EA046248B1

EA046248B1 - Получение огм

Info

Publication number: EA046248B1
Application number: EA202292159
Authority: EA
Inventors: Маргит Педерсен; Манос Пападакис; Катрине Бых Кампманн
Original assignee: Глюком А/С
Priority date: 2020-01-23
Filing date: 2021-01-22
Publication date: 2024-02-20

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области рекомбинантного получения биологических молекул в клетках-хозяевах. Более конкретно, оно относится к способу рекомбинантного получения олигосахаридов грудного молока (ОГМ) с применением генетически модифицированных клеток, экспрессирующих белок суперсемейства основных посредников (MFS).

Уровень техники

Олигосахариды грудного молока (ОГМ) составляют третий по величине твердый компонент грудного молока и обладают высокой устойчивостью к ферментативному гидролизу. Как следствие, значительная часть ОГМ остается в значительной степени непереваренной и неабсорбированной, что делает возможным их проникновение в толстую кишку. В толстой кишке ОГМ могут служить субстратами для формирования кишечной экосистемы путем избирательной стимуляции роста специфических сахаролитических бактерий. Эта избирательность считается полезной как для младенцев, так и для взрослых, поскольку считается, что штаммы видов Bifidobacterium положительно влияют на здоровье кишечника (Chichiowski M. et al., (2012) J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 5:251-258; Elison E. et al., (2016) Brit J. Nutr, 116: 1356-1368).

Помимо своих пребиотических свойств, ОГМ связаны с дополнительными положительными эффектами, что расширяет область их применения (Kunz С. et al., (2014) Food Oligosaccharides: Production, Analysis and Bioactivity, 1st Edition, p 5-20, Eds. Moreno J. and Luz Sanz M., John Wiley & Sons, Ltd).

Очевидная польза ОГМ для здоровья позволила разрешить их применение в пищевых продуктах, таких как детские смеси и пищевые продукты, а также в потребительских товарах для здоровья. Биотехнологическое производство ОГМ представляет собой ценный экономичный и масштабный способ производства ОГМ. Оно основано на генетически модифицированных бактериях, сконструированных таким образом, чтобы экспрессировать гликозилтрансферазы, необходимые для синтеза желаемых олигосахаридов, и в нем применяют врожденный пул нуклеотидных Сахаров бактерий в качестве предшественников ОГМ. Недавние разработки в биотехнологическом производстве ОГМ позволили преодолеть некоторые присущие бактериальным экспрессионным системам ограничения. Например, бактериальные клетки, продуцирующие ОГМ, могут быть генетически модифицированы для увеличения ограниченного внутриклеточного пула нуклеотидных Сахаров в бактериях (WO2012112777), для повышения активности ферментов, участвующих в продукции ОГМ (WO2016040531), или для облегчения секреции синтезированных ОГМ во внеклеточную среду (WO2010142305, WO2017042382). Кроме того, экспрессию представляющих интерес генов в рекомбинантных клетках можно регулировать с помощью конкретных промоторов или других регуляторов экспрессии генов, таких как, например, те, что недавно были описаны в WO 2019123324.

Подход, описанный в WO 2010142305 и WO 2017042382, имеет то преимущество, что он позволяет снизить метаболическую нагрузку, воздействующую на продуцирующую клетку, за счет высоких уровней экспрессии рекомбинантных генов, т.е. с применением способов WO2012112777, WO2016040531 или WO2019123324. Этот подход привлекает все большее внимание к конструированию рекомбинантных клеток, продуцирующих ОГМ, например, недавно были описаны несколько новых генов переносчиков сахара, кодирующих белки и процедуры ферментации, которые могут способствовать выведению рекомбинантно продуцируемой 2'-фукозиллактозы (2'-FL), самого распространенного ОГМ грудного молока (WO2018077892, US201900323053, US201900323052). Однако в настоящее время не существует алгоритма, который мог бы точно определить правильный белок-транспортер, способный обеспечивать отток различных структур ОГМ, полученных рекомбинантно, среди многочисленных бактериальных белков с предсказанной функцией транспортера в нескольких базах данных белков, например, в UniProt, поскольку структуры/факторы, определяющие субстратную специфичность переносчиков Сахаров, до сих пор недостаточно изучены и остаются крайне непредсказуемыми.

Раскрытие изобретения

Идентификация новых эффективных белков-транспортеров оттока Сахаров, обладающих специфичностью к различным рекомбинантно полученным ОГМ и разработка рекомбинантных клеток, экспрессирующих указанный белок, выгодны для крупномасштабного промышленного производства ОГМ.

Настоящее изобретение относится к рекомбинантным клеткам, способным продуцировать олигосахарид грудного молока (ОГМ), при этом клетки экспрессируют гетерологичный ген, кодирующий предполагаемый транспортный белок MFS (major facilitator superfamily, суперсемейство основных посредников), происходящий из бактерии Rosenbergiella nectarea. Более конкретно, изобретение относится к генетически модифицированной клетке, оптимизированной для продукции олигосахаридов, в особенности, ОГМ, содержащей рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, последовательность которого, по меньшей мере, на 80% сходна с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1. Аминокислотная последовательность, обозначенная в настоящем документе как SEQ ID NO:1, представляет собой аминокислотную последовательность, которая на 100% идентична аминокислотной последовательности, имеющей номер доступа в GenBank IDWP_092672081.1(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/WP_092672081.1). Белок-транспортер MFS, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, идентифицируют в настоящем документе как белок Nec, или транспортер Nec, или Nec, взаимозаменяемо; последовательность нуклеиновой кислоты,

- 1 046248 кодирующую белок Nec, идентифицируют в настоящем документе как кодирующая nec нуклеиновая кислота/ДНК, или ген nec, или nec.

Настоящее изобретение показывает, что применение рекомбинантных клеток, продуцирующих ОГМ, которые экспрессируют белок Nec, приводит к весьма отчетливым улучшениям процесса производства ОГМ как с точки зрения ферментации, так и очистки ОГМ. Описанные в настоящем документе рекомбинантные клетки и способы получения ОГМ обеспечивают как более высокие выходы всех произведенных ОГМ, более низкое образование побочных продуктов или отношение побочного продукта к продукту, более низкое образование биомассы за ферментацию, так и облегченное извлечение ОГМ во время последующей обработки ферментационный бульон.

Неожиданно было обнаружено, что экспрессия последовательности ДНК, кодирующей Nec, в различных ОГМ-продуцирующих клетках связана с накоплением некоторых ОГМ во внеклеточной среде и других ОГМ внутри продуцирующих клеток, а также с увеличением общей продукции ОГМ. Неожиданно оказалось, что увеличение выхода образующихся ОГМ характерно для ОГМ, состоящих либо из трех, либо из четырех звеньев моносахаридов, т.е. для ОГМ, которые представляют собой трисахариды и тетрасахариды, например, 2'-фукозиллактозы (2'-FL), 3-фукозиллактозы (3-FL), 3-сиалиллактозы (3'-SL), 6'сиалиллактозы (6'-SL), лакто-Ы-триозы 2, (LNT-2), лакто-Ы-неотетраозы (LNnT) и лакто-Ы-тетраозы (LNT), но не для более крупных олигосахаридных структур, таких как пентасахариды и гексасахариды, которые накапливаются внутри продуцирующих клеток. Неожиданно также обнаружено, что общая продукция основных ОГМ, например, 2'-фукозиллактозы (2'-FL), 3-фукозиллактозы (3-FL), лакто-Ы-триозы (LNT II) и лакто-Ы-тетраозы (LNT) соответствующими ОГМ-продуцирующими клетками, экспрессирующими Nec, также увеличивается, в то время как образование побочных продуктов, например, дифукозиллактозы (DFL), лакто-Ы-фукопентаозы V (LNFP V) или паралактонеогексаозы-I (pLNH-I), в этих клетках, соответственно, часто снижены, и указанные побочные олигосахариды обычно накапливаются внутри ОГМ-продуцирующих клеток. Далее, весьма неожиданно, оказалось, что экспрессия белка Nec в клетках, продуцирующих ОГМ, приводит к снижению образования биомассы во время ферментации и к более здоровым клеточным культурам, отражаясь в уменьшении количества мертвых клеток в конце ферментации, что делает производственный процесс более эффективным, поскольку на единицу биомассы производится больше продукта.

Соответственно, первый аспект изобретения относится к генетически модифицированной клетке, способной продуцировать один или несколько ОГМ, где указанная клетка включает рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок SEQ ID NO:1 (фиг. 6), или его функциональный гомолог, аминокислотная последовательность которого идентична, по меньшей мере, на 80%, предпочтительно идентична, по меньшей мере, на 85%, более предпочтительно идентична, по меньшей мере, на 90% последовательности SEQ ID NO: 1.

Второй аспект изобретения относится к конструкции нуклеиновой кислоты, включающей последовательность(последовательности) нуклеиновой кислоты, кодирующую(кодирующие) белок-транспортер MFS, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, имеет, по меньшей мере, 70% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 2, например, по меньшей мере, 80%, например, по меньшей мере, 85%, например, по меньшей мере, 95%, например, по меньшей мере, 99%, а также к генетически модифицированной клетке, включающей конструкцию нуклеиновой кислоты, которая представляет собой Escherichia coli.

В одном аспекте конструкция нуклеиновой кислоты включает последовательность(последовательности) нуклеиновой кислоты, кодирующую(кодирующие) белок-транспортер MFS, в которой последовательность нуклеиновой кислоты идентична, по меньшей мере, на 70% последовательности SEQ ID NO:2.

Третий аспект изобретения относится к способу получения одного или нескольких олигосахаридов, включающему следующие стадии:

(i) получение генетически модифицированной клетки, способной продуцировать ОГМ, в котором указанная клетка включает рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок SEQ ID NO:1, или его функциональный гомолог, аминокислотная последовательность которого идентична, по меньшей мере, на 80%, предпочтительно идентична, по меньшей мере, на 85%, более предпочтительно идентична, по меньшей мере, на 90% последовательности SEQ ID NO: 1;

(ii) культивирование клеток в соответствии с (i) в подходящей среде культивирования клеток для экспрессии указанной рекомбинантной нуклеиновой кислоты;

(iii) сбор одного или нескольких ОГМ, полученных на стадии (ii).

Изобретение также относится к применению генетически модифицированной клетки или конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок суперсемейства основных посредников (MFS), причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты имеет, по меньшей мере, 70% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 2, для производства одного или нескольких олигосахаридов грудного молока (ОГМ).

Как упоминалось выше, при культивировании генетически модифицированных клеток, способных продуцировать один или несколько ОГМ, клеток включающих нуклеиновую кислоту, кодирующую бе

- 2 046248 лок-транспортер Nec, неожиданно было обнаружено, что соответствующие один или несколько ОГМ продуцируются с высокими выходами, тогда как образование побочных продуктов и биомассы снижается. Это облегчает извлечение ОГМ в последующих процессах, например, общая процедура извлечения и очистки может включать меньше стадий и общее время очистки может быть сокращено.

Эти эффекты повышенного выхода продукта и облегчения извлечения продукта делают настоящее изобретение превосходящим раскрытия предшествующего уровня техники.

Другие аспекты и полезные признаки настоящего изобретения подробно описаны и проиллюстрированы приведенными ниже неограничивающими рабочими примерами.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показаны относительная продукция 2'-FL (фиг. 1А), относительное распределение 2'-FL внутри и снаружи клеток (фиг. 1В), относительное соотношение DFL к 2'-FL (фиг. 1В), и относительная оптическая плотность (фиг. 1D) модифицированной Е. coli со сверхэкспрессией белка-транспортера MFS с последовательностью SEQ ID NO: 1 и без сверхэкспрессии.

На фиг. 2 показано относительное распределение 3 -FL внутри и снаружи клеток в модифицированной Е. coli со сверхэкспрессией белка-транспортера MFS с последовательностью SEQ ID NO: 1 и без сверхэкспрессии.

На фиг. 3 показаны относительные концентрации LNT2 в процентах (%) для штаммов МР4002 и МР4039 в общих образцах и в образцах супернатанта и осадка. Хотя оба штамма демонстрируют оптимальную экспрессию гена гликозилтрансферазы lgtA, только МР4039 экспрессирует ген гетерологичного переносчика nec.

На фиг. 4 показано процентное содержание (%) относительных концентраций LNT и побочных продуктов для штаммов МР4473 и МР4537 в общих образцах и в образцах супернатанта и осадка. Хотя оба штамма демонстрируют оптимальную экспрессию генов гликозилтрансфераз lgtA и galTK, только МР4537 экспрессирует ген гетерологичного переносчика nec.

На фиг. 5 показано процентное соотношение (%) относительной суммарной концентраций LNFP-I, 2'-FL, LNT и ОГМ для штаммов МР2789 и МР4597 во всех образцах. Хотя оба штамма демонстрируют оптимальную экспрессию генов гликозилтрансфераз IgtA, galTK и futC, только МР4597 экспрессирует ген гетерологичного переносчика nec.

На фиг. 6 представлена аминокислотная последовательность белка Nec (SEQ ID NO: 1).

Осуществление изобретения

Далее воплощения изобретения будут описаны более подробно. Каждая конкретная вариация признаков может быть применена к другим воплощениям изобретения, если специально не указано иное.

Как правило, все применяемые в настоящем документе термины следует интерпретировать в соответствии с их обычным значением в технической области и как применимые ко всем аспектам и воплощениям изобретения, если явно не определено или не указано иное. Все ссылки на a/an/the [клетка, последовательность, ген, транспортер, стадия и т.д.] нужно интерпретировать открыто как относящиеся, по меньшей мере, к одному экземпляру указанной клетки, последовательности, гена, транспортера, стадии и т.д. если прямо не указано иное. Этапы любого раскрытого в настоящем документе способа не обязательно выполнять в точном раскрытом порядке, если это не указано явно.

Настоящее изобретение в целом относится к генетически модифицированной клетке для эффективного производства олигосахаридов и к применению указанной генетически модифицированной клетки в способе получения олигосахаридов. В особенности, настоящее изобретение относится к генетически модифицированной клетке, способной к синтезу олигосахарида, предпочтительно, гетерологичный олигосахарид, в особенности, олигосахарид грудного молока (ОГМ). Соответственно, клетка по изобретению модифицируют для экспрессии набора рекомбинантных нуклеиновых кислот, которые необходимы для синтеза клетками одного или нескольких ОГМ (которые позволяют клетке синтезировать один или несколько ОГМ), таких как гены, кодирующие один или несколько ферментов с гликозилтрансферазной активностью, описанных ниже.

Продуцирующую олигосахарид рекомбинантную клетку по изобретению дополнительно модифицируют для включения гетерологичной последовательности рекомбинантной нуклеиновой кислоты, предпочтительно, последовательности ДНК, кодирующей предполагаемый транспортный белок MFS (major facilitator superfamily, суперсемейство основных посредников), происходящий из бактерии Rosenbergiella nectarea. Более конкретно, изобретение относится к генетически модифицированной клетке, оптимизированной для продукции одного или нескольких конкретных олигосахаридов, в особенности, одного или нескольких конкретных ОГМ, содержащей рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, имеющий, по меньшей мере, 80% сходства последовательности, предпочтительно, по меньшей мере, 85%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90% и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 95% сходства последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 (фиг. 6). Аминокислотная последовательность, обозначенная в настоящем документе как SEQ ID NO:1, представляет собой аминокислотную последовательность, которая на 100% идентична аминокислотной последовательности, имеющей номер доступа в GenBank: WP_092672081.1.

Соответственно, первый аспект изобретения относится к генетически модифицированной клетке, способной продуцировать один или несколько ОГМ, при этом указанная клетка включает рекомбинант

- 3 046248 ную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок SEQ ID NO:1, или его функциональный гомолог, аминокислотная последовательность которого идентична, по меньшей мере, на 80%, предпочтительно идентична, по меньшей мере, на 85%, более предпочтительно идентична, по меньшей мере, на 90% последовательности SEQ ID NO: 1. Под термином функциональный гомолог в настоящем контексте подразумевают белок, аминокислотная последовательность которого на 80-99,9 % идентична SEQ ID NO: 1, и который обладает функцией, полезной для достижения по меньшей мере одного преимущественного эффекта изобретения, т.е. увеличение общего производства ОГМ клеткой-хозяином, облегчение восстановления произведенного(произведенных) ОГМ, эффективность продукции ОГМ и/или жизнеспособность клетки, продуцирующей ОГМ.

Белок-транспортер MFS, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, идентифицируют в настоящем документе как белок Nec, или транспортер Nec, или Nec, взаимозаменяемо; последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок Nec, идентифицируют в настоящем документе как кодирующую nec нуклеиновую кислоту/ДНК, или ген nec, или nec.

Под термином суперсемейства основных посредников (MFS) подразумевают большое и исключительно разнообразное семейство класса вторичных активных транспортеров, которые отвечают за транспорт ряда различных субстратов, включая сахара, лекарства, гидрофобные молекулы, пептиды, органические ионы и т.д. Специфичность белков-переносчиков сахара крайне непредсказуема, и идентификация нового белка-переносчика со специфичностью, например, в отношении олигосахаридов требует необременительных лабораторных экспериментов (более подробную информацию смотри в обзоре Reddy V.S. et al., (2012), FEBS J. 279(11): 2022-2035). Термин переносчик MFS в данном контексте означает белок, который облегчает транспорт олигосахарида, предпочтительно ОГМ, через клеточную мембрану, предпочтительно транспорт ОГМ/олигосахарида, синтезированного клеткой-хозяином, из цитозоля клетки в клеточную среду, предпочтительно, ОГМ/олигосахарида, содержащего три или четыре звена сахара, например, 2'-FL, 3-FL, LNT-2, LNT, LNnT, 3'-SL или 6'-SL. Дополнительно или альтернативно переносчик MFS может также способствовать оттоку молекул, которые не считаются ОГМ или олигосахаридами согласно настоящему изобретению, таких как лактоза, глюкоза, клеточные метаболиты или токсины.

Термин идентичность последовательности [определенного] % в контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислот означает, что две или более последовательностей имеют общие нуклеотиды или аминокислотные остатки в данном проценте при сравнении и выравнивании для максимального соответствие в окне сравнения или обозначенных последовательностях нуклеиновых кислот или аминокислот (т.е. последовательности имеют, по меньшей мере, 90-процентную (%) идентичность). Процентную идентичность последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислот можно определить с помощью алгоритма сравнения последовательностей BLAST 2.0 с параметрами по умолчанию или путем ручного выравнивания и визуального контроля (см., например, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Это определение также применимо к комплементу тестируемой последовательности и к последовательностям, которые имеют делеции и/или добавления, а также к тем, которые имеют замены. Примером алгоритма, подходящего для определения процента идентичности, сходства последовательностей и выравнивания, служит алгоритм BLAST 2.2.20+, описанный в Altschul et al. Nucl. Acids Res. 25, 3389 (1997). BLAST 2.2.20+ применяют для определения процента идентичности последовательностей нуклеиновых кислот и белков по изобретению. Программное обеспечение для проведения анализов BLAST общедоступно через Национальный центр биотехнологической информации, (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). CLUSTAL Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/), EMBOSS Needle (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/), MAFFT (http://mafftcbrc.jp/alignment/server/) или MUSCLE (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/) представляют собой примеры алгоритмов выравнивания последовательностей.

В контексте изобретения термин олигосахарид означает сахаридный полимер, содержащий ряд моносахаридных звеньев. В некоторых воплощениях предпочтительными олигосахариды представляют собой полимеры сахаридов, состоящие из трех или четырех моносахаридных звеньев, т.е. трисахариды или тетрасахариды. Предпочтительные олигосахариды изобретения представляют собой олигосахариды грудного молока (ОГМ).

Термин олигосахарид грудного молока или ОГМ в данном контексте означает сложный углевод, обнаруженный в грудном молоке человека (для отсылки смотри Urashima et al:. Milk Oligosaccharides. Nova Science Publisher (2011); или Chen, Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 72, 113 (2015)). ОГМ имеют структуру ядра, включающую единицу лактозы на восстанавливающем конце, которая может быть удлинена одной или несколькими единицами бета-Ы-ацетил-лактозаминила и/или одной или несколькими единицами бета-лакто-Н-биозила, и эта структура ядра может быть замещенный альфа-Lфукопиранозильной и/или альфа-М-ацетилнейраминильной (сиалильной) частью. В связи с этим некислотные (или нейтральные) ОГМ лишены остатка сиалила, а кислые ОГМ имеют в своей структуре хотя бы один остаток сиалила. Некислотный (или нейтральный) ОГМ может быть фукозилированным или нефукозилированным. Примеры таких нейтральных нефукозилированных ОГМ включают лакто-Nтриозу 2 (LNT-2), лакто-И-тетраозу (LNT), лакто-N-неотетраозу (LNnT), лαкто-N-неогексаозу (LNnH),

- 4 046248 пара-лакто-Ы-неогексаозу (pLNnH), пара-лакто-Ы-гексаозу (pLNH) и лакто-Ы-гексаозу (LNH). Примеры нейтральных фукозилированных ОГМ включают 2'-фукозиллактозу (2'-FL), лакто-Ы-фукопентаозу I (LNFP-I), лакто-Ы-дифукогексаозу I (LNDFH-I), 3-фукозиллактозу (3-FL), дифукозиллактозу (DFL), лакто-Ы-фукопентаозу II (ЪЫРР-П), лакто-Ы-фукопентаозу III (ЪЫЕР-111). лакто-Ы-дифукогексаозу III (LNDFH-Ш), фукозил-лакто-Ы-гексаозу II (FLNH-II), лакто-Ы-фукопентаозу V (LOTP-V), лакто-Ыдифукогексаозу II (LNDFH-II), фукозил-лакто-Ы-гексаозу I (FLNH-I), фукозил-пара-лакто-Ы-гексаозу I (FpLNH-I), фукозил-пара-лакто-Ы-неогексаозу II (F-pLNnH II) и фукозил-лакто-Ы-неогексаозу (FLNnH). Примеры кислотных ОГМ включают З'-сиалиллактозу (3'-SL), 6'-сиалиллактозу (6'-SL), 3-фукозил- 3'сиалиллактозу (FSL), З'-О-сиалиллакто-Ы-тетраозу a (LST а), фукозил-LST a (FLST а), 6'-О-сиалиллактоЫ-тетраозу b (LST b), фукозил-LST b (FLST b), 6'-О-сиалиллакто-Ы-неотетраозу (LST c), фукозил-LST с (FLST с), З'-О-сиалиллакто-Ы-неотетраозу (LST d), фукозил-LST d (FLST d), сиалил-лакто-Ы-гексаозу (SLNH), сиалил-лакто-Ы-неогексаозу I (SLNH-I), сиалил-лакто-Ы-неогексаозу II (SLNH-II) и дисиалиллакто-Ы-тетраозу (DSLKT). В контексте настоящего изобретения лактозу не рассматривают как разновидность ОГМ.

В некоторых воплощениях изобретения предпочтительными могут быть три-ОГМ и тетра-ОГМ, например, трисахариды 2'-FL, 3-FL, LOT^, З'-SL, 6'-SL и тетрасахариды DFL, Ь-ЫП 1.ЫпГ FSL.

Чтобы иметь возможность синтезировать один или несколько ОГМ, рекомбинантная клетка по изобретению включает, по меньшей мере, одну рекомбинантную нуклеиновую кислоту, которая кодирует функциональный фермент с гликозилтрансферазной активностью. Ген галактозилтрансферазы может быть интегрирован в геном (посредством хромосомной интеграции) клетки-хозяина, или, альтернативно, он может быть включен в плазмидную ДНК и экспрессироваться как переносимый плазмидой. Если для производства ОГМ необходимы две или более гликозилтрансфераз, например, LNT или LNпT, то две или более рекомбинантных нуклеиновых кислоты, кодирующих разные ферменты с гликозилтрансферазной активностью, могут быть интегрированы в геном и/или экспрессированы из плазмиды, например бета1,3-Ы-ацетилглюкозаминилтрансферазу (первая рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая первую гликозилтрансферазу) в сочетании с бета-1,4-галактозилтрансферазой (вторая рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая вторую гликозилтрансферазу) для продукции LNT, где первая и вторая рекомбинантные нуклеиновые кислоты могут быть независимо друг от друга интегрированы хромосомно на плазмиде. В одном предпочтительном воплощении как первая, так и вторая рекомбинантные нуклеиновые кислоты стабильно интегрированы в хромосому клетки-продуцента; в другом воплощении, по меньшей мере, одна из первой и второй гликозилтрансфераз представляет собой переносимую плазмидой. Белок/фермент с гликозилтрансферазной активностью (гликозилтрансфераза) может быть выбран в различных воплощениях из ферментов, обладающих активностью альфа-1,2-фукозилтрансферазы, альфа1,3-фукозилтрансферазы, альфа-1,3/4-фукозилтрансферазы, альфа-1,4-фукозилтрансферазы, альфа-2,3сиалилтрансферазы, альфа-2,6-сиалилтрансферазы, бета-1,3-Ы-ацетилглюкозаминилтрансферазы, бета1,6-Ы-ацетилглюкозаминилтрансферазы, бета-1,3-галактозилтрансферазы и бета-1,4-галактозилтрансферазы. Например, для продукции 2'-FL требуется, чтобы модифицированная клетка экспрессировала активный фермент альфа-1,2-фукозилтрансферазу; для продукции 3-FL модифицированная клетка нуждается в экспрессии активного фермента альфа-1,3-фукозилтрансферазы; для продукции LOT модифицированная клетка должна экспрессировать, по крайней мере, две гликозилтрансферазы, бета-1,3-Ыацетилглюкозаминилтрансферазу и бета-1,3-галактозилтрансферазу; для продукции 6'-SL модифицированная клетка должна экспрессировать активный фермент альфа-2,6-сиалилтрансферазу и путь для синтеза СМР-сиаловой кислоты; для производства 3'-SL модифицированная клетка должна экспрессировать активный фермент альфа-2,3-сиалилтрансферазу и путь для синтеза СМР-сиаловой кислоты. Некоторые неограничивающие воплощения белков, обладающих гликозилтрансферазной активностью, которые могут кодироваться рекомбинантными генами, содержащимися в клетке-продуценте, могут быть выбраны из неограничивающих примеров табл. 1.

- 5 046248

Таблица 1

Ген	ID белковой последовательности (GenBank)	Описание	Пример ОГМ
IgtANm	WP 002248149.1	ββ-1,3-Ν- ацетилглюкозаминил-трансфераза	LNT, LNnT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-III, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNH I, pLNnH
IgtA Nm 54(758	AAF42258.1	β-1,3-Ν- ацетилглюкозаминил-трансфераза	LNT, LNnT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-III, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNH I, pLNnH
IgtA Hd	AAN05638.1	β-1,3-Ν- ацетилглюкозаминил-трансфераза	LNT, LNnT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-III, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNH I, pLNnH
IgtA Ng PID2	AAK70338.1	β-1,3-Ν- ацетилглюкозаминил-трансфераза	LNT, LNnT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-III, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNH I, pLNnH
IgtA Ng NCCP1 1945	ACF31229.1	β-1,3-Ν- ацетилглюкозаминил-трансфераза	LNT, LNnT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-III, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNH I, pLNnH
IgtA Past	AAK02595.1	β-1,3-Ν- ацетилглюкозаминил-трансфераза	LNT, LNnT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-III, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNH I, pLNnH
IgtANc	EEZ72046.1	β-1,3-Ν- ацетилглюкозаминил-трансфераза	LNT, LNnT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-III, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNH I, pLNnH
IgtA Nm 8 7255	ELK60643.1	β-1,3-Ν- ацетилглюкозаминил-трансфераза	LNT, LNnT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-III, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNH I, pLNnH
galT Hp/HP0826	NP 207619.1	ββ-l,4-гaлaκτoзилтрансфераза	LNnT, LNFP-III, LNFP-VI, pLNH I, F-pLNH I, pLNnH

- 6 046248

galT Nm IgtB	AAF42257.1	β-1,4-галактозилтрансфераза	LNnT, LNFP-III, LNFP-VI, pLNH I, F-pLNH I, pLNnH
wbgO	WP000582563.1	β-1,3 -галактозилтрансфераза	LNT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-V, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNHI
cpsIBJ	AB050723.1	ββ-1,3 - галактозилтрансфераза	LNT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-V, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNHI
jhp0563	AEZ55696.1	β-1,3 -галактозилтрансфераза	LNT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-V, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNHI
galTK	homologous to BD182026	β-1,3 -галактозилтрансфераза	LNT, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-V, LNDFH-I, LNDFH-II, pLNH, FpLNHI
futC	WP 080473865.1	а-1,2-фукозилтрансфераза	2'-FL, DFL, LNFP-I, LNDFH-I
FucT2HpUA802	AAC99764.1	а-1,2-фукозилтрансфераза	2'-FL, DFL, LNFP-I, LNDFH-I
FucT2EcO126t	ABE98421.1	а-1,2-фукозилтрансфераза	2'-FL, DFL, LNFP-I, LNDFH-I
FucT2 Hml2198	CBG40460.1	а-1,2-фукозилтрансфераза	2'-FL, DFL, LNFP-I, LNDFH-I
FucT2Pm9515	ABM71599.1	а-1,2-фукозилтрансфераза	2'-FL, DFL, LNFP-I, LNDFH-I
FucT2HpF57	BAJ59215.1	а-1,2-фукозилтрансфераза	2'-FL, DFL, LNFP-I, LNDFH-I
FucT6 3 Bf	CAH09151.1	а-1,3-фукозилтрансфераза	2'-FL, 3-FL, DFL, LNFP-I, LNFP-III, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-II, F-pLNH I
FucT7 3 Bf	CAH09495.1	а-1,3-фукозилтрансфераза	2'-FL, 3-FL, DFL, LNFP-I, LNFP-III, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-II, F-pLNH I
FucT 3 Am	ACD04596.1	а-1,3-фукозилтрансфераза	2'-FL, 3-FL, DFL, LNFP-I, LNFP-III, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-II, F-pLNH I
MAMAR764	AGC02224.1	а-1,3-фукозилтрансфераза	2'-FL, 3-FL, DFL, LNFP-I, LNFP-III, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-II, F-pLNH I
Mg791	AEQ33441.1	а-1,3-фукозилтрансфераза	2'-FL, 3-FL, DFL, LNFP-I, LNFP-III, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-II, F-pLNH I
Moumou 00703	YP 007354660	а-1,3-фукозилтрансфераза	2'-FL, 3-FL, DFL, LNFP-I, LNFP-III, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-II, F-pLNH I
futA	NP 207177.1	а-1,3-фукозилтрансфераза	2'-FL, 3-FL, DFL, LNFP-I, LNFP-III, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-II, F-pLNH I

- 7 046248

fucT	AAB81031.1	а-1,3-фукозилтрансфераза	2'-FL, 3-FL, DFL, LNFP-I, LNFP-III, LNFP-V, LNFP-VI, LNDFH-II, F-pLNH I
fucTIII	AY450598.1	а-1,4-фукозилтрансфераза	LNDFH-I, LNDFH-II
fucTa	AFI94963.1	а-1,3/4-фукозилтрансфераза	LNFP-II, LNDFH-I, LNDFH-II
Pd2,6ST	BAA25316.1	а-2,6сиал ил трансфераза	6'-SL
PspST6	BAF92026.1	а-2,6сиалилтрансфераза	6'-SL
PiST6 145	BAF91416.1	а-2,6сиалилтрансфераза	6'-SL
PiST6 119	BAI49484.1	а-2,6сиалилтрансфераза	6'-SL
NST	AAC44541.1	а-2,3- сиалилтрансфераза	3'-SL

Один из аспектов настоящего изобретения представляет собой обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты, включающей гетерологичную(гетерологичные) последовательность(последовательности) нуклеиновой кислоты, кодирующую(кодирующие) белок, способный к транспортировке сахара, который представляет собой белок суперсемейства основных посредников (MFS), как показано в SEQ ID NO: 1, или его функциональный гомолог, аминокислотная последовательность которого, по меньшей мере, на 80% идентична SEQ ID NO: 1, при этом последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок MFS, имеет, по меньшей мере, 70% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 2.

Под термином гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая рекомбинантный ген/нуклеиновая кислота/ДНК или кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты подразумевают искусственную последовательность нуклеиновой кислоты (т.е. полученную in vitro с применением стандартных лабораторных способов получения последовательностей нуклеиновых кислот), которая включает набор последовательных, неперекрывающихся триплетов (кодонов), которые транскрибируются в мРНК и транслируются в полипептид, когда их помещают под контроль соответствующих контрольных последовательностей, т.е. промотора. Границы кодирующей последовательности обычно определяются сайтом связывания рибосомы, расположенным прямо перед открытой рамкой считывания на 5'-конце мРНК, стартовым кодоном транскрипции (AUG, GUG или UUG) и стоп-кодоном трансляции (UAA, UGA или UAG). Кодирующая последовательность может включать, но не ограничиваться ими, геномную ДНК, кДНК синтетические и рекомбинантные последовательности нуклеиновых кислот. Термин нуклеиновая кислота включает молекулы РНК, ДНК и кДНК. Понятно, что в результате вырождения генетического кода может быть получено множество нуклеотидных последовательностей, кодирующих данный белок. Термин нуклеиновая кислота применяют взаимозаменяемо с термином полинуклеотид. Олигонуклеотид представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты с короткой цепью. Праймер представляет собой олигонуклеотид, встречающийся в природе в виде очищенного фрагмента рестрикции или полученный синтетическим путем, который способен действовать как точка инициации синтеза при помещении в условия, в которых индуцируется синтез продукта удлинения праймера, комплементарного цепи нуклеиновой кислоты (т.е. в присутствии нуклеотидов и индуцирующего агента, такого как ДНК-полимераза, и при подходящей температуре и рН). Праймер предпочтительно применяют одноцепочечный для максимальной эффективности амплификации, но альтернативно он может быть двухцепочечным. Если праймер двухцепочечный, то его сначала обрабатывают, чтобы разделить его нити, прежде чем применять для приготовления продуктов для удлинения. Предпочтительно праймер представляет собой дезоксирибонуклеотид. Праймер должен быть достаточно длинным, чтобы инициировать синтез продуктов удлинения в присутствии индуцирующего агента. Точная длина праймеров будет зависеть от многих факторов, включая температуру, источник праймера и применение способа.

Рекомбинантная нуклеиновая последовательность по изобретению может представлять собой кодирующую последовательность ДНК, например, ген или некодирующая последовательность ДНК, например, регуляторную ДНК, такую как промоторная последовательность. Один аспект изобретения относится к получению рекомбинантной клетки, включающей последовательности рекомбинантной ДНК, кодирующие ферменты, необходимые для продукции одного или нескольких ОГМ, и последовательность ДНК, кодирующую переносчик Nec. Соответственно, в одном воплощении изобретение относится к кон

- 8 046248 струкции нуклеиновой кислоты, включающей кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты, т.е. последовательность рекомбинантной ДНК представляющего интерес гена, например, гена гликозилтрансферазы или гена nec, и некодирующую последовательность ДНК, например, последовательность промоторной ДНК, например, рекомбинантную промоторную последовательность, полученную из промотора оперона lac или оперона glp, или промоторную последовательность, полученную из другой последовательности ДНК геномного промотора, или синтетическая промоторная последовательность, где кодирующая и промоторная последовательности функционально связаны. Термин функционально связанный относится к функциональной взаимосвязи между двумя или более сегментами нуклеиновой кислоты (например, ДНК). Как правило, это относится к функциональной связи регуляторной последовательности транскрипции с транскрибируемой последовательностью. Например, промоторная последовательность функционально связана с кодирующей последовательностью, если она стимулирует или модулирует транскрипцию кодирующей последовательности в подходящей клетке-хозяине или другой системе экспрессии. Как правило, промоторные регуляторные последовательности транскрипции, которые функционально связаны с транскрибируемой последовательностью, физически примыкают к транскрибируемой последовательности, т.е. они представляют собой цис-действующие последовательности.

В одном воплощении конструкция нуклеиновой кислоты по изобретению может представлять собой частью векторной ДНК, в другом воплощении конструкция представляет собой экспрессионную кассету/картридж, интегрированную в геном клетки-хозяина. Соответственно, термин конструкция нуклеиновой кислоты означает искусственно сконструированный сегмент нуклеиновой кислоты, в особенности, сегмент ДНК, который предназначен для трансплантации в клетку-мишень, например, в клеткумишень, например, в бактериальную клетку, для модификации экспрессии гена генома или экспрессии последовательности гена/кодирующей ДНК, которая может быть включена в конструкцию. В контексте изобретения конструкция нуклеиновой кислоты включает последовательность рекомбинантной ДНК, включающую две или более последовательностей рекомбинантной ДНК: по существу, некодирующую последовательность ДНК, включающую последовательность промоторной ДНК, и кодирующую последовательность ДНК, кодирующую представляющий интерес ген, например, белка Nec, гликозилтрансферазы или другого гена, пригодного для продукции ОГМ в клетке-хозяине. Предпочтительно конструкция включает дополнительные некодирующие последовательности ДНК, которые либо регулируют транскрипцию, либо трансляцию кодирующей ДНК конструкции, например, последовательность ДНК, облегчающую связывание рибосомы с транскриптом, лидирующую последовательность ДНК, которая стабилизирует транскрипт.

Интеграция представляющей интерес рекомбинантной нуклеиновой кислоты, включенной в конструкции (т.е. в экспрессионную кассету), в бактериальный геном может быть достигнута обычными способами, например, с помощью линейных картриджей, содержащих фланкирующие последовательности, гомологичные определенному участку на хромосоме, как описано для attTn7-сайта (Waddell C.S. and Craig N.L., Genes Dev. (1988) Feb;2(2):137-49.); способами геномной интеграции последовательностей нуклеиновых кислот, в которых рекомбинация опосредована рекомбиназной функцией Red фага λ или рекомбиназной функцией RecE/RecT профага Rac (Murphy, J Bacteriol.(1998);180(8):2063-7; Zhang et al., Nature Genetics (1998)20: 123-128 Muyrers et al., EMBO Rep.(2000) 1(3): 239-243); способами, основанными на рекомбинации Red/ET (Wenzel et al., Chem Biol. (2005), 12(3):349-56.; Vetcher et al., Appl Environ Microbiol. (2005);71(4): 1829-35); или с помощью положительных клонов, т.е. клонов, которые несут кассету экспрессии, могут быть отобраны, например, с помощью маркерного гена, или потери или усиления функции гена.

Одной копии кассеты экспрессии, включающей интересующий ген, может быть достаточно для обеспечения продукции желаемого ОГМ и достижения желаемых эффектов согласно изобретению. Соответственно, в некоторых предпочтительных воплощениях изобретение относится к рекомбинантной ОГМ-продуцирующей клетке, которая включает одну, две или три копии представляющего интерес гена, интегрированного в геномную ДНК клетки. В некоторых воплощениях предпочтительна единственная копия гена.

В одном предпочтительном воплощении рекомбинантная кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты конструкции нуклеиновой кислоты по изобретению представляет собой гетерологичную последовательность по отношению к промотору, что означает, что эквивалентная нативная кодирующая последовательность в геноме вида происхождения транскрибируется под контролем другой промоторной последовательности (т.е. не промоторной последовательности конструкции). Тем не менее, что касается клетки-хозяина, кодирующая ДНК может быть либо гетерологичной (т.е. полученной из другого биологического вида или рода), такой как, например, последовательность ДНК, кодирующая белок Nec, экспрессированная в клетках-хозяевах Escherichia coli, или гомологичной (т.е. полученной из клеткихозяина), такой как, например, гены оперона толстой кишки, гены wca.

Термин регуляторный элемент, или промотор, или промоторная область, или промоторный элемент представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая распознается и связывается ДНК-зависимой РНК-полимеразой во время инициации транскрипции. Промотор вместе с другими последовательностями нуклеиновых кислот, регулирующими транскрипцию и трансляцию (также

- 9 046248 называемыми контрольными последовательностями), необходим для экспрессии данного гена или группы генов (оперона). Как правило, транскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности включают, но не ограничиваются ими, промоторные последовательности, сайты связывания рибосом, последовательности начала и остановки транскрипции, последовательности начала и остановки трансляции и последовательности энхансера или активатора. Сайт старта транскрипции означает первый транскрибируемый нуклеотид и обозначен как +1. Нуклеотиды ниже стартового сайта пронумерованы +2, +3, +4 и т.д., а нуклеотиды в 5' противоположном (выше) направлении пронумерованы -1, -2, -3 и т.д. Последовательность промоторной ДНК конструкции может происходить из промоторной области любого гена генома выбранного вида, предпочтительно, из промоторной области геномной ДНК E.coli. Соответственно, любая промоторная последовательность ДНК, которая способна связываться с РНКполимеразой и инициировать транскрипцию, подходит для осуществления изобретения. В принципе, любая промоторная последовательность ДНК может быть применена для контроля транскрипции интересующего рекомбинантного гена конструкции, разные или одинаковые промоторные последовательности могут быть применены для управления транскрипцией различных представляющих интерес генов, интегрированных в геном клетки-хозяина или в ДНК вектора экспрессии. Для обеспечения оптимальной экспрессии рекомбинантного гена(рекомбинантных генов), включенного(включенных) в конструкцию, конструкция может содержать дополнительные регуляторные последовательности, например, лидирующую последовательность ДНК, такую как последовательность ДНК, полученную из 5'-нетранслируемой области (5UTR) гена glp E. coli, последовательность для рибосомного связывания. Примеры последних последовательностей описаны в WO 2019123324 (включена в настоящий документ в качестве отсылки) и проиллюстрированы в настоящем документе в неограничивающих рабочих примерах.

В некоторых предпочтительных воплощениях регуляторный элемент для регуляции экспрессии рекомбинантного гена, включенного в конструкцию по изобретению, представляет собой промотор оперона glpFKX, PglpF, в других предпочтительных воплощениях промотор представляет собой промотор оперона lac, Plac.

В еще одном аспекте регуляторный элемент для регуляции экспрессии рекомбинантного гена, включенного в конструкцию по изобретению, представляет собой mglBAC; промотор транспортера галактозы/метилгалактозидазы PmglB или их варианты, такие как, но не ограничиваясь ими, PmglB_70UTR последовательности SEQ ID NO: 15 или PmglB_70UTR_SD4 последовательности SEQ ID NO: 16.

В еще одном аспекте регуляторный элемент для регуляции экспрессии рекомбинантного гена, включенного в конструкцию по изобретению, представляет собой gatYZABCD] промотор тагатозо-1,6бисР-альдолазы PgatY или его варианты, такие как, но, не ограничиваясь ими PgatY_U70UTR последовательности SEQ ID NO: 17.

Предпочтительный регуляторный элемент, присутствующий в генетически модифицированной клетке или в конструкции нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, выбирают из группы, состоящей из PgatY_70UTR, PglpF, PglpF_SD1, PglpF_SD10, PglpF_SD2, PglpF_SD3, PglpF_SD4, PglpF_SD5, PglpF_SD6, PglpF_SD7, PglpF_SD8, PglpF_SD9, Plac_16UTR, Plac, PmglB_70UTR и PmglB_70UTR_SD4.

Особенно предпочтительные регуляторные элементы, присутствующие в генетически модифицированной клетке или в конструкции нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, выбирают из группы, состоящей из PglpF и Plac.

Однако любой промотор, обеспечивающий транскрипцию и/или регуляцию уровня транскрипции одной или нескольких рекомбинантных нуклеиновых кислот, кодирующих один или несколько белков (или одну или несколько регуляторных нуклеиновых кислот), которые либо необходимы, либо полезны для достижения оптимального уровня биосинтетического производства одного или нескольких ОГМ в клетке-хозяине, например, белков, участвующих в трансмембранном транспорте ОГМ или предшественника, результат разложения побочных продуктов продукции ОГМ, белков, регулирующих экспрессию генов, и т.д., и позволяющих достичь желаемых эффектов по изобретению, подходят для практического применения изобретения.

Предпочтительно конструкция по настоящему изобретению, включающая ген, связанный с биосинтетическим продуцированием ОГМ, промоторную последовательность ДНК и другие регуляторные последовательности, такие как последовательность сайта связывания рибосомы (например, последовательность Шайна-Дальгарно), экспрессируемая в клетке-хозяине, обеспечивает ОГМ на уровне не менее 0,03 г /OD (оптическая плотность) на 1 л ферментационной среды, содержащей суспензию клеток-хозяев, например, на уровне от около 0,05 г/л/OD до около 0,1 г/л/OD. Для целей изобретения последний уровень продукции ОГМ считается достаточным, а клетка-хозяин, способная продуцировать желаемый уровень ОГМ, считается подходящей клеткой-хозяином, т.е. клетка может быть дополнительно модифицирована для экспрессии белка-переносчика ОГМ, например, Nec, для достижения хотя бы одного из описанных в настоящем документе эффектов, выгодных для производства ОГМ.

Генетически модифицированная клетка или конструкция нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включает последовательность нуклеиновой кислоты, такую как гетерологичный ген, кодирующий предполагаемый белок-переносчик MFS (суперсемейство основных посредников).

- 10 046248

Белок Nec - это транспортный белок MFS, представляющий особый интерес в настоящем изобретении. Таким образом, конструкция нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включает последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичности последовательности с геном, nec, SEQ ID NO: 2.

Последовательность нуклеиновой кислоты, содержащаяся в генетически модифицированной клетке или в конструкции нуклеиновой кислоты, кодирует белок последовательности SEQ ID NO: 1 или его функциональный гомолог, аминокислотная последовательность которого, по меньшей мере, на 80% идентична SEQ ID NO: 1.

Функциональный гомолог белка последовательности SEQ ID NO: 1 может быть получен путем мутагенеза. Функциональный гомолог должен иметь оставшуюся функциональность не менее 50%, такую как 60%, 70%, 80%, 90% или 100% по сравнению с функциональностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. Функциональный гомолог может иметь более высокую функциональность по сравнению с функциональностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. Функциональный гомолог последовательности SEQ ID NO: 1 должен быть способен усиливать продукцию ОГМ генетически модифицированной клетки по изобретению.

Генетически модифицированная клетка (клетка-хозяин или рекомбинантная клетка) может представлять собой, например, бактериальную или дрожжевую клетку. В одном предпочтительном воплощении генетически модифицированная клетка представляет собой бактериальную клетку. Что касается бактериальных клеток-хозяев, то, в принципе ограничений нет; они могут представлять собой эубактерии (грамположительные или грамотрицательные) или архебактерии, если они допускают генетические манипуляции для вставки интересующего гена и их можно культивировать в производственных масштабах. Предпочтительно клетка-хозяин обладает свойством культивирования до высокой плотности клеток. Неограничивающими примерами бактериальных клеток-хозяев, подходящих для рекомбинантного промышленного производства ОГМ согласно изобретению, могут представлять собой Erwinia herbicola (Pantoea agglomerans),Citrobacter freundii, Pantoea citrea, Pectobacterium carotovorum или Xanthomonas campestris. Также могут быть применены бактерии рода Bacillus, в том числе Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus coagulans, Bacillus thermophilus, Bacillus laterosporus, Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacillus pumilus, Bacillus lentus, Bacillus cereus и Bacillus circulans. Аналогично, бактерии родов Lactobacillus and Lactococcus могут быть модифицированы с применением способов по данному изобретению, включая, но не ограничиваясь ими, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus casei, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus jensenii и Lactococcus lactis. Streptococcus thermophiles и Proprionibacterium freudenreichii также представляют собой подходящие виды бактерий для описанного в настоящем документе изобретения. Также часть этого изобретения представляют собой штаммы, модифицированные, как описано в настоящем документе, из родов Enterococcus (например, Enterococcus faecium и Enterococcus thermophiles), Bifidobacterium (например, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis и Bifidobacterium bifidum), Sporolactobacillus spp., Micromomospora spp., Micrococcus spp., Rhodococcus spp. и Pseudomonas (например, Pseudomonas fluorescens и Pseudomonas aeruginosa). Бактерии, обладающие характеристиками, описанными в настоящем документе, культивируют в присутствии лактозы, и олигосахарид, такой как ОГМ, продуцируемый клеткой, выделяют либо из самой бактерии, либо из культурального супернатанта бактерии. В одном предпочтительном воплощении генетически модифицированная клетка по изобретению представляет собой клетку Escherichia coli.

В другом предпочтительном воплощении клетка-хозяин представляет собой дрожжевую клетку, например, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Kluveromyces lactis, Kluveromyces marxianus и т.п.

ОГМ, продуцируемый рекомбинантными клетками по изобретению, могут быть очищены с применением подходящей процедуры, доступной в данной области техники (например, такой, как описан в WO2015188834, WO2017182965 или WO2017152918).

Генетически модифицированные клетки по изобретению могут быть получены с применением стандартных способов в данной области техники, например, описанных в руководствах Sambrook et al., Wilson & Walker, Maniatise et al. и Ausubel et al.

Хозяин, подходящий для продукции ОГМ, например Е. coli, может включать эндогенный ген Ргалактозидазы или экзогенный ген β-галактозидазы, например, Е. coli включает эндогенный ген lacZ (например, номер доступа в GenBank V00296 (GL41901)). Для целей изобретения клетка-хозяин, продуцирующая ОГМ, подвергается генетическим манипуляциям либо для включения любого гена βгалактозидазы, либо для включения гена, который инактивирован. Ген может быть инактивирован путем полной или частичной делеции соответствующей последовательности нуклеиновой кислоты из бактериального генома, или последовательность гена может быть мутирована так, как она транскрибируется, или, если транскрибируется, транскрипт не транслируется, или если транслируется в белок (т.е. βгалактозидазу), то белок не обладает соответствующей ферментативной активностью. Таким образом,

- 11 046248 бактерия, продуцирующая ОГМ, накапливает повышенный внутриклеточный пул лактозы, что полезно для продукции ОГМ.

В некоторых воплощениях сконструированная клетка, например, бактерия, включает дефицитный катаболический путь сиаловой кислоты. Под катаболическим путем сиаловой кислоты подразумевается последовательность реакций, обычно контролируемая и катализируемая ферментами, которая приводит к разложению сиаловой кислоты. Примерный путь катаболизма сиаловой кислоты, описанный в настоящем документе, представляет собой путь Е. coli. В этом пути сиаловая кислота (Neu5Ac; Nацетилнейраминовая кислота) расщепляется ферментами NanA (лиаза N-ацетилнейраминовой кислоты), NanK (N-ацетилманнозаминкиназа) и NanE (N-ацетилманнозамин-б-фосфатэпимераза), все кодируемые из оперона nanATEK-yhcH, и подавляется NanR (http://ecocyc.org/ECOLI). Дефицитный катаболический путь сиаловой кислоты воспроизводится у хозяина Е. coli путем внесения мутации в эндогенные гены nanA (N-ацетилнейраминалиаза) (например, номер доступа в GenBank D00067.1 (GL216588)) и/или nanK (N-ацетилманнозаминкиназа) (например, номер доступа в GenBank (аминокислота) ВАЕ77265.1 (GL85676015)), и/или nanE (N-ацетилманнозамин-б-фосфатэпимераза, GI: 947745, включена сюда посредством отсылки). Необязательно, ген nanT (транспортер N-ацетилнейрамината) также инактивируют или мутируют. Другие промежуточные продукты метаболизма сиаловой кислоты включают: (ManNAc-6P) N-ацетилманнозамин-б-фосфат; (GlcNAc-6-P) N-ацетилглюкозаминил-б-фосфат; (GlcN-6-P) глюкозамин-6-фосфат и (Fruc-6-P) фруктозо-6-фосфат. В некоторых предпочтительных воплощениях, nanA мутирован. В других предпочтительных воплощениях, nanA и nanK мутированы, тогда как nanE остается функциональным. В другом предпочтительном воплощении, nanA и nanE мутированы, тогда как nanK не был мутирован, инактивирован или удален. Мутация представляет собой одно или несколько изменений в последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт гена nanA, nanK, nanE и/или nanT. Например, мутация может представлять собой 1, 2, до 5, до 10, до 25, до 50 или до 100 изменений в последовательности нуклеиновой кислоты. Например, nanA, nanK, nanE и/или nanT гены мутируют путем нулевой мутации. Нулевые мутации, как описано в настоящем документе, включают аминокислотные замены, добавления, делеции или вставки, которые либо вызывают потерю функции фермента (т.е. снижение или отсутствие активности), либо потерю фермента (т.е. отсутствие генного продукта). Под удаленными подразумевают, что кодирующая область удалена полностью или частично, так что не образуется (функциональный) продукт гена. Под инактивацией подразумевается, что кодирующая последовательность была изменена таким образом, что полученный генный продукт будет функционально неактивным или будет кодировать генный продукт с активностью, менее чем на 100%, например, на 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30% или 20% по сравнению с активностью нативного, встречающегося в природе, эндогенного генного продукта. Немутированный ген или белок не отличается от нативной, встречающейся в природе или эндогенной кодирующей последовательности на 1, 2, вплоть до 5, вплоть до 10, вплоть до 20, вплоть до 50, вплоть до 100, вплоть до от 200 или вплоть до 500 или более кодонов или до соответствующей закодированной аминокислотной последовательности.

Кроме того, бактерия (например, Е. coli) также обладает способностью к синтезу сиаловой кислоты. Например, бактерия обладает способностью синтезировать сиаловую кислоту за счет экзогенной UDPGlcNAc 2-эпимеразы (например, neuC из Campylobacter jejuni (GenBank AAK91727.1) или ее эквивалента (например, (GenBank CAR04561.1), синтазы Neu5Ac (например, nauB из С. jejuni (GenBank AAK91726.1) или ее эквивалента (например, синтазы сиаловой кислоты из Flavobacterium limnosediminis, GenBank WP_023580510.1), и/или синтазы CMP-Neu5Ac (например, neuA из С. jejuni (GenBank AAK91728.1) или ее эквивалента (например, СМР-синтазы сиаловой кислоты из Vibrio brasiliensis, GenBank WP_006881452.1).

Получение нейтрального ОГМ, содержащего N-ацетилглюкозаминил, в сконструированных бактериях также известно в данной области техники (смотри, например, Gebus С. et al. (2012) Carbohydrate Research 363 83-90).

Для производства ОГМ, содержащих N-ацетилглюкозаминил, таких как лакто-Ы-триоза 2 (LNT-2), лакто-Ы-тетраоза (LNT), лакто-Н-неотетраоза (LNnT), лакто-Н-фукопентаоза I (LNFP-I), лакто-Nфукопентаоза II (LNFP-II), лакто-М-фукопентаоза III (LNFP-III), лакто-М-фукопентаоза V (LNFP-V), лакTO-N-дифукогексаоза I (LDFH-I), лакто-N-дифукогексаоза II (LDFH-II) и лакто-N-неодифукогексаоза II (LNDFH-III), бактерия включает функциональный ген lacY и дисфункциональный ген lacZ, как описано выше, и он сконструирован так, чтобы включать экзогенный ген UDP-GlcNAc:Gala/e-R бета-3-Nацетилглюкозаминилтрансферазы или его функциональный вариант или фрагмент. Этот экзогенный ген UDP-GlcNAc:Gala/e-R бета-3-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы может быть получен из любого из ряда источников, например, из гена lgtA, описанного в N. meningitides (номер доступа белка в GenBank AAF42258.1) или N. gonorrhoeae (номер доступа белка в GenBank ACF31229.1). Необязательно, дополнительный ген экзогенной гликозилтрансферазы может быть коэкспрессирован в бактерии, включающей экзогенный ген UDP-GlcNAc:Gala/e-R бета-3-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы. Например, ген бета1,4-галактозилтрансферазы коэкспрессируется с геном UDP-GlcNAc:Gala/e-R бета-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы. Этот экзогенный ген бета-1,4-галактозилтрансферазы может быть получен

- 12 046248 из любого источника, например, описанного в N. meningitidis, ген lgtB (номер доступа белка в GenBank AAF42257.1) или из Н. pylori, ген HP0826/galT (номер доступа белка в GenBank NP_207619.1). Необязательно дополнительный ген экзогенной гликозилтрансферазы, коэкспрессируемый в бактерии, включающей экзогенный ген UDP-GlcNAc:Gala/e-R бета-3-Ы-ацетилглюкозаминилтрансферазы, представляет собой ген P-1,3-galactosyltransferase, например, тот, что описан из Е. coli 055:Н7, ген wbgO (номер доступа белка в GenBank WP_000582563.1), или из Н. pylori, ген jhp0563 (номер доступа белка в GenBank AEZ55696.1), или из Streptococcus agalactiae type Ib OI2 ген cpslBJ (номер доступа белка в GenBank AB050723). Раскрытое изобретение также охватывает функциональные варианты и фрагменты любого из ферментов, описанных выше.

Ген N-ацетилглюкозаминилтрансферазы и/или ген галактозилтрансферазы также может быть функционально связан с Pglp и экспрессироваться из соответствующей интегрированной в геном кассеты. В одном воплощении ген, интегрированный в геном, представляет собой ген, кодирующий галактозилтрансферазу, например, ген НР0826, кодирующий фермент GalT из Н. pylori (номер доступа белка в GenBank NP_207619.1); в другом воплощении ген, интегрированный в геном, представляет собой ген, кодирующий бета-1,3-Ы-ацетилглюкозаминилтрансферазу, например, ген lgtA из N. meningitidis (номер доступа белка в GenBank AAF42258.1). В этих воплощениях второй ген, т.е. ген, кодирующий бета-1,3N-ацетилглюкозаминилтрансферазу или галактозилтрансферазу, соответственно, может экспрессироваться либо из интегрированной в геном, либо из переносимой плазмидой кассеты. Второй ген необязательно может экспрессироваться либо под контролем промотора glp или под контролем любого другого промотора, подходящего для системы экспрессии, например, Plac.

Если не указано иное, все технические и научные термины, применяемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в области, к которой относится данное изобретение. Singleton et al. (1994) Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, second edition, John Wiley and Sons (New York) предоставляет специалисту общий словарь многих терминов, применяемых в этом изобретении. Хотя любые способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в настоящем документе, могут быть применены на практике или тестировании настоящего изобретения, описаны предпочтительные способы и материалы. Большую часть номенклатуры и общих лабораторных процедур, необходимых для этого приложения, можно найти в руководствах Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (2012); Wilson K. and Walker J., Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology (2010), Cambridge University Press; или в Maniatis et al., Molecular Cloning A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (2012); или в Ausubel et al., Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sohns (2010). Руководства далее именуют Sambrook et al, Wilson & Walker, Maniatise et al., Ausubel et al., соответственно.

Второй аспект изобретения относится к способу получения одного или нескольких ОГМ, включающему следующие этапы:

(i) обеспечение генетически модифицированной клетки, способной продуцировать ОГМ, причем указанная клетка включает рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок последовательности SEQ ID NO: 1, или ее функциональный гомолог, аминокислотная последовательность которого идентична, по меньшей мере, на 80%, предпочтительно идентична, по меньшей мере, на 85%, более предпочтительно идентична, по меньшей мере, на 90% последовательности SEQ ID NO: 1;

(ii) культивирование клетки (i) в подходящей среде для культивирования клеток, позволяющей продукцию ОГМ и экспрессию последовательности ДНК для продукции белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или ее функционал, аминокислотная последовательность которого идентична, по меньшей мере, на 80%, предпочтительно идентична, по меньшей мере, на 85%, более предпочтительно идентична, по меньшей мере, на 90% последовательности SEQ ID NO: 1;

(iii) сбор ОГМ, полученного на этапе (ii).

Согласно изобретению термин культивирование (culturing) (или культивирование (cultivating) или ведение культуры (cultivation), также называемое ферментация) относится к размножению бактериальных экспрессирующих клеток в контролируемом биореакторе в соответствии со способами, известными в промышленности.

Для получения одного или нескольких ОГМ бактерии, продуцирующие ОГМ, как описано в настоящем документе, культивируют в соответствии с процедурами, известными в данной области техники, в присутствии подходящего источника углерода, например глюкозы, глицерина, лактозы и т.д., и полученный ОГМ собирают из сред культивирования и микробной биомассы, образующейся в процессе культивирования.

После этого ОГМ очищают в соответствии с процедурами, известными в данной области техники, например, такими, как описаны в WO2015188834, WO2017182965 или WO2017152918, и очищенный ОГМ применяют в качестве нутрицевтиков, фармацевтических препаратов или для любых других целей, например, для исследований. Производство ОГМ обычно осуществляется путем культивирования в больших объемах. Термин производство и производственный масштаб в значении изобретения определяет ферментацию с минимальным объемом 5 л культурального бульона. Обычно процесс в произ

- 13 046248 водственном масштабе определяют способностью обрабатывать большие объемы препарата, содержащего ОГМ или представляющий интерес ОГМ, и производить такие количества представляющий интерес белка, которые соответствуют, например, в случае терапевтического соединения или композиции, требованиям для клинических испытаний, а также для предложения на рынке. Помимо большого объема, способ в производственных масштабах, в отличие от простых способов в лабораторных масштабах, таких как культивирование во встряхиваемых колбах, характеризуется применением технической системы биореактора (ферментера), оснащенного устройствами для перемешивания, аэрации, подачи питательных веществ, слежения за параметрами процесса и контроля параметров процесса (рН, температура, давление растворенного кислорода, обратное давление и др.). В значительной степени поведение системы экспрессии в лабораторном масштабе, например, во встряхиваемых колбах, настольных биореакторах или формате глубоких лунок, описанных в примерах настоящего раскрытия, позволяет предсказать поведение этой системы в сложной среде биореактора.

Что касается подходящей среды для культивирования, применяемой в процессе ферментации, ограничений нет. Культуральная среда может быть полуопределенной, то есть содержащей комплексные соединения среды (например, дрожжевой экстракт, соевый пептон, казаминовые кислоты и т.д.), или она может быть химически определенной, без каких-либо комплексных соединений.

Под термином один или несколько ОГМ подразумевают, что производственная ячейка ОГМ может быть способна производить одну структуру ОГМ (первый ОГМ) или несколько структур ОГМ (второй, третий и т.д. ОГМ). В некоторых воплощениях может быть предпочтительной клетка-хозяин, которая продуцирует один ОГМ, в других предпочтительных воплощениях может быть предпочтительной клетка-хозяин, продуцирующая несколько структур ОГМ. Клетки, продуцирующие 2'-FL, 3-FL, 3'-SL, 6'SL или LNT-2 представляют собой неограничивающие примеры клеток-хозяев, продуцирующих ОГМ единственной структуры. Неограничивающие примеры клеток-хозяев, способных продуцировать несколько структур ОГМ, могут представлять собой клетки-продуценты DFL, FSL, LNT, LNnT, LNFP I, LNFP II, LNFP III, LNFP IV, LNFP V, pLNnH, pLNH2.

Термин сбор в контексте изобретения относится к сбору полученных ОГМ после прекращения ферментации. В различных воплощениях это может включать сбор ОГМ, включенных как в биомассу (т.е. клетки-хозяева), так и в среду культивирования, т.е. до/без отделения ферментационного бульона от биомассы. В других воплощениях полученный ОГМ можно собирать отдельно от биомассы и ферментационного бульона, т.е. после отделения /следом за отделением биомассы от среды культивирования (т.е. ферментационного бульона). Отделение клеток от среды может быть осуществлено любым из способов, хорошо известных специалисту в данной области техники, например, любым подходящим типом центрифугирования или фильтрации. Отделение клеток от среды может следовать сразу за сбором ферментационного бульона или осуществляться на более позднем этапе после хранения ферментационного бульона в соответствующих условиях. Извлечение произведенных ОГМ из оставшейся биомассы (или полная ферментация) включает их извлечение из биомассы (клеток-продуцентов). Это можно осуществить любыми подходящими способами в данной области техники, например, обработкой ультразвуком, кипячением, гомогенизацией, ферментативным лизисом с применением лизоцима или замораживанием и измельчением.

После восстановления после ферментации ОГМ доступны для дальнейшей обработки и очистки.

Очистку ОГМ, полученных ферментацией, можно проводить с применением подходящей процедуры, описанной в WO2016095924, WO2015188834, WO2017152918, WO2017182965, US20190119314 (все включены посредством отсылки).

В некоторых воплощениях изобретения клетка-хозяин может продуцировать несколько ОГМ, где один ОГМ представляет собой ОГМ-продукт, а некоторые/все прочие ОГМ представляют собой ОГМпобочный продукт. Как правило, побочные ОГМ представляют собой либо основных предшественников ОГМ, либо продукты дальнейшей модификации основных ОГМ. В некоторых воплощениях может быть желательно производить продукт ОГМ в больших количествах и побочный продукт ОГМ в малых количествах. Клетки и способы получения ОГМ, описанные в настоящем документе, обеспечивают контролируемое производство продукта ОГМ с заданным профилем ОГМ, например, в одном воплощении полученная смесь ОГМ, в которой продукт ОГМ представляет собой доминирующим ОГМ по сравнению с другими ОГМ (т.е. побочными ОГМ) смеси, т.е. ОГМ-продукт производится в большем количестве, чем другие ОГМ-побочные продукты; в других воплощениях клетка, производящая одну и ту же смесь ОГМ, может быть настроена на производство одного или нескольких побочных продуктов ОГМ в большем количестве, чем ОГМ-продукт. Например, при производстве 2'-FL, ОГМ-продукта, часто образуется значительное количество DFL, ОГМ-побочного продукта. С генетически модифицированными клетками по настоящему изобретению уровень DFL в 2'-РЪ-продукте может быть значительно снижен.

Преимущественно изобретение обеспечивает как снижение отношения побочного продукта к продукту, так и увеличение общего выхода продукта (и/или ОГМ в целом). Это, сниженное образование побочных продуктов по сравнению с образованием продукта, способствует повышенному образованию продукта и повышает эффективность как производства, так и процесса извлечения продукта, обеспечивая превосходную технологию производства ОГМ.

- 14 046248

В различных предпочтительных воплощениях могут быть выбраны различные клетки-хозяева, продуцирующие один/оба 2'-FL, 3-FL, 3'-SL, 6'-SL, LNT-2, DFL, FSL, LNT, LNnT, DFL, FSL, LNT, LNnT, LNFP I, LNFP II, LNFP III, LNFP IV, LNFP V, pLNnH, pLNH2, в качестве ОГМ продукта или побочного продукта. В одном предпочтительном воплощении продукт представляет собой 3-FL, а побочный продукт представляет собой DFL. В другом предпочтительном воплощении продукт представляет собой 2'FL, a побочный продукт представляет собой DFL. В другом предпочтительном воплощении продукт представляет собой LNT-2, а побочный продукт представляет собой LNT и LNFP I.

Изобретение также относится к применению генетически модифицированной клетки или конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению для продукции одного или нескольких олигосахаридов, предпочтительно, одного или нескольких олигосахаридов грудного молока. В одном воплощении генетически модифицированную клетку или конструкцию нуклеиновой кислоты по изобретению применяют для получения конкретного ОГМ, выбранного из группы, состоящей из 2'-FL, 3-FL, DLF, LNT, LNT-II, LNnT, LNFP-1, pLNnH and pLNH-II. В предпочтительном воплощении генетически модифицированная клетка или конструкция нуклеиновой кислоты по изобретению используется для получения конкретной ОГМ, выбранной из группы, состоящей из 2'-FL, 3-FL, DLF, LNT, LNT-II, LNnT, pLNnH и pLNH-II.

В особенно предпочтительном воплощении генетически модифицированную клетку или конструкцию нуклеиновой кислоты по изобретению применяют для получения конкретного ОГМ, выбранного из группы, состоящей из 2'-FL, 3-FL, LNT, LNT-II, LNnT и pLNH-II.

Изобретение дополнительно проиллюстрировано приведенными ниже неограничивающими примерами и воплощениями.

Примеры

Материалы и методы.

Если не указано иное, для манипулирования с нуклеиновыми кислотами, трансформации и экспрессии нуклеиновых кислот применяют стандартные методики, векторы, элементы контрольной последовательности и другие элементы системы экспрессии, известные в области молекулярной биологии. Такие стандартные техники, векторы и элементы можно найти, например, в руководствах: Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (1995) (John Wiley & Sons); Sambrook, Fritsch, & Maniatis (eds.), Molecular Cloning (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY); Berger & Kimmel, Methods in Enzymology 152: Guide to Molecular Cloning Techniques (1987) (Academic Press); Bukhari et al. (eds.), DNA Insertion Elements, Plasmids and Episomes (1977) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY); Miller, J.H. Experiments in molecular genetics (1972.) (Cold spring Harbor Laboratory Press, NY)

Штаммы.

Применяемый бактериальный штамм, MDO, был сконструирован из Escherichia coli K12 DH1. Генотип Е. coli K12 DH1 представлял собой: F^-, Т-, gyrA96, recA1, relA1, endA1, thi-1, hsdR17, supE44. Штаммы, примененные в настоящих примерах, описаны в табл. 2.

Таблица 2


DH1	-	7 eridAlrecADedAlnyrA9(}lhi-la/iV'44hsdRl7(i'K me )
MDO	-	E co!i DHI AlacZ. AlacA. AnanKE'JA, AnteLA, AwcaJ. AmdaH
МРА1	2‘-PL	MDO CA -futC
МРА2	MDO CA futC nec
МРАЗ	3-FL	MDO CA futA
МРА4	MDO CA futA nec
МР4002	LNT2	MDO IgtA IgtA
МР4039	MDO IgtA nec
МР4473	LNT	MDO l^tA χιιΙΐΚ
МР4537	MDO -IgtA galTK пел:
МР2789		MDO IgtA galTK futC CA
	LNFP-I
МР4597		MDO χίΑ χιιίΤΚfutC nec

Среда.

Среду для бульона Луриа (LB) готовили с применением порошка бульона LB, Millers (Fisher Scientific), а чашки с агаром LB готовили с применением порошка агара LB, Millers (Fisher Scientific). При необходимости добавляли ампициллин ((100 мкг/мл) или любой подходящий антибиотик) и/или хлорамфеникол (20 мкг/мл).

Базовая минимальная среда имела следующий состав: NaOH (1 г/л), KOH (2,5 г/л), KH₂PO₄ (7 г/л), NH₄H₂PO₄ (7 г/л), лимонная кислота (0,5 г/л), раствор микроэлементов (5 мл/л). Исходный раствор микроэлементов содержал: ZnSO₄-7H₂O 0,82 г/л, лимонную кислоту 20 г/л, MnSO₄-H₂O 0,98 г/л, FeSO₄-7H₂O 3,925 г/л, CuSO₄-5H₂O 0,2 г/л. рН базовой минимальной среды доводили до 7,0 с помощью 5 н NaOH и автоклавировали. Перед инокуляцией в базовую минимальную среду добавляли 1 мМ MgSO₄, 4 мкг/мл тиамина, 0,5% заданного источника углерода (глицерин (Carbosynth)) и при необходимости добавляли

- 15 046248 изопропил-в-Э-тиогалактозид (IPTG) (0,2 мМ). Тиамин, антибиотики и IPTG стерилизовали фильтрованием. Все процентные концентрации для глицерина выражены как объем/объем, а для глюкозы - масса/объем.

Чашки М9, содержащие 2-дезоксигалактозу, имели следующий состав: 15 г/л агара (Fisher Scientific), 2,26 г/л 5х М9 Minimal Salt (Sigma-Aldrich), 2 мМ MgSO₄, 4 мкг/мл тиамина, 0,2% глицерина и 0,2% 2-дезокси-О-галактозы (Carbosynth).

Индикаторные планшеты МакКонки имели следующий состав: 40 г/л агаровая основа МакКонки (BD Difco™) и источник углерода в конечной концентрации 1%.

Культивирование.

Если не указано иное, то штаммы Е. coli размножали в среде Луриа-Бертани (LB), содержащей 0,2% глюкозы, при 37°С при перемешивании. Чашки с агаром инкубировали при 37°С в течение ночи.

Химически компетентные клетки и трансформации.

Е. coli инокулировали из чашек LB в 5 мл LB, содержащего 0,2% глюкозы, при 37°С при встряхивании до OD₆₀₀ ~0,4. 2 мл культуры собирали центрифугированием в течение 25 секунд при 13000 g. Супернатант удаляли, а клеточный осадок ресуспендировали в 600 мкл холодных растворов ТВ (10 мМ PIPES, 15 мМ CaCl₂, 250 мМ KCl). Клетки инкубировали на льду в течение 20 минут с последующим осаждением в течение 15 секунд при 13000 g. Супернатант удаляли, а клеточный осадок ресуспендировали в 100 мкл холодного раствора ТВ. Трансформацию плазмид проводили с применением 100 мкл компетентных клеток и 1-10 нг плазмидной ДНК. Клетки и ДНК инкубировали на льду в течение 20 минут, а затем подвергали тепловому шоку при 42°С в течение 45 секунд. После 2-минутной инкубации на льду добавляли 400 мкл SOC (20 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 0,5 г/л NaCl, 0,186 г/л KCl, 10 мМ MgCl₂, 10 мМ MgSO₄ и 20 мМ глюкозы) и культуру клеток инкубировали при 37°С при встряхивании в течение 1-го часа перед посевом на селективные чашки.

Плазмиду трансформировали в химически компетентные клетки ТОР10 в условиях, рекомендованных поставщиком (ThermoFisher Scientific).

ДНК-технологии.

Плазмидную ДНК из Е. coli выделяли с применением набора QIAprep Spin Miniprep (Qiagen). Хромосомную ДНК из Е. coli выделяли с применением набора QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen). Продукты ПЦР очищали с применением набора QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). Мастер-микс для ПЦР DreamTaq (Thermofisher), мастер-микс для ПЦР с горячим стартом Phusion U (Thermofisher), USER Enzyme (New England Biolab) применяли в соответствии с рекомендациями поставщика. Праймеры были поставлены компанией Eurofins Genomics, Германия. Фрагменты ПЦР и плазмиды были секвенированы компанией Eurofins Genomics. ПЦР колоний проводили с применением DreamTaq PCR Master Mix в термоциклере Т100ТМ (Bio-Rad).

Таблица 3 Олигонуклеотиды, применяемые для амплификации остова плазмиды, промоторных элементов и nec


040	5	АТТА АС ОС U ОС AGGCATCAAATAAAACGAAA GGC	Остов, прямой
068	6	ATGCGCAAAUTGTGAGTTAGCTCACTCATTAG	Р1ас.прямой
079	7	A TTTGCG С A UC АСС А А ТС А АА ТТ СА CGCGG СС	Остов, обратный
0113	8	A GC Т GTT UC СТС СТТ A GGT АС СС AG CTTTTGTTCC С	Р1ас.обратный
0261	9	ATGC GCAAAUGCGGCACGCCTTGC AGATTACG	PglpF.прямой
0262	10	A GC Т GTT UC СТС CTTG GTT A A TG TTTG Т TG Т ATGC G	PdpF.обратный
0741	1 1	AAACAGCUATGCAGAGCTTCACCCCGCC	пес.прямой
0742	12	AGGGTTAAUTTACGCCTGCTCTTTAACACGCAGC	пес.обратны
048	13	С СС A GCGA GA С CTG AC CG С AG АА С	gillK. прямой
049	14	С СС С AGT СС АТС AGС GTGАС Т А С С	щйК.обратный

- 16 046248

Таблица 4

Г етерологичные белки, эекспрессируемые в ОГМ-продуцирующих клетках


futC	Helicobacter pylori 26695	EF452503	алпфа-i .З-фукопптране^храш
IgtA	.Veiss ei io in en ii i^itidis 6534-12 '	CPOOO381	oemu-l Д-.V- apem i n. пока ήι. itnttn. t шраме ферм ча
^ίΤ	Helicobacter prion 26695	AE000511	iiemct-l ,4-.’алакп1о--ш.1трансферача
galTK	Helicobacter pylon 43504	гомологичен BD1S2O26	пета-1.3-.’алакто-щлшранефера'ш
	Rosen beryicllа л ectarea	WP 092672081.1	М F S-тра нс [ 1 ордер

Таблица 5

Элементы синтетической ДНК, примененные для экспрессии nec

PtfpF

GCGGCACGCCTTGC.AGATTACGGTTTGCCA САСТТТТС ATCCTTCTCCTGGTGAC АТААТС С АС АТ С АА TCG А АА ATGTT А АТ.АА ATTTGT TGC G CGAA TGA ТСТАА САААС ATGCAТСАТ GTACAATCAGATGGAATAAATGGCGCGATA A CGCTC АТТТТ ATGA С GA GG СА С АС АС АТТ TTAAGTTCGATATTTCTCGTTTTTGCTCGTT AACGATAAGTTTACAGCATGCCTACAAGCA TCGTGG AGGTCC GTGA С ТТТС AC GC АТАСА А С AAA С АТТ АА СС A AG GAGG АА AC A GC Т

Элемент экспрессии ДНК из 300

HYK) ICO гидов

ATGCGCAAATTGTGAGTTAGCTCАСТСАТТ A GG СА С СС С AG GC Т ТТА С А CTTTATG СТТС С GGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGG А ТА АС А АТТТ СА СА С AG GAAA CAG СТA TG А CCATGATTACGCCA AGC GCGCA АТТААССС ТС АС ТА A AG GG А АСА А АА GC TGG GT А СС ТА AGGAGGAAACAGCT

A TG С AG AGCTT С АССС CGC С GG CG С CG A A G GGTGGC AACCCGGTGTTCATGATGTTTATG CTGGTGACCTTCTTTGTGAGCATTGCGGGTG CGCTGCAGGCGCCGACCCTGAGCCTGTACC TGAGCCAAGAGCTGGC GGCGAAACCGTTC А TGG TGGGC C TG TTC TTTA С С A T TA AC G CG GT ТАС CGGT АТС ATT АТС AG CTTT ATCC TGGCG A AG CG TAGCGAC CGT AAAGG T GA CC GTC GT C GTC TG C TG ATG T TC TGC TGC GC GATGGCG A TC G CG A A C GC GC TG AT GTTCG CG TT TG TTC G TC A GTACG TG GTTC TG ATTA CC CTG GG C CT G АТС CTG AG CG CG C TG A CC AG C GTGG TT AT G CC GCA AC TGTTCG C GCT GG CG CGTGAGTA TGC G GA CC G T A CCG GTC GTG AA GTGG TT AT G TTTAG CAGCG TGAT GCGTA CC C AA ATGAG CCTGGC GTGGGTTATTGGCC CGCCG АТС AG

Элемент экспрессии ДНК из 195 нуклеотидов

ДНК.

кодирующая предполагаемый транспортер MFS

WP_092672081.1 (Nec)

- 17 046248

CTTCGCGCTGGC GCTGAACT.ACGGTTTTATT АССС TGT.ATCTGGTGGCTGCGGC 'GC TGTTTC TGCTGA GC С TG АТТС TG А ТС А AG АС С А ССС TGCCGAGCGTTCCGCGTCTGT.ATCCGGCGG A AGAC CTGGCGAAGAGC GCG GC GA G CGGT TGGAAACGTACCGATGTGC GTTTCCTGTTTG CGGCGAGCGTGCTGATGTGGGTTTGCAACC TGA TGTA СА ТТА TCG ATA TG С CGCTGTА Т АТ С AGCAAAAGCC TGGGT.ATGCCGGAGAGC ТТ CGC G GG TG ТТС TG ATGG GC AC CGC G GCGG G TC TG GA ААТТС CGGTGA TG C TG C TG GC GGG CTACCTGGCGAAGCGTGTTGGTAAACGTCC G CTG GTG ATTG TTGC GGCG G TG TGC GG C CT G GC GTTC TA TCCGG C GA TG C TG G TTTT TC AC CAGCAAACCGGTCTGCTGATTATCCAGC TG CT GA AC GCG GTGTTC ATT GG CA TCG T GGCG G GTC TG GTTATG CTG TGG TTTC AA G ACC TG ATGCCGGGTAAAGCGGGTGCGGCGACCAC CCTGTTC ACC.AACAGCGTTAGC ACC GGC AT G.ATC TTTGCGGGCCTGTGCCAGGGTCTGCT G AGCG АТС TGC TGG GTC ACCA A GCGAT TT A CGTG CTG GC GA CCGTGC TGATGGTTATC GC G CTG CTG CTGC TGC TGC G TG TTA A A G AGCA GGCGTAA

Конструирование плазмид.

Были синтезированы плазмидные скелеты, содержащие два эндонуклеазных сайта I-SceI, разделенных двумя фрагментами ДНК, приспособленными для гомологичной рекомбинации в геном Е. coli, и последовательностью терминатора транскрипции Т1. Например, в одной плазмидной основе был синтезирован оперон gal (необходимый для гомологичной рекомбинации в galK) и последовательность терминатора транскрипции Т1 (pUC57::gal) (GeneScript). Последовательности ДНК, примененные для гомологичной рекомбинации в гал-опероне, охватывают пары оснований 3.628.621-3.628.720 и 3.627.5723.627.671 в последовательности Escherichia coli K-12 MG155, полный геном GenBank: ID: CP014225.1. Вставка путем гомологичной рекомбинации привела бы к делеции 949 пар оснований galK и фенотипа galK-. Подобным образом могут быть синтезированы скелеты на основе pUC57 (GeneScript) или любого другого подходящего вектора, содержащего два сайта эндонуклеазы I-Scel, разделенных двумя фрагментами ДНК, приспособленными для гомологичной рекомбинации в геном Е. coli, и последовательностью терминатора транскрипции Т1. Для конструирования праймеров и амплификации специфических последовательностей ДНК хромосомной ДНК Escherichia coli K-12 DH1 применяли стандартные методики, хорошо известные в области молекулярной биологии. Такие стандартные приемы, векторы и элементы можно найти, например, в руководствах: Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (1995) (John Wiley & Sons); Sambrook, Fritsch, & Maniatis (eds.), Molecular Cloning (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY); Berger & Kimmel, Methods in Enzymology 152: Guide to Molecular Cloning Techniques (1987) (Academic Press); Bukhari et al. (eds.).

Хромосомную ДНК, полученную из Е. coli DH1, применяли для амплификации фрагмента ДНК размером 300 п.н., содержащего промотор PglpF, с применением олигонуклеотидов O261 и O262, и фрагмента ДНК длиной 195 п.н., содержащего Plac, с применением олигонуклеотидов O68 и O113 (табл. 3).

Фрагмент ДНК длиной 1.185 п.н., содержащий кодон-оптимизированную версию гена nec, происходящего из Rosenbergiella nectarea синтезировали с помощью GeneScript (табл. 5). Ген nec амплифицировали методом ПЦР с применением олигонуклеотидов O741 и O742.

Все ПЦР-фрагменты (основы плазмиды, элементы, содержащие промотор, и ген nec) очищали и собирали основы плазмиды, элементы промотора (PglpF или Plac) и фрагмент ДНК, содержащий nec. Плазмиды клонировали с помощью стандартного клонирования USER. Клонирование в любой подходящей плазмиде может быть осуществлено с помощью любых стандартных способов клонирования ДНК. Плазмиды трансформировали в клетки ТОР10 и отбирали на чашках LB, содержащих 100 мкг/мл ампициллина (или любого подходящего антибиотика) и 0,2% глюкозы. Сконструированные плазмиды очищали, а последовательность промотора и 5'-конец гена nec подтверждали секвенированием ДНК (MWG Eurofins Genomics). Таким образом конструировали генетическую кассету, содержавшую любой представляющий интерес промотор, связанный с геном nec.

- 18 046248

Таблица 6

Примеры хелперных и донорных плазмид, применяемых для конструирования штаммов


pACBSR	Para-i-Rcel-/. Red, pl5.4 on. aun^r	cam
pUC57	pMB!. Mu	Bia
pUC57:	pl‘C5 7::%alTK' / ΤΙ-χαΙΚΜ'	Bia

Конструирование штаммов.

Применяемый бактериальный штамм, MDO, был сконструирован из Escherichia coli K-12 DHL Генотип Е. coli K-12 DH1 представляет собой: F^-, Ϊ-, gyrA96, recA1, relA1, endA1, thi-1, hsdR17, supE44. В дополнение к генотипу Е. coli K-12 DH1 MDO имеет следующие модификации: lacZ: делеция, размером 1,5 т.п.н., lacA: делеция, размером 0,5 т.п.н., nanKETA: делеция, размером 3,3 т.п.н., melA: делеция, размером 0,9 т.п.н., wcaJ: делеция, размером 0,5 т.п.н., mdoH: делеция, размером 0,5 т.п.н., и вставка промотора Plac выше гена gmd.

Вставку кассеты экспрессии, содержавшей промотор, связанный с геном nec и последовательностью терминатора транскрипции Т1, осуществляли с помощью Gene Gorging, по существу, как описано Herring et al. (Herring, C.D., Glasner, J.D. and Blattner, F.R. (2003). 311). 153-163). Вкратце, донорную плазмиду и хелперную плазмиду ко-трансформировали в MDO и отбирали на чашках с LB, содержавших 0,2% глюкозы, ампициллин (100 мкг/мл) или канамицин (50 мг/мл) и хлорамфеникол (20 мкг/мл). Одиночную колонию инокулировали в 1 мл LB, содержащего хлорамфеникол (20 мкг/мл) и 10 мкл 20% Lарабинозы, и инкубировали при 37°С при встряхивании в течение 7-8 ч. Для интеграции в локусы galK клеток Е. coli затем высевали на чашки M9-DOG и инкубировали при 37°С в течение 48 ч. Отдельные колонии, сформированные на чашках MM-DOG, повторно высевали штрихом на чашки с LB, содержавшие 0,2% глюкозы, и инкубировали в течение 24 ч при 37°С. Ожидалось, что колонии, которые выглядили белыми на чашках с агаром MacConkey-галактоза и были чувствительны как к ампициллину, так и к хлорамфениколу, потеряли донорную и вспомогательную плазмиду и содержали вставку в локусах galK. Вставки в сайт galK идентифицировали с помощью ПЦР колоний с применением праймеров 048 (SEQ ID NO: 13) и 049 (SEQ ID NO: 14), а вставленную ДНК проверяли секвенированием (Eurofins Genomics, Германия).

Встраивание генетических кассет в другие локусы хромосомной ДНК Е. coli осуществляли аналогичным образом с применением различных маркерных генов селекции.

Анализ в глубоких лунках.

Одиночную колонию из LB-чашки предварительно культивировали в 1 мл базовой минимальной среды, содержащей 5 г/л глюкозы, 1 М MgSO₄ и 4 мг/л тиамина, в 10 мл 24-луночном планшете с глубокими лунками (Axygen). Перед культивированием планшет запечатывали гидрофобной газопроницаемой самоклеющейся пленкой (Axygen) и инкубировали в течение 24 ч при 34°С при встряхивании при 700 об/мин на орбитальном шейкере (Edmund Buhler GmbH). Плотность клеток культуры контролировали при 600 нм на спектрофотометре S-20 (Воесо, Германия). 40 мкл ночной культуры применяли для инокуляции в 2 мл базовой минимальной среды, содержавшей 0,1 г/л глюкозы, 5 г/л лактозы, 20 г/л сахарозы, 1 М MgSO₄, 4 мг/л тиамина и 0,25 мг/л SUH (Sigma). При необходимости добавляли IPTG. Планшеты с глубокими лунками запечатывали самоклеющейся пленкой и инкубировали в течение 48 или 72 ч при 28°С с орбитальным встряхиванием при 700 об/мин. После инкубации измеряли OD600, планшет накрывали герметизирующей лентой для нагревания (Saveen Werner) и инкубировали в термомиксере в течение 1 ч при 100°С при встряхивании при 400 об/мин.

Для анализа общих образцов клеточный лизат, приготовленный кипячением, осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 4700 об/мин. Концентрацию ОГМ в супернатанте определяли с помощью HPLC или HPAC.

После первоначального центрифугирования планшета с глубокими лунками в течение 10 мин при 4700 об/мин образцы надосадочной жидкости сохраняли для аналитических измерений. Для анализа клеточного осадка оставшийся супернатант выбрасывали, а клетки промывали 2 мл холодного PBS. После этой стадии промывки и повторного центрифугирования осадок повторно суспендировали в 500 мл MQ воды и весь планшет с глубокими лунками кипятили в термомиксере в течение 1 ч при встряхивании со скоростью 400 об/мин. Лизат клеток, приготовленный кипячением, осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 4700 об/мин. Концентрацию НМО в супернатанте определяли с помощью HPLC или HPAC.

Результаты.

Пример 1. Конструирование Escherichia coli, экспрессирующих ген nec, для продукции 2'-FL.

Штаммы Escherichia coli K-12 (DH1) MDO можно изменять для экспрессии представляющих интерес гетерологичных генов. Например, штамм МРА1 представляет собой штамм-продуцент 2'-FL со сверхэкспрессией гена альфа-1,2-фукозилтрансферазы, futC, и генов колановой кислоты (gmd-fcI-gmmwcaI-cpsB-cpsG). Вставка экспрессионной кассеты, содержащей промоторный элемент (PglpF), связанный с геном nec, в хромосомную ДНК МРА2 приводила к: i) относительно более высоким титрам 2'-FL

-

Claims

(фиг. 1А), ii) более низкому количеству 2'-FL в фракция клеток и более высокое количество 2'_FL в среде (фиг. 1B), iii) относительно более низкому отношению DFL к 2'-FL (фиг. 1С) и iv) относительно более низкой оптической плотности при измерении плотности клеток при 600 нм (фиг. 1D).

Пример 2. Конструирование Escherichia coli, экспрессирующих ген nec, для продукции 3-FL.

Штаммы Escherichia coli K-12 (DH1) MDO можно изменять для экспрессии представляющих интерес гетерологичных генов. Например, штамм МРА3 представляет собой штамм-продуцент 3-FL со сверхэкспрессией гена альфа-1,3-фукозилтрансферазы, futA и генов колановой кислоты (gmd-fcI-gmmwcaI-cpsB-cpsG). Вставка экспрессионной кассеты, содержащей промоторный элемент (Plac), связанный с геном nec в единственной копии, в основной штамм МРА3 (см. штамм МРА4), привела к i) относительно более высоким количествам 3-FL во фракции среды и ii) относительному снижению количествам 3FL, обнаруживаемым внутри клеток.

Пример 3. Конструирование Escherichia coli, экспрессирующих ген nec, для продукции LNT2.

Штаммы Escherichia coli K-12 (DH1) MDO можно изменять для экспрессии представляющих интерес гетерологичных генов. Например, штамм МР4002 представляет собой штамм-продуцент LNT2 с оптимальной сверхэкспрессией гена бета-1,3-Н-ацетилглюкозаминилтрансферазы, igtA (табл. 4).

Анализ всех образцов (фиг. 3) показал, что титр LNT2 может быть заметно улучшен, если экспрессионную кассету, содержащую промоторный элемент (PglpF), связанный с геном nec, интегрируют в хромосомную ДНК штамма МР4002 для создания штамма МР4039 (табл. 2). Интересно, что внеклеточная фракция LNT2 также была намного больше у штамма МР4039, чем у штамма МР4002, факт, который также проявляется в более низких уровнях трисахаридов, которые обнаруживают во фракции осадка штамма МР4039, экспрессирующего nec, по сравнению с соответствующими уровнями в штамме МР4002, не экспрессирующем транспортер (фиг. 3).

Пример 4. Конструирование Escherichia coli для продукции LNT с применением гена nec.

Штаммы Escherichia coli K-12 (DH1) MDO можно изменять для экспрессии представляющих интерес гетерологичных генов. Например, штамм МР4473 представляет собой штамм-продуцент LNT со сверхэкспрессией гена бета-1,3-№ацетилглюкозаминилтрансферазы, IgtA, и гена бета-1,3галактозилтрансферазы, galTK (табл. 4).

Вставка экспрессионной кассеты, содержащей промоторный элемент (PglpF), связанный с геном nec, в хромосомную ДНК штамма МР4473, генерирующего штамм МР4537 (табл. 2), приводила к: i) увеличению общего титра LNT более чем в 2 раза, ii) умеренному увеличению общей концентрации LNT2 и iii) более чем в 2 раза более высокому общему образованию pLNH2 (фиг. 4).

Концентрация LNT в фракции супернатантов культур штамма МР4537 повышена была в 2 раза по сравнению с таковой, измеренной в среде МР4473 (фиг. 4). Хотя можно наблюдать ограниченный Necопосредованный экспорт LNT2, внеклеточная фракция LNT2 у штамма МР4537 была лишь немного выше, чем у штамма МР4473. Явление транспорта LNT2 происходит предположительно медленнее, чем Nec-опосредованный экспорт LNT. Интересно, что, несмотря на значительное увеличение общего образования pLNH2 в клетках, экспрессирующих транспортер, pLNH2 обнаруживают исключительно в осадке клеток штамма МР4537 (фиг. 4).

Пример 5. Конструирование Escherichia coli для получения LNFP-I с применением гена nec.

Штаммы Escherichia coli K-12 (DH1) MDO можно изменять для экспрессии представляющих интерес гетерологичных генов. Например, штамм МР2789 представляет собой штамм-продуцент LNFP-I со сверхэкспрессией гена бета-1,3-Н-ацетилглюкозаминилтрансферазы, lgtA, гена бета-1,3-галактозилтрансферазы, galTK, гена альфа-1,2-фукозилтрансферазы, futC и нативных генов колановой кислоты (gmd-fcI-gmm-wcaI-cpsB-cpsG) (табл. 4). Введение экспрессионной кассеты, содержащей промоторный элемент (PglpF), связанный с геном nec, в хромосомную ДНК штамма МР2789 для получения штамма МР4597 (табл. 2), приводило к: i) сходным титрам LNFP-I, ii) более чем 2-кратному увеличению общего титра 2'-FL и iii) заметно более высокой общей сумме HMO (2'-FL, LNFP-I и LNT) (фиг. 5). Представленные в настоящем документе данные показывают, что 2'-FL, а не LNFP-I и LNT, эффективно транспортируются из клеток, экспрессирующих переносчик Nec, и, таким образом, образование 2'-FL и последующий экспорт благоприятны в nec-экспрессирующих клетках, продуцирующих LNFP-I.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Генетически модифицированная клетка, способная продуцировать один или несколько олигосахаридов грудного молока (ОГМ), где указанная клетка включает рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок-транспортер суперсемейства major facilitator superfamily (MFS) с последовательностью SEQ ID NO: 1 или его функциональный гомолог, аминокислотная последовательность которого идентична по меньшей мере на 85% последовательности SEQ ID NO: 1.
2. Генетически модифицированная клетка по п.1, где олигосахарид выбирают из 2'-фукозиллактозы (2'-FL), 3-фукозиллактозы (3-FL), дифукозиллактозы (DFL), 3'-сиалиллактозы (3'-SL), 6'-сиалиллактозы (6'-SL), лакто-Н-триозы-2 (LNT-2), лакто-Ы-тетраозы (LNT), лакто-Ы-фукопентаозы I (LNFP I), лакто-Nфукопентаозы II (LNFP II), лакто-К-фукопентаозы III (LNFP III), лакто-К-фукопентаозы IV (LNFP IV) и лакто-К-фукопентаозы V (LNFP V) и/или пара-лакто-К-неогексаозы (pLNnH).

- 20 046248
3. Генетически модифицированная клетка по любому из предшествующих пунктов, где генетически модифицированная клетка представляет собой Escherichia coli.
4. Генетически модифицированная клетка по любому из предшествующих пунктов, где генетически модифицированная клетка дополнительно содержит по меньшей мере одну рекомбинантную нуклеиновую кислоту, которая кодирует функциональный фермент с гликозилтрансферазной активностью, выбранный из группы, состоящей из альфа-1,2-фукозилтрансферазы, альфа-1,3-фукозилтрансферазы, альфа-1,3/4-фукозилтрансферазы, альфа-1,4-фукозилтрансферазы, альфа-2,3-сиалилтрансферазы, альфа-2,6сиалилтрансферазы, бета- 1,3-Ы-ацетилглюкозаминилтрансферазы, бета-1,6-Ы-ацетилглюкозаминилтрансферазы, бета-1,3-галактозилтрансферазы и бета-1,4-галактозилтрансферазы.
5. Генетически модифицированная клетка по любому из предшествующих пунктов, где клетка дополнительно включает последовательность рекомбинантной ДНК, включающую регуляторный элемент для регуляции экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты.
6. Генетически модифицированная клетка по п.5, где регуляторный элемент для регуляции экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты представляет собой элемент экспрессии, выбранный из lacпромотора или glp-промотора.
7. Конструкция нуклеиновой кислоты, включающая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок-транспортер суперсемейства major facilitator superfamily (MFS) с последовательностью SEQ ID NO: 1 или его функциональный гомолог, имеющая более чем 85% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок с последовательностью SEQ ID NO: 1, имеет по меньшей мере 85% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 2, в котором конструкция дополнительно включает последовательность нуклеиновой кислоты, включающую регуляторный элемент.
8. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.7, где регуляторный элемент регулирует экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 85% идентичности последовательности с SEQ ID NO:2.
9. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.7 или 8, где регуляторный элемент для регуляции экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты представляет собой элемент экспрессии, выбранный из lac-промотора или glp-промотора.
10. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.7 или 8, где конструкция нуклеиновой кислоты является частью векторной ДНК или кассеты/картриджа экспрессии, интегрированной в геном клетки-хозяина.
11. Способ получения одного или нескольких олигосахаридов, включающий стадии: (i) обеспечения генетически модифицированной клетки, способной продуцировать ОГМ, по любому из пп.1-6; (ii) культивирование клетки в соответствии с (i) в подходящей среде для культивирования клеток для экспрессии указанной рекомбинантной нуклеиновой кислоты; (iii) сбор одного или нескольких ОГМ, полученных на этапе (ii).
12. Способ по п.11, где полученный ОГМ собирают из среды культивирования и микробной биомассы, образующейся в процессе культивирования.
13. Применение генетически модифицированной клетки по любому из пп.1-6 или конструкции нуклеиновой кислоты по любому из пп.7-10 для получения одного или нескольких олигосахаридов грудного молока (ОГМ).
14. Применение по п.13, где ОГМ выбран из группы, состоящей из 2'-FL, 3-FL, DLF, LNT, LNT-II, LNnT, LNFP-I, pLNnH и pLNH-II.
15. Применение по п.14, где ОГМ выбран из группы, состоящей из 2'-FL, 3-FL, DFL, LNT, LNT-II, LNnT, pLNnH и pLNH-II.
16. Применение по любому из пп.14 или 15, где ОГМ выбран из группы, состоящей из 2'-FL, 3-FL, LNT, LNT-II, LNnT и pLNH-II.

-