EA045818B1 - VACCINE COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF CANCER BASED ON INORGANIC NANOPARTICLES - Google Patents
VACCINE COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF CANCER BASED ON INORGANIC NANOPARTICLES Download PDFInfo
- Publication number
- EA045818B1 EA045818B1 EA202293285 EA045818B1 EA 045818 B1 EA045818 B1 EA 045818B1 EA 202293285 EA202293285 EA 202293285 EA 045818 B1 EA045818 B1 EA 045818B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- rhegf
- rp64k
- hap
- vaccine composition
- composition according
- Prior art date
Links
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 title claims description 62
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 44
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 33
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims description 26
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims description 15
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 58
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 58
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 48
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 42
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 41
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 38
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 33
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 33
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 16
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 15
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 15
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 12
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims description 10
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 claims description 10
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 claims description 9
- 239000013110 organic ligand Substances 0.000 claims description 9
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 8
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 5
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 claims description 5
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 claims description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 4
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 claims description 3
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 claims description 3
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011707 mineral Substances 0.000 claims description 3
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 claims description 3
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical group [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 claims description 3
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 claims description 3
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 claims description 3
- 101500025419 Homo sapiens Epidermal growth factor Proteins 0.000 claims description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 claims description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 claims description 2
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 claims description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims 1
- 108700008924 Neisseria meningitidis lpdA Proteins 0.000 claims 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 claims 1
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 claims 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 33
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 33
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 17
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 17
- 239000010954 inorganic particle Substances 0.000 description 17
- 230000004044 response Effects 0.000 description 17
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 13
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 13
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 13
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 11
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 9
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 150000007942 carboxylates Chemical group 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 6
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 6
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 5
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 5
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000005033 Fourier transform infrared spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 4
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 4
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000003725 proteoliposome Substances 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- 229910052684 Cerium Inorganic materials 0.000 description 3
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QCWXUUIWCKQGHC-UHFFFAOYSA-N Zirconium Chemical compound [Zr] QCWXUUIWCKQGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 229910052790 beryllium Inorganic materials 0.000 description 3
- ATBAMAFKBVZNFJ-UHFFFAOYSA-N beryllium atom Chemical compound [Be] ATBAMAFKBVZNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GWXLDORMOJMVQZ-UHFFFAOYSA-N cerium Chemical compound [Ce] GWXLDORMOJMVQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 description 3
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 3
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 3
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 3
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 3
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 3
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 3
- 229910052726 zirconium Inorganic materials 0.000 description 3
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 241000402062 Dolphin rhabdovirus Species 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 2
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 2
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000003328 fibroblastic effect Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 2
- 150000004679 hydroxides Chemical class 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 2
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 2
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 1
- 206010061424 Anal cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910014497 Ca10(PO4)6(OH)2 Inorganic materials 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910002483 Cu Ka Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 201000000297 Erysipelas Diseases 0.000 description 1
- 206010017993 Gastrointestinal neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101000851176 Homo sapiens Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010062049 Lymphocytic infiltration Diseases 0.000 description 1
- 208000029549 Muscle injury Diseases 0.000 description 1
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 1
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000237988 Patellidae Species 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000004337 Salivary Gland Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010061934 Salivary gland cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 206010047741 Vulval cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000004354 Vulvar Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 1
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 1
- DIZPMCHEQGEION-UHFFFAOYSA-H aluminium sulfate (anhydrous) Chemical compound [Al+3].[Al+3].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O DIZPMCHEQGEION-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 201000007538 anal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 239000007771 core particle Substances 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 229960005097 diphtheria vaccines Drugs 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 1
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000005243 lung squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000005210 lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002346 musculoskeletal system Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 159000000001 potassium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004994 reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229910001467 sodium calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- -1 synthetic Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000001931 thermography Methods 0.000 description 1
- 238000001757 thermogravimetry curve Methods 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 201000005102 vulva cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Description
Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности, к области здоровья человека. В частности, в нем описаны новые составы вакцин, содержащие системы наночастиц, которые вызывают иммунный ответ против эпидермального фактора роста и, следовательно, могут быть применены в качестве средства для лечения рака.The present invention relates to biotechnology, in particular to the field of human health. In particular, it describes new vaccine formulations containing nanoparticle systems that induce an immune response against epidermal growth factor and, therefore, can be used as a treatment for cancer.
Уровень техникиState of the art
Опухоли в тканях эпителиального происхождения обычно сверхэкспрессируют рецептор эпидермального фактора роста (EGF - англ.: epidermal growth factor) на своей поверхности. Связывание аутологичного EGF с его рецептором (EGFR - англ.: epidermal growth factor receptor) активирует в опухоли механизмы, которые приводят к ее росту и уходу от защиты, которую обеспечивает иммунная система. Исходя из этой информации, с 1990-х годов EGF был идентифицирован как терапевтическая мишень для лечения рака легкого и других видов рака эпителиального происхождения, для которых имеет релевантность связывание EGF с его рецептором.Tumors in tissues of epithelial origin usually overexpress the epidermal growth factor receptor (EGF) on their surface. The binding of autologous EGF to its receptor (EGFR - English: epidermal growth factor receptor) activates mechanisms in the tumor that lead to its growth and escape from the protection provided by the immune system. Based on this information, since the 1990s, EGF has been identified as a therapeutic target for the treatment of lung cancer and other cancers of epithelial origin for which binding of EGF to its receptor is relevant.
Было проведено множество исследований, направленных на оценку пассивной иммунотерапии антителами, нацеленными на EGFR. Ранее было продемонстрировано, что специфическое распознавание рецептора антителами мышиного происхождения ингибирует митогенную стимуляцию злокачественных клеток (Sato J.D. et al., Methods in Enzymology (1987) 146:63-81). В другом исследовании, опубликованном в патенте US 5,891,996, описаны патентованные, химерные и гуманизированные моноклональные антитела, которые могут играть диагностическую или терапевтическую роль в опухолях со сверхэкспрессией EGFR.Numerous studies have been conducted to evaluate passive immunotherapy with antibodies targeting EGFR. It has previously been demonstrated that specific recognition of the receptor by antibodies of mouse origin inhibits mitogenic stimulation of malignant cells (Sato J.D. et al., Methods in Enzymology (1987) 146:63-81). Another study published in US Pat. No. 5,891,996 describes proprietary, chimeric and humanized monoclonal antibodies that may have a diagnostic or therapeutic role in tumors overexpressing EGFR.
В последние несколько лет применение активной иммунотерапии быстро распространяется по причине ее потенциала для борьбы с раком и его превращения в хроническое управляемое заболевание. В отличие от пассивных способов терапии, активная терапия основана на стимуляции иммунной системы для борьбы с опухолью или другими элементами, которые способствуют ее развитию. Помимо других преимуществ, она снижает токсичность, поскольку требуемые дозы содержат лишь небольшие количества активных веществ.The use of active immunotherapy has rapidly expanded in the last few years due to its potential to combat cancer and make it a chronic, manageable disease. Unlike passive therapies, active therapies rely on stimulating the immune system to fight the tumor or other elements that contribute to its development. Among other benefits, it reduces toxicity because the required doses contain only small amounts of active substances.
Состав, упомянутый в патенте US 5,894,018, представляет собой композицию вакцины, которая вызывает иммунный ответ против аутологичного EGF. Упомянутый состав содержит аутологичный EGF, конъюгированный с белком-носителем (субъединицей В холерного токсина, столбнячным анатоксином, моноклональным антителом или белком наружной мембраны Neisseria meningitidis), и с добавленным в качестве адъюванта гидроксидом алюминия. С другой стороны, патент US 8,778,879 описывает композицию вакцины для терапевтического применения на пациентах с раком, которая имеет в качестве активного начала химический конъюгат рекомбинантного EGF человека (rhEGF - англ.: recombinant human epidermal growth factor) с рекомбинантным белком P64k. В этом документе описана процедура очистки химического конъюгата, повышающая его чистоту и иммуногенную активность. Эта композиция содержит адъювант, который может представлять собой гидроксид алюминия или монтанид (Montanide).The composition mentioned in US patent 5,894,018 is a vaccine composition that induces an immune response against autologous EGF. Said composition contains autologous EGF conjugated to a carrier protein (cholera toxin subunit B, tetanus toxoid, monoclonal antibody or Neisseria meningitidis outer membrane protein), and with aluminum hydroxide added as an adjuvant. On the other hand, US patent 8,778,879 describes a vaccine composition for therapeutic use in patients with cancer, which has as the active principle a chemical conjugate of recombinant human EGF (rhEGF - English: recombinant human epidermal growth factor) with recombinant protein P64k. This document describes a procedure for purifying a chemical conjugate to enhance its purity and immunogenic activity. This composition contains an adjuvant, which may be aluminum hydroxide or Montanide.
Более поздние клинические исследования показали, что терапевтическая вакцина, полученная на основе ранее упомянутых изобретений, безопасна и эффективна для лечения запущенной стадии немелкоклеточного рака легкого (NSCLC - англ.: Non-Small Cell Lung Cancer) (Rodriguez P.O. и соавт., Clinical Cancer Research (2016), 22 (15): 3782-3790). Однако было доказано, что пациенты, достигшие высоких показателей выживаемости (пять лет и более), страдают от повреждения мышц (дельтовидной и ягодичной) в местах инъекций в результате накопления минерального масла, содержащегося в указанном адъюванте. Это, в конечном итоге, приводит к необходимости прерывания лечения у некоторых пациентов или введения препарата в мышцы, более удаленные от лимфоидных органов.More recent clinical studies have shown that the therapeutic vaccine derived from the previously mentioned inventions is safe and effective for the treatment of advanced non-small cell lung cancer (NSCLC - Non-Small Cell Lung Cancer) (Rodriguez P.O. et al., Clinical Cancer Research (2016), 22(15): 3782-3790). However, it has been proven that patients who achieve high survival rates (five years or more) suffer from muscle damage (deltoid and gluteal) at the injection sites as a result of the accumulation of mineral oil contained in the said adjuvant. This ultimately leads to the need to interrupt treatment in some patients or inject the drug into muscles further away from the lymphoid organs.
Иммунологические адъюванты возникли из-за потребности в повышении иммуногенности вакцин, разработанных на основе рекомбинантных белков. Первым примененным адъювантом в 1926 году стал двойной сульфат алюминия. Впоследствии были квалифицированы различные неорганические адъюванты из алюминия, кальция, магния, железа, цинка, циркония, церия, бериллия и кремния. Однако для применения на человеке были одобрены только соли алюминия и кальция (Paneque-Quevedo A., Applied Biotechnology (2013) 30: 243-249). Во всех предшествующих проведенных исследованиях неорганические адъюванты применяли в сочетании с гетерологичными антигенами.Immunological adjuvants arose from the need to increase the immunogenicity of vaccines developed based on recombinant proteins. The first adjuvant used was double aluminum sulfate in 1926. Subsequently, various inorganic adjuvants from aluminum, calcium, magnesium, iron, zinc, zirconium, cerium, beryllium and silicon were qualified. However, only aluminum and calcium salts have been approved for use in humans (Paneque-Quevedo A., Applied Biotechnology (2013) 30: 243-249). In all previous studies, inorganic adjuvants were used in combination with heterologous antigens.
Гидроксид алюминия и адъюванты на основе фосфата алюминия не очень подходят для лечения хронических заболеваний, поскольку алюминий является токсичным и плохо метаболизируется в организме человека. Влияние накопления алюминия на здоровье человека задокументировано в полной мере, особенно на следующие системы: центральную нервную систему, опорно-двигательную систему, дыхательную, сердечно-сосудистую, эндокринную, мочевыделительную и репродуктивную системы (Nayak P., Environmental Research Section TO (2002), 89: 101-115; Verstraeten S. А. и соавт., Arch Toxicol (2008) 82: 789-802; Flaten T. P., Brain Research Bulletin (2001) 2: 187-196).Aluminum hydroxide and aluminum phosphate adjuvants are not very suitable for the treatment of chronic diseases because aluminum is toxic and poorly metabolized in the human body. The impact of aluminum accumulation on human health is fully documented, especially on the following systems: central nervous system, musculoskeletal system, respiratory, cardiovascular, endocrine, urinary and reproductive systems (Nayak P., Environmental Research Section TO (2002), 89: 101-115; Verstraeten S. A. et al., Arch Toxicol (2008) 82: 789-802; Flaten T. P., Brain Research Bulletin (2001) 2: 187-196).
С другой стороны, фосфаты кальция (далее СаР) представляют собой неорганические вещества, которые, как было показано, могут быть применены в качестве иммунологических адъювантов. В патенте US 2,967,802 предложена смесь антигена рожи с гидратированным гелем СаР. В ходе исследований и последующего патентования были разработаны профилактические вакцины против инфекций, вызываеOn the other hand, calcium phosphates (hereinafter CaP) are inorganic substances that have been shown to be useful as immunological adjuvants. US Pat. No. 2,967,802 proposes a mixture of erysipelas antigen with hydrated CaP gel. Through research and subsequent patenting, preventive vaccines were developed against infections caused by
- 1 045818 мых несколькими патогенными и аллергенными микроорганизмами, адсорбируемыми в СаР (US 3,608,071, US 4016252; US 4350686; US 20120121714; Coursaget, P. и соавт., Infect Immun (1986) 51(3): 784-787).- 1045818 by several pathogenic and allergenic microorganisms adsorbed in CaP (US 3,608,071, US 4016252; US 4350686; US 20120121714; Coursaget, P. et al., Infect Immun (1986) 51(3): 784-787).
Как и в случае с гидроксидом и фосфатом алюминия, иммунологический эффект адъювантов с СаР основан на формировании резерва медленно высвобождаемого антигена, что обеспечивает продолжительное время презентации для иммунной системы, достаточное для формирования ответа против привитого антигена. В патенте US 8,333,996 заявлена разработка иммуногенных систем, образованных путем адсорбции антигенов, таких как: Bordetella pertusis, аллергены, инактивированные вирусы иммунодефицита человека (HIV-2), гемоцианин лимфы фисуреллы (KLH), вакцины против дифтерии, столбнячный анатоксин, стрептококки, ослабленные бактерии или вирусы, полиомиелита и гепатита А и В. Они также включают в себя адсорбцию ДНК и цитокинов, такие как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF).As with aluminum hydroxide and aluminum phosphate, the immunological effect of CaP adjuvants is based on the formation of a reserve of slowly released antigen, which provides a long presentation time to the immune system sufficient to mount a response against the inoculated antigen. US Patent 8,333,996 claims the development of immunogenic systems formed by adsorption of antigens such as: Bordetella pertusis, allergens, inactivated human immunodeficiency viruses (HIV-2), fisurella limpet hemocyanin (KLH), diphtheria vaccines, tetanus toxoid, streptococci, attenuated bacteria or viruses, polio, and hepatitis A and B. They also involve the adsorption of DNA and cytokines such as granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF).
В патенте US 6,355,271 заявлен способ получения частиц СаР диаметром от 300 до 4000 нм, основанный на водной смеси хлорида кальция, фосфата натрия и цитрата натрия для адсорбции вирусов простого герпеса (HSV-1, HSV-2) и вируса Эпштейна-Барра (EBV), ДНК, а также антигенов овальбумина и Mycobacterium tuberculosis.US patent 6,355,271 claims a method for producing CaP particles with a diameter of 300 to 4000 nm, based on an aqueous mixture of calcium chloride, sodium phosphate and sodium citrate for the adsorption of herpes simplex viruses (HSV-1, HSV-2) and Epstein-Barr virus (EBV) , DNA, as well as ovalbumin and Mycobacterium tuberculosis antigens.
В недавних исследованиях было оценено применение СаР в качестве адъюванта вакцины или для выпуска различных лекарственных средств. Среди них релевантными являются те, в которых проанализирована разработка дисперсных гидроксиапатитовых систем (Са10(РО4)6(ОН)2, далее именуемых НАр), предпочтительно в форме наночастиц. Это вещество является основным неорганическим компонентом костной ткани, поэтому гарантирована его биологическая совместимость. Кроме того, аморфные или низкокристаллические НАр подвержены биоразложению при контакте с биологической средой. Уменьшение размера частиц и выбранный материал придают ему превосходные свойства в качестве адъюванта по сравнению с гидроксидом алюминия. Они вызывают более сбалансированный ответ Th1/Th2 и меньшее образование антител типа IgE (Qing, H. и соавт. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology (2000) 7(6): 899-903; Jones, S. и соавт., Vaccine (2014) 32: 4234-4242; Lin, Y. и соавт. Expert Review of Vaccines (2017), 16(9): 895-906. Кроме того, это вещество уменьшает побочные эффекты в месте инъекции, поскольку является биосовместимым, а в аморфной форме - биоразлагаемым.Recent studies have evaluated the use of CaP as a vaccine adjuvant or for the release of various drugs. Among them, the relevant ones are those that analyze the development of dispersed hydroxyapatite systems (Ca 10 (PO 4 )6(OH) 2 , hereafter referred to as HAr), preferably in the form of nanoparticles. This substance is the main inorganic component of bone tissue, therefore its biological compatibility is guaranteed. In addition, amorphous or low-crystalline HAr are susceptible to biodegradation upon contact with the biological environment. The reduction in particle size and selected material give it superior properties as an adjuvant compared to aluminum hydroxide. They induce a more balanced Th1/Th2 response and less production of IgE-type antibodies (Qing, H. et al. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology (2000) 7(6): 899-903; Jones, S. et al., Vaccine (2014 ) 32: 4234-4242; Lin, Y. et al. Expert Review of Vaccines (2017), 16(9): 895-906. In addition, this substance reduces side effects at the injection site because it is biocompatible and amorphous form - biodegradable.
В патенте WO 2005084637 заявлена система, содержащая: ядро из наночастицы СаР, биологически активную макромолекулу, инкапсулированную в частицу ядра, и агент модифицирования поверхности. Биологически активная макромолекула может представлять собой белок, полипептид, полисахарид, нуклеиновую кислоту, полинуклеотид, липид или углевод.WO 2005084637 claims a system containing: a CaP nanoparticle core, a biologically active macromolecule encapsulated in the core particle, and a surface modifying agent. The biologically active macromolecule may be a protein, polypeptide, polysaccharide, nucleic acid, polynucleotide, lipid or carbohydrate.
С другой стороны, в изобретении WO 2003051394 в едином составе представлены наночастицы НАр с различными типами покрытия для применения в качестве адъюванта. В нем наночастицы используются в качестве носителей нативных или рекомбинантных антигенов или других фармакологических агентов для применения на поверхности слизистых оболочек.On the other hand, the invention WO 2003051394 presents HAP nanoparticles with different types of coating in a single composition for use as an adjuvant. It uses nanoparticles as carriers of native or recombinant antigens or other pharmacological agents for application on the surface of mucous membranes.
В других исследования заявлено о разработках и применении СаР в целом и, в частности, наночастиц НАр в качестве иммунологических адъювантов или носителей активных веществ для лечения инфекционных заболеваний или заболеваний иммунной системы, включая рак (US 5,443,832; US 6,355,271; US 6,767,550; US 20020068090; US 7,776,600; WO 2017025359).Other studies claim the development and use of CaP in general and, in particular, NaP nanoparticles as immunological adjuvants or carriers of active substances for the treatment of infectious diseases or diseases of the immune system, including cancer (US 5,443,832; US 6,355,271; US 6,767,550; US 20020068090; US 7,776,600; WO 2017025359).
Ни в одном из предыдущих документов не описаны композиции вакцины, которые вызывают специфический иммунный ответ против EGF или других аутологичных белков, сконструированных на поверхности частиц СаР, за счет их химического связывания с молекулами rhEGF и белком-носителем независимо друг от друга или путем их конъюгации.None of the previous documents describe vaccine compositions that induce a specific immune response against EGF or other autologous proteins engineered on the surface of CaP particles by chemically binding to rhEGF molecules and a carrier protein independently or by conjugation thereof.
Новизна данного изобретения заключается в создании новых композиций вакцин для длительного лечения рака, образованных ядром из биоразлагаемых неорганических наночастиц, химически связанных с аутологичными антигенами. Посредством связывания частиц СаР, в частности НАр, нанометрового или субмикронного размера, с rhEGF или его пептидами и другим белком или пептидом-носителем, можно вызвать иммунный ответ против EGF. Эти новые композиции превосходят существующие композиции, вызывающие ответ на EGF, тем, что они не сопровождаются побочными эффектами в месте инъекции и не накапливаются в организме. Кроме того, их дозируют в одном флаконе, поэтому во время применения не требуются дополнительные процедуры, такие как приготовление смесей или эмульсий.The novelty of this invention lies in the creation of new vaccine compositions for long-term treatment of cancer, formed by a core of biodegradable inorganic nanoparticles chemically associated with autologous antigens. By binding CaP particles, in particular nanometer- or submicron-sized HAP, to rhEGF or peptides thereof and another carrier protein or peptide, an immune response against EGF can be elicited. These new compositions are superior to existing EGF response compositions in that they do not cause side effects at the injection site and do not accumulate in the body. In addition, they are dosed in one bottle, so during use no additional procedures are required, such as the preparation of mixtures or emulsions.
Краткое описание изобретенияBrief description of the invention
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композициям вакцины, которые вызывают иммунный ответ против EGF. Оно отличается тем, что содержит в качестве активного начала систему, содержащую rhEGF или его пептиды и белок-носитель или пептид, связанные с ядром, которое образовано биоразлагаемыми неорганическими наночастицами, которые могут представлять собой соли, оксиды или гидроксиды кальция, железа, цинка, магния, циркония, церия, бериллия, кремния или смесь двух или более из них. Предпочтительно неорганическое ядро состоит из СаР, более конкретно - из типа НАр. Этот НАр предпочтительно является аморфным или низкокристаллическим и частично или полностью покрыт органическим лигандом, в частности, цитратом натрия. Кроме того, белок или пептидный носитель выбирают из группы, состоящей из: субъединицы В холерного токсина, столбнячIn one embodiment, the present invention provides vaccine compositions that induce an immune response against EGF. It is distinguished by the fact that it contains as an active principle a system containing rhEGF or its peptides and a carrier protein or peptide associated with a core formed by biodegradable inorganic nanoparticles, which can be salts, oxides or hydroxides of calcium, iron, zinc, magnesium , zirconium, cerium, beryllium, silicon or a mixture of two or more of them. Preferably, the inorganic core consists of CaP, more particularly of the HAP type. This HAr is preferably amorphous or low crystalline and partially or completely coated with an organic ligand, in particular sodium citrate. In addition, the protein or peptide carrier is selected from the group consisting of: cholera toxin subunit B, tetanus
- 2 045818 ного анатоксина, гемоцианина лимфы фисуреллы (KLH) и P64k Neisseria meningitidis.- 2 045818 toxoid, fisurella lymph hemocyanin (KLH) and P64k Neisseria meningitidis.
Кроме того, активное начало композиций вакцины по настоящему изобретению находится на поверхности наночастиц НАр, связанное одним из следующих способов: Ковалентная связь химического конъюгата rhEGF или его пептидов и белка-носителя или пептида с наночастицей НАр (HAp-rhEGFrP64k).In addition, the active principle of the vaccine compositions of the present invention is on the surface of the HAP nanoparticles, bound in one of the following ways: Covalent bonding of a chemical conjugate of rhEGF or its peptides and a carrier protein or peptide to the HAP nanoparticle (HAp-rhEGFrP64k).
Ковалентная связь rhEGF или его пептидов и белка-носителя или пептида с наночастицей НАр независимым образом (НАр-PI).Covalent bonding of rhEGF or its peptides and a carrier protein or peptide to a HAP nanoparticle in an independent manner (HAp-PI).
Последовательная ковалентная связь rhEGF или его пептидов и белка-носителя или пептида с наночастицей НАр.Sequential covalent bonding of rhEGF or its peptides and a carrier protein or peptide to a HAP nanoparticle.
Множественная конъюгация между rhEGF или его пептидами и белком-носителем или пептидом на поверхности НАр (НАр-СМ).Multiple conjugation between rhEGF or its peptides and a carrier protein or peptide on the surface of HAP (HAp-SM).
Инкапсуляция или физическая адсорбция rhEGF и белка-носителя или пептида на поверхности НАр.Encapsulation or physical adsorption of rhEGF and carrier protein or peptide onto the surface of HAP.
В другом аспекте настоящего изобретения рассмотрена комбинация композиций вакцины, описанных в настоящем документе, с адъювантами, выбранными из групп, включающих в себя: неполные адъюванты Фрейнда, адъюванты на основе сквалена, адъюванты синтетического происхождения, адъюванты минерального происхождения, адъюванты растительного происхождения, адъюванты животного происхождения, адъюванты на основе белковых частиц и липосомы. В дополнительном варианте осуществления задачей настоящего изобретения является применение описанных здесь композиций вакцины для длительного лечения рака. Еще одной задачей настоящего изобретения является предложение способа лечения субъекта, нуждающегося в этом, который включает в себя введение терапевтически эффективного количества описанных здесь композиций вакцины. Этот способ, в частности, отличается тем, что он поддерживает вызов иммунного ответа, достигнутого с помощью другой композиции вакцины против EGF.Another aspect of the present invention provides for the combination of the vaccine compositions described herein with adjuvants selected from the group consisting of: incomplete Freund's adjuvants, squalene-based adjuvants, synthetic adjuvants, mineral adjuvants, plant adjuvants, animal adjuvants , adjuvants based on protein particles and liposomes. In a further embodiment, it is an object of the present invention to use the vaccine compositions described herein for the long-term treatment of cancer. It is yet another object of the present invention to provide a method of treating a subject in need thereof which comprises administering a therapeutically effective amount of the vaccine compositions described herein. This method is particularly characterized in that it supports the elicitation of an immune response achieved by another EGF vaccine composition.
Подробное описание изобретенияDetailed Description of the Invention
Настоящее изобретение включает в себя синтез биоразлагаемых неорганических наночастиц, покрытых органическими лигандами, их химическую активацию, а также их связывание посредством ковалентных связей или электростатических взаимодействий с антигеном, вызывающим специфический иммунный ответ против EGF, и их конструирование на поверхности этой частицы.The present invention includes the synthesis of biodegradable inorganic nanoparticles coated with organic ligands, their chemical activation, as well as their binding through covalent bonds or electrostatic interactions with an antigen that causes a specific immune response against EGF, and their construction on the surface of this particle.
Получение и активация биоразлагаемых неорганических наночастиц.Preparation and activation of biodegradable inorganic nanoparticles.
Настоящее изобретение включает в себя образование биоразлагаемых неорганических частиц нанометрового, субмикронного или микронного размера. Эти частицы покрыты органическим лигандом, предпочтительно цитратом натрия, и получены путем осаждения, хотя этот способ не следует рассматривать как ограничение объема настоящего изобретения.The present invention includes the formation of biodegradable inorganic particles of nanometer, submicron or micron size. These particles are coated with an organic ligand, preferably sodium citrate, and are obtained by precipitation, although this method should not be construed as limiting the scope of the present invention.
Биоразлагаемые частицы имеют неорганическое ядро, образованное солями, оксидами или гидроксидами кальция, железа, цинка, магния, циркония, церия, бериллия, кремния или смесью двух или более из них. Предпочтительно они образованы из СаР, более предпочтительно - из аморфного НАр или аморфного НАр с изоморфными замещениями одного или нескольких металлов.Biodegradable particles have an inorganic core formed by salts, oxides or hydroxides of calcium, iron, zinc, magnesium, zirconium, cerium, beryllium, silicon or a mixture of two or more of them. Preferably they are formed from CaP, more preferably from amorphous HAr or amorphous HAr with isomorphic substitutions of one or more metals.
Для образования указанных неорганических частиц используют источники кальция и ионов фосфата, а также органический лиганд, придающий им поверхностный заряд, и функциональную группу, позволяющую осуществлять химическую конъюгацию с биомолекулами.To form these inorganic particles, sources of calcium and phosphate ions are used, as well as an organic ligand that gives them a surface charge and a functional group that allows chemical conjugation with biomolecules.
Частицы, используемые в иммунотерапевтических системах, которые описаны в настоящем изобретении, отличаются тем, что они обладают по меньшей мере одним из следующих свойств:The particles used in the immunotherapy systems that are described in the present invention are characterized in that they have at least one of the following properties:
Они образованы биоразлагаемыми неорганическими частицами, которые могут иметь изоморфные замещения ионами металлов или другими ионами.They are formed by biodegradable inorganic particles, which may have isomorphic substitutions with metal ions or other ions.
Их получают предпочтительно влажным синтезом, более предпочтительно осаждением, хотя этот способ не следует рассматривать как ограничение объема настоящего изобретения.They are prepared preferably by wet synthesis, more preferably by precipitation, although this method should not be construed as limiting the scope of the present invention.
Они имеют микронные, субмикронные, нанометровые размеры или их комбинации.They have micron, submicron, nanometer sizes or combinations thereof.
Они имеют сферическую, цилиндрическую или пластинчатую морфологию или их комбинации, хотя эти морфологии не следует рассматривать как ограничение объема настоящего изобретения.They have spherical, cylindrical or lamellar morphologies, or combinations thereof, although these morphologies should not be construed as limiting the scope of the present invention.
Они предпочтительно покрыты органическим лигандом, который придает им поверхностный заряд и функциональные группы, что делает возможным их конъюгацию с антигенами.They are preferably coated with an organic ligand, which imparts surface charge and functional groups to them, allowing their conjugation to antigens.
Для получения неорганических частиц, описанных в данном изобретении, предпочтительно требуется:To obtain the inorganic particles described in this invention, it is preferably required:
Поддержание молярного соотношения катиона к аниону в пределах 1:4. Добавление к реагентам цитрата натрия или другого органического лиганда, обладающего аналогичным действием, в количестве, достаточном для обеспечения молярного соотношения между 3:5 и содержанием ионов кальция.Maintaining the molar ratio of cation to anion within 1:4. Addition to the reagents of sodium citrate or other organic ligand having a similar effect, in an amount sufficient to provide a molar ratio between 3:5 and the content of calcium ions.
Довести рН до 7-13 путем добавления щелочи, предпочтительно гидроксида аммония или гидроксида натрия.Adjust pH to 7-13 by adding alkali, preferably ammonium hydroxide or sodium hydroxide.
Проводить реакцию в течение 1-4 ч, желательно при комнатной температуре (20±5°С).Carry out the reaction for 1-4 hours, preferably at room temperature (20±5°C).
Выполнить процесс вакуумной сушки при комнатной температуре.Carry out the vacuum drying process at room temperature.
Неорганические частицы, полученные в описанных ранее условиях, частично или полностью поInorganic particles obtained under the previously described conditions, partially or completely according to
- 3 045818 крытые органическим лигандом, который содержит карбоксилатные группы, предпочтительно цитрат натрия, активируют путем добавления сшивающего реагента из семейства карбодиимидов или другого семейства с аналогичными функциями. В этом процессе используют массовое соотношение реагент/частица от 1 до 6, предпочтительно от 2 до 5 мг/мг. Указанную суспензию выдерживают с перемешиванием при комнатной температуре (20±5°С) в течение 1-4 ч, предпочтительно в течение 0,5-3 ч. Затем активированные частицы очищают, предпочтительно с помощью процессов центрифугирования или фильтрации.- 3 045818 coated with an organic ligand which contains carboxylate groups, preferably sodium citrate, is activated by the addition of a cross-linking reagent from the carbodiimide family or other family with similar functions. In this process, a reagent/particle mass ratio of 1 to 6, preferably 2 to 5 mg/mg is used. Said suspension is kept with stirring at room temperature (20±5°C) for 1-4 hours, preferably for 0.5-3 hours. The activated particles are then purified, preferably using centrifugation or filtration processes.
С помощью описанной ранее процедуры получают частицы с преобладающим размером <200 нм и активированной поверхностью, обладающие способностью связываться с белками, имеющими открытые функциональные группы. Вышеупомянутые характеристики делают их превосходящими предшествующие разработки в сфере неорганических частиц для инкапсуляции или физической адсорбции активных компонентов.Using the previously described procedure, particles with a predominant size of <200 nm and an activated surface are obtained, which have the ability to bind to proteins having open functional groups. The above characteristics make them superior to previous developments in the field of inorganic particles for encapsulation or physical adsorption of active components.
Получение системы наночастиц для формирования ответа против EGF.Preparation of a nanoparticle system for generating a response against EGF.
Предварительно активированные частицы смешивают с химическим конъюгатом рекомбинантных белков rhEGF и rP64k при массовом соотношении rhEGF-rP64k/HAp 1-10, предпочтительно 2-7 мг/мг. Описанная ранее реакция приводит к ковалентной связи амидного типа между аминогруппами (NH2) конъюгата и карбоксилатными группами (СОО-) на поверхности частицы. Электростатические взаимодействия также происходят между кальциевыми группами, оставшимися на поверхности НАр, и конъюгатом rhEGF-rP64k, который заряжен отрицательно и имеет открытые карбоксилатные группы. Затем коллоидную суспензию диспергируют, предпочтительно с помощью ЭДТА, и, наконец, ее рН доводят до значения от 6,7 до 7,3.Pre-activated particles are mixed with a chemical conjugate of recombinant proteins rhEGF and rP64k at a weight ratio of rhEGF-rP64k/HAp of 1-10, preferably 2-7 mg/mg. The previously described reaction results in an amide-type covalent bond between the amino groups (NH2) of the conjugate and the carboxylate groups (COO - ) on the surface of the particle. Electrostatic interactions also occur between the calcium groups remaining on the surface of HAr and the rhEGF-rP64k conjugate, which is negatively charged and has exposed carboxylate groups. The colloidal suspension is then dispersed, preferably with EDTA, and finally its pH is adjusted to between 6.7 and 7.3.
В другом варианте реализации химический конъюгат рекомбинантных белков rhEGF и rP64k заменен конъюгатом rP64k или другого белка-носителя с одним или несколькими пептидами rhEGF.In another embodiment, the chemical conjugate of the recombinant rhEGF and rP64k proteins is replaced by a conjugate of rP64k or another carrier protein with one or more rhEGF peptides.
Связывание конъюгатов, описанных в настоящем изобретении, с поверхностью неорганических частиц происходит посредством указанной ранее процедуры. Результатом является новая система для лечения рака, первая в своем роде, которая имеет состав, существенно отличающийся от состава вакцин, описанных в патентах US 5,894,018 и US 8,778,879. Вакцинация этой системой вызывает иммунный ответ, который включает в себя выработку антител против EGF, способных захватывать циркулирующий EGF и предотвращать его связывание с его рецептором на поверхности опухоли.The binding of the conjugates described in the present invention to the surface of inorganic particles occurs through the previously described procedure. The result is a new cancer treatment system, the first of its kind, that has a composition significantly different from the vaccines described in US patents 5,894,018 and US 8,778,879. Vaccination with this system induces an immune response that includes the production of anti-EGF antibodies capable of capturing circulating EGF and preventing it from binding to its receptor on the tumor surface.
Система, полученная путем ковалентного связывания антигена с неорганическими частицами, является стабильной и может храниться в течение длительного периода времени, как это требуется для парентеральных препаратов. Этот признак делает ее превосходящей иммунотерапевтические системы или системы доставки лекарств, разработанные ранее на основе неорганических частиц с помощью способов инкапсуляции или адсорбции активных веществ.The system obtained by covalently binding the antigen to inorganic particles is stable and can be stored for long periods of time, as required for parenteral drugs. This feature makes it superior to immunotherapeutic systems or drug delivery systems previously developed based on inorganic particles using encapsulation or adsorption methods of active substances.
Формирование конъюгатов на неорганических частицах посредством ковалентных связей и электростатических взаимодействий для вызова ответа против EGF.Formation of conjugates on inorganic particles through covalent bonds and electrostatic interactions to elicit an anti-EGF response.
Настоящее изобретение содержит другие способы формирования систем для вызова иммунного ответа против EGF посредством ковалентных связей и электростатических взаимодействий между его компонентами, которые подробно описаны ниже:The present invention contains other methods of forming systems for inducing an immune response against EGF through covalent bonds and electrostatic interactions between its components, which are described in detail below:
Связывание rhEGF или его пептидов и белка-носителя или его пептидов с неорганическими наночастицами.Binding of rhEGF or its peptides and carrier protein or its peptides to inorganic nanoparticles.
Частицы, полученные по ранее описанным методикам, предварительно активированные с помощью карбодиимида, предпочтительно 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимидом (EDC), смешивают со стерильным раствором фосфатно-солевого буфера (PBS), рН 7±0, содержащего rhEGF и rP64k при молярном соотношении rhEGF/rP64k от 3 до 9, предпочтительно от 4 до 8. Кроме того, применяемые массовые соотношения HAp/rP64k и HAp/rhEGF составляют от 1 до 6, предпочтительно от 2 до 5 мг/мг. Затем суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение 1-4 часов, более предпочтительно, в течение 2-3 часов.Particles obtained by previously described methods, pre-activated with carbodiimide, preferably 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC), are mixed with a sterile solution of phosphate-buffered saline (PBS), pH 7 ± 0, containing rhEGF and rP64k at a molar ratio of rhEGF/rP64k from 3 to 9, preferably from 4 to 8. In addition, the weight ratios of HAp/rP64k and HAp/rhEGF used are from 1 to 6, preferably from 2 to 5 mg/mg. The suspension is then stirred at room temperature for 1-4 hours, more preferably for 2-3 hours.
В дополнительных вариантах реализации рекомбинантный белок rP64k замещен белком-носителем, таким как столбнячный анатоксин, гемоцианин лимфы фисуреллы (KLH) или другим. Настоящее изобретение также включает в себя замену белка rP64k одним или несколькими иммуногенными пептидами природного или синтетического происхождения.In further embodiments, the recombinant rP64k protein is replaced with a carrier protein such as tetanus toxoid, lymph fisurella hemocyanin (KLH), or others. The present invention also includes replacing the rP64k protein with one or more immunogenic peptides of natural or synthetic origin.
В дополнительных вариантах реализации rhEGF замещен одним или несколькими его пептидами.In additional embodiments, rhEGF is replaced by one or more peptides thereof.
Используя описанный выше способ, получают систему, в которой белки rhEGF и rP64k связаны с наночастицами химически и посредством электростатических взаимодействий, но не связаны друг с другом. Неорганическая частица представляет собой структурный элемент для связывания, который обеспечивает иммуногенность системы. Кроме того, он снижает до 40% количество rhEGF, необходимого для образования указанной системы, и снижает риски, связанные с токсичностью глутарового альдегида, применяемого по изобретениям US 5,894,018 и US 8,778,879.Using the method described above, a system is obtained in which the rhEGF and rP64k proteins are associated with the nanoparticles chemically and through electrostatic interactions, but are not associated with each other. The inorganic particle provides the binding structure that makes the system immunogenic. In addition, it reduces by up to 40% the amount of rhEGF required for the formation of this system and reduces the risks associated with the toxicity of glutaraldehyde used according to the inventions US 5,894,018 and US 8,778,879.
Конъюгация rhEGF или его пептидов и белка-носителя или его пептидов с помощью двух этапов реакции.Conjugation of rhEGF or its peptides and a carrier protein or its peptides using two reaction steps.
- 4 045818- 4 045818
Наночастицы, полученные с помощью ранее описанных методик, предварительно активированные карбодиимидом, предпочтительно EDC, смешивают с раствором PBS, рН 7±0,3, содержащим rP64k в массовом отношении 1-6, предпочтительно между 2-5. Суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение 1-4 часов, предпочтительно в течение 2-3 часов. Затем удаляют избыток белка rP64k, активируют ее предпочтительно с помощью EDC, затем удаляют избыток EDC и смешивают с rhEGF при молярном соотношении rhEGF и rP64k 1-10, предпочтительно 2-6.Nanoparticles obtained using previously described methods, pre-activated with carbodiimide, preferably EDC, are mixed with a PBS solution, pH 7±0.3, containing rP64k in a mass ratio of 1-6, preferably between 2-5. The suspension is stirred at room temperature for 1-4 hours, preferably for 2-3 hours. Excess rP64k protein is then removed, preferably activated with EDC, then excess EDC is removed and mixed with rhEGF at a molar ratio of rhEGF to rP64k of 1-10, preferably 2-6.
В дополнительных вариантах реализации рекомбинантный белок rP64k заменяют столбнячным анатоксином, гемоцианином лимфы фисуреллы (KLH) или другим белком-носителем. Настоящее изобретение также включает в себя замену белка rP64k одним или несколькими иммуногенными пептидами естественного или синтетического происхождения.In additional embodiments, the recombinant rP64k protein is replaced with tetanus toxoid, KLH, or other carrier protein. The present invention also includes replacement of the rP64k protein with one or more immunogenic peptides of natural or synthetic origin.
В дополнительных вариантах реализации rhEGF замещен одним или несколькими его пептидами.In additional embodiments, rhEGF is replaced by one or more peptides thereof.
Эта процедура создает систему, в которой белок-носитель химически или с помощью электростатических взаимодействий связан с биоразлагаемыми неорганическими наночастицами, а также с rhEGF. Этим способом получают конъюгат rhEGF-rP64k, образованный двумя слоями белков высокой чистоты, без свободного rhEGF или rP64k. Этот конъюгат превосходит конъюгат rhEGF-rP64k по изобретениям US 5,894,018 и US 8,778,879, в которых более 40% полученного rhEGF находится в свободной форме, которая не имеет никакого биологического значения. Кроме того, это снижает риски, связанные с токсичностью глутарового альдегида, применяемого в двух упомянутых выше изобретениях.This procedure creates a system in which the carrier protein is chemically or electrostatically coupled to biodegradable inorganic nanoparticles as well as rhEGF. This method produces a rhEGF-rP64k conjugate formed by two layers of high purity proteins, without free rhEGF or rP64k. This conjugate is superior to the rhEGF-rP64k conjugate of US 5,894,018 and US 8,778,879, in which more than 40% of the rhEGF produced is in free form, which has no biological significance. In addition, it reduces the risks associated with the toxicity of glutaraldehyde used in the two inventions mentioned above.
Множественная конъюгация rhEGF или его пептидов и белка-носителя или его пептидов на поверхности неорганической частицы.Multiple conjugation of rhEGF or its peptides and a carrier protein or its peptides on the surface of an inorganic particle.
Частицы, полученные с помощью ранее описанных методик, предварительно активированные с помощью карбодиимида, предпочтительно EDC, смешивают с раствором PBS, рН 7±0,3, содержащим rhEGF и rP64k. Оба белка реагируют с активированными частицами и с избытком EDC, который остается в растворенном состоянии после активации, связывая белки друг с другом и с поверхностью частицы. Для получения этого результата следует применять молярное соотношение rhEGF/rP64k, равное 3-9, предпочтительно 4-8. Кроме того, массовые соотношения частица/rP64k и частица/rhEGF должны составлять от 1 до 6, предпочтительно от 2 до 5. Их перемешивают при комнатной температуре в течение 1-4 часов, более предпочтительно в течение 2-3 часов.Particles obtained using previously described methods, pre-activated with carbodiimide, preferably EDC, are mixed with a PBS solution, pH 7±0.3, containing rhEGF and rP64k. Both proteins react with the activated particles and with the excess EDC that remains dissolved after activation, binding the proteins to each other and to the particle surface. To obtain this result, a rhEGF/rP64k molar ratio of 3-9, preferably 4-8, should be used. In addition, the mass ratios of particle/rP64k and particle/rhEGF should be from 1 to 6, preferably from 2 to 5. They are stirred at room temperature for 1-4 hours, more preferably for 2-3 hours.
В дополнительных вариантах реализации рекомбинантный белок rP64k заменяют столбнячным анатоксином, гемоцианином лимфы фисуреллы (KLH) или другим белком-носителем. Настоящее изобретение также включает в себя замену белка rP64k одним или несколькими иммуногенными пептидами естественного или синтетического происхождения.In additional embodiments, the recombinant rP64k protein is replaced with tetanus toxoid, KLH, or other carrier protein. The present invention also includes replacing the rP64k protein with one or more immunogenic peptides of natural or synthetic origin.
В дополнительных вариантах реализации rhEGF замещен одним или несколькими его пептидами.In additional embodiments, rhEGF is replaced by one or more peptides thereof.
Формируется сложная матрица конъюгатов rhEGF-rP64k, и эти белки связываются с лигандом, который покрывает неорганическую наночастицу. Аналогично предыдущим реализациям, эта система вызывает иммунный ответ антител против EGF. Также она снижает до 40% количество rhEGF, необходимого для образования указанной системы, и снижает риски, связанные с токсичностью глутарового альдегида, применяемого по изобретениям US 5,894,018 и US 8,778,879.A complex matrix of rhEGF-rP64k conjugates is formed, and these proteins bind to a ligand that coats the inorganic nanoparticle. Similar to previous implementations, this system induces an anti-EGF antibody response. It also reduces by up to 40% the amount of rhEGF required for the formation of this system, and reduces the risks associated with the toxicity of glutaraldehyde used according to the inventions US 5,894,018 and US 8,778,879.
Формирование систем для вызова ответа против EGF путем инкапсуляции или адсорбции на неорганической частице.Formation of systems to elicit an anti-EGF response by encapsulation or adsorption onto an inorganic particle.
Хотя химически связанные системы, полученные с помощью описанных ранее процедур, являются более стабильными и подходят для составов вакцин, инкапсуляция и адсорбция антигена также являются полезными процедурами. По этой причине настоящее изобретение обеспечивает способы синтеза иммуногенов, которые имеют неорганическое ядро и конъюгат rhEGF-rP64k или rhEGF и rP64k или их пептиды внутри частицы или адсорбированы на ее поверхности.Although chemically coupled systems prepared using previously described procedures are more stable and suitable for vaccine formulations, antigen encapsulation and adsorption are also useful procedures. For this reason, the present invention provides methods for synthesizing immunogens that have an inorganic core and a rhEGF-rP64k conjugate or rhEGF and rP64k or peptides thereof within the particle or adsorbed on its surface.
Инкапсуляция конъюгата rhEGF и белка-носителя или его пептидов в неорганическую частицу:Encapsulation of rhEGF conjugate and carrier protein or its peptides into an inorganic particle:
Источники, несущие ионы кальция и фосфата, смешивают в водном растворе, обеспечивая поддержание соответствующего молярного соотношения катиона к аниону в пределах 1,4-3,5. Конъюгат rhEGFP64k добавляют при массовом соотношении rhEGF-rP64k/неорганическая наночастица в пределах 1-10, более предпочтительно 2-7. Затем добавляют гидроксид аммония или гидроксид натрия до тех пор, пока не будет получен показатель рН 8-10, и реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре с перемешиванием в течение 1-4 ч. После завершения реакции смесь предпочтительно промывают очищенной водой и отделяют фильтрованием. Эта процедура формирует наночастицы и микрочастицы, которые содержат конъюгаты rhEGF-rP64k внутри и на поверхности, связанные взаимодействиями между положительно заряженными группами частицы и карбоксилатными группами конъюгата и между отрицательно заряженными группами частицы и аминогруппами конъюгата.Sources carrying calcium and phosphate ions are mixed in an aqueous solution, ensuring that the appropriate cation to anion molar ratio is maintained within the range of 1.4-3.5. The rhEGFP64k conjugate is added at a weight ratio of rhEGF-rP64k/inorganic nanoparticle in the range of 1-10, more preferably 2-7. Ammonium hydroxide or sodium hydroxide is then added until a pH of 8-10 is obtained, and the reaction mixture is kept at room temperature with stirring for 1-4 hours. After completion of the reaction, the mixture is preferably washed with purified water and separated by filtration. This procedure forms nanoparticles and microparticles that contain rhEGF-rP64k conjugates internally and on the surface, linked by interactions between the positively charged groups of the particle and the carboxylate groups of the conjugate and between the negatively charged groups of the particle and the amine groups of the conjugate.
В дополнительном варианте реализации рекомбинантный белок rP64k заменяют столбнячным анатоксином, гемоцианином лимфы фисуреллы (KLH) или другим белком-носителем. Настоящее изобретение также включает в себя замену белка rP64k одним или несколькими иммуногенными пептидами естественного или синтетического происхождения.In a further embodiment, the recombinant rP64k protein is replaced with tetanus toxoid, KLH, or other carrier protein. The present invention also includes replacing the rP64k protein with one or more immunogenic peptides of natural or synthetic origin.
В дополнительных вариантах реализации rhEGF замещен одним или несколькими его пептидами.In additional embodiments, rhEGF is replaced by one or more peptides thereof.
- 5 045818- 5 045818
Инкапсуляция rhEGF или его пептидов и белка-носителя или его пептидов в неорганической частице:Encapsulation of rhEGF or its peptides and a carrier protein or its peptides in an inorganic particle:
Эта процедура аналогична описанной ранее, и отличается только тем, что к раствору вместо конъюгата rhEGF-rP64k добавляют rhEGF и rP64k в массовом соотношении 1-10, еще более предпочтительно 27. Во время этого процесса поддерживают молярное соотношение rhEGF и rP64k 1-10, более предпочтительно соотношение rhEGF и rP64k 2-5. После завершения реакции смесь предпочтительно промывают очищенной водой и отделяют фильтрованием. Эта процедура формирует наночастицы и микрочастицы, которые содержат конъюгаты rhEGF-rP64k внутри и на поверхности, связанные электростатическими взаимодействиями между положительно заряженными группами частицы и карбоксилатными группами конъюгата и между отрицательно заряженными группами частицы и аминогруппами конъюгата.This procedure is similar to that described earlier, and differs only in that instead of the rhEGF-rP64k conjugate, rhEGF and rP64k are added to the solution in a mass ratio of 1-10, even more preferably 27. During this process, the molar ratio of rhEGF and rP64k is maintained at 1-10, more preferably a ratio of rhEGF to rP64k of 2-5. After completion of the reaction, the mixture is preferably washed with purified water and separated by filtration. This procedure forms nanoparticles and microparticles that contain rhEGF-rP64k conjugates internally and on the surface, linked by electrostatic interactions between the positively charged groups of the particle and the carboxylate groups of the conjugate and between the negatively charged groups of the particle and the amine groups of the conjugate.
В другом дополнительном варианте реализации рекомбинантный белок rP64k заменяют столбнячным анатоксином, гемоцианином лимфы фисуреллы (KLH) или другим белком-носителем. Настоящее изобретение также включает в себя замену белка rP64k одним или несколькими иммуногенными пептидами естественного или синтетического происхождения.In another further embodiment, the recombinant rP64k protein is replaced with tetanus toxoid, KLH, or other carrier protein. The present invention also includes replacing the rP64k protein with one or more immunogenic peptides of natural or synthetic origin.
В дополнительных вариантах реализации rhEGF замещен одним или несколькими его пептидами.In additional embodiments, rhEGF is replaced by one or more peptides thereof.
Адсорбция конъюгата rhEGF и белка-носителя или его пептидов на неорганической частице:Adsorption of rhEGF conjugate and carrier protein or its peptides on an inorganic particle:
Описанные ранее частицы, покрытые цитратом натрия, смешивают с раствором PBS, имеющим рН 7±0,3, который содержит конъюгат rhEGF-rP64k в массовом соотношении 1-10, еще более предпочтительно 2-7. Их перемешивают при комнатной температуре в течение 1-4 часов, более предпочтительно 23 часов. Система, полученная в результате этой процедуры, состоит преимущественно из наночастиц с размерами менее 200 нм. Конъюгат rhEGF-rP64k связан электростатическими взаимодействиями между положительно заряженными группами на поверхности наночастицы и карбоксилатными группами конъюгата, а также между карбоксилатными группами цитрата и аминогруппами конъюгата. В других вариантах реализации рекомбинантный белок rP64k заменяют столбнячным анатоксином, гемоцианином лимфы фисуреллы (KLH) или другим белком-носителем. Настоящее изобретение также включает в себя замену белка rP64k одним или несколькими иммуногенными пептидами естественного или синтетического происхождения.The previously described sodium citrate-coated particles are mixed with a PBS solution having a pH of 7±0.3, which contains the rhEGF-rP64k conjugate in a weight ratio of 1-10, even more preferably 2-7. They are stirred at room temperature for 1-4 hours, more preferably 23 hours. The system obtained as a result of this procedure consists predominantly of nanoparticles with sizes less than 200 nm. The rhEGF-rP64k conjugate is bound by electrostatic interactions between positively charged groups on the surface of the nanoparticle and the carboxylate groups of the conjugate, as well as between the carboxylate groups of the citrate and the amino groups of the conjugate. In other embodiments, the recombinant rP64k protein is replaced with tetanus toxoid, KLH, or other carrier protein. The present invention also includes replacing the rP64k protein with one or more immunogenic peptides of natural or synthetic origin.
В дополнительных вариантах реализации rhEGF замещен одним или несколькими его пептидами.In additional embodiments, rhEGF is replaced by one or more peptides thereof.
Адсорбция rhEGF или его пептидов и белка-носителя или его пептидов на неорганической частице:Adsorption of rhEGF or its peptides and a carrier protein or its peptides onto an inorganic particle:
Эта процедура аналогична описанной ранее в предыдущем варианте реализации, и отличается только тем, что к раствору вместо конъюгата rhEGF-rP64k добавляют rhEGF и rP64k в массовом соотношении 1-10, еще более предпочтительно 2-7. Для этого процесса требуется поддерживать молярное соотношение rhEGF и rP64k 1-10, более предпочтительно молярное соотношение rhEGF и rP64k 2-5. Эта процедура формирует наночастицы и микрочастицы, которые содержат на поверхности молекулы rhEGF и rP64k, связанные взаимодействиями между положительно заряженными группами частицы и карбоксилатными группами белков и между отрицательно заряженными группами частицы и аминогруппами белков. В дополнительных вариантах реализации рекомбинантный белок rP64k заменяют столбнячным анатоксином, гемоцианином лимфы фисуреллы (KLH) или другим белком-носителем. Настоящее изобретение также включает в себя замену белка rP64k одним или несколькими иммуногенными пептидами естественного или синтетического происхождения.This procedure is similar to that previously described in the previous embodiment, and differs only in that instead of the rhEGF-rP64k conjugate, rhEGF and rP64k are added to the solution in a mass ratio of 1-10, even more preferably 2-7. This process requires maintaining a molar ratio of rhEGF to rP64k of 1-10, more preferably a molar ratio of rhEGF to rP64k of 2-5. This procedure forms nanoparticles and microparticles that contain rhEGF and rP64k molecules on the surface, linked by interactions between the positively charged groups of the particle and the carboxylate groups of the proteins and between the negatively charged groups of the particle and the amino groups of the proteins. In additional embodiments, the recombinant rP64k protein is replaced with tetanus toxoid, KLH, or other carrier protein. The present invention also includes replacing the rP64k protein with one or more immunogenic peptides of natural or synthetic origin.
В дополнительных вариантах реализации rhEGF замещен одним или несколькими его пептидами.In additional embodiments, rhEGF is replaced by one or more peptides thereof.
Ранее описанные новые системы частиц формируются на биоразлагаемом неорганическом ядре. Это ядро связано с аутологичными антигенами, предпочтительно химическими конъюгатами рекомбинантных белков rhEGF и rP64k, или индивидуально связано с упомянутыми белками или их пептидами. Эти системы поддерживаются ковалентными связями амидного типа, инкапсуляцией или адсорбцией на поверхности наночастицы. Они составляют основу составов вакцин для лечения рака, вводимых парентеральным способом после диспергирования с ЭДТА и регулирования рН до уровня 7±0,3.The previously described new particle systems are formed on a biodegradable inorganic core. This core is associated with autologous antigens, preferably chemical conjugates of the recombinant proteins rhEGF and rP64k, or individually associated with these proteins or their peptides. These systems are supported by amide-type covalent bonds, encapsulation, or adsorption on the nanoparticle surface. They form the basis of vaccine formulations for the treatment of cancer, administered parenterally after dispersing with EDTA and adjusting the pH to 7 ± 0.3.
Фармацевтические композиции и способы лечения.Pharmaceutical compositions and methods of treatment.
Фармацевтические составы, полученные в соответствии с настоящим изобретением, применимы для лечения рака эпителиально-тканевого происхождения. Например: рак клеток плоского эпителия, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарцинома легкого, плоскоклеточная карцинома легкого, печеночноклеточный рак, рак желудка, рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак прямой кишки, колоректальный рак, рак головки, шейки и матки, глиобластома, рак слюнной железы, рак почки, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, карцинома анального канала и карцинома полового члена.The pharmaceutical compositions prepared in accordance with the present invention are useful for the treatment of cancer of epithelial tissue origin. For example: squamous cell carcinoma, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, lung adenocarcinoma, squamous cell lung carcinoma, hepatocellular carcinoma, stomach cancer, gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, urinary cancer bladder, breast cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, head, cervical and uterine cancer, glioblastoma, salivary gland cancer, kidney cancer, prostate cancer, vulvar cancer, thyroid cancer, anal carcinoma and genital carcinoma member.
Они могут быть применены отдельно или в сочетании с адъювантами, которые усиливают или дополняют формируемый ими ответ против антител EGF. В частности, задачей настоящего изобретения является комбинация систем биоразлагаемых неорганических наночастиц, связанных с белками rhEGFrP64k, с маслянистыми адъювантами, такими как неполные адъюванты Фрейнда, адъюванты на основе сквалена, синтетические, минеральные, растительные адъюванты или адъюванты животного происхождения. Также сюда входят адъюванты с белковыми частицами и липосомами или другие адъюванты илиThey can be used alone or in combination with adjuvants that enhance or complement the response they generate against EGF antibodies. In particular, it is an object of the present invention to combine biodegradable inorganic nanoparticle systems coupled to rhEGFrP64k proteins with oleaginous adjuvants such as Freund's incomplete adjuvants, squalene-based adjuvants, synthetic, mineral, vegetable or animal adjuvants. Also included are adjuvants with protein particles and liposomes or other adjuvants or
- 6 045818 системы, способные вызывать или усиливать гуморальные или клеточно-опосредованные иммунные ответы, или их комбинацию. Описанные выше системы эффективно поддерживают предшествующую стимуляцию иммунного ответа против антител EGF, вызываемого составом, который описан в патенте US 8,778,879, или другой системой, дающей аналогичные результаты.- 6 045818 systems capable of inducing or enhancing humoral or cell-mediated immune responses, or a combination thereof. The systems described above effectively support the prior stimulation of the immune response against EGF antibodies caused by the composition as described in US Pat. No. 8,778,879 or another system providing similar results.
Комбинации, описанные ранее, благоприятствуют длительному лечению рака эпителиальнотканевого происхождения, поскольку лечение с их помощью позволяет избежать накопления инородных веществ в организме в местах инъекций и, следовательно, не приводит к токсичности, связанной с введением. В системах противо-EGF, содержащихся в настоящем изобретении, применяются фармацевтически приемлемые наполнители. Эти наполнители включают в себя, но не ограничиваются ими: воду для инъекций, хлорид натрия, соли фосфора и калия, хлорид кальция, цитрат натрия, гидроксид натрия и ЭДТА. Они могут быть введены пациентам с раком эпителиального происхождения в виде парентеральных препаратов с концентрацией белка от 0,5 до 5 мг/мл и в диапазоне доз 20-70 мкл/кг или 20-70 мкг общего белка на килограмм или до 5 мг общего белка, более предпочтительно 30-60 мкг/кг. Доза неорганического компонента, ограниченная для введения по настоящему изобретению, должна составлять от 2 до 4,5 мг/кг, предпочтительно от 3 до 4 мг/кг, при условии, что она находится в пределах утвержденного диапазона доз для введения человеку внутримышечно или подкожно.The combinations described previously favor long-term treatment of cancers of epithelial tissue origin because treatment with them avoids the accumulation of foreign substances in the body at injection sites and therefore does not lead to injection-related toxicity. The anti-EGF systems contained in the present invention utilize pharmaceutically acceptable excipients. These excipients include, but are not limited to: water for injection, sodium chloride, phosphorus and potassium salts, calcium chloride, sodium citrate, sodium hydroxide and EDTA. They can be administered to patients with cancer of epithelial origin as parenteral preparations with protein concentrations ranging from 0.5 to 5 mg/ml and in a dose range of 20-70 μl/kg or 20-70 μg total protein per kilogram or up to 5 mg total protein , more preferably 30-60 µg/kg. The dose of the inorganic component limited for administration according to the present invention should be 2 to 4.5 mg/kg, preferably 3 to 4 mg/kg, provided that it is within the approved dosage range for intramuscular or subcutaneous administration to humans.
Настоящее изобретение дополнительно разъяснено с помощью следующих примеров и графических материалов. Однако эти примеры не следует рассматривать, как ограничивающие объем настоящего изобретения.The present invention is further explained with the help of the following examples and drawings. However, these examples should not be construed as limiting the scope of the present invention.
Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials
Фиг. 1. Дифракционная рентгенограмма А) Частицы аморфного НАр, полученные по настоящему изобретению. В) Стандартная дифрактограмма НАр - JCPDS (Объединённый комитет по химическому анализу с использованием порошковых дифракционных методов при Национальном Бюро стандартов США): PDF Ref. 09-0432.Fig. 1. X-ray diffraction pattern A) Amorphous HAr particles obtained according to the present invention. B) HAP standard diffraction pattern - JCPDS (Joint Committee on Chemical Analysis by Powder Diffraction of the US National Bureau of Standards): PDF Ref. 09-0432.
Фиг. 2. Спектр инфракрасной спектроскопии на основе преобразования Фурье (FTIR) А) Частицы аморфного НАр, полученные по настоящему изобретению. В) Цитрат натрия.Fig. 2. Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) Spectrum A) Amorphous HAr particles produced by the present invention. B) Sodium citrate.
Фиг. 3. Размер частиц аморфного НАр, полученных по настоящему изобретению, определяют с помощью электронной просвечивающей микроскопии. А) Изображение частиц, записанное при увеличении в 25 000 раз. В) Изображение частиц, записанное при увеличении в 500 000 раз. С) Распределение размеров частиц.Fig. 3. The particle size of the amorphous HAr obtained according to the present invention is determined by transmission electron microscopy. A) Image of particles recorded at 25,000x magnification. B) Image of particles recorded at 500,000x magnification. C) Particle size distribution.
Фиг. 4.Термограмма наночастиц аморфного НАр, полученных по настоящему изобретению.Fig. 4. Thermogram of amorphous HAr nanoparticles obtained according to the present invention.
Фиг. 5. Распределение размеров ковалентно связанной системы HAp-rhEGF-rP64k, определенное способом динамического рассеяния света (DLS).Fig. 5. Size distribution of the covalently bound HAp-rhEGF-rP64k system determined by dynamic light scattering (DLS).
Фиг. 6. Характеристика системы HAp-rhEGF-rP64k с помощью: А) электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE): 1 - Диаграмма молекулярной массы 2 - Положительный контроль конъюгата rhEGF-rP64k, подробно описанного в изобретении US 8,778,879, 3 - система HAp-rhEGF-rP64k. В) Профиль вестерн-блоттинга: 1 - Положительный контроль конъюгата rhEGF-rP64k, 2 - система НАр-rhEGFrP64k.Fig. 6. Characterization of the HAp-rhEGF-rP64k system using: A) polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE): 1 - Molecular weight diagram 2 - Positive control of the rhEGF-rP64k conjugate, described in detail in the invention US 8,778,879, 3 - HAp- system rhEGF-rP64k. B) Western blot profile: 1 - Positive control of the rhEGF-rP64k conjugate, 2 - HAP-rhEGFrP64k system.
Фиг. 7. Ответ на антитело к EGF мышей C57BL/6, иммунизированных с помощью ковалентно связанной системы HAp-rhEGF-rP64k и контрольной группы (Montanide-rhEGF-rP64k).Fig. 7. Anti-EGF response of C57BL/6 mice immunized with the covalently linked HAp-rhEGF-rP64k system and a control group (Montanide-rhEGF-rP64k).
Фиг. 8. Соотношение антител подклассов (IgG2b + IgG2c)/IgG1, содержащихся в сыворотке мышей C57BL/6, иммунизированных системами HAp-rhEGF-rP64k и контрольной группы (Montanide-rhEGFrP64k).Fig. 8. The ratio of antibodies of subclasses (IgG2b + IgG2c)/IgG1 contained in the serum of C57BL/6 mice immunized with the HAp-rhEGF-rP64k and control group systems (Montanide-rhEGFrP64k).
Фиг. 9. Фотография эффектов от систем HAp-rhEGF-rP64k и Montanide-rhEGF-rP64k в месте инъекции у мышей BALB/c. А) Эффект системы Montanide-rhEGF-rP64k. В) Эффект системы HAp-rhEGFrP64k.Fig. 9. Photograph of the effects of the HAp-rhEGF-rP64k and Montanide-rhEGF-rP64k systems at the injection site in BALB/c mice. A) Effect of the Montanide-rhEGF-rP64k system. B) Effect of the HAp-rhEGFrP64k system.
Фиг. 10. Ответ на антитело к EGF мышей C57BL/6, иммунизированных с помощью системы HAprhEGF-rP64k в комбинации с протеолипосомой малого размера (VSSP) и с rhEGF-rP64k, инкапсулированной в липосомах.Fig. 10. Anti-EGF response of C57BL/6 mice immunized with the HAprhEGF-rP64k system in combination with small size proteoliposome (VSSP) and liposome-encapsulated rhEGF-rP64k.
Фиг. 11. Соотношение антител подклассов (IgG2b + IgG2c)/IgG1, содержащихся в сыворотке мышей C57BL/6, иммунизированных с помощью системы HAp-rhEGF-rP64k в комбинации с протеолипосомой малого размера (VSSP) и с rhEGF-rP64k, инкапсулированной в липосомах.Fig. 11. Ratio of antibodies of subclasses (IgG2b + IgG2c)/IgG1 contained in the serum of C57BL/6 mice immunized with the HAp-rhEGF-rP64k system in combination with a small size proteoliposome (VSSP) and with rhEGF-rP64k encapsulated in liposomes.
Фиг. 12. Поддержание ответа на антитело к EGF системы HAp-rhEGF-rP64k с предшествующей стимуляцией иммунного ответа, вызванного одной или двумя дозами системы Montanide-rhEGF-rP64k.Fig. 12. Maintenance of the anti-EGF antibody response of the HAp-rhEGF-rP64k system, preceded by stimulation of the immune response caused by one or two doses of the Montanide-rhEGF-rP64k system.
Фиг. 13. Распределение размеров системы НАр-PI, сформированной на частице, определенное с помощью способа динамического рассеяния света (DLS).Fig. 13. Size distribution of the HAr-PI system formed on a particle, determined using the dynamic light scattering (DLS) method.
Фиг. 14. Характеристика системы НАр-PI с помощью: А) электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE): 1 - Диаграмма молекулярной массы 2 - Положительный контроль rP64k, 3 - Положительный контроль rhEGF, 4 - система НАр-PI и В) Профиль вестерн-блоттинга: 1 - Положительный контроль rP64k, 2 - система НАр-PI.Fig. 14. Characterization of the HAr-PI system using: A) polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE): 1 - Molecular weight diagram 2 - Positive control rP64k, 3 - Positive control rhEGF, 4 - HAr-PI system and B) Western profile -blotting: 1 - Positive control rP64k, 2 - HAP-PI system.
Фиг. 15. Распределение размеров системы НАр-СМ, определенное с помощью способа динамического рассеяния света (DLS).Fig. 15. Size distribution of the HAr-SM system determined using the dynamic light scattering (DLS) method.
- 7 045818- 7 045818
Фиг. 16. Характеристика системы НАр-СМ с помощью: А) электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE): 1 - Диаграмма молекулярной массы, 2 - Положительный контроль конъюгата rhEGF-rP64k, подробно описанного в изобретении US 8,778,879, 3 - система НАр-СМ и В) Профиль вестерн-блоттинга 1 - Положительный контроль конъюгата rhEGF-rP64k, 2 - система НАр-СМ.Fig. 16. Characterization of the HAr-SM system using: A) polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE): 1 - Molecular weight diagram, 2 - Positive control of the rhEGF-rP64k conjugate, described in detail in the invention US 8,778,879, 3 - HAr-SM system and B) Western blot profile 1 - Positive control rhEGF-rP64k conjugate, 2 - HAP-SM system.
Фиг. 17. Ответ на антитело к EGF мышей C57BL/6, иммунизированных с помощью систем HAprhEGF-rP64k, HAp-PI и НАр-СМ.Fig. 17. Response to anti-EGF antibody in C57BL/6 mice immunized with the HAprhEGF-rP64k, HAp-PI and HAP-CM systems.
Фиг. 18. Соотношение антител подклассов (IgG2b + IgG2c)/IgG1, содержащихся в сыворотке мышей C57BL/6, иммунизированных системами HAp-rhEGF-rP64k, HAp-PI и НАр-СМ, и контроля Montanide-rhEGF-rP64k.Fig. 18. The ratio of antibodies of the (IgG2b + IgG2c)/IgG1 subclasses contained in the serum of C57BL/6 mice immunized with the HAp-rhEGF-rP64k, HAp-PI and HAP-SM systems, and the Montanide-rhEGF-rP64k control.
Фиг. 19. Фотографические изображения гистологических срезов мышечной ткани, извлеченных из места вакцинации, и прилегающей мышечной ткани мышей C57BL/6, при 10-кратном увеличении.Fig. 19. Photographic images of histological sections of muscle tissue removed from the vaccination site and adjacent muscle tissue of C57BL/6 mice, at 10x magnification.
Изображения фибробластной восстановительной ткани. Мыши были обработаны с помощью: А-С: Montanide-rhEGF-rP64k, D: НАр-rhEGF-rP64k, E: НАр-СМ, F: HAp-PI.Images of fibroblastic repair tissue. Mice were treated with: A-C: Montanide-rhEGF-rP64k, D: HAp-rhEGF-rP64k, E: HAp-SM, F: HAp-PI.
Фиг. 20. Количество поражений, наблюдаемых в тканях в местах инъекции у мышей C57BL/6, иммунизированных системами HAp-rhEGF-rP64k, HAp-PI и НАр-СМ, и контроля Montanide-rhEGF-rP64k.Fig. 20. Number of lesions observed in tissues at injection sites in C57BL/6 mice immunized with the HAp-rhEGF-rP64k, HAp-PI and HAp-CM systems, and the Montanide-rhEGF-rP64k control.
ПримерыExamples
Пример №1. Синтез, характеристика и активация наночастиц НАр.Example No. 1. Synthesis, characterization and activation of HAr nanoparticles.
Следуя модифицированному варианту процедуры, описанной М. Королевой и соавт., Журнал неорганической химии (2016), 61(6): 674-680), были получены наночастицы аморфного НАр, покрытые цитратом натрия. Раствор готовили в контролируемых условиях окружающей среды из CaCl2 0,05 моль/л и цитрата натрия при молярном соотношении цитрат натрия/кальций в 4:1 (раствор А). Затем добавляли стерильный раствор В, образованный из NaH2PO4 0,06 моль/л с расходом в 1 мл/мин, поддерживая молярное соотношение Са/Р на уровне 1,67. Затем рН реакции доводили до показателя 10 путем растворения гидроксида натрия и в течение трех часов продолжали перемешивание при комнатной температуре. После завершения реакции ее продукт промывали очищенной водой и отделяли фильтрованием с применением полиэфирсульфоновой мембраны Amicon на 10 кДа. Полученное твердое вещество сушили в вакууме при комнатной температуре. Далее в течение 30 минут выполняли стерилизацию с помощью чистого пара с температурой 120°С и сушили в вакууме. С помощью рентгеновского дифракционного анализа было продемонстрировано, что образуются аморфные наночастицы НАр со степенью кристалличности 9,3% и размером кристаллитов 16,5 нм (фиг. 1). В этом анализе использовали медное излучение (Cu Ka) в трубке, работающей при 45 кВ и 40 мА. Диапазон составлял от 10° до 90° с шагом 0,013° и интервалом в девять секунд.Following a modified version of the procedure described by M. Koroleva et al., Journal of Inorganic Chemistry (2016), 61(6): 674-680), amorphous HAr nanoparticles coated with sodium citrate were obtained. The solution was prepared under controlled environmental conditions from CaCl 2 0.05 mol/l and sodium citrate at a sodium citrate/calcium molar ratio of 4:1 (solution A). Sterile solution B, formed from NaH 2 PO 4 0.06 mol/L, was then added at a flow rate of 1 ml/min, maintaining the Ca/P molar ratio at 1.67. The reaction pH was then adjusted to 10 by dissolving sodium hydroxide and stirring was continued at room temperature for three hours. After completion of the reaction, the product was washed with purified water and separated by filtration using an Amicon 10 kDa polyethersulfone membrane. The resulting solid was dried in vacuo at room temperature. Next, sterilization was carried out for 30 minutes using pure steam at a temperature of 120°C and dried in a vacuum. Using X-ray diffraction analysis, it was demonstrated that amorphous HAr nanoparticles were formed with a degree of crystallinity of 9.3% and a crystallite size of 16.5 nm (Figure 1). This analysis used copper radiation (Cu Ka) in a tube operating at 45 kV and 40 mA. The range was from 10° to 90° in 0.013° increments and nine second intervals.
Спектр инфракрасной спектроскопии на основе преобразования Фурье (FTIR) наночастиц (А) и цитрата натрия (В), применяемого в качестве контроля, показаны на фиг. 2. Полосы, наблюдаемые в спектре наночастиц при 1090, 1030, 962, 604, 561 и 472 см-1, подтверждают наличие фосфатных групп, соответствующих НАр. Также при 3400 см-1 наблюдалась широкая полоса, присущая остаточной воде и группам ОН-1. Полосы карбоксилатных групп цитрата также наблюдались в обоих спектрах при 1610 и 1413 см-1, что подтверждает присутствие этого лиганда на поверхности. Наночастицы, определенные с помощью электронной просвечивающей микроскопии, имели сферическую морфологию (фиг. 3А и 3В) при среднем размере 62±13 нм (фиг. 3С).Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) spectra of nanoparticles (A) and sodium citrate (B) used as a control are shown in FIG. 2. The bands observed in the spectrum of nanoparticles at 1090, 1030, 962, 604, 561 and 472 cm -1 confirm the presence of phosphate groups corresponding to HAr. Also at 3400 cm -1 a wide band was observed, inherent to residual water and OH -1 groups. Bands of citrate carboxylate groups were also observed in both spectra at 1610 and 1413 cm -1 , confirming the presence of this ligand on the surface. The nanoparticles, determined by transmission electron microscopy, had a spherical morphology (Fig. 3A and 3B) with an average size of 62 ± 13 nm (Fig. 3C).
С помощью термографии была обнаружена потеря 6,2% массы при температурах выше 200°С (фиг. 4), связанная с наличием цитрата натрия на поверхности наночастиц. Диапазон проанализированных температур составил от 25°С до 1000°С при скорости нагрева 20 К/мин, с применением аргона при расходе 60 мл/мин. Наночастицы аморфного НАр обрабатывали стерильным раствором EDC, поддерживая массовое соотношение EDC/HAp 2:1 в течение одного часа в контролируемых условиях окружающей среды. Затем суспензию обрабатывали на центрифуге при 6708 g и удаляли избыток EDC.Thermography revealed a 6.2% weight loss at temperatures above 200°C (Figure 4), due to the presence of sodium citrate on the surface of the nanoparticles. The temperature range analyzed was from 25°C to 1000°C at a heating rate of 20 K/min, using argon at a flow rate of 60 ml/min. Amorphous HAp nanoparticles were treated with a sterile EDC solution, maintaining an EDC/HAp weight ratio of 2:1 for one hour under controlled environmental conditions. The suspension was then centrifuged at 6708 g and excess EDC was removed.
Пример 2. Получение системы HAp-rhEGF-rP64k за счет ковалентной связи между наночастицами аморфного НАр и конъюгатом rhEGF-rP64k.Example 2. Preparation of the HAp-rhEGF-rP64k system due to a covalent bond between amorphous HAP nanoparticles and the rhEGF-rP64k conjugate.
Наночастицы аморфного НАр, полученные и активированные по методике, описанной в примере 1, смешивали в контролируемых условиях окружающей среды со стерильным раствором PBS при уровне рН 7±0,3, содержащим химический конъюгат rhEGF-rP64k, полученный по методике, описанной в патенте US 8,778,879, при массовом соотношении rhEGF-rP64k/HAp, равном 1:2,5. Образовавшуюся суспензию выдерживали при встряхивании с частотой 140 циклов в минуту в течение 2 ч при комнатной температуре.Nanoparticles of amorphous HAr, obtained and activated according to the method described in example 1, were mixed under controlled environmental conditions with a sterile PBS solution at a pH level of 7±0.3 containing the chemical conjugate rhEGF-rP64k, obtained according to the method described in US patent 8,778,879 , with a rhEGF-rP64k/HAp weight ratio of 1:2.5. The resulting suspension was kept shaking at a frequency of 140 cycles per minute for 2 hours at room temperature.
Полученную систему HAp-rhEGF-rP64k диспергировали с помощью ЭДТА, условия среды доводили до рН 7±0,3 и концентрации белка 1±0,2 мг/мл стерильными растворами PBS и гидроксида натрия.The resulting HAp-rhEGF-rP64k system was dispersed with EDTA, and the media were adjusted to a pH of 7 ± 0.3 and a protein concentration of 1 ± 0.2 mg/ml with sterile solutions of PBS and sodium hydroxide.
Анализ с помощью способа динамического рассеяния света (DLS) показал присутствие наночастиц со средним гидродинамическим диаметром 97,5 нм и показателем полидисперсности 0,36. Полученная система была полидисперсной с диаметром частиц от 9 до 366 нм, измеренным по интенсивности (фиг. 5). Система наночастиц, полученная с помощью описанной ранее процедуры, была охарактеризована с поDynamic light scattering (DLS) analysis revealed the presence of nanoparticles with an average hydrodynamic diameter of 97.5 nm and a polydispersity index of 0.36. The resulting system was polydisperse with particle diameters ranging from 9 to 366 nm, measured by intensity (Fig. 5). The nanoparticle system obtained using the previously described procedure was characterized from...
- 8 045818 мощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) и вестерн-блоттинга (фиг. 6). Электрофорез показал, что конъюгат rhEGF-rP64k имел структуру полос, аналогичную структуре в положительном контроле (то есть преобладают полосы с молекулярной массой, равной или превышающей 66 кДа), что указывает на присутствие в системе конъюгата. В анализе способом вестерн-блоттинга наблюдали полосу, сходную с полосой в контроле свободного конъюгата rhEGFrP64k, что демонстрирует присутствие rhEGF в конъюгатах с молекулярной массой более 200 кДа. С помощью этого анализа было подтверждено, что конъюгат rhEGF-rP64k, связанный с наночастицами, способен сохранять свою структурную и функциональную целостность, что подтверждается тем фактом, что он все еще распознается антителами к EGF.- 8 045818 by the power of sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blotting (Fig. 6). Electrophoresis showed that the rhEGF-rP64k conjugate had a band pattern similar to that of the positive control (i.e., bands with a molecular weight equal to or greater than 66 kDa predominated), indicating the presence of a conjugate in the system. In Western blot analysis, a band similar to that in the free rhEGFrP64k conjugate control was observed, demonstrating the presence of rhEGF in conjugates with a molecular weight greater than 200 kDa. Using this assay, it was confirmed that the rhEGF-rP64k conjugate bound to nanoparticles was able to maintain its structural and functional integrity, as evidenced by the fact that it was still recognized by anti-EGF antibodies.
Пример 3. Система HAp-rhEGF-rP64k вызывает гуморальный ответ против EGF без видимых побочных эффектов в местах инъекций.Example 3: The HAp-rhEGF-rP64k system induces an anti-EGF humoral response without apparent side effects at injection sites.
Мышей C57BL/6 (n=5) иммунизировали с помощью 63 мкг белков, содержащихся в системе, описанной в примере 2. В качестве положительного контроля анализа применяли партию продукта, полученного по методике, описанной в патенте US 8,778,879 (Montanide-rhEGF-rP64k). Применяли протокол иммунизации, состоящий из четырех доз (дни: 0, 14, 28 и 42).C57BL/6 mice (n=5) were immunized with 63 μg of proteins contained in the system described in example 2. A batch of the product obtained according to the method described in US patent 8,778,879 (Montanide-rhEGF-rP64k) was used as a positive control assay. . An immunization protocol consisting of four doses was used (days 0, 14, 28 and 42).
За два дня до начала протокола иммунизации и на 35-й и 56-й дни в обеих группах мышей способом ферментно-связанного иммуносорбентного анализа (ELISA) определяли титры суммарных IgGантител против EGF. Соотношение (IgG2b + IgG2c)/IgG1, специфичное для EGF, в иммунной сыворотке также определяли на 56-й день. Статистический анализ проводили с помощью теста сравнения средних значений Крускала-Уоллиса, и разные литеры показали статистически значимые различия (р<0,05).Two days before the start of the immunization protocol and on days 35 and 56, the titers of total IgG antibodies against EGF were determined in both groups of mice using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The EGF-specific (IgG2b + IgG2c)/IgG1 ratio in immune serum was also determined on day 56. Statistical analysis was performed using the Kruskal-Wallis mean comparison test, and different letters showed statistically significant differences (p<0.05).
Система HAp-rhEGF-rP64k вырабатывает антитела к EGF, которые обнаруживали в иммунной сыворотке на 56-й день при разведении 1/10000 (фиг. 7). Этот результат демонстрирует, что связывание конъюгата rhEGF-rP64k с частицей не влияет на его целостность, и что НАр усиливает гуморальный ответ против EGF, несмотря на то, что он значительно ниже, чем у контрольной группы. С другой стороны, соотношение (IgG2b + IgG2c)/IgG1 показало отсутствие статистически значимых различий в ответах, полученных с помощью системы HAp-rhEGF-rP64k и контроля (Montanide-rhEGF-rP64k) (фиг. 8). В обеих системах преобладали ответы гуморального типа (Th2), что делает их очень подходящими для снижения EGF в рамках лечения рака эпителиально-тканевого происхождения.The HAp-rhEGF-rP64k system produces antibodies to EGF, which were detected in immune serum on day 56 at a dilution of 1/10,000 (Fig. 7). This result demonstrates that binding of the rhEGF-rP64k conjugate to the particle does not affect its integrity and that HAP enhances the humoral response against EGF, although it is significantly lower than that of the control group. On the other hand, the ratio (IgG2b + IgG2c)/IgG1 showed no statistically significant differences in the responses obtained with the HAp-rhEGF-rP64k system and the control (Montanide-rhEGF-rP64k) (Fig. 8). In both systems, humoral type (Th2) responses predominated, making them very suitable for reducing EGF as part of the treatment of cancers of epithelial tissue origin.
Определяли эффект системы HAp-rhEGF-rP64k в месте инъекции. С этой целью пяти мышам BALB/c вводили противо-EGF систему, описанную в примере 2 (HaP-rhEGF-rP64k), а пяти мышам вводили Montanide-rhEGF-rP64k в качестве контроля. Протокол вакцинации был аналогичен описанному ранее. После завершения эксперимента были сделаны фотографические изображения мест инъекций у мышей из двух обработанных групп. Как видно на фиг. 9А, у мышей из контрольной группы наблюдали скопления минерального масла в местах инъекций, вызванные введением монтанида (Montanide). В противоположность, у мышей, обработанных системой HAp-rhEGF-rP64k, полученной в соответствии с процедурой, которая описана в примере 2 (фиг. 9В), в местах инъекций не было обнаружено никаких повреждений. Эти результаты показывают, что новая система, разработанная согласно настоящему изобретению, значительно уменьшает повреждения в месте инъекции и, таким образом, демонстрирует большой потенциал при длительном введении, в частности, для лечения рака, требующего периодических инъекций в течение нескольких лет.The effect of the HAp-rhEGF-rP64k system at the injection site was determined. To this end, five BALB/c mice were administered the anti-EGF system described in Example 2 (HaP-rhEGF-rP64k), and five mice were administered Montanide-rhEGF-rP64k as a control. The vaccination protocol was similar to that described previously. After completion of the experiment, photographic images were taken of the injection sites in mice from the two treated groups. As can be seen in FIG. 9A, mice from the control group showed accumulations of mineral oil at the injection sites caused by the administration of Montanide. In contrast, mice treated with the HAp-rhEGF-rP64k system prepared according to the procedure described in Example 2 (FIG. 9B) showed no lesions at the injection sites. These results indicate that the new system developed according to the present invention significantly reduces damage at the injection site and thus shows great potential for long-term administration, in particular for the treatment of cancers requiring periodic injections over several years.
Пример 4. Комбинация системы HAp-rhEGF-rP64k с адъювантами в форме частиц вызывает гуморальный ответ антитела IgG против EGF и индуцирует ответа типа Th1.Example 4 Combination of the HAp-rhEGF-rP64k system with particulate adjuvants induces an anti-EGF IgG antibody response and induces a Th1 type response.
Использовали мышей C57BL/6, разделенных на три группы по пять животных в каждой. Животных иммунизировали следующим образом:C57BL/6 mice were used, divided into three groups of five animals each. Animals were immunized as follows:
Группа 1: 63 мкг белков композиции вакцины, описанной в патенте US 8,778,879 (Montanide-rhEGFrhP64k) (Положительный контроль).Group 1: 63 μg of proteins of the vaccine composition described in US patent 8,778,879 (Montanide-rhEGFrhP64k) (Positive control).
Группа 2: 63 мкг белков системы HAp-rhEGF-rP64k с 100 мкг белков адъюванта в форме наночастиц протеолипосомы малого размера (VSSP).Group 2: 63 μg of HAp-rhEGF-rP64k proteins with 100 μg of adjuvant proteins in the form of small size proteoliposome particles (VSSP).
Группа 3: 31,5 мкг белков системы HAp-rhEGF-rP64k и 31,5 мкг конъюгата rhEGF-rP64k, инкапсулированных в липосомные везикулы (DRV), полученные по методике дегидратации-регидратации (Kirby and Gregoriadis, Biotechnology, (1984) 2: 979-984).Group 3: 31.5 μg of HAp-rhEGF-rP64k proteins and 31.5 μg of rhEGF-rP64k conjugate encapsulated in liposome vesicles (DRVs) prepared by the dehydration-rehydration procedure (Kirby and Gregoriadis, Biotechnology, (1984) 2: 979-984).
Иммунизацию проводили в 0, 14-й, 28-й и 42-й дни. Забор крови осуществляли за два дня до начала протокола иммунизации и на 35-й и 56-й дни, а общие титры антител IgG против EGF в полученной сыворотке определяли с помощью ферментно-связанного иммуносорбентного анализа (ELISA). Соотношение (IgG2b + IgG2c)/IgG1 в иммунной сыворотке, специфичное для EGF, также определяли на 56-й день. Статистический анализ проводили с помощью теста сравнения средних значений Крускала-Уоллиса, и разные литеры показали статистически значимые различия (р<0,05).Immunization was carried out on days 0, 14, 28 and 42. Blood was collected two days before the start of the immunization protocol and on days 35 and 56, and total anti-EGF IgG antibody titers in the resulting serum were determined using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The EGF-specific immune serum (IgG2b + IgG2c)/IgG1 ratio was also determined on day 56. Statistical analysis was performed using the Kruskal-Wallis mean comparison test, and different letters showed statistically significant differences (p<0.05).
Выработка антител против EGF была обнаружена в трех исследованных группах. Комбинации системы HAp-rhEGF-rP64k с протеолипосомой малого размера (VSSP) и липосомами DRV вырабатывали антитела, которые выявляли в иммунной сыворотке при разведении 1/10000 и оставались одинаковыми во время двух экстракций (фиг. 10). Было продемонстрировано наличие статистически значимых отличий данной комбинации по отношению к контролю.The development of antibodies against EGF was detected in three groups studied. Combinations of the HAp-rhEGF-rP64k system with small size proteoliposome (VSSP) and DRV liposomes produced antibodies that were detected in immune serum at a dilution of 1/10,000 and remained the same during the two extractions (Fig. 10). It was demonstrated that there were statistically significant differences between this combination and the control.
- 9 045818- 9 045818
На 56-й день анализ соотношения (IgG2b + IgG2c)/IgG1, специфичного для EGF, показал, что обе комбинации адъювантов давали сходные ответы, и обе они статистически были лучше по сравнению с контролем (фиг. 11). Эти результаты продемонстрировали, что комбинация составов на основе НАр с другими адъювантами в форме частиц усиливает специфический иммунный ответ на EGF, который индуцирует превосходный ответ типа Thl, который является наиболее благоприятным для целевого лечения рака.At day 56, analysis of the EGF-specific (IgG2b + IgG2c)/IgG1 ratio showed that both adjuvant combinations produced similar responses and both were statistically superior to control (Figure 11). These results demonstrated that the combination of HAP-based formulations with other particulate adjuvants enhances the specific immune response to EGF, which induces a superior Thl-type response that is most beneficial for targeted cancer treatment.
Пример 5. Система HAp-rhEGF-rP64k поддерживает ответ на антитела IgG против EGF, вызванный ранее с помощью Montanide-rhEGF-rP64k.Example 5 The HAp-rhEGF-rP64k system maintains the anti-EGF IgG antibody response previously induced by Montanide-rhEGF-rP64k.
Использовали три группы мышей C57BL/6 (n=5), которых иммунизировали в дни: 0, 14-й, 28-й, 42й и 70-й по следующим схемам иммунизации:Three groups of C57BL/6 mice (n=5) were used, which were immunized on days 0, 14, 28, 42 and 70 according to the following immunization schedules:
Группа 1. Контрольных мышей иммунизировали с помощью 63 мкг белков, содержащихся в системе, описанной в патенте US 8,778,879 (Montanide-rhEGF-rhP64k).Group 1: Control mice were immunized with 63 μg of proteins contained in the system described in US patent 8,778,879 (Montanide-rhEGF-rhP64k).
Группа 2. Во время остальных проведенных иммунизации мышей иммунизировали в 0-й день с помощью 63 мкг белков, содержащихся в системе Montanide-rhEGF-rhP64k, и таким же количеством белков, содержащихся в системе HAp-rhEGF-rP64k. Группа 3. Во время остальных проведенных иммунизации мышей иммунизировали в дни 0-й и 14-й с помощью 63 мкг белков, содержащихся в системе Montanide-rhEGF-rhP64k, и таким же количеством белков, содержащихся в системе HAp-rhEGF-rP64k.Group 2. For the remaining immunizations, mice were immunized on day 0 with 63 μg of proteins contained in the Montanide-rhEGF-rhP64k system and the same amount of proteins contained in the HAp-rhEGF-rP64k system. Group 3. During the remaining immunizations, mice were immunized on days 0 and 14 with 63 μg of proteins contained in the Montanide-rhEGF-rhP64k system and the same amount of proteins contained in the HAp-rhEGF-rP64k system.
За два дня до первой иммунизации извлекали предиммунную сыворотку, а на 35-й, 56-й и 84-й дни проводили извлечение иммунных сывороток и количественно определяли титры антител IgG против EGF с помощью ферментно-связанного иммуносорбентного анализа (ELISA).Two days before the first immunization, preimmune serum was collected, and on days 35, 56, and 84, immune sera were extracted and anti-EGF IgG antibody titers were quantified using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
Титры антител против EGF обнаруживались в трех исследуемых группах без статистически значимых различий между ними, при разведении 1/50000 на 35-й день и при разведении 1/100000 на 56-й и 84-й дни (фиг. 12). В течение исследуемого периода времени прививка системой HAp-rhEGF-rP64k была способна поддерживать ответ антител IgG против EGF, вызванный системами Montanide-rhEGF-rP64k. Этот результат подтверждает возможность замены монтанида (Montanide) на НАр в качестве адъюванта для конъюгата rhEGF-rP64k на этапе поддержки иммунного ответа против EGF, и его пригодность для длительного лечения рака эпителиального происхождения.Anti-EGF antibody titers were detected in the three study groups with no statistically significant differences between them, at a dilution of 1/50,000 on day 35 and at a dilution of 1/100,000 on days 56 and 84 (Fig. 12). During the time period studied, inoculation with the HAp-rhEGF-rP64k system was able to maintain the anti-EGF IgG antibody response induced by the Montanide-rhEGF-rP64k systems. This result supports the possibility of replacing Montanide with HAP as an adjuvant for the rhEGF-rP64k conjugate in the support phase of the anti-EGF immune response, and its suitability for the long-term treatment of cancers of epithelial origin.
Пример 6. Формирование системы НАр-PI путем ковалентного связывания белков rhEGF и rP64k на поверхности наночастиц аморфного НАр.Example 6. Formation of the HAr-PI system by covalent binding of rhEGF and rP64k proteins on the surface of amorphous HAr nanoparticles.
Полученные по методике, описанной в примере 1, наночастицы НАр, предварительно покрытые цитратом натрия и активированные EDC, смешивали в контролируемых условиях окружающей среды со стерильным раствором PBS, рН 7±0,3, содержащим rhEGF и rP64k в молярном соотношении rhEGF на rP64k, равном 6, при массовом соотношении белков/НАр, равном 1:2,5. Образовавшуюся суспензию выдерживали при встряхивании с частотой 140 циклов в минуту в течение 2 ч при комнатной температуре. С помощью этой процедуры получали систему rhEGF-HAp-rP64k, отличающуюся тем, что белки связаны с наночастицей НАр, но не друг с другом. Указанную систему диспергировали с помощью ЭДТА, доводя рН до 7±0,3 и концентрацию белка до 1±0,2 мг/мл.Obtained according to the procedure described in example 1, HAP nanoparticles, pre-coated with sodium citrate and activated with EDC, were mixed under controlled environmental conditions with a sterile PBS solution, pH 7±0.3, containing rhEGF and rP64k in a molar ratio of rhEGF to rP64k equal to 6, with a protein/HAr mass ratio of 1:2.5. The resulting suspension was kept shaking at a frequency of 140 cycles per minute for 2 hours at room temperature. Using this procedure, a rhEGF-HAp-rP64k system was obtained, characterized in that the proteins are associated with the HAP nanoparticle, but not with each other. This system was dispersed using EDTA, bringing the pH to 7±0.3 and the protein concentration to 1±0.2 mg/ml.
На фиг. 13 показан профиль размера частиц, измеренный способом динамического рассеяния света (DLS). Средний диаметр составил 111,2 нм при показателе полидисперсности 0,347. С точки зрения размера, полидисперсности и профилей DLS, полученная система была аналогична системе, полученной в примере 2. Вышеупомянутые аспекты показывают, что когда rhEGF и rP64k связаны с наночастицами НАр, но не друг с другом, они обладали дисперсией, аналогичной дисперсии конъюгата rhEGF-rP64k.In fig. 13 shows a particle size profile measured by dynamic light scattering (DLS). The average diameter was 111.2 nm with a polydispersity index of 0.347. In terms of size, polydispersity, and DLS profiles, the resulting system was similar to the system obtained in Example 2. The above aspects indicate that when rhEGF and rP64k are bound to HAP nanoparticles, but not to each other, they have a dispersion similar to that of the rhEGF- conjugate rP64k.
Как видно на фиг. 14А, где представлены результаты анализа с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE), на дорожке, соответствующей системе НАр-PI, появляется основная полоса высотой 66 кДа, характерная для белка rP64k, и другая полоса, высота которой сходна с контролем rhEGF (6 кДа). Эти результаты показали, что оба рекомбинантных белка были связаны с наночастицами НАр и что при восстановлении они сохраняли свою характерную молекулярную массу, поскольку они не были связаны друг с другом.As can be seen in FIG. 14A, which shows the results of sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis, a major band of 66 kDa, characteristic of the rP64k protein, and another band of similar height appears in the HAP-PI lane. with rhEGF control (6 kDa). These results showed that both recombinant proteins were associated with HAr nanoparticles and that upon reconstitution they retained their characteristic molecular weights since they were not associated with each other.
Как видно на фиг. 14В, на дорожках 1 и 2 имеется полоса высотой примерно 66 кДа, что подтверждает присутствие белка rP64k в системе НАр-PI, а также то, что белок сохраняет свою целостность, когда он связан с наночастицами НАр.As can be seen in FIG. 14B, in lanes 1 and 2 there is a band at approximately 66 kDa, confirming the presence of the rP64k protein in the HAP-PI system and that the protein retains its integrity when bound to HAP nanoparticles.
Пример 7. Формирование системы НАр-СМ на поверхности наночастиц аморфного НАр с помощью множественной конъюгации белков rhEGF и rP64k.Example 7. Formation of the HAr-SM system on the surface of amorphous HAr nanoparticles using multiple conjugation of rhEGF and rP64k proteins.
Наночастицы аморфного НАр, полученные в примере 1, обрабатывали в контролируемых условиях окружающей среды в течение 1 ч стерильным раствором EDC, поддерживая массовое соотношение EDC и НАр на уровне 2,7. Далее добавляли стерильный раствор PBS с показателем рН 7±0,3, содержащий rhEGF и rP64k в молярном соотношении rhEGF на rP64k, равном 6, при массовом соотношении белков/НАр, равном 1:2,5. Образовавшуюся суспензию выдерживали при встряхивании с частотой 140 циклов в минуту в течение 2 ч при комнатной температуре.The amorphous HAr nanoparticles prepared in Example 1 were treated under controlled environmental conditions for 1 hour with a sterile EDC solution, maintaining the EDC to HAr weight ratio at 2.7. Next, a sterile PBS solution with a pH of 7 ± 0.3 was added, containing rhEGF and rP64k in a molar ratio of rhEGF to rP64k of 6, with a protein/HAr weight ratio of 1:2.5. The resulting suspension was kept shaking at a frequency of 140 cycles per minute for 2 hours at room temperature.
В результате этой процедуры была получена система, образованная наночастицами НАр, которые покрыты обоими рекомбинантными белками, связанными как друг с другом, так и с наночастицами. ЭтуAs a result of this procedure, a system formed by HAP nanoparticles was obtained, which were coated with both recombinant proteins bound both to each other and to the nanoparticles. This
- 10 045818 систему диспергировали с помощью ЭДТА и рН доводили до 7±0,3. Затем его разбавляли раствором PBS до достижения концентрации белка 1±0,2 мг/мл.- 10 045818 the system was dispersed with EDTA and the pH was adjusted to 7±0.3. It was then diluted with PBS solution to achieve a protein concentration of 1 ± 0.2 mg/ml.
С помощью ранее описанной множественной конъюгации была получена сложная система HAprhEGF-rP64k со средним размером 90,2 нм, измеренным способом динамического рассеяния света (DLS), и индексом полидисперсности 0,337 (фиг. 15). Определение характеристик, выполненное с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) и вестернблоттинга, показали конъюгацию указанных белков. Был получен продукт, аналогичный положительному контролю rhEGF-rP64k, который распознает антитела против EGF (фиг. 16).Using the previously described multiple conjugation, a complex HAprhEGF-rP64k system was obtained with an average dynamic light scattering (DLS) size of 90.2 nm and a polydispersity index of 0.337 (Figure 15). Characterization by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blotting showed conjugation of these proteins. A product similar to the positive control rhEGF-rP64k, which recognizes anti-EGF antibodies, was obtained (Fig. 16).
Пример 8. Новые системы, сформированные на наночастицах НАр, вызывают гуморальный ответ антител IgG против EGF и вызывают меньшее количество эпидермальных поражений в месте инъекции.Example 8. New systems formed on HAP nanoparticles induce a humoral IgG antibody response against EGF and cause fewer epidermal lesions at the injection site.
Три группы по пять мышей типа C57BL/6 в каждой были иммунизированы с помощью 63 мкг белков, содержащихся в следующих системах:Three groups of five C57BL/6 mice each were immunized with 63 μg of proteins contained in the following systems:
Группа 1: Система HAp-rhEGF-rhP64k, полученная по методике, описанной в примере 2.Group 1: System HAp-rhEGF-rhP64k, obtained according to the method described in example 2.
Группа 2: Система НАр-PI, полученная по методике, описанной в примере 6. Группа 3: Система НАр-СМ, полученная по методике, описанной в примере 7.Group 2: HAr-PI system, obtained according to the method described in example 6. Group 3: HAr-SM system, obtained according to the method described in example 7.
Иммунизации проводили в 0, 14-й, 28-й и 42-й дни. Забор крови проводили за двое суток до начала протокола и на 35-й и 56-й день. Общие титры антитела IgG против EGF в полученных сыворотках определяли с помощью ферментно-связанного иммуносорбентного анализа (ELISA). Соотношение (IgG2b + IgG2c)/IgG1 в иммунной сыворотке, специфичное для EGF, также определяли на 56-й день. Статистический анализ проводили с помощью теста сравнения средних значений Крускала-Уоллиса, и разные литеры показали статистически значимые различия (р<0,05). Системы HAp-rhEGF-rP64k и НАр-СМ вырабатывали антитела к EGF, которые выявляли в иммунной сыворотке при разведении до 1/10000 и в системе НАр-PI при разведении до 1/8000 на 35-й и 56 (фиг. 17). Были подтверждены результаты, полученные с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) и вестерн-блоттинга (примеры 6 и 7), и было продемонстрировано, что все системы, построенные на наночастицах НАр, являлись иммуногенными, хотя в системе НАр-PI элемент rhEGF не имеет ковалентной связи с rP64k. Эта система является доказательством того, что возможно получение систем, которые вызывают иммунный ответ против EGF без необходимости химического связывания rhEGF с белком-носителем.Immunizations were carried out on days 0, 14, 28 and 42. Blood sampling was carried out two days before the start of the protocol and on the 35th and 56th days. Total anti-EGF IgG antibody titers in the resulting sera were determined using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The EGF-specific immune serum (IgG2b + IgG2c)/IgG1 ratio was also determined on day 56. Statistical analysis was performed using the Kruskal-Wallis mean comparison test, and different letters showed statistically significant differences (p<0.05). The HAp-rhEGF-rP64k and HAp-CM systems produced antibodies to EGF, which were detected in the immune serum at a dilution of up to 1/10,000 and in the HAp-PI system at a dilution of 1/8,000 at 35 and 56 (Fig. 17). The results obtained using sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blotting (Examples 6 and 7) were confirmed and it was demonstrated that all systems based on HAP nanoparticles were immunogenic, although in the system The HAP-PI element of rhEGF is not covalently linked to rP64k. This system provides evidence that it is possible to produce systems that induce an immune response against EGF without the need for chemical coupling of rhEGF to a carrier protein.
Анализ соотношения (IgG2b IgG2c)/IgG1 показал отсутствие статистически значимых различий в вызываемом ими ответе. Преобладали ответы гуморального типа (Th2), что делает их подходящими для снижения EGF в рамках лечения рака эпителиально-тканевого происхождения. (фиг. 18).Analysis of the ratio (IgG2b IgG2c)/IgG1 showed no statistically significant differences in the response they caused. Humoral type (Th2) responses predominated, making them suitable for EGF reduction as part of the treatment of cancers of epithelial tissue origin. (Fig. 18).
Через 120 дней после начала эксперимента мышей C57BL/6 умерщвляли и извлекали из мест инъекций образцы тканей для патологоанатомического анализа, предварительно окрашивая их гематоксилин-эозином. Срезы тканей фиксировали в нейтральном забуференном формалине и обрабатывали методом заливки парафином. Как можно видеть на фиг. 19А-С, которая показывает результаты для контрольной группы (Montanide-rhEGF-rP64k), в месте прививки наблюдается потеря нормальной структуры мышечной ткани. Зона А характеризуется воспалительным инфильтратом и расширенными кровеносными сосудами с нарушением целостности прилежащей мышечной ткани. На фиг. 19В и С можно наблюдать продольные (В) и поперечные (С) волокна прилегающей мышечной ткани в месте прививки с инвазией реакции фибробластной восстановительной ткани. Однако на фиг. 19D-F, которые представляют результаты лечения мышей новой системой, являющейся задачей настоящего изобретения, можно наблюдать нормальную структуру в месте прививки и прилегающей мышечной ткани. D: HAp-rhEGF-rP64k. E: HAp-CM. F: НАр-PI. У каждой мыши из трех предыдущих групп оценивали наличие или отсутствие следующих поражений:120 days after the start of the experiment, C57BL/6 mice were sacrificed and tissue samples were removed from the injection sites for post-mortem analysis, pre-stained with hematoxylin-eosin. Tissue sections were fixed in neutral buffered formalin and processed by paraffin embedding. As can be seen in FIG. 19A-C, which shows the results for the control group (Montanide-rhEGF-rP64k), loss of normal muscle tissue structure is observed at the grafting site. Zone A is characterized by an inflammatory infiltrate and dilated blood vessels with disruption of the integrity of the adjacent muscle tissue. In fig. 19B and C, longitudinal (B) and transverse (C) fibers of the adjacent muscle tissue can be observed at the grafting site with an invasive fibroblastic repair tissue reaction. However, in FIG. 19D-F, which represent the results of treating mice with the new system of the present invention, normal structure can be observed at the grafting site and adjacent muscle tissue. D: HAp-rhEGF-rP64k. E: HAp-CM. F: HAr-PI. Each mouse from the three previous groups was assessed for the presence or absence of the following lesions:
Неоднородность эпидермиса и лимфоцитарная инфильтрация дермы.Heterogeneity of the epidermis and lymphocytic infiltration of the dermis.
Воспалительный инфильтрат.Inflammatory infiltrate.
Инвазия мышечной ткани.Invasion of muscle tissue.
Вакуолярная дегенерация эпителиальных клеток.Vacuolar degeneration of epithelial cells.
Расширенные кровеносные сосуды.Dilated blood vessels.
Каждый раз, когда обнаруживали поражение, добавляли точку, значения, соответствующие каждой мыши в группах, складывали, а результат отображали в виде графика.Each time a lesion was detected, a dot was added, the values corresponding to each mouse in the groups were added up, and the result was graphed.
Исследование показало, что в группах, обработанных системами, разработанными в соответствии с настоящим изобретением, наблюдали очень незначительное количество поражений, в отличие от наблюдаемых в контрольной группе, привитой системой Montanide-rhEGF-rP64k (фиг. 20). Этот результат подтверждает визуальные наблюдения в примере 3.The study showed that in the groups treated with systems developed in accordance with the present invention, very few lesions were observed, in contrast to those observed in the control group grafted with the Montanide-rhEGF-rP64k system (Fig. 20). This result confirms the visual observations in Example 3.
Эти результаты подтверждают низкую токсичность противо-EGF систем на основе наночастиц НАр и незначительные побочные эффекты в местах инъекций, вызванные минеральным маслом, которое содержится в системе Montanide-rhEGF-rP64k.These results confirm the low toxicity of anti-EGF systems based on HAP nanoparticles and the minor injection site side effects caused by the mineral oil contained in the Montanide-rhEGF-rP64k system.
Claims (13)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CUCU-2020-0032 | 2020-06-09 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045818B1 true EA045818B1 (en) | 2023-12-28 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100756677B1 (en) | Calcium phosphate delivery vehicle and adjuvant | |
| Sahdev et al. | Calcium phosphate nanoparticles for transcutaneous vaccine delivery | |
| JP4743928B2 (en) | Formulation | |
| JP2011190278A (en) | New, non-antigenic, mucosal adjuvant formulation for modulating effect of substance, including vaccine antigen, in contact with mucosal body surface | |
| US20090035330A1 (en) | Vaccine Composition Comprising B-Subunit Of E. coli Heat Toxin And An Antigen And An Adjuvant | |
| AU2018359358B2 (en) | Nano-particles that contain synthetic variants of GM3 ganglioside as adjuvants in vaccines | |
| Zhang et al. | Engineered hydroxyapatite nanoadjuvants with controlled shape and aspect ratios reveal their immunomodulatory potentials | |
| EP4162949A2 (en) | Inorganic nanoparticle-based vaccine compositions for cancer treatment | |
| EA045818B1 (en) | VACCINE COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF CANCER BASED ON INORGANIC NANOPARTICLES | |
| US20100196451A1 (en) | Vaccines Containing Non-Live Antigenic Vectors | |
| CN111701018A (en) | Cyclic dinucleotide modified aluminum nanoparticle vaccine adjuvant-delivery system | |
| Gonzalez-Martinez et al. | Hydroxyapatite nanoparticles as a potential long-term treatment of cancer of epithelial origin | |
| JP2009535428A (en) | Method for delivering human chorionic gonadotropin (hCG) vaccine to produce long acting antibodies | |
| Rosales-Mendoza et al. | Silica-based mucosal nanovaccines | |
| US20240131152A1 (en) | Nano-particles that contain synthetic variants of gm3 ganglioside as adjuvants in vaccines | |
| Frère et al. | Peptide Nanostructured Conjugates for Therapeutics: The Example of P140 Peptide for the Treatment of Systemic Lupus Erythematosus | |
| Ern et al. | Peptide Vaccine | |
| CN117860879A (en) | Nanometer vaccine delivery system and preparation method and application thereof | |
| He et al. | Cistanche deserticola polysaccharide-functionalized dendritic fibrous nano-silica as oral vaccine adjuvant delivery enhancing both the mucosal and systemic immunity | |
| CN115715801A (en) | Vaccine and preparation method and application thereof | |
| US20020106376A1 (en) | Therapeutic or prophylactic composition of fibronectin-binding protein 1 (SFBI) as adjuvant |