EA045585B1 - METHOD FOR OBTAINING IMMUNOGLOBULIN PREPARATION FROM PLASMA WITH LOW CONTENT OF C-1 INHIBITOR - Google Patents

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявкиCross reference to related applications

Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США № 63/002791, поданной 31 марта 2020 г., которая включена в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте.This application claims benefit from U.S. Provisional Patent Application No. 63/002791, filed March 31, 2020, which is incorporated herein by reference in its entirety.

Уровень техникиState of the art

Полученные из плазмы препараты крови применяют для лечения не только различных заболеваний крови, но также заболеваний другого происхождения. Например, продукты иммунного глобулина (IgG) из плазмы человека впервые применили в 1952 г. для лечения иммунодефицита. С того времени препараты IgG нашли широкое применение по меньшей мере в трех основных категориях медицинских состояний:Blood products obtained from plasma are used to treat not only various blood diseases, but also diseases of other origins. For example, immune globulin (IgG) products from human plasma were first used in 1952 to treat immunodeficiency. Since that time, IgG drugs have found widespread use in at least three major categories of medical conditions:

(1) иммунодефициты, такие как агаммаглобулинемия, сцепленная с Х-хромосомой, гипогаммаглобулинемия (первичные иммунодефициты), и приобретенные состояния, связанные со сниженным иммунитетом (вторичные иммунодефициты), включая низкий уровень антител;(1) immunodeficiencies such as X-linked agammaglobulinemia, hypogammaglobulinemia (primary immunodeficiencies), and acquired conditions associated with reduced immunity (secondary immunodeficiencies), including low antibody levels;

(2) воспалительные и аутоиммунные заболевания; и (3) острые инфекции.(2) inflammatory and autoimmune diseases; and (3) acute infections.

В то время как лечение IVIG может быть очень эффективным для управления первичными иммунодефицитными состояниями, данная терапия является только временным замещением антител, которые не вырабатываются в организме, а не лечением заболевания. Соответственно пациентам, зависимым от терапии IVIG, необходимы повторные дозы, обычно около одного раза в месяц в течение жизни. Данная потребность предъявляет значительные требования к непрерывному производству композиций IVIG. Тем не менее, в отличие от других биопрепаратов, которые получают посредством экспрессии in vitro рекомбинантных векторов ДНК, IVIG получают из донорской крови и плазмы человека. Таким образом, количество продуктов IVIG нельзя увеличить, просто увеличивая объем производства. Скорее уровень имеющихся в продаже IVIG ограничен имеющимся запасом донорской крови и плазмы.While IVIG treatment can be very effective in managing primary immunodeficiency conditions, this therapy is only a temporary replacement for antibodies that the body does not produce and is not a treatment for the disease. Accordingly, patients dependent on IVIG therapy require repeated doses, usually about once a month for life. This need places significant demands on the continuous production of IVIG compositions. However, unlike other biologics that are produced through in vitro expression of recombinant DNA vectors, IVIG is derived from human blood and plasma donations. Thus, the number of IVIG products cannot be increased simply by increasing production volume. Rather, the level of commercially available IVIG is limited by the available supply of donor blood and plasma.

Ряд способов получения IVIG применяется коммерческими поставщиками продуктов IVIG. Одна из распространенных проблем, связанных с существующими способами производства IVIG, заключается в существенной потере IgG в ходе процесса очистки, которая по оценкам составляет по меньшей мере от 30 до 35% общего содержания IgG в сырье. Одной из задач является поддержание качества инактивации вирусов и отсутствие примесей, которые могут вызывать побочные реакции, при одновременном повышении выхода IgG.A number of methods for obtaining IVIG are used by commercial suppliers of IVIG products. One of the common problems associated with existing IVIG production processes is the significant loss of IgG during the purification process, which is estimated to be at least 30 to 35% of the total IgG content of the raw material. One of the challenges is to maintain the quality of virus inactivation and the absence of contaminants that may cause adverse reactions, while increasing IgG yield.

При нынешнем уровне производства IVIG то, что может считаться небольшим увеличением выхода, на самом деле является очень значительным. Например, при уровнях производства 2007 г. повышение эффективности на 2%, равное дополнительным 56 мг на литр, будет образовывать 1,5 дополнительные метрические тонны IVIG.At the current level of IVIG production, what may be considered a small increase in yield is actually very significant. For example, at 2007 production levels, a 2% increase in efficiency equal to an additional 56 mg per liter would generate 1.5 additional metric tons of IVIG.

При производстве и разработке биологических препаратов на основе плазмы необходимо принимать во внимание различные меры предосторожности. Они включают способы удаления и/или инактивации переносимых с кровью патогенов (например, вирусных и бактериальных патогенов), антикомплементарной активности и других нежелательных загрязняющих примесей, возникающих вследствие применения донорской плазмы. Исследования показали, что введение высоких уровней амидолитической активности может привести к нежелательным тромбоэмболическим осложнениям (Wolberg A.S. et al., Coagulation factor XI is a contaminant in intravenous immunoglobulin preparations, Am. J. Hematol., 2000, 65:30-34; Alving BM et al., Contact-activated factors: contaminants of immunoglobulins preparations with coagulant and vasoactive properties, J. Lab. Clin. Med., 1980, 96:334-346, раскрытия которых включены в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей).Various precautions must be taken into account during the production and development of plasma-derived biologics. These include methods for removing and/or inactivating blood-borne pathogens (eg, viral and bacterial pathogens), anticomplementary activity, and other unwanted contaminants resulting from the use of donated plasma. Studies have shown that administration of high levels of amidolytic activity can lead to unwanted thromboembolic complications (Wolberg A.S. et al., Coagulation factor XI is a contaminant in intravenous immunoglobulin preparations, Am. J. Hematol., 2000, 65:30-34; Alving BM et al., Contact-activated factors: contaminants of immunoglobulins preparations with coagulant and vasoactive properties, J. Lab. Clin. Med., 1980, 96:334-346, the disclosures of which are incorporated herein by reference in their entirety to the public goals).

Об этой озабоченности свидетельствует недавний добровольный отзыв Octagam® (Octapharma) в США и прекращение разрешения на медицинское применение препарата Octagam® и Octagam 10% Европейской комиссией после растущего числа сообщений о случаях тромбоэмболии. Вполне вероятно, что увеличение явлений тромбоза было вызвано высоким уровнем амидолитической активности в биологическом препарате, вызванным примесями сериновой протеазы и зимогена сериновой протеазы, таких как фактор XI, фактор XIa, фактор XII и фактор XIIa (Заметка FDA: добровольный отзыв с рынка 23 сентября 2010 г. Octagam [иммунный глобулин для внутривенного введения (человеческий)] 5% жидкий препарат; Octagam 50 мг/мл, раствор - Octapharma France - Mise en quarantaine de tous les lots, опубликованная онлайн 9 сентября 2010 г. в AFSSAPS; и Вопросы и ответы о прекращение разрешения на медицинское применение препарата для Octagam (человеческий нормальный иммуноглобулин 5 и 10%), опубликованной онлайн 23 сентября 2010 г. Европейским агентством лекарственных средств).This concern is evidenced by the recent voluntary recall of Octagam® (Octapharma) in the United States and the withdrawal of medical approval for Octagam® and Octagam 10% by the European Commission following an increasing number of reports of thromboembolism. It is likely that the increase in thrombotic events was caused by high levels of amidolytic activity in the biologic product caused by serine protease and serine protease zymogen impurities such as factor XI, factor XIa, factor XII, and factor XIIa (FDA Notice: Voluntary Recall September 23, 2010 Octagam [immune globulin for intravenous administration (human)] 5% liquid preparation; Octagam 50 mg/ml, solution - Octapharma France - Mise en quarantaine de tous les lots, published online September 9, 2010 in AFSSAPS; and Questions and responses to the withdrawal of the medical use authorization for Octagam (human normal immunoglobulin 5 and 10%) published online on 23 September 2010 by the European Medicines Agency).

В WO 2014113659 А1 раскрыт способ выделения одного или более препаратов крови из материала препаратов крови с низким содержанием интер-альфа ингибиторного белка (IaIp). Препарат крови выделяют хроматорафически из криосупернатантной плазмы с низким содержанием IaIp посредством контакта указанной криосупернатантной плазмы с низким содержанием IaIp в с поддержкой DEAE. Данная ссылка не описывает использование супернатанта плазмы с низким содержанием C1-INH для производства IgG. В нем также не раскрывается обработка супернатанта плазмы гепарином, что приводит к сни- 1 045585 жению амидолитической и прокоагулянтной активности IgG.WO 2014113659 A1 discloses a method for isolating one or more blood products from blood product material low in inter-alpha inhibitory protein (IaIp). The blood product is isolated chromatographically from low-IaIp cryosupernatant plasma by contacting said low-IaIp cryosupernatant plasma with DEAE support. This reference does not describe the use of low C1-INH plasma supernatant for IgG production. It also does not disclose the treatment of plasma supernatant with heparin, which leads to a decrease in the amidolytic and procoagulant activity of IgG.

Вследствие растущих опасений по поводу ограниченного количества исходного материала для получения IgG и потери значительного количества IgG в процессе очистки в данной области существует неотложная потребность в разработке способа увеличения доступности значительного количества альтернативных исходных материалов для производства IgG.Due to increasing concerns about the limited amount of starting material for IgG production and the loss of significant amounts of IgG during purification processes, there is an urgent need in the field to develop a method to increase the availability of a significant amount of alternative starting materials for the production of IgG.

Краткое описание сущности изобретенияBrief description of the invention

Настоящее описание направлено на указанные и другие проблемы. В одном варианте осуществления настоящее изобретение основано на обнаружении того, что супернатант плазмы с низким содержанием C1-INH можно применять в качестве исходного материала для получения фракции с высоким содержанием иммуноглобулина G (IgG), получая таким образом доступность другого исходного материала для получения IgG. Недавние опасения по поводу амидолитического содержания данных композиций в сочетании с возникновением тромбоэмболических явлений у пациентов, получающих белковые композиции из плазмы, высветили потребность в данной области в способе снижения уровня сериновых протеаз (например, FXIa и FXIIa) и зимогены сериновых протеаз (например, FXI и FXII) в ходе производства данных биопрепаратов. Преимущественно настоящее изобретение основано, по меньшей мере частично, на неожиданном заключении, что гепарин можно применять для снижения прокоаулянтной и амидолитической активности до приемлемых уровней в ходе процесса фракционирования. Также представлены терапевтические образованные из плазмы белковые композиции со сниженной активностью сериновой протеазы, содержанием сериновой протеазы и/или содержанием зимогена сериновой протеазы. Также представлены способы лечения или предупреждения заболевания посредством введения композиции по настоящему изобретению.The present disclosure addresses these and other problems. In one embodiment, the present invention is based on the discovery that a low C1-INH plasma supernatant can be used as a starting material to produce a high immunoglobulin G (IgG) fraction, thereby making another starting material available for producing IgG. Recent concerns regarding the amidolytic content of these compositions, coupled with the occurrence of thromboembolic events in patients receiving plasma protein compositions, have highlighted the need in the field for a method of reducing the levels of serine proteases (e.g., FXIa and FXIIa) and serine protease zymogens (e.g., FXI and FXII) during the production of these biological products. Advantageously, the present invention is based, at least in part, on the unexpected finding that heparin can be used to reduce procoulant and amidolytic activity to acceptable levels during the fractionation process. Also provided are therapeutic plasma-derived protein compositions with reduced serine protease activity, serine protease content, and/or serine protease zymogen content. Methods of treating or preventing a disease by administering a composition of the present invention are also provided.

В одном варианте осуществления в настоящем изобретении представлен способ получения фракции с высоким содержанием иммунолобулина G (IgG) из супернатантной фракции с низким содержанием C1-INH, содержащей IgG. Способ включает следующее:In one embodiment, the present invention provides a method for producing a high immunolobulin G (IgG) fraction from a low C1-INH supernatant fraction containing IgG. The method includes the following:

(a) обеспечение контакта супернатантной фракции с низким содержанием C1-INH с гепарином с образованием таким образом гепаринизированной фракции с низким содержанием C1-INH; и (b) выделение IgG из гепаринизированной фракции с низким содержанием C1-INH с образованием таким образом фракции с высоким содержанием IgG.(a) contacting the supernatant low C1-INH fraction with heparin, thereby forming a heparinized low C1-INH fraction; and (b) isolating IgG from the heparinized low-C1-INH fraction, thereby forming a high-IgG fraction.

В одном варианте осуществления способов, описанных в данном документе, супернатантная фракция представляет собой супернатант, полученный после адсорбции С1-ингибитора.In one embodiment of the methods described herein, the supernatant fraction is the supernatant obtained after adsorption of the C1 inhibitor.

В одном иллюстративном варианте осуществления супернатантная фракция представляет собой супернатант плазмы.In one illustrative embodiment, the supernatant fraction is plasma supernatant.

В одном варианте осуществления супернатант плазмы представляет собой криосупернатантную плазму с низким содержанием C1-INH.In one embodiment, the plasma supernatant is low C1-INH cryosupernatant plasma.

В различных вариантах осуществления супернатант плазмы образован из дважды обедненной криосупернатантной плазмы (DDCPP).In various embodiments, the plasma supernatant is formed from doubly depleted cryosupernatant plasma (DDCPP).

В одном иллюстративном варианте осуществления супернатантная фракция имеет низкое содержание одного или более других факторов коагуляции крови, выбранных из фактора II, VII, IX, X и их смеси.In one illustrative embodiment, the supernatant fraction is low in one or more other blood coagulation factors selected from factor II, VII, IX, X, and mixtures thereof.

В одном варианте осуществления супернатантную фракцию концентрируют до значения белка нормальной плазмы перед последующей обработкой.In one embodiment, the supernatant fraction is concentrated to normal plasma protein levels before subsequent processing.

В одном иллюстративном варианте осуществления гепарин добавляют в количестве от около 1 единиц на мл до около 20 единиц на мл супернатантной фракции.In one illustrative embodiment, heparin is added in an amount from about 1 unit per ml to about 20 units per ml of the supernatant fraction.

В одном иллюстративном варианте осуществления гепарин добавляют в количестве от около 5 единиц на мл до около 10 единиц на мл супернатантной фракции.In one illustrative embodiment, heparin is added in an amount of from about 5 units per ml to about 10 units per ml of the supernatant fraction.

В одном варианте осуществления гепарин добавляют в количестве около 5 единиц на мл супернатантной фракции.In one embodiment, heparin is added in an amount of about 5 units per ml of supernatant fraction.

В различных вариантах осуществления гепарин добавляют в количестве около 10 единиц на мл супернатантной фракции.In various embodiments, heparin is added in an amount of about 10 units per ml of supernatant fraction.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения способ дополнительно включает в себя (с) удаление ингибитора эстеразы C1-INH (C1-INH) из фракции криосупернатантной плазмы, содержащей C1-INH, с образованием таким образом супернатантной фракции с низким содержанием C1-INH.In some embodiments of the present invention, the method further includes (c) removing the C1-INH esterase inhibitor (C1-INH) from the cryosupernatant plasma fraction containing C1-INH, thereby forming a supernatant fraction low in C1-INH.

В одном варианте осуществления фракция с высоким содержанием IgG содержит от около 60% до около 80% содержания IgG в супернатантной фракции.In one embodiment, the high-IgG fraction contains from about 60% to about 80% of the IgG content of the supernatant fraction.

В одном варианте осуществления фракция с высоким содержанием IgG содержит по меньшей мере около 50% содержания IgG в супернатантной фракции.In one embodiment, the high-IgG fraction contains at least about 50% of the IgG content of the supernatant fraction.

В одном варианте осуществления способов, описанных выше, чистота γ-глобулинов во фракции с высоким содержанием IgG составляет по меньшей мере около 95%.In one embodiment of the methods described above, the purity of the γ-globulins in the high-IgG fraction is at least about 95%.

В одном варианте осуществления способов, описанных выше, чистота γ-глобулинов во фракции с высоким содержанием IgG составляет от около 95% до около 99,9%.In one embodiment of the methods described above, the purity of the γ-globulins in the high-IgG fraction is from about 95% to about 99.9%.

В одном иллюстративном варианте осуществления в настоящем изобретении представлен способIn one illustrative embodiment, the present invention provides a method

- 2 045585 выделения IgG из гепаринизированной фракции, включающий одну или более из следующих стадий в любом порядке или комбинации:- 2 045585 isolation of IgG from a heparinized fraction, comprising one or more of the following steps in any order or combination:

(i) осаждение гепаринизированной фракции, содержащей от около 6% до около 10% этанола, например водного раствора этанола, при рН от около 7,0 до около 7,5 с получением осадка фракции I и супернатанта фракции I; и (ii) осаждение IgG из супернатанта фракции I, содержащего от около 18% до около 27% этанола, например водного раствора этанола, при рН от около 6,7 до около 7,3 с образованием осадка фракции II+III.(i) precipitating a heparinized fraction containing from about 6% to about 10% ethanol, for example an aqueous solution of ethanol, at a pH of from about 7.0 to about 7.5 to obtain a fraction I precipitate and a fraction I supernatant; and (ii) precipitating IgG from a fraction I supernatant containing about 18% to about 27% ethanol, such as an aqueous ethanol solution, at a pH of about 6.7 to about 7.3 to form a fraction II+III precipitate.

В одном варианте осуществления способов, раскрытых выше, способ дополнительно включает осаждение IgG из гепаринизированной фракции, содержащей от около 18% до около 27% этанола, например водного раствора этанола, при рН от около 6,7 до около 7,3 с образованием осадка фракции I+II+III.In one embodiment of the methods disclosed above, the method further comprises precipitating IgG from a heparinized fraction containing about 18% to about 27% ethanol, such as an aqueous ethanol solution, at a pH of about 6.7 to about 7.3 to form a precipitated fraction I+II+III.

В одном варианте осуществления способ дополнительно включает одну или более из следующих стадий в любом порядке или комбинации:In one embodiment, the method further includes one or more of the following steps, in any order or combination:

(iii) суспендирование осадка фракции II+III или фракции I+II+III в суспензионном буфере с образованием таким образом суспензии IgG;(iii) suspending the precipitate of fraction II+III or fraction I+II+III in a suspension buffer, thereby forming an IgG suspension;

(iv) смешивание мелкодисперсного диоксида кремния (SiO₂) с суспензией IgG, например, в течение по меньшей мере около 30 мин;(iv) mixing the fine silica (SiO ₂ ) with the IgG suspension, for example, for at least about 30 minutes;

(v) фильтрование суспензии IgG с образованием таким образом фильтрата и осадка на фильтре.(v) filtering the IgG suspension, thereby forming a filtrate and a filter cake.

В одном варианте осуществления способ дополнительно включает одну или более из следующих стадий в любом порядке или комбинации:In one embodiment, the method further includes one or more of the following steps, in any order or combination:

(vi) промывка осадка на фильтре по меньшей мере с около 1 мертвым объемом фильтр-пресса промывочного буфера с рН от около 4,9 до около 5,3 с образованием таким образом промывочного раствора;(vi) washing the filter cake with at least about 1 dead volume of a filter press wash buffer having a pH of about 4.9 to about 5.3, thereby forming a wash solution;

(vii) объединение фильтрата с промывочным раствором с образованием таким образом объединенного раствора и обработка объединенного раствора моющим средством;(vii) combining the filtrate with the wash solution to thereby form a combined solution and treating the combined solution with a detergent;

(viii) регулирование рН объединенный раствор со стадии (vii) до около 7,0 и добавление к нему этанола до конечной концентрации от около 20% до около 30% с образованием таким образом осажденного осадка G;(viii) adjusting the pH of the combined solution from step (vii) to about 7.0 and adding ethanol thereto to a final concentration of about 20% to about 30%, thereby forming precipitate G;

(ix) растворение осажденного осадка G в водном растворе, содержащем составляющее, выбранное из растворителя, моющего средства и их комбинации, и инкубация раствора, например, в течение по меньшей мере около 60 мин с образованием инкубированного раствора;(ix) dissolving the precipitated precipitate G in an aqueous solution containing a constituent selected from a solvent, a detergent, and a combination thereof, and incubating the solution, for example, for at least about 60 minutes to form an incubated solution;

(х) пропускание инкубированного раствора через катионообменную хроматографическую колонку и элюирование белков, абсорбированных на колонке в элюате;(x) passing the incubated solution through a cation exchange chromatography column and eluting the proteins adsorbed on the column in the eluate;

(xi) пропускание элюата через анионообменную хроматографическую колонку с образованием проточной фракции;(xi) passing the eluate through an anion exchange chromatography column to form a flow-through fraction;

(х) пропускание потока через фракцию через нанофильтр с образованием нанофильтрата;(x) passing the stream through the fraction through a nanofilter to form a nanofiltrate;

(xi) концентрация нанофильтрата посредством ультрафильтрации с образованием первого ульрафильтрата;(xi) concentrating the nanofiltrate by ultrafiltration to form a first ultrafiltrate;

(xii) диафильтрация первого ультрафильтрата через диафильтрационный буфер с образованием диафильтрата; и (xiii) концентрация диафильтрата посредством ультрафильтрации с образованием второго ультрафильтрата с концентрацией белка от около 8% (вес/об.) до около 22% (вес/об.) с образованием таким образом фракции с высоким содержанием IgG.(xii) diafiltration of the first ultrafiltrate through a diafiltration buffer to form a diafiltrate; and (xiii) concentrating the diafiltrate by ultrafiltration to form a second ultrafiltrate having a protein concentration of from about 8% (w/v) to about 22% (w/v), thereby forming a high-IgG fraction.

В одном варианте осуществления способ включает добавление SiO₂ к конечной концентрации от около 0,02 г до около 0,10 г SiO₂ на грамм осадка фракции II+III или фракции I+II+III.In one embodiment, the method includes adding SiO ₂ to a final concentration of about 0.02 g to about 0.10 g SiO ₂ per gram of fraction II+III or fraction I+II+III sediment.

В одном варианте осуществления способ включает промывку осадка на фильтре по меньшей мере с около 3 мертвыми объемами фильтр-пресса промывочный буфер.In one embodiment, the method includes washing the filter cake with at least about 3 dead volumes of filter press wash buffer.

В одном варианте осуществления способ включает промывку осадка на фильтре по меньшей мере с около 2 мертвыми объемами фильтр-пресса промывочный буфер.In one embodiment, the method includes washing the filter cake with at least about 2 dead volumes of filter press wash buffer.

В одном варианте осуществления способ включает элюирование по меньшей мере одного белка с использованием по меньшей мере около 35 мМ натрия дигидрофосфата дигидрата.In one embodiment, the method includes eluting at least one protein using at least about 35 mM sodium dihydrogen phosphate dihydrate.

В одном варианте осуществления диафильтрационный буфер содержит от около 200 мМ до около 300 мМ глицина.In one embodiment, the diafiltration buffer contains from about 200 mM to about 300 mM glycine.

В одном варианте осуществления способ дополнительно включает обработку раствора IgG растворителем и/или моющим средством по меньшей мере на одной стадии инактивации или удаления вируса.In one embodiment, the method further includes treating the IgG solution with a solvent and/or detergent in at least one virus inactivation or removal step.

В одном варианте осуществления способов, описанных выше, способ дополнительно включает стадию инкубации при низком рН от около 4,0 до около 5,2.In one embodiment of the methods described above, the method further includes the step of incubating at a low pH of about 4.0 to about 5.2.

В одном варианте осуществления способов, описанных выше, способ дополнительно включает стадию инкубации при низком рН от около 4,4 до около 4,9.In one embodiment of the methods described above, the method further includes the step of incubating at a low pH of about 4.4 to about 4.9.

В одном иллюстративном варианте осуществления в настоящем изобретении представлен супернатант после адсорбционной фракции С1-ингибитора, содержащей IgG, причем указанная фракция представляет собой фракцию криосупернатантной плазмы с низким содержанием C1-INH по меньшей мере на около 70% общего процента во фракции криосупернатантной плазмы.In one illustrative embodiment, the present invention provides a supernatant after an adsorption fraction of a C1 inhibitor containing IgG, wherein said fraction is a cryosupernatant plasma fraction that is low in C1-INH at least about 70% of the total percentage in the cryosupernatant plasma fraction.

В четвертом аспекте настоящего изобретения представлена фармацевтическая композиция, содер- 3 045585 жащая фракцию с высоким содержанием IgG, полученную в соответствии с настоящим изобретением.In a fourth aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition containing a high IgG content fraction prepared in accordance with the present invention.

В одном варианте осуществления композиция содержит по меньшей мере около 80-220 г IgG на литр композиции.In one embodiment, the composition contains at least about 80-220 g of IgG per liter of composition.

В одном варианте осуществления рН фармацевтической композиции составляет от около 4,4 до около 4,9.In one embodiment, the pH of the pharmaceutical composition is from about 4.4 to about 4.9.

Подробное описание изобретенияDetailed Description of the Invention

Введение.Introduction.

В отличие от других биопрепаратов, которые получаю посредством рекомбинантной экспрессии векторов ДНК в линии клеток-хозяев, образованные из плазмы белки фракционированы из донорской человеческой крови и плазмы. Таким образом, поставку таких продуктов невозможно повысить посредством простого повышения объема производства. Скорее уровень имеющихся в продаже препаратов крови ограничен имеющимся запасом донорской крови и плазмы. Данная динамика приводит к нехватке сырой человеческой плазмы для производства новых факторов крови, полученных из плазмы, которые имеют менее развитые коммерческие рынки, включая фактор комплемента Н (CFH) и белки-ингибиторы интер-альфа-трипсина (IaIp).Unlike other biologics, which are produced by recombinant expression of DNA vectors in a host cell line, plasma-derived proteins are fractionated from donated human blood and plasma. Thus, the supply of such products cannot be increased by simply increasing production volumes. Rather, the level of commercially available blood products is limited by the available supply of donor blood and plasma. These dynamics result in a shortage of raw human plasma for the production of new plasma-derived blood factors that have less developed commercial markets, including complement factor H (CFH) and inter-alpha trypsin inhibitor proteins (IaIp).

Опасения по поводу амидолитического содержания композиций, полученных из плазмы, выдвинули на первый план потребность в способе снижения сериновых протеаз (например, FXIa и FXIIa) и зимогенов сериновых протеаз (например, FXI и FXII) при производстве IgG и других биопрепаратов.Concerns about the amidolytic content of plasma-derived compositions have highlighted the need for a method of reducing serine proteases (eg, FXIa and FXIIa) and serine protease zymogens (eg, FXI and FXII) in the production of IgG and other biologics.

С1-ингибитор (C1-INH, ингибитор эстеразы С1) является наиболее важным физиологическим ингибитором калликреина плазмы, фактора XIa и фактора XIIa. Снижение концентрации С1-ингибитора может обеспечивать накопление данных факторов в исходных материалах для производства коммерческих терапевтических средств на основе IgG, таких как GAMMAGARD® LIQUID (GGL), затрудняя производство препаратов IgG для внутривенного введения без повышенного риска тромбоэмболических осложнений. Вследствие сложности производства иммуноглобулинов из супернатантов плазмы после адсорбции С1-ингибитора, называемого двойной обедненной криосупернатантной плазмой (DDCPP), нативную супернатантную плазму не используют в качестве исходного материала для производства IgG. Таким образом, для обеспечения достаточного удаления калликреина плазмы, фактора XIa и фактора XIIa со сниженной концентрацией С1-ингибитора, рассчитанное количество 10,000 МЕ/л гепарина добавляют к DDCPP до начала процесса спиртового фракционирования.C1 inhibitor (C1-INH, C1 esterase inhibitor) is the most important physiological inhibitor of plasma kallikrein, factor XIa and factor XIIa. Reducing the concentration of C1 inhibitor may allow these factors to accumulate in the starting materials for the production of commercial IgG therapeutics, such as GAMMAGARD® LIQUID (GGL), making it difficult to produce intravenous IgG formulations without an increased risk of thromboembolic complications. Due to the difficulty of producing immunoglobulins from plasma supernatants after adsorption of a C1 inhibitor called double depleted cryosuppernatant plasma (DDCPP), native supernatant plasma is not used as a starting material for the production of IgG. Therefore, to ensure sufficient removal of plasma kallikrein, factor XIa, and factor XIIa with a reduced concentration of C1 inhibitor, a calculated amount of 10,000 IU/L of heparin is added to DDCPP prior to the alcohol fractionation process.

Настоящее раскрытие на части выявления того, что супернатант плазмы с низким содержанием C1INH, а также супернатантная фракция с низким содержанием одного или более других факторов свертывания крови, выбранных из фактора II, VII, IX и X и их смеси, можно применять в качестве исходного материала для получения фракции, обогащенной иммуноглобулином G (IgG), делая таким образом доступный другой исходный материал для получения IgG. Преимущественно настоящее изобретение основано, по меньшей мере частично, на неожиданном заключении, что гепарин можно применять для усиленного снижения прокоагулянтной активности в ходе процесса фракционирования.The present disclosure discloses that a plasma supernatant with a low content of C1INH, as well as a supernatant fraction with a low content of one or more other coagulation factors selected from factors II, VII, IX and X and mixtures thereof, can be used as starting material to obtain a fraction enriched in immunoglobulin G (IgG), thereby making available other starting material for the production of IgG. Advantageously, the present invention is based, at least in part, on the unexpected finding that heparin can be used to enhance the reduction of procoagulant activity during the fractionation process.

Для преодоления данных проблем, авторы настоящего изобретения разработали процесс, включающий стадию очистки, например, стадию исходной очистки, в ходе которого совместно осаждается супернатант плазмы с низким содержанием C1-INH с гепарином, с образованием таким образом гепаринизированной фракции; а затем выделения IgG из гепаринизированной фракции. Таким образом, гепарин, обработанный гепарином супернатант плазмы с низким содержанием Щ-INH можно применять в качестве исходный материал для получения обогащенной иммуноглобулином G (IgG) фракции, получая новый исходный материал для получения IgG.To overcome these problems, the inventors of the present invention have developed a process comprising a purification step, for example, an initial purification step, in which the low C1-INH plasma supernatant is co-precipitated with heparin, thereby forming a heparinized fraction; and then isolating IgG from the heparinized fraction. Thus, heparin, heparin-treated plasma supernatant with low A-INH content can be used as a starting material to obtain an immunoglobulin G (IgG)-enriched fraction, obtaining a new starting material for the production of IgG.

В определенных аспектах настоящего изобретения представлены способы для производства IVIG со сниженной прокоагулянтной и амидолитической активностью.In certain aspects of the present invention, methods are provided for the production of IVIG with reduced procoagulant and amidolytic activity.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представлены композиции IgG, полученные в соответствии с улучшенными способами производства, представленными в данном документе. Преимущественно данные композиции являются менее дорогостоящими при получении, чем коммерческие продукты, доступные в настоящее время, вследствие улучшенного выхода, обеспечиваемого способами, представленными в данном документе. Кроме того, данные композиции являются такими же чистыми, возможно, даже более чистыми, чем композиции, полученные с использованием коммерческих способов. Важно отметить, что данные композиции подходят для применения в терапии IVIG для иммунодефицитов, воспалительных и аутоиммунных заболеваний, и острых инфекций. В одном варианте осуществления композиция IgG имеет концентрацию IgG, равную или практически равную 10%, для внутривенного введения. В другом варианте осуществления композиция IgG имеет концентрацию, равную или практически равную 20%, для подкожного или внутримышечного введения.In some embodiments, the present invention provides IgG compositions prepared in accordance with the improved manufacturing methods presented herein. Advantageously, these compositions are less expensive to produce than commercial products currently available due to the improved yield provided by the methods presented herein. In addition, these compositions are as pure, perhaps even more pure, than compositions obtained using commercial methods. It is important to note that these compositions are suitable for use in IVIG therapy for immunodeficiencies, inflammatory and autoimmune diseases, and acute infections. In one embodiment, the IgG composition has an IgG concentration equal to or substantially equal to 10% for intravenous administration. In another embodiment, the IgG composition has a concentration equal to or substantially equal to 20% for subcutaneous or intramuscular administration.

В различных вариантах осуществления настоящего изобретения представлены фармацевтические композиции и составы композиций IgG, полученных из супернатанта плазмы с низким содержанием C1INH, как представлено в данном документе. В определенных вариантах осуществления данные композиции и составы обеспечивают улучшенные свойства по сравнению с другими композициями IVIG, представленными в настоящее время на рынке. Например, в определенных вариантах осуществления компо- 4 045585 зиции и составы, представленные в данном документе, стабильны в течение длительного периода времени.Various embodiments of the present invention provide pharmaceutical compositions and formulations of IgG compositions derived from low C1INH plasma supernatant as provided herein. In certain embodiments, these compositions and formulations provide improved properties compared to other IVIG compositions currently on the market. For example, in certain embodiments, the compositions and formulations provided herein are stable over long periods of time.

В одном иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения представлен способ лечения иммунодефицитов, воспалительных и аутоиммунных заболеваний, и острых инфекций, включающий введение композиции IgG, полученной из супернатанта плазмы с низким содержанием C1-INH. В различных вариантах осуществления композицию IgG получают посредством способа по настоящему изобретению.In one illustrative embodiment of the present invention, a method of treating immunodeficiencies, inflammatory and autoimmune diseases, and acute infections is provided, comprising administering an IgG composition derived from low C1-INH plasma supernatant. In various embodiments, an IgG composition is prepared by the method of the present invention.

Иллюстративные способы получения содержащей ингибитор C1-INH-эстеразы (C1-INH) композиции можно найти в WO 2001046219 А2, где описаны анионообменники при кислотном рН (т.е. ниже рН 7), для выделения C1-INH.Exemplary methods for preparing a C1-INH esterase (C1-INH) inhibitor-containing composition can be found in WO 2001046219 A2, which describes anion exchangers at acidic pH (ie, below pH 7) to release C1-INH.

Определения.Definitions.

В контексте данного документа термин IgG для внутривенного введения или лечение IVIG в целом относится к терапевтическому способу внутривенного, подкожного или внутримышечного введения фармацевтической композиции иммуноглобулинов IgG пациенту для лечения состояния, такого как, например, иммунодефициты, воспалительные заболевания и аутоиммунные заболевания. Иммуноглобулины IgG обычно объединяют и получают из плазмы. Можно применять полные антитела или фрагменты. Иммуноглобулины IgG могут быть составлены с более высокими концентрациями (например, более 10%) для подкожного введения, или составлены для внутримышечного введения. Это особенно характерно для специальных препаратов IgG, которые получают с титрами выше среднего для специфических антигенов (например, фактора Rho D, коклюшного токсина, столбнячного токсина, токсин ботулизма, бешенство и т.д.). Для простоты обсуждения в настоящей заявке такие композиции IgG для подкожного или внутримышечного введения также включены в термин IVIG.As used herein, the term intravenous IgG or IVIG treatment generally refers to a therapeutic method of intravenous, subcutaneous or intramuscular administration of a pharmaceutical composition of IgG immunoglobulins to a patient for the treatment of a condition, such as, for example, immunodeficiencies, inflammatory diseases and autoimmune diseases. IgG immunoglobulins are usually pooled and obtained from plasma. Full antibodies or fragments can be used. IgG immunoglobulins can be formulated at higher concentrations (eg, greater than 10%) for subcutaneous administration, or formulated for intramuscular administration. This is especially true for specialty IgG preparations that are produced at above-average titers for specific antigens (eg, Rho D factor, pertussis toxin, tetanus toxin, botulinum toxin, rabies, etc.). For ease of discussion in this application, such IgG compositions for subcutaneous or intramuscular administration are also included under the term IVIG.

В контексте данного документа термин амидолитическая активность относится к способности полипептида катализировать гидролиз по меньшей мере одной пептидной связи в другом полипептиде. Профиль амидолитической активности для композиции иммуноглобулина IgG может быть определен посредством исследования с различными хромогенными субстратами, с различными специфичностями к протеазам, обнаруженным в человеческой плазме, включая без ограничения следующие: PL-1 (широкий спектр), S-2288 (широкий спектр), S-2266 (FXIa, железистые калликреины), S-2222 (FXa, трипсин), S-2251 (плазмин), и S-2302 (калликреин, FXIa и FXIIa). Способы определения амидолитической активности композиции хорошо известны в данной области, например, как указано в М. Etscheid et al. (Identification of kallikrein and FXIa as impurities in therapeutic immunoglobulins: implications for the safety and control of intravenous blood products, Vox Sang 2011; раскрытие которой включено в настоящий документ во всей своей полноте для всех целей.)As used herein, the term amidolytic activity refers to the ability of a polypeptide to catalyze the hydrolysis of at least one peptide bond in another polypeptide. The amidolytic activity profile for an IgG immunoglobulin composition can be determined by testing with various chromogenic substrates, with various specificities for proteases found in human plasma, including without limitation the following: PL-1 (broad spectrum), S-2288 (broad spectrum), S -2266 (FXIa, glandular kallikreins), S-2222 (FXa, trypsin), S-2251 (plasmin), and S-2302 (kallikrein, FXIa and FXIIa). Methods for determining the amidolytic activity of a composition are well known in the art, for example as described in M. Etscheid et al. (Identification of kallikrein and FXIa as impurities in therapeutic immunoglobulins: implications for the safety and control of intravenous blood products, Vox Sang 2011; the disclosure of which is incorporated herein in its entirety for all purposes.)

В контексте данного документе антитело относится к полипептиду, по существу кодированному геном иммуноглобулинов или генами иммуноглобулинов, или их фрагментами, который специфически связывается и распознает аналит (антиген). Распознанные гены иммуноглобулинов включают гены константных областей каппа, лямбда, альфа, гамма, дельта, эпсилон и мю, а также множество генов вариабельных областей иммуноглобулинов. Легкие цепи классифицируются как каппа или лямбда. Тяжелые цепи классифицируются как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон, которые, в свою очередь, определяют классы иммуноглобулинов, IgG, IgM, IgA, IgD и IgE соответственно. Структурная единица типового иммуноглобулина (антитела) состоит из двух пар полипептидных цепей, каждая пара содержит одну легкую (около 25 кДа) и одну тяжелую цепь (около 50-70 кДа). N-конец каждой цепи определяет вариабельную область от примерно 100 до 110 или более аминокислот, в основном ответственных за распознавание антигена. Термины вариабельная легкая цепь (VL) и вариабельная тяжелая цепь (V_H) относятся к данным легким и тяжелым цепям, соответственно.As used herein, an antibody refers to a polypeptide substantially encoded by an immunoglobulin gene or immunoglobulin genes, or fragments thereof, that specifically binds to and recognizes an analyte (antigen). Recognized immunoglobulin genes include the kappa, lambda, alpha, gamma, delta, epsilon and mu constant region genes, as well as many immunoglobulin variable region genes. Light chains are classified as kappa or lambda. Heavy chains are classified as gamma, mu, alpha, delta or epsilon, which in turn define the immunoglobulin classes, IgG, IgM, IgA, IgD and IgE, respectively. The structural unit of a typical immunoglobulin (antibody) consists of two pairs of polypeptide chains, each pair containing one light chain (about 25 kDa) and one heavy chain (about 50-70 kDa). The N-terminus of each chain defines a variable region of about 100 to 110 or more amino acids primarily responsible for antigen recognition. The terms variable light chain (VL) and variable heavy chain ( _VH ) refer to these light and heavy chains, respectively.

В контексте данного документа термин ультрафильтрация (UF) охватывает различные способы мембранной фильтрации, в которых гидростатическое давление выталкивает жидкость через полупроницаемую мембрану. Суспендированные твердые вещества и растворенные вещества с высокой молекулярной массой задерживаются, тогда как вода и растворенные вещества с низкой молекулярной массой проходят через мембрану. Данный процесс разделения зачастую применяют для очистки и концентрации макромолекулярных растворов (103-106 Да), в частности растворов белков. Ряд мембран для ультрафильтрации доступны в зависимости от размера молекул, которые они задерживают. Ультрафильтрация обычно характеризуется размером пор мембраны от 1 до 1000 кДа и рабочими давлениями от 0,01 до 10 бар, и ее конкретно применяют для разделения коллоидов, таких как белки из малых молекул, таких как сахара и соли.As used herein, the term ultrafiltration (UF) covers various membrane filtration techniques in which hydrostatic pressure forces liquid through a semi-permeable membrane. Suspended solids and high molecular weight solutes are retained, while water and low molecular weight solutes pass through the membrane. This separation process is often used for the purification and concentration of macromolecular solutions (103-106 Da), in particular protein solutions. A range of ultrafiltration membranes are available depending on the size of the molecules they retain. Ultrafiltration is typically characterized by membrane pore sizes ranging from 1 to 1000 kDa and operating pressures ranging from 0.01 to 10 bar, and is specifically applied to the separation of colloids such as proteins from small molecules such as sugars and salts.

В контексте данного документа термин диафильтрация осуществляется с теми же мембранами, что и ультрафильтрация, и она представляет собой тангенциальную поточную фильтрацию. В ходе диафильтрации буфер вводят в бак для рециркуляции, тогда как фильтрат удаляют из отдельной операции. В процессах, в которых продукты находятся в ретентате (например, IgG), диафильтрация обеспечивает вымывание компонентов ряда продуктов в фильтрат, обменивая таким образом буферы и снижая концентрацию нежелательных форм.As used herein, diafiltration uses the same membranes as ultrafiltration and is tangential flow filtration. During diafiltration, a buffer is introduced into a recirculation tank while the filtrate is removed in a separate operation. In processes where products are in a retentate (eg IgG), diafiltration ensures that components of a number of products are leached into the filtrate, thereby exchanging buffers and reducing the concentration of undesired forms.

В контексте данного документа термин около означает приблизительный диапазон относительно указанного значения. В некоторых вариантах осуществления диапазон составляет плюс или минус 1-10%As used herein, the term about means an approximate range relative to a specified value. In some embodiments, the range is plus or minus 1-10%

- 5 045585 от указанного значения. Таким образом, около охватывает плюс или минус 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10% от указанного значения. Например, выражение около 20% охватывает диапазон 18-22%.- 5 045585 from the specified value. Thus, about covers plus or minus 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10% of the specified value. For example, an expression of about 20% covers the range of 18-22%.

В контексте данного документа термин растворитель охватывает любое жидкое вещество, способное растворять или диспергировать одно или более других веществ. Растворитель может иметь неорганическую природу, например, вода, или он может представлять собой органическую жидкость, такую как этанол, ацетон, метилацетат, этилацетат, гексан, петролейный эфир и т.д. В контексте данного термина обработка растворителем и моющим средством растворитель означает органический растворитель (например, три-К-бутилфосфат), который является частью смеси растворителя и моющего средства, применяемой для инактивации окруженных жидкостью вирусов в растворе.As used herein, the term solvent covers any liquid substance capable of dissolving or dispersing one or more other substances. The solvent may be inorganic in nature, such as water, or it may be an organic liquid, such as ethanol, acetone, methyl acetate, ethyl acetate, hexane, petroleum ether, etc. As used herein, solvent and detergent treatment, solvent means an organic solvent (eg, tri-K-butyl phosphate) that is part of the solvent and detergent mixture used to inactivate liquid-surrounded viruses in solution.

В контексте данного документа термин моющее средство применяют взаимозаменяемо с термином поверхностно-активное вещество или поверхностно-активное средство. Поверхностно-активные вещества обычно представляют собой органические соединения, которые являются амфифильными, т.е. содержащими как гидрофобные группы (хвосты), так и гидрофильные головы (головные области), которые делают поверхностно-активные вещества растворимыми как в органических растворителях, так и в воде. Поверхностно-активное вещество может быть классифицировано по наличию формально заряженных групп в его головной области. Неионное поверхностно-активное вещество не имеет заряженных группы в его головной области, тогда как ионное поверхностно-активное вещество имеет суммарный заряд в его головной области. Цвиттерионное поверхностно-активное вещество содержит головную область с двумя противоположно заряженными группами. Некоторые примеры распространенных поверхностно-активных веществ включают следующие: анионные (на основе сульфатных, сульфонатных или карбоксилатных анионов): перфтороктаноат (PFOA или PFO), перфтороктансульфонат (PFOS), додецилсульфат натрия (SDS), лаурилсульфат аммония и другие алкилсульфатные соли, лауретсульфат натрия (также известный как лаурилэфирсульфат натрия или SLES), алкилбензолсульфонат; катионные (на основе катионов четвертичного аммония): цетилтриметиламмония бромид (СТАВ), также известный как гексадецилтриметиламмония бромид, и другие соли алкилтриметиламмония, цетилпиридиния хлорид (СРС), полиэтоксилированный талловый амин (РОЕА), бензалкония хлорид (ВАС), бензентония хлорид (BZT); доинноцепочечные жирные кислоты и их соли: в том числе каприлат, каприловая кислота, гептаноат, гексановая кислота, гептановая кислота, нонановая кислота, декановая кислота и т.д.;As used herein, the term detergent is used interchangeably with the term surfactant or surfactant. Surfactants are usually organic compounds that are amphiphilic, i.e. containing both hydrophobic groups (tails) and hydrophilic heads (head regions), which make surfactants soluble in both organic solvents and water. A surfactant can be classified by the presence of formally charged groups in its head region. A nonionic surfactant has no charged groups in its head region, whereas an ionic surfactant has a net charge in its head region. A zwitterionic surfactant contains a head region with two oppositely charged groups. Some examples of common surfactants include the following: anionic (based on sulfate, sulfonate or carboxylate anions): perfluorooctanoate (PFOA or PFO), perfluorooctane sulfonate (PFOS), sodium dodecyl sulfate (SDS), ammonium lauryl sulfate and other alkyl sulfate salts, sodium laureth sulfate ( also known as sodium lauryl ether sulfate or SLES), alkyl benzene sulfonate; cationic (based on quaternary ammonium cations): cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), also known as hexadecyltrimethylammonium bromide, and other alkyltrimethylammonium salts, cetylpyridinium chloride (CPC), polyethoxylated tallow amine (POEA), benzalkonium chloride (BAC), benzenthonium chloride (BZT) ; doinochain fatty acids and their salts: including caprylate, caprylic acid, heptanoate, hexanoic acid, heptanoic acid, nonanoic acid, decanoic acid, etc.;

цвиттерионные (амфотерные): додецилбетаин; кокамидопропилбетаин;zwitterionic (amphoteric): dodecylbetaine; cocamidopropyl betaine;

кокоамфоглицинат; неионные: алкилполи(этиленоксид), алкилфенолполи(этиленоксид), сополимеры поли(этиленоксида) и поли(пропиленоксида) (известны под торговыми названиями полоксамеры или полоксамины), алкилполигликозиды, в том числе октилглюкозид, децилмальтозид, жирные спирты (например, цетиловый спирт и олеиловый спирт), кокамид МЕА, кокамид DEA, полисорбаты (Tween 20, Tween 80 и т.д.), моющие средства Triton и додецилдиметиламиноксид.cocoamphoglycinate; nonionic: alkylpoly(ethylene oxide), alkylphenolpoly(ethylene oxide), copolymers of poly(ethylene oxide) and poly(propylene oxide) (known by the trade names poloxamers or poloxamines), alkyl polyglycosides, including octyl glucoside, decyl maltoside, fatty alcohols (for example, cetyl alcohol and oleyl alcohol alcohol), cocamide MEA, cocamide DEA, polysorbates (Tween 20, Tween 80, etc.), Triton detergents and dodecyldimethylamine oxide.

В контексте данной заявки термин распыление относится к средствам доставки жидкого вещества в систему, например, в ходе стадии осаждения спиртом, например, I или II+Ш стадии осаждения модифицированного фракционирования по Кону в виде мелких капель или тумана жидкого вещества. Распыление может быть достигнуто с использованием любого устройства под давлением, такого как контейнер (например, флакон с распылителем), который имеет распылительную головку или сопло и управляется вручную или автоматически для образования мелкого тумана из жидкости. Как правило, распыление осуществляют в то время, как система, получающая жидкое вещество, непрерывно перемешивается или иным образом смешивается для обеспечения быстрого и равномерного распределения жидкости в системе.As used herein, the term nebulization refers to the means of delivering a liquid substance into a system, for example, during an alcohol precipitation step, eg I or II+III precipitation stage of a modified Cohn fractionation, in the form of fine droplets or a mist of liquid substance. Atomization can be achieved using any pressurized device, such as a container (such as a spray bottle) that has a spray head or nozzle and is controlled manually or automatically to produce a fine mist of liquid. Typically, spraying is carried out while the system receiving the liquid substance is continuously agitated or otherwise mixed to ensure rapid and uniform distribution of the liquid throughout the system.

В контексте данного документа криосупернатантная плазма относится к супернатанту, образованному после холодного осаждения (крио-осаждения) плазмы или объединенной плазмы при температурах, близких к температурам замерзания, например, при температурах ниже около 10°С. В контексте настоящего изобретения плазма может взаимозаменяемо относиться к восстановленной плазме (т.е. плазме, которая была отделена от цельной крови ex vivo) или свежезамороженной плазме (т.е. плазмы, собранной посредством плазмафереза). Крио-осаждение обычно осуществляют, например, посредством оттаивания предварительно замороженной объединенной плазмы, которая уже прошла испытание из соображений безопасности и качества, хотя можно применять также и свежесобранную плазму. Оттаивание обычно осуществляют при температуре не более 6°С. После полного оттаивания замороженной плазмы при низкой температуре, выполняют центрифугирование на холоде (например, не более 6°С) для отделения твердых крио-осадков от жидкого супернатанта. В качестве альтернативы стадию отделения можно выполнять посредством фильтрации, а не центрифугирования.As used herein, cryosupernatant plasma refers to the supernatant formed after cold precipitation (cryo-precipitation) of plasma or pooled plasma at temperatures near freezing temperatures, for example, at temperatures below about 10°C. In the context of the present invention, plasma can interchangeably refer to reconstituted plasma (ie, plasma that has been separated from whole blood ex vivo) or fresh frozen plasma (ie, plasma collected through plasmapheresis). Cryoprecipitation is usually carried out, for example, by thawing pre-frozen pooled plasma that has already been tested for safety and quality reasons, although freshly collected plasma can also be used. Thawing is usually carried out at a temperature of no more than 6°C. After complete thawing of the frozen plasma at low temperature, centrifugation is performed in the cold (for example, no more than 6°C) to separate the solid cryo-precipitates from the liquid supernatant. Alternatively, the separation step can be performed by filtration rather than centrifugation.

В контексте данного документа объединенные вещества по Кону относятся к исходному материалу, применяемому для фракционирования образца плазмы или объединенных образцов плазмы. Объединенные вещества по Кону включают цельную плазму, образцы криосупернатантной плазмы и объединенные образцы криосупернатантной плазмы, которые могут подвергаться стадии предварительной обработки или не подвергаться ей. В определенных вариантах осуществления объединенные вещества по Кону представляют собой образец криосупернатантной плазмы, из которого были удалены один или более факторов крови на стадии предварительной обработки, например, адсорбции на твердой фазе (например, гидроксиде алюминия, мелкодисперсный диоксид кремния и т.д.), или стадии хроматографииAs used herein, Cohn pools refer to the starting material used to fractionate a plasma sample or pooled plasma samples. Cohn's pooled substances include whole plasma, cryosuppernatant plasma samples, and pooled cryosuppernatant plasma samples, which may or may not be subject to a pretreatment step. In certain embodiments, the Cohn pooled substances are a sample of cryosupernatant plasma from which one or more blood factors have been removed by a pretreatment step, e.g., adsorption to a solid phase (e.g., aluminum hydroxide, fine silica, etc.), or chromatography steps

- 6 045585 (например, ионообменной или афинной хроматографии с гепарином). Различные факторы крови, включая без ограничения ингибиторную шунтирующую активность фактора VIII (FEIBA), комплекса фактора IX, концентрата фактора VII или комплекса антитромбина III, могут быть выделены из образца криосупернатантной плазмы с образованием объединенных веществ по Кону.- 6 045585 (for example, ion exchange or affinity chromatography with heparin). Various blood factors, including but not limited to factor VIII inhibitory bypass activity (FEIBA), factor IX complex, factor VII concentrate, or antithrombin III complex, can be isolated from a cryosuppernatant plasma sample to form Cohn pooled substances.

В контексте данного документа термин образец плазмы относится к любому подходящему материалу, например, восстановленной плазме или свежезамороженной плазме, или фракциям плазмы, или супернатантам плазмы, или полученные из плазмы белковые препараты. Иллюстративный образец плазмы включает IgG, образованный из плазмы или фракций плазмы, IgG, образованный из криосупернатантной плазмы, IgG, образованный из адсорбции ингибитора С-1 эстеразы криосупернатантной плазмы, IgG, образованный из дважды обедненной криосупернатантной плазмы (DDCPP).As used herein, the term plasma sample refers to any suitable material, for example, reconstituted plasma or fresh frozen plasma, or plasma fractions, or plasma supernatants, or plasma-derived protein preparations. An exemplary plasma sample includes IgG formed from plasma or plasma fractions, IgG formed from cryosupernatant plasma, IgG formed from C-1 esterase inhibitor adsorption to cryosupernatant plasma, IgG formed from doubly depleted cryosupernatant plasma (DDCPP).

В контексте данного документа дважды обедненная криосупернатантная плазма (также известная как DDCPP/криосупернатантная плазма с низким содержанием ингибитора С-1 эстеразы) относится к адсорбции супернатанта, образованной после адсорбции С1-ингибитора криосупернатантной плазмы при температурах, близких к температурам замерзания, например, при температурах ниже около 8°С. В способе производства GAMMAGARD® LIQUID (Baxter Healthcare Corporation, Вестлейк Виллидж, Калифорния) применяется модифицированная процедура холодного фракционирования этанолом по КонуОнкли для выделения промежуточной фракции иммуноглобулина G (IgG), называемой осадок G (PptG), из замороженных объединенных образцов человеческой плазмы. PptG дополнительно очищают посредством последующего использования слабой катионообменной и слабой анионообменной хроматографии. В последующую очистку PptG включены три специальные стадии снижения количества вирусов, а именно: обработка растворителем/моющим средством, нанофильтрация и инкубация при низком рН и повышенной температуре в конечном составе. Исходный материал для процесса фракционирования этанолом может подвергаться различным стадиям потребления для получения промежуточных продуктов для очистки факторов свертывания крови и ингибиторов белков плазмы. Адсорбция супернатанта, полученная после дозирования С1-ингибитора в процессе производства CINRYZE®, называется дважды обедненной криосупернатантной плазмой (DDCPP).As used herein, doubly depleted cryosupernatant plasma (also known as DDCPP/low C-1 esterase inhibitor cryosupernatant plasma) refers to the adsorption of supernatant formed after adsorption of C1 inhibitor cryosupernatant plasma at temperatures near freezing temperatures, e.g. below about 8°C. The GAMMAGARD® LIQUID manufacturing method (Baxter Healthcare Corporation, Westlake Village, Calif.) uses a modified Cohn Oncley cold ethanol fractionation procedure to isolate an intermediate fraction of immunoglobulin G (IgG), called pellet G (PptG), from frozen pooled human plasma samples. PptG is further purified by subsequent use of weak cation exchange and weak anion exchange chromatography. The subsequent purification of PptG involves three specific virus reduction steps, namely solvent/detergent treatment, nanofiltration, and low pH, elevated temperature incubation in the final formulation. The feedstock for the ethanol fractionation process can be subjected to various consumption steps to produce intermediates for the purification of coagulation factors and plasma protein inhibitors. The adsorption of supernatant obtained after dosing C1 inhibitor during the production of CINRYZE® is called doubly depleted cryosupernatant plasma (DDCPP).

В контексте данного документа термин нативный или вариантно-нативный относится к применению DDCPP в качестве исходного материала без какого-либо регулирования/модификации и вариантный гепарин относится к добавлению 5000 ME гепарина/л DDCPP или 10000 ME гепарина/л DDCPP к исходному материалу. Вариантный NaCl относится к добавлению раствора хлорида для повышения проводимости DDCPP.As used herein, the term native or variant-native refers to the use of DDCPP as a starting material without any adjustment/modification and variant heparin refers to the addition of 5000 IU heparin/L DDCPP or 10000 IU heparin/L DDCPP to the starting material. Variant NaCl refers to the addition of a chloride solution to increase the conductivity of DDCPP.

В контексте данного документа термин С1-ингибитор (C1-inh, ингибитор С1 эстеразы) представляет собой ингибитор протеазы, принадлежащий к надсемейству серпинов. Его основная функция заключается в ингибировании системы комплемента для предотвращения спонтанной активации. С1-ингибитор представляет собой белок острой фазы, который циркулирует в крови на уровне около 0,25 г/л. Уровни повышаются примерно в 2 раза во время воспаления. С1-ингибитор необратимо связывается и инактивирует протеазы C1r и C1s в комплексе С1 классического пути комплемента. Протеазы MASP-1 и MASP-2 в маннозосвязывающих лектиновых (MBL) комплексах лектинового пути также инактивированы. Таким образом, С1-ингибитор предотвращает протеолитическое расщепление более поздних компонентов комплемента С4 и С2 под действием С1 и MBL. Несмотря на то что С1-ингибитор назван в честь его ингибирующей активности в отношении комплемента, он также ингибирует протеазы фибринолитического, свертывающего и кининового путей. Следует отметить, что С1-ингибитор является наиболее важным физиологическим ингибитором калликреина плазмы, FXIa и FXIIa.As used herein, the term C1 inhibitor (C1-inh, C1 esterase inhibitor) is a protease inhibitor belonging to the serpin superfamily. Its main function is to inhibit the complement system to prevent spontaneous activation. The C1 inhibitor is an acute phase protein that circulates in the blood at a level of about 0.25 g/L. Levels increase approximately 2-fold during inflammation. The C1 inhibitor irreversibly binds to and inactivates the C1r and C1s proteases in the C1 complex of the classical complement pathway. The proteases MASP-1 and MASP-2 in the mannose-binding lectin (MBL) complexes of the lectin pathway are also inactivated. Thus, the C1 inhibitor prevents the proteolytic cleavage of later complement components C4 and C2 by C1 and MBL. Although the C1 inhibitor is named for its complement inhibitory activity, it also inhibits proteases of the fibrinolytic, coagulation, and kinin pathways. It should be noted that the C1 inhibitor is the most important physiological inhibitor of plasma kallikrein, FXIa and FXIIa.

1. Получение супернатантной фракции с низким содержанием C1-INH.1. Obtaining a supernatant fraction with a low content of C1-INH.

Исходный материал, применяемый для получения фракции с высоким содержанием IgG, обычно состоит из супернатанта после адсорбции С1-ингибитора или замороженной плазмы после адсорбции С1-ингибитора, или незамороженной плазмы после адсорбции С1-ингибитора. Иллюстративный образец, например, супернатант плазмы, состоит из адсорбции супернатанта, полученной после адсорбции С1ингибитора в ходе процесса производства CINRYZE®. Процесс очистки обычно начинают с оттаивания ранее замороженной объединенной плазмы, которая предпочтительно уже была проанализирована с точки зрения безопасности и качества. Оттаивание обычно проводят при температуре не выше 6°С. После полного оттаивания замороженной плазмы при низкой температуре проводят центрифугирование на холоду (например, не более 6°С) для отделения твердых крио-осадков от жидкого супернатанта. В качестве альтернативы стадию разделения выполняют посредством фильтрации, а не центрифугирования. Жидкий супернатант (также называемый криосупернатантной плазмой после удаления холодонерастворимых белков посредством центрифугирования из свежей размороженной плазмы) затем подвергают одной или более стадиям адсорбции для получения промежуточных продуктов для очистки факторов свертывания и ингибиторов белков плазмы. Адсорбция супернатанта, полученная после дозирования С1-ингибитора из криосупернатантной плазмы, также называют дважды обедненной криосупернатантной плазмой (DDCPP).The starting material used to obtain the high-IgG fraction typically consists of C1 inhibitor adsorption supernatant or C1 inhibitor frozen plasma or unfrozen C1 inhibitor adsorption plasma. An exemplary sample, for example, plasma supernatant, consists of adsorption of supernatant obtained after adsorption of a C1 inhibitor during the CINRYZE® manufacturing process. The purification process typically begins by thawing previously frozen pooled plasma, which has preferably already been analyzed for safety and quality. Thawing is usually carried out at a temperature no higher than 6°C. After complete thawing of the frozen plasma at a low temperature, centrifugation is carried out in the cold (for example, no more than 6 ° C) to separate the solid cryo-precipitates from the liquid supernatant. Alternatively, the separation step is performed by filtration rather than centrifugation. The liquid supernatant (also called cryosupernatant plasma after removal of cold-insoluble proteins by centrifugation from fresh thawed plasma) is then subjected to one or more adsorption steps to produce intermediates for the purification of clotting factors and inhibitors of plasma proteins. The adsorption of supernatant obtained after dosing C1 inhibitor from cryosuppernatant plasma is also called doubly depleted cryosuppernatant plasma (DDCPP).

- 7 045585- 7 045585

2. Получение гепаринизированной фракции.2. Obtaining the heparinized fraction.

Супернатантная фракция с низким содержанием С1-INH обычно считается не идеальным исходным материалом для производства IgG, поскольку снижение содержания C1-INH обеспечивает накопление калликреина плазмы, фактора XIa и Factor XIIa. Для обеспечения адекватного удаления данных факторов с явно сниженной концентрацией C1-INH расчетное количество гепарина (5000 ед./кг DDCPP или 10000 ед./кг DDCPP) добавляют к супернатантной фракции с низким содержанием C1-INH до начала процесса спиртового фракционирования. Показано, что конечный полученный продукт IgG содержит остаточные концентрации гепарина менее 1 МЕ/мл.The low C1-INH supernatant fraction is generally considered to be a less than ideal starting material for IgG production because the reduction in C1-INH content allows for the accumulation of plasma kallikrein, Factor XIa, and Factor XIIa. To ensure adequate removal of these factors with clearly reduced C1-INH concentrations, a calculated amount of heparin (5000 U/kg DDCPP or 10,000 U/kg DDCPP) is added to the low C1-INH supernatant fraction prior to the alcohol fractionation process. The final IgG product obtained was shown to contain residual heparin concentrations of less than 1 IU/ml.

3. Первое явление осаждения - модифицированное фракционирование I.3. The first precipitation phenomenon is modified fractionation I.

Исходным материалом для фракционирования I был DDCPP (супернатант после адсорбции С1-ингибитора). DDCPP обычно охлаждают до около 0±2°С и рН регулируют до значения от около 7,0 до около 7,5, предпочтительно от около 7,1 до около 7,3, наиболее предпочтительно около 7,2 посредством добавления кислоты, например уксусной кислоты. В одном варианте осуществления рН криосупернатантной плазмы регулируют до рН около 7,2. Затем предварительно охлажденный этанол добавляют при перемешивании плазмы до целевой концентрации этанола около 8% об./об или около. В то же время температуру дополнительно снижают до значения от около -2°С до около +2°С. В предпочтительном варианте осуществления температуру снижают до значения -1,5°С или около для осаждения загрязняющих веществ, таких как а₂-макроглобулин, e_1A- и β_1C-глобулин, фибриноген и фактор VIII. Как правило, явление осаждения будет включать время выдержки менее по меньшей мере около 1 ч, Несмотря на то что также могут быть использованы более короткие или более длительные периоды времени выдержки. Затем супернатант (супернатант I), в идеале содержащий большую часть содержимого IgG, присутствующего в DDCPP, собирают посредством центрифугирования, фильтрования или другого подходящего способа.The starting material for fractionation I was DDCPP (supernatant after adsorption of C1 inhibitor). The DDCPP is typically cooled to about 0±2°C and the pH is adjusted to about 7.0 to about 7.5, preferably about 7.1 to about 7.3, most preferably about 7.2 by adding an acid such as acetic acid acids. In one embodiment, the pH of the cryosuppernatant plasma is adjusted to a pH of about 7.2. Pre-cooled ethanol is then added while mixing the plasma to a target ethanol concentration of about 8% v/v or so. At the same time, the temperature is further reduced to a value of from about -2°C to about +2°C. In a preferred embodiment, the temperature is reduced to -1.5°C or so to precipitate contaminants such as a ₂ -macroglobulin, e _1A - and β _1C -globulin, fibrinogen and factor VIII. Typically, the precipitation phenomenon will involve a dwell time of less than at least about 1 hour, although shorter or longer dwell times may also be used. The supernatant (supernatant I), ideally containing most of the IgG content present in the DDCPP, is then collected by centrifugation, filtration or other suitable method.

По сравнению с общепринятыми способами, применяемыми в качестве первой стадии фракционирования для криосупернатантной плазмы (Cohn et al., выше; Oncley et al, выше), в настоящем изобретении в некоторых вариантах осуществления представлены способы, которые обеспечивают улучшенные выходы IgG из фракции супернатанта I. В одном варианте осуществления улучшенного выхода IgG достигают посредством добавления спирта посредством распыления. В другом варианте осуществления улучшенного выхода IgG достигают посредством добавления рН-модифицирующего средства посредством распыления. В другом варианте осуществления улучшенного выхода IgG достигают посредством регулирования рН раствора после добавления спирта. В связанном варианте осуществления улучшенного выхода IgG достигают посредством регулирования рН раствора в ходе добавления спирта.Compared to conventional methods used as a first fractionation step for cryosupernatant plasma (Cohn et al., supra; Oncley et al., supra), the present invention in some embodiments provides methods that provide improved IgG yields from supernatant fraction I. In one embodiment, improved IgG yield is achieved by adding alcohol via nebulization. In another embodiment, improved IgG yield is achieved by adding a pH modifying agent via nebulization. In another embodiment, improved IgG yield is achieved by adjusting the pH of the solution after adding alcohol. In a related embodiment, improved IgG yield is achieved by adjusting the pH of the solution during the addition of the alcohol.

В одном конкретном аспекте улучшение относится к способу, в котором уменьшенное количество IgG представляет собой потерю в осажденной фракции на первой стадии осаждения. Например, в определенных вариантах осуществления уменьшенное количество IgG представляет собой потерю в осажденной фракции на первой стадии осаждения по сравнению с количеством IgG, утерянным на первой стадии осаждения протокола способа 6 по Кону.In one particular aspect, the improvement relates to a method in which a reduced amount of IgG is lost in the precipitated fraction in the first precipitation step. For example, in certain embodiments, the reduced amount of IgG represents loss in the precipitated fraction in the first precipitation step compared to the amount of IgG lost in the first precipitation step of the Cohn Method 6 protocol.

В определенных вариантах осуществления улучшение процесса реализовано посредством регулирования рН раствора до значения от около 7,0 до около 7,5 после добавления спирта для осаждения. В других вариантах осуществления рН раствора регулируют до значения от около 7,1 до около 7,3 после добавления спирта для осаждения.In certain embodiments, process improvement is realized by adjusting the pH of the solution to a value of from about 7.0 to about 7.5 after adding the alcohol to precipitate. In other embodiments, the pH of the solution is adjusted to a value of from about 7.1 to about 7.3 after adding alcohol to precipitate.

В следующих вариантах осуществления рН раствора регулируют до значения около 7,0 или около 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 или 7,5 после добавления спирта для осаждения. В конкретном варианте осуществления рН раствора регулируют до значения около 7,2 после добавления спирта для осаждения. Соответственно в определенных вариантах осуществления уменьшенное количество IgG утеряно в осажденной фракции на первой стадии осаждения по сравнению с аналогичной стадией осаждения, в которой рН раствора регулируют до, но не после добавления спирта для осаждения. В одном варианте осуществления рН поддерживают на необходимом уровне в ходе выдерживания для осаждения или времени инкубации посредством непрерывного регулирования рН раствора. В одном варианте осуществления спирт представляет собой этанол.In further embodiments, the pH of the solution is adjusted to about 7.0, or about 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, or 7.5 after adding the alcohol to precipitate. In a specific embodiment, the pH of the solution is adjusted to about 7.2 after adding alcohol to precipitate. Accordingly, in certain embodiments, a reduced amount of IgG is lost in the precipitate fraction in the first precipitation step compared to a similar precipitation step in which the pH of the solution is adjusted before, but not after, the addition of the precipitation alcohol. In one embodiment, the pH is maintained at the desired level during the settling or incubation time by continuously adjusting the pH of the solution. In one embodiment, the alcohol is ethanol.

В других определенных вариантах осуществления улучшение процесса реализуют посредством добавления спирта для осаждения и/или раствора, применяемого для регулирования рН посредством распыления, а не посредством добавления потоком. Соответственно в определенных вариантах осуществления уменьшенное количество IgG утеряно в осажденной фракции на первой стадии осаждения по сравнению с аналогичной стадией осаждения, в которой спирт и/или раствор, применяемый для регулирования рН, вводят посредством добавления потоком. В одном варианте осуществления сприт представляет собой этанол.In other certain embodiments, process improvement is achieved by adding a precipitating alcohol and/or a solution used to adjust the pH by spraying rather than by adding a stream. Accordingly, in certain embodiments, a reduced amount of IgG is lost in the precipitate fraction in the first precipitation step compared to a similar precipitation step in which the alcohol and/or pH adjusting solution is added by flow addition. In one embodiment, the sprit is ethanol.

В следующих определенных вариантах осуществления улучшение реализуют посредством регулирования рН раствора до значения от около 7,0 до около 7,5. В предпочтительном варианте осуществления рН раствора регулируют до значения от около 7,1 до около 7,3. В других вариантах осуществления рН раствора регулируют до около 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 или 7,5 после добавления спирта для осаждения иIn certain further embodiments, the improvement is achieved by adjusting the pH of the solution to a value of from about 7.0 to about 7.5. In a preferred embodiment, the pH of the solution is adjusted to a value of from about 7.1 to about 7.3. In other embodiments, the pH of the solution is adjusted to about 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, or 7.5 after adding alcohol to precipitate and

- 8 045585 посредством добавления спирта для осаждения и/или раствора, применяемого для регулирования рН посредством распыления, а не посредством добавления потоком. В конкретном варианте осуществления рН раствора регулируют до около 7,2 после добавления спирта для осаждения и посредством добавления спирта для осаждения и/или раствора, применяемого для регулирования рН посредством распыления, а не добавления потоком. В одном варианте осуществления сприт представляет собой этанол.- 8 045585 by adding alcohol to precipitate and/or a solution used to adjust the pH by spraying rather than by adding in a stream. In a particular embodiment, the pH of the solution is adjusted to about 7.2 after the addition of the precipitating alcohol and by adding the precipitating alcohol and/or the solution used to adjust the pH by spray rather than by flow addition. In one embodiment, the sprit is ethanol.

4. Второе явление осаждения - модифицированное фракционирование II+III.4. The second precipitation phenomenon is modified II+III fractionation.

Для дальнейшего повышения содержания IgG и чистоты фракционирования супернатант I подвергают второй стадии осаждения, которая представляет собой модифицированное фракционирование фракции II+III по Кону-Онкли. В целом, рН раствора регулируют до значения от около 6,6 до около 6,8. В предпочтительном варианте осуществления рН раствора регулируют до около 6,7. Затем в раствор добавляют спирт, предпочтительно этанол, при перемешивании до конечной концентрации от около 20% до около 25% (об./об.) для осаждения IgG во фракции. В предпочтительном варианте осуществления спирт добавляют до конечной концентрации около 25% (об./об.) для осаждения IgG во фракции. В целом, загрязняющие вещества, такие как αι-липопротеин, αι-антитрипсин, Gc-глобулины, α_1X-гликопротеин, гаптоглобулин, церулооплазмин, трансферрин, гемопексин, фракция плазменный компонент тромбопластина, глобулин сыворотки, связывающий тироксин, холинэстераза, гипертензиноген и альбумин не будут осаждаться при данной температуре.To further increase the IgG content and fractionation purity, supernatant I is subjected to a second precipitation step, which is a modified Cohn-Onkley fractionation of fraction II+III. In general, the pH of the solution is adjusted to a value of from about 6.6 to about 6.8. In a preferred embodiment, the pH of the solution is adjusted to about 6.7. An alcohol, preferably ethanol, is then added to the solution with stirring to a final concentration of about 20% to about 25% (v/v) to precipitate the IgG into the fraction. In a preferred embodiment, alcohol is added to a final concentration of about 25% (v/v) to precipitate the IgG into the fraction. In general, contaminants such as αι-lipoprotein, αι-antitrypsin, Gc-globulins, _α1X -glycoprotein, haptoglobulin, ceruloplasmin, transferrin, hemopexin, plasma fraction of thromboplastin, serum thyroxine-binding globulin, cholinesterase, hypertensinogen and albumin are not will precipitate at this temperature.

До или совместно с добавлением спирта раствор дополнительно охлаждают до температуры от около -7°С до около -9°С. В предпочтительном варианте осуществления раствор охлаждают до температуры около -7°С. После завершения добавления спирта рН раствора немедленно регулируют до значения от около 6,8 до около 7,0. В предпочтительном варианте осуществления рН раствора регулируют до около 6,9. Как правило, явление осаждения будет включать время выдержки менее по меньшей мере около 10 ч, несмотря на то что также могут быть использованы более короткие или более длительные периоды времени выдержки. Затем осадок (модифицированная фракция II+III), которая в идеале содержит по меньшей мере около 85%, предпочтительно по меньшей мере около 90%, более предпочтительно по меньшей мере около 95% содержания IgG, присутствующего в криосупернатантной плазме, отделяют от супернатанта посредством центрифугирования, фильтрации или другого подходящего способа и собирают. По сравнению с общепринятыми способами, применяемыми в качестве стадии второго фракционирования для криосупернатантной плазмы (Cohn et al., выше; Oncley et al., выше), в настоящем изобретение в некоторых вариантах осуществления представлены способы, которые обеспечивают улучшенные выходы IgG в осадке модифицированной фракции II+III. В связанном варианте осуществления настоящего изобретения представлены способы, которые обеспечивают сниженную потерю IgG в модифицированном супернатанте II+III.Before or together with the addition of alcohol, the solution is further cooled to a temperature of from about -7°C to about -9°C. In a preferred embodiment, the solution is cooled to a temperature of about -7°C. Once the addition of alcohol is complete, the pH of the solution is immediately adjusted to a value of about 6.8 to about 7.0. In a preferred embodiment, the pH of the solution is adjusted to about 6.9. Typically, the precipitation phenomenon will involve a dwell time of less than at least about 10 hours, although shorter or longer dwell times may also be used. The precipitate (modified fraction II+III), which ideally contains at least about 85%, preferably at least about 90%, more preferably at least about 95% of the IgG content present in the cryosupernatant plasma, is then separated from the supernatant by centrifugation , filtration or other suitable method and collected. Compared to conventional methods used as a second fractionation step for cryosupernatant plasma (Cohn et al., supra; Oncley et al., supra), the present invention in some embodiments provides methods that provide improved IgG yields in the modified fraction pellet II+III. In a related embodiment, the present invention provides methods that provide reduced loss of IgG in a modified II+III supernatant.

По сравнению с общепринятыми способами, применяемыми в качестве стадии второго фракционирования для криосупернатантной плазмы (Cohn et al., выше; Oncley et al., выше), в настоящем изобретение в некоторых вариантах осуществления представлены способы, которые обеспечивают улучшенные выходы IgG в осадке модифицированной фракции II+III. В одном варианте осуществления улучшение реализуют посредством добавления спирта посредством распыления. В другом варианте осуществления улучшение реализуют посредством добавления рН-модифицирующего средства посредством распыления. В другом варианте осуществления улучшение реализуют посредством регулирования рН раствора после добавления спирта. В связанном варианте осуществления улучшение реализуют посредством регулирования рН раствора в ходе добавления спирта. В другом варианте осуществления улучшение реализуют посредством повышения концентрации спирта (например, этанола) до около 25% (об./об.). В другом варианте осуществления улучшение реализуют посредством снижения температуры стадии осаждения до температуры от около -7°С до около -9°С. В предпочтительном варианте осуществления улучшение реализуют посредством повышения концентрации спирта (например, этанола) до около 25% (об./об.) и снижения температуры до значения от около -7°С до около -9°С. Для сравнения, как в Cohn et al., так и в Oncley et al. осаждение осуществляют при температуре -5°С, при этом в Oncley et al. применяют 20% спирта с целью снижения уровня загрязняющих веществ в осадке. Преимущественно способы, представленные в данном документе, обеспечивают максимальный выход IgG без высоких уровней загрязнения конечного продукта.Compared to conventional methods used as a second fractionation step for cryosupernatant plasma (Cohn et al., supra; Oncley et al., supra), the present invention in some embodiments provides methods that provide improved IgG yields in the modified fraction pellet II+III. In one embodiment, the improvement is realized by adding alcohol by spraying. In another embodiment, the improvement is realized by adding a pH-modifying agent through spraying. In another embodiment, the improvement is realized by adjusting the pH of the solution after adding alcohol. In a related embodiment, the improvement is realized by adjusting the pH of the solution during the addition of the alcohol. In another embodiment, the improvement is realized by increasing the concentration of alcohol (eg, ethanol) to about 25% (v/v). In another embodiment, the improvement is realized by reducing the temperature of the deposition step to a temperature of from about -7°C to about -9°C. In a preferred embodiment, the improvement is achieved by increasing the alcohol (eg, ethanol) concentration to about 25% (v/v) and decreasing the temperature to about -7°C to about -9°C. In comparison, both Cohn et al. and Oncley et al. precipitation is carried out at -5°C, while Oncley et al. 20% alcohol is used to reduce the level of pollutants in the sediment. Advantageously, the methods presented herein provide maximum IgG yield without high levels of contamination of the final product.

Было обнаружено, что если перед добавлением осаждающего спирта рН раствора регулируют до около 6,9, рН раствора сдвигается от 6,9 до значения от около 7,4 до около 7,7, частично вследствие осаждения белка. По мере того как рН раствора сдвигается от 6,9, осаждение IgG становится менее благоприятным, а осаждение некоторых загрязняющих веществ становится более благоприятным. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что при регулировании рН раствора после добавления осаждающего спирта в осадке фракции II+III извлекается более высокий процент IgG.It has been found that if the pH of the solution is adjusted to about 6.9 before adding the precipitating alcohol, the pH of the solution shifts from 6.9 to about 7.4 to about 7.7, due in part to protein precipitation. As the solution pH moves away from 6.9, precipitation of IgG becomes less favorable and precipitation of some contaminants becomes more favorable. The present inventors have found that by adjusting the pH of the solution after adding the precipitating alcohol, a higher percentage of IgG is recovered from the fraction II+III precipitate.

В различных вариантах осуществления улучшение, реализуемое посредством настоящего изобретения, связано со способом, в котором сниженное количество IgG утеряно в супернатантной фракции на стадии осаждения модифицированной фракции II+III по сравнению с идентичным способом, в котором улучшение настоящего изобретения не включено. Другими словами повышенный процент исходного IgG присутствует в осадке фракции II+III. В определенных вариантах осуществления улучшение процес- 9 045585 са реализую посредством регулирования рН раствора до значения от около 6,7 до около 7,1 сразу после или в ходе добавления спирта для осаждения. В некоторых вариантах осуществления улучшение процесса реализуют посредством поддержания рН раствора от около 6,7 до около 7,1 непрерывно в ходе периода осаждения и/или инкубации. В некоторых вариантах осуществления рН раствора регулируют до значения от около 6,8 до около 7,0 сразу после или в ходе добавления спирта для осаждения, или до рН около 6,7, 6,8, 6,9, 7,0 или 7,1 сразу после или в ходе добавления спирта для осаждения. В конкретном варианте осуществления рН раствора регулируют до около 6,9 сразу после или в ходе добавления спирта для осаждения. В определенных вариантах осуществления рН раствора поддерживают на значении от около 6,8 до около 7,0 непрерывно в ходе периода осаждения и инкубации, или при рН около 6,9 непрерывно в ходе периода осаждения и инкубации. Применение параметров процесса по настоящему изобретению в определенных вариантах осуществления уменьшенное количество IgG утеряно в супернатантной фракции второй стадии осаждения по сравнению с аналогичной стадией осаждения, в которой рН раствора регулируют до, но не после добавления спирта для осаждения, или с аналогичной стадией осаждения, в которой рН раствора не поддерживают в ходе всего периода осаждения и инкубации. В одном варианте осуществления рН поддерживают на необходимом уровне в ходе выдерживания для осаждения или времени инкубации посредством непрерывного регулирования рН раствора. В одном варианте осуществления спирт представляет собой этанол.In various embodiments, the improvement realized by the present invention is associated with a method in which a reduced amount of IgG is lost in the supernatant fraction during the modified fraction II+III precipitation step compared to an identical method in which the improvement of the present invention is not included. In other words, an increased percentage of the original IgG is present in the sediment of fraction II+III. In certain embodiments, process improvement is realized by adjusting the pH of the solution to a value of from about 6.7 to about 7.1 immediately after or during the addition of the precipitation alcohol. In some embodiments, process improvement is achieved by maintaining the pH of the solution from about 6.7 to about 7.1 continuously during the precipitation and/or incubation period. In some embodiments, the pH of the solution is adjusted to a value of about 6.8 to about 7.0 immediately after or during the addition of the alcohol to precipitate, or to a pH of about 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, or 7 ,1 immediately after or during the addition of alcohol for precipitation. In a particular embodiment, the pH of the solution is adjusted to about 6.9 immediately after or during the addition of the alcohol for precipitation. In certain embodiments, the pH of the solution is maintained at a value of about 6.8 to about 7.0 continuously during the precipitation and incubation period, or at a pH of about 6.9 continuously during the precipitation and incubation period. Using the process parameters of the present invention, in certain embodiments, a reduced amount of IgG is lost in the supernatant fraction of the second precipitation step compared to a similar precipitation step in which the pH of the solution is adjusted before, but not after the addition of the alcohol for precipitation, or with a similar precipitation step in which The pH of the solution is not maintained during the entire precipitation and incubation period. In one embodiment, the pH is maintained at the desired level during the settling or incubation time by continuously adjusting the pH of the solution. In one embodiment, the alcohol is ethanol.

В некоторых вариантах осуществления улучшение процесса реализуют посредством добавления спирта для осаждения и/или раствора, применяемого для регулирования рН посредством распыления, а не добавления потоком. Соответственно в определенных вариантах осуществления уменьшенное количество IgG утеряно в супернатантной фракции на второй стадии осаждения по сравнению с аналогичной стадией осаждения, в которой спирт и/или раствор, применяемый для регулирования рН, вводят посредством порционного добавления потоком. В одном варианте осуществления спирт представляет собой этанол.In some embodiments, process improvement is realized by adding a precipitating alcohol and/or a solution used to adjust the pH by spraying rather than adding in a stream. Accordingly, in certain embodiments, a reduced amount of IgG is lost in the supernatant fraction in the second precipitation step compared to a similar precipitation step in which the alcohol and/or pH adjusting solution is added via batch addition. In one embodiment, the alcohol is ethanol.

В другом варианте осуществления улучшение процесса реализуют посредством осуществления стадии осаждения при температуре от около -7°С до около -9°С. В одном варианте осуществления стадию осаждения осуществляют при температуре около -7°С. В одном иллюстративном варианте осуществления стадию осаждения осуществляют при температуре около -8°С. В различных вариантах осуществления стадию осаждения осуществляют при температуре около -9°С. В определенных вариантах осуществления концентрация спирта на стадии осаждения составляет от около 23% до около 27%. В предпочтительном варианте осуществления концентрация is спирта составляет от около 24% до около 26%. В одном иллюстративном варианте осуществления концентрация спирта составляет около 25%. В некоторых вариантах осуществления концентрация спирта может составлять 23, 24, 25, 26 или 27%, или около. В одном иллюстративном варианте осуществления вторую стадию осаждения осуществляют при температуре -7°С или около при концентрации спирта около 25%. В одном варианте осуществления спирт представляет собой этанол.In another embodiment, process improvement is realized by performing the precipitation step at a temperature of about -7°C to about -9°C. In one embodiment, the precipitation step is carried out at a temperature of about -7°C. In one illustrative embodiment, the deposition step is carried out at a temperature of about -8°C. In various embodiments, the deposition step is carried out at a temperature of about -9°C. In certain embodiments, the alcohol concentration in the precipitation step is from about 23% to about 27%. In a preferred embodiment, the is alcohol concentration is from about 24% to about 26%. In one illustrative embodiment, the alcohol concentration is about 25%. In some embodiments, the alcohol concentration may be 23, 24, 25, 26, or 27%, or about. In one illustrative embodiment, the second precipitation step is carried out at or about -7° C. at an alcohol concentration of about 25%. In one embodiment, the alcohol is ethanol.

Эффект увеличения концентрации спирта во втором осаждении с 20%, как это было использовано в Oncley et al., выше, до 25% и снижения температуры инкубации -5°С, как это было использовано в способах по Кону и Онкли, до около -7°С заключается в неожиданном повышении содержания IgG в осадке модифицированной фракции II+III на 5-6%.The effect of increasing the alcohol concentration in the second precipitation from 20%, as used in Oncley et al., is higher, to 25%, and reducing the incubation temperature to -5°C, as used in the methods of Cohn and Oncley, to about -7 °C is an unexpected increase in the IgG content in the sediment of the modified fraction II+III by 5-6%.

В другом варианте осуществления улучшение процесса реализуют посредством регулирования рН раствора до значения от около 6,7 до около 7,1, предпочтительно до значения 6,9 или около, сразу после или в ходе добавления спирта для осаждения, поддерживая рН раствора на значении от около 6,7 до около 7,1, предпочтительно при 6,9 или около, посредством непрерывного регулирования рН в ходе периода осаждения и инкубации и посредством добавления спирта для осаждения и/или раствора, применяемого для регулирования рН посредством распыления, а не посредством добавления потоком.In another embodiment, process improvement is achieved by adjusting the pH of the solution to a value of from about 6.7 to about 7.1, preferably to a value of 6.9 or about, immediately after or during the addition of the precipitation alcohol, maintaining the pH of the solution at a value of about 6.7 to about 7.1, preferably at or about 6.9, by continuously adjusting the pH during the settling and incubation period and by adding a precipitating alcohol and/or solution used to adjust the pH by spray rather than by flow addition .

В одном иллюстративном варианте осуществления улучшение процесса реализуют посредством осуществления стадии осаждения при температура от около -7°С до около -9°С, например -7°С и посредством осаждения IgG с концентрацией спирта от около 23% до около 27%, например 25%. В различных вариантах осуществления улучшение процесса реализуют посредством введения всех улучшений модифицированной фракции II+III, представленных выше, в процесс. В одном иллюстративном варианте осуществления улучшение процесса реализуют посредством осаждения IgG при температуре -7°С с 25% этанола, добавленного посредством распыления, а затем регулирования рН раствора до 6,9 после добавления спирта для осаждения. В другом предпочтительном варианте осуществления рН раствора поддерживают на значении 6,9 в течение всего времени осаждения, инкубации или удержания.In one illustrative embodiment, process improvement is realized by performing the precipitation step at a temperature of about -7°C to about -9°C, for example -7°C, and by precipitating IgG at an alcohol concentration of about 23% to about 27%, for example 25 %. In various embodiments, process improvement is realized by introducing all of the modified fraction II+III improvements presented above into the process. In one exemplary embodiment, process improvement is realized by precipitating IgG at -7°C with 25% ethanol added by nebulization and then adjusting the pH of the solution to 6.9 after adding alcohol to precipitate. In another preferred embodiment, the pH of the solution is maintained at 6.9 throughout the precipitation, incubation or retention time.

5. Экстракция осадка модифицированной фракции II+III.5. Extraction of sediment of modified fraction II+III.

Для солюбилизации IgG, содержащегося в осадке модифицированной фракции II+III, для повторного суспендирования осадка фракционирования II+III используют холодный буфер для экстракции в соотношении примерно 1 часть осадка на около 15 частей буфера для экстракции. Можно использовать другие подходящие соотношения повторного суспендирования, например, от около 1:8 до около 1:30, например от около 1:10 до около 1:20, от около 1:12 до около 1:18, от около 1:13 до около 1:17, от около 1:14 до около 1:16. В определенных вариантах осуществления соотношение повторного суспендированияTo solubilize the IgG contained in the modified fraction II+III precipitate, cold extraction buffer is used to resuspend the II+III fractionation precipitate at a ratio of about 1 part precipitate to about 15 parts extraction buffer. Other suitable resuspension ratios may be used, for example, from about 1:8 to about 1:30, for example from about 1:10 to about 1:20, from about 1:12 to about 1:18, from about 1:13 to around 1:17, from around 1:14 to around 1:16. In certain embodiments, the resuspension ratio

- 10 045585 может составлять 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24,- 10 045585 can be 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1 :19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24,

1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30 или более.1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30 or more.

Подходящие растворы для экстракции модифицированного осадка II+III обычно имеют рН от около 4,0 до около 5,5. В определенных вариантах осуществления раствор имеет рН от около 4,5 до около 5,0. В некоторых вариантах осуществления раствор для экстракции имеет рН около 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4 или 5,5. В одном иллюстративном варианте осуществления рН экстракционного буфера составляет около 4,5. В одном иллюстративном варианте осуществления рН экстракционного буфера составляет около 4,7. В одном иллюстративном варианте осуществления рН экстракционного буфера будет составлять около 4,9. Как правило, данные требования к рН могут быть удовлетворены с использованием буферного средства, выбранного, например, из ацетата, цитрата, одноосновного фосфата, двухосновного фосфата, их смесей и т.п. Подходящие концентрации буфера обычно варьируют от около 5 мМ до около 100 мМ, или от около 10 мМ до около 50 мМ, или около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 мМ или 100 мМ буферного средства.Suitable II+III modified precipitate extraction solutions typically have a pH of about 4.0 to about 5.5. In certain embodiments, the solution has a pH of from about 4.5 to about 5.0. In some embodiments, the extraction solution has a pH of about 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4 or 5.5. In one illustrative embodiment, the pH of the extraction buffer is about 4.5. In one illustrative embodiment, the pH of the extraction buffer is about 4.7. In one illustrative embodiment, the pH of the extraction buffer will be about 4.9. Typically, these pH requirements can be met using a buffer agent selected from, for example, acetate, citrate, monobasic phosphate, dibasic phosphate, mixtures thereof, and the like. Suitable buffer concentrations typically range from about 5 mM to about 100 mM, or from about 10 mM to about 50 mM, or about 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 mM or 100 mM buffer.

Иллюстративные экстракционные буферы имеют проводимость от около 0,5 мСм/см^-1 до около 2,0 мСм/см^-1. Например, в определенных вариантах осуществления проводимость экстракционного буфера составляет около 0,5 мСм/см^-1, или около 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 или около 2,0 мСм/см^-1. Специалисту в данной области техники известно, как создавать экстракционные буферы, имеющие соответствующую проводимость.Exemplary extraction buffers have a conductivity of from about 0.5 mS/cm ^-1 to about 2.0 mS/cm ^-1 . For example, in certain embodiments, the conductivity of the extraction buffer is about 0.5 mS/cm ^-1 , or about 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9 or about 2.0 mS/cm ^-1 . One skilled in the art will know how to create extraction buffers having appropriate conductivity.

В одном конкретном варианте осуществления иллюстративный экстракционный буфер может содержать примерно 5 мМ одноосновного фосфата натрия и примерно 5 мМ ацетата при рН около 4,5±0,2 и проводимости около 0,7-0,9 мСм/см.In one particular embodiment, an exemplary extraction buffer may contain about 5 mM monobasic sodium phosphate and about 5 mM acetate at a pH of about 4.5±0.2 and a conductivity of about 0.7-0.9 mS/cm.

В целом, экстракцию осуществляют при температуре от около 0°С до около 10°С или от около 2°С до около 8°С. В определенных вариантах осуществления экстракцию можно осуществлять при температуре около 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10°С. В одном иллюстративном варианте осуществления экстракцию осуществляют при температуре от около 2°С до около 10°С. Как правило, процесс экстракции будет проходить в течение от около 60 мин до около 300 мин, или в течение от около 120 мин до около 240 мин, или от около 150 мин до около 210 мин при непрерывном перемешивании суспензии. В определенных вариантах осуществления процесс экстракции будет проходить в течение 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 мин или около 300 мин. В предпочтительном варианте осуществления процесс экстракции будет проходить в течение по меньшей мере около 160 мин при непрерывном перемешивании.In general, extraction is carried out at a temperature of from about 0°C to about 10°C, or from about 2°C to about 8°C. In certain embodiments, the extraction can be performed at a temperature of about 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10°C. In one illustrative embodiment, the extraction is carried out at a temperature of from about 2°C to about 10°C. Typically, the extraction process will take place over a period of from about 60 minutes to about 300 minutes, or from about 120 minutes to about 240 minutes, or from about 150 minutes to about 210 minutes, with continuous stirring of the suspension. In certain embodiments, the extraction process will proceed for 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 min or about 300 min. In a preferred embodiment, the extraction process will take place for at least about 160 minutes with continuous stirring.

Было обнаружено, что в способах с использованием экстракционного буфера, содержащего 5 мМ одноосновного фосфата натрия, 5 мМ ацетата и от 0,051 до 0,06% ледяной уксусной кислоты (об./об.), существенное увеличение выхода в конечной композиции IgG может быть получено без ущерба для чистоты конечного продукта. В предпочтительном варианте осуществления осадок фракции II+III экстрагируют пастой до отношения буфера 1:15 или около при рН 4,5±0,2 или около.It has been found that in methods using an extraction buffer containing 5 mM monobasic sodium phosphate, 5 mM acetate and 0.051 to 0.06% glacial acetic acid (v/v), a significant increase in yield in the final IgG composition can be obtained without compromising the purity of the final product. In a preferred embodiment, the fraction II+III precipitate is extracted with a paste to a buffer ratio of 1:15 or so at a pH of 4.5±0.2 or so.

Преимущественно было обнаружено, что по сравнению с существующим в настоящее время процессом производства GAMMAGARD® LIQUID (Baxter Healthcare), в котором используют экстракционный буфер, содержащий 5 мМ одноосновного фосфата натрия, 5 мМ ацетата и 0,051% ледяной уксусной кислоты (об./об.), посредством повышения содержания ледяной уксусной кислоты до 0,06% (об./об.) или около можно получить существенное увеличение выхода конечной композиции IgG. По сравнению со способами, ранее использовавшимися для экстракции осадка, образованного на второй стадии осаждения (GAMMAGARD® LIQUID), в настоящем изобретении в нескольких вариантах осуществления представлены способы, которые приводят к повышению выхода IgG в суспензии модифицированной фракции II+III.Advantageously, it was found that compared to the current GAMMAGARD® LIQUID manufacturing process (Baxter Healthcare), which uses an extraction buffer containing 5 mM sodium phosphate monobasic, 5 mM acetate, and 0.051% glacial acetic acid (v/v). ), by increasing the glacial acetic acid content to 0.06% (v/v) or so, a significant increase in the yield of the final IgG composition can be obtained. Compared to methods previously used to extract the precipitate formed in the second precipitation step (GAMMAGARD® LIQUID), the present invention provides in several embodiments methods that result in increased IgG yield in a modified fraction II+III suspension.

В одном варианте осуществления улучшение относится к способу, в котором уменьшенное количество IgG утеряно в нерастворимой фракции осадка модифицированной фракции II+III. В одном варианте осуществления улучшение процесса реализуют посредством экстракции осадка модифицированной фракции II+III с соотношением 1:15 (осадка к буферу) раствором, содержащим 5 мМ одноосновного фосфата натрия, 5 мМ ацетата и 0,06% ледяной уксусной кислоты (об./об.). В другом варианте осуществления улучшение реализуют посредством поддержания рН раствора относительно постоянным в ходе процесса экстракции. В одном варианте осуществления рН раствора поддерживают на значении от около 4,1 до около 4,9 в ходе процесса экстракции. В одном иллюстративном варианте осуществления рН раствора поддерживают на значении от около 4,2 до около 4,8 в ходе процесса экстракции. В некоторых вариантах осуществления рН раствора поддерживают на значении от около 4,3 до около 4,7 в ходе процесса экстракции. В различных вариантах осуществления рН раствора поддерживают на значении от около 4,4 до около 4,6 в ходе процесса экстракции. В некоторых вариантах осуществления рН раствора поддерживают на значении 4,5 в ходе процесса экстракции.In one embodiment, the improvement relates to a method in which a reduced amount of IgG is lost in the insoluble fraction of the modified fraction II+III precipitate. In one embodiment, process improvement is achieved by extracting the 1:15 modified fraction II+III precipitate (precipitate to buffer) with a solution containing 5 mM monobasic sodium phosphate, 5 mM acetate, and 0.06% glacial acetic acid (v/v). .). In another embodiment, the improvement is realized by maintaining the pH of the solution relatively constant during the extraction process. In one embodiment, the pH of the solution is maintained at a value of from about 4.1 to about 4.9 during the extraction process. In one illustrative embodiment, the pH of the solution is maintained at a value of from about 4.2 to about 4.8 during the extraction process. In some embodiments, the pH of the solution is maintained at a value of from about 4.3 to about 4.7 during the extraction process. In various embodiments, the pH of the solution is maintained at a value of from about 4.4 to about 4.6 during the extraction process. In some embodiments, the pH of the solution is maintained at 4.5 during the extraction process.

В одном иллюстративном варианте осуществления улучшение относится к способу, в котором повышенное количество IgG солюбилизируют из осадка фракции II+III на стадии растворения фракции II+III. В одном варианте осуществления улучшение процесса реализуют посредством солюбилизации осадка фракции II+III в буфере для растворения, содержащем около 600 мл ледяной уксусной кислоты наIn one illustrative embodiment, the improvement relates to a method in which an increased amount of IgG is solubilized from the Fraction II+III precipitate in the Fraction II+III dissolution step. In one embodiment, process improvement is realized by solubilizing the fraction II+III precipitate in a dissolution buffer containing about 600 ml of glacial acetic acid per

- 11 045585 около 1000 л. В другом варианте осуществления улучшение относится к способу, в котором количество примесей снижается после солюбилизации IgG в осадке фракции II+III. В одном варианте осуществления улучшение процесса реализуют посредством смешивания мелкодисперсного диоксида кремния (SiO2) с суспензией фракции II+III в течение по меньшей мере около 30 мин.- 11 045585 about 1000 l. In another embodiment, the improvement relates to a method in which the amount of impurities is reduced after solubilization of the IgG in the fraction II+III precipitate. In one embodiment, process improvement is achieved by mixing fine silica (SiO2) with the Fraction II+III slurry for at least about 30 minutes.

6. Предварительная обработка и фильтрация суспензии модифицированной фракции II+III.6. Pre-treatment and filtration of the suspension of modified fraction II+III.

С целью улучшения несолюбилизированной фракции осадка модифицированной фракции II+III (т.е. осадка на фильтре модифицированной фракции II+III) суспензию фильтруют, обычно с использованием глубинной фильтрации. Глубинные фильтры, которые можно применять в способах, представленных в настоящем документе, включают металлические, стеклянные, керамические, органические (такие как диатомовая земля) глубинные фильтры и т.п. Пример подходящих фильтров включает без ограничения фильтры Cuno 50SA, Cuno 90SA и Cuno VR06 (Cuno). В качестве альтернативы стадию разделения можно осуществлять посредством центрифугирования, а не фильтрации.In order to improve the unsolubilized fraction of the modified fraction II+III cake (ie the modified fraction II+III filter cake), the suspension is filtered, usually using depth filtration. Depth filters that can be used in the methods presented herein include metal, glass, ceramic, organic (such as diatomaceous earth) depth filters, and the like. Examples of suitable filters include, but are not limited to, Cuno 50SA, Cuno 90SA, and Cuno VR06 (Cuno) filters. Alternatively, the separation step can be carried out by centrifugation rather than filtration.

Несмотря на то что описанные выше усовершенствования производственного процесса сводят к минимуму потери IgG на начальных стадиях процесса очистки, критические примеси, в том числе активность PKA, амидолитическая активность и содержание фибриногена, намного выше, если, например, пасту II+III экстрагируют при рН 4,5 или 4,6 по сравнению с тем, когда экстракцию осуществляют при рН от 4,9 до 5,0.Although the manufacturing process improvements described above minimize IgG losses early in the purification process, critical impurities, including PKA activity, amidolytic activity, and fibrinogen content, are much higher if, for example, the II+III paste is extracted at pH 4 .5 or 4.6 compared to when the extraction is carried out at a pH of 4.9 to 5.0.

В настоящее время обнаружено, что для уменьшения примесей, экстрагируемых в способах, представленных в настоящем документе, чистота композиции IgG может быть значительно повышена за счет добавления стадии предварительной обработки перед фильтрацией/центрифугированием. В одном варианте осуществления данная стадия предварительной обработки включает добавление частиц мелкодисперсного диоксида кремния (например, коллоидного диоксида кремния, Aerosil®). В одном иллюстративном варианте осуществления после данной обработки следует период инкубации 40-80 мин, при котором суспензия постоянно перемешивается. В определенных вариантах осуществления период инкубации составляет от около 50 мин до около 70 мин. В различных вариантах осуществления период инкубации составляет около 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 мин или более. В целом обработку будут осуществлять при температуре от около 0°С до около 10°С, или от около 2°С до около 8°С. В определенных вариантах осуществления экстракцию можно осуществлять при температуре около 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10°С. В конкретном варианте осуществления обработку осуществляют при температуре от около 2°С до около 10°С.It has now been discovered that to reduce the impurities extracted in the methods presented herein, the purity of the IgG composition can be significantly increased by adding a pretreatment step prior to filtration/centrifugation. In one embodiment, this pre-treatment step includes adding fine silica particles (eg, fumed silica, Aerosil®). In one exemplary embodiment, this treatment is followed by an incubation period of 40-80 minutes during which the suspension is continuously agitated. In certain embodiments, the incubation period is from about 50 minutes to about 70 minutes. In various embodiments, the incubation period is about 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 minutes or more. In general, processing will be carried out at a temperature of from about 0°C to about 10°C, or from about 2°C to about 8°C. In certain embodiments, the extraction can be performed at a temperature of about 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10°C. In a specific embodiment, the treatment is carried out at a temperature of from about 2°C to about 10°C.

Обработка коллоидным диоксидом кремния проиллюстрирована в WO 2011150284 A2. В данной заявке на патент осадок фракции II+III суспендируют и разделяют на два образца, один из которых осветляют с использованием фильтрующего материала только перед фильтрацией, а другой обрабатывают коллоидным диоксидом кремния перед добавлением фильтрующего материала и фильтрации. Как видно из хроматографических и количественных данных, образец фильтрата, предварительно обработанный коллоидальным диоксидом кремния, имел гораздо более высокую чистоту IgG, чем образец, обработанный только вспомогательным фильтрующим средством.Treatment with colloidal silica is illustrated in WO 2011150284 A2. In this patent application, the fraction II+III precipitate is suspended and separated into two samples, one of which is clarified using filter material just before filtration, and the other is treated with colloidal silica before adding filter material and filtration. As can be seen from the chromatographic and quantitative data, the filtrate sample pretreated with fumed silica had much higher IgG purity than the sample treated with filter aid alone.

В определенных вариантах осуществления коллоидный диоксид кремния добавляют в концентрации от около 20 г/кг пасты II+III до около 100 г/кг пасты II+III (например, осадка модифицированной фракции II+III, который экстрагируют в соотношении 1:15, коллоидный диоксид кремния необходимо добавлять в концентрации от около 20 г/16 кг суспензии II+III до около 100 г/16 кг суспензии II+III, или в конечной концентрации около 0,125% (вес/вес) до около 0,625% (вес/вес)). В определенных вариантах осуществления коллоидный диоксид кремния можно добавлять в концентрации около 20 г/кг пасты II+III, или около 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, или 100 г/кг пасты II+III. В одном конкретном варианте осуществления коллоидный диоксид кремния (например, Aerosil 380 или эквивалент) добавляют к суспензии модифицированной фракции II+III до конечной концентрации около 40 г/16 кг II+III. Смешивание происходит при температуре от около 2°С до около 8°С в течение по меньшей мере от около 50 мин до около 70 мин.In certain embodiments, colloidal silica is added at a concentration of from about 20 g/kg II+III paste to about 100 g/kg II+III paste (e.g., modified II+III fraction extracted at a ratio of 1:15 colloidal silica silicon must be added in concentrations ranging from about 20 g/16 kg of suspension II+III to about 100 g/16 kg of suspension II+III, or in a final concentration of about 0.125% (w/w) to about 0.625% (w/w) . In certain embodiments, fumed silica may be added at a concentration of about 20 g/kg II+III paste, or about 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 , 95, or 100 g/kg of paste II+III. In one particular embodiment, colloidal silica (eg Aerosil 380 or equivalent) is added to the modified fraction II+III suspension to a final concentration of about 40 g/16 kg II+III. Mixing occurs at a temperature of about 2°C to about 8°C for at least about 50 minutes to about 70 minutes.

В определенных вариантах осуществления SiO2 добавляют к композиции IgG при концентрации от около 0,01 г/г белка до около 10 г/г белка. В другом варианте осуществления SiO2 добавляют к композиции IgG в концентрации от около 0,01 г/г белка до около 5 г/г белка. В другом варианте осуществления SiO₂ добавляют к композиция IgG в концентрации от около 0,02 г/г белка до около 4 г/г белка. В одном варианте осуществления SiO₂ добавляют в конечной концентрации по меньшей мере 0,1 г на грамм общего белка. В другом конкретном варианте осуществления коллоидный диоксид кремния добавляют в концентрации по меньшей мере 0,2 г на грамм общего белка. В другом конкретном варианте осуществления коллоидный диоксид кремния добавляют в концентрации по меньшей мере 0,25 г на грамм общего белка. В других конкретных вариантах осуществления коллоидный диоксид кремния добавляют в концентрации по меньшей мере 1 г на грамм общего белка. В другом конкретном варианте осуществления коллоидный диоксид кремния добавляют в концентрации по меньшей мере 2 г на грамм общего белка. В другом конкретном варианте осуществления коллоидный диоксид кремния добавляют в концентрации по меньшей мере 2,5 г на грамм общего белка. В других конкретных вариантах осуществления мелкодисперсный диоксид кремния добавляют в концентрации по меньшей мере 0,01 г/г общего белка или поIn certain embodiments, SiO2 is added to the IgG composition at a concentration of from about 0.01 g/g protein to about 10 g/g protein. In another embodiment, SiO2 is added to the IgG composition at a concentration of from about 0.01 g/g protein to about 5 g/g protein. In another embodiment, SiO ₂ is added to the IgG composition at a concentration of from about 0.02 g/g protein to about 4 g/g protein. In one embodiment, SiO ₂ is added at a final concentration of at least 0.1 g per gram of total protein. In another specific embodiment, colloidal silica is added at a concentration of at least 0.2 grams per gram of total protein. In another specific embodiment, colloidal silica is added at a concentration of at least 0.25 grams per gram of total protein. In other specific embodiments, fumed silica is added at a concentration of at least 1 gram per gram of total protein. In another specific embodiment, colloidal silica is added at a concentration of at least 2 grams per gram of total protein. In another specific embodiment, colloidal silica is added at a concentration of at least 2.5 grams per gram of total protein. In other specific embodiments, the micronized silica is added at a concentration of at least 0.01 g/g total protein or

- 12 045585 меньшей мере 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0,- 12 045585 at least 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0 ,4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0,

2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0 г или более на грамм общего белка.2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8, 5, 9.0, 9.5, 10.0 g or more per gram of total protein.

В определенных вариантах осуществления фильтрующая добавка, например Celpure C300 (Celpure) или Hyflo-Supper-Cel (World Minerals), добавляют после обработки диоксидом кремния для облегчения глубинной фильтрации. Фильтрующую добавку можно добавлять в конечной концентрации от около 0,01 кг/кг пасты II+III до около 1,0 кг/кг пасты II+III, или от около 0,02 кг/кг пасты II+III до около 0,8 кг/кг пасты II+III, или от около 0,03 кг/кг пасты II+III до около 0,7 кг/кг пасты II+III. В других вариантах осуществления фильтрующую добавку можно добавлять в конечной концентрации от около 0,01 кг/кг пасты II+III до около 0,07 кг/кг пасты II+III, или от около 0,02 кг/кг пасты II+III до около 0,06 кг/кг пасты II+III, или от около 0,03 кг/кг пасты II+III до около 0,05 кг/кг пасты II+III. В определенных вариантах осуществления фильтрующую добавку будут добавлять в конечной концентрации около 0,01 кг/кг пасты II+III, или около 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 кг/кг пасты II+III.In certain embodiments, a filtration additive, such as Celpure C300 (Celpure) or Hyflo-Supper-Cel (World Minerals), is added after the silica treatment to facilitate depth filtration. The filter aid can be added at a final concentration of from about 0.01 kg/kg paste II+III to about 1.0 kg/kg paste II+III, or from about 0.02 kg/kg paste II+III to about 0.8 kg/kg paste II+III, or from about 0.03 kg/kg paste II+III to about 0.7 kg/kg paste II+III. In other embodiments, the filter aid may be added at a final concentration of from about 0.01 kg/kg II+III paste to about 0.07 kg/kg II+III paste, or from about 0.02 kg/kg II+III paste to about 0.06 kg/kg paste II+III, or from about 0.03 kg/kg paste II+III to about 0.05 kg/kg paste II+III. In certain embodiments, the filter aid will be added at a final concentration of about 0.01 kg/kg II+III paste, or about 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0 .08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 or 1.0 kg/kg paste II+III.

В предыдущих способах очистки IgG значительная фракция IgG была утеряна в ходе стадии фильтрации указанного процесса. Установлено, что стандартные способы постфильтрационной промывки с использованием 1,8 мертвых объемов суспензионного буфера для очистки рам и линий фильтр-пресса недостаточны для максимального извлечения IgG на данной стадии. Неожиданно было обнаружено, что по меньшей мере 3,0 мертвых объема, например, 3,6 мертвых объемов суспензионного буфера были полезны для эффективного извлечения IgG в осветленной суспензии модифицированной фракции II+III. В определенных вариантах осуществления фильтр-пресс промывают любым подходящим суспензионным буфером. В одном иллюстративном варианте осуществления промывочный буфер будет содержать, например, 5 мМ одноосновного фосфатата натрия, 5 мМ ацетата и 0,015% ледяной уксусной кислоты (об./об.).In previous IgG purification methods, a significant fraction of the IgG was lost during the filtration step of the process. Standard post-filtration wash methods using 1.8 dead volumes of suspension buffer to clean frames and filter press lines were found to be insufficient to maximize IgG recovery at this stage. Surprisingly, it was found that at least 3.0 dead volumes, eg 3.6 dead volumes of suspension buffer were useful for efficient recovery of IgG in the clarified modified fraction II+III suspension. In certain embodiments, the filter press is washed with any suitable suspension buffer. In one illustrative embodiment, the wash buffer will contain, for example, 5 mM sodium phosphate monobasic, 5 mM acetate, and 0.015% glacial acetic acid (v/v).

В одном варианте осуществления улучшение относится к способу, в котором сниженное количество IgG утеряно в ходе стадии фильтрации суспензии фракции II+III. В одном варианте осуществления улучшение процесса реализуют посредством последующей промывки фильтра с использованием по меньшей мере около 3,6 мертвых объемов буфера для растворения, содержащего 150 мл ледяной уксусной кислоты на 1000 л. В одном варианте осуществления рН экстракционного буфера для последующей промывки составляет от около 4,6 до около 5,3. В предпочтительном варианте осуществления рН промывочного буфера для последующей промывки составляет от около 4,7 до около 5,2. В другом предпочтительном варианте осуществления рН промывочного буфера для последующей промывки составляет от около 4,8 до около 5,1. В другом предпочтительном варианте осуществления рН промывочного буфера для последующей промывки составляет от около 4,9 до около 5,0.In one embodiment, the improvement relates to a method in which a reduced amount of IgG is lost during the filtration step of the fraction II+III suspension. In one embodiment, process improvement is realized by post-washing the filter using at least about 3.6 dead volumes of dissolution buffer containing 150 mL of glacial acetic acid per 1000 L. In one embodiment, the pH of the post-wash extraction buffer is from about 4.6 to about 5.3. In a preferred embodiment, the pH of the post-wash wash buffer is from about 4.7 to about 5.2. In another preferred embodiment, the pH of the post-wash wash buffer is from about 4.8 to about 5.1. In another preferred embodiment, the pH of the post-wash wash buffer is from about 4.9 to about 5.0.

По сравнению со способами, ранее использовавшимися для осветления суспензии, полученной на второй стадии осаждения, в настоящем изобретении в нескольких вариантах осуществления представлены способы, которые обеспечивают повышение выхода IgG и повышение чистоты в осветленной суспензии фракции II+III. В одном аспекте улучшение относится к способу, в котором уменьшенное количество IgG утеряно в осадке на фильтре модифицированной фракции II+III. В другом аспекте улучшение относится к способу, в котором в осветленной суспензии фракции II+III обнаруживается уменьшенное количество примеси.Compared to methods previously used to clarify the suspension obtained in the second precipitation step, the present invention provides in several embodiments methods that provide increased IgG yield and increased purity in the clarified Fraction II+III suspension. In one aspect, the improvement relates to a method in which a reduced amount of IgG is lost in the modified fraction II+III filter cake. In another aspect, the improvement relates to a process in which a reduced amount of impurity is detected in the clarified fraction II+III suspension.

В одном варианте осуществления улучшения процесса реализуют посредством включения обработки коллоидным диоксидом кремния перед фильтрацией или очисткой в центрифуге суспензии фракции II+III. В определенных вариантах осуществления обработка коллоидным диоксидом кремния будет вкллючать добавление от около 0,01 кг/кг пасты II+III до около 0,07 кг/кг пасты II+III, или от около 0,02 кг/кг пасты II+III до около 0,06 кг/кг пасты II+III, или от около 0,03 кг/кг пасты II+III до около 0,05 кг/кг пасты II+III, или около 0,02 кг/кг пасты II+III, 0,03 кг/кг пасты II+III, 0,04 кг/кг пасты II+III, 0,05 кг/кг пасты II+III, 0,06 кг/кг пасты II+III, 0,07 кг/кг пасты II+III, 0,08 кг/кг пасты II+III, 0,09 кг/кг пасты II+III, или 0,1 кг/кг пасты II+III, и смесь будут инкубировать в течение от около 50 мин до около 70 мин, или около 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 мин или более при температуре от около 2°С до около 8°С. В другом варианте осуществления улучшения процесса реализуют посредством включения обработки коллоидным диоксидом кремния, которая обеспечивает снижение уровней остаточного фибриногена, амидолитической активности и/или активности активации прекалликреина. В конкретном варианте осуществления улучшения процесса реализуют посредством включения обработки коллоидным диоксидом кремния, которая обеспечивает снижение уровней FXI, FXIa, FXII и FXIIa в препарате иммуноглобулина.In one embodiment, process improvements are realized by incorporating fumed silica treatment prior to filtration or centrifuge purification of the fraction II+III suspension. In certain embodiments, the fumed silica treatment will include adding about 0.01 kg/kg paste II+III to about 0.07 kg/kg paste II+III, or about 0.02 kg/kg paste II+III to about 0.06 kg/kg paste II+III, or from about 0.03 kg/kg paste II+III to about 0.05 kg/kg paste II+III, or about 0.02 kg/kg paste II+III , 0.03 kg/kg paste II+III, 0.04 kg/kg paste II+III, 0.05 kg/kg paste II+III, 0.06 kg/kg paste II+III, 0.07 kg/ kg paste II+III, 0.08 kg/kg paste II+III, 0.09 kg/kg paste II+III, or 0.1 kg/kg paste II+III, and the mixture will be incubated for about 50 minutes up to about 70 minutes, or about 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 minutes or more at a temperature of about 2°C to about 8°C. In another embodiment, process improvements are realized by incorporating a colloidal silica treatment that provides a reduction in levels of residual fibrinogen, amidolytic activity, and/or prekallikrein activation activity. In a specific embodiment, process improvements are realized by including a colloidal silica treatment that reduces the levels of FXI, FXIa, FXII, and FXIIa in the immunoglobulin preparation.

В другом варианте осуществления улучшения процесса реализуют посредством промывки глубинного фильтра с использованием от около 3 до около 5 мертвого объема фильтра после завершения стадии фильтрации суспензии модифицированной фракции II+III. В определенных вариантах осуществления фильтр промывают с использованием от около 3,5 объемов до около 4,5 объемов, или по меньшей мере около 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0 объемов мертвого объема фильтра. В конкретном варианте осуществления фильтр-пресс промывают с использованием по меньшей мере около 3,6 мертвых объемов суспензионного буфера.In another embodiment, process improvements are realized by flushing the depth filter using about 3 to about 5 filter dead volume after completion of the modified fraction II+III slurry filtration step. In certain embodiments, the filter is washed using from about 3.5 volumes to about 4.5 volumes, or at least about 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4, 3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0 filter dead volume. In a specific embodiment, the filter press is washed with at least about 3.6 dead volumes of suspension buffer.

7. Обработка моющим средством.7. Treatment with detergent.

С целью удаления дополнительных примесей из модифицированного фильтрата фракции II+III об- 13 045585 разец затем подвергают обработке моющим средством. Способы обработки моющим средством фракций, полученных из плазмы, хорошо известны в данной области. В целом любая стандартная обработка неионным моющим средством может быть использована в сочетании со способами, представленными в настоящем документе. Например, иллюстративный протокол для обработки моющим средством представлен ниже.In order to remove additional impurities from the modified filtrate of fractions II+III, the sample is then treated with a detergent. Methods for treating plasma-derived fractions with detergent are well known in the art. In general, any standard non-ionic detergent treatment can be used in combination with the methods presented herein. For example, an exemplary protocol for detergent treatment is presented below.

Вкратце в одном иллюстративном варианте осуществления моющее средство, например полисорбат-80, добавляют к фильтрату модифицированной фракции II+III в конечной концентрации около 0,2% (вес/об.) при перемешивании и образец инкубируют в течение по меньшей мере около 30 мин при температуре от около 2°С до около 8°С. Затем к раствору подмешивают обезвоженный цитрат натрия до конечной концентрации около 8 г/л и образец инкубируют в течение еще 30 мин при непрерывном перемешивании при температуре от около 2 до 8°С.Briefly, in one illustrative embodiment, a detergent, such as polysorbate-80, is added to the modified fraction II+III filtrate at a final concentration of about 0.2% (w/v) with stirring and the sample is incubated for at least about 30 minutes at temperature from about 2°C to about 8°C. Anhydrous sodium citrate is then mixed into the solution to a final concentration of about 8 g/L and the sample is incubated for a further 30 minutes with continuous stirring at a temperature of about 2 to 8°C.

В определенных вариантах осуществления применяют любое подходящее неионогенное моющее средство. Примеры подходящих неионных моющих средств включают без ограничения октилглюкозид, дигитонин, С12Е8, Lubrol, Triton Х-100, Nonidet Р-40, Tween-20 (т.е. полисорбит-20), Tween-80 (т.е. полисорбат-80), алкил поли(этиленоксид), моющее средство Brij, алкилфенол поли(этиленоксид), полоксамер, октилглюкозид, децилмальтозид и т.п.In certain embodiments, any suitable non-ionic detergent is used. Examples of suitable nonionic detergents include, but are not limited to, octyl glucoside, digitonin, C12E8, Lubrol, Triton X-100, Nonidet P-40, Tween-20 (i.e., polysorbitol-20), Tween-80 (i.e., polysorbate-80 ), alkyl poly(ethylene oxide), Brij detergent, alkyl phenol poly(ethylene oxide), poloxamer, octyl glucoside, decyl maltoside, etc.

В одном варианте осуществления улучшение процесса реализуют посредством добавления моющих реагентов (например, полисорбат-80 и дегидрат цитрата натрия) посредством распыления, а не посредством добавления потоком. В других вариантах осуществления моющие реагенты можно добавлять в виде твердых веществ к фильтрату модифицированной фракции II+III при перемешивании образца для обеспечения быстрого распределения добавок. В определенных вариантах осуществления предпочтительным является добавление твердых реагентов посредством орошения твердых веществ по делокализованной площади поверхности фильтрата, локальная избыточная концентрация не возникает, как при добавлении потоком.In one embodiment, process improvement is achieved by adding detergents (eg, polysorbate-80 and sodium citrate dehydrate) via spray rather than flow addition. In other embodiments, detergents can be added as solids to the modified Fraction II+III filtrate while stirring the sample to ensure rapid distribution of the additives. In certain embodiments, it is preferred to add solid reactants by sprinkling the solids over a delocalized surface area of the filtrate without causing localized excess concentration as with flow addition.

8. Третье явление осаждения - осаждение G.8. The third phenomenon of deposition is G deposition.

В иллюстративных вариантах осуществления с целью удаления нескольких остаточных малых белков, например, альбумина и трансферрина, третье осаждение осуществляют в концентрации 25% спирта. Вкратце рН обработанного моющим средством фильтрата II+III регулируют до значения от около 6,8 до около 7,2, например от около 6,9 до около 7,1, например около 7,0, с использованием подходящего рН-модифицирующего раствора (например, 1 М гидроксида натрия или 1 М уксусной кислоты). Затем к раствору добавляют спирт до конечной концентрации около 25% (об./об.) и смесь инкубируют при перемешивании при температуре от около -6°С до около -10°С в течение по меньшей мере 1 ч с образованием третьего осадка (т.е. осадка G). В одном варианте осуществления смесь инкубируют в течение по меньшей мере 2 ч, или по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ч или более. В предпочтительном варианте осуществления смесь инкубируют в течение по меньшей мере 2 ч. В одном иллюстративном варианте осуществления смесь инкубируют в течение по меньшей мере 4 ч. В некоторых вариантах осуществления смесь инкубируют в течение по меньшей мере 8 ч.In exemplary embodiments, to remove a few residual small proteins, such as albumin and transferrin, a third precipitation is performed at a concentration of 25% alcohol. Briefly, the pH of the detergent-treated filtrate II+III is adjusted to a value of from about 6.8 to about 7.2, such as from about 6.9 to about 7.1, such as about 7.0, using a suitable pH-modifying solution (eg , 1 M sodium hydroxide or 1 M acetic acid). Alcohol is then added to the solution to a final concentration of about 25% (v/v) and the mixture is incubated with stirring at a temperature of about -6°C to about -10°C for at least 1 hour to form a third precipitate (t i.e. sediment G). In one embodiment, the mixture is incubated for at least 2 hours, or at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 hours or more. In a preferred embodiment, the mixture is incubated for at least 2 hours. In one illustrative embodiment, the mixture is incubated for at least 4 hours. In some embodiments, the mixture is incubated for at least 8 hours.

В одном варианте осуществления улучшение процесса по настоящему изобретению относится к способу, в котором сниженное количество IgG утеряно в супернатантной фракции на третьей стадии осаждения. В определенных вариантах осуществления улучшение процесса реализую посредством регулирования рН раствора до значения от около 6,8 до около 7,2 сразу после или в ходе добавления спирта для осаждения. В другом варианте осуществления улучшение процесса реализуют посредством поддержания рН раствора на значении от около 6,8 до около 7,2 непрерывно в ходе периода осаждения и инкубации. В некоторых вариантах осуществления рН раствора регулируют до значения от около 6,9 до около 7,1 сразу после или в ходе добавления спирта для осаждения, или до рН около 6,8, 6,9, 7,0, 7,1 или 7,2 сразу после или в ходе добавления спирта для осаждения. В конкретном варианте осуществления рН раствора регулируют до около 7,0 сразу после или в ходе добавления спирта для осаждения. В определенных вариантах осуществления рН раствора поддерживают на значении от около 6,9 до около 7,1 непрерывно в ходе периода осаждения и инкубации, или при рН около 7,0 непрерывно в ходе периода осаждения и инкубации. В соответствии с улучшенным способом, в определенных вариантах осуществления сниженное количество IgG утеряно в супернатантной фракции на третьей стадии осаждения по сравнению с аналогичной стадией осаждения, в которой рН раствора регулируют до, но не после добавления спирта для осаждения, или аналогичной стадией осаждения, в которой рН раствора не поддерживают в ходе всего периода осаждения и инкубации. В одном варианте осуществления рН поддерживают на необходимом уровне в ходе выдерживания для осаждения или времени инкубации посредством непрерывного регулирования рН раствора. В одном варианте осуществления спирт представляет собой этанол.In one embodiment, the process improvement of the present invention relates to a method in which a reduced amount of IgG is lost in the supernatant fraction in the third precipitation step. In certain embodiments, process improvement is realized by adjusting the pH of the solution to a value from about 6.8 to about 7.2 immediately after or during the addition of the precipitation alcohol. In another embodiment, process improvement is realized by maintaining the pH of the solution at a value of from about 6.8 to about 7.2 continuously during the precipitation and incubation period. In some embodiments, the pH of the solution is adjusted to a value of about 6.9 to about 7.1 immediately after or during the addition of the alcohol to precipitate, or to a pH of about 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, or 7 ,2 immediately after or during the addition of alcohol for precipitation. In a particular embodiment, the pH of the solution is adjusted to about 7.0 immediately after or during the addition of the alcohol for precipitation. In certain embodiments, the pH of the solution is maintained at a value of from about 6.9 to about 7.1 continuously during the precipitation and incubation period, or at a pH of about 7.0 continuously during the precipitation and incubation period. According to the improved method, in certain embodiments, a reduced amount of IgG is lost in the supernatant fraction in the third precipitation step compared to a similar precipitation step in which the pH of the solution is adjusted before, but not after the addition of the alcohol for precipitation, or a similar precipitation step in which The pH of the solution is not maintained during the entire precipitation and incubation period. In one embodiment, the pH is maintained at the desired level during the settling or incubation time by continuously adjusting the pH of the solution. In one embodiment, the alcohol is ethanol.

В некоторых вариантах осуществления улучшение процесса реализуют посредством добавления спирта для осаждения и/или раствора, применяемого для регулирования рН посредством распыления, а не порционного добавления потоком. Соответственно в определенных вариантах осуществления уменьшенное количество IgG утеряно в супернатантной фракции на третьей стадии осаждения по сравнению с аналогичной стадией осаждения, в которой спирт и/или раствор, применяемый для регулирования рН, вводят посредством добавления потоком. В одном варианте осуществления спирт представляет собой этанол.In some embodiments, process improvement is realized by adding a precipitating alcohol and/or a solution used to adjust the pH by spraying rather than batchwise addition by flow. Accordingly, in certain embodiments, a reduced amount of IgG is lost in the supernatant fraction in the third precipitation step compared to a similar precipitation step in which the alcohol and/or pH adjusting solution is introduced by flow addition. In one embodiment, the alcohol is ethanol.

- 14 045585- 14 045585

9. Суспензия и фильтрация осадка G (PptG).9. Suspension and filtration of precipitate G (PptG).

С целью растворения IgG, содержащегося в осадке G, для ресуспендирования PptG используют холодный экстракционный буфер. Вкратце осадок G растворяют от 1 до 3,5 в воде для инъекций (WFI) при температуре от около 0°С до около 8°С для достижения значения AU₂₈₀_₃₂₀ от около 40 до 95. Конечный рН раствора, который перемешивают в течение менее 2 ч, затем регулируют до около 5,2±0,2. В одном варианте осуществления данное регулирование рН осуществляют с использованием 1 М уксусной кислоты. Для повышения растворимости IgG проводимость суспензии повышают от около 2,5 мСм/см до около 6,0 мСм/см. В одном варианте осуществления проводимость повышают посредством добавления хлорида натрия. Затем взвешенный раствор PptG фильтруют с использованием подходящего глубинного фильтра с номинальным размером пор от около 0,1 мкм до около 0,4 мкм для удаления любых нерастворенных частиц. В одном варианте осуществления номинальный размер пор глубинного фильтра составляет около 0,2 мкм (например, фильтр Cuno VR06 или аналогичный) для получения осветленного фильтрата. В другом варианте осуществления суспендированный раствор PptG центрифугируют для восстановления очищенного супернатанта. Последующая промывка фильтра с использованием раствора хлорида натрия с проводимостью от около 2,5 мСм/см до около 6,0 мСм/см. Как правило, подходящие растворы для экстракции осадка G включают WFI и буферы с низкой проводимостью. В одном варианте осуществления буфер с низкой проводимостью имеет проводимость менее около 10 мСм/см. В предпочтительном варианте осуществления буфер с низкой проводимостью имеет проводимость менее около 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 мСм/см. В предпочтительном варианте осуществления буфер с низкой проводимостью имеет проводимость менее около 6 мСм/см. В другом варианте осуществления буфер с низкой проводимостью имеет проводимость менее около 4 мСм/см. В другом варианте осуществления буфер с низкой проводимостью имеет проводимость менее около 2 мСм/см.In order to dissolve the IgG contained in the G precipitate, a cold extraction buffer is used to resuspend PptG. Briefly, precipitate G is dissolved 1 to 3.5 in water for injection (WFI) at a temperature of about 0°C to about 8°C to achieve an AU value of ₂₈₀ - ₃₂₀ of about 40 to 95. The final pH of the solution, which is stirred for less than 2 hours, then adjust to about 5.2±0.2. In one embodiment, this pH adjustment is accomplished using 1 M acetic acid. To increase the solubility of the IgG, the conductivity of the suspension is increased from about 2.5 mS/cm to about 6.0 mS/cm. In one embodiment, conductivity is increased by adding sodium chloride. The suspended PptG solution is then filtered using a suitable depth filter with a nominal pore size of about 0.1 μm to about 0.4 μm to remove any undissolved particles. In one embodiment, the nominal pore size of the depth filter is about 0.2 microns (eg, Cuno VR06 filter or similar) to produce a clarified filtrate. In another embodiment, the suspended PptG solution is centrifuged to recover the purified supernatant. Subsequent rinsing of the filter using a sodium chloride solution with a conductivity of about 2.5 mS/cm to about 6.0 mS/cm. Generally, suitable solutions for extracting precipitate G include WFI and low conductivity buffers. In one embodiment, the low conductivity buffer has a conductivity of less than about 10 mS/cm. In a preferred embodiment, the low conductivity buffer has a conductivity of less than about 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 mS/cm. In a preferred embodiment, the low conductivity buffer has a conductivity of less than about 6 mS/cm. In another embodiment, the low conductivity buffer has a conductivity of less than about 4 mS/cm. In another embodiment, the low conductivity buffer has a conductivity of less than about 2 mS/cm.

10. Обработка растворяющим моющим средством.10. Treatment with solvent detergent.

С целью инактивации различных вирусных загрязняющих веществ, которые могут присутствовать в продуктах, полученных из плазмы, очищенный фильтрат PptG затем подвергают обработке растворяющим моющим средством (S/D). Способы обработки моющим средством полученных из плазмы фракций хорошо известны в данной области (обзор см. Pelletier J.P. et al., Best Pract. Res. Clin. Haematol., 2006, 19(1):205-42). Как правило, любую стандартную обработку S/D можно применять в сочетании со способами, представленными в настоящем документе. Иллюстративный протокол для обработки S/D представлен ниже.To inactivate various viral contaminants that may be present in plasma-derived products, the purified PptG filtrate is then subjected to a solvent detergent (S/D) treatment. Methods for treating plasma-derived fractions with detergent are well known in the art (for a review, see Pelletier J.P. et al., Best Pract. Res. Clin. Haematol., 2006, 19(1):205-42). In general, any standard S/D processing can be used in combination with the methods presented herein. An exemplary protocol for S/D processing is presented below.

Вкратце в осветленный фильтрат PptG добавляют Triton Х-100, Tween-20 и три(н-бутил)фосфат (TNBP) в конечных концентрациях около 1,0, 0,3 и 0,3% соответственно. Затем смесь перемешивают при температуре от около 18°С до около 25°С в течение по меньшей мере около 1 ч.Briefly, Triton X-100, Tween-20, and tri(n-butyl)phosphate (TNBP) were added to the clarified PptG filtrate at final concentrations of about 1.0, 0.3, and 0.3%, respectively. The mixture is then stirred at a temperature of about 18°C to about 25°C for at least about 1 hour.

В одном варианте осуществления улучшение процесса реализуют посредством добавления реагентов S/D (например, Triton Х-100, Tween-20, и TNBP) путем распыления, а не порционного добавления потоком. В других вариантах осуществления моющие реагенты можно добавлять в виде твердых веществ в очищенный фильтрат PptG, который перемешивают для обеспечения быстрого распределения компонентов S/D. В определенных вариантах осуществления предпочтительным является добавление твердых реагентов посредством орошения твердых веществ по делокализованной площади поверхности фильтрата, локальная избыточная концентрация не возникает, как при добавлении потоком.In one embodiment, process improvement is achieved by adding S/D reagents (eg, Triton X-100, Tween-20, and TNBP) by spraying rather than batch-flow addition. In other embodiments, detergents may be added as solids to the purified PptG filtrate, which is stirred to provide rapid distribution of the S/D components. In certain embodiments, it is preferred to add solid reactants by sprinkling the solids over a delocalized surface area of the filtrate without causing localized excess concentration as with flow addition.

11. Ионообменная хроматография.11. Ion exchange chromatography.

Для дальнейшей очистки и концентрирования IgG из обработанного S/D фильтрата PptG можно использовать катионообменную и/или анионообменную хроматографию. Способы очистки и концентрирования IgG с использованием ионообменной хроматографии хорошо известны в данной области. Например, в Патенте США № 5886154 описан способ, в котором осадок фракции П+Ш экстрагируют при низком рН (от около 3,8 до 4,5), с последующим осаждением IgG с использованием каприловой кислоты и, наконец, осуществлением двух стадий анионообменной хроматографии. В патенте США № 6069236 описана схема хроматографической очистки IgG, которая вообще не основана на осаждении спиртом. В публикации РСТ № WO 2005/073252 описан способ очистки IgG, включающий экстракцию осадка фракции II+III, обработку каприловой кислотой, обработку ПЭГ и единственную стадию анионообменной хроматографии. В патенте США № 7186410 описан способ очистки IgG, включающий экстракцию либо осадка фракции I+II+III, либо фракции II с последующей единственной стадией анионообмена, проводимой при щелочном рН. В патенте США № 7553938 описан способ, включающий экстракцию осадка фракции I+II+III или фракции II+III, обработку каприлатом и либо одну, либо две стадии анионообменной хроматографии. В патенте США № 6093324 описан способ очистки, включающий использование макропористой анионообменной смолы, работающей при рН от около 6,0 до около 6,6. В патенте США № 6835379 описан способ очистки, основанный на катионообменной хроматографии в отсутствие спиртового фракционирования. Описание вышеупомянутых публикаций настоящим включено в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.Cation exchange and/or anion exchange chromatography can be used to further purify and concentrate IgG from the S/D treated PptG filtrate. Methods for purifying and concentrating IgG using ion exchange chromatography are well known in the art. For example, US Pat. No. 5,886,154 describes a process in which the P+III fraction precipitate is extracted at low pH (about 3.8 to 4.5), followed by IgG precipitation using caprylic acid, and finally two steps of anion exchange chromatography . US Pat. No. 6,069,236 describes a chromatographic purification scheme for IgG that does not rely on alcohol precipitation at all. PCT Publication No. WO 2005/073252 describes a method for purifying IgG, comprising extraction of the fraction II+III precipitate, treatment with caprylic acid, treatment with PEG and a single anion exchange chromatography step. US Pat. No. 7,186,410 describes a method for purifying IgG involving extraction of either the Fraction I+II+III or Fraction II precipitate, followed by a single anion exchange step performed at an alkaline pH. US Pat. No. 7,553,938 describes a process comprising extraction of the fraction I+II+III or fraction II+III precipitate, treatment with caprylate, and either one or two steps of anion exchange chromatography. US Pat. No. 6,093,324 describes a purification process involving the use of a macroporous anion exchange resin operating at a pH of about 6.0 to about 6.6. US Pat. No. 6,835,379 describes a purification method based on cation exchange chromatography in the absence of alcohol fractionation. The description of the foregoing publications is hereby incorporated herein by reference in its entirety for all purposes.

В одном варианте осуществления способов по настоящему изобретению обработанный S/D фильтрат PptG можно подвергать как катионообменной хроматографии, так и анионообменной хроматографии. Например, в одном варианте осуществления обработанный S/D фильтрат PptG пропускают черезIn one embodiment of the methods of the present invention, the S/D treated PptG filtrate can be subjected to both cation exchange chromatography and anion exchange chromatography. For example, in one embodiment, the S/D-treated PptG filtrate is passed through

- 15 045585 катионообменную колонку, которая связывает IgG в растворе. Затем реагенты S/D можно отмыть от абсорбированного IgG, который затем элюируют с колонки элюирующим буфером с высоким рН, имеющим рН около 8,0 и 9,0. Таким образом, стадию катионообменной хроматографии можно использовать для удаления реагентов S/D из препарата, концентрирования раствора, содержащего IgG, или для того и другого. В определенных вариантах осуществления элюирующий буфер с высоким рН может иметь рН от около 8,2 до около 8,8, или от около 8,4 до около 8,6, или рН около 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9 или 9,0. В предпочтительном варианте осуществления рН элюирующего буфера составляет около 8,5+0,1.- 15 045585 cation exchange column, which binds IgG in solution. The S/D reagents can then be washed to remove absorbed IgG, which is then eluted from the column with a high pH elution buffer having a pH of about 8.0 and 9.0. Thus, the cation exchange chromatography step can be used to remove S/D reagents from a preparation, concentrate a solution containing IgG, or both. In certain embodiments, the high pH elution buffer may have a pH of about 8.2 to about 8.8, or about 8.4 to about 8.6, or a pH of about 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9 or 9.0. In a preferred embodiment, the pH of the elution buffer is about 8.5+0.1.

В определенных вариантах осуществления рН элюата из катионообменной колонки можно регулировать до более низкого значения, например, от около 5,5 до около 6,5, и разбавить соответствующим буфером для уменьшения проводимости раствора. В определенных вариантах осуществления рН катионообменного элюата можно регулировать до рН от около 5,7 до около 6,3, или от около 5,9 до около 6,1, или рН около 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4 или 6,5. В предпочтительном варианте осуществления рН элюата регулируют до рН около 6,0±0,1. Затем элюат загружают в анионообменную колонку, которая связывает несколько загрязняющих веществ, обнаруженных в препарате. Поток через колонку, содержащий фракцию IgG, собирают во время загрузки и промывки колонки. В определенных вариантах осуществления стадии ионообменной хроматографии по настоящему изобретению можно проводить в колоночном режиме, периодическом режиме или в их комбинации.In certain embodiments, the pH of the cation exchange column eluate can be adjusted to a lower value, such as about 5.5 to about 6.5, and diluted with an appropriate buffer to reduce the conductivity of the solution. In certain embodiments, the pH of the cation exchange eluate can be adjusted to a pH of about 5.7 to about 6.3, or about 5.9 to about 6.1, or a pH of about 5.5, 5.6, 5.7, 5 .8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4 or 6.5. In a preferred embodiment, the pH of the eluate is adjusted to a pH of about 6.0 ± 0.1. The eluate is then loaded into an anion exchange column, which binds several contaminants found in the drug. The column flow containing the IgG fraction is collected during column loading and washing. In certain embodiments, the ion exchange chromatography steps of the present invention can be performed in column mode, batch mode, or a combination thereof.

В определенных вариантах осуществления улучшение процесса реализуют посредством добавления раствора, используемого для регулирования рН, с использованием распыления, а не порционного добавления потоком.In certain embodiments, process improvement is achieved by adding the solution used to adjust the pH using a spray rather than batch addition in a flow manner.

12. Нанофильтрация и ультра/диафильтрация.12. Nanofiltration and ultra/diafiltration.

Для дальнейшего снижения вирусной нагрузки композиции IgG, представленной в настоящем документе, анионообменную жидкость, вытекающую из колонки, в некоторых вариантах осуществления подвергают нанофильтрации с использованием подходящего устройства для нанофильтрации. В определенных вариантах осуществления устройство для нанофильтрации имеет средний размер пор от около 15 нм до около 200 нм. Примеры нанофильтров, подходящих для данного применения включают без ограничения DVD, DV 50, DV 20 (Pall), Viresolve NFP, Viresolve NFR (Millipore), Planova 15N, 20N, 35N, и 75N (Planova). В конкретном варианте осуществления нанофильтр может иметь средний размер пор от около 15 нм до около 72 нм, или от около 19 нм до около 35 нм, или около 15, 19, 35 или 72 нм. В предпочтительном варианте осуществления нанофильтр будет иметь средний размер пор около 35 нм, такой как фильтр Asahi PLANOVA 35N или его аналог.To further reduce the viral load of the IgG composition provided herein, the anion exchange fluid effluent from the column is, in some embodiments, subjected to nanofiltration using a suitable nanofiltration device. In certain embodiments, the nanofiltration device has an average pore size of from about 15 nm to about 200 nm. Examples of nanofilters suitable for this application include, but are not limited to, DVD, DV 50, DV 20 (Pall), Viresolve NFP, Viresolve NFR (Millipore), Planova 15N, 20N, 35N, and 75N (Planova). In a specific embodiment, the nanofilter may have an average pore size of from about 15 nm to about 72 nm, or from about 19 nm to about 35 nm, or about 15, 19, 35 or 72 nm. In a preferred embodiment, the nanofilter will have an average pore size of about 35 nm, such as the Asahi PLANOVA 35N filter or equivalent.

Необязательно ультрафильтрацию/диафильтрацию можно осуществлять для дополнительного концентрирования нанофильтрата. В одном варианте осуществления мембрану с открытым каналом применяют со специально разработанной рецептурой после промывки и ближе к концу производственный процесс обеспечивает в два раза большую концентрацию белка в полученной композиции IgG (200 мг/мл) по сравнению с современными IVIG (например, GAMMAGARD® LIQUID) без негативного влияния на выход или стабильность при хранении. С большинством имеющихся в продаже мембран для ультрафильтрации концентрация IgG 200 мг/мл не может быть достигнута без больших потерь белка. Данные мембраны будут заблокированы на ранней стадии, поэтому трудно добиться адекватной последующей промывки. Поэтому необходимо использовать конфигурации мембран с открытым каналом. Даже с мембранами с открытым каналом необходимо использовать специально разработанную процедуру последующей промывки для получения требуемой концентрации без значительной потери белка (потеря менее 2%). Еще более неожиданным является тот факт, что более высокая концентрация белка 200 мг/мл не снижает инактивационную способность вируса на стадии хранения с низким рН.Optionally, ultrafiltration/diafiltration can be performed to further concentrate the nanofiltrate. In one embodiment, an open channel membrane is used with a specially designed formulation after washing and near the end of the manufacturing process provides twice the protein concentration in the resulting IgG composition (200 mg/ml) compared to current IVIGs (e.g. GAMMAGARD® LIQUID) without negatively affecting yield or storage stability. With most commercially available ultrafiltration membranes, an IgG concentration of 200 mg/mL cannot be achieved without large protein losses. These membranes will be blocked at an early stage, making it difficult to achieve adequate post-flushing. Therefore, it is necessary to use open channel membrane configurations. Even with open channel membranes, a specially designed post-wash procedure must be used to obtain the required concentration without significant loss of protein (less than 2% loss). Even more surprising is the fact that the higher protein concentration of 200 mg/ml does not reduce the inactivation ability of the virus during the low pH storage stage.

После нанофильтрации фильтрат может быть дополнительно сконцентрирован посредством ультрафильтрации/диафильтрации. В одном варианте осуществления нанофильтрат концентрируют посредством ультрафильтрации до концентрации белка от около 2% до около 10% (вес/об.). В определенных вариантах осуществления ультрафильтрацию проводят в кассете с экраном с открытым каналом, а ультрафильтрационная мембрана имеет номинальную отсечку по молекулярной массе (NMWCO) менее около 100 кДа или менее около 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 или менее кДа. В предпочтительном варианте осуществления мембрана для ультрафильтрации имеет NMWCO не более 50 кДа.After nanofiltration, the filtrate can be further concentrated by ultrafiltration/diafiltration. In one embodiment, the nanofiltrate is concentrated by ultrafiltration to a protein concentration of from about 2% to about 10% (w/v). In certain embodiments, the ultrafiltration is performed in an open channel screen cassette and the ultrafiltration membrane has a nominal molecular weight cutoff (NMWCO) of less than about 100 kDa or less than about 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 kDa, or less. In a preferred embodiment, the ultrafiltration membrane has an NMWCO of no more than 50 kDa.

После завершения стадии ультрафильтрации концентрат может быть дополнительно сконцентрирован посредством диафильтрации относительно раствора, пригодного для внутривенного или внутримышечного введения. В определенных вариантах осуществления раствор для диафильтрации может содержать стабилизирующее и/или буферное средство. В предпочтительном варианте осуществления стабилизирующее и буферное средство представляет собой глицин в соответствующей концентрации, например от около 0,20 М до около 0,30 М, или от около 0,22 М до около 0,28 М, или от около 0,24 М до около 0,26 мМ, или в концентрации около 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 или 3,0. В предпочтительном варианте осуществления диафильтрационный буфер содержит глицин в концентрации 0,25 М или около.After completion of the ultrafiltration step, the concentrate can be further concentrated by diafiltration against a solution suitable for intravenous or intramuscular administration. In certain embodiments, the diafiltration solution may contain a stabilizing and/or buffering agent. In a preferred embodiment, the stabilizing and buffering agent is glycine at an appropriate concentration, for example from about 0.20 M to about 0.30 M, or from about 0.22 M to about 0.28 M, or from about 0.24 M to about 0.26 mM, or at a concentration of about 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9 or 3.0. In a preferred embodiment, the diafiltration buffer contains glycine at a concentration of 0.25 M or about.

Как правило, минимальный обменный объем не менее чем в 3 раза превышает исходный объемAs a rule, the minimum exchange volume is at least 3 times the initial volume

- 16 045585 концентрата или менее около 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более раз исходный объем концентрата. Раствор IgG может быть концентрирован до конечной концентрации от около 5% до около 25% (вес/об.), или от около 6% до около 18% (вес/об.), или от около 7% до около 16% (вес/об.), или от около 8% до около 14% (вес/об.), или от около 9% до около 12%, или до конечной концентрации около 5 или 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25% или выше. В одном варианте осуществления конечной концентрации белка по меньшей мере около 23% достигают без добавления послепромывочной фракции в концентрированный раствор. В другом варианте осуществления конечной концентрации белка по меньшей мере около 24% достигают без добавления послепромывочной фракции в концентрированный раствор. Конечной концентрации белка по меньшей мере около 25% достигают без добавления послепромывочной фракции в концентрированный раствор. Как правило, в конце процесса концентрирования рН раствора составляет от около 4,6 до 5,1.- 16 045585 concentrate or less about 4, 5, 6, 7, 8, 9 or more times the original volume of concentrate. The IgG solution may be concentrated to a final concentration of about 5% to about 25% (w/v), or about 6% to about 18% (w/v), or about 7% to about 16% (w/v). /vol.), or from about 8% to about 14% (w/v), or from about 9% to about 12%, or to a final concentration of about 5 or 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25% or higher. In one embodiment, a final protein concentration of at least about 23% is achieved without adding a post-wash fraction to the concentrated solution. In another embodiment, a final protein concentration of at least about 24% is achieved without adding a post-wash fraction to the concentrated solution. A final protein concentration of at least about 25% is achieved without adding a post-wash fraction to the concentrated solution. Typically, at the end of the concentration process, the pH of the solution is between about 4.6 and 5.1.

В одном иллюстративном варианте осуществления рН композиции IgG регулируют до около 4,5 перед ультрафильтрацией. Раствор концентрируют до концентрации белка 5±2% вес/об, посредством ультрафильтрации. UF-мембрана имеет номинальную отсечку по молекулярной массе (NMWCO) 50000 дальтон или менее (полиэфирсульфоновая мембрана Millipore Pellicon). Концентрат подвергают диафильтрации через десять объемов 0,25 М раствора глицина, рН 4,5±0,2. В ходе всей операции ультрадиафильтрации раствор поддерживают при температуре от около 2°С до около 8°С. После диафильтрации раствор концентрируют до концентрации белка по меньшей мере 11% (вес/об.).In one illustrative embodiment, the pH of the IgG composition is adjusted to about 4.5 before ultrafiltration. The solution is concentrated to a protein concentration of 5±2% w/v by ultrafiltration. The UF membrane has a nominal molecular weight cutoff (NMWCO) of 50,000 daltons or less (Millipore Pellicon polyethersulfone membrane). The concentrate is subjected to diafiltration through ten volumes of 0.25 M glycine solution, pH 4.5±0.2. During the entire ultradiafiltration operation, the solution is maintained at a temperature of about 2°C to about 8°C. After diafiltration, the solution is concentrated to a protein concentration of at least 11% (w/v).

13. Состав.13. Composition.

По завершении стадии диафильтрации концентрацию белка в растворе регулируют посредством диафильтрационного буфера до конечной концентрации от около 5% до около 20% (вес/об.), или от около 6% до около 18% (вес/об.), или от около 7% до около 16% (вес/об.), или от около 8% до около 14% (вес/об.), или от около 9% до около 12%, или до конечной концентрации около 5%, или 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20%. В одном иллюстративном варианте осуществления конечная концентрация белка в растворе составляет от около 9% до около 11%, например 10%.Upon completion of the diafiltration step, the protein concentration in the solution is adjusted by diafiltration buffer to a final concentration of about 5% to about 20% (w/v), or about 6% to about 18% (w/v), or about 7 % to about 16% (w/v), or about 8% to about 14% (w/v), or about 9% to about 12%, or to a final concentration of about 5%, or 6, 7 , 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20%. In one illustrative embodiment, the final concentration of protein in solution is from about 9% to about 11%, such as 10%.

В различных вариантах осуществления составленный объединенный раствор дополнительно стерилизуют посредством фильтрования через мембранный фильтр с абсолютным размером пор не более примерно 0,22 мкм, например примерно 0,2 мкм. Раствор необязательно распределяют в асептических условиях в конечные контейнеры для надлежащей герметизации, а образцы отбирают для испытания.In various embodiments, the formulated combined solution is further sterilized by filtration through a membrane filter having an absolute pore size of no more than about 0.22 μm, such as about 0.2 μm. The solution is optionally dispensed aseptically into final containers for proper sealing and samples are taken for testing.

В одном варианте осуществления композицию IgG дополнительно регулируют до концентрации около 10,2±0,2% (вес/об.) с использованием диафильтрационного буфера. При необходимости рН регулируют до значения от около 4,4 до около 4,9. Наконец, раствор фильтруют в стерильных условиях и инкубируют в течение трех недель при температуре около 30°С.In one embodiment, the IgG composition is further adjusted to a concentration of about 10.2 ± 0.2% (w/v) using diafiltration buffer. If necessary, the pH is adjusted to a value of from about 4.4 to about 4.9. Finally, the solution is filtered under sterile conditions and incubated for three weeks at approximately 30°C.

14. Способы лечения.14. Methods of treatment.

В соответствии с обычной практикой в современной медицине стерилизованные препараты концентрированных иммуноглобулинов (особенно IgG) применяют для лечения заболеваний, которые относятся к трем основным классам: иммунодефициты, воспалительные и аутоиммунные заболевания и острые инфекции. Данные препараты IgG также могут быть полезны для лечения рассеянного склероза (особенно рецидивирующе-ремиттирующего рассеянного склероза или RRMS), болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона. Очищенный препарат IgG по настоящему изобретению подходит для данных целей, а также для других клинически приемлемых применений препаратов IgG.In accordance with common practice in modern medicine, sterilized preparations of concentrated immunoglobulins (especially IgG) are used to treat diseases that fall into three main classes: immunodeficiencies, inflammatory and autoimmune diseases and acute infections. These IgG drugs may also be useful in treating multiple sclerosis (especially relapsing-remitting multiple sclerosis, or RRMS), Alzheimer's disease, and Parkinson's disease. The purified IgG preparation of the present invention is suitable for these purposes, as well as other clinically acceptable uses of IgG preparations.

FDA одобрило использование IVIG для лечения различных показаний, включая аллогенную трансплантацию костного мозга, хронический лимфолейкоз, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ITP), детский ВИЧ, первичный иммунодефицит, болезнь Кавасаки, хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию (CIDP) и трансплантацию почки с реципиентом с высоким уровнем антител или с несовместимым по системе АВО донором. В определенных вариантах осуществления композиции IVIG, представленные в настоящем документе, полезны для лечения или контроля данных заболеваний и состояний.The FDA has approved the use of IVIG for the treatment of a variety of indications, including allogeneic bone marrow transplantation, chronic lymphocytic leukemia, idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP), childhood HIV, primary immunodeficiency, Kawasaki disease, chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP), and kidney transplantation with a recipient with high antibody levels or with an ABO-incompatible donor. In certain embodiments, the IVIG compositions provided herein are useful for treating or controlling these diseases and conditions.

Кроме того, IVIG не по прямому назначению обычно назначают пациентам для лечения или контроля различных показаний, например, синдрома хронической усталости, колита, вызванного Clostridium difficile, дерматомиозит и полимиозит, офтальмопатии Грейвса, синдрома Гийена-Барре, мышечной дистрофии, миозита с тельцами включения, синдрома Ламберта-Итона, красной волчанки, мультифокальной моторной невропатии, рассеянного склероза (PC), тяжелой миастении, неонатальной аллоиммунной тромбоцитопенией, парвовирусной инфекции В19, пузырчатки, посттрансфузионной пурпуры, отторжения почечного трансплантата, самопроизвольного аборта/выкидыша, синдрома ригидности, опсоклонусмиоклонуса, тяжелого сепсиса и септического шока у взрослых в критическом состоянии, токсического эпидермального некролиза, хронического лимфолейкоза, множественной миеломы, агаммаглобулинемии, сцепленной с Х-хромосомой, и гипогаммаглобулинемии. В определенных вариантах осуществления композиции IVIG, представленные в настоящем документе, полезны для лечения или контроля данных заболеваний и состояний.In addition, IVIG is commonly prescribed off-label to patients for the treatment or control of various indications, such as chronic fatigue syndrome, Clostridium difficile colitis, dermatomyositis and polymyositis, Graves' ophthalmopathy, Guillain-Barré syndrome, muscular dystrophy, inclusion body myositis, Lambert-Eaton syndrome, lupus erythematosus, multifocal motor neuropathy, multiple sclerosis (MS), myasthenia gravis, neonatal alloimmune thrombocytopenia, parvovirus B19, pemphigus, post-transfusion purpura, renal transplant rejection, spontaneous abortion/miscarriage, rigidity syndrome, opsoclonus myoclonus, severe sepsis sa and septic shock in critically ill adults, toxic epidermal necrolysis, chronic lymphocytic leukemia, multiple myeloma, X-linked agammaglobulinemia, and hypogammaglobulinemia. In certain embodiments, the IVIG compositions provided herein are useful for treating or controlling these diseases and conditions.

Наконец, было предложено экспериментальное использование IVIG для лечения или контроля за- 17 045585 болеваний, включая первичный иммунодефицит, RRMS, болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона (публикация заявки на патент США № 2009/0148463, которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки для всех целей). В определенных вариантах осуществления композиции IVIG, представленные в данном документе, подходят для лечения или управления первичного иммунного дефицита, RRMS, болезни Альцгеймера или болезни Паркинсона. В некоторых вариантах осуществления, включающих ежедневное введение, эффективное количество, вводимое субъекту, может определить врач с учетом индивидуальных различий в возрасте, массе тела, тяжести заболевания, способе введения (например, внутривенном или подкожном) и реакции на терапию. В определенных вариантах осуществления препарат иммуноглобулина по настоящему изобретению можно вводить субъекту в количестве от 5 мг/кг до около 2000 мг/кг ежедневно. В дополнительных вариантах осуществления препарат иммуноглобулина можно вводить в количествах по меньшей мере около 10 мг/кг, по меньшей мере 15 мг/кг, по меньшей мере 20 мг/кг, по меньшей мере 25 мг/кг, по меньшей мере 30 мг/кг или по меньшей мере 50 мг/кг. В дополнительных вариантах осуществления препарат иммуноглобулина можно вводить субъекту в дозах до около 100 мг/кг, до около 150 мг/кг, до около 200 мг/кг, до около 250 мг/кг, до около 300 мг/кг, до около 400 мг/кг ежедневно. В других вариантах осуществления дозы препарата иммуноглобулина могут быть больше или меньше. Кроме того, препараты иммуноглобулина можно вводить в одной или более дозах в сутки. Клиницисты, знакомые с заболеваниями, которые лечат препаратами IgG, могут определить подходящую дозу для пациента в соответствии с критериями, известными в данной области.Finally, the experimental use of IVIG for the treatment or control of diseases including primary immunodeficiency, RRMS, Alzheimer's disease and Parkinson's disease has been proposed (US Patent Application Publication No. 2009/0148463, which is incorporated herein by reference in its entirety for all purposes ). In certain embodiments, the IVIG compositions provided herein are suitable for the treatment or management of primary immune deficiency, RRMS, Alzheimer's disease, or Parkinson's disease. In some embodiments involving daily administration, the effective amount administered to a subject may be determined by a physician based on individual differences in age, body weight, severity of disease, route of administration (eg, intravenous or subcutaneous), and response to therapy. In certain embodiments, the immunoglobulin preparation of the present invention can be administered to a subject in an amount of from 5 mg/kg to about 2000 mg/kg daily. In additional embodiments, the immunoglobulin preparation may be administered in amounts of at least about 10 mg/kg, at least 15 mg/kg, at least 20 mg/kg, at least 25 mg/kg, at least 30 mg/kg or at least 50 mg/kg. In additional embodiments, the immunoglobulin preparation can be administered to a subject in doses of up to about 100 mg/kg, up to about 150 mg/kg, up to about 200 mg/kg, up to about 250 mg/kg, up to about 300 mg/kg, up to about 400 mg /kg daily. In other embodiments, the dosage of the immunoglobulin preparation may be higher or lower. In addition, immunoglobulin preparations can be administered in one or more doses per day. Clinicians familiar with diseases treated with IgG preparations can determine the appropriate dose for a patient according to criteria known in the art.

В соответствии с настоящим изобретением время, необходимое для завершения курса лечения, может определять врач и оно может варьировать от одного дня до более месяца. В определенных вариантах осуществления курс лечения может составлять от 1 до 6 месяцев.In accordance with the present invention, the time required to complete the course of treatment can be determined by the physician and can vary from one day to more than a month. In certain embodiments, the course of treatment may range from 1 to 6 months.

Эффективное количество препарата IVIG вводят субъекту внутривенно. Термин эффективное количество относится к количеству препарата IVIG, которое приводит к улучшению или излечению заболевания или состояния у субъекта. Эффективное количество, которое следует вводить субъекту, может определить врач с учетом индивидуальных различий в возрасте, массе тела, заболевании или состоянии, которое подлежит лечению, тяжести заболевания и реакции на терапию. В определенных вариантах осуществления препарат IVIG можно вводить субъекту в дозе от около 5 мг/кг до около 2000 мг/кг на одно введение. В определенных вариантах осуществления доза может составлять по меньшей мере около 5 мг/кг, или по меньшей мере около 10 мг/кг, или по меньшей мере около 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 мг/кг, или по меньшей мере около 2000 мг/кг.An effective amount of IVIG is administered to the subject intravenously. The term effective amount refers to the amount of IVIG drug that results in an improvement or cure of a disease or condition in a subject. The effective amount to be administered to a subject may be determined by a physician, taking into account individual differences in age, body weight, disease or condition being treated, severity of the disease, and response to therapy. In certain embodiments, the IVIG drug can be administered to a subject at a dose of from about 5 mg/kg to about 2000 mg/kg per administration. In certain embodiments, the dose may be at least about 5 mg/kg, or at least about 10 mg/kg, or at least about 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125 , 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1 500, 1600 , 1700, 1800, 1900 mg/kg, or at least about 2000 mg/kg.

Дозировка и частота лечения IVIG будут зависеть, помимо прочего, от других факторов: заболевания или состояния, подвергаемого лечению, и тяжести заболевания или состояния у пациента. Как правило, при первичной иммунной дисфункции дозу от около 100 мг/кг до около 400 мг/кг массы тела вводят примерно каждые 3-4 недели. При неврологических и аутоиммунных заболеваниях вводят до 2 г/кг массы тела в течение трех-шести месяцев пятидневным курсом один раз в месяц. Обычно введение дополняют поддерживающей терапией, включающей введение от около 100 мг/кг до около 400 мг/кг массы тела примерно один раз каждые 3-4 недели. Как правило, пациент будет получать дозу или лечение примерно раз в 14-35 дней или примерно каждые 21-28 дней. Частота лечения будет зависеть, помимо прочих факторов, от заболевания или состояния, подвергаемого лечению, и тяжести заболевания или состояния у пациента.The dosage and frequency of IVIG treatment will depend on, among other factors, the disease or condition being treated and the severity of the disease or condition in the patient. Typically, for primary immune dysfunction, a dose of about 100 mg/kg to about 400 mg/kg body weight is administered approximately every 3 to 4 weeks. For neurological and autoimmune diseases, up to 2 g/kg body weight is administered for three to six months in a five-day course once a month. Typically, administration is supplemented with maintenance therapy, including administration of from about 100 mg/kg to about 400 mg/kg body weight approximately once every 3-4 weeks. Typically, the patient will receive a dose or treatment approximately every 14-35 days or approximately every 21-28 days. The frequency of treatment will depend, among other factors, on the disease or condition being treated and the severity of the disease or condition in the patient.

В предпочтительном варианте осуществления представлен способ лечения иммунодефицита, аутоиммунного заболевания или острой инфекции у человека, нуждающегося в этом, при этом способ включает введение фармацевтической композиции IVIG по настоящему изобретению. В связанном варианте осуществления в настоящем изобретении представлены композиции IVIG, полученные в соответствии со способом, представленным в настоящем документе, для лечения иммунодефицита, аутоиммунного заболевания или острой инфекции у человека, нуждающегося в этом.In a preferred embodiment, a method is provided for treating an immunodeficiency, autoimmune disease, or acute infection in a human in need thereof, the method comprising administering an IVIG pharmaceutical composition of the present invention. In a related embodiment, the present invention provides IVIG compositions prepared in accordance with the method presented herein for the treatment of an immunodeficiency, autoimmune disease, or acute infection in a human in need thereof.

В определенных вариантах осуществления иммунодефицит, аутоиммунное заболевание или острая инфекция выбраны из аллогенной трансплантации костного мозга, хронического лимфолейкоза, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ITP), детского ВИЧ, первичных иммунодефицитов, болезни Кавасаки, хронической воспалительной демиелинизирующей полинейропатии (CIDP), трансплантации почки реципиенту с высоким уровнем антител или донору, несовместимому по системе АВО, синдрома хронической усталости, колита, вызванного clostridium difficile, дерматомиозита и полимиозита, офтальмопатии Грейвса, синдрома Гийена-Барре, мышечной дистрофии, миозита с включениями, синдрома Ламберта-Итона, красной волчанки, мультифокальной моторной невропатии, рассеянного склероза (MS), тяжелой миастении, неонатальной аллоиммунной тромбоцитопении, парвовирусной инфекции В19, пузырчатки, посттрансфузионной пурпуры, отторжения почечного трансплантата, самопроизвольного аборта/выкидыша, синдрома ригидности, опсоклонус-миоклонуса, тяжелого сепсиса и септического шока у взрослых в критическом состоянии, токсического эпидермального некролиза, хронического лимфолейкоза, множественной миеломы, агаммаглобулинемии, сцепленной с Х-хромосомой, гипогаммаглобулинемии, первичного иммунодефицита, RRMS, болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона.In certain embodiments, the immunodeficiency, autoimmune disease, or acute infection is selected from allogeneic bone marrow transplantation, chronic lymphocytic leukemia, idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP), childhood HIV, primary immunodeficiencies, Kawasaki disease, chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP), kidney transplantation to a recipient with high antibody level or ABO incompatible donor, chronic fatigue syndrome, clostridium difficile colitis, dermatomyositis and polymyositis, Graves' ophthalmopathy, Guillain-Barré syndrome, muscular dystrophy, inclusion body myositis, Lambert-Eaton syndrome, lupus erythematosus, multifocal motor neuropathy , multiple sclerosis (MS), myasthenia gravis, neonatal alloimmune thrombocytopenia, parvovirus B19, pemphigus, post-transfusion purpura, renal transplant rejection, spontaneous abortion/miscarriage, rigidity syndrome, opsoclonus-myoclonus, severe sepsis and septic shock in critically ill adults, toxic epidermal necrolysis, chronic lymphocytic leukemia, multiple myeloma, X-linked agammaglobulinemia, hypogammaglobulinemia, primary immunodeficiency, RRMS, Alzheimer's disease and Parkinson's disease.

- 18 045585- 18 045585

15. Фармацевтические композиции.15. Pharmaceutical compositions.

В другом аспекте в настоящем изобретении представлены фармацевтические композиции и составы, содержащие очищенный IgG, полученные посредством способов, представленных в настоящем документе. Как правило, фармацевтические композиции и составы IgG, приготовленные с использованием новых способов, описанных в настоящем документе, будут иметь высокое содержание и чистоту IgG. Например, фармацевтические композиции IgG и составы, представленные в настоящем документе, могут иметь концентрацию белка по меньшей мере около 7% (вес/об.) и содержание IgG чистоты более около 95%. Данные фармацевтические композиции и составы IgG высокой чистоты подходят для терапевтического введения, например, для терапии IVIG. В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция IgG составлена для внутривенного введения (например, терапия IVIG).In another aspect, the present invention provides pharmaceutical compositions and formulations containing purified IgG obtained by the methods presented herein. Typically, pharmaceutical compositions and IgG formulations prepared using the new methods described herein will have high IgG content and purity. For example, the pharmaceutical IgG compositions and formulations provided herein may have a protein concentration of at least about 7% (w/v) and an IgG purity greater than about 95%. These pharmaceutical compositions and high purity IgG formulations are suitable for therapeutic administration, for example, IVIG therapy. In a preferred embodiment, the IgG pharmaceutical composition is formulated for intravenous administration (eg, IVIG therapy).

В одном варианте осуществления фармацевтические композиции, представленные в настоящем документе, готовят посредством составления водной композиции IgG, выделенного с использованием способа, представленного в настоящем документе. Как правило, составленную композицию будут подвергать по меньшей мере одной, предпочтительно по меньшей мере двум, наиболее предпочтительно по меньшей мере трем стадиям инактивации или удаления вирусов. Неограничивающие примеры стадий инактивации или удаления вирусов, которые можно применять посредством способов, представленных в настоящем документе, включают обработку растворяющим моющим средством (Horowitz et al., Blood Coagul Fibrinolysis, 1994 (5 Suppl 3):S21-S28; и Kreil et al., Transfusion, 2003 (43):1023-1028, обе из которых непосредственно включены в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей), нанофильтрацию (Hamamoto et al., Vox Sang, 1989 (56)230-236; и Yuasa et al., J. Gen. Virol., 1991 (72 (pt 8)):2021-2024, обе из которых прямо включены в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.) и инкубацию при низком рН при высоких температурах (Kempf et al., Transfusion, 1991 (31)423-427; и Louie et al., Biologicals, 1994 (22):13-19).In one embodiment, the pharmaceutical compositions provided herein are prepared by formulating an aqueous IgG composition isolated using the method presented herein. Typically, the formulated composition will be subjected to at least one, preferably at least two, most preferably at least three virus inactivation or removal steps. Non-limiting examples of virus inactivation or removal steps that can be used by the methods presented herein include solvent detergent treatment (Horowitz et al., Blood Coagul Fibrinolysis, 1994 (5 Suppl 3):S21-S28; and Kreil et al. , Transfusion, 2003 (43):1023-1028, both of which are expressly incorporated herein by reference in their entirety for all purposes), nanofiltration (Hamamoto et al., Vox Sang, 1989 (56)230-236; and Yuasa et al., J. Gen. Virol., 1991 (72 (pt 8)):2021-2024, both of which are expressly incorporated herein by reference in their entirety for all purposes.) and low pH incubation at high temperatures (Kempf et al., Transfusion, 1991 (31)423-427; and Louie et al., Biologicals, 1994 (22):13-19).

В определенных вариантах осуществления представлены фармацевтические препараты с содержанием IgG от около 80 г/л IgG до около 220 г/л IgG. Как правило, данные составы IVIG готовят посредством выделения композиции или IgG из плазмы с использованием описанного в данном документе способа, концентрирования композиции и получения концентрированной композиции в растворе, подходящем для внутривенного введения. Композиции IgG можно концентрировать с использованием любого подходящего способа, известного специалисту в данной области. В одном варианте осуществления композицию концентрируют посредством ультрафильтрации/диафильтрации. В некоторых вариантах осуществления в устройстве для ультрафильтрации, используемом для концентрирования композиции, будет применяться мембрана для ультрафильтрации, имеющая номинальную отсечку по молекулярной массе (NMWCO) менее около 100 кДа или менее около 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 кДа или менее. В предпочтительном варианте осуществления мембрана для ультрафильтрации имеет NMWCO не более 50 кДа. Буферный обмен можно осуществлять с использованием любого подходящего способа, известного специалисту в данной области. В конкретном варианте буферный обмен достигают посредством диафильтрации.In certain embodiments, pharmaceutical preparations are provided with an IgG content of from about 80 g/L IgG to about 220 g/L IgG. Typically, these IVIG formulations are prepared by isolating the composition or IgG from plasma using the method described herein, concentrating the composition, and obtaining the concentrated composition in a solution suitable for intravenous administration. The IgG compositions can be concentrated using any suitable method known to one of ordinary skill in the art. In one embodiment, the composition is concentrated by ultrafiltration/diafiltration. In some embodiments, the ultrafiltration device used to concentrate the composition will employ an ultrafiltration membrane having a nominal molecular weight cutoff (NMWCO) of less than about 100 kDa or less than about 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 kDa or less. In a preferred embodiment, the ultrafiltration membrane has an NMWCO of no more than 50 kDa. Buffer exchange can be carried out using any suitable method known to one skilled in the art. In a particular embodiment, buffer exchange is achieved through diafiltration.

В одном конкретном варианте осуществления представлена фармацевтическая композиция IgG, в которой композиция IgG очищена от супернатантной фракции, лишенной C1-INH, содержащей IgG, при этом способ включает следующее:In one specific embodiment, an IgG pharmaceutical composition is provided, wherein the IgG composition is purified from a supernatant fraction devoid of C1-INH containing IgG, the method comprising the following:

(a) связывание обедненной C1-INH супернатантной фракции с гепарином, в результате чего образуется гепаринизированная фракция; а также (b) выделение IgG из гепаринизированной фракции с образованием обогащенной IgG фракции.(a) binding the C1-INH-depleted supernatant fraction to heparin, resulting in the formation of a heparinized fraction; and (b) isolating IgG from the heparinized fraction to form an IgG-enriched fraction.

В конкретном варианте осуществления представлена фармацевтическая композиция IgG, причем композиция IgG была очищена от гепаринизированной фракции посредством способа, включающего стадии (а) осаждения белковой гепаринизированной фракции, на первой стадии осаждения с использованием от около 6% до около 10% этанола при рН от около 7,0 до 7,5 с получением первого осадка и первого супернатанта;In a specific embodiment, an IgG pharmaceutical composition is provided, wherein the IgG composition has been purified from the heparinized fraction by a method comprising the steps of (a) precipitating the heparinized protein fraction, the first precipitation step using about 6% to about 10% ethanol at a pH of about 7 ,0 to 7.5 to obtain the first sediment and the first supernatant;

(b) регулирования концентрации этанола гепаринизированной фракции со стадии (а) до около 25% (об./об.) при температуре от около -5°С до около -9°С с образованием таким образом смеси;(b) adjusting the ethanol concentration of the heparinized fraction from step (a) to about 25% (v/v) at a temperature of about -5°C to about -9°C, thereby forming a mixture;

(с) отделения жидкости и осадка от смеси со стадии (b);(c) separating liquid and sediment from the mixture from step (b);

(d) повторного суспендирования осадка со стадии (с) в буфере, содержащем фосфат и ацетат, при этом рН буфера регулируют посредством добавления 600 мл ледяной уксусной кислоты на 1000 л буфера с образованием суспензии;(d) re-suspending the precipitate from step (c) in a buffer containing phosphate and acetate, the pH of the buffer being adjusted by adding 600 ml of glacial acetic acid per 1000 liters of buffer to form a suspension;

(е) смешивания мелкодисперсного диоксида кремния (SiO₂) с суспензией со стадии (d) в течение по меньшей мере около 30 мин;(e) mixing fine silica (SiO ₂ ) with the suspension from step (d) for at least about 30 minutes;

(f) фильтрации суспензии на фильтр-прессе с образованием фильтрата;(f) filtering the suspension on a filter press to form a filtrate;

(g) промывки фильтр-пресса по меньшей мере с 3 мертвыми объемами фильтр-пресса буфера, содержащего фосфат и ацетат, при этом рН буфера регулируют с использованием 150 мл ледяной уксусной кислоты на 1000 л буфера, образуя при этом промывочный раствор;(g) washing the filter press with at least 3 dead volumes of filter press buffer containing phosphate and acetate, the pH of the buffer being adjusted using 150 ml of glacial acetic acid per 1000 L of buffer, thereby forming a wash solution;

(h) объединения фильтрата со стадии (f) с промывочным раствором со стадии (g) с образованием(h) combining the filtrate from step (f) with the wash solution from step (g) to form

- 19 045585 таким образом раствора и обработки раствора моющим средством;- 19 045585 thus solution and treatment of the solution with detergent;

(i) регулирования рН раствора со стадии (h) до около 7,0 и добавления этанола до конечной концентрации около 25% с образованием таким образом осадка;(i) adjusting the pH of the solution from step (h) to about 7.0 and adding ethanol to a final concentration of about 25%, thereby forming a precipitate;

(j) отделения жидкости и осадка от смеси со стадии (i);(j) separating liquid and sediment from the mixture from step (i);

(k) растворения осадка в водном растворе, содержащем растворитель или моющее средство, и поддерживая раствор в течение по меньшей мере 60 мин;(k) dissolving the precipitate in an aqueous solution containing a solvent or detergent, and maintaining the solution for at least 60 minutes;

(l) пропускания раствора после стадии (k) через катионообменную хроматографическую колонку и элюирования белков, абсорбированных на колонке в элюате;(l) passing the solution from step (k) through a cation exchange chromatography column and eluting the proteins absorbed on the column in the eluate;

(m) пропускания элюата со стадии (l) через анионообменную хроматографическую колонку с образованием выходящего потока;(m) passing the eluate from step (l) through an anion exchange chromatography column to form an effluent;

(n) пропускания выходящего потока со стадии (m) через нанофильтр с образованием нанофильтрата;(n) passing the effluent from step (m) through a nanofilter to form a nanofiltrate;

(о) пропускания нанофильтрата со стадии (n) через мембрану для ультрафильтрации с образованием ультрафильтрата; и (р) диафильтрации ультрафильтрата со стадии (о) через диафильтрационный буфер с образованием диафильтрата с концентрацией белка от около 8% (вес/об.) до около 12% (вес/об.) с получением таким образом композиции концентрированного IgG.(o) passing the nanofiltrate from step (n) through an ultrafiltration membrane to form an ultrafiltrate; and (p) diafiltrating the ultrafiltrate from step (o) through a diafiltration buffer to form a diafiltrate having a protein concentration of from about 8% (w/v) to about 12% (w/v), thereby obtaining a concentrated IgG composition.

В определенных вариантах осуществления представлена фармацевтическая композиция IgG, в которой композицию IgG получают с использованием способа, представленного в данном документе, который включает улучшения двух или более стадий процесса фракционирования, описанных выше. Например, в некоторых вариантах осуществления улучшения могут быть обнаружены на первой стадии осаждения, на стадии осаждения с модифицированной фракцией II+III, на стадии растворения с модифицированной фракцией II+III и/или на стадии фильтрации суспензии с модифицированной фракцией II+III.In certain embodiments, an IgG pharmaceutical composition is provided, wherein the IgG composition is prepared using a method presented herein that includes improvements to two or more of the fractionation process steps described above. For example, in some embodiments, improvements may be found in the first precipitation stage, the modified Fraction II+III precipitation stage, the modified Fraction II+III dissolution stage, and/or the modified Fraction II+III slurry filtration stage.

В определенных вариантах осуществления представлена фармацевтическая композиция IgG, в которой композицию IgG получают с использованием способа очистки, описанного в настоящем документе, причем способ включает добавление распылением одного или более растворов, которые в противном случае были бы введены во фракцию плазмы посредством добавления потоком. Например, в определенных вариантах осуществления способ будет включать введение спирта (например, этанола) во фракцию плазмы посредством распыления. В других вариантах осуществления растворы, которые можно добавлять во фракцию плазмы посредством распыления, включают без ограничения рН-модифицирующий раствор, раствор растворителя, раствор моющего средства, буфер для разведения, раствор, модифицирующий проводимость и т.п. В предпочтительном варианте осуществления одну или более стадий осаждения спиртом осуществляют посредством добавления спирта в фракцию плазмы посредством распыления. Во втором предпочтительном варианте одну или более стадий регулирования рН осуществляют посредством добавления рН-модифицирующего раствора к фракции плазмы посредством распыления.In certain embodiments, an IgG pharmaceutical composition is provided, wherein the IgG composition is prepared using a purification method described herein, the method comprising nebulizing one or more solutions that would otherwise be introduced into the plasma fraction by flow addition. For example, in certain embodiments, the method will include introducing an alcohol (eg, ethanol) into the plasma fraction by nebulization. In other embodiments, solutions that can be added to the plasma fraction by nebulization include, but are not limited to, a pH-modifying solution, a solvent solution, a detergent solution, a dilution buffer, a conductivity-modifying solution, and the like. In a preferred embodiment, one or more alcohol precipitation steps are carried out by adding alcohol to the plasma fraction by nebulization. In a second preferred embodiment, one or more pH adjustment steps are carried out by adding a pH-modifying solution to the plasma fraction by nebulization.

В определенных вариантах осуществления представлена фармацевтическая композиция IgG, причем композицию IgG получают посредством способа очистки, описанного в данном документе, причем способ включает регулирование рН фракции плазмы, осаждаемой после и/или совместно с добавлением осаждающего средства (например, спирта или полиэтиленгликоля). В некоторых вариантах осуществления представлено улучшение процесса, при котором рН активно осаждаемой фракции плазмы поддерживается на протяжении всей стадии инкубации или выдержки осаждения посредством непрерывного контроля и регулирования рН. В предпочтительных вариантах осуществления регулирование рН осуществляют посредством распыления рН-модифицирующего раствора.In certain embodiments, a pharmaceutical composition of an IgG is provided, the IgG composition being prepared by a purification method described herein, the method including adjusting the pH of the plasma fraction precipitated after and/or in conjunction with the addition of a precipitating agent (eg, alcohol or polyethylene glycol). In some embodiments, an improvement to the process is provided wherein the pH of the actively sedimented plasma fraction is maintained throughout the incubation or settling stage through continuous monitoring and adjustment of the pH. In preferred embodiments, pH adjustment is accomplished by spraying a pH-modifying solution.

В одном варианте осуществления в настоящем изобретении представлена фармацевтическая композиция IgG, имеющая концентрацию белка от около 70 г/л до около 130 г/л. В определенных вариантах осуществления концентрация белка композиции IgG составляет от около 80 г/л до около 120 г/л, например от около 90 г/л до около 110 г/л, например около 100 г/л, или представляет собой любую подходящую концентрацию в указанных диапазонах, например, около 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125 или 130 г/л. В предпочтительном варианте осуществления представлена фармацевтическая композиция с концентрацией белка 100 г/л или около. В особенно предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция будет иметь концентрацию белка около 102 г/л.In one embodiment, the present invention provides an IgG pharmaceutical composition having a protein concentration of from about 70 g/L to about 130 g/L. In certain embodiments, the protein concentration of the IgG composition is from about 80 g/L to about 120 g/L, such as about 90 g/L to about 110 g/L, such as about 100 g/L, or any suitable concentration in specified ranges, for example, about 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125 or 130 g/l. In a preferred embodiment, a pharmaceutical composition is provided with a protein concentration of 100 g/L or about. In a particularly preferred embodiment, the pharmaceutical composition will have a protein concentration of about 102 g/L.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения представлена фармацевтическая композиция IgG, имеющая концентрацию белка от около 170 г/л до около 230 г/л. В определенных вариантах осуществления концентрация белка в композиции IgG составляет от около 180 г/л до около 220 г/л, например от около 190 г/л до около 210 г/л, например около 200 г/л, или представляет собой любую подходящую концентрацию в указанных диапазонах, например около 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225 или 230 г/л. В предпочтительном варианте осуществления представлена фармацевтическая композиция с концентрацией белка 200 г/л или около.In another embodiment, the present invention provides an IgG pharmaceutical composition having a protein concentration of from about 170 g/L to about 230 g/L. In certain embodiments, the protein concentration of the IgG composition is from about 180 g/L to about 220 g/L, such as about 190 g/L to about 210 g/L, such as about 200 g/L, or any suitable concentration in specified ranges, for example about 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225 or 230 g/l. In a preferred embodiment, a pharmaceutical composition is provided with a protein concentration of 200 g/L or about.

Способы, представленные в данном документе, обеспечивают получение фармацевтических композиций IgG с очень высокими уровнями чистоты. Например, в одном варианте осуществления по меньшей мере около 95% общего белка в композиции, представленной в данном документе, будет представлять собой IgG. В других вариантах осуществления по меньшей мере около 96% белка представляет собой IgG или по меньшей мере около 97, 98, 99, 99,5% или более общего белка композиции будет представ- 20 045585 лять собой IgG. В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере 97% общего белка в композиции будет представлять собой IgG. В другом предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере 98% общего белка в композиции будет представлять собой IgG. В другом предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере 99% общего белка в композиции будет представлять собой IgG.The methods presented herein provide pharmaceutical IgG compositions with very high levels of purity. For example, in one embodiment, at least about 95% of the total protein in the composition provided herein will be IgG. In other embodiments, at least about 96% of the protein is IgG, or at least about 97, 98, 99, 99.5% or more of the total protein of the composition will be IgG. In a preferred embodiment, at least 97% of the total protein in the composition will be IgG. In another preferred embodiment, at least 98% of the total protein in the composition will be IgG. In another preferred embodiment, at least 99% of the total protein in the composition will be IgG.

Подобным образом, способы, представленные в данном документе, обеспечивают получение фармацевтических композиций IgG, которые содержат чрезвычайно высокие уровни загрязняющих веществ. Например, в определенных вариантах осуществления представлены композиции IgG, которые содержат менее около 100 мг/л IgA. В других вариантах осуществления композиция IgG будет содержать менее около 50 мг/л IgA, предпочтительно менее около 35 мг/л IgA, наиболее предпочтительно менее около 20 мг/л IgA.Likewise, the methods presented herein provide pharmaceutical IgG compositions that contain extremely high levels of contaminants. For example, in certain embodiments, IgG compositions are provided that contain less than about 100 mg/L IgA. In other embodiments, the IgG composition will contain less than about 50 mg/L IgA, preferably less than about 35 mg/L IgA, most preferably less than about 20 mg/L IgA.

Представленные в данном документе фармацевтические композиции обычно содержат один или более буферных средств или средств, стабилизирующих рН, подходящих для внутривенного, подкожного и/или внутримышечного введения. Неограничивающие примеры буферных средств, подходящих для составления композиции IgG, представленных в настоящем документе, включают глицин, цитрат, фосфат, ацетат, глутамат, тартрат, бензоат, лактат, гистидин или другие аминокислоты, глюконат, малат, сукцинат, формиат, пропионат, карбонат или любую их комбинацию, доведенную до соответствующего рН. Как правило, буферного средства будет достаточно для поддержания подходящего рН в составе в течение продолжительного периода времени. В предпочтительном варианте осуществления буферное средство представляет собой глицин.The pharmaceutical compositions provided herein typically contain one or more buffering agents or pH stabilizing agents suitable for intravenous, subcutaneous and/or intramuscular administration. Non-limiting examples of buffer agents suitable for formulation of the IgGs provided herein include glycine, citrate, phosphate, acetate, glutamate, tartrate, benzoate, lactate, histidine or other amino acids, gluconate, malate, succinate, formate, propionate, carbonate or any combination of them, adjusted to the appropriate pH. Typically, a buffering agent will be sufficient to maintain a suitable pH in the formulation over an extended period of time. In a preferred embodiment, the buffering agent is glycine.

В некоторых вариантах осуществления концентрация буферного средства в составе будет составлять от около 100 мМ до около 400 мМ, например от около 150 мМ до около 350 мМ, например от около 200 мМ до около 300 мМ, например 250 мМ. В особенно предпочтительном варианте осуществления композиция IVIG будет содержать от около 200 мМ до около 300 мМ глицина, например около 250 мМ глицина.In some embodiments, the concentration of buffer agent in the composition will be from about 100 mM to about 400 mM, such as from about 150 mM to about 350 mM, such as from about 200 mM to about 300 mM, such as 250 mM. In a particularly preferred embodiment, the IVIG composition will contain from about 200 mm to about 300 mm glycine, for example about 250 mm glycine.

В определенных вариантах осуществления рН состава будет составлять от около 4,1 до около 5,6, например от около 4,4 до около 5,3, например от 4,6 до около 5,1. В конкретных вариантах осуществления рН состава может составлять около 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5 или 5,6. В предпочтительном варианте осуществления рН состава будет составлять от около 4,6 до около 5,1.In certain embodiments, the pH of the formulation will be from about 4.1 to about 5.6, such as from about 4.4 to about 5.3, such as from 4.6 to about 5.1. In specific embodiments, the pH of the formulation may be about 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5 ,1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5 or 5.6. In a preferred embodiment, the pH of the formulation will be from about 4.6 to about 5.1.

В некоторых вариантах осуществления представленные в данном документе фармацевтические композиции могут дополнительно содержать средство для регулирования осмолярности композиции. Неограничивающие примеры средств для регулирования осмолярности включают маннит, сорбит, глицерин, сахарозу, глюкозу, декстрозу, левулозу, фруктозу, лактозу, полиэтиленгликоли, фосфаты, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, глюконоглюкогептонат кальция, диметилсульфон и т.п.In some embodiments, the pharmaceutical compositions provided herein may further comprise an agent for adjusting the osmolarity of the composition. Non-limiting examples of osmolarity adjusting agents include mannitol, sorbitol, glycerol, sucrose, glucose, dextrose, levulose, fructose, lactose, polyethylene glycols, phosphates, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, calcium glucoglucoheptonate, dimethyl sulfone, and the like.

Как правило, представленные в данном документе составы будут иметь осмолярность, сравнимую с физиологической осмолярностью, от около 285 до 295 мОсмоль/кг (Lacy et al., Drug Information Handbook Lexi-Comp 1999:1254. В определенных вариантах осуществления осмолярность препарата будет составлять от около 200 мОсмоль/кг до около 350 мОсмоль/кг, предпочтительно от около 240 мОсмоль/кг до около 300 мОсмоль/кг. В конкретных вариантах осуществления осмолярность состава будет составлять около 200 или 210, 220, 230, 240, 245,250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 310, 320, 330, 340, 340 или 350 мОсмоль/кг.Typically, the formulations provided herein will have an osmolarity comparable to physiological osmolarity, from about 285 to 295 mOsmol/kg (Lacy et al., Drug Information Handbook Lexi-Comp 1999:1254. In certain embodiments, the drug osmolarity will be from about 200 mOsmol/kg to about 350 mOsmol/kg, preferably from about 240 mOsmol/kg to about 300 mOsmol/kg In particular embodiments, the osmolarity of the composition will be about 200 or 210, 220, 230, 240, 245,250, 255, 260 , 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 310, 320, 330, 340, 340 or 350 mOsmol/kg.

Предлагаемые в данном документе составы IgG обычно стабильны в жидкой форме в течение продолжительного периода времени. В определенных вариантах осуществления составы стабильны в течение по меньшей мере около 3 месяцев при комнатной температуре или по меньшей мере около 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 месяцев при комнатной температуре. Состав также обычно стабилен в течение 6 месяцев, или по меньшей мере менее около 18 месяцев в условиях охлаждения (обычно от около 2°С до около 8°С), или по меньшей мере менее около 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42 или 45 месяцев в условиях охлаждения.The IgG formulations provided herein are generally stable in liquid form over an extended period of time. In certain embodiments, the formulations are stable for at least about 3 months at room temperature, or at least about 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 months at room temperature. The composition is also typically stable for 6 months, or at least less than about 18 months under refrigerated conditions (typically about 2°C to about 8°C), or at least less than about 21, 24, 27, 30, 33. 36, 39, 42 or 45 months under refrigerated conditions.

ПримерыExamples

Следующие примеры приведены с целью иллюстрации, а не с целью ограничения. Специалистам в данной области будет легко распознать множество некритических параметров, которые можно изменить или модифицировать для получения по существу таких же или подобных результатов.The following examples are provided for purposes of illustration and not limitation. Those skilled in the art will readily recognize many non-critical parameters that can be changed or modified to obtain substantially the same or similar results.

Использованные условные сокращения.Abbreviations used.

САЕ - электрофорез ацетата целлюлозы;CAE - cellulose acetate electrophoresis;

CZE - капиллярный зональный электрофорез;CZE - capillary zone electrophoresis;

FC - конечный контейнер;FC - final container;

NAPTT - неактивированное частичное тромбопластиновое время;NAPTT - non-activated partial thromboplastin time;

НП - нормальная плазма;NP - normal plasma;

PKA - прекалликреиновая активность;PKA - prekallikrein activity;

PL-1 - амидолитическая активность, измеренная с хромогенным субстратом PL-1;PL-1 - amidolytic activity measured with chromogenic substrate PL-1;

PptG - осадок G;PptG - precipitate G;

TGA - анализ образования тромбина;TGA - thrombin generation assay;

- 21 045585- 21 045585

ТР - общий белокTP - total protein

Пример 1.Example 1.

В настоящем примере показано, что значительные количества фибриногена, амидолитической активности, прекалликреиновой активности могут быть удалены из осадка PptG, полученного из супернатанта плазмы с низким содержанием C1-INH (DDCPP).The present example demonstrates that significant amounts of fibrinogen, amidolytic activity, and prekallikrein activity can be removed from a PptG precipitate obtained from low C1-INH plasma supernatant (DDCPP).

Содержание фибриногена из исходного материала в супернатанте I снижается с 0,94 до 0,26 г/л DDCPP для варианта нативного (см. табл. 1), с 1,23 до 0,34 г/л DDCPP для варианта гепарина (см. табл. 2) и с 1,4 до 0,37 г/л DDCPP для варианта NaCl (см. табл. 3). Дальнейшее снижение происходит при аэрозольной обработке и фильтрации до 0,01 г/л для варианта гепарина (табл. 2) и до 0,02 г/л DDCPP для обоих других вариантов (табл. 1 и 3). Фибриноген в растворенных образцах PptG из 6 партий составляет 0,1-0,3% от общего белка (табл. 4). Содержание фибриногена на данной стадии равно содержанию в соответствующих партиях, полученных из PptG (0,1-0,3% общего белка). Фибриноген был ниже предела обнаружения на уровне конечного контейнера (см. табл. 15).The content of fibrinogen from the starting material in supernatant I decreases from 0.94 to 0.26 g/l DDCPP for the native variant (see Table 1), from 1.23 to 0.34 g/l DDCPP for the heparin variant (see Table 1). table 2) and from 1.4 to 0.37 g/l DDCPP for the NaCl option (see table 3). Further reductions occur with aerosolization and filtration to 0.01 g/L for the heparin option (Table 2) and to 0.02 g/L DDCPP for both other options (Tables 1 and 3). Fibrinogen in dissolved PptG samples from 6 batches accounted for 0.1-0.3% of total protein (Table 4). The fibrinogen content at this stage is equal to the content in the corresponding batches obtained from PptG (0.1-0.3% total protein). Fibrinogen was below the limit of detection at the final container level (see Table 15).

Фракционирование II+III обеспечивает отделение необработанных иммуноглобулинов (осадка II+III) от необработанного альбумина (супернатант II+III). Гаптоглобин и трансферрин в основном сохраняются в супернатантах II+III (см. табл. 1, 2 и 3). Комплемент С3 является низким в исходных объединенных веществах по Кону и удаляется при обработке аэросилом и стадии фильтрации от 0,03-0,05 г/л DDCPP до 0,004 г/л DDCPP для гепарина и 0,01 г/л DDCPP для обоих других вариантов. Белок FXI снижается от около 1000 ед./л DDCPP до 148 ед./л DDCPP для гепарина, до 383 ед./л DDCPP для нативного и до 461 ед./л DDCPP для варианта NaCl. Обработка аэросилом и стадия фильтрации снижает уровень фибриногена, гаптоглобина, а также части белка IgA, IgM и FXI.Fractionation II+III ensures the separation of untreated immunoglobulins (precipitate II+III) from untreated albumin (supernatant II+III). Haptoglobin and transferrin are mainly retained in supernatants II+III (see Tables 1, 2 and 3). Complement C3 is low in the original Cohn pools and is removed by Aerosil treatment and the filtration step from 0.03-0.05 g/L DDCPP to 0.004 g/L DDCPP for heparin and 0.01 g/L DDCPP for both other options . FXI protein decreases from about 1000 U/L DDCPP to 148 U/L DDCPP for heparin, to 383 U/L DDCPP for native and to 461 U/L DDCPP for the NaCl variant. Treatment with Aerosil and the filtration stage reduces the level of fibrinogen, haptoglobin, as well as parts of the IgA, IgM and FXI proteins.

В PptG обнаружено низкое содержание низкомолекулярных компонентов, измеренное распределением молекулярных размеров (см. табл. 4). Трансферрин и макроглобулин α2 остаются в супернатанте PptG (табл. 1-3). Содержание IgA (от 7,7 до 10,9% общего белка (ТР), измеренное посредством ELISA) в растворенном PptG имеет несколько более низкий диапазон, чем в соответствующих партиях в VIE (9,6-12,7% ТР). В растворенном PptG уровень а2-макроглобулина колеблется от 4,7 до 5,6% от ТР (табл. 4). Белок FXI является одинаково высоким для всех партий с вариантом нативным и вариантом NaCl (37,5-41,9 ед./г белка) в PptG, но ниже для партий, в которых был добавлен гепарин (12,1-12,4 ед./г белка) (см. табл. 4). Это еще лучше отражено значениями г/л DDCPP, которые показаны в табл. 4.PptG exhibits a low content of low molecular weight components as measured by molecular size distribution (see Table 4). Transferrin and α2 macroglobulin remain in the PptG supernatant (Tables 1-3). The IgA content (7.7 to 10.9% total protein (TP) measured by ELISA) in dissolved PptG has a slightly lower range than the corresponding batches in VIE (9.6 to 12.7% TP). In dissolved PptG, the level of a2-macroglobulin ranges from 4.7 to 5.6% of TP (Table 4). FXI protein is equally high for all batches with the native variant and the NaCl variant (37.5-41.9 U/g protein) in PptG, but lower for batches in which heparin was added (12.1-12.4 U ./g protein) (see Table 4). This is further reflected by the g/l DDCPP values shown in Table 1. 4.

Таблица 1Table 1

Промежуточные результаты выше по потоку (объединенные вещества по Кону до супернатанта PptG) - нативныеUpstream intermediate results (Cohn pools to PptG supernatant) - native

Выше по потоку вариантно-нативный Upstream variant-native Объедине иные вещества DDCPP по Кону (4/4) Combine other substances DDCPP according to Cohn (4/4) Супернатант I (4/8) Supernatant I (4/8) Супернатант II-i111(5/8) Supernatant II-i111(5/8) Суспензи я II-i-III (6/5) Suspensions II-i-III (6/5) Фильтра т CUNO (7/13) Filter t CUNO (7/13) Супернат ант PptG (8/6) Supernate ant PptG (8/6) Белок (Biuret) Protein (Biuret) [мг/мл] [mg/ml] 48,23 48.23 42,66 42.66 31,03 31.03 17,54 17.54 8,52 8.52 1,07 1.07 Распредел ение молекулрн ого размера (HPLC) [% площади] Molecular size distribution (HPLC) [area%] Агрегат Unit 15,07 15.07 6,89 6.89 25,7 25.7 15,35 15.35 Олиго/ цимер Oligo/ Ziemer 38,52 38.52 16,21 16.21 65,36 65.36 79,8 79.8 Мономер Monomer 46,13 46.13 76,71 76.71 5,82 5.82 4,64 4.64 Фрагменты Fragments 0,24 0.24 0,19 0.19 3,12 3.12 0,21 0.21

- 22 045585- 22 045585

[мг/мл] [mg/ml] 1,47 1.47 1,27 1.27 0,25 0.25 1,43 1.43 0,81 0.81 IgA (ELISA) IgA (ELISA) [г/л DDCPP] [g/l DDCPP] 1,47 1.47 1,35 1.35 0,28 0.28 0,93 0.93 0,88 0.88 [мг/мл] [mg/ml] 0,48 0.48 0,29 0.29 0,001 0.001 0,58 0.58 0,26 0.26 IgM (ELISA) IgM (ELISA) [г/л DDCPP] [g/l DDCPP] 0,48 0.48 0,31 0.31 0,002 0.002 0,37 0.37 0,29 0.29 Фибриноген Fibrinogen [мг/мл] [mg/ml] 0,94 0.94 0,24 0.24 0,0002 0.0002 0,48 0.48 0,02 0.02 [g/L [g/L 0,94 0.94 0,26 0.26 0,0002 0.0002 0,31 0.31 0,02 0.02 DDCPP] DDCPP] Комплемент Complement [мг/мл] [mg/ml] 0,09 0.09 0,05 0.05 0,004 0.004 0,05 0.05 0,01 0.01 СЗ NW [г/л DDCPP] [g/l DDCPP] 0,09 0.09 0,05 0.05 0,005 0.005 0,03 0.03 0,01 0.01 al- al- [мг/мл] [mg/ml] 1,39 1.39 1,15 1.15 0,01 0.01 0,01 0.01 антитрипсин antitrypsin [г/л DDCPP] [g/l DDCPP] 1,39 1.39 1,21 1.21 0,01 0.01 0,01 0.01 а2-макро- a2-macro- [мг/мл] [mg/ml] 1,33 1.33 1,14 1.14 0,31 0.31 1,26 1.26 0,76 0.76 0,19 0.19 глобулин globulin [г/л DDCPP] [g/l DDCPP] 1,33 1.33 1,21 1.21 0,35 0.35 0,82 0.82 0,83 0.83 0,27 0.27 Аполипопро Apolipopro [мг/мл] [mg/ml] 1,25 1.25 1,И 1,I 0,71 0.71 более 0,019 more than 0.019 0,003 0.003 теин thein [г/л DDCPP] [g/l DDCPP] 1,25 1.25 1,17 1.17 0,81 0.81 0,003 0.003 Церулоплаз Ceruloplas [мг/мл] [г/л DDCPP] [mg/ml] [g/l DDCPP] 0,02 0.02 0,002 0.002 0,02 0.02 0,002 0.002 0,001 0.001 мин min 0,02 0.02 0,002 0.002 0,02 0.02 0,002 0.002 0,001 0.001 [Ед ./мл] [U/ml] 1,14 1.14 1,03 1.03 0,21 0.21 1,13 1.13 0,35 0.35 Белок FXI FXI protein [Ед ./л DDCPP] [Unit/l DDCPP] 1140 1140 1089 1089 241 241 737 737 383 383 [мг/мл] [mg/ml] 1,06 1.06 0,94 0.94 0,04 0.04 0,01 0.01 0,01 0.01 Гаптоглобин Haptoglobin [г/л DDCPP] [g/l DDCPP] 1,06 1.06 1,08 1.08 0,02 0.02 0,01 0.01 0,01 0.01 Трансферри Transferferry [мг/мл] [г/л DDCPP] [mg/ml] [g/l DDCPP] 2,32 2.32 2,08 2.08 1,91 1.91 0,18 0.18 о,и oh and 0,08 0.08 и And 2,32 2.32 2,20 2.20 2,18 2.18 0,12 0.12 0,12 0.12 0,12 0.12 Пром вещ| Industrial items| I ежуточны ества по К I daily foods according to K е результ ону до се: e result is: аты выш< прнатант: aty vys<prnatant: е по пот а PptG) - e by sweat a PptG) - оку (объе вариант oku (volume option Т диненны гепарин T-dinen heparin аблица 2 е а table 2 e A Вариант гепарина выше по потоку Upstream Heparin Option Объединен ные вещества Combined substances Супернатант I (4/8) Supernatant I (4/8) Супер- натант ] П+Ш Super- natant ] P+SH Суспензия [I+III (6/5) Suspension [I+III (6/5) Фильтра т CUNO (7/13) Filter t CUNO (7/13) Супернат ант PptG (8/6) Supernate ant PptG (8/6) по Кону according to Kohn (5/8) (5/8) (4/4) (4/4) Белок (Biuret) ' Protein (Biuret)' ’мг/мл] 'mg/ml] 47,42 47.42 42,31 42.31 31,26 31.26 20,04 20.04 7,33 7.33 0,92 0.92

- 23 045585- 23 045585

Распределени е молекулрног о размера (HPLC) [% площади] Molecular size distribution (HPLC) [area%] Агрегат Unit 12,79 12.79 10,38 10.38 22,80 22.80 15,39 15.39 Олиго/дим ер Oligo/dim er 37,78 37.78 13,96 13.96 69,88 69.88 79,99 79.99 Мономер Monomer 49,19 49.19 75,14 75.14 6,60 6.60 4,49 4.49 Фрагменты Fragments 0,24 0.24 0,51 0.51 0,72 0.72 0,13 0.13 IgA (ELISA) IgA (ELISA) [мг/мл] [mg/ml] 1,63 1.63 1,34 1.34 0,26 0.26 1,55 1.55 0,66 0.66 [г/л DDCPP] [g/l DDCPP] 1,63 1.63 1,42 1.42 0,30 0.30 1,00 1.00 0,81 0.81 IgM (ELISA) IgM (ELISA) [мг/мл] [mg/ml] 0,56 0.56 0,31 0.31 0,002 0.002 0,55 0.55 0,19 0.19 [г/л DDCPP] [g/l DDCPP] 0,56 0.56 0,33 0.33 0,002 0.002 0,35 0.35 0,23 0.23 Фибриноген Fibrinogen [мг/мл] [mg/ml] 1,23 1.23 0,32 0.32 0,0004 0.0004 0,69 0.69 0,008 0.008 [г/л DDCPP] [g/l DDCPP] 1,23 1.23 0,34 0.34 0,0004 0.0004 0,44 0.44 0,01 0.01 Комплемент СЗ Complement NW [мг/мл] [mg/ml] 0,09 0.09 0,05 0.05 0,0003 0.0003 0,05 0.05 0,003 0.003 [г/л DDCPP] [g/l DDCPP] 0,09 0.09 0,05 0.05 0,0003 0.0003 0,03 0.03 0,004 0.004 al- антитрипсин al- antitrypsin [мг/мл] [mg/ml] 1,49 1.49 1,40 1.40 0,04 0.04 0,007 0.007 [г/л DDCPP] [g/l DDCPP] 1,49 1.49 1,49 1.49 0,03 0.03 0,01 0.01 а2-макроглобулин a2-macroglobulin [мг/мл] [mg/ml] 1,32 1.32 1,15 1.15 0,28 0.28 1,37 1.37 0,67 0.67 0,19 0.19 [г/л DDCPP] [g/l DDCPP] 1,32 1.32 1,22 1.22 0,32 0.32 0,88 0.88 0,82 0.82 0,31 0.31 Церулоплазм ин Ceruloplasm in [мг/мл] [mg/ml] 0,03 0.03 0,01 0.01 0,01 0.01 0,003 0.003 0,001 0.001 [г/л DDCPP] [g/l DDCPP] 0,03 0.03 0,01 0.01 0,01 0.01 0,003 0.003 0,001 0.001 Белок FXI FXI protein [Ед ./мл] [U/ml] 1,1 1.1 0,87 0.87 0,08 0.08 1,54 1.54 0,12 0.12 [Ед ./л DDCPP] [Unit/l DDCPP] 1100 1100 922 922 92 92 994 994 148 148 Гаптоглобин Haptoglobin мг/мл] mg/ml] 1,15 1.15 0,91 0.91 0,04 0.04 0,006 0.006 0,004 0.004 д/л DDCPP] d/l DDCPP] 1,15 1.15 1,04 1.04 0,03 0.03 0,01 0.01 0,01 0.01 Трансферрин Transferrin ~ мг/мл] ~ mg/ml] 2,27 2.27 1,96 1.96 1,68 1.68 0,16 0.16 0,08 0.08 0,06 0.06 д/л DDCPP] d/l DDCPP] 2,27 2.27 2,07 2.07 1,93 1.93 0,10 0.10 0,10 0.10 0,10 0.10

- 24 045585- 24 045585

Таблица 3Table 3

Промежуточные результаты выше по потоку (объединенные вещества по Кону до супернатанта PptG) - вариант NaClIntermediate results upstream (Cohn pools to PptG supernatant) - NaCl option

Выше по потоку Вариант NaCl Upstream Option NaCl Обведи ценные веществ а по Кону (4/4) Circle the valuable substances according to Kohn (4/4) Супернатант 1(4/8) Supernatant 1(4/8) Супернатант П+Ш (5/8) Supernatant P+SH (5/8) Суспензи я П+Ш (6/5) Suspensions P+Sh (6/5) Фильтрат CUNO (7/13) Filtrate CUNO (7/13) Супернат ант PptG (8/6) Supernate ant PptG (8/6) Белок (Biuret) Protein (Biuret) [мг/мл] [mg/ml] 48,54 48.54 43,40 43.40 30,78 30.78 12,45 12.45 7,00 7.00 0,89 0.89 Распредел ение молекулрн ого размера (HPLC) [% площади] Molecular size distribution (HPLC) [area%] Агрегат Unit 13,16 13.16 11,13 11.13 22,22 22.22 16,99 16.99 О л иго/диме Р About ligo/dima R 38,93 38.93 14,49 14.49 70,79 70.79 78,57 78.57 Мономер Monomer 47,71 47.71 74,01 74.01 6,81 6.81 4,36 4.36 Фрагменты Fragments 0,18 0.18 0,38 0.38 0,17 0.17 0,10 0.10 IgA (ELISA) IgA (ELISA) [мг/мл] [mg/ml] 1,521 1.521 1,56 1.56 0,23 0.23 1,30 1.30 0,62 0.62 [г/л DDCPP] [g/l DDCPP] 1,52 1.52 1,70 1.70 0,27 0.27 0,95 0.95 0,87 0.87 IgM (ELISA) IgM (ELISA) [мг/мл] [mg/ml] 0,50 0.50 0,46 0.46 0,002 0.002 0,72 0.72 0,25 0.25 [г/л DDCPP] [g/l DDCPP] 0,50 0.50 0,50 0.50 0,002 0.002 0,53 0.53 0,34 0.34 Фибриноген Fibrinogen [мг/мл] [mg/ml] 1,4 1.4 0,34 0.34 0,0005 0.0005 0,49 0.49 0,02 0.02 [г/л DDCPP] [g/l DDCPP] 1,4 1.4 0,37 0.37 0,0006 0.0006 0,36 0.36 0,02 0.02 Комплемент СЗ Complement NW [мг/мл] [mg/ml] 0,09 0.09 0,08 0.08 0,0004 0.0004 0,06 0.06 0,006 0.006 [г/л DDCPP] [g/l DDCPP] 0,09 0.09 0,09 0.09 0,0005 0.0005 0,05 0.05 0,009 0.009 al- антитрипсин al- antitrypsin [мг/мл] [mg/ml] 1,29 1.29 1,14 1.14 0,07 0.07 0,006 0.006 [г/л DDCPP] [g/l DDCPP] 1,29 1.29 1,24 1.24 0,05 0.05 0,008 0.008 а2-макроглобулин a2-macroglobulin [мг/мл] [mg/ml] 1,40 1.40 1,19 1.19 0,25 0.25 1,19 1.19 0,59 0.59 0,18 0.18 [г/л DDCPP] [g/l DDCPP] 1,40 1.40 1,30 1.30 0,30 0.30 0,87 0.87 0,83 0.83 0,32 0.32 Церулоплаз мин Ceruloplas min [мг/мл] [mg/ml] 0,02 0.02 0,007 0.007 0,015 0.015 0,001 0.001 < 0,00032 <0.00032 [г/л DDCPP] [g/l DDCPP] 0,02 0.02 0,008 0.008 0,01 0.01 0,002 0.002 н.а. on the. Белок FXI FXI protein [Ед./мл] [U/ml] 0,99 0.99 0,96 0.96 0,25 0.25 1,1 1.1 0,33 0.33 [Ед./л DDCPP] [U/l DDCPP] 990 990 1047 1047 295 295 807 807 461 461

- 25 045585- 25 045585

Гаптоглобин Haptoglobin [мг/мл] [mg/ml] 1,02 1.02 0,91 0.91 0,048 0.048 0,008 0.008 0,005 0.005 [г/л DDCPP] [g/l DDCPP] 1,02 1.02 1,08 1.08 0,035 0.035 0,011 0.011 0,010 0.010 Трансферри н Transferri n [мг/мл] [mg/ml] 2,44 2.44 2,02 2.02 1,76 1.76 0,15 0.15 0,08 0.08 0,06 0.06 [г/л DDCPP] [g/l DDCPP] 2,44 2.44 2,21 2.21 2,08 2.08 о,и oh and о,и oh and о,и oh and

Таблица 4Table 4

Характеристика осадка GCharacteristics of sediment G

Растворенный осадок G Dissolved precipitate G Нативный Native Гепарин Heparin NaCl NaCl 35шМ 35shM 35шМ 35shM 35шМ 35shM Испытание Trial Единица Unit Белок (Biuret) Protein (Biuret) [мг/мл] [mg/ml] 69,58 69.58 73,80 73.80 75,25 75.25 Распределение молекулярных размеров (HPLC) [% площади] Molecular size distribution (HPLC) [area%] Агрегат Unit 10,60 10.60 9,12 9.12 11,21 11.21 Олиго/димер Oligo/dimer 13,76 13.76 13,44 13.44 12,76 12.76 Мономер Monomer 75,53 75.53 77,31 77.31 75,90 75.90 Фрагменты Fragments 0,11 0.11 0,13 0.13 0,13 0.13 IgA (ELISA) IgA (ELISA) [мг/мл] [mg/ml] 6,22 6.22 7,460 7,460 6,06 6.06 [% TP] [%TP] 8,9 8.9 юдо Yudo 8,1 8.1 [г/л DDCPP] [g/l DDCPP] 0,79 0.79 0,780 0.780 0,66 0.66 IgM (ELISA) IgM (ELISA) [мг/мл] [mg/ml] 1,81 1.81 1,80 1.80 2,43 2.43 [% ТР] [% TR] 2,6 2.6 2,4 2.4 3,2 3.2 [г/л DDCPP] [g/l DDCPP] 0,23 0.23 0,19 0.19 0,27 0.27 Фибриноген Fibrinogen [мг/мл] [mg/ml] 0,18 0.18 0,09 0.09 0,21 0.21 [% ТР] [%TR] 0,25 0.25 0,12 0.12 0,27 0.27 [г/л DDCPP] [g/l DDCPP] 0,02 0.02 0,01 0.01 0,02 0.02 Комплемент СЗ Complement SZ [мг/мл] [mg/ml] 0,08 0.08 0,04 0.04 0,10 0.10 [% ТР] [%TR] 0,12 0.12 0,05 0.05 0,13 0.13 [г/л DDCPP] [g/l DDCPP] 0,01 0.01 0,004 0.004 0,01 0.01 а2-макро-глобулин a2-macro-globulin [мг/мл] [mg/ml] 3,52 3.52 3,57 3.57 3,78 3.78 [% ТР] [%TR] 5,06 5.06 4,84 4.84 5,02 5.02 [г/л DDCPP] [g/l DDCPP] 0,45 0.45 0,37 0.37 0,41 0.41 Белок FXI FXI protein [Ед./мл] [U/ml] 2,75 2.75 0,89 0.89 2,82 2.82 [Ед./г ТР] [Unit/g TR] 39,52 39.52 12,06 12.06 37,47 37.47 [Ед./л DDCPP] [U/l DDCPP] 349,3 349.3 92,9 92.9 308,0 308.0

PKA в растворенном PptG колеблется от ниже предела количественного определения до 9,4 ед./мл. В порции PKA ниже предела количественного определения (см. табл. 5) для всех вариантов процесса. Калликреиноподобная активность является высокой на стадии растворения PptG (490-733 нмоль/млхмин), но может быть сильно снижена в ходе последующего процесса: при использовании 35 мМ элюирующего буфера для хроматографии на СМ сефарозе уровни являются ниже предела количественного определения (менее 10 нмоль/млхмин). Неактивированное частичное тромбопластиновое время, измеренное в плазме с дефицитом FXI, не укорачивается при растворении PptG при любом варианте. Амидолитическая активность, измеренная с использованием хромогенного субстрата PL-1, является высокой в растворенном PptG (97,2-163,1 нмоль/млхмин), но снижена в большинстве случаев до уровней ниже предела количественного определения при конечном общем уровне (менее 10 нмоль/млхмин). Генерацию тромбина измеряли на уровне растворенного PptG только для информации. Испытание варьирует, но TGA, измеренный на данной стадии, является ниже (113,14 и 103,33% от нормальной плазмы) (контрольный предел 132% NP для FC) для партии, в которой гепарин добавляли к DDCPP. В объединенном образце перед инкубацией при низком рН значение TGA выше предела мониторинга для обычных конечных контейнеров, составляющего 132% для всех образцов. Значение TGA составляет от 185 до 195% нормальной плазмы для опытов с 35 мМ элюирующего буфера независимо от добавления NaCl, гепарина или нативного. Значения FXIa находятся ниже предела количественного определения для партии, полученной сPKA in dissolved PptG ranges from below the limit of quantitation to 9.4 U/mL. The PKA portion was below the limit of quantitation (see Table 5) for all process options. Kallikrein-like activity is high during the PptG dissolution step (490-733 nmol/mLhmin), but can be greatly reduced during the subsequent process: when using 35 mM SM Sepharose elution buffer, levels are below the limit of quantitation (less than 10 nmol/mLhmin ). Unactivated partial thromboplastin time measured in FXI-deficient plasma was not shortened by PptG dissolution in either treatment. Amidolytic activity, measured using the chromogenic substrate PL-1, is high in dissolved PptG (97.2-163.1 nmol/mL min), but is reduced in most cases to levels below the limit of quantitation at the final total level (less than 10 nmol/mL). mlhmin). Thrombin generation was measured at the level of dissolved PptG for information only. The test varies, but the TGA measured at this stage is lower (113.14 and 103.33% of normal plasma) (control limit of 132% NP for FC) for the batch in which heparin was added to DDCPP. The pooled sample before low pH incubation had a TGA value above the monitoring limit for conventional final containers of 132% for all samples. The TGA value ranges from 185 to 195% of normal plasma for experiments with 35 mM elution buffer, regardless of the addition of NaCl, heparin or native. FXIa values are below the limit of quantitation for the batch obtained with

- 26 045585 вариантом гепарина при растворении PptG. Для обеих других партий значения являются довольно высокими (10,3-16,7 нг/г белка) по сравнению с другими исследованиями. Для всех партий значения FXIa были обнаружены в конечной партии. Снова самые низкие значения наблюдались при добавлении гепарина к DDCPP.- 26 045585 variant of heparin when dissolving PptG. For both other batches the values are quite high (10.3-16.7 ng/g protein) compared to other studies. For all batches, FXIa values were detected in the final batch. Again, the lowest values were observed when heparin was added to DDCPP.

Высокая калликреиноподобная активность при растворении PptG отражается также профилем амидолитической активности. Субстрат позволяет специфически измерять калликреин, FXIa и FXIIa, который составляет от 570 до 1780 нмоль/млхмин. Данные значения снижаются до 8 и 22 нмоль/млхмин в конечной массе (см. табл. 5).The high kallikrein-like activity upon dissolution of PptG is also reflected by the amidolytic activity profile. The substrate allows the specific measurement of kallikrein, FXIa and FXIIa, which ranges from 570 to 1780 nmol/mLhmin. These values decrease to 8 and 22 nmol/mLhmin in the final mass (see Table 5).

Таблица 5Table 5

Результаты PKA, прокоагулянтных примесей и амидолитической активности в PptG и порцииResults of PKA, procoagulant impurities and amidolytic activity in PptG and portions

Эксперимент Experiment Нативная Native Добавление гепарина Adding Heparin Добавление NaCl Addition NaCl Буфер для элюирования СМ сефарозы Elution buffer SM Sepharose 35 мМ 35 mM 35 мМ 35 mM 35 мМ 35 mM Растворенн ый PptG Dissolved PptG РКА Ед ./мл RKA Units/ml <4 <4 7,5 7.5 <4 <4 Калликреиноподобная активность [нмоль/мл*мин.] Kallikrein-like activity [nmol/ml*min.] 555 555 733 733 490 490 NAPTT [мг] NAPTT [mg] более 6,6 more than 6.6 Более 7,4 More than 7.4 Более 6,6 More than 6.6 Амидолитическая активность (PL-1) [нмоль/мл*мин.] Amidolytic activity (PL-1) [nmol/ml*min.] 143,6 143.6 163,1 163.1 97,2 97.2 TGA [%NP] TGA [%NP] 155,85 155.85 113,14 113.14 177,01 177.01 Белок FXI FXI protein [Ед./мл] [U/ml] 2,75 2.75 0,89 0.89 2,82 2.82 [Ед ./г белка] [U/g protein] 39,52 39.52 12,06 12.06 37,47 37.47 FXIa FXIa [нг/мл] [ng/ml] 0,719 0.719 <0,25 <0.25 0,830 0.830 [нг/г белка] [ng/g protein] 10,33 10.33 н.а. on the. 11,03 11.03 Профиль амидолитической активности [нмол ь/мл * мин. ] Amidolytic profile activity [nmol l/ml * min. ] 28,40 28.40 28,30 28.30 19,50 19.50 32,20 32.20 39,50 39.50 19,20 19.20 661 661 927,0 927.0 341,0 341.0 1242 1242 1716 1716 574 574 РКА [Ед./мл] RCA [U/ml] <4 <4 <4 <4 <4 <4

- 27 045585- 27 045585

Порция A portion Калликреиноподобная активность [нмоль/мл*мин.] Kallikrein-like activity [nmol/ml*min.] <10 <10 <10 <10 11 eleven Амидолитическая активность (PL-1) [нмоль/мл*мин.] Amidolytic activity (PL-1) [nmol/ml*min.] 2,30 2.30 <10 <10 <10 <10 TGA [%NP] TGA [%NP] 195,49 195.49 186,59 186.59 184,96 184.96 Белок FXI FXI protein [Ед ./мл] [U/ml] 0,42 0.42 0,10 0.10 0,34 0.34 [Ед ./г белка] [U/g protein] 4,10 4.10 1,02 1.02 3,34 3.34 FXIa FXIa [нг/мл] [ng/ml] 4,18 4.18 1,97 1.97 1,42 1.42 [нг/г белка] [ng/g protein] 40,77 40.77 20,01 20.01 13,95 13.95 Профиль амидолитической активности [нмол ь/мл * мин. ] Amidolytic profile activity [nmol l/ml * min. ] <5 <5 <5 <5 <5 <5 <5 <5 <5 <5 <5 <5 7,2 7.2 5,68 5.68 7,4 7.4 8,22 8.22 7,63 7.63 9,29 9.29

Пример 2.Example 2.

Чистоту в объединенных веществах по Кону в супернатанте II+III (альбумин) и в промежуточной пасте PptG определяют посредством электрофореза ацетата целлюлозы (см. табл. 6). Согласно текущим спецификациям Gammagard Liquid/KIOVIG, промежуточный продукт, осадок G, должен соответствовать спецификации чистоты не менее 86% гамма-глобулина, измеренной с использованием электрофореза САЕ или эквивалентного. Пасты PptG, полученные из DDCPP (плазма после С1-ингибитора дозирования), явно соответствовали промежуточному пределу спецификации Gammagard Liquid/KIOVIG более 86% (см. табл. 6). Добавление гепарина и хлорида натрия повышало чистоту от 88 до 93%.The Cohn purity of the combined substances in supernatant II+III (albumin) and intermediate PptG paste was determined by cellulose acetate electrophoresis (see Table 6). According to current Gammagard Liquid/KIOVIG specifications, the intermediate product, Precipitate G, must meet a purity specification of at least 86% gamma globulin measured using CAE electrophoresis or equivalent. PptG pastes derived from DDCPP (plasma after C1 inhibitor dosing) clearly met the intermediate Gammagard Liquid/KIOVIG specification limit of over 86% (see Table 6). The addition of heparin and sodium chloride increased the purity from 88 to 93%.

Чистоту также измеряют посредством CZE на стадии растворения PptG и конечного контейнера. Ppt G имеет чистоту γ-глобулина 92-93% и чистота в конечном контейнере составляла 100% γ-глобулина (см. табл. 7).Purity is also measured by CZE at the PptG dissolution stage and the final container. Ppt G has a γ-globulin purity of 92-93% and the purity in the final container was 100% γ-globulin (see Table 7).

Таблица 6Table 6

Чистота объединенных веществ по Кону, супернатанта II+III и PptG по данным САЕPurity of combined substances according to Cohn, supernatant II+III and PptG according to SAE

Электрофорез с ацетатом целлюлозы спец. ед. не менее 86% Electrophoresis with cellulose acetate special. units at least 86% Описание эксперимента Description of the experiment Нативная Native Добавление гепарина Adding Heparin Добавление NaCl Adding NaCl № партии выше по потоку Upstream batch no. Обведи ценные веществ а по Кону (DDCPP ) Circle the valuable substances Konu (DDCPP ) Альбумин Albumen 67,6 67.6 68,1 68.1 68,5 68.5 α,β - глобулин α,β - globulin 18,9 18.9 18,9 18.9 18,6 18.6 γ- глобулин γ-globulin 9,2 9.2 12,0 12.0 12,9 12.9 Преальбумин Prealbumin 0 0 0 0 0 0 Фибриноген Fibrinogen 4,3 4.3 0 0 0 0

- 28 045585- 28 045585

суперната нтП+Ш supernate NTP+Sh Альбумин Albumen 83 83 81,2 81.2 79,7 79.7 α,β - глобулин α,β - globulin 15,1 15.1 17,2 17.2 18 18 у - глобулин y-globulin 1,9 1.9 1,6 1.6 2,3 2.3 Преальбумин Prealbumin 0 0 0 0 0 0 Фибриноген Fibrinogen 0 0 0 0 0 0 № партии ниже по потоку Downstream batch no. Раствор енный PptG Dissolved PptG Альбумин Albumen θ,ι θ,ι 0,1 0.1 0,1 0.1 0,1 0.1 0,1 0.1 0,1 0.1 α,β - глобулин α,β - globulin И,7 I,7 11,2 11.2 6,5 6.5 8,9 8.9 9,7 9.7 8,6 8.6 у - глобулин y-globulin 88,2 88.2 88,7 88.7 93,4 93.4 91,0 91.0 90,2 90.2 91,3 91.3 Den. Белок Den. Protein - - - - - - - - - - - -

Таблица 7Table 7

Чистота растворенного PptG и конечного контейнера (FC), измеренная посредством CZEPurity of dissolved PptG and final container (FC) measured by CZE

Чистота при электрофорезе с ацетатом целлюлозы [%] Purity by cellulose acetate electrophoresis [%] Вариант Option Нативная Native Добавление гепарина Adding Heparin Добавление NaCl Adding NaCl № партии ниже по потоку Downstream batch no. Растворенный PptG Dissolved PptG 92 92 не обнаружено not detected 93 93 93 93 93 93 93 93 Конечный контейнер End container 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

Пример 3.Example 3.

Высокое выделение IgG и выход белка определяют для подтверждения того, что исходный материал подходит для использования в производстве IgG. Выходы белков и IgG приведены в % и г/л плазмы для демонстрации эффективности процесса. Высокая степень извлечения IgG из объединенных веществ по Кону до порции отражает очень хорошую эффективность процесса. Было получено восстановление от 68 до 75% на основе измерения IgG (см. табл. 8-10). Добавление хлорида натрия к объединенным веществам по Кону для регулирования проводимости приводит к несколько более низкому общему извлечению по сравнению с двумя другими вариантами (68% по сравнению с более 70%).High IgG recovery and protein yield are determined to confirm that the starting material is suitable for use in IgG production. Protein and IgG yields are given in % and g/L plasma to demonstrate the efficiency of the process. The high recovery of IgG from the Cohn pooled substances to the batch reflects the very good efficiency of the process. Recovery of 68 to 75% was obtained based on IgG measurements (see Tables 8-10). Adding sodium chloride to the Cohn pools to control conductivity resulted in slightly lower overall recovery compared to the other two options (68% versus over 70%).

- 29 045585- 29 045585

Таблица 8Table 8

Восстановление белка и IgG - нативное с использованием 35 мМ элюирующего буфера СМProtein and IgG recovery - native using 35 mM elution buffer CM

Нативная Native Корр. веса Corr. weight Белок Protein Способ определ ения белка Protein determination method Выход белка Protein yield Восстановление IgG 1) IgG recovery 1) Стадия способа Method stage [кг] [kg] [%] [%] [%] [%] [%] [%] [г/л плазмы ] [g/l plasma] [%] [%] Чистот а Purity [г/л плазмы ] [g/l plasma] Объединенные вещества по Кону (DDCPP) Combined Cohn Substances (DDCPP) 149,0 149.0 4,82 4.82 Биурет Biuret 100 100 48,23 48.23 100 100 14,7 14.7 7,09 7.09 супернатант I supernatant I 157,5 157.5 4,27 4.27 Биурет Biuret 93,5 93.5 45,10 45.10 89,7 89.7 14,1 14.1 6,36 6.36 супернатант П+Ш supernatant P+SH 170,7 170.7 3,10 3.10 Биурет Biuret 73,7 73.7 35,56 35.56 2,2 2.2 0,4 0.4 0,16 0.16 Экстракт П+Ш P+SH extract 97,1 97.1 1,75 1.75 Биурет Biuret 23,7 23.7 11,43 11.43 88,6 88.6 54,9 54.9 6,28 6.28 фильтрат Cuno Cuno filtrate 163,0 163.0 0,85 0.85 Биурет Biuret 19,3 19.3 9,32 9.32 82,1 82.1 62,4 62.4 5,82 5.82 супернатант PptG supernatant pptg 209,8 209.8 о,и oh and Биурет Biuret 3,1 3.1 1,51 1.51 1,0 1.0 4,8 4.8 0,07 0.07 Растворенный PptG Dissolved pptg 3,1 3.1 6,96 6.96 Биурет Biuret 18,3 18.3 100 100 8,84 8.84 100 100 72,6 72.6 6,41 6.41 6,65 6.65 UV UV 17,5 17.5 100 100 8,44 8.44 Фильтрат растворенного PptG Dissolved PptG filtrate 6,1 6.1 3,45 3.45 Биурет Biuret 18,2 18.2 99,1 99.1 8,76 8.76 100 100 72,6 72.6 6,41 6.41 СМ-элюат SM-eluate 6,6 6.6 2,77 2.77 Биурет Biuret 15,7 15.7 85,8 85.8 7,58 7.58 92,8 92.8 78,5 78.5 5,95 5.95 2,54 2.54 UV UV 14,4 14.4 82,2 82.2 6,94 6.94 ANX поток ANX stream 13,2 13.2 1,02 1.02 UV UV И,6 I,6 66,2 66.2 5,59 5.59 86,9 86.9 99,7 99.7 5,58 5.58 Нанофильтрат Nanofiltrate 16,0 16.0 0,83 0.83 UV UV И,4 I,4 65,1 65.1 5,49 5.49 79,0 79.0 92,3 92.3 5,07 5.07 Стерильная порция Sterile portion 1,21 1.21 10,25 10.25 UV UV 10,7 10.7 60,9 60.9 5,14 5.14 70,8 70.8 88,4 88.4 4,54 4.54

1) Измерено посредством QC VIE.1) Measured by QC VIE.

- 30 045585- 30 045585

Таблица 9Table 9

Восстановление белка и IgG - вариант гепарина с использованием 35 мМ элюирующего буфера СМProtein and IgG recovery - heparin variant using 35 mM CM elution buffer

NG2C134/P00215 NG NG2C134/P00215 NG Корр. веса Corr. weight Белок Protein Способ определ ения белка Protein determination method Выход белка Protein yield Восстановление IgG О IgG recovery ABOUT Стадия способа Method stage [кг] [kg] [%] [%] [%] [%] [%] [%] [г/л плазмы ] [g/l plasma ] [%] [%] Чистот а Purity [г/л плазмы ] [g/l plasma ] Объединенные вещества по Кону United substances according to Cohn 150,0 150.0 4,74 4.74 Биурет Biuret 100 100 47,42 47.42 100 100 16,2 16.2 7,67 7.67 супернатант I supernatant I 159,0 159.0 4,23 4.23 Биурет Biuret 94,6 94.6 44,86 44.86 89,8 89.8 15,4 15.4 6,89 6.89 супернатант П+Ш supernatant P+SH 172,2 172.2 3,13 3.13 Биурет Biuret 75,7 75.7 35,89 35.89 2,0 2.0 0,4 0.4 0,15 0.15 Экстракт П+Ш P+SH extract 96,9 96.9 2,00 2.00 Биурет Biuret 27,3 27.3 12,94 12.94 85,0 85.0 50,4 50.4 6,52 6.52 фильтрат Cuno Cuno filtrate 185,0 185.0 0,73 0.73 Биурет Biuret 19,1 19.1 9,04 9.04 79,3 79.3 67,2 67.2 6,08 6.08 супернатант PptG supernatant pptg 238,5 238.5 0,09 0.09 Биурет Biuret 3,1 3.1 1,46 1.46 0,8 0.8 4,2 4.2 0,06 0.06 Растворенный PptG Dissolved pptg 2,8 2.8 7,38 7.38 Биурет Biuret 16,2 16.2 100 100 7,70 7.70 100 100 73,4 73.4 5,66 5.66 6,54 6.54 UV UV 14,4 14.4 100 100 6,82 6.82 Фильтрат растворенного PptG Dissolved PptG filtrate 5,5 5.5 3,66 3.66 Биурет Biuret 16,1 16.1 99,2 99.2 7,64 7.64 СМ-элюат SM-eluate 6,4 6.4 2,65 2.65 Биурет Biuret 13,4 13.4 82,5 82.5 6,35 6.35 66,6 66.6 59,3 59.3 3,77 3.77 2,55 2.55 UV UV 12,9 12.9 89,8 89.8 6,13 6.13 ANX поток ANX stream 12,5 12.5 1,04 1.04 UV UV 10,4 10.4 72,4 72.4 4,94 4.94 78,5 78.5 89,9 89.9 4,44 4.44 Нанофильтрат Nanofiltrate 15,3 15.3 0,83 0.83 UV UV 10,0 10.0 69,8 69.8 4,76 4.76 71,1 71.1 84,5 84.5 4,02 4.02 Стерильная порция Sterile portion 1,1 1.1 9,84 9.84 UV UV 8,8 8.8 61,4 61.4 4,19 4.19 71,9 71.9 97,1 97.1 4,07 4.07

1) Измерено посредством QC VIE.1) Measured by QC VIE.

Таблица 10Table 10

Восстановление белка и IgG - вариант NaCl с использованием 35 мМ элюирующего буфера СМProtein and IgG recovery - NaCl version using 35 mM SM elution buffer

Вариант NaCl NaCl option Корр. веса Corr. weight Белок Protein Способ определ Way defined Выход белка Protein yield Восстановление IgG 1)2) Recovery of IgG 1)2) Стадия способа Method stage [кг] [kg] [%] [%] ения белка leniya squirrel [%] [%] [%] [%] [г/л плазмы ] [g/l plasma ] [%] [%] Чистот а Purity [г/л плазмы ] [g/l plasma ] Объединенные вещества по Кону Combined substances according to Cohn 146,4 146.4 4,85 4.85 Биурет Biuret 100 100 48,54 48.54 100 100 15,5 15.5 7,540 7,540 супернатант I supernatant I 159,7 159.7 4,34 4.34 Биурет Biuret 97,5 97.5 47,34 47.34 98,4 98.4 15,7 15.7 7,420 7,420 супернатант П+Ш supernatant P+SH 172,9 172.9 3,08 3.08 Биурет Biuret 74,9 74.9 36,36 36.36 3,6 3.6 0,7 0.7 0,270 0.270 Экстракт П+Ш P+SH extract 107,4 107.4 1,25 1.25 Биурет Biuret 18,8 18.8 9,13 9.13 91 91 75,1 75.1 6,860 6,860 фильтрат Cuno Cuno filtrate 204,3 204.3 0,70 0.70 Биурет Biuret 20,1 20.1 9,77 9.77 85,7 85.7 66,2 66.2 6,460 6,460 супернатант PptG supernatant pptg 262,2 262.2 0,09 0.09 Биурет Biuret 3,3 3.3 1,60 1.60 0,6 0.6 2,9 2.9 0,050 0.050

- 31 045585- 31 045585

Растворенный PptG Dissolved pptg 3,02 3.02 7,53 7.53 Биурет Biuret 6,9 6.9 100 100 8,22 8.22 100 100 75,1 75.1 6,180 6,180 6,79 6.79 UV UV 15,3 15.3 100 100 7,42 7.42 Фильтрат растворенного PptG Dissolved PptG filtrate 6,0 6.0 3,88 3.88 Биурет Biuret 17,4 17.4 102,8 102.8 8,44 8.44 92,9 92.9 68,5 68.5 5,78²>5.78 ² > СМ-элюат SM-eluate 7,2 7.2 2,75 2.75 Биурет Biuret 14,7 14.7 86,9 86.9 7,15 7.15 83,9 83.9 73,1 73.1 5,220 5,220 2,17 2.17 UV UV И,6 I,6 76,0 76.0 5,64 5.64 ANX поток ANX stream 15,3 15.3 1,04 1.04 UV UV 11,8 11.8 77,3 77.3 5,74 5.74 85,7 85.7 93,0 93.0 5,340 5,340 Нанофильтрат Nanofiltrate 18,4 18.4 0,83 0.83 UV UV И,4 I,4 74,4 74.4 5,52 5.52 85,4 85.4 96,2 96.2 5,310 5,310 Стерильная порция Sterile portion 1,3 1.3 10,19 10.19 UV UV 9,8 9.8 63,9 63.9 4,74 4.74 68,5 68.5 89,2 89.2 4,230 4,230

1) Измерено посредством QC VIE.1) Measured by QC VIE.

²⁾ Измерено посредством PSP/PSTO. ²⁾ Measured by PSP/PSTO.

Пример 4.Example 4.

Окончательные параметры высвобождения из контейнера испытывали в соответствии со схемой производства Gammagard Liquid/KIOVIG и приведены в табл. 11 для опытов с 35 мМ элюирующего буфера. Результаты титра антитела по параметрам высвобождения сведены в табл. 12 и 13.The final container release parameters were tested according to the Gammagard Liquid/KIOVIG production schedule and are shown in Table 1. 11 for experiments with 35 mM elution buffer. The results of the antibody titer according to the release parameters are summarized in table. 12 and 13.

Таблица 11Table 11

Результаты испытаний спецификации конечного контейнера с использованием элюирующего буфера 35 мМ СМ сефарозыFinal container specification test results using 35 mM SM Sepharose elution buffer

Параметр № партии с 35 мМ Parameter Lot No. with 35 mM Единиц а Units Спец. Specialist. Нативна я I'm native Добавлен не гепарина No heparin added Добавлен не NaCl No NaCl added Соответству ющие партии [1] Corresponding Parts [1] АСА ASA [%] [%] US/EU: NMT 50% или 1 СН50Ед./мг белка. US/EU: NMT 50% or 1 CH50U/mg protein. 31 31 30 thirty 31 31 Глицин Glycine [М] [M] US: 0,21-0,26 EU: 0,20-0,30 US: 0.21-0.26 EU: 0.20-0.30 0,234 0.234 0,229 0.229 0,228 0.228 0,227-0,234 0.227-0.234 IgA IgA [р.г/мл] [r.g/ml] EU/US менее 0,14 мг/мл EU/US less 0.14 mg/ml 42,0 42.0 41,2 41.2 32,9 32.9 - - [р.г/мл] 10% белка] [pg/ml] 10% protein] 43,2 43.2 39,4 39.4 32,7 32.7 36-53 36-53 IgM IgM [мг/дл] [mg/dl] цля US менее 100 for US less 100 <4,17 <4.17 <4,17 <4.17 <4,17 <4.17 < 1,6 < 1.6 Распределение молекулярных размеров Мономер IgG и Димер полимер IgG Фрагменты IgG (US) Molecular size distribution IgG Monomer and Dimer Polymer IgG IgG Fragments (US) [%] [%] 2 95% менее 2% менее 3% (только US) 2 95% less than 2% less than 3% (US only) 99,6 0,13 0,28 99.6 0.13 0.28 99,6 0,13 0,25 99.6 0.13 0.25 99,6 0,16 0,27 99.6 0.16 0.27 н.а. on the.

- 32 045585- 32 045585

Осмоляльность Osmolality [мОсмо ль/ кг] [mOsmo l/kg] EU/US: 240-300 EU/US: 240-300 269 269 265 265 266 266 261-269 261-269 Плотность Density [г/см³][g/ ^cm3 ] Инфо Info 1,032 1.032 1,033 1.033 1,032 1.032 1,031-1,033 1.031-1.033 pH (разведенный) pH (diluted) EU/US: 4,6-5,1, разведено до 1% раствора белка с использованием 0,9% NaCl EU/US: 4.6-5.1, diluted to 1% protein solution using 0.9% NaCl 4,5 4.5 4,5 4.5 4,5 4.5 4,7-4,8 4.7-4.8 Активность РКА RKA activity [МЕ/мл ] [IU/ml] EU: менее 10 МЕ/мл US: менее 10% эталонная EU: less than 10 IU/ml US: less than 10% reference <4 <4 <4 <4 <4 <4 н.а. on the. партия CBER CBER party Калликреинопод обная активность Kallikreinopod general activity [нмоль/ мл *мин.] [nmol/ ml *min.] Инфо Info < 10 < 10 < 10 < 10 < 10 < 10 Идентификация белка (человеческого белка) Protein Identification (Human Protein) EU/US: человеческий белок: положительный EU/US: human protein: positive положит ельный will put spruce положител ьный positive ny положител ьный positive ny положительны й are positive th Композиция белка: чистота Composition squirrel: purity 2 98% гаммаглобулин 2 98% gammaglobulin 100 100 100 100 100 100 н.а. on the. Эндотоксины (LAL) Endotoxins (LAL) [МЕ/мл ] [IU/ml] менее 1,0 МЕ/мл less than 1.0 IU/ml <0,500 <0.500 < 0,500 <0.500 < 0,500 <0.500 н.а. on the. Общее содержание белка (UV) Total protein content (UV) [мг/мл] [mg/ml] EU/US: 9,0-11,0 г/100 мл EU/US: 9.0-11.0 g/100 ml 97,0 97.0 104,5 104.5 100,9 100.9 н.а. on the. TNBP (три-N- бутил-фосфат) TNBP (three-N- butyl phosphate) [м. д.] [m. d.] менее 1,0 ррш less than 1.0 ppsh <0,2 <0.2 <0,2 <0.2 <0,2 <0.2 н.а. on the. Triton Х-100 (Octoxynol 9) Triton X-100 (Octoxynol 9) [м. д.] [m. d.] менее 1,0 ррш less than 1.0 ppsh <0,4 <0.4 <0,4 <0.4 <0,1 <0.1 н.а. on the. TWEEN 80 (полисорбат 80) TWEEN 80 (polysorbate 80) [м. д.] [m. d.] менее 100 ррш less than 100 ppm <26 <26 <26 <26 <26 <26 н.а. on the.

Пример 5.Example 5.

Испытания высвобождения для гемагглютининов к А/к В и антител к D, антител против дифтерии (только US), ВГА (только EU), HBsAg, кори (только US), парвовируса В19 (только EU) и полиомиелита (только US) выполняли для конечных партий контейнеров (см. табл. 12 - 35 мМ элюирующего буфера). Все испытания с антителами соответствуют требованиям.Release tests for hemagglutinins anti-A/kB and anti-D, diphtheria (US only), HAV (EU only), HBsAg, measles (US only), parvovirus B19 (EU only) and polio (US only) were performed for final batches of containers (see Table 12 - 35 mM elution buffer). All antibody tests are compliant.

Таблица 12Table 12

Уровни антител в FC (МЕ/г белка, рассчитанные относительно общего белка) - 35 мМ элюирующего буфераAntibody levels in FC (IU/g protein, calculated relative to total protein) - 35 mM elution buffer

Испытание с антителами Antibody test Единица Unit Описание Description Нативная Native Гепарин Heparin NaCl NaCl Антитела к D Antibodies to D Удовлетворитель но Satisfactory But EU/US: Титр равен или менее эталонного препарата EU/US: Titer equal to or less than the reference drug Удовлетво рительно Satisfied emphatically Удовлетв орительно Satisfied impressive Удовлет воритель Satisfy thief

- 33 045585- 33 045585

NIBSC 02/228 или эквивалентного NIBSC 02/228 or equivalent 1:<2 1:<2 1:<2 1:<2 но 1:<2 But 1:<2 Г емагглюти НИНЫ, антитела кА/кВ Gemaggluti NINS, antibodies kA/kB Антитела к А Antibodies to A 1:32 (US) или 1:64 (EU) разведения не показывают агглютинации для растворов, содержащих макс. 30 г/л иммуноглобулина 1:32 (US) or 1:64 (EU) dilutions do not show agglutination for solutions containing Max. 30 g/l immunoglobulin 1:16 1:16 1:16 1:16 1:16 1:16 Антитела к В Antibodies to B 1:16 1:16 1:16 1:16 1:8 1:8 Антитела к дифтерии Antibodies to diphtheria [МЕ/мл] [IU/ml] Только US: более 1,2 Ед. US стандарта антитоксин/мл US only: more than 1.2 units. US standard antitoxin/ml 8,2 8.2 9,0 9.0 8,6 8.6 [МЕ/г белка] [IU/g protein] 77,6 77.6 91,5 91.5 84,0 84.0 Антитела HAV Antibodies HAV [МЕ/мл] [IU/ml] EU: более 3,5 МЕ/мтт EU: more than 3.5 IU/mtt 10,5 10.5 10,9 10.9 и,о and about [МЕ/г белка] [IU/g protein] 99,3 99.3 110,8 110.8 107,5 107.5 Антитела HBsAg Antibodies HBsAg [мМЕ/мл] [mIU/ml] EU/US: более 0,20 МЕ/мл (EU: 2 МЕ/г общего белка) EU/US: more than 0.20 IU/ml (EU: 2 IU/g total protein) 9787 9787 14240 14240 >10000 >10000 [МЕ/г белка] [IU/g protein] 92,6 92.6 144,7 144.7 н.а. on the. Антитела к цистицерко ’У Antibodies to cysticerco 'U [Частное] [Private] Только US: более чем 0,30кратный уровень антител эталонного иммуно глобулина против кори CBER US only: more than 0.30 times the antibody level of the reference immuno measles globulin CBER 0,63 0.63 0,58 0.58 0,53 0.53 Антитела к парвовирус уВ19 Antibodies to parvovirus uB19 [МЕ/мл] [IU/ml] EU: более50 МЕ/мл EU: more than 50 IU/ml 418 418 401 401 307 307 [МЕ/г белка] [IU/g protein] 3954 3954 4075 4075 3000 3000 Антитела к полиомиели ту Antibodies to polio Частное Private Только US: более чем 0,2кратный уровень антител эталонного иммуно глобулина против полиомиелита CBER US only: more than 0.2 times the antibody level of the reference immuno globulin against polio CBER 0,98 0.98 не обнаруже но not detected 0,90 0.90

Пример 6.Example 6.

С целью определения остаточного содержания сериновой протеазы и активности, присутствующих в белковых композициях, полученных из плазмы, определяли профиль амидолитической активности для препаратов IgG из супернатанта плазмы с низким содержанием C1-INH.To determine the residual serine protease content and activity present in plasma-derived protein compositions, the amidolytic activity profile of IgG preparations from low C1-INH plasma supernatant was determined.

Вкратце был определен профиль амидолитической активности белковых композиций, полученных из плазмы. Испытывал PL-1, профиль амидолитической активности, TGA, NAPTT, FXIa и белок FXI, результаты суммировали в табл. 13 (35 мМ элюирующего буфера). Как показано в табл. 13, амидолитическая активность, измеренная с использованием хромогенного субстрата PL-1, была ниже предела количественного определения для всех партий, что демонстрирует высокий восстановительный потенциал последующих процессов, независимо от содержания фосфатов в элюирующем буфере СМ. Данные амидолитической активности, полученные с различными хромогенными субстратами, также показывают очень низкие значения NAPTT, в соответствии с испытанием в плазме с дефицитом FXI, не сокращается в образцах конечных контейнеров. FXIa был ниже предела количественного определения при использовании 35 мМ буфера для элюирования СМ при добавлении гепарина. Испытание белка FXI, который обнаруживает не только FXI, но и FXIa, имеет очень низкие значения при добавлении гепарина к DDCPP с использованием 35 мМ элюирующего буфера СМ.The amidolytic activity profile of plasma-derived protein compositions was briefly determined. PL-1, amidolytic activity profile, TGA, NAPTT, FXIa and FXI protein were tested and the results are summarized in Table. 13 (35 mM elution buffer). As shown in table. 13, amidolytic activity measured using the chromogenic substrate PL-1 was below the limit of quantitation for all batches, demonstrating the high reducing potential of downstream processes, regardless of the phosphate content of the SM elution buffer. Amidolytic activity data obtained with various chromogenic substrates also show very low NAPTT values, consistent with testing in FXI-deficient plasma, not being reduced in final container samples. FXIa was below the limit of quantitation using 35 mM SM elution buffer with the addition of heparin. The FXI protein assay, which detects not only FXI but also FXIa, has very low values when heparin is added to DDCPP using 35 mM CM elution buffer.

- 34 045585- 34 045585

Таблица 13Table 13

Амидолитическая активность и прокоагулянтная активность, измеренные при FC с использованием 35 мМ элюирующего буфераAmidolytic activity and procoagulant activity measured at FC using 35 mM elution buffer

Испытание (SOP#) Test (SOP#) Единица Unit Нативный Native Гепарин Heparin NaCl NaCl Амидол итическая активность (PL-1) (KVAACPLM) Amidol itic activity (PL-1) (KVAACPLM) [нмоль/мл мин.] [nmol/ml min.] < 10 < 10 < 10 < 10 < 10 < 10 Профиль амидолитической активности [нмоль/мл*мин.] Amidolytic activity profile [nmol/ml*min.] S-2222 S-2222 <5 <5 <5 <5 <5 <5 S-2251 S-2251 <5 <5 <5 <5 <5 <5 S-2288 S-2288 <5 <5 <5 <5 5,0 5.0 S-2302 S-2302 <5 <5 <5 <5 <5 <5 Белок FXI FXI protein [Ед./мл] [U/ml] 0,33 0.33 0,08 0.08 0,25 0.25 [Ед. @ 10% белка] [Units @10% protein] 0,34 0.34 0,08 0.08 0,25 0.25 FXIa FXIa [нг/мл] [ng/ml] <0,5 <0.5 <0,5 <0.5 <0,5 <0.5 [нг/г белка] [ng/g protein] н.а. on the. н.а. on the. н.а. on the. NAPTT NAPTT [мг] [mg] более 10 more than 10 более 10 more than 10 более 10 more than 10 TGA (LE13A18006) TGA (LE13A18006) [% нормльной плазмы] [% normal plasma] 125,21 125.21 120,45 120.45 190,11 190.11

Пример 7.Example 7.

Испытание белка FXI также является индикатором на протяжении всего производственного процесса. В табл. 14 суммировано общее снижение содержания белка FXI от DDCPP до конечного контейнера. Значения белка FXI в исходном материале установлены на 100%. Основное снижение происходит при обработке аэросилом с последующей фильтрацией. Последующий процесс дополнительно снижал содержание белка FXI до уровней 0,01% от начальных значений.FXI protein testing is also an indicator throughout the entire manufacturing process. In table 14 summarizes the overall decrease in FXI protein content from DDCPP to the final container. FXI protein values in the starting material are set to 100%. The main reduction occurs during treatment with Aerosil followed by filtration. The subsequent process further reduced the FXI protein content to levels of 0.01% of the initial values.

Таблица 14Table 14

Общее снижение белка FXI (% восстановления) из исходного материала DDCPP до FCTotal reduction of FXI protein (% recovery) from DDCPP starting material to FC

Восстановление белка FXI Recovery FXI protein 5000 ME гепарина/л замороженн ого DDCPP 5000 IU heparin/l frozen DDCPP 5000 ME гепарина/л незамороженный DDCPP 5000 IU heparin/l unfrozen DDCPP 10000 ME гепарина/л замороженного DDCPP 10,000 IU heparin/L frozen DDCPP Объединенные вещества по Кону - DDCPP Combined substances according to Kohn - DDCPP 100 100 100 100 100 100 супернатант I supernatant I 84 84 91 91 90 90 Растворенный H+HI Dissolved H+HI 90 90 88 88 74 74 Фильтрат П+Ш после обработки аэросилом Filtrate P+Sh after treatment with Aerosil 14 14 1,3 1.3 Ниже предела количественного определения Below the limit of quantitation Эмульсионный буфер СМ Emulsion buffer SM 35 мМрН 8,5 35 mMrH 8.5 35 мМрН 8,65 35 mMrH 8.65 35 мМрН 8,5 35 mMrH 8.5 35 мМрН 8,65 35 mMrH 8.65 Суспензия Ppt G Suspension Ppt G 1,5 1.5 1,3 1.3 1,3 1.3 0,08 0.08 Составленный pH на порцию Composite pH per serving pH 4,35 pH 4.35 pH 4,5 pH 4.5 pH 4,65 pH 4.65 pH 4,5 pH 4.5 pH 4,65 pH 4.65 pH 4,5 pH 4.5 pH 4,65 pH 4.65 Стерильная порция Sterile portion 0,07 0.07 0,06 0.06 0,10 0.10 0,03 0.03 0,04 0.04 0,01 0.01 0,01 0.01 Конечный контейнер End container 0,05 0.05 0,06 0.06 0,08 0.08 0,03 0.03 0,04 0.04 0,01 0.01 0,01 0.01

Пример 8.Example 8.

Затем определяли уровень различных белковых примесей в препаратах IgG из супернатантной плазмы с низким содержанием C1-INH. Как показано в табл. 15, фибриноген находится ниже предела обнаружения (менее 0,03 мкг/мл), а уровень С3 комплемента (0,04-0,07 мг/дл) значительно ниже пределаThe levels of various protein contaminants in IgG preparations from supernatant plasma with low C1-INH content were then determined. As shown in table. 15, fibrinogen is below the detection limit (less than 0.03 μg/ml), and complement C3 levels (0.04-0.07 mg/dl) are well below the limit

- 35 045585 мониторинга (менее 19,4 мг/дл).- 35 045585 monitoring (less than 19.4 mg/dL).

Таблица 15Table 15

Содержание остаточного белка в конечном контейнере с использованием 35 мМ элюирующего буфераResidual protein content in the final container using 35 mM elution buffer

Испытание Trial Единица Unit Нативный Native Гепарин Heparin NaCl NaCl СЗ NW [мг/мл] [mg/ml] 0,53 0.53 0,50 0.50 0,64 0.64 комплемент complement [мг @ 10% белка] [mg @ 10% protein] 0,55 0.55 0,48 0.48 0,63 0.63 Фибриноген Fibrinogen [мг/мл] [mg/ml] <0,03 <0.03 <0,03 <0.03 <0,03 <0.03

Понятно, что примеры и варианты осуществления, описанные в данном документе, предназначены только для иллюстративных целей и что различные модификации или изменения в их свете будут предложены специалистам в данной области техники и должны быть включены в сущность и сферу применения этой заявки и объема прилагаемой формулы изобретения. Все публикации, патентные и патентные заявки, цитируемые в данном документе, в полном объеме и во всех целях включены посредством ссылки.It is understood that the examples and embodiments described herein are for illustrative purposes only and that various modifications or changes in light thereof will be suggested to those skilled in the art and should be included within the spirit and scope of this application and the scope of the appended claims. . All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated by reference in their entirety and for all purposes.

Claims (25)

1. Способ получения фракции, обогащенной иммуноглобулином G (IgG) из супернатантной фракции, обедненной ингибитором C1-INH-эстеразы (C1-INH), содержащей IgG, включающий следующее:1. A method for obtaining a fraction enriched in immunoglobulin G (IgG) from a supernatant fraction depleted in a C1-INH esterase inhibitor (C1-INH) containing IgG, comprising the following: (a) связывание обедненной C1-INH супернатантной фракции с гепарином, в результате чего образуется гепаринизированная фракция; а также (b) выделение IgG из гепаринизированной фракции с образованием обогащенной IgG фракции.(a) binding the C1-INH-depleted supernatant fraction to heparin, resulting in the formation of a heparinized fraction; and (b) isolating IgG from the heparinized fraction to form an IgG-enriched fraction. 2. Способ по п.1, в котором супернатантная фракция представляет собой супернатант после адсорбции С1-ингибитора.2. The method according to claim 1, in which the supernatant fraction is the supernatant after adsorption of the C1 inhibitor. 3. Способ по п.1 или 2, в котором супернатантная фракция представляет собой супернатант плазмы.3. Method according to claim 1 or 2, wherein the supernatant fraction is plasma supernatant. 4. Способ по п.3, в котором супернатант плазмы представляет собой криосупернатантную плазму с низким содержанием d-INH.4. The method of claim 3, wherein the plasma supernatant is cryosupernatant plasma with a low d-INH content. 5. Способ по любому из пп.1-4, в котором супернатантная фракция имеет низкое содержание одного или более других факторов свертывания крови, выбранных из фактора II, VII, IX и X или их смеси.5. Method according to any one of claims 1 to 4, wherein the supernatant fraction has a low content of one or more other coagulation factors selected from factor II, VII, IX and X or a mixture thereof. 6. Способ по любому из пп.1-5, в котором супернатантную фракцию концентрируют до значения белка нормальной плазмы перед дополнительной обработкой.6. Method according to any one of claims 1 to 5, in which the supernatant fraction is concentrated to the value of normal plasma protein before further processing. 7. Способ по любому из пп.1-6, в котором гепарин добавляют в количестве от 1 до 20 единиц на мл супернатантной фракции.7. Method according to any one of claims 1 to 6, wherein heparin is added in an amount of 1 to 20 units per ml of the supernatant fraction. 8. Способ по п.7, в котором гепарин добавляют в количестве 5 единиц на мл супернатантной фракции.8. The method according to claim 7, in which heparin is added in an amount of 5 units per ml of the supernatant fraction. 9. Способ по п.7, в котором гепарин добавляют в количестве 10 единиц на мл супернатантной фракции.9. The method according to claim 7, in which heparin is added in an amount of 10 units per ml of the supernatant fraction. 10. Способ по любому из пп.1-9, дополнительно включающий перед стадией (а) удаление ингибитора C1-INH-эстеразы (C1-INH) из фракции криосупернатантной плазмы, содержащей C1-INH, с образованием таким образом супернатантной фракции с низким содержанием C1-INH.10. The method according to any one of claims 1 to 9, further comprising, before step (a), removing the C1-INH esterase inhibitor (C1-INH) from the cryosupernatant plasma fraction containing C1-INH, thereby forming a supernatant fraction with a low content C1-INH. 11. Способ по любому из пп.1-10, в котором обогащенная IG фракция содержит по меньшей мере 50% содержания IgG, обнаруженного в супернатантной фракции.11. The method according to any one of claims 1 to 10, wherein the IG-enriched fraction contains at least 50% of the IgG content found in the supernatant fraction. 12. Способ по любому из пп.1-11, в котором чистота IgG в обогащенной IG фракции составляет по меньшей мере 95%.12. Method according to any one of claims 1 to 11, wherein the purity of IgG in the IG-enriched fraction is at least 95%. 13. Способ по любому из пп.1-12, в котором указанное выделение IgG из гепаринизированной фракции в (b) включает следующее:13. The method according to any one of claims 1 to 12, wherein said isolation of IgG from the heparinized fraction in (b) comprises the following: (i) осаждение гепаринизированной фракции с использованием от 6 до 10% этанола при рН от 7,0 до 7,5 с получением осадка фракции I и супернатанта фракции I; и (ii) осаждение IgG из супернатанта фракции I с использованием от 18 до 27% спирта при рН от 6,7 до 7,3 с образованием осадка фракции II+III.(i) precipitating the heparinized fraction using 6 to 10% ethanol at a pH of 7.0 to 7.5 to obtain a fraction I precipitate and a fraction I supernatant; and (ii) precipitation of IgG from the fraction I supernatant using 18 to 27% alcohol at pH 6.7 to 7.3 to form a fraction II+III precipitate. 14. Способ по любому из пп.1-12, в котором указанное выделение IgG из гепаринизированной фракции в b) включает следующее:14. The method according to any one of claims 1 to 12, wherein said isolation of IgG from the heparinized fraction in b) comprises the following: (i) осаждение IgG из гепаринизированной фракция с использованием от 18 до 27% спирта при рН от 6,7 до 7,3 с образованием осадка фракции I+II+III.(i) precipitation of IgG from the heparinized fraction using 18 to 27% alcohol at pH 6.7 to 7.3 to form a fraction I+II+III precipitate. 15. Способ по п.13 или 14, дополнительно включающий следующее:15. The method according to claim 13 or 14, further comprising the following: (iii) суспендирование осадка фракции II+III или фракции I+II+III в суспензионном буфере с образованием таким образом суспензии IgG;(iii) suspending the precipitate of fraction II+III or fraction I+II+III in a suspension buffer, thereby forming an IgG suspension; (iv) смешивание мелкодисперсного диоксида кремния (SiO₂) с суспензией IgG в течение по меньшей мере 30 мин;(iv) mixing fine silica (SiO ₂ ) with the IgG suspension for at least 30 minutes; (v) фильтрование суспензии IgG с образованием таким образом фильтрата и осадка на фильтре.(v) filtering the IgG suspension, thereby forming a filtrate and a filter cake. 16. Способ по п.15, дополнительно включающий следующее:16. The method according to claim 15, further comprising the following: (vi) промывка осадка на фильтре по меньшей мере с 1 мертвым объемом фильтр-пресса промывочного буфера с рН от 4,9 до 5,3 с образованием таким образом промывочного раствора;(vi) washing the filter cake with at least 1 filter press dead volume of a wash buffer having a pH of 4.9 to 5.3, thereby forming a wash solution; - 36 045585 (vii) объединение фильтрата с промывочным раствором с образованием таким образом раствора и обработка раствора моющим средством;- 36 045585 (vii) combining the filtrate with the washing solution to thereby form a solution and treating the solution with a detergent; (viii) регулирование pH раствора со стадии (vii) до 7,0 и добавление этанола до конечной концентрации от 20 до 30% с образованием таким образом осажденного осадка G;(viii) adjusting the pH of the solution from step (vii) to 7.0 and adding ethanol to a final concentration of 20 to 30% to thereby form a precipitated precipitate G; (ix) растворение осадка G в водном растворе, содержащем растворитель и/или моющее средство/моющие средства, и поддержание раствора в течение по меньшей мере 60 мин;(ix) dissolving precipitate G in an aqueous solution containing solvent and/or detergent/detergents and maintaining the solution for at least 60 minutes; (х) пропускание раствора через катионообменную хроматографическую колонку и элюирование белков, абсорбированных на колонке в элюате;(x) passing the solution through a cation exchange chromatography column and eluting the proteins adsorbed on the column in the eluate; (xi) пропускание элюата через анионообменную хроматографическую колонку с образованием проточного выходящего потока;(xi) passing the eluate through an anion exchange chromatography column to form a flow-through effluent; (хй) пропускание выходящего потока через нанофильтр с образованием нанофильтрата;(xx) passing the effluent through a nanofilter to form a nanofiltrate; (xiii) концентрация нанофильтрата посредством ультрафильтрации с образованием первого ультрафильтрата;(xiii) concentrating the nanofiltrate by ultrafiltration to form a first ultrafiltrate; (xiv) диафильтрация первого ультрафильтрата через диафильтрационный буфер с образованием диафильтрата; и (xv) концентрация диафильтрата посредством ультрафильтрации с образованием второго ультрафильтрата с концентрацией белка от 8% (вес/об.) до 22% (вес/об.) с образованием таким образом обогащенной IgG фракции.(xiv) diafiltration of the first ultrafiltrate through a diafiltration buffer to form a diafiltrate; and (xv) concentrating the diafiltrate by ultrafiltration to form a second ultrafiltrate having a protein concentration of 8% (w/v) to 22% (w/v), thereby forming an IgG-enriched fraction. 17. Способ по п.15 или 16, в котором (iv) включает добавления SiO₂ до конечной концентрации от 0,02 до 0,10 граммов на грамм осадка фракции П+Ш или фракции I+II+III.17. The method according to claim 15 or 16, in which (iv) includes adding SiO ₂ to a final concentration of 0.02 to 0.10 grams per gram of sediment of fraction P+III or fraction I+II+III. 18. Способ по п.16 или 17, в котором (vi) включает промывку осадка на фильтре по меньшей мере 2 мертвыми объемами фильтр-пресса промывочного буфера.18. The method of claim 16 or 17, wherein (vi) comprises washing the filter cake with at least 2 filter press dead volumes of wash buffer. 19. Способ по любому из пп.16-18, в котором (х) включает элюирование белков с использованием по меньшей мере 35 мМ дигидрата дигидрофосфата натрия.19. The method according to any one of claims 16 to 18, wherein (x) comprises eluting proteins using at least 35 mM sodium dihydrogen phosphate dihydrate. 20. Способ по любому из пп.16-19, в котором диафильтрационный буфер в (xiv) содержит от 200 до 300 мМ глицина.20. Method according to any one of claims 16 to 19, wherein the diafiltration buffer in (xiv) contains from 200 to 300 mM glycine. 21. Способ по любому из пп. 16-20, в котором обработка раствора растворителем и/или моющим средством/моющими средствами в (vii) включает по меньшей мере одну стадию инактивации или удаления вирусов.21. Method according to any one of paragraphs. 16-20, wherein treating the solution with the solvent and/or detergent(s) in (vii) includes at least one step of inactivating or removing viruses. 22. Способ по п.21, в котором инактивация вируса представляет собой стадию инактивации вируса растворителем/моющим средством (S/D).22. The method of claim 21, wherein the virus inactivation is a solvent/detergent (S/D) virus inactivation step. 23. Способ по любому из пп. 16-22, причем способ дополнительно включает стадию инкубации при pH от 4,0 до 5,2.23. Method according to any one of paragraphs. 16-22, the method further comprising the step of incubation at a pH of 4.0 to 5.2. 24. Способ по любому из пп. 16-22, причем способ дополнительно включает стадию инкубации при pH от 4,4 до 4,9.24. Method according to any one of paragraphs. 16-22, the method further comprising the step of incubation at a pH of 4.4 to 4.9. 25. Супернатант после адсорбции фракции С1-ингибитора, содержащий IgG, причем указанная фракция представляет собой фракцию криосупернатантной плазмы, обедненную C1-INH по меньшей мере на 70% от общего содержания, присутствующего во фракции криосупернатантной плазмы.25. Supernatant after adsorption of the C1 inhibitor fraction, containing IgG, wherein said fraction is a cryosupernatant plasma fraction depleted of C1-INH by at least 70% of the total content present in the cryosupernatant plasma fraction.