EA045961B1 - SELECTIVE ESTROGEN RECEPTOR SUPPRESSORS - Google Patents
SELECTIVE ESTROGEN RECEPTOR SUPPRESSORS Download PDFInfo
- Publication number
- EA045961B1 EA045961B1 EA202291144 EA045961B1 EA 045961 B1 EA045961 B1 EA 045961B1 EA 202291144 EA202291144 EA 202291144 EA 045961 B1 EA045961 B1 EA 045961B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- cancer
- compound
- formula
- pharmaceutically acceptable
- breast cancer
- Prior art date
Links
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 title description 39
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 title 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 167
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 118
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 73
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 71
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 69
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 48
- 229950001573 abemaciclib Drugs 0.000 claims description 43
- UZWDCWONPYILKI-UHFFFAOYSA-N n-[5-[(4-ethylpiperazin-1-yl)methyl]pyridin-2-yl]-5-fluoro-4-(7-fluoro-2-methyl-3-propan-2-ylbenzimidazol-5-yl)pyrimidin-2-amine Chemical group C1CN(CC)CCN1CC(C=N1)=CC=C1NC1=NC=C(F)C(C=2C=C3N(C(C)C)C(C)=NC3=C(F)C=2)=N1 UZWDCWONPYILKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 41
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 26
- 229960005167 everolimus Drugs 0.000 claims description 25
- HKVAMNSJSFKALM-GKUWKFKPSA-N Everolimus Chemical compound C1C[C@@H](OCCO)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 HKVAMNSJSFKALM-GKUWKFKPSA-N 0.000 claims description 24
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 23
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 23
- 229950010482 alpelisib Drugs 0.000 claims description 23
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 23
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 23
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 23
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 23
- STUWGJZDJHPWGZ-LBPRGKRZSA-N (2S)-N1-[4-methyl-5-[2-(1,1,1-trifluoro-2-methylpropan-2-yl)-4-pyridinyl]-2-thiazolyl]pyrrolidine-1,2-dicarboxamide Chemical group S1C(C=2C=C(N=CC=2)C(C)(C)C(F)(F)F)=C(C)N=C1NC(=O)N1CCC[C@H]1C(N)=O STUWGJZDJHPWGZ-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims description 22
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 22
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 16
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 13
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 claims description 12
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 claims description 12
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 12
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 12
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 12
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 12
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 claims description 12
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 claims description 12
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 9
- 238000000634 powder X-ray diffraction Methods 0.000 claims description 9
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000000333 selective estrogen receptor modulator Substances 0.000 claims description 8
- 229940095743 selective estrogen receptor modulator Drugs 0.000 claims description 8
- 229940124302 mTOR inhibitor Drugs 0.000 claims description 7
- 239000003628 mammalian target of rapamycin inhibitor Substances 0.000 claims description 7
- 108010025468 Cyclin-Dependent Kinase 6 Proteins 0.000 claims description 5
- 102100026804 Cyclin-dependent kinase 6 Human genes 0.000 claims description 5
- 239000012828 PI3K inhibitor Substances 0.000 claims description 5
- 239000012823 PI3K/mTOR inhibitor Substances 0.000 claims description 5
- 239000003886 aromatase inhibitor Substances 0.000 claims description 5
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 5
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 5
- 229940043441 phosphoinositide 3-kinase inhibitor Drugs 0.000 claims description 5
- 108010025464 Cyclin-Dependent Kinase 4 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100036252 Cyclin-dependent kinase 4 Human genes 0.000 claims description 4
- 229940046844 aromatase inhibitors Drugs 0.000 claims description 4
- 150000008107 benzenesulfonic acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 4
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 4
- SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N benzenesulfonic acid Chemical group OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 125000002023 trifluoromethyl group Chemical group FC(F)(F)* 0.000 claims description 2
- LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N teixobactin Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H]1C(N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C[C@@H]2NC(=N)NC2)C(=O)N[C@H](C(=O)O[C@H]1C)[C@@H](C)CC)=O)NC)C1=CC=CC=C1 LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N 0.000 claims 2
- 229940122815 Aromatase inhibitor Drugs 0.000 claims 1
- 229940083347 Cyclin-dependent kinase 4 inhibitor Drugs 0.000 claims 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 126
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 122
- 102100038595 Estrogen receptor Human genes 0.000 description 60
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 56
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 52
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 38
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 36
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 35
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 35
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 32
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 31
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 30
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 29
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 29
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 28
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 27
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 27
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical class O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 25
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 23
- 229940126062 Compound A Drugs 0.000 description 22
- NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N Heterophylliin A Natural products O1C2COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC2C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C(O)C1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- LISFMEBWQUVKPJ-UHFFFAOYSA-N quinolin-2-ol Chemical compound C1=CC=C2NC(=O)C=CC2=C1 LISFMEBWQUVKPJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 22
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 101000882584 Homo sapiens Estrogen receptor Proteins 0.000 description 21
- 101150006605 rpa gene Proteins 0.000 description 21
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 21
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 19
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 16
- -1 azetidine ester Chemical class 0.000 description 16
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 16
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 16
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 16
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 14
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 13
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 11
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 11
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 11
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 11
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 11
- 230000004044 response Effects 0.000 description 11
- IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N N-Heptane Chemical compound CCCCCCC IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229920000663 Hydroxyethyl cellulose Polymers 0.000 description 9
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 102000003998 progesterone receptors Human genes 0.000 description 9
- 108090000468 progesterone receptors Proteins 0.000 description 9
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 9
- ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 2-Butanone Chemical compound CCC(C)=O ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- UVBQMXOKKDCBJN-UHFFFAOYSA-N 5-[4-[2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy]phenyl]-8-(trifluoromethyl)-5H-chromeno[4,3-c]quinolin-2-ol Chemical compound FCC1CN(C1)CCOC1=CC=C(C=C1)C1OC2=C(C=CC(=C2)C(F)(F)F)C=2C=NC=3C=C(C=CC=3C=21)O UVBQMXOKKDCBJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 8
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 8
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 8
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 8
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 7
- 239000004354 Hydroxyethyl cellulose Substances 0.000 description 7
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 7
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 7
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 7
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 7
- 235000019447 hydroxyethyl cellulose Nutrition 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 7
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 7
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 7
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 7
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N palladium Substances [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- MSXVEPNJUHWQHW-UHFFFAOYSA-N 2-methylbutan-2-ol Chemical compound CCC(C)(C)O MSXVEPNJUHWQHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 6
- ILAHWRKJUDSMFH-UHFFFAOYSA-N boron tribromide Chemical compound BrB(Br)Br ILAHWRKJUDSMFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 6
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 6
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 6
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 6
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 6
- 229940124297 CDK 4/6 inhibitor Drugs 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- VWUXBMIQPBEWFH-WCCTWKNTSA-N Fulvestrant Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3[C@H](CCCCCCCCCS(=O)CCCC(F)(F)C(F)(F)F)CC2=C1 VWUXBMIQPBEWFH-WCCTWKNTSA-N 0.000 description 5
- UEEJHVSXFDXPFK-UHFFFAOYSA-N N-dimethylaminoethanol Chemical compound CN(C)CCO UEEJHVSXFDXPFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000011789 NOD SCID mouse Methods 0.000 description 5
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 5
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 5
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 5
- 239000012972 dimethylethanolamine Substances 0.000 description 5
- 229960002258 fulvestrant Drugs 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 5
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000012312 sodium hydride Substances 0.000 description 5
- 229910000104 sodium hydride Inorganic materials 0.000 description 5
- CXNIUSPIQKWYAI-UHFFFAOYSA-N xantphos Chemical compound C=12OC3=C(P(C=4C=CC=CC=4)C=4C=CC=CC=4)C=CC=C3C(C)(C)C2=CC=CC=1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 CXNIUSPIQKWYAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- WPFXKSQRNMAJGV-UHFFFAOYSA-N 7-chloro-5-[4-[2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy]phenyl]-5H-chromeno[4,3-c]quinolin-2-ol Chemical compound ClC1=CC=CC2=C1OC(C1=C2C=NC=2C=C(C=CC1=2)O)C1=CC=C(C=C1)OCCN1CC(C1)CF WPFXKSQRNMAJGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UQBGEQPSMYFQHH-UHFFFAOYSA-N 7-fluoro-5-[4-[2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy]phenyl]-5H-chromeno[4,3-c]quinolin-2-ol Chemical compound FC1=CC=CC2=C1OC(C1=C2C=NC=2C=C(C=CC1=2)O)C1=CC=C(C=C1)OCCN1CC(C1)CF UQBGEQPSMYFQHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HPRZXPUOMAQVBB-UHFFFAOYSA-N 8-chloro-5-[4-[2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy]phenyl]-5H-chromeno[4,3-c]quinolin-2-ol Chemical compound ClC1=CC2=C(C=C1)C=1C=NC=3C=C(C=CC=3C=1C(O2)C1=CC=C(C=C1)OCCN1CC(C1)CF)O HPRZXPUOMAQVBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OGEAHDJGRDNLQY-UHFFFAOYSA-N 8-fluoro-5-[4-[2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy]phenyl]-5H-chromeno[4,3-c]quinolin-2-ol Chemical compound FC1=CC2=C(C=C1)C=1C=NC=3C=C(C=CC=3C=1C(O2)C1=CC=C(C=C1)OCCN1CC(C1)CF)O OGEAHDJGRDNLQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 4
- 229910016523 CuKa Inorganic materials 0.000 description 4
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 4
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 4
- 101000605639 Homo sapiens Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha isoform Proteins 0.000 description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100038332 Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha isoform Human genes 0.000 description 4
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000012391 XPhos Pd G2 Substances 0.000 description 4
- PUEXHTAHEBAFQR-UHFFFAOYSA-N [4-[2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy]phenyl]-[3-[2-fluoro-4-(trifluoromethyl)phenyl]-7-hydroxyquinolin-4-yl]methanone Chemical compound FCC1CN(C1)CCOC1=CC=C(C=C1)C(=O)C1=C(C=NC2=CC(=CC=C12)O)C1=C(C=C(C=C1)C(F)(F)F)F PUEXHTAHEBAFQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 239000002585 base Substances 0.000 description 4
- UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N borane Chemical compound B UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- RSLSVURFMXHEEU-UHFFFAOYSA-M chloropalladium(1+);dicyclohexyl-[3-[2,4,6-tri(propan-2-yl)phenyl]phenyl]phosphane;2-phenylaniline Chemical compound [Pd+]Cl.NC1=CC=CC=C1C1=CC=CC=[C-]1.CC(C)C1=CC(C(C)C)=CC(C(C)C)=C1C1=CC=CC(P(C2CCCCC2)C2CCCCC2)=C1 RSLSVURFMXHEEU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000003821 enantio-separation Methods 0.000 description 4
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 4
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 4
- 238000013100 final test Methods 0.000 description 4
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 4
- IUYHWZFSGMZEOG-UHFFFAOYSA-M magnesium;propane;chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].C[CH-]C IUYHWZFSGMZEOG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical class CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 4
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 4
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- MFRIHAYPQRLWNB-UHFFFAOYSA-N sodium tert-butoxide Chemical compound [Na+].CC(C)(C)[O-] MFRIHAYPQRLWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010055113 Breast cancer metastatic Diseases 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N Dimethyl sulfide Chemical compound CSC QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 3
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102220497176 Small vasohibin-binding protein_T47D_mutation Human genes 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical class [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 3
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- FJDQFPXHSGXQBY-UHFFFAOYSA-L caesium carbonate Chemical compound [Cs+].[Cs+].[O-]C([O-])=O FJDQFPXHSGXQBY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229910000024 caesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 229940126214 compound 3 Drugs 0.000 description 3
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000003304 gavage Methods 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 125000004356 hydroxy functional group Chemical group O* 0.000 description 3
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 3
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- CYPYTURSJDMMMP-WVCUSYJESA-N (1e,4e)-1,5-diphenylpenta-1,4-dien-3-one;palladium Chemical compound [Pd].[Pd].C=1C=CC=CC=1\C=C\C(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1.C=1C=CC=CC=1\C=C\C(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1.C=1C=CC=CC=1\C=C\C(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 CYPYTURSJDMMMP-WVCUSYJESA-N 0.000 description 2
- NXBLTKBZGUXELX-UHFFFAOYSA-N (3-chloro-7-hydroxyquinolin-4-yl)-(4-fluorophenyl)methanone Chemical compound ClC=1C=NC2=CC(=CC=C2C=1C(=O)C1=CC=C(C=C1)F)O NXBLTKBZGUXELX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRYYUNFOMSNJET-UHFFFAOYSA-N (3-chloro-7-hydroxyquinolin-4-yl)-[4-[2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy]phenyl]methanone Chemical compound ClC=1C=NC2=CC(=CC=C2C=1C(=O)C1=CC=C(C=C1)OCCN1CC(C1)CF)O HRYYUNFOMSNJET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OCOWSFIETXPYNS-UHFFFAOYSA-N (3-chloro-7-methoxyquinolin-4-yl)-(4-fluorophenyl)methanone Chemical compound ClC=1C=NC2=CC(=CC=C2C=1C(=O)C1=CC=C(C=C1)F)OC OCOWSFIETXPYNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NGNBDVOYPDDBFK-UHFFFAOYSA-N 2-[2,4-di(pentan-2-yl)phenoxy]acetyl chloride Chemical compound CCCC(C)C1=CC=C(OCC(Cl)=O)C(C(C)CCC)=C1 NGNBDVOYPDDBFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OWUTXBIONAXKAK-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethanol Chemical compound OCCN1CC(CF)C1 OWUTXBIONAXKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VJIJKIDPCAHSMJ-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethanol hydrochloride Chemical compound Cl.OCCN1CC(CF)C1 VJIJKIDPCAHSMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CZKLEJHVLCMVQR-UHFFFAOYSA-N 4-fluorobenzoyl chloride Chemical compound FC1=CC=C(C(Cl)=O)C=C1 CZKLEJHVLCMVQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 5-[(1r)-1-hydroxy-2-[4-[(2r)-2-hydroxy-2-(4-methyl-1-oxo-3h-2-benzofuran-5-yl)ethyl]piperazin-1-yl]ethyl]-4-methyl-3h-2-benzofuran-1-one Chemical compound C1=C2C(=O)OCC2=C(C)C([C@@H](O)CN2CCN(CC2)C[C@H](O)C2=CC=C3C(=O)OCC3=C2C)=C1 OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 0.000 description 2
- MKEHACYTGGCYPQ-UHFFFAOYSA-N 5-[4-[2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy]phenyl]-7-methyl-5H-chromeno[4,3-c]quinolin-2-ol Chemical compound FCC1CN(C1)CCOC1=CC=C(C=C1)C1OC2=C(C=CC=C2C)C=2C=NC=3C=C(C=CC=3C=21)O MKEHACYTGGCYPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 238000003747 Grignard reaction Methods 0.000 description 2
- 239000007818 Grignard reagent Substances 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- SSFSVKVWAURAAM-UHFFFAOYSA-N [2-fluoro-4-(trifluoromethyl)phenyl]boronic acid Chemical compound OB(O)C1=CC=C(C(F)(F)F)C=C1F SSFSVKVWAURAAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N acetic acid trimethyl ester Natural products COC(C)=O KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 2
- 229940092714 benzenesulfonic acid Drugs 0.000 description 2
- MVIOINXPSFUJEN-UHFFFAOYSA-N benzenesulfonic acid;hydrate Chemical compound O.OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 MVIOINXPSFUJEN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 2
- 229910000085 borane Inorganic materials 0.000 description 2
- MCQRPQCQMGVWIQ-UHFFFAOYSA-N boron;methylsulfanylmethane Chemical compound [B].CSC MCQRPQCQMGVWIQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 2
- 238000003570 cell viability assay Methods 0.000 description 2
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000001728 clone cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 2
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 2
- 229940125782 compound 2 Drugs 0.000 description 2
- 239000013058 crude material Substances 0.000 description 2
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 229940111685 dibasic potassium phosphate Drugs 0.000 description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 238000009261 endocrine therapy Methods 0.000 description 2
- 229940034984 endocrine therapy antineoplastic and immunomodulating agent Drugs 0.000 description 2
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 2
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000012458 free base Substances 0.000 description 2
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 150000004795 grignard reagents Chemical class 0.000 description 2
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- IBIKHMZPHNKTHM-RDTXWAMCSA-N merck compound 25 Chemical compound C1C[C@@H](C(O)=O)[C@H](O)CN1C(C1=C(F)C=CC=C11)=NN1C(=O)C1=C(Cl)C=CC=C1C1CC1 IBIKHMZPHNKTHM-RDTXWAMCSA-N 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 2
- MUJIDPITZJWBSW-UHFFFAOYSA-N palladium(2+) Chemical compound [Pd+2] MUJIDPITZJWBSW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 2
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 2
- NROKBHXJSPEDAR-UHFFFAOYSA-M potassium fluoride Chemical compound [F-].[K+] NROKBHXJSPEDAR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- LPNYRYFBWFDTMA-UHFFFAOYSA-N potassium tert-butoxide Chemical compound [K+].CC(C)(C)[O-] LPNYRYFBWFDTMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- IZJIGPRJUJLLTJ-UHFFFAOYSA-N quinolin-7-ol Chemical compound Oc1ccc2cccnc2c1.Oc1ccc2cccnc2c1 IZJIGPRJUJLLTJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- WRECIMRULFAWHA-UHFFFAOYSA-N trimethyl borate Chemical compound COB(OC)OC WRECIMRULFAWHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KYBBNISHBZGENY-UHFFFAOYSA-N 3-(fluoromethyl)azetidine;hydrochloride Chemical compound Cl.FCC1CNC1 KYBBNISHBZGENY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003349 3-pyridyl group Chemical group N1=C([H])C([*])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- AXUVEBXTLZJXMK-UHFFFAOYSA-N 4-bromo-3-chloro-7-methoxyquinoline Chemical compound BrC1=C(Cl)C=NC2=CC(OC)=CC=C21 AXUVEBXTLZJXMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YJXTZWWKNXVRHA-UHFFFAOYSA-N 4-chloro-1h-quinolin-2-one Chemical compound C1=CC=CC2=NC(O)=CC(Cl)=C21 YJXTZWWKNXVRHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BGOOMSGEXIBXHQ-UHFFFAOYSA-N 5-[4-[2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy]phenyl]-7-(trifluoromethyl)-5H-chromeno[4,3-c]quinolin-2-ol Chemical compound FCC1CN(C1)CCOC1=CC=C(C=C1)C1OC2=C(C=CC=C2C(F)(F)F)C=2C=NC=3C=C(C=CC=3C=21)O BGOOMSGEXIBXHQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRPASBVXQUEVRW-UHFFFAOYSA-N 5-[4-[2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy]phenyl]-8-methyl-5H-chromeno[4,3-c]quinolin-2-ol Chemical compound FCC1CN(C1)CCOC1=CC=C(C=C1)C1OC2=C(C=CC(=C2)C)C=2C=NC=3C=C(C=CC=3C=21)O DRPASBVXQUEVRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ACCFLVVUVBJNGT-AWEZNQCLSA-N 8-[5-(2-hydroxypropan-2-yl)pyridin-3-yl]-1-[(2s)-2-methoxypropyl]-3-methylimidazo[4,5-c]quinolin-2-one Chemical compound CN1C(=O)N(C[C@H](C)OC)C(C2=C3)=C1C=NC2=CC=C3C1=CN=CC(C(C)(C)O)=C1 ACCFLVVUVBJNGT-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 101001011741 Bos taurus Insulin Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical class OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N Deuterium Chemical compound [2H] YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 101150064205 ESR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- RSEPBGGWRJCQGY-RBRWEJTLSA-N Estradiol valerate Chemical compound C1CC2=CC(O)=CC=C2[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](OC(=O)CCCC)[C@@]1(C)CC2 RSEPBGGWRJCQGY-RBRWEJTLSA-N 0.000 description 1
- 108010007005 Estrogen Receptor alpha Proteins 0.000 description 1
- 108010041356 Estrogen Receptor beta Proteins 0.000 description 1
- 102100029951 Estrogen receptor beta Human genes 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- ATFVTAOSZBVGHC-UHFFFAOYSA-N Glycolaldehyde dimer Chemical compound OC1COC(O)CO1 ATFVTAOSZBVGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Chemical class 0.000 description 1
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 101710150344 Protein Rev Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102100023085 Serine/threonine-protein kinase mTOR Human genes 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Chemical class 0.000 description 1
- 108010065917 TOR Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 1
- REJAZCJIAVRTRR-UHFFFAOYSA-N [3-(2,3-difluorophenyl)-7-hydroxyquinolin-4-yl]-[4-[2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy]phenyl]methanone Chemical compound FC1=C(C=CC=C1F)C=1C=NC2=CC(=CC=C2C=1C(=O)C1=CC=C(C=C1)OCCN1CC(C1)CF)O REJAZCJIAVRTRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NMCAZRSOQKPNCT-UHFFFAOYSA-N [3-(2,4-difluorophenyl)-7-hydroxyquinolin-4-yl]-[4-[2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy]phenyl]methanone Chemical compound FC1=C(C=CC(=C1)F)C=1C=NC2=CC(=CC=C2C=1C(=O)C1=CC=C(C=C1)OCCN1CC(C1)CF)O NMCAZRSOQKPNCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AJPFRLHLKYUUKB-UHFFFAOYSA-N [3-(3-chloro-2-fluorophenyl)-7-hydroxyquinolin-4-yl]-[4-[2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy]phenyl]methanone Chemical compound ClC=1C(=C(C=CC=1)C=1C=NC2=CC(=CC=C2C=1C(=O)C1=CC=C(C=C1)OCCN1CC(C1)CF)O)F AJPFRLHLKYUUKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ISXGRDNBTQZMMG-UHFFFAOYSA-N [3-(4-chloro-2-fluorophenyl)-7-hydroxyquinolin-4-yl]-[4-[2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy]phenyl]methanone Chemical compound ClC1=CC(=C(C=C1)C=1C=NC2=CC(=CC=C2C=1C(=O)C1=CC=C(C=C1)OCCN1CC(C1)CF)O)F ISXGRDNBTQZMMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XTWFHFPWSPQDDZ-UHFFFAOYSA-N [4-[2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy]phenyl]-[3-(2-fluoro-3-methylphenyl)-7-hydroxyquinolin-4-yl]methanone Chemical compound FCC1CN(C1)CCOC1=CC=C(C=C1)C(=O)C1=C(C=NC2=CC(=CC=C12)O)C1=C(C(=CC=C1)C)F XTWFHFPWSPQDDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VNLZCYHLHXNHNN-UHFFFAOYSA-N [4-[2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy]phenyl]-[3-(2-fluoro-4-methylphenyl)-7-hydroxyquinolin-4-yl]methanone Chemical compound FCC1CN(C1)CCOC1=CC=C(C=C1)C(=O)C1=C(C=NC2=CC(=CC=C12)O)C1=C(C=C(C=C1)C)F VNLZCYHLHXNHNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 150000004703 alkoxides Chemical class 0.000 description 1
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 150000001543 aryl boronic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000001501 aryl fluorides Chemical class 0.000 description 1
- 150000004792 aryl magnesium halides Chemical class 0.000 description 1
- 125000005002 aryl methyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 125000004566 azetidin-1-yl group Chemical group N1(CCC1)* 0.000 description 1
- HONIICLYMWZJFZ-UHFFFAOYSA-N azetidine Chemical compound C1CNC1 HONIICLYMWZJFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 description 1
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 description 1
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N beta-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N 0.000 description 1
- 229960004853 betadex Drugs 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000003353 bioavailability assay Methods 0.000 description 1
- YNHIGQDRGKUECZ-UHFFFAOYSA-L bis(triphenylphosphine)palladium(ii) dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Pd+2].C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1.C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 YNHIGQDRGKUECZ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- ZADPBFCGQRWHPN-UHFFFAOYSA-N boronic acid Chemical compound OBO ZADPBFCGQRWHPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N bovine insulin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011203 carbon fibre reinforced carbon Substances 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 150000005829 chemical entities Chemical class 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000012069 chiral reagent Substances 0.000 description 1
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- NXQGGXCHGDYOHB-UHFFFAOYSA-L cyclopenta-1,4-dien-1-yl(diphenyl)phosphane;dichloropalladium;iron(2+) Chemical compound [Fe+2].Cl[Pd]Cl.[CH-]1C=CC(P(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)=C1.[CH-]1C=CC(P(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)=C1 NXQGGXCHGDYOHB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 229940005558 delestrogen Drugs 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000002027 dichloromethane extract Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000011038 discontinuous diafiltration by volume reduction Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- HKSZLNNOFSGOKW-UHFFFAOYSA-N ent-staurosporine Natural products C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1C1CC(NC)C(OC)C4(C)O1 HKSZLNNOFSGOKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 229960004766 estradiol valerate Drugs 0.000 description 1
- 125000001301 ethoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- LZWQNOHZMQIFBX-UHFFFAOYSA-N lithium;2-methylpropan-2-olate Chemical compound [Li+].CC(C)(C)[O-] LZWQNOHZMQIFBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Chemical class 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- DAZXVJBJRMWXJP-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylethylamine Chemical compound CCN(C)C DAZXVJBJRMWXJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010653 organometallic reaction Methods 0.000 description 1
- LXNAVEXFUKBNMK-UHFFFAOYSA-N palladium(II) acetate Substances [Pd].CC(O)=O.CC(O)=O LXNAVEXFUKBNMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YJVFFLUZDVXJQI-UHFFFAOYSA-L palladium(ii) acetate Chemical compound [Pd+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O YJVFFLUZDVXJQI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 239000003880 polar aprotic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Chemical class 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000011698 potassium fluoride Substances 0.000 description 1
- 235000003270 potassium fluoride Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- HNJBEVLQSNELDL-UHFFFAOYSA-N pyrrolidin-2-one Chemical compound O=C1CCCN1 HNJBEVLQSNELDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 150000003333 secondary alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 238000010956 selective crystallization Methods 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012321 sodium triacetoxyborohydride Substances 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Chemical class 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000000528 statistical test Methods 0.000 description 1
- HKSZLNNOFSGOKW-FYTWVXJKSA-N staurosporine Chemical compound C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1[C@H]1C[C@@H](NC)[C@@H](OC)[C@]4(C)O1 HKSZLNNOFSGOKW-FYTWVXJKSA-N 0.000 description 1
- CGPUWJWCVCFERF-UHFFFAOYSA-N staurosporine Natural products C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1C1CC(NC)C(OC)C4(OC)O1 CGPUWJWCVCFERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000011885 synergistic combination Substances 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- WLPUWLXVBWGYMZ-UHFFFAOYSA-N tricyclohexylphosphine Chemical compound C1CCCCC1P(C1CCCCC1)C1CCCCC1 WLPUWLXVBWGYMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RMNIZOOYFMNEJJ-UHFFFAOYSA-K tripotassium;phosphate;hydrate Chemical compound O.[K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O RMNIZOOYFMNEJJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000001665 trituration Methods 0.000 description 1
- 238000007492 two-way ANOVA Methods 0.000 description 1
Description
Уровень техникиState of the art
Селективные супрессоры рецептора эстрогена (ССРЭ) связываются с рецептором эстрогена (РЭ) и подавляют опосредованную РЭ транскрипционную активность. Это разрушение и даунгрегуляция, вызванная ССРЭ, может быть полезно при лечении нарушений пролиферации клеток, таких как рак. Некоторые примеры низкомолекулярных ССРЭ описаны в литературе (см., например, WO 2005073204, WO 2014205136 и WO 2016097071). Однако известные ССРЭ пока не так полезны, как это необходимо для эффективного лечения рака. Например, обнаружение ССРЭ с лучшими фармакокинетическими (ФК) и фармакодинамическими (ФД) свойствами, более высокой эффективностью при клиническом применении и хорошей биодоступностью при пероральном введении было бы очень полезным при лечении рака. Чистый антагонист ССРЭ с сильным ингибированием опосредованной РЭ транскрипции был бы особенно полезен при лечении рака. Существует потребность в новых ССРЭ для лечения таких видов рака, как рак груди, рак яичников, рак эндометрия, рак простаты, рак матки, рак желудка и рак легких, а также мутации из-за возникающей резистентности. В частности, существует потребность в новых ССРЭ для лечения РЭ-позитивного рака груди, рака желудка и/или рака легких.Selective estrogen receptor suppressors (SSREs) bind to the estrogen receptor (ER) and suppress ER-mediated transcriptional activity. This disruption and downregulation caused by SSRE may be useful in the treatment of cell proliferation disorders such as cancer. Some examples of low molecular weight SSPEs are described in the literature (see, for example, WO 2005073204, WO 2014205136 and WO 2016097071). However, known SSREs are not yet as useful as needed for effective cancer treatment. For example, the discovery of SSREs with better pharmacokinetic (PK) and pharmacodynamic (PD) properties, higher efficacy in clinical use, and good oral bioavailability would be very useful in cancer treatment. A pure SSRE antagonist with potent inhibition of ER-mediated transcription would be particularly useful in the treatment of cancer. There is a need for new SSREs to treat cancers such as breast cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, prostate cancer, uterine cancer, gastric cancer and lung cancer, as well as mutations due to emerging resistance. In particular, there is a need for new SSREs for the treatment of ER-positive breast cancer, gastric cancer and/or lung cancer.
Суть изобретенияThe essence of the invention
Соединения формулы:Compounds formula:
и их фармацевтически приемлемые соли и их фармацевтические композиции представлены в данном документе. В этой формуле или R1, или R2 независимо выбирают из Cl, F, -CF3 или -СН3, а другой представляет собой водород.and their pharmaceutically acceptable salts and pharmaceutical compositions thereof are presented herein. In this formula, either R 1 or R 2 is independently selected from Cl, F, -CF 3 or -CH 3 and the other is hydrogen.
Также предусмотрены способы применения описанных в данном документе соединений, их фармацевтически приемлемых солей и фармацевтических композиций для лечения рака груди, рака яичников, рака эндометрия, рака простаты, рака матки, рака желудка или рака легких. Способы включают введение терапевтически эффективного количества соединения, описанного в данном документе, или его фармацевтически приемлемой соли, нуждающемуся пациенту.Also provided are methods of using the compounds described herein, their pharmaceutically acceptable salts and pharmaceutical compositions for the treatment of breast cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, prostate cancer, uterine cancer, gastric cancer or lung cancer. The methods include administering a therapeutically effective amount of a compound described herein, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, to a patient in need.
Кроме того, предлагается соединение, описанное в данном документе, и его фармацевтически приемлемые соли для применения в терапии. Описанные в данном документе соединения и их фармацевтически приемлемые соли можно использовать в лечении рака груди, рака яичников, рака эндометрия, рака простаты, рака матки, рака желудка или рака легких.In addition, the compound described herein and its pharmaceutically acceptable salts are provided for use in therapy. The compounds described herein and their pharmaceutically acceptable salts can be used in the treatment of breast cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, prostate cancer, uterine cancer, gastric cancer or lung cancer.
Также предлагается применение описанных в данном документе соединений и их фармацевтически приемлемых солей для производства лекарственного средства для лечения рака груди, рака яичников, рака эндометрия, рака простаты, рака матки, рака желудка или рака легких.Also proposed is the use of the compounds described herein and their pharmaceutically acceptable salts for the manufacture of a medicament for the treatment of breast cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, prostate cancer, uterine cancer, gastric cancer or lung cancer.
Подробное описание сути изобретенияDetailed description of the invention
В данном документе описаны новые тетрациклические соединения и их фармацевтические соли, которые действуют как ССРЭ. Недавно открытые ССРЭ, которые описаны в данном документе, обеспечивают ингибирование опосредованной РЭ транскрипции, что будет полезно при лечении таких видов рака, как рак груди, рак яичников, рак эндометрия, рак простаты, рак матки, рак желудка и рак легких, а также мутации из-за возникающей резистентности. Эти ССРЭ могут использоваться либо в качестве отдельных агентов, либо в комбинации с другими классами лекарственных средств, включая селективные модуляторы рецептора эстрогена (СМРЭ), ингибиторы ароматазы, ингибиторы CDK4, ингибиторы CDK6, ингибиторы PI3K и ингибиторы mTOR для лечения рака, позитивного по рецептору гормонов, таких как рак груди, рак желудка и/или рак легких.This document describes new tetracyclic compounds and their pharmaceutical salts that act as SSREs. The newly discovered SSREs, which are described herein, provide inhibition of RE-mediated transcription, which will be useful in the treatment of cancers such as breast cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, prostate cancer, uterine cancer, gastric cancer and lung cancer, as well as mutations due to emerging resistance. These SSREs can be used either as single agents or in combination with other classes of drugs, including selective estrogen receptor modulators (SERMs), aromatase inhibitors, CDK4 inhibitors, CDK6 inhibitors, PI3K inhibitors and mTOR inhibitors for the treatment of hormone receptor-positive cancers , such as breast cancer, stomach cancer and/or lung cancer.
Описанные в данном документе новые соединения представлены формулой I:The novel compounds described herein are represented by Formula I:
I и их фармацевтически приемлемыми солями, где или R1, или R2 независимо выбирают из Cl, F, -CF3 или -СН3, а другой представляет собой водород. Специалист в данной области поймет, что соединения, описанные формулой I, или их фармацевтически приемлемые соли содержат хиральный центр, положение которого обозначено * выше. Специалист в данной области техники также поймет, что обозначения по Кану-Ингольду-Прелогу (R) или (S) для хиральных центров будут варьироваться в зависимости от схем замещения вокруг хирального центра. Хиральный центр в соединении формулы I обеспечивает Rэнантиомерную форму, представленную формулой II:I and their pharmaceutically acceptable salts, wherein either R1 or R2 is independently selected from Cl, F, -CF 3 or -CH 3 and the other is hydrogen. One skilled in the art will appreciate that the compounds described by Formula I, or their pharmaceutically acceptable salts, contain a chiral center, the position of which is indicated by * above. One skilled in the art will also appreciate that the Cahn-Ingold-Prelog designations (R) or (S) for chiral centers will vary depending on the substitution patterns around the chiral center. The chiral center in a compound of formula I provides the R enantiomeric form represented by formula II:
- 1 045961- 1 045961
А S-энантиомерная форма, представленная формулой III:And the S-enantiomeric form represented by formula III:
Все индивидуальные стереоизомеры, энантиомеры и диастереомеры, а также смеси энантиомеров и диастереомеров соединений формулы I, формулы II и формулы III, включая рацематы, включены в объем описанных в данном документе соединений. Соединения для фармацевтического применения, которые содержат хиральные центры, часто выделены в виде отдельных энантиомеров или диастереомеров, и такие выделенные соединения формулы I, формулы II и формулы III включены в объем соединений, описанных в данном документе. Специалист в данной области также поймет, что соединения формулы I, формулы II и формулы III, описанные в данном документе, и их фармацевтически приемлемые соли могут быть дейтерированы (где водород может быть заменен дейтерием), и считается, что такие молекулы должны быть включены в объем описанных в данном документе соединений.All individual stereoisomers, enantiomers and diastereomers, as well as mixtures of enantiomers and diastereomers of the compounds of formula I, formula II and formula III, including racemates, are included within the scope of the compounds described herein. Compounds for pharmaceutical use that contain chiral centers are often isolated as individual enantiomers or diastereomers, and such isolated compounds of Formula I, Formula II and Formula III are included within the scope of the compounds described herein. One skilled in the art will also appreciate that the compounds of Formula I, Formula II and Formula III described herein and their pharmaceutically acceptable salts may be deuterated (where hydrogen may be replaced by deuterium), and it is believed that such molecules should be included in scope of connections described in this document.
Конкретные примеры соединений формулы I (включая номенклатурные названия IUPAC) показаны в данном документе:Specific examples of compounds of Formula I (including IUPAC nomenclature names) are shown herein:
5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1 -ил] этокси} фенил)-8-(трифторметил)-5Н- [ 1 ] бензопирано [4,3с]хинолин-2-ол;5-(4-{2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-8-(trifluoromethyl)-5H-[1]benzopyrano[4,3c]quinolin-2-ol;
5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1 -ил] этокси} фенил) -7-(трифторметил)-5Н- [ 1 ] бензопирано [4,3с]хинолин-2-ол;5-(4-{2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-7-(trifluoromethyl)-5H-[1]benzopyrano[4,3c]quinolin-2-ol;
8-хлор-5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-5Н-[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ол;8-chloro-5-(4-{2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-5H-[1]benzopyrano[4,3-c]quinolin-2-ol;
7-хлор-5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-5Н-[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ол;7-chloro-5-(4-{2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-5H-[1]benzopyrano[4,3-c]quinolin-2-ol;
8-фтор-5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-5Н-[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ол;8-fluoro-5-(4-{2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-5H-[1]benzopyrano[4,3-c]quinolin-2-ol;
7-фтор-5-(4-{2-[3 -(фторметил)азетидин-1 -ил] этокси}фенил)-5Н- [ 1 ] бензопирано [4,3-с]хинолин-2-ол;7-fluoro-5-(4-{2-[3 -(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-5H-[1]benzopyrano[4,3-c]quinolin-2-ol;
- 2 045961- 2 045961
5-(4-{2-[3 -(фторметил)азетидин-1 -ил]этокси} фенил)-8-метил-5Н- [ 1]бензопирано [4,3 -с]хинолин-2-ол; и5-(4-{2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-8-methyl-5H-[1]benzopyrano[4,3-c]quinolin-2-ol; And
5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-7-метил-5Н-[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ол.5-(4-{2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-7-methyl-5H-[1]benzopyrano[4,3-c]quinolin-2-ol.
Из-за хирального центра, указанного выше, каждый из этих конкретных примеров соединений формулы I, показанных выше, имеет R- и S-энантиомерные формы (то есть, R-энантиомерные соединения формулы II и S-энантиомерные соединения формулы III), как показано в табл. 1.Because of the chiral center noted above, each of these specific examples of compounds of formula I shown above have R- and S-enantiomeric forms (i.e., R-enantiomeric compounds of formula II and S-enantiomeric compounds of formula III), as shown in table 1.
Таблица 1Table 1
Энантиомерные формы соединений формулы IEnantiomeric forms of compounds of formula I
- 3 045961- 3 045961
В данном документе также описаны фармацевтические композиции, включающие соединения формулы I, формулы II и формулы III, описанные в данном документе, или их фармацевтически приемлемые соли в комбинации с фармацевтически приемлемым наполнителем, носителем или разбавителем. Описанные в данном документе фармацевтические композиции могут быть получены с использованием фармацевтически приемлемых добавок. Используемый в данном документе термин фармацевтически приемлемая добавка(и) относится к одному или нескольким носителям, разбавителям и наполнителям, которые совместимы с другими добавками композиции или состава и не вредны для пациента. Соединения формулы I, формулы II и формулы III или их фармацевтически приемлемые соли, описанные в данном документе, могут быть составлены в виде фармацевтических композиций, вводимых различными путями, такими как перорально или внутривенно. Биодоступность часто является фактором лечения рака, и полезна возможность выбора способов введения и фармацевтических композиций для контроля или оптимизации биодоступности активного ингредиента. Например, пероральная биодоступная композиция ССРЭ будет особенно полезной. Считается, что соединения формулы I, формулы II и формулы III или их фармацевтически приемлемые соли, описанные в данном документе, обладают пероральной биодоступностью. Примеры фармацевтических композиций и способов их получения можно найти в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, L.V. Allen Jr, Editor, 22nd Ed., Mack Publishing Co., 2012. Неограничивающие примеры фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей и эксципиентов включают следующее: физиологический раствор, вода, крахмал, сахара, маннит и производные силикона; связыAlso described herein are pharmaceutical compositions comprising the compounds of Formula I, Formula II and Formula III described herein, or pharmaceutically acceptable salts thereof, in combination with a pharmaceutically acceptable excipient, carrier or diluent. The pharmaceutical compositions described herein can be prepared using pharmaceutically acceptable additives. As used herein, the term pharmaceutically acceptable additive(s) refers to one or more carriers, diluents and excipients that are compatible with the other additives of the composition or formulation and are not harmful to the patient. The compounds of Formula I, Formula II and Formula III, or pharmaceutically acceptable salts thereof, described herein can be formulated as pharmaceutical compositions administered by various routes, such as orally or intravenously. Bioavailability is often a factor in cancer treatment, and it is useful to be able to select routes of administration and pharmaceutical compositions to control or optimize the bioavailability of the active ingredient. For example, an orally bioavailable SSPE composition would be particularly useful. The compounds of Formula I, Formula II and Formula III or their pharmaceutically acceptable salts described herein are believed to have oral bioavailability. Examples of pharmaceutical compositions and methods for their preparation can be found in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, L.V. Allen Jr, Editor, 22nd Ed., Mack Publishing Co., 2012. Non-limiting examples of pharmaceutically acceptable carriers, diluents and excipients include the following: saline, water, starch, sugars, mannitol and silicone derivatives; connections
- 4 045961 вающие агенты, такие как карбоксиметилцеллюлоза и другие производные целлюлозы, альгинаты, желатин и поливинилпирролидон; каолин и бентонит; и полиэтилгликоли.- 4 045961 binding agents such as carboxymethylcellulose and other cellulose derivatives, alginates, gelatin and polyvinylpyrrolidone; kaolin and bentonite; and polyethylglycols.
Далее в данном документе описаны способы лечения рака. Описанные в данном документе способы включают введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения формулы I, формулы II и формулы III, описанные в данном документе, или их фармацевтически приемлемой соли. Например, способ введения эффективного количества соединения формулы I, формулы II и формулы III, описанные в данном документе, или их фармацевтически приемлемой соли, может представлять собой пероральное введение. Рак может быть раком, чувствительным к эстрогену. Кроме того, раком может представлять собой рак груди, рак яичников, рак эндометрия, рак простаты, рак матки, рак желудка или рак легких. Например, рак может быть РЭ-позитивным раком груди, РЭ-позитивным раком желудка или РЭ-позитивным раком легких.Methods for treating cancer are further described herein. The methods described herein include administering to a patient in need of such treatment an effective amount of a compound of formula I, formula II and formula III described herein, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. For example, a method of administering an effective amount of a compound of Formula I, Formula II and Formula III described herein, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, may be by oral administration. The cancer may be an estrogen-sensitive cancer. In addition, the cancer may be breast cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, prostate cancer, uterine cancer, stomach cancer or lung cancer. For example, the cancer may be ER-positive breast cancer, ER-positive stomach cancer, or ER-positive lung cancer.
В данном документе также описаны соединения формулы I, формулы II и формулы III, описанные в данном документе, или их фармацевтически приемлемые соли для применения в терапии. Также в данном документе представлены соединения формулы I, формулы II и формулы III, описанные в данном документе, или их фармацевтически приемлемые соли для применения при лечении рака груди, рака яичников, рака эндометрия, рака простаты, рака матки, рака желудка, или рак легких. В частности, рак может быть РЭ-позитивным раком груди, РЭ-позитивным раком желудка или РЭ-позитивным раком легких. Например, соединение формулы I, формулы II и формулы III или их фармацевтически приемлемую соль можно вводить перорально.Also described herein are the compounds of formula I, formula II and formula III described herein, or pharmaceutically acceptable salts thereof, for use in therapy. Also provided herein are the compounds of formula I, formula II and formula III described herein, or pharmaceutically acceptable salts thereof, for use in the treatment of breast cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, prostate cancer, uterine cancer, gastric cancer, or lung cancer . Specifically, the cancer may be ER-positive breast cancer, ER-positive stomach cancer, or ER-positive lung cancer. For example, a compound of Formula I, Formula II and Formula III, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, can be administered orally.
Кроме того, соединения формулы I, формулы II и формулы III, описанные в данном документе, или их фармацевтически приемлемые соли можно использовать в производстве лекарственного средства для лечения рака. Например, лекарство можно вводить перорально. Типы рака, для лечения которых могут быть использованы описанные в данном документе лекарственные средства, включают рак груди, рак яичников, рак эндометрия, рак простаты, рак матки, рак желудка или рак легких. В частности, рак может быть РЭ-позитивным раком груди, РЭ-позитивным раком желудка или РЭ-позитивным раком легких.In addition, the compounds of Formula I, Formula II and Formula III described herein, or pharmaceutically acceptable salts thereof, can be used in the manufacture of a medicament for the treatment of cancer. For example, the drug can be administered orally. Types of cancer that the drugs described herein may be used to treat include breast cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, prostate cancer, uterine cancer, stomach cancer, or lung cancer. Specifically, the cancer may be ER-positive breast cancer, ER-positive stomach cancer, or ER-positive lung cancer.
Соединения формулы I, формулы II и формулы III, описанные в данном документе, и их фармацевтически приемлемые соли могут иметь клиническое применение в качестве единственного агента или в комбинации с одним или несколькими другими терапевтическими агентами (например, противораковыми агентами) для лечение рака, такого как рак груди, рак яичников, рак эндометрия, рак простаты, рак матки, рак желудка или рак легких. При использовании в комбинации с другими терапевтическими агентами (такими как противораковые агенты) соединения формулы I, формулы II и формулы III, описанные в данном документе, или их фармацевтически приемлемые соли можно использовать одновременно, последовательно или отдельно с другими лечебными средствами. Примеры классов лекарств, с которыми соединения формулы I, формулы II и формулы III, описанные в данном документе, или их фармацевтически приемлемые соли могут быть скомбинированы, включают СМРЭ, ингибиторы ароматазы, ингибиторы CDK4, ингибиторы CDK6, ингибиторы PI3K и ингибиторы mTOR для лечения рака груди, позитивного по рецептору гормонов. Более конкретные примеры лекарственных средств, с которыми можно комбинировать соединения формулы I, формулы II и формулы III, описанные в данном документе, или их фармацевтически приемлемые соли, включают абемациклиб (ингибитор CDK4/6), эверолимус (ингибитор mTOR), алпелисиб (ингибитор PIK3CA) и 8-[5-(1-гидрокси-1-метилэтил)пиридин-3-ил]-1-[^)-2метоксипропил]-3-метил-1,3-дигидро-2Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2-он (ингибитор PI3K/mTOR).The compounds of formula I, formula II and formula III described herein, and their pharmaceutically acceptable salts, may have clinical use as a single agent or in combination with one or more other therapeutic agents (eg, anticancer agents) for the treatment of cancer, such as breast cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, prostate cancer, uterine cancer, stomach cancer or lung cancer. When used in combination with other therapeutic agents (such as anticancer agents), the compounds of Formula I, Formula II and Formula III described herein, or pharmaceutically acceptable salts thereof, can be used simultaneously, sequentially or separately with other therapeutic agents. Examples of drug classes with which the compounds of Formula I, Formula II and Formula III described herein, or pharmaceutically acceptable salts thereof, may be combined include SERMs, aromatase inhibitors, CDK4 inhibitors, CDK6 inhibitors, PI3K inhibitors and mTOR inhibitors for the treatment of cancer breast, hormone receptor positive. More specific examples of drugs with which the compounds of Formula I, Formula II and Formula III described herein, or pharmaceutically acceptable salts thereof, can be combined include abemaciclib (CDK4/6 inhibitor), everolimus (mTOR inhibitor), alpelisib (PIK3CA inhibitor ) and 8-[5-(1-hydroxy-1-methylethyl)pyridin-3-yl]-1-[^)-2methoxypropyl]-3-methyl-1,3-dihydro-2H-imidazo[4,5- c]quinolin-2-one (PI3K/mTOR inhibitor).
Используемый в данном документе термин эффективное количество относится к количеству или дозе соединения формулы I, формулы II и формулы III, описанного в данном документе, или его фармацевтически приемлемой соли, которое при однократном или многократном введении пациенту обеспечивает требуемый эффект у пациента, подлежащего диагностике или лечению. Предпочтительно желаемый эффект представляет собой ингибирование пролиферации опухолевых клеток, гибель опухолевых клеток или оба. Соединения формулы I, формулы II и формулы III, описанные в данном документе, или их фармацевтически приемлемые соли обычно эффективны в широком диапазоне доз. Например, дневные дозировки обычно находятся в дневном диапазоне от около 100 мг до около 2000 мг.As used herein, the term effective amount refers to the amount or dosage of a compound of Formula I, Formula II and Formula III described herein, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which, when administered single or multiple times to a patient, provides the desired effect in the patient being diagnosed or treated. . Preferably, the desired effect is inhibition of tumor cell proliferation, tumor cell death, or both. The compounds of Formula I, Formula II and Formula III described herein, or pharmaceutically acceptable salts thereof, are generally effective over a wide range of dosages. For example, daily dosages are typically in the daily range of about 100 mg to about 2000 mg.
Используемый в данном документе термин лечить, лечащий или лечение относится к ограничению, замедлению, остановке или реверсированию прогрессирования или тяжести существующего симптома или расстройства.As used herein, the term treat, treat or treatment refers to limiting, slowing, stopping or reversing the progression or severity of an existing symptom or disorder.
Используемый в данном документе термин пациент относится к человеку, который поражен определенным заболеванием, расстройством или состоянием.As used herein, the term patient refers to a person who is affected by a specific disease, disorder or condition.
Соединения формулы I, формулы II и формулы III, описанные в данном документе, или их фармацевтически приемлемые соли можно получать различными способами, известными в данной области техники, некоторые из которых проиллюстрированы ниже на схемах и в примерах получения и примерах. Конкретные стадии синтеза для каждого из описанных способов можно комбинировать по-разному или в сочетании со стадиями из разных методик, с получением соединений формулы I, формулы II и формулы III, описанных в данном документе, или их фармацевтически приемлемых солей. Продукты стадий синтеза можно выделять стандартными способами, хорошо известными в данной области техники, включая экстракцию, выпаривание, осаждение, хроматографию, фильтрацию, растирание и кристалThe compounds of Formula I, Formula II and Formula III described herein, or pharmaceutically acceptable salts thereof, can be prepared by various methods known in the art, some of which are illustrated below in the diagrams and preparation examples and examples. The specific synthetic steps for each of the described methods can be combined differently or in combination with steps from different techniques to produce the compounds of Formula I, Formula II and Formula III described herein, or pharmaceutically acceptable salts thereof. The products of the synthetic steps can be isolated by standard methods well known in the art, including extraction, evaporation, precipitation, chromatography, filtration, trituration and crystallization
- 5 045961 лизацию. Указанные реагенты и исходные материалы легко доступны специалистам в данной области техники.- 5 045961 lization. These reagents and starting materials are readily available to those skilled in the art.
Промежуточные соединения и способы, используемые для синтеза соединений формулы I, формулы II и формулы III, описанных в данном документе, предназначены для включения в это описание. Кроме того, определенные промежуточные соединения, описанные в данном документе, могут содержать одну или несколько защитных групп. Вариабельная защитная группа может быть в каждом случае одинаковой или различной, в зависимости от конкретных условий реакции и конкретных проводимых превращений. Условия защиты и снятия защиты хорошо известны специалистам в данной области техники и описаны в литературе (см., например, Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, Fourth Edition, by Peter G.M. Wuts and Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007).Intermediates and methods used for the synthesis of the compounds of Formula I, Formula II and Formula III described herein are intended to be included in this specification. In addition, certain intermediates described herein may contain one or more protecting groups. The variable protecting group may be the same or different in each case, depending on the specific reaction conditions and the specific transformations being carried out. The conditions for protection and deprotection are well known to those skilled in the art and described in the literature (see, for example, Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, Fourth Edition, by Peter G. M. Wuts and Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007 ).
Отдельные изомеры, энантиомеры и диастереомеры могут быть отделены или разделены специалистом в данной области в любой удобный момент синтеза соединений формулы I, формулы II и формулы III, описанных в данном документе, такими способами, как способ селективной кристаллизации или хиральная хроматография (см., например, J. Jacques, et al., Enantiomers, Racemates, and Resolutions, John Wiley and Sons, Inc., 1981, и E.L. Eliel and S.H. Wilen, Stereochemistry of Organic Compounds, WileyInterscience, 1994). Хотя отдельные изомеры, энантиомеры и диастереомеры могут быть отделены или разделены, как указано, их обозначения по Кану-Ингольду-Прелогу (R) или (S) для хиральных центров, возможно, еще не определены. Если обозначения по Кану-Ингольду-Прелогу (R) или (S) недоступны, используются идентификаторы изомер 1 и изомер 2, которые комбинируются с названием по IUPAC без обозначения стереохимии по Кану-Ингольду-Прелогу. Соединения формулы I, формулы II и формулы III, обозначенные в данном документе как изомер 1 или изомер 2, выделены, как определено в конкретных описаниях экспериментов ниже. Независимо от того в каком порядке изомеры 1 или 2 формулы I, формулы II и формулы III элюируются из колонки для хиральной хроматографии в указанных условиях, изомер 1 элюируется из колонки первым при указанных условиях. Если хиральная хроматография инициируется на ранней стадии синтеза, то же обозначение применяется к последующим промежуточным продуктам и соединениям формулы I, формулы II и формулы III.The individual isomers, enantiomers and diastereomers can be isolated or separated by one skilled in the art at any convenient time during the synthesis of the compounds of Formula I, Formula II and Formula III described herein by methods such as selective crystallization or chiral chromatography (see, e.g. , J. Jacques, et al., Enantiomers, Racemates, and Resolutions, John Wiley and Sons, Inc., 1981, and E. L. Eliel and S. H. Wilen, Stereochemistry of Organic Compounds, WileyInterscience, 1994). Although individual isomers, enantiomers, and diastereomers can be separated or separated as indicated, their Cahn-Ingold-Prelog designations (R) or (S) for chiral centers may not yet be determined. If the Kahn-Ingold-Prelog designation (R) or (S) is not available, the identifiers isomer 1 and isomer 2 are used and combined with the IUPAC name without the Kahn-Ingold-Prelog stereochemical designation. The compounds of formula I, formula II and formula III, designated herein as isomer 1 or isomer 2, are isolated as defined in the specific experimental descriptions below. Regardless of the order in which isomers 1 or 2 of Formula I, Formula II, and Formula III are eluted from the chiral chromatography column under the specified conditions, isomer 1 elutes from the column first under the specified conditions. If chiral chromatography is initiated early in the synthesis, the same designation applies to subsequent intermediates and compounds of Formula I, Formula II and Formula III.
Если не указано иное, используемые в данном документе сокращения определены в соответствии с Aldrichimica Ada, Vol. 17, No. 1, 1984. Другие сокращения определены следующим образом: ACN относится к ацетонитрилу; BSA относится к альбумину бычьей сыворотки; cataCXium® APd G3 относится к [(ди(1-адамантил)бутилфосфин)-2-(2'-амино-1,1'-бифенил)]метансульфонату палладия (II); DCM относится к дихлорметану или метиленхлориду; DMA относится к диметилацетамиду; DMEA относится к диметилэтиламину; DMEM относится к среде Игла, модифицированной Дульбекко; DMF относится к КН-диметилформамиду; DMSO относится к диметилсульфоксиду; ДНК относится к дезоксирибонуклеиновой кислоте; кДНК относится к комплементарной ДНК; ДНКаза относится к дезоксирибонуклеазе; DTT относится к дитиотреитолу; ЕС50относится к концентрации агента, которая вызывает 50% ответ целевой активности по сравнению с заранее определенным позитивным контрольным соединением (абсолютноеЕС50); EDTA относится к этилендиаминтетрауксусной кислоте; ее относится к энантиомерному избытку; РЭа относится к альфа-рецептору эстрогена; РЭв относится к бета-рецептору эстрогена; EtOAc относится к этилацетату; EtOH относится к этанолу или этиловому спирту; FBS относится к фетальной бычьей сыворотке; HBSS относится к сбалансированному солевому раствору Хэнка; НЕС относится к гидроксиэтилцеллюлозе; HEPES относится к 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоте; ВЭЖХ относится к высокоэффективной жидкостной хроматографии; IC50 относится к концентрации агента, которая вызывает 50% максимальной ингибирующей реакции, возможной для этого агента, (относительная IC50) или концентрации агента, которая вызывает 50% ингибирование активности целевого фермента по сравнению с контролем плацебо (абсолютное IC50); IPA относится к изопропиламину; iPrOH относится к изопропанолу или изопропиловому спирту; ВВ относится к внутривенному введению; Ki относится к константе ингибирования; МЕК относится к метилэтилкетону; МеОН относится к метиловому спирту или метанолу; МТВЕ относится к метил-тирети-бутиловому эфиру; PBS относится к физиологическому раствору с фосфатным буфером; ПО относится к пероральному введению; РПа относится к альфа-рецептору прогестерона; QD относится к дозировке один раз в день; РНК относится к рибонуклеиновой кислоте; РНКаза относится к рибонуклеазе; ОТ-ПЦР относится к полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией; ОТ-кПЦР относится к количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскприцией; СЖХ относится к сверхкритической жидкостной хроматографии; TED50 относится к эффективной дозе для достижения 50% ингибирования мишени в опухолях; THF относится к тетрагидрофурану; ”t(R) относится ко времени удерживания; XantPhos Pd G2 относится к хлор[(4,5бис(дифенилфосфино)-9,9-диметилксантен)-2-(2'-амино-1,1'-бифенил)]палладию (II); и XPhos Pd G2 относится к хлор(2-дициклогексилфосфино-2',4',6'-триизопропил-1,1'-бифенил)[2-(2'-амино-1,1'бифенил)]палладию (II).Unless otherwise specified, abbreviations used in this document are defined in accordance with Aldrichimica Ada, Vol. 17, No. 1, 1984. Other abbreviations are defined as follows: ACN refers to acetonitrile; BSA refers to bovine serum albumin; cataCXium® APd G3 refers to [(di(1-adamantyl)butylphosphine)-2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II)methanesulfonate; DCM refers to dichloromethane or methylene chloride; DMA refers to dimethylacetamide; DMEA refers to dimethylethylamine; DMEM refers to Dulbecco's modified Eagle's medium; DMF refers to KH-dimethylformamide; DMSO refers to dimethyl sulfoxide; DNA refers to deoxyribonucleic acid; cDNA refers to complementary DNA; DNase refers to deoxyribonuclease; DTT refers to dithiothreitol; EC 50 refers to the concentration of agent that produces a 50% response of target activity compared to a predetermined positive control compound (absolute EC 50 ); EDTA refers to ethylenediaminetetraacetic acid; it refers to enantiomeric excess; REa refers to estrogen receptor alpha; REv refers to estrogen receptor beta; EtOAc refers to ethyl acetate; EtOH refers to ethanol or ethyl alcohol; FBS refers to fetal bovine serum; HBSS refers to Hank's Balanced Salt Solution; HEC refers to hydroxyethylcellulose; HEPES refers to 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid; HPLC refers to high-performance liquid chromatography; IC 50 refers to the concentration of an agent that produces 50% of the maximum inhibitory response possible for that agent (relative IC 50 ) or the concentration of agent that produces 50% inhibition of target enzyme activity compared to a placebo control (absolute IC 50 ); IPA refers to isopropylamine; iPrOH refers to isopropanol or isopropyl alcohol; IV refers to intravenous administration; Ki refers to the inhibition constant; MEK refers to methyl ethyl ketone; MeOH refers to methyl alcohol or methanol; MTBE refers to methyl tereti-butyl ether; PBS refers to phosphate buffered saline; PO refers to oral administration; RPa refers to the progesterone receptor alpha; QD refers to once daily dosing; RNA refers to ribonucleic acid; RNase refers to ribonuclease; RT-PCR refers to reverse transcription polymerase chain reaction; RT-qPCR refers to quantitative reverse transcription polymerase chain reaction; SLC refers to supercritical liquid chromatography; TED50 refers to the effective dose to achieve 50% target inhibition in tumors; THF refers to tetrahydrofuran; ”t(R) refers to the retention time; XantPhos Pd G2 refers to chloro[(4,5bis(diphenylphosphino)-9,9-dimethylxanthene)-2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II); and XPhos Pd G2 refers to chloro(2-dicyclohexylphosphino-2',4',6'-triisopropyl-1,1'-biphenyl)[2-(2'-amino-1,1'biphenyl)]palladium(II) .
Следующие способы получения и примеры дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение.The following preparation methods and examples further illustrate the present invention.
- 6 045961- 6 045961
Схема 1.Scheme 1.
Получение и примерыReceipt and examples
II
На схеме 1 показан синтез соединений формулы I.Scheme 1 shows the synthesis of compounds of formula I.
На стадии А осуществляется реакция Гриньяра. Реакция Гриньяра хорошо известна в данной области как реакция образования углерод-углеродных связей. Реакция включает металлоорганическую реакцию, в которой арилмагнийгалогенид, реактив Гриньяра, присоединяется к карбонильной группе, такой как хлорангидрид соединения 2, с получением соединения стадии А. Например, 4-хлорзамещенный хинолон, соединение 1, обрабатывают реактивом Гриньяра, таким как изопропилмагнийхлорид, с образованием промежуточного продукта Гриньяра с последующим добавлением хлорангидрида, 4фторбензоилхлорида, соединения 2, в растворителе, таком как THF. По завершении реакцию можно погасить водой с получением соединения 3.In step A, the Grignard reaction occurs. The Grignard reaction is well known in the art as a carbon-carbon bonding reaction. The reaction involves an organometallic reaction in which an arylmagnesium halide, a Grignard reagent, is added to a carbonyl group such as the acid chloride of Compound 2 to produce the compound of Step A. For example, the 4-chloroquinolone, Compound 1, is treated with a Grignard reagent such as isopropylmagnesium chloride to form the intermediate Grignard product followed by the addition of the acid chloride, 4fluorobenzoyl chloride, compound 2, in a solvent such as THF. Once complete, the reaction can be quenched with water to give compound 3.
На стадии В арилметиловый эфир соединения 3 может быть деметилирован в различных условиях, известных специалисту в данной области, таких как обработка трибромидом бора. Например, соединение 3 медленно обрабатывают трибромидом бора при температуре около 0°С в растворителе, таком как DCM. Смесь перемешивают при комнатной температуре и гасят двухосновным фосфатом калия с получением соединения 4.In Step B, the aryl methyl ester of compound 3 can be demethylated under various conditions known to one skilled in the art, such as treatment with boron tribromide. For example, compound 3 is slowly treated with boron tribromide at about 0° C. in a solvent such as DCM. The mixture is stirred at room temperature and quenched with dibasic potassium phosphate to give compound 4.
На стадии С, азетидиновый эфир 6 может быть образован обработкой соответствующего пфторфенилкетона 4 и спиртовой соли азетидина 5 или соответствующего свободного основания подходящим основанием, например, гидридом натрия, трет-бутоксидом натрия или трет-бутоксидом калия в подходящем полярном апротонном растворителе, таком как DMF или THF, с получением эфира 6.In Step C, azetidine ester 6 can be formed by treating the corresponding pfluorophenyl ketone 4 and the alcohol salt of azetidine 5 or the corresponding free base with a suitable base, for example sodium hydride, sodium t-butoxide or potassium t-butoxide in a suitable polar aprotic solvent such as DMF or THF, to obtain ester 6.
Затем соединение 6 алкилируют соответствующей замещенной арилбороновой кислотой, соединением 7, в реакции конденсации Сузуки с получением соединения 8 на стадии D. Специалист в данной области поймет, что существует множество условий, которые могут быть полезны для облегчения таких реакций конденсации. Подходящие палладиевые реагенты могут включать XantPhos Pd G2, cataCXium® A Pd G3, хлорид бис(трифенилфосфин)палладия (II), трис(дибензилиденацетон)дипалладий (0) с трициклогексилфосфином, хлорид (1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен)палладия (II), тетракистрифенилфосфин палладия или ацетат палладия (II). Подходящие основания могут включать фторид калия, карбонат цезия, карбонат натрия, карбонат калия, трет-бутоксид лития или трехосновный моногидрат фосфата калия. Соединение 6, например, может реагировать с соответствующей бороновой кислотой, соединением 7, таким как 2-фтор-4-(трифторметил)фенилбороновая кислота в растворителе, таком как 2-метил-2бутанол, с основанием, таким как карбонат калия, и катализатором, таким как XPhos Pd G2, и нагрета до около 80°С в условиях микроволнового облучения, с получением соединения 8.Compound 6 is then alkylated with the appropriately substituted arylboronic acid, compound 7, in a Suzuki condensation reaction to give compound 8 in step D. One skilled in the art will appreciate that there are a variety of conditions that may be useful in facilitating such condensation reactions. Suitable palladium reagents may include XantPhos Pd G2, cataCXium® A Pd G3, bis(triphenylphosphine)palladium(II) chloride, tris(dibenzylideneacetone)dipalladium(0) with tricyclohexylphosphine, (1,1'-bis(diphenylphosphino)ferrocene)palladium chloride (II), palladium tetrakistriphenylphosphine or palladium (II) acetate. Suitable bases may include potassium fluoride, cesium carbonate, sodium carbonate, potassium carbonate, lithium tert-butoxide or potassium phosphate tribasic monohydrate. Compound 6, for example, can be reacted with a corresponding boronic acid, compound 7, such as 2-fluoro-4-(trifluoromethyl)phenylboronic acid in a solvent such as 2-methyl-2butanol, a base such as potassium carbonate, and a catalyst, such as XPhos Pd G2, and heated to about 80°C under microwave irradiation to give compound 8.
Специалист в данной области поймет, что стадия D, реакция конденсации Сузуки, может быть завершена до образования азетидинового эфира на стадии С.One skilled in the art will appreciate that Step D, the Suzuki condensation reaction, can be completed before the azetidine ester is formed in Step C.
Специалист в данной области поймет, что на стадии Е соединение 8 можно циклизовать путем начального восстановления кетона. Это может быть выполнено с использованием восстанавливающего агента, такого как триэтилборогидрид лития, в таких растворителях, как 1,4-диоксан и THF, и при температуре от около 0°С до комнатной температуры, с получением соответствующего вторичного спирта.One skilled in the art will appreciate that in step E, compound 8 can be cyclized by initial reduction of the ketone. This can be accomplished using a reducing agent such as lithium triethylborohydride, in solvents such as 1,4-dioxane and THF, and at temperatures from about 0° C. to room temperature, to produce the corresponding secondary alcohol.
- 7 045961- 7 045961
Этот промежуточный спирт можно использовать неочищенным и депротонировать при помощи подходящего основания, такого как карбонат цезия, гидрид натрия, трет-бутоксид натрия или трет-бутоксид калия, в растворителе, таком как THF, DMSO или DMF. Полученный алкоксид может циклизоваться в арилфторид при комнатной температуре, при нагревании до кипения или при температуре около 60°С. Замещенный циклический эфир, образующийся при замещении фторида, затем может быть получен с образованием соединений формулы I.This intermediate alcohol can be used crude and deprotonated with a suitable base such as cesium carbonate, sodium hydride, sodium t-butoxide or potassium t-butoxide in a solvent such as THF, DMSO or DMF. The resulting alkoxide can cyclize to aryl fluoride at room temperature, when heated to boiling, or at a temperature of about 60°C. The substituted cyclic ester formed by fluoride displacement can then be prepared to form compounds of formula I.
Альтернативно, кетон 8 можно восстановить до спирта и хирально очистить на стадии F с получением хирального спирта 9, и затем циклизовать на стадии G, как описано выше для стадии Е, с получением соединений формулы I.Alternatively, ketone 8 can be reduced to an alcohol and chirally purified in step F to give chiral alcohol 9, and then cyclized in step G as described above for step E to give compounds of formula I.
В другой альтернативной реакции кетон может быть восстановлен с использованием хирального реагента, такого как ^)-(+)-а.а-дифенил-2-пирролидинметанол вместе с триметилборатом и борандиметилсульфидом, непосредственно с получением желаемого хирального спирта, соединения 9, который затем можно циклизовать на стадии G, как описано выше для стадии Е, с получением соединений формулы I.In another alternative reaction, the ketone can be reduced using a chiral reagent such as ^)-(+)-a.a-diphenyl-2-pyrrolidinemethanol along with trimethyl borate and boran dimethyl sulfide, directly yielding the desired chiral alcohol, compound 9, which can then be cyclize in step G as described above for step E to give compounds of formula I.
На необязательной стадии может быть получена фармацевтически приемлемая соль соединения формулы I, формулы II и формулы III, как описано в данном документе, посредством взаимодействия соответствующего свободного основания формулы I, формулы II и формулы III, описанных в данном документе, с подходящей фармацевтически приемлемой кислотой в подходящем растворителем в стандартных условиях. Кроме того, указанные соли можно получать одновременно с удалением азотзащитных групп. Возможное образование фармацевтически приемлемых солей хорошо известно. См., например, Gould, P.L., Salt selection for basic drugs, International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986); Bastin, R.I, et al. Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities, Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000); и Berge, S.M., et al., Pharmaceutical Salts, Journal oj Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977). Специалистам в данной области техники будет понятно, что соединение формулы I, формулы II и формулы III, описанное в данном документе, может быть легко превращено и выделено в виде фармацевтически приемлемой соли. Примеры полезных солей включают, но не ограничиваются ими, соли бензолсульфоновой кислоты и соли 4метилбензолсульфоновой кислоты. Соли 4-метилбензолсульфоновой кислоты также известны как тозилатные соли.In an optional step, a pharmaceutically acceptable salt of a compound of Formula I, Formula II and Formula III as described herein can be prepared by reacting the appropriate free base of Formula I, Formula II and Formula III described herein with a suitable pharmaceutically acceptable acid in suitable solvent under standard conditions. In addition, these salts can be obtained simultaneously with the removal of nitrogen protecting groups. The possible formation of pharmaceutically acceptable salts is well known. See, for example, Gould, P. L., Salt selection for basic drugs, International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986); Bastin, R. I, et al. Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities, Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000); and Berge, S.M., et al., Pharmaceutical Salts, Journal oj Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977). Those skilled in the art will appreciate that the compound of Formula I, Formula II and Formula III described herein can be readily converted and isolated as a pharmaceutically acceptable salt. Examples of useful salts include, but are not limited to, benzenesulfonic acid salts and 4methylbenzenesulfonic acid salts. Salts of 4-methylbenzenesulfonic acid are also known as tosylate salts.
Синтез 1. 2-[3-(Фторметил)азетидин-1-ил]этан-1-ол.Synthesis of 1. 2-[3-(Fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethan-1-ol.
Добавляют триацетоксиборгидрид натрия (405 г, 1,91 моль) порциями в течение 15 мин к перемешиваемому раствору 3-(фторметил)азетидина гидрохлорида (160 г, 1,28 моль) в DCM (2,4 л) в атмосфере N2 при 0°С и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Добавляют 1,4-диоксан-2,5-диол (99 г, 0,83 моль) при 0°С, 6 порций в течение 1 ч, затем перемешивают при 0-5°С в течение 15 мин. Позволяют реакционной смеси нагреваться до комнатной температуры и перемешивают в течение 2 ч в атмосфере N2. Реакционную смесь охлаждают до 10-15°С в течение 20 мин, затем нагревают до 25-30°С и выдерживают при этой температуре в течение 2 ч. Добавляют воду (800 мл) в течение 25-30 мин при 10-15°С, позволяют нагреться до комнатной температуры в течение 5-10 мин, и затем разделяют слои. Водный слой промывают DCM (800 мл), разделяют слои, затем охлаждают объединенные водные слои до 10-15°С и доводят рН до 13-14, используя 50% раствор гидроксида натрия (~540 мл). Позволяют водному слою нагреться до комнатной температуры, экстрагируют DCM (4 х 800 мл), сушат сульфатом натрия (80 г), фильтруют и концентрируют досуха с получением указанного в заголовке соединения (139 г, 82%) в виде густого желтого масла. ЭС/МС (m/z): 134,1 (M+H).Add sodium triacetoxyborohydride (405 g, 1.91 mol) in portions over 15 min to a stirred solution of 3-(fluoromethyl)azetidine hydrochloride (160 g, 1.28 mol) in DCM (2.4 L) under N2 at 0°C C and stir at 0°C for 10 minutes. Add 1,4-dioxane-2,5-diol (99 g, 0.83 mol) at 0°C, 6 portions over 1 hour, then stir at 0-5°C for 15 minutes. Allow the reaction mixture to warm to room temperature and stir for 2 hours under N 2 atmosphere. The reaction mixture is cooled to 10-15°C for 20 minutes, then heated to 25-30°C and maintained at this temperature for 2 hours. Add water (800 ml) over 25-30 minutes at 10-15°C , allow to warm to room temperature for 5-10 minutes, and then separate the layers. The aqueous layer is washed with DCM (800 ml), the layers are separated, then the combined aqueous layers are cooled to 10-15°C and the pH is adjusted to 13-14 using 50% sodium hydroxide solution (~540 ml). Allow the aqueous layer to warm to room temperature, extract with DCM (4 x 800 ml), dry with sodium sulfate (80 g), filter and concentrate to dryness to give the title compound (139 g, 82%) as a thick yellow oil. ES/MS (m/z): 134.1 (M+H).
Синтез 2. 2-[3-(Фторметил)азетидин-1-ил]этан-1-ол гидрохлорид.Synthesis 2. 2-[3-(Fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethan-1-ol hydrochloride.
F'Xk/--.0H F 'Xk/--. 0H
HCIHCI
Растворяют 2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этан-1-ол (529 г, 4 моль) в МТВЕ (2,6 л) и охлаждают до 0°С. Добавляют раствор HCl/EtOH (492 мл, 30 мас.%) по каплям в течение 30 мин, затем перемешивают при 0°С в течение 30 мин. Фильтруют твердые частицы и промывают осадок на фильтре МТВЕ (2x200 мл). Сушат в атмосфере N2 в течение 8 ч с получением указанного в заголовке соединения (580 г, 86%) в виде белого твердого вещества. ЭС/МС (m/z): 134,0 (М+Н).Dissolve 2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethan-1-ol (529 g, 4 mol) in MTBE (2.6 L) and cool to 0°C. Add HCl/EtOH solution (492 ml, 30 wt%) dropwise over 30 min, then stir at 0°C for 30 min. Filter solid particles and wash the precipitate on a MTBE filter (2x200 ml). Dry under N2 for 8 hours to give the title compound (580 g, 86%) as a white solid. ES/MS (m/z): 134.0 (M+H).
Синтез 3. (3-Хлор-7-метоксихинолин-4-ил)-(4-фторфенил)метанон.Synthesis 3. (3-Chloro-7-methoxyquinolin-4-yl)-(4-fluorophenyl)methanone.
Охлаждают смесь 4-бром-3-хлор-7-метоксихинолина (70 г, 254 ммоль) в THF (1 л) до -40°С в атмосфере N2, что приводит к осаждению материала. Добавляют изопропилмагнийхлорид (2M в THF, 254 мл,Cool the mixture of 4-bromo-3-chloro-7-methoxyquinoline (70 g, 254 mmol) in THF (1 L) to -40° C. under N 2 to allow the material to precipitate. Add isopropyl magnesium chloride (2M in THF, 254 ml,
- 8 045961- 8 045961
509 ммоль) в течение 20 мин и перемешивают смесь в течение 1 ч. Добавляют раствор 4фторбензоилхлорида (66 мл, 559 ммоль) в THF (140 мл) по каплям, затем позволяют раствору нагреться до комнатной температуры. Гасят реакцию насыщенным раствором NH4Cl (300 мл) и водой (200 мл) и разделяют слои. Органический слой промывают насыщенным раствором NH4Cl (300 мл), сушат над MgSO4, фильтруют и концентрируют, с получением маслянистого остатка. Сырое коричневое масло фильтруют через силикагель, элюируют смесью МТВЕ/гексаны (1:1), с получением сырого продукта в виде желтого твердого вещества (84 г). Обрабатывают твердое вещество 10% смесью метилацетат/гептан (800 мл) и перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Фильтруют для сбора твердых частиц и запаса. Концентрируют фильтрат и очищают на силикагеле, элюируют смесью 10-40% EtOAc/гексаны, затем обрабатывают продукт 10% метилацетатом/гептаном (200 мл) и перемешивают при комнатной температуре в течение 3 часов. Полученные твердые вещества фильтруют, объединяют с твердыми веществами от предыдущей фильтрации и сушат в вакууме в течение ночи с получением указанного в заголовке соединения (31 г, 38%) в виде желтого твердого вещества. ЭС/МС (m/z): 316,0 (М+Н).509 mmol) for 20 min and stir the mixture for 1 h. Add a solution of 4-fluorobenzoyl chloride (66 ml, 559 mmol) in THF (140 ml) dropwise, then allow the solution to warm to room temperature. Quench the reaction with a saturated solution of NH4Cl (300 ml) and water (200 ml) and separate the layers. The organic layer was washed with saturated NH4Cl solution (300 ml), dried over MgSO 4 , filtered and concentrated to leave an oily residue. The crude brown oil was filtered through silica gel, eluting with MTBE/hexanes (1:1) to give the crude product as a yellow solid (84 g). Treat the solid with 10% methyl acetate/heptane (800 ml) and stir at room temperature overnight. Filter to collect solids and stock. Concentrate the filtrate and purify on silica gel, elute with 10-40% EtOAc/hexanes, then treat the product with 10% methyl acetate/heptane (200 ml) and stir at room temperature for 3 hours. The resulting solids were filtered, combined with the solids from the previous filtration and dried in vacuo overnight to give the title compound (31 g, 38%) as a yellow solid. ES/MS (m/z): 316.0 (M+H).
Синтез 4. (3-Хлор-7-гидроксихинолин-4-ил)-(4-фторфенил)метанон.Synthesis 4. (3-Chloro-7-hydroxyquinolin-4-yl)-(4-fluorophenyl)methanone.
Добавляют трибромид бора (1M в DCM, 295 мл, 295 ммоль) к смеси (3-хлор-7-метоксихинолин-4ил)-(4-фторфенил)метанона (31 г, 98 ммоль) в DCM (217 мл) и перемешивают смесь при комнатной температуре в течение 3 дней. Медленно выливают смесь в раствор двухосновного фосфата калия (2M в воде, 700 мл) и воды (200 мл) при 0°С. Смесь оставляют нагреться до комнатной температуры и перемешивают в течение 1 ч. Раствор концентрируют в вакууме для удаления органических растворителей, фильтруют, собирают фильтрат и сушат фильтрат в вакууме при 45°С в течение ночи. Обрабатывают твердые вещества смесью DCM/гептан (1:1, 450 мл) и перемешивают в течение ночи. Собирают твердые вещества и сушат в вакууме в течение ночи с получением указанного в заголовке соединения (32 г, количественный выход) в виде светло-коричневого твердого вещества. ЭС/МС (m/z): 302,0 (М+Н).Add boron tribromide (1M in DCM, 295 ml, 295 mmol) to a mixture of (3-chloro-7-methoxyquinolin-4yl)-(4-fluorophenyl)methanone (31 g, 98 mmol) in DCM (217 ml) and stir the mixture at room temperature for 3 days. Slowly pour the mixture into a solution of dibasic potassium phosphate (2M in water, 700 ml) and water (200 ml) at 0°C. The mixture is allowed to warm to room temperature and stirred for 1 hour. The solution is concentrated in vacuo to remove organic solvents, filtered, the filtrate is collected and the filtrate is dried in vacuo at 45°C overnight. Treat the solids with DCM/heptane (1:1, 450 ml) and stir overnight. Collect the solids and dry in vacuo overnight to give the title compound (32 g, quantitative yield) as a light brown solid. ES/MS (m/z): 302.0 (M+H).
Синтез 5. (3 -Хлор-7-гидроксихинолин-4-ил)-(4- {2-[3 -(фторметил)азетидин-1 -ил] этокси}фенил)метанон.Synthesis 5. (3-Chloro-7-hydroxyquinolin-4-yl)-(4-{2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)methanone.
Добавляют 2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этан-1-ол гидрохлорид (3,90 г, 23,0 ммоль) к перемешиваемому раствору (3-хлор-7-гидроксихинолин-4-ил)-(4-фторфенил)метанона (5,00 г, 15,3 ммоль) в DMF (75 мл) с последующим добавлением гидрида натрия (60% в минеральном масле, 3,02 г, 76,8 ммоль). Перемешивают в атмосфере N2 и нагревают до 40°С в течение 45 мин. Гасят раствор водой и концентрируют. Разделяют остаток между 20% iPrOH/CHCl3 и насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и разделяют, водный раствор экстрагируют 2x20% iPrOH/CHCl3, объединяют органические экстракты, сушат объединенные органические слои над сульфатом магния, фильтруют и концентрируют фильтрат с получением сырого продукта в виде темно-красного масла. Сырой материал очищают хроматографией на колонке с силикагелем, элюируют градиентом 5-10% 7 N NH3 в MeOH/DCM, с получением указанного в заголовке соединения (5,31 г, 84%) в виде желтого твердого вещества. ЭС/МС (m/z): 415,0 (М+Н).Add 2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethan-1-ol hydrochloride (3.90 g, 23.0 mmol) to the stirred solution of (3-chloro-7-hydroxyquinolin-4-yl)-( 4-fluorophenyl)methanone (5.00 g, 15.3 mmol) in DMF (75 ml) followed by sodium hydride (60% in mineral oil, 3.02 g, 76.8 mmol). Stir under N 2 atmosphere and heat to 40°C for 45 minutes. Quench the solution with water and concentrate. Divide the residue between 20% iPrOH/CHCl 3 and saturated aqueous sodium bicarbonate and separate, extract the aqueous solution with 2x20% iPrOH/CHCl 3 , combine the organic extracts, dry the combined organic layers over magnesium sulfate, filter and concentrate the filtrate to give the crude product as dark red oil. The crude material was purified by silica gel column chromatography, eluting with a gradient of 5-10% 7 N NH 3 in MeOH/DCM to give the title compound (5.31 g, 84%) as a yellow solid. ES/MS (m/z): 415.0 (M+H).
Синтез 6. (4-{2-[3-(Фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил){3-[2-фтор-4-(трифторметил)фенил]-7гидроксихинолин-4-ил } метанон.Synthesis 6. (4-{2-[3-(Fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl){3-[2-fluoro-4-(trifluoromethyl)phenyl]-7hydroxyquinolin-4-yl} methanone.
Дегазируют N2 (5x) смесь (3-хлор-7-гидроксихинолин-4-ил)-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1ил]этокси}фенил)метанона (200 мг, 0,48 ммоль), 2-фтор-4-(трифторметил)фенилбороновой кислоты (158 мг, 0,72 ммоль), карбоната калия (202 мг, 1,45 ммоль), 2-метил-2-бутанола (3 мл) и воды (1 мл) в сосуде для микроволновой обработки. Добавляют XPhos Pd G2 (12 мг, 0,015 ммоль), герметизируют и помещают в микроволновую печь при 80°С на 2 ч. Разделяют остаток между МТВЕ и насыщенным раствором NH4Cl. Разделяют слои и экстрагируют водную фазу МТВЕ. Объединяют органические экстракты, сушат сульфатом магния, фильтруют и концентрируют фильтрат с получением оранжевого остатка. Сырой материал очищают колоночной хроматографией на силикагеле, элюируют 5% MeOH/DCM, с получением указанного в заголовке соединения (205 мг, 78%) в виде желтого твердого вещества. ЭС/МС (m/z): 543,2Degas N 2 (5x) mixture of (3-chloro-7-hydroxyquinolin-4-yl)-(4-{2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1yl]ethoxy}phenyl)methanone (200 mg, 0.48 mmol ), 2-fluoro-4-(trifluoromethyl)phenylboronic acid (158 mg, 0.72 mmol), potassium carbonate (202 mg, 1.45 mmol), 2-methyl-2-butanol (3 ml) and water (1 ml) in a microwave-safe vessel. Add XPhos Pd G2 (12 mg, 0.015 mmol), seal and microwave at 80°C for 2 hours. Divide the residue between MTBE and saturated NH4Cl solution. Separate the layers and extract the aqueous phase with MTBE. Combine the organic extracts, dry with magnesium sulfate, filter and concentrate the filtrate to obtain an orange residue. The crude material was purified by silica gel column chromatography, eluting with 5% MeOH/DCM to give the title compound (205 mg, 78%) as a yellow solid. ES/MS (m/z): 543.2
- 9 045961 (М+Н).- 9 045961 (M+N).
Получают следующие соединения способом, по сути аналогичным способу Синтеза 6, со следующими вариантами способа, продолжительностью нагревания 1 -2 ч, экстракцией МТВЕ или EtOAc и сушкой органических слоев сульфатом магния или сульфатом натрия. Очищают колоночной хроматографией на силикагеле, используя до 10% (МеОН или 7 М аммиак в МеОН) в DCM (Синтез 10: градиент 3-8% 7 М аммиак в МеОН в DCM; Синтез 9 и 11: градиент от 4 до 10% 7 М аммиак в МеОН в DCM) и/или обращенно-фазовой хроматографией при высоком рН, как указано.The following compounds are prepared in a manner substantially similar to that of Synthesis 6, with the following process variations, heating times of 1-2 hours, extraction with MTBE or EtOAc, and drying of the organic layers with magnesium sulfate or sodium sulfate. Purify by column chromatography on silica gel using up to 10% (MeOH or 7 M ammonia in MeOH) in DCM (Synthesis 10: gradient 3-8% 7 M ammonia in MeOH in DCM; Synthesis 9 and 11: gradient 4 to 10% 7 M ammonia in MeOH in DCM) and/or high pH reverse phase chromatography as indicated.
Таблица 2table 2
Соединения, полученные согласно синтезу 6Compounds obtained according to synthesis 6
- 10 045961- 10 045961
а Очищают обращенно-фазовой флэш-хроматографией при высоком рН (колонка RediSep Rf GOLD® High Performance C18, элюируют 35-45% ACN в 10 мМ водном бикарбонате аммония с 5% МеОН). a Purify by high pH reverse phase flash chromatography (RediSep Rf GOLD® High Performance C18 column, elute with 35-45% ACN in 10 mM aqueous ammonium bicarbonate with 5% MeOH).
b После очистки на силикагеле, элюируют 4-10% 7 М аммик в МеОН в DCM, дополнительно очищали обращенно-фазовой флэш-хроматографией при высоком рН (колонка RediSep Rf b After purification on silica gel, elute with 4-10% 7 M ammonia in MeOH in DCM, further purified by reverse phase high pH flash chromatography (RediSep Rf column
GOLD® High Performance C18, элюируют 30-44% ACN в 10 мМ водном бикарбонате аммония с 5% МеОН).GOLD® High Performance C18, elute with 30-44% ACN in 10 mM aqueous ammonium bicarbonate with 5% MeOH).
Синтез 14. Рацемический 4-{2-[3-(Фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)(гидрокси)метил]-3-[2фтор-4-(трифторметил)фенил]хинолин-7-ол.Synthesis 14. Racemic 4-{2-[3-(Fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)(hydroxy)methyl]-3-[2fluoro-4-(trifluoromethyl)phenyl]quinolin-7-ol.
ОН^ X,jOlTfOH^ X,jOlTf
Добавляют (4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил){3-[2-фтор-4-(трифторметил)фенил]7-гидроксихинолин-4-ил}метанон (305 г, 562,2 ммоль) и THF (1,5 л) вместе в атмосфере N2 и охлаждают раствор до 0-5°С. По каплям добавляют триэтилборгидрид лития (1M в THF, 1,5 л, 1,5 моль). Перемешивают при 0-5°С в течение 1 ч. По каплям добавляют воду (300 мл) и насыщенный NH4Cl (1 л). Смесь нагревают до комнатной температуры. Добавляют EtOAc (2 л) и собирают органический слой. Органический слой промывают рассолом (500 мл), сушат над MgSO4, фильтруют и концентрируют досуха. Остаток растворяют в смеси 95:5 ацетона и 2 М аммиака в МеОН и фильтруют через силикагель, с получением указанного в заголовке соединения (264 г, 86,2%) в виде оранжевого твердого вещества. ЭС/МС (m/z): 545,2 (М+Н).Add (4-{2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl){3-[2-fluoro-4-(trifluoromethyl)phenyl]7-hydroxyquinolin-4-yl}methanone (305 g , 562.2 mmol) and THF (1.5 L) together under N 2 atmosphere and cool the solution to 0-5°C. Add lithium triethylborohydride (1M in THF, 1.5 L, 1.5 mol) dropwise. Stir at 0-5°C for 1 hour. Add water (300 ml) and saturated NH4Cl (1 l) dropwise. The mixture is warmed to room temperature. Add EtOAc (2 L) and collect the organic layer. The organic layer is washed with brine (500 ml), dried over MgSO 4 , filtered and concentrated to dryness. The residue was dissolved in a 95:5 mixture of acetone and 2 M ammonia in MeOH and filtered through silica gel to give the title compound (264 g, 86.2%) as an orange solid. ES/MS (m/z): 545.2 (M+H).
Синтез 15. 4-{2-[3 -(Фторметил)азетидин-1 -ил]этокси}фенил)(гидрокси)метил] -3 - [2-фтор-4(трифторметил)фенил]хинолин-7-ол, изомер 1.Synthesis 15. 4-{2-[3 -(Fluoromethyl)azetidin-1 -yl]ethoxy}phenyl)(hydroxy)methyl] -3 - [2-fluoro-4(trifluoromethyl)phenyl]quinolin-7-ol, isomer 1.
Очищают рацемический 4-{2-[3 - (фторметил)азетидин-1 -ил]этокси} фенил)(гидрокси)метил] -3-[2фтор-4-(трифторметил)фенил]хинолин-7-ол (354 г, 0,62 моль) хиральной хроматографией в следующих условиях: колонка Chiralpak AD-H, 150х 50 мм, скорость потока 300 г/мин, УФ 350 нм, подвижная фаза 35% iPrOH с 0,5% DMEA/CO2, температура колонки 40°С с получением указанного в заголовке соединения (171,4 г, 48%) первого элюируемого изомера. Подтверждают энантиомерное обогащение Изомера 1 при помощи хиральной аналитической СЖХ, >98% ее, t(R) = 0,79 минуты, колонка: 4,6x150 мм Chiralpak AD-H, элюируют подвижной фазой 35% iPrOH с 0,5% DMEA в СО2, скорость потока 0,6 мл/мин, УФдетектирование 350 нм.Purify racemic 4-{2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)(hydroxy)methyl]-3-[2fluoro-4-(trifluoromethyl)phenyl]quinolin-7-ol (354 g, 0.62 mol) by chiral chromatography under the following conditions: Chiralpak AD-H column, 150x50 mm, flow rate 300 g/min, UV 350 nm, mobile phase 35% iPrOH with 0.5% DMEA/CO2, column temperature 40° C to give the title compound (171.4 g, 48%) of the first eluting isomer. Confirm enantiomeric enrichment of Isomer 1 by chiral analytical SLC, >98% ee, t( R ) = 0.79 minutes, column: 4.6x150 mm Chiralpak AD-H, elute with mobile phase 35% iPrOH with 0.5% DMEA in CO 2 , flow rate 0.6 ml/min, UV detection 350 nm.
Альтернативный синтез 15.Alternative synthesis 15.
Добавляют триметилборат (65 мг, 0,62 ммоль) к раствору ^)-(+)-а.а-дифенил-2-пирролидинметанола (132 мг, 0,52 ммоль) в THF (20 мл). Смесь перемешивают в атмосфере N2 при комнатной температуре в течение 1 ч. Добавляют боран-диметилсульфид (2,0 М в THF, 2,6 мл, 5,2 ммоль), а затем (4-{2-[3(фторметил)азетидин-1 -ил] этокси} фенил) { 3 - [2-фтор-4-(трифторметил)фенил] -7 -гидроксихинолин-4ил}метанон (1,0 г, 1,73 ммоль). Нагревают реакционную смесь в течение ночи при 45°С. Добавляют дополнительно боран-диметилсульфид (2,0 М в THF, 2,6 мл, 5,2 ммоль) и перемешивают в течение 5 часов приAdd trimethylborate (65 mg, 0.62 mmol) to a solution of N)-(+)-a.a-diphenyl-2-pyrrolidinemethanol (132 mg, 0.52 mmol) in THF (20 ml). The mixture was stirred under N2 at room temperature for 1 hour. Borane dimethyl sulfide (2.0 M in THF, 2.6 mL, 5.2 mmol) was added followed by (4-{2-[3(fluoromethyl)azetidine -1-yl]ethoxy}phenyl){3-[2-fluoro-4-(trifluoromethyl)phenyl]-7-hydroxyquinolin-4yl}methanone (1.0 g, 1.73 mmol). Heat the reaction mixture overnight at 45°C. Add additional borane dimethyl sulfide (2.0 M in THF, 2.6 ml, 5.2 mmol) and stir for 5 hours at
- 11 045961- 11 045961
45°С. Медленно добавляют насыщенный раствор NH4Cl (25 мл) и выделяют органическую фазу. Повторно экстрагируют водный экстракт 20% iPrOH/CHCl3. Органические экстракты объединяют, сушат над Na2SO4, фильтруют и упаривают, с получением промежуточного боранового комплекса (1,2 г). Растворяют одну треть промежуточного боранового комплекса (0,4 г, 0,6 ммоль) в 1,4-диоксане (4 мл) и этаноламине (0,3 мл, 5 ммоль) и нагревают реакционную смесь до 70°С в течение 3 часов. Гасят реакцию насыщенным раствором NH4Cl (25 мл) и выделяют органическую фазу. Повторно экстрагируют водный экстракт 20% iPrOH/CHCl3 (4x25 мл). Объединяют органические экстракты, сушат над Na2SO4, фильтруют и концентрируют досуха с получением указанного в заголовке соединения в виде оранжевого твердого вещества (0,33 г, 0,57 ммоль, выход 100%). ЖХ/МС (m/z): [М+Н]+ 545. Подтверждают энантиомерное обогащение Изомера 1 при помощи хиральной аналитической СЖХ, 96% ее, t(R) = 0,79 минуты, колонка: 4,6x150 мм Chiralpak AD-H, элюирование подвижной фазой 35% iPrOH с 0,5% DMEA в СО2, скорость потока 0,6 мл/мин, УФ-детектирование 350 нм.45°C. Slowly add saturated NH 4 Cl solution (25 ml) and separate out the organic phase. The aqueous extract is re-extracted with 20% iPrOH/CHCl 3 . The organic extracts are combined, dried over Na 2 SO 4 , filtered and evaporated to give the intermediate borane complex (1.2 g). Dissolve one third of the intermediate borane complex (0.4 g, 0.6 mmol) in 1,4-dioxane (4 ml) and ethanolamine (0.3 ml, 5 mmol) and heat the reaction mixture to 70°C for 3 hours . Quench the reaction with saturated NH 4 Cl solution (25 ml) and isolate the organic phase. Re-extract the aqueous extract with 20% iPrOH/CHCl 3 (4x25 ml). Combine the organic extracts, dry over Na 2 SO 4 , filter and concentrate to dryness to give the title compound as an orange solid (0.33 g, 0.57 mmol, 100% yield). LC/MS (m/z): [M+H]+ 545. Confirm enantiomeric enrichment of Isomer 1 using chiral analytical SLC, 96% ee, t(R) = 0.79 minutes, column: 4.6x150 mm Chiralpak AD -H, elution with mobile phase 35% iPrOH with 0.5% DMEA in CO 2 , flow rate 0.6 ml/min, UV detection 350 nm.
Пример 1.Example 1.
Рацемический 5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-8-(трифторметил)-5Н-[1] бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ол.Racemic 5-(4-{2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-8-(trifluoromethyl)-5H-[1]benzopyrano[4,3-c]quinolin-2-ol .
Охлаждают раствор (4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси} фенил) {3-[2-фтор-4(трифторметил)фенил]-7-гидроксихинолин-4-ил}метанона (5,27 г, 9,71 ммоль) в 1,4-диоксане (100 мл) до 5°С. Добавляют триэтилборгидрид лития (1M в THF, 30,0 мл, 30,0 ммоль). Убирают охлаждающую баню и перемешивают 1 ч при комнатной температуре. Смесь гасят водой. Добавляют насыщенный раствор NH4Cl и EtOAc. Разделяют слои и экстрагируют водный слой EtOAc. Органические экстракты объединяют, сушат над безводным MgSO4, фильтруют и концентрируют фильтрат. Растворяют неочищенный остаток в THF (100 мл). Добавляют гидрид натрия (60% в минеральном масле, 1,94 г, 48,5 ммоль). Раствор кипятят с обратным холодильником 1 ч. Добавляют дополнительно гидрид натрия (60% в минеральном масле, 1,94 г, 48,5 ммоль), затем кипятят с обратным холодильником еще 30 мин. Охлаждают раствор до комнатной температуры и гасят водой. Добавляют EtOAc и насыщенный раствор NH4Cl. Разделяют слои и экстрагируют водный слой EtOAc. Органический экстракт объединяют, сушат над безводным MgSO4, фильтруют и концентрируют фильтрат. Очищают остаток колоночной хроматографией на силикагеле, элюируют градиентом 5-7%МеОН в DCM, с получением указанного в заголовке соединения (3,70 г, выход 72%) в виде желтого пенистого вещества. ЭС/МС (m/z): 525,2 (М+Н).Cool the solution of (4-{2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl){3-[2-fluoro-4(trifluoromethyl)phenyl]-7-hydroxyquinolin-4-yl}methanone (5 .27 g, 9.71 mmol) in 1,4-dioxane (100 ml) to 5°C. Add lithium triethylborohydride (1M in THF, 30.0 mL, 30.0 mmol). Remove the cooling bath and stir for 1 hour at room temperature. The mixture is quenched with water. Add a saturated solution of NH 4 Cl and EtOAc. Separate the layers and extract the aqueous layer with EtOAc. The organic extracts are combined, dried over anhydrous MgSO 4 , filtered and the filtrate is concentrated. Dissolve the crude residue in THF (100 ml). Add sodium hydride (60% in mineral oil, 1.94 g, 48.5 mmol). The solution is refluxed for 1 hour. Additional sodium hydride (60% in mineral oil, 1.94 g, 48.5 mmol) is added, then refluxed for another 30 minutes. Cool the solution to room temperature and quench with water. Add EtOAc and saturated NH 4 Cl solution. Separate the layers and extract the aqueous layer with EtOAc. The organic extract is combined, dried over anhydrous MgSO4, filtered and the filtrate is concentrated. Purify the residue by silica gel column chromatography, eluting with a gradient of 5-7% MeOH in DCM to give the title compound (3.70 g, 72% yield) as a yellow foam. ES/MS (m/z): 525.2 (M+H).
Следующие соединения получают способом, практически аналогичным способу примера 1, со следующими вариантами методики. Для восстановления используют от 3 до 5 эквивалентов триэтилборгидрида лития со временем реакции от 30 мин до одного часа и сушат органические слои над сульфатом магния или сульфатом натрия. Неочищенный остаток используют непосредственно или очищают колоночной хроматографией на силикагеле, элюируют градиентом 0-5-7,5-10% МеОН в DCM перед циклизацией. Проводят циклизацию при нагревании с обратным холодильником в THF в течение 16 ч или в DMF, от 2 ч при комнатной температуре для примера 2, до 2 ч при 85°С для примера 8. Экстрагируют DCM или EtOAc и сушат органические слои над сульфатом магния или сульфатом натрия. Очищают колоночной хроматографией на силикагеле, используя до 10% (МеОН или 7 М аммиак в МеОН) в DCM (пример 2: градиент 0-10% МеОН в DCM; пример 5: градиент 4-10% 7 М аммиак в МеОН в DCM; пример 8: градиент 5-7,5% 7 М аммиак в МеОН в DCM) или при помощи обращенно-фазовой ВЭЖХ при высоком рН, как указано.The following compounds are prepared in a manner substantially similar to that of Example 1, with the following variations in procedure. For reduction, use 3 to 5 equivalents of lithium triethylborohydride with a reaction time of 30 minutes to one hour and dry the organic layers over magnesium sulfate or sodium sulfate. The crude residue is used directly or purified by silica gel column chromatography, eluting with a gradient of 0-5-7.5-10% MeOH in DCM before cyclization. Carry out cyclization under reflux in THF for 16 hours or in DMF, from 2 hours at room temperature for example 2, to 2 hours at 85°C for example 8. Extract with DCM or EtOAc and dry the organic layers over magnesium sulfate or sodium sulfate. Purify by silica gel column chromatography using up to 10% (MeOH or 7 M ammonia in MeOH) in DCM (Example 2: gradient 0-10% MeOH in DCM; Example 5: gradient 4-10% 7 M ammonia in MeOH in DCM; example 8: gradient 5-7.5% 7 M ammonia in MeOH in DCM) or by reverse phase HPLC at high pH as indicated.
- 12 045961- 12 045961
Таблица 3Table 3
Примеры соединений, полученных согласно примеру 1Examples of compounds prepared according to example 1
- 13 045961- 13 045961
Рацемический 5-(4-{2[3(фторметил)азетидин1 -ил]этокси} фенил)-8метил-5НRacemic 5-(4-{2[3(fluoromethyl)azetidin1 -yl]ethoxy}phenyl)-8methyl-5H
[1 ]бензопирано[4,3с]хинолин-2-ол[1]benzopyrano[4,3c]quinolin-2-ol
Рацемический 5-(4-{2[з(фторметил)азетидин1 -ил]этокси} фенил)-7метил-5НRacemic 5-(4-{2[s(fluoromethyl)azetidin1 -yl]ethoxy}phenyl)-7methyl-5H
[1 ]бензопирано[4,3с]хинолин-2-ол[1]benzopyrano[4,3c]quinolin-2-ol
а Очистка при помощи обращенно-фазовой ВЭЖХ с высоким рН (KINETEX® С18, 5 мкм, колонка 30x250 мм, элюируют 35-50% ACN в 10 мМ водном бикарбонате аммония с 5% МеОН) b Очистка при помощи обращенно-фазовой ВЭЖХ с высоким рН (KINETEX® С18, 5 мкм, колонка 30x250 мм, элюируют 35-43% ACN в 10 мМ водном бикарбонате аммония с 5% МеОН) a Purification by high pH reverse phase HPLC (KINETEX® C18, 5 µm, 30x250 mm column, elute with 35-50% ACN in 10 mM aqueous ammonium bicarbonate with 5% MeOH) b Purification by high pH reverse phase HPLC pH (KINETEX® C18, 5 µm, 30x250 mm column, elute with 35-43% ACN in 10 mM aqueous ammonium bicarbonate with 5% MeOH)
После очистки на силикагеле, элюируют 4-10% 7М аммиак в МеОН в DCM, проводят дополни тельную очистку при помощи обращенно-фазовой ВЭЖХ при высоком рН (KINETEX® C18, 5 мкм, колонка 30x250 мм, элюируют 30-44% ACN в 10 мМ водном бикарбонате аммония с 5% МеОН) d Очистка при помощи обращенно-фазовой ВЭЖХ при высоком рН (XBRIDGE® C18 5 мкм OBD, колонка 30x75 мм, элюируют 10-75% ACN в 10 мМ водном бикарбонате аммония с 5% МеОН) е Очистка при помощи обращенно-фазовой ВЭЖХ с высоким рН (XBRIDGE® С18 5 мкм OBD, колонка 30x75 мм, элюируют 10-60% ACN в 10 мМ водном бикарбонате аммония с 5% МеОН)After purification on silica gel, elute with 4-10% 7M ammonia in MeOH in DCM, further purify using reverse phase HPLC at high pH (KINETEX® C18, 5 µm, 30x250 mm column, elute with 30-44% ACN in 10 mM aqueous ammonium bicarbonate with 5% MeOH) d Purification by reverse phase HPLC at high pH (XBRIDGE® C18 5 µm OBD, 30x75 mm column, elute with 10-75% ACN in 10 mM aqueous ammonium bicarbonate with 5% MeOH) e Purification by reverse phase high pH HPLC (XBRIDGE® C18 5 µm OBD, 30x75 mm column, elute with 10-60% ACN in 10 mM aqueous ammonium bicarbonate with 5% MeOH)
Пример 1А.Example 1A.
5-(4-{2-[3-(Фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-8-(трифторметил)-5Н-[1]бензопирано[4,3с]хинолин-2-ол, изомер 1.5-(4-{2-[3-(Fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-8-(trifluoromethyl)-5H-[1]benzopyrano[4,3c]quinolin-2-ol, isomer 1 .
Пример 1В.Example 1B.
5-(4-{2-[3-(Фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-8-(трифторметил)-5Н-[1]бензопирано[4,3с]хинолин-2-ол, изомер 2.5-(4-{2-[3-(Fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-8-(trifluoromethyl)-5H-[1]benzopyrano[4,3c]quinolin-2-ol, isomer 2 .
Разделяют два энантиомера 5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-8-(трифторметил)5Н-[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ол при помощи хиральной СЖХ в следующих условиях: колонка: LUX® Cellulose-1, 5x25 см; элюируют подвижной фазой 30% iPrOH (с 0,5% DMEA) в СО2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 300 г/мин; длина волны УФ-детектирования: 270 нм с получением Примера 1А в качестве первого элюируемого энантиомера (изомер 1). ЭС/МС (m/z): 525,2 (М+Н). Подтверждают энантиомерное обогащение Изомера 1 при помощи хиральной аналитической СЖХ, >99% ее, t(R): 1,30 мины; колонка: CHIRALCEL® OD-H, 4,6x150 мм; элюируют подвижной фазой 30% МеОН (0,2% IPA) в CO2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 5 мл/мин; длина волны УФ-детектирования: 225 нм. Выделяют указанное в заголовке соединение Примера 1В, с получением второго элюируемого энантиомера (Изомер 2). ЭС/МС (m/z): 525,2 (М+Н). Подтверждают энантиомерное обогащение Изомера 2 при помощи хиральной аналитической СЖХ, 98% ее, r(R): 2,03 минуты; колонка: CHIRALCEL® OD-H, 4,6x150 мм; элюируют подвижной фазой 30% МеОН (0,2% IPA) в СО2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 5 мл/мин; длина волны УФ-детектирования: 225 нм.Two enantiomers of 5-(4-{2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-8-(trifluoromethyl)5H-[1]benzopyrano[4,3-c]quinoline-2- are separated ol using chiral SLC under the following conditions: column: LUX® Cellulose-1, 5x25 cm; elute with a mobile phase of 30% iPrOH (with 0.5% DMEA) in CO 2 ; column temperature: 40°C; flow rate: 300 g/min; UV detection wavelength: 270 nm, yielding Example 1A as the first enantiomer eluted (isomer 1). ES/MS (m/z): 525.2 (M+H). Confirm enantiomeric enrichment of Isomer 1 by chiral analytical SLC, >99% ee, t( R ): 1.30 min; column: CHIRALCEL® OD-H, 4.6x150 mm; elute with a mobile phase of 30% MeOH (0.2% IPA) in CO 2 ; column temperature: 40°C; flow rate: 5 ml/min; UV detection wavelength: 225 nm. The title compound of Example 1B is isolated to give the second eluting enantiomer (Isomer 2). ES/MS (m/z): 525.2 (M+H). Enantiomeric enrichment of Isomer 2 was confirmed by chiral analytical SLC, 98% ee, r( R ): 2.03 minutes; column: CHIRALCEL® OD-H, 4.6x150 mm; elute with a mobile phase of 30% MeOH (0.2% IPA) in CO 2 ; column temperature: 40°C; flow rate: 5 ml/min; UV detection wavelength: 225 nm.
Альтернативный синтез примера 1В.Alternative synthesis of example 1B.
Кристаллический 5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-8-(трифторметил)-5Н[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ол, Изомер 2 Перемешивают 5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1ил]этокси}фенил)-8-(трифторметил)-5Н-[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ол, 4-метилбензолсульфоновуюCrystalline 5-(4-{2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-8-(trifluoromethyl)-5H[1]benzopyrano[4,3-c]quinolin-2-ol, Isomer 2 Stir 5-(4-{2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1yl]ethoxy}phenyl)-8-(trifluoromethyl)-5H-[1]benzopyrano[4,3-c]quinolin-2-ol , 4-methylbenzenesulfonic
- 14 045961 кислоту, Изомер 2 (23,8 г, 0,034 моль) в воде (250 мл) при 1000 об/мин. Добавляют NaOH (76 мкл) и перемешивают раствор в течение 2 ч. Добавляют DCM (600 мл). Разделяют смесь, сушат экстракт DCM сульфатом магния, фильтруют материал через шприцевой фильтр (0,45 мкм) и концентрируют досуха. Оставляют материал в потоке N2 в течение выходных. Добавляют 1: 1 EtOH/вода (80 мл) и перемешивают смесь ультразвуком. Собирают рыжевато-коричневое твердое вещество фильтрованием на нейлоновой мембране с получением указанного в заголовке соединения (10,47 г, 0,02 моль, 59%).- 14 045961 acid, Isomer 2 (23.8 g, 0.034 mol) in water (250 ml) at 1000 rpm. Add NaOH (76 µl) and stir the solution for 2 hours. Add DCM (600 ml). Separate the mixture, dry the DCM extract with magnesium sulfate, filter the material through a syringe filter (0.45 µm) and concentrate to dryness. Leave the material in the N2 stream over the weekend. Add 1:1 EtOH/water (80 ml) and stir the mixture ultrasonically. Collect the tan solid by filtration on a nylon membrane to give the title compound (10.47 g, 0.02 mol, 59%).
Рентгеновская порошковая дифрактометрия (РПД).X-ray powder diffractometry (RPD).
Рентгенограммы кристаллических твердых веществ получены на рентгеновском порошковом дифрактометре Bruker D4 Endeavour, оснащенном источником CuKa и детектором Vantec, работающем при 35 кВ и 50 мА. Образец сканировали в диапазоне от 4 до 40 2θ°, с шагом 0,008 2θ°, и скоростью сканирования 0,5 секунд/шаг, и используя дивергенцию 1,0 мм, неподвижную отсеивающую решетку 6,6 мм и щель детектора 11,3 мм. Сухой порошок упаковывают в кварцевую кювету и гладкую поверхность получают при помощи предметного стекла. Дифрактограммы кристаллической формы снимали при температуре окружающей среды и относительной влажности. Положения пиков кристаллов определяют в MDIJade после полного сдвига дифрактограмм на основе внутреннего стандарта NIST 675 с пиками при 8,853 и 26,774 2θ°. В области кристаллографии хорошо известно, что для любой данной кристаллической формы относительные интенсивности дифракционных пиков могут варьироваться вследствие предпочтительной ориентации, обусловленной такими факторами, как морфология и структура кристалла. Если присутствует влияние предпочтительной ориентации, интенсивности пиков изменяются, но характерные положения пиков полиморфа остаются неизменными. См., например, The United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18, pages 1843-1844, 1995. Дополнительно, в области кристаллографии также хорошо известно, что для любой данной формы кристалла угловые положения пиков могут незначительно изменяться. Например, положения пиков могут смещаться из-за изменения температуры, при которой анализируется образец, смещения образца или наличия или отсутствия внутреннего стандарта. В данном случае изменчивость положения пика в ± 0,2 2θ° учитывает эти потенциальные изменения, не мешая однозначной идентификации указанной кристаллической формы. Подтверждение кристаллической формы может быть сделано на основе любой уникальной комбинации отличительных пиков.X-ray diffraction patterns of crystalline solids were obtained on a Bruker D4 Endeavor X-ray powder diffractometer equipped with a CuKa source and a Vantec detector operating at 35 kV and 50 mA. The sample was scanned from 4 to 40 2θ°, with a step size of 0.008 2θ°, and a scan speed of 0.5 seconds/step, and using a divergence of 1.0 mm, a fixed screening grating of 6.6 mm, and a detector slit of 11.3 mm. The dry powder is packed into a quartz cuvette and a smooth surface is obtained using a glass slide. X-ray diffraction patterns of the crystalline form were taken at ambient temperature and relative humidity. Crystal peak positions are determined in MDIJade after fully shifting the diffraction patterns based on the NIST 675 internal standard with peaks at 8.853 and 26.774 2θ°. It is well known in the field of crystallography that for any given crystal form, the relative intensities of the diffraction peaks can vary due to preferred orientation caused by factors such as morphology and crystal structure. If the influence of preferred orientation is present, the peak intensities change, but the characteristic peak positions of the polymorph remain unchanged. See, for example, The United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18, pages 1843-1844, 1995. Additionally, it is also well known in the field of crystallography that for any given crystal shape the angular positions of the peaks may vary slightly. For example, peak positions may shift due to changes in the temperature at which the sample is analyzed, sample drift, or the presence or absence of an internal standard. In this case, the peak position variability of ±0.2 2θ° accounts for these potential changes without interfering with the unambiguous identification of the indicated crystalline form. Confirmation of the crystal form can be made based on any unique combination of distinctive peaks.
Полученный образец кристаллического 5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-8(трифторметил)-5Н-[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ола, изомер 2, характеризовали по рентгенограмме с использованием излучения CuKa, имеющего дифракционные пики (значения 2-тета), как описано в табл. 3 ниже, и, в частности, имеющего пики при 19,8 в комбинации с одним или несколькими из пиков, выбранных из группы, состоящей из 6,8, 16,0 и 22,1; с допуском на углы дифракции 0,2 градуса.The resulting sample of crystalline 5-(4-{2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-8(trifluoromethyl)-5H-[1]benzopyrano[4,3-c]quinoline-2- ol isomer 2 was characterized by X-ray diffraction using CuKa radiation having diffraction peaks (2-theta values) as described in Table. 3 below, and in particular having peaks at 19.8 in combination with one or more of the peaks selected from the group consisting of 6.8, 16.0 and 22.1; with a tolerance for diffraction angles of 0.2 degrees.
Таблица 4Table 4
Пики рентгеновской порошковой дифрактометрии кристаллического примера 1ВX-ray powder diffraction peaks of crystalline example 1B
Альтернативный синтез примера 1В.Alternative synthesis of example 1B.
Растворяют 4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)(гидрокси)метил]-3-[2-фтор-4(трифторметил)фенил]хинолин-7-ол, изомер 1(63,05 г, 104,7 ммоль) в DMSO (1,3 л) в атмосфере N2 при комнатной температуре. Добавляют порциями карбонат цезия (108 г, 331 ммоль) в течение 5 мин. Нагревают смесь до 60°С в течение 15 ч. Смесь охлаждают до комнатной температуры и разбавляют водой (2,1 л) и EtOAc (1,3 л). Смесь перемешивают 5 мин и разделяют. Повторно экстрагируют водный материал EtOAc (1,3 л) и перемешивают в течение 5 мин. Разделяют и объединяют органические экстракты, промывают рассолом, водой и EtOAc. Органические экстракты сушат над MgSO4, концентрируют и суDissolve 4-{2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)(hydroxy)methyl]-3-[2-fluoro-4(trifluoromethyl)phenyl]quinolin-7-ol, isomer 1( 63.05 g, 104.7 mmol) in DMSO (1.3 L) under N2 at room temperature. Add cesium carbonate (108 g, 331 mmol) in portions over 5 minutes. Heat the mixture to 60°C for 15 hours. Cool the mixture to room temperature and dilute with water (2.1 L) and EtOAc (1.3 L). The mixture is stirred for 5 minutes and separated. Re-extract the aqueous material with EtOAc (1.3 L) and stir for 5 minutes. Separate and combine the organic extracts, wash with brine, water and EtOAc. Organic extracts are dried over MgSO 4 , concentrated and dried
- 15 045961 шат в вакууме в течение ночи при комнатной температуре с получением указанного в заголовке соединения в виде коричневого твердого вещества (52,69 г, 95,9%).- 15 045961 in vacuo overnight at room temperature to give the title compound as a brown solid (52.69 g, 95.9%).
Подтверждают энантиомерное обогащение примера 1В при помощи хиральной аналитической СЖХ, 98,1% ее, 1^:2,03 минуты; колонка: CHIRALCEL® OD-H, 4,6x150 мм; элюируют подвижной фазой 30% МеОН (0,2% IPA) в CO2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 5 мл/мин; длина волны УФ-детектирования: 225 нм.Enantiomeric enrichment of Example 1B was confirmed by chiral analytical SLC, 98.1% ee, 1^:2.03 minutes; column: CHIRALCEL® OD-H, 4.6x150 mm; elute with a mobile phase of 30% MeOH (0.2% IPA) in CO2; column temperature: 40°C; flow rate: 5 ml/min; UV detection wavelength: 225 nm.
Пример 2А.Example 2A.
5-(4-{2-[3 -(Фторметил)азетидин-1 -ил]этокси} фенил)-7-(трифторметил)-5Н- [ 1 ] бензопирано [4,3с]хинолин-2-ол, изомер 1.5-(4-{2-[3 -(Fluoromethyl)azetidin-1 -yl]ethoxy}phenyl)-7-(trifluoromethyl)-5H-[1]benzopyrano[4,3c]quinolin-2-ol, isomer 1 .
Пример 2В.Example 2B.
5-(4-{2-[3 -(Фторметил)азетидин-1 -ил]этокси} фенил)-7-(трифторметил)-5Н- [ 1 ] бензопирано [4,3с]хинолин-2-ол, изомер 2.5-(4-{2-[3 -(Fluoromethyl)azetidin-1 -yl]ethoxy}phenyl)-7-(trifluoromethyl)-5H-[1]benzopyrano[4,3c]quinolin-2-ol, isomer 2 .
Разделяют два энантиомера 5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-7-(трифторметил)5Н-[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ола хиральной СЖХ в следующих условиях: колонка: CHIRALPAK® IC, 21x250 см; элюируют подвижной фазой 30% iPrOH (с 0,2% IPA) в СО2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 70 г/мин; длина волны УФ-детектирования: 225 нм с получением Примера 2А в качестве первого элюируемого энантиомера (изомер 1). ЭС/МС (m/z): 525,1 (М+Н). Подтверждают энантиомерное обогащение Изомера 1 при помощи хиральной аналитической СЖХ, >99% ее, t-Ry 1,56 минуты; колонка: CHIRALPAK® IC, 4,6x150 мм; элюируют подвижной фазой 30% iPrOH (0,2% IPA) в CO2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 5 мл/мин; длина волны УФ-детектирования: 225 нм. Выделяют указанное в заголовке соединение Примера 2В с получением второго элюируемого энантиомера (Изомер 2). ЭС/МС (m/z): 525,2 (М+Н). Подтверждают энантиомерное обогащение Изомера 2 при помощи хиральной аналитической СЖХ, 98% ее, t (R): 2,33 минуты; колонка: CHIRALPAK® IC, 4,6x150 мм; элюируют подвижной фазой 30% iPrOH (0,2% IPA) в CO2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 5 мл/мин; длина волны УФ-детектирования: 225 нм.Two enantiomers of 5-(4-{2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-7-(trifluoromethyl)5H-[1]benzopyrano[4,3-c]quinoline-2- are separated ola chiral SLC under the following conditions: column: CHIRALPAK® IC, 21x250 cm; elute with a mobile phase of 30% iPrOH (with 0.2% IPA) in CO 2 ; column temperature: 40°C; flow rate: 70 g/min; UV detection wavelength: 225 nm, yielding Example 2A as the first enantiomer eluted (isomer 1). ES/MS (m/z): 525.1 (M+H). Confirm enantiomeric enrichment of Isomer 1 by chiral analytical SLC, >99% ee, t-Ry 1.56 minutes; column: CHIRALPAK® IC, 4.6x150 mm; elute with a mobile phase of 30% iPrOH (0.2% IPA) in CO2; column temperature: 40°C; flow rate: 5 ml/min; UV detection wavelength: 225 nm. The title compound of Example 2B is isolated to give the second eluting enantiomer (Isomer 2). ES/MS (m/z): 525.2 (M+H). Enantiomeric enrichment of Isomer 2 was confirmed by chiral analytical SLC, 98% ee, t(R): 2.33 minutes; column: CHIRALPAK® IC, 4.6x150 mm; elute with a mobile phase of 30% iPrOH (0.2% IPA) in CO 2 ; column temperature: 40°C; flow rate: 5 ml/min; UV detection wavelength: 225 nm.
Пример 3А.Example 3A.
8-Хлор-5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-5Н-[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ол, изомер 1.8-Chloro-5-(4-{2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-5H-[1]benzopyrano[4,3-c]quinolin-2-ol, isomer 1 .
Пример 3В.Example 3B.
8-Хлор-5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-5Н-[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ол, изомер 2.8-Chloro-5-(4-{2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-5H-[1]benzopyrano[4,3-c]quinolin-2-ol, isomer 2 .
Разделяют два энантиомера 8-хлор-5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-5Н[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ола при помощи хиральной СЖХ в следующих условиях: колонка: CHIRALCEL® OD-H, 21x250 см; элюируют подвижной фазой 35% МеОН (с 0,2% IPA) в CO2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 80 г/мин; длина волны УФ-детектирования: 225 нм, с получением Примера 3А в качестве первого элюируемого энантиомера (изомер 1). ЭС/МС (m/z): 491,0 (М+Н). Подтверждают энантиомерное обогащение Изомера 1 при помощи хиральной аналитической СЖХ, >99% ее, t(R): 1,55 мины; колонка: CHIRALCEL® OD-H, 4,6x150 мм; элюируют подвижной фазой 35% МеОН (0,2% IPA) в СО2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 5 мл/мин; длина волны УФ-детектирования: 225 нм. Выделяют указанное в заголовке соединение Примера 3В с получением второго элюируемого энантиомера (Изомер 2). ЭС/МС (m/z): 491,0 (М+Н). Подтверждают энантиомерное обогащение Изомера 2 при помощи хиральной аналитической СЖХ, >99% ее, t(R): 2,26 минуты; колонка: CHIRALCEL® OD-H, 4,6x150 мм; элюируют подвижной фазой 35% МеОН (0,2% IPA) в СО2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 5 мл/мин; длина волны УФ-детектирования: 225 нм.Two enantiomers of 8-chloro-5-(4-{2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-5H[1]benzopyrano[4,3-c]quinolin-2-ol are separated at using chiral SLC under the following conditions: column: CHIRALCEL® OD-H, 21x250 cm; elute with a mobile phase of 35% MeOH (with 0.2% IPA) in CO2; column temperature: 40°C; flow rate: 80 g/min; UV detection wavelength: 225 nm, yielding Example 3A as the first enantiomer eluted (isomer 1). ES/MS (m/z): 491.0 (M+H). Confirm enantiomeric enrichment of Isomer 1 by chiral analytical SLC, >99% ee, t( R ): 1.55 min; column: CHIRALCEL® OD-H, 4.6x150 mm; elute with a mobile phase of 35% MeOH (0.2% IPA) in CO 2 ; column temperature: 40°C; flow rate: 5 ml/min; UV detection wavelength: 225 nm. The title compound of Example 3B is isolated to give the second eluting enantiomer (Isomer 2). ES/MS (m/z): 491.0 (M+H). Confirm enantiomeric enrichment of Isomer 2 by chiral analytical SLC, >99% ee, t( R ): 2.26 minutes; column: CHIRALCEL® OD-H, 4.6x150 mm; elute with a mobile phase of 35% MeOH (0.2% IPA) in CO 2 ; column temperature: 40°C; flow rate: 5 ml/min; UV detection wavelength: 225 nm.
Пример 4А.Example 4A.
7-Хлор-5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-5Н-[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ол, изомер 1.7-Chloro-5-(4-{2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-5H-[1]benzopyrano[4,3-c]quinolin-2-ol, isomer 1 .
Пример 4В.Example 4B.
7-Хлор-5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-5Н-[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ол, изомер 2.7-Chloro-5-(4-{2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-5H-[1]benzopyrano[4,3-c]quinolin-2-ol, isomer 2 .
- 16 045961- 16 045961
Разделяют два энантиомера 7-хлор-5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-5Н[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ола при помощи хиральной СЖХ в следующих условиях: колонка: CHIRALCEL® OD-H, 21x250 см; элюируют подвижной фазой 35% МеОН (с 0,2% IPA) в CO2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 80 г/мин; длина волны УФ-детектирования: 225 нм, с получением Примера 4А в качестве первого элюируемого энантиомера (изомер 1). ЭС/МС (m/z): 491,0 (М+Н). Подтверждают энантиомерное обогащение Изомера 1 при помощи хиральной аналитической СЖХ, >99% ее, t(R): 1,71 минуты; колонка: CHIRALCEL® OD-H, 4,6x150 мм; элюируют подвижной фазой 35% МеОН (0,2% IPA) в СО2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 5 мл/мин; длина волны УФ-детектирования: 225 нм. Выделяют указанное в заголовке соединение Примера 4В с получением второго элюируемого энантиомера (Изомер 2). ЭС/МС (m/z): 491,0 (М+Н). Подтверждают энантиомерное обогащение Изомера 2 при помощи хиральной аналитической СЖХ, >99% ее, t(R): 2,38 минуты; колонка: CHIRALCEL® OD-H, 4,6x150 мм; элюируют подвижной фазой 35% МеОН (0,2% IPA) в CO2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 5 мл/мин; длина волны УФ-детектирования: 225 нм.Two enantiomers of 7-chloro-5-(4-{2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-5H[1]benzopyrano[4,3-c]quinolin-2-ol are separated at using chiral SLC under the following conditions: column: CHIRALCEL® OD-H, 21x250 cm; elute with a mobile phase of 35% MeOH (with 0.2% IPA) in CO 2 ; column temperature: 40°C; flow rate: 80 g/min; UV detection wavelength: 225 nm, yielding Example 4A as the first enantiomer eluted (isomer 1). ES/MS (m/z): 491.0 (M+H). Confirm enantiomeric enrichment of Isomer 1 by chiral analytical SLC, >99% ee, t( R ): 1.71 minutes; column: CHIRALCEL® OD-H, 4.6x150 mm; elute with a mobile phase of 35% MeOH (0.2% IPA) in CO 2 ; column temperature: 40°C; flow rate: 5 ml/min; UV detection wavelength: 225 nm. The title compound of Example 4B is isolated to give the second eluting enantiomer (Isomer 2). ES/MS (m/z): 491.0 (M+H). Confirm enantiomeric enrichment of Isomer 2 by chiral analytical SLC, >99% ee, t( R ): 2.38 minutes; column: CHIRALCEL® OD-H, 4.6x150 mm; elute with a mobile phase of 35% MeOH (0.2% IPA) in CO 2 ; column temperature: 40°C; flow rate: 5 ml/min; UV detection wavelength: 225 nm.
Пример 5А.Example 5A.
8-Фтор-5-(4-{2-[3 -(фторметил)азетидин-1 -ил] этокси}фенил)-5Н- [ 1 ] бензопирано [4,3-с]хинолин-2-ол, изомер 1.8-Fluoro-5-(4-{2-[3 -(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-5H-[1]benzopyrano[4,3-c]quinolin-2-ol, isomer 1 .
Пример 5В.Example 5B.
8-Фтор-5-(4-{2-[3 -(фторметил)азетидин-1 -ил] этокси}фенил)-5Н- [ 1 ] бензопирано [4,3-с]хинолин-2-ол, изомер 2.8-Fluoro-5-(4-{2-[3 -(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-5H-[1]benzopyrano[4,3-c]quinolin-2-ol, isomer 2 .
F 0 Х/Хх/ F F 0 Х/Хх/ F
TTJT XXXTTJT XXX
Разделяют два энантиомера 8-фтор-5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-5Н[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ола при помощи хиральной СЖХ в следующих условиях: колонка: CHIRALCEL® OD-H, 21x250 см; элюируют подвижной фазой 30% МеОН (с 0,2% IPA) в CO2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 80 г/мин; длина волны УФ-детектирования: 225 нм, с получением Примера 5А в качестве первого элюируемого энантиомера (изомер 1). ЭС/МС (m/z): 475,0 (М+Н). Подтверждают энантиомерное обогащение Изомера 1 при помощи хиральной аналитической СЖХ, >99% ее, t(R):1,56 минуты; колонка: CHIRALCEL® OD-H, 4,6x150 мм; элюируют подвижной фазой 30% МеОН (0,2% IPA) в CO2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 5 мл/мин; длина волны УФдетектирования: 225 нм. Выделяют указанное в заголовке соединение Примера 5В с получением второго элюируемого энантиомера (Изомер 2). ЭС/МС (m/z): 475,0 (М+Н). Подтверждают энантиомерное обогащение Изомера 2 при помощи хиральной аналитической СЖХ, >99% ее, t(R): 2,29 минуты; колонка: CHIRALCEL® OD-H, 4,6x150 мм; элюируют подвижной фазой 30% МеОН (0,2% IPA) в CO2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 5 мл/мин; длина волны УФ-детектирования: 225 нм.Two enantiomers of 8-fluoro-5-(4-{2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-5H[1]benzopyrano[4,3-c]quinolin-2-ol are separated at using chiral SLC under the following conditions: column: CHIRALCEL® OD-H, 21x250 cm; elute with a mobile phase of 30% MeOH (with 0.2% IPA) in CO 2 ; column temperature: 40°C; flow rate: 80 g/min; UV detection wavelength: 225 nm, yielding Example 5A as the first enantiomer eluted (isomer 1). ES/MS (m/z): 475.0 (M+H). Confirm enantiomeric enrichment of Isomer 1 by chiral analytical SLC, >99% ee, t(R): 1.56 minutes; column: CHIRALCEL® OD-H, 4.6x150 mm; elute with a mobile phase of 30% MeOH (0.2% IPA) in CO 2 ; column temperature: 40°C; flow rate: 5 ml/min; UV detection wavelength: 225 nm. The title compound of Example 5B is isolated to give the second eluting enantiomer (Isomer 2). ES/MS (m/z): 475.0 (M+H). Confirm enantiomeric enrichment of Isomer 2 by chiral analytical SLC, >99% ee, t( R ): 2.29 minutes; column: CHIRALCEL® OD-H, 4.6x150 mm; elute with a mobile phase of 30% MeOH (0.2% IPA) in CO 2 ; column temperature: 40°C; flow rate: 5 ml/min; UV detection wavelength: 225 nm.
Пример 6А.Example 6A.
7-Фтор-5-(4-{2-[3 -(фторметил)азетидин-1 -ил] этокси}фенил)-5Н- [ 1 ] бензопирано [4,3-с] хинолин-2ол, изомер 1.7-Fluoro-5-(4-{2-[3 -(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-5H-[1]benzopyrano[4,3-c]quinolin-2ol, isomer 1.
Пример 6В.Example 6B.
7-Фтор-5-(4-{2-[3 -(фторметил)азетидин-1 -ил] этокси}фенил)-5Н- [ 1 ] бензопирано [4,3-с]хинолин-2-ол, изомер 2.7-Fluoro-5-(4-{2-[3 -(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-5H-[1]benzopyrano[4,3-c]quinolin-2-ol, isomer 2 .
Т Т J н о hrT T J no hr
Разделяют два энантиомера 7-фтор-5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-5Н[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ола при помощи хиральной СЖХ в следующих условиях: колонка: CHIRALCEL® OD-H, 21x250 см; элюируют подвижной фазой 35% МеОН (с 0,2% IPA) в CO2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 80 г/мин; длина волны УФ-детектирования: 225 нм, с получением Примера 6А в качестве первого элюируемого энантиомера (изомер 1). ЭС/МС (m/z): 475,0 (М+Н). Подтверждают энантиомерное обогащение Изомера 1 при помощи хиральной аналитической СЖХ, >99% ее, t(R): 1,32 минуты; колонка: CHIRALCEL® OD-H, 4,6x150 мм; элюируют подвижной фазой 35% МеОН (0,2% IPA) в CO2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 5 мл/мин; длина волны УФTwo enantiomers of 7-fluoro-5-(4-{2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-5H[1]benzopyrano[4,3-c]quinolin-2-ol are separated at using chiral SLC under the following conditions: column: CHIRALCEL® OD-H, 21x250 cm; elute with a mobile phase of 35% MeOH (with 0.2% IPA) in CO 2 ; column temperature: 40°C; flow rate: 80 g/min; UV detection wavelength: 225 nm, yielding Example 6A as the first enantiomer eluted (isomer 1). ES/MS (m/z): 475.0 (M+H). Confirm enantiomeric enrichment of Isomer 1 by chiral analytical SLC, >99% ee, t( R ): 1.32 minutes; column: CHIRALCEL® OD-H, 4.6x150 mm; elute with a mobile phase of 35% MeOH (0.2% IPA) in CO 2 ; column temperature: 40°C; flow rate: 5 ml/min; UV wavelength
- 17 045961 детектирования: 225 нм. Выделяют указанное в заголовке соединение примера 6В с получением второго элюируемого энантиомера (изомер 2). ЭС/МС (m/z): 475,0 (М+Н). Подтверждают энантиомерное обогащение изомера 2 при помощи хиральной аналитической СЖХ, >99% ее, r(R>: 1,95 мины; колонка: CHIRALCEL® OD-H, 4,6x150 мм; элюируют подвижной фазой 35% МеОН (0,2% IPA) в CO2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 5 мл/мин; длина волны УФ-детектирования: 225 нм.- 17 045961 detection: 225 nm. The title compound of Example 6B is isolated to give the second eluting enantiomer (isomer 2). ES/MS (m/z): 475.0 (M+H). Confirm enantiomeric enrichment of isomer 2 by chiral analytical SLC, >99% ee, r(R>: 1.95 min; column: CHIRALCEL® OD-H, 4.6x150 mm; elute with mobile phase 35% MeOH (0.2% IPA) in CO2; column temperature: 40°C; flow rate: 5 ml/min; UV detection wavelength: 225 nm.
Пример 8А.Example 8A.
-(4-{2-[3-(Фторметил)азетидин-1 -ил] этокси} фенил)-7-метил-5Н- [ 1 ] бензопирано [4,3-с]хинолин-2ол, изомер 1.-(4-{2-[3-(Fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-7-methyl-5H-[1]benzopyrano[4,3-c]quinolin-2ol, isomer 1.
Пример 8В.Example 8B.
-(4-{2-[3-(Фторметил)азетидин-1 -ил] этокси} фенил)-7-метил-5Н- [ 1 ] бензопирано [4,3-с]хинолин-2ол, изомер 2.-(4-{2-[3-(Fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-7-methyl-5H-[1]benzopyrano[4,3-c]quinolin-2ol, isomer 2.
Разделяют два энантиомера 5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-7-метил-5Н[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ола при помощи хиральной СЖХ в следующих условиях: колонка: CHIRALCEL® OD-H, 21x250 см; элюируют подвижной фазой 30% iPrOH (с 0,2% IPA) в CO2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 80 г/мин; длина волны УФ-детектирования: 265 нм, с получением Примера 8А в качестве первого элюируемого энантиомера (изомер 1). ЭС/МС (m/z): 471,2 (М+Н). Подтверждают энантиомерное обогащение Изомера 1 при помощи хиральной аналитической СЖХ, >99% ее, t(R): 1,47 минуты; колонка: CHIRALCEL® OD-H, 4,6x150 мм; элюируют подвижной фазой 30% iPrOH (0,2% IPA) в CO2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 5 мл/мин; длина волны УФдетектирования: 225 нм. Выделяют указанное в заголовке соединение Примера 8В с получением второго элюируемого энантиомера (Изомер 2). ЭС/МС (m/z): 471,2 (М+Н). Подтверждают энантиомерное обогащение Изомера 2 при помощи хиральной аналитической СЖХ, >99% ее, t(R): 2,05 мины; колонка: CHIRALCEL® OD-H, 4,6x150 мм; элюируют подвижной фазой 30% iPrOH (0,2% IPA) в CO2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 5 мл/мин; длина волны УФ-детектирования: 225 нм.Two enantiomers of 5-(4-{2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-7-methyl-5H[1]benzopyrano[4,3-c]quinolin-2-ol are separated at using chiral SLC under the following conditions: column: CHIRALCEL® OD-H, 21x250 cm; elute with mobile phase 30% iPrOH (with 0.2% IPA) in CO2; column temperature: 40°C; flow rate: 80 g/min; UV detection wavelength: 265 nm, yielding Example 8A as the first enantiomer eluted (isomer 1). ES/MS (m/z): 471.2 (M+H). Confirm enantiomeric enrichment of Isomer 1 by chiral analytical SLC, >99% ee, t( R ): 1.47 minutes; column: CHIRALCEL® OD-H, 4.6x150 mm; elute with a mobile phase of 30% iPrOH (0.2% IPA) in CO 2 ; column temperature: 40°C; flow rate: 5 ml/min; UV detection wavelength: 225 nm. The title compound of Example 8B is isolated to give the second eluting enantiomer (Isomer 2). ES/MS (m/z): 471.2 (M+H). Confirm enantiomeric enrichment of Isomer 2 by chiral analytical SLC, >99% ee, t( R ): 2.05 min; column: CHIRALCEL® OD-H, 4.6x150 mm; elute with a mobile phase of 30% iPrOH (0.2% IPA) in CO 2 ; column temperature: 40°C; flow rate: 5 ml/min; UV detection wavelength: 225 nm.
Пример 9.Example 9.
-(4-{2-[3-(Фторметил)азетидин-1 -ил] этокси} фенил)-8-(трифторметил)-5Н- [ 1 ] бензопирано [4,3с]хинолин-2-ол, Изомер 2, бензолсульфоновая кислота.-(4-{2-[3-(Fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-8-(trifluoromethyl)-5H-[1]benzopyrano[4,3c]quinolin-2-ol, Isomer 2, benzenesulfonic acid.
Нагревают суспензию 5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-8-(трифторметил)-5Н[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ола, Изомер 2 (Пример 1В) (100 мг, 0,19 ммоль) в ACN (3 мл) при 50°С. Добавляют раствор моногидрата бензолсульфоновой кислоты (40 мг, 0,23 ммоль) в ACN (1 мл). Нагревают прозрачный желтый раствор в течение 10 мин при 50°С. Прекращают нагревание, позволяют реакционной смеси остыть до комнатной температуры и перемешивают смесь в течение ночи. Добавляют толуол (2 мл) и перемешивают реакционную смесь 2 ч. Раствор фильтруют, собирают образовавшееся твердое вещество и промывают твердое вещество ACN (1 мл). Сушат твердое вещество в вакууме, с получением указанного в заголовке соединения (74 мг, 55%).A suspension of 5-(4-{2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-8-(trifluoromethyl)-5H[1]benzopyrano[4,3-c]quinolin-2-ol is heated , Isomer 2 (Example 1B) (100 mg, 0.19 mmol) in ACN (3 ml) at 50°C. Add a solution of benzenesulfonic acid monohydrate (40 mg, 0.23 mmol) in ACN (1 ml). Heat the clear yellow solution for 10 minutes at 50°C. Stop heating, allow the reaction mixture to cool to room temperature, and stir the mixture overnight. Add toluene (2 ml) and stir the reaction mixture for 2 hours. The solution is filtered, the resulting solid is collected and the solid is washed with ACN (1 ml). Dry the solid in vacuo to give the title compound (74 mg, 55%).
Альтернативный синтез примера 9.Alternative synthesis of example 9.
Нагревают суспензию 5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-8-(трифторметил)-5Н[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ола, Изомер 2 (Пример 1В) (124,1 мг, 0,24 ммоль) в MEK (4 мл) при 50°С. Добавляют раствор моногидрата бензолсульфоновой кислоты (50 мг, 0,28 ммоль), растворенный в MEK (1 мл). Прекращают нагревание, позволяют реакционной смеси остыть до комнатной температуры и перемешивают смесь в течение выходных. Концентрируют в потоке N2. Добавляют MEK (1 мл) и суспендируют с получением желтого кристаллического твердого вещества. Собирают твердое вещество, промывают MEK и сушат в вакууме при комнатной температуре с получением указанного в заголовке соединения (78,8 мг, 48%).A suspension of 5-(4-{2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-8-(trifluoromethyl)-5H[1]benzopyrano[4,3-c]quinolin-2-ol is heated , Isomer 2 (Example 1B) (124.1 mg, 0.24 mmol) in MEK (4 ml) at 50°C. Add a solution of benzenesulfonic acid monohydrate (50 mg, 0.28 mmol) dissolved in MEK (1 ml). Stop heating, allow the reaction mixture to cool to room temperature, and stir the mixture over the weekend. Concentrate in N2 stream. Add MEK (1 ml) and suspend to obtain a yellow crystalline solid. Collect the solid, wash with MEK and dry in vacuo at room temperature to give the title compound (78.8 mg, 48%).
РД, пример 9.RD, example 9.
Выполняют РД, как описано для примера 1В. Характеризуют полученный образец (4-{2-[3(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-8-(трифторметил)-5Н-[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ола, изомер 2, бензолсульфоновой кислоты по рентгенограмме с использованием излучения CuKa, имеющего дифракционные пики (значения 2-тета), как описано в табл. 4 ниже, и, в частности, имеющего пики при 20,5 в комбинации с одним или несколькими пиками, выбранными из группы, состоящей из 12,3, 22,2 и 23,1; с допуском на углы дифракции 0,2 градуса.Perform RD as described for Example 1B. Characterize the resulting sample (4-{2-[3(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-8-(trifluoromethyl)-5H-[1]benzopyrano[4,3-c]quinolin-2-ol, isomer 2, benzenesulfonic acid by X-ray diffraction using CuKa radiation having diffraction peaks (2-theta values) as described in Table. 4 below, and in particular having peaks at 20.5 in combination with one or more peaks selected from the group consisting of 12.3, 22.2 and 23.1; with a tolerance for diffraction angles of 0.2 degrees.
- 18 045961- 18 045961
Таблица 5Table 5
Пики рентгеновской порошковой дифракции кристаллического примера 9X-ray powder diffraction peaks of crystalline example 9
Пример 10.Example 10.
Кристаллический 5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-8-(трифторметил)-5Н[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ол, 4-метилбензолсульфоновая кислота, изомер 2.Crystalline 5-(4-{2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-8-(trifluoromethyl)-5H[1]benzopyrano[4,3-c]quinolin-2-ol, 4-methylbenzenesulfonic acid, isomer 2.
Объединяют вместе 5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-8-(трифторметил)-5Н[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ол, Изомер 2 (Пример 1В) (204,2 г, 389 ммоль) и EtOAc (5 л) и переме шивают при 60°С с последующим добавлением МеОН (200 мл) при 60°С с получением прозрачного коричневого раствора. Добавляют указанный в заголовке продукт (11,48 г) для затравки раствора с последующим добавлением предварительно смешанного раствора 4-метилбензолсульфоновой кислоты; гидратируют (81,4 г, 428 ммоль) в EtOAc (800 мл) с получением желтой суспензии. Перемешивают суспензию 30 мин при 50°С. Концентрируют суспензию до 1/2 объема. Раствор охлаждают при комнатной температуре в течение 1 ч, фильтруют, собирают твердое вещество и промывают твердое вещество EtOAc. Сушат твердое вещество в вакууме при 30°С в течение выходных с получением указанного в заголовке соединения (239 г, 343 ммоль). Для дополнительной очистки материала добавляют указанное в заголовке соединение (229 г, 328,7 ммоль) и 2-пропанол (4,6 л) вместе и нагревают до 60°С в течение 2 ч. Охлаждают до комнатной температуры в течение 30 мин. Фильтруют твердое вещество и промывают водой (100 мл). Сушат твердое вещество в потоке N2 в течение ночи с получением указанного в заголовке соединения (174,4 г, 76,2%). Объединяют различные партии указанного в заголовке соединения, полученного по сути таким же образом, и добавляют гептан (2 л). Суспензию перемешивают в течение 30 мин, твердое вещество фильтруют и промывают гептаном (300 мл). Сушат собранное твердое вещество в потоке N2 в течение ночи с получением указанного в заголовке соединения (199,7 г, 99,5%).Combine together 5-(4-{2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-8-(trifluoromethyl)-5H[1]benzopyrano[4,3-c]quinolin-2-ol , Isomer 2 (Example 1B) (204.2 g, 389 mmol) and EtOAc (5 L) and stirred at 60°C followed by the addition of MeOH (200 ml) at 60°C to obtain a clear brown solution. Add the title product (11.48 g) to seed the solution, followed by the addition of the premixed 4-methylbenzenesulfonic acid solution; hydrate (81.4 g, 428 mmol) in EtOAc (800 ml) to give a yellow suspension. Stir the suspension for 30 minutes at 50°C. Concentrate the suspension to 1/2 volume. Cool the solution at room temperature for 1 hour, filter, collect the solid and wash the solid with EtOAc. Dry the solid in vacuo at 30°C over the weekend to give the title compound (239 g, 343 mmol). To further purify the material, add the title compound (229 g, 328.7 mmol) and 2-propanol (4.6 L) together and heat to 60° C. for 2 hours. Cool to room temperature over 30 minutes. Filter the solid and wash with water (100 ml). Dry the solid under N2 stream overnight to give the title compound (174.4 g, 76.2%). Combine the various batches of the title compound prepared in substantially the same manner and add heptane (2 L). The suspension is stirred for 30 minutes, the solid is filtered and washed with heptane (300 ml). Dry the collected solid under N2 stream overnight to give the title compound (199.7 g, 99.5%).
РД, пример 10.RD, example 10.
Выполняют РД, как описано для примера 1В. Характеризуют полученный образец 5-(4-{2-[3(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-8-(трифторметил)-5Н-[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ола, 4метилбензолсульфоновой кислоты, изомер 2 (пример 10) по рентгенограмме с использованием излучения CuKa, имеющего дифракционные пики (значения 2-тета), как описано в табл. 5 ниже, и, в частности, имеющего пики при 20,1 в комбинации с одним или несколькими пиками, выбранными из группы, состоящей из 12,8, 19,5 и 22,8; с допуском на углы дифракции 0,2 градуса.Perform RD as described for Example 1B. Characterize the resulting sample 5-(4-{2-[3(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy}phenyl)-8-(trifluoromethyl)-5H-[1]benzopyrano[4,3-c]quinoline-2- ol, 4methylbenzenesulfonic acid, isomer 2 (Example 10) by X-ray diffraction using CuKa radiation having diffraction peaks (2-theta values) as described in Table. 5 below, and in particular having peaks at 20.1 in combination with one or more peaks selected from the group consisting of 12.8, 19.5 and 22.8; with a tolerance for diffraction angles of 0.2 degrees.
- 19 045961- 19 045961
Таблица 6Table 6
Пики рентгеновской порошковой дифракции кристаллического примера 10X-ray powder diffraction peaks of crystalline example 10
Биологические анализы.Biological analyses.
Доказательства взаимосвязи между экспрессией РЭ и некоторыми видами рака хорошо известны в данной области.Evidence of a relationship between RE expression and certain cancers is well known in the field.
Результаты следующих анализов демонстрируют, что соединения формулы I, формулы II и формулы III примеров представляют собой активные ССРЭ и считаются полезными при лечении рака.The results of the following assays demonstrate that the compounds of Formula I, Formula II and Formula III of the Examples are active SSREs and are considered useful in the treatment of cancer.
Анализ конкурентного связывания РЭа (дикий тип), РЭа (мутант Y537S) и РЭв.Competitive binding assay of REa (wild type), REa (Y537S mutant) and REv.
Целью следующих анализов конкурентного связывания РЭ является определение аффинности тестируемого соединения к РЭа (дикий тип), РЭа (мутант Y537S) и РЭв.The purpose of the following RE competitive binding assays is to determine the affinity of the test compound for REa (wild type), REa (Y537S mutant) and REv.
Запускают анализ конкурентного связывания в буфере, содержащем 50 мМ HEPES, pH 7,5, 1,5 мМ EDTA, 150 мМ NaCl, 10% глицерин, 1 мг/мл яичного альбумина и 5 мМ DTT, используя 0,025 мкКи на лунку 3Н-эстрадиола (118 Ки/ммоль, 1 мКи/мл), 7,2 нг/лунку РЭа (дикий тип), или 7,2 нг/лунка РЭа (Y537S мутант) или 7,7 нг/лунку РЭв . Добавляют тестируемое соединение в 10 различных концентрациях в диапазоне от 10000 нМ до 0,5 нМ и определяют неспецифическое связывание в присутствии 1 мкМ 17-в эстрадиола. Инкубируют реакцию связывания (140 мкл) в течение 4 часов при комнатной температуре, и затем добавляют холодный декстран-угольный буфер (70 мкл) (содержащий на 50 мл аналитического буфера 0,75 г древесного угля и 0,25 г декстрана) к каждой реакции. Перемешивают планшеты в течение 8 минут на орбитальном шейкере при 4°С, и затем центрифугируют при 3000 об/мин при 4°С в течение 10 мин. Переносят аликвоту (120 мкл) смеси в другой 96-луночный белый планшет с плоским дном (Costar) и добавляют сцинтилляционную жидкость Perkin Elmer Optiphase Supermix (175 мкл) в каждую лунку. Герметизируют планшеты и энергично встряхивают на орбитальном шейкере. После инкубации в течение 2,5 часов считывают данные планшетов на счетчике Wallac Microbeta. Рассчитывают IC50 с использованием 4-параметрической логистической кривой и рассчитывают % ингибирования при 10 мкМ. Преобразовывают значения IC50 для соединения в Ki, используя уравнение Ченга-Прусоффа. Результаты этого анализа демонстрируют, что Примеры 1, 1А и 1В (и другие) связываются с рекомбинантным РЭа дикого типа и мутантом РЭа (Y537S), как показано в табл. 7 ниже, и также было определено, что Пример 1В связывается с РЭв конкурируя с Ki (нМ) РЭв 0,11±0,07, n=3.Run the competition binding assay in a buffer containing 50 mM HEPES, pH 7.5, 1.5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 10% glycerol, 1 mg/ml egg albumin and 5 mM DTT using 0.025 μCi per well 3 H- estradiol (118 Ci/mmol, 1 mCi/ml), 7.2 ng/well REa (wild type), or 7.2 ng/well REa (Y537S mutant) or 7.7 ng/well REv. The test compound is added at 10 different concentrations ranging from 10,000 nM to 0.5 nM and nonspecific binding is determined in the presence of 1 μM 17-B estradiol. Incubate the binding reaction (140 µl) for 4 hours at room temperature, and then add cold dextran-charcoal buffer (70 µl) (containing 0.75 g charcoal and 0.25 g dextran per 50 ml assay buffer) to each reaction . Mix the plates for 8 minutes on an orbital shaker at 4°C, and then centrifuge at 3000 rpm at 4°C for 10 minutes. Transfer an aliquot (120 µl) of the mixture to another 96-well white flat-bottom plate (Costar) and add Perkin Elmer Optiphase Supermix scintillation fluid (175 µl) to each well. Seal the plates and shake vigorously on an orbital shaker. After incubation for 2.5 hours, the plates are read on a Wallac Microbeta counter. Calculate IC 50 using a 4-parameter logistic curve and calculate % inhibition at 10 μM. Convert the IC 50 values for the compound to Ki using the Cheng-Prusoff equation. The results of this assay demonstrate that Examples 1, 1A and 1B (and others) bind to recombinant wild-type REa and mutant REa (Y537S) as shown in Table 1. 7 below, and Example 1B was also determined to bind to REv competitively with Ki (nM) REv of 0.11±0.07, n=3.
- 20 045961- 20 045961
Таблица 7 Результаты конкурентного связывания РЭа (дикий тип), РЭа (мутант Y537S) и РЭвTable 7 Results of competitive binding of REa (wild type), REa (Y537S mutant) and REv
Из приведенных в качестве примеров протестированных соединений, Ki для РЭа дикого типа находится в диапазоне от около 0,300 нМ до около 65 нМ. Ki для мутанта РЭа Y537S находится в диапазоне от около 2 до 300 нМ. Результаты этого анализа демонстрируют аффинность связывания и эффективность приведенных в качестве примеров соединений к белкам РЭа дикого типа, мутантам (ESR1 Y537S) и белкам РЭв.Of the exemplary compounds tested, the Ki for wild-type REa ranged from about 0.300 nM to about 65 nM. The Ki for the REa Y537S mutant ranges from about 2 to 300 nM. The results of this assay demonstrate the binding affinity and potency of the exemplified compounds to wild-type, mutant (ESR1 Y537S) and REv proteins.
Анализ разрушения РЭа в клетках MCF7.Analysis of REa degradation in MCF7 cells.
Целью следующего анализа разрушаемости РЭа является измерение разрушаемости РЭа тестируемым соединением в РЭа-позитивной клеточной линии рака груди, такой как MCF7.The purpose of the following REa degradability assay is to measure the REa degradation of a test compound in a REa-positive breast cancer cell line, such as MCF7.
Культивируют клетки MCF7 (приобретенные у АТСС НТВ-22) в среде DMEM с добавлением 10% FBS, 0,01 мг/мл человеческого инсулина 1 и 1% антибиотиков пенициллина/стрептомицина и помещают в 384-луночные планшеты с плоским дном при плотности 4000 клеток на лунку в среде DMEM (20 мкл) без фенолового красного, содержащей 10% очищенную от угля FBS. Клетки инкубируют в течение ночи в инкубаторе для культивирования клеток (5% CO2, относительная влажность 95% и 37°С) и позволяют клеткам прикрепится к планшету. На следующий день вводят в клетки тестируемое соединение. Используют акустический дозатор Echo 555 для получения серийных разведений тестируемого соединения (1:3) в диапазоне от 6 мкМ до 0,0003 мкМ. Дозируют клетки, добавляя 5 мкл из планшета для серийного разведения в планшет для клеток, получая конечную концентрацию DMSO 0,2% с диапазоном доз конечной концентрации тестируемого соединения от 2 до 0,0001 мкМ. Для максимальной точки используют среду, содержащую 0,2% DMSO, и для минимальной точки используют фулвестрант, разведенный до конечных концентраций 2 мкМ в среде для выращивания, содержащей 0,2% DMSO. После дозирования тестируеMCF7 cells (purchased from ATCC NTV-22) are cultured in DMEM supplemented with 10% FBS, 0.01 mg/ml human insulin 1 and 1% penicillin/streptomycin antibiotics and placed in 384-well flat-bottom plates at a density of 4000 cells. per well in DMEM (20 μl) without phenol red containing 10% carbon-free FBS. The cells are incubated overnight in a cell culture incubator (5% CO 2 , 95% relative humidity and 37°C) and allow the cells to attach to the plate. The next day, the test compound is introduced into the cells. Use an Echo 555 acoustic pipette to obtain serial dilutions of the test compound (1:3) ranging from 6 µM to 0.0003 µM. Dispense cells by adding 5 μl from the serial dilution plate to the cell plate, resulting in a final DMSO concentration of 0.2% with a dose range of final test compound concentration from 2 to 0.0001 μM. For the maximum point, medium containing 0.2% DMSO is used, and for the minimum point, fulvestrant is used, diluted to final concentrations of 2 μM in growth medium containing 0.2% DMSO. After dosing, test
- 21 045961 мого соединения инкубируют планшеты с клетками при 37°С и 5% CO2 в течение 24 ч. Фиксируют клетки, добавляя 14% параформальдегид (10 мкл) в течение 30 мин при комнатной температуре. Промывают клетки один раз PBS (20 мкл) и инкубируют с PBS (20 мкл), содержащим 0,5% (об./об.) TWEEN® 20, в течение 1 ч. Промывают клетки PBS, содержащим 0,05% TWEEN® 20 (2х), и блокируют 3% BSA в PBS, содержащем 0,05% TWEEN® 20 и 0,1% TRITON™ Х-100 (20 мкл/лунку), в течение 1 ч при комнатной температуре. Добавляют 1:500 первичное антитело (20 мкл) (РЭа (Клон SP1) моноклональное антитело кролика №RM-9101-S, Thermo Scientific) в разведении 1% BSA в PBS, содержащем 0,05% TWEEN® 20 на лунку, закрывают планшеты и инкубируют в течение ночи при 4°С. На следующий день промывают клетки PBS, содержащим 0,05% TWEEN® 20 (2х), и инкубируют с вторичным антителом (20 мкл/лунку) (разведение 1:1000, козий антикроличий IgM ALEXA FLUOR™ 488) в PBS 1% BSA в течение 105 мин при комнатной температуре. После промывания планшетов PBS (2х20 мкл) добавляют РНКазу (Sigma) (20 мкл, 50 мкг/мл) и раствор йодида пропидия в PBS 1:1000 на лунку (20 мкл). Закрывают чашки и инкубируют 1 час при комнатной температуре на столе (в защищенном от света месте). Сканируют планшеты при помощи ACUMEN EXPLORER™ [лазерно-сканирующий флуоресцентный цитометр для планшетов, производимый ТТР LABTECH LTD] для измерения РЭа. Анализ изображений основан на клеточных флуоресцентных сигналах для идентификации позитивных клеток. Определяют РЭпозитивные клетки по средней интенсивности. Используют общую интенсивность 575-640 нм от йодида пропидия/ДНК для идентификации отдельных клеток. Результат анализа составляет % позитивных клеток РЭ. IC50 определяют путем аппроксимации кривой для логистического уравнения с четырьмя параметрами для каждого вывода с использованием GENE DATA™. Результаты этого анализа демонстрируют сильную разрушаемость РЭа, индуцированную соединениями формулы I, формулы II и формулы III, описанными в данном документе, в клетках MCF7 рака груди. Относительные значения IC50 для примеров 1, 1А и 1В показаны в табл. 8.- 21 045961 of this compound, plates with cells are incubated at 37°C and 5% CO2 for 24 hours. Cells are fixed by adding 14% paraformaldehyde (10 μl) for 30 minutes at room temperature. Wash cells once with PBS (20 µl) and incubate with PBS (20 µl) containing 0.5% (v/v) TWEEN® 20 for 1 hour. Wash cells with PBS containing 0.05% TWEEN® 20 (2x), and blocked with 3% BSA in PBS containing 0.05% TWEEN® 20 and 0.1% TRITON™ X-100 (20 μl/well) for 1 h at room temperature. Add 1:500 primary antibody (20 μl) (REA (Clone SP1) rabbit monoclonal antibody No. RM-9101-S, Thermo Scientific) diluted with 1% BSA in PBS containing 0.05% TWEEN® 20 per well, cap the plates and incubated overnight at 4°C. The next day, wash the cells with PBS containing 0.05% TWEEN® 20 (2x) and incubate with secondary antibody (20 μl/well) (1:1000 dilution, goat anti-rabbit IgM ALEXA FLUOR™ 488) in PBS 1% BSA in for 105 minutes at room temperature. After washing the plates with PBS (2x20 µl), RNase (Sigma) (20 µl, 50 µg/ml) and a solution of propidium iodide in PBS 1:1000 per well (20 µl) are added. Cover the dishes and incubate for 1 hour at room temperature on the table (protected from light). The plates are scanned using ACUMEN EXPLORER™ [a laser scanning fluorescence cytometer for plates manufactured by TTP LABTECH LTD] to measure REa. Image analysis relies on cellular fluorescent signals to identify positive cells. RE-positive cells are determined by average intensity. Use a total intensity of 575-640 nm from propidium iodide/DNA to identify individual cells. The result of the analysis is % positive ER cells. IC 50 is determined by curve fitting to a four-parameter logistic equation for each output using GENE DATA™. The results of this assay demonstrate the potent degradability of REa induced by the compounds of Formula I, Formula II and Formula III described herein in MCF7 breast cancer cells. The relative IC 50 values for examples 1, 1A and 1B are shown in table. 8.
Таблица 8Table 8
Анализ разрушения РЭа в клетках MCF7Analysis of RE destruction in MCF7 cells
- 22 045961- 22 045961
В частности, результаты в табл. 7 показывают сильное разрушение РЭа соединением примера 1 в клетках MCF7 рака груди. Для приведенных в качестве примеров протестированных соединений, относительная IC50 варьируется от 0,003 до >2 мкМ, что указывает на то, что все, кроме примера 2В, проявляли активность при тестируемой концентрации. Результаты этого анализа демонстрируют, что соединение формулы (I) представляет собой ССРЭ с сильной активностью разрушения РЭа в клетках.In particular, the results in table. 7 shows the potent destruction of REa by the compound of Example 1 in MCF7 breast cancer cells. For the exemplified compounds tested, the relative IC50 ranged from 0.003 to >2 μM, indicating that all except Example 2B were active at the concentration tested. The results of this assay demonstrate that the compound of formula (I) is a SSPE with potent REa degrading activity in cells.
Индукционный анализ РПа в клетках MCF7.Induction assay of RPa in MCF7 cells.
Цель следующего индукционного анализа РПа предназначена для определения, обладает ли тестируемое соединение агонистической активностью против рецептора РЭа (ожидается, что агонист активирует рецептор).The purpose of the following RPA induction assay is to determine whether the test compound has agonist activity against the REa receptor (the agonist is expected to activate the receptor).
Культивируют MCF7 (приобретенные у АТСС НТВ-22) в среде DMEM с добавлением 10% FBS, 0,01 мг/мл человеческого инсулина 1 и 1% антибиотиков пенициллина/стрептомицина и помещают клетки (до слияния на 70%) в 384-луночные планшеты с плоским дном с плотностью 4000 клеток на лунку в объеме 20 мкл в среде DMEM без фенолового красного, содержащей 10% FBS (очищенный от угля). Клетки инкубируют в течение ночи в инкубаторе для культивирования клеток (5% СО2, относительная влажность 95% и 37°С) и позволяют клеткам прикрепится к планшету. На следующий день вводят в клетки тестируемое соединение. Используют акустический дозатор Echo 555 для получения серийных разведений соединения (1:3) в диапазоне от 6 мкМ до 0,0003 мкМ. Дозируют клетки с добавлением тестируемого соединения (5 мкл) из планшета для серийного разведения в планшет с клетками, получая конечную концентрацию DMSO 0,2% с конечной концентрацией в диапазоне доз тестируемого соединения от 2 до 0,0001 мкМ. Для максимальной точки используют среду, содержащую 0,2% DMSO, а для минимальной точки используют фулвестрант, разведенный до конечных концентраций 2 мкМ в среде для выращивания, содержащей 0,2% DMSO. После дозирования тестируемого соединения инкубируют планшеты с клетками при 37°С и 5% CO2 в течение 24 ч. Фиксируют клетки, добавляя 14% параформальдегид (10 мкл) в течение 30 мин при комнатной температуре. Промывают клетки один раз PBS (20 мкл) и инкубируют с PBS (20 мкл), содержащим 0,5% (об./об.) TWEEN® 20, в течение 1 ч. Дважды промывают клетки PBS (20 мкл), содержащим 0,05% TWEEN® 20, и блокируют 3% BSA в PBS, содержащем 0,05% TWEEN® 20 и 0,1% TRITON™ Х-100 (20 мкл/лунку), в течение 1 ч при комнатной температуре. Добавляют 1:500 первичных антител (20 мкл) (моноклональные антитела РП мыши к человеку, клон PgR 636 Dako, M3569) в разведении 1% BSA/PBS с 0,05 TWEEN® 20 на лунку, закрывают планшеты и инкубируют в течение ночи при 4°С.Cultivate MCF7 (purchased from ATCC NTV-22) in DMEM supplemented with 10% FBS, 0.01 mg/ml human insulin 1 and 1% penicillin/streptomycin antibiotics and place the cells (until 70% confluence) in 384-well plates flat bottom at a density of 4000 cells per well in a volume of 20 μl in DMEM without phenol red containing 10% FBS (carbon-free). The cells are incubated overnight in a cell culture incubator (5% CO 2 , 95% relative humidity and 37°C) and allow the cells to attach to the plate. The next day, the test compound is introduced into the cells. Use an Echo 555 acoustic pipette to obtain serial dilutions of the compound (1:3) ranging from 6 µM to 0.0003 µM. Dispense cells with added test compound (5 μl) from the serial dilution plate into the cell plate to obtain a final concentration of DMSO of 0.2% with a final concentration in the test compound dose range of 2 to 0.0001 μM. For the maximum point, medium containing 0.2% DMSO is used, and for the minimum point, fulvestrant is used, diluted to final concentrations of 2 μM in growth medium containing 0.2% DMSO. After dosing the test compound, incubate the plates with cells at 37°C and 5% CO2 for 24 hours. Fix the cells by adding 14% paraformaldehyde (10 μl) for 30 minutes at room temperature. Wash cells once with PBS (20 µl) and incubate with PBS (20 µl) containing 0.5% (v/v) TWEEN® 20 for 1 hour. Wash cells twice with PBS (20 µl) containing 0 .05% TWEEN® 20, and blocked with 3% BSA in PBS containing 0.05% TWEEN® 20 and 0.1% TRITON™ X-100 (20 μl/well) for 1 hour at room temperature. Add 1:500 primary antibodies (20 µl) (mouse anti-human RP monoclonal antibody, clone PgR 636 Dako, M3569) diluted in 1% BSA/PBS with 0.05 TWEEN® 20 per well, cap the plates and incubate overnight at 4°C.
На следующий день промывают клетки при помощи PBS 0,05% TWEEN® 20 (2x20 мкл) и инкубируют со вторичным антителом (20 мкл/лунку) (разведение 1:1000, козий антикроличий IgM ALEXA FLUOR™ 488) в PBS 1% BSA в течение 105 мин при комнатной температуре. После промывания PBS (2x20 мкл) добавляют РНКазу (20 мкл, 50 мкг/мл) (Sigma) и разводят йодидом пропидия 1:1000 в PBS на лунку. Герметизируют планшеты и инкубируют 1 час при комнатной температуре на столе (в защищенном от света месте). Сканируют планшеты при помощи ACUMEN EXPLORER™ [лазерный сканирующий флуоресцентный цитометр для микропланшетов, производимый ТТР LABTECH LTD] для измерения РПа. Анализ изображений основан на клеточных флуоресцентных сигналах для идентификации позитивных клеток. Определяют РП-позитивные клетки по средней интенсивности. Используют общую интенсивность 575-640 нм от йодида пропидия/ДНК для идентификации отдельных клеток. Результат анализа составляет % позитивных клеток РП. IC50 определяли путем аппроксимации кривой для логистического уравнения с четырьмя параметрами для каждого вывода с использованием GENE DATA™. Результаты этого анализа не демонстрируют значительной агонистической активности Примеров 1, 1А и 1В в отношении клеток MCF7 рака груди. Для тестируемых соединений относительные IC50 в этом анализе составляют >2 мкМ. Результаты этого анализа демонстрируют отсутствие значительной агонистической активности приведенных в качестве примеров соединений, тестируемых в отношении клеток MCF7 рака груди. Эти результаты также демонстрируют, что приведенные в качестве примера тестируемые соединения являются антагонистами РЭа в клетках MCF7 рака груди (т.е. они обладают активностью ССРЭ).The next day, wash cells with PBS 0.05% TWEEN® 20 (2x20 µl) and incubate with secondary antibody (20 µl/well) (1:1000 dilution, goat anti-rabbit IgM ALEXA FLUOR™ 488) in PBS 1% BSA in for 105 minutes at room temperature. After washing with PBS (2x20 μl), RNase (20 μl, 50 μg/ml) (Sigma) was added and diluted with propidium iodide 1:1000 in PBS per well. Seal the plates and incubate for 1 hour at room temperature on the table (protected from light). The plates are scanned using ACUMEN EXPLORER™ [a microplate laser scanning fluorescence cytometer manufactured by TTP LABTECH LTD] to measure RPa. Image analysis relies on cellular fluorescent signals to identify positive cells. RP-positive cells are determined by average intensity. Use a total intensity of 575-640 nm from propidium iodide/DNA to identify individual cells. The result of the analysis is % positive RP cells. IC 50 was determined by curve fitting to a four-parameter logistic equation for each output using GENE DATA™. The results of this assay do not demonstrate significant agonist activity of Examples 1, 1A and 1B against MCF7 breast cancer cells. For the tested compounds, the relative IC 50 in this assay are >2 μM. The results of this assay demonstrate the lack of significant agonist activity of the exemplified compounds tested against MCF7 breast cancer cells. These results also demonstrate that the exemplary test compounds are REa antagonists in MCF7 breast cancer cells (ie, they have SREA activity).
Анализ ингибирования РПа (функциональный антагонизм РЭа) в клетках MCF7-ESR1 Y537N 682 CRISPR.RPa inhibition assay (functional antagonism of REa) in MCF7-ESR1 Y537N 682 CRISPR cells.
Цель следующего анализа ингибирования РПа (функциональный антагонизм РЭа) в клетках предназначен для определения антагонистической активности тестируемого соединения против мутантного рецептора РЭа Y537N. Ожидается, что антагонист в этом анализе блокирует функцию РЭа рецептора. РПа является нижестоящей транскрипционной мишенью РЭа, и, следовательно, ожидается, что антагонист РЭа будет ингибировать экспрессию РПа.The purpose of the following RPa inhibition assay (functional REa antagonism) in cells is to determine the antagonistic activity of the test compound against the REa Y537N mutant receptor. The antagonist in this assay is expected to block REa receptor function. RPa is a downstream transcriptional target of REa, and therefore a REa antagonist is expected to inhibit RPa expression.
Культивируют MCF7-ESR1 Y537N-682 (сгенерированная редактированием гена CRISPR/Cas9 гена ESR1 в клетках MCF7, клон № 682) в среде DMEM с добавлением 10%MCF7-ESR1 Y537N-682 (generated by CRISPR/Cas9 gene editing of the ESR1 gene in MCF7 cells, clone no. 682) is cultured in DMEM supplemented with 10%
FBS и 1% антибиотиков пенициллина/стрептомицина и помещают клетки (до достижения 70% конфлюэнтности) в 384-луночные планшеты с плоским дном при плотности 4000 клеток на лунку в средеFBS and 1% penicillin/streptomycin antibiotics and plate cells (until 70% confluent) in 384-well flat bottom plates at a density of 4000 cells per well in media
- 23 045961- 23 045961
DMEM, не содержащей фенолового красного, 10% FBS (объем 20 мкл) (очищенный уголь). Клетки инкубируют в течение ночи в инкубаторе для культивирования клеток (5% СО2, относительная влажность 95% и 37°С) и позволяют клеткам прикрепится к планшету. На следующий день вводят в клетки тестируемое соединение. Используют акустический дозатор Echo 555 для получения серийных разведений соединения (1:3) в диапазоне от 6 мкМ до 0,0003 мкМ. Дозируют клетки, добавляя 5 мкл из планшета для серийного разведения в планшет для клеток, с получением конечной концентрации DMSO 0,2% с диапазоном доз конечной концентрации тестируемого соединения от 2 до 0,0001 мкМ. Для максимальной точки используют среду, содержащую 0,2% DMSO, и для минимальной точки используют фулвестрант, разведенный до конечных концентраций 2 мкМ в среде для выращивания, содержащей 0,2% DMSO. После дозирования тестируемого соединения инкубируют планшеты с клетками при 37°С и 5% CO2 в течение 72 ч. Фиксируют клетки, добавляя 14% параформальдегид (10 мкл) в течение 30 мин при комнатной температуре. Промыть клетки PBS (1x20 мкл) и инкубируют с PBS (20 мкл), содержащим 0,5% (об./об.) TWEEN® 20 в течение 1 ч. Промывают клетки PBS (2x20 мкл), 0,05% TWEEN® 20 и блокируют 3% BSA/PBS 0,05% TWEEN® 20, 0,1% TRITON™ X-100 (20 мкл/лунку) в течение 1 ч при комнатной температуре. Добавляют 1:500 первичных антител (20 мкл) (моноклональные антитела РП мыши к человеку, клон PgR 636 Dako, М3569) в разведении 1% BSA/PBS с 0,05 TWEEN® 20 на лунку, герметизируют планшеты и инкубируют в течение ночи при 4°С.Phenol red-free DMEM, 10% FBS (20 µl volume) (purified carbon). The cells are incubated overnight in a cell culture incubator (5% CO 2 , 95% relative humidity and 37°C) and allow the cells to attach to the plate. The next day, the test compound is introduced into the cells. Use an Echo 555 acoustic pipette to obtain serial dilutions of the compound (1:3) ranging from 6 µM to 0.0003 µM. Dispense cells by adding 5 μl from the serial plate to the cell plate to obtain a final DMSO concentration of 0.2% with a dose range of final test compound concentration from 2 to 0.0001 μM. For the maximum point, medium containing 0.2% DMSO is used, and for the minimum point, fulvestrant is used, diluted to final concentrations of 2 μM in growth medium containing 0.2% DMSO. After dosing the test compound, incubate the plates with cells at 37°C and 5% CO2 for 72 hours. Fix the cells by adding 14% paraformaldehyde (10 μl) for 30 minutes at room temperature. Wash cells with PBS (1x20 µl) and incubate with PBS (20 µl) containing 0.5% (v/v) TWEEN® 20 for 1 hour. Wash cells with PBS (2x20 µl), 0.05% TWEEN® 20 and blocked with 3% BSA/PBS 0.05% TWEEN® 20, 0.1% TRITON™ X-100 (20 µl/well) for 1 h at room temperature. Add 1:500 primary antibodies (20 μl) (mouse anti-human RP monoclonal antibody, Dako clone PgR 636, M3569) diluted in 1% BSA/PBS with 0.05 TWEEN® 20 per well, seal the plates and incubate overnight at 4°C.
На следующий день промывают клетки PBS 0,05% ® (2x20 мкл) и инкубируют со вторичным антителом (20 мкл/лунку) (разведение 1: 1000, козий антикроличий IgM ALEXA FLUOR™ 488) в PBS 1% BSA в течение 105 мин при комнатной температуре. После промывания PBS (2x20 мкл) добавляют РНКазу (20 мкл, 50 мкг/мл) (Sigma) и разводят йодидом пропидия 1:1000 в PBS на лунку. Герметизируют чашки и инкубируют 1 час при комнатной температуре на столе (в защищенном от света месте). Сканируют планшеты при помощи ACUMEN EXPLORER™ (лазерный сканирующий флуоресцентный цитометр для планшетов, производимый ТТР LABTECH LTD) для измерения РПа. Анализ изображений основан на клеточных флуоресцентных сигналах для идентификации позитивных клеток. Определяют ПРпозитивные клетки по средней интенсивности. Используют общую интенсивность 575-640 нм от йодида пропидия/ДНК для идентификации отдельных клеток. Результат анализа составляет % позитивных клеток РП. IC50 определяют путем аппроксимации кривой для логистического уравнения с четырьмя параметрами для каждого вывода с использованием GENE DATA™.The next day, wash cells with PBS 0.05% ® (2x20 µl) and incubate with secondary antibody (20 µl/well) (1:1000 dilution, goat anti-rabbit IgM ALEXA FLUOR™ 488) in PBS 1% BSA for 105 min at room temperature. After washing with PBS (2x20 μl), RNase (20 μl, 50 μg/ml) (Sigma) was added and diluted with propidium iodide 1:1000 in PBS per well. Seal the dishes and incubate for 1 hour at room temperature on the table (in a place protected from light). The plates are scanned using ACUMEN EXPLORER™ (laser scanning fluorescence cytometer for plates manufactured by TTP LABTECH LTD) to measure RPa. Image analysis relies on cellular fluorescent signals to identify positive cells. PR-positive cells are determined by average intensity. Use a total intensity of 575-640 nm from propidium iodide/DNA to identify individual cells. The result of the analysis is % positive RP cells. IC 50 is determined by curve fitting to a four-parameter logistic equation for each output using GENE DATA™.
Результаты этого анализа демонстрируют сильное ингибирование РПа и функциональный антагонизм примеров 1, 1А и 1В в клетках MCF7 (ESR1 Y537N, гетерозиготный мутант) рака груди. Относительные значения IC50 примеров 1, 1А и 1В (и других) в этом анализе показаны в табл. 9 ниже. Относительные IC50 тестируемых примеров соединений находятся в диапазоне от около 0,0118 до >1,6 мкМ, что указывает на то, что приведенные в качестве примеров соединения являются сильными антагонистами мутанта РЭа (Y537N) и сильными ингибиторами транскрипции, опосредованной РЭа, за исключением примера 2В 1,6 мкМ). РПа (PGR) также является мишенью транскрипции РЭа, и результаты этого анализа демонстрируют сильное ингибирование опосредованной РЭа транскрипции РПа.The results of this assay demonstrate potent inhibition of RPa and functional antagonism of Examples 1, 1A and 1B in MCF7 (ESR1 Y537N heterozygous mutant) breast cancer cells. The relative IC50 values of examples 1, 1A and 1B (and others) in this analysis are shown in table. 9 below. The relative IC 50 of the exemplified compounds tested range from about 0.0118 to >1.6 μM, indicating that the exemplified compounds are potent antagonists of the REa mutant (Y537N) and potent inhibitors of REa-mediated transcription, with the exception of example 2B 1.6 µM). RPa (PGR) is also a transcriptional target of REa, and the results of this assay demonstrate strong inhibition of REa-mediated transcription of RPa.
- 24 045961- 24 045961
Таблица 9Table 9
Анализ ингибирования РПа (функциональный антагонизм РЭа) в клетках MCF7 Y537N 682 CRISPRRPa inhibition assay (functional antagonism of REa) in MCF7 Y537N 682 CRISPR cells
Анализ ингибирования РПа (функциональный антагонизм РЭа) в клетках MCF7.Analysis of RPa inhibition (functional antagonism of REa) in MCF7 cells.
Цель следующего анализа ингибирования РПа (функциональный антагонизм РЭа) в клетках предназначен для определения антагонистической активности тестируемого соединения против рецептора РЭа. Ожидается, что антагонист в этом анализе блокирует функцию рецептора РЭа. РПа является нижестоящей транскрипционной мишенью РЭа, и, следовательно, ожидается, что антагонист РЭа будет ингибировать экспрессию РПа.The purpose of the following RPa inhibition assay (functional REa antagonism) in cells is to determine the antagonistic activity of the test compound against the REa receptor. The antagonist in this assay is expected to block REa receptor function. RPa is a downstream transcriptional target of REa, and therefore, a REa antagonist is expected to inhibit RPa expression.
Выполняют условия анализа, как подробно описано в анализе Acumen основанном на клеточном разрушении РЭа выше, используя линию клеток MCF7, за исключением того, что перед распределением тестируемого соединения удаляют среду с планшета и предварительно обрабатывают все лунки, кроме лунок с отрицательным контролем (столбец 24 планшета), аналитической средой, содержащей 0,47 нМ эстрадиола, в течение 30 мин. В этом анализе проводят иммуноокрашивание для обнаружения РПа и сканируют планшеты при помощи ACUMEN EXPLORER™ [лазерный сканирующий флуоресцентный цитометр для микропланшетов, производимый ТТР LABTECH LTD] для измерения РПа. Анализ изображений основан на клеточных флуоресцентных сигналах для идентификации позитивных клеток. Определяют РПа-позитивные клетки по средней интенсивности. Используют общую интенсивность 575640 нм от йодида пропидия/ДНК для идентификации отдельных клеток. Результат анализа составляет % РПа-позитивных клеток. IC50 определяют путем аппроксимации кривой для логистического уравнения с четырьмя параметрами для каждого вывода с использованием GENE DATA™. Результаты этого анализа демонстрируют сильное ингибирование РПа и функциональный антагонизм Примеров 1, 1А и 1В в клетках MCF7 рака груди. Относительные IC50 Примеров 1, 1А и 1В в этом анализе показаны в Таблице 10 ниже. Относительные IC50 приведенных в качестве примеров соединений находится в диапазоне отPerform assay conditions as detailed in the Acumen CEA cell disruption assay above using the MCF7 cell line, except that prior to dispensing the test compound, remove the media from the plate and pretreat all wells except the negative control wells (column 24 of the plate ), analytical medium containing 0.47 nM estradiol for 30 minutes. In this assay, immunostaining is performed to detect RP and the plates are scanned using ACUMEN EXPLORER™ [a microplate laser scanning fluorescence cytometer manufactured by TTP LABTECH LTD] to measure RP. Image analysis relies on cellular fluorescent signals to identify positive cells. RPA-positive cells are determined by average intensity. Use a total intensity of 575640 nm from propidium iodide/DNA to identify individual cells. The result of the analysis is % RPA-positive cells. IC 50 is determined by curve fitting to a four-parameter logistic equation for each output using GENE DATA™. The results of this assay demonstrate potent RPa inhibition and functional antagonism of Examples 1, 1A and 1B in MCF7 breast cancer cells. The relative IC 50 of Examples 1, 1A and 1B in this analysis are shown in Table 10 below. The relative IC 50 of the exemplified compounds ranges from
- 25 045961 около 0,029 до >2 мкМ, что указывает на то, что все приведенные в качестве примеров соединения, за исключением 1А и 2В, являются сильными антагонистами белка дикого типа РЭа и сильными ингибитором транскрипции, опосредованной РЭа. РПа (PGR) также является мишенью транскрипции РЭа, и результаты этого анализа демонстрируют сильное ингибирование опосредованной РЭа транскрипции РПа в тестируемой концентрации.- 25 045961 about 0.029 to >2 μM, indicating that all exemplified compounds except 1A and 2B are potent antagonists of wild-type REa protein and potent inhibitors of REa-mediated transcription. RPa (PGR) is also a transcriptional target of REa, and the results of this assay demonstrate strong inhibition of REa-mediated transcription by RPa at the concentration tested.
Таблица 10Table 10
Анализ ингибирования РПа (функциональный антагонизм РЭа) в клетках MCF7Analysis of RPa inhibition (functional antagonism of REa) in MCF7 cells
Анализ пролиферации клеток в MCF7 и MCF7-ESR1 Y537N-682.Cell proliferation assay in MCF7 and MCF7-ESR1 Y537N-682.
Целью следующих анализов пролиферации клеток обычно является определение того, оказывает ли тестируемое соединение влияние на пролиферацию клеток.The purpose of the following cell proliferation assays is usually to determine whether the test compound has an effect on cell proliferation.
Высевают клетки MCF7 (приобретенные у АТСС НТВ-22) с плотностью 2000 клеток на лунку в среде DMEM, свободной от фенолового красного, 10% FBS (объем 20 мкл) (очищенный от угля) в 384луночный планшет для культивирования клеток с прозрачным дном. Помещают MCF7-ESRY537N -682 (сгенерированные посредством редактирования гена CRISPR/Cas9 гена ESr1 в клетках MCF7, клон №682) в среду DMEM с добавлением 10% FBS и 1% антибиотиков пенициллина/стрептомицина при плотности 1000 клеток на лунку. Инкубируют планшеты при 37°С и 5% CO2. На следующий день вводят в клетки тестируемое соединение. Используют акустический дозатор Echo 555 для получения серийных разведений тестируемого соединения (1:3) в диапазоне от 60 мкМ до 0,003 мкМ. Дозируют клетки, добавляя 5 мкл из планшета для серийного разведения в планшет для клеток с получением конечной концентрации DMSO 0,2% с диапазоном доз конечной концентрации тестируемого соединения от 20 до 0,001 мкМ. Для максимальной точки используют среду, содержащую 0,2% DMSO, и для минимальной точки используют фулвестрант, разбавленный до конечных концентраций 2 мкМ в среде для выращивания, содержащей 0,2% DMSO. После дозирования тестируемого соединения инкубируют планшеты сSow MCF7 cells (purchased from ATCC NTV-22) at a density of 2000 cells per well in phenol red-free DMEM, 10% FBS (volume 20 μl) (charcoal-free) in a 384-well cell culture plate with a transparent bottom. Place MCF7-ESRY537N -682 (generated through CRISPR/Cas9 gene editing of the ESr1 gene in MCF7 cells, clone #682) in DMEM supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin antibiotics at a density of 1000 cells per well. Incubate the plates at 37°C and 5% CO2. The next day, the test compound is introduced into the cells. Use an Echo 555 acoustic pipette to obtain serial dilutions of the test compound (1:3) ranging from 60 µM to 0.003 µM. Dispense cells by adding 5 μl from the serial dilution plate to the cell plate to obtain a final DMSO concentration of 0.2% with a dose range of final test compound concentration from 20 to 0.001 μM. For the maximum point, medium containing 0.2% DMSO is used, and for the minimum point, fulvestrant is used, diluted to final concentrations of 2 μM in growth medium containing 0.2% DMSO. After dosing the test compound, incubate the plates with
- 26 045961 клетками при 37°С и 5% СО2. Через семь дней после добавления тестируемого соединения вынимают планшеты из инкубатора и добавляют 96% холодного EtOH (65 мкл) в каждую лунку. Через 30 мин удаляют среду и добавляют РНКазу (20 мкл, 50 мкг/мл) (Sigma) и раствор йодида пропидия 1:1000 в PBS на лунку. Герметизируют планшеты и инкубируют 1 час при комнатной температуре на столе (в защищенном от света месте). Сканируют планшеты при помощи ACUMEN EXPLORER™ [лазерный сканирующий флуоресцентный цитометр для планшетов, производимый ТТР LABTECH LTD]. Клеточная линия MCF-7 растет, образуя агрегаты, количество клеток как количество объектов не может быть использовано для считывания; таким образом, количество клеток может быть оценено при помощи предполагаемого количества клеток (рассчитывается при помощи параметра площади (отношение общей площади к общей популяции клеток (заданный диапазон пиковой интенсивности FL-1 (ПИ) и средней площади популяции отдельных клеток (определяется по периметру)). IC50 определяют путем аппроксимации кривой для логистического уравнения с четырьмя параметрами для каждого вывода с использованием GENE DATA™. Относительные IC50 Примеров 1, 1А и 1B (и других) в клетках MCF7 ESR1 дикого типа и мутантных клетках MCF7-ESR1 Y537N показаны в табл. 10 ниже. Результаты этого анализа демонстрируют сильную антипролиферативную активность и ингибирование роста клеток при помощи примеров 1, 1А и 1В (и других) в клетках MCF7 (ESR1 дикого типа) и MCF7 (мутант ESR1 Y537N) рака груди. Относительные IC50 приведенных в качестве примеров соединений находятся в диапазоне от около 0,0035 до 1,176 мкМ в MCF7 ESR1 дикого типа и от 0,014 до 1,86 мкМ в клетках MCF7 (мутант ESR1 Y537N) рака груди, что указывает на то, что все приведенные в качестве примера соединения демонстрируют сильную антипролиферативную активность и ингибирование роста клеток MCF7 (ESR1 дикого типа) и MCF7 (мутант ESR1 Y537N) рака груди.- 26 045961 cells at 37°C and 5% CO2. Seven days after addition of the test compound, remove the plates from the incubator and add 96% cold EtOH (65 μl) to each well. After 30 min, remove the medium and add RNase (20 μl, 50 μg/ml) (Sigma) and a 1:1000 solution of propidium iodide in PBS per well. Seal the plates and incubate for 1 hour at room temperature on the table (protected from light). The plates are scanned using ACUMEN EXPLORER™ [a laser scanning fluorescence cytometer for plates manufactured by TTP LABTECH LTD]. The MCF-7 cell line grows to form aggregates, the number of cells as the number of objects cannot be used for reading; Thus, the number of cells can be estimated using the estimated number of cells (calculated using the area parameter (the ratio of the total area to the total cell population (a given range of FL-1 peak intensity (PI) and the average area of the population of individual cells (determined by the perimeter)) The IC 50 is determined by curve fitting to a four-parameter logistic equation for each output using GENE DATA™ The relative IC 50 of Examples 1, 1A and 1B (and others) in wild-type MCF7 ESR1 cells and MCF7-ESR1 Y537N mutant cells are shown in Table 10 below. The results of this assay demonstrate potent antiproliferative activity and cell growth inhibition by Examples 1, 1A and 1B (and others) in MCF7 (ESR1 wild type) and MCF7 (ESR1 Y537N mutant) breast cancer cells. Relative IC 50 given exemplary compounds range from about 0.0035 to 1.176 μM in wild-type MCF7 ESR1 and from 0.014 to 1.86 μM in MCF7 (ESR1 Y537N mutant) breast cancer cells, indicating that all exemplified the compounds exhibit potent antiproliferative activity and growth inhibition of MCF7 (ESR1 wild type) and MCF7 (ESR1 Y537N mutant) breast cancer cells.
- 27 045961- 27 045961
Таблица 11Table 11
Анализ пролиферации клеток в MCF7 и MCF7-ESR1Y537N-682Cell Proliferation Analysis in MCF7 and MCF7-ESR1Y537N-682
Анализ целевого ингибирования In Vivo (ЦИ IV) (анализ PGR RT-qPCR) в опухолях MCF7.In Vivo Targeted Inhibition (CI IV) Assay (PGR RT-qPCR Assay) in MCF7 Tumors.
Целью этого анализа ЦИ IV является измерение способности тестируемого соединения (ССРЭ) ингибировать экспрессию (транскрипцию) гена РПа ниже РЭа в ксенотрансплантированных опухолях, имплантированных мышам.The purpose of this CI IV assay is to measure the ability of a test compound (TSRE) to inhibit the expression (transcription) of the RPa gene downstream of REa in xenograft tumors implanted in mice.
Имплантируют самкам мышей NOD SCID (22-25 г) от Envigo RMS, Inc., Мэдисон, Висконсин подкожно 5х10е6 РЭ-позитивные клетки MCF7 рака груди (АТСС, № НТВ-22) в область правого фланга в 1:1 раствор HBSS+MATRIGEL™ (200 мкл). Имплантируют гранулы 17-β эстрадиола (0,18 мг/гранула, высвобождение 90 дней, от Innovative Research) подкожно за 1 день до имплантации опухолевых клеток. Измеряют рост опухоли и массу тела дважды в неделю, начиная с седьмого дня после имплантации. Когда размер опухоли достигнет 250-350 мм3, рандомизируют животных и группируют их в группы по пять животных. Вводят животным несколько доз тестируемого соединения в специфическом для тестируемого соединения носителе (1% гидроксиэтилцеллюлоза/0,25% TWEEN® 80/0,05% пеногаситель в очищенной воде) или только носителем перорально в течение 3 дней и собирают опухоли и кровь через желаемые интервалы времени после последней дозы. Умерщвляют животных используя анестезию изофлураном и вывих шейных позвонков. Быстро замораживают опухоли и хранят при -80°С до обработки для выделения РНК и анализа РВ-кПЦР. Собирают кровь в пробирки с EDTA, замедляют вращение для сбора плазмы и замораживают при -80°С в 96-луночном планшете. Определяют воздействие тестируемого соединения при помощи масс-спектрометрии.Female NOD SCID mice (22-25 g) from Envigo RMS, Inc., Madison, Wisconsin are implanted subcutaneously with 5x10e 6 ER-positive MCF7 breast cancer cells (ATCC, No. NTV-22) into the area of the right flank in a 1:1 solution of HBSS+ MATRIGEL™ (200 µl). Implant 17-β estradiol beads (0.18 mg/bead, 90 day release, from Innovative Research) subcutaneously 1 day before tumor cell implantation. Tumor growth and body weight are measured twice a week, starting on the seventh day after implantation. When the tumor size reaches 250-350 mm 3 , animals are randomized and grouped into groups of five animals. Administer multiple doses of test compound in test compound-specific vehicle (1% hydroxyethylcellulose/0.25% TWEEN® 80/0.05% antifoam in purified water) or vehicle alone orally for 3 days and collect tumors and blood at desired intervals time since last dose. Animals are killed using isoflurane anesthesia and cervical vertebral dislocation. The tumors were quickly frozen and stored at -80°C until processed for RNA extraction and RT-qPCR analysis. Collect blood in EDTA tubes, slow rotation to collect plasma, and freeze at -80°C in a 96-well plate. Determine the effect of the test compound using mass spectrometry.
Измельчают опухоли в жидком азоте и лизируют в буфере для лизиса 1 хРНК (из наборов для выдеThe tumors are crushed in liquid nitrogen and lysed in 1 xRNA lysis buffer (from extraction kits).
- 28 045961 ления РНК) с использованием шариков Matrix D (MP Biomedical, № 6913-500) в машине FASTPREP-24™ Cell Disrupter (MP Biomedical). Переносят лизаты опухолей в свежие пробирки после вращения при 14000 об/мин в течение 20 мин при 4°С. Выделяют РНК из опухолевых лизатов при помощи набора PURELINK® RNA Mini (Invitrogen № 12183018А) или RNeasy Mini Kit (Qiagen № 74104 и № 74106). Удаляют загрязнения ДНК при помощи набора PURELINK® DNase (Invitrogen № 12185010) или набора RNase-Free DNase (Qiagen № 79254). Измеряют концентрацию выделенной РНК, разбавив образцы водой, свободной от РНКазы, и измеряют поглощение при 260 нм на считывателе для планшетов (SpectraMax190). Вычитают среднее измерение поглощения при 260 нм пустого опыта (только вода, не содержащая РНКазу) из измерений при 260 нм всех других образцов РНК. Разводят образцы РНК до равных концентраций в воде, свободной от РНКазы. Синтезируют кДНК из разбавленной РНК, используя систему синтеза первой цепи для РВ-ПЦР (Invitrogen, № 18080-051). Для проведения РВ-кПЦР, сначала разбавляют кДНК в воде, свободной от РНКазы. Объединяют 2х Absolute Blue qPCR ROX Mix (Thermo, № AB-4139/A), праймер PGR (Thermo, Hs01556702_m1) и разведенную кДНК для каждой реакции в планшете для PCR (Applied Biosystems, № 4309849). Амплифицируют кДНК, инкубируя образцы в течение 2 минут при 50°С, а затем 15 мин при 95°С в термоциклере (севентатор ABI Prism 7900НТ). Продолжают инкубировать при 95°С в течение 15 секунд, а затем при 50°С в течение 60 секунд, всего 40 циклов. Циклы нормализованы по домашнему гену и используются для расчета % ингибирования PGR по сравнению с одним носителем. Анализируют каждый образец в двух экземплярах и используют средние числа для расчетов. Рассчитывают целевой процент ингибирования (PGR) при помощи Excel и XL Fit.- 28 045961 RNA lysis) using Matrix D beads (MP Biomedical, no. 6913-500) in a FASTPREP-24™ Cell Disrupter (MP Biomedical). Transfer tumor lysates to fresh tubes after spinning at 14,000 rpm for 20 min at 4°C. RNA was isolated from tumor lysates using the PURELINK® RNA Mini Kit (Invitrogen no. 12183018A) or the RNeasy Mini Kit (Qiagen no. 74104 and no. 74106). Remove DNA contaminants using the PURELINK® DNase Kit (Invitrogen #12185010) or the RNase-Free DNase Kit (Qiagen #79254). Measure the concentration of the isolated RNA by diluting the samples with RNase-free water and measure the absorbance at 260 nm on a plate reader (SpectraMax190). Subtract the average absorbance measurement at 260 nm of the blank run (RNase-free water only) from the measurements at 260 nm of all other RNA samples. Dilute RNA samples to equal concentrations in RNase-free water. Synthesize cDNA from diluted RNA using a first-strand RT-PCR synthesis system (Invitrogen, no. 18080-051). To perform RT-qPCR, first dilute the cDNA in RNase-free water. Combine 2x Absolute Blue qPCR ROX Mix (Thermo, #AB-4139/A), PGR primer (Thermo, Hs01556702_m1) and diluted cDNA for each reaction in a PCR plate (Applied Biosystems, #4309849). Amplify cDNA by incubating samples for 2 minutes at 50°C and then 15 minutes at 95°C in a thermal cycler (ABI Prism 7900HT seventator). Continue incubating at 95°C for 15 seconds and then at 50°C for 60 seconds, for a total of 40 cycles. Cycles are normalized to the housekeeping gene and used to calculate % PGR inhibition compared to vehicle alone. Analyze each sample in duplicate and use the average numbers for calculations. Calculate target percent inhibition (PGR) using Excel and XL Fit.
Результаты этого анализа демонстрируют, что Пример 1В ингибирует экспрессию РПа (PGR) в модели ксенотрансплантированной опухоли. Пример 1В ингибирует экспрессию РПа (PGR) на ~78% в модели ксенотрансплантированной опухоли в течение 24 ч с дозой 30 мг/кг при пероральном введении. Эти результаты демонстрируют значительное и устойчивое ингибирование антагонистической активности РЭа и опосредованной РЭа транскрипционной активности in vivo на модели ксенотрансплантированной опухоли.The results of this assay demonstrate that Example 1B inhibits PGR expression in a xenograft tumor model. Example 1B inhibits PGR expression by ~78% in a xenograft tumor model for 24 hours at a dose of 30 mg/kg administered orally. These results demonstrate significant and sustained inhibition of REa antagonistic activity and REa-mediated transcriptional activity in vivo in a xenograft tumor model.
Исследование ингибирования роста опухоли in vivo на РЭ-позитивных (ESR1 дикого типа) моделях ксенотрансплантированной опухоли рака груди, имплантированной мышам.In vivo tumor growth inhibition study in RE-positive (ESR1 wild-type) breast cancer xenograft tumor models implanted in mice.
Целью следующего анализа ингибирования ксенотрансплантированной опухоли является измерение уменьшения объема опухоли в ответ на введение тестируемого соединения.The purpose of the following xenograft tumor inhibition assay is to measure the reduction in tumor volume in response to administration of a test compound.
Размножают клетки MCF7 рака груди человека (АТсС № НТВ-22) и НСС1428 (АТСС № CRL-2327) в культуре, собирают и вводят 5х10е6 клеток в растворе HBSS+MATRIGEL™ 1:1 (200 мкл) подкожно на задний правый бок самок мышей NOD SCID (22-25 г, Envigo RMS, Inc). За двадцать четыре часа до имплантации клеток имплантируют гранулы эстрогена (0,18 мг/гранулу, 17β эстрадиол, высвобождение 90 дней, Innovative Research) подкожно. Размножают клетки T47D рака груди человека (АТСС № НТВ22) в культуре, собирают и вводят 5х10е6 клеток в растворе HBSS+MATRIGEL™ 1:1 (200 мкл) подкожно на задний правый бок самок мышей NOD SCID (22-25 г, Envigo RMS, Inc). За 24 часа до имплантации клеток имплантируют гранулы эстрогена (0,38 мг/гранулу, 17β эстрадиол, высвобождение 90 дней, Innovative Research) подкожно. Размножают клетки ZR-75-1 рака груди человека (АТСС № CRL-1500) в культуре, собирают и вводят 5х10е6 клеток в растворе HBSS+MATRIGEL™ 1:1 (200 мкл) подкожно на задний правый бок самок мышей NOD SCID (22-25 г, Envigo RMS, Inc). За двадцать четыре часа до имплантации клеток животным вводят внутримышечно (10 мг/мл) 50 мкл эстрадиола валерата (Delestrogen®), и затем один раз каждые 14 дней в течение всего исследования. Измеряют рост опухоли и массу тела дважды в неделю, начиная с седьмого дня после имплантации. Когда размеры опухоли достигают 250-350 мм3, животных рандомизируют и группируют в группы по 5 животных. Готовят тестируемое соединение, пример 1В в подходящем носителе (1% гидроксиэтилцеллюлоза/0,25% TWEEN® 80/0,05% пеногаситель в очищенной воде) и вводят через желудочный зонд в течение 28 дней, QD. Определяют ответ опухоли путем измерения объема опухоли два раза в неделю в течение курса лечения. При измерении объема опухоли в качестве общей меры токсичности принимают массу тела.Human breast cancer MCF7 cells (ATcS no. NTV-22) and HCC1428 (ATCC no. CRL-2327) are propagated in culture, 5x10e 6 cells in a solution of HBSS+MATRIGEL™ 1:1 (200 μl) are injected subcutaneously into the posterior right side of females. NOD SCID mice (22-25 g, Envigo RMS, Inc). Twenty-four hours before cell implantation, estrogen beads (0.18 mg/bead, 17β estradiol, 90 days release, Innovative Research) are implanted subcutaneously. T47D human breast cancer cells (ATCC No. NTV22) are propagated in culture, collected and 5x10e 6 cells in a 1:1 HBSS+MATRIGEL™ solution (200 μl) are injected subcutaneously into the posterior right side of female NOD SCID mice (22-25 g, Envigo RMS , Inc.). 24 hours before cell implantation, estrogen beads (0.38 mg/bead, 17β estradiol, 90 days release, Innovative Research) are implanted subcutaneously. Human breast cancer ZR-75-1 cells (ATCC No. CRL-1500) are propagated in culture, collected, and 5x10e 6 cells in a 1:1 HBSS+MATRIGEL™ solution (200 μl) are injected subcutaneously into the posterior right side of female NOD SCID mice (22 -25 g, Envigo RMS, Inc). Twenty-four hours before cell implantation, animals were injected intramuscularly (10 mg/ml) with 50 μl of estradiol valerate (Delestrogen®), and then once every 14 days for the duration of the study. Tumor growth and body weight are measured twice a week, starting on the seventh day after implantation. When the tumor size reaches 250-350 mm 3 , the animals are randomized and grouped into groups of 5 animals. Prepare test compound Example 1B in a suitable vehicle (1% hydroxyethylcellulose/0.25% TWEEN® 80/0.05% antifoam in purified water) and administer by gavage for 28 days, QD. Tumor response is determined by measuring tumor volume twice a week during the course of treatment. When measuring tumor volume, body weight is used as a general measure of toxicity.
Было обнаружено, что соединение примера 1В имеет значения дельта Т/С%, как показано в табл. 12 ниже. Эти результаты показывают, что соединение примера 1В демонстрирует хорошую пероральную биодоступность у мышей и значительную противоопухолевую активность или регрессию опухоли на РЭпозитивных (ESR1 дикого типа) ксенотрансплантированных моделях рака груди человека.The compound of Example 1B was found to have delta T/C% values as shown in Table 1. 12 below. These results indicate that the compound of Example 1B exhibits good oral bioavailability in mice and significant antitumor activity or tumor regression in ESR1-positive (wild-type) xenograft human breast cancer models.
- 29 045961- 29 045961
Таблица 12Table 12
Исследование ингибирования роста опухоли in vivo на ксенотрансплантированных моделях РЭ-позитивного рака груди, имплантированного мышамIn vivo tumor growth inhibition study in xenograft models of ER-positive breast cancer implanted in mice
Анализ объема опухоли основан на ковариационной структуре Log 10 и SpatialPower.Tumor volume analysis is based on Log 10 and SpatialPower covariance structure.
*: значительно (р<0,05) по сравнению с растворителем контролем*: significant (p<0.05) compared to solvent control
Дельта Т/С% рассчитывают, когда конечный объем опухоли в обработанной группе находился на уровне или выше исходного объема опухоли. Формула 100*(Т-Т0)/(С-С0), в которой Т и С являются средними конечными объемами опухоли в обработанной или контрольной группе соответственно. Т0 и С0 - средние исходные объемы опухолей в данных группах.Delta T/C% was calculated when the final tumor volume in the treated group was at or above the initial tumor volume. The formula is 100*(T-T 0 )/(C-C 0 ), in which T and C are the average final tumor volumes in the treated or control group, respectively. T 0 and C 0 are the average initial volumes of tumors in these groups.
% регрессии рассчитывают, когда конечный объем ниже исходного. Формула 100*(Т-Т0)/Т0, в которой Т0 - средний исходный объем опухоли для обработанной группы.% regression is calculated when the final volume is lower than the initial volume. The formula is 100*(T-T0)/T0, in which T0 is the average initial tumor volume for the treated group.
Общее среднее значение всех групп от исходного уровня (рандомизация) на 32 день используется для вычисления % изменения Т/С.The overall mean of all groups from baseline (randomization) at day 32 is used to calculate the % change in T/C.
Исследование ингибирования роста опухоли in vivo на модели опухоли (ST941/HI) в мутантной ESR1 (Y537S) рака груди PDX, имплантированной мышам.In vivo tumor growth inhibition study in a tumor model (ST941/HI) in ESR1 mutant (Y537S) breast cancer PDX implanted into mice.
Целью следующего анализа ингибирования ксенотрансплантированной опухоли является измерение уменьшения объема опухоли в ответ на введение тестируемого соединения в мутантный ESR1 и независимую от гормонов (HI) ксенотрансплантированную (PDX) модель рака груди, полученную от пациента.The purpose of the following xenograft tumor inhibition assay is to measure tumor volume reduction in response to administration of a test compound in an ESR1 mutant and hormone-independent (HI) patient-derived xenograft (PDX) breast cancer model.
Модель ST941/HI PDX была разработана и выпущена South Texas Accelerated Research Therapeutics (Сан-Антонио, Техас). Фрагменты опухоли собирали у животных-хозяев и имплантировали мышам с иммунодефицитом (лаборатория Джексона), и исследование начинали при среднем объеме опухоли около 125-250 мм3. Получают тестируемое соединение, пример 1В в подходящем носителе (1% гидроксиэтилцеллюлоза/0,25% TWEEN® 80/0,05% пеногасителя в очищенной воде) и вводят через желудочный зонд в течение 28 дней. Определяют ответ опухоли путем измерения объема опухоли два раза в неделю в течение курса лечения. При измерении объема опухоли в качестве общей меры токсичности принимают массу тела.Model ST941/HI PDX was developed and marketed by South Texas Accelerated Research Therapeutics (San Antonio, TX). Tumor fragments were collected from animal hosts and implanted into immunodeficient mice (Jackson Laboratory), and the study began with an average tumor volume of about 125-250 mm 3 . Prepare test compound Example 1B in a suitable vehicle (1% hydroxyethylcellulose/0.25% TWEEN® 80/0.05% antifoam in purified water) and administer by gavage for 28 days. Tumor response is determined by measuring tumor volume twice a week during the course of treatment. When measuring tumor volume, body weight is used as a general measure of toxicity.
Было обнаружено, что соединение примера 1В имеет значения дельта Т/С%, как показано в табл. 13 ниже. Эти результаты показывают, что соединение Примера 1В демонстрирует хорошую пероральную биодоступность у мышей и значительную противоопухолевую активность или регрессию опухоли в модели PDX рака груди человека с мутантным ESR1 (Y537S).The compound of Example 1B was found to have delta T/C% values as shown in Table 1. 13 below. These results indicate that the compound of Example 1B exhibits good oral bioavailability in mice and significant antitumor activity or tumor regression in the ESR1 mutant (Y537S) human breast cancer PDX model.
- 30 045961- 30 045961
Таблица 13Table 13
Исследование ингибирования роста опухоли in vivo на модели опухоли PDX мутантного ESR1 рака груди, имплантированной мышамIn vivo tumor growth inhibition study in a PDX tumor model of ESR1 mutant breast cancer implanted in mice
Анализ объема опухоли основан на ковариационной структуре Log 10 и SpatialPower.Tumor volume analysis is based on Log 10 and SpatialPower covariance structure.
*: значительно (р<0,05) по сравнению с растворителем контролем*: significant (p<0.05) compared to solvent control
Дельта Т/С% рассчитывали, когда конечный объем опухоли в обработанной группе находился на уровне или выше исходного объема опухоли. Формула 1ОО*(Т-То)/(С-Со), в которой Т и С являются средними конечными объемами опухоли в обработанной или контрольной группе соответственно. Т0 и С0 - средние исходные объемы опухолей в данных группах.Delta T/C% was calculated when the final tumor volume in the treated group was at or above the initial tumor volume. The formula is 1OO*(T-To)/(C-Co), in which T and C are the average final tumor volumes in the treated or control group, respectively. T 0 and C 0 are the average initial volumes of tumors in these groups.
% регрессии рассчитывается, когда конечный объем ниже исходного. Формула 1ОО*(То)/То, в которой Т0 - средний исходный объем опухоли для обработанной группы.% regression is calculated when the final volume is lower than the initial volume. The formula is 1OO*(T o )/T o , in which T 0 is the average initial tumor volume for the treated group.
Общее среднее значение всех групп от исходного уровня (рандомизация) на 32 день используется для вычисления % изменения Т/С.The overall mean of all groups from baseline (randomization) at day 32 is used to calculate the % change in T/C.
Комбинированные исследованияCombined studies
Из-за неоднородности опухоли и приобретенной устойчивости к эндокринной терапии, комбинированная терапия стала незаменимой при лечении РЭ-позитивного и распространенного/метастатического рака груди для эффективной терапии или преодоления приобретенной устойчивости. Мы протестировали комбинированный эффект Примера 1В с ингибитором CDK4/6 - абемациклибом, ингибитором mTOR - эверолимусом, ингибитором PIK3CA - алпелисибом и ингибитором PI3K/mTOR - 8-[5-(1-гидрокси-1метилэтил)пиридин-3-ил]-1-[(2S)-2-метоксипропил]-3-метил-1,3-дигидро-2Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2оном (Соединение А) в пяти РЭ-позитивных линиях клеток рака груди in vitro. Анализ жизнеспособности клеток для комбинированных исследований Высевают клетки с плотностью, указанной в табл. 14 ниже, в объеме среды 20 мкл, описанной в таблице, в 384-луночный планшет с прозрачным дном для культивирования клеток.Due to tumor heterogeneity and acquired resistance to endocrine therapy, combination therapy has become indispensable in the treatment of ER-positive and advanced/metastatic breast cancer to effectively treat or overcome acquired resistance. We tested the combination effect of Example 1B with the CDK4/6 inhibitor abemaciclib, the mTOR inhibitor everolimus, the PIK3CA inhibitor alpelisib, and the PI3K/mTOR inhibitor 8-[5-(1-hydroxy-1methylethyl)pyridin-3-yl]-1- [(2S)-2-methoxypropyl]-3-methyl-1,3-dihydro-2H-imidazo[4,5-c]quinolin-2one (Compound A) in five ER-positive breast cancer cell lines in vitro. Cell viability assay for combination studies Cells are seeded at the density indicated in the table. 14 below, in a volume of medium 20 µl, described in the table, in a 384-well plate with a transparent bottom for cell culture.
Таблица 14Table 14
Информация о клеточной линии для анализа жизнеспособности клетокCell line information for cell viability assay
Инкубируют планшеты при 37°С и 5% CO2. На следующий день вводят в клетки тестируемое со- 31 045961 единение, пример 1В.Incubate the plates at 37°C and 5% CO2. The next day, the test compound is introduced into the cells, example 1B.
Получают соединения в виде 10 мМ исходных растворов DMSO и используют для исследования ответа на дозу с максимальной концентрацией, начиная с 10 или 1 мкМ, два соединения, тестируемых вместе при фиксированном соотношении, и затем полученные серийные разведения 1:3, а также соединения по отдельности для определение IC50 с начальной концентрацией 20 мкМ. Дозируют клетки путем добавления 5 мкл из планшета для серийного разведения в планшет для клеток, получая конечную концентрацию DMSO 0,2% с диапазоном конечной дозы тестируемого соединения от 20 до 0,001 мкМ для однократной обработки или меньшего диапазона для комбинаций. Для максимальной точки используют среду, содержащую 0,2% DMSO, и для минимальной точки используют стауроспорин, разведенный до конечных концентраций 2 мкМ в среде для выращивания, содержащей 0,2% DMSO. После дозирования тестируемого соединения инкубируют планшеты с клетками при 37°С и 5% CO2. После двукратной инкубации с соединениями вынимают планшеты из инкубатора и добавляют 96% холодный EtOH (65 мкл) в каждую лунку. Через 30 мин удаляют среду и добавляют РНКазу (20 мкл, 50 мкг/мл) (Sigma) и раствор йодида пропидия 1:1000 в PBS на лунку. Герметизируют планшеты и инкубируют 1 час при комнатной температуре (в защищенном от света месте). Сканируют планшеты при помощи ACUMEN EXPLORER™ [лазерный сканирующий флуоресцентный цитометр для планшетов, производимый ТТР LABTECH LTD]. Поскольку некоторые клеточные линии растут, образуя агрегаты, число клеток как число объектов может не использоваться для считывания; поэтому для оценки количества клеток используется общая популяция площади (обозначенный диапазон пиковой интенсивности FL-1 (ПИ)) или общая интенсивность ПИ.Compounds are prepared as 10 mM DMSO stock solutions and used for dose response studies with the highest concentration starting at 10 or 1 μM, the two compounds tested together at a fixed ratio, and then the resulting 1:3 serial dilutions, as well as the compounds individually to determine IC 50 with an initial concentration of 20 µM. Dispense cells by adding 5 μl from the serial dilution plate to the cell plate, yielding a final DMSO concentration of 0.2% with a final test compound dose range of 20 to 0.001 μM for a single treatment or a lower range for combinations. For the maximum point, medium containing 0.2% DMSO is used, and for the minimum point, staurosporine is used, diluted to final concentrations of 2 μM in growth medium containing 0.2% DMSO. After dosing the test compound, incubate the cell plates at 37°C and 5% CO2. After incubation with compounds twice, remove the plates from the incubator and add 96% cold EtOH (65 µl) to each well. After 30 min, remove the medium and add RNase (20 μl, 50 μg/ml) (Sigma) and a 1:1000 solution of propidium iodide in PBS per well. Seal the plates and incubate for 1 hour at room temperature (protected from light). The plates are scanned using ACUMEN EXPLORER™ [a laser scanning fluorescence cytometer for plates manufactured by TTP LABTECH LTD]. Because some cell lines grow to form aggregates, the number of cells as the number of objects may not be used for reading; therefore, total area population (designated FL-1 peak intensity range (PI)) or total PI intensity is used to estimate cell number.
Данные комбинации in vitro предполагают синергизм (как определено ниже) с комбинацией примера 1В с абемациклибом или эверолимусом в 5 из 5 РЭ-позитивных клеточных линий рака груди, как показано в табл. 15. Комбинация примера 1В с соединением А синергична в 4 из 4 испытанных линий РЭпозитивных клеток рака груди. Комбинированный эффект примера 1В с алпелисибом является аддитивным в 2 из 4 РЭ-позитивных клеточных линиях рака груди и синергичным в 2 из 4 РЭ-позитивных клеточных линиях рака груди.These in vitro combinations suggest synergy (as defined below) with the combination of Example 1B with abemaciclib or everolimus in 5 of 5 ER-positive breast cancer cell lines, as shown in Table. 15. The combination of Example 1B with Compound A is synergistic in 4 of 4 ER positive breast cancer cell lines tested. The combined effect of Example 1B with alpelisib is additive in 2 of 4 ER-positive breast cancer cell lines and synergistic in 2 of 4 ER-positive breast cancer cell lines.
- 32 045961- 32 045961
Таблица 15Table 15
Комбинация in vitro примера 1B с другими целевыми агентами в РЭ-позитивных клеточных линиях рака грудиIn vitro combination of Example 1B with other targeted agents in ER-positive breast cancer cell lines
Анализ данных и интерпретация комбинированного эффектаData analysis and interpretation of the combined effect
Используют методы, опубликованные в литературе, для расчета комбинированного эффекта in vitro (L. Zhao, et al, Front Biosci, 2010, 2:241-249 и L. Zhao, et al, Clin Cancer Res, 2004, 10 (23):7994-8004). Для выявления синергетических или антагонистических взаимодействий между двумя лекарствами был проведен анализ сдвига кривой с использованием настроенного шаблона XL с надстройками XLFit 5. Кривые одного агента корректируются с использованием 4 параметров логистической регрессии. Критерии и ограничения, используемые для подгонки: (i) нижняя часть <(-20) фиксируется на 0 и (ii) верхняя часть >120 фиксируется на 100. Если все наблюдения ниже порога, установленного пользователем, то выполняется постоянная аппроксимация с холмом = 0, и IC50 считается выше, чем максимальная включенная концентрация. После получения абсолютного значения IC50 для каждого отдельного агента рассчитывают эквивалентную концентрацию при 50% активности для отдельных агентов и комбинации. Используя эти эквивалентные концентрации вместе с измеренными активностями, мы пересчитываем абсолютную IC50, кривая для отдельных агентов достигнет активности 50% при значениях эквивалентных концентраций, равных 1, в то время как синергетические комбинации достигнут 50% при более низких значениях, что приведет к отклонению сдвига влево, и антагонистическая комбинация покажет сдвиг вправо. Эквивалентные концентрации также используются для расчета CI50 (индекс комбинирования при 50% активности), где CI50 равен абсолютному IC50 кривой комбинации. Вместе с CI50 могут быть рассчитаны другие CI (индексы комбинирования) при различных процентах активности (CI10, CI20, CI30, CI40, CI60, CI70, CI80, CI90). Для расчета CInn рассчитываются эквивалентные концентрации при различных процентах активности. Для каждого процента активности мы вычисляем предел погрешности, который представляет собой доверительный интервал при 95%, и, используя этот доверительный интервал, мы рассчитываем верхний предел как добавление допустимой погрешности к CI и нижний предел как вычитание допустимой погрешности к CI. Верхний предел = CI + доверительный интервал 95% и Нижний предел = CI - доверительный интервал 95%. Эти пределы затем используются для интерпретации результатов.Use methods published in the literature to calculate the combined effect in vitro (L. Zhao, et al, Front Biosci, 2010, 2:241-249 and L. Zhao, et al, Clin Cancer Res, 2004, 10 (23): 7994-8004). To identify synergistic or antagonistic interactions between two drugs, curve shift analysis was performed using a customized XL template with XLFit 5 add-ons. Single agent curves are adjusted using 4 logistic regression parameters. The criteria and constraints used for the fit are: (i) the bottom <(-20) is fixed to 0 and (ii) the top >120 is fixed to 100. If all observations are below a user-specified threshold, then a constant fit is performed with hill = 0 , and the IC 50 is considered higher than the maximum concentration included. Once the absolute IC 50 value for each individual agent is obtained, the equivalent concentration at 50% activity is calculated for the individual agents and the combination. Using these equivalent concentrations along with the measured activities, we recalculate the absolute IC50, the curve for individual agents will reach 50% activity at equivalent concentration values of 1, while synergistic combinations will reach 50% at lower values, resulting in a left shift bias , and the antagonistic combination will show a shift to the right. Equivalent concentrations are also used to calculate CI 50 (combination index at 50% activity), where CI 50 is equal to the absolute IC 50 of the combination curve. Together with CI 50 , other CIs (combination indices) can be calculated at different percentages of activity (CI10, CI20, CI30, CI40, CI60, CI70, CI80, CI90). To calculate CInn, equivalent concentrations are calculated at different percentages of activity. For each percentage of activity, we calculate the margin of error, which is the 95% confidence interval, and using this confidence interval, we calculate the upper limit as adding the margin of error to the CI and the lower limit as subtracting the margin of error to the CI. Upper Limit = CI + 95% Confidence Interval and Lower Limit = CI - 95% Confidence Interval. These limits are then used to interpret the results.
Статистическая интерпретация для каждого процента активности выглядит следующим образом:The statistical interpretation for each percentage of activity is as follows:
- 33 045961- 33 045961
Биологическая интерпретация для каждого процента активности выглядит следующим образом:The biological interpretation for each percentage of activity is as follows:
Комбинированные исследования in vivoCombined in vivo studies
Из-за неоднородности опухоли и приобретенной устойчивости к эндокринной терапии, комбинированная терапия стала незаменимой при лечении РЭ-позитивного и распространенного/метастатического рака груди для эффективной терапии или преодоления приобретенной устойчивости. Предполагается, что комбинация целевой терапии может быть более эффективной в замедлении или даже прекращении РЭ-позитивного рака груди. Комбинация ингибиторов CDK4/6 и фулвестранта была одобрена для лечения РЭ-позитивного метастатического рака груди, но у большого процента пациентов развивается резистентность из-за приобретенных мутаций в ESR1 или PIK3CA. В качестве сильного супрессора и антагониста РЭа пероральный ССРЭ, такой как пример 1В, может быть более эффективным в замедлении или остановке мутантного ESR1 или мутантного PIK3CA рака груди в качестве единственного агента или в комбинации с ингибитором CDK4/6, таким как абемациклиб или ингибитором PI3K/mTOR, таким как соединение А. В этом контексте соединение Примера 1В тестируется на ингибирование роста опухоли в комбинации с абемациклибом (патентная ссылка) или соединением А (патентная ссылка). Более конкретно, соединение Примера 1В тестируют в комбинации с абемациклибом или соединением А на ксенотрансплантированной модели рака груди дикого типа ESR1 и мутантного PIK3Са MCF7.Due to tumor heterogeneity and acquired resistance to endocrine therapy, combination therapy has become indispensable in the treatment of ER-positive and advanced/metastatic breast cancer to effectively treat or overcome acquired resistance. It is suggested that a combination of targeted therapies may be more effective in slowing or even stopping ER-positive breast cancer. The combination of CDK4/6 inhibitors and fulvestrant has been approved for the treatment of ER-positive metastatic breast cancer, but a large percentage of patients develop resistance due to acquired mutations in ESR1 or PIK3CA. As a potent suppressor and antagonist of REa, an oral SSRE such as Example 1B may be more effective in slowing or stopping ESR1 mutant or PIK3CA mutant breast cancer as a single agent or in combination with a CDK4/6 inhibitor such as abemaciclib or a PI3K inhibitor. mTOR, such as Compound A. In this context, the compound of Example 1B is tested for tumor growth inhibition in combination with abemaciclib (patent reference) or compound A (patent reference). More specifically, the compound of Example 1B is tested in combination with abemaciclib or compound A in a xenograft model of wild-type ESR1 and PIK3Ca mutant MCF7 breast cancer.
Размножают клетки рака груди человека MCF7 (АТСС № НТВ-22) в культуре, собирают и вводят 5х10е6 клеток в растворе HBSS+MATRIGEL™ 1:1 (200 мкл) подкожно на задний правый бок самок мышей NOD SCID (22-25 г, Envigo RMS, Inc). За двадцать четыре часа до имплантации клеток, подкожно имплантируют гранулы эстрогена (0,18 мг/гранулу, 17β эстрадиол, высвобождение 90 дней, Innovative Research). Измеряют рост опухоли и массу тела дважды в неделю, начиная с седьмого дня после имплантации. Когда размеры опухоли достигают 250-350 мм3, животных рандомизируют и группируют в группы по 5 животных. Получают тестируемое соединение, Пример 1В в подходящем носителе (1% гидроксиэтилцеллюлоза/0,25% TWEEN® 80/0,05% пеногасителя в очищенной воде) и вводят через желудочный зонд в течение 42 дней. Ингибитор CDK4/6 (абемациклиб) получают из 1% НЕС в 25 мМ натрийфосфатном буфере, рН 2,0. Ингибитор PI3K/mTOR (Соединение А) получают из 1% гидроксиэтилцеллюлозы/0,25% TWEEN® 80/0,05% пеногасителя в очищенной воде. Определяют ответ опухоли путем измерения объема опухоли два раза в неделю в течение курса лечения. При измерении объема опухоли в качестве общей меры токсичности принимают массу тела. Объем опухоли оценивают по формуле v = 1 х w2 x 0,535, где 1 - больше измеренного диаметра, a w- меньше перпендикулярного диаметра.Human breast cancer cells MCF7 (ATCC No. NTV-22) are propagated in culture, 5x10e 6 cells in a solution of HBSS+MATRIGEL™ 1:1 (200 μl) are injected subcutaneously into the posterior right side of female NOD SCID mice (22-25 g, Envigo RMS, Inc. Twenty-four hours before cell implantation, estrogen beads (0.18 mg/bead, 17β estradiol, 90 days release, Innovative Research) are implanted subcutaneously. Tumor growth and body weight are measured twice a week, starting on the seventh day after implantation. When the tumor size reaches 250-350 mm 3 , the animals are randomized and grouped into groups of 5 animals. Prepare test compound Example 1B in a suitable vehicle (1% hydroxyethylcellulose/0.25% TWEEN® 80/0.05% antifoam in purified water) and administer by gavage for 42 days. The CDK4/6 inhibitor (abemaciclib) is prepared from 1% HEC in 25 mM sodium phosphate buffer, pH 2.0. The PI3K/mTOR inhibitor (Compound A) is prepared from 1% hydroxyethylcellulose/0.25% TWEEN® 80/0.05% antifoam in purified water. Tumor response is determined by measuring tumor volume twice a week during the course of treatment. When measuring tumor volume, body weight is used as a general measure of toxicity. Tumor volume is estimated using the formula v = 1 x w2 x 0.535, where 1 is greater than the measured diameter, and w is less than the perpendicular diameter.
Статистический анализ.Statistical analysis.
Статистический анализ данных объема опухоли начинается с преобразования данных в логарифмическую шкалу для выравнивания дисперсии по времени и группам лечения. Данные об объеме опухли анализируют при помощи двухстороннего дисперсионного анализа с повторными измерениями по времени и лечению с использованием методик MIXED в программном обеспечении SAS (Версия 9.3). Модель корреляции для повторных измерений представляет собой Spatial Power. Обработанные группы сравнивают с контрольной группой в каждый момент времени. Методика MIXED также используется отдельно для каждой группы лечения для расчета скорректированных средних и стандартных ошибок в каждый момент времени. Оба анализа учитывают автокорреляцию внутри каждого животного и потерю данных, которая происходит, когда животные с большими опухолями удаляются из исследования на раннем этапе. Скорректированные средние и стандартные ошибки (с.о.) нанесены на график для каждой экспериментальной группы в зависимости от времени. Анализ объема опухоли основан на log10 и пространственной ковариационной структуре мощности. Значение Р основано на сравнении двух конкретных групп.Statistical analysis of tumor volume data begins with converting the data to a logarithmic scale to equalize variance across time and treatment groups. Tumor volume data were analyzed using two-way ANOVA with repeated measures by time and treatment using MIXED techniques in SAS software (Version 9.3). The correlation model for repeated measures is Spatial Power. The treated groups are compared with the control group at each time point. The MIXED technique is also used separately for each treatment group to calculate adjusted means and standard errors at each time point. Both analyzes account for autocorrelation within each animal and the loss of data that occurs when animals with large tumors are removed from the study early. Adjusted means and standard errors (s.e.) are plotted for each experimental group over time. Tumor volume analysis is based on log 10 and spatial power covariance structure. The P value is based on comparisons between two specific groups.
Способ комбинированного анализа (независимый анализ по Блиссу для исследований IVEF).Combined analysis method (independent Bliss analysis for IVEF studies).
Во-первых, обычная модель повторных измерений подходит для регистрации объема в зависимости от группы и времени. Затем показатели контраста используют для проверки эффекта взаимодействия в каждый момент времени с использованием двух комбинированных способов лечения. Это эквивалентно способу независимого анализа Блисса и предполагает, что объем опухоли теоретически может достигнуть нуля, то есть полной регрессии. Ожидаемый аддитивный ответ (EAR) для комбинации рассчитывают по шкале объема опухоли как: ответ (EAR) объем EAR= V1 * V2/V0, где V0, V1 и V2 - расчетныеFirst, the conventional repeated measures model is suitable for recording volume across groups and time. The contrast scores are then used to test the interaction effect at each time point using the two combined treatments. This is equivalent to the independent Bliss analysis method and assumes that tumor volume could theoretically reach zero, i.e. complete regression. The expected additive response (EAR) for the combination is calculated on a tumor volume scale as: response (EAR) volume EAR= V1 * V2/V0, where V0, V1 and V2 are estimated
- 34 045961 средние объемы опухоли для контроля носителя, только обработка 1 и только обработка 2 соответственно. Если тест взаимодействия является значимым, комбинированный эффект объявляется статистически большим, чем аддитивный, или меньшим, чем аддитивный, в зависимости от наблюдаемого среднего объема комбинации, который меньше или больше, чем объем EAR, соответственно. В противном случае статистический вывод является аддитивным. Кроме того, биологически значимый диапазон аддитивности может быть определен как % X выше и ниже объема EAR. Обычно X составляет от 25 до 40%. Затем биологический вывод может быть сделан для комбинации как больше, чем аддитивный, аддитивный или меньше, чем аддитивный, если наблюдаемый средний объем комбинации ниже, в или выше интервала аддитивности.- 34 045961 mean tumor volumes for vehicle control, treatment 1 only and treatment 2 only, respectively. If the interaction test is significant, the combination effect is declared statistically greater than additive or less than additive, depending on the observed mean volume of the combination, which is less or greater than the volume of the EAR, respectively. Otherwise, the statistical inference is additive. Additionally, the biologically significant range of additivity can be defined as the % X above and below the volume of the EAR. Typically X is between 25 and 40%. A biological inference can then be made for the combination as greater than additive, additive, or less than additive if the observed mean volume of the combination is below, at, or above the additivity interval.
Могут быть ситуации, когда стазис - лучший ожидаемый ответ. В таких ситуациях способ Блисса может быть применен непосредственно к значениям % дельта Т/С для получения процентного отклика EAR: % EAR дельта Т/С = Y1 * Y2/100, где Y1 и Y2 -процент значения дельта Т/С для лечения одним агентом. В настоящее время не существует статистического теста для сравнения наблюдаемого % дельта Т/С в комбинированной группе с EAR, но можно применить биологический критерий, описанный выше.There may be situations where stasis is the best expected response. In such situations, the Bliss method can be applied directly to the % delta T/C values to obtain the percentage EAR response: % EAR delta T/C = Y1 * Y2/100, where Y1 and Y2 are the percentage delta T/C value for the single agent treatment . There is currently no statistical test to compare the observed % delta T/C in the combination group with EAR, but the biological criterion described above can be applied.
Как показано в таблицах 15 и 16, лечение препаратом примера 1В или абемациклибом в качестве единственного агента приводило к 32% (%dT/C = -32) и 52% (%dT/C = -52) регрессии опухоли соответственно, и оба они статистически значимы (р <0,001) по сравнению с растворителем контролем. Эффективность комбинации Примера 1В с абемациклибом была меньше, чем аддитивная, но эффективность комбинации Примера 1В плюс абемациклиб была значительно выше, чем эффективность комбинации Примера 1В отдельно (р <0,001). Однако эффективность абемациклиба в качестве единственного агента не была статистически значимой в сравнении с комбинацией (Р = 0,055). Комбинация переносится животными без значительной потери массы тела.As shown in Tables 15 and 16, treatment with Example 1B or abemaciclib as a single agent resulted in 32% (%dT/C = -32) and 52% (%dT/C = -52) tumor regression, respectively, and both statistically significant (p <0.001) compared to solvent control. The efficacy of the combination of Example 1B plus abemaciclib was less than additive, but the efficacy of the combination of Example 1B plus abemaciclib was significantly greater than the efficacy of the combination of Example 1B alone (p < 0.001). However, the efficacy of abemaciclib as a single agent was not statistically significant compared with the combination (P = 0.055). The combination is tolerated by animals without significant loss of body weight.
- 35 045961- 35 045961
Таблица 15Table 15
Эффективность комбинации примера 1В с абемациклибом в MCF7 РЭ-позитивной модели рака грудиEfficacy of the combination of Example 1B with abemaciclib in an MCF7 ER-positive breast cancer model
Разница = лечение 1 - лечение 2 * р-значение: значительно (р <0,05) СО - Стандартная ошибкаDifference = Treatment 1 - Treatment 2 * p-value: significant (p < 0.05) SD - Standard error
- 36 045961- 36 045961
Таблица 16Table 16
Эффективность комбинации примера 1В с абемациклибом в MCF7 РЭ-позитивной модели рака грудиEfficacy of the combination of Example 1B with abemaciclib in an MCF7 ER-positive breast cancer model
Анализ объема опухоли основан на Log10 и Spatial Power ковариационной структуры.Tumor volume analysis is based on Log 10 and Spatial Power covariance structure.
* р-значение: значительно (р<0,05); н.с: не соответствует % дельта Т/С рассчитывают, когда конечный объем опухоли в обработанной группе находился на уровне или выше исходного объема опухоли; и % регрессии рассчитывают для объема опухоли ниже исходного значения. Формула 100*(Т-Т0)/(С-С0), в которой Т и С являются средними конечными объемами опухоли в обработанной или контрольной группе соответственно. Т0 и С0 - средние исходные объемы опухолей в данных группах.*p-value: significant (p<0.05); n.s: does not correspond to % delta T/C is calculated when the final tumor volume in the treated group was at or above the initial tumor volume; and % regression is calculated for tumor volume below the baseline value. The formula is 100*(T-T0)/(C-C0), in which T and C are the average final tumor volumes in the treated or control group, respectively. T 0 and C 0 are the average initial volumes of tumors in these groups.
Как показано в таблицах 17 и 18, лечение примером 1В или только соединением А приводило к 32% (%dT/C = -32) и 36% (%dT/C = -36) регрессии опухоли соответственно, и оба являются статистически значимыми (р<0,001) по сравнению с растворителем контролем. Эффективность комбинации примера 1В с соединением А была меньше, чем аддитивной, но эффективность комбинации примера 1В плюс соединение А была значительно лучше, чем эффективность только соединения примера 1B (p<0,001) или только соединения А (р=0,002*). Комбинация переносится животными без значительной потери массы тела.As shown in Tables 17 and 18, treatment with Example 1B or Compound A alone resulted in 32% (%dT/C = -32) and 36% (%dT/C = -36) tumor regression, respectively, both of which are statistically significant ( p<0.001) compared to solvent control. The potency of the combination of Example 1B with Compound A was less than additive, but the potency of the combination of Example 1B plus Compound A was significantly better than that of Example 1B alone (p<0.001) or Compound A alone (p=0.002*). The combination is tolerated by animals without significant loss of body weight.
- 37 045961- 37 045961
Таблица 17Table 17
Эффективность комбинации примера 1В с соединением А вEfficiency of the combination of example 1B with compound A in
MCF7 модели РЭ-позитивного рака грудиMCF7 model of ER-positive breast cancer
Разница = лечение 1 - лечение 2 *р-значение: значительно (р<0,05)Difference = Treatment 1 - Treatment 2 *p-value: significant (p<0.05)
СО - Стандартная ошибкаSD - Standard error
Таблица 18Table 18
Эффективность комбинации примера 1В с абемациклибом вThe effectiveness of the combination of example 1B with abemaciclib in
MCF7 РЭ-позитивной модели рака грудиMCF7 ER-positive breast cancer model
Анализ объема опухоли основан на Log10 и Spatial Power ковариационной структуры.Tumor volume analysis is based on Log 10 and Spatial Power covariance structure.
* р-значение: значительно (р<0,05); н.с: не соответствует % дельта Т/С рассчитывают, когда конечный объем опухоли в обработанной группе находился на уровне или выше исходного объема опухоли; и % регрессии рассчитывают для объема опухоли ниже исходного значения. Формула 100*(Т-Т0)/(С-С0), в которой Т и С являются средними конечными объемами опухоли в обработанной или контрольной группе соответственно. Т0 и С0 - средние исходные объемы опухолей в данных группах.*p-value: significant (p<0.05); n.s: does not correspond to % delta T/C is calculated when the final tumor volume in the treated group was at or above the initial tumor volume; and % regression is calculated for tumor volume below the baseline value. The formula is 100*(T-T 0 )/(C-C 0 ), in which T and C are the average final tumor volumes in the treated or control group, respectively. T 0 and C 0 are the average initial volumes of tumors in these groups.
- 38 045961- 38 045961
Как показано в таблицах 19 и 20, лечение препаратом примера 10 или абемациклибом в качестве единственного агента приводило к 51% (%dT/C = -51) и 70% (%dT/C = -70) регрессии опухоли соответственно, и оба они статистически значимы (р<0,001) по сравнению с растворителем контролем. Эффективность комбинации примера 10 с абемациклибом была меньше, чем аддитивная, но эффективность комбинации примера 10 плюс абемациклиб была значительно выше, чем эффективность комбинации примера 10 отдельно (р=0,039). Однако эффективность комбинации примера 10 плюс абемациклиб существенно не отличалась от эффективности только абемациклиба (р=0,905). Комбинация переносится животными без значительной потери массы тела.As shown in Tables 19 and 20, treatment with Example 10 or abemaciclib as a single agent resulted in 51% (%dT/C = -51) and 70% (%dT/C = -70) tumor regression, respectively, and both statistically significant (p<0.001) compared to the solvent control. The efficacy of the combination of Example 10 with abemaciclib was less than additive, but the efficacy of the combination of Example 10 plus abemaciclib was significantly greater than the efficacy of the combination of Example 10 alone (p=0.039). However, the efficacy of the combination of Example 10 plus abemaciclib was not significantly different from that of abemaciclib alone (p=0.905). The combination is tolerated by animals without significant loss of body weight.
Таблица 19Table 19
Эффективность комбинации примера 10 с абемациклибом в MCF7 РЭ-позитивной модели рака грудиEfficacy of the combination of example 10 with abemaciclib in the MCF7 ER-positive breast cancer model
Разница = лечение 1 - лечение 2 *р-значение: значительно (р<0,05) СО - Стандартная ошибкаDifference = Treatment 1 - Treatment 2 *p-value: significant (p<0.05) SD - Standard error
- 39 045961- 39 045961
Таблица 20Table 20
Эффективность комбинации примера 10 с абемациклибом в MCF7 РЭ-позитивной модели рака грудиEfficacy of the combination of example 10 with abemaciclib in the MCF7 ER-positive breast cancer model
Анализ объема опухоли основан на Log10 и Spatial Power ковариационной структуры.Tumor volume analysis is based on Log 10 and Spatial Power covariance structure.
* р-значение: значительно (р<0,05); н.с: не соответствует % дельта Т/С рассчитывают, когда конечный объем опухоли в обработанной группе находился на уровне или выше исходного объема опухоли; и % регрессии рассчитывают для объема опухоли ниже исходного значения. Формула 100*(Т-Т0)/(С-С0), в которой Т и С являются средними конечными объемами опухоли в обработанной или контрольной группе соответственно. Т0 и С0 - средние исходные объемы опухолей в данных группах.*p-value: significant (p<0.05); n.s: does not correspond to % delta T/C is calculated when the final tumor volume in the treated group was at or above the initial tumor volume; and % regression is calculated for tumor volume below the baseline value. The formula is 100*(T-T0)/(C-C0), in which T and C are the average final tumor volumes in the treated or control group, respectively. T 0 and C 0 are the average initial volumes of tumors in these groups.
Как показано в таблицах 21 и 22, лечение препаратом примера 10 или алпелисибом в качестве единственного агента приводило к 51% (%dT/C = -51) и 21% (%dT/C = -21) регрессии опухоли соответственно, и оба они статистически значимы (р<0,001 и р=0,013) по сравнению с растворителем контролем. Эффективность комбинации примера 10 с алпелисибом была аддитивная, и эффективность комбинации примера 10 плюс алпелисиб была значительно выше, чем эффективность только примера 10 (р=0,009). Эффективность комбинации примера 10 и алпелисиба также была значительно выше, чем эффективность только алпелисиба (р = <0,001). Комбинация переносится животными без значительной потери массы тела.As shown in Tables 21 and 22, treatment with Example 10 or alpelisib as a single agent resulted in 51% (%dT/C = -51) and 21% (%dT/C = -21) tumor regression, respectively, and both statistically significant (p<0.001 and p=0.013) compared to the solvent control. The efficacy of the combination of Example 10 with alpelisib was additive, and the efficacy of the combination of Example 10 plus alpelisib was significantly greater than that of Example 10 alone (p=0.009). The efficacy of the combination of Example 10 and alpelisib was also significantly higher than that of alpelisib alone (p = <0.001). The combination is tolerated by animals without significant loss of body weight.
- 40 045961- 40 045961
Таблица 21Table 21
Эффективность комбинации примера 10 с алпелисибом на модели MCF7 РЭ-позитивного рака грудиEfficacy of the combination of example 10 with alpelisib in the MCF7 model of ER-positive breast cancer
Разница = лечение 1 - лечение 2 *р-значение: значительно (р<0,05) СО - Стандартная ошибкаDifference = Treatment 1 - Treatment 2 *p-value: significant (p<0.05) SD - Standard error
- 41 045961- 41 045961
Таблица 22Table 22
Эффективность комбинации примера 10 с алпелисибом на модели MCF7 РЭ-позитивного рака грудиEfficacy of the combination of example 10 with alpelisib in the MCF7 model of ER-positive breast cancer
Анализ объема опухоли основан на Log10 и Spatial Power ковариационной структуры.Tumor volume analysis is based on Log 10 and Spatial Power covariance structure.
* р-значение: значительно (р<0,05); н.с: не соответствует % дельта Т/С рассчитывают, когда конечный объем опухоли в обработанной группе находился на уровне или выше исходного объема опухоли; и % регрессии рассчитывают для объема опухоли ниже исходного значения. Формула 100*(Т-Т0)/(С-С0), в которой Т и С являются средними конечными объемами опухоли в обработанной или контрольной группе соответственно. Т0 и С0 - средние исходные объемы опухолей в данных группах.*p-value: significant (p<0.05); n.s: does not correspond to % delta T/C is calculated when the final tumor volume in the treated group was at or above the initial tumor volume; and % regression is calculated for tumor volume below the baseline value. The formula is 100*(T-T 0 )/(C-C 0 ), in which T and C are the average final tumor volumes in the treated or control group, respectively. T 0 and C 0 are the average initial volumes of tumors in these groups.
Как показано в таблицах 23 и 24, лечение препаратом примера 10 или эверолимусом в качестве единственного агента приводит к 51% (%dT/C = -51) и 50% (%dT/C = -50) регрессии опухоли соответственно, и оба они статистически значимы (р<0,001 и р<0,001) по сравнению с растворителем контролем. Эффективность комбинации Примера 10 с эверолимусом была аддитивной, и эффективность комбинации примера 10 плюс эверолимус была значительно выше, чем эффективность только примера 10 (р=0,004). Эффективность комбинации примера 10 плюс эверолимус также была значительно выше, чем эффективность только эверолимуса (р=0,04). Комбинация переносится животными без значительной потери массы тела.As shown in Tables 23 and 24, treatment with Example 10 or everolimus as a single agent resulted in 51% (%dT/C = -51) and 50% (%dT/C = -50) tumor regression, respectively, and both statistically significant (p<0.001 and p<0.001) compared to the solvent control. The efficacy of the combination of Example 10 with everolimus was additive, and the efficacy of the combination of Example 10 plus everolimus was significantly greater than that of Example 10 alone (p=0.004). The efficacy of the combination of Example 10 plus everolimus was also significantly higher than that of everolimus alone (p=0.04). The combination is tolerated by animals without significant loss of body weight.
- 42 045961- 42 045961
Таблица 23Table 23
Эффективность комбинации примера 10 с эверолимусом на модели MCF7 РЭ-позитивного рака грудиEfficacy of the combination of example 10 with everolimus in the MCF7 model of ER-positive breast cancer
Разница = лечение 1 - лечение 2 *р-значение: значительно (р<0,05)Difference = Treatment 1 - Treatment 2 *p-value: significant (p<0.05)
СО - Стандартная ошибкаSD - Standard error
Таблица 24Table 24
Эффективность комбинации примера 10 с эверолимусом на модели MCF7 РЭ-позитивного рака грудиEfficacy of the combination of example 10 with everolimus in the MCF7 model of ER-positive breast cancer
Анализ объема опухоли основан на Log10 и Spatial Power ковариационной структуры.Tumor volume analysis is based on Log 10 and Spatial Power covariance structure.
* р-значение: значительно (р<0,05); н.с: не соответствует % дельта Т/С рассчитывают, когда конечный объем опухоли в обработанной группе находился на уровне или выше исходного объема опухоли; и % регрессии рассчитывают для объема опухоли ниже исходного значения. Формула 100*(Т-Т0)/(С-С0), в которой Т и С являются средними конечными объемами опухоли в обработанной или контрольной группе соответственно. Т0 и С0 - средние исходные объемы опухолей в данных группах.*p-value: significant (p<0.05); n.s: does not correspond to % delta T/C is calculated when the final tumor volume in the treated group was at or above the initial tumor volume; and % regression is calculated for tumor volume below the baseline value. The formula is 100*(T-T 0 )/(C-C 0 ), in which T and C are the average final tumor volumes in the treated or control group, respectively. T 0 and C 0 are the average initial volumes of tumors in these groups.
- 43 045961- 43 045961
Анализ пероральной биодоступности у крыс.Oral bioavailability assay in rats.
Цель следующего анализа - продемонстрировать, является ли тестируемое соединение биодоступным при пероральном введении.The purpose of the following assay is to demonstrate whether the test compound is orally bioavailable.
Испытываемое соединение вводят крысам линии Спрега-Доули внутривенно (ВВ) в количестве 1 мг/кг (с применением растворителей: 20% CAPTISOL® в 25 мМ натрий-фосфатном буфере, достаточное количество для рН 2; или 25% DMA, 15% EtOH, 10% пропиленгликоля, 25% 2-пирролидона и 25% очищенной воды) и перорально (ПО) в количестве 10 мг/кг (с применением растворителя: 1% гидроксиэтилцеллюлозы, 0,25% полисорбата 80, 0,05% пеногасителя 1510-US и достаточное количество очищенной воды). Серийные образцы крови отбирали через 0,08, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8 и 12 ч после ВВ болюсного введения дозы и через 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8 и 12 ч после перорального введения дозы. После обработки коагулянтом EDTA, плазму получали путем центрифугирования и хранили при -70°С до анализа путем ЖХМС/МС. Определяли концентрацию тестируемого соединения в плазме и загружали в систему Watson LIMS™, где для расчета площади под кривой (ППК) для ВВ и ПО ветвей применяли некомпартментный анализ. Рассчитывают пероральную биодоступность (% F) при помощи следующего уравнения:The test compound is administered intravenously (IV) to Sprague-Dawley rats at 1 mg/kg (using solvents: 20% CAPTISOL® in 25 mM sodium phosphate buffer, sufficient for pH 2; or 25% DMA, 15% EtOH, 10% propylene glycol, 25% 2-pyrrolidone and 25% purified water) and orally (PO) at 10 mg/kg (using solvent: 1% hydroxyethylcellulose, 0.25% polysorbate 80, 0.05% antifoam 1510-US and a sufficient amount of purified water). Serial blood samples were collected at 0.08, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 and 12 hours after the IV bolus dose and at 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 and 12 hours after oral dosing. After treatment with EDTA coagulant, plasma was obtained by centrifugation and stored at -70°C until analyzed by LCMS/MS. Plasma concentrations of the test compound were determined and loaded into the Watson LIMS™ system, where non-compartmental analysis was used to calculate the area under the curve (AUC) for IV and PO arms. Calculate oral bioavailability (% F) using the following equation:
%F = (ППКпо X дозавв)/(Я77Лвв X дозапо) X 100.%F = (PPKpo X dose)/(Y77Lvv X dose) X 100.
Соединения примера 1В показывают значение % F ~ 50% в вышеупомянутом анализе. Этот анализ показывает, что пример 1В имеет хорошую биодоступность при пероральном введении.The compounds of Example 1B show a %F value of ~50% in the above analysis. This analysis shows that Example 1B has good oral bioavailability.
Claims (36)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62/697,100 | 2018-07-12 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045961B1 true EA045961B1 (en) | 2024-01-23 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7241211B2 (en) | selective estrogen receptor degrading agent | |
| JP5581390B2 (en) | AKT inhibitor | |
| CN112424205A (en) | Selective estrogen receptor degraders | |
| EA045961B1 (en) | SELECTIVE ESTROGEN RECEPTOR SUPPRESSORS | |
| EA040517B1 (en) | SELECTIVE ESTROGEN RECEPTOR SUPPRESSORS | |
| EA041610B1 (en) | SELECTIVE ESTROGEN RECEPTOR SUPPRESSORS |