EA045448B1 - METHOD FOR CREATION OF SILK FIBROIN NERVE GRAFT FUSED WITH NT3 - Google Patents
METHOD FOR CREATION OF SILK FIBROIN NERVE GRAFT FUSED WITH NT3 Download PDFInfo
- Publication number
- EA045448B1 EA045448B1 EA202292044 EA045448B1 EA 045448 B1 EA045448 B1 EA 045448B1 EA 202292044 EA202292044 EA 202292044 EA 045448 B1 EA045448 B1 EA 045448B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- silk fibroin
- creating
- fused
- solution
- nerve graft
- Prior art date
Links
- 108010022355 Fibroins Proteins 0.000 title claims description 79
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 title claims description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 21
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 23
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 14
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 claims description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 10
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 9
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 claims description 9
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 6
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 claims description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 5
- ZJZXSOKJEJFHCP-UHFFFAOYSA-M lithium;thiocyanate Chemical compound [Li+].[S-]C#N ZJZXSOKJEJFHCP-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 235000008708 Morus alba Nutrition 0.000 claims description 4
- 240000000249 Morus alba Species 0.000 claims description 4
- 108010013296 Sericins Proteins 0.000 claims description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 4
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 claims description 3
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 claims description 3
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 claims description 3
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 2
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 2
- 102100029268 Neurotrophin-3 Human genes 0.000 claims 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 5
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 101150108335 FIBL gene Proteins 0.000 description 2
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 2
- 230000014511 neuron projection development Effects 0.000 description 2
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 description 2
- 235000003170 nutritional factors Nutrition 0.000 description 2
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 2
- 210000003594 spinal ganglia Anatomy 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150036143 NTF3 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000010886 Peripheral nerve injury Diseases 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 229940030225 antihemorrhagics Drugs 0.000 description 1
- 230000003376 axonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000004020 conductor Substances 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000002874 hemostatic agent Substances 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002121 nanofiber Substances 0.000 description 1
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000004112 neuroprotection Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000003356 suture material Substances 0.000 description 1
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 239000002407 tissue scaffold Substances 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- -1 tubes Substances 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
Description
Изобретение относится к области биомедицинских материалов, в частности к шелковому фиброиновому нервному трансплантату с NT3-активностью, и может способствовать восстановлению нервов, что может быть применено при восстановлении и регенерации периферических нервов, травмах спинного и головного мозга.The invention relates to the field of biomedical materials, in particular to a silk fibroin nerve graft with NT3 activity, and can promote nerve restoration, which can be used in the restoration and regeneration of peripheral nerves, spinal cord and brain injuries.
Уровень техникиState of the art
С развитием тканевой инженерии, биоматериаловедения и других новых дисциплин для восстановления нервов используются все больше и больше биоматериалов. Превосходные биоматериалы должны обладать хорошей биосовместимостью, поддерживать клеточную адгезию, миграцию, межклеточное взаимодействие, пролиферацию и дифференцировку. В то же время эти материалы также нуждаются в соответствующей скорости деградации, механических свойствах и ограниченном иммунном ответе, а также имеют множество вариантов обработки, которые могут изменять структуру и морфологию в соответствии с конкретными потребностями ткани. В качестве компонента натуральной ткани белок является рациональным выбором для приложений тканевой инженерии. Структурные белки, такие как коллаген, эластин, фибриллярный белок, альбумин и фибрин, используются в качестве шовных материалов, тканевых каркасов, гемостатиков и средств доставки лекарств.With the advancement of tissue engineering, biomaterials science, and other new disciplines, more and more biomaterials are being used for nerve repair. Excellent biomaterials must have good biocompatibility, support cell adhesion, migration, cell-cell interaction, proliferation and differentiation. At the same time, these materials also require appropriate degradation rates, mechanical properties and limited immune response, and have a variety of processing options that can modify the structure and morphology to suit the specific needs of the tissue. As a component of natural tissue, protein is a rational choice for tissue engineering applications. Structural proteins such as collagen, elastin, fibrillar protein, albumin and fibrin are used as sutures, tissue scaffolds, hemostatic agents and drug delivery vehicles.
Повреждение нерва включает повреждение периферического нерва и повреждение центрального нерва. В настоящее время для лечения отдаленных повреждений периферических нервов и повреждений спинного мозга часто требуется использование различных типов трансплантатов. Из-за отсутствия источников и ограниченной области применения начинают искать новые заменители тканеинженерных трансплантатов. Протеин шелка является распространенным природным биополимерным материалом, который имеет долгую историю применения в организме человека в качестве шовного материала. В последние годы он постепенно привлекает внимание людей как биоматериал благодаря некоторым своим характеристикам. По сравнению с другими биоматериалами на основе белков из тех же или гетерогенных исходных тканей, фиброин шелка имеет несколько основных преимуществ: хорошую биосовместимость, отличные механические свойства, контролируемую биоразлагаемость, простую технологию обработки и др. В то же время полимеры фиброина шелка проявляют различную пластичность при обработке. Благодаря изменениям в технологии производства можно получить различные конфигурации матриц, включая трехмерную пористую пену, нановолокна, гидрогели, трубки и пленки, которые можно применять для восстановления различных тканей. Нейротрофический фактор 3 представляет собой белок, кодируемый геном NTF3. Это важный член семейства факторов роста нервов. Он способен питать нейроны периферической и центральной нервной системы. Он может не только способствовать выживанию существующих нейронов, но также выживанию и дифференцировке новообразованных нейронов и синаптических связей.Nerve damage includes peripheral nerve damage and central nerve damage. Currently, the treatment of long-term peripheral nerve injuries and spinal cord injuries often requires the use of different types of grafts. Due to the lack of sources and limited scope of application, new substitutes for tissue-engineered grafts are being sought. Silk protein is a common natural biopolymer material that has a long history of use in the human body as a suture material. In recent years, it has gradually attracted people's attention as a biomaterial due to some of its characteristics. Compared with other biomaterials based on proteins from the same or heterogeneous source tissues, silk fibroin has several main advantages: good biocompatibility, excellent mechanical properties, controlled biodegradability, simple processing technology, etc. At the same time, silk fibroin polymers exhibit different plasticity when processing. Changes in manufacturing technology can produce a variety of matrix configurations, including three-dimensional porous foams, nanofibers, hydrogels, tubes, and films, which can be used to repair a variety of tissues. Neurotrophic factor 3 is a protein encoded by the NTF3 gene. It is an important member of the nerve growth factor family. It is able to nourish neurons of the peripheral and central nervous system. It can not only promote the survival of existing neurons, but also the survival and differentiation of newly formed neurons and synaptic connections.
В настоящее время функция каркасов тканевой инженерии, построенных только из фиброина шелка, является относительно единственной, а роль содействия восстановлению нервной ткани относительно ограничена. Было изучено, что нервные трансплантаты могут быть пропитаны питательными факторами (такими как NGF) или лиофилизированы после смешивания с фиброином шелка для формирования проводников, что оказывает хороший эффект на стимулирование роста нервов на ранней стадии, однако этот эффект будет постепенно ослабевают с увеличением времени. В то же время нестабильность факторов питания в организме и ограниченность источников сильно ограничивают их использование.Currently, the function of tissue engineering scaffolds constructed only from silk fibroin is relatively singular, and the role of promoting neural tissue repair is relatively limited. It has been studied that nerve grafts can be impregnated with nutritional factors (such as NGF) or lyophilized after mixing with silk fibroin to form conductors, which has a good effect in promoting nerve growth in the early stage, but this effect will gradually weaken with increasing time. At the same time, the instability of nutritional factors in the body and limited sources greatly limit their use.
Суть изобретенияThe essence of the invention
Стремясь устранить недостатки предшествующего уровня техники, изобретение объединяет активный пептид нейропротекторного фактора 3 (NT-3) с пептидом легкой цепи фиброина шелка с образованием слитого белка. На основе слитого белка осуществляется самосборка фиброина шелка и получается новый тип нервного трансплантата, способный не только обеспечить хорошую механическую поддержку, но и стабильно длительное время выполнять нейропротекторную функцию.In an effort to overcome the shortcomings of the prior art, the invention combines active neuroprotective factor 3 (NT-3) peptide with silk fibroin light chain peptide to form a fusion protein. Based on the fusion protein, silk fibroin self-assembles and a new type of nerve graft is obtained that can not only provide good mechanical support, but also perform a neuroprotective function for a long time.
Техническая схема настоящего изобретения выглядит следующим образом.The technical diagram of the present invention is as follows.
Способ создания шелкового фиброинового нервного трансплантата, слитого с NT3, включающий следующие этапы:A method for creating a silk fibroin nerve graft fused to NT3, comprising the following steps:
синтезировать фрагмента гена, содержащего легкую цепь фиброина шелка и NT-3, соединить его с вектором экспрессии pET-30 и перенести полученный рекомбинантный вектор экспрессии в кишечную палочку BL21 для получения слитого белка;synthesize a gene fragment containing the light chain of silk fibroin and NT-3, combine it with the expression vector pET-30 and transfer the resulting recombinant expression vector into Escherichia coli BL21 to obtain a fusion protein;
слитый белок и раствор фиброина шелка смешать для получения раствора смешанного белка, шелковую фиброиновую сеть поместить в форму, раствор смешанного белка залить в форму для лиофилизации и формирования нервного канала; после денатурации получают конечный продукт с активностью NT-3 из шелковых фиброиновых нервных трансплантатов. Далее, из фиброина шелка на ткацком станке ткут шелковую фиброиновую сеть.the fusion protein and silk fibroin solution are mixed to obtain a mixed protein solution, the silk fibroin network is placed in a mold, the mixed protein solution is poured into a mold to lyophilize and form a nerve canal; after denaturation, a final product with NT-3 activity is obtained from silk fibroin nerve grafts. Next, a silk fibroin network is woven from silk fibroin on a loom.
Далее, способ создания раствора шелкового фиброина заключается в следующем: шелковое фиброиновое волокно помещают в раствор тиоцианата лития для растворения, а растворенный раствор помещают в мешок для диализа и подвергают диализу с тройной дистиллированной водой в качестве диализата в течение 60-80 часов для получения раствора фиброина шелка.Next, the method of creating silk fibroin solution is as follows: silk fibroin fiber is put into lithium thiocyanate solution to dissolve, and the dissolved solution is put into a dialysis bag and dialyzed with triple distilled water as dialysate for 60-80 hours to obtain fibroin solution silks.
- 1 045448- 1 045448
Далее способ создания шелкового фиброина заключается в следующем: тутовый шелк помещают в раствор карбоната натрия и кипятят без в течение менее 20 мин, его полностью промывают тройной дистиллированной водой, и этот этап повторяют от 2 до 4 раз для получения волокон фиброина шелка с удаленным наружным серицином.Next, the method of creating silk fibroin is as follows: mulberry silk is placed in a sodium carbonate solution and boiled without for less than 20 minutes, it is completely washed with triple distilled water, and this step is repeated 2 to 4 times to obtain silk fibroin fibers with the outer sericin removed .
Далее, концентрация раствора слитого белка и шелкового фиброина составляет 5-40%, массовое соотношение слитого белка и шелкового фиброина составляет 1:99-50:50.Further, the concentration of the fusion protein and silk fibroin solution is 5-40%, the mass ratio of the fusion protein and silk fibroin is 1:99-50:50.
Далее, деформационная обработка заключается в погружении в 60%-ый этанол на 10-14 ч.Next, deformation treatment consists of immersion in 60% ethanol for 10-14 hours.
Далее, молекулярная масса диализного мешка составляет 12-16 кДа.Further, the molecular weight of the dialysis bag is 12-16 kDa.
Далее температура лиофилизации составляет -70°C.Further, the lyophilization temperature is -70°C.
Далее, концентрация раствора тиоцианата лития составляет 9 моль/л.Further, the concentration of the lithium thiocyanate solution is 9 mol/L.
Настоящее изобретение также относится к шелковому фиброиновому нервному трансплантату, слитому с NT3, который получают описанным выше способом.The present invention also relates to a silk fibroin nerve graft fused to NT3, which is obtained by the method described above.
Положительные эффекты.Positive effects.
В предшествующем уровне техники в основном используется метод адсорбции нейротрофического фактора или ковалентного соединения с каркасом. В настоящем изобретении используется биоактивный фрагмент NT-3 и фиброина легкой цепи шелка для одновременной экспрессии в слитом белке. Слитый белок является эффективным компонентом слияния NT-3 с фиброином шелка в качестве основного тела и может фиксироваться в шелковом катетере с фиброином шелка. Он может играть роль нейропротекции и регенерации нервов в течение длительного времени без изменения состава фиброина шелка.The prior art mainly uses the method of adsorption of neurotrophic factor or covalent connection to the scaffold. The present invention uses a bioactive fragment of NT-3 and silk fibroin light chain for simultaneous expression in a fusion protein. The fusion protein is an effective fusion component of NT-3 with silk fibroin as the main body, and can be fixed into a silk catheter with silk fibroin. It can play the role of neuroprotection and nerve regeneration for a long time without changing the composition of silk fibroin.
Основным материалом, используемым в настоящем изобретении, является шелковый фиброин, дополненный легкой цепью шелкового фиброина, слитой с активным пептидным сегментом NT-3. В процессе обработки токсичные вещества и вещества с побочными эффектами, такие как сшивающий агент и поверхностно-активное вещество, не добавляются, поэтому он обладает хорошей биосовместимостью.The basic material used in the present invention is silk fibroin supplemented with a silk fibroin light chain fused to the active peptide segment of NT-3. During the processing process, toxic substances and substances with side effects, such as cross-linking agent and surfactant, are not added, so it has good biocompatibility.
Когда слитый белок шелкового фиброина согласно настоящему изобретению совместно культивируют in vitro с клетками нервной ткани, он проявляет очевидный стимулирующий рост эффект посредством морфологического наблюдения и определения экспрессии факторов, родственных NT-3, среди которых FIBL-NT3-L-NT3 самый активный.When the silk fibroin fusion protein of the present invention is co-cultured in vitro with neural tissue cells, it exhibits an obvious growth-promoting effect through morphological observation and determination of the expression of NT-3-related factors, among which FIBL-NT3-L-NT3 is the most active.
Катетер из шелкового фиброина, описанный в изобретении, вводит легкую цепь шелкового фиброина, слитую с сегментом функционального пептида NT-3, перед кристаллизацией шелкового фиброина. Следовательно, в процессе самосборки шелкового фиброина активный полипептид NT-3 будет фиксироваться в катетере шелкового фиброина вместе с легкой цепью шелкового фиброина, что может играть роль защиты нерва и регенерации нерва в течение длительного времени, в то же время пропорцию активного пептида NT-3 в нервном канале можно регулировать в соответствии с реальной ситуацией, что способствует восстановлению повреждения нерва.The silk fibroin catheter described in the invention introduces a silk fibroin light chain fused to a functional peptide segment of NT-3 prior to crystallization of the silk fibroin. Therefore, in the process of silk fibroin self-assembly, the active NT-3 polypeptide will be fixed in the silk fibroin catheter together with the silk fibroin light chain, which can play the role of nerve protection and nerve regeneration for a long time, at the same time the proportion of active NT-3 peptide in The nerve channel can be adjusted according to the actual situation, which is conducive to repairing nerve damage.
Описание прилагаемых чертежейDescription of the attached drawings
На фиг. 1 показано влияние различных конструкций слитых белков, содержащих NT3, на рост нейритов нейронов ганглия дорзальных корешков, культивируемых in vitro.In fig. Figure 1 shows the effect of various NT3-containing fusion protein constructs on neurite growth of dorsal root ganglion neurons cultured in vitro.
На фиг. 2 показано влияние различных конструкций слитых белков, содержащих NT3, на рост нейритов нейронов ганглия дорзальных корешков, культивируемых in vitro.In fig. Figure 2 shows the effect of various NT3-containing fusion protein constructs on neurite growth of dorsal root ganglion neurons cultured in vitro.
Конкретные варианты осуществленияSpecific Embodiments
Пример 1.Example 1.
Способ создания шелкового фиброинового нервного трансплантата, слитого с NT3, включающий следующие этапы.A method for creating a silk fibroin nerve graft fused to NT3, comprising the following steps.
1. Экспрессия и очистка слитого белка шелкового фиброина: создание рекомбинантного вектора экспрессии, экспрессия целевого белка и его очистка.1. Expression and purification of silk fibroin fusion protein: construction of a recombinant expression vector, expression of the target protein and its purification.
2. Получение волокна шелкового фиброина: взять шелк-сырец из шелка шелковицы, удалить серицин и получить волокно шелкового фиброина.2. Obtaining silk fibroin fiber: take raw silk from mulberry silk, remove sericin and obtain silk fibroin fiber.
3. Приготовление раствора шелкового фиброина.3. Preparation of silk fibroin solution.
4. Подготовка шелковой фиброиновой сети.4. Preparation of silk fibroin network.
5. Поместить шелковую фиброиновую сеть в форму, перемешать белковый раствор, полученный на этапах 1 и 3, и переместить в форму. Лиофилизировать шелковый фиброин для самосборки и формирования нервного канала.5. Place the silk fibroin network in the mold, mix the protein solution obtained in steps 1 and 3, and transfer to the mold. Lyophilize silk fibroin to self-assemble and form a nerve canal.
Пример 2.Example 2.
Способ создания шелкового фиброинового нервного трансплантата, слитого с NT3, включающий следующие этапы.A method for creating a silk fibroin nerve graft fused to NT3, comprising the following steps.
1. Конструирование рекомбинантного вектора экспрессии: синтезировать фрагмент гена, содержащий легкую цепь шелкового фиброина и NT-3, соединить его с вектором экспрессии pET-30 и завершить конструирование рекомбинантного вектора экспрессии. Различные последовательности слитых белков, содержащие tag и linker, следующие.1. Construction of a recombinant expression vector: synthesize a gene fragment containing the light chain of silk fibroin and NT-3, combine it with the expression vector pET-30 and complete the construction of the recombinant expression vector. The various fusion protein sequences containing tag and linker are as follows.
Последовательность слитого белка (включая N-концевой His и гибкий Linker):Fusion protein sequence (including N-terminal His and flexible Linker):
- 2 045448- 2 045448
Длина белка FIBL=253 MW=26898,8 pI=6,10Protein length FIBL=253 MW=26898.8 pI=6.10
MHHHHHHAPSVTINQYSDNEIPRDIDDGKASSVISRAWDYVDDTDKSI AILNVQEILKDMASQGDYASQASAVAQTAGIIAHLSAGIPGDACAAANVINS YTDGVRSGNFAGFRQSLGPFFGHVGQNLNLINQLVINPGQLRYSVGPALGC AGGGRIYDFEAAWDAILASSDSSFLNEEYCIVKRLYNSRNSQSNNIAAYITAH LLPPVAQVFHQSAGSITDLLRGVGNG NDATGLVANAQRYIAQAASQVHVMHHHHHHAPSVTINQYSDNEIPRDIDDGKASSVISRAWDYVDDTDKSI AILNVQEILKDMASQGDYASQASAVAQTAGIIAHLSAGIPGDACAAANVINS YTDGVRSGNFAGFRQSLGPFFGHVGQNLNLINQLVINPGQLRYSVGPALGC AGGGRIYDFEAAWDAILASSDSSFLNEEYCIVKRLYNSRNSQSNNIAAYITAH LLPPVAQVFHQSAGSITDLLRGVGNG NDATGLVANAQRYIAQAASQVHV
Длина белка FIBL-NT3=372 MW=40503,7 pl=7,39Protein length FIBL-NT3=372 MW=40503.7 pl=7.39
MHHHHHHAPSVTINQYSDNEIPRDIDDGKASSVISRAWDYVDDTDKSI AILNVQEILKDMASQGDYASQASAVAQTAGIIAHLSAGIPGDACAAANVINS YTDGVRSGNFAGFRQSLGPFFGHVGQNLNLINQLVINPGQLRYSVGPALGC AGGGRIYDFEAAWDAILASSDSSFLNEEYCIVKRLYNSRNSQSNNIAAYITAH LLPPVAQVFHQSAGSITDLLRGVGNGNDATGLVANAQRYIAQAASQVHVYA EHKSHRGEYSVCDSESLWVTDKSSAIDIRGHQVTVLGEIKTGNSPVKQYFYE TRCKEARPVKNGCRGIDDKHWNSQCKTSQTYVRALTSENNKLVGWRWIRI DTSCVCALSRKIGRTMHHHHHHAPSVTINQYSDNEIPRDIDDGKASSVISRAWDYVDDTDKSI AILNVQEILKDMASQGDYASQASAVAQTAGIIAHLSAGIPGDACAAANVINS YTDGVRSGNFAGFRQSLGPFFGHVGQNLNLINQLVINPGQLRYSVGPALGC AGGGRIYDFEAAWDAILASSDSSFLNEEYCIVKRLYNSRNSQSNNIAAYITAH LLPPVAQVFHQSAGSITDLLRGVGNGNDATGLVANAQRYIAQAASQVHVYA EHKSHRGEYSVCDSESLWVTDKSSAIDIRGHQVTVLGEIKTGNSPVKQYFYE TRCKEARPVKNGCRGIDDKHWNSQCKTSQTYVRALTSENNKLVGWRWIRI DTSVCVCALSRKIGRT
FIBL-linker-NT3 Длина белка=382 MW=41134,1 pl=7,39FIBL-linker-NT3 Protein length=382 MW=41134.1 pl=7.39
MHHHHHHAPSVTINQYSDNEIPRDIDDGKASSVISRAWDYVDDTDKSI AILNVQEILKDMASQGDYASQASAVAQTAGIIAHLSAGIPGDACAAANVINS YTDGVRSGNFAGFRQSLGPFFGHVGQNLNLINQLVINPGQLRYSVGPALGC AGGGRIYDFEAAWDAILASSDSSFLNEEYCIVKRLYNSRNSQSNNIAAYITAH LLPPVAQVFHQSAGSITDLLRGVGNGNDATGLVANAQRYIAQAASQVHVGG GGSGGGGSYAEHKSHRGEYSVCDSESLWVTDKSSAIDIRGHQVTVLGEIKT GNSPVKQYFYETRCKEARPVKNGCRGIDDKHWNSQCKTSQTYVRALTSEN NKLVGWRWIRIDTS CVCALSRKIG RTMHHHHHHAPSVTINQYSDNEIPRDIDDGKASSVISRAWDYVDDTDKSI AILNVQEILKDMASQGDYASQASAVAQTAGIIAHLSAGIPGDACAAANVINS YTDGVRSGNFAGFRQSLGPFFGHVGQNLNLINQLVINPGQLRYSVGPALGC AGGGRIYDFEAAWDAILASSDSSFLNEEYCIVKRLYNSRNSQSNNIAAYITAH LLPPVAQVFHQSAGSITDLLRGVGNGNDATGLVANAQRYIAQAASQVHVGG GGSGGGGSYAEHKSHRGEYSVCDSESLWVTDKSSAIDIRGHQVTVLGEIKT GNSPVKQYFYETRCKEARPVKNGCRGIDDKHWNSQCKTSQTYVRALTSEN NKLVGWRWIRIDTS CVCALSRKIG RT
FIBL- (NT3) 2 Длина белка=501 MW=54739,0 pl=8,28FIBL- (NT3) 2 Protein length=501 MW=54739.0 pl=8.28
MHHHHHHAPSVTINQYSDNEIPRDIDDGKASSVISRAWDYVDDTDKSI AILNVQEILKDMASQGDYASQASAVAQTAGIIAHLSAGIPGDACAAANVINS YTDGVRSGNFAGFRQSLGPFFGHVGQNLNLINQLVINPGQLRYSVGPALGC AGGGRIYDFEAAWDAILASSDSSFLNEEYCIVKRLYNSRNSQSNNIAAYITAH LLPPVAQVFHQSAGSITDLLRGVGNGNDATGLVANAQRYIAQAASQVHVYA EHKSHRGEYSVCDSESLWVTDKSSAIDIRGHQVTVLGEIKTGNSPVKQYFYE TRCKEARPVKNGCRGIDDKHWNSQCKTSQTYVRALTSENNKLVGWRWIRI DTSCVCALSRKIGRTGGGGSGGGGSYAEHKSHRGEYSVCDSESLWVTDKSS AIDIRGHQVTVLGEIKTGNSPVKQYFYETRCKEARPVKNGCRGIDDKHWNS QCKTSQTYVRALTSENNKLVGWRWIRIDTSCVCALSRKIGRTMHHHHHHAPSVTINQYSDNEIPRDIDDGKASSVISRAWDYVDDTDKSI AILNVQEILKDMASQGDYASQASAVAQTAGIIAHLSAGIPGDACAAANVINS YTDGVRSGNFAGFRQSLGPFFGHVGQNLNLINQLVINPGQLRYSVGPALGC AGGGRIYDFEAAWDAILASSDSSFLNEEYCIVKRLYNSRNSQSNNIAAYITAH LLPPVAQVFHQSAGSITDLLRGVGNGNDATGLVANAQRYIAQAASQVHVYA EHKSHRGEYSVCDSESLWVTDKSSAIDIRGHQVTVLGEIKTGNSPVKQYFYE TRCKEARPVKNGCRGIDDKHWNSQCKTSQTYVRALTSENNKLVGWRWIRI DTSVCVCALSRKIGRTGGGGSGGGGSYAEHKSHRGEYSVCDSESLWVT DKSS AIDIRGHQVTVLGEIKTGNSPVKQYFYETRCKEARPVKNGCRGIDDKHWNS QCKTSQTYVRALTSENNKLVGWRWIRIDTSCVCALSRKIGRT
2. Экспрессия и очистка слитого белка: перенос рекомбинантного вектора экспрессии, полученного на этапе 1, в кишечную палочку BL21, индукция экспрессии при 37°C и разрушение ее ультразвуком. Очистка слитого белка с помощью Ni NTA и его идентификация, чтобы получить слитый белок.2. Expression and purification of the fusion protein: transfer the recombinant expression vector obtained in step 1 into Escherichia coli BL21, induce expression at 37°C and destroy it with ultrasound. Purification of the fusion protein using Ni NTA and its identification to obtain the fusion protein.
3. Взять соответствующее количество шелка тутового дерева и кипятят его в 0,2% растворе карбоната натрия в течение 30 мин. После извлечения полностью промыть его тройной дистиллированной водой. Повторить этот шаг три раза, чтобы получить шелковое фиброиновое волокно с удаленным внешним серицином, и поместить его в ультрачистый стол для просушки в режиме ожидания.3. Take an appropriate amount of mulberry silk and boil it in 0.2% sodium carbonate solution for 30 minutes. Once removed, rinse it completely with triple distilled water. Repeat this step three times to obtain silk fibroin fiber with the outer sericin removed and place it on an ultraclean bench to dry on standby.
4. Поместите шелковое фиброиновое волокно в 9М раствор тиоцианата лития для растворения, поместите растворенный раствор в мешок для диализа (остаточная молекулярная масса составляет около 14 кДа) и диализировать тройной дистиллированной водой в качестве диализата в течение 72 часов для получения раствора шелкового фиброина.4. Place the silk fibroin fiber into 9M lithium thiocyanate solution to dissolve, put the dissolved solution into a dialysis bag (residual molecular weight is about 14 kDa), and dialyze with triple distilled water as dialysate for 72 hours to obtain silk fibroin solution.
5. Шелковое фиброиновое волокно, полученное на этапе 3, вплетают в шелковую фиброиновую сеть с помощью ткацкого станка.5. The silk fibroin fiber obtained in step 3 is woven into the silk fibroin network using a loom.
- 3 045448- 3 045448
6. Смешать слитый белок, полученный на этапе 2, и раствор шелкового фиброина, полученный на этапе 4, в определенной пропорции, чтобы получить раствор смешанного белка. Настроить концентрацию смешанного белкового раствора на 5-40%, а массовое соотношение слитого белка и шелкового фиброина - 1:99-50:50. Поместить полотно из шелковой фиброиновой сети, полученной на этапе 5, в форму, залить раствор смешанного белка в форму и лиофилизировать его при температуре -70°C, шелковый фиброин, слитые белки и шелковая фиброиновая сеть перекрестно связываются, образуя нервные каналы.6. Mix the fusion protein obtained in step 2 and the silk fibroin solution obtained in step 4 in a certain proportion to obtain a mixed protein solution. Adjust the concentration of the mixed protein solution to 5-40%, and the mass ratio of the fusion protein and silk fibroin to 1:99-50:50. Place the silk fibroin network fabric obtained in step 5 into a mold, pour the mixed protein solution into the mold and lyophilize it at -70°C, the silk fibroin, fusion proteins and silk fibroin network cross-link to form nerve channels.
7. Замачивание в 60% этаноле для деформационной обработки в течение 12 ч, промывание тройной дистиллированной водой и сушка на воздухе, и наконец, получение шелковых фиброиновых нервных трансплантатов с активностью NT-3.7. Soaking in 60% ethanol for strain treatment for 12 hours, rinsing with triple distilled water and air drying, and finally obtaining silk fibroin nerve grafts with NT-3 activity.
Чертеж (фиг. 1) и статистическая диаграмма (фиг. 2). Фиброин, слитый с NT-3, FIBL, FIBL-NT3, FIBL-linker-NT3, FIBL-(NT3)2 способствует росту аксонов DRG. Статистические данные получают из среднего значения длины аксонов 30 нейронов в каждой группе. Из чертежей видно, что по сравнению с контрольной группой NT3 может способствовать росту аксонов клеток, а FIBL-NT3, FIBL-linker-NT3, FIBL-(NT3) могут более эффективно способствовать росту аксонов.Drawing (Fig. 1) and statistical diagram (Fig. 2). Fibroin fused to NT-3, FIBL, FIBL-NT3, FIBL-linker-NT3, FIBL-(NT3) 2 promotes DRG axonal growth. Statistics are obtained from the average axon length of 30 neurons in each group. From the drawings, it can be seen that compared with the control group, NT3 can promote the growth of cell axons, and FIBL-NT3, FIBL-linker-NT3, FIBL-(NT3) can more effectively promote the growth of axons.
Claims (9)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010396807.7 | 2020-05-12 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045448B1 true EA045448B1 (en) | 2023-11-27 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107998450B (en) | Artificial skin and preparation method and application thereof | |
| Hernández‐Rangel et al. | Collagen based electrospun materials for skin wounds treatment | |
| Kapoor et al. | Silk protein-based hydrogels: Promising advanced materials for biomedical applications | |
| US8071722B2 (en) | Silk biomaterials and methods of use thereof | |
| Hu et al. | Biocompatible fibroin blended films with recombinant human-like collagen for hepatic tissue engineering | |
| JP4463702B2 (en) | Stretchable collagen molded body, production method and use thereof | |
| Li et al. | Silk fibroin scaffolds with a micro-/nano-fibrous architecture for dermal regeneration | |
| CN111821514B (en) | Silk sericin composite membrane and preparation method thereof | |
| Bakhshandeh et al. | A review on advances in the applications of spider silk in biomedical issues | |
| Vidya et al. | Silk fibroin: a promising tool for wound healing and skin regeneration | |
| WO2004001103A2 (en) | Silk biomaterials and methods of use thereof | |
| CN106039416A (en) | Chitosan-sericin composite biological scaffold as well as preparation method and application thereof | |
| WO2021227255A1 (en) | Preparation method for silk fibroin nerve graft fused with nt3 | |
| CN111671980B (en) | Bionic composite bone scaffold and preparation method thereof | |
| Mohammadzadehmoghadam et al. | Electrospinning of silk fibroin-based nanofibers and their applications in tissue engineering | |
| Monzack et al. | Natural materials in tissue engineering applications | |
| EA045448B1 (en) | METHOD FOR CREATION OF SILK FIBROIN NERVE GRAFT FUSED WITH NT3 | |
| US20130230573A1 (en) | Collagen structures and method of fabricating the same | |
| Das et al. | Silk fiber composites in biomedical applications | |
| Wang et al. | Degradable allyl Antheraea pernyi silk fibroin thermoresponsive hydrogels to support cell adhesion and growth | |
| CN111777685A (en) | VEGF-fused silk fibroin graft and preparation method thereof | |
| Dong et al. | Electrospun nanofibrous membranes of recombinant human collagen type III promote cutaneous wound healing | |
| CN105079877B (en) | Fibroin albumen periodontal sticking patch and preparation method thereof | |
| CN114591419B (en) | Thermal hydrolysis protein and preparation method and application thereof | |
| CN117100840A (en) | Application of silk fibroin fusion protein in preparation of skin injury external product |