EA045776B1

EA045776B1 - PLATFORM FOR NATIVE LIQUID CHROMATO-MASS SPECTROMETRY

Info

Publication number: EA045776B1
Application number: EA202292219
Authority: EA
Inventors: Шунхай Ванг; Юэтянь Янь
Original assignee: Ридженерон Фармасьютикалз, Инк.
Priority date: 2020-01-30
Filing date: 2021-01-29
Publication date: 2023-12-26

Description

Область изобретенияField of invention

Данное изобретение относится к системе и способу характеристики белка и, в частности, к платформе нативной жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС) для характеристики белков, таких как белковые биофармацевтические препараты.This invention relates to a system and method for protein characterization and, in particular, to a native liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) platform for characterizing proteins, such as protein biopharmaceuticals.

Уровень техникиState of the art

Масс-спектрометрия (МС) с ионизацией электрораспылением (ESI) в сочетании с методами хроматографического и электрофоретического разделения является ключевой технологией в протеомике. Она стал важным инструментом для углубленной характеристики белковых биофармацевтических препаратов в аналитических лабораториях для поддержки их разработки и подачи нормативных документов. Белковые биофармацевтические препараты должны соответствовать очень высоким стандартам чистоты, поэтому важно отслеживать и характеризовать белки на разных этапах разработки и производства лекарств.Electrospray ionization (ESI) mass spectrometry (MS) coupled with chromatographic and electrophoretic separation techniques is a key technology in proteomics. It has become an important tool for in-depth characterization of protein biopharmaceuticals in analytical laboratories to support their development and regulatory filings. Protein biopharmaceuticals must meet very high standards of purity, so it is important to track and characterize proteins at different stages of drug development and production.

Анализ белковых биофармацевтических препаратов на основе жидкостной хромато-массспектрометрии (ЖХ-МС) может значительно выиграть от повышения качества данных, что впоследствии может привести к улучшению характеристик лекарств с большей достоверностью и меньшей неопределенностью. Чтобы получить характеристику различных атрибутов белка, можно выполнить широкий спектр анализов на основе ЖХ-МС, в рамках которых анализ пептидного картирования и анализ интактной массы наиболее часто и широко применяются. Чтобы повысить достоверность анализа и уменьшить неоднозначность, связанную с интерпретацией данных, необходимо прилагать постоянные усилия для улучшения качества данных анализа ЖХ-МС, в том числе с использованием оптимизированных экспериментальных процедур, а также точной настройки параметров прибора и более совершенных масс-спектрометров.Liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) analysis of protein biopharmaceuticals can greatly benefit from improved data quality, which can subsequently lead to improved drug characterization with greater confidence and less uncertainty. To characterize various protein attributes, a wide range of LCMS-based assays can be performed, with peptide mapping analysis and intact mass analysis being the most commonly and widely used. To improve the confidence of the analysis and reduce the ambiguity associated with data interpretation, ongoing efforts must be made to improve the quality of LC-MS analysis data, including the use of optimized experimental procedures, as well as fine tuning of instrument parameters and more advanced mass spectrometers.

Краткая сущность изобретенияBrief summary of the invention

В одном аспекте, данное изобретение обеспечивает систему нативной жидкостной хроматографиимасс-спектрометрии, включающую: систему жидкостной хроматографии, способную разделять образец; а также систему масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (ESI-MS), сообщающаяся по текучей среде с системой жидкостной хроматографии, при этом система ESI-MS включает эмиттер ионизации электрораспылением с несколькими соплами, систему модификации десольватационного газа и масс-спектрометр, причем масс-спектрометр сконфигурирован для приема ионов и определения отношения массы к заряду ионов.In one aspect, the present invention provides a native liquid chromatography mass spectrometry system, including: a liquid chromatography system capable of separating a sample; and an electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) system in fluid communication with a liquid chromatography system, the ESI-MS system comprising a multi-nozzle electrospray ionization emitter, a desolvation gas modification system, and a mass spectrometer, the mass The spectrometer is configured to receive ions and determine the mass to charge ratio of the ions.

В некоторых вариантах реализации, система для модификации газа десольватации содержит контейнер с крышкой, при этом крышка имеет порт впускной линии и порт выпускной линии; впускную линию защитного газа для подачи защитного газа к порту впускной линии; и модифицированную выпускную линию газа десольватации, способную соединять порт выпускной линии модифицированного газа десольватации с эмиттером ионизации электрораспылением с несколькими соплами.In some embodiments, the desolvation gas modification system comprises a container with a lid, the lid having an inlet line port and an outlet line port; a shield gas inlet line for supplying shield gas to the inlet line port; and a modified desolvation gas outlet line capable of connecting a port of the modified desolvation gas outlet line to a multi-nozzle electrospray ionization emitter.

В некоторых вариантах реализации, контейнер содержит органический растворитель и дополнительный химический компонент.In some embodiments, the container contains an organic solvent and an additional chemical component.

В некоторых вариантах реализации дополнительный химический компонент представляет собой кислоту.In some embodiments, the additional chemical component is an acid.

В некоторых вариантах реализации, кислота представляет собой трифторуксусную кислоту.In some embodiments, the acid is trifluoroacetic acid.

В некоторых вариантах реализации дополнительный химический компонент представляет собой основание.In some embodiments, the additional chemical component is a base.

В некоторых вариантах реализации, основание представляет собой триэтиламин.In some embodiments, the base is triethylamine.

В некоторых вариантах реализации органический сорастворитель представляет собой ацетонитрил.In some embodiments, the organic co-solvent is acetonitrile.

В некоторых вариантах реализации, защитный газ представляет собой азот.In some embodiments, the shielding gas is nitrogen.

В некоторых вариантах реализации, впускная линия защитного газа частично вставлена в отверстие впускной линии.In some embodiments, the shielding gas inlet line is partially inserted into the inlet line opening.

В некоторых вариантах реализации, выпускная линия модифицированного газа десольватации частично вставлена в отверстие выпускной линии.In some embodiments, the modified desolvation gas outlet line is partially inserted into the outlet line opening.

В некоторых вариантах реализации, защитный газ поступает из впускной линии защитного газа через контейнер, содержащий органический растворитель, в выпускную линию газа десольватации.In some embodiments, the shielding gas flows from the shielding gas inlet line through a container containing an organic solvent to the desolvation gas outlet line.

В некоторых вариантах реализации, эмиттер ионизации электрораспылением с несколькими соплами включает в себя восемь сопел.In some embodiments, the multi-nozzle electrospray ionization emitter includes eight nozzles.

В некоторых вариантах реализации, система жидкостной хроматографии включает колонку для эксклюзионной хроматографии (ЭХ).In some embodiments, the liquid chromatography system includes a size exclusion chromatography (SEC) column.

В некоторых вариантах реализации, система жидкостной хроматографии содержит столбец ионообменной хроматографии (IEX).In some embodiments, the liquid chromatography system includes an ion exchange chromatography (IEX) column.

В некоторых вариантах реализации, система жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии дополнительно содержит аналитический делитель потока для регулирования скорости потока от жидкостного хроматографа к масс-спектрометру.In some embodiments, the liquid chromatography-mass spectrometry system further comprises an analytical flow divider for controlling the flow rate from the liquid chromatograph to the mass spectrometer.

В некоторых вариантах реализации, аналитический делитель потока способен обеспечить электрораспыление со скоростью потока растворителя около от 1 до 5 мкл/мин.In some embodiments, the analytical flow splitter is capable of providing electrospray at a solvent flow rate of about 1 to 5 μL/min.

- 1 045776- 1 045776

В некоторых вариантах реализации, масс-спектрометр содержит масс-анализатор с орбитальной ловушкой.In some embodiments, the mass spectrometer includes an orbitrap mass analyzer.

В некоторых вариантах реализации, раскрыт способ характеристики белка в образце, включающий: подачу образца в систему жидкостной хроматографии, обеспечивающую разделение и фрагментацию образца; и анализ фрагментированного образца с использованием системы масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (ESI-MS), сообщающейся по текучей среде с системой жидкостной хроматографии, при этом система ESI-MS включает эмиттер ионизации электрораспылением с несколькими соплами, систему для модификации десольватирующего газа и масс-спектрометр, при этом масс-спектрометр сконфигурирован для приема ионов и определения отношения массы к заряду ионов для идентификации компонентов белка для характеристики белка.In some embodiments, a method of characterizing a protein in a sample is disclosed, comprising: submitting the sample to a liquid chromatography system allowing separation and fragmentation of the sample; and analyzing the fragmented sample using an electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) system in fluid communication with a liquid chromatography system, the ESI-MS system including a multi-nozzle electrospray ionization emitter, a desolvation gas modification system, and a mass a spectrometer, wherein the mass spectrometer is configured to receive ions and determine the mass to charge ratio of the ions to identify protein components for characterization of the protein.

В некоторых вариантах реализации, белок представляет собой антитело, слитый белок, рекомбинантный белок или их комбинацию.In some embodiments, the protein is an antibody, a fusion protein, a recombinant protein, or a combination thereof.

В некоторых вариантах реализации, антитело представляет собой моноклональное антитело.In some embodiments, the antibody is a monoclonal antibody.

В некоторых вариантах реализации, моноклональное антитело изотипа IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или смешанного изотипа.In some embodiments, a monoclonal antibody of an IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, or mixed isotype.

В некоторых вариантах реализации, способ не требует дегликозилирования белка в образце перед подачей образца в систему жидкостной хроматографии.In some embodiments, the method does not require deglycosylation of the protein in the sample before submitting the sample to the liquid chromatography system.

В некоторых вариантах реализации, способ предназначен для определения характеристик примесей с высокой молекулярной массой и с низкой молекулярной массой.In some embodiments, the method is designed to characterize high molecular weight and low molecular weight impurities.

В некоторых вариантах реализации способа, система для модификации газа десольватации содержит контейнер с крышкой, при этом крышка имеет порт впускной линии и порт выпускной линии; впускную линию защитного газа для подачи защитного газа на вход линейный порт; и модифицированную выпускную линию газа десольватации, способную соединять порт выпускной линии модифицированного газа десольватации с эмиттером ионизации электрораспылением с несколькими соплами.In some embodiments of the method, the desolvation gas modification system comprises a container with a lid, the lid having an inlet line port and an outlet line port; a shielding gas inlet line for supplying shielding gas to the inlet line port; and a modified desolvation gas outlet line capable of connecting a port of the modified desolvation gas outlet line to a multi-nozzle electrospray ionization emitter.

В некоторых вариантах реализации способа, контейнер содержит органический растворитель и дополнительный химический компонент.In some embodiments of the method, the container contains an organic solvent and an additional chemical component.

В некоторых вариантах реализации способа, дополнительным химическим компонентом является кислота.In some embodiments of the method, the additional chemical component is an acid.

В некоторых вариантах реализации способа, кислота представляет собой трифторуксусную кислоту.In some embodiments of the method, the acid is trifluoroacetic acid.

В некоторых вариантах реализации способа, дополнительным химическим компонентом является основание.In some embodiments of the method, the additional chemical component is a base.

В некоторых вариантах реализации способа, основание представляет собой триэтиламин.In some embodiments of the method, the base is triethylamine.

В некоторых вариантах реализации способа, органическим растворителем является ацетонитрил.In some embodiments of the method, the organic solvent is acetonitrile.

В некоторых вариантах реализации способа, защитный газ представляет собой азот.In some embodiments of the method, the shielding gas is nitrogen.

В некоторых вариантах реализации способа, впускная линия защитного газа частично вставляется в порт впускной линии.In some embodiments of the method, the shielding gas inlet line is partially inserted into the inlet line port.

В некоторых вариантах реализации способа, выпускная линия модифицированного газа десольватации частично вставляется в порт выпускной линии.In some embodiments of the method, the modified desolvation gas outlet line is partially inserted into the outlet line port.

В некоторых вариантах реализации способа защитный газ поступает из впускной линии защитного газа через контейнер, содержащий органический растворитель, в выпускную линию газа десольватации.In some embodiments of the method, the shielding gas flows from a shielding gas inlet line through a container containing an organic solvent to a desolvation gas outlet line.

В некоторых вариантах реализации способа излучатель ионизации электрораспылением с несколькими соплами включает в себя восемь сопел.In some embodiments of the method, the multi-nozzle electrospray ionization emitter includes eight nozzles.

В некоторых вариантах реализации способа система жидкостной хроматографии включает колонку для эксклюзионной хроматографии (ЭХ).In some embodiments of the method, the liquid chromatography system includes a size exclusion chromatography (SEC) column.

В некоторых вариантах реализации способа система жидкостной хроматографии включает ионообменную хроматографическую (IEX) колонку.In some embodiments of the method, the liquid chromatography system includes an ion exchange chromatography (IEX) column.

В некоторых вариантах реализации способ дополнительно включает использование аналитического делителя потока для регулирования скорости потока от жидкостного хроматографа к масс-спектрометру.In some embodiments, the method further includes using an analytical flow divider to control the flow rate from the liquid chromatograph to the mass spectrometer.

В некоторых вариантах реализации способа аналитический делитель потока способен обеспечивать электрораспыление со скоростью потока растворителя от 1 до 5 мкл/мин.In some embodiments of the method, the analytical flow splitter is capable of providing electrospray at a solvent flow rate of 1 to 5 μL/min.

В некоторых вариантах реализации способа масс-спектрометр содержит масс-анализатор с орбитальной ловушкой.In some embodiments of the method, the mass spectrometer contains a mass analyzer with an orbitrap.

В различных вариантах реализации изобретения, любые из признаков или компонентов вариантов реализации изобретения, обсуждаемых выше или описанных в данном документе, можно комбинировать, и такие комбинации входят в рамки настоящего изобретения. Любое конкретное значение, обсуждаемое выше или далее в данном документе, может быть комбинировано с другим взаимосвязанным значением, обсуждаемым выше или далее в данном документе, для определения диапазона, в котором указанные значения представляют собой верхний и нижний пределы диапазона, и такие диапазоны и все значения, входящие в такие диапазоны, охваченные в пределах объема настоящего изобретения. Каждое из значений, обсуждаемых выше или далее в настоящем документе,In various embodiments of the invention, any of the features or components of the embodiments discussed above or described herein can be combined, and such combinations are within the scope of the present invention. Any particular value discussed above or hereinafter may be combined with another related value discussed above or hereinafter to define a range, in which said values represent the upper and lower limits of the range, and such ranges and all values , falling within such ranges covered within the scope of the present invention. Each of the meanings discussed above or hereafter,

- 2 045776 может быть указано с отклонением в 1%, 5%, 10% или 20%. Например, концентрация 10 мМ может быть указана как 10 мМ ± 0,1 мМ (отклонение в 1%), 10 мМ ± 0,5 мМ (отклонение в 5%), 10 мМ ± 1 мМ (отклонение в 10%) или 10 мМ ± 2 мМ (отклонение в 20%). Другие варианты реализации изобретения будут выявлены из обзора следующего подробного описания изобретения.- 2 045776 can be specified with a deviation of 1%, 5%, 10% or 20%. For example, a concentration of 10 mM could be reported as 10 mM ± 0.1 mM (1% deviation), 10 mM ± 0.5 mM (5% deviation), 10 mM ± 1 mM (10% deviation), or 10 mM ± 2 mM (20% deviation). Other embodiments of the invention will be apparent from a review of the following detailed description of the invention.

Описание графических материаловDescription of graphic materials

На фиг. 1 показана схема околого варианта реализации собственной платформы ЖХ-МС, раскрытой в настоящем документе, которая обеспечивает чувствительную, надежную и универсальную собственную платформу ЖХ-МС.In fig. 1 shows a schematic diagram of an exemplary embodiment of a proprietary LC/MS platform disclosed herein that provides a sensitive, robust, and versatile proprietary LC/MS platform.

На фиг. 2 показан микроизготовленный монолитный эмиттер с несколькими соплами (M3), который используется в варианте реализации собственной платформы ЖХ-МС, описанной в настоящем документе.In fig. Figure 2 shows a microfabricated monolithic multiple nozzle emitter (M3) used in an embodiment of the proprietary LC/MS platform described herein.

На фиг. 3 показана чувствительность платформы с помощью анализа SEC-MS NISTmAb (10 мкг). Низкое потребление количества образца, введение 10 мкг образца NISTmAb приводит к интенсивности TIC ~ E9. Превосходное качество данных благодаря эффективной десольватации с помощью газа десольватации, модифицированного ИПС. Чувствительное обнаружение видов с низкой численностью (например, виды HMW и LMW) без необходимости дегликозилирования. Точные измерения массы позволяют однозначно идентифицировать эти виды.In fig. Figure 3 shows the sensitivity of the platform using the NISTmAb (10 μg) SEC-MS assay. Low sample quantity consumption, administration of 10 μg sample of NISTmAb results in TIC intensity ~E9. Superior data quality due to efficient desolvation using IPA-modified desolvation gas. Sensitive detection of low abundance species (e.g. HMW and LMW species) without the need for deglycosylation. Accurate mass measurements allow these species to be unambiguously identified.

На фиг. 4A и B показана надежность платформы, продемонстрированная 101 последовательным прогоном нативной SEC-MS NISTmAb.In fig. 4A and B show platform robustness demonstrated by 101 consecutive runs of native NISTmAb SEC-MS.

На фиг. 5A и B показан эффект снижения заряда, обеспечиваемый модификацией десольватирующего газа во время анализа нативной SCX-MS. На фиг. 5А показано небольшое падение интенсивности TIC, связанное с уменьшением заряда. На фиг. 5B показан эффект снижения заряда, продемонстрированный антителом B.In fig. 5A and B show the charge reduction effect provided by modification of the desolvation gas during native SCX-MS analysis. In fig. Figure 5A shows a slight drop in TIC intensity associated with a decrease in charge. In fig. 5B shows the charge reduction effect demonstrated by Antibody B.

На фиг. 6 показан анализ гетерогенных и/или лабильных биомолекул с помощью снижения заряда. На верхней панели представлены результаты нативного анализа SEC-MS имитатора ADC цистеина со снижением заряда, а на нижней панели - без снижения заряда. Как показано, уменьшение заряда предотвратило перекрытие состояний заряда благодаря улучшенному пространственному разрешению, что позволило проводить анализ образца с высокой неоднородностью по массе. Кроме того, снижение заряда помогло сохранить лабильные биомолекулы (не связанные ковалентно) во время процесса ионизации и свести к минимуму нежелательные события диссоциации.In fig. Figure 6 shows the analysis of heterogeneous and/or labile biomolecules using charge reduction. The top panel shows native SEC-MS analysis of the cysteine ADC mimic with charge reduction and the bottom panel without charge reduction. As shown, charge reduction prevented charge state overlap due to improved spatial resolution, allowing analysis of a sample with high mass heterogeneity. Additionally, charge reduction helped preserve labile biomolecules (not covalently bound) during the ionization process and minimize unwanted dissociation events.

На фиг. 7 показана платформа НЖХ-МС в соответствии с раскрытыми здесь вариантами реализации.In fig. 7 illustrates an NLC-MS platform in accordance with embodiments disclosed herein.

На фиг. 8A показаноУФ- и TIC-следы, полученные в результате обессоливающего анализа SEC-MS mAb1 при различных скоростях потока;In fig. 8A shows UV and TIC traces obtained from desalting SEC-MS analysis of mAb1 at various flow rates;

на фиг. 8B показан TIC след от 90 обессоливающих циклов SEC-MS mAb2 при 0,8 мл/мин. Каждое инъекционное количество (0,1, 1 и 10 мкг) повторно анализировали 30 раз. На вставке показана увеличенная область, содержащая 4 цикла обессоливания SEC-MS.in fig. 8B shows the TIC trace from 90 desalting cycles of SEC-MS mAb2 at 0.8 mL/min. Each injection amount (0.1, 1, and 10 μg) was reassayed 30 times. The inset shows a magnified region containing 4 SEC-MS desalting cycles.

Фиг. 9A и B показывают обессоливающий SEC-MS анализ mAb1. На фиг. 9A представлено сравнение интенсивности сигнала МС (левая ось ординат) и точности массы (правая ось ординат), достигнутой при использовании 150, 300, 450 и 600 мМ ацетата аммония в качестве подвижной фазы (по три повторения анализа для каждого). На фиг. 9B приведен пример необработанного масс-спектра mAb1, полученного с использованием 600 мМ ацетата аммония, демонстрирующего успешное обнаружение различных гликоформ в результате макро- и микрогетерогенности N-гликозилирования Fc.Fig. 9A and B show desalting SEC-MS analysis of mAb1. In fig. Figure 9A compares the MS signal intensity (left y-axis) and mass accuracy (right y-axis) achieved using 150, 300, 450, and 600 mM ammonium acetate as the mobile phase (three assay replicates for each). In fig. 9B is an example of a raw mass spectrum of mAb1 obtained using 600 mM ammonium acetate, demonstrating the successful detection of different glycoforms resulting from macro- and microheterogeneity of Fc N-glycosylation.

На фиг. 10A показаны репрезентативные нативные масс-спектры mAb5, полученные при различных условиях снижения заряда.In fig. 10A shows representative native mass spectra of mAb5 obtained under various charge reduction conditions.

На фиг. 10B и C показана оценка различных органических модификаторов на способность к снижению заряда в режиме онлайн путем проведения анализа nSEC-MS и nIEX-MS образца смеси из четырех mAb. Интенсивность МС (левая ось ординат) и среднее состояние заряда (правая ось ординат) каждой молекулы mAb измеряют в трех повторениях и наносят на график для каждого условия.In fig. 10B and C show the on-line evaluation of various organic modifiers for charge reduction ability by nSEC-MS and nIEX-MS analysis of a sample of a mixture of four mAbs. The MS intensity (left y-axis) and average charge state (right y-axis) of each mAb molecule are measured in triplicate and plotted for each condition.

На фиг. 11 показаны масс-спектры после деконволюции.In fig. Figure 11 shows the mass spectra after deconvolution.

На фиг. 12A и B показаны исходные масс-спектры, полученные в результате обессоливающего SEC-MS анализа mAb1 с использованием скорости потока подвижной фазы 0,1, 0,2, 0,4, 0,6 и 0,8 мл/мин.In fig. 12A and B show raw mass spectra obtained from desalting SEC-MS analysis of mAb1 using mobile phase flow rates of 0.1, 0.2, 0.4, 0.6 and 0.8 ml/min.

На фиг. 13A и B показан TIC девяти непрерывных нативных HIC-MS-анализов различных mAb с использованием стратегии разделения потока на нативной платформе LC-MS.In fig. 13A and B show the TIC of nine continuous native HIC-MS analyzes of various mAbs using a split-flow strategy on a native LC-MS platform.

На фиг. 14A, B и C показан анализ смеси mAb с помощью ACN/NH3 с помощью nIEX-MS, показывающий (фиг. 14A) nIEX-TIC, (фиг. 14B) необработанные масс-спектры основных пиков каждого mAb и (фиг. 14C) в увеличенном масштабе z=7 из необработанных масс-спектров.In fig. 14A, B, and C show ACN/NH3 analysis of a mAb mixture using nIEX-MS, showing (FIG. 14A) nIEX-TIC, (FIG. 14B) raw mass spectra of the main peaks of each mAb, and (FIG. 14C) in zoomed z=7 scale from raw mass spectra.

На фиг. 15 показаны нативные масс-спектры mAb2, полученные на платформе нЖХ-МС после длительного анализа (> 24 ч) с использованием немодифицированного газа для десольватации (верхняя панель) или газа для десольватации, модифицированного ИПС (нижняя панель).In fig. Figure 15 shows native mass spectra of mAb2 obtained on the nLC-MS platform after long-term analysis (>24 h) using unmodified desolvation gas (top panel) or IPA-modified desolvation gas (bottom panel).

На фиг. 16-1 и 16-2 показан нативный анализ SCX-MS NISTmAb с количеством инъекции 10 мкг.In fig. 16-1 and 16-2 show the native SCX-MS assay of NISTmAb with an injection amount of 10 μg.

- 3 045776- 3 045776

На фиг. 17 показана оценка надежности собственной платформы ЖХ-МС путем проведения непрерывного анализа с использованием nSEC-MS (вверху, рабочий цикл 24 мин) или nIEX-MS (внизу, рабочий цикл 30 мин) в течение > 24 ч каждый.In fig. Figure 17 shows an assessment of the reliability of a proprietary LC/MS platform by running continuous analysis using nSEC-MS (top, 24 min duty cycle) or nIEX-MS (bottom, 30 min duty cycle) for >24 h each.

На фиг. 18 показана сводка вариантов размера и заряда, обнаруженных с помощью nSEC-MS и nIEX-MS анализов 10 мкг эталонного стандартного образца NISTmAb.In fig. Figure 18 shows a summary of the size and charge variants detected by nSEC-MS and nIEX-MS analyzes of the 10 μg NISTmAb reference standard.

Подробное описание сущности изобретенияDetailed description of the invention

Под описанием сущности настоящего изобретения следует понимать, что данное изобретение не ограничивается конкретными описанными способами и экспериментальными условиями, поскольку такие способы и условия могут варьироваться. Также следует понимать, что используемая в настоящем документе терминология предназначена только для описания частных вариантов реализации и не предназначена для ограничения, так как объем настоящего изобретения ограничен только прилагаемой формулой изобретения. Любые варианты реализации или признаки вариантов реализации могут быть объединены друг с другом, и такие комбинации явно входят в объем настоящего изобретения.By describing the essence of the present invention, it is to be understood that the invention is not limited to the specific methods and experimental conditions described, since such methods and conditions may vary. It should also be understood that the terminology used herein is intended to describe particular embodiments only and is not intended to be limiting, as the scope of the present invention is limited only by the appended claims. Any embodiments or features of embodiments may be combined with each other, and such combinations are clearly within the scope of the present invention.

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют значение, обычно понимаемое специалистом в данной области техники, к которой принадлежит данное изобретение. В настоящем документе термин около при использовании в отношении конкретного приведенного числового значения означает, что значение может отличаться от приведенного значения не более чем на 1%. Например, в контексте настоящего документа выражение около 100 включает 99 и 101, и все значения между ними (например, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4 и т.д.).Unless otherwise specified, all technical and scientific terms used herein have the meaning commonly understood by one skilled in the art to which this invention belongs. As used herein, the term about, when used in relation to a particular numerical value given, means that the value may differ from the given value by no more than 1%. For example, as used herein, the expression about 100 includes 99 and 101, and all values in between (eg, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, etc.).

Используемые здесь термины включает, включает и включающий не имеют ограничительного характера и понимаются как означающие включать, включает и содержащий соответственно.As used herein, the terms includes, comprises, and including are not limiting in nature and are understood to mean include, comprises, and containing, respectively.

Хотя любые способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, могут использоваться при практическом осуществлении или испытании данного изобретения, предпочтительные способы и материалы описаны далее. Содержание всех патентов, заявок и непатентных публикаций, упомянутых в настоящей спецификации, включено в данный документ в полном объеме посредством ссылок.Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein may be used in the practice or testing of this invention, preferred methods and materials are described below. The contents of all patents, applications and non-patent publications mentioned in this specification are incorporated herein in their entirety by reference.

Сокращения, используемые в дальнейшем:Abbreviations used below:

ACN: ацетонитрил;ACN: acetonitrile;

Asn: аспарагин;Asn: asparagine;

CQA: критические атрибуты качества;CQA: Critical Quality Attributes;

CV: коэффициент вариации;CV: coefficient of variation;

EIC: хроматограф извлеченных ионов;EIC: extracted ion chromatograph;

ESI-MS: масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением;ESI-MS: electrospray ionization mass spectrometry;

FA: муравьиная кислота;FA: formic acid;

FDA: Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов;FDA: Food and Drug Administration;

FG: полностью гликозилированный;FG: fully glycosylated;

FLR: флуоресцентное обнаружение;FLR: fluorescent detection;

HBA: 4-гидроксибензойная кислота;HBA: 4-hydroxybenzoic acid;

HC: тяжелая цепь;HC: heavy chain;

HIC: хроматография гидрофобного взаимодействия;HIC: hydrophobic interaction chromatography;

HILIC: жидкостная хроматография гидрофильного взаимодействия;HILIC: hydrophilic interaction liquid chromatography;

HMW: высокая молекулярная масса;HMW: high molecular weight;

IEX: ионобменная хроматография;IEX: ion exchange chromatography;

IgG: иммуноглобулин G;IgG: immunoglobulin G;

IPA: изопропанол;IPA: isopropanol;

LC: легкая цепь;LC: light chain;

ЖХ-МС: жидкостная хроматография-масс-спектрометрия;LC-MS: liquid chromatography-mass spectrometry;

LMW: низкомолекулярный вес;LMW: low molecular weight;

mAb: моноклональное антитело;mAb: monoclonal antibody;

MS: масс-спектрометрия;MS: mass spectrometry;

MW: молекулярная масса;MW: molecular weight;

NCE: нормализованная энергия столкновения;NCE: normalized collision energy;

NG: негликозилированный;NG: non-glycosylated;

nLC: нативная жидкостная хроматография;nLC: native liquid chromatography;

PA: пропионовая кислота;PA: propionic acid;

PG: частично гликозилированный;PG: partially glycosylated;

PK: фармакокинетика;PK: pharmacokinetics;

PQA: атрибут качества продукта;PQA: Product Quality Attribute;

PTM: посттрансляционная модификация;PTM: post-translational modification;

RP-LC: жидкостная хроматография с обращенной фазой;RP-LC: reverse phase liquid chromatography;

SPE: твердофазная экстракция;SPE: solid phase extraction;

SEC: эксклюзионная хроматография;SEC: size exclusion chromatography;

- 4 045776- 4 045776

TCEP-HCl: трис (2-карбоксиэтил) фосфин гидрохлорид;TCEP-HCl: tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride;

TFA: трифторуксусная кислота;TFA: trifluoroacetic acid;

TMT: тандемная массовая метка;TMT: tandem mass tag;

UV: ультрафиолет.UV: ultraviolet.

ОпределенияDefinitions

Используемый в данном документе термин белок включает любой полимер аминокислоты, имеющий ковалентно связанные амидные связи. Белки содержат одну или несколько полимерных цепей аминокислот, широко известных в данной области техники как полипептиды. Полипептид относится к полимеру, состоящему из аминокислотных остатков, родственных встречающихся в природе структурных вариантов и их синтетических неприродных аналогов, связанных пептидными связями, родственных природных структурных вариантов и их синтетических не встречающихся в природе аналогов. Синтетические пептиды или полипептиды относится к не встречающимся в природе пептидам или полипептидам. Синтетические пептиды или полипептиды можно синтезировать, например, с помощью автоматического синтезатора полипептидов. Специалистам в данной области известны различные методы твердофазного синтеза пептидов. Белок может содержать один или несколько полипептидов для формирования одной функционирующей биомолекулы. Белок может включать любой из биотерапевтических белков, рекомбинантных белков, используемых в исследованиях или терапии, белков-ловушек и других химерных белков, слитых с рецептором Fc, химерных белков, антител, моноклональных антител, поликлональных антител, человеческих антител и биспецифических антител. В другом иллюстративном аспекте белок может включать фрагменты антител, нанотела, рекомбинантные химеры антител, цитокины, хемокины, пептидные гормоны и т.п. Белки могут быть получены с использованием рекомбинантных систем продукции на основе клеток, таких как баккуловирусная система насекомых, системы дрожжей (например, Pichia sp.), системы млекопитающих (например, клетки СНО и производные СНО, такие как клетки Сно-Κι). Недавний обзор, посвященный биотерапевтическим белкам и их производству, см. в Ghaderi et al., Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non-human sialylation (Biotechnol. Genet. Eng. Rev. (2012) 147-75). В некоторых вариантах реализации белки включают модификации, аддукты и другие ковалентно связанные фрагменты. Эти модификации, аддукты и фрагменты включают, например, авидин, стрептавидин, биотин, гликаны (например, N-ацетилгалактозамин, галактозу, нейраминовую кислоту, N-ацетилглюкозамин, фукозу, маннозу и другие моносахариды), PEG, полигистидин, FLAGtag, белок, связывающий мальтозу (MBP), белок, связывающий хитин (CBP), myc-эпитоп глутатион-Sтрансферазы (GST), флуоресцентные метки и другие красители и т.п. Белки можно классифицировать на основе состава и растворимости и, таким образом, они могут включать простые белки, такие как глобулярные белки и волокнистые белки; конъюгированные белки, такие как нуклеопротеины, гликопротеины, мукопротеины, хромопротеины, фосфопротеины, металлопротеины и липопротеины; и производные белки, такие как первичные производные белки и вторичные производные белки.As used herein, the term protein includes any polymer of an amino acid having covalently linked amide bonds. Proteins contain one or more polymer chains of amino acids, commonly known in the art as polypeptides. A polypeptide refers to a polymer consisting of amino acid residues, related naturally occurring structural variants and their synthetic non-natural analogs linked by peptide bonds, related natural structural variants and their synthetic non-natural analogs. Synthetic peptides or polypeptides refer to non-naturally occurring peptides or polypeptides. Synthetic peptides or polypeptides can be synthesized, for example, using an automatic polypeptide synthesizer. Various methods for solid-phase peptide synthesis are known to those skilled in the art. A protein may contain one or more polypeptides to form one functioning biomolecule. The protein may include any of biotherapeutic proteins, recombinant proteins used in research or therapy, decoy proteins and other chimeric proteins fused to the Fc receptor, chimeric proteins, antibodies, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, human antibodies and bispecific antibodies. In another illustrative aspect, the protein may include antibody fragments, nanobodies, recombinant antibody chimeras, cytokines, chemokines, peptide hormones, and the like. Proteins can be produced using recombinant cell-based production systems such as the insect baculovirus system, yeast systems (eg, Pichia sp.), mammalian systems (eg, CHO cells and CHO derivatives such as CHO-Κι cells). For a recent review on biotherapeutic proteins and their production, see Ghaderi et al., Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non-human sialylation (Biotechnol. Genet. Eng. Rev. (2012) 147-75). In some embodiments, the proteins include modifications, adducts, and other covalently linked moieties. These modifications, adducts and fragments include, for example, avidin, streptavidin, biotin, glycans (e.g. N-acetylgalactosamine, galactose, neuraminic acid, N-acetylglucosamine, fucose, mannose and other monosaccharides), PEG, polyhistidine, FLAGtag, binding protein maltose (MBP), chitin binding protein (CBP), myc epitope of glutathione Stransferase (GST), fluorescent tags and other dyes, etc. Proteins can be classified based on composition and solubility and thus may include simple proteins such as globular proteins and fibrous proteins; conjugated proteins such as nucleoproteins, glycoproteins, mucoproteins, chromoproteins, phosphoproteins, metalloproteins and lipoproteins; and derived proteins, such as primary derived proteins and secondary derived proteins.

Вариант белка, или белковый вариант, или вариант, как используется в данном документе, может включать белок, который отличается от целевого белка на основании по меньшей мере одной модификации аминокислоты. Вариант белка может относиться к самому белку, композиции, содержащей белок, или аминопоследовательности, которая его кодирует. Предпочтительно вариант белка имеет по меньшей мере одну аминокислотную модификацию по сравнению с исходным белком, например, от около одной до около десяти аминокислотных модификаций и предпочтительно от около одной до около пяти аминокислотных модификаций по сравнению с исходным белком. Последовательность варианта белка в настоящем документе предпочтительно будет иметь по меньшей мере около 80% гомологии с последовательностью исходного белка и наиболее предпочтительно по меньшей мере около 90% гомологии, более предпочтительно по меньшей мере около 95% гомологии. В некоторых вариантах реализации белок может представлять собой антитело, биспецифическое антитело, мультиспецифическое антитело, фрагмент антитела, моноклональное антитело или их комбинации.A protein variant, or protein variant, or variant, as used herein, may include a protein that differs from the target protein based on at least one amino acid modification. A protein variant may refer to the protein itself, a composition containing the protein, or an amino sequence that encodes it. Preferably, the protein variant has at least one amino acid modification compared to the parent protein, such as about one to about ten amino acid modifications, and preferably about one to about five amino acid modifications compared to the parent protein. The variant protein sequence herein will preferably have at least about 80% homology to the parent protein sequence, and most preferably at least about 90% homology, more preferably at least about 95% homology. In some embodiments, the protein may be an antibody, a bispecific antibody, a multispecific antibody, an antibody fragment, a monoclonal antibody, or combinations thereof.

Термин антитело, используемый в данном документе, предназначен для обозначения молекул иммуноглобулина, состоящих из четырех полипептидных цепей, двух тяжелых (H) цепей и двух легких (L) цепей, связанных между собой дисульфидными связями (т.е., молекулами полноразмерного антитела), а также их мультимеров (например, IgM) или их антигенсвязывающих фрагментов. Каждая тяжелая цепь состоит из сменной области тяжелой цепи (HCVR или VH) и постоянной области тяжелой цепи (состоящей из доменов CH1, C_H2 и CH3). В различных вариантах реализации тяжелая цепь может быть изотипом IgG. В некоторых вариантах тяжелая цепь выбрана из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В некоторых вариантах реализации, тяжелая цепь относится к изотипу IgG1 или IgG4, необязательно включая химерную шарнирную область изотипа IgG1/IgG2 или IgG4/IgG2. Каждая легкая цепь состоит из сменной области легкой цепи (LCVR или VL) и постоянной области легкой цепи (C_L). В VH и V_Lобластях можно дополнительно выделить области гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR), которые разделены более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждая V_H и V_L состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3,The term antibody, as used herein, is intended to refer to immunoglobulin molecules consisting of four polypeptide chains, two heavy (H) chains and two light (L) chains linked together by disulfide bonds (i.e., full-length antibody molecules), as well as their multimers (for example, IgM) or their antigen-binding fragments. Each heavy chain consists of a replaceable heavy chain region (HCVR or VH) and a constant heavy chain region (consisting of CH1, _CH2 and CH3 domains). In various embodiments, the heavy chain may be an IgG isotype. In some embodiments, the heavy chain is selected from IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4. In some embodiments, the heavy chain is of the IgG1 or IgG4 isotype, optionally including a chimeric hinge region of the IgG1/IgG2 or IgG4/IgG2 isotype. Each light chain consists of a light chain replaceable region (LCVR or VL) and a permanent light chain region ( _CL ). The VH and _VL regions can further be distinguished by regions of hypervariability called complementarity determining regions (CDRs), which are separated by more conserved regions called framework regions (FRs). Each V _H and V _L consists of three CDRs and four FRs, located from the amino terminus to the carboxy terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3,

- 5 045776- 5 045776

CDR3, FR4. Термин антитело включает ссылку как на гликозилированные, так и на негликозилированные иммуноглобулины любого изотипа или подкласса. Термин антитело включает молекулы антител, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные рекомбинантными способами, такие как антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансфицированной для экспрессии антитела. Для обзора структуры антител см. Lefranc et al., Уникальная нумерация IMGT для вариабельных доменов иммуноглобулина и Т-клеточного рецептора и V- подобных доменов суперсемейства Ig, 27(1) Dev. Comp. Immunol. 55-77 (2003 г.); и M. Potter, Structural correlates of immunoglobulin diversity, 2(1) Surv. Immunol. Res. 27-42 (1983).CDR3, FR4. The term antibody includes reference to both glycosylated and non-glycosylated immunoglobulins of any isotype or subclass. The term antibody includes antibody molecules produced, expressed, generated or isolated by recombinant methods, such as antibodies isolated from a host cell transfected to express the antibody. For a review of antibody structure, see Lefranc et al., Unique IMGT numbering for immunoglobulin and T-cell receptor variable domains and V-like domains of the Ig superfamily, 27(1) Dev. Comp. Immunol. 55-77 (2003); and M. Potter, Structural correlates of immunoglobulin diversity, 2(1) Surv. Immunol. Res. 27-42 (1983).

Термин антитело также включает биспецифическое антитело, которое включает гетеротетрамерный иммуноглобулин, который может связываться более чем с одним различным эпитопом. Одна половина биспецифического антитела, которое включает одну тяжелую цепь и одну легкую цепь и шесть CDR, связывается с одним антигеном или эпитопом, а другая половина антитела связывается с другим антигеном или эпитопом. В некоторых случаях биспецифическое антитело может связывать один и тот же антиген, но с разными эпитопами или с неперекрывающимися эпитопами. В некоторых случаях обе половины биспецифического антитела имеют идентичные легкие цепи, сохраняя при этом двойную специфичность. Биспецифические антитела в целом описаны в U.S. Patent App. Pub. № 2010/0331527 (30 декабря 2010 г.).The term antibody also includes a bispecific antibody, which includes a heterotetrameric immunoglobulin that can bind to more than one different epitope. One half of a bispecific antibody, which includes one heavy chain and one light chain and six CDRs, binds to one antigen or epitope, and the other half of the antibody binds to another antigen or epitope. In some cases, a bispecific antibody may bind the same antigen but to different epitopes or to non-overlapping epitopes. In some cases, both halves of a bispecific antibody have identical light chains while maintaining dual specificity. Bispecific antibodies are generally described in the U.S. Patent App. Pub. No. 2010/0331527 (December 30, 2010).

Термины антигенсвязывающий фрагмент антитела (или фрагмент антитела), относятся к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфично связываться с антигеном. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином антигенсвязывающая часть антитела, включают (i) Fab-фрагмент - одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) F(ab')2-фрагмент - двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела, (v) фрагмент dAb (Ward et al. (1989) Nature 241:544-546), состоящий из домена VH, (vi) выделенную CDR и (vii) scFv, состоящий из двух доменов Fv-фрагмента, VL и VH, соединенных синтетическим линкером с образованием единой белковой цепи, в которой области VL и VH спариваются, образуя одновалентные молекулы. Другие формы одноцепочечных антител, такие как диатела, также охватываются термином антитело (см., например, источники Holliger et al. (1993) 90 PNAS U.S.A. 6444-6448; и Poljak et al. (1994) 2 Structure 1121-1123).The terms antigen-binding antibody fragment (or antibody fragment) refer to one or more antibody fragments that retain the ability to specifically bind an antigen. Examples of binding fragments encompassed by the term antigen-binding portion of an antibody include (i) a Fab fragment—a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL, and CH1 domains; (ii) F(ab')2 fragment - a divalent fragment containing two Fab fragments linked by a disulfide bridge in the hinge region; (iii) Fd fragment consisting of VH and CH1 domains; (iv) an Fv fragment consisting of the VL and VH domains of one arm of the antibody, (v) a dAb fragment (Ward et al. (1989) Nature 241:544-546) consisting of a VH domain, (vi) a dedicated CDR and ( vii) scFv, consisting of two Fv fragment domains, VL and VH, connected by a synthetic linker to form a single protein chain in which the VL and VH regions are paired to form monovalent molecules. Other forms of single chain antibodies, such as diabodies, are also encompassed by the term antibody (see, for example, Holliger et al. (1993) 90 PNAS U.S.A. 6444-6448; and Poljak et al. (1994) 2 Structure 1121-1123).

Кроме того, антитела и их антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены с использованием стандартных способик рекомбинантных ДНК, широко известных в данной области (см. Sambrook et al., 1989). Способы получения антител человека у трансгенных мышей известны в данной области техники. С использованием технологии VELOCIMMUNE™ (см., например, патент США № 6596541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®) или любой другой известный способ получения моноклональных антител, сначала выделяют химерные антитела с высоким сродством к желаемому антигену, имеющие сменную область человека и постоянную область мышей. Технология VELOCIMMUNE® включает создание трансгенной мыши, геном которой содержит сменные области тяжелой и легкой цепи человека, функционально связанные с эндогенными локусами константной области мыши, так что мышь продуцирует антитело, содержащее вариабельную область человека и константную область мыши, в ответ на антигенную стимуляцию. ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой и легкой цепей антитела, выделяют и функционально связывают с ДНК, кодирующей константные области тяжелой и легкой цепи человека. Затем ДНК экспрессируют в клетке, способной экспрессировать полностью человеческое антитело.In addition, antibodies and antigen binding fragments thereof can be produced using standard recombinant DNA techniques well known in the art (see Sambrook et al., 1989). Methods for producing human antibodies in transgenic mice are known in the art. Using VELOCIMMUNE™ technology (see, for example, US Patent No. 6596541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®) or any other known method for producing monoclonal antibodies, chimeric antibodies with high affinity for the desired antigen are first isolated, having a human removable region and a murine constant region . VELOCIMMUNE® technology involves the creation of a transgenic mouse whose genome contains human heavy and light chain variable regions operably linked to endogenous mouse constant region loci such that the mouse produces an antibody containing the human variable region and the mouse constant region in response to antigenic stimulation. DNA encoding the variable regions of the heavy and light chains of the antibody is isolated and operably linked to DNA encoding the human heavy and light chain constant regions. The DNA is then expressed in a cell capable of expressing a fully human antibody.

Предусмотрено, что термин антитело человека включает антитела, имеющие вариабельные и константные области, происходящие из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Человеческие моноклональные антитела (mAb) по данному изобретению могут содержать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии человека (например, мутации, введенные путем случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или соматической мутации in vivo), например, в CDR и, в частности, в CDR3. В то же время термин человеческое антитело, используемый в данном документе, не предполагает включение mAb, в которых последовательности CDR, происходящие из зародышевой линии других видов млекопитающих (например, мыши), были привиты к FR последовательностям человека. Указанный термин включает антитела, рекомбинантно продуцируемые в организме млекопитающего, не являющегося человеком, или в клетках млекопитающего, не являющегося человеком. Указанный термин не предполагает включение антител, выделенных из или полученных в организме субъекта-человека.The term human antibody is intended to include antibodies having variable and constant regions derived from human germline immunoglobulin sequences. Human monoclonal antibodies (mAbs) of the present invention may contain amino acid residues not encoded by human germline immunoglobulin sequences (e.g., mutations introduced by random or site-specific mutagenesis in vitro or somatic mutation in vivo), for example, in the CDR and, in specifically in CDR3. However, the term human antibody as used herein is not intended to include mAbs in which CDR sequences derived from the germ line of other mammalian species (eg, mouse) have been grafted onto human FR sequences. The term includes antibodies produced recombinantly in the body of a non-human mammal or in the cells of a non-human mammal. The term is not intended to include antibodies isolated from or obtained from a human subject.

В дальнейшем, термин субъект относится к животному, предпочтительно млекопитающему, более предпочтительно человеку, нуждающемуся, например, в облегчении, предупреждении и/или лечении заболевания или расстройства.In the following, the term subject refers to an animal, preferably a mammal, more preferably a human, in need, for example, of alleviating, preventing and/or treating a disease or disorder.

Используемый в данном документе термин примесь может включать любой нежелательный белок, присутствующий в биофармацевтическом продукте. Примеси могут включать технологическиеAs used herein, the term impurity can include any undesirable protein present in a biopharmaceutical product. Impurities may include technological

- 6 045776 примеси и примеси, связанные с продуктом. Кроме того, примесь может иметь известную структуру, частично охарактеризованную или неидентифицированную. Связанные с технологическим процессом примеси могут быть получены в результате производственного процесса и могут включать три основные категории: полученные из клеточного субстрата, полученные из клеточной культуры и полученные в дальнейшем. Примеси, происходящие из клеточного субстрата, включают, помимо прочего, белки, полученные из организма-хозяина, и нуклеиновую кислоту (геномную, векторную или тотальную ДНК клетки-хозяина). Примеси, полученные из клеточных культур, включают, помимо прочего, индукторы, антибиотики, сыворотку и другие компоненты среды. Побочные примеси включают, помимо прочего, ферменты, реагенты для химической и биохимической обработки (например, бромид циана, гуанидин, окислители и восстановители), неорганические соли (например, тяжелые металлы, мышьяк, неметаллический ион), растворители, носители, лиганды (например, моноклональные антитела) и другие вымываемые вещества. Связанные с продуктом примеси (например, прекурсоры, определенные продукты разложения) могут представлять собой молекулярные варианты, возникающие во время производства и/или хранения, которые не обладают свойствами, сравнимыми со свойствами желаемого продукта в отношении активности, эффективности и безопасности. Такие варианты могут потребовать значительных усилий по выделению и характеристике, чтобы определить тип модификации (модификаций). Примеси, связанные с продуктом, могут включать усеченные формы, модифицированные формы и агрегаты. Усеченные формы образуются под действием гидролитических ферментов или химических веществ, катализирующих расщепление пептидных связей. Модифицированные формы включают, но не ограничиваются ими, дезамидированные, изомеризованные, несовпадающие S-S-связанные, окисленные или измененные конъюгированные формы (например, гликозилирование, фосфорилирование). Модифицированные формы также могут включать любую форму посттрансляционной модификации. Агрегаты включают димеры и более высокие кратные желаемому продукту (Q6B Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products, ICH August 1999, U.S. Dept. of Health and Humans Services).- 6 045776 impurities and impurities associated with the product. In addition, the impurity may have a known structure, partially characterized or unidentified. Process-related impurities can be derived from the manufacturing process and can include three main categories: cell substrate-derived, cell culture-derived, and downstream-derived. Impurities derived from the cellular substrate include, but are not limited to, host-derived proteins and nucleic acid (host cell genomic, vector, or total DNA). Impurities derived from cell cultures include, but are not limited to, inducers, antibiotics, serum, and other media components. Contaminants include, but are not limited to, enzymes, chemical and biochemical processing reagents (e.g., cyanogen bromide, guanidine, oxidizing and reducing agents), inorganic salts (e.g., heavy metals, arsenic, nonmetallic ion), solvents, carriers, ligands (e.g., monoclonal antibodies) and other leachable substances. Product-associated impurities (e.g., precursors, certain degradation products) may be molecular variants arising during manufacturing and/or storage that do not have properties comparable to those of the desired product with respect to potency, efficacy, and safety. Such variants may require significant isolation and characterization efforts to determine the type of modification(s). Product-associated impurities may include truncated forms, modified forms, and aggregates. Truncated forms are formed under the action of hydrolytic enzymes or chemicals that catalyze the cleavage of peptide bonds. Modified forms include, but are not limited to, deamidated, isomerized, mismatched S-S-linked, oxidized, or altered conjugated forms (eg, glycosylation, phosphorylation). Modified forms may also include any form of post-translational modification. Aggregates include dimers and higher multiples of the desired product (Q6B Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products, ICH August 1999, U.S. Dept. of Health and Humans Services).

Термин низкомолекулярная (LMW) белковая примесь лекарственного средства включает, но не ограничивается ими, предшественники, продукты деградации, укороченные виды, протеолитические фрагменты, включая Fab-фрагменты, Fc-фрагменты или фрагменты тяжелой цепи, фрагменты лиганда или рецептора, H2L (2 тяжелых цепи и 1 легкая цепь), H2 (2 тяжелые цепи), HL (1 тяжелая цепь и 1 легкая цепь), HC (1 тяжелая цепь) и LC (1 легкая цепь). Примесь препарата низкомолекулярного белка может представлять собой любой вариант, который представляет собой неполную версию белкового продукта, например, один или несколько компонентов мультимерного белка. Термины белковая примесь лекарственного средства, примесь лекарственного средства или примесь продукта могут использоваться как синонимы в описании. Примеси низкомолекулярных препаратов или продуктов обычно считаются молекулярными вариантами с такими свойствами, как активность, эффективность и безопасность, которые могут отличаться от свойств желаемого лекарственного продукта.The term low molecular weight (LMW) protein drug impurity includes, but is not limited to, precursors, degradation products, truncated species, proteolytic fragments including Fab fragments, Fc fragments or heavy chain fragments, ligand or receptor fragments, H2L (2 heavy chains and 1 light chain), H2 (2 heavy chains), HL (1 heavy chain and 1 light chain), HC (1 heavy chain) and LC (1 light chain). A small molecule protein drug impurity can be any variant that is an incomplete version of the protein product, such as one or more components of a multimeric protein. The terms protein drug impurity, drug impurity, or product impurity may be used interchangeably in the specification. Small molecule drug or product impurities are generally considered to be molecular variants with properties such as potency, efficacy, and safety that may differ from those of the desired drug product.

Деградация белкового продукта является проблематичной при производстве белкового лекарственного препарата в системах культивирования клеток. Например, протеолиз белкового продукта может происходить из-за высвобождения протеаз в среде культивирования клеток. Добавки к среде, такие как растворимые источники железа, добавленные для ингибирования металлопротеаз, или ингибиторы сериновых и цистеиновых протеаз, были введены в культуру клеток для предотвращения деградации (Clincke, M.-F., et al, BMC Proc. 2011, 5, стр. 115). С-концевые фрагменты могут быть расщеплены во время производства под действием карбоксильных пептидаз в культуре клеток (Dick, LW et al, Biotechnol Bioeng 2008; 100:1132-43).Degradation of the protein product is problematic during the production of protein drug in cell culture systems. For example, proteolysis of a protein product may occur due to the release of proteases in the cell culture medium. Medium supplements, such as soluble iron sources added to inhibit metalloproteases or serine and cysteine protease inhibitors, have been introduced into cell culture to prevent degradation (Clincke, M.-F., et al, BMC Proc. 2011, 5, pp 115). The C-terminal fragments can be cleaved during production by carboxyl peptidases in cell culture (Dick, LW et al, Biotechnol Bioeng 2008; 100:1132-43).

Термин высокомолекулярная (HMW) белковая примесь лекарственного средства включает, но не ограничивается ими, тримеры и димеры mAb. Виды HMW можно разделить на две группы: 1) мономер с дополнительными легкими цепями (виды H2L3 и H2L4) и 2) мономер плюс Fab-фрагменты комплексы. Кроме того, после обработки ферментативным расщеплением IdeS образуются различные димеризованные фрагменты (Fab2-Fab2, Fc-Fc и Fab2-Fc).The term high molecular weight (HMW) protein drug impurity includes, but is not limited to, mAb trimers and dimers. HMW species can be divided into two groups: 1) monomer with additional light chains (species H2L3 and H2L4) and 2) monomer plus Fab fragment complexes. In addition, after treatment with enzymatic cleavage of IdeS, various dimerized fragments (Fab2-Fab2, Fc-Fc and Fab2-Fc) are formed.

Посттрансляционная модификация (PTM) относится к ковалентной модификации белков после биосинтеза белка. Посттрансляционные модификации могут иметь место на боковых цепях аминокислот или на С- или N-концах белка. PTM обычно вводятся специфическими ферментами или ферментативными путями. Многие из них происходят в месте специфической характерной белковой последовательности (например, сигнатурной последовательности) внутри белкового остова. Было зарегистрировано несколько сотен PTM, и эти модификации неизменно влияют на некоторые аспекты структуры или функции белка (Walsh, G. Proteins (2014), second edition, published by Wiley and Sons, Ltd., ISBN: 9780470669853). Различные посттрансляционные модификации включают, помимо прочего, расщепление, удлинение N-конца, деградацию белка, ацилирование N-конца, биотинилирование (ацилирование остатков лизина альфа-биотином), амидирование C-конца, гликозилирование, йодирование, ковалентное присоединение простетических групп, ацетилирование (присоединение ацетильной группы, обычно к N-концу белка), алкилирование (присоединение алкильной группы (например, метил, этил, пропил) обычно по остаткам лизина или аргинина), метилирование,Post-translational modification (PTM) refers to the covalent modification of proteins after protein biosynthesis. Post-translational modifications can occur on amino acid side chains or at the C or N termini of the protein. PTMs are usually introduced by specific enzymes or enzymatic pathways. Many of them occur at the location of a specific characteristic protein sequence (eg, a signature sequence) within the protein backbone. Several hundred PTMs have been reported, and these modifications invariably affect some aspect of protein structure or function (Walsh, G. Proteins (2014), second edition, published by Wiley and Sons, Ltd., ISBN: 9780470669853). Various post-translational modifications include, but are not limited to, cleavage, N-terminal extension, protein degradation, N-terminal acylation, biotinylation (acylation of lysine residues with alpha-biotin), C-terminal amidation, glycosylation, iodination, covalent addition of prosthetic groups, acetylation (addition acetyl group, usually to the N-terminus of the protein), alkylation (the addition of an alkyl group (for example, methyl, ethyl, propyl) usually at lysine or arginine residues), methylation,

- 7 045776 аденилирование, АДФ-рибозилирование, ковалентные поперечные связи внутри или между полипептидными цепями, сульфирование, пренилирование, модификации, зависящие от витамина С (гидроксилирование пролина и лизина и карбоксиконцевое амидирование), зависимая от витамина K модификация, при которой витамин K является кофактором карбоксилирования остатков глутаминовой кислоты, что приводит к образованию γ-карбоксиглутамата (остаток глутаминовой кислоты), глутамилированию (ковалентная связь остатка глутаминовой кислоты s), глицилирование (ковалентная связь остатков глицина), гликозилирование (присоединение гликозильной группы к аспарагину, гидроксилизину, серину или треонину, что приводит к образованию гликопротеина), изопренилирование (присоединение изопреноидной группы, такой как фарнезол и геранилгераниол), липоилирование (присоединение липоатной функциональности), фосфопантетеинилирование (присоединение 4'фосфопантетеинильного остатка кофермента А, например, в биосинтезе жирной кислоты, поликетида, нерибосомального пептида и лейцина), фосфорилирование (добавление фосфатная группа, обычно к серину, тирозину, треонину или гистидину) и сульфатирование (присоединение сульфатной группы, обычно к остатку тирозина). Посттрансляционные модификации, которые изменяют химическую природу аминокислот, включают, помимо прочего, цитруллинирование (например, превращение аргинина в цитруллин путем деиминирования) и дезамидирование (например, превращение глутамина в глутамин). кислоты или аспарагина в аспарагиновую кислоту). Посттрансляционные модификации, которые включают структурные изменения, включают, помимо прочего, образование дисульфидных мостиков (ковалентная связь двух цистеиновых аминокислот) и протеолитическое расщепление (расщепление белка по пептидной связи). Определенные посттрансляционные модификации включают добавление других белков или пептидов, таких как ISGylation (ковалентная связь с белком ISG15 (интерферон-стимулируемый ген)), SUMOylation (ковалентная связь с белком SUMO (Small Ubiquitinrelated MOdifier)) и убиквитинирование (ковалентная связь с белком убиквитином). См. www.uniprot.org/docs/ptmlist для более подробного контролируемого словаря PTM, созданного UniProt.- 7 045776 adenylation, ADP-ribosylation, covalent cross-links within or between polypeptide chains, sulfonation, prenylation, vitamin C-dependent modifications (hydroxylation of proline and lysine and carboxy-terminal amidation), vitamin K-dependent modification in which vitamin K is a cofactor carboxylation of glutamic acid residues, resulting in the formation of γ-carboxyglutamate (glutamic acid residue), glutamylation (covalent bonding of glutamic acid residues), glycylation (covalent bonding of glycine residues), glycosylation (attachment of a glycosyl group to asparagine, hydroxylysine, serine or threonine, resulting in the formation of a glycoprotein), isoprenylation (addition of an isoprenoid group such as farnesol and geranylgeraniol), lipoylation (addition of lipoate functionality), phosphopantheenylation (addition of the 4'phosphopantetheinyl residue of coenzyme A, for example in the biosynthesis of fatty acid, polyketide, non-ribosomal peptide and leucine ), phosphorylation (adding a phosphate group, usually to a serine, tyrosine, threonine or histidine), and sulfation (adding a sulfate group, usually to a tyrosine residue). Post-translational modifications that change the chemical nature of amino acids include, but are not limited to, citrullination (eg, converting arginine to citrulline by deimination) and deamidation (eg, converting glutamine to glutamine). acid or asparagine to aspartic acid). Post-translational modifications that involve structural changes include, but are not limited to, the formation of disulfide bridges (covalent bonding of two cysteine amino acids) and proteolytic cleavage (cleavage of a protein at a peptide bond). Certain post-translational modifications include the addition of other proteins or peptides, such as ISGylation (covalently linked to the ISG15 (interferon-stimulated gene) protein), SUMOylation (covalently linked to the SUMO (Small Ubiquitin-related MOdifier) protein), and ubiquitination (covalently linked to the protein ubiquitin). See www.uniprot.org/docs/ptmlist for a more detailed controlled vocabulary of PTMs created by UniProt.

Используемый в данном документе термин гликопептид/гликопротеин представляет собой модифицированный пептид/белок во время или после их синтеза с ковалентно связанными углеводами или гликаном. В некоторых вариантах реализации изобретения, гликопептид получают из моноклонального антитела, например, из протеазного гидролизата моноклонального антитела.As used herein, the term glycopeptide/glycoprotein is a modified peptide/protein during or after its synthesis with covalently linked carbohydrates or glycan. In some embodiments, the glycopeptide is derived from a monoclonal antibody, for example, from a protease hydrolyzate of the monoclonal antibody.

Используемый в данном документе термин гликан представляет собой соединение, содержащее одну или несколько единиц сахара, которые обычно включают глюкозу (Glc), галактозу (Gal), маннозу (Man), фукозу (Fuc), N-ацетилгалактозамин (GalNAc), N-ацетилглюкозамин (GlcNAc) и Nацетилнейраминовую кислоту (NeuNAc) (Frank Kjeldsen, et al. Anal. Chem. 2003, 75, 2355-2361). Фрагмент гликана в гликопротеине, таком как моноклональное антитело, является важным признаком для определения его функции или расположения в клетке. Например, конкретное моноклональное антитело модифицировано специфическим фрагментом гликана.As used herein, the term glycan is a compound containing one or more sugar units, which typically include glucose (Glc), galactose (Gal), mannose (Man), fucose (Fuc), N-acetylgalactosamine (GalNAc), N-acetylglucosamine (GlcNAc) and Nacetylneuraminic acid (NeuNAc) (Frank Kjeldsen, et al. Anal. Chem. 2003, 75, 2355-2361). The glycan moiety of a glycoprotein, such as a monoclonal antibody, is an important feature for determining its function or location in the cell. For example, a particular monoclonal antibody is modified with a specific glycan fragment.

Используемый в данном документе термин образец относится к смеси молекул, которая содержит, по крайней мере, молекулу анализируемого вещества, например, гликопептид, полученный из моноклонального антитела, который подвергается манипуляции в соответствии с методами изобретение, включая, например, разделение, анализ, извлечение, концентрирование или профилирование.As used herein, the term sample refers to a mixture of molecules that contains at least a molecule of an analyte, e.g., a glycopeptide derived from a monoclonal antibody, that is manipulated in accordance with the methods of the invention, including, for example, separation, analysis, extraction, concentration or profiling.

Используемые в данном документе термины анализ или анализирование используются взаимозаменяемо и относятся к любому из различных методов разделения, обнаружения, выделения, очистки, солюбилизации, обнаружения и/или характеристики представляющих интерес молекул (например, пептидов). Примеры включают, но не ограничиваются ими, твердофазную экстракцию, твердофазную микроэкстракцию, электрофорез, масс-спектрометрию, например, ESI-MS, SPE HILIC или MALDI-MS, жидкостную хроматографию, например, высокоэффективную, например, обращенная фаза, нормальная фаза или вытеснение по размеру, ионно-парная жидкостная хроматография, жидкостножидкостная экстракция, например, ускоренная жидкостная экстракция, сверхкритическая жидкостная экстракция, микроволновая экстракция, мембранная экстракция, экстракция по Сокслету, осаждение, осветление, электрохимическая обнаружение, окрашивание, элементный анализ, деградация по Эдмунду, ядерно-магнитный резонанс, инфракрасный анализ, проточный анализ, капиллярная электрохроматография, ультрафиолетовое обнаружение и их комбинации.As used herein, the terms assay or analysis are used interchangeably and refer to any of various methods for separating, detecting, isolating, purifying, solubilizing, detecting and/or characterizing molecules of interest (eg, peptides). Examples include, but are not limited to, solid phase extraction, solid phase microextraction, electrophoresis, mass spectrometry, e.g. ESI-MS, SPE HILIC or MALDI-MS, liquid chromatography, e.g. high performance, e.g. reverse phase, normal phase or displacement size, ion-pair liquid chromatography, liquid-liquid extraction, e.g. accelerated liquid extraction, supercritical liquid extraction, microwave extraction, membrane extraction, Soxhlet extraction, precipitation, clarification, electrochemical detection, staining, elemental analysis, Edmunds degradation, nuclear magnetic resonance, infrared analysis, flow analysis, capillary electrochromatography, ultraviolet detection and combinations thereof.

Термин профилирование, используемый в данном документе, относится к любому из различных методов анализа, которые используются в комбинации для определения содержания, состава или характеристического соотношения белков, таких как пептид в образце.The term profiling as used herein refers to any of various analytical methods that are used in combination to determine the abundance, composition, or characteristic ratio of proteins, such as a peptide, in a sample.

Приведение в контакт, как используется в данном документе, включает соединение по меньшей мере двух веществ в растворе или твердой фазе.Contacting, as used herein, involves bringing together at least two substances in solution or solid phase.

Используемый в данном документе термин анализ интактной массы включает нисходящие эксперименты, в которых белок характеризуется как интактный белок. Неповрежденный масс-анализ может свести подготовку проб к минимуму и сохранить информацию, которая иногда может быть потеряна в других стратегиях протеомики, таких как подключение нескольких PTM.As used herein, the term intact assay includes top-down experiments in which the protein is characterized as an intact protein. Intact mass analysis can keep sample preparation to a minimum and preserve information that can sometimes be lost in other proteomics strategies, such as connecting multiple PTMs.

Анализ картирования пептидов, используемый в данном документе, включает эксперименты, в которых белок подвергается расщеплению с последующим разделением полученных пептидов и ихThe peptide mapping assay used herein involves experiments in which a protein is digested and then separated from the resulting peptides and their

- 8 045776 анализом, предпочтительно с использованием ЖХ-МС. В некоторых вариантах реализации анализ картирования пептидов может применяться для подтверждения первичной последовательности белковых биофармацевтических препаратов, где белковая молекула может быть сначала гидролизована на небольшие пептидные фрагменты с использованием гидролизующего агента, а затем аминокислотная последовательность каждого пептидного фрагмента. определяется анализом ЖХ-МС с учетом предсказанной последовательности кДНК и специфичности используемой протеазы. Данные анализа пептидного картирования также могут быть использованы для выявления и количественной оценки посттрансляционных модификаций, подтверждения дисульфидных связей и даже обнаружения событий замещения аминокислот, присутствующих на очень низких уровнях (<0,1%) (Zeck et al. PloS one 2012, 7, e40328). Во время анализа пептидного картирования белковых биофармацевтических препаратов ЖХМС часто можно проводить в сочетании с ультрафиолетовым (УФ) обнаружением для получения так называемых УФ-отпечатков пальцев, которые сами по себе могут использоваться в качестве идентификационного анализа во время контроля качества (КК) и выпуска препаратов.- 8 045776 analysis, preferably using LC-MS. In some embodiments, peptide mapping analysis may be used to confirm the primary sequence of protein biopharmaceuticals, where the protein molecule may be first hydrolyzed into small peptide fragments using a hydrolyzing agent, followed by the amino acid sequence of each peptide fragment. determined by LC-MS analysis taking into account the predicted cDNA sequence and the specificity of the protease used. Peptide mapping analysis data can also be used to identify and quantify post-translational modifications, confirm disulfide bonds, and even detect amino acid substitution events present at very low levels (<0.1%) (Zeck et al. PloS one 2012, 7, e40328 ). During peptide mapping analysis of protein biopharmaceuticals, LCMS can often be performed in conjunction with ultraviolet (UV) detection to produce so-called UV fingerprints, which themselves can be used as an identification assay during quality control (QC) and drug release.

Используемый в данном документе термин переваривание относится к гидролизу одной или нескольких пептидных связей белка. Существует несколько подходов к расщеплению белка в образце с использованием соответствующего гидролизующего агента, например, ферментативное расщепление или неферментативное расщепление. Используемый в данном документе термин гидролизующий агент относится к любому одному или комбинации из большого количества различных агентов, которые могут выполнять расщепление белка. Неограничивающие примеры гидролизующих агентов, которые могут осуществлять ферментативное расщепление, включают трипсин, эндопротеиназу Arg-C, эндопротеиназу Asp-N, эндопротеиназу Glu-C, протеазу наружной мембраны T (OmpT), фермент, разрушающий иммуноглобулин Streptococcus pyogenes (IdeS), химотрипсин, пепсин, термолизин, папаин, проназа и протеаза из Aspergillus Saitoi. Неограничивающие примеры гидролизующих агентов, которые могут осуществлять неферментативное расщепление, включают использование высокой температуры, микроволнового излучения, ультразвука, высокого давления, инфракрасного излучения, растворителей (неограничивающие примеры включают этанол и ацетонитрил), расщепление иммобилизованными ферментами (IMER), ферменты, иммобилизованные на магнитных частицах, и ферменты, иммобилизованные на кристалле. Недавний обзор, в котором обсуждаются доступные методы переваривания белков, см. в Switazar et al., Protein Digestion: An Overview of the Available Techniques and Recent Developments (J. Proteome Research 2013, 12, 1067-1077). Один или комбинация гидролизующих агентов могут расщеплять пептидные связи в белке или полипептиде специфичным для последовательности образом, создавая предсказуемый набор более коротких пептидов.As used herein, the term digestion refers to the hydrolysis of one or more peptide bonds of a protein. There are several approaches to digest the protein in a sample using an appropriate hydrolyzing agent, such as enzymatic digestion or non-enzymatic digestion. As used herein, the term hydrolyzing agent refers to any one or combination of a wide variety of agents that can perform protein degradation. Non-limiting examples of hydrolyzing agents that can perform enzymatic degradation include trypsin, Arg-C endoproteinase, Asp-N endoproteinase, Glu-C endoproteinase, outer membrane protease T (OmpT), Streptococcus pyogenes immunoglobulin degrading enzyme (IdeS), chymotrypsin, pepsin , thermolysin, papain, pronase and protease from Aspergillus Saitoi. Non-limiting examples of hydrolyzing agents that can perform non-enzymatic digestion include the use of high temperature, microwave radiation, ultrasound, high pressure, infrared radiation, solvents (non-limiting examples include ethanol and acetonitrile), immobilized enzyme digestion (IMER), enzymes immobilized on magnetic particles , and enzymes immobilized on the crystal. For a recent review discussing available methods for protein digestion, see Switazar et al., Protein Digestion: An Overview of the Available Techniques and Recent Developments (J. Proteome Research 2013, 12, 1067-1077). One or a combination of hydrolyzing agents can cleave peptide bonds in a protein or polypeptide in a sequence-specific manner, creating a predictable set of shorter peptides.

Доступны несколько подходов, которые можно использовать для переваривания белка. Один из широко распространенных способов расщепления белков в образце включает использование протеаз. Доступно множество протеаз, и каждая из них имеет свои особенности с точки зрения специфичности, эффективности и оптимальных условий переваривания. Протеазы относятся как к эндопептидазам, так и к экзопептидазам, которые классифицируются на основе способности протеазы расщеплять неконцевые или концевые аминокислоты в пептиде. Кроме того, протеазы также относятся к шести различным классам - аспарагиновой, глутаминовой и металлопротеазам, цистеиновым, сериновым и треониновым протеазам, классифицированным по механизму катализа. Термины протеаза и пептидаза используются взаимозаменяемо для обозначения ферментов, которые гидролизуют пептидные связи. Протеазы также можно разделить на специфические и неспецифические протеазы. Используемый в настоящем документе термин специфическая протеаза относится к протеазе, обладающей способностью расщеплять пептидный субстрат на специфической аминокислотной боковой цепи пептида. Используемый в настоящем документе термин неспецифическая протеаза относится к протеазе со сниженной способностью расщеплять пептидный субстрат по специфической аминокислотной боковой цепи пептида. Предпочтение расщепления может быть определено на основе отношения количества конкретной аминокислоты в качестве сайта расщепления к общему количеству расщепленных аминокислот в последовательностях белка.Several approaches are available that can be used to digest protein. One common way to break down proteins in a sample involves the use of proteases. There are many proteases available and each has its own characteristics in terms of specificity, efficiency and optimal digestion conditions. Proteases are classified as both endopeptidases and exopeptidases, which are classified based on the protease's ability to cleave non-terminal or terminal amino acids in a peptide. In addition, proteases also fall into six different classes - aspartic, glutamic and metalloproteases, cysteine, serine and threonine proteases, classified according to the mechanism of catalysis. The terms protease and peptidase are used interchangeably to refer to enzymes that hydrolyze peptide bonds. Proteases can also be divided into specific and nonspecific proteases. As used herein, the term specific protease refers to a protease having the ability to cleave a peptide substrate at a specific amino acid side chain of the peptide. As used herein, the term nonspecific protease refers to a protease with a reduced ability to cleave a peptide substrate at a specific amino acid side chain of the peptide. Cleavage preference can be determined based on the ratio of the amount of a particular amino acid as a cleavage site to the total amount of cleaved amino acids in protein sequences.

Белок необязательно может быть приготовлен перед характеристикой. В некоторых типовых вариантах реализации приготовление белка включает стадию расщепления белка. В некоторых конкретных типовых вариантах реализации препарат белка включает стадию расщепления белка, при этом расщепление белка можно проводить с использованием трипсина.The protein may not necessarily be cooked prior to characterization. In some exemplary embodiments, protein preparation includes a protein digestion step. In some specific exemplary embodiments, the protein preparation includes a protein digestion step, wherein the protein digestion may be performed using trypsin.

В некоторых типовых вариантах реализации препарат белка может включать стадию денатурации белка, восстановления белка, забуферивания белка и/или обессоливания образца перед стадией расщепления белка. Эти этапы могут быть выполнены любым подходящим способом по желанию.In some exemplary embodiments, the protein preparation may include the step of denaturing the protein, reducing the protein, buffering the protein, and/or desalting the sample prior to the step of protein digestion. These steps can be performed in any suitable manner desired.

Чтобы обеспечить характеристику различных свойств белка с помощью анализа пептидного картирования или анализа интактной массы, можно выполнить широкий спектр анализов на основе ЖХ-МС.To provide characterization of various protein properties using peptide mapping analysis or intact mass analysis, a wide range of LC-MS-based assays can be performed.

Используемый в данном документе термин жидкостная хроматография относится к процессу, в котором химическая смесь, переносимая жидкостью, может быть разделена на компоненты в результате дифференциального распределения химических соединений, когда они обтекают или над неподвижной жидкостью или твердая фаза. Неограничивающие примеры жидкостной хроматографии включаютAs used herein, the term liquid chromatography refers to a process in which a chemical mixture carried by a liquid can be separated into components as a result of the differential distribution of chemical compounds as they flow over either a stationary liquid or a solid phase. Non-limiting examples of liquid chromatography include

- 9 045776 обращенно-фазовую жидкостную хроматографию, ионообменную хроматографию, эксклюзионную хроматографию, аффинную хроматографию и гидрофобную хроматографию.- 9 045776 reverse phase liquid chromatography, ion exchange chromatography, size exclusion chromatography, affinity chromatography and hydrophobic chromatography.

Используемый в данном документе термин масс-спектрометр относится к устройству, способному обнаруживать определенные виды молекул и точно измерять их массы. Этот термин может означать включение любого молекулярного детектора, в который можно элюировать полипептид или пептид для обнаружения и/или характеристики. Масс-спектрометр состоит из трех основных частей: источника ионов, масс-анализатора и детектора. Роль источника ионов заключается в создании ионов газовой фазы. Атомы, молекулы или кластеры аналита могут быть переведены в газовую фазу и ионизированы либо одновременно (как при ионизации электрораспылением). Выбор источника ионов зависит от области применения.As used herein, the term mass spectrometer refers to a device capable of detecting certain types of molecules and accurately measuring their masses. The term may include any molecular detector into which a polypeptide or peptide can be eluted for detection and/or characterization. A mass spectrometer consists of three main parts: an ion source, a mass analyzer, and a detector. The role of the ion source is to create gas phase ions. Atoms, molecules or clusters of the analyte can be transferred into the gas phase and ionized either simultaneously (as in electrospray ionization). The choice of ion source depends on the application.

Используемый в данном документе термин ионизация электрораспылением или ESI относится к процессу ионизации распылением, при котором либо катионы, либо анионы в растворе переходят в газовую фазу посредством образования и десольватации при атмосферном давлении потока сильно заряженных частиц. капли, возникающие в результате приложения разности потенциалов между кончиком иглы эмиттера электрораспыления, содержащей раствор, и противоэлектродом. Существует три основных этапа производства ионов в газовой фазе из ионов электролита в растворе. К ним относятся: (а) образование заряженных капель на наконечнике для инфузии ЭС; (б) усадка заряженных капель в результате испарения растворителя и повторные распада капель, приводящие к образованию небольших сильно заряженных капель, способных производить ионы в газовой фазе; и (c) механизм образования ионов газовой фазы из очень маленьких и сильно заряженных капель. Стадии (а)-(с) обычно происходят в области атмосферного давления аппарата.As used herein, the term electrospray ionization or ESI refers to a spray ionization process in which either cations or anions in solution are transferred to the gas phase through the formation and desolvation at atmospheric pressure of a stream of highly charged species. droplets resulting from the application of a potential difference between the tip of an electrospray emitter needle containing a solution and the counter electrode. There are three main steps in the production of ions in the gas phase from electrolyte ions in solution. These include: (a) the formation of charged droplets at the ES infusion tip; (b) shrinkage of charged droplets as a result of solvent evaporation and repeated droplet disintegration, leading to the formation of small, highly charged droplets capable of producing ions in the gas phase; and (c) the mechanism for the formation of gas phase ions from very small and highly charged droplets. Steps (a)-(c) usually occur in the atmospheric pressure region of the apparatus.

Используемый в данном документе термин источник ионизации электрораспылением относится к системе ионизации электрораспылением, которая может быть совместима с масс-спектрометром, используемым для масс-анализа белка.As used herein, the term electrospray ionization source refers to an electrospray ionization system that can be compatible with a mass spectrometer used for protein mass analysis.

Нативная МС представляет собой особый подход, основанный на ионизации электрораспылением, при котором биологические аналиты распыляются из неденатурирующего растворителя. Он определяется как процесс, посредством которого биомолекулы, такие как большие биомолекулы и их комплексы, могут быть переведены из трехмерного функционального существования в конденсированной жидкой фазе в газовую фазу с помощью процесса масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (ESI-MS).Native MS is a specific approach based on electrospray ionization in which biological analytes are nebulized from a nondenaturing solvent. It is defined as the process by which biomolecules, such as large biomolecules and their complexes, can be transferred from a three-dimensional functional existence in a condensed liquid phase to a gas phase using the process of electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS).

Термин наноэлектрораспыление или нанораспыление, используемый в данном документе, относится к ионизации электрораспылением при очень низкой скорости потока растворителя, обычно сотен нанолитров в минуту раствора образца или ниже, часто без использования внешней подачи растворителя.The term nanoelectrospray or nanospray as used herein refers to electrospray ionization at very low solvent flow rates, typically hundreds of nanoliters per minute or lower of a sample solution, often without the use of an external solvent supply.

Используемый в данном документе термин анализатор массы относится к устройству, которое может разделять виды, то есть атомы, молекулы или кластеры, в зависимости от их массы. Неограничивающими примерами масс-анализаторов, которые можно использовать для быстрого секвенирования белков, являются времяпролетный (TOF), магнитно-электрический сектор, квадрупольный масс-фильтр (Q), квадрупольная ионная ловушка (QIT), орбитальная ловушка, преобразование Фурье ионно циклотронный резонанс (FTICR), а также метод ускорительной массспектрометрии (AMS).As used herein, the term mass analyzer refers to a device that can separate species, that is, atoms, molecules or clusters, depending on their mass. Non-limiting examples of mass analyzers that can be used for rapid protein sequencing include time-of-flight (TOF), magnetic-electric sector, quadrupole (Q) mass filter, quadrupole ion trap (QIT), orbitrap, Fourier transform ion cyclotron resonance (FTICR) ), as well as the accelerator mass spectrometry (AMS) method.

Используемый в данном документе термин отношение массы к заряду или m/z используется для обозначения безразмерной величины, образованной путем деления массы иона в единых атомных единицах массы на его зарядовое число (независимо от знака). В общем, состояние заряда зависит от: метода ионизации (так как ионизация электрораспылением, ESI имеет тенденцию способствовать многократной ионизации, которая не так часто встречается в MALDI), длины пептида (поскольку более длинные пептиды имеют больше групп, где могут быть дополнительные протоны). присоединены (основные остатки)), последовательность пептидов (поскольку некоторые аминокислоты (например, Arg или Lys) более восприимчивы к ионизации, чем другие), настройки прибора, pH растворителя и состав растворителя.As used herein, the term mass-to-charge ratio, or m/z, is used to denote a dimensionless quantity formed by dividing the mass of an ion in common atomic mass units by its charge number (regardless of sign). In general, the charge state depends on: the ionization method (since electrospray ionization, ESI tends to promote multiple ionization, which is not as common in MALDI), the length of the peptide (since longer peptides have more groups where there can be extra protons). attached (basic residues)), peptide sequence (because some amino acids (e.g. Arg or Lys) are more susceptible to ionization than others), instrument settings, solvent pH, and solvent composition.

Используемый в данном документе термин тандемная масс-спектрометрия относится к методу, при котором структурная информация о молекулах образца может быть получена с использованием нескольких стадий массового отбора и массового разделения. Предпосылкой является то, что молекулы образца могут быть переведены в газовую фазу и ионизированы в неизменном виде, а также что их можно заставить распасться некоторым предсказуемым и контролируемым образом после первого этапа массового отбора. Многоступенчатая МС/МС, или MSn, может быть выполнена путем сначала выбора и выделения иона-предшественника (MS2), его фрагментации, выделения первичного иона-фрагмента (MS3), его фрагментации, выделения вторичного фрагмента (MS4) и т.д. до тех пор, пока можно получить значимую информацию или можно обнаружить сигнал осколочного иона. Тандемная МС успешно выполнялась с широким спектром комбинаций анализаторов. Какие анализаторы следует комбинировать для определенного приложения, зависит от множества различных факторов, таких как чувствительность, селективность и скорость, а также размер, стоимость и доступность. ДвумяAs used herein, the term tandem mass spectrometry refers to a technique in which structural information about the molecules of a sample can be obtained using multiple steps of mass selection and mass separation. The premise is that the sample molecules can be brought into the gas phase and ionized intact, and that they can be forced to decay in some predictable and controllable manner after the first step of mass selection. Multi-step MS/MS, or MSn, can be performed by first selecting and isolating a precursor ion (MS2), fragmenting it, isolating a primary fragment ion (MS3), fragmenting it, isolating a secondary fragment (MS4), etc. as long as meaningful information can be obtained or the fragment ion signal can be detected. Tandem MS has been successfully performed with a wide range of analyzer combinations. Which analyzers should be combined for a particular application depends on many different factors, such as sensitivity, selectivity and speed, as well as size, cost and availability. Two

- 10 045776 основными категориями тандемных методов МС являются тандемные в пространстве и тандемные во времени, но существуют также гибриды, в которых тандемные во времени анализаторы соединяются в пространстве или с тандемными в пространстве анализаторами.- 10 045776 The main categories of tandem MS methods are spatial tandem and time tandem, but there are also hybrids in which time tandem analyzers are combined in space or with spatial tandem analyzers.

Тандемный масс-спектрометр в пространстве состоит из источника ионов, устройства активации прекурсорных ионов и как минимум двух масс-анализаторов без захвата. Конкретные функции разделения m/z могут быть разработаны таким образом, что в одной секции прибора ионы отбираются, диссоциируют в промежуточной области, а затем ионы-продукты передаются в другой анализатор для разделения m/z и сбора данных.A tandem space mass spectrometer consists of an ion source, a precursor ion activation device, and at least two non-capture mass analyzers. Specific m/z separation functions can be designed such that ions are sampled in one section of the instrument, dissociated in an intermediate region, and then the product ions are transferred to another analyzer for m/z separation and data collection.

В тандемно-временном масс-спектрометре ионы, образующиеся в источнике ионов, могут быть захвачены, изолированы, фрагментированы и разделены по m/z в одном и том же физическом устройстве.In a tandem time mass spectrometer, ions produced in the ion source can be captured, isolated, fragmented, and m/z separated in the same physical device.

Целевая масс-спектрометрия, как используется в данном документе, представляет собой метод масс-спектрометрии, который использует несколько стадий тандемной масс-спектрометрии (MSn с n=2 или 3) для ионов определенной массы (m/z) в определенное время. Значения m/z и времени определены в списке включений, который получен из предыдущего анализа.Targeted mass spectrometry, as used herein, is a mass spectrometry technique that uses multiple tandem mass spectrometry steps (MSn with n=2 or 3) on ions of a specific mass (m/z) at a specific time. The m/z and time values are defined in the inclusion list, which is obtained from the previous analysis.

Используемый в данном документе термин гибридный масс-спектрометр с квадрупольноорбитальной ловушкой относится к гибридной системе, созданной путем соединения квадрупольного масс-спектрометра с масс-анализатором с орбитальной ловушкой. Тандемный эксперимент во времени с использованием гибридного масс-спектрометра квадруполь-орбитрап начинается с выброса всех ионов, кроме тех, которые находятся в выбранном узком диапазоне m/z из квадрупольного масс-спектрометра. Отобранные ионы могут быть введены в орбитальную ловушку и фрагментированы чаще всего с помощью низкоэнергетического CID. Фрагменты в пределах допустимого диапазона m/z ловушки должны оставаться в ловушке, и можно получить спектр МС-МС. Подобные гибридные системы можно использовать для быстрого секвенирования белков, такие как, помимо прочего, QIT-FTICR и Qq-FTICR.As used herein, the term hybrid quadrupole orbitrap mass spectrometer refers to a hybrid system created by coupling a quadrupole mass spectrometer with an orbitrap mass analyzer. A tandem time course experiment using a hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer begins by ejecting all ions except those in a selected narrow m/z range from the quadrupole mass spectrometer. Selected ions can be introduced into an orbitrap and fragmented, most commonly using low-energy CID. Fragments within the acceptable m/z range of the trap should remain trapped and an MS/MS spectrum can be acquired. Similar hybrid systems can be used for rapid protein sequencing, such as QIT-FTICR and Qq-FTICR, among others.

Используемый в данном документе термин секвенирование белка de novo относится к процедуре определения аминокислотной последовательности пептида без использования информации, полученной из других источников. Благодаря высокому уровню чувствительности масс-спектрометрии этот метод может предоставить жизненно важную информацию, которая часто выходит за рамки возможностей обычных методов секвенирования.As used herein, the term de novo protein sequencing refers to the procedure of determining the amino acid sequence of a peptide without the use of information obtained from other sources. Thanks to the high level of sensitivity of mass spectrometry, this technique can provide vital information that is often beyond the capabilities of conventional sequencing methods.

Используемый в данном документе термин покрытие белковой последовательности относится к процентной доле белковой последовательности, покрытой идентифицированными пептидами. Процент покрытия можно рассчитать, разделив количество аминокислот во всех найденных пептидах на общее количество аминокислот во всей белковой последовательности.As used herein, the term protein sequence coverage refers to the percentage of protein sequence covered by identified peptides. Percent coverage can be calculated by dividing the number of amino acids in all peptides found by the total number of amino acids in the entire protein sequence.

Используемый в данном документе термин база данных относится к биоинформационным инструментам, которые обеспечивают возможность поиска неинтерпретированных спектров МС-МС по всем возможным последовательностям в базе данных (базах данных). Неограничивающими примерами таких инструментов являются Mascot (www.matrixscience.com), Spectrum Mill (www.chem.agilent.com), PLGS (www.waters.com), PEAKS (www.bioinformaticssolutions.com), Proteinpilot (download.appliedbiosystems.com//proteinpilot), Phenyx (www.phenyx-ms.com), Sorcerer (www.sagenresearch.com), OMSSA (www.pubchem.ncbi.nlm.nih. gov/omssa/), X!Tandem (www.thegpm.org/TANDEM/), Protein Prospector (www.prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm), Byonic (www.proteinmetrics.com/ products/byonic) или Sequest (fields.scripps.edu/sequest).As used herein, the term database refers to bioinformatics tools that provide the ability to search uninterpreted MS/MS spectra against all possible sequences in the database(s). Non-limiting examples of such tools include Mascot (www.matrixscience.com), Spectrum Mill (www.chem.agilent.com), PLGS (www.waters.com), PEAKS (www.bioinformaticssolutions.com), Proteinpilot (download.appliedbiosystems. com//proteinpilot), Phenyx (www.phenyx-ms.com), Sorcerer (www.sagenresearch.com), OMSSA (www.pubchem.ncbi.nlm.nih. gov/omssa/), X!Tandem (www. thegpm.org/TANDEM/), Protein Prospector (www.prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm), Byonic (www.proteinmetrics.com/products/byonic) or Sequest (fields.scripps.edu/sequest).

Общее описание изобретенияGeneral Description of the Invention

Из вышеизложенного понятно, что существует потребность в усовершенствованных методах и системах для улучшения характеристики белков. Раскрытое изобретение отвечает этой потребности.From the above, it is clear that there is a need for improved methods and systems to improve the characterization of proteins. The disclosed invention meets this need.

В данном документе раскрыта платформа ЖХ-МС с улучшенными характеристиками. В вариантах реализации собственная платформа ЖХ-МС объединяет эмиттер с несколькими соплами и модификацию газа для десольватации, тем самым создавая более надежную платформу.This document discloses an LC-MS platform with improved performance. In embodiments, a proprietary LC-MS platform integrates a multi-nozzle emitter and gas modification for desolvation, thereby creating a more robust platform.

Описанные здесь варианты реализации обеспечивают системы и способы быстрой и высокочувствительной характеристики белков в образце.The embodiments described herein provide systems and methods for quickly and highly sensitively characterizing proteins in a sample.

В некоторых типовых вариантах реализации в настоящем изобретении предложена жидкостная хроматографическая масс-спектрометрическая система, содержащая (i) жидкостное хроматографическое устройство, (iii) источник ионизации электрораспылением и (iii) масс-спектрометрическое устройство.In some exemplary embodiments, the present invention provides a liquid chromatography mass spectrometry system comprising (i) a liquid chromatography device, (iii) an electrospray ionization source, and (iii) a mass spectrometry device.

В некоторых типовых вариантах реализации данное раскрытие обеспечивает систему модификатора 106, содержащую (i) контейнер 110, (ii) линию 112 впуска защитного газа и (iii) линию 114 выхода модифицированного газа десольватации, которая подается в излучатель ионизации электрораспылением. с несколькими насадками 108. В некоторых вариантах реализации эмиттер ионизации электрораспылением представляет собой коммерчески доступный эмиттер, такой как эмиттер M3 (Newomics, Berkeley, CA).In some exemplary embodiments, this disclosure provides a modifier system 106 comprising (i) a container 110, (ii) a shielding gas inlet line 112, and (iii) a modified desolvation gas outlet line 114 that is supplied to an electrospray ionization emitter. with multiple attachments 108. In some embodiments, the electrospray ionization emitter is a commercially available emitter such as the M3 emitter (Newomics, Berkeley, CA).

В некоторых типовых вариантах реализации изобретение обеспечивает способ характеристики белка в образце, включающий (i) подачу образца на вход источника ионизации электрораспылением, (ii) генерирование ионов компонентов белка в образце при выход источника ионизации электрораспылениемIn some exemplary embodiments, the invention provides a method for characterizing a protein in a sample, comprising (i) applying the sample to the input of an electrospray ionization source, (ii) generating ions of protein components in the sample at the output of the electrospray ionization source

- 11 045776 и (iii) анализ ионов с использованием масс-спектрометра для идентификации компонентов белка для характеристики белка.- 11 045776 and (iii) ion analysis using a mass spectrometer to identify protein components for protein characterization.

Ссылаясь на фиг. 1, раскрыта примерная собственная платформа ЖХ-МС, обеспечивающая надежный сигнал. Как показано на фиг. 1, исходная платформа 100 ЖХ-МС включает аналитическую колонку 102, делитель 104, систему модификаторов 106, эмиттер 108 ионизации электрораспылением и устройство 118 масс-спектрометрии.Referring to FIG. 1, an exemplary proprietary LC-MS platform providing reliable signal is disclosed. As shown in FIG. 1, the initial LC-MS platform 100 includes an analytical column 102, a splitter 104, a modifier system 106, an electrospray ionization emitter 108, and a mass spectrometry device 118.

В вариантах реализации аналитическая колонка 102 представляет собой разделительную колонку для жидкостной хроматографии (ЖХ). Неограничивающие примеры устройства жидкостной хроматографии могут включать обращенно-фазовую жидкостную хроматографию, ионообменную хроматографию, эксклюзионную хроматографию, аффинную хроматографию, хроматографию гидрофильного взаимодействия и гидрофобную хроматографию. Жидкостная хроматография, включая ВЭЖХ, может использоваться для анализа пептидов, включая моноклональные антитела. Для изучения этих структур можно использовать различные формы жидкостной хроматографии, включая анионообменную хроматографию, обращенно-фазовую ВЭЖХ, эксклюзионную хроматографию, высокоэффективную анионообменную хроматографию и нормально-фазовую (НФ) хроматографию, включая НФ-ВЭЖХ (см., например, Alpert et al., J. Chromatogr. А 676:191-202 (1994)). Хроматография гидрофильного взаимодействия (HILIC) представляет собой вариант NP-HPLC, который можно проводить с частично водными подвижными фазами, что позволяет разделять пептиды, углеводы, нуклеиновые кислоты и многие белки в нормальной фазе. Порядок элюирования для HILIC от наименее полярного до наиболее полярного, противоположный порядку в ВЭЖХ с обращенной фазой. ВЭЖХ можно проводить, например, на системе ВЭЖХ от Waters (например, система ВЭЖХ Waters 2695 Alliance), Agilent, Perkin Elmer, Gilson и т.д.In embodiments, analytical column 102 is a liquid chromatography (LC) separation column. Non-limiting examples of liquid chromatography apparatus may include reverse phase liquid chromatography, ion exchange chromatography, size exclusion chromatography, affinity chromatography, hydrophilic interaction chromatography, and hydrophobic interaction chromatography. Liquid chromatography, including HPLC, can be used to analyze peptides, including monoclonal antibodies. Various forms of liquid chromatography can be used to study these structures, including anion exchange chromatography, reverse phase HPLC, size exclusion chromatography, high performance anion exchange chromatography, and normal phase (NP) chromatography, including NP-HPLC (see, for example, Alpert et al., J. Chromatogr. A 676:191-202 (1994)). Hydrophilic interaction chromatography (HILIC) is a variant of NP-HPLC that can be performed with partially aqueous mobile phases, allowing the separation of peptides, carbohydrates, nucleic acids, and many proteins in normal phase. The elution order for HILIC is from least polar to most polar, the opposite of reverse phase HPLC. HPLC can be performed, for example, on an HPLC system from Waters (for example, Waters 2695 Alliance HPLC system), Agilent, Perkin Elmer, Gilson, etc.

В некоторых вариантах реализации ЖХ-анализ проводят с использованием колонки ACQUITY UPLC peptide BEH C18. Температуру колонки можно поддерживать на постоянном уровне в течение всего цикла хроматографии, например, с помощью промышленного нагревателя колонки. В некоторых вариантах реализации, колонку поддерживают при температуре от около 18°C до около 70°C, например, от около 30°C до около 60°C, от около 40°C до около 50°C, например, при температуре около 20°C, около 25°C, около 30°C, около 35°C, около 40°C, около 45°C, около 50°C, около 55°C, около 60°C, около 65°C или около 70°C. В некоторых вариантах реализации температура колонки составляет около 40°C. В некоторых вариантах реализации время работы может составлять от около 15 до около 240 мин, например, от около 20 до около 70 мин, от около 30 до около 60 мин, от около 40 до около 90 мин, от около 50 до около 100 мин, от около 60 до около 120 мин, от около 50 до около 80 мин.In some embodiments, LC analysis is performed using an ACQUITY UPLC peptide BEH C18 column. The column temperature can be maintained at a constant level throughout the chromatography run, for example, using a commercial column heater. In some embodiments, the column is maintained at a temperature of about 18°C to about 70°C, for example, from about 30°C to about 60°C, from about 40°C to about 50°C, for example, at a temperature of about 20 °C, about 25°C, about 30°C, about 35°C, about 40°C, about 45°C, about 50°C, about 55°C, about 60°C, about 65°C or about 70 °C. In some embodiments, the column temperature is about 40°C. In some embodiments, the operating time may be from about 15 to about 240 minutes, for example, from about 20 to about 70 minutes, from about 30 to about 60 minutes, from about 40 to about 90 minutes, from about 50 to about 100 minutes, from about 60 to about 120 minutes, from about 50 to about 80 minutes.

В некоторых вариантах реализации ЖХ-анализ включает колонка для эксклюзионной хроматографии (SEC) или система ионообменной хроматографии (IEX), сообщающаяся по текучей среде с системой нативной масс-спектрометрии. Колонки подходят для использования с дегликозилированными белками. В одном варианте реализации колонка SEC представляет собой колонку Waters BEH® SEC (4,6x300 мм). В одном варианте реализации колонка IEX представляет собой колонку с сильным катионообменом.In some embodiments, the LC analysis includes a size exclusion chromatography (SEC) column or ion exchange chromatography (IEX) system in fluid communication with the native mass spectrometry system. The columns are suitable for use with deglycosylated proteins. In one embodiment, the SEC column is a Waters BEH® SEC column (4.6 x 300 mm). In one embodiment, the IEX column is a strong cation exchange column.

Колонка, такая как колонка SEC или IEX, находится в жидкостном сообщении с массспектрометром через аналитический делитель потока 104, который может регулировать скорость потока в масс-спектрометре.A column, such as an SEC or IEX column, is in fluid communication with the mass spectrometer through an analytical flow splitter 104, which can control the flow rate in the mass spectrometer.

В некоторых вариантах реализации подвижная фаза представляет собой водную подвижную фазу. Типичная водная подвижная фаза содержит 140 мМ ацетата натрия и 10 мМ бикарбоната аммония. УФследы обычно регистрируются при 215 и 280 нм.In some embodiments, the mobile phase is an aqueous mobile phase. A typical aqueous mobile phase contains 140 mM sodium acetate and 10 mM ammonium bicarbonate. UV traces are usually recorded at 215 and 280 nm.

В некоторых типовых вариантах реализации подвижная фаза, используемая для элюирования белка, может представлять собой подвижную фазу, которая может быть совместима с масс-спектрометром.In some exemplary embodiments, the mobile phase used to elute the protein may be a mobile phase that may be compatible with the mass spectrometer.

В некоторых типовых вариантах реализации подвижная фаза, используемая в устройстве для жидкостной хроматографии, может включать воду, ацетонитрил, трифторуксусную кислоту, муравьиную кислоту или их комбинацию.In some exemplary embodiments, the mobile phase used in the liquid chromatography apparatus may include water, acetonitrile, trifluoroacetic acid, formic acid, or a combination thereof.

В некоторых типовых вариантах реализации подвижная фаза может иметь скорость потока от около 0,1 мл/мин до около 0,8 мл/мин, например, от около 0,1 мл/мин до около 0,4 мл/мин в устройстве для жидкостной хроматографии. В одном аспекте скорость потока подвижной фазы в устройстве для жидкостной хроматографии может составлять около 0,1 мл/мин, около 0,15 мл/мин, около 0,20 мл/мин, около 0,25 мл/мин, около 0,30 мл/мин, около 0,35 мл/мин, около 0,4 мл/мин, около 0,45 мл/мин, около 0,50 мл/мин, около 0,55 мл/мин, около 0,60 мл/мин, около 0,65 мл/мин, около 0,70 мл/мин, около 0,75 мл/мин или около 0,80 мл/мин.In some exemplary embodiments, the mobile phase may have a flow rate of from about 0.1 mL/min to about 0.8 mL/min, for example, from about 0.1 mL/min to about 0.4 mL/min in a liquid fluidization device. chromatography. In one aspect, the flow rate of the mobile phase in the liquid chromatography apparatus may be about 0.1 ml/min, about 0.15 ml/min, about 0.20 ml/min, about 0.25 ml/min, about 0.30 ml/min, about 0.35 ml/min, about 0.4 ml/min, about 0.45 ml/min, about 0.50 ml/min, about 0.55 ml/min, about 0.60 ml/ min, about 0.65 ml/min, about 0.70 ml/min, about 0.75 ml/min, or about 0.80 ml/min.

В некоторых типовых вариантах реализации подвижная фаза может содержать соли до около 600 мМ. В одном аспекте концентрация соли составляет около 100 мМ, около 150 мМ, около 200 мМ, 250 мМ, около 300 мМ, около 350 мМ, около 400 мМ, около 450 мМ, около 500 мМ, около 550 мМ или около 600 мМ.In some exemplary embodiments, the mobile phase may contain salts up to about 600 mM. In one aspect, the salt concentration is about 100 mM, about 150 mM, about 200 mM, 250 mM, about 300 mM, about 350 mM, about 400 mM, about 450 mM, about 500 mM, about 550 mM, or about 600 mM.

Понятно, что система не ограничивается каким-либо из вышеупомянутых белков, примесей, подвижной фазы, масс-спектрометра, органического растворителя, кислоты, основания илиIt is understood that the system is not limited to any of the above proteins, impurities, mobile phase, mass spectrometer, organic solvent, acid, base or

- 12 045776 хроматографической колонки.- 12 045776 chromatographic column.

В одном варианте реализации эксклюзионное разделение достигается при комнатной температуре с использованием изократического потока 0,2 мл/мин в течение 24 мин.In one embodiment, size exclusion separation is achieved at room temperature using an isocratic flow of 0.2 ml/min for 24 minutes.

В одном варианте реализации напряжение для электрораспыления подается через тройник жидкостного перехода непосредственно перед эмиттером.In one embodiment, the electrospray voltage is applied through a liquid junction tee just before the emitter.

В некоторых типовых вариантах реализации, как показано на фиг. 1, система 106 модификатора включает в себя контейнер 110, линию 112 впуска защитного газа, линию 114 выпуска защитного газа и колпачок 116.In some exemplary implementations, as shown in FIG. 1, the inoculant system 106 includes a container 110, a shielding gas inlet line 112, a shielding gas outlet line 114, and a cap 116.

В некоторых типовых вариантах реализации впускная линия 112 защитного газа может представлять собой тефлоновую трубку.In some exemplary embodiments, the shielding gas inlet line 112 may be a Teflon tube.

В некоторых типовых вариантах реализации впускная линия 112 защитного газа может представлять собой гибкую трубку из нержавеющей стали.In some exemplary embodiments, the shielding gas inlet line 112 may be a flexible stainless steel tube.

В некоторых типовых вариантах реализации впускной трубопровод 112 защитного газа может представлять собой трубу, изготовленную из полиэфиркетона.In some exemplary embodiments, the shielding gas inlet conduit 112 may be a pipe made of polyetheretherketone.

В некоторых типовых вариантах реализации модифицированная линия 114 выпуска газа десольватации может представлять собой тефлоновую трубку.In some exemplary embodiments, the modified desolvation gas release line 114 may be a Teflon tube.

В некоторых типовых вариантах реализации модифицированная линия 114 выпуска газа десольватации может представлять собой гибкую трубку из нержавеющей стали.In some exemplary embodiments, the modified desolvation gas release line 114 may be a flexible stainless steel tube.

В некоторых типовых вариантах реализации модифицированная линия выпуска газа десольватации 114 может представлять собой трубу, изготовленную из полиэфиркетона.In some exemplary embodiments, the modified desolvation gas release line 114 may be a pipe made of polyetheretherketone.

В некоторых типовых вариантах реализации контейнер 110 может содержать крышку 116. Колпачок 116 можно безопасно использовать с подвижной фазой.In some exemplary embodiments, container 110 may include a cap 116. The cap 116 can be safely used with the mobile phase.

В некоторых типовых вариантах реализации контейнер 110 может содержать крышку 116, при этом крышка 110 может образовывать воздухонепроницаемое уплотнение между крышкой 116 и контейнером 110. Неограничивающие примеры крышек, которые можно использовать, включают Canary-Safe Cap от Analytical Sales, крышку бутылки Restek Eco-cap, крышку бутылки Restek Opti-cap и крышку бутылки VWR с инертной подвижной фазой.In some exemplary embodiments, container 110 may include a cap 116, wherein cap 110 may form an airtight seal between cap 116 and container 110. Non-limiting examples of caps that may be used include Canary-Safe Cap from Analytical Sales, Restek Eco-cap Bottle Cap , Restek Opti-cap bottle cap and VWR bottle cap with inert mobile phase.

В некоторых типовых вариантах реализации колпачок 116 может представлять собой навинчивающийся колпачок.In some exemplary embodiments, cap 116 may be a screw cap.

В некоторых типовых вариантах реализации колпачок 116 может быть изготовлен из политетрафторэтилена (ПТФЭ) материала.In some exemplary embodiments, cap 116 may be made of polytetrafluoroethylene (PTFE) material.

В некоторых типовых вариантах реализации крышка 116 может дополнительно содержать уплотнительное кольцо для обеспечения воздухонепроницаемого соединения между крышкой и контейнером.In some exemplary embodiments, the lid 116 may further include an O-ring to provide an airtight seal between the lid and the container.

В некоторых типовых вариантах реализации крышка 116 в контейнере 110 может иметь по меньшей мере одно отверстие для трубки. В одном аспекте крышка 116 в контейнере 110 может иметь два порта для трубок.In some exemplary embodiments, the cap 116 in the container 110 may have at least one tube opening. In one aspect, the lid 116 in the container 110 may have two tubing ports.

В некоторых типовых вариантах реализации крышка 116 в контейнере может иметь по меньшей мере одно впускное отверстие 160.In some exemplary embodiments, the lid 116 on the container may have at least one inlet 160.

В некоторых типовых вариантах реализации крышка 116 в контейнере 110 может иметь по меньшей мере одно выпускное отверстие.In some exemplary embodiments, the lid 116 in the container 110 may have at least one outlet.

В некоторых типовых вариантах реализации эмиттер 108 ионизации электрораспылением соединен с линией 114 выхода защитного газа.In some exemplary embodiments, the electrospray ionization emitter 108 is coupled to the shielding gas output line 114.

В некоторых типовых вариантах реализации система 106 модификатора может содержать контейнер 110, имеющий крышку 116 с портом впускной линии и портом выпускной линии, а также впускную линию 112 защитного газа, способную подавать защитный газ к порту впускной линии.In some exemplary embodiments, the inoculant system 106 may include a container 110 having a lid 116 with an inlet line port and an outlet line port, as well as a shield gas inlet line 112 capable of supplying shielding gas to the inlet line port.

В некоторых типовых вариантах реализации система 106 модификатора может содержать контейнер 110, имеющий крышку 116 с портом впускной линии и портом выпускной линии, и модифицированную выпускную линию 114 газа десольватации, способную соединять порт выпускной линии с излучателем ионизации электрораспылением. 108.In some exemplary embodiments, the inoculant system 106 may include a container 110 having a lid 116 with an inlet line port and an outlet line port, and a modified desolvation gas outlet line 114 capable of connecting the outlet line port to an electrospray ionization emitter. 108.

В некоторых типовых вариантах реализации эмиттер 108 ионизации электрораспылением содержит несколько эмиттерных сопел, таких как по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь эмиттерных сопел, например два, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь эмиттерных сопел.In some exemplary embodiments, the electrospray ionization emitter 108 includes multiple emitter nozzles, such as at least two, at least three, at least four, at least five, at least six, at least seven, at least eight emitter nozzles, for example two, three, four, five, six, seven or eight emitter nozzles.

В некоторых типовых вариантах реализации эмиттер 108 ионизации электрораспылением представляет собой эмиттер M3 от Newomics (Беркли, Калифорния), который включает в себя 8 эмиттерных сопел.In some exemplary embodiments, the electrospray ionization emitter 108 is an M3 emitter from Newomics (Berkeley, Calif.), which includes 8 emitter nozzles.

В некоторых типовых вариантах реализации защитный газ может подаваться источником защитного газа в контейнер 110, имеющий крышку 116 с портом впускной линии через впускную линию 112 защитного газа. Неограничивающие примеры газа оболочки включают воздух, азот, IPA, ACN и/или ACN/NH₃.In some exemplary embodiments, the shielding gas may be supplied by a shielding gas source to a container 110 having a cover 116 with an inlet line port through a shielding gas inlet line 112. Non-limiting examples of sheath gas include air, nitrogen, IPA, ACN and/or ACN/NH ₃ .

В некоторых типовых вариантах реализации защитный газ, который может подаваться источникомIn some exemplary embodiments, the shielding gas, which may be supplied by a source

- 13 045776 защитного газа в контейнер, имеющий крышку с портом впускной линии через впускную линию 112 защитного газа, может представлять собой газообразный азот.- 13 045776 shielding gas into a container having a lid with an inlet line port through the shielding gas inlet line 112 may be nitrogen gas.

В некоторых типовых вариантах реализации эмиттер 108 ионизации электрораспылением может быть автоматизирован для выполнения аспирации образца, дозирования образца, доставки образца и/или для распыления образца.In some exemplary embodiments, the electrospray ionization emitter 108 may be automated to perform sample aspiration, sample dispensing, sample delivery, and/or sample nebulization.

В некоторых типовых вариантах реализации контейнер 110 имеет крышку 116 с портом впускной линии и впускной линией 112 защитного газа, при этом впускная линия 112 защитного газа может быть частично вставлена в порт впускной линии.In some exemplary embodiments, container 110 has a lid 116 with an inlet line port and a shielding gas inlet line 112, wherein the shielding gas inlet line 112 may be partially inserted into the inlet line port.

В некоторых типовых вариантах реализации крышка 116 с портом выпускной линии и модифицированной выпускной линией 114 газа десольватации, при этом модифицированная выпускная линия 114 газа десольватации может быть частично вставлена в порт выпускной линии.In some exemplary embodiments, the cap 116 has a release line port and a modified desolvation gas release line 114, wherein the modified desolvation gas release line 114 may be partially inserted into the release line port.

В некоторых типовых вариантах реализации система 106 модификатора может быть сконфигурирована так, чтобы пропускать поток защитного газа из впускной линии 112 защитного газа через контейнер 110 в выпускную линию 114 газа десольватации, например, защитный газ представляет собой азот.In some exemplary embodiments, the inoculant system 106 may be configured to pass a shielding gas stream from the shielding gas inlet line 112 through the container 110 to the desolvation gas outlet line 114, for example, the shielding gas is nitrogen.

В некоторых типовых вариантах реализации контейнер может быть окружен вторым контейнером. В некоторых конкретных типовых вариантах реализации второй контейнер может быть изготовлен из полиэтилена. В одном аспекте второй контейнер может обеспечивать небьющуюся защиту стеклянных бутылок. В другом аспекте второй контейнер может иметь отверстие в верхней части.In some exemplary embodiments, the container may be surrounded by a second container. In some specific exemplary embodiments, the second container may be made of polyethylene. In one aspect, the second container may provide unbreakable protection for glass bottles. In another aspect, the second container may have an opening in the top.

В некоторых типовых вариантах реализации контейнер 110 может быть изготовлен из боросиликатного стекла.In some exemplary embodiments, container 110 may be made of borosilicate glass.

В некоторых типовых вариантах реализации объем контейнера 110 может варьироваться от около 10 мл до около 5000 мл. В одном аспекте объем контейнера 110 может составлять около 10 мл, около 20 мл, около 30 мл, около 40 мл, около 50 мл, около 60 мл, около 70 мл, около 80 мл, около 90 мл, около 100 мл, около 110 мл, около 120 мл, около 130 мл, около 140 мл, около 150 мл, около 160 мл, околоIn some exemplary embodiments, the volume of container 110 may range from about 10 ml to about 5000 ml. In one aspect, the volume of container 110 may be about 10 ml, about 20 ml, about 30 ml, about 40 ml, about 50 ml, about 60 ml, about 70 ml, about 80 ml, about 90 ml, about 100 ml, about 110 ml, about 120 ml, about 130 ml, about 140 ml, about 150 ml, about 160 ml, about

170 мл, около 180 мл, около 190 мл, около 200 мл, около 210 мл, около 220 мл, около 230 мл, около170 ml, about 180 ml, about 190 ml, about 200 ml, about 210 ml, about 220 ml, about 230 ml, about

240 мл, около 250 мл, около 260 мл, около 270 мл, около 280 мл, около 290 мл, около 300 мл, около240 ml, about 250 ml, about 260 ml, about 270 ml, about 280 ml, about 290 ml, about 300 ml, about

310 мл, около 320 мл, около 330 мл, около 340 мл, около 350 мл, около 360 мл, около 370 мл, около310 ml, about 320 ml, about 330 ml, about 340 ml, about 350 ml, about 360 ml, about 370 ml, about

380 мл, около 390 мл, около 400 мл, около 410 мл, около 420 мл, около 430 мл, около 440 мл, около380 ml, about 390 ml, about 400 ml, about 410 ml, about 420 ml, about 430 ml, about 440 ml, about

450 мл, около 460 мл, около 470 мл, около 480 мл, около 490 мл, около 1000 мл, около 1100 мл, около 1200 мл, около 1300 мл, около 1400 мл, около 1500 мл, около 1600 мл, около 1700 мл, около 1800 мл, около 1900 мл, около 2000 мл, около 2500 мл, около 3000 мл, около 3500 мл, около 4000 мл, около 4500 мл или около 5000 мл.450 ml, about 460 ml, about 470 ml, about 480 ml, about 490 ml, about 1000 ml, about 1100 ml, about 1200 ml, about 1300 ml, about 1400 ml, about 1500 ml, about 1600 ml, about 1700 ml , about 1800 ml, about 1900 ml, about 2000 ml, about 2500 ml, about 3000 ml, about 3500 ml, about 4000 ml, about 4500 ml or about 5000 ml.

В некоторых типовых вариантах реализации контейнер 110 может быть устойчивым к давлению контейнером.In some exemplary embodiments, container 110 may be a pressure resistant container.

В некоторых типовых вариантах реализации контейнер 110 может иметь сопротивление давлению по меньшей мере около 0,5 бар манометрического давления. В одном аспекте контейнер 110 может иметь сопротивление давлению по меньшей мере около 0,5 бар манометрического давления, по меньшей мере около 0,6 бар манометрического давления, по меньшей мере около 0,7 бар манометрического давления, по меньшей мере около 0,8 бар манометрического давления, по меньшей мере около 0,9 бар манометрического давления, по крайней мере около 1 бар манометра, по крайней мере около 1,1 бар манометра, по крайней мере около 1,2 бар манометра, по крайней мере около 1,3 бар манометра, по крайней мере около 1,4 бар манометра, по крайней мере около 1,5 бар манометра, по крайней мере около 1,6 бар манометра, по крайней мере около 1,7 бар манометра, по крайней мере около 1,8 бар манометра, по крайней мере около 1,9 бар манометра или по крайней мере около 2,0 бар манометра.In some exemplary embodiments, container 110 may have a pressure resistance of at least about 0.5 barg. In one aspect, container 110 may have a pressure resistance of at least about 0.5 barg, at least about 0.6 barg, at least about 0.7 barg, at least about 0.8 barg gauge pressure, at least about 0.9 bar gauge pressure, at least about 1 bar gauge, at least about 1.1 bar gauge, at least about 1.2 bar gauge, at least about 1.3 bar pressure gauge, at least about 1.4 bar pressure gauge, at least about 1.5 bar pressure gauge, at least about 1.6 bar pressure gauge, at least about 1.7 bar pressure gauge, at least about 1.8 bar pressure gauge, at least about 1.9 bar gauge or at least about 2.0 bar gauge.

В некоторых типовых вариантах реализации контейнер 110 может быть заполнен по меньшей мере одним органическим растворителем. Неограничивающие примеры органических растворителей включают ацетонитрил, пропанол, изопропанол, воду и метанол.In some exemplary embodiments, container 110 may be filled with at least one organic solvent. Non-limiting examples of organic solvents include acetonitrile, propanol, isopropanol, water and methanol.

В некоторых типовых вариантах реализации контейнер 110 может быть заполнен по меньшей мере одной кислотой. Неограничивающие примеры кислоты включают уксусную кислоту, пропионовую кислоту и муравьиную кислоту.In some exemplary embodiments, container 110 may be filled with at least one acid. Non-limiting examples of acid include acetic acid, propionic acid and formic acid.

В некоторых типовых вариантах реализации контейнер 110 может быть заполнен по меньшей мере одним основанием. Неограничивающие примеры основания включают аммиак, диэтиламин, триэтиламин, К,К-диизопропилэтиламин (DIPEA) и пиперидин. В некоторых типовых вариантах реализации контейнер 110 может быть заполнен по меньшей мере одним органическим растворителем и по меньшей мере одной кислотой.In some exemplary embodiments, container 110 may be filled with at least one base. Non-limiting examples of the base include ammonia, diethylamine, triethylamine, K,K-diisopropylethylamine (DIPEA) and piperidine. In some exemplary embodiments, container 110 may be filled with at least one organic solvent and at least one acid.

В некоторых типовых вариантах реализации контейнер 110 может быть заполнен по меньшей мере одним органическим растворителем и по меньшей мере одним основанием.In some exemplary embodiments, container 110 may be filled with at least one organic solvent and at least one base.

В некоторых типовых вариантах реализации система модификатора может быть сконфигурирована таким образом, чтобы обеспечивать поток защитного газа из впускной линии 112 защитного газа через контейнер 110, который может быть заполнен органическим растворителем и дополнительным химическим компонентом, в газ десольватации. выпускная линия 114.In some exemplary embodiments, the inoculant system may be configured to allow shield gas to flow from shield gas inlet line 112 through container 110, which may be filled with an organic solvent and an additional chemical component, into the desolvation gas. outlet line 114.

- 14 045776- 14 045776

В некоторых типовых вариантах реализации источник ионизации электрораспылением может обеспечивать электрораспыление со скоростью потока растворителя более чем около 1-5 мкл/мин. В одном аспекте источник ионизации электрораспылением может обеспечивать электрораспыление со скоростью потока растворителя более чем около 1 мкл/мин, более чем около 2 мкл/мин, более чем около 3 мкл/мин, более чем около 4 мкл/мин, более чем около 5 мкл/мин, более чем около 6 мкл/мин, более чем около 7 мкл/мин, более чем около 8 мкл/мин, более чем около 9 мкл/мин, более чем около 10 мкл/мин, более чем около 11 мкл/мин, более чем около 12 мкл/мин, более чем около 13 мкл/мин, более чем около 14 мкл/мин, более чем около 15 мкл/мин, более чем около 16 мкл/мин, более чем около 17 мкл/мин, более чем около 18 мкл/мин, более чем около 19 мкл/мин, более чем около 20 мкл/мин, более чем около 25 мкл/мин, более чем около 30 мкл/мин, более чем около 35 мкл/мин, более чем около 40 мкл/мин, более чем около 45 мкл/мин, более чем около 50 мкл/мин, более чем около 55 мкл/мин мин, более чем около 60 мкл/мин, более чем около 65 мкл/мин, более чем около 70 мкл/мин, более чем около 75 мкл/мин, более чем около 80 мкл/мин, более чем около 85 мкл/мин, более чем около 90 мкл/мин, более чем около 95 мкл/мин мин, более чем около 100 мкл/мин, более чем около 110 мкл/мин, более чем около 120 мкл/мин, более чем около 130 мкл/мин, более чем около 140 мкл/мин, более чем около 150 мкл/мин, более чем около 160 мкл/мин, более чем около 170 мкл/мин, более чем около 180 мкл/мин, более чем около 190 мкл/мин, более чем около 200 мкл/мин, более чем около 225 мкл/мин, более чем около 250 мкл/мин, более чем около 275 мкл/мин, более чем около 300 мкл/мин, более чем около 325 мкл/мин, более чем около 350 мкл/мин, более чем около 375 мкл/мин, более чем около 700 мкл/мин, более чем около 425 мкл/мин, более чем около 450 мкл/мин или более чем около 500 мкл/мин.In some exemplary embodiments, the electrospray ionization source may provide electrospray at a solvent flow rate of greater than about 1-5 μL/min. In one aspect, the electrospray ionization source may provide electrospray at a solvent flow rate of greater than about 1 μL/min, greater than about 2 μL/min, greater than about 3 μL/min, greater than about 4 μL/min, greater than about 5 μL /min, more than about 6 µl/min, more than about 7 µl/min, more than about 8 µl/min, more than about 9 µl/min, more than about 10 µl/min, more than about 11 µl/min , more than about 12 μL/min, more than about 13 μL/min, more than about 14 μL/min, more than about 15 μL/min, more than about 16 μL/min, more than about 17 μL/min, more greater than about 18 μL/min, greater than about 19 μL/min, greater than about 20 μL/min, greater than about 25 μL/min, greater than about 30 μL/min, greater than about 35 μL/min, more than about 40 µl/min, more than about 45 µl/min, more than about 50 µl/min, more than about 55 µl/min min, more than about 60 µl/min, more than about 65 µl/min, more than about 70 µL/min, more than about 75 µL/min, more than about 80 µL/min, more than about 85 µL/min, more than about 90 µL/min, more than about 95 µL/min min, more than about 100 µL /min, more than about 110 µl/min, more than about 120 µl/min, more than about 130 µl/min, more than about 140 µl/min, more than about 150 µl/min, more than about 160 µl/min , more than about 170 μL/min, more than about 180 μL/min, more than about 190 μL/min, more than about 200 μL/min, more than about 225 μL/min, more than about 250 μL/min, more greater than about 275 μL/min, greater than about 300 μL/min, greater than about 325 μL/min, greater than about 350 μL/min, greater than about 375 μL/min, greater than about 700 μL/min, more than about 425 μL/min, greater than about 450 μL/min, or greater than about 500 μL/min.

В некоторых вариантах реализации, чтобы приспособиться к широкому диапазону скоростей потока (0,1-0,8 мл/мин), используемому при разделении аналитической шкалы, применяется стратегия разделения после колонки для снижения скоростей потока до диапазона менее 10 мкл/мин, например, менее 1 мкл/мин, менее 0,1 мкл/мин или менее 0,01 мкл/мин, которые могут быть легко обеспечены эмиттером с несколькими соплами, например эмиттером M3 для NSI (см. фиг. 7). В некоторых вариантах реализации коэффициент разделения регулируется двумя фиксированными трубками разных размеров, такими как две трубки Viper разных размеров, соединенными с тройником, таким как тройник из нержавеющей стали. В некоторых вариантах реализации тройник из нержавеющей стали расположен после колонки, соединяя две трубки Viper с разными размерами (20 мкм х 15 см и 100 мкм х 65 см) для уменьшения различных аналитических потоков (<0,8 мл/мин) до микропотока. диапазон (менее мкл/мин) для обнаружения нативного МС и отвести оставшийся высокий поток для обнаружения УФ (например, при 280 нм).In some embodiments, to accommodate the wide range of flow rates (0.1-0.8 mL/min) used in analytical scale separations, a post-column separation strategy is used to reduce flow rates to a range of less than 10 μL/min, e.g. less than 1 μL/min, less than 0.1 μL/min, or less than 0.01 μL/min, which can be easily achieved by a multi-nozzle emitter such as the M3 emitter for NSI (see FIG. 7). In some embodiments, the split ratio is controlled by two fixed tubes of different sizes, such as two Viper tubes of different sizes, connected to a tee, such as a stainless steel tee. In some embodiments, a stainless steel tee is located downstream of the column, connecting two Viper tubes of different sizes (20 µm x 15 cm and 100 µm x 65 cm) to reduce different analytical flows (<0.8 mL/min) to microflow. range (less than µL/min) for native MS detection and divert the remaining high flow for UV detection (e.g. at 280 nm).

В некоторых типовых вариантах реализации нативный масс-спектрометр 118 может быть способен идентифицировать компоненты белка для его характеристики. Собственная система масс-спектрометрии может быть собственной системой масс-спектрометрии ESI.In some exemplary embodiments, native mass spectrometer 118 may be capable of identifying protein components for characterization. The in-house mass spectrometry system may be ESI's in-house mass spectrometry system.

В некоторых типовых вариантах реализации масс-спектрометр 118 может представлять собой гибридный масс-спектрометр с квадрупольной орбитальной ловушкой. Гибридный масс-спектрометр Quadrupole-Orbitrap может быть Q Exactive™ Focus Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ Mass Spectrometer, Q Exactive™ Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ Mass Spectrometer, Q Exactive™ BioPharma Platform, Q Exactive™ UHMR Hybrid Quadrupole-Orbitrap ™, масс-спектрометр Q Exactive™ HF Hybrid QuadrupoleOrbitrap™, масс-спектрометр Q Exactive™ HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ и масс-спектрометр Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ .In some exemplary embodiments, mass spectrometer 118 may be a hybrid quadrupole orbitrap mass spectrometer. The Quadrupole-Orbitrap Hybrid Mass Spectrometer can be Q Exactive™ Focus Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ Mass Spectrometer, Q Exactive™ Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ Mass Spectrometer, Q Exactive™ BioPharma Platform, Q Exactive™ UHMR Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ Mass -Q Exactive™ HF Hybrid QuadrupoleOrbitrap™ Spectrometer, Q Exactive™ HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ Mass Spectrometer and Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ Mass Spectrometer.

В некоторых типичных вариантах реализации система масс-спектрометрии представляет собой масс-спектрометр Thermo Exactive EMR. Система масс-спектрометрии может также содержать детектор ультрафиолетового излучения.In some exemplary embodiments, the mass spectrometry system is a Thermo Exactive EMR mass spectrometer. The mass spectrometry system may also include an ultraviolet radiation detector.

В некоторых типовых вариантах реализации масс-спектрометр 118 может представлять собой QITFTICR.In some exemplary embodiments, mass spectrometer 118 may be a QITFTICR.

В некоторых типовых вариантах реализации масс-спектрометр 118 может представлять собой QqFTICR.In some exemplary embodiments, mass spectrometer 118 may be a QqFTICR.

В некоторых типовых вариантах реализации масс-спектрометр 118 может быть тандемным массспектрометром.In some exemplary embodiments, mass spectrometer 118 may be a tandem mass spectrometer.

В некоторых типовых вариантах реализации масс-спектрометр 118 может представлять собой совмещенный во времени масс-спектрометр.In some exemplary embodiments, mass spectrometer 118 may be a time-coupled mass spectrometer.

В некоторых типовых вариантах реализации масс-спектрометр 118 может представлять собой тандемно пространственный масс-спектрометр.In some exemplary embodiments, mass spectrometer 118 may be a tandem spatial mass spectrometer.

В некоторых типовых вариантах реализации масс-спектрометр 118 может быть гибридным, в котором тандемный анализатор во времени может быть соединен в пространстве или с тандемным анализатором в пространстве.In some exemplary embodiments, mass spectrometer 118 may be a hybrid mass spectrometer, in which a tandem analyzer in time may be coupled in space or to a tandem analyzer in space.

В некоторых типовых вариантах реализации способ характеристики белка в образце может включать обнаружение или количественное определение белка в образце.In some exemplary embodiments, a method of characterizing a protein in a sample may include detecting or quantifying the protein in the sample.

В одном околом варианте белок может включать антитело, биспецифическое антитело, фрагментIn one embodiment, the protein may comprise an antibody, a bispecific antibody, a fragment

- 15 045776 антитела или мультиспецифическое антитело.- 15 045776 antibodies or multispecific antibodies.

В некоторых типовых вариантах реализации белок может представлять собой терапевтическое антитело.In some exemplary embodiments, the protein may be a therapeutic antibody.

В некоторых типовых вариантах реализации белок может представлять собой белок иммуноглобулина.In some exemplary embodiments, the protein may be an immunoglobulin protein.

В одном типичном варианте реализации иммуноглобулиновый белок может представлять собой IgG1.In one exemplary embodiment, the immunoglobulin protein may be IgG1.

В одном типичном варианте реализации белок иммуноглобулина может представлять собой IgG4.In one exemplary embodiment, the immunoglobulin protein may be IgG4.

В некоторых типовых вариантах реализации белок может представлять собой биспецифическое антитело.In some exemplary embodiments, the protein may be a bispecific antibody.

В некоторых типовых вариантах реализации белок может представлять собой фрагмент антитела, образованный при расщеплении антитела.In some exemplary embodiments, the protein may be an antibody fragment formed by cleavage of the antibody.

В одном типовом варианте реализации белок может представлять собой вариант белка.In one exemplary embodiment, the protein may be a variant protein.

В одном типовом варианте белок может быть посттрансляционно модифицированным белком.In one exemplary embodiment, the protein may be a post-translationally modified protein.

В одном типовом варианте реализации посттрансляционно модифицированный белок может быть образован расщеплением, удлинением N-конца, деградацией белка, ацилированием N-конца, биотинилированием, амидированием C-конца, окислением, гликозилированием, йодированием, ковалентное присоединение простетических групп, ацетилирование, алкилирование, метилирование, аденилирование, АДФ-рибозилирование, ковалентные поперечные связи внутри или между полипептидными цепями, сульфирование, пренилирование, модификации, зависимые от витамина С, зависимые модификации от витамина К, глутамилирование, гликирование, гликозилирование, дегликозилирование, изопренилирование, липоилирование, фосфопантетеинилирование, фосфорилирование, сульфатирование, цитруллинирование, дезамидирование, образование дисульфидных мостиков, протеолитическое расщепление, ISG-илирование, SUMO-илирование или убиквитинирование (ковалентное связывание с белком убиквитином).In one exemplary embodiment, the post-translationally modified protein may be formed by cleavage, N-terminal extension, protein degradation, N-terminal acylation, biotinylation, C-terminal amidation, oxidation, glycosylation, iodination, covalent addition of prosthetic groups, acetylation, alkylation, methylation, adenylation, ADP-ribosylation, covalent cross-links within or between polypeptide chains, sulfonation, prenylation, vitamin C-dependent modifications, vitamin K-dependent modifications, glutamylation, glycation, glycosylation, deglycosylation, isoprenylation, lipoylation, phosphopantheenylation, phosphorylation, sulfation, citrullination, deamidation, disulfide bridge formation, proteolytic cleavage, ISGylation, SUMOylation, or ubiquitination (covalent binding to the protein ubiquitin).

В одном типовом варианте реализации посттрансляционно модифицированный белок может образовываться при окислении белка.In one exemplary embodiment, the post-translationally modified protein may be generated by oxidation of the protein.

В другом типовом варианте реализации продукт деградации может включать посттрансляционную модификацию терапевтического белка.In another exemplary embodiment, the degradation product may include post-translational modification of the therapeutic protein.

В другом типовом варианте реализации белок может быть продуктом деградации белка.In another exemplary embodiment, the protein may be a protein degradation product.

В еще одном типовом варианте белок может быть примесью, присутствующей в биофармацевтическом продукте.In yet another exemplary embodiment, the protein may be an impurity present in a biopharmaceutical product.

В другом типовом варианте белок может быть примесью, обнаруженной во время производства биофармацевтического продукта.In another exemplary embodiment, the protein may be an impurity discovered during the manufacture of a biopharmaceutical product.

В некоторых типовых вариантах реализации белок может представлять собой белок с pI в диапазоне от около 4,5 до около 9,0. В одном аспекте белок может представлять собой белок с pI около 4,5, около 5,0, около 5,5, около 5,6, около 5,7, около 5,8, около 5,9, около 6,0, около 6,1, около 6,2, около 6,3, около . около 6,4, около 6,5, около 6,6, около 6,7, около 6,8, около 6,9, около 7,0, около 7,1 около 7,2, около 7,3, около 7,4, около 7,5, около 7,6, около 7,7, около 7,8, около 7,9, около 8,0, около 8,1, около 8,2, около 8,3, около 8,4, около 8,5, около 8,6, около 8,7, около 8,8, около 8,9 или около 9,0.In some exemplary embodiments, the protein may be a protein with a pI ranging from about 4.5 to about 9.0. In one aspect, the protein may be a protein with a pI of about 4.5, about 5.0, about 5.5, about 5.6, about 5.7, about 5.8, about 5.9, about 6.0, about 6.1, about 6.2, about 6.3, about . about 6.4, about 6.5, about 6.6, about 6.7, about 6.8, about 6.9, about 7.0, about 7.1 about 7.2, about 7.3, about 7.4, about 7.5, about 7.6, about 7.7, about 7.8, about 7.9, about 8.0, about 8.1, about 8.2, about 8.3, about 8.4, about 8.5, about 8.6, about 8.7, about 8.8, about 8.9 or about 9.0.

В некоторых типовых вариантах реализации белок может быть примесью, относящейся к продукту. Связанная с продуктом примесь может быть молекулярными вариантами, предшественниками, продуктами деградации, фрагментированным белком, расщепленным продуктом, агрегатами, формой посттрансляционной модификации или их комбинациями.In some exemplary embodiments, the protein may be a product-related impurity. The product-associated impurity may be molecular variants, precursors, degradation products, fragmented protein, cleaved product, aggregates, a form of post-translational modification, or combinations thereof.

В некоторых конкретных типовых вариантах реализации белок может представлять собой связанную с процессом примесь. Связанная с процессом примесь может включать примеси, полученные в процессе производства, например, нуклеиновые кислоты и белки клеток-хозяев, антибиотики, сыворотку, другие компоненты среды, ферменты, химические и биохимические реагенты для обработки, неорганические соли, растворители, носители, лиганды. и другие вымываемые вещества, используемые в производственном процессе.In some specific exemplary embodiments, the protein may be a process-related impurity. A process-related impurity may include impurities produced during the manufacturing process, for example, host cell nucleic acids and proteins, antibiotics, serum, other media components, enzymes, chemical and biochemical processing reagents, inorganic salts, solvents, carriers, ligands. and other leachables used in the manufacturing process.

В некоторых конкретных типовых вариантах реализации белок может быть примесью. В одном околом варианте количество примесей в образце может быть не менее двух.In some specific exemplary embodiments, the protein may be an impurity. In one embodiment, the number of impurities in the sample can be at least two.

Раскрытые системы и способы могут быть использованы для характеристики вариантов размера, вариантов заряда, связывания антитело-антиген, характеристики ПТМ, характеристики частично восстановленных и алкилированных mAb, характеристики димеров для совместно составленных лекарственных препаратов, характеристики обмена IgG4 Fab и характеристика гетерогенных образцов с использованием снижения заряда. Примеры посттрансляционных модификаций (PTM), которые могут быть обнаружены и идентифицированы и которые способствуют образованию кислотных вариантов, включают, помимо прочего, гликирование, глюкуронилирование, карбоксиметилирование, сиалирование, неконсенсусное гликозилирование в Fab-области. ПТМ, которые могут быть обнаружены и идентифицированы и которые способствуют основным вариантам, включают, помимо прочего, образование сукцинимида, N-концевой глутамин (не преобразованный в пироглутамат), С-концевой Lys и не-/частично-гликозилированные виды.The disclosed systems and methods can be used to characterize size variants, charge variants, antibody-antigen binding, characterization of PTMs, characterization of partially reduced and alkylated mAbs, characterization of dimers for coformulated drugs, characterization of IgG4 Fab turnover, and characterization of heterogeneous samples using charge reduction . Examples of post-translational modifications (PTMs) that can be detected and identified that contribute to the formation of acidic variants include, but are not limited to, glycation, glucuronylation, carboxymethylation, sialylation, non-consensus glycosylation in the Fab region. PTMs that can be detected and identified and that contribute to major variants include, but are not limited to, succinimide formation, N-terminal glutamine (not converted to pyroglutamate), C-terminal Lys, and non-/partially glycosylated species.

- 16 045776- 16 045776

1. Варианты размера.1. Size options.

В одном варианте реализации предложен способ характеристики вариантов размера примесей белкового лекарственного продукта, включающий разделение белковых компонентов образца белкового лекарственного продукта с помощью нативной SEC-хроматография с использованием водной подвижной фазы и анализ разделенных белковых компонентов с помощью масс-спектрометрии для характеристики высокомолекулярных видов, низкомолекулярных видов и промежуточных высокомолекулярных видов примесей белкового лекарственного продукта в образце белкового лекарственного продукта с использованием раскрытой платформы. В одном варианте реализации, подвижная фаза включает ацетат аммония и бикарбонат аммония. Использование раскрытой платформы избавляет от необходимости дегликозилирование образца белкового лекарственного препарата перед разделением и анализом.In one embodiment, a method is provided for characterizing size variants of impurities in a protein drug product, comprising separating the protein components of a sample of the protein drug product using native SEC chromatography using an aqueous mobile phase and analyzing the separated protein components using mass spectrometry to characterize high molecular weight species, low molecular weight species and intermediate high molecular weight protein drug product impurity species in a protein drug product sample using the disclosed platform. In one embodiment, the mobile phase includes ammonium acetate and ammonium bicarbonate. Use of the disclosed platform eliminates the need to deglycosylate the protein drug sample prior to separation and analysis.

В одном варианте реализации образец белкового лекарственного продукта берут или очищают из культуры клеток с подпиткой, непрерывной культуры клеток или перфузионной культуры клеток.In one embodiment, a sample of the protein drug product is taken or purified from a fed-batch cell culture, continuous cell culture, or perfusion cell culture.

Примеры белковых лекарственных продуктов включают, но не ограничиваются антителом, слитым белком, рекомбинантным белком или их комбинацией.Examples of protein drug products include, but are not limited to, an antibody, a fusion protein, a recombinant protein, or a combination thereof.

Примеры примесей низкомолекулярного белкового лекарственного препарата включают, но не ограничиваются ими, предшественники, продукты деградации, укороченные соединения, протеолитические фрагменты, включая Fab, фрагменты лиганда или рецептора или фрагменты тяжелой цепи, свободная легкая цепь, полуантитело, H2L, H2, HL, HC или их комбинация.Examples of small molecule protein drug impurities include, but are not limited to, precursors, degradation products, truncates, proteolytic fragments including Fab, ligand or receptor fragments or heavy chain fragments, free light chain, half-antibody, H2L, H2, HL, HC or their combination.

Примеры высокомолекулярных примесей включают, но не ограничиваются тримерами mAb и димерами mAb.Examples of high molecular weight impurities include, but are not limited to mAb trimers and mAb dimers.

Примеры промежуточных HMW включают, но не ограничиваются ими, мономер с дополнительными легкими цепями (виды H2L3 и H2L4), комплексы мономер плюс Fab-фрагменты, Fab2-Fab2, Fc-Fc и Fab2-Fc.Examples of HMW intermediates include, but are not limited to, monomer with additional light chains (H2L3 and H2L4 species), monomer plus Fab complexes, Fab2-Fab2, Fc-Fc, and Fab2-Fc.

2. Характеристика варианта заряда.2. Characteristics of the charge option.

В одном варианте реализации предлагается способ характеристики вариантов заряда примесей белкового лекарственного продукта, включающий стадии, необязательно, дегликозилирование образца белкового лекарственного препарата, необязательная обработка образца IdeS от Streptocoocus pyogenes, разделяя белковые компоненты образца белкового лекарственного препарата нативной сильной катионообменной хроматографией с использованием водной подвижной фазы и анализируя разделенные белковые компоненты масс-спектрометрией охарактеризовать различные виды заряда примесей белкового лекарственного препарата в образце белкового лекарственного препарата. В одном варианте реализации, подвижная фаза включает ацетат аммония и бикарбонат аммония. Использование раскрытой платформы избавляет от необходимости дегликозилирование образца белкового лекарственного препарата перед характеристикой.In one embodiment, a method is provided for characterizing charge variants of protein drug product impurities, comprising the steps of optionally deglycosylating a protein drug sample, optionally treating the sample with IdeS from Streptococcus pyogenes, separating the protein components of the protein drug sample by native strong cation exchange chromatography using an aqueous mobile phase, and By analyzing separated protein components by mass spectrometry, characterize the different charge patterns of protein drug impurities in a protein drug sample. In one embodiment, the mobile phase includes ammonium acetate and ammonium bicarbonate. Use of the disclosed platform eliminates the need to deglycosylate the protein drug sample prior to characterization.

В одном варианте реализации образец белкового лекарственного препарата берут или очищают из клеточной культуры с подпиткой, непрерывной клеточной культуры или перфузионной клеточной культуры.In one embodiment, a sample of the protein drug is taken or purified from a fed-batch cell culture, continuous cell culture, or perfusion cell culture.

Примеры вариантов заряда включают, но не ограничиваются ими, гликирование, глюкуронилирование, карбоксиметилирование, сиалирование, неконсенсусное гликозилирование в области Fab. PTM, которые могут быть обнаружены и идентифицированы, которые способствуют основным вариантам, включают, помимо прочего, образование сукцинимида, N-концевой глутамин (не преобразованный в пироглутамат), C-концевой Lys и не-/частично гликозилированные виды.Examples of charge variants include, but are not limited to, glycation, glucuronylation, carboxymethylation, sialylation, non-consensus glycosylation in the Fab region. PTMs that can be detected and identified that contribute to major variants include, but are not limited to, succinimide formation, N-terminal glutamine (not converted to pyroglutamate), C-terminal Lys, and non-/partially glycosylated species.

Также раскрыты способы производства высокочистых белковых лекарственных препаратов. Некоторые варианты реализации обеспечивают способ получения антитела, включающий этапы культивирования клеток, продуцирующих антитело, например, в периодической культуре с подпиткой, получения образца из культуры клеток, характеристики и количественного определения низкомолекулярных, высокомолекулярных и промежуточных молекулярных масс. массы примесей в образце с использованием систем и способов, раскрытых в настоящем документе, и модификации одного или нескольких условий культивирования культуры клеток для уменьшения количества охарактеризованных низкомолекулярных белковых примесей лекарственного средства, образующихся во время культивирования антитела. Как правило, условия изменяют так, чтобы содержание примесей белкового лекарственного средства находилось в диапазоне от 0,05% до 30,0%, предпочтительно от 0,05% до 15%, от 0,05% до 10%, от 0,05% до 5% или от 0,05% до 2% (вес./вес.).Methods for the production of high-purity protein drugs are also disclosed. Some embodiments provide a method for producing an antibody, including the steps of culturing cells producing the antibody, for example, in a fed-batch culture, obtaining a sample from the cell culture, characterizing and quantifying low molecular weight, high molecular weight and intermediate molecular weights. the mass of impurities in the sample using the systems and methods disclosed herein and modifying one or more cell culture culture conditions to reduce the amount of characterized low molecular weight protein drug impurities generated during antibody culture. Typically, the conditions are adjusted so that the protein drug impurity content is in the range of 0.05% to 30.0%, preferably 0.05% to 15%, 0.05% to 10%, 0.05 % to 5% or 0.05% to 2% (w/w).

Одно или несколько условий клеточной культуры, которые изменяют для уменьшения количества примесей низкомолекулярного белкового лекарственного средства, выбирают из группы, состоящей из температуры, pH, плотности клеток, концентрации аминокислот, осмоляльности, концентрации фактора роста, перемешивания, газа. парциальное давление, поверхностно-активные вещества или их комбинации.The one or more cell culture conditions that are modified to reduce the amount of small molecule protein drug impurities are selected from the group consisting of temperature, pH, cell density, amino acid concentration, osmolality, growth factor concentration, agitation, gas. partial pressure, surfactants or combinations thereof.

В некоторых вариантах реализации клетки, продуцирующие антитело, представляют собой клетки яичника китайского хомячка. В других вариантах реализации клетки представляют собой клетки гибридомы.In some embodiments, the antibody-producing cells are Chinese hamster ovary cells. In other embodiments, the cells are hybridoma cells.

В другом варианте реализации предложено антитело, полученное в соответствии со способами,Another embodiment provides an antibody prepared in accordance with methods

- 17 045776 представленными в настоящем документе, которое содержит от 1 до 5%, от 5 до 10%, от 10 до 15%, от 15 до 20% примесей белкового лекарственного средства.- 17 045776 presented herein, which contains from 1 to 5%, from 5 to 10%, from 10 to 15%, from 15 to 20% protein drug impurities.

ПримерыExamples

Следующие примеры приведены для того, чтобы предоставить специалистам в данной области техники полное раскрытие и описание того, как получать и применять способы согласно настоящему изобретению, и не предназначены для ограничения объема того, что авторы данного изобретения считают созданным ими изобретением. Были предприняты усилия для обеспечения точности в отношении используемых чисел (например, количеств, температуры и т.д.), но следует учитывать возможность некоторых погрешностей эксперимента и отклонений. Если не указано иное, части представляют собой части по массе, молекулярная масса представляет собой среднюю молекулярную массу, температура приведена в градусах Цельсия, комнатная температура составляет приблизительно 25°C, а давление равно атмосферному или близко к нему.The following examples are provided to provide those skilled in the art with a complete disclosure and description of how to make and use the methods of the present invention and are not intended to limit the scope of what the inventors believe to be their invention. Efforts have been made to ensure accuracy in terms of numbers used (e.g. quantities, temperatures, etc.), but the possibility of some experimental error and variation must be considered. Unless otherwise noted, parts are parts by weight, molecular weight is average molecular weight, temperature is in degrees Celsius, room temperature is approximately 25°C, and pressure is at or near atmospheric pressure.

Пример 1. Материалы и способы.Example 1. Materials and methods.

Подготовка образца. Исходный образец NISTmAb использовали в концентрации 10 мкг/мкл.Sample preparation. The original NISTmAb sample was used at a concentration of 10 μg/μl.

Нативный анализ SEC LC-MS. Для нативного SEC LC-MS анализа NISTmAb 10 мкг NISTmAb отделяли с использованием колонки ACQUITY UPLC Protein BEH C18 (200А, 1,7 мкм, 4,6 мм х 300 мм) (Waters, Милфорд, Массачусетс) для онлайн-анализа LC-MS на масс-спектрометр Q-Exactive UHMR. Для разделения подвижная фаза представляла собой 150 мМ ацетата аммония в воде. Подробные параметры градиента ЖХ и МС включены в табл. 1 и 2 соответственно.Native SEC LC-MS analysis. For native SEC LC-MS analysis of NISTmAb, 10 μg of NISTmAb was separated using an ACQUITY UPLC Protein BEH C18 column (200A, 1.7 μm, 4.6 mm x 300 mm) (Waters, Milford, MA) for online LC-MS analysis to the Q-Exactive UHMR mass spectrometer. For separation, the mobile phase was 150 mM ammonium acetate in water. Detailed LC and MS gradient parameters are included in Table. 1 and 2 respectively.

Таблица 1Table 1

Градиент ЖХ для нативного анализа SEC LC-MSLC Gradient for Native SEC LC-MS Analysis

Мобильная фаза Mobile phase 150 мМ ацетат аммония в воде 150 mM ammonium acetate in water Колонка Column Waters ACQUITY UPLC Protein ВЕН 200 A, 1,7 мкм, колонка 4,6 мм х 300 мм Waters ACQUITY UPLC Protein VEN 200 A, 1.7 µm, 4.6 mm x column 300 mm Температура колонки Column temperature 25 °C 25 °C Градиент Gradient Время (мин) Time (min) Поток (мл/мин) Flow (ml/min) 0,0 0.0 0,200 0.200 23,0 23.0 0,200 0.200

Таблица 2table 2

Параметры МС для нативного анализа SEC LC-MSMS parameters for native SEC LC-MS analysis

Параметры МС MS parameters Контрольный эксперимент Control experiment Модифицированный метод десольватации газом Modified method gas desolvation Напряжение источника [кВ] Source voltage [kV] 3,0 3.0 3,0 3.0 Капиллярная температура [°C] Capillary temperature [°C] 320 320 320 320 S-линза RF уровень S-lens RF level 200 200 200 200 Защитный газ [л/мин] Shielding gas [l/min] 2,0 2.0 2,0 2.0 Диапазон сканирования [м/з] Scan range [m/z] 2000-15000 2000-15000 2000-15000 2000-15000

Нативный анализ SCX LC-MS. Для анализа NISTmAb с помощью нативной SCX LC-MS 10 мкг NISTmAb отделяли с использованием YMC BioPro IEX SF 4,6x100 мм (YMC, Япония) для онлайнанализа LC-MS на масс-спектрометре Q-Exactive UHMR. Для разделения подвижная фаза А представляла собой 20 мМ ацетата аммония в воде при рН 5,6, подвижная фаза В представляла собой 150 мМ ацетата аммония в воде. Подробные условия градиента ЖХ включены в табл. 3, а параметры МС такие же, как и в нативном анализе SEC-MS.Native SCX LC-MS analysis. For NISTmAb analysis by native SCX LC-MS, 10 μg of NISTmAb was separated using a YMC BioPro IEX SF 4.6x100 mm (YMC, Japan) for online LC-MS analysis on a Q-Exactive UHMR mass spectrometer. For separation, mobile phase A was 20 mM ammonium acetate in water at pH 5.6, mobile phase B was 150 mM ammonium acetate in water. Detailed LC gradient conditions are included in Table. 3, and the MS parameters are the same as in the native SEC-MS analysis.

- 18 045776- 18 045776

Таблица 3Table 3

Градиент ЖХ для нативного анализа SCX ЖХ-МСLC Gradient for Native SCX LC-MS Analysis

Мобильная фаза Mobile phase А: 20 мМ ацетата аммония в воде, pH 5,6; В: 150 мМ ацетата аммония в воде, pH 7,4 A: 20 mM ammonium acetate in water, pH 5.6; B: 150 mM ammonium acetate in water, pH 7.4 Колонка Column YMC BioPro IEX SF 4,6x100 мм, 5 мкм YMC BioPro IEX SF 4.6x100 mm, 5 µm Температура колонки Column temperature 45 °C 45°C Градиент Gradient Время (мин) Time (min) %А %A %в %V 0 0 100 100 0 0 2 2 100 100 0 0 18 18 0 0 100 100 22 22 0 0 100 100 23 23 100 100 0 0 30 thirty 100 100 0 0

Модификация газа десольватации. Поток защитного газа был направлен в баллон Duran с бутылкой (SCHOTT North America, Inc., Элмсфорд, Нью-Йорк) через Canary-Safe Cap (Analytical Sales and Services, Inc., Фландер, Нью-Джерси) с использованием 1/ 8-дюймовая трубка из ТЕФЛОНА (см. фиг. 1). Выходящая из бутылки трубка была затем напрямую подключена к излучателю Newomics M3 в ионном источнике Thermo Scientific Ion Max. Для нативного интактного анализа МС во флакон переносили 200 мл изопропанола (IPA).Modification of desolvation gas. A flow of shielding gas was directed into a Duran bottle and bottle (SCHOTT North America, Inc., Elmsford, New York) through a Canary-Safe Cap (Analytical Sales and Services, Inc., Flanders, New Jersey) using 1/8- inch TEFLON tube (see Fig. 1). The tube coming out of the bottle was then directly connected to the Newomics M3 emitter in the Thermo Scientific Ion Max ion source. For native intact MS analysis, 200 ml of isopropanol (IPA) was transferred into the vial.

Пример 2. Чувствительность и надежность платформы нативной SEC-MS.Case Study 2: Sensitivity and Reliability of the Native SEC-MS Platform.

Используя способы и материалы, описанные в примере 1, чувствительность раскрытой платформы была продемонстрирована путем проведения анализа NISTmAb методом SEC-MS. Нативный анализ SEC-MS выполняли на 10 мкг NISTmAb. Как показано На фиг. 3, введение 10 мкг образца NISTmAb привело к интенсивности TIC ~E9, что демонстрирует низкое потребление количества образца с раскрытой платформой. Превосходное качество данных благодаря эффективной десольватации с помощью газа для десольватации, модифицированного IPA, также наблюдалось с раскрытой платформой. Чувствительное обнаружение видов с низкой численностью (например, видов HMW и LMW) было продемонстрировано без необходимости дегликозилирования. Точные измерения массы позволили однозначно идентифицировать эти виды. Кроме того, на фиг. 4A и 4B показана устойчивость платформы, продемонстрированная 101 последовательным запуском нативной SEC-MS NISTmAb, и относительное количество было почти одинаковым между первым и 101-м запусками.Using the methods and materials described in Example 1, the sensitivity of the disclosed platform was demonstrated by performing SEC-MS analysis of the NISTmAb. Native SEC-MS analysis was performed on 10 μg of NISTmAb. As shown in FIG. 3, administration of 10 μg of NISTmAb sample resulted in a TIC intensity of ~E9, demonstrating low sample quantity consumption with the platform exposed. Superior data quality due to efficient desolvation with IPA-modified desolvation gas was also observed with the exposed platform. Sensitive detection of low abundance species (e.g., HMW and LMW species) was demonstrated without the need for deglycosylation. Accurate mass measurements allowed these species to be unambiguously identified. In addition, in FIG. 4A and 4B show the platform robustness demonstrated by 101 consecutive runs of native SEC-MS NISTmAb, and the relative abundance was almost the same between the first and 101st runs.

Пример 3. Эффективная модификация газа десольватации для снижения заряда.Example 3: Efficient modification of desolvation gas to reduce charge.

Были проведены исследования для определения влияния модификации газа десольватации во время анализа нативной SCX-MS. Как показано На фиг. 5A и 5B, небольшое падение интенсивности TIC было связано с уменьшением заряда, когда газ для десольватации был модифицирован IPA, ACN или ACN/NH3. Как показано На фиг. 6, снижение заряда помогает анализу гетерогенных и/или лабильных биомолекул. На верхней панели фиг. 6 показан нативный анализ SEC-MS имитатора цистеина ADC с уменьшением заряда, тогда как на нижней панели - без восстановления. Снижение заряда предотвращает перекрытие зарядовых состояний благодаря улучшенному пространственному разрешению, что позволяет анализировать образцы с высокой неоднородностью по массе. Снижение заряда предотвращает перекрытие состояний заряда благодаря улучшенному пространственному разрешению, что позволяет анализировать образцы с высокой неоднородностью массы. Кроме того, снижение заряда помогло сохранить лабильные биомолекулы (не связанные ковалентно) во время процесса ионизации и свести к минимуму нежелательные события диссоциации.Studies were conducted to determine the effect of desolvation gas modification during native SCX-MS analysis. As shown in FIG. 5A and 5B, a small drop in TIC intensity was associated with a decrease in charge when the desolvation gas was modified with IPA, ACN, or ACN/NH3. As shown in FIG. 6, Charge reduction aids the analysis of heterogeneous and/or labile biomolecules. On the top panel of Fig. Figure 6 shows native SEC-MS analysis of the cysteine mimic ADC with charge reduction, while the bottom panel shows no reduction. Charge reduction prevents overlap of charge states due to improved spatial resolution, allowing analysis of samples with high mass heterogeneity. Charge reduction prevents charge state overlap due to improved spatial resolution, allowing analysis of samples with high mass heterogeneity. Additionally, charge reduction helped preserve labile biomolecules (not covalently bound) during the ionization process and minimize unwanted dissociation events.

Пример 4. Универсальная, чувствительная и надежная платформа нативной ЖХ-МС для анализа массы интактного белка.Example 4: A versatile, sensitive and reliable native LC-MS platform for intact protein mass analysis.

Дополнительные примеры универсальной, чувствительной и надежной собственной платформы ЖХ-МС в соответствии с раскрытыми здесь вариантами реализации представлены ниже.Additional examples of a versatile, sensitive, and robust proprietary LC-MS platform in accordance with the embodiments disclosed herein are provided below.

За последние несколько лет переносы методов нативной (неденатурирующей) жидкостной хроматографии (nLC), таких как эксклюзионная хроматография (SEC), ионообменная хроматография (IEX) и хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC), с масс-спектрометрией (MS) вызвал большой интерес к изучению размера, заряда и структурной неоднородности белковых лекарственных препаратов. Несмотря на наличие большого разнообразия методов nLC-MS, интегрированная платформа, которая может работать с различными приложениями, по-прежнему отсутствует. В этом примере описывается разработка новой платформы nLC-MS, которая может легко включать различные приложения nLC-MS и отличается большой универсальностью, чувствительностью и надежностью. В частности, разработанная платформа может выдерживать широкий диапазон скоростей потока ЖХ иOver the past few years, the transfer of native (non-denaturing) liquid chromatography (nLC) techniques such as size exclusion chromatography (SEC), ion exchange chromatography (IEX) and hydrophobic interaction chromatography (HIC) to mass spectrometry (MS) has generated great interest in the study of size , charge and structural heterogeneity of protein drugs. Despite the availability of a wide variety of nLC-MS methods, an integrated platform that can handle various applications is still missing. This case study describes the development of a new nLC-MS platform that can easily accommodate a variety of nLC-MS applications and is highly versatile, sensitive, and robust. In particular, the developed platform can accommodate a wide range of LC flow rates and

- 19 045776 высоких концентраций солей, что является ключом к достигнутой универсальности при использовании различных методов nLC. Кроме того, с помощью этой платформы можно было бы легко применять десольватационный газ, модифицированный легирующей примесью, для достижения собственного МС со снижением заряда, чтобы улучшить характеристику как гетерогенных, так и лабильных биомолекул. Наконец, продемонстрировано, что эта платформа nLC-MS обладает высокой чувствительностью и надежностью и может регулярно применяться для характеристики белковых препаратов.- 19 045776 high salt concentrations, which is the key to the achieved versatility when using different nLC methods. Additionally, using this platform, dopant-modified desolvation gas could be easily applied to achieve intrinsic charge-reducing MS to improve the characterization of both heterogeneous and labile biomolecules. Finally, this nLC-MS platform is demonstrated to be highly sensitive and robust and can be routinely used for the characterization of protein drugs.

Материалы. Деионизированная вода обеспечивалась встроенной системой очистки воды MilliQ, установленной с фильтром MilliPak Express 20 (Millipore Sigma, Burlington, MA). Эталонный материал моноклональных антител NIST 8671 (NIST-mAb, гуманизированное моноклональное антитело IgG1K) был приобретен в Национальном институте стандартов и технологий (Гейтерсберг, Мэриленд). Ацетат аммония (грейд ЖХ/МС) и миметик конъюгата антитела и лекарственного средства SigmaMAb (ADC) были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури). Пептид N-гликозидаза F (PNGase F) была приобретена у New England Biolabs Inc (Ипсвич, Массачусетс). Буфер Invitrogen UltraPure 1 M Tris-HCl, pH 7,5, был получен от Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). Ацетонитрил (ACN) (марка Optima LC/MS) был приобретен у Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA), гидроксид аммония (NH3) (30%) был приобретен у JTBaker (Center Valley, PA). 2-пропанол (IPA) (чистота для ВЭЖХ) был приобретен у Honeywell (Маскегон, Мичиган). Все остальные моноклональные антитела, включая подклассы IgG1 и IgG4, были произведены в Regeneron (Тарритаун, Нью-Йорк).Materials. Deionized water was provided by an integrated MilliQ water purification system installed with a MilliPak Express 20 filter (Millipore Sigma, Burlington, MA). NIST monoclonal antibody reference material 8671 (NIST-mAb, humanized monoclonal antibody IgG1K) was purchased from the National Institute of Standards and Technology (Gaithersburg, MD). Ammonium acetate (LC/MS grade) and SigmaMAb antibody-drug conjugate mimetic (ADC) were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Peptide N-glycosidase F (PNGase F) was purchased from New England Biolabs Inc (Ipswich, MA). Invitrogen UltraPure 1 M Tris-HCl buffer, pH 7.5, was obtained from Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). Acetonitrile (ACN) (Optima LC/MS grade) was purchased from Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA), ammonium hydroxide (NH3) (30%) was purchased from JTBaker (Center Valley, PA). 2-propanol (IPA) (HPLC grade) was purchased from Honeywell (Muskegon, MI). All other monoclonal antibodies, including IgG1 and IgG4 subclasses, were produced by Regeneron (Tarrytown, NY).

Подготовка образца. Образец смеси mAb был приготовлен путем смешивания четырех моноклональных антител собственного производства в конечных концентрациях 5 мг/мл для каждого mAb. Одну аликвоту смеси обрабатывали PNGase F (1 миллиединица IUB на 10 мкг белка) в 100 мМ Tris-HCl (pH 7,5) при 45°C в течение 1 ч перед анализом nSEC-MS. Другая аликвота была непосредственно подвергнута анализу nIEX-MS без обработки образца. Все другие образцы mAb, в том числе имитатор SigmaMAb ADC, были разбавлены водой до концентрации 2-5 мг/мл перед вводом для анализа nLC-MS.Sample preparation. A sample mAb mixture was prepared by mixing four in-house monoclonal antibodies at final concentrations of 5 mg/mL for each mAb. One aliquot of the mixture was treated with PNGase F (1 milliunit IUB per 10 μg protein) in 100 mM Tris-HCl (pH 7.5) at 45°C for 1 h before nSEC-MS analysis. Another aliquot was directly subjected to nIEX-MS analysis without sample processing. All other mAb samples, including the SigmaMAb ADC mimic, were diluted in water to a concentration of 2–5 mg/mL prior to injection for nLC-MS analysis.

Способ nLC-MS. Все разделения ЖХ выполняли на системе УВЭЖХ UltiMate 3000 (Thermo Fisher Scientific, Бремен, Германия). Для анализа nSEC-MS использовали колонку Acquity BEH200 SEC (4,6x300 мм, 1,7 мкм, 200 A) (Waters, Milford, MA) при комнатной температуре с изократическим элюированием 150 мМ ацетата аммония при 0,2 мл/мин. Для анализа nIEX-MS использовали колонку BioPro IEX SF (4,6 мм x 100 мм, 5 мкм) (YMC Co., LTD., Киото, Япония) при 45°C с линейным градиентом от 20 мМ ацетата аммония (pH 5,6, доведено уксусной кислотой) до 150 мМ ацетата аммония (pH 6,8) за 16 мин при скорости 0,4 мл/мин. Для обессоливающего анализа SEC-MS использовали защитную колонку Acquity BEH200 SEC (4,6x30 мм, 1,7 мкм, 200 A) (Waters, Milford, MA) при комнатной температуре с изократическим элюированием 150 мМ ацетата аммония с следующие скорости потока: 0,1 мл/мин, 0,2 мл/мин, 0,4 мл/мин, 0,6 мл/мин или 0,8 мл/мин. Чтобы обеспечить обнаружение нативного МС в режиме онлайн, после колонки был применен тройник из нержавеющей стали, соединяющий две трубки Viper с разными размерами (20 мкм x 15 см и 100 мкм x 65 см) (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс), чтобы уменьшить различные аналитические потоки (<0,8 мл/мин) до диапазона микропотоков (менее мкл/мин) для нативного детектирования МС и перенаправить оставшийся высокий поток на УФ-детектирование (280 нм). Масс-спектрометр Thermo Q Exactive UHMR или Exactive Plus EMR, оснащенный источником ионов Nanospray Flex™ (Thermo Fisher Scientific, Бремен, Германия), использовали для нативного МС анализа. Для достижения наноэлектрораспыления (NSI) с микропотоком был применен эмиттер Newomics Microfabricated Monolithic Multi-Nozzle (M3) (Berkley, CA). Для достижения естественного МС со снижением заряда используется газ десольватации, модифицированный легирующей примесью (2 л/мин, азот), что достигается путем пропускания потока газа через свободное пространство над давлением DURAN плюс бутылка (1 л) (SCHOTT, Северная Америка, Inc., Элмсфорд, штат Нью-Йорк), содержащий 200 мл различных модификаторов (например, IPA, ACN или 5% аммиака в ACN), был применен для помощи NSI (фиг. 7). Все эксперименты в этом примере были выполнены с анализом нативной МС с ИПС, если не указано иное. Разрешение МС было установлено на 12500 (UHMR) или 17500 (ЭМИ), напряжение капиллярного распыления было установлено на 3,0 кВ, температура капилляра была установлена на 350°C, уровень RF S-линзы был установлен на 200, энергия фрагментации в источнике была установлена на уровне 100 (или 50 для анализа имитации ADC), давление газа-ловушки HCD было установлено на уровне 3. Масс-спектры были получены с окном диапазона m/z от 2000 до 15000.nLC-MS method. All LC separations were performed on an UltiMate 3000 UHPLC system (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany). For nSEC-MS analysis, an Acquity BEH200 SEC column (4.6 x 300 mm, 1.7 μm, 200 A) (Waters, Milford, MA) was used at room temperature with isocratic elution with 150 mM ammonium acetate at 0.2 mL/min. For nIEX-MS analysis, a BioPro IEX SF column (4.6 mm x 100 mm, 5 μm) (YMC Co., LTD., Kyoto, Japan) was used at 45°C with a linear gradient from 20 mM ammonium acetate (pH 5, 6, adjusted with acetic acid) to 150 mM ammonium acetate (pH 6.8) in 16 min at a rate of 0.4 ml/min. For desalting SEC-MS analysis, an Acquity BEH200 SEC guard column (4.6 x 30 mm, 1.7 μm, 200 A) (Waters, Milford, MA) was used at room temperature with isocratic elution of 150 mM ammonium acetate at the following flow rates: 0. 1 ml/min, 0.2 ml/min, 0.4 ml/min, 0.6 ml/min or 0.8 ml/min. To enable online detection of native MS, a stainless steel tee connecting two different sized Viper tubes (20 µm x 15 cm and 100 µm x 65 cm) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) was used downstream of the column to reduce various analytical flows (<0.8 mL/min) to the microflow range (less than µL/min) for native MS detection and redirect the remaining high flow to UV detection (280 nm). A Thermo Q Exactive UHMR or Exactive Plus EMR mass spectrometer equipped with a Nanospray Flex™ ion source (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany) was used for native MS analysis. To achieve nanoelectrospray (NSI) microflow, a Newomics Microfabricated Monolithic Multi-Nozzle (M3) emitter (Berkley, CA) was used. To achieve natural MS with charge reduction, a dopant-modified desolvation gas (2 L/min, nitrogen) is used, which is achieved by passing the gas stream through the headspace of DURAN plus a bottle (1 L) (SCHOTT, North America, Inc., Elmsford, NY) containing 200 ml of various modifiers (eg, IPA, ACN, or 5% ammonia in ACN) was applied to aid NSI (Fig. 7). All experiments in this example were performed with native IPA MS analysis unless otherwise noted. MS resolution was set to 12500 (UHMR) or 17500 (EMR), capillary spray voltage was set to 3.0 kV, capillary temperature was set to 350 °C, S-lens RF level was set to 200, source fragmentation energy was set at 100 (or 50 for simulated ADC analysis), HCD trap gas pressure was set at 3. Mass spectra were acquired with an m/z range window of 2000 to 15000.

Интегрированная платформа nLC-MS. Для характеристики белковых препаратов с помощью nLCMS использовались колонки аналитической шкалы (внутренний диаметр 2,1 мм или 4,6 мм), поскольку они имеют много преимуществ. Во-первых, по сравнению с форматом капиллярных колонок, доступен гораздо более широкий выбор колонок с аналитическим масштабом, что облегчает разработку методов, особенно для таких сложных молекул. Кроме того, колонки аналитической шкалы преобладают по надежности и пропускной способности и широко используются с оптическим детектированием в анализах контроля качества (КК). Выполняя анализ нЖХ-МС на идентичной аналитической колонке,Integrated nLC-MS platform. Analytical scale columns (2.1 mm or 4.6 mm i.d.) were used to characterize protein drugs using nLCMS because they have many advantages. First, compared to the capillary column format, a much wider selection of analytical scale columns are available, making method development easier, especially for such complex molecules. In addition, analytical scale columns excel in reliability and throughput and are widely used with optical detection in quality control (QC) analyses. By performing nLC-MS analysis on an identical analytical column,

- 20 045776 хотя и с другими условиями подвижной фазы, все же с большей вероятностью можно получить результаты, сопоставимые с анализами контроля качества, по сравнению с использованием капиллярной колонки. Чтобы справиться с широким диапазоном скоростей потока (0,1-0,8 мл/мин), используемым при разделении аналитической шкалы, была применена стратегия разделения после колонки для снижения скорости потока до диапазона (<10 мкл/мин), который может быть легко размещается многосопловым эмиттером (M3) для NSI (фиг. 7). Коэффициент разделения в основном контролировался двумя фиксированными трубками Viper разных размеров, соединенными с тройником из нержавеющей стали (фиг. 7), и оставался неизменным для всех тестируемых методов НЖХ в этом исследовании. Следует отметить, что конструкция эмиттера M3 с несколькими соплами имеет отношение к успешному выполнению NSI при субмикрорасходах, поскольку она еще больше снижает расход за счет разделения субмикропотока на восемь сопел перед NSI. Между тем, применение NSI не только снижает жесткость исходных условий для мягкой ионизации, но и значительно повышает чувствительность МС, а также устойчивость к высоким концентрациям солей, что является ключевым фактором для адаптации к широкому спектру различные методы НЖХ (например, SEC, IEX и HIC). Более того, в отличие от большинства других установок NSI, этот подход на основе эмиттера M3 позволяет подавать газ десольватации к эмиттеру распыления через встроенную линию газа десольватации (фиг. 7), что полезно для достижения улучшенного распыления. стабильность и эффективность десольватации. Кроме того, это дало возможность еще больше расширить универсальность платформы за счет модификации газа десольватации. Например, путем простого легирования газа десольватации летучими органическими модификаторами с возможностью снижения заряда (фиг. 7) можно легко добиться снижения заряда в реальном времени для естественного МС-анализа. Поскольку эта платформа была построена со всеми легкодоступными частями без какой-либо настройки, ее можно легко обслуживать для обеспечения стабильной производительности. В следующих параграфах были проведены обширные оценки, чтобы продемонстрировать универсальность, чувствительность и надежность этой платформы nLC-MS.- 20 045776 although with different mobile phase conditions, results comparable to quality control analyzes are still more likely to be obtained compared to using a capillary column. To cope with the wide range of flow rates (0.1-0.8 mL/min) used in analytical scale separations, a post-column separation strategy was applied to reduce the flow rate to a range (<10 μL/min) that can be easily is placed by a multi-nozzle emitter (M3) for NSI (Fig. 7). The separation coefficient was primarily controlled by two fixed Viper tubes of different sizes connected to a stainless steel tee (Figure 7) and remained constant for all NLC methods tested in this study. It should be noted that the multi-nozzle design of the M3 emitter is relevant to the successful performance of NSI at sub-microflows as it further reduces the flow by dividing the sub-microflow into eight nozzles before NSI. Meanwhile, the application of NSI not only reduces the harshness of the initial conditions for soft ionization, but also significantly improves the sensitivity of MS as well as the tolerance to high salt concentrations, which is a key factor for adapting to a wide range of different NLC methods (e.g. SEC, IEX and HIC ). Moreover, unlike most other NSI setups, this M3 emitter-based approach allows desolvation gas to be supplied to the atomization emitter through an integrated desolvation gas line (Figure 7), which is useful for achieving improved atomization. stability and efficiency of desolvation. In addition, this provided the opportunity to further expand the versatility of the platform through modification of the desolvation gas. For example, by simply doping the desolvation gas with charge-reducing volatile organic modifiers (Figure 7), real-time charge reduction can be easily achieved for native MS analysis. Since this platform was built with all parts easily accessible without any customization, it can be easily maintained to ensure consistent performance. In the following paragraphs, extensive evaluations have been performed to demonstrate the versatility, sensitivity, and robustness of this nLC-MS platform.

Универсальность платформы для интеграции nLC. Когда для анализа nLC-MS используются разные методы НЖХ (например, SEC, IEX и HIC), концентрации летучих солей, используемых в подвижных фазах, и/или скорости потока ЖХ часто необходимо оптимизировать для достижения наилучших хроматографических характеристик. Следовательно, желательно, чтобы разработанная платформа nLCMS могла работать с широким диапазоном скоростей потока и концентраций соли для различных приложений nLC-MS. Чтобы оценить устойчивость этой платформы nLC-MS к различным скоростям потока и концентрациям соли, было проведено два теста путем проведения нативного МС-анализа образца mAb1 после этапа быстрого оперативного обессоливания с использованием защитной колонки Waters BEH200 SEC (4,6 мм х 30 мм). Во-первых, с использованием 150 мМ ацетата аммония в качестве подвижной фазы и количества вводимого раствора 10 мкг, были протестированы пять различных скоростей потока в диапазоне от 0,1 до 0,8 мл/мин. Без изменения настроек разделения или параметров источника МС все ионные хроматограммы (TIC), полученные при пяти скоростях потока, продемонстрировали хорошую интенсивность сигнала, стабильность распыления, а также высокое сходство с соответствующими УФ-профилями (фиг. 8A). В частности, относительные интенсивности пиков УФ и TIC обычно коррелируют друг с другом при различных скоростях потока, указывая на то, что чувствительность NSI-MS при более высоких скоростях потока не снижается из-за менее достаточной десольватации. Кроме того, все усредненные необработанные спектры МС, полученные при этих пяти условиях, демонстрировали высокосимметричные пики m/z и отличное отношение сигнал/шум (фиг. 12A и 12B), что указывает на достаточную десольватацию даже при самой высокой испытанной скорости потока (0,8 мл/мин). Эти наблюдения показывают, что эта разработанная платформа nLC-MS может хорошо выдерживать скорость потока ЖХ от 0,1 до 0,8 мл/мин, что должно быть достаточным для большинства приложений nLC-MS. Кроме того, стоит отметить, что успех работы с высокими скоростями потока на короткой колонке SEC для быстрого и эффективного обессоливания на этой платформе дал большие надежды в собственных приложениях для высокопроизводительного скрининга на основе MS. В качестве подтверждения концепции 2 мкл образцов mAb2 в трех различных концентрациях (0,05, 0,5 и 5 мкг/мкл) вводили повторно по 30 раз каждую и анализировали со скоростью 0,8 мл/мин. TIC был представлен на фиг. 8B. Из-за применяемой высокой скорости потока рабочий цикл между инъекциями составлял всего 42 с, что соответствует пропускной способности ~ 2050 образцов в день. Хотя достигнутая пропускная способность не так высока по сравнению с некоторыми платформами МС на основе прямой инфузии, этот подход, основанный на SEC-MS, преобладает при минимальной обработке образцов, что не только экономит время лабораторных исследований, но также снижает риски Артефакты, вызванные подготовкой. Кроме того, анализ 30 повторов продемонстрировал как превосходную чувствительность МС, так и повторяемость, о чем свидетельствуют низкие значения коэффициента вариации (CV 17%, 5% и 4% для количества инъекции 0,1, 1 и 10 мкг, соответственно). Более высокий CV для анализов инъекций 0,1 мкг, вероятно, был связан с постепенным снижением концентрации исходного белка (0,05 мкг/мкл) в результате потери образца, вызванной адсорбцией иглой при повторных инъекциях.Platform versatility for nLC integration. When different NLC methods (e.g., SEC, IEX, and HIC) are used for nLC-MS analysis, the concentrations of volatile salts used in the mobile phases and/or LC flow rates often need to be optimized to achieve the best chromatographic performance. Therefore, it is desirable that the developed nLCMS platform can handle a wide range of flow rates and salt concentrations for various nLC-MS applications. To evaluate the robustness of this nLC-MS platform to different flow rates and salt concentrations, two tests were performed by performing native MS analysis on the mAb1 sample after a rapid on-line desalting step using a Waters BEH200 SEC guard column (4.6 mm x 30 mm). First, using 150 mM ammonium acetate as the mobile phase and an injection amount of 10 μg, five different flow rates ranging from 0.1 to 0.8 mL/min were tested. Without changing separation settings or MS source parameters, all ion chromatograms (TICs) obtained at five flow rates demonstrated good signal intensity, spray stability, and high similarity to the corresponding UV profiles (Figure 8A). In particular, the relative intensities of UV and TIC peaks generally correlate with each other at different flow rates, indicating that NSI-MS sensitivity at higher flow rates is not reduced by less sufficient desolvation. Additionally, all averaged raw MS spectra obtained under these five conditions exhibited highly symmetric m/z peaks and excellent signal-to-noise ratio (Figures 12A and 12B), indicating sufficient desolvation even at the highest flow rate tested (0. 8 ml/min). These observations indicate that this developed nLC-MS platform can well handle LC flow rates of 0.1 to 0.8 mL/min, which should be sufficient for most nLC-MS applications. Additionally, it is worth noting that the success of operating high flow rates on a short SEC column for fast and efficient desalting on this platform has shown great promise in native MS-based high-throughput screening applications. As a proof of concept, 2 μL of mAb2 samples at three different concentrations (0.05, 0.5, and 5 μg/μL) were injected 30 times each and analyzed at a rate of 0.8 mL/min. The TIC was presented in FIG. 8B. Due to the high flow rate used, the duty cycle between injections was only 42 s, corresponding to a throughput of ~2050 samples per day. Although the throughput achieved is not as high compared to some direct infusion based MS platforms, this SEC-MS based approach prevails with minimal sample processing, which not only saves laboratory time but also reduces the risks of preparation-induced artifacts. In addition, analysis of 30 replicates demonstrated both excellent MS sensitivity and repeatability, as evidenced by low coefficient of variation values (CVs of 17%, 5%, and 4% for injection amounts of 0.1, 1, and 10 μg, respectively). The higher CV for the 0.1 μg injection assays was likely due to a gradual decrease in the starting protein concentration (0.05 μg/μL) resulting from sample loss caused by needle adsorption with repeated injections.

Во втором тесте, поддерживая скорость потока на уровне 0,4 мл/мин и изменяя концентрацииIn the second test, maintaining the flow rate at 0.4 ml/min and varying the concentrations

- 21 045776 ацетата аммония в подвижной фазе, устойчивость платформы к концентрациям соли также оценивалась с использованием того же метода обессоливания SEC-MS. Из практических соображений концентрации ацетата аммония в диапазоне от 150 мМ до 600 мМ были изучены на предмет влияния как на чувствительность МС, так и на качество спектра. Как показано На фиг. 9A, высокая интенсивность МС постоянно достигалась при трехкратном анализе mAb1 при каждой концентрации соли (150, 300, 450 и 600 мМ). Хотя наблюдалось заметное снижение интенсивности МС наряду с увеличением концентрации соли, предположительно из-за менее эффективной ионизации при более высоких концентрациях соли, общий сигнал МС по-прежнему считался достаточным для большинства применений нЖХ-МС. Кроме того, тщательное изучение нативного МС-спектра mAb1, полученного при концентрации соли 600 мМ, продемонстрировало превосходное качество спектра с высокосимметричными пиками m/z и хорошим соотношением сигнал/шум (фиг. 9B). Различные гликоформы, возникающие в результате макро- и микрогетерогенности N-гликозилирования Fc, могут быть хорошо разделены и надежно отнесены к массе с хорошей точностью. Наконец, следует отметить, что оцененный диапазон концентраций ацетата аммония (150-600 мМ) достаточен для использования в большинстве приложений nLC-MS , таких как nIEX-MS и nSEC-MS, большинство из которых были разработаны и зарегистрированы с использованием подвижных фаз, содержащих 20-200 мМ солей на основе аммония. Чтобы обеспечить анализ nHIC-MS с использованием концентраций соли в пределах тестируемого диапазона, можно применить стратегию подпитки и разделения потока, недавно представленную нашей группой. Вкратце, вводя поток разбавителя (воды) после колонки, подвижные фазы HIC (до 3 М ацетата аммония) можно разбавить в шесть раз (до 500 мМ) до обнаружения нативной МС. Применяя эту стратегию, на этой платформе был проведен анализ nHIC-MS нескольких образцов mAb, и были последовательно получены высококачественные данные (фиг. 13A и B). Таким образом, разработанная платформа nLC-MS может универсально применяться для поддержки большинства приложений nLC-MS.- 21 045776 ammonium acetate in the mobile phase, the stability of the platform to salt concentrations was also assessed using the same SEC-MS desalting method. For practical reasons, ammonium acetate concentrations ranging from 150 mM to 600 mM were studied for effects on both MS sensitivity and spectral quality. As shown in FIG. 9A, high MS intensity was consistently achieved when mAb1 was assayed in triplicate at each salt concentration (150, 300, 450, and 600 mM). Although there was a noticeable decrease in MS intensity along with increasing salt concentration, presumably due to less efficient ionization at higher salt concentrations, the overall MS signal was still considered sufficient for most nLC-MS applications. In addition, careful examination of the native MS spectrum of mAb1 obtained at 600 mM salt concentration demonstrated excellent spectral quality with highly symmetrical m/z peaks and good signal-to-noise ratio (Figure 9B). The different glycoforms resulting from macro- and microheterogeneity of Fc N-glycosylation can be well separated and reliably assigned to mass with good accuracy. Finally, it should be noted that the estimated concentration range of ammonium acetate (150-600 mM) is sufficient for use in most nLC-MS applications, such as nIEX-MS and nSEC-MS, most of which were developed and reported using mobile phases containing 20-200 mM ammonium-based salts. To enable nHIC-MS analysis using salt concentrations within the test range, the makeup and flow splitting strategy recently introduced by our group can be applied. Briefly, by introducing a stream of diluent (water) after the column, HIC mobile phases (up to 3 M ammonium acetate) can be diluted sixfold (up to 500 mM) before native MS detection. Using this strategy, nHIC-MS analysis of multiple mAb samples was performed on this platform and consistently high-quality data were obtained (Figure 13A and B). Thus, the developed nLC-MS platform can be universally applied to support most nLC-MS applications.

Универсальность платформы для онлайн-снижения затрат. Нативный МС-анализ. Снижение заряда это стратегия, часто используемая для облегчения нативного МС-анализа лабильных белковых комплексов или сильно гетерогенных образцов белков. Благодаря уменьшению заряда нековалентные взаимодействия, присутствующие в белковых комплексах, могут быть лучше сохранены во время анализа нативной МС благодаря уменьшению кулоновского отталкивания. Кроме того, за счет смещения огибающей состояния заряда в сторону более высоких значений m/z можно значительно улучшить пространственное разрешение между соседними состояниями заряда и, следовательно, уменьшить сложность спектра. Наиболее распространенный подход к включению естественного МС со снижением заряда заключается в добавлении реагентов, снижающих заряд, таких как имидазол или триэтиламин (TEA), в общий раствор аналита перед ESI. Используя эту платформу, разработанную для nLC-MS, можно легко достичь естественного МС со снижением заряда в режиме онлайн путем легирования газа десольватации различными органическими модификаторами. Чтобы оценить эффект снижения заряда трех различных модификаторов (IPA, ACN и 5% (об./об.) аммиака в ACN), смесь четырех различных mAb с pI в диапазоне от 6,8 до 8,5 была проанализирована обеими nSEC-MS и nIEX-MS анализы с десольватационным газом, модифицированным допантом. Затем было рассчитано среднее состояние заряда каждого mAb при каждом условии снижения заряда и проведено сравнение с таковым из контрольных экспериментов, которые проводились с использованием немодифицированного азота в качестве десольватационного газа (фиг. 10A-10C). Исследование показало, что, независимо от аналитов mAb (например, разный pI), условий растворения для NSI (например, разные pH и концентрация соли от градиента IEX) или методов nLC (например, SEC против IEX) наблюдался последовательный порядок снижения заряда: ACN/NH3 (5% аммиака в ACN) приводил к наибольшему снижению заряда (~9,5 зарядов), за которым следовали ACN (~ 8 зарядов) и IPA. (~5 зарядов).Platform versatility for online cost reduction. Native MS analysis. Charge reduction is a strategy often used to facilitate native MS analysis of labile protein complexes or highly heterogeneous protein samples. By reducing charge, noncovalent interactions present in protein complexes can be better preserved during native MS analysis due to reduced Coulomb repulsion. In addition, by shifting the charge state envelope toward higher m/z values, the spatial resolution between adjacent charge states can be significantly improved and hence spectral complexity can be reduced. The most common approach to incorporating native charge-reducing MS is to add charge-reducing reagents such as imidazole or triethylamine (TEA) to the bulk analyte solution prior to ESI. Using this platform designed for nLC-MS, native on-line charge-reduction MS can be easily achieved by doping the desolvation gas with various organic modifiers. To evaluate the charge-reducing effect of three different modifiers (IPA, ACN, and 5% (v/v) ammonia in ACN), a mixture of four different mAbs with pI ranging from 6.8 to 8.5 was analyzed by both nSEC-MS and nIEX-MS analyzes with dopant-modified desolvation gas. The average charge state of each mAb under each charge reduction condition was then calculated and compared with that of control experiments that were performed using unmodified nitrogen as the desolvation gas (Figures 10A-10C). The study found that, regardless of mAb analytes (e.g., different pI), dissolution conditions for NSI (e.g., different pH and salt concentration from IEX gradient), or nLC methods (e.g., SEC vs. IEX), a consistent order of charge reduction was observed: ACN/ NH3 (5% ammonia in ACN) resulted in the largest charge reduction (~9.5 charges), followed by ACN (~8 charges) and IPA. (~5 charges).

Снижение заряда также привело к соответствующему снижению общей интенсивности МС (фиг. 10A-C), что, вероятно, было связано с менее эффективной передачей и обнаружением ионов с большим значением m/z с помощью прибора Orbitrap. Тем не менее, даже в условиях наибольшего снижения заряда, достигаемых с помощью газа десольватации, модифицированного ACN/NH3, общая интенсивность МС при анализе 5 мкг образцов mAb все еще может достигать уровня E8 с высококачественными спектрами МС (фиг. 14A-C). Стоит отметить, что, в отличие от TEA, который трудно удалить после введения в инструменты для МС, снижение заряда с помощью этого подхода считается полностью безопасным. Интересно, что было обнаружено, что модификация газа десольватации с помощью IPA или ACN также может повысить эффективность десольватации во время NSI, тем самым сводя к минимуму образование аддуктов, которые имеют тенденцию образовываться в течение продолжительного анализа, что приводит к улучшению качества спектра (фиг. 15) и более длительному анализу. срок спрей стабильность. Поэтому самый мягкий модификатор снижения заряда, IPA, применялся по умолчанию для всех приложений nLC-MS на этой платформе.The reduction in charge also resulted in a corresponding decrease in overall MS intensity (Figure 10A-C), which was likely due to less efficient transmission and detection of higher m/z ions by the Orbitrap instrument. However, even under the highest charge-reducing conditions achieved with ACN/NH3-modified desolvation gas, overall MS intensity when analyzing 5 μg mAb samples could still reach E8 levels with high-quality MS spectra (Figure 14A-C). It is worth noting that, unlike TEA, which is difficult to remove once introduced into MS instruments, charge reduction using this approach is considered completely safe. Interestingly, it has been found that modification of the desolvation gas with IPA or ACN can also improve desolvation efficiency during NSI, thereby minimizing the formation of adducts that tend to form during long-term analysis, resulting in improved spectral quality (Fig. 15) and longer analysis. term spray stability. Therefore, the mildest charge reduction modifier, IPA, was applied by default for all nLC-MS applications on this platform.

Способность добиваться снижения заряда нативного МС в режиме онлайн ценна для анализа лабильных и/или гетерогенных белковых препаратов. Например, Cys-связанные конъюгаты антителолекарственное средство (ADC) часто создают проблемы для анализа интактного белка из-за их нестабильности в газовой фазе из-за отсутствия межцепочечных дисульфидных связей, а также из-заThe ability to achieve on-line charge reduction of native MS is valuable for the analysis of labile and/or heterogeneous protein drugs. For example, Cys-linked antibody-drug conjugates (ADCs) often pose problems for intact protein analysis due to their instability in the gas phase due to the lack of interchain disulfide bonds, as well as

- 22 045776 высокой неоднородности массы, возникающей из-за различного количества полезных нагрузок. Используя имитатор SigmaMab ADC в качестве модельной системы, были оценены преимущества применения онлайн-снижения заряда для нативного MS-анализа Cys-связанных ADC (фиг. 6 и 11). Этот имитатор ADC состоит из смеси видов, нагруженных лекарственным средством, с 0-4 парами полезных нагрузок (~668 Да), конъюгированных в межцепочечной дисульфидной связи с остатками Cys из mAb IgG1. Без удаления N-гликозилирования Fc из молекулы анализы nSEC-MS проводили с онлайнснижением заряда и без него. Было показано, что при анализе без снижения заряда диссоциация нековалентного комплекса ADC легко наблюдалась даже при приложении минимальной энергии в источнике (SID=50 эВ), что приводило к образованию высокозаряженных частиц легкой цепи (LC). и вид H2L с полосой заряда (фиг. 6). Напротив, когда применялось снижение заряда с помощью ACN/NH3, такие события диссоциации резко уменьшались даже при более высокой энергии источника (SID=100 эВ, оптимизировано для эффективной десольватации) (фиг. 6). Путем расчета относительной интенсивности MS LC по сравнению с интактным ADC было оценено, что эта склонность к диссоциации снижается с 8,3% до 0,4% при снижении заряда. Эта повышенная стабильность комплекса ADC в газовой фазе, вероятно, связана с уменьшением кулоновского отталкивания при более низких состояниях заряда, а также с уменьшением внутренней энергии ионов за счет испарительного охлаждения (с помощью реагентов, снижающих заряд). Более того, из-за повышенной неоднородности массы, вызванной разным количеством полезных нагрузок, без снижения заряда оболочки состояния заряда разных видов DAR (соотношение лекарство-антитело) перекрываются в определенных областях m/z. Например, состояния заряда +30, +29 и +28 у видов DAR8 проявлялись в тех же m/z областях, что и состояния заряда +29, +28 и +27 у видов DAR0 соответственно (фиг. 6). Такое перекрытие m/z могло создать трудности для спектральной деконволюции, и в этом случае виды DAR0 не были обнаружены после деконволюции (фиг. 11, нижняя панель). Напротив, при уменьшении заряда с помощью ACN/NH3 вся огибающая состояния заряда была смещена в области с более высокими m/z, где пространственное разрешение между соседними состояниями заряда было значительно улучшено. В результате не наблюдалось перекрытия между состояниями заряда от разных видов DAR (например, z=+20 от DAR8 и z=+19 от DAR0) (фиг. 6), что способствовало уверенной спектральной деконволюции (фиг. 11, верхняя панель). Для Cys-связанных АЦП, чтобы точно измерить средний DAR и охарактеризовать распределение полезной нагрузки, важно свести к минимуму нежелательную диссоциацию цепи и спектральное перекрытие. Цепная диссоциация в газовой фазе, вероятно, приведет к недооценке среднего DAR из-за предпочтительной диссоциации видов с высоким DAR. Спектральное перекрытие приведет к неоднозначности или даже потере информации во время деконволюции. В этом примере, несмотря на то, что средние значения DAR, полученные при двух условиях, были сопоставимы (DAR=4,3 по методу снижения заряда по сравнению с DAR=4,2 по методу контроля), распределения полезной нагрузки были разными. Без снижения заряда виды DAR0 не наблюдались после деконволюции, тогда как относительное обилие видов с высоким DAR было занижено из-за их преимущественной диссоциации. Эти две причины повлияли на расчет среднего DAR в противоположных направлениях и привели к сопоставимому среднему DAR. Однако только в условиях снижения заряда были точно охарактеризованы как средний DAR, так и распределение полезной нагрузки этого имитатора Cys-ADC.- 22 045776 high mass heterogeneity resulting from different numbers of payloads. Using the SigmaMab ADC simulator as a model system, the benefits of using online charge reduction for native MS analysis of Cys-linked ADCs were evaluated (Figures 6 and 11). This ADC mimic consists of a mixture of drug-loaded species with 0-4 payload pairs (~668 Da) conjugated in an interchain disulfide bond to Cys residues from the IgG1 mAb. Without removing Fc N-glycosylation from the molecule, nSEC-MS analyzes were performed with and without online charge reduction. It was shown that when analyzed without charge reduction, dissociation of the non-covalent ADC complex was readily observed even when applying minimal source energy (SID=50 eV), resulting in the formation of highly charged light chain (LC) species. and a view of H2L with a charge stripe (Fig. 6). In contrast, when charge reduction with ACN/NH3 was applied, such dissociation events were dramatically reduced even at higher source energy (SID=100 eV, optimized for efficient desolvation) (Figure 6). By calculating the relative intensity of MS LC compared to intact ADC, it was estimated that this dissociation propensity decreases from 8.3% to 0.4% as charge decreases. This increased stability of the ADC complex in the gas phase is likely due to a decrease in Coulomb repulsion at lower charge states, as well as a decrease in the internal energy of the ions due to evaporative cooling (via charge-reducing reagents). Moreover, due to the increased mass heterogeneity caused by different payload numbers, without reducing the shell charge, the charge states of different DAR species (drug-antibody ratio) overlap in certain m/z regions. For example, charge states +30, +29, and +28 in DAR8 species appeared in the same m/z regions as charge states +29, +28, and +27 in DAR0 species, respectively (Fig. 6). This m/z overlap could create difficulties for spectral deconvolution, in which case DAR0 species were not detected after deconvolution (Fig. 11, bottom panel). In contrast, upon charge reduction with ACN/NH3, the entire charge state envelope was shifted to higher m/z regions where the spatial resolution between adjacent charge states was significantly improved. As a result, no overlap was observed between charge states from different DAR species (e.g., z=+20 from DAR8 and z=+19 from DAR0) (Figure 6), facilitating robust spectral deconvolution (Figure 11, top panel). For Cys-coupled ADCs, to accurately measure average DAR and characterize payload distribution, it is important to minimize unwanted chain dissociation and spectral overlap. Chain dissociation in the gas phase is likely to lead to an underestimation of the average DAR due to preferential dissociation of high DAR species. Spectral overlap will lead to ambiguity or even loss of information during deconvolution. In this example, although the average DAR values obtained from the two conditions were comparable (DAR=4.3 for the charge reduction method versus DAR=4.2 for the control method), the payload distributions were different. Without charge reduction, DAR0 species were not observed after deconvolution, whereas the relative abundance of high DAR species was underestimated due to their preferential dissociation. These two reasons influenced the calculation of the average DAR in opposite directions and resulted in a comparable average DAR. However, only under charge-reducing conditions were both the average DAR and payload distribution of this Cys-ADC simulator accurately characterized.

Чувствительность платформы и динамический диапазон. Углубленная характеристика гетерогенности белковых препаратов требует от аналитических методов как высокой чувствительности, так и большого динамического диапазона. Первый позволяет получить характеристику с минимальным потреблением образцов, а второй позволяет идентифицировать эти малочисленные варианты. Для оценки чувствительности и динамического диапазона разработанной платформы nLC-MS в качестве образца для тестирования использовался эталонный стандарт NISTmAb, который подвергался анализу как nSEC-MS, так и nIEX-MS. Без какой-либо обработки образца 10 мкг NISTmAb вводили в колонку Waters BEH200 SEC (4,6 мм х 300 мм) с последующим анализом нативной МС с помощью IPA. TIC из анализа nSEC-MS выявил два пика высокой молекулярной массы (HMW) и два пика низкой молекулярной массы (LMW), которые были отделены или частично отделены от основного пика (фиг. 3). Основной пик, обнаруженный при общей интенсивности ионов ~1E9, был приписан мономеру NISTmAb. Пик 1 ВМ и Пик 2 ВМ, присутствующие в количестве ~0,1% и ~1,3% соответственно, на основе количественного определения на основе УФ, оба были отнесены к димерным формам NISTmAb, которые предположительно были разделены с помощью SEC из-за их различных конформаций. Примечательно, что даже при таких низких уровнях для этих двух димерных видов были получены высококачественные данные МС, демонстрирующие массовые пики с разрешением гликоформы после деконволюции (фиг. 3, вставки). Кроме того, два пика LMW также продемонстрировали отличное качество спектра и были однозначно идентифицированы как два комплементарных фрагмента, возникших в результате серии событий отсечения, происходящих в верхней шарнирной области (фиг. 3, вставки). Затем был проведен анализ 10 мкг необработанного NISTmAb методом nIEX-MS с использованием известного метода сильного катионного обмена в этой платформе nLC-MS. Множественные виды с вариантами заряда, присутствующие на очень разных уровнях, включая одни и те же усеченные фрагменты mAb, были уверенно идентифицированы на основе высококачественных данных МС (фиг. 16-1 и 16-2). Наконец,Platform sensitivity and dynamic range. In-depth characterization of the heterogeneity of protein drugs requires analytical methods to have both high sensitivity and a large dynamic range. The first allows for characterization with minimal sample consumption, and the second allows for the identification of these low-abundance variants. To evaluate the sensitivity and dynamic range of the developed nLC-MS platform, the NISTmAb reference standard was used as a testing sample and subjected to both nSEC-MS and nIEX-MS analysis. Without any sample treatment, 10 μg of NISTmAb was injected onto a Waters BEH200 SEC column (4.6 mm x 300 mm) followed by native MS analysis using IPA. TIC from nSEC-MS analysis revealed two high molecular weight (HMW) peaks and two low molecular weight (LMW) peaks that were separated or partially separated from the main peak (Figure 3). The main peak detected at a total ion intensity of ~1E9 was attributed to the NISTmAb monomer. Peak 1 BM and Peak 2 BM, present at ~0.1% and ~1.3%, respectively, based on UV-based quantitation, were both assigned to dimeric forms of NISTmAb, which were presumably separated by SEC due to their different conformations. Remarkably, even at these low levels, high-quality MS data were obtained for these two dimeric species, showing glycoform-resolved mass peaks after deconvolution (Figure 3, insets). In addition, two LMW peaks also showed excellent spectral quality and were clearly identified as two complementary fragments resulting from a series of clipping events occurring in the upper hinge region (Figure 3, insets). 10 μg of raw NISTmAb was then analyzed by nIEX-MS using the well-known strong cation exchange method in this nLC-MS platform. Multiple charge variant species present at very different levels, including the same truncated mAb fragments, were confidently identified based on high quality MS data (Figures 16-1 and 16-2). Finally,

--

Claims

варианты размера и заряда в NISTmAb, идентифицированные этими двумя методами nLC-MS, были суммированы На фиг. 18, а их относительное содержание количественно определено соответствующими УФ-пиками. Поскольку второстепенные виды могут быть легко обнаружены на уровнях до ~0,02%, динамический диапазон около в четыре порядка может быть достигнут путем применения методов nSEC-MS и nIEX-MS на этой разработанной платформе nLC-MS с количеством ввода 10 мкг NISTmAb. Наконец, поскольку 0,02% второстепенных видов из инъекции 10 мкг представляют собой абсолютное количество 2 нг на колонке, эта платформа также считается высокочувствительной и может быть полезной для приложений биоанализа на основе МС.The size and charge variants in NISTmAb identified by these two nLC-MS methods were summarized in FIG. 18, and their relative abundances were quantified by the corresponding UV peaks. Since minor species can be readily detected at levels up to ∼0.02%, a dynamic range of about four orders of magnitude can be achieved by applying nSEC-MS and nIEX-MS methods on this developed nLC-MS platform with an input amount of 10 μg of NISTmAb. Finally, since 0.02% of minor species from a 10 μg injection represents an absolute amount of 2 ng on column, this platform is also considered highly sensitive and may be useful for MS-based bioanalysis applications.

Надежность платформы. Надежность - еще одно важное соображение при разработке аналитических методов для рутинных применений в промышленных лабораториях. В частности, методы nLC-MS непрерывно вводят водные растворы солей в источник ионов МС, что приводит к трудностям в поддержании стабильности распыления и интенсивности сигнала в течение продолжительного времени анализа. Чтобы оценить, можно ли использовать разработанную платформу nLC-MS для непрерывного анализа и можно ли поддерживать стабильность спрея и чувствительность метода в течение длительного периода времени, как nSEC-MS, так и nIEX-MS анализ молекул mAb неоднократно выполняли в течение 24 ч, производя более 50 запусков каждый. Как показано На фиг. 17, хорошая интенсивность и стабильность сигнала были достигнуты в течение 24 ч со значениями CV 6,0% и 4,1% для анализов nSEC-MS и nIEX-MS соответственно. Высокая надежность, достигнутая этой платформой nLC-MS, вероятно, связана как с применением эмиттера с несколькими соплами, так и с нативной МС с помощью IPA. Первый не только уменьшает размер капель, вводимых в NSI, но также снижает риск засорения изза осаждения и накопления белка. Нативный МС с ИПС дополнительно повышает эффективность десольватации, вероятно, за счет снижения поверхностного натяжения капель.Platform reliability. Reliability is another important consideration when developing analytical methods for routine applications in industrial laboratories. In particular, nLC-MS methods continuously inject aqueous salt solutions into the MS ion source, leading to difficulties in maintaining spray stability and signal intensity over extended analysis times. To evaluate whether the developed nLC-MS platform can be used for continuous analysis and whether spray stability and method sensitivity can be maintained over a long period of time, both nSEC-MS and nIEX-MS analysis of mAb molecules were repeatedly performed over 24 h, producing more than 50 starts each. As shown in FIG. 17, good signal intensity and stability were achieved within 24 h with CV values of 6.0% and 4.1% for nSEC-MS and nIEX-MS analyses, respectively. The high reliability achieved by this nLC-MS platform is likely due to both the use of a multi-nozzle emitter and native MS by IPA. The former not only reduces the size of the droplets introduced into the NSI, but also reduces the risk of clogging due to sedimentation and protein accumulation. Native IPA MS further enhances desolvation efficiency, likely by reducing the surface tension of the droplets.

ЗаключениеConclusion

Разработка платформы nLC-MS, подходящей для промышленных лабораторных приложений, представляет большой интерес для биофармацевтического сообщества в связи с растущим интересом и спросом на применение различных методов nLC-MS для характеристики белковых препаратов. В этом примере раскрывается разработка новой платформы nLC-MS, которая может быть легко интегрирована с различными методами nLC и отличается большой универсальностью, чувствительностью и надежностью. Благодаря инновационным конструкциям было продемонстрировано, что разработанная платформа может работать в широком диапазоне скоростей потока ЖХ (от 0,1 до 0,8 мл/мин) и выдерживать высокие концентрации солей (до 600 мМ в подвижной фазе), что в совокупности способствовало достижению универсальности. в размещении различных методов НЖК. Затем были исследованы различные десольватационные газы, модифицированные легирующей примесью, для достижения нативной МС со снижением заряда в режиме онлайн на этой платформе. Впоследствии тематическое исследование Cys-связанного миметика ADC продемонстрировало пригодность и преимущества применения нативного MS со снижением заряда для характеристики лабильных и/или гетерогенных белковых молекул. Кроме того, с помощью анализа nSEC-MS и nIEX-MS с использованием этой платформы была достигнута глубокая характеристика гетерогенности размера и заряда NISTmAb, которая продемонстрировала большой динамический диапазон и высокую чувствительность. Кроме того, эта платформа nLC-MS также оказалась очень надежной и, таким образом, пригодной для непрерывного анализа в течение длительного времени (> 24 ч). Наконец, настоящая платформа была построена со всеми коммерчески доступными деталями и, следовательно, может быть легко внедрена другими лабораториями для стабильной работы.The development of an nLC-MS platform suitable for industrial laboratory applications is of great interest to the biopharmaceutical community due to the growing interest and demand for the application of various nLC-MS methods for the characterization of protein drugs. This case study reveals the development of a new nLC-MS platform that can be easily integrated with a variety of nLC techniques and offers great versatility, sensitivity, and robustness. Through innovative designs, it was demonstrated that the developed platform could operate over a wide range of LC flow rates (from 0.1 to 0.8 ml/min) and withstand high salt concentrations (up to 600 mM in the mobile phase), which together contributed to the achievement of versatility . in the placement of various NLC methods. Various dopant-modified desolvation gases were then explored to achieve native on-line charge-reduction MS on this platform. Subsequently, a case study of a Cys-linked ADC mimetic demonstrated the utility and benefits of using native charge-reducing MS for the characterization of labile and/or heterogeneous protein molecules. Additionally, in-depth characterization of NISTmAb size and charge heterogeneity was achieved through nSEC-MS and nIEX-MS analysis using this platform, demonstrating large dynamic range and high sensitivity. In addition, this nLC-MS platform also proved to be very robust and thus suitable for continuous analysis over long periods of time (>24 h). Finally, the present platform was built with all commercially available parts and hence can be easily implemented by other laboratories for stable operation.

В целом, как показано здесь для анализа образцов моноклональных антител в различных тематических исследованиях, разработанный подход обеспечивает более эффективный способ по сравнению с традиционным подходом, чтобы лучше удовлетворять постоянно растущие потребности в характеристике моноклональных антител на различных этапах разработки лекарств.Overall, as demonstrated here for the analysis of monoclonal antibody samples in various case studies, the developed approach provides a more efficient way than the traditional approach to better meet the ever-increasing needs for monoclonal antibody characterization at various stages of drug development.

Данное изобретение не предполагает ограничение объема конкретными вариантами реализации, описанными в данном документе. Действительно, различные модификации данного изобретения в дополнение к описанным в настоящем документе будут выявлены специалистами в данной области техники из предшествующего описания и прилагаемых фигур. Предполагается, что указанные модификации включены в объем прилагаемой формулы изобретения.The present invention is not intended to be limited in scope to the specific embodiments described herein. Indeed, various modifications of the present invention in addition to those described herein will be apparent to those skilled in the art from the foregoing description and the accompanying drawings. These modifications are intended to be included within the scope of the appended claims.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM

1. Система жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии, включающая систему жидкостной хроматографии, способную разделять образец в неденатурирующих условиях; а также систему масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (ESI-MS), сообщающуюся по текучей среде с системой жидкостной хроматографии, при этом система ESI-MS включает эмиттер ионизации электрораспылением с несколькими соплами, систему модификации десольватационного газа и масс-спектрометр, причем масс-спектрометр сконфигурирован для приема ионов и определения отноше- 24 045776 ния массы к заряду ионов, причем система нативной жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии содержит (i) контейнер с крышкой, при этом крышка имеет порт впускной линии и порт выпускной линии; (ii) впускную линию защитного газа для подачи защитный газ к порту впускной линии; и (iii) модифицированную выпускную линию газа десольватации, способную соединять порт выпускной линии модифицированного газа десольватации с эмиттером ионизации электрораспылением с несколькими соплами.1. A liquid chromatography-mass spectrometry system, including a liquid chromatography system capable of separating a sample under non-denaturing conditions; and an electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) system in fluid communication with a liquid chromatography system, the ESI-MS system comprising a multi-nozzle electrospray ionization emitter, a desolvation gas modification system, and a mass spectrometer, the mass the spectrometer is configured to receive ions and determine the mass-to-charge ratio of the ions, the native liquid chromatography-mass spectrometry system comprising (i) a container with a lid, the lid having an inlet line port and an outlet line port; (ii) a shielding gas inlet line for supplying shielding gas to the inlet line port; and (iii) a modified desolvation gas outlet line capable of connecting a port of the modified desolvation gas outlet line to a multi-nozzle electrospray ionization emitter.

2. Система жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии по п.1, отличающаяся тем, что контейнер содержит органический растворитель и дополнительный химический компонент.2. The liquid chromatography-mass spectrometry system according to claim 1, characterized in that the container contains an organic solvent and an additional chemical component.

3. Система жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии по п.2, отличающаяся тем, что дополнительный химический компонент представляет собой кислоту.3. The liquid chromatography-mass spectrometry system according to claim 2, characterized in that the additional chemical component is an acid.

4. Система жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии по п.3, отличающаяся тем, что кислота представляет собой трифторуксусную кислоту.4. The liquid chromatography-mass spectrometry system according to claim 3, characterized in that the acid is trifluoroacetic acid.

5. Система жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии по п.2, отличающаяся тем, что дополнительный химический компонент представляет собой основание.5. The liquid chromatography-mass spectrometry system according to claim 2, characterized in that the additional chemical component is a base.

6. Система жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии по п.5, отличающаяся тем, что основа ние представляет собой триэтиламин.6. Liquid chromatography-mass spectrometry system according to claim 5, characterized in that the base is triethylamine.

7. Система жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии по любому из пп.2-6, отличающаяся тем, что органическим растворителем является ацетонитрил.7. Liquid chromatography-mass spectrometry system according to any one of claims 2-6, characterized in that the organic solvent is acetonitrile.

8. Система жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии по любому из пп.1-7, отличающаяся тем, что защитный газ представляет собой азот.8. Liquid chromatography-mass spectrometry system according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the protective gas is nitrogen.

9. Система жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии по любому из пп.1-8, отличающаяся тем, что линия впуска защитного газа частично вставлена в порт впускной линии.9. The liquid chromatography-mass spectrometry system according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the shielding gas inlet line is partially inserted into the inlet line port.

10. Система жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии по любому из пп.1-9, отличающаяся тем, что выпускная линия модифицированного газа десольватации частично вставлена в отверстие выпу скной линии.10. The liquid chromatography-mass spectrometry system according to any one of claims 1 to 9, characterized in that the modified desolvation gas outlet line is partially inserted into the outlet line opening.

11. Система жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии по любому из пп.1-10, отличающаяся тем, что защитный газ поступает из впускной линии защитного газа через контейнер, содержащий органический растворитель, в выпускную линию газа десольватации.11. The liquid chromatography-mass spectrometry system according to any one of claims 1 to 10, characterized in that the protective gas flows from the protective gas inlet line through a container containing an organic solvent into the desolvation gas outlet line.

12. Система жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии по любому из пп.1-11, отличающаяся тем, что эмиттер ионизации электрораспылением с несколькими соплами включает восемь сопел.12. The liquid chromatography-mass spectrometry system according to any one of claims 1 to 11, wherein the multi-nozzle electrospray ionization emitter includes eight nozzles.

13. Система жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии по любому из пп.1-12, отличающаяся тем, что система жидкостной хроматографии содержит колонку для эксклюзионной хроматографии (ЭХ).13. The liquid chromatography-mass spectrometry system according to any one of claims 1 to 12, characterized in that the liquid chromatography system contains a size exclusion chromatography (SEC) column.

14. Система жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии по любому из пп.1-12, отличающаяся тем, что система жидкостной хроматографии содержит ионообменной хроматографии (IEX) столбец.14. The liquid chromatography-mass spectrometry system according to any one of claims 1 to 12, characterized in that the liquid chromatography system contains an ion exchange chromatography (IEX) column.

15. Система жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии по любому из пп.1-14, отличающаяся тем, что система жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии дополнительно содержит аналитический делитель потока для регулирования скорости потока от жидкостного хроматографа к массспектрометру.15. The liquid chromatography-mass spectrometry system according to any one of claims 1 to 14, characterized in that the liquid chromatography-mass spectrometry system further comprises an analytical flow divider for controlling the flow rate from the liquid chromatograph to the mass spectrometer.

16. Система жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии по п.15, отличающаяся тем, что аналитический делитель потока способен обеспечить электрораспыление со скоростью потока растворителя около от 1 до 5 мкл/мин.16. The liquid chromatography-mass spectrometry system of claim 15, wherein the analytical flow splitter is capable of electrospraying at a solvent flow rate of about 1 to 5 μL/min.

17. Система жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии по любому из пп.1-16, отличающаяся тем, что масс-спектрометр содержит масс-анализатор с орбитальной ловушкой.17. Liquid chromatography-mass spectrometry system according to any one of claims 1 to 16, characterized in that the mass spectrometer contains a mass analyzer with an orbitrap.

18. Способ характеристики белка в образце, включающий подачу образца в систему жидкостной хроматографии, обеспечивающую разделение образца в неденатурирующих условиях; а также анализ образца с использованием системы масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (ESI-MS), сообщающейся по текучей среде с системой жидкостной хроматографии, при этом система ESI-MS содержит эмиттер ионизации электрораспылением с несколькими соплами, систему для модификации десольватирующего газа и масс-спектрометр, причем система для модификации газа десольватации содержит (i) контейнер с крышкой, при этом крышка имеет порт впускной линии и порт выпускной линии; (ii) впускную линию защитного газа для обеспечения защитного газа к порту впускной линии; и (iii) модифицированную выпускную линию газа десольватации, способную соединять порт выпускной линии модифицированного газа десольватации с эмиттером ионизации электрораспылением с несколькими соплами.18. A method for characterizing a protein in a sample, comprising submitting the sample to a liquid chromatography system that ensures separation of the sample under non-denaturing conditions; and sample analysis using an electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) system in fluid communication with a liquid chromatography system, the ESI-MS system comprising a multi-nozzle electrospray ionization emitter, a desolvation gas modification system, and a mass a spectrometer, the desolvation gas modification system comprising (i) a container with a lid, the lid having an inlet line port and an outlet line port; (ii) a shield gas inlet line for providing shield gas to the inlet line port; and (iii) a modified desolvation gas outlet line capable of connecting a port of the modified desolvation gas outlet line to a multi-nozzle electrospray ionization emitter.

19. Способ по п.18, отличающийся тем, что белок представляет собой антитело, гибридный белок, рекомбинантный белок или их комбинацию.19. The method of claim 18, wherein the protein is an antibody, a fusion protein, a recombinant protein, or a combination thereof.

20. Способ по п.19, отличающийся тем, что антитело представляет собой моноклональное антитело.20. The method according to claim 19, characterized in that the antibody is a monoclonal antibody.

21. Способ по п.20, отличающийся тем, что моноклональное антитело изотипа IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или смешанного изотипа.21. The method according to claim 20, characterized in that the monoclonal antibody is of the IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 or mixed isotype.

22. Способ по любому из пп.18-21, отличающийся тем, что способ не требует дегликозилирования белка в образце перед подачей образца в систему жидкостной хроматографии.22. The method according to any one of claims 18-21, characterized in that the method does not require deglycosylation of the protein in the sample before submitting the sample to the liquid chromatography system.

--