EA045368B1 - T-CELL ANTIGEN BINDING AGENT WITH VARIOUS OPTIMIZATION OF DESIGNS - Google Patents

T-CELL ANTIGEN BINDING AGENT WITH VARIOUS OPTIMIZATION OF DESIGNS Download PDF

Info

Publication number
EA045368B1
EA045368B1 EA202190288 EA045368B1 EA 045368 B1 EA045368 B1 EA 045368B1 EA 202190288 EA202190288 EA 202190288 EA 045368 B1 EA045368 B1 EA 045368B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
seq
tac
cells
acid sequence
domain
Prior art date
Application number
EA202190288
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Джонатан Лорн Брэмсон
Кристофер В. Хелсен
Джоанн Алисия Хэммилл
Кеннет Энтони Мваваси
Original Assignee
ТРИУМВИРА ИММЬЮНОЛОДЖИКС ЮЭсЭЙ, ИНК.
Макмастерс Юниверсити
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ТРИУМВИРА ИММЬЮНОЛОДЖИКС ЮЭсЭЙ, ИНК., Макмастерс Юниверсити filed Critical ТРИУМВИРА ИММЬЮНОЛОДЖИКС ЮЭсЭЙ, ИНК.
Publication of EA045368B1 publication Critical patent/EA045368B1/en

Links

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявкиCross reference to related applications

По изобретению испрашивается приоритет Предварительной заявки США No. 62/699173, поданной 17 июля 2018 г., предварительной заявки США No. 62/703037, поданной 25 июля 2018 г., предварительной заявки США No. 62/773120, поданной 29 ноября 2018 г., предварительной заявки США No. 62/826853, поданной 29 марта 2019 г., предварительной заявки США No. 62/828879, поданной 03 апреля 2019 г., предварительной заявки США No. 62/839235, поданной 26 апреля 2019 г., Обычной заявки США No. 16/442274, поданной 14 июня 2019 г., и предварительной заявки США No. 62/874426, поданной 15 июля 2019 г., полное содержание каждой из которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки.The invention claims priority to U.S. Provisional Application No. 62/699173, filed July 17, 2018, U.S. Provisional Application No. 62/703037, filed July 25, 2018, U.S. Provisional Application No. 62/773120, filed November 29, 2018, U.S. Provisional Application No. 62/826853, filed March 29, 2019, U.S. Provisional Application No. 62/828879, filed April 3, 2019, U.S. Provisional Application No. 62/839235, filed April 26, 2019, U.S. Regular Application No. 16/442274, filed June 14, 2019, and U.S. Provisional Application No. 62/874426, filed July 15, 2019, the entire contents of each of which are incorporated herein by reference.

Список последовательностейList of sequences

Изобретение содержит список последовательностей, который был подан в электронной форме в формате ASCII и полное содержание которого, таким образом, приведено в качестве ссылки. Указанная копия ASCII, созданная 17 июля 2019 г., названа 55247704601_SL.txt и имеет размер 131072 байт.The invention contains a sequence listing which has been filed electronically in ASCII format and the entire contents of which are therefore incorporated by reference. The ASCII copy in question, created on July 17, 2019, is named 55247704601_SL.txt and is 131072 bytes in size.

Сущность изобретенияThe essence of the invention

В конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к последовательностям нуклеиновой кислоты, кодирующим CD19-трифункциональный связывающий Т-клетку с антигеном агент (CD19-TAC). В некоторых вариантах осуществления, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая CD19-трифункциональный связывающий Т-клетку с антигеном агент (CD19-TAC), содержит: (а) первый полинуклеотид, кодирующий лиганд, избирательно связывающий антиген CD19. В некоторых вариантах осуществления, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая CD19трифункциональный связывающий Т-клетку с антигеном агент (CD19-TAC), содержит: (b) второй полинуклеотид, кодирующий лиганд UCHT1, связывающий CD3. В некоторых вариантах осуществления, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая CD19-трифункциональный связывающий Тклетку с антигеном агент (CD19-TAC), содержит: (с) третий полинуклеотид, кодирующий полипептид передающего сигналы домена TCR, содержащий цитозольный домен и трансмембранный домен. В некоторых вариантах осуществления, компоненты, кодируемые первым, вторым и/или третьим полинуклеотидами, соединены любым подходящим образом, например, в любом подходящим порядке и/или с содержанием любых пригодных линкера(линкеров). В некоторых вариантах осуществления, компоненты, кодируемые (а), компоненты, кодируемые (b), и компоненты, кодируемые (с), слиты непосредственно друг с другом, или соединены посредством по меньшей мере одного линкера. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, избирательно связывающий антиген CD19, представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). В некоторых вариантах осуществления, лиганд, избирательно связывающий антиген CD19, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 96, по меньшей мере 97, по меньшей мере 98, по меньшей мере 99 или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 36. В некоторых вариантах осуществления, лиганд UCHT1 представляет собой одноцепочечное антитело. В некоторых вариантах осуществления, лиганд UCHT1 содержит мутацию Y182T (SEQ ID NO: 72). В некоторых вариантах осуществления, лиганд UCHT1 представляет собой гуманизированный вариант лиганда UCHT1 (huUCHT1) (SEQ ID NO: 44). В некоторых вариантах осуществления, лиганд UCHT1 представляет собой гуманизированный вариант UCHT1, содержащий мутацию Y177T (huUCHT1 (Y177T)) (SEQ ID NO: 46). В некоторых вариантах осуществления, лиганд UCHT1 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 96, по меньшей мере 97, по меньшей мере 98, по меньшей мере 99 или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 44 или SEQ ID NO: 46. В некоторых вариантах осуществления, цитозольный домен представляет собой цитозольный домен CD4, и трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен CD4. В некоторых вариантах осуществления, третий полинуклеотид кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 96, по меньшей мере 97, по меньшей мере 98, по меньшей мере 99 или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления, компонент, кодируемый посредством (а), и компонент, кодируемый посредством (с), слиты с компонентом, кодируемым посредством (b). В некоторых вариантах осуществления, компонент, кодируемый посредством (b), и компонент, кодируемый посредством (с), слиты с компонентом, кодируемым посредством (а). В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере один линкер соединяет компонент, кодируемый посредством (а), с компонентом, кодируемым посредством (b). В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере один линкер представляет собой гибкий линкер G4S (SEQ ID NO: 73), большой домен белка, структуру длинной спирали или структуру короткой спирали. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере один линкер содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 96, по меньшей мере 97, по меньшей мере 98, по меньшей мере 99 или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 12 (гибкий линкер G4S (G4S, описанный как SEQ ID NO: 73)), SEQ ID NO: 32 (большой домен белка), SEQ ID NO: 30 (структура длинной спирали) или SEQ ID NO: 28 (структура короткойIn specific embodiments, the present invention relates to nucleic acid sequences encoding a CD19 trifunctional T cell antigen binding agent (CD19-TAC). In some embodiments, the nucleic acid sequence encoding a CD19 trifunctional T cell antigen binding agent (CD19-TAC) comprises: (a) a first polynucleotide encoding a ligand that selectively binds CD19 antigen. In some embodiments, the nucleic acid sequence encoding a CD19 trifunctional T cell antigen binding agent (CD19-TAC) comprises: (b) a second polynucleotide encoding a CD3 binding UCHT1 ligand. In some embodiments, the nucleic acid sequence encoding a CD19 trifunctional T-cell antigen binding agent (CD19-TAC) comprises: (c) a third polynucleotide encoding a TCR signaling domain polypeptide comprising a cytosolic domain and a transmembrane domain. In some embodiments, the components encoded by the first, second and/or third polynucleotides are linked in any suitable manner, for example, in any suitable order and/or containing any suitable linker(s). In some embodiments, components encoded by (a), components encoded by (b), and components encoded by (c) are fused directly to each other, or connected through at least one linker. In some embodiments, the ligand that selectively binds the CD19 antigen is a single chain variable fragment (scFv). In some embodiments, the CD19 antigen selectively binding ligand comprises an amino acid sequence having at least 80, at least 85, at least 90, at least 95, at least 96, at least 97, at least 98, at least 99 or 100% sequence identity to SEQ ID NO: 36. In some embodiments, the UCHT1 ligand is a single chain antibody. In some embodiments, the UCHT1 ligand contains the Y182T mutation (SEQ ID NO: 72). In some embodiments, the UCHT1 ligand is a humanized variant of the UCHT1 ligand (huUCHT1) (SEQ ID NO: 44). In some embodiments, the UCHT1 ligand is a humanized variant of UCHT1 containing the Y177T mutation (huUCHT1 (Y177T)) (SEQ ID NO: 46). In some embodiments, the UCHT1 ligand comprises an amino acid sequence having at least 80, at least 85, at least 90, at least 95, at least 96, at least 97, at least 98, at least 99 or 100% sequence identity to SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 44, or SEQ ID NO: 46. In some embodiments, the cytosolic domain is a CD4 cytosolic domain, and the transmembrane domain is a CD4 transmembrane domain. CD4 domain. In some embodiments, the third polynucleotide encodes a polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 80, at least 85, at least 90, at least 95, at least 96, at least 97, at least 98, at least 99 or 100% sequence identity to SEQ ID NO: 18. In some embodiments, the component encoded by (a) and the component encoded by (c) are fused to the component encoded by (b). In some embodiments, the component encoded by (b) and the component encoded by (c) are fused with the component encoded by (a). In some embodiments, at least one linker connects the component encoded by (a) to the component encoded by (b). In some embodiments, the at least one linker is a G4S flexible linker (SEQ ID NO: 73), a large protein domain, a long helix structure, or a short helix structure. In some embodiments, the at least one linker contains an amino acid sequence having at least 80, at least 85, at least 90, at least 95, at least 96, at least 97, at least 98, at least 99 or 100% sequence identity to SEQ ID NO: 12 (G4S flexible linker (G4S, described as SEQ ID NO: 73)), SEQ ID NO: 32 (large protein domain), SEQ ID NO: 30 (structure long helix) or SEQ ID NO: 28 (short helix structure

- 1 045368 спирали). В некоторых вариантах осуществления, CD3 происходит из комплекса TCR на клетке, экспрессирующей второй полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления, связывание CD3 индуцирует активацию клетки, экспрессирующей второй полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления, CD19-TAC содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 96, по меньшей мере 97, по меньшей мере 98, по меньшей мере 99 или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 63. В некоторых вариантах осуществления, CD19-TAC содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 96, по меньшей мере 97, по меньшей мере 98, по меньшей мере 99 или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 64. В некоторых вариантах осуществления, последовательность нуклеиновой кислоты не кодирует костимулирующий домен. В некоторых вариантах осуществления, последовательность нуклеиновой кислоты не кодирует активирующий домен.- 1 045368 spirals). In some embodiments, CD3 is derived from a TCR complex on a cell expressing the second polynucleotide. In some embodiments, CD3 binding induces activation of a cell expressing the second polynucleotide. In some embodiments, CD19-TAC comprises a nucleic acid sequence having at least 80, at least 85, at least 90, at least 95, at least 96, at least 97, at least 98, at least 99 or 100% sequence identity to SEQ ID NO: 63. In some embodiments, CD19-TAC comprises an amino acid sequence having at least 80, at least 85, at least 90, at least 95, at least at least 96, at least 97, at least 98, at least 99, or 100% sequence identity to SEQ ID NO: 64. In some embodiments, the nucleic acid sequence does not encode a costimulatory domain. In some embodiments, the nucleic acid sequence does not encode an activating domain.

В конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к векторным конструкциям, содержащим: (а) последовательность нуклеиновой кислоты, описанную в настоящем описании (например, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CD19-TAC); и (b) промотор, функциональный в клетке млекопитающего.In specific embodiments, the present invention provides vector constructs comprising: (a) a nucleic acid sequence described herein (eg, a nucleic acid sequence encoding CD19-TAC); and (b) a promoter functional in a mammalian cell.

В конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к Т-клеткам, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, описанную в настоящем описании (например, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CD19-TAC).In specific embodiments, the present invention relates to T cells containing a nucleic acid sequence described herein (eg, a nucleic acid sequence encoding CD19-TAC).

В конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащем Т-клетку, описанную в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый наполнитель.In specific embodiments, the present invention provides pharmaceutical compositions comprising a T cell as described herein and a pharmaceutically acceptable excipient.

В конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способам лечения злокачественной опухоли, экспрессирующей CD19, у нуждающегося в этом индивидуума, включающим введение индивидууму фармацевтической композиции, описанной в настоящем описании, (например, фармацевтической композиции, содержащей Т-клетку, содержащую любую последовательность нуклеиновой кислоты, описанную в настоящем описании, такую как любые последовательность или последовательности нуклеиновой кислоты, описанные в настоящем описании как кодирующие CD19трифункциональный связывающий Т-клетку с антигеном агент (CD19-TAC)). В некоторых вариантах осуществления, злокачественная опухоль представляет собой В-клеточное злокачественное новообразование. В некоторых вариантах осуществления, злокачественная опухоль представляет собой Вклеточную лимфому, острый лимфобластный лейкоз (ALL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL) или неходжкинскую лимфому. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтическую композицию вводят трансартериально, подкожно, внутрикожно, внутрь опухоли, внутрь узлов, интрамедуллярно, внутримышечно, внутривенно или внутрибрюшинно.In specific embodiments, the present invention relates to methods of treating a CD19-expressing cancer in an individual in need thereof, comprising administering to the individual a pharmaceutical composition described herein (e.g., a pharmaceutical composition comprising a T cell containing any nucleic acid sequence described herein, such as any nucleic acid sequence or sequences described herein as encoding a CD19 trifunctional T cell antigen binding agent (CD19-TAC)). In some embodiments, the cancer is a B-cell malignancy. In some embodiments, the cancer is B cell lymphoma, acute lymphoblastic leukemia (ALL), chronic lymphocytic leukemia (CLL), or non-Hodgkin's lymphoma. In some embodiments, the pharmaceutical composition is administered transarterially, subcutaneously, intradermally, intratumorally, intranodally, intramedullary, intramuscularly, intravenously, or intraperitoneally.

В конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей трифункциональный связывающий Т-клетку с антигеном агент (триТАС), содержащей: (а) первый полинуклеотид, кодирующий специфический для мишени лиганд; (b) второй полинуклеотид, кодирующий лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR; и (с) третий полинуклеотид, кодирующий полипептид передающего сигналы домена Т-клеточного рецептора; где лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR, выбран из ОКТ3, F6A или L2K. В некоторых вариантах осуществления, компонент, кодируемый посредством (а), компонент, кодируемый посредством (b), и компонент, кодируемый посредством (с), слиты непосредственно друг с другом или соединены посредством по меньшей мере одного линкера. В некоторых вариантах осуществления, компонент, кодируемый посредством (а), и компонент, кодируемый посредством (b), непосредственно связаны и соединены с компонентом, кодируемым посредством (с), посредством линкера. В некоторых вариантах осуществления, компонент, кодируемый посредством (b), и компонент, кодируемый посредством (с), непосредственно связаны и соединены с компонентом, кодируемым посредством (а), посредством линкера. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере один линкер представляет собой гибкий линкер G4S (SEQ ID NO: 73), большой домен белка, структуру длинной спирали или структуру короткой спирали. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере один линкер имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 96, по меньшей мере 97, по меньшей мере 98, по меньшей мере 99 или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 12 (гибкий линкер G4S (G4S, описанный как SEQ ID NO: 73)), SEQ ID NO: 32 (большой домен белка), SEQ ID NO: 30 (структура длинной спирали) или SEQ ID NO: 28 (структура короткой спирали). В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR, представляет собой ОКТ3. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 96, по меньшей мере 97, по меньшей мере 98, по меньшей мере 99 или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR, представIn specific embodiments, the present invention provides a nucleic acid sequence encoding a trifunctional T cell antigen binding agent (triTAC) comprising: (a) a first polynucleotide encoding a target-specific ligand; (b) a second polynucleotide encoding a ligand that binds a protein associated with the TCR complex; and (c) a third polynucleotide encoding a T cell receptor signaling domain polypeptide; wherein the ligand binding protein associated with the TCR complex is selected from OKT3, F6A or L2K. In some embodiments, the component encoded by (a), the component encoded by (b), and the component encoded by (c) are fused directly to each other or connected through at least one linker. In some embodiments, the component encoded by (a) and the component encoded by (b) are directly linked and connected to the component encoded by (c) via a linker. In some embodiments, the component encoded by (b) and the component encoded by (c) are directly linked and connected to the component encoded by (a) via a linker. In some embodiments, the at least one linker is a G4S flexible linker (SEQ ID NO: 73), a large protein domain, a long helix structure, or a short helix structure. In some embodiments, the at least one linker has an amino acid sequence having at least 80, at least 85, at least 90, at least 95, at least 96, at least 97, at least 98, at least 99 or 100% sequence identity to SEQ ID NO: 12 (G4S flexible linker (G4S, described as SEQ ID NO: 73)), SEQ ID NO: 32 (protein large domain), SEQ ID NO: 30 (structure long helix) or SEQ ID NO: 28 (short helix structure). In some embodiments, the TCR complex-associated protein binding ligand is OKT3. In some embodiments, the TCR complex-associated protein binding ligand comprises an amino acid sequence having at least 80, at least 85, at least 90, at least 95, at least 96, at least 97, at least 98, at least 99, or 100% sequence identity to SEQ ID NO: 22. In some embodiments, the TCR complex-associated protein binding ligand is

- 2 045368 ляет собой F6A. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 96, по меньшей мере 97, по меньшей мере 98, по меньшей мере 99 или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR, представляет собой L2K. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 96, по меньшей мере 97, по меньшей мере 98, по меньшей мере 99 или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления, белок, ассоциированный с комплексом TCR, представляет собой CD3. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд избирательно связывает антиген опухоли. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд представляет собой сконструированный полипептид с анкириновым повтором (DARPin) или одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд избирательно связывает антиген CD19, антиген HER2 или антиген ВСМА. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд, избирательно связывающий антиген HER-2, содержит антигенсвязывающий домен антитела, выбранного из трастузумаба, пертузумаба, лапатиниба, нератиниба, адо-трастузумаба эмтанзина, ганкотамаба, маргетуксимаба, тимигутузумаба и эртумаксомаба. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд, избирательно связывающий антиген ВСМА, содержит антигенсвязывающий домен антитела, выбранного из белантамаба мафодотина и GSK2857916. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 96, по меньшей мере 97, по меньшей мере 98, по меньшей мере 99 или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 34. В некоторых вариантах осуществления, полипептид передающего сигналы домена Т-клеточного рецептора содержит цитозольный домен и трансмембранный домен. В некоторых вариантах осуществления, цитозольный домен представляет собой цитозольный домен CD4, и трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен CD4, или при этом цитозольный домен представляет собой цитозольный домен CD8, и трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен CD8. В некоторых вариантах осуществления, последовательности нуклеиновой кислоты дополнительно содержат лидерную последовательность. В некоторых вариантах осуществления, лидерная последовательность содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 96, по меньшей мере 97, по меньшей мере 98, по меньшей мере 99 или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 48 или SEQ ID NO: 50. В некоторых вариантах осуществления, CD3 происходит из комплекса TCR на клетке, экспрессирующей второй полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления, связывание CD3 индуцирует активацию клетки, экспрессирующей второй полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 96, по меньшей мере 97, по меньшей мере 98, по меньшей мере 99 или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59 или SEQ ID NO: 61. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 96, по меньшей мере 97, по меньшей мере 98, по меньшей мере 99 или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60 или SEQ ID NO: 62. В некоторых вариантах осуществления, последовательность нуклеиновой кислоты не кодирует костимулирующий домен. В некоторых вариантах осуществления, последовательность нуклеиновой кислоты не кодирует активирующий домен.- 2 045368 is an F6A. In some embodiments, the TCR complex-associated protein binding ligand comprises an amino acid sequence having at least 80, at least 85, at least 90, at least 95, at least 96, at least 97, at least 98, at least 99, or 100% sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, the TCR complex-associated protein binding ligand is L2K. In some embodiments, the TCR complex-associated protein binding ligand comprises an amino acid sequence having at least 80, at least 85, at least 90, at least 95, at least 96, at least 97, at least 98, at least 99, or 100% sequence identity to SEQ ID NO: 26. In some embodiments, the TCR complex-associated protein is CD3. In some embodiments, the target-specific ligand selectively binds a tumor antigen. In some embodiments, the target-specific ligand is a designed ankyrin repeat polypeptide (DARPin) or single chain variable fragment (scFv). In some embodiments, the target-specific ligand selectively binds CD19 antigen, HER2 antigen, or BCMA antigen. In some embodiments, the target-specific ligand that selectively binds the HER-2 antigen comprises the antigen binding domain of an antibody selected from trastuzumab, pertuzumab, lapatinib, neratinib, ado-trastuzumab emtansine, gancotamab, margetuximab, timigutuzumab, and ertumaxomab. In some embodiments, the target-specific ligand that selectively binds the BCMA antigen comprises the antigen binding domain of an antibody selected from belantamab mafodotin and GSK2857916. In some embodiments, the target-specific ligand comprises an amino acid sequence having at least 80, at least 85, at least 90, at least 95, at least 96, at least 97, at least 98, at least 99 or 100% sequence identity to SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 8, or SEQ ID NO: 34. In some embodiments, the T cell receptor signaling domain polypeptide comprises a cytosolic domain and a transmembrane domain. In some embodiments, the cytosolic domain is a CD4 cytosolic domain and the transmembrane domain is a CD4 transmembrane domain, or wherein the cytosolic domain is a CD8 cytosolic domain and the transmembrane domain is a CD8 transmembrane domain. In some embodiments, the nucleic acid sequences further comprise a leader sequence. In some embodiments, the leader sequence comprises an amino acid sequence having at least 80, at least 85, at least 90, at least 95, at least 96, at least 97, at least 98, at least 99 or 100% sequence identity to SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 48, or SEQ ID NO: 50. In some embodiments, CD3 is derived from the TCR complex on a cell expressing the second polynucleotide. In some embodiments, CD3 binding induces activation of a cell expressing the second polynucleotide. In some embodiments, tri-TAC comprises a nucleic acid sequence having at least 80, at least 85, at least 90, at least 95, at least 96, at least 97, at least 98, at least 99 or 100% sequence identity to SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59 or SEQ ID NO: 61. In some embodiments, tri-TAC comprises an amino acid sequence having at least 80, at least 85, at least 90, at least 95, at least 96, at least 97, at least 98, at least 99, or 100% sequence identity to SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58 , SEQ ID NO: 60 or SEQ ID NO: 62. In some embodiments, the nucleic acid sequence does not encode a costimulatory domain. In some embodiments, the nucleic acid sequence does not encode an activating domain.

В конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей трифункциональный связывающий Т-клетку с антигеном агент (триТАС), содержащий: (а) первый полинуклеотид, кодирующий специфический для мишени лиганд; (b) второй полинуклеотид, кодирующий лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR; и (с) третий полинуклеотид, кодирующий полипептид передающего сигналы домена Т-клеточного рецептора; где последовательность нуклеиновой кислоты дополнительно содержит лидерную последовательность, и где компонент, кодируемый посредством (а), компонент, кодируемый посредством (b), и компонент, кодируемый посредством (с), слиты непосредственно друг с другом или соединены посредством по меньшей мере одного линкера. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд избирательно связывает антиген опухоли. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд представляет собой сконструированный полипептид с анкириновым повтором (DARPin) или одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд избирательно связывает антиген CD19, антиген HER2 илиIn specific embodiments, the present invention provides a nucleic acid sequence encoding a trifunctional T cell antigen binding agent (triTAC) comprising: (a) a first polynucleotide encoding a target-specific ligand; (b) a second polynucleotide encoding a ligand that binds a protein associated with the TCR complex; and (c) a third polynucleotide encoding a T cell receptor signaling domain polypeptide; wherein the nucleic acid sequence further comprises a leader sequence, and wherein the component encoded by (a), the component encoded by (b), and the component encoded by (c) are directly fused to each other or connected by at least one linker. In some embodiments, the target-specific ligand selectively binds a tumor antigen. In some embodiments, the target-specific ligand is a designed ankyrin repeat polypeptide (DARPin) or single chain variable fragment (scFv). In some embodiments, the target-specific ligand selectively binds CD19 antigen, HER2 antigen, or

- 3 045368 антиген ВСМА. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд, избирательно связывающий антиген HER-2, содержит антигенсвязывающий домен антитела, выбранного из трастузумаба, пертузумаба, лапатиниба, нератиниба, адо-трастузумаба эмтанзина, ганкотамаба, маргетуксимаба, тимигутузумаба и эртумаксомаба. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд, избирательно связывающий антиген ВСМА, содержит антигенсвязывающий домен антитела, выбранного из белантамаба мафодотина и GSK2857916. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 96, по меньшей мере 97, по меньшей мере 98, по меньшей мере 99 или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 52 или SEQ ID NO: 54. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR, выбран из UCHT1, UCHT1 (Y182T), huUCHT1, huUCHTl (Y177T), ОКТ3, F6A или L2K. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR, имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 96, по меньшей мере 97, по меньшей мере 98, по меньшей мере 99 или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 или SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления, белок, ассоциированный с комплексом TCR, представляет собой CD3. В некоторых вариантах осуществления, полипептид передающего сигналы домена Т-клеточного рецептора содержит цитозольный домен и трансмембранный домен. В некоторых вариантах осуществления, цитозольный домен представляет собой цитозольный домен CD4, и трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен CD4, или при этом цитозольный домен представляет собой цитозольный домен CD8, и трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен CD8. В некоторых вариантах осуществления, лидерная последовательность содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 96, по меньшей мере 97, по меньшей мере 98, по меньшей мере 99 или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 48 или SEQ ID NO: 50. В некоторых вариантах осуществления, компонент, кодируемый посредством (а), и компонент, кодируемый посредством (b), непосредственно связаны и соединены с компонентом, кодируемым посредством (с), посредством линкера. В некоторых вариантах осуществления, компонент, кодируемый посредством (b), и компонент, кодируемый посредством (с), непосредственно связаны и соединены с компонентом, кодируемым посредством (а), посредством линкера. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере один линкер представляет собой гибкий линкер G4S (SEQ ID NO: 73), большой домен белка, структуру длинной спирали или структуру короткой спирали. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере один линкер имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 96, по меньшей мере 97, по меньшей мере 98, по меньшей мере 99 или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 12 (гибкий линкер G4S (G4S, описанный как SEQ ID NO: 73)), SEQ ID NO: 32 (большой домен белка), sEq ID NO: 30 (структура длинной спирали) или SEQ ID NO: 28 (структура короткой спирали). В некоторых вариантах осуществления, CD3 происходит из комплекса TCR на клетке, экспрессирующей второй полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления, связывание CD3 индуцирует активацию клетки, экспрессирующей второй полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 96, по меньшей мере 97, по меньшей мере 98, по меньшей мере 99 или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59 или SEQ ID NO: 61. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 96, по меньшей мере 97, по меньшей мере 98, по меньшей мере 99 или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60 или SEQ ID NO: 62. В некоторых вариантах осуществления, последовательность нуклеиновой кислоты не кодирует костимулирующий домен. В некоторых вариантах осуществления, последовательность нуклеиновой кислоты не кодирует активирующий домен.- 3 045368 BCMA antigen. In some embodiments, the target-specific ligand that selectively binds the HER-2 antigen comprises the antigen binding domain of an antibody selected from trastuzumab, pertuzumab, lapatinib, neratinib, ado-trastuzumab emtansine, gancotamab, margetuximab, timigutuzumab, and ertumaxomab. In some embodiments, the target-specific ligand that selectively binds the BCMA antigen comprises the antigen binding domain of an antibody selected from belantamab mafodotin and GSK2857916. In some embodiments, the target-specific ligand comprises an amino acid sequence having at least 80, at least 85, at least 90, at least 95, at least 96, at least 97, at least 98, at least 99 or 100% sequence identity to SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 52, or SEQ ID NO: 54. In some embodiments, the ligand binding protein associated with a TCR complex, selected from UCHT1, UCHT1 (Y182T), huUCHT1, huUCHTl (Y177T), OKT3, F6A or L2K. In some embodiments, the TCR complex-associated protein binding ligand has an amino acid sequence having at least 80, at least 85, at least 90, at least 95, at least 96, at least 97, at least 98, at least 99, or 100% sequence identity to SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 or SEQ ID NO: 26. In some embodiments, the TCR complex associated protein is CD3. In some embodiments, the T cell receptor signaling domain polypeptide comprises a cytosolic domain and a transmembrane domain. In some embodiments, the cytosolic domain is a CD4 cytosolic domain and the transmembrane domain is a CD4 transmembrane domain, or wherein the cytosolic domain is a CD8 cytosolic domain and the transmembrane domain is a CD8 transmembrane domain. In some embodiments, the leader sequence comprises an amino acid sequence having at least 80, at least 85, at least 90, at least 95, at least 96, at least 97, at least 98, at least 99 or 100% sequence identity to SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 48, or SEQ ID NO: 50. In some embodiments, the component encoded by (a) and the component encoded by (b) are directly related and connected to the component encoded by (c) via a linker. In some embodiments, the component encoded by (b) and the component encoded by (c) are directly linked and connected to the component encoded by (a) via a linker. In some embodiments, the at least one linker is a G4S flexible linker (SEQ ID NO: 73), a large protein domain, a long helix structure, or a short helix structure. In some embodiments, the at least one linker has an amino acid sequence having at least 80, at least 85, at least 90, at least 95, at least 96, at least 97, at least 98, at least 99 or 100% sequence identity to SEQ ID NO: 12 (G4S flexible linker (G4S, described as SEQ ID NO: 73)), SEQ ID NO: 32 (large protein domain), sEq ID NO: 30 (structure long helix) or SEQ ID NO: 28 (short helix structure). In some embodiments, CD3 is derived from a TCR complex on a cell expressing the second polynucleotide. In some embodiments, CD3 binding induces activation of a cell expressing the second polynucleotide. In some embodiments, tri-TAC comprises a nucleic acid sequence having at least 80, at least 85, at least 90, at least 95, at least 96, at least 97, at least 98, at least 99 or 100% sequence identity to SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59 or SEQ ID NO: 61. In some embodiments, tri-TAC comprises an amino acid sequence having at least 80, at least 85, at least 90, at least 95, at least 96, at least 97, at least 98, at least 99, or 100% sequence identity to SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58 , SEQ ID NO: 60 or SEQ ID NO: 62. In some embodiments, the nucleic acid sequence does not encode a costimulatory domain. In some embodiments, the nucleic acid sequence does not encode an activating domain.

В конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к полипептидам, кодируемым посредством последовательности нуклеиновой кислоты, описанной в настоящем описании.In specific embodiments, the present invention relates to polypeptides encoded by a nucleic acid sequence described herein.

В конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к векторным конструкциям, содержащим: (а) последовательность нуклеиновой кислоты, описанную в настоящем описании; и (b) промотор, функциональный в клетке млекопитающего.In specific embodiments, the present invention provides vector constructs comprising: (a) a nucleic acid sequence described herein; and (b) a promoter functional in a mammalian cell.

В конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к Т-клеткам, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, описанную в настоящем описании.In specific embodiments, the present invention relates to T cells containing a nucleic acid sequence described herein.

В конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим Т-клетку, описанную в настоящем описании, и фармацевтически приемле- 4 045368 мый наполнитель.In specific embodiments, the present invention provides pharmaceutical compositions comprising a T cell as described herein and a pharmaceutically acceptable excipient.

В конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способам лечения злокачественной опухоли у нуждающегося в этом индивидуума, включающим введение индивидууму фармацевтической композиции, описанной в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления, субъект представляет собой млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления, злокачественная опухоль представляет собой солидную злокачественную опухоль или жидкую злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления, злокачественная опухоль представляет собой рак легкого, рак молочной железы, множественную миелому, глиобластому, рак желудка, рак яичника, рак желудка, колоректальный рак, рак уротелия, рак эндометрия, или рак ободочной кишки. В некоторых вариантах осуществления, злокачественная опухоль содержит экспрессирующую CD19 клетку злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления, злокачественная опухоль представляет собой Вклеточное злокачественное новообразование. В некоторых вариантах осуществления, злокачественная опухоль представляет собой В-клеточную лимфому, острый лимфобластный лейкоз (ALL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL) или неходжкинскую лимфому. В некоторых вариантах осуществления, злокачественная опухоль содержит экспрессирующую HER-2 клетку злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления, злокачественная опухоль представляет собой рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак яичника или рак желудка. В некоторых вариантах осуществления, злокачественная опухоль содержит экспрессирующую ВСМА клетку злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления, злокачественная опухоль представляет собой лейкоз, лимфому или множественную миелому. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтическую композицию вводят индивидууму трансартериально, подкожно, внутрикожно, внутрь опухоли, внутрь узлов, интрамедуллярно, внутримышечно, внутривенно или внутрибрюшинно. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтическая композиция находится в форме единичной дозы. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтическая композиция содержит приблизительно 0,5-2x109 Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтическую композицию вводят ежесуточно, еженедельно, раз в две недели, ежемесячно, раз в два месяца или ежегодно.In specific embodiments, the present invention relates to methods of treating a cancer in an individual in need thereof, comprising administering to the individual a pharmaceutical composition described herein. In some embodiments, the subject is a mammal. In some embodiments, the cancer is a solid cancer or a liquid cancer. In some embodiments, the cancer is lung cancer, breast cancer, multiple myeloma, glioblastoma, gastric cancer, ovarian cancer, gastric cancer, colorectal cancer, urothelial cancer, endometrial cancer, or colon cancer. In some embodiments, the cancer comprises a CD19-expressing cancer cell. In some embodiments, the cancer is a B-cell malignancy. In some embodiments, the cancer is a B cell lymphoma, acute lymphoblastic leukemia (ALL), chronic lymphocytic leukemia (CLL), or non-Hodgkin's lymphoma. In some embodiments, the cancer comprises a HER-2 expressing cancer cell. In some embodiments, the cancer is breast cancer, bladder cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, or stomach cancer. In some embodiments, the cancer comprises a BCMA-expressing cancer cell. In some embodiments, the cancer is leukemia, lymphoma, or multiple myeloma. In some embodiments, the pharmaceutical composition is administered to an individual transarterially, subcutaneously, intradermally, intratumorally, intranodally, intramedullary, intramuscularly, intravenously, or intraperitoneally. In some embodiments, the pharmaceutical composition is in unit dose form. In some embodiments, the pharmaceutical composition contains approximately 0.5-2x109 T cells. In some embodiments, the pharmaceutical composition is administered daily, weekly, biweekly, monthly, bimonthly, or annually.

В конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей CD19-трифункциональный связывающий Т-клетку с антигеном агент (CD19-TAC), содержащий: (а) первый полинуклеотид, кодирующий лиганд, избирательно связывающий антиген CD19; (b) второй полинуклеотид, кодирующий гуманизированный вариант лиганда UCHT1 (huUCHT1), содержащий мутацию Y177T (huUCHT1 (Y177T)), связывающий CD3; и (с) третий полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий цитозольный домен CD4 и трансмембранный домен CD4; где лиганд, кодируемый посредством (а), лиганд, кодируемый посредством (b), и полипептид, кодируемый посредством (с), слиты непосредственно друг с другом, или соединены посредством по меньшей мере одного линкера. В некоторых вариантах осуществления, последовательность нуклеиновой кислоты не кодирует костимулирующий домен, активирующий домен или как костимулирующий домен, так и активирующий домен. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, избирательно связывающий антиген CD19, представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). В некоторых вариантах осуществления, лиганд, избирательно связывающий антиген CD19, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80, по меньшей мере 90 или по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 36. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, избирательно связывающий антиген CD19, содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 36. В некоторых вариантах осуществления, лиганд huUCHT1 (Y177T) представляет собой одноцепочечное антитело. В некоторых вариантах осуществления, лиганд huUCHT1 (Y177T) содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80, по меньшей мере 90, или по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 46. В некоторых вариантах осуществления, лиганд huUCHT1 (Y177T) содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 46. В некоторых вариантах осуществления, третий полинуклеотид кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 18.In specific embodiments, the present invention provides a nucleic acid sequence encoding a CD19 trifunctional T cell antigen binding agent (CD19-TAC) comprising: (a) a first polynucleotide encoding a ligand that selectively binds CD19 antigen; (b) a second polynucleotide encoding a humanized variant of the UCHT1 ligand (huUCHT1) containing the Y177T mutation (huUCHT1 (Y177T)) binding to CD3; and (c) a third polynucleotide encoding a polypeptide comprising a CD4 cytosolic domain and a CD4 transmembrane domain; wherein the ligand encoded by (a), the ligand encoded by (b), and the polypeptide encoded by (c) are fused directly to each other, or connected through at least one linker. In some embodiments, the nucleic acid sequence does not encode a costimulatory domain, an activating domain, or both a costimulatory domain and an activating domain. In some embodiments, the ligand that selectively binds the CD19 antigen is a single chain variable fragment (scFv). In some embodiments, the CD19 antigen selectively binding ligand contains an amino acid sequence having at least 80%, at least 90%, or at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 36. In some embodiments, the CD19 antigen selectively binding ligand has CD19 antigen, contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36. In some embodiments, the huUCHT1 ligand (Y177T) is a single chain antibody. In some embodiments, the huUCHT1 ligand (Y177T) comprises an amino acid sequence having at least 80, at least 90, or at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 46. In some embodiments, the huUCHT1 ligand (Y177T) contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46. In some embodiments, the third polynucleotide encodes a polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 80%, at least 90%, or at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 18 .

В некоторых вариантах осуществления, третий полинуклеотид кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере один линкер представляет собой гибкий линкер G4S, большой домен белка, структуру длинной спирали или структуру короткой спирали. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере один линкер содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 30 или SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере один линкер содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 30 или SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах осуществления, CD3 экспрессирован на клетке, экспрессирующей второй полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления, CD19-TAC содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 63. В некоторых вариантах осущестIn some embodiments, the third polynucleotide encodes a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18. In some embodiments, the at least one linker is a G 4 S flexible linker, a large protein domain, a long helix structure, or a short helix structure. In some embodiments, the at least one linker comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 90%, or at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO : 30 or SEQ ID NO: 28. In some embodiments, the at least one linker comprises an amino acid sequence from SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 30, or SEQ ID NO: 28. In some embodiments implementation, CD3 is expressed on a cell expressing the second polynucleotide. In some embodiments, CD19-TAC comprises a nucleic acid sequence having at least 80%, at least 90%, or at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 63. In some embodiments,

- 5 045368 вления, CD19-TAC содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 64. В некоторых вариантах осуществления, CD19-TAC содержит последовательность из SEQ ID NO: 63 или SEQ ID NO: 64. В конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к векторным конструкциям, содержащим: (а) последовательность нуклеиновой кислоты, описанную в настоящем описании; и (b) промотор, функциональный в клетке млекопитающего. В конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к композициям, содержащим вектор, описанный в настоящем описании, и наполнитель. В конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к полипептидам, кодируемым посредством последовательности нуклеиновой кислоты, описанной в настоящем описании.- 5 045368 phenomenon, CD19-TAC contains an amino acid sequence having at least 80%, at least 90%, or at least 95% sequence identity with SEQ ID NO: 64. In some embodiments, CD19-TAC contains the sequence from SEQ ID NO: 63 or SEQ ID NO: 64. In specific embodiments, the present invention provides vector constructs comprising: (a) a nucleic acid sequence described herein; and (b) a promoter functional in a mammalian cell. In specific embodiments, the present invention provides compositions comprising a vector as described herein and an excipient. In specific embodiments, the present invention relates to polypeptides encoded by a nucleic acid sequence described herein.

В конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к последовательностям нуклеиновой кислоты, кодирующим HER2-трифункциональный связывающий Т-клетку с антигеном агент (HER2-TAC), содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 96, по меньшей мере 97, по меньшей мере 98, по меньшей мере 99 или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67 или SEQ ID NO: 75. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 96, по меньшей мере 97, по меньшей мере 98, по меньшей мере 99 или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68 или SEQ ID NO: 76. В некоторых вариантах осуществления, последовательность нуклеиновой кислоты не кодирует костимулирующий домен. В некоторых вариантах осуществления, последовательность нуклеиновой кислоты не кодирует активирующий домен.In specific embodiments, the present invention provides nucleic acid sequences encoding a HER2 trifunctional T cell antigen binding agent (HER2-TAC), comprising a nucleic acid sequence having at least 80, at least 85, at least 90 , at least 95, at least 96, at least 97, at least 98, at least 99, or 100% sequence identity to SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, or SEQ ID NO: 75. B In some embodiments, HER2-TAC comprises an amino acid sequence having at least 80, at least 85, at least 90, at least 95, at least 96, at least 97, at least 98, at least 99 or 100% sequence identity to SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, or SEQ ID NO: 76. In some embodiments, the nucleic acid sequence does not encode a costimulatory domain. In some embodiments, the nucleic acid sequence does not encode an activating domain.

В конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к последовательностям нуклеиновой кислоты, кодирующим ВСМА-трифункциональный связывающий Т-клетку с антигеном агент (ВСМА-ТАС), содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 96, по меньшей мере 97, по меньшей мере 98, по меньшей мере 99 или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59 или SEQ ID NO: 61. В некоторых вариантах осуществления, ВСМА-ТАС содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 96, по меньшей мере 97, по меньшей мере 98, по меньшей мере 99 или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, или SEQ ID NO: 62. В некоторых вариантах осуществления, последовательность нуклеиновой кислоты не кодирует костимулирующий домен. В некоторых вариантах осуществления, последовательность нуклеиновой кислоты не кодирует активирующий домен.In specific embodiments, the present invention provides nucleic acid sequences encoding a BCMA-trifunctional T-cell antigen binding agent (BCMA-TAC) comprising a nucleic acid sequence having at least 80, at least 85, at least 90 , at least 95, at least 96, at least 97, at least 98, at least 99, or 100% sequence identity to SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, or SEQ ID NO: 61. In some embodiments, BCMA-TAC comprises an amino acid sequence having at least 80, at least 85, at least 90, at least 95, at least 96, at least 97, at least at least 98, at least 99, or 100% sequence identity to SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, or SEQ ID NO: 62. In some embodiments, the nucleic acid sequence does not encode a co-stimulatory domain . In some embodiments, the nucleic acid sequence does not encode an activating domain.

Краткое описание чертежейBrief description of drawings

Новые признаки изобретения конкретно указаны в прилагаемой формуле изобретения. Лучшее понимание признаков и преимуществ настоящего изобретения можно получить со ссылкой на следующее подробное описание, в котором указаны иллюстративные варианты осуществления, в которых использованы принципы изобретения, и на сопутствующие чертежи, в которых:The new features of the invention are specifically indicated in the accompanying claims. A better understanding of the features and advantages of the present invention may be obtained with reference to the following detailed description, which sets forth illustrative embodiments employing the principles of the invention, and the accompanying drawings, in which:

Фиг. 1А представляет собой схему природной активации Т-клетки.Fig. 1A is a diagram of natural T cell activation.

Фиг. 1В представляет собой схему основанной на CAR активации Т-клетки.Fig. 1B is a diagram of CAR-based T cell activation.

Фиг. 1С представляет собой схему основанной на трифункциональном связывающем Т-клетку с антигеном агенте (три-ТАС) активации Т-клетки.Fig. 1C is a diagram of trifunctional T cell antigen binding agent (tri-TAC) based T cell activation.

Фиг. 1D представляет собой схему природной активации Т-клетки.Fig. 1D is a diagram of natural T cell activation.

Фиг. 1E представляет собой схему основанной на CAR активации Т-клетки.Fig. 1E is a diagram of CAR-based T cell activation.

Фиг. 1F представляет собой схему основанной на три-ТАС активации Т-клетки.Fig. 1F is a diagram of tri-TAC-based T cell activation.

Фиг. 2А представляет собой схему конфигурации три-ТАС с доменом UCHT1 в центре между трансмембранным доменом (ТМ) и антигенсвязывающим доменом.Fig. 2A is a diagram of the tri-TAC configuration with the UCHT1 domain in the center between the transmembrane domain (TM) and the antigen binding domain.

Фиг. 2В представляет собой схему конфигурации три-ТАС, в которой домен UCHT1 находится на N-конце, за ним следуют антигенсвязывающий домен и трансмембранный домен.Fig. 2B is a diagram of the tri-TAC configuration in which the UCHT1 domain is at the N-terminus, followed by the antigen binding domain and the transmembrane domain.

Фиг. 2С представляет собой схему молекулы три-ТАС с типичным антигенсвязывающим доменом и доменом UCHT1.Fig. 2C is a diagram of a tri-TAC molecule with a typical antigen binding domain and a UCHT1 domain.

Фиг. 3А представляет собой схему молекулы три-ТАС с типичным антигенсвязывающим доменом.Fig. 3A is a diagram of a tri-TAC molecule with a typical antigen binding domain.

Фиг. 3В представляет собой схему три-ТАС с антигенсвязывающим доменом DARPin против HER2.Fig. 3B is a tri-TAC design with the anti-HER2 DARPin antigen binding domain.

Фиг. 3С представляет собой схему три-ТАС с антигенсвязывающим доменом scFv против CD19.Fig. 3C is a tri-TAC design with anti-CD19 scFv antigen binding domain.

Фиг. 3D представляет собой схему три-ТАС с антигенсвязывающим доменом scFv против ВСМА.Fig. 3D is a diagram of tri-TAC with anti-BCMA scFv antigen binding domain.

Фиг. 3Е представляет собой схему молекулы три-ТАС с антигенсвязывающим доменом DARPin против HER-2.Fig. 3E is a diagram of a tri-TAC molecule with an anti-HER-2 DARPin antigen binding domain.

Фиг. 3F представляет собой схему молекулы три-ТАС с антигенсвязывающим доменом scFv против ВСМА.Fig. 3F is a diagram of a tri-TAC molecule with an anti-BCMA scFv antigen binding domain.

Фиг. 4A-4D иллюстрируют Т-клетки, модифицированные с использованием три-ТАС или CAR наFig. 4A-4D illustrate T cells modified using tri-TAC or CAR on

- 6 045368 основе CD28, нацеленных против HER-2 с использованием DARPin. Фиг. 4А иллюстрирует поверхностную экспрессию три-ТАС и CAR, по сравнению с Т-клетками, не экспрессирующими химерного рецептора. Фиг. 4В иллюстрирует рост трех популяций клеток. Фиг. 4С, 4D иллюстрируют процент модифицированных клеток, положительных по различным маркерам активации Т-клетки, после стимуляции антигеном.- 6 045368 based CD28 targeting HER-2 using DARPin. Fig. 4A illustrates surface expression of tri-TAC and CAR compared to T cells not expressing the chimeric receptor. Fig. 4B illustrates the growth of three cell populations. Fig. 4C, 4D illustrate the percentage of modified cells positive for various markers of T cell activation following antigen stimulation.

Фиг. 5 иллюстрирует модель структуры белка CD19-TAC.Fig. 5 illustrates a model of the CD19-TAC protein structure.

Фиг. 6A-6J иллюстрируют поверхностную экспрессию рецептора и активацию различных контрольных DARPin против HER-2-три-ТАС. Т-клетки были модифицированы с использованием варианта три-ТАС, лишенного нацеливающего элемента (-DARPin), варианта три-ТАС, лишенного UCHT1 (-UCHT1), или полноразмерного три-ТАС. Фиг. 6А, 6D, 6G иллюстрируют трансдукцию Т-клетки и способность связывания Her2 (слева); фиг. 6В, 6Е, 6Н - дегрануляцию (в середине), и фиг. 6С, 6F, 6I - продукцию цитокинов (справа). Фиг. 6J иллюстрирует, что только полноразмерный DARPin против HER-2три-ТАС является способным вызывать цитотоксический ответ.Fig. 6A-6J illustrate receptor surface expression and activation of various control DARPins against HER-2-tri-TAC. T cells were modified using a tri-TAC variant lacking the targeting element (-DARPin), a tri-TAC variant lacking UCHT1 (-UCHT1), or full-length tri-TAC. Fig. 6A, 6D, 6G illustrate T cell transduction and Her2 binding ability (left); fig. 6B, 6E, 6H - degranulation (middle), and FIG. 6C, 6F, 6I - production of cytokines (right). Fig. 6J illustrates that only full-length DARPin against HER-2tri-TAC is capable of inducing a cytotoxic response.

Фиг. 7А-7С иллюстрируют противоопухолевую активность, токсичность и продукцию цитокинов для Т-клеток, модифицированных с использованием либо DARPin против HER-2-три-ТАС, либо DARPin против HER-2-CAR на основе CD28. Мышей, несущих развившиеся опухоли OVCAR-3, подвергали лечению с использованием Т-клеток, модифицированных с использованием DARPin против HER-2-триТАС или DARPin против HER-2-CAR. Фиг. 7А иллюстрирует изменение роста опухоли, относительно суток инфузии Т-клеток (сутки 35). Фиг. 7В иллюстрирует изменение массы, показатель токсичности, у тех же самых мышей. Фиг. 7С иллюстрирует концентрации цитокинов в сыворотке мышей на сутки 7 после инфузии Т-клеток.Fig. 7A-7C illustrate the antitumor activity, toxicity, and cytokine production of T cells modified with either anti-HER-2-tri-TAC DARPin or CD28-based anti-HER-2-CAR DARPin. Mice bearing established OVCAR-3 tumors were treated with T cells engineered with anti-HER-2-triTAC DARPin or anti-HER-2-CAR DARPin. Fig. 7A illustrates the change in tumor growth relative to the day of T cell infusion (day 35). Fig. 7B illustrates the change in mass, an indicator of toxicity, in the same mice. Fig. 7C illustrates serum cytokine concentrations in mice on day 7 after T cell infusion.

Фиг. 8А-8Н иллюстрируют три-ТАС, сконструированные с различными альтернативами домену привлечения UCHT1 scFv-CD3. Фиг. 8А обеспечивает схематическое представление конструкций рецептора ТАС с использованием DARPin против HER-2, в паре либо с UCHT1, либо с OKT3 scFv против CD3. фиг. 8В иллюстрирует поверхностную экспрессию HER-2-TAC для CD8+ NGFR+ (слева) или CD4+ NGFR+ Т-клеток (справа). Фиг. 8С, 8С1 иллюстрируют продукцию цитокинов специфическими для HER-2 ТАС-Т-клетками, стимулированными положительными по антигену клетками опухоли SK-OV-3. Фиг. 8D иллюстрирует уничтожение клеток опухоли SK-OV-3 посредством Т-клеток с HER-2-TAC и контрольным вектором (вектором, несущим только tNGFR). Т-клетки с контрольным вектором (круги) сравнивают со специфическими для HER-2 ТАС-Т-клетками, несущими UCHT1 (квадраты) или OKT3 (треугольники). Фиг. 8Е обеспечивает схематическое представление конструкций рецептора ТАС с использованием scFv против CD19, в паре с huUCHT1, F6A, или L2K scFv против CD3. Фиг. 8F иллюстрирует поверхностную экспрессию CD19-TAC для CD8+ NGFR+ (слева) или CD4+ NGFR+ Т-клеток (справа). Фиг. 8G, 8G1 иллюстрируют продукцию цитокинов специфическими для CD19 ТАС-Т-клетками, стимулированными положительными по антигену клетками опухоли Raji. Продуцирующие цитокины клетки сравнивают из числа ТАС-Т-клеток, несущих huUCHT1 (квадраты), F6A (треугольники), или L2K (ромбы). Фиг. 8Н иллюстрирует уничтожение клеток опухоли NALM-6 посредством Т-клеток с CD19TAC и контрольным вектором (вектором, несущим только tNGFR). Т-клетки с контрольным вектором (круги) сравнивают со специфическими для CD19 ТАС-Т-клетками, несущими huUCHT1 (квадраты), F6A (треугольники) или L2K (ромбы).Fig. 8A-8H illustrate tri-TACs constructed with various alternatives to the UCHT1 recruitment domain of scFv-CD3. Fig. 8A provides a schematic representation of TAC receptor constructs using anti-HER-2 DARPin paired with either UCHT1 or OKT3 anti-CD3 scFv. fig. 8B illustrates surface expression of HER-2-TAC for CD8+ NGFR+ (left) or CD4+ NGFR+ T cells (right). Fig. 8C, 8C1 illustrate cytokine production by HER-2 specific TAC T cells stimulated by antigen positive SK-OV-3 tumor cells. Fig. 8D illustrates the killing of SK-OV-3 tumor cells by T cells with HER-2-TAC and a control vector (vector carrying only tNGFR). Control vector T cells (circles) are compared with HER-2-specific TAC T cells carrying UCHT1 (squares) or OKT3 (triangles). Fig. 8E provides a schematic representation of TAC receptor constructs using anti-CD19 scFv paired with huUCHT1, F6A, or L2K anti-CD3 scFv. Fig. 8F illustrates surface expression of CD19-TAC for CD8+ NGFR+ (left) or CD4+ NGFR+ T cells (right). Fig. 8G, 8G1 illustrate cytokine production by CD19-specific TAC T cells stimulated by antigen-positive Raji tumor cells. Cytokine-producing cells are compared from among TAC T cells harboring huUCHT1 (squares), F6A (triangles), or L2K (diamonds). Fig. 8H illustrates the killing of NALM-6 tumor cells by T cells with CD19TAC and a control vector (vector carrying only tNGFR). Control vector T cells (circles) are compared with CD19-specific TAC T cells carrying huUCHT1 (squares), F6A (triangles), or L2K (diamonds).

Фиг. 9А-9Н иллюстрирует эффект различных scFv против CD3 на поверхностную экспрессию TCR. Фиг. 9А, 9Е иллюстрируют поверхностную экспрессию TCR для Т-клеток, модифицированных с использованием контрольного вектора (tNGFR), UCHT1 или вариантов OKT3 ТАС. Фиг. 9В, 9F показывают, что Т-клетки, модифицированные с использованием ОКТЗ-ТАС, имеют значимо уменьшенную поверхностную экспрессию TCR, по сравнению с UCHT1-TAC. Фиг. 9С, 9G иллюстрируют поверхностную экспрессию TCR для Т-клеток, модифицированных с использованием контрольного вектора (tNGFR), вариантов ТАС huUCHT1, F6A или L2K. Фиг. 9D, 9Н показывает, что Т-клетки, модифицированные с использованием L2K ТАС, имеют значимо уменьшенную поверхностную экспрессию TCR, по сравнению с huUCHT1 -ТАС.Fig. 9A-9H illustrate the effect of various anti-CD3 scFvs on TCR surface expression. Fig. 9A, 9E illustrate TCR surface expression for T cells modified with control vector (tNGFR), UCHT1 or OKT3 TAC variants. Fig. 9B, 9F show that T cells modified with OKTZ-TAC have significantly reduced TCR surface expression compared to UCHT1-TAC. Fig. 9C, 9G illustrate TCR surface expression for T cells modified with control vector (tNGFR), TAC variants huUCHT1, F6A or L2K. Fig. 9D, 9H shows that T cells modified with L2K TAC have significantly reduced TCR surface expression compared to huUCHT1 -TAC.

Фиг. 10А, 10В иллюстрируют варианты домена соединителя. Домен, соединяющий антигенсвязывающий домен с доменом привлечения TCR, называют доменом соединителя. На фиг. 10А представлена схема вариантов ТАС с различными доменами соединителя: (i) гибкий соединитель, (ii) соединитель с большим доменом (сконструированный из доменов 3 и 4, происходящих из внеклеточного домена CD4), (iii) соединитель с длинной спиралью и (iv) соединитель с короткой спиралью. На фиг. 10В представлена иллюстративная аминокислотная последовательность доменов, представленных на фиг. 10А. (SEQ ID NO 69, 28, 30 и 32, соответственно, в порядке упоминания)Fig. 10A, 10B illustrate connector domain embodiments. The domain connecting the antigen binding domain to the TCR recruitment domain is called a connector domain. In fig. 10A is a diagram of TAC variants with different connector domains: (i) flexible connector, (ii) large domain connector (constructed from domains 3 and 4 derived from the CD4 extracellular domain), (iii) long helix connector, and (iv) connector with a short spiral. In fig. 10B shows an exemplary amino acid sequence of the domains shown in FIG. 10A. (SEQ ID NOs 69, 28, 30 and 32, respectively, in order of mention)

Фиг. 11А-11Е иллюстрируют иллюстративные параметры in vitro CD19-TAC, сконструированного с различными вариантами соединителя. Фиг. 11А иллюстрирует поверхностную экспрессию варианта ТАС в CD4 и CD8 клетках. Фиг. 11В иллюстрирует поверхностную экспрессию ТАС, содержащего гибкие соединители, по сравнению с ТАС, содержащим соединители со спиралью или с большим доменом. Фиг. 11С иллюстрирует общую трансдукцию ТАС, содержащего альтернативные соединители, по сравнению с гибким соединителем. Фиг. 11D, 11Е иллюстрируют относительную реакционную способность клетокFig. 11A-11E illustrate exemplary in vitro parameters of CD19-TAC constructed with various connector options. Fig. 11A illustrates the surface expression of the TAC variant in CD4 and CD8 cells. Fig. 11B illustrates the surface expression of TAC containing flexible connectors compared to TAC containing coiled-coil or large domain connectors. Fig. 11C illustrates the overall transduction of TAC containing alternative connectors compared to a flexible connector. Fig. 11D, 11E illustrate the relative reactivity of cells

- 7 045368 по отношению к положительным по антигену клеткам Raji.- 7 045368 against antigen positive Raji cells.

Фиг. 12А иллюстрирует цитотоксичность in vitro вариантов ВСМА три-ТАС, сконструированных с использованием различных соединителей. Фиг. 12В иллюстрирует контроль опухоли in vivo для вариантов ВСМА-три-ТАС, сконструированных с использованием гибкого соединителя, по сравнению с соединителем с короткой спиралью.Fig. 12A illustrates the in vitro cytotoxicity of BCMA tri-TAC variants constructed using different connectors. Fig. 12B illustrates in vivo tumor control for BCMA-tri-TAC variants constructed using a flexible connector compared to a short-coil connector.

Фиг. 13А-13С иллюстрируют свойства CD8α-три-TAC-scFv против HER-2 и CD8α-три-TACDARPin против HER-2. Фиг. 13А, 13С иллюстрируют поверхностную экспрессию. Фиг. 13В иллюстрирует продукцию цитокинов.Fig. 13A-13C illustrate the anti-HER-2 properties of CD8α-tri-TAC-scFv and anti-HER-2 CD8α-tri-TACDARPin. Fig. 13A, 13C illustrate surface expression. Fig. 13B illustrates cytokine production.

На фиг. 14A-14D представлены схемы вариантов CD8-tpu-TAC. DARPin против HER-2 используют в качестве иллюстративного антигенсвязывающего домена, и домен привлечения UCHT1 CD3 используют в качестве иллюстративного домена привлечения. Фиг. 14А иллюстрирует три-ТАС, содержащий трансмембранный и цитозольный домен CD4 (слева), и сравнимые области гетеродимера CD8a/CD8e (справа). Ключевые области для функциональности корецептора (богатый аргинином домен и мотив СХСР) выделены. Фиг. 14В представляет собой схему CD8α-три-TAC, содержащего мутацию цистеина до серина, для обеспечения распространения мономерного рецептора, и цитозольный домен CD8a. Фиг. 14С представляет собой схему CD8a+Re три-ТАС, содержащего мутацию цистеина до серина, для обеспечения распространения мономерного рецептора, и химерный цитозольный домен CD8a, где богатая аргинином область CD8a заменена на богатую аргинином область CD8e. Фиг. 14D представляет собой схему CD8β+Lck-три-ТАС, содержащего мутацию цистеина до серина, для обеспечения распространения мономерного рецептора, и химерный цитозольный домен CD8e, где домен СХСР CD8a, содержащий связывающий Lck мотив, добавлен к С-концу цитозольного домена CD8e.In fig. 14A-14D are diagrams of CD8-tpu-TAC variants. The anti-HER-2 DARPin is used as an exemplary antigen binding domain, and the UCHT1 CD3 recruitment domain is used as an exemplary recruitment domain. Fig. 14A illustrates a tri-TAC containing the CD4 transmembrane and cytosolic domain (left) and comparable regions of the CD8a/CD8e heterodimer (right). Key regions for coreceptor functionality (arginine-rich domain and CXCP motif) are highlighted. Fig. 14B is a diagram of a CD8α tri-TAC containing a cysteine to serine mutation to promote monomeric receptor propagation, and a CD8a cytosolic domain. Fig. 14C is a CD8a+Re tri-TAS design containing a cysteine to serine mutation to promote monomeric receptor propagation, and a chimeric CD8a cytosolic domain where the arginine-rich region of CD8a is replaced by the arginine-rich region of CD8e. Fig. 14D is a CD8β+Lck-tri-TAS design containing a cysteine to serine mutation to promote monomeric receptor propagation, and a chimeric CD8e cytosolic domain where the CD8a CXCP domain containing the Lck binding motif is added to the C-terminus of the CD8e cytosolic domain.

Фиг. 15А-15Е иллюстрируют характеризацию in vitro вариантов CD8-tpu-TAC, по сравнению с прототипическим три-ТАС, содержащим области CD4. Фиг. 15А-15В иллюстрируют поверхностную экспрессию вариантов CD8-tpu-TAC, по сравнению с прототипическим три-ТАС. Фиг. 15С иллюстрирует цитотоксичность in vitro вариантов CD8-tpu-TAC при совместном культивировании с LOX IMVI (отрицательными по HER-2), или А549, SKOV3, SKBR3 или MBA MB 231 (положительными по HER-2). Фиг. 15D иллюстрирует деление клеток для Т-клеток, модифицированных с использованием либо вариантов CD8-tpu-TAC, либо прототипического три-ТАС. Фиг. 15Е иллюстрирует поверхностную экспрессию TCR для модифицированных Т-клеток, содержащих варианты CD8-tpu-TAC или прототипический три-ТАС.Fig. 15A-15E illustrate in vitro characterization of CD8-tpu-TAC variants, compared to the prototypical tri-TAC containing CD4 regions. Fig. 15A-15B illustrate the surface expression of CD8-tpu-TAC variants compared to the prototypical tri-TAC. Fig. 15C illustrates the in vitro cytotoxicity of CD8-tpu-TAC variants when co-cultured with LOX IMVI (HER-2 negative), or A549, SKOV3, SKBR3 or MBA MB 231 (HER-2 positive). Fig. 15D illustrates cell division for T cells modified using either CD8-tpu-TAC variants or prototypical tri-TAC. Fig. 15E illustrates TCR surface expression for modified T cells containing CD8-tpu-TAC variants or prototypical tri-TAC.

Фиг. 16 иллюстрирует различные три-ТАС.Fig. 16 illustrates various three-TAS.

Фиг. 17 иллюстрирует вставку TAC-CD19 в лентивирусный вектор pCCL. Фиг. 17 иллюстрирует различные домены TAC-CD19 (лидер CD8a, FMC63 scFv, метку Мус, мутант Y177T huUCHT1 и укороченный якорный домен корецептора CD4).Fig. 17 illustrates the insertion of TAC-CD19 into the pCCL lentiviral vector. Fig. 17 illustrates the various domains of TAC-CD19 (CD8a leader, FMC63 scFv, Myc tag, Y177T huUCHT1 mutant, and truncated CD4 coreceptor anchor domain).

Фиг. 18 иллюстрирует эффективность in vivo TAC-CD19, полученного от различных доноров.Fig. 18 illustrates the in vivo effectiveness of TAC-CD19 obtained from various donors.

Фиг. 19А-19С иллюстрирует пример цитотоксичности in vitro TAC-CD19 против линий опухолей. Фиг. 19А NALM-6 (острый лимфобластный лейкоз), фиг. 19В Jeko-1 (лимфома из клеток мантийной зоны) и фиг. 19С Raji (лимфома Беркитта).Fig. 19A-19C illustrate an example of in vitro cytotoxicity of TAC-CD19 against tumor lines. Fig. 19A NALM-6 (acute lymphoblastic leukemia), FIG. 19B Jeko-1 (mantle cell lymphoma) and FIG. 19C Raji (Burkitt's lymphoma).

Фиг. 19D иллюстрирует схему 3 различных моделей in vivo на мышах NRG.Fig. 19D illustrates a schematic of 3 different in vivo NRG mouse models.

Фиг. 19E-19G иллюстрируют эффективность in vivo CD19-TAC для NALM-6 (острый лимфобластный лейкоз) фиг 19Е, Jeko-1 (лимфома из клеток мантийной зоны) фиг. 19F и Raji (лимфома Беркитта) фиг. 19G.Fig. 19E-19G illustrate in vivo efficacy of CD19-TAC for NALM-6 (acute lymphoblastic leukemia) FIG. 19E, Jeko-1 (mantle cell lymphoma) FIG. 19F and Raji (Burkitt's lymphoma) fig. 19G.

Фиг. 20А иллюстрирует разработку эксперимента для подвергнутых лечению посредством TACCD19 мышей с опухолью NALM-6. После успешного лечения мышей затем повторно заражали клетками опухолей либо NALM-6 (положительными по CD19), либо KMS11 (отрицательными по CD19).Fig. 20A illustrates the design of an experiment for TACCD19-treated mice bearing a NALM-6 tumor. After successful treatment, mice were then reinfected with either NALM-6 (CD19 positive) or KMS11 (CD19 negative) tumor cells.

Фиг. 20В иллюстрирует эффективность in vivo для мышей, подвергнутых лечению с использованием TAC-CD19.Fig. 20B illustrates in vivo efficacy for mice treated with TAC-CD19.

Фиг. 21А иллюстрирует дизайн эксперимента для оценки режима дозирования и влияния дозирования на эффективность и размножение клеток.Fig. 21A illustrates an experimental design for evaluating a dosing regimen and the effect of dosing on efficacy and cell proliferation.

Фиг. 21В иллюстрирует выживаемость in vivo несущих NALM-6 мышей, подвергнутых лечению с использованием либо однократной, либо дробной дозы TAC-CD19.Fig. 21B illustrates the in vivo survival of NALM-6-bearing mice treated with either a single dose or a divided dose of TAC-CD19.

Фиг. 22А, 22В иллюстрируют разработку эксперимента и данные, применительно к размножению in vivo TAC-CD19 после введения дробной дозы. Фиг. 22А иллюстрирует способ отбора, используемый для идентификации Т-клеток в крови мыши. Фиг. 22В иллюстрирует результаты in vivo для размножения Тклеток в крови.Fig. 22A, 22B illustrate experimental design and data for in vivo propagation of TAC-CD19 following fractional dosing. Fig. 22A illustrates a selection method used to identify T cells in mouse blood. Fig. 22B illustrates in vivo results for T cell expansion in blood.

Фиг. 23А-23С иллюстрируют длительные исследования in vivo TAC-CD19 у мышей. Фиг. 23А иллюстрирует способ эксперимента для несущих NALM-6 мышей, подвергнутых лечению с использованием различного контроля и TAC-CD19 на двух уровнях дозирования. Фиг. 23В иллюстрирует эффективность in vivo для контрольных групп, по сравнению с группами лечения TAC-CD19 на двух уровнях дозирования. Фиг. 23С иллюстрирует длительную выживаемость мышей, подвергнутых лечению низкой дозой TAC-CD19.Fig. 23A-23C illustrate long-term in vivo studies of TAC-CD19 in mice. Fig. 23A illustrates the experimental method for NALM-6-bearing mice treated with various controls and TAC-CD19 at two dosage levels. Fig. 23B illustrates in vivo efficacy for control groups compared to TAC-CD19 treatment groups at two dosage levels. Fig. 23C illustrates the long-term survival of mice treated with a low dose of TAC-CD19.

- 8 045368- 8 045368

Фиг. 24 иллюстрирует результаты анализа клинической химии для мышей, подвергнутых лечению с использованием трансдуцированных TAC-CD19 или нетрансдуцированных Т-клеток.Fig. 24 illustrates clinical chemistry results for mice treated with TAC-CD19 transduced or non-transduced T cells.

Фиг. 25 иллюстрирует высвобождение цитокинов в крови мышей после лечения с использованиемFig. 25 illustrates the release of cytokines in the blood of mice after treatment with

TAC-CD19 или нетрансдуцированных Т-клеток.TAC-CD19 or non-transduced T cells.

Фиг. 26А-26С иллюстрирует эффективность ВСМА-ТАС в различных конфигурациях. Фиг. 26А иллюстрирует дизайн эксперимента. Фиг. 26В иллюстрирует различные контрольные и тестируемые вещества. Фиг. 26С иллюстрирует эффективность in vivo различных конструкций ТАС. Фиг. 26А-26С описывают G4S как SEQ ID NO: 73.Fig. 26A-26C illustrate the effectiveness of BCMA-TAS in various configurations. Fig. 26A illustrates the experimental design. Fig. 26B illustrates various control and test substances. Fig. 26C illustrates the in vivo effectiveness of various TAC constructs. Fig. 26A-26C describe G4S as SEQ ID NO: 73.

Фиг. 27 иллюстрирует, что ТАС осуществляют пролиферацию, когда сталкиваются с антигеном на клетках, но не когда антиген представлен на искусственных бусинах; но CAR осуществляют пролиферацию, независимо от того, представлены ли антигены на бусинах или клетках.Fig. 27 illustrates that TACs proliferate when they encounter antigen on cells, but not when antigen is presented on artificial beads; but CARs proliferate whether antigens are presented on beads or cells.

Фиг. 28А, 28В иллюстрируют, что модифицированные посредством ТАС Т-клетки размножаются in vivo и обеспечивают длительную защиту, показывая персистенцию клеток в модели миеломы. Фиг. 28А28В иллюстрируют, что ВСМА-ТАС-Т-клетки приводят к отторжению опухоли множественной миеломы в модели ксенотрансплантата KMS-11, сконструированной с использованием NanoLuc (KMS 11NanoLuc) (ВСМАпол). После приживления опухоли, мышей подвергали лечению с использованием ВСМА-ТАС-Т-клеток (несущих люциферазу светляка). ТАС-Т-клетки значительно размножались после введения. Это коррелирует с регрессией опухоли. Подвергнутые лечению мыши являлись устойчивыми к повторному заражению опухолью, что указывает на длительную персистенцию ТАС-Т-клеток.Fig. 28A, 28B illustrate that TAC-modified T cells expand in vivo and provide long-lasting protection, demonstrating cell persistence in a myeloma model. Fig. 28A28B illustrate that BCMA-TAC T cells lead to multiple myeloma tumor rejection in the KMS-11 xenograft model constructed using NanoLuc (KMS 11NanoLuc) (BCMA floor ). After tumor engraftment, mice were treated with BCMA-TAC T cells (carrying firefly luciferase). TAC T cells expanded significantly after administration. This correlates with tumor regression. Treated mice were resistant to tumor re-infection, indicating long-term persistence of TAC T cells.

Фиг. 29 иллюстрирует высвобождение цитокинов человека в крови мышей после лечения с использованием TAC-CD19 или нетрансдуцированных Т-клеток.Fig. 29 illustrates the release of human cytokines in the blood of mice following treatment with TAC-CD19 or non-transduced T cells.

На фиг. 30 показаны иллюстративные гистограммы поверхностной экспрессии рецептора ТАС на CD4 и CD8 модифицированных Т-клетках. Клетки были модифицированы с использованием muIgGHER2-TAC (промотор EF1a), huIgG-HER2-ТАС (промотор MSCV) и muIgG-HER2-TAC (промотор MSCV). После модификации, Т-клетки окрашивали с использованием специфического для ТАС реагента и измеряли с использованием проточной цитометрии. Для всех конструкций показаны сравнимые уровни поверхностной экспрессии, где управляемая EF1a экспрессия являлась более высокой, по сравнению с конструкциями с MSCV.In fig. 30 shows exemplary histograms of TAC receptor surface expression on CD4 and CD8 engineered T cells. Cells were modified using muIgGHER2-TAC (EF1a promoter), huIgG-HER2-TAC (MSCV promoter), and muIgG-HER2-TAC (MSCV promoter). After modification, T cells were stained using a TAC-specific reagent and measured using flow cytometry. All constructs showed comparable levels of surface expression, with EF1a-driven expression being higher compared to MSCV constructs.

Фиг. 31 иллюстрирует относительный процент Т-клеток, экспрессирующих TNFa, IFNy или IL-2, после совместного культивирования с клетками либо OVCAR3 (положительными по HER2 positive), либо LOX EMVI (отрицательными по HER2). Т-клетки были модифицированы с использованием muIgGHER2-TAC (промотор EF1a), конструкции ТАС, лишенной связывающего HER2 домена (Δ связывающий домен ТАС; промотор EF1a), huIgG-HER2-TAC (промотор MSCV) или muIgG HER2 ТАС (промотор MSCV). При совместном культивировании с LOX-IMVI (HER20tp), для контроля Δ связывающий домен ТАС и клеток с HER2-TAC не показано значительной экспрессии цитокинов. Для всех сконструированных конструкций HER2-TAC при совместном культивировании с OVCAR3(HER2nол) показана сходная способность к продукции цитокинов, в то время как для контрольных Т-клеток, сконструированных с Δ связывающий домен ТАС, не показано значительной продукции цитокинов.Fig. 31 illustrates the relative percentage of T cells expressing TNFa, IFNy, or IL-2 after coculture with either OVCAR3 (HER2 positive) or LOX EMVI (HER2 negative) cells. T cells were modified using muIgGHER2-TAC (EF1a promoter), a TAC construct lacking the HER2 binding domain (Δ TAC binding domain; EF1a promoter), huIgG-HER2-TAC (MSCV promoter), or muIgG HER2 TAC (MSCV promoter). When co-cultured with LOX-IMVI (HER2 0tp ), to control the Δ TAC binding domain and cells with HER2-TAC, no significant expression of cytokines was shown. All engineered HER2-TAC constructs, when co-cultured with OVCAR3(HER2 null ), showed similar ability to produce cytokines, while control T cells engineered with the Δ TAC binding domain did not show significant cytokine production.

Фиг. 32 иллюстрирует эффективность in vivo модифицированных посредством ТАС Т-клеток в модели солидной опухоли OVCAR3. Т-клетки были модифицированы с использованием Δ связывающий домен ТАС (промотор EF1a), muIgG-HER2-TAC (промотор EF1a), huIgG-HER2-TAC (промотор MSCV) или muIgG-HER2-TAC (промотор MSCV). Мышам инокулировали подкожно опухоли OVCAR3 (положительные по HER-2). Их выращивали до размера приблизительно 100 мм3. Затем мышей подвергали лечению с использованием дробной дозы всего 6 миллионов модифицированных с использованием HER2-TAC, или контрольных Т-клеток с Δ связывающий домен ТАС, с интервалом 48 ч, посредством инъекции в хвостовую вену. Прогрессирование опухоли отслеживали посредством измерений раз в две недели. Для Δ связывающий домен ТАС не показано контроля опухоли или регрессии опухоли. Для всех модифицированных с использованием HER2-TAC Т-клеток показано значительно уменьшенное прогрессирования опухоли, включая регрессию опухоли, по сравнению с контрольными мышами. Все модифицированные с использованием HER2-TAC Т-клетки имели сходную противоопухолевую активность.Fig. 32 illustrates the in vivo efficacy of TAC-modified T cells in the OVCAR3 solid tumor model. T cells were modified using the Δ binding domain of TAC (EF1a promoter), muIgG-HER2-TAC (EF1a promoter), huIgG-HER2-TAC (MSCV promoter), or muIgG-HER2-TAC (MSCV promoter). Mice were inoculated subcutaneously with OVCAR3 tumors (HER-2 positive). They were grown to a size of approximately 100 mm 3 . Mice were then treated with a fractional dose of a total of 6 million HER2-TAC-modified or control Δ TAC binding domain T cells, 48 hours apart, via tail vein injection. Tumor progression was monitored through biweekly measurements. The Δ TAC binding domain has not shown tumor control or tumor regression. All HER2-TAC-modified T cells showed significantly reduced tumor progression, including tumor regression, compared to control mice. All HER2-TAC-modified T cells had similar antitumor activity.

Подробное описаниеDetailed description

Злокачественная опухоль представляет собой основную проблему здравоохранения, с ожидаемой диагностикой более чем 150000 случаев злокачественных опухолей, только в Канаде. В то время как пациентов с заболеванием на ранних стадиях иногда эффективно лечат посредством общепринятых видов терапии (хирургии, радиации, химиотерапии), мало возможностей являются доступными для пациентов с заболеванием на поздних стадиях, и эти возможности, как правило, имеют паллиативный характер.Malignancy is a major health care problem, with more than 150,000 cases of malignancy expected to be diagnosed in Canada alone. While patients with early-stage disease are sometimes effectively treated with conventional therapies (surgery, radiation, chemotherapy), few options are available for patients with advanced-stage disease, and these options are usually palliative in nature.

Активная иммунотерапия ориентирована на использование иммунной системы пациента для клиренса опухолей и предлагает возможность для пациентов, для которых общепринятые виды терапии оказались неудачными. Как правило, это лечение включает инфузию пациентам больших количеств специфических для опухоли Т-клеток. Доказано, что этот способ является успешным в ранней фазе клинических исследований для ряда заболеваний, включая меланому, миелому, лейкоз, лимфому и синовиаль- 9 045368 ную саркому. В качестве конкретного примера, в нескольких клинических исследованиях показано, что иммунотерапия Т-клетками является излечивающей у пациентов с меланомой на поздних стадиях, подтверждая полезность этого способа. Кроме того, пациентов, страдающих хроническим лимфоцитарным лейкозом (CLL) и острым лимфобластным лейкозом (ALL), также эффективно лечили и излечивали с помощью иммунотерапии Т-клетками.Active immunotherapy focuses on using the patient's immune system to clear tumors and offers an option for patients for whom conventional therapies have failed. Typically, this treatment involves infusing patients with large amounts of tumor-specific T cells. This method has been proven to be successful in early phase clinical studies for a number of diseases, including melanoma, myeloma, leukemia, lymphoma and synovial sarcoma. As a specific example, several clinical studies have shown that T-cell immunotherapy is curative in patients with advanced melanoma, supporting the utility of this modality. In addition, patients suffering from chronic lymphocytic leukemia (CLL) and acute lymphoblastic leukemia (ALL) have also been effectively treated and cured using T-cell immunotherapy.

Ключевой проблемой, стоящей перед клиническим применением адоптивной Т-клеточной терапии является источник Т-клеток. Как правило, Т-клетки, выделенные от несущего опухоль пациента, выращивают до больших количеств ex vivo и вводят обратно пациенту для индукции надежного противоопухолевого иммунного ответа. Специфичности для опухоли достигают посредством любого из: (i) выделения природных специфических для опухоли Т-клеток от пациента; или (ii) модификации множества Тклеток из периферической крови для экспрессии специфических для опухоли рецепторов. Природные специфические для опухоли Т-клетки являются редкими, и выделение таких клеток в терапевтических количествах от пациентов со злокачественными опухолями является трудоемким и дорогостоящим способом. В отличие от этого, становится более эффективной модификация легко доступных периферических Т-клеток с использованием специфических для опухоли рецепторов, посредством генетической манипуляции. Для этого процесса модификации разработаны способы, которые являются клинически осуществимыми, и в нескольких клинических исследованиях показана целесообразность и эффективность генетически модифицированных Т-клеток для лечения злокачественной опухоли.A key challenge facing the clinical application of adoptive T cell therapy is the source of T cells. Typically, T cells isolated from a tumor-bearing patient are grown to large numbers ex vivo and infused back into the patient to induce a robust antitumor immune response. Tumor specificity is achieved by any of: (i) isolating natural tumor-specific T cells from the patient; or (ii) modifying multiple T cells from peripheral blood to express tumor-specific receptors. Naturally occurring tumor-specific T cells are rare, and isolating such cells in therapeutic quantities from patients with cancer is labor-intensive and expensive. In contrast, it is becoming more effective to modify readily available peripheral T cells using tumor-specific receptors through genetic manipulation. Methods have been developed for this modification process that are clinically feasible, and several clinical studies have demonstrated the feasibility and effectiveness of genetically modified T cells for the treatment of cancer.

До настоящего времени, большинство видов терапии модифицированными Т-клетками, включающие генетическую модификацию Т-клеток, приводили к: (i) усиленной экспрессии Т-клеточного рецептора (TCR); или (ii) химерного рецептора антигена (CAR), специфического для антигенных мишеней на опухоли. До настоящего времени, химерные рецепторы антигенов, использованные для модификации Тклеток, состояли из: (i) нацеливающего домена, обычно одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv); (ii) трансмембранного домена; и (iii) цитозольного домена, содержащего передающие сигналы элементы из Т-клеточного рецептора и ассоциированных белков. Такие химерные рецепторы антигенов также обозначены как Т-тельце или химерный иммунный рецептор (CIR), однако, в настоящее время, большинство исследователей используют термин CAR. Одним преимуществом способа CAR является то, что он позволяет нацеливать любые иммуноциты пациента против любой желательной мишени независимым от главного комплекса гистосовместимости (МНС) образом. Это является привлекательным, поскольку представление МНС часто является дефектным в клетках опухолей.To date, most engineered T cell therapies involving genetic modification of T cells have resulted in: (i) increased expression of the T cell receptor (TCR); or (ii) a chimeric antigen receptor (CAR) specific for antigenic targets on the tumor. To date, chimeric antigen receptors used to modify T cells have consisted of: (i) a targeting domain, typically a single chain variable fragment (scFv); (ii) transmembrane domain; and (iii) a cytosolic domain containing signaling elements from the T cell receptor and associated proteins. Such chimeric antigen receptors are also referred to as T-body or chimeric immune receptor (CIR), however, currently, most researchers use the term CAR. One advantage of the CAR method is that it allows any patient's immunocytes to be targeted against any desired target in a major histocompatibility complex (MHC)-independent manner. This is attractive because MHC presentation is often defective in tumor cells.

CAR рассматривают в модульных терминах, и ученые потратили значительное время на исследование влияния различных цитоплазматических передающих сигналы доменов на функцию CAR. Общепринятые CAR, как правило, разделяют два главных компонента: (i) цитоплазматический домен CD3-дзета, содержащий иммунорецепторные тирозиновые активирующие мотивы (ITAM), критические для активации Т-клетки; и (ii) компоненты костимулирующих рецепторов, запускающие важные пути выживания, такие как путь Akt.CARs are viewed in modular terms, and scientists have spent considerable time investigating the influence of different cytoplasmic signaling domains on CAR function. Conventional CARs typically share two major components: (i) a cytoplasmic CD3-zeta domain containing immunoreceptor tyrosine activating motifs (ITAMs) critical for T cell activation; and (ii) co-stimulatory receptor components that trigger important survival pathways such as the Akt pathway.

В CAR первого поколения используют один передающий сигналы домен либо из CD3Z, либо из FcεRIγ. В CAR второго поколения объединяют передающий сигналы домен из CD3Z, с цитоплазматическим доменом костимулирующих рецепторов из семейства рецепторов либо CD28, либо TNFR. В большинстве модифицированных посредством CAR Т-клеток, тестируемых в настоящее время в клинике, используют CAR второго поколения, в которых CD3Z, соединен с цитоплазматическим доменом либо из CD28, либо из CD137. Для этих CAR второго поколения показана противоопухолевая активность для положительных по CD19 опухолей. В CAR третьего поколения объединены множество костимулирующих доменов, но существует опасение, что CAR третьего поколения могут терять специфичность для антигена.First-generation CARs use a single signaling domain from either CD3Z or FcεRIγ. Second-generation CARs combine the signaling domain from CD3Z with the cytoplasmic domain of co-stimulatory receptors from either the CD28 or TNFR family of receptors. Most CAR-modified T cells currently being tested in the clinic use second-generation CARs in which CD3Z is coupled to a cytoplasmic domain from either CD28 or CD137. These second-generation CARs have shown antitumor activity in CD19-positive tumors. Third-generation CARs combine multiple co-stimulatory domains, but there is concern that third-generation CARs may lose antigen specificity.

В то время как показано, что модифицированные посредством CAR T-клетки являются многообещающими в клиническом применении, они основаны на синтетическом способе замены природного сигнала активации, обеспечиваемого Т-клеточным рецептором (TCR). Поскольку этот синтетический рецептор не доставляет все передающие сигналы компоненты, ассоциированные с TCR (например, ITAM на CD3y, CD38, CD3ε), остается неясным, оптимально ли Т-клетки активируются посредством CAR, или каким образом активация CAR влияет на дифференцировку Т-клетки (например, прогрессирование до клетки памяти). Кроме того, поскольку передающие сигналы домены CAR оторваны от своих природных регуляторных партнеров, по самому характеру структуры CAR, существует присущий им риск того, что CAR могут приводить к низкому уровню конститутивной активации, что может приводить к неспецифической токсичности. Таким образом, синтетический характер прототипического CAR может нарушать канонические механизмы, ограничивающие активацию TCR, и может лежать в основе тяжелой токсичности, часто ассоциированной с общепринятыми CAR-T-клетками.While CAR-modified T cells have shown promise in clinical applications, they rely on a synthetic method of replacing the natural activation signal provided by the T cell receptor (TCR). Because this synthetic receptor does not deliver all TCR-associated signaling components (e.g., ITAMs on CD3y, CD38, CD3ε), it remains unclear whether T cells are optimally activated by CAR or how CAR activation influences T cell differentiation ( e.g. progression to memory cell). Additionally, because the signaling domains of CARs are divorced from their natural regulatory partners, by the very nature of CAR structure, there is an inherent risk that CARs may result in low levels of constitutive activation, which can lead to nonspecific toxicity. Thus, the synthetic nature of the prototypical CAR may disrupt canonical mechanisms limiting TCR activation and may underlie the severe toxicity often associated with conventional CAR-T cells.

Принимая во внимание эти ограничения, является предпочтительным перенацеливать Т-клетки для атаки на опухоли посредством их природного TCR. С этой целью, создан класс рекомбинантных белков, названных привлекающими Т-клетки биспецифическими активаторами (BiTE). Эти белки используют фрагменты биспецифических антител для перекрестного связывания Т-клеточных рецепторов TCR с ан- 10 045368 тигенами-мишенями. Это приводит к эффективной активации Т-клеток, запускающей цитотоксичность. Подобным образом, получены биспецифические антитела, достигающие этой цели, и некоторые ученые просто связывали антитела против CD3 со специфическими для опухоли антителами с использованием химической связи. В то время как для этих биспецифических белков показана некоторая активность in vitro, получение в соответствии с GMP, короткие биологические периоды времени полужизни и ограниченная биодоступность представляют значительные проблемы для успешного использования этих молекул в лечении злокачественных опухолей. Кроме того, эти молекулы также не могут надлежащим образом воспроизводить передачу сигналов природного TCR, поскольку они не привлекают корецепторы TCR (CD8 и CD4).Taking these limitations into account, it is preferable to retarget T cells to attack tumors through their natural TCR. To this end, a class of recombinant proteins called bispecific activators of T cells (BiTE) has been created. These proteins use bispecific antibody fragments to cross-link T-cell TCR receptors with target antigens. This results in efficient T cell activation triggering cytotoxicity. Similarly, bispecific antibodies have been produced that achieve this goal, and some scientists have simply linked anti-CD3 antibodies to tumor-specific antibodies using a chemical linkage. While these bispecific proteins have shown some in vitro activity, GMP production, short biological half-lives, and limited bioavailability pose significant challenges to the successful use of these molecules in the treatment of malignancies. In addition, these molecules also cannot properly recapitulate native TCR signaling because they do not recruit TCR coreceptors (CD8 and CD4).

В свете вышесказанного, остается необходимость в химерных рецепторах с увеличенной активностью и безопасностью.In light of the above, there remains a need for chimeric receptors with increased activity and safety.

Разработан альтернативный химерный рецептор, названный трифункциональным связывающим Тклетку с антигеном (три-ТАС или ТАС) рецептором, который использует отличные биологические механизмы для нацеливания Т-клеток для атаки на опухоли. В то время как CAR представляет собой полностью синтетический рецептор, сшивающий вместе компоненты передающего сигналы комплекса Тклеточного рецептора (TCR), рецептор ТАС перенацеливает TCR на мишени опухолей и воспроизводит передающую сигналы структуру природного TCR. Например, в некоторых вариантах осуществления, ТАС, описанные в настоящем описании, активируют природную передачу сигналов главного комплекса гистосовместимости (МНС) через Т-клеточный рецептор (TCR), в то же время сохраняя нерестрицированное по МНС нацеливание. Кроме того, ТАС, описанные в настоящем описании, привлекают Тклеточный рецептор (TCR) в комбинации со стимуляцией корецептором. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления, для три-ТАС, описанных в настоящем описании, показана увеличенная активность и безопасность.An alternative chimeric receptor, called trifunctional T-cell antigen-binding (tri-TAC or TAC) receptor, has been developed that uses distinct biological mechanisms to target T cells to attack tumors. While CAR is a fully synthetic receptor that cross-links together components of the T Cell Receptor (TCR) signaling complex, the TAC receptor redirects TCR to tumor targets and replicates the signaling structure of the natural TCR. For example, in some embodiments, TACs described herein activate natural major histocompatibility complex (MHC) signaling through the T cell receptor (TCR) while maintaining MHC-unrestricted targeting. In addition, the TACs described herein recruit the T cell receptor (TCR) in combination with coreceptor stimulation. Additionally, in some embodiments, the tri-TACs described herein show increased activity and safety.

Конкретная терминология.Specific terminology.

Термин Т-клетка, в рамках изобретения, относится к типу лимфоцита, играющему центральную роль в опосредованном клетками. Т-клетки, также обозначенные как Т-лимфоциты, отличаются от других лимфоцитов, таких как В-клетки и клетки естественные киллеры, по присутствию Т-клеточного рецептора (TCR) на поверхности клетки. Существует несколько подгрупп Т-клеток с отличными функциями, включая, но без ограничения, Т-клетки-помощники, цитотоксические Т-клетки, Т-клетки памяти, регуляторные Т-клетки и Т-клетки естественные киллеры.The term T cell, as used herein, refers to a type of lymphocyte that plays a central role in cell-mediated. T cells, also designated T lymphocytes, are distinguished from other lymphocytes such as B cells and natural killer cells by the presence of the T cell receptor (TCR) on the cell surface. There are several subsets of T cells with distinct functions, including, but not limited to, helper T cells, cytotoxic T cells, memory T cells, regulatory T cells, and natural killer T cells.

Термин связывающий Т-клетку с антигеном агент или ТАС использован взаимозаменяемо с трифункциональным связывающим Т-клетку с антигеном агентом или три-ТАС, и обозначает сконструированную конструкцию нуклеиновой кислоты или полипептида, которая, при экспрессии на Т-клетке, способствует облегчению нацеливания Т-клетки на конкретный антиген. В некоторых вариантах осуществления, ТАС содержит (а) специфический для мишени лиганд, (b) лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом Т-клеточного рецептора (TCR), и (с) передающий сигналы домен Т-клеточного рецептора.The term T-cell antigen binding agent or TAC is used interchangeably with trifunctional T-cell antigen binding agent or tri-TAC and refers to an engineered nucleic acid or polypeptide construct that, when expressed on a T cell, facilitates T cell targeting to a specific antigen. In some embodiments, the TAC comprises (a) a target-specific ligand, (b) a T-cell receptor (TCR) complex-associated protein binding ligand, and (c) a T-cell receptor signaling domain.

Термин полинуклеотид и/или последовательность нуклеиновой кислоты, и/или нуклеиновая кислота, в рамках изобретения, относится к последовательности мономеров нуклеозидов или нуклеотидов, состоящей из оснований, сахаров и межсахарных (каркасных) связей. Термин включает также модифицированные или замещенные последовательности, содержащие не встречающиеся в природе мономеры или их части. Последовательности нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению могут представлять собой последовательности дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или последовательности рибонуклеиновой кислоты (РНК), и могут включать природные основания, включая аденин, гуанин, цитозин, тимидин и урацил. Последовательности могут также содержать модифицированные основания. Примеры таких модифицированных оснований включают аза- и деазааденин, гуанин, цитозин, тимидин и урацил; и ксантин и гипоксантин. Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению можно выделять из биологических организмов, получать лабораторными способами генетической рекомбинации, или получать посредством химического синтеза или других известных способов получения нуклеиновых кислот.The term polynucleotide and/or nucleic acid sequence and/or nucleic acid, as used herein, refers to a sequence of nucleoside or nucleotide monomers consisting of bases, sugars and intersugar (backbone) linkages. The term also includes modified or substituted sequences containing non-naturally occurring monomers or portions thereof. The nucleic acid sequences of the present invention may be deoxyribonucleic acid (DNA) sequences or ribonucleic acid (RNA) sequences, and may include natural bases including adenine, guanine, cytosine, thymidine and uracil. The sequences may also contain modified bases. Examples of such modified bases include aza- and deazaadenine, guanine, cytosine, thymidine and uracil; and xanthine and hypoxanthine. Nucleic acids of the present invention can be isolated from biological organisms, obtained by laboratory methods of genetic recombination, or obtained through chemical synthesis or other known methods for producing nucleic acids.

Термин выделенный полинуклеотид или выделенная последовательность нуклеиновой кислоты, в рамках изобретения, относится к нуклеиновой кислоте, в основном свободной от клеточного материала или культуральной среды при получении способами рекомбинантной ДНК, или химических предшественников или других химических веществ при химическом синтезе. Выделенная нуклеиновая кислота является также в основном свободной от последовательностей, которые в природе фланкируют нуклеиновую кислоту (т.е. последовательностей, локализованных на 5'- и 3'-концах нуклеиновой кислоты), из которой происходит эта нуклеиновая кислота. Термин нуклеиновая кислота предназначен для включения ДНК и РНК, и является либо двухцепочечной, либо одноцепочечной, и представляют собой смысловую или антисмысловую цепь. Кроме того, термин нуклеиновая кислота включает комплементарные последовательности нуклеиновой кислоты.The term isolated polynucleotide or isolated nucleic acid sequence, as used herein, refers to a nucleic acid substantially free from cellular material or culture medium when produced by recombinant DNA methods, or chemical precursors or other chemicals in chemical synthesis. The isolated nucleic acid is also substantially free of sequences that naturally flank the nucleic acid (ie, sequences located at the 5' and 3' ends of the nucleic acid) from which the nucleic acid is derived. The term nucleic acid is intended to include DNA and RNA, and is either double-stranded or single-stranded, and is either the sense or antisense strand. In addition, the term nucleic acid includes complementary nucleic acid sequences.

Термин рекомбинантная нуклеиновая кислота или сконструированная нуклеиновая кислота, в рамках изобретения, относится к нуклеиновой кислоте или полинуклеотиду, не обнаруженному в биоло- 11 045368 гическом организме. Например, рекомбинантные нуклеиновые кислоты можно получать лабораторными способами генетической рекомбинации (такими как молекулярное клонирование) для получения последовательностей, в ином случае не обнаруживаемых в природе. Рекомбинантные нуклеиновые кислоты можно также получать посредством химического синтеза или других известных способов получения нуклеиновых кислот.The term recombinant nucleic acid or engineered nucleic acid, as used herein, refers to a nucleic acid or polynucleotide not found in a biological organism. For example, recombinant nucleic acids can be produced by laboratory genetic recombination techniques (such as molecular cloning) to produce sequences not otherwise found in nature. Recombinant nucleic acids can also be produced by chemical synthesis or other known methods for producing nucleic acids.

Термин полипептид или белок, в рамках изобретения, описывает цепь из аминокислот. Полипептид или белок по настоящему изобретению представляет собой пептид, который обычно описывает цепь из аминокислот. Термин белок, в рамках изобретения, описывает также большую молекулу, содержащую одну или несколько цепей из аминокислот и, в некоторых вариантах осуществления, представляет собой фрагмент или домен белка или полноразмерный белок. Кроме того, в рамках изобретения, термин белок относится либо к линейной цепи из аминокислот, либо к цепи из аминокислот, процессированной и свернутой в функциональный белок. Структуру белка разделяют на четыре различных уровня: (1) первичная структура - относящаяся к последовательности аминокислот в полипептидной цепи, (2) вторичная структура - относящаяся к регулярным локальным подструктурам цепи остова полипептида, таким как α-спираль и β-листы, (3) третичная структура - относящаяся к трехмерной структуре мономерных и мультимерных молекул белка, и (4) четвертичная структура - относящаяся к трехмерной структуре, включающей агрегацию двух или более индивидуальных полипептидных цепей, действующих как одна функциональная единица. Белки, по настоящему изобретению, в некоторых вариантах осуществления, получают посредством выделения и очистки белков из клеток, в которых они продуцированы естественным образом, посредством ферментного (например, протеолитического) расщепления, и/или рекомбинантным способом посредством экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей белки или фрагменты по настоящему изобретению. Белки и/или фрагменты по настоящему изобретению, в некоторых вариантах осуществления, получают посредством химического синтеза или других известных способов получения белков и фрагментов.The term polypeptide or protein, as used herein, describes a chain of amino acids. The polypeptide or protein of the present invention is a peptide that typically describes a chain of amino acids. The term protein, as used herein, also describes a large molecule containing one or more chains of amino acids and, in some embodiments, is a fragment or domain of a protein or a full-length protein. Moreover, as used herein, the term protein refers to either a linear chain of amino acids or a chain of amino acids processed and folded into a functional protein. Protein structure is divided into four different levels: (1) primary structure - related to the sequence of amino acids in the polypeptide chain, (2) secondary structure - related to the regular local substructures of the polypeptide backbone chain, such as the α-helix and β-sheets, (3) tertiary structure - referring to the three-dimensional structure of monomeric and multimeric protein molecules, and (4) quaternary structure - referring to the three-dimensional structure involving the aggregation of two or more individual polypeptide chains acting as one functional unit. The proteins of the present invention, in some embodiments, are produced by isolating and purifying proteins from the cells in which they are naturally produced, through enzymatic (e.g., proteolytic) digestion, and/or recombinantly through expression of nucleic acid encoding proteins or fragments according to the present invention. The proteins and/or fragments of the present invention, in some embodiments, are obtained through chemical synthesis or other known methods for producing proteins and fragments.

Термин выделенный полипептид относится к полипептиду, в основном свободному от клеточного материала или культуральной среды при получении способами рекомбинантной ДНК, или химических предшественников или других химических веществ при химическом синтезе.The term isolated polypeptide refers to a polypeptide substantially free of cellular material or culture medium when produced by recombinant DNA techniques, or chemical precursors or other chemicals by chemical synthesis.

Термин антитело, в рамках изобретения, предназначен для включения моноклональных антител, поликлональных антител, одноцепочечных антител, химерных антител и слитых с антителами белков. Антитело может происходить из рекомбинантных источников и/или быть продуцировано в трансгенных животных. Термин фрагмент антитела, в рамках изобретения предназначен для включения, без ограничений, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dsFv, ds-scFv, димеров, миниантител, диател и их мультимеров, мультиспецифических фрагментов антител и доменных антител.The term antibody, as used herein, is intended to include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, single chain antibodies, chimeric antibodies, and antibody fusion proteins. The antibody may come from recombinant sources and/or be produced in transgenic animals. The term antibody fragment, as used herein, is intended to include, without limitation, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dsFv, ds-scFv, dimers, miniantibodies, diabodies and multimers thereof, multispecific antibody fragments and domain antibodies.

Термин вектор, в рамках изобретения, относится к полинуклеотиду, используемому для доставки нуклеиновой кислоты во внутреннее пространство клетки. В некоторых вариантах осуществления, вектор представляет собой экспрессирующий вектор, содержащий последовательности для контроля экспрессии (например, промотор), функционально связанные с нуклеиновой кислотой, подлежащей экспрессии в клетке. Векторы, известные в данной области, включают, но без ограничения, плазмиды, фаги, космиды и вирусы.The term vector, as used herein, refers to a polynucleotide used to deliver a nucleic acid into the interior of a cell. In some embodiments, the vector is an expression vector containing expression control sequences (eg, a promoter) operably linked to a nucleic acid to be expressed in a cell. Vectors known in the art include, but are not limited to, plasmids, phages, cosmids and viruses.

Термин антиген опухоли или опухолеассоциированный антиген, в рамках изобретения, относится к антигенному веществу, продуцируемому в клетках опухолей, которое запускает иммунный ответ у хозяина (например, когда оно представлено посредством комплексов МНС). В некоторых вариантах осуществления, антиген опухоли находится на поверхности клетки опухоли.The term tumor antigen or tumor-associated antigen, as used herein, refers to an antigenic substance produced in tumor cells that triggers an immune response in the host (eg, when presented via MHC complexes). In some embodiments, the tumor antigen is located on the surface of a tumor cell.

Термин Т-клеточный рецептор или TCR, в рамках изобретения, относится к комплексу интегральных мембранных белков, который участвует в активации Т-клеток в ответ на связывание антигена. TCR представляет собой связанный дисульфидными связями заякоренный в мембране гетеродимер, в норме состоящий из высоко вариабельных цепей альфа (α) и бета (β), экспрессированных как часть комплекса с инвариантными молекулами цепей CD3 (кластера дифференцировки 3). Т-клетки, экспрессирующие этот рецептор, обозначены как α:β (или αβ) Т-клетки, хотя незначительная часть Т-клеток экспрессируют альтернативный рецептор, сформированный вариабельными цепями гамма (γ) и дельта (δ), они обозначены как γδ Т-клетки. CD3 представляет собой белковый комплекс, состоящий из четырех отдельных цепей. У млекопитающих, комплекс содержит цепь CD3y, цепь CD3δ, две цепи CD3ε и две цепи CD3Z.The term T cell receptor or TCR, as used herein, refers to a complex of integral membrane proteins that is involved in the activation of T cells in response to antigen binding. The TCR is a disulfide-linked, membrane-anchored heterodimer normally composed of highly variable alpha (α) and beta (β) chains expressed as part of a complex with invariant CD3 chain molecules (cluster of differentiation 3). T cells expressing this receptor are designated α:β (or αβ) T cells, although a minority of T cells express an alternative receptor formed by the gamma (γ) and delta (δ) variable chains, these are designated γδ T- cells. CD3 is a protein complex consisting of four separate chains. In mammals, the complex contains a CD3y chain, a CD3δ chain, two CD3ε chains, and two CD3Z chains.

В рамках изобретения, термин трансмембранный и цитозольный домен относится к полипептиду, который содержит трансмембранный домен и цитозольный домен белка, ассоциированного с комплексом Т-клеточного рецептора (TCR). В некоторых вариантах осуществления, такой трансмембранный и цитозольный домен может включать, но без ограничения, домены белка, которые (а) ассоциированы с липидным рафтом и/или (b) связывают Lck.As used herein, the term transmembrane and cytosolic domain refers to a polypeptide that contains a transmembrane domain and a cytosolic domain of a T cell receptor (TCR) complex-associated protein. In some embodiments, such transmembrane and cytosolic domain may include, but is not limited to, protein domains that (a) lipid raft associated and/or (b) bind Lck.

Корецептор TCR в рамках изобретения, относится к молекуле, которая помогает Т-клеточному рецептору (TCR) в коммуникации с антигенпредставляющей клеткой и которую можно рассматривать как часть первого сигнала, приводящего к активации TCR. Примеры корецепторов TCR включают, ноA TCR coreceptor, as used herein, refers to a molecule that assists the T cell receptor (TCR) in communicating with an antigen presenting cell and which can be considered part of the first signal leading to TCR activation. Examples of TCR coreceptors include but

- 12 045368 без ограничения, CD4, LAG3 и CD8.- 12 045368 unlimited, CD4, LAG3 and CD8.

Костимулятор TCR в рамках изобретения, относится к молекуле, которая усиливает ответ Тклетки на антиген и которую можно рассматривать как второй сигнал, приводящий к активации TCR. Примеры костимуляторов TCR включают, но без ограничения, ICOS, CD27, CD28, 4-1ВВ (CD 137), ОХ40 (CD134), CD30, CD40, ассоциированный с функцией лимфоцитов антиген 1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, В7-Н3 и лиганд, специфически связывающий CD83.A TCR costimulator, as used herein, refers to a molecule that enhances a T Cell's response to an antigen and which can be considered as a second signal leading to TCR activation. Examples of TCR costimulators include, but are not limited to, ICOS, CD27, CD28, 4-1BB (CD 137), OX40 (CD134), CD30, CD40, lymphocyte function-associated antigen 1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 and CD83-specific binding ligand.

Коингибитор TCR или рецептор контрольной точки, в рамках изобретения, относится к молекуле, которая ингибирует ответ Т-клетки на антиген. Примеры коингибиторов TCR включают, но без ограничения, PD-1, TIM3, LAG-3, TIGIT, BTLA, CD160 и CD37.A TCR coinhibitor or checkpoint receptor, as used herein, refers to a molecule that inhibits a T cell response to an antigen. Examples of TCR coinhibitors include, but are not limited to, PD-1, TIM3, LAG-3, TIGIT, BTLA, CD160 and CD37.

Термины реципиент, индивидуум, субъект, хозяин и пациент использованы в настоящем описании взаимозаменяемо, и в некоторых вариантах осуществления, относятся к любому субъектумлекопитающему, для которого диагностика, лечение или терапия являются желательными, в частности, к человеку. Млекопитающее, для целей лечения, относится к любому животному, классифицированному как млекопитающее, включая человека, домашних и сельскохозяйственных животных, и лабораторных животных, животных в зоопарке, спортивных животных или животных-компаньонов, таких как собаки, лошади, кошки, коровы, овцы, козы, свиньи, мыши, крысы, кролики, морские свинки, обезьяны и т.д. В некоторых вариантах осуществления, млекопитающее представляет собой человека. Ни один из этих терминов не требует наблюдения медицинского персонала.The terms recipient, individual, subject, host, and patient are used interchangeably herein, and in some embodiments, refer to any mammalian subject for which diagnosis, treatment, or therapy is desired, particularly a human. Mammal, for purposes of treatment, refers to any animal classified as a mammal, including humans, domestic and farm animals, and laboratory animals, zoo animals, sporting animals or companion animals such as dogs, horses, cats, cows, sheep, goats, pigs, mice, rats, rabbits, guinea pigs, monkeys, etc. In some embodiments, the mammal is a human. None of these terms require supervision by medical personnel.

В рамках изобретения, термины лечение, обработка, и т.п., в некоторых вариантах осуществления, относятся к введению средства или осуществлению способа, с целью получения эффекта. Эффект может являться профилактическим в отношении полного или частичного предотвращения заболевания или его симптома, и/или может являться терапевтическим в отношении вызова частичного или полного излечения заболевания и/или симптомов заболевания. Лечение, в рамках изобретения, может включать лечение заболевания или нарушения (например, злокачественной опухоли) у млекопитающего, в частности, у человека, и включает: (а) предотвращение возникновения заболевания или симптома заболевания у субъекта, который может иметь предрасположенность к заболеванию, но еще не диагностирован как имеющий его (например, включая заболевания, которые могут быть ассоциированы с или вызваны первичным заболеванием; (b) ингибирование заболевания, т.е., арест его развития; и (с) облегчение заболевания, т.е. вызов регрессии заболевания. Лечение может относиться к любым показателям успеха лечения или облегчения, или предотвращения злокачественной опухоли, включая любой объективный или субъективный параметр, такой как ослабление; ремиссия; уменьшение симптомов; или доведение состояния заболевания до более переносимого для пациента; замедление скорости дегенерации или ухудшения; или доведение конечной точки дегенерации до менее истощающей. Лечение или облегчение симптомов основано на одном или нескольких объективных или субъективных параметрах; включая результаты обследования терапевтом. Соответственно, термин лечение включает введение соединений или средств по настоящему изобретению для предотвращения, задержки, облегчения, ареста или ингибирования развития симптомов или состояний, ассоциированных с заболеваниями (например, злокачественными опухолями). Термин терапевтический эффект относится к уменьшению, прекращению, или предотвращению заболевания, симптомов заболевания или побочных эффектов заболевания у субъекта.As used herein, the terms treatment, treatment, and the like, in some embodiments, refer to administering an agent or carrying out a method to produce an effect. The effect may be prophylactic in terms of completely or partially preventing a disease or symptom thereof, and/or may be therapeutic in terms of causing partial or complete cure of a disease and/or disease symptoms. Treatment, within the scope of the invention, may include treating a disease or disorder (eg, a cancer) in a mammal, particularly a human, and includes: (a) preventing the occurrence of a disease or symptom of a disease in a subject who may have a predisposition to the disease, but not yet diagnosed as having it (eg, including diseases that may be associated with or caused by a primary disease; (b) inhibition of the disease, i.e., arresting its progression; and (c) alleviation of the disease, i.e., causing regression Disease Treatment may refer to any measure of success in treating or alleviating or preventing a malignancy, including any objective or subjective parameter such as attenuation; remission; reduction of symptoms; or making the disease state more tolerable to the patient; slowing the rate of degeneration or deterioration; or bringing the end point of degeneration to a less debilitating level.Treatment or relief of symptoms is based on one or more objective or subjective parameters; including the results of the examination by the therapist. Accordingly, the term treatment includes the administration of compounds or agents of the present invention to prevent, delay, alleviate, arrest or inhibit the development of symptoms or conditions associated with diseases (eg, cancer). The term therapeutic effect refers to the reduction, cessation, or prevention of a disease, symptoms of a disease, or side effects of a disease in a subject.

В рамках изобретения, формы единственного числа включают объекты ссылки множественного числа, если контекст явно не требует иного. Таким образом, например, ссылка на антитело включает множество антител, и ссылка на антитело, в некоторых вариантах осуществления, включает несколько антител и т.д.For the purposes of the invention, singular forms include plural entities of reference unless the context clearly requires otherwise. Thus, for example, a reference to an antibody includes a plurality of antibodies, and a reference to an antibody, in some embodiments, includes multiple antibodies, etc.

В рамках изобретения, все числовые значения или числовые диапазоны включают целые числа внутри таких диапазонов или включающие такие диапазоны, и доли значений или целых чисел внутри диапазонов или включающие диапазоны, если контекст явно не требует иного. Таким образом, например, ссылка на диапазон 90-100% включает 91, 92, 93, 94, 95, 95, 96, 97% и т.д., так же как 91,1, 91,2, 91,3, 91,4, 91,5% и т.д., 92,1, 92,2, 92,3, 92,4, 92,5% и т.д. В другом примере, ссылка на диапазон 1-5000 раз включает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 раз и т.д., так же как 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 раза и т.д., 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5 раз и т.д., и т.п.As used herein, all numeric values or numeric ranges include integers within or including such ranges, and fractions of values or integers within or including ranges, unless the context clearly requires otherwise. Thus, for example, reference to the 90-100% range includes 91, 92, 93, 94, 95, 95, 96, 97%, etc., as well as 91.1, 91.2, 91.3, 91.4, 91.5%, etc., 92.1, 92.2, 92.3, 92.4, 92.5%, etc. In another example, a reference to the range 1-5000 times includes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 times, etc., same as 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5 times, etc., 2.1, 2.2, 2.3, 2 ,4, 2.5 times, etc., etc.

Приблизительное количество, в рамках изобретения, относится к диапазону, включающему количество и лежащему в диапазоне от на 10% ниже этого количества до на 10% выше этого количества. Приблизительный диапазон относится к 10% ниже нижнего предела диапазона, простираясь до 10% выше верхнего предела диапазона.An approximate amount, as used herein, refers to a range including an amount ranging from 10% below that amount to 10% above that amount. The approximate range refers to 10% below the lower end of the range, extending to 10% above the upper end of the range.

Процент (%) идентичности относится к степени, в которой две последовательности (нуклеотидов или аминокислот) имеют одинаковый остаток в тех же самых положениях при выравнивании. Например, аминокислотная последовательность является на Х% идентичной SEQ ID NO: Y обозначает % идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: Y и уточняет, что Х% остатков в аминокислотной последовательности являются идентичными остаткам из последовательности, описанной в SEQ ID NO: Y. Как правило, компьютерные программы используют для таких расчетов. Иллюстративные программы, сравнивающие и выравнивающие пары последовательностей, включают ALIGN (Myers and Miller, 1988), FASTA (Pearson and Lipman, 1988; Pearson, 1990) и gapped BLAST (Altschul et al., 1997),Percentage (%) identity refers to the degree to which two sequences (nucleotides or amino acids) have the same residue at the same positions in the alignment. For example, an amino acid sequence is X% identical to SEQ ID NO: Y indicates % amino acid sequence identity to SEQ ID NO: Y and specifies that X% of residues in the amino acid sequence are identical to residues from the sequence described in SEQ ID NO: Y. How As a rule, computer programs are used for such calculations. Exemplary programs that compare and align sequence pairs include ALIGN (Myers and Miller, 1988), FASTA (Pearson and Lipman, 1988; Pearson, 1990), and gapped BLAST (Altschul et al., 1997).

- 13 045368- 13 045368

BLASTP, BLASTN или GCG (Devereux et al., 1984).BLASTP, BLASTN or GCG (Devereux et al., 1984).

В рамках изобретения, термин избирательное связывание относится к более высокой аффинности, с которой молекула (например, белок, такой как связывающий мишень лиганд ТАС) связывается со своей молекулой-мишенью (например, антигеном-мишенью, таким как HER-2, ВСМА или CD19), по сравнению с другими молекулами.As used herein, the term selective binding refers to the higher affinity with which a molecule (e.g., a protein such as a target binding TAC ligand) binds to its target molecule (e.g., a target antigen such as HER-2, BCMA, or CD19 ), compared to other molecules.

Связывающий Т-клетку с антигеном агент (три-ТАС или ТАС).T cell antigen binding agent (tri-TAC or TAC).

В конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим трифункциональный связывающий Т-клетку с антигеном агент (три-ТАС). В некоторых вариантах осуществления, нуклеиновые кислоты, кодирующие три-ТАС, содержат: (а) первый полинуклеотид, кодирующий специфический для мишени лиганд; (b) второй полинуклеотид, кодирующий лиганд, связывающий комплекс TCR; и (с) третий полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен и цитозольный домен. В некоторых вариантах осуществления, нуклеиновые кислоты, кодирующие триТАС, не кодируют костимулирующий домен. В некоторых вариантах осуществления, нуклеиновые кислоты, кодирующие три-ТАС, не кодируют коактивирующий домен.In specific embodiments, the present invention relates to nucleic acids encoding a trifunctional T cell antigen binding agent (tri-TAC). In some embodiments, the nucleic acids encoding tri-TAC comprise: (a) a first polynucleotide encoding a target-specific ligand; (b) a second polynucleotide encoding a TCR complex binding ligand; and (c) a third polynucleotide encoding a transmembrane domain and a cytosolic domain. In some embodiments, the nucleic acids encoding triTAS do not encode a co-stimulatory domain. In some embodiments, the nucleic acids encoding tri-TAC do not encode a coactivating domain.

Специфический для мишени лиганд.Target specific ligand.

Специфический для мишени лиганд, также обозначенный как антигенсвязывающий домен, относится к любому веществу или молекуле, связывающимся, напрямую или опосредованно, с клеткоймишенью. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд связывается с антигеном на клетке-мишени. В некоторых вариантах осуществления, клетка-мишень представляет собой клетку, ассоциированную с состоянием заболевания, включая, но без ограничения, злокачественную опухоль, гематологическое злокачественное новообразование, крупноклеточную В-клеточную лимфому, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому, первичную медиастинальную В-клеточную лимфому, В-клеточную лимфому высокой степени злокачественности или крупноклеточную В-клеточную лимфому, возникающую из фолликулярной лимфомы. В некоторых вариантах осуществления, клеткамишень представляет собой клетку опухоли. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд связывается с антигеном опухоли или опухолеассоциированным антигеном на клетке опухоли. В некоторых вариантах осуществления, антиген-мишень представляет собой антиген опухоли. В некоторых вариантах осуществления, антиген опухоли, когда является белковым, представляет собой последовательность из 8 или более аминокислот, вплоть до полноразмерного белка. В некоторых вариантах осуществления, антиген опухоли представляет собой любое количество аминокислот между 8 и полноразмерным белком, которое содержит по меньшей мере один антигенный фрагмент полноразмерного белка, представленный на главном комплексе гистосовместимости (МНС). Примеры антигенов опухолей включают, но без ограничения, CD19, HER-2 (erbB-2), антиген созревания В-клеток (ВСМА), альфафетопротеин (AFP), карциноэмбриональный антиген (СЕА), СА-125, MUC-1, эпителиальный антиген опухоли (ЕТА), тирозиназу, ассоциированный с меланомой антиген (MAGE), простатспецифический антиген (PSA), ассоциированный с глиомой антиген, β-субъединицу хорионического гонадотропина человека, тиреоглобулин, RAGE-1, MN-CA IX, обратную транскриптазу теломеразы человека, RU1, RU2 (AS), карбоксилэстеразу кишечника, mut hsp70-2, M-CSF, простазу, PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, простеин, PSMA, сурвивин и теломеразу, антиген-1 опухоли карциномы предстательной железы (РСТА-1), ELF2M, эластазу нейтрофилов, CD22, инсулиновый фактор роста (IGF)-I, IGF-II, рецептор IGF-I и мезотелин.A target-specific ligand, also referred to as an antigen-binding domain, refers to any substance or molecule that binds, directly or indirectly, to a target cell. In some embodiments, the target-specific ligand binds to an antigen on the target cell. In some embodiments, the target cell is a cell associated with a disease condition, including, but not limited to, cancer, hematologic malignancy, large B-cell lymphoma, diffuse large B-cell lymphoma, primary mediastinal B-cell lymphoma, High-grade B-cell lymphoma or large B-cell lymphoma arising from follicular lymphoma. In some embodiments, the target cell is a tumor cell. In some embodiments, the target-specific ligand binds to a tumor antigen or tumor-associated antigen on a tumor cell. In some embodiments, the target antigen is a tumor antigen. In some embodiments, the tumor antigen, when proteinaceous, is a sequence of 8 or more amino acids, up to a full-length protein. In some embodiments, the tumor antigen is any number of amino acids between 8 and a full-length protein that contains at least one antigenic fragment of the full-length protein presented on the major histocompatibility complex (MHC). Examples of tumor antigens include, but are not limited to, CD19, HER-2 (erbB-2), B-cell maturation antigen (BCMA), alphafetoprotein (AFP), carcinoembryonic antigen (CEA), CA-125, MUC-1, epithelial antigen tumor (ETA), tyrosinase, melanoma-associated antigen (MAGE), prostate-specific antigen (PSA), glioma-associated antigen, β-subunit of human chorionic gonadotropin, thyroglobulin, RAGE-1, MN-CA IX, human telomerase reverse transcriptase, RU1 , RU2 (AS), intestinal carboxylesterase, mut hsp70-2, M-CSF, prostase, PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, prostein, PSMA, survivin and telomerase, prostate carcinoma tumor antigen-1 ( PCTA-1), ELF2M, neutrophil elastase, CD22, insulin growth factor (IGF)-I, IGF-II, IGF-I receptor and mesothelin.

В некоторых вариантах осуществления, специфические для мишени лиганды включают, но без ограничения, антитела и их фрагменты, например, одноцепочечные антитела, такие как одноцепочечные антитела (scFv), однодоменные антитела, пептиды, пептидомиметики, белки, гликопротеины или протеогликаны, которые связываются с клеткой и/или антигеном - мишенью. В некоторых вариантах осуществления, специфические для мишени лиганды включают, но без ограничения, сконструированные с анкириновым повтором белки (DARPin), лектины, ноттины, центририны, антикалины или природные лиганды для антигена опухоли, такие как факторы роста, субстраты ферментов, рецепторы или связывающие белки. В некоторых вариантах осуществления, специфические для мишени лиганды включают небелковые соединения, которые связываются с клетками и/или антигенами - мишенями, включая, но без ограничения, углеводы, липиды, нуклеиновые кислоты или малые молекулы. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд представляет собой сконструированный анкириновый повтор (DARPin), нацеленный на специфическую клетку и/или антиген. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (ScFv), нацеленный на специфическую клетку и/или антиген.In some embodiments, target-specific ligands include, but are not limited to, antibodies and fragments thereof, e.g., single-chain antibodies, such as single-chain antibodies (scFv), single-domain antibodies, peptides, peptidomimetics, proteins, glycoproteins, or proteoglycans, that bind to a cell and/or target antigen. In some embodiments, target-specific ligands include, but are not limited to, engineered ankyrin repeat proteins (DARPins), lectins, nottins, centrins, anticalins, or natural ligands for a tumor antigen, such as growth factors, enzyme substrates, receptors, or binding proteins . In some embodiments, target-specific ligands include non-protein compounds that bind to target cells and/or antigens, including, but not limited to, carbohydrates, lipids, nucleic acids, or small molecules. In some embodiments, the target-specific ligand is an engineered ankyrin repeat (DARPin) targeted to a specific cell and/or antigen. In some embodiments, the target-specific ligand is a single chain variable fragment (ScFv) targeting a specific cell and/or antigen.

В некоторых вариантах осуществления, антиген опухоли представляет собой антиген HER-2. В некоторых вариантах осуществления, специфический для HER-2 лиганд содержит антигенсвязывающий домен антитела, выбранного из трастузумаба, пертузумаба, лапатиниба, нератиниба, адо-трастузумаба эмтанзина, ганкотамаба, маргетуксимаба, тимигутузумаба и эртумаксомаба. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд представляет собой DARPin, избирательно связывающий антиген HER-2 (erbB-2). В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд представляет собой DARPin, специфически связывающий антиген HER-2 (erbB-2). В некоторыхIn some embodiments, the tumor antigen is a HER-2 antigen. In some embodiments, the HER-2 specific ligand comprises the antigen binding domain of an antibody selected from trastuzumab, pertuzumab, lapatinib, neratinib, ado-trastuzumab emtansine, gancotamab, margetuximab, timigutuzumab, and ertumaxomab. In some embodiments, the target-specific ligand is a DARPin that selectively binds HER-2 antigen (erbB-2). In some embodiments, the target-specific ligand is a DARPin that specifically binds HER-2 antigen (erbB-2). In some

- 14 045368 вариантах осуществления, DARPin, нацеленный на HER-2 (erb-2), содержит SEQ ID NO: 7 или SEQ ID- 14045368 embodiments, the DARPin targeting HER-2 (erb-2) contains SEQ ID NO: 7 or SEQ ID

NO: 8.NO: 8.

В некоторых вариантах осуществления, первый полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления, первый полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления, первый полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления, первый полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления, первый полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления, первый полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления, первый полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 7.In some embodiments, the first polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 7. In some embodiments, the first polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 75% sequence identity to SEQ ID NO: 7. In some embodiments, the first polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 7. In some embodiments, the first polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 85% sequence identity to SEQ ID NO: 7. In some embodiments, the first polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 7. In some embodiments, the first polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 7. In some embodiments, the first polynucleotide comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7.

В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 8.In some embodiments, the target-specific ligand contains an amino acid sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 8. In some embodiments, the target-specific ligand contains an amino acid sequence having at least 75% sequence identity to SEQ ID NO: 8. In some embodiments, the target-specific ligand contains an amino acid sequence having at least 80% sequence identity with SEQ ID NO: 8. In some embodiments, the target-specific ligand contains an amino acid sequence having at least at least 85% sequence identity to SEQ ID NO: 8. In some embodiments, the target-specific ligand comprises an amino acid sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 8. In some embodiments, the target-specific ligand comprises an amino acid sequence having at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 8. In some embodiments, the target-specific ligand comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.

В некоторых вариантах осуществления, антиген опухоли представляет собой антиген ВСМА. В некоторых вариантах осуществления, специфический для ВСМА лиганд содержит антигенсвязывающий домен антитела, выбранного из белантамаба мафодотина, и GSK2857916. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд представляет собой scFv, избирательно связывающий ВСМА. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд представляет собой scFv, специфически связывающий ВСМА. В некоторых вариантах осуществления, scFv, связывающий ВСМА, содержит SEQ ID NO: 33 или SEQ ID NO: 34.In some embodiments, the tumor antigen is a BCMA antigen. In some embodiments, the BCMA-specific ligand comprises the antigen binding domain of an antibody selected from belantamab mafodotin and GSK2857916. In some embodiments, the target-specific ligand is a scFv that selectively binds BCMA. In some embodiments, the target-specific ligand is a scFv that specifically binds BCMA. In some embodiments, the BCMA binding scFv comprises SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 34.

В некоторых вариантах осуществления, первый полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 33. В некоторых вариантах осуществления, первый полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 33. В некоторых вариантах осуществления, первый полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 33. В некоторых вариантах осуществления, первый полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 33. В некоторых вариантах осуществления, первый полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 33. В некоторых вариантах осуществления, первый полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 33. В некоторых вариантах осуществления, первый полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 33.In some embodiments, the first polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 33. In some embodiments, the first polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 75% sequence identity to SEQ ID NO: 33. In some embodiments, the first polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 33. In some embodiments, the first polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 85% sequence identity to SEQ ID NO: 33. In some embodiments, the first polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 33. In some embodiments, the first polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 33. In some embodiments, the first polynucleotide comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 33.

В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 34. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 34. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 34. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 34. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 34. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 34. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишениIn some embodiments, the target-specific ligand contains an amino acid sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 34. In some embodiments, the target-specific ligand contains an amino acid sequence having at least 75% sequence identity to SEQ ID NO: 34. In some embodiments, the target-specific ligand contains an amino acid sequence having at least 80% sequence identity with SEQ ID NO: 34. In some embodiments, the target-specific ligand contains an amino acid sequence having at least at least 85% sequence identity to SEQ ID NO: 34. In some embodiments, the target-specific ligand comprises an amino acid sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 34. In some embodiments, the target-specific ligand comprises an amino acid sequence having at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 34. In some embodiments, target specific

- 15 045368 лиганд содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 34.- 15 045368 ligand contains the amino acid sequence from SEQ ID NO: 34.

В некоторых вариантах осуществления, антиген опухоли представляет собой антиген CD19. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд представляет собой scFv, избирательно связывающий CD19. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд представляет собой scFv, специфически связывающий CD19. В некоторых вариантах осуществления, scFv, связывающий CD19, содержит SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 36.In some embodiments, the tumor antigen is a CD19 antigen. In some embodiments, the target-specific ligand is an scFv that selectively binds CD19. In some embodiments, the target-specific ligand is an scFv that specifically binds CD19. In some embodiments, the CD19 binding scFv comprises SEQ ID NO: 35 or SEQ ID NO: 36.

В некоторых вариантах осуществления, первый полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 35. В некоторых вариантах осуществления, первый полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 35. В некоторых вариантах осуществления, первый полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 35. В некоторых вариантах осуществления, первый полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 35. В некоторых вариантах осуществления, первый полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 35. В некоторых вариантах осуществления, первый полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 35. В некоторых вариантах осуществления, первый полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 35.In some embodiments, the first polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 35. In some embodiments, the first polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 75% sequence identity to SEQ ID NO: 35. In some embodiments, the first polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 35. In some embodiments, the first polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 85% sequence identity to SEQ ID NO: 35. In some embodiments, the first polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 35. In some embodiments, the first polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 35. In some embodiments, the first polynucleotide comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 35.

В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 36. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 36. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 36. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 36. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 36. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 36. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 36.In some embodiments, the target-specific ligand contains an amino acid sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 36. In some embodiments, the target-specific ligand contains an amino acid sequence having at least 75% sequence identity to SEQ ID NO: 36. In some embodiments, the target-specific ligand contains an amino acid sequence having at least 80% sequence identity with SEQ ID NO: 36. In some embodiments, the target-specific ligand contains an amino acid sequence having at least at least 85% sequence identity to SEQ ID NO: 36. In some embodiments, the target-specific ligand comprises an amino acid sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 36. In some embodiments, the target-specific ligand comprises an amino acid sequence having at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 36. In some embodiments, the target-specific ligand comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36.

Лиганд, связывающий комплекс TCR.Ligand that binds the TCR complex.

В некоторых вариантах осуществления, ТАС содержит лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR, содержит вещество, связывающееся, напрямую или опосредованно, с белком из TCR. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR, содержит вещество, избирательно связывающееся с белком из TCR. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR, содержит вещество, специфически связывающееся с белком из TCR. Белки, ассоциированные с TCR, включают, но без ограничения, цепь альфа (α) TCR, цепь бета (β) TCR, цепь гамма (γ) TCR, цепь дельта (δ) TCR, цепь CD3y, цепь CD3δ и цепи CD3ε. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR, представляет собой антитело против цепи альфа (α) TCR, цепи бета (β) TCR, цепи гамма (γ) TCR, цепи дельта (δ) TCR, цепи CD3y, цепи CD3δ и/или цепи CD3ε. В некоторых вариантах осуществления, белок, ассоциированный с комплексом TCR, представляет собой CD3. В некоторых вариантах осуществления, белок, ассоциированный с комплексом TCR, представляет собой CD3ε. Примеры антител против CD3, включают, но без ограничения. В некоторых вариантах осуществления, антитело, связывающее CD3, представляет собой одноцепочечное антитело, например, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий TCR, представляет собой антитело против CD3, или его фрагмент, такие как муромонаб, отелизизумаб, теплизумаб, висилизумаб, CD3-12, МЕМ-57, 4D10A6, CD3D или TR66.In some embodiments, the TAC contains a ligand that binds a protein associated with the TCR complex. In some embodiments, the TCR complex-associated protein binding ligand comprises a substance that binds, directly or indirectly, to a protein from the TCR. In some embodiments, the TCR complex-associated protein binding ligand comprises a substance that selectively binds to the TCR protein. In some embodiments, the TCR complex-associated protein binding ligand comprises a substance that specifically binds to a TCR protein. TCR associated proteins include, but are not limited to, TCR alpha (α) chain, TCR beta (β) chain, TCR gamma (γ) chain, TCR delta (δ) chain, CD3y chain, CD3δ chain, and CD3ε chains. In some embodiments, the TCR complex-associated protein binding ligand is an antibody against TCR alpha (α) chain, TCR beta (β) chain, TCR gamma (γ) chain, TCR delta (δ) chain, CD3y chain, CD3δ chains and/or CD3ε chains. In some embodiments, the TCR complex-associated protein is CD3. In some embodiments, the TCR complex-associated protein is CD3ε. Examples of anti-CD3 antibodies include, but are not limited to. In some embodiments, the CD3 binding antibody is a single chain antibody, such as a single chain fragment variable (scFv). In some embodiments, the TCR binding ligand is an anti-CD3 antibody, or a fragment thereof, such as muromonab, otelizumab, teplizumab, visilizumab, CD3-12, MEM-57, 4D10A6, CD3D, or TR66.

В некоторых вариантах осуществления, CD3 происходит из комплекса TCR на клетке, экспрессирующей второй полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления, связывание CD3 индуцирует активацию клетки, экспрессирующей второй полинуклеотид.In some embodiments, CD3 is derived from a TCR complex on a cell expressing the second polynucleotide. In some embodiments, CD3 binding induces activation of a cell expressing the second polynucleotide.

В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, представляет собой UCHT1 или его вариант. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, представляет собой UCHT1 (SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 или его гомологи). В некоторых вариантах осуществления, лиганд UCHT1 связывает CD3. В некоторых вариантах осуществления, лиганд UCHT1 избирательно связывает CD3. В некоторых вариантах осуществления, лиганд UCHT1 специфически связывает CD3. В некоторых вариантах осуществления, лиганд UCHT1 связывает CD3ε. В некоторых вариIn some embodiments, the TCR complex binding ligand is UCHT1 or a variant thereof. In some embodiments, the TCR complex binding ligand is UCHT1 (SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, or homologs thereof). In some embodiments, the UCHT1 ligand binds CD3. In some embodiments, the UCHT1 ligand selectively binds CD3. In some embodiments, the UCHT1 ligand specifically binds CD3. In some embodiments, the UCHT1 ligand binds CD3ε. In some countries

- 16 045368 антах осуществления, лиганд UCHT1 избирательно связывает CD3ε. В некоторых вариантах осуществления, лиганд UCHT1 специфически связывает CD3ε. В некоторых вариантах осуществления, лиганд UCHT1 кодирован посредством SEQ ID NO 13. В некоторых вариантах осуществления, лиганд UCHT1 содержит SEQ ID NO 14. В некоторых вариантах осуществления, лиганд UCHT1 является мутантным. В некоторых вариантах осуществления, лиганд UCHT1 содержит мутацию Y182T (также обозначенный как UCHT1 (Y182T)) (SEQ ID NO: 71 и SEQ ID NO: 72). В некоторых вариантах осуществления, лиганд UCHT1 (Y182T) связывает CD3. В некоторых вариантах осуществления, лиганд UCHT1 (Y182T) избирательно связывает CD3. В некоторых вариантах осуществления, лиганд UCHT1 (Y182T) специфически связывает CD3. В некоторых вариантах осуществления, лиганд UCHT1 (Y182T) связывает CD3ε. В некоторых вариантах осуществления, лиганд UCHT1 (Y182T) избирательно связывает CD3ε. В некоторых вариантах осуществления, лиганд UCHT1 (Y182T) специфически связывает CD3ε. В некоторых вариантах осуществления, лиганд UCHT1 (Y182T) кодирован посредством SEQ ID NO 71. В некоторых вариантах осуществления, лиганд UCHT1 (Y182T) содержит SEQ ID NO 72. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, представляет собой гуманизированный UCHT1 (huUCHT1). В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, представляет собой huUCHT1 (SEQ ID NO 43, SEQ ID NO: 44 или его гомологи). В некоторых вариантах осуществления, лиганд huUCHT1 связывает CD3. В некоторых вариантах осуществления, лиганд huUCHT1 избирательно связывает CD3. В некоторых вариантах осуществления, лиганд huUCHT1 специфически связывает CD3. В некоторых вариантах осуществления, лиганд huUCHT1 связывает CD3ε. В некоторых вариантах осуществления, лиганд huUCHT1 избирательно связывает CD3ε. В некоторых вариантах осуществления, лиганд huUCHT1 специфически связывает CD3ε. В некоторых вариантах осуществления, лиганд huUCHT1 кодирован посредством SEQ ID NO 43. В некоторых вариантах осуществления, лиганд huUCHT1 содержит SEQ ID NO 44. В некоторых вариантах осуществления, huUCHT1 имеет мутацию Y177T (также обозначенный как huUCHT1 (Y177T)) (SEQ ID NO: 45 и SEQ ID NO: 46). В некоторых вариантах осуществления, лиганд huUCHT1 (Y177T) связывает CD3. В некоторых вариантах осуществления, лиганд huUCHT1 (Y177T) избирательно связывает CD3. В некоторых вариантах осуществления, лиганд huUCHT1 (Y177T) специфически связывает CD3. В некоторых вариантах осуществления, лиганд huUCHT1 (Y177T) связывает CD3ε. В некоторых вариантах осуществления, лиганд huUCHT1 (Y177T) избирательно связывает CD3ε. В некоторых вариантах осуществления, лиганд huUCHT1 (Y177T) специфически связывает CD3ε. В некоторых вариантах осуществления, лиганд huUCHT1 (Y177T) кодирован посредством SEQ ID NO 45. В некоторых вариантах осуществления, лиганд huUCHT1 содержит SEQ ID NO 46.- 16 045368 ant implementation, the UCHT1 ligand selectively binds CD3ε. In some embodiments, the UCHT1 ligand specifically binds CD3ε. In some embodiments, the UCHT1 ligand is encoded by SEQ ID NO 13. In some embodiments, the UCHT1 ligand contains SEQ ID NO 14. In some embodiments, the UCHT1 ligand is mutated. In some embodiments, the UCHT1 ligand contains the Y182T mutation (also referred to as UCHT1 (Y182T)) (SEQ ID NO: 71 and SEQ ID NO: 72). In some embodiments, the UCHT1 ligand (Y182T) binds CD3. In some embodiments, the UCHT1 ligand (Y182T) selectively binds CD3. In some embodiments, the UCHT1 ligand (Y182T) specifically binds CD3. In some embodiments, the UCHT1 ligand (Y182T) binds CD3ε. In some embodiments, the UCHT1 ligand (Y182T) selectively binds CD3ε. In some embodiments, the UCHT1 ligand (Y182T) specifically binds CD3ε. In some embodiments, the UCHT1 ligand (Y182T) is encoded by SEQ ID NO 71. In some embodiments, the UCHT1 ligand (Y182T) is SEQ ID NO 72. In some embodiments, the TCR complex binding ligand is humanized UCHT1 (huUCHT1 ). In some embodiments, the TCR complex binding ligand is huUCHT1 (SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, or homologues thereof). In some embodiments, the huUCHT1 ligand binds CD3. In some embodiments, the huUCHT1 ligand selectively binds CD3. In some embodiments, the huUCHT1 ligand specifically binds CD3. In some embodiments, the huUCHT1 ligand binds CD3ε. In some embodiments, the huUCHT1 ligand selectively binds CD3ε. In some embodiments, the huUCHT1 ligand specifically binds CD3ε. In some embodiments, the huUCHT1 ligand is encoded by SEQ ID NO 43. In some embodiments, the huUCHT1 ligand contains SEQ ID NO 44. In some embodiments, huUCHT1 has the Y177T mutation (also designated huUCHT1 (Y177T)) (SEQ ID NO: 45 and SEQ ID NO: 46). In some embodiments, the huUCHT1 ligand (Y177T) binds CD3. In some embodiments, the huUCHT1 ligand (Y177T) selectively binds CD3. In some embodiments, the huUCHT1 ligand (Y177T) specifically binds CD3. In some embodiments, the huUCHT1 ligand (Y177T) binds CD3ε. In some embodiments, the huUCHT1 ligand (Y177T) selectively binds CD3ε. In some embodiments, the huUCHT1 ligand (Y177T) specifically binds CD3ε. In some embodiments, the huUCHT1 ligand (Y177T) is encoded by SEQ ID NO 45. In some embodiments, the huUCHT1 ligand contains SEQ ID NO 46.

В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 13.In some embodiments, the second polynucleotide comprises a nucleotide sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 13. In some embodiments, the second polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 75% sequence identity to SEQ ID NO: 13. In some embodiments, the second polynucleotide comprises a nucleotide sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 13. In some embodiments, the second polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 85% sequence identity to SEQ ID NO: 13. In some embodiments, the second polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 13. In some embodiments, the second polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 13. In some embodiments, the second polynucleotide comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13.

В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 14. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 14. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 14. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 14. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 14. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 14. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 14.In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 14. In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence having at least 75 % sequence identity to SEQ ID NO: 14. In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 14. In some embodiments, the TCR complex binding ligand , contains an amino acid sequence having at least 85% sequence identity to SEQ ID NO: 14. In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 14. In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence having at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 14. In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence from SEQ ID NO: 14 .

В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 71. В некоIn some embodiments, the second polynucleotide comprises a nucleotide sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 71. In some embodiments

- 17 045368 торых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 71. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 71. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 71. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 71. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 71. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 71.- 17 045368 In some embodiments, the second polynucleotide comprises a nucleotide sequence having at least 75% sequence identity to SEQ ID NO: 71. In some embodiments, the second polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 71. In some embodiments, the second polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 85% sequence identity to SEQ ID NO: 71. In some embodiments, the second polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 71. In some embodiments, the second polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 71. In some embodiments, the second polynucleotide contains a nucleotide sequence from SEQ ID NO: 71.

В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 72. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 72. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 72. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 72. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 72. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 72. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 72.In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 72. In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence having at least 75 % sequence identity to SEQ ID NO: 72. In some embodiments, the TCR complex binding ligand comprises an amino acid sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 72. In some embodiments, the TCR complex binding ligand , contains an amino acid sequence having at least 85% sequence identity to SEQ ID NO: 72. In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 72. In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence having at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 72. In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence from SEQ ID NO: 72 .

В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 43. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 43. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 43. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 43. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 43. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 43. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 43.In some embodiments, the second polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, the second polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 75% sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, the second polynucleotide comprises a nucleotide sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, the second polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 85% sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, the second polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, the second polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, the second polynucleotide comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 43.

В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 44. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 44. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 44. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 44. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 44. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 44. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 44.In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 44. In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence having at least 75 % sequence identity to SEQ ID NO: 44. In some embodiments, the TCR complex binding ligand comprises an amino acid sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 44. In some embodiments, the TCR complex binding ligand , contains an amino acid sequence having at least 85% sequence identity to SEQ ID NO: 44. In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 44. In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence having at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 44. In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence from SEQ ID NO: 44 .

В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 45. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 45. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 45. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 45. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 45. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклео- 18 045368 тид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 45. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 45.In some embodiments, the second polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, the second polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 75% sequence identity to SEQ ID NO: 45. 45. In some embodiments, the second polynucleotide comprises a nucleotide sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, the second polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 85% sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, the second polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, the second polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 95 % sequence identity to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, the second polynucleotide comprises a nucleotide sequence from SEQ ID NO: 45.

В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 46. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 46. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 46. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 46. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 46. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 46. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 46.In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 46. In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence having at least 75 % sequence identity to SEQ ID NO: 46. In some embodiments, the TCR complex binding ligand comprises an amino acid sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 46. In some embodiments, the TCR complex binding ligand , contains an amino acid sequence having at least 85% sequence identity to SEQ ID NO: 46. In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 46. In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence having at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 46. In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence from SEQ ID NO: 46 .

В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий CD3, представляет собой OKT3. В некоторых вариантах осуществления, лиганд OKT3 связывает CD3. В некоторых вариантах осуществления, лиганд OKT3 избирательно связывает CD3. В некоторых вариантах осуществления, лиганд OKT3 специфически связывает CD3. В некоторых вариантах осуществления, лиганд OKT3 связывает CD3ε. В некоторых вариантах осуществления, лиганд OKT3 избирательно связывает CD3ε. В некоторых вариантах осуществления, лиганд OKT3 специфически связывает CD3ε. В некоторых вариантах осуществления, лиганд OKT3 мыши кодирован посредством SEQ ID NO 21. В некоторых вариантах осуществления, лиганд OKT3 содержит SEQ ID NO 22.In some embodiments, the CD3 binding ligand is OKT3. In some embodiments, the OKT3 ligand binds CD3. In some embodiments, the OKT3 ligand selectively binds CD3. In some embodiments, the OKT3 ligand specifically binds CD3. In some embodiments, the OKT3 ligand binds CD3ε. In some embodiments, the OKT3 ligand selectively binds CD3ε. In some embodiments, the OKT3 ligand specifically binds CD3ε. In some embodiments, the mouse OKT3 ligand is encoded by SEQ ID NO 21. In some embodiments, the OKT3 ligand contains SEQ ID NO 22.

В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 21. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 21. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 21. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 21. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 21. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 21. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 21.In some embodiments, the second polynucleotide comprises a nucleotide sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 21. In some embodiments, the second polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 75% sequence identity to SEQ ID NO: 21. 21. In some embodiments, the second polynucleotide comprises a nucleotide sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 21. In some embodiments, the second polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 85% sequence identity to SEQ ID NO: 21. In some embodiments, the second polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 21. In some embodiments, the second polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 21. In some embodiments, the second polynucleotide comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21.

В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 22.In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 22. In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence having at least 75 % sequence identity to SEQ ID NO: 22. In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 22. In some embodiments, the TCR complex binding ligand , contains an amino acid sequence having at least 85% sequence identity to SEQ ID NO: 22. In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 22. In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence having at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 22. In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence from SEQ ID NO: 22 .

В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий CD3, представляет собой F6A. В некоторых вариантах осуществления, лиганд F6A связывает CD3. В некоторых вариантах осуществления, лиганд F6A избирательно связывает CD3. В некоторых вариантах осуществления, лиганд F6A специфически связывает CD3. В некоторых вариантах осуществления, лиганд F6A связывает CD3ε. В некоторых вариантах осуществления, лиганд F6A избирательно связывает CD3ε. В некоторых вариантах осуществления, лиганд F6A специфически связывает CD3ε. В некоторых вариантах осуществления, лиганд F6A мыши кодирован посредством SEQ ID NO 23. В некоторых вариантах осуществления, лиганд F6A содержит SEQ ID NO 24.In some embodiments, the CD3 binding ligand is F6A. In some embodiments, the F6A ligand binds CD3. In some embodiments, the F6A ligand selectively binds CD3. In some embodiments, the F6A ligand specifically binds CD3. In some embodiments, the F6A ligand binds CD3ε. In some embodiments, the F6A ligand selectively binds CD3ε. In some embodiments, the F6A ligand specifically binds CD3ε. In some embodiments, the mouse F6A ligand is encoded by SEQ ID NO 23. In some embodiments, the F6A ligand is encoded by SEQ ID NO 24.

В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последова- 19 045368 тельность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 23. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 23. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 23. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 23. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 23. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 23. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 23.In some embodiments, the second polynucleotide comprises a nucleotide sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 23. In some embodiments, the second polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 75% sequence identity to SEQ ID NO: 23. In some embodiments, the second polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 23. In some embodiments, the second polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 85% sequence identity sequences of SEQ ID NO: 23. In some embodiments, the second polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 23. In some embodiments, the second polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 95 % sequence identity to SEQ ID NO: 23. In some embodiments, the second polynucleotide comprises a nucleotide sequence from SEQ ID NO: 23.

В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 24.In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence having at least 75 % sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, the TCR complex binding ligand comprises an amino acid sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, the TCR complex binding ligand , contains an amino acid sequence having at least 85% sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence having at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence from SEQ ID NO: 24 .

В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий CD3, представляет собой L2K. В некоторых вариантах осуществления, лиганд L2K связывает CD3. В некоторых вариантах осуществления, лиганд L2K избирательно связывает CD3. В некоторых вариантах осуществления, лиганд L2K специфически связывает CD3. В некоторых вариантах осуществления, лиганд L2K связывает CD3ε. В некоторых вариантах осуществления, лиганд L2K избирательно связывает CD3ε. В некоторых вариантах осуществления, лиганд L2K специфически связывает CD3ε. В некоторых вариантах осуществления, лиганд L2K мыши кодирован посредством SEQ ID NO 25. В некоторых вариантах осуществления, лиганд L2K содержит SEQ ID NO 26.In some embodiments, the CD3 binding ligand is L2K. In some embodiments, the L2K ligand binds CD3. In some embodiments, the L2K ligand selectively binds CD3. In some embodiments, the L2K ligand specifically binds CD3. In some embodiments, the L2K ligand binds CD3ε. In some embodiments, the L2K ligand selectively binds CD3ε. In some embodiments, the L2K ligand specifically binds CD3ε. In some embodiments, the mouse L2K ligand is encoded by SEQ ID NO 25. In some embodiments, the L2K ligand contains SEQ ID NO 26.

В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 25.In some embodiments, the second polynucleotide comprises a nucleotide sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 25. In some embodiments, the second polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 75% sequence identity to SEQ ID NO: 25. In some embodiments, the second polynucleotide comprises a nucleotide sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 25. In some embodiments, the second polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 85% sequence identity to SEQ ID NO: 25. In some embodiments, the second polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 25. In some embodiments, the second polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 25. In some embodiments, the second polynucleotide comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25.

В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий комплекс TCR, содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 26.In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 26. In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence having at least 75 % sequence identity to SEQ ID NO: 26. In some embodiments, the TCR complex binding ligand comprises an amino acid sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 26. In some embodiments, the TCR complex binding ligand , contains an amino acid sequence having at least 85% sequence identity to SEQ ID NO: 26. In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 26. In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence having at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 26. In some embodiments, the TCR complex binding ligand contains an amino acid sequence from SEQ ID NO: 26 .

- 20 045368- 20 045368

Трансмембранный домен и цитозольный домен.Transmembrane domain and cytosolic domain.

В некоторых вариантах осуществления, связывающий Т-клетку с антигеном агент включает полипептид передающего сигналы домена Т-клеточного рецептора. В некоторых вариантах осуществления, полипептид передающего сигналы домена TCR содержит трансмембранный домен. В некоторых вариантах осуществления, полипептид передающего сигналы домена TCR содержит цитозольный домен. В некоторых вариантах осуществления, полипептид передающего сигналы домена TCR содержит трансмембранный домен и цитозольный домен. В некоторых вариантах осуществления, цитозольный домен и трансмембранные домены, необязательно, соединены посредством линкера. В некоторых вариантах осуществления, полипептид передающего сигналы домена Т-клеточного рецептора содержит домен корецептора TCR. В некоторых вариантах осуществления, полипептид передающего сигналы домена Тклеточного рецептора не содержит домен костимулятора TCR. В некоторых вариантах осуществления, полипептид передающего сигналы домена TCR содержит трансмембранный домен и/или цитозольный домен корецептора TCR. В некоторых вариантах осуществления, корецептор TCR представляет собой CD4, CD8, LAG3 или его химерный вариант.In some embodiments, the T cell antigen binding agent comprises a T cell receptor signaling domain polypeptide. In some embodiments, the TCR signaling domain polypeptide comprises a transmembrane domain. In some embodiments, the TCR signaling domain polypeptide comprises a cytosolic domain. In some embodiments, the TCR signaling domain polypeptide comprises a transmembrane domain and a cytosolic domain. In some embodiments, the cytosolic domain and transmembrane domains are optionally connected via a linker. In some embodiments, the T cell receptor signaling domain polypeptide comprises a TCR coreceptor domain. In some embodiments, the T cell receptor signaling domain polypeptide does not comprise a TCR costimulator domain. In some embodiments, the TCR signaling domain polypeptide comprises a transmembrane domain and/or a cytosolic domain of a TCR coreceptor. In some embodiments, the TCR coreceptor is CD4, CD8, LAG3, or a chimeric variant thereof.

В некоторых вариантах осуществления, корецептор TCR представляет собой CD4. В некоторых вариантах осуществления, полипептид передающего сигналы домена TCR содержит трансмембранный и цитозольный домены корецептора CD4, кодированные посредством SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления, полипептид передающего сигналы домена TCR содержит трансмембранный и цитозольный домены корецептора CD4, содержащие SEQ ID NO: 18.In some embodiments, the TCR coreceptor is CD4. In some embodiments, the TCR signaling domain polypeptide comprises transmembrane and cytosolic CD4 coreceptor domains encoded by SEQ ID NO: 17. In some embodiments, the TCR signaling domain polypeptide comprises transmembrane and cytosolic CD4 coreceptor domains encoded by SEQ ID NO: 18 .

В некоторых вариантах осуществления, третий полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления, третий полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления, третий полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления, третий полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления, третий полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления, третий полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления, третий полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 17.In some embodiments, the third polynucleotide comprises a nucleotide sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 17. In some embodiments, the third polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 75% sequence identity to SEQ ID NO: 17. In some embodiments, the third polynucleotide comprises a nucleotide sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 17. In some embodiments, the third polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 85% sequence identity to SEQ ID NO: 17. In some embodiments, the third polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 17. In some embodiments, the third polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 17. In some embodiments, the third polynucleotide comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17.

В некоторых вариантах осуществления, трансмембранный домен и цитозольный домен содержат аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления, трансмембранный домен и цитозольный домен содержат аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления, трансмембранный домен и цитозольный домен содержат аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления, трансмембранный домен и цитозольный домен содержат аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления, трансмембранный домен и цитозольный домен содержат аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления, трансмембранный домен и цитозольный домен содержат аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления, трансмембранный домен и цитозольный домен содержат аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 18.In some embodiments, the transmembrane domain and the cytosolic domain contain an amino acid sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 18. In some embodiments, the transmembrane domain and the cytosolic domain contain an amino acid sequence having at least 75% sequence identity sequences of SEQ ID NO: 18. In some embodiments, the transmembrane domain and the cytosolic domain comprise an amino acid sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 18. In some embodiments, the transmembrane domain and the cytosolic domain comprise an amino acid sequence having at least 85% sequence identity to SEQ ID NO: 18. In some embodiments, the transmembrane domain and the cytosolic domain comprise an amino acid sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 18. In some embodiments, the transmembrane domain and the cytosolic domain comprise an amino acid sequence having at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 18. In some embodiments, the transmembrane domain and the cytosolic domain comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18.

В некоторых вариантах осуществления, корецептор TCR представляет собой CD8. В некоторых вариантах осуществления, корецептор TCR представляет собой CD8a. В некоторых вариантах осуществления, полипептид передающего сигналы домена TCR содержит трансмембранный и цитозольные домены корецептора CD8a, кодируемые посредством SEQ ID NO: 37. В некоторых вариантах осуществления, полипептид передающего сигналы домена TCR содержит трансмембранный и цитозольный домены корецептора CD8a, содержащие SEQ ID NO: 38.In some embodiments, the TCR coreceptor is CD8. In some embodiments, the TCR coreceptor is CD8a. In some embodiments, the TCR signaling domain polypeptide comprises the transmembrane and cytosolic domains of the CD8a coreceptor, encoded by SEQ ID NO: 37. In some embodiments, the TCR signaling domain polypeptide comprises the transmembrane and cytosolic domains of the CD8a coreceptor, comprising SEQ ID NO: 38 .

В некоторых вариантах осуществления, третий полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 37. В некоторых вариантах осуществления, третий полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 37. В некоторых вариантах осуществления, третий полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 37. В некоторых вариантах осуществления, третий полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 37. В некоторых вариантах осуществления, третийIn some embodiments, the third polynucleotide comprises a nucleotide sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 37. In some embodiments, the third polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 75% sequence identity to SEQ ID NO: 37. In some embodiments, the third polynucleotide comprises a nucleotide sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 37. In some embodiments, the third polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 85% sequence identity to SEQ ID NO: 37. In some embodiments, the third

- 21 045368 полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 37. В некоторых вариантах осуществления, третий полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 37. В некоторых вариантах осуществления, третий полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 37.- 21 045368 polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 37. In some embodiments, the third polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 37. B In some embodiments, the third polynucleotide comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 37.

В некоторых вариантах осуществления, трансмембранный домен и цитозольный домен содержат аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 38. В некоторых вариантах осуществления, трансмембранный домен и цитозольный домен содержат аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 38. В некоторых вариантах осуществления, трансмембранный домен и цитозольный домен содержат аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 38. В некоторых вариантах осуществления, трансмембранный домен и цитозольный домен содержат аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 38. В некоторых вариантах осуществления, трансмембранный домен и цитозольный домен содержат аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 38. В некоторых вариантах осуществления, трансмембранный домен и цитозольный домен содержат аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 38. В некоторых вариантах осуществления, трансмембранный домен и цитозольный домен содержат аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 38.In some embodiments, the transmembrane domain and the cytosolic domain contain an amino acid sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 38. In some embodiments, the transmembrane domain and the cytosolic domain contain an amino acid sequence having at least 75% sequence identity sequences of SEQ ID NO: 38. In some embodiments, the transmembrane domain and the cytosolic domain comprise an amino acid sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 38. In some embodiments, the transmembrane domain and the cytosolic domain comprise an amino acid sequence having at least 85% sequence identity to SEQ ID NO: 38. In some embodiments, the transmembrane domain and the cytosolic domain comprise an amino acid sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 38. In some embodiments, the transmembrane domain and the cytosolic domain comprise an amino acid sequence having at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 38. In some embodiments, the transmembrane domain and the cytosolic domain comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид передающего сигналы домена TCR содержит химеру последовательностей или доменов из корецепторов. В некоторых вариантах осуществления, полипептид передающего сигналы домена TCR содержит химеру CD8a и CD8e, где богатая аргинином область CD8a заменена на богатую аргинином область CD8e. В некоторых вариантах осуществления, полипептид передающего сигналы домена Т-клеточного рецептора содержит трансмембранный и цитозольный домены химеры корецептора CD8a+R(e), кодируемой посредством SEQ ID NO: 39. В некоторых вариантах осуществления, полипептид передающего сигналы домена Т-клеточного рецептора содержит трансмембранный и цитозольный домены химеры корецептора CD8a+R(e), представленные SEQ ID NO: 40. В некоторых вариантах осуществления, полипептид передающего сигналы домена TCR содержит химеру CD8a и CD8e, домен СХСР CD8a, содержащий связывающий Lck мотив, добавлен к Сконцу цитозольного домена CD8e. В некоторых вариантах осуществления, полипептид передающего сигналы домена Т-клеточного рецептора содержит трансмембранный и цитозольный домены химеры корецептора CD8e+Lck, кодируемые посредством SEQ ID NO: 41. В некоторых вариантах осуществления, полипептид передающего сигналы домена Т-клеточного рецептора содержит трансмембранный и цитозольный домены химеры корецептора CD8e+Lck, представленные SEQ ID NO: 42.In some embodiments, the TCR signaling domain polypeptide comprises a chimera of coreceptor sequences or domains. In some embodiments, the TCR signaling domain polypeptide comprises a chimera of CD8a and CD8e, wherein the arginine-rich region of CD8a is replaced by the arginine-rich region of CD8e. In some embodiments, the T cell receptor signaling domain polypeptide comprises transmembrane and cytosolic domains of the CD8a+R(e) coreceptor chimera encoded by SEQ ID NO: 39. In some embodiments, the T cell receptor signaling domain polypeptide comprises transmembrane and the cytosolic domains of the CD8a+R(e) co-receptor chimera represented by SEQ ID NO: 40. In some embodiments, the TCR signaling domain polypeptide comprises a CD8a and CD8e chimera, the CD8a CXCP domain containing the Lck binding motif is added to the end of the CD8e cytosolic domain . In some embodiments, the T cell receptor signaling domain polypeptide comprises the transmembrane and cytosolic domains of the CD8e+Lck coreceptor chimera encoded by SEQ ID NO: 41. In some embodiments, the T cell receptor signaling domain polypeptide comprises the transmembrane and cytosolic domains CD8e+Lck coreceptor chimeras represented by SEQ ID NO: 42.

В некоторых вариантах осуществления, третий полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 39. В некоторых вариантах осуществления, третий полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 39. В некоторых вариантах осуществления, третий полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 39. В некоторых вариантах осуществления, третий полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 39. В некоторых вариантах осуществления, третий полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 39. В некоторых вариантах осуществления, третий полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 39. В некоторых вариантах осуществления, третий полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 39.In some embodiments, the third polynucleotide comprises a nucleotide sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 39. In some embodiments, the third polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 75% sequence identity to SEQ ID NO: 39. In some embodiments, the third polynucleotide comprises a nucleotide sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 39. In some embodiments, the third polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 85% sequence identity to SEQ ID NO: 39. In some embodiments, the third polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 39. In some embodiments, the third polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 39. In some embodiments, the third polynucleotide comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 39.

В некоторых вариантах осуществления, трансмембранный домен и цитозольный домен содержат аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 40. В некоторых вариантах осуществления, трансмембранный домен и цитозольный домен содержат аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 40. В некоторых вариантах осуществления, трансмембранный домен и цитозольный домен содержат аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 40. В некоторых вариантах осуществления, трансмембранный домен и цитозольный домен содержат аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 40. В некоторых вариантах осуществления, трансмембранный домен и цитозольный домен содержат аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 40. В некоторых вариантах осуществления, трансмембранный домен и цитозольный домен содержат аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 40. ВIn some embodiments, the transmembrane domain and the cytosolic domain contain an amino acid sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 40. In some embodiments, the transmembrane domain and the cytosolic domain contain an amino acid sequence having at least 75% sequence identity sequences of SEQ ID NO: 40. In some embodiments, the transmembrane domain and the cytosolic domain comprise an amino acid sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 40. In some embodiments, the transmembrane domain and the cytosolic domain comprise an amino acid sequence having at least 85% sequence identity to SEQ ID NO: 40. In some embodiments, the transmembrane domain and the cytosolic domain comprise an amino acid sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 40. In some embodiments, the transmembrane domain and the cytosolic domain contain an amino acid sequence having at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 40. B

- 22 045368 некоторых вариантах осуществления, трансмембранный домен и цитозольный домен содержат аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 40.- 22045368 In some embodiments, the transmembrane domain and the cytosolic domain comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40.

В некоторых вариантах осуществления, третий полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 41. В некоторых вариантах осуществления, третий полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 41. В некоторых вариантах осуществления, третий полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 41. В некоторых вариантах осуществления, третий полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 41. В некоторых вариантах осуществления, третий полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 41. В некоторых вариантах осуществления, третий полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 41. В некоторых вариантах осуществления, третий полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 41.In some embodiments, the third polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 41. In some embodiments, the third polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 75% sequence identity to SEQ ID NO: 41. In some embodiments, the third polynucleotide comprises a nucleotide sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 41. In some embodiments, the third polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 85% sequence identity to SEQ ID NO: 41. In some embodiments, the third polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 41. In some embodiments, the third polynucleotide contains a nucleotide sequence having at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 41. In some embodiments, the third polynucleotide comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 41.

В некоторых вариантах осуществления, трансмембранный домен и цитозольный домен содержат аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 42. В некоторых вариантах осуществления, трансмембранный домен и цитозольный домен содержат аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 42. В некоторых вариантах осуществления, трансмембранный домен и цитозольный домен содержат аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 42. В некоторых вариантах осуществления, трансмембранный домен и цитозольный домен содержат аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 42. В некоторых вариантах осуществления, трансмембранный домен и цитозольный домен содержат аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 42. В некоторых вариантах осуществления, трансмембранный домен и цитозольный домен содержат аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 42. В некоторых вариантах осуществления, трансмембранный домен и цитозольный домен содержат аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 42.In some embodiments, the transmembrane domain and the cytosolic domain contain an amino acid sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 42. In some embodiments, the transmembrane domain and the cytosolic domain contain an amino acid sequence having at least 75% sequence identity sequences of SEQ ID NO: 42. In some embodiments, the transmembrane domain and the cytosolic domain comprise an amino acid sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 42. In some embodiments, the transmembrane domain and the cytosolic domain comprise an amino acid sequence having at least 85% sequence identity to SEQ ID NO: 42. In some embodiments, the transmembrane domain and the cytosolic domain comprise an amino acid sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 42. In some embodiments, the transmembrane domain and the cytosolic domain comprise an amino acid sequence having at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 42. In some embodiments, the transmembrane domain and the cytosolic domain comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид передающего сигналы домена Т-клеточного рецептора содержит домен костимулятора TCR. В некоторых вариантах осуществления, костимулятор TCR представляет собой ICOS. В некоторых вариантах осуществления, костимулятор TCR представляет собой CD27. В некоторых вариантах осуществления, костимулятор TCR представляет собой CD28. В некоторых вариантах осуществления, костимулятор TCR представляет собой 4-1ВВ (CD137). В некоторых вариантах осуществления, костимулятор TCR представляет собой ОХ40 (CD134). В некоторых вариантах осуществления, костимулятор TCR представляет собой CD30. В некоторых вариантах осуществления, костимулятор TCR представляет собой CD40. В некоторых вариантах осуществления, костимулятор TCR представляет собой ассоциированный с функцией лимфоцитов антиген 1 (LFA-1). В некоторых вариантах осуществления, костимулятор TCR представляет собой CD2. В некоторых вариантах осуществления, костимулятор TCR представляет собой CD7. В некоторых вариантах осуществления, костимулятор TCR представляет собой LIGHT. В некоторых вариантах осуществления, костимулятор TCR представляет собой NKG2C. В некоторых вариантах осуществления, костимулятор TCR представляет собой В7-Н3. В некоторых вариантах осуществления, костимулятор TCR представляет собой лиганд, специфически связывающий CD83.In some embodiments, the T cell receptor signaling domain polypeptide comprises a TCR costimulator domain. In some embodiments, the TCR costimulator is ICOS. In some embodiments, the TCR costimulator is CD27. In some embodiments, the TCR costimulator is CD28. In some embodiments, the TCR costimulator is 4-1BB (CD137). In some embodiments, the TCR costimulator is OX40 (CD134). In some embodiments, the TCR costimulator is CD30. In some embodiments, the TCR costimulator is CD40. In some embodiments, the TCR costimulator is lymphocyte function associated antigen 1 (LFA-1). In some embodiments, the TCR costimulator is CD2. In some embodiments, the TCR costimulator is CD7. In some embodiments, the TCR costimulator is LIGHT. In some embodiments, the TCR costimulator is NKG2C. In some embodiments, the TCR costimulator is B7-H3. In some embodiments, the TCR costimulator is a ligand that specifically binds CD83.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид передающего сигналы домена TCR содержит трансмембранный домен и/или цитозольный домен коингибитора TCR. В некоторых вариантах осуществления, коингибитор TCR представляет собой PD-1. В некоторых вариантах осуществления, коингибитор TCR представляет собой TIM3. В некоторых вариантах осуществления, коингибитор TCR представляет собой LAG-3. В некоторых вариантах осуществления, коингибитор TCR представляет собой TIGIT. В некоторых вариантах осуществления, коингибитор TCR представляет собой BTLA. В некоторых вариантах осуществления, коингибитор TCR представляет собой CD160. В некоторых вариантах осуществления, коингибитор TCR представляет собой CD37.In some embodiments, the TCR signaling domain polypeptide comprises a transmembrane domain and/or a cytosolic TCR coinhibitor domain. In some embodiments, the TCR coinhibitor is PD-1. In some embodiments, the TCR coinhibitor is TIM3. In some embodiments, the TCR coinhibitor is LAG-3. In some embodiments, the TCR coinhibitor is TIGIT. In some embodiments, the TCR coinhibitor is BTLA. In some embodiments, the TCR coinhibitor is CD160. In some embodiments, the TCR coinhibitor is CD37.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид передающего сигналы домена TCR включает как цитозольный домен, так и трансмембранный домен корецептора или костимулирующего белка TCR. В некоторых вариантах осуществления, цитозольный домен и трансмембранный домен происходят из одного и того же корецептора или костимулятора, или из различных корецепторов или костимуляторов. В некоторых вариантах осуществления, ТАС дополнительно содержит другие полипептиды, которые напрямую или опосредованно действуют для нацеливания или активации Т-клетки.In some embodiments, the TCR signaling domain polypeptide includes both a cytosolic domain and a transmembrane domain of a TCR coreceptor or co-stimulatory protein. In some embodiments, the cytosolic domain and the transmembrane domain are derived from the same coreceptor or costimulator, or from different coreceptors or costimulators. In some embodiments, the TAC further comprises other polypeptides that act directly or indirectly to target or activate a T cell.

Линкеры, соединители и конфигурации.Linkers, connectors and configurations.

В некоторых вариантах осуществления, нуклеиновая кислота, описанная в настоящем описании, организована в следующем порядке (1) первый полинуклеотид, кодирующий специфический для мише- 23 045368 ни лиганд; (2) второй полинуклеотид, кодирующий лиганд, связывающий комплекс TCR; (3) третий полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен и цитозольный домен. В некоторых вариантах осуществления, нуклеиновая кислота, описанная в настоящем описании, организована в следующем порядке (1) первый полинуклеотид, кодирующий специфический для мишени лиганд; (2) второй полинуклеотид, кодирующий лиганд, связывающий комплекс TCR; (3) третий полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен и цитозольный домен, где порядок приведен от 5'-конца до 3'-конца. В некоторых вариантах осуществления, нуклеиновая кислота, описанная в настоящем описании, организована в следующем порядке (1) первый полинуклеотид, кодирующий специфический для мишени лиганд; (2) второй полинуклеотид, кодирующий лиганд, связывающий комплекс TCR; (3) третий полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен и цитозольный домен, где порядок приведен от 3'-конца до 5'-конца. В некоторых вариантах осуществления, нуклеиновая кислота, описанная в настоящем описании, организована в следующем порядке (1) первый полинуклеотид, кодирующий лиганд, связывающий комплекс TCR; (2) второй полинуклеотид, кодирующий специфический для мишени лиганд; (3) третий полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен и цитозольный домен. В некоторых вариантах осуществления, нуклеиновая кислота, описанная в настоящем описании, организована в следующем порядке (1) первый полинуклеотид, кодирующий лиганд, связывающий комплекс TCR; (2) второй полинуклеотид, кодирующий специфический для мишени лиганд; (3) третий полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен и цитозольный домен, где порядок приведен от 5'-конца до 3'-конца. В некоторых вариантах осуществления, нуклеиновая кислота, описанная в настоящем описании, организована в следующем порядке (1) первый полинуклеотид, кодирующий лиганд, связывающий комплекс TCR; (2) второй полинуклеотид, кодирующий специфический для мишени лиганд; (3) третий полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен и цитозольный домен, где порядок приведен от 3'-конца до 5'-конца.In some embodiments, the nucleic acid described herein is organized in the following order: (1) a first polynucleotide encoding a target-specific ligand; (2) a second polynucleotide encoding a TCR complex-binding ligand; (3) a third polynucleotide encoding the transmembrane domain and the cytosolic domain. In some embodiments, the nucleic acid described herein is organized in the following order: (1) a first polynucleotide encoding a target-specific ligand; (2) a second polynucleotide encoding a TCR complex-binding ligand; (3) a third polynucleotide encoding the transmembrane domain and the cytosolic domain, where the order is from the 5' end to the 3' end. In some embodiments, the nucleic acid described herein is organized in the following order: (1) a first polynucleotide encoding a target-specific ligand; (2) a second polynucleotide encoding a TCR complex-binding ligand; (3) a third polynucleotide encoding the transmembrane domain and the cytosolic domain, where the order is from the 3' end to the 5' end. In some embodiments, the nucleic acid described herein is organized in the following order (1) a first polynucleotide encoding a TCR complex binding ligand; (2) a second polynucleotide encoding a target-specific ligand; (3) a third polynucleotide encoding the transmembrane domain and the cytosolic domain. In some embodiments, the nucleic acid described herein is organized in the following order (1) a first polynucleotide encoding a TCR complex binding ligand; (2) a second polynucleotide encoding a target-specific ligand; (3) a third polynucleotide encoding the transmembrane domain and the cytosolic domain, where the order is from the 5' end to the 3' end. In some embodiments, the nucleic acid described herein is organized in the following order (1) a first polynucleotide encoding a TCR complex binding ligand; (2) a second polynucleotide encoding a target-specific ligand; (3) a third polynucleotide encoding the transmembrane domain and the cytosolic domain, where the order is from the 3' end to the 5' end.

В некоторых вариантах осуществления, первая нуклеиновая кислота кодирует первый полипептид, вторая нуклеиновая кислота кодирует второй полипептид, и третья нуклеиновая кислота кодирует третий полипептид. В некоторых вариантах осуществления, первый полипептид, второй полипептид и третий полипептид слиты напрямую. Например, специфический для мишени лиганд и полипептид передающего сигналы домена Т-клеточного рецептора оба слиты с лигандом, связывающим комплекс TCR. В некоторых вариантах осуществления, первый полипептид, второй полипептид, и третий полипептид соединены посредством по меньшей мере одного линкера. В некоторых вариантах осуществления, первый полипептид и второй полипептид слиты напрямую, и соединены с третьим полипептидом посредством линкера. В некоторых вариантах осуществления, второй полипептид и третий полипептид слиты напрямую, и соединены с первым полипептидом посредством линкера.In some embodiments, the first nucleic acid encodes a first polypeptide, the second nucleic acid encodes a second polypeptide, and the third nucleic acid encodes a third polypeptide. In some embodiments, the first polypeptide, the second polypeptide, and the third polypeptide are directly fused. For example, a target-specific ligand and a T cell receptor signaling domain polypeptide are both fused to a TCR complex-binding ligand. In some embodiments, the first polypeptide, the second polypeptide, and the third polypeptide are connected via at least one linker. In some embodiments, the first polypeptide and the second polypeptide are directly fused and connected to the third polypeptide via a linker. In some embodiments, the second polypeptide and the third polypeptide are directly fused and connected to the first polypeptide via a linker.

В некоторых вариантах осуществления, линкер представляет собой пептидный линкер. В некоторых вариантах осуществления, пептидный линкер содержит 1-40 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, пептидный линкер содержит 1-30 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, пептидный линкер содержит 1-15 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, пептидный линкер содержит 1-10 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, пептидный линкер содержит 1-6 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, пептидный линкер содержит 30-40 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, пептидный линкер содержит 32-36 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, пептидный линкер содержит 5-30 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, пептидный линкер содержит 5 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, пептидный линкер содержит 10 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, пептидный линкер содержит 15 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, пептидный линкер содержит 20 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, пептидный линкер содержит 25 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, пептидный линкер содержит 30 аминокислот.In some embodiments, the linker is a peptide linker. In some embodiments, the peptide linker contains 1-40 amino acids. In some embodiments, the peptide linker contains 1-30 amino acids. In some embodiments, the peptide linker contains 1-15 amino acids. In some embodiments, the peptide linker contains 1-10 amino acids. In some embodiments, the peptide linker contains 1-6 amino acids. In some embodiments, the peptide linker contains 30-40 amino acids. In some embodiments, the peptide linker contains 32-36 amino acids. In some embodiments, the peptide linker contains 5-30 amino acids. In some embodiments, the peptide linker contains 5 amino acids. In some embodiments, the peptide linker contains 10 amino acids. In some embodiments, the peptide linker contains 15 amino acids. In some embodiments, the peptide linker contains 20 amino acids. In some embodiments, the peptide linker contains 25 amino acids. In some embodiments, the peptide linker contains 30 amino acids.

В некоторых вариантах осуществления, пептидный линкер содержит линкер G4S3 (SEQ ID NO: 74). В некоторых вариантах осуществления, пептидный линкер содержит SEQ ID NO: 11, 12, 15, 16, 19, 20, или их варианты или фрагменты.In some embodiments, the peptide linker comprises a G4S3 linker (SEQ ID NO: 74). In some embodiments, the peptide linker contains SEQ ID NO: 11, 12, 15, 16, 19, 20, or variants or fragments thereof.

В некоторых вариантах осуществления, пептидный линкер, который соединяет специфический для мишени лиганд с лигандом, связывающим комплекс TCR, (например, UCHT1), известен как соединитель, чтобы отличать этот домен белка от других линкеров в три-ТАС. Соединитель имеет любой размер. В некоторых вариантах осуществления, соединитель между лигандом, связывающим комплекс TCR, и специфическим для мишени лигандом представляет собой короткую спираль, содержащую SEQ ID NO ID: 28. В некоторых вариантах осуществления, соединитель между лигандом, связывающим комплекс TCR, и специфическим для мишени лигандом представляет собой короткую спираль, кодируемую посредством SEQ ID NO ID: 27. В некоторых вариантах осуществления, соединитель между лигандом, связывающим комплекс TCR, и специфическим для мишени лигандом представляет собой длинную спираль, содержащую SEQ ID NO ID: 30. В некоторых вариантах осуществления, соединитель между лигандом, связывающим комплекс TCR, и специфическим для мишени лигандом представляет собой длинную спираль, кодируемую посредством SEQ ID NO ID: 29. В некоторых вариантах осуществления, соединитель между лигандом, связывающим комплекс TCR, и специфическим для мишени лигандом представляет собой большой домен, содержащий SEQ ID NO ID: 32. В некоторых вариантах осуществления, со- 24 045368 единитель между лигандом, связывающим комплекс TCR, и специфическим для мишени лигандом представляет собой большой домен, кодируемый посредством SEQ ID NO ID: 31.In some embodiments, the peptide linker that connects the target-specific ligand to the TCR complex-binding ligand (eg, UCHT1) is known as a connector to distinguish this domain of the protein from other linkers in tri-TAC. The connector is available in any size. In some embodiments, the connector between the TCR complex binding ligand and the target specific ligand is a short helix comprising SEQ ID NO ID: 28. In some embodiments, the connector between the TCR complex binding ligand and the target specific ligand is is a short helix encoded by SEQ ID NO ID: 27. In some embodiments, the connector between the TCR complex-binding ligand and the target-specific ligand is a long helix comprising SEQ ID NO ID: 30. In some embodiments, the connector between the TCR complex binding ligand and the target specific ligand is a long helix encoded by SEQ ID NO ID: 29. In some embodiments, the connector between the TCR complex binding ligand and the target specific ligand is a large domain containing SEQ ID NO ID: 32. In some embodiments, the connector between the TCR complex binding ligand and the target specific ligand is a large domain encoded by SEQ ID NO ID: 31.

В некоторых вариантах осуществления, нуклеиновая кислота, описанная в настоящем описании, содержит лидерную последовательность. В некоторых вариантах осуществления, лидерная последовательность содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 5, 47 или 49. В некоторых вариантах осуществления, лидерная последовательность содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 5, 47 или 49. В некоторых вариантах осуществления, лидерная последовательность содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 5, 47 или 49. В некоторых вариантах осуществления, лидерная последовательность содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 5, 47 или 49. В некоторых вариантах осуществления, лидерная последовательность содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 5, 47 или 49. В некоторых вариантах осуществления, лидерная последовательность содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 5, 47 или 49. В некоторых вариантах осуществления, лидерная последовательность содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 5, 47 или 49.In some embodiments, a nucleic acid described herein comprises a leader sequence. In some embodiments, the leader sequence comprises a nucleotide sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 5, 47, or 49. In some embodiments, the leader sequence comprises a nucleotide sequence having at least 75% sequence identity to SEQ ID NO: 5, 47, or 49. In some embodiments, the leader sequence comprises a nucleotide sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 5, 47, or 49. In some embodiments, the leader sequence comprises a nucleotide sequence having at least 85% sequence identity to SEQ ID NO: 5, 47, or 49. In some embodiments, the leader sequence comprises a nucleotide sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 5, 47, or 49. In some embodiments, the leader sequence comprises a nucleotide sequence having at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 5, 47, or 49. In some embodiments, the leader sequence comprises a nucleotide sequence from SEQ ID NO: 5, 47, or 49 .

В некоторых вариантах осуществления, нуклеиновая кислота, описанная в настоящем описании, содержит лидерную последовательность. В некоторых вариантах осуществления, лидерная последовательность содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 6, 48 или 50. В некоторых вариантах осуществления, лидерная последовательность содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 6, 48 или 50. В некоторых вариантах осуществления, лидерная последовательность содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 6, 48 или 50. В некоторых вариантах осуществления, лидерная последовательность содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 6, 48 или 50. В некоторых вариантах осуществления, лидерная последовательность содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 6, 48 или 50. В некоторых вариантах осуществления, лидерная последовательность содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 6, 48 или 50. В некоторых вариантах осуществления, лидерная последовательность содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 6, 48 или 50.In some embodiments, a nucleic acid described herein comprises a leader sequence. In some embodiments, the leader sequence comprises an amino acid sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 6, 48, or 50. In some embodiments, the leader sequence comprises an amino acid sequence having at least 75% sequence identity to SEQ ID NO: 6, 48, or 50. In some embodiments, the leader sequence comprises an amino acid sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 6, 48, or 50. In some embodiments, the leader sequence comprises an amino acid sequence having at least 85% sequence identity to SEQ ID NO: 6, 48, or 50. In some embodiments, the leader sequence comprises an amino acid sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 6, 48, or 50. In some embodiments, the leader sequence comprises an amino acid sequence having at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 6, 48, or 50. In some embodiments, the leader sequence comprises an amino acid sequence from SEQ ID NO: 6, 48, or 50 .

Предусматривают, что три-ТАС представлен в различных конфигурациях и комбинациях (а) специфического для мишени лиганда, (b) лиганда, связывающего комплекс TCR, и (с) передающего сигналы домена TCR, как описано в настоящем описании.Tri-TAC is contemplated to be present in various configurations and combinations of (a) a target-specific ligand, (b) a TCR complex binding ligand, and (c) a TCR signaling domain as described herein.

В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для мишени лиганд, (b) одноцепочечное антитело (scFv), связывающее CD3ε, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для мишени лиганд, (b) UCHT1, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для мишени лиганд, (b) UCHT1 (Y182T), и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для мишени лиганд, (b) huUCHT1, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для мишени лиганд, (b) huUCHT1 (Y177T), и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для мишени лиганд, (b) OKT3, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для мишени лиганд, (b) F6A, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, триТАС содержит (а) специфический для мишени лиганд, (b) L2K, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4.In some embodiments, the tri-TAC comprises (a) a target-specific ligand, (b) a CD3ε-binding single chain antibody (scFv), and (c) a CD4 coreceptor transmembrane and cytosolic domain. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) a target-specific ligand, (b) UCHT1, and (c) a transmembrane and cytosolic domain of a CD4 coreceptor. In some embodiments, the tri-TAC comprises (a) a target-specific ligand, (b) UCHT1 (Y182T), and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD4 coreceptor. In some embodiments, the tri-TAC comprises (a) a target-specific ligand, (b) huUCHT1, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD4 coreceptor. In some embodiments, the tri-TAC comprises (a) a target-specific ligand, (b) huUCHT1 (Y177T), and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD4 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) a target-specific ligand, (b) OKT3, and (c) a transmembrane and cytosolic domain of a CD4 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) a target-specific ligand, (b) F6A, and (c) a CD4 coreceptor transmembrane and cytosolic domain. In some embodiments, triTAC comprises (a) a target-specific ligand, (b) L2K, and (c) a CD4 coreceptor transmembrane and cytosolic domain.

В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (a) DARPin, (b) UCHT1, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (a) DARPin, (b) UCHT1 (Y182T), и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (a) DARPin, (b) huUCHT1, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (a) DARPin, (b) huUCHT1 (Y177T), и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (a) DARPin, (b) OKT3, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (a) DARPin, (b) F6A, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (a) DARPin, (b) L2K, и (с) трансмембранный и цито- 25 045368 зольный домен корецептора CD4.In some embodiments, tri-TAC comprises (a) DARPin, (b) UCHT1, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD4 coreceptor. In some embodiments, the tri-TAC comprises (a) DARPin, (b) UCHT1 (Y182T), and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD4 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) DARPin, (b) huUCHT1, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD4 coreceptor. In some embodiments, the tri-TAC comprises (a) DARPin, (b) huUCHT1 (Y177T), and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD4 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) DARPin, (b) OKT3, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD4 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) DARPin, (b) F6A, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD4 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) DARPin, (b) L2K, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD4 coreceptor.

В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (a) scFv, (b) UCHT1, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (a) scFv, (b) UCHT1 (Y182T), и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (a) scFv, (b) huUCHT1, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (a) scFv, (b) huUCHT1 (Y177T), и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (a) scFv, (b) OKT3, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (a) scFv, (b) F6A, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (a) scFv, (b) L2K, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4.In some embodiments, tri-TAC comprises (a) scFv, (b) UCHT1, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD4 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) scFv, (b) UCHT1 (Y182T), and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD4 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) scFv, (b) huUCHT1, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD4 coreceptor. In some embodiments, the tri-TAC comprises (a) scFv, (b) huUCHT1 (Y177T), and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD4 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) scFv, (b) OKT3, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD4 coreceptor. In some embodiments, the tri-TAC comprises (a) scFv, (b) F6A, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD4 coreceptor. In some embodiments, the tri-TAC comprises (a) scFv, (b) L2K, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD4 coreceptor.

В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для HER-2 DARPin, (b) UCHT1, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для HER-2 DARPin, (b) UCHT1 (Y182T), и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для HER-2 DARPin, (b) huUCHT1, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для мишени лиганд, (b) huUCHT1 (Y177T), и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для HER-2 DARPin, (b) OKT3, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для HER-2 DARPin, (b) F6A, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для HER-2 DARPin, (b) L2K, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4.In some embodiments, tri-TAC comprises (a) a HER-2-specific DARPin, (b) UCHT1, and (c) a CD4 coreceptor transmembrane and cytosolic domain. In some embodiments, the tri-TAC comprises (a) a HER-2-specific DARPin, (b) UCHT1 (Y182T), and (c) a CD4 coreceptor transmembrane and cytosolic domain. In some embodiments, the tri-TAC comprises (a) a HER-2-specific DARPin, (b) huUCHT1, and (c) a CD4 coreceptor transmembrane and cytosolic domain. In some embodiments, the tri-TAC comprises (a) a target-specific ligand, (b) huUCHT1 (Y177T), and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD4 coreceptor. In some embodiments, the tri-TAC comprises (a) a HER-2-specific DARPin, (b) OKT3, and (c) a CD4 coreceptor transmembrane and cytosolic domain. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) a HER-2-specific DARPin, (b) F6A, and (c) a CD4 coreceptor transmembrane and cytosolic domain. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) a HER-2-specific DARPin, (b) L2K, and (c) a CD4 coreceptor transmembrane and cytosolic domain.

В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для ВСМА ScFv, (b) UCHT1, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для ВСМА ScFv, (b) UCHT1 (Y182T), и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для ВСМА ScFv, (b) huUCHT1, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для ВСМА ScFv, (b) huUCHT1 (Y177T), и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для ВСМА ScFv, (b) OKT3, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для ВСМА ScFv, (b) F6A, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для ВСМА ScFv, (b) L2K, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4.In some embodiments, tri-TAC comprises (a) BCMA-specific ScFv, (b) UCHT1, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD4 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) BCMA-specific ScFv, (b) UCHT1 (Y182T), and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD4 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) BCMA-specific ScFv, (b) huUCHT1, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD4 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) BCMA-specific ScFv, (b) huUCHT1 (Y177T), and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD4 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) BCMA-specific ScFv, (b) OKT3, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD4 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) BCMA-specific ScFv, (b) F6A, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD4 coreceptor. In some embodiments, the tri-TAC comprises (a) a BCMA-specific ScFv, (b) an L2K, and (c) a CD4 coreceptor transmembrane and cytosolic domain.

В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для CD19 ScFv, (b) UCHT1, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для CD19 ScFv, (b) UCHT1 (Y182T), и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для CD19 ScFv, (b) huUCHT1, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для CD19 ScFv, (b) huUCHT1 (Y177T), и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для CD19 ScFv, (b) OKT3, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для CD19 ScFv, (b) F6A, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для CD19 ScFv, (b) L2K, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4.In some embodiments, tri-TAC comprises (a) a CD19-specific ScFv, (b) UCHT1, and (c) a CD4 coreceptor transmembrane and cytosolic domain. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) a CD19-specific ScFv, (b) UCHT1 (Y182T), and (c) a CD4 coreceptor transmembrane and cytosolic domain. In some embodiments, the tri-TAC comprises (a) a CD19-specific ScFv, (b) huUCHT1, and (c) a CD4 coreceptor transmembrane and cytosolic domain. In some embodiments, the tri-TAC comprises (a) a CD19-specific ScFv, (b) huUCHT1 (Y177T), and (c) a CD4 coreceptor transmembrane and cytosolic domain. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) CD19-specific ScFv, (b) OKT3, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD4 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) a CD19-specific ScFv, (b) F6A, and (c) a CD4 coreceptor transmembrane and cytosolic domain. In some embodiments, the tri-TAC comprises (a) a CD19-specific ScFv, (b) an L2K, and (c) a CD4 coreceptor transmembrane and cytosolic domain.

В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для мишени лиганд, (b) одноцепочечное антитело (scFv), связывающее CD3ε, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для мишени лиганд, (b) UCHT1, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для мишени лиганд, (b) UCHT1 (Y182T), и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для мишени лиганд, (b) huUCHT1, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для мишени лиганд, (b) huUCHT1 (Y177T), и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для мишени лиганд, (b) OKT3, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для мишени лиганд, (b) F6A, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три- 26 045368In some embodiments, the tri-TAC comprises (a) a target-specific ligand, (b) a CD3ε-binding single chain antibody (scFv), and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) a target-specific ligand, (b) UCHT1, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor. In some embodiments, the tri-TAC comprises (a) a target-specific ligand, (b) UCHT1 (Y182T), and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor. In some embodiments, the tri-TAC comprises (a) a target-specific ligand, (b) huUCHT1, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor. In some embodiments, the tri-TAC comprises (a) a target-specific ligand, (b) huUCHT1 (Y177T), and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) a target-specific ligand, (b) OKT3, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor. In some embodiments, the tri-TAC comprises (a) a target-specific ligand, (b) F6A, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor. In some embodiments, three- 26 045368

ТАС содержит (а) специфический для мишени лиганд, (b) L2K, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8.TAC contains (a) a target-specific ligand, (b) L2K, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor.

В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (a) DARPin, (b) UCHT1, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD4. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (a) DARPin, (b) UCHT1 (Y182T), и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (a) DARPin, (b) huUCHT1, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (a) DARPin, (b) huUCHT1 (Y177T), и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (a) DARPin, (b) OKT3, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (a) DARPin, (b) F6A, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (a) DARPin, (b) L2K, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8.In some embodiments, tri-TAC comprises (a) DARPin, (b) UCHT1, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD4 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) DARPin, (b) UCHT1 (Y182T), and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) DARPin, (b) huUCHT1, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor. In some embodiments, the tri-TAC comprises (a) DARPin, (b) huUCHT1 (Y177T), and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) DARPin, (b) OKT3, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) DARPin, (b) F6A, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) DARPin, (b) L2K, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor.

В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (a) scFv, (b) UCHT1, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (a) scFv, (b) UCHT1 (Y182T), и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (a) scFv, (b) huUCHT1, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (a) scFv, (b) huUCHT1 (Y177T), и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (a) scFv, (b) OKT3, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (a) scFv, (b) F6A, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (a) scFv, (b) L2K, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8.In some embodiments, tri-TAC comprises (a) scFv, (b) UCHT1, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor. In some embodiments, the tri-TAC comprises (a) scFv, (b) UCHT1 (Y182T), and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor. In some embodiments, the tri-TAC comprises (a) scFv, (b) huUCHT1, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor. In some embodiments, the tri-TAC comprises (a) scFv, (b) huUCHT1 (Y177T), and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) scFv, (b) OKT3, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor. In some embodiments, the tri-TAC comprises (a) scFv, (b) F6A, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor. In some embodiments, the tri-TAC comprises (a) scFv, (b) L2K, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor.

В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для HER-2 DARPin, (b) UCHT1, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для HER-2 DARPin, (b) UCHT1 (Y182T), и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для HER-2 DARPin, (b) huUCHT1, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для мишени лиганд, (b) huUCHT1 (Y177T), и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для HER-2 DARPin, (b) OKT3, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для HER-2 DARPin, (b) F6A, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для HER-2 DARPin, (b) L2K, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8.In some embodiments, tri-TAC comprises (a) HER-2-specific DARPin, (b) UCHT1, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) HER-2-specific DARPin, (b) UCHT1 (Y182T), and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) HER-2-specific DARPin, (b) huUCHT1, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor. In some embodiments, the tri-TAC comprises (a) a target-specific ligand, (b) huUCHT1 (Y177T), and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) HER-2-specific DARPin, (b) OKT3, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) a HER-2-specific DARPin, (b) F6A, and (c) a CD8 coreceptor transmembrane and cytosolic domain. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) a HER-2-specific DARPin, (b) L2K, and (c) a CD8 coreceptor transmembrane and cytosolic domain.

В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для ВСМА ScFv, (b) UCHT1, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для ВСМА ScFv, (b) UCHT1 (Y182T), и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для ВСМА ScFv, (b) huUCHT1, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для ВСМА ScFv, (b) huUCHT1 (Y177T), и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для ВСМА ScFv, (b) OKT3, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для ВСМА ScFv, (b) F6A, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для ВСМА ScFv, (b) L2K, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8.In some embodiments, tri-TAC comprises (a) BCMA-specific ScFv, (b) UCHT1, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) BCMA-specific ScFv, (b) UCHT1 (Y182T), and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) BCMA-specific ScFv, (b) huUCHT1, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) BCMA-specific ScFv, (b) huUCHT1 (Y177T), and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) BCMA-specific ScFv, (b) OKT3, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) BCMA-specific ScFv, (b) F6A, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) BCMA-specific ScFv, (b) L2K, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor.

В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для CD19 ScFv, (b) UCHT1, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для CD19 ScFv, (b) UCHT1 (Y182T), и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для CD19 ScFv, (b) huUCHT1, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для CD19 ScFv, (b) huUCHT1 (Y177T), и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для CD19 ScFv, (b) OKT3, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для CD19 ScFv, (b) F6A, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8. В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС содержит (а) специфический для CD19 ScFv, (b) L2K, и (с) трансмембранный и цитозольный домен корецептора CD8.In some embodiments, tri-TAC comprises (a) a CD19-specific ScFv, (b) UCHT1, and (c) a transmembrane and cytosolic domain of a CD8 coreceptor. In some embodiments, the tri-TAC comprises (a) a CD19-specific ScFv, (b) UCHT1 (Y182T), and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) CD19-specific ScFv, (b) huUCHT1, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor. In some embodiments, the tri-TAC comprises (a) CD19-specific ScFv, (b) huUCHT1 (Y177T), and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) CD19-specific ScFv, (b) OKT3, and (c) the transmembrane and cytosolic domain of the CD8 coreceptor. In some embodiments, tri-TAC comprises (a) a CD19-specific ScFv, (b) F6A, and (c) a CD8 coreceptor transmembrane and cytosolic domain. In some embodiments, the tri-TAC comprises (a) a CD19-specific ScFv, (b) an L2K, and (c) a CD8 coreceptor transmembrane and cytosolic domain.

В некоторых вариантах осуществления, три-ТАС переносит CD3 и TCR в области липидных рафтовIn some embodiments, tri-TAC transports CD3 and TCR to areas of lipid rafts

- 27 045368 мембраны, и располагает Lck поблизости от TCR, сходным образом с природным связыванием МНС.- 27 045368 membrane, and locates Lck close to the TCR, similar to natural MHC binding.

В некоторых вариантах осуществления, ТАС, описанный в настоящем описании, представляет собой DARPin против HER-2-три-ТАС (также обозначенный как конфигурация 1; SEQ ID NO: 1 и 2), включает, в следующем порядке:In some embodiments, the TAC described herein is an anti-HER-2-tri-TAC DARPin (also referred to as Configuration 1; SEQ ID NOs: 1 and 2), comprising, in the following order:

i) лидерную последовательность против HER-2-три-ТАС (сигнал секреции) (SEQ ID NO: 5 и 6), ii) DARPin, специфический для антигена HER-2 (SEQ ID NO: 7 и 8), iii) метку Мус (SEQ ID NO: 9 и 10), iv) соединитель (SEQ ID NO: 11 и 12),i) anti-HER-2 tri-TAC (secretion signal) leader sequence (SEQ ID NO: 5 and 6), ii) HER-2 antigen specific DARPin (SEQ ID NO: 7 and 8), iii) Myc tag (SEQ ID NO: 9 and 10), iv) connector (SEQ ID NO: 11 and 12),

v) UCHT1 (SEQ ID NO: 13 и 14), vi) линкер (SEQ ID NO: 15 и 16), vii) CD4 (SEQ ID NO: 17 и 18).v) UCHT1 (SEQ ID NO: 13 and 14), vi) linker (SEQ ID NO: 15 and 16), vii) CD4 (SEQ ID NO: 17 and 18).

В некоторых вариантах осуществления, ТАС, описанный в настоящем описании, представляет собой HER2-TAC. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 65. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 65. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 65. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 65. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 65. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 65. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 65.In some embodiments, the TAC described herein is HER2-TAC. In some embodiments, HER2-TAC contains a nucleotide sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 65. In some embodiments, HER2-TAC contains a nucleotide sequence having at least 75% sequence identity to SEQ ID NO: 65. In some embodiments, HER2-TAC comprises a nucleotide sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 65. In some embodiments, HER2-TAC comprises a nucleotide sequence having at least 85% sequence identity sequences having SEQ ID NO: 65. In some embodiments, HER2-TAC contains a nucleotide sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 65. In some embodiments, HER2-TAC contains a nucleotide sequence having at least at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 65. In some embodiments, HER2-TAC comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 65.

В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 66. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 66. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 66. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 66. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 66. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 66. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 66.In some embodiments, HER2-TAC comprises an amino acid sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 66. In some embodiments, HER2-TAC comprises an amino acid sequence having at least 75% sequence identity to SEQ ID NO: 66. In some embodiments, HER2-TAC comprises an amino acid sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 66. In some embodiments, HER2-TAC comprises an amino acid sequence having at least 85% sequence identity sequence with SEQ ID NO: 66. In some embodiments, HER2-TAC contains a nucleotide sequence having at least 90% sequence identity with SEQ ID NO: 66. In some embodiments, HER2-TAC contains an amino acid sequence having at least at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 66. In some embodiments, HER2-TAC comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 66.

В некоторых вариантах осуществления, ТАС, описанный в настоящем описании, представляет собой HER2-TAC. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 67. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 67. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 67. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 67. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 67. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 67. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 67.In some embodiments, the TAC described herein is HER2-TAC. In some embodiments, HER2-TAC contains a nucleotide sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 67. In some embodiments, HER2-TAC contains a nucleotide sequence having at least 75% sequence identity to SEQ ID NO: 67. In some embodiments, HER2-TAC comprises a nucleotide sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 67. In some embodiments, HER2-TAC comprises a nucleotide sequence having at least 85% sequence identity sequence with SEQ ID NO: 67. In some embodiments, HER2-TAC contains a nucleotide sequence having at least 90% sequence identity with SEQ ID NO: 67. In some embodiments, HER2-TAC contains a nucleotide sequence having at least at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 67. In some embodiments, HER2-TAC comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 67.

В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 68.In some embodiments, HER2-TAC comprises an amino acid sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 68. In some embodiments, HER2-TAC comprises an amino acid sequence having at least 75% sequence identity to SEQ ID NO: 68. In some embodiments, HER2-TAC comprises an amino acid sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 68. In some embodiments, HER2-TAC comprises an amino acid sequence having at least 85% sequence identity sequence with SEQ ID NO: 68. In some embodiments, HER2-TAC contains an amino acid sequence having at least 90% sequence identity with SEQ ID NO: 68. In some embodiments, HER2-TAC contains an amino acid sequence having at least at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 68. In some embodiments, HER2-TAC comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 68.

В некоторых вариантах осуществления, ТАС, описанный в настоящем описании, представляет со- 28 045368 бой HER2-TAC. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 75. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 75. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 75. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 75. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 75. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 75. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 75.In some embodiments, the TAC described herein is a HER2-TAC. In some embodiments, HER2-TAC contains a nucleotide sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 75. In some embodiments, HER2-TAC contains a nucleotide sequence having at least 75% sequence identity to SEQ ID NO: 75. In some embodiments, HER2-TAC contains a nucleotide sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 75. In some embodiments, HER2-TAC contains a nucleotide sequence having at least 85% sequence identity sequence with SEQ ID NO: 75. In some embodiments, HER2-TAC contains a nucleotide sequence having at least 90% sequence identity with SEQ ID NO: 75. In some embodiments, HER2-TAC contains a nucleotide sequence having at least at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 75. In some embodiments, HER2-TAC comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 75.

В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 76. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 76. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 76. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 76. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 76. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 76. В некоторых вариантах осуществления, HER2-TAC содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 76.In some embodiments, HER2-TAC comprises an amino acid sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 76. In some embodiments, HER2-TAC contains an amino acid sequence having at least 75% sequence identity to SEQ ID NO: 76. In some embodiments, HER2-TAC comprises an amino acid sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 76. In some embodiments, HER2-TAC comprises an amino acid sequence having at least 85% sequence identity sequence with SEQ ID NO: 76. In some embodiments, HER2-TAC contains a nucleotide sequence having at least 90% sequence identity with SEQ ID NO: 76. In some embodiments, HER2-TAC contains an amino acid sequence having at least at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 76. In some embodiments, HER2-TAC comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 76.

В некоторых вариантах осуществления, ТАС, описанный в настоящем описании, представляет собой ВСМА-ТАС. В некоторых вариантах осуществления, ВСМА-ТАС содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 55, 57, 59 или 61. В некоторых вариантах осуществления, ВСМА-ТАС содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 55, 57, 59 или 61. В некоторых вариантах осуществления, ВСМА-ТАС содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 55, 57, 59 или 61. В некоторых вариантах осуществления, ВСМА-ТАС содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 55, 57, 59 или 61. В некоторых вариантах осуществления, ВСМА-ТАС содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 55, 57, 59 или 61. В некоторых вариантах осуществления, ВСМА-ТАС содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 55, 57, 59 или 61. В некоторых вариантах осуществления, ВСМА-ТАС содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 55, 57, 59 или 61.In some embodiments, the TAC described herein is a BCMA-TAC. In some embodiments, BCMA-TAC contains a nucleotide sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 55, 57, 59, or 61. In some embodiments, BCMA-TAC contains a nucleotide sequence having at least 75 % sequence identity to SEQ ID NO: 55, 57, 59, or 61. In some embodiments, BCMA-TAC comprises a nucleotide sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 55, 57, 59, or 61. B In some embodiments, BCMA-TAC contains a nucleotide sequence having at least 85% sequence identity to SEQ ID NO: 55, 57, 59, or 61. In some embodiments, BCMA-TAC contains a nucleotide sequence having at least 90% sequence identity. sequence identity to SEQ ID NO: 55, 57, 59, or 61. In some embodiments, BCMA-TAC comprises a nucleotide sequence having at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 55, 57, 59, or 61. In some In embodiments, BCMA-TAC comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 55, 57, 59, or 61.

В некоторых вариантах осуществления, ВСМА-ТАС содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 56, 58, 60 или 62. В некоторых вариантах осуществления, ВСМА-ТАС содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 56, 58, 60 или 62. В некоторых вариантах осуществления, ВСМА-ТАС содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 56, 58, 60 или 62. В некоторых вариантах осуществления, ВСМА-ТАС содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 56, 58, 60 или 62. В некоторых вариантах осуществления, ВСМА-ТАС содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 56, 58, 60 или 62. В некоторых вариантах осуществления, ВСМА-ТАС содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 56, 58, 60 или 62. В некоторых вариантах осуществления, ВСМА-ТАС содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 56, 58, 60 или 62.In some embodiments, BCMA-TAC comprises an amino acid sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 56, 58, 60, or 62. In some embodiments, BCMA-TAC comprises an amino acid sequence having at least 75 % sequence identity to SEQ ID NO: 56, 58, 60, or 62. In some embodiments, BCMA-TAC comprises an amino acid sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 56, 58, 60, or 62. B In some embodiments, BCMA-TAC comprises an amino acid sequence having at least 85% sequence identity to SEQ ID NO: 56, 58, 60, or 62. In some embodiments, BCMA-TAC comprises an amino acid sequence having at least 90% sequence identity. sequence identity to SEQ ID NO: 56, 58, 60, or 62. In some embodiments, BCMA-TAC comprises an amino acid sequence having at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 56, 58, 60, or 62. In some In embodiments, BCMA-TAC comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56, 58, 60, or 62.

В некоторых вариантах осуществления, ТАС, описанный в настоящем описании, представляет собой CD19-TAC. В некоторых вариантах осуществления, CD19-ТAС содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 63. В некоторых вариантах осуществления, CD19-TAC содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 63. В некоторых вариантах осуществления, CD19-TAC содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 63. В некоторых вариантах осуществления, CD19-TAC содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 63. В некоторых вариантах осуществления, CD19-TAC содержит нуклеотиднуюIn some embodiments, the TAC described herein is a CD19-TAC. In some embodiments, CD19-TAC contains a nucleotide sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 63. In some embodiments, CD19-TAC contains a nucleotide sequence having at least 75% sequence identity to SEQ ID NO: 63. In some embodiments, CD19-TAC contains a nucleotide sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 63. In some embodiments, CD19-TAC contains a nucleotide sequence having at least 85% sequence identity sequence with SEQ ID NO: 63. In some embodiments, CD19-TAC comprises a nucleotide

- 29 045368 последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO:- 29 045368 sequence having at least 90% sequence identity with SEQ ID NO:

63. В некоторых вариантах осуществления, CD19-TAC содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 63. В некоторых вариантах осуществления, CD19-TAC содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 63.63. In some embodiments, CD19-TAC comprises a nucleotide sequence having at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 63. In some embodiments, CD19-TAC comprises a nucleotide sequence from SEQ ID NO: 63.

В некоторых вариантах осуществления, CD19-TAC содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 64. В некоторых вариантах осуществления, CD19-TAC содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 64. В некоторых вариантах осуществления, CD19-TAC содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 64. В некоторых вариантах осуществления, CD19-TAC содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 64. В некоторых вариантах осуществления, CD19-TAC содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 64. В некоторых вариантах осуществления, CD19-TAC содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 64. В некоторых вариантах осуществления, CD19-TAC содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 64.In some embodiments, CD19-TAC contains an amino acid sequence having at least 70% sequence identity to SEQ ID NO: 64. In some embodiments, CD19-TAC contains an amino acid sequence having at least 75% sequence identity to SEQ ID NO: 64. In some embodiments, CD19-TAC contains an amino acid sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 64. In some embodiments, CD19-TAC contains an amino acid sequence having at least 85% sequence identity sequence with SEQ ID NO: 64. In some embodiments, CD19-TAC contains an amino acid sequence having at least 90% sequence identity with SEQ ID NO: 64. In some embodiments, CD19-TAC contains an amino acid sequence having at least at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 64. In some embodiments, CD19-TAC comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 64.

Полипептиды и векторные конструкции.Polypeptides and vector constructs.

В конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к полипептидам, кодируемым посредством последовательности нуклеиновой кислоты, как описано в настоящем описании. Настоящее изобретение относится также к векторам, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, как описано в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления, векторы дополнительно содержат промотор. В некоторых вариантах осуществления, промотор является функциональным в клетке млекопитающего. Промоторы, области ДНК, инициирующие транскрипцию конкретной последовательности нуклеиновой кислоты, хорошо известны в данной области. Промотор, функциональный в клетке млекопитающего, относится к промотору, управляющему экспрессией ассоциированной последовательности нуклеиновой кислоты в клетке млекопитающего. Промотор, управляющий экспрессией последовательности нуклеиновой кислоты, обозначают как являющийся функционально связанным с последовательностью нуклеиновой кислоты.In specific embodiments, the present invention relates to polypeptides encoded by a nucleic acid sequence as described herein. The present invention also relates to vectors containing a nucleic acid sequence as described herein. In some embodiments, the vectors further comprise a promoter. In some embodiments, the promoter is functional in a mammalian cell. Promoters, regions of DNA that initiate transcription of a particular nucleic acid sequence, are well known in the art. A promoter functional in a mammalian cell refers to a promoter that drives the expression of an associated nucleic acid sequence in a mammalian cell. A promoter that drives the expression of a nucleic acid sequence is referred to as being operably linked to the nucleic acid sequence.

Множество векторов для доставки и экспрессирующих векторов используют для введения нуклеиновых кислот, описанных в настоящем описании, в клетку.A variety of delivery vectors and expression vectors are used to introduce the nucleic acids described herein into a cell.

В конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, содержащимся в векторе, для получения векторной конструкции, также обозначенной в настоящем описании как вектор. В некоторых вариантах осуществления, настоящее описание относится к вектору, содержащему:In specific embodiments, the present invention relates to polynucleotides contained in a vector to produce a vector construct, also referred to herein as a vector. In some embodiments, the present description relates to a vector comprising:

a) первый полинуклеотид, кодирующий специфический для мишени лиганд;a) a first polynucleotide encoding a target-specific ligand;

b) второй полинуклеотид, кодирующий лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR;b) a second polynucleotide encoding a ligand that binds a protein associated with the TCR complex;

c) третий полинуклеотид, кодирующий полипептид передающего сигналы домена Т-клеточного рецептора; иc) a third polynucleotide encoding a T cell receptor signaling domain polypeptide; And

d) промотор, который является функциональным в клетке млекопитающего.d) a promoter that is functional in a mammalian cell.

В некоторых вариантах осуществления, мишенью специфического для мишени лиганда является HER-2, ВСМА или CD19. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд представляет собой DARPin, избирательно связывающий антиген HER-2 (erbB-2). В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд представляет собой DARPin, специфически связывающий антиген HER-2 (erbB-2). В некоторых вариантах осуществления, DARPin, нацеленный на HER-2 (erb-2), содержит SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд представляет собой scFv, избирательно связывающий ВСМА. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд представляет собой scFv, специфически связывающий ВСМА. В некоторых вариантах осуществления, scFv, связывающий ВСМА, содержит SEQ ID NO: 33 или SEQ ID NO: 34. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд представляет собой scFv, избирательно связывающий CD19. В некоторых вариантах осуществления, специфический для мишени лиганд представляет собой scFv, специфически связывающий CD19. В некоторых вариантах осуществления, scFv, связывающий CD19, содержит SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 36.In some embodiments, the target of the target-specific ligand is HER-2, BCMA, or CD19. In some embodiments, the target-specific ligand is a DARPin that selectively binds HER-2 antigen (erbB-2). In some embodiments, the target-specific ligand is a DARPin that specifically binds HER-2 antigen (erbB-2). In some embodiments, the DARPin targeting HER-2 (erb-2) comprises SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8. In some embodiments, the target-specific ligand is a scFv that selectively binds BCMA. In some embodiments, the target-specific ligand is a scFv that specifically binds BCMA. In some embodiments, the BCMA-binding scFv comprises SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 34. In some embodiments, the target-specific ligand is a CD19-selective binding scFv. In some embodiments, the target-specific ligand is an scFv that specifically binds CD19. In some embodiments, the CD19-binding scFv comprises SEQ ID NO: 35 or SEQ ID NO: 36.

В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR, представляет собой UCHT1, гуманизированный UCHT1 (huUCHT1), OKT3, F6A или L2K. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR, представляет собой UCHT1 или его вариант. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR, представляет собой UCHT1 и кодирован посредством SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR, представляет собой UCHT1 и содержит SEQ ID NO: 14.In some embodiments, the TCR complex-associated protein binding ligand is UCHT1, humanized UCHT1 (huUCHT1), OKT3, F6A, or L2K. In some embodiments, the TCR complex-associated protein binding ligand is UCHT1 or a variant thereof. In some embodiments, the TCR complex-associated protein-binding ligand is UCHT1 and is encoded by SEQ ID NO: 13. In some embodiments, the TCR complex-associated protein-binding ligand is UCHT1 and is encoded by SEQ ID NO: 13. : 14.

В некоторых вариантах осуществления, лиганд UCHT1, связывающий белок, ассоциированный сIn some embodiments, the UCHT1 ligand binding protein associated with

- 30 045368 комплексом TCR, имеет мутацию Y182T (UCHT1 (Y182T)) и кодирован посредством SEQ ID NO: 71. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR, представляет собой UCHT1 (Y182T) и содержит SEQ ID NO: 72. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR, представляет собой гуманизированный UCHT1 (huUCHT1), или его вариант. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR, представляет собой гуманизированный UCHT1 (huUCHT1) и кодирован посредством SEQ ID NO: 43. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR, представляет собой huUCHT1 и содержит SEQ ID NO: 44. В некоторых вариантах осуществления, лиганд huUCHT1, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR, имеет мутацию Y177T (huUCHT1 (Y177T)) и кодирован посредством SEQ ID NO: 45. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR, представляет собой huUCHT1 (Y177T) и содержит SEQ ID NO: 46.- 30 045368 by the TCR complex, has a mutation Y182T (UCHT1 (Y182T)) and is encoded by SEQ ID NO: 71. In some embodiments, the ligand binding protein associated with the TCR complex is UCHT1 (Y182T) and contains SEQ ID NO : 72. In some embodiments, the TCR complex-associated protein binding ligand is humanized UCHT1 (huUCHT1), or a variant thereof. In some embodiments, the TCR complex-associated protein binding ligand is humanized UCHT1 (huUCHT1) and is encoded by SEQ ID NO: 43. In some embodiments, the TCR complex-associated protein binding ligand is huUCHT1 and contains SEQ ID NO: 44. In some embodiments, the huUCHT1 binding protein ligand associated with the TCR complex has a Y177T mutation (huUCHT1 (Y177T)) and is encoded by SEQ ID NO: 45. In some embodiments, the ligand binding protein , associated with the TCR complex, is huUCHT1 (Y177T) and contains SEQ ID NO: 46.

В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR, представляет собой OKT3, или его вариант. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR, представляет собой OKT3 и кодирован посредством SEQ ID NO: 21. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR, представляет собой OKT3 и содержит SEQ ID NO: 22.In some embodiments, the TCR complex-associated protein binding ligand is OKT3, or a variant thereof. In some embodiments, the TCR complex-associated protein-binding ligand is OKT3 and is encoded by SEQ ID NO: 21. In some embodiments, the TCR complex-associated protein-binding ligand is OKT3 and is encoded by SEQ ID NO: 21. : 22.

В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR, представляет собой F6A или его вариант. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR, представляет собой F6A и кодирован посредством SEQ ID NO: 23. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR, представляет собой F6A и содержит SEQ ID NO: 24.In some embodiments, the TCR complex-associated protein binding ligand is F6A or a variant thereof. In some embodiments, the TCR complex-associated protein-binding ligand is F6A and is encoded by SEQ ID NO: 23. In some embodiments, the TCR complex-associated protein-binding ligand is F6A and is encoded by SEQ ID NO: 23. : 24.

В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR, представляет собой L2K или его вариант. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR, представляет собой L2K и кодирован посредством SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах осуществления, лиганд, связывающий белок, ассоциированный с комплексом TCR, представляет собой L2K и содержит SEQ ID NO: 26.In some embodiments, the ligand binding protein associated with the TCR complex is L2K or a variant thereof. In some embodiments, the TCR complex-associated protein-binding ligand is L2K and is encoded by SEQ ID NO: 25. In some embodiments, the TCR complex-associated protein-binding ligand is L2K and is encoded by SEQ ID NO: : 26.

В некоторых вариантах осуществления, белок, ассоциированный с комплексом TCR, представляет собой CD3. В некоторых вариантах осуществления, белок, ассоциированный с комплексом TCR, представляет собой CD3ε.In some embodiments, the TCR complex-associated protein is CD3. In some embodiments, the TCR complex-associated protein is CD3ε.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид передающего сигналы домена TCR содержит трансмембранный домен и/или цитозольный домен корецептора TCR. В некоторых вариантах осуществления, корецептор TCR представляет собой CD4, CD8, LAG3 или его химерный вариант.In some embodiments, the TCR signaling domain polypeptide comprises a transmembrane domain and/or a cytosolic domain of a TCR coreceptor. In some embodiments, the TCR coreceptor is CD4, CD8, LAG3, or a chimeric variant thereof.

В некоторых вариантах осуществления, первый полинуклеотид и третий полинуклеотид слиты с вторым полинуклеотидом, и кодирующая последовательность является функционально связанной с промотором. В некоторых вариантах осуществления, второй полинуклеотид и третий полинуклеотид слиты с первым полинуклеотидом, и кодирующая последовательность является функционально связанной с промотором. В некоторых вариантах осуществления, вектор сконструирован для экспрессии в клетках млекопитающих, таких как Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления, вектор представляет собой вирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления, вирусный вектор представляет собой ретровирусный вектор.In some embodiments, the first polynucleotide and the third polynucleotide are fused to the second polynucleotide and the coding sequence is operably linked to a promoter. In some embodiments, the second polynucleotide and the third polynucleotide are fused to the first polynucleotide and the coding sequence is operably linked to a promoter. In some embodiments, the vector is designed for expression in mammalian cells, such as T cells. In some embodiments, the vector is a viral vector. In some embodiments, the viral vector is a retroviral vector.

В некоторых вариантах осуществления, векторы, которые можно использовать, включают векторы, происходящие из лентивирусов, вирусов мышиных стволовых клеток (MSCV), поксвирусов, онкоретровирусов, аденовирусов и аденоассоциированных вирусов. Другие векторы для доставки, которые можно использовать, включают векторы, происходящие из вирусов простого герпеса, транспозонов, вирусов осповакцины, вируса папилломы человека, вирусов имонудефицита обезьян, HTLV, пенистого вируса человека и их вариантов. Дополнительные векторы, которые можно использовать, включают векторы, происходящие из спумавирусов, ретровирусов млекопитающих типа В, ретровирусов млекопитающих типа С, ретровирусов птиц типа С, ретровирусов млекопитающих типа D и ретровирусов типа HTLV/BLV. Одним примером лентивирусного вектора, который можно использовать в описанных композициях и способах, является вектор pCCL4.In some embodiments, vectors that can be used include vectors derived from lentiviruses, murine stem cell viruses (MSCVs), poxviruses, oncoretroviruses, adenoviruses, and adeno-associated viruses. Other delivery vectors that can be used include those derived from herpes simplex viruses, transposons, vaccinia viruses, human papillomavirus, simian immunodeficiency virus, HTLV, human foamy virus, and variants thereof. Additional vectors that can be used include those derived from spumaviruses, mammalian retroviruses type B, mammalian retroviruses type C, avian retroviruses type C, mammalian retroviruses type D and retroviruses type HTLV/BLV. One example of a lentiviral vector that can be used in the described compositions and methods is the pCCL4 vector.

В некоторых вариантах осуществления, нуклеиновая кислота представляет собой рекомбинантную, или сконструированную, нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления, первый, второй и/или третий полинуклеотиды представляют собой рекомбинантные, или сконструированные, полинуклеотиды. В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотиды, описанные в настоящем описании, подлежат модификации или мутагенезу для оптимизации функции кодированного полипептида и/или функции, активности и/или экспрессии связывающего Т-клетку с антигеном агента. В некоторых вариантах осуществления, нуклеиновая кислота кодирует полипептид.In some embodiments, the nucleic acid is a recombinant, or engineered, nucleic acid. In some embodiments, the first, second and/or third polynucleotides are recombinant, or engineered, polynucleotides. In some embodiments, the polynucleotides described herein are subject to modification or mutagenesis to optimize the function of the encoded polypeptide and/or the function, activity and/or expression of the T cell antigen binding agent. In some embodiments, the nucleic acid encodes a polypeptide.

В некоторых вариантах осуществления, модификации вносят в полинуклеотидные последовательности, включая векторные последовательности и полипептидные последовательности, описанные в настоящем описании. Модификации включают замены, вставку или делецию нуклеотидов или аминокислот, или изменение относительных положений или порядка нуклеотидов или аминокислот.In some embodiments, modifications are made to polynucleotide sequences, including vector sequences and polypeptide sequences described herein. Modifications include substitutions, insertions or deletions of nucleotides or amino acids, or changes in the relative positions or order of nucleotides or amino acids.

- 31 045368- 31 045368

Экспрессия в Т-клетках.Expression in T cells.

В конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к модифицированным Т-клеткам, содержащим последовательности нуклеиновой кислоты, описанные в настоящем описании, или векторы, описанные в настоящем описании. В конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к Т-клеткам человека, модифицированным для экспрессии три-ТАС, описанного в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления, Т-клетка экспрессирует три-ТАС, описанный в настоящем описании. Кроме того, настоящее изобретение относится к Т-клеткам, трансдуцированным или трансфицированным с использованием связывающего Т-клетку с антигеном агента или вектора, содержащего три-ТАС. В некоторых вариантах осуществления, Т-клетка представляет собой выделенную Т-клетку.In specific embodiments, the present invention relates to modified T cells containing nucleic acid sequences described herein or vectors described herein. In specific embodiments, the present invention provides human T cells modified to express tri-TAC as described herein. In some embodiments, the T cell expresses tri-TAC as described herein. In addition, the present invention relates to T cells transduced or transfected using a T cell antigen binding agent or a vector containing tri-TAC. In some embodiments, the T cell is an isolated T cell.

В некоторых вариантах осуществления, для Т-клеток человека, модифицированных для экспрессии три-ТАС, показана функциональность, эквивалентная общепринятому CAR in vitro. В некоторых вариантах осуществления, для Т-клеток, модифицированных с использованием три-ТАС, показана функциональность, превосходящая общепринятый CAR in vitro. В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к Т-клеткам человека, модифицированным с использованием три-ТАС, для которых показана улучшенная безопасность, по сравнению с традиционными CAR. В некоторых вариантах осуществления, для Т-клеток человека, модифицированных для экспрессии три-ТАС, показана улучшенная безопасность, по сравнению с традиционными CAR.In some embodiments, human T cells modified to express tri-TAC exhibit functionality equivalent to a conventional CAR in vitro. In some embodiments, T cells modified using tri-TAC exhibit functionality superior to conventional CAR in vitro. In some embodiments, the present invention relates to human T cells modified using tri-TAC, which have shown improved safety compared to traditional CARs. In some embodiments, human T cells modified to express tri-TAC have shown improved safety compared to traditional CARs.

Т-клетки, в некоторых вариантах осуществления, получают из ряда источников, включая, но без ограничения, кровь (например, мононуклеарные клетки периферической крови), костный мозг, ткань тимуса, ткань лимфатического узла, пуповинную кровь, ткань тимуса, ткань из участка инфекции, ткань селезенки или опухоли. В некоторых вариантах осуществления, Т-клетки представляют собой аутологичные Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления, Т-клетки получают из линии клеток из Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления, Т-клетки получают от доноров (аллогенные Т-клетки). В некоторых вариантах осуществления, Т-клетки получают посредством дифференцировки эмбриональных стволовых клеток или стволовых клеток, или из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. В некоторых вариантах осуществления, независимо от источника Т-клеток, Т-клетки модифицированы таким образом, чтобы в них отсутствовала экспрессия эндогенного TCR и/или временно или постоянно отсутствовала экспрессия молекул MHC/HLA (универсальные донорные Т-клетки). В некоторых вариантах осуществления, Т-клетки являются аутологичными по отношению к субъекту. В некоторых вариантах осуществления, клетки являются аллогенными, сингенными или ксеногенными по отношению к субъекту.T cells, in some embodiments, are obtained from a number of sources, including, but not limited to, blood (eg, peripheral blood mononuclear cells), bone marrow, thymic tissue, lymph node tissue, umbilical cord blood, thymic tissue, tissue from a site of infection , spleen tissue or tumor. In some embodiments, the T cells are autologous T cells. In some embodiments, the T cells are derived from a T cell line. In some embodiments, T cells are obtained from donors (allogeneic T cells). In some embodiments, T cells are obtained through differentiation of embryonic stem cells or stem cells, or from induced pluripotent stem cells. In some embodiments, regardless of the source of the T cells, the T cells are modified to lack endogenous TCR expression and/or to temporarily or permanently lack expression of MHC/HLA (universal donor T cell) molecules. In some embodiments, the T cells are autologous to the subject. In some embodiments, the cells are allogeneic, syngeneic, or xenogeneic to the subject.

В некоторых вариантах осуществления, после получения, Т-клетки, необязательно, обогащают in vitro. В некоторых вариантах осуществления, популяцию клеток обогащают посредством положительного или отрицательного отбора. Кроме того, Т-клетки, необязательно, замораживают или криоконсервируют и затем размораживают в более позднюю дату.In some embodiments, once obtained, T cells are optionally enriched in vitro. In some embodiments, a population of cells is enriched through positive or negative selection. In addition, the T cells are optionally frozen or cryopreserved and then thawed at a later date.

В некоторых вариантах осуществления, Т-клетки активируют и/или размножают до или после введения три-ТАС в Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления, Т-клетки размножают посредством контакта с поверхностью, к которой прикреплено средство, стимулирующее ассоциированный с CD3/комплексом TCR сигнал, и лиганд, стимулирующий костимулирующую молекулу на поверхности Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления, Т-клетки размножают посредством контакта с одним или несколькими растворимыми средствами, стимулирующими передачу сигналов CD3/комплекса TCR и передачу сигналов костимулирующей молекулы.In some embodiments, T cells are activated and/or expanded before or after administration of tri-TAC to the T cells. In some embodiments, T cells are propagated by contact with a surface to which a CD3/TCR complex-associated signal stimulating agent and a ligand stimulating costimulatory molecule on the surface of the T cells are attached. In some embodiments, T cells are expanded by contact with one or more soluble agents that stimulate CD3/TCR complex signaling and co-stimulatory molecule signaling.

В некоторых вариантах осуществления, Т-клетки трансдуцируют или трансфицируют с использованием последовательностей нуклеиновой кислоты. Трансдуцированные или трансфицированные Тклетки экспрессируют белки, кодированные трансфицированными или трансдуцированными последовательностями нуклеиновой кислоты. Нуклеиновую кислоту можно вводить в клетку посредством физических, химических или биологических способов. Физические способы включают, но без ограничения, микроинъекцию, электропорацию, бомбардировку частицам, липофекцию и преципитацию фосфатом кальция. Биологические способы включают использование ДНК- и РНК-векторов.In some embodiments, T cells are transduced or transfected using nucleic acid sequences. Transduced or transfected T cells express proteins encoded by the transfected or transduced nucleic acid sequences. Nucleic acid can be introduced into a cell through physical, chemical or biological means. Physical methods include, but are not limited to, microinjection, electroporation, particle bombardment, lipofection, and calcium phosphate precipitation. Biological methods include the use of DNA and RNA vectors.

Вирусные векторы, включая ретровирусные векторы, используют для введения и экспрессии нуклеиновой кислоты в Т-клетке. Вирусные векторы включают векторы, происходящие из лентивируса, вирусов мышиных стволовых клеток (MSCV), поксвирусов, вируса простого герпеса I, аденовируса и аденоассоциированных вирусов. Вектор, необязательно, включает промотор, управляющий экспрессией трансдуцированной молекулы нуклеиновой кислоты в Т-клетке (например, промотор CMV, промотор eF1a или промотор MSCV).Viral vectors, including retroviral vectors, are used to introduce and express nucleic acid into a T cell. Viral vectors include those derived from lentivirus, murine stem cell viruses (MSCV), poxviruses, herpes simplex virus I, adenovirus, and adeno-associated viruses. The vector optionally includes a promoter that drives expression of the transduced nucleic acid molecule in the T cell (eg, a CMV promoter, an eF1a promoter, or an MSCV promoter).

Любой подходящий анализ используют для подтверждения присутствия и/или экспрессии трансдуцированной последовательности нуклеиновой кислоты, и/или полипептида, кодируемого посредством нуклеиновой кислоты, в Т-клетке. Анализы включают, но без ограничения, Саузерн- и Нозерн-блоттинг, RT-ПЦР и ПНР, ELISA, Вестерн-блоттинг и проточную цитометрию.Any suitable assay is used to confirm the presence and/or expression of the transduced nucleic acid sequence, and/or the polypeptide encoded by the nucleic acid, in the T cell. Analyzes include, but are not limited to, Southern and Northern blotting, RT-PCR and NLR, ELISA, Western blotting and flow cytometry.

Т-клетка, экспрессирующая ТАС, имеет увеличенную активацию Т-клетки в присутствии антигена, по сравнению с Т-клеткой, не экспрессирующей ТАС, и/или по сравнению с Т-клеткой, экспрессирую- 32 045368 щей традиционный CAR. Увеличенную активацию Т-клетки устанавливают многочисленными способами, включая, но без ограничения, увеличенное уничтожение линии клеток опухоли, увеличенную продукцию цитокинов, увеличенный цитолиз, увеличенную дегрануляцию и/или увеличенную экспрессию маркеров активации, таких как CD107a, IFNy, IL2 или TNFa. В некоторых вариантах осуществления, увеличения измеряют в индивидуальной клетке или в популяции клеток.A T cell expressing TAC has increased T cell activation in the presence of antigen compared to a T cell not expressing TAC and/or compared to a T cell expressing a conventional CAR. Increased T cell activation is established in numerous ways, including, but not limited to, increased tumor cell line killing, increased cytokine production, increased cytolysis, increased degranulation and/or increased expression of activation markers such as CD107a, IFNy, IL2 or TNFa. In some embodiments, increases are measured in an individual cell or in a population of cells.

Термины увеличенный или увеличение, в рамках изобретения, относятся к увеличению по меньшей мере на 1, 2, 5, 10, 25, 50, 100 или 200% в Т-клетке или популяции Т-клеток, экспрессирующей ТАС, по сравнению с Т-клеткой или популяцией Т-клеток, не экспрессирующей ТАС, и/или по сравнению с Т-клеткой или популяцией Т-клеток, экспрессирующей традиционный CAR.The terms increased or increased, as used herein, refer to an increase of at least 1, 2, 5, 10, 25, 50, 100 or 200% in a T cell or population of T cells expressing TAC compared to T a cell or population of T cells not expressing TAC, and/or compared to a T cell or population of T cells expressing a conventional CAR.

Фармацевтические композиции.Pharmaceutical compositions.

В конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим сконструированную Т-клетку, описанную в настоящем описании (трансдуцированную с использованием ТАС и/или экспрессирующую ТАС), и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемый носители включают, но без ограничения, буферы, такие как нейтральный забуференный солевой раствор, фосфатно-солевой буфер и т.п.; углеводы, такие как глюкоза, манноза, сахароза или декстраны, маннит; белки; полипептиды или аминокислоты, такие как глицин; антиоксиданты; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА или глутатион; адъюванты (например, гидроксид алюминия); или консерванты. В некоторых вариантах осуществления, модифицированные Т-клетки составляют для внутривенного введения.In specific embodiments, the present invention provides pharmaceutical compositions comprising an engineered T cell as described herein (transduced with TAC and/or expressing TAC) and a pharmaceutically acceptable carrier. Pharmaceutically acceptable carriers include, but are not limited to, buffers such as neutral buffered saline, phosphate buffered saline, and the like; carbohydrates such as glucose, mannose, sucrose or dextrans, mannitol; proteins; polypeptides or amino acids such as glycine; antioxidants; chelating agents such as EDTA or glutathione; adjuvants (eg aluminum hydroxide); or preservatives. In some embodiments, the modified T cells are formulated for intravenous administration.

Фармацевтические композиции вводят способом, подходящим для заболевания, подлежащего лечению (или предотвращению). Количество и частоту введения определяют посредством таких факторов, как состояние пациента, и тип и тяжесть заболевания пациента, хотя подходящие дозы определяют посредством клинических исследований. Когда указано иммунологически эффективное количество, противоопухолевое эффективное количество, ингибирующее опухоль эффективное количество или терапевтическое количество, точное количество композиций по настоящему изобретению, подлежащее введению, определяет терапевт, с учетом индивидуальных различий в возрасте, массе, размере опухоли, степени инфекции или метастазирования и состоянии пациента (субъекта).Pharmaceutical compositions are administered in a manner suitable for the disease being treated (or prevented). The amount and frequency of administration are determined by factors such as the patient's condition and the type and severity of the patient's disease, although suitable dosages are determined through clinical studies. When an immunologically effective amount, an antitumor effective amount, a tumor inhibitory effective amount, or a therapeutic amount is stated, the exact amount of the compositions of the present invention to be administered is determined by the physician, taking into account individual differences in age, weight, tumor size, degree of infection or metastasis, and condition of the patient. (subject).

В некоторых вариантах осуществления, модифицированные Т-клетки и/или фармацевтические композиции, описанные в настоящем описании, вводят в дозе 101-1015 клеток на кг массы тела, 104-109 клеток на кг массы тела, необязательно, 105-108 клеток на кг массы тела, 106-107 клеток на кг массы тела или 105-106 клеток на кг массы тела, включая все целые значения в пределах этих диапазонов. В некоторых вариантах осуществления, модифицированные Т-клетки и/или фармацевтические композиции, описанные в настоящем описании, вводят в дозе более, чем 101 клеток на кг массы тела. В некоторых вариантах осуществления, модифицированные Т-клетки и/или фармацевтические композиции, описанные в настоящем описании, вводят в дозе менее чем 1015 клеток на кг массы тела.In some embodiments, the modified T cells and/or pharmaceutical compositions described herein are administered at a dose of 101-10 15 cells per kg body weight, 104-10 9 cells per kg body weight, optionally 105-10 8 cells per kg body weight, 10 6 -10 7 cells per kg body weight, or 105-10 6 cells per kg body weight, including all integer values within these ranges. In some embodiments, the modified T cells and/or pharmaceutical compositions described herein are administered at a dose of greater than 101 cells per kg of body weight. In some embodiments, the modified T cells and/or pharmaceutical compositions described herein are administered at a dose of less than 10 to 15 cells per kg of body weight.

В некоторых вариантах осуществления, модифицированные Т-клетки и/или фармацевтические композиции, описанные в настоящем описании, вводят в дозе 0,5х106 клеток, 2х106 клеток, 4х106 клеток, 5х106 клеток, 1,2х107 клеток, 2х107 клеток, 5х107 клеток, 2х108 клеток, 5х108 клеток, 2х109 клеток, 0,52000х106 клеток, 0,5-2х106 клеток, 0,5-2х107 клеток, 0,5-2х108 клеток или 0,5-2х109 клеток, включая все целые значения в пределах этих диапазонов.In some embodiments, the modified T cells and/or pharmaceutical compositions described herein are administered at a dose of 0.5 x 10 6 cells, 2 x 10 6 cells, 4 x 10 6 cells , 5 x 10 6 cells, 1.2 x 10 7 cells, 2 x 10 7 cells , 5x10 7 cells, 2x10 8 cells, 5x10 8 cells, 2x10 9 cells, 0.52000x10 6 cells, 0.5-2x10 6 cells, 0.5-2x10 7 cells, 0.5-2x10 8 cells or 0.5 -2x10 9 cells, including all integer values within these ranges.

В некоторых вариантах осуществления, композиции Т-клеток вводят множество раз в этих дозах. В некоторых вариантах осуществления, дозу вводят один раз или множество раз, например, ежесуточно, еженедельно, раз в две недели или ежемесячно, один раз в час, или вводят при обострении, рецидиве или прогрессировании злокачественной опухоли, подвергаемой лечению. Клетки, в некоторых вариантах осуществления, вводят с использованием способов инфузии, общеизвестных в иммунотерапии (см., например, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988).In some embodiments, the T cell compositions are administered multiple times at these dosages. In some embodiments, the dosage is administered once or multiple times, such as daily, weekly, biweekly or monthly, once per hour, or administered upon exacerbation, relapse, or progression of the cancer being treated. The cells, in some embodiments, are administered using infusion techniques well known in immunotherapy (see, eg, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988).

Фармацевтическая композиция является в основном свободной от, например, не содержит поддающихся детекции уровней контаминанта, например, выбранного из группы, состоящей из эндотоксина, микоплазмы, компетентного по репликации лентивируса (RCL), р24, нуклеиновой кислоты VSV-G, gag HIV, остаточных покрытых антителами против CD3/против CD28 бусин, мышиных антител, пулированной человеческой сыворотки, бычьего сывороточного альбумина, бычьей сыворотки, компонентов культуральной среды, компонентов упаковывающей вектор клетки или плазмиды, бактерии, гриба, микоплазмы, IL-2 и IL-7.The pharmaceutical composition is substantially free from, for example, does not contain detectable levels of a contaminant, for example, selected from the group consisting of endotoxin, mycoplasma, replication competent lentivirus (RCL), p24, VSV-G nucleic acid, HIV gag, residual coated anti-CD3/anti-CD28 beads, mouse antibodies, pooled human serum, bovine serum albumin, bovine serum, culture medium components, vector packaging cell or plasmid components, bacteria, fungi, mycoplasma, IL-2 and IL-7.

В некоторых вариантах осуществления, модифицированные Т-клетки, описанные в настоящем описании, вводят субъекту, и затем отбирают кровь (или проводят аферез), Т-клетки оттуда активируют и повторно вводят посредством инфузии пациенту с модифицированными Т-клетками. Этот процесс, в некоторых вариантах осуществления, проводят множество раз каждые несколько недель. Т-клетки активируют из отборов крови от 10 до 400 см3. Т-клетки активируют из отборов крови 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 см3.In some embodiments, the modified T cells described herein are administered to a subject and blood is then drawn (or apheresis) and the T cells therefrom are activated and reinfused into the patient with the modified T cells. This process, in some embodiments, is carried out multiple times every few weeks. T cells are activated from blood samples from 10 to 400 cm 3 . T cells are activated from blood samples of 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 or 100 cm 3 .

Модифицированные/сконструированные Т-клетки и/или фармацевтические композиции вводят способами, включающими, но без ограничения, аэрозольную ингаляцию, инъекцию, инфузию, прогла- 33 045368 тывание, трансфузию, имплантацию или трансплантацию. Модифицированные Т-клетки и/или фармацевтические композиции вводят субъекту трансартериально, подкожно, внутрикожно, внутрь опухоли, внутрь узлов, интрамедуллярно, внутримышечно, посредством внутривенной (i.v.) инъекции, посредством внутривенной (i.v.) инфузии или внутрибрюшинно.Modified/engineered T cells and/or pharmaceutical compositions are administered by methods including, but not limited to, aerosol inhalation, injection, infusion, ingestion, transfusion, implantation or transplantation. The modified T cells and/or pharmaceutical compositions are administered to the subject transarterially, subcutaneously, intradermally, intratumorally, intranodally, intramedullary, intramuscularly, by intravenous (i.v.) injection, by intravenous (i.v.) infusion, or intraperitoneally.

Модифицированные/сконструированные Т-клетки и/или их фармацевтические композиции вводят пациенту посредством внутрикожной или подкожной инъекции. Модифицированные/сконструированные Т-клетки и/или их фармацевтические композиции вводят посредством i.v. инъекции. Модифицированные/сконструированные Т-клетки и/или их фармацевтические композиции инъецируют непосредственно в опухоль, лимфатический узел или участок инфекции.The modified/engineered T cells and/or pharmaceutical compositions thereof are administered to the patient via intradermal or subcutaneous injection. Modified/engineered T cells and/or pharmaceutical compositions thereof are administered via i.v. injections. Modified/engineered T cells and/or pharmaceutical compositions thereof are injected directly into the tumor, lymph node or site of infection.

Модифицированные/сконструированные Т-клетки и/или фармацевтические композиции вводят в объеме приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 300, 400 или 500 мл.Modified/engineered T cells and/or pharmaceutical compositions are administered in a volume of approximately 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130 , 140, 150, 200, 300, 400 or 500 ml.

Модифицированные/сконструированные Т-клетки и/или фармацевтические композиции вводят в объеме более чем максимум приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 300, 400 или 500 мл.Modified/engineered T cells and/or pharmaceutical compositions are administered in a volume greater than a maximum of approximately 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 300, 400 or 500 ml.

Модифицированные/сконструированные Т-клетки и/или фармацевтические композиции вводят в объеме по меньшей мере приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 300, 400 или 500 мл.Modified/engineered T cells and/or pharmaceutical compositions are administered in a volume of at least about 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 300, 400 or 500 ml.

Фармацевтическую композицию получают известными по существу способами получения фармацевтически приемлемых композиций, которые вводят субъектам, таким образом, что эффективное количество Т-клеток объединяют в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. Пригодные носители описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA, 2000). На этой основе композиции включают, но не исключительно, растворы веществ в ассоциации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями, и содержащиеся в забуференных растворах с подходящим рН и изоосмотических с физиологическими жидкостями.The pharmaceutical composition is prepared by per se known methods for preparing pharmaceutically acceptable compositions that are administered to subjects such that an effective amount of T cells are combined in admixture with a pharmaceutically acceptable carrier. Suitable carriers are described, for example, in Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA, 2000). On this basis, compositions include, but are not limited to, solutions of the substances in association with one or more pharmaceutically acceptable carriers or diluents, and contained in buffered solutions of suitable pH and isosmotic with physiological fluids.

Пригодные фармацевтически приемлемые носители включают по существу химически инертные и нетоксичные композиции, которые не создают помех для эффективности биологической активности фармацевтической композиции. Примеры пригодных фармацевтических носителей включают, но без ограничения, воду, солевые растворы, растворы глицерина, хлорид К-(1(2,3-диолеилокси)пропил)К,К,Ктриметиламмония (DOTMA), диолеилфосфатидилхолинэтаноламин (DOPE) и липосомы. В некоторых вариантах осуществления, такие композиции содержат терапевтически эффективное количество соединения, вместе с подходящим количеством носителя, таким образом, чтобы обеспечивать форму для прямого введения пациенту.Suitable pharmaceutically acceptable carriers include substantially chemically inert and non-toxic compositions that do not interfere with the effectiveness of the biological activity of the pharmaceutical composition. Examples of suitable pharmaceutical carriers include, but are not limited to, water, saline solutions, glycerol solutions, K-(1(2,3-dioleyloxy)propyl)K,K,Ctrimethylammonium chloride (DOTMA), dioleylphosphatidylcholinethanolamine (DOPE) and liposomes. In some embodiments, such compositions contain a therapeutically effective amount of the compound, together with a suitable amount of carrier, so as to provide a form for direct administration to a patient.

Фармацевтические композиции включают, без ограничения, лиофилизированные порошки или водные или неводные стерильные пригодные для инъекции растворы или суспензии, которые могут дополнительно содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатики и растворенные вещества, которые делают композиции по существу совместимыми с тканями или кровью намеченного реципиента. Другие компоненты, которые могут присутствовать в таких композициях, включают, например, воду, поверхностноактивные вещества (такие как Tween), спирты, полиолы, глицерин и растительные масла. Растворы и суспензии для немедленной инъекции можно получать из стерильных порошков, гранул, таблеток или концентрированных растворов или суспензий.Pharmaceutical compositions include, without limitation, lyophilized powders or aqueous or non-aqueous sterile injectable solutions or suspensions, which may further contain antioxidants, buffers, bacteriostatics and solutes that make the compositions substantially compatible with the tissues or blood of the intended recipient. Other components that may be present in such compositions include, for example, water, surfactants (such as Tween), alcohols, polyols, glycerin and vegetable oils. Solutions and suspensions for immediate injection can be prepared from sterile powders, granules, tablets, or concentrated solutions or suspensions.

Фармацевтическую композицию, описанную в настоящем описании, составляют во множестве форм и вводят посредством ряда различных способов. Фармацевтический состав вводят перорально, ректально или парентерально, в составах, содержащих общепринятые носители, адъюванты и связующие, как желательно. Термин парентерально, в рамках изобретения, включает способы подкожной, внутривенной, внутримышечной или интрастернальной инъекции и инфузии. Введение включает инъекцию или инфузию, включая внутриартериальное, интракардиальное, интрацеребровентрикулярное, внутрикожное, интрадуоденальное, интрамедуллярное, внутримышечное, внутрикостное, внутрибрюшинное, интратекальное, внутрисосудистое, внутривенное введение, введение в стекловидное тело, эпидуральное и подкожное введение), ингаляционное, чрескожное, трансмукозальное, подъязычное, буккальное и местное (включая накожное, кожное введение, введение посредством клизмы, глазных капель, ушных капель, интраназальное, вагинальное) введение. В некоторых иллюстративных вариантах осуществления, способ введения осуществляют посредством инъекции, такой как внутримышечная, внутривенная, подкожная или внутрибрюшинная инъекция.The pharmaceutical composition described herein is formulated in a variety of forms and administered through a number of different routes. The pharmaceutical composition is administered orally, rectally or parenterally, in formulations containing conventional carriers, adjuvants and binders, as desired. The term parenteral, as used herein, includes methods of subcutaneous, intravenous, intramuscular or intrasternal injection and infusion. Introduction includes an injection or infusion, including intra -arterial, intracardial, intracerstericentric, intradermal, intraduodenal, intramedullar, intramuscular, intraoschous, intra -abdominal, intra -vascular, intravenous introduction, introduction to the glassy, epidural and subcutaneous administration), inhalation, custody , transmucosal, sub -language , buccal and local (including cutaneous, dermal, enema, eye drops, ear drops, intranasal, vaginal) administration. In some illustrative embodiments, the method of administration is by injection, such as intramuscular, intravenous, subcutaneous, or intraperitoneal injection.

Жидкие составы включают пероральный состав, внутривенный состав, интраназальный состав, глазной состав, ушной состав, аэрозоль и т.п. В конкретных вариантах осуществления, вводят комбинацию различных составов. В конкретных вариантах осуществления, композицию составляют для профиля замедленного высвобождения.Liquid formulations include an oral formulation, an intravenous formulation, an intranasal formulation, an ophthalmic formulation, an otic formulation, an aerosol, and the like. In specific embodiments, a combination of different formulations is administered. In specific embodiments, the composition is formulated for a sustained release profile.

Способы лечения и использования.Methods of treatment and use.

В конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способам использования три-ТАС, описанных в настоящем описании, в лечении злокачественной опухоли у нуждающегося вIn specific embodiments, the present invention relates to methods of using tri-TAS described herein in the treatment of a malignant tumor in a patient in need of

- 34 045368 этом индивидуума. В некоторых вариантах осуществления, специфические для мишени лиганды из ТАС, описанных в настоящем описании, связываются с антигеном опухоли или опухолеассоциированным антигеном на клетке опухоли. В некоторых вариантах осуществления, специфические для мишени лиганды из ТАС, описанных в настоящем описании, избирательно связываются с антигеном опухоли или опухолеассоциированным антигеном на клетке опухоли. В некоторых вариантах осуществления, специфические для мишени лиганды из ТАС, описанных в настоящем описании, специфически связываются с антигеном опухоли или опухолеассоциированным антигеном на клетке опухоли. В некоторых вариантах осуществления, антиген-мишень представляет собой антиген опухоли. Примеры антигенов опухолей включают, но без ограничения, CD19, HER-2 (erbB-2), антиген созревания В-клеток (ВСМА), альфафетопротеин (AFP), карциноэмбриональный антиген (СЕА), СА-125, MUC-1, эпителиальный антиген опухоли (ЕТА), тирозиназу, ассоциированный с меланомой антиген (MAGE), простатспецифический антиген (PSA), ассоциированный с глиомой антиген, β-субъединицу хорионического гонадотропина человека, тиреоглобулин, RAGE-1, MN-CA IX, обратную транскриптазу теломеразы человека, RU1, RU2 (AS), карбоксилэстеразу кишечника, mut hsp70-2, M-CSF, простазу, PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, простеин, PSMA, сурвивин и теломеразу, антиген-1 опухоли карциномы предстательной железы (РСТА-1), ELF2M, эластазу нейтрофилов, CD22, инсулиновый фактор роста (IGF)-I, IGF-II, рецептор IGF-I и мезотелин.- 34 045368 this individual. In some embodiments, target-specific ligands from the TACs described herein bind to a tumor antigen or tumor-associated antigen on a tumor cell. In some embodiments, target-specific ligands from the TACs described herein selectively bind to a tumor antigen or tumor-associated antigen on a tumor cell. In some embodiments, target-specific ligands from the TACs described herein specifically bind to a tumor antigen or tumor-associated antigen on a tumor cell. In some embodiments, the target antigen is a tumor antigen. Examples of tumor antigens include, but are not limited to, CD19, HER-2 (erbB-2), B-cell maturation antigen (BCMA), alphafetoprotein (AFP), carcinoembryonic antigen (CEA), CA-125, MUC-1, epithelial antigen tumor (ETA), tyrosinase, melanoma-associated antigen (MAGE), prostate-specific antigen (PSA), glioma-associated antigen, β-subunit of human chorionic gonadotropin, thyroglobulin, RAGE-1, MN-CA IX, human telomerase reverse transcriptase, RU1 , RU2 (AS), intestinal carboxylesterase, mut hsp70-2, M-CSF, prostase, PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, prostein, PSMA, survivin and telomerase, prostate carcinoma tumor antigen-1 ( PCTA-1), ELF2M, neutrophil elastase, CD22, insulin growth factor (IGF)-I, IGF-II, IGF-I receptor and mesothelin.

В конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способам лечения злокачественной опухоли, экспрессирующей антиген-мишень, у нуждающегося в этом индивидуума, включающим введение индивидууму модифицированных Т-клеток, описанных в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления, антиген-мишень представляет собой CD19. В некоторых вариантах осуществления, способ лечения злокачественной опухоли, экспрессирующей CD19, у нуждающегося в этом индивидуума включает введение индивидууму модифицированных Т-клеток, содержащих ТАС, содержащий нацеливающий на CD19 лиганд. В некоторых вариантах осуществления, примеры злокачественных опухолей, подвергаемых лечению посредством ТАС, содержащего нацеливающий на CD19 лиганд, включают, но без ограничения, В-клеточные злокачественные новообразования. В некоторых вариантах осуществления, примеры злокачественных опухолей, подвергаемых лечению посредством ТАС, содержащего нацеливающий на CD19 лиганд, включают, но без ограничения, В-клеточные лимфомы, острый лимфобластный лейкоз (ALL) и хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL). В некоторых вариантах осуществления, примеры злокачественных опухолей, подвергаемых лечению посредством ТАС, содержащего нацеливающий на CD19 лиганд, включают, но без ограничения, неходжскинскую лимфому (NHL).In specific embodiments, the present invention relates to methods of treating a cancer expressing a target antigen in an individual in need thereof, comprising administering to the individual modified T cells described herein. In some embodiments, the target antigen is CD19. In some embodiments, a method of treating a CD19-expressing cancer in an individual in need thereof comprises administering to the individual modified T cells containing a TAC containing a CD19-targeting ligand. In some embodiments, examples of cancers treated with a TAC containing a CD19-targeting ligand include, but are not limited to, B cell malignancies. In some embodiments, examples of cancers treated with a TAC containing a CD19-targeting ligand include, but are not limited to, B cell lymphomas, acute lymphoblastic leukemia (ALL), and chronic lymphocytic leukemia (CLL). In some embodiments, examples of cancers treated with a TAC containing a CD19-targeting ligand include, but are not limited to, non-Hodgkin's lymphoma (NHL).

В некоторых вариантах осуществления, антиген-мишень представляет собой HER-2. В некоторых вариантах осуществления, способ лечения злокачественной опухоли, где клетка злокачественной опухоли экспрессирует HER-2, у нуждающегося в этом индивидуума включает введение индивидууму модифицированных Т-клеток, содержащих ТАС, содержащий нацеливающий на HER-2 лиганд. В некоторых вариантах осуществления, примеры злокачественных опухолей, подвергаемых лечению посредством ТАС, содержащего нацеливающий на HER-2 лиганд, включают, но без ограничения, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак яичника и рак желудка.In some embodiments, the target antigen is HER-2. In some embodiments, a method of treating a cancer where the cancer cell expresses HER-2 in an individual in need thereof comprises administering to the individual modified T cells containing a TAC containing a HER-2 targeting ligand. In some embodiments, examples of cancers treated with a TAC containing a HER-2 targeting ligand include, but are not limited to, breast cancer, bladder cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, and gastric cancer.

В некоторых вариантах осуществления, антиген-мишень представляет собой ВСМА. В некоторых вариантах осуществления, способ лечения злокачественной опухоли, где клетка злокачественной опухоли экспрессирует ВСМА, у нуждающегося в этом индивидуума включает введение индивидууму модифицированных Т-клеток, содержащих ТАС, содержащий нацеливающий на ВСМА лиганд. В некоторых вариантах осуществления, примеры злокачественных опухолей, подвергаемых лечению посредством ТАС, содержащего нацеливающий на ВСМА лиганд, включают, но без ограничения, лейкоз, лимфомы и множественную миелому.In some embodiments, the target antigen is BCMA. In some embodiments, a method of treating a cancer where the cancer cell expresses BCMA in an individual in need thereof comprises administering to the individual modified T cells containing a TAC containing a BCMA-targeting ligand. In some embodiments, examples of cancers treated with a TAC containing a BCMA-targeting ligand include, but are not limited to, leukemia, lymphomas, and multiple myeloma.

Кроме того, настоящее изобретение относится к использованию модифицированной Т-клетки, описанной в настоящем описании, в получении лекарственного средства для лечения злокачественной опухоли у нуждающегося в этом индивидуума. Настоящее изобретение относится также к использованию смеси Т-клеток, содержащей модифицированные и немодифицированные клетки, или, содержащей различные популяции модифицированных клеток в присутствии или в отсутствие немодифицированных клеток. Специалисту в данной области понятно, что терапевтическое количество модифицированных Тклеток не должно иметь гомогенный характер.In addition, the present invention relates to the use of a modified T cell described herein in the production of a medicament for the treatment of a malignant tumor in an individual in need thereof. The present invention also relates to the use of a mixture of T cells containing modified and unmodified cells, or containing different populations of modified cells in the presence or absence of unmodified cells. One skilled in the art will appreciate that the therapeutic amount of modified T cells need not be homogeneous.

В некоторых вариантах осуществления, модифицированные Т-клетки, описанные в настоящем описании, являются частью комбинированной терапии. В некоторых вариантах осуществления, эффективность терапии, описанной в настоящем описании, оценивают множество раз. В некоторых вариантах осуществления, пациентов стратифицируют на основании ответа на лечение, описанное в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления, эффективность лечения определяет вход в исследование.In some embodiments, the modified T cells described herein are part of a combination therapy. In some embodiments, the effectiveness of a therapy described herein is assessed multiple times. In some embodiments, patients are stratified based on response to treatment described herein. In some embodiments, treatment efficacy determines study entry.

В некоторых вариантах осуществления, злокачественные опухоли, подвергаемые лечению с использованием модифицированных Т-клеток, содержащих любой из ТАС, описанных в настоящем описании, включают любую форму неопластического заболевания. В некоторых вариантах осуществления, примеры злокачественных опухолей, подвергаемых лечению, включают, но без ограничения, рак молочIn some embodiments, the cancers treated with modified T cells containing any of the TACs described herein include any form of neoplastic disease. In some embodiments, examples of cancers treated include, but are not limited to, breast cancer

- 35 045368 ной железы, рак легкого и лейкоз, например, лейкоз смешанного происхождения (MLL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL) острый лимфобластный лейкоз (ALL). В некоторых вариантах осуществления, примеры злокачественных опухолей, подвергаемых лечению, включают, но без ограничения, крупноклеточную В-клеточную лимфому, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому, первичную медиастинальную В-клеточную лимфому, В-клеточную лимфому высокой степени злокачественности или крупноклеточную В-клеточную лимфому, возникающую из фолликулярной лимфомы. Другие злокачественные опухоли включают карциномы, бластомы, меланомы, саркомы, гематологические злокачественные опухоли, лимфоидные злокачественные новообразования, доброкачественные и злокачественные опухоли, и злокачественные новообразования. В некоторых вариантах осуществления, злокачественная опухоль включает несолидные опухоли или солидные опухоли. В некоторых вариантах осуществления, злокачественные опухоли, подвергаемые лечению, включают опухоли, которые не являются васкуляризированными, или еще не являются значительно васкуляризированными, так же как васкуляризированные опухоли. В некоторых вариантах осуществления, злокачественная опухоль представляет собой солидную злокачественную опухоль или содержит солидную опухоль. В некоторых вариантах осуществления, злокачественная опухоль представляет собой жидкую злокачественную опухоль или содержит жидкую опухоль. В некоторых вариантах осуществления, злокачественная опухоль представляет собой рак легкого, рак молочной железы, рак ободочной кишки, множественную миелому, глиобластому, злокачественную опухоль желудочно-кишечного тракта, рак яичника, рак желудка, колоректальный рак, рак уротелия, рак эндометрия или меланому. В некоторых вариантах осуществления, злокачественная опухоль представляет собой рак легкого. В некоторых вариантах осуществления, злокачественная опухоль представляет собой рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления, злокачественная опухоль представляет собой рак ободочной кишки. В некоторых вариантах осуществления, злокачественная опухоль представляет собой множественную миелому. В некоторых вариантах осуществления, злокачественная опухоль представляет собой глиобластому. В некоторых вариантах осуществления, злокачественная опухоль представляет собой злокачественную опухоль желудочно-кишечного тракта. В некоторых вариантах осуществления, злокачественная опухоль представляет собой рак яичника. В некоторых вариантах осуществления, злокачественная опухоль представляет собой рак желудка. В некоторых вариантах осуществления, злокачественная опухоль представляет собой колоректальный рак. В некоторых вариантах осуществления, злокачественная опухоль представляет собой рак уротелия. В некоторых вариантах осуществления, злокачественная опухоль представляет собой рак эндометрия. В некоторых вариантах осуществления, злокачественная опухоль представляет собой меланому.- 35 045368 gland, lung cancer and leukemia, for example, mixed lineage leukemia (MLL), chronic lymphocytic leukemia (CLL) and acute lymphoblastic leukemia (ALL). In some embodiments, examples of cancers treated include, but are not limited to, large B-cell lymphoma, diffuse large B-cell lymphoma, primary mediastinal B-cell lymphoma, high-grade B-cell lymphoma, or large B-cell lymphoma. lymphoma arising from follicular lymphoma. Other malignancies include carcinomas, blastomas, melanomas, sarcomas, hematologic malignancies, lymphoid malignancies, benign and malignant tumors, and malignancies. In some embodiments, the cancer includes non-solid tumors or solid tumors. In some embodiments, the cancers being treated include tumors that are not vascularized, or not yet significantly vascularized, as well as vascularized tumors. In some embodiments, the cancer is a solid cancer or contains a solid tumor. In some embodiments, the cancer is a liquid cancer or contains a liquid tumor. In some embodiments, the cancer is lung cancer, breast cancer, colorectal cancer, multiple myeloma, glioblastoma, gastrointestinal cancer, ovarian cancer, gastric cancer, colorectal cancer, urothelial cancer, endometrial cancer, or melanoma. In some embodiments, the cancer is lung cancer. In some embodiments, the cancer is breast cancer. In some embodiments, the cancer is colon cancer. In some embodiments, the cancer is multiple myeloma. In some embodiments, the cancer is a glioblastoma. In some embodiments, the cancer is a gastrointestinal cancer. In some embodiments, the cancer is ovarian cancer. In some embodiments, the cancer is gastric cancer. In some embodiments, the cancer is colorectal cancer. In some embodiments, the malignancy is a urothelial cancer. In some embodiments, the cancer is endometrial cancer. In some embodiments, the cancer is melanoma.

- 36 045368- 36 045368

Таблица последовательностейSequence table

SEQ ID NO SEQ ID NO Описание Description Нуклеотид ы/аминокисло ты Nucleotide/amino acid SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 1 Три-ТАС, конфигурация 1 Tri-TAS, configuration 1 Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 2 Три-ТАС, конфигурация 1 Tri-TAS, configuration 1 Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 3 Три-ТАС, конфигурация 2 Tri-TAS, configuration 2 Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 4 Три-ТАС, конфигурация 2 Tri-TAS, configuration 2 Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 5 Лидер muIgG (сигнал секреции) muIgG leader (secretion signal) Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 6 Лидер muIgG (сигнал секреции) muIgG leader (secretion signal) Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 7 DARPin, специфический для антигена Нег2 DARPin, specific for Her2 antigen Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 8 DARPin, специфический для антигена Нег2 DARPin, specific for Her2 antigen Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 9 Метка Мус Mus Label Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 10 Метка Мус Mus Label Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 11 Линкер 1 Linker 1 Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 12 Линкер 1 Linker 1 Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 13 UCHT11 UCHT1 1 Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 14 UCHT12 UCHT1 2 Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 15 Линкер 2 Linker 2 Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 16 Линкер 2 Linker 2 Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 17 Домен CD43 CD4 domain 3 Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 18 Домен CD44 CD4 domain 4 Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 19 Линкер на основе CD4 CD4 based linker Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 20 Линкер на основе CD4 CD4 based linker Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 21 ОКТЗ OKTZ Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 22 ОКТЗ OKTZ Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 23 F6A F6A Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 24 F6A F6A Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 25 L2K L2K Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 26 L2K L2K Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 27 SEQ ID NO: 27 Соединитель с короткой спиралью Short Spiral Connector Нуклеотиды Nucleotides

- 37 045368- 37 045368

SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 28 Соединитель с короткой спиралью Short Spiral Connector Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 29 Соединитель с длинной спиралью Long Spiral Connector Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 30 Соединитель с длинной спиралью Long Spiral Connector Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 31 Соединитель с большим доменом Large Domain Connector Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 32 Соединитель с большим доменом Large Domain Connector Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 33 SEQ ID NO: 33 ScFv, специфический для антигена ВСМА ScFv specific for BCMA antigen Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 34 ScFv, специфический для антигена ВСМА ScFv specific for BCMA antigen Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 35 ScFv, специфический для антигена CD 19 ScFv specific for CD 19 antigen Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 36 SEQ ID NO: 36 ScFv, специфический для антигена CD 19 ScFv specific for CD 19 antigen Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 37 SEQ ID NO: 37 Домен CD8a CD8a domain Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 38 SEQ ID NO: 38 Домен CD8a CD8a domain Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 39 Домен CD8a+R(p) CD8a+R(p) domain Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 40 SEQ ID NO: 40 Домен CD8a+R(3) Domain CD8a+R(3) Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 41 SEQ ID NO: 41 Домен CD8 a +Lck CD8 domain a +Lck Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO: 42 Домен CD8 a +Lck CD8 domain a +Lck Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 43 huUCHTl huUCHTl Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 44 SEQ ID NO: 44 huUCHTl huUCHTl Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 45 huUCHTl (Y177T) huUCHTl (Y177T) Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 46 SEQ ID NO: 46 huUCHTl (Y177T) huUCHTl (Y177T) Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 47 SEQ ID NO: 47 huIgG huIgG Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 48 SEQ ID NO: 48 huIgG huIgG Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 49 SEQ ID NO: 49 huCD8a huCD8a Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 50 SEQ ID NO: 50 huCD8a huCD8a Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 51 SEQ ID NO: 51 3625 scFv BCMA Vh-Vl 3625 scFv BCMA Vh-Vl Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 52 SEQ ID NO: 52 3625 scFv BCMA Vh-Vl 3625 scFv BCMA Vh-Vl Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 53 SEQ ID NO: 53 3625 scFv BCMA VI-Vh 3625 scFv BCMA VI-Vh Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 54 SEQ ID NO: 54 3625 scFv BCMA VI-Vh 3625 scFv BCMA VI-Vh Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 55 SEQ ID NO: 55 3625 ТАС-спираль-Vh-Vl huUCHTl 3625 TAC-helix-Vh-Vl huUCHTl Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 56 3625 ТАС-спираль-Vh-Vl huUCHTl 3625 TAC-helix-Vh-Vl huUCHTl Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 57 SEQ ID NO: 57 3625 ТАС-спираль-VI-Vh huUCHTl 3625 TAC-helix-VI-Vh huUCHTl Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 58 SEQ ID NO: 58 3625 ТАС-спираль-VI-Vh huUCHTl 3625 TAC-helix-VI-Vh huUCHTl Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 59 SEQ ID NO: 59 3625 TAC-G4S-Vh-Vl huUCHTl3625 TAC-G 4 S-Vh-Vl huUCHTl Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 60 SEQ ID NO: 60 3625 TAC-G4S-Vh-Vl huUCHTl 3625 TAC-G4S-Vh-Vl huUCHTl Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 61 SEQ ID NO: 61 3625 TAC-G4S-VL-VH huUCHTl 3625 TAC-G4S-VL-VH huUCHTl Нуклеотиды Nucleotides

- 38 045368- 38 045368

SEQ ID NO: 62 SEQ ID NO: 62 3625 TAC-G4S-VL-VH huUCHTl3625 TAC-G 4 S-VL-VH huUCHTl Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 63 SEQ ID NO: 63 CD19-TAC CD19-TAC Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 64 SEQ ID NO: 64 CD19-TAC CD19-TAC Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 65 SEQ ID NO: 65 huIgG Her2-TAC huUCHTl huIgG Her2-TAC huUCHTl Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 66 SEQ ID NO: 66 huIgG Her2-TAC huUCHTl huIgG Her2-TAC huUCHTl Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 67 SEQ ID NO: 67 CD8a Her2-TAC huUCHTl CD8a Her2-TAC huUCHTl Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 68 SEQ ID NO: 68 CD8a Her2-TAC huUCHTl CD8a Her2-TAC huUCHTl Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 69 SEQ ID NO: 69 Гибкий соединитель Flexible connector Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 70 SEQ ID NO: 70 Гибкий соединитель Flexible connector Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 71 SEQ ID NO: 71 UCHT1 (Y182T) UCHT1 (Y182T) Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 72 SEQ ID NO: 72 UCHT1 (Y182T) UCHT1 (Y182T) Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 73 SEQ ID NO: 73 Гибкий линкер G4S G4S flexible linker Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 74 SEQ ID NO: 74 Линкер G4S3 Linker G4S3 Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 75 SEQ ID NO: 75 muIgG Her2-TAC huUCHTl muIgG Her2-TAC huUCHTl Нуклеотиды Nucleotides SEQ ID NO: 76 SEQ ID NO: 76 muIgG Her2-TAC huUCHTl muIgG Her2-TAC huUCHTl Аминокислоты Amino acids SEQ ID NO: 77 SEQ ID NO: 77 Линкер G4S3 Linker G4S3 Нуклеотиды Nucleotides

1 Легкая цепь, нуклеотиды 1-324; линкер, нуклеотиды 325-387; тяжелая цепь, нуклеотиды 388-750. 1 Light chain, nucleotides 1-324; linker, nucleotides 325-387; heavy chain, nucleotides 388-750.

2 Легкая цепь, аминокислоты 1-108; линкер, аминокислоты 109-128; тяжелая цепь, аминокислоты 129-250. 2 Light chain, amino acids 1-108; linker, amino acids 109-128; heavy chain, amino acids 129-250.

3 Внеклеточный линкер, нуклеотиды 1-66; трансмембранный домен, нуклеотиды 67-132; цитозольный домен, нуклеотиды 133-254. 3 Extracellular linker, nucleotides 1-66; transmembrane domain, nucleotides 67-132; cytosolic domain, nucleotides 133-254.

4 Внеклеточный линкер, аминокислоты 1-22; трансмембранный домен, аминокислоты 23-44; цитозольный домен, аминокислоты 45 84. 4 Extracellular linker, amino acids 1-22; transmembrane domain, amino acids 23-44; cytosolic domain, amino acids 45-84.

ПримерыExamples

Следующие примеры приведены с целью иллюстрации различных вариантов осуществления изобретения и не предназначены для ограничения настоящего изобретения никаким образом. Настоящие примеры, вместе со способами, описанными в настоящем описании, являются в настоящее время репрезентативными для предпочтительных вариантов осуществления, являются иллюстративными и не предназначены для ограничения объема изобретения. Их изменения и другие применения, включенные в содержание изобретения, как определено посредством объема формулы изобретения, могут прийти на ум специалисту в данной области.The following examples are provided to illustrate various embodiments of the invention and are not intended to limit the present invention in any way. The present examples, together with the methods described herein, are currently representative of the preferred embodiments, are illustrative and are not intended to limit the scope of the invention. Variations thereof and other uses included within the scope of the invention, as defined by the scope of the claims, may occur to one skilled in the art.

Пример 1. Характеризация технологии три-ТАС.Example 1. Characterization of tri-TAS technology.

Обзор технологии три-ТАС представлен на фиг. 1А-1С.An overview of tri-TAC technology is presented in Fig. 1A-1C.

На фиг. 1А показан пример активации CD8 Т-клетки на основе совместной сборки различных рецепторов и ассоциированных с ними белковых партнеров. Сначала, главный комплекс гистосовместимости I представляет антиген (спираль). Это узнает комплекс Т-клеточного рецептора (TCR), способный связывать антиген. Комплекс TCR содержит несколько индивидуальных субъединиц. Домены α/β являются способными взаимодействовать непосредственно с антигеном, представленным на MHC-I. Затем домены α/β взаимодействуют с несколькими другими доменами (ε, γ, δ и ζ, все из которых участвуют в активации Т-клетки посредством различных внутриклеточных активирующих доменов. Комплекс TCR взаимодействует с MHC-I одновременно с корецептором CD8. Корецептор CD8 связывается с MHC-I независимым от антигена образом. CD8 взаимодействует непосредственно с Lck, протеинкиназой, важной для активации комплекса рецептора TCR. Взаимодействие CD8 и Lck также обеспечивает их ассоциацию с микродоменами липидных рафтов (частью мембраны), которые, согласно гипотезе, организуют и инкапсулируют другие соответствующие передающие сигналы группы (темные сферы). Затем более поздние стадии активации приводят к привлечению CD28. Если этот каскад взаимодействий возникает параллельно несколько раз, Т-клетки становятся активированными и способны проявлять свои цитотоксические эффекты.In fig. 1A shows an example of CD8 T cell activation based on the co-assembly of various receptors and their associated protein partners. First, major histocompatibility complex I presents an antigen (helix). This is recognized by the T cell receptor (TCR) complex, which is able to bind the antigen. The TCR complex contains several individual subunits. The α/β domains are capable of interacting directly with antigen presented on MHC-I. The α/β domains then interact with several other domains (ε, γ, δ, and ζ, all of which are involved in T cell activation through various intracellular activating domains. The TCR complex interacts with MHC-I simultaneously with the CD8 coreceptor. The CD8 coreceptor binds to MHC-I in an antigen-independent manner. CD8 interacts directly with Lck, a protein kinase important for activation of the TCR receptor complex. The interaction of CD8 and Lck also mediates their association with lipid raft microdomains (part of the membrane), which are hypothesized to organize and encapsulate other relevant signaling groups (dark spheres).Later stages of activation then lead to the recruitment of CD28.If this cascade of interactions occurs several times in parallel, the T cells become activated and are able to exert their cytotoxic effects.

На фиг. 1В представлен обзор химерных рецепторов антигенов (CAR). В CAR стараются воспроизводить комплексный механизм активации Т-клетки посредством объединения нескольких ключевых активирующих доменов, таких как CD3Z, и CD28, в одной синтетически сконструированной молекуле. Затем CAR взаимодействует непосредственно с выбранным антигеном с использованием специфических связывающих доменов. На этой фигуре изображен белок с анкириновым повтором (DARPin). Считают, что несколько таких взаимодействий, возникающих параллельно, приводят к активации Т-клетки.In fig. 1B provides an overview of chimeric antigen receptors (CARs). CARs attempt to recapitulate the complex mechanism of T cell activation by combining several key activating domains, such as CD3Z, and CD28, into a single synthetically engineered molecule. The CAR then interacts directly with the selected antigen using specific binding domains. This figure depicts ankyrin repeat protein (DARPin). It is believed that several such interactions occurring in parallel lead to T cell activation.

- 39 045368- 39 045368

Фиг. 1С представляет собой обзор технологии три-ТАС, имитирующей природный процесс активации. Три-ТАС разработан для лучшего воспроизведения природной передачи сигналов посредством TCR, в то же время сохраняя нерестрицированное по МНС нацеливание. Активация Т-клетки происходит после связывания МНС посредством TCR и Т-клеточного корецептора (либо CD4, либо CD8), которые одновременно связываются с консервативными областями молекулы МНС. Корецепторы специфически локализованы внутри липидных рафтов, микродоменов мембраны, которые являются особенно важными для формирования передающего сигналы комплекса TCR. В дополнение к обеспечению правильной локализации микродоменов активирующего комплекса TCR, эти корецепторы также связываются непосредственно с Lck, протеинкиназой, которая является критической для активации Т-клеток. Ни один из традиционных химерных рецепторов или бифункциональных белков не привлекает молекулы корецептора или Lck. Получена молекула, в которой трансмембранные и внутриклеточные области корецептора CD4, которые локализованы в липидном рафте и связывают Lck, соответственно, были слиты с одноцепочечным антителом, связывающим CD3 (UCHT1; SEQ ID NO: 13, 14 и его гомологи). Эта конструкция сконструирована для переноса молекулы CD3 и TCR в области липидных рафтов и расположения Lck поблизости от TCR, сходным образом с природным связыванием МНС. Для нацеливания на этот рецептор, сконструированный анкириновый повтор (DARPin) связывали с химерой CD4-UCHT1 для получения трифункционального связывающего Т-клетку с антигеном средства (три-ТАС). В этом примере, DARPin являлся специфическим для протоонкогена, HER-2 (erbB-2).Fig. 1C is an overview of tri-TAS technology, which imitates the natural activation process. Tri-TAC is designed to better recapitulate natural TCR signaling while maintaining MHC-unrestricted targeting. T cell activation occurs following MHC binding via the TCR and a T cell coreceptor (either CD4 or CD8), which simultaneously bind to conserved regions of the MHC molecule. Coreceptors are specifically localized within lipid rafts, membrane microdomains that are particularly important for the formation of the TCR signaling complex. In addition to ensuring proper localization of the microdomains of the TCR activating complex, these coreceptors also bind directly to Lck, a protein kinase that is critical for T cell activation. None of the traditional chimeric receptors or bifunctional proteins recruit coreceptor or Lck molecules. A molecule was obtained in which the transmembrane and intracellular regions of the CD4 co-receptor, which are localized in the lipid raft and bind Lck, respectively, were fused with a single-chain CD3-binding antibody (UCHT1; SEQ ID NO: 13, 14 and its homologues). This construct is designed to transport CD3 and TCR molecules to lipid raft regions and locate Lck in proximity to the TCR, similar to natural MHC binding. To target this receptor, an engineered ankyrin repeat (DARPin) was coupled to a CD4-UCHT1 chimera to generate a trifunctional T cell antigen binding agent (tri-TAC). In this example, DARPin was specific for the proto-oncogene, HER-2 (erbB-2).

Возможно множество конфигураций три-ТАС (фиг. 2А и 2В). В конфигурации 1 (фиг. 2А), антигенсвязывающий домен локализован на N-конце, соединенный со связывающим лиганд CD3 доменом и затем доменом корецептора. В конфигурации 2 (фиг. 2В) связывающий лиганд CD3 домен локализован на N-конце, соединенный с антигенсвязывающим доменом, который, в свою очередь, соединен с доменом рецептора.Many tri-TAC configurations are possible (FIGS. 2A and 2B). In configuration 1 (Fig. 2A), the antigen binding domain is located at the N-terminus, connected to the CD3 ligand binding domain and then to the coreceptor domain. In configuration 2 (Fig. 2B), the CD3 ligand binding domain is located at the N-terminus, connected to the antigen binding domain, which in turn is connected to the receptor domain.

Множество классов связывающих лиганд доменов можно включать в молекулу три-ТАС (фиг. 3А3D). Примеры в настоящем описании иллюстрируют общую схему конфигурации 1 три-ТАС (фиг. 3А), три-ТАС, несущий специфический для HER-2 DARPin (фиг. 3В), три-ТАС, несущий специфический для CD19 scFv (фиг. 3С), и три-ТАС, несущий специфический для ВСМА scFv (фиг. 3D).Multiple classes of ligand binding domains can be included in a tri-TAC molecule (FIG. 3A3D). The examples herein illustrate the general outline of configuration 1 of tri-TAC (Figure 3A), tri-TAC carrying HER-2-specific DARPin (Figure 3B), tri-TAC carrying CD19-specific scFv (Figure 3C), and tri-TAC carrying the BCMA-specific scFv (Fig. 3D).

Фиг. 4A-4D иллюстрируют функциональность три-ТАС, несущего специфический для HER-2 DARPin. Т-клетки человека модифицировали для экспрессии либо три-ТАС, как описано в настоящем описании, либо общепринятого CAR с таким же DARPin. Определили, что, во всех аспектах, для Тклеток, сконструированных с использованием три-ТАС, показана функциональность, по меньшей мере эквивалентная общепринятому CAR. Интересно, что, применительно к 2 параметрам (продукции TNF-α и мобилизации CD107а), наблюдали, что три-ТАС являлся более активным, чем общепринятый CAR, в некоторых условиях.Fig. 4A-4D illustrate the functionality of tri-TAC carrying the HER-2 specific DARPin. Human T cells were modified to express either tri-TAC as described herein or a conventional CAR with the same DARPin. It has been determined that, in all respects, T cells engineered using tri-TAC exhibit functionality at least equivalent to conventional CAR. Interestingly, for 2 parameters (TNF-α production and CD107a mobilization), tri-TAC was observed to be more active than conventional CAR under some conditions.

На фиг. 4А показана поверхностная экспрессия DARPin против HER-2-три-ТАС, по сравнению с DARPin против HER-2-CAR и контрольными Т-клетками. Химерные рецепторы детектировали посредством инкубации с рекомбинантным HER-2. DARPin против HER-2-три-ТАС хорошо экспрессировался на поверхности модифицированных Т-клеток. На фиг. 4В показан рост культур модифицированных Тклеток. Т-клетки активировали с использованием Dynabeads против CD3/против CD28 и модифицировали с использованием лентивирусов, кодирующих три-ТАС, CAR или без рецептора (контроль). Через 2 недели, CAR- и контрольные культуры выращивали до сходных количеств в то время как три-ТАСкультуры росли немного более медленно. На фиг. 4С и 4D показаны функциональные признаки модифицированных Т-клеток. Т-клетки, модифицированные для экспрессии три-ТАС или CAR, несущего HER-2 DARPin, стимулировали с использованием связанного с планшетом антигена. Т-клетки, модифицированные для экспрессии три-ТАС и CAR, могли осуществлять все измеренные функции (продукцию TNF-α, продукцию IFN-γ и мобилизацию CD107а, фиг. 3С и 3D). Для Т-клеток, модифицированных с использованием три-ТАС, показаны увеличенные частоты положительных по CD107а клеток после стимуляции, по сравнению с Т-клетками, модифицированными с использованием CAR (фиг. 3D), что позволяет предполагать увеличенную цитотоксичность на основании отдельных клеток.In fig. 4A shows surface expression of anti-HER-2-tri-TAC DARPin compared with anti-HER-2-CAR DARPin and control T cells. Chimeric receptors were detected by incubation with recombinant HER-2. DARPin against HER-2-tri-TAC was well expressed on the surface of modified T cells. In fig. Figure 4B shows the growth of modified T cell cultures. T cells were activated using anti-CD3/anti-CD28 Dynabeads and modified with lentiviruses encoding tri-TAC, CAR, or no receptor (control). After 2 weeks, the CAR and control cultures grew to similar amounts, while the tri-TAC cultures grew slightly more slowly. In fig. 4C and 4D show functional signatures of the modified T cells. T cells modified to express tri-TAC or CAR bearing HER-2 DARPin were stimulated with plate-bound antigen. T cells modified to express tri-TAC and CAR were able to perform all measured functions (TNF-α production, IFN-γ production, and CD107a mobilization, Figures 3C and 3D). T cells modified with tri-TAC showed increased frequencies of CD107a positive cells after stimulation compared with T cells modified with CAR (Fig. 3D), suggesting increased cytotoxicity on a single cell basis.

На фиг. 6A-6J представлены данные, подтверждающие важность как связывающего лиганд домена, так и связывающего UCHT1 CD3 домена для функциональности три-ТАС. Т-клетки были модифицированы с использованием полноразмерного три-ТАС, несущего HER-2 DARPin (фиг. 6G, 6Н, 6I, нижний ряд), варианта три-ТАС, лишенного DARPin (фиг. 6А, 6В, 6С, верхний ряд), или варианта три-ТАС, лишенного UCHT1 (фиг. 6D, 6Е, 6F, средний ряд). Все популяции модифицированных Т-клеток стимулировали с использованием положительных по HER-2 клеток опухолей. Т-клетки, модифицированные с использованием полноразмерного три-ТАС, могли продуцировать IFN-g, TNF- и IL-2 после стимуляции, в то время как для вариантов не удалось продуцировать какой-либо цитокин после стимуляции. Три популяции Т-клеток также культивировали совместно с клетками D2F2/E2 (экспрессирующими HER-2) или клетками D2F2 (отрицательными по HER-2) в соотношении эффектор: мишень 4:1 (фиг. 6J). Для Тклеток, модифицированных с использованием полноразмерного три-ТАС, показано надежное уничтожение клеток D2F2/E2, но не уничтожение клеток D2F2. Для других вариантов три-ТАС, лишенных либоIn fig. 6A-6J provide data supporting the importance of both the ligand binding domain and the UCHT1 CD3 binding domain for tri-TAC functionality. T cells were modified with a full-length tri-TAC carrying HER-2 DARPin (Figures 6G, 6H, 6I, bottom row), a tri-TAC variant lacking DARPin (Figures 6A, 6B, 6C, top row), or a tri-TAC variant lacking UCHT1 (Figures 6D, 6E, 6F, middle row). All engineered T cell populations were stimulated using HER-2 positive tumor cells. T cells modified with full-length tri-TAC were able to produce IFN-γ, TNF-γ, and IL-2 after stimulation, while the variants failed to produce any cytokine after stimulation. Three T cell populations were also cocultured with D2F2/E2 cells (HER-2 expressing) or D2F2 cells (HER-2 negative) at an effector:target ratio of 4:1 ( Fig. 6J ). T cells modified with full-length tri-TAC showed robust killing of D2F2/E2 cells but not killing of D2F2 cells. For other three-TAS variants lacking either

- 40 045368- 40 045368

DARPin, либо UCHT1, не показано уничтожения.DARPin or UCHT1 is not shown to be killed.

На фиг. 7А-7С показаны результаты для мышей, подвергнутых лечению с использованием контрольного вектора (NGFR), DARPin против HER-2 CAR или DARPin против HER-2-три-ТАС. Использовали модель ксенотрансплантата на мышах. Клетки опухоли OVCAR-3 вводили мышам подкожно и позволяли расти, пока опухоли не достигали размера 100-200 мм3. На фиг. 7А показано относительное прогрессирование опухоли, нормализованное по размеру опухоли на сутки лечения. Модифицированные с использованием DARPin против HER-2-три-ТАС Т-клетки вызывали быстрое уменьшение объема опухоли, контроль не оказывал эффекта, и клетки с CAR замедляли рост опухоли, и для них показано отсроченное уменьшение размера опухоли. Фиг. 7В иллюстрирует относительные изменения массы тела после инфузии Т-клеток. Как для контрольных, так и для модифицированных с использованием DARPin против HER-2-три-ТАС клеток, не показано значимых изменений массы тела мышей после лечения. В отличие от этого, для мышей после лечения DARPin против HER-2 CAR показана значимая потеря массы тела, показательная для тяжелой токсичности. Фиг. 7С иллюстрирует концентрации цитокинов в сыворотке мышей на сутки 7 после инфузии Т-клеток. Уровни цитокинов были выше у мышей после лечения CAR, по сравнению с мышами после лечения три-ТАС.In fig. 7A-7C show results for mice treated with control vector (NGFR), DARPin anti-HER-2 CAR, or DARPin anti-HER-2-tri-TAC. A xenograft mouse model was used. OVCAR-3 tumor cells were injected subcutaneously into mice and allowed to grow until tumors reached a size of 100-200 mm 3 . In fig. Figure 7A shows relative tumor progression normalized by tumor size per day of treatment. DARPin-modified anti-HER-2-tri-TAC T cells caused rapid tumor shrinkage, control had no effect, and CAR cells slowed tumor growth and showed delayed tumor shrinkage. Fig. 7B illustrates the relative changes in body weight after T cell infusion. For both control and DARPin-modified anti-HER-2-tri-TAC cells, there were no significant changes in the body weight of mice after treatment. In contrast, mice treated with DARPin against the HER-2 CAR showed significant weight loss, indicative of severe toxicity. Fig. 7C illustrates serum cytokine concentrations in mice on day 7 after T cell infusion. Cytokine levels were higher in mice after CAR treatment compared to mice after tri-TAC treatment.

Пример 2. Замены UCHT1 влияют на функцию три-ТАС.Example 2: UCHT1 substitutions affect tri-TAC function.

Фиг. 8А-8Н иллюстрируют функциональность три-ТАС, несущих альтернативные связывающие CD3 домены. Домены перечислены на фиг. 8А и 8Е. Для три-ТАС, содержащих UCHT1 (фиг. 8В), OKT3 (фиг. 8В) и huUCHT1 (фиг. 8F), показана высокая поверхностная экспрессия, в то время как для триТАС, содержащих F6A (фиг. 8F) и L2K (фиг. 8F), выявлена более низкая поверхностная экспрессия. Для клеток, экспрессирующих три-ТАС, содержащий OKT3, показана низкая продукция цитокинов (фиг. 8С, 8С1) и промежуточная цитотоксичность (фиг. 8D) после связывания три-ТАС. Для клеток, экспрессирующих три-ТАС, содержащий F6A, показана сильная продукция цитокинов (фиг. 8G, 8G1) и цитотоксичность (фиг. 8Н) после связывания три-ТАС. Для клеток, экспрессирующих три-ТАС, содержащий L2K, показана низкая продукция цитокинов (фиг. 8G, 8G1) и промежуточная цитотоксичность (фиг. 8Н).Fig. 8A-8H illustrate the functionality of tri-TACs bearing alternative CD3 binding domains. The domains are listed in FIG. 8A and 8E. Tri-TACs containing UCHT1 (Figure 8B), OKT3 (Figure 8B) and huUCHT1 (Figure 8F) showed high surface expression, while triTACs containing F6A (Figure 8F) and L2K (Figure 8F) 8F), lower surface expression was detected. Cells expressing tri-TAC containing OKT3 showed low cytokine production (Fig. 8C, 8C1) and intermediate cytotoxicity (Fig. 8D) upon tri-TAC binding. Cells expressing tri-TAC containing F6A showed robust cytokine production (Fig. 8G, 8G1) and cytotoxicity (Fig. 8H) upon tri-TAC binding. Cells expressing tri-TAC containing L2K showed low cytokine production (Fig. 8G, 8G1) and intermediate cytotoxicity (Fig. 8H).

Фиг. 9А-9Н иллюстрирует поверхностную экспрессию TCR на Т-клетках, модифицированных с использованием различных вариантов три-ТАС, показанных на фиг. 8А и 8Е. Для Т-клеток, модифицированных с использованием вариантов три-ТАС, содержащих OKT3 (фиг. 9А, 9Е и 9В, 9F) или L2K (фиг. 9С, 9G и 9D, 9Н), показана более низкая поверхностная экспрессия TCR, по сравнению с Т-клетками, модифицированными с использованием три-ТАС, содержащих UCHT1 или huUCHT1, соответственно. В отличие от этого, для Т-клеток, модифицированных с использованием варианта три-ТАС, содержащего F6A, не выявлена понижающая регуляция TCR, по сравнению с три-ТАС, несущим huUCHT1 (фиг. 9С, 9G и 9D, 9Н). Замена F6A уменьшала поверхностную экспрессию рецептора три-ТАС, в то же время сохраняя умеренную продукцию цитокинов и цитотоксичность. Замена L2K умеренно уменьшала поверхностную экспрессию и уменьшала продукцию цитокинов, но сохраняла промежуточную цитотоксичность. Замена OKT3 приводила к высокой поверхностной экспрессии три-ТАС, низкой продукции цитокинов и промежуточной цитотоксичности. Эти данные показывают, что поверхностной экспрессии триТАС и эффекторным функциям Т-клетки не свойственна пропорциональность, и что замены доменов три-ТАС, в некоторых случаях, изменяют эффекторные функции, независимо от уровней поверхностной экспрессии. Можно предположить, что вариант ТАС с уменьшенной цитотоксичностью и низкой поверхностной экспрессией может являться полезным в конкретных клинических применениях.Fig. 9A-9H illustrate TCR surface expression on T cells modified with various tri-TAC variants shown in FIG. 8A and 8E. T cells modified with tri-TAC variants containing OKT3 (FIGS. 9A, 9E and 9B, 9F) or L2K (FIGS. 9C, 9G and 9D, 9H) showed lower TCR surface expression compared to T cells modified with tri-TAC containing UCHT1 or huUCHT1, respectively. In contrast, T cells modified with the F6A-containing tri-TAC variant did not exhibit TCR down-regulation compared with tri-TAC harboring huUCHT1 (FIGS. 9C, 9G and 9D, 9H). The F6A substitution reduced surface expression of the tri-TAC receptor while maintaining moderate cytokine production and cytotoxicity. L2K substitution moderately reduced surface expression and reduced cytokine production but maintained intermediate cytotoxicity. Replacement of OKT3 resulted in high surface expression of tri-TAC, low cytokine production, and intermediate cytotoxicity. These data indicate that triTAC surface expression and T cell effector functions are not proportional and that substitutions of triTAC domains, in some cases, alter effector functions independent of surface expression levels. It can be assumed that a TAC variant with reduced cytotoxicity and low surface expression may be useful in specific clinical applications.

Во многих случаях, замены scFv уменьшают способность модифицированной Т-клетки вырабатывать IFN-γ, TNF-α и IL-2, где модифицированные Т-клетки еще сохраняют способность уничтожать клетки-мишени. Избыточная продукция цитокинов ассоциирована с неблагоприятными событиями в клинических условиях, ограничивая современные технологии CAR опасными заболеваниями. Возможность модификации молекул ТАС для уменьшения для них продукции цитокинов, в то же время с сохранением умеренной цитотоксичности, может позволять получение рецепторов три-ТАС с точным уровнем реакционной способности, необходимой для удовлетворения клинической эффективности и безопасности.In many cases, scFv substitutions reduce the ability of the modified T cell to produce IFN-γ, TNF-α, and IL-2, where the modified T cells still retain the ability to kill target cells. Excessive cytokine production is associated with adverse events in clinical settings, limiting current CAR technologies to dangerous diseases. The ability to modify TAC molecules to reduce their cytokine production while maintaining moderate cytotoxicity may allow tri-TAC receptors to be produced with the precise level of reactivity required to meet clinical efficacy and safety.

Способность варианта три-ТАС, содержащего OKT3, супрессировать поверхностную экспрессию TCR и продукцию цитокинов, в то же время с сохранением цитотоксичности, может являться очень полезной в аллогенных ситуациях, когда супрессия TCR может супрессировать реакцию трансплантат против хозяина.The ability of the tri-TAC variant containing OKT3 to suppress TCR surface expression and cytokine production while maintaining cytotoxicity may be very useful in allogeneic situations where TCR suppression may suppress graft-versus-host disease.

Эти данные показывают, что замены scFv UCHT1 влияют на функцию три-ТАС. Дополнительные модификации могут приводить к получению три-ТАС, которые можно использовать в различных применениях (например, для онкологии, аутоииммунитета, аллергии).These data indicate that scFv UCHT1 substitutions affect tri-TAC function. Additional modifications can result in tri-TACs that can be used in various applications (eg, oncology, autoimmunity, allergy).

Пример 3. Введение различных линкеров, соединяющих лиганд, связывающий комплекс TCR, с доменом связывающего мишень лигандаExample 3 Introduction of Various Linkers Connecting the TCR Complex-Binding Ligand to the Target-Binding Ligand Domain

Фиг. 10А, 10В иллюстрируют несколько вариантов ТАС с различными линкерами, соединяющими лиганд, связывающий комплекс TCR, и домен связывающего мишень лиганда. Гибкий соединитель позволяет движение между двумя доменами. Соединитель с большим доменом содержит два свернутых домена и является очень большим и жестким. Соединители с короткой и длинной спиралью также вводятFig. 10A, 10B illustrate several TAC variants with different linkers connecting the TCR complex binding ligand and the target ligand binding domain. A flexible connector allows movement between two domains. The large domain connector contains two folded domains and is very large and rigid. Short and long helix connectors are also included

- 41 045368 жесткость, но являются менее ограничивающими, по сравнению с линкером с большим доменом.- 41 045368 rigidity, but are less restrictive compared to a large domain linker.

Фиг. 11А-11Е иллюстрируют влияние замены соединителя на поверхностную экспрессию три-ТАС, эффективность трансдукции три-ТАС, и продукцию цитокинов после связывания три-ТАС. На фиг. 11А и 11В показано, что спиральные линкеры увеличивают поверхностную экспрессию и эффективность трансдукции, по сравнению с гибким линкером, в то время как соединитель с большим доменом улучшает эффективность трансдукции, но не поверхностную экспрессию. Фиг. 11D, фиг. 11Е иллюстрирует продукцию цитокинов для клеток, экспрессирующих три-ТАС с соединителями с короткой спиралью, с длинной спиралью, или с большим доменом.Fig. 11A-11E illustrate the effects of connector replacement on tri-TAC surface expression, tri-TAC transduction efficiency, and cytokine production following tri-TAC binding. In fig. 11A and 11B show that helical linkers increase surface expression and transduction efficiency compared to a flexible linker, while the large domain connector improves transduction efficiency but not surface expression. Fig. 11D, fig. 11E illustrates cytokine production for cells expressing tri-TAC with short-helix, long-helix, or large domain connectors.

Фиг. 12А иллюстрирует увеличенную цитотоксичность in vitro Т-клеток, экспрессирующих триТАС с соединителем с короткой спиралью. Фиг. 12В иллюстрирует усиленный контроль опухоли in vivo для Т-клеток, экспрессирующих три-ТАС с соединителем с короткой спиралью. Соединитель с короткой спиралью был ассоциирован с высокой цитотоксичностью in vitro и эффективным контролем опухоли in vivo.Fig. 12A illustrates the increased in vitro cytotoxicity of T cells expressing triTAC with a short-coil connector. Fig. 12B illustrates enhanced tumor control in vivo for T cells expressing tri-TAC with a short-coil connector. The short-coil connector was associated with high cytotoxicity in vitro and effective tumor control in vivo.

Пример 4. Введение цитозольного домена CD8a/e.Example 4: Introduction of the CD8a/e cytosolic domain.

Фиг. 13А иллюстрирует поверхностную экспрессию CD8α-три-ТАС в паре с scFv против HER-2, или фиг. 13С - с DARPin против HER-2. Фиг. 13В иллюстрирует продукцию цитокинов Т-клетками, экспрессирующими CD8a три-ТАС, в паре с scFv против HER-2 или DARPin против HER-2.Fig. 13A illustrates surface expression of CD8α-tri-TAC paired with anti-HER-2 scFv, or FIG. 13C - with DARPin against HER-2. Fig. 13B illustrates cytokine production by T cells expressing CD8a tri-TAC paired with anti-HER-2 scFv or anti-HER-2 DARPin.

Фиг. 14А иллюстрирует мономер CD4 три-ТАС и гетеродимер CD8a/e. Корецепторы TCR, как CD4, так и CD8, несут функциональные домены, важные для функциональности корецептора. Эти области включают богатые аргинином области, согласно гипотезе, важные для ассоциации с липидным рафтом, и мотив СХСР, необходимый для связывания Lck. В отличие от CD4, который представляет собой мономер, корецептор CD8 представляет собой гетеродимер, состоящий из субъединиц α и β (фиг. 14А). Обе субъединицы α и β CD8 содержат богатые аргинином области, но только субъединица а содержит мотив СХСР.Fig. 14A illustrates a CD4 tri-TAC monomer and a CD8a/e heterodimer. TCR coreceptors, both CD4 and CD8, carry functional domains important for coreceptor functionality. These regions include arginine-rich regions hypothesized to be important for lipid raft association and the CXCP motif required for Lck binding. Unlike CD4, which is a monomer, the CD8 coreceptor is a heterodimer consisting of α and β subunits (Fig. 14A). Both the α and β subunits of CD8 contain arginine-rich regions, but only the a subunit contains the CXCP motif.

На фиг. 14B-14D представлены схемы вариантов три-ТАС, включающих элементы из корецептора CD8, показанные на фиг. 14А. Цистеин, ответственный за димеризацию CD8a и CD8e , заменен на аланин во всех вариантах CD8-tpu-TAC. Фиг. 14В представляет собой схему CD8a три-ТАС, содержащего мутацию цистеина до серина, для обеспечения распространения мономерного рецептора, и цитозольный домен CD8a. Фиг. 14С представляет собой схему CD8a+Re три-ТАС, содержащего мутацию цистеина до серина, для обеспечения распространения мономерного рецептора, и химерный цитозольный домен CD8a, где богатая аргинином область CD8a заменена на богатую аргинином область CD8e. Фиг. 14D представляет собой схему CD8β+Lck-три-TAC, содержащего мутацию цистеина до серина, для обеспечения распространения мономерного рецептора, и химерный цитозольный домен CD8e, где домен СХСР CD8a, содержащий связывающий Lck мотив, добавлен к С-концу цитозольного домена CD8e.In fig. 14B-14D are diagrams of tri-TAC variants incorporating elements from the CD8 coreceptor shown in FIG. 14A. Cysteine, responsible for the dimerization of CD8a and CD8e, is replaced by alanine in all CD8-tpu-TAC variants. Fig. 14B is a diagram of a CD8a tri-TAC containing a cysteine to serine mutation to promote monomeric receptor propagation, and a CD8a cytosolic domain. Fig. 14C is a CD8a+Re tri-TAS design containing a cysteine to serine mutation to promote monomeric receptor propagation, and a chimeric CD8a cytosolic domain where the arginine-rich region of CD8a is replaced by the arginine-rich region of CD8e. Fig. 14D is a CD8β+Lck tri-TAC design containing a cysteine to serine mutation to promote monomeric receptor propagation, and a chimeric CD8e cytosolic domain where the CD8a CXCP domain containing the Lck binding motif is added to the C-terminus of the CD8e cytosolic domain.

Фиг. 15A-15D иллюстрируют различные фенотипические и функциональные признаки вариантов три-ТАС на основе CD8, по сравнению с прототипическим три-ТАС. Фиг. 15А-15В иллюстрируют поверхностную экспрессию вариантов CD8-tpu-TAC, по сравнению с прототипическим три-ТАС. Поверхностная экспрессия являлась сравнимой среди различных три-ТАС. Фиг. 15С иллюстрирует цитотоксичность in vitro вариантов CD8-tpu-TAC при совместном культивировании с LOX IMVI (отрицательными по HER-2) и А549, SKOV3, SKBR3 или MBA MB 231 (все являются положительными по HER-2). Для всех Т-клеток, модифицированных с использованием три-ТАС, показана цитотоксичность. Фиг. 15D иллюстрирует деление клеток для Т-клеток, модифицированных с использованием либо вариантов CD8три-TAC, либо прототипического три-ТАС (фиг. 15D). Фиг. 15Е иллюстрирует поверхностную экспрессию TCR для модифицированных Т-клеток, содержащих варианты CD8-tpu-TAC или прототипический три-ТАС. Все варианты три-ТАС оказывали сходный эффект на экспрессию TCR. В то время как для корецептора CD4 показана хорошая поверхностная экспрессия и функциональность, как с scFv, так и с DARPin против HER-2, для конструкции CD8a показана активность только в контексте антигенсвязывающего домена DARPin. При тестировании различных цитозольных доменов CD8a, все конфигурации имели ключевые атрибуты последовательности, ассоциированные с функциональностью корецептора, (богатую аргинином область и СХСР). Для всех конструкций CD8a/e показана сходная активность, при сравнении с прототипом CD4. Это подчеркивает, что сохранение специфических биохимических свойств, таких как аффинность для липидного рафта и связывание Lck, является более важным для определения активности три-ТАС, чем конкретная последовательность цитозольного полипептида.Fig. 15A-15D illustrate different phenotypic and functional features of the CD8-based tri-TAC variants compared to the prototypical tri-TAC. Fig. 15A-15B illustrate the surface expression of CD8-tpu-TAC variants compared to the prototypical tri-TAC. Surface expression was comparable among different tri-TAS. Fig. 15C illustrates the in vitro cytotoxicity of CD8-tpu-TAC variants when co-cultured with LOX IMVI (HER-2 negative) and A549, SKOV3, SKBR3 or MBA MB 231 (all HER-2 positive). All T cells modified using tri-TAS showed cytotoxicity. Fig. 15D illustrates cell division for T cells modified using either CD8 tri-TAC variants or prototypical tri-TAC (FIG. 15D). Fig. 15E illustrates TCR surface expression for modified T cells containing CD8-tpu-TAC variants or prototypical tri-TAC. All tri-TAC variants had similar effects on TCR expression. While the CD4 co-receptor shows good surface expression and functionality with both scFv and anti-HER-2 DARPin, the CD8a construct only shows activity in the context of the DARPin antigen-binding domain. When testing different cytosolic domains of CD8a, all configurations had key sequence attributes associated with coreceptor functionality (arginine-rich region and CXCP). All CD8a/e constructs showed similar activity when compared to the CD4 prototype. This highlights that the conservation of specific biochemical properties, such as lipid raft affinity and Lck binding, is more important in determining tri-TAC activity than the specific cytosolic polypeptide sequence.

Рост Т-клеток, модифицированных с использованием CD8a+R(e)- и CD8β+Lck-три-TAC, являлся значимо ослабленным, по сравнению с ростом Т-клеток, модифицированных с использованием других вариантов. Несмотря на значительное влияние на рост, для всех этих три-ТАС показана сравнимая способность к активации Т-клеток. Уменьшенный рост для CD8a+R(e)- и CD8β+Lck-три-ТАС может обеспечивать преимущества для конкретного применения, где максимальное размножение Т-клеток не является желательным.The growth of T cells modified with CD8a+R(e)- and CD8β+Lck-tri-TAC was significantly attenuated compared to the growth of T cells modified with other variants. Despite the significant effect on growth, all of these tri-TACs showed comparable T cell activation abilities. Reduced growth for CD8a+R(e)- and CD8β+Lck-tri-TAC may provide benefits for a particular application where maximum T cell expansion is not desired.

Пример 5. Разработка конструкции CD19-TAC.Example 5: Development of the CD19-TAC construct.

- 42 045368- 42 045368

Фиг. 16 иллюстрирует ступенчатую разработку конструкции CD19-TAC. Получают несколько поколений лентивирусных векторов с различными изменениями в дизайне элементов для обеспечения специфичности для CD19, надлежащей экспрессии ТАС и продукции лентивируса квалификации GMP. Каждая рамка представляет лентивирусный вектор и определяет 3 главных элемента дизайна: (А) антигенсвязывающий домен, (В) TCR/CD3-связывающий домен, и (С) домен корецептора. Затемненные области указывают домены, являвшиеся объектом модификации в ходе процесса разработки вектора.Fig. 16 illustrates the stepwise development of the CD19-TAC construct. Multiple generations of lentiviral vectors are produced with various changes in element design to ensure CD19 specificity, proper TAC expression, and GMP-grade lentivirus production. Each box represents a lentiviral vector and defines 3 major design elements: (A) antigen binding domain, (B) TCR/CD3 binding domain, and (C) coreceptor domain. Shaded areas indicate domains that were modified during the vector development process.

ТАС на первой стадии содержит специфический для HER-2 сконструированный с анкириновым повтором белок (DARPin), мышиный UCHT1, специфический для CD3 scFv, и гибкий трансмембранный и цитозольный полипептид CD4. ТАС клонируют в лентивирусный вектор pCCL4.The first stage TAC contains the HER-2-specific engineered ankyrin repeat protein (DARPin), the murine UCHT1, the CD3-specific scFv, and the CD4 transmembrane and cytosolic flexible polypeptide. TAC is cloned into the pCCL4 lentiviral vector.

Для получения специфического для CD19 три-ТАС, специфический для HER-2 DARPin заменяли полипептидом, содержащим N-концевой лидерный пептид CD8a, слитый с scFv против CD19. Тяжелые и легкие цепи CD19 scFv были соединены посредством глицин-сериновой линкерной области.To generate the CD19-specific tri-TAC, the HER-2-specific DARPin was replaced with a polypeptide containing the N-terminal CD8a leader peptide fused to an anti-CD19 scFv. The CD19 scFv heavy and light chains were connected via a glycine-serine linker region.

Домен UCHT1 заменяли гуманизированным вариантом (huUCHT1) для уменьшения иммуногенности. Для этой конструкции ТАС показаны уровни поверхностной экспрессии, превосходящие ее предшественника.The UCHT1 domain was replaced with a humanized variant (huUCHT1) to reduce immunogenicity. This TAC construct shows surface expression levels superior to its predecessor.

Для дальнейшего улучшения экспрессии рецептора на клеточной поверхности Т-клеток без нарушения функциональности, две отдельные модификации оценивали параллельно. Для увеличения стабилизации одиночной цепи, линкер G4S (SEQ ID NO: 73), использованный в scFv против CD19, заменяли на более структурированный линкер Уитлоу. Отдельно, мутацию Y177T вводили в домен huUCHT1. Оба способа увеличивали экспрессию рецептора ТАС, и рецептор получали с использованием как линкера Уитлоу, так и мутации Y177T.To further improve receptor expression on the cell surface of T cells without compromising functionality, two separate modifications were evaluated in parallel. To increase single chain stabilization, the G4S linker (SEQ ID NO: 73) used in the anti-CD19 scFv was replaced with a more structured Whitlow linker. Separately, the Y177T mutation was introduced into the huUCHT1 domain. Both methods increased expression of the TAC receptor, and the receptor was generated using both the Whitlow linker and the Y177T mutation.

Фиг. 17 иллюстрирует вставку CD19-TAC в лентивирусный вектор pCCL. Вектор pCCL характеризуется двунаправленной промоторной системой с ANGFR(hu) под контролем промотора mCMV и экспрессией ТАС, управляемой промотором EF-1a. ANGFR(hu) представляет собой укороченный CD271 человека (член 16 суперсемейства рецептора фактора некроза опухоли), с трансмембранным доменом, но лишенный цитозольного передающего сигналы домена. Продукт экспрессии ANGFR(hu) используют для количественной оценки лентивирусной трансдукции. Открытая рамка считывания CD19-TAC#921 увеличена, чтобы показать ключевые элементы конструкции ТАС: лидер CD8a, одиночную цепь FMC63 (scFv против CD19), метку с-Мус человека, huUCHT1 (Y177T) и домен ACD4. Мутация huUCHT1 (Y177T) была идентифицирована посредством проверки точечных мутаций, случайным образом введенных в остатки поверхности связывания мышиного UCHT1 - CD3-эпсилон. При скрининге успешно идентифицирована мутация (Y177T). Мутация (Y177T) приводит к лучшей поверхностной экспрессии триТАС, в то же время сохраняя активацию Т-клетки. ACD4 лишен четырех внеклеточных подобных иммуноглобулину доменов CD4 и сохраняет внеклеточный линкер, трансмембранный и цитозольный домены.Fig. 17 illustrates the insertion of CD19-TAC into the pCCL lentiviral vector. The pCCL vector is characterized by a bidirectional promoter system with ANGFR(hu) under the control of the mCMV promoter and TAC expression driven by the EF-1a promoter. ANGFR(hu) is a truncated human CD271 (tumor necrosis factor receptor superfamily member 16), with a transmembrane domain but lacking a cytosolic signaling domain. The ANGFR(hu) expression product is used to quantify lentiviral transduction. The CD19-TAC#921 open reading frame is enlarged to show the key elements of the TAC construct: the CD8a leader, the single chain FMC63 (scFv against CD19), the human c-Myc tag, huUCHT1 (Y177T) and the ACD4 domain. The huUCHT1 mutation (Y177T) was identified by testing point mutations randomly introduced into residues of the mouse UCHT1-CD3 epsilon binding surface. Screening successfully identified a mutation (Y177T). The mutation (Y177T) results in better surface expression of triTAS while maintaining T cell activation. ACD4 lacks the four extracellular CD4 immunoglobulin-like domains and retains the extracellular linker, transmembrane, and cytosolic domains.

Для получения лентивирусного вектора квалификации GMP, конструкцию CD19-tpu-TAC клонировали в новый лентивирусный вектор под контролем промотора MSCV. Конструкция CD19-tpu-TAC является такой, как описано на фиг. 17.To obtain a GMP-qualified lentiviral vector, the CD19-tpu-TAC construct was cloned into a new lentiviral vector under the control of the MSCV promoter. The CD19-tpu-TAC construct is as described in FIG. 17.

Пример 6. Возможность промышленного получения экспрессирующих CD19-TAC Т-клеток из различного донорного материала.Example 6. Possibility of industrial production of CD19-TAC expressing T cells from various donor materials.

Фиг. 18 иллюстрирует эффективность экспрессирующих CD19-TAC Т-клеток, полученных от множества доноров. Экспрессирующие CD19-TAC Т-клетки получали с использованием Т-клеток от трех различных доноров, и тестировали в модели опухоли NALM-6. Мышей, несущих развившиеся опухоли NALM-6, подвергали лечению с использованием однократной дозы 4x106 экспрессирующих CD19-TAC Т-клеток. Для контрольных мышей показано быстрое разрастание опухоли, где все мыши достигли конечной точки к концу исследования. Продукты Т-клеток от доноров 1 и 2 приводили к полному контролю у всех мышей. Продукт Т-клеток от донора 3 приводил к надежному контролю опухоли у всех мышей и длительному контролю у 2/4 подвергнутых лечению мышей. Исследование подтверждает, что отторжения опухоли достигают посредством экспрессирующих CD19-TAC Т-клеток, происходящих от множества здоровых доноров. Результаты для модели опухоли NALM-6 на фиг. 18 позволяют предполагать, что эффективный CD19-TAC получен из материалов из множества донорских источников.Fig. 18 illustrates the efficacy of CD19-TAC expressing T cells obtained from multiple donors. CD19-TAC-expressing T cells were generated using T cells from three different donors and tested in the NALM-6 tumor model. Mice bearing established NALM-6 tumors were treated with a single dose of 4x106 CD19-TAC expressing T cells. Control mice showed rapid tumor growth, with all mice reaching the end point by the end of the study. T cell products from donors 1 and 2 resulted in complete control in all mice. The T cell product from donor 3 resulted in robust tumor control in all mice and long-term control in 2/4 of treated mice. The study confirms that tumor rejection is achieved through CD19-TAC-expressing T cells derived from multiple healthy donors. Results for the NALM-6 tumor model in FIG. 18 suggest that effective CD19-TAC is derived from materials from multiple donor sources.

Пример 7. Цитотоксичность in vitro и эффективность in vivo экспрессирующих CD19-TAC Тклеток.Example 7: In vitro cytotoxicity and in vivo efficacy of CD19-TAC-expressing T cells.

Для оценки способности CD19-TAC эффективно привлекать различные положительные по CD19 клетки, модифицированные с использованием три-ТАС-Т-клетки культивировали совместно с NALM-6 (острый лимфобластный лейкоз), Raji (лимфома Беркитта) или Jeko-1 (лимфома из клеток мантийной зоны). Клетки NALM-6, Jeko-1 и Raji модифицировали с использованием усиленной люциферазы светляка, чтобы позволить отслеживание опухолевой нагрузки in vitro и в живом животном посредством биолюминесцентной визуализации.To evaluate the ability of CD19-TAC to effectively recruit a variety of CD19-positive cells, tri-TAC T cells were cocultured with NALM-6 (acute lymphoblastic leukemia), Raji (Burkitt's lymphoma), or Jeko-1 (mantle cell lymphoma). zones). NALM-6, Jeko-1, and Raji cells were modified with enhanced firefly luciferase to allow tumor burden monitoring in vitro and in a living animal via bioluminescent imaging.

Фиг. 19А-19С иллюстрирует уничтожение линий клеток опухолей посредством экспрессирующих CD19-TAC Т-клеток. Эффекты являлись зависимыми от дозы и увеличивались с увеличением соотношений эффектора к мишени (Е:Т). В качестве отрицательного контроля, использовали клетки, модифициро- 43 045368 ванные с использованием АТАС (лишенного антигенсвязывающего домена), или нетрансдуцированныеFig. 19A-19C illustrate killing of tumor cell lines by CD19-TAC expressing T cells. The effects were dose dependent and increased with increasing effector to target (E:T) ratios. As a negative control, cells modified with ATAC (lacking the antigen-binding domain) or untransduced cells were used.

Т-клетки.T cells.

Эти результаты показывают, что экспрессирующие CD19-TAC Т-клетки уничтожают положительные по CD19 клетки опухолей.These results indicate that CD19-TAC-expressing T cells eliminate CD19-positive tumor cells.

Фиг. 19D-19G иллюстрирует дизайн и исход исследования in vivo, оценивающего эффективность CD19-TAC у мышей с трансплантированными жидкими опухолями NALM-6 (острый лимфобластный лейкоз), Raji (лимфома Беркитта) или Jeko-1 (лимфома из клеток мантийной зоны). Для инициации развития опухолей NALM-6, Raji и Jeko-1, мышам инокулировали клетки NALM-6, Raji или Jeko-1, и содержали 4 или 7 суток, соответственно, чтобы обеспечить приживление опухолей. На сутки 4 или 7, экспрессирующие CD19-TAC Т-клетки вводили в форме внутривенной инъекции в хвостовую вену. Опухолевую нагрузку измеряли с еженедельными интервалами, и данные наносили на график как среднее излучение [ф/с/смЛ2/ср].Fig. 19D-19G illustrate the design and outcome of an in vivo study evaluating the efficacy of CD19-TAC in mice transplanted with liquid NALM-6 (acute lymphoblastic leukemia), Raji (Burkitt's lymphoma), or Jeko-1 (mantle cell lymphoma) tumors. To initiate the development of NALM-6, Raji, and Jeko-1 tumors, mice were inoculated with NALM-6, Raji, or Jeko-1 cells and maintained for 4 or 7 days, respectively, to allow tumor engraftment. On days 4 or 7, CD19-TAC-expressing T cells were administered by intravenous injection into the tail vein. Tumor burden was measured at weekly intervals and data were plotted as mean irradiance [f/s/cm L 2/sr].

Фиг. 19E-19G иллюстрирует, что модифицированные посредством CD19-TAC Т-клетки являются эффективными для индукции регрессии опухоли и длительного контроля опухоли для жидких опухолей NALM-6 (острый лимфобластный лейкоз), Raji (лимфома Беркитта) или Jeko-1 (лимфома из клеток мантийной зоны).Fig. 19E-19G illustrate that CD19-TAC-modified T cells are effective in inducing tumor regression and long-term tumor control for NALM-6 (acute lymphoblastic leukemia), Raji (Burkitt's lymphoma), or Jeko-1 (mantle cell lymphoma) liquid tumors. zones).

Результаты для моделей опухолей NAML-6, Raji или Jeko-1 на фиг. 19A-19G позволяют предполагать, что CD19-TAC является эффективным во множестве моделей положительных по CD19 опухолей.Results for NAML-6, Raji, or Jeko-1 tumor models in FIG. 19A-19G suggest that CD19-TAC is effective in a variety of CD19-positive tumor models.

Пример 8. Персистенция экспрессирующих CD19-TAC Т-клеток и длительный иммунитет против опухоли.Example 8: Persistence of CD19-TAC-expressing T cells and long-term immunity against tumor.

Фиг. 20А, 20В иллюстрируют персистенцию иммунитета против опухоли и устойчивость к повторному заражению у мышей, которым вводили экспрессирующие CD19-TAC Т-клетки. Мышей, несущих развившиеся опухоли NALM-6, подвергали лечению с использованием экспрессирующих CD19-TAC Тклеток.Fig. 20A, 20B illustrate the persistence of tumor immunity and resistance to re-challenge in mice treated with CD19-TAC expressing T cells. Mice bearing established NALM-6 tumors were treated with CD19-TAC-expressing T cells.

Фиг. 20А иллюстрирует разработку эксперимента для определения персистенции CD19-TAC у мышей. Мышей, которым сначала инокулировали клетки NALM-6, за чем следовал период приживления 4 суток, подвергали лечению с использованием CD19-TAC. Для всех мышей показана регрессия опухоли и полный контроль опухоли. Через 56 суток после начального лечения, мышей повторно заражали жидкими опухолями либо NALM-6 (положительной по CD19), либо KMS11 (отрицательной по CD 19). Во всех случаях, наивных мышей подвергали совместной инъекции клеток опухолей и использовали в качестве отрицательного контроля. Опухолевую нагрузку отслеживали посредством сигнал люминесценции.Fig. 20A illustrates the design of an experiment to determine the persistence of CD19-TAC in mice. Mice that were first inoculated with NALM-6 cells, followed by an engraftment period of 4 days, were treated with CD19-TAC. All mice showed tumor regression and complete tumor control. Fifty-six days after initial treatment, mice were reinfected with liquid tumors of either NALM-6 (CD19 positive) or KMS11 (CD 19 negative). In all cases, naïve mice were co-injected with tumor cells and used as negative controls. Tumor load was monitored via luminescence signal.

Фиг. 20В. Мышей, несущих развившиеся опухоли NALM-6, подвергали лечению с использованием экспрессирующих CD19-TAC Т-клеток, введенных в форме дробной дозы, всего 4x106 модифицированных клеток. В качестве контроля, использовали группу животных без лечения. После ACT, у подвергнутых лечению мышей проявлялись длительные противоопухолевые ответы. В отличие от этого, для контрольных мышей показано экспоненциальное увеличение масс опухолей и достижение связанной с опухолевой нагрузкой конечной точки. На сутки 56 после ACT, мышей повторно заражали либо клетками опухоли NALM-6 (положительными по CD19), либо клетками опухоли KMS11 (отрицательными по CD19). Подвергнутые лечению с использованием CD19-TAC мыши оставались защищенными от клеток опухоли NALM-6 (положительных по CD19), но не от клеток опухоли KMS11 (отрицательных по CD19) й.Fig. 20V. Mice bearing established NALM-6 tumors were treated with CD19-TAC-expressing T cells administered in a fractional dose, totaling 4x106 modified cells. A group of animals without treatment was used as a control. Following ACT, treated mice exhibited durable antitumor responses. In contrast, control mice showed an exponential increase in tumor burden and reached the tumor burden-related endpoint. At day 56 post-ACT, mice were reinfected with either NALM-6 tumor cells (CD19 positive) or KMS11 tumor cells (CD19 negative). Mice treated with CD19-TAC remained protected from NALM-6 tumor cells (CD19 positive) but not from KMS11 tumor cells (CD19 negative).

Результаты экспериментов повторного заражения на фиг. 20А и 20В позволяют предполагать, что CD19-TAC, в некоторых случаях, подвергаются дифференцировке в долгоживущие клетки памяти, сохраняющие противоопухолевые свойства.The results of reinfection experiments in Fig. 20A and 20B suggest that CD19-TAC, in some cases, undergo differentiation into long-lived memory cells that retain antitumor properties.

Пример 9. Размножение in vivo и зависимость от дозы для экспрессирующих CD19-TAC Т-клеток.Example 9: In Vivo Expansion and Dose Response for CD19-TAC Expressing T Cells.

Фиг. 21 и 22 иллюстрируют зависимость от дозы, режим дозирования (дробный или однократный) и размножение экспрессирующих CD19-TAC Т-клеток в модели злокачественной опухоли NALM-6. Фиг. 21А иллюстрирует дизайн эксперимента. Мышам вводили либо однократную дозу экспрессирующих CD19-TAC Т-клеток на сутки четыре после инокуляции опухоли, либо дробную дозу, доставляемую с интервалом в семь суток. Тестировали множество доз экспрессирующих CD19-TAC Т-клеток: 0,5x106, 1x106 и 4x106 клеток. Фиг. 21В в контрольных группах мышей вводили 4x106 нетрансдуцированных клеток или среды для замораживания (контрольный носитель).Fig. 21 and 22 illustrate the dose response, dosing regimen (fractional or single dose) and expansion of CD19-TAC expressing T cells in the NALM-6 cancer model. Fig. 21A illustrates the experimental design. Mice were given either a single dose of CD19-TAC-expressing T cells on day four after tumor inoculation, or split doses delivered seven days apart. Multiple doses of CD19-TAC expressing T cells were tested: 0.5x106, 1x106, and 4x106 cells. Fig. 21B control groups of mice were injected with 4x106 untransduced cells or freezing medium (vehicle control).

Фиг. 21В иллюстрируют выживаемость мышей после инъекции NALM-6 и инъекции CD19-TAC. Зависимую от дозы стимуляцию выживаемости наблюдали в группах как однократной дозы, так и дробной дозы, где введение наивысшей однократной дозы ограничивало рост опухоли и стимулировало выживаемость мышей.Fig. 21B illustrates the survival of mice after NALM-6 injection and CD19-TAC injection. Dose-dependent stimulation of survival was observed in both single-dose and split-dose groups, where administration of the highest single dose limited tumor growth and promoted survival of mice.

Фиг 22А иллюстрирует способ отбора, использованный для оценки пролиферации Т-клеток. Клетки сначала отбирали на основании прямого и бокового рассеяния для отбора популяции лимфоцитов. Синглеты клеток идентифицировали посредством области прямого рассеяния, превышающей отбор по высоте. Живые клетки идентифицировали посредством отбора в ближнем ИК. Клетки человека идентифицировали посредством отбора по hCD45. Из полученной подгруппы клеток далее отделяли положительныеFIG. 22A illustrates the selection method used to assess T cell proliferation. Cells were first selected based on forward and side scatter to select the lymphocyte population. Cell singlets were identified by a forward scatter region above height selection. Live cells were identified through NIR selection. Human cells were identified by selection for hCD45. Positive cells were then separated from the resulting subgroup of cells.

- 44 045368 по CD3 клетки. Затем эти клетки отбирали посредством CD4/CD8 и белка L. Способ окрашивания также включал идентификацию мышиных клеток крови по muCD45_l. CD19 включали для окрашивания клеток- 44 045368 for CD3 cells. These cells were then selected by CD4/CD8 and protein L. The staining method also included identification of murine blood cells by muCD45_l. CD19 was included for cell staining

NALM-6.NALM-6.

Фиг. 22В - размножение Т-клеток мышей после дробной дозы адаптивного переноса Т-клеток (ACT). После ACT, образцы крови отбирали регулярно и анализировали посредством проточной цитометрии. Значения нормализовали по количеству тотальных Т-клеток, присутствующих в крови после АСТ1. Значения также нормализовали по общему количеству CD45.1+ (мышиных) клеток для учета различий в отборах крови. Для Т-клеток у мышей, подвергнутых лечению с использованием модифицированных посредством CD19-TAC клеток, показано размножение у мышей-реципиентов в пределах приблизительно 1-2 недель после первой ACT (фиг. 22В). Нетрансдуцированные клетки не размножались (фиг. 22В).Fig. 22B - expansion of mouse T cells after fractional dose adaptive T cell transfer (ACT). After ACT, blood samples were collected regularly and analyzed by flow cytometry. Values were normalized to the number of total T cells present in the blood after ACT1. Values were also normalized to total CD45.1+ (mouse) cells to account for differences in blood sampling. T cells in mice treated with CD19-TAC-modified cells showed expansion in recipient mice within approximately 1-2 weeks after the first ACT (FIG. 22B). Non-transduced cells did not proliferate (Fig. 22B).

Результаты для различных доз, режимов дозирования (фиг. 21В) и количеств Т-клеток (фиг. 22В) позволяют предполагать, что эффективность CD19-TAC является зависимой от дозы, что модифицированные Т-клетки размножаются in vivo, и что это размножение является специфическим для модифицированных посредством CD19-TAC клеток у животных, несущих положительные по CD19 опухоли.Results for various doses, dosing regimens (Fig. 21B) and numbers of T cells (Fig. 22B) suggest that the effectiveness of CD19-TAC is dose dependent, that the modified T cells expand in vivo, and that this expansion is specific for CD19-TAC-modified cells in animals bearing CD19-positive tumors.

Пример 10. Эффективность in vivo, длительная эффективность и безопасность лечения посредством CD19-TACExample 10 In Vivo Efficacy, Long-Term Efficacy and Safety of CD19-TAC Treatment

На фиг. 23-25 показана длительная безопасность и эффективность (фиг. 23) и отсутствие какойлибо острой ассоциированной с лечением токсичности (фиг. 24, 25).In fig. 23-25 show long-term safety and efficacy (Fig. 23) and the absence of any acute treatment-associated toxicity (Figs. 24, 25).

Фиг. 23А иллюстрирует дизайн эксперимента. Мышам инъецировали 0,5x106 модифицированных с использованием усиленной люциферазы клеток NALM-6, которым позволяли приживаться в течение 4 суток. Затем мышей подвергали лечению с использованием двух уровней дозирования (4 и 12x106 модифицированных клеток) модифицированных посредством CD19-TAC Т-клеток, при введении в однократной дозе. Рост опухоли затем отслеживали посредством регулярных измерений люминесценции. Состояние здоровья мышей регулярно оценивали посредством проверки поведения мышей и физических характеристик (ухода за шерстью, подвижности, целостности меха)Fig. 23A illustrates the experimental design. Mice were injected with 0.5x106 enhanced-luciferase modified NALM-6 cells and allowed to engraft for 4 days. Mice were then treated with two dosage levels (4 and 12x106 modified cells) of CD19-TAC-modified T cells, administered as a single dose. Tumor growth was then monitored through regular luminescence measurements. The health of the mice was regularly assessed by checking the mice's behavior and physical characteristics (grooming, mobility, fur integrity)

Фиг. 23В иллюстрирует опухолевую нагрузку по люминесценции после лечения только носителем (средами для замораживания), немодифицированными контрольными клетками (дозой тотальных Тклеток, равной дозе тотальных Т-клеток из группы лечения наивысшей дозой модифицированных клеток) и либо 4, либо 12x106 модифицированных посредством сконструированного CD19-TAC Т-клеток. Для обоих видов контроля показано быстрое разрастание опухоли и отсутствие противоопухолевой эффективности. Контрольная доза приводит к задержке разрастания опухоли, по сравнению только с носителем, предположительно, из-за конкуренции между высокой дозой Т-клеток и клетками опухолей за ниши для приживления. Для модифицированных Т-клеток показана регрессия опухоли, во всех случаях. Для групп лечения высокой дозой показан полный контроль опухоли, во всех случаях. Для группы лечения 4x106 показаны 3 мыши с полным контролем, одна с задержкой разрастания опухоли и одна с контролируемой, но высокой опухолевой нагрузкой.Fig. 23B illustrates tumor luminescence load after treatment with vehicle alone (freezing media), unmodified control cells (a dose of total T cells equal to the dose of total T cells from the highest dose of modified cell treatment group), and either 4 or 12x106 modified with engineered CD19-TAC T cells. Both types of control showed rapid tumor growth and lack of antitumor efficacy. The challenge dose results in a delay in tumor expansion compared with vehicle alone, presumably due to competition between the high dose of T cells and tumor cells for engraftment niches. Tumor regression was shown for modified T cells in all cases. For the high dose treatment groups, complete tumor control was indicated in all cases. The 4x106 treatment group shows 3 mice with complete control, one with delayed tumor growth, and one with a controlled but high tumor burden.

Фиг. 23С иллюстрирует общую выживаемость для различных групп лечения. В обеих контрольных группах мышей, с носителем и без модификации, все мыши погибли из-за опухоли в пределах 23-35 суток, соответственно. В случае лечения высокой дозой CD19-TAC, у всех мышей развились симптомы GvHD, и они погибли от GvHD в пределах 61 суток. GvHD представляет собой последствие собственно модели на мышах, а не лечения с использованием модифицированных Т-клеток. Для мышей с низкой дозой показана выживаемость 3 мышей до окончания исследования на 90 сутки, одна мышь погибла изза высокой опухолевой нагрузки, одна мышь погибла из-за GvHD.Fig. 23C illustrates overall survival for various treatment groups. In both control groups of mice, with vehicle and without modification, all mice died due to tumor within 23-35 days, respectively. When treated with a high dose of CD19-TAC, all mice developed symptoms of GvHD and died of GvHD within 61 days. GvHD is a consequence of the mouse model itself and not of treatment using engineered T cells. For mice with a low dose, 3 mice survived until the end of the study on day 90, one mouse died due to a high tumor load, one mouse died due to GvHD.

Фиг. 24 и 25 иллюстрируют параметры клинической химии и уровни цитокинов для мышей, подвергнутых лечению контрольным носителем, не модифицированными клетками и CD19-TAC (4 и 12x106 эффективных модифицированных посредством CD19-TAC клеток). Мышей отслеживали в течение 33 суток с использованием образцов крови, отобранных через 5, 12 и 33 суток после ACT. Только мыши, подвергнутые лечению CD19-TAC, выживали в течение 33 суток. Мыши с контрольным носителем погибали от опухолевой нагрузки до того, как можно было отобрать 3-й образец, мышей с немодифицированными клетками умерщвляли рано на сутки 26, непосредственно перед тем, как мыши достигали связанной с опухолевой нагрузкой конечной точки. Все образцы крови анализировали по нескольким параметрам клинической химии и уровням цитокинов.Fig. 24 and 25 illustrate clinical chemistry parameters and cytokine levels for mice treated with vehicle control, unmodified cells, and CD19-TAC (4 and 12x106 effective CD19-TAC-modified cells). Mice were monitored for 33 days using blood samples collected 5, 12, and 33 days after ACT. Only mice treated with CD19-TAC survived for 33 days. While vehicle control mice succumbed to tumor load before the 3rd sample could be collected, unmodified mice were sacrificed early on day 26, just before the mice reached the tumor load-related endpoint. All blood samples were analyzed for several clinical chemistry parameters and cytokine levels.

Фиг. 24 иллюстрирует, что на сутки 5 и 12, для мышей, подвергнутых лечению CD19-TAC, не показано параметра, который является значимо более высоким, по сравнению с контрольными группами. На сутки 33, для всех подвергнутых лечению мышей показаны параметры клинической химии, сравнимые с ранними временными точками лечения, за исключением аланинаминотрансферазы (ALT) и аспартатаминотрансферазы (AST), где некоторые мыши испытывали высокие уровни, подобно мышам, подвергнутым лечению с использованием немодифицированными клеток, с образами, отобранными на сутки 26.Fig. 24 illustrates that on days 5 and 12, mice treated with CD19-TAC did not show a parameter that was significantly higher compared to the control groups. At day 33, all treated mice showed clinical chemistry parameters comparable to early treatment time points, with the exception of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST), where some mice experienced high levels similar to mice treated with unmodified cells. with images selected on day 26.

Фиг. 25 иллюстрирует ответ цитокинов на сутки 5, 12 и 33. На сутки 5 после ACT, для CD19-TAC, но не для контрольных мышей, показано увеличение уровней всех тестированных цитокинов. Увеличе- 45 045368 ние уровня цитокинов согласуется с воспалительным ответом модифицированных посредством CD19TAC Т-клеток, узнающих и вступающих в реакцию с положительными по антигену клетками опухоли NALM-6. После их первоначальной реакции на сутки 12, уровни цитокинов падают, что коррелирует с индуцированной к этому времени регрессией опухоли и, как правило, низкой опухолевой нагрузкой. На сутки 12 уровни цитокинов для лечения CD19-TAC являются либо сходными, либо более низкими, чем для немодифицированных Т-клеток, за исключением IL10. На более поздней стадии, для всех мышей, подвергнутых лечению с использованием нетрансдуцированных или модифицированных посредством CD19-TAC Т-клеток, показано увеличение уровня цитокинов, предположительно, ассоциированное с началом GvHD. См. также фиг. 29, которая иллюстрирует ответ цитокинов на сутки 5, 12, 26 и 33.Fig. 25 illustrates the cytokine response at days 5, 12, and 33. At day 5 post-ACT, CD19-TAC, but not control mice, showed increased levels of all cytokines tested. The increase in cytokine levels is consistent with the inflammatory response of CD19TAC-modified T cells recognizing and reacting with antigen-positive NALM-6 tumor cells. After their initial response on day 12, cytokine levels fall, which correlates with tumor regression induced by this time and a generally low tumor burden. At day 12, cytokine levels for CD19-TAC treatment are either similar or lower than for unmodified T cells, with the exception of IL10. At a later stage, all mice treated with non-transduced or modified CD19-TAC T cells showed an increase in cytokine levels, presumably associated with the onset of GvHD. See also FIG. 29, which illustrates the cytokine response on days 5, 12, 26 and 33.

Результаты длительного отслеживания мышей, подвергнутых лечению с использованием CD19TAC, и их профилей клинической химии, показывают, что модифицированные Т-клетки являются безопасными и для них не показано никаких показателей токсичности, вызванной специфически модификацией CD19-TAC. Результаты исследования цитокинов показывают ранний воспалительный ответ, ассоциированный с противоопухолевой эффективностью, за которым следует падение уровней всех цитокинов, что позволяет предполагать контролируемый воспалительный ответ.Long-term tracking of CD19TAC-treated mice and their clinical chemistry profiles indicate that the modified T cells are safe and show no evidence of toxicity caused specifically by the CD19-TAC modification. Cytokine results show an early inflammatory response associated with antitumor efficacy, followed by a fall in all cytokine levels, suggesting a controlled inflammatory response.

Пример 11. Эффективность in vivo нескольких вариантов ВСМА-три-ТАС.Example 11: In vivo efficacy of several BCMA-tri-TAC variants.

Фиг. 26 иллюстрирует исследование эффективности in vivo различных конструкций ВСМА-триТАС. Фиг. 26А иллюстрирует общий дизайн эксперимента. 1 миллиону модифицированных посредством люциферазы клеток опухолей KMS11 (положительных по ВСМА) позволяли приживаться в течение 12 суток. Затем мышей подвергали лечению с использованием однократной эффективной дозы 4 миллиона конструкций для ВСМА и контроля (фиг. 26В). Опухолевую нагрузку регулярно оценивали посредством измерений люминесценции. Всех мышей, для которых показана регрессия опухоли и контроль опухоли, затем повторно заражали на сутки 25 после ACT с использованием 1 миллиона клеток KMS11.Fig. 26 illustrates an in vivo efficacy study of various BCMA-triTAC constructs. Fig. 26A illustrates the general experimental design. 1 million luciferase-modified KMS11 tumor cells (BCMA positive) were allowed to engraft for 12 days. Mice were then treated with a single effective dose of 4 million BCMA and control constructs (Figure 26B). Tumor burden was assessed regularly through luminescence measurements. All mice showing tumor regression and tumor control were then reinfected on day 25 post-ACT with 1 million KMS11 cells.

Фиг. 26С. После ACT, для контрольных мышей показано быстрое разрастание клеток опухолей, достигающее ассоциированной с опухолью конечной точки в пределах 19-25 суток. В отличие от этого, для всех мышей, подвергнутых лечению с использованием ВСМА-ТАС, показана начальная регрессия опухоли. Контроль опухоли менялся среди конструкций, где для G4S (SEQ ID NO: 73) 3625VH-VL показан самый низкий уровень начального контроля опухоли, и для 3625 VL-VH с короткой спиралью показан самый высокий уровень начального контроля опухоли. После повторного заражения, большинство из всех конструкций, сохраняющих контроль опухоли до суток 25, оставались защитными после повторного заражения.Fig. 26C. After ACT, control mice showed rapid proliferation of tumor cells, reaching the tumor-associated end point within 19-25 days. In contrast, all mice treated with BCMA-TAC showed initial tumor regression. Tumor control varied among the designs, with G4S (SEQ ID NO: 73) 3625VH-VL showing the lowest level of initial tumor control and 3625 VL-VH short coil showing the highest level of initial tumor control. After reinfection, the majority of all constructs that maintained tumor control up to day 25 remained protective after reinfection.

Результаты этого исследования in vivo показывают, что множество конструкций ВСМА-три-ТАС являются эффективными для контроля жидких опухолей KMS11 (положительных по ВСМА). Но при этом, конкретные предпочтительные конфигурации обеспечивают превосходящую эффективность. Как правило, спиральная область соединителя обеспечивает относительное преимущество, по сравнению с гибким линкером внутри той же самой конфигурации scFv.The results of this in vivo study indicate that multiple BCMA-tri-TAC constructs are effective for the control of KMS11 liquid tumors (BCMA-positive). However, specific preferred configurations provide superior performance. Typically, the helical region of the connector provides a relative advantage over a flexible linker within the same scFv configuration.

Пример 12. TAC-Her2 in vivo.Example 12 TAC-Her2 in vivo.

Мышам инокулируют в задний пах солидные опухоли OVCAR3. Опухолям позволяют развиться и расти до размера 100 мм3. Затем мышей подвергают лечению с использованием инъекции в хвостовую вену модифицированных посредством ТАС-Her2 Т-клеток. Объем опухоли измеряют регулярно.Mice are inoculated into the hindgroin with OVCAR3 solid tumors. Tumors are allowed to develop and grow to a size of 100 mm 3 . The mice are then treated using tail vein injection of TAC-Her2 modified T cells. The tumor volume is measured regularly.

Пример 13. Клинические исследования.Example 13: Clinical studies.

Проводили клиническое исследование, в котором субъектов в возрасте по меньшей мере 18 лет с положительной по CD19 диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомой, для которых были неудачными по меньшей мере две предшествующих линии терапии, включая ASCT, или которые являются неподходящими для ASCT, подвергали лечению с использованием экспрессирующих CD19-TAC Тклеток. Исследование представляет собой открытое двухстадийное исследование фазы 1/2, с одной группой, характеризующееся стадией повышения дозы для определения максимально переносимой дозы (MTD) или рекомендованной дозы для фазы II (RPh2D), с последующей расширением когорты для выбранной дозы.A clinical trial was conducted in which subjects at least 18 years of age with CD19-positive diffuse large B-cell lymphoma who had failed at least two prior lines of therapy, including ASCT, or who were ineligible for ASCT, were treated with using CD19-TAC expressing T cells. The study is an open-label, two-stage, single-arm, phase 1/2 study characterized by a dose escalation phase to determine the maximum tolerated dose (MTD) or recommended phase II dose (RPh2D), followed by cohort expansion at the selected dose.

После регистрации, субъектов подвергают лейкаферезу для получения Т-клеток для получения экспрессирующих CD19-TAC Т-клеток. После успешного получения, субъектов переводят в фазу лечения. Эта фаза включает противолимфоцитарную химиотерапию флударабином и циклофосфамидом, с последующим внутривенным (IV) введением экспрессирующих CD19-TAC Т-клеток. После лечения экспрессирующими CD19-TAC Т-клетками, субъектов переводят в отслеживание после лечения и отслеживают по безопасности, статусу заболевания и выживаемости в течение 2 лет после их последней дозы экспрессирующих CD19-TAC Т-клеток. После завершения исследования, субъектов отслеживают по выживаемости, длительной токсичности и безопасности вирусного вектора по отдельному протоколу длительного отслеживания в течение вплоть до 15 лет после последней дозы экспрессирующих CD19-TAC Тклеток.After enrollment, subjects undergo T cell leukapheresis to obtain CD19-TAC expressing T cells. After successful acquisition, subjects are transferred to the treatment phase. This phase includes antilymphocyte chemotherapy with fludarabine and cyclophosphamide, followed by intravenous (IV) administration of CD19-TAC-expressing T cells. Following treatment with CD19-TAC-expressing T cells, subjects are transferred to post-treatment follow-up and monitored for safety, disease status, and survival for 2 years after their last dose of CD19-TAC expressing T cells. After completion of the study, subjects are monitored for survival, long-term toxicity, and viral vector safety using a separate long-term tracking protocol for up to 15 years after the last dose of CD19-TAC-expressing T cells.

Во всех группах, безопасность оценивают на протяжения исследования. Размножение Т-клеток оценивают от времени первой дозы экспрессирующих CD19-TAC Т-клеток до тех пор, пока клетки не перестанут дальше поддаваться детекции. Радиографическую оценку заболевания проводят посредствомIn all groups, safety was assessed throughout the study. T cell expansion is assessed from the time of the first dose of CD19-TAC expressing T cells until the cells are no longer detectable. Radiographic assessment of the disease is carried out using

- 46 045368 сканирований позитронной эмиссионной томографии (PET) и/или компьютерной томографии (СТ) до лечения и приблизительно через 3, 6, 9, 12, 18 и 24 месяцев после последней дозы экспрессирующих- 46,045,368 positron emission tomography (PET) and/or computed tomography (CT) scans before treatment and approximately 3, 6, 9, 12, 18 and 24 months after the last dose of expressing

CD19-TAC Т-клеток, или до прогрессирования заболевания, или до лечения с использованием дополнительной противораковой терапии.CD19-TAC T cells, either before disease progression or before treatment with additional anticancer therapy.

Пример 14. Изготовление фармацевтических продуктов из экспрессирующих CD19-TAC Т-клеток.Example 14: Production of Pharmaceutical Products from CD19-TAC Expressing T Cells.

Способ изготовления фармацевтических продуктов из экспрессирующих CD19-TAC Т-клеток включает отбор CD4/CD8 Т-клеток из продукта лейкафереза, активацию положительных по CD4/CD8 клеток, трансдукцию клеток лентивирусным вектором, содержащим конструкцию CD19-TAC (как описано в примере 5), размножение трансдуцированных клеток до уровня, адекватного для предполагаемого расписания дозирования, и сбор и криоконсервацию конечного продукта.A method for manufacturing pharmaceutical products from CD19-TAC expressing T cells includes selecting CD4/CD8 T cells from the leukapheresis product, activating CD4/CD8 positive cells, transducing cells with a lentiviral vector containing the CD19-TAC construct (as described in example 5), expansion of the transduced cells to a level adequate for the intended dosing schedule, and collection and cryopreservation of the final product.

Материал после лейкафереза от пациента с ассоциированным с ним уникальным идентификатором субъекта (UPN) получают в производственном участке и присваивают уникальный номер образца (ISN). Отобранные CD4/CD8 клетки криоконсервируют до начала стадий способа культивирования.Leukapheresis material from a patient with an associated unique subject identifier (UPN) is obtained in the production area and assigned a unique sample number (ISN). The selected CD4/CD8 cells are cryopreserved prior to the start of the culture steps.

Криоконсервированные положительно отобранные по CD4/CD8 Т-клетки размораживают при 37°С, ресуспендируют в подходящей среде и рассевают в культуральные пакеты с активирующими реагентами, культуры инкубируют в течение ночи при 37°С/5% СО2.Cryopreserved CD4/CD8 positive-selected T cells are thawed at 37°C, resuspended in a suitable medium and plated in culture bags with activating reagents, and the cultures are incubated overnight at 37°C/5% CO 2 .

Клетки трансдуцируют с использованием лентивирусного вектора CD19-TAC с подходящей множественностью инфекции (MOI) и инкубируют в течение ночи при 37°С/5% СО2. В последующие несколько суток, культуру дополняют полной средой для поддержания желательной концентрации клеток и в конечном счете пулируют в пакеты для переноса, осаждают, ресуспендируют и рассевают в большие культуральные пакеты при целевой плотности клеток.Cells are transduced using the CD19-TAC lentiviral vector at the appropriate multiplicity of infection (MOI) and incubated overnight at 37°C/5% CO 2 . Over the next few days, the culture is supplemented with complete medium to maintain the desired cell concentration and is ultimately pooled into transfer bags, pelleted, resuspended, and seeded into larger culture bags at the target cell density.

Для состава фармацевтического продукта, собранную суспензию клеток ресуспендируют в наполнителе и криоконсервируют с использованием замораживателя с контролируемой скоростью, затем переносят в хранилище с LN2.For pharmaceutical product formulation, the collected cell suspension is resuspended in vehicle and cryopreserved using a controlled rate freezer, then transferred to LN2 storage.

Продукт транспортируют до клинического центра в замороженном состоянии, размораживают на месте лечения пациента и вводят внутривенно.The product is transported to the clinical center in a frozen state, thawed at the patient's site of treatment and administered intravenously.

Перед клиническими исследованиями, проводят мероприятия по технологической подготовке производства, включая все тестирования в ходе технологического процесса и при выпуске продукции, с использованием материала после лейкафереза от здорового донора. В дополнение к тестированию в ходе технологического процесса и при выпуске продукции, исследования, поддерживающие отчеты регулирующим органам, проводят для конечного фармацевтического продукта из этих мероприятий по технологической подготовке. Эти исследования включают стабильность после размораживания, инициацию длительной стабильности, тестирование на остаточное содержание, чтобы убедиться в клиренсе стимулирующих рост цитокинов, и раннюю оценку потенциальной функциональности/показывающие активность анализы.Before clinical trials, measures are taken for technological preparation of production, including all testing during the technological process and during product release, using material after leukapheresis from a healthy donor. In addition to in-process and product release testing, studies supporting regulatory reporting are conducted on the final pharmaceutical product from these process preparation activities. These studies include post-thaw stability, initiation of long-term stability, residue testing to ensure clearance of growth-promoting cytokines, and early assessment of potential functionality/activity assays.

Пример 15. Доклиническая разработка терапии специфическим для ВСМА связывающим Т-клетку с антигеном агентом (ТАС) для лечения положительных по ВСМА злокачественных новообразований.Example 15: Preclinical development of BCMA-specific T-cell antigen binding agent (TAB) therapy for the treatment of BCMA-positive malignancies.

Фиг. 27 иллюстрирует, что ТАС осуществляют пролиферацию, когда сталкиваются с антигеном на клетках, но не когда антиген представлен на искусственных бусинах; но CAR осуществляют пролиферацию, независимо от того, представлены ли антигены на бусинах или клетках.Fig. 27 illustrates that TACs proliferate when they encounter antigen on cells, but not when antigen is presented on artificial beads; but CARs proliferate whether antigens are presented on beads or cells.

Фиг. 28А, 28В иллюстрируют, что модифицированные посредством ТАС Т-клетки размножаются in vivo и обеспечивают длительную защиту, показывая персистенцию клеток в модели миеломы. Фиг. 28А, 28В иллюстрируют, что ВСМА-ТАС-Т-клетки приводят к отторжению опухоли множественной миеломы в модели ксенотрансплантата KMS-11, сконструированной с использованием NanoLuc (KMS 11NanoLuc) (ВСМАпол). После приживления опухоли, мышей подвергали лечению с использованием ВСМА-ТАС-Т-клеток (несущих люциферазу светляка). ТАС-Т-клетки значительно размножались после введения. Это коррелирует с регрессией опухоли. Подвергнутые лечению мыши являлись устойчивыми к повторному заражению опухолью, что указывает на длительную персистенцию ТАС-Т-клеток.Fig. 28A, 28B illustrate that TAC-modified T cells expand in vivo and provide long-lasting protection, demonstrating cell persistence in a myeloma model. Fig. 28A, 28B illustrate that BCMA-TAC T cells lead to multiple myeloma tumor rejection in the KMS-11 xenograft model constructed using NanoLuc (KMS 11NanoLuc) (BCMA floor ). After tumor engraftment, mice were treated with BCMA-TAC T cells (carrying firefly luciferase). TAC T cells expanded significantly after administration. This correlates with tumor regression. Treated mice were resistant to tumor re-infection, indicating long-term persistence of TAC T cells.

Эти данные иллюстрируют, что ТАС-Т-клетки разрушают клетки опухолей, вероятно, посредством механизма, имитирующего природный процесс активации Т-клетки. Технология ТАС иллюстрирует 1) сильную эффективность в жидкости, 2) пролиферацию in vivo, 3) персистенцию Т-клеток, защищающих мышей от повторного заражения, и 4) размножение клеток после введения Т-клеток.These data illustrate that TAC T cells destroy tumor cells, likely through a mechanism that mimics the natural process of T cell activation. TAC technology illustrates 1) strong efficacy in liquid, 2) in vivo proliferation, 3) persistence of T cells protecting mice from reinfection, and 4) cell expansion following T cell administration.

Пример 16. Активность in vivo и in vitro hu- или muIgK-HER2-TAC с промотором MSCV или EF1a.Example 16: In vivo and in vitro activity of hu- or muIgK-HER2-TAC with MSCV or EF1a promoter.

CD4 и CD8 Т-клетки были модифицированы с использованием множества экспрессирующих ТАС вирусов. Одна группа клеток была модифицирована с использованием лентивируса, в котором использован промотор MSCV для экспрессии ТАС, специфического для HER-2, в котором использован сигнальный пептид мышиного IgG [muIgG-TAC (MSCV)]. Другая группа клеток была модифицирована с использованием лентивируса, в котором использован промотор MSCV для экспрессии ТАС, специфического для HER-2, в котором использован сигнальный пептид человеческого IgG [huIgG-TAC (MSCV)]. Третья группа клеток была модифицирована с использованием лентивируса, в котором использован промотор EF1a для экспрессии ТАС, специфического для HER-2, в котором использован сигнальный пептидCD4 and CD8 T cells have been modified using multiple TAC-expressing viruses. One group of cells was modified with a lentivirus that uses the MSCV promoter to express a HER-2-specific TAC that uses the mouse IgG signal peptide [muIgG-TAC (MSCV)]. Another group of cells was modified with a lentivirus that uses the MSCV promoter to express a HER-2-specific TAC that uses the human IgG signal peptide [huIgG-TAC (MSCV)]. The third group of cells was modified using a lentivirus that uses the EF1a promoter to express a HER-2-specific TAC that uses a signal peptide

--

Claims (25)

мышиного IgG [muIgG-TAC (EF1a)]. В качестве отрицательного контроля, использовали конструкциюmouse IgG [muIgG-TAC (EF1a)]. As a negative control, we used the construct ТАС, лишенную связывающего HER2 домена (Δ связывающий домен ТАС). Затем модифицированные клетки характеризовали in vitro по измененной поверхностной экспрессии и специфической активности, и in vivo по активности в модели положительной по HER2 солидной опухоли OVCAR3.TAC lacking the HER2 binding domain (Δ TAC binding domain). The modified cells were then characterized in vitro for altered surface expression and specific activity, and in vivo for activity in the HER2-positive solid tumor model OVCAR3. Фиг. 30 иллюстрирует поверхностную экспрессию на Т-клетке рецепторов HER2-TAC с лидером из человеческого или мышиного IgG, под контролем промотора MCSV или EF1a. Поверхностная экспрессия является ключевым требованием для биологической активности, и это иллюстрирует, что на экспрессию рецепторов HER2-TAC не влияет вид - источник сигнального пептида IgG.Fig. 30 illustrates the surface expression on a T cell of HER2-TAC receptors with a human or murine IgG leader, under the control of the MCSV or EF1a promoter. Surface expression is a key requirement for biological activity, and this illustrates that expression of HER2-TAC receptors is not affected by the source species of the IgG signal peptide. На фиг. 31 показано, что Т-клетки, модифицированные с использованием конструкций HER2-TAC с лидером либо из человеческого, либо из мышиного IgG, под контролем промотора MCSV или EF1a, индуцируют продукцию цитокинов, при совместном культивировании с положительными по HER2 клетками-мишенями (OVCAR3), но не с отрицательными по HER2 клетками (LOX IMVI). Это показывает, что модифицированные с использованием рецептора HER2-TAC Т-клетки являются способными к специфическому привлечению экспрессирующих HER2 клеток-мишеней, но не являются реакционноспособными против отрицательных по антигену клеток.In fig. 31 shows that T cells modified using HER2-TAC constructs with either human or murine IgG leader under the control of the MCSV or EF1a promoter induce cytokine production when co-cultured with HER2-positive target cells (OVCAR3) , but not with HER2-negative cells (LOX IMVI). This shows that HER2-TAC receptor-modified T cells are capable of specifically recruiting HER2-expressing target cells but are not reactive against antigen-negative cells. На фиг. 32 показана эффективность in vivo конструкций HER2-TAC с лидером из человеческого или мышиного IgG, под контролем промотора MCSV или EF1a. После введения дробной дозы модифицированных Т-клеток, для модифицированных с использованием HER2-TAC клеток показано значительное влияние на рост опухоли, включая регрессию опухоли, по сравнению с отрицательным контролем Δ связывающий домен ТАС. Этот эксперимент in vivo показывает, что для всех модифицированных с использованием HER2-TAC клеток показана значительная активность против солидной опухоли в модели in vivo.In fig. 32 shows the in vivo efficacy of HER2-TAC constructs with a human or murine IgG leader under the control of the MCSV or EF1a promoter. After administration of a fractional dose of engineered T cells, HER2-TAC-engineered cells showed significant effects on tumor growth, including tumor regression, compared with the negative control Δ TAC binding domain. This in vivo experiment shows that all HER2-TAC-modified cells showed significant activity against solid tumors in an in vivo model. В то время как предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения показаны и описаны в настоящем описании, специалисту в данной области очевидно, что такие варианты осуществления представлены только в качестве примера. Многочисленные варианты, изменения и замены в настоящее время очевидны специалисту в данной области без отклонения от изобретения. Следует понимать, что различные альтернативы вариантам осуществления изобретения, описанным в настоящем описании, можно использовать в практическом осуществлении изобретения. Подразумевают, что следующие ниже пункты формулы изобретения определяют объем изобретения, и что способы и структуры в пределах объема этих пунктов формулы изобретения и их эквивалентов охвачены таким образом.While preferred embodiments of the present invention are shown and described herein, it will be apparent to one skilled in the art that such embodiments are presented by way of example only. Numerous variations, changes and substitutions will be apparent to one skilled in the art without departing from the invention. It should be understood that various alternatives to the embodiments described herein may be used in the practice of the invention. The following claims are intended to define the scope of the invention, and that methods and structures within the scope of these claims and their equivalents are so covered. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM 1. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая CD19 связывающий Т-клетку с антигеном агент (CD19-TAC), содержащая:1. Nucleic acid sequence encoding CD19 T-cell antigen binding agent (CD19-TAC), containing: (a) первый полинуклеотид, кодирующий лиганд, избирательно связывающий антиген CD19;(a) a first polynucleotide encoding a ligand that selectively binds CD19 antigen; (b) второй полинуклеотид, кодирующий лиганд UCHT1, связывающий CD3, где лиганд UCHT1 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 46, и имеет мутацию Y177T, как определено в SEQ ID NO: 46; и (c) третий полинуклеотид, кодирующий полипептид передающего сигналы домена TCR, содержащий цитозольный домен и трансмембранный домен;(b) a second polynucleotide encoding a CD3 binding UCHT1 ligand, wherein the UCHT1 ligand contains an amino acid sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 46, and has the Y177T mutation as defined in SEQ ID NO: 46; and (c) a third polynucleotide encoding a TCR signaling domain polypeptide comprising a cytosolic domain and a transmembrane domain; где компоненты, кодируемые (а), компоненты, кодируемые (b), и компоненты, кодируемые (с), слиты непосредственно друг с другом, или соединены посредством по меньшей мере одного линкера.wherein the components encoded by (a), the components encoded by (b), and the components encoded by (c) are fused directly to each other, or connected by at least one linker. 2. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.1, где лиганд, избирательно связывающий антиген CD19, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 36.2. The nucleic acid sequence of claim 1, wherein the ligand that selectively binds the CD19 antigen comprises an amino acid sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 36. 3. Последовательность нуклеиновой кислоты по любому из пп.1, 2, где цитозольный домен представляет собой цитозольный домен CD4, и трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен CD4.3. The nucleic acid sequence according to any one of claims 1, 2, wherein the cytosolic domain is a CD4 cytosolic domain, and the transmembrane domain is a CD4 transmembrane domain. 4. Последовательность нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-3, где третий полинуклеотид кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 18.4. The nucleic acid sequence according to any one of claims 1 to 3, wherein the third polynucleotide encodes a polypeptide containing an amino acid sequence having at least 80% sequence identity with SEQ ID NO: 18. 5. Последовательность нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-4, где последовательность нуклеиновой кислоты включает последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 63.5. The nucleic acid sequence according to any one of claims 1 to 4, wherein the nucleic acid sequence includes a nucleic acid sequence having at least 80% sequence identity with SEQ ID NO: 63. 6. Последовательность нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-5, где CD19-TAC содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 64.6. The nucleic acid sequence according to any one of claims 1 to 5, wherein CD19-TAC contains an amino acid sequence having at least 80% sequence identity with SEQ ID NO: 64. 7. Последовательность нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-6, не кодирующая костимулирующий домен.7. The nucleic acid sequence according to any one of claims 1 to 6, which does not encode a costimulatory domain. 8. Последовательность нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-7, не кодирующая активирующий домен.8. The nucleic acid sequence according to any one of claims 1 to 7, which does not encode an activating domain. - 48 045368- 48 045368 9. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая связывающий Т-клетку с антигеном агент (ТАС), содержащая:9. A nucleic acid sequence encoding a T cell antigen binding agent (TAC), containing: (а) первый полинуклеотид, кодирующий специфический для мишени лиганд, где специфический для мишени лиганд содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 52 или SEQ ID NO: 54;(a) a first polynucleotide encoding a target-specific ligand, wherein the target-specific ligand contains an amino acid sequence having at least 80% sequence identity with SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 52 or SEQ ID NO: 54; (b) второй полинуклеотид, кодирующий лиганд UCHT1, где лиганд UCHT1 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 46, и имеет мутацию Y177T, как определено в SEQ ID NO: 46; и (c) третий полинуклеотид, кодирующий полипептид передающего сигналы домена Т-клеточного рецептора; где последовательность нуклеиновой кислоты дополнительно содержит лидерную последовательность, и где компонент, кодируемый посредством (а), компонент, кодируемый посредством (b), и компонент, кодируемый посредством (с), слиты непосредственно друг с другом или соединены посредством по меньшей мере одного линкера.(b) a second polynucleotide encoding a UCHT1 ligand, wherein the UCHT1 ligand contains an amino acid sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 46, and has the Y177T mutation as defined in SEQ ID NO: 46; and (c) a third polynucleotide encoding a T cell receptor signaling domain polypeptide; wherein the nucleic acid sequence further comprises a leader sequence, and wherein the component encoded by (a), the component encoded by (b), and the component encoded by (c) are directly fused to each other or connected by at least one linker. 10. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.9, где последовательность нуклеиновой кислоты включает последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59 или SEQ ID NO: 61.10. The nucleic acid sequence of claim 9, wherein the nucleic acid sequence includes a nucleic acid sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59 or SEQ ID NO: 61. 11. Последовательность нуклеиновой кислоты по пп.9, 10, где ТАС содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60 или SEQ ID NO: 62.11. The nucleic acid sequence according to claims 9, 10, where TAC contains an amino acid sequence having at least 80% sequence identity with SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 76 , SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60 or SEQ ID NO: 62. 12. Последовательность нуклеиновой кислоты по любому из пп.9-11, не кодирующая костимулирующий домен.12. The nucleic acid sequence according to any one of claims 9 to 11, which does not encode a costimulatory domain. 13. Последовательность нуклеиновой кислоты по любому из пп.9-12, не кодирующая активирующий домен.13. The nucleic acid sequence according to any one of claims 9 to 12, which does not encode an activating domain. 14. Полипептид, кодируемый посредством последовательности нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-13.14. A polypeptide encoded by the nucleic acid sequence according to any one of claims 1 to 13. 15. Векторная конструкция, содержащая:15. Vector design containing: (a) последовательность нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-13; и (b) промотор, функциональный в клетке млекопитающего.(a) a nucleic acid sequence according to any one of claims 1 to 13; and (b) a promoter functional in a mammalian cell. 16. Т-клетка, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-13.16. A T cell containing the nucleic acid sequence according to any one of claims 1 to 13. 17. Фармацевтическая композиция, содержащая Т-клетку по п.16 и фармацевтически приемлемый наполнитель.17. A pharmaceutical composition containing the T cell according to claim 16 and a pharmaceutically acceptable excipient. 18. Способ лечения злокачественной опухоли у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму фармацевтической композиции по п.17.18. A method of treating a malignant tumor in an individual in need thereof, comprising administering to the individual a pharmaceutical composition according to claim 17. 19. Способ по п.18, где злокачественная опухоль содержит экспрессирующую CD19 клетку злокачественной опухоли.19. The method of claim 18, wherein the cancer comprises a CD19-expressing cancer cell. 20. Способ по любому из пп.18, 19, где злокачественная опухоль представляет собой В-клеточное злокачественное новообразование.20. The method according to any one of claims 18, 19, wherein the malignancy is a B-cell malignancy. 21. Способ по любому из пп.18-20, где злокачественная опухоль представляет собой В-клеточную лимфому, острый лимфобластный лейкоз (ALL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL) или неходжкинскую лимфому.21. The method according to any one of claims 18 to 20, wherein the malignant tumor is B-cell lymphoma, acute lymphoblastic leukemia (ALL), chronic lymphocytic leukemia (CLL) or non-Hodgkin's lymphoma. 22. Способ по п.18, где злокачественная опухоль содержит экспрессирующую HER-2 клетку злокачественной опухоли.22. The method of claim 18, wherein the cancer comprises a HER-2 expressing cancer cell. 23. Способ по любому из пп.18 или 22, где злокачественная опухоль представляет собой рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак яичника или рак желудка.23. The method according to any one of claims 18 or 22, wherein the malignant tumor is breast cancer, bladder cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer or stomach cancer. 24. Способ по п.18, где злокачественная опухоль содержит экспрессирующую ВСМА клетку злокачественной опухоли.24. The method of claim 18, wherein the cancer comprises a BCMA-expressing cancer cell. 25. Способ по любому из пп.18 или 24, где злокачественная опухоль представляет собой лейкоз, лимфому или множественную миелому.25. The method according to any one of claims 18 or 24, wherein the malignant tumor is leukemia, lymphoma or multiple myeloma. --
EA202190288 2018-07-17 2019-07-17 T-CELL ANTIGEN BINDING AGENT WITH VARIOUS OPTIMIZATION OF DESIGNS EA045368B1 (en)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US62/699,173 2018-07-17
US62/703,037 2018-07-25
US62/773,120 2018-11-29
US62/826,853 2019-03-29
US62/828,879 2019-04-03
US62/839,235 2019-04-26
US16/442,274 2019-06-14
US62/874,426 2019-07-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EA045368B1 true EA045368B1 (en) 2023-11-21

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11976117B2 (en) T cell-antigen coupler with various construct optimizations
US11878035B2 (en) T cell-antigen coupler with various construct optimizations
JP7179041B2 (en) Trifunctional T cell-antigen couplers and methods and uses thereof
JP7404279B2 (en) T cell antigen couplers with various construct optimizations
US11970545B2 (en) T cell-antigen coupler with Y182T mutation and methods of uses thereof
JP2023002556A (en) Chimeric antigen receptor cells for treating solid tumor
US20230364237A1 (en) Claudin 18.2 t cell-antigen couplers and uses thereof
EA045368B1 (en) T-CELL ANTIGEN BINDING AGENT WITH VARIOUS OPTIMIZATION OF DESIGNS