов. Следует отметить, что количество мономерных побочных продуктов, т.е. половинных молекул, является менее важным, поскольку эти половинные молекулы без труда отделяют от димеров с использованием их отличий по размеру.The present invention relates to methods for efficiently and controllably producing a mixture of Ig-like molecules with a precisely defined composition, containing a high proportion of bispecific molecules in the mixture. In a system in which two bispecific molecules are desired, even the proportion of (two) bispecific compounds is at least 95%, at least 97% or more. This means that only no more than 5%, no more than 3%, or less monospecific divalent by-products are obtained. It should be noted that the amount of monomeric by-products, i.e. half molecules is less important since these half molecules are easily separated from dimers using their size differences.

В другом предпочтительном варианте осуществления вариабельные области 1- и 2-й содержащих СН3-домен полипептидных цепей распознают различные эпитопы-мишени, в то время как вариабельныеIn another preferred embodiment, the variable regions of the 1st and 2nd CH3 domain-containing polypeptide chains recognize different target epitopes, while the variable regions

- 6 046272 области 3- и 4-й содержащих СНЗ-домен полипептидных цепей распознают те же эпитопы-мишени. Это приводит к преимущественному образованию одного типа биспецифической Ig-подобной молекулы и одного типа моноспецифической Ig-подобной молекулы. Например, если вариабельные области 1- и 2-й содержащих CH3-домен полипептидных цепей распознают различные эпитопы-мишени и если обе вариабельные области 3- и 4-й содержащих СН3-домен полипептидных цепей распознают один и тот же эпитоп-мишень, который отличается от эпитопов-мишеней, распознаваемых 1- и 2-м CH3-доменами, будет образовываться смесь Ig-подобных молекул, обладающих специфичностью к АВ или СС. Кроме того, таким образом, предусматривается способ по изобретению, где эпитоп-мишень, распознаваемый вариабельными областями 3- и 4-й содержащими CH3-домен полипептидными цепями, является одинаковым, но отличается от эпитопа-мишени, распознаваемого вариабельной областью 1- или 2-й содержащих CH3-домен полипептидных цепей.- 6 046272 regions of the 3rd and 4th CH3 domain-containing polypeptide chains recognize the same target epitopes. This results in the preferential formation of one type of bispecific Ig-like molecule and one type of monospecific Ig-like molecule. For example, if the variable regions of the 1st and 2nd CH3 domain-containing polypeptide chains recognize different target epitopes and if both the variable regions of the 3rd and 4th CH3 domain-containing polypeptide chains recognize the same target epitope, which is different from target epitopes recognized by the 1st and 2nd CH3 domains, a mixture of Ig-like molecules with specificity for AB or CC will be formed. Furthermore, the method of the invention is thus provided wherein the target epitope recognized by the variable regions 3- and 4-CH3 domain-containing polypeptide chains is the same but different from the target epitope recognized by the variable region 1- or 2- and CH3 domain-containing polypeptide chains.

Альтернативно, когда вариабельные области 1- и 2-й содержащих CH3-домен полипептидных цепей распознают различные эпитопы-мишени, и когда обе вариабельные области 3- и 4-й содержащих CH3-домен полипептидных цепей распознают тот же эпитоп, что и 1- или 2-я содержащие CH3-домен полипептидные цепи, будет образовываться смесь Ig-подобных молекул, обладающих специфичностью к АВ и АА, или АВ и ВВ. Таким образом, также предусматривается способ по изобретению, где эпитопмишень, распознаваемый вариабельными областями 3- и 4-й содержащих CH3-домен полипептидных цепей, является таким же, как и эпитоп-мишень, распознаваемый вариабельной областью 1- или 2-й содержащих СН3-домен полипептидных цепей.Alternatively, when the variable regions of the 1 and 2 CH3 domain containing polypeptide chains recognize different target epitopes, and when both the variable regions of the 3 and 4 CH3 domain containing polypeptide chains recognize the same epitope as the 1 or 2nd polypeptide chains containing the CH3 domain, a mixture of Ig-like molecules will be formed that have specificity for AB and AA, or AB and BB. Thus, also provided is the method of the invention, wherein the target epitope recognized by the variable regions of the 3- and 4-th CH3-domain-containing polypeptide chains is the same as the target epitope recognized by the variable region of the 1- or 2-th CH3-containing polypeptide chains. domain of polypeptide chains.

Другой задачей настоящего изобретения является предоставление средств и способов для получения определенных смесей биспецифических антител и моноспецифических антител в культуре отдельных клеток. Неограничивающим примером такой смеси с точно определенным составом является смесь биспецифических антител со специфичностью АВ и моноспецифических антител со специфичностью АА. Другим примером является смесь биспецифических антител со специфичностью АВ и моноспецифических антител со специфичностью ВВ. Другим примером является смесь биспецифических антител со специфичностью АВ и моноспецифических антител со специфичностью СС. Вновь предпочтительно предусматриваются средства и способы, которые обеспечивают смеси представляющих интерес антител с по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 97% или даже более 99% желаемых антител.Another object of the present invention is to provide means and methods for producing certain mixtures of bispecific antibodies and monospecific antibodies in single cell culture. A non-limiting example of such a mixture with a precisely defined composition is a mixture of bispecific antibodies with specificity AB and monospecific antibodies with specificity AA. Another example is a mixture of bispecific antibodies with AB specificity and monospecific antibodies with BB specificity. Another example is a mixture of bispecific antibodies with AB specificity and monospecific antibodies with CC specificity. Again, preferably, means and methods are provided that provide mixtures of antibodies of interest with at least 90%, more preferably at least 95%, and most preferably at least 97% or even greater than 99% of the desired antibodies.

В другом варианте осуществления предусматривается способ по изобретению, где вариабельные области 1- и 2-й содержащих CH3-домен полипептидных цепей распознают один и тот же эпитопмишень, в то время как вариабельные области 3- и 4-й содержащих CH3-домен полипептидных цепей распознают второй эпитоп-мишень, который отличается от эпитопа-мишени, распознаваемого указанными 1- и 2-й вариабельными областями. Это приведет к преимущественной продукции моноспецифических Ig-подобных молекул, обладающих либо специфичностью к АА, либо специфичностью к ВВ. Образование биспецифических Ig-подобных молекул снижается или даже устраняется. В нескольких вариантах осуществления является предпочтительным продуцирование смесей моноспецифических антител в одной клетке, а не смесей биспецифических антител. Например, это является предпочтительным, когда является желательным сшивание двух идентичных молекул-мишеней, или когда две мишени расположены слишком далеко друг от друга так, что они не могут связываться одним биспецифическим антителом. Также может быть предпочтительным получение смесей моноспецифических антител в единичной клетке, поскольку смесь может считаться единым терапевтическим продуктом. В данной области терапевтическая эффективность и безопасность различных моноспецифических антител уже была доказана, и было получено разрешение для выпуска в продажу. Таким образом, получение смесей моноспецифических антител в одной клетке будет упрощать исследование эффективности и безопасности нескольких таких смесей и снизит усилия и затраты на разрешение контролирующего органа и производство. Однако в настоящее время не существует способов, доступных для получения конкретных смесей моноспецифических антител в одной клетке, где образование биспецифических побочных продуктов снижено до менее чем 5%. Другой задачей настоящего изобретения является предоставление средств и способов для получения таких смесей с определенным составом из гомодимерных антител в единичных клетках, где образование биспецифических антител снижено до уровня менее 5%.In another embodiment, a method of the invention is provided wherein the variable regions of the 1st and 2nd CH3 domain containing polypeptide chains recognize the same target epitope, while the variable regions of the 3rd and 4th CH3 domain containing polypeptide chains recognize a second target epitope that is different from the target epitope recognized by said 1 and 2 variable regions. This will lead to the preferential production of monospecific Ig-like molecules with either AA specificity or EV specificity. The formation of bispecific Ig-like molecules is reduced or even eliminated. In several embodiments, it is preferred to produce mixtures of monospecific antibodies in a single cell rather than mixtures of bispecific antibodies. For example, this is preferred when cross-linking of two identical target molecules is desired, or when the two targets are located too far apart so that they cannot be bound by a single bispecific antibody. It may also be preferable to produce mixtures of monospecific antibodies in a single cell, since the mixture can be considered a single therapeutic product. In this field, the therapeutic efficacy and safety of various monospecific antibodies have already been proven and marketing approval has been obtained. Thus, producing mixtures of monospecific antibodies in a single cell will simplify the study of the effectiveness and safety of several such mixtures and will reduce the effort and cost of regulatory approval and production. However, there are currently no methods available to produce specific mixtures of monospecific antibodies in a single cell where the formation of bispecific byproducts is reduced to less than 5%. Another object of the present invention is to provide means and methods for producing such mixtures with a defined composition of homodimeric antibodies in single cells, where the formation of bispecific antibodies is reduced to a level of less than 5%.

Таким образом, способ в соответствии с настоящим изобретением является пригодным для получения любой желаемой смеси биспецифических и/или моноспецифических Ig-подобных молекул. Вновь является возможным использование дополнительных молекул нуклеиновой кислоты, например, кодирующих 5- и 6-й (и 7- и 8-й и т.д.) содержащий CH3-домен полипептид, для получения смесей с определенным составом, содержащих более двух различных Ig-подобных молекул.Thus, the method in accordance with the present invention is suitable for obtaining any desired mixture of bispecific and/or monospecific Ig-like molecules. It is again possible to use additional nucleic acid molecules, for example those encoding the 5th and 6th (and 7th and 8th, etc.) CH3 domain-containing polypeptide, to obtain compositionally defined mixtures containing more than two different Igs -like molecules.

Предпочтительно в способе в соответствии с настоящим изобретением используют по меньшей мере два CH3-домена, которые содержат по меньшей мере одну комбинацию мутаций, предусматриваемых настоящим изобретением. С помощью этих мутаций формируются новые специфические взаимодействия между двумя CH3-доменами. Эти мутации в соответствии с настоящим изобретением более подробно рассмотрены ниже.Preferably, the method of the present invention uses at least two CH3 domains that contain at least one combination of mutations contemplated by the present invention. With the help of these mutations, new specific interactions are formed between the two CH3 domains. These mutations in accordance with the present invention are discussed in more detail below.

Термин Ig-подобная молекула, как используют в рамках изобретения, означает белковую молекуThe term Ig-like molecule, as used herein, means a protein molecule

- 7 046272 лу, которая обладает по меньшей мере одним доменом иммуноглобулина (Ig). Указанная Ig-подобная молекула содержит последовательность, имеющую функцию по меньшей мере CH3-домена иммуноглобулина, предпочтительно последовательность содержит CH3-домен IgG1. Белковые молекулы, которые обладают по меньшей мере CH3-доменом, могут быть далее снабжены определенными связывающими частями. CH3-домены по настоящему изобретению, содержащие средства для преимущественного образования пар, таким образом, можно использовать для преимущественного образования пар между двумя содержащими CH3-домен белковыми молекулами для конструирования желаемых гетеродимерных связывающих молекул или смесей связывающих молекул. Связывающие части, которые могут быть включены в содержащие CH3-домен белковые молекулы, могут представлять собой любую связывающую структуру, включая, но не ограничиваясь ими, одноцепочечные Fv, одноцепочечные или тандемные диантитела (TandAb®), VHH, Anticalin®, Nanobody®, BiTE®, Fab, белки с анкириновыми повторами или DARPIN®, Avimer®, DART, TCR-подобное антитело, Adnectin®, Affilin®, Trans-body®, Affibody®, TrimerX®, MicroProteins, Fynomer®, Centyrin® или KALBITOR®. В предпочтительном варианте осуществления связывающие части представляют собой вариабельные области антител (т.е. комбинации VH/VL). Вариабельные области, которые являются частью содержащих CH3-домен полипептидных цепей, предпочтительно имеют общую легкую цепь. В этом случае отличаются только VH вариабельных областей, в то время как VL во всех вариабельных областях являются по существу одинаковыми.- 7 046272 lu, which has at least one immunoglobulin (Ig) domain. Said Ig-like molecule contains a sequence having the function of at least an immunoglobulin CH3 domain, preferably the sequence contains an IgG1 CH3 domain. Protein molecules that have at least a CH3 domain can be further provided with certain binding moieties. The CH3 domains of the present invention containing preferential pairing agents can thus be used to preferentially pair between two CH3 domain-containing protein molecules to construct desired heterodimeric binding molecules or mixtures of binding molecules. The binding moieties that may be included in CH3 domain-containing protein molecules can be any binding structure, including, but not limited to, single chain Fv, single chain or tandem diantibodies (TandAb®), VHH, Anticalin®, Nanobody®, BiTE ®, Fab, ankyrin repeat proteins or DARPIN®, Avimer®, DART, TCR-like antibody, Adnectin®, Affilin®, Trans-body®, Affibody®, TrimerX®, MicroProteins, Fynomer®, Centyrin® or KALBITOR®. In a preferred embodiment, the binding moieties are antibody variable regions (ie, VH/VL combinations). Variable regions that are part of CH3 domain-containing polypeptide chains preferably share a common light chain. In this case, only the VHs of the variable regions differ, while the VLs in all variable regions are substantially the same.

Альтернативно или дополнительно к CH3-доменам по настоящему изобретению можно присоединять способами инженерии другие молекулы, включая цитокины, гормоны, растворимые лиганды, рецепторы и/или пептиды.Alternatively or in addition to the CH3 domains of the present invention, other molecules can be engineered, including cytokines, hormones, soluble ligands, receptors, and/or peptides.

В более предпочтительном варианте осуществления указанная Ig-подобная молекула содержит полноразмерный остов Fc. В наиболее предпочтительном варианте осуществления Ig-подобные молекулы представляют собой антитела. Вариабельные области этих антител предпочтительно обладают общей легкой цепью, однако они могут различаться в их VH-областях. Термин антитело, как используют в рамках изобретения, означает белковую молекулу, принадлежащую иммуноглобулиновому классу белков, содержащую один или несколько доменов, которые связывают эпитоп на антигене, где такие домены происходят из вариабельной области антитела или обладают гомологией последовательности с ней.In a more preferred embodiment, said Ig-like molecule contains a full-length Fc backbone. In the most preferred embodiment, the Ig-like molecules are antibodies. The variable regions of these antibodies preferably share a common light chain, however they may differ in their VH regions. The term antibody, as used herein, means a protein molecule belonging to the immunoglobulin class of proteins containing one or more domains that bind an epitope on an antigen, where such domains are derived from or have sequence homology to the variable region of the antibody.

Антитела известны в данной области и включают несколько изотипов, таких как IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE и IgM. Антитело по изобретению может представлять собой любой из этих изотипов или их функциональное производное и/или фрагмент. В предпочтительном варианте осуществления получают Ig-подобные молекулы, которые представляют собой антитела IgG-изотипа, поскольку IgG-антитела, например, имеют более длительное время полужизни по сравнению с антителами других изотипов.Antibodies are known in the art and include several isotypes such as IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE and IgM. The antibody of the invention may be any of these isotypes or a functional derivative and/or fragment thereof. In a preferred embodiment, Ig-like molecules are produced that are antibodies of the IgG isotype, since IgG antibodies, for example, have a longer half-life compared to antibodies of other isotypes.

Антитела, полученные способами в соответствии с настоящим изобретением, могут иметь последовательности любого происхождения, включая последовательности мыши и человека. Антитела могут состоять из последовательностей, имеющих только одно происхождение, или они могут иметь последовательности, имеющие более одного происхождения, с образованием например химерных или гуманизированных антител. Антитела для терапевтического применения, предпочтительно настолько сходны с природными антителами индивидуума, подвергаемого лечению, насколько это возможно (например, антитела человека для людей). Связывание антитела может быть выражено в величинах специфичности и аффинности. Специфичность определяет, какой антиген или его эпитоп связывается связывающим доменом. Аффинность является мерой прочности связывания с конкретным антигеном или эпитопом. Специфическое связывание определяют как связывание с аффинностью (K_D) по меньшей мере 1х 10^-5 М, более предпочтительно 1х10^-7 M, более предпочтительно более 1х10^-9 M. Как правило, моноклональные антитела для терапевтического применения обладают аффинностью вплоть до 1х10^-10 М или даже выше. Термин антиген, как используют в рамках изобретения, означает вещество или молекулу, которые при введении в организм запускают продукцию антитела иммунной системой. Антиген, среди прочих, может происходить из патогенных организмов, опухолевых клеток или других аберрантных клеток, из гаптенов или даже из собственных структур. На молекулярном уровне антиген характеризуется способностью быть связанным антигенсвязывающим участком антитела. Также антигеном могут считаться смеси антигенов, т.е. квалифицированному специалисту будет понятно, что иногда лизат опухолевых клеток или вирусные частицы могут быть указаны как антиген, в то время как такой лизат опухолевых клеток или препарат вирусных частиц состоит из множества антигенных детерминант. Антиген содержит по меньшей мере один эпитоп, но часто более. Термин эпитоп, как используют в рамках изобретения, означает часть антигена, которая распознается иммунной системой, в частности, антителами, В-клетками или Т-клетками. Хотя обычно полагают, что эпитопы происходят из несобственных белков, последовательности, происходящие из хозяина, которые могут распознаваться, также классифицируют как эпитопы.Antibodies produced by the methods of the present invention may have sequences of any origin, including mouse and human sequences. Antibodies may consist of sequences having only one origin, or they may have sequences having more than one origin, forming, for example, chimeric or humanized antibodies. Antibodies for therapeutic use are preferably as similar to the natural antibodies of the individual being treated as possible (eg, human antibodies for humans). Antibody binding can be expressed in terms of specificity and affinity. Specificity determines which antigen or its epitope is bound by the binding domain. Affinity is a measure of the strength of binding to a specific antigen or epitope. Specific binding is defined as binding with an affinity (K _D ) of at least 1 x 10 ^-5 M, more preferably 1 x 10 ^-7 M, more preferably greater than 1 x 10 ^-9 M. Typically, monoclonal antibodies for therapeutic use have affinities up to 1 x 10 ^-10 M or even higher. The term antigen, as used herein, means a substance or molecule that, when introduced into the body, triggers the production of an antibody by the immune system. The antigen, among others, can be derived from pathogenic organisms, tumor cells or other aberrant cells, from haptens or even from self-structures. At the molecular level, an antigen is characterized by its ability to be bound by the antigen-binding site of an antibody. Antigens can also be considered mixtures of antigens, i.e. one skilled in the art will appreciate that sometimes a tumor cell lysate or viral particle may be indicated as an antigen when such a tumor cell lysate or viral particle preparation is composed of multiple antigenic determinants. An antigen contains at least one epitope, but often more. The term epitope, as used herein, means the portion of an antigen that is recognized by the immune system, in particular by antibodies, B cells or T cells. Although epitopes are generally believed to be derived from non-self proteins, host-derived sequences that can be recognized are also classified as epitopes.

Термин CH3-домен хорошо известен в данной области. Структура IgG имеет четыре цепи: две легких цепи и две тяжелых цепи; каждая легкая цепь имеет два домена: вариабельная и константная область легкой цепи (VL и CL), и каждая тяжелая цепь имеет четыре домена: вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и три константных домена тяжелой цепи (CH1, CH2, CH3). Область СН2- и О№-домена тяжелой цепи называют областью Fc (кристаллизующийся фрагмент), Fc-фрагментом, Fc-остовом или простоThe term CH3 domain is well known in the art. The structure of IgG has four chains: two light chains and two heavy chains; each light chain has two domains: a light chain variable and a constant region (VL and CL), and each heavy chain has four domains: a heavy chain variable domain (VH) and three heavy chain constant domains (CH1, CH2, CH3). The region of the CH2 and OIII domain of the heavy chain is called the Fc region (crystallizing fragment), Fc fragment, Fc core, or simply

- 8 046272- 8 046272

Fc. Молекула IgG представляет собой гетеротетрамер, имеющий две тяжелых цепи, которые удерживаются вместе дисульфидными связями (-S-S-) в шарнирной области и двумя легкими цепями. Тяжелые цепи димеризуются посредством взаимодействий на поверхности контакта доменов CH3-CH3 и посредством взаимодействий в шарнирной области. Количество дисульфидных связей в шарнирной области варьирует среди подклассов иммуноглобулинов (Papadea and Check, 1989). Fc-фрагмент молекулы иммуноглобулина представляет собой димер двух С-концевых константных областей, т.е. СН2- и CH3-доменов, тяжелой цепи. Среди его физиологических функций находятся взаимодействия с системой комплемента и с определенными рецепторами на поверхности различных клеток. Известно, что взаимодействия между CH3-доменами двух индивидуальных тяжелых цепей играют важную роль в запуске димеризации тяжелых цепей. Таким образом, CH3-домены контролируют ассоциацию тяжелых цепей антитела, и известно, что поверхность контакта между CH3-доменами содержит более 20 контактных остатков из каждой цепи, которые участвуют во взаимодействии CH3-CH3 (Deisenhofer J., Biochemistry, 1981(20)2361-2370; Miller S., J. Mol. Biol., 1990(216)965-973; Padlan, Advances in Protein Chemistry, 1996(49)57-133). Таким образом, варианты CH3 по настоящему изобретению можно использовать вместе с другими доменами антител для получения полноразмерных антител, которые являются либо биспецифическими, либо моноспецифическими. Специфичность антитела, определяемая комбинациями VH/VL, как правило, не влияет на поведение димеризации тяжелых цепей, обеспечиваемое доменами CH3.Fc. The IgG molecule is a heterotetramer having two heavy chains that are held together by disulfide bonds (-S-S-) in the hinge region and two light chains. Heavy chains dimerize through interactions at the CH3-CH3 domain interface and through interactions at the hinge region. The number of disulfide bonds in the hinge region varies among immunoglobulin subclasses (Papadea and Check, 1989). The Fc fragment of an immunoglobulin molecule is a dimer of two C-terminal constant regions, i.e. CH2 and CH3 domains, heavy chain. Among its physiological functions are interactions with the complement system and with certain receptors on the surface of various cells. Interactions between the CH3 domains of two individual heavy chains are known to play an important role in triggering heavy chain dimerization. Thus, CH3 domains control the association of antibody heavy chains, and it is known that the contact surface between CH3 domains contains more than 20 contact residues from each chain that are involved in the CH3-CH3 interaction (Deisenhofer J., Biochemistry, 1981(20)2361 -2370; Miller S., J. Mol. Biol., 1990(216)965-973; Padlan, Advances in Protein Chemistry, 1996(49)57-133). Thus, the CH3 variants of the present invention can be used in conjunction with other antibody domains to produce full-length antibodies that are either bispecific or monospecific. Antibody specificity determined by VH/VL combinations generally does not affect the heavy chain dimerization behavior mediated by CH3 domains.

Термины контактный остаток, контактная аминокислота, остаток поверхности контакта и аминокислота поверхности контакта, как используют в рамках изобретения, как правило, относится к любому аминокислотному остатку, присутствующему в СН3-домене, который может быть вовлечен в контакты между доменами, что можно определять с помощью технологий, известных в данной области, в том числе путем вычисления доступной для растворителя площади поверхности (ASA) остатков CI 13-домена в присутствии и в отсутствие второй цепи (Lee and Richards J. Mol. Biol., 1971(55)379), где остатки, которые демонстрируют разность (>1 А²) в ASA между двумя результатами вычислений идентифицируют как контактные остатки. Идентифицированные контактные остатки включают остатки в положениях 347, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 360, 364, 366, 368, 370, 390, 392, 394, 395, 397, 399, 400, 405, 407, 409, 439 в соответствии с системой нумерации EU (табл. А).The terms contact residue, contact amino acid, contact surface residue and contact surface amino acid, as used herein, generally refer to any amino acid residue present in a CH3 domain that may be involved in contacts between domains, as determined by technologies known in the art, including by calculating the solvent accessible surface area (ASA) of CI 13 domain residues in the presence and absence of the second chain (Lee and Richards J. Mol. Biol., 1971(55)379), where residues that exhibit a difference (>1 A ² ) in ASA between two calculation results are identified as contact residues. Identified contact residues include residues at positions 347, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 360, 364, 366, 368, 370, 390, 392, 394, 395, 397, 399, 400 , 405, 407, 409, 439 according to the EU numbering system (Table A).

Таблица АTable A

Перечень остатков поверхности контакта СН3-доменовList of contact surface residues of CH3 domains

Остаток поверхности контакта в цепи А Remaining contact surface in circuit A Контактирующие остатки в цепи В Contacting residues in the circuit IN Q347 Q347 К360 K360 Y349 Y349 S354, D356, Е357, К360 S354, D356, E357, K360 Т350 T350 S354, R355 S354, R355 L351 L351 L351, Р352, Р353, S354, Т366 L351, P352, P353, S354, T366 S354 S354 Y349, Т350, L351 Y349, T350, L351 R355 R355 Т350 T350 D356 D356 Y349, К439 Y349, K439 Е357 E357 Y349, К370 Y349, K370 К360 K360 Q347, Y349 Q347, Y349 S364 S364 L368, К370 L368, K370 Т366 T366 L351, Y407 L351, Y407 L368 L368 S364, К409 S364, K409 К370 K370 Е357, S364 E357, S364 N390 N390 S400 S400 К392 K392 L398, D399, S400, F405 L398, D399, S400, F405 Т394 T394 Т394, V397, F405, Y407 T394, V397, F405, Y407 Р395 P395 V397 V397 V397 V397 Т394, Р395 T394, P395

- 9 046272- 9 046272

Контактные остатки на поверхности контакта CH3-CH3 могут представлять собой либо аминокислоты, которые являются заряженными, либо аминокислотные остатки, которые являются нейтральными. Термин заряженный аминокислотный остаток или заряженный остаток, как используют в рамках изобретения, означает аминокислотные остатки с электрически заряженными боковыми цепями. Они могут представлять собой либо положительно заряженные боковые цепи, такие как цепи, присутствующие в аргинине (Arg, R), гистидине (His, H) и лизине (Lys, K), либо они могут представлять собой отрицательно заряженные боковые цепи, такие как цепи, присутствующие в аспарагиновой кислоте (Asp, D) и глутаминовой кислоте (Glu, E). Термин нейтральный аминокислотный остаток или нейтральный остаток, как используют в рамках изобретения, относится ко всем другим аминокислотам, которые не содержат электрически заряженных боковых цепей. Эти нейтральные остатки включают серин (Ser, S), треонин (Thr, T), аспарагин (Asn, N), глутамин (GLu, Q), цистеин (Cys, С), глицин (Gly, G), пролин (Pro, P), аланин (Ala, A), валин (Val, V), изолейцин (Ile, I), лейцин (Leu, L), метионин (Met, M), фенилаланин (Phe, F), тирозин (Tyr, Y) и триптофан (Trp, T).The contact residues at the CH3-CH3 interface can be either amino acid residues that are charged or amino acid residues that are neutral. The term charged amino acid residue or charged residue as used herein means amino acid residues with electrically charged side chains. They can be either positively charged side chains, such as the chains present in arginine (Arg, R), histidine (His, H), and lysine (Lys, K), or they can be negatively charged side chains, such as the chains , present in aspartic acid (Asp, D) and glutamic acid (Glu, E). The term neutral amino acid residue or neutral residue as used herein refers to all other amino acids that do not contain electrically charged side chains. These neutral residues include serine (Ser, S), threonine (Thr, T), asparagine (Asn, N), glutamine (GLu, Q), cysteine (Cys, C), glycine (Gly, G), proline (Pro, P), alanine (Ala, A), valine (Val, V), isoleucine (Ile, I), leucine (Leu, L), methionine (Met, M), phenylalanine (Phe, F), tyrosine (Tyr, Y ) and tryptophan (Trp, T).

Термин поверхность контакта CH3-CH3 или поверхность контакта, пара CH3-CH3, поверхность контакта доменов или просто поверхность контакта, как используют в рамках изобретения, относится к ассоциации между двумя CH3-доменами отдельных содержащих (Ί 13-домен полипептидов, которая является результатом взаимодействия аминокислотных остатков, т.е. по меньшей мере одного взаимодействия между аминокислотой первого CH3-домена и аминокислотой второго CH3-домена. Такое взаимодействие осуществляется, например, посредством ван-дер-ваальсовых сил, водородных связей, опосредуемых водой водородных связей, солевых мостиков или других электростатических сил, сил притяжения между ароматическими боковыми цепями, образования дисульфидных связей или других сил, известных специалисту в данной области.The term CH3-CH3 interface or interface, CH3-CH3 pair, domain interface, or simply interface as used herein, refers to the association between two CH3 domains of individual (Ί 13-domain) polypeptides that results from the interaction amino acid residues, i.e. at least one interaction between an amino acid of the first CH3 domain and an amino acid of the second CH3 domain. Such interaction occurs, for example, through van der Waals forces, hydrogen bonds, water-mediated hydrogen bonds, salt bridges or other electrostatic forces, attractive forces between aromatic side chains, formation of disulfide bonds, or other forces known to one skilled in the art.

Как используют в рамках изобретения, указанные средства для преимущественного образования пары между первым и вторым содержащими Cffi-домен полипептидами и указанными третьим и четвертым содержащими Cffi-домен полипептидами могут представлять собой любые средства, известные в данной области. В одном варианте осуществления по меньшей мере одна молекула нуклеиновой кислоты кодирует Cffi-домен, которые содержит в положении контактного остатка большой аминокислотный остаток (т.е. выступ или выпуклость), например, такой как R, F, Y, W, I или L, в то время как по меньшей мере одна другая молекула нуклеиновой кислоты кодирует (Ί 13-доме'н, который содержит в положении, комплементарном контактному остатку, небольшой аминокислотный остаток (т.е. полость или углубление), например, такой как G, A, S, Т или V. Полученные CH3-домены предпочтительно образуют пару друг с другом вследствие пространственной конформации указанных контактных аминокислот.As used herein, said means for preferentially pairing between the first and second Cffi domain-containing polypeptides and said third and fourth Cffi domain-containing polypeptides may be any means known in the art. In one embodiment, the at least one nucleic acid molecule encodes a Cffi domain that contains, at the contact residue position, a large amino acid residue (i.e., overhang or bulge), such as R, F, Y, W, I, or L , while at least one other nucleic acid molecule encodes (Ί 13-domain, which contains, in a position complementary to the contact residue, a small amino acid residue (i.e., cavity or recess), for example, such as G, A, S, T or V. The resulting CH3 domains preferentially pair with each other due to the spatial conformation of these contact amino acids.

Технология выступ-в-полости более подробно описана в настоящем описании выше. В следующем варианте осуществления настоящего изобретения по меньшей мере одна молекула нуклеиновой кислоты кодирует Cffi-домен, который содержит в положении контактного остатка, который естественным образом заряжен, т.е. имеет естественным образом встречающиеся K, Н, R, D или Е, аминокислоту, которая теперь содержит противоположный заряд по сравнению с диким типом, в то время как по меньшей мере одна другая молекула нуклеиновой кислоты кодирует CH3-домен, который содержит в положении, комплементарном контактному остатку, который естественным образом заряжен, аминокислоту, которая теперь имеет противоположный заряд по сравнению с диким типом. Полученные сконструированные CH3-домены предпочтительно образуют пару друг с другом вследствие противоположных зарядов указанных контактных аминокислот, в то время как образование пар между идентичными CH3-доменами снижено вследствие электростатического отталкивания. В одном варианте осуществления используют мутации CH3, как описано в ЕР 01870459; WO 2009/089004; Gunasekaran et al. (2010). В одном варианте осуществления средствами преимущественного образования пар между указанными 1- и 2-м содержащими Cffi-домен полипептидами являются аминокислотные остатки выступа и полости и средствами для преимущественного образования пар между указанными 3- и 4-м содержащими Cffi-домен полипептидами являются аминокислоты с модифицированным способами инженерии зарядом. Предпочтительно оба из указанных средств для преимущественного образования пар между указанными 1- и 2-м содержащими Cffi-домен полипептидами и указанными 3- и 4-м содержащими CH3домен полипептидами представляют собой аминокислоты с модифицированным способами инженерии зарядом. В одном варианте осуществления различные аминокислотные остатки модифицируют способаThe protrusion-in-cavity technology is described in more detail in the present specification above. In a further embodiment of the present invention, at least one nucleic acid molecule encodes a Cffi domain that contains, at a contact position, a residue that is naturally charged, i.e. has a naturally occurring K, H, R, D or E, amino acid that now contains the opposite charge compared to the wild type, while at least one other nucleic acid molecule encodes a CH3 domain that contains in a position complementary to a contact residue that is naturally charged, an amino acid that now has the opposite charge compared to the wild type. The resulting engineered CH3 domains preferentially pair with each other due to the opposite charges of said contact amino acids, while pairing between identical CH3 domains is reduced due to electrostatic repulsion. In one embodiment, CH3 mutations are used as described in EP 01870459; WO 2009/089004; Gunasekaran et al. (2010). In one embodiment, the means of preferential pairing between said 1 and 2 Cffi domain-containing polypeptides are protrusion and cavity amino acid residues, and the means for preferential pairing between said 3 and 4 Cffi domain-containing polypeptides are modified amino acids. charge engineering methods. Preferably, both of said means for preferential pairing between said 1 and 2 Cffi domain-containing polypeptides and said 3 and 4 CH3 domain-containing polypeptides are charge engineered amino acids. In one embodiment, various amino acid residues are modified in a manner

- 10 046272 ми инженерии для преимущественного образования пар между указанными 1- и 2-м содержащими СНЗ-домен полипептидами по сравнению с аминокислотными остатками, которые модифицированы способами инженерии для преимущественного образования пар между указанными 3- и 4-м содержащими CH3-домен полипептидами. В особенно предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере первая и вторая молекулы нуклеиновой кислоты кодируют CH3-домены с новыми мутациями, предусматриваемыми настоящим изобретением. Как более подробно описано в настоящем описании ниже, настоящее изобретение относится к новым мутациям CH3, которые обеспечивают продукцию определенных представляющих интерес биспецифических Ig-подобных молекул без существенного количества нежелательных (димерных) побочных продуктов. Настоящее изобретение также относится к новым мутациям CH3, которые обеспечивают продукцию определенных представляющих интерес моноспецифических Ig-подобных молекул без существенного количества нежелательных (димерных) побочных продуктов. Таким образом, является предпочтительным применение по меньшей мере одной из этих мутаций CH3 в соответствии с настоящим изобретением.- 10 046272 engineered to preferentially pair between said 1st and 2nd CH3 domain-containing polypeptides over amino acid residues that are engineered to preferentially pair between said 3rd and 4th CH3 domain-containing polypeptides. In a particularly preferred embodiment, at least the first and second nucleic acid molecules encode CH3 domains with the novel mutations provided by the present invention. As described in more detail below, the present invention provides novel CH3 mutations that provide the production of certain bispecific Ig-like molecules of interest without significant amounts of unwanted (dimeric) by-products. The present invention also provides novel CH3 mutations that provide the production of certain monospecific Ig-like molecules of interest without significant amounts of unwanted (dimeric) by-products. Thus, it is preferred to use at least one of these CH3 mutations in accordance with the present invention.

Термин полипептид, полипептидная молекула или полипептидная цепь, как используют в рамках изобретения, относится к цепи из аминокислот, которые ковалентно связаны через пептидные связи. Белки, как правило, состоят из одной или нескольких полипептидных молекул. Один конец каждого полипептида, называемый аминоконцом или N-концом, имеет свободную аминогруппу. Другой конец со свободной карбоксильной группой называют карбоксильным концом или С-концом. Полипептиды в соответствии с настоящим изобретением могут подвергаться посттрансляционным процессам и, например, могут быть гликозилированными. Таким образом, содержащие CH3-домен полипептидные цепи по настоящему изобретению относятся к полипептидным цепям, которые по меньшей мере охватывают CH3-домен Ig и которые могут подвергаться посттрансляционным процессам модификации.The term polypeptide, polypeptide molecule or polypeptide chain, as used herein, refers to a chain of amino acids that are covalently linked through peptide bonds. Proteins typically consist of one or more polypeptide molecules. One end of each polypeptide, called the amino terminus or N-terminus, has a free amino group. The other end with a free carboxyl group is called the carboxyl terminus or C-terminus. The polypeptides of the present invention may be post-translationally processed and, for example, may be glycosylated. Thus, the CH3 domain-containing polypeptide chains of the present invention refer to polypeptide chains that at least span the CH3 domain of an Ig and that can be subject to post-translational modification processes.

Термин молекула нуклеиновой кислоты, как используют в рамках изобретения, определяют как молекула, содержащая цепь нуклеотидов, более предпочтительно ДНК и/или РНК. В одном варианте осуществления используют двухцепочечную РНК. В других вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты по изобретению содержит другие типы структур нуклеиновой кислоты, например, такие как спираль ДНК/РНК, пептидно-нуклеиновая кислота (PNA), замкнутая нуклеиновая кислота (LNA) и/или рибозим. Таким образом, термин молекула нуклеиновой кислоты также охватывает цепь, содержащую неприродные нуклеотиды, модифицированные нуклеотиды и/или ненуклеотидные структурные элементы, которые проявляют ту же функцию, что и природные нуклеотиды.The term nucleic acid molecule, as used herein, is defined as a molecule containing a chain of nucleotides, more preferably DNA and/or RNA. In one embodiment, double-stranded RNA is used. In other embodiments, the nucleic acid molecule of the invention comprises other types of nucleic acid structures, such as, for example, a DNA/RNA helix, a peptide nucleic acid (PNA), a locked nucleic acid (LNA), and/or a ribozyme. Thus, the term nucleic acid molecule also covers a chain containing non-natural nucleotides, modified nucleotides and/or non-nucleotide structural elements that exhibit the same function as natural nucleotides.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения клетки-хозяина для продуцирования по меньшей мере двух различных Ig-подобных молекул, причем способ включает стадию введения в указанную клетку-хозяина последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих по меньшей мере первую, вторую, третью и четвертую содержащую СНЗ-домен полипептидную цепь, где по меньшей мере две из указанных последовательностей нуклеиновой кислоты предоставлены со средствами для преимущественного образования пар между указанными первым и вторым содержащими СНЗ-домен полипептидами и указанными третьим и четвертым содержащими СНЗ-домен полипептидами, где указанные последовательности нуклеиновой кислоты вводят последовательно или одновременно.In addition, the present invention relates to a method of obtaining a host cell for producing at least two different Ig-like molecules, the method comprising the step of introducing into said host cell nucleic acid sequences encoding at least a first, second, third and fourth containing a CH3 domain polypeptide chain, wherein at least two of said nucleic acid sequences are provided with means for preferentially pairing between said first and second CH3 domain-containing polypeptides and said third and fourth CH3 domain-containing polypeptides, wherein said nucleic acid sequences are introduced sequentially or simultaneously.

Следующим аспектом настоящего изобретения является предоставление способа получения клеткихозяина для продуцирования гетеродимерной Ig-подобной молекулы, причем способ включает стадию введения в указанную клетку-хозяина последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих по меньшей мере первую и вторую содержащие СНЗ-домен полипептидные цепи, где указанная содержащая СНЗ-домен полипептидная цепь содержит по меньшей мере одну замену нейтрального аминокислотного остатка на положительно заряженный аминокислотный остаток и где указанная вторая содержащая СНЗ-домен полипептидная цепь содержит по меньшей мере одну замену нейтрального аминокислотного остатка на отрицательно заряженный аминокислотный остаток, где указанные последовательности нуклеиновой кислоты вводят последовательно или одновременно. Указанные способы получения указанных клеток-хозяев предпочтительно дополнительно включают стадию введения в указанную клетку-хозяина последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей общую легкую цепь.Another aspect of the present invention is to provide a method of producing a host cell for producing a heterodimeric Ig-like molecule, the method comprising the step of introducing into said host cell nucleic acid sequences encoding at least a first and second CH3 domain-containing polypeptide chain, wherein said CH3-containing polypeptide chain domain, the polypeptide chain comprises at least one substitution of a neutral amino acid residue for a positively charged amino acid residue, and wherein said second CH3 domain-containing polypeptide chain comprises at least one substitution of a neutral amino acid residue for a negatively charged amino acid residue, wherein said nucleic acid sequences are introduced sequentially or simultaneously. Said methods of producing said host cells preferably further comprise the step of introducing into said host cell a nucleic acid sequence encoding a common light chain.

Также в настоящем описании предусматривается рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие по меньшей мере первую, вторую, третью и четвертую содержащие СНЗ-домен полипептидные цепи, где по меньшей мере две из указанных молекул нуклеиновой кислоты предоставлены со средствами для преимущественного образования пар между указанными первым и вторым содержащими СНЗ-домен полипептидами и указанными третьим и четвертым содержащими СНЗ-домен полипептидами.Also provided herein is a recombinant host cell comprising nucleic acid sequences encoding at least first, second, third and fourth CH3 domain-containing polypeptide chains, wherein at least two of said nucleic acid molecules are provided with means for preferential pairing between said first and second CH3 domain-containing polypeptides and said third and fourth CH3 domain-containing polypeptides.

Более того, изобретение относится к рекомбинантной клетке-хозяину, содержащей последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие по меньшей мере первую и вторую содержащие СНЗ-домен полипептидные цепи, где указанная первая содержащая СНЗ-домен полипептидная цепь содержит по меньшей мере одну замену нейтрального аминокислотного остатка на положительно заряженный аминокислотный остаток, и где указанная вторая содержащая СНЗ-домен полипептидная цепь содержит по меньшей мере одну замену нейтрального аминокислотного остатка на отрицательно заряженный аминокислотный остаток.Moreover, the invention relates to a recombinant host cell containing nucleic acid sequences encoding at least a first and a second CH3 domain-containing polypeptide chain, wherein said first CH3 domain-containing polypeptide chain contains at least one change from a neutral to a positive amino acid residue. a charged amino acid residue, and wherein said second CH3 domain-containing polypeptide chain comprises at least one substitution of a neutral amino acid residue for a negatively charged amino acid residue.

- 11 046272- 11 046272

Рекомбинантная клетка-хозяин по изобретению предпочтительно дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую общую легкую цепь.The recombinant host cell of the invention preferably further comprises a nucleic acid sequence encoding a common light chain.

Клетка-хозяин по изобретению может представлять собой любую клетку-хозяина, способную экспрессировать рекомбинантные молекулы ДНК, включая бактерии, например такие, как Escherichia (например E.coIi), Enterobacter, Salmonella, Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, дрожжи, такие как S. cerevisiae, K. lactis, P. pastoris, Candida или Yarrowia, нитчатые грибы, такие как Neurospora, Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans и Aspergillus niger, клетки насекомых, такие как клетки SF-9 или SF-21 Spodoptera frugiperda, и предпочтительно клетки млекопитающих, такие как клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки BHK, клетки мыши, включающие клетки SP2/0 и клетки миеломы NS-0, клетки приматов, такие как клетки COS и Vero, клетки MDCK, клетки BRL 3А, гибридомы, опухолевые клетки, иммортализованные первичные клетки, клетки человека, такие как W138, HepG2, HeLa, HEK293, НТ1080, или клетки сетчатки эмбриона, такие как PER.C6 и т.п. Часто, предпочтительная для выбора экспрессирующая система вовлекает экспрессирующий вектор для клеток млекопитающих и хозяина, так что антитела могут быть соответствующим образом гликозилированными. Линию клеток человека, предпочтительно PER.C6, можно преимущественно использовать для получения антител с полностью человеческим профилем гликозилирования. Условия для выращивания или увеличения клеток в количестве (см. например Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973)) и условия для экспрессии рекомбинантного продукта могут в некоторой степени отличаться, и обычно проводят оптимизацию процесса для увеличения соотношений продуктов и/или выращивания одних клеток относительно других, в соответствии со способами, общеизвестными специалистам в данной области. Как правило, принципы, протоколы и практические технологии для максимизации продуктивности культур клеток млекопитающих могут быть найдены в Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach (M. Butler, ed., IRL Press, 1991). Экспрессия антител в рекомбинантных клетках-хозяевах подробно описана в данной области (см., например, ЕР 0120694; ЕР 0314161; ЕР 0481790; ЕР 0523949; патент США 4816567; WO 00/63403). Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие легкие и тяжелые цепи, могут присутствовать в качестве внехромосомных копий и/или могут стабильно встраиваться в хромосому клетки-хозяина, причем последнее является предпочтительным.The host cell of the invention may be any host cell capable of expressing recombinant DNA molecules, including bacteria, such as Escherichia (eg E.coIi), Enterobacter, Salmonella, Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, yeast such as S. cerevisiae, K. lactis, P. pastoris, Candida or Yarrowia, filamentous fungi such as Neurospora, Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans and Aspergillus niger, insect cells such as SF-9 or SF-21 Spodoptera frugiperda cells, and preferably mammalian cells , such as Chinese hamster ovary (CHO) cells, BHK cells, mouse cells including SP2/0 cells and NS-0 myeloma cells, primate cells such as COS and Vero cells, MDCK cells, BRL 3A cells, hybridomas, tumor cells , immortalized primary cells, human cells such as W138, HepG2, HeLa, HEK293, HT1080, or embryonic retinal cells such as PER.C6 and the like. Often, the preferred expression system involves an expression vector for mammalian and host cells so that the antibodies can be suitably glycosylated. A human cell line, preferably PER.C6, can advantageously be used to produce antibodies with a fully human glycosylation profile. Conditions for growing or expanding cells (see for example Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973)) and conditions for expressing the recombinant product may differ to some extent, and it is common to optimize the process to increase ratios of products and/or or growing some cells relative to others, in accordance with methods generally known to specialists in this field. Generally, principles, protocols and practical technologies for maximizing the productivity of mammalian cell cultures can be found in Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach (M. Butler, ed., IRL Press, 1991). The expression of antibodies in recombinant host cells is described in detail in the art (see, for example, EP 0120694; EP 0314161; EP 0481790; EP 0523949; US patent 4816567; WO 00/63403). The nucleic acid molecules encoding the light and heavy chains may be present as extrachromosomal copies and/or may be stably integrated into the host cell chromosome, the latter being preferred.

Следующим аспектом настоящего изобретения является предоставление культуры рекомбинантных клеток-хозяев по изобретению или культуры рекомбинантных клеток, получаемых или полученных способом по изобретению, причем указанная культура продуцирует либо по меньшей мере две различных Ig-подобных молекулы, либо гетеродимерную Ig-подобную молекулу.Another aspect of the present invention is to provide a culture of recombinant host cells according to the invention or a culture of recombinant cells obtained or produced by the method of the invention, wherein said culture produces either at least two different Ig-like molecules or a heterodimeric Ig-like molecule.

Специалистам в данной области хорошо известно, что для обеспечения экспрессии последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих содержащие CH3-домен полипептиды, с последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими содержащие CH3-домен полипептиды могут быть функционально связаны последовательности, способные запускать такую экспрессию. Функционально связанный означает, что последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие содержащие CH3-домен полипептиды или их предшественники, связаны с последовательностями, способными запускать экспрессию, так чтобы эти последовательности могли запускать экспрессию содержащих CH3-домен полипептидов или их предшественников. Пригодные экспрессирующие векторы доступны в данной области, например, вектор серии pcDNA от Invitrogen. Когда последовательность, кодирующая представляющий интерес полипептид, надлежащим образом встроена относительно последовательностей, контролирующих транскрипцию и трансляцию кодируемого полипептида, полученная экспрессирующая кассета является пригодной для продукции представляющего интерес полипептида, которую упоминают как экспрессия.It is well known to those skilled in the art that to promote expression of nucleic acid sequences encoding CH3 domain-containing polypeptides, sequences capable of driving such expression can be operably linked to nucleic acid sequences encoding CH3 domain-containing polypeptides. Operatively linked means that nucleic acid sequences encoding CH3 domain-containing polypeptides or their precursors are linked to expression-driver sequences such that the sequences can drive expression of CH3 domain-containing polypeptides or their precursors. Suitable expression vectors are available in the art, for example, the pcDNA series vector from Invitrogen. When the sequence encoding the polypeptide of interest is suitably inserted relative to the sequences controlling transcription and translation of the encoded polypeptide, the resulting expression cassette is useful for producing the polypeptide of interest, which is referred to as expression.

Последовательности, контролирующие экспрессию, могут включать промоторы, энхансеры и т.п., их комбинации. Они должны быть способны функционировать в клетке-хозяине, тем самым контролируя экспрессию последовательностей нуклеиновой кислоты, которые функционально связаны с ними. Промоторы могут быть конститутивными или регулируемыми, и они могут быть получены из различных источников, включая вирусы, прокариотические или эукариотические источники, и они могут быть искусственно сконструированными. Экспрессия представляющих интерес нуклеиновых кислот может осуществляться с естественного промотора или его производного или с полностью гетерологичного для них промотора. Некоторые хорошо известные и широко используемые промоторы для экспрессии в эукариотических клетках включают промоторы, происходящие из вирусов, таких как аденовирус, например промотор Е1А, промоторы, происходящие из цитомегаловируса (CMV), такие как предранний промотор CMV (IE), промоторы, происходящие из вируса обезьян 40 (SV40), и т.п.Expression control sequences may include promoters, enhancers, etc., or combinations thereof. They must be able to function in the host cell, thereby controlling the expression of nucleic acid sequences that are operably linked to them. Promoters can be constitutive or regulated, and they can be obtained from a variety of sources, including viruses, prokaryotic or eukaryotic sources, and they can be artificially engineered. Expression of nucleic acids of interest can be carried out from a natural promoter or a derivative thereof, or from a promoter that is completely heterologous to them. Some well known and widely used promoters for expression in eukaryotic cells include promoters derived from viruses such as adenovirus, such as the E1A promoter, promoters derived from cytomegalovirus (CMV), such as the CMV immediate early (IE) promoter, promoters derived from a virus monkeys 40 (SV40), etc.

Пригодные промоторы также могут происходить из эукариотических клеток, такие как промоторы металлотионеина (МТ), промотор фактора элонгации 1α (EF-1a), промотор актина, промотор иммуноглобулина, промоторы теплового шока и т.п. В рамках настоящего изобретения является пригодным любой промотор энхансер/промотор, способные контролировать экспрессию представляющей интерес последовательности в клетке-хозяине. В одном варианте осуществления последовательность, способная контролировать экспрессию, содержит область из промотора CMV, предпочтительно область, содержащую нуклеотиды с -735 по +95 предраннего энхансера/промотора генов CMV. Квалифицированному специалисту будет известно, что последовательности для экспрессии, используемые в рамках изобретеSuitable promoters may also be derived from eukaryotic cells, such as metallothionein (MT) promoters, elongation factor 1α (EF-1a) promoter, actin promoter, immunoglobulin promoter, heat shock promoters, and the like. Any enhancer/promoter capable of controlling the expression of a sequence of interest in a host cell is suitable within the scope of the present invention. In one embodiment, the sequence capable of controlling expression comprises a region from the CMV promoter, preferably a region containing nucleotides -735 to +95 of the CMV immediate early enhancer/promoter genes. One skilled in the art will recognize that the expression sequences used within the scope of the invention

- 12 046272 ния, можно пригодным образом комбинировать с элементами, которые могут стабилизировать или усиливать экспрессию, такими как инсуляторы, участки прикрепления к матриксу, элементы STAR (WO 03/004704) и т.п. Это может повышать стабильность и/или уровни экспрессии.- 12 046272 niya, can be suitably combined with elements that can stabilize or enhance expression, such as insulators, matrix attachment sites, STAR elements (WO 03/004704) and the like. This may increase stability and/or expression levels.

Продукция белков в рекомбинантных клетках-хозяевах широко описана, например, в Current Protocols in Protein Science, 1995, Coligan J.E., Dunn B.M., Ploegh H.L., Speicher D.W., Wingfield P.T., ISBN 0-471-11184-8; Bendig, 1988. Культивирование клетки проводят для обеспечения ее метаболизма, и/или роста, и/или деления и/или для получения представляющих интерес рекомбинантных белков. Это можно осуществлять способами, хорошо известными специалистам в данной области, и они включают, но не ограничиваются ими, предоставление клетке питательных веществ. Способы включают выращивание прикрепленных на поверхности культур, выращивание в суспензии или их комбинацию. Несколько условий культивирования можно оптимизировать способами, хорошо известными в данной области, для оптимизации выхода белковых продуктов. Культивирование можно проводить, например, в чашках, вращающихся флаконах или в биореакторах, с использованием периодических систем, периодических систем с подпиткой, непрерывных систем, полых волокон и т.п. Для обеспечения крупномасштабной (непрерывной) продукции рекомбинантных белков посредством культивирования клеток в данной области предпочтительны клетки, способные расти в суспензии, и являются предпочтительными клетки, которые могут культивироваться в отсутствие происходящей из животных или человека сыворотки или происходящих из человека компонентов сыворотки. Таким образом, очистка упрощается и безопасность увеличивается вследствие отсутствия дополнительных белков животных или человека, происходящих из культуральной среды, в то время как система также является очень надежной, поскольку воспроизводимость в синтетических средах является наивысшей.Protein production in recombinant host cells has been widely described, for example, in Current Protocols in Protein Science, 1995, Coligan J.E., Dunn B.M., Ploegh H.L., Speicher D.W., Wingfield P.T., ISBN 0-471-11184-8; Bendig, 1988. Cell culture is carried out to promote its metabolism and/or growth and/or division and/or to obtain recombinant proteins of interest. This can be accomplished in ways well known to those skilled in the art, and these include, but are not limited to, providing nutrients to the cell. Methods include growing surface-attached crops, growing in suspension, or a combination thereof. Several culture conditions can be optimized by methods well known in the art to optimize the yield of protein products. Cultivation can be carried out, for example, in plates, spinner flasks or bioreactors, using batch systems, fed-batch systems, continuous systems, hollow fibers and the like. To provide large-scale (continuous) production of recombinant proteins through cell culture, cells that can grow in suspension are preferred in the art, and cells that can be cultured in the absence of animal- or human-derived serum or human-derived serum components are preferred. Purification is thus simplified and safety is increased due to the absence of additional animal or human proteins originating from the culture medium, while the system is also very reliable since reproducibility in synthetic media is highest.

Ig-подобные молекулы экспрессируются в клетках-хозяевах и их собирают из клеток или предпочтительно из клеточной культуральной среды способами, общеизвестными специалистам в данной области. После сбора эти Ig-подобные молекулы можно очищать с использованием способов, известных в данной области. Такие способы могут включать преципитацию, центрифугирование, фильтрацию, эксклюзионную хроматографию, аффинную хроматографию, катионообменную и/или анионообменную хроматографию, хроматографию гидрофобного взаимодействия и т.п. Для смеси антител, содержащей молекулы IgG, является пригодной аффинная хроматография с белком А или белком G (см., например, патенты США 4801687 и 5151504).Ig-like molecules are expressed in host cells and are collected from cells or preferably from cell culture medium by methods well known to those skilled in the art. Once collected, these Ig-like molecules can be purified using methods known in the art. Such methods may include precipitation, centrifugation, filtration, size exclusion chromatography, affinity chromatography, cation exchange and/or anion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, and the like. For an antibody mixture containing IgG molecules, affinity chromatography with protein A or protein G is suitable (see, for example, US patents 4801687 and 5151504).

Ig-подобные молекулы и/или их смеси, полученные способами в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно имеют общую легкую цепь. Таким образом, дополнительно предусматривается способ по изобретению, далее включающий предоставление указанной клетке-хозяину молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей общую легкую цепь. Она представляет собой легкую цепь, которая способна образовывать пару по меньшей мере с двумя различными тяжелыми цепями, тем самым образуя функциональные антигенсвязывающие домены. Функциональный антигенсвязывающий домен способен специфически связываться с антигеном. Предпочтительно используют общую легкую цепь, которая способна образовывать пару со всеми тяжелыми цепями, полученными способами по изобретению, тем самым образуя функциональные антигенсвязывающие домены так, чтобы предотвращалось неправильное спаривание несоответствующих тяжелых и легких цепей. В одном аспекте используют только общие легкие цепи с одной идентичной аминокислотной последовательностью. Альтернативно специалистам в данной области будет понятно, что общий также относится к функциональным эквивалентам легкой цепи, аминокислотная последовательность которых не является идентичной. Существует множество вариантов указанной легкой цепи, где присутствуют мутации (делеции, замены, вставки), которые не оказывают существенного влияния на образование функциональных связывающих областей. Таким образом, такие варианты также способны связывать различные тяжелые цепи и образовывать функциональные антигенсвязывающие домены. Термин общая легкая цепь, как используют в рамках изобретения, таким образом, относится к легким цепям, которые могут быть идентичными или имеют некоторые отличия в аминокислотной последовательности при сохранении специфичности связывания полученного антитела после образования пары с тяжелой цепью. Например, можно получить или найти легкие цепи, которые не являются идентичными, но тем не менее являются функционально эквивалентными, например, вследствие внесения и исследования консервативных аминокислотных замен и/или замен аминокислот в областях, которые не вносят вклада или только частично вносят вклад в специфичность связывания, когда они спарены с тяжелой цепью и т.п. Комбинация определенной общей легкой цепи и таких функционально эквивалентных вариантов охватывается термином общая легкая цепь. См. WO 2004/009618 для подробного описания применения общих легких цепей. Предпочтительно в рамках настоящего изобретения используют общую легкую цепь, которая представляет собой легкую цепь, подобную легкой цепи эмбрионального типа, более предпочтительно легкую цепь эмбрионального типа, предпочтительно реаранжированную легкую цепь каппа эмбрионального типа, наиболее предпочтительно реаранжированную легкую цепь каппа человека эмбрионального типа либо IgVK1-39/JK, либо IGVk3-20/Jk.Ig-like molecules and/or mixtures thereof produced by the methods of the present invention preferably have a common light chain. Thus, the method of the invention is further provided further comprising providing said host cell with a nucleic acid molecule encoding a common light chain. It is a light chain that is capable of pairing with at least two different heavy chains, thereby forming functional antigen-binding domains. A functional antigen-binding domain is capable of specifically binding to an antigen. Preferably, a common light chain is used that is capable of pairing with all of the heavy chains produced by the methods of the invention, thereby forming functional antigen binding domains so that mispairing of inappropriate heavy and light chains is prevented. In one aspect, only common light chains with one identical amino acid sequence are used. Alternatively, those skilled in the art will understand that generic also refers to light chain functional equivalents whose amino acid sequence is not identical. There are many variants of this light chain, where mutations (deletions, substitutions, insertions) are present that do not significantly affect the formation of functional binding regions. Thus, such variants are also capable of binding various heavy chains and forming functional antigen-binding domains. The term common light chain, as used herein, thus refers to light chains that may be identical or have some differences in amino acid sequence while maintaining the binding specificity of the resulting antibody after pairing with the heavy chain. For example, it is possible to obtain or find light chains that are not identical but are nonetheless functionally equivalent, for example, by introducing and exploring conservative amino acid substitutions and/or amino acid substitutions in regions that do not or only partially contribute to specificity binding when they are paired with a heavy chain, etc. The combination of a particular common light chain and such functionally equivalent variants is encompassed by the term common light chain. See WO 2004/009618 for a detailed description of the use of general light chains. Preferably, the present invention uses a common light chain that is a germline-like light chain, more preferably a germline light chain, preferably a rearranged germline kappa light chain, most preferably a rearranged human germline kappa light chain or IgVK1-39 /JK, or IGVk3-20/Jk.

Альтернативно квалифицированный специалист может выбрать, в качестве альтернативы использованию общей легкой цепи и для предотвращения неправильного спаривания несоответствующих тяжелых и легких цепей, средства для вынужденного образования пар между тяжелой и легкой цепью, наAlternatively, one skilled in the art may choose, as an alternative to using a common light chain and to prevent mispairing of inappropriate heavy and light chains, a means of forcing pairing between the heavy and light chains, on

- 13 046272 пример, таких как средства, описанные в WO 2009/080251; WO 2009/080252; и/или WO 2009/080253.- 13 046272 example, such as the means described in WO 2009/080251; WO 2009/080252; and/or WO 2009/080253.

Настоящее изобретение относится к новым сконструированным CH3-доменам, а также к новым комбинациям мутаций CH3. До настоящего изобретения заряженные контактные аминокислоты CH3-доменов, о которых было известно, что они вовлечены в образование пар CH3-CH3, заменяли аминокислотами противоположного заряда (обращение заряда), тем самым влияя на образование пар CH3-CH3. Мутации в соответствии с настоящим изобретением являются оригинальной альтернативной этому подходу, поскольку теперь аминокислоты CH3, которые являются незаряженными или нейтральными в CH3 дикого типа, заменены заряженными остатками. В этом варианте осуществления в рамках настоящего изобретения не происходит замены контактных аминокислот на аминокислоты противоположного заряда, а происходит замена незаряженных аминокислот CH3 на заряженные аминокислоты. Этот подход по настоящему изобретению обеспечивает не только способ эффективного управления димеризацией доменов CH3, но также он имеет преимущество, состоящее в том, что создается по меньшей мере одно дополнительное заряд-зарядовое взаимодействие на поверхности контакта CH3. Ввиду этого дополнительного заряд-зарядового взаимодействия помимо существующих зарядовых пар на поверхности контакта CH3-CH3, димеры по изобретению, как правило, являются более стабильными по сравнению с димерами дикого типа (димер дикого типа определяют как биспецифический IgG (AB) без модификации способами инженерии CH3 в противоположность его родительским гомодимерам (АА или ВВ)). Более того, неожиданно стало возможным еще большее увеличение доли одной или нескольких представляющих интерес Ig-подобных молекул в смеси. Как описано в настоящем описании выше, способы, известные в данной области, для преимущественного продуцирования биспецифического антитела, как правило, вовлекают продукцию некоторых нежелательных димерных побочных продуктов. Например, доля представляющего интерес биспецифического антитела при использовании технологии выступ-в-полости составляет по меньшей мере 87%, в то время как подход электростатической инженерии, где заряженные контактные молекулы заменяют аминокислотами противоположного заряда, также приводит к долям вплоть до 96% (см., например, пример 11). Совершенно неожиданно, авторы настоящего изобретения успешно внесли мутации, которые далее повышают долю представляющей интерес Ig-подобной молекулы в смеси. Например, в примере 17 описан способ с использованием мутаций в соответствии с настоящим изобретением, где доля представляющего интерес биспецифического антитела была увеличена так, чтобы димерный побочный продукт совсем не поддавался обнаружению в полученной смеси. Неспаренные половинные молекулы, состоящие только из единичной тяжелой цепи, спаренной с общей легкой цепью, присутствовали в смеси в некоторой степени, однако они являются результатом несбалансированной экспрессии тяжелых цепей и могут быть без труда отделены от смеси эксклюзионной хроматографией. Таким образом, с помощью таких мутаций в соответствии с настоящим изобретением можно обеспечивать высокую долю биспецифической Ig-подобной молекулы в одной клетке по существу без примесей димерных побочных продуктов, что является особенно пригодным для изготовления фармацевтической композиции.The present invention relates to new designed CH3 domains, as well as new combinations of CH3 mutations. Prior to the present invention, charged contact amino acids of CH3 domains known to be involved in CH3-CH3 pairing were replaced with amino acids of opposite charge (charge reversal), thereby affecting CH3-CH3 pairing. The mutations of the present invention provide a novel alternative to this approach in that the CH3 amino acids that are uncharged or neutral in wild type CH3 are now replaced with charged residues. In this embodiment, the present invention does not replace the contact amino acids with amino acids of opposite charge, but instead replaces the uncharged CH3 amino acids with charged amino acids. This approach of the present invention not only provides a method for effectively controlling the dimerization of CH3 domains, but it also has the advantage that at least one additional charge-charge interaction is created at the CH3 contact surface. Because of this additional charge-charge interaction beyond the existing charge pairs at the CH3-CH3 interface, dimers of the invention are generally more stable than wild-type dimers (a wild-type dimer is defined as a bispecific IgG (AB) without modification by CH3 engineering techniques in contrast to its parent homodimers (AA or BB)). Moreover, it was unexpectedly possible to further increase the proportion of one or more Ig-like molecules of interest in the mixture. As described herein above, methods known in the art to advantageously produce a bispecific antibody typically involve the production of certain undesirable dimeric byproducts. For example, the fraction of a bispecific antibody of interest using protrusion-in-cavity technology is at least 87%, while the electrostatic engineering approach, where charged contact molecules are replaced by amino acids of opposite charge, also results in fractions of up to 96% (see Table 1). , for example, example 11). Quite unexpectedly, the present inventors have successfully introduced mutations that further increase the proportion of the Ig-like molecule of interest in the mixture. For example, Example 17 describes the mutation method of the present invention where the proportion of the bispecific antibody of interest was increased so that the dimeric byproduct was not detectable at all in the resulting mixture. Unpaired half molecules, consisting of only a single heavy chain paired with a common light chain, were present in the mixture to some extent, but they are the result of unbalanced expression of the heavy chains and can be easily separated from the mixture by size exclusion chromatography. Thus, with such mutations in accordance with the present invention, it is possible to provide a high proportion of bispecific Ig-like molecule per cell, substantially free of dimeric byproduct impurities, which is particularly suitable for the manufacture of a pharmaceutical composition.

Таким образом, один предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу получения гетеродимерной Ig-подобной молекулы из одной клетки, где указанная Ig-подобная молекула содержит два CH3-домена, которые способны образовывать поверхность контакта, причем указанный способ включает предоставление в указанной клетке первой молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей 1-ю содержащую CH3-домен полипе птидную цепь; и второй молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей 2-ю содержащую CH3-домен полипептидную цепь, где указанная первая содержащая CH3 -домен полипептидная цепь содержит по меньшей мере одну замену нейтрального аминокислотного остатка положительно заряженным аминокислотным остатком и где указанная вторая содержащая CH3-домен полипептидная цепь содержит по меньшей мере одну замену нейтрального аминокислотного остатка отрицательно заряженным аминокислотным остатком, причем указанный способ дополнительно включает стадии культивирования указанной клетки-хозяина, и обеспечения экспрессии указанных двух молекул нуклеиновой кислоты, и сбора указанной гетеродимерной Ig-подобной молекулы из культуры.Thus, one preferred embodiment of the present invention relates to a method of producing a heterodimeric Ig-like molecule from a single cell, wherein said Ig-like molecule contains two CH3 domains that are capable of forming a contact surface, said method comprising providing a first molecule to said cell a nucleic acid encoding the 1st CH3 domain-containing polypeptide chain; and a second nucleic acid molecule encoding a 2nd CH3 domain-containing polypeptide chain, wherein said first CH3 domain-containing polypeptide chain comprises at least one substitution of a neutral amino acid residue with a positively charged amino acid residue and wherein said second CH3 domain-containing polypeptide chain comprises at least one replacement of a neutral amino acid residue with a negatively charged amino acid residue, said method further comprising the steps of culturing said host cell, and allowing expression of said two nucleic acid molecules, and collecting said heterodimeric Ig-like molecule from the culture.

Указанный способ предпочтительно дополнительно включает стадию предоставления указанной клетки-хозяина с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей общую легкую цепь, которая имеет преимущества, как описано в настоящем описании выше.Said method preferably further includes the step of providing said host cell with a nucleic acid molecule encoding a common light chain, which has the advantages as described herein above.

Было описано, что аминокислоты в положении 366 одного CH3-домена и в положении 351 второго CH3-домена представляют собой пару контактных остатков на поверхности контакта CH3-CH3, что означает, что они расположены достаточно близко друг к другу в трехмерной конформации полученной Igподобной молекулы, чтобы они были способны взаимодействовать друг с другом. Таким образом, первый CH3-домен предпочтительно будет образовывать пару со вторым CH3-доменом.It has been described that the amino acids at position 366 of one CH3 domain and at position 351 of the second CH3 domain are a pair of contact residues at the CH3-CH3 interface, which means that they are located quite close to each other in the three-dimensional conformation of the resulting Ig-like molecule. so that they are able to interact with each other. Thus, the first CH3 domain will preferentially pair with the second CH3 domain.

В одном варианте осуществления треонин (Т) в положении Збб первого CH3-домена заменен первой заряженной аминокислотой, и лейцин (L) в положении 351 второго CH3-домена заменен второй заряженной аминокислотой, где указанные первая и вторая заряженные кислоты имеют противоположныйIn one embodiment, threonine (T) at position 3bb of the first CH3 domain is replaced by a first charged amino acid, and leucine (L) at position 351 of the second CH3 domain is replaced by a second charged amino acid, wherein said first and second charged acids are opposite

- 14 046272 заряд. Если первый содержащий СНЗ-домен полипептид, который содержит заряженный остаток в положении 366, дополнительно содержит вариабельный домен, который обладает специфичностью к антигену А, и если второй содержащий CH3-домен полипептид, который содержит положительно заряженный остаток в положении 351, дополнительно содержит вариабельный домен, который обладает специфичностью к антигену В, в основном будут образовываться биспецифические Ig-подобные молекулы со специфичностью к АВ. Таким образом, дополнительно предусматривается способ в соответствии с настоящим изобретением, где указанное средство для предпочтительного образования пар между указанными 1- и 2-м содержащими CH3-домен полипептидами, или указанное средство для преимущественного образования пар между указанными 3- и 4-м содержащими CH3-домен полипептидами является заменой треонина в положении 366 указанного 1- или 3-го CH3-домена первой заряженной аминокислотой и заменой лейцина в положении 351 указанного 2- или 4-го CH3-домена второй заряженной аминокислотой, где указанные первая и вторая заряженные аминокислоты имеют противоположный заряд.- 14 046272 charge. If the first CH3 domain-containing polypeptide, which contains a charged residue at position 366, further contains a variable domain that has specificity for antigen A, and if the second CH3 domain-containing polypeptide, which contains a positively charged residue at position 351, further contains a variable domain , which has specificity for the B antigen, will mainly produce bispecific Ig-like molecules with AB specificity. Thus, further provided is a method according to the present invention, wherein said means for preferential pairing between said 1- and 2-CH3 domain-containing polypeptides, or said means for preferentially pairing between said 3- and 4-CH3 domain-containing polypeptides -domain polypeptides are the replacement of threonine at position 366 of said 1- or 3-th CH3 domain with a first charged amino acid and the replacement of leucine at position 351 of said 2- or 4-th CH3 domain with a second charged amino acid, wherein said first and second charged amino acids have opposite charge.

Одной предпочтительной комбинацией мутаций в соответствии с настоящим изобретением является замена треонина (Т) лизином (K) в положении 366 первого содержащего CH3-домен полипептида, который дополнительно содержит вариабельный домен (например, со специфичностью А), и замена лейцина (L) аспарагиновой кислотой (D) в положении 351 второго содержащего CH3-домен полипептида, который дополнительно содержит вариабельный домен (например, со специфичностью В). Это обозначают как парную мутацию T366K/L351'D. Как объяснено выше, сообщалось, что аминокислоты в положении 366 одного СН3-домена и в положении 351 второго СН3-домена являются парой контактных остатков на поверхности контакта CH3-CH3. Лизин, который внесен в положение 366, и аспарагиновая кислота, внесенная в положение 351, имеют противоположные заряды, так что эти аминокислоты электростатически притягиваются друг к другу. Таким образом, первый СН3-домен предпочтительно притягивает второй СН3-домен, и преимущественно образуются Ig-подобные молекулы, содержащие первый СН3-домен, содержащий лизин в положении 366, спаренный со вторым СН3-доменом, содержащим аспарагиновую кислоту в положении 351. Если первый содержащий СН3-домен полипептид обладает специфичностью к антигену А и если второй содержащий СН3-домен полипептид обладает специфичностью к антигену В, преимущественно образуются биспецифические Ig-подобные молекулы со специфичностью АВ. Следует отметить, что в некоторых вариантах осуществления специфичность вариабельных доменов как указанной первой, так и указанной второй содержащих СН3-домен полипептидных цепей может быть одинаковой, что приводит к образованию моноспецифических Ig-подобных молекул (например, со специфичностью АА). Как упоминалось выше, одним из преимуществ мутаций в соответствии с настоящим изобретением является тот факт, что обеспечивается новое взаимодействие между вновь внесенной парой заряженных аминокислот вместо замены существующих взаимодействий заряженных аминокислот. Это ранее не было описано или предложено. Таким образом, один аспект изобретения предусматривает способ в соответствии с настоящим изобретением для получения по меньшей мере двух различных Ig-подобных молекул из одной клетки-хозяина, где указанная 1-я содержащая СН3-домен полипептидная цепь содержит аминокислотную замену T366K, и указанная 2-я содержащая СН3-домен полипептидная цепь содержит аминокислотную замену L351D. Один вариант осуществления относится к способу получения гетеродимерной Ig-подобной молекулы из единичной клетки, где указанная Ig-подобная молекула содержит два СН3-домена, которые способны образовывать поверхность контакта, причем указанный способ включает предоставление в указанной клетке первой молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей 1-ю содержащую СН3-домен полипе птидную цепь; и второй молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей 2-ю содержащую СН3-домен полипептидную цепь, где указанная первая содержащая СН3-домен полипептидная цепь содержит аминокислотную замену T366K и где указанная вторая содержащая СН3-домен полипептидная цепь содержит аминокислотную замену L351D, причем указанный способ дополнительно включает стадии культивирования указанной клетки-хозяина, и обеспечения экспрессии указанных двух молекул нуклеиновой кислоты, и сбора указанной гетеродимерной Ig-подобной молекулы из культуры.One preferred combination of mutations in accordance with the present invention is the replacement of threonine (T) with lysine (K) at position 366 of the first CH3 domain-containing polypeptide that further contains a variable domain (for example, with specificity A), and the replacement of leucine (L) with aspartic acid (D) at position 351 of a second CH3 domain-containing polypeptide that further contains a variable domain (eg, with specificity B). This is referred to as the T366K/L351'D pairwise mutation. As explained above, the amino acids at position 366 of one CH3 domain and at position 351 of the second CH3 domain have been reported to be a pair of contact residues at the CH3-CH3 interface. Lysine, which is introduced at position 366, and aspartic acid, which is introduced at position 351, have opposite charges, so these amino acids are electrostatically attracted to each other. Thus, the first CH3 domain preferentially attracts the second CH3 domain, and Ig-like molecules are preferentially formed containing a first CH3 domain containing a lysine at position 366 paired with a second CH3 domain containing aspartic acid at position 351. If the first a polypeptide containing a CH3 domain has specificity for antigen A, and if a second polypeptide containing a CH3 domain has specificity for antigen B, bispecific Ig-like molecules with AB specificity are preferentially formed. It should be noted that in some embodiments, the specificity of the variable domains of both the first and second CH3 domain-containing polypeptide chains may be the same, resulting in the formation of monospecific Ig-like molecules (eg, with AA specificity). As mentioned above, one of the advantages of mutations in accordance with the present invention is the fact that a new interaction is provided between the newly introduced pair of charged amino acids instead of replacing existing charged amino acid interactions. This has not been previously described or suggested. Thus, one aspect of the invention provides a method in accordance with the present invention for producing at least two different Ig-like molecules from a single host cell, wherein said 1st CH3 domain-containing polypeptide chain contains a T366K amino acid substitution, and said 2- The polypeptide chain containing the CH3 domain contains the amino acid substitution L351D. One embodiment relates to a method of producing a heterodimeric Ig-like molecule from a single cell, wherein said Ig-like molecule contains two CH3 domains that are capable of forming an interface, the method comprising providing in said cell a first nucleic acid molecule encoding 1- a polypeptide chain containing a CH3 domain; and a second nucleic acid molecule encoding a 2nd CH3 domain-containing polypeptide chain, wherein said first CH3 domain-containing polypeptide chain contains a T366K amino acid substitution and wherein said second CH3 domain-containing polypeptide chain contains an L351D amino acid substitution, wherein said method further includes the step of culturing said host cell, and causing expression of said two nucleic acid molecules, and collecting said heterodimeric Ig-like molecule from the culture.

С использованием упомянутых выше аминокислотных замен по настоящему изобретению, стало возможным продуцировать гетеродимерную Ig-подобную молекулу из единичной клетки, где присутствие примесей гомодимеров составляет менее 5%, предпочтительно менее 2%, более предпочтительно менее 1% или наиболее предпочтительно где примеси гомодимеров по существу отсутствуют. Таким образом, в одном варианте осуществления предусматривается способ получения гетеродимерной Ig-подобной молекулы из единичной клетки, где указанная Ig-подобная молекула содержит два СН3-домена, которые способны образовывать поверхность контакта, и где присутствие примесей гомодимеров составляет менее 5%, предпочтительно менее 2%, более предпочтительно менее 1% и наиболее предпочтительно примеси гомодимеров по существу отсутствуют, причем указанный способ включает предоставление в указанной клетке первой молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей 1-ю содержащую СН3-домен полипептидную цепь; иUsing the above-mentioned amino acid substitutions of the present invention, it is possible to produce a heterodimeric Ig-like molecule from a single cell where the presence of homodimer impurities is less than 5%, preferably less than 2%, more preferably less than 1%, or most preferably where homodimer impurities are substantially absent . Thus, in one embodiment, a method is provided for producing a heterodimeric Ig-like molecule from a single cell, wherein the Ig-like molecule contains two CH3 domains that are capable of forming an interface, and where the presence of homodimer impurities is less than 5%, preferably less than 2% %, more preferably less than 1% and most preferably substantially free of homodimer impurities, the method comprising providing in said cell a first nucleic acid molecule encoding a 1st CH3 domain containing polypeptide chain; And

- 15 046272 второй молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей 2-ю содержащую СНЗ-домен полипептидную цепь, где указанная первая содержащая СНЗ-домен полипептидная цепь содержит аминокислотную замену T366K и где указанная вторая содержащая СНЗ-домен полипептидная цепь содержит аминокислотную замену L351D, причем указанный способ дополнительно включает стадии культивирования указанной клетки-хозяина, и обеспечения экспрессии указанных двух молекул нуклеиновой кислоты, и сбора указанной гетеродимерной Ig-подобной молекулы из культуры.- 15 046272 of a second nucleic acid molecule encoding a 2nd CH3 domain-containing polypeptide chain, wherein said first CH3 domain-containing polypeptide chain contains a T366K amino acid substitution and wherein said second CH3 domain-containing polypeptide chain contains an L351D amino acid substitution, wherein said method further includes the steps of culturing said host cell, and allowing expression of said two nucleic acid molecules, and collecting said heterodimeric Ig-like molecule from the culture.

Предпочтительно предусматривается способ в соответствии с настоящим изобретением для получения по меньшей мере двух различных Ig-подобных молекул, или способ в соответствии с изобретением для получения гетеродимерной Ig-подобной молекулы, где указанная первая содержащая СНЗ-домен полипептидная цепь дополнительно содержит аминокислотную замену L351K. Кроме того, предпочтительно, чтобы указанная вторая содержащая СНЗ-домен полипептидная цепь дополнительно содержала аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из Y349E, Y349D и L368E. Наиболее предпочтительно, указанная вторая содержащая ОИЗ-домен полипептидная цепь дополнительно содержит аминокислотную замену L368E.Preferably, a method according to the present invention is provided for producing at least two different Ig-like molecules, or a method according to the invention is provided for producing a heterodimeric Ig-like molecule, wherein said first CH3 domain-containing polypeptide chain further comprises an L351K amino acid substitution. It is further preferred that said second CH3 domain-containing polypeptide chain further comprises an amino acid substitution selected from the group consisting of Y349E, Y349D and L368E. Most preferably, said second OIZ domain-containing polypeptide chain further comprises the L368E amino acid substitution.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления упомянутые выше мутации T366I</L351'D в соответствии с настоящим изобретением далее комбинируют с заменой лейцина (L) на глутаминовую кислоту (Е) в положении 368 второго СНЗ-домена. Ее, например, обозначают как мутация T366K/L351'D,L368'E (однако также возможны альтернативные способы обозначения, такие как T336K/L351D-L368E или T366K/L351D, L368E или T366K - L351D,L368E). Как показано в примере 17, внесение этой мутации в соответствии с изобретением в первый содержащий СНЗ-домен полипептид со специфичностью к антигену А, и второй содержащий СНЗ-домен полипептид со специфичностью к антигену В приводит к особенно высокой доле биспецифических Ig-подобных молекул с двойной специфичностью к АВ. С помощью этой пары мутаций стало возможным получение биспецифического антитела без какого-либо поддающегося обнаружению количества образовавшихся гомодимеров. Таким образом, особенно предпочтительный вариант осуществления относится к способу получения гетеродимерной Ig-подобной молекулы из единичной клетки, где указанная Ig-подобная молекула содержит два СНЗ-домена, которые способны образовывать поверхность контакта, и где присутствие примесей гомодимеров составляет менее 5%, предпочтительно менее 2%, более предпочтительно менее 1% и наиболее предпочтительно примеси гомодимеров по существу отсутствуют, причем указанный способ включает предоставление в указанной клетке первой молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей 1-ю содержащую СНЗ-домен полипептидную цепь; и второй молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей 2-ю содержащую СНЗ-домен полипептидную цепь, где указанная первая содержащая СНЗ-домен полипептидная цепь содержит аминокислотную замену ТЗ66К и где указанная вторая содержащая СНЗ-домен полипептидная цепь содержит аминокислотные замены L351D и L368E, причем указанный способ дополнительно включает стадии культивирования указанной клетки-хозяина, и обеспечения экспрессии указанных двух молекул нуклеиновой кислоты, и сбора указанной гетеродимерной Ig-подобной молекулы из культуры.Thus, in a preferred embodiment, the above-mentioned T366I</L351'D mutations in accordance with the present invention are further combined with a change from leucine (L) to glutamic acid (E) at position 368 of the second CH3 domain. It is, for example, designated as the T366K/L351'D,L368'E mutation (however, alternative designations are also possible, such as T336K/L351D-L368E or T366K/L351D, L368E or T366K - L351D,L368E). As shown in Example 17, introduction of this mutation according to the invention into a first CH3 domain-containing polypeptide with specificity for antigen A, and a second CH3 domain-containing polypeptide with specificity for antigen B, results in a particularly high proportion of bispecific Ig-like molecules with double specificity for AV. With this pair of mutations, it was possible to produce a bispecific antibody without any detectable amount of homodimers formed. Thus, a particularly preferred embodiment relates to a method for producing a heterodimeric Ig-like molecule from a single cell, wherein said Ig-like molecule contains two CH3 domains that are capable of forming a contact surface, and where the presence of homodimer impurities is less than 5%, preferably less 2%, more preferably less than 1%, and most preferably substantially free of homodimer impurities, the method comprising providing in said cell a first nucleic acid molecule encoding a 1st CH3 domain-containing polypeptide chain; and a second nucleic acid molecule encoding a 2nd CH3 domain-containing polypeptide chain, wherein said first CH3 domain-containing polypeptide chain contains an amino acid substitution T366K and wherein said second CH3 domain-containing polypeptide chain contains amino acid substitutions L351D and L368E, wherein said method further includes the steps of culturing said host cell, and allowing expression of said two nucleic acid molecules, and collecting said heterodimeric Ig-like molecule from the culture.

В другом предпочтительном варианте осуществления треонин (Т) заменен лизином (K) в положении З66 первого СНЗ-домена и лейцин (L) заменен аспарагиновой кислотой (D) в положении З51 второго СНЗ-домена, и тирозин (Y) заменен глутаминовой кислотой (Е) в положении З49 указанного второго СНЗ-домена. Это, например, обозначают как мутация ТЗ66К^З51'В,УЗ49'Е, однако другие способы обозначения этих мутаций могут включать, например, ТЗ66К - L351D:Y349E, или ТЗ661<ЖЗ51О.УЗ49Е или просто ТЗ66К^З5ЮУЗ49Е. Остаток УЗ49 является соседним остатком для остатка в положении З51, который может участвовать во взаимодействиях димеров. В соответствии с данными in silico, УЗ49Е способствует стабильности гетеродимера (более низкие показатели in silico), а также дестабилизации монодимера (более высокие показатели in silico) и глутаминовая кислота (Е) в положении З49 является более благоприятной, чем аспарагиновая кислота (D). Таким образом, внесение второй аминокислотной замены во второй содержащий СНЗ-домен полипептид, уже содержащий аминокислотную замену в положении З51, далее способствует гетеродимеризации.In another preferred embodiment, threonine (T) is replaced by lysine (K) at position 366 of the first CH3 domain and leucine (L) is replaced by aspartic acid (D) at position 351 of the second CH3 domain, and tyrosine (Y) is replaced by glutamic acid (E ) at position 349 of said second CH3 domain. This, for example, is referred to as the mutation T366K^Z51'B,UZ49'E, however other ways of designating these mutations may include, for example, T366K - L351D:Y349E, or T3661<Zh351O.UZ49E or simply T366K^35YU349E. Residue 339 is a neighboring residue to the residue at position 351, which may participate in dimer interactions. According to in silico data, US49E promotes heterodimer stability (lower in silico scores) as well as monodimer destabilization (higher in silico scores) and glutamic acid (E) at position Z49 is more favorable than aspartic acid (D). Thus, introducing a second amino acid substitution into a second CH3 domain-containing polypeptide that already contains an amino acid substitution at position 351 further promotes heterodimerization.

Особенно предпочтительный вариант осуществления, таким образом, относится к способу получения гетеродимерной Ig-подобной молекулы из единичной клетки, где указанная Ig-подобная молекула содержит два СНЗ-домена, которые способны образовывать поверхность контакта, и где примеси гомодимеров составляют менее 5%, более предпочтительно менее 2%, еще более предпочтительно менее 1%, и наиболее предпочтительно по существу отсутствуют, причем указанный способ включает предоставление в указанной клетке первой молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей 1-ую содержащую СНЗ-домен полипептидную цепь; и второй молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей 2-ую содержащую СНЗ-домен полипептидную цепь,A particularly preferred embodiment therefore relates to a method for producing a heterodimeric Ig-like molecule from a single cell, wherein said Ig-like molecule contains two CH3 domains that are capable of forming a contact surface, and wherein the homodimer impurity is less than 5%, more preferably less than 2%, even more preferably less than 1%, and most preferably substantially absent, the method comprising providing in said cell a first nucleic acid molecule encoding a 1st CH3 domain-containing polypeptide chain; and a second nucleic acid molecule encoding a 2nd CH3 domain-containing polypeptide chain,

- 16 046272 где указанная первая содержащая СНЗ-домен полипептидная цепь содержит аминокислотную замену T366K и где указанная вторая содержащая CH3-домен полипептидная цепь содержит аминокислотные замены L351D и Y349E, причем указанный способ дополнительно включает стадии культивирования указанной клетки-хозяина, и обеспечения экспрессии указанных двух молекул нуклеиновой кислоты, и сбора указанной гетеродимерной Ig-подобной молекулы из культуры.- 16 046272 wherein said first CH3 domain-containing polypeptide chain contains the amino acid substitution T366K and wherein said second CH3 domain-containing polypeptide chain contains the amino acid substitutions L351D and Y349E, wherein said method further comprises the steps of culturing said host cell and causing expression of said two nucleic acid molecules, and collecting said heterodimeric Ig-like molecule from the culture.

В другом предпочтительном варианте осуществления треонин (Т) заменен лизином (K) в положении 366 первого CH3-домена и лейцин (L) заменен аспарагиновой кислотой (D) в положении 351 второго CH3-домена, и тирозин (Y) заменен глутаминовой кислотой (Е) в положении 349 указанного второго CH3-домена, и лейцин (L) заменен глутаминовой кислотой (Е) в положении 368 указанного второго CH3-домена. Это обозначают как мутация T366K/L351'D,Y349'E,L368'E. Два остатка Y349 и L368 представляют собой остатки, которые могут участвовать во взаимодействиях димеров. В соответствии с данными in silico, Y349E и L368E способствуют стабильности гетеродимера (более низкие показатели in silico), а также дестабилизации димера ВВ (более высокие показатели in silico), и глутаминовая кислота (Е) в положениях 349 и 368 является более благоприятной, чем аспарагиновая кислота (D). Таким образом, внесение второй и третьей аминокислотной замены в В-цепь, которая уже содержит аминокислотную замену в положении 351, далее способствует гетеродимеризации. Таким образом, особенно предпочтительный вариант осуществления относится к способу получения гетеродимерной Ig-подобной молекулы из единичной клетки, где указанная Ig-подобная молекула содержит два СИ3-домена, которые способны образовывать поверхность контакта и где примеси гомодимеров составляют менее 5%, более предпочтительно менее 2%, еще более предпочтительно менее 1%, и наиболее предпочтительно по существу отсутствуют, причем указанный способ включает предоставление в указанной клетке первой молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей 1-ю содержащую СИ3-домен полипептидную цепь; и второй молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей 2-ю содержащую ОИЗ-домен полипептидную цепь, где указанная первая содержащая СИ3-домен полипептидная цепь содержит аминокислотную замену T366K и где указанная вторая содержащая СИ3-домен полипептидная цепь содержит аминокислотные замены L351D, и Y349E, и L368E, причем указанный способ дополнительно включает стадии культивирования указанной клетки-хозяина, и обеспечения экспрессии указанных двух молекул нуклеиновой кислоты, и сбора указанной гетеродимерной Ig-подобной молекулы из культуры.In another preferred embodiment, threonine (T) is replaced by lysine (K) at position 366 of the first CH3 domain and leucine (L) is replaced by aspartic acid (D) at position 351 of the second CH3 domain, and tyrosine (Y) is replaced by glutamic acid (E ) at position 349 of said second CH3 domain, and leucine (L) is replaced by glutamic acid (E) at position 368 of said second CH3 domain. This is referred to as the T366K/L351'D,Y349'E,L368'E mutation. The two residues Y349 and L368 are residues that may be involved in dimer interactions. According to in silico data, Y349E and L368E promote heterodimer stability (lower in silico scores) as well as BB dimer destabilization (higher in silico scores), and glutamic acid (E) at positions 349 and 368 is more favorable than aspartic acid (D). Thus, introducing a second and third amino acid substitution into a B chain that already contains an amino acid substitution at position 351 further promotes heterodimerization. Thus, a particularly preferred embodiment relates to a method for producing a heterodimeric Ig-like molecule from a single cell, wherein said Ig-like molecule contains two CI3 domains that are capable of forming a contact surface and wherein the homodimer impurity is less than 5%, more preferably less than 2% %, even more preferably less than 1%, and most preferably substantially absent, the method comprising providing in said cell a first nucleic acid molecule encoding a 1st CI3 domain-containing polypeptide chain; and a second nucleic acid molecule encoding a 2nd CI3 domain-containing polypeptide chain, wherein said first CI3 domain-containing polypeptide chain contains amino acid substitution T366K and wherein said second CI3 domain-containing polypeptide chain contains amino acid substitutions L351D, and Y349E, and L368E wherein said method further comprises the steps of culturing said host cell, and causing expression of said two nucleic acid molecules, and collecting said heterodimeric Ig-like molecule from the culture.

В другом предпочтительном варианте осуществления треонин (Т) заменен лизином (K) в положении 366 первого СИ3-домена, и лейцин (L) заменен лизином (K) в положении 351 указанного первого СИ3-домена, и лейцин (L) заменен аспарагиновой кислотой (D) в положении 351 второго СИ3-домена, и лейцин (L) заменен глутаминовой кислотой (Е) в положении 368 указанного второго СИ3-домена. Это обозначают как мутация T366K,L351K/L351'D,L368'E. Эта мутация также увеличивает долю представляющего интерес (биспецифического) антитела, как показано в разделе Примеры. Также с помощью этой мутации стало возможным получение биспецифического антитела без образования какого-либо поддающегося обнаружению количества гомодимеров. Таким образом, дополнительно предусматривается способ получения гетеродимерной Ig-подобной молекулы из единичной клетки, где указанная Ig-подобная молекула содержит два СИ3-домена, которые способны образовывать поверхность контакта, и где примеси гомодимеров составляют менее 5%, предпочтительно менее 2%, более предпочтительно менее 1% и наиболее предпочтительно по существу отсутствуют, причем указанный способ включает предоставление в указанной клетке первой молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей 1-ю содержащую СИ3-домен полипептидную цепь; и второй молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей 2-ю содержащую СИ3-домен полипептидную цепь, где указанная первая содержащая СИ3-домен полипептидная цепь содержит аминокислотную замену T366K и где указанная вторая содержащая СИ3-домен полипептидная цепь содержит аминокислотные замены L351D и L368E, причем указанный способ дополнительно включает стадии культивирования указанной клетки-хозяина, и обеспечения экспрессии указанных двух молекул нуклеиновой кислоты, и сбора указанной гетеродимерной Ig-подобной молекулы из культуры.In another preferred embodiment, threonine (T) is replaced by lysine (K) at position 366 of the first CI3 domain, and leucine (L) is replaced by lysine (K) at position 351 of the first CI3 domain, and leucine (L) is replaced by aspartic acid ( D) at position 351 of the second CI3 domain, and leucine (L) is replaced by glutamic acid (E) at position 368 of the second CI3 domain. This is referred to as the T366K,L351K/L351'D,L368'E mutation. This mutation also increases the proportion of antibody of interest (bispecific) as shown in the Examples section. It was also possible with this mutation to produce a bispecific antibody without the formation of any detectable amount of homodimers. Thus, further provided is a method for producing a heterodimeric Ig-like molecule from a single cell, wherein said Ig-like molecule contains two CI3 domains that are capable of forming a contact surface, and wherein the homodimer impurity is less than 5%, preferably less than 2%, more preferably less than 1% and most preferably substantially absent, the method comprising providing in said cell a first nucleic acid molecule encoding a 1st CI3 domain-containing polypeptide chain; and a second nucleic acid molecule encoding a 2nd CI3 domain-containing polypeptide chain, wherein said first CI3 domain-containing polypeptide chain contains amino acid substitution T366K and wherein said second CI3 domain-containing polypeptide chain contains amino acid substitutions L351D and L368E, wherein said method further includes the steps of culturing said host cell, and allowing expression of said two nucleic acid molecules, and collecting said heterodimeric Ig-like molecule from the culture.

В другом предпочтительном варианте осуществления треонин (Т) заменен на лизин (K) в положении 366 первого СИ3-домена, и лейцин (L) заменен лизином (K) в положении 351 указанного первого СИ3-домена, и лейцин (L) заменен аспарагиновой кислотой (D) в положении 351 второго СИ3-домена, и тирозин (Y) заменен аспарагиновой кислотой (D) в положении 349 указанного второго СИ3-домена, и аргинин (R) заменен аспарагиновой кислотой (D) в положении 355 указанного второго СИ3-домена. Это обозначают как мутация T366K,L351K/L351'D,Y349'D,R355'D. Пара Т366К^351К/Ъ351^^349^ может быть далее улучшена посредством мутации R355'D в В-цепи, что приводит к более высокому показателю ВВ in silico, но также показатель АВ in silico является несколько более высоким. Таким образом, дополнительно предусматривается способ получения гетеродимерной Ig-подобной молекулы из единичной клетки, где указанная Ig-подобная молекула содержит два СИ3-домена, которые способны образоIn another preferred embodiment, threonine (T) is replaced by lysine (K) at position 366 of the first CI3 domain, and leucine (L) is replaced by lysine (K) at position 351 of the first CI3 domain, and leucine (L) is replaced by aspartic acid (D) at position 351 of the second CI3 domain, and tyrosine (Y) is replaced by aspartic acid (D) at position 349 of the second CI3 domain, and arginine (R) is replaced by aspartic acid (D) at position 355 of the second CI3 domain . This is referred to as the T366K,L351K/L351'D,Y349'D,R355'D mutation. The T366K^351K/B351^^349^ pair can be further improved by the R355'D mutation in the B chain, resulting in a higher in silico BB score, but also a slightly higher in silico AB score. Thus, further provided is a method for producing a heterodimeric Ig-like molecule from a single cell, wherein said Ig-like molecule contains two CI3 domains that are capable of forming

- 17 046272 вывать поверхность контакта, и где примеси гомодимеров составляют менее 5%, более предпочтительно менее 2%, еще более предпочтительно менее 1%, и наиболее предпочтительно по существу отсутствуют, причем указанный способ включает предоставление в указанной клетке первой молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей 1-ю содержащую С113-домен полипептидную цепь; и второй молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей 2-ю содержащую СНЗ-домен полипептидную цепь, где указанная первая содержащая СН3-домен полипептидная цепь содержит аминокислотные замены T366K и L351K, и где указанная вторая содержащая СН3-домен полипептидная цепь содержит аминокислотные замены L351D, и Y349D, и R355D, причем указанный способ дополнительно включает стадии культивирования указанной клетки-хозяина, и обеспечения экспрессии указанных двух молекул нуклеиновой кислоты, и сбора указанной гетеродимерной Ig-подобной молекулы из культуры.- 17 046272 contact surface, and wherein the homodimer impurities are less than 5%, more preferably less than 2%, even more preferably less than 1%, and most preferably substantially absent, wherein said method comprises providing in said cell a first nucleic acid molecule encoding 1st polypeptide chain containing the C113 domain; and a second nucleic acid molecule encoding a 2nd CH3 domain-containing polypeptide chain, wherein said first CH3 domain-containing polypeptide chain contains amino acid substitutions T366K and L351K, and wherein said second CH3 domain-containing polypeptide chain contains amino acid substitutions L351D, and Y349D , and R355D, wherein said method further comprises the steps of culturing said host cell, and allowing expression of said two nucleic acid molecules, and collecting said heterodimeric Ig-like molecule from the culture.

В табл. В предоставлен обзор мутаций, которые можно вносить в СН3-домены в качестве предпочтительных средств для преимущественного образования пар, чтобы получить либо гетеродимеры, либо гомодимеры.In table B provides an overview of mutations that can be introduced into CH3 domains as a means of preferential pairing to produce either heterodimers or homodimers.

Таблица ВTable B

Замены ΆΑ в СНЗ ΆΑ substitutions in SNZ Конструкция # Design # Предпочтительно образует пары с Preferably pairs with - (дикий тип) - (wild type) - - Дикий тип Wild type Е356К, D399K E356K, D399K 1 1 Конструкция 2 или 3 Design 2 or 3 K392D, K409D K392D, K409D 2 2 Конструкция 1 Design 1 K392D, K409D, K439D K392D, K409D, K439D 3 3 Конструкция 1 Design 1 K392D, D399K, K409D K392D, D399K, K409D 4 4 Конструкция 4 Design 4 Е356К, Е357К, K439D, K370D E356K, E357K, K439D, K370D 5 5 Конструкция 5 Design 5 T366W T366W 6 6 Конструкция 7 Design 7 T366S, L368A, Y407V T366S, L368A, Y407V 7 7 Конструкция 6 Design 6 Т366К T366K 43 43 Конструкция 63, 69, 70, 71, 73 Design 63, 69, 70, 71, 73 L351D L351D 63 63 Конструкция 43, 68 Design 43, 68 Т366К, L351K T366K, L351K 68 68 Конструкция 63, 69, 70, 71, 72, 75 Design 63, 69, 70, 71, 72, 75 L351D, L368E L351D, L368E 69 69 Конструкция 43, 68 Design 43, 68 L351E, Y349E L351E, Y349E 70 70 Конструкция 43, 68 Design 43, 68 L351D, Y349E L351D, Y349E 71 71 Конструкция 43, 68 Design 43, 68 L351D, R355D L351D, R355D 72 72 Конструкция 43, 68 Design 43, 68 L351D, Y349E, L368E L351D, Y349E, L368E 73 73 Конструкция 43 Design 43 L351D, Y349D, R355D L351D, Y349D, R355D 75 75 Конструкция 68 Design 68

Таким образом, также предусматривается способ в соответствии с настоящим изобретением для получения по меньшей мере двух различных Ig-подобных молекул, или способ в соответствии с изобретением для получения гетеродимерной Ig-подобной молекулы, где указанные средства для преимущественного образования пар между указанными 1- и 2-м содержащими СН3-домен полипептидами, и/или указанные средства для преимущественного образования пар между указанными 3- и 4-м содержащими СН3-домен полипептидами содержат по меньшей мере одну комбинацию мутаций, как представлено в табл. В. Предпочтительно указанные средства для преимущественного образования пар между указанными 1- и 2-м содержащими СН3-домен полипептидами и указанные средства для преимущественного образования пар между указанными 3- и 4-м содержащими СН3-домен полипептидами содержат по меньшей мере две комбинации мутаций, как представлено в табл. В.Thus, also provided is a method in accordance with the present invention for producing at least two different Ig-like molecules, or a method in accordance with the invention for producing a heterodimeric Ig-like molecule, wherein said means for preferentially pairing between said 1- and 2 - containing CH3 domain polypeptides, and/or said means for preferential pairing between said 3 and 4 CH3 domain containing polypeptides contain at least one combination of mutations, as presented in table. B. Preferably, said means for preferential pairing between said 1 and 2 CH3 domain-containing polypeptides and said means for preferential pairing between said 3 and 4 CH3 domain-containing polypeptides contain at least two combinations of mutations, as presented in table. IN.

Настоящее изобретение также относится к новым комбинациям мутаций СН3, с которыми стало возможным получить смесь по меньшей мере двух моноспецифических Ig-подобных молекул в единичной клетке, где примеси биспецифических Ig-подобных молекул составляют менее 5%, предпочтительно не более чем 2%, еще более предпочтительно менее 1% и наиболее предпочтительно по существу отсутствуют. Эти мутации в соответствии с изобретением, таким образом, являются особенно пригодными для получения смеси моноспецифических антител, которая, например, является преимущественной, когдаThe present invention also relates to new combinations of CH3 mutations with which it is possible to obtain a mixture of at least two monospecific Ig-like molecules in a single cell, where the admixture of bispecific Ig-like molecules is less than 5%, preferably no more than 2%, even more preferably less than 1% and most preferably substantially absent. These mutations according to the invention are therefore particularly suitable for producing a mixture of monospecific antibodies, which is, for example, advantageous when

- 18 046272 является желательным высокий уровень сшивания двух идентичных молекул-мишеней, когда плотность антител на клетках-мишенях должна быть достаточно высокой, чтобы привлечь определенные эффекторные функции, такие как опосредуемый комплементом лизис опухолевой клетки, или когда две мишени расположены слишком далеко друг от друга, так что они не могут связываться одним биспецифическим антителом, или для упрощения процедур получения разрешения контролирующего органа. В таких случаях часто является желательной оптимизация производственной платформы для таких моноспецифических антител. Как показано в примере 10, настоящее изобретение относится наблюдению, что, когда лизин (K) в положении 392 первого содержащего CH3-домен полипептида (например, обладающего специфичностью А) заменен аспарагиновой кислотой (D), и когда аспарагиновая кислота (D) в положении 399 указанного первого содержащего CH3-домен полипептида заменена лизином (K), и когда лизин (K) в положении 409 указанного первого содержащего CH3-домен полипептид заменен аспарагиновой кислотой (D), стало возможным получение смеси по меньшей мере двух различных моноспецифических Igподобных молекул в одной клетке, включая моноспецифические Ig-подобные молекулы со специфичностью АА, где образование биспецифических побочных продуктов (биспецифические Ig-подобные молекулы) снижено до уровня ниже 5%, или даже до уровня ниже 3%, или даже по существу совсем не обнаруживается. Таким образом, упомянутая выше комбинация мутаций (обозначаемая в настоящем описании как K392D, D399K, K409D) является особенно предпочтительной для получения смеси моноспецифических Ig-подобных молекул. Квалифицированному специалисту будет понятно, что их функциональные варианты, т.е. К392Е, D399R, К4О9Е, могут приводить к сходным эффектам. Кроме того, также к сходным эффектам могут приводить двойные мутанты, содержащие замены D399K и K409D, или другие функциональные варианты, например, такие как K392D и K409D, D399R и К4О9Е и т.д.- 18 046272 a high level of cross-linking of two identical target molecules is desirable when the antibody density on the target cells must be high enough to attract certain effector functions, such as complement-mediated tumor cell lysis, or when the two targets are located too far apart , so that they cannot be bound by a single bispecific antibody, or to simplify regulatory approval procedures. In such cases, it is often desirable to optimize the production platform for such monospecific antibodies. As shown in Example 10, the present invention relates to the observation that when lysine (K) at position 392 of a first CH3 domain-containing polypeptide (eg, having specificity A) is replaced by aspartic acid (D), and when aspartic acid (D) at position 399 of said first CH3 domain-containing polypeptide is replaced by lysine (K), and when the lysine (K) at position 409 of said first CH3 domain-containing polypeptide is replaced by aspartic acid (D), it is possible to obtain a mixture of at least two different monospecific Ig-like molecules in one cell, including monospecific Ig-like molecules with AA specificity, where the formation of bispecific by-products (bispecific Ig-like molecules) is reduced to below 5%, or even to below 3%, or even essentially undetectable. Thus, the above combination of mutations (referred to herein as K392D, D399K, K409D) is particularly preferred for producing a mixture of monospecific Ig-like molecules. It will be clear to a qualified specialist that their functional variants, i.e. K392E, D399R, K4O9E, can lead to similar effects. In addition, double mutants containing substitutions D399K and K409D, or other functional variants, for example, such as K392D and K409D, D399R and K4O9E, etc., can also lead to similar effects.

Вышеуказанное справедливо для комбинации мутаций, где глутаминовая кислота (Е) в положении 356 первого содержащего CH3-домен полипептида заменена лизином (K), и где глутаминовая кислота (Е) в положении 357 указанного первого содержащего CH3-домен полипептида заменена лизином (K), и где лизин (K) в положении 439 указанного первого содержащего CH3-домен полипептида заменен аспарагиновой кислотой (D), и где лизин (K) в положении 370 указанного первого содержащего CH3-домен полипептида заменен аспарагиновой кислотой (D). Эта комбинаций мутаций (обозначаемая в настоящем описании как E356K, Е357К, K439D, K370D) также является особенно предпочтительной для получения смеси моноспецифических Ig-подобных молекул. Квалифицированному специалисту будет понятно, что их функциональные варианты, т.е. E356R, E357R, К439Е, К37ОЕ, могут приводить к сходным эффектам. Кроме того, также к сходным эффектам могут приводить тройные или двойные мутанты, содержащие замены Е356К и K439D, и Е357К и K370D, или другие функциональные варианты. Таким образом, следующий вариант осуществления относится к способу получения по меньшей мере двух различных моноспецифических Ig-подобных молекул из одной клетки-хозяина, где каждая из указанных двух Ig-подобных молекул содержит два CH3-домена, которые способны образовывать поверхность контакта, причем указанный способ включает предоставление в указанной клетке первой молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей 1-ю содержащую CH3-домен полипе птидную цепь, обладающую специфичностью А; и второй молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей 2-ю содержащую CH3-домен полипептидную цепь, обладающую специфичностью В, где указанная первая содержащая CH3-домен полипептидная цепь содержит мутации K392D, D399K, K409D, и указанная вторая содержащая CH3-домен полипептидная цепь либо содержит CH3-домен дикого типа, либо содержит мутацию Е356К, Е357К, K439D, K370D, причем указанный способ дополнительно включает стадии культивирования указанной клетки-хозяина, и обеспечения экспрессии указанных молекул нуклеиновой кислоты, и сбора указанных по меньшей мере двух различных Ig-подобных молекул из культуры.The above is true for a combination of mutations where the glutamic acid (E) at position 356 of the first CH3 domain-containing polypeptide is replaced by lysine (K), and where the glutamic acid (E) at position 357 of the first CH3 domain-containing polypeptide is replaced by lysine (K), and wherein the lysine (K) at position 439 of said first CH3 domain-containing polypeptide is replaced by aspartic acid (D), and where the lysine (K) at position 370 of said first CH3 domain-containing polypeptide is replaced by aspartic acid (D). This combination of mutations (referred to herein as E356K, E357K, K439D, K370D) is also particularly preferred for producing a mixture of monospecific Ig-like molecules. It will be clear to a qualified specialist that their functional variants, i.e. E356R, E357R, K439E, K37OE, can lead to similar effects. In addition, triple or double mutants containing the substitutions E356K and K439D, and E357K and K370D, or other functional variants can also lead to similar effects. Thus, the following embodiment relates to a method for producing at least two different monospecific Ig-like molecules from a single host cell, wherein each of the two Ig-like molecules contains two CH3 domains that are capable of forming a contact surface, wherein said method includes providing in said cell a first nucleic acid molecule encoding a 1st CH3 domain-containing polypeptide chain having specificity A; and a second nucleic acid molecule encoding a 2nd CH3 domain-containing polypeptide chain having specificity B, wherein said first CH3 domain-containing polypeptide chain contains mutations K392D, D399K, K409D, and said second CH3 domain-containing polypeptide chain either contains CH3 -wild type domain, or contains the mutation E356K, E357K, K439D, K370D, wherein the method further includes the steps of culturing the specified host cell, and ensuring the expression of the specified nucleic acid molecules, and collecting the specified at least two different Ig-like molecules from the culture .

Альтернативный вариант осуществления относится к способу получения по меньшей мере двух различных моноспецифических Ig-подобных молекул из одной клетки-хозяина, где каждая из указанных двух Ig-подобных молекул содержит два CH3-домена, которые способны образовывать поверхность контакта, причем указанный способ включает предоставление в указанной клетке первой молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей 1-ю содержащую CH3-домен полипептидную цепь, обладающую специфичностью А; и второй молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей 2-ю содержащую CH3-домен полипептидную цепь, обладающую специфичностью В, где указанная первая содержащая CH3-домен полипептидная цепь либо содержит CH3-домен дикого типа, либо содержит мутацию K392D, D399K, K409D, и указанная вторая содержащая CH3-домен полипептидная цепь содержит мутацию Е356К, Е357К, K439D, K370D, причем указанный способ дополнительно включает стадии культивирования клетки-хозяина, и обеспечения экспрессии указанных молекул нуклеиновой кислоты, и сбора указанных по меньшей мере двух различных Ig-подобных молекул из культуры.An alternative embodiment relates to a method of producing at least two different monospecific Ig-like molecules from a single host cell, wherein each of the two Ig-like molecules contains two CH3 domains that are capable of forming a contact surface, the method comprising providing said cell of a first nucleic acid molecule encoding a 1st CH3 domain-containing polypeptide chain having specificity A; and a second nucleic acid molecule encoding a 2nd CH3 domain-containing polypeptide chain having specificity B, wherein said first CH3 domain-containing polypeptide chain either contains a wild-type CH3 domain or contains a mutation K392D, D399K, K409D, and said second the CH3 domain-containing polypeptide chain contains the mutation E356K, E357K, K439D, K370D, wherein the method further includes the steps of culturing the host cell, and ensuring the expression of the specified nucleic acid molecules, and collecting the specified at least two different Ig-like molecules from the culture.

Как представлено в примере 10, две моноспецифических Ig-подобных молекулы можно получать в единичной клетке, где образование биспецифических Ig-подобных молекул по существу не поддаетсяAs presented in Example 10, two monospecific Ig-like molecules can be produced in a single cell, where the formation of bispecific Ig-like molecules is essentially impossible

- 19 046272 обнаружению. Квалифицированный специалист может выбрать 3-ю молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую содержащую ОИЗ-домен полипептидную цепь дикого типа или модифицированную способами инженерии содержащую ОИЗ-домен полипептидную цепь для предоставления указанной клеткехозяину, так чтобы образовывалась смесь 3 моноспецифических антител и т.д.- 19 046272 detection. One of skill in the art may select a 3 nucleic acid molecule encoding a wild-type OI domain-containing polypeptide chain or an engineered OI domain-containing polypeptide chain to provide to said host cell so as to produce a mixture of 3 monospecific antibodies, etc.

В одном аспекте изобретения предусматривается способ по изобретению для получения по меньшей мере двух различных Ig-подобных молекул или для получения гетеродимерной Ig-подобной молекулы, где каждая из содержащих CH3 -домен полипептидных цепей дополнительно содержит вариабельную область, распознающую отличающийся эпитоп-мишень, где эпитопы-мишени расположены на одной и той же молекуле. Это часто обеспечивает более эффективное противодействие (биологической) функции указанной молекулы-мишени по сравнению с ситуацией нацеливания только на один эпитоп. Например, гетеродимерная Ig-подобная молекула может одновременно связываться с 2 эпитопами, присутствующими, например, на рецепторах факторов роста или растворимых молекулах, важных для пролиферации опухолевых клеток, тем самым эффективно блокируя несколько независимых каскадов передачи сигнала, ведущих к неконтролируемой пролиферации, и любая комбинация по меньшей мере двух Ig-подобных молекул может одновременно связываться с 2, или даже 3 или 4 эпитопами, присутствующими на таких рецепторах факторов роста или растворимых молекулах.In one aspect of the invention, there is provided a method of the invention for producing at least two different Ig-like molecules or for producing a heterodimeric Ig-like molecule, wherein each of the CH3 domain-containing polypeptide chains further comprises a variable region recognizing a different target epitope, wherein the epitopes -targets are located on the same molecule. This often provides more effective counteraction to the (biological) function of the specified target molecule compared to the situation of targeting only one epitope. For example, a heterodimeric Ig-like molecule can simultaneously bind to 2 epitopes present, for example, on growth factor receptors or soluble molecules important for tumor cell proliferation, thereby effectively blocking multiple independent signal transduction cascades leading to uncontrolled proliferation, and any combination at least two Ig-like molecules can simultaneously bind to 2, or even 3 or 4 epitopes present on such growth factor receptors or soluble molecules.

В предпочтительном варианте осуществления молекула-мишень представляет собой растворимую молекулу. В другом предпочтительном варианте осуществления молекула-мишень представляет собой мембраносвязанную молекулу.In a preferred embodiment, the target molecule is a soluble molecule. In another preferred embodiment, the target molecule is a membrane-bound molecule.

В другом аспекте изобретения предусматривается способ по изобретению для получения по меньшей мере двух различных Ig-подобных молекул или для получения гетеродимерной Ig-подобной молекулы, где каждая из содержащих ОИЗ-домен полипептидных цепей дополнительно содержит вариабельную область, распознающую эпитоп-мишень, где эпитопы-мишени расположены на различных молекулах. В этом случае каждая из различных молекул-мишеней может представлять собой либо растворимую молекулу, либо мембраносвязанную молекулу. В одном варианте осуществления различные молекулымишени являются растворимыми молекулами. Альтернативно одна молекула-мишень представляет собой растворимую молекулу, в то время как вторая молекула-мишень представляет собой мембраносвязанную молекулу. В другой альтернативе обе молекулы-мишени являются мембраносвязанными молекулами. В одном варианте осуществления различные молекулы-мишени экспрессируются на одних и тех же клетках, в то время как в других вариантах осуществления различные молекулы-мишени экспрессируются на различных клетках. В качестве неограничивающего примера любая гетеродимерная Ig-подобная молекула или любая комбинация по меньшей мере двух Ig-подобных молекул может быть пригодной для одновременного блокирования множества мембраносвязанных рецепторов, нейтрализации множества растворимых молекул, таких как цитокины или факторы роста для опухолевых клеток, или нейтрализации различных серотипов вирусов или штаммов вирусов.In another aspect of the invention, there is provided a method of the invention for producing at least two different Ig-like molecules or for producing a heterodimeric Ig-like molecule, wherein each of the OI domain-containing polypeptide chains further comprises a variable region recognizing a target epitope, wherein the epitopes are the targets are located on different molecules. In this case, each of the different target molecules can be either a soluble molecule or a membrane-bound molecule. In one embodiment, the various target molecules are soluble molecules. Alternatively, one target molecule is a soluble molecule while the second target molecule is a membrane-bound molecule. In another alternative, both target molecules are membrane-bound molecules. In one embodiment, different target molecules are expressed on the same cells, while in other embodiments, different target molecules are expressed on different cells. As a non-limiting example, any heterodimeric Ig-like molecule or any combination of at least two Ig-like molecules may be useful for simultaneously blocking multiple membrane-bound receptors, neutralizing multiple soluble molecules such as cytokines or growth factors for tumor cells, or neutralizing different serotypes viruses or strains of viruses.

Один предпочтительный вариант осуществления относится к способу по изобретению для получения по меньшей мере двух различных Ig-подобных молекул или для получения гетеродимерной Ig-подобной молекулы, где по меньшей мере один из указанных эпитопов-мишеней расположен на опухолевой клетке. Альтернативно или дополнительно по меньшей мере один из указанных эпитоповмишеней расположен на поверхности эффекторной клетки. Например, это пригодно для привлечения Т-клеток или NK-клеток для уничтожения опухолевых клеток. Например, в способе по изобретению продуцируется по меньшей мере одна Ig-подобная молекула, которая способна привлекать иммунные эффекторные клетки, предпочтительно иммунные эффекторные клетки человека, посредством специфического связывания с молекулой-мишенью, расположенной на иммунных эффекторных клетках. В следующем варианте осуществления указанная иммунная эффекторная клетка активируется при связывании Ig-подобной молекулы с молекулой-мишенью. Привлечение эффекторных механизмов может охватывать, например, перенацеливание иммуномодулируемой цитотоксичности путем введения Ig-подобной молекулы, полученной способом по изобретению, которая способна связываться с цитотоксической триггерной молекулой, такой как Т-клеточный рецептор или Fc-гамма-рецептор, тем самым активируя последующие иммунные эффекторые каскады. Термин иммунная эффекторная клетка или эффекторная клетка, как используют в рамках изобретения, относится к клетке из природного репертуара клеток в иммунной системе млекопитающих, которые могут активироваться, влияя на жизнеспособность клетки-мишени. Иммунные эффекторные клетки включают клетки лимфоидного ростка, такие как натуральные киллерные (NK) клетки, Т-клетки, включая цитотоксические Т-клетки или В-клетки, но также иммунными эффекторными клетками могут считаться клетки миелоидного ростка, такие как моноциты или макрофаги, дендритные клетки и нейтрофильные гранулоциты. Таким образом, указанная эффекторная клетка предпочтительно представляет собой NK-клетку, Т-клетку, В-клетку, моноцит, макрофаг, дендритную клетку или нейтрофильный гранулоцит.One preferred embodiment relates to the method of the invention for producing at least two different Ig-like molecules or for producing a heterodimeric Ig-like molecule, wherein at least one of said target epitopes is located on a tumor cell. Alternatively or additionally, at least one of these target epitopes is located on the surface of the effector cell. For example, this is useful for recruiting T cells or NK cells to kill tumor cells. For example, the method of the invention produces at least one Ig-like molecule that is capable of attracting immune effector cells, preferably human immune effector cells, by specifically binding to a target molecule located on the immune effector cells. In a further embodiment, said immune effector cell is activated upon binding of an Ig-like molecule to a target molecule. Involvement of effector mechanisms may include, for example, retargeting immunomodulated cytotoxicity by administering an Ig-like molecule produced by the method of the invention that is capable of binding to a cytotoxic trigger molecule such as a T cell receptor or Fc gamma receptor, thereby activating downstream immune effectors cascades. The term immune effector cell or effector cell, as used herein, refers to a cell from the natural repertoire of cells in the mammalian immune system that can be activated to affect the viability of a target cell. Immune effector cells include lymphoid lineage cells, such as natural killer (NK) cells, T cells, including cytotoxic T cells or B cells, but myeloid lineage cells, such as monocytes or macrophages, and dendritic cells may also be considered immune effector cells. and neutrophil granulocytes. Thus, said effector cell is preferably an NK cell, a T cell, a B cell, a monocyte, a macrophage, a dendritic cell or a neutrophil granulocyte.

Антигены-мишени, присутствующие иммунных эффекторных клетках, могут включать CD3, CD16, CD25, CD28, CD64, CD89, NKG2D и NKp46. Таким образом, дополнительно предусматривается способ в соответствии с изобретением для получения по меньшей мере двух различных Ig-подобных молекул или для получения гетеродимерной Ig-подобной молекулы, где указанный эпитоп-мишень расположен наTarget antigens present on immune effector cells may include CD3, CD16, CD25, CD28, CD64, CD89, NKG2D and NKp46. Thus, further provided is a method in accordance with the invention for producing at least two different Ig-like molecules or for producing a heterodimeric Ig-like molecule, wherein said target epitope is located on

- 20 046272 молекуле CD3, CD16, CD25, CD28, CD64, CD89, NKG2D или NKp46.- 20 046272 molecule CD3, CD16, CD25, CD28, CD64, CD89, NKG2D or NKp46.

Жизнеспособность клетки-мишени может включать выживание, пролиферацию и/или способность клеток взаимодействовать с другими клетками.Target cell viability may include survival, proliferation, and/or the ability of the cells to interact with other cells.

В одном аспекте настоящее изобретение, таким образом, относится к способам по изобретению для получения гетеродимерной Ig-подобной молекулы, где каждая из содержащих CH3-домен полипептидных цепей дополнительно содержит вариабельную область, распознающую эпитоп-мишень. В одном варианте осуществления каждая из 2 вариабельных областей содержащих CH3-домен полипептидных цепей распознает один и тот же эпитоп-мишень, но с отличающейся аффинностью. В другом варианте осуществления каждая из 2 вариабельных областей содержащих CH3-домен полипептидных цепей распознает отличающийся эпитоп-мишень. В другом варианте осуществления отличающиеся эпитопымишени расположены на одной и той же молекуле-мишени, которая может представлять собой либо мембраносвязанную молекулу, либо растворимую молекулу. В другом варианте осуществления отличающиеся эпитопы-мишени расположены на различных молекулах-мишенях, которые могут экспрессироваться либо на одних и тех же клетках, либо на различных клетках. Альтернативно различные молекулы-мишени могут представлять собой растворимые молекулы, или одна молекула-мишень может представлять собой растворимую молекулу, в то время как вторая молекула-мишень представляет собой мембраносвязанную молекулу. В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере одна из молекул-мишеней гетеродимерной Ig-подобной молекулы расположена на опухолевой клетке. В другом предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере одна из молекул-мишеней гетеродимерной Ig-подобной молекулы расположена на эффекторной клетке (т.е. NK-клетка, Т-клетка, В-клетка, моноцит, макрофаг, дендритная клетка или нейтрофильный гранулоцит, и указанный эпитоп-мишень может быть расположен на молекуле CD3, CD16, CD25, CD28, CD64, CD89, NKG2D или NKp46).In one aspect, the present invention thus provides methods of the invention for producing a heterodimeric Ig-like molecule, wherein each of the CH3 domain-containing polypeptide chains further comprises a variable region recognizing a target epitope. In one embodiment, each of the 2 variable regions of the CH3 domain-containing polypeptide chains recognizes the same target epitope, but with a different affinity. In another embodiment, each of the 2 variable regions of the CH3 domain-containing polypeptide chains recognizes a different target epitope. In another embodiment, the different target epitopes are located on the same target molecule, which can be either a membrane-bound molecule or a soluble molecule. In another embodiment, different target epitopes are located on different target molecules, which may be expressed either on the same cells or on different cells. Alternatively, the different target molecules may be soluble molecules, or one target molecule may be a soluble molecule while a second target molecule is a membrane-bound molecule. In a preferred embodiment, at least one of the target molecules of the heterodimeric Ig-like molecule is located on a tumor cell. In another preferred embodiment, at least one of the target molecules of the heterodimeric Ig-like molecule is located on an effector cell (i.e., NK cell, T cell, B cell, monocyte, macrophage, dendritic cell, or neutrophil granulocyte, and said target epitope may be located on a CD3, CD16, CD25, CD28, CD64, CD89, NKG2D, or NKp46 molecule).

В предпочтительном варианте осуществления предусматривается способ по изобретению для получения по меньшей мере двух различных Ig-подобных молекул или для получения гетеродимерной Ig-подобной молекулы, где указанные по меньшей мере две различных Ig-подобных молекулы представляют собой антитела, наиболее предпочтительно антитела IgG-изотипа, еще более предпочтительно IgG1-изотипа, как описано в настоящем описании выше.In a preferred embodiment, the method of the invention is provided for producing at least two different Ig-like molecules or for producing a heterodimeric Ig-like molecule, wherein said at least two different Ig-like molecules are antibodies, most preferably antibodies of the IgG isotype, even more preferably the IgG1 isotype as described herein above.

Кроме того, предусматривается Ig-подобная молекула, гетеродимерная Ig-подобная молекула, или смесь по меньшей мере двух Ig-подобных молекул, получаемая способом в соответствии с настоящим изобретением. Указанная (гетеродимерная) Ig-подобная молекула или смесь Ig-подобных молекул предпочтительно содержит по меньшей мере одну мутацию CH3, как представлено в табл. В. Также в рамках настоящего изобретения предусматривается (гетеродимерная) Ig-подобная молекула или смесь по меньшей мере двух Ig-подобных молекул, содержащая по меньшей мере одну мутацию, как представлено в табл. В, а также фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере одну Ig-подобную молекулу, или смесь по меньшей мере двух Ig-подобных молекул, в соответствии с настоящим изобретением. В одном варианте осуществления указанная Ig-подобная молекула представляет собой биспецифическую Ig-подобную молекулу, такую как биспецифическое антитело. В другом варианте осуществления указанная Ig-подобная молекула представляет собой моноспецифическую Ig-подобную молекулу, такую как моноспецифическое антитело. Один предпочтительный вариант осуществления относится к смеси по меньшей мере двух различных Ig-подобных молекул, получаемых способом по изобретению, где указанные по меньшей мере две различных Ig-подобных молекулы связываются с различными эпитопами на одном и том же антигене и/или с различными эпитопами на различных антигенах. Кроме того, предусматривается гетеродимерная Ig-подобная молекула, получаемая способом по изобретению, где указанная гетеродимерная Ig-подобная молекула связывается с различными эпитопами на одном и том же антигене и/или с различными эпитопами на различных антигенах. Преимущества и предпочтительные применения таких смесей и антител описаны в настоящем описании выше. Изобретение также относится к смеси по меньшей мере двух различных Ig-подобных молекул, получаемых способом по изобретению, где указанные по меньшей мере две различные Ig-подобные молекулы содержат по меньшей мере одну гетеродимерную Ig-подобную молекулу. В одном варианте осуществления две из указанных по меньшей мере двух различных Ig-подобных молекул представляют собой гетеродимерные Ig-подобные молекулы. Другой предпочтительный вариант осуществления относится к гетеродимерному антителу, содержащему два CH3-домена, где один из указанных двух CH3-доменов содержит аминокислотные замены L351D и L368E, и где другой из указанных двух CH3-доменов содержит аминокислотные замены T366K и L351K. Эти аминокислотные замены являются предпочтительными средствами для преимущественного образования пар между указанными двумя CH3-доменами, как объяснено выше. Аминокислотные замены L351D и L368E в одном из указанных двух CH3-доменов и аминокислотные замены T366K и L351K в другом из указанных двух CH3-доменов вместе называют комбинацией мутаций DEKK, вариантом DEKK, парой DEKK, модифицированными способами инженерии CH3-доменами DEKK, DEKK или используют названия, альтернативные названиям DEKK. CH3-домен, который содержит аминокислотные замены L351D и L368E, также называют DE-стороной, и CH3-домен, который содержит аминокислотные замены T366K и L351K, также называют KK-стороной.Also provided is an Ig-like molecule, a heterodimeric Ig-like molecule, or a mixture of at least two Ig-like molecules produced by the method of the present invention. Said (heterodimeric) Ig-like molecule or mixture of Ig-like molecules preferably contains at least one CH3 mutation, as shown in Table. B. Also provided within the scope of the present invention is a (heterodimeric) Ig-like molecule or a mixture of at least two Ig-like molecules containing at least one mutation, as presented in table. B, as well as a pharmaceutical composition containing at least one Ig-like molecule, or a mixture of at least two Ig-like molecules, in accordance with the present invention. In one embodiment, said Ig-like molecule is a bispecific Ig-like molecule, such as a bispecific antibody. In another embodiment, said Ig-like molecule is a monospecific Ig-like molecule, such as a monospecific antibody. One preferred embodiment relates to a mixture of at least two different Ig-like molecules produced by the method of the invention, wherein said at least two different Ig-like molecules bind to different epitopes on the same antigen and/or to different epitopes on various antigens. In addition, a heterodimeric Ig-like molecule produced by the method of the invention is provided, wherein said heterodimeric Ig-like molecule binds to different epitopes on the same antigen and/or to different epitopes on different antigens. The advantages and preferred uses of such mixtures and antibodies are described above herein. The invention also relates to a mixture of at least two different Ig-like molecules obtained by the method according to the invention, wherein said at least two different Ig-like molecules contain at least one heterodimeric Ig-like molecule. In one embodiment, two of the at least two different Ig-like molecules are heterodimeric Ig-like molecules. Another preferred embodiment provides a heterodimeric antibody comprising two CH3 domains, wherein one of the two CH3 domains contains the amino acid substitutions L351D and L368E, and where the other of the two CH3 domains contains the amino acid substitutions T366K and L351K. These amino acid substitutions are the preferred means for preferential pairing between these two CH3 domains, as explained above. The amino acid substitutions L351D and L368E in one of the two CH3 domains and the amino acid substitutions T366K and L351K in the other of the two CH3 domains are collectively referred to as a DEKK mutation combination, DEKK variant, DEKK pair, engineered DEKK CH3 domains, DEKK, or use alternative names to DEKK. The CH3 domain, which contains the amino acid substitutions L351D and L368E, is also called the DE side, and the CH3 domain, which contains the amino acid substitutions T366K and L351K, is also called the KK side.

Также предусматривается фармацевтическая композиция, содержащая (гетеродимерную)Also provided is a pharmaceutical composition containing (heterodimeric)

- 21 046272- 21 046272

Ig-подобную молекулу или смесь по меньшей мере двух Ig-подобных молекул, получаемых любым способом по изобретению. Указанной (гетеродимерной) Ig-подобной молекулой или указанными по меньшей мере двумя Ig-подобными молекулами по изобретению предпочтительно является/являются антитело/антитела. Указанная фармацевтическая композиция может содержать указанную (гетеродимерную) Ig-подобную молекулу, смесь, содержащую моноспецифические или биспецифические Ig-подобные молекулы, или комбинацию моноспецифических и биспецифических Ig-подобных молекул. Кроме того, фармацевтическая композиция по изобретению содержит фармацевтически приемлемый носитель. Как используют в рамках изобретения, такой фармацевтически приемлемый носитель включает любые и все растворители, соли, дисперсные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические и замедляющие всасывание средства и т.п., которые являются физиологически совместимыми. В зависимости от пути введения (например, внутривенно, подкожно, внутрь сустава и т.п.) Ig-подобные молекулы могут быть покрыты материалом для защиты Ig-подобных молекул от действия кислот и других природных условий, которые могут инактивировать Ig-подобные молекулы. В одном аспекте предусматривается фармацевтическая композиция, содержащая смесь по меньшей мере двух Ig-подобных молекул, получаемых любым способом по изобретению, где указанные по меньшей мере две различных Ig-подобных молекулы продуцированы рекомбинантными клетками-хозяевами в соответствии с настоящим изобретением. Более того, предусматривается фармацевтическая композиция, содержащая гетеродимерную Ig-подобную молекулу, получаемую любым способом по изобретению, где указанная гетеродимерная Ig-подобная молекула продуцирована рекомбинантными клетками-хозяевами в соответствии с настоящим изобретением.An Ig-like molecule or a mixture of at least two Ig-like molecules obtained by any method according to the invention. Preferably, said (heterodimeric) Ig-like molecule or said at least two Ig-like molecules of the invention is/are an antibody/antibodies. Said pharmaceutical composition may contain said (heterodimeric) Ig-like molecule, a mixture containing monospecific or bispecific Ig-like molecules, or a combination of monospecific and bispecific Ig-like molecules. In addition, the pharmaceutical composition of the invention contains a pharmaceutically acceptable carrier. As used herein, such a pharmaceutically acceptable carrier includes any and all solvents, salts, dispersions, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption retarding agents, and the like that are physiologically compatible. Depending on the route of administration (eg, intravenous, subcutaneous, intra-articular, etc.), the Ig-like molecules may be coated with a material to protect the Ig-like molecules from acids and other environmental conditions that can inactivate the Ig-like molecules. In one aspect, a pharmaceutical composition is provided comprising a mixture of at least two Ig-like molecules produced by any method of the invention, wherein said at least two different Ig-like molecules are produced by recombinant host cells in accordance with the present invention. Moreover, a pharmaceutical composition is provided comprising a heterodimeric Ig-like molecule produced by any method of the invention, wherein said heterodimeric Ig-like molecule is produced by recombinant host cells in accordance with the present invention.

Также в рамках настоящего изобретения предусматривается молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая содержащую CH3-домен полипептидную цепь, которая содержит по меньшей мере одну мутацию, как представлено в табл. В, а также рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую содержащую CH3-домен полипептидную цепь, которая содержит по меньшей мере одну мутацию, как представлено в табл. В.Also provided within the scope of the present invention is a nucleic acid molecule encoding a CH3 domain-containing polypeptide chain that contains at least one mutation, as shown in Table 1. B, as well as a recombinant host cell containing at least one nucleic acid molecule encoding a CH3 domain-containing polypeptide chain that contains at least one mutation, as shown in table. IN.

Далее изобретение проиллюстрировано с помощью следующих примеров. Эти примеры не ограничивают изобретение никоим образом, а могут служить для пояснения изобретения.The invention is further illustrated using the following examples. These examples do not limit the invention in any way, but may serve to explain the invention.

Краткое описание чертежейBrief description of drawings

На фиг. 1 показано (А) схематическое представление сконструированного вектора MV1057. Область вставки представляет собой область, в которую клонирована VH-область антитела. (В) Схематическое представление вектора фагового дисплея MV1043.In fig. Figure 1 shows (A) a schematic representation of the constructed vector MV1057. The insertion region is the region into which the VH region of the antibody is cloned. (B) Schematic representation of the MV1043 phage display vector.

На фиг. 2 показана аминокислотная последовательность Fc IgG1 дикого типа, присутствующая в сконструированном векторе MV1057 (с использованием схемы нумерации EU).In fig. 2 shows the amino acid sequence of wild-type IgG1 Fc present in the constructed vector MV1057 (using the EU numbering scheme).

На фиг. 3 показаны нуклеотидные и аминокислотные последовательности VH-областей, используемых для клонирования в различные конструкции.In fig. Figure 3 shows the nucleotide and amino acid sequences of the VH regions used for cloning into various constructs.

На фиг. 4 показаны данные масс-спектрометрии для трансфекций A, G и Н.In fig. Figure 4 shows mass spectrometry data for transfections A, G, and H.

На фиг. 5 показаны данные масс-спектрометрии для трансфекций М и U.In fig. Figure 5 shows mass spectrometry data for M and U transfections.

На фиг. 6 показаны данные масс-спектрометрии для трансфекции О.In fig. Figure 6 shows mass spectrometry data for transfection of O.

На фиг. 7 показано предотвращение гомодимеризации посредством замены нейтральных аминокислот заряженными аминокислотами.In fig. 7 shows the prevention of homodimerization by replacing neutral amino acids with charged amino acids.

На фиг. 8 показан нативный спектр MS для образца транскфекции ZO (T366K/L351'D) (А) и свернутый спектр MS для образца трансфекции ZO (T366K/L351D). Второй/главный пик соответствует биспецифической молекуле (В).In fig. 8 shows the native MS spectrum for the ZO transfection sample (T366K/L351'D) (A) and the collapsed MS spectrum for the ZO transfection sample (T366K/L351D). The second/main peak corresponds to the bispecific molecule (B).

На фиг. 9 даны показатели HADDOCK для экспериментально подтвержденных пар мутаций.In fig. Figure 9 shows HADDOCK indicators for experimentally confirmed pairs of mutations.

На фиг. 10 показано динамическое изображение взаимодействий на поверхности контакта CH3-CH3; (A) K4O9D:K392D/D399'K:E356'K; (В) D399K:E356K/D399'K:E356'K; (С) K409D:K392D/K409'D:K392'D.In fig. 10 shows a dynamic image of interactions at the CH3-CH3 contact surface; (A) K4O9D:K392D/D399'K:E356'K; (B) D399K:E356K/D399'K:E356'K; (C) K409D:K392D/K409'D:K392'D.

На фиг. 11 даны показатели HADDOCK для различных зарядовых мутантов 366/351'.In fig. Figure 11 shows the HADDOCK scores for various charge mutants 366/351'.

На фиг. 12 показаны динамические изображения на границе контакта CH3-CH3; (A) L351D/L351'D; (В) L351D:S354A:R355D/L351'D:S354'A:R355'D.In fig. 12 shows dynamic images at the CH3-CH3 contact boundary; (A) L351D/L351'D; (B) L351D:S354A:R355D/L351'D:S354'A:R355'D.

На фиг. 13 даны показатели HADDOCK для дополнительных зарядовых мутаций рядом с положением L351.In fig. Figure 13 shows the HADDOCK scores for additional charge mutations near the L351 position.

На фиг. 14 даны показатели HADDOCK для дополнительных зарядовых мутаций рядом с положением E366K в цепи А и с положением L351 в цепи В.In fig. Figure 14 shows the HADDOCK scores for additional charge mutations near the E366K position in chain A and the L351 position in chain B.

На фиг. 15 показаны динамические изображения для взаимодействий на поверхности контакта CH3-CH3.In fig. Figure 15 shows dynamic images for interactions at the CH3-CH3 interface.

На фиг. 16 даны показатели HADDOCK для вариантов рядом с T366/L351.In fig. 16 shows HADDOCK indicators for variants next to T366/L351.

На фиг. 17 даны показатели HADDOCK для дополнительных вариантов рядом с T366/L351.In fig. 17 shows the HADDOCK indicators for additional options next to the T366/L351.

На фиг. 18 показаны примеры спектров nMS для биспецифического IgG, полученного после совместной экспрессии конструкции T366K,L351K с конструкцией либо L351D (левая панель), либо L351D,Y349E (правая панель), с увеличенным изображением состояния одиночного заряда полного IgG (половинные молекулы не представлены).In fig. 18 shows example nMS spectra for bispecific IgG obtained after coexpression of the T366K,L351K construct with either the L351D (left panel) or L351D,Y349E (right panel) construct, with a magnified view of the single charge state of the full IgG (half molecules not shown).

На фиг. 19 показаны (А) результаты нативной MS, демонстрирующие относительный избыток АА,In fig. 19 shows (A) native MS results showing relative excess of AA,

- 22 046272- 22 046272

АВ, ВВ, А и В (общее количество всех типов составляет 100%); (В) то же самое, но без АВ, чтобы иметь лучший обзор нежелательных типов АА, ВВ, А и В.AB, BB, A and B (the total number of all types is 100%); (B) the same, but without AB, to have a better overview of the unwanted types AA, BB, A and B.

На фиг. 20 показаны результаты анализа термостабильности. Квадраты: дикий тип; треугольники: пара с обращенным зарядом E356K:D399K/K392D:K409D; круги: комбинации мутантов CH3, как указано выше каждого графика.In fig. Figure 20 shows the results of thermal stability analysis. Squares: wild type; triangles: reverse charge pair E356K:D399K/K392D:K409D; circles: combinations of CH3 mutants as indicated above each graph.

На фиг. 21 показаны результаты для эксперимента по 10х замораживанию-размораживанию. 1122=1-й родительское антитело ВВ; 1337=2-е родительское антитело АА; дикий тип=АА, АВ, ВВ; CR=биспецифическая молекула с парой обращенных зарядов E356K:D399K/K392D:K409D; 3-6 и 9-12=биспецифические молекулы из комбинаций 3-6 и 9-12 из табл. 15.In fig. Figure 21 shows the results for the 10x freeze-thaw experiment. 1122=1st parental antibody BB; 1337=2nd parental antibody AA; wild type=AA, AB, BB; CR=bispecific molecule with reverse charge pair E356K:D399K/K392D:K409D; 3-6 and 9-12=bispecific molecules from combinations 3-6 and 9-12 from table. 15.

На фиг. 22 показаны результаты стабильности в сыворотке, измеренные с помощью ELISA с использованием фибриногена в качестве нанесенного антигена. (А) Данные ELISA для образцов IgG, разбавленных до 0,5 мкг/мл. (В) Данные ELISA для образцов IgG, разбавленных до 0,05 мкг/мл. Результаты нормализованы к моменту времени Т=0 суток (100%). 1337=2-е родительское антитело АА; дикий тип=АА, АВ, ВВ; CR=биспецифическая молекула с парой обращенных зарядов E356K:D399K/K392D:K4O9D; 3-6 и 9-12 биспецифические молекулы из комбинаций 3-6 и 9-12 из табл. 15.In fig. 22 shows serum stability results measured by ELISA using fibrinogen as the applied antigen. (A) ELISA data for IgG samples diluted to 0.5 μg/ml. (B) ELISA data for IgG samples diluted to 0.05 μg/ml. The results are normalized to the time point T=0 days (100%). 1337=2nd parental antibody AA; wild type=AA, AB, BB; CR=bispecific molecule with reverse charge pair E356K:D399K/K392D:K4O9D; 3-6 and 9-12 bispecific molecules from combinations 3-6 and 9-12 from table. 15.

На фиг. 23 показаны результаты nMS в экспериментах по изменению соотношения с соотношениями при трансфекции от 1:5 до 5:1. (А) Комбинация мутаций DEKK со специфичностью А на DE-стороне и В на KK-стороне; (В) комбинация мутаций DEKK со специфичностью С на DE-стороне и В на KK-стороне; (С) комбинация мутаций с обращением заряда со специфичностью А на стороне E356K:D399K и В на стороне K392D:K409D.In fig. Figure 23 shows the results of nMS in ratio manipulation experiments with transfection ratios ranging from 1:5 to 5:1. (A) Combination of DEKK mutations with specificity A on the DE side and B on the KK side; (B) combination of DEKK mutations with specificity C on the DE side and B on the KK side; (C) combination of charge reversal mutations with specificity A on the E356K:D399K side and B on the K392D:K409D side.

На фиг. 24 показаны результаты nMS для трансфекций #1-11 из табл. 20.In fig. 24 shows nMS results for transfections #1-11 from Table. 20.

На фиг. 25 даны показатели HADDOCK для димеров с различными сконструированными векторами для CH3. Серые столбцы: желаемые типы АВ и CD; черные столбцы: нежелательные типы АА, ВВ, СС, DD, АС, ВС, AD, BD.In fig. Figure 25 gives the HADDOCK scores for dimers with various designed CH3 vectors. Gray bars: desired types AB and CD; black columns: undesirable types AA, BB, SS, DD, AC, BC, AD, BD.

На фиг. 26 показаны SDS-PAGE для трансфекций #1-11 из табл. 20. Также включены контрольные образцы DE/KK, DE/DE и KK/KK.In fig. 26 shows SDS-PAGE for transfections #1-11 from table. 20. DE/KK, DE/DE, and KK/KK controls are also included.

На фиг. 27 показаны nMS для трансфекций #9 (А) и #11 (В).In fig. 27 shows nMS for transfections #9 (A) and #11 (B).

На фиг. 28 показаны nMS для образцов после гель-фильтрации 1516:1516 (А), 1337:1337 (В) и 1516:1337 (С).In fig. 28 shows nMS for gel filtration samples 1516:1516 (A), 1337:1337 (B), and 1516:1337 (C).

На фиг. 29 показаны сывороточные уровни образцов сконструированного антитела DEKK и двух его родительских антител (исследование pK).In fig. 29 shows serum levels of samples of the engineered DEKK antibody and its two parent antibodies (pK assay).

ПримерыExamples

Пример 1. Аминокислотные замены для создания различных CH3-доменов.Example 1: Amino acid substitutions to create different CH3 domains.

Чтобы иметь широкое множество Ig-подобных молекул, которые отличаются их CH3-доменами, так что образование пар между содержащими CI 13-домен Ig-подобными молекулами предпочтительно усиливается или ингибируется, ряд аминокислотных замен, о которых было известно, что они усиливают образование гетеродимера, а также ряд альтернативных аминокислотных замен, которые ранее не были ни описаны, ни исследованы, но которые были выбраны для усиления образования гомодимера, вносили в сконструированный вектор (сконструированный вектор MV1057; фиг. 1А). Сконструированный вектор MV1057 содержит последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие нормальную Fc-часть IgG1 дикого типа, как представлено на фиг. 2. В табл. 1 приведены аминокислотные замены, которые вносили в эту Fc дикого типа с получением серии из семи конструкций. Все конструкции получали в Geneart. Ранее было описано, что конструкции 1, 2 и 3, или их альтернативы запускают гетеродимеризацию (ЕР 01870459; WO 2009/089004), как и конструкции 6 и 7 (WO 98/50431). Конструкции 4 и 5 являются новыми и сконструированы для усиления гомодимеризации.To have a wide variety of Ig-like molecules that differ in their CH3 domains such that pairing between CI 13 domain-containing Ig-like molecules is preferentially enhanced or inhibited, a number of amino acid substitutions have been known to enhance heterodimer formation, as well as a number of alternative amino acid substitutions that had not previously been described or studied, but which were selected to enhance homodimer formation, were introduced into the constructed vector (designed vector MV1057; Fig. 1A). The constructed vector MV1057 contains nucleic acid sequences encoding the normal Fc portion of wild-type IgG1, as shown in FIG. 2. In table. Figure 1 shows the amino acid substitutions that were introduced into this wild-type Fc to produce a series of seven constructs. All designs were obtained from Geneart. Constructs 1, 2 and 3, or their alternatives, have previously been described to trigger heterodimerization (EP 01870459; WO 2009/089004), as have constructs 6 and 7 (WO 98/50431). Constructs 4 and 5 are novel and designed to enhance homodimerization.

Таблица 1Table 1

Замены ΆΑ в СНЗ Substitutions of ΆΑ in SNZ # конструкции # designs Образует пару с Pairs with описанный % биспецифического продукта % bispecific product described - (дикий тип) - (wild type) - - - (дикий тип) - (wild type) -50% -50% Е356К, D399K E356K, D399K 1 1 Конструкция 2 или 3 Design 2 or 3 -100% -100%

- 23 046272- 23 046272

K392D, K409D K392D, K409D 2 2 Конструкция 1 Design 1 -100% -100% K392D, K409D, K439D K392D, K409D, K439D 3 3 Конструкция 1 Design 1 -100% -100% K392D, D399K, K409D K392D, D399K, K409D 4 4 Конструкция 4 Design 4 Е356К, Е357К, K439D, K370D E356K, E357K, K439D, K370D 5 5 Конструкция 5 Design 5 T366W T366W 6 6 Конструкция 7 Design 7 -86,7% -86.7% T366S, L368A, Y407V T366S, L368A, Y407V 7 7 Конструкция 6 Design 6 -86,7% -86.7%

Пример 2. Клонирование VH в конструкции с мутациями CH3.Example 2: Cloning of VH in a construct with CH3 mutations.

Несколько VH-областей антитела с известной специфичностью и известной способностью образовывать пары с легкой цепью IGKV1-39 человека использовали для клонирования в эти конструкции.Several antibody VH regions with known specificity and known ability to pair with the light chain of human IGKV1-39 were used for cloning into these constructs.

Как указано ранее, все варианты CH3 можно использовать вместе с другими доменами антител с получением полноразмерных антител, которые являются либо биспецифическими, либо моноспецифическими. Специфичность антитела, определяемая комбинациями VH/VL, не влияет на поведение димеризации тяжелых цепей, которое запускается CH3-доменами. На протяжении исследований использовали модельные комбинации VH/VL, где все VL основаны на IGKV1-39 человека эмбрионального типа и VH варьируют. На фиг. 3 представлены полноразмерные последовательности и специфичности VH-областей антител, используемых на протяжении исследований. Кодирование MF относится к внутреннему обозначению Meras для различных VH, например VH MF1337 обладает специфичностью к столбнячному токсоиду, MF1025 обладает специфичностью к тиреоглобулину свиней, MF1122 обладает специфичностью к фибриногену крупного рогатого скота.As stated previously, all CH3 variants can be used in conjunction with other antibody domains to produce full-length antibodies that are either bispecific or monospecific. Antibody specificity determined by VH/VL combinations does not affect the heavy chain dimerization behavior that is driven by CH3 domains. Throughout the studies, model VH/VL combinations were used, where all VLs are based on human germline IGKV1-39 and the VHs vary. In fig. Figure 3 shows the full-length sequences and specificities of the VH regions of the antibodies used throughout the studies. MF coding refers to the internal Meras designation for different VHs, for example VH MF1337 is specific for tetanus toxoid, MF1025 is specific for porcine thyroglobulin, MF1122 is specific for bovine fibrinogen.

Области VH, присутствующие в векторе фагового дисплея MV1043 (фиг. 1В), расщепляют ферментами рестрикции SfiI и BstEII (New England Biolabs/ каталожный номер #R0123L и R0162L/ в соответствии с инструкциями изготовителя), которые высвобождают фрагмент VH из этого вектора. Вектор MV1057 расщепляют SfiI и BstEII по стандартным методикам (в соответствии с инструкциями изготовителя). Фрагменты и вектор очищают в геле (Promega/ каталожный номер #V3125/ в соответствии с инструкциями изготовителя) для выделения разрезанного вектора и вставок гена VH. Оба из них объединяют путем лигирования, после чего продукт лигирования трансформируют в DH5a E.coli (Invitrogen/ каталожный номер #12297-016/ в соответствии с инструкциями изготовителя). После селекции в течение ночи единичные колонии отбирают и векторы с правильной вставкой идентифицируют посредством секвенирования.The VH regions present in the phage display vector MV1043 (Fig. 1B) are digested with the restriction enzymes SfiI and BstEII (New England Biolabs/catalog #R0123L and R0162L/ according to the manufacturer's instructions), which release the VH fragment from the vector. The MV1057 vector is digested with SfiI and BstEII using standard procedures (according to the manufacturer's instructions). The fragments and vector were gel purified (Promega/catalog #V3125/according to the manufacturer's instructions) to isolate the cut vector and VH gene inserts. Both of these are combined by ligation, after which the ligation product is transformed into E. coli DH5a (Invitrogen/catalog #12297-016/according to the manufacturer's instructions). After overnight selection, single colonies are selected and vectors with the correct insert are identified by sequencing.

Пример 3. Трансфекция и экспрессия полного IgG в клетках HEK293T.Example 3 Transfection and expression of total IgG in HEK293T cells.

Трансфекцию различных плазмид, кодирующих повторно клонированные варианты VH, и дополнительно кодирующих общую легкую цепь huIGKV1-39, в клетки HEK293T проводили по стандартным методикам так, чтобы IgG мог экспрессироваться (de Kruif et al., Biotech. Bioeng., 2010). После трансфекции уровни экспрессии IgG в супернатантах измеряли с использованием системы ForteBIO Octet-QK, которая основана на Bio-Layer Interferometry (BLI) и которая обеспечивает количественное определение в реальном времени и охарактеризацию кинетики биомолекулярных взаимодействий; для деталей см. www.fortebio.com. Когда определяли уровни экспрессии, превышающие 5 мкг/мл, IgG очищали с использованием аффинной очистки с белком А.Transfection of various plasmids encoding recloned VH variants and additionally encoding the common light chain of huIGKV1-39 into HEK293T cells was carried out according to standard procedures so that IgG could be expressed (de Kruif et al., Biotech. Bioeng., 2010). After transfection, IgG expression levels in supernatants were measured using the ForteBIO Octet-QK system, which is based on Bio-Layer Interferometry (BLI) and provides real-time quantification and characterization of the kinetics of biomolecular interactions; for details see www.fortebio.com. When expression levels greater than 5 μg/ml were detected, IgG was purified using protein A affinity purification.

Пример 4. Очистка IgG.Example 4 Purification of IgG.

Культуральные супернатанты очищали с использованием колонок с белком A (GE Healthcare/каталожный номер #11-0034-95/ в соответствии с инструкциями изготовителя) и элюировали в 0,1 М цитратном буфере, рН 3,0, и сразу нейтрализовывали в равном объеме 1,0 М Tris-HCl рН 8,0 или прямо заменяли буфер на PBS с использованием колонки для обессоливания. Альтернативно можно очищать IgG с использованием гранул с белком А (гранулы сефарозы CL-4B, GE healthcare, каталожный номер #170780-01).Culture supernatants were purified using Protein A columns (GE Healthcare/catalog #11-0034-95/ according to the manufacturer's instructions) and eluted in 0.1 M citrate buffer, pH 3.0, and immediately neutralized in an equal volume of 1 .0 M Tris-HCl pH 8.0 or directly buffer exchanged to PBS using a desalting column. Alternatively, IgG can be purified using Protein A beads (Sepharose CL-4B beads, GE healthcare, catalog #170780-01).

Пример 5. Ag-специфические ELISA.Example 5 Ag-specific ELISA.

Антиген-специфические ELISA проводили для установления активности связывания против антигенов и улавливающий ELISA проводили, чтобы продемонстрировать активность связывания биспецифичских антител. Для обнаружения комплекса использовали биотинилированный второй антиген (de Kruif et al., Biotech. Bioeng., 2010).Antigen-specific ELISAs were performed to establish binding activity against antigens, and capture ELISAs were performed to demonstrate bispecific antibody binding activity. A biotinylated second antigen was used to detect the complex (de Kruif et al., Biotech. Bioeng., 2010).

Пример 6. SDS-PAGE.Example 6. SDS-PAGE.

Очищенные смеси IgG анализировали с помощью SDS-PAGE (NuPAGE® 4-12% бис-трис гель/Invitrogen/каталожный номер #NP0323BOX) в восстанавливающих и невосстанавливающих условиPurified IgG mixtures were analyzed by SDS-PAGE (NuPAGE® 4-12% Bis-Tris gel/Invitrogen/catalog #NP0323BOX) under reducing and non-reducing conditions

- 24 046272 ях по стандартной методике, и окрашивание белков в геле проводили с помощью коллоидного синего (раствор для окрашивания белков PageBlue™/Fermentas/каталожный номер #RO571).- 24 046272 according to standard procedures, and protein staining in the gel was carried out using colloidal blue (PageBlue™/Fermentas/catalog number #RO571 protein staining solution).

Пример 7. Ферментативное дегликозилирование IgG1.Example 7 Enzymatic deglycosylation of IgG1.

Поскольку существует гетерогенность гликозилирования IgG, белки дегликозилировали для получения единого продукта с отличающейся массой, пригодного для масс-спектроскопического анализа. Одну единицу N-гликозидазы F (PNG-аза F; Roche Diagnostics, Mannheim, Германия) инкубировали на 10 мкг IgG1, в течение ночи при 37°C. Замену буфера с использованием центрифужных фильтрующих колонок 10 кДа MWCO (Millipore) проводили для удаления исходного буфера для очистки (0,1 М цитратный буфер, рН 3,0/1,0 М Tris-HCl, pH 8,0) и для замены буфера на PBS. Сходные процессы замены буфера проводили для удаления отщепленных гликановых цепей и для замены буфера на 150 мМ ацетат аммония, рН 7,5. Фильтры промывали с помощью 200 мкл 150 мМ ацетата аммония, рН 7,5, в течение 12 мин при 11000 об/мин и при 4°C. После промывания 50 мкл дегликозилированного IgG наносили на фильтр и добавляли 450 мкл 150 мМ ацетата аммония, рН 7,5, а затем проводили другой раунд центрифугирования в течение 12 мин при 11000 об/мин при 4°C. В целом центрифугирование повторяли 5 раз, каждый раз свежий 150 мМ аммоний-ацетатный буфер, рН 7,5, добавляли до общего объема 500 мкл. После последней стадии центрифугирования оставшийся буфер заменяли дегликозилированным IgG1, приблизительно 25 мкл собирали и переносили в пробирку eppendorf, готовую для масс-спектроскопического анализа.Because there is heterogeneity in IgG glycosylation, proteins were deglycosylated to obtain a single product with distinct masses suitable for mass spectroscopic analysis. One unit of N-glycosidase F (PNGase F; Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) was incubated with 10 μg of IgG1 overnight at 37°C. Buffer exchange using 10 kDa MWCO spin filter columns (Millipore) was performed to remove the original purification buffer (0.1 M citrate buffer, pH 3.0/1.0 M Tris-HCl, pH 8.0) and to exchange the buffer on PBS. Similar buffer exchange processes were performed to remove cleaved glycan chains and to replace the buffer with 150 mM ammonium acetate, pH 7.5. Filters were washed with 200 μl of 150 mM ammonium acetate, pH 7.5, for 12 min at 11,000 rpm and 4°C. After washing, 50 μl of deglycosylated IgG was applied to the filter and 450 μl of 150 mM ammonium acetate, pH 7.5, was added, followed by another round of centrifugation for 12 min at 11,000 rpm at 4°C. In total, centrifugation was repeated 5 times, each time fresh 150 mM ammonium acetate buffer, pH 7.5, was added to a total volume of 500 μl. After the last centrifugation step, the remaining buffer was replaced with deglycosylated IgG1, approximately 25 μl was collected and transferred to an eppendorf tube ready for mass spectroscopic analysis.

Пример 8. Нативный масс-спектроскопический анализ.Example 8. Native mass spectroscopic analysis.

Масс-спектрометрию использовали для идентификации различных типов IgG в очищенных смесях IgG и для установления соотношений, в которых эти типы IgG присутствовали. В кратком изложении 2-3 мкл IgG в концентрации 1 мкМ в 150 мМ ацетате аммония, рН 7,5, помещали в позолоченные боросиликатные капилляры, изготовленные в собственной лаборатории (с использованием устройства для вытягивания Sutter P-97 [Sutter Instruments Co., Novato, CA, США] и шестиструйного устройства для нанесения покрытий Edwards Scancoat [Edwards Laboratories, Milpitas, CA, США]) для анализа на массспектрометре LCT 1 (Waters Corp., Milford, MA, США), настроенном для оптимального проведения детекции высоких масс (Tahallah et al., RCM, 2001). Использовали напряжение на капиллярах 1300 В и напряжение на конусе для взятия образцов 200 В; однако эти параметры корректировали, когда требовалось более высокое разрешение соотношения сигнал к шум. Давление накачки из источника повышали до приблизительно 7,5 мбар для ускорения уменьшения энергии за счет столкновений. Для определения IgG1 в денатурирующих условиях белки распыляли в концентрации 1 мкМ в 5% муравьиной кислоте.Mass spectrometry was used to identify different types of IgG in purified IgG mixtures and to determine the ratios in which these types of IgG were present. Briefly, 2–3 μl of IgG at a concentration of 1 μM in 150 mM ammonium acetate, pH 7.5, was placed in gold-plated borosilicate capillaries made in-house (using a Sutter P-97 pull-down device [Sutter Instruments Co., Novato , CA, USA] and an Edwards Scancoat six-jet coater [Edwards Laboratories, Milpitas, CA, USA]) for analysis on an LCT 1 mass spectrometer (Waters Corp., Milford, MA, USA), configured for optimal performance of high mass detection ( Tahallah et al., RCM, 2001). A capillary voltage of 1300 V and a sampling cone voltage of 200 V were used; however, these parameters were adjusted when higher signal-to-noise resolution was required. The pump pressure from the source was increased to approximately 7.5 mbar to accelerate the energy reduction due to collisions. To determine IgG1 under denaturing conditions, proteins were sprayed at a concentration of 1 μM in 5% formic acid.

Пример 9. Обработка и количественное определение данных.Example 9: Data processing and quantification.

Обработку полученных спектров проводили с использованием программного обеспечения MassLynx 4.1 (Waters Corp., Milford, MA, США). Использовали минимальное сглаживание, после чего спектры центрировали. Массу типов молекул вычисляли с использованием каждого зарядового состояния последовательно. Соответствующие интенсивности каждого зарядового состояния присваивались с помощью MassLynx и суммировались. Этот подход позволил относительное количественное определение всех типов молекул в образце. Альтернативно количественное определение пиков можно проводить с использованием методов площади под кривой (AUC), известных в данной области. Все анализы повторяли три раза для вычисления стандартных отклонений как масс IgG, a также их относительного содержания.The obtained spectra were processed using MassLynx 4.1 software (Waters Corp., Milford, MA, USA). Minimal smoothing was used, after which the spectra were centered. The mass of the molecular types was calculated using each charge state sequentially. The corresponding intensities of each charge state were assigned using MassLynx and summed. This approach allowed the relative quantification of all types of molecules in a sample. Alternatively, peak quantification can be performed using area under the curve (AUC) methods known in the art. All analyzes were repeated three times to calculate standard deviations of both IgG masses as well as their relative abundances.

Пример 10. Смеси 2 или 3 моноспецифических антител из единичной клетки.Example 10. Mixtures of 2 or 3 monospecific antibodies from a single cell.

Несколько VH-областей антител с известной специфичностью и известной способностью образовывать пары с легкой цепью IGKV1-39 человека (фиг. 3) использовали для повторного клонирования в сконструированный вектор дикого типа MV1057, или в конструкцию 4 или конструкцию 5 табл. 1, с получением векторов I-III (табл. 2). Затем полученные векторы I, II и III, каждый из которых содержал последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие общую легкую цепь человека, а также тяжелую цепь Ig с отличающейся областью CH3 и отличающейся специфичностью VH, трансфицировали в клетки, либо отдельно, чтобы продемонстрировать образование только интактных моноспецифических антител, либо в комбинации с одним или двумя другими сконструированными векторами с получением смесей двух моноспецифических или трех моноспецифических антител. В табл. 3 представлена схема и результаты трансфекции.Several VH regions of antibodies with known specificity and known ability to pair with the light chain of human IGKV1-39 (Fig. 3) were used for re-cloning into the engineered wild-type vector MV1057, or into construct 4 or construct 5 of Table 1. 1, obtaining vectors I-III (Table 2). The resulting vectors I, II, and III, each containing nucleic acid sequences encoding the common human light chain as well as an Ig heavy chain with a different CH3 region and different VH specificity, were then transfected into cells, either separately, to demonstrate the formation of only intact monospecific antibodies, or in combination with one or two other engineered vectors to produce mixtures of two monospecific or three monospecific antibodies. In table Figure 3 shows the scheme and results of transfection.

- 25 046272- 25 046272

Таблица 2table 2

Специфичность VH, встроенных в различные конструкции________Specificity of VHs built into various designs________

Вектор Vector Ген VH Gene VH Антигенная специфичность Antigen specificity Масса VH (Да) Weight VH (Yes) Обозначение Merus Designation Merus клонирован в конструкцию # cloned into construction # I I IGHV 1.08 IGHV 1.08 Столбняк (А) Tetanus (A) 13703 13703 MF1337 MF1337 дикий тип wild type II II IGHV 3.23 IGHV 3.23 Тиреоглобулин (В) Thyroglobulin (IN) 12472 12472 MF1025 MF1025 4 4 III III IGHV 3.30 IGHV 3.30 Фибриноген (С) Fibrinogen (WITH) 12794 12794 MF1122 MF1122 5 5

Таблица 3Table 3

Схема и результаты трансфекцииTransfection scheme and results

# полученных отличающихся моноспецифических молекул # of different monospecific molecules obtained Объект трансфекции An object transfections Код трансфекции и соотношение Code transfections and ratio Ожидаемый тип Expected type Вычисленная масса -2LYS Calculated mass -2LYS Экспериментальная масса Experimental mass Выявленные АА (%) Identified AA (%) Выявленные ВВ (%) Identified BB (%) Выявленные С С (%) Identified C C (%) Другие молекулы (%) Other molecules (%) 1 1 Только вектор I Only vector I А A АА AA 146521 146521 146503 146503 100 100 1 1 Только вектор II Only vector II G G ВВ BB 144032 144032 144087 144087 100 100 1 1 Только вектор III Only vector III Н N СС SS 144647 144647 144656 144656 100 100 2 2 Вектор I и II Vector I and II М (1:11= 1:1) M (1:11= 1:1) АА ВВ AA BB 146521 144032 146521 144032 146518 144030 146518 144030 51 51 45 45 4 4 2 2 Вектор I и III Vector I and III N (1:111= 1:1) N (1:111= 1:1) АА СС AA SS 146521 144647 146521 144647 146509 144633 146509 144633 88 88 9 9 3 3 и (1:111= 1:5) and (1:111= 1:5) АА СС AA SS 146521 144647 146521 144647 146522 144643 146522 144643 47 47 48 48 5 5 2 2 Вектор II и III Vector II and III nd nd ВВ СС BB SS 3 3 Вектор I, II и III Vector I, II and III 0 (1:11:11 1 = 1:1:1) 0 (1:11:11 1 = 1:1:1) АА ВВ СС AA BB SS 146521 144032 144647 146521 144032 144647 146525 144032 144650 146525 144032 144650 66 66 4 4 30 thirty V (1:11:11 1 = 1:1:10) V (1:11:11 1 = 1:1:10) АА ВВ СС AA BB SS 146521 144032 144647 146521 144032 144647 146531 144043 144654 146531 144043 144654 8 8 81 81 9 9 2 2

пб=не проводили.pb = not carried out.

Было выявлено, что трансфекции A, G и Н приводили к образованию только гомодимеров, и 100% двухвалентных моноспецифических АА, ВВ или СС было извлечено из клеток, трансфицированных любым из векторов I, II или III (фиг. 4). Хотя это ожидалось и ранее было продемонстрировано для трансфекции А, в настоящее время в действительности впервые показана гомодимеризация тяжелых цепей Ig с модифицированными способами инженерии CH3, содержащими либо тройную аминокислотную замену из конструкции 4 (т.е. K392D, D399K, K409D), либо четырехкратную аминокислотную замену из конструкции 5 (т.е. Е356К, Е357К, K439D, K370D) (трансфекции G и Н).Transfections A, G, and H were found to result in the formation of only homodimers, and 100% of the divalent monospecific AA, BB, or CC was recovered from cells transfected with any of vectors I, II, or III (Fig. 4). Although this was expected and had previously been demonstrated for transfection A, this is actually the first time that homodimerization of Ig heavy chains has been shown with modified CH3 engineering methods containing either a triple amino acid substitution from construct 4 (i.e. K392D, D399K, K409D) or a quadruple amino acid substitution from construct 5 (i.e. E356K, E357K, K439D, K370D) (transfections G and H).

Далее проводили эксперименты по коэкспрессии двух векторов в одной клетке. Интересно, что трансфекции М и N демонстрируют, что тяжелые цепи Ig дикого типа и тяжелые цепи Ig с модифицированными способами инженерии CH3 могут коэкспрессироваться в единичной клетке вместе с общей легNext, experiments were carried out on the coexpression of two vectors in one cell. Interestingly, M and N transfections demonstrate that wild-type Ig heavy chains and CH3-engineered Ig heavy chains can be coexpressed in a single cell along with the total leg

- 26 046272 кой цепью, что приводит к смеси двух типов моноспецифических антител без присутствия нежелательных биспецифических антител и только с 4-5% примесей других молекул, присутствующих в смеси. Другие молекулы определяют как все молекулы, которые не имеют массы интактного IgG, и включают половинные молекулы, состоящие из одной пары тяжелой и легкой цепей. Важно, что фракция других молекул не включает биспецифический продукт. При трансфекции М соотношение АА:ВВ было близким к 1:1, если трансфицировали равные соотношения векторной ДНК. Однако трансфекция N привела к соотношению АА:СС практически 10:1. Таким образом, эту трансфекцию повторяют с измененными соотношениями ДНК (трансфекция U). Действительно, соотношение 1:5 векторной ДНК I:III уравновешивало соотношение антительного продукта АА:СС в смеси практически до соотношения 1:1. Таким образом, трансфекции М и U демонстрируют, что возможно экспрессировать два по существу чистых моноспецифических антитела в единичной клетке без нежелательных побочных продуктов (т.е. без избыточного присутствия АС или половинных молекул А или С) (фиг. 5). Новые модификации CH3 конструкций 4 и 5 существенно отличаются от CH3 дикого типа, так что гетеродимеризация между диким типом и 4, или диким типом и 5, не происходит, что является преимущественным для применения при крупномасштабной продукции смесей моноспецифических антител из единичных клеток.- 26 046272 chain, which results in a mixture of two types of monospecific antibodies without the presence of unwanted bispecific antibodies and with only 4-5% impurities of other molecules present in the mixture. Other molecules are defined as all molecules that do not have an intact IgG mass and include half molecules consisting of a single pair of heavy and light chains. It is important that the fraction of other molecules does not include the bispecific product. For M transfection, the AA:BB ratio was close to 1:1 when equal ratios of vector DNA were transfected. However, transfection with N resulted in an AA:CC ratio of almost 10:1. Thus, this transfection is repeated with altered DNA ratios (U transfection). Indeed, the 1:5 ratio of vector DNA I:III balanced the ratio of the antibody product AA:CC in the mixture to almost a 1:1 ratio. Thus, the M and U transfections demonstrate that it is possible to express two essentially pure monospecific antibodies in a single cell without unwanted by-products (ie, without the excessive presence of AC or half molecules of A or C) (Fig. 5). The new modifications of CH3 constructs 4 and 5 are substantially different from wild type CH3 such that heterodimerization between wild type and 4 or wild type and 5 does not occur, which is advantageous for use in the large scale production of mixtures of monospecific antibodies from single cells.

Аналогично этим результатам, также ожидается, что трансфекция двух различных тяжелых цепей Ig с модифицированными способами инженерии CH3 (конструкции 4 и 5) приведет к смесям только двух различных моноспецифических антител без присутствия других нежелательных типов молекул. Был сделан вывод, что модификации CH3 конструкции 4 существенно отличаются от модификаций CH3 конструкций 5, так что гетеродимеризация не происходит. В этом случае коэкспрессия тяжелых цепей с модифицированным CH3 конструкций 4 и 5 вместе с тяжелыми цепями с CH3 дикого типа в единичной клетки приведет только к 3 моноспецифическим антителам.Similar to these results, it is also expected that transfection of two different CH3 engineered Ig heavy chains (designs 4 and 5) will result in mixtures of only two different monospecific antibodies without the presence of other undesirable types of molecules. It was concluded that the CH3 modifications of construct 4 are significantly different from the CH3 modifications of construct 5 such that heterodimerization does not occur. In this case, coexpression of CH3-modified heavy chains of constructs 4 and 5 along with wild-type CH3 heavy chains in a single cell would result in only 3 monospecific antibodies.

Действительно, это было подтверждено, поскольку было выявлено, что также смесь трех чистых моноспецифических антител может быть получена путем экспрессии трех различных тяжелых цепей Ig, сконструированных так, чтобы они образовывали гомодимеры, а не гетеродимеры, вместе с общей легкой цепью в единой клетке без присутствия в смеси примесей (трансфекция О) (фиг. 6). Как очевидно из табл. 3, при равных соотношениях векторных ДНК, использованных во время трансфекции О, не было получено соотношения 1:1:1 для антител АА:ВВ:СС. Трансфекция с измененными соотношениями векторной ДНК (1:1:10, трансфекция V) продемонстрировала, что соотношения АА:ВВ:СС в смесях можно скорректировать в направлении желательных соотношений.Indeed, this was confirmed as it was found that also a mixture of three pure monospecific antibodies could be produced by expressing three different Ig heavy chains, designed to form homodimers rather than heterodimers, together with a common light chain in a single cell without the presence of in a mixture of impurities (transfection O) (Fig. 6). As is obvious from the table. 3, with equal ratios of vector DNA used during O transfection, a 1:1:1 ratio was not obtained for AA:BB:CC antibodies. Transfection with altered vector DNA ratios (1:1:10, transfection V) demonstrated that the AA:BB:CC ratios in the mixtures could be adjusted toward the desired ratios.

Взятые вместе, эти эксперименты демонстрируют, что два или три по существу чистых моноспецифических антитела могут экспрессироваться в единичной клетке без нежелательных побочных продуктов, что обеспечивает преимущество для крупномасштабной продукции смесей терапевтических моноспецифических антител.Taken together, these experiments demonstrate that two or three essentially pure monospecific antibodies can be expressed in a single cell without unwanted by-products, providing an advantage for the large-scale production of mixtures of therapeutic monospecific antibodies.

Пример 11. Смеси 2 биспецифических антител из единичной клетки.Example 11. Mixtures of 2 bispecific antibodies from a single cell.

В то время как применение тяжелых цепей с модифицированными способами инженерии CH3 для продукции единичных биспецифических антител было описано в других источниках, этот эксперимент был задуман для исследования, является ли осуществимым продуцирование смесей 2 различных биспецифических антител из единичной клетки.While the use of CH3 engineered heavy chains to produce single bispecific antibodies has been described elsewhere, this experiment was designed to investigate whether producing mixtures of 2 different bispecific antibodies from a single cell is feasible.

VH-области антител с известной специфичностью и известной способностью образовывать пару с легкой цепью IGKV1-39 человека (фиг. 3) использовали для повторного клонирования в векторы, содержащие конструкции 1-3 или 6-7, представленные в табл. 1, с получением векторов IV-X (табл. 4). Затем векторы IV-X, каждый из которых содержал последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие общую легкую цепь человека, а также тяжелую цепь Ig с отличающейся областью CH3 и отличающейся специфичностью VH, трансфицировали в клетки либо отдельно, чтобы продемонстрировать препятствование образованию интактных моноспецифических антител, либо в комбинации с другим сконструированным вектором, для получения биспецифических антител или смесей двух биспецифических антител. В табл. 5 представлена схема и результаты трансфекции.VH regions of antibodies with known specificity and known ability to pair with the light chain of human IGKV1-39 (Fig. 3) were used for re-cloning into vectors containing constructs 1-3 or 6-7, presented in table. 1, obtaining vectors IV-X (Table 4). Vectors IV-X, each containing nucleic acid sequences encoding the common human light chain as well as an Ig heavy chain with a different CH3 region and different VH specificity, were then transfected into cells either alone to demonstrate inhibition of the formation of intact monospecific antibodies or in combinations with another engineered vector to produce bispecific antibodies or mixtures of two bispecific antibodies. In table Figure 5 shows the scheme and results of transfection.

- 27 046272- 27 046272

Таблица 4Table 4

Специфичность VH, встроенных в различные конструкцииSpecificity of VHs built into various designs

Вектор Vector ген VH VH gene Антигенная специфичность Antigen specificity Масса VH (Да) Weight VH (Yes) Клонирован в конструкцию # Cloned into design # IV IV IGHV 3.23 IGHV 3.23 Тиреоглобулин (В) Thyroglobulin (B) 12472 12472 1 1 V V IGHV 3.30 IGHV 3.30 Фибриноген (С) Fibrinogen (C) 12794 12794 2 2 VI VI IGHV 1.08 IGHV 1.08 Столбняк (А) Tetanus (A) 13703 13703 2 2 VII VII IGHV 3.30 IGHV 3.30 Фибриноген (С) Fibrinogen (C) 12794 12794 3 3 VIII VIII IGHV 1.08 IGHV 1.08 Столбняк (А) Tetanus (A) 13703 13703 3 3 IX IX IGHV 1.08 IGHV 1.08 Столбняк (А) Tetanus (A) 13703 13703 б b X X IGHV 3.23 IGHV 3.23 Тиреоглобулин (В) Thyroglobulin (B) 12472 12472 7 7

Таблица 5Table 5

# продуцированной отличающейся биспецифической молекулы # produced by a different bispecific molecules Объект трансфекции An object transfections Код трансфекции и соотношение Code transfections and ratio Ожидаемые типы Expected types Вычисленная масса -2LYS Calculated mass -2LYS Экспериментальная масса Experimental mass Выявленные половинные молекулы (%) Identified half molecules (%) Выявленный полный IgG (%) Detected total IgG (%) Выявленные биспецифические молекулы (%) Identified bispecific molecules (%) Другие молекулы (%) Other molecules (%) 0 0 вектор IV vector IV В IN половинный В half IN 144082 144082 144066 144066 40 40 60 60 0 0 вектор V vector V С WITH половинный с half s 144651 144651 144622 144622 77 77 23 23 0 0 вектор VI vector VI D D половинный А half A 146469 146469 146459 146459 23 23 77 77 0 0 вектор VII vector VII Е E половинный с half s 144625 144625 144643 144643 76 76 24 24 0 0 вектор VIII vector VIII F F половинный А half A 146443 146443 146468 146468 64 64 36 36 0 0 вектор IX vector IX В IN половинный А half A 146691 146691 146677 146677 82 82 18 18 0 0 вектор X vector X Q Q половинный в half in 143818 143818 143844 143844 58 58 42 42 1 1 Вектор IV и V Vector IV and V I (1:1) I (1:1) ВС Sun 144367 144367 144352 144352 96 96 4 4 1 1 Вектор IV и VII Vector IV and VII J (1:1) J (1:1) ВС Sun 144354 144354 144382 144382 96 96 4 4 2 2 Вектор IV, V и VI Vector IV, V and VI К (1: 1: 1) K(1:1:1) ВС+АВ BC+AB 144367+ 145276 144367+ 145276 144351+ 145260 144351+ 145260 38 + 47 38 + 47 15 (А+С) 15 (A+C) S(2 : 1: 1) S(2:1:1) ВС+АВ BC+AB 144367+ 145276 144367+ 145276 144371 + 145277 144371 + 145277 42 + 55 42 + 55 3 (ВВ) 3 (BB) 2 2 Вектор IV, VII и VIII Vector IV, VII and VIII L (1:1:1) L (1:1:1) ВС+АВ BC+AB 144354+ 145263 144354+ 145263 144346 + 145255 144346 + 145255 16+60 16+60 24 (А+С) 24 (A+C) Т (2:1:1) T (2:1:1) ВС+АВ BC+AB 144354+ 145263 144354+ 145263 144385+1 45292 144385+1 45292 58 + 39 58 + 39 3 (ВВ) 3 (BB)

Ранее было продемонстрировано, что тяжелые цепи Ig с модифицированными способами инженерии CH3, кодируемые конструкциями 1 и 2, тем не менее способны образовывать гомодимеры при экспрессии отдельно в единичных клетках (WO 2009/089004). Однако в WO 2009/089004 далее описано, что CH3-домены, которые сконструированы так, чтобы они содержали мутации трех зарядовых пар, такие как присутствуют в конструкции 3, более не способны образовывать гомодимеры при экспрессии отдельно.It has previously been demonstrated that CH3 engineered Ig heavy chains encoded by constructs 1 and 2 are nonetheless capable of forming homodimers when expressed alone in single cells (WO 2009/089004). However, WO 2009/089004 further describes that CH3 domains that are designed to contain mutations of three charge pairs, such as those present in construct 3, are no longer capable of forming homodimers when expressed alone.

- 28 046272- 28 046272

В настоящем исследования эти данные были только частично подтверждены. Действительно, результаты трансфекций В, С и D продемонстрировали присутствие полных IgG, в дополнение к высокой доле неспаренных половинных молекул, демонстрируя некоторую гомодимеризацию CH3-доменов, кодируемых конструкциями 1 и 2. Трансфекции Е и F также приводили к продукции полных IgG в дополнение к непарным половинным молекулам, что демонстрирует, что тройные зарядовые мутации конструкции 3 не полностью нарушают гомодимеризацию.In the present study, these data were only partially confirmed. Indeed, results from transfections B, C and D demonstrated the presence of full IgGs, in addition to a high proportion of unpaired half molecules, demonstrating some homodimerization of the CH3 domains encoded by constructs 1 and 2. Transfections E and F also resulted in the production of full IgGs in addition to unpaired ones half molecules, demonstrating that triple charge mutations of construct 3 do not completely disrupt homodimerization.

Более того, также было продемонстрировано, что варианты CH3 с выступом и полостью конструкций 6 и 7 образуют гомодимеры (18% гомодимеров выступ-выступ и 42% гомодимеров полостьполость).Moreover, the protrusion-cavity CH3 variants of constructs 6 and 7 were also demonstrated to form homodimers (18% protrusion-protrusion homodimers and 42% cavity-cavity homodimers).

Варианты CH3, которые полностью препятствуют гомодимеризации при экспрессии отдельно, являются предпочтительными, чтобы предотвратить или минимизировать нежелательные побочные продукты (гомодимеры) при коэкспрессии со вторым вариантом CH3 для гетеродимеризации.CH3 variants that completely prevent homodimerization when expressed alone are preferred to prevent or minimize unwanted by-products (homodimers) when coexpressed with a second CH3 heterodimerization variant.

Интересно, что данные эксперименты впервые демонстрируют, что также смеси биспецифических антител могут экспрессироваться в единичных клетках практически без гомодимеров в смеси. Трансфекции K и L отчетливо демонстрируют, что действительно получают ожидаемые биспецифические типы ВС+АВ (38+47% при трансфекции K, и 16+60% при трансфекции L). При обеих трансфекциях наблюдали относительно высокий процент нежелательных половинных молекул (15% половинной молекулы А+половинной молекулы С при трансфекции K, и 24% половинной молекулы А+половинной молекулы С при трансфекции L). Относительно высокий процент присутствующих половинных молекул был объяснен низкими количествами совпадающих тяжелых цепей вектора IV вследствие несбалансированной экспрессии тяжелых цепей в соответствующей паре. Таким образом, трансфекции повторяли при скорректированном соотношении векторных ДНК, 2:1:1, в трансфекциях S и Т. Это приводило к равным количествам тяжелых цепей IgG, составляющих соответствующую пару, и чистым смесям биспецифических IgG без присутствия половинных молекул IgG и с присутствием только 3% гомодимерного ВВ. В идеальном случае, эта низкая доля примесей моноспецифического продукта должна быть снижена по существ до нуля. Таким образом, является желательным найти дополнительные мутанты CH3, которые привели бы к смесям биспецифических антител с минимальным присутствием примесей моноспецифических антител.Interestingly, these experiments demonstrate for the first time that mixtures of bispecific antibodies can also be expressed in single cells with virtually no homodimers in the mixture. Transfections K and L clearly demonstrate that the expected bispecific BC+AB types are indeed obtained (38+47% with K transfection, and 16+60% with L transfection). A relatively high percentage of unwanted half molecules was observed in both transfections (15% half A+half C in transfection K, and 24% half A+half C in transfection L). The relatively high percentage of half molecules present was explained by low numbers of matching vector IV heavy chains due to unbalanced expression of the heavy chains in the corresponding pair. Thus, transfections were repeated at an adjusted vector DNA ratio, 2:1:1, in S and T transfections. This resulted in equal amounts of IgG heavy chains making up the corresponding pair, and pure mixtures of bispecific IgG without the presence of half IgG molecules and with the presence of only 3% homodimeric BB. Ideally, this low proportion of monospecific product impurities should be reduced essentially to zero. Thus, it is desirable to find additional CH3 mutants that would result in mixtures of bispecific antibodies with minimal presence of monospecific antibody contaminants.

В настоящем исследовании впервые продемонстрировано, что по существу чистые смеси двух биспецифических антител, распознающие 3 различных эпитопа-мишени, можно продуцировать в единичной клетке с минимальным присутствием моноспецифических антител в смеси.The present study demonstrates for the first time that essentially pure mixtures of two bispecific antibodies recognizing 3 different target epitopes can be produced in a single cell with minimal presence of monospecific antibodies in the mixture.

Пример 12. Разновидности смесей.Example 12. Varieties of mixtures.

Поскольку было продемонстрировано, что продукция смесей 2 биспецифических антител, распознающих 3 эпитопа, из единичной клетки или продукция смесей 2 или 3 моноспецифических антител из единичной клетки является технически осуществимой, авторы настоящего изобретения далее исследовали возможность контролируемой продукции различных других смесей. Четвертую VH-область антитела с известной специфичностью и известной способностью образовывать пару с легкой цепью человека IGKV1-39 используют для повторного клонирования в векторы, содержащие конструкции 1-3 или 7 табл. 1, с получением векторов I', II', III' или X' (' указывает на отличающуюся специфичность по сравнению с соответствующими номерами векторов). Затем полученные векторы I'-III', X' и IV-IX, каждый из которых содержит последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие общую легкую цепь человека, а также тяжелую цепь Ig с отличающейся областью CH3 и отличающейся специфичностью VH, трансфицируют в клетки в комбинации с другими сконструированными векторами с получением различных смесей биспецифических и/или моноспецифических антител. Множество смесей, которые получают, включают смеси 2 биспецифических антител, распознающих 4 эпитопа, 2 биспецифических антител и одного моноспецифического антитела, или смеси 1 биспецифического и одного моноспецифического антитела из единичной клетки. В табл. 6 представлена схема трансфекции и ожидаемые результаты.Since it has been demonstrated that the production of mixtures of 2 bispecific antibodies recognizing 3 epitopes from a single cell or the production of mixtures of 2 or 3 monospecific antibodies from a single cell is technically feasible, the present inventors further explored the possibility of controlled production of various other mixtures. The fourth VH region of an antibody with known specificity and known ability to pair with the human light chain of IGKV1-39 is used for re-cloning into vectors containing constructs 1-3 or 7 of Table. 1, producing vectors I', II', III', or X' (' indicates different specificity compared to the corresponding vector numbers). The resulting vectors I'-III', X' and IV-IX, each containing nucleic acid sequences encoding a common human light chain as well as an Ig heavy chain with a different CH3 region and a different VH specificity, are then transfected into cells in combination with other constructed vectors to obtain various mixtures of bispecific and/or monospecific antibodies. A variety of mixtures that are produced include mixtures of 2 bispecific antibodies recognizing 4 epitopes, 2 bispecific antibodies and one monospecific antibody, or mixtures of 1 bispecific and one monospecific antibody from a single cell. In table Figure 6 shows the transfection scheme and expected results.

- 29 046272- 29 046272

Таблица 6Table 6

Разновидность смеси Variety mixtures Объект трансфекции Transfection object Код трансфекции и соотношение Transfection code and ratio Ожидаемый тип Expected type Ожидаемый % моноспецифического IgG Expected % monospecific IgG Ожидаемый % биспецифической молекулы Expected % bispecific molecule 2 BsAb, 4 эпитопа 2 BsAbs, 4 epitopes IV+V+IX+X' IV+V+IX+X' ZA (1: 1: 1 : 1) ZA (1:1:1:1) BC+AD BC+AD 0 0 50 + 50 50 + 50 2 BsAb, 4 эпитопа 2 BsAbs, 4 epitopes IV+VII+IX+X' IV+VII+IX+X' ZB (1:1:1:1) ZB (1:1:1:1) BC+AD BC+AD 0 0 50 + 50 50 + 50 2 bsAb+1 mAb 2 bsAb+1 mAb IV+V+VI+wt' IV+V+VI+wt' ZC (2:1:1:2) ZC (2:1:1:2) BC+AB+DD BC+AB+DD 33 33 33 + 33 33 + 33 2 bsAb+1 mAb 2 bsAb+1 mAb IV+V+VI+II' IV+V+VI+II' ZD (2:1:1:2) ZD (2:1:1:2) BC+AB+DD BC+AB+DD 33 33 33 + 33 33 + 33 2 bsAb+1 mAb 2 bsAb+1 mAb IV+V+VI+III' IV+V+VI+III' ZE (2:1:1:2) ZE (2:1:1:2) BC+AB+DD BC+AB+DD 33 33 33 + 33 33 + 33 1 bsAb+1 mAb 1 bsAb+1 mAb IV+V+wt' IV+V+wt' ZE (1:1:2) ZE (1:1:2) BC+DD BC+DD 50 50 50 50 1 bsAb+1 mAb 1 bsAb+1 mAb IV+V+II' IV+V+II' ZG(1:1:2) ZG(1:1:2) BC+DD BC+DD 50 50 50 50 1 bsAb+1 mAb 1 bsAb+1 mAb IV+V+III' IV+V+III' ZH(1:1:2) ZH(1:1:2) BC+DD BC+DD 50 50 50 50 1 bsAb+1 mAb 1 bsAb+1 mAb IV+VII+wt' IV+VII+wt' ZI (1:1:2) ZI (1:1:2) BC+DD BC+DD 50 50 50 50 1 bsAb+1 mAb 1 bsAb+1 mAb IV+VII+II' IV+VII+II' ZJ (1:1:2) ZJ (1:1:2) BC+DD BC+DD 50 50 50 50 1 bsAb+1 mAb 1 bsAb+1 mAb IV+VII+III' IV+VII+III' ZK (1:1:2) ZK (1:1:2) BC+DD BC+DD 50 50 50 50 1 bsAb+1 mAb 1 bsAb+1 mAb IX+X+wt' IX+X+wt' ZL (1:1:2) ZL (1:1:2) AB+DD AB+DD 50 50 50 50 1 bsAb+1 mAb 1 bsAb+1 mAb IX+X+II' IX+X+II' ZM (1:1:2) ZM (1:1:2) AB+DD AB+DD 50 50 50 50 1 bsAb+1 mAb 1 bsAb+1 mAb IX+X+III' IX+X+III' ZN (1:1:2) ZN (1:1:2) AB+DD AB+DD 50 50 50 50

Хотя теоретические получение всех смесей должно быть осуществимым, из предшествующей работы других авторов известно, что крупномасштабной продукции классических вариантов выступ-вполости препятствуют проблемы нестабильности. Таким образом, ожидается, что получение смесей в результате трансфекций ZA, ZB, ZL, ZM и ZN станет проблематичным при переходе на крупномасштабную продукцию.Although the theoretical preparation of all mixtures should be feasible, it is known from previous work by others that large-scale production of classical lip-hollow variants is hampered by instability problems. Thus, the production of mixtures from ZA, ZB, ZL, ZM, and ZN transfections is expected to become problematic when moving to large-scale production.

Таким образом, текущий набор конструкций, присутствующих в табл. 1, не позволяет получение всех теоретических смесей из единичных клеток в более крупном масштабе, поскольку описано, что варианты выступ-в-полости являются нестабильными, и нельзя исключить, что CH3-домены, содержащие выступ или полость, будут димеризоваться либо с зарядовыми вариантами, либо с CH3доменами дикого типа. Таким образом, является желательным моделирование новых вариантов CH3, которые сконструированы так, чтобы предпочтительно образовывать только гомодимеры или гетеродимеры, и которые не гомодимеризуются или не гетеродимеризуются с конструкциями 1-5 табл. 1, чтобы обеспечить возможность коэкспрессии в единичных клетках.Thus, the current set of structures present in the table. 1 does not allow the production of all theoretical mixtures from single cells on a larger scale, since knob-in-cavity variants are described to be unstable, and it cannot be excluded that CH3 domains containing a knob or cavity will dimerize with either charge variants. or with wild-type CH3 domains. Thus, it is desirable to model new CH3 variants that are designed to preferentially form only homodimers or heterodimers, and that do not homodimerize or heterodimerize with designs 1-5 of Table. 1 to allow coexpression in single cells.

Пример 13. Идентификация новых мутантов зарядовых пар.Example 13. Identification of new charge pair mutants.

Задачей данного исследования было конструирование CH3-области IgG так, чтобы обеспечить продукцию только гетеродимеров или только гомодимеров при смешанной экспрессии различных тяжелых цепей IgG в единичной клетке, где новые сконструированные CH3-домены не гомодимеризуются или не гетеродимеризуются с известными сконструированными CH3-доменами, или с CH3-доменами дикого типа. Таким образом, в качестве первой стадии при идентификации новых сконструированных CH3доменов, которые удовлетворяют критериям, многие остатки поверхности контакта в Cffi-домене IgG сканировали по одному или группами в отношении замен, которые приведет к отталкиванию идентичных тяжелых цепей, т.е. сниженному образованию гомодимеров, посредством электростатических взаимодействий. Задачей было получение перечня остатков, которые, когда они замещены заряженным остатком, приведут к отталкиванию идентичных цепей, так что эти мутации можно использовать для обеспечения образования гомодимеров и/или гетеродимеров при смешанной экспрессии различных тяжелых цепей IgG, при этом полученные полноразмерные IgG являются стабильными и продуцируются при высоких долях. По итогам, идентифицированные замены используют для получения биспецифических антител или смесей биспецифических или моноспецифических антител путем модификации способами инженерии соответствующих пар остатков CH3 в одной или нескольких тяжелых цепях IgG - областях CH3. Кроме того, вновь идентифицированные пары мутаций заряда можно комбинировать с существующими парами, так чтобы несколько молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих различные тяжелые цепи, все из которых содержат различные и взаимодополняющие мутации CH3, можно было использовать для экспрессии в таких клетках, чтобы предпочтительно можно было получить смеси только моноспецифических антител, или только биспецифических антител, или смеси определенных моноспецифических и биспецифических антител. Остатки, подлежащие изучению в настоящем исследовании, представляют собой контактные остатки, как указано ранее (Deisenhofer J., 1981; Miller S., 1990; Padlan, 1996, Gunasekaran, 2010). Обоснованием этого подхода является то, что отталкивающие заряды встраивают способами инженерии в каждую доступную пару контактирующих остатков. Затем образцы анализируютThe objective of this study was to engineer the CH3 region of an IgG to allow the production of only heterodimers or only homodimers when mixed expression of different IgG heavy chains in a single cell, where the new engineered CH3 domains do not homodimerize or heterodimerize with known engineered CH3 domains, or with wild type CH3 domains. Thus, as a first step in identifying new designed CH3 domains that meet the criteria, many contact surface residues in the IgG Cffi domain were scanned individually or in groups for substitutions that would result in repulsion of identical heavy chains, i.e. reduced formation of homodimers through electrostatic interactions. The goal was to obtain a list of residues that, when substituted with a charged residue, will result in repulsion of identical chains, so that these mutations can be used to promote the formation of homodimers and/or heterodimers during mixed expression of different IgG heavy chains, while the resulting full-length IgGs are stable and are produced at high proportions. As a result, the identified substitutions are used to produce bispecific antibodies or mixtures of bispecific or monospecific antibodies by modifying the corresponding pairs of CH3 residues in one or more heavy chains of IgG - CH3 regions by engineering methods. In addition, newly identified charge mutation pairs can be combined with existing pairs so that multiple nucleic acid molecules encoding different heavy chains, all of which contain different and complementary CH3 mutations, can be used for expression in such cells so that preferentially one can obtain mixtures of monospecific antibodies only, or bispecific antibodies only, or mixtures of certain monospecific and bispecific antibodies. The residues to be studied in the present study are contact residues as previously stated (Deisenhofer J., 1981; Miller S., 1990; Padlan, 1996, Gunasekaran, 2010). The rationale for this approach is that repulsive charges are engineered into each available pair of contacting residues. The samples are then analyzed

- 30 046272 на невосстанавливающем SDS-PAGE для идентификации пар, в которых снижено образование димера, что визуализируют по присутствию полос размером приблизительно 72 кДа. Все доступные пары подвергают скринингу в качестве единичных мутаций или в комбинации с единичной другой мутацией, поскольку отталкивающего электростатического взаимодействия между одной несоответствующей парой может быть достаточно или может быть недостаточно, чтобы образовалось достаточные количества половинных молекул для обнаружения этим способом, также мутации комбинируют.- 30 046272 on non-reducing SDS-PAGE to identify pairs in which dimer formation is reduced, as visualized by the presence of approximately 72 kDa bands. All available pairs are screened as single mutations or in combination with a single other mutation, since the repulsive electrostatic interaction between one mismatched pair may or may not be sufficient to generate sufficient numbers of half molecules to be detected by this method, and mutations are also combined.

Аминокислотные замены вносили в сконструированный вектор MV1057 в Geneart в соответствии с табл. 7 и экспрессию конструкций проводили посредством трансфекции в клетки HEK293T по стандартным методикам. Уровни экспрессии IgG измеряли в Octet. Когда продукция дважды оказывалась неудачной, мутацию считали неблагоприятной для экспрессии и мутацию далее не исследовали.Amino acid substitutions were introduced into the constructed vector MV1057 in Geneart in accordance with Table. 7 and expression of the constructs was carried out by transfection into HEK293T cells using standard procedures. IgG expression levels were measured in Octet. When production failed twice, the mutation was considered unfavorable for expression and the mutation was not examined further.

Таблица 7Table 7

Перечень аминокислотных замен в различных _________конструкциях, которые были внесены (нумерация EU)_________List of amino acid substitutions in various _________constructs that have been introduced (EU numbering)_________

Замены ΆΆ в СНЗ ΆΆ substitutions in SNZ # конструкции # designs Эффект на образование гомодимера (- = нет эффекта; +++ = максимальное ингибирование; NT= не исследовали на геле) Effect on homodimer formation (- = no effect; +++ = maximum inhibition; NT= not tested on gel) Q347K Q347K 8 8 - - Y349D Y349D 9 9 + - + - Y349K Y349K 10 10 + - + - Т350К T350K 11 eleven - - Т350К, S354K T350K, S354K 12 12 + - + - L351K, S354K L351K, S354K 13 13 + - + - L351K, Т366К L351K, T366K 14 14 + + + + L351K, Р352К L351K, Р352К 15 15 + - + - L351K, Р353К L351K, Р353К 16 16 + + + + S354K, Y349K S354K, Y349K 17 17 + + + + D356K D356K 18 18 - - Е357К E357K 19 19 - - S364K S364K 20 20 + + + + Т366К, L351K T366K, L351K 21 21 + + + + Т366К, Y407K T366K, Y407K 22 22 + + + + + + L368K L368K 23 23 NT NT L368K, S364K L368K, S364K 24 24 + + + + N390K, S400K N390K, S400K 25 25 + - + - Т394К, V397K T394K, V397K 26 26 + + Т394К, F405K T394K, F405K 27 27 + + + + + + Т394К, Y407K T394K, Y407K 28 28 + + + + + + Р395К, V397K Р395К, V397K 29 29 + - + -

- 31 046272- 31 046272

S400K S400K 30 thirty - - F405K F405K 31 31 + + + + + + Y407K Y407K 32 32 + + + + Q347K, V397K, Т394К Q347K, V397K, T394K 33 33 + + Y349D, Р395К, V397K Y349D, Р395К, V397K 34 34 + + Т350К, Т394К, V397K T350K, T394K, V397K 35 35 NT NT L351K, S354K, S400K L351K, S354K, S400K 36 36 + + S354K, Y349K, Y407K S354K, Y349K, Y407K 37 37 + - + - Т350К, N390K, S400K T350K, N390K, S400K 38 38 + - + - L368K, F405K L368K, F405K 39 39 + + + + D356K, Т366К, L351K D356K, T366K, L351K 40 40 + + + + + + Q347K, S364K Q347K, S364K 41 41 + + + + + + L368D, Y407F L368D, Y407F 42 42 + + Т366К T366K 43 43 + + L351K, S354K, Т366К L351K, S354K, T366K 44 44 + + Y349D, Y407D Y349D, Y407D 45 45 + + Y349D, S364K, Y407D Y349D, S364K, Y407D 46 46 + + Y349D, S364K, S400K, T407D Y349D, S364K, S400K, T407D 47 47 + + D399K D399K 48 48 + - + - D399R D399R 49 49 + - + - D399H D399H 50 50 + - + - K392D K392D 51 51 + - + - К392Е K392E 52 52 + - + - K409D K409D 53 53 + +

Супернатанты, содержавшие >5 мкг/мл IgG, анализировали в SDS-PAGE, и IgG очищали с использованием белка А. Белки окрашивали с использованием коллоидного синего. Гомодимеры были видны в качестве полосы размером приблизительно 150 кДа. Полосы меньших размеров, составляющие приблизительно 75 кДа, отражали присутствие половинных молекул (см. отрицательный контроль: K392D, K409D). Блоты представлены на фиг. 7.Supernatants containing >5 μg/ml IgG were analyzed by SDS-PAGE and IgG purified using protein A. Proteins were stained using colloidal blue. Homodimers were visible as a band of approximately 150 kDa. Smaller bands of approximately 75 kDa reflected the presence of half molecules (see negative controls: K392D, K409D). The blots are shown in Fig. 7.

Результаты гелей SDS-PAGE анализировали и оценивали, как показано в табл. 7, правая колонка. Ряд остатков считали перспективными для дальнейшего исследования в комбинации, включая остатки Q347, S354, Y349, L351, K360, Т366, Т394 и V397. Выбор был основан на высоких показателях ингибирования образования гомодимеров в сочетании с доступностью контактирующих остатков, которые могут быть модифицированы, не сталкиваясь с проблемами, такими как другие некомплементарные заряды. Например, известно, что остатки F405 и Y407 имеют множество взаимодействий на поверхности контакта CH3-CH3, включая взаимодействия с остатками, которые уже заряжены, что может быть проблематичным после внесения множества зарядовых мутаций в эти взаимодействующие остатки (см. табл. А). Новые конструкции встраивали в вектор MV1057 (табл. 8) и VH-области антитела с известной специфичностью и известной способностью образовывать пару с легкой цепью IGKV1-39 человека использовали для повторного клонирования в векторы, содержащие эти новые конструкции (см. табл. 9), так что комбинации можно было исследовать далее. В табл. 10 представлены схемы и результаты трансфекции.The results of SDS-PAGE gels were analyzed and evaluated as shown in Table. 7, right column. A number of residues were considered promising for further study in combination, including residues Q347, S354, Y349, L351, K360, T366, T394, and V397. The choice was based on the high rates of inhibition of homodimer formation combined with the availability of contacting residues that can be modified without encountering problems such as other non-complementary charges. For example, residues F405 and Y407 are known to have multiple interactions at the CH3-CH3 interface, including interactions with residues that are already charged, which can be problematic once multiple charge mutations are introduced into these interacting residues (see Table A). New constructs were inserted into the MV1057 vector (Table 8) and the VH regions of antibodies with known specificity and known ability to pair with the light chain of human IGKV1-39 were used for re-cloning into vectors containing these new constructs (see Table 9), so the combinations could be explored further. In table 10 shows the schemes and results of transfection.

Таблица 8Table 8

Замены ΆΆ с СНЗ Replacement of ΆΆ with SNZ # конструкции # designs L351K L351K 61 61 Т394К T394K 62 62 L351D L351D 63 63 T366D T366D 64 64 S354D, Y349D S354D, Y349D 65 65 V397D V397D 66 66 K360D K360D 67 67

- 32 046272- 32 046272

Таблица 9Table 9

Вектор Vector ген VH VH gene Антигенная специфичность Antigen specificity Масса VH (Да) Weight VH (Yes) Клонирован в конструкцию # Cloned into design # XI XI IGHV 1.08 IGHV 1.08 Столбняк (A) Tetanus (A) 13703 13703 8 8 XII XII IGHV 1.08 IGHV 1.08 Столбняк (A) Tetanus (A) 13703 13703 17 17 XIII XIII IGHV 1.08 IGHV 1.08 Столбняк (A) Tetanus (A) 13703 13703 43 43 XIV XIV IGHV 1.08 IGHV 1.08 Столбняк (A) Tetanus (A) 13703 13703 61 61 XV XV IGHV 1.08 IGHV 1.08 Столбняк (A) Tetanus (A) 13703 13703 62 62 XVI XVI IGHV 3.30 IGHV 3.30 Фибриноген (С) Fibrinogen (C) 12794 12794 63 63 XVII XVII IGHV 3.30 IGHV 3.30 Фибриноген (С) Fibrinogen (C) 12794 12794 64 64 XVIII XVIII IGHV 3.30 IGHV 3.30 Фибриноген (С) Fibrinogen (C) 12794 12794 65 65 XIX XIX IGHV 3.30 IGHV 3.30 Фибриноген (С) Fibrinogen (C) 12794 12794 66 66 XX XX IGHV 3.30 IGHV 3.30 Фибриноген (С) Fibrinogen (C) 12794 12794 67 67

Таблица 10Table 10

Объект трансфекции An object transfections Код трансфекции (соотношение) Transfection code (ratio) Ожидаемый тип Expected type Выявленные АА (%) Identified AA (%) Выявленные АС (%) Identified AC (%) Выявленные СС (%) Identified SS (%) Выявленные половинные А (%) Identified half A (%) Выявленные половинные С (%) Identified half C (%) Другие (%) Other (%) XIII+XVI XIII+XVI ZO (1:1) ZO (1:1) АС AC 0 0 69 69 7 7 24 24 0 0 0 0 ZT (3:1) ZT (3:1) АС AC 10 10 45 45 16 16 27 27 0 0 0 0 ZU (1:1) ZU (1:1) АС AC 5 5 61 61 10 10 13 13 0 0 0 0 ZV (1:3) ZV (1:3) АС AC 3 3 61 61 23 23 13 13 0 0 0 0 ZW (1:1) ZW (1:1) АС AC 0 0 88,3 88.3 2,4 2.4 7 7 0 0 2,3 2.3 XIV+XVII XIV+XVII ZP ZP АС AC 30 thirty 52 52 13 13 0 0 0 0 5 5 XII+XVIII XII+XVIII ZQ ZQ АС AC 4 4 51 51 33 33 2 2 1 1 8 8 XV+XIX XV+XIX ZR ZR АС AC 20 20 42 42 11 eleven 0 0 1 1 26 26 XI+XX XI+XX ZS ZS АС AC 34 34 41 41 15 15 0 0 0 0 10 10

Комбинации вариантов CH3 экспрессировали и анализировали в SDS-PAGE (данные не представлены) и в нативной масс-спектрометрии (MS). Результаты обобщенно представлены в табл. 10. Трансфекция ZO приводила к наиболее высокой доле гетеродимеров в смеси (69% АС). Интересно, что при трансфекции ZO, гомодимер АА не присутствовал, в то время как гомодимер СС составлял небольшую долю (7%). Масс-спектроскопический анализ показал, что оставшийся белок в смеси состоял из половинной молекулы А, вероятно вследствие неравной экспрессии тяжелых цепей A и C. Исходные данные MS для образцов трансфекции ZO представлены на фиг. 8.Combinations of CH3 variants were expressed and analyzed by SDS-PAGE (data not shown) and native mass spectrometry (MS). The results are summarized in table. 10. Transfection with ZO resulted in the highest proportion of heterodimers in the mixture (69% AC). Interestingly, when ZO was transfected, the AA homodimer was not present, while the CC homodimer constituted a small proportion (7%). Mass spectroscopic analysis revealed that the remaining protein in the mixture consisted of half an A molecule, likely due to unequal expression of heavy chains A and C. Raw MS data for ZO transfection samples are presented in FIG. 8.

Неожиданно, в то время как трансфекция ZO приводила к значительным количествам биспецифического продукта, пара с обращенным зарядом при трансфекции ZP (Ι.351ΚΖΤ366Ί) против T366KZL351D для ZO) не привела к сходным результатам, и наблюдали только 52% биспецифического продукта с присутствием значительных количеств двух гомодимеров (30% АА и 13% СС). Это может быть объяснено тем, что отрицательно заряженный D структурно высоко сходен с Т, таким образом, сама по себе замена T366D может не быть достаточно эффективной для отталкивания, и, таким образом, T366D все еще образуют гомодимеры, что и наблюдалось в действительности.Surprisingly, while ZO transfection resulted in significant amounts of bispecific product, the charge-reversed transfection pair ZP (Ι.351ΚΖΤ366Ί) vs. T366KZL351D for ZO) did not produce similar results, and only 52% of the bispecific product was observed, with significant amounts of the two homodimers (30% AA and 13% CC). This could be explained by the fact that the negatively charged D is structurally highly similar to T, so the T366D substitution alone may not be effective enough for repulsion, and thus T366D still form homodimers, as was actually observed.

Можно предположить, что несущественно отличающиеся варианты вновь выявленной пары T366KZL351D (например, при исследовании всех перестановок, включающих новые конструкции T366R и L351E), может приводить к сходным процентам BsAb.One might speculate that nonsignificantly different variants of the newly identified T366KZL351D pair (e.g., when examining all permutations involving the novel constructs T366R and L351E) could result in similar BsAb percentages.

Пример 14. HADDOCK для конструирования новых мутантов CH3 для обеспечения эффективной гетеродимеризации.Example 14: HADDOCK to design novel CH3 mutants to promote efficient heterodimerization.

Как описано в примере 13, вновь выявленная зарядовая пара T366KZL351D увеличивает долю гетеродимеров в смеси (69%) с минимальной долей нежелательных гомодимеров СС (7%) (L351DZL35KD) и существенной долей половинных молекул А (24%), являющихся примесями в смеси. В этом примере использовали подход in silico, чтобы далее выявить аминокислотные остатки, вовлеченные во взаимодействия на поверхности контакта CH3, для исследования дополняющих замен в противоположных областях CH3 и для поиска новых пар CH3, содержащих комплементарные замены, которые далее увеличивают эффективную гетеродимеризацию, одновременно предотвращая эффективное образование гомодимеров двух тяжелых цепей.As described in Example 13, the newly identified charge pair T366KZL351D increases the proportion of heterodimers in the mixture (69%) with a minimal proportion of undesirable CC homodimers (7%) (L351DZL35KD) and a significant proportion of half A molecules (24%) being impurities in the mixture. This example used an in silico approach to further identify amino acid residues involved in interactions at the CH3 interface, to investigate complementary substitutions in opposing CH3 regions, and to search for new CH3 pairs containing complementary substitutions that further increase efficient heterodimerization while preventing efficient formation of homodimers of two heavy chains.

HADDOCK (обусловленная высокой степенью неоднозначности состыковка белок-белок) представляет собой подход опосредуемой информацией гибкой состыковки для моделирования биомолекуHADDOCK (High Ambiguity Driven Protein-Protein Docking) is an information-driven flexible docking approach for biomolecule modeling.

- 33 046272 лярных комплексов. HADDOCK отличается от способов состыковки с нуля тем, что в нем закодирована информация из идентифицированных или предсказанных поверхностей контакта белков в нечетких границах взаимодействия (AIR) для обеспечения процесса состыковки. (de Vries et al., 2010).- 33 046272 polar complexes. HADDOCK differs from greenfield docking methods in that it encodes information from identified or predicted protein interfaces into fuzzy interaction boundaries (AIRs) to enable the docking process. (de Vries et al., 2010).

Входные данные для web-сервера HADDOCK состоят из файла белковой структуры, которая может представлять собой кристаллическую структуру, структуру ЯМР или смоделированную структуру. После состыковки или детализации, HADDOCK выдает так называемый показатель HADDOCK, который представляет собой средневзвешенное значение ван-дер-ваальсовой энергии, электростатической энергии, площади погруженной поверхности и энергии десольватации. Показатель HADDOCK можно интерпретировать как показатель энергии связывания или аффинности, даже несмотря на то, что прямого перехода к экспериментальным данным часто трудно достигнуть. В дополнение к этому, HADDOCK предоставляет файлы со структурами для наилучших четырех структур, полученных в результате проведения состыковки. Эти файлы со структурами можно загрузить и визуализировать, позволяя детальный анализ взаимодействий индивидуальных остатков.The input data to the HADDOCK web server consists of a protein structure file, which can be a crystal structure, an NMR structure, or a modeled structure. After docking or detailing, HADDOCK produces the so-called HADDOCK score, which is a weighted average of van der Waals energy, electrostatic energy, submerged surface area and desolvation energy. The HADDOCK score can be interpreted as a measure of binding energy or affinity, even though direct translation to experimental data is often difficult to achieve. In addition, HADDOCK provides structure files for the best four structures resulting from the docking. These structure files can be downloaded and visualized, allowing detailed analysis of individual residue interactions.

В этом примере исследовали взаимодействия между CH3-доменапми тяжелых цепей IgG1. Кристаллическую структуру высокого разрешения для Fc-части IgG (структура 1L6X) использовали в качестве исходной структуры (http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=116x; Idusogie, E.E. et al., J.I. 2000(164)4178-4184).In this example, interactions between the CH3 domains of IgG1 heavy chains were examined. The high resolution crystal structure for the Fc portion of IgG (structure 1L6X) was used as the starting structure (http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=116x; Idusogie, E.E. et al., J.I. 2000 (164)4178-4184).

В примере 13 было выявлено, что котрансфекция векторов XIII и XVI приводила к образованию примеси гомодимера СС (табл. 10). HADDOCK использовали для поиска дополнительных мутаций к паре T366K/L35TD, которые препятствуют гомодимеризации.In example 13, it was revealed that cotransfection of vectors XIII and XVI led to the formation of a CC homodimer impurity (Table 10). HADDOCK was used to search for additional mutations to the T366K/L35TD pair that interfere with homodimerization.

Выходные данные HADDOCK состоят из набора вычисленных энергий, показателя HADDOCK (который представляет собой средневзвешенное значение для энергий) и четыре файла со структурами, соответствующие четырем структурам с наиболее низкой энергией, выявленным программой. Показатели HADDOCK используют для сравнения различных структур; другие энергии используют только для получения информации о том, что происходит в структурах (например, хорошие электростатические взаимодействия, меньшая погруженная поверхность, высокая ван-дер-ваальсова энергия). Чем ниже показатель HADDOCK, тем лучше. Для каждой пары мутаций вычисляли показатели для димеров АА, АВ и ВВ.The HADDOCK output consists of a set of calculated energies, a HADDOCK score (which is a weighted average of the energies), and four structure files corresponding to the four lowest energy structures identified by the program. HADDOCK indicators are used to compare different structures; other energies are used only to obtain information about what is happening in structures (eg, good electrostatic interactions, smaller submerged surface, high van der Waals energy). The lower the HADDOCK score, the better. For each pair of mutations, the indicators for dimers AA, AB, and BB were calculated.

Наборы пар мутаций из примера 12 анализировали в HADDOCK, чтобы видеть, коррелируют ли вычисленные энергии с экспериментальными данными. В табл. 11 представлены все теоретические энергии, которые визуализированы на фиг. 9.The sets of mutation pairs from Example 12 were analyzed in HADDOCK to see if the calculated energies correlated with the experimental data. In table 11 presents all the theoretical energies that are visualized in FIG. 9.

Таблица 11Table 11

Комбинации конструкций Combinations of designs Показатель HADDOCK Index HADDOCK Энергия VdW Energy VdW Электростатическая энергия Electrostatic energy Энергия десольватации Desolvation energy Площадь погруженной поверхности Submerged surface area ДИКИЙ ТИП-ДИКИЙ тип WILD TYPE-WILD type -208,2 -208.2 -62,8 -62.8 -773 -773 9, 2 9, 2 2505,8 2505.8 1-2 (E356KD399K - K392DK409D) 1-2 (E356KD399K - K392DK409D) -225,8 -225.8 -56, 4 -56.4 -862 -862 3 3 2458,3 2458.3 2-2 (K392DK409D - K392DK409D) 2-2 (K392DK409D - K392DK409D) -180,3 -180.3 -67,9 -67.9 -562,1 -562.1 0, 1 0, 1 2312,5 2312.5 1-1 (E356KD399K - E356KD399K) 1-1 (E356KD399K - E356KD399K) -176, 7 -176.7 -75, 5 -75.5 -469,3 -469.3 -7,3 -7.3 2349,6 2349.6 1-3 (E356KD399K - K392DK409DK439D) 1-3 (E356KD399K - K392DK409DK439D) -220,6 -220.6 -67,9 -67.9 -793,8 -793.8 6, 1 6, 1 2499,8 2499.8 3-3 (K392DK409DK439D - K392DK409DK439D) 3-3 (K392DK409DK439D - K392DK409DK439D) -150,1 -150.1 -76, 6 -76.6 -387,6 -387.6 4, 1 4, 1 2261,2 2261.2 6-7 (T366W - T366SL368AY407V) 6-7 (T366W - T366SL368AY407V) -221,3 -221.3 -65, 8 -65.8 -735,5 -735.5 -8,3 -8.3 2509,0 2509.0 6-6 (T366W - T366W) 6-6 (T366W - T366W) 1916,9* 1916.9* 2072,3 2072.3 -681,3 -681.3 -19, 2 -19, 2 2499,9 2499.9

- 34 046272- 34 046272

7-7 (T366SL368AY407V - T366SL368AY407V) 7-7 (T366SL368AY407V - T366SL368AY407V) -191,9 -191.9 -55, 0 -55.0 -683,2 -683.2 -0,2 -0.2 2427,2 2427.2 43-63 (Т366К - L351D) 43-63 (T366K - L351D) -210,6 -210.6 -64 -64 -758,4 -758.4 5, 1 5, 1 2456,5 2456.5 43-43 (Т366К - Т366К) 43-43 (T366K - T366K) -191,7 -191.7 -71,2 -71.2 -634,1 -634.1 6, 3 6, 3 2533,5 2533.5 63-63 (L351D - L351D) 63-63 (L351D - L351D) -212,5 -212.5 -60,4 -60.4 -774 -774 2, 6 2, 6 2445,6 2445.6

* Эта величина является необычно высокой вследствие высокого показателя ван-дер-ваальсовой энергии, возможно вследствие пространственного столкновения в случае T366W/T366'W* This value is unusually high due to the high van der Waals energy, possibly due to spatial collision in the case of T366W/T366'W

В случае 2 доменов CH3 дикого типа, показатели HADDOCK являются одинаковыми для АА, АВ и ВВ, поскольку области CH3 А и В являются идентичными. В большинстве других случаев пара АВ имеет наиболее низкий показатель, который является таким, как и ожидается. Для пары T366K/L351D показатель ВВ немного лучше, чем показатель АВ (-210,6 против -212,5), однако это отличие находится в пределах ошибки вычислений. С использованием HADDOCK визуализировали структуры гетеро димеров этих пар. Например, комбинации конструкций 1-2, 1-1 и 2-2 представлены на фиг. 10. Исходя из этой визуализации, очевидно, что в гетеродимере образуются солевые мостики (фиг. 10А, левая панель), в то время как между остатками идентичных цепей происходит электростатическое отталкивание (фиг. 10В и 10С, средняя и правая панель). Таким образом, более высокие показатели HADDOCK могут быть объяснены электростатическим отталкиванием мутантных остатков поверхности контакта. Эти остатки должны отворачиваться друг от друга и не взаимодействуют с остатками на другой цепи, вызывая снижение аффинности.In the case of 2 wild-type CH3 domains, the HADDOCK scores are the same for AA, AB, and BB because the A and B CH3 regions are identical. In most other cases, the AB pair has the lowest score, which is as expected. For the T366K/L351D pair, the BB indicator is slightly better than the AB indicator (-210.6 versus -212.5), but this difference is within the calculation error. The structures of heterodimers of these pairs were visualized using HADDOCK. For example, combinations of designs 1-2, 1-1 and 2-2 are shown in FIG. 10. From this visualization, it is apparent that salt bridges are formed in the heterodimer (Figure 10A, left panel), while electrostatic repulsion occurs between residues of identical chains (Figures 10B and 10C, middle and right panels). Thus, the higher HADDOCK performance can be explained by the electrostatic repulsion of the mutant contact surface residues. These residues must turn away from each other and do not interact with residues on the other chain, causing a decrease in affinity.

В табл. 11 и на фиг. 9 подтверждено то, что наблюдали в примере 13. Гетеродимер AC T366K/L351D и гомодимер СС L351D/L351'D образуются со сходной энергией, что объясняет присутствие как гетеродимера, так и гомодимера, в смеси. Гомодимер АА T366K/T366'K, с другой стороны, практически не поддается обнаружению в смеси, хотя присутствуют половинные молекулы А T366K. В табл. 11 и на фиг. 9 действительно показано, что показатель HADDOCK для гомодимера гомодимер АА T366K/T366'K является более высоким, чем показатель для гетеродимера АС; таким образом, образование этого гомодимера энергетически менее выгодно.In table 11 and fig. 9 confirms what was observed in Example 13. The heterodimer AC T366K/L351D and the homodimer CC L351D/L351'D are formed with similar energies, which explains the presence of both the heterodimer and homodimer in the mixture. The T366K/T366'K AA homodimer, on the other hand, is virtually undetectable in the mixture, although T366K half molecules of A are present. In table 11 and fig. 9 indeed shows that the HADDOCK index for the homodimer homodimer AA T366K/T366'K is higher than that for the heterodimer AC; thus, the formation of this homodimer is energetically less favorable.

Пример 15. В арианты 366/351.Example 15. Options 366/351.

В примере 13 предполагается, что могут быть сконструированы альтернативы для пары зарядовых мутантов T366K/L351D, которые могут иметь сходные результаты в значениях процента биспецифических антител в смеси. Альтернативы могут включать замены T366R, T366D, T366E, L351E, L351K и L351R. Доля гомодимеров СС L351D/L351D может быть уменьшена путем создания вариантов пары 366/351. Все возможные пары мутаций анализировали в HADDOCK и полученные показатели представлены в табл. 12 и визуализированы на фиг. 11.Example 13 suggests that alternatives can be constructed for the T366K/L351D charge mutant pair that may have similar results in terms of the percentage of bispecific antibodies in the mixture. Alternatives may include replacements T366R, T366D, T366E, L351E, L351K and L351R. The proportion of L351D/L351D CC homodimers can be reduced by creating variants of the 366/351 pair. All possible pairs of mutations were analyzed in HADDOCK and the obtained indicators are presented in table. 12 and visualized in FIG. eleven.

Таблица 12Table 12

Комбинации конструкций Combinations of designs Показатель HADDOCK Index HADDOCK Энергия VdW Energy VdW Электростатическая энергия Electrostatic energy Энергия десольватации Desolvation energy Площадь погруженной поверхности Submerged surface area Т366К - L351D T366K - L351D -210,6 -210.6 -64 -64 -758,4 -758.4 5, 1 5, 1 2456,5 2456.5 Т366К - Т366К T366K - T366K -191,7 -191.7 -71,2 -71.2 -634,1 -634.1 6, 3 6, 3 2533,5 2533.5 L351D - L351D L351D - L351D -212,5 -212.5 -60,4 -60.4 -774 -774 2, 6 2, 6 2445,6 2445.6 Т366К - L351E T366K - L351E -216,9 -216.9 -55, 7 -55.7 -854,7 -854.7 9, 8 9, 8 2532,7 2532.7 L351E - L351E L351E - L351E -217,9 -217.9 -65, 5 -65.5 -802,2 -802.2 8 8 2532 2532 T366R - L351D T366R - L351D -210,5 -210.5 -68,8 -68.8 -760,8 -760.8 10,4 10.4 2514,5 2514.5 T366R - T366R T366R - T366R -201,8 -201.8 -77,4 -77.4 -626, 4 -626.4 0, 9 0.9 2608 2608 T366R - L351E T366R - L351E -225,8 -225.8 -56, 2 -56.2 -874,8 -874.8 5, 4 5, 4 2579,2 2579.2 T366D - L351R T366D - L351R -211,2 -211.2 -71,3 -71.3 -723,6 -723.6 4,8 4.8 2455,6 2455.6 T366D - T366D T366D - T366D -198,1 -198.1 -58,1 -58.1 -713,4 -713.4 2,1 2.1 2477 2477 L351R - L351R L351R - L351R -220,7 -220.7 -75, 5 -75.5 -806,5 -806.5 16,1 16.1 2552,2 2552.2 T366D - L351K T366D - L351K -223,9 -223.9 -62,1 -62.1 -810,1 -810.1 0,3 0.3 2487,8 2487.8 L351K - L351K L351K - L351K -224,4 -224.4 -75, 6 -75.6 -812,1 -812.1 13, 6 13, 6 204,5 204.5 Т366Е - L351R T366E - L351R -222,3 -222.3 -69 -69 -783 -783 3,4 3.4 2557,2 2557.2 Т366Е - Т366Е T366E - T366E -201,9 -201.9 -57, 6 -57.6 -741 -741 4 4 2487,5 2487.5 Т366Е - L351K T366E - L351K -215,9 -215.9 -58,4 -58.4 -808,9 -808.9 4,3 4.3 2486 2486

При изучении показателей HADDOCK было выявлено, что некоторые из мутаций имеют сходныйWhen studying HADDOCK indicators, it was revealed that some of the mutations have a similar

- 35 046272 характер при сравнении с T366K/L351'D. Для большинства перестановок было выявлено, что гомодимер АА имеет более высокий показатель HADDOCK, чем гетеродимер АВ, однако гомодимер ВВ оказался настолько же выгодным, как и гетеродимер АВ. Даже несмотря на то, что известно, что остаток 351 является соседним для него же самого на другой цепи, т.е. остаток 351 цепи А образует пару с остатком 351 цепи В на поверхности контакта CH3-CH3, практически не существует отрицательного влияния идентичных зарядов, когда образуется димер ВВ. При рассмотрении структуры L351D/L351'D это объясняется аспарагиновыми кислотами отклоняющимися друг от друга, и стабилизирующим влиянием по меньшей мере встречающегося в природе аргинина в положении 355 и также некоторой стабилизацией отрицательного заряда встречающимся в природе остатком серина в положении 354 (см. фиг. 12А). Мутация этих остатков (S354A и R355D) обеспечивает только небольшое усовершенствование. Из фиг. 12В понятно, что водород остова А354 вызывает стабилизацию гомодимера. Из этой серии пара T366R/L351'E, по-видимому, является наиболее выгодной с наименьшим показателем HADDOCK для биспецифической молекулы.- 35 046272 character when compared with T366K/L351'D. For most permutations, the AA homodimer was found to have a higher HADDOCK score than the AB heterodimer, but the BB homodimer was found to be as advantageous as the AB heterodimer. Even though it is known that residue 351 is adjacent to itself on another chain, i.e. residue 351 of chain A pairs with residue 351 of chain B at the CH3-CH3 interface, there is virtually no negative effect of identical charges when the BB dimer is formed. When considering the structure of L351D/L351'D, this is explained by the aspartic acids diverging from each other, and the stabilizing influence of at least the naturally occurring arginine at position 355 and also some stabilization of the negative charge by the naturally occurring serine residue at position 354 (see Fig. 12A ). Mutation of these residues (S354A and R355D) provides only a small improvement. From fig. 12B, it is clear that the hydrogen backbone of A354 causes stabilization of the homodimer. Of this series, the T366R/L351'E pair appears to be the most advantageous, with the lowest HADDOCK score for the bispecific molecule.

Пример 16. Мутации в области T366K/L351'D.Example 16. Mutations in the T366K/L351'D region.

В серии анализов HADDOCK в этом примере пары T366K/L351D или T366K/L351E были взяты в качестве исходной структуры. Для идентификации дополнительных мутаций, которые далее могут увеличить предсказанный процент биспецифических молекул этих цепей А и В, дополнительные мутации на В-цепи использовали для вычисления показателей HADDOCK и энергий. При исследовании структуры ОИЗ-домена с использованием программы для визуализации структур белков на молекулярном уровне (YASARA, www.yasara.org), можно вычислять расстояния между индивидуальными остатками. При этом было выявлено, что два остатка, Y349 и L368, являются соседними остатками, которые могут вносить положительный или отрицательный вклад во взаимодействия димеров, и в них вносили мутации в этом примере (в дополнение к мутации L351D) для исследования результата образования димера для гомо- и гетеродимеров (см. фиг. 13). Оба остатка по-видимому, способствовали стабильности гетеродимера (более низкие показатели HADDOCK), а также дестабилизации димера ВВ (более высокие показатели HADDOCK). Глутаминовые кислоты (Е) в положениях 349 и 368, по-видимому, являются более выгодными, чем аспарагиновые кислоты (D). Таким образом, внесение второй аминокислотной замены в В-цепь, уже содержащую аминокислотную замену в положении 351, по-видимому, еще более способствует гетеродимеризации.In the series of HADDOCK analyzes in this example, the pairs T366K/L351D or T366K/L351E were taken as the starting structure. To identify additional mutations that could further increase the predicted percentage of bispecific molecules of these A and B chains, additional mutations on the B chain were used to calculate HADDOCK scores and energies. When studying the structure of the OI domain using a program for visualizing protein structures at the molecular level (YASARA, www.yasara.org), it is possible to calculate the distances between individual residues. Two residues, Y349 and L368, were identified as adjacent residues that could contribute positively or negatively to dimer interactions and were mutated in this example (in addition to the L351D mutation) to investigate the outcome of dimer formation for homo - and heterodimers (see Fig. 13). Both residues appeared to contribute to heterodimer stability (lower HADDOCK scores) as well as destabilization of the BB dimer (higher HADDOCK scores). Glutamic acids (E) at positions 349 and 368 appear to be favored over aspartic acids (D). Thus, introducing a second amino acid substitution into a B chain that already contains an amino acid substitution at position 351 appears to further promote heterodimerization.

В следующей группе анализов HADDOCK вновь в качестве исходной структуры брали пару T366K/L35BD. В дополнение к заменам в В-цепи, которые далее увеличивают гетеродимеризацию (т.е. Y349D/E и L368E), к А-цепи, которая уже содержит замену T366K, добавляли дополнительные мутации. Как показано на фиг. 14, существует несколько пар мутаций, которые, по-видимому, способствуют образованию биспецифических гетеродимеров. В паре T366K-L351K/L351'D-Y349'D все четыре мутантных остатка вовлечены в образование гетеродимерной пары, чего не происходит в случае T366KL351K/L351'E-L368'E, где K351 не вовлечен прямо в связывание. Однако показатель HADDOCK для этого последнего гетеродимера равен -228,9; что значительно ниже чем -214,2 для T366K/L351'E-L368'E, что может быть объяснено взаимодействиями с образованием водородных связей K в положении 351 (см. фиг. 15). Пара T366K-L351K/L351'D-Y349'D может быть далее улучшена мутацией R355'D в В-цепи, что приводит к более высокому показателю HADDOCK для ВВ, однако также показатель HADDOCK для АВ является несколько более высоким. В целом, дополнительный L351K приводит к более низким показателям для АВ и сходным показателям для АА и ВВ при сравнению с единственной мутацией T366K в Ацепи. Теоретически, это должно привести к более высоким количествам биспецифических гетеродимеров в образцах.In the next set of HADDOCK analyses, the T366K/L35BD pair was again taken as the starting structure. In addition to substitutions in the B chain that further increase heterodimerization (ie, Y349D/E and L368E), additional mutations were added to the A chain, which already contains the T366K substitution. As shown in FIG. 14, there are several pairs of mutations that appear to promote the formation of bispecific heterodimers. In the T366K-L351K/L351'D-Y349'D pair, all four mutant residues are involved in the formation of the heterodimeric pair, which does not occur in the case of T366KL351K/L351'E-L368'E, where K351 is not directly involved in binding. However, the HADDOCK score for this latter heterodimer is −228.9; which is significantly lower than -214.2 for T366K/L351'E-L368'E, which can be explained by K hydrogen bonding interactions at position 351 (see Fig. 15). The T366K-L351K/L351'D-Y349'D pair can be further improved by the R355'D mutation in the B chain, resulting in a higher HADDOCK score for BB, but also a slightly higher HADDOCK score for AB. Overall, the additional L351K results in lower rates for AB and similar rates for AA and BB compared to the single T366K mutation in Acepi. In theory, this should result in higher amounts of bispecific heterodimers in the samples.

Из фиг. 11 очевидно, что наличие R вместо K в положении 366 может быть более эффективным в отношении обеспечения гетеродимеризации. Таким образом, некоторые из анализов HADDOCK, представленных на фиг. 13 повторяли, однако теперь с T366R вместо T366K в А-цепи. Было продемонстрировано, что не является выгодным комбинирование R366 в А-цепи с двойными мутациями в В-цепи (фиг. 16). Это может быть следствием крупных размеров этого остатка, препятствующего другим взаимодействиям поверхности контакта, даже несмотря на то, что в структурах присутствуют ожидаемые солевые мостики с R366. Также показатель HADDOCK для гомодимера АА является более низким в случае R366, чем в случае K366, что также не вносит положительного вклада в образование гетеродимера. Таким образом, не проводили дальнейших анализов HADDOCK с использованием R366 на поверхности контакта.From fig. 11 it is evident that the presence of R instead of K at position 366 may be more effective in promoting heterodimerization. Thus, some of the HADDOCK analyzes presented in Fig. 13 was repeated, but now with T366R instead of T366K in the A chain. It has been demonstrated that it is not advantageous to combine R366 in the A chain with double mutations in the B chain (FIG. 16). This may be a consequence of the large size of this residue preventing other interface interactions even though the expected salt bridges with R366 are present in the structures. Also, the HADDOCK index for the AA homodimer is lower in the case of R366 than in the case of K366, which also does not make a positive contribution to the formation of the heterodimer. Therefore, no further HADDOCK analyzes were performed using R366 on the contact surface.

Было выбрано всего 14 пар с наилучшими характеристиками в соответствии с прогнозированием HADDOCK (см. табл. 13 и фиг. 17). В некоторых парах включена замена R355D для устранения стабилизирующего влияния встречающегося в природе R355 на взаимодействие L351/L351'D.A total of 14 pairs with the best performance according to HADDOCK prediction were selected (see Table 13 and Fig. 17). In some pairs, an R355D substitution is included to eliminate the stabilizing effect of naturally occurring R355 on the L351/L351'D interaction.

- 36 046272- 36 046272

Таблица 13Table 13

Комбинации конструкций Combinations of designs Показатель АВ HADDOCK Index AB HADDOCK Показатель АА HADDOCK Index AA HADDOCK Показатель ВВ HADDOCK Index BB HADDOCK дикий тип - дикий тип wild type - wild type -208,2 -208.2 -208,2 -208.2 -208,2 -208.2 Т366К - L351D T366K - L351D -210,6 -210.6 -191,7 -191.7 -212,5 -212.5 Т366К - L351E T366K - L351E -216,9 -216.9 -191,7 -191.7 -217,9 -217.9 T366R - L351E T366R - L351E -225,8 -225.8 -201,8 -201.8 -217,9 -217.9 Т366Е - L351R T366E - L351R -222,3 -222.3 -201,9 -201.9 -220,3 -220.3 Т366К - L351DY349E Т366К - L351DY349E -215,9 -215.9 -191,7 -191.7 -190 -190 Т366К - L351DL368E T366K - L351DL368E -223,3 -223.3 -191,7 -191.7 -198,9 -198.9 Т366К - L351EY349E Т366К - L351EY349E -214,5 -214.5 -191,7 -191.7 -187,5 -187.5 T366KL351K - L351D T366KL351K - L351D -233,2 -233.2 -205 -205 -212,5 -212.5 Т366К - L351DY349EL368E Т366К - L351DY349EL368E -207,5 -207.5 -191,7 -191.7 -179,5 -179.5 T366KL351K - L351DY349D T366KL351K - L351DY349D -255,2 -255.2 -205 -205 -204,3 -204.3 T366KL351K - L351DY349E T366KL351K - L351DY349E -227,2 -227.2 -205 -205 -190 -190 T366KL351K - L351DL368E T366KL351K - L351DL368E -243,9 -243.9 -205 -205 -198,9 -198.9 T366KL351K - L351DR355D T366KL351K - L351DR355D -233,6 -233.6 -205 -205 -211,9 -211.9 T366KL351K - T366KL351K - -242,8 -242.8 -205 -205 -183,5 -183.5 L351DY349DR355D L351DY349DR355D T366D - L351KY349K T366D - L351KY349K -237,9 -237.9 -198,1 -198.1 -228,4 -228.4

Пример 17. Экспрессия in vitro биспецифических молекул с использованием мутантов CH3 на основе прогнозирования HADDOCK.Example 17: In vitro expression of bispecific molecules using CH3 mutants based on HADDOCK prediction.

Анализ в примере 16 показал, что некоторые варианты CH3 с дополнительными мутациями в области пары T366K/L351D должны привести к смесям с высоким содержанием биспецифического компонента и потенциально более низким содержанием гомодимерного компонента. Эти пары с наилучшей эффективностью отбирали для продукции и дальнейшего анализа. Кроме того, также получали конструкции T366R и L351E. В табл. 14 приведены конструкции, которые были получены и которые использовали для повторного клонирования VH-областей антитела с известной специфичностью и известной способностью образовывать пару с легкой цепью IGKV1-39 человека. Экспрессия IgG, которые содержат индивидуальные конструкции, ранее была описана в примере 13, и она была описана для конструкций, приведенных в табл. 14. Целью была оценка того, какие конструкции гомодимеризуются в отсутствие соответствующего партнера по гетеродимеризации. В идеальном случае, должны образовываться высокие проценты половинных молекул и низкие проценты гомодимеров. В качестве контроля также использовали конструкции, содержащие ранее описанные зарядовые мутации, и конструкции, содержащие ранее описанные мутации выступ-в-полости также использовали для экспрессии в качестве целого IgG рекомбинантными клетками. Очищенные с белком А супернатанты анализировали в SDS-PAGE; результаты анализировали и оценивали, как показано в табл. 14.Analysis in Example 16 indicated that some CH3 variants with additional mutations in the T366K/L351D pair region should result in mixtures with a high content of the bispecific component and potentially a lower content of the homodimer component. These pairs with the best performance were selected for production and further analysis. In addition, constructs T366R and L351E were also prepared. In table 14 shows constructs that were prepared and used to re-clon the VH regions of an antibody with known specificity and known ability to pair with the light chain of human IGKV1-39. The expression of IgGs that contain individual constructs was previously described in example 13, and it was described for the constructs shown in table. 14 The goal was to evaluate which constructs homodimerize in the absence of a corresponding heterodimerization partner. Ideally, high percentages of half molecules and low percentages of homodimers should be formed. Constructs containing previously described charge mutations were also used as controls, and constructs containing previously described protrusion-in-cavity mutations were also used to express whole IgG by recombinant cells. Protein A-purified supernatants were analyzed by SDS-PAGE; the results were analyzed and evaluated as shown in table. 14.

____________________________________________________________Таблица 14____________________________________________________________Table 14

Замены АА в СНЗ Replacement of AA in SNZ # конструкции # designs % IgG %IgG % половинных молекул % half molecules Е356К, D399K E356K, D399K 1 1 64,2 64.2 35, 8 35, 8 K392D, K409D K392D, K409D 2 2 30, 9 30, 9 69, 1 69, 1 K392D, K409D, K439D K392D, K409D, K439D 3 3 24,5 24.5 75, 5 75.5

- 37 046272- 37 046272

T366W T366W 6 6 27, 6 27, 6 72,4 72.4 T366S, L368A, Y407V T366S, L368A, Y407V 7 7 58, 6 58, 6 41,4 41.4 7Т366К 7T366K 43 43 32,9 32.9 67,1 67.1 L351D L351D 63 63 89, 8 89, 8 10,2 10.2 T366D T366D 64 64 89, 6 89, 6 10,4 10.4 Т366К, L351K T366K, L351K 68 68 34,7 34.7 65, 3 65, 3 L351D, L368E L351D, L368E 69 69 83,7 83.7 16,3 16.3 L351E, Y349E L351E, Y349E 70 70 67,8 67.8 32,2 32.2 L351D, Y349E L351D, Y349E 71 71 79, 7 79, 7 20,3 20.3 L351D, R355D L351D, R355D 72 72 100 100 - - L351D, Y349E, L368E L351D, Y349E, L368E 73 73 79, 3 79, 3 20,7 20.7 L351D, Y349D L351D, Y349D 74 74 88, 6 88, 6 11,4 11.4 L351D, Y349D, R355D L351D, Y349D, R355D 75 75 89, 9 89, 9 10, 1 10, 1 L351K, L368K L351K, L368K 76 76 56, 6 56, 6 43,4 43.4 L351R L351R 77 77 100 100 - - Т366Е T366E 78 78 44,4 44.4 55, 6 55, 6 T366R T366R 79 79 29, 6 29, 6 70,4 70.4 L351E L351E 80 80 100 100 - -

Результаты коэкспрессии общей легкой цепи и двух различных тяжелых цепей, содержащих аминокислотные замены в конструкциях, представленных в табл. 14, или тяжелых цепей, содержащих аминокислотные замены предшествующих конструкций, представлены в табл. 15. Экспрессия двух различных тяжелых цепей, содержащих аминокислотные замены T366K и L351'D:L368'E, соответственно, привела приблизительно к 87% биспецифического гетеродимера АВ в смеси без присутствия гомодимеров АА или ВВ (комбинация номер 3 в табл. 15). Наблюдали приблизительно 12% половинных молекул (половинный А), содержащих замену T366K. Более того, было выявлено, что процент биспецифического гетеродимера АВ возрастал, когда в первую тяжелую цепь вносили дополнительную аминокислотную замену L351K. Например, коэкспрессия двух различных тяжелых цепей, содержащих аминокислотные замены T366K:L351K и L351'D:L368'E, соответственно, привела приблизительно к 92% биспецифического гетеродимера АВ, в то время как гомодимеры АА и ВВ по существу отсутствовали в смеси (комбинация номер 12 в табл. 15). Комбинации 10 и 11 также приводили к благоприятным распределениям высоких процентов гетеродимеров и практически к отсутствию гомодимеров. Отсутствие гомодимеров является преимущественным, поскольку фракция, содержащая интактные молекулы IgG, содержит только гетеродимеры АВ. Для очистки и последующего терапевтического применения половинные молекулы могут быть удалены с помощью стандартных подходов, таких как эксклюзионная хроматография. Таким образом, использование этих вновь идентифицированных зарядовых мутантов в процессе получения биспецифических антител обеспечивает преимущества над известными зарядовыми мутантами и мутантами типа выступ-в-полости, где присутствие примесей гомодимерных антител не исключено. Кроме того, зарядовые пары T366K/L351'D:L368'E и T366K:L351K/L351'D:L368'E имеют дополнительное преимущество над ранее описанными парами с обращенным зарядом E356K:D399K/K392'D:K409'D и E356K:D399K/K392'D:K4O9'D:K439'D, поскольку ранее описанные зарядовые варианты основаны на обращении существующих зарядов на поверхности контакта CH3-CH3, в то время как во вновь идентифицированных зарядовых вариантах добавлены дополнительные зарядовые пары (заряд-зарядовые взаимодействия) на поверхности контакта CH3-CH3. Внесение дополнительных зарядовых пар на поверхности контакта CH3-CH3 может далее увеличить стабильность поверхности контакта и, тем самым всего антитела. Вышеуказанное справедливо для мутаций, используемых в комбинациях номер 4, 5, 6, 9, 10 и 11, которые также приводили к благоприятным долям биспецифического гетеродимера чрезвычайно низкими долями гомодимеров АА и ВВ, присутствующих в смесях.The results of coexpression of a common light chain and two different heavy chains containing amino acid substitutions in the constructs presented in Table. 14, or heavy chains containing amino acid substitutions of the previous structures, are presented in table. 15. Expression of two different heavy chains containing amino acid substitutions T366K and L351'D:L368'E, respectively, resulted in approximately 87% bispecific AB heterodimer in a mixture without the presence of AA or BB homodimers (combination number 3 in Table 15). Approximately 12% of half molecules (half A) containing the T366K substitution were observed. Moreover, it was found that the percentage of bispecific AB heterodimer increased when an additional amino acid substitution L351K was introduced into the first heavy chain. For example, coexpression of two different heavy chains containing the amino acid substitutions T366K:L351K and L351'D:L368'E, respectively, resulted in approximately 92% bispecific AB heterodimer, while AA and BB homodimers were essentially absent from the mixture (combination no. 12 in Table 15). Combinations 10 and 11 also resulted in favorable distributions of high percentages of heterodimers and virtually no homodimers. The absence of homodimers is advantageous since the fraction containing intact IgG molecules contains only AB heterodimers. For purification and subsequent therapeutic use, the half molecules can be removed using standard approaches such as size exclusion chromatography. Thus, the use of these newly identified charge mutants in the production of bispecific antibodies provides advantages over known charge mutants and projection-in-cavity mutants, where the presence of homodimeric antibody impurities is not excluded. In addition, the T366K/L351'D:L368'E and T366K:L351K/L351'D:L368'E charge pairs have an additional advantage over the previously described reverse charge pairs E356K:D399K/K392'D:K409'D and E356K: D399K/K392'D:K4O9'D:K439'D, since the previously described charge variants are based on the reversal of existing charges at the CH3-CH3 contact surface, while the newly identified charge variants add additional charge pairs (charge-charge interactions) at the CH3-CH3 contact surface. The introduction of additional charge pairs at the CH3-CH3 contact surface can further increase the stability of the contact surface and thereby the overall antibody. The above was true for the mutations used in combinations numbers 4, 5, 6, 9, 10 and 11, which also resulted in favorable proportions of bispecific heterodimer with extremely low proportions of AA and BB homodimers present in the mixtures.

- 38 046272- 38 046272

Таблица 15Table 15

Комбинация 2 различных тяжелых цепей Combination 2 different heavy chains цепь А*/ мутации (# конструкции) chain A*/ mutations (# constructs) цепь В**/ мутации (# конструкции) chain B**/ mutations (# constructs) обнаруженный % AA discovered %AA обнаруженный % AB detected % AB обнаруженный % BB detected % BB Обнаруженный % половинного A % Half A Detected Обнаруженный % половинного В Detected % half V 1 1 Т366Е (78) T366E (78) L351R (77) L351R (77) 3 3 81 81 2 2 13 13 0 0 2 2 Т366К (43) T366K (43) L351D (63) L351D (63) 0 0 88 88 3 3 9 9 0 0 3 3 Т366К (43) T366K (43) L351D,L368E (69) L351D,L368E (69) 0 0 87 87 0 0 12 12 0 0 4 4 Т366К (43) T366K (43) L351E,Y349E (70) L351E,Y349E (70) 2 2 85 85 0 0 11 eleven 0 0 5 5 Т366К (43) T366K (43) L351D,Y349E (71) L351D,Y349E (71) 2 2 92 92 1 1 5 5 0 0 6 6 Т366К (43) T366K (43) L351D,Y349E, L368E (73) L351D,Y349E, L368E (73) 0 0 96 96 1 1 4 4 0 0 7 7 Т366К,L351K (68) T366K,L351K (68) L351D (63) L351D (63) 0 0 77 77 12 12 10 10 1 1 8 8 Т366К,L351K (68) T366K,L351K (68) L351D,R355D (72) L351D,R355D (72) 0 0 79 79 8 8 10 10 1 1 9 9 Т366К,L351K (68) T366K,L351K (68) L351D,Y349D, R355D (75) L351D,Y349D, R355D (75) 1 1 93 93 2 2 4 4 1 1 10 10 Т366К,L351K (68) T366K,L351K (68) L351D,Y349D (74) L351D,Y349D (74) 1 1 95 95 1 1 3 3 0 0 11 eleven Т366К,L351K (68) T366K,L351K (68) L351D,Y349E (71) L351D,Y349E (71) 1 1 95 95 0 0 3 3 1 1 12 12 Т366К,L351K (68) T366K,L351K (68) L351D,L368E (69) L351D,L368E (69) 0 0 92 92 0 0 8 8 0 0 13 13 Т366К (43) T366K (43) L351E (80) L351E (80) 0 0 70 70 10 10 18 18 2 2 14 14 T366R (79) T366R (79) L351E (80) L351E (80) 4 4 38 38 36 36 21 21 1 1 15 15 T366D (64) T366D (64) L351K,L368K (76) L351K,L368K (76) 3 3 92 92 2,5 2.5 2,5 2.5 0 0 16 16 T366D (64) T366D (64) L351R (77) L351R (77) 30 thirty 69 69 1 1 0 0 0 0

* А-цепь имеет специфичность MF1337 (=столбнячный токсоид).* The A-chain has the specificity of MF1337 (=tetanus toxoid).

** В-цепь имеет специфичность MF1122 (=фибриноген).** The B chain has the specificity of MF1122 (=fibrinogen).

Нативная MS.Native MS.

Нативную MS проводили для всех биспецифических образцов. Полученные графики анализировали для определения относительной доли присутствующего типа двумя путями: по высоте пика и по площади пика. Площадь пика является наиболее правильным с научной точки зрения способом анализа, однако поскольку все предшествующие анализы в других исследованиях проводили на основе высоты пика, в анализ были включены оба способа для целей сравнения. Различия между способами находились в пределах погрешности измерения, и, таким образом, для последующих измерений использовали только величины площади пика. Два типичных спектра представлены на фиг. 18. Обобщение результатов представлено графически на фиг. 19, числовые величины могут быть найдены в табл. 15. Приблизительно в половине образцов общее содержание примесей моноспецифического IgG составляет менее 5%, и только в трех случаях оно составляет >10%, в то время как для IgG wt ожидается обнаружить приблизительно 50% моноспецифического IgG в смеси.Native MS was performed for all bispecific samples. The resulting graphs were analyzed to determine the relative proportion of type present in two ways: peak height and peak area. Peak area is the most scientifically correct method of analysis, however, since all previous analyzes in other studies were based on peak height, both methods were included in the analysis for comparison purposes. The differences between the methods were within the measurement error, and thus only the peak area values were used for subsequent measurements. Two typical spectra are shown in Fig. 18. A summary of the results is presented graphically in FIG. 19, numerical values can be found in table. 15. Approximately half of the samples showed total monospecific IgG impurities of less than 5%, and only three cases showed >10%, whereas wt IgG would be expected to detect approximately 50% monospecific IgG in the mixture.

Панель из десяти комбинаций 2 различных цепей была выбрана из табл. 15 для дальнейшего анализа. Эти десять комбинаций включали комбинации 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11 и 12 (табл. 15). Выбор этих десяти комбинаций был основан на низких процентах гомодимеров, присутствующих в смеси, при определении с помощью nMS, однако также он основан на их общих физико-химических свойствах, включая выход продукции, SDS-PAGE, а также количество мутаций, присутствующих в CI 13-домене.A panel of ten combinations of 2 different circuits was selected from the table. 15 for further analysis. These ten combinations included combinations 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11 and 12 (Table 15). The selection of these ten combinations was based on the low percentages of homodimers present in the mixture as determined by nMS, but was also based on their overall physicochemical properties, including yield, SDS-PAGE, and the number of mutations present in CI 13 -domain

Пример 18. Анализы стабильности IgG.Example 18 IgG Stability Assays.

В этом исследовании далее анализируют серию пар мутаций CH3, которые приводят к высоким долям биспецифических гетеродимеров во фракции целых IgG и к очень низким количествам (<5%) исходных IgG, в отношении стабильности Fc-части молекулы IgG. Мутантные CH3-домены, которые используют для обеспечения гетеродимеризации тяжелых цепей, могут иметь неожиданные дестабилизирующие эффекты на Fc-область IgG, которые могут привести к нежелательным свойствам, таким как уменьшение времени полужизни in vivo, снижение эффекторной функции и/или увеличение иммуногенности. Вновь идентифицированные зарядовые пары сравнивают с биспецифическими молекулами дикого типа и биспецифическими молекулами, содержащими ранее идентифицированные зарядовые мутации (цепь А, содержащая конструкцию 1, и цепь В, содержащая конструкцию 2). Все биспецифические конструкции в этом исследовании содержат одинаковые вариабельные области тяжелых и легких цепей, что гарантирует то, что наблюдаемые эффекты вызваны мутациями в Fc-части молекулы, а не варьированием вариаThis study further analyzes a series of pairs of CH3 mutations that result in high proportions of bispecific heterodimers in the whole IgG fraction and very low quantities (<5%) of parent IgG, with respect to the stability of the Fc portion of the IgG molecule. Mutant CH3 domains that are used to promote heavy chain heterodimerization may have unexpected destabilizing effects on the Fc region of IgG, which may lead to undesirable properties such as decreased in vivo half-life, decreased effector function, and/or increased immunogenicity. The newly identified charge pairs are compared to wild-type bispecific molecules and bispecific molecules containing previously identified charge mutations (chain A containing construct 1 and chain B containing construct 2). All bispecific constructs in this study contain the same heavy and light chain variable regions, ensuring that the observed effects are due to mutations in the Fc portion of the molecule and not to variations in the variable region.

- 39 046272 бельных областей.- 39 046272 white areas.

Для этих биспецифических молекул проводят серию исследований стабильности. Эти исследования включают спектроскопические (поглощение в ультрафиолетовой и видимой области, флуоресценция и рассеяние света) и микроскопические (световая и флуоресцентная микроскопия с окрашиванием Nile Red) анализы, которые обеспечивают информацию о состоянии агрегации вариантов CH3.A series of stability studies are carried out on these bispecific molecules. These studies include spectroscopic (ultraviolet-visible absorption, fluorescence and light scattering) and microscopic (light and fluorescence microscopy with Nile Red staining) analyzes that provide information on the aggregation state of CH3 variants.

Спектры поглощения в ультрафиолетовой и видимой области регистрируют с помощью двулучевого спектрофотометра с двумя монохроматорами Cary 300 Bio при 25°C. Мониторинг спектров проводят при от 250 до 400 нм с использованием длины пути 1 см. Поглощение при длине волны 320 нм и более обеспечивает информацию о состоянии агрегации IgG.Ultraviolet-visible absorption spectra were recorded using a Cary 300 Bio dual-beam spectrophotometer with two monochromators at 25°C. Spectra are monitored from 250 to 400 nm using a path length of 1 cm. Absorbance at wavelengths of 320 nm or greater provides information about the aggregation state of IgG.

Мониторинг спектров собственной флуоресценции проводят при 25°C с использованием спектрофотометра FluoroMax. Способ флуоресценции оптимизируют. Испускание флуоресценции обеспечивает информацию о конформации и свойствах агрегации.Intrinsic fluorescence spectra are monitored at 25°C using a FluoroMax spectrophotometer. The fluorescence method is optimized. Fluorescence emission provides information about the conformation and properties of aggregation.

Мониторинг спектров рассеяния света при 90° проводят при 25°C с использованием спектрофотометра FluoroMax путем проведения синхронного сканирования (λ^=λ^) между 400 и 750 нм со временем интегрирования 0,01 с. Щели для возбуждения и испускания оптимизируют. Например, рассеяние света под прямым углом может различить образцы IgG, которые не имеют димеров и имеют 5% димеров.Light scattering spectra at 90° are monitored at 25°C using a FluoroMax spectrophotometer by performing a synchronous scan (λ^=λ^) between 400 and 750 nm with an integration time of 0.01 s. The excitation and emission slits are optimized. For example, right angle light scattering can distinguish between IgG samples that have no dimers and those that have 5% dimers.

Для флуоресцентной микроскопии с окрашиванием Nile Red, непосредственно перед измерениями к образцу добавляют Nile Red в этаноле. Образцы заливают на предметном стекле и анализируют с помощью флуоресцентной микроскопии. Частицы подсчитывают. Нижний предел размера частиц, который может быть выявлен с помощью флуоресцентной микроскопии, составляет приблизительно 0,5 мкм.For fluorescence microscopy with Nile Red staining, Nile Red in ethanol is added to the sample immediately before measurements. Samples are mounted on a glass slide and analyzed using fluorescence microscopy. The particles are counted. The lower limit of particle size that can be detected by fluorescence microscopy is approximately 0.5 μm.

Применение стрессового воздействия, такого как температура, рН, механическое воздействие или денатурирующие вещества, к белкам может привести к изменению конформации (например, разворачиванию) и/или агрегации. Как сообщалось ранее, биспецифические антитела с модифицированным способами инженерии зарядом имеют сниженную температуру плавления модифицированного CH3 (Gunasekaran 2010), целью этих исследований является различение новых зарядовых мутантов по настоящему изобретению и существующих известных зарядовых мутантов.Applying stress, such as temperature, pH, mechanical stress, or denaturing agents, to proteins can result in conformational changes (eg, unfolding) and/or aggregation. As previously reported that charge engineered bispecific antibodies have a reduced melting point of the modified CH3 (Gunasekaran 2010), the purpose of these studies is to distinguish between the new charge mutants of the present invention and existing known charge mutants.

Проводят исследования термостабильности с использованием Octet, как с помощью биосенсоров с белком А, так и с использованием связывания FcRn с IgG. Для исследования температурной стабильности IgG с модифицированным способами инженерии CH3 образцы инкубируют в концентрации 100 мкг/мл (в PBS) при 4, 50, 55, 60, 65, 70 и 75°C в течение 1 ч с использованием устройства для ПЦР. После этого образцы медленно охлаждают в течение 15 мин до 25°C и держат при этой температуре в течение 2 ч, после чего их хранят в течение ночи при 4°C. Преципитировавшие антитела удаляют центрифугированием, после чего определяют общую концентрацию IgG в растворимых антителах с помощью Octet с использованием биосенсора с белком А (разведение в PBS 1/10). Проводят анализы, которые измеряют связывание IgG, имеющего модифицированный способами инженерии CH3, с FcRn с использованием Octet. Используют либо биосенсоры с белком L для связывания легкой цепи IgG с биосенсором с последующей инкубацией с FcRn в растворе, либо биосенсоры с антителом против пента-HIS для связывания Hisмеченного белка FcRn, a затем проводят инкубацию с представляющим интерес IgG. Эти способы могут быть более чувствительными, чем использование биосенсора с белком А, и их также можно использовать для исследований температурной стабильности.Thermal stability studies are being conducted using Octet, both using Protein A biosensors and using FcRn binding to IgG. To study the temperature stability of CH3 engineered IgG, samples were incubated at 100 μg/mL (in PBS) at 4, 50, 55, 60, 65, 70, and 75°C for 1 h using a PCR apparatus. The samples are then slowly cooled to 25°C over 15 min and kept at this temperature for 2 h before being stored overnight at 4°C. Precipitated antibodies are removed by centrifugation and the total IgG concentration in soluble antibodies is determined by Octet using a Protein A biosensor (1/10 dilution in PBS). Assays are performed that measure the binding of CH3 engineered IgG to FcRn using Octet. Either L protein biosensors are used to bind the IgG light chain to the biosensor followed by incubation with FcRn in solution, or anti-penta-HIS biosensors are used to bind His-tagged FcRn protein, followed by incubation with the IgG of interest. These methods can be more sensitive than using a protein A biosensor and can also be used for temperature stability studies.

Все образцы также анализируют в отношении стабильности в сыворотке. В кратком изложении (модифицированные способами инженерии) образцы IgG инкубируют при 37°C в сыворотке человека, контрольные образцы поддерживают при 4°C. Через 1, 2, 3 и 4 недели образцы центрифугируют для удаления преципитировавшего IgG. Затем образец титруют в антигенспецифическом ELISA для определения относительных количеств функционального IgG. Очищенное контрольное антитело, в которое добавлена свежая сыворотка человека, используют в качестве эталона.All samples are also analyzed for serum stability. Briefly, (engineered) IgG samples are incubated at 37°C in human serum, controls are maintained at 4°C. After 1, 2, 3 and 4 weeks, samples are centrifuged to remove precipitated IgG. The sample is then titrated in an antigen-specific ELISA to determine the relative amounts of functional IgG. A purified control antibody spiked with fresh human serum is used as a reference.

Пример 19. Анализы стабильности.Example 19 Stability Assays

В предшествующих экспериментах получали высокие проценты биспецифических антител посредством коэкспрессии двух различных тяжелых цепей, содержащих мутации CH3, и общей легкой цепи (пример 17).In previous experiments, high percentages of bispecific antibodies were produced by coexpression of two different heavy chains containing CH3 mutations and a common light chain (Example 17).

Панель из восьми комбинаций из 2 различных тяжелых цепей была выбрана из табл. 15 для дальнейшего анализа. Эти восемь комбинаций включали комбинации 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11 и 12 (табл. 15). В этом исследовании эти восемь комбинаций анализировали, обращая особое внимание на стабильность Fc-части IgG. В качестве контролей включали биспецифические молекулы дикого типа (т.е. без мутаций CH3) и/или биспецифические молекулы на основе ранее сообщенных зарядовых мутаций CH3. Следует отметить, что для биспецифических молекул дикого типа 2 тяжелых цепи и общую легкую цепь коэкспрессируют без средств для преимущественного смещения в сторону гетеродимеров. Эти биспецифические молекулы дикого типа, таким образом, представляют собой смесь АА, АВ и ВВ. Все биспецифические молекулы в этом исследовании конструировали так, чтобы они имели те же комбинации VH/VL, что гарантирует, что наблюдаемые эффекты вызваны мутациями в Fc-части молекулы, а не варьированием(ями) Fab-частей.A panel of eight combinations of 2 different heavy chains was selected from Table. 15 for further analysis. These eight combinations included combinations 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11 and 12 (Table 15). In this study, these eight combinations were analyzed with particular attention to the stability of the Fc portion of IgG. Controls included wild-type bispecific molecules (i.e., without CH3 mutations) and/or bispecific molecules based on previously reported CH3 charge mutations. It should be noted that for wild-type bispecific molecules, the 2 heavy chains and the common light chain are coexpressed without a means of preferential bias toward heterodimers. These wild-type bispecific molecules are thus a mixture of AA, AB and BB. All bispecific molecules in this study were designed to have the same VH/VL combinations, ensuring that the observed effects were caused by mutations in the Fc portion of the molecule and not by variation(s) in the Fab portions.

Было предположено, что пары мутаций, которые использовали для обеспечения образования гетеIt was suggested that the pairs of mutations that were used to produce goethe

- 40 046272 родимерных пар двух различных тяжелых цепей, могут ассоциировать с неожиданными структурными или иными дестабилизирующими эффектами на Fc-область IgG. Это впоследствии может привести к проблемам, которые могут препятствовать дальнейшей клинической разработке, таким как уменьшение времени полужизни in vivo, уменьшение эффекторной функции и/или увеличение иммуногенности вследствие присутствия этих мутаций.- 40 046272 rhodiummer pairs of two different heavy chains may be associated with unexpected structural or other destabilizing effects on the Fc region of IgG. This may subsequently lead to problems that may hinder further clinical development, such as decreased in vivo half-life, decreased effector function, and/or increased immunogenicity due to the presence of these mutations.

Термостабильность.Thermal stability.

Применение стрессового воздействия, такого как увеличение или уменьшение температуры, может привести к конформационному изменению (например, разворачиванию) и/или агрегации белков. Для исследования термической стабильности IgG с модифицированными способами инженерии CH3, биспецифические молекулы с комбинациями 3-6 и 9-12 (табл. 15), а также биспецифические молекулы дикого типа и биспецифические молекулы, полученные с использованием конструкций 1 и 2 (комбинация E356K:D399K/ K392D':K409D', также называемая парой с обращенным зарядом) инкубировали в концентрации 100 мкг/мл (в PBS) при 4, 60, 62,5, 65, 67,5, 70 и 72,5°C в течение 1 ч с использованием устройства для ПЦР. После этого образцы медленно охлаждали в течение 15 мин до 25°C и держали при этой температуре в течение 2 ч, после чего их хранили в течение ночи при 4°C. На следующие сутки преципитировавшие антитела удаляли центрифугированием (18000 об/мин; 4°C, 20 мин), после чего определяли общую концентрацию IgG с помощью Octet с использованием биосенсора с белком А (разведение 1/10 в PBS). Результаты представлены на фиг. 20. Было выявлено, что контрольное биспецифическое антитело с модифицированным способами инженерии CH3 (комбинация с обращенным зарядом E356K:D399K/ K392D':K409D' (треугольники)) имеет сниженную термическую стабильность по сравнению с биспецифическими молекулами дикого типа (квадраты). Биспецифические молекулы с комбинациями 3-6 и 9-12 (ромбы) также продемонстрировали уменьшенную термическую стабильность по сравнению с диким типом. Однако примечательно, что три комбинации продемонстрировали увеличенную стабильность по сравнению с контрольным биспецифическим антителом с модифицированным способами инженерии CH3. Биспецифические молекулы с комбинациями 9, 10 и 11 являются значительно более стабильными, чем другие биспецифические молекулы с модифицированным способами инженерии CH3 (с обращенным зарядом), и они являются настолько же стабильными, как и биспецифические молекулы дикого типа, при наиболее высокой измеренной температуре. Стабильность при замораживанииразмораживании Для исследования стабильности IgG с модифицированным способами инженерии CH3 при повторяющемся замораживании и размораживании биспецифические молекулы из комбинаций 3-6 и 912 (табл. 15), а также биспецифические молекулы дикого типа и биспецифические молекулы, полученные с использованием конструкций 1 и 2 (комбинация E356K:D399K/ K392D':K409D' (пара с обращенным зарядом)) подвергали воздействию десяти последовательных циклов замораживания-размораживания, помещая образцы в условия -80°C в течение по меньшей мере 15 мин до тех пор, пока они не заморозятся полностью. После этого образцы размораживали при комнатной температуре. Когда они были полностью разморожены, цикл замораживание-размораживание повторяли. После 10 циклов замораживаниеразмораживание, преципитировавшие антитела удаляли центрифугированием (18000 об/мин; 4°C, 20 мин), после чего определяли общую концентрацию растворимых IgG-антител с помощью Octet с использованием биосенсора с белком А (разведение 1/10 в PBS) . Исследование стабильности при замораживанииразмораживании повторяли три раза. Результаты представлены на фиг. 21. Было выявлено, что контрольное биспецифическое антитело с модифицированным способами инженерии CH3 с обращением заряда, по-видимому, имеет несколько сниженную стабильность по сравнению с биспецифической молекулой дикого типа. Напротив, биспецифические молекулы из комбинаций 3, 4 и 9, по-видимому, имеют несколько увеличенную стабильность по сравнению с биспецифическим контролем дикого типа. В целом, можно заключить, что строгие условия циклов замораживания-размораживания не приводят к значительным проблемам стабильности для вариантов с модифицированным способами инженерии CH3.The application of stress, such as an increase or decrease in temperature, can lead to conformational changes (eg, unfolding) and/or aggregation of proteins. To study the thermal stability of IgG with modified CH3 engineering methods, bispecific molecules with combinations 3-6 and 9-12 (Table 15), as well as wild-type bispecific molecules and bispecific molecules obtained using constructs 1 and 2 (combination E356K:D399K / K392D':K409D', also called reverse charge pair) were incubated at 100 µg/ml (in PBS) at 4, 60, 62.5, 65, 67.5, 70 and 72.5°C for 1 h using a PCR device. The samples were then slowly cooled over 15 min to 25°C and kept at this temperature for 2 h, after which they were stored overnight at 4°C. The next day, precipitated antibodies were removed by centrifugation (18,000 rpm; 4°C, 20 min), after which the total IgG concentration was determined using Octet using a protein A biosensor (1/10 dilution in PBS). The results are presented in Fig. 20. The control CH3 engineered bispecific antibody (reversed charge combination E356K:D399K/ K392D':K409D' (triangles)) was found to have reduced thermal stability compared to the wild type bispecific molecules (squares). Bispecific molecules with combinations 3-6 and 9-12 (diamonds) also showed reduced thermal stability compared to the wild type. However, it is noteworthy that the three combinations demonstrated increased stability compared to the CH3 engineered bispecific antibody control. The bispecific molecules with combinations 9, 10 and 11 are significantly more stable than other CH3 engineered bispecific molecules (charge reversed), and they are as stable as the wild type bispecific molecules at the highest measured temperature. Freeze-Thaw Stability To study the stability of CH3-engineered IgG during repeated freezing and thawing, the bispecific molecules from combinations 3-6 and 912 (Table 15), as well as the wild-type bispecific molecules and the bispecific molecules obtained using constructs 1 and 2 ( combination E356K:D399K/ K392D':K409D' (reversed charge pair)) was subjected to ten consecutive freeze-thaw cycles, placing the samples at -80°C for at least 15 min until they were completely frozen . After this, the samples were thawed at room temperature. When they were completely thawed, the freeze-thaw cycle was repeated. After 10 freeze-thaw cycles, precipitated antibodies were removed by centrifugation (18,000 rpm; 4°C, 20 min), and the total concentration of soluble IgG antibodies was determined by Octet using a protein A biosensor (1/10 dilution in PBS). The freeze-thaw stability study was repeated three times. The results are presented in Fig. 21. A control bispecific antibody modified with charge reversal CH3 engineering was found to appear to have slightly reduced stability compared to the wild type bispecific molecule. In contrast, the bispecific molecules from combinations 3, 4, and 9 appear to have slightly increased stability compared to the wild-type bispecific control. Overall, it can be concluded that the stringent freeze-thaw cycling conditions do not result in significant stability issues for the CH3 engineered variants.

Стабильность в сыворотке in vitro.Stability in serum in vitro.

Для исследования стабильности IgG с модифицированным способами инженерии CH3 в сыворотке при 37°C, биспецифические молекулы из комбинаций 3-6 и 9-12 (табл. 15), а также биспецифические молекулы дикого типа и биспецифические молекулы с обращением заряда инкубировали при 37°C в сыворотке человека 10%. Контрольные образцы держали в сыворотке человека при 4°C. Через 1, 2 или 5 суток преципитировавшие антитела удаляли центрифугированием. После этого образцы титровали в фибриногенспецифическом ELISA для определения относительных количеств функционального IgG. Очищенное контрольное антитело, в которое была добавлена свежая сыворотка человека, использовали в качестве эталона.To study the stability of CH3-engineered IgG in serum at 37°C, the bispecific molecules from combinations 3-6 and 9-12 (Table 15), as well as the wild-type and charge-reversal bispecific molecules, were incubated at 37°C in human serum 10%. Control samples were kept in human serum at 4°C. After 1, 2 or 5 days, precipitated antibodies were removed by centrifugation. The samples were then titrated in a fibrinogen-specific ELISA to determine the relative amounts of functional IgG. A purified control antibody spiked with fresh human serum was used as a reference.

Данные ELISA с фибриногеном продемонстрировали, что все образцы были довольно стабильными в 10% сыворотке человека при 37°C в течение 5 суток. При более низкой концентрации IgG биспецифические молекулы с комбинациями 4 и 5, по-видимому, были несколько менее стабильными, особенно в моменты Т=1 и Т=2, однако в конце этого эксперимента различие является минимальным (см. фиг. 22).Fibrinogen ELISA data demonstrated that all samples were fairly stable in 10% human serum at 37°C for 5 days. At lower IgG concentrations, the bispecific molecules with combinations 4 and 5 appeared to be somewhat less stable, especially at T=1 and T=2, however at the end of this experiment the difference is minimal (see FIG. 22).

Пример 20. Дальнейшее исследование стабильности.Example 20: Further stability study.

Дальнейшую серию аналитических способов использовали для оценки стабильности вариантов IgG. Биспецифические молекулы с комбинациями 3-6 и 9-12 (табл. 15), а также биспецифические молекулыA further series of analytical methods were used to assess the stability of the IgG variants. Bispecific molecules with combinations 3-6 and 9-12 (Table 15), as well as bispecific molecules

- 41 046272 дикого типа (АА, АВ, ВВ), индивидуальные родительские антитела (АА и ВВ) и биспецифические молекулы, полученные с использованием конструкций 1 и 2 (комбинация E356K:D399K/K392D':K409D' (пара с обращением заряда)) использовали в качестве образцов в этих анализах стабильности.- 41 046272 wild type (AA, AB, BB), individual parent antibodies (AA and BB) and bispecific molecules obtained using constructs 1 and 2 (combination E356K:D399K/K392D':K409D' (charge reversal pair)) were used as samples in these stability analyses.

Все IgG разбавляли до 0,2 мг/мл и использовали несколько условий стрессового воздействия (2 суток при 50°C, 2 недели при 40°C, 5х замораживание-размораживание), с целью иметь способность различить различные образцы. Следует отметить, что эти высокие уровни стрессового воздействия обеспечивали условия, в которых одно из родительских антител (родительское антитело ВВ, имеющее две Fab 1122), используемых во всех биспецифических молекулах, стало нестабильным. Через 2 суток при 50°C была выявлена агрегация этого белка по поглощению в УФ-области. Это позволило предположить, что эти стрессовые условия не позволяют различить нестабильность Fab и CH3 в биспецифической молекуле, и данные, полученные при инкубации при 50°C, следует использовать осторожно.All IgGs were diluted to 0.2 mg/ml and several stress conditions were used (2 days at 50°C, 2 weeks at 40°C, 5x freeze-thaw) in order to be able to discriminate between different samples. It should be noted that these high levels of stress exposure provided conditions in which one of the parent antibodies (parent BB antibody having two Fab 1122) used in all bispecific molecules became unstable. After 2 days at 50°C, aggregation of this protein was detected by absorption in the UV region. This suggested that these stress conditions do not distinguish between Fab and CH3 instability in the bispecific molecule, and data obtained from incubation at 50°C should be used with caution.

Результаты обобщенно представлены в табл. 16. Аналитические способы, которые использовали, включали следующие:The results are summarized in table. 16. Analytical methods used included the following:

флуоресцентная микроскопия с Nile Red (частицы Nile Red в табл. 16); для выявления количества частиц >0,5 мкм после добавления красителя Nile Red;fluorescence microscopy with Nile Red (Nile Red particles in Table 16); to detect the number of particles >0.5 µm after adding Nile Red dye;

УФ-спектрометрия при 350 нм (УФ, 350 нм); изменение поглощения при длинах волн >320 нм дает информацию о состоянии агрегации белка;UV spectrometry at 350 nm (UV, 350 nm); changes in absorption at wavelengths >320 nm provide information about the state of protein aggregation;

рассеяние света при 90° при 400 нм (LS, 400 нм); чувствительный способ выявления изменений агрегации белка, например, отличий между мономерами и димерами IgG;light scattering at 90° at 400 nm (LS, 400 nm); a sensitive method for detecting changes in protein aggregation, such as differences between IgG monomers and dimers;

собственная флуоресценция; максимальная длина волны флуоресценции и интенсивность ароматических остатков в белке изменяется при изменениях окружающих условий (например, разворачивание);intrinsic fluorescence; the maximum fluorescence wavelength and intensity of aromatic residues in a protein changes with changes in environmental conditions (eg, unfolding);

флуоресцентная спектроскопия 1,8-ANS; 1,8-ANS связывается посредством электростатических взаимодействия с катионными группами через образование ионных пар, и можно выявлять изменения структуры и/или конформации белка.1,8-ANS fluorescence spectroscopy; 1,8-ANS binds through electrostatic interactions with cationic groups through the formation of ion pairs, and changes in protein structure and/or conformation can be detected.

Спектроскопия в ультрафиолетовой и видимой области спектра Спектры поглощения в ультрафиолетовой и видимой области спектра измеряли при 25°C с помощью двулучевого спектрофотометра с двумя монохроматорами Cary 300 Bio от Varian в различных кварцевых кюветах (таких как черные кюветы низкого объема Hellma с длиной пути 1,0 см и прозрачные кюветы Hellma 0,2х1,0 см). Мониторинг спектров проводили между 220 и 450 нм с использованием длины пути 1,0 см. Поглощение в области 280 нм обеспечивает информацию о концентрации белка. Область между 320 и 450 нм может обеспечить информацию о состоянии агрегации в образце.Ultraviolet-Visible Spectroscopy UV-visible absorption spectra were measured at 25°C using a Varian Cary 300 Bio dual-beam spectrophotometer with two monochromators in various quartz cuvettes (such as Hellma's low volume black 1.0 path length cuvettes cm and transparent Hellma cuvettes 0.2x1.0 cm). Spectra were monitored between 220 and 450 nm using a path length of 1.0 cm. Absorbance in the 280 nm region provides information on protein concentration. The region between 320 and 450 nm can provide information about the state of aggregation in the sample.

Рассеяние света при 90°.Light scattering at 90°.

Спектроскопия рассеяния света при 90° была разработана для исследования агрегации белка и ее проводили, как описано в Capelle, 2005; Demeule, 2007a. Мониторинг спектров рассеяния света при 90° проводили при 25°C с использованием спектрофотометра FluoroMax (Spex, Instruments S.A., Inc. U.K.) путем проведения синхронного сканирования ^_em^_ex) между 400 и 750 нм со временем интеграции 0,01 с. Исследовали различные параметры щели, чтобы найти оптимальные условия. После оптимизации для всех измерений использовали одни и те же параметры щели.90° light scattering spectroscopy was developed to study protein aggregation and was performed as described in Capelle, 2005; Demeule, 2007a. Light scattering spectra at 90° were monitored at 25°C using a FluoroMax spectrophotometer (Spex, Instruments SA, Inc. UK) by performing a synchronous scan^ _em ^ _ex ) between 400 and 750 nm with an integration time of 0.01 s. Various slot parameters were studied to find optimal conditions. After optimization, the same slit parameters were used for all measurements.

Испускание флуоресценции в стационарном состоянии.Fluorescence emission in a steady state.

Испускание флуоресценции остатков триптофана, тирозина и фенилаланина дает информацию о локальном окружении этих флуорофоров. Измеряют изменения или отличия гидрофобности и/или жесткости. Как правило, более гидрофобные и жесткие условия приводят к увеличению интенсивности флуоресценции и коротковолновому сдвигу максимума эмиссии. Спектроскопия собственной флуоресценции может обеспечить информацию о текущем состоянии белка и осуществить мониторинг изменений физических и химических свойств. Больше информации о флуоресценции тирозина и триптофана может быть найдено в книге Lakowicz (Lakowicz, 2006).The fluorescence emission of tryptophan, tyrosine and phenylalanine residues provides information about the local environment of these fluorophores. Changes or differences in hydrophobicity and/or stiffness are measured. Typically, more hydrophobic and harsh conditions lead to an increase in fluorescence intensity and a shorter wavelength shift of the emission maximum. Intrinsic fluorescence spectroscopy can provide information about the current state of a protein and monitor changes in physical and chemical properties. More information about tyrosine and tryptophan fluorescence can be found in the book by Lakowicz (Lakowicz, 2006).

Спектры испускания и возбуждения флуоресценции регистрировали при 25°C в различных кварцевых кюветах. Возбуждение образцов осуществляли при различных длинах волн. Время интегрирования и параметры щели оптимизировали. После оптимизации для всех образцов использовали то же время оптимизации и параметры щели.Fluorescence emission and excitation spectra were recorded at 25°C in various quartz cuvettes. The samples were excited at different wavelengths. The integration time and slit parameters were optimized. After optimization, the same optimization time and slit parameters were used for all samples.

Флуоресцентная микроскопия с окрашиванием Nile Red.Fluorescence microscopy with Nile Red staining.

Способ окрашивания с помощью Nile Red был разработан для визуализации агрегатов белка, и его выполняли, как описано в Demeule et al., 2007b.The Nile Red staining method was developed to visualize protein aggregates and was performed as described in Demeule et al., 2007b.

Микроскопию проводили на микроскопе Leica DM RXE (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Германия), оборудованном ртутной лампой. Изображения получали с помощью камеры Sony NEX-5 и ее встроенных программ. Объективы были 10х, 20х и 40х. Для исследований с помощью микроскопии использовали предметные стекла с фиксированным расстоянием 0,1 мм между предметным и покровным стеклом. Размер решеток 4х4 составляет 1х1 мм и он соответствует 0,1 мкл.Microscopy was performed on a Leica DM RXE microscope (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany) equipped with a mercury lamp. Images were acquired using a Sony NEX-5 camera and its built-in software. The lenses were 10x, 20x and 40x. For microscopy studies, glass slides were used with a fixed distance of 0.1 mm between the slide and coverslip. The size of the 4x4 grids is 1x1 mm and corresponds to 0.1 μL.

Флуоресцентная спектроскопия с 1,8-ANS.Fluorescence spectroscopy with 1,8-ANS.

1-Анилиннафталин-8-сульфоновая кислота (1,8-ANS) представляет собой незаряженный небольшой флуоресцентный зонд (ММ 299,34 Да), используемый для исследования как мембранных поверхностей,1-Anilinnaphthalene-8-sulfonic acid (1,8-ANS) is an uncharged small fluorescent probe (MW 299.34 Da) used to probe both membrane surfaces,

- 42 046272 так и белков.- 42 046272 and proteins.

1,8-ANS является по существу нефлуоресцентной в воде и становится ощутимо флуоресцентной, когда она связана с мембранами (квантовый выход ~0,25) с или белками (квантовый выход ~0,7). Это свойство 1,8-ANS делает ее чувствительным индикатором укладки белка, конформационных изменений и других процессов, которые модифицируют экспозицию зонда воде. Информация о 1,8-ANS может быть найдена на домашней странице Интернет Molecular Probes, www.probes.com.1,8-ANS is essentially nonfluorescent in water and becomes noticeably fluorescent when bound to membranes (quantum yield ~0.25) or proteins (quantum yield ~0.7). This property of 1,8-ANS makes it a sensitive indicator of protein folding, conformational changes, and other processes that modify probe exposure to water. Information about 1,8-ANS can be found on the Molecular Probes Internet home page, www.probes.com.

Спектры испускания флуоресценции 1,8-ANS регистрировали с использованием спектрометра FluoroMax. Прямое сравнение флуоресценции 1,8-ANS между IgG не проводят. Каждый IgG может иметь отличающееся количество участков связывания 1,8-ANS и, таким образом, их нельзя сравнивать. В принципе, чем ниже флуоресценция 1,8-ANS, тем меньше молекул 1,8-ANS связывается с антителом. Оценивают изменения интенсивности флуоресценции 1,8-ANS и длины волны испускания вследствие стрессовых воздействий.Fluorescence emission spectra of 1,8-ANS were recorded using a FluoroMax spectrometer. Direct comparisons of 1,8-ANS fluorescence between IgGs are not made. Each IgG may have a different number of 1,8-ANS binding sites and thus cannot be compared. Basically, the lower the fluorescence of 1,8-ANS, the fewer 1,8-ANS molecules that bind to the antibody. Changes in 1,8-ANS fluorescence intensity and emission wavelength due to stress exposures are assessed.

Таблица 16Table 16

Обзор различных результатов ускоренной деградации для различных образцов IgG после разбавления до 0,2 мг/млReview of different accelerated degradation results for different IgG samples after dilution to 0.2 mg/ml

Образец белка Protein sample Стрессовое воздействие Stress exposure Частицы Nile red Particles Nile red УФ, 350 HM UV, 350 H.M. LS 400, HM (10'cps) LS 400, HM (10'cps) Собственная флуоресценция Own fluorescence Флуоресценция 1,8-ANS Fluorescence 1,8-ANS собственная флуо ресценция (10^б имп/с) intrinsic fluorescence (10 ^b cps) λ Мах. (нм) λ Max. (nm) собственная 1,8-ANS (Ю⁶ имп/с) own 1.8-ANS (U ⁶ imp/s) λ Мах. (нм) λ Max. (nm) Сдвиг (нм) Shear (nm) ВВ BB 2d4°C 2d4°C 0-10 0-10 0.001 0.001 0.7 0.7 4.2 4.2 335 335 2d50°C 2d50°C 0-10 0-10 0.8 0.8 4.2 4.2 335 335 АА AA 2d4°C 2d4°C 10-20 10-20 0 0 1.2 1.2 5.7 5.7 338 338 2d50°C 2d50°C 10-20 10-20 0.002 0.002 1.0 1.0 5.5 5.5 338 338 Бислецифическая молекула дикого типа (АА АВ ВВ) Bisclectic wild-type molecule (AA AB BB) 2d4°C 2d4°C iiiiiiiii iiiiiiiii 0.003 0.003 0.9 0.9 5.1 5.1 336 336 7.1 7.1 507 507 2d50°C 2d50°C >10000** >10000** iiiiiiiii iiiiiiiii 0.9 0.9 5.0 5.0 336 336 7.1 7.1 507 507 2w4°C 2w4°C 0 0 0.9 0.9 5.0 5.0 336 336 2w40°C 2w40°C >2000** >2000** 0 0 0.8 0.8 5.0 5.0 336 336 TO TO 0.001 0.001 0.8 0.8 5.0 5.0 336 336 5FT 5FT >2000** >2000** IIIIIIIII IIIIIIIII 1.2 1.2 4.8 4.8 336 336 Бислецифическая молекула с обращенным зарядом (Е356К,D399K/ K392D,K409D) Bisclectic molecule with reverse charge (E356K,D399K/ K392D,K409D) 2d4°C 2d4°C 10-20 10-20 0.001 0.001 1.3 1.3 5.9 5.9 336 336 7.0 7.0 507 507 2d50°C 2d50°C 10-20 10-20 0.002 0.002 1.2 1.2 5.7 5.7 336 336 7.0 7.0 507 507 2w4°C 2w4°C >2000** >2000** 0 0 1.1 1.1 5.5 5.5 336 336 2w40°C 2w40°C >2000** >2000** 0.002 0.002 1.1 1.1 5.5 5.5 336 336 TO TO 0.001 0.001 1.3 1.3 5.7 5.7 336 336 5FT 5FT iiiiiiiiiiii iiiiiiiiiiii Iglllllllllii Igllllllllii 5.5 5.5 336 336 Комбинация # 3* Combination #3* 2d4°C 2d4°C lllllllllll lllllllllll 0 0 0.9 0.9 5.0 5.0 337 337 2d50°C 2d50°C lllllllllll lllllllllll 0.001 0.001 0.8 0.8 4.9 4.9 337 337 Комбинация # 4 Combination #4 2d4°C 2d4°C 20-30 20-30 0 0 1.0 1.0 6.2 6.2 337 337 7.5 7.5 505 505 2d50°C 2d50°C >3000** >3000** 0.001 0.001 1.0 1.0 6.2 6.2 337 337 7.5 7.5 505 505 2w4°C 2w4°C 0.001 0.001 1.0 1.0 6.3 6.3 337 337 2w40°C 2w40°C >2000** >2000** 0.003 0.003 0.9 0.9 6.3 6.3 337 337 TO TO 0.002 0.002 1.1 1.1 6.3 6.3 337 337 5FT 5FT >2000** >2000** 0.003 0.003 1.2 1.2 6.0 6.0 337 337 Комбинация # 5 Combination #5 2d4°C 2d4°C >2000** >2000** 0.001 0.001 1.1 1.1 4.9 4.9 337 337 2d50°C 2d50°C >10000** >10000** 0.001 0.001 0.9 0.9 5.0 5.0 337 337

- 43 046272- 43 046272

Комбинация # б Combination # b 2d4°C 2d4°C 10-20 10-20 0 0 0.7 0.7 4.3 4.3 337 337 2d50°C 2d50°C 20-30 20-30 0.001 0.001 0.7 0.7 4.3 4.3 337 337 Комбинация # 9 Combination #9 2d4°C 2d4°C llllllllll llllllllll 0 0 1.0 1.0 5.5 5.5 337 337 7.5 7.5 507 507 2d50°C 2d50°C 50-100 50-100 0 0 1.0 1.0 5.5 5.5 337 337 llillll llillll llillll! lllllll! 2w4°C 2w4°C >2000** >2000** 0 0 0.9 0.9 5.1 5.1 337 337 2w40°C 2w40°C >2000** >2000** 0 0 0.9 0.9 5.2 5.2 337 337 TO TO 0.002 0.002 0.8 0.8 5.1 5.1 337 337 5FT 5FT >2000** >2000** iiiitiiii iiiitiiii llilllllllll lllllllllll 4.9 4.9 337 337 Комбинация # 10 Combination #10 2d4°C 2d4°C lllllllllll lllllllllll 0.002 0.002 1.0 1.0 5.6 5.6 337 337 7.0 7.0 505 505 2d50°C 2d50°C llflte llflte 0.001 0.001 1.1 1.1 5.9 5.9 337 337 2w4°C 2w4°C >2000** >2000** 0 0 0.9 0.9 5.2 5.2 337 337 2w40°C 2w40°C >2000** >2000** 0 0 0.9 0.9 5.4 5.4 337 337 TO TO 0.005 0.005 1.0 1.0 5.3 5.3 337 337 5FT 5FT 20-30 20-30 0.004 0.004 1.1 1.1 5.4 5.4 337 337 Комбинация # 11 Combination #11 2d4°C 2d4°C 20-30 20-30 0 0 0.9 0.9 4.9 4.9 337 337 2d50°C 2d50°C lllllllllll lllllllllll 0.002 0.002 0.9 0.9 5.1 5.1 337 337 2w4°C 2w4°C >2000** >2000** 0 0 0.8 0.8 5.0 5.0 337 337 2w40°C 2w40°C >2000** >2000** 0 0 0.8 0.8 5.1 5.1 337 337 TO TO 0.004 0.004 1.1 1.1 5.0 5.0 337 337 5FT 5FT >2000** >2000** 0.002 0.002 1.2 1.2 5.0 5.0 337 337 Комбинация # 12 Combination #12 2d4°C 2d4°C 10-20 10-20 0.001 0.001 0.8 0.8 3.8 3.8 337 337 6.2 6.2 511 511 2d50°C 2d50°C 10-20 10-20 0.002 0.002 0.7 0.7 3.8 3.8 337 337 iiiiiiiiii iiiiiiiiii llillll llillll iiiiiiii iiiiiiii 2w4°C 2w4°C >2000** >2000** 0.003 0.003 0.6 0.6 3.6 3.6 337 337 2w40°C 2w40°C >2000** >2000** 0.001 0.001 0.5 0.5 3.5 3.5 337 337 TO TO 0.005 0.005 0.6 0.6 3.7 3.7 337 337 5FT 5FT 0.004 0.004 0.7 0.7 3.6 3.6 337 337

Цвет ячеек указывает на варьирование между Т=0 и моментом времени после стрессового воздействия: темно-серый=большое изменение, светло-серый=небольшое изменение, и нет цвета=нет изменения (=стабильный).The color of the cells indicates the variation between T=0 and the post-stress time point: dark gray=large change, light gray=small change, and no color=no change (=stable).

* #комбинации относится к комбинации мутаций, приведенных в табл. 15.* #combination refers to the combination of mutations given in table. 15.

* * Очень малые частицы при флуоресцентной микроскопии, значимость этих частиц неизвестна. 2d4°C=2 суток при 4°C.* *Very small particles by fluorescence microscopy, the significance of these particles is unknown. 2d4°C=2 days at 4°C.

2d50°C=2 суток при 50°C.2d50°C=2 days at 50°C.

2w4°C=2 недели при 4°C.2w4°C=2 weeks at 4°C.

2w40°C=2 недели при 40°C.2w40°C=2 weeks at 40°C.

Т0=начало эксперимента.T0=start of experiment.

5FT=5 циклы замораживания-размораживания.5FT=5 freeze-thaw cycles.

Взятые вместе, эти данные указывают на то, что различные образцы IgG являются в значительной степени стабильными. Требовались условия высокого стрессового воздействия (например, 2 суток при 50°C), чтобы получить поддающиеся измерению различия между исследуемыми образцами. В этих условиях образцы комбинаций #9 и #10 по-видимому, агрегируют больше, чем другие образцы.Taken together, these data indicate that the various IgG samples are largely stable. High stress conditions (eg, 2 days at 50°C) were required to obtain measurable differences between the study samples. Under these conditions, combination samples #9 and #10 appear to aggregate more than other samples.

Наиболее различающими факторами для стабильности между белками являются циклы замораживания-размораживания и увеличенная температура. Учитывая очень жесткий стрессовый фактор инкубации при 50°C, варианты T366K/L351E,Y349E (комбинация #4) и T366K,L351K/L351D,Y349E (комбинация #11) являются двумя из наиболее стабильных белков в панели, за которыми близко следуютThe most differentiating factors for stability between proteins are freeze-thaw cycles and increased temperature. Considering the very stringent incubation stress factor at 50°C, the variants T366K/L351E,Y349E (combination #4) and T366K,L351K/L351D,Y349E (combination #11) are two of the most stable proteins in the panel, followed closely by

- 44 046272- 44 046272

T366K,L351K/L351D,Y349D (комбинация #10) и T366K,L351K/L351D,L368E (комбинация #12).T366K,L351K/L351D,Y349D (combination #10) and T366K,L351K/L351D,L368E (combination #12).

Пример 21. Нативная MS в экспериментах по соотношению; соотношение при трансфекции от 1:5 до 5:1.Example 21: Native MS in ratio experiments; the transfection ratio is from 1:5 to 5:1.

Чтобы узнать больше о поведении IgG с мутантным CH3 в смещенных смесях для трансфекции, в частности, о комбинации T366K:L351K/L351D':L368E' (далее обозначаемая как KK/DE или DEKK), проводили более детальные эксперименты по соотношению.To learn more about the behavior of CH3 mutant IgG in biased transfection mixtures, in particular the combination T366K:L351K/L351D':L368E' (hereafter referred to as KK/DE or DEKK), more detailed ratio experiments were performed.

Ранее использованные VH-области антител с известной способностью образовывать пары с общей легкой цепью IGKV1-39 использовали для повторного клонирования в конструкции 1, 2, 68 и 69, с получением векторов I-V табл. 17. Векторы I-V, каждый из которых содержал последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие общую легкую цепь человека, а также тяжелую цепь Ig с отличающейся CH3-областью и отличающейся антигенной специфичностью, впоследствии трансфицировали в клетки с различными соотношениями при трансфекции, как указано в табл. 18. Результаты представлены на фиг. 23.Previously used VH regions of antibodies with a known ability to form pairs with the common light chain of IGKV1-39 were used for re-cloning into constructs 1, 2, 68 and 69, obtaining vectors I-V table. 17. Vectors I-V, each containing nucleic acid sequences encoding a common human light chain as well as an Ig heavy chain with a different CH3 region and different antigenic specificity, were subsequently transfected into cells at different transfection ratios as indicated in Table 1. 18. The results are shown in FIG. 23.

Таблица 17Table 17

Вектор Vector Ген VH Gene VH Антигенная специфичность Antigen specificity Масса VH (Да) Weight VH (Yes) Обозначение Merus Designation Merus Клонирован в конструкцию # Cloned into design # I I IGHV 3.30 IGHV 3.30 Фибриноген (А) Fibrinogen (A) 12794 12794 MF1122 MF1122 69 (L351D, L368E) 69 (L351D, L368E) II II IGHV 3.23 IGHV 3.23 RSV (С) RSV (C) 13941 13941 MF2729 MF2729 69 (L351D, L368E) 69 (L351D, L368E) III III IGHV 1.08 IGHV 1.08 Столбняк (В) Tetanus (B) 13703 13703 MF1337 MF1337 68 (Т366К, L351K) 68 (T366K, L351K) IV IV IGHV 3.30 IGHV 3.30 Фибриноген (А) Fibrinogen (A) 12794 12794 MF1122 MF1122 1 (Е356К, D399K) 1 (E356K, D399K) V V IGHV 1.08 IGHV 1.08 Столбняк (В) Tetanus (B) 13703 13703 MF1337 MF1337 2 (K392D, K409D) 2 (K392D, K409D)

Таблица 18Table 18

Номер трансфекции Transfection number векторы vectors соотношение ratio 1 1 I и III I and III 5:1 5:1 2 2 I и III I and III 3:1 3:1 3 3 I и III I and III 1: 1 eleven 4 4 I и III I and III 1: 3 13 5 5 I и III I and III 1: 5 15 6 6 II и III II and III 5:1 5:1 7 7 II и III II and III 3:1* 3:1* 8 8 II и III II and III 1: 1 eleven 9 9 II и III II and III 1: 3 13 10 10 II и III II and III 1: 5 15 11 eleven IV и V IV and V 5:1 5:1 12 12 IV и V IV and V 3:1 3:1 13 13 IV и V IV and V 1: 1 eleven 14 14 IV и V IV and V 1: 3 13 15 15 IV и V IV and V 1: 5 15

* Вследствие технической ошибки измерение для этого образца не проводили.* Due to a technical error, this sample was not measured.

На фиг. 23A и 23В показано, что для комбинации мутаций DEKK, когда присутствует избыток А или С (А или С находятся на DE-стороне и В находится на KK-стороне), образуется АВ или ВС, однако присутствует избыток А или С в качестве смеси обоих гомодимеров и половинных молекул во всех случаях. Однако, когда присутствует избыток В (В находится на KK-стороне и А или С находятся на DE-стороне), существует отчетливое отличие. АВ или ВС все еще образуются, однако избыток В по существу отсутствует в качестве гомодимера, и образуются только половинные молекулы. Проценты вновь измеряли по высоте пика. Следует отметить, что пики, обнаруженные в диапазоне 2% или менее,In fig. 23A and 23B show that for a combination of DEKK mutations, when an excess of A or C is present (A or C is on the DE side and B is on the KK side), AB or BC is produced, but an excess of A or C is present as a mixture of both homodimers and half molecules in all cases. However, when an excess of B is present (B is on the KK side and A or C is on the DE side), there is a distinct difference. AB or BC are still formed, but excess B is essentially absent as a homodimer and only half molecules are formed. Percentages were again measured by peak height. It should be noted that peaks detected in the range of 2% or less

- 45 046272 находятся ниже порога точного измерения с помощью используемой технологии nMS. Таким образом, результаты измерений <2% считаются находящимися в пределах уровня шума анализа и, таким образом, игнорируются. Неожиданно, избыток В приводит к высоким процентам только половинной молекулы В. Особенно высокие проценты половинной молекулы В наблюдали при соотношениях 1:3 и 1:5 А:В (фиг. 23А и 23В) в отсутствие гомодимера ВВ, что указывает на то, что мутации CH3 на KK-стороне являются неблагоприятными для гомодимеризации. Отсутствие гомодимеров обеспечивает ключевое преимущество, поскольку эта KK-сторона комбинации DEKK может быть выбрана так, чтобы она включала специфичность, которая может иметь известные неблагоприятные эффекты, когда она присутствует в качестве гомодимера (например, известно, что антитела против сМЕТ или CD3 имеют нежелательные побочные эффекты, когда они присутствуют в терапевтических композициях в качестве двухвалентных гомодимеров).- 45 046272 are below the threshold for accurate measurement using the nMS technology used. Thus, measurements <2% are considered to be within the noise level of the analysis and are thus ignored. Surprisingly, excess B results in high percentages of half B molecule only. Particularly high percentages of half B molecule were observed at 1:3 and 1:5 A:B ratios (FIGS. 23A and 23B) in the absence of BB homodimer, indicating that CH3 mutations on the KK side are unfavorable for homodimerization. The absence of homodimers provides a key advantage since this KK side of the DEKK combination can be selected to include specificities that may have known adverse effects when present as a homodimer (for example, antibodies against cMET or CD3 are known to have unwanted side effects effects when present in therapeutic compositions as divalent homodimers).

Выявленные данные для различных соотношений DE:KK являются противоположными контрольным мутациям CH3 с обращением заряда в векторах IV и V. На фиг. 23С показано, что для комбинации мутаций E356K:D399K/K392D':K4O9D', когда присутствует избыток А (А находится на стороне K392D:K409D), избыток А присутствует в качестве смеси обоих гомодимеров и половинных молекул во всех случаях, но также когда присутствует избыток В (В находится на Е356К:1)399К-стороне), избыток В присутствует в качестве смеси обоих гомодимеров и половинных антител во всех случаях. Даже при более высоких соотношениях 1:3 и 1:5 не наблюдают половинных молекул В, хотя гомодимеры присутствуют, что указывает на то, что сторона E356K:D399K не является настолько же неблагоприятной для гомодимеризации, как и KK-сторона комбинации DEKK.The findings for various DE:KK ratios are the opposite of the control charge-reversal CH3 mutations in vectors IV and V. FIG. 23C shows that for the mutation combination E356K:D399K/K392D':K4O9D', when excess A is present (A is on the K392D:K409D side), excess A is present as a mixture of both homodimers and half molecules in all cases, but also when present excess B (B is on the E356K:1)399K side), excess B is present as a mixture of both homodimers and half antibodies in all cases. Even at the higher ratios of 1:3 and 1:5, no half B molecules are observed, although homodimers are present, indicating that the E356K:D399K side is not as unfavorable for homodimerization as the KK side of the DEKK combination.

В совокупности комбинация мутаций DEKK обеспечивает очевидную пользу относительно мутаций CH3 с обращением заряда, поскольку одна из цепей гетеродимера не образует гомодимеров.Taken together, the combination of DEKK mutations provides a clear benefit over charge-reversal CH3 mutations, since one of the heterodimer chains does not form homodimers.

Пример 22. Разновидности смесей с использованием комбинации DEKK.Example 22. Varieties of mixtures using the DEKK combination.

Поскольку было продемонстрировано, что комбинация мутаций DEKK обеспечивает образование биспецифических IgG-молекул (АВ) с высокой чистотой, авторы настоящего изобретения далее исследовали осуществимость контролируемого получения более комплексных смесей антител из одной клетки, таких как смеси АВ и АА или АВ и АС. Ранее использованные модельные Fab включали в векторы, которые содержат либо конструкцию DE, либо конструкцию КК и различные комбинации этих векторов коэкспрессировали с получением смесей, чтобы продемонстрировать универсальность технологии. Модельные Fab MF1337 (столбнячный токсоид), MF1122 (фибриноген) и MF1025 (тиреоглобулин) были выбраны, исходя из их общего стабильного поведения, высоких уровней экспрессии и отличий масс между IgG, содержащими эти Fab (см. табл. 19).Since a combination of DEKK mutations has been demonstrated to produce high purity bispecific IgG molecules (AB), we further investigated the feasibility of controlled production of more complex mixtures of antibodies from a single cell, such as mixtures of AB and AA or AB and AC. Previously used model Fabs were incorporated into vectors that contained either a DE construct or a KK construct, and various combinations of these vectors were coexpressed to produce mixtures to demonstrate the versatility of the technology. Model Fabs MF1337 (tetanus toxoid), MF1122 (fibrinogen), and MF1025 (thyroglobulin) were selected based on their overall stable behavior, high expression levels, and mass differences between IgGs containing these Fabs (see Table 19).

Таблица 19Table 19

Специфичность Specificity Название Fab Name Fab Масса IgG IgG mass Δ-масса MF1122 Δ-mass MF1122 Столбняк (А) Tetanus (A) (MF) *1337 (MF) *1337 146747,03 146747.03 +1842,05 +1842.05 Фибриноген (В) Fibrinogen (B) (MF) 1122 (MF) 1122 144904,98 144904.98 0 0 Тиреоглобулин (С) Thyroglobulin (C) (MF) 1025 (MF) 1025 144259,87 144259.87 -645,11 -645.11

* MF=Fab Merus, оба обозначения, такие как MF1337 и 1337, используют взаимозаменяемо.* MF=Fab Merus, both designations such as MF1337 and 1337 are used interchangeably.

Таблица 20Table 20

Схема трансфекцииTransfection scheme

Трансфекция # Transfection # Тяжелая цепь 1 Heavy chain 1 Тяжелая цепь 2 Heavy chain 2 Тяжелая цепь 3 Heavy chain 3 Соотношение трансфекции Transfection ratio Ожидаемые типы (%) Expected types (%) Наблюдаемые типы (%) Observable types (%) 1 1 1337-КК 1337-KK 1122-DE 1122-DE 1025-DE 1025-DE 2:1:1 2:1:1 АВ (50%) АС (50%) AB (50%) AC (50%) АВ (43%) АС (57%) AB (43%) AC (57%) 2 2 1337-DE 1337-DE 1122-КК 1122-KK 1025-КК 1025-КК 2:1:1 2:1:1 АВ (50%) АС (50%) AB (50%) AC (50%) АВ (40%) АС (54%) АА (6%) AB (40%) AC (54%) AA (6%) 3 3 1337-КК 1337-KK 1122-DE 1122-DE 1025-КК 1025-КК 1:2:1 1:2:1 АВ (50%) ВС (50%) AB (50%) BC (50%) АВ (54%) ВС (46%) AB (54%) BC (46%) 4 4 1337-КК 1337-KK 1122-КК 1122-KK 1025-DE 1025-DE 1:1:2 1:1:2 АС (50%) ВС (50%) AC (50%) BC (50%) АС (66%) ВС (33%) СС (1%) AC (66%) BC (33%) SS (1%) 5 5 1337-КК 1337-KK 1337-DE 1337-DE 1122-DE 1122-DE 2:1:1 2:1:1 АА (50%) АВ (50%) AA (50%) AB (50%) АА (57%) АВ (43%) AA (57%) AB (43%) 6 6 1337-КК 1337-KK 1122-КК 1122-KK 1122-DE 1122-DE 1:1:2 1:1:2 АВ (50%) ВВ (50%) AB (50%) BB (50%) АВ (75%) ВВ (25%) AB (75%) BB (25%)

- 46 046272- 46 046272

7 7 1337-КК 1337-KK 1337-DE 1337-DE 1025-DE 1025-DE 2:1:1 2:1:1 АА (50%) АС (50%) AA (50%) AC (50%) АА (46%) АС (54%) AA (46%) AC (54%) 8 8 1337-КК 1337-KK 1025-КК 1025-КК 1025-DE 1025-DE 1:1:2 1:1:2 АС (50%) СС (50%) AC (50%) CC (50%) АС (60%) СС (40%) AC (60%) CC (40%) 9 9 1337-КК 1337-KK 1122-DE 1122-DE 1: 1 eleven АВ (100%) AB (100%) АВ (>98%) AB (>98%) 10 10 1337-КК 1337-KK 1025-DE 1025-DE 1:1 1:1 АС (100%) AC (100%) АС (>98%) AC (>98%) 11 eleven 1122-КК 1122-KK 1025-DE 1025-DE 1:1 1:1 ВС (100%) Sun (100%) АС (>98%) AC (>98%)

Анализ SDS-PAGE продемонстрировал, что большинство образцов в основном состояло из IgG и в некоторых случаях присутствовали половинные молекулы в небольших процентных соотношениях. Более того, многие из образцов продемонстрировали две полосы на уровне приблизительно 150 кДа на невосстанавливающих гелях, что отражает присутствие двух различных типов IgG в образце. Также на восстанавливающих гелях в некоторых образцах были видны две полосы тяжелых цепей (данные не представлены).SDS-PAGE analysis demonstrated that most samples were primarily composed of IgG and in some cases half molecules were present in small percentages. Moreover, many of the samples showed two bands at approximately 150 kDa on non-reducing gels, reflecting the presence of two different types of IgG in the sample. Also, two heavy chain bands were visible on reducing gels in some samples (data not shown).

Нативную MS проводили для всех образцов и проценты выявленных типов вычисляли, исходя из высоты пика (% наблюдаемых типов в табл. 20). Результаты представлены на фиг. 24. Во всех восьми образцах, где коэкспрессировались три тяжелых цепи, наблюдали два основных пика, которые соответствовали ожидаемым типам. В двух из этих образцов (трансфекции 2 и 4) и в случае трансфекции 11 наблюдали небольшое количество примесей гомодимера DE-DE. Половинные молекулы были выявлены в очень небольших количествах в большинстве образцов (менее 2%), что не является проблематичным, поскольку они могут быть без труда отделены от фракции полноразмерных IgG, как описано ранее. После nMS было обнаружено, что выявленная масса IgG в образце 11 соответствовала типу, отличающемуся от ожидаемого, и было сделано заключение, что это является следствием ошибки при трансфекции, т.е. в образце 11, по-видимому, 1025-DE был котрансфицирован с 1337-KK вместо 1122-KK.Native MS was performed on all samples and the percentages of types detected were calculated based on the peak height (% of types observed in Table 20). The results are presented in Fig. 24. In all eight samples where the three heavy chains were coexpressed, two major peaks were observed that were consistent with the expected types. In two of these samples (transfections 2 and 4) and in transfection 11, small amounts of DE-DE homodimer impurity were observed. Half molecules were detected in very small quantities in most samples (less than 2%), which is not problematic since they can be easily separated from the full-length IgG fraction as previously described. After nMS, it was found that the detected IgG mass in sample 11 was of a different type than expected, and it was concluded that this was due to a transfection error, i.e. in sample 11, 1025-DE appeared to be cotransfected with 1337-KK instead of 1122-KK.

Образцы IgG далее исследовали в сэндвич-ELISA для подтверждения функционального присутствия желаемой специфичности. Покрытие планшетов для ELISA проводили с помощью фибриногена или тиреоглобулина и обнаружение проводили с помощью меченного флуоресцеином тиреоглобулина или столбнячного токсоида. Антигены для обнаружения были мечены флуоресцеином (набор Pierce NHSfluorescin Antibody Labeling kit, каталожный № #53029) в соответствии с инструкциями изготовителя. Затем меченные флуоресцеином антигены можно было впоследствии обнаруживать с помощью конъюгированного с FITC антитела против флуоресцеина (Roche diagnostics, каталожный № #11426346910).The IgG samples were further tested in a sandwich ELISA to confirm the functional presence of the desired specificity. ELISA plates were coated with fibrinogen or thyroglobulin and detection was performed with fluorescein-labeled thyroglobulin or tetanus toxoid. Detection antigens were labeled with fluorescein (Pierce NHSfluorescin Antibody Labeling kit, catalog #53029) according to the manufacturer's instructions. Fluorescein-labeled antigens could then be subsequently detected using a FITC-conjugated anti-fluorescein antibody (Roche diagnostics, catalog #11426346910).

Результаты ELISA для биспецифических молекул (величины OD450) обобщенно представлены в табл. 21. В выделенных серым цветом ячейках указаны ожидаемые типы для каждой трансфекции. Как правило, результаты удовлетворяют ожидаемому исходу, с учетом исключений, указанных курсивом или полужирным шрифтом. При трансфекциях 1-3, предполагаемая отрицательная лунка для типов ВС (трансфекция #1 и 2) или АС (трансфекция 3) продемонстрировала значительный фоновый сигнал. Из предшествующих исследований известно, что ELISA для биспецифических молекул может иметь недостаток в виде высоких фоновых уровней. Эти фоновые уровни также могут быть вызваны потенциальным присутствием половинных молекул в образце. Следует отметить, что результаты биспецифического ELISA действительно подтвердили, что произошла ошибка при трансфекции #11, поскольку был обнаружен тип АС (величина, выделенная полужирным шрифтом) вместо ВС.ELISA results for bispecific molecules (OD450 values) are summarized in Table. 21. Boxes highlighted in gray indicate the expected types for each transfection. In general, the results satisfy the expected outcome, with exceptions indicated in italics or bold. In transfections 1–3, the putative negative well for BC (transfection #1 and 2) or AC (transfection 3) types showed significant background signal. It is known from previous studies that ELISAs for bispecific molecules may have the disadvantage of high background levels. These background levels may also be caused by the potential presence of half molecules in the sample. It should be noted that the results of the bispecific ELISA did confirm that there was an error in transfection #11, since the type AC (value in bold) was detected instead of BC.

Таблица 21Table 21

Величины OD450 для биспецифического ELISAOD450 values for bispecific ELISA

Обнаруженные типы IgG Detected IgG types Трансфекция Transfection АВ( столбнякфибриноген) AB (tetanus fibrinogen) АС (столбняктиреоглобулин) AS (tetanus thyroglobulin) ВС (фибриногентиреоглобулин) BC (fibrinogenthyreoglobulin) 1 1 0.438 0.438 2 2 1.085 1.085 ||||||||||||||||||| |||||||||||||||||| 0.418 0.418 3 3 1.419 1.419 0.775 0.775 4 4 0.205 0.205 Р795 P795 5 5 1.367 1.367 0.047 0.047 0.057 0.057 6 6 0.043 0.043 0.06 0.06 7 7 0.054 0.054 '1 '1 0054 0054 8 8 0.04 0.04 1.338 : : :: : < < : 1.338 : : :: : < < : 0.052 0.052 9 9 iiliiiiiiiiiiiiiii iiliiiiiiiiiiiiiii 0.048 0.048 0.051 0.051 10 10 0.044 0.044 4.805 4.805 0.055 0.055 11 eleven 0.043 0.043 1.821 1.821 lliilllllllllllll lliillllllllllllll

- 47 046272- 47 046272

Пример 23. Усовершенствованные смеси двух биспецифических антител, распознающих 4 различных эпитопа (АВ и CD), из одной клетки.Example 23. Improved mixtures of two bispecific antibodies recognizing 4 different epitopes (AB and CD) from the same cell.

В примере 12 было предположено, что смеси вследствие трансфекций ZA или ZB, как ожидается, будут проблематичными при переходе на крупномасштабную продукцию, поскольку описано, что варианты типа выступ-в-полости являются нестабильными и нельзя исключить, что CH3-домены, содержащие выступ или полость будут димеризоваться с CH3-доменами с модифицированным способами инженерии зарядом. Как было продемонстрировано в указанных выше примерах, было выявлено, что новые мутанты с зарядовой парой предпочтительно обеспечивают гетеродимеризацию практически без образования гомодимеров, содержащие CI 13-домен полипептидные цепи, содержащие эти новые мутанты с зарядовыми парами, могут экспрессироваться в клетках вместе с ранее известными содержащими СНЗ-домен полипептидными цепями с модифицированным способами инженерии зарядом или потенциально с молекулами SEED, и, вероятно, это приведет к преимущественному образованию только двух биспецифических молекул.In Example 12, it was suggested that mixtures due to ZA or ZB transfections are expected to be problematic when moving to large scale production, since knob-in-cavity variants are described to be unstable and it cannot be excluded that CH3 domains containing knob or the cavity will dimerize with charge-engineered CH3 domains. As demonstrated in the above examples, it was found that the new charge pair mutants preferentially allow heterodimerization with virtually no homodimer formation, CI 13 domain containing polypeptide chains containing these new charge pair mutants can be expressed in cells along with previously known containing CH3 domain with charge engineered polypeptide chains or potentially with SEED molecules and is likely to result in the preferential formation of only two bispecific molecules.

Из описанных выше примеров, понятно, что комбинация мутаций DEKK является превосходной для продуцирования одной биспецифической молекулы (АВ) или двух биспецифических молекул (АВ плюс АС) клональными клетками, где димеризация тяжелых цепей запускается СН3-доменами. Однако, использование только одного набора векторов для комплементарных мутаций CI3 ограничивает количество возможностей для разновидностей смесей, которые могут быть получены. Было бы возможно получить более комплексные смеси IgG и/или биспецифических молекул, таких как смеси АВ и CD или АВ и СС, если бы второй независимый набор векторов можно было использовать в комбинации с DEKK. При комбинировании двух наборов векторов, важным требованием является то, чтобы тяжелые цепи, экспрессированные с двух различных наборов векторов для модифицированных способами инженерии CH3, не могли формировать перекрестные димеры, что представляет собой случай, когда тяжелые цепи, продуцированные одним из наборов векторов, димеризуются в полный IgG с тяжелыми цепями, экспрессированными другим набором векторов.From the examples described above, it is clear that the combination of DEKK mutations is excellent for the production of one bispecific molecule (AB) or two bispecific molecules (AB plus AC) by clonal cells where heavy chain dimerization is driven by CH3 domains. However, using only one set of vectors for CI3 complementation mutations limits the number of possibilities for the variety of mixtures that can be generated. It would be possible to obtain more complex mixtures of IgG and/or bispecific molecules, such as mixtures of AB and CD or AB and CC, if a second independent set of vectors could be used in combination with DEKK. When combining two sets of vectors, an important requirement is that the heavy chains expressed from two different sets of CH3 engineered vectors cannot form crossover dimers, which is the case where the heavy chains produced by one of the vector sets dimerize into full IgG with heavy chains expressed by a different set of vectors.

Для исследования такого потенциального образования перекрестных димеров проводили анализ in silico с использованием HADDOCK для получения дополнительной информации о том, произойдет ли возможное образование пары между CI 13-домечшми дикого типа и CH3-доменами, содержащими DE- или KK-мутации. Аналогично анализировали потенциальное образование пар между CH3-доменами дикого типа и ОТЗ-доменами, содержащими мутации E356K,D399K или K392D,K409D, а также потенциальное образование пар между ОТЗ-доменами дикого типа и CI 13-домечшми, содержащими мутации типа выступ-в-полости и любую комбинацию из вышеуказанных. Комбинации мутантов CI3, которые анализировали в IADDOCK, приведены в табл. 22, и полученные показатели IADDOCK обобщенно представлены на фиг. 25.To investigate this potential cross-dimer formation, in silico analysis was performed using HADDOCK to obtain additional information on whether pairing would occur between wild-type CI 13 domains and CH3 domains containing DE or KK mutations. Potential pairing between wild-type CH3 domains and OTP domains containing the E356K,D399K or K392D,K409D mutations, as well as potential pairing between wild-type OTT domains and CI 13-domestic containing knob-to-mutations, were similarly analyzed. cavities and any combination of the above. The combinations of CI3 mutants that were analyzed in IADDOCK are given in Table. 22, and the resulting IADDOCK scores are summarized in FIG. 25.

Таблица 22Table 22

Варианты CI3, проанализированные в IADDOCK с однобуквенными кодами, присвоенными для каждой содержащей вариант CH3 тяжелой цепиCI3 variants analyzed in IADDOCK with single letter codes assigned for each heavy chain containing a CH3 variant

Комбинация СНЗ SNZ combination Мутации Mutations Однобуквенный код в HADDOCK Single letter code in HADDOCK DEKK DECK Цепь 1: T366K,L351K Chain 1: T366K,L351K А A Цепь 2: L351D,L368E Chain 2: L351D,L368E В IN Дикий тип (WT) Wild type (WT) Цепь 1: нет Circuit 1: no С* WITH* Цепь 2: нет Circuit 2: no D* D* Обращение заряда (CR) Charge Reversal (CR) Цепь 1: K392D,K409D Chain 1: K392D,K409D А/С** A/C** Цепь 2: E356K,D399K Chain 2: E356K,D399K B/D** B/D** выступ-в- полости (KIH) ledge-in- cavities (KIH) Цепь 1: T366W Chain 1: T366W С WITH Цепь 2: T366S,L368A,Y407V Chain 2: T366S,L368A,Y407V D D

* Цепи дикого типа обозначают как С и D для систематичности.*Wild-type chains are referred to as C and D for consistency.

** Варианты с обращением заряда обозначают как А и В, когда они находятся в комбинации с вариантами типа выступ-в-полости, и их обозначают С и D, когда они находится в комбинации с вариантами DE/KK.**Charge reversal options are designated A and B when in combination with lip-in-hollow options, and are designated C and D when in combination with DE/KK options.

На фиг. 25 показано, что, исходя из этих прогнозов HADDOCK, комбинирование комбинаций DEKK CI3 с комбинациями CI3 с обращением заряда, наиболее вероятно, будет успешным с точки зрения образования желаемой комбинации двух биспецифических молекул (АВ и CD) без примесей побочных продуктов (особенно АС, AD, ВС, BD) при котрансфекции в одной клетке. Как можно видеть из фиг. 25, эти нежелательные биспецифические типы AC, AD, ВС и BD имеют относительно высокие показатели IADDOCK, в то время как желаемые типы АВ и CD имеют наиболее низкие показателиIn fig. 25 shows that, based on these HADDOCK predictions, combining DEKK CI3 combinations with charge reversal CI3 combinations is most likely to be successful in terms of producing the desired combination of two bispecific molecules (AB and CD) without byproduct impurities (especially AC, AD , BC, BD) when cotransfected in one cell. As can be seen from FIG. 25, these undesirable bispecific types AC, AD, BC and BD have relatively high IADDOCK scores, while the desirable types AB and CD have the lowest scores.

- 48 046272- 48 046272

HADDOCK. Безусловно, когда любая из комбинаций CH3 DEKK или с обращением заряда будет помещена в конструкцию, обладающую той же специфичностью (например С на DE-стороне, С на KK-стороне, А на Ε356Κ^399Κ^τορο^ и В на Ε356Κ^399Κ^τορο^, или А на DE-стороне, В на KK-стороне, С на Ε356Κ^399Κ^τορο^ и С на E356K,D399K-стороне), это приведет к продукции в основном СС и АВ при коэкспрессии в клетке.HADDOCK. Of course, when any of the CH3 DEKK or charge reversal combinations are placed in a structure having the same specificity (for example C on the DE side, C on the KK side, A on Ε356Κ^399Κ^τορο^ and B on Ε356Κ^399Κ^ τορο^, or A on the DE side, B on the KK side, C on the Ε356Κ^399Κ^τορο^ and C on the E356K,D399K side), this will lead to the production of mostly CC and AB when co-expressed in the cell.

Напротив, при рассмотрении прогнозов для коэкспрессии DEKK с диким типом можно видеть, что показатели HADDOCK для АС и AD являются более низкими, чем показатель HADDOCK для CD, что указывает на то, что АС и AD являются очень вероятными примесями при попытке получить смесь АВ и CD путем коэкспрессии векторов, кодирующих комбинации CH3 DEKK, вместе с векторами, кодирующими CH3 дикого типа. Наконец, прогнозы для коэкспрессии либо DEKK, либо вариантов с обращением заряда вместе с вариантами типа выступ-в-полости дают нежелательные биспецифические варианты с относительно низкими показателями HADDOCK, т.е. высокой вероятностью того, что эти нежелательные типы будут продуцироваться при коэкспрессии.In contrast, when considering the predictions for coexpression of DEKK with wild type, it can be seen that the HADDOCK scores for AC and AD are lower than the HADDOCK score for CD, indicating that AC and AD are very likely contaminants when attempting to produce a mixture of AB and CD by coexpression of vectors encoding CH3 DEKK combinations together with vectors encoding wild-type CH3. Finally, predictions for coexpression of either DEKK or charge-reversal variants together with knob-in-cavity variants yield undesirable bispecific variants with relatively low HADDOCK scores, i.e. there is a high probability that these undesirable types will be produced when co-expressed.

Таким образом, было сделано заключение, что комбинирование комбинаций CH3 DEKK с комбинациями CH3 с обращением заряда (E356K,D399K/K392'’D,K4O9D') идеально подходит для получения по существу чистых смесей антител АВ и CD и/или АВ и СС.It was therefore concluded that combining CH3 DEKK combinations with charge reversal CH3 combinations (E356K,D399K/K392''D,K4O9D') is ideal for producing essentially pure mixtures of AB and CD and/or AB and CC antibodies.

Далее получали смеси 2 биспецифических молекул, распознающих 4 мишени/эпитопа (АВ и CD), и смеси одного биспецифического и 1 моноспецифического антитела, распознающих 3 мишени/эпитопа (АВ и СС), применяя вышеописанное на практике. Эти смеси создавали с использованием 4 различных VH, все из которых способны образовывать пару с общей легкой цепью IGVK1-39, однако все индивидуальные комбинации VH/VL обладают отличающейся специфичностью. Для проведения анализа с помощью нативной MS различие масс между (ожидаемыми) типами должно быть достаточным, т.е. >190 Да. Было выбрано четырех индивидуальных VH и их массы были такими, чтобы ожидаемые типы при котрансфекции можно было идентифицировать и разделить с помощью nMS. Более того, различия масс между 4 выбранными VH также являются достаточно большими, чтобы идентифицировать большинство возможных примесей в смесях, в дополнение к двум желаемым типам. Выбранные VH приведены в табл. 23.Next, mixtures of 2 bispecific molecules recognizing 4 targets/epitopes (AB and CD), and mixtures of one bispecific and 1 monospecific antibody recognizing 3 targets/epitopes (AB and CC) were obtained, applying the above in practice. These mixtures were created using 4 different VHs, all of which are able to pair with the common light chain of IGVK1-39, but each individual VH/VL combinations have different specificities. To perform analysis using native MS, the mass difference between the (expected) types must be sufficient, i.e. >190 Yes. Four individual VHs were selected and their masses were such that the expected types upon cotransfection could be identified and separated by nMS. Moreover, the mass differences between the 4 selected VHs are also large enough to identify most of the possible impurities in the mixtures, in addition to the two desired types. Selected VH are given in table. 23.

Таблица 23Table 23

VH (мишень) VH (target) Масса как в IgG wt Weight as in IgG wt A (RTK1) A (RTK1) 146736,78 146736.78 В (столбнячный токсоид) B (tetanus toxoid) 146106,20 146106.20 С (Фибриноген) C (Fibrinogen) 144904,98 144904.98 D (RTK2) D (RTK2) 145421,37 145421.37

Четыре различных VH клонировали в векторы, содержащие конструкции DE или KK или конструкции с обращением заряда, и проводили несколько котрансфекций, как указано в табл. 24. Примечание: как всегда, все векторы также содержали нуклеиновую кислоту, кодирующую общую легкую цепь IGKV1-39. Как описано ранее, при комбинировании двух наборов векторов важным требованием является то, что тяжелые цепи, экспрессированные с двух различных наборов сконструированных векторов с CH3, не могут образовывать перекрестные димеры, что означает, что тяжелые цепи, продуцированные одним из наборов векторов, димеризуются в полноразмерный IgG с тяжелыми цепями, экспрессируемыми другим набором векторов. Для исследования такого потенциального образования перекрестных димеров между тяжелыми цепями, содержащими мутации с обращением заряда, и тяжелыми цепями, содержащими мутации DE или KK, проводили контрольные трансфекции.Four different VHs were cloned into vectors containing DE or KK constructs or charge reversal constructs, and several cotransfections were performed as indicated in Table. 24. Note: As always, all vectors also contained nucleic acid encoding the common IGKV1-39 light chain. As described previously, when combining two sets of vectors, an important requirement is that the heavy chains expressed from two different sets of CH3-constructed vectors cannot form cross-dimers, meaning that the heavy chains produced by one of the vector sets dimerize into the full-length IgG with heavy chains expressed by a different set of vectors. To investigate this potential cross-dimer formation between heavy chains containing charge-reversal mutations and heavy chains containing DE or KK mutations, control transfections were performed.

- 49 046272- 49 046272

Таблица 24Table 24

Трансфекция # Transfection # 1-ая VH/конструкция # 1st VH/design # 2-ая VH/конструкция # 2nd VH/design # Ожидаемые типы Expected types 1 1 D/68 D/68 А/68 A/68 несоответствие КК и КК; ожидаются по большей части половинные молекулы inconsistency between QC and QC; mostly half molecules are expected 2 2 D/68 D/68 А/69 A/69 соответствие КК и DE; ожидается продукт AD compliance with QC and DE; AD product expected 3 3 D/68 D/68 А/1 A/1 Ожидается несоответствие КК и Е356К:D399K Expected discrepancy between QC and E356K:D399K 4 4 D/68 D/68 А/2 A/2 Ожидается несоответствие КК и K392D:К409D Expected discrepancy between QC and K392D:K409D 5 5 D/69 D/69 А/68 A/68 соответствие DE и КК; ожидается продукт AD DE and QC compliance; AD product expected 6 6 D/69 D/69 А/69 A/69 несоответствие DE и DE; ожидается смесь половинных молекул, АА, AD и DD DE and DE mismatch; a mixture of half molecules, AA, AD and DD is expected 7 7 D/69 D/69 А/1 A/1 Ожидается несоответствие DE и Е356К:D399K Expected discrepancy between DE and E356K:D399K 8 8 D/69 D/69 А/2 A/2 Ожидается несоответствие DE и K392D:К409D Expected discrepancy between DE and K392D:K409D Трансфекция # Transfection # 1-ая VH/конструкция # 1st VH/design # 2-ая VH/конструкция # 2nd VH/design # 3-я VH/конструкция # 3rd VH/design # 4-ая VH/конструкция # 4th VH/design # Ожидаемые типы Expected types 9 9 А/68 A/68 В/69 B/69 С/1 C/1 D/2 D/2 АВ и CD AB and CD 10 10 А/68 A/68 А/69 A/69 С/1 C/1 D/2 D/2 АА и CD AA and CD 11 eleven А/68 A/68 В/69 B/69 С/1 C/1 С/2 C/2 АВ и СС AB and SS

В табл. 25 предоставлен дополнительный обзор масс ожидаемых типов и возможные примеси при трансфекциях #9-11 табл. 24.In table Table 25 provides an additional overview of the masses of expected types and possible impurities in transfections #9-11 table. 24.

Таблица 25Table 25

Трансфекция # 9 Transfection #9 Тип* Type* Масса Weight Отличие масс Mass difference С WITH 72464,62 72464.62 D D 72684,53 72684.53 219,90 219.90 В IN 73070,99 73070.99 386,47 386.47 А A 73410,46 73410.46 339,47 339.47 СС SS 144929,2 144929.2 71518,78 71518.78 ociiiiiS ociiiiS 145149:2:::::::::: 145149:2:::::::::: DD DD 145369,1 145369.1 219,90 219.90 ВС Sun 145535,6 145535.6 166,56 166.56 BD BD 145755,5 145755.5 219,90 219.90 АС AC 145875,1 145875.1 119,57 119.57 AD AD 146095 146095 219,90 219.90 ВВ BB 146142 146142 47,00 47.00 146481-5 :: ::: :: : :: :: 146481-5 :: ::: :: : :: :: lillfillillilll) lillfillillill) АА AA 146820,9 146820.9 339,47 339.47 Трансфекция # 10 Transfection #10 Тип Type Масса Weight Отличие масс Mass difference С WITH 72464,62 72464.62 D D 72684,53 72684.53 219,90 219.90 А A 73410,46 73410.46 725,94 725.94 СС SS 144929,2 144929.2 71518,78 71518.78 DD DD 145369,1 145369.1 219,90 219.90 АС AC 145875,1 145875.1 506,03 506.03 AD AD 146095 146095 219,90 219.90 14682(19 : 14682(19 : lliilillllllllll lliilillllllllll

- 50 046272- 50 046272

Трансфекция # 11 Transfection #11 Тип Type Масса Weight Отличие масс Mass difference С WITH 72464,62 72464.62 в V 73070,99 73070.99 606,37 606.37 А A 73410,46 73410.46 339,47 339.47 СС SS 144890,95 144890.95 71480,49 71480.49 ВС Sun 145535,61 145535.61 644,66 644.66 АС AC 145875,08 145875.08 339,47 339.47 вв bb 146141,98 146141.98 266,90 266.90 АВ AB 146481,45 146481.45 339,47 339.47 АА AA 146820,92 146820.92 339,47 339.47

Для каждой из трансфекций #9-11 типы отсортированы по массе, отличие масс вычислено с помощью масс, указанных выше.For each of transfections #9-11, the types are sorted by mass, the mass difference being calculated using the masses listed above.

Серые ячейки: ожидаемые (и желательные) типы.Gray cells: expected (and desired) types.

Курсив: отличие масс является слишком малым, чтобы осуществить разделение в анализе nMS.Italics: The mass difference is too small to allow separation in nMS analysis.

* Типы: единичные буквы соответствуют половинным молекулам; двухбуквенный код указывает на целый IgG.* Types: single letters correspond to half molecules; the two-letter code indicates whole IgG.

Все очищенные образцы белков, полученные после трансфекций.All purified protein samples obtained after transfections.

#1-11 анализировали на SDS-PAGE, и было включено три контрольных образца (фиг. 26). Кроме того, анализ nMS проводили на образцах белка после трансфекций # 9-11 для идентификации всех типов в образцах. Как можно видеть из фиг. 26, трансфекции #3 и #4 приводили к ожидаемому несоответствию между конструкциями KK и либо E356K:D399K, либо K392D:K409D, и количество половинных молекул в образцах белков после этих трансфекций превышало количество полноразмерных молекул IgG. Трансфекции #7 и #8 привели к образцам белков, где как половинные молекулы, так и полный IgG присутствуют приблизительно в равных количествах. Однако из SDS-PAGE нельзя установить, соответствует ли полный IgG димеру DE/DE, димеру DE/E356K:D399K или димеру DE/K392D:K409D. Примечательно, что практически не наблюдали половинных молекул в образцах после трансфекций #9-11.#1-11 were analyzed on SDS-PAGE and three controls were included (FIG. 26). Additionally, nMS analysis was performed on protein samples from transfections #9-11 to identify all types within the samples. As can be seen from FIG. 26, transfections #3 and #4 resulted in the expected mismatch between the KK constructs and either E356K:D399K or K392D:K409D, and the number of half-molecules in the protein samples from these transfections exceeded the number of full-length IgG molecules. Transfections #7 and #8 resulted in protein samples where both half molecules and full IgG were present in approximately equal amounts. However, it cannot be determined from SDS-PAGE whether the total IgG corresponds to the DE/DE dimer, the DE/E356K:D399K dimer, or the DE/K392D:K409D dimer. It is noteworthy that almost no half molecules were observed in the samples after transfections #9-11.

На фиг. 27 представлен анализ nMS для трансфекций #9 и #11. Проценты ожидаемых типов и являющихся примесями типов вычисляли по высоте пика. Было продемонстрировано, что для трансфекции #9, ожидаемые типы АВ и CD соответствуют 97% смеси (30% АВ и 67% CD), в то время как присутствовало только приблизительно 3% примесей BD (фиг. 27А). Для трансфекции # 11 ожидаемые типы АВ и СС соответствуют 94% смеси (33% АВ и 61% СС), в то время как присутствует только приблизительно 6% примесей ВС (4,1%) и АС (1,8%) (фиг. 27В). Эти данные демонстрируют, что действительно возможно получить более комплексные смеси IgG и/или биспецифических молекул, такие как смеси АВ и CD или АВ и СС, когда второй независимый набор векторов используют в комбинации с DEKK. Комбинация конструкций с обращенным зарядом с конструкциями DEKK приводит к только очень ограниченному образованию перекрестных димеров. Ожидается, что путем корректирования соотношений трансфекции низкие проценты этих примесей побочных продуктов могут быть снижены еще далее.In fig. 27 shows nMS analysis for transfections #9 and #11. The percentages of expected types and contaminant types were calculated from the peak height. It was demonstrated that for transfection #9, the expected AB and CD types corresponded to 97% of the mixture (30% AB and 67% CD), while only approximately 3% BD impurities were present (Fig. 27A). For transfection #11, the expected AB and CC types correspond to 94% of the mixture (33% AB and 61% CC), while only approximately 6% BC (4.1%) and AC (1.8%) contaminants are present (Fig. .27V). These data demonstrate that it is indeed possible to obtain more complex mixtures of IgG and/or bispecific molecules, such as mixtures of AB and CD or AB and CC, when a second independent set of vectors is used in combination with DEKK. Combining charge-reversed constructs with DEKK constructs results in only very limited cross-dimer formation. It is expected that by adjusting transfection ratios, the low percentages of these byproduct impurities can be reduced even further.

Пример 24. Исследование фармакокинетики с однократной дозой у мышей.Example 24 Single dose pharmacokinetic study in mice.

Для исследования фармакокинетического (pK) поведения биспецифических антител, содержащих комбинацию мутаций DEKK в их областях CH3, в этом исследовании определяли и сравнивали параметры pK для трех различных партий IgG.To investigate the pharmacokinetic (pK) behavior of bispecific antibodies containing a combination of DEKK mutations in their CH3 regions, this study determined and compared pK parameters for three different batches of IgG.

Три партии IgG включалиThree batches of IgG included

1) родительское антитело дикого типа против столбнячного токсоида 1337:1337 (два Fab MF1337 на остове Fc дикого типа);1) parental wild-type antibody against tetanus toxoid 1337:1337 (two Fab MF1337 on the wild-type Fc backbone);

2) родительское антитело против столбнячного токсоида 1516:1516 (два MF1516 Fab на Fc-остове дикого типа);2) parental anti-tetanus toxoid antibody 1516:1516 (two MF1516 Fabs on the wild-type Fc backbone);

3) биспецифическое антитело против столбнячного токсоида с модифицированным способами инженерии CH3 1516:1337, которое содержит комбинацию мутаций DEKK в Fc-области (MF1516 Fab на DE-стороне, MF1337 Fab на KK-стороне).3) bispecific antibody against tetanus toxoid engineered CH3 1516:1337, which contains a combination of DEKK mutations in the Fc region (MF1516 Fab on the DE side, MF1337 Fab on the KK side).

Родительские антитела 1337:1337 и 1516:1516 были выбраны в качестве специфичностей для включения в биспецифический продукт с DEKK, поскольку было известно, что исходя из предшествующих исследований в нескольких штаммах мышей отсутствовал ответ в сыворотке до введения дозы. Примечание: присутствие ответа сыворотки до введения дозы, безусловно, делает исследование недействительным. Кроме того, существует достаточное отличие масс между родительскими антителами, чтобы обеспечить идентификацию типов 1337:1337 (wt Fc), 1516:1337 (DEKK Fc) и 1516:1516 (wt Fc) с помощью nMS. Три партии IgG получали, как описано ранее, однако ДНК, используемую для трансфекции, получали с использованием набора Endo-free maxiprep kit, чтобы гарантировать, что количество эндотокParental antibodies 1337:1337 and 1516:1516 were selected as specificities for inclusion in the DEKK bispecific product because it was known that there was no pre-dose serum response from previous studies in several mouse strains. Note: The presence of a serum response prior to dosing will certainly invalidate the study. In addition, there is sufficient mass difference between the parent antibodies to allow identification of types 1337:1337 (wt Fc), 1516:1337 (DEKK Fc), and 1516:1516 (wt Fc) by nMS. Three batches of IgG were prepared as previously described, however the DNA used for transfection was prepared using the Endo-free maxiprep kit to ensure that the amount of endocurrent

- 51 046272 синов является максимально низким. Затем партии исследовали в отношении концентрации белков, уровней агрегатов, уровней эндотоксинов и процента биспецифического продукта. Было продемонстрировано, что критерии соответствия для последующего применения партий IgG в исследовании pK удовлетворялись, т.е. концентрация IgG после гель-фильтрации составляла >0,3 мг/мл, уровни агрегатов составляли <5%, уровни эндотоксинов составляли <3 EU/мг белка и партия DEKK содержала >90% биспецифического IgG.- 51 046272 syns is the lowest possible. The batches were then examined for protein concentration, aggregate levels, endotoxin levels, and percentage of bispecific product. It was demonstrated that the eligibility criteria for subsequent use of IgG lots in the pK study were met, i.e. the IgG concentration after gel filtration was >0.3 mg/mL, aggregate levels were <5%, endotoxin levels were <3 EU/mg protein, and the DEKK batch contained >90% bispecific IgG.

Нативная масс-спектрометрия образцов после гель-фильтрации продемонстрировала, что ожидаемые типы присутствовали на высоких процентах. В образце 1516:1337 обнаружено небольшое количество гомодимера DE:DE, которое, согласно оценке, составляет приблизительно 2% (фиг. 28). Было сделано заключение, что 3 партии IgG подходят для использования в исследовании pK.Native mass spectrometry of samples after gel filtration demonstrated that the expected types were present at high percentages. Sample 1516:1337 contained a small amount of DE:DE homodimer, estimated to be approximately 2% (FIG. 28). It was concluded that 3 batches of IgG were suitable for use in the pK study.

Для сравнения параметров pK между тремя партиями 3 группам самок мышей C57BL/6J (Harlan, Нидерланды) вводили 1 мг/кг IgG человека (5 мл/кг раствор иммуноглобулина/кг массы тела). В момент введения возраст животных составлял 7-8 недель, и они имели массу тела приблизительно 18-20 г. Образцы крови собирали до введения дозы и через 15, 60 мин и 2, 4, 8, 24, 48, 96, 168, 268 и 336 ч после дозирования. Образцы сыворотки получали и хранили при <-20°C до анализа. Каждая группа состояла из 3 подгрупп по 4 мыши, т.е. 12 мышей/группа. Проводили взятие образцов от каждой мыши в 6 моментов времени. Жизнеобеспечение животных осуществляли в соответствии с общими принципами, регулирующими использование животных в экспериментах European Communities (директива 86/609/ЕЕС) и Dutch legislation (The Experiments on Animals Act, 1997). Это исследование также проводили в соответствии со Standards for Humane Care and Use of Laboratory Animals, от Office of Laboratory Animal Welfare, U.S. National Institutes of Health, под идентификационным номером 45859-01 (дата истечения срока: 30 апреля 2015 г.).To compare pK parameters between the three batches, 3 groups of female C57BL/6J mice (Harlan, the Netherlands) were injected with 1 mg/kg human IgG (5 ml/kg immunoglobulin solution/kg body weight). At the time of administration, the animals were 7-8 weeks old and had a body weight of approximately 18-20 g. Blood samples were collected pre-dose and at 15, 60 and 2, 4, 8, 24, 48, 96, 168, 268 and 336 hours after dosing. Serum samples were obtained and stored at <−20°C until analysis. Each group consisted of 3 subgroups of 4 mice, i.e. 12 mice/group. Samples were taken from each mouse at 6 time points. Animal welfare was carried out in accordance with the general principles governing the use of animals in experiments of the European Communities (directive 86/609/EEC) and Dutch legislation (The Experiments on Animals Act, 1997). This study was also conducted in accordance with the Standards for Humane Care and Use of Laboratory Animals, Office of Laboratory Animal Welfare, U.S. National Institutes of Health, under ID number 45859-01 (expiration date: April 30, 2015).

Мышам группы 1 вводили полноразмерное моноспецифическое IgG-антитело 1516:1516 (треугольники); мышам в группе 2 вводили полноразмерное моноспецифическое IgG-антитело 1337:1337 (квадраты); мышам в группе 3 вводили полноразмерное биспецифическое IgG-антитело 1516:1337 (ромбы) с модифицированными способами инженерии DEKK областями CH3 (1516 на DE-стороне и 1337 на KK-стороне).Group 1 mice were injected with full-length monospecific IgG antibody 1516:1516 (triangles); mice in group 2 were injected with full-length monospecific IgG antibody 1337:1337 (squares); Mice in Group 3 were treated with full-length bispecific IgG antibody 1516:1337 (diamonds) with DEKK-engineered CH3 regions (1516 on the DE side and 1337 on the KK side).

Анализ ELISA использовали для количественного анализа моноклональных антител человека в сыворотке мыши с использованием количественного ELISA для IgG человека (ZeptoMetrix, NY USA; набор ELISA № 0801182). В кратком изложении, анализ ELISA основан на принципе, что моноклональное антитело человека связывается с IgG против антител человека, нанесенным на 96-луночный планшет для ELISA. Затем связавшееся антитело визуализируют с использованием поликлонального IgG-антитела против антител человека, конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP). Оптическая плотность каждой лунки прямо пропорциональна количеству антитела в образце сыворотки. Результаты представлены на фиг. 29, и было выявлено, что сывороточные уровни как биспецифического полноразмерного IgG-антитела, содержащего комбинацию мутаций DEKK, так и его родительских моноспецифических антител, являются поразительно сходными. Было сделано заключение, что мутации CH3, присутствующие в биспецифическом антителе DEKK, не изменяют ни стабильности, ни времени полужизни, и вариант DEKK имеет такое же поведение, как и IgG дикого типа.The ELISA assay was used to quantify human monoclonal antibodies in mouse serum using the human IgG quantitative ELISA (ZeptoMetrix, NY USA; ELISA kit no. 0801182). Briefly, the ELISA assay is based on the principle that a human monoclonal antibody binds to an anti-human IgG coated on a 96-well ELISA plate. The bound antibody is then visualized using a polyclonal anti-human IgG antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP). The optical density of each well is directly proportional to the amount of antibody in the serum sample. The results are presented in Fig. 29, and serum levels of both the bispecific full-length IgG antibody containing a combination of DEKK mutations and its parental monospecific antibodies were found to be strikingly similar. It was concluded that the CH3 mutations present in the DEKK bispecific antibody do not alter either stability or half-life, and the DEKK variant has the same behavior as wild-type IgG.

СсылкиLinks

Deisenhofer J., Biochemistry 1981(20)2361-2370;Deisenhofer J., Biochemistry 1981(20)2361-2370;

Miller S., J. Mol. Biol. 1990(216)965-973;Miller S., J. Mol. Biol. 1990(216)965-973;

Padlan, Advances in Protein Chemistry 1996 (49) 57-133Padlan, Advances in Protein Chemistry 1996 (49) 57-133

Ellerson JR., et al., J. Immunol 1976 (116) 510-517;Ellerson JR., et al., J. Immunol 1976 (116) 510-517;

Lee and Richards J. Mol. Biol. 1971(55)379.Lee and Richards J. Mol. Biol. 1971(55)379.

Gunasekaran et al J.Biol.Chern. 2010(285)19637-19646Gunasekaran et al J Biol Chern. 2010(285)19637-19646

De Vries Nature Protocols 2010(5)883De Vries Nature Protocols 2010(5)883

Rabat et al, (1991)Rabat et al (1991)

- 52 046272- 52 046272

Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach (M.Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach (M.

Butler, ed., IRL Press, 1991Butler, ed., IRL Press, 1991

Merchant Nature biotechnology 1998(16)677Merchant Nature biotechnology 1998(16)677

Ridgeway Protein Engineering 1996(9)617-621.Ridgeway Protein Engineering 1996(9)617-621.

Davis JH. Et al., Protein Engineering, Design & SelectionDavis JH. Et al., Protein Engineering, Design & Selection

2010(23)195-2022010(23)195-202

Papadea and Check. Crit Rev Clin Lab Sci. 1989,-27(1):2758 .Papadea and Check. Crit Rev Clin Lab Sci. 1989, -27(1):2758.

Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973)Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973)

Ionescu et al., J. Pharm. Sci. 2008 (97)1414)Ionescu et al., J. Pharm. Sci. 2008 (97)1414)

Current protocols in Protein Science 1995, coligan JE et al., Wingfield PT, ISBN 0-471-11184-8, Bendig 1988.Current protocols in Protein Science 1995, Coligan JE et al., Wingfield PT, ISBN 0-471-11184-8, Bendig 1988.

Capelle, M.A.H., Brugger, P., Arvinte, T. Vaccine 23 (2005), 1686-1694.Capelle, M.A.H., Brugger, P., Arvinte, T. Vaccine 23 (2005), 1686-1694.

Demeule, B., Lawrence, M.J., Drake, A.F., Gurny, R.,Demeule, B., Lawrence, M. J., Drake, A. F., Gurny, R.,

Arvinte, T. Biochim. Biophys. Acta 1774 (2007a), 146-153.Arvinte, T. Biochim. Biophys. Acta 1774 (2007a), 146-153.

Demeule, B., Gurny, R., Arvinte, T., Int. J. Pharm 329 (2007b), 37-45.Demeule, B., Gurny, R., Arvinte, T., Int. J. Pharm 329 (2007b), 37-45.

Lakowicz, J.R., Principles of fluorescence spectroscopy;Lakowicz, J.R., Principles of fluorescence spectroscopy;

Second Edition Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York,Second Edition Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York,

Boston, Dordrecht, London, Moscow, (2006) ISBN 0-306-46093-9.Boston, Dordrecht, London, Moscow, (2006) ISBN 0-306-46093-9.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM

1. Способ получения гетеродимерного антитела с помощью клетки-хозяина, где указанное антитело содержит два CH3-домена, которые способны образовывать поверхность контакта, причем указанный способ включает1. A method for producing a heterodimeric antibody using a host cell, wherein said antibody contains two CH3 domains that are capable of forming a contact surface, said method comprising

i) введение первой нуклеиновой кислоты, кодирующей первую содержащую CH3-домен полипептидную цепь, и второй нуклеиновой кислоты, кодирующей вторую содержащую CI 13-доме'н полипептидную цепь, в клетку-хозяина, где указанная первая содержащая CI 13-доме'н полипептидная цепь содержит положительно заряженный аминокислотный остаток в аминокислотном положении 366 согласно системе нумерации EU и указанная вторая содержащая CI 13-доме'н полипептидная цепь содержит отрицательно заряженный аминокислотный остаток в аминокислотном положении 351 согласно системе нумерации EU;i) introducing a first nucleic acid encoding a first CH3 domain-containing polypeptide chain and a second nucleic acid encoding a second CI 13 domain-containing polypeptide chain into a host cell, wherein said first CI 13 domain-containing polypeptide chain contains a positively charged amino acid residue at amino acid position 366 according to the EU numbering system and said second CI 13-domain polypeptide chain contains a negatively charged amino acid residue at amino acid position 351 according to the EU numbering system;

ii) культивирование указанной клетки-хозяина и обеспечение экспрессии указанных двух нуклеиновых кислот; и iii) сбор указанного гетеродимерного антитела из культуры.ii) culturing said host cell and causing expression of said two nucleic acids; and iii) collecting said heterodimeric antibody from the culture.

2. Способ получения гетеродимерного антитела с помощью клетки-хозяина, где указанное антитело содержит два CH3-домена, которые способны образовывать поверхность контакта, причем указанный способ включает2. A method for producing a heterodimeric antibody using a host cell, wherein said antibody contains two CH3 domains that are capable of forming a contact surface, said method comprising

i) введение первой нуклеиновой кислоты, кодирующей первую содержащую CI 13-доме'н полипептидную цепь, и второй нуклеиновой кислоты, кодирующей вторую содержащую CI 13-доме'н полипептидную цепь, в клетку-хозяина, где указанная первая содержащая CI 13-доме'н полипептидная цепь содержит отрицательно заряженный аминокислотный остаток в аминокислотном положении 366 согласно системе нумерации EU и указанная вторая содержащая CI 13-доме'н полипептидная цепь содержит положительно заряженный аминокислотный остаток в аминокислотном положении 351 согласно системе нумерации EU;i) introducing a first nucleic acid encoding a first CI 13 domain-containing polypeptide chain and a second nucleic acid encoding a second CI 13 domain-containing polypeptide chain into a host cell, wherein said first CI 13 domain-containing polypeptide chain n polypeptide chain contains a negatively charged amino acid residue at amino acid position 366 according to the EU numbering system and said second CI-containing 13-domain polypeptide chain contains a positively charged amino acid residue at amino acid position 351 according to the EU numbering system;

3. Способ по п.1 или 2, дополнительно включающий предоставление клетке-хозяину указанной нуклеиновой кислоты, кодирующей общую легкую цепь, которая способна образовывать пару по меньшей мере с двумя различными тяжелыми цепями.3. The method of claim 1 or 2, further comprising providing the host cell with said nucleic acid encoding a common light chain that is capable of pairing with at least two different heavy chains.

4. Способ по п.1 или 3, где указанная первая содержащая CI 13-доме'н полипептидная цепь содержит остаток лизина (K) в аминокислотном положении 366 согласно системе нумерации EU и указанная вто4. The method according to claim 1 or 3, wherein said first CI-containing 13-domain polypeptide chain contains a lysine residue (K) at amino acid position 366 according to the EU numbering system and said second

- 53 046272 рая содержащая СНЗ-домен полипептидная цепь содержит остаток аспарагиновой кислоты (D) в аминокислотном положении 351 согласно системе нумерации EU.- 53 046272 The CH3 domain-containing polypeptide chain contains an aspartic acid residue (D) at amino acid position 351 according to the EU numbering system.

5. Способ по п.4, где указанная первая содержащая CH3-домен полипептидная цепь дополнительно содержит остаток лизина (K) в аминокислотном положении 351 согласно системе нумерации EU.5. The method of claim 4, wherein said first CH3 domain-containing polypeptide chain further comprises a lysine residue (K) at amino acid position 351 according to the EU numbering system.

6. Способ по п.4 или 5, где указанная вторая содержащая CH3-домен полипептидная цепь дополнительно содержит остаток глутаминовой кислоты (Е) или остаток аспарагиновой кислоты (D) в аминокислотном положении 349 согласно системе нумерации EU и/или остаток глутаминовой кислоты (Е) в аминокислотном положении 368 согласно системе нумерации EU.6. The method according to claim 4 or 5, wherein said second CH3 domain-containing polypeptide chain further comprises a glutamic acid residue (E) or an aspartic acid residue (D) at amino acid position 349 according to the EU numbering system and/or a glutamic acid residue (E ) at amino acid position 368 according to the EU numbering system.

7. Способ по п.6, где указанная вторая содержащая CH3-домен полипептидная цепь дополнительно содержит остаток глутаминовой кислоты (Е) в аминокислотном положении 368 согласно системе нумерации EU.7. The method of claim 6, wherein said second CH3 domain-containing polypeptide chain further comprises a glutamic acid (E) residue at amino acid position 368 according to the EU numbering system.

8. Способ по любому из пп.1-7, в котором наличие загрязняющих гомодимеров в культуре клетокхозяев составляет менее 5%.8. The method according to any one of claims 1 to 7, wherein the presence of contaminating homodimers in the host cell culture is less than 5%.

9. Способ по любому из пп.1-8, в котором наличие загрязняющих гомодимеров в культуре клетокхозяев составляет менее 2%.9. The method according to any one of claims 1 to 8, wherein the presence of contaminating homodimers in the host cell culture is less than 2%.

10. Способ по любому из пп.1-9, в котором наличие загрязняющих гомодимеров в культуре клетокхозяев составляет менее 1%.10. The method according to any one of claims 1 to 9, wherein the presence of contaminating homodimers in the host cell culture is less than 1%.

11. Способ по любому из пп.1-10, в котором загрязняющие гомодимеры по существу отсутствуют в культуре клеток-хозяев.11. The method according to any one of claims 1 to 10, wherein the contaminating homodimers are substantially absent from the host cell culture.

12. Способ по любому из пп.1-11, в котором каждая кодируемая содержащая CH3-домен полипептидная цепь дополнительно содержит вариабельную область, распознающую эпитоп.12. The method according to any one of claims 1 to 11, wherein each encoded CH3 domain-containing polypeptide chain further comprises an epitope recognition variable region.

13. Способ по п.12, где две вариабельные области содержащих CH3-домен полипептидных цепей распознают различные эпитопы.13. The method according to claim 12, where two variable regions of the CH3 domain-containing polypeptide chains recognize different epitopes.

14. Способ по п.13, в котором различные эпитопы расположены на одной и той же мишени.14. The method of claim 13, wherein the different epitopes are located on the same target.

15. Способ по п.14, в котором мишень является растворимой.15. The method according to claim 14, in which the target is soluble.

16. Способ по п.14, в котором мишень является мембраносвязанной.16. The method according to claim 14, in which the target is membrane-bound.

17. Способ по п.13, в котором различные эпитопы расположены на различных мишенях.17. The method of claim 13, wherein the different epitopes are located on different targets.

18. Способ по п.17, в котором различные мишени экспрессированы на одной и той же клетке.18. The method of claim 17, wherein the different targets are expressed on the same cell.

19. Способ по п.17, в котором различные мишени экспрессированы на разных клетках.19. The method of claim 17, wherein different targets are expressed on different cells.

20. Способ по п.17, в котором различные мишени являются растворимыми.20. The method of claim 17, wherein the various targets are soluble.

21. Способ по п.17, где одна мишень является растворимой, а вторая является мембраносвязанной.21. The method according to claim 17, where one target is soluble and the second is membrane-bound.

22. Способ по любому из пп.12-14, 16-19 или 21, где по меньшей мере один из указанных эпитопов расположен на опухолевой клетке.22. The method according to any one of claims 12-14, 16-19 or 21, where at least one of these epitopes is located on the tumor cell.

23. Способ по любому из пп.12-14, 16-19 или 21, где по меньшей мере один из указанных эпитопов расположен на эффекторной клетке.23. The method according to any one of claims 12-14, 16-19 or 21, where at least one of these epitopes is located on the effector cell.

24. Способ по п.23, где указанная эффекторная клетка представляет собой NK-клетку, Т-клетку, В-клетку, моноцит, макрофаг, дендритную клетку или нейтрофильный гранулоцит.24. The method of claim 23, wherein said effector cell is an NK cell, a T cell, a B cell, a monocyte, a macrophage, a dendritic cell, or a neutrophil granulocyte.

25. Способ по п.23 или 24, где указанный эпитоп расположен на молекуле CD3, CD16, CD25, CD28, CD64, CD89, NKG2D или NKp46.25. The method according to claim 23 or 24, wherein said epitope is located on a CD3, CD16, CD25, CD28, CD64, CD89, NKG2D or NKp46 molecule.

26. Способ по любому из пп.1-25, в котором указанное гетеродимерное антитело представляет собой IgG человека.26. The method according to any one of claims 1 to 25, wherein said heterodimeric antibody is human IgG.

27. Способ по любому из пп.1-26, в котором гетеродимерное антитело представляет собой IgG1 человека.27. The method according to any one of claims 1 to 26, wherein the heterodimeric antibody is human IgG1.

28. Способ по любому из пп.3-27, в котором указанная общая легкая цепь является зародышевой легкой цепью.28. The method according to any one of claims 3 to 27, wherein said common light chain is a germ light chain.

29. Способ по любому из пп.3-28, в котором указанная общая легкая цепь представляет собой перестроенную зародышевую легкую цепь каппа IgVkl-39*01/IGJk1*01 человека.29. The method according to any one of claims 3 to 28, wherein said common light chain is a rearranged germline human kappa light chain IgVkl-39*01/IGJk1*01.

30. Гетеродимерное антитело для противоопухолевой терапии, полученное способами по любому из пп.1-29.30. Heterodimeric antibody for antitumor therapy, obtained by the methods according to any one of claims 1 to 29.

31. Гетеродимерное антитело для терапии инфекционного заболевания, полученное способами по любому из пп.1-29.31. A heterodimeric antibody for the treatment of an infectious disease, obtained by the methods according to any one of claims 1 to 29.

32. Гетеродимерное антитело по п.30 или 31, где указанное гетеродимерное антитело связывается с различными эпитопами на том же антигене и/или на различных эпитопах на различных антигенах.32. The heterodimeric antibody of claim 30 or 31, wherein said heterodimeric antibody binds to different epitopes on the same antigen and/or to different epitopes on different antigens.

33. Гетеродимерное антитело для противоопухолевой терапии, где указанное антитело содержит два CH3-домена, которые способны образовывать поверхность контакта, где указанный первый CH3-домен содержит положительно заряженный аминокислотный остаток в аминокислотном положении 366 согласно системе нумерации EU и указанный второй CH3-домен содержит отрицательно заряженный аминокислотный остаток в аминокислотном положении 351 согласно системе нумерации EU.33. A heterodimeric antibody for antitumor therapy, wherein said antibody contains two CH3 domains that are capable of forming a contact surface, wherein said first CH3 domain contains a positively charged amino acid residue at amino acid position 366 according to the EU numbering system and said second CH3 domain contains a negatively charged one. charged amino acid residue at amino acid position 351 according to the EU numbering system.

34. Гетеродимерное антитело для терапии инфекционного заболевания, где указанное антитело содержит два CH3-домена, которые способны образовывать поверхность контакта, где указанный первый CH3-домен содержит положительно заряженный аминокислотный остаток в аминокислотном положении 366 согласно системе нумерации EU и указанный второй CH3-домен содержит отрицательно заря34. A heterodimeric antibody for the treatment of an infectious disease, wherein said antibody contains two CH3 domains that are capable of forming an interface, wherein said first CH3 domain contains a positively charged amino acid residue at amino acid position 366 according to the EU numbering system and said second CH3 domain contains negative dawn

- 54 046272 женный аминокислотный остаток в аминокислотном положении 351 согласно системе нумерации EU.- 54 046272 fused amino acid residue at amino acid position 351 according to the EU numbering system.

35. Гетеродимерное антитело для противоопухолевой терапии, где указанное антитело содержит два CH3-домена, которые способны образовывать поверхность контакта, где указанный первый CH3-домен содержит отрицательно заряженный аминокислотный остаток в аминокислотном положении 366 согласно системе нумерации EU и указанный второй CH3-домен содержит положительно заряженный аминокислотный остаток в аминокислотном положении 351 согласно системе нумерации EU.35. A heterodimeric antibody for anticancer therapy, wherein said antibody contains two CH3 domains that are capable of forming a contact surface, wherein said first CH3 domain contains a negatively charged amino acid residue at amino acid position 366 according to the EU numbering system and said second CH3 domain contains a positively charged charged amino acid residue at amino acid position 351 according to the EU numbering system.

36. Гетеродимерное антитело для терапии инфекционного заболевания, где указанное антитело содержит два CH3-домена, которые способны образовывать поверхность контакта, где указанный первый CH3-домен содержит отрицательно заряженный аминокислотный остаток в аминокислотном положении 366 согласно системе нумерации EU и указанный второй CH3-домен содержит положительно заряженный аминокислотный остаток в аминокислотном положении 351 согласно системе нумерации EU.36. A heterodimeric antibody for the treatment of an infectious disease, wherein said antibody comprises two CH3 domains that are capable of forming an interface, wherein said first CH3 domain comprises a negatively charged amino acid residue at amino acid position 366 according to the EU numbering system, and said second CH3 domain comprises the positively charged amino acid residue at amino acid position 351 according to the EU numbering system.

37. Гетеродимерное антитело для противоопухолевой терапии, полученное способом по любому из пп.1 или 3-29, содержащее два ОИ3-домена, в котором одно из указанных двух СИ3-доменов содержит остаток аспарагиновой кислоты (D) в аминокислотном положении 351 согласно системе нумерации EU и остаток глутаминовой кислоты (Е) в аминокислотном положении 368 согласно системе нумерации EU и в котором другие указанные два СН3-домена содержат лизин (K) в аминокислотном положении 366 согласно системе нумерации EU и лизин (K) в аминокислотном положении 351 согласно системе нумерации EU.37. A heterodimeric antibody for antitumor therapy, obtained by the method according to any one of claims 1 or 3-29, containing two CI3 domains, in which one of the two CI3 domains contains an aspartic acid residue (D) at amino acid position 351 according to the numbering system EU and a glutamic acid residue (E) at amino acid position 368 according to the EU numbering system and in which the other two CH3 domains contain lysine (K) at amino acid position 366 according to the EU numbering system and lysine (K) at amino acid position 351 according to the numbering system EU.

38. Гетеродимерное антитело для терапии инфекционного заболевания, полученное способом по любому из пп.1 или 3-29, содержащее два ОИ3-домена, в котором одно из указанных двух ОИ3-доменов содержит остаток аспарагиновой кислоты (D) в аминокислотном положении 351 согласно системе нумерации EU и остаток глутаминовой кислоты (Е) в аминокислотном положении 368 согласно системе нумерации EU и в котором другие указанные два ОИЗ-домена содержат лизин (K) в аминокислотном положении 366 согласно системе нумерации EU и лизин (K) в аминокислотном положении 351 согласно системе нумерации EU.38. A heterodimeric antibody for the treatment of an infectious disease, obtained by the method according to any one of claims 1 or 3-29, containing two OI3 domains, in which one of the two OI3 domains contains an aspartic acid residue (D) at amino acid position 351 according to the system EU numbering and a glutamic acid residue (E) at amino acid position 368 according to the EU numbering system and in which the other two OIZ domains contain lysine (K) at amino acid position 366 according to the EU numbering system and lysine (K) at amino acid position 351 according to the EU numbering system EU numbering.

39. Гетеродимерное антитело для противоопухолевой терапии, содержащее два СИ3-домена, в котором одно из указанных двух ОИ3-доменов содержит остаток аспарагиновой кислоты (D) в аминокислотном положении 351 согласно системе нумерации EU и остаток глутаминовой кислоты (Е) в аминокислотном положении 368 согласно системе нумерации EU и в котором другие указанные два ОИ3-домена содержат лизин (K) в аминокислотном положении 366 согласно системе нумерации EU и лизин (K) в аминокислотном положении 351 согласно системе нумерации EU.39. A heterodimeric antibody for antitumor therapy containing two CI3 domains, in which one of the two CI3 domains contains an aspartic acid residue (D) at amino acid position 351 according to the EU numbering system and a glutamic acid residue (E) at amino acid position 368 according to the EU numbering system and wherein the other two OI3 domains contain a lysine (K) at amino acid position 366 according to the EU numbering system and a lysine (K) at amino acid position 351 according to the EU numbering system.

40. Гетеродимерное антитело для терапии инфекционного заболевания, содержащее два СН3-домена, в котором одно из указанных двух СН3-доменов содержит остаток аспарагиновой кислоты (D) в аминокислотном положении 351 согласно системе нумерации EU и остаток глутаминовой кислоты (Е) в аминокислотном положении 368 согласно системе нумерации EU и в котором другие указанные два СН3-домена содержат лизин (K) в аминокислотном положении 366 согласно системе нумерации EU и лизин (K) в аминокислотном положении 351 согласно системе нумерации EU.40. A heterodimeric antibody for the treatment of an infectious disease containing two CH3 domains, in which one of the two CH3 domains contains an aspartic acid residue (D) at amino acid position 351 according to the EU numbering system and a glutamic acid residue (E) at amino acid position 368 according to the EU numbering system and wherein the other two CH3 domains contain lysine (K) at amino acid position 366 according to the EU numbering system and lysine (K) at amino acid position 351 according to the EU numbering system.

41. Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая одну или несколько нуклеиновых кислот, кодирующих первую и вторую полипептидные цепи, содержащие ОИ3-домены антитела, полученного способом по любому из пп.1 или 3-29, где указанная первая содержащая ОИ3-домен полипептидная цепь содержит положительно заряженный аминокислотный остаток в аминокислотном положении 366 согласно системе нумерации EU и где указанная вторая содержащая ОИ3-домен полипептидная цепь содержит отрицательно заряженный аминокислотный остаток в аминокислотном положении 351 согласно системе нумерации EU.41. A recombinant host cell containing one or more nucleic acids encoding the first and second polypeptide chains containing the OI3 domains of an antibody obtained by the method according to any one of claims 1 or 3-29, wherein said first OI3 domain-containing polypeptide chain contains a positively charged amino acid residue at amino acid position 366 according to the EU numbering system; and wherein said second OI3 domain-containing polypeptide chain contains a negatively charged amino acid residue at amino acid position 351 according to the EU numbering system.

42. Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая одну или несколько нуклеиновых кислот, кодирующих первую и вторую полипептидные цепи, содержащие ОИ3-домены антитела, полученного способом по любому из пп.2-29, где указанная первая содержащая СН3-домен полипептидная цепь содержит отрицательно заряженный аминокислотный остаток в аминокислотном положении 366 согласно системе нумерации EU и где указанная вторая содержащая ОИ3-домен полипептидная цепь содержит положительно заряженный аминокислотный остаток в аминокислотном положении 351 согласно системе нумерации EU.42. A recombinant host cell containing one or more nucleic acids encoding the first and second polypeptide chains containing the CH3 domains of an antibody produced by the method according to any one of claims 2 to 29, wherein said first CH3 domain-containing polypeptide chain contains a negatively charged an amino acid residue at amino acid position 366 according to the EU numbering system; and wherein said second OI3 domain-containing polypeptide chain contains a positively charged amino acid residue at amino acid position 351 according to the EU numbering system.

43. Рекомбинантная клетка-хозяин по п.41 или 42, где указанная клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую общую легкую цепь, которая способна образовывать пару по меньшей мере с двумя различными тяжелыми цепями.43. The recombinant host cell of claim 41 or 42, wherein said host cell further comprises a nucleic acid encoding a common light chain that is capable of pairing with at least two different heavy chains.

44. Фармацевтическая композиция, предназначенная для противоопухолевой терапии или терапии инфекционного заболевания, содержащая гетеродимерное антитело по любому из пп.30-40 и фармацевтически приемлемый носитель.44. A pharmaceutical composition intended for antitumor therapy or therapy of an infectious disease, containing a heterodimeric antibody according to any one of claims 30-40 and a pharmaceutically acceptable carrier.

45. Фармацевтическая композиция по п.44, в которой указанное гетеродимерное антитело получено с помощью рекомбинантных клеток-хозяев по любому из пп.41-43.45. The pharmaceutical composition according to claim 44, wherein said heterodimeric antibody is produced using recombinant host cells according to any one of claims 41-43.

46. Способ получения клетки-хозяина по п.41 или 43 для продукции гетеродимерного антитела, причем способ включает стадию введения в указанную клетку-хозяина одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих по меньшей мере первую и вторую содержащие СН3-домен полипептидные цепи, 46. The method of producing a host cell according to claim 41 or 43 for the production of a heterodimeric antibody, the method comprising the step of introducing into said host cell one or more nucleic acids encoding at least first and second CH3 domain-containing polypeptide chains,

- 55 046272 где указанная первая содержащая СНЗ-домен полипептидная цепь содержит положительно заряженный аминокислотный остаток в аминокислотном положении 366 согласно системе нумерации EU, и где указанная вторая содержащая CI 13-домен полипептидная цепь содержит отрицательно заряженный аминокислотный остаток в аминокислотном положении 351 согласно системе нумерации EU.- 55 046272 wherein said first CH3 domain-containing polypeptide chain contains a positively charged amino acid residue at amino acid position 366 according to the EU numbering system, and wherein said second CI 13 domain-containing polypeptide chain contains a negatively charged amino acid residue at amino acid position 351 according to the EU numbering system .

47. Способ получения клетки-хозяина по п.42 или 43 для продукции гетеродимерного антитела, причем способ включает стадию введения в указанную клетку-хозяина одной или нескольких нуклеиновых кислот, кодирующих по меньшей мере первую и вторую содержащие Cffi-домен полипептидные цепи, где указанная первая содержащая CI 13-доме'н полипептидная цепь содержит отрицательно заряженный аминокислотный остаток в аминокислотном положении 366 согласно системе нумерации EU и где указанная вторая содержащая CI 13-доме'н полипептидная цепь содержит положительно заряженный аминокислотный остаток в аминокислотном положении 351 согласно системе нумерации EU.47. A method for producing a host cell according to claim 42 or 43 for the production of a heterodimeric antibody, the method comprising the step of introducing into said host cell one or more nucleic acids encoding at least first and second Cffi domain-containing polypeptide chains, wherein said wherein the first CI 13-domain polypeptide chain contains a negatively charged amino acid residue at amino acid position 366 according to the EU numbering system, and wherein said second CI 13-domain polypeptide chain contains a positively charged amino acid residue at amino acid position 351 according to the EU numbering system.

48. Способ по п.46 или 47, дополнительно включающий стадию введения в указанную клеткухозяина нуклеиновой кислоты, кодирующей общую легкую цепь, которая способна образовывать пару по меньшей мере с двумя различными тяжелыми цепями.48. The method of claim 46 or 47, further comprising the step of introducing into said host cell a nucleic acid encoding a common light chain that is capable of pairing with at least two different heavy chains.