EA046193B1

EA046193B1 - Гетеротандемный бициклический пептидный комплекс

Info

Publication number: EA046193B1
Application number: EA202290417
Authority: EA
Inventors: Кевин Макдоннелл; Пунит Упадхиайа; Джоанна Лехденрента; Джемма Мадд
Original assignee: Байсиклтэкс Лимитед
Priority date: 2019-07-30
Filing date: 2020-07-30
Publication date: 2024-02-15

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к гетеротандемному бициклическому пептидному комплексу, который включает первый пептидный лиганд, который связывается с нектин-4, конъюгированный через линкер с двумя вторыми пептидными лигандами, которые связываются с CD137. Изобретение также относится к применению указанных гетеротандемных бициклических пептидных комплексов для предотвращения, подавления или лечения рака.

Уровень техники

Циклические пептиды могут связываться с высокой аффинностью и специфичностью с белкамимишенями, и вследствие этого они представляют собой перспективный класс молекул для разработки терапевтических средств. В действительности несколько циклических пептидов уже успешно используются в клинической практике, например антибактериальный пептид ванкомицин, иммунодепрессант циклоспорин или противораковый препарат октреотид (Driggers et al. (2008), Nat. Rev. Drug. Discov., 7 (7), 608-24). Высокая способность к связыванию обусловлена относительно большой поверхностью взаимодействия, образующейся между пептидом и мишенью, а также пониженной конформационной гибкостью циклических структур. Обычно макроциклы связываются с поверхностями площадью несколько сотен квадратных ангстрем, как, например циклический пептидный антагонист CXCR4-CVX15 (400 A²; Wu et al. (2007), Science, 330, 1066-71), циклический пептид с мотивом Arg-Gly-Asp, связывающийся с интегрином aVb3 (355 A²) (Xiong et al. (2002), Science, 296 (5565), 151-5) или циклический пептидный ингибитор упаин-1, связывающийся с активатором плазминогена урокиназного типа (603 A²; Zhao et al. (2007), J. Struct. Biol., 160 (1), 1-10).

Вследствие своей циклической конфигурации пептидные макроциклы являются менее гибкими, чем линейные пептиды, что приводит к меньшей потере энтропии при связывании с мишенями и обуславливает более высокую аффинность связывания. Пониженная гибкость также приводит к блокированию мишень-специфичных конформаций, повышая специфичность связывания по сравнению с линейными пептидами. Этот эффект был продемонстрирован на высокоактивном и селективном ингибиторе матриксной металлопротеиназы-8 (ММР-8), который терял свою селективность относительно других ММР при раскрытии его кольца (Cherney et al. (1998), J. Med. Chem., 41 (11), 1749-51). Достигаемая за счет макроциклизации высокая способность к связыванию еще более выражена у полициклических пептидов, имеющих более одного пептидного кольца, как, например, у ванкомицина, низина и актиномицина.

Ранее различные группы исследователей проводили связывание полипептидов с остатками цистеина с синтетической молекулярной структурой (Kemp and McNamara (1985), J. Org. Chem; Timmerman et al. (2005), ChemBioChem). Meloen с соавторами использовали трис(бромметил)бензол и родственные молекулы для быстрой и количественной циклизации множества пептидных петель на синтетических каркасах для структурной имитации поверхности белков (Timmerman et al. (2005), ChemBioChem). Способы получения перспективных лекарственных соединений, в которых указанные соединения получают путем связывания цистеинсодержащих полипептидов с молекулярным каркасом, таким как, например, 1,1',1-(1,3,5-триазинан-1,3,5-триил)трипроп-2-ен-1-он (ТАТА), раскрыты в патентных документах WO 2019/122860 и WO 2019/122863.

Для создания и скрининга больших библиотек бициклических пептидов на связывание с представляющими интерес мишенями были разработаны комбинаторные подходы на основе фагового дисплея (Heinis et al. (2009), Nat. Chem. Biol., 5 (7), 502-7 и патентный документ WO 2009/098450). Вкратце комбинаторные библиотеки линейных пептидов, содержащих три остатка цистеина и две области из шести случайно выбранных аминокислот (Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)6-Cys), представляли на фаге и подвергали циклизации путем ковалентного связывания боковых цепей цистеина с малой молекулой (трис(бромметил)бензолом).

Сущность изобретения

Согласно первому аспекту изобретения, предлагается гетеротандемный бициклический пептидный комплекс, включающий (a) первый пептидный лиганд, который связывается с нектин-4 и который имеет последовательность C₁P[1Nal][dD]C₁₁M[HArg]DWSTP[HyP]WC₁₁₁ (SEQ ID NO: 1; BCY8116), конъюгированный через линкер N-(кислота-PEGз)-N-бис(PEGз-азид)линкер с (b) двумя вторыми пептидными лигандами, которые связываются CD137, оба из которых имеют последовательность Ac-C₁[tBuAla]PE[D-Lys(PYA)]PYC₁₁FADPY[Nle]C₁₁₁-A (SEQ ID NO: 2; BCY8928), где каждый из указанных пептидных лигандов включает полипептид, содержащий по меньшей мере три реакционно-способных группы, разделенных по меньшей мере двумя петлевыми последовательностями, и молекулярный каркас, который представляет собой 1,1',1-(1,3,5-триазинан-1,3,5триил)трипроп-2-ен-1-он (ТАТА) и который образует ковалентные связи с реакционно-способными цистеиновыми группами полипептида, вследствие чего на молекулярном каркасе образуются две полипептидных петли, где Ас представляет ацетил, HArg представляет гомоаргинин, НуР представляет транс-4-гидроксиL-пролин, 1Nal представляет 1-нафтилаланин, tBuAla представляет третбутил-аланин, PYA представляет 4-пентиноевую кислоту и Nle представляет норлейцин.

- 1 046193

Согласно дополнительному аспекту изобретения, предлагается фармацевтическая композиция, включающая указанный в изобретении гетеротандемный бициклический пептидный комплекс в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами.

Согласно дополнительному аспекту изобретения предлагается фармацевтическая композиция, включающая указанный в изобретении гетеротандемный бициклический пептидный комплекс для применения с целью предотвращения, подавления или лечения рака.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1А показан анализ гетеротандемного бициклического пептидного комплекса нектин4/CD137 путем проведения анализа репортерного гена люциферазы на CD137 фирмы Promega в присутствии клеток Н292, экспрессирующих нектин-4. BCY11617 представляет собой гетеротандемный бициклический пептидный комплекс, который связывается с нектин-4 с той же аффинностью, что и BCY11863, но не связывается с CD137. На фиг. 1В показаны данные по ЕС5₀ (нМ) для BCY11863, полученные анализом репортерного гена люциферазы на CD137 фирмы Promega в совместной культуре с другими клеточными линиями, которые экспрессируют эндогенно нектин-4 или которые сконструированы для сверхэкспрессирования нектин-4.

На фиг. 2 показаны гетеротандемные бициклические пептидные комплексы нектин-4/CD137 индуцируют секрецию цитокинов IFN-γ (фиг. 2А) и IL-2 (фиг. 2В) в анализе совместной культуры РВМС-4Т1. Клетки 4Т1 конструировали для экспрессии нектин-4. BCY11617 представляет собой гетеротандемный бициклический пептидный комплекс, который связывается с нектин-4 с той же аффинностью, что и BCY11863, но не связывается с CD137. На фиг. 2С приведены данные по ЕС5₀ (нМ) для BCY11863, полученные анализом секреции цитокина мононуклеарными клетками периферической крови (РВМС) человека от многих доноров и линиями опухолевых клеток.

На фиг. 3 показаны фармакокинетические данные, полученные при внутривенном введении гетеротандемного бициклического пептидного комплекса BCY11863 крысам линии SD и яванским макакам (супо) в дозе 2 мг/кг (n=3) и 1 мг/кг (n=2) соответственно.

На фиг. 4 показана противоопухолевая активность BCY11863 в отношении опухоли МС38#13 в модели сингенной нектин-4 сверхэкспрессирующей опухоли МС38 (МС38#13). Объемы опухолей в процессе лечения и после лечения с помощью BCY11863. Число мышей с полным ответом (CR) на день D69 указано в скобках. QD: ежедневное дозирование; Q3D: дозирование каждые три дня; ip: интраперитонеальное введение.

На фиг. 5 показано, что лечение с помощью BCY11863 приводит к появлению иммунологической памяти в модели нектин-4 сверхэкспрессирующей опухоли МС38. Объемы опухолей МС38#13 после инокуляции наивным мышам C57BL/6J-hCD137 или мышам, которые имели полные ответы (CR) на лечение с помощью BCY11863. Следует отметить, что ни у одной из мышей CR не появлялись опухоли к концу периода наблюдения (22 дня).

На фиг. 6 BCY11863 демонстрирует противоопухолевую активность в модели сингенной нектин-4 сверхэкспрессирующей опухоли СТ26 (СТ26#7). Объемы опухолей СТ26#7 в процессе лечения с помощью BCY11863. Q3D: дозирование каждые три дня; ip: интраперитонеальное введение.

На фиг. 7 показано, как суммарное число Т-клеток и CD8+ Т-клеток увеличивается в ткани опухоли СТ26#7 через 1 ч после последнего (6-го) Q3D дозирования BCY11863. Анализ (A) суммарного числа Т-клеток, CD8+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток, регуляторных Т-клеток и (B) отношения CD8+ Т-клетки/регуляторные Т-клетки в ткани опухоли СТ26#7 через 1 ч после последнего Q3D дозирования BCY11863.

На фиг. 8 показаны фармакокинетические профили BCY11863 в плазме и ткани животных, несущих сингенную опухоль СТ26#7, после одноразового внутривенного (iv) введения 5 мг/кг BCY11863.

На фиг. 9 показаны кривые зависимости концентрации BCY11863 в плазме от времени при введении интраперитонеальной дозы 15 мг/кг мышам CD-1 (n=3) и конечные периоды полувыведения BCY118633.

На фиг. 10 показаны исследования методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) связывания BCY11863 с иммобилизированными (А) нектин-4 и (В) CD137. Исследования методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) двойного связывания путем иммобилизирования (С) CD137 и (D) нектин-4 на сенсорном чипе SPR с последующим захватом BCY11863. Аффинность связанного BCY11863 к растворимому человеческому нектин-4 (С) или CD137 (D) измеряют путем полива растворимого рецептора на поверхность чипа при различных концентрациях. (Е) Связывание BCY13582 (биотинилированного BCY11863), иммобилизированного на покрытой стрептавидином поверхности SPR чипа, с растворимым человеческим CD137.

На фиг. 11 показана технология клеточных микрочипов фирмы Retrogenix, используемая для изучения неспецифических нецелевых взаимодействий BCY13582 (биотинилированного BCY11863). На фигуре приведены данные скрининга, которые показывают, что 1 мкМ BCY13582, добавленный на микрочип с микропрепаратами, экспрессирующими 11 различных белков, связывается только с CD137 и нектин-4 (что детектируется с использованием стрептавидина, меченного с помощью AlexaFluor647). Сигнал связывания пропадает при инкубировании с BCY11863.

На фиг. 12 кривые роста опухолей МС38#13 у мышей линии huCD137 C57B1/6 демонстрируют

- 2 046193 противоопухолевую активность BCY11863 при различных дозах и различных интервалах между введением доз. Число животных с полным ответом (CR; отсутствие пальпируемой опухоли) на день 15 после начала лечения указано в скобках.

На фиг. 13 кривые роста опухоли (среднее значение±стандартная ошибка среднего значения) МС38#13 у мышей линии huCD137 C57B1/6 (п=6/группа) демонстрируют противоопухолевую активность BCY11863 при различных дозах и различных интервалах между введением доз. Число животных с полным ответом (CR; отсутствие пальпируемой опухоли) на день 52 после начала лечения указано в скобках. (А) Группы, в которых вводят плацебо (среду) или суммарную недельную дозу 3 мг/кг BCY11863. (В) Группы, в которых вводят плацебо (среду) или суммарную недельную дозу 10 мг/кг BCY11863. (С) Группы, в которых вводят плацебо (среду) или суммарную недельную дозу 30 мг/кг BCY11863.

На фиг. 14 показаны фармакокинетические данные для гетеротандемного бициклического пептидного комплекса BCY11863 в случае крыс SD, внутривенно дозируемых 100 мг/кг (n=3), и результаты измерений концентрации BCY11863 и потенциальных метаболитов BCY15155 и BCY14602 в плазме.

Подробное описание изобретения

Согласно первому аспекту изобретения предлагается гетеротандемный бициклический пептидный комплекс, включающий (a) первый пептидный лиганд, который связывается с нектин-4 и который имеет последовательность C₁P[1Nal][dD]C₁₁M[HArg]DWSTP[HyP]WC₁₁₁ (SEQ ID NO: 1; BCY8116), конъюгированный через линкер N-(кислота-PEG3)-N-бис(PEG₃-αзид), с (b) вторыми пептидными лигандами, которые связываются с CD137, оба из которых имеют последовательность Ac-C₁[tBuAla]PE[D-Lys(PYA)]PYC₁₁FADPY[Nle]C₁₁₁-A (SEQ ID NO: 2; BCY8928), где каждый из указанных пептидных лигандов включает полипептид, содержащий три реакционноспособные цистеиновые группы (C₁, C₁₁ и C₁₁₁), разделенных двумя петлевыми последовательностями, и молекулярный каркас, который представляет собой 1,1',1-(1,3,5-триазинан-1,3,5-триил)трипроп-2-ен-1он (ТАТА) и который образует ковалентные связи с реакционно-способными цистеиновыми группами полипептида, вследствие чего на молекулярном каркасе образуются две полипептидных петли, где Ас представляет ацетил, HArg представляет гомоаргинин, НуР представляет транс-4-гидроксиL-пролин, 1Nal представляет 1-нафтилаланин, tBuAla представляет третбутил-аланин, PYA представляет 4-пентиноевую кислоту и Nle представляет норлейцин.

Упоминания в изобретении линкера N-(кислота-PEG₃)-N-бис(PEG₃-αзид) включают линкер

N-(кислота-PEG₃)-N-бис(PEG₃-aзид).

В одном варианте осуществления гетеротандемный бициклический пептидный комплекс представляет собой BCY11863:

Подробная информация по BCY11863 приведена в табл. А ниже.

- 3 046193

Таблица А

Состав BCY11863

№ комплекса	№ BCY ДЛЯ нектин-4	Точка присоединения	Линкер	№ BCY для CD 137	Точка присоединения
BCY11863	BCY8116	N-конец	И-(кислотаPEG3)-N6hc(PEG3азид)	BCY8928, BCY8928	dLys (PYA)4

На фиг. 1 и в табл. 1 представлены данные, которые показывают, что 1 BCY11863 демонстрирует сильную активацию CD137 в репортерном анализе на CD137. Кроме того, на фиг. 2 и в табл. 2 представлены данные, которые показывают, что BCY11863 индуцирует устойчивую секрецию цитокинов IL-2 и IFN-γ при проведении анализа в совместной культуре РВМС с многими линиями опухолевых клеток и РВМС людей-доноров. Кроме того, на фиг. 3 и в табл. 5 представлены данные, которые показывают, что BCY11863 демонстрировал очень высокий фармакокинетический профиль с величиной конечного периода полувыведения 4,1 ч у крыс SD и 5,3 ч у яванских макаков. Данные, представленные на фиг. 10 и 11 наряду с методами, описанными в разделах 11 и 12, демонстрируют связывание и очень высокую селективность BCY11863 в отношении его мишеней нектин-4 и CD137. На фиг. 4 и 5 представлены данные по высокой противоопухолевой активности BCY11863 в отношении сингенных опухолевых клеток МС38#13 у мышей и доказательства формирования иммунологической памяти после лечения с помощью BCY11863. На фиг. 6 и 7 представлены данные по противоопухолевой активности BCY11863 в модели сингенных клеток СТ26#7 с соответствующей инфильтрацией цитотоксических Т-клеток в опухоль. На фиг. 12 и 13 однозначно показано, что нет необходимости поддержания значительных концентраций BCY11863 в плазме, так как при его дозировании 1,5 мг/кг BIW и 5 мг/кг при 0, 24 ч в неделю BCY11863 продуцировал устойчивую противоопухолевую активность.

В изобретении упоминаются конкретные аналоги (т.е. модифицированные производные) и метаболиты BCY11863, каждый из которых образует дополнительные аспекты изобретения и данные о которых приведены в табл. В ниже.

Таблица В

Композиция аналогов и метаболитов BCY11863

№ комплекса	№ BCY для нектин-4	Точка присоединения	Линкер	№ BCY для CD137	Точка присоединения	Модификатор
BCY13390	BCY8116	N-конец	К-(кислотаPEG₃)-N6hc(PEG₃азид)	BCY8928, BCY13389	dLys(PYA)4 dLys(PYA)4
BCY13582	BCY8116	N-конец	К-(кислотаPEG₃)-N6hc(PEG₃азид)	BCY8928, BCY13389	dLys(PYA)4 dLys(PYA)4	Биотин- Peg 12
BCY13583	BCY8116	N-конец	К-(кислотаPEG₃)-N6hc(PEG₃азид)	BCY8928, BCY13389	dLys(PYA)4 dLys(PYA)4	Alexa Fluor 488
BCY13628	BCY8116	N-конец	И-(кислотаPEG₃)-N6hc(PEG₃азид)	BCY8928, BCY13389	dLys(PYA)4 dLys(PYA)4	Ц,ианин 5

- 4 046193

BCY14601 представляет бициклический пептидный лиганд, имеющий последовательность C₁[tBuAla]PE[D-Lys(PYA)]PYC₁₁FADPY[Nle]C₁₁₁-A (SEQ ID NO: 3), с ТАТА в качестве молекулярного каркаса; и

BCY13389 представляет бициклический пептидный лиганд, имеющий последовательность [Ac]C₁[tBuAla]PE[D-Lys(PYA)]PYC₁₁FADPY[Nle]C₁₁₁-K (SEQ ID NO: 4), с ТАТА в качестве молекулярного каркаса.

Если не указано иное, то все технические и научные термины, используемые в настоящем изобретении, имеют те же значения, которые являются общепринятыми для специалистов в данной области, например, в области химии пептидов, культуры клеток и фагового дисплея, химии нуклеиновых кислот и биохимии. Используются стандартные методы молекулярной биологии, генетических и биохимических исследований (см. монографии Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999), 4th ed., John Wiley & Sons, Inc.), содержание которых включены в настоящее изобретение путем ссылки на них.

Номенклатура.

Нумерация.

При указании положений аминокислотного остатка в соединениях по изобретению для остатков цистеина (Ci, Cii и Ciii) нумерация не приводится, поскольку они являются инвариантными, поэтому нумерация аминокислотных остатков в SEQ ID NO: 1 является такой, как показано ниже:

Ci-Pi-lNal2-dD₃-C_ii-M4-HArg₅-D₆-W7-S8-T₉-Pio-HyPii-Wi2-Ci_ii (SEQ Ш NO: 1)

Применительно к настоящему изобретению предполагается, что все бициклические пептиды циклизованы с помощью 1,1',1-(1,3,5-триазинан-1,3,5-триил)трипроп-2-ен-1-она (ТАТА) с образованием тризамещенной структуры. Циклизация с помощью ТАТА происходит по Ci, Cii и Ciii.

Молекулярный формат.

N- или С-концевые удлинения для коровой последовательности бицикла добавляются к левой или правой стороне последовательности и отделяются дефисом. Например, N-концевой eAla-Sa10-Ala хвост будет обозначаться как

PAla-SarlO-A-(SEQ ID NO: X)

Обратные пептидные последовательности.

В свете публикации Nair et al (2003), J. Immunol., 170(3), 1362-1373 предполагается, что раскрытые в изобретении пептидные последовательности могут также найти применение в их ретро-инверсной форме. Например, порядок последовательности изменяют на обратный (т.е. N-конец становится С-концом и наоборот), и ее стереохимия таким же образом становится обратной (т.е. D-аминокислоты становятся L-аминокислотами и наоборот). Во избежание неправильного толкования предполагается, что при указании аминокислот либо в виде их полного названия, либо в виде их буквенного кода из одной или трех букв в изобретении они представляются как L-аминокислоты, если не заявлено иное. Если предполагается, что такая аминокислота должна быть представлена в изобретении как D-аминокислота, то в этом случае перед обозначением аминокислоты будет стоять строчная буква d и все обозначение будет взято в квадратные скобки, например [dA], [dD], [dE], [dK], [d1Nal], [dNle] и т.д.

Преимущества пептидных лигандов.

Конкретные гетеротандемные бициклические пептидные комплексы по настоящему изобретению имеют ряд предпочтительных свойств, благодаря которым они могут рассматриваться в качестве подходящих молекул, подобных лекарственным средствам, для инъекционного, ингаляционного, назального, глазного, перорального или местного введения. Такие предпочтительные свойства включают межвидовую перекрестную реактивность; она является обычным требованием для проведения преклинических фармакодинамических и фармакокинетических исследований;

устойчивость к воздействию протеаз; гетеротандемные бициклические пептидные комплексы должны, в идеальном варианте, проявлять устойчивость к воздействию протеаз плазмы, эпителиальных (заякоренных в мембране) протеаз, желудочных и кишечных протеаз, протеаз на поверхности легких, внутриклеточных протеаз и других подобных протеаз; устойчивость к воздействию протеаз должна сохраняться между различными видами, благодаря чему на животных моделях может быть разработан пер

- 5 046193 спективный гетеротандемный бициклический пептид, который затем с высокой степенью достоверности может применяться на людях;

требуемый профиль растворимости; он зависит от отношения заряженных и гидрофильных остатков к гидрофобным остаткам и от внешних/внутренних молекулярных водородных связей, что является важным с точки зрения приготовления и абсорбции лекарственного препарата;

селективность; конкретные гетеротандемные бициклические пептидные комплексы по изобретению проявляют высокую селективность в присутствии других мишеней;

оптимальный период полувыведения из плазмы в кровотоке; в зависимости от клинических показаний и схемы лечения, может потребоваться разработка гетеротандемного бициклического пептидного комплекса с кратковременным воздействием в случае лечения острого заболевания, или разработка гетеротандемного бициклического пептидного комплекса с повышенным временем нахождения в кровотоке, что, вследствие этого, является оптимальным при лечении хронического течения заболеваний; другими факторами, определяющими требуемый период полувыведения из плазмы, являются требования при пролонгированном воздействии достижения максимальной терапевтической эффективности с учетом сопровождающего токсического действия, обусловленного пролонгированным воздействием лекарственного средства.

Важно отметить, что в изобретении представлены данные, согласно которым выбранные гетеротандемные бициклические пептидные комплексы демонстрируют противоопухолевую активность при их дозировании с частотой, при которой не поддерживаются концентрации соединения в плазме выше его величины EC50 in vitro. Это отличается от методов применения более крупных по размеру биологических препаратов (т.е. на основе антител) для агонизма CD137 или биспецифического агонизма CD137 (Segal et al., Clin. Cancer Res., 23(8):1929-1936 (2017); Claus et al., Sci. Trans. Med., 11(496):eaav5989, 1-12 (2019); Hinner et al., Clin. Cancer Res., 25(19):5878-5889 (2019)). Не приводя в качестве обоснования какую-либо теорию, тем не менее, можно предположить, что наблюдаемое явление обусловлено тем, что гетеротандемные бициклические комплексы имеют относительно низкую молекулярную массу (как правило, <15 кДа), они являются полностью синтетическими продуктами и они представляют собой нацеленные на опухоль агонисты CD137. В качестве таковых, они характеризуются относительно короткими периодами полувыведения из плазмы, но высокой проницаемостью в опухоль и продолжительным временем нахождения в опухоли. В изобретении приведены данные, которые полностью поддерживают наличие этих преимуществ. Например, противоопухолевая активность в моделях сингенной опухоли на мышах с гуманизированным CD137 проявляется либо ежедневно, либо на каждый третий день. Кроме того, фармакокинетические данные, полученные в случае интраперитонеального введения, показывают, что период полувыведения из плазмы составляет <3 ч, что позволяет предположить стабильное падение циркулирующей концентрации комплекса ниже величины in vitro EC50 в промежутках времени между введениями доз. Кроме того, фармакокинетические данные для опухоли показывают, что уровни гетеротандемного бициклического комплекса в опухолевой ткани могут быть более высокими и более устойчивыми по сравнению с уровнями в плазме.

Следует отметить, что этот вывод образует важный дополнительный аспект изобретения. Так, согласно дополнительному аспекту изобретения в изобретении предлагается способ лечения рака, который включает введение описанного в изобретении гетеротандемного бициклического пептидного комплекса при частоте введения доз, при которой не поддерживаются концентрации указанного комплекса в плазме выше величины in vitro EC₅₀ для указанного комплекса.

Иммунологическую память. Сочетание связывающегося с раковой клеткой бициклического пептидного лиганда со связывающимся с иммунной клеткой бициклическим пептидным лигандом обеспечивает синергетический положительный эффект для иммунологической памяти. В изобретении представлены данные, которые показывают, что выбранные гетеротандемные бициклические пептидные комплексы по изобретению позволяют не только уничтожать опухоли, но при повторном введении вызывающего образование опухоли средства, ни у одной из инокулированных мышей с полным ответом не развивались опухоли (см. фиг. 5). Это указывает на то, что лечение с помощью выбранных гетеротандемных бициклических пептидных комплексов по изобретению вызывало иммунологическую память у мышей с полным ответом. Это является значительным клиническим преимуществом с точки зрения предотвращения повторного возникновения указанной опухоли, после того как она первоначально была подвергнута противоопухолевой терапии и уничтожена.

Пептидные лиганды.

Упоминаемый в изобретении пептидный лиганд относится к пептиду, ковалентно связанному с молекулярным каркасом. Как правило, такие пептиды включают две или более реакционно-способных групп (т.е. остатки цистеина), которые способны образовывать ковалентные связи с каркасом, и последовательность, находящуюся между указанными реакционно-способными группами, которую называют петлевой последовательностью, так как она образует петлю при связывании пептида с каркасом. В данном случае пептиды включают по меньшей мере три реакционно-способные группы, выбранные из цистеина, 3-меркаптопропионовой кислоты и/или цистеамина, и образуют по меньшей мере две петли на каркасе.

- 6 046193

Фармацевтически приемлемые соли.

Следует иметь в виду, что в объем настоящего изобретения входят солевые формы и упоминания пептидных лигандов включают и солевые формы указанных лигандов.

Соли по настоящему изобретению могут быть синтезированы из исходного соединения, которое содержит фрагмент с основными или кислотными свойствами, обычными химическими методами, такими как методы, описанные в монографии Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (editor), ISBN: 3-90639-026-8, Hardcover, 388 pages, August 2002. Как правило, такие соли можно получить реакцией этих соединений в форме свободной кислоты или свободного основания с подходящим основанием или кислотой в воде или в органическом растворителе или в их смеси.

Соли присоединения кислот (моно- или дисоли) могут быть образованы с широким спектром кислот, как неорганических, так и органических. Примеры солей включают моно- или дисоли, образованные с кислотой, выбранной из группы, состоящей из уксусной, 2,2-дихлоруксусной, адипиновой, альгиновой, аскорбиновой (например, L-аскорбиновой), L-аспарагиновой, бензолсульфоновой, бензойной, 4-ацетамидобензойной, бутановой, (+)-камфорной, камфорносульфоновой, (+)-(^)-камфора-10сульфоновой, каприновой, капроновой, каприловой, коричной, лимонной, цикламовой, додецилсерной, этан-1,2-дисульфоновой, этансульфоновой, 2-гидроксиэтансульфоновой, муравьиной, фумаровой, слизевой, гентизиновой, глюкогептоновой, D-глюконовой, глюкуроновой (например, D-глюкуроновой), глутаминовой (например, L-глутаминовой), α-оксоглутаровой, гликолевой, гиппуровой, гидрогалогеновых кислот (например, бромистоводородной, хлористоводородной, йодистоводородной), изетионовой, молочной (например, (+)-Ь-молочной, (±)-DL-молочной), лактобионовой, малеиновой, яблочной, (-)-Lяблочной, малоновой, (±)-DL-миндальной, метансульфоновой, нафталин-2-сульфоновой, нафталин-1,5дисульфоновой, 1-гидрокси-2-нафтойной, никотиновой, азотной, олеиновой, оротовой, щавелевой, пальмитиновой, памовой, фосфорной, пропионовой, пировиноградной, L-пироглутаминовой, салициловой, 4-амино-салициловой, себациновой, стеариновой, янтарной, серной, дубильной, (+)-Ь-винной, тиоциановой, п-толуолсульфоновой, ундециленовой и валериановой кислот, а также ацилированных аминокислот и катионообменных смол.

Одна конкретная группа солей состоит из солей, образованных из уксусной, хлористоводородной, йодистоводородной, фосфорной, азотной, серной, лимонной, молочной, янтарной, малеиновой, яблочной, изетионовой, фумаровой, бензолсульфоновой, толуолсульфоновой, серной, метансульфоновой (мезилат), этансульфоновой, нафталинсульфоновой, валериановой, пропановой, бутановой, малоновой, глюкуроновой и лактобионовой кислот. Одной конкретной солью является гидрохлорид. Другой конкретной солью является ацетат.

Если соединение является анионным или имеет функциональную группу, которая может быть анионной (например, -СООН может находиться в форме аниона -СОО-), то соль может быть образована с органическим или неорганическим основанием, генерирующим подходящий катион. Примеры подходящих неорганических катионов включают, но этим не ограничивая, ионы щелочных металлов, такие как Li⁺, Na⁺ и K+, катионы щелочно-земельных металлов, такие как Ca²⁺ и Mg2⁺, и другие катионы, такие как Al³⁺ или Zn⁺. Примеры подходящих органических катионов включают, но этим не ограничивая, ион аммония (т.е. NH4⁺) и ионы замещенного аммония (например, NH3R⁺, NH2R2+, NHR3⁺, NR4+). Примерами некоторых подходящих замещенных ионов аммония являются ионы, которые образованы из метиламина, этиламина, диэтиламина, пропиламина, дициклогексиламина, триэтиламина, бутиламина, этилендиамина, этаноламина, диэтаноламина, пиперазина, бензиламина, фенилбензиламина, холина, меглумина и трометамина, а также аминокислот, таких как лизин и аргинин. Примером типичного иона четвертичного аммония является N(CH3)₄ ⁺.

Когда соединения по изобретению содержат аминную функциональность, они могут образовывать четвертичные аммониевые соли, например, путем реакции с алкилирующим агентом в соответствии с методами, хорошо известными специалисту в данной области. Такие соединения четвертичного аммония входят в объем изобретения.

Модифицированные производные.

Следует иметь в виду, что описанные в изобретении модифицированные производные пептидных лигандов входят в объем настоящего изобретения. Примеры таких подходящих модифицированных производных включают одну или более модификаций, выбранных из N-концевых и/или С-концевых модификаций;

замены одного или более аминокислотных остатков одним или более неприродными аминокислотными остатками (например, замены одного или более полярных аминокислотных остатков одной или более изостерическими или изоэлектронными аминокислотами;

замены одного или более неполярных аминокислотных остатков другими неприродными изостерическими или изоэлектронными аминокислотами);

добавления спейсерной группы;

замены одного или более чувствительных к окислению аминокислотных остатков одним или более

- 7 046193 устойчивыми к окислению аминокислотными остатками;

замены одного или более аминокислотных остатков на аланин, замены одного или более L-аминокислотных остатков одним или более D-аминокислотными остатками;

N-алкилирования одной или более амидных связей внутри бициклического пептидного лиганда;

замены одной или более пептидных связей суррогатной связью; модификации длины главной цепи пептида;

замены водорода на альфа-углероде одного или нескольких аминокислотных остатков другой химической группой, модификации аминокислот, таких как цистеин, лизин, глутамат/аспартат и тирозин, подходящими аминами, тиолами, карбоновой кислотой и реагентами, взаимодействующими с фенолом, для функционализации указанных аминокислот, и введения или замены на аминокислоты, которые вводят ортогональные реакционноспособные группы, которые подходят для функционализации, например аминокислоты, несущие азидные или алкиновые группы, которые позволяют функционализировать с помощью алкиновых или несущих азид фрагментов соответственно.

В одном варианте осуществления модифицированное производное включает N-концевую и/или С-концевую модификацию. В дополнительном варианте осуществления, в котором модифицированное производное включает N-концевую модификацию с использованием подходящих химических реакций с аминогруппой, и/или С-концевую модификацию с использованием подходящих химических реакций с карбоксильной группой. В дополнительном варианте осуществления, указанная N-концевая или С-концевая модификация включает введение эффекторной группы, включая, но этим не ограничивая, цитотоксическое средство, радиоактивное хелатирующее вещество или хромофор.

В дополнительном варианте осуществления, модифицированное производное включает N-концевую модификацию. В дополнительном варианте осуществления, N-концевая модификация включает N-концевую ацетильную группу. В этом варианте осуществления, N-концевую цистеиновую группу (группу, обозначаемую в изобретении как Ci) блокируют с помощью уксусного ангидрида или других подходящих реагентов в процессе синтеза пептида, что приводит к образованию молекулы с ацетилированным N-концом. В этом варианте осуществления обеспечивается преимущество, связанное с удалением потенциальной точки распознавания аминопептидаз и предотвращением возможной деградации бициклического пептида.

В альтернативном варианте осуществления N-концевая модификация включает введение молекулярной спейсерной группы, которая облегчает конъюгацию эффекторных групп и способствует сохранению активности бициклического пептида в отношении его мишени.

В дополнительном варианте осуществления, модифицированное производное включает С-концевую модификацию. В дополнительном варианте осуществления, С-концевая модификация включает амидную группу. В этом варианте осуществления С-концевую цистеиновую группу (обозначаемую в изобретении как Ciii) синтезируют в форме амида в процессе синтеза пептида, что приводит к образованию молекулы с амидированным С-концом. В этом варианте осуществления обеспечивается преимущество, связанное с удалением потенциальной точки распознавания карбоксипептидазы и снижением вероятности протеолитической деградации бициклического пептида.

В одном варианте осуществления модифицированное производное включает замену одного или более аминокислотных остатков одним или более остатками неприродных аминокислот. В этом варианте осуществления могут быть выбраны неприродные аминокислоты, имеющие изостерические/изоэлектронные боковые цепи, которые не распознаются деградирующими протеазами и не оказывают никакого неблагоприятного воздействия на эффективность в отношении мишени.

В качестве варианта могут быть использованы неприродные аминокислоты, имеющие стерически затрудненные аминокислотные боковые цепи, в результате чего конформационно и стерически затруднен протеолитический гидролиз соседней пептидной связи. В частности, они относятся к аналогам пролина, объемным боковым цепям, Са-дизамещенным производным (например, аминоизомасляной кислоте, Aib) и циклическим аминокислотам, простым производным которых является аминоциклопропилкарбоновая кислота.

В одном варианте осуществления модифицированное производное включает добавление спейсерной группы. В дополнительном варианте осуществления, модифицированное производное включает добавление спейсерной группы к N-концевому цистеину (Ci) и/или к С-концевому цистеину (Ciii).

В одном варианте осуществления модифицированное производное включает замену одного или более чувствительных к окислению аминокислотных остатков одним или более устойчивыми к окислению аминокислотными остатками. В другом варианте осуществления, модифицированное производное включает замену остатка триптофана остатком нафтилаланина или аланина. Этот вариант осуществления обеспечивает преимущество, связанное с улучшением профиля фармацевтической стабильности полученного бициклического пептидного лиганда.

В одном варианте осуществления модифицированное производное включает замену одного или более заряженных аминокислотных остатков одним или более гидрофобными аминокислотными остатками. В альтернативном варианте осуществления модифицированное производное включает замену одного или более гидрофобных аминокислотных остатков одним или более заряженными аминокислотными

- 8 046193 остатками. Благоприятный баланс между заряженными и гидрофобными аминокислотными остатками является важной характеристикой бициклических пептидных лигандов. Например, гидрофобные аминокислотные остатки влияют на степень связывания с белками плазмы и, таким образом, на концентрацию доступной свободной фракции в плазме, в то время как заряженные аминокислотные остатки (в частности, аргинин) могут влиять на взаимодействие пептида с фосфолипидными мембранами на поверхности клеток. Эти два типа остатков в комбинации могут влиять на период полувыведения, объем распределения и воздействие пептидного лекарственного средства, и могут быть подобраны в соответствии с требуемым клиническим результатом. Кроме того, благоприятная комбинация и число заряженных аминокислотных остатков относительно гидрофобных аминокислотных остатков могут снижать раздражение в месте инъекции (при подкожном введении пептидного лекарственного средства).

В одном варианте осуществления модифицированное производное включает замену одного или более остатков L-аминокислоты одним или более остатками D-аминокислоты. В этом варианте осуществления предполагается, что такая замена позволяет повысить протеолитическую устойчивость за счет стерических затруднений и за счет способности D-аминокислоты стабилизировать конформационную изомерию (Tugyi et al. (2005), PNAS, 102(2), 413-418).

В одном варианте осуществления модифицированное производное включает удаление любых аминокислотных остатков и замену их аланинами. В этом варианте осуществления обеспечивается преимущество, связанное с удалением потенциального(ых) места(мест) протеолитической атаки.

Следует отметить, что каждая из упомянутых выше модификаций предназначена для планируемого повышения активности или стабильности пептида. Дополнительное повышение активности путем модификаций может быть достигнуто на основе следующих механизмов:

введение гидрофобных фрагментов, которые обеспечивают гидрофобный эффект и приводят к более низким скоростям диссоциации, в результате чего достигаются более высокие степени аффинности;

введение заряженных групп, которые обеспечивают ионные взаимодействия дальнего порядка, что приводит к более высоким скоростям ассоциации и к более высоким степеням аффинности (см., например, Schreiber et al., Rapid, electrostatically assisted association of proteins (1996), Nature Struct. Biol., 3, 427-31); и введение в пептид дополнительных ограничений степеней свободы путем, например, правильного выбора ограничения степеней свободы боковых цепей аминокислоты, благодаря чему минимизируется потеря энтропии при связывании с мишенью, ограничения степеней свободы торсионных углов основной цепи, благодаря чему минимизируется потеря энтропии при связывании с мишенью, и путем введения дополнительных циклов в молекулу по тем же самым причинам (обзорную информацию можно найти в публикациях Gentilucci et al., Curr. Pharmaceutical Design (2010), 16, 3185-203; и Nestor et al., Curr. Medicinal Chem (2009), 16, 4399-418).

Изотопные варианты.

Настоящее изобретение включает все фармацевтически приемлемые (радиоактивно)изотопномеченые пептидные лиганды по изобретению, в которых один или более атомов заменены атомами, имеющими тот же атомный номер, но атомную массу или массовое число, отличное от атомной массы или массового числа, обычно встречающихся в природе, и пептидные лиганды по изобретению, к которым присоединены хелатирующие металлы группы (называемые эффекторными), которые способны удерживать соответствующие (радиоактивные)изотопы, и пептидные лиганды по изобретению, в которых некоторые функциональные группы ковалентно заменены соответствующими (радиоактивными)изотопами или изотопно-мечеными функциональными группами.

Примеры изотопов, подходящих для введения в пептидные лиганды по изобретению, включают изотопы водорода, такие как ²Н (D) и ³Н (Т), углерода, такие как ¹¹С, ¹³С и ¹⁴С, хлора, такие как ³⁶Cl, фтора, такие как 18F, йода, такие как ¹²³I, ¹²⁵I и ¹³¹I, азота, такие как ¹³N и ¹⁵N, кислорода, такие как ¹⁵О, ¹⁷О и ¹⁸О, фосфора, такие как ³²Р, серы, такие как ³⁵S, меди, такие как ⁶⁴Cu, галлия, такие как ⁶⁷Ga или ⁶⁸Ga, иттрия, такие как ⁹⁰Y, и лютеция, такие как ¹⁷⁷Lu, и висмута, такие как ²¹³Bi.

Конкретные изотопно-меченые пептидные лиганды по изобретению, например, те, в которые введен радиоактивный изотоп, могут применяться в исследованиях распределения лекарственных соединений и/или субстратов в тканях, а также для клинической оценки присутствия и/или отсутствия мишени нектина-4 в пораженных тканях. Пептидные лиганды по изобретению могут дополнительно обладать ценными диагностическими свойствами, в силу чего они могут применяться для детекции или идентификации образования комплекса между меченым соединением и другими молекулами, пептидами, белками, ферментами или рецепторами. В методах детекции или идентификации могут использоваться соединения, которые мечены с помощью наносящих метку средств, таких как радиоизотопы, ферменты, флуоресцирующие вещества, люминесцирующие вещества (например, люминол, производные люминола, люциферин, экворин и люцифераза) и т.д. В частности, с этой целью могут применяться радиоактивные изотопы тритий, т.е. ³Н (Т), и углерод-14, т.е. ¹⁴С, в виду простоты их введения и доступности средств для их детекции.

Замещение с помощью более тяжелых изотопов, таких как дейтерий, т.е. ²Н (D), может давать определенные терапевтические преимущества, обусловленные более высокой метаболической стабильностью, например повышение in vivo периода полувыведения или снижение величины необходимой дозы,

- 9 046193 и, следовательно, может быть предпочтительным при некоторых обстоятельствах.

Замещение с помощью позитрон-активных изотопов, таких как С. ¹⁸F, ¹⁵О и ¹³N, может применяться при проведении исследований методом позитронно-эмиссионная томография (PET) с целью определения степени занятости мишени.

Меченые изотопами соединения пептидных лигандов по изобретению могут быть получены, как правило, обычными методами, известными специалистам в данной области, или методами, аналогичными методам, которые описаны в приводимых в изобретении примерах, путем использования соответствующего меченого изотопом реагента вместо применяемого ранее немеченого реагента.

Синтез.

Пептиды по настоящему изобретению могут быть получены синтетическим путем стандартными методами с последующей реакцией с молекулярным каркасом in vitro. После завершения этого процесса, могут быть использованы стандартные методы химии. Это позволяет быстро получать в большом количестве растворимый материал для проведения последующих экспериментов или валидации. Такие методы могут быть осуществлены с использованием традиционных химических методик, таких как описанные в упомянутой выше публикации Timmerman et al.

Поэтому изобретение также относится к получению полипептидов или конъюгатов, выбранных как указано в изобретении, где получение включает необязательные дополнительные стадии, разъясняемые ниже. В одном варианте осуществления эти стадии проводят на конечном продукте полипептид/конъюгат, полученном химическим синтезом.

Аминокислотные остатки в представляющем интерес полипептиде могут быть необязательно замещены при получении конъюгата или комплекса.

Пептиды могут быть также удлинены, например, для того чтобы ввести еще одну петлю и, следовательно, для достижения множественной специфичности.

Чтобы удлинить пептид, его можно просто удлинить химическими методами по его N-концу или С-концу или внутри петель с использованием ортогонально защищенных лизинов (и их аналогов) с использованием стандартных методов твердофазного синтеза или методов синтеза в растворе. Для введения активированного или активируемого N- или С-конца могут быть использованы стандартные методики (био)конъюгации. В качестве варианта, добавления могут быть осуществлены фрагментарной конденсацией или нативным химическим лигированием, например, как описано в публикации Dawson et al., 1994, Synthesis Proteins by Native Chemical Ligation, Science, 266:776-779, или с помощью ферментов, например, используя субтилигазу, как это описано в публикациях Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1994 Dec 20, 91(26):12544-8; или Hikari et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol. 18, issue 22, 15 November 2008, p. 6000-6003.

В качестве варианта пептиды могут быть удлинены или модифицированы путем дальнейшей конъюгации за счет использования дисульфидных связей. Этот подход имеет дополнительное преимущество, обусловленное тем, что он позволяет разъединение друг от друга первого и второго пептидов сразу после попадания в восстановительную среду клетки. В этом случае, молекулярный каркас (например, ТАТА) может быть добавлен в процессе химического синтеза первого пептида, для того чтобы прореагировать с тремя цистеиновыми группами; затем к N- или С-концу первого пептида может быть присоединен дополнительный цистеин или тиол, вследствие чего этот цистеин или тиол реагирует только со свободным цистеином или тиолом вторых пептидов, образуя связанный дисульфидной связью бициклический конъюгат пептид-пептид.

Аналогичные методы в равной степени применимы к синтезу/связыванию двух бициклических и биспецифичных макроциклов, что позволяет создавать тетраспецифичные молекулы.

Кроме того, аналогичным образом может быть осуществлено добавление других функциональных групп или эффекторных групп путем использования соответствующих химических реакций, присоединения на N- или С-концах или через боковые цепи. В одном варианте осуществления присоединение осуществляют таким образом, что оно не блокирует активность ни одного объекта.

Фармацевтические композиции.

Согласно дополнительному аспекту изобретения предлагается фармацевтическая композиция, включающая определенный в изобретении пептидный лиганд в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами.

Как правило, пептидные лиганды по настоящему изобретению должны использоваться в очищенной форме вместе с фармакологически приемлемыми вспомогательными веществами или носителями. Обычно эти вспомогательные вещества или носители включают водный или спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, в том числе физиологический раствор и/или забуференные среды. Среды для парентерального введения включают раствор хлорида натрия, раствор Рингера с декстрозой, раствор декстрозы и хлорида натрия и раствор Рингера с лактатом. Подходящие физиологически приемлемые вспомогательные вещества, если необходимо поддерживать полипептидный комплекс в форме суспензии, могут быть выбраны из загустителей, таких как карбоксиметилцеллюлоза, поливинилпирролидон, желатин и альгинаты.

Среды для внутривенного введения включают жидкость и средства для восполнения питательных

- 10 046193 веществ и средства для восстановления содержания электролитов, такие как растворы Рингера с декстрозой. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как противомикробные средства, антиоксиданты, хелатирующие средства и инертные газы (Mack (1982), Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition).

Пептидные лиганды по настоящему изобретению могут быть использованы в форме отдельно вводимых композиций или в сочетании с другими лекарственными средствами. Они могут включать антитела, фрагменты антител и различные иммунотерапевтические препараты, такие как циклоспорин, метотрексат, адриамицин или цисплатин, а также иммунотоксины. Фармацевтические композиции могут включать коктейли из различных цитотоксических или других лекарственных средств в сочетании с белковыми лигандами по настоящему изобретению или даже в комбинации с выбранными полипептидами по настоящему изобретению, обладающими различной специфичностью, такими как полипептиды, выбранные с использованием различных целевых лиганд, независимо от того, объединят ли их или не объединяют перед введением.

Способ введения фармацевтических композиций по изобретению может представлять собой любой из способов, хорошо известных специалистам в данной области. С целью проведения терапии, пептидные лиганды по изобретению могут быть введены любому пациенту стандартными способами. Введение может быть осуществлено любым подходящим способом, включая парентеральный, внутривенный, внутримышечный, интраперитонеальный, трансдермальный способы введения, путем ингаляции или, в случае необходимости, путем прямой инфузии через катетер. Предпочтительно вводить фармацевтические композиции по изобретению путем ингаляции. Доза и частота введения будут зависеть от возраста, пола и состояния пациента, одновременного введения других лекарственных средств, противопоказаний и других параметров, которые должны учитываться лечащим врачом.

Пептидные лиганды по настоящему изобретению могут быть лиофилизированы для хранения и затем диспергированы в подходящей среде перед использованием. Было показано, что этот подход является эффективным и могут быть использованы известные в данной области методы лиофилизации и диспергирования. Для специалистов в данной области является очевидным, что лиофилизация и диспергирование могут приводить к потере в различной степени активности и что может потребоваться корректировка уровней в сторону увеличения для компенсации этих потерь.

Композиции, содержащие пептидные лиганды по настоящему изобретению или их коктейль, могут быть введены с целью профилактического и/или терапевтического лечения. В некоторых вариантах терапевтического применения количество, достаточное для достижения, по меньшей мере, частичного ингибирования, подавления, модуляции, уничтожения или какого-либо другого измеримого параметра популяции выбранных клеток, определяется как терапевтически эффективная доза. Количества, необходимые для достижения этой дозы, будут зависеть от тяжести заболевания и общего состояния собственной иммунной системы пациента, и они обычно изменяются в диапазоне от 0,005 до 5,0 мг выбранного пептидного лиганда на килограмм массы тела, причем чаще всего используют дозы от 0,05 до 2,0 мг/кг/доза. Для профилактических целей, композиции, содержащие пептидные лиганды по настоящему изобретению или их смеси, могут быть также введены в аналогичных или чуть более низких дозах.

Композиция, содержащая пептидный лиганд по настоящему изобретению, может быть использована в профилактических и терапевтических целях для содействия изменению, инактивации, уничтожению или удалению выбранной популяции клеток-мишеней у млекопитающего. Кроме того, описанные в изобретении пептидные лиганды могут быть использованы экстракорпорально или селективно in vitro для уничтожения, истощения или иного эффективного удаления популяции клеток-мишеней из гетерогенного набора клеток. Кровь млекопитающего может быть экстракорпорально объединена с выбранными пептидными лигандами, в результате чего нежелательные клетки уничтожаются или иным образом удаляются из крови, которую затем возвращают млекопитающему, используя стандартные методы.

Терапевтическое применение.

Согласно дополнительному аспекту изобретения, предлагается фармацевтическая композиция, включающая указанный в изобретении гетеротандемный бициклический пептидный комплекс для применения с целью предотвращения, подавления или лечения рака.

Примеры видов рака (и их доброкачественных аналогов), которые могут быть подвергнуты лечению (или подавлены) включают, но этим не ограничивая, опухоли эпителиального происхождения (аденомы и карциномы различных типов, включая аденокарциномы, плоскоклеточный рак, переходные клеточные карциномы и другие карциномы), такие как карциномы мочевого пузыря и мочевых путей, молочной железы, желудочно-кишечного тракта (включая карциномы пищевода, желудка (желудочные), тонкой кишки, толстой кишки, прямой кишки и заднего прохода), печени (гепатоцеллюлярную карциному), желчного пузыря и желчевыделительной системы, экзокринной части поджелудочной железы, почек, легких (например, аденокарциномы, мелкоклеточные карциномы легких, немелкоклеточные карциномы легких, бронхоальвеолярные карциномы и мезотелиомы), карциномы головы и шеи (например, рак языка, ротовой полости, гортани, глотки, носоглотки, миндалин, слюнных желез, полости носа и околоносовых пазух), яичников, маточных труб, брюшной полости, влагалища, вульвы, пениса, шейки матки, миометрия, эндометрия, щитовидной железы (например, фолликулярную карциному щитовидной желе

- 11 046193 зы), надпочечников, предстательной железы, кожи и прилежащих органов (например, меланому, базальноклеточную карциному, плоскоклеточную карциному, кератоакантому, диспластический невус); гематологические злокачественные опухоли (например, лейкозы, лимфомы) и предраковые гематологические нарушения и нарушения с пограничной злокачественностью, включая гематологические злокачественные заболевания и связанные с ними состояния клеток лимфоидного ряда (например, острый лимфолейкоз [ALL], хронический лимфолейкоз [CLL], В-клеточные лимфомы, такие как диффузная В-клеточная крупноклеточная лимфома [DLBCL], фолликулярная лимфома, лимфома Беркитта, лимфома клеток мантийной зоны, Т- клеточные лимфомы и лейкозы, лимфомы натуральных клеток-киллеров [NK], лимфомы Ходжкина, лейкоз ворсистых клеток, моноклональную гаммапатию неясного генеза, плазмоцитому, множественную миелому и лимфопролиферативные нарушения после трансплантации), а также гематологические злокачественные и родственные состояния клеток миелоидного ряда (например, острый миелолейкоз [AML], хронический миелолейкоз [CML], хронический миеломоноцитарный лейкоз [CMML], гиперэозинофильный синдром, миелопролиферативные расстройства, такие как полицитемия вера, эссенциальная тромбоцитемия и первичный миелофиброз, миелопролиферативный синдром, синдром миелодисплазии и промиелоцитарный лейкоз); опухоли мезенхимального происхождения, например, саркомы мягких тканей, кости или хряща, такие как остеосаркомы, фибросаркомы, хондросаркомы, рабдомиосаркомы, лейомиосаркомы, липосаркомы, ангиосаркомы, саркому Капоши, саркому Юинга, синовиальную саркому, эпителиоидные саркомы, желудочно-кишечные стромальные опухоли, доброкачественные и злокачественные гистоцитомы и дерматофибросаркому протуберанс; опухоли центральной или периферической нервной системы (например, астроцитомы, глиомы и глиобластомы, менингиомы, эпендимомы, опухоли эпифиза и шванномы); эндокринные опухоли (например, опухоли гипофиза, опухоли надпочечников, опухоли островковых клеток, опухоли паращитовидных желез, карциноидные опухоли и медуллярную карциному щитовидной железы); опухоли глаз и их придатков (например, ретинобластому); опухоли зародышевых клеток и трофобласта (например, тератомы, семиномы, дисгерминомы, пузырный занос и хориокарциному); и педиатрические и эмбриональные опухоли (например, медуллобластомы, нейробластомы, опухоль Вильмса и примитивные нейроэктодермальные опухоли); или синдромы, врожденные или иные, которые делают больного восприимчивым к возникновению злокачественного новообразования (например, пигментной ксеродермы).

В дополнительном варианте осуществления, рак выбирают из злокачественных гематологических заболеваний, таких как неходжкинская лимфома (NHL), лимфома Беркитта (BL), множественная миелома (ММ), В-клеточный хронический лимфолейкоз (B-CLL), В- и Т-клеточный острый лимфолейкоз (ALL), Т-клеточная лимфома (TCL), острый миелолейкоз (AML), лейкоз ворсистых клеток (HCL), лимфома Ходжкина (HL) и хронический миелолейкоз (CML).

Используемый в изобретении термин предотвращение включает введение защищающей композиции до возникновения заболевания. Подавление относится к введению композиции после события, приводящего к возникновению заболевания, но до клинического проявления заболевания. Лечение включает введение защищающей композиции после проявления симптомов заболевания.

Известны и доступны системы экспериментальных моделей на животных, которые могут быть использованы для скрининга эффективности пептидных лигандов для предотвращения или лечения заболевания. Настоящее изобретение позволяет облегчить использование систем моделей на животных, что дает возможность разрабатывать полипептидные лиганды, которые могут перекрестно реагировать с мишенями у человека и животных, что и позволяет использовать модели на животных.

Далее изобретение дополнительно описано с помощью представленных ниже примеров.

Примеры

В большинстве случаев некоторые из гетеротандемных бициклических пептидных комплексов по изобретению могут быть получены следующим общим методом:

- 12 046193

Все растворители дегазируют и продувают с помощью N2 3 раза. Раствор ВР-23825 (1,0 экв.), HATU (1,2 экв.) и DIEA (2,0 экв.) в DMF смешивают в течение 5 мин, затем добавляют Бицикл 1 (1,2 экв.). Реакционную смесь перемешивают при 40°C в течение 16 ч. Реакционную смесь затем концентрируют при пониженном давлении с удалением растворителя и очищают препаративной HPLC с получением промежуточного соединения 2.

Смесь промежуточного соединения 2 (1,0 экв.) и бицикла 2 (2,0 экв.) растворяют в t-BuOH/H₂O (1:1) и затем добавляют CuSO₄ (1,0 экв.), VcNa (4,0 экв.) и ТНРТА (2,0 экв.). И наконец, добавляют 0,2 М NH4HCO₃ для доведения величины рН до 8. Реакционную смесь перемешивают при 40°C в течение 16 ч в атмосфере N2. Реакционную смесь непосредственно очищают препаративной HPLC.

Более подробные описания экспериментов по получению выбранных гетеротандемных бициклических пептидных комплексов по изобретению приведены ниже.

Пример 1. Синтез BCY11863.

- 13 046193

Методика получения BCY12476.

Смесь N-(KUCTOTa-PEG₃)-N-6uc(PEG₃-a3ug) (70,0 мг, 112,2 мкмоль, 1,0 экв.), HATU (51,2 мг, 134,7 мкмоль, 1,2 экв.) и DIEA (29,0 мг, 224,4 мкмоль, 40 мкл, 2,0 экв.) растворяли в DMF (2 мл) и смешивали в течение 5 мин. Затем добавляли BCY8116 (294,0 мг, 135,3 мкмоль, 1,2 экв.). Реакционную смесь перемешивали при 40°C в течение 16 ч. Анализ методом LC-MS обнаруживал один основной пик с требуемой величиной m/z. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении с удалением растворителя и получали остаток. Остаток затем очищали препаративной HPLC.

Получали BCY12476 (194,5 мг, 66,02 мкмоль, 29% выход, 94% чистота) в виде белого твердого вещества. Рассчитанная величина MW: 2778,17, наблюдаемые величины m/z: 1389,3 ([М+2Н]²+), 926,7 ([М+3Н]³⁺).

Методика получения BCY11863.

N₃

O'

BCY12476 n^n

BCY8928—A Ν

O'

BCY8S28 ν=_ν ,Ν .Ο.

CuSO₄5H₂O VcNa ТНРТА

BCY8928 ----------------------t-BuOH/O.2 М NH₄HCO₃(1:1) _BCY8116

Ν

Η

О О BCY11863

Смесь BCY12476 (100,0 мг, 36,0 мкмоль, 1,0 экв.), BCY8928 (160,0 мг, 72,0 мкмоль, 2,0 экв.) сначала растворяли в 2 мл t-BuOH/H₂O (1:1), и затем добавляли CuSO₄ (0,4 М, 180 мкл, 1,0 экв.) и VcNa (28,5 мг, 143,8 мкмоль, 4,0 экв.), ТНРТА (31,2 мг, 71,8 мкмоль, 2,0 экв.). И наконец, добавляли 0,2 М NH4HCO3 для доведения величины рН до 8. Все растворители дегазировали и продували с помощью N2. Реакционную смесь перемешивали при 40°C в течение 16 ч в атмосфере N2. Анализ методом LC-MS показывал, что оставался BCY8928 и также обнаруживался пик с требуемой величиной m/z. Реакционную смесь непосредственно очищали препаративной HPLC. Первая очистка давала BCY11863 (117,7 мг, 15,22 мкмоль, 42,29% выход, 93,29% чистота) в виде TFA соли, после чего снова очищали менее чистые фракции методом препаративной HPLC, получая BCY11863 (33,2 мг, 4,3 мкмоль, 12% выход, 95% чистота) в виде TFA соли. Рассчитанная величина MW: 7213,32, наблюдаемая величина m/z: 1444,0 ([М+5Н]5+).

- 14 046193

Пример 2. Синтез BCY13390.

Методика получения BCY13689.

CuSO₄'5H₂O VcNa ΤΗΡΤΑ

BCY8928 ----------------------t-BuOH/O.2 M NH₄HCO₃(1:1)

Смесь BCY12476 (47,0 мг, 16,91 мкмоль, 1,0 экв.), BCY8928 (30,0 мг, 13,53 мкмоль, 0,8 экв.) и ТНРТА (36,7 мг, 84,55 мкмоль, 5,0 экв.) растворяли в смеси t-BuOH/H₂O (1:1, 8 мл, предварительно дегазированной и продутой с помощью N2), и затем добавляли CuSO₄ (0,4 М, 21,0 мкл, 0,5 экв.) и VcNa (67,0 мг, 338,21 мкмоль, 20,0 экв.) в атмосфере N2. Величину рН этого раствора доводили до 8 путем добавления по каплям 0,2 М NH4HCO3 (в 1:1 t-BuOH/H₂O), и раствор приобретал желтый цвет. Реакционную смесь перемешивали при 25°C в течение 1,5 ч в атмосфере N2. Анализ методом LC-MS показывал, что оставалось некоторое количество BCY12476, BCY8928 полностью прореагировал, и был обнаружен пик с требуемой величиной m/z. Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением остатка. Неочищенный продукт очищали препаративной HPLC и получали BCY13689 (25,3 мг, 4,56 мкмоль, 27% выход, 90% чистота) в виде белого твердого вещества. Рассчитанная величина MW: 4995,74, наблюдаемые величины m/z: 1249,4 ([М+4Н]4+), 999,9([М+5Н]⁵⁺).

- 15 046193

Методика получения BCY13390.

, CuSO₄-5H₂O VcNa ΤΗΡΤΑ

BCY13389 ---------------------t-BuOH/0 2 Μ МН₄НСОз(1:1)

Смесь BCY13689 (43,6 мг, 8,73 мкмоль, 1,0 экв.), BCY13389 (20,8 мг, 9,16 мкмоль, 1,05 экв.) и ТНРТА (3,8 мг, 8,73 мкмоль, 1,0 экв.) растворяли в смеси t-BuOH/H₂O (1:1, 1 мл, предварительно дегазированной и продутой с помощью N2) и затем добавляли CuSO₄ (0,4 М, 22,0 мкл, 1,0 экв.) и VcNa (3,5 мг, 17,45 мкмоль, 2,0 экв.) в атмосфере N2. Величину рН этого раствора доводили до 8 путем добавления по каплям 0,2 М NH4HCO₃ (в 1:1 t-BuOH/H₂O), и раствор приобретал светло-желтый цвет. Реакционную смесь перемешивали при 25°C в течение 2 ч в атмосфере N2. Анализ методом LC-MS обнаруживал значительный пик, соответствующий требуемой величине m/z. Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением остатка. Неочищенный продукт очищали препаративной HPLC, и получали BCY13390 (33,8 мг, 4,21 мкмоль, 48% выход, 90% чистота) в виде белого твердого вещества. Рассчитанная величина MW: 7270,41, наблюдаемые величины m/z: 1454,9([M+5H]5+), 1213,2 ([М+6Н]⁶⁺).

Пример 3. Синтез BCY13582.

- 16 046193

Методика получения BCY13582.

Смесь BCY13390 (5,0 мг, 0,6 мкмоль, 1,0 экв.), 6uotuh-PEG12-NHS эфира (CAS 365441-71-0, 0,7 мг, 0,72 мкмоль, 1,1 экв.) растворяли в MeCN/H₂O (1:1, 2 мл). Величину рН этого раствора доводили до 8 путем добавления по каплям 1,0 М NaHCO₃. Реакционную смесь перемешивали при 25°C в течение 0,5 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что BCY13390 полностью прореагировало, и был обнаружен один основной пик с требуемой величиной m/z. Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением остатка. Неочищенный продукт очищали препаративной HPLC и получали BCY13582 (2,5 мг, 0,30 мкмоль, 43% выход, 96% чистота) в виде белого твердого вещества. Рассчитанная величина MW: 8096,43, наблюдаемые величины m/z: 1351,1 ([М+6Н]6+), 1158,5 ([М+7Н]⁷⁺).

Пример 4. Синтез BCY13583.

Методика получения BCY13583.

Alexa486-NHS

Смесь BCY13390 (15,0 мг, 2,06 мкмоль, 1,0 экв.) и Alexa fluor® 488 MIS эфира (2,5 мг, 4,12 мкмоль, 2,0 экв.) растворяли в DMF (0,5 мл). Затем добавляли по каплям DIEA (2,6 мг, 20,63 мкмоль, 3,6 мкл,

- 17 046193 экв.). Реакционную смесь перемешивали при 25°C в течение 1 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что оставался BCY13390, и был обнаружен один основной пик с требуемой величиной m/z. К реакционной смеси добавляли дополнительное количество Alexa fluor® 488 NHS эфира (2,0 мг, 3,09 мкмоль, 1,5 экв.) и реакционную смесь перемешивали при 25°C в течение еще 1 ч. Анализ методом HPLC показывал, что BCY13390 полностью прореагировал. Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением остатка. Неочищенный продукт очищали препаративной HPLC и получали BCY13583 (5 мг, 0,61 мкмоль, 29% выход, 95% чистота) в виде красного твердого вещества. Рассчитанная величина MW: 7787,9, наблюдаемые величины m/z: 1948,8 ([М+4Н+Н₂О]⁴⁺), 1558,6 ([М+5Н+Н2О]⁵⁺), 1299,1 ([М+7Н+Н2О]⁷⁺).

Пример 5. Синтез BCY13628.

Методика получения BCY13628.

Смесь BCY13390 (5,6 мг, 0,77 мкмоль, 1,0 экв.) и цианина 5 NHS эфира (0,5 мг, 0,85 мкмоль, 1,1 экв.) растворяли в MeCN/H₂O (1:1, 2 мл). Величину рН этого раствора доводили до 8 путем добавления по каплям 1,0 М NaHCO₃. Реакционную смесь перемешивали при 25°C в течение 0,5 ч. Анализ методом LC-MS показывал, что BCY13390 полностью прореагировал и был обнаружен один основной пик с требуемой величиной m/z. Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением остатка. Неочищенный продукт очищали препаративной HPLC и получали BCY13628 (2,9 мг, 0,36 мкмоль, 46% выход, 95% чистота) в виде голубого твердого вещества. Рассчитанная величина MW: 7736,06, наблюдаемые величины m/z: 1289,9 ([М+6Н]⁶⁺), 1105,5 ([М+7Н]⁷⁺).

- 18 046193

Пример 6. Синтез BCY15155.

Методика получения BCY15155.

Смесь BCY13689 (25,0 мг, 5,00 мкмоль, 1,0 экв.), BCY14601 (13,0 мг, 6,01 мкмоль, 1,2 экв.) и ТНРТА (2,0 мг, 5,00 мкмоль, 1,0 экв.) растворяли в смеси t-BuOH/0,2 M NH₄HCO₃ (1:1, 0,5 мл, предварительно дегазированной и продутой с помощью N2) и затем добавляли CuSO₄ (0,4 M, 12,5 мкл, 1,0 экв.) и Vc (3,5 мг, 20,02 мкмоль, 4,0 экв.) в атмосфере N2. Величину рН этого раствора доводили до 8, и раствор приобретал желтый цвет. Реакционную смесь перемешивали при 25°C в течение 2 ч в атмосфере N2. Анализ методом LC-MS показывал, что BCY13689 полностью прореагировал, оставалось некоторое количество BCY14601, и был обнаружен один основной пик с требуемой величиной m/z. Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением остатка. Неочищенный продукт очищали препаративной HPLC и получали BCY15155 (19,7 мг, 2,41 мкмоль, 36% выход, 97% чистота) в виде белого твердого вещества. Рассчитанная величина MW: 7171,3, наблюдаемые величины m/z: 1434,7 ([М+5Н]⁵+), 1196,2 ([М+6Н]⁶⁺).

- 19 046193

Пример 7. Синтез BCY14602.

cuso₄’bH₂o VcNa ιηργα t-BuOH/O.2 M NH₄HCO₃(1:1)

Методика получения BCY14602.

Смесь BCY12476 (100,0 мг, 36,00 мкмоль, 1,0 экв.), BCY14601 (158,0 мг, 72,63 мкмоль, 2,04 экв.) и ТНРТА (15,6 мг, 36,00 мкмоль, 1,0 экв.) растворяли в смеси t-BuOH/0,2 M NH₄HCO₃ (1:1, 2 мл, предварительно дегазированной и продутой с помощью N2) и затем добавляли CuSO₄ (0,4 M, 89,0 мкл, 1,0 экв.) и VcNa (28,5 мг, 143,98 мкмоль, 4,0 экв.) в атмосфере N2. Величину рН этого раствора доводили до 8, и раствор приобретал желтый цвет. Еще раз два раза добавляли ТНРТА и VcNa и общий раствор перемешивали при 25°C в течение 48 ч в атмосфере N2. Анализ методом LC-MS показывал, что BCY12476 полностью прореагировал, BCY14601 оставался, и был обнаружен один основной пик с требуемой величиной m/z. Было также обнаружено некоторое количество побочного продукта. Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением остатка. Неочищенный продукт очищали препаративной HPLC и получали BCY14602 (45,2 мг, 5,51 мкмоль, 15% выход, 86% чистота) в виде белого твердого вещества. Рассчитанная величина MW: 7129,2, наблюдаемые величины m/z: 1426,6 ([М+5Н]⁵⁺), 1189,1 ([М+6Н]⁶⁺).

Данные анализа

Проводили анализ следующих гетеротандемных бициклических пептидных комплексов по изобретению методами масс-спектрометрии высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC). Анализы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии проводили при указанных ниже условиях:

подвижная фаза: A: 0,1% TFA в Н₂О В: 0,1% TFA в ACN;

расход: 1,0 мл/мин;

колонка: Gemini-NX C18 5 мкм 110А 150x4,6 мм;

прибор: Agilent 1200 HPLC-BE(1-614).

- 20 046193

Использовали градиенты 30-60% В в течение 20 мин, и были получены следующие данные.

№ комплекса	Данные анализа методом масс-спектроскопии	Время удерживания (мин) методом HPLC
BCY11863	рассчитанная величина MW: 7213,32, наблюдаемая величина m/z: 1444,0 ([М/5+Н]+)	10,649

Данные исследования биологической активности

1. Репортерный анализ на CD137 в совместной культуре с опухолевыми клетками.

Культуральную среду, называемую средой R1, готовят путем добавления 1% FBS к RPMI-1640 (компонент набора Promega CS196005). Серийные разведения испытуемых образцов в R1 готовят в стерильном 96-луночном планшете. Добавляют 25 мкл на лунку исследуемых образцов или R1 (в качестве фонового контроля) в указанные лунки в планшете белого цвета для культивирования клеток. Опухолевые клетки* собирают и ресуспендируют в среде R1 при концентрации 400000 клеток/мл. Двадцать пять (25) мкл/лунка опухолевых клеток добавляют в планшет белого цвета для культивирования клеток. Клетки Jurkat (набор Promega CS196005, 0,5 мл) размораживают на водяной бане и затем добавляют к 5 мл предварительно подогретой среды R1. Двадцать пять (25) мкл/лунка клеток Jurkat затем добавляют в планшет белого цвета для культивирования клеток. Инкубируют клетки и испытуемые образцы в течение 6 ч при 37°C, 5% CO₂. По истечении 6 ч добавляют 75 мкл/лунка реагента Bio-Glo™ (Promega) и инкубируют в течение 10 мин, затем считывают люминесценцию на планшет-ридере (Clariostar, BMG). Рассчитывают кратность изменения по отношению к взятым отдельно клеткам (клетки Jurkat+клеточная линия, используемая при совместном культивировании) и строят графическую зависимость ответа от логарифма концентрации (агониста) с использованием программного обеспечения GraphPad Prism для определения величины ЕС₅₀ (нМ) и кратности индукции относительно фона (Мах).

Опухолевые клетки, используемые в совместной культуре, представляют собой NCI-H292, СТ26 #7, МС38 #13, НТ1376, NCI-H322 и T47D, которые, как было показано, экспрессируют нектин-4.

Данные, представленные на фиг. 1А, показывают, что гетеротандем нектин-4/CD137 (BCY11863) индуцирует сильную активацию CD137 в репортерном анализе на CD137, и активация зависит от связывания гетеротандема с CD137. BCY11617, молекула, в которой CD137 бициклический пептид состоит полностью из D-аминокислот, которые предотвращают связывание, не индуцирует агонизма CD137.

Данные по величине ЕС₅₀ (нМ), индуцируемой гетеротандемным бициклическим пептидным комплексом BCY11863 и его наиболее близкими аналогами, полученные при репортерном анализе на CD137 в совместной культуре с нектин-4-экспрессирующей линией опухолевых клеток, приведены в табл. 1 ниже и представлены на фиг. 1В. Эти данные демонстрируют способность BCY11863 индуцировать агонизм CD137 в совместной культуре с клеточными линями, которые экспрессируют в различной степени нектин-4.

Таблица 1

Величина ЕС₅₀ (нМ) кратности индукции относительно фона, вызываемой нектин-4/CD137 гетеротандемными бициклическими пептидными комплексами в репортерном анализе на CD137

№ комплекса	Линия опухолевых клеток представителя биологического вид	Линия клеток, используемая в совместной культуре	Средняя арифметическая величина ЕС50 (нМ)
BCY11863	мышь	СТ26#7	0,14±0,07
BCY11863	мышь	МС38#13	0,31±0,26
BCY11863	человек	NCI-H292	0,28±0,20
BCY11863	человек	НТ1376	0,52±0,30
BCY11863	человек	NCI-H322	0,33±0,21
BCY11863	человек	T47D	0,42±0,24
BCY11863	человек	MDA-MB-468	0,23±0,01
BCY13582	человек	НТ1376	0,58±0,27
BCY13582	человек	MDA-MB-468	0,34±0,02
BCY13583	человек	НТ1376	1,7±0,9
BCY13583	человек	MDA-MB-468	0,84±0,07

- 21 046193

2. Анализ в совместной культуре мононуклеарные клетки периферической крови человека (РВМС)опухолевые клетки (анализ высвобождения цитокинов).

Опухолевые линии клеток человека и мыши культивировали в соответствии с рекомендациями фирм-поставщиков. Замороженные РВМС здоровых людей-доноров оттаивали и промывали один раз в PBS при комнатной температуре, а затем ресуспендировали в среде R10. Для анализа совместной культуры, высевали 100 мкл РВМС (1000000 РВМС/мл) и 100 мкл опухолевых клеток (100000 опухолевых клеток/мл) (соотношение эффектор:клетки-мишени (Э:Т) 10:1) в каждую лунку 96-луночного планшета с плоским дном. 100 нг/мл растворимого моноклонального антитела (mAb) против CD3 (клон OKT3) добавляли в культуру в день 0 для стимуляции РВМС человека. Испытуемые соединения, контрольные соединения или контрольные среды (плацебо) разводили в среде R10 и добавляли по 50 мкл в соответствующие лунки с доведением конечного объема лунки до 250 мкл. Планшеты накрывали воздухопроницаемой пленкой и инкубировали во влажной камере при 37°C с 5% CO₂ в течение трех дней. Через 48 ч после стимуляции, собирали надосадочные жидкости и определяли в них IL-2 и IFN-γ человека с помощью анализатора Luminex. Вкратце стандарты и образцы добавляли в 96-луночный планшет черного цвета. Добавляли и встряхивали в течение 2 ч при комнатной температуре коктейль из микрочастиц (предоставляется в комплекте Luminex, R&D Systems). Планшет промывали 3 раза с использованием магнитного держателя. Затем в планшет добавляли коктейль с биотином и встряхивали в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшет промывали 3 раза с использованием магнитного держателя. Добавляли в планшет коктейль из стрептавидина и встряхивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Планшеты промывали 3 раза с использованием магнитного держателя, ресуспендировали в 100 мкл промывочного буфера, встряхивали в течение 2 мин при комнатной температуре и считывали с помощью анализатора Luminex 2000. Проводили анализ полученных исходных данных с использованием встроенного программного обеспечения Luminex для построения стандартных кривых и интерполяции концентраций белка, все остальные анализы данных и построение графиков проводили с использованием программного обеспечения Excel и Prism. Данные относятся к одному исследованию с 3-5 независимыми донорскими РВМС, подвергнутых испытанию в трех параллельных экспериментах.

Данные, представленные на фиг. 2А и 2В, показывают, что нектин-4/CD137 гетеротандем (BCY11863) индуцирует устойчивую секрецию цитокинов IL-2 и IFN-γ при анализе в совместной культуре РВМС-4Т1. BCY11617 используют в качестве отрицательного контроля, который связывает нектин-4, но не связывает CD137.

Данные по величине ЕС₅₀ (нМ) и максимальной секреции цитокина IFN-γ (пг/мл), индуцированной выбранными нектин-4/CD137 гетеротандемными бициклическими пептидными комплексами в анализе совместной культуре РВМС человека (высвобождение цитокина), приведены в табл. 2 ниже и изображены на фиг. 2С. Они демонстрируют способность BCY11863 индуцировать секрецию цитокина в присутствии ряда различных линий опухолевых клеток, экспрессирующих нектин-4.

Таблица 2

Величина ЕС₅₀ при секреции цитокина IFN-γ, индуцированной выбранными нектин-4/CD137 гетеротандемными бициклическими пептидными комплексами при анализе в совместной культуре РВМС человека-4Т 1 (высвобождение цитокина)

Клеточная линия	IL-2 (нМ)	IFN-γ (нМ)	Число доноров
МСЗ 8 #13 (мыши)	0,25±0,08	0,17±0,11	4
4T1-D02 (мыши)	0,16±0,22	0,04±0,04	4
НТ1376 (человека)	0,39±0,29	0,23±0,15	5
T-47D (человека)	0,20±0,07	0,08±0,06	3
Н322 (человека)	0,84±0,15	0,85±0,66	3
BCY11863	4Т1- парентерально (нектин4-)	Отсутствие индуцирования вплоть до 100 нМ

3. Исследование фармакокинетики нектин-4/CD137 гетеротандема BCY11863 на крысах SD.

Самцам крыс SD вводили нектин-4/CD137 гетеротандем BCY11863, приготовленный в 25 мМ гистидина HCl, 10% сахарозы, рН 7, путем внутривенного струйного введения, внутривенного капельного введения (15 мин) или подкожно. Проводили последовательный отбор крови (приблизительно 80 мкл крови/момент времени) из подчелюстной или подкожной вены в каждый момент времени. Все образцы крови незамедлительно переносили в предварительно охлажденные микроцентрифужные пробирки, содержащие 2 мкл K2-EDTA (0,5М) в качестве антикоагулянта, и помещали на натуральный лед. Образцы крови незамедлительно подвергали обработки с получением плазмы путем центрифугирования при при

- 22 046193 близительно 4°C при 3000 g. В плазму быстро добавляли осадитель, содержащий внутренний стандарт, хорошо смешивали и центрифугировали при 12000 об/мин, при 4°C в течение 10 мин. Надосадочную жидкость переносили в предварительно маркированные полипропиленовые микроцентрифужные пробирки, и затем быстро замораживали на сухом льду. Образцы хранили при -70°C или ниже в необходимом количестве до проведения анализа. Образцы надосадочной жидкости объемом 7,5 мкл непосредственно вводили в прибор для проведения жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS) Orbitrap Q Exactive в режиме детекции положительно заряженных ионов для определения концентраций в анализируемом образце. Проводили анализ зависимости концентрации в плазме от времени в соответствии с некомпартментными методиками, используя программное обеспечение Phoenix WinNonlin 6.3. Регистрировали С0, Cl, Vdss, T¹/₂, AUC(_0-last), AUC(_0-inf), MRT(₀._last), MRT(_0-inf) и строили кривые зависимости концентрации в плазме от времени. Фармакокинетические параметры, полученные в этом эксперименте, приведены в табл. 3.

Таблица 3

Фармакокинетические параметры на крысах SD

Соединение	Доза (мг/кг)	Способ дозирования	Т1/2( ч)	Vdss (л/кг)	С1р (мл/мин/кг)	%F
BCY11863	1,9	внутривенный болюс	4,1	1,6	7,7	-
3,2	внутривенная инфузия (15 минут)	3,1	1,3	9,3	-
6,3	подкожно	2,5	-	-	95%

Данные в табл. 3 выше и на фиг. 5 показывают, что BCY11863 представляет собой молекулу с низким клиренсом с объемом распределения большим, чем объем плазмы. Кроме того, биодоступность при подкожном дозировании BCY11863 является высокой у крыс.

Таблица 4

Фармакокинетические параметры BCY11863 и возможных метаболитов, полученные при фармакокинетическом исследовании на крысах SD после внутривенного введения дозы 100 мг/кг

Анализируемые вещества	Стах (нг/мл)	AUC (нг.ч/мл)	Т1/2(ч)	Vdss (л/кг)	С1р (мл/мин/кг)
BCY11863	279540	129863	5,4	2,3	13
BCY15155	2854	1296	3,1	-	-
BCY14602	-	-	-	-	-

Данные в табл. 4 и на фиг. 14 показывают, что <1% BCY11863 метабилизируется в BCY15155 при внутривенном введении BCY11863 крысам SD. Не отмечается значимого превращения в BCY14602 в течение первых 24 ч исследования.

4. Исследование фармакокинетики нектин-4/CD137 гетеротандема BCY11863 на яванских макаках.

Ненаивным яванским макакам вводили путем внутривенной инфузии (15 или 30 мин) в подкожную вену 1 мг/кг нектин-4/CD137 гетеротандема BCY11863, приготовленный в 25 мМ гистидина HCl, 10% сахарозы, рН 7. Проводили последовательный отбор крови (приблизительно 1,2 мл крови/момент времени) из периферического кровеносного сосуда обездвиженных, не подвергнутых воздействию седативных средств животных, в каждый момент времени в выпускаемые промышленностью пробирки, содержащие соль калий (K2) EDTAx2H2O (0,85-1,15 мг), на натуральном льду и подвергали обработке с целью получения плазмы. Образцы центрифугировали (3000xg в течение 10 мин при температуре от 2 до 8°C) сразу после отбора образцов. Плазму в объеме 0,1 мл переносили в маркированные полипропиленовые микроцентрифужные пробирки. В плазму быстро добавляли 5-кратное количество осадителя, включающего внутренний стандарт 100 нг/мл лабеталол+100 нг/мл дексаметазон+100 нг/мл толбутамид+100 нг/мл верапамил+100 нг/мл глибурид+100 нг/мл целекоксиб в растворе плазмы в МеОН, хорошо смешивали и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 мин при температуре от 2 до 8°C. Образцы надосадочной жидкости переносили в предварительно маркированные полипропиленовые микроцентрифужные пробирки и замораживали на сухом льду. Образцы хранили при -60°C или ниже до проведения анализа методом LC-MS/MS. Аликвоту 40 мкл калибровочного стандарта, контроля качества, одиночного холостого и двойного холостого образцов добавляли в пробирку объемом 1,5 мл. Каждый образец (за исключением двойного холостого) гасили с помощью 200 мкл IS 1 соответственно (двойной холостой образец гасили с помощью 200 мкл МеОН с 0,5% triton Х-100), и затем смесь хорошо смешивали с помощью смесителя Vortex (по меньшей мере 15 с) и центрифугировали в течение 15 мин при 12000 g при 4°C. Образцы надосадочной жидкости объемом 10 мкл вводили в прибор для проведения жидкостной хроматогра

- 23 046193 фии с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS) Orbitrap Q Exactive в режиме детекции положительно заряженных ионов для определения концентраций в анализируемом образце. Проводили анализ зависимости концентрации в плазме от времени в соответствии с некомпартментными методиками, используя программное обеспечение Phoenix WinNonlin 6.3. Регистрировали С0, Cl, Vdss, Т1/2, AUC(₀-_last), AUC(_0-inf), MRT(_0-i_ast), MRT(_0-i_nf) и кривые зависимости концентрации в плазме от времени. Фармакокинетические параметры для двух биспецифичных соединений приведены в табл. 5.

Таблица 5 Фармакокинетические параметры на яванском макаке

Соединение	Dose (мг/кг)	Способ дозирования	Т1/г(ч)	С1р (мл/мин/кг)	Vdss (л/к)
BCY11863	0,93	внутривенная инфузия (30 мин)	5,3	3,3	0,62
0,97	внутривенная инфузия (15 мин)	4,5	4,8	0,91
9,4	внутривенная инфузия (15 мин)	8,9	3,9	1,1

На фиг. 3 приведена кривая зависимости концентрации в плазме от времени для BCY11863 после внутривенного введения 2 мг/кг крысам SD (n=3) и внутривенной инфузии 1 мг/кг IV яванским макакам (n=2). BCY11863 имеет объем распределения в равновесном состоянии (Vdss) 1,6 л/кг и клиренс 7,7 мл/мин/кг у крыс, что дает в результате конечный период полувыведения 4,1 ч. BCY11863 имеет объем распределения в равновесном состоянии (Vdss) 0,62 л/кг и клиренс 3,3 мл/мин/кг у яванских макаков, что дает в результате конечный период полувыведения 5,3 ч. Последующие исследования находятся в соответствии с этими результатами. Фармакокинетические параметры, полученные на яванских макаках при внутривенном введении, указывают, что BCY11863 представляет собой молекулу с плазменным клиренсом с объемом распределения, аналогичным общего количества воды в организме.

5. Исследование фармакокинетики нектин-4/CD137 гетеротандема BCY11863 на мышах CD1.

Шести самцам мышей CD-1. вводили каждому интраперитонеально или внутривенно 15 мг/кг некtuh-4/CD137 гетеротандема BCY11863, приготовленного в 25 мМ гистидина HCl, 10% сахарозы, рН 7. Проводили последовательный отбор крови (приблизительно 80 мкл крови/ момент времени) из подчелюстной или подкожной вены в каждый момент времени. Все образцы крови незамедлительно переносили в предварительно охлажденные микроцентрифужные пробирки, содержащие 2 мкл K2-EDTA (0,5М) в качестве антикоагулянта, и помещали на натуральный лед. Образцы крови незамедлительно подвергали обработки с получением плазмы путем центрифугирования при приблизительно 4°C при 3000 g. В плазму быстро добавляли осадитель, содержащий внутренний стандарт, хорошо смешивали и центрифугировали при 12000 об/мин, при 4°C в течение 10 мин. Надосадочную жидкость переносили в предварительно маркированные полипропиленовые микроцентрифужные пробирки, и затем быстро замораживали на сухом льду. Образцы хранили при -70°C или ниже в необходимом количестве до проведения анализа. Образцы надосадочной жидкости объемом 7,5 мкл непосредственно вводили в прибор для проведения жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS) Orbitrap Q Exactive в режиме детекции положительно заряженных ионов для определения концентраций в анализируемом образце. Проводили анализ зависимости концентрации в плазме от времени в соответствии с некомпартментными методиками, используя программное обеспечение Phoenix WinNonlin 6.3. Регистрировали С0, Cl, Vdss, Т/₂, AUC(_0-last), AUC(_0-inf), MRT(_0-last), MRT(_0-inf) и строили кривые зависимости концентрации в плазме от времени.

На фиг. 9 представлены кривые зависимости концентрации в плазме от времени для BCY11863 при интраперитонеальном введении 15 мг/кг мышам CD1 (n=3) и конечные периоды полувыведения из плазмы крови для BCY11863.

- 24 046193

Таблица 6

Фармакокинетические параметры на мышах CD-1

Соединение	Доза (мг/кг)	Способ дозирования	Т1/2 (ч)	Vdss (л/кг)	С1р (мл/мин/кг)	%F
BCY11863	5,6	внутривенный болюс	2,6	1,6	9,7
0,96	внутривенный болюс	1,7	2,9	21
12	внутривенный болюс	2,6	2,5	17
32	внутривенный болюс	2,4	2,1	16
15,5	интраперитонеально	2,5	-	-	100

Данные на фиг. 9 и в табл. 6 выше показывают, что BCY11863 может быть введен мышам в форме внутривенного болюса и интраперитонеально. Биодоступность при интраперитонеальном дозировании BCY11863 является высокой у мышей. Фармакокинетические параметры, полученные при исследовании внутривенного введения, указывают, что BCY11863 представляет собой молекулу с низким клиренсом с объемом распределения большим, чем объем плазмы.

6. Противоопухолевая активность BCY11863 в модели сингенной опухоли МС38 (МС38#13), сверхэкспрессирующей нектин-4.

Самкам мышей линии C57BL/6J-hCD137 в возрасте 6-8 недель инокулировали в бок 1x106 сингенных клеток МС38 (МС38#13), сверхэкспрессирующих нектин-4. Когда опухоли достигали среднего размера 72 мм³, мышей рандомизировали для введения среды (плацебо) или BCY11863 (путем интраперитонеального введения). BCY11863 вводили (n=6 мышей/подвергаемая лечению группа) в дозе либо 1 мг/кг, либо 10 мг/кг, или ежедневно (QD), или один раз каждые три дня (Q3D). Дозируемые ежедневно мыши получали 16 доз BCY11863, а дозируемые один раз каждые три дня мыши получали 10 доз BCY11863. Рост опухоли постоянно контролировали путем проведения измерений с помощью штангенциркуля вплоть до дня 69 после начала лечения. Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 4, на которой видно статистически значимое уменьшение (р<0,05, двухфакторный дисперсионный анализ с критерием Даннета для множественных сравнений) роста опухоли в двух подвергаемых лечению группах 2 ко дню 7, и ко дню 14 все подвергаемые лечению группы статистически значимо отличались от группы с плацебо (в которой вводили среду). Ко дню 48, 22 из 24 подвергнутых лечению с помощью BCY11863 животных демонстрировали полный ответ на лечение и не имели оставшихся пальпируемых опухолей.

Исходя из периода полувыведения циркулирующего в плазме BCY11863 у мышей после интраперитонеальной инъекции (2,5 ч) минимальные уровни в плазме будут близки к 0 после обеих доз BCY11863 (1 и 10 мг/кг) и интервалов дозирования (QD и Q3D), тем самым демонстрируя, что не являющееся постоянным содержание в плазме BCY11863 в результате интермиттирующего дозирования является достаточным для достижения значительной противоопухолевой активности, приводящей к длительным полным ответам.

7. Лечение с помощью BCY11863 вызывает иммунологическую память в модели опухоли МС38, сверхэкспрессирующей нектин-4.

На день 69, 5 животным, которые имели полные ответы на лечение с помощью BCY11863, повторно инокулировали 1x106 клеток МС38#13. Группе из 5 наивных самок мышей линии C57BL/6J-hCD137 инокулировали 1x106 клеток МС38#13 в качестве контроля. Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 5, на которой видно, что у всех 5 инокулированных наивных самок мышей линии C57BL/6JhCD137 выросли опухоли ко дню 13 после инокуляции, в то время как ни у одной из инокулированных мышей с полным ответом опухоли не развивались. Это показывает, что животные, которые достигали полного противоопухолевого ответа в результате лечения с помощью BCY11863, имеют развитую иммунологическую память.

8. BCY11863 демонстрирует противоопухолевую активность в модели сингенной опухоли СТ26 (СТ26#7), сверхэкспрессирующей нектин-4.

Самкам мышей линии BALB/c-hCD137 в возрасте 6-8 недель инокулировали в бок 3x105 сингенных клеток СТ26 (СТ26#7), сверхэкспрессирующих нектин-4. Когда опухоли достигали среднего размера 70 мм³, мышей рандомизировали для введения среды (плацебо) или 5 мг/кг BCY11863 интраперитонеально один раз каждые три дня (суммарно 6 доз). Рост опухоли постоянно контролировали путем прове

- 25 046193 дения измерений с помощью штангенциркуля вплоть до дня 14 после начала лечения. Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 6, на которой видно, что лечение с помощью BCY11863 статистически значимо (р<0,0001, критерий Стьюдента) уменьшало рост опухоли от дня 7 и далее.

Исходя из периода полувыведения циркулирующего в плазме BCY11863 у мышей после интраперитонеальной инъекции (2,5 ч) содержание BCY11863 в плазме крови не будет постоянным на протяжении всего периода дозирования, демонстрируя, что не являющееся постоянным содержание в плазме BCY11863 является достаточным для достижения значительной противоопухолевой активности.

9. Суммарное количество Т-клеток и CD8+ Т-клеток увеличивается в ткани опухоли СТ26#7 через 1 ч после последнего (шестого) Q3D дозирования BCY11863.

Через 1 ч после последнего введения плацебо (среды) или BCY11863, несущих опухоли CD26#7 мышей умерщвляли, и опухоли собирали, обрабатывали с целью получения суспензий отдельных клеток и окрашивали для анализа методом проточной цитометрии на суммарное количество Т-клеток (CD45+CD3+), CD8+ Т-клеток (CD45+CD3+CD8+), CD4+ Т-клеток (CD45+CD3+CD4+) и регуляторных Т-клеток (регуляторные Т-клетки; CD45+CD3+CD4+Foxp3+). Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 7, на которой можно увидеть, что лечение с помощью BCY11863 приводило к статистически значимому увеличению суммарного количества Т-клеток (р<0,0001, критерий Стьюдента) и CD8+ Т-клеток (р<0,0001, критерий Стьюдента), а также к статистически значимому увеличению отношения CD8+ Т клетки/регуляторные Т-клетки (р<0,05, критерий Стьюдента).

Это показывает, что лечение с помощью BCY11863 может приводить к повышению уровня Т-клеток локально в опухолевой ткани после интермиттирующего дозирования.

10. Фармакокинетические профили BCY11863 в плазме и опухолевой ткани животных, несущих сингенную опухоль СТ26#7, после разового внутривенного (iv) введения 5 мг/кг BCY11863.

Самкам мышей линии BALB/c в возрасте 6-8 недель инокулировали в бок 3х10⁵ сингенных клеток опухоли СТ26 (СТ26#7), сверхэкспрессирующих нектин-4. Когда опухоли достигали среднего размера приблизительно 400 мм³, мышей рандомизировали для введения им разовой внутривенной дозы плацебо (среды) или 5 мг/кг BCY11863. Группу мышей (n=3/момент времени) умерщвляли в моменты времени 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8 и 24 ч, и собранную плазму и опухолевую ткань анализировали на BCY11863. Для анализа содержания BCY11863 в опухоли, приготавливали гомогенат опухоли путем гомогенизации ткани опухоли с 10 объемами (масса:объем) гомогенизирующего раствора (МеОН/15 мМ PBS (1:2, по объему)). 40 мкл Образца гасили с помощью 200 мкл IS1 и смесь перемешивали на вортексе в течение 10 мин при 800 об/мин и центрифугировали в течение 15 мин при 3220 g при 4°C. Надосадочную жидкость переносили в другой чистый 96-луночный планшет и центрифугировали в течение 5 мин при 3220 g при 4°C, и 10,0 мкл надосадочной жидкости вводили в прибор для проведения жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS) Orbitrap Q Exactive в режиме детекции положительно заряженных ионов для определения концентраций в анализируемом образце. Для анализа содержания BCY11863 в плазме, собирали образцы крови в пробирки с K2-EDTA и незамедлительно подвергали обработки с получением плазмы путем центрифугирования при приблизительно 4°C, 3000 g. 40 мкл образца плазмы гасили с помощью 200 мкл IS1, и смесь перемешивали на вортексе в течение 10 мин при 800 об/мин и центрифугировали в течение 15 мин при 3220 g при 4°C. Надосадочную жидкость переносили в другой чистый 96-луночный планшет и центрифугировали в течение 5 мин при 3220 g при 4°C, и 10,0 мкл надосадочной жидкости затем вводили в прибор для проведения жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS) Orbitrap Q Exactive в режиме детекции положительно заряженных ионов для определения концентраций в анализируемом образце.

Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 8, на которой можно увидеть, что BCY11863 удерживался в ткани опухоли после удаления из кровообращения BCY11863, содержащегося в плазме, на что указывает разница величин T¹/2 плазмы (1,65 ч) и T¹/2 опухоли (13,4 ч) для BCY11863.

11. Преклиническое исследование связывания BCY11863 с нектин-4 и CD137 у четырех видов животных с перекрестной реактивностью.

Связывание BCY11863 с его главной мишенью нектин-4 и CD137 исследовали методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR).

(а) Нектин-4.

BCY11863 связывается с нектин-4 яванского макака, крысы, мыши и человека с величиной KD в диапазоне 5-27 нМ, измеренной путем прямого связывания с внеклеточным доменом, который был биотинилирован и захвачен стрептавидином на поверхности сенсорного чипа.

- 26 046193

Таблица 7

Величины аффинности связывания BCY11863 с биотинилированным нектин-4 внеклеточным доменом, полученные методом SPR

SPRK_d(нМ)	Тип анализа	Человек (25°С)	Человек (37 °C)	NHP (25°С)	Крыса (25°С)	Мышь (25°С)
BCY11863	Прямое связывание	5,0±2,1 п=7	5,2±1,1 п=9	27±15 п=9	15±1 п=6	4,6±2,1 п=9

Для того чтобы выяснить, изменяется ли связывание BCY11863 с нектин-4 в случае тройного комплекса, т.е., когда также происходит связывание с CD137, был разработан анализ многокомпонентного связывания методом SPR. BCY11863 сначала захватывался CD137 человека, иммоболизированным на поверхности чипа SPR, и затем нектин-4 от различных животных пропускали над поверхностью чипа для определения величин их аффинности к захваченному BCY11863 (см. фиг. 10С). Величины аффинностей к нектин-4 обычно сохранялись в присутствии связывания CD137, как показано ниже.

Таблица 8

Величины аффинности связывания BCY11863 с биотинилированным нектин-4 внеклеточным доменом при использовании биотинилированного CD137 человека в качестве реагента захвата

SPR K_D (нМ)	Тип анализа	Человек	NHP	Крыса	Мышь
BCY11863	Сэндвичанализ	12±2 п=4	28±5 п=3	25±2 п=3	6,7±1,7 п=3

(b) CD137.

Прямое связывание BCY11863 с поверхностно связанным CD137 не может быть измерено корректно методом SPR вследствие авидности, обусловленной двумя CD137 связывающими бициклами в BCY11863, что приводит к экстремально медленной k_off (см. фиг. 10В). Кроме того, биотинилирование CD137 яванского макака аннулирует связывание BCY11863, вероятно, вследствие модификации лизина на белке яванского макака, который является необходимым для BCY11863 связывания. Поэтому, аналог BCY11863, содержащий С-концевой биотинилированный лизин (BCY13582), подвергали анализу методом SPR для определения межвидовой специфичности BCY11863. BCY13582 захватывали на сенсорном чипе, используя набор для обратимого захвата биотина, и определяли величины аффинностей к нектин-4 различных видов животных. Оба подхода показали, что эти аналоги BCY11863 связывались с CD137 человека или яванского макака с величиной K_D<10 нМ и характеризовались пренебрежимо малой величиной связывания как с CD137 мыши, так и с CD137 крысы.

Таблица 9

Величины аффинности связывания биотинилированных аналогов BCY11863 с CD137 внеклеточным доменом, полученные методом SPR

SPRK_d(нМ)	Тип анализа	Человек	NHP	Крыса	Мышь
BCY13582	Прямое связывание	8,4±4,2 п=3	4,23 п=1	NB п=1	NB п=1

Для того чтобы выяснить, изменяется ли связывание BCY11863 с CD137 в случае тройного комплекса, т.е., когда также происходит связывание с нектин-4, был разработан анализ двойного связывания методом SPR. BCY11863 сначала захватывался нектин-4 человека, иммоболизированным на поверхности чипа SPR, и затем растворимый CD137 от различных животных пропускали над поверхностью чипа для определения величин их аффинности к захваченному BCY11863 (см. фиг. 10D). Величины аффинностей к CD137 обычно сохранялись в присутствии связывания нектин-4, как показано ниже.

Таблица 10

Величины аффинности связывания с CD137 внеклеточным доменом при использовании биотинилированного нектин-4 человека в качестве реагента захвата

SPR K_D (нМ)	Тип анализа	Человек	NHP	Крыса	Мышь
BCY11863	Двойное связывание	6,3±0,7 п=4	18±6 п=3	NB п=2	NB п=2

На фиг. 10А представлен один пример сенсограммы, которая показывает, что BCY11863 связывается с нектин-4 (человека) с величиной аффинности 4,1 нМ. На фиг. 10В представлена сенсограмма, которая показывает, что BCY11863 связывается с CD137 (человека) с высокой аффинностью. Вследствие присутствия двух CD137 связывающих бициклов в BCY11863, скорость диссоциации иммобилизирован

- 27 046193 ного белка CD137 является очень медленной, и приведенная величина KD может быть завышенной (фиг. 10В). На фиг. 10С показано, что BCY11863 связывается с нектин-4, в то время как CD137 боковые цепи связаны с белком CD137, иммобилизированным на чипе, с образованием тройного комплекса. На фиг. 10D показано, что BCY11863 связывается с CD137, в то время как нектин-4 связывающая боковая цепь связана с белком нектин-4, иммобилизированным на чипе, с образованием тройного комплекса. На фиг. 10Е представлена способность BCY13582, иммобилизированного на чипе SPR, связывать CD137 человека.

12. Селективность BCY11863 в отношении нектин-4 и CD137.

Скрининг паралога нектин-4. Методом SPR оценивали связывание BCY11863 с нектин-1 (2880-N1, R&D Systems), нектин-2 (2229-N2, R&D Systems), нектин-3 (3064-N3, R&D Systems), нектин-подобным-1 (3678-S4-050, R&D Systems), нектин-подобным-2 (3519-S4-050, R&D Systems), нектин-подобным-3 (4290-S4-050, R&D Systems), нектин-подобным-4 (4164-S4, R&D Systems) и нектин-подобным-5 (2530-CD050, R&D Systems) путем введения в них метки биотина и иммобилизирования их на поверхности стрептавидина. BCY11863 не демонстрировал никакого связывания с этим мишенями вплоть до концентрации 5000 нМ.

Скрининг паралога CD137. Методом SPR оценивали связывание захваченного стрептавидином BCY13582 (биотинилированного-BCY11863) с растворимыми рецепторами ОХ40 и CD40, являющимися представителями семейства TNF. BCY13582 не связывался с этими мишенями вплоть до концентрации 100 нМ.

Скрининг методом микроматричного анализа фирмы Retrogenix. Технологию микроматричного анализа клеток фирмы Retrogenix использовали для скрининга специфичных нецелевых связывающих взаимодействий биотинилированного BCY11863, известного как BCY13582.

Исследование уровней связывания испытуемого пептида с фиксированными, нетрансфицированными клетками HEK293 и с клетками, сверхэкспрессирующими нектин-4 и CD137 (TNFRSF9), показало, что для скрининга является достаточной концентрация пептида 1 мкМ. При этих условиях, проводили скрининг испытуемого пептида на связывания с клетками HEK293 человека, индивидуально экспрессирующими 5484 полноразмерных белков клеточных мембран человека и выделяемых белков. Скрининг выявил 9 первичных попаданий в цель, включающих нектин-4 и CD137.

Каждое первичное попадание в цель повторно экспрессировали наряду с двумя контрольными рецепторами (TGFBR2 and EGFR) и повторно проводили исследование с использованием 1 мкМ испытуемого пептида BCY13582, 1 мкМ испытуемого пептида BCY13582 в присутствии 100 мкМ BCY11863 и других положительных и отрицательных контрольных веществ, вводимых при лечении (фиг. 4). После удаления неспецифичных, невоспроизводимых и не незначимых попаданий, оставались три специфичных взаимодействия для испытуемого пептида. Они являлись несвязанными и связанными формами нектин-4 и CD137, представляющими собой основные мишени.

Не были выявлено специфичных нецелевых взаимодействий для BCY13582, что указывало на высокую специфичность в отношении его главных мишеней.

13. Противоопухолевая активность BCY11863 в модели сингенной опухоли МС38 (МС38#13), сверхэкспрессирующей нектин-4, при введении два раза в неделю дозы 5 мг/кг при 0, 24 ч и 10 мг/кг при 0 ч.

Самкам мышей линии C57BL/6J-hCD137 [B-hTNFRSF9(CD137); Biocytogen] в возрасте 6-8 недель имплантировали подкожно 1 х 10⁶ клеток МС38#13 (клеток МС38, сконструированных для сверхэкспрессии нектин-4 мышей). Мышей рандомизировали по группам лечения (n=6/группа лечения), когда средние объемы опухолей достигали приблизительно 95 мм³, и проводили лечение путем еженедельного дозирования плацебо (25 мМ гистидин, 10% сахароза, рН7) или 10 мг/кг BCY11863 при различных режимах дозирования на протяжении двух циклов дозирования (5 мг/кг BCY11863 при 0 и 24 ч на день D0 и день D7 или 10 мг/кг при 0 ч на день D0 и день D7). Все лечебные процедуры проводили путем внутривенного введения. Рост опухоли постоянно контролировали вплоть до дня 15 от начала лечения.

BCY11863 приводил к значительной противоопухолевой активности при обоих режимах дозирования, но режим дозирования при дозе 5 мг/кг, вводимой в моменты времени 0 и 24 ч, был более предпочтительным по сравнению с дозированием 10 мг/кг в момент времени 0 ч, что обнаруживалось при анализе достижения полных ответов на день 15 после начала лечения (фиг. 12). Введение дозы 5 мг/кг BCY11863 в моменты времени 0 и 24 ч на день D0 и D7 давало в результате 4 полных ответов из 6 ответов, в то время как введение дозы 10 мг/кг BCY11863 в момент времени 0 ч на день D0 и D7 давало один полный ответ из 6 ответов. Эти данные вместе с фармакокинетическими данными для BCY11863 в плазме мышей указывают, что поддержание концентрации BCY11863 в плазме крови на уровне, который продуцируется в результате введения 5 мг/кг в момент времени 0 ч и момент времени 24 ч при еженедельном цикле, позволяет достигать ответа, близкого к полному противоопухолевому ответу, в модели опухоли МС38#13.

14. Противоопухолевая активность BCY11863 в модели сингенной опухоли МС38 (МС38#13), сверхэкспрессирующей нектин-4.

Для проведения лечения при 3 еженедельных дозах 3, 10 и 30 мг/кг при дозах, разделенных на дозирование один раз в неделю, два раза в неделю и один раз в день, самкам мышей линии C57BL/6J

-

Claims

hCD137 [B-hTNFRSF9(CD137); Biocytogen] в возрасте 6-8 недель имплантировали подкожно 1 х 10⁶ клеток МС38#13 (клеток МС38, сконструированных для сверхэкспрессии нектин-4 мышей). Мышей рандомизировали по группам лечения ^=6/группа лечения), когда средние объемы опухолей достигали приблизительно 107 мм³, и подвергали лечению путем введения 21 ежедневных доз плацебо (25 мМ гистидина, 10% сахарозы, рН7). Лечение с помощью BCY11863 проводили при трех различных уровнях доз (3, 10 и 30 мг/кг суммарная еженедельная доза), разделенных на три различных режима (QD: один раз в сутки; BIW: два раза в неделю или QW: один раз в неделю). Различные группы лечения с помощью BCY11863 получали либо 21 ежедневную дозу (0,43, 1,4 или 4,3 мг/кг), 6 доз два раза в неделю (1,5, 5 или 15 мг/кг), либо 3 еженедельных дозы (3, 10 или 30 мг/кг). Все лечебные процедуры проводили путем внутривенного введения. Рост опухолей постоянно контролировали до достижения их объемов выше 2000 мм или вплоть до дня 31 после начала лечения. Продолжали наблюдения за животными с полными ответами (животными с не пальпируемыми опухолями) до дня D52.

BCY11863 приводит к значительной противоопухолевой активности при многих режимах дозирования, при этом режим дозирования два раза в неделю (BIW) является самым эффективным режимом, в частности дозирование 5 мг/кг два раза в неделю. Это демонстрируется числом животных с полным ответом на день 52. На день 52 после начала лечения, у 15 из 18 мышей, подвергнутых лечению с помощью BCY11863 путем введения два раза в неделю, обнаруживали полные ответы, у 12 из 18 мышей, подвергнутых лечению с помощью путем BCY11863 путем введения один раз в сутки, обнаруживали полные ответы, и у 6 из 18 мышей, подвергнутых лечению с помощью BCY11863 путем введения один раз в неделю, обнаруживали полные ответы. Дозирование 5 мг/кг два раза в неделю приводило к 100% полных ответов при 6 полных ответов из 6 (фиг. 13). Эти данные вместе с фармакокинетическими данными для BCY11863 в плазме мышей указывают, что для противоопухолевого ответа на воздействие BCY11863 в модели опухоли МС38#13 не требуется постоянного присутствия BCY11863 в плазме крови.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Гетеротандемный бициклический пептидный комплекс, включающий (a) первый пептидный лиганд, который связывается с нектин-4 и который имеет последовательность C_iP[1Nal][dD]C_iiM[HArg]DWSTP[HyP]WC_iii (SEQ ID NO: 1; BCY8116), конъюгированный через линкер N-(кислота-PEG₃)-N-бис(PEG₃-азид) с (b) вторыми пептидными лигандами, которые связываются с CD137, оба из которых имеют последовательность Ac-Ci[tBuAla]PE[D-Lys(PYA)]PYC_iiFADPY[Nle]C_iii-A (SEQ ID NO: 2; BCY8928), где каждый из указанных пептидных лигандов включает полипептид, содержащий три реакционноспособные цистеиновые группы (Ci, Cii и Ciii), разделенные двумя петлевыми последовательностями, и молекулярный каркас, который представляет собой 1,1',1-(1,3,5-триазинан-1,3,5-триил)трипроп-2-ен-1он (ТАТА) и который образует ковалентные связи с реакционноспособными цистеиновыми группами полипептида, вследствие чего на молекулярном каркасе образуются две полипептидных петли, где Ас представляет ацетил, dD представляет D-аспарагиновую кислоту, HArg представляет гомоаргинин, НуР представляет транс-4-гидрокси-Ь-пролин, 1Nal представляет 1-нафтилаланин, tBuAla представляет третбутил-аланин, PYA представляет 4-пентиноевую кислоту и Nle представляет норлейцин.
2. Гетеротандемный бициклический пептидный комплекс по п.1, который представляет собой BCY11863:

-