EA046254B1 - PROBIOTIC MOLECULES TO REDUCE PATHOGEN VIRULENCE - Google Patents

Description

Область техникиField of technology

Настоящее изобретение относится к пробиотическим молекулам. Более конкретно, настоящее изобретение в своих аспектах относится к пробиотическим молекулам, композициям, содержащим пробиотические молекулы и различным способам и применениям пробиотических молекул.The present invention relates to probiotic molecules. More specifically, the present invention in its aspects relates to probiotic molecules, compositions containing probiotic molecules and various methods and uses of probiotic molecules.

Уровень техникиState of the art

Показано, что малый биопептид, продуцируемый видом Lactobacillus является эффективным в отношении инфекции энтерогеморрагических Escherichia coli [Medellin-Pena et al., 2009]. Было показано, что он влияет, оказывая отрицательную регуляцию, на транскрипцию генов E.coli. вовлеченных в колонизацию и чувство кворума, и способен предотвращать адгеренцию E.coli к эпителиальным клеткам хозяина [Medellin-Pena et al., 2009]. Было продемонстрировано, что биопептид влияет на секреторную систему E.coli типа III (T3SS) и способен препятствовать сигнальной системе чувства кворума (QS), что приводит к отрицательной регуляции генов вирулентности [Medellin-Pena et al., 2007, Medellin-Pena and Griffiths, 2009].It has been shown that a small biopeptide produced by the Lactobacillus species is effective against enterohemorrhagic Escherichia coli infection [Medellin-Pena et al., 2009]. It has been shown to influence, through negative regulation, the transcription of E. coli genes. involved in colonization and quorum sensing, and is able to prevent E. coli adhesion to host epithelial cells [Medellin-Pena et al., 2009]. The biopeptide has been demonstrated to interfere with the E. coli type III secretory system (T3SS) and is able to interfere with quorum sensing (QS) signaling, resulting in the negative regulation of virulence genes [Medellin-Pena et al., 2007, Medellin-Pena and Griffiths , 2009].

В международном патенте WO 2009/155711 описаны выделенные и охарактеризованные молекулы, полученные из пробиотических бактерий из родов Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus или Bifidobacterium для применения в композициях и способах для лечения и/или профилактики инфекции вредоносными патогенными бактериями, такими как Salmonella или E.coli. Выделенные молекулы также можно применять в пищевых продуктах или продуктах лечебного питания, которые обеспечивают пробиотики в желудочно-кишечном тракте млекопитающего.International patent WO 2009/155711 describes isolated and characterized molecules derived from probiotic bacteria from the genera Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus or Bifidobacterium for use in compositions and methods for the treatment and/or prevention of infection by harmful pathogenic bacteria such as Salmonella or E. coli . The isolated molecules can also be used in foods or nutritional products that provide probiotics in the gastrointestinal tract of a mammal.

В международном патенте описаны молекулы, полученные из пробиотических бактерий, которые предложены для применения в композициях и способах для лечения и/или профилактики инфекции патогенными вирусами. Выделенные молекулы также можно применять в пищевых продуктах или продуктах лечебного питания, которые обеспечивают пробиотики в желудочно-кишечном тракте млекопитающего.The international patent describes molecules derived from probiotic bacteria, which are proposed for use in compositions and methods for the treatment and/or prevention of infection by pathogenic viruses. The isolated molecules can also be used in foods or nutritional products that provide probiotics in the gastrointestinal tract of a mammal.

Существует потребность в альтернативных терапиях, чтобы преодолеть или ослабить по меньшей мере некоторые недостатки предшествующего уровня техники и/или предложить полезную альтернативу.There is a need for alternative therapies to overcome or mitigate at least some of the disadvantages of the prior art and/or to provide a useful alternative.

Описание чертежейDescription of drawings

Настоящее изобретение будет более понятным из следующего описания в сочетании со ссылками на чертежи, на которых на фиг. 1 показан анализ клеточной токсичности лактатдегидрогеназы. Дозозависимая кривая ингибирования клеточной токсичности бесклеточным супернатантом. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение;The present invention will be better understood from the following description in conjunction with reference to the drawings, in which: FIGS. Figure 1 shows a lactate dehydrogenase cellular toxicity assay. Dose-dependent inhibition curve of cell toxicity by cell-free supernatant. Error bars represent standard deviation;

на фиг. 2 показан анализ клеточной токсичности лактатдегидрогеназы. Дозозависимая кривая ингибирования клеточной токсичности бесклеточным супернатантом. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение.in fig. Figure 2 shows a lactate dehydrogenase cellular toxicity assay. Dose-dependent inhibition curve of cell toxicity by cell-free supernatant. Error bars represent standard deviation.

Сущность изобретенияThe essence of the invention

В соответствии с одним аспектом предлагается пептид для профилактики и/или лечения не энтеральной инфекции у субъекта и/или для снижения вирулентности не энтеральной инфекции у субъекта, пептид получен из пробиотических бактерий.In accordance with one aspect, a peptide is provided for the prevention and/or treatment of a non-enteric infection in a subject and/or for reducing the virulence of a non-enteric infection in a subject, the peptide being derived from probiotic bacteria.

В одном аспекте пробиотические бактерии выбирают из Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bifidobacterium, Pediococcus и их комбинаций.In one aspect, the probiotic bacteria are selected from Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bifidobacterium, Pediococcus, and combinations thereof.

В одном аспекте Lactobacillus выбирают из Lactobacillus acidophilus (La-5), Lactobacillus fermentum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus helveticus и Lactobacillus plantarum.In one aspect, the Lactobacillus is selected from Lactobacillus acidophilus (La-5), Lactobacillus fermentum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus helveticus, and Lactobacillus plantarum.

В одном аспекте Lactococcus представляет собой Lactococcus lactis.In one aspect, the Lactococcus is Lactococcus lactis.

В одном аспекте Bifidobacterium выбирают из Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis и Bifidobacterium crudilactis и их смесей.In one aspect, Bifidobacterium is selected from Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis and Bifidobacterium crudilactis and mixtures thereof.

В одном аспекте Streptococcus представляет собой Streptococcus thermophilus.In one aspect, the Streptococcus is Streptococcus thermophilus.

В одном аспекте пептид эффективен против инфекции, выбранной из группы, состоящей из инфекции мочевыводящих путей, вагинальной инфекции, инфекции дыхательных путей, инфекции желудка, вырабатывающей биопленку инфекции, мастита, кожной инфекции и инфекции полости рта.In one aspect, the peptide is effective against an infection selected from the group consisting of a urinary tract infection, a vaginal infection, a respiratory tract infection, a stomach infection, a biofilm-producing infection, mastitis, a skin infection, and an oral infection.

В одном аспекте пептид эффективен против E.coli, UPEC, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Helicobacter pylori, резистентных к метициллину Staphylococcus aureus (MRSA), Porphyrmonas gingivalis, Prevotella intermedia, S. saprophytic, Klebiessa, Enterobacter, Proteus mirabillis, Enterococci, Clostridium, Klebsiella или Proteus.In one aspect, the peptide is effective against E. coli, UPEC, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Helicobacter pylori, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Porphyrmonas gingivalis, Prevotella intermedia, S. saprophytic, Kle biessa, Enterobacter, Proteus mirabillis, Enterococci, Clostridium, Klebsiella or Proteus.

В одном аспекте пептид эффективен против биопленок.In one aspect, the peptide is effective against biofilms.

В одном аспекте пептид дополнительно скомбинирован с одним или более из антивирусного препарата, источника сахара, съедобного пищевого продукта, пищевой добавки и принимаемой внутрь жидкости.In one aspect, the peptide is further combined with one or more of an antiviral drug, a sugar source, an edible food product, a dietary supplement, and an ingestible liquid.

В одном аспекте пептид сконцентрирован из бесклеточного супернатанта или его фракции.In one aspect, the peptide is concentrated from a cell-free supernatant or a fraction thereof.

В одном аспекте пептид предложен в виде сухой фракции культуральной среды, например в лиофилизированном виде или в высушенном распылением виде.In one aspect, the peptide is provided as a dry fraction of the culture medium, such as lyophilized or spray-dried form.

- 1 046254- 1 046254

В одном аспекте высушенная фракция культуральной среды представляет собой бесклеточный супернатант.In one aspect, the dried fraction of the culture medium is a cell-free supernatant.

В одном аспекте пептид содержит или состоит из последовательности, выбранной из YPVEPF, YPPGGP, YPPG, NQPY и их комбинаций.In one aspect, the peptide contains or consists of a sequence selected from YPVEPF, YPPGGP, YPPG, NQPY, and combinations thereof.

В одном аспекте пептид содержит или состоит из последовательности YPPGGP.In one aspect, the peptide contains or consists of the sequence YPPGGP.

В соответствии с одним аспектом предложена композиция, содержащая описанный в настоящем документе пептид.In accordance with one aspect, a composition is provided comprising a peptide described herein.

В одном аспекте композиция представляет собой пищевой продукт, питьевой продукт, продукт здорового питания, медикамент или пищевую добавку.In one aspect, the composition is a food, drink, health food, medication, or dietary supplement.

В одном аспекте композиция содержит живые пробиотические бактерии, из которых получают пептиды.In one aspect, the composition contains live probiotic bacteria from which the peptides are derived.

В одном аспекте композиция содержит живые пробиотические бактерии, отличные от тех бактерий, из которых получают пептиды.In one aspect, the composition contains live probiotic bacteria other than those from which the peptides are derived.

В одном аспекте пептиды в композиции являются очищенными.In one aspect, the peptides in the composition are purified.

В соответствии с одним аспектом предложен способ лечения и/или профилактики не энтеральной инфекции у субъекта и/или снижения вирулентности не энтеральной инфекции у субъекта, причем способ содержит введение пептида или композиции, описанных в настоящем документе, субъекту, нуждающемуся в этом.In accordance with one aspect, there is provided a method of treating and/or preventing a non-enteric infection in a subject and/or reducing the virulence of a non-enteric infection in a subject, the method comprising administering a peptide or composition described herein to a subject in need thereof.

В одном аспекте не энтеральная инфекция выбрана из группы, состоящей из инфекции мочевыводящих путей, вагинальной инфекции, инфекции дыхательных путей, инфекции желудка, вырабатывающей биопленку инфекции, мастита, кожной инфекции и инфекции полости рта.In one aspect, the non-enteric infection is selected from the group consisting of a urinary tract infection, a vaginal infection, a respiratory tract infection, a stomach infection, a biofilm-producing infection, mastitis, a skin infection, and an oral infection.

В одном аспекте не энтеральная инфекция вызвана видом, выбранным из группы, состоящей из Е. coli, UPEC, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Helicobacter pylori, резистентных к метициллину Staphylococcus aureus (MRSA), Porphyrmonas gingivalis, Prevotella intermedia, S. saprophytic, Klebiessa, Enterobacter, Proteus mirabillis, Enterococci, Clostridium, Klebsiella и Proteus.In one aspect, the non-enteric infection is caused by a species selected from the group consisting of E. coli, UPEC, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Helicobacter pylori, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Porphyrmonas gingivalis, Prevotella intermedia, S. saprophytic, Klebiessa, Enterobacter, Proteus mirabillis, Enterococci, Clostridium, Klebsiella and Proteus.

В соответствии с одним аспектом предложен способ снижения антибиотической резистентности, содержащий введение описанных в настоящем документе пептидов субъекту, нуждающемуся в этом.In accordance with one aspect, a method of reducing antibiotic resistance is provided, comprising administering peptides described herein to a subject in need thereof.

В одном аспекте способ предназначен для снижения антибиотической резистентности MRS.In one aspect, the method is intended to reduce antibiotic resistance in MRS.

В соответствии с одним аспектом предложен способ лечения MRS, содержащий введение описанных в настоящем документе пептидов субъекту, нуждающемуся в этом.In accordance with one aspect, a method of treating MRS is provided, comprising administering the peptides described herein to a subject in need thereof.

В соответствии с одним аспектом предложен способ предотвращения или разрушения и/или пенетрации биопленок, содержащий введение описанных в настоящем документе пептидов.In accordance with one aspect, a method of preventing or disrupting and/or penetrating biofilms is provided, comprising administering peptides described herein.

В соответствии с одним аспектом предложен способ лечения раны, содержащий введение описанных в настоящем документе пептидов.In accordance with one aspect, a method of treating a wound is provided, comprising administering peptides described herein.

В соответствии с одним аспектом предложен способ уменьшения прилипания не энтерального патогена к ткани субъекта, содержащий введение описанных в настоящем документе пептидов.In accordance with one aspect, there is provided a method of reducing the adherence of a non-enteric pathogen to tissue of a subject, comprising administering peptides described herein.

В соответствии с одним аспектом предложен инертный объект, содержащий описанные в настоящем документе пептиды.In accordance with one aspect, an inert entity is provided containing the peptides described herein.

В одном аспекте инертный объект представляет собой стент, катетер или раневую повязку, содержащий(ую) пробиотические молекулы, которые высвобождаются из объекта за некоторый период времени.In one aspect, the inert object is a stent, catheter, or wound dressing containing probiotic molecules that are released from the object over a period of time.

Другие признаки и преимущества настоящего изобретения станут более очевидными после прочтения следующего подробного описания. Однако следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры, хотя и показывают варианты осуществления изобретения, предназначены исключительно для иллюстрации, поскольку многочисленные изменения и модификации, не выходящие за пределы сути и объема настоящего изобретения, будут понятны специалистам в данной области техники после прочтения подробного описания.Other features and advantages of the present invention will become more apparent upon reading the following detailed description. However, it should be understood that the detailed description and specific examples, while showing embodiments of the invention, are intended for illustration purposes only, as numerous changes and modifications without departing from the spirit and scope of the present invention will be apparent to those skilled in the art upon reading the detailed description. .

Подробное описаниеDetailed description

Описано применение пробиотических молекул в лечении инфекций желудочно-кишечного тракта. Без ограничения какой-либо теорией, предполагают, что молекулы, описанные в международных заявках на патент №№ WO 2009/155711 и WO 2015/021530, препятствуют у патогенов работе системы чувства кворума (QS) в системе секреции типа III (T3SS), и в предыдущей работе было показано, что пробиотические молекулы могут приводить к отрицательной регуляции генов вирулентности множества энтеральных патогенов. Бесклеточный экстракт штамма L. acidophilus обладал способностью препятствовать чувству кворума у Clostridium difficile и мог отрицательно регулировать гены вирулентности С. difficile [Yun et al., 2014]. Бесклеточные экстракты штаммов Lactobacillus и Bifidobacterium ингибировали рост Campylobacter jejuni и отрицательно регулировали промотор flaA sigma 28, а также обладали способностью отрицательно регулировать экспрессию генов ciaB и flaA у Campylobactor jejuni [Ding et al., 2005, Mundi et al., 2013]. Обнаружили также, что пробиотические молекулы, вырабатываемые Lactobacillus, влияют на вирулентность Salmonella, и показали, что основной их мишенью являются гены вирулентности, участвующие в T3SS [Sharma 2014]. В полевом исследовании, проведенном в 2015 г., тестировалиThe use of probiotic molecules in the treatment of gastrointestinal infections has been described. Without being bound by any theory, the molecules described in international patent applications WO 2009/155711 and WO 2015/021530 are believed to interfere with the quorum sensing (QS) system in the type III secretion system (T3SS) in pathogens, and Previous work has shown that probiotic molecules can lead to the negative regulation of virulence genes in a variety of enteric pathogens. A cell-free extract of a L. acidophilus strain had the ability to interfere with quorum sensing in Clostridium difficile and could negatively regulate C. difficile virulence genes [Yun et al., 2014]. Cell-free extracts of Lactobacillus and Bifidobacterium strains inhibited the growth of Campylobacter jejuni and negatively regulated the flaA sigma 28 promoter, and also had the ability to negatively regulate the expression of the ciaB and flaA genes in Campylobactor jejuni [Ding et al., 2005, Mundi et al., 2013]. They also found that probiotic molecules produced by Lactobacillus affect the virulence of Salmonella, and showed that their main target is virulence genes involved in T3SS [Sharma 2014]. A field study conducted in 2015 tested

- 2 046254 пробиотические молекулы in vivo на поросенках-отъемышах и обнаружили, что эти молекулы оказывают значимое влияние на снижение тяжести и встречаемости диареи [University of Guelph/MicroSintesis, 2015].- 2 046254 probiotic molecules in vivo in weaned piglets and found that these molecules had a significant effect on reducing the severity and incidence of diarrhea [University of Guelph/MicroSintesis, 2015].

В настоящее время обнаружили, что такой способ действия эффективен также при отрицательной регуляции эффектов генов вирулентности, которые регулируются чувством кворума, не только у кишечных патогенов, но и у других типов патогенов и инфекционных агентов. Кроме того, эти пептиды согласно аспектам изобретения способны, по меньшей мере, частично преодолевать лекарственную резистентность, согласно другим аспектам изобретения способны снижать лекарственную резистентность, согласно другим аспектам изобретения способны излечивать и/или предотвращать и/или снижать вирулентность инфекций, вызванных резистентными к лекарственным средствам бактериями, и согласно другим аспектам изобретения способны потенцировать эффекты, оказываемые антибиотиками на бактерии и/или резистентные к лекарственным средствам бактерии.It has now been found that this mode of action is also effective in negatively regulating the effects of virulence genes that are regulated by quorum sensing, not only in intestinal pathogens, but also in other types of pathogens and infectious agents. In addition, these peptides, in accordance with aspects of the invention, are capable of at least partially overcoming drug resistance, in other aspects of the invention are capable of reducing drug resistance, in other aspects of the invention are capable of treating and/or preventing and/or reducing the virulence of infections caused by drug-resistant drugs. bacteria, and according to other aspects of the invention are capable of potentiating the effects of antibiotics on bacteria and/or drug-resistant bacteria.

ОпределенияDefinitions

Если иное не определено в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь значения, которые обычно понятны специалистам в той области, к которой относится настоящее изобретения. См., например, Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994); Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989), каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки. Для целей настоящего изобретения ниже приводится определение следующих терминов.Unless otherwise defined herein, scientific and technical terms used in connection with the present invention will have the meanings that are commonly understood by those skilled in the art to which the present invention relates. See, for example, Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994); Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989), each of which is incorporated herein by reference. For purposes of the present invention, the following terms are defined below.

Полученный означает, что пробиотические молекулы вырабатываются непосредственно или опосредованно пробиотическими бактериями. Например, пробиотические бактерии могут секретировать пробиотические молекулы непосредственно в культуральную среду. В других аспектах молекулы могут образовываться опосредованно в культуральной среде, например, путем отщепления от более длинных пептидов.Derived means that probiotic molecules are produced directly or indirectly by probiotic bacteria. For example, probiotic bacteria can secrete probiotic molecules directly into the culture medium. In other aspects, molecules can be formed indirectly in the culture medium, for example, by cleavage from longer peptides.

Варианты последовательностей, описанные в настоящем документе, представляют собой биологически активные последовательности, которые имеют пептидную последовательность, которая отличается от нативной последовательности или последовательности дикого типа, за счет вставки, делеции, модификации и/или замены одной или более аминокислот в пределах нативной последовательности. Такие варианты обычно имеют менее чем 100% идентичность последовательности с нативной последовательностью. Первоначально, однако, биологически активный вариант будет иметь аминокислотную последовательность с более чем 70% идентичностью последовательности с последовательностью соответствующей встречающейся в природе последовательности, обычно по меньшей мере около 75%, более обычно по меньшей мере около 80%, еще более обычно по меньшей мере около 85%, еще более обычно по меньшей мере около 90%, и еще более обычно по меньшей мере около 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности. Варианты нуклеотидных фрагментов любой длины, которые сохраняют биологическую активность соответствующей нативной последовательности. Варианты также включают последовательности, где одна или более аминокислоты добавлены к любому концу или внутри нативной последовательности. Варианты также включают последовательности, где ряд аминокислот удален и необязательно заменен на одну или более различных аминокислот.Sequence variants described herein are biologically active sequences that have a peptide sequence that differs from the native or wild-type sequence by insertion, deletion, modification and/or substitution of one or more amino acids within the native sequence. Such variants typically have less than 100% sequence identity to the native sequence. Initially, however, the biologically active variant will have an amino acid sequence with greater than 70% sequence identity to the corresponding naturally occurring sequence, typically at least about 75%, more typically at least about 80%, even more typically at least about 85%, even more typically at least about 90%, and even more typically at least about 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% sequence identity. Variants of nucleotide fragments of any length that retain the biological activity of the corresponding native sequence. Variants also include sequences where one or more amino acids are added to either end of or within the native sequence. Variants also include sequences where a number of amino acids are deleted and optionally replaced by one or more different amino acids.

Процент идентичности последовательности в настоящем документе определен как процент аминокислотных остатков в перспективной последовательности, которые идентичны остаткам в интересующей последовательности после выравнивания последовательностей и введения разрывов, при необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательности, и без учета любых консервативных замен в качестве части идентичности последовательности. Никакие из 5', 3' или удлиняющих сегментов, делеций или вставок в перспективную последовательность не следует толковать как влияющие на идентичность или гомологичность последовательности. Методы и компьютерные программы для сравнения хорошо известны в обрасти техники, например, BLAST.Percent sequence identity is defined herein as the percentage of amino acid residues in a candidate sequence that are identical to residues in the sequence of interest after sequence alignment and introduction of breaks as necessary to achieve the maximum percent sequence identity, and without considering any conservative substitutions as part of the sequence identity. None of the 5', 3' or extension segments, deletions or insertions in the prospective sequence should be interpreted as affecting the identity or homology of the sequence. Methods and computer programs for comparison are well known in the art, for example, BLAST.

Активный или активность для целей настоящего документа относится к биологической активности нативной или встречающейся в природе пробиотический молекулы, где биологическая активность означает биологическую функцию (ингибиторную или стимулирующую), вызываемую нативной или встречающейся в природе пробиотической молекулой.Active or activity for the purposes of this document refers to the biological activity of a native or naturally occurring probiotic molecule, where biological activity means the biological function (inhibitory or stimulatory) caused by the native or naturally occurring probiotic molecule.

Таким образом, биологически активный или биологическая активность при использовании в сочетании с описанными в настоящем документе пробиотическими молекулами относится к пробиотической молекуле или аминокислотной последовательности, которая проявляет или разделяет эффекторную функцию нативной пробиотической молекулы или последовательности. Например, описанные в настоящем документе пробиотические молекулы обладают биологической активностью по предотвращению, ингибированию или лечению инфекции у животного.Thus, biologically active or biological activity when used in combination with the probiotic molecules described herein refers to a probiotic molecule or amino acid sequence that exhibits or shares the effector function of the native probiotic molecule or sequence. For example, the probiotic molecules described herein have biological activity to prevent, inhibit or treat infection in an animal.

Биологически активный или биологическая активность при использовании в сочетании с вариантными последовательностями означает, что вариантные последовательности проявляют или разделяют эффекторную функцию родительской последовательности. Биологическая активность вариантной последовательности может быть повышенной, пониженной, или на таком же уровне по сравнению с родительBiologically active or biologically active when used in combination with variant sequences means that the variant sequences exhibit or share the effector function of the parent sequence. The biological activity of the variant sequence may be increased, decreased, or at the same level compared to the parent

- 3 046254 ской последовательностью.- 3 046254 sequence.

Изолированный относится к молекуле, которая была очищена от своего источника или была получена рекомбинантными или синтетическими способами и очищена. Очищенные пробиотические молекулы существенно свободны от других аминокислот.Isolated refers to a molecule that has been purified from its source or has been produced by recombinant or synthetic methods and purified. Purified probiotic molecules are substantially free of other amino acids.

Существенно свободный в настоящем документе означает менее чем примерно 5%, обычно менее чем примерно 2%, более обычно менее чем примерно 1%, еще более обычно менее чем примерно 0,5%, наиболее обычно менее чем примерно 0,1% контаминацию аминокислотами других источников. Существенно чистая композиция пробиотической молекулы означает композицию, содержащую по меньшей мере примерно 90% по массе пробиотической молекулы в расчете на общую массу композиции, обычно по меньшей мере примерно 95% по массе, более обычно по меньшей мере примерно 90% по массе, еще более обычно по меньшей мере примерно 95% по массе и еще более обычно по меньшей мере примерно 99% по массе нуклеотида в расчете на общую массу композиции.Substantially free as used herein means less than about 5%, typically less than about 2%, more typically less than about 1%, even more typically less than about 0.5%, most typically less than about 0.1% contamination with other amino acids sources. A substantially pure probiotic molecule composition means a composition containing at least about 90% by weight of the probiotic molecule based on the total weight of the composition, typically at least about 95% by weight, more typically at least about 90% by weight, even more typically at least about 95% by weight, and more typically at least about 99% by weight, of the nucleotide, based on the total weight of the composition.

Используемый в данном документе термин лечение или терапия представляет собой подход для получения полезных или желательных клинических результатов. Для целей настоящего изобретения полезные или желательные клинические результаты включают, но не ограничиваются этим, снижение симптомов, снижение степени заболевания, стабилизированное (т.е. не ухудшающееся) состояние заболевания, откладывание или замедление прогрессирования заболевания, смягчение или облегчение состояния заболевания и ремиссию (частичную или полную), обнаруживаемую или не обнаруживаемую. Лечение и терапия могут также означать продление выживаемости по сравнению с ожидаемой выживаемостью при отсутствии лечения или терапии. Таким образом, термин лечение или терапия представляет собой вмешательство, проводимое с целью изменения патологии расстройства. В частности, лечение или терапия могут непосредственно предотвращать, замедлять или иным образом уменьшать патологию заболевания или расстройства, такого как инфекция, или могут сделать инфекцию более восприимчивой к лечению или терапии другими терапевтическими агентами.As used herein, the term treatment or therapy is an approach to obtain useful or desirable clinical results. For purposes of the present invention, beneficial or desirable clinical outcomes include, but are not limited to, reduction of symptoms, reduction in disease severity, stable (i.e., not worsening) disease state, delay or slowing of disease progression, mitigation or relief of disease state, and remission (partial or complete), detectable or undetectable. Treatment and therapy may also mean prolonged survival compared to what would be expected without treatment or therapy. Thus, the term treatment or therapy represents an intervention carried out with the aim of changing the pathology of a disorder. In particular, the treatment or therapy may directly prevent, slow or otherwise reduce the pathology of a disease or disorder, such as an infection, or may make the infection more responsive to treatment or therapy with other therapeutic agents.

Термины терапевтически эффективное количество, эффективное количество или достаточное количество означают количество, достаточное при введении субъекту, включая млекопитающего, например человека, для достижения желаемого результата, например, количество, эффективное для лечения инфекции. Эффективные количества пробиотических молекул, описанных в настоящем документе, могут изменяться в зависимости от таких факторов, как патологическое состояние, возраст, пол и вес субъекта. Режимы дозирования или лечения могут быть скорректированы для обеспечения оптимального терапевтического ответа, как понятно специалисту.The terms therapeutically effective amount, effective amount or sufficient amount mean an amount sufficient when administered to a subject, including a mammal, such as a human, to achieve a desired result, for example, an amount effective to treat an infection. Effective amounts of the probiotic molecules described herein may vary depending on factors such as the pathological condition, age, sex and weight of the subject. Dosing or treatment regimens may be adjusted to provide the optimal therapeutic response as appreciated by one skilled in the art.

Кроме того, режим лечения субъекта терапевтически эффективным количеством может состоять из однократного введения или, альтернативно, включать серию применений. Продолжительность периода лечения зависит от множества факторов, таких как степень тяжести и/или место заболевания, возраст субъекта, концентрация агента, ответная реакция пациента на агент или их комбинации. Также следует понимать, что эффективная дозировка агента, используемого для лечения, может увеличиваться или уменьшаться в ходе конкретного режима лечения. Изменения дозировки могут возникать и проявляться в стандартных диагностических анализах, известных в данной области техники. Пробиотические молекулы, описанные в настоящем документе, могут в некоторых аспектах вводиться до, во время или после лечения традиционными способами лечения рассматриваемого заболевания или расстройства, такого как инфекция.In addition, a regimen for treating a subject with a therapeutically effective amount may consist of a single administration or, alternatively, include a series of applications. The length of the treatment period depends on a variety of factors, such as the severity and/or location of the disease, the age of the subject, the concentration of the agent, the patient's response to the agent, or combinations thereof. It should also be understood that the effective dosage of the agent used for treatment may be increased or decreased during a particular treatment regimen. Dosage changes may occur and be detected by standard diagnostic assays known in the art. The probiotic molecules described herein can, in some aspects, be administered before, during, or after treatment with conventional treatments for the disease or disorder in question, such as an infection.

Термин субъект, применяемый в данной заявке, относится к любому представителю царства животных, включая птиц, рыб, беспозвоночных, земноводных, млекопитающих и рептилий. Как правило, субъект является относящемуся к человеку или не относящемуся к человеку позвоночному. Не относящиеся к человеку позвоночные включают сельскохозяйственных животных, домашних животных и лабораторных животных. Не относящиеся к человеку субъекты также в частности включают не относящихся к человеку приматов и грызунов. Не относящиеся к человеку субъекты также, в частности, включают, без ограничения, домашнюю птицу, кур, лошадей, коров, свиней, коз, собак, кошек, морских свинок, хомяков, норок, кроликов, ракообразных и моллюсков. Обычно субъект представляет собой птицу или млекопитающее. Термин млекопитающее относится к любому животному, классифицируемому как млекопитающее, включая человека, других высших приматов, домашних и сельскохозяйственных животных, и животных в зоопарке, спортивных или комнатных животных, таких как собаки, кошки, крупный рогатый скот, лошади, овцы, свиньи, козы, кролики и т.д. Обычно млекопитающее представляет собой человека.The term subject as used in this application refers to any member of the animal kingdom, including birds, fish, invertebrates, amphibians, mammals and reptiles. Typically, the subject is a human or non-human vertebrate. Non-human vertebrates include farm animals, domestic animals and laboratory animals. Non-human subjects also specifically include non-human primates and rodents. Non-human subjects also include, but are not limited to, poultry, chickens, horses, cows, pigs, goats, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, minks, rabbits, crustaceans and molluscs. Typically the subject is a bird or mammal. The term mammal refers to any animal classified as a mammal, including humans, other great apes, domestic, farm, and zoo animals, sporting or pet animals, such as dogs, cats, cattle, horses, sheep, pigs, goats , rabbits, etc. Typically the mammal is a human.

Введение в сочетании с одним или более дополнительными терапевтическими агентами включает в себя одновременное (совместное) и последовательное введение в любом порядке.Administration in combination with one or more additional therapeutic agents includes simultaneous (co-) and sequential administration in any order.

Термин фармацевтически приемлемый означает, что соединение или комбинация соединений совместимы с остальными ингредиентами состава для фармацевтического применения, и что его в основном безопасно вводить людям в соответствии с установленными государственными стандартами, в том числе теми, которые опубликованы Управлением по контролю за продуктами питания и лекарствами США.The term pharmaceutically acceptable means that a compound or combination of compounds is compatible with the other ingredients of a formulation for pharmaceutical use and that it is substantially safe to administer to humans in accordance with established government standards, including those published by the US Food and Drug Administration .

Носители, как применяют в настоящем документе, включают фармацевтически приемлемые ноCarriers as used herein include pharmaceutically acceptable but

- 4 046254 сители, эксципиенты или стабилизаторы, которые нетоксичны для клетки или субъекта, подвергаемых их воздействию при используемых дозах и концентрациях. Часто физиологически приемлемый носитель представляет собой водный рН буферный раствор. Примеры физиологически приемлемых носителей включают буферы, такие как фосфорную, лимонную и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту; низкомолекулярный (менее чем примерно 10 остатков) полипептид; белки, например, сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие средства, такие как ЭДТА; сахарные спирты, такие как маннит или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, полиэтиленгликоль (ПЭГ) и PLURONICS™.- 4 046254 vehicles, excipients or stabilizers that are non-toxic to the cell or subject exposed to them at the doses and concentrations used. Often the physiologically acceptable carrier is an aqueous pH buffer solution. Examples of physiologically acceptable carriers include buffers such as phosphoric, citric and other organic acids; antioxidants, including ascorbic acid; low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptide; proteins such as serum albumin, gelatin or immunoglobulins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, arginine or lysine; monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates, including glucose, mannose or dextrins; chelating agents such as EDTA; sugar alcohols such as mannitol or sorbitol; salt-forming counterions such as sodium; and/or non-ionic surfactants such as TWEEN™, polyethylene glycol (PEG) and PLURONICS™.

Липосома представляет собой маленькую везикулу, которая состоит из различных типов липидов, фосфолипидов и/или поверхностно-активных веществ, которые могут использоваться для доставки агента, такого как пробиотические молекулы, описанные в настоящем документе, субъекту, такому как млекопитающее. Компоненты липосомы обычно собраны в двухслойную структуру, похожую на липидную структуру биологических мембран.A liposome is a small vesicle that is composed of various types of lipids, phospholipids and/or surfactants that can be used to deliver an agent, such as the probiotic molecules described herein, to a subject, such as a mammal. The components of a liposome are typically assembled into a bilayer structure, similar to the lipid structure of biological membranes.

В понимании объема настоящей заявки слова один и указанный служат для обозначения, что есть один элемент или более. Кроме того, термин содержит и его производные при использовании в настоящем документе следует понимать как неограничивающие термины, которые определяют наличие упомянутых свойств, элементов, компонентов, групп, систем и/или этапов, но не исключают наличия других неупомянутых свойств, элементов, компонентов, групп, систем и/или этапов. Вышеизложенное также применяют к словам, имеющим одинаковые значения, таким как термины, включая, имея и их производным.Within the scope of this application, the words one and specified are used to indicate that there is one or more elements. In addition, the term contains and its derivatives when used herein should be understood as non-limiting terms that define the presence of the mentioned properties, elements, components, groups, systems and/or steps, but do not exclude the presence of other unmentioned properties, elements, components, groups , systems and/or stages. The above also applies to words that have the same meaning, such as the terms including, having and their derivatives.

Следует понимать, что любые аспекты, описанные как содержащие определенные компоненты, могут также состоять из или состоять существенно из, где состоять из имеет ограниченное или ограничительное значение, а состоять преимущественно из означает включение спецификационных компонентов, но невключение других компонентов, за исключением материалов, присутствующих как примеси, неизбежных материалов, присутствующих как результат процессов, применяемых для обеспечения компонентов, и компонентов, добавленных с целью, отличной от достижения технического эффекта изобретения. Например, композиция, определенная с использованием фразы состоящая существенно из охватывает все известные фармацевтически приемлемые добавки, эксципиенты, растворители, носители и тому подобное. Обычно композиция, состоящая существенно из набора компонентов, будет содержать менее чем 5% по массе, обычно менее чем 3% по массе, более обычно менее чем 1% по массе не спецификационных компонентов.It should be understood that any aspects described as containing specific components may also consist of or consist substantially of, where to consist of has a limited or limiting meaning, and to consist primarily of means the inclusion of the specification components but not the inclusion of other components other than the materials present as impurities, unavoidable materials present as a result of processes used to provide components, and components added for a purpose other than achieving the technical effect of the invention. For example, a composition defined using the phrase consisting essentially of includes all known pharmaceutically acceptable additives, excipients, solvents, carriers and the like. Typically, a composition consisting substantially of a set of components will contain less than 5% by weight, typically less than 3% by weight, more typically less than 1% by weight of non-specification components.

Следует понимать, что любой компонент, определенный в настоящем документе как включенный, может быть явным образом не включен в формулу изобретения при помощи оговорки или негативного признака. Например, в аспектах изобретения энтеральные инфекции, такие как энтеральные бактериальные и/или энтеральные вирусные инфекции, явным образом не включены в композиции и способы, описанные в настоящем документе. В других аспектах изобретения молекулы, описанные в настоящем документе, не являются бактериоцинами.It should be understood that any component defined herein as included may not be expressly included in the claims by qualification or attribute. For example, in aspects of the invention, enteric infections, such as enteric bacterial and/or enteric viral infections, are not expressly included in the compositions and methods described herein. In other aspects of the invention, the molecules described herein are not bacteriocins.

Кроме того, все приведенные в настоящем документе диапазоны включают конец диапазонов, а также все промежуточные точки диапазона, указано ли это явно или нет.In addition, all ranges given herein include the end of the ranges as well as all intermediate points of the range, whether explicitly stated or not.

Наконец, термины степени, такие как по существу, примерно и приблизительно, при использовании в данном документе означают приемлемую величину отклонения модифицированного термина, из условия чтобы конечный результат не был значительно изменен. Эти термины степени должны толковаться как включающие отклонение по меньшей мере ±5% от модифицированного термина, если такое отклонение не отрицает значение слова, которое оно модифицирует. Пробиотические молекулы и композиции, содержащие пробиотические молекулыFinally, terms of degree, such as substantially, approximately, and approximately, when used herein, mean an acceptable amount of deviation of the modified term so that the final result is not significantly altered. These degree terms must be construed to include a deviation of at least ±5% from the modified term, unless such deviation negates the meaning of the word it modifies. Probiotic molecules and compositions containing probiotic molecules

В настоящем изобретении предложены пробиотические молекулы, выделенные из пробиотических бактерий и других культуральных фракций, таких как бесклеточный супернатант, бактерий, которые могут минимизировать, ингибировать, лечить и/или предотвращать инфекцию у субъектов, обычно не энтеральные инфекции. В частности, молекула (молекулы) могут быть получены из одного или более видов бактерий, выбранных из группы, состоящей из родов Aerococcus, Bacillus, Bacteroides, Bifidobacterium, Clostridium, Enterococcus, Fusobactehum, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Melissococcus, Micrococcus, Pediococcus, Peptostrepococcus, Propionibacterium, Staphylococcus, Streptococcus и Weissella. Конкретные пробиотически активные виды молочнокислых бактерий включают Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus casei Shirota, Lactobacillus casei subsp. paracasei, Lactobacillus casei subsp. casei, Lactobacillus casei, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbruckii subsp. lactis, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus farciminus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum, LactobaThe present invention provides probiotic molecules isolated from probiotic bacteria and other culture fractions, such as cell-free supernatant, of bacteria that can minimize, inhibit, treat and/or prevent infection in subjects, typically not enteric infections. In particular, the molecule(s) may be derived from one or more species of bacteria selected from the group consisting of the genera Aerococcus, Bacillus, Bacteroides, Bifidobacterium, Clostridium, Enterococcus, Fusobactehum, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Melissococcus, Micrococcus, Pediococcus, Peptostrepococcus, Propionibacterium, Staphylococcus, Streptococcus and Weissella. Specific probiotically active lactic acid bacteria species include Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus casei Shirota, Lactobacillus casei subsp. paracasei, Lactobacillus casei subsp. casei, Lactobacillus casei, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbruckii subsp. lactis, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus farciminus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum, Lactoba

- 5 046254 cillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sake, Lactococcus lactis, Lactocoocus lactis subsp. cremoris, Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, Streptococcus salivarius и Streptococcus thermophilus. Дополнительные примеры содержат пробиотически активные виды Bifidobacterium включая Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis и Bifidobacterium breve.- 5 046254 cillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sake, Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, Streptococcus salivarius and Streptococcus thermophilus. Additional examples include probiotically active Bifidobacterium species including Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis and Bifidobacterium breve.

Дополнительные виды бактерий могут быть выбраны из группы, состоящей из пробиотически активных Paenibacillus lautus, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Micrococcus varians, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidi- lactici, Pediococcus halophilus, Staphylococcus carnosus и Staphylococcus xylosus, а также микроорганизма Lactobacillus casei ssp. rhamnosus, штамм LC-705, DSM 7061, описанный в публикации ЕР № 0576780 и описанный как Lactobacillus rhamnosus LC-705, DSM 7061 в US5908646, отдельно или в комбинации с бактерией рода Propionibacterium или другим штаммом Lactobacillus casei.Additional bacterial species may be selected from the group consisting of probiotically active Paenibacillus lautus, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Micrococcus varians, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, Pediococcus halophilus, Staphylococcus carnosus and Staphylococcus xylosus, and also microorganism Lactobacillus casei ssp. rhamnosus, strain LC-705, DSM 7061, described in EP publication No. 0576780 and described as Lactobacillus rhamnosus LC-705, DSM 7061 in US5908646, alone or in combination with a bacterium of the genus Propionibacterium or another strain of Lactobacillus casei.

Конкретные штаммы пробиотических бактерий, которые могут продуцировать описанные в настоящем документе молекулы, в некоторых аспектах, выбирают из группы штаммов, состоящей из: Bifidobacterium animalis штамм DSM 15954, Bifidobacterium longum subsp. infantis штамм DSM15953, Bifidobacterium longum subsp. longum штамм DSM15955, Enterococcus faecium штамм DSM15958, Lactobacillus acidophilus штамм DSM13241 (La-5), Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus штамм DSM15956, Lactobacillus helveticus штамм DSM14998, Lactobacillus helveticus штамм DSM14997, Lactococcus lactis штамм DSM 14797, Streptococcus thermophilus штамм DSM15957, Lactobacillus fermentum штамм АТСС55845 и Lactobacillus rhamnosus штамм АТСС55826.Specific strains of probiotic bacteria that can produce the molecules described herein, in some aspects, are selected from the group of strains consisting of: Bifidobacterium animalis strain DSM 15954, Bifidobacterium longum subsp. infantis strain DSM15953, Bifidobacterium longum subsp. longum strain DSM15955, Enterococcus faecium strain DSM15958, Lactobacillus acidophilus strain DSM13241 (La-5), Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus strain DSM15956, Lactobacillus helveticus strain DSM14998, Lactobacillus helveticus strain DSM14997, Lactococcus lactis strain DSM 14797, Streptococcus thermophilus strain DSM15957, Lactobacillus fermentum strain ATCC55845 and Lactobacillus rhamnosus strain ATCC55 826.

В преимущественных аспектах молекулы получают из Lactobacillus acidophilus (La-5), а также из штаммов Pediococcus, штаммов Bifidobacterium, таких как, но не ограничиваясь ими, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis и Bifidobacterium crudilactis, а также из штаммов Lactobacillus fermentum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis и Streptococcus thermophilus.In advantageous aspects, the molecules are derived from Lactobacillus acidophilus (La-5), as well as from Pediococcus strains, Bifidobacterium strains such as, but not limited to, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis and Bifidobacterium crudilactis, as well as Lactobacillus fermentum strains, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis and Streptococcus thermophilus.

В настоящее время было показано, что пробиотические молекулы эффективны против не энтеральных патогенов, также были идентифицированы новые молекулы, которые эффективны против энтеральных и не энтеральных патогенов. Пробиотические молекулы, описанные в настоящем документе, включают молекулы, описанные в международных патентных заявках №№ WO 2009/155711 и WO 2015/021530, каждая из которых включена во всей своей полноте в настоящий документ посредством ссылки.Probiotic molecules have now been shown to be effective against non-enteric pathogens, and new molecules have been identified that are effective against enteric and non-enteric pathogens. The probiotic molecules described herein include those described in International Patent Application Nos. WO 2009/155711 and WO 2015/021530, each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

В некоторых аспектах пробиотические молекулы представляют собой малые молекулы, обычно белковые, которые являются термостойкими (могут нагреваться, замораживаться и размораживаться и все еще проявлять активность), стабильны в течение длительных периодов времени в замороженном состоянии (более двух лет), могут быть легко продуцированы в больших объемах (например, около 2 мг/л) и могут быть высушены такими способами, как лиофилизация и/или высушивание распылением. Обычно молекулы представляют собой пептиды.In some aspects, probiotic molecules are small molecules, usually proteins, that are heat stable (can be heated, frozen and thawed and still be active), stable for long periods of time when frozen (more than two years), can be easily produced in large volumes (eg, about 2 mg/L) and can be dried by methods such as lyophilization and/or spray drying. Typically the molecules are peptides.

Молекулы могут быть включены в различные вещества для введения субъекту, такому как любой тип животного и человек. Например, молекулы могут быть включены в любой тип пищевого продукта, пищевой добавки или напитка для потребления животным или человеком.The molecules can be included in various substances for administration to a subject, such as any type of animal and human. For example, the molecules may be included in any type of food, dietary supplement or beverage for animal or human consumption.

Как терапевтическое средство, пробиотические молекулы, описанные в настоящем документе, могут быть введены известным образом животному или человеку для эффективного лечения инфекции. Как терапевтическое или профилактическое средство, лечение можно проводить в сочетании с другими терапиями, если это желательно. В другом варианте осуществления пробиотические молекулы, описанные в настоящем документе, могут быть применены в композициях и способах в добавление к применению целых пробиотических бактерий. Альтернативно, целые пробиотические бактерии могут быть использованы отдельно, при условии, что бактерии культивируют и/или используют так, что молекулы продуцируются в культуральной среде в терапевтически эффективном количестве.As a therapeutic agent, the probiotic molecules described herein can be administered in a known manner to an animal or human to effectively treat an infection. As a therapeutic or prophylactic agent, treatment can be carried out in combination with other therapies if desired. In another embodiment, the probiotic molecules described herein can be used in compositions and methods in addition to the use of whole probiotic bacteria. Alternatively, whole probiotic bacteria can be used alone, provided that the bacteria are cultured and/or used such that the molecules are produced in the culture medium in a therapeutically effective amount.

В некоторых аспектах пробиотические молекулы получают из пробиотических бактерий, таких как Lactobacillus acidophilus (La-5), где молекула содержит одну или более из следующих аминокислотных последовательностей: YPVEPF, YPPGGP, YPPG и NQPY. Преимущественно, молекула содержит следующую аминокислотную последовательность: YPPGGP. Специалисту в данной области понятно, что эти последовательности могут быть изменены путем делеции, замены или вставки при условии, что активность молекул существенно не снижена. Последовательности могут дополнительно содержать вставки, замены или делеции одного или более аминокислотных остатков. Кроме того, молекулы, описанные в настоящем документе, могут быть дополнительно изменены с помощью гликозилирования, дегликозилирования, органических и неорганических солей и ковалентно модифицированы. Также охватываются молекулы, модифицированные для увеличения периода полувыведения in vivo, например пегилированные. Возможные, но не ограничивающие модификации молекул, описанных в настоящем документе, включают модификации, содержащие комбинации аминокислотных замен вместе с делецией одной или более аминокислот или добавлением одной или более аминокислот.In some aspects, probiotic molecules are derived from probiotic bacteria, such as Lactobacillus acidophilus (La-5), where the molecule contains one or more of the following amino acid sequences: YPVEPF, YPPGGP, YPPG, and NQPY. Advantageously, the molecule contains the following amino acid sequence: YPPGGP. One skilled in the art will understand that these sequences may be altered by deletion, substitution or insertion, provided that the activity of the molecules is not significantly reduced. The sequences may further comprise insertions, substitutions or deletions of one or more amino acid residues. In addition, the molecules described herein can be further modified by glycosylation, deglycosylation, organic and inorganic salts, and covalent modification. Also covered are molecules modified to increase half-life in vivo, such as pegylated. Possible, but not limiting, modifications to the molecules described herein include modifications containing combinations of amino acid substitutions together with the deletion of one or more amino acids or the addition of one or more amino acids.

В общем аспекте молекулы, описанные в настоящем документе, могут быть предоставлены в тераIn a general aspect, the molecules described herein may be provided in tera

- 6 046254 певтически эффективном количестве отдельно или в составе композиции и в количествах, которые могут изменяться в зависимости от таких факторов, как статус инфекции/состояние здоровья, возраст, пол и вес реципиента. Режимы дозирования или лечения могут быть скорректированы для обеспечения оптимального терапевтического ответа и могут зависеть от решения лечащего врача или ветеринара. Например, несколько разделенных доз могут быть введены ежедневно или с периодическими интервалами, и/или дозу можно пропорционально уменьшить, в зависимости от остроты терапевтической ситуации. Количество молекулы для введения будет зависеть от пути введения, времени введения и может изменяться в соответствии с индивидуальными ответами субъекта. Подходящими путями введения являются, например, местный, оральный, ректальный или парентеральный (например, внутривенный, подкожный или внутримышечный) путь. Кроме того, молекулы могут быть включены в полимеры, обеспечивающие замедленное высвобождение, причем полимеры имплантируются вблизи места, где требуется доставка, например, в место инфекции, или полимеры могут быть имплантированы, например, подкожно или внутримышечно или доставлены внутривенно или внутрибрюшинно так, чтобы привести к системной доставке молекул, описанных в настоящем документе.- 6 046254 pharmaceutically effective amount alone or in a composition and in amounts that may vary depending on factors such as infection/health status, age, sex and weight of the recipient. Dosage or treatment regimens may be adjusted to ensure optimal therapeutic response and may depend on the judgment of the treating physician or veterinarian. For example, multiple divided doses may be administered daily or at periodic intervals, and/or the dose may be proportionally reduced depending on the severity of the therapeutic situation. The amount of molecule to be administered will depend on the route of administration, the time of administration, and may vary according to the individual responses of the subject. Suitable routes of administration are, for example, topical, oral, rectal or parenteral (eg intravenous, subcutaneous or intramuscular) route. In addition, the molecules can be included in polymers that provide sustained release, where the polymers are implanted near the site where delivery is required, for example, at the site of infection, or the polymers can be implanted, for example, subcutaneously or intramuscularly or delivered intravenously or intraperitoneally so as to lead to systemic delivery of the molecules described herein.

Описанные в настоящем документе молекулы могут быть введены в форме, например, таблетки, капсулы, таблетки для рассасывания, облатки, раствора, суспензии, эмульсии, порошка, аэрозоля, суппозитория, спрея, пастилки, мази, крема, пасты, пены, геля, тампона, пессария, гранулы, болюса, жидкости для полоскания рта или трансдермального пластыря. Молекулы могут быть введены в виде бесклеточного супернатанта, который, в некоторых аспектах, представляет собой концентрат бесклеточного супернатанта. Концентрат может быть в виде жидкости или порошка.The molecules described herein may be administered in the form of, for example, a tablet, capsule, lozenge, cachet, solution, suspension, emulsion, powder, aerosol, suppository, spray, lozenge, ointment, cream, paste, foam, gel, tampon , pessary, granules, bolus, mouthwash, or transdermal patch. The molecules can be administered as a cell-free supernatant, which, in some aspects, is a cell-free supernatant concentrate. The concentrate can be in the form of a liquid or powder.

Лекарственные формы включают лекарственные формы, подходящие для перорального, ректального, назального, ингаляционного, местного (в том числе дермального, трансдермального, буккального и сублингвального), вагинального, парентерального (включая подкожного, внутримышечного, внутривенного, интрадермального, интраокулярного, интратрахеального и эпидурального), интрацистернального или ингаляционного введения. Для удобства лекарственные формы могут быть представлены в виде стандартной дозовой формы и могут быть получены традиционными способами, используемыми в фармацевтике. Такие способы включают этап объединения активного ингредиента с фармацевтическим носителем (носителями) или эксципиентом (эксципиентами). В общем, композиции готовят путем равномерного и тщательного объединения активного ингредиента с жидкими носителями или тонко измельченными твердыми носителями, либо и теми и другими, с последующим, в случае необходимости, формованием продукта.Dosage forms include dosage forms suitable for oral, rectal, nasal, inhalation, topical (including dermal, transdermal, buccal and sublingual), vaginal, parenteral (including subcutaneous, intramuscular, intravenous, intradermal, intraocular, intratracheal and epidural), intracisternal or inhalation administration. For convenience, the dosage forms may be presented in unit dosage form and may be prepared by conventional pharmaceutical methods. Such methods include the step of combining the active ingredient with a pharmaceutical carrier(s) or excipient(s). In general, compositions are prepared by uniformly and thoroughly combining the active ingredient with liquid carriers or finely divided solid carriers, or both, and then, if necessary, molding the product.

Лекарственные формы для перорального введения могут быть представлены в виде дискретных единиц, таких как капсулы, облатки или таблетки, каждая из которых содержит предварительно заданное количество активного ингредиента; или в виде порошка или гранул; или в виде раствора или суспензии в водной или неводной жидкости; или в виде жидкой эмульсии масло-в-воде или вода-в-масле и т.д.Oral dosage forms may be presented in discrete units such as capsules, cachets or tablets, each containing a predetermined amount of the active ingredient; or in powder or granule form; or as a solution or suspension in an aqueous or non-aqueous liquid; or in the form of a liquid emulsion oil-in-water or water-in-oil, etc.

Таблетка может быть изготовлена путем прессования или отливки в форме необязательно с одним или более дополнительными ингредиентами. Прессованные таблетки могут быть изготовлены путем прессования в подходящих машинах молекул, описанных в настоящем документе, в свободно текущей форме, такой как порошок или гранулы, необязательно смешанных со связующим веществом, смазывающим веществом, инертным разбавителем, консервантом, поверхностно-активным и/или диспергирующим агентом. Литые таблетки могут быть приготовлены путем разливки по формам в подходящей машине смеси порошкообразных соединений, смоченной инертным жидким разбавителем. Таблетки могут быть необязательно покрыты оболочкой или помечены риской и могут быть составлены таким образом, чтобы обеспечить замедленное или контролируемое высвобождение активного ингредиента, содержащегося в них.A tablet may be made by compression or casting into a mold, optionally with one or more additional ingredients. Compressed tablets can be prepared by compressing in suitable machines the molecules described herein into a free-flowing form such as powder or granules, optionally mixed with a binder, lubricant, inert diluent, preservative, surfactant and/or dispersant . Cast tablets can be prepared by casting into molds in a suitable machine a mixture of powdered compounds moistened with an inert liquid diluent. Tablets may optionally be coated or scored and may be formulated to provide sustained or controlled release of the active ingredient contained therein.

Составы для местного применения через рот включают таблетки для рассасывания, содержащие ингредиенты в ароматизированной основе, обычно сахарозе и гуммиарабике или трагаканте; пастилки, содержащие активный ингредиент в инертной основе, такой как желатин и глицерин, или сахароза и гуммиарабик; и ополаскиватели для полости рта, содержащие ингредиент в подходящем жидком носителе.Formulations for topical oral administration include lozenges containing the ingredients in a flavored base, usually sucrose and gum arabic or tragacanth; lozenges containing the active ingredient in an inert base such as gelatin and glycerin, or sucrose and gum arabic; and mouth rinses containing the ingredient in a suitable liquid carrier.

Составы, подходящие для местного введения в кожу, могут быть представлены в виде мазей, кремов, гелей или паст, содержащих ингредиент, который нужно вводить, в фармацевтически приемлемом носителе. В одном варианте осуществления система местной доставки представляет собой трансдермальный пластырь, содержащий ингредиент, который нужно вводить.Formulations suitable for topical administration to the skin may be in the form of ointments, creams, gels or pastes containing the ingredient to be administered in a pharmaceutically acceptable carrier. In one embodiment, the topical delivery system is a transdermal patch containing the ingredient to be administered.

Лекарственные формы для ректального введения могут быть представлены в виде суппозитория с подходящей основой, содержащей, например, масло какао или салицилат.Dosage forms for rectal administration can be presented in the form of a suppository with a suitable base containing, for example, cocoa butter or salicylate.

Лекарственные формы, подходящие для назального введения, в которых носитель представляет собой твердую фазу, включают неизмельченный порошок, имеющий размер частиц, например, в диапазоне от 20 до 500 мкм, который вводят путем быстрой ингаляции через носовые ходы порошка из контейнера, подносимого близко к носу. Подходящие лекарственные формы, в которых носитель представляет собой жидкость, для введения, например назальный спрей или назальные капли, включают водные или масляные растворы активного ингредиента.Dosage forms suitable for nasal administration, in which the carrier is a solid phase, include a non-comminuted powder having a particle size, for example, in the range of 20 to 500 microns, which is administered by rapid inhalation through the nasal passages of the powder from a container held close to the nose . Suitable dosage forms in which the carrier is a liquid for administration, for example a nasal spray or nasal drops, include aqueous or oily solutions of the active ingredient.

Лекарственные формы, подходящие для вагинального введения, могут быть представлены в видеDosage forms suitable for vaginal administration may be presented as

- 7 046254 пессариев, тампонов, кремов, гелей, паст, пен или спреев, содержащих в дополнение к активному ингредиенту такие ингредиенты, как носители, которые, как известно из уровня техники, являются подходящими.- 7 046254 pessaries, tampons, creams, gels, pastes, foams or sprays containing, in addition to the active ingredient, ingredients such as carriers known in the art to be suitable.

Лекарственные формы, подходящие для ингаляции, могут быть представлены в виде аэрозолей, распылительных растворов, порошков или спреев, содержащих в дополнение к активному ингредиенту такие ингредиенты, как носители, которые, как известно из уровня техники, являются подходящими.Dosage forms suitable for inhalation may be in the form of aerosols, nebulizers, powders or sprays containing, in addition to the active ingredient, such ingredients as carriers known in the art to be suitable.

Лекарственные формы, подходящие для парентерального введения, включают водные и неводные стерильные инъекционные растворы, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатики и растворы, которые делают лекарственную форму изотонической по отношению к крови предполагаемого реципиента; и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты и загустители. Лекарственные формы, подходящие для парентерального введения, включают аэрозольные препараты антиангиогенных агентов в том числе, но не ограничиваясь ими, частицы низкомикронных или нанометрических (например, менее 2000 нм, обычно менее 1000 нм, наиболее обычно менее 500 нм в поперечном сечении в среднем) размеров, каковые частицы состоят из молекул, описанных в настоящем документе, отдельно или в комбинации с дополнительными ингредиентами или в полимере для пролонгированного высвобождения. Лекарственные формы могут быть представлены в однодозовых или мультидозовых контейнерах, например запечатанные ампулы и флаконы, и могут храниться в высушенном сублимацией (лиофилизированном) состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя, например, воды для инъекций, непосредственно перед использованием. Приготовленные для немедленного приема растворы и суспензии могут быть приготовлены из стерильных порошков, гранул и таблеток ранее описанного типа.Dosage forms suitable for parenteral administration include aqueous and non-aqueous sterile injectable solutions, which may contain antioxidants, buffers, bacteriostatics and solutions that render the dosage form isotonic with the blood of the intended recipient; and aqueous and non-aqueous sterile suspensions, which may include suspending agents and thickening agents. Dosage forms suitable for parenteral administration include aerosol formulations of antiangiogenic agents including, but not limited to, low-micron or nanometric (e.g., less than 2000 nm, typically less than 1000 nm, most typically less than 500 nm cross-sectional average) particle sizes. which particles consist of the molecules described herein, alone or in combination with additional ingredients or in a polymer for sustained release. The dosage forms may be presented in single-dose or multi-dose containers, such as sealed ampoules and vials, and may be stored in a freeze-dried (lyophilized) state, requiring only the addition of a sterile liquid carrier, such as water for injection, immediately prior to use. Solutions and suspensions prepared for immediate administration can be prepared from sterile powders, granules and tablets of the type previously described.

Композиции, содержащие описанные в настоящем документе молекулы, могут содержать от примерно 0,00001% по массе до примерно 99% по массе активного ингредиента и в любом диапазоне в указанном интервале значений. Например, типичные дозы могут содержать от примерно 0,1 до примерно 100 мкг молекул, описанных в настоящем документе, на дозу 300 мг, например примерно 0,5 мкг, примерно 1 мкг, примерно 2 мкг, примерно 3 мкг, примерно 4 мкг, примерно 5 мкг, примерно 6 мкг, примерно 7 мкг, примерно 8 мкг, примерно 9 мкг, примерно 10 мкг, примерно 25 мкг, примерно 50 мкг или примерно 75 мкг на дозу 300 мг, например, от примерно 0,1 до около 10 мкг, или от примерно 1 до примерно 5 мкг, или от примерно 1 до примерно 2 мкг на дозу 300 мг (включая любые соответствующие приращения и проценты по массе).Compositions containing the molecules described herein may contain from about 0.00001% by weight to about 99% by weight of the active ingredient and anywhere within that range. For example, typical doses may contain from about 0.1 to about 100 μg of the molecules described herein per 300 mg dose, such as about 0.5 μg, about 1 μg, about 2 μg, about 3 μg, about 4 μg, about 5 mcg, about 6 mcg, about 7 mcg, about 8 mcg, about 9 mcg, about 10 mcg, about 25 mcg, about 50 mcg, or about 75 mcg per 300 mg dose, e.g., about 0.1 to about 10 mcg, or from about 1 to about 5 mcg, or from about 1 to about 2 mcg per 300 mg dose (including any appropriate increments and percentages by weight).

Пробиотические молекулы могут вводиться на протяжении нескольких часов, дней, недель или месяцев, в зависимости от нескольких факторов, включающих тяжесть подлежащей лечению инфекции, считается ли рецидив инфекции вероятным или для профилактики инфекции и т.д. Введение может быть непрерывным, например непрерывная инфузия в течение нескольких часов, дней, недель, месяцев и т.д. Альтернативно, введение может быть прерывистым, например молекулы могут вводиться один раз в день на протяжении нескольких дней, один раз в час на протяжении нескольких часов или по любому другому такому графику, как это считается подходящим.Probiotic molecules may be administered over a period of hours, days, weeks or months, depending on several factors including the severity of the infection being treated, whether recurrence of the infection is considered likely or to prevent infection, etc. Administration may be continuous, such as continuous infusion over hours, days, weeks, months, etc. Alternatively, administration may be intermittent, for example the molecules may be administered once daily for several days, once per hour for several hours, or on any other such schedule as deemed appropriate.

Композиции, описанные в настоящем документе, могут быть получены с помощью хорошо известных способов получения фармацевтически приемлемых композиций, которые можно вводить субъектам, таким образом, что эффективное количество активного вещества объединено в смеси с фармацевтически приемлемым наполнителем. Подходящие наполнители описаны, например, в Handbook of Pharmaceutical Additives (составлено Майклом и Ирен Эш, Gower Publishing Limited, Олдершот, Англия (1995)). Исходя из этого композиции включают, хотя и не исключительно, растворы веществ в сочетании с одним или более фармацевтически приемлемыми наполнителями или разбавителями и могут содержаться в буферных растворах с подходящим рН и/или быть изоосмотическими с физиологическими жидкостями. В этой связи может быть сделана ссылка на патент США № 5843456 (который включен во всей своей полноте в настоящий документ посредством ссылки).The compositions described herein can be prepared using well known methods for preparing pharmaceutically acceptable compositions that can be administered to subjects such that an effective amount of the active substance is combined in admixture with a pharmaceutically acceptable excipient. Suitable excipients are described, for example, in the Handbook of Pharmaceutical Additives (compiled by Michael and Irene Ash, Gower Publishing Limited, Aldershot, England (1995)). Accordingly, the compositions include, although not exclusively, solutions of substances in combination with one or more pharmaceutically acceptable excipients or diluents and may be contained in buffer solutions of suitable pH and/or be isosmotic with physiological fluids. In this regard, reference may be made to US Pat. No. 5,843,456 (which is incorporated herein by reference in its entirety).

Фармацевтически приемлемые носители хорошо известны специалистам в данной области техники и включают, например, стерильный физиологический раствор, лактозу, сахарозу, фосфат кальция, желатин, декстрин, агар, пектин, арахисовое масло, оливковое масло, кунжутное масло и воду. Кроме того, фармацевтическая композиция может содержать один или более стабилизаторов, такие как, например, углеводы, включая сорбитол, маннитол, крахмал, сахарозу, декстрин и глюкозу, белки, такие как альбумин или казеин, и буферы, подобные щелочным фосфатам.Pharmaceutically acceptable carriers are well known to those skilled in the art and include, for example, sterile saline, lactose, sucrose, calcium phosphate, gelatin, dextrin, agar, pectin, peanut oil, olive oil, sesame oil and water. In addition, the pharmaceutical composition may contain one or more stabilizers, such as, for example, carbohydrates including sorbitol, mannitol, starch, sucrose, dextrin and glucose, proteins such as albumin or casein, and buffers like alkaline phosphates.

В другом неограничивающем аспекте введение пробиотических молекул может осуществляться любым способом, подходящим для введения молекулы в пищеварительный тракт, например, перорально или ректально, после чего пробиотические молекулы попадают в кровоток. Бактерии, продуцирующие пробиотические молекулы и/или выделенные пробиотические молекулы, могут быть смешаны с носителем и нанесены на жидкий или твердый корм или на питьевую воду. Материал носителя должен быть нетоксичным для животного. Бактерии, продуцирующие пробиотические молекулы и/или выделенные пробиотические молекулы, также могут быть в составе композиции, представленной в виде пасты с бактериальным раствором для непосредственного введения в рот животного. Лекарственная форма может включать добавленные ингредиенты для улучшения вкусовых качеств, увеличения срока годности, приIn another non-limiting aspect, administration of probiotic molecules can be accomplished by any method suitable for administering the molecule to the digestive tract, such as orally or rectally, after which the probiotic molecules enter the bloodstream. Bacteria producing probiotic molecules and/or isolated probiotic molecules can be mixed with a carrier and applied to liquid or solid food or drinking water. The carrier material must be non-toxic to the animal. Bacteria producing probiotic molecules and/or isolated probiotic molecules may also be formulated as a paste with a bacterial solution for direct administration to the animal's mouth. The dosage form may include added ingredients to improve taste, increase shelf life, and

- 8 046254 дания питательной ценности и тому подобное. Если желательна воспроизводимая и измеренная доза, молекулы могут вводиться канюлей рубца, как описано в настоящем документе. Количество молекул, выделенных из пробиотических бактерий, подлежащих введению, зависит от факторов, влияющих на эффективность. Путем мониторинга инфекции до, во время и после введения пробиотических молекул из пробиотических бактерий специалисты в данной области техники могут легко определить уровень дозировки, необходимый для уменьшения количества инфекции, переносимой животными. Молекулы из одного или более штаммов пробиотических бактерий могут быть введены совместно. Комбинация штаммов может быть полезной, поскольку отдельные животные могут различаться в отношении штамма, который является наиболее стойким у данного животного.- 8 046254 nutritional information and the like. If a reproducible and measurable dose is desired, the molecules can be administered by rumen cannula as described herein. The number of molecules isolated from probiotic bacteria to be administered depends on factors affecting effectiveness. By monitoring infection before, during and after administration of probiotic molecules from probiotic bacteria, those skilled in the art can easily determine the dosage level necessary to reduce the amount of infection carried by animals. Molecules from one or more strains of probiotic bacteria may be co-administered. A combination of strains may be beneficial because individual animals may differ as to which strain is most resistant in a given animal.

Способы введения пробиотических молекул по существу одинаковы как для профилактики, так и для лечения. Следовательно, исключена необходимость первоначально определить, переносится ли патогенная инфекция животными. Путем регулярного введения эффективной дозы всем животным в стаде риск заражения патогенной инфекцией может быть существенно уменьшен или устранен путем комбинации профилактики и лечения.The routes of administration of probiotic molecules are essentially the same for both prevention and treatment. Therefore, there is no need to initially determine whether the pathogenic infection is carried by animals. By regularly administering an effective dose to all animals in a herd, the risk of contracting a pathogenic infection can be significantly reduced or eliminated through a combination of prevention and treatment.

Специалисту в данной области техники понятно, что выделенные молекулы и содержащие их фракции культуры могут использоваться в сочетании с известными терапиями для профилактики и/или лечения инфекций у субъектов. Также понятно, что композиции пробиотических молекул, описанных в настоящем документе, будь то выделенные или во фракции культуры или в сочетании с пробиотическими бактериями, также могут использоваться в сочетании (в составе с) с источником сахара, таким как, например, глюкоза, в количестве до от примерно 0,01% до примерно 0,1% или более от массы композиции.One skilled in the art will appreciate that the isolated molecules and culture fractions containing them can be used in combination with known therapies to prevent and/or treat infections in subjects. It is also understood that the compositions of probiotic molecules described herein, whether isolated or in a culture fraction or in combination with probiotic bacteria, can also be used in combination with (in combination with) a sugar source, such as, for example, glucose, in an amount to from about 0.01% to about 0.1% or more by weight of the composition.

Также понятно, что хотя композиции, описанные в настоящем документе, могут быть непосредственно приняты внутрь или использованы в качестве добавки в сочетании с пищевыми продуктами, следует понимать, что они могут быть включены в различные пищевые продукты и напитки, включая, не не ограничиваясь этим, йогурты, мороженое, сыры, хлебобулочные изделия, такие как хлеб, печенье и пирожные, молочные продукты и заменители молока, кондитерские изделия, композиции пищевых масел, спреды, хлопья для завтрака, соки, мясо, плодоовощную продукцию и тому подобное. В объем термина пищевые продукты должны входить, в частности, пищевые продукты, которые возможно классифицировать как функциональные пищевые продукты, то есть пищевые продукты, схожие по внешнему виду с обычными пищевыми продуктами и предназначенные для употребления в составе нормальной диеты, но которые были модифицированы для физиологических ролей, помимо предоставления простых питательных веществ. Подобным образом, композиции, описанные в настоящем документе, могут быть представлены в дозированных формах, таких как капсула или высушенная и спрессованная таблетка или ректальный или вагинальный суппозиторий, или в виде аэрозоля или ингалятора. Опять же количество активных пробиотических молекул будет изменяться в зависимости от конкретного пищевого продукта или напитка и может содержать любое количество до примерно 100% продукта, особенно когда они сформулированы в виде глотаемой капсулы/таблетки.It is also understood that while the compositions described herein may be directly ingested or used as a supplement in combination with foods, it should be understood that they may be included in a variety of foods and beverages, including, but not limited to, yoghurts, ice cream, cheeses, baked goods such as bread, cookies and cakes, dairy products and milk substitutes, confectionery, edible oil compositions, spreads, breakfast cereals, juices, meats, fruit and vegetable products and the like. The scope of the term food products shall include, in particular, food products that can be classified as functional foods, that is, food products similar in appearance to conventional foods and intended to be consumed as part of a normal diet, but which have been modified for physiological purposes. roles beyond providing simple nutrients. Likewise, the compositions described herein may be presented in dosage forms, such as a capsule or dried and compressed tablet or rectal or vaginal suppository, or as an aerosol or inhaler. Again, the amount of active probiotic molecules will vary depending on the specific food or beverage and may be present in any amount up to about 100% of the product, especially when formulated as a swallowable capsule/tablet.

Специалисту в данной области также понятно, что молекулы, описанные в настоящем документе, независимо от того, выделены ли они или представлены как внутри фракции культуры, могут быть объединены с использованием пробиотических бактерий в способах лечения или для пищевых добавок. В конкретных аспектах молекулы, описанные в настоящем документе, могут быть объединены с живыми пробиотическими бактериями вида, из которого получены молекулы. В других аспектах эти виды бактерий могут быть исключены из композиций. В других аспектах молекулы, описанные в настоящем документе, могут быть объединены с живыми пробиотическими бактериями вида, который не продуцирует данные молекулы.One skilled in the art will also understand that the molecules described herein, whether isolated or presented as part of a culture fraction, can be combined for use with probiotic bacteria in treatments or for nutritional supplementation. In particular aspects, the molecules described herein can be combined with live probiotic bacteria of the species from which the molecules are derived. In other aspects, these types of bacteria may be excluded from the compositions. In other aspects, the molecules described herein can be combined with live probiotic bacteria of a species that does not produce the molecules.

Способы примененияMethods of application

Неожиданным образом обнаружили, что пробиотические молекулы, описанные в настоящей заявке, при введении в выделенной форме или в форме бактерий, из которых получают пробиотические молекулы, нашли применение при лечении инфекций, согласно аспектам изобретения при лечении энтеральных или не энтеральных инфекций, ряд которых, в частности, описан ниже.Surprisingly, it has been discovered that the probiotic molecules described herein, when administered in isolated form or in the form of bacteria from which the probiotic molecules are derived, have found use in the treatment of infections, according to aspects of the invention in the treatment of enteral or non-enteric infections, a number of which, in specifically described below.

Согласно отдельным аспектам настоящего изобретения молекулы, описанные в настоящей заявке, синергетически взаимодействуют друг с другом и/или с антибиотиками или другими противоинфекционными агентами при лечении и/или профилактике энтеральной или не энтеральной инфекции и/или снижении вирулентности энтеральной или не энтеральной инфекции, понижая резистентность к антибиотикам и/или повышая чувствительность определенного патогенного микроорганизма к общепринятому лечению, такому как лечение антибиотиками.In certain aspects of the present invention, the molecules described herein interact synergistically with each other and/or with antibiotics or other anti-infective agents in the treatment and/or prevention of enteric or non-enteric infections and/or reducing the virulence of enteric or non-enteric infections, reducing resistance to antibiotics and/or by increasing the sensitivity of a particular pathogen to conventional treatment, such as antibiotic treatment.

Инфекции мочевыводящих путейUrinary tract infections

Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) являются одними из наиболее часто встречающихся бактериальных инфекций у людей, причем Е.соН ответственна за 90% всех ИМП и по оценке каждый год поражает 11,3 млн женщин [Marrs et al., 2005]. Штаммы Lactobacillus, которые являются доминирующей микрофлорой, обнаруживаемой во влагалище здоровых женщин, проникают туда из прямой кишки и промежности и формируют во влагалище барьер, блокирующий проникновение уропатогенов. Концепцию искусственного увеличения количества лактобацилл с помощью пробиотиков давно обсуждают теоUrinary tract infections (UTIs) are among the most common bacterial infections in humans, with E. coN responsible for 90% of all UTIs and an estimated 11.3 million women affected each year [Marrs et al., 2005]. Strains of Lactobacillus, which are the dominant microflora found in the vagina of healthy women, penetrate there from the rectum and perineum and form a barrier in the vagina that blocks the penetration of uropathogens. The concept of artificially increasing the number of lactobacilli using probiotics has long been discussed.

- 9 046254 ретически, но лишь недавно была показана ее эффективность [Reid and Bruce, 2005]. В ряде исследований было показано положительное влияние пробиотических штаммов Lactobacillus, применяемых в лечении ИМП, в частности при профилактике рецидивов ИМП [Bruce et al., 1992; Chrisholm, 2015; Delley et al., 2015; Stapleton et al., 2011]. Существует сильная потребность в нахождении безопасного, эффективного и не являющегося антибактериальным способа лечения рецидивов инфекций мочевыводящих путей [Stapleton et al., 2011].- 9 046254 retically, but only recently has its effectiveness been shown [Reid and Bruce, 2005]. A number of studies have shown the positive effect of probiotic Lactobacillus strains used in the treatment of UTIs, in particular in the prevention of recurrent UTIs [Bruce et al., 1992; Chrisholm, 2015; Delley et al., 2015; Stapleton et al., 2011]. There is a strong need to find a safe, effective and non-antibacterial treatment for recurrent urinary tract infections [Stapleton et al., 2011].

Наиболее распространенным патогеном ИМП является Е.соН, которая обладает вирулентностью, регулируемой посредством QS, и ранее было показано, что энтеральная Е.соН становится менее вирулентной при лечении пробиотическими молекулами, описанными в настоящей заявке [Medellin-Pena et al., 2007, Medellin-Pena and Griffiths, 2009, включено в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки]. Уропатогенная Е.соН (UPEC) имеет многие гены вирулентности, совпадающие с генами вирулентности энтеральных Е.соН и активируемые таким же образом, и обладает T3SS. Таким образом, пробиотические молекулы, описанные в настоящей заявке, должны быть эффективны в отношении снижения вирулентности штамма UPEC [Snyder et al., 2004]. Reid [2000] показал, что штамм Lactobacillus acidophilus вырабатывал соединение, которое значимо ингибировало адгезию уропатогенных энтерококков на уроэпителиальных клетках. Основным геном, чья роль в ИМП показана in vivo, являются гены fim, представляющие собой гены фимбриального белка, который необходим для прикрепления к поверхности уроэпителиальных клеток, что нужно для возникновения инфекции [Snyder et al., 2004]. Мы протестируем регуляцию этих генов в штамме UPEC на отрицательную регуляцию при воздействии пробиотических молекул, описанных в настоящей заявке, чтобы убедиться, что этот биопептид эффективно снижает вирулентность уропатогенного штамма Е.соН.The most common UTI pathogen is E. coH, which has QS-regulated virulence, and enteral E. coH has previously been shown to become less virulent when treated with the probiotic molecules described herein [Medellin-Pena et al., 2007, Medellin -Pena and Griffiths, 2009, incorporated herein by reference in its entirety]. Uropathogenic E. coH (UPEC) has many virulence genes that are the same as enteric E. coH virulence genes and are activated in the same way, and has a T3SS. Thus, the probiotic molecules described herein should be effective in reducing the virulence of the UPEC strain [Snyder et al., 2004]. Reid [2000] showed that a strain of Lactobacillus acidophilus produced a compound that significantly inhibited the adhesion of uropathogenic enterococci to uroepithelial cells. The main gene whose role in UTI has been demonstrated in vivo is the fim genes, which are fimbrial protein genes that are required for attachment to the surface of uroepithelial cells, which is necessary for infection to occur [Snyder et al., 2004]. We will test the regulation of these genes in the UPEC strain for down-regulation when exposed to the probiotic molecules described herein to ensure that this biopeptide effectively reduces the virulence of the uropathogenic E. coH strain.

Согласно другим аспектам, пробиотические молекулы, описанные в настоящей заявке, могут найти применение в лечении острого цистита, например, вызванного Е.соН или S. saprophyticus; в лечении пиелонефрита, например, вызванного Е.соН, Klebsiella, Enterobacter или Proteus mirabillis; при лечении осложненной ИМП, например, вызванной Е.соН, Enterococci, Klebsiella, Proteus или Р. aeruginosa; или простатита, например, вызванного Е.соН, грамотрицательными бактериями, Staphylococcus или Enterococcus.In other aspects, the probiotic molecules described herein may find use in the treatment of acute cystitis, for example, caused by E. coli or S. saprophyticus; in the treatment of pyelonephritis, for example, caused by E.coH, Klebsiella, Enterobacter or Proteus mirabillis; in the treatment of complicated UTI, for example, caused by E. con, Enterococci, Klebsiella, Proteus or P. aeruginosa; or prostatitis, for example caused by E. con, gram-negative bacteria, Staphylococcus or Enterococcus.

Бактериальный вагинозBacterial vaginosis

Другой распространенной инфекцией является бактериальный вагиноз (БВ), для которого характерен переход в вагинальной микрофлоре от доминирования защитных лактобактерий к патогенным бактериям, и который является причиной до 25% визитов в гинекологические клиники [Barrons and Tassone, 2008]. БВ повышает риск инфекции ВИЧ и повышает риск рождения детей с низкой массой тела и преждевременных родов [Reid and Burton, 2002]. Частота излечивания БВ с помощью традиционных антибиотиков низкая, и до 50% женщин испытывают рецидив инфекции за 6 месяцев [Barrons and Tassone, 2008]. Ежедневный прием штаммов Lactobacillus приводил к восстановлению нормальной вагинальной микрофлоры у пациентов с асимптоматическим БВ [Reid and Burton, 2002]. В исследовании обнаружили, что применение штаммов Lactobacillus в виде монопрепарата было связано с частотой излечения БВ, сравнимой с частотой излечения при стандартной терапии антибиотиками [Barrons and Tassone, 2008].Another common infection is bacterial vaginosis (BV), which is characterized by a shift in the vaginal microflora from dominance of protective lactobacilli to pathogenic bacteria and is responsible for up to 25% of visits to gynecological clinics [Barrons and Tassone, 2008]. BV increases the risk of HIV infection and increases the risk of low birth weight babies and preterm birth [Reid and Burton, 2002]. Cure rates for BV with traditional antibiotics are low, and up to 50% of women experience recurrent infection within 6 months [Barrons and Tassone, 2008]. Daily intake of Lactobacillus strains resulted in the restoration of normal vaginal microflora in patients with asymptomatic BV [Reid and Burton, 2002]. A study found that single-agent use of Lactobacillus strains was associated with cure rates for BV that were comparable to cure rates with standard antibiotic therapy [Barrons and Tassone, 2008].

Исследования показали, что применение лиофилизированных суппозиториев с пробиотическими бактериями дает возможность быстрой колонизации мочеполового тракта пробиотическими клетками [Barrons and Tassone, 2008; Reid and Bruce, 2006]. Поскольку пробиотические молекулы, описанные в настоящей заявке, устойчивы к способам высушивания, таким как лиофилизация, лиофилизированные суппозитории являются эффективным путем доставки. Это улучшило бы доступность пробиотических молекул к месту локализации инфекции.Studies have shown that the use of lyophilized suppositories with probiotic bacteria allows rapid colonization of the genitourinary tract with probiotic cells [Barrons and Tassone, 2008; Reid and Bruce, 2006]. Because the probiotic molecules described herein are resistant to drying methods such as lyophilization, lyophilized suppositories are an effective route of delivery. This would improve the availability of probiotic molecules to the site of infection.

Инфекции дыхательных путейRespiratory tract infections

Инфекции дыхательных путей охватывают большое число инфекций (отиты, пневмония, фарингиты) и патогенов, включая такие распространенные штаммы, как Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, и Staphylococcus aureus [Nagalingam et al, 2013]. Инфекции дыхательных путей являются очень тяжелыми, особенно у младенцев и пожилых людей, и вносят значимый вклад в заболеваемость и смертность в мировом масштабе. Альтернативные методы лечения и профилактики принесли бы пользу [Veras de Araujo et al., 2015].Respiratory tract infections cover a wide range of infections (otitis, pneumonia, pharyngitis) and pathogens, including common strains such as Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Staphylococcus aureus [Nagalingam et al, 2013]. Respiratory tract infections are very serious, especially in infants and the elderly, and are a significant contributor to morbidity and mortality worldwide. Alternative treatment and prevention methods would be beneficial [Veras de Araujo et al., 2015].

В настоящей заявке в частности рассмотрены инфекции нижних и верхних дыхательных путей с точки зрения пользы лечения описанными в настоящей заявке молекулами. Например, Streptococcus pyogenes, стрептококк группы А при стрептококковых фарингитах (стрептококковое горло) и/или другие инфекции горла можно лечить молекулами, описанными в настоящей заявке.This application particularly addresses infections of the lower and upper respiratory tract in terms of the benefits of treatment with the molecules described herein. For example, Streptococcus pyogenes, group A streptococcus for streptococcal pharyngitis (strep throat) and/or other throat infections can be treated with the molecules described herein.

Nagalingam и соавторы предполагают, что состав микробиома носовых пазух коррелирует с заболеванием. Микробиом носовых пазух пациентов с хроническим риносинуситом показал значимое снижение популяций молочнокислых бактерий (LAB) по сравнению со здоровыми лицами [Nagalingam et al., 2013]. Кроме того, они предполагают, что добавку LAB можно применять для защиты слизистых оболочек дыхательного пути от инфекций, так же как и в случае ЖК и мочеполового пути [Nagalingam et al., 2013]. Есть целый ряд исследований того, как пробиотики влияют на инфекции верхних дыхательных путей. Два примера показали, что в двух очень восприимчивых популяциях (младенцы и пожилые) у лиц, получавших пероральные добавки пробиотических бактерий, инфекции верхних дыхательных путейNagalingam et al suggest that the composition of the sinus microbiome correlates with disease. The sinus microbiome of patients with chronic rhinosinusitis showed a significant decrease in lactic acid bacteria (LAB) populations compared to healthy individuals [Nagalingam et al., 2013]. In addition, they suggest that LAB supplementation can be used to protect the mucous membranes of the respiratory tract from infections, as in the case of GI and genitourinary tracts [Nagalingam et al., 2013]. There are a number of studies on how probiotics affect upper respiratory tract infections. Two examples showed that in two highly susceptible populations (infants and the elderly), individuals receiving oral probiotic bacteria supplements developed upper respiratory tract infections

- 10 046254 (ИВДП) встречались реже по сравнению с контрольными группами [Maldonado et al, 2012; Guillmard et al., 2010].- 10 046254 (URTI) were less common compared to control groups [Maldonado et al, 2012; Guilmard et al., 2010].

В большинстве исследований использовали пероральный прием пробиотических бактерий, однако назальные спреи также были эффективными [Skovberg et al., 2009]. Таким образом, еще одним способом доставки могут быть назальные спреи. Это улучшило бы доставку пробиотических бактерий к месту инфицирования.Most studies have used oral probiotic bacteria, but nasal sprays have also been effective [Skovberg et al., 2009]. So another delivery option could be nasal sprays. This would improve the delivery of probiotic bacteria to the site of infection.

Инфекция Helicobacter pyloriHelicobacter pylori infection

Helicobacter pylori вызывает хронический гастрит и отвечает за развитие язвенной болезни, и его считают фактором риска развития злокачественных заболеваний желудка, таких как лимфомы лимфоидной ткани, ассоциированные со слизистой оболочкой желудка, и аденокарцинома желудка [Wang et al., 2004]. Хотя существующие антибактериальные терапии являются эффективными, есть опасения, связанные с резистентностью к антибиотикам. Кроме того, такие лекарственные средства могут иметь негативные побочные эффекты, которые часто приводят к прекращению лечения. По этим причинам желательно изучать альтернативные терапии [Wang et al., 2004]. В своем исследовании Wang et al., [2004] обнаружили, что при приеме внутрь пробиотический йогурт, содержавший штаммы Lactobacillus и Bifidobacterium, был способен подавлять инфекцию Н. pylori у людей [Wang et al., 2004]. В более старом исследовании обнаружили, что супернатант Lactobacillus acidophilus La1 подавлял рост Н. pylori in vitro, и было показано, что он оказывал подавляющее действие на Н. pylori у людей [Michetti et al., 1999]. В другом исследовании, проведенном Canducci с соавторами, было также показано, что истощенный культуральный супернатант L. acidophilus обладает способностью резко снижать жизнеспособность Н. pylori как in vitro, так и in vivo [2000]. Это дает убедительное подтверждение того, что пробиотическая биоактивность, продуцируемая штаммами Lactobacillus в бесклеточной истощенной среде, может оказывать полезный эффект при лечении инфекции Н. pylori.Helicobacter pylori causes chronic gastritis and is responsible for the development of peptic ulcers, and is considered a risk factor for the development of gastric malignancies, such as gastric mucosa-associated lymphoid tissue lymphomas and gastric adenocarcinoma [Wang et al., 2004]. Although existing antibacterial therapies are effective, there are concerns regarding antibiotic resistance. In addition, such drugs can have negative side effects, which often lead to discontinuation of treatment. For these reasons, it is desirable to explore alternative therapies [Wang et al., 2004]. In their study, Wang et al., [2004] found that when taken orally, probiotic yogurt containing Lactobacillus and Bifidobacterium strains was able to suppress H. pylori infection in humans [Wang et al., 2004]. An older study found that Lactobacillus acidophilus La1 supernatant inhibited the growth of H. pylori in vitro and was shown to have an inhibitory effect on H. pylori in humans [Michetti et al., 1999]. Another study by Canducci et al also showed that depleted culture supernatant of L. acidophilus had the ability to dramatically reduce the viability of H. pylori both in vitro and in vivo [2000]. This provides strong evidence that probiotic bioactivity produced by Lactobacillus strains in cell-free depleted media may have a beneficial effect in the treatment of H. pylori infection.

Инфекция метициллин-резистентного Staphylococcus aureus (MRSA)Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) infection

Метициллин-резистентный Staphylococcus aureus (MRSA) отвечает за многие угрожающие жизни инфекции, включая пневмонию, сепсис, остеомиелит и эндокардит. Колонизация пациентов обычно длится в течение долгого периода времени, при этом 50% пациентов остаются колонизированными по истечении одного года [Karska-Wysocki, et al., 2010]. MRSA представляет собой биопленку, вырабатываемую патогеном, которая способна к адгезии со многими поверхностями. Это исследование продемонстрировало, что Lactobacillus acidophilus обладали способностью элиминировать 99% клеток MRSA через 24 часа инкубации. В исследовании этот эффект связывают с молочнокислыми бактериями, вырабатывающими биоактивные пептиды, которые ингибируют формирование биопленки [Karska-Wysocki, et al., 2010]. Показано, что пробиотические молекулы, описанные в настоящей заявке, препятствуют системам QS, которые регулируют формирование биопленки. Это могло бы ингибировать биопленки и, следовательно, пробиотические молекулы могли бы быть эффективны в лечении не только MRSA, но и других резистентных к антибиотикам патогенов.Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is responsible for many life-threatening infections, including pneumonia, sepsis, osteomyelitis, and endocarditis. Colonization of patients usually continues over a long period of time, with 50% of patients remaining colonized after one year [Karska-Wysocki, et al., 2010]. MRSA is a biofilm produced by the pathogen that is capable of adhesion to many surfaces. This study demonstrated that Lactobacillus acidophilus had the ability to eliminate 99% of MRSA cells after 24 hours of incubation. The study attributed this effect to lactic acid bacteria that produce bioactive peptides that inhibit biofilm formation [Karska-Wysocki, et al., 2010]. The probiotic molecules described herein have been shown to interfere with the QS systems that regulate biofilm formation. This could inhibit biofilms and therefore probiotic molecules could be effective in treating not only MRSA but also other antibiotic-resistant pathogens.

Здоровье полости ртаOral health

Научные исследования подтверждают, что пробиотики эффективны для поддержания здоровья полости рта и профилактики болезней полости рта. Например, показано, что пробиотики могут усиливать симбиотическую микрофлору и предотвращать колонизацию патогенами, тем самым предотвращая воспаление десен [Iniesta et al., 2012]. Есть несколько исследований, в которых оценивается применение Lactobacilli probiotics для поддержания здоровья полости рта. Результаты указывают на то, что применение таблеток, содержащих L reuteri, было связано со значительным снижением Prevotella intermedia в слюне, а также с количеством периодонтальных патогенов, таких как P. gingivalis [Iniesta et al., 2012]. Результаты указывают на то, что пероральное введение таблеток для рассасывания с L. reuteri может быть полезным в сочетании со снятием зубных отложений и выравниванием поверхности корней зубов при хроническом периодонтите [Teughels et al., 2013].Scientific research confirms that probiotics are effective in maintaining oral health and preventing oral disease. For example, it has been shown that probiotics can enhance commensal microflora and prevent colonization by pathogens, thereby preventing gingival inflammation [Iniesta et al., 2012]. There are several studies evaluating the use of Lactobacilli probiotics for maintaining oral health. Results indicate that the use of tablets containing L reuteri was associated with a significant reduction in Prevotella intermedia in saliva, as well as the incidence of periodontal pathogens such as P. gingivalis [Iniesta et al., 2012]. Results indicate that oral lozenges containing L. reuteri may be beneficial in combination with plaque removal and root planing in chronic periodontitis [Teughels et al., 2013].

Porphyrmonas gingivalis - распространенный патоген, ответственный за периодонтит. Пробиотический штамм Lactobacillus значимо снижал количество Р. gingivalis [Matsuoka and Koga, 2014]. Примеры показывают, что применение пробиотических бактерий Lactobacillus может препятствовать адгеренции патогенов, и колонизация этих бактерий может давать значимую пользу для здоровья.Porphyrmonas gingivalis is a common pathogen responsible for periodontitis. The probiotic strain Lactobacillus significantly reduced the number of P. gingivalis [Matsuoka and Koga, 2014]. Examples show that the use of probiotic Lactobacillus bacteria can inhibit the adhesion of pathogens, and colonization of these bacteria can provide significant health benefits.

Из вышесказанного очевидно, что пробиотические молекулы, описанные в настоящей заявке, могут найти применение в лечении широкого множества патогенов, включая бактерии, вирусы, дрожжи, грибы и паразиты. Согласно аспектам изобретения патоген не является энтеральным и/или инфекция локализована не в кишечнике.From the foregoing, it is apparent that the probiotic molecules described herein may find use in the treatment of a wide variety of pathogens, including bacteria, viruses, yeast, fungi and parasites. According to aspects of the invention, the pathogen is not enteric and/or the infection is not localized in the intestine.

Например, пробиотические молекулы, описанные в настоящем документе, могут быть полезными при лечении бактериальной инфекции, вызванной родом, выбранным из группы, состоящей из Abiotrophia, Achromobacter, Acidaminococcus, Acidovorax, Acinetobacter, Actinobacillus, Actinobaculum, Actinomadura, Actinomyces, Aerococcus, Aeromonas, Afipia, Agrobacterium, Alcaligenes, Alloiococcus, Alteromonas, Amycolata, Amycolatopsis, Anaerobospirillum, Anaerorhabdus, Anguillina, Arachnia, Arcanobacterium, Arcobacter, Arthrobacter, Atopobium, Aureobacterium, Bacillus, Bacteroides, Balneatrix, Bartonella, Bergeyella, Bifidobacterium, Bilophila, Branhamella, Borrelia, Bordetella, Brachyspira, Brevibacillus, BrevibacteFor example, the probiotic molecules described herein may be useful in treating a bacterial infection caused by a genus selected from the group consisting of Abiotrophia, Achromobacter, Acidaminococcus, Acidovorax, Acinetobacter, Actinobacillus, Actinobaculum, Actinomadura, Actinomyces, Aerococcus, Aeromonas, Afipia , Agrobacterium, Alcaligenes, Alloiococcus, Alteromonas, Amycolata, Amycolatopsis, Anaerobospirillum, Anaerorhabdus, Anguillina, Arachnia, Arcanobacterium, Arcobacter, Arthrobacter, Atopobium, Aureobacterium, Bacillus, Bacteroides, Balneatrix, Bartonella, Bergeyella, Bifidobacterium, Bilophila, Branhamella, Borre lia, Bordetella , Brachyspira, Brevibacillus, Brevibacte

- 11 046254 rium, Brevundimonas, Brucella, Burkholderia, Buttiauxella, Butyrivibrio, Calymmatobacterium, Campylobacter, Capnocytophaga, Cardiobacterium, Catonella, Cedecea, Cellulomonas, Centipeda, Chlamydia, Chlamydophila, Chromobacterium, Chyseobacterium, Chryseomonas, Citrobacter, Clostridium, Collinsella, Comamonas, Corynebacterium, Coxiella, Cryptobacterium, Delfiia, Dermabacter, Dermatophilus, Desulfomonas, Desulfovibrio, Dialister, Dichelobacter, Dolosicoccus, Dolosigranulum, Edwardsiella, Eggerthella, Ehrlichia, Eikenella, Empedobacter, Enterobacter, Enterococcus, Erwinia, Erysipelothrix, Escherichia, Eubacterium, Ewingella, Exiguobacterium, Facklamia, Filif actor, Flavimonas, Flavobacterium, Flexispira, Francisella, Fusobacterium, Gardnerella, Gemella Globicatella, Gordona, Haemophilus, Hafnia, Helicobacter, Helococcus, Holdemania, Ignavigranum, Johnsonella, Kingella, Klebsiella, Kocuria, Koserella, Kurthia, Kytococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Lautropia, Leclercia, Legionella, Leminorella, Leptospira, Leptotrichia, Leuconostoc, Listeria, Listonella, Megasphaera, Methylobacterium, Microbacterium, Micrococcus, Mitsuokella, Mobiluncus, Moellerella, Moraxella, Morganella, Mycobacterium, Mycoplasma, Myroides, Neisseria, Nocardia, Nocardiopsis, Ochrobactrum, Oeskovia, Oligella, Orientia, Paenibacillus, Pantoea, Parachlamydia, Pasteurella, Pediococcus, Peptococcus, Peptostreptococcus, Photobacterium, Photorhabdus, Plesiomonas Porphyrimonas, Prevotella, Propionibacterium, Proteus, Providencia, Pseudomonas, Pseudonocardia, Pseudoramibacter, Psychrobacter, Rahnella, Ralstonia, Rhodococcus, Rickettsia, Rochalimaea, Roseomonas, Rothia, Ruminococcus, Salmonella, Selenomonas, Serpulina, Serratia, Shewenella, Shigella, Simkania, Slackia, Sphingobacterium, Sphingomonas, Spirillum, Staphylococcus, Stenotrophomonas, Stomatococcus, Streptobacillus, Streptococcus, Streptomyces, Succinivibrio, Sutterella, Suttonella, Tatumella, Tissierella, Trabulsiella, Treponema, Tropheryma, Tsakamurella, Turicella, Ureaplasma, Vagococcus, Veillonella, Vibrio, Weeksella, Wolinella, Xanthomonas, Xenorhabdus, Yersinia и Yokenella.- 11 046254 rium, Brevundimonas, Brucella, Burkholderia, Buttiauxella, Butyrivibrio, Calymmatobacterium, Campylobacter, Capnocytophaga, Cardiobacterium, Catonella, Cedecea, Cellulomonas, Centipeda, Chlamydia, Chlamydophila, Chromobacterium, Chyseobacterium, Chryseomonas, Citrobacter, Clostridium, Collins ella, Comamonas, Corynebacterium , Coxiella, Cryptobacterium, Delfiia, Dermabacter, Dermatophilus, Desulfomonas, Desulfovibrio, Dialister, Dichelobacter, Dolosicoccus, Dolosigranulum, Edwardsiella, Eggerthella, Ehrlichia, Eikenella, Empedobacter, Enterobacter, Enterococcus, Erwinia, Erysipelothrix, Escherichia, Eubacterium, Ewingella, Exiguobacterium, Facklamia , Filif actor, Flavimonas, Flavobacterium, Flexispira, Francisella, Fusobacterium, Gardnerella, Gemella Globicatella, Gordona, Haemophilus, Hafnia, Helicobacter, Helococcus, Holdemania, Ignavigranum, Johnsonella, Kingella, Klebsiella, Kocuria, Koserella, Kurthia, Kytococcus, Lactobacillus, Lactococcus , Lautropia, Leclercia, Legionella, Leminorella, Leptospira, Leptotrichia, Leuconostoc, Listeria, Listonella, Megasphaera, Methylobacterium, Microbacterium, Micrococcus, Mitsuokella, Mobiluncus, Moellerella, Moraxella, Morganella, Mycobacterium, Mycoplasma, Myroides, Neisseria, Nocardia, Nocardiopsis, Ochrobactrum , Oeskovia, Oligella, Orientia, Paenibacillus, Pantoea, Parachlamydia, Pasteurella, Pediococcus, Peptococcus, Peptostreptococcus, Photobacterium, Photorhabdus, Plesiomonas Porphyrimonas, Prevotella, Propionibacterium, Proteus, Providencia, Pseudomonas, Pseudonocardia, Pseudoramibacter, Psychrobacter , Rahnella, Ralstonia, Rhodococcus, Rickettsia, Rochalimaea, Roseomonas, Rothia, Ruminococcus, Salmonella, Selenomonas, Serpulina, Serratia, Shewenella, Shigella, Simkania, Slackia, Sphingobacterium, Sphingomonas, Spirillum, Staphylococcus, Stenotrophomonas, Stomatococcus, Streptobacillus, Streptococcus, Streptomyces, Succinivibri o, Sutterella, Suttonella, Tatumella, Tissierella, Trabulsiella, Treponema, Tropheryma, Tsakamurella, Turicella, Ureaplasma, Vagococcus, Veillonella, Vibrio, Weeksella, Wolinella, Xanthomonas, Xenorhabdus, Yersinia and Yokenella.

Например, бактериальная инфекция может быть вызвана бактерией, выбранной из группы, состоящей из Actimomyces europeus, Actimomyces georgiae, Actimomyces gerencseriae, Actimomyces graevenitzii, Actimomyces israelii,, Actimomyces meyeri, Actimomyces naeslundii, Actimomyces neuii neuii, Actimomyces neuii anitratus, Actimomyces odontolyticus, Actimomyces radingae, Actimomyces turicensis, Actimomyces viscosus, Arthrobacter creatinolyticus, Arthrobacter cumminsii, Arthrobacter woluwensis, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus myroides, Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Borrelia afzelii, Borrelia andersonii, Borrelia bissettii, Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii, Borrelia japonica, Borrelia lusitaniae, Borrelia tanukii, Borrelia turdi, Borrelia valaisiana Borrelia caucasica, Borrelia crocidurae, Borrelia recurrentis, Borrelia duttoni, Borrelia graingeri, Borrelia hermsii, Borrelia hispanica, Borrelia latyschewii, Borrelia mazzottii, Borrelia parkeri, Borrelia persica, Borrelia recurrentis, Borrelia turicatae, Borrelia venezuelensi, Bordetella bronchiseptica, Bordetella hinzii, Bordetella holmseii, Bordetella parapertussis, Bordetella pertussis, Bordetella trematum, Clostridium absonum, Clostridium argentinense, Clostridium baratii, Clostridium bifermentans, Clostridium beijerinckii, Clostridium butyricum, Clostridium cadaveris, Clostridium carnis, Clostridium celatum, Clostridium clostridioforme, Clostridium cochlearium, Clostridium cocleatum, Clostridium fallax, Clostridium ghonii, Clostridium glycolicum, Clostridium haemolyticum, Clostridium hastiforme, Clostridium histolyticum, Clostridium indolis, Clostridium innocuum, Clostridium irregulare, Clostridium leptum, Clostridium limosum, Clostridium malenominatum, Clostridium novyi, Clostridium oroticum, Clostridium paraputriecum, Clostridium piliforme, Clostridium putrefasciens, Clostridium ramosum, Clostridium septicum, Clostridium sordelii, Clostridium sphenoides, Clostridium sporogenes, Clostridium subterminale, Clostridium symbiosum, Clostridium tertium, Escherichia coli, Escherichia fergusonii, Escherichia hermanii, Escherichia vulneris, Enterococcus avium, Enterococcus casseliflavus, Enterococcus cecorum, Enterococcus dispar, Enterococcus durans, Enterococcus faecal is, Enterococcus faecium, Enterococcus flavescens, Enterococcus gallinarum, Enterococcus hirae, Enterococcus malodoratus, Enterococcus mundtii, Enterococcus pseudoavium, Enterococcus raffinosus, Enterococcus solitarius, Haemophilus aegyptius, Haemophilus aphrophilus, Haemophilus par aphrophilus, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus segnis, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Klebsiella ornitholytica, Klebsiella oxytoca, Klebsiella planticola, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenae, Klebsiella terrigena, Lysteria ivanovii, Lysteria monocytogenes, Mycobacterium abscessus, Mycobacterium africanum, Mycobacterium alvei, Mycobacterium asiaticum, Mycobacterium aurum, Mycobacterium avium, Mycobacterium bohemicum, Mycobacterium bovis, Mycobacterium branderi, Mycobacterium brumae, Mycobacterium celatum, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium chubense, Mycobacterium confluentis, Mycobacterium conspicuum, Mycobacterium cookii, Mycobacterium flavescens, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium gadium, Mycobacterium gastri, Mycobacterium genavense, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium goodii, Mycobacterium haemophilum, Mycobacterium hassicum, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium interjectum, Mycobacterium heidelberense, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium lentiflavum, Mycobacterium leprae, Mycobacterium malmoense, Mycobacterium marinum, Mycobacterium microgenicum, Mycobacterium microti, Mycobacterium mucogenicum, Mycobacterium neoaurum, Mycobacterium nonchromogenicum, Mycobacterium peregrinum, Mycobacterium phlei, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium shimoidei, Mycobacterium simiae, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium szulgai, Mycobacterium terrae, Mycobacterium thermoresistabile, Mycobacterium triplex, Mycobacterium triviale, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium tusciae, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium vaccae, Mycobacterium wolinskyi, Mycobacterium xenopi, MycoplasmaFor example, the bacterial infection may be caused by a bacterium selected from the group consisting of Actimomyces europeus, Actimomyces georgiae, Actimomyces gerencseriae, Actimomyces graevenitzii, Actimomyces israelii, Actimomyces meyeri, Actimomyces naeslundii, Actimomyces neuii neuii, Actimomyces neuii anitratus, Actimomyces ces odontolyticus, Actimomyces radingae , Actimomyces turicensis, Actimomyces viscosus, Arthrobacter creatinolyticus, Arthrobacter cumminsii, Arthrobacter woluwensis, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus myroides, Bacillus pumilus, Bacillus s phaericus, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Borrelia afzelii, Borrelia andersonii, Borrelia bissettii, Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii, Borrelia japonica, Borrelia lusitaniae, Borrelia tanukii, Borrelia turdi, Borrelia valaisiana Borrelia caucasica, Borrelia crocidurae, Borrelia recurrentis, Borrelia duttoni, Borrelia graingeri, Borrelia hermsii, Bor relia hispanica, Borrelia latyschewii, Borrelia mazzottii, Borrelia parkeri, Borrelia persica, Borrelia recurrentis, Borrelia turicatae, Borrelia venezuelensi, Bordetella bronchiseptica, Bordetella hinzii, Bordetella holmseii, Bordetella parapertussis, Bordetella pertussis, Bordetella trematum, Clostridium absonum, Clostridium argent inense, Clostridium baratii, Clostridium bifermentans, Clostridium beijerinckii, Clostridium butyricum, Clostridium cadaveris, Clostridium carnis, Clostridium celatum, Clostridium clostridioforme, Clostridium cochlearium, Clostridium cocleatum, Clostridium fallax, Clostridium ghonii, Clostridium glycolicum, Clostridium haemolyticum, Clostridium hastiforme, Clostridium histo lyticum, Clostridium indolis, Clostridium innocuum, Clostridium irregulare , Clostridium leptum, Clostridium limosum, Clostridium malenominatum, Clostridium novyi, Clostridium oroticum, Clostridium paraputriecum, Clostridium piliforme, Clostridium putrefasciens, Clostridium ramosum, Clostridium septicum, Clostridium sordelii, Clostridium sphenoides, Clostridium sporogenes, Clostridium subterm inale, Clostridium symbiosum, Clostridium tertium, Escherichia coli, Escherichia fergusonii, Escherichia hermanii, Escherichia vulneris, Enterococcus avium, Enterococcus casseliflavus, Enterococcus cecorum, Enterococcus dispar, Enterococcus durans, Enterococcus faecal is, Enterococcus faecium, Enterococcus flavescens, Enterococcus gallinarum, Enterococcus hirae, Enterococcus malodoratus, Enterococcus ococcus mundtii, Enterococcus pseudoavium , Enterococcus raffinosus, Enterococcus solitarius, Haemophilus aegyptius, Haemophilus aphrophilus, Haemophilus par aphrophilus, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus segnis, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Klebsiella ornitholytica, Klebsiella oxytoca, Klebsiella planticola, Klebs iella pneumoniae, Klebsiella ozaenae, Klebsiella terrigena, Lysteria ivanovii, Lysteria monocytogenes, Mycobacterium abscessus, Mycobacterium africanum, Mycobacterium alvei, Mycobacterium asiaticum, Mycobacterium aurum, Mycobacterium avium, Mycobacterium bohemicum, Mycobacterium bovis, Mycobacterium branderi, Mycobacterium brumae, Mycobacterium celatum, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium chubense, Mycobacterium confluentis , Mycobacterium conspicuum, Mycobacterium cookii , Mycobacterium flavescens, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium gadium, Mycobacterium gastri, Mycobacterium genavense, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium goodii, Mycobacterium haemophilum, Mycobacterium hassicum, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium interjectum, Mycobacterium heidelberense, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium lentiflavum, Mycobacterium leprae, Mycobacterium malmoense, Mycobacterium marinum, Mycobacterium microgenicum, Mycobacterium microti, Mycobacterium mucogenicum, Mycobacterium neoaurum, Mycobacterium nonchromogenicum, Mycobacterium peregrinum, Mycobacterium phlei, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium shimoidei, Mycobacterium simiae, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium szulgai, Mycobacterium terrae, Mycobacterium thermoresistabile, Mycobacterium triplex, Mycobacterium triviale, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium tusciae, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium vaccae, Mycobacterium wolinskyi, Mycobacterium xenopi, Mycoplasma

- 12 046254 buccale, Mycoplasma faucium, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma lipophilum, Mycoplasma orale, Mycoplasma penetrans, Mycoplasma pirum, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma primatum, Mycoplasma salivarium, Mycoplasma spermatophilum, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas luteola. Pseudomonas mendocina, Pseudomonas monteilii, Pseudomonas oryzihabitans, Pseudomonas pertocinogena, Pseudomonas pseudalcaligenes, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, Rickettsia africae, Rickettsia akari, Rickettsia australis, Rickettsia conorii, Rickettsia felis, Rickettsia honei, Rickettsia japonica, Rickettsia mongolotimonae, Rickettsia prowazeldi, Rickettsia rickettsiae, Rickettsia sibirica, Rickettsia slovaca, Rickettsia typhi, Salmonella choleraesuis choleraesuis, Salmonella choleraesuis arizonae, Salmonella choleraesuis bongori, Salmonella choleraesuis diarizonae, Salmonella choleraesuis houtenae, Salmonella choleraesuis indica, Salmonella choleraesuis salamae, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Shigella dysentaeriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Staphylococcus auricularis, Staphylococcus capitis capitis, Staphylococcus с. ureolyticus, Staphylococcus caprae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus cohnii cohnii, Staphylococcus с. ureolyticus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus equorum, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis hominis, Staphylococcus h. novobiosepticius, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus pasteuri, Staphylococcus saccharolyticus, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus schleiferi schleiferi, Staphylococcus s. coagulans, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus simulans, Staphylococcus warneri, Staphylococcus xylosus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus canis, Streptococcus dysgalactiae dysgalactiae, Streptococcus dysgalactiae equisimilis, Streptococcus equi equi, Streptococcus equi zooepidemicus, Streptococcus iniae, Streptococcus porcinus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus anginosus, Streptococcus constellatus constellatus, Streptococcus constellatus pharyngidis, Streptococcus intermedius, Streptococcus mitis, Streptococcus oralis, Streptococcus sanguinis, Streptococcus cristatus, Streptococcus gordonii, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus salivarius, Streptococcus vestibularis, Streptococcus criceti, Streptococcus mutans, Streptococcus ratti, Streptococcus sobrinus, Streptococcus acidominimus, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus suis, Vibrio alginolyticus, V, carchariae, Vibrio cholerae, C. cincinnatiensis, Vibrio damsela, Vibrio fluvialis, Vibrio furnissii, Vibrio hollisae, Vibrio metschnikovii, Vibrio mimicus, Vibrio par ahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Yersinia pestis, Yersinia aldovae, Yersinia bercovieri, Yersinia enterocolitica, Yersinia frederiksenii, Yersinia intermedia, Yersinia kristensenii, Yersinia mollaretii, Yersinia pseudotuberculosis и Yersinia rohdei.- 12 046254 buccale, Mycoplasma faucium, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma lipophilum, Mycoplasma orale, Mycoplasma penetrans, Mycoplasma pirum, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma primatum, Mycoplasma salivarium, Mycoplasma spermatophilum, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas luteola. Pseudomonas mendocina, Pseudomonas monteilii, Pseudomonas oryzihabitans, Pseudomonas pertocinogena, Pseudomonas pseudalcaligenes, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, Rickettsia africae, Rickettsia akari, Rickettsia australis, Rickettsia conorii, Rickettsia felis, Rickettsia honei , Rickettsia japonica, Rickettsia mongolotimonae, Rickettsia prowazeldi, Rickettsia rickettsiae , Rickettsia sibirica, Rickettsia slovaca, Rickettsia typhi, Salmonella choleraesuis choleraesuis, Salmonella choleraesuis arizonae, Salmonella choleraesuis bongori, Salmonella choleraesuis diarizonae, Salmonella choleraesuis houtenae, Salmonella choleraesuis indica, Salmonella choleraesuis salamae, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Shigella dysentaeriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Staphylococcus auricularis, Staphylococcus capitis capitis, Staphylococcus p. ureolyticus, Staphylococcus caprae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus cohnii cohnii, Staphylococcus p. ureolyticus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus equorum, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis hominis, Staphylococcus h. novobiosepticius, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus pasteuri, Staphylococcus saccharolyticus, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus schleiferi schleiferi, Staphylococcus s. coagulans, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus simulans, Staphylococcus warneri, Staphylococcus xylosus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus canis, Streptococcus dysgalactiae dysgalactiae, Streptococcus dysgalactiae equisimilis, Streptococcus equi equi, Streptococcus equi zooepidemicus, Streptococcus iniae, Streptococcus porcinus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus anginosus, Streptococcus constellatus constellatus, Streptococcus constellatus pharyngidis, Streptococcus intermedius, Streptococcus mitis, Streptococcus oralis, Streptococcus sanguinis, Streptococcus cristatus, Streptococcus gordonii, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus salivarius, Streptococcus vestibularis, Streptococcus criceti, Streptococcus mutans, Streptococcus ratti, Streptococcus sobrinus, Streptococcus acidominimus, Streptococcus bovis , Streptococcus equinus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus suis, Vibrio alginolyticus, V, carchariae, Vibrio cholerae, C. cincinnatiensis, Vibrio damsela, Vibrio fluvialis, Vibrio furnissii, Vibrio hollisae, Vibrio metschnikovii, Vibrio mimicus, Vibrio par ahaemolyticus , Vibrio vulnificus, Yersinia pestis, Yersinia aldovae, Yersinia bercovieri, Yersinia enterocolitica, Yersinia frederiksenii, Yersinia intermedia, Yersinia kristensenii, Yersinia mollaretii, Yersinia pseudotuberculosis and Yersinia rohdei.

Альтернативно, пробиотические молекулы, описанные в настоящем документе, могут найти применение при лечении вируса из семейства, выбранного из группы, состоящей из Astroviridae, Caliciviridae, Picornaviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Caronaviridae, Paramyxviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Reoviridae, Bornaviridae, Retroviridae, Poxviridae, Herpesviridae, Adenoviridae, Papovaviridae, Parvoviridae, Hepadnaviridae, (например, вируса, выбраного из группы, состоящей из вируса Коксаки А-24, вируса Адено 11, вируса Адено 21, вируса Коксаки В, вируса болезни Борна, респираторно-синцитиального вируса, вируса парагриппа, вируса калифорнийского энцефалита, вируса папилломы человека, вируса ветряной оспы, вируса колорадской клещевой лихорадки, вируса простого герпеса, вируса коровьей оспы, вируса парагриппа 1, вируса парагриппа 2, вируса парагриппа 3, вируса лихорадки Денге, вируса эболы, парвовируса В19, вируса Коксаки А- 16, ВПГ-1, вируса гепатита А, вируса гепатита В, вируса гепатита С, вируса гепатита D, вируса гепатита Е, вируса иммунодефицита человека, Коксакки В1-В5, вирусов гриппа А, В или С, вируса Ла-Кросс, вируса Ласса, вируса краснухи Коксаки А или В, эховируса, вируса лимфатического хориоменингита, ВПГ-2, вируса свинки, респираторно-синцитиального вируса, вируса Эпштейна-Барра, полиовируса, энтеровируса, вируса бешенства, рубивируса, вируса оспы человека, вируса WEE, вируса жетой лихорадки и вируса варицелла-зостер).Alternatively, the probiotic molecules described herein may find use in the treatment of a virus from a family selected from the group consisting of Astroviridae, Caliciviridae, Picornaviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Caronaviridae, Paramyxviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Reoviridae , Bornaviridae, Retroviridae, Poxviridae, Herpesviridae, Adenoviridae, Papovaviridae, Parvoviridae, Hepadnaviridae, (for example, a virus selected from the group consisting of Coxsackie A-24 virus, Adeno 11 virus, Adeno 21 virus, Coxsackie B virus, Borna disease virus, respiratory syncytial virus, parainfluenza virus, California encephalitis virus, human papillomavirus, varicella zoster virus, Colorado tick fever virus, herpes simplex virus, vaccinia virus, parainfluenza virus 1, parainfluenza virus 2, parainfluenza virus 3, dengue fever virus Ebola, parvovirus B19, Coxsackie virus A-16, HSV-1, hepatitis A virus, hepatitis B virus, hepatitis C virus, hepatitis D virus, hepatitis E virus, human immunodeficiency virus, Coxsackie B1-B5, influenza A, B or C, La Crosse virus, Lassa virus, Coxsackie rubella virus A or B, echovirus, lymphatic choriomeningitis virus, HSV-2, mumps virus, respiratory syncytial virus, Epstein-Barr virus, poliovirus, enterovirus, rabies virus, rubivirus, virus humanpox, WEE virus, yellow fever virus and varicella-zoster virus).

Альтернативно, пробиотические молекулы, описанные в настоящем документе, могут найти применение при лечении дрожжей или грибков. Например, грибок или дрожжевой грибок, который инфицировал хозяина, выбран из группы, состоящей из Aspergillus sp., Dermatophytes, Blastomyces dermatitidis, Candida sp., Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenckii, Histoplasma capsulatum и Dematiaceous Fungi.Alternatively, the probiotic molecules described herein may find use in the treatment of yeast or fungi. For example, the fungus or yeast that infects the host is selected from the group consisting of Aspergillus sp., Dermatophytes, Blastomyces dermatitidis, Candida sp., Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenckii, Histoplasma capsulatum and Dematiaceous Fungi.

При использовании в настоящем документе термин паразит или паразитическая инфекция следует рассматривать в значении организма, одноклеточного либо многоклеточного, отличного от вируса, бактерии, грибка или дрожжевого грибка, который способен инфицировать другой организм, например, человека. Примеры таких паразитов включают, например, паразита, выбранного из группы, состоящей из Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Ascaris lumbricoides, Balantidium coli, Blastocystis hominis, Clonorchis sinensis, Cyclospora cayetanensis, Dientamoeba fragilis, Diphyllobothrium latum, Dipylidium caninum, Encephalitozoon intestinalis, Entamoeba histolytica, Enterobius vermicularis, Fasciola hepatica, Enterobius vermicularis, Fasciola hepatica, Fasciolopsis buski, Giardia intestinalis (син. Giardia lamblia), Heterophyes heterophyes, Hymenolepis diminuta, Hymenolepis nana, Isospora belli, Metagonimus yokogawai, Necator americanus, Opisthorchis felineus, Paragonimus westermani, Schistosoma haematobium, Schistosoma intercalatum, Schistosoma japonicum, Schistosoma mansoni, Taenia saginata, Trichuris trichiura, Babesia diver gens, Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, Plasmodium vivax, Leishmania braziliensis и Leishmania donovani.As used herein, the term parasite or parasitic infection should be considered to mean an organism, unicellular or multicellular, other than a virus, bacterium, fungus or yeast that is capable of infecting another organism, such as a human. Examples of such parasites include, for example, a parasite selected from the group consisting of Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Ascaris lumbricoides, Balantidium coli, Blastocystis hominis, Clonorchis sinensis, Cyclospora cayetanensis, Dientamoeba fragilis, Diphyllobothrium latum, Dipylidium caninum, Encephalitozoon intestinalis, Entamoeba histolytica , Enterobius vermicularis, Fasciola hepatica, Enterobius vermicularis, Fasciola hepatica, Fasciolopsis buski, Giardia intestinalis (syn. Giardia lamblia), Heterophyes heterophyes, Hymenolepis diminuta, Hymenolepis nana, Isospora belli, Metagonimus yokogawai, Necator americanus, Opisthorchis felineus, Paragonimus westermani, Schistosoma haematobium, Schistosoma intercalatum, Schistosoma japonicum, Schistosoma mansoni, Taenia saginata, Trichuris trichiura, Babesia diver gens, Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, Plasmodium vivax, Leishmania braziliensis and Leishmania donovani.

- 13 046254- 13 046254

Согласно аспектам изобретения пробиотические молекулы можно применять в целом для снижения формирования биопленки или для разрушения уже сформированных биопленок. Пробиотические молекулы также могут найти применение в отрицательной регуляции генов вирулентности, преимущественно тех, которые связаны с T3SS, и в снижении присоединения патогенов к ткани и/или поверхностям. Предусмотрено также лечение ран и лечение и/или профилактика инфекций в ранах с применением пробиотических молекул, описанных в настоящей заявке.According to aspects of the invention, probiotic molecules can be used generally to reduce biofilm formation or to disrupt biofilms that have already formed. Probiotic molecules may also have utility in the negative regulation of virulence genes, predominantly those associated with the T3SS, and in reducing pathogen attachment to tissues and/or surfaces. Also contemplated is the treatment of wounds and the treatment and/or prevention of infections in wounds using the probiotic molecules described herein.

Согласно более общим аспектам изобретения пробиотические молекулы можно применять в качестве альтернативы или дополнения к стандартным терапиям антибиотиками, для того чтобы снизить применение антибиотиков и ослабить развитие резистентности к антибиотикам.In more general aspects of the invention, probiotic molecules can be used as an alternative or adjunct to standard antibiotic therapies in order to reduce the use of antibiotics and reduce the development of antibiotic resistance.

Пробиотические молекулы, описанные в настоящей заявке, могут согласно аспектам изобретения быть введены, например, путем парентерального, внутривенного, подкожного, интрадермального, внутримышечного, внутричерепного, интраорбитального, офтальмического, интравентрикулярного, интракапсулярного, интраспинального, интрацистериального, внутрибрюшинного, интраназального, интраректального, интравагинального, аэрозольного или перорального введения. Обычно композиции согласно изобретению вводят перорально или непосредственно в место локализации инфекции.The probiotic molecules described herein may, in accordance with aspects of the invention, be administered, for example, by parenteral, intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular, intracranial, intraorbital, ophthalmic, intraventricular, intracapsular, intraspinal, intracysterial, intraperitoneal, intranasal, intrarectal, intravaginal, aerosol or oral administration. Typically, the compositions of the invention are administered orally or directly to the site of infection.

Пробиотические молекулы, описанные в настоящей заявке, могут, согласно аспектам изобретения, быть введены в комбинации, одновременно или последовательно, со стандартными терапевтическими средствами при инфекции, включая, например, антибиотики. Пробиотические молекулы, описанные в настоящей заявке, могут находиться в лекарственной форме совместно с такими стандартными терапевтическими средствами, если это применимо.The probiotic molecules described herein can, according to aspects of the invention, be administered in combination, simultaneously or sequentially, with standard therapeutic agents for infection, including, for example, antibiotics. The probiotic molecules described herein may be co-formulated with such standard therapeutic agents, if applicable.

Пробиотические молекулы, описанные в настоящей заявке, могут быть применены в любом подходящем количестве, но как правило они предложены в дозах, содержащих от примерно 1 до примерно 10000 нг/кг, таких как от примерно 1 до примерно 1000, примерно 1 до примерно 500, примерно 10 до примерно 250, или от примерно 50 до примерно 100 нг/кг, таких как примерно 1, примерно 10, примерно 25, примерно 50, примерно 75, примерно 100, примерно 150, примерно 200, примерно 250, примерно 300 или примерно 500 нг/кг.The probiotic molecules described herein can be used in any suitable amount, but are typically provided in doses containing from about 1 to about 10,000 ng/kg, such as from about 1 to about 1000, about 1 to about 500, about 10 to about 250, or about 50 to about 100 ng/kg, such as about 1, about 10, about 25, about 50, about 75, about 100, about 150, about 200, about 250, about 300, or about 500 ng/kg.

В вышеприведенном описании настоящее изобретение раскрыто в общих чертах. Более полное понимание можно получить посредством ссылки на следующие конкретные Примеры. Эти Примеры описаны исключительно в иллюстративных целях и не предназначены для ограничения объема изобретения. Изменения в форме и замена эквивалентов предусматриваются в зависимости от обстоятельств или целесообразности. Хотя в настоящем документе использованы специфические термины, такие термины предназначены для описания, а не для ограничительных целей.In the above description, the present invention has been described in general terms. A more complete understanding can be obtained by reference to the following specific Examples. These Examples are described for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the invention. Changes in form and replacement of equivalents are provided depending on the circumstances or expediency. Although specific terms are used herein, such terms are intended for descriptive and not limiting purposes.

ПримерыExamples

Пример 1. Сводная информация по уропатогенной Е. coli и идентификации биопептидовExample 1: Summary of Uropathogenic E. coli and Biopeptide Identification

Цель:Target:

Целью экспериментов было определить, может ли бесклеточный супернатант из La-5 отрицательно регулировать экспрессию генов вирулентности в уропатогенной Е. coli (UPEC).The purpose of the experiments was to determine whether cell-free supernatant from La-5 could negatively regulate the expression of virulence genes in uropathogenic E. coli (UPEC).

Материалы и методы:Materials and methods:

Применяемый в этих экспериментах бесклеточный супернатант La-5 представлял собой серию D4. Два штамма UPEC были выделены при инфекции мочевыводящего пути собаки. Они были предоставлены патобиологической лабораторией Университета Гуэлфа. Штамм 1 получил обозначение UPEC99, а штамм 2 - UPEC804. Штаммы культивировали в агаре LB. Были протестированы две различные среды: LB и среда из синтетической мочи.The La-5 cell-free supernatant used in these experiments was the D4 series. Two strains of UPEC have been isolated from a dog urinary tract infection. They were provided by the Pathobiology Laboratory of the University of Guelph. Strain 1 was designated UPEC99, and strain 2 was designated UPEC804. Strains were cultured in LB agar. Two different media were tested: LB and synthetic urine media.

Наборы протестированных праймеров:Tested primer sets:

Обозначение гена Gene designation Название гена Gene name FWD или REV FWD or REV Последовательность 5’-3’ Sequence 5’-3’ FimA FimA Фимбриальный белок типа 1 Fimbrial protein type 1 FWD F.W.D. CATCGTTTCCAACGCATCCT CATCGTTTCCAACGCATCCT FimA FimA Фимбриальный белок типа 1 Fimbrial protein type 1 REV REV GGTTGCGGCACCAATGGCATAATA GGTTGCGGCACCAATGGCATAATA FliC FliC Флагеллин Flagellin FWD F.W.D. ACAGCCTCTCGCTGATCACTCAAA ACAGCCCTCGCTGATCACTCAAA FliC FliC Флагеллин Flagellin REV REV GCGCTGTTAATACGCAAGCCAGAA GCGCTGTTAATACGCAAGCCAGAA GapA GapA Г лицеральдегид-3фосфатдегидрогеназа Glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase FWD F.W.D. CATCGTTTCCAACGCATCCT CATCGTTTCCAACGCATCCT GapA GapA Г лицеральдегид-3фосфатдегидрогеназа Glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase REV REV ACCTTCGATGATGCCGAAGTT ACCTTCGATGATGCCGAAGTT PapA_2 PapA_2 Основной фимбриальный Pilus Р Basic fimbrial Pilus P FWD F.W.D. GTGCCTGCAGAAAATGCAGAT GTGCCTGCAGAAAATGCAGAT PapA_2 PapA_2 Основной фимбриальный Pilus Р Basic fimbrial Pilus P REV REV CCCGTTTTCCACTCGAATCA CCCGTTTTCCACTCGAATCA HylA HylA Гемолизин А Hemolysin A FWD F.W.D. ACCTTGTCAGGACGGCAGAT ACCTTGTCAGGACGGCAGAT HylA HylA Гемолизин А Hemolysin A REV REV CCGTGCCATTCTTTTCATCA CCGTGCCATTCTTTTCATCA TufA TufA Фактор элонгации Ти Elongation factor Ti FWD F.W.D. ACTTCCCGGGCGACGACACTC ACTTCCCGGGCGACGACACTC TufA TufA Фактор элонгации Ти Elongation factor Ti REV REV CGCCCGGCATTACCATCTCTAC CGCCCGGCATTACCATCTCTAC

Анализы были проведены аналогично анализам Salmonella, как описано в Sharma 2014. UPEC выращивали 4 ч в присутствии бесклеточного супернатанта. Клетки собирали и выделяли РНК. Чтобы удалить геномную ДНК, РНК обрабатывали ДНКазой. РНК использовали в качестве матрицы для созданияAssays were performed similarly to Salmonella assays as described in Sharma 2014. UPEC was grown for 4 h in the presence of cell-free supernatant. Cells were collected and RNA was isolated. To remove genomic DNA, the RNA was treated with DNase. RNA was used as a template to create

- 14 046254 кДНК. кДНК проанализировали с помощью количественной ПЦР, и экспрессию генов нормализировали по отношению к референсному гену и сравнили с контролем без бесклеточной среды.- 14 046254 cDNA. The cDNA was analyzed by qPCR and gene expression was normalized to a reference gene and compared to a cell-free control.

Результаты:Results:

Таблица 1.1: Сравнение экспрессии генов в среде LB и в среде из синтетической мочиTable 1.1: Comparison of gene expression in LB medium and synthetic urine medium

Целевой ген Target gene Штамм Strain Среда Wednesday Референсный ген Reference gene Отрицательная регуляция Negative regulation FliC FliC Штамм 1 (E99) Strain 1 (E99) LB LB GapA GapA 0,024 0.024 FliC FliC Штамм 1 (E99) Strain 1 (E99) Среда из синтетической мочи Synthetic urine medium GapA GapA 0,014 0.014 FliC FliC Штамм 2 (Е804) Strain 2 (E804) LB LB GapA GapA 0,56 0.56 FliC FliC Штамм 2 (Е804) Strain 2 (E804) Среда из синтетической мочи Synthetic urine medium GapA GapA 0,045 0.045 HylA HylA Штамм 1 (Е99) Strain 1 (E99) LB LB GapA GapA 16,47 16.47 HylA HylA Штамм 1 (Е99) Strain 1 (E99) Среда из синтетической мочи Synthetic urine medium GapA GapA 1,35 1.35 HylA HylA Штамм 2 (Е804) Strain 2 (E804) LB LB GapA GapA He экспрессировался He expressed HylA HylA Штамм 2 (Е804) Strain 2 (E804) Среда из синтетической мочи Synthetic urine medium GapA GapA He экспрессировался He expressed FimA FimA Штамм 1 (Е99) Strain 1 (E99) LB LB GapA GapA He эксп ресси ровался He exp. regressed FimA FimA Штамм 1 (Е99) Strain 1 (E99) Среда из синтетической мочи Synthetic urine medium GapA GapA Не э ксп ресси ров ался Not e ksp was repressed FimA FimA Штамм 2 (Е804) Strain 2 (E804) LB LB GapA GapA Не эксп ресси ровался Not exp. regressed FimA FimA Штамм 2 (Е804) Strain 2 (E804) Среда из синтетической мочи Synthetic urine medium GapA GapA Не э ксп ресси ров ался Not e ksp was repressed

Данные табл. 1.1 подтвердили, что бесклеточный супернатант э( )фективен при отрицательной регуляции HylA, но не FliC. Также в среде LB отрицательная регуляция HylA более выражена, чем в среде из синтетической мочи. Экспрессию этих генов в дальнейшем исследовали только в среде LB, поскольку в ней отрицательная регуляция генов была выше. Этот эксперимент поставили еще раз, чтобы подтвердить, что ответ был штаммоспецифичным.Table data 1.1 confirmed that cell-free supernatant is effective in down-regulating HylA but not FliC. Also, in LB medium, the negative regulation of HylA is more pronounced than in synthetic urine medium. The expression of these genes was further studied only in LB medium, since the negative regulation of genes was higher in it. This experiment was repeated to confirm that the response was strain specific.

Таблица 1.2: Сравнение штаммоспецифичной регуляции геновTable 1.2: Comparison of strain-specific gene regulation

Целевой ген Target gene Штамм Strain Среда Wednesday Референсный ген Reference gene Отрицательная регуляция Negative regulation FliC FliC Штамм 1 (Е99) Strain 1 (E99) LB LB GapA GapA 1,90 1.90 FliC FliC Штамм 2 (Е804) Strain 2 (E804) LB LB GapA GapA 0,705 0.705 HylA HylA Штамм 1 (Е99) Strain 1 (E99) LB LB GapA GapA 12,72 12.72 HylA HylA Штамм 2 (Е804) Strain 2 (E804) LB LB GapA GapA Не экспрессировался Not expressed

Данные табл. 1.2 подтверждают, что бесклеточный супернатант может отрицательно регулировать HylA, но только в штамме 1, поскольку HylA, по-видимому, в штамме 2 не экспрессируется. Бесклеточный супернатант, по-видимому, не оказывает влияния на отрицательную регуляцию FliC.Table data 1.2 confirm that cell-free supernatant can negatively regulate HylA, but only in strain 1, since HylA does not appear to be expressed in strain 2. Cell-free supernatant does not appear to have an effect on the negative regulation of FliC.

Таблица 1.3: Дозозависимая кривая серии D4 UPEC штамма 1 (Е99)Table 1.3: Dose-response curve of the D4 UPEC series strain 1 (E99)

Целевой ген Target gene Доза Dose Референсный ген Reference gene Отрицательная регуляция Negative regulation HylA HylA 4x 4x GapA GapA 40,46 40.46 HylA HylA 2x 2x GapA GapA 19,86 19.86 HylA HylA 1 x 1 x GapA GapA 24,69 24.69 HylA HylA 0.5 x 0.5x GapA GapA 4,90 4.90 HylA HylA 0.25 x 0.25 x GapA GapA 2,79 2.79

1х доза является эквивалентом 10 мл бесклеточного супернатанта (1х). Отрицательная регуляция HylA коррелирует с количеством анализируемого материала. Это подтверждает, что бесклеточный супернатант специфично взаимодействует с регуляцией HylA и потенциальными последующими механизмами.1x dose is equivalent to 10 ml cell-free supernatant (1x). Negative regulation of HylA correlates with the amount of material analyzed. This confirms that the cell-free supernatant specifically interacts with HylA regulation and potential downstream mechanisms.

Таблица 1.4: Сводная таблица экспрессии гена HylA в штамме 1 (Е99) в серии для испытаний стабильности (S1)Table 1.4: Summary table of HylA gene expression in strain 1 (E99) in the stability test series (S1)

Целевой ген Target gene Обработка Treatment Референсный ген Reference gene Кратная отрицательная регуляция HylA Multiple negative regulation of HylA HylA HylA E99 0,25x E99 0.25x GapA GapA 0,98 0.98 HylA HylA E99 0,5x E99 0.5x GapA GapA 3,16 3.16 HylA HylA E99 1x E99 1x GapA GapA 6,96 6.96 HylA HylA E99 2x E99 2x GapA GapA 10,85 10.85

1х доза является эквивалентом 10 мл бесклеточного супернатанта (1х). Вторую серию материала протестировали для того, чтобы определить в сухом бесклеточном супернатанте, может ли дополнитель- 15 046254 ная независимая производственная серия также отрицательно регулировать экспрессию HylA. Наблюдали дозозависимый ответ отрицательной регуляции HylA на количество сухого бесклеточного супернатанта.1x dose is equivalent to 10 ml cell-free supernatant (1x). A second batch of material was tested to determine in the dry cell-free supernatant whether an additional independent production batch could also negatively regulate HylA expression. A dose-dependent down-regulation response of HylA to the amount of dry cell-free supernatant was observed.

Пример 2. Идентификация биоактивных молекул из бесклеточного супернатантаExample 2: Identification of Bioactive Molecules from Cell-Free Supernatant

Цель:Target:

Целью этих экспериментов было идентифицировать биоактивные пептиды из бесклеточного супернатанта.The goal of these experiments was to identify bioactive peptides from cell-free supernatant.

Материалы и методы:Materials and methods:

Бесклеточный супернатант разделяли с использованием смолы Сефадекс G75. Образцы разделяли и собирали по фракциям: фракция 1 (> 163000 Да), фракция 2 (163000-14500 Да), фракция 3(14500-1300 Да), фракция 4 (1300-110 Да), фракция 5 (110-10 Да). Образцы собирали и анализировали с помощью количественной ПЦР с использованием штамма Salmonella enteric тифимуриум DT104. Отрицательную регуляцию HilA сравнивали с референсным геном 16S.The cell-free supernatant was separated using Sephadex G75 resin. Samples were separated and collected into fractions: fraction 1 (> 163000 Da), fraction 2 (163000-14500 Da), fraction 3 (14500-1300 Da), fraction 4 (1300-110 Da), fraction 5 (110-10 Da) . Samples were collected and analyzed by qPCR using Salmonella enteric typhimurium strain DT104. The down-regulation of HilA was compared with the 16S reference gene.

Праймеры:Primers:

HilA FWD 5'-3'-TGTCGGAAGATAAAGAGCATHilA FWD 5'-3'-TGTCGGAAGATAAAGAGCAT

HilA REV 5'-3'-AAGGAAGTATCGCCAATGTAHilA REV 5'-3'-AAGGAAGTATCGCCAATGTA

16S FWD 5'-3'-CAAGTCATCATGGCCCTTAC16S FWD 5'-3'-CAAGTCATCATGGCCCTTAC

16S REV 5'-3'-CGGACTACGACGCACTTTAT16S REV 5'-3'-CGGACTACGACGCACTTTAT

Активную фракцию после эксклюзионной хроматографии G75 в дальнейшем разделяли с помощью обращенно-фазовой хроматографии. Фракции после обратной фазы: фракция 1 (0-2 мин), фракция 2 (2-4 мин), фракция 3 (4-16 мин), фракция 4 (16-32 мин), фракция 5 (32-40 мин), фракция 6 (40-58 мин). Фракции высушивали и нейтрализовывали с целью удаления из раствора ацетонитрила и трифторуксусной кислоты. Высушенные фракции анализировали с использованием тех же условий анализа по количественной ПЦР, как описано выше. Фракции анализировали с помощью независимого секвенирования в высокотехнологичном аналитическом центре Университета Гуэлфа. Провели сравнение пептидов из активных фракций 6 серий, и установили часто встречающиеся в сериях пептиды.The active fraction from G75 size exclusion chromatography was further separated using reverse phase chromatography. Fractions after the reverse phase: fraction 1 (0-2 min), fraction 2 (2-4 min), fraction 3 (4-16 min), fraction 4 (16-32 min), fraction 5 (32-40 min), fraction 6 (40-58 min). The fractions were dried and neutralized to remove acetonitrile and trifluoroacetic acid from the solution. Dried fractions were analyzed using the same qPCR assay conditions as described above. Fractions were analyzed by independent sequencing at the University of Guelph's high-tech analytical facility. We compared peptides from the active fractions of 6 series and identified peptides that were frequently found in the series.

Таблица 2.1: Определение отрицательной регуляции в фракциях, полученных на эксклюзионной хроматографии, по методу количественной ПЦРTable 2.1: Determination of down-regulation in size exclusion chromatography fractions by qPCR

Обработка Treatment Целевой ген Target gene Референсный ген Reference gene Кратная отрицательная регуляция Multiple negative regulation Ввод Enter HilA HilA 16S 16S 14,36 14.36 Фракция 1 Faction 1 HilA HilA 16S 16S 1,38 1.38 Фракция 2 Faction 2 HilA HilA 16S 16S 2,98 2.98 Фракция 3 Faction 3 HilA HilA 16S 16S 10,97 10.97 Фракция 4 Faction 4 HilA HilA 16S 16S 1,84 1.84 Фракция 5 Fraction 5 HilA HilA 16S 16S 3,30 3.30

Фракцию 3, полученную на эксклюзионной хроматографии, охарактеризовали дополнительно, поскольку ее активность была аналогична активности при вводе, а это подтверждает, что активность этой фракции является основным компонентом биоактивных молекул.Size exclusion chromatography fraction 3 was further characterized because its activity was similar to that of the injection, confirming that the activity of this fraction is a major component of the bioactive molecules.

Таблица 2.2: Количественная ПЦР отрицательной регуляции в полученной после обращенно-фазовой хроматографии (ОФ) фракции, которую очистили из фракции 3, полученной после эксклюзионной хроматографииTable 2.2: Quantitative PCR of negative regulation in the reverse phase chromatography (RP) fraction purified from size exclusion chromatography fraction 3

Обработка Treatment Целевой ген Target gene Референсный ген Reference gene Кратная отрицательная регуляция Multiple negative regulation ОФ фракция 1 OF faction 1 HilA HilA 16S 16S 1,15 1.15 ОФ фракция 2 OF faction 2 HilA HilA 16S 16S 0,68 0.68 ОФ фракция 3 OF fraction 3 HilA HilA 16S 16S 3,78 3.78 ОФ фракция 4 OF fraction 4 HilA HilA 16S 16S 0,56 0.56 ОФ фракция 5 OF fraction 5 HilA HilA 16S 16S 169 169 ОФ фракция 6 OF fraction 6 HilA HilA 16S 16S 0,0096 0.0096

ОФ фракции 3 и 5 были выбраны для независимого секвенирования, результаты получены для фракции 5, поскольку она обладала наибольшей активностью. Следует отметить, что MALPPK также обнаружили в ОФ фракции 3, но другие пептиды были обнаружены только в фракции 5.OF fractions 3 and 5 were selected for independent sequencing; the results were obtained for fraction 5, since it had the highest activity. It should be noted that MALPPK was also detected in OF fraction 3, but other peptides were detected only in fraction 5.

Таблица 2.3: Независимое секвенирование биопептидов ОФ фракции 5, проанализированных из 6 производственных серийTable 2.3: Independent sequencing of OP fraction 5 biopeptides analyzed from 6 production batches

Номер се Se number рии ries Последовательность пептида Peptide sequence D4 D4 D8 D8 D10 D10 D14 D14 D15 D15 Р64 P64 MALPPK MALPPK Присутствует Present Присутствует Present Присутствует Present Присутствует Present Присутствует Present Присутствует Present CVLPPK CVLPPK Присутствует Present Присутствует Present Присутствует Present Присутствует Present Присутствует Present Присутствует Present HLLPLP HLLPLP Присутствует Present Присутствует Present Присутствует Present Присутствует Present Не обнаружен Not found Не обнаружен Not found LKPTPEGD LKPTPEGD Не обнаружен Not found Присутствует Present Присутствует Present Присутствует Present Присутствует Present Не обнаружен Not found

Независимое секвенирование использовали для идентификации аминокислотных последовательностей, ответственных за отрицательную регуляцию генов вирулентности, таких как HilA, в Salmonella enterica тифимуриум DT104. Анализировали шесть независимых производственных серий. БесклеточныйIndependent sequencing was used to identify amino acid sequences responsible for the negative regulation of virulence genes such as HilA in Salmonella enterica typhimurium DT104. Six independent production runs were analyzed. Acellular

- 16 046254 супернатант разделяли с использованием эксклюзионной хроматографии (Сефадекс G75). Образцы выделяли в 5 фракций на основании их молекулярной массы. Третью фракцию с прогнозируемой молекулярной массой в диапазоне 14,5-1,3 кДа дополнительно проанализировали с помощью обращеннофазовой хроматографии, а фракцию ОФ 5 проанализировали с помощью независимого секвенирования. При сравнении всех проанализированных биопептидов были идентифицированы два пептида, часто встречавшиеся во всех шести сериях, и два дополнительных пептида, часто встречавшиеся по меньшей мере в 4 сериях. Поскольку независимое секвенирование дает только количественный анализ, все эти четыре пептида были синтезированы, чтобы идентифицировать, какие пептиды ответственны за отрицательную регуляцию HilA у Salmonella enteric тифимуриум DT104.- 16 046254 the supernatant was separated using size exclusion chromatography (Sephadex G75). Samples were separated into 5 fractions based on their molecular weight. The third fraction, with a predicted molecular mass in the range of 14.5–1.3 kDa, was further analyzed by reverse phase chromatography, and the OF 5 fraction was analyzed by independent sequencing. Comparison of all biopeptides analyzed identified two peptides that were frequent in all six series and two additional peptides that were frequent in at least 4 series. Since independent sequencing only provides quantitative analysis, all four of these peptides were synthesized to identify which peptides are responsible for the negative regulation of HilA in Salmonella enteric typhimurium DT104.

Таблица 2.4: Полуколичественное определение биопептидов из полученной на эксклюзионной хроматографии фракции 3 из серии для испытаний стабильности 1 (S1)Table 2.4: Semi-quantitative determination of biopeptides from size exclusion chromatography fraction 3 of stability test series 1 (S1)

Последовательность пептида Peptide sequence Концентрация пептида (нг/мл) Peptide concentration (ng/ml) MALPPK MALPPK 2500 2500 CVLPPK CVLPPK Ниже предела обнаружения Below detection limit HLLPLP HLLPLP 2,5-5 2.5-5 LKPTPEGD LKPTPEGD 25-50 25-50 YPVEPF YPVEPF 10-25 10-25 YPPGGP YPPGGP 100 100

Выбранные по независимому секвенированию биопептиды и два дополнительных пептида, которые были идентифицированы в Международной заявке на патент № WO 2009/155711, проанализировали с помощью масс-спектрометрии с использованием метода мониторинга множественных реакций (MRM) с целью полуколичественного определения количества биопептида, находившегося в серии для испытаний стабильности S1. Пиковое значение каждого пептида сравнивали с пиковым значением серий разведения известного количества каждого биопептида. С помощью такого полуколичественного метода идентифицировали, что MALPPK был наиболее часто встречающимся пептидом из 6 проанализированных пептидов.Selected biopeptides from independent sequencing and two additional peptides that were identified in International Patent Application No. WO 2009/155711 were analyzed by mass spectrometry using multiple reaction monitoring (MRM) to semi-quantitatively determine the amount of biopeptide present in the batch for S1 stability tests. The peak value of each peptide was compared to the peak value of a serial dilution of a known amount of each biopeptide. Using this semi-quantitative method, it was identified that MALPPK was the most abundant peptide of the 6 peptides analyzed.

Таблица 2.5: Анализ с помощью количественной ПЦР изменений в экспрессии HylA и HilA в присутствии отдельных синтетических биопептидовTable 2.5: qPCR analysis of changes in HylA and HilA expression in the presence of selected synthetic biopeptides

Последовательность пептида Peptide sequence Целевой ген Target gene Референсный ген Reference gene Кратная отрицательная регуляция Multiple negative regulation MALPPK MALPPK HylA HylA GapA GapA 9,06 9.06 CVLPPK CVLPPK HylA HylA GapA GapA 3,20 3.20 HLLPLP HLLPLP HylA HylA GapA GapA 2,64 2.64 LKPTPEGD LKPTPEGD HylA HylA GapA GapA 4,69 4.69 YPVEPF YPVEPF HylA HylA GapA GapA 1,03 1.03 YPPGGP YPPGGP HylA HylA GapA GapA 3,56 3.56 MALPPK MALPPK HilA HilA 16S 16S 19,56 19.56 CVLPPK CVLPPK HilA HilA 16S 16S 3,75 3.75 HLLPLP HLLPLP HilA HilA 16S 16S 2,93 2.93 LKPTPEGD LKPTPEGD HilA HilA 16S 16S 11,08 11.08 YPVEPF YPVEPF HilA HilA 16S 16S 0,68 0.68 YPPGGP YPPGGP HilA HilA 16S 16S 2,93 2.93

Синтетические биопептиды проанализировали в количестве 50 мкг на анализ. Анализ с помощью количественной ПЦР подтвердил, что все пептиды влияют на отрицательную регуляцию HylA за исключением YPVEPF. По-видимому, пептид MALPPK оказывает самое сильное влияние на отрицательную регуляцию HylA, a затем следуют LKPTPEGD, YPPGGP, CVLPPK и HLLPLP.Synthetic biopeptides were analyzed at 50 μg per assay. qPCR analysis confirmed that all peptides affected the negative regulation of HylA with the exception of YPVEPF. The MALPPK peptide appears to have the strongest effect on the negative regulation of HylA, followed by LKPTPEGD, YPPGGP, CVLPPK and HLLPLP.

Сводная информация:Free information:

Данные, представленные в табл. 2.1-2.5 демонстрируют, что пептиды, обнаруженные в бесклеточном супернатанте из ферментизированной La-5 среды могут отрицательно регулировать экспрессию HilA в Salmonella enterica тифимуриум DT104 и гемолизина A (HylA). HylA - порообразующий токсин, вырабатывающийся UPEC и являющийся одним из вирулентных факторов, задействованных в инфекционном процессе. По-видимому, взаимодействие является специфическим, поскольку присутствие бесклеточного супернатанта не оказывает отрицательной регуляции экспрессии флагеллина (FNC). Две независимых производственных серии продемонстрировали дозозависимую специфичную отрицательную регуляцию HylA. При независимом секвенировании полученной на эксклюзионной хроматографии фракции 3 идентифицировали четыре пептида. Были синтезированы эти четыре пептида и два дополнительных пептида из предыдущего патента, и их влияние на экспрессию гена HylA было количественным образом оценено с помощью количественной ПЦР. Проанализировали все биопептиды за исключением YPVEPF, и MALPPK оказался наиболее активным пептидом из 6 проанализированных пептидов.The data presented in table. 2.1-2.5 demonstrate that peptides detected in the cell-free supernatant from La-5 fermentation medium can negatively regulate the expression of HilA in Salmonella enterica typhimurium DT104 and hemolysin A (HylA). HylA is a pore-forming toxin produced by UPEC and is one of the virulence factors involved in the infectious process. The interaction appears to be specific, since the presence of cell-free supernatant does not negatively regulate flagellin (FNC) expression. Two independent production runs demonstrated dose-dependent, specific down-regulation of HylA. Independent sequencing of fraction 3 obtained from size exclusion chromatography identified four peptides. These four peptides and two additional peptides from the previous patent were synthesized and their effects on HylA gene expression were quantified using qPCR. All biopeptides except YPVEPF were analyzed, and MALPPK was the most active peptide of the 6 peptides analyzed.

Пример 3. Анализ клеточной токсичности уропатогенной Е.соПExample 3. Analysis of cellular toxicity of uropathogenic E. coP

Цель:Target:

Целью этого эксперимента было определить с помощью анализа физиологической клеточной токсичности, снижалась ли выработка токсина у уропатогенной Е.соП в присутствии бесклеточной среды Lactobacillus acidophilus.The purpose of this experiment was to determine, using a physiological cell toxicity assay, whether toxin production in uropathogenic E. coP was reduced in the presence of Lactobacillus acidophilus cell-free medium.

- 17 046254- 17 046254

Материалы и методы:Materials and methods:

Высушенный бесклеточный супернатант растворили в жидкой питательной среде LB (14 мг/мл) и довели до рН 7,2 с использованием 0,1 N NaOH. Раствор развели жидкой питательной средой LB до конечной концентрации. Жидкую питательную среду (5 мл) инокулировали 50 мл культуры штамма UPEC099 18 ч. Образец выращивали в течение 4 ч при 37°С с перемешиванием 200 об/мин. Аликвоту культуры 1 мл центрифугировали при 10000 х g, чтобы удалить клетки Е.соН. Супернатант (100 мл) добавили к 1 мл клеток млекопитающих НТ29 (1Е6 клеток/мл) и инкубировали в течение 1 ч при 37°С с добавлением 5% СО₂. После инкубации смесь перенесли в 1,5 мл тубу и центрифугировали при 250 х g, чтобы удалить клетки млекопитающих. Супернатант (50 мкл) использовали для тестирования клеточной токсичности с помощью набора для анализа цитотоксичности Pierce Lactate Dehydrogenase LDH (Thermo Fisher Scientific). Растворы для анализа приготавливали в соответствии с инструкциями производителя. 50 мкл супернатанта инкубировали с 50 мкл анализационной реакционной смеси в 96-луночном планшете. Планшет накрывали фольгой для защиты от света и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Добавляли смесь для остановки реакции (50 мкл) и данные с 96-луночного планшета считывали при 490 и 680 нм. Значения абсорбции были использованы для расчета цитотоксичности, данные выражены как процент ингибирования.The dried cell-free supernatant was dissolved in liquid LB culture medium (14 mg/ml) and adjusted to pH 7.2 using 0.1 N NaOH. The solution was diluted with LB liquid nutrient medium to the final concentration. Liquid nutrient medium (5 ml) was inoculated with 50 ml of culture of strain UPEC099 for 18 hours. The sample was grown for 4 hours at 37°C with stirring at 200 rpm. A 1-ml aliquot of the culture was centrifuged at 10,000 x g to remove E. coH cells. The supernatant (100 ml) was added to 1 ml of mammalian HT29 cells (1E6 cells/ml) and incubated for 1 hour at 37°C with the addition of 5% CO ₂ . After incubation, the mixture was transferred to a 1.5 ml tube and centrifuged at 250 x g to remove mammalian cells. The supernatant (50 μl) was used for cell toxicity testing using the Pierce Lactate Dehydrogenase LDH Cytotoxicity Assay Kit (Thermo Fisher Scientific). Assay solutions were prepared according to the manufacturer's instructions. 50 μl of the supernatant was incubated with 50 μl of the assay reaction mixture in a 96-well plate. The plate was covered with foil to protect from light and incubated at room temperature for 30 min. Stop mixture (50 µl) was added and the 96-well plate was read at 490 and 680 nm. Absorbance values were used to calculate cytotoxicity and data are expressed as percent inhibition.

Результаты/Обсуждение:Results/Discussion:

Данные, представленные на фиг. 1 и 2, показывают ингибирование образования токсина UPEC бесклеточным супернатантом. Эти данные дают физиологическое подтверждение тому, что бесклеточный супернатант способен дозозависимым образом снижать влияние токсина на клетки млекопитающих НТ29. Лактатдегидрогеназа является физиологическим маркером лизиса клеток, и ингибирование лактатдегидрогеназы в конечной точке анализа подтверждает, что лизису подверглось меньшее количество клеток млекопитающих, из чего можно сделать вывод, что бесклеточный супернатант может снижать количество токсина, вырабатываемого UPEC099.The data presented in Fig. 1 and 2 show inhibition of UPEC toxin production by the cell-free supernatant. These data provide physiological evidence that the cell-free supernatant is capable of reducing the effects of the toxin on mammalian HT29 cells in a dose-dependent manner. Lactate dehydrogenase is a physiological marker of cell lysis, and inhibition of lactate dehydrogenase at the endpoint of the assay confirms that fewer mammalian cells were lysed, suggesting that the cell-free supernatant may reduce the amount of toxin produced by UPEC099.

Пример 4. Преодоление лекарственной резистентностиExample 4. Overcoming drug resistance

Цель:Target:

Определить, может ли бесклеточный супернатант из пробиотических бактерий, таких как Lactobacillus acidophilus La-5, повышать у обладающих лекарственной резистентностью бактерий чувствительность к антибиотикам, в частности у резистентных к метициллину стафилококков устойчивость к цефокситину.To determine whether cell-free supernatant from probiotic bacteria, such as Lactobacillus acidophilus La-5, can increase antibiotic sensitivity in drug-resistant bacteria, particularly methicillin-resistant staphylococci, resistance to cefoxitin.

Материалы и методы:Materials and methods:

Бесклеточный супернатант La-5, применяемый в этих экспериментах, был получен из серий N9-N10 и N13. В этих экспериментах применяли три устойчивых к метициллину штамма стафилококка (MRS):1) Staphylococcus pseudintermedius (обозначение штамма С260 22-2011 dtqa), клинический изолят из кожной инфекции собаки; 2) Staphylococcus aureus (обозначение штамма LA - 414М SPA t034), связанный с сельскохозяйственными животными штамм, выделенный из говядины, поставленной продовольственным магазином в Шарлоттауне, PEI, Канада; и 3) Staphylococcus aureus (обозначение штамма 81М SPA t008), выделенный из куриного мяса, поставленного продовольственным магазином в Шарлоттауне, PEI, Канада. Все три штамма MRS были предоставлены Атлантическим ветеринарным колледжем (AVC) Университета острова принца Эдуарда. Резистентность этих штаммов к метициллину была подтверждена персоналом AVC с помощью диско-диффузионного метода с использованием оксициллинового диска. Штаммы исходно культивировали на скошенном агаре с овечьей кровью, а затем переносили на чашки с агаром и лизогенным бульоном. Цефокситин, ресуспендированный в метаноле, применяли для тестирования резистентности к антибиотикам, а рост тестировали в двух различных типах сред, стандартном лизогенном бульоне и стандартной BBL™ среды Мюллера-Хинтона со стандартизированным содержанием катионов (Becton, Dickinson and Company). Для каждого штамма в каждой соответствующей среде определяли минимальные ингибирующие концентрации (MIC) цефокситина в присутствии и отсутствии бесклеточного супернатанта. Анализы проводили в соответствии с руководствами Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI) для тестирования MIC видов стафилококков [CLSI, 2015], а также Европейского комитета по тестированию антимикробной чувствительности (EUCAST) Европейского общества клинической микробиологии и инфекционных болезней [EUCAST, 2003].The La-5 cell-free supernatant used in these experiments was obtained from batches N9-N10 and N13. Three methicillin-resistant staphylococcal (MRS) strains were used in these experiments: 1) Staphylococcus pseudintermedius (strain designation C260 22-2011 dtqa), a clinical isolate from a dog skin infection; 2) Staphylococcus aureus (strain designation LA - 414M SPA t034), a farm animal-associated strain isolated from beef supplied by a grocery store in Charlottetown, PEI, Canada; and 3) Staphylococcus aureus (strain designation 81M SPA t008) isolated from chicken supplied by a grocery store in Charlottetown, PEI, Canada. All three MRS strains were provided by the Atlantic Veterinary College (AVC) of the University of Prince Edward Island. Methicillin resistance of these strains was confirmed by AVC personnel using the disk diffusion method using an oxycillin disk. Strains were initially cultured on sheep blood agar slants and then transferred to agar and lysogeny broth plates. Cefoxitin resuspended in methanol was used to test antibiotic resistance, and growth was tested in two different types of media, standard lysogeny broth and standard BBL™ Mueller-Hinton medium with standardized cations (Becton, Dickinson and Company). For each strain in each respective medium, the minimum inhibitory concentrations (MIC) of cefoxitin were determined in the presence and absence of cell-free supernatant. Assays were performed in accordance with Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) guidelines for MIC testing of staphylococcal species [CLSI, 2015] and the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases [EUCAST, 2003].

Протокол тестирования MIC был следующим. Бесклеточные супернатанты ресуспендировали в соответствующей среде и стерилизовали с помощью фильтра с размером пор 0,22 мкм. Сухой бесклеточный супернатант взвешивали для получения требуемой концентрации и добавляли в концентрациях в диапазоне 0-60 мг/мл.The MIC testing protocol was as follows. Cell-free supernatants were resuspended in appropriate media and sterilized using a 0.22-μm filter. The dried cell-free supernatant was weighed to obtain the required concentration and added at concentrations ranging from 0-60 mg/ml.

Цефокситин добавляли для получения конечных концентраций в диапазоне 0-250 мг/мл. Культуры каждого соответствующего штамма выращивали в течение ночи либо в лизогенном бульоне, либо в среде Мюллера-Хинтона в течение 16-20 ч при 37°С и с перемешиванием на 200 об/мин в аэробных условиях до достижения оптической плотности 1,2-1,6 на 600 нм (OD600). Культуры, выросшие в течение ночи, разводили в 1000 раз и инокулировали ими соответствующие образцы; такое разведение выросшей в течение ночи культуры обеспечивало инокулят, содержавший около 5 х 106 КОЕ/мл. Культуры (150 мкл)Cefoxitin was added to achieve final concentrations ranging from 0-250 mg/ml. Cultures of each respective strain were grown overnight in either lysogeny broth or Mueller-Hinton medium for 16-20 h at 37°C and agitated at 200 rpm under aerobic conditions until an optical density of 1.2-1 was achieved. 6 at 600 nm (OD600). Cultures grown overnight were diluted 1000-fold and inoculated into appropriate samples; This dilution of the overnight culture provided an inoculum containing approximately 5 x 106 CFU/ml. Cultures (150 µl)

- 18 046254 выращивали в 96-луночном чистом титрационном микропланшете с плоским дном. Титрационный микропланшет затем покрывали парафильмом и инкубировали при 35°С±2°С в течение 24 ч. После инкубирования данные с микропланшетов считывали при 600 нм с помощью микропланшетного ридера. Значение MIC представляло собой концентрацию антибиотика, которая приводила к OD °< 0,1 при 600 нм. Данные представляют собой среднее по двум техническим повторам из двух биологических повторов.- 18 046254 was grown in a 96-well clean microtiter plate with a flat bottom. The microtiter plate was then coated with parafilm and incubated at 35°C ± 2°C for 24 hours. After incubation, data from the microplates was read at 600 nm using a microplate reader. The MIC value was the concentration of antibiotic that resulted in an OD °<0.1 at 600 nm. Data are the average of two technical replicates from two biological replicates.

β-лактамы, такие как метициллин и цефокситин, ингибируют биосинтез бактериальной клеточной стенки. У бактерий развились механизмы, позволяющие не реагировать на такие ингибиторы, что приводит к резистентности к антибиотикам. МесА - ген, который может связывать β-лактамы, тем самым снижая их активность. Стафилококки, получившие ген МесА, являются устойчивыми к метициллину. Поскольку экспрессию МесА регулирует чувство кворума, мы изучили, может ли бесклеточный супернатант повышать чувствительность резистентных к метициллину стафилококков путем ингибирования чувства кворума.β-lactams, such as methicillin and cefoxitin, inhibit bacterial cell wall biosynthesis. Bacteria have evolved mechanisms to avoid responding to such inhibitors, leading to antibiotic resistance. MesA is a gene that can bind β-lactams, thereby reducing their activity. Staphylococci that have received the MecA gene are resistant to methicillin. Because MesA expression is regulated by quorum sensing, we examined whether cell-free supernatant could sensitize methicillin-resistant staphylococci by inhibiting quorum sensing.

Данные показывают, что бесклеточный супернатант может повышать чувствительность резистентных к метициллину видов стафилококков к антибиотику цефокситину; это в свою очередь снижает концентрацию цефокситина, необходимую для приостановки или профилактики пролиферации резистентных к метициллину видов стафилококков. Для тестируемых концентраций бесклеточного супернатанта (5, 30 и 60 мг/мл) данные указывают на дозозависимый ответ: при возрастании концентрации бесклеточного супернатанта наблюдается более высокое снижение MIC цитотоксина по сравнению с контролем 0 мг/мл. Комбинация цефотоксина и бесклеточного супернатанта может повышать чувствительность резистентных к метициллину стафилококков в 2,5-6,25 раз по сравнению с одним цефотоксином (табл. 3).Data indicate that cell-free supernatant may sensitize methicillin-resistant staphylococcal species to the antibiotic cefoxitin; this in turn reduces the concentration of cefoxitin required to arrest or prevent the proliferation of methicillin-resistant staphylococcal species. For the cell-free supernatant concentrations tested (5, 30, and 60 mg/mL), the data indicate a dose-dependent response: as cell-free supernatant concentration increases, a greater reduction in cytotoxin MIC is observed compared to the 0 mg/mL control. The combination of cefotoxin and cell-free supernatant can increase the sensitivity of methicillin-resistant staphylococci by 2.5-6.25 times compared with cefotoxin alone (Table 3).

Таблица 3. Диапазон значений MIC цефокситина для резистентных к метициллину стафилококковTable 3. Cefoxitin MIC range for methicillin-resistant staphylococci

Диапазон концентраций цефокситина (цг/мл), ингибирующих рост до O.D. < 0.1 Range of cefoxitin concentrations (cg/ml) that inhibit growth to O.D. <0.1 Концентрация сухого бесклеточного супернатанта на анализ (мг/мл) Concentration of dry cell-free supernatant for analysis (mg/ml) MSRP С260 Лизогенный бульон MSRP C260 Lysogenic Broth MRSA LA 414М Лизогенный бульон MRSA LA 414M Lysogenic broth MRSA LA 414М Бульон МюллераХинтона MRSA LA 414M Muller-Hinton Broth MRSA 81М Лизогенный бульон MRSA 81M Lysogenic Broth MRSA 81М Бульон МюллераХинтона MRSA 81M MuellerHinton Broth 0 0 125-175 125-175 30-40 30-40 50-60 50-60 75-125 75-125 75-100 75-100 5 5 50-75 50-75 15-20 15-20 40-50 40-50 40-50 40-50 40-50 40-50 30 thirty 20-30 20-30 15-20 15-20 20-30 20-30 30-40 30-40 30-40 30-40 60 60 20-30 20-30 10-15 10-15 20-30 20-30 30-40 30-40 20-30 20-30

Для эксклюзионной хроматографии образец разделяли с помощью смолы Сефандекс G75. Образцы разделяли и собирали по фракциям: фракция 1 (>163000 Да), фракция 2 (163000-14500 Да), фракция 3(14500-1300 Да), фракция 4 (1300-110 Да), фракция 5 (110-10 Да). Резистентный к метициллину Staphylococcus aureus 81М был наиболее устойчив к цефоксицину при совместной инкубации с полученной на эксклюзиционной хроматографии фракцией 3. Этот факт указывает на то, что активным компонентом является полученная на эксклюзионной хроматографии фракция 3 (табл. 4), и убедительно подтверждает, что биоактивные молекулы, ответственные за этот эффект, аналогичны описанным и охарактеризованным в настоящей заявке молекулам.For size exclusion chromatography, the sample was separated using Sefandex G75 resin. Samples were separated and collected into fractions: fraction 1 (>163000 Da), fraction 2 (163000-14500 Da), fraction 3 (14500-1300 Da), fraction 4 (1300-110 Da), fraction 5 (110-10 Da) . Methicillin-resistant Staphylococcus aureus 81M was most resistant to cefoxicin when co-incubated with fraction 3 obtained by size exclusion chromatography. This fact indicates that the active component is fraction 3 obtained by size exclusion chromatography (Table 4), and convincingly confirms that bioactive the molecules responsible for this effect are similar to those described and characterized in this application.

Таблица 4. Диапазон значений MIC цефокситина для резистентного к метициллину Staphylococcus aureus 81М с полученными на эксклюзиционной хроматографии фракциями бесклеточного супернатантаTable 4. Cefoxitin MIC range for methicillin-resistant Staphylococcus aureus 81M with cell-free supernatant fractions obtained by size exclusion chromatography

Контроли Controls Диапазон концентраций цефокситина (цг/мл), ингибирующих рост до O.D. < 0.1 Range of cefoxitin concentrations (cg/ml) that inhibit growth to O.D. <0.1 Необработанный (0 мг/мл) Unprocessed (0 mg/ml) 60-75 60-75 Бесклеточный супернатант (30 мг/мл) Cell-free supernatant (30 mg/ml) 20-30 20-30 Номер фракции эксклюзионной хроматографии Size exclusion chromatography fraction number Фракция 1 Faction 1 60-75 60-75 Фракция 2 Faction 2 75-100 75-100 Фракция 3 Faction 3 30-40 30-40 Фракция 4 Faction 4 60-75 60-75 Фракция 5 Fraction 5 40-50 40-50

В вышеприведенном описании настоящее изобретение раскрыто в общих чертах. Хотя в настоящем документе использованы специфические термины, такие термины предназначены для описания, а не для ограничительных целей.In the above description, the present invention has been described in general terms. Although specific terms are used herein, such terms are intended for descriptive and not limiting purposes.

Все публикации, патенты и заявки на патенты, процитированные выше, включены в настоящую заявку во всей своей полноте посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая(ый) отдельная(ый)All publications, patents and patent applications cited above are incorporated herein in their entirety by reference to the same extent as if each individual

--

Claims (22)

публикация, патент или заявка на патент был(а) в частности и отдельно указана как включенная во всей своей полноте посредством ссылки.the publication, patent or patent application has been specifically and separately stated to be incorporated by reference in its entirety. Хотя предпочтительные варианты осуществления изобретения детально описаны в настоящей заявке, специалисты в данной области техники поймут, что в них можно внести вариации без отхода от сущности изобретения или объема прилагаемой формулы изобретения.Although the preferred embodiments of the invention are described in detail herein, those skilled in the art will appreciate that variations may be made without departing from the spirit of the invention or the scope of the appended claims. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM 1. Применение пептида, полученного из пробиотической бактерии, для профилактики и/или лечения не энтеральной инфекции у субъекта и/или для снижения вирулентности не энтеральной инфекции у субъекта, причем пептид содержит или состоит из YPVEPF, YPPGGP, YPPG, NQPY и их комбинаций, или аминокислотных последовательностей с по меньшей мере около 70% идентичности последовательности с указанными последовательностями, сохраняющими биологическую активность соответствующих нативных последовательностей.1. The use of a peptide derived from a probiotic bacterium for the prevention and/or treatment of a non-enteric infection in a subject and/or for reducing the virulence of a non-enteric infection in a subject, wherein the peptide contains or consists of YPVEPF, YPPGGP, YPPG, NQPY and combinations thereof, or amino acid sequences with at least about 70% sequence identity with the specified sequences that retain the biological activity of the corresponding native sequences. 2. Применение по п.1, где пробиотические бактерии выбраны из Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Bifidobacterium и Streptococcus2. Use according to claim 1, wherein the probiotic bacteria are selected from Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Bifidobacterium and Streptococcus 3. Применение по п.2, при этом Enterococcus выбран из Enterococcus faecalis и Enterococcus faecium.3. Use according to claim 2, wherein Enterococcus is selected from Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium. 4. Применение по п.2, при этом Lactobacillus выбрана из Lactobacillus acidophilus (La-5), Lactobacillus fermentum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus helveticus и Lactobacillus plantarum.4. Use according to claim 2, wherein Lactobacillus is selected from Lactobacillus acidophilus (La-5), Lactobacillus fermentum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus helveticus and Lactobacillus plantarum. 5. Применение по п.2, при этом Lactococcus представляет собой Lactococcus lactis.5. Use according to claim 2, wherein the Lactococcus is Lactococcus lactis. 6. Применение по п.2, при этом Bifidobacterium выбран из Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis и Bifidobacterium crudilactis и их смесей.6. Use according to claim 2, wherein Bifidobacterium is selected from Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis and Bifidobacterium crudilactis and mixtures thereof. 7. Применение по п.2, при этом Streptococcus представляет собой Streptococcus thermophilus.7. Use according to claim 2, wherein the Streptococcus is Streptococcus thermophilus. 8. Применение по любому из пп.1-7, при этом пептид эффективен против инфекции, выбранной из группы, состоящей из инфекции мочевыводящих путей, вагинальной инфекции, инфекции дыхательных путей, инфекции желудка, вырабатывающей биопленку инфекции, мастита, кожной инфекции и инфекции полости рта.8. Use according to any one of claims 1 to 7, wherein the peptide is effective against an infection selected from the group consisting of urinary tract infection, vaginal infection, respiratory tract infection, stomach infection, biofilm-producing infection, mastitis, skin infection and cavity infection mouth 9. Применение по п.8, при этом пептид эффективен против Е.соН, UPEC, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Helicobacter pylori, резистентных к метициллину Staphylococcus aureus (MRSA), Porphyrmonas gingivalis, Prevotella intermedia, S. saprophytic, Klebiessa, Enterobacter, Proteus mirabillis, Enterococci, Clostridium, Klebsiella или Proteus.9. Use according to claim 8, wherein the peptide is effective against E.coH, UPEC, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Helicobacter pylori, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Porphyrmonas gingivalis, Prevotella intermedia, S. saprophytic, Klebiessa, Enterobacter, Proteus mirabillis, Enterococci, Clostridium, Klebsiella or Proteus. 10. Применение по п.9, при этом пептид эффективен против биопленок.10. Use according to claim 9, wherein the peptide is effective against biofilms. 11. Применение по любому из пп.1-10, при этом пептид дополнительно скомбинирован с одним или более из антивирусного средства, источника сахара, съедобного пищевого продукта, пищевой добавки и принимаемой внутрь жидкости.11. Use according to any one of claims 1 to 10, wherein the peptide is further combined with one or more of an antiviral agent, a sugar source, an edible food product, a dietary supplement and an ingestible liquid. 12. Применение по любому из пп.1-11, при этом пептид сконцентрирован из бесклеточного супернатанта или его фракции.12. Use according to any one of claims 1 to 11, wherein the peptide is concentrated from the cell-free supernatant or a fraction thereof. 13. Применение по любому из пп.1-11, при этом пептид предложен в виде сухой культуральной фракции, например в лиофилизированном виде или в высушенном распылением виде.13. Use according to any one of claims 1 to 11, wherein the peptide is provided in the form of a dry culture fraction, for example in lyophilized or spray-dried form. 14. Применение по п.13, при этом сухая культуральная фракция представляет собой бесклеточный супернатант.14. Use according to claim 13, wherein the dry culture fraction is a cell-free supernatant. 15. Применение по любому из пп.1-14, при этом пептид содержит или состоит из последовательности, выбранной из YPVEPF, YPPGGP, YPPG, NQPY и их комбинаций.15. Use according to any one of claims 1 to 14, wherein the peptide contains or consists of a sequence selected from YPVEPF, YPPGGP, YPPG, NQPY and combinations thereof. 16. Применение по п.15, при этом пептид содержит или состоит из последовательности YPPGGP.16. Use according to claim 15, wherein the peptide contains or consists of the sequence YPPGGP. 17. Применение по любому из пп.1-16, где пептид содержится в композиции.17. Use according to any one of claims 1 to 16, wherein the peptide is contained in the composition. 18. Применение по п.17, где композиция представляет собой бесклеточный супернатант, пищевой продукт, питьевой продукт, продукт здорового питания, медикамент или пищевую добавку.18. Use according to claim 17, wherein the composition is a cell-free supernatant, food product, drink product, health food product, medicine or dietary supplement. 19. Применение п.17, при этом композиция содержит живые пробиотические бактерии, из которых получены пептиды.19. Application of claim 17, wherein the composition contains live probiotic bacteria from which the peptides are obtained. 20. Применение по любому из пп.17-19, при этом композиция содержит живые пробиотические бактерии, не являющиеся бактериями, из которых получены пептиды.20. Use according to any one of claims 17 to 19, wherein the composition contains live probiotic bacteria other than the bacteria from which the peptides are derived. 21. Применение по любому из пп.17-20, при этом пептиды в композиции являются очищенными.21. Use according to any one of claims 17-20, wherein the peptides in the composition are purified. 22. Способ лечения и/или профилактики не энтеральной инфекции у субъекта и/или снижения вирулентности не энтеральной инфекции у субъекта, причем способ включает введение пептида, полученного из пробиотической бактерии, причем пептид содержит или состоит из YPVEPF, YPPGGP, YPPG, NQPY и их комбинаций, или аминокислотных последовательностей с по меньшей мере около 70% идентичности последовательности с указанными последовательностями, сохраняющими биологическую активность соответствующих нативных последовательностей, или композиции, содержащей пептид, полученный из пробиотической бактерии, где пептид содержит или состоит из YPVEPF, YPPGGP, YPPG, NQPY и их комбинаций, или аминокислотных последовательностей с по меньшей мере около 70% иден22. A method of treating and/or preventing a non-enteric infection in a subject and/or reducing the virulence of a non-enteric infection in a subject, the method comprising administering a peptide derived from a probiotic bacterium, wherein the peptide contains or consists of YPVEPF, YPPGGP, YPPG, NQPY and their combinations, or amino acid sequences with at least about 70% sequence identity with said sequences retaining the biological activity of the corresponding native sequences, or a composition containing a peptide derived from a probiotic bacterium, wherein the peptide contains or consists of YPVEPF, YPPGGP, YPPG, NQPY and combinations thereof, or amino acid sequences having at least about 70% identity --