EA045815B1 - SINGLE-STRAIN RNA EDITING OLIGONUCLEOTIDES - Google Patents

Description

Область техники, к которой относится настоящее изобретениеField of technology to which the present invention relates

Настоящее изобретение относится к области медицины. Более конкретно, оно относится к области редактирования РНК, в соответствии с чем на последовательность РНК нацелено воздействуют одноцепочечным антисмысловым олигонуклеотидом для специфической коррекции мутации в последовательности РНК.The present invention relates to the field of medicine. More specifically, it relates to the field of RNA editing, whereby an RNA sequence is targeted with a single-stranded antisense oligonucleotide to specifically correct a mutation in the RNA sequence.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION

Редактирование РНК представляет собой естественный процесс, посредством которого эукариотические клетки изменяют последовательность своих молекул РНК, часто сайт-специфическим и точным путем, тем самым увеличивая репертуар кодированных геномом РНК на несколько порядков. Редактирующие РНК ферменты были описаны для эукариотических видов во всем животном и растительном царствах, и эти процессы играют важную роль в управлении клеточным гомеостазом у многоклеточных организмов от самых простых форм жизни (таких как Caenorhabditis elegans) до людей. Примерами редактирования РНК являются превращения аденозина (А) в инозин (I) и цитидина (С) в уридин (U), которые происходят посредством ферментов, называемых аденозиндезаминазой и цитидиндезаминазой соответственно. Наиболее широко изученная система редактирования РНК представляет собой фермент аденозиндезаминазу.RNA editing is a natural process by which eukaryotic cells change the sequence of their RNA molecules, often in a site-specific and precise manner, thereby increasing the repertoire of genome-encoded RNAs by several orders of magnitude. RNA editing enzymes have been described in eukaryotic species throughout the animal and plant kingdoms, and these processes play important roles in controlling cellular homeostasis in multicellular organisms from the simplest life forms (such as Caenorhabditis elegans) to humans. Examples of RNA editing are the conversions of adenosine (A) to inosine (I) and cytidine (C) to uridine (U), which occur through enzymes called adenosine deaminase and cytidine deaminase, respectively. The most widely studied RNA editing system is the enzyme adenosine deaminase.

Аденозиндезаминаза представляет собой многодоменный белок, содержащий в зависимости от рассматриваемого фермента от 2 до 3 доменов распознавания двухцепочечных РНК и каталитического домена. Домен распознавания распознает специфическую последовательность двухцепочечной РНК (dsRNA) и/или конформацию, тогда как каталитический домен превращает аденозин (А) в инозин (I) в соседнем, более или менее предопределенном, положении в целевой РНК путем дезаминирования нуклеотидного основания. Инозин считывается как гуанин трансляционным механизмом клетки, а это означает, что если отредактированный аденозин находится в кодирующей области мРНК или пре-мРНК, он может перекодировать белковую последовательность.Adenosine deaminase is a multidomain protein containing, depending on the enzyme in question, from 2 to 3 double-stranded RNA recognition domains and a catalytic domain. The recognition domain recognizes a specific double-stranded RNA (dsRNA) sequence and/or conformation, while the catalytic domain converts adenosine (A) to inosine (I) at an adjacent, more or less predetermined, position in the target RNA by deamination of the nucleotide base. Inosine is read as guanine by the cell's translation machinery, meaning that if the edited adenosine is in the coding region of an mRNA or pre-mRNA, it can recode a protein sequence.

Превращения Ав I могут также встречаться в 5'-некодирующих последовательностях целевой мРНК, создавая новые исходные сайты трансляции выше против хода транскрипции от исходного сайта, что приводит к появлению удлиненных на N-конце белков, или в 3' UTR или других некодирующих частях транскрипта, которые могут влиять на процессинг и/или стабильность РНК. Кроме того, превращение А в I могут происходить в элементах сплайсинга в интронах или экзонах в пре-мРНК, тем самым изменяя паттерн сплайсинга. Вследствие этого экзоны могут быть включены или пропущены. Аденозиндезаминазы представляют собой часть семейства ферментов, называемых действующими на РНК аденозиндезаминазами (ADAR), включая в себя человеческие дезаминазы hADAR1, hADAR2 и hADAR3.Ab I transformations can also occur in the 5' non-coding sequences of the target mRNA, creating new translation start sites upstream of the start site, resulting in N-terminally extended proteins, or in the 3' UTR or other non-coding portions of the transcript. which may affect RNA processing and/or stability. Additionally, A to I conversions can occur at splice elements in introns or exons in pre-mRNA, thereby altering the splicing pattern. As a result, exons may be included or skipped. Adenosine deaminases are part of a family of enzymes called RNA-acting adenosine deaminases (ADARs), including the human deaminases hADAR1, hADAR2 and hADAR3.

Было описано использование олигонуклеотидов для редактирования целевой РНК с применением аденозиндезаминазы (например, Monti el-Gonzalez et al., PNAS, 2013, 110(45):18285-18290; Vogel et al., 2014, Angewandte Chemie Int Ed, 53:267-271; Woolf et al., 1995., PNAS, 92:8298-8302). Montiel-Gonzalez et al. (2013) описал редактирование целевой РНК с использованием генетически сконструированного слитого белка, содержащего домен аденозиндезаминазы белка hADAR2, слитый с белком N бактериофага лямбда, который распознает последовательность шпильки РНК boxB. Природные связывающие dsRNA домены в hADAR2 были удалены, чтобы исключить свойства распознавания субстрата природной ADAR, и заменены доменом распознавания boxB белка N лямбда. Авторы создали антисмысловой олигонуклеотид, содержащий часть гидовой РНК, которая комплементарна целевой последовательности для редактирования, слитую с частью boxB для специфического распознавания последовательности слитым белком N-домен-дезаминаза. Таким образом, было изящно показано, что олигонуклеотид гидовой РНК точно направляет слитый белок аденозиндезаминазы на целевой сайт, что приводит к направленному гидовой РНК специфическому редактированию А на I целевой РНК. Эти гидовые РНК, описанные в публикации Montiel-Gonzalez et al. (2013), длиннее чем 50 нуклеотидов, которые, как правило, слишком велики для терапевтических применений (трудности при изготовлении и входе в клетки). Недостаток этого способа в терапевтическом плане также представляет собой потребность в слитом белке, состоящем из домена распознавания boxB белка N бактериафага лямбда, генетически слитого с доменом аденозиндезаминазы усеченного природного белка ADAR. Это требует, чтобы целевые клетки подвергались трансдуцированию со слитым белком, который представляет собой основное препятствие, или чтобы целевые клетки трансфицировали с конструкцией нуклеиновой кислоты, кодирующей сконструированный слитый белок аденозиндезаминазы для экспрессии. Последнее требование не представляет собой второстепенное препятствие, когда редактирование должно быть достигнуто в многоклеточном организме, например, при лечении заболеваний человека для коррекции генетического нарушения.The use of oligonucleotides to edit target RNA using adenosine deaminase has been described (e.g., Monti el-Gonzalez et al., PNAS, 2013, 110(45):18285-18290; Vogel et al., 2014, Angewandte Chemie Int Ed, 53:267 -271; Woolf et al., 1995, PNAS, 92:8298-8302). Montiel-Gonzalez et al. (2013) described target RNA editing using a genetically engineered fusion protein containing the adenosine deaminase domain of the hADAR2 protein fused to the bacteriophage lambda N protein, which recognizes the RNA boxB hairpin sequence. The natural dsRNA binding domains in hADAR2 were removed to eliminate the substrate recognition properties of the natural ADAR and replaced with the boxB recognition domain of the N lambda protein. We created an antisense oligonucleotide containing a portion of the guide RNA that is complementary to the target sequence for editing, fused to a portion of boxB for sequence-specific recognition by an N-domain deaminase fusion protein. Thus, it has been elegantly shown that a guide RNA oligonucleotide precisely targets an adenosine deaminase fusion protein to the target site, resulting in guide RNA-directed specific editing of A to I of the target RNA. These guide RNAs, described in Montiel-Gonzalez et al. (2013), longer than 50 nucleotides, which are generally too large for therapeutic applications (difficulty in production and entry into cells). Another therapeutic disadvantage of this method is the requirement for a fusion protein consisting of the boxB recognition domain of the bacteriophage lambda N protein genetically fused to the adenosine deaminase domain of the truncated native ADAR protein. This requires that the target cells be transduced with a fusion protein that represents a major obstacle, or that the target cells are transfected with a nucleic acid construct encoding the engineered adenosine deaminase fusion protein for expression. The latter requirement does not pose a minor obstacle when editing must be achieved in a multicellular organism, for example, in the treatment of human diseases to correct a genetic disorder.

Vogel et al. (2014) раскрыл редактирование РНК-кодирования для eCFP и фактора V Лейдена с использованием замещенной бензилгуанином гидовой РНК и генетически сконструированного слитого белка, содержащего домены аденозиндезаминазы ADAR1 или 2 (без доменов связывания dsRNA), генетически слитых с доменом SNAP-tag (сконструированная O₆-алкилгуанин-ДНК-αлкилтрансфераза). Несмотря на то, что генетически сконструированный слитый белок искусственной дезаминазы может быть нацелен на желаемый сайт редактирования в целевых РНК в клетках HeLa в культуре через его домен SNAP-tag, который ковалентно связан с гидовой РНК через 5'-концевую модификацию O₆-бензuлгуанина,Vogel et al. (2014) disclosed RNA coding editing for eCFP and factor V Leiden using a benzylguanine-substituted guide RNA and a genetically engineered fusion protein containing ADAR1 or 2 adenosine deaminase domains (no dsRNA binding domains) genetically fused to a SNAP-tag domain (engineered _O6 -alkylguanine-DNA-αalkyltransferase). Although the genetically engineered artificial deaminase fusion protein can be targeted to the desired editing site in target RNAs in HeLa cells in culture through its SNAP-tag domain, which is covalently linked to the guide RNA through a 5'-terminal _O6 -benzylguanine modification,

- 1 045815 эта система страдает от подобных недостатков из-за генетически сконструированных ADAR, описанных Montiel-Gonzalez et al. (2013), в том, что неясно, как применять систему без первоначального генетического изменения ADAR, а затем трансфицировать или трансдуцировать клетки, несущие целевую РНК, для обеспечения клеток этим генетически сконструированным белком. Очевидно, что эта система не легко адаптируется для использования у людей, например, в терапевтическом плане.- 1 045815 this system suffers from similar deficiencies due to the genetically engineered ADARs described by Montiel-Gonzalez et al. (2013), in that it is unclear how to apply the system without first genetically altering the ADAR and then transfect or transduce cells carrying the target RNA to provide the cells with this genetically engineered protein. Obviously, this system is not easily adapted for use in humans, for example, therapeutically.

Woolf et al. (1995) раскрыл более простой подход с использованием относительно длинных одноцепочечных антисмысловых олигонуклеотидов РНК (длиной 25-52 нуклеотида), причем более длинные олигонуклеотиды (34-мер и 52-мер) могут способствовать редактированию целевой РНК посредством эндогенной ADAR из-за двухцепочечной природы целевой РНК и олигонуклеотида, гибридизующегося с ней. Олигонуклеотиды Woolf et al. (1995), которые были на 100% комплементарны только целевым последовательностям РНК, по всей видимости, функционировали в клеточных экстрактах или в ооцитах земноводных (Xenopus) посредством микроинъекции и страдали от серьезной нехватки специфичности: редактировали почти все аденозины в цепи целевой РНК, которые были комплементарны антисмысловому олигонуклеотиду. Исследовали олигонуклеотид длиной 34 нуклеотида, в котором каждый нуклеотид содержал 2'O-метил-модификацию, и показали, что он неактивен в публикации Woolf et al. (1995). Для обеспечения устойчивости к нуклеазам также испытали 34-мерную РНК, модифицированную 2'Oметил-модифицированными фосфоротиоатными нуклеотидами на 5'- и 3'-концевых 5 нуклеотидах. Было показано, что центральная немодифицированная область этого олигонуклеотида может способствовать редактированию целевой РНК посредством эндогенной ADAR, с использованием терминальных модификаций, обеспечивающих защиту от деградации экзонуклеазой. Woolf et al. (1995) не достигает дезаминирования специфического целевого аденозина в целевой последовательности РНК. Как уже упоминалось, почти все аденозины, противоположные немодифицированному нуклеотиду в антисмысловом олигонуклеотиде, были отредактированы (следовательно почти все аденозины противоположных нуклеотидов в центральной немодифицированной области, если 5'- и 3'-концевые 5 нуклеотидов антисмыслового олигонуклеотида были модифицированы, или почти все аденозины в целевой цепи РНК, если нуклеотиды не были модифицированы). Известно, что ADAR может действовать на любую dsRNA. Через процесс, иногда называемый неизбирательное редактирование, фермент будет редактировать несколько А в dsRNA. Следовательно, существует потребность в способах и средствах, которые обходят такое неизбирательное редактирование и которые нацеленно воздействуют только на конкретные аденозины в целевой последовательности РНК для применимости в терапевтических целях. Vogel et al. (2014) показал, что такое редактирование вне мишени может быть подавлено с использованием 2'-О-метилмодифицированных нуклеотидов в олигонуклеотиде в положениях, противоположных аденозинам, которые не следует редактировать, и использовать немодифицированный нуклеотид, непосредственно противоположный специфически нацеленному аденозину на целевую РНК. Однако эффект специфического редактирования в целевом нуклеотиде не показан в этой статье без использования рекомбинантных ферментов ADAR, которые содержат ковалентные связи с антисмысловым олигонуклеотидом.Woolf et al. (1995) disclosed a simpler approach using relatively long single-stranded antisense RNA oligonucleotides (25-52 nucleotides in length), with longer oligonucleotides (34-mer and 52-mer) able to facilitate editing of the target RNA via endogenous ADAR due to the double-stranded nature of the target RNA and oligonucleotide that hybridizes with it. Oligonucleotides Woolf et al. (1995), which were 100% complementary only to the target RNA sequences, appeared to function in cell extracts or in amphibian (Xenopus) oocytes by microinjection and suffered from a serious lack of specificity: they edited almost all adenosines in the target RNA strand that were complementary to the antisense oligonucleotide. A 34 nucleotide oligonucleotide in which each nucleotide contained a 2'O-methyl modification was studied and shown to be inactive by Woolf et al. (1995). To ensure nuclease resistance, a 34-mer RNA modified with 2'Omethyl-modified phosphorothioate nucleotides at the 5' and 3' terminal 5 nucleotides was also tested. It has been shown that the central unmodified region of this oligonucleotide can facilitate editing of target RNA through endogenous ADAR, using terminal modifications that provide protection from exonuclease degradation. Woolf et al. (1995) does not achieve deamination of the specific target adenosine in the target RNA sequence. As mentioned, almost all of the adenosines opposite the unmodified nucleotide in the antisense oligonucleotide have been edited (hence almost all of the adenosines of the opposite nucleotides in the central unmodified region if the 5' and 3' terminal 5 nucleotides of the antisense oligonucleotide have been modified, or almost all of the adenosines in target RNA strand if the nucleotides have not been modified). It is known that ADAR can act on any dsRNA. Through a process sometimes called indiscriminate editing, the enzyme will edit multiple A's in the dsRNA. Therefore, there is a need for methods and means that bypass such indiscriminate editing and that target only specific adenosines in the target RNA sequence for therapeutic utility. Vogel et al. (2014) showed that such off-target editing can be suppressed by using 2′-O-methyl-modified nucleotides in the oligonucleotide at positions opposite to the adenosines that should not be edited, and using an unmodified nucleotide directly opposite to the specifically targeted adenosine on the target RNA. However, the effect of specific editing at the target nucleotide is not shown in this paper without the use of recombinant ADAR enzymes that contain covalent bonds to the antisense oligonucleotide.

Отмечается, что существует еще один способ редактирования, который использует олигонуклеотиды, известные как система CRISPR/Cas9. Однако этот комплекс редактирования действует на ДНК. Он также страдает от того же недостатка, что и разработанные выше ADAR-системы, поскольку он требует совместной доставки в целевую клетку фермента CRISPR/Cas9 или конструкции экспрессии, кодирующей ее, вместе с гидовым олигонуклеотидом.It is noted that there is another editing method that uses oligonucleotides known as the CRISPR/Cas9 system. However, this editing complex acts on DNA. It also suffers from the same disadvantage as the ADAR systems developed above in that it requires co-delivery of the CRISPR/Cas9 enzyme or expression construct encoding it into the target cell along with a guide oligonucleotide.

Ввиду вышеизложенного остается необходимость в новых способах и соединениях, которые могут использовать эндогенные клеточные пути и доступные в природе ферменты ADAR для специфического редактирования эндогенных нуклеиновых кислот в клетках млекопитающих даже в целых организмах без проблем, связанных со способами предшествующего уровня техники.In view of the above, there remains a need for new methods and compounds that can utilize endogenous cellular pathways and naturally available ADAR enzymes to specifically edit endogenous nucleic acids in mammalian cells, even in whole organisms, without the problems associated with prior art methods.

Краткое раскрытие настоящего изобретенияBrief Disclosure of the Present Invention

Настоящее изобретение устраняет недостатки способов в соответствии с предшествующим уровнем техники путем обеспечения целевого подхода к редактированию РНК с использованием согласно одному варианту осуществления антисмыслового олигонуклеотида (AON), способного образовывать двухцепочечный комплекс с целевой РНК в клетке, для дезаминирования специфического целевого аденозина в указанной целевой РНК ферментом ADAR млекопитающего, присутствующим в указанной клетке; причем указанный AON комплементарен целевой РНК, содержащей целевой аденозин, причем указанный AON необязательно содержит одно или более несоответствий, неоднозначных соответствий и/или выпуклостей с указанной целевой РНК; причем AON содержит один или более нуклеотидов с модификацией сахара, при условии, что нуклеотид, противоположный целевому аденозину, содержит рибозу с 2-ОНгруппой или дезоксирибозу с 2'-Н-группой; причем AON не содержит (некомплементарную) часть (не комплементарную мишени и не комплементарную по отношению к себе), которая способна образовывать внутримолекулярную структуру петля-на-стебле, которая способна связывать фермент ADAR млекопитающих; причем AON не содержит 5'-концевой O6-бензилгуанин или 5'-концевую аминомодификацию; и причем AON не связан ковалентно с доменом SNAP-tag. AON по настоящему изобретению предпочтительно находится в своей основной структуре одноцепочечного редактирующего РНК олигонуклеотида. Согласно предпочтительному варианту осуществления нуклеотид, противоположныйThe present invention overcomes the disadvantages of prior art methods by providing a targeted RNA editing approach using, in one embodiment, an antisense oligonucleotide (AON) capable of forming a double-stranded complex with a target RNA in a cell to deaminate a specific target adenosine in said target RNA by an enzyme ADAR of a mammal present in the specified cell; wherein said AON is complementary to a target RNA containing the target adenosine, wherein said AON optionally contains one or more mismatches, ambiguous matches and/or bulges with said target RNA; wherein AON contains one or more nucleotides with a sugar modification, provided that the nucleotide opposite the target adenosine contains ribose with a 2-OH group or deoxyribose with a 2'-H group; wherein the AON does not contain a (non-complementary) moiety (non-complementary to the target and non-complementary to itself) that is capable of forming an intramolecular stem-loop structure that is capable of binding the mammalian ADAR enzyme; wherein AON does not contain a 5'-terminal O6-benzylguanine or a 5'-terminal amino modification; and wherein the AON is not covalently linked to the SNAP-tag domain. The AON of the present invention is preferably located in its core structure of a single-stranded RNA editing oligonucleotide. In a preferred embodiment, the nucleotide opposite

- 2 045815 целевому аденозину, представляет собой цитидин или уридин, более предпочтительно цитидин. Согласно еще одному предпочтительному аспекту нуклеотид непосредственно 5' и/или 3' от нуклеотида, противоположного целевому аденозину, содержит рибозу с 2'-ОН-группой или дезоксирибозу с 2'-Н-группой. Чтобы предотвратить деградацию эндонуклеазами в максимально возможной степени, предпочтительно, чтобы все остальные нуклеотиды в указанном AON, кроме нуклеотида, который находится напротив целевого аденозина, и одного или обоих нуклеотидов, непосредственно смежных с находящимся напротив нуклеотидом, содержали бы 2'-О-алкильную группу, предпочтительно 2'-O-метильную группу. Согласно другому предпочтительному аспекту каждый нуклеотид, противоположный аденозину в целевой последовательности РНК, содержит 2'-О-алкильную группу, предпочтительно 2'-О-метильную группу, за исключением нуклеотида, противоположного целевому аденозину, который содержит рибозу с 2'-ОНгруппой. Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления AON содержит помимо цитидина, противоположного целевому аденозину (который может иметь одно несоответствие), по меньшей мере одну дополнительную пару оснований с несоответствием или неоднозначным соответствием с целевой последовательностью. Наличие по меньшей мере одной дополнительной пары оснований с несоответствием или неоднозначным соответствием может усилить эффективность редактирования РНК, возможно, потому что усиливает измененную скорость ассоциации/диссоциации AON с его целевой молекулой и/или связывание молекулы ADAR с dsRNA и/или распознавание ею, также в зависимости от целевой последовательности. Как указано в настоящем документе, одно конкретное предпочтительное положение для дополнительного несоответствия и/или неоднозначной пары оснований между AON и целевой последовательностью (помимо предпочтительного С-А целевого положения) представляет собой положение на четыре нуклеотида выше против хода транскрипции (в направлении 5') от целевого аденозина в целевой последовательности. Также в настоящем документе раскрыто, что в зависимости от целевой последовательности дополнительные несоответствия и/или неоднозначные пары оснований, а также дополнительные выступы (не спаривающиеся нуклеотиды и небольшие удлинения из петли) могут усилить эффективность редактирования РНК. Поэтому предпочтительный аспект настоящего изобретения представляет собой наличие дополнительных выпуклостей, несоответствий и/или неоднозначных соответствий между AON и целевой последовательностью, кроме разницы между цитидином, противоположным целевому аденозину (или кроме уридина, напротив целевого аденозина, который представляет собой не несоответствие, но который может быть предпочтительным для определенных целевых последовательностей). Согласно предпочтительному аспекту клетка, в которую вводится AON, представляет собой клетку человека. Согласно еще одному предпочтительному аспекту AON по настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну фосфоротиоатную связь, предпочтительно, когда 2, 3, 4, 5 или 6 концевых нуклеотидов 5'- и 3'-конца AON связаны с фосфоротиоатными связями, еще более предпочтительно, когда терминальные пять нуклеотидов на 5'- и 3'-конце связаны с (в этом случае четырьмя) фосфоротиоатными связями. Согласно одному варианту осуществления AON по настоящему изобретению не содержит 5'-кэп. Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения AON не является 17-мерным или 20-мерным. Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения часть AON, которая комплементарна целевой последовательности РНК, длиннее 17 нуклеотидов или короче 14 нуклеотидов. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей AON в соответствии с настоящим изобретением и фармацевтически приемлемый носитель.- 2 045815 the target adenosine is cytidine or uridine, more preferably cytidine. In yet another preferred aspect, the nucleotide immediately 5' and/or 3' from the nucleotide opposite the target adenosine contains ribose with a 2'-OH group or deoxyribose with a 2'-H group. To prevent degradation by endonucleases to the greatest extent possible, it is preferred that all other nucleotides in said AON, except the nucleotide that is opposite the target adenosine and one or both nucleotides immediately adjacent to the opposite nucleotide, contain a 2'-O-alkyl group , preferably a 2'-O-methyl group. In another preferred aspect, each nucleotide opposite to adenosine in the target RNA sequence contains a 2'-O-alkyl group, preferably a 2'-O-methyl group, except for the nucleotide opposite to the target adenosine, which contains ribose with a 2'-OH group. In another preferred embodiment, the AON contains, in addition to the cytidine opposite the target adenosine (which may have one mismatch), at least one additional base pair with a mismatch or ambiguous match to the target sequence. The presence of at least one additional mismatched or ambiguous base pair may enhance the efficiency of RNA editing, possibly because it enhances the altered rate of association/dissociation of AON with its target molecule and/or ADAR molecule binding and/or recognition by dsRNA, also in depending on the target sequence. As stated herein, one particular preferred position for additional mismatch and/or ambiguous base pair between AON and the target sequence (other than the preferred C-A target position) is a position four nucleotides upstream (in the 5' direction) of target adenosine in the target sequence. Also disclosed herein is that, depending on the target sequence, additional mismatches and/or ambiguous base pairs, as well as additional overhangs (unpaired nucleotides and small extensions from the loop) can enhance the efficiency of RNA editing. Therefore, a preferred aspect of the present invention is the presence of additional bulges, mismatches and/or ambiguous matches between the AON and the target sequence other than the difference between cytidine opposite the target adenosine (or other than uridine opposite the target adenosine, which is not a mismatch, but which may be preferred for certain target sequences). In a preferred aspect, the cell into which the AON is introduced is a human cell. In another preferred aspect, the AON of the present invention contains at least one phosphorothioate linkage, preferably when 2, 3, 4, 5 or 6 terminal nucleotides of the 5' and 3' end of the AON are linked to phosphorothioate linkages, even more preferably when the terminal five nucleotides at the 5' and 3' ends are linked by (in this case four) phosphorothioate bonds. In one embodiment, the AON of the present invention does not contain a 5' cap. According to another embodiment of the present invention, the AON is not 17-dimensional or 20-dimensional. According to another embodiment of the present invention, the portion of the AON that is complementary to the target RNA sequence is longer than 17 nucleotides or shorter than 14 nucleotides. The present invention also relates to a pharmaceutical composition containing an AON in accordance with the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.

Настоящее изобретение также относится к AON в соответствии с настоящим изобретением для применения при лечении или предотвращении генетического нарушения, предпочтительно выбранного из группы, состоящей из муковисцидоза, синдрома Гурлера, дефицита альфа-1-антитрипсина (А1АТ), болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, альбинизма, бокового амиотрофического склероза, астмы, β-талассемии, синдрома Кадасила, болезни Шарко-Мари-Тута, хронической обструктивной болезни легких (COPD), дистальной спинальной мышечной атрофии (DSMA), мышечной дистрофии Дюшенна/Беккера, дистрофического буллезного эпидермоза, буллезного эпидермоза, болезни Фабри, связанных с фактором V Лейдена нарушений, семейного аденоматозного полипоза, галактоземии, болезни Гоше, дефицита глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, гемофилии, наследственного гемохроматоза, синдрома Хантера, болезни Хантингтона, воспалительного заболевания кишечника (IBD), наследственного синдрома полиагглютинации, врожденного амароза Лебера, синдрома Леша-Нихана, синдрома Линча, синдрома Марфана, мукополисахаридоза, мышечной дистрофии, миотонической дистрофии I и II типов, нейрофиброматоза, болезни Ниманна-Пика типа А, В и С, связанного с NY-eso1 рака, синдрома ПейтцаЕгерса, фенилкетонурии, болезни Помпе, первичного цилиарного заболевания, нарушений, связанных с протромбиновой мутацией, такой как мутация G20210A протромбина, легочной гипертензии, пигментной дистрофии сетчатки, болезни Сандхоффа, синдрома тяжелой комбинированной иммунной недостаточности (SCID), серповидно-клеточной анемии, спинальной мышечной атрофии, болезни Старгардта, болезни Тай-Сакса, синдрома Ушера, связанного с Х-хромосомой иммунодефицита и рака.The present invention also relates to an AON in accordance with the present invention for use in the treatment or prevention of a genetic disorder, preferably selected from the group consisting of cystic fibrosis, Hurler's syndrome, alpha-1-antitrypsin (A1AT) deficiency, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, albinism, amyotrophic lateral sclerosis, asthma, β-thalassemia, Cadacil syndrome, Charcot-Marie-Tooth disease, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), distal spinal muscular atrophy (DSMA), Duchenne/Becker muscular dystrophy, dystrophic epidermos bullosa, epidermos bullosa, disease Fabry, factor V Leiden disorders, familial adenomatous polyposis, galactosemia, Gaucher disease, glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency, hemophilia, hereditary hemochromatosis, Hunter syndrome, Huntington disease, inflammatory bowel disease (IBD), hereditary polyagglutination syndrome, Leber congenital amarosis , Lesch-Nyhan syndrome, Lynch syndrome, Marfan syndrome, mucopolysaccharidosis, muscular dystrophy, myotonic dystrophy types I and II, neurofibromatosis, Niemann-Pick disease types A, B and C, NY-eso1-related cancer, Peutz-Jeghers syndrome, phenylketonuria, disease Pompe, primary ciliary disease, disorders associated with prothrombin mutation such as prothrombin G20210A mutation, pulmonary hypertension, retinal pigmentary dystrophy, Sandhoff disease, severe combined immune deficiency syndrome (SCID), sickle cell disease, spinal muscular atrophy, Stargardt disease, Tay-Sachs disease, Usher syndrome, X-linked immunodeficiency and cancer.

Настоящее изобретение также относится к способу дезаминирования специфического целевого аденозина, присутствующего в целевой последовательности РНК в клетке, причем указанный способ предусматривает следующие стадии: предоставление указанной клетки с AON согласно настоящему изобретению; обеспечение возможности захватывать клеткой указанного AON; обеспечение возможности отжигаThe present invention also provides a method for deamination of a specific target adenosine present in a target RNA sequence in a cell, the method comprising the following steps: providing said cell with an AON according to the present invention; allowing the cell to capture said AON; providing the possibility of annealing

- 3 045815 указанного AON с целевой последовательностью РНК; обеспечение возможности ферменту ADAR млекопитающего, содержащему природный связывающий dsRNA домен, который обнаружен в ферменте дикого типа, дезаминировать указанный целевой аденозин в указанной целевой последовательности РНК до инозина; и идентификация присутствия указанного инозина в последовательности РНК.- 3 045815 of the specified AON with the target RNA sequence; allowing a mammalian ADAR enzyme containing a natural dsRNA binding domain as found in the wild type enzyme to deaminate said target adenosine in said target RNA sequence to inosine; and identifying the presence of said inosine in the RNA sequence.

Согласно предпочтительным вариантам осуществления настоящего изобретения целевая последовательность РНК кодирует CFTR (например, для редактирования мутации 1784G>A), CEP290 (например, для редактирования мутации c.2991+1655A>G), альфа1-антитрипсин (А1АТ, например, для редактирования мутации 9989G>A или мутации 1096G>A), LRRK2 (например, для редактирования мутации G6055), BDNF (например, для восстановления мутации Val66Met на уровне РНК) или при этом целевая РНК кодируется геном IDUA (например, для редактирования мутации c.1205G>A (W402X)).In preferred embodiments of the present invention, the target RNA sequence encodes CFTR (e.g., to edit the 1784G>A mutation), CEP290 (e.g., to edit the c.2991+1655A>G mutation), alpha1-antitrypsin (A1AT, e.g., to edit the 9989G mutation >A or 1096G>A mutations), LRRK2 (for example, to edit the G6055 mutation), BDNF (for example, to restore the Val66Met mutation at the RNA level) or where the target RNA is encoded by the IDUA gene (for example, to edit the c.1205G>A mutation (W402X)).

Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials

На фиг. 1 показана комплементарность антисмысловых олигонуклеотидов (верхние нити) к GFP-стоп целевой последовательности (нижние нити). В панелях A-D часть последовательности целевой РНК показана от 5' к 3' (нижняя нить на каждой панели), а целевой аденозин (А) выделен жирным шрифтом. Последовательность олигонуклеотидов в верхней нити показана от 3' к 5', при этом подчеркиваются несоответствия, неоднозначные соответствия и выпуклости. Химические модификации не показаны. Нижняя нить на всех панелях одинакова (SEQ ID NO: 5) и отражает только часть целевой последовательности GFP. UAG в целевой последовательности представляет собой стоп-кодон (от 5' к 3'), который, когда А отредактирован до I (считывается как G), преобразуется в UGG, представляющий кодон Tip, позволяющий белку GFP быть полностью транслированным в функциональный белок. (А) Верхняя нить AON ADAR56 (SEQ ID NO: 1); (В) верхняя нить AON ADAR57 (SEQ ID NO: 2); (С) верхняя нить AON ADAR58 (SEQ ID NO: 3); (D) верхняя нить AON ADAR59 (SEQ ID NO: 4).In fig. Figure 1 shows the complementarity of antisense oligonucleotides (top strands) to the GFP stop target sequence (bottom strands). In panels A-D, part of the target RNA sequence is shown from 5' to 3' (bottom strand in each panel), and the target adenosine (A) is shown in bold. The sequence of oligonucleotides in the top strand is shown from 3' to 5', highlighting mismatches, ambiguous matches, and bulges. Chemical modifications are not indicated. The bottom strand is the same in all panels (SEQ ID NO: 5) and reflects only part of the GFP target sequence. The UAG in the target sequence is a stop codon (5' to 3') which, when A is edited to I (read as G), is converted to UGG, which is a Tip codon allowing the GFP protein to be fully translated into a functional protein. (A) AON ADAR56 top strand (SEQ ID NO: 1); (B) AON ADAR57 top strand (SEQ ID NO: 2); (C) AON ADAR58 top strand (SEQ ID NO: 3); (D) AON ADAR59 top strand (SEQ ID NO: 4).

На фиг. 2 показана эффективность редактирования, анализируемая способом анализа последовательности. Хроматограммы (от А до J) показывают частоту нуклеотидов в целевом сайте (выделенном над центром А) и соседними нуклеотидами. Нуклеотидная идентичность пиков указана тем же цветом, что и в последовательности ниже хроматограмм, где G представлены в черном цвете. На панели (А) показаны результаты необработанных клеток (NT), а на панели (В) использовался только реагент трансфекции (CTRL). AON ADAR56 - ADAR59 использовали в концентрациях 50 или 100 нМ, как показано на панелях (С-J). Существует явное увеличение сигнала G над центральным А (показано как плечо в соседнем G-сигнале, в то время как в контролях плечо не наблюдается), что показывает, что во всех четырех случаях с использованием любого из четырех AON редактирование РНК произошло в этом положении.In fig. 2 shows the editing efficiency analyzed by the sequence analysis method. Chromatograms (A to J) show the frequency of nucleotides at the target site (highlighted above center A) and neighboring nucleotides. The nucleotide identity of the peaks is indicated in the same color as in the sequence below the chromatograms, where the Gs are presented in black. Panel (A) shows the results from untreated cells (NT), while panel (B) only used the transfection reagent (CTRL). AON ADAR56 - ADAR59 were used at concentrations of 50 or 100 nM as shown in panels (C-J). There is a clear increase in G signal above the central A (shown as a shoulder in the adjacent G signal, while no shoulder is observed in controls), indicating that in all four cases using any of the four AONs, RNA editing occurred at this position.

На фиг. 3 показаны результаты секвенирования после использования ADAR59-2 и ADAR72-1 (которые по сравнению с ADAR59-2 содержат дополнительные неоднозначные пары оснований) в лизате клеток HeLa из клеток, трансфицированных ADAR2a в целевой последовательности GFP. Дополнительные неоднозначные соответствия добавляют к эффективности редактирования РНК. Положение отредактированной мишени указано стрелкой.In fig. Figure 3 shows the sequencing results after using ADAR59-2 and ADAR72-1 (which contain additional ambiguous base pairs compared to ADAR59-2) in HeLa cell lysate from cells transfected with ADAR2a at the GFP target sequence. Additional ambiguous matches add to the efficiency of RNA editing. The position of the edited target is indicated by an arrow.

На фиг. 4 показана ферментативная активность (как относительная единица флуоресценции, нормированная к общей концентрации белка), измеренная в анализе a-L-идуронидазы. Как указано, средняя активность и стандартное отклонение от двух повторяющихся измерений показаны для каждого AON. NT: не обработанные.In fig. 4 shows enzymatic activity (as relative fluorescence unit normalized to total protein concentration) measured in the a-L-iduronidase assay. As indicated, the mean activity and standard deviation of the two repeated measurements are shown for each AON. NT: untreated.

На фиг. 5A и 5B показан тот же ферментативный анализ, что и на фиг. 4, после использования двух пар антисмысловых олигонуклеотидов, которые отличаются друг от друга несоответствием с целевой последовательностью в положении 4 выше против хода транскрипции целевой последовательности, что указывает на положительный эффект этой конкретной дополнительной выпуклости между олигонуклеотидом и целевой последовательностью.In fig. 5A and 5B show the same enzymatic assay as in FIG. 4, after using two pairs of antisense oligonucleotides that differ from each other by a mismatch with the target sequence at position 4 upstream of the target sequence, indicating the beneficial effect of this particular additional bulge between the oligonucleotide and the target sequence.

Фиг. 6 представляет собой вестерн-блот восьми различных линий рака человека (нумерация полос в соответствии с таблицей в нижней панели), оценивающий экспрессию ADAR1 и ADAR2 для последующего анализа эндогенной активности ADAR.Fig. 6 is a Western blot of eight different human cancer lines (band numbering as per table in bottom panel) assessing ADAR1 and ADAR2 expression for subsequent analysis of endogenous ADAR activity.

На фиг. 7 показаны результаты секвенирования продукта ПЦР, полученного из целевой плазмиды GFPstop57, которую инкубировали с четырьмя различными антисмысловыми олигонуклеотидами (ADAR56-2, ADAR57-2, ADAR58-2 и ADAR59-2, сокращены в настоящем документе до 56-2, 57-2, 58-2 и 59-2 соответственно) в клетках рака печени SNU-475. ADAR59-2=ADAR59. РНК-редактирование происходило без необходимости сверхэкспрессии ферментов ADAR. Fwd=прямое секвенирование; Rev=обратное секвенирование. Место целевого аденозина (смещение к гуанозину в прямой последовательности и цитидину в обратной последовательности) указано стрелкой.In fig. 7 shows the sequencing results of a PCR product obtained from the target plasmid GFPstop57, which was incubated with four different antisense oligonucleotides (ADAR56-2, ADAR57-2, ADAR58-2 and ADAR59-2, abbreviated herein to 56-2, 57-2, 58-2 and 59-2, respectively) in SNU-475 liver cancer cells. ADAR59-2=ADAR59. RNA editing occurred without the need for overexpression of ADAR enzymes. Fwd=direct sequencing; Rev=reverse sequencing. The location of the target adenosine (bias to guanosine in forward sequence and cytidine in reverse sequence) is indicated by an arrow.

На фиг. 8 показаны результаты секвенирования продукта ПЦР, полученного из целевой плазмиды GFPstop57, которую инкубировали с четырьмя различными антисмысловыми олигонуклеотидами (ADAR56-2, ADAR57-2, ADAR58-2 и ADAR59-2, сокращены в настоящем документе до 56-2, 57- 2, 58-2 и 59-2 соответственно) в клетках рака молочной железы MCF7. РНК-редактирование происходило без необходимости сверхэкспрессии ферментов ADAR. Fwd=прямое секвенирование. Место целевого аденозина (смещение к гуанозину) указано стрелкой. Никаких значительных смещений не наблюдалось с ADAR56-2, ADAR57-2 и ADAR58-2, но с ADAR59-2 наблюдался очень значительное смещение редактиIn fig. Figure 8 shows the sequencing results of a PCR product obtained from the target plasmid GFPstop57, which was incubated with four different antisense oligonucleotides (ADAR56-2, ADAR57-2, ADAR58-2 and ADAR59-2, abbreviated herein to 56-2, 57-2, 58-2 and 59-2, respectively) in MCF7 breast cancer cells. RNA editing occurred without the need for overexpression of ADAR enzymes. Fwd=direct sequencing. The target adenosine location (bias to guanosine) is indicated by an arrow. No significant biases were observed with ADAR56-2, ADAR57-2 and ADAR58-2, but a very significant editing bias was observed with ADAR59-2

- 4 045815 рования РНК.- 4 045815 RNA formation.

На фиг. 9 показаны данные последовательности области, окружающей целевой аденозин (стрелка) после воздействия ADAR57-2 (см. также фиг. 7, внизу слева) и показано, что дезаминирование не происходит у других аденозинов вблизи целевого аденозина и в целевой области AON.In fig. Figure 9 shows sequence data of the region surrounding the target adenosine (arrow) after exposure to ADAR57-2 (see also Figure 7, bottom left) and shows that deamination does not occur at other adenosines in the vicinity of the target adenosine and in the AON target region.

На фиг. 10 (А) показана карта экспрессирующей плазмиды, несущей вставку GFPstop57. Последовательность нуклеиновой кислоты и полученная в результате аминокислотная последовательность GFP представлена в (В) и она показывает, что конструкция кодирует белок из 57 аминокислот из-за стопкодона TAG в триплете 58. Аденозин в этом кодоне TAG редактируют до инозина (считывается как гуанозин), приводя к кодону TGG, как описано в настоящем документе.In fig. 10 (A) shows a map of the expression plasmid carrying the GFPstop57 insert. The nucleic acid sequence and resulting amino acid sequence of GFP is presented in (B) and it shows that the construct encodes a protein of 57 amino acids due to the TAG stop codon in triplet 58. The adenosine at this TAG codon is edited to inosine (read as guanosine), resulting in to the TGG codon as described herein.

На фиг. 11 (А) показана 5'-концевая часть последовательности РНК гена полипептида А малых ядерных рибонуклеопротеинов (SNRPA) (SEQ ID NO: 16). В верхней нити кодирующая последовательность подчеркивается до стоп-кодона UAG (жирный шрифт). РНК-редактирование А в стоп-кодоне до I (учитывается как G) приводит к кодированию UGG для триптофана (W); отредактированная последовательность также предоставляется (SEQ ID NO: 17). Таким образом, это сквозное прочитывание теоретически приводит к белку, который на 25 аминокислот длиннее, когда транслируется до последующего стоп-кодона (также выделен жирным шрифтом). На (В) показана та же 5'-концевая часть SNRPA, как указано в (А). Ниже последовательности кодирования приводятся последовательности AON ADAR87-1, ADAR89-1, ADAR89-2 и ADAR94-1. Выпуклости, неоднозначные соответствия и несоответствия подчеркнуты. Цитидин, противоположный целевому аденозину, представлен более крупным шрифтом. Три нуклеозида в центральном триплете 5'-ССА-3' в ADAR89-2 и ADAR94-1 представляют собой ДНК, тогда как все остальные нуклеозиды в этих олигонуклеотидах представляют собой РНК.In fig. 11(A) shows the 5'-terminal portion of the RNA sequence of the small nuclear ribonucleoprotein polypeptide A (SNRPA) gene (SEQ ID NO: 16). In the top strand, the coding sequence is underlined up to the UAG stop codon (bold). RNA editing of A at the stop codon before I (counted as G) results in the coding of UGG for tryptophan (W); the edited sequence is also provided (SEQ ID NO: 17). Thus, this read-through theoretically results in a protein that is 25 amino acids longer when translated before the subsequent stop codon (also in bold). (B) shows the same 5′ end portion of SNRPA as indicated in (A). Below the coding sequences are the AON sequences of ADAR87-1, ADAR89-1, ADAR89-2 and ADAR94-1. Convexities, ambiguous correspondences and inconsistencies are underlined. Cytidine, the opposite of the target adenosine, is represented in larger font. The three nucleosides in the central triplet 5'-CCA-3' in ADAR89-2 and ADAR94-1 are DNA, whereas all other nucleosides in these oligonucleotides are RNA.

На фиг. 12 показаны результаты редактирования РНК на эндогенной РНК SNRPA в клетках мыши Нера 1-6 с использованием AON. На панели (А) показан контроль без трансфекции (NT). На панели (В) показан контроль, в котором трансфицирована только плазмида, кодирующая короткую изоформу ADAR2. На панели (С) показано увеличение пика G, обозначенного стрелкой, которая указывает, что редактирование РНК (А на I) происходило в желаемом положении после трансфекции с помощью AON ADAR89-1 в клетках, которые не были трансфицированы с помощью сверхэкспрессирующей ADAR2 плазмиды. На панели (D) показан положительный контроль как с плазмидой экспрессии ADARsh, так и с AON.In fig. 12 shows the results of RNA editing on endogenous SNRPA RNA in mouse Hera 1-6 cells using AON. Panel (A) shows the no-transfection (NT) control. Panel (B) shows a control in which only the plasmid encoding the short ADAR2 isoform was transfected. Panel (C) shows an increase in peak G, indicated by an arrow, which indicates that RNA editing (A to I) occurred at the desired position after transfection with AON ADAR89-1 in cells that were not transfected with the ADAR2 overexpression plasmid. Panel (D) shows positive controls with both the ADARsh and AON expression plasmid.

На фиг. 13 показаны результаты секвенирования после введения AON ADAR89-2 и ADAR94-1 в клетки мыши Нера 1-6, и показано, что редактирование РНК может быть достигнуто с помощью AON, которые содержат нуклеозиды ДНК в центральном триплете напротив целевого аденозина, и что такое редактирование РНК может быть дополнительно увеличено при введении дополнительных несоответствий.In fig. 13 shows the sequencing results after introducing AONs ADAR89-2 and ADAR94-1 into mouse Hera 1-6 cells, and shows that RNA editing can be achieved using AONs that contain DNA nucleosides in the central triplet opposite the target adenosine, and what editing is The RNA can be further increased by introducing additional mismatches.

Подробное описание настоящего изобретенияDetailed Description of the Present Invention

В публикации международной заявки WO 2016/097212 раскрыты антисмысловые олигонуклеотиды (AON) для целевого редактирования РНК, причем AON характеризуются последовательностью, комплементарной целевой последовательности РНК (в настоящем документе упоминается как нацеливающий участок), и наличием структуры петля-на-стебле (в настоящем документе упоминается как мобилизующий участок), которая предпочтительно некомплементарна целевой РНК. Такие олигонуклеотиды называются AON с самоформирующейся петлей. Мобилизующий участок действует при мобилизации природного фермента ADAR, присутствующего в клетке, в dsRNA, образованную гибридизацией целевой последовательности с нацеливающим участком. Благодаря мобилизующему участку нет необходимости в конъюгированных элементах или наличии модифицированных рекомбинантных ферментов ADAR. В публикации международной заявки WO 2016/097212 описана часть мобилизации как структура петля-на-стебле, имитирующая либо природный субстрат (например, GluB-рецептор), либо структуру Z-ДНК, которая, как известно, распознается связывающими dsRNA областями ферментов ADAR. Структура петля-на-стебле может представлять собой межмолекулярную структуру петля-на-стебле, образованную двумя отдельными нитями нуклеиновой кислоты, или внутримолекулярную структуру петля-настебле, образованную в одной цепи нуклеиновой кислоты. Структура петля-на-стебле мобилизующего участка, как описано в публикации международной заявки WO 2016/097212, представляет собой внутримолекулярную структуру петля-на-стебле, образованную внутри самой AON и способную привлекать ADAR.International Application Publication WO 2016/097212 discloses antisense oligonucleotides (AONs) for targeted RNA editing, wherein AONs are characterized by a sequence complementary to the target RNA sequence (referred to herein as a targeting site) and the presence of a stem-loop structure (herein referred to as a targeting site). referred to as the mobilizing site), which is preferentially non-complementary to the target RNA. Such oligonucleotides are called self-loop AONs. The mobilizing site acts by mobilizing the natural ADAR enzyme present in the cell into the dsRNA formed by hybridization of the target sequence to the targeting site. Due to the mobilizing site, there is no need for conjugated elements or modified recombinant ADAR enzymes. International Application Publication WO 2016/097212 describes the mobilization portion as a stem-loop structure mimicking either a natural substrate (eg GluB receptor) or a Z-DNA structure known to be recognized by the dsRNA binding regions of ADAR enzymes. The loop-on-stem structure may be an intermolecular loop-on-stem structure formed by two separate strands of nucleic acid, or an intramolecular loop-on-stem structure formed on a single strand of nucleic acid. The mobilizing site loop-on-stem structure, as described in International Application Publication WO 2016/097212, is an intramolecular loop-on-stem structure formed within the AON itself and is capable of recruiting ADAR.

AON согласно настоящему изобретению не содержат мобилизующий участок, как описано в публикации международной заявки WO 2016/097212. AON согласно настоящему изобретению не содержат участок, который способен образовывать внутримолекулярную структуру петля-на-стебле. AON согласно настоящему изобретению короче, что делает их более дешевыми для производства, проще в использовании и проще в изготовлении. Кроме того, у них нет недостатка потенциально связывающих ферментов ADAR в отношении их нормальной функции в клетке. Неожиданно изобретатели настоящего изобретения обнаружили, что AON, которые комплементарны целевой РНК для дезаминирования целевого аденозина, присутствующего в целевой последовательности РНК, к которой комплементарен AON, но, что важно, не имеют описанного выше мобилизующего участка, способны использовать ферменты ADAR, присутствующие в клетке, для редактирования целевого аденозина. Согласно предпочтительному аспекту AON согласно настоящему изобретению содержит несоответствие в положении целевого аденозина, причем противоположный нуклеотид в AON представляет собой цитидин. Также, когда уридинThe AONs of the present invention do not contain a mobilizing region as described in International Application Publication WO 2016/097212. The AONs of the present invention do not contain a region that is capable of forming an intramolecular stem-loop structure. The AONs of the present invention are shorter, making them cheaper to produce, easier to use, and easier to manufacture. In addition, they do not lack potential ADAR binding enzymes for their normal function in the cell. Surprisingly, the inventors of the present invention have discovered that AONs that are complementary to the target RNA to deaminate the target adenosine present in the target RNA sequence to which the AON is complementary, but importantly do not have the mobilizing site described above, are capable of using ADAR enzymes present in the cell, to edit the target adenosine. In a preferred aspect, the AON of the present invention contains a mismatch in the position of the target adenosine, wherein the opposite nucleotide in the AON is a cytidine. Also, when uridine

- 5 045815 находится напротив целевого аденозина (который фактически не был бы несоответствием), AON способен приводить к дезаминированию целевого аденозина. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что дополнительные несоответствия, неоднозначные соответствия и/или выпуклости из петли (вызванные нуклеотидами в антисмысловом олигонуклеотиде, которые не образуют идеальных пар оснований с целевой РНК в соответствии с правилами спаривания оснований Уотсона-Крика) являются допустимыми, в некоторых случаях предпочтительными, но в возрастающих количествах не всегда необходимы для конкретного специфического нацеленного редактирования целевой последовательности РНК. Количество несоответствий, неоднозначных соответствий или выпуклостей в AON согласно настоящему изобретению (когда он гибридизуется со своей целевой последовательностью РНК) может быть равно нулю (когда нуклеозид, противоположный целевому аденозину, представляет собой уридин, а остальная часть AON также на 100% комплементарна целевой последовательности), может быть одним (которое может представлять собой одно несоответствие, образованное в положении целевого аденозина, когда цитозин является противоположным нуклеозидом, или в каком-либо другом положении в AON) или более (либо включая в себя, либо не включая в себя (не)соответствие целевому аденозину) в зависимости от длины AON. Дополнительные несоответствия, неоднозначные соответствия или выпуклости могут находиться против хода транскрипции, а также ниже по ходу транскрипции от целевого аденозина. Согласно конкретному предпочтительному варианту осуществления несоответствие или неоднозначное соответствие присутствует в положении в четырех нуклеотидах выше против хода транскрипции (к 5'-концу) от целевого аденозина, который также может представлять собой единственное несоответствие или неоднозначное соответствие, когда уридин образует пару с целевым аденозином, или который может затем представлять собой дополнительное несоответствие или неоднозначное соответствие, когда нуклеозид, противоположный целевому аденозину, представляет собой цитидин. Выпуклости или несоответствия могут находиться в одном положении (вызванном одной несоответствующей, неоднозначной или выпуклой парой оснований) или рядом нуклеотидов, которые не являются полностью комплементарными (вызваны более чем одной последовательной несоответствующей или неоднозначной парой оснований или выпуклостью, предпочтительно двумя или тремя последовательными несоответствующими и/или неоднозначными парами оснований и/или выпуклостями).- 5045815 is opposite the target adenosine (which would not actually be a mismatch), AON is capable of causing deamination of the target adenosine. The present inventors have found that additional mismatches, ambiguous matches and/or loop bulges (caused by nucleotides in the antisense oligonucleotide that do not form perfect base pairs with the target RNA according to Watson-Crick base pairing rules) are acceptable, in some cases preferred , but in increasing quantities are not always necessary for specific targeted editing of the target RNA sequence. The number of mismatches, ambiguous matches or bulges in the AON of the present invention (when it hybridizes to its target RNA sequence) can be zero (when the nucleoside opposite the target adenosine is uridine and the rest of the AON is also 100% complementary to the target sequence) , may be one (which may be a single mismatch formed at the position of the target adenosine when cytosine is the opposite nucleoside, or at some other position in the AON) or more (either including or not including (not) matching the target adenosine) depending on the length of the AON. Additional mismatches, ambiguous matches, or bulges may be located upstream of, as well as downstream of, the target adenosine. In a particular preferred embodiment, the mismatch or ambiguous match is present at a position four nucleotides upstream of the target adenosine, which may also represent a single mismatch or ambiguous match when the uridine pairs with the target adenosine, or which may then represent an additional mismatch or ambiguous match when the nucleoside opposite the target adenosine is cytidine. Bumps or mismatches can be at a single position (caused by a single mismatched, ambiguous or bumpy base pair) or a series of nucleotides that are not completely complementary (caused by more than one consecutive mismatched or ambiguous base pair or bump, preferably two or three consecutive mismatches and/or bumps). or ambiguous base pairs and/or bulges).

В любом случае AON согласно настоящему изобретению обладают определенными преимуществами по сравнению с олигонуклеотидами, описанными в публикации международной заявки WO 2016/097212, поскольку нет необходимости в структурах шпильки или петля-на-стебле, которые позволяют использовать более короткие (значительно) AON по настоящему изобретению. Более того, олигонуклеотиды, описанные в публикации международной заявки WO 2016/097212, имеют потенциальный риск секвестрации ферментом ADAR, присутствующим в клетке. Под секвестрацией в этом контексте подразумевается, что природный белок ADAR может связываться с олигонуклеотидами, описанными в публикации международной заявки WO 2016/097212, даже в отсутствие образования комплекса dsRNA между целевой частью олигонуклеотида и целевой РНК. Это прямое связывание ADAR с олигонуклеотидами, описанными в публикации международной заявки WO 2016/097212 (из-за наличия внутримолекулярной структуры петля-на-стебле), в отсутствие целевых последовательностей РНК не происходит при использовании AON по настоящему изобретению, которые не содержат участок, который способен образовывать внутримолекулярную структуру петля-на-стебле. Хотя олигонуклеотиды, описанные в публикации международной заявки WO 2016/097212, могут характеризоваться определенными применениями, существует множество случаев, когда предпочтительно избегать наличия шпилек и/или структур петля (на стебле).In any case, the AONs of the present invention have certain advantages over the oligonucleotides described in international application publication WO 2016/097212, since there is no need for hairpin or loop-on-stem structures, which allow the use of significantly shorter AONs of the present invention . Moreover, the oligonucleotides described in international application publication WO 2016/097212 have the potential risk of being sequestered by the ADAR enzyme present in the cell. By sequestration in this context it is meant that the native ADAR protein can bind to the oligonucleotides described in WO 2016/097212, even in the absence of formation of a dsRNA complex between the target portion of the oligonucleotide and the target RNA. This direct binding of ADAR to the oligonucleotides described in International Application Publication WO 2016/097212 (due to the presence of a stem-loop intramolecular structure), in the absence of target RNA sequences, does not occur when using AONs of the present invention that do not contain a region that capable of forming an intramolecular loop-on-stem structure. Although the oligonucleotides described in international application publication WO 2016/097212 may be characterized by certain applications, there are many cases where it is preferable to avoid the presence of hairpins and/or stem-loop structures.

Таким образом, настоящее изобретение относится к антисмысловому олигонуклеотиду (AON), способному образовывать двухцепочечный комплекс с целевой РНК в клетке, для дезаминирования целевого аденозина, присутствующего в целевой РНК, с помощью фермента ADAR, присутствующего в клетке, причем AON комплементарен целевой РНК-области, содержащей целевой аденозин, и AON необязательно содержит одно или более несоответствий, неоднозначных соответствий и/или выпуклостей с комплементарной областью целевой РНК; AON содержит один или более нуклеотидов с одной или более модификациями сахара, при условии, что нуклеотид, противоположный целевому аденозину, содержит рибозу с 2'-ОН-группой или дезоксирибозу с 2'-Н-группой; AON не содержит участок, который способен образовывать внутримолекулярную структуру петля-на-стебле, которая способна связывать фермент ADAR; AON не содержит 5'-концевую модификацию O₆-бензилгуанина; AON не содержит 5'-концевую амино-модификацию и AON не связан ковалентно с доменом SNAP-tag.Thus, the present invention relates to an antisense oligonucleotide (AON) capable of forming a double-stranded complex with a target RNA in a cell to deaminate a target adenosine present in the target RNA by the ADAR enzyme present in the cell, wherein the AON is complementary to the target RNA region, containing the target adenosine, and the AON optionally contains one or more mismatches, ambiguous matches and/or bulges with a complementary region of the target RNA; AON contains one or more nucleotides with one or more sugar modifications, provided that the nucleotide opposite the target adenosine contains ribose with a 2'-OH group or deoxyribose with a 2'-H group; AON does not contain a region that is capable of forming an intramolecular stem-loop structure that is capable of binding the ADAR enzyme; AON does not contain the 5'-terminal O ₆ -benzylguanine modification; AON does not contain a 5'-terminal amino modification and AON is not covalently linked to the SNAP-tag domain.

Согласно предпочтительному аспекту нуклеотид в AON, противоположный целевому аденозину, представляет собой не РНК, а ДНК, и согласно еще более предпочтительному аспекту нуклеотид, противоположный целевому аденозину, а также нуклеотид 5' и/или 3' от нуклеотида, противоположного целевому аденозину, представляют собой нуклеотиды ДНК, в то время как остальная часть (не ДНК) нуклеотидов в AON предпочтительно представляют собой 2'-О-алкил-модифицированные рибонуклеотиды. Когда два нуклеотида представляют собой ДНК, все остальные могут представлять собой РНК и могут быть 2'-О-метил-модифицированными, тогда как согласно определенным аспектам третий нуклеотид в триплете, противоположном целевому аденозину, может представлять собой РНК и быть немодифицированным, если нуклеотид, противоположный целевому аденозину не является 2'-О-метилIn a preferred aspect, the nucleotide in the AON opposite the target adenosine is DNA rather than RNA, and in an even more preferred aspect, the nucleotide opposite the target adenosine, as well as the nucleotide 5' and/or 3' from the nucleotide opposite the target adenosine, is DNA nucleotides, while the remaining (non-DNA) nucleotides in AON are preferably 2'-O-alkyl-modified ribonucleotides. When two nucleotides are DNA, all others may be RNA and may be 2'-O-methyl-modified, while in certain aspects the third nucleotide in a triplet opposite the target adenosine may be RNA and be unmodified if the nucleotide the opposite of the target adenosine is not 2'-O-methyl

- 6 045815 модифицированным. Согласно одному конкретному аспекту настоящее изобретение относится к AON, способному образовывать двухцепочечный комплекс с целевой РНК в клетке для дезаминирования целевого аденозина, присутствующего в целевой РНК, с помощью фермента, присутствующего в клетке (вероятно, фермента ADAR), причем AON (частично) комплементарен целевой области РНК, содержащей целевой аденозин, причем нуклеотид, противоположный целевому аденозину, содержит дезоксирибозу с 2'-Н-группой, причем нуклеотид 5' и/или 3' от нуклеотида напротив целевого аденозина также содержит дезоксирибозу с 2'-Н-группой, а остальная часть AON содержит рибонуклеозиды, предпочтительно все с 2'-О-метил-модификациями.- 6 045815 modified. In one specific aspect, the present invention provides an AON capable of forming a double-stranded complex with a target RNA in a cell to deaminate the target adenosine present in the target RNA by an enzyme present in the cell (likely an ADAR enzyme), wherein the AON is (partially) complementary to the target a region of RNA containing the target adenosine, wherein the nucleotide opposite the target adenosine contains deoxyribose with a 2'-H group, and the nucleotide 5' and/or 3' from the nucleotide opposite the target adenosine also contains deoxyribose with a 2'-H group, and the remainder of the AON contains ribonucleosides, preferably all with 2'-O-methyl modifications.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к AON, способному образовывать двухцепочечный комплекс с целевой РНК в клетке для дезаминирования целевого аденозина, присутствующего в целевой РНК, с помощью фермента ADAR, присутствующего в клетке, причем AON комплементарен целевой области РНК, содержащей целевой аденозин, и AON необязательно содержит одно или более несоответствий, неоднозначных соответствий и/или выпуклостей с комплементарной областью целевой РНК; AON содержит один или более нуклеотидов с одной или более модификациями сахара, при условии, что нуклеотид, противоположный целевому аденозину, содержит рибозу с 2'-ОН-группой или дезоксирибозу с 2'-Н-группой; AON не содержит участок, который способен образовывать внутримолекулярную структуру петля-на-стебле, которая способна связывать фермент ADAR; и AON не является 17- или 20-мерным.In another aspect, the present invention provides an AON capable of forming a double-stranded complex with a target RNA in a cell to deaminate a target adenosine present in the target RNA by an ADAR enzyme present in the cell, wherein the AON is complementary to the target RNA region containing the target adenosine and the AON optionally contains one or more mismatches, ambiguous matches and/or bulges with a complementary region of the target RNA; AON contains one or more nucleotides with one or more sugar modifications, provided that the nucleotide opposite the target adenosine contains ribose with a 2'-OH group or deoxyribose with a 2'-H group; AON does not contain a region that is capable of forming an intramolecular stem-loop structure that is capable of binding the ADAR enzyme; and AON is not 17- or 20-dimensional.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к AON, способному образовывать двухцепочечный комплекс с целевой РНК в клетке для дезаминирования целевого аденозина, присутствующего в целевой РНК, с помощью фермента ADAR, присутствующего в клетке, причем AON комплементарен целевой РНК-области, содержащей целевой аденозин, и AON необязательно содержит одно или более несоответствий, неоднозначных соответствий и/или выпуклости с комплементарной областью целевой РНК; AON содержит один или более нуклеотидов с одной или более модификациями сахара, при условии, что нуклеотид, противоположный целевому аденозину, содержит рибозу с 2'-ОН-группой или дезоксирибозу с 2'-Н-группой; AON не содержит участок, который способен образовывать внутримолекулярную структуру петля-на-стебле, которая способна связывать фермент ADAR; и AON длиннее 17 нуклеотидов или короче 14 нуклеотидов.In another aspect, the present invention provides an AON capable of forming a double-stranded complex with a target RNA in a cell to deaminate a target adenosine present in the target RNA by an ADAR enzyme present in the cell, wherein the AON is complementary to a target RNA region containing the target adenosine, and The AON optionally contains one or more mismatches, ambiguous matches and/or bulges with a complementary region of the target RNA; AON contains one or more nucleotides with one or more sugar modifications, provided that the nucleotide opposite the target adenosine contains ribose with a 2'-OH group or deoxyribose with a 2'-H group; AON does not contain a region that is capable of forming an intramolecular stem-loop structure that is capable of binding the ADAR enzyme; and AON longer than 17 nucleotides or shorter than 14 nucleotides.

Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к AON, способному образовывать двухцепочечный комплекс с целевой РНК в клетке для дезаминирования целевого аденозина, присутствующего в целевой РНК, с помощью фермента ADAR, присутствующего в клетке, причем AON комплементарен целевой области РНК, содержащей целевой аденозин; AON содержит один или более нуклеотидов с одной или более модификациями сахара, при условии, что нуклеотид, противоположный целевому аденозину, содержит рибозу с 2'-ОН-группой или дезоксирибозу с 2'-Н-группой; AON не содержит участок, который способен образовывать внутримолекулярную структуру петля-на-стебле, которая способна связывать фермент ADAR; AON необязательно содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 несоответствий, неоднозначных соответствий и/или выпуклостей с комплементарной областью целевой РНК. Предпочтительно, нуклеотид, противоположный целевому аденозину, представляет собой цитидин, дезоксицитидин, уридин или дезоксиуридин. Когда нуклеотид, противоположный целевому аденозину, представляет собой цитидин или дезоксицитидин, AON содержит по меньшей мере одно несоответствие с целевой РНК. Когда нуклеотид, противоположный целевому аденозину, представляет собой уридин или дезоксиуридин, AON может быть 100% комплементарным и не иметь никаких несоответствий, неоднозначных соответствий или выпуклостей по отношению к целевой РНК. Однако согласно предпочтительному аспекту между AON и целевой РНК присутствует одно или более дополнительных несоответствий, независимо от того, является ли нуклеотид противоположным целевому аденозину, цитидином, дезоксицитидином, уридином или дексиуридином. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления нуклеотид, расположенный непосредственно 5' и/или 3' от нуклеотида, противоположного целевому аденозину, содержит рибозу с 2'-ОН-группой или дезоксирибозу с 2'-Н-группой, или их смесь (триплет состоит тогда из ДНК-ДНК-ДНК, ДНК-ДНК-РНК, РНК-ДНК-ДНК, РНК-ДНК-РНК или РНК-РНК-РНК, предпочтительно при этом средний нуклеозид не содержит 2'-О-метил-модификацию (когда РНК) и один или оба окружающих нуклеозида также не содержит 2'-О-метил-модификации). Затем предпочтительно, чтобы все остальные нуклеотиды в AON содержали 2'-О-алкильную группу, предпочтительно 2'-Ометильную группу, или 2'-О-метоксиэтильную группу (2'-МОЕ), или любую модификацию, как раскрыто в настоящем документе. AON согласно настоящему изобретению предпочтительно содержат по меньшей мере одну фосфоротиоатную связь. Согласно еще одному предпочтительному аспекту 2, 3, 4, 5 или 6 концевых нуклеотидов 5'- и 3'-конца AON связаны с фосфоротиоатными связями. Более предпочтительно, 5 концевых нуклеотидов на 5'- и 3'-конце связаны с фосфоротиоатными связями. Согласно одному конкретному варианту осуществления настоящего изобретения AON длиннее, чем 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 нуклеотидов. Предпочтительно AON короче, чем 100 нуклеотидов, более предпочтительно короче, чем 60 нуклеотидов, и еще более предпочтительно AON содержит от 18 до 70 нуклеотидов, от 18 до 60 нуклеотидов или от 18 до 50 нуклеотидов. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей AON в соответствии с настоящим изобретением и фармацевтически приемлемыйIn another aspect, the present invention provides an AON capable of forming a double-stranded complex with a target RNA in a cell to deaminate a target adenosine present in the target RNA by an ADAR enzyme present in the cell, wherein the AON is complementary to the target RNA region containing the target adenosine; AON contains one or more nucleotides with one or more sugar modifications, provided that the nucleotide opposite the target adenosine contains ribose with a 2'-OH group or deoxyribose with a 2'-H group; AON does not contain a region that is capable of forming an intramolecular stem-loop structure that is capable of binding the ADAR enzyme; The AON optionally contains 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 mismatches, ambiguous matches and/or bulges with a complementary region of the target RNA. Preferably, the nucleotide opposite to the target adenosine is cytidine, deoxycytidine, uridine or deoxyuridine. When the nucleotide opposite to the target adenosine is cytidine or deoxycytidine, the AON contains at least one mismatch with the target RNA. When the nucleotide opposite to the target adenosine is uridine or deoxyuridine, the AON can be 100% complementary and have no mismatches, ambiguous matches, or overhangs to the target RNA. However, in a preferred aspect, one or more additional mismatches are present between the AON and the target RNA, regardless of whether the nucleotide opposite to the target is adenosine, cytidine, deoxycytidine, uridine, or dexiuridine. In another preferred embodiment, the nucleotide located immediately 5' and/or 3' from the nucleotide opposite the target adenosine contains ribose with a 2'-OH group or deoxyribose with a 2'-H group, or a mixture thereof (the triplet then consists of DNA-DNA-DNA, DNA-DNA-RNA, RNA-DNA-DNA, RNA-DNA-RNA or RNA-RNA-RNA, preferably the middle nucleoside does not contain a 2'-O-methyl modification (when RNA) and one or both of the surrounding nucleosides also does not contain the 2'-O-methyl modification). It is then preferred that all remaining nucleotides in the AON contain a 2'-O-alkyl group, preferably a 2'-Omethyl group, or a 2'-O-methoxyethyl group (2'-MOE), or any modification as disclosed herein. AONs according to the present invention preferably contain at least one phosphorothioate linkage. In another preferred aspect, the 2, 3, 4, 5 or 6 terminal nucleotides of the 5' and 3' ends of the AON are linked to phosphorothioate linkages. More preferably, the 5 terminal nucleotides at the 5' and 3' ends are linked to phosphorothioate linkages. In one specific embodiment of the present invention, the AON is longer than 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, or 17 nucleotides. Preferably, the AON is shorter than 100 nucleotides, more preferably shorter than 60 nucleotides, and even more preferably the AON is 18 to 70 nucleotides, 18 to 60 nucleotides, or 18 to 50 nucleotides. The present invention also relates to a pharmaceutical composition containing an AON in accordance with the present invention and a pharmaceutically acceptable

- 7 045815 носитель. Настоящее изобретение также относится к AON в соответствии с настоящим изобретением для применения при лечении или профилактике генетического нарушения, предпочтительно выбранного из группы, состоящей из муковисцидоза, синдрома Гурлера, дефицита альфа-1-антитрипсина (А1АТ), болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, альбинизма, бокового амиотрофического склероза, астмы, βталассемии, синдрома Кадасила, болезни Шарко-Мари-Тута, хронической обструктивной болезни легких (COPD), дистальной спинальной мышечной атрофии (DSMA), мышечной дистрофии Дюшенна/Беккера, дистрофического буллезного эпидермоза, буллезного эпидермоза, болезни Фабри, связанных с фактором V Лейдена нарушений, семейного аденоматозного полипоза, галактоземии, болезни Гоше, дефицита глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, гемофилии, наследственного гемохроматоза, синдрома Хантера, болезни Хантингтона, воспалительного заболевания кишечника (IBD), наследственного синдрома полиагглютинации, врожденного амароза Лебера, синдрома Леша-Нихана, синдрома Линча, синдрома Марфана, мукополисахаридоза, мышечной дистрофии, миотонической дистрофии I и II типов, нейрофиброматоза, болезни Ниманна-Пика типа А, В и С, связанного с NY-eso1 рака, синдрома Пейтца-Егерса, фенилкетонурии, болезни Помпе, первичного цилиарного заболевания, нарушений, связанных с протромбиновой мутацией, такой как мутация G20210A протромбина, легочной гипертензии, пигментной дистрофии сетчатки, болезни Сандхоффа, синдрома тяжелой комбинированной иммунной недостаточности (SCID), серповидно-клеточной анемии, спинальной мышечной атрофии, болезни Старгардта, болезни Тай-Сакса, синдрома Ушера, связанного с Х-хромосомой иммунодефицита и рака. Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к применению AON в соответствии с настоящим изобретением при изготовлении лекарственного средства для лечения или профилактики генетического нарушения, предпочтительно выбранного из группы, состоящей из муковисцидоза, синдрома Гурлера, дефицита альфа-1антитрипсина (A1AT), болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, альбинизма, бокового амиотрофического склероза, астмы, β-талассемии, синдрома Кадасила, болезни Шарко-Мари-Тута, хронической обструктивной болезни легких (COPD), дистальной спинальной мышечной атрофии (DSMA), мышечной дистрофии Дюшенна/Беккера, дистрофического буллезного эпидермоза, буллезного эпидермоза, болезни Фабри, связанных с фактором V Лейдена нарушений, семейного аденоматозного полипоза, галактоземии, болезни Гоше, дефицита глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, гемофилии, наследственного гемохроматоза, синдрома Хантера, болезни Хантингтона, воспалительного заболевания кишечника (IBD), наследственного синдрома полиагглютинации, врожденного амароза Лебера, синдрома Леша-Нихана, синдрома Линча, синдрома Марфана, мукополисахаридоза, мышечной дистрофии, миотонической дистрофии I и II типов, нейрофиброматоза, болезни Ниманна-Пика типа А, В и С, связанного с NY-eso1 рака, синдрома Пейтца-Егерса, фенилкетонурии, болезни Помпе, первичного цилиарного заболевания, нарушений, связанных с протромбиновой мутацией, такой как мутация G20210A протромбина, легочной гипертензии, пигментной дистрофии сетчатки, болезни Сандхоффа, синдрома тяжелой комбинированной иммунной недостаточности (SCID), серповидно-клеточной анемии, спинальной мышечной атрофии, болезни Старгардта, болезни Тай-Сакса, синдрома Ушера, связанного с Х-хромосомой иммунодефицита и рака. Согласно еще одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу дезаминирования по меньшей мере одного целевого аденозина, присутствующего в целевой РНК в клетке, причем способ предусматривает следующие стадии: предоставление клетки с AON в соответствии с настоящим изобретением; обеспечение возможности захватывать клеткой AON; что позволяет отжиг AON с целевой РНК; обеспечение возможности ферменту ADAR, содержащему природный связывающий dsRNA домен, обнаруженный в ферменте дикого типа, дезаминировать целевой аденозин в целевой РНК до инозина; и необязательно идентификация наличия инозина в целевой РНК, предпочтительно при этом последняя стадия предусматривает секвенирование целевой последовательности РНК; оценку наличия функционального, удлиненного, полноразмерного белка и/или белка дикого типа, когда целевой аденозин находится в стоп-кодоне UGA или UAG, который редактируется до кодона UGG посредством дезаминирования; оценку наличия функционального, удлиненного, полноразмерного белка и/или белка дикого типа, когда два целевых аденозина расположены в стоп-кодоне UAA, который редактируется до кодона UGG через дезаминирование обоих целевых аденозинов; оценку того, было ли сплайсирование пре-мРНК изменено дезаминированием; или использование функционального считывания, при котором целевая РНК после дезаминирования кодирует функциональный, полноразмерный, удлиненный белок и/или белок дикого типа. Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к AON или способу в соответствии с настоящим изобретением, при котором целевая последовательность РНК кодирует CFTR (например, для редактирования мутации 1784G>A), CEP290 (например, для редактирования мутации c.2991+1655A>G), альфа-антитрипсин (А1АТ, например, для редактирования мутации 9989G>A или мутации 1096G>A), LRRK2 (например, для редактирования мутации G6055), BDNF (например, для восстановления мутации Val66Met на уровне РНК) или при котором целевая РНК кодируется геном IDUA (например, для редактирования мутации c.1205G>A (W402X)).- 7 045815 carrier. The present invention also relates to an AON in accordance with the present invention for use in the treatment or prevention of a genetic disorder, preferably selected from the group consisting of cystic fibrosis, Hurler's syndrome, alpha-1-antitrypsin (A1AT) deficiency, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, albinism, amyotrophic lateral sclerosis, asthma, βthalassemia, Kadacil syndrome, Charcot-Marie-Tooth disease, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), distal spinal muscular atrophy (DSMA), Duchenne/Becker muscular dystrophy, dystrophic epidermosus bullosa, epidermos bullosa, Fabry disease, factor V Leiden disorders, familial adenomatous polyposis, galactosemia, Gaucher disease, glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency, hemophilia, hereditary hemochromatosis, Hunter syndrome, Huntington disease, inflammatory bowel disease (IBD), hereditary polyagglutination syndrome, Leber congenital amarosis, syndrome Lesch-Nyhan syndrome, Lynch syndrome, Marfan syndrome, mucopolysaccharidosis, muscular dystrophy, myotonic dystrophy types I and II, neurofibromatosis, Niemann-Pick disease types A, B and C, NY-eso1 associated cancer, Peutz-Jeghers syndrome, phenylketonuria, disease Pompe, primary ciliary disease, disorders associated with prothrombin mutation such as prothrombin G20210A mutation, pulmonary hypertension, retinal pigmentary dystrophy, Sandhoff disease, severe combined immune deficiency syndrome (SCID), sickle cell disease, spinal muscular atrophy, Stargardt disease, Tay-Sachs disease, Usher syndrome, X-linked immunodeficiency and cancer. According to another aspect, the present invention relates to the use of the AON in accordance with the present invention in the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of a genetic disorder, preferably selected from the group consisting of cystic fibrosis, Hurler's syndrome, alpha-1 antitrypsin (A1AT) deficiency, Parkinson's disease, Alzheimer's disease , albinism, amyotrophic lateral sclerosis, asthma, β-thalassemia, Cadacil syndrome, Charcot-Marie-Tooth disease, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), distal spinal muscular atrophy (DSMA), Duchenne/Becker muscular dystrophy, dystrophic epidermosis bullosa, bullous epidermosis, Fabry disease, factor V Leiden disorders, familial adenomatous polyposis, galactosemia, Gaucher disease, glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency, hemophilia, hereditary hemochromatosis, Hunter syndrome, Huntington disease, inflammatory bowel disease (IBD), hereditary polyagglutination syndrome, Leber congenital amarosis, Lesch-Nyhan syndrome, Lynch syndrome, Marfan syndrome, mucopolysaccharidosis, muscular dystrophy, myotonic dystrophy types I and II, neurofibromatosis, Niemann-Pick disease types A, B and C, NY-eso1-related cancer, Peutz syndrome- Jegher's disease, phenylketonuria, Pompe disease, primary ciliary disease, disorders associated with prothrombin mutation such as the G20210A prothrombin mutation, pulmonary hypertension, retinal pigmentary dystrophy, Sandhoff disease, severe combined immune deficiency syndrome (SCID), sickle cell disease, spinal muscular disease atrophy, Stargardt disease, Tay-Sachs disease, Usher syndrome, X-linked immunodeficiency and cancer. According to yet another embodiment, the present invention provides a method for deamination of at least one target adenosine present in a target RNA in a cell, the method comprising the following steps: providing the cell with an AON in accordance with the present invention; allowing the cell to capture AON; which allows annealing of the AON to the target RNA; allowing an ADAR enzyme containing the natural dsRNA binding domain found in the wild type enzyme to deaminate the target adenosine in the target RNA to inosine; and optionally identifying the presence of inosine in the target RNA, preferably the last step comprising sequencing the target RNA sequence; assessing the presence of a functional, extended, full-length and/or wild-type protein when the target adenosine is at a UGA or UAG stop codon that is edited to a UGG codon by deamination; assessing the presence of a functional, extended, full-length and/or wild-type protein when two target adenosines are located at a UAA stop codon that is edited to a UGG codon through deamination of both target adenosines; assessing whether pre-mRNA splicing was altered by deamination; or the use of a functional readout in which the target RNA, after deamination, encodes a functional, full-length, extended, and/or wild-type protein. In another embodiment, the present invention relates to an AON or method in accordance with the present invention, wherein the target RNA sequence encodes CFTR (for example, to edit the 1784G>A mutation), CEP290 (for example, to edit the c.2991+1655A>G mutation) , alpha antitrypsin (A1AT, e.g. to edit the 9989G>A mutation or the 1096G>A mutation), LRRK2 (e.g. to edit the G6055 mutation), BDNF (e.g. to repair the Val66Met mutation at the RNA level) or in which the target RNA is encoded IDUA genome (for example, to edit the c.1205G>A (W402X) mutation).

Важным аспектом настоящего изобретения является то, что AON содержит один или более нуклеотидов с одной или более модификациями сахара. Таким образом, один нуклеотид AON может содержать одну или более чем одну модификацию сахара. В пределах AON один или более нуклеотидов могут соAn important aspect of the present invention is that AON contains one or more nucleotides with one or more sugar modifications. Thus, one AON nucleotide may contain one or more than one sugar modification. Within an AON, one or more nucleotides may

- 8 045815 держать такую модификацию(и) сахара.- 8 045815 keep such modification(s) of sugar.

Также важным аспектом настоящего изобретения является то, что нуклеотид в AON по настоящему изобретению, который является противоположным нуклеотиду, который нуждается в редактировании, не содержит 2'-О-метил-модификацию (в настоящем документе часто упоминается как 2'-ОМе, или как 2'-О-метилирование) и предпочтительно содержит 2'-ОН-группу или представляет собой дезоксирибозу с 2'-Н-группой. Предпочтительно, чтобы нуклеотиды, которые расположены непосредственно 3' и/или 5' от этого нуклеотида (соседние нуклеотиды), также не имели такой химической модификации, хотя считается, что допускается, что один из этих соседних нуклеотидов может содержать 2'-О-алкильную группу (такую как 2'-О-метильная группа), но предпочтительно не оба. Либо один, либо оба соседних нуклеотида могут представлять собой 2'-ОН или совместимую замену (как определено в настоящем документе).It is also an important aspect of the present invention that the nucleotide in the AON of the present invention that is opposite to the nucleotide that needs editing does not contain a 2'-O-methyl modification (often referred to herein as 2'-OMe, or as 2'-O-methylation) and preferably contains a 2'-OH group or is deoxyribose with a 2'-H group. Preferably, nucleotides that are located immediately 3' and/or 5' from this nucleotide (adjacent nucleotides) also do not have such chemical modification, although it is believed that it is acceptable that one of these adjacent nucleotides may contain a 2'-O-alkyl group (such as a 2'-O-methyl group), but preferably not both. Either one or both adjacent nucleotides may be a 2'-OH or a compatible substitution (as defined herein).

Другим важным аспектом AON настоящего изобретения является то, что он не содержит участок, который комплементарен целевой РНК или области РНК, которая содержит целевой аденозин, который позволяет AON самому по себе складываться во внутримолекулярную шпильку или другой тип структуры петли (-на-стебле) (в настоящем документе также упоминается как автовыпетливание или самовыпетливание) и которое потенциально может выступать в качестве структуры, которая связывает ADAR. Согласно одному аспекте одноцепочечный AON по настоящему изобретению полностью комплементарен целевой РНК, хотя он предпочтительно не идеально образует пару по меньшей мере в одном положении, которое находится в положении целевого аденозина, где противоположный нуклеозид тогда предпочтительно представляет собой цитидин. Одноцепочечные редактирующие РНК олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут также иметь одно или более несоответствий, неоднозначных соответствий или выпуклостей (без противоположного нуклеозида) с целевой последовательностью в других положениях, чем в положении целевого аденозина. Эти неоднозначные соответствия, несоответствия и/или выпуклости AON по настоящему изобретению с целевой последовательностью не препятствуют гибридизации олигонуклеотида с целевой последовательностью РНК, но увеличивают эффективность редактирования РНК посредством ADAR, присутствующего в клетке, в положении целевого аденозина. Специалист в настоящей области техники способен определить, действительно ли происходит гибридизация в физиологических условиях. Предпочтительные одноцепочечные редактирующие РНК олигонуклеотиды по настоящему изобретению не содержат 5'-концевой O₆-бензилгуанин или 5'-концевую аминомодификацию и не ковалентно связаны с доменом SNAP-tag (сконструированная O₆-алкилгуанин-ДНКалкилтрансфераза), в отличие от Vogel et al. (2014). Домен SNAP-tag получают из O₆-алкилгуанин-ДНКалкилтрансферазы (AGT) ДНК ремонтного белка человека и он может быть ковалентно помечен в живых клетках с использованием производных O₆-бензилгуанина. Публикация Vogel et al. (2014) раскрывает гидовые РНК с общей длиной 20 или 17 нуклеотидов, причем первые три нуклеотида на 5'-конце не связываются с целевой последовательностью РНК, но связывают гидовую РНК с доменом SNAP-tag. Таким образом, часть гидовой РНК, которая связывается с целевой последовательностью РНК, составляет в длину 14 или 17 нуклеотидов. Гидовые РНК одинаковой длины с 5'-концевой амино-модификацией вместо 5'-концевой модификации O₆-бензилгуанина также описаны в публикации Vogel et al. (2014), однако обнаруживалось только очень небольшое количество или отсутствие дезаминирования или целевой последовательности РНК. Согласно одному варианту осуществления AON по настоящему изобретению содержит менее четырех несоответствий и/или неоднозначных соответствий по отношению к целевой последовательности РНК. Аналогично предпочтительный AON по настоящему изобретению не содержит последовательность шпильки РНК boxB, в отличие от Montiel-Gonzalez et al (2013). Последовательность шпильки РНК boxB, используемая в Montiel-Gonzalez et al. (2013), представляет собой короткий участок РНК из 17 нуклеотидов (с последовательностью GGCCCUGAAAAAGGGCC, SEQ ID NO: 6), которая распознается N-белком бактериофага лямбда. Транскрипция генов, расположенных ниже по ходу транскрипции в ранних оперонах бактериофага, требует промотор-проксимального элемента, известного как nut. Этот сайт действует in cis в форме РНК для сборки транскрипционного анти-терминального комплекса, который состоит из белка N бактериофага лямбда и хозяйских факторов. РНК nut-сайта содержит небольшую структуру петля-на-стебле, называемую boxB. Последовательность шпильки РНК boxB известна в настоящей области техники как прерывистый палиндром с потенциалом для образования шпильки (петля-на-стебле). Ее последовательность варьирует у родственников бактериофага лямбда, которые кодируют различные геном-специфические гомологи N. Ни Vogel et al. (2014), ни MontielGonzalez et al. (2013) не используют фермент ADAR млекопитающего, присутствующий в клетке, причем фермент ADAR содержит природный связывающий dsRNA домен, который содержится в ферменте дикого типа. Vogel et al. (2014) использует генетически сконструированный слитый белок, содержащий домен аденозиндезаминазы ADAR1 или 2, слитый с доменом SNAP-tag, a Montiel-Gonzalez et al. использует генетически сконструированный слитый белок, содержащий домен аденозиндезаминазы белка hADAR2, слитый с доменом распознавания boxB белка N бактериофага лямбда. В отличие от предшествующего уровня техники, AON по настоящему изобретению использует фермент ADAR млекопитающего, присутствующий в клетке, причем фермент ADAR содержит свой природный связывающий dsRNA домен, который содержится в ферменте дикого типа. Поэтому нет необходимости включать поAnother important aspect of the AON of the present invention is that it does not contain a region that is complementary to the target RNA or a region of the RNA that contains the target adenosine, which allows the AON itself to fold into an intramolecular hairpin or other type of loop-on-stem structure ( also referred to herein as autoloop or self-loop) and which could potentially act as a structure that binds ADAR. In one aspect, the single-stranded AON of the present invention is fully complementary to the target RNA, although it preferably does not perfectly pair at at least one position, which is the position of the target adenosine, where the opposite nucleoside is then preferably a cytidine. The single-stranded RNA editing oligonucleotides of the present invention may also have one or more mismatches, ambiguous matches, or bulges (without the opposing nucleoside) with the target sequence at positions other than the target adenosine position. These ambiguous matches, mismatches and/or bulges of the AON of the present invention with the target sequence do not prevent the oligonucleotide from hybridizing to the target RNA sequence, but increase the efficiency of RNA editing by ADAR present in the cell at the target adenosine position. One skilled in the art will be able to determine whether hybridization actually occurs under physiological conditions. Preferred single-stranded RNA editing oligonucleotides of the present invention do not contain a 5'-terminal O ₆ -benzylguanine or 5'-terminal amino modification and are not covalently linked to a SNAP-tag (designed O ₆ -alkylguanine-DNA alkyltransferase) domain, unlike Vogel et al. (2014). The SNAP-tag domain is derived from the O ₆ -alkylguanine DNA alkyltransferase (AGT) human DNA repair protein and can be covalently tagged in living cells using O ₆ -benzylguanine derivatives. Publication by Vogel et al. (2014) disclose guide RNAs with a total length of 20 or 17 nucleotides, with the first three nucleotides at the 5' end not binding to the target RNA sequence but binding the guide RNA to the SNAP-tag domain. Thus, the portion of the guide RNA that binds to the target RNA sequence is 14 or 17 nucleotides in length. Guide RNAs of the same length with a 5'-terminal amino modification instead of a 5'-terminal O ₆ -benzylguanine modification are also described in Vogel et al. (2014), however, only very little or no deamination or target RNA sequence was detected. In one embodiment, the AON of the present invention contains less than four mismatches and/or ambiguous matches with respect to the target RNA sequence. Likewise, the preferred AON of the present invention does not contain the boxB RNA hairpin sequence, contrary to Montiel-Gonzalez et al (2013). The boxB RNA hairpin sequence used in Montiel-Gonzalez et al. (2013), is a short section of RNA of 17 nucleotides (with the sequence GGCCCUGAAAAAGGGCC, SEQ ID NO: 6), which is recognized by the N-protein of bacteriophage lambda. Transcription of genes located downstream in the early bacteriophage operons requires a promoter-proximal element known as nut. This site acts in cis in the form of RNA to assemble the transcriptional anti-terminal complex, which consists of the bacteriophage lambda N protein and host factors. The nut site RNA contains a small stem-loop structure called boxB. The boxB RNA hairpin sequence is known in the art as a discontinuous palindrome with the potential to form a hairpin (stem-loop). Its sequence varies among relatives of bacteriophage lambda, which encode different genome-specific homologs of N. Neither Vogel et al. (2014) nor MontielGonzalez et al. (2013) do not use the mammalian ADAR enzyme present in the cell, and the ADAR enzyme contains a natural dsRNA binding domain that is found in the wild type enzyme. Vogel et al. (2014) uses a genetically engineered fusion protein containing an ADAR1 or 2 adenosine deaminase domain fused to a SNAP-tag domain, and Montiel-Gonzalez et al. uses a genetically engineered fusion protein containing the adenosine deaminase domain of the hADAR2 protein fused to the boxB recognition domain of the bacteriophage lambda N protein. Unlike the prior art, the AON of the present invention uses the mammalian ADAR enzyme present in the cell, the ADAR enzyme containing its natural dsRNA binding domain, which is contained in the wild type enzyme. Therefore there is no need to include

- 9 045815 следовательность шпильки РНК boxB, 5'-концевой 06-бензилгуанин, 5'-концевую амино-модификацию или домен SNAP-tag в AON по настоящему изобретению, чтобы позволить мобилизацию ADAR. Следовательно, AON согласно настоящему изобретению имеют определенные преимущества по сравнению с олигонуклеотидами, описанными в публикациях Vogel et al. (2014) и Montiel-Gonzalez et al (2013). AON согласно настоящему изобретению могут использовать эндогенные клеточные пути и природные доступные ферменты ADAR для специфического редактирования целевого аденозина в целевой последовательности РНК. Согласно одному варианту осуществления AON по настоящему изобретению не связан ковалентно с человеческой О6-алкилгуанин-ДНК-алкилтрансферазой. Предпочтительно, AON по настоящему изобретению не связан ковалентно с полипептидом. Согласно другому аспекту AON по настоящему изобретению AON не содержит 5'-кэп. У эукарйотов 5'-кэп состоит из гуанинового нуклеотида, присоединенного к РНК через 5'-5'-трифосфатную связь. Этот гуанозин метилирован в положении 7 и упоминается как 7-метилгуанозин. Как раскрыто в настоящем документе, одноцепочечные индуцирующие редактирование РНК олигонуклеотиды по настоящему изобретению способны дезаминировать специфический нуклеотид целевого аденозина в целевой последовательности РНК. В идеале, только один аденозин дезаминирован. Альтернативно, дезаминируют 1, 2 или 3 аденозиновых нуклеотида, но предпочтительно только один. Рассматривая особенности AON по настоящему изобретению вместе, нет необходимости в модифицированной рекомбинантной экспрессии ADAR, нет необходимости в конъюгированных объектах, прикрепленных к AON, или наличии длинных мобилизующих участков, которые не являются комплементарными целевой последовательности РНК. Кроме того, AON по настоящему изобретению позволяет специфически дезаминировать целевой аденозин, присутствующий в целевой последовательности РНК, до инозина природным ферментом ADAR, содержащим природный связывающий dsRNA домен, который содержится в ферменте дикого типа, без риска неизбирательного редактирования в другом месте в комплексе PHK/AON.- 9 045815 RNA boxB hairpin sequence, 5'-terminal 06-benzylguanine, 5'-terminal amino modification or SNAP-tag domain in the AON of the present invention to allow ADAR mobilization. Therefore, the AONs of the present invention have certain advantages over the oligonucleotides described in the publications of Vogel et al. (2014) and Montiel-Gonzalez et al (2013). The AONs of the present invention can utilize endogenous cellular pathways and naturally available ADAR enzymes to specifically edit the target adenosine in the target RNA sequence. In one embodiment, the AON of the present invention is not covalently linked to human O6 alkylguanine DNA alkyltransferase. Preferably, the AON of the present invention is not covalently linked to the polypeptide. According to another aspect of the AON of the present invention, the AON does not contain a 5' cap. In eukaryotes, the 5' cap consists of a guanine nucleotide attached to the RNA through a 5'-5' triphosphate bond. This guanosine is methylated at position 7 and is referred to as 7-methylguanosine. As disclosed herein, the single-stranded RNA editing-inducing oligonucleotides of the present invention are capable of deaminating a specific target adenosine nucleotide in a target RNA sequence. Ideally, only one adenosine is deaminated. Alternatively, 1, 2 or 3 adenosine nucleotides are deaminated, but preferably only one. Considering the features of the AON of the present invention together, there is no need for modified recombinant ADAR expression, no need for conjugated entities attached to the AON, or the presence of long mobilizing regions that are not complementary to the target RNA sequence. In addition, the AON of the present invention allows the target adenosine present in the target RNA sequence to be specifically deaminated to inosine by a natural ADAR enzyme containing the natural dsRNA binding domain found in the wild-type enzyme, without the risk of indiscriminate editing elsewhere in the RNA/AON complex .

Мобилизация цитидиндезаминазы к целевому сайту работает так же, как и для аденозиндезаминаз hADAR1 и hADAR2. Однако цитидиндезаминазы характеризуются различными требованиями к связыванию и распознают разные структуры в их целевых последовательностях РНК, которые определяют редактирование цитидина. Одна особенно хорошо изученная цитидиндезаминаза представляет собой Apobec1 человека. Общий принцип редактирования РНК с использованием олигонуклеотидной конструкции для нацеливания на сайт редактирования и для мобилизации резидентного, естественно присутствующего, редактирующего объекта остается тем же самым для цитидиндезаминаз и представляет собой часть настоящего изобретения, раскрытого и заявленного в настоящем документе.Mobilization of cytidine deaminase to the target site works in the same way as for the adenosine deaminases hADAR1 and hADAR2. However, cytidine deaminases have different binding requirements and recognize different structures in their target RNA sequences that determine cytidine editing. One particularly well-studied cytidine deaminase is human Apobec1. The general principle of RNA editing using an oligonucleotide construct to target the editing site and to mobilize a resident, naturally present editing entity remains the same for cytidine deaminases and forms part of the present invention as disclosed and claimed herein.

Анализ природных мишеней ферментов ADAR показал, что они, как правило, включают в себя несоответствия между двумя нитями, которые образуют спираль РНК, отредактированную ADAR1 или ADAR2. Было высказано предположение, что эти несоответствия повышают специфичность реакции на редактирование (Stefl et al., 2006, Structure, 14(2):345-355; Tian et al., 2011, Nucleic. Acids. Res., 39(13):56695681). Характеристика оптимальных паттернов спаренных/несоответствующих нуклеотидов между AON и целевой РНК также имеет решающее значение для разработки эффективной терапии AON на основе ADAR. Улучшенной особенностью AON по настоящему изобретению является использование специфических нуклеотидных модификаций в предопределенных точках для обеспечения стабильности, а также надлежащего связывания и активности ADAR. Эти изменения могут варьировать и могут включать в себя модификации в основной цепи AON, в фрагменте сахара нуклеотидов, а также в нуклеотидных основаниях. Они также могут быть вариативно распределены по всей последовательности AON, в зависимости от мишени и вторичных структур. Могут потребоваться конкретные химические модификации для поддержки взаимодействий различных аминокислотных остатков в РНК-связывающих доменах ферментов ADAR, a также в доменах дезаминазы. Например, фосфоротиоатные связи между нуклеотидами и/или 2'-О-метил-модификациями могут переноситься в некоторых частях AON, в то время как в других частях их следует избегать, чтобы не нарушать критические взаимодействия фермента с фосфатом и/или 2'-ОН. Часть этих правил дизайна руководствуется опубликованными структурами ADAR2, в то время как другие должны быть определены эмпирически. Для ADAR1 и ADAR2 могут существовать различные предпочтения. Модификации также следует выбирать таким образом, чтобы они предотвращали деградацию AON. Специфические нуклеотидные модификации также могут быть необходимы для усиления активности редактирования на субстратных РНК, где целевая последовательность не является оптимальной для редактирования ADAR. В предыдущей работе было установлено, что некоторые контексты последовательности поддаются редактированию в большей степени. Например, целевая последовательность 5'-UAG-3' (с мишенью А в середине) содержит наиболее предпочтительные нуклеотиды ближайших соседей для ADAR2, тогда как целевая последовательность 5'-САА-3' не подвергается неблагоприятному воздействию (Schneider et al., 2014, Nucleic. Acids. Res., 42(10):e87). Недавний структурный анализ домена дезаминазы ADAR2 указывает на возможность улучшения редактирования путем тщательного выбора нуклеотидов, которые противоположны целевому тринуклеотиду. Например, целевая последовательность 5'-САА-3', спаренная с последовательностью 3'-GCU-5' на противоположной нити (с несоответствием А-С, образованным в середине), неблагоприятна, поскольку основание гуанозин стерически сталкивается с аминокислотной боковой цепью ADAR2. Однако в настоящем документе постулируется, чтоAnalysis of the natural targets of ADAR enzymes has shown that they typically involve mismatches between two strands that form an RNA helix edited by ADAR1 or ADAR2. It has been suggested that these discrepancies increase the specificity of the editing response (Stefl et al., 2006, Structure, 14(2):345-355; Tian et al., 2011, Nucleic. Acids. Res., 39(13): 56695681). Characterization of optimal paired/mismatched nucleotide patterns between AON and target RNA is also critical for the development of effective ADAR-based therapies for AON. An improved feature of the AON of the present invention is the use of specific nucleotide modifications at predetermined points to ensure stability as well as proper ADAR binding and activity. These changes may vary and may include modifications in the AON backbone, in the nucleotide sugar moiety, as well as in the nucleotide bases. They may also be variably distributed throughout the AON sequence, depending on the target and secondary structures. Specific chemical modifications may be required to support interactions of different amino acid residues in the RNA-binding domains of ADAR enzymes, as well as in the deaminase domains. For example, phosphorothioate bonds between nucleotides and/or 2'-O-methyl modifications may be tolerated in some parts of the AON, while in other parts they should be avoided so as not to disrupt the enzyme's critical interactions with phosphate and/or 2'-OH . Some of these design rules are guided by published ADAR2 structures, while others must be determined empirically. There may be different preferences for ADAR1 and ADAR2. Modifications should also be selected to prevent AON degradation. Specific nucleotide modifications may also be necessary to enhance editing activity on substrate RNAs where the target sequence is not optimal for ADAR editing. Previous work has found that some sequence contexts are more amenable to editing. For example, the target sequence 5'-UAG-3' (with target A in the middle) contains the most preferred nearest neighbor nucleotides for ADAR2, whereas the target sequence 5'-CAA-3' is not adversely affected (Schneider et al., 2014, Nucleic Acids Res, 42(10):e87). Recent structural analysis of the ADAR2 deaminase domain suggests that editing can be improved by carefully selecting nucleotides that are opposite to the target trinucleotide. For example, the target sequence 5'-CAA-3' paired with a 3'-GCU-5' sequence on the opposite strand (with an A-C mismatch formed in the middle) is unfavorable because the guanosine base sterically clashes with the amino acid side chain of ADAR2. However, this document postulates that

- 10 045815 меньшее нуклеотидное основание, такое как инозин, может потенциально лучше вписываться в это положение, не вызывая стерических столкновений, сохраняя при этом потенциал спаривания основания для противоположного цитидина. Модификации, которые могут усилить активность субоптимальных последовательностей, предусматривают использование модификаций остовов, которые увеличивают гибкость AON или, наоборот, заставляют его принимать конформацию, которая способствует редактированию.- 10 045815 a smaller nucleotide base, such as inosine, could potentially fit better into this position without causing steric clashes, while maintaining base pairing potential for the opposite cytidine. Modifications that can enhance the activity of suboptimal sequences involve the use of backbone modifications that increase the flexibility of the AON or, conversely, force it to adopt a conformation that favors editing.

Определения терминов, используемых в настоящем документеDefinitions of terms used in this document

Используемые в настоящем документе термины аденин, гуанин, цитозин, тимин, урацил и гипоксантин (нуклеотидное основание в инозине) относятся к нуклеотидам как таковым.As used herein, the terms adenine, guanine, cytosine, thymine, uracil, and hypoxanthine (the nucleotide base in inosine) refer to nucleotides as such.

Термины аденозин, гуанозин, цитидин, тимидин, уридин и инозин относятся к нуклеотидам, связанным с (дезокси)рибозиловым сахаром.The terms adenosine, guanosine, cytidine, thymidine, uridine, and inosine refer to nucleotides linked to a (deoxy)ribosyl sugar.

Термин нуклеозид относится к нуклеотидному основанию, связанному с (дезокси)рибозиловым сахаром.The term nucleoside refers to a nucleotide base linked to a (deoxy)ribosyl sugar.

Термин нуклеотид относится к соответствующему нуклеотидному основанию (дезокси)рибозилфосфолинкеру, а также к любым химическим модификациям рибозного фрагмента или фосфогруппы. Таким образом, этот термин будет предусматривать нуклеотид, включающий в себя блокированный рибозильный фрагмент (содержащий мостик 2'-4', содержащий метиленовую группу или любую другую группу, хорошо известную в настоящей области техники), нуклеотид, включающий в себя линкер, содержащий фосфодиэфир, фосфотриэфир, фосфоро(ди)тиоат, метилфосфонаты, фосфорамидатные линкеры и тому подобное.The term nucleotide refers to the corresponding nucleotide base (deoxy)ribosylphospholinker, as well as any chemical modifications of the ribose moiety or phosphogroup. Thus, the term will include a nucleotide including a blocked ribosyl moiety (containing a 2'-4' bridge containing a methylene group or any other group well known in the art), a nucleotide including a linker containing a phosphodiester, phosphotriester, phosphoro(di)thioate, methylphosphonates, phosphoramidate linkers and the like.

Иногда термины аденозин и аденин, гуанозин и гуанин, цитозин и цитидин, урацил и уридин, тимин и тимидин, инозин и гипоксантин используются взаимозаменяемо, чтобы обозначить соответствующее нуклеотидное основание, нуклеозид или нуклеотид.Sometimes the terms adenosine and adenine, guanosine and guanine, cytosine and cytidine, uracil and uridine, thymine and thymidine, inosine and hypoxanthine are used interchangeably to designate the corresponding nucleotide base, nucleoside or nucleotide.

Иногда термины нуклеотидное основание, нуклеозид и нуклеотид используются взаимозаменяемо, если контекст явно не требует иного. Термины рибонуклеозид и дезоксирибонуклеозид или рибоза и дезоксирибоза являются такими, как используется в настоящей области техники.Sometimes the terms nucleotide base, nucleoside, and nucleotide are used interchangeably unless the context clearly requires otherwise. The terms ribonucleoside and deoxyribonucleoside or ribose and deoxyribose are as used in the art.

Всякий раз, когда упоминается олигонуклеотид, подразумеваются как олигорибонуклеотиды, так и дезоксиолигорибонуклеотиды, если контекст не диктует иное. Всякий раз, когда упоминается олигорибонуклеотид, он может содержать основания А, G, С, U или I. Всякий раз, когда упоминается дезоксиолигорибонуклеотид, он может содержать основания A, G, С, Т или I. Согласно предпочтительному аспекту AON по настоящему изобретению представляет собой олигорибонуклеотид, который может содержать химические модификации.Whenever an oligonucleotide is mentioned, both oligoribonucleotides and deoxyoligonucleotides are meant unless the context dictates otherwise. Whenever an oligoribonucleotide is mentioned, it may contain the bases A, G, C, U or I. Whenever a deoxyoligoribonucleotide is mentioned, it may contain the bases A, G, C, T or I. In a preferred aspect, the AON of the present invention is is an oligoribonucleotide that may contain chemical modifications.

Когда упоминаются нуклеотиды в олигонуклеотидной конструкции, они содержат цитозин, 5-метилцитозин, 5-гидроксиметилцитозин и β-D-глюкозил-5-гидроксиметилцитозин; когда упоминается аденин, включены ^-метиладенин и 7 метиладенин; когда упоминается урацил, включены дигидроурацил, 4-тиоурацил и 5-гидроксиметилурацил; когда упоминается гуанин, включен 1-метилгуанин.When referred to as nucleotides in an oligonucleotide construct, they include cytosine, 5-methylcytosine, 5-hydroxymethylcytosine, and β-D-glucosyl-5-hydroxymethylcytosine; when adenine is mentioned, ^-methyladenine and 7-methyladenine are included; when uracil is mentioned, dihydrouracil, 4-thiouracil and 5-hydroxymethyluracil are included; when guanine is mentioned, 1-methylguanine is included.

Когда упоминаются нуклеозиды или нуклеотиды, включаются производные рибофуранозы, такие как 2'-дезокси, 2'-гидрокси и 2'-О-замещенные варианты, такие как 2'-O-метил, а также другие модификации, включая в себя 2'-4' мостиковые варианты.When nucleosides or nucleotides are mentioned, ribofuranose derivatives such as 2'-deoxy, 2'-hydroxy and 2'-O-substituted variants such as 2'-O-methyl are included, as well as other modifications including 2'- 4' bridge options.

Всякий раз, когда упоминаются олигонуклеотиды, связи между двумя мононуклеотидами могут представлять собой фосфодиэфирные связи, а также их модификации, включая в себя фосфодиэфир, фосфотриэфир, фосфоро(ди)тиоат, метилфосфонат, фосфор-амидатные линкеры и тому подобное.Whenever oligonucleotides are mentioned, the linkages between two mononucleotides may be phosphodiester linkages, as well as modifications thereof, including phosphodiester, phosphotriester, phosphoro(di)thioate, methylphosphonate, phosphorus-amidate linkers, and the like.

Термин содержащий охватывает включающий в себя, а также состоящий, например, композиция, содержащая X, может состоять исключительно из X или может включать в себя что-то дополнительное, например, X+Y.The term containing includes including as well as consisting of, for example, a composition containing X may consist solely of X or may include something additional, for example, X+Y.

Термин приблизительно по отношению к числовому значению х является необязательным и означает, например, х+10%.The term approximately in relation to the numerical value of x is optional and means, for example, x+10%.

Слово по существу не исключает полностью, например, композиция, которая по существу не содержит Y, может быть полностью свободна от Y. В соответствующих случаях слово по существу может быть опущено из определения настоящего изобретения.The word essentially is not completely exclusive, for example, a composition that is substantially free of Y may be completely free of Y. Where appropriate, the word essentially may be omitted from the definition of the present invention.

Используемый в настоящем документе термин комплементарный относится к тому факту, что AON гибридизуется в физиологических условиях с целевой последовательностью. Этот термин не означает, что каждый нуклеотид в AON характеризуется идеальным спариванием с его противоположным нуклеотидом в целевой последовательности. Другими словами, хотя AON может быть комплементарным целевой последовательности, могут быть несоответствия, неоднозначные соответствия и/или выпуклости между AON и целевой последовательностью, тогда как в физиологических условиях AON все еще гибридизуется с целевой последовательностью, так что редактирующие клеточную РНК ферменты могут редактировать целевой аденозин. Таким образом, термин по существу комплементарный также означает, что, несмотря на наличие несоответствий, неоднозначных соответствий и/или выпуклостей, AON содержит достаточное количество нуклеотидов для соответствия между AON и целевой последовательностью, так что в физиологических условиях AON гибридизуется с целевой РНК. Как показано в настоящем документе, AON может быть комплементарным, но может также содержать одно или более несоответствий, неоднозначных соответствий и/или выпуклостей с целевой последовательностью, если в фиAs used herein, the term complementary refers to the fact that the AON hybridizes under physiological conditions to the target sequence. This term does not mean that each nucleotide in an AON is characterized by a perfect pairing with its opposite nucleotide in the target sequence. In other words, although the AON may be complementary to the target sequence, there may be mismatches, ambiguous matches and/or bulges between the AON and the target sequence, whereas under physiological conditions the AON still hybridizes to the target sequence so that cellular RNA editing enzymes can edit the target adenosine . Thus, the term substantially complementary also means that, despite the presence of mismatches, ambiguous matches and/or bulges, the AON contains a sufficient number of nucleotides to match between the AON and the target sequence such that, under physiological conditions, the AON hybridizes to the target RNA. As illustrated herein, an AON may be complementary, but may also contain one or more mismatches, ambiguous matches, and/or bulges with the target sequence if in fi

- 11 045815 зиологических условиях AON способен гибридизоваться с его мишенью.- 11 045815 under physiological conditions, AON is capable of hybridizing with its target.

Термин ниже по ходу транскрипции в отношении последовательности нуклеиновой кислоты означает далее вдоль последовательности в направлении 3'; термин выше против хода транскрипции означает обратное. Таким образом, в любой последовательности, кодирующей полипептид, стартовый кодон находится выше против хода транскрипции от стоп-кодона в смысловой цепи, но находится ниже по ходу транскрипции от стоп-кодона в антисмысловой цепи.The term downstream of a nucleic acid sequence means further along the sequence in the 3' direction; the term above upstream means the opposite. Thus, in any polypeptide coding sequence, the start codon is upstream of the stop codon on the sense strand, but is downstream of the stop codon on the antisense strand.

Ссылки на гибридизацию, как правило, относятся к специфической гибридизации и исключают неспецифическую гибридизацию. Специфическая гибридизация может происходить в экспериментальных условиях, выбранных с использованием способов, хорошо известных в настоящей области техники, для обеспечения того, чтобы большинство стабильных взаимодействий между зондом и мишенью находилось там, где зонд и мишень характеризуются идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%.References to hybridization generally refer to specific hybridization and exclude nonspecific hybridization. Specific hybridization may occur under experimental conditions selected using methods well known in the art to ensure that the majority of stable probe-target interactions are where the probe and target share at least 70% sequence identity. preferably at least 80%, more preferably at least 90%.

Термин несоответствие используется в настоящем документе для обозначения противоположных нуклеотидов в комплексе двухцепочечной РНК, которые не образуют идеальных пар оснований в соответствии с правилами спаривания оснований Уотсона-Крика. Несоответствующими нуклеотидами являются пары G-A, C-A, U-C, A-A, G-G, С-С, U-U. Согласно некоторым вариантам осуществления AON по настоящему изобретению содержат менее четырех несоответствий, например, 0, 1 или 2 несоответствия. Неоднозначные пары оснований представляют собой: пары оснований G-U, I-U, I-A и I-C.The term mismatch is used herein to refer to opposing nucleotides in a double-stranded RNA complex that do not form perfect base pairs according to the Watson-Crick base pairing rules. Mismatched nucleotide pairs are G-A, C-A, U-C, A-A, G-G, C-C, U-U. In some embodiments, the AONs of the present invention contain fewer than four mismatches, such as 0, 1, or 2 mismatches. The ambiguous base pairs are: G-U, I-U, I-A and I-C base pairs.

AON согласно настоящему изобретению может быть химически модифицирован практически полностью, например, путем обеспечения всех нуклеотидов 2'-O-метилированным фрагментом сахара (2'-OMe). Однако нуклеотид, противоположный целевому аденозину, не содержит модификацию 2'-OMe и согласно еще одному предпочтительному аспекту по меньшей мере один, а согласно предпочтительному аспекту, оба соседних нуклеотида, окружающие по бокам каждый нуклеотид, противоположный целевому аденозину, дополнительно не содержат модификация 2'-OMe. Полная модификация, в которой все нуклеотиды в AON содержат модификацию 2'-OMe, приводит к нефункциональному олигонуклеотиду по мере того, как происходит редактирование РНК, по-видимому, потому, что оно препятствует активности ADAR в целевом положении. Как правило, аденозин в целевой РНК может быть защищен от редактирования путем обеспечения противоположного нуклеотида группой 2'-OMe или путем обеспечения гуанина или аденина в качестве противоположного основания, так как эти две нуклеотидные группы также могут уменьшить редактирование противоположного аденозина.The AON of the present invention can be chemically modified almost completely, for example by providing all nucleotides with a 2'-O-methylated sugar moiety (2'-OMe). However, the nucleotide opposite the target adenosine does not contain the 2'-OMe modification and, in another preferred aspect, at least one, and in a preferred aspect, both adjacent nucleotides flanking each nucleotide opposite the target adenosine additionally do not contain the 2' modification -OMe. The complete modification, in which all nucleotides in the AON contain the 2′-OMe modification, results in a nonfunctional oligonucleotide as RNA editing occurs, presumably because it interferes with ADAR activity at the target position. In general, adenosine in the target RNA can be protected from editing by providing the opposite nucleotide with a 2'-OMe group or by providing guanine or adenine as the opposite base, since these two nucleotide groups can also reduce editing of the opposite adenosine.

В области олигонуклеотидов известны различные химические вещества и модификации, которые могут быть легко использованы в соответствии с настоящим изобретением. Регулярные межнуклеозидные связи между нуклеотидами могут быть изменены моно- или дитиолирование фосфодиэфирных связей с образованием сложных эфиров фосфоротиоата или сложных эфиров фосфородитиоата соответственно. Возможны и другие модификации межнуклеозидных связей, включая в себя амидирование и пептидные линкеры. Согласно предпочтительному аспекту AON по настоящему изобретению содержат одну, две, три, четыре или более фосфоротиоатных связей между наиболее концевыми нуклеотидами AON (следовательно, предпочтительно на обоих концах 5' и 3'), что означает, что в случае четырех фосфоротиоатных связей, конечные пять нуклеотидов связаны соответственно. Специалисту в настоящей области техники будет понятно, что количество таких связей может изменяться на каждом конце, в зависимости от целевой последовательности или на основе других аспектов, таких как токсичность.Various chemicals and modifications are known in the oligonucleotide field that can be readily used in accordance with the present invention. Regular internucleoside bonds between nucleotides can be modified by mono- or dithiolation of phosphodiester bonds to form phosphorothioate esters or phosphorodithioate esters, respectively. Other modifications of internucleoside bonds are possible, including amidation and peptide linkers. In a preferred aspect, the AONs of the present invention contain one, two, three, four or more phosphorothioate bonds between the most terminal nucleotides of the AON (hence preferably at both the 5' and 3' ends), which means that in the case of four phosphorothioate bonds, the final five nucleotides are linked accordingly. One skilled in the art will appreciate that the number of such bonds may vary at each end, depending on the target sequence or based on other aspects such as toxicity.

Сахар рибоза может быть модифицирован путем замещения 2'-О-фрагмента на низший алкил (См, такой как 2'-O-Ме), алкенил (С_2-4), алкинил (С_2-4), метоксиэтил (2'-МОЕ) или другой заместитель. Предпочтительными заместителями 2'-ОН-группы являются метильная, метоксиэтильная или 3,3'-диметилаллильная группа. Последняя известна тем, что обладает свойством ингибировать чувствительность нуклеазы из-за ее объемности, одновременно повышая эффективность гибридизации (Angus & Sproat, FEBS, 1993, vol. 325, № 1, 2, 123-7). Альтернативно могут быть применены последовательности закрытых нуклеиновых кислот (LNA), содержащие 2'-4' внутримолекулярную мостиковую (как правило, метиленовый мостик между 2' кислородом и 4' углеродом) связь внутри кольца рибозы. Пуриновые нуклеотидные основания и/или пиримидиновые нуклеотидные основания могут быть модифицированы для изменения их свойств, например, путем аминирования или дезаминирования гетероциклических колец. Точные химические вещества и форматы могут зависеть от олигонуклеотидной конструкции и от применения и могут быть разработаны в соответствии с пожеланиями и предпочтениями специалистов в настоящей области техники.The ribose sugar can be modified by replacing the 2'-O moiety with a lower alkyl (Cm, such as 2'-O-Me), alkenyl ( _C2-4 ), alkynyl ( _C2-4 ), methoxyethyl (2'- MOE) or another substitute. Preferred substituents on the 2'-OH group are methyl, methoxyethyl or 3,3'-dimethylallyl group. The latter is known to have the property of inhibiting nuclease sensitivity due to its bulk, while increasing hybridization efficiency (Angus & Sproat, FEBS, 1993, vol. 325, no. 1, 2, 123-7). Alternatively, locked nucleic acid (LNA) sequences containing a 2'-4' intramolecular bridging (typically a methylene bridge between the 2' oxygen and 4' carbon) bond within the ribose ring can be used. Purine nucleotide bases and/or pyrimidine nucleotide bases can be modified to change their properties, for example, by amination or deamination of heterocyclic rings. The exact chemistries and formats may depend on the oligonucleotide design and application and may be designed in accordance with the wishes and preferences of those skilled in the art.

AON согласно настоящему изобретению, как правило, должен быть длиннее, чем 10 нуклеотидов, предпочтительно более чем 11, 12, 13, 14, 15, 16, еще более предпочтительно более чем 17 нуклеотидов. Согласно одному варианту осуществления AON согласно настоящему изобретению длиннее, чем 20 нуклеотидов. Олигонуклеотид согласно настоящему изобретению предпочтительно короче, чем 100 нуклеотидов, еще более предпочтительно менее чем 60 нуклеотидов. Согласно одному варианту осуществления AON согласно настоящему изобретению составляет менее чем 50 нуклеотидов. Согласно предпочтительному аспекту олигонуклеотид согласно настоящему изобретению содержит от 18 до 70 нуклеотидов, более предпочтительно содержит от 18 до 60 нуклеотидов и еще более предпочтительно содержит отThe AON of the present invention will generally be longer than 10 nucleotides, preferably greater than 11, 12, 13, 14, 15, 16, even more preferably greater than 17 nucleotides. In one embodiment, the AON of the present invention is longer than 20 nucleotides. The oligonucleotide of the present invention is preferably shorter than 100 nucleotides, even more preferably less than 60 nucleotides. In one embodiment, the AON of the present invention is less than 50 nucleotides. In a preferred aspect, the oligonucleotide of the present invention contains from 18 to 70 nucleotides, more preferably contains from 18 to 60 nucleotides, and even more preferably contains from

- 12 045815 до 50 нуклеотидов. Следовательно, согласно наиболее предпочтительному аспекту олигонуклеотид по настоящему изобретению содержит 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 нуклеотидов.- 12 045815 up to 50 nucleotides. Therefore, in a most preferred aspect, the oligonucleotide of the present invention contains 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 , 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 or 50 nucleotides.

В настоящей области техники известно, что редактирующие РНК объекты (такие как ферменты ADAR человека) редактируют структуры dsRNA с различной специфичностью, в зависимости от ряда факторов. Одним из важных факторов является степень комплементарности двух нитей, составляющих последовательность dsRNA. Совершенная комплементарность двух нитей, как правило, приводит к тому, что каталитический домен hADAR дезаминирует аденозины недискриминационным образом, более или менее реагируя на любой аденозин, с которым он сталкивается. Специфичность hADAR1 и 2 может быть увеличена путем введения химических модификаций и/или обеспечения ряда несоответствий в dsRNA, которые, по-видимому, помогают расположить связывающие dsRNA домены таким образом, который еще не был четко определен. Кроме того, сама реакция дезаминирования может быть усилена за счет предоставления AON, который содержит несоответствие, противоположное редактируемому аденозину. Несоответствие предпочтительно создается путем обеспечения нацеливающего участка, содержащего цитидин, противоположный редактируемому аденозину. В качестве альтернативы также можно использовать уридины напротив аденозина, что по понятным причинам не приведет к несоответствию из-за пары U и А. При дезаминировании аденозина в целевой нити целевая нить будет получать инозин, который для большинства биохимических процессов считывается биохимическим механизмом клетки в виде G. Следовательно, после преобразования А в I несоответствие было разрешено, поскольку I отлично способен к образованию пары оснований с противоположным С в нацеливающем участке олигонуклеотидной конструкции в соответствии с настоящим изобретением. После того как несоответствие было разрешено благодаря редактированию, субстрат высвобождается и редактирующий олигонуклеотидную конструкцию комплекс объектов освобождается от целевой последовательности РНК, которая затем становится доступной для последующих биохимических процессов, таких как сплайсинг и трансляция. Также эта скорость ассоциации/диссоциации важна, поскольку целевой олигонуклеотид не должен быть слишком сильно связан с целевой РНК.It is known in the art that RNA editing entities (such as human ADAR enzymes) edit dsRNA structures with varying specificities, depending on a number of factors. One important factor is the degree of complementarity of the two strands that make up the dsRNA sequence. Perfect complementarity of the two strands typically causes the hADAR catalytic domain to deaminate adenosines in a nondiscriminatory manner, more or less responsive to any adenosine it encounters. The specificity of hADAR1 and 2 can be increased by introducing chemical modifications and/or providing a series of mismatches in the dsRNA that appear to help position the dsRNA binding domains in a manner that has not yet been clearly defined. Additionally, the deamination reaction itself can be enhanced by providing an AON that contains the opposite mismatch to the adenosine being edited. The mismatch is preferably created by providing a targeting site containing a cytidine opposite the adenosine being edited. As an alternative, it is also possible to use uridines opposite adenosine, which for obvious reasons will not result in a mismatch due to the U and A pair. By deaminating the adenosine in the target strand, the target strand will receive inosine, which for most biochemical processes is read by the cell's biochemical machinery as G Therefore, after conversion of A to I, the mismatch was resolved since I is perfectly capable of forming a base pair with the opposite C in the targeting region of the oligonucleotide construct in accordance with the present invention. Once the mismatch has been resolved by editing, the substrate is released and the oligonucleotide construct editing complex is freed from the target RNA sequence, which then becomes available for subsequent biochemical processes such as splicing and translation. Also, this association/dissociation rate is important because the target oligonucleotide should not be too strongly associated with the target RNA.

Желаемый уровень специфичности редактирования целевой последовательности РНК может зависеть от мишени. Следуя инструкциям, приведенным в настоящей патентной заявке, специалисты в настоящей области техники смогут разработать комплементарную часть олигонуклеотида в соответствии с их потребностями и экспериментальным путем получить желаемый результат.The desired level of specificity for editing a target RNA sequence may depend on the target. By following the instructions given in this patent application, those skilled in the art will be able to design the complementary portion of the oligonucleotide according to their needs and experimentally obtain the desired result.

Олигонуклеотид по настоящему изобретению, как правило, будет содержать нормальные нуклеотиды A, G, U и С, но может также включать в себя инозин (I), например, вместо одного или более нуклеотидов G.The oligonucleotide of the present invention will generally contain the normal A, G, U and C nucleotides, but may also include inosine (I), for example, in place of one or more G nucleotides.

Чтобы предотвратить нежелательное редактирование аденозинов в целевой последовательности РНК в области перекрытия с олигонуклеотидной конструкцией, олигонуклеотид может быть химически модифицирован. В настоящей области техники показано, что 2'-О-метилирование рибозильного фрагмента нуклеозида, противоположного аденозину в целевой последовательности РНК, значительно снижает дезаминирование этого аденозина с помощью ADAR (Vogel et al., 2014). Следовательно, путем включения 2'-метокси (2'-ОМе) нуклеотидов в желаемое положение олигонуклеотидной конструкции, специфичность редактирования значительно улучшается. Другие 2'-О-замены рибозильной группы, такие как 2'-метоксиэтильные (2'-МОЕ) и 2'-О-диметилаллильные группы, также могут уменьшить нежелательное редактирование соответствующего (противоположного) аденозина в целевой последовательности РНК. Все эти модификации могут быть применены в олигонуклеотидах по настоящему изобретению. Другие химические модификации также легко доступны специалисту, имеющему обычный навык в области синтеза и дизайна олигонуклеотидов. Синтез таких химически модифицированных олигонуклеотидов и их исследование в способах согласно настоящему изобретению не вызывает чрезмерных сложностей, и другие модификации охватываются настоящим изобретением.To prevent unwanted editing of adenosines in the target RNA sequence in the region of overlap with the oligonucleotide construct, the oligonucleotide can be chemically modified. The present art has shown that 2'-O-methylation of the ribosyl moiety of the nucleoside opposite the adenosine in the target RNA sequence significantly reduces the deamination of that adenosine by ADAR (Vogel et al., 2014). Therefore, by incorporating 2'-methoxy (2'-OMe) nucleotides at the desired position of the oligonucleotide construct, editing specificity is significantly improved. Other 2'-O-ribosyl group substitutions, such as 2'-methoxyethyl (2'-MOE) and 2'-O-dimethylallyl groups, can also reduce unwanted editing of the corresponding (opposite) adenosine in the target RNA sequence. All of these modifications can be used in the oligonucleotides of the present invention. Other chemical modifications are also readily available to one of ordinary skill in the art of oligonucleotide synthesis and design. The synthesis of such chemically modified oligonucleotides and their testing in the methods of the present invention is not unduly difficult, and other modifications are covered by the present invention.

Редактирующие РНК молекулы, присутствующие в клетке, как правило, будут белковыми по своей природе, такими как ферменты ADAR, обнаруженные в многоклеточных организмах, включая в себя млекопитающих. Предпочтительно, клеточный редактирующий объект представляет собой фермент, более предпочтительно аденозиндезаминазу или цитидиндезаминазу, еще более предпочтительно аденозиндезаминазу. Наиболее интересны человеческие ADAR, hADAR1 и hADAR2, включая в себя любые их изоформы, такие как hADAR1 p110 и р150. Редактирующие РНК ферменты, известные в настоящей области техники, для которых могут быть сконструированы олигонуклеотидные конструкции в соответствии с настоящим изобретением, включают в себя аденозиндезаминазы, действующие на РНК (ADAR), такие как hADAR1 и hADAR2 у людей или в клетках человека, и цитидиндезаминазы. Человеческий ADAR3 (hADAR3) описан в предшествующем уровне техники, но, как сообщается, не имеет дезаминазной активности. Известно, что hADAR1 существует в двух изоформах; длинная индуцибельная версия интерферона длиной 150 кДа и более короткая версия длиной 100 кДа, которая производится путем альтернативного сплайсинга из общей пре-мРНК. Следовательно, содержание изоформы размером 150 кДа, присутствующей в клетке, может зависеть от интерферона, в частности, интерферона-гамма (IFN-гамма). hADAR1 также индуцируется TNF-альфа. Это дает возможность разработать комбинированную тера- 13 045815 пию, при которой интерферон-гамма или TNF-альфа и олигонуклеотиды согласно настоящему изобретению вводят пациенту либо в виде комбинированного продукта, либо в виде отдельных продуктов, как одновременно, так и последовательно в любом порядке. Некоторые заболевания могут уже совпадать с повышенным содержанием IFN-гамма или TNF-альфа в определенных тканях пациента, создавая дополнительные возможности для более специфического редактирования для пораженных тканей.RNA editing molecules present in a cell will typically be protein in nature, such as ADAR enzymes found in multicellular organisms, including mammals. Preferably, the cellular editing entity is an enzyme, more preferably an adenosine deaminase or a cytidine deaminase, even more preferably an adenosine deaminase. The most interesting are the human ADARs, hADAR1 and hADAR2, including any of their isoforms, such as hADAR1 p110 and p150. RNA editing enzymes known in the art for which oligonucleotide constructs can be designed in accordance with the present invention include adenosine deaminases acting on RNA (ADARs), such as hADAR1 and hADAR2 in humans or in human cells, and cytidine deaminases. Human ADAR3 (hADAR3) is described in the prior art, but is reported to have no deaminase activity. hADAR1 is known to exist in two isoforms; a long inducible 150 kDa version of interferon and a shorter 100 kDa version that is produced by alternative splicing from common pre-mRNA. Therefore, the amount of the 150 kDa isoform present in the cell may depend on interferon, in particular interferon-gamma (IFN-gamma). hADAR1 is also induced by TNF-alpha. This makes it possible to develop a combination therapy in which interferon-gamma or TNF-alpha and the oligonucleotides of the present invention are administered to a patient either as a combination product or as separate products, either simultaneously or sequentially in any order. Some diseases may already coincide with elevated levels of IFN-gamma or TNF-alpha in certain patient tissues, creating additional opportunities for more specific editing to affected tissues.

Примерами химических модификаций в AON по настоящему изобретению являются модификации фрагмента сахара, включая в себя сшивающие заместители внутри фрагмента сахара (рибозы) (например, как в LNA или замкнутых нуклеиновых кислотах) путем замещения атома 2'-О-алкильной (например, 2'-О-метильной), алкинильной (2'-О-алкинильной), алкенильной (2'-О-алкенильной), алкоксиалкильной (например, метоксиэтильной, 2'-МОЕ) групп, характеризующихся длиной, указанной выше, и т.п. Кроме того, фосфодиэфирная группа остова может быть модифицирована посредством тиолирования, дитиолирования, амидирования и т.п., чтобы получить фосфоротиоатные, фосфородитиоатные, фосфорамидатные и т.д. межнуклеозидные связи. Межнуклеозидные связи могут быть полностью или частично заменены пептидными связями с выходом последовательности пептидонуклеиновой кислоты и т.п. Альтернативно или дополнительно нуклеотидные основания могут быть модифицированы путем (де)аминирования с получением инозина или 2'6'-диаминопуринов и т.п. Еще одной модификацией может быть метилирование С5 в цитидинном фрагменте нуклеотида для уменьшения потенциальных иммуногенных свойств, которые, как известно, связаны с последовательностями CpG.Examples of chemical modifications in the AON of the present invention are modifications of the sugar moiety to include cross-linking substituents within the sugar (ribose) moiety (eg, as in LNA or locked nucleic acids) by substituting a 2'-O-alkyl atom (eg, 2'- O-methyl), alkynyl (2'-O-alkynyl), alkenyl (2'-O-alkenyl), alkoxyalkyl (e.g. methoxyethyl, 2'-MOE) groups having the length specified above, etc. In addition, the phosphodiester group of the backbone can be modified by thiolation, dithiolation, amidation, etc. to obtain phosphorothioate, phosphorodithioate, phosphoramidate, etc. internucleoside bonds. Internucleoside bonds can be completely or partially replaced by peptide bonds to yield a peptide nucleic acid sequence or the like. Alternatively or additionally, the nucleotide bases can be modified by (de)amination to produce inosine or 2'6'-diaminopurines and the like. Another modification could be methylation of C5 in the cytidine moiety of the nucleotide to reduce the potential immunogenic properties known to be associated with CpG sequences.

В случае, когда комплекс dsRNA мобилизует ферменты ADAR для дезаминирования А в I в целевой последовательности РНК, пара оснований, несоответствие, выпуклость или неоднозначное соответствие между подлежащим редактированию аденозином и противоположным нуклеотидом может содержать аденозин, гуанин, уридин или остаток цитидина, но предпочтительно остаток цитидина. За исключением потенциального несоответствия напротив сайта редактирования (когда не применяется уридин), оставшаяся часть AON может быть полностью комплементарной целевой РНК. Однако, как показано в настоящем документе, согласно некоторым аспектам настоящее изобретение относится к AON, которые содержат ограниченное количество несовершенных соответствий. Специалисту в настоящей области техники будет понятно, что степень, в которой объекты редактирования внутри клетки перенаправляются к другим целевым сайтам, может регулироваться путем изменения аффинности олигонуклеотидов в соответствии с настоящим изобретением для домена распознавания молекулы редактирования. Точная модификация может быть определена с помощью экспериментальных способов и/или посредством вычислительных способов, основанных на структурных взаимодействиях между олигонуклеотидом и доменом распознавания молекулы редактирования.In the case where the dsRNA complex mobilizes ADAR enzymes to deaminate A to I in the target RNA sequence, the base pair, mismatch, bulge, or ambiguous match between the adenosine to be edited and the opposing nucleotide may contain an adenosine, guanine, uridine, or cytidine residue, but preferably a cytidine residue . Except for a potential mismatch opposite the editing site (when no uridine is used), the remainder of the AON may be completely complementary to the target RNA. However, as shown herein, in some aspects, the present invention relates to AONs that contain a limited number of imperfect matches. One skilled in the art will appreciate that the extent to which editing targets within a cell are redirected to other target sites can be controlled by changing the affinity of the oligonucleotides of the present invention for the editing molecule recognition domain. The exact modification can be determined using experimental methods and/or computational methods based on structural interactions between the oligonucleotide and the recognition domain of the editing molecule.

Дополнительно или альтернативно, степень мобилизации и перенаправления объекта редактирования, находящегося в клетке, может регулироваться дозированием и режимом дозирования олигонуклеотида. Это может быть определено экспериментатором (in vitro) или клиницистом, как правило, в I и/или II фазе клинических испытаний.Additionally or alternatively, the degree of mobilization and redirection of the editing target located in the cell can be controlled by the dosage and dosage regimen of the oligonucleotide. This can be determined by an experimenter (in vitro) or a clinician, usually in phase I and/or II clinical trials.

Настоящее изобретение относится к модификации целевых последовательностей РНК в эукариотических организмах, предпочтительно многоклеточных организмах, более предпочтительных клетках млекопитающих. В принципе настоящее изобретение может быть использовано с клетками любых видов млекопитающих, но оно предпочтительно используется с клеткой человека. Настоящее изобретение может быть использовано с клетками из любого органа, например, кожи, легкого, сердца, почки, печени, поджелудочной железы, кишечника, мышцы, железы, глаза, головного мозга, крови и т.п. Настоящее изобретение особенно подходит для модификации последовательностей в клетках, тканях или органах, вовлеченных в состояние заболевания (человека). Такие клетки включают в себя, без ограничения, эпителиальные клетки легкого или желудочно-кишечного тракта, клетки репродуктивных органов, мышечные клетки, клетки глаза, клетки кожи, клетки таких тканей и органов, как печень, почки, поджелудочная железа, иммунные клетки, раковые клетки, клетки желез, клетки головного мозга и т.п. Настоящее изобретение также может быть использовано с клетками млекопитающих, которые, по своей природе, не присутствуют в организме, например, с клеточной линией или с эмбриональной стволовой (ES) клеткой. Настоящее изобретение может быть использовано с различными типами стволовых клеток, включая в себя плюрипотентные стволовые клетки, тотипотентные стволовые клетки, эмбриональные стволовые клетки, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки и т.д. Клетка может находиться in vitro или in vivo. Одно из преимуществ настоящего изобретения состоит в том, что его можно использовать с клетками in situ в живом организме, но его можно также использовать с клетками в культуре. Согласно некоторым вариантам осуществления клетки обрабатывают ex vivo и затем вводят в живой организм (например, повторно вводят в организм, из которого они были первоначально получены). Настоящее изобретение также может быть использовано для редактирования целевых последовательностей РНК в клетках внутри так называемого органоида. Органоиды можно рассматривать как трехмерные ткани, полученные in vitro, но полученные с использованием конкретных условий для создания отдельных выделенных тканей (например, Lancaster & Knoblich, Science, 2014, vol. 345, № 6194, 1247125). В плане терапии они полезны, потому что они могут быть получены in vitro из клеток пациента, и органоиды затем могут быть повторно введены пациенту в качестве аутологичного материала, который с меньшей вероятThe present invention relates to the modification of target RNA sequences in eukaryotic organisms, preferably multicellular organisms, more preferably mammalian cells. In principle, the present invention can be used with cells of any mammalian species, but it is preferably used with a human cell. The present invention can be used with cells from any organ, such as skin, lung, heart, kidney, liver, pancreas, intestine, muscle, gland, eye, brain, blood, etc. The present invention is particularly suitable for modifying sequences in cells, tissues or organs involved in a (human) disease state. Such cells include, but are not limited to, epithelial cells of the lung or gastrointestinal tract, cells of the reproductive organs, muscle cells, eye cells, skin cells, cells of tissues and organs such as the liver, kidneys, pancreas, immune cells, cancer cells , gland cells, brain cells, etc. The present invention can also be used with mammalian cells that are not naturally present in the body, such as a cell line or an embryonic stem (ES) cell. The present invention can be used with various types of stem cells, including pluripotent stem cells, totipotent stem cells, embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells, etc. The cell may be in vitro or in vivo. One of the advantages of the present invention is that it can be used with cells in situ in a living organism, but it can also be used with cells in culture. In some embodiments, the cells are processed ex vivo and then introduced into a living organism (eg, reintroduced into the organism from which they were originally obtained). The present invention can also be used to edit target RNA sequences in cells within a so-called organelle. Organoids can be thought of as three-dimensional tissues produced in vitro, but produced using specific conditions to create individual isolated tissues (e.g., Lancaster & Knoblich, Science, 2014, vol. 345, no. 6194, 1247125). In terms of therapy, they are useful because they can be obtained in vitro from the patient's cells, and the organoids can then be reintroduced into the patient as autologous material, which is less likely to

- 14 045815 ностью будет отторгнут, чем обычный трансплантат. Таким образом, согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящее изобретение может быть осуществлено на органоидах, выращенных из образцов тканей, взятых у пациента (например, из их желудочно-кишечного тракта; см. Sala et al., J. Surg. Res., 2009, 156(2):205-12; а также Sato et al., Gastroenterology, 2011, 141:1762-72); при редактировании РНК в соответствии с настоящим изобретением органоиды или стволовые клетки, находящиеся внутри органоидов, могут быть использованы для пересадки обратно пациенту для улучшения функции органа. Подлежащая лечению клетка, как правило, будет иметь генетическую мутацию. Мутация может быть гетерозиготной или гомозиготной. Настоящее изобретение, как правило, будет использоваться для модификации точечных мутаций, таких как мутации N на А, где N может представлять собой G, С, U (Т на уровне ДНК), предпочтительно мутации G на А или мутации N на С, где N может представлять собой A, G, U (Т на уровне ДНК), предпочтительно мутации U на С. Гены, содержащие представляющие особый интерес мутации, обсуждаются ниже. Однако согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение используется противоположным путем посредством введения мутации, связанной с заболеванием, в клеточную линию или животное, чтобы обеспечить полезный исследовательский инструмент для рассматриваемого заболевания. В качестве примера создания модели заболевания авторы настоящего изобретения предоставили олигонуклеотидную последовательность, которая предусматривает набор редактирующей активности в клетке человека для создания мутации в гене СЕР290, создавая криптический сайт сплайсинга, который составляет основу для формы врожденного амавроза Лебера (LCA 10), наиболее распространенной формы врожденной детской слепоты.- 14 045815 will be more rejected than a regular transplant. Thus, in another preferred embodiment, the present invention can be practiced on organoids grown from tissue samples taken from a patient (eg, from their gastrointestinal tract; see Sala et al., J. Surg. Res., 2009, 156(2):205-12; and Sato et al., Gastroenterology, 2011, 141:1762-72); by editing the RNA in accordance with the present invention, the organoids or stem cells contained within the organoids can be used to be transplanted back into the patient to improve organ function. The cell being treated will usually have a genetic mutation. The mutation can be heterozygous or homozygous. The present invention will generally be used to modify point mutations such as N to A mutations, where N may be G, C, U (T at the DNA level), preferably G to A mutations or N to C mutations, where N may be A, G, U (T at the DNA level), preferably U to C mutations. Genes containing mutations of particular interest are discussed below. However, in some embodiments, the present invention is used in the opposite way by introducing a disease-associated mutation into a cell line or animal to provide a useful research tool for the disease in question. As an example of creating a disease model, the present inventors have provided an oligonucleotide sequence that recruits editing activity in a human cell to create a mutation in the CEP290 gene, creating a cryptic splice site that forms the basis for a form of Leber congenital amaurosis (LCA 10), the most common form of congenital amaurosis. childhood blindness.

Мутация, которая должна быть восстановлена посредством редактирования РНК, возможно, возникла на уровне хромосомы или какой-либо другой формы ДНК, такой как митохондриальная ДНК или РНК, включая в себя пре-мРНК, рибосомальную РНК или митохондриальную РНК. Могут быть внесены изменения в целевую РНК возбудителя, включая в себя грибы, дрожжи, паразиты, кинетопластиды, бактерии, фаги, вирусы и т.д., которыми была инфицирована клетка или субъект. Впоследствии редактирование может происходить на уровне РНК на целевой последовательности внутри такой клетки, субъекта или патогена. Некоторые патогены, такие как вирусы, высвобождают свою нуклеиновую кислоту, ДНК или РНК, в клетку инфицированного хозяина (клетку). Другие патогены обитают или циркулируют в зараженном хозяине. Олигонуклеотидные конструкции по настоящему изобретению могут быть использованы для редактирования целевых последовательностей РНК, находящихся в клетке инфицированного эукариотического хозяина, или для редактирования последовательности РНК внутри клетки патогена, проживающего или циркулирующего в эукариотическом хозяине, до тех пор, пока клетки, где должно происходить редактирование, содержат объект редактирования, совместимый с олигонуклеотидной конструкцией, введенной в него.The mutation to be repaired by RNA editing may have occurred at the level of a chromosome or some other form of DNA such as mitochondrial DNA or RNA, including pre-mRNA, ribosomal RNA or mitochondrial RNA. Changes may be made to the target RNA of the pathogen, including fungi, yeast, parasites, kinetoplastids, bacteria, phages, viruses, etc., with which the cell or subject has been infected. Subsequently, editing can occur at the RNA level on the target sequence within such a cell, subject or pathogen. Some pathogens, such as viruses, release their nucleic acid, DNA or RNA, into an infected host cell (cell). Other pathogens reside or circulate in the infected host. The oligonucleotide constructs of the present invention can be used to edit target RNA sequences located in the cell of an infected eukaryotic host, or to edit RNA sequences within the cell of a pathogen residing or circulating in the eukaryotic host, as long as the cells where editing is to occur contain an editing object compatible with the oligonucleotide construct introduced into it.

Без желания быть связанными с теорией, авторы полагают, что редактирование РНК через hADAR1 и hADAR2, как полагают, имеет место на первичных транскриптах в ядре во время транскрипции или сплайсинга или в цитоплазме, где, например, зрелая мРНК, miRNA или ncRNA, могут быть отредактированы. Известно, что различные изоформы редактирующих ферментов локализуются по-разному, например, p110 hADAR1 обнаруживается в основном в ядре, а р150 hADAR1 в цитоплазме. Считается, что редактирование РНК цитидиндезаминазами происходит на уровне мРНК. Редактирование кодонов митохондриальных РНК или некодирующих последовательностей в зрелых мРНК не исключается.Without wishing to be bound by theory, the authors believe that RNA editing through hADAR1 and hADAR2 is believed to take place on primary transcripts in the nucleus during transcription or splicing or in the cytoplasm, where, for example, mature mRNA, miRNA or ncRNA, may be edited. It is known that different isoforms of editing enzymes are localized differently, for example, p110 hADAR1 is found mainly in the nucleus, and p150 hADAR1 in the cytoplasm. It is believed that RNA editing by cytidine deaminases occurs at the mRNA level. Editing of mitochondrial RNA codons or non-coding sequences in mature mRNAs is not excluded.

Настоящее изобретение используется для внесения изменения в целевую последовательность РНК в эукариотической клетке с использованием олигонуклеотида, который способен нацеленно воздействовать на подлежащий редактированию сайт и мобилизировать объекты редактирования РНК, находящиеся в клетке, чтобы вызвать реакцию(и) редактирования). Предпочтительными реакциями редактирования являются аденозиновые дезаминирования и цитидиновые дезаминирования, превращающие аденозины в инозины и цитидины в уридины соответственно. Изменения могут быть в 5' или 3' нетранслируемых областях целевой РНК, в (криптических) сайтах сплайсинга, в экзонах (изменение аминокислот в белке, транслированном из целевой РНК, использование кодонов или сплайсинг путем изменения экзонных сайленсеров или энхансеров сплайсинга, путем введения или удаления старт-кодонов или стоп-кодонов), в интронах (изменение сплайсинга путем изменения интронных сайленсеров сплайсинга или интронных энхансеров сплайсинга, точек ветвления) и вообще в любой области, влияющей на стабильность, структуру или функционирование РНК. Целевая последовательность РНК может содержать мутацию, которую можно исправить или изменить, такую как точечная мутация (транзиция или трансверсия). Альтернативно, целевая последовательность РНК преднамеренно подвергают мутации для создания измененного фенотипа (или генотипа, в случае организмов на основе РНК, таких как РНК-вирусы), где раньше не было мутаций. Например, могут быть получены клеточные линии или животные, которые несут изменения (мутации) в целевой последовательности РНК, которые могут использоваться в анализах или в качестве (животных, органоидных и др.) модельных систем для изучения заболевания, исследования экспериментальных соединений против заболевания и т.п. Олигонуклеотидные конструкции и способы согласно настоящему изобретению могут быть использованы в системах высокопроизводительного скрининга (в формате массивов) для создания банков клеток с большим количеством целевых РНК, например, кодирования большого разнообразия белковых изоформ, для дальнейших экспериментов, включая в себяThe present invention is used to make a change to a target RNA sequence in a eukaryotic cell using an oligonucleotide that is capable of targeting the site to be edited and mobilizing RNA editing entities present in the cell to induce the editing reaction(s). The preferred editing reactions are adenosine deaminations and cytidine deaminations, converting adenosines to inosines and cytidines to uridines, respectively. Changes can be in the 5' or 3' untranslated regions of the target RNA, in (cryptic) splice sites, in exons (amino acid changes in the protein translated from the target RNA, codon usage, or splicing by changing exonic silencers or splice enhancers, by insertion or deletion start codons or stop codons), in introns (changes in splicing by changing intronic splicing silencers or intronic splicing enhancers, branch points) and in general in any area that affects the stability, structure or functioning of RNA. The target RNA sequence may contain a mutation that can be corrected or changed, such as a point mutation (transition or transversion). Alternatively, the target RNA sequence is deliberately mutated to create an altered phenotype (or genotype, in the case of RNA-based organisms such as RNA viruses) where there was no mutation before. For example, cell lines or animals can be obtained that carry changes (mutations) in the target RNA sequence, which can be used in assays or as (animal, organoid, etc.) model systems for studying disease, researching experimental compounds against disease, etc. .P. Oligonucleotide constructs and methods according to the present invention can be used in high-throughput screening systems (in array format) to create banks of cells with a large number of target RNAs, for example, encoding a wide variety of protein isoforms, for further experiments, including

- 15 045815 скрининг соединений, белковую инженерию и тому подобное.- 15 045815 compound screening, protein engineering and the like.

Целевая РНК может представлять собой любую клеточную или вирусную последовательность РНК, но чаще она представляет собой пре-мРНК или мРНК с функцией кодирования белка.The target RNA can be any cellular or viral RNA sequence, but is more commonly pre-mRNA or mRNA with protein-coding function.

Исключительно для облегчения упоминания и без намерения ограничить настоящее изобретение представлена табл. 1 для иллюстрации потенциальных изменений кодонов, которые могут быть вызваны редактированием аденозиндезаминазы, направленным олигонуклеотидами по настоящему изобретению. Табл. 1, в частности, не должна интерпретироваться как ограничение применимости настоящего изобретения к кодирующим последовательностям в любой РНК; как уже отмечалось, настоящее изобретение может быть осуществлено на любой целевой РНК, содержащей аденозин, будь то в кодирующей области, интроне, некодирующем экзоне (таком как 5'- или 3'-нетранслируемый участок), в miRNA, тРНК, рРНК и т.д. Чтобы избежать какого-либо недоразумения в отношении ширины применимости, изменения, которые несущественны (молчащие) с точки зрения кодирования, могут все еще изменять экспрессию гена определенного белка, поскольку некоторые кодоны для той же аминокислоты могут быть более предпочтительными, чем другие, и могут приводить, например, к отличающейся стабильности транскрипции или эффективности трансляции, в результате чего кодируемый белок становится более или менее многочисленным, чем без изменений.For ease of reference only and without intention to limit the present invention, the present invention is presented in Table 1. 1 to illustrate the potential codon changes that may be caused by adenosine deaminase editing directed by the oligonucleotides of the present invention. Table 1 in particular should not be interpreted as limiting the applicability of the present invention to coding sequences in any RNA; As noted, the present invention can be practiced on any target RNA containing adenosine, whether in the coding region, intron, non-coding exon (such as the 5' or 3' untranslated region), miRNA, tRNA, rRNA, etc. d. To avoid any confusion regarding the breadth of applicability, changes that are unimportant (silent) from a coding perspective may still alter the gene expression of a particular protein, since some codons for the same amino acid may be more favored than others and may result in , for example, to differing transcriptional stability or translational efficiency, causing the encoded protein to be more or less abundant than without the change.

- 16 045815- 16 045815

AUA AUA He He GAU GAU Asp Asp AUG AUG Met Met GUG G.U.G. Vai Vai AUC AUC He He GUC GUC Vai Vai AUG AUG Met Met GUG G.U.G. Vai Vai AUU AUU lie lie GUU GUU Vai Vai САА SAA Gin Gin CGA C.G.A. Arg Arg CGG CGG Arg Arg САС CAC His His CGC C.G.C. Arg Arg CAG CAG Gin Gin CGG CGG Arg Arg CAU CAU His His CGU C.G.U. Arg Arg ССА SSA Pro Pro CGA C.G.A. Arg Arg CUA CUA Leu Leu GAA GAA Glu Glu GGA GGA Gly Gly GGG GGG Gly Gly GCA G.C.A. Ala Ala GUA GUA Vai Vai GGA GGA Gly Gly GAC GAC Asp Asp GGC GGC Gly Gly GAG GAG Glu Glu GGG GGG Gly Gly GAU GAU Asp Asp GGU GGU Gly Gly UAA UAA Stop Stop UGG UGG Trp Trp UCA UCA Ser Ser UGA U.G.A. Stop Stop UGG UGG Trp Trp UUA UUA Leu Leu UAC UAC Tyr Tyr UGC UGC Cys Cys UAG UAG Stop Stop UGG UGG Trp Trp UAU UAU Tyr Tyr UGU UGU Cys Cys

Целевыми аденозинами, представляющими особый интерес для редактирования с использованием олигонуклеотидов в соответствии с настоящим изобретением, являются те, которые представляют собой часть кодонов для аминокислотных остатков, которые определяют ключевые функции или характеристики, такие как каталитические сайты, сайты связывания для других белков, связывание субстратами, домены локализации, для ко- или посттрансляционной модификации, такой как гликозилирование, гидроксилирование, миристоилирование, расщепление белка протеазами (для созревания белка и/или как часть внутриклеточной маршрутизации) и т.д.Target adenosines of particular interest for editing using oligonucleotides in accordance with the present invention are those that represent part of the codons for amino acid residues that define key functions or characteristics, such as catalytic sites, binding sites for other proteins, binding by substrates, localization domains, for co- or post-translational modification such as glycosylation, hydroxylation, myristoylation, protein cleavage by proteases (for protein maturation and/or as part of intracellular routing), etc.

Множество генетических заболеваний вызвано мутациями из G в А, и они представляют собой предпочтительные целевые заболевания, поскольку дезаминирование аденозина у мутированного целевого аденозина приведет к превращению мутации в дикий тип. Однако превращение в дикий тип не всегда может быть необходимо для получения положительного эффекта. Модификация из А в G в мишени также может быть полезной, если нуклеотид дикого типа отличается от G. В определенных обстоятельствах это может быть предсказано на основе доказательств, в других это может потребовать некоторого исследования. В определенных обстоятельствах модификация из А в целевой РНК в G, где дикий тип не представляет собой G, может быть молчащей (не транслироваться в другую аминокислоту) или иным образом незначимой (например, аминокислота замещена, но она представляет собой консервативную замену, которая не нарушает структуру и функцию белка), или аминокислота представляет собой часть функционального домена, который обладает определенной устойчивостью к изменениям. Если переходMany genetic diseases are caused by G to A mutations, and these are preferred target diseases because deamination of adenosine in the mutated target adenosine will cause the mutation to become wild type. However, transformation into the wild type may not always be necessary to obtain a beneficial effect. An A to G modification in the target may also be useful if the wild-type nucleotide is different from G. In certain circumstances this may be predicted by evidence, in others it may require some investigation. In certain circumstances, the modification from A in the target RNA to G, where the wild type is not G, may be silent (not translated to another amino acid) or otherwise insignificant (for example, an amino acid is substituted, but it is a conservative substitution that does not disrupt protein structure and function), or an amino acid is part of a functional domain that has a certain resistance to change. If the transition

- 17 045815 из А в G, вызванный редактированием в соответствии с настоящим изобретением, относится к некодирующей РНК или некодирующей части РНК, это может также быть несущественным или менее серьезным, чем исходная мутация. Специалисты в настоящей области техники поймут, что применимость настоящего изобретения очень широка и даже не ограничена профилактикой или лечением заболеваний. Настоящее изобретение также может быть использовано для модификации транскриптов для изучения ее влияния, даже если или особенно когда такая модификация индуцирует заболевание, например, в клетке или модели животного, отличного от человека. Предпочтительными примерами генетических заболеваний, которые могут быть предотвращены и/или подвергаться лечению олигонуклеотидами согласно настоящему изобретению, являются любые заболевания, при которых модификация одного или более аденозинов в целевой РНК приведет к (потенциально) полезному изменению.- 17 045815 from A to G caused by editing in accordance with the present invention refers to non-coding RNA or non-coding part of RNA, it may also be minor or less severe than the original mutation. Those skilled in the art will appreciate that the applicability of the present invention is very broad and is not even limited to the prevention or treatment of diseases. The present invention can also be used to modify transcripts to study its effect, even if or especially when such modification induces disease, for example, in a cell or non-human animal model. Preferred examples of genetic diseases that may be prevented and/or treated by the oligonucleotides of the present invention are any disease in which modification of one or more adenosines in the target RNA will result in a (potentially) beneficial change.

Транскрибированные последовательности РНК, которые представляют собой потенциальные целевые последовательности РНК в соответствии с настоящим изобретением, содержащие представляющие особый интерес мутации, включают в себя, без ограничения, транскрибируемые из гена CFTR (муковисцидозный регулятор трансмембранной проводимости), дистрофии, хантингтин, нейрофибромин 1, нейрофибромин 2, β-глобиновую цепь гемоглобина, СЕР290 (центросомальный белок 290 кДа), ген НЕХА β-гексозаминидазы А и любой из генов Usher (например, USH2A, кодирующий Usherin), ответственный за форму генетической слепоты, называемой синдромом Ушера. Более подробный список представлен ниже. Целевая последовательность будет выбрана соответствующим образом, и олигонуклеотидная конструкция будет включать желаемую модификацию для коррекции мутации. Специалисты в области мутаций CF признают, что в гене CFTR известны от 1000 до 2000 мутаций, включающих в себя R117H, G542X, G551D, R553X, W1282X HN1303K.Transcribed RNA sequences that are potential target RNA sequences in accordance with the present invention containing mutations of particular interest include, but are not limited to, those transcribed from the CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) gene, dystrophy, huntingtin, neurofibromin 1, neurofibromin 2 , the β-globin chain of hemoglobin, CEP290 (centrosomal protein 290 kDa), the HEXA β-hexosaminidase A gene, and any of the Usher genes (for example, USH2A, encoding Usherin), responsible for a form of genetic blindness called Usher syndrome. A more detailed list is provided below. The target sequence will be selected accordingly and the oligonucleotide design will include the desired modification to correct the mutation. Experts in the field of CF mutations recognize that there are between 1000 and 2000 known mutations in the CFTR gene, including R117H, G542X, G551D, R553X, W1282X HN1303K.

В общем, мутации в любой целевой РНК, которая может быть обращена вспять с использованием олигонуклеотидных конструкций в соответствии с настоящим изобретением, представляют собой мутации из G в А, в случае мобилизации аденозиндезаминазы и мутации из U в С в случае мобилизации цитидиндезаминазы, а олигонуклеотидные конструкции могут соответственно. Мутации, которые могут быть нацелены с использованием олигонуклеотидных конструкций в соответствии с настоящим изобретением, также включают в себя из С в А, из U в А (из Т в А на уровне ДНК) в случае мобилизации аденозиндезаминаз и мутаций из А вС и из О вСв случае мобилизации цитидиндезаминаз. Хотя редактирование РНК в последних обстоятельствах может не обязательно возвращать мутацию в дикий тип, отредактированный нуклеотид может привести к улучшению по сравнению с исходной мутацией. Например, мутация, которая вызывает в рамке считывания стоп-кодон, приводящий к укороченному белку при трансляции, может быть изменена на кодон, кодирующий аминокислоту, которая не может быть исходной аминокислотой в этом положении, но это приводит к возникновению (полноразмерного) белка, по меньшей мере с некоторой функциональностью, по меньшей мере более функционального, чем усеченный белок.In general, mutations in any target RNA that can be reversed using the oligonucleotide constructs of the present invention are G to A mutations in the case of adenosine deaminase mobilization and U to C mutations in the case of cytidine deaminase mobilization, and the oligonucleotide constructs can accordingly. Mutations that can be targeted using the oligonucleotide constructs of the present invention also include C to A, U to A (T to A at the DNA level) in the case of adenosine deaminase mobilization and A to C and O mutations in case of mobilization of cytidine deaminases. Although RNA editing in the latter circumstances may not necessarily revert the mutation to wild type, the edited nucleotide may result in an improvement over the original mutation. For example, a mutation that causes an in-frame stop codon, resulting in a truncated protein when translated, may be changed to a codon encoding an amino acid that may not be the original amino acid at that position, but this results in a (full-length) protein, but with at least some functionality, at least more functional than the truncated protein.

Целевая последовательность является эндогенной для эукариотической клетки, предпочтительно клетки млекопитающего, более предпочтительно человеческой клетки. Таким образом, целевая последовательность не представляет собой, например, трансгенный или маркерный ген, который был искусственно введен в какой-то момент в истории клетки, а скорее представляет собой геном, который естественно присутствует в клетке (будь то в мутантной или не мутантной форме).The target sequence is endogenous to a eukaryotic cell, preferably a mammalian cell, more preferably a human cell. Thus, the target sequence is not, for example, a transgenic or marker gene that was artificially introduced at some point in the cell's history, but rather a genome that is naturally present in the cell (whether in mutant or non-mutant form) .

Настоящее изобретение не ограничивается корректирующими мутациями, так как вместо этого оно может быть полезным для изменения последовательности дикого типа в мутированную последовательность путем применения олигонуклеотидов в соответствии с настоящим изобретением. Одним из примеров, когда может быть выгодным модифицировать аденозин дикого типа, представляет собой введение пропускания экзона, например, путем модификации аденозина, который представляет собой сайт ветвления, необходимый для сплайсинга указанного экзона. Другим примером является то, где аденозин определяет или представляет собой часть последовательности распознавания для связывания белка или участвует во вторичной структуре, определяющей стабильность мРНК. Как отмечено выше, поэтому настоящее изобретение может быть использовано для предоставления инструментов исследования заболеваний, введения новых мутаций, которые менее вредны, чем существующие мутации, и т.д.The present invention is not limited to corrective mutations, as it may instead be useful for changing a wild-type sequence into a mutated sequence by using oligonucleotides in accordance with the present invention. One example where it may be advantageous to modify a wild-type adenosine is the introduction of exon skipping, for example by modifying an adenosine that is a branch site required for splicing of said exon. Another example is where adenosine defines or is part of a recognition sequence for protein binding or is involved in a secondary structure that determines the stability of an mRNA. As noted above, therefore, the present invention can be used to provide tools for disease research, introduction of new mutations that are less harmful than existing mutations, etc.

Количество вводимого олигонуклеотида, дозировка и режим дозирования могут варьировать от типа клеток к типу клеток, подлежащего лечению заболевания, целевой популяции, способа введения (например, системного и местного), тяжести заболевания и приемлемого уровня побочной активности, но они могут и должны оцениваться экспериментальным способом во время исследования in vitro в доклинических и клинических испытаниях. Испытания являются особенно простыми, когда модифицированная последовательность приводит к легко обнаруживаемому фенотипическому изменению. Возможно, что более высокие дозы олигонуклеотида могут конкурировать за связывание с объектом редактирования нуклеиновой кислоты (например, ADAR) в клетке, тем самым истощая количество объекта, который может принимать участие в редактировании РНК, но в обычных испытаниях дозирования будут выявлены любые такие эффекты для данного олигонуклеотида и заданной мишени.The amount of oligonucleotide administered, dosage, and dosing regimen may vary from cell type to cell type, disease being treated, target population, route of administration (eg, systemic versus topical), disease severity, and acceptable level of side activity, but can and should be evaluated experimentally during in vitro studies in preclinical and clinical trials. Testing is particularly simple when the modified sequence results in an easily detectable phenotypic change. It is possible that higher doses of the oligonucleotide may compete for binding to a nucleic acid editing target (eg ADAR) in the cell, thereby depleting the amount of target that can be involved in RNA editing, but routine dosing trials will detect any such effects for a given oligonucleotide and a given target.

Один подходящий способ испытания предусматривает доставку олигонуклеотидной конструкции кOne suitable test method involves delivering the oligonucleotide construct to

- 18 045815 клеточным линиям или исследуемому организму, а затем последующее взятие образцов биопсии в различные моменты времени. Последовательность целевой РНК может быть оценена в образце биопсии, и можно легко следить за количеством клеток, имеющих модификацию. После того, как это испытание будет выполнено один раз, информация может быть сохранена, и будущая доставка может быть выполнена без необходимости брать образцы биопсии.- 18 045815 cell lines or organism of interest, and then subsequent collection of biopsy samples at various time points. The sequence of the target RNA can be assessed in the biopsy sample, and the number of cells having the modification can be easily monitored. Once this test is performed once, the information can be stored and future delivery can be performed without the need to take biopsy samples.

Таким образом, способ по настоящему изобретению может предусматривать стадию идентификации наличия желаемого изменения в последовательности целевой РНК клетки, тем самым подтверждая, что целевая последовательность РНК была модифицирована. Эта стадия, как правило, предусматривает секвенирование соответствующей части целевой РНК или ее копии кДНК (или копии кДНК продукта ее сплайсинга в случае, если целевая РНК представляет собой пре-мРНК), как обсуждалось выше, и изменение последовательности может быть легко проверено. Альтернативно, изменение может быть оценено на уровне белка (длина, гликозилирование, функция или т.п.) или с помощью некоторого функционального считывания, такого как (индуцируемый) ток, когда белок, кодируемый целевой последовательностью РНК представляет собой ионный канал, например. В случае функции CFTR специалисту в настоящей области техники хорошо известна анализируемая камера Ussing или тест NPD у млекопитающего, включая в себя человека, для оценки восстановления или усиления функции.Thus, the method of the present invention may include the step of identifying the presence of a desired change in the target RNA sequence of the cell, thereby confirming that the target RNA sequence has been modified. This step typically involves sequencing the relevant portion of the target RNA or a cDNA copy thereof (or a cDNA copy of its spliced product in the case the target RNA is a pre-mRNA), as discussed above, and the sequence change can be easily verified. Alternatively, the change can be assessed at the protein level (length, glycosylation, function or the like) or by some functional readout such as (induced) current when the protein encoded by the target RNA sequence is an ion channel, for example. In the case of CFTR function, a Ussing chamber assay or NPD test in a mammal, including a human, is well known to one skilled in the art to evaluate restoration or gain of function.

После редактирования РНК в клетке модифицированная РНК может со временем растворяться, например, из-за деления клеток, ограниченного периода полураспада отредактированных РНК и т.д. Таким образом, в практических терапевтических терминах способ по настоящему изобретению может предусматривать повторение доставки олигонуклеотидной конструкции до тех пор, пока не будет изменено достаточное количество целевой РНК, чтобы обеспечить ощутимую пользу пациенту и/или сохранить преимущества с течением времени.Once RNA is edited in a cell, the modified RNA may dissolve over time, for example due to cell division, limited half-life of edited RNAs, etc. Thus, in practical therapeutic terms, the method of the present invention may involve repeated delivery of the oligonucleotide construct until sufficient amounts of the target RNA have been altered to provide measurable benefit to the patient and/or to maintain benefits over time.

Олигонуклеотиды по настоящему изобретению особенно подходят для терапевтического применения, и поэтому настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую олигонуклеотид по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой просто физиологический раствор. Может быть полезно быть изотоническим или гипотоническим, особенно для легочной доставки. Настоящее изобретение также обеспечивает устройство доставки (например, шприц, ингалятор, распылитель), который содержит фармацевтическую композицию по настоящему изобретению.The oligonucleotides of the present invention are particularly suitable for therapeutic use, and therefore the present invention provides a pharmaceutical composition comprising an oligonucleotide of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier. In some embodiments of the present invention, the pharmaceutically acceptable carrier may simply be a saline solution. It may be useful to be isotonic or hypotonic, especially for pulmonary delivery. The present invention also provides a delivery device (eg, syringe, inhaler, nebulizer) that contains the pharmaceutical composition of the present invention.

В настоящем изобретение также предусмотрен олигонуклеотид по настоящему изобретению для применения в способе внесения изменения в целевую последовательность РНК в клетке млекопитающего, предпочтительно клетке человека, как описано в настоящем документе. Аналогично в настоящем изобретении предусмотрено применение олигонуклеотидной конструкции по настоящему изобретению при изготовлении лекарственного средства для осуществления изменения в целевой последовательности РНК в клетке млекопитающего, предпочтительно клетке человека, как описано в настоящем документе.The present invention also provides an oligonucleotide of the present invention for use in a method of introducing a change in a target RNA sequence in a mammalian cell, preferably a human cell, as described herein. Likewise, the present invention provides for the use of an oligonucleotide construct of the present invention in the manufacture of a medicament to effect a change in a target RNA sequence in a mammalian cell, preferably a human cell, as described herein.

Настоящее изобретение также относится к способу дезаминирования по меньшей мере одного специфического целевого аденозина, присутствующего в целевой последовательности РНК в клетке, причем указанный способ предусматривает следующие стадии: предоставление указанной клетки с AON согласно настоящему изобретению; обеспечение возможности захвата клеткой указанного AON; обеспечение возможности отжига указанный AON с целевой последовательностью РНК; обеспечение возможности ферменту ADAR млекопитающего, содержащему природный связывающий dsRNA домен, который обнаружен в ферменте дикого типа, дезаминировать указанный целевой аденозин в указанной целевой РНК последовательности до инозина; и необязательно идентификация наличия указанного инозина в последовательности РНК. Введение AON в соответствии с настоящим изобретением в клетку осуществляют с помощью общих способов, известных специалисту в настоящей области техники. После дезаминирования считывание эффекта (изменения целевой последовательности РНК) может контролироваться различными способами. Следовательно, стадия идентификации того, действительно ли дезаминирование целевого аденозина имеет место, в целом зависит от положения целевого аденозина в целевой последовательности РНК и эффекта, который возникает в результате присутствия аденозина (точечная мутация, ранний стоп-кодон, аберрантный сайт сплайсинга, альтернативный сайт сплайсинга, неправильное сворачивание полученного белка и т.д.). Следовательно, согласно предпочтительному аспекту в зависимости от конечного эффекта дезаминирования превращения из А в I, стадия идентификации предусматривает: секвенирование целевой РНК; оценку наличия функционального, удлиненного, полноразмерного белка и/или белка дикого типа, когда указанный целевой аденозин находится в стоп-кодоне UGA или UAG, который редактируется до кодона UGG посредством указанного дезаминирования; оценку наличия функционального, удлиненного, полноразмерного белка и/или белка дикого типа, когда два целевых аденозина расположены в стоп-кодоне UAA, который редактируется до кодона UGG через дезаминирование обоих целевых аденозинов; оценку того, был ли изменен сплайсинг пре-мРНК указанным дезаминированием; или использование функционального считывания, в котором целевая РНК после указанного дезаминирования кодирует функциональный, полноразмерный, удлиненный белок и/или белок дикого типа. В случае, если существует стоп-кодон UAA, это означает, что оба аденозина должны быть дезамиThe present invention also provides a method for deamination of at least one specific target adenosine present in a target RNA sequence in a cell, the method comprising the following steps: providing said cell with an AON according to the present invention; allowing the cell to take up said AON; allowing said AON to anneal to the target RNA sequence; allowing a mammalian ADAR enzyme containing a natural dsRNA binding domain as found in the wild type enzyme to deaminate said target adenosine in said target RNA sequence to inosine; and optionally identifying the presence of said inosine in the RNA sequence. Introduction of AON in accordance with the present invention into a cell is carried out using general methods known to one skilled in the art. After deamination, the readout effect (changes in the target RNA sequence) can be controlled in various ways. Therefore, the step of identifying whether deamination of the target adenosine has actually occurred generally depends on the position of the target adenosine in the target RNA sequence and the effect that results from the presence of the adenosine (point mutation, early stop codon, aberrant splice site, alternative splice site , incorrect folding of the resulting protein, etc.). Therefore, according to a preferred aspect, depending on the final deamination effect of the conversion from A to I, the identification step includes: sequencing the target RNA; assessing the presence of a functional, extended, full-length and/or wild-type protein when said target adenosine is at a UGA or UAG stop codon that is edited to a UGG codon by said deamination; assessing the presence of a functional, extended, full-length and/or wild-type protein when two target adenosines are located at a UAA stop codon that is edited to a UGG codon through deamination of both target adenosines; assessing whether pre-mRNA splicing has been altered by said deamination; or the use of a functional readout in which the target RNA, after said deamination, encodes a functional, full-length, extended, and/or wild-type protein. In case there is a UAA stop codon, this means that both adenosines must be des.

- 19 045815 нированы. Следовательно, настоящее изобретение также относится к олигонуклеотидам и способам, при которых два аденозина, которые находятся рядом друг с другом, совместно дезаминированы с помощью редактирующего РНК фермента, такого как ADAR. В этом конкретном случае стоп-кодон UAA преобразуется в кодирующий Tip кодон UGG (см. табл. 1). Поскольку дезаминирование аденозина в инозин может приводить к белку, который больше не страдает от мутированного А в целевом положении, идентификация дезаминирования в инозин также может представлять собой функциональное считывание, например, оценку того, присутствует ли функциональный белок, или даже оценку того, что заболевание, вызванное присутствием аденозина, (частично) регрессировано. Функциональная оценка для каждого из заболеваний, указанных в настоящем документе, будет в основном осуществляться способом, известным специалисту в настоящей области техники. Когда присутствие целевого аденозина вызывает аберрантный сплайсинг, считывание может представлять собой оценку того, происходит ли аберрантный сплайсинг или нет, или стал меньше. С другой стороны, когда дезаминирование целевого аденозина необходимо для введения сайта сплайсинга, то аналогичные подходы могут быть использованы для проверки того, действительно ли имеет место необходимый тип сплайсинга. Очень подходящим способом идентификации наличия инозина после дезаминирования целевого аденозина является, конечно, RT-PCR и секвенирование с использованием способов, которые хорошо известны специалисту в настоящей области техники.- 19 045815 nirovanny. Therefore, the present invention also relates to oligonucleotides and methods in which two adenosines that are adjacent to each other are co-deaminated using an RNA editing enzyme such as ADAR. In this particular case, the stop codon UAA is converted to the Tip coding codon UGG (see Table 1). Since deamination of adenosine to inosine can result in a protein that no longer suffers from a mutated A at the target position, identification of deamination to inosine can also represent a functional readout, such as assessing whether a functional protein is present, or even assessing that a disease is present. caused by the presence of adenosine, is (partially) regressed. Functional assessment for each of the diseases specified herein will generally be carried out in a manner known to one of ordinary skill in the art. When the presence of a target adenosine causes aberrant splicing, the readout may represent an assessment of whether aberrant splicing is occurring or not, or has become smaller. On the other hand, when deamination of the target adenosine is necessary to introduce a splice site, then similar approaches can be used to test whether the required type of splicing actually occurs. A very suitable way to identify the presence of inosine after deamination of the target adenosine is, of course, RT-PCR and sequencing using methods that are well known to one skilled in the art.

Олигонуклеотид согласно настоящему изобретению соответствующим образом вводится в водный раствор, например, солевой раствор, или в суспензию, необязательно содержащую добавки, вспомогательные вещества и другие ингредиенты, совместимые с фармацевтическим использованием, в концентрациях от 1 нг/мл до 1 г/мл, предпочтительно от 10 нг/мл до 500 мг/мл, более предпочтительно от 100 нг/мл до 100 мг/мл. Дозировка может составлять от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 100 мг/кг, предпочтительно от приблизительно 10 мкг/кг до приблизительно 10 мг/кг, более предпочтительно от приблизительно 100 мкг/кг до приблизительно 1 мг/кг. Введение может осуществляться путем ингаляции (например, путем распыления), интраназально, перорально, путем инъекции или инфузии, внутривенно, подкожно, внутрикожно, внутрикраниально, внутримышечно, внутритрахеально, внутрибрюшинно, внутриректально, путем прямой инъекции в опухоль и т.п. Введение может быть в твердой форме в виде порошка, таблетки или в любой другой форме, совместимой с фармацевтическим использованием у людей.The oligonucleotide of the present invention is suitably administered in an aqueous solution, for example saline, or in a suspension, optionally containing additives, excipients and other ingredients compatible with pharmaceutical use, in concentrations from 1 ng/ml to 1 g/ml, preferably from 10 ng/ml to 500 mg/ml, more preferably 100 ng/ml to 100 mg/ml. The dosage may be from about 1 μg/kg to about 100 mg/kg, preferably from about 10 μg/kg to about 10 mg/kg, more preferably from about 100 μg/kg to about 1 mg/kg. Administration may be by inhalation (eg, nebulization), intranasal, oral, injection or infusion, intravenous, subcutaneous, intradermal, intracranial, intramuscular, intratracheal, intraperitoneal, intrarectal, direct tumor injection, or the like. Administration may be in solid form as a powder, tablet or any other form compatible with pharmaceutical use in humans.

Настоящее изобретение особенно подходит для лечения генетических заболеваний, таких как муковисцидоз, альбинизм, дефицит альфа-1-антитрипсина (А1АТ), болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз, астма, β-талассемия, синдром Кадасила, болезнь Шарко-Мари-Тута, хроническая обструктивная болезнь легких (COPD), дистальная спинальная мышечная атрофия (DSMA), мышечная дистрофия Дюшенна/Беккера, дистрофический буллезный эпидермолиз, буллезный эпидермолиз, болезнь Фабри, связанные с фактором V Лейдена нарушения, семейный аденоматозный полипоз, галактоземия, болезнь Гоше, дефицит глюкоза-6-фосфатдегидрогеназы, гемофилия, наследственный гемохроматоз, синдром Хантера, болезнь Хантингтона, синдром Гурлера, воспалительное заболевание кишечника (IBD), синдром наследуемой полиаглютинации, врожденный амавроз Лебера, синдром Леш-Нихана, синдром Линча, синдром Марфана, мукополисахаридоз, мышечная дистрофия, миотоническая дистрофия I и II типов, нейрофиброматоз, болезнь Ниманна-Пика типа А, В и С, связанный с NY-eso1 рак, болезнь Паркинсона, синдром Пейтца-Егерса, фенилкетонурия, болезнь Помпе, первичное цилиарное заболевание, нарушения, связанные с протромбиновой мутацией, такие как мутация протромбина G20210A, легочная гипертензия, ретинит пигментоза, болезнь Сандхоффа, синдром тяжелой комбинированной иммунной недостаточности (SCID), серповидноклеточная анемия, спинальная мышечная атрофия, болезнь Старгардта, болезнь Тай-Сакса, синдром Ушера, связанный с Х-хромосомой иммунодефицит, различные формы рака (например, связанный с BRCA1 и 2 рак молочной железы и рак яичников) и т.п.The present invention is particularly suitable for the treatment of genetic diseases such as cystic fibrosis, albinism, alpha-1-antitrypsin (A1AT) deficiency, Alzheimer's disease, amyotrophic lateral sclerosis, asthma, β-thalassemia, Cadacil syndrome, Charcot-Marie-Tooth disease, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), distal spinal muscular atrophy (DSMA), Duchenne/Becker muscular dystrophy, dystrophic epidermolysis bullosa, epidermolysis bullosa, Fabry disease, factor V Leiden disorders, familial adenomatous polyposis, galactosemia, Gaucher disease, glucose-6 deficiency -phosphate dehydrogenases, hemophilia, hereditary hemochromatosis, Hunter syndrome, Huntington's disease, Hurler syndrome, inflammatory bowel disease (IBD), hereditary polyaglutination syndrome, Leber congenital amaurosis, Lesch-Nyhan syndrome, Lynch syndrome, Marfan syndrome, mucopolysaccharidosis, muscular dystrophy, myotonic dystrophy Types I and II, neurofibromatosis, Niemann-Pick disease types A, B and C, NY-eso1 associated cancer, Parkinson's disease, Peutz-Jeghers syndrome, phenylketonuria, Pompe disease, primary ciliary disease, prothrombin mutation-related disorders, such such as prothrombin G20210A mutation, pulmonary hypertension, retinitis pigmentosa, Sandhoff disease, severe combined immune deficiency syndrome (SCID), sickle cell anemia, spinal muscular atrophy, Stargardt disease, Thai-Sachs disease, Usher syndrome, X-linked immunodeficiency, various forms cancer (eg BRCA1 and 2 related breast cancer and ovarian cancer) and the like.

Согласно некоторым вариантам осуществления олигонуклеотидная конструкция может доставляться системно, но более типично доставлять олигонуклеотид в клетки, в которых наблюдается фенотип целевой последовательности. Например, мутации в CFTR вызывают муковисцидоз, который прежде всего наблюдается в эпителиальной ткани легкого, поэтому в отношении целевой последовательности CFTR предпочтительно доставлять олигонуклеотидную конструкцию специфически и непосредственно в легкие. Это может быть удобно достигнуто путем ингаляции, например, порошка или аэрозоля, как правило, с использованием распылителя. Особенно предпочтительными являются распылители, которые используют так называемое вибрирующее сито, включая в себя PARI eFlow (Rapid) или i-neb от Respironics. Изобретатели обнаружили, что ингаляционное использование олигонуклеотидных конструкций может приводить к системному распределению олигонуклеотидной конструкции и поглощению клетками в тканях кишечника, печени, поджелудочной железы, почек и слюнных желез, среди прочих. Поэтому следует ожидать, что ингаляционная доставка олигонуклеотидных конструкций в соответствии с настоящим изобретением может также эффективно нацеливаться на эти клетки, что в случае нацеливания гена CFTR может привести к улучшению желудочно-кишечных симптомов, также связанных с муковисцидозом. Для других целевых последовательностей, в зависимости от заболевания и/или целевого органа, введение может быть местным (например, на кожу), внутрикожным, подкожным, внутримышечным, внутриIn some embodiments, the oligonucleotide construct can be delivered systemically, but more typically deliver the oligonucleotide to cells that exhibit a phenotype of the target sequence. For example, mutations in CFTR cause cystic fibrosis, which is primarily observed in lung epithelial tissue, so with respect to the target CFTR sequence, it is preferable to deliver the oligonucleotide construct specifically and directly to the lungs. This can be conveniently achieved by inhalation, for example of a powder or aerosol, typically using a nebulizer. Particularly preferred are nebulizers that use a so-called vibrating screen, including PARI eFlow (Rapid) or i-neb from Respironics. The inventors have discovered that inhaled use of oligonucleotide constructs can result in systemic distribution of the oligonucleotide construct and cellular uptake in tissues of the intestine, liver, pancreas, kidney, and salivary glands, among others. Therefore, it is expected that inhaled delivery of oligonucleotide constructs in accordance with the present invention can also effectively target these cells, which, in the case of targeting the CFTR gene, may lead to an improvement in gastrointestinal symptoms also associated with cystic fibrosis. For other target sequences, depending on the disease and/or target organ, administration may be local (e.g., skin), intradermal, subcutaneous, intramuscular, intramuscular,

- 20 045815 венным, оральным, представлять собой инъекцию склеры и т.д.- 20 045815 venous, oral, represent an injection of the sclera, etc.

При некоторых заболеваниях слизистый слой проявляет повышенную толщину, что приводит к уменьшению абсорбции лекарств через легкие. Одним из таких заболеваний является хронический бронхит, другим примером является муковисцидоз. Существуют различные формы нормализаторов слизи, такие как ДНКазы, гипертонический солевой раствор или маннит, который коммерчески доступен под названием бронхитол. Когда нормализаторы слизи используются в сочетании с редактирующими РНК олигонуклеотидными конструкциями, такими как олигонуклеотидные конструкции согласно настоящему изобретению, они могут повысить эффективность этих лекарственных средств. Соответственно, введение олигонуклеотидной конструкции в соответствии с настоящим изобретением субъекту, предпочтительно человеку, предпочтительно объединяют с нормализаторами слизи, предпочтительно с описанными в настоящем документе нормализаторами слизи. Кроме того, введение олигонуклеотидных конструкций в соответствии с настоящим изобретением может быть объединено с введением небольшой молекулы для лечения CF, такой как потенцирующие соединения, например, калидеко (ивакафтор, VX-770) или корректорные соединения, например, VX-809 (лумакафтор) и/или VX 661. Другие комбинированные терапии в CF могут предусматривать использование олигонуклеотидной конструкции в соответствии с настоящим изобретением в сочетании с индуктором аденозиндезаминазы с использованием IFN-гамма или TNF-альфа.In some diseases, the mucous layer exhibits increased thickness, which leads to decreased absorption of drugs through the lungs. One such disease is chronic bronchitis, another example is cystic fibrosis. There are various forms of mucus normalizers, such as DNase, hypertonic saline, or mannitol, which is commercially available under the name bronchitol. When mucus normalizers are used in combination with RNA editing oligonucleotide constructs, such as the oligonucleotide constructs of the present invention, they can enhance the efficacy of these drugs. Accordingly, administration of an oligonucleotide construct according to the present invention to a subject, preferably a human, is preferably combined with mucus normalizers, preferably the mucus normalizers described herein. In addition, the administration of oligonucleotide constructs in accordance with the present invention can be combined with the administration of a small molecule for the treatment of CF, such as potentiating compounds, for example, Kalydeco (ivacaftor, VX-770) or corrective compounds, for example, VX-809 (lumacaftor) and /or VX 661. Other combination therapies in CF may involve the use of an oligonucleotide construct according to the present invention in combination with an adenosine deaminase inducer using IFN-gamma or TNF-alpha.

Альтернативно, или в комбинации с нормализаторами слизи, доставка в проникающие в слизь частицы или наночастицы может быть применена для эффективной доставки редактирующих РНК молекул к эпителиальным клеткам, например, легких и кишечника. Соответственно, введение олигонуклеотидной конструкции в соответствии с настоящим изобретением субъекту, предпочтительно человеку, предпочтительно использует доставку в проникающие в слизь частицы или наночастицы.Alternatively, or in combination with mucus normalizers, delivery of mucus-penetrating particles or nanoparticles can be used to effectively deliver RNA editing molecules to epithelial cells, such as those of the lungs and intestines. Accordingly, administration of an oligonucleotide construct in accordance with the present invention to a subject, preferably a human, preferably utilizes mucus-permeable particle or nanoparticle delivery.

Хронические и острые инфекции легких часто присутствуют у пациентов с такими заболеваниями, как муковисцидоз. Лечение антибиотиками снижает бактериальные инфекции и такие симптомы, как сгущение слизи и/или образование биопленки. Использование антибиотиков в сочетании с олигонуклеотидными конструкциями согласно настоящему изобретению может повысить эффективность редактирования РНК из-за более легкого доступа целевых клеток к олигонуклеотидной конструкции. Соответственно, введение олигонуклеотидной конструкции в соответствии с настоящим изобретением субъекту, предпочтительно человеку, предпочтительно объединяют с терапией антибиотиками для снижения бактериальных инфекций и таких симптомов, как сгущение слизи и/или образование биопленки. Антибиотики можно вводить системно или локально или и так, и так.Chronic and acute lung infections are often present in patients with diseases such as cystic fibrosis. Antibiotic treatment reduces bacterial infections and symptoms such as thickening of mucus and/or biofilm formation. The use of antibiotics in combination with the oligonucleotide constructs of the present invention can increase the efficiency of RNA editing due to easier access of the target cells to the oligonucleotide construct. Accordingly, administration of an oligonucleotide construct in accordance with the present invention to a subject, preferably a human, is preferably combined with antibiotic therapy to reduce bacterial infections and symptoms such as mucus thickening and/or biofilm formation. Antibiotics can be administered systemically or locally, or both.

Для применения, например, для пациентов с муковисцидозом, олигонуклеотидные конструкции согласно настоящему изобретению или упакованные или связанные в комплекс олигонуклеотидные конструкции в соответствии с настоящим изобретением могут быть объединены с любым нормализатором слизи, таким как ДНКаза, маннит, гипертонический физиологический раствор и/или антибиотики и/или малая молекула для лечения CF, такая как соединения потенцирующего вещества, например, ивакафтор, или корректорные соединения, например, лумакафтор и/или VX-661. Чтобы увеличить доступ к целевым клеткам, может применяться бронхоальвеолярный лаваж (BAL) для очистки легких перед введением олигонуклеотида в соответствии с настоящим изобретением.For use in, for example, patients with cystic fibrosis, the oligonucleotide constructs of the present invention or packaged or complexed oligonucleotide constructs of the present invention can be combined with any mucus normalizer such as DNase, mannitol, hypertonic saline and/or antibiotics and /or a small molecule for the treatment of CF, such as potentiating compounds, for example, ivacaftor, or corrective compounds, for example, lumacaftor and/or VX-661. To increase access to target cells, bronchoalveolar lavage (BAL) may be used to clear the lungs prior to administration of the oligonucleotide of the present invention.

ПримерыExamples

Пример 1. Редактирование нонсенс-мутации в целевой РНК GFP с использованием различных антисмысловых олигонуклеотидов и анализа последовательности.Example 1: Nonsense mutation editing in GFP target RNA using various antisense oligonucleotides and sequence analysis.

Редактирование РНК впервые исследовали в клеточной системе с использованием клеток HeLa, которая содержат экспрессионную конструкцию, кодирующую зеленый флуоресцентный белок (GFP), стабильно интегрированный в клеточный геном. В этой конструкции стоп-кодон (TAG) был введен в положение кодонов 57, что приводит к триплетному UAG в мРНК. Редактирование РНК в аденозине в центре этого триплета в конечном итоге приведет к экспрессии нормального полноразмерного белка. Конструкцию (см. ниже) и клеточную линию получали с использованием способов, известных специалисту в настоящей области техники.RNA editing was first examined in a cellular system using HeLa cells, which contain an expression construct encoding green fluorescent protein (GFP) stably integrated into the cellular genome. In this design, a stop codon (TAG) was introduced at codon position 57, resulting in a triplet UAG in the mRNA. Editing the RNA at the adenosine at the center of this triplet will eventually result in the expression of a normal full-length protein. The construct (see below) and cell line were prepared using methods known to one skilled in the art.

Исследовали, можно ли А в центре этого триплета фактически дезаминировать до I (который впоследствии будет считываться как G), используя набор различных антисмысловых олигонуклеотидов, содержащих различные несоответствия по сравнению с целевой РНК; см. фиг. 1. Редактирование триплета UAG приведет к UGG, представляющему собой кодон для Tip, а затем функциональному белку GFP. Чтобы гарантировать, что никакие другие аденозины в целевой РНК не будут редактироваться, только три нуклеотида в антисмысловом олигонуклеотиде, противоположном стоп-кодону (3'-АСС-5' в каждом из олигонуклеотидов с несоответствием С в центре; см. фиг. 1) не содержали 2'-ОМе-группу, тогда как все остальные нуклеотиды в антисмысловом олигонуклеотиде содержали. Кроме того, терминальные четыре связи на каждой стороне всех исследуемых олигонуклеотидов представляют собой фосфоротиоатные связи, тогда как остальные связи представляют собой нормальные фосфодиэфирные связи.It was investigated whether the A at the center of this triplet could actually be deaminated to an I (which would subsequently be read as a G) using a set of different antisense oligonucleotides containing different mismatches relative to the target RNA; see fig. 1. Editing the UAG triplet will result in UGG, which is the codon for Tip, and then a functional GFP protein. To ensure that no other adenosines in the target RNA are edited, only three nucleotides in the antisense oligonucleotide opposite the stop codon (3'-ACC-5' in each of the oligonucleotides with a C mismatch in the center; see Fig. 1) are not contained a 2'-OMe group, while all other nucleotides in the antisense oligonucleotide did. In addition, the terminal four bonds on each side of all tested oligonucleotides are phosphorothioate bonds, while the remaining bonds are normal phosphodiester bonds.

В качестве первой стадии исследовали, выявит ли анализ последовательности то, что нуклеотид в этом положении действительно может быть отредактирован комбинацией любого из олигонуклеотидов по настоящему изобретению и ADAR2. Для этого 0,4x106 клеток HeLa, стабильно экспрессирующих конAs a first step, it was examined whether sequence analysis would reveal that the nucleotide at this position could indeed be edited by a combination of any of the oligonucleotides of the present invention and ADAR2. For this purpose, 0.4x106 HeLa cells stably expressing con

- 21 045815 струкцию GFPstop57, высевали в лунку (6-луночные планшеты) в модифицированной Дульбекко среде Игла с 10% фетальной бычьей сывороткой. Через 24 ч клетки для последующих трансфекций AON трансфицировали с 2 мкг сверхэкспрессирующей ADAR2 плазмиды (RC212324, Origene) с использованием липофектамина 3000. Спустя 48 ч выбранные образцы клеток трансфицировали либо 0, 50, либо 100 нМ каждого AON (см. фиг. 1) с использованием липофектамина 3000. Спустя еще 24 ч РНК выделяли из лизированных клеток и использовали в качестве матрицы для синтеза кДНК. Анализ редактирования РНК проводили с помощью анализа RT-PCR (прямой праймер 5'-AGAGGGTGAAGGTGATGCAA-3' (SEQ ID NO: 7) и обратный праймер 5'-GGGCATGGCACTCTTGAAAA-3' (SEQ ID NO: 8)), за которым следовало секвенирование Сэнгера продукта ПЦР с использованием общей RT-PCR и способов секвенирования, известных специалисту в настоящей области техники. Эффективность редактирования А в I может быть проанализирована с помощью секвенирования Сэнгера продуктов RT-PCR, где редактирование А в I должно быть очевидным в хроматограмме секвенирования в виде (частичного) сдвига в интенсивности сигнала от А к G. Хотя способ не является полностью количественным, отношение частот А и G можно использовать в качестве приблизительной оценки эффективности редактирования А в I. Как и ожидалось, никакого сигнала для G не наблюдается, перекрывая пик А в целевом сайте в образцах, которые не были трансфицированы ни одним AON (фиг. 2, панели А и В). Напротив, в образцах, трансфицированных AON, в этом положении наблюдается частичное изменение в G, о чем свидетельствуют перекрывающиеся пики А и G (зеленый и черный на фиг. 2 соответственно). Эффект варьирует: в то время как небольшое количество перекрывающегося G-сигнала в целевом сайте может наблюдаться с каждым AON, эффект сильнее всего с такими AON, как ADAR58 и ADAR59 (фиг. 2G-2J).- 21 045815 GFPstop57 structure was seeded into a well (6-well plates) in Dulbecco's modified Eagle's medium with 10% fetal bovine serum. After 24 h, cells for subsequent AON transfections were transfected with 2 μg of ADAR2 overexpression plasmid (RC212324, Origene) using Lipofectamine 3000. After 48 h, selected cell samples were transfected with either 0, 50, or 100 nM of each AON (see Fig. 1) with using Lipofectamine 3000. After another 24 h, RNA was isolated from lysed cells and used as a template for cDNA synthesis. RNA editing analysis was performed using RT-PCR analysis (forward primer 5'-AGAGGGTGAAGGTGATGCAA-3' (SEQ ID NO: 7) and reverse primer 5'-GGGCATGGCACTCTTGAAAA-3' (SEQ ID NO: 8)) followed by sequencing Sanger of the PCR product using general RT-PCR and sequencing methods known to one skilled in the art. The efficiency of A to I editing can be analyzed by Sanger sequencing of RT-PCR products, where A to I editing should be evident in the sequencing chromatogram as a (partial) shift in signal intensity from A to G. Although the method is not fully quantitative, the ratio frequencies of A and G can be used as a rough estimate of the efficiency of editing A in I. As expected, no signal for G is observed, overlapping peak A at the target site in samples that were not transfected with either AON (Fig. 2, panels A and B). In contrast, in samples transfected with AON, a partial change in G is observed at this position, as evidenced by overlapping peaks A and G (green and black in Fig. 2, respectively). The effect varies: while a small amount of overlapping G signal at the target site can be observed with each AON, the effect is strongest with AONs such as ADAR58 and ADAR59 (Figures 2G-2J).

Неоднозначные пары оснований играют фундаментальную роль во вторичной структуре РНК и присутствуют в тРНК в большой степени. Очень часто их присутствие в последовательности РНК близко к выпуклым структурам РНК, петлям и несоответствиям. Чтобы исследовать влияние наличия неоднозначных пар оснований в области AON на редактирование РНК, изобретатели настоящего изобретения разработали ADAR72-1, содержащий пять неоднозначных пар оснований. Исследовали его способность индуцировать редактирование нонсенс-мутации в целевой РНК GFP (см. выше) и сопоставили с олигонуклеотидом ADAR59-2 (=ADAR59; см. выше), который характеризуется точно такой же последовательностью, но без неоднозначных пар оснований:Ambiguous base pairs play a fundamental role in the secondary structure of RNA and are present to a large extent in tRNA. Very often their presence in the RNA sequence is close to RNA bulges, loops and mismatches. To investigate the effect of the presence of ambiguous base pairs in the AON region on RNA editing, the inventors of the present invention developed ADAR72-1 containing five ambiguous base pairs. Its ability to induce nonsense mutation editing in the target GFP RNA (see above) was studied and compared with the oligonucleotide ADAR59-2 (=ADAR59; see above), which has exactly the same sequence, but without the ambiguous base pairs:

3'-GAUGGACAAGGUACCGGUUGUGAAGAGUCAUGAAAGAGAAUAGAAGAAGUUAC-5' (ADAR5 9-2)3'-GAUGGACAAGGUACCGGUUGUGAAGAGUCAUGAAAGAGAAUAGAAGAAGUUAC-5' (ADAR5 9-2)

5'-AACUACCUGUUCCAUAGCCAACACUUGUCACUACUUUCUCUUAUGGUGUUCAAUGCU-3'5'-AACUACCUGUUCCAUAGCCAACACUUGUCACUACUUUCUCUUAUGGUGUUCAAUGCU-3'

3'-GAUGGACGAGGUACCGGUUGUGGAGAGUCGUGAAAGAGAAUGGAAGGAGUUAC-5' (ADAR7 2-1)3'-GAUGGACGAGGUACCGGUUGUGGAGAGUCGUGAAAGAGAAUGGAAGGAGUUAC-5' (ADAR7 2-1)

5'-AACUACCUGUUCCAUAGCCAACACUUGUCACUACUUUCUCUUAUGGUGUUCAAUGCU-3'5'-AACUACCUGUUCCAUAGCCAACACUUGUCACUACUUUCUCUUAUGGUGUUCAAUGCU-3'

Верхняя нить представляет собой AON, тогда как нижняя нить представляет собой целевую РНК от 5' к 3'. Целевой аденозин выделен жирным шрифтом. Несоответствия и неоднозначные соответствия подчеркнуты, а стрелки показывают положения дополнительных неоднозначных пар оснований.The top strand is the AON, while the bottom strand is the 5' to 3' target RNA. The target adenosine is shown in bold. Mismatches and ambiguous matches are underlined, and arrows indicate the positions of additional ambiguous base pairs.

ADAR59-2 (=ADAR59, SEQ ID NO: 4; см. также пример 5) и ADAR72-1 (SEQ ID NO: 34) химически модифицированы, как показано ниже: регистр строчных букв представляет 2'-О-метилированные модифицированные нуклеотиды РНК, тогда как нуклеотиды регистра прописных букв представляют собой немодифицированные нуклеотиды РНК. Звездочки представляют собой межнуклеозидные фосфоротиоатные связи на 3'- и 5'-концах AON. Несоответствия и неоднозначные соответствия обозначены подчеркиванием.ADAR59-2 (=ADAR59, SEQ ID NO: 4; see also Example 5) and ADAR72-1 (SEQ ID NO: 34) are chemically modified as shown below: lowercase case represents 2'-O-methylated modified RNA nucleotides , whereas capital case nucleotides represent unmodified RNA nucleotides. Asterisks represent internucleoside phosphorothioate bonds at the 3′ and 5′ ends of AON. Inconsistencies and ambiguous matches are indicated by underlining.

ADAR59-2ADAR59-2

5'-c*a*u*u*qaaqaaqauaaqaqaaaquacuqaqaaququuqqCCAuqqaacaq*q*u*a*q-3'5'-c*a*u*u*qaaqaaqauaaqaqaaaquacuqaqaaququuqqCCAuqqaacaq*q*u*a*q-3'

ADAR72-1ADAR72-1

5'-c*a*u*u*qaqqaaqquaaqaqaaaquqcuqaqaqququuqqCCAuqqaqcaq*q*u*a*q3'5'-c*a*u*u*qaqqaaqquaaqaqaaaquqcuqaqaqququuqqCCAuqqaqcaq*q*u*a*q3'

Как ADAR59-2, так и ADAR72-1 исследовали в анализе редактирования in vitro с использованием лизатов клеток HEK293 со сверхэкспрессированной изоформой 2 ADAR2 (ADAR2a). В качестве отрицательных контролей использовали лизат клеток HEK293 со сверхэкспрессированным ADAR2a, но без AON. Для получения лизатов клетки HEK293 сначала трансфицировали в течение ночи экспрессирующей ADARB1 плазмидой (OriGene) в количестве 500 нг с использованием липофектамина 3000. Затем клетки лизировали с использованием реагента Lysis-M. 200 нМ AON и 90 мМ матрицы ssRNA предварительно инкубировали вместе в буфере для редактирования in vitro в течение 30 мин при 30°С. После предварительной инкубации добавляли клеточные лизаты (10 мкл) и реакционную смесь инкубировали в течение 30 мин при 30°С и затем в течение 30 мин при 37°С. Затем целевые РНК экстрагировали фенольно-хлороформной экстракцией и обратно транскрибировали с использованием реагентов Maxima RT, используя протокол изготовителя, и секвенирование готовили, как описано выше. Данные секвениBoth ADAR59-2 and ADAR72-1 were examined in an in vitro editing assay using HEK293 cell lysates overexpressing ADAR2 isoform 2 (ADAR2a). HEK293 cell lysate with overexpressed ADAR2a but without AON was used as negative controls. To obtain lysates, HEK293 cells were first transfected overnight with 500 ng of ADARB1 expression plasmid (OriGene) using Lipofectamine 3000. Cells were then lysed using Lysis-M reagent. 200 nM AON and 90 mM ssRNA template were preincubated together in in vitro editing buffer for 30 min at 30°C. After preincubation, cell lysates (10 μl) were added and the reaction mixture was incubated for 30 min at 30°C and then for 30 min at 37°C. Target RNAs were then extracted by phenol-chloroform extraction and reverse transcribed using Maxima RT reagents using the manufacturer's protocol, and sequencing was prepared as described above. Sequencing data

- 22 045815 рования, представленные на фиг. 3, не показывают обнаруживаемого редактирования А в I для образца, где не использовался AON: не было видно сигнала G выше фона. Напротив, имеется явное присутствие сигнала G, видимого для образца, где в анализе редактирования использовали олигонуклеотид ADAR59-2. Кроме того, для олигонуклеотида ADAR72-1 показана еще более высокая интенсивность сигнала G, что указывает на то, что наличие дополнительных неоднозначных пар оснований в целевой последовательности PHK/AON помогает увеличить редактирование А в I.- 22 045815 layers shown in Fig. 3 show no detectable A in I editing for the sample where no AON was used: no G signal was visible above the background. In contrast, there is a clear presence of a G signal visible for the sample where the ADAR59-2 oligonucleotide was used in the editing assay. In addition, the ADAR72-1 oligonucleotide showed even higher G signal intensity, indicating that the presence of additional ambiguous base pairs in the RNA/AON target sequence helps to increase A to I editing.

Пример 2. Редактирование РНК при лечении синдрома Гурлера.Example 2: RNA editing for the treatment of Hurler syndrome.

Одно потенциальное целевое заболевание для редактирования РНК с использованием системы по настоящему изобретению представляет собой мукополисахаридоз типа I-Гурлера (MPS I-H, синдром Гурлера). Это заболевание вызвано мутацией c.1205G>A (W402X) в гене IDUA, который кодирует лизосомальный фермент a-L-идуронидазу. Редактирование А в I с использованием способов и средств согласно настоящему изобретению потенциально может обратить мутацию в последовательность дикого типа. Синдром Гурлера представляет собой лизосомальную болезнь накопления, которая вызывает множественную органную недостаточность из-за накопления гликозаминогликанов. Существует мышиная модель с аналогичной мутацией (W392X) с мутацией в эндогенном гене. Первоначальные эксперименты проводят на этой мышиной модели, оценивая эффект в разных тканях и органах. Кроме того, оценивают содержание гликозаминогликанов в разных тканях для оценки терапевтического потенциала подхода к редактированию.One potential target disease for RNA editing using the system of the present invention is mucopolysaccharidosis type I-Hurler (MPS I-H, Hurler syndrome). This disease is caused by the c.1205G>A (W402X) mutation in the IDUA gene, which encodes the lysosomal enzyme a-L-iduronidase. Editing A to I using the methods and means of the present invention can potentially reverse the mutation to a wild-type sequence. Hurler syndrome is a lysosomal storage disease that causes multiple organ failure due to the accumulation of glycosaminoglycans. There is a mouse model with a similar mutation (W392X) with a mutation in the endogenous gene. Initial experiments are carried out on this mouse model, assessing the effect in different tissues and organs. In addition, glycosaminoglycan content in different tissues is assessed to evaluate the therapeutic potential of the editing approach.

Часть последовательности экзона 9 гена Idua мыши выглядит следующим образом (мутация выделена жирным шрифтом):Part of the sequence of exon 9 of the mouse Idua gene is as follows (mutation in bold):

Эта последовательность ДНК представляет собой SEQ ID NO: 11, соответствующая последовательность РНК представляет собой SEQ ID NO: 12.This DNA sequence is SEQ ID NO: 11, the corresponding RNA sequence is SEQ ID NO: 12.

Авторы настоящего изобретения получили ряд антисмысловых олигонуклеотидов, направленных на пре-мРНК, поступающую из этой части последовательности Idua, которые используются в редактировании РНК, как описано в настоящем документе, с использованием мышиной модели, со следующими последовательностями (верхняя нить представляет собой олигонуклеотид от 3' к 5', нижняя нить представляет собой целевую РНК от 5' к 3' (SEQ ID NO: 12), несоответствия и неоднозначные соответствия подчеркнуты):The present inventors have prepared a series of antisense oligonucleotides targeting the pre-mRNA coming from this portion of the Idua sequence, which are used in RNA editing as described herein using a mouse model, with the following sequences (the top strand is an oligonucleotide from 3' to 5', the bottom strand is the target RNA from 5' to 3' (SEQ ID NO: 12), mismatches and ambiguous matches are underlined):

3' -CCUCUUGUUGAGACCCGUCUCCAGAGUUUCCGACCCCGACACAACCUGUC-5' (ADAR65)3' -CCUCUUGUUGAGACCCGUCUCCAGAGUUUCCGACCCCGACACAACCUGUC-5' (ADAR65)

5' -AUGGAGAACAACUCUAGGCAGAGGUCUCAAAGGCUGGGGCUGUGUUGGACAGCAAUCAUACAGUGGGU-3'5' -AUGGAGAACAACUCUAGGCAGAGGUCUCAAAGGCUGGGGCUGUGUUGGACAGCAAUCAUACAGUGGGU-3'

3' -CCUCUUGUUGAGACCCGUCUCCAGAGUUUCCGACCCCGACACAACCUGUC-5' (ADAR65-2)3' -CCUCUUGUUGAGACCCGUCUCCAGAGUUUCCGACCCCGACACAACCUGUC-5' (ADAR65-2)

5' -AUGGAGAACAACUCUAGGCAGAGGUCUCAAAGGCUGGGGCUGUGUUGGACAGCAAUCAUACAGUGGGU-3'5' -AUGGAGAACAACUCUAGGCAGAGGUCUCAAAGGCUGGGGCUGUGUUGGACAGCAAUCAUACAGUGGGU-3'

3' -CCUCUUGUUGAGACCUGUCUCCAGAGUUUCCGACCCCGACACAACCUGUC-5' (ADAR65-2x)3' -CCUCUUGUUGAGACCUGUCUCCAGAGUUUCCGACCCCGACACAACCUGUC-5' (ADAR65-2x)

5'-AUGGAGAACAACUCUAGGCAGAGGUCUCAAAGGCUGGGGCUGUGUUGGACAGCAAUCAUACAGUGGGU-3'5'-AUGGAGAACAACUCUAGGCAGAGGUCUCAAAGGCUGGGGCUGUGUUGGACAGCAAUCAUACAGUGGGU-3'

3'-UUGUUGAGACCCGUCUCCAGAGUUUCCGACCCCGACACAACCUGUC-5' (ADAR66)3'-UUGUUGAGACCCGUCUCCAGAGUUUCCGACCCCGACACAACCUGUC-5' (ADAR66)

5'-AUGGAGAACAACUCUAGGCAGAGGUCUCAAAGGCUGGGGCUGUGUUGGACAGCAAUCAUACAGUGGGU-3'5'-AUGGAGAACAACUCUAGGCAGAGGUCUCAAAGGCUGGGGCUGUGUUGGACAGCAAUCAUACAGUGGGU-3'

3'-CCUCUUGUUGAGACСCGUCUCCAGAGAUUCAGACССCGACAACCCCU GU C-5' (ADAR6 7)3'-CCUCUUGUUGAGACCCGUCUCCAGAGAUUCAGACCCCGACAACCCCU GU C-5' (ADAR6 7)

5'-AUGGAGAACAACUCUAGGCAGAGGUCUCAAAGGCUGGGGCUGUGUUGGACAGCAAUCAUACAGUGGGU-3'5'-AUGGAGAACAACUCUAGGCAGAGGUCUCAAAGGCUGGGGCUGUGUUGGACAGCAAUCAUACAGUGGGU-3'

3'-CCUCUUGUUGAGACСCGUCUCCAGAGAUUCAGACCUCGACAACUCCUGUCGUUA 5' (ADAR91)3'-CCUCUUGUUGAGACCCGUCUCCAGAGAUUCAGACCUCGACAACUCCUGUCGUUA 5' (ADAR91)

5'-AUGGAGAACAACUCUAGGCAGAGGUCUAAAAGGCUGGGGCUGUGUUGGACAGCAAUCAUACAGUGGGU-3'5'-AUGGAGAACAACUCUAGGCAGAGGUCUAAAAGGCUGGGGCUGUGUUGGACAGCAAUCAUACAGUGGGU-3'

3' -CCUCUUGUUGAGACCCGUCUCCAGAGUUUCCGACCUCGACACA-5' (ADAR93)3' -CCUCUUGUUGAGACCCGUCUCCAGAGUUUCCGACCUCGACACA-5' (ADAR93)

5'-AUGGAGAACAACUCUAGGCAGAGGUCUCAAAGGCUGGGGCUGUGUUGGACAGCAAUCAUACAGUGGGU-3'5'-AUGGAGAACAACUCUAGGCAGAGGUCUCAAAGGCUGGGGCUGUGUUGGACAGCAAUCAUACAGUGGGU-3'

ADAR65 (SEQ ID NO:13), ADAR65-2 (SEQ ID NO:24), ADAR65-2x (SEQ ID NO:25), ADAR66 (SEQ ID NO:14), ADAR67 (SEQ ID NO:15), ADAR91 (SEQ ID NO:26) и ADAR93 (SEQ ID NO:27) содержат ряд химических модификаций, указанных ниже:ADAR65 (SEQ ID NO:13), ADAR65-2 (SEQ ID NO:24), ADAR65-2x (SEQ ID NO:25), ADAR66 (SEQ ID NO:14), ADAR67 (SEQ ID NO:15), ADAR91 (SEQ ID NO:26) and ADAR93 (SEQ ID NO:27) contain a number of chemical modifications as follows:

- 23 045815- 23 045815

ADAR65: 5' -c*u*g*u*ccaacacagccccagccuuugagaccucugcCCAgaguuguu*c*u*c*c-3'ADAR65: 5' -c*u*g*u*ccaacacagccccagccuuugagaccucugcCCAgaguuguu*c*u*c*c-3'

ADAR65-2: 5'-c*u*g*u*ccaacacagccccagccuuugagaccucugcccagaguuguu*c*u*c*c-3' ADAR65-2x:5'-c*u*g*u*ccaacacagccccagccuuugagaccucuguCCAgaguuguu*c*u*c*c-3' ADAR66: 5'-c*u*g*u*ccaacacagccccagccuuugagaccucugcCCAgagu*u*g*u*u-3'ADAR65-2: 5'-c*u*g*u*ccaacacagccccagccuuugagaccucugcccagaguuguu*c*u*c*c-3' ADAR65-2x:5'-c*u*g*u*ccaacacagccccagccuuugagaccucuguCCAgaguuguu*c*u*c* c-3' ADAR66: 5'-c*u*g*u*ccaacacagccccagccuuugagaccucugcCCAgagu*u*g*u*u-3'

ADAR67: 5' - c*u*g*u*ccccaacagccccagacuuagagaccucugcCCAgaguuguu*c*u*c*c-3'ADAR67: 5' - c*u*g*u*ccccaacagccccagacuuagagaccucugcCCAgaguuguu*c*u*c*c-3'

ADAR91: 5' -a*u*u*g*cuguccucaacagcuccagacuuagagaccucugcCCAgaguuguu*c*u*c*c3'ADAR91: 5' -a*u*u*g*cuguccucaacagcuccagacuuagagaccucugcCCAgaguuguu*c*u*c*c3'

ADAR93: 5'-a*c*a*c*agcuccagccuuugagaccucugcCCAgaguuguu*c*u*c*c-3'ADAR93: 5'-a*c*a*c*agcuccagccuuugagaccucugcCCAgaguuguu*c*u*c*c-3'

Буквы регистра строчных букв представляют собой 2'-О-метил-модифицированные нуклеотиды РНК, нуклеотиды регистра прописных букв представляют собой немодифицированные нуклеотиды РНК (следовательно, не содержат 2'-O-метил-модификацию) и окружают центральный цитидин, который находится напротив целевого аденозина, за исключением ADAR65-2, который содержит 2'-О-метилмодификацию на всех своих нуклеотидах. Звездочки обозначают (4) фосфоротиоатные связи на всех концах олигонуклеотидов. Несоответствия и неоднозначные соответствия обозначены подчеркиванием. ADAR91 содержит 5 (областей) несоответствий/неоднозначных соответствий с целевой РНК, ADAR67 содержит 4, ADAR93 и ADAR65-2X оба содержат 2, тогда как AON ADAR65, ADAR65-2 и ADAR66 различаются только нуклеотидом, противоположным целевому аденозину. ADAR65 и ADAR66 идентичны по модификациям, но длина ADAR66 на 2 нуклеотида короче, чем ADAR65 на 3'-конце.Lowercase case letters represent 2'-O-methyl-modified RNA nucleotides, uppercase case nucleotides represent unmodified RNA nucleotides (hence do not contain the 2'-O-methyl modification) and surround the central cytidine, which is opposite the target adenosine , with the exception of ADAR65-2, which contains a 2'-O-methyl modification on all its nucleotides. Asterisks indicate (4) phosphorothioate bonds at all ends of the oligonucleotides. Inconsistencies and ambiguous matches are indicated by underlining. ADAR91 contains 5 mismatches/ambiguous matches to the target RNA, ADAR67 contains 4, ADAR93 and ADAR65-2X both contain 2, while AON ADAR65, ADAR65-2 and ADAR66 differ only in the nucleotide opposite to the target adenosine. ADAR65 and ADAR66 are identical in modifications, but ADAR66 is 2 nucleotides shorter than ADAR65 at the 3' end.

Влияние этих AON на восстановление последовательности дикого типа исследовали в анализе, который измеряет активность фермента a-L-идуронидазы, кодируемого Idua. Для этого иммортализованные эмбриональные клетки фибробластов (70000 на образец), полученные из мыши W392X, культивировали в среде для роста (DMEM/10% FCS) и трансфицировали с 1 мкг плазмиды, экспрессирующей мРНК W392X Idua с использованием липофектамина 3000. Через 24 ч клетки аналогичным образом трансфицировали с 100 нМ (конечная концентрация) олигонуклеотида и культивировали в течение дополнительных 48 ч. Затем клетки собирали и лизировали в буфере mPER (Thermo Scientific #78501). Клеточные фрагменты удаляли из лизатов путем центрифугирования и для ферментативного анализа использовали 25 мкл супернатанта: 25 из 360 мкл 4-метилумбеллиферил-α-L-ифуронида в 0,4 М буфере формиата натрия (рН 3,5) добавляли в образцы лизата, которые затем инкубировали в течение 2 ч при температуре 37°С. Реакцию прерывали добавлением 200 мкл 0,17 М глицинового буфера (рН 9,9) и затем измеряли полученную флуоресцентную интенсивность (длина волны возбуждения 365 нм и излучение 450 нм). Результаты нормировали к общей концентрации белка в образцах, как измерено с помощью анализа ВСА (Pierce™ BCA Protein Assay Kit, Thermo Scientific).The effect of these AONs on wild-type sequence recovery was examined in an assay that measures the activity of the a-L-iduronidase enzyme encoded by Idua. To do this, immortalized embryonic fibroblast cells (70,000 per sample) obtained from the W392X mouse were cultured in growth medium (DMEM/10% FCS) and transfected with 1 μg of plasmid expressing W392X Idua mRNA using Lipofectamine 3000. After 24 h, the cells were similarly were transfected with 100 nM (final concentration) of oligonucleotide and cultured for an additional 48 h. Cells were then harvested and lysed in mPER buffer (Thermo Scientific #78501). Cellular fragments were removed from the lysates by centrifugation and 25 μl of the supernatant was used for enzymatic analysis: 25 of 360 μl 4-methylumbelliferyl-α-L-ifuronide in 0.4 M sodium formate buffer (pH 3.5) was added to the lysate samples, which were then incubated for 2 hours at 37°C. The reaction was terminated by adding 200 μL of 0.17 M glycine buffer (pH 9.9) and then the resulting fluorescent intensity was measured (excitation wavelength 365 nm and emission 450 nm). Results were normalized to the total protein concentration of the samples as measured by the BCA assay (Pierce™ BCA Protein Assay Kit, Thermo Scientific).

Результаты (см. фиг. 4) ясно показывают, что в этих условиях трансфекции с олигонуклеотидами ADAR65-2 и ADAR 93-1 приводили к лишь небольшим улучшениям в ферментативной активности (менее чем в 2 раза) по сравнению с флуоресценцией, полученной с образцами из обработанных неолигонуклеотидом клеток (NT), которые экспрессируют только мРНК мутантного Idua. Напротив, с другими AON наблюдались значительные увеличения, при этом AON ADAR67 и ADAR91 приводили к увеличению активности более чем в 2 раза, a AON ADAR66, ADAR65 и ADAR65-2X приводили к увеличению более чем в 3,4 и 6 раз соответственно.The results (see Fig. 4) clearly show that under these conditions, transfections with the ADAR65-2 and ADAR 93-1 oligonucleotides resulted in only small improvements in enzymatic activity (less than 2-fold) compared to the fluorescence obtained with samples from neo-oligonucleotide-treated cells (NT) that express only mutant Idua mRNA. In contrast, significant increases were observed with other AONs, with AONs ADAR67 and ADAR91 leading to more than 2-fold increases in activity, and AONs ADAR66, ADAR65, and ADAR65-2X leading to more than 3.4- and 6-fold increases, respectively.

Впоследствии, основываясь на данных моделирования взаимодействия между олигонуклеотидом, целевой РНК и белком ADAR, изобретатели предположили, что несоответствие олигонуклеотида с положением 4 выше по ходу транскрипции от сайта редактирования может усилить связывание белков ADAR с целевой РНК и тем самым увеличить эффективность редактирования и уровни редактирования. Разработали четыре олигонуклеотида (ADAR93-2, ADAR93-3, ADAR93-4 и ADAR93-5) для исследования влияния несоответствия в положении 4 на редактирование целевой мРНК мышиного мутантного гена Idua (W392X) и восстановление его последовательности WT.Subsequently, based on data from modeling the interaction between the oligonucleotide, the target RNA, and the ADAR protein, the inventors hypothesized that mismatching the oligonucleotide at position 4 upstream of the editing site could enhance the binding of ADAR proteins to the target RNA and thereby increase editing efficiency and editing levels. Four oligonucleotides (ADAR93-2, ADAR93-3, ADAR93-4, and ADAR93-5) were designed to study the effect of mismatch at position 4 on target mRNA editing of the mouse mutant Idua gene (W392X) and restoration of its WT sequence.

3' CCUCUUGUUGAGACCCGUCUCCAGAGUUUCCGACCUCGACACA 5' (ADAR93-2) 5' UGUUGGAUGGAGAACAACUCUAGGCAGAGGUCUCAAAGGCUGGGGCUGUGUUGGACAGCAA 3'3' CCUCUUGUUGAGACCCGUCUCCAGAGUUUCCGACCUCGACACA 5' (ADAR93-2) 5' UGUUGGAUGGAGAACAACUCUAGGCAGAGGUCUCAAAGGCUGGGGCUGUGUUGGACAGCAA 3'

3' CCUCUUGUUAAGACCCGUCUCCAGAGUUUCCGACCUCGACACA 5' (ADAR93-3) 5' UGUUGGAUGGAGAACAACUCUAGGCAGAGGUCUCAAAGGCUGGGGCUGUGUUGGACAGCAA 3' ΐ3' CCUCUUGUUAAGACCCGUCUCCAGAGUUUCCGACCUCGACACA 5' (ADAR93-3) 5' UGUUGGAUGGAGAACAACUCUAGGCAGAGGUCUCAAAGGCUGGGGCUGUGUUGGACAGCAA 3' ΐ

3' CCUCUUGUUGAGACCCGUCUCCACAGUAUCCGACCUCUACACA 5' (ADAR93-4) 5' UGUUGGAUGGAGAACAACUCUAGGCAGAGGUCUCAAAGGCUGGGGCUGUGUUGGACAGCAA 3'3' CCUCUUGUUGAGACCCGUCUCCACAGUAUCCGACCUCUACACA 5' (ADAR93-4) 5' UGUUGGAUGGAGAACAACUCUAGGCAGAGGUCUCAAAGGCUGGGGCUGUGUUGGACAGCAA 3'

3' CCUCUUGUUAAGACCCGUCUCCACAGUAUCCGACCUCUACACA 5' (ADAR93-5) 5' UGUUGGAUGGAGAACAACUCUAGGCAGAGGUCUCAAAGGCUGGGGCUGUGUUGGACAGCAA 3' т3' CCUCUUGUUAAGACCCGUCUCCACAGUAUCCGACCUCUACACA 5' (ADAR93-5) 5' UGUUGGAUGGAGAACAACUCUAGGCAGAGGUCUCAAAGGCUGGGGCUGUGUUGGACAGCAA 3' t

Верхние нити представляют собой олигонуклеотиды, нижняя нить представляет собой целевую РНК с мутацией (А), выделенной жирным шрифтом. Несоответствия и неоднозначные соответствия подThe top strands are oligonucleotides, the bottom strand is the target RNA with the mutation (A) in bold. Inconsistencies and ambiguous matches under

- 24 045815 черкнуты. Несоответствие между олигонуклеотидом ADAR93-3 и ADAR93-5 с целевой последовательностью в положении, которое расположено в 4 нуклеотидах выше против хода транскрипции от мутации в целевой последовательности, обозначено стрелкой. ADAR92-2 (помимо этого несоответствия) идентична ADAR93-3. ADAR93-4 (помимо этого несоответствия) идентична ADAR93-5. ADAR93-2 (SEQ ID NO: 28), ADAR93-3 (SEQ ID NO: 29), ADAR93-4 (SEQ ID NO: 30) и ADAR93-5 (SEQ ID NO: 31) содержат ряд химических модификаций, представленных ниже:- 24 045815 crossed out. The mismatch between the ADAR93-3 and ADAR93-5 oligonucleotides with the target sequence at a position that is located 4 nucleotides upstream of the mutation in the target sequence is indicated by an arrow. ADAR92-2 (other than this discrepancy) is identical to ADAR93-3. ADAR93-4 (other than this discrepancy) is identical to ADAR93-5. ADAR93-2 (SEQ ID NO: 28), ADAR93-3 (SEQ ID NO: 29), ADAR93-4 (SEQ ID NO: 30) and ADAR93-5 (SEQ ID NO: 31) contain a number of chemical modifications presented below :

ADAR93-2ADAR93-2

5'-a*c*a*c*a*G*cuc*c*a*g*c*c*u*u*u*G*A*gaccu*c*u*g*cCCAGaguu*g*u*u*c*u*c*c-3'5'-a*c*a*c*a*G*cuc*c*a*g*c*c*u*u*u*G*A*gaccu*c*u*g*cCCAGaguu*g*u *u*c*u*c*c-3'

ADAR93-3ADAR93-3

5' - a*c*a*c*a*G*cuc*c*a*g*c*c*u*u*u*G*A*gaccu*c*u*g*cCCAGaauu*g*u*u*c*u*c*c-3'5' - a*c*a*c*a*G*cuc*c*a*g*c*c*u*u*u*G*A*gaccu*c*u*g*cCCAGaauu*g*u *u*c*u*c*c-3'

ADAR93-4ADAR93-4

5'-a*c*a*c*a*U*cuc*c*a*g*c*c*u*a*u*G*A*caccu*c*u*g*cCCAGaguu*g*u*u*c*u*c*c-3'5'-a*c*a*c*a*U*cuc*c*a*g*c*c*u*a*u*G*A*caccu*c*u*g*cCCAGaguu*g*u *u*c*u*c*c-3'

ADAR93-5ADAR93-5

5'-a*c*a*c*a*U*cuc*c*a*g*c*c*u*a*u*G*A*caccu*c*u*g*cCCAGaauu*g*u*u*c*u*c*c-3'5'-a*c*a*c*a*U*cuc*c*a*g*c*c*u*a*u*G*A*caccu*c*u*g*cCCAGaauu*g*u *u*c*u*c*c-3'

Буквы регистра строчных букв представляют собой 2'-О-метил-модифицированные РНК-нуклеотиды, нуклеотиды регистра прописных букв представляют собой немодифицированные нуклеотиды РНК (следовательно, с отсутствием модификации 2'-O-метила). Звездочки между нуклеозидами изображают фосфоротиоатные связи. Несоответствия и неоднозначные соответствия обозначены подчеркиванием.Lowercase case letters represent 2'-O-methyl-modified RNA nucleotides, uppercase case nucleotides represent unmodified RNA nucleotides (hence lacking 2'-O-methyl modification). Asterisks between nucleosides represent phosphorothioate bonds. Inconsistencies and ambiguous matches are indicated by underlining.

Влияние этих четырех олигонуклеотидов на восстановление последовательности дикого типа исследовали в редактировании и ферментативном анализе, как описано выше. Как показано на фиг. 5А и 5В, введение несоответствия С-А олигонуклеотида ADAR93-2 и ADAR93-5 с целевой последовательностью оказало положительное влияние на редактирование, что показано посредством увеличения флуоресцентного сигнала по сравнению с олигонуклеотидами без несоответствия (ADAR93-2 и ADAR93-4 соответственно). Это указывает на то, что дополнительное несоответствие с положением в 4 нуклеотидах выше против хода транскрипции от сайта редактирования (выше против хода транскрипции соответствует направлению к 5' в целевой последовательности) может помочь белкам ADAR дополнительно связываться с целевой РНК, что затем приводит к повышению эффективности редактирования.The effect of these four oligonucleotides on wild-type sequence recovery was examined in editing and enzymatic assays as described above. As shown in FIG. 5A and 5B, introduction of a C-A mismatch of the ADAR93-2 and ADAR93-5 oligonucleotides with the target sequence had a positive effect on editing, as shown by an increase in fluorescent signal compared to oligonucleotides without a mismatch (ADAR93-2 and ADAR93-4, respectively). This indicates that an additional mismatch at a position 4 nucleotides upstream of the editing site (upstream corresponds to the 5' direction in the target sequence) may help ADAR proteins further bind to the target RNA, which then leads to increased efficiency editing.

Пример 3. Редактирование РНК при лечении дефицита АААТ.Example 3: RNA editing in the treatment of AAAT deficiency.

Другим целевым заболеванием для редактирования РНК с использованием подхода, описанного в настоящем документе, является дефицит А1АТ (A1ATD), вызванный мутацией c.1096G>A в гене SERPINA1. Мишенью является мутантная последовательность с. 1096G>A человека как для доставки in vitro, так и для in vivo. Мышиные модели содержат гуманизированную последовательность. Для доставки in vivo основной целью конструкций, которые разработаны в соответствии с настоящим изобретением, является печень, так как именно здесь вырабатывается большая часть А1АТ. Оценка основана на наблюдаемой активности редактирования на уровне РНК, а также на функциональном восстановлении фенотипов легких и печени, связанных с этим заболеванием.Another target disease for RNA editing using the approach described herein is A1AT deficiency (A1ATD), caused by the c.1096G>A mutation in the SERPINA1 gene. The target is the mutant sequence c. 1096G>A human for both in vitro and in vivo delivery. Mouse models contain humanized sequence. For in vivo delivery, the primary target of the constructs that are developed in accordance with the present invention is the liver, since this is where the majority of A1AT is produced. The assessment is based on observed editing activity at the RNA level as well as functional restoration of lung and liver phenotypes associated with the disease.

Пример 4. Редактирование РНК при лечении болезни Паркинсона.Example 4: RNA editing in the treatment of Parkinson's disease.

Еще одним целевым заболеванием для редактирования РНК с использованием подхода по настоящему изобретению является болезнь Паркинсона, вызванная мутацией c.6055G>A в гене LRRK2. Это самая распространенная генетическая причина, связанная с болезнью Паркинсона. Исследуют различные способы направленного воздействия антисмысловыми олигонуклеотидами на клетки головного мозга, разработанными, как представлено в настоящем документе, начиная с прямых инъекций с использованием мышиной модели. Оценка эффективности в основном основана на активности редактирования, наблюдаемой на уровне РНК. Также изучают фосфопротеому клеток, чтобы установить, что активность гиперактивной киназы (которая, как известно, влияет, например, на ГТФазы Rab), вызванная мутацией, отменяется. В конечном счете, оценивается влияние на целостность нигростриарных дофаминергических нейронов мышей.Another target disease for RNA editing using the approach of the present invention is Parkinson's disease caused by the c.6055G>A mutation in the LRRK2 gene. This is the most common genetic cause associated with Parkinson's disease. Various methods of targeting brain cells with antisense oligonucleotides developed as presented herein are being explored, starting with direct injections using a mouse model. Efficiency assessment is primarily based on editing activity observed at the RNA level. The phosphoproteome of the cells is also studied to determine that the hyperactive kinase activity (known to affect, for example, Rab GTPases) caused by the mutation is abolished. Ultimately, the impact on the integrity of mouse nigrostriatal dopaminergic neurons is assessed.

Пример 5. Редактирование РНК эндогенным ADAR.Example 5. RNA editing by endogenous ADAR.

Чтобы исследовать, может ли быть выполнено редактирование РНК без сверхэкспрессии экзогенных ферментов ADAR, сначала оценивали, какие доступные клеточные линии экспрессируют ADAR1 и/или ADAR2. Эти клетки (если (сверх)экспрессирующие ADAR1 и/или ADAR2) затем трансфицировали конструкцией, содержащей стоп-кодон GFP, как описано в примере 1, вместе с представляющими интерес олигонуклеотидами для редактирования остановки GFP. Следующие линии клеток первоначально исследовали в отношении экспрессии ADAR: A549 (карцинома легкого человека), НСТ116 (карцинома толстого кишечника человека), Т84 (карцинома толстого кишечника человека), SNU-449 (гепатоцеллюлярная карцинома человека), SNU-475 (гепатоцеллюлярная карцинома человека) PANC1 (рак поджелудочной железы человека), SK-N-SH (нейробластома человека) и MCF7 (карцинома молочной железы человека). Клетки А549 хранили в RPMI1640+10% FBS, HCT116 (АТСС #62765668) хранили в 5А+10% FBS McCoy, T84 хранили в DMEM: F12 (1:1)+10% FBS, SNU-449 (АТСС #63014146) хранили вTo investigate whether RNA editing could be performed without overexpression of exogenous ADAR enzymes, we first assessed which available cell lines expressed ADAR1 and/or ADAR2. These cells (if (over)expressing ADAR1 and/or ADAR2) were then transfected with a construct containing a GFP stop codon as described in Example 1, along with GFP stop editing oligonucleotides of interest. The following cell lines were initially examined for ADAR expression: A549 (human lung carcinoma), HCT116 (human colon carcinoma), T84 (human colon carcinoma), SNU-449 (human hepatocellular carcinoma), SNU-475 (human hepatocellular carcinoma) PANC1 (human pancreatic cancer), SK-N-SH (human neuroblastoma) and MCF7 (human breast carcinoma). A549 cells were stored in RPMI1640+10% FBS, HCT116 (ATCC #62765668) were stored in 5A+10% McCoy FBS, T84 were stored in DMEM: F12 (1:1)+10% FBS, SNU-449 (ATCC #63014146) were stored V

- 25 045815- 25 045815

RPMI1640+10% FBS, SNU-475 (АТСС #62996846) хранили в RPMI1640+10% FBS, PANC1 хранили в DMEM+10% FBS, SK-N-SH хранили в МЕМЕ+10% FBS+5 мл/л NaPyr+5 мл/л глутамакс и клетки MCF7 хранили в DMEM+10% FBS. Экспрессию ADAR1 и ADAR2 в каждой клеточной линии проверяли с помощью вестерн-блоттинга. Для этого клетки собирали, а количественную оценку белка проводили с использованием набора для анализа белков BSA Pierce (Thermo Scientific) с использованием протокола изготовителя. Равные количества белка разделяли на геле ДСН-ПААГ и переносили в мембраны для анализа. Первоначально блоты окрашивали Ponceau S для визуализации полной загрузки белка, которая оказалась равной для всех линий/полос клеток (данные не показаны). Затем мембраны промывали 1 раз в PBST, инкубировали в 10 мл первичных мышиных антител к ADARB1 (SAB1405426 (Sigma), 1:1000 в 0,05% PBS-T) и мышином антителе к ADAR1 (GT1066 ab 184527 (Abcam) 1:1000, в 0,05% PBS-T) и растворе антитела к тубулину кроликов (1:5000 в 0,05% PBS-T) на испытательном стенде O/N при 4°С. На следующий день мембраны промывали 3x5 мин PBS-T и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с 1:5000 антимышиным IRDye 800CW и 1:5000 антикроличьим IRDye 680RD. Мембраны промывали 3x5 мин PBS-T и затем 5 мин с PBS. Мембраны сканировали с использованием системы обработки изображений Oddysey CLx (LiCor Bioscence) с параметрами длины волны 700 и 800 и автоматической настройкой изображения.RPMI1640+10% FBS, SNU-475 (ATCC #62996846) were stored in RPMI1640+10% FBS, PANC1 were stored in DMEM+10% FBS, SK-N-SH were stored in MEME+10% FBS+5 ml/L NaPyr+ 5 ml/L glutamax and MCF7 cells were stored in DMEM+10% FBS. The expression of ADAR1 and ADAR2 in each cell line was checked by Western blotting. To do this, cells were harvested and protein quantification was performed using the BSA Pierce Protein Assay Kit (Thermo Scientific) using the manufacturer's protocol. Equal amounts of protein were separated on an SDS-PAGE gel and transferred to membranes for analysis. Blots were initially stained with Ponceau S to visualize total protein loading, which was found to be equal for all cell lines/strips (data not shown). Then the membranes were washed 1 time in PBST, incubated in 10 ml of primary mouse antibodies to ADARB1 (SAB1405426 (Sigma), 1:1000 in 0.05% PBS-T) and mouse anti-ADAR1 antibody (GT1066 ab 184527 (Abcam) 1:1000 , in 0.05% PBS-T) and anti-rabbit tubulin antibody solution (1:5000 in 0.05% PBS-T) on an O/N test bench at 4°C. The next day, membranes were washed 3x5 min with PBS-T and incubated for 1 h at room temperature with 1:5000 anti-mouse IRDye 800CW and 1:5000 anti-rabbit IRDye 680RD. Membranes were washed 3x5 min with PBS-T and then 5 min with PBS. Membranes were scanned using an Oddysey CLx imaging system (LiCor Bioscence) with wavelength settings of 700 and 800 and automatic image adjustment.

Вестерн-блоты показаны на фиг. 6. В то время как загрузка белка была эквивалентна для всех клеточных линий, что может быть выведено из экспрессии В-тубулина, представляется, что экспрессия ADAR1 схожа для всех клеточных линий, за исключением клеточной линии рака молочной железы человека MCF7, в которой экспрессия значительно ниже. С другой стороны, экспрессия ADAR2 схожа для всех клеточных линий, за исключением гепатоцеллюлярной карциномы SNU-475 человека, где она, повидимому, присутствует, но значительно менее распространена. Остальные 6 клеточных линий, повидимому, экспрессируют ADAR1 и ADAR2 до сопоставимых уровней.Western blots are shown in Fig. 6. While protein loading was equivalent for all cell lines, which can be inferred from B-tubulin expression, ADAR1 expression appears to be similar for all cell lines, with the exception of the human breast cancer cell line MCF7, in which expression was significantly below. On the other hand, ADAR2 expression is similar in all cell lines, with the exception of human hepatocellular carcinoma SNU-475, where it appears to be present but is much less abundant. The remaining 6 cell lines appear to express ADAR1 and ADAR2 to comparable levels.

Так как все клеточные линии экспрессировали ADAR1 или ADAR2 или и ADAR1, и ADAR2, все клетки, кроме Т84, которые оказалось трудно трансфицировать, исследовали, чтобы проверить, достаточно ли этого эндогенного содержания редактирующих РНК ферментов для редактирования РНК в заданном положении в целевой последовательности.Because all cell lines expressed ADAR1 or ADAR2 or both ADAR1 and ADAR2, all cells except T84, which proved difficult to transfect, were examined to test whether this endogenous content of RNA-editing enzymes was sufficient to edit the RNA at a given position in the target sequence.

Для этого клети трансфицировали целевой последовательностью (GFPstop57) и олигонуклеотидами. Экспрессионная конструкция GFPstop57 (фиг. 10А) представляет собой ту же конструкцию, что и при получении линии клеток HeLa (пример 1) со стабильно интегрированной последовательностью GFPstop57 (SEQ ID NO: 9; фиг. 10В), которая кодирует белок из 57 аминокислот из-за остановки в остатке 58 (SEQ ID NO: 10 для аминокислотной последовательности, фиг. 10В).For this purpose, cells were transfected with the target sequence (GFPstop57) and oligonucleotides. The GFPstop57 expression construct (Fig. 10A) is the same construct used to generate the HeLa cell line (Example 1) with the GFPstop57 sequence (SEQ ID NO: 9; Fig. 10B) stably integrated, which encodes a 57 amino acid protein from - for stops at residue 58 (SEQ ID NO: 10 for the amino acid sequence, Fig. 10B).

Клетки высевали в количестве приблизительно 0,3x106 клеток на лунку в 6-луночном планшете в 2 мл среды. Через 24 ч после высевания клетки трансфицировали плазмидой GFPstop57 в количестве 1000 нг с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen) и Opti-Mem (Gibco), применяя общие технологии, известные специалисту в настоящей области техники. Через 6 ч после этой трансфекции добавляли 2 мл свежей среды и через 48 ч после высевания клетки трансфицировали олигонуклеотидом в количестве 100 нМ, и снова через 6 ч добавляли 2 мл свежей среды. Клетки собирали через 30 ч после трансфекции олигонуклеотидом. Рандомизированные трансфекции олигонуклеотидом и Mock (Cy5) принимались как отрицательные контроли. Исследовали следующие антисмысловые олигонуклеотиды, аналогичные тем, что показаны в примере 1 и на фиг. 1 и SEQ ID NO: 1-4 соответственно:Cells were seeded at approximately 0.3 x 106 cells per well in a 6-well plate in 2 ml of medium. 24 hours after plating, cells were transfected with 1000 ng of GFPstop57 plasmid using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) and Opti-Mem (Gibco) using general techniques known to one skilled in the art. 6 hours after this transfection, 2 ml of fresh medium was added and 48 hours after plating, the cells were transfected with 100 nM oligonucleotide, and 2 ml of fresh medium was added again 6 hours later. Cells were harvested 30 h after oligonucleotide transfection. Randomized transfections with oligonucleotide and Mock (Cy5) were taken as negative controls. The following antisense oligonucleotides were tested, similar to those shown in Example 1 and FIG. 1 and SEQ ID NO: 1-4 respectively:

ADAR56-2ADAR56-2

5'- g*a*a*a*guagugacaaguguuggCCAuggaacagguaguuuuc*c*a*g*u -3'5'- g*a*a*a*guagugacaaguguuggCCAuggaacagguaguuuuc*c*a*g*u -3'

ADAR57-2ADAR57-2

5'- g*a*a*a*guagugagaaguguuggCCAuggaacagguuguuuuc*c*a*g*u -3'5'- g*a*a*a*guagugagaaguguuggCCAuggaacagguuguuuuc*c*a*g*u -3'

ADAR58-2ADAR58-2

5'- g*a*a*a*gucucgacaaguguuggCCAuggaacagguacaauuc*c*a*g*u -3'5'- g*a*a*a*gucucgacaaguguuggCCAuggaacagguacaauuc*c*a*g*u -3'

ADAR59-2ADAR59-2

5'- c*a*u*u*gaagaagauaagagaaaguacugagaaguguuggCCAuggaacag*g*u*a*g -3'5'- c*a*u*u*gaagaagauaagagaaaguacugagaaguguuggCCAuggaacag*g*u*a*g -3'

Буквы регистра строчных букв представляют собой 2'-О-метил-модифицированные РНК-нуклеотиды, нуклеотиды регистра прописных букв представляют собой немодифицированные нуклеотиды РНК (следовательно, с отсутствием модификации 2'-О-метила) и окружают центр С, который находится напротив целевого аденозина в GFPstop57. Звездочки (*) отображают фосфоротиоатные связи между нуклеозидами на концах олигонуклеотидов.Lowercase case letters represent 2'-O-methyl-modified RNA nucleotides, uppercase case nucleotides represent unmodified RNA nucleotides (hence lacking 2'-O-methyl modification) and surround the C center, which is opposite the target adenosine in GFPstop57. Asterisks (*) represent phosphorothioate bonds between nucleosides at the ends of oligonucleotides.

Через 36 ч после трансфекции РНК выделяли из лизированных клеток и использовали в качестве матрицы для синтеза кДНК и ПЦР. Качество РНК проверяли с помощью биоанализатора Agilent 2100. Анализ редактирования РНК проводили с помощью RT-PCR, как описано в примере 1, с последующим секвенированием Сэнгера ПЦР-продукта с использованием общей RT-ПЦР и способов секвенирования, известных специалисту в настоящей области техники. RT-PCR показала, что все 5 оставшихся клеточных линий, которые трансфицировали конструкцией GFPstop57 и олигонуклеотидами (за исключением клеток SK-N-SH, которые трансфицировали ADAR59-2), дали продукт с нуклеотидом 175 (данные не пока36 h after transfection, RNA was isolated from lysed cells and used as a template for cDNA synthesis and PCR. RNA quality was checked using an Agilent 2100 Bioanalyzer. RNA editing analysis was performed using RT-PCR as described in Example 1, followed by Sanger sequencing of the PCR product using general RT-PCR and sequencing methods known to one skilled in the art. RT-PCR showed that all 5 remaining cell lines that were transfected with the GFPstop57 construct and oligonucleotides (with the exception of SK-N-SH cells, which were transfected with ADAR59-2) produced a product at nucleotide 175 (data not yet

- 26 045815 заны). Продукт ПЦР из разных клеточных линий использовали в анализе последовательностей с использованием праймера GFP forward3 (SEQ ID NO: 7; см. выше) и GFP reverse3 (SEQ ID NO: 8; см. выше). В клетках А549, НСТ116 и PANC1 никакого существенного сдвига от TAG^TGG (прямое направление) или от СТА^ССА (обратное направление) не могло быть обнаружено выше фоновых уровней, тогда как в клетках SNU-449 наблюдался некоторый сдвиг с олигонуклеотидами ADAR56-2 и ADAR59-2 (данные не показаны). Самые ясные результаты, которые были намного выше, получили с клетками SNU-475 и MCF7. На фиг. 7 показаны результаты с четырьмя олигонуклеотидами на клетках SNU-475 (рак печени) с использованием прямого (FWD) и обратного (REV) праймеров в секвенировании. На фиг. 8 показаны результаты с четырьмя олигонуклеотидами на клетках MCF7 (рак молочной железы) с использованием прямого (FWD) праймера в секвенировании. Эти фигуры показывают очень четкий и значительный сдвиг в последовательности в целевом положении, при этом, похоже, что ADAR59-2 обеспечивал наилучшие результаты в MCF7, тогда как редактирование РНК с эндогенным ADAR наблюдалось в клетках SNU-475 с использованием всех четырех олигонуклеотидов. На фиг. 9 представлены результаты секвенирования после использования ADAR57-2 (см. также фиг. 7 слева внизу), указывающие, что только в целевом аденозине (стрелка) происходит дезаминирование, показывая, что не происходит неизбирательного редактирования в окружающих аденозинах, a AON и способы по настоящему изобретению обеспечивают очень сайт-специфическое редактирование. Эти результаты показывают, что авторы настоящего изобретения достигли редактирования РНК в клетках, в которые была введена целевая последовательность и редактирующий РНК олигонуклеотид (со специфическими модификациями), без необходимости сверхэкспрессии редактирующего РНК фермента, то есть, опираясь на ферментативную активность эндогенных белков ADAR и сайт-специфический способ (т.е. был отредактирован только один аденозин в последовательности РНК, нацеленный посредством AON; см. фиг. 9).- 26 045815 zana). PCR product from different cell lines was used in sequence analysis using primers GFP forward3 (SEQ ID NO: 7; see above) and GFP reverse3 (SEQ ID NO: 8; see above). In A549, HCT116 and PANC1 cells, no significant shift from TAG^TGG (forward direction) or from TAG^CCA (reverse direction) could be detected above background levels, whereas in SNU-449 cells some shift was observed with ADAR56-2 oligonucleotides and ADAR59-2 (data not shown). The clearest results, which were much higher, were obtained with SNU-475 and MCF7 cells. In fig. Figure 7 shows results with four oligonucleotides on SNU-475 (liver cancer) cells using forward (FWD) and reverse (REV) primers in sequencing. In fig. Figure 8 shows results with four oligonucleotides on MCF7 (breast cancer) cells using the forward (FWD) primer in sequencing. These figures show a very clear and significant sequence shift at the target position, with ADAR59-2 appearing to provide the best performance in MCF7, while RNA editing with endogenous ADAR was observed in SNU-475 cells using all four oligonucleotides. In fig. 9 shows sequencing results after using ADAR57-2 (see also FIG. 7 bottom left) indicating that only the target adenosine (arrow) undergoes deamination, indicating that no indiscriminate editing occurs at surrounding adenosines, and AON and methods of the present The invention provides very site-specific editing. These results indicate that the present inventors have achieved RNA editing in cells into which the target sequence and the RNA editing oligonucleotide (with specific modifications) have been introduced, without the need for overexpression of the RNA editing enzyme, i.e., relying on the enzymatic activity of endogenous ADAR and site proteins. in a specific manner (i.e., only one adenosine in the RNA sequence targeted by AON was edited; see Fig. 9).

Пример 6. Редактирование РНК эндогенным ADAR на эндогенной мишени.Example 6. RNA editing by endogenous ADAR on an endogenous target.

После достижения редактирования РНК с использованием эндогенных ферментов ADAR, как описано в примере 5, исследовали, может ли быть достигнуто редактирование РНК с использованием эндогенных ферментов ADAR без использования совместной трансфекции целевой последовательности. Авторы настоящего изобретения выбрали полипептид А малых ядерных рибонуклеопротеинов (Snrpa) в качестве эндогенной мишени из-за его относительно высокого изобилия и повсеместной экспрессии. Г ен кодирует белок, который связывается со структурой петля-на-стебле II малого ядерного рибонуклеопротеина U1, который связывает 5'-сайт сплайсинга предшественников мРНК и необходим для сплайсинга. AON разрабатывали для редактирования стоп-кодона дикого типа (UAG) Snrpa мРНК мыши, который затем, вероятно, приводил бы к удлинению открытой рамки считывания и удлинению белка, кодируемого последовательностями ниже по ходу транскрипции (фиг. 11).Having achieved RNA editing using endogenous ADAR enzymes as described in Example 5, it was examined whether RNA editing could be achieved using endogenous ADAR enzymes without the use of co-transfection of the target sequence. The present inventors selected small nuclear ribonucleoprotein polypeptide A (Snrpa) as an endogenous target due to its relatively high abundance and ubiquitous expression. The gene encodes a protein that binds to the stem-loop II structure of small nuclear ribonucleoprotein U1, which binds the 5' splice site of precursor mRNAs and is required for splicing. AON was designed to edit the wild-type stop codon (UAG) of mouse Snrpa mRNA, which would then likely lead to an extension of the open reading frame and extension of the protein encoded by downstream sequences (Fig. 11).

Сначала разработали два AON: ADAR87-1 и ADAR89-1 (см. табл. 2) и исследовали в клетках Нера 1-6, которые представляют собой клеточную линию, полученную из гепатомы мыши BW7756, которая возникла у мышей C57/L. Клетки высевали в 6-луночный планшет за 24 ч до трансфекции в количестве 200000 клеток/лунку в обычной культуральной среде (DMEM+10% FCS). Через 24 ч клетки либо не трансфицировали (контроль NT и только AON), либо трансфицировали плазмидой в количестве 1000 нг, кодирующей короткую изоформу ADAR2 (ADAR2sh) с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen) в соответствии с протоколами производителя. Среду меняли перед добавлением трансфекционной смеси, и среду обновляли в лунках без трансфекции. Снова через 24 ч клетки либо не трансфицировали (контроль NT), либо трансфицировали AON ADAR87-1 или ADAR89-1c конечной концентрацией 100 нМ на лунку. Среду обновляли до трансфекции.First, two AONs were developed: ADAR87-1 and ADAR89-1 (see Table 2) and studied in Hepa 1-6 cells, which are a cell line derived from the mouse hepatoma BW7756, which arose in C57/L mice. Cells were seeded in a 6-well plate 24 hours before transfection at a rate of 200,000 cells/well in normal culture medium (DMEM+10% FCS). After 24 h, cells were either not transfected (NT control and AON only) or transfected with 1000 ng of plasmid encoding the short isoform of ADAR2 (ADAR2sh) using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) according to the manufacturer's protocols. The medium was changed before adding the transfection mixture, and the medium was refreshed in wells without transfection. Again, 24 h later, cells were either not transfected (NT control) or transfected with AON ADAR87-1 or ADAR89-1c at a final concentration of 100 nM per well. The medium was refreshed prior to transfection.

Клетки инкубировали в течение 48 ч после второй трансфекции (или в случае только AON, после единственной трансфекции) при 37°С. Среду удаляли и клетки промывали один раз 1xPBS, и 400 мкл Trizol добавляли в каждую лунку для клеточного лизиса. Затем Trizol собирали в 1,5 мл пробирках Эппендорфа, а РНК экстрагировали с помощью miniprep Direct-Zol (Zymo) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрации РНК измеряли с использованием Nanodrop, и 500 нг РНК использовали для синтеза кДНК с помощью набора Maxima Reverse Transcriptase (ThermoFisher Scientific). На первой стадии AON диссоциировали из целевой мРНК путем инкубации с частично комплементарным смысловым олигонуклеотидом mSnrpa-SON3 в количестве 1,2 мкл (2 мкМ):Cells were incubated for 48 h after the second transfection (or in the case of AON only, after a single transfection) at 37°C. The medium was removed and the cells were washed once with 1xPBS, and 400 μl Trizol was added to each well for cell lysis. Trizol was then collected in 1.5 mL Eppendorf tubes, and RNA was extracted using Direct-Zol miniprep (Zymo) according to the manufacturer's instructions. RNA concentrations were measured using Nanodrop, and 500 ng of RNA was used for cDNA synthesis using a Maxima Reverse Transcriptase kit (ThermoFisher Scientific). In the first step, AON was dissociated from the target mRNA by incubation with the partially complementary sense oligonucleotide mSnrpa-SON3 in an amount of 1.2 μl (2 μM):

5’-U*C*C*U*UUGCCAAGAAGUGGCACCUUUUCCUCCCAUGCCUACUCC*U*U*C*C-3’ (SEQ ID NO: 20). Звездочки в mSnrpa-SON3 указывают на межнуклеозидные фосфоротиоатные связи. Все нуклеотиды в этом олигонуклеотиде являются 2-О-метилированными. Синтез кДНК проводили с использованием протоколов изготовителя.5’-U*C*C*U*UUGCCAAGAAGUGGCACCUUUUCCUCCCAUGCCUACUCC*U*U*C*C-3’ (SEQ ID NO: 20). Asterisks in mSnrpa-SON3 indicate internucleoside phosphorothioate bonds. All nucleotides in this oligonucleotide are 2-O-methylated. cDNA synthesis was performed using the manufacturer's protocols.

ПЦР проводили с использованием прямого праймера Fw1 mSNRPA 5'-GCCTTCGTGGAGTTTGACA-3' (SEQ ID NO: 21) и обратного праймера Rev1_mSNRPA 5'-ACACACGGCTCTGAGAAGGT-3' (SEQ ID NO: 22) с использованием способов, общеизвестных специалисту в настоящей области техники. Продукт ПЦР проверяли на биоанализаторе Agilent 2100 и очищали с помощью геля Nucleo-Spin и набора для ПЦР-очистки (Macherey-Nagel), а очищенные продукты секвенировали с секвенирующим праймером Snrp-1-Fw1 5'-CGTGGAGTTTGACAATGAAGT-3'.PCR was performed using forward primer Fw1 mSNRPA 5'-GCCTTCGTGGAGTTTGACA-3' (SEQ ID NO: 21) and reverse primer Rev1_mSNRPA 5'-ACACACGGCTCTGAGAAGGT-3' (SEQ ID NO: 22) using methods well known to one skilled in the art . The PCR product was tested on an Agilent 2100 Bioanalyzer and purified using a Nucleo-Spin gel and PCR purification kit (Macherey-Nagel), and the purified products were sequenced with the sequencing primer Snrp-1-Fw1 5′-CGTGGAGTTTGACAATGAAGT-3′.

- 27 045815- 27 045815

Таблица 2table 2

Название Name Неизмененная последовательность (от 5’ к 3’) Unchanged sequence (5’ to 3’) Последовательность с модификациями (от 5’ к 3’) Sequence with modifications (from 5’ to 3’) ADAR87-I (SEQ ID NO: 18) ADAR87-I (SEQ ID NO: 18) GUAGGCAUGGGAGGAAAAG GUGCCACUUCUUGGCAAAG GA GUAGGCAUGGGAGGAAAAG GUGCCACUUCUUGGCAAAG GA mG*mU*mA*mG*mGmCmAmUmGmG mGmA mGmGmAmAmAmAmGmGmUmGCCA mCmU mUmCmUmUmGmGmCmA mA*mA*mG*mG*mA mG*mU*mA*mG*mGmCmAmUmGmG mGmA mGmGmAmAmAmAmGmGmUmGCCA mCmU mUmCmUmUmGmGmCmA mA*mA*mG*mG*mA ADAR89-1 (SEQ ID NO: 19) ADAR89-1 (SEQ ID NO: 19) GACUGAGGUACUCCAUAGG GAAAGGUGCCACUUCUUGG CAAAGGA GACUGAGGUACUCCAUAGG GAAAGGUGCCACUUCUUGG CAAAGGA mG*mA*mC*mU*mGmAmGmGmUmA mCmU mCmCmAmUmAmGmGmGmAmAmAm GmGmUmGCCAmCmUmUmCmUmUm GmGmCmA mA*mA*mG*mG*mA mG*mA*mC*mU*mGmAmGmGmUmA mCmU mCmCmAmUmAmGmGmGmAmAmAm GmGmUmGCCAmCmUmUmCmUmUm GmGmCmA mA*mA*mG*mG*mA ADAR89-2 (SEQ ID NO:32) ADAR89-2 (SEQ ID NO:32) GACUGAGGUACUCCAUAGG GAAAGGUGCCACUUCUUGG CAAAGGA GACUGAGGUACUCCAUAGG GAAAGGUGCCACUUCUUGG CAAAGGA mG*mA*mC*mU*mGmAmGmGmUmA mCmU mCmCmAmUmAmGmGmGmAmAmAm GmGmUmGCCAmCmUmUmCmUmUm GmGmCmA mA*mA*mG*mG*mA mG*mA*mC*mU*mGmAmGmGmUmA mCmU mCmCmAmUmAmGmGmGmAmAmAm GmGmUmGCCAmCmUmUmCmUmUm GmGmCmA mA*mA*mG*mG*mA ADAR94-1 (SEQ ID NO:33) ADAR94-1 (SEQ ID NO:33) GACUGAGGUACUCCUUAGA GAAAGGUGCCACUUCUUGG CAAAGGA GACUGAGGUACUCCUUAGA GAAAGGUGCCACUUCUUGG CAAAGGA mG*mA*mC*mU*mGmAmGmGmUmA mCmU mCmCmUmUmAmGmAmGmAmAmAm GmGmUmGCCAmCmUmUmCmUmUm GmGmCmA mA*mA*mG*mG*mA mG*mA*mC*mU*mGmAmGmGmUmA mCmU mCmCmUmUmAmGmAmGmAmAmAm GmGmUmGCCAmCmUmUmCmUmUm GmGmCmA mA*mA*mG*mG*mA

А, С, G и U представляют собой РНК; подчеркнутые С и А представляют собой ДНК; mA, mC, mG и mU представляют собой 2'-О-метилированные рибонуклеотиды; звездочки указывают на фосфоротиоатные связи.A, C, G and U represent RNA; underlined C and A represent DNA; mA, mC, mG and mU are 2'-O-methylated ribonucleotides; asterisks indicate phosphorothioate bonds.

При использовании ADAR87-1 (данные не показаны) редактирование выше фона не наблюдалось. Результаты редактирования РНК, вызванные олигонуклеотидом ADAR89-1, представлены на фиг. 12. На панели (А) показан нетрансфицированный (NT) контроль без какого-либо обнаруживаемого редактирования РНК в положении стоп-кодона (указан стрелкой). На панели (В) показан контроль, в котором трансфицирована только плазмида, кодирующая короткую изоформу ADAR2. На панели (С) показано увеличение пика G, обозначенного стрелкой. Это увеличение, которое явно выше фона, указывает на то, что редактирование РНК (А >I) происходило в желаемом положении после трансфекции только с помощью AON ADAR89-1 в клетках, которые не были трансфицированы сверхэкспрессирующей плазмидой ADAR2. На панели (D) показан положительный контроль как с плазмидой экспрессии ADARsh, так и с AON. Считается, что этот результат (панель С) является первым среди когда-либо наблюдаемого индуцированного редактирования РНК специфически в желаемом положении путем введения антисмыслового олигонуклеотида в отсутствие сверхэкспрессии ADAR и без совместной трансфекции плазмид, которые вызывают сверхэкспрессию целевой РНК.No editing above background was observed using ADAR87-1 (data not shown). The results of RNA editing caused by the ADAR89-1 oligonucleotide are presented in Fig. 12. Panel (A) shows a non-transfected (NT) control without any detectable RNA editing at the stop codon position (indicated by arrow). Panel (B) shows a control in which only the plasmid encoding the short ADAR2 isoform was transfected. Panel (C) shows the magnification of peak G, indicated by the arrow. This increase, which is clearly above background, indicates that RNA editing (A>I) occurred at the desired position after transfection with AON ADAR89-1 alone in cells that were not transfected with the ADAR2 overexpression plasmid. Panel (D) shows positive controls with both the ADARsh and AON expression plasmid. This result (panel C) is believed to be the first ever observed to induce RNA editing specifically at a desired position by introducing an antisense oligonucleotide in the absence of ADAR overexpression and without cotransfection of plasmids that induce overexpression of the target RNA.

Были разработаны еще два олигонуклеотида: ADAR89-2 и ADAR94-1 (см. табл. 2), в которых центральный триплет ССА (средний нуклеотид С противоположен редактируемому аденозину) представляет собой ДНК, тогда как остальная часть олигонуклеотида является 2'-О-метил-модифицированной. Последовательность ADAR89-2 идентична ADAR89-1, тогда как последовательность ADAR94-1 имеет два дополнительных несоответствия по отношению к ADAR89-2 (см. фиг. 12). Эти AON исследовали в том же анализе, что и описанный в этом примере выше в клетках Нера 1-6. Полученные данные секвенирования изображены на фиг. 13, и они показывают, что для нетрансфицированного контроля (NCTRL) не обнаружено никакого редактирования РНК. Данные секвенирования для олигонуклеотида ADAR89-2 показывают наличие нуклеотида G в сайте редактирования, как указано стрелкой, что показывает, что когда центральный триплет представляет собой ДНК (а не РНК), также можно получить хорошее редактирование. Замена РНК-нуклеотидов центрального триплета, которые очень чувствительны к нуклеазам, на ДНК может добавить стабильности AON. Явное увеличение сигнала для G-пика для олигонуклеотида ADAR94-1 указывает на то, что введение двух дополнительных несоответствий в положениях 10 и 14 в последовательности ADAR89-2 оказывает еще более положительное влияние на редактирование премРНК эндогенного Snrpa, что снова показывает, что дополнительные выступы, несоответствия и/или неоднозначные соответствия могут еще больше повысить эффективность редактирования РНК (что во всех разных мишенях очень вероятно зависит от множества факторов, таких как последовательность, температура плавления спирали AON-PHK, перекрытие, вторичные структуры и так далее).Two more oligonucleotides have been developed: ADAR89-2 and ADAR94-1 (see Table 2), in which the central triplet CCA (middle nucleotide C opposite the adenosine being edited) is DNA, while the rest of the oligonucleotide is 2'-O-methyl -modified. The ADAR89-2 sequence is identical to ADAR89-1, while the ADAR94-1 sequence has two additional mismatches relative to ADAR89-2 (see Fig. 12). These AONs were examined in the same assay as described in this example above in Hepa 1-6 cells. The resulting sequencing data is depicted in FIG. 13 and they show that no RNA editing was detected for the untransfected control (NCTRL). Sequencing data for the ADAR89-2 oligonucleotide shows the presence of a G nucleotide at the editing site, as indicated by the arrow, indicating that when the central triplet is DNA (rather than RNA), good editing can also be obtained. Replacing the central triplet RNA nucleotides, which are highly sensitive to nucleases, with DNA may add stability to AON. The clear increase in signal for the G peak for the ADAR94-1 oligonucleotide indicates that the introduction of two additional mismatches at positions 10 and 14 in the ADAR89-2 sequence has an even more positive effect on pre-mRNA editing of endogenous Snrpa, again indicating that the additional overhangs, mismatches and/or ambiguous matches can further increase the efficiency of RNA editing (which in all different targets very likely depends on many factors such as sequence, melting temperature of the AON-RNA helix, overlap, secondary structures, and so on).

Пример 7. Редактирование РНК для восстановления мутации Val66Met в РНК, кодирующей BDNF.Example 7: RNA editing to restore the Val66Met mutation in RNA encoding BDNF.

Конструкция одноцепочечной модификации РНК, индуцирующей олигонуклеотиды, может быть использована для различных целевых РНК и множества заболеваний и нарушений, связанных с такими содержащими мутацию мишенями. Одной из недавно выявленных потенциальных мишеней для болезниThe design of single-stranded RNA modification inducing oligonucleotides can be used for a variety of RNA targets and a variety of diseases and disorders associated with such mutation-containing targets. One of the recently identified potential targets for the disease

--

Claims (15)

Альцгеймера является полиморфизм Val66Met нейротрофического фактора головного мозга (BDNF), который также вызван мутацией G на A (Boots et al., Neurology May, 30, 2017, vol 88(22):2098-2106). Раскрытые в настоящем документе AON используют для редактирования РНК в конкретном положении мРНК BDNF. AON, которые используются для этой цели, характеризуются следующими последовательности (с нижней нитью, представляющей собой целевую последовательность BDNF (SEQ ID NO: 35), и верхними нитями, представляющими собой олигонуклеотиды). Модификации представляют собой 2'-О-метил (регистр строчных букв), ДНК (регистр прописных букв), фосфоротиоатные связи (звездочки) и несоответствия и неоднозначные соответствия (подчеркнутые). Целевой аденозин выделен жирным шрифтом.Alzheimer's disease is the Val66Met polymorphism of brain-derived neurotrophic factor (BDNF), which is also caused by the G to A mutation (Boots et al., Neurology May, 30, 2017, vol 88(22):2098-2106). The AONs disclosed herein are used to edit RNA at a specific position in the BDNF mRNA. AONs that are used for this purpose are characterized by the following sequences (with the bottom strand being the BDNF target sequence (SEQ ID NO: 35) and the top strands being oligonucleotides). The modifications are 2'-O-methyl (lower case), DNA (upper case), phosphorothioate bonds (asterisks), and mismatches and ambiguous matches (underlined). The target adenosine is shown in bold. BDNF AON1 (SEQ ID NO:36)BDNF AON1 (SEQ ID NO:36) 3'-CUGUGAAAGCUUGUGCAUUAUCUUCUCGACAACCUACUCCUGGUCUUUCAAG-5 5'-AUCAUUGGCUGACACUUUCGAACACAUGAUAGAAGAGCUGUUGGAUGAGGACCAGAAAGUUCGGCCCAAUG-3' 5'-g*a*a*c*uuucugguccucauccaacagcucuucuauuACGuguucgaaag*u*g*u*c-3'3'-CUGUGAAAGCUUGUGCAUUAUCUUCUCGACAACCUACUCCUGGUCUUUCAAG-5 5'-AUCAUUGGCUGACACUUUCGAACACAUGAUAGAAGAGCUGUUGGAUGAGGACCAGAAAGUUCGGCCCAAUG-3' 5'-g*a*a*c*uuucugguccuccaacagcucuucuauuACGuguucgaaag*u*g*u*c -3' BDNF AON2 (SEQ ID NO:37)BDNF AON2 (SEQ ID NO:37) 3' -CU GUGAAAGCUUGUICAUUAUCUUCUCGACAACCUACUCCUGGUCUUUCAAG-53' -CU GUGAAAGCUUGUICAUUAUCUUCUCGACAACCUACUCCUGGUCUUUCAAG-5 5' -AUCAUUGGCUGACACUUUCGAACACAUGAUAGAAGAGCUGUUGGAUGAGGACCAGAAAGUUCGGCCCAAUG-35' -AUCAUUGGCUGACACUUUCGAACACAUGAUAGAAGAGCUGUUGGAUGAGGACCAGAAAGUUCGGCCCAAUG-3 5'-g*a*a*c*uuucugguccucauccaacagcucuucuauuACIuguucgaaag*u*g*u*c-3'5'-g*a*a*c*uuucugguccucauccaacagcucuucuauuACIuguucgaaag*u*g*u*c-3' BDNF AON3 (SEQ ID NO:38)BDNF AON3 (SEQ ID NO:38) 3'-CUGUGAAAGCUUGUGCAUUAUCUUCUCGUCAAACUACUCCUGUAAUUUCAAG-53'-CUGUGAAAGCUUGUGCAUUAUCUUCUCGUCAAACUACUCCUGUAAUUUCAAG-5 5' -AUCAUUGGCUGACACUUUCGAACACAUGAUAGAAGAGCUGUUGGAUGAGGACCAGAAAGUUCGGCCCAAUG-3'5' -AUCAUUGGCUGACACUUUCGAACACAUGAUAGAAGAGCUGUUGGAUGAGGACCAGAAAGUUCGGCCCAAUG-3' 5'-g*a*a*c*uuuaauguccucaucaaacugcucuucuauuACGuguucgaaag*u*g*u*c-3'5'-g*a*a*c*uuuaauguccuaucaaacugcucuucuauuACGuguucgaaag*u*g*u*c-3' Понятно, что настоящее изобретение описано выше только в качестве примера, и могут быть сделаны модификации, оставаясь в пределах объема и сущности настоящего изобретения.It is understood that the present invention has been described above by way of example only, and modifications may be made while remaining within the scope and spirit of the present invention. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM 1. Антисмысловой олигонуклеотид (AON), способный образовывать двухцепочечный комплекс с целевой РНК в клетке, для дезаминирования целевого аденозина, присутствующего в целевой РНК, с помощью фермента аденозиндезаминазы, действующей на РНК (ADAR), присутствующей в клетке, причем1. An antisense oligonucleotide (AON) capable of forming a double-stranded complex with a target RNA in a cell to deaminate the target adenosine present in the target RNA by the enzyme adenosine deaminase acting on RNA (ADAR) present in the cell, wherein a) AON комплементарен области целевой РНК, содержащей целевой аденозин, и AON содержит одно или более несоответствий, неоднозначных соответствий и/или выпуклостей с комплементарной областью целевой РНК;a) the AON is complementary to a region of the target RNA containing the target adenosine, and the AON contains one or more mismatches, ambiguous matches and/or bulges with the complementary region of the target RNA; b) AON содержит один или более нуклеотидов с одной или более модификациями сахара при условии, что нуклеотид, противоположный целевому аденозину, представляет собой дезоксицитидин;b) AON contains one or more nucleotides with one or more sugar modifications, provided that the nucleotide opposite to the target adenosine is deoxycytidine; c) AON не содержит участок, который способен образовывать внутримолекулярную структуру петля-на-стебле, которая способна связывать фермент ADAR;c) AON does not contain a region that is capable of forming an intramolecular stem-loop structure that is capable of binding the ADAR enzyme; d) AON не содержит 5'-концевую модификацию O₆-бензилгуанина;d) AON does not contain a 5'-terminal O ₆ -benzylguanine modification; e) AON не содержит 5'-концевую амино-модификацию; а такжеe) AON does not contain a 5'-terminal amino modification; and f) AON не связан ковалентно с доменом SNAP-tag.f) AON is not covalently linked to the SNAP-tag domain. 2. AON, способный образовывать двухцепочечный комплекс с целевой РНК в клетке для дезаминирования целевого аденозина, присутствующего в целевой РНК, с помощью фермента ADAR, присутствующего в клетке, причем2. An AON capable of forming a double-stranded complex with a target RNA in a cell to deaminate the target adenosine present in the target RNA using the ADAR enzyme present in the cell, wherein a) AON комплементарен области целевой РНК, содержащей целевой аденозин, и AON содержит одно или более несоответствий, неоднозначных соответствий и/или выпуклостей с комплементарной областью целевой РНК;a) the AON is complementary to a region of the target RNA containing the target adenosine, and the AON contains one or more mismatches, ambiguous matches and/or bulges with the complementary region of the target RNA; b) AON содержит один или более нуклеотидов с одной или более модификациями сахара при условии, что нуклеотид, противоположный целевому аденозину, представляет собой дезоксицитидин;b) AON contains one or more nucleotides with one or more sugar modifications, provided that the nucleotide opposite to the target adenosine is deoxycytidine; c) AON не содержит участок, который способен образовывать внутримолекулярную структуру петля-на-стебле, которая способна связывать фермент ADAR; а такжеc) AON does not contain a region that is capable of forming an intramolecular stem-loop structure that is capable of binding the ADAR enzyme; and d) AON не является 17- или 20-мерным.d) AON is not 17- or 20-dimensional. - 29 045815- 29 045815 3. AON, способный образовывать двухцепочечный комплекс с целевой РНК в клетке, для дезаминирования целевого аденозина, присутствующего в целевой РНК, с помощью фермента ADAR, присутствующего в клетке, причем3. An AON capable of forming a double-stranded complex with a target RNA in the cell to deaminate the target adenosine present in the target RNA with the help of the ADAR enzyme present in the cell, wherein a) AON комплементарен целевой области РНК, содержащей целевой аденозин, и AON содержит одно или более несоответствий, неоднозначных соответствий и/или выпуклостей с комплементарной областью целевой РНК;a) the AON is complementary to the target RNA region containing the target adenosine, and the AON contains one or more mismatches, ambiguous matches and/or bulges with the complementary region of the target RNA; b) AON содержит один или более нуклеотидов с одной или более модификациями сахара при условии, что нуклеотид, противоположный целевому аденозину, представляет собой дезоксицитидин;b) AON contains one or more nucleotides with one or more sugar modifications, provided that the nucleotide opposite to the target adenosine is deoxycytidine; c) AON не содержит участок, который способен образовывать внутримолекулярную структуру петля-на-стебле, которая способна связывать фермент ADAR; а такжеc) AON does not contain a region that is capable of forming an intramolecular stem-loop structure that is capable of binding the ADAR enzyme; and d) AON длиннее 17 нуклеотидов или короче 14 нуклеотидов.d) AON is longer than 17 nucleotides or shorter than 14 nucleotides. 4. AON, способный образовывать двухцепочечный комплекс с целевой РНК в клетке для дезаминирования целевого аденозина, присутствующего в целевой РНК, с помощью фермента ADAR, присутствующего в клетке, причем4. An AON capable of forming a double-stranded complex with a target RNA in a cell to deaminate the target adenosine present in the target RNA using the ADAR enzyme present in the cell, wherein a) AON комплементарен области целевой РНК, содержащей целевой аденозин;a) AON is complementary to the region of the target RNA containing the target adenosine; b) AON содержит один или более нуклеотидов с одной или более модификациями сахара при условии, что нуклеотид, противоположный целевому аденозину, представляет собой дезоксицитидин;b) AON contains one or more nucleotides with one or more sugar modifications, provided that the nucleotide opposite to the target adenosine is deoxycytidine; c) AON не содержит участок, который способен образовывать внутримолекулярную структуру петля-на-стебле, которая способна связывать фермент ADAR; а такжеc) AON does not contain a region that is capable of forming an intramolecular stem-loop structure that is capable of binding the ADAR enzyme; and d) AON содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 несоответствий, неоднозначных соответствий и/или выпуклостей с комплементарной областью целевой РНК.d) The AON contains 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 mismatches, ambiguous matches and/or bulges with the complementary region of the target RNA. 5. AON по любому из пп.1-4, в котором нуклеотид, расположенный непосредственно 5' и/или 3' от нуклеотида, противоположного целевому аденозину, содержит рибозу с 2'-ОН-группой или дезоксирибозу с 2'-Н-группой.5. AON according to any one of claims 1 to 4, in which the nucleotide located immediately 5' and/or 3' from the nucleotide opposite to the target adenosine contains ribose with a 2'-OH group or deoxyribose with a 2'-H group . 6. AON по п.5, причем все остальные нуклеотиды в AON содержат 2'-О-алкильную группу, предпочтительно 2'-О-метильную группу.6. AON according to claim 5, wherein all other nucleotides in AON contain a 2'-O-alkyl group, preferably a 2'-O-methyl group. 7. AON по любому из пп.1-6, содержащий по меньшей мере одну фосфоротиоатную связь.7. AON according to any one of claims 1 to 6, containing at least one phosphorothioate bond. 8. AON по п.7, в котором 2, 3, 4, 5 или 6 концевых нуклеотидов 5'- и 3'-конца AON связаны с фосфоротиоатными связями.8. The AON according to claim 7, wherein the 2, 3, 4, 5 or 6 terminal nucleotides of the 5' and 3' ends of the AON are linked to phosphorothioate bonds. 9. AON по п.8, в котором 5 концевых нуклеотидов на 5'- и 3'-конце связаны с фосфоротиоатными связями.9. AON according to claim 8, wherein the 5 terminal nucleotides at the 5' and 3' ends are linked to phosphorothioate bonds. 10. AON по любому из пп.1-9, причем AON длиннее, чем 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 нуклеотидов.10. AON according to any one of claims 1 to 9, wherein the AON is longer than 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 or 17 nucleotides. 11. AON по любому из пп.1-10, причем AON короче, чем 100 нуклеотидов, предпочтительно короче, чем 60 нуклеотидов.11. AON according to any one of claims 1 to 10, wherein the AON is shorter than 100 nucleotides, preferably shorter than 60 nucleotides. 12. AON по п.10 или 11, причем AON содержит от 18 до 70 нуклеотидов, предпочтительно от 18 до 60 нуклеотидов и более предпочтительно от 18 до 50 нуклеотидов.12. AON according to claim 10 or 11, wherein the AON contains from 18 to 70 nucleotides, preferably from 18 to 60 nucleotides, and more preferably from 18 to 50 nucleotides. 13. Фармацевтическая композиция, содержащая AON по любому из пп.1-12 и фармацевтически приемлемый носитель.13. A pharmaceutical composition containing the AON according to any one of claims 1 to 12 and a pharmaceutically acceptable carrier. 14. Применение AON по любому из пп.1-12 для лечения или профилактики генетического нарушения, предпочтительно выбранного из группы, состоящей из муковисцидоза, синдрома Гурлера, дефицита альфа-1-антитрипсина (А1АТ), болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, альбинизма, бокового амиотрофического склероза, астмы, β-талассемии, синдрома Кадасила, болезни Шарко-Мари-Тута, хронической обструктивной болезни легких (COPD), дистальной спинальной мышечной атрофии (DSMA), мышечной дистрофии Дюшенна/Беккера, дистрофического буллезного эпидермоза, буллезного эпидермоза, болезни Фабри, связанных с фактором V Лейдена нарушений, семейного аденоматозного полипоза, галактоземии, болезни Гоше, дефицита глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, гемофилии, наследственного гемохроматоза, синдрома Хантера, болезни Хантингтона, воспалительного заболевания кишечника (IBD), наследственного синдрома полиагглютинации, врожденного амароза Лебера, синдрома Леша-Нихана, синдрома Линча, синдрома Марфана, мукополисахаридоза, мышечной дистрофии, миотонической дистрофии I и II типов, нейрофиброматоза, болезни Ниманна-Пика типа А, В и С, связанного с NY-eso1 рака, синдрома Пейтца-Егерса, фенилкетонурии, болезни Помпе, первичного цилиарного заболевания, нарушений, связанных с протромбиновой мутацией, легочной гипертензии, пигментной дистрофии сетчатки, болезни Сандхоффа, синдрома тяжелой комбинированной иммунной недостаточности (SCID), серповидно-клеточной анемии, спинальной мышечной атрофии, болезни Старгардта, болезни Тай-Сакса, синдрома Ушера, связанного с Х-хромосомой иммунодефицита и рака.14. Use of AON according to any one of claims 1 to 12 for the treatment or prevention of a genetic disorder, preferably selected from the group consisting of cystic fibrosis, Hurler syndrome, alpha-1-antitrypsin (A1AT) deficiency, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, albinism, lateral Amyotrophic sclerosis, asthma, β-thalassemia, Kadacil syndrome, Charcot-Marie-Tooth disease, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), distal spinal muscular atrophy (DSMA), Duchenne/Becker muscular dystrophy, dystrophic epidermos bullosa, epidermos bullosa, Fabry disease , factor V Leiden disorders, familial adenomatous polyposis, galactosemia, Gaucher disease, glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency, hemophilia, hereditary hemochromatosis, Hunter syndrome, Huntington disease, inflammatory bowel disease (IBD), hereditary polyagglutination syndrome, Leber congenital amarosis, Lesch-Nyhan syndrome, Lynch syndrome, Marfan syndrome, mucopolysaccharidosis, muscular dystrophy, myotonic dystrophy types I and II, neurofibromatosis, Niemann-Pick disease types A, B and C, NY-eso1-related cancer, Peutz-Jeghers syndrome, phenylketonuria, Pompe disease, primary ciliary disease, prothrombin mutation disorders, pulmonary hypertension, retinal pigmentary dystrophy, Sandhoff disease, severe combined immune deficiency syndrome (SCID), sickle cell disease, spinal muscular atrophy, Stargardt disease, Thai-Sachs disease, Usher syndrome, X-linked immunodeficiency and cancer. 15. Применение AON по любому из пп.1-12 в изготовлении лекарственного средства для лечения или профилактики генетического нарушения, предпочтительно выбранного из группы, состоящей из муковисцидоза, синдрома Гурлера, дефицита альфа-1-антитрипсина (А1АТ), болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, альбинизма, бокового амиотрофического склероза, астмы, β-талассемии, синдрома Кадасила, болезни Шарко-Мари-Тута, хронической обструктивной болезни легких (COPD), дистальной спинальной мышечной атрофии (DSMA), мышечной дистрофии Дюшенна/Беккера, дистрофического бул15. Use of the AON according to any one of claims 1 to 12 in the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of a genetic disorder, preferably selected from the group consisting of cystic fibrosis, Hurler's syndrome, alpha-1-antitrypsin (A1AT) deficiency, Parkinson's disease, Alzheimer's disease , albinism, amyotrophic lateral sclerosis, asthma, β-thalassemia, Cadacil syndrome, Charcot-Marie-Tooth disease, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), distal spinal muscular atrophy (DSMA), Duchenne/Becker muscular dystrophy, dystrophic b. --