EA045552B1 - CRYSTAL FORMS OF PHARMACEUTICAL COMPOUND - Google Patents
CRYSTAL FORMS OF PHARMACEUTICAL COMPOUND Download PDFInfo
- Publication number
- EA045552B1 EA045552B1 EA202391012 EA045552B1 EA 045552 B1 EA045552 B1 EA 045552B1 EA 202391012 EA202391012 EA 202391012 EA 045552 B1 EA045552 B1 EA 045552B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- compound
- crystalline form
- mice
- pharmaceutical composition
- npc
- Prior art date
Links
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims description 262
- 239000013078 crystal Substances 0.000 title claims description 10
- 208000010577 Niemann-Pick disease type C Diseases 0.000 claims description 73
- 208000007930 Type C Niemann-Pick Disease Diseases 0.000 claims description 73
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 70
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 64
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 62
- 238000000634 powder X-ray diffraction Methods 0.000 claims description 59
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 57
- 150000002305 glucosylceramides Chemical class 0.000 claims description 36
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 34
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 34
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 31
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 claims description 30
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims description 28
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims description 28
- 150000002339 glycosphingolipids Chemical class 0.000 claims description 25
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 claims description 22
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 claims description 20
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 14
- 201000000788 Niemann-Pick disease type C1 Diseases 0.000 claims description 12
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 12
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 11
- 210000000449 purkinje cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims description 10
- 102000016838 Calbindin 1 Human genes 0.000 claims description 8
- 108010028310 Calbindin 1 Proteins 0.000 claims description 8
- 208000021811 Sandhoff disease Diseases 0.000 claims description 8
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 5
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 3
- 206010008096 Cerebral atrophy Diseases 0.000 claims description 2
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 claims description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 claims description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 claims description 2
- 101150071246 Hexb gene Proteins 0.000 claims 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims 2
- 101100282794 Caenorhabditis elegans gba-2 gene Proteins 0.000 claims 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims 1
- 208000035977 Rare disease Diseases 0.000 claims 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 claims 1
- 230000003376 axonal effect Effects 0.000 claims 1
- 230000031154 cholesterol homeostasis Effects 0.000 claims 1
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 claims 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims 1
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 96
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 72
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 45
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 38
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 31
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 23
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 18
- 239000012458 free base Substances 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 16
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000000113 differential scanning calorimetry Methods 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 14
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 13
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 12
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 12
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 12
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 12
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 11
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 11
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 10
- 101001124388 Homo sapiens NPC intracellular cholesterol transporter 1 Proteins 0.000 description 9
- 102100029565 NPC intracellular cholesterol transporter 1 Human genes 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 102000044956 Ceramide glucosyltransferases Human genes 0.000 description 8
- 108091000114 ceramide glucosyltransferase Proteins 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000001907 polarising light microscopy Methods 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 102100033342 Lysosomal acid glucosylceramidase Human genes 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000015439 Lysosomal storage disease Diseases 0.000 description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 230000036541 health Effects 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 6
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 6
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 6
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 6
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 6
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 6
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 6
- 238000001757 thermogravimetry curve Methods 0.000 description 6
- 102100022548 Beta-hexosaminidase subunit alpha Human genes 0.000 description 5
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010017544 Glucosylceramidase Proteins 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 5
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 5
- WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 2,5-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=CC=C1O WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 4
- 208000001905 GM2 Gangliosidoses Diseases 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-N L-lactic acid Chemical compound C[C@H](O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000022292 Tay-Sachs disease Diseases 0.000 description 4
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 4
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- -1 compound (I) Chemical class 0.000 description 4
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 4
- DQYBDCGIPTYXML-UHFFFAOYSA-N ethoxyethane;hydrate Chemical compound O.CCOCC DQYBDCGIPTYXML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 4
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 4
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 4
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 3
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 3
- 208000009796 Gangliosidoses Diseases 0.000 description 3
- 208000015872 Gaucher disease Diseases 0.000 description 3
- IBAQFPQHRJAVAV-ULAWRXDQSA-N Miglitol Chemical compound OCCN1C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1CO IBAQFPQHRJAVAV-ULAWRXDQSA-N 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003570 air Substances 0.000 description 3
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N benzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940092714 benzenesulfonic acid Drugs 0.000 description 3
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical class OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001642 boronic acid derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 3
- 238000001938 differential scanning calorimetry curve Methods 0.000 description 3
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 3
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 3
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 3
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 3
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 229960001110 miglitol Drugs 0.000 description 3
- UQRORFVVSGFNRO-UTINFBMNSA-N miglustat Chemical compound CCCCN1C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1CO UQRORFVVSGFNRO-UTINFBMNSA-N 0.000 description 3
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 3
- 230000007171 neuropathology Effects 0.000 description 3
- 238000003305 oral gavage Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 3
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 3
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 3
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 3
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 3
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 2
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 2
- 206010010947 Coordination abnormal Diseases 0.000 description 2
- 206010067889 Dementia with Lewy bodies Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000024720 Fabry Disease Diseases 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- 206010017577 Gait disturbance Diseases 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000997662 Homo sapiens Lysosomal acid glucosylceramidase Proteins 0.000 description 2
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 2
- 208000031226 Hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 2
- 238000004566 IR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 2
- 201000002832 Lewy body dementia Diseases 0.000 description 2
- 208000001145 Metabolic Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 208000008955 Mucolipidoses Diseases 0.000 description 2
- 206010072927 Mucolipidosis type I Diseases 0.000 description 2
- 208000002033 Myoclonus Diseases 0.000 description 2
- 101150007813 NIH gene Proteins 0.000 description 2
- 102100027814 Non-lysosomal glucosylceramidase Human genes 0.000 description 2
- 101710083785 Non-lysosomal glucosylceramidase Proteins 0.000 description 2
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 2
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 102000011971 Sphingomyelin Phosphodiesterase Human genes 0.000 description 2
- 108010061312 Sphingomyelin Phosphodiesterase Proteins 0.000 description 2
- 201000000690 abdominal obesity-metabolic syndrome Diseases 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N adipic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC(O)=O WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 238000012754 cardiac puncture Methods 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 2
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 2
- 210000000877 corpus callosum Anatomy 0.000 description 2
- 210000001653 corpus striatum Anatomy 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- LXBIFEVIBLOUGU-JGWLITMVSA-N duvoglustat Chemical class OC[C@H]1NC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O LXBIFEVIBLOUGU-JGWLITMVSA-N 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229960005219 gentisic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 201000008977 glycoproteinosis Diseases 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 208000016290 incoordination Diseases 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N isopentane Chemical compound CCC(C)C QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 2
- IWYDHOAUDWTVEP-UHFFFAOYSA-N mandelic acid Chemical compound OC(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 IWYDHOAUDWTVEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 229960001512 miglustat Drugs 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 101150049361 npc-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150107867 npc-2 gene Proteins 0.000 description 2
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 2
- GLDOVTGHNKAZLK-UHFFFAOYSA-N octadecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCO GLDOVTGHNKAZLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030761 polycystic kidney disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000013102 re-test Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 210000005241 right ventricle Anatomy 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 208000011985 sialidosis Diseases 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000005979 thermal decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- IWYDHOAUDWTVEP-SSDOTTSWSA-N (R)-mandelic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)C1=CC=CC=C1 IWYDHOAUDWTVEP-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- OVXWHHYDMKASOR-UHFFFAOYSA-N 1-methylcyclohexa-2,4-diene-1-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1(C)CC=CC=C1 OVXWHHYDMKASOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LBLYYCQCTBFVLH-UHFFFAOYSA-N 2-Methylbenzenesulfonic acid Chemical compound CC1=CC=CC=C1S(O)(=O)=O LBLYYCQCTBFVLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XASWYPVFCVEQSU-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;potassium Chemical compound [K].OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O XASWYPVFCVEQSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035657 Abasia Diseases 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 101100059544 Arabidopsis thaliana CDC5 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 208000024806 Brain atrophy Diseases 0.000 description 1
- 101150061009 C1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000005979 Citrus limon Nutrition 0.000 description 1
- 244000131522 Citrus pyriformis Species 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910002483 Cu Ka Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 239000001856 Ethyl cellulose Substances 0.000 description 1
- ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N Ethyl cellulose Chemical compound CCOCC1OC(OC)C(OCC)C(OCC)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005033 Fourier transform infrared spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 201000008892 GM1 Gangliosidosis Diseases 0.000 description 1
- 201000008905 GM2 gangliosidosis Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 206010018168 Genital prolapse Diseases 0.000 description 1
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 1
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 101001045440 Homo sapiens Beta-hexosaminidase subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101001109579 Homo sapiens NPC intracellular cholesterol transporter 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010059881 Lactase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 101150115300 MAC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 208000014060 Niemann-Pick disease Diseases 0.000 description 1
- 201000000785 Niemann-Pick disease type C2 Diseases 0.000 description 1
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 101710184309 Probable sucrose-6-phosphate hydrolase Proteins 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 102400000472 Sucrase Human genes 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 101710112652 Sucrose-6-phosphate hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 230000004308 accommodation Effects 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000001361 adipic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011037 adipic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 102000016679 alpha-Glucosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012080 ambient air Substances 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003472 antidiabetic agent Substances 0.000 description 1
- 229940125708 antidiabetic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 210000002376 aorta thoracic Anatomy 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000003705 background correction Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- 239000011093 chipboard Substances 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000002178 crystalline material Substances 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000007416 differential thermogravimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N dimethyl butane Natural products CCCC(C)C AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 210000001029 dorsal striatum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 229940125436 dual inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 235000019325 ethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001249 ethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000003885 eye ointment Substances 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005429 filling process Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000002546 full scan Methods 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 125000002519 galactosyl group Chemical class C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000443 hydrochloric acid Drugs 0.000 description 1
- 238000002013 hydrophilic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- 229940116298 l- malic acid Drugs 0.000 description 1
- 229940116108 lactase Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 210000005240 left ventricle Anatomy 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 1
- 230000006724 microglial activation Effects 0.000 description 1
- 230000037230 mobility Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- GOQYKNQRPGWPLP-UHFFFAOYSA-N n-heptadecyl alcohol Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCO GOQYKNQRPGWPLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002241 neurite Anatomy 0.000 description 1
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 1
- 230000002981 neuropathic effect Effects 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- ZWLPBLYKEWSWPD-UHFFFAOYSA-N o-toluic acid Chemical compound CC1=CC=CC=C1C(O)=O ZWLPBLYKEWSWPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 239000002997 ophthalmic solution Substances 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 238000013105 post hoc analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010149 post-hoc-test Methods 0.000 description 1
- 238000001144 powder X-ray diffraction data Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 201000010727 rectal prolapse Diseases 0.000 description 1
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 229940100486 rice starch Drugs 0.000 description 1
- 230000028527 righting reflex Effects 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000007909 solid dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000007614 solvation Methods 0.000 description 1
- 238000002336 sorption--desorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 238000002411 thermogravimetry Methods 0.000 description 1
- 239000012749 thinning agent Substances 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000007492 two-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 229940100445 wheat starch Drugs 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 1
- 238000004846 x-ray emission Methods 0.000 description 1
- 229940099072 zavesca Drugs 0.000 description 1
Description
Область техники, к которой относится настоящее изобретениеField of technology to which the present invention relates
Настоящее изобретение относится к кристаллической форме соединения (I),The present invention relates to the crystalline form of compound (I),
Настоящее изобретение также относится к способу получения кристаллической формы соединения (I), и к фармацевтическим композициям, содержащим кристаллическую форму соединения (I). Кроме того, настоящее изобретение относится к способам применения этой кристаллической формы соединения (I) в качестве лекарственного средства и к способам применения ее при лечении заболеваний, связанных с аномальными уровнями глюкозилцерамида и/или с повышенными уровнями гликосфинголипидов.The present invention also relates to a method for producing a crystalline form of the compound (I), and to pharmaceutical compositions containing a crystalline form of the compound (I). In addition, the present invention relates to methods of using this crystalline form of compound (I) as a drug and to methods of using it in the treatment of diseases associated with abnormal levels of glucosylceramide and/or elevated levels of glycosphingolipids.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION
Кристаллическая форма соединения может быть важна, когда это соединение используется в фармацевтических целях. Это связано с тем, что морфология, размер частиц, полиморфизм, сольватация или гидратация кристаллической формы соединения могут влиять на фильтрацию, текучесть, таблетирование, растворимость и биодоступность фармацевтического агента.The crystalline form of a compound may be important when the compound is used for pharmaceutical purposes. This is because morphology, particle size, polymorphism, solvation or hydration of the crystalline form of a compound can affect the filtration, flowability, tabletting, solubility and bioavailability of a pharmaceutical agent.
Производные дезоксиноджиримицина представляют собой важный класс соединений в медицинской химии и разработке лекарств. N-(гидроксиэтил)-дезоксиноджиримицин представлен в продаже как миглитол, и он применяется в качестве антидиабетического средства для лечения диабета типа 2. Миглитол также действует как ингибитор широкого спектра действия нескольких кишечных гликозидаз (мальтазы, сахаразы и лактазы) (Hillebrand et al, Diabetes, 1986, Vol. 35, A93-A93; Scott and Spencer, Drugs, 2000, Vol. 59, 521-549).Deoxynojirimycin derivatives represent an important class of compounds in medicinal chemistry and drug development. N-(hydroxyethyl)-deoxynojirimycin is marketed as miglitol and is used as an antidiabetic agent for the treatment of type 2 diabetes. Miglitol also acts as a broad-spectrum inhibitor of several intestinal glycosidases (maltase, sucrase and lactase) (Hillebrand et al, Diabetes , 1986, Vol. 35, A93-A93; Scott and Spencer, Drugs, 2000, Vol. 59, 521-549).
N-бутилдезоксиноджиримицин (миглустат, Zavesca®) был разработан как ингибитор глюкозилцерамидсинтазы (также называемой церамидглюкозилтрансферазой, ЕС 2.4.1.80, код UniProt: Q16739), и он используется в клиниках для лечения пациентов с лизосомной болезнью накопления, болезнью Гоше (Platt et al., J. Biol. Chem., 1994, Vol. 269, 8362-8365; Cox et al., Lancet, 2000, Vol. 355, 1481-1485) и болезнью Нимана-Пика типа С (Pineda et al. Orphanet J. Rare Dis., 2018, Vol. 13, 140).N-butyldeoxynojirimycin (miglustat, Zavesca®) was developed as an inhibitor of glucosylceramide synthase (also called ceramide glucosyltransferase, EC 2.4.1.80, UniProt code: Q16739) and is used clinically to treat patients with the lysosomal storage disease Gaucher disease (Platt et al. , J. Biol. Chem., 1994, Vol. 269, 8362-8365; Cox et al., Lancet, 2000, Vol. 355, 1481-1485) and Niemann-Pick disease type C (Pineda et al. Orphanet J. Rare Dis., 2018, Vol. 13, 140).
В публикации WO 2015/147639 A1 описаны новые производные дезоксиноджиримицина, включая соединение (I),WO 2015/147639 A1 describes new deoxynojirimycin derivatives, including compound (I),
которые эффективны при лечении заболеваний, связанных с аномальными уровнями цитозольного или лизосомального глюкозилцерамида и/или с повышенными уровнями гликосфинголипидов. Соединение (I) является мощным двойным ингибитором глюкозилцерамидсинтазы и нелизосомальной глюкозилцерамидазы (GBA2, код UniProt: Q9HCG7).which are effective in the treatment of diseases associated with abnormal levels of cytosolic or lysosomal glucosylceramide and/or elevated levels of glycosphingolipids. Compound (I) is a potent dual inhibitor of glucosylceramide synthase and non-lysosomal glucosylceramidase (GBA2, UniProt code: Q9HCG7).
Терапевтические соединения, полезные для лечения аномальных уровней глюкозилцерамида и/или повышенных уровней гликосфинголипидов, часто вводят в форме таблеток. При приготовлении фармацевтических композиций и препаратов, применяемых в виде таблеток, весьма желательно иметь кристаллическую форму терапевтического соединения, имеющую низкий уровень гигроскопичности и/или низкий уровень поглощения влаги из воздуха, приводящий к расплыванию, что позволяет прессовать соединение в желаемую форму с соответствующим размером.Therapeutic compounds useful for treating abnormal glucosylceramide levels and/or elevated glycosphingolipid levels are often administered in tablet form. In the preparation of pharmaceutical compositions and preparations for use in tablet form, it is highly desirable to have a crystalline form of the therapeutic compound that has a low level of hygroscopicity and/or a low level of absorption of moisture from the air resulting in spreading, allowing the compound to be compressed into the desired shape with the appropriate size.
Кроме того, относительно высокая температура плавления (обычно выше приблизительно 80°С) терапевтического соединения способствует его устойчивости к разложению, облегчая тем самым хранение и увеличивая срок годности терапевтического соединения, что является желательным для любого фармацевтического средства.In addition, the relatively high melting point (typically above about 80° C.) of the therapeutic compound contributes to its resistance to degradation, thereby facilitating storage and increasing the shelf life of the therapeutic compound, which is desirable for any pharmaceutical agent.
Также особенно выгодно, чтобы терапевтическое соединение было негигроскопичным или по существу негигроскопичным с точки зрения обращения с ним, производства и хранения фармацевтического средства. Если фармацевтическое средство проявляет гигроскопические свойства, то может возникнуть множество проблем, например, таких как:It is also particularly advantageous for the therapeutic compound to be non-hygroscopic or substantially non-hygroscopic from the point of view of handling, manufacturing and storage of the pharmaceutical. If a pharmaceutical product exhibits hygroscopic properties, many problems may arise, such as:
сложность измельчения материала на мелкие частицы или в порошок при его дроблении;the difficulty of crushing the material into small particles or powder when crushing it;
наличие нежелательной влаги, которая способствует протеканию желательных реакций, и приводящая к образованию нежелательных конечных продуктов, что приводит к низкому качеству продукта и сокращению его срока годности;the presence of unwanted moisture, which promotes the occurrence of desired reactions, and leads to the formation of undesirable end products, which leads to poor quality of the product and a shortening of its shelf life;
образование мягких таблеток при изготовлении или попадание влаги внутрь упаковки;formation of soft tablets during manufacturing or moisture ingress into the packaging;
- 1 045552 прилипание порошка к конвейерному оборудованию может влиять на процесс наполнения.- 1 045552 powder sticking to conveyor equipment can affect the filling process.
Таким образом, желательно иметь кристаллическую форму терапевтического соединения, которая является негигроскопичной или по существу негигроскопичной.Thus, it is desirable to have a crystalline form of a therapeutic compound that is non-hygroscopic or substantially non-hygroscopic.
Ранее не сообщалось о кристаллических формах соединения (I). Соответственно, существует потребность в стабильных и/или нерасплывающихся кристаллических формах соединения (I), которые предпочтительно являются по существу негигроскопичными и/или которые имеют относительно высокие температуры плавления.No crystalline forms of compound (I) have been previously reported. Accordingly, there is a need for stable and/or non-deliquescent crystalline forms of compound (I), which are preferably substantially non-hygroscopic and/or which have relatively high melting points.
Краткое раскрытие настоящего изобретенияBrief Disclosure of the Present Invention
В первом аспекте настоящее изобретение относится к кристаллической форме соединения (I)In a first aspect, the present invention relates to a crystalline form of compound (I)
Каждый аспект или вариант осуществления настоящего изобретения, как определено в настоящем документе, может быть объединен с любым другим аспектом(ами) или вариантом(ами) осуществления, если явно не указано иное. В частности, любой признак, указанный как предпочтительный или выгодный, может быть объединен с любым другим признаком или признаками, указанными как предпочтительные или выгодные.Each aspect or embodiment of the present invention, as defined herein, may be combined with any other aspect(s) or embodiment(s) unless expressly indicated otherwise. In particular, any feature indicated as preferred or advantageous may be combined with any other feature or features indicated as preferred or advantageous.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей кристаллическую форму соединения (I), описанную в настоящем документе.In another aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition containing a crystalline form of compound (I) described herein.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к кристаллической форме соединения (I), описанной в настоящем документе, или к фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе, для применения в терапии.In another aspect, the present invention relates to a crystalline form of compound (I) described herein, or a pharmaceutical composition described herein, for use in therapy.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к кристаллической форме соединения (I), описанной в настоящем документе, или фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе, для применения в качестве лекарственного средства.In yet another aspect, the present invention relates to a crystalline form of compound (I) described herein or a pharmaceutical composition described herein for use as a drug.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к кристаллической форме соединения (I), описанной в настоящем документе, или фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе, для применения при лечении заболевания, связанного с аномальными уровнями глюкозилцерамида и/или с повышенными уровнями гликосфинголипидов.In another aspect, the present invention relates to a crystalline form of compound (I) described herein, or a pharmaceutical composition described herein, for use in the treatment of a disease associated with abnormal levels of glucosylceramide and/or elevated levels of glycosphingolipids.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к кристаллической форме соединения (I), описанной в настоящем документе, или фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе, для применения при лечении болезни Ниманна-Пика типа С.In yet another aspect, the present invention relates to a crystalline form of compound (I) described herein or a pharmaceutical composition described herein for use in the treatment of Niemann-Pick disease type C.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания, связанного с аномальными уровнями глюкозилцерамида и/или с повышенными уровнями гликосфинголипидов у людей или животных, где способ предусматривает введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества кристаллической формы соединения (I), описанной в настоящем документе, или фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе.In another aspect, the present invention relates to a method of treating a disease associated with abnormal levels of glucosylceramide and/or elevated levels of glycosphingolipids in humans or animals, wherein the method comprises administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of a crystalline form of compound (I) described in herein, or a pharmaceutical composition described herein.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения болезни Ниманна-Пика типа С у людей или животных, где способ предусматривает введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества кристаллической формы соединения (I), описанной в настоящем документе, или фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе.In yet another aspect, the present invention relates to a method of treating Niemann-Pick disease type C in humans or animals, wherein the method comprises administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of a crystalline form of compound (I) described herein, or a pharmaceutical composition, described in this document.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения кристаллической формы соединения (I), описанной в настоящем документе, где способ предусматривает приведение образца соединения (I) в контакт с растворителем.In yet another aspect, the present invention relates to a method for preparing a crystalline form of compound (I) described herein, wherein the method comprises contacting a sample of compound (I) with a solvent.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к кристаллической форме соединения (I), полученной путем осуществления описанного здесь способа.In yet another aspect, the present invention relates to a crystalline form of compound (I) obtained by carrying out the method described herein.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению свободного основания соединения (I) для получения кристаллической формы соединения (I).In yet another aspect, the present invention relates to the use of the free base of compound (I) to obtain a crystalline form of compound (I).
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения кристаллической формы соединения (I), где способ предусматривает кристаллизацию свободного основания соединения (I).In yet another aspect, the present invention relates to a method for preparing a crystalline form of compound (I), wherein the method involves crystallizing the free base of compound (I).
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к кристаллической форме соединения (I), полученной способом получения кристаллической формы соединения (I), где способ предусматривает кристаллизацию свободного основания соединения (I).In yet another aspect, the present invention relates to a crystalline form of compound (I) obtained by a process for preparing a crystalline form of compound (I), wherein the method involves crystallizing the free base of compound (I).
Другие предпочтительные варианты осуществления изобретения описаны в настоящем документе, и, в частности, в примерах.Other preferred embodiments of the invention are described herein, and in particular in the examples.
Авторы настоящего изобретения неожиданно получили кристаллическую форму соединения (I), которая является стабильной и нерасплывающейся. Настоящее изобретение обеспечило дополнительные полезные свойства этого соединения, такие как существенное отсутствие гигроскопичности и относительно высокая температура плавления кристаллической формы соединения (I).The inventors of the present invention have unexpectedly obtained a crystalline form of compound (I) which is stable and non-deliquescent. The present invention has provided additional beneficial properties of this compound, such as a significant lack of hygroscopicity and a relatively high melting point of the crystalline form of compound (I).
- 2 045552- 2 045552
Авторы настоящего изобретения неожиданно получили кристаллическую форму соединения (I), которая дополнительно показала хорошую растворимость в воде. Эти свойства делают кристаллические формы по изобретению особенно подходящими для использования их в составе фармацевтической композиции.The inventors of the present invention unexpectedly obtained a crystalline form of compound (I), which further showed good solubility in water. These properties make the crystalline forms of the invention particularly suitable for use in pharmaceutical compositions.
Кристаллизация терапевтических соединений часто включает использование различных солей. Как правило, соли легко подвергаются кристаллизации, и полученный материал облегчает последующую кристаллизацию терапевтических соединений. По этой причине использование соли часто является предпочтительным методом кристаллизации терапевтического соединения. Поэтому очень удивительно, что авторы настоящего изобретения смогли получить кристаллическую форму свободного основания соединения (I).Crystallization of therapeutic compounds often involves the use of various salts. In general, salts readily crystallize, and the resulting material facilitates subsequent crystallization of therapeutic compounds. For this reason, the use of salt is often the preferred method for crystallizing a therapeutic compound. It is therefore very surprising that the inventors of the present invention were able to obtain the free base crystalline form of compound (I).
Поскольку кристаллическая форма любого терапевтического соединения в виде свободного основания не требует присутствия противоиона, то концентрация терапевтического соединения в порошке кристаллической формы в виде свободного основания обычно выше, чем в форме соответствующей соли, что очень полезно, поскольку снижает стоимость производства лекарственного препарата.Since the free base crystalline form of any therapeutic compound does not require the presence of a counterion, the concentration of the therapeutic compound in the free base crystalline form powder is typically higher than in the corresponding salt form, which is very beneficial because it reduces the cost of drug production.
Не желая быть связанными какой-либо теорией, считается, что кристаллические формы по изобретению проявляют благоприятные эффекты, описанные выше, благодаря их кристаллической структуре.Without wishing to be bound by any theory, it is believed that the crystalline forms of the invention exhibit the beneficial effects described above due to their crystalline structure.
Краткое описание фигурBrief description of the figures
Эти и другие аспекты настоящего изобретения будут дополнительно описаны со ссылкой на прилагаемые фигуры, на которых показано следующее:These and other aspects of the present invention will be further described with reference to the accompanying drawings, which show the following:
На фиг. 1 представлены иллюстративные изображения, полученные с помощью микроскопии в поляризованном свете, кристаллической формы соединения (I), названной формой 2, полученной путем уравновешивания с ацетонитрилом; слева: в виде сухого порошка, справа: в парафиновом масле.In fig. 1 shows illustrative polarized light microscopy images of a crystalline form of compound (I), designated Form 2, prepared by equilibration with acetonitrile; left: in the form of dry powder, right: in paraffin oil.
На фиг. 2 показана порошковая рентгенограмма формы 2, полученной путем уравновешивания с ацетонитрилом.In fig. 2 shows an X-ray powder diffraction pattern of Form 2 obtained by equilibration with acetonitrile.
На фиг. 3А показана термограмма TG-FTIR формы 2, полученной путем уравновешивания с ацетонитрилом.In fig. 3A shows a TG-FTIR thermogram of Form 2 obtained by equilibration with acetonitrile.
На фиг. 3В показана термограмма дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) формы 2, полученной путем уравновешивания с ацетонитрилом.In fig. 3B shows a differential scanning calorimetry (DSC) thermogram of Form 2 obtained by equilibration with acetonitrile.
На фиг. 4А показана изотерма динамической сорбции паров (ДСП) формы 2, полученной уравновешиванием с ацетонитрилом: изменение содержания воды (красная кривая) и относительной влажности (синяя кривая) в зависимости от времени.In fig. 4A shows the dynamic vapor sorption (DVA) isotherm of Form 2 obtained by equilibration with acetonitrile: change in water content (red curve) and relative humidity (blue curve) as a function of time.
На фиг. 4В показана изотерма ДСП формы 2, полученная уравновешиванием с ацетонитрилом: изменение содержания воды в зависимости от относительной влажности.In fig. 4B shows the isotherm of EAF Form 2 obtained by equilibration with acetonitrile: change in water content as a function of relative humidity.
На фиг. 5 представлены иллюстративные изображения, полученные с помощью микроскопии в поляризованном свете, кристаллической формы соединения (I), названной формой 3, полученной уравновешиванием с ацетонитрилом, анизолом или этилацетатом соответственно.In fig. 5 shows illustrative polarized light microscopy images of a crystalline form of compound (I), designated Form 3, prepared by equilibration with acetonitrile, anisole, or ethyl acetate, respectively.
На фиг. 6А показана порошковая рентгенограмма формы 3, полученной уравновешиванием с ацетонитрилом.In fig. 6A shows an X-ray powder diffraction pattern of Form 3 obtained by equilibration with acetonitrile.
На фиг. 6В показано наложение порошковых рентгенограмм форм 3, полученных путем уравновешивания с ТВМЕ, водой, изопропанолом, этилацетатом, ацетонитрилом или анизолом, соответственно.In fig. 6B shows an overlay of X-ray powder diffraction patterns of Forms 3 obtained by equilibration with TBME, water, isopropanol, ethyl acetate, acetonitrile, or anisole, respectively.
На фиг. 7 показано наложение порошковых рентгенограмм двух кристаллических форм соединения (I), полученных уравновешиванием с ацетонитрилом:In fig. Figure 7 shows an overlay of X-ray powder diffraction patterns of two crystalline forms of compound (I), obtained by equilibration with acetonitrile:
1) форма 3 (пример 3) и1) form 3 (example 3) and
2) форма 2 (пример 2).2) form 2 (example 2).
На фиг. 8А показана термограмма TG-FTIR формы 3, полученной уравновешиванием с этилацетатом.In fig. 8A shows a TG-FTIR thermogram of Form 3 obtained by equilibration with ethyl acetate.
На фиг. 8В показана термограмма TG-FTIR формы 3, полученной уравновешиванием с изопропанолом.In fig. 8B shows a TG-FTIR thermogram of Form 3 obtained by equilibration with isopropanol.
На фиг. 8С показана термограмма ДСК формы 3, полученной уравновешиванием с этилацетатом.In fig. 8C shows a DSC thermogram of Form 3 obtained by equilibration with ethyl acetate.
На фиг. 9А показана изотерма ДСП формы 3, полученной уравновешиванием с этилацетатом: изменение содержания воды (красная кривая) и относительной влажности (синяя кривая) в зависимости от времени.In fig. 9A shows the isotherm of Form 3 EAF obtained by equilibration with ethyl acetate: change in water content (red curve) and relative humidity (blue curve) as a function of time.
На фиг. 9В показана изотерма ДСП формы 3, полученной уравновешиванием с этилацетатом: изменение содержания воды в зависимости от относительной влажности.In fig. 9B shows the isotherm of EAF Form 3 prepared by equilibration with ethyl acetate: change in water content as a function of relative humidity.
На фиг. 10 показаны приблизительные медио-сагиттальные уровни, полученные в соответствии с протоколом сечений, согласно Paxinos & Franklin The Mouse Brain Atlas, 2nd edition, с указанием стереотаксических координат.In fig. Figure 10 shows approximate mediosagittal levels obtained according to the sectioning protocol according to Paxinos & Franklin The Mouse Brain Atlas, 2nd edition, with stereotactic coordinates indicated.
На фиг. 11 показано процентное изменение массы тела мышей между 11-м днем после рождения (PND) и 9-й неделей жизни.In fig. 11 shows the percentage change in body weight of mice between postnatal day (PND) 11 and week 9 of life.
На фиг. 12 показаны уровни глюкозилцерамидов С16:0 и С18:0 после регулярного перорального введения мышам из группы в возрасте PND 11-70.In fig. 12 shows the levels of glucosylceramides C16:0 and C18:0 after regular oral administration to group mice aged PND 11-70.
На фиг. 13 показана оценка клинических признаков у мышей NPC(-/-) из группы в возрасте PND 56- 3 045552In fig. Figure 13 shows an assessment of clinical signs in NPC(-/-) mice from the group aged PND 56-3 045552
70, получавших носитель и AZ-3102.70 treated with vehicle and AZ-3102.
На фиг. 14 показаны показатели оценки тремора у мышей NPC(-/-) из группы PND 56-70, получавших носитель и AZ-3102.In fig. 14 shows tremor scores in NPC(-/-) mice from the PND 56-70 group treated with vehicle and AZ-3102.
На фиг. 15 показано определение областей интереса (ROI). На изображении показаны контуры ROI мозжечка (cerebellum), образования гиппокампа (hippocampus), мозолистого тела (corpus callosum )и полосатого тела (дорсального стриатума, caudate-putamen).In fig. Figure 15 shows the definition of regions of interest (ROI). The image shows the ROI outlines of the cerebellum, hippocampus, corpus callosum, and striatum (dorsal striatum, caudate-putamen).
На фиг. 16 показана иммуногистохимия головного мозга: мечение кальбиндином-D28k у мышей NCP(-/-) и NPC(+/-), получавших носитель, по сравнению с мышами NPC(+/+, мыши дикого типа) и NPC(-/-), получавшими AZ-3102.In fig. Figure 16 shows brain immunohistochemistry: calbindin-D28k labeling in vehicle-treated NCP(-/-) and NPC(+/-) mice compared with NPC(+/+, wild-type) and NPC(-/-) mice. , receiving AZ-3102.
На фиг. 17 показан обобщенный механизм действия кристаллической формы соединения (I) (AZ3102).In fig. 17 shows a generalized mechanism of action of the crystalline form of compound (I) (AZ3102).
Подробное раскрытие настоящего изобретенияDetailed Disclosure of the Present Invention
Если не указано иное, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, имеют смысловые значения, которые обычно понимают специалисты в данной области. Значение и определения используемых терминов должны быть ясны, однако в случае любой скрытой двусмысленности, приведенные здесь определения имеют приоритет над любым словарным или сторонним определением.Unless otherwise specified, scientific and technical terms used in connection with the present invention have the meanings commonly understood by those skilled in the art. The meaning and definitions of the terms used should be clear, but in the event of any hidden ambiguity, the definitions given here take precedence over any dictionary or third-party definition.
Следует понимать, что выражения, представленные в единственном числе, часто используются для удобства, однако все выражения и определения, представленные в единственном числе, предназначены для охвата вариантов во множественном числе, если явно не указано иное или не следует из контекста. Термины содержащий, включающий и имеющий предназначены для включения и они подразумевают, что могут быть дополнительные элементы, отличные от перечисленных. Кроме того, следует понимать, что все ссылки, включая журнальные статьи, книги, патенты, техническую литературу и т.п., упомянутые в данном документе, включены в настоящий документ во всей своей полноте и для всех целей посредством ссылки.It should be understood that expressions presented in the singular are often used for convenience, but all expressions and definitions presented in the singular are intended to cover the plural unless expressly stated otherwise or the context requires. The terms comprising, including and having are intended to be inclusive and imply that there may be additional elements other than those listed. In addition, it should be understood that all references, including journal articles, books, patents, technical literature, etc., mentioned herein are incorporated herein in their entirety and for all purposes by reference.
Термин приблизительно, используемый здесь для числовых показателей, относится к их значению в пределах 10% от основного параметра (т. е. плюс или минус 10%), а термин приблизительно, используемый в начале строки числовых показателей, относится к каждому значению (т.е. выражение приблизительно 1, 2 и 3 эквивалентно выражению приблизительно 1, приблизительно 2 и приблизительно 3). Например, температура, указанная как приблизительно 85°С, может включать температуры в диапазоне от 75 до 95°С.The term approximately, used here for numeric measures, refers to their value within 10% of the underlying parameter (i.e., plus or minus 10%), and the term approximately, used at the beginning of a line of numeric measures, refers to each value (i.e., i.e. the expressions about 1, 2 and 3 are equivalent to the expressions about 1, about 2 and about 3). For example, a temperature specified as approximately 85°C may include temperatures in the range of 75 to 95°C.
Термин температура плавления хорошо известен в данной области техники. Термин относительно высокая температура плавления, как он используется в данном документе, предназначен для описания кристаллических форм, которые достаточно стабильны, чтобы использовать их для изготовления фармацевтических композиций. Предпочтительно, когда термин относительно высокая температура плавления описывает температуру плавления, превышающую приблизительно 65°С. Еще более предпочтительно - когда температура плавления выше приблизительно 80°С.The term melting point is well known in the art. The term relatively high melting point, as used herein, is intended to describe crystalline forms that are stable enough to be used for the manufacture of pharmaceutical compositions. Preferably, the term relatively high melting point describes a melting point greater than about 65°C. Even more preferably, the melting point is above about 80°C.
Термин композиция, используемый в данном документе, охватывает продукт, содержащий указанные ингредиенты в указанных количествах, а также любой продукт, который прямо или косвенно является результатом комбинации указанных ингредиентов в указанных количествах. Предполагается, что такой термин в отношении фармацевтической композиции включает продукт, содержащий кристаллическую форму соединения (I), и, необязательно, дополнительные ингредиенты, входящие в состав носителя, а также любой продукт, который прямо или косвенно является результатом комбинации, комплексообразования или агрегации любых двух или более ингредиентов, или диссоциации одного или более ингредиентов, или других типов реакций или взаимодействий одного или более ингредиентов. Соответственно, фармацевтические композиции настоящего изобретения охватывают любую композицию, содержащую кристаллическую форму по изобретению и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель. Под фармацевтически приемлемым подразумевается, что носитель, разбавитель или эксципиент должны быть совместимы с другими ингредиентами композиции, и при этом не оказывать вредного воздействия на реципиента.The term composition as used herein covers a product containing the specified ingredients in the specified amounts, as well as any product that is directly or indirectly the result of a combination of the specified ingredients in the specified amounts. Such term, in relation to a pharmaceutical composition, is intended to include a product containing a crystalline form of compound (I), and, optionally, additional ingredients contained in the carrier, as well as any product that directly or indirectly results from the combination, complexation or aggregation of any two or more ingredients, or dissociation of one or more ingredients, or other types of reactions or interactions of one or more ingredients. Accordingly, the pharmaceutical compositions of the present invention include any composition containing a crystalline form of the invention and, optionally, a pharmaceutically acceptable carrier. By pharmaceutically acceptable is meant that the carrier, diluent or excipient must be compatible with the other ingredients of the composition without causing any harmful effects to the recipient.
Термин терапевтически эффективное количество означает количество кристаллической формы или фармацевтической композиции, которое при введении пациенту с целью лечения заболевания достаточно для осуществления такого лечения заболевания. Терапевтически эффективное количество будет варьироваться в зависимости от заболевания и его тяжести, а также от возраста и массы тела пациента, подлежащего лечению. Термин пациент (или субъект) включает, но без ограничения, животных, таких как, например, млекопитающие. Предпочтительно, когда пациент является человеком.The term therapeutically effective amount means an amount of a crystalline form or pharmaceutical composition that, when administered to a patient for the purpose of treating a disease, is sufficient to effect such treatment of the disease. The therapeutically effective amount will vary depending on the disease and its severity, as well as the age and body weight of the patient being treated. The term patient (or subject) includes, but is not limited to, animals such as, for example, mammals. Preferably, the patient is human.
Настоящее изобретение относится к кристаллической форме соединения (I)The present invention relates to the crystalline form of compound (I)
- 4 045552- 4 045552
(i).(i).
Кристаллическая форма соединения (I) может находиться в любом кристаллическом состоянии. Кристаллическая форма соединения (I) может представлять собой кристаллическую соль или кристаллическое свободное основание (в неионизированной форме). Предпочтительно, когда кристаллическая форма соединения (I) представляет собой кристаллическое свободное основание. Кроме того, соединение (I) может образовывать сокристаллы.The crystalline form of compound (I) may be in any crystalline state. The crystalline form of compound (I) may be a crystalline salt or a crystalline free base (in non-ionized form). Preferably, the crystalline form of compound (I) is a crystalline free base. In addition, compound (I) can form cocrystals.
Если кристаллическая форма соединения (I) представляет собой кристаллическую соль, то молекулярная структура указанного выше соединения (I) включает протонированный атом азота.If the crystalline form of compound (I) is a crystalline salt, then the molecular structure of the above compound (I) includes a protonated nitrogen atom.
Настоящее изобретение не ограничивается монокристаллической формой соединения (I). Твердые материалы могут существовать более чем в одной кристаллической форме. Эти альтернативные кристаллические формы называются полиморфами. Каждый полиморф имеет различную ориентацию и/или конформацию молекул в кристаллической решетке. Каждое кристаллическое состояние, или полиморф, обладает уникальным набором физико-химических свойств из-за различий в кристаллической структуре.The present invention is not limited to the single crystalline form of compound (I). Solid materials can exist in more than one crystalline form. These alternative crystal forms are called polymorphs. Each polymorph has a different orientation and/or conformation of molecules in the crystal lattice. Each crystalline state, or polymorph, has a unique set of physicochemical properties due to differences in crystal structure.
Полиморфные формы могут иметь различные механические свойства, такие как текучесть и прессуемость порошка, которые влияют на технологические свойства соединения. Стабильность и продолжительность хранения соединения также могут зависеть от конкретного типа полиморфа.Polymorphs may have different mechanical properties, such as powder flow and compressibility, which affect the processing properties of the compound. The stability and shelf life of a compound may also depend on the specific type of polymorph.
Полиморфы можно отличать друг от друга по-разному. Полиморфы ярко проявляют спектроскопические свойства, и их можно определить, например, с помощью инфракрасной спектроскопии, спектроскопии комбинационного рассеяния и спектроскопии 13С-ЯМР. Ввиду того факта, что каждая кристаллическая форма преломляет рентгеновские лучи по-разному, то для характеристики полиморфов также может использоваться метод порошковой рентгеновской дифракции (ПРД). Кроме того, тепловые методы, такие как дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) и термогравиметрический анализ (ТТА), также могут предоставить уникальную информацию о конкретном полиморфе.Polymorphs can be distinguished from each other in different ways. The polymorphs exhibit distinct spectroscopic properties and can be determined, for example, by infrared spectroscopy, Raman spectroscopy and 13 C-NMR spectroscopy. Due to the fact that each crystalline form refracts x-rays differently, powder x-ray diffraction (XRD) can also be used to characterize polymorphs. In addition, thermal techniques such as differential scanning calorimetry (DSC) and thermogravimetric analysis (TGA) can also provide unique information about a specific polymorph.
Как хорошо известно в области порошковой рентгеновской дифракции, относительные высоты пиков порошковых рентгеновских дифракционных спектров могут использоваться для описания различных кристаллических форм. Соответственно, в одном аспекте, касающемся формы 3, настоящее изобретение относится к кристаллической форме соединения (I), характеризующейся отражением на порошковой рентгеновской дифрактограмме, указанным как значение 2θ, при 17,8±0,2°, где отражение при 17,8±0,2° является одним из четырех самых сильных отражений на порошковой рентгеновской дифрактограмме. Предпочтительно, когда отражение при 17,8±0,2° является одним из трех самых сильных отражений на порошковой рентгеновской дифрактограмме, или отражение при 17,8±0,2° является одним из двух самых сильных отражений на порошковой рентгеновской дифрактограмме. Более предпочтительно, когда отражение при 17,8±0,2° является самым сильным отражением на порошковой рентгеновской дифрактограмме. Еще более предпочтительно, когда в аспекте, касающемся формы 3, кристаллическая форма соединения (I) характеризуется отражением на порошковой рентгеновской дифрактограмме, указанным как значение 2θ, при 17,8±0,1°, где отражение при 17,8±0,1° является одним из четырех самых сильных отражений на порошковой рентгеновской дифрактограмме. Предпочтительно, когда отражение при 17,8 ±0,1° является одним из трех самых сильных отражений на порошковой рентгеновской дифрактограмме, или отражение при 17,8±0,1° является одним из двух самых сильных отражений на порошковой рентгеновской дифрактограмме. Более предпочтительно, когда отражение при 17,8±0,1° является самым сильным отражением на порошковой рентгеновской дифрактограмме.As is well known in the field of powder X-ray diffraction, the relative peak heights of powder X-ray diffraction spectra can be used to describe different crystalline forms. Accordingly, in one aspect regarding Form 3, the present invention relates to a crystalline form of compound (I) characterized by a reflectance in a powder X-ray diffraction pattern indicated as a 2θ value at 17.8±0.2°, wherein the reflectance at 17.8± 0.2° is one of the four strongest reflections in a powder X-ray diffraction pattern. Preferably, the reflection at 17.8±0.2° is one of the three strongest reflections in the powder X-ray diffraction pattern, or the reflection at 17.8±0.2° is one of the two strongest reflections in the powder X-ray diffraction pattern. More preferably, the reflection at 17.8±0.2° is the strongest reflection in the X-ray powder diffraction pattern. Even more preferably, in the aspect regarding Form 3, the crystalline form of compound (I) is characterized by a reflectance in a powder X-ray diffraction pattern indicated as a 2θ value at 17.8±0.1°, wherein the reflectance at 17.8±0.1 ° is one of the four strongest reflections in a powder X-ray diffraction pattern. Preferably, the reflection at 17.8 ± 0.1° is one of the three strongest reflections in the X-ray powder diffraction pattern, or the reflection at 17.8 ± 0.1° is one of the two strongest reflections in the X-ray powder diffraction pattern. More preferably, the reflection at 17.8 ± 0.1° is the strongest reflection in the X-ray powder diffraction pattern.
Термин наиболее сильное отражение описывает самый высокий пик порошковой рентгеновской дифрактограммы. Высота пика на порошковой рентгеновской дифрактограмме определяется по интенсивности рентгеновского излучения (в единицах импульсов или импульсов/сек). Таким образом, самым сильным отражением является отражение, которое показывает наибольшую интенсивность рентгеновского излучения на порошковой рентгеновской дифрактограмме. Например, самым сильным отражением на порошковой рентгеновской дифрактограмме, показанной на фиг. 6А, является отражение, указанное как значение 2θ, при 17,8±0,2°.The term strongest reflection describes the highest peak in a powder X-ray diffraction pattern. The peak height in a powder X-ray diffraction pattern is determined by the intensity of the X-ray emission (in units of counts or counts/sec). Thus, the strongest reflection is the reflection that shows the highest x-ray intensity in the powder x-ray diffraction pattern. For example, the strongest reflection in the X-ray powder diffraction pattern shown in FIG. 6A is the reflection, indicated as the value 2θ, at 17.8±0.2°.
Если прямо не указано иное, то все порошковые рентгеновские дифрактограммы получены с использованием К-альфа-излучения меди при температуре приблизительно 25°С.Unless otherwise expressly stated, all X-ray powder diffraction patterns were obtained using copper K-alpha radiation at approximately 25°C.
Предпочтительно, когда в аспекте, касающемся формы 3, кристаллическая форма соединения (I) дополнительно характеризуется одним или более отражений, выраженных как значение 2θ, при одном или более углов из 4,1±0,2°, 8,3±0,2°, 12,4±0,2°, 13,6±0,2°, 14,5±0,2°, 14,9±0,2°, 15,2±0,2°, 17,2±0,2°, 19,3±0,2°, 21,2±0,2°, 22,4±0,2°, 22,9± 0,2° и 23,3±0,2° на порошковой рентгеновской дифрактограмме.Preferably, in the aspect regarding Form 3, the crystalline form of compound (I) is further characterized by one or more reflections, expressed as a 2θ value, at one or more angles of 4.1±0.2°, 8.3±0.2 °, 12.4±0.2°, 13.6±0.2°, 14.5±0.2°, 14.9±0.2°, 15.2±0.2°, 17.2 ±0.2°, 19.3±0.2°, 21.2±0.2°, 22.4±0.2°, 22.9±0.2° and 23.3±0.2° on a powder X-ray diffraction pattern.
- 5 045552- 5 045552
Еще более предпочтительно, когда в аспекте, касающемся формы 3, кристаллическая форма соединения (I) дополнительно характеризуется одним или несколькими отражениями, выраженными как значение 2θ, при одном или более углов из 4,1±0,1°, 8,3±0,1°, 12,4+0,1°, 13,6+0,1°, 14,5+0,1°, 14,9+0,1°,Even more preferably, in the aspect regarding Form 3, the crystalline form of compound (I) is further characterized by one or more reflections, expressed as a 2θ value, at one or more angles of 4.1±0.1°, 8.3±0 ,1°, 12.4+0.1°, 13.6+0.1°, 14.5+0.1°, 14.9+0.1°,
15,2+0,1°, 17,2+0,1°, 19,3+0,1°, 21,2+0,1°, 22,4 ±0,1°, 22,9±0,1° и 23,3±0,1° на порошковой рентгеновской дифрактограмме.15.2+0.1°, 17.2+0.1°, 19.3+0.1°, 21.2+0.1°, 22.4 ±0.1°, 22.9±0 ,1° and 23.3±0.1° on the powder X-ray diffraction pattern.
Положения пиков на порошковой рентгеновской дифрактограмме относительно нечувствительны к деталям эксперимента. Таким образом, кристаллические соединения по изобретению могут быть охарактеризованы порошковой рентгеновской дифрактограммой с определенными положениями пиков. Соответственно, в аспекте, касающемся формы 3, кристаллическая форма соединения (I) предпочтительно характеризуется отражениями, выраженными как значение 2θ, при 17,2+0,2°, 17,8+0,2°, 21,2+0,2° и 22,4±0,2° на порошковой рентгеновской дифрактограмме. Более предпочтительно, когда в аспекте, касающемся формы 3, кристаллическая форма соединения (I) характеризуется отражениями, выраженными как значение 2θ, при 4,1±0,2°, 8,3±0,2°, 12,4+0,2°, 13,6+0,2°, 14,5+0,2°, 14,9+0,1°, 15,2+0,2°, 17,2+0,2°, 17,8+0,2°, 19,3+0,2°, 21,2+0,2°, 22,4±0,2°, 22,9±0,2° и 23,3±0,2° на порошковой рентгеновской дифрактограмме. Еще более предпочтительно, когда в аспекте, касающемся формы 3, кристаллическая форма соединения (I) характеризуется отражениями, выраженными как значение 2θ, при 17,2±0,1°, 17,8+0,1°, 21,2+0,1° и 22,4±0,1° на порошковой рентгеновской дифрактограмме. Наиболее предпочтительно, когда в аспекте, касающемся формы 3, кристаллическая форма соединения (I) характеризуется отражениями, выраженными как значение 2θ, при 4,1±0,1°, 8,3±0,1°, 12,4+0,1°, 13,6+0,1°, 14,5+0,1°, 14,9+0,1°, 15,2+0,1°, 17,2+0,1°, 17,8+0,1°, 19,3+0,1°, 21,2+0,1°, 22,4+0,1°, 22,9+0,1° и 23,3+0,1° на порошковой рентгеновской дифрактограмме.The peak positions in a powder X-ray diffraction pattern are relatively insensitive to experimental details. Thus, the crystalline compounds of the invention can be characterized by powder X-ray diffraction patterns with specific peak positions. Accordingly, in the aspect regarding Form 3, the crystalline form of compound (I) is preferably characterized by reflections, expressed as a 2θ value, at 17.2+0.2°, 17.8+0.2°, 21.2+0.2 ° and 22.4±0.2° on the powder X-ray diffraction pattern. More preferably, in the aspect regarding Form 3, the crystalline form of compound (I) is characterized by reflections, expressed as a 2θ value, at 4.1±0.2°, 8.3±0.2°, 12.4+0, 2°, 13.6+0.2°, 14.5+0.2°, 14.9+0.1°, 15.2+0.2°, 17.2+0.2°, 17, 8+0.2°, 19.3+0.2°, 21.2+0.2°, 22.4±0.2°, 22.9±0.2° and 23.3±0.2 ° on a powder X-ray diffraction pattern. Even more preferably, in the aspect regarding Form 3, the crystalline form of compound (I) is characterized by reflections, expressed as a 2θ value, at 17.2±0.1°, 17.8+0.1°, 21.2+0 ,1° and 22.4±0.1° on the powder X-ray diffraction pattern. Most preferably, in the aspect regarding Form 3, the crystalline form of compound (I) is characterized by reflections, expressed as a 2θ value, at 4.1±0.1°, 8.3±0.1°, 12.4+0, 1°, 13.6+0.1°, 14.5+0.1°, 14.9+0.1°, 15.2+0.1°, 17.2+0.1°, 17, 8+0.1°, 19.3+0.1°, 21.2+0.1°, 22.4+0.1°, 22.9+0.1° and 23.3+0.1 ° on a powder X-ray diffraction pattern.
Кристаллические формы соединения можно охарактеризовать с помощью термограммы дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). Таким образом, кристаллическая форма соединения (I) в аспекте, касающемся формы 3 предпочтительно характеризуется термограммой ДСК, которая показывает начало эндотермического теплового потока приблизительно при 87°С и/или температуру плавления равную приблизительно 92,4°С, как показано на фиг. 8С. Соответственно, предпочтительно, когда в аспекте, касающемся формы 3, кристаллическая форма соединения (I) имеет температуру плавления от 89 до 96°С, определенную методом ДСК. Предпочтительно, когда кристаллическая форма в аспекте, касающемся формы 3, имеет температуру плавления от 90 до 95°С, определенную методом ДСК. Еще более предпочтительно, когда кристаллическая форма соединения (I) в аспекте, касающемся формы 3, имеет температуру плавления от 91 до 94°С, определенную методом ДСК. Наиболее предпочтительно, когда кристаллическая форма соединения (I) в аспекте, касающемся формы 3, имеет температуру плавления от 92 до 93°С, определенную методом ДСК.Crystalline forms of a compound can be characterized using a differential scanning calorimetry (DSC) thermogram. Thus, the crystalline form of compound (I) in the aspect of Form 3 is preferably characterized by a DSC thermogram that shows the onset of endothermic heat flow at approximately 87° C. and/or a melting point of approximately 92.4° C., as shown in FIG. 8C. Accordingly, it is preferable that, in the aspect regarding Form 3, the crystalline form of compound (I) has a melting point of 89 to 96° C. determined by DSC. Preferably, the crystalline form in the form 3 aspect has a melting point of 90 to 95° C., as determined by DSC. Even more preferably, the crystalline form of compound (I) in the form 3 aspect has a melting point of 91 to 94°C as determined by DSC. Most preferably, the crystalline form of compound (I) in the form 3 aspect has a melting point of 92 to 93°C as determined by DSC.
Кристаллические формы соединения можно охарактеризовать по их гигроскопичности. Гигроскопичность продукта отражает увеличение или уменьшение содержания в нем воды в зависимости от относительной влажности при определенной температуре. По существу негигроскопичные продукты показывают или характеризуются лишь незначительным изменением содержания воды в результате изменений относительной влажности. В сильно гигроскопичных продуктах содержание воды может варьироваться в широких пределах. Соответственно, предпочтительно, чтобы кристаллическая форма соединения (I) была по существу негигроскопичной.Crystalline forms of a compound can be characterized by their hygroscopicity. The hygroscopicity of a product reflects the increase or decrease in its water content depending on the relative humidity at a certain temperature. Essentially non-hygroscopic products show or are characterized by only minor changes in water content as a result of changes in relative humidity. In highly hygroscopic products, the water content can vary widely. Accordingly, it is preferable that the crystalline form of compound (I) is substantially non-hygroscopic.
Кристаллические формы соединения можно охарактеризовать по их термогравиметрическому показателям. Таким образом, кристаллическую форму соединения (I) предпочтительно можно охарактеризовать по ее термогравиметрическим показателям. В одном варианте осуществления кристалл соединения (I) характеризуется термогравиметрическими показателями, представленными на фиг. 8А или 8В.Crystalline forms of a compound can be characterized by their thermogravimetric properties. Thus, the crystalline form of compound (I) can preferably be characterized by its thermogravimetric properties. In one embodiment, the crystal of compound (I) is characterized by thermogravimetric properties presented in FIG. 8A or 8B.
Кристаллические формы соединения также могут быть охарактеризованы профилем динамической сорбции паров (ДСП). Соответственно, кристаллическую форму соединения (I) предпочтительно можно охарактеризовать по профилю ДСП, представленному на фиг. 9А и 9В. Предпочтительно, когда кристаллическая форма соединения (I) имеет обратимый профиль сорбции/десорбции. Предпочтительно, когда профиль ДСП показывает по существу негигроскопичную природу кристаллической формы.Crystalline forms of a compound can also be characterized by a dynamic vapor sorption (DVA) profile. Accordingly, the crystalline form of compound (I) can preferably be characterized by the EAF profile shown in FIG. 9A and 9B. Preferably, the crystalline form of compound (I) has a reversible sorption/desorption profile. Preferably, the chipboard profile shows the substantially non-hygroscopic nature of the crystalline form.
По существу негигроскопичные вещества имеют водопоглощение менее приблизительно 2% при относительной влажности приблизительно 95%, измеренной при температуре приблизительно 25°С. Предпочтительно, когда водопоглощение составляет менее приблизительно 1% при относительной влажности приблизительно 95%, измеренной при температуре приблизительно 25°С. Значения водопоглощения получают путем измерения прироста массы испытуемой кристаллической формы по отношению к исходной массе при относительной влажности приблизительно 95% и температуре приблизительно 25°С.Essentially non-hygroscopic substances have a water absorption of less than about 2% at a relative humidity of about 95%, measured at a temperature of about 25°C. Preferably, water absorption is less than about 1% at a relative humidity of about 95%, measured at a temperature of about 25°C. Water absorption values are obtained by measuring the weight gain of the test crystalline form relative to the initial weight at a relative humidity of approximately 95% and a temperature of approximately 25°C.
Соответственно, кристаллическая форма соединения (I) предпочтительно поглощает от 0 до 2% воды при относительной влажности приблизительно 95% при температуре приблизительно 25°С. Еще более предпочтительно, когда кристаллическая форма соединения (I) поглощает от 0 до 1,5% воды при относительной влажности приблизительно 95% при температуре приблизительно 25°С. Наиболее предпоч- 6 045552 тительно, когда кристаллическая форма соединения (I) поглощает от 0% до 1% воды при относительной влажности приблизительно 95% при температуре приблизительно 25°С.Accordingly, the crystalline form of compound (I) preferably absorbs from 0 to 2% water at a relative humidity of about 95% at a temperature of about 25°C. Even more preferably, the crystalline form of compound (I) absorbs from 0 to 1.5% water at a relative humidity of about 95% at a temperature of about 25°C. Most preferably, the crystalline form of compound (I) absorbs from 0% to 1% water at a relative humidity of about 95% at a temperature of about 25°C.
Кроме того, кристаллическая форма по изобретению предпочтительно является стабильной. Например, продолжительная инкубация в этилацетате (в течение 1 недели) при температуре приблизительно 25°С привела к получению кристаллических форм соединения (I) хорошего качества, как показано на фиг. 5.Moreover, the crystalline form of the invention is preferably stable. For example, prolonged incubation in ethyl acetate (1 week) at approximately 25°C resulted in good quality crystalline forms of compound (I) as shown in FIG. 5.
В одном аспекте, касающемся формы 2, настоящее изобретение относится к дополнительной кристаллической форме соединения (I). Эта кристаллическая форма (форма 2) характеризуется отражением, выраженным как значение 2θ, при 16,9±0,2° на порошковой рентгеновской дифрактограмме, где отражение при 16,9±0,2° является одним из четырех самых сильных отражений на порошковой рентгеновской дифрактограмме. Предпочтительно, когда отражение при 16,9±0,2° является одним из трех самых сильных отражений на порошковой рентгеновской дифрактограмме, или отражение при 16,9±0,2° является одним из двух самых сильных отражений на порошковой рентгеновской дифрактограмме. Более предпочтительно, когда отражение при 16,9±0,2° является самым сильным отражением на порошковой рентгеновской дифрактограмме. Еще более предпочтительно, когда кристаллическая форма в аспекте, касающемся формы 2, характеризуется отражением, выраженным как значение 2θ, при 16,9 ± 0,1° на порошковой рентгеновской дифрактограмме, где отражение при 16,9±0,1° является одним из четырех самых сильных отражений на порошковой рентгеновской дифрактограмме. Предпочтительно, когда отражение при 16,9±0,1° является одним из трех самых сильных отражений на порошковой рентгеновской дифрактограмме, или отражение при 16,9±0,1° является одним из двух самых сильных отражений на порошковой рентгеновской дифрактограмме. Более предпочтительно, когда отражение при 16,9±0,1° является самым сильным отражением на порошковой рентгеновской дифрактограмме.In one aspect regarding Form 2, the present invention provides an additional crystalline form of compound (I). This crystalline form (Form 2) is characterized by a reflection, expressed as a 2θ value, at 16.9±0.2° in the powder X-ray diffraction pattern, where the reflection at 16.9±0.2° is one of the four strongest reflections in the powder X-ray diffraction pattern diffraction pattern. Preferably, the reflection at 16.9±0.2° is one of the three strongest reflections in the powder X-ray diffraction pattern, or the reflection at 16.9±0.2° is one of the two strongest reflections in the powder X-ray diffraction pattern. More preferably, the reflection at 16.9±0.2° is the strongest reflection in the X-ray powder diffraction pattern. Even more preferably, the crystalline form in the form 2 aspect is characterized by a reflection, expressed as a 2θ value, at 16.9 ± 0.1° in a powder X-ray diffraction pattern, where the reflection at 16.9 ± 0.1° is one of the four strongest reflections in the X-ray powder diffraction pattern. Preferably, the reflection at 16.9±0.1° is one of the three strongest reflections in the powder X-ray diffraction pattern, or the reflection at 16.9±0.1° is one of the two strongest reflections in the powder X-ray diffraction pattern. More preferably, the reflection at 16.9±0.1° is the strongest reflection in the X-ray powder diffraction pattern.
Предпочтительно, когда кристаллическая форма соединения (I) в аспекте настоящего изобретения, касающемся формы 2, характеризуется одним или несколькими отражениями, выраженными как значение 2θ, при одном или более углов из 15,2±0,2°, 16,1±0,2°, 16,5±0,2°, 18,9±0,2°, 23,1 ± 0,2°, 25,5±0,2°, 27,7±0,2° и 28,5±0,2° на порошковой рентгеновской дифрактограмме. Еще более предпочтительно, когда в аспекте настоящего изобретения, касающемся формы 2, кристаллическая форма соединения (I) характеризуется одним или несколькими отражениями, выраженными как значение 2θ, при одном или более углов из 15,2±0,1°, 16,1±0,1°, 16,5±0,1°, 18,9±0,1°, 23,1±0,1°, 25,5±0,1°, 27,7±0,1° и 28,5±0,1°.Preferably, the crystalline form of compound (I) in the Form 2 aspect of the present invention is characterized by one or more reflections, expressed as a 2θ value, at one or more angles of 15.2±0.2°, 16.1±0, 2°, 16.5±0.2°, 18.9±0.2°, 23.1±0.2°, 25.5±0.2°, 27.7±0.2° and 28, 5±0.2° on the powder X-ray diffraction pattern. Even more preferably, in the Form 2 aspect of the present invention, the crystalline form of compound (I) is characterized by one or more reflections, expressed as a 2θ value, at one or more angles of 15.2±0.1°, 16.1± 0.1°, 16.5±0.1°, 18.9±0.1°, 23.1±0.1°, 25.5±0.1°, 27.7±0.1° and 28.5±0.1°.
В аспекте настоящего изобретения, касающемся формы 2, эта кристаллическая форма соединения (I) также может характеризоваться отражениями, выраженными как значение 2θ, при 16,1±0,2°, 16,5±0,2°, 16,9±0,2°, 18,9±0,2° и 23,1±0,2° на порошковой рентгеновской дифрактограмме. Предпочтительно когда в аспекте настоящего изобретения, касающемся формы 2, кристаллическая форма соединения (I) также может характеризоваться отражениями, выраженными как значение 2θ, при 16,1±0,1°, 16,5±0,1°, 16,9±0,1°, 18,9±0,1° и 23,1±0,1° на порошковой рентгеновской дифрактограмме.In the Form 2 aspect of the present invention, this crystalline form of compound (I) can also be characterized by reflections, expressed as a 2θ value, at 16.1±0.2°, 16.5±0.2°, 16.9±0 ,2°, 18.9±0.2° and 23.1±0.2° in the powder X-ray diffraction pattern. Preferably, in the Form 2 aspect of the present invention, the crystalline form of compound (I) may also be characterized by reflections, expressed as a 2θ value, at 16.1±0.1°, 16.5±0.1°, 16.9± 0.1°, 18.9±0.1° and 23.1±0.1° in the X-ray powder diffraction pattern.
В аспекте настоящего изобретения, касающемся формы 2, кристаллическая форма соединения (I) может быть охарактеризована с помощью термограммы ДСК, которая показывает начало эндотермического теплового потока приблизительно при 58°С и температуру плавления приблизительно 70°С, как показано на фиг. 3В. Соответственно, в аспекте настоящего изобретения, касающемся формы 2, кристаллическая форма соединения (I) имеет температуру плавления от 67 до 74°С. Предпочтительно, когда в аспекте настоящего изобретения, касающемся формы 2, кристаллическая форма соединения (I) имеет температуру плавления от 68 до 73°С. Еще более предпочтительно, когда в аспекте настоящего изобретения, касающемся формы 2, кристаллическая форма соединения (I) имеет температуру плавления от 69 до 72°С. Наиболее предпочтительно, когда в аспекте настоящего изобретения, касающемся формы 2, кристаллическая форма соединения (I) имеет температуру плавления от 69 до 71 °С.In the Form 2 aspect of the present invention, the crystalline form of compound (I) can be characterized by a DSC thermogram which shows the onset of endothermic heat flow at approximately 58° C. and a melting point at approximately 70° C., as shown in FIG. 3B. Accordingly, in the Form 2 aspect of the present invention, the crystalline form of compound (I) has a melting point of 67 to 74°C. Preferably, in the Form 2 aspect of the present invention, the crystalline form of compound (I) has a melting point of 68 to 73°C. Even more preferably, in the Form 2 aspect of the present invention, the crystalline form of compound (I) has a melting point of 69 to 72°C. Most preferably, in the Form 2 aspect of the present invention, the crystalline form of compound (I) has a melting point of 69 to 71°C.
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что в аспекте, касающемся формы 2, кристаллическая форма соединения (I) особенно растворима в воде. Соответственно, в аспекте настоящего изобретения, касающемся формы 2, предпочтительно, когда кристаллическая форма соединения (I) имеет растворимость в воде от приблизительно 75 мг/мл до приблизительно 85 мг/мл, измеренную приблизительно при 25°С. Более предпочтительно, когда в аспекте настоящего изобретения, касающемся формы 2, кристаллическая форма имеет растворимость в воде от приблизительно 78 мг/мл до приблизительно 82 мг/мл, измеренную при температуре приблизительно 25°С. Наиболее предпочтительно, когда в аспекте настоящего изобретения, касающемся формы 2, кристаллическая форма соединения (I) имеет растворимость в воде приблизительно 80 мг/мл, измеренную приблизительно при 25°С.The inventors of the present invention have unexpectedly discovered that, in the form 2 aspect, the crystalline form of compound (I) is particularly soluble in water. Accordingly, in the Form 2 aspect of the present invention, it is preferred that the crystalline form of compound (I) has a water solubility of from about 75 mg/ml to about 85 mg/ml, measured at about 25°C. More preferably, in the Form 2 aspect of the present invention, the crystalline form has a water solubility of from about 78 mg/ml to about 82 mg/ml, measured at a temperature of about 25°C. Most preferably, in the Form 2 aspect of the present invention, the crystalline form of compound (I) has a water solubility of approximately 80 mg/ml, measured at approximately 25°C.
Способы измерения растворимости известны в данной области техники; например, метод со встряхиванием колбы, метод с обработкой ультразвуком, метод элюирования с колонки и метод ультрафиолетовой или видимой спектроскопии. Если прямо не указано иное, то растворимость в воде определяют с помощью метода со встряхиванием колбы и/или методом с обработкой ультразвуком.Methods for measuring solubility are known in the art; for example, shake flask method, sonication method, column elution method, and ultraviolet-visible spectroscopy method. Unless otherwise expressly stated, solubility in water is determined using the shake flask method and/or the sonication method.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей кристаллическую форму соединения (I), описанной в настоящем документе.The present invention also relates to a pharmaceutical composition containing a crystalline form of compound (I) described herein.
- 7 045552- 7 045552
Обычно кристаллическую форму соединения (I) вводят пациенту в виде фармацевтической композиции или препарата. Такие фармацевтические композиции можно вводить пациенту любым приемлемым способом введения, включая, но без ограничения, пероральный, местный (включая трансдермальный) и парентеральный способы введения.Typically, the crystalline form of compound (I) is administered to a patient in the form of a pharmaceutical composition or drug. Such pharmaceutical compositions can be administered to a patient by any suitable route of administration, including, but not limited to, oral, topical (including transdermal), and parenteral routes of administration.
Фармацевтические композиции по изобретению обычно готовят с использованием фармацевтически приемлемого носителя и одного или нескольких необязательных ингредиентов. При необходимости или желании полученная однородно смешанная смесь может быть затем сформована или загружена в таблетки, капсулы, пилюли, емкости, картриджи, дозаторы и т.п. с использованием обычных процедур и оборудования.The pharmaceutical compositions of the invention are typically prepared using a pharmaceutically acceptable carrier and one or more optional ingredients. If necessary or desired, the resulting uniformly mixed mixture may then be formed or loaded into tablets, capsules, pills, containers, cartridges, dispensers, and the like. using normal procedures and equipment.
Фармацевтические композиции по изобретению, предназначенные для перорального введения в виде твердой лекарственной формы (т.е. в виде капсул, таблеток, пилюль и т.п.), обычно содержат кристаллическую форму соединения (I) в качестве активного ингредиента. Предпочтительно, когда фармацевтическая композиция по изобретению содержит кристаллическую форму соединения (I), и при этом она не содержит других активных ингредиентов. Предпочтительно, когда фармацевтическая композиция по изобретению содержится в капсуле. Предпочтительно, когда фармацевтическая композиция по изобретению содержится в капсуле без какого-либо другого активного ингредиента. Капсула может представлять собой желатиновую капсулу или капсулу из гидроксипропилметилцеллюлозы (ГПМЦ). Альтернативно, фармацевтическая композиция по изобретению может содержать кристаллическую форму соединения (I) в качестве активного ингредиента и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей. Подходящие фармацевтически приемлемые носители известны специалистам в данной области, и они представляют собой, например, жиры, воду, физиологический раствор, спирт (например, этанол), глицерин, полиолы, водный раствор глюкозы, разжижающий агент, дезинтегрирующий агент, связующее, смазывающее вещество, смачивающий агент, стабилизатор, эмульгатор, диспергатор, консервант, подсластитель, краситель, вкусовую добавку или ароматизатор, концентрирующий агент, разбавитель, буферное вещество, растворитель или солюбилизирующий агент, химическое соединение для эффективного хранения, соль для изменения осмотического давления, покрывающий агент или антиоксидант, сахариды, такие как лактоза или глюкоза; крахмал кукурузный, пшеничный или рисовый; жирные кислоты, такие как стеариновая кислота; неорганические соли, такие как алюминат метасиликата магния или безводный фосфат кальция; синтетические полимеры, такие как поливинилпирролидон или полиалкиленгликоль; спирты, такие как стеариловый спирт или бензиловый спирт; синтетические производные целлюлозы, такие как метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза или гидроксипропилметилцеллюлоза; а также другие обычно используемые добавки, такие как желатин, тальк, растительное масло и гуммиарабик.The pharmaceutical compositions of the invention intended for oral administration in solid dosage form (ie, capsules, tablets, pills, etc.) generally contain a crystalline form of compound (I) as the active ingredient. Preferably, the pharmaceutical composition of the invention contains a crystalline form of compound (I) and does not contain other active ingredients. Preferably, the pharmaceutical composition of the invention is contained in a capsule. Preferably, the pharmaceutical composition of the invention is contained in a capsule without any other active ingredient. The capsule may be a gelatin capsule or a hydroxypropyl methylcellulose (HPMC) capsule. Alternatively, the pharmaceutical composition of the invention may contain a crystalline form of compound (I) as an active ingredient and one or more pharmaceutically acceptable carriers. Suitable pharmaceutically acceptable carriers are known to those skilled in the art and include, for example, fats, water, saline, alcohol (e.g. ethanol), glycerin, polyols, aqueous glucose, thinning agent, disintegrating agent, binder, lubricant, wetting agent, stabilizer, emulsifier, dispersant, preservative, sweetener, coloring agent, flavoring agent, concentrating agent, diluent, buffering agent, solvent or solubilizing agent, chemical compound for effective storage, salt for altering osmotic pressure, coating agent or antioxidant, saccharides such as lactose or glucose; corn, wheat or rice starch; fatty acids such as stearic acid; inorganic salts such as magnesium metasilicate aluminate or anhydrous calcium phosphate; synthetic polymers such as polyvinylpyrrolidone or polyalkylene glycol; alcohols such as stearyl alcohol or benzyl alcohol; synthetic cellulose derivatives such as methylcellulose, carboxymethylcellulose, ethylcellulose or hydroxypropylmethylcellulose; as well as other commonly used additives such as gelatin, talc, vegetable oil and gum arabic.
Фармацевтическую композицию, содержащую кристаллические формы соединения (I), также можно вводить трансдермально или трансмукозально с использованием известных систем доставки и эксципиентов. Например, фармацевтическая композиция может быть смешана с усилителями проницаемости, такими как пропиленгликоль, монолаурат полиэтиленгликоля, азациклоалкан-2-он и т.п., и она может быть включена в пластырь или подобную систему доставки. Также могут быть использованы дополнительные эксципиенты, включая гелеобразующие агенты, эмульгаторы и буферы.The pharmaceutical composition containing crystalline forms of compound (I) can also be administered transdermally or transmucosally using known delivery systems and excipients. For example, the pharmaceutical composition can be mixed with penetration enhancers such as propylene glycol, polyethylene glycol monolaurate, azacycloalkan-2-one, and the like, and it can be included in a patch or similar delivery system. Additional excipients may also be used, including gelling agents, emulsifiers and buffers.
Препараты для инъекций, предназначенные для парентерального введения, включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Водные растворители включают, например, дистиллированную воду для инъекций и/или физиологический раствор. Примеры неводных растворителей включают спирты, такие как этанол.Injectable preparations intended for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions and emulsions. Aqueous solvents include, for example, distilled water for injection and/or saline. Examples of non-aqueous solvents include alcohols such as ethanol.
Предпочтительно, когда фармацевтическая композиция содержит один или несколько дополнительных фармацевтически активных агентов. Такая комбинированная терапия предусматривает использование кристаллической формы соединения (I) в сочетании с одним или несколькими дополнительными фармацевтически активными агентами, либо представленными вместе (например, приготовленными вместе в составе одного препарата), либо представленными отдельно (например, упакованными в виде отдельных единичных дозированных лекарственных форм).Preferably, the pharmaceutical composition contains one or more additional pharmaceutically active agents. Such combination therapy involves the use of a crystalline form of compound (I) in combination with one or more additional pharmaceutically active agents, either presented together (for example, formulated together in a single preparation) or presented separately (for example, packaged in separate unit dosage forms ).
У здорового человека основной гликосфинголипид, такой как глюкозилцерамид, гидролизуется в лизосомах кислой глюкозилцерамидазой (также называемой глюкоцереброзидазой или GBA1, ЕС 3.2.1.45, код UniProt: P04062). Кроме того, нелизосомальная глюкозилцерамидаза (GBA2, код UniProt: Q9HCG7), находящаяся в цитоплазме, также способна процессировать глюкозилцерамид. В результате, как GBA1, так и GBA2, участвуют в нейропатологических эффектах, наблюдаемых при некоторых лизосомных болезнях накопления.In healthy humans, a basic glycosphingolipid such as glucosylceramide is hydrolyzed in lysosomes by acid glucosylceramidase (also called glucocerebrosidase or GBA1, EC 3.2.1.45, UniProt code: P04062). In addition, non-lysosomal glucosylceramidase (GBA2, UniProt code: Q9HCG7), located in the cytoplasm, is also capable of processing glucosylceramide. As a result, both GBA1 and GBA2 are involved in the neuropathological effects observed in several lysosomal storage diseases.
У пациентов с лизосомной болезнью накопления возникают дефекты биосинтеза или деградации гликосфинголипидов, что приводит к аномальным уровням глюкозилцерамида и/или других гликосфинголипидов.Patients with lysosomal storage disease have defects in the biosynthesis or degradation of glycosphingolipids, resulting in abnormal levels of glucosylceramide and/or other glycosphingolipids.
Ранее в публикации WO 2015/147639 А1 было показано, что соединение (I) эффективно при лечении заболеваний, связанных с аномальными уровнями цитозольного или лизосомального глюкозилцерамида и/или с повышенными уровнями гликосфинголипидов. Поскольку биодоступность кристаллических форм соединения (I) сравнима с биодоступностью аморфного соединения (I), то кристаллическиеPreviously, in publication WO 2015/147639 A1, compound (I) was shown to be effective in the treatment of diseases associated with abnormal levels of cytosolic or lysosomal glucosylceramide and/or elevated levels of glycosphingolipids. Since the bioavailability of crystalline forms of compound (I) is comparable to the bioavailability of amorphous compound (I), then crystalline forms
- 8 045552 формы соединения (I) также эффективны при лечении заболеваний, связанных с аномальными уровнями клеточного глюкозилцерамида и/или с повышенными уровнями гликосфинголипидов. В частности, кристаллические формы соединения (I) эффективны при лечении заболеваний, связанных с аномальными уровнями цитозольного или лизосомального глюкозилцерамида и/или с повышенными уровнями гликосфинголипидов.- 8 045552 forms of compound (I) are also effective in the treatment of diseases associated with abnormal levels of cellular glucosylceramide and/or elevated levels of glycosphingolipids. In particular, crystalline forms of compound (I) are effective in the treatment of diseases associated with abnormal levels of cytosolic or lysosomal glucosylceramide and/or elevated levels of glycosphingolipids.
Как показано в Примере 4, кристаллическая форма соединения (I) (форма 3) эффективна при лечении заболеваний, связанных с аномальными уровнями цитозольного или лизосомального глюкозилцерамида и/или с повышенными уровнями гликосфинголипидов. В частности, показано, что форма 3 улучшает клинические признаки у мышей с болезнью Ниманна-Пика типа С.As shown in Example 4, the crystalline form of compound (I) (Form 3) is effective in the treatment of diseases associated with abnormal levels of cytosolic or lysosomal glucosylceramide and/or elevated levels of glycosphingolipids. In particular, Form 3 has been shown to improve clinical signs in mice with Niemann-Pick disease type C.
Соответственно, настоящее изобретение относится к кристаллической форме соединения (I), описанной в настоящем документе, или к фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе, для применения в терапии.Accordingly, the present invention relates to a crystalline form of compound (I) described herein or a pharmaceutical composition described herein for use in therapy.
Настоящее изобретение также относится к кристаллической форме, описанной в настоящем документе, или к фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе, для применения в качестве лекарственного средства.The present invention also provides a crystalline form as described herein or a pharmaceutical composition as described herein for use as a drug.
Предпочтительно, когда настоящее изобретение относится к кристаллической форме соединения (I), описанной в настоящем документе, или к фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе, для применения при лечении заболевания, связанного с аномальными уровнями глюкозилцерамида и/или с повышенными уровнями гликосфинголипидов. Предпочтительно, когда заболевание, сопровождающееся аномальными уровнями глюкозилцерамида и/или повышенными уровнями гликосфинголипидов, представляет собой лизосомную болезнь накопления, такую как болезнь Гоше (типа 1, 2 и 3), болезнь Фабри, ганглиозидозы GM1, ганглиозидозы GM2 (такие как болезнь Тея-Сакса, болезнь Сандхоффа и вариант АВ), сиалидоз, болезнь Ниманна-Пика типа С и синдром миоклонуса движенияпочечной недостаточности, или симптом одного из заболеваний, в совокупности классифицируемых как метаболический синдром, например ожирение, резистентность к инсулину, гиперлипидемия, гиперхолестеринемия, поликистозная болезнь почек, диабет типа II и хроническое воспаление, или нейродегенеративное заболевание, такое как болезнь Паркинсона или деменция с тельцами Леви, или атеросклероз. Еще более предпочтительно, когда кристаллическая форма соединения (I) или фармацевтическая композиция, содержащая кристаллическую форму соединения (I), применяется для лечения ганглиозидозов GM1 и/или ганглиозидозов GM2 (таких как болезнь Тея-Сакса, болезнь Сандхоффа и вариант АВ).Preferably, the present invention relates to a crystalline form of compound (I) described herein, or a pharmaceutical composition described herein, for use in the treatment of a disease associated with abnormal levels of glucosylceramide and/or elevated levels of glycosphingolipids. Preferably, the disease accompanied by abnormal levels of glucosylceramide and/or elevated levels of glycosphingolipids is a lysosomal storage disease such as Gaucher disease (types 1, 2 and 3), Fabry disease, GM1 gangliosidoses, GM2 gangliosidoses (such as Tay-Sachs disease , Sandhoff disease and variant AB), sialidosis, Niemann-Pick disease type C and myoclonus movement syndrome, renal failure, or a symptom of one of the diseases collectively classified as metabolic syndrome, for example obesity, insulin resistance, hyperlipidemia, hypercholesterolemia, polycystic kidney disease, type II diabetes and chronic inflammation, or a neurodegenerative disease such as Parkinson's disease or dementia with Lewy bodies, or atherosclerosis. Even more preferably, a crystalline form of compound (I) or a pharmaceutical composition containing a crystalline form of compound (I) is used for the treatment of GM1 gangliosidoses and/or GM2 gangliosidoses (such as Tay-Sachs disease, Sandhoff disease and variant AB).
Еще более предпочтительно, когда настоящее изобретение относится к кристаллической форме соединения (I), описанного в настоящем документе, или к фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе, для применения при лечении болезни Ниманна-Пика типа С.Even more preferably, the present invention relates to a crystalline form of compound (I) described herein or a pharmaceutical composition described herein for use in the treatment of Niemann-Pick disease type C.
Настоящее изобретение относится к кристаллической форме соединения (I), описанной в настоящем документе, или к фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе, для применения при лечении болезни Сандхоффа.The present invention relates to a crystalline form of compound (I) described herein or a pharmaceutical composition described herein for use in the treatment of Sandhoff's disease.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения заболевания, связанного с аномальными уровнями глюкозилцерамида и/или с повышенными уровнями гликосфинголипидов у людей или животных, где способ предусматривает введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества кристаллической формы соединения (I), описанной в настоящем документе, или фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе.The present invention also provides a method for treating a disease associated with abnormal levels of glucosylceramide and/or elevated levels of glycosphingolipids in humans or animals, wherein the method comprises administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of a crystalline form of compound (I) described herein , or a pharmaceutical composition described herein.
Настоящее изобретение относится к кристаллической форме соединения (I), описанной в настоящем документе, или к фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе, для применения для облегчения симптомов заболевания, связанного с аномальными уровнями глюкозилцерамида и/или с повышенными уровнями гликосфинголипидов.The present invention relates to a crystalline form of compound (I) described herein, or to a pharmaceutical composition described herein, for use in alleviating the symptoms of a disease associated with abnormal levels of glucosylceramide and/or elevated levels of glycosphingolipids.
Настоящее изобретение еще более предпочтительно относится к кристаллической форме соединения (I), описанной в настоящем документе, или к фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе, для применения для облегчения симптомов болезни Ниманна-Пика типа С.The present invention even more preferably relates to a crystalline form of compound (I) described herein or a pharmaceutical composition described herein for use in alleviating the symptoms of Niemann-Pick disease type C.
Настоящее изобретение относится к кристаллической форме соединения (I), описанной в настоящем документе, или к фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе, для применения для облегчения симптомов болезни Сандхоффа.The present invention relates to a crystalline form of compound (I) described herein or a pharmaceutical composition described herein for use in alleviating the symptoms of Sandhoff's disease.
Настоящее изобретение также относится к способу облегчения симптомов заболевания, связанного с аномальными уровнями глюкозилцерамида и/или с повышенными уровнями гликосфинголипидов у пациентов-людей или животных, где способ предусматривает введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества кристаллической формы соединения (I), описанной в настоящем документе, или фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе.The present invention also provides a method for alleviating symptoms of a disease associated with abnormal levels of glucosylceramide and/or elevated levels of glycosphingolipids in human or animal patients, wherein the method comprises administering to the patient in need thereof a therapeutically effective amount of a crystalline form of compound (I) described herein, or a pharmaceutical composition described herein.
Кристаллическая форма соединения (I) (например, форма 3) может быть использована для улучшения различных клинических симптомов, например, таких как:The crystalline form of compound (I) (eg Form 3) can be used to improve various clinical symptoms, such as:
1) потеря массы тела, связанная с заболеванием;1) weight loss associated with the disease;
2) тремор; и/или2) tremor; and/or
3) атаксическая походка.3) ataxic gait.
Как показано в Примере 4, кристаллическая форма соединения (I) (например, форма 3) эффективноAs shown in Example 4, the crystalline form of compound (I) (eg, Form 3) effectively
- 9 045552 проникает в головной мозг. Таким образом, кристаллическая форма соединения (I) (например, форма 3) может быть использована для лечения или облегчения заболевания или симптомов заболевания, возникающих в головном мозге. Например, кристаллическая форма соединения (I) (например, форма 3) может быть использована для предотвращения или уменьшения потери клеток Пуркинье в мозжечке. Кристаллическая форма соединения (I) (например, форма 3) может быть использована для предотвращения или уменьшения гибели нейронов. Кристаллическая форма соединения (I) (например, форма 3) может быть использована для предотвращения или уменьшения церебральной атрофии.- 9 045552 penetrates the brain. Thus, the crystalline form of compound (I) (eg, Form 3) can be used to treat or alleviate a disease or symptoms of a disease occurring in the brain. For example, a crystalline form of compound (I) (eg, Form 3) can be used to prevent or reduce the loss of Purkinje cells in the cerebellum. The crystalline form of compound (I) (eg, form 3) can be used to prevent or reduce neuronal death. The crystalline form of compound (I) (eg, Form 3) can be used to prevent or reduce cerebral atrophy.
Считается, что высокая эффективность кристаллической формы соединения (I) при лечении заболеваний, связанных с аномальными уровнями глюкозилцерамида и/или с повышенными уровнями гликосфинголипидов, является результатом высокой активности кристаллической формы соединения (I) в отношении глюкозилцерамидсинтазы (GCS) и нелизосомальной глюкозилцереброзидазы (GBA2).The high efficacy of the crystalline form of compound (I) in the treatment of diseases associated with abnormal levels of glucosylceramide and/or elevated levels of glycosphingolipids is believed to be a result of the high activity of the crystalline form of compound (I) against glucosylceramide synthase (GCS) and non-lysosomal glucosylcerebrosidase (GBA2). .
Описанные здесь способы могут быть способами in vitro или in vivo.The methods described herein may be in vitro or in vivo methods.
Введение может быть осуществлено либо перорально, с использованием таблеток, пилюль, капсул, гранул, порошков, растворов и т.п., либо путем парентерального введения, такого как инъекции, включая внутрисуставные, внутривенные и внутримышечные инъекции, путем введения с использованием суппозиториев, офтальмологических растворов, глазных мазей или средств для наружного применения, таких как трансдермальные жидкие препараты, мази, трансдермальные пластыри, трансмукозальные жидкие препараты, трансмукозальные пластыри, ингаляторы и т.п.Administration may be either orally, using tablets, pills, capsules, granules, powders, solutions, etc., or by parenteral administration, such as injections, including intra-articular, intravenous and intramuscular injections, by administration using suppositories, ophthalmic solutions, ophthalmic ointments or topical preparations such as transdermal liquid preparations, ointments, transdermal patches, transmucosal liquid preparations, transmucosal patches, inhalers and the like.
При пероральном введении суточная доза обычно составляет приблизительно от 0,0001 до 10 мг/кг, предпочтительно от 0,001 до 1 мг/кг или от 0,005 до 5 мг/кг, и более предпочтительно - от 0,01 до 0,5 мг/кг массы тела, и суточную дозу можно вводить одной дозой или 2-4 отдельными дозами. Например, для человека массой 70 кг оптимальная суточная доза для перорального введения составляет приблизительно 0,01-30 мг/день. В случае внутривенного введения суточную дозу целесообразно вводить из расчета приблизительно от 0,00001 до 10 мг/кг массы тела один раз в день или два или более раз в день. Кроме того, трансмукозальное средство вводят в дозе приблизительно от 0,0001 до 10 мг/кг массы тела один раз в день или два или более раз в день. Дозу подбирают соответствующим образом в зависимости от конкретного случая, принимая во внимание симптомы, возраст, пол и т.п.When administered orally, the daily dose is typically about 0.0001 to 10 mg/kg, preferably 0.001 to 1 mg/kg or 0.005 to 5 mg/kg, and more preferably 0.01 to 0.5 mg/kg body weight, and the daily dose can be administered in one dose or in 2-4 separate doses. For example, for a 70 kg person, the optimal daily oral dose is approximately 0.01-30 mg/day. In the case of intravenous administration, the daily dose is suitably administered at a rate of approximately 0.00001 to 10 mg/kg body weight once a day or two or more times a day. In addition, the transmucosal agent is administered at a dose of about 0.0001 to 10 mg/kg body weight once daily or two or more times daily. The dose is selected according to the individual case, taking into account the symptoms, age, sex, etc.
Поскольку эффективность кристаллической формы соединения (I) при лечении заболевания, связанного с аномальными уровнями глюкозилцерамида и/или с повышенными уровнями гликосфинголипидов (например, такого как болезнь Нимана-Пика типа С), очень высока, а требуемая доза относительно низка, то кристаллическая форма соединения (I) вызывает меньше побочных эффектов, чем известные соединения, используемые для лечения таких заболеваний, в частности, например, миглитол (его доза составляет 1200 мг/кг/день).Since the effectiveness of the crystalline form of compound (I) in the treatment of a disease associated with abnormal levels of glucosylceramide and/or elevated levels of glycosphingolipids (for example, such as Niemann-Pick disease type C) is very high and the required dose is relatively low, the crystalline form of the compound (I) causes fewer side effects than known compounds used to treat such diseases, in particular, for example, miglitol (its dose is 1200 mg/kg/day).
Настоящее изобретение также относится к способу получения кристаллической формы, описанной в настоящем документе, где способ предусматривает приведение в контакт образца соединения (I) с растворителем. Растворитель предпочтительно выбирают из ацетонитрила, этилацетата, изопропанола, анизола, воды и трет-бутилметилового эфира (ТВМЕ). Еще более предпочтительно, когда растворителем является этилацетат, ацетонитрил или изопропанол. Предпочтительно, когда перед контактированием образца соединения (I) с растворителем образец соединения (I) очищают для удаления эфиров борной кислоты. Предпочтительно, когда образец соединения (I) очищают с помощью хроматографии. Еще более предпочтительно, когда образец соединения (I) очищают с использованием хроматографической колонки с силикагелем. Дополнительно и/или альтернативно образец соединения (I) очищают перегонкой с метанолом.The present invention also relates to a method for preparing the crystalline form described herein, wherein the method involves contacting a sample of compound (I) with a solvent. The solvent is preferably selected from acetonitrile, ethyl acetate, isopropanol, anisole, water and tert-butyl methyl ether (TBME). Even more preferably, the solvent is ethyl acetate, acetonitrile or isopropanol. Preferably, before contacting the sample of compound (I) with a solvent, the sample of compound (I) is purified to remove boric acid esters. Preferably, a sample of compound (I) is purified by chromatography. Even more preferably, a sample of compound (I) is purified using a silica gel column chromatography. Additionally and/or alternatively, a sample of compound (I) is purified by distillation with methanol.
Кристаллическую форму формы 3 соединения (I) можно получить любым из следующих иллюстративных способов:The Form 3 crystalline form of compound (I) can be obtained by any of the following exemplary methods:
1) перемешиванием смеси приблизительно 74 мг соединения (I) и 2,0 мл ацетонитрила в течение трех дней при температуре от 20 до 30°С, например, при приблизительно 25°С, с последующим фильтрованием, с получением кристаллической формы соединения (I);1) stirring a mixture of about 74 mg of compound (I) and 2.0 ml of acetonitrile for three days at a temperature of 20 to 30°C, for example at about 25°C, followed by filtration, to obtain a crystalline form of compound (I) ;
2) перемешиванием смеси приблизительно 74 мг соединения (I) и 2,0 мл анизола в течение трех дней при температуре в диапазоне от 20 до 30°С, например, при приблизительно 25°С, с последующим фильтрованием, с получением кристаллической формы соединения (I);2) stirring a mixture of about 74 mg of compound (I) and 2.0 ml of anisole for three days at a temperature in the range of 20 to 30°C, for example at about 25°C, followed by filtration, to obtain a crystalline form of the compound ( I);
3) перемешиванием смеси приблизительно 82 мг соединения (I) и 1,0 мл этилацетата в течение трех дней при температуре от 20 до 30°С, например, при приблизительно 25°С, с последующим фильтрованием, с получением кристаллической формы соединения (I);3) stirring a mixture of about 82 mg of compound (I) and 1.0 ml of ethyl acetate for three days at a temperature of 20 to 30°C, for example at about 25°C, followed by filtration, to obtain a crystalline form of compound (I) ;
4) перемешиванием смеси приблизительно 82 мг соединения (I) и 1,0 мл изопропанола в течение трех дней при температуре от 20 до 30°С, например, при приблизительно 25°С, с последующим фильтрованием, с получением кристаллической формы соединения (I);4) stirring a mixture of about 82 mg of compound (I) and 1.0 ml of isopropanol for three days at a temperature of 20 to 30°C, for example at about 25°C, followed by filtration, to obtain a crystalline form of compound (I) ;
5) перемешиванием смеси приблизительно 45 мг соединения (I) и 1,0 мл воды в течение трех дней при температуре от 20 до 30°С, например, при приблизительно 25°С, с последующим фильтрованием, с получением кристаллической формы соединения (I);5) stirring a mixture of about 45 mg of compound (I) and 1.0 ml of water for three days at a temperature of 20 to 30°C, for example at about 25°C, followed by filtration, to obtain a crystalline form of compound (I) ;
6) перемешиванием смеси приблизительно 100 мг соединения (I) и 3,0 мл ТВМЕ в течение трех6) stirring a mixture of approximately 100 mg of compound (I) and 3.0 ml of TBME for three
- 10 045552 дней при температуре в диапазоне от 20 до 30°С, например, при приблизительно 25°С, с последующим фильтрованием, с получением кристаллической формы соединения (I).- 10 045552 days at a temperature in the range from 20 to 30°C, for example at approximately 25°C, followed by filtration, to obtain the crystalline form of compound (I).
Предпочтительно, когда перед смешиванием соединения (I) с растворителем образец соединения (I) очищают для удаления эфиров борной кислоты. Предпочтительно, когда образец соединения (I) очищают с помощью хроматографии. Еще более предпочтительно, когда образец соединения (I) очищают с использованием хроматографической колонки с силикагелем. Дополнительно и/или альтернативно образец соединения (I) очищают перегонкой с метанолом.Preferably, before mixing compound (I) with a solvent, a sample of compound (I) is purified to remove boric acid esters. Preferably, a sample of compound (I) is purified by chromatography. Even more preferably, a sample of compound (I) is purified using a silica gel column chromatography. Additionally and/or alternatively, a sample of compound (I) is purified by distillation with methanol.
Способы фильтрации известны специалистам в данной области техники, и они включают, но без ограничения, фильтрацию с использованием бумажного фильтра и фильтрацию с использованием фильтра из пористого стекла.Filtration methods are known to those skilled in the art and include, but are not limited to, paper filter filtration and cellular glass filter filtration.
Способы получения формы 3 соединения (I), описанные в настоящем документе, можно осуществлять в более крупном масштабе, поддерживая аналогичное соотношение используемых реагентов. Например, кристаллическую форму формы 3 соединения (I) можно получить путем перемешивания смеси соединения (I) с этилацетатом в соотношении 0,05-1 г на 1 мл [соединение (I):этилацетат] в течение трех дней при температуре от 20 до 30°С, например, при приблизительно 25°С, с последующим фильтрованием, с получением кристаллической формы соединения (I).The methods for preparing Form 3 of compound (I) described herein can be carried out on a larger scale by maintaining similar ratios of reagents used. For example, the crystalline form of Form 3 of compound (I) can be obtained by stirring a mixture of compound (I) with ethyl acetate in a ratio of 0.05 to 1 g per 1 ml [compound (I): ethyl acetate] for three days at a temperature of 20 to 30 °C, for example at about 25 °C, followed by filtration to obtain the crystalline form of compound (I).
Описанные здесь способы получения формы 3 соединения (I) очень эффективны. Выход способов, описанных в данном документе, обычно превышает 70% (выраженное как массовое отношение количества полученной формы 3 к первоначально использованному количеству соединения (I)). Предпочтительно, когда для описанных здесь способов выход превышает 75%.The methods described herein for preparing Form 3 of compound (I) are very effective. The yield of the methods described herein generally exceeds 70% (expressed as the mass ratio of the amount of Form 3 obtained to the amount of compound (I) originally used). Preferably, the yields are greater than 75% for the methods described herein.
Предпочтительно, когда кристаллическая форма 2 образуется в качестве промежуточного продукта перед образованием кристаллической формы 3.Preferably, crystalline form 2 is formed as an intermediate before the formation of crystalline form 3.
Предпочтительно, когда кристаллическая форма 2, характеризующаяся отражениями, выраженными как значение 2θ, при 16,1±0,2°, 16,5±0,2°, 16,9±0,2°, 18,9±0,2° и 23,1±0,2° на порошковой рентгеновской дифрактограмме, образуется в качестве промежуточного продукта перед образованием кристаллической формы 3, характеризующейся отражениями, выраженными как значение 2θ, при 17,2±0,2°, 17,8±0,2°, 21,2±0,2° и 22,4±0,2° на порошковой рентгеновской дифрактограмме.Preferably, crystalline form 2, characterized by reflections expressed as a 2θ value at 16.1±0.2°, 16.5±0.2°, 16.9±0.2°, 18.9±0.2 ° and 23.1±0.2° in the X-ray powder diffraction pattern, forms as an intermediate before the formation of crystalline form 3, characterized by reflections, expressed as a 2θ value, at 17.2±0.2°, 17.8±0, 2°, 21.2±0.2° and 22.4±0.2° in the X-ray powder diffraction pattern.
Настоящее изобретение также относится к кристаллической форме соединения (I), полученной путем осуществления описанного здесь способа.The present invention also relates to a crystalline form of compound (I) obtained by carrying out the method described herein.
Настоящее изобретение также относится к применению свободного основания соединения (I) для получения кристаллической формы соединения (I).The present invention also relates to the use of the free base of compound (I) to obtain a crystalline form of compound (I).
Настоящее изобретение также относится к способу получения кристаллической формы соединения (I), где способ предусматривает кристаллизацию свободного основания соединения (I).The present invention also relates to a method for obtaining a crystalline form of compound (I), wherein the method involves crystallizing the free base of compound (I).
Настоящее изобретение также относится к кристаллической форме соединения (I), полученной способом получения кристаллической формы соединения (I), где указанный способ предусматривает кристаллизацию свободного основания соединения (I).The present invention also relates to a crystalline form of the compound (I) obtained by a method for producing a crystalline form of the compound (I), wherein the method involves crystallizing the free base of the compound (I).
Считается, что помимо других преимуществ настоящего изобретения, образование кристаллической формы соединения (I) полезно для очистки соединения (I). Например, кристаллическая форма соединения (I), полученная описанными здесь способами, имеет чистоту более 90%, а обычно более 95%.It is believed that, in addition to other advantages of the present invention, the formation of a crystalline form of compound (I) is useful for the purification of compound (I). For example, the crystalline form of compound (I) obtained by the methods described herein has a purity of greater than 90%, and typically greater than 95%.
Предшествующее подробное описание было представлено с целью пояснения и иллюстрации настоящего изобретения, и оно не предназначено для ограничения объема притязаний, определяемого прилагаемой формулой изобретения. Многие варианты предпочтительных осуществлений настоящего изобретения, проиллюстрированных здесь, будут очевидны специалистам в данной области техники, и этим варианты находятся в пределах объема притязаний, определенных прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентов.The foregoing detailed description has been presented for the purpose of explaining and illustrating the present invention, and is not intended to limit the scope of the appended claims. Many of the preferred embodiments of the present invention illustrated herein will be apparent to those skilled in the art and are within the scope of the appended claims and their equivalents.
Настоящее изобретение может быть дополнительно охарактеризовано определениями, представленными в следующих пунктах.The present invention may be further characterized by the definitions presented in the following paragraphs.
1. Кристаллическая форма соединения (I),1. Crystalline form of compound (I),
2. Кристаллическая форма по пункту 1, где кристаллическая форма представляет собой кристаллическое свободное основание.2. The crystalline form according to claim 1, wherein the crystalline form is a crystalline free base.
3. Кристаллическая форма по пункту 1 или 2, где кристаллическая форма характеризуется отражением, выраженным как значение 2θ, при 17,8±0,2° на порошковой рентгеновской дифрактограмме, при этом отражение при 17,8±0,2° является одним из четырех самых сильных отражений на порошковой рентгеновской дифрактограмме.3. The crystalline form according to claim 1 or 2, wherein the crystalline form is characterized by a reflection, expressed as a 2θ value, at 17.8±0.2° in a powder X-ray diffraction pattern, wherein the reflection at 17.8±0.2° is one of the four strongest reflections in the X-ray powder diffraction pattern.
- 11 045552- 11 045552
4. Кристаллическая форма по пункту 3, дополнительно характеризующаяся одним или несколькими отражениями, выраженными как значение 2θ, при одном или более углах из 4,1±0,2°, 8,3±0,2°, 12,4±0,2°,4. The crystalline form of claim 3, further characterized by one or more reflections, expressed as a 2θ value, at one or more of angles of 4.1±0.2°, 8.3±0.2°, 12.4±0, 2°,
13,6±0,2°, 14,5±0,2°, 14,9±0,2°, 15,2±0,2°, 17,2±0,2°, 19,3±0,2°, 21,2±0,2°, 22,4±0,2°, 22,9±0,2° и 23,3±0,2° на порошковой рентгеновской дифрактограмме.13.6±0.2°, 14.5±0.2°, 14.9±0.2°, 15.2±0.2°, 17.2±0.2°, 19.3±0 ,2°, 21.2±0.2°, 22.4±0.2°, 22.9±0.2° and 23.3±0.2° in the X-ray powder diffraction pattern.
5. Кристаллическая форма по любому из пунктов 1-4, характеризующаяся отражениями, выраженными как значение 2θ, при углах 17,2±0,2°, 17,8±0,2°, 21,2±0,2° и 22,4±0,2° на порошковой рентгеновской дифрактограмме.5. The crystalline form according to any one of paragraphs 1 to 4, characterized by reflections, expressed as a 2θ value, at angles of 17.2±0.2°, 17.8±0.2°, 21.2±0.2° and 22 .4±0.2° on the powder X-ray diffraction pattern.
6. Кристаллическая форма по любому из пунктов 1-5, имеющая температуру плавления от 89°С до 96°С.6. Crystalline form according to any of points 1-5, having a melting point from 89°C to 96°C.
7. Кристаллическая форма по любому из пунктов 1-6, имеющая температуру плавления от 92°С до 93°С.7. Crystalline form according to any of paragraphs 1-6, having a melting point from 92°C to 93°C.
8. Кристаллическая форма по любому из пунктов 1-7, где кристаллическая форма является по существу негигроскопичной.8. The crystalline form according to any one of claims 1-7, wherein the crystalline form is substantially non-hygroscopic.
9. Кристаллическая форма по пункту 1 или пункту 2, где кристаллическая форма характеризуется отражением, выраженным как значение 2θ, при угле 16,9±0,2° на порошковой рентгеновской дифрактограмме, при этом отражение при 16,9±0,2° является одним из четырех самых сильных отражений на порошковой рентгеновской дифрактограмме.9. The crystalline form according to claim 1 or claim 2, wherein the crystalline form is characterized by a reflection, expressed as a 2θ value, at an angle of 16.9±0.2° in a powder X-ray diffraction pattern, wherein the reflection at 16.9±0.2° is one of the four strongest reflections in a powder X-ray diffraction pattern.
10. Кристаллическая форма по пункту 9, дополнительно характеризующаяся одним или несколькими отражениями, выраженными как значение 2θ, при одном или более углах из 15,2±0,2°, 16,1±0,2°, 16,5±0,2°, 18,9±0,2°, 23,1±0,2°, 25,5±0,2°, 27,7±0,2° и 28,5±0,2° на порошковой рентгеновской дифрактограмме.10. The crystalline form of claim 9, further characterized by one or more reflections, expressed as a 2θ value, at one or more of 15.2±0.2°, 16.1±0.2°, 16.5±0, 2°, 18.9±0.2°, 23.1±0.2°, 25.5±0.2°, 27.7±0.2° and 28.5±0.2° on X-ray powder diffraction pattern.
11. Кристаллическая форма по любому из пунктов 1, 2, 9 или 10, характеризующаяся отражениями, выраженными как значение 2θ, при углах 16,1±0,2°, 16,5±0,2°, 16,9±0,2°, 18,9±0,2° и 23,1±0,2° на порошковой рентгеновской дифрактограмме.11. The crystalline form according to any one of paragraphs 1, 2, 9 or 10, characterized by reflections, expressed as a 2θ value, at angles of 16.1±0.2°, 16.5±0.2°, 16.9±0, 2°, 18.9±0.2° and 23.1±0.2° in the X-ray powder diffraction pattern.
12. Кристаллическая форма по любому из пунктов 9-11, имеющая температуру плавления от 67 до 74°С.12. Crystalline form according to any of paragraphs 9-11, having a melting point from 67 to 74°C.
13. Кристаллическая форма по любому из пунктов 9-12, имеющая температуру плавления от 69 до 71°С.13. Crystalline form according to any of paragraphs 9-12, having a melting point from 69 to 71°C.
14. Кристаллическая форма по любому из пунктов 9-13, имеющая растворимость в воде от 75 мг/мл до 85 мг/ мл.14. Crystalline form according to any of paragraphs 9-13, having a solubility in water from 75 mg/ml to 85 mg/ml.
15. Фармацевтическая композиция, содержащая кристаллическую форму по любому из пунктов 114.15. A pharmaceutical composition containing a crystalline form according to any one of paragraphs 114.
16. Фармацевтическая композиция по пункту 15, где фармацевтическая композиция содержится в капсуле.16. The pharmaceutical composition according to claim 15, where the pharmaceutical composition is contained in a capsule.
17. Фармацевтическая композиция по пункту 16, где фармацевтическая композиция содержится в капсуле без какого-либо другого ингредиента.17. The pharmaceutical composition according to claim 16, wherein the pharmaceutical composition is contained in a capsule without any other ingredient.
18. Фармацевтическая композиция по пункту 15 или 16, содержащая по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.18. The pharmaceutical composition according to claim 15 or 16, containing at least one pharmaceutically acceptable carrier.
19. Кристаллическая форма по любому из пунктов 1-14 или фармацевтическая композиция по любому из пунктов 15-18 для применения в терапии.19. The crystalline form according to any of paragraphs 1-14 or the pharmaceutical composition according to any of paragraphs 15-18 for use in therapy.
20. Кристаллическая форма по любому из пунктов 1-14 или фармацевтическая композиция по любому из пунктов 15-18 для применения в качестве лекарственного средства.20. The crystalline form according to any of paragraphs 1-14 or the pharmaceutical composition according to any of paragraphs 15-18 for use as a medicinal product.
21. Кристаллическая форма по любому из пунктов 1-14 или фармацевтическая композиция по любому из пунктов 15-18 для применения при лечении заболевания, связанного с аномальными уровнями глюкозилцерамида и/или с повышенными уровнями гликосфинголипидов.21. The crystalline form of any one of claims 1 to 14 or the pharmaceutical composition of any of claims 15 to 18 for use in the treatment of a disease associated with abnormal levels of glucosylceramide and/or elevated levels of glycosphingolipids.
22. Кристаллическая форма или фармацевтическая композиция для применения по пункту 21, где заболевание, связанное с аномальными уровнями глюкозилцерамида и/или с повышенными уровнями гликосфинголипидов, представляет собой лизосомную болезнь накопления, такую как болезнь Гоше, болезнь Фабри, ганглиозидозы GM1, ганглиозидозы GM2 (такие как болезнь Тея-Сакса, болезнь Сандхоффа и вариант АВ), сиалидоз, болезнь Ниманна-Пика типа С и синдром миоклонуса движенияпочечной недостаточности, или симптом одного из заболеваний, которые в совокупности классифицируются как метаболический синдром, например, ожирение, резистентность к инсулину, гиперлипидемия, гиперхолестеринемия, поликистоз почек, диабет типа II и хроническое воспаление или нейродегенеративное заболевание, такое как болезнь Паркинсона или деменция с тельцами Леви, или атеросклероз.22. A crystalline form or pharmaceutical composition for use according to claim 21, wherein the disease associated with abnormal levels of glucosylceramide and/or elevated levels of glycosphingolipids is a lysosomal storage disease such as Gaucher disease, Fabry disease, GM1 gangliosidoses, GM2 gangliosidoses (such such as Tay-Sachs disease, Sandhoff disease, and variant AB), sialidosis, Niemann-Pick disease type C, and myoclonus movement syndrome, renal failure, or a symptom of one of the diseases collectively classified as metabolic syndrome, such as obesity, insulin resistance, hyperlipidemia , hypercholesterolemia, polycystic kidney disease, type II diabetes, and chronic inflammation or neurodegenerative disease such as Parkinson's disease or dementia with Lewy bodies, or atherosclerosis.
23. Кристаллическая форма или фармацевтическая композиция для применения по пункту 21 или 22, где заболевание представляет собой ганглиозидозы GM1 или ганглиозидозы GM2 (такие как болезнь Тея-Сакса, болезнь Сандхоффа или вариант АВ).23. A crystalline form or pharmaceutical composition for use according to claim 21 or 22, wherein the disease is a GM1 gangliosidosis or a GM2 gangliosidosis (such as Tay-Sachs disease, Sandhoff disease or variant AB).
24. Способ лечения заболевания, связанного с аномальными уровнями глюкозилцерамида и/или с повышенными уровнями гликосфинголипидов у пациентов-людей или у животных, где способ предусматривает введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества кристаллической формы по любому из пунктов 1-14, или фармацевтическая композиция по любому из пунк-24. A method of treating a disease associated with abnormal levels of glucosylceramide and/or elevated levels of glycosphingolipids in human or animal patients, wherein the method comprises administering to the patient in need thereof a therapeutically effective amount of a crystalline form of any one of claims 1 to 14, or pharmaceutical composition according to any one of paragraphs-
- 12 045552 тов 15-18.- 12 045552 tov 15-18.
25. Способ получения кристаллической формы по любому из пунктов 1-8, где способ предусматривает приведение в контакт образца соединения (I) с растворителем.25. A method for obtaining a crystalline form according to any one of claims 1 to 8, wherein the method involves contacting a sample of compound (I) with a solvent.
26. Способ по пункту 25, в котором растворитель выбирают из ацетонитрила, этилацетата, изопропанола, анизола, воды и трет-бутилметилового эфира (TBME).26. The method of claim 25, wherein the solvent is selected from acetonitrile, ethyl acetate, isopropanol, anisole, water and tert-butyl methyl ether (TBME).
27. Способ по пункту 25 или 26, в котором образец соединения (I) очищают перед приведением в контакт образца соединения (I) с растворителем.27. The method of claim 25 or 26, wherein the sample of compound (I) is purified before contacting the sample of compound (I) with a solvent.
28. Способ по пункту 27, в котором образец соединения (I) очищают с помощью хроматографии.28. The method according to claim 27, wherein a sample of compound (I) is purified by chromatography.
29. Способ по пункту 28, в котором образец соединения (I) очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле.29. The method according to claim 28, wherein a sample of compound (I) is purified using silica gel column chromatography.
30. Способ по любому из пунктов 27-29, в котором образец соединения (I) после очистки не содержит боратных эфиров.30. The method according to any one of paragraphs 27-29, in which the sample of compound (I) after purification does not contain borate esters.
31. Способ по любому из пунктов 25-30, в котором кристаллическая форма по любому из пунктов 9-14 образуется в качестве промежуточного продукта перед образованием кристаллической формы по любому из пунктов 1-8.31. The method of any one of claims 25-30, wherein the crystalline form of any of claims 9-14 is formed as an intermediate before the crystalline form of any of claims 1-8 is formed.
32. Кристаллическая форма соединения (I), полученная в результате осуществления способа по любому из пунктов 25-31.32. Crystalline form of compound (I) obtained by implementing the method according to any of paragraphs 25-31.
33. Применение свободного основания соединения (I) для получения кристаллической формы.33. Use of the free base of compound (I) to obtain crystalline form.
34. Способ получения кристаллической формы соединения (I), где способ предусматривает кристаллизацию свободного основания соединения (I).34. A method for obtaining a crystalline form of a compound (I), wherein the method involves crystallizing the free base of the compound (I).
35. Кристаллическая форма соединения (I), полученная способом по пункту 34.35. Crystalline form of compound (I), obtained by the method according to paragraph 34.
36. Способ получения кристаллической формы соединения (I), где способ предусматривает выполнение следующих стадий:36. A method for obtaining a crystalline form of compound (I), where the method involves performing the following steps:
i) добавление соединения (I) в колонку для очистки, с получением очищенного образца соединения (I);i) adding compound (I) to a purification column to obtain a purified sample of compound (I);
ii) добавление растворителя к очищенному образцу соединения (I), с получением суспензии соединения (I) в растворителе;ii) adding a solvent to the purified sample of compound (I) to obtain a suspension of compound (I) in the solvent;
iii) перемешивание суспензии соединения (I) в растворителе, с получением кристаллической формы соединения (I); и iv) отделение кристаллической формы соединения (I), с получением чистого образца кристаллической формы соединения (I).iii) stirring a suspension of compound (I) in a solvent to obtain a crystalline form of compound (I); and iv) separating the crystalline form of compound (I), to obtain a pure sample of the crystalline form of compound (I).
37. Способ по пункту 36, в котором очищенный образец соединения (I) не содержит боратных эфиров.37. The method according to paragraph 36, in which the purified sample of compound (I) does not contain borate esters.
38. Способ по пункту 36 или 37, в котором растворитель выбирают из ацетонитрила, этилацетата, изопропанола, анизола, воды и трет-бутилметилового эфира (ТВМЕ).38. The method of claim 36 or 37, wherein the solvent is selected from acetonitrile, ethyl acetate, isopropanol, anisole, water and tert-butyl methyl ether (TBME).
39. Способ по любому из пунктов 36-38, в котором стадию ii проводят при температуре 25-35°С.39. The method according to any of paragraphs 36-38, in which stage ii is carried out at a temperature of 25-35°C.
40. Способ по любому из пунктов 36-39, в котором перемешивание на стадии (iii) проводят при температуре 20-35°С.40. The method according to any one of paragraphs 36-39, in which the mixing in step (iii) is carried out at a temperature of 20-35°C.
41. Способ по любому из пунктов 36-40, в котором перемешивание на стадии (iii) проводят в течение по меньшей мере 1 ч.41. The method according to any one of paragraphs 36-40, in which the mixing in step (iii) is carried out for at least 1 hour.
42. Способ по пункту 41, в котором перемешивание на стадии (iii) проводят в течение по меньшей мере 16 ч.42. The method according to paragraph 41, in which the mixing in step (iii) is carried out for at least 16 hours.
Экспериментальный разделExperimental section
Анализы методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) выполняли на приборе ТА Instruments Q2000 (использовали закрытую алюминиевую кювету или алюминиевую кювету с точечным отверстием в крышке, скорость нагрева 20 град/мин). Под температурой плавления принимали максимум пика.Differential scanning calorimetry (DSC) analyzes were performed on a TA Instruments Q2000 instrument (a closed aluminum cuvette or an aluminum cuvette with a pinhole in the lid was used, heating rate 20 deg/min). The maximum of the peak was taken as the melting temperature.
Анализы методом динамической сорбцией паров (ДСП) выполняли на приборе SPS11-100n Sorptions Prufsystem от ProUmid (ранее Projekt Messtechnik), August-Nagel-Str. 23, 89079, Ульм (Германия). В алюминиевую кювету для образцов помещали от 5 до 20 мг образца. Использовали скорость изменения влажности 5% в час. Программа измерений может быть описана следующим образом:Dynamic vapor sorption (DVA) analyzes were performed on an SPS11-100n Sorptions Prufsystem from ProUmid (formerly Projekt Messtechnik), August-Nagel-Str. 23, 89079 Ulm (Germany). From 5 to 20 mg of sample was placed into an aluminum sample cuvette. A humidity change rate of 5% per hour was used. The measurement program can be described as follows:
Образец помещали на алюминиевый или платиновый держатель сверху микровесов, и давали ему уравновеситься при относительной влажности (RH) 50% перед запуском предварительно заданных программ изменения влажности:The sample was placed on an aluminum or platinum holder on top of the microbalance, and allowed to equilibrate at 50% relative humidity (RH) before running preset humidity programs:
(1) 2 ч при относительной влажности 50%;(1) 2 hours at 50% relative humidity;
(2) 50 ^ 0% относительной влажности (5%/ч); 5 ч при 0% относительной влажности;(2) 50^0% relative humidity (5%/h); 5 hours at 0% relative humidity;
(3) 0 ^ 95% относительной влажности (5%/ч); 5 ч при относительной влажности 95%;(3) 0^95% relative humidity (5%/h); 5 hours at 95% relative humidity;
(4) 95 ^ 0% относительной влажности (5%/ч); 5 ч при 0% относительной влажности;(4) 95^0% relative humidity (5%/h); 5 hours at 0% relative humidity;
(5) 0 ^ 95% относительной влажности (5%/ч); 5 ч при относительной влажности 95%;(5) 0^95% relative humidity (5%/h); 5 hours at 95% relative humidity;
(6) 95 ^ 50% относительной влажности (5%/ч); 2 ч при относительной влажности 50%.(6) 95^50% relative humidity (5%/h); 2 hours at 50% relative humidity.
Анализы методом порошковой рентгеновской дифракции выполняли на дифрактометре Stoe Stadi PX-ray powder diffraction analyzes were performed on a Stoe Stadi P diffractometer
- 13 045552 с детектором MythenlK, работающим на излучении Cu-Ka1. Измерения на этом приборе проводили при напряжении на трубке 40 кВ и силе тока 40 мА. Измерения проводили с использованием изогнутого Ge монохроматора для излучения Cu-Ka1. На дифрактометре устанавливали режим со следующими параметрами: шаг 0,02° 2θ, время шага 12 с, диапазон сканирования 1,5-50,5° 2θ, и шаг детектора 1° 2Θ (режим детектирования при пошаговом сканировании). Для типичной пробоподготовки приблизительно 10 мг образца помещали между двумя ацетатными пленками, и образец устанавливали в держатель для образцов дифрактометра Stoe. Во время измерения образец вращался. Всю подготовку образцов и измерения проводили в атмосфере окружающего воздуха (приблизительно 25 °С).- 13 045552 with a MythenlK detector operating on Cu-Ka1 radiation. Measurements on this device were carried out at a tube voltage of 40 kV and a current of 40 mA. The measurements were carried out using a curved Ge monochromator for Cu-Ka 1 radiation. The diffractometer was set to a mode with the following parameters: step 0.02° 2θ, step time 12 s, scanning range 1.5-50.5° 2θ, and detector step 1° 2Θ (step-by-step scanning detection mode). For typical sample preparation, approximately 10 mg of sample was placed between two acetate films and the sample was mounted in the sample holder of a Stoe diffractometer. The sample was rotated during the measurement. All sample preparation and measurements were carried out in ambient air (approximately 25 °C).
Приблизительную растворимость определяли путем постепенного добавления растворителя приблизительно к 10 мг соединения, с последующим встряхиванием и/или обработкой ультразвуком в течение короткого периода времени. Если вещество не растворилось при добавлении в общей сложности не менее 10 мл растворителя, то растворимость указывали как <1 мг/мл. Эксперименты проводили при температуре приблизительно 25°С.Approximate solubility was determined by gradually adding solvent to approximately 10 mg of compound, followed by shaking and/or sonication for a short period of time. If a substance did not dissolve when a total of at least 10 mL of solvent was added, the solubility was reported as <1 mg/mL. Experiments were carried out at a temperature of approximately 25°C.
Термогравиметрические измерения, выполненные путем совместного анализа методами термогравиметрии и инфракрасной спектроскопии (TG-FTIR), проводили с помощью Netzsch ThermoMicrobalance TG 209, соединенного со спектрометром Bruker FTIR Spectrometer Vector 22 (использовали чашки для образцов с точечным отверстием, атмосфера N2, скорость нагрева 10°С/мин).Thermogravimetric measurements, performed by coupled thermogravimetry-infrared spectroscopy (TG-FTIR) analysis, were carried out using a Netzsch ThermoMicrobalance TG 209 coupled to a Bruker FTIR Spectrometer Vector 22 (using pinhole sample cups, N2 atmosphere, heating rate 10° S/min).
Примеры.Examples.
Следующие неограничивающие примеры дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение.The following non-limiting examples further illustrate the present invention.
Пример 1. Образование кристаллической солиExample 1 Formation of Crystalline Salt
Исследования по программе высокопроизводительного скрининга солей соединения (I) выполняли с использованием 16 различных солеобразователей, указанных в табл. 1, при попытке получения кристаллической формы соединения (I) в шести различных условиях.Studies under the program of high-throughput screening of salts of compound (I) were carried out using 16 different salt-forming agents listed in table. 1, while attempting to obtain the crystalline form of compound (I) under six different conditions.
Первоначальные эксперименты по скринингу проводили путем добавления 0,05 М раствора соединения (I) в ацетоне в каждую лунку кварцевого 96-микротитрационного планшета, с последующим добавлением маточных растворов солеобразователя в концентрации 0,1 М. Растворители выпаривали из каждой лунки под током азота при комнатной температуре. Твердые остатки в лунках исследовали с помощью микроскопии в поляризованном свете.Initial screening experiments were performed by adding a 0.05 M solution of compound (I) in acetone to each well of a 96-microtiter quartz plate, followed by the addition of 0.1 M salt-forming stock solutions. Solvents were evaporated from each well under a stream of nitrogen at room temperature. temperature. Solid residues in the wells were examined using polarized light microscopy.
Таблица 1Table 1
Кислоты, выбранные для исследования по программе скрининга солейAcids selected for study under the salt screening program
Хотя целью этих первоначальных экспериментов было получение соотношения 1: 1 соединения (I) к солеобразователю, исследования с помощью световой микроскопии выявили некоторые экспериментальные условия, подходящие для образования кристаллической формы. Например, при смешивании соединения (I) с бензолсульфоновой кислотой, соляной кислотой, DL-миндальной кислотой, L-винной кислотой, фосфорной кислотой и серной кислотой происходило образование кристаллических остатков.Although the goal of these initial experiments was to obtain a 1:1 ratio of compound (I) to salt former, light microscopy studies revealed some experimental conditions suitable for the formation of the crystalline form. For example, when compound (I) was mixed with benzenesulfonic acid, hydrochloric acid, DL-mandelic acid, L-tartaric acid, phosphoric acid and sulfuric acid, crystalline residues were formed.
В другом эксперименте по скринингу были выбраны шесть систем растворителей, а именно ацетон, ацетонитрил, этилацетат, этанол, смесь изопропанол/вода (3:1) и смесь ацетон/вода (9:1). К остатку в каждую лунку добавляли 200 мкл растворителя для уравновешивания суспензии. Подготовленный такимIn another screening experiment, six solvent systems were selected, namely acetone, acetonitrile, ethyl acetate, ethanol, isopropanol/water (3:1), and acetone/water (9:1). 200 μL of solvent was added to the residue in each well to equilibrate the suspension. Prepared like this
- 14 045552 образом микротитровальный планшет встряхивали при 400 об/мин в течение одного дня при комнатной температуре (приблизительно 25°С). Затем растворители упаривали в токе азота, и полученные твердые остатки исследовали с помощью микроскопии в поляризованном свете.- 14 045552 the microtiter plate was shaken at 400 rpm for one day at room temperature (approximately 25°C). The solvents were then evaporated under a stream of nitrogen, and the resulting solid residues were examined by polarized light microscopy.
На основании исследований с помощью световой микроскопии были обнаружены признаки возможного образования солей при использовании бензолсульфоновой кислоты, гентизиновой кислоты, соляной кислоты, L-молочной кислоты, D-миндальной кислоты, фосфорной кислоты, L-винной кислоты и толуолсульфоновой кислоты. Некоторые из наиболее многообещающих образцов были отобраны для последующих экспериментов в масштабе от 50 до 200 мг (эксперименты с увеличенным масштабом).Based on light microscopy studies, indications of possible salt formation were found when using benzenesulfonic acid, gentisic acid, hydrochloric acid, L-lactic acid, D-mandelic acid, phosphoric acid, L-tartaric acid and toluenesulfonic acid. Some of the most promising samples were selected for subsequent experiments in the 50 to 200 mg scale (upscale experiments).
Эксперименты с увеличенным масштабом для всех испытанных условий привели к образованию аморфных форм соединения (I) или жидкокристаллических солей соединения (I). Хотя микроскопическое исследование часто выявляло двойное лучепреломление, однако фильтрация полученных смесей была невозможна, и ни в одном из экспериментов не удалось выделить твердый материал.Scale-up experiments for all conditions tested resulted in the formation of amorphous forms of compound (I) or liquid crystalline salts of compound (I). Although microscopic examination often revealed birefringence, filtration of the resulting mixtures was impossible, and none of the experiments succeeded in isolating solid material.
Подводя итог, можно отметить, что во всех экспериментах с солеобразователями не удалось получить кристаллическую форму соединения (I).To summarize, it can be noted that in all experiments with salt formers it was not possible to obtain a crystalline form of compound (I).
Пример 2. Кристаллическая форма формы 2.Example 2: Crystalline form of Form 2.
Поскольку эксперименты, описанные в примере 1, не привели к получению полезного кристаллического материала, то была исследована кристаллическая форма свободного основания соединения (I).Since the experiments described in Example 1 did not result in useful crystalline material, the free base crystalline form of compound (I) was investigated.
Соединение (I) очищали с использованием колонки с силикагелем для удаления эфиров борной кислоты, с последующим кратковременным уравновешиванием с ацетонитрилом (в течение приблизительно 1-5 мин). Установлено, что растворимость очищенного соединения (I) в ацетонитриле составила от 5 до 8 мг/мл. Также была исследована растворимость очищенного соединения (I) в других растворителях, и результаты представлены в табл. 2. Эти значения определяли путем добавления небольших аликвот растворителя к ~10 мг твердого соединения (I) и последующего встряхивания или путем обработки ультразвуком в течение короткого периода времени при комнатной температуре (приблизительно при 25°С).Compound (I) was purified using a silica gel column to remove borate esters, followed by brief equilibration with acetonitrile (approximately 1-5 minutes). It was found that the solubility of purified compound (I) in acetonitrile ranged from 5 to 8 mg/ml. The solubility of purified compound (I) in other solvents was also studied, and the results are presented in table. 2. These values were determined by adding small aliquots of solvent to ~10 mg of solid compound (I) and then shaking or sonicating for a short period of time at room temperature (at approximately 25°C).
Таблица 2table 2
Приблизительные значения растворимости очищенного соединения (I)Approximate solubility values for purified compound (I)
Кристаллическую форму формы 2 соединения (I), полученную в результате короткого (приблизительно 1-5 мин) уравновешивания с ацетонитрилом, исследовали с помощью микроскопии в поляризованном свете, экспериментов с использованием методов порошковой рентгеновской дифракции (ПРД), TG-FTIR, дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) и динамической сорбции паров (ДСП).The crystalline form of form 2 of compound (I), obtained by short (approximately 1-5 min) equilibration with acetonitrile, was studied using polarized light microscopy, powder X-ray diffraction (XRD), TG-FTIR, differential scanning calorimetry experiments (DSC) and dynamic vapor sorption (DSP).
Результаты исследования микроскопии в поляризованном свете представлены на фиг. 1, а дифрактограмма, полученная с помощью ПРД, показана на фиг. 2. Эта кристаллическая форма 2 соединения (I) показала самые сильные отражения при значениях 2θ, равных 16,1 ±0,2°, 16,5±0,2°, 16,9±0,2°, 18,9±0,2° и 23,1±0,2°.The results of polarized light microscopy are presented in Fig. 1, and the X-ray diffraction pattern obtained using SRD is shown in FIG. 2. This crystal form 2 of compound (I) showed the strongest reflections at 2θ values of 16.1±0.2°, 16.5±0.2°, 16.9±0.2°, 18.9± 0.2° and 23.1±0.2°.
Результаты термоаналитической оценки характеристик кристаллической формы 2 соединения (I), полученной в результате короткого уравновешивания с ацетонитрилом (термограммы TG-FTIR), представлены на фиг. 3А, а результаты, полученные с помощью ДСК, показаны на фиг. 3В. Результаты показывают, что образец содержал приблизительно 0,5% воды, которая высвобождается при нагревании приблизительно до 120°С. При более высоких температурах наблюдали термическое разложение. Анализ с помощью ДСК выявил два значительных эндотермических события. За первым сильным эндотермом с пиковой температурой приблизительно 70°С и энтальпией приблизительно 54 Дж/г, следовал более слабый сигнал при 81 °С и энтальпией приблизительно 3 Дж/г.The results of thermoanalytical characterization of crystalline Form 2 of compound (I) obtained by short equilibration with acetonitrile (TG-FTIR thermograms) are presented in FIG. 3A, and the results obtained by DSC are shown in FIG. 3B. The results show that the sample contained approximately 0.5% water, which is released when heated to approximately 120°C. At higher temperatures, thermal decomposition was observed. DSC analysis revealed two significant endothermic events. The first strong endotherm with a peak temperature of approximately 70°C and an enthalpy of approximately 54 J/g was followed by a weaker signal at 81°C and an enthalpy of approximately 3 J/g.
Кроме того, было исследовано поведение кристаллического образца свободного основания при различных давлениях водяного пара. При высокой относительной влажности образец поглощал приблизительно 18% воды; однако большая часть абсорбированной воды высвобождалась, когда относительная влажность возвращалась к относительной влажности на уровне 50%. Результаты измерений, полученных с помощью метода ДСП, представлены на фиг. 4А и 4В.In addition, the behavior of a crystalline free base sample at various water vapor pressures was investigated. At high relative humidity, the sample absorbed approximately 18% water; however, most of the absorbed water was released when the relative humidity returned to 50% relative humidity. The measurement results obtained using the DSP method are presented in Fig. 4A and 4B.
Обобщенные показатели, характеризующие кристаллическую форму соединения (I), полученную в рамках примера 2, представлены в табл. 3.Generalized indicators characterizing the crystalline form of compound (I) obtained in Example 2 are presented in table. 3.
- 15 045552- 15 045552
Таблица 3Table 3
Обобщенные показатели, характеризующие кристаллическую форму 2 соединения (I)Generalized indicators characterizing crystalline form 2 of compound (I)
Полученная кристаллическая форма 2 соединения (I) имеет низкую стабильность, и она в дальнейшем переходит в кристаллическую форму 3 соединения (I) при воздействии повышенной температуры (более приблизительно 30°С) в течение приблизительно 1-5 мин. Альтернативно, форма 2 переходит в форму 3 при уравновешивании с растворителем (например, ацетоном) в течение времени более 5 мин при температуре приблизительно 25°С. Эта кристаллическая форма 3 свободного основания соединения (I) обладала лучшей стабильностью и уникальным набором физико-химических свойств.The resulting crystalline form 2 of compound (I) has low stability, and it further transforms into crystalline form 3 of compound (I) when exposed to elevated temperature (more than about 30° C.) for about 1-5 minutes. Alternatively, Form 2 converts to Form 3 when equilibrated with a solvent (eg, acetone) for more than 5 minutes at approximately 25°C. This crystalline form 3 of the free base of compound (I) had better stability and a unique set of physicochemical properties.
Пример 3. Форма 3.Example 3. Form 3.
Стабильную кристаллическую форму соединения (I) получали в результате независимых экспериментов по уравновешиванию суспензии очищенного соединения (I) с различными соответствующими растворителями, например, с ацетонитрилом, этилацетатом, изопропанолом, анизолом, водой или ТВМЕ, соответственно, при комнатной температуре (приблизительно при 25°С).The stable crystalline form of compound (I) was obtained from independent experiments by equilibrating a suspension of purified compound (I) with various appropriate solvents, for example, acetonitrile, ethyl acetate, isopropanol, anisole, water or TBME, respectively, at room temperature (at approximately 25° WITH).
В частности, кристаллическую форму формы 3 соединения (I) получали с помощью следующих экспериментальных методов:Specifically, the Form 3 crystalline form of compound (I) was obtained using the following experimental methods:
1) приблизительно 74 мг соединения (I) добавляли к 2,0 мл ацетонитрила, и суспензию перемешивали в течение трех дней при комнатной температуре (приблизительно 25°С), а затем ее отфильтровывали;1) approximately 74 mg of compound (I) was added to 2.0 ml of acetonitrile, and the suspension was stirred for three days at room temperature (approximately 25°C), and then it was filtered;
2) приблизительно 74 мг соединения (I) добавляли к 2,0 мл анизола, и суспензию перемешивали в течение трех дней при комнатной температуре (приблизительно 25°С), а затем ее отфильтровывали;2) approximately 74 mg of compound (I) was added to 2.0 ml of anisole, and the suspension was stirred for three days at room temperature (approximately 25°C), and then it was filtered;
3) приблизительно 82 мг соединение (I) добавляли к 1,0 мл этилацетата, и суспензию перемешивали в течение трех дней при комнатной температуре (приблизительно 25°С), а затем ее отфильтровывали;3) approximately 82 mg of compound (I) was added to 1.0 ml of ethyl acetate, and the suspension was stirred for three days at room temperature (about 25° C.), and then it was filtered;
4) приблизительно 82 мг соединения (I) добавляли к 1,0 мл изопропанола, и суспензию перемешивали в течение трех дней при комнатной температуре (приблизительно 25°С), а затем ее отфильтровывали;4) approximately 82 mg of compound (I) was added to 1.0 ml of isopropanol, and the suspension was stirred for three days at room temperature (approximately 25°C), and then it was filtered;
5) приблизительно 45 мг соединения (I) добавляли к 1,0 мл воды, и суспензию перемешивали в течение трех дней при комнатной температуре (приблизительно 25°С), а затем ее отфильтровывали;5) approximately 45 mg of compound (I) was added to 1.0 ml of water, and the suspension was stirred for three days at room temperature (approximately 25°C), and then it was filtered;
6) приблизительно 100 мг соединения (I) добавляли к 3,0 мл ТВМЕ, и суспензию перемешивали в течение трех дней при комнатной температуре (приблизительно 25°С), а затем ее отфильтровывали.6) Approximately 100 mg of compound (I) was added to 3.0 ml of TBME, and the suspension was stirred for three days at room temperature (approximately 25° C.) and then filtered.
Перед добавлением растворителя соединение (I) очищали для удаления эфиров борной кислоты с использованием колонки с силикагелем.Before adding the solvent, compound (I) was purified to remove boric acid esters using a silica gel column.
Полученную кристаллическую форму соединения (I) охарактеризовывали с помощью методов микроскопии в поляризованном свете, порошковой рентгеновской дифракции, TG-FTIR, ДСК и ДСП.The resulting crystalline form of compound (I) was characterized by polarized light microscopy, powder X-ray diffraction, TG-FTIR, DSC and DSP techniques.
Результаты исследования методом микроскопии в поляризованном свете для выбранных растворителей представлены на фиг. 5.The results of the study using polarized light microscopy for selected solvents are presented in Fig. 5.
Дифрактограмма, полученная методом ПРД для кристаллической формы 3 соединения (I), полученной в результате экспериментов по уравновешиванию суспензии с ацетонитрилом, показана на фиг. 6А. Наложение дирактограмм ПРД кристаллических форм 3 соединения (I), полученных в результате экспериментов по уравновешиванию суспензии с другими растворителями, показано на фиг. 6В. Эта кристаллическая форма соединения (I) показывает самые сильные отражения при значении 2Θ равных 17,2±0,2°, 17,8±0,2°, 21,2±0,2° и 22,4±0,2°. Эти результаты согласуются между собой, несмотря на то, что для получения кристаллической формы соединения (I) использовались разные растворители.The XRD pattern of crystalline form 3 of compound (I) obtained from suspension equilibration experiments with acetonitrile is shown in FIG. 6A. An overlay of PRD diractograms of crystalline forms 3 of compound (I) obtained from suspension equilibration experiments with other solvents is shown in FIG. 6B. This crystalline form of compound (I) shows the strongest reflections at 2Θ values of 17.2±0.2°, 17.8±0.2°, 21.2±0.2° and 22.4±0.2° . These results are consistent with each other, despite the fact that different solvents were used to obtain the crystalline form of compound (I).
Для сравнения, на фиг. 7 показано наложение дифрактограммы ПРД для кристаллической формы, полученной в Примере 2 (форма 2), и кристаллической формы, полученной в рамках настоящего Примера (форма 3). Две кристаллические формы имеют разные дирактограммы ПРД.For comparison, in FIG. 7 shows an overlay of the PXRD pattern for the crystal form obtained in Example 2 (Form 2) and the crystal form obtained in this Example (Form 3). The two crystal forms have different PDP diractograms.
Результаты типичных экспериментов по определению характеристик методом TG-FTIR для кристаллической формы 3 соединения (I), показаны на фиг. 8А (этилацетат) и фиг. 8В (изопропанол).The results of typical TG-FTIR characterization experiments for crystalline form 3 of compound (I) are shown in FIG. 8A (ethyl acetate) and FIG. 8B (isopropanol).
На фиг. 8А показано, что образец кристаллической формы 3 соединения (I), полученной уравновешиванием с этилацетатом, содержит приблизительно 0,7% этилацетата, несмотря на сушку в вакууме при 40°С в течение нескольких дней. Этилацетат высвобождается при температуре приблизительно от 100°С до 200°С. При более высоких температурах наблюдается термическое разложение.In fig. 8A shows that a sample of crystalline form 3 of compound (I) prepared by equilibration with ethyl acetate contains approximately 0.7% ethyl acetate despite drying in vacuo at 40° C. for several days. Ethyl acetate is released at temperatures between approximately 100°C and 200°C. At higher temperatures thermal decomposition occurs.
Образец формы 3, полученной в результате образования суспензии соединения (I) в изопропаноле (IPA) и сушки на воздухе при комнатной температуре, неожиданно показал, что начальное содержаниеA sample of Form 3, obtained by forming a suspension of compound (I) in isopropanol (IPA) and air drying at room temperature, unexpectedly showed that the initial content
- 16 045552 изопропанола составляет менее 0,5% (см. фиг. 8В).- 16 045552 isopropanol is less than 0.5% (see Fig. 8B).
Типичные результаты измерений методом ДСК для образца кристаллической формы 3 соединения (I), полученной путем уравновешивания с этилацетатом, представлены на фиг. 8С; при этом показан острый эндотермический пик плавления приблизительно при 92°С, связанный с энтальпией, составляющей приблизительно 103 Дж/г. Таким образом, кристаллическая форма формы 3 соединения (I), полученная в рамках этого Примера, имеет более высокую температуру плавления, чем кристаллическая форма по Примеру 2 (форма 2).Typical DSC measurements for a sample of crystalline form 3 of compound (I) obtained by equilibration with ethyl acetate are shown in FIG. 8C; showing a sharp endothermic melting peak at approximately 92°C associated with an enthalpy of approximately 103 J/g. Thus, the crystalline form of Form 3 of compound (I) obtained in this Example has a higher melting point than the crystalline form in Example 2 (Form 2).
Кроме того, исследовали поведение образца кристаллической формы 3 соединения (I), полученной уравновешиванием с этилацетатом, при различных давлениях водяного пара. При самой высокой относительной влажности, равной 95%, образец поглощал приблизительно 1,2% воды, которая высвобождалась, когда относительная влажность возвращалась к 50% относительной влажности. Результаты измерения методом ДСП показаны на фиг. 9А и фиг. 9В. Количество поглощенной воды оказалось незначительным, и сорбция воды была обратимой. Таким образом, эта кристаллическая форма формы 3 соединения (I) является негигроскопичной или по существу негигроскопичной.In addition, the behavior of a sample of crystalline form 3 of compound (I), obtained by equilibration with ethyl acetate, was studied at various water vapor pressures. At the highest relative humidity of 95%, the sample absorbed approximately 1.2% of water, which was released when the relative humidity returned to 50% relative humidity. The measurement results using the EAF method are shown in Fig. 9A and FIG. 9B. The amount of absorbed water turned out to be insignificant, and water sorption was reversible. Thus, this crystalline form of Form 3 of compound (I) is non-hygroscopic or substantially non-hygroscopic.
Обобщенные показатели, характеризующие кристаллическую форму 3 соединения (I), полученную в рамках примера 3, представлены в табл. 4.Generalized indicators characterizing crystalline form 3 of compound (I), obtained in Example 3, are presented in table. 4.
Таблица 4Table 4
Обобщенные показатели, характеризующие кристаллическую форму 3 соединения (I)Generalized indicators characterizing crystalline form 3 of compound (I)
Пример 4. Эффект от введения кристаллической формы соединения (I) мышам, страдающим болезнью Ниманна-Пика типа С (NPC).Example 4 Effect of administration of the crystalline form of compound (I) to mice suffering from Niemann-Pick disease type C (NPC).
В этом примере AZ-3102-00 представляет собой название формы 3 соединения (I).In this example, AZ-3102-00 is the name of form 3 of compound (I).
Цель исследования.Purpose of the study.
Цель исследования состояла в том, чтобы оценить эффективность лечения молодых мышей NPC1 (NPC(-/-) (возраст Р11-Р70)) прогнозируемой фармакологически активной дозой AZ-3102-00 с использованием перорального зонда, а также оценить ФК и гистологические маркеры для характеристики невропатологии, которая может возникнуть.The purpose of the study was to evaluate the efficacy of treating young NPC1 mice (NPC(-/-) (ages P11-P70)) with a predicted pharmacologically active dose of AZ-3102-00 using an oral gavage, and to evaluate PK and histological markers for characterization neuropathology that may occur.
Схема исследования.Study design.
В это исследование было включено 38 мышей, из них: 30 мышей NPC(-/-) с нокаутом (KO), 4 гетерозиготных мыши NPC(+/-) и 4 мыши NPC(+/+) дикого типа (мыши WT, Balb/c). Мыши NPC1(-/-) имеют преждевременное усечение белка с делецией 11 трансмембранных доменов из 13, при этом первые два трансмембранных домена остаются без изменений. Мыши NPC1 (-/-), гомозиготные по рецессивному аллелю гена NIH Нимана Пика типа C1 (Npc1m1N), характеризуются двойным дефицитом активности сфингомиелиназы и глюкоцереброзидазы (JAX# 003092). Животные были выведены из линии мышей BALB/c OlaHsd.This study included 38 mice, including: 30 NPC(-/-) knockout (KO) mice, 4 heterozygous NPC(+/-) mice and 4 wild-type NPC(+/+) mice (WT, Balb mice /c). NPC1(-/-) mice have premature truncation of the protein with deletion of 11 of the 13 transmembrane domains, while the first two transmembrane domains remain unchanged. NPC1 (-/-) mice homozygous for the recessive allele of the NIH Niemann Pick type C1 gene (Npc1m1N) are characterized by dual deficiencies in sphingomyelinase and glucocerebrosidase activity (JAX# 003092). The animals were bred from the BALB/c OlaHsd mouse line.
мышам NPC1(-/-)через пероральный желудочный зонд вводили AZ-3102-00 с 11-го дня после рождения (Р11) до 70-го дня после рождения (Р70). Контрольные мыши того же возраста включали 6 мышей NPC(-/-) и 4 мыши NPC(+/-), получавших носитель, а также 4 мыши NPC(+/+), получавших AZ3102-00. После последней обработки в день Р70 мышей NPC(-/-) (n=4 для каждого момента времени) подвергали эвтаназии путем внутрибрюшинной инъекцией 600 мг/кг пентобарбитала в следующие моменты времени: 30 мин, 1 ч, 2 ч, 4 ч, 8 ч и 24 ч. После последней обработки также умерщвляли контрольных мышей (не критично по времени). Терминальную кровь собирали путем пункции сердца в пробирки, покрытые ЭДТА. Плазму крови собирали центрифугированием (3000xg в течение 10 мин при комнатной температуре), и аликвоты 50 мкл плазмы переносили в пробирки объемом 1,5 мл, замораживали на сухом льду и хранили при -80°С.NPC1(-/-) mice were administered AZ-3102-00 via oral gavage from postnatal day 11 (P11) to postnatal day 70 (P70). Age-matched control mice included 6 NPC(-/-) and 4 NPC(+/-) mice treated with vehicle and 4 NPC(+/+) mice treated with AZ3102-00. After the last treatment on day P70, NPC(-/-) mice (n=4 for each time point) were euthanized by intraperitoneal injection of 600 mg/kg pentobarbital at the following time points: 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h and 24 h. After the last treatment, control mice were also killed (not time critical). Terminal blood was collected by cardiac puncture into EDTA-coated tubes. Blood plasma was collected by centrifugation (3000xg for 10 min at room temperature), and 50 μl aliquots of plasma were transferred into 1.5 ml tubes, frozen on dry ice and stored at -80°C.
После транскардиальной перфузии извлекали мозг и его рассекали пополам. Правое полушарие мозга постфиксировали и помещали в криоформы для дальнейшего иммуногистохимического анализа. Левое полушарие мозга замораживали на сухом льду для дальнейшего анализа.After transcardial perfusion, the brain was removed and cut in half. The right hemisphere of the brain was postfixed and placed in cryoforms for further immunohistochemical analysis. The left hemisphere of the brain was frozen on dry ice for further analysis.
Мозг подвергали криотомии (12 уровней по 5 срезов для каждого). Затем использовали по 5 срезов от одного животного для количественного иммунофлуоресцентного мечения микроглии (МАС1) и астроцитов (GFAP) в двух областях мозга.The brain was subjected to cryotomy (12 levels, 5 sections each). Five sections per animal were then used for quantitative immunofluorescent labeling of microglia (MAC1) and astrocytes (GFAP) in two brain regions.
Тестовая система и обоснование тестовой системы.Test system and justification for the test system.
Болезнь Ниманна-Пика типа С (NPC) представляет собой аутосомно-рецессивное нейродегенеративное заболевание, связанное с мутациями в генах NPC1 и NPC2, и она характеризуется накоплением неэтерифицированного холестерина и гликосфинголипидов (GSL). Приблизительно 95% случаев болезниNiemann-Pick disease type C (NPC) is an autosomal recessive neurodegenerative disorder associated with mutations in the NPC1 and NPC2 genes, and is characterized by the accumulation of non-esterified cholesterol and glycosphingolipids (GSL). Approximately 95% of cases of the disease
- 17 045552- 17 045552
Ниманна-Пика типа С вызваны генетическими мутациями в гене NPC1, и называемыми болезнью Ниманна-Пика типа С1; 5% вызваны мутациями в гене NPC2, и называемыми болезнью Ниманна-Пика типа С2. Клинические проявления болезни Ниманна-Пика типов С1 и С2 сходны, поскольку оба соответствующих гена участвуют в выходе липидов, особенно холестерина, из поздних эндосом или лизосом. Ген NPC1 кодирует белок, расположенный в мембранах внутри клетки, и он участвует в перемещении холестерина и липидов внутри клеток. Дефицит этого белка приводит к аномальному накоплению липидов и холестерина в клеточных мембранах. Ген NPC2 кодирует белок, который связывает и транспортирует холестерин. Мыши, гомозиготные по рецессивному аллелю гена NIH с болезнью Нимана-Пика типа С1, обнаруживают двойной дефицит активности сфингомиелиназы и глюкоцереброзидазы. Мутантные мыши начинают терять вес и проявляют тремор и атаксическую походку приблизительно в возрасте 7 недель. Потеря веса продолжается, а тремор и атаксия становятся более тяжелыми, и продолжаются до самой смерти в возрасте приблизительно 12-14 недель. Печень и селезенка также увеличены, а клетки Пуркинье в мозжечке сильно истощены. Некоторые из этих признаков у мышей напоминают признаки болезни Ниманна-Пика типа С у людей.Niemann-Pick type C is caused by genetic mutations in the NPC1 gene, called Niemann-Pick disease type C1; 5% are caused by mutations in the NPC2 gene, called Niemann-Pick disease type C2. The clinical manifestations of Niemann-Pick disease types C1 and C2 are similar because both respective genes are involved in the release of lipids, especially cholesterol, from late endosomes or lysosomes. The NPC1 gene encodes a protein located in membranes inside cells, and it is involved in the movement of cholesterol and lipids within cells. Deficiency of this protein leads to abnormal accumulation of lipids and cholesterol in cell membranes. The NPC2 gene encodes a protein that binds and transports cholesterol. Mice homozygous for the recessive allele of the NIH gene with Niemann-Pick disease type C1 exhibit dual deficiency in sphingomyelinase and glucocerebrosidase activity. Mutant mice begin to lose weight and exhibit tremors and ataxic gait at approximately 7 weeks of age. Weight loss continues and tremors and ataxia become more severe and continue until death at approximately 12-14 weeks of age. The liver and spleen are also enlarged, and the Purkinje cells in the cerebellum are severely depleted. Some of these signs in mice resemble those of Niemann-Pick disease type C in humans.
Таблица 5Table 5
Сведения об элементах тестаTest Item Details
Подготовка соединений.Preparing connections.
Дозированные препараты разделяли на аликвоты, где это требовалось, чтобы их можно было дозировать в каждом случае введения.Dosed preparations were aliquoted where required so that they could be dosed on each administration occasion.
- 18 045552- 18 045552
Таблица 6Table 6
Сведения о препаратахInformation about drugs
Требуемое количество тестируемого соединения взвешивали и растворяли в воде Elix (мас./мас.), и рН доводили до кислого значения. Дополнительные вспомогательные вещества не добавляли.The required amount of test compound was weighed and dissolved in Elix water (w/w) and the pH was adjusted to acidic. No additional excipients were added.
Не делали никаких поправок на удельный вес испытуемого соединения или чистоту/состав тестируемого соединения.No corrections were made for the specific gravity of the test compound or the purity/composition of the test compound.
После приготовления каждой дозы оставшуюся часть раствора замораживали для ее анализа в конце исследования.After each dose was prepared, the remainder of the solution was frozen for analysis at the end of the study.
Анализы в отношении стабильности, выполненные ранее в связи с разработкой и проверкой метода, показали, что испытуемое соединение стабильно в носителе при приготовлении и хранении в тех же условиях при концентрациях, граничащих с теми, которые использовались в этом исследовании, по меньшей мере в течение 24 ч при комнатной температуре в защищенном от света месте; по меньшей мере в течение 8 дней в холодильнике (2-8°С) и по меньшей мере в течение 3 недель в морозильной камере (< 15°С) при концентрациях, близких к тем, которые использовались в настоящем исследовании (от 0,01 до 2 мг/мл).Stability analyzes previously performed in connection with method development and validation showed that the test compound was stable in the vehicle when prepared and stored under the same conditions at concentrations adjacent to those used in this study for at least 24 h at room temperature in a place protected from light; for at least 8 days in the refrigerator (2-8°C) and at least 3 weeks in the freezer (<15°C) at concentrations similar to those used in the present study (from 0.01 up to 2 mg/ml).
Обращение с животными.Animal handling.
Размещение животных.Pet accommodation.
Животных содержали в индивидуальных вентилируемых клетках на стандартных подстилках для грызунов, поставляемых Rettenmaier. В каждой клетке содержали не более пяти мышей. Температуру в виварии поддерживали в интервале от 20 до 24°С, а относительную влажность поддерживали в интервале от 45% до 65%. Животных содержали при постоянном световом цикле (12 ч свет/темнота). У животных был неограниченный доступ к сухому гранулированному стандартному корму для грызунов (Altromin), а также к обычной водопроводной воде. Влажный корм давали животным под руководством лечащего ветеринара.Animals were housed in individual ventilated cages on standard rodent bedding supplied by Rettenmaier. Each cage contained no more than five mice. The temperature in the vivarium was maintained in the range of 20 to 24°C, and the relative humidity was maintained in the range of 45% to 65%. Animals were kept under a constant light cycle (12 h light/dark). Animals had unlimited access to dry pelleted standard rodent chow (Altromin) as well as regular tap water. Wet food was provided to the animals under the direction of the treating veterinarian.
Идентификация животных.Animal identification.
Животных нумеровали последовательно классическими обозначениями.Animals were numbered sequentially using classical designations.
Каждую клетку идентифицировали цветной карточкой с указанием номера исследования, пола, индивидуальных регистрационных номеров (ИРН) животных, даты рождения, а также распределения по группам лечения. Генотип (трансгенный или дикий тип) каждого животного определяли с помощью ГЩР, специфичной для трансгенной конструкции. Каждая мышь была генотипирована с использованием ДНК, выделенной из биопсии уха до начала исследования.Each cage was identified with a colored card indicating the study number, sex, individual registration numbers (IRN) of the animals, date of birth, and allocation to treatment groups. The genotype (transgenic or wild type) of each animal was determined using GAS specific for the transgenic construct. Each mouse was genotyped using DNA isolated from an ear biopsy prior to the study.
Распределение по группам.Distribution into groups.
В исследование включали животных только с удовлетворительным состоянием здоровья. Рандомизацию распределения по группам проводили для каждой клетки. Животных распределяли по разным исходным группам (когортам), включая животных в группах, получающих лечение. Количество животных в стартовой группе было ограничено, чтобы обеспечить одинаковый возраст животных и одинаковые условия содержания.Only animals with satisfactory health were included in the study. Randomization of group assignment was performed for each cell. Animals were assigned to different initial groups (cohorts), including animals in treatment groups. The number of animals in the starting group was limited to ensure the same age of the animals and the same housing conditions.
Состояние здоровья и наблюдения за клетками с животными.Animal cage health and monitoring.
Перед включением животных в исследование оценивали состояние здоровья каждого отдельного животного. Во время исследования проводили ежедневные наблюдения, и регистрировали любые замечания в отношении поведения животных в клетках, о чем немедленно сообщались руководителю исследования и лечащему ветеринару, которые принимали решение о дальнейших действиях (например, об эвтаназии).Before animals were included in the study, the health status of each individual animal was assessed. During the study, daily observations were made and any observations regarding the behavior of animals in cages were recorded and immediately reported to the study director and the treating veterinarian, who decided on further action (eg, euthanasia).
- 19 045552- 19 045552
Массу тела и состояние здоровья животных регистрировали ежедневно в течение первой недели, а затем один раз в неделю.The body weight and health status of the animals were recorded daily for the first week and then once a week.
Преждевременное прекращение эксперимента и гуманные конечные точкиPremature termination of the experiment and humane endpoints
Ни одно животное не было подвергнуто преждевременной эвтаназии.No animals were prematurely euthanized.
Материалы и методыMaterials and methods
Животные.Animals.
Уход за животными.Animal care.
мыши NPC1(-/-) (группы D - I) получали AZ-3102-00 через пероральный желудочный зонд (10 мл/кг) с 11-го дня после рождения (Р11) до 70-го дня после рождения (Р70). Дозировка начиналась с 1,5 мг/кг в период с Р11 по Р25, а затем в период с Р26 до Р70 вводили 3 мг/кг. Контрольные мыши включали: 6 мышей NPC1(-/-) и 4 мыши NPC(+/-), получавших носитель, и 4 мыши NPC (+/+), получавших AZ3102-00 (группы А-С).NPC1(-/-) mice (groups D - I) received AZ-3102-00 via oral gavage (10 ml/kg) from postnatal day 11 (P11) to postnatal day 70 (P70). Dosing was started at 1.5 mg/kg from P11 to P25, followed by 3 mg/kg from P26 to P70. Control mice included: 6 NPC1(-/-) and 4 NPC(+/-) mice treated with vehicle, and 4 NPC (+/+) mice treated with AZ3102-00 (groups A-C).
После последнего введения в день Р70 мышей NPC(-/-) (n=4 для каждого момента времени; группы D-I) подвергали эвтаназии внутрибрюшинной инъекцией 600 мг/кг пентобарбитала в следующие моменты времени: 30 мин, 1 час, 2 ч, 4 ч, 8 ч и 24 ч. Контрольных мышей (группы А, В и С) также умерщвляли после последнего дозирования (не критично по времени).After the last challenge on day P70, NPC(-/-) mice (n=4 for each time point; groups D-I) were euthanized by intraperitoneal injection of 600 mg/kg pentobarbital at the following time points: 30 min, 1 hour, 2 hours, 4 hours. , 8 h and 24 h. Control mice (groups A, B and C) were also sacrificed after the last dosing (not time critical).
Таблица 7Table 7
Описание групп животных, получавших леченияDescription of groups of animals treated
Отбор проб тканей.Tissue sampling.
После последнего введения в день Р70 мышей подвергали эвтаназии внутрибрюшинной инъекцией: через 30 мин (группа D), через 1 ч (+/- 5 мин, группа Е), через 2 ч (+/- 5 мин, группа F), через 4 ч (+/- 5 мин, группа G), через 8 ч (+/- 5 мин, группа Н) и через 24 ч (+/- 5 мин, группа I) (все времена критичны).After the last administration on day P70, mice were euthanized by intraperitoneal injection: after 30 min (group D), after 1 h (+/- 5 min, group E), after 2 h (+/- 5 min, group F), after 4 h (+/- 5 min, group G), after 8 h (+/- 5 min, group H) and after 24 h (+/- 5 min, group I) (all times are critical).
мышей NPC1(-/-) из группы А, 4 мыши NPC(+/-) из группы В и 4 мыши NPC(+/+) из группы СNPC1(-/-) mice from group A, 4 NPC(+/-) mice from group B and 4 NPC(+/+) mice from group C
- 20 045552 служили в качестве контроля, и они также были подвергнуты эвтаназии в день Р70 (приблизительно через 2 ч после последнего введения).- 20 045552 served as a control and they were also euthanized on day P70 (approximately 2 hours after the last administration).
Мышей перед эвтаназией анестезировали внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала (600 мг/кг, доза 10 мкл/грамм массы тела).Before euthanasia, mice were anesthetized with an intraperitoneal injection of pentobarbital (600 mg/kg, dose 10 μl/gram body weight).
Отбор проб крови.Blood sampling.
Вскрывали грудную клетку мышей и собирали кровь путем пункции сердца иглой 23 калибра. Иглу удаляли, и кровь переносили в пробирку для проб (MiniCollect® K2EDTA (калиевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты)). Пробирку тщательно переворачивали, чтобы облегчить равномерное распределение ЭДТА и предотвратить свертывание. Образцы крови центрифугировали при 3000 g в течение 10 мин при комнатной температуре (22°С). Аликвоты плазмы объемом 50 мкл переносили в предварительно меченые LoBind 1,5-мл пробирки Эппендорфа, замороженные на сухом льду, и хранили при -80°С.The thorax of the mice was opened and blood was collected by cardiac puncture with a 23-gauge needle. The needle was removed and the blood was transferred to a sample tube (MiniCollect® K2EDTA (potassium ethylenediaminetetraacetic acid)). The tube was carefully inverted to facilitate uniform distribution of EDTA and prevent clotting. Blood samples were centrifuged at 3000 g for 10 min at room temperature (22°C). Plasma aliquots of 50 μl were transferred to LoBind pre-labeled 1.5-ml Eppendorf tubes frozen on dry ice and stored at -80°C.
Перфузия.Perfusion.
Затем животных подвергали транскардиальной перфузии с использованием 0,9% физиологического раствора. С этой целью иглу 23-го калибра, соединенную с флаконом с 0,9% физиологическим раствором, вводили в левый желудочек. Грудную аорту между легкими и печенью пережимали кровоостанавливающими щипцами, чтобы блокировать кровоток от сердца к брюшной полости, но позволяя крови течь к мозгу. Правый желудочек вскрывали ножницами. Поддерживали постоянное давление перфузионного раствора от 100 до 120 мм рт. ст. путем подсоединения флакона с раствором к воздушному компрессору с манометрическим управлением. Перфузию продолжали до тех пор, пока поверхность черепа не становилась белой, и из правого желудочка выходил только перфузионный раствор вместо крови.Animals were then transcardially perfused using 0.9% saline. For this purpose, a 23-gauge needle connected to a vial of 0.9% saline was inserted into the left ventricle. The thoracic aorta between the lungs and the liver was clamped with hemostats to block blood flow from the heart to the abdomen while allowing blood to flow to the brain. The right ventricle was opened with scissors. A constant pressure of the perfusion solution was maintained from 100 to 120 mmHg. Art. by connecting the bottle with the solution to a pressure-controlled air compressor. Perfusion was continued until the skull surface became white and only perfusion solution instead of blood emerged from the right ventricle.
Отбор проб мозга.Brain sampling.
После перфузии вскрывали череп, осторожно удаляли мозг и рассекали его пополам на охлажденной поверхности. Левое полушарие взвешивали, быстро замораживали на сухом льду и хранили при 80°С. Правое полушарие фиксировали погружением в 4% раствор параформальдегида в фосфатном буфере (рН 7,4) на 2 ч при комнатной температуре.After perfusion, the skull was opened, the brain was carefully removed and dissected in half on a cooled surface. The left hemisphere was weighed, quickly frozen on dry ice, and stored at 80°C. The right hemisphere was fixed by immersion in 4% paraformaldehyde in phosphate buffer (pH 7.4) for 2 hours at room temperature.
Гистология.Histology.
Подготовка ткани.Fabric preparation.
Правое полушарие мозга мышей фиксировали погружением в свежеприготовленный 4% раствор параформальдегида в РВ (рН 7,4) на два ч при комнатной температуре. После этого полушария переносили в 15% раствор сахарозы/PBS и хранили при 4°С до погружения в среду для криозащиты. Затем блоки ткани обрезали по мере необходимости, переносили в криоформы, заливали среду ОСТ, замораживали в изопентане, охлаждаемом сухим льдом, и хранили в морозильной камере сверхглубокого охлаждения (целевая температура -80°С).The right hemisphere of the mouse brain was fixed by immersion in a freshly prepared 4% paraformaldehyde solution in PB (pH 7.4) for two hours at room temperature. The hemispheres were then transferred to a 15% sucrose/PBS solution and stored at 4°C until immersed in cryoprotection medium. Tissue blocks were then trimmed as needed, transferred to cryoforms, embedded in OCT medium, frozen in isopentane cooled with dry ice, and stored in an ultra-deep freezer (target temperature -80°C).
Получение срезов.Obtaining slices.
На криотоме Leica получали пять последовательных криосрезов толщиной 10 мкм в сагиттальном направлении. Следующие 25 срезов для каждого уровня отбрасывали. Эту схему получения срезов повторяли для 12 уровней, и она могла быть изменена для получения срезов с правильных уровней, например, если мозг был меньше из-за молодого возраста или генотипа. Всего получали 12x5 = 60 срезов. Уровни для срезов выбирали в соответствии с атласом мозга (Paxinos and Franklin The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, 2nd edition, 2001). Сбор срезов начинали на уровне ~0,2 мм латеральнее средней линии и затем продолжали через полушарие, чтобы обеспечить систематическую случайную выборку, охватывающую целевые области (см. фиг. 10 и фиг. 15). Срезы хранили при -20°С. В результаты были получены срезы почти всего головного мозга, и после сбора всех срезов блок остаточной ткани утилизировали.Five consecutive cryosections with a thickness of 10 μm in the sagittal direction were obtained using a Leica cryotome. The next 25 slices for each level were discarded. This slice acquisition scheme was repeated for 12 levels and could be modified to obtain slices from the correct levels, for example, if the brain was smaller due to young age or genotype. A total of 12x5 = 60 slices were obtained. Levels for sections were chosen in accordance with the brain atlas (Paxinos and Franklin The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, 2nd edition, 2001). Slice collection began at ∼0.2 mm lateral to the midline and then continued across the hemisphere to ensure systematic random sampling covering the target regions (see Fig. 10 and Fig. 15). Sections were stored at -20°C. The results included sections from almost the entire brain, and after all sections were collected, the residual tissue block was discarded.
Иммунофлуоресценция Ехр353 (кальбиндин-В28k).Immunofluorescence of Exp353 (calbindin-B28k).
Для каждой инкубации отбирали однородный систематический случайный набор из пяти срезов от одной мыши (по одному срезу на уровнях 2, 4, 6, 8, 10); для получения информации о систематической случайной выборке см. ссылку: http://www.stereology.info/sampling/.For each incubation, a homogeneous systematic random set of five sections from one mouse was selected (one section each at levels 2, 4, 6, 8, 10); For information about systematic random sampling, see: http://www.stereology.info/sampling/.
Все указанные ниже стадии выполняли в забуференном фосфатом физиологическом растворе Дульбекко с рН 7,2-7,8 (PBS) при комнатной температуре, если не указано иное:All steps below were performed in Dulbecco's phosphate buffered saline pH 7.2-7.8 (PBS) at room temperature unless otherwise noted:
1) криосрезы высушивали на воздухе в течение 45 мин и промывали в PBS 10 мин;1) cryosections were air-dried for 45 min and washed in PBS for 10 min;
2) неспецифическое связывание блокировали за счет 10% нормальной ослиной сыворотки (Jackson Immuno Research) в 0,1% растворе TritonX-100/PBS в течение 60 мин во влажной камере;2) nonspecific binding was blocked with 10% normal donkey serum (Jackson Immuno Research) in 0.1% TritonX-100/PBS for 60 min in a humidified chamber;
3) каждый срез промывали 3x5 мин в PBS;3) each section was washed for 3x5 min in PBS;
4) срезы инкубировали с первичными антителами в 1% нормальной ослиной сыворотке/PBS в течение ночи при 4°С во влажной камере; использовали поликлональное антитело морской свинки к Calbindin-D28k (Synaptic Systems, 214005) в разведении 1:1000;4) sections were incubated with primary antibodies in 1% normal donkey serum/PBS overnight at 4°C in a humidified chamber; We used a guinea pig polyclonal antibody to Calbindin-D28k (Synaptic Systems, 214005) at a dilution of 1:1000;
5) каждый срез промывали 3x5 мин в PBS;5) each section was washed for 3x5 min in PBS;
6) срезы инкубировали с вторичными антителами в 1% нормальной ослиной сыворотке/PBS в течение 60 мин во влажной камере (с защитой от света); использовали Cy3-конъюгированное вторичное ослиное антитело к антителам морской свинки (H+L), (Jackson ImmunoResearch, 706-165-148) в разведении6) sections were incubated with secondary antibodies in 1% normal donkey serum/PBS for 60 min in a humidified chamber (protected from light); used Cy3-conjugated secondary donkey anti-guinea pig antibody (H+L), (Jackson ImmunoResearch, 706-165-148) diluted
- 21 045552- 21 045552
1:500;1:500;
7) каждый срез промывали 3x5 мин в PBS (с защитой от света);7) each section was washed for 3x5 min in PBS (protected from light);
8) срезы инкубировали с рабочим раствором DAPI в течение 15 мин (с защитой от света)8) sections were incubated with DAPI working solution for 15 min (protected from light)
9) срезы промывали 2x5 мин в PBS (с защитой от света);9) sections were washed for 2x5 min in PBS (protected from light);
10) срезы промывали 5 мин в ddH2O (с защитой от света);10) sections were washed for 5 min in ddH 2 O (protected from light);
11) срезы покрывали слоем Mowiol и покровными стеклами (с защитой от света).11) sections were covered with a layer of Mowiol and coverslips (protected from light).
Визуализация.Visualization.
Полные сканы окрашенных срезов регистрировали с помощью автоматического микроскопа Zeiss AxioScan Z1 с объективами с высокой апертурой, оснащенного монохромной камерой Zeiss Axiocam 506 и камерой Hitachi 3CCD HV-F202SCL, и с использованием программного обеспечения Zeiss ZEN 2.3.Full scans of stained sections were recorded using a Zeiss AxioScan Z1 automated microscope with high aperture objectives, equipped with a Zeiss Axiocam 506 monochrome camera and a Hitachi 3CCD HV-F202SCL camera, and using Zeiss ZEN 2.3 software.
Количественная оценка.Quantitative assessment.
Анализ изображений выполняли с помощью программного обеспечения Image Pro 10 (Media Cybernetics). В начале на изображениях определяли целевые области (мозжечок и гиппокамп или мозолистое тело и полосатое тело) путем обрисовки областей интереса (ROI). Дополнительно из ROI исключали морщины, пузырьки воздуха или любые другие артефакты, мешающие измерению. После этого количественно оценивали иммунофлуоресценцию в пределах идентифицированных участков.Image analysis was performed using Image Pro 10 software (Media Cybernetics). First, target regions (cerebellum and hippocampus or corpus callosum and striatum) were identified in the images by outlining regions of interest (ROIs). Additionally, wrinkles, air bubbles, or any other artifacts that interfered with the measurement were excluded from the ROI. Immunofluorescence within the identified areas was then quantified.
Для количественного определения при необходимости использовали коррекцию фона и выявляли иммунореактивные объекты с помощью адекватной пороговой и морфологической фильтрации (по размеру и форме). Затем количественно определяли различные характеристики объекта, включая процент совокупной площади объекта на основе размера ROI (иммунореактивная площадь - это наиболее полный параметр, указывающий на наличие различий в иммунореактивности), количество объектов, нормализованных к размеру ROI (плотность объектов), среднюю интенсивность сигнала выявленных объектов (средняя интенсивность указывает на наличие различий в уровне клеточной экспрессии белков-мишеней) и размеры надпороговых объектов. После того как определены параметры целевых объектов в тестовом прогоне, то количественный анализ изображения запускается автоматически, поэтому результаты не зависят от оператора и они полностью воспроизводимы.For quantification, background correction was used when necessary and immunoreactive objects were identified using adequate threshold and morphological filtering (by size and shape). Various object characteristics were then quantified, including the percentage of total object area based on ROI size (immunoreactive area is the most comprehensive parameter indicating the presence of differences in immunoreactivity), number of objects normalized to ROI size (object density), average signal intensity of detected objects (average intensity indicates differences in the level of cellular expression of target proteins) and the size of suprathreshold objects. Once the parameters of the target objects are determined in the test run, the quantitative image analysis is launched automatically, so the results are independent of the operator and are fully reproducible.
Необработанные данные систематизировали с использованием программы Excel, a затем их анализировали с помощью программного обеспечения GraphPad Prism для статистического анализа и подготовки графиков. Графики, полученные с использованием программного обеспечения GraphPad Prism, являются частью отчета об исследовании, а таблицы с необработанными данными прилагаются к окончательному отчету после выполнения проверок качества.The raw data were organized using Excel and then analyzed using GraphPad Prism software for statistical analysis and graph preparation. Graphs produced using GraphPad Prism software are part of the study report, and raw data tables are appended to the final report after quality checks have been completed.
Измерение AZ-3102 и глюкозилцерамида в плазме и мозговой ткани мышей.Measurement of AZ-3102 and glucosylceramide in mouse plasma and brain tissue.
Сначала из образцов плазмы осаждали белки раствором ацетонитрил/ультрачистая вода/метанол (90:5:5), содержащим 500 нМ внутреннего стандарта глюкозилцерамида С17:0 (GlcCer C17:0) и 0,1% муравьиной кислоты. После перемешивания в течение 5 мин при комнатной температуре образцы центрифугировали (5 мин, 13000 об/мин, 20°С), и 50 мкл супернатантов переносили в силиконизированный 96луночный планшет МТР.First, proteins were precipitated from plasma samples with acetonitrile/ultrapure water/methanol (90:5:5) solution containing 500 nM internal standard glucosylceramide C17:0 (GlcCer C17:0) and 0.1% formic acid. After stirring for 5 min at room temperature, the samples were centrifuged (5 min, 13,000 rpm, 20°C), and 50 μl of supernatants were transferred to a siliconized 96-well MTP plate.
Ткани головного мозга гомогенизировали в растворе ультрачистой воды с метанолом (1:1) с добавкой 0,1% муравьиной кислоты (4 мл на каждый грамм ткани) с использованием гомогенизатора FastPrep 24™ Microtube. Затем для осаждения белка гомогенаты тканей смешивали с раствором ацетонитрил/ультрачистая вода/метанол (90:5:5), содержащим 500 нМ GlcCer С17:0 и 0,1% муравьиной кислоты. После инкубации в течение 5 мин при комнатной температуре образцы центрифугировали (5 мин, 13000 об/мин, 20°С), и 50 мкл супернатантов переносили в силиконизированный 96-луночный планшет МТР.Brain tissues were homogenized in a solution of ultrapure water and methanol (1:1) supplemented with 0.1% formic acid (4 ml per gram of tissue) using a FastPrep 24™ Microtube homogenizer. Tissue homogenates were then mixed with an acetonitrile/ultrapure water/methanol (90:5:5) solution containing 500 nM GlcCer C17:0 and 0.1% formic acid to precipitate the protein. After incubation for 5 min at room temperature, samples were centrifuged (5 min, 13,000 rpm, 20°C), and 50 μl of supernatants were transferred to a siliconized 96-well MTP plate.
Измерения AZ-3102.AZ-3102 measurements.
Сначала для осаждения белка смешивали образцы плазмы с раствором ацетонитрила, содержащим 50 нг /мл AZ-3101 (внутренний стандарт). После инкубации в течение 5 мин при комнатной температуре образцы центрифугировали (5 мин, 13000 об/мин, 4°С), и супернатанты разбавляли в 10 раз ультрачистой водой с 0,1% муравьиной кислоты.First, plasma samples were mixed with an acetonitrile solution containing 50 ng/mL AZ-3101 (internal standard) to precipitate the protein. After incubation for 5 min at room temperature, the samples were centrifuged (5 min, 13,000 rpm, 4°C), and the supernatants were diluted 10-fold with ultrapure water with 0.1% formic acid.
Ткани головного мозга гомогенизировали в растворе ультрачистой воды с метанолом (1:1) с добавкой 0,1% муравьиной кислоты (4 мл на каждый грамм ткани) с использованием гомогенизатора FastPrep 24™ Microtube (MP Biomedicals, США). Для осаждения белков гомогенаты мозга смешивали с раствором ацетонитрила, содержащим 10 нг /мл AZ-3101 (внутренний стандарт). После инкубации в течение 5 мин при комнатной температуре образцы центрифугировали (5 мин, 13000 об/мин, 4°С), и супернатанты разбавляли в 10 раз ультрачистой водой с 0,1% муравьиной кислоты.Brain tissues were homogenized in a solution of ultrapure water with methanol (1:1) with the addition of 0.1% formic acid (4 ml per gram of tissue) using a FastPrep 24™ Microtube homogenizer (MP Biomedicals, USA). To precipitate proteins, brain homogenates were mixed with an acetonitrile solution containing 10 ng/ml AZ-3101 (internal standard). After incubation for 5 min at room temperature, the samples were centrifuged (5 min, 13,000 rpm, 4°C), and the supernatants were diluted 10-fold with ultrapure water with 0.1% formic acid.
Разбавленные супернатанты плазмы и ткани головного мозга вводили в систему жидкостной хроматографии Agilent LC (Agilent, США) с помощью автоматического инъектора образцов (SIL-30, Shimadzu, США). Аналиты разделяли методом жидкостной хроматографии с использованием линейного градиента подвижной фазы В при скорости потока 0,800 мл/мин на обращенно-фазовой колонке XBridge ВЕН С8 (2,1*50 мм, размер частиц 2,5 мкм; Waters, США) при температуре 40°С. Подвижная фаза А состояла из ультрачистой воды с добавкой 0,1% муравьиной кислоты. Подвижная фаза В представляла собой ацетонитрил с добавкой 0,1% муравьиной кислоты.Diluted plasma and brain tissue supernatants were injected into an Agilent LC liquid chromatography system (Agilent, USA) using an automatic sample injector (SIL-30, Shimadzu, USA). Analytes were separated by liquid chromatography using a linear gradient of mobile phase B at a flow rate of 0.800 ml/min on a reverse-phase XBridge BEH C8 column (2.1*50 mm, particle size 2.5 μm; Waters, USA) at a temperature of 40° WITH. Mobile phase A consisted of ultrapure water supplemented with 0.1% formic acid. Mobile phase B was acetonitrile supplemented with 0.1% formic acid.
- 22 045552- 22 045552
Регистрацию осуществляли в режиме положительной ионизации с использованием тройного квадрупольного масс-спектрометра API 5500 (АВ Sciex, США), оснащенного интерфейсом Turbo Ion Spray.Registration was carried out in positive ionization mode using an API 5500 triple quadrupole mass spectrometer (AB Sciex, USA) equipped with a Turbo Ion Spray interface.
Данные нормировали и количественно оценивали с использованием программного обеспечения для анализа данных Analyst™ (AB Sciex, версия 1.6.3). Нижний предел количественного обнаружения (LLOQ) для AZ-3102 составил 0,2 нг/мл в образцах плазмы и 2 нг/г ткани головного мозга, соответственно.Data were normalized and quantified using Analyst™ data analysis software (AB Sciex, version 1.6.3). The lower limit of quantitation (LLOQ) for AZ-3102 was 0.2 ng/mL in plasma and 2 ng/g brain tissue samples, respectively.
Измерение глюкозилцерамидаGlucosylceramide measurement
Сначала из образцов плазмы осаждали белок раствором ацетонитрил/ультрачистая вода/метанол (90:5:5), содержащим в качестве внутреннего стандарта 500 нМ глюкозилцерамида С17:0 (GlcCer С17:0) и 0,1% муравьиной кислоты. После перемешивания в течение 5 мин при комнатной температуре образцы центрифугировали (5 мин, 13000 об/мин, 20°С), и 50 мкл супернатантов переносили в силиконизированный 96-луночный планшет МТР.First, protein was precipitated from plasma samples with an acetonitrile/ultrapure water/methanol solution (90:5:5) containing 500 nM glucosylceramide C17:0 (GlcCer C17:0) and 0.1% formic acid as an internal standard. After stirring for 5 min at room temperature, the samples were centrifuged (5 min, 13,000 rpm, 20°C), and 50 μl of supernatants were transferred to a siliconized 96-well MTP plate.
Ткани головного мозга гомогенизировали в растворе ультрачистая вода/метанол (1:1) с добавкой 0,1% муравьиной кислоты (4 мл на каждый грамм ткани) с использованием гомогенизатора FastPrep 24™ Microtube. Затем для осаждения белка гомогенаты тканей смешивали с раствором ацетонитрил/ультрачистая вода/метанол (90:5:5), содержащим 500 нМ GlcCer С17:0 и 0,1% муравьиной кислоты. После инкубации в течение 5 мин при комнатной температуре образцы центрифугировали (5 мин, 13000 об/мин, 20°С), и 50 мкл супернатантов переносили в силиконизированный 96-луночный планшет МТР.Brain tissues were homogenized in ultrapure water/methanol (1:1) supplemented with 0.1% formic acid (4 ml per gram of tissue) using a FastPrep 24™ Microtube homogenizer. Tissue homogenates were then mixed with an acetonitrile/ultrapure water/methanol (90:5:5) solution containing 500 nM GlcCer C17:0 and 0.1% formic acid to precipitate the protein. After incubation for 5 min at room temperature, samples were centrifuged (5 min, 13,000 rpm, 20°C), and 50 μl of supernatants were transferred to a siliconized 96-well MTP plate.
Концентрации глюкозилцерамида С16:0 (GlcCer С16:0), глюкозилцерамида С18:0 (GlcCer С18:0) и глюкозилцерамида C24:1 (GlcCer C24:1) в образцах головного мозга количественно определяли с помощью метода ВЭЖХ-МС/МС в режиме мониторинга множественных реакций (MRM). Супернатанты анализировали с помощью метода ВЭЖХ-МС/МС с использованием колонки HALO HILIC (150*4,6 мм, 2,7 мкм) от Advanced Materials Technology для различения изомеров галактозил- и глюкозил-церамидов. Данные МС/МС получали в режиме положительной ионизации с использованием тройного квадруполя API 4000 (Applied Biosystems, США), с интерфейсом Turbo Ion Spray. Анализ GlcCer С 16:0 и GlcCer C18:0 проводили с использованием градиента с подвижной фазой А: 5 мМ ацетата аммония в растворе 94,5% ацетонитрила, 2,5% метанола, 2,5% ультрачистой воды и 0,5% муравьиной кислоты, и с подвижной фазой В: сверхчистая вода и 0,1% муравьиной кислоты. LLOQ в образцах головного мозга для GlcCer 16:0, GlcCer 18:0 и GlcCer 24:1 составлял 25,1, 250 и 381,5 пмоль на грамм ткани, соответственно.Concentrations of glucosylceramide C16:0 (GlcCer C16:0), glucosylceramide C18:0 (GlcCer C18:0) and glucosylceramide C24:1 (GlcCer C24:1) in brain samples were quantified using HPLC-MS/MS in monitoring mode multiple reactions (MRM). Supernatants were analyzed by HPLC-MS/MS using a HALO HILIC column (150*4.6 mm, 2.7 μm) from Advanced Materials Technology to distinguish between galactosyl and glucosyl ceramide isomers. MS/MS data were acquired in positive ionization mode using an API 4000 triple quadrupole (Applied Biosystems, USA), with a Turbo Ion Spray interface. Analysis of GlcCer C 16:0 and GlcCer C18:0 was carried out using a gradient with mobile phase A: 5 mM ammonium acetate in a solution of 94.5% acetonitrile, 2.5% methanol, 2.5% ultrapure water and 0.5% formic acid. acid, and with mobile phase B: ultrapure water and 0.1% formic acid. The LLOQ in brain samples for GlcCer 16:0, GlcCer 18:0, and GlcCer 24:1 was 25.1, 250, and 381.5 pmol per gram of tissue, respectively.
Статистика.Statistics.
Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 9. Данные представляли в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего (SEM) или среднего значения + стандартная ошибка среднего.Statistical analysis was performed using GraphPad Prism 9 software. Data were presented as mean ± standard error of the mean (SEM) or mean + SEM.
Данные in vivo: Различия между группами проверяли с помощью двустороннего анализа ANOVA для повторных измерений с последующим апостериорным анализом Бонферрони или Даннетта.In vivo data: Differences between groups were tested using two-way ANOVA for repeated measures followed by Bonferroni or Dunnett post hoc analyses.
Гистология: Распределение данных нельзя было проверить из-за низкого значения n, и поэтому предполагали наличие нормального распределения. Различия между группами проверяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным анализом Даннетта. Группу А (мыши NPC-/-, получавшие носитель) использовали в качестве контрольной группы для попарных сравнений.Histology: The distribution of the data could not be verified due to the low n value and was therefore assumed to be normally distributed. Differences between groups were tested using one-way analysis of variance followed by Dunnett's post hoc analysis. Group A (vehicle-treated NPC −/− mice) was used as the control group for pairwise comparisons.
Полученные результаты.Results.
Масса тела.Body mass.
На фиг. 11 показано процентное изменение массы тела между днем PND 11 и 9-ой неделей. График представляет изменение массы тела [г] в каждой группе, при ежедневных измерениях в течение первой недели лечения, а затем один раз в неделю.In fig. Figure 11 shows the percentage change in body weight between PND 11 and week 9. The graph represents the change in body weight [g] in each group, measured daily during the first week of treatment and then once a week.
Полученные результаты показывают, что общее состояние здоровья животных, о чем свидетельствует средний процент прироста массы тела, не ухудшалось под действием AZ-3102, и мыши NPC(-/-) обоих полов, получавших AZ-3102, прибавляли в весе больше, чем мыши NPC(-/-) не получавшие лечения.The results indicate that the overall health of the animals, as measured by mean percentage body weight gain, was not impaired by AZ-3102, and NPC(-/-) mice of both sexes treated with AZ-3102 gained more weight than mice. NPC(-/-) untreated.
Фармакокинетика.Pharmacokinetics.
Таблица 8Table 8
Соотношения при действии AZ-3102 на мозг: показатели в плазме после регулярного перорального введения в дни PND 11-70Correlations of AZ-3102 effects on the brain: plasma values after regular oral administration on days PND 11-70
Уровни глюкозилцерамида.Glucosylceramide levels.
На фиг. 12 показаны уровни глюкозилцерамида С16:0 и С18:0 после регулярного перорального введения в дни PND 11-70.In fig. 12 shows the levels of glucosylceramide C16:0 and C18:0 after regular oral administration on days PND 11-70.
У мышей, получавших AZ-3102, наблюдали повышенные уровни глюкозилцерамида С16:0 и С18:0вIncreased levels of glucosylceramide C16:0 and C18:0b were observed in mice treated with AZ-3102
- 23 045552 головном мозге.- 23 045552 brain.
Клинические признаки.Clinical signs.
Определения клинических показателей и гуманных конечных точек.Definitions of clinical indicators and humane endpoints.
Клинические признаки отслеживали ежедневно, начиная с дня Р45 до конца исследования (в соответствии со схемой, приведенной ниже в табл. 9). Регистрировали параметры потеря массы тела, общее состояние здоровья, клинические данные и линия поведения, и их оценивали по бальной шкале. Для общей оценки использовали сумму баллов.Clinical signs were monitored daily from day P45 until the end of the study (according to the schedule shown in Table 9 below). Parameters of weight loss, general health, clinical data and behavior were recorded and assessed on a point scale. The total score was used for the overall assessment.
Таблица 9Table 9
Таблица оценки клинических признаковTable for assessing clinical signs
Экспериментатор (имя/инициалы):Experimenter (name/initials):
Линия поведенияLine of conduct
ПараметрParameter
Эксперимент№: I Линия: NPC1 | Дата?Experiment#: I Line: NPC1 | Date of?
Время:Time:
Клинические данныеClinical data
- 24 045552- 24 045552
Таблица 10Table 10
Оценка тремораTremor assessment
На фиг. 13 показаны обобщенные результаты общих оценок клинических признаков для каждой мыши в период PND 56-70 по всем группам показателей и для всех групп животных NPC(-/-), получавших носитель и AZ-3102. Слева: общие баллы для животных и по группам лечения, визуализированные с помощью градиента: более низкие баллы отмечены зеленым цветом, а более высокие баллы отмечены красным цветом. Правая сторона: баллы, выраженные численными показателями. Пороговые баллы, превышающие значение 7, редко встречаются в группах животных, получавших лечение; тем не менее, группы, не получавшие лечение, имели более высокие общие баллы в ходе исследования.In fig. 13 shows summary results of overall clinical sign scores for each mouse during PND 56-70 across all score groups and for all groups of NPC(-/-) animals treated with vehicle and AZ-3102. Left: Overall scores for animals and by treatment group, visualized using a gradient, with lower scores in green and higher scores in red. Right side: scores expressed in numerical terms. Cutoff scores greater than 7 are rare in treated animal groups; however, the untreated groups had higher overall scores throughout the study.
Результаты показывают, что у мышей NPC(-/-), получавших носитель, наблюдали ухудшение (большие баллы) общих клинических признаков по сравнению с животными NPC(-/-), получавшими AZ3102. Это также показано на фиг. 13: правая сторона, на которой баллы, например, превышающие 8, чаще наблюдались в группе животных NPC(-/-), получавших носитель, по сравнению с животными NPC(-/-), получавшими AZ-3102. Исследуя эти показатели, авторы изобретения установили, что появление, продолжительность и интенсивность тремора также уменьшались при лечении животных с использованием AZ-3102 (фиг. 14). Высокий уровень тремора наблюдали у всех животных NPC(-/-), получавших носитель, кроме одной мыши, тогда как AZ-3102 по существу устранил этот высокий уровень тремора у всех животных, кроме одной мыши, из 24 протестированных животных.The results show that NPC(-/-) mice treated with vehicle had worsening (higher scores) of global clinical signs compared to NPC(-/-) animals treated with AZ3102. This is also shown in Fig. 13: Right side, where scores, eg, greater than 8, were more frequently observed in vehicle-treated NPC(-/-) animals compared to AZ-3102-treated NPC(-/-) animals. By examining these indicators, the inventors found that the occurrence, duration and intensity of tremor were also reduced when animals were treated with AZ-3102 (Fig. 14). High levels of tremor were observed in all vehicle-treated NPC(-/-) animals except one mouse, whereas AZ-3102 essentially eliminated these high levels of tremor in all but one mouse of the 24 animals tested.
На фиг. 14 показана оценка тремора в дни 56-70 после рождения (PND 56-70) у мышей NPC(-/-), получавших носитель и AZ-3102. Розовые (=светло-серые) столбцы отражают появление и продолжительность сильного тремора (5 баллов); тогда как зеленые (= темно-серые) столбцы отражают появление и продолжительность легкого или умеренного тремора. За исключением одной мыши в группе, не получавшей лечения, все остальные животные показали высокий уровень тремора (у 4 из 5 мышей). Напротив, только у одной мыши в группе, получавшей AZ-3102, был высокий уровень тремора (у 1 из 24). Оценки тремора: 0: нет тремора; 1: легкое нарушение координации, легкий-умеренный тремор; 5: высокий уровень тремора, некоординированные движения; 10: снижение рефлекса восстановления (такой оценки не было ни у одного животного).In fig. 14 shows tremor scores at postnatal days 56-70 (PND 56-70) in NPC(-/-) mice treated with vehicle and AZ-3102. Pink (=light gray) bars reflect the occurrence and duration of severe tremor (5 points); whereas green (= dark gray) bars reflect the occurrence and duration of mild to moderate tremor. With the exception of one mouse in the untreated group, all other animals showed high levels of tremor (4 out of 5 mice). In contrast, only one mouse in the AZ-3102 group had high levels of tremor (1 of 24). Tremor scores: 0: no tremor; 1: mild incoordination, mild-moderate tremor; 5: high level of tremors, uncoordinated movements; 10: decreased righting reflex (not assessed in any animal).
Гистологические результаты.Histological results.
Определение целевых областей.Defining target areas.
Целевые области отмечали вручную, определяя область интереса (ROI) для последующего количественного анализа с флуоресцентным мечением.Target regions were marked manually, defining a region of interest (ROI) for subsequent quantitative analysis with fluorescent labeling.
Показатели для количественного анализа.Indicators for quantitative analysis.
В таблице, приведенной ниже, представлены четыре стандартных показателя.The table below shows four standard indicators.
Размер области [мм2]: этот показатель характеризует среднюю площадь участка мозга, охватывае- 25 045552 мого целевой областью. Этот показатель важен для проверки правильности отбора проб. Также полезно идентифицировать атрофию головного мозга, которая является частью фенотипа некоторых животных моделей.Area size [mm 2 ]: this indicator characterizes the average area of the brain area covered by the target area. This indicator is important for checking the correctness of sampling. It is also useful to identify brain atrophy that is part of the phenotype of some animal models.
Иммунореактивная область [%]: процент области интереса, которая покрыта надпороговыми иммунореактивными объектами (например: соматы клеток, нейриты, бляшки); это наиболее полный показатель, указывающий на наличие общих различий в иммунореактивности.Immunoreactive area [%]: percentage of the area of interest that is covered by suprathreshold immunoreactive objects (eg: cell somata, neurites, plaques); this is the most comprehensive indicator indicating the presence of overall differences in immunoreactivity.
Плотность объектов [количество объектов на мм2]: количество надпороговых иммунореактивных объектов, нормированное к размеру целевой области; этот показатель особенно полезен для обнаружения изменений в плотности нейронов.Object density [number of objects per mm2 ]: number of suprathreshold immunoreactive objects normalized to the size of the target area; this measure is particularly useful for detecting changes in neuronal density.
Яркость объекта [а.u.]: средняя яркость пикселей надпороговых иммунореактивных объектов; этот показатель указывает на наличие различий в уровне клеточной экспрессии белков-мишеней.Object brightness [a.u.]: average pixel brightness of suprathreshold immunoreactive objects; this indicator indicates the presence of differences in the level of cellular expression of target proteins.
Размер объекта [мкм2]: размер надпороговых иммунореактивных объектов; этот показатель полезен для обнаружения различий в активации микроглии или роста бляшек.Object size [ μm2 ]: size of suprathreshold immunoreactive objects; this measure is useful for detecting differences in microglial activation or plaque growth.
Кальбиндин-В28k.Kalbindin-B28k.
Иммунофлуоресценцию кальбиндина-D28k регистрировали с помощью поликлональных антител морской свинки, и сигнал количественно определяли в мозжечке и гиппокампе. Мыши NCP(-/-) показали значительно сниженные уровни кальбиндина-D28k по сравнению с мышами NCP(+/-) и NPC(+/+). Лечение тестируемым соединением значительно увеличивало уровни кальбиндина-D28k в мозжечке во всех группах. Все эффекты являются регион-специфическими, поскольку в гиппокампе мышей в различных группах не было обнаружено существенных различий.Calbindin-D28k immunofluorescence was detected using guinea pig polyclonal antibodies, and the signal was quantified in the cerebellum and hippocampus. NCP(-/-) mice showed significantly reduced levels of calbindin-D28k compared to NCP(+/-) and NPC(+/+) mice. Treatment with the test compound significantly increased calbindin-D28k levels in the cerebellum in all groups. All effects are region specific, as no significant differences were found in the hippocampus of mice in the different groups.
На фиг. 16 показаны результаты иммуногистохимии головного мозга: мечение кальбиндином-D28k у мышей NCP(-/-) и NPC(+/-), получавших носитель, по сравнению с мышами NPC(+/+, мыши дикого типа) и NPC(-/-), получавшими лечение. На графиках представлены средние значения иммунофлуоресцентного сигнала, измеренного в пределах ROI в 5 срезах мозга мыши (n=2-4 на группу). Данные анализировали с помощью однофакторного анализа ANOVA и апостериорного критерия Даннета. Интервалы на гистограмме представляют собой средние показания для группы + SEM. * значение Р:<0,001.In fig. Figure 16 shows brain immunohistochemistry results of calbindin-D28k labeling in vehicle-treated NCP(-/-) and NPC(+/-) mice compared with NPC(+/+, wild-type) and NPC(-/-) mice. ), who received treatment. The graphs represent the average immunofluorescence signal measured within the ROI in 5 mouse brain sections (n=2-4 per group). Data were analyzed using one-way ANOVA and Dunnett's post hoc test. Intervals in the histogram represent group means + SEM. * P value: <0.001.
Применяя иммуногистологические методы с использованием кальбиндин-D28k в качестве маркера для клеток Пуркинье, авторы изобретения обнаружили, что обработка AZ-3102, по сравнению с мышами NPC(-/-), получавшими носитель, значительно ограничивала потерю клеток Пуркинье в мозжечке (фиг. 16).Using immunohistological methods using calbindin-D28k as a marker for Purkinje cells, we found that treatment with AZ-3102, compared with vehicle-treated NPC(-/-) mice, significantly limited the loss of Purkinje cells in the cerebellum (Fig. 16). ).
Выводы.Conclusions.
AZ-3102 представляет собой новое низкомолекулярное соединение для перорального применения, разработанное для лечения различных лизосомных нарушений накопления. Уникальный механизм действия AZ-3102 заключается в его высокой эффективности в отношении глюкозилцерамидсинтазы (GCS), нелизосомальной глюкозилцереброзидазы (GbA2), а также в отношении ее свойств по прониканию в мозг свойства. AZ-3102 исследовали на мышиной модели болезни Нимана-Пика типа С [1, 2] в которой мыши NPC, гомозиготные по рецессивному аллелю гена NIH, начинают терять массу тела, проявляют тремор и атаксическую походку приблизительно в возрасте 7 недель [3]. Тяжесть заболевания связана со значительной потерей мозжечком клеток Пуркинье, и клинические признаки ухудшаются до тех пор, пока не будет достигнута гуманная конечная точка (обычно в возрасте 12-14 недель) [3]. В этом исследовании авторы настоящего изобретения исследовали эффективность ежедневного перорального введения AZ-3102 с 11-го по 70-й день после рождения (PND) для мышей NPC(-/-), NPC(-/+) и WT (NPC(+/+); Balb/c) для оценки фармакокинетических (ФК) свойств AZ-3102, его способности модулировать глюкозилцерамид (GlcCer C16:0, GlcCer C18:0) и улучшать клинические признаки заболевания. Кроме того, авторы настоящего изобретения также исследовали влияние лечения на иммуногистохимический маркер клеток Пуркинье, которые коррелируют с тяжестью невропатологии. После регулярного ежедневного перорального введения AZ-3102 в дни PND 11-70 общее состояние здоровья животных не ухудшалось, о чем свидетельствует средний процент прироста массы тела, и мыши NPC(-/-) обоих полов, получавших AZ-3102, прибавляли в весе больше, чем животные NPC(-/-), не получавшие лечения (фиг. 11). AZ-3102 оказал высокое воздействие на мозг: см. показатели для плазмы (табл. 8). В соответствии с целевым воздействием AZ-3102, имело место увеличение количества видов GlcCer, измеренное в гомогенатах цельного мозга, по сравнению с животными, получавшими носитель: более чем в 2 раза для GlcCer 16:0 и приблизительно в 9 раз для GlcCer 18:0. Эти два вида GlcCer, вероятно, являются представителями других видов GlcCer, которые также будут реагировать на действие AZ-3102. Чтобы оценить, достигает ли AZ-3102 достаточных концентраций в мозге, чтобы воздействовать на более специфические признаки, характеризующие общее состояние здоровья и невропатологии, оценивали различные клинические признаки (табл. 9). Баллы, суммированные за весь период наблюдения, дают картину состояния здоровья в период PND 56-70. На фиг. 13 представлено графическое изображение результатов оценки состояния каждого животного в наблюдаемой когорте в течение времени. На этой фигуре видно, что у мышей NPC(-/-), получавших носитель, наблюдалось ухудшение общих клинических признаков (большие баллы) по сравнению с животными NPC(-/-), получавшими AZ-3102. Количественная оценка дополнительно иллюстрирует (фиг. 13: правая сторона), что более высокие баллы, например, более 8, чаще наблюдалисьAZ-3102 is a novel oral small molecule compound developed for the treatment of various lysosomal storage disorders. The unique mechanism of action of AZ-3102 lies in its high potency against glucosylceramide synthase (GCS), non-lysosomal glucosylcerebrosidase (GbA2), as well as its brain-penetrating properties. AZ-3102 was studied in a mouse model of Niemann-Pick disease type C [1, 2] in which NPC mice homozygous for the recessive allele of the NIH gene begin to lose body weight and exhibit tremors and ataxic gait at approximately 7 weeks of age [3]. The severity of the disease is associated with significant loss of cerebellar Purkinje cells, and clinical signs worsen until the humane endpoint is reached (usually 12–14 weeks of age) [3]. In this study, we investigated the effectiveness of daily oral administration of AZ-3102 from postnatal day (PND) 11 to 70 in NPC(-/-), NPC(-/+) and WT (NPC(+/)) mice. +); Balb/c) to evaluate the pharmacokinetic (PK) properties of AZ-3102, its ability to modulate glucosylceramide (GlcCer C16:0, GlcCer C18:0) and improve clinical signs of the disease. In addition, the present inventors also examined the effect of treatment on the immunohistochemical marker of Purkinje cells, which correlate with the severity of neuropathology. Following regular daily oral administration of AZ-3102 on days PND 11-70, the animals' general health did not deteriorate as measured by mean percent body weight gain, and NPC(-/-) mice of both sexes treated with AZ-3102 gained more weight than untreated NPC(-/-) animals (Fig. 11). AZ-3102 had a high brain effect: see plasma values (Table 8). Consistent with the targeting of AZ-3102, there was an increase in the number of GlcCer species measured in whole brain homogenates compared with vehicle-treated animals: more than 2-fold for GlcCer 16:0 and approximately 9-fold for GlcCer 18:0 . These two GlcCer species are likely representative of other GlcCer species that will also respond to AZ-3102. To assess whether AZ-3102 reaches sufficient concentrations in the brain to affect more specific features characterizing general health and neuropathology, various clinical features were assessed (Table 9). The scores, summed up over the entire observation period, give a picture of the health status during the period PND 56-70. In fig. Figure 13 provides a graphical representation of the results of assessing the condition of each animal in the observed cohort over time. This figure shows that NPC(-/-) mice treated with vehicle had worsening overall clinical signs (higher scores) compared to NPC(-/-) animals treated with AZ-3102. The quantitative assessment further illustrates (Fig. 13: right side) that higher scores, such as more than 8, were more often observed
--
Claims (9)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP20199934.9 | 2020-10-02 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA045552B1 true EA045552B1 (en) | 2023-12-05 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2022291486B2 (en) | Crystalline forms of a pharmaceutical compound | |
JP2020189873A (en) | Amorphous and crystalline genz112638 hemi tartrate as inhibitor of glucosylceramide synthase | |
EA019819B1 (en) | C crystalline polymorphic form of protein inhibitor activating 5-lipoxygenase, pharmaceutical composition based thereon and use in treatment | |
US20210198236A1 (en) | Crystals of cyclic amine derivative and pharmaceutical use thereof | |
US9259403B2 (en) | Crystalline forms of (1S,2R)-2-(amino methyl)-N,N-diethyl-1-phenyl cyclopropane carboxamide | |
US20110200687A1 (en) | Bifeprunox mesylate maintenance dose compositions and methods for using the same | |
EA045552B1 (en) | CRYSTAL FORMS OF PHARMACEUTICAL COMPOUND | |
NZ798892B2 (en) | Crystalline forms of a pharmaceutical compound | |
US11891350B2 (en) | Compounds for use in the treatment or prophylaxis of pain, inflammation and/or autoimmunity | |
KR20150120386A (en) | Formulation comprising benzothiazolone compound | |
Lahiri et al. | Differential effects of two hexahydropyrroloindole carbamate-based anticholinesterase drugs on the amyloid beta protein pathway involved in Alzheimer disease | |
US20240216352A1 (en) | Lpa1 antagonists for treating interstitial lung disease | |
AU2023205441A1 (en) | Treatment of gm2 gangliosidosis | |
WO2023057896A1 (en) | Modulators of the beta-3 adrenergic receptor useful for the treatment or prevention of disorders related thereto |