EA045199B1 - EXPRESSION OF PNEUMOCOCCAL SURFACE PROTEIN A (PspA) - Google Patents
EXPRESSION OF PNEUMOCOCCAL SURFACE PROTEIN A (PspA) Download PDFInfo
- Publication number
- EA045199B1 EA045199B1 EA202092065 EA045199B1 EA 045199 B1 EA045199 B1 EA 045199B1 EA 202092065 EA202092065 EA 202092065 EA 045199 B1 EA045199 B1 EA 045199B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- pspa1
- truncated
- seq
- expression
- valent
- Prior art date
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims description 85
- 108010040473 pneumococcal surface protein A Proteins 0.000 title description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 64
- 150000004676 glycans Chemical group 0.000 claims description 35
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 35
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 35
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 23
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 22
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims description 21
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 20
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 claims description 19
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 claims description 18
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 17
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 17
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 17
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 17
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 12
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 10
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 8
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 claims description 7
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 claims description 7
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 claims description 7
- 108010071134 CRM197 (non-toxic variant of diphtheria toxin) Proteins 0.000 claims description 6
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 5
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 claims description 3
- 101710099976 Photosystem I P700 chlorophyll a apoprotein A1 Proteins 0.000 claims description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 2
- 229940031999 pneumococcal conjugate vaccine Drugs 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims 2
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 claims 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims 1
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 24
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 15
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 14
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 14
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 13
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 13
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 12
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 12
- 239000013622 capto Q Substances 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 7
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710138270 PspA protein Proteins 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N anthrone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=CC=CC=C3CC2=C1 RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 235000021474 generally recognized As safe (food) Nutrition 0.000 description 3
- 235000021473 generally recognized as safe (food ingredients) Nutrition 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 238000000569 multi-angle light scattering Methods 0.000 description 3
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 229940124733 pneumococcal vaccine Drugs 0.000 description 3
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000012531 mass spectrometric analysis of intact mass Methods 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013365 molecular weight analysis method Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 101150080370 pspA gene Proteins 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 2
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 101100298079 African swine fever virus (strain Badajoz 1971 Vero-adapted) pNG2 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 1
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102000006465 DNA Restriction-Modification Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010044289 DNA Restriction-Modification Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010001817 Endo-1,4-beta Xylanases Proteins 0.000 description 1
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 description 1
- 101710089384 Extracellular protease Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 208000035109 Pneumococcal Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710090029 Replication-associated protein A Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 201000005010 Streptococcus pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 230000009056 active transport Effects 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 101150111615 ftsZ gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 1
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M monosodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M 0.000 description 1
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004223 monosodium glutamate Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000009057 passive transport Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 229940031960 pneumococcal polysaccharide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940033515 pneumovax 23 Drugs 0.000 description 1
- 229940031937 polysaccharide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000004801 process automation Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000013120 recombinational repair Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000024053 secondary metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229940124856 vaccine component Drugs 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Description
Область техники, к которой относится изобретениеField of technology to which the invention relates
Настоящее изобретение относится к высокоуровневой экспрессии усеченного пневмококкового поверхностного белка A1 (PspA1) в бактериях.The present invention relates to high-level expression of truncated pneumococcal surface protein A1 (PspA1) in bacteria.
Уровень техникиState of the art
Streptococcus pneumoniae является важным возбудителем отита среднего уха, менингита, бактериемии и пневмонии, а также основной причиной смертельных инфекций у людей пожилого возраста и лиц с имеющимися сопутствующими заболеваниями. Привлекательной целью вакцинации против стрептококков является снижение числа носителей инфекции в вакцинированных популяциях и, как следствие, снижение уровня заболеваемости пневмококковой инфекцией.Streptococcus pneumoniae is an important causative agent of otitis media, meningitis, bacteremia, and pneumonia, and is a leading cause of fatal infections in the elderly and those with underlying medical conditions. An attractive goal of vaccination against streptococci is to reduce the number of carriers of the infection in vaccinated populations and, as a result, reduce the incidence of pneumococcal disease.
Пневмококковые полисахаридные вакцины, представленные на рынке под товарным знаком Pneumovax23, не эффективны у детей младше 2 лет. Отсутствие эффективности полисахаридных вакцин в данной популяции является следствием незрелости детской иммунной системы в отношении экспрессии В-клеточных рецепторов. Конъюгация полисахаридов (PS) с белками-носителями превращает их из Т-независимого антигена в Т-зависимый антиген. В качестве Т-зависимого антигена полисахариды могут вызывать ответную реакцию с переключением изотипа иммуноглобулинов, генерацией клеток памяти и стимуляцией иммунного ответа.Pneumococcal polysaccharide vaccines, marketed under the brand name Pneumovax23, are not effective in children younger than 2 years of age. The lack of effectiveness of polysaccharide vaccines in this population is a consequence of the immaturity of the child's immune system with respect to the expression of B-cell receptors. Conjugation of polysaccharides (PS) to carrier proteins converts them from a T-independent antigen to a T-dependent antigen. As a T-dependent antigen, polysaccharides can cause a response with immunoglobulin isotype switching, generation of memory cells and stimulation of the immune response.
Мембранные белки находятся внутри мембраны и охватывают ее, через которую они служат для транспорта молекул или облегчения клеточной адгезии. Белки могут способствовать перемещению веществ за счет облегченной диффузии (т.е. пассивного транспорта) или активного транспорта. Пневмококковый поверхностный белок A (PspA) является мембранным белком и еще одним важным фактором вирулентности, обнаруженным присоединенным к клеточной стенке всех штаммов Streptococcus pneumoniae.Membrane proteins are found within and enclosing a membrane, through which they serve to transport molecules or facilitate cell adhesion. Proteins can facilitate the movement of substances through facilitated diffusion (i.e., passive transport) or active transport. Pneumococcal surface protein A (PspA) is a membrane protein and another important virulence factor found attached to the cell wall of all strains of Streptococcus pneumoniae.
Замена универсальных белков-носителей, таких как столбнячный анатоксин (ТТ) или CRM197, пневмококковым белком, в частности PspA1 или его фрагментом, помимо расширения охвата действия вакцины, также предупреждает нарушение иммунных ответов, вызванных чрезмерным использованием одних и тех же белков-носителей в конъюгированных вакцинах. Экспрессионная плазмида сконструирована таким образом, чтобы включать регуляторные последовательности, которые функционируют в качестве энхансерной и промоторной областей и приводят к эффективной транскрипции гена, переносимого в экспрессионном векторе. Целью хорошо сконструированного экспрессионного вектора является эффективная продукция белка, и это может быть достигнуто посредством синтеза значительного количества стабильной матричной РНК. Возможно сконструировать экспрессионный вектор, который обеспечивает жесткий контроль экспрессии, и белок продуцируется в больших количествах только при необходимости в подходящих для экспрессии условиях. В отсутствие жесткого контроля экспрессии гена белок также может экспрессироваться конститутивно.Replacing universal carrier proteins such as tetanus toxoid (TT) or CRM197 with a pneumococcal protein, particularly PspA1 or a fragment thereof, in addition to increasing vaccine coverage, also prevents disruption of immune responses caused by overuse of the same carrier proteins in conjugates. vaccines. The expression plasmid is designed to include regulatory sequences that function as enhancer and promoter regions and result in efficient transcription of the gene carried in the expression vector. The goal of a well-designed expression vector is efficient protein production, and this can be achieved by synthesizing a significant amount of stable messenger RNA. It is possible to construct an expression vector that provides tight control of expression so that the protein is produced in large quantities only when needed under conditions suitable for expression. In the absence of tight control of gene expression, the protein can also be expressed constitutively.
Corynebacterium glutamicum представляет собой грамположительную ферментативную бактерию, которая широко используется в производстве глутамата натрия в больших количествах. За счет своих стабильных генетических характеристик и отсутствия каких-либо эндотоксинов Corynebacterium glutamicum классифицируется как GRAS-микроорганизм (в общем, считается безопасным). Известно, что бактерия не секретирует каких-либо внеклеточных протеаз, и как следствие она становится привлекательной платформой для продуцирования гетерологичных белков в среду. Это может быть достигнуто с использованием экспрессионной плазмидной конструкции, которая может синтезировать рекомбинантный белок в больших количествах.Corynebacterium glutamicum is a Gram-positive fermentative bacterium that is widely used in the production of monosodium glutamate in large quantities. Due to its stable genetic characteristics and the absence of any endotoxins, Corynebacterium glutamicum is classified as a GRAS microorganism (generally considered safe). The bacterium is not known to secrete any extracellular proteases, and as a consequence it becomes an attractive platform for the production of heterologous proteins into the environment. This can be achieved using an expression plasmid construct that can synthesize the recombinant protein in large quantities.
В ЕР 2310502 В1 раскрыто применение промотора Ptac в конструкции, где штамм Escherichia coli, содержащий IPTG-индуцибельную мутацию ftsZ и делецию minCDE, культивировали в среде LB.EP 2310502 B1 discloses the use of the P tac promoter in a construct where an Escherichia coli strain containing an IPTG-inducible ftsZ mutation and a minCDE deletion was cultured in LB medium.
В публикации Nokano et al., J. Bacteriol., 1984 Jan., 157(1):79-83 раскрыто использование гена устойчивости к канамицину в плазмидной конструкции для создания трансформированного штамма, который приобретает свойство устойчивости к канамицину.Nokano et al., J. Bacteriol., 1984 Jan., 157(1):79-83 disclose the use of a kanamycin resistance gene in a plasmid construct to create a transformed strain that acquires kanamycin resistance properties.
В публикации Masai et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1987 Jul., 84(14):4781-5 раскрыт белок RepA для инициации репликации плазмиды R1 и взаимодействия с последовательностью oriR.Masai et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1987 Jul., 84(14):4781-5, the RepA protein is disclosed to initiate replication of the R1 plasmid and interact with the oriR sequence.
В публикации Nayak et al., Infect. Immun.-1998-Nayak-3744-51 раскрыта живая рекомбинантная вакцина для перорального введения на основе штамма Salmonella, экспрессирующего пневмококковый поверхностный белок A (PspA).Nayak et al., Infect. Immun.-1998-Nayak-3744-51 discloses a live recombinant oral vaccine based on a Salmonella strain expressing pneumococcal surface protein A (PspA).
В публикации Nabors et.al. Vaccine, 18 (2000) 1743-54 раскрыта экспрессия рекомбинантного усеченного PspA в виде цитоплазматического белка в Escherichia coli.In the publication Nabors et.al. Vaccine, 18 (2000) 1743-54 disclosed expression of recombinant truncated PspA as a cytoplasmic protein in Escherichia coli.
В публикации Figueredo et.al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2017), 101:2305-2317 раскрыто получение и очистка немеченого рекомбинантного пневмококкового поверхностного белка A (PspA4Pro).Figueredo et.al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2017), 101:2305-2317 discloses the preparation and purification of untagged recombinant pneumococcal surface protein A (PspA4Pro).
В вышеуказанных документах раскрыты генетические элементы экспрессионного вектора или экспрессия пневмококкового поверхностного протеина А в Escherichia coli и Salmonella.The above documents disclose the genetic elements of the expression vector or expression of pneumococcal surface protein A in Escherichia coli and Salmonella.
Авторы изобретения идентифицировали иммуногенные фрагменты пневмококкового поверхностного белка. Затем авторы изобретения приложили интенсивные усилия для разработки экспрессионных конструкций, способных к стабильной и конститутивной или индуцибельной экспрессии усеченного пневмококкового поверхностного белка A1 (PspA1) в бактериях на высоком уровне.The inventors have identified immunogenic fragments of pneumococcal surface protein. We then devoted intensive efforts to develop expression constructs capable of stably and constitutively or inducibly expressing truncated pneumococcal surface protein A1 (PspA1) in bacteria at high levels.
- 1 045199- 1 045199
Следовательно, настоящее изобретение обеспечивает преодоление проблем предшествующего уровня техники посредством получения экспрессионных векторов и рекомбинантных клеток-хозяев для экспрессии усеченных пневмококковых поверхностных белков. Кроме того, авторы изобретения получили вакцинные композиции, содержащие усеченные белки в качестве белков-носителей.Therefore, the present invention overcomes the problems of the prior art by providing expression vectors and recombinant host cells for the expression of truncated pneumococcal surface proteins. In addition, the inventors have obtained vaccine compositions containing truncated proteins as carrier proteins.
Цель изобретенияPurpose of the invention
Основной целью настоящего изобретения является получение экспрессионной конструкции для высокоуровневой экспрессии усеченного пневмококкового поверхностного белка A1 (PspA1) в бактериях.The main object of the present invention is to provide an expression construct for high-level expression of truncated pneumococcal surface protein A1 (PspA1) in bacteria.
Другой целью настоящего изобретения является получение экспрессионной конструкции, способной к стабильной и конститутивной или индуцибельной экспрессии на высоком уровне усеченного пневмококкового поверхностного белка A1 (PspA1) в бактериях.Another object of the present invention is to provide an expression construct capable of stably and constitutively or inducibly expressing truncated pneumococcal surface protein A1 (PspA1) at high levels in bacteria.
Сущность изобретенияThe essence of the invention
Настоящее изобретение относится к экспрессионной конструкции, способной к высокоуровневой экспрессии усеченного пневмококкового поверхностного белка А1 (PspA1) с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3 и 4.The present invention relates to an expression construct capable of high-level expression of truncated pneumococcal surface protein A1 (PspA1) with the sequence shown in SEQ ID NO: 3 and 4.
Настоящее изобретение относится к экспрессионной конструкции, содержащей ген, который кодирует усеченный PspA1, с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 5 и 6.The present invention relates to an expression construct containing a gene that encodes a truncated PspA1, with the sequence shown in SEQ ID NO: 5 and 6.
Настоящее изобретение относится к экспрессионной конструкции для высокоуровневой экспрессии усеченного PspA1 (пневмококкового поверхностного белка А1) с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3 или 4, в бактериях, содержащейThe present invention relates to an expression construct for high-level expression of truncated PspA1 (pneumococcal surface protein A1) with the sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4 in bacteria containing
a) ген, кодирующий усеченный PspA1, с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 5 или 6;a) a gene encoding a truncated PspA1, with the sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 6;
b) ориджин репликации;b) origin of replication;
c) ген устойчивости к антибиотикам;c) antibiotic resistance gene;
d) промотор; иd) promoter; And
e) сайт связывания рибосомы.e) ribosome binding site.
Настоящее изобретение также относится к способу высокоуровневой экспрессии усеченного PspA1 (пневмококкового поверхностного белка А1), который включает культивирование бактерий, трансформированных экспрессионной конструкцией, и тем самым очистку экспрессированного белка.The present invention also provides a method for high-level expression of truncated PspA1 (pneumococcal surface protein A1), which involves culturing bacteria transformed with the expression construct and thereby purifying the expressed protein.
Краткое описание фигурBrief description of the figures
На фиг. 1 на панели А приведено схематическое представление рВЕ31С. На панели В приведено схематическое представление доменов pspA, определенных из выведенной аминокислотной последовательности Rx1 PspA1. На панели С приведено схематическое представление рВЕ117. На панели D показан ампликон ПЦР, содержащий RBS, нативный сигнальный пептид, усеченный PspA1, нативный терминатор и trrnB.In fig. Panel A of Figure 1 shows a schematic representation of pBE31C. Panel B shows a schematic representation of the pspA domains determined from the deduced amino acid sequence of Rx1 PspA1. Panel C shows a schematic representation of pBE117. Panel D shows a PCR amplicon containing RBS, native signal peptide, truncated PspA1, native terminator, and trrnB.
На фиг. 2 показано покрытие белковой последовательности усеченного PspA1 в анализе пептида отпечатков пальцев.In fig. Figure 2 shows the protein sequence coverage of truncated PspA1 in the peptide fingerprinting assay.
На фиг. 3 показан анализ интактной массы усеченного PspA1, экспрессированного в Corynebacterium glutamicum.In fig. 3 shows intact mass analysis of truncated PspA1 expressed in Corynebacterium glutamicum.
На фиг. 4 показан усеченный PspA1, элюированный с колонки с керамическим гидроксиапатитом (СНТ-II).In fig. Figure 4 shows truncated PspA1 eluted from a ceramic hydroxyapatite (CHT-II) column.
На фиг. 5 показан усеченный PspA1, элюированный с анионообменной колонки.In fig. Figure 5 shows truncated PspA1 eluted from an anion exchange column.
На фиг. 6 показан усеченный PspA1 после диафильтрации.In fig. Figure 6 shows truncated PspA1 after diafiltration.
На фиг. 7 показана хроматограмма SEC-HPLC кинетики реакции конъюгации пневмококкового полисахарида серотипа 3 (А), 6А (В) и 6В (С).In fig. Figure 7 shows an SEC-HPLC chromatogram of the conjugation reaction kinetics of pneumococcal polysaccharide serotypes 3 (A), 6A (B), and 6B (C).
На фиг. 8 показан титр сывороточных антител у иммунизированных кроликов против различных конъюгатов полисахарида Streptococcus pneumoniae серотипов 3, 6А, 6В (2,2 мкг) с усеченным белкомносителем PspA1.In fig. Figure 8 shows the titer of serum antibodies in immunized rabbits against various conjugates of the polysaccharide Streptococcus pneumoniae serotypes 3, 6A, 6B (2.2 μg) with a truncated carrier protein PspA1.
На фиг. 9 показан титр сывороточных антител у иммунизированных кроликов против различных конъюгатов полисахарида Streptococcus pneumoniae серотипов 3, 6А, 6В (4,4 мкг) с усеченным белкомносителем PspA1.In fig. Figure 9 shows the titer of serum antibodies in immunized rabbits against various conjugates of the polysaccharide Streptococcus pneumoniae serotypes 3, 6A, 6B (4.4 μg) with a truncated carrier protein PspA1.
На фиг. 10 на панели А приведено схематическое представление рВЕ114k. На панели В показано подтверждение pBE114k рестрикционным расщеплением.In fig. 10, Panel A is a schematic representation of pBE114k. Panel B shows confirmation of pBE114k by restriction digestion.
На фиг. 11 показан усеченный PspA1, элюированный с хроматографической колонки с CHT I.In fig. 11 shows truncated PspA1 eluted from a CHT I chromatography column.
На фиг. 12 показан усеченный PspA1, элюированный с хроматографической колонки с Capto Q Impress.In fig. 12 shows truncated PspA1 eluted from a Capto Q Impress chromatography column.
На фиг. 13 показано покрытие белка PspA1 MALDI.In fig. 13 shows MALDI coating of PspA1 protein.
На фиг. 14 показан анализ интактной массы усеченного PspA1, экспрессированного в Escherichia coli.In fig. 14 shows intact mass analysis of truncated PspA1 expressed in Escherichia coli.
Подробное описание изобретенияDetailed Description of the Invention
Термин PspA1 относится к пневмококковому поверхностному белку А1 из Streptococcus pneumonia.The term PspA1 refers to pneumococcal surface protein A1 from Streptococcus pneumonia.
Настоящее изобретение относится к высокоуровневой экспрессии усеченного PspA1 (пневмококкового поверхностного белка А1) в бактериях. Бактериями, подходящими для высокоуровневой экспрессии PspA1, являются Corynebacterium glutamicum и Escherichia coli.The present invention relates to high-level expression of truncated PspA1 (pneumococcal surface protein A1) in bacteria. Bacteria suitable for high-level expression of PspA1 are Corynebacterium glutamicum and Escherichia coli.
- 2 045199- 2 045199
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к высокоуровневой экспрессии усеченного PspA1 (пневмококкового поверхностного белка А1) с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3, в Corynebacterium glutamicum.In one embodiment, the present invention relates to high-level expression of truncated PspA1 (pneumococcal surface protein A1) with the sequence shown in SEQ ID NO: 3 in Corynebacterium glutamicum.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к высокоуровневой экспрессии усеченного PspA1 (пневмококкового поверхностного протеина А1) с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4, в Escherichia coli.In yet another embodiment, the present invention relates to high-level expression of truncated PspA1 (pneumococcal surface protein A1) with the sequence shown in SEQ ID NO: 4 in Escherichia coli.
Настоящее изобретение относится к экспрессионной конструкции, способной к высокоуровневой экспрессии поверхностного белка с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO:3.The present invention relates to an expression construct capable of high-level expression of a surface protein with the sequence shown in SEQ ID NO:3.
Настоящее изобретение также относится к экспрессионной конструкции, способной к высокоуровневой экспрессии поверхностного белка с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4.The present invention also provides an expression construct capable of high-level expression of a surface protein having the sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к экспрессионной конструкции для высокоуровневой экспрессии усеченного PspA1 (пневмококкового поверхностного белка А1) с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3, в Corynebacterium glutamicum.In yet another embodiment, the present invention provides an expression construct for high-level expression of truncated PspA1 (pneumococcal surface protein A1) with the sequence shown in SEQ ID NO: 3 in Corynebacterium glutamicum.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к экспрессионной конструкции для высокоуровневой экспрессии усеченного PspA1 (пневмококкового поверхностного белка А1) с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4, в Escherichia coli.In yet another embodiment, the present invention provides an expression construct for high-level expression of truncated PspA1 (pneumococcal surface protein A1) with the sequence shown in SEQ ID NO: 4 in Escherichia coli.
Настоящее изобретение относится к экспрессионной конструкции, которая используется для высокоуровневой экспрессии усеченного PspA1, в Corynebacterium glutamicum, содержащейThe present invention relates to an expression construct that is used for high-level expression of truncated PspA1 in Corynebacterium glutamicum containing
i) ориджин репликации ori R;i) origin of replication ori R;
ii) ген устойчивости к канамицину;ii) kanamycin resistance gene;
iii) промотор Ptac;iii) P tac promoter;
iv) представляющий интерес ген, кодирующий усеченный PspA1 (SEQ ID NO: 5).iv) a gene of interest encoding truncated PspA1 (SEQ ID NO: 5).
Настоящее изобретение также относится к экспрессионной конструкции, которая используется для высокоуровневой экспрессии усеченного PspA1 в Escherichia coli, содержащейThe present invention also provides an expression construct that is used for high-level expression of truncated PspA1 in Escherichia coli containing
i) ориджин репликации pUC;i) pUC origin of replication;
ii) ген устойчивости к канамицину;ii) kanamycin resistance gene;
iii) промотор PT7;iii) P T7 promoter;
iv) представляющий интерес ген, кодирующий усеченный PspA1 (SEQ ID NO: 6).iv) a gene of interest encoding truncated PspA1 (SEQ ID NO: 6).
В одном варианте осуществления экспрессионная конструкция для высокоуровневой экспрессии усеченного PspA1 дополнительно содержит сайт связывания рибосомы (RBS). RBS включен в прямой праймер, и короткий участок ДНК, содержащий нативные терминаторы, включен в обратный праймер, используемые для дальнейшей амплификации усеченного PspA1. RBS (сайт связывания рибосомы) представляет сайт гена триозофосфатизомеразы в экспрессионной конструкции для экспрессии усеченного PspA1 в Corynebacterium glutamicum.In one embodiment, the expression construct for high-level expression of truncated PspA1 further comprises a ribosome binding site (RBS). The RBS is included in the forward primer, and a short stretch of DNA containing native terminators is included in the reverse primer used to further amplify the truncated PspA1. The RBS (ribosome binding site) represents the triosephosphate isomerase gene site in an expression construct for expressing truncated PspA1 in Corynebacterium glutamicum.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения экспрессионная конструкция содержит кодирующую область (нативную) сигнального пептида PspA1, усеченный PspA1, промотор Ptac и сайт связывания рибосомы (RBS) гена триозофосфатизомеразы.In one embodiment of the present invention, the expression construct comprises the (native) PspA1 signal peptide coding region, a truncated PspA1, a P tac promoter, and a ribosome binding site (RBS) of the triose phosphate isomerase gene.
В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к экспрессионной конструкции для высокоуровневой экспрессии усеченного PspA1 (SEQ ID NO: 3) в Corynebacterium glutamicum, которая содержитIn a preferred embodiment, the present invention provides an expression construct for high-level expression of truncated PspA1 (SEQ ID NO: 3) in Corynebacterium glutamicum, which contains
a) ген, кодирующий усеченный PspA1 (SEQ ID NO: 5);a) a gene encoding a truncated PspA1 (SEQ ID NO: 5);
b) ориджин репликации ori R (SEQ ID NO: 12);b) origin of replication ori R (SEQ ID NO: 12);
c) ген устойчивости к канамицину (SEQ ID NO: 1);c) kanamycin resistance gene (SEQ ID NO: 1);
d) промотор Ptac (SEQ ID NO: 2); иd) P tac promoter (SEQ ID NO: 2); And
е) сайт связывания рибосомы гена триозофосфатизомеразы.f) ribosome binding site of the triosephosphate isomerase gene.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к экспрессионной конструкции для высокоуровневой экспрессии усеченного PspA1 (SEQ ID NO: 4) в Escherichia coli, которая содержитIn yet another preferred embodiment, the present invention provides an expression construct for high-level expression of truncated PspA1 (SEQ ID NO: 4) in Escherichia coli, which contains
a) ген, кодирующий усеченный PspA1 (SEQ ID NO: 6);a) a gene encoding a truncated PspA1 (SEQ ID NO: 6);
b) ориджин репликации pUC;b) pUC origin of replication;
c) ген устойчивости к канамицину (SEQ ID NO: 1);c) kanamycin resistance gene (SEQ ID NO: 1);
d) промотор РТ7 (SEQ ID NO: 11); иd) PT7 promoter (SEQ ID NO: 11); And
e) сайт связывания рибосомы.e) ribosome binding site.
Пневмококковый поверхностный белок A (PspA) является мембранным белком и представляет важный фактор вирулентности, обнаруженный присоединенным к клеточной стенке всех штаммов Streptococcus pneumoniae, и является многообещающим компонентом вакцины, который, как было показано, обладает высокой иммуногенностью.Pneumococcal surface protein A (PspA) is a membrane protein and is an important virulence factor found attached to the cell wall of all strains of Streptococcus pneumoniae and is a promising vaccine component that has been shown to be highly immunogenic.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения усеченный PspA1 используется в качестве белка-носителя. Белки-носители, используемые в конъюгированных вакцинах, предпочтительно представляют собой белки, которые не являются токсичными и реактогенными, и которые можно получить в большом количестве и с высокой чистотой. Белок-носитель можно конъюгировать с капсульным полисахаридом, выделенным из патогенных бактерий, для усиления иммуногенности полисахарида. БелIn a specific embodiment of the present invention, truncated PspA1 is used as a carrier protein. The carrier proteins used in conjugate vaccines are preferably proteins that are non-toxic and non-reactive and that can be produced in large quantities and in high purity. The carrier protein can be conjugated to a capsular polysaccharide isolated from pathogenic bacteria to enhance the immunogenicity of the polysaccharide. Bel
- 3 045199 ки-носители должны поддаваться стандартным процедурам химической конъюгации.- 3 045199 Ki carriers must be amenable to standard chemical conjugation procedures.
Усеченный PspA1 в Corynebacterium glutamicum секретируется во внеклеточную среду. Секреция во внеклеточную среду способствует эффективной очистке.Truncated PspA1 in Corynebacterium glutamicum is secreted into the extracellular environment. Secretion into the extracellular environment promotes efficient clearance.
Настоящее изобретение относится к высокоуровневой экспрессии усеченного PspA1 в Corynebacterium glutamicum, где N-концевая область вместе с пролин-богатой областью усеченного гена PspA1 была амплифицирована из капсульного серотипа 23F Streptococcus pneumoniae вместе с расположенной выше областью.The present invention relates to high-level expression of truncated PspA1 in Corynebacterium glutamicum, wherein the N-terminal region together with the proline-rich region of the truncated PspA1 gene was amplified from capsular serotype 23F of Streptococcus pneumoniae together with the upstream region.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения экспрессионная конструкция содержит усеченный PspA1, промотор Ptac и сайт связывания рибосомы (RBS) гена триозофосфатизомеразы.In one embodiment of the present invention, the expression construct comprises a truncated PspA1, a P tac promoter, and a ribosome binding site (RBS) of the triose phosphate isomerase gene.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения экспрессионная конструкция содержит усеченный PspA1, промотор PT7 и сайт связывания рибосомы (RBS).In one embodiment of the present invention, the expression construct comprises a truncated PspA1, a P T7 promoter, and a ribosome binding site (RBS).
Экспрессионную конструкцию подвергают электропорации в Corynebacterium glutamicum и отбирают на чашках со средой LB с использованием канамицина в качестве селективного маркера.The expression construct is electroporated into Corynebacterium glutamicum and selected on LB medium plates using kanamycin as a selection marker.
Ptac представляет сильный гибридный промотор, состоящий из области -35 промотора trp и области -10 промотора/оператора lacUV5.P tac is a strong hybrid promoter consisting of the -35 region of the trp promoter and the -10 region of the lacUV5 promoter/operator.
Последовательности pspA получали из GenBank и выравнивали с белками из базы данных. Праймеры конструировали для специфической амплификации кодирующей области нативного сигнального пептида, N-концевой области вместе с пролин-богатой областью генов PspA, относящихся к семействам 1 и 2. Необходимые области PspA1 и PspA2 амплифицировали из доступных клинических изолятов Streptococcus pneumoniae. Анализ МНС пептидов показал, что PspA1 является сравнительно более иммуногенным, чем pspA2.Sequences of pspA were obtained from GenBank and aligned with proteins from the database. Primers were designed to specifically amplify the coding region of the native signal peptide, the N-terminal region along with the proline-rich region of the PspA genes belonging to families 1 and 2. The required regions of PspA1 and PspA2 were amplified from available clinical isolates of Streptococcus pneumoniae. MHC peptide analysis showed that PspA1 is comparatively more immunogenic than pspA2.
Аминокислотная последовательность кодированного усеченного PspA1, экспрессированного и продуцированного в Corynebacterium glutamicum, приведена в SEQ ID NO: 3, имеет определенную интактную массу, составляющую 35452 Да.The amino acid sequence of the encoded truncated PspA1, expressed and produced in Corynebacterium glutamicum, is given in SEQ ID NO: 3, has a determined intact mass of 35452 Da.
Аминокислотная последовательность кодированного усеченного PspA1, экспрессированного и продуцированного в Escherichia coli, приведена в SEQ ID NO: 4, имеет определенную интактную массу, составляющую 41966 Да.The amino acid sequence of the encoded truncated PspA1, expressed and produced in Escherichia coli, is given in SEQ ID NO: 4, has a defined intact mass of 41966 Da.
Последовательность ДНК, кодирующая усеченный PspA1, экспрессированный в Corynebacterium glutamicum и Escherichia coli, приведена в SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO 6 соответственно.The DNA sequence encoding the truncated PspA1 expressed in Corynebacterium glutamicum and Escherichia coli is shown in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, respectively.
Corynebacterium glutamicum (ранее известная как Mcrococcus glutamicus), используемая для экспрессии усеченного PspA1, представляет собой GRAS-микроорганизм, грамположительные палочковидные бактерии. Corynebacterium glutamicum представляет GRAS-микроорганизм. Доступна полная геномная последовательность Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, которую можно культивировать до более высокой плотности клеток, и которая также является генетически стабильной за счет отсутствия системы рекомбинационной репарации. Она имеет ограниченную систему рестрикции-модификации. Она не проявляет аутолиза и может сохранять метаболическую активность в условиях задержки роста. Она обладает низкой протеазной активностью, что способствует получению рекомбинантного белка. Пластичность ее метаболизма и сильный вторичный метаболизм, способность использовать широкий спектр источников углерода (пентозы, гексозы и альтернативные источники углерода), стрессоустойчивость к источникам углерода делают ее многообещающим хозяином для продукции гетерологичных белков. Такие физиологические свойства делают Corynebacterium glutamicum доступной для манипуляций и культивирования в жестких производственных условиях, что делает ее успешной промышленной рабочей лошадкой. Сообщалось о гетерологичной экспрессии таких белков, как а-амилаза, эндоглюканаза, эндоксиланаза, GFP, ксиланаза и т. д., в Corynebacterium glutamicum.Corynebacterium glutamicum (formerly known as Micrococcus glutamicus), used to express truncated PspA1, is a GRAS microorganism, a Gram-positive rod-shaped bacterium. Corynebacterium glutamicum is a GRAS microorganism. The complete genome sequence of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 is available, which can be cultured to higher cell densities and is also genetically stable due to the absence of a recombinational repair system. It has a limited restriction-modification system. It does not exhibit autolysis and can maintain metabolic activity under conditions of growth retardation. It has low protease activity, which facilitates the production of recombinant protein. Its metabolic plasticity and strong secondary metabolism, ability to utilize a wide range of carbon sources (pentoses, hexoses and alternative carbon sources), and stress tolerance to carbon sources make it a promising host for the production of heterologous proteins. These physiological properties make Corynebacterium glutamicum amenable to manipulation and cultivation under harsh industrial conditions, making it a successful industrial workhorse. Heterologous expression of proteins such as α-amylase, endoglucanase, endoxylanase, GFP, xylanase, etc. has been reported in Corynebacterium glutamicum.
В варианте осуществления настоящего изобретения выход усеченного PspA1 составляет приблизительно 500 мг/л, приблизительно 400 мг/л, приблизительно 300 мг/л, приблизительно 250 мг/л, приблизительно 220 мг/л, приблизительно 200 мг/л, приблизительно 180 мг/л, приблизительно 160 мг/л, приблизительно 150 мг/л, приблизительно 120 мг/л, приблизительно 100 мг/л.In an embodiment of the present invention, the yield of truncated PspA1 is about 500 mg/L, about 400 mg/L, about 300 mg/L, about 250 mg/L, about 220 mg/L, about 200 mg/L, about 180 mg/L , approximately 160 mg/l, approximately 150 mg/l, approximately 120 mg/l, approximately 100 mg/l.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к пневмококковой конъюгированной вакцине, содержащей по меньшей мере один полисахарид из Streptococcus pneumoniae серотипов, выбранных из 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 6С, 6D, 7F, 8, 9N, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15А, 15В, 15С, 16F, 17F, 18С, 19F, 19А, 20А, 20В, 22F, 23А, 23В, 23F, 24В, 24F, 31, 33F, 34, 35В, 35F, 38, 39 и 45, конъюгированный с усеченным PspA1 по настоящему изобретению или комбинацией усеченного PspA1 и других белков-носителей, таких как CRM197, столбнячный анатоксин, коклюшный анатоксин; PsaA и т.п.In yet another embodiment, the present invention provides a pneumococcal conjugate vaccine comprising at least one polysaccharide from Streptococcus pneumoniae serotypes selected from 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15С, 16F, 17F, 18С, 19F, 19А, 20А, 20В, 22F, 23А, 23В, 23F, 24В, 24F, 31, 33F, 34, 35В, 35F, 38, 39 and 45, conjugated to a truncated PspA1 of the present invention or a combination of a truncated PspA1 and other carrier proteins such as CRM197, tetanus toxoid, pertussis toxoid; PsaA, etc.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к поливалентной пневмококковой вакцинной композиции, выбранной из 10-валентной, 14-валентной, 15-валентной, 17-валентной, 18-валентной, 19-валентной, 20-валентной, 22-валентной, 23-валентной, 24-валентной или 25-валентной композиции, содержащей полисахариды из Streptococcus pneumoniae серотипов, выбранных из 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 6С, 6D, 7F, 8, 9N, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15А, 15В, 15С, 16F, 17F, 18С, 19F, 19А, 20А, 20В, 22F, 23А, 23В, 23F, 24В, 24F, 31, 33F, 34, 35В, 35F, 38, 39 и 45, конъюгированные с усеченным PspA1 по настоящему изобретению или комбинацией усеченного PspA1 и других белков-носителей, таких как CRM197, столбнячный анатоксин, коклюшный анатоксин; PsaA и т.п.In yet another embodiment, the present invention provides a multivalent pneumococcal vaccine composition selected from 10-valent, 14-valent, 15-valent, 17-valent, 18-valent, 19-valent, 20-valent, 22-valent, 23-valent a valent, 24-valent or 25-valent composition containing polysaccharides from Streptococcus pneumoniae serotypes selected from 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19F, 19A, 20A, 20B, 22F, 23A, 23B, 23F, 24B, 24F, 31, 33F, 34, 35B, 35F, 38, 39 and 45, conjugated to a truncated PspA1 of the present invention or a combination of a truncated PspA1 and other carrier proteins such as CRM197, tetanus toxoid, pertussis toxoid; PsaA, etc.
- 4 045199- 4 045199
В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к поливалентной конъюгированной вакцине, содержащей по меньшей мере три полисахарида из Streptococcus pneumoniae серотипов 3, 6А и 6В, конъюгированные с усеченным PspA1 по настоящему изобретению.In a preferred embodiment, the present invention provides a multivalent conjugate vaccine comprising at least three polysaccharides from Streptococcus pneumoniae serotypes 3, 6A and 6B conjugated to a truncated PspA1 of the present invention.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к конъюгированной вакцине, содержащей полисахариды из Streptococcus pneumoniae серотипов 3, 6А и 6В, конъюгированные с усеченным PspA1 по настоящему изобретению, и из Streptococcus pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, конъюгированные с CRM197.In one embodiment, the present invention provides a conjugate vaccine comprising polysaccharides from Streptococcus pneumoniae serotypes 3, 6A and 6B conjugated to a truncated PspA1 of the present invention, and from Streptococcus pneumoniae serotypes 1, 4, 5, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F and 33F conjugated to CRM 197 .
Настоящее изобретение относится к составам, содержащим приблизительно 2,2 мкг или 4,4 мкг каждого из пневмококковых полисахаридов из серотипов 3, 6А и 6В, каждый конъюгированный с усеченным PspA1 по настоящему изобретению, и приблизительно 2,2 мкг каждого из пневмококковых полисахаридов из серотипов 1, 4, 5, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, каждый конъюгированный с CRM197.The present invention provides compositions containing approximately 2.2 μg or 4.4 μg of each of pneumococcal polysaccharides from serotypes 3, 6A and 6B, each conjugated to a truncated PspA1 of the present invention, and approximately 2.2 μg of each of pneumococcal polysaccharides from serotypes 3, 6A and 6B. 1, 4, 5, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F and 33F, each conjugated to CRM197.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к пневмококковой вакцинной композиции в виде разовой дозы 0,5 мл, где разовая доза содержит приблизительно от 2,2 до 4,4 мкг одного или более пневмококковых полисахаридов; приблизительно от 1 мкг до приблизительно 50 мкг усеченного PspA1 по настоящему изобретению, конъюгированного с каждым из одного или более пневмококковых полисахаридов; приблизительно от 0,2 мг до приблизительно 1 мг адъюванта на основе фосфата алюминия; и эксципиент.In yet another embodiment, the present invention provides a pneumococcal vaccine composition in the form of a single dose of 0.5 ml, where the single dose contains from about 2.2 to 4.4 μg of one or more pneumococcal polysaccharides; about 1 μg to about 50 μg of truncated PspA1 of the present invention conjugated to each of one or more pneumococcal polysaccharides; about 0.2 mg to about 1 mg aluminum phosphate adjuvant; and excipient.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к пневмококковой вакцинной композиции в виде разовой дозы 0,5 мл, где разовая доза содержит приблизительно от 2,2 до 4,4 мкг одного или более пневмококковых полисахаридов; приблизительно от 1 мкг до приблизительно 30 мкг усеченного PspA1 по настоящему изобретению, конъюгированного с каждым из одного или более пневмококковых полисахаридов; приблизительно от 1 мкг до приблизительно 30 мкг CRM197, конъюгированного с каждым из одного или более пневмококковых полисахаридов; приблизительно от 0,2 мг до приблизительно 1 мг адъюванта на основе фосфата алюминия; и эксципиент.In yet another embodiment, the present invention provides a pneumococcal vaccine composition in the form of a single dose of 0.5 ml, where the single dose contains from about 2.2 to 4.4 μg of one or more pneumococcal polysaccharides; about 1 μg to about 30 μg of truncated PspA1 of the present invention conjugated to each of one or more pneumococcal polysaccharides; from about 1 μg to about 30 μg of CRM 197 conjugated to each of one or more pneumococcal polysaccharides; about 0.2 mg to about 1 mg aluminum phosphate adjuvant; and excipient.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение также относится к вакцине для профилактики инфекционного заболевания, вызванного Streptococcus pneumoniae, введением конъюгированной вакцины, полученной посредством конъюгации усеченного PspA1 по настоящему изобретению с пневмококковыми полисахаридами.In yet another embodiment, the present invention also provides a vaccine for the prevention of an infectious disease caused by Streptococcus pneumoniae by administering a conjugate vaccine obtained by conjugating the truncated PspA1 of the present invention with pneumococcal polysaccharides.
ПримерыExamples
Следующие примеры приведены для иллюстрации изобретения и предназначены только для иллюстративных целей и не должны истолковываться как ограничивающие объем изобретения.The following examples are provided to illustrate the invention and are intended for illustrative purposes only and should not be construed as limiting the scope of the invention.
Пример 1. Рекомбинантная экспрессия усеченного PspA1 в Corynebacterium glutamicum.Example 1 Recombinant expression of truncated PspA1 in Corynebacterium glutamicum.
Конструирование рВЕ31С.Construction of rBE31C.
Небольшую, стабильно реплицирующуюся плазмиду рВЕ30 с широким кругом хозяев получали с использованием синтетической плазмиды, имеющей последовательность pNG2 oriR размером 2,692 т.п.н. Используя данную плазмидную ДНК в качестве матрицы, область oriR размером 1,8 т.п.н. амплифицировали с использованием праймеров pEP-F1 (5'-GCG CGG ACT AGT aGa tCt ATG GTA AAT CTG CGC AGA CAG-3') и pEP-R1 (5'-GCG CGG ACT AGT GAA TTC GGT GAG GTT ATG GCG-3').A small, stably replicating broad host range plasmid pBE30 was generated using a synthetic plasmid having the 2.692 kb pNG2 oriR sequence. Using this plasmid DNA as a template, the 1.8 kb oriR region. amplified using primers pEP-F1 (5'-GCG CGG ACT AGT aGa tCt ATG GTA AAT CTG CGC AGA CAG-3') and pEP-R1 (5'-GCG CGG ACT AGT GAA TTC GGT GAG GTT ATG GCG-3' ).
Одновременно амплифицировали последовательность kanR размером 1,033 т.п.н. с использованием ДНК-матрицы pUC4-KIXX и праймеров Kan-F2 (5'-AAG GTC CCG GGA TGG CGA TAG СТА GAC TGG GCG GT-3') и Kan-R2 (5'-AAG GTC CCG GGG GTT GGG CGT CGC TTG GTC GG-3'). Ампликон гена kanR и ампликон oriR лигировали по тупым концам для получения вектора рВЕ30. Также экспрессионную кассету размером 0,851 т.п.н., содержащую тандем из промотора tac lac UV5, сайта множественного клонирования, компонента lacZa и последовательности терминатора TrrnB, амплифицировали с использованием праймеров Ptac-F1 (5'-GG AGC ACT AGT CTG AAA TGA GCT GTT GAC AAT TAA TC-3') и Ptac-R1 (5'-GG AGC ACT AGT TTT AAA CAT GAG CGG ATA CAT ATT TGA A-3'), каждый из которых добавляет сайт рестрикции SpeI. ДНК-матрица, используемая для амплификации экспрессионной кассеты, представляет собой рММВ206 (АТСС 37808). Затем экспрессионную кассету клонировали в уникальный сайт SpeI, сконструированный в плазмиде рВЕ30. Плазмиду, полученную таким образом, обозначали как рВЕ31С (фиг. 1А; SEQ ID NO: 14).Simultaneously, a 1.033-kb kanR sequence was amplified. using DNA template pUC4-KIXX and primers Kan-F2 (5'-AAG GTC CCG GGA TGG CGA TAG CTA GAC TGG GCG GT-3') and Kan-R2 (5'-AAG GTC CCG GGG GTT GGG CGT CGC TTG GTC GG-3'). The kanR gene amplicon and the oriR amplicon were blunt-end ligated to obtain the pBE30 vector. Also, a 0.851 kb expression cassette containing a tandem of tac lac UV5 promoter, multiple cloning site, lacZa component and TrrnB terminator sequence was amplified using primers P tac -F1 (5'-GG AGC ACT AGT CTG AAA TGA GCT GTT GAC AAT TAA TC-3') and P tac -R1 (5'-GG AGC ACT AGT TTT AAA CAT GAG CGG ATA CAT ATT TGA A-3'), each adding a SpeI restriction site. The template DNA used to amplify the expression cassette is pMMB206 (ATCC 37808). The expression cassette was then cloned into a unique SpeI site constructed in plasmid pBE30. The plasmid thus obtained was designated pBE31C (Fig. 1A; SEQ ID NO: 14).
Конструирование рВЕ117.Construction of pBE117.
Усеченный ген PspA1 (N-концевая область вместе с пролин-богатой областью, фиг. 1В) амплифицировали из капсульного серотипа 23F Streptococcus pneumoniae вместе с расположенной выше областью. Ампликон клонировали в вектор ТА (pTZ57R/T, полученный от Fermentas) с использованием праймеров PSPAF1_FP (5'-ATG AAT AAG ААА ААА ATG АТТ ТТА АСА AGT СТА GCC-3') и PSPAF1_RP (5'-CGA GAG AGA TCT ААА ТТА ААА TGT CAA ATG TTC ТТА АСА TGC TTT AAT TTT TAT TTT GGT GC-3') и последовательность подтверждали. Ее обозначали как pTZ-PspA1. Последовательность нативного терминатора включали в обратный праймер PSPAF1RP. Определяющие клад области картировали в полученной последовательности усеченного PspA1, для подтверждения его принадлежности к семейству 1 белков PspA.The truncated PspA1 gene (N-terminal region together with the proline-rich region, Fig. 1B) was amplified from capsular Streptococcus pneumoniae serotype 23F along with the upstream region. The amplicon was cloned into the TA vector (pTZ57R/T, obtained from Fermentas) using primers PSPAF1_FP (5'-ATG AAT AAG AAA AAA ATG ATT TTA ACA AGT CTA GCC-3') and PSPAF1_RP (5'-CGA GAG AGA TCT AAA TTA AAA TGT CAA ATG TTC TTA ACA TGC TTT AAT TTT TAT TTT GGT GC-3') and the sequence was confirmed. It was designated pTZ-PspA1. The native terminator sequence was included in the reverse primer PSPAF1RP. Clade-defining regions were mapped to the resulting sequence of truncated PspA1 to confirm its membership in family 1 of the PspA proteins.
Для экспрессии усеченного PspA1 в Corynebacterium glutamicum выбрали промотор Ptac (SEQ ID NO: 2)The P tac promoter (SEQ ID NO: 2) was selected to express truncated PspA1 in Corynebacterium glutamicum.
- 5 045199 и сайт связывания рибосомы (RBS) гена триозофосфатизомеразы (SEQ ID NO: 7), относящийся к Corynebacterium. Ген PspA1 вместе со всей кассетой, включая RBS, нативный сигнальный пептид (SEQ ID NO: 8), усеченный ген PspA1, нативный терминатор (SEQ ID NO: 10), амплифицировали с использованием праймеров -SDTICGR0949_FP5 (5'-GAG CGA TGG АТС СТА GAA AGG TGT GTT ТСА ССС ATG AAT AAG ААА АА-3') и PSPA2_2RP (5'-ТСА AAT GTT CTT AAC ATG СТТ ТАА ТТТ ТТА TGG TGC AGG AGC TGG TTG-3') и pTZ-PspA1 в качестве матрицы. RBS включали в прямой праймер SDTICGR0949_FP5. Область терминатора rrnB (SEQ ID NO: 13) амплифицировали из рВЕ31С, имеющегося у заявителей, и лигировали с геном, кодирующим усеченный PspA1, с использованием ПЦР на основе сплайсинга путем расширения перекрытия (SOE). Ген rrnB амплифицировали с использованием TER FP2 (5'-ATG ТТА AGA АСА TTT GAC АТТ ТТА ATT TCG GCA CTG GCC GTC GTT-3') и TER_RP3 (5'GCG ATA TGG АТС CCA TGA GCG GAT АСА 3'). PSPA2_2RP и TER FP2 конструировали таким образом, чтобы имело место перекрытие 17 оснований. Оба ампликона PspA1 и rrnB добавляли в молярном соотношении 1:1 и использовали в качестве матрицы для ПЦР на основе SOE с праймерами SDTICGR0949_FP5 (5'-GAG CGA TGG АТС СТА GAA AGG TGT GTT ТСА ССС ATG AAT AAG ААА АА-3') и TER_RP3 (5'-GCG ATA TGG АТС CCA TGA GCG GAT АСА-3'). Затем весь ампликон, включая RBS, нативный сигнальный пептид (SEQ ID NO: 8), усеченный ген PspA1, нативный терминатор (SEQ ID NO: 10), терминатор rrnB, расщепляли рестриктазой, добавленной в прямой (SDTICGR0949_FP5) и обратный (TER_RP3) праймеры и клонировали в экспрессионный вектор рВЕ31С, сконструированный для Corynebacterium. Полученный клон обозначали как экспрессионную конструкцию рВЕ117 (фиг. 1С; SEQ ID NO: 15). Экспрессионный вектор вместе с усеченным PspA1 далее по тексту относится к экспрессионной конструкции. Ориентацию вставки (фиг. 1D) подтверждали анализом ПЦР. Последовательность усеченного гена PspA1 вместе с его экспрессионной кассетой подтверждали секвенированием ДНК.- 5 045199 and the ribosome binding site (RBS) of the triose phosphate isomerase gene (SEQ ID NO: 7) related to Corynebacterium. The PspA1 gene along with the entire cassette, including RBS, native signal peptide (SEQ ID NO: 8), truncated PspA1 gene, native terminator (SEQ ID NO: 10), was amplified using primers -SDTICGR0949_FP5 (5'-GAG CGA TGG ATC CTA GAA AGG TGT GTT TCA CCC ATG AAT AAG AAA AA-3') and PSPA2_2RP (5'-TCA AAT GTT CTT AAC ATG CTT TAA TTT TTA TGG TGC AGG AGC TGG TTG-3') and pTZ-PspA1 as a template. RBS was included in the forward primer SDTICGR0949_FP5. The rrnB terminator region (SEQ ID NO: 13) was amplified from pBE31C available from the inventors and ligated to the gene encoding the truncated PspA1 using splicing overlap extension (SOE) PCR. The rrnB gene was amplified using TER FP2 (5'-ATG TTA AGA ACA TTT GAC ATT TTA ATT TCG GCA CTG GCC GTC GTT-3') and TER_RP3 (5'GCG ATA TGG ATC CCA TGA GCG GAT ACA 3'). PSPA2_2RP and TER FP2 were designed to have 17 bases of overlap. Both PspA1 and rrnB amplicons were added in a 1:1 molar ratio and used as a template for SOE-based PCR with primers SDTICGR0949_FP5 (5'-GAG CGA TGG ATC CTA GAA AGG TGT GTT TCA CCC ATG AAT AAG AAA AA-3') and TER_RP3 (5'-GCG ATA TGG ATC CCA TGA GCG GAT ACA-3'). Then the entire amplicon, including RBS, native signal peptide (SEQ ID NO: 8), truncated PspA1 gene, native terminator (SEQ ID NO: 10), rrnB terminator, was digested with restriction enzyme added to the forward (SDTICGR0949_FP5) and reverse (TER_RP3) primers and cloned into the pBE31C expression vector constructed for Corynebacterium. The resulting clone was designated expression construct pBE117 (FIG. 1C; SEQ ID NO: 15). The expression vector together with the truncated PspA1 is referred to hereinafter as an expression construct. The orientation of the insert (Fig. 1D) was confirmed by PCR analysis. The sequence of the truncated PspA1 gene along with its expression cassette was confirmed by DNA sequencing.
Экспрессия усеченного PspA1.Expression of truncated PspA1.
Экспрессионную конструкцию подвергали электропорации в Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 и отбирали на чашках со средой LB с использованием канамицина в качестве селективного маркера. Собирали двадцать рекомбинантных колоний Corynebacterium glutamicum и анализировали с помощью ПЦР. Было отобрано пять колоний для конститутивной экспрессии усеченного PspA1. Рекомбинантные колонии вместе с Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (использовали в качестве отрицательного контроля) инокулировали в 10 мл бульона Terrific с конечной концентрацией канамицина 25 мкг/мл и инкубировали при 35°С со встряхиванием при 200 об/мин. Через 16 ч проводили вторичную инокуляцию в 10 мл той же среды, указанной выше, так что конечное значение OD составило 0,1. Культуры инкубировали при 35°С со встряхиванием при 200 об/мин в течение 18-20 ч. Через 18 ч культуральные супернатанты тестировали на экспрессию усеченного PspA1. 30 мкл супернатанта загружали в 12% SDS-PAGE и анализировали на экспрессию усеченного PspA1. Видна заметная полоса приблизительно на уровне 45 кДа.The expression construct was electroporated into Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 and selected on LB medium plates using kanamycin as a selection marker. Twenty recombinant colonies of Corynebacterium glutamicum were collected and analyzed by PCR. Five colonies were selected to constitutively express truncated PspA1. Recombinant colonies along with Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (used as a negative control) were inoculated into 10 ml of Terrific broth with a final kanamycin concentration of 25 μg/ml and incubated at 35°C with shaking at 200 rpm. After 16 h, a secondary inoculation was carried out in 10 ml of the same medium above, so that the final OD value was 0.1. Cultures were incubated at 35°C with shaking at 200 rpm for 18-20 hours. After 18 hours, culture supernatants were tested for expression of truncated PspA1. 30 μl of supernatant was loaded onto 12% SDS-PAGE and analyzed for truncated PspA1 expression. A prominent band is visible at approximately 45 kDa.
Результаты анализа вестерН блоттингом с использованием поликлонального антитела против pspA, специфичного к N-концевому эпитопу (SantaCruz), подтверждали экспрессию усеченного PspA1. Анализ экспрессии рекомбинантного клона 5 масштабировали до 500 мл, и экспрессия усеченного PspA1 была подтверждена, по меньшей мере, 3 раза. Усеченный PspA1 был первоначально очищен в опытах со встряхиваемыми колбами с использованием смолы СНТ типа 1 и Capto Qpress почти до 99% чистоты. Позднее после подтверждения стабильной экспрессии усеченного PspA1 в С. glutamicum, экспрессию масштабировали до 1,5 л.Western blot analysis using a polyclonal anti-pspA antibody specific for the N-terminal epitope (SantaCruz) confirmed the expression of truncated PspA1. Expression analysis of recombinant clone 5 was scaled up to 500 ml, and expression of the truncated PspA1 was confirmed at least 3 times. Truncated PspA1 was initially purified in shake flask experiments using CHT type 1 resin and Capto Qpress to nearly 99% purity. Later, after confirmation of stable expression of truncated PspA1 in C. glutamicum, expression was scaled up to 1.5 l.
Очистка и валидация усеченного PspA1.Purification and validation of truncated PspA1.
800 мл культурального супернатанта, содержащего усеченный PspA1 из 1,6 л (0,66 мг/мл), полученного как описано выше, диализовали с порогом отсечения по молекулярной массе 10 кДа и концентрировали до 260 мл (1,92 мг/мл). 70 мл данного диализованного концентрата подвергали очистке с использованием колонок со смолой СНТ типа 1 и Capto Q Impress. Конечное извлечение усеченного PspA1 составляло 162 мг/л.800 ml of culture supernatant containing truncated PspA1 from 1.6 L (0.66 mg/ml) obtained as described above was dialyzed to a molecular weight cutoff of 10 kDa and concentrated to 260 ml (1.92 mg/ml). 70 ml of this dialyzed concentrate was purified using CHT Type 1 and Capto Q Impress resin columns. The final recovery of truncated PspA1 was 162 mg/L.
Анализ MALDI MS/MS гелевой заслонки, содержащей очищенный усеченный PspA1 из SDS-PAGE, дал четкую оценку попадания 233 для пневмококкового поверхностного белка А. 31% покрытие последовательности (фиг. 2) было показано для белка PspA с белком с идентификационным номером NCBI ABY67187.1. Анализ интактной молекулярной массы показал, что молекулярная масса экспрессированного усеченного PspA1 составляет 35,4 кДа. Данная масса совпадает с теоретической молекулярной массой усеченного PspA1. Пик при 17725,4 представляет собой пик молекулы, имеющей заряд 2, поскольку в m/z пик появляется на половине интактной массы усеченного PspA1 (фиг. 3).MALDI MS/MS analysis of a gel blank containing purified truncated PspA1 from SDS-PAGE yielded a clear hit score of 233 for pneumococcal surface protein A. 31% sequence coverage (Fig. 2) was shown for the PspA protein with protein NCBI ID ABY67187. 1. Intact molecular weight analysis indicated that the molecular weight of the expressed truncated PspA1 was 35.4 kDa. This mass matches the theoretical molecular mass of truncated PspA1. The peak at 17725.4 represents the peak of the molecule having charge 2, since in m / z the peak appears at half the intact mass of truncated PspA1 (Fig. 3).
Пример 2. Получение усеченного PspA1.Example 2. Preparation of truncated PspA1.
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, несущую экспрессионную конструкцию, содержащую усеченный ген PspA1 (далее по тексту относящийся к PspA1), восстанавливали из исходного банка в среде LB. Ее использовали для инокуляции ферментера (объемом 5 л; CSTR). В процессе получения контролировали следующие параметры: рН, DO, температура (AT), источник углерода, метаболиты. СтратеCorynebacterium glutamicum ATCC 13032, carrying an expression construct containing a truncated PspA1 gene (hereinafter referred to as PspA1), was recovered from the original bank in LB medium. It was used to inoculate a fermenter (5 L volume; CSTR). During the production process, the following parameters were controlled: pH, DO, temperature (AT), carbon source, metabolites. Strata
- 6 045199 гия подачи, основанная на технологии автоматизации процессов (PAT), была принята для проведения короткой периодической ферментации с подпиткой для получения усеченного PspA1. Отсутствовал индукционный контроль продукта (усеченного PspA1), поскольку это был продукт, связанный с ростом. OD выхода собранного продукта составляла приблизительно 90 (OD600 НМ) на время сбора продукта в полусинтетической среде. Клетки собирали и промывали PBS перед разрушением клеток во Френч-прессе.- 6 045199 feed technology based on process automation technology (PAT) was adopted to perform short fed-batch fermentation to produce truncated PspA1. There was no induction control for the product (truncated PspA1) because it was a growth-related product. The yield OD of the collected product was approximately 90 (OD 600 NM ) at the time of collection of the product in a semi-synthetic medium. Cells were collected and washed with PBS before breaking the cells in a French press.
Очистка усеченного PspA1.Purification of truncated PspA1.
16,2 л отработанной среды с концентрацией общего белка 0,8 мг/мл было собрано из партии ферментации объемом 20 л. 16,2 л отработанной среды концентрировали до 2,6 л (3,6 мг/мл) с использованием кассеты с порогом отсечения по молекулярной массе 10 кДа 0,5 м с последующей диафильтрацией против 20 мМ фосфата калия, рН 6,8, электропроводность 3,2 мС/см. Эти 2,6 л разделяли на две партии, т. е. партию 1 объемом 1,4 л и партию 2 объемом 1,2 л, и переходили к дальнейшей очистке. 500 мл смолы СНТ I помещали в колонку HiScale 50/40. Смолу промывали стерильной дистиллированной водой с последующим уравновешиванием 8 объемами колонки (CV) 20 мМ фосфата калия, рН 6,8 (буфер А). 1400 мл (3,6 мг/мл) концентрата отработанной среды (партия 1) загружали на колонку и собирали проточную фракцию. Колонку промывали 5 объемами колонки буфера A. PspA1 элюировали в ступенчатом градиенте с использованием 250 мМ фосфата калия рН 6,8 (буфер В). Ступенчатый градиент включал 5 CV на стадии 40% В, 5 CV на стадии 80% В и 3 CV 0,5 М калий-фосфатного буфера. Скорость потока поддерживалась на уровне 80 мл/мин в течение всего цикла. PspA1 собирали во фракции 1 на стадии 80% В с объемом фракции 1250 мл (фиг. 4).16.2 L of spent medium with a total protein concentration of 0.8 mg/mL was collected from a 20 L fermentation batch. 16.2 L of spent medium was concentrated to 2.6 L (3.6 mg/ml) using a 10 kDa molecular weight cutoff cassette of 0.5 m, followed by diafiltration against 20 mM potassium phosphate, pH 6.8, conductivity 3.2 mS/cm. These 2.6 L were divided into two batches, i.e. Batch 1 of 1.4 L and Batch 2 of 1.2 L, and proceeded to further purification. 500 ml of SNT I resin was placed in a HiScale 50/40 column. The resin was washed with sterile distilled water followed by equilibration with 8 column volumes (CV) of 20 mM potassium phosphate, pH 6.8 (buffer A). 1400 ml (3.6 mg/ml) of the spent medium concentrate (batch 1) was loaded onto the column and the flow-through fraction was collected. The column was washed with 5 column volumes of buffer A. PspA1 was eluted in a step gradient using 250 mM potassium phosphate pH 6.8 (buffer B). The step gradient included 5 CV at the 40% B stage, 5 CV at the 80% B stage and 3 CV of 0.5 M potassium phosphate buffer. The flow rate was maintained at 80 mL/min throughout the entire run. PspA1 was collected in fraction 1 at the 80% B stage with a fraction volume of 1250 ml (Fig. 4).
Capto Q Impress использовали на второй стадии хроматографии в очистке PspA1. 250 мл смолы Capto Q Impress упаковывали в колонку XK 50/20. Смолу промывали стерильной дистиллированной водой с последующим уравновешиванием 5 объемами колонки (CV) 20 мМ фосфата калия и 100 мМ NaCl, рН 6,8 (буфер А). 1250 мл фракции с колонки со смолой СНТ I разбавляли до 2300 мл 20 мМ фосфатом калия, рН 6,8, загружали на колонку и собирали проточную фракцию. Колонку промывали 5 объемами колонки буфера A. PspA1 элюировали с использованием 12 CV буфера В (20 мМ фосфат калия с 1 М NaCl, рН 6,2) в линейном градиенте от 0 до 40% В и на заключительной стадии 3 CV 100% В. Каждую фракцию собирали в объеме 250 мл. Скорость потока поддерживали на уровне 40 мл/мин. PspA1 собирали в линейном градиенте 40% В с объемом объединенной фракции 1250 мл (фиг. 5).Capto Q Impress was used in the second chromatography step in the purification of PspA1. 250 ml Capto Q Impress resin was packed into an XK 50/20 column. The resin was washed with sterile distilled water followed by equilibration with 5 column volumes (CV) of 20 mM potassium phosphate and 100 mM NaCl, pH 6.8 (buffer A). 1250 ml of the fraction from the column with SNT I resin was diluted to 2300 ml with 20 mM potassium phosphate, pH 6.8, loaded onto the column and the flow-through fraction was collected. The column was washed with 5 column volumes of buffer A. PspA1 was eluted using 12 CV of buffer B (20 mM potassium phosphate with 1 M NaCl, pH 6.2) in a linear gradient from 0 to 40% B and a final step of 3 CV of 100% B. Each fraction was collected in a volume of 250 ml. The flow rate was maintained at 40 ml/min. PspA1 was collected on a linear gradient of 40% B with a pooled fraction volume of 1250 ml (Fig. 5).
Фракции 4,5,6,7 и 8 с колонки с Capto Q объединяли, концентрировали/подвергали диафильтрации с 20 мМ фосфатом калия рН 6,8. Полученное конечное извлечение составляло 100 мл PspA1 с концентрацией 15,5 мг/мл (общее количество PspA1 составляло 1550 мг) из партии 1. Аналогичную процедуру выполняли для партии 2, и полученное конечное извлечение составило 70 мл PspA1 с концентрацией 16 мг/мл (общее количество PspA1 составляло 1120 мг) из партии 2. Очищенный PspA1 из партии 1 и партии 2 составлял 2670 мг из партии объемом 16,2 л (выход очищенного PspA1 составлял 164 мг/л) (фиг. 6).Fractions 4,5,6,7 and 8 from the Capto Q column were pooled, concentrated/diafiltered with 20 mM potassium phosphate pH 6.8. The final recovery obtained was 100 ml of PspA1 at a concentration of 15.5 mg/ml (total amount of PspA1 was 1550 mg) from batch 1. A similar procedure was performed for batch 2 and the final recovery obtained was 70 ml of PspA1 at a concentration of 16 mg/ml (total the amount of PspA1 was 1120 mg) from batch 2. Purified PspA1 from batch 1 and batch 2 was 2670 mg from a 16.2 L batch (yield of purified PspA1 was 164 mg/L) (Fig. 6).
Пример 3. Конструирование рВЕ114k.Example 3. Construction of pBE114k.
Экспрессионный вектор pRSET А (коммерческий вектор от Invitrogen) модифицировали удалением гена устойчивости к ампициллину с использованием рестрикционного расщепления DraI и лигирования с расщепленным SmaI геном, кодирующим канамицин (полученным из pUC4 KIXX). Данный модифицированный вектор обозначали как pRSET-km. Усеченный PspA1 экспрессировали в Escherichia coli под контролем промотора РТ7 (SEQ ID NO: 11) pRSET-km. Короткий участок ДНК, содержащий нативные терминаторы, включали в обратный праймер, использованный для дальнейшей амплификации PspA1. Затем весь усеченный ген PspA1 вместе с его нативным терминатором амплифицировали, расщепляли рестриктазой, добавленной в прямой и обратный праймеры, и клонировали в вектор pRSET-km. Полученный клон обозначали как pBE114k (фиг. 10А). Экспрессионный вектор вместе с усеченным PspA1 в дальнейшем по тексту относится к экспрессионной конструкции. Экспрессионную конструкцию рВЕ114k подтверждали рестрикционным расщеплением (фиг. 10В). Последовательность гена усеченного PspA1 вместе с его экспрессионной кассетой подтверждали секвенированием ДНК.The expression vector pRSET A (commercial vector from Invitrogen) was modified to remove the ampicillin resistance gene using DraI restriction digestion and ligation to the SmaI digested gene encoding kanamycin (derived from pUC4 KIXX). This modified vector was designated pRSET-km. Truncated PspA1 was expressed in Escherichia coli under the control of the PT7 promoter (SEQ ID NO: 11) pRSET-km. A short DNA segment containing native terminators was included in the reverse primer used for further amplification of PspA1. The entire truncated PspA1 gene along with its native terminator was then amplified, digested with a restriction enzyme added to the forward and reverse primers, and cloned into the pRSET-km vector. The resulting clone was designated pBE114k (Fig. 10A). The expression vector together with the truncated PspA1 is referred to hereinafter as an expression construct. The expression construct pBE114k was confirmed by restriction digestion (Fig. 10B). The sequence of the truncated PspA1 gene along with its expression cassette was confirmed by DNA sequencing.
Экспрессия усеченного PspA1.Expression of truncated PspA1.
pBE114k трансформировали в химически компетентные клетки Escherichia coli DH5a-T1R (полученные от Invitrogen) и отбирали на чашках со средой LB с канамицином, который использовали в качестве селективного маркера. Было собрано и анализировано с помощью ПЦР 40 рекомбинантных колоний Escherichia coli. Все 40 колоний отбирали на индуцибельную экспрессию усеченного PspA1. Рекомбинантные колонии вместе с Escherichia coli (в качестве отрицательного контроля) инокулировали в 10 мл бульона Terrific с конечной концентрацией канамицина 25 мкг/мл и инкубировали при 37°С со встряхиванием при 200 об/мин. В середине логарифмической фазы роста добавляли 1 мМ IPTG для индукции экспрессии PspA1 в Escherichia coli (pBE114k). Культуры инкубировали при 30°С со встряхиванием при 200 об/мин в течение 16 ч после индукции. Через 16 ч культуральные супернатанты тестировали на экспрессию усеченного PspA1. Клетки собирали центрифугированием, лизировали и загружали в 12% SDS-PAGE и анализировали на экспрессию усеченного PspA1. Видна заметная полоса приблизительно на уровне 65 кДа. Анализ вестерН блоттингом с использованием поликлонального антитела против PspA, специфичного кpBE114k was transformed into chemically competent Escherichia coli DH5a-T1R cells (obtained from Invitrogen) and selected on LB media plates with kanamycin used as a selectable marker. Forty recombinant Escherichia coli colonies were collected and analyzed by PCR. All 40 colonies were selected for inducible expression of truncated PspA1. Recombinant colonies along with Escherichia coli (as a negative control) were inoculated into 10 ml of Terrific broth with a final kanamycin concentration of 25 μg/ml and incubated at 37°C with shaking at 200 rpm. At mid-log phase of growth, 1 mM IPTG was added to induce PspA1 expression in Escherichia coli (pBE114k). Cultures were incubated at 30°C with shaking at 200 rpm for 16 h after induction. After 16 h, culture supernatants were tested for expression of truncated PspA1. Cells were collected by centrifugation, lysed and loaded onto 12% SDS-PAGE and analyzed for expression of truncated PspA1. A prominent band is visible at approximately 65 kDa. Western blot analysis using a polyclonal anti-PspA antibody specific for
- 7 045199- 7 045199
N-концевому эпитопу (SantaCruz), подтвердил экспрессию усеченного PspAl. Анализ экспрессии рекомбинантного клона 29 подтвердил экспрессию усеченного PspA1 по меньшей мере 3 раза. Усеченный PspA1 первоначально очищали в экспериментах со встряхиваемыми колбами с использованием колонок со смолой СНТ типа 1 и Capto Q Impress.N-terminal epitope (SantaCruz), confirmed the expression of truncated PspAl. Expression analysis of recombinant clone 29 confirmed expression of the truncated PspA1 at least 3-fold. Truncated PspA1 was initially purified in shake flask experiments using CHT type 1 resin columns and Capto Q Impress.
Очистка и валидация усеченного PspA1.Purification and validation of truncated PspA1.
Отбирали 40 г (влажная масса) клеточного осадка из Escherichia coli (pBE114k) и ресуспендировали в 400 мл 20 мМ калий-фосфатного буфера с рН 6,8, содержащего 1 мг/мл лизоцима и 1 мМ PMSF. Клеточную суспензию лизировали с использованием гомогенизатора высокого давления за 3 хода при 1000 фунт/кв. дюйм. 400 мл клеточного лизата с общей концентрацией белка 4 мг/мл разбавляли до 750 мл 20 мМ калий-фосфатным буфером рН 6,8 и очищали, используя смолу СНТ I, и затем смолу Capto Q Impress на второй стадии хроматографии.40 g (wet weight) of cell pellet from Escherichia coli (pBE114k) was collected and resuspended in 400 ml of 20 mM potassium phosphate buffer, pH 6.8, containing 1 mg/ml lysozyme and 1 mM PMSF. The cell suspension was lysed using a high pressure homogenizer for 3 passes at 1000 psi. inch. 400 ml of cell lysate with a total protein concentration of 4 mg/ml was diluted to 750 ml with 20 mM potassium phosphate buffer pH 6.8 and purified using CHT I resin, and then Capto Q Impress resin in a second chromatography step.
250 мл смолы СНТ I помещали в колонку HiScale 50/20. Смолу промывали стерильной дистиллированной водой с последующим уравновешиванием 5 объемами колонки (CV) буфера А. 750 мл разбавленного клеточного лизата загружали на колонку и собирали проточную фракцию. Колонку промывали 5 объемами колонки буфера A. PspA1 элюировали в ступенчатом градиенте, используя 250 мМ фосфат калия, рН 6,8, электропроводность 29,5 мС/см (буфер В). Ступенчатый градиент включал 5 CV на стадии 50% буфера В, 5 CV на стадии 80% буфера В, и колонку промывали 3 CV 0,5 М фосфатно-калиевого буфера рН 6,8, электропроводность 48 мС/см (буфер С). Скорость потока поддерживали на уровне 40 мл/мин в течение всего цикла. Фракции пика белка PspA1 собирали вручную, пул элюированных фракций 5, 6 и 7 на стадии 80% В с конечным объемом 350 мл (фиг. 11).250 ml of SNT I resin was placed in a HiScale 50/20 column. The resin was washed with sterile distilled water followed by equilibration with 5 column volumes (CV) of buffer A. 750 ml of diluted cell lysate was loaded onto the column and the flow-through fraction was collected. The column was washed with 5 column volumes of buffer A. PspA1 was eluted in a step gradient using 250 mM potassium phosphate, pH 6.8, conductivity 29.5 mS/cm (buffer B). The step gradient included 5 CV at 50% buffer B stage, 5 CV at 80% buffer B stage, and the column was washed with 3 CV of 0.5 M potassium phosphate buffer pH 6.8, conductivity 48 mS/cm (buffer C). The flow rate was maintained at 40 mL/min throughout the run. PspA1 protein peak fractions were collected manually, pooling fractions 5, 6 and 7 eluted at 80% B step with a final volume of 350 ml (Figure 11).
Capto Q Impress использовали на второй стадии хроматографии в очистке PspA1. 60 мл смолы Capto Q Impress упаковывали в колонку XK 26/20. Смолу промывали стерильной дистиллированной водой с последующим уравновешиванием 5 объемами колонки (CV) 20 мМ фосфата калия и 100 мМ NaCl, рН 6,8, электропроводность 13,6 мС/см (буфер А). 350 мл фракции с колонки с СНТ I разбавляли до 700 мл 1 мМ фосфатом калия, рН 6,8, загружали на колонку и собирали проточную фракцию. Колонку промывали 5 объемами колонки буфера A. PspA1 элюировали с использованием линейного градиента из 10 объемов колонки буфера В (20 мМ фосфат калия с 1 М NaCl, рН 6,2, электропроводность 89 мС/см) в линейном градиенте от 0 до 40% В, которые собирали вручную, фракции 4-8, 10 и 11 составляли 60 мл, и фракции 9 и 12 составляли 100 мл (фиг. 12). На заключительной стадии из 3 CV 100% В, собирали 180 мл в виде фракции 13. Скорость потока поддерживали на уровне 10 мл/мин. Белок PspA1 собирали во фракции 9 в линейном градиенте 40% В, которая составляла 100 мл.Capto Q Impress was used in the second chromatography step in the purification of PspA1. 60 ml of Capto Q Impress resin was packed into an XK 26/20 column. The resin was washed with sterile distilled water followed by equilibration with 5 column volumes (CV) of 20 mM potassium phosphate and 100 mM NaCl, pH 6.8, conductivity 13.6 mS/cm (buffer A). 350 ml of the fraction from the column with SNT I was diluted to 700 ml with 1 mM potassium phosphate, pH 6.8, loaded onto the column, and the flow-through fraction was collected. The column was washed with 5 column volumes of buffer A. PspA1 was eluted using a linear gradient from 10 column volumes of buffer B (20 mM potassium phosphate with 1 M NaCl, pH 6.2, conductivity 89 mS/cm) in a linear gradient from 0 to 40% B that were collected manually, fractions 4-8, 10 and 11 were 60 ml, and fractions 9 and 12 were 100 ml (Fig. 12). At the final stage, from 3 CV 100% B, 180 ml was collected as fraction 13. The flow rate was maintained at 10 ml/min. PspA1 protein was collected in fraction 9 in a linear gradient of 40% B, which was 100 ml.
Собирали фракцию 9 с колонки с Capto Q, концентрировали/подвергали диафильтрации с 20 мМ фосфатом калия, рН 6,8. Полученное конечное извлечение составляло 100 мл PspA1 с концентрацией 5 мг/мл белка (общий белок PspA1 равнялся 500 мг) из 400 мл клеточного лизата с концентрацией 4 мг/мл. % извлечения составил 31,25.Fraction 9 from the Capto Q column was collected and concentrated/diafiltered with 20 mM potassium phosphate, pH 6.8. The final recovery obtained was 100 ml PspA1 at 5 mg/ml protein (total PspA1 protein was 500 mg) from 400 ml cell lysate at 4 mg/ml. % recovery was 31.25.
Анализ MALDI MS/MS гелевой заслонки, содержащей очищенный усеченный PspA1 из SDS-PAGE, дал четкую оценку попадания 223 для поверхностного пневмококкового белка А. 39% покрытие последовательности (фиг. 13) было показано для белка PspA с белком с идентификационным номером NCBI WP_050210652.1.MALDI MS/MS analysis of a gel blank containing purified truncated PspA1 from SDS-PAGE yielded a clear hit score of 223 for pneumococcal surface protein A. 39% sequence coverage (Fig. 13) was shown for the PspA protein with protein NCBI ID number WP_050210652. 1.
Анализ интактной молекулярной массы показал, что молекулярная масса экспрессированного усеченного PspA1 составляет 41,96 кДа. Анализ интактной массы усеченного PspA1, экспрессированного в Escherichia coli, показал 41966 Да (41,9 кДа), что совпадает с теоретической молекулярной массой усеченного PspA1. Пик при 20982,7 Да является пиком молекулы, имеющей заряд 2, поскольку в m/z пик появляется на половине интактной массы усеченного PspA1 (фиг. 14).Intact molecular weight analysis indicated that the molecular weight of the expressed truncated PspA1 was 41.96 kDa. Analysis of the intact mass of truncated PspA1 expressed in Escherichia coli showed 41,966 Da (41.9 kDa), which matches the theoretical molecular mass of truncated PspA1. The peak at 20982.7 Da is the peak of the molecule having charge 2, since in m/z the peak appears at half the intact mass of truncated PspA1 (Fig. 14).
Пример 4. Конъюгация отдельного пневмококкового полисахарида с белком-носителем с образованием конъюгатов полисахарид-усеченный PspA1.Example 4. Conjugation of a single pneumococcal polysaccharide to a carrier protein to form polysaccharide-truncated PspA1 conjugates.
Активация серотипа 3 и конъюгация с усеченным PspA1.Serotype 3 activation and conjugation to truncated PspA1.
Серотип 3 (6,0 мл PS, концентрация 10 мг/мл) и CDAP (100 мг/мл в ацетонитриле (мас./об.) в приблизительном соотношении по размеру 1:1 смешивали в стеклянном флаконе и перемешивали в течение 1 мин. рН пневмококкового полисахарида серотипа 3 доводили до 9,25 с использованием 0,2 М триэтиламина и перемешивали в течение 3 мин при комнатной температуре (RT). Усеченный PspA1 (4,0 мл с концентрацией 15,0 мг/мл) добавляли к активированному серотипу 3 в соотношении 1:1 (усеченный PspA1:серотип 3).Serotype 3 (6.0 mL PS, 10 mg/mL concentration) and CDAP (100 mg/mL in acetonitrile (w/v) in an approximate size ratio of 1:1 were mixed in a glass vial and stirred for 1 min. The pH of pneumococcal polysaccharide serotype 3 was adjusted to 9.25 using 0.2 M triethylamine and stirred for 3 min at room temperature (RT). Truncated PspA1 (4.0 ml at a concentration of 15.0 mg/ml) was added to the activated serotype 3 in a 1:1 ratio (truncated PspA1:serotype 3).
рН реакционной смеси доводили до 9,05 с использованием 0,2 М триэтиламина, и реакцию продолжали при перемешивании в течение 5 ч при комнатной температуре, и, наконец, реакцию гасили добавлением избыточной концентрации глицина.The pH of the reaction mixture was adjusted to 9.05 using 0.2 M triethylamine, and the reaction was continued with stirring for 5 hours at room temperature, and finally the reaction was quenched by adding excess glycine.
Реакционную смесь подвергали диафильтрации, используя мембрану с порогом отсечения по молекулярной массе 100 кДа, и очищали с помощью эксклюзионной хроматографии, где сплошная линия соответствует полисахаридам и пунктирная линия - усеченному PspA1, и 5-часовая реакция представлена пунктирной линией на хроматограмме А (фиг. 7). Фракции анализировали антроновым методом SEC-MALLS, фракции, содержащие конъюгаты, объединяли и стерилизовали фильтрованием с использованием 0,2 мкм фильтров. Далее данный материал называется моновалентным конъюгатом (конъюгатThe reaction mixture was diafiltered using a 100 kDa molecular weight cutoff membrane and purified by size exclusion chromatography, where the solid line represents polysaccharides and the dotted line represents truncated PspA1, and the 5 hour reaction is represented by the dotted line in chromatogram A (Figure 7 ). Fractions were analyzed by the anthrone SEC-MALLS method, and fractions containing conjugates were pooled and filter sterilized using 0.2 μm filters. Hereafter, this material is called a monovalent conjugate (conjugate
- 8 045199 серотип 3-усеченный PspAl).- 8 045199 serotype 3-truncated PspAl).
Активация серотипа 6А и конъюгация с усеченным PspAl.Activation of serotype 6A and conjugation to truncated PspAl.
Серотип 6А (6,0 мл PS, концентрация 10 мг/мл) и CDAP (100 мг/мл в ацетонитриле (мас./об.) в приблизительном соотношении по размеру 1:1 смешивали в стеклянном флаконе и перемешивали в течение 1 мин. рН пневмококкового полисахарида серотипа 6А доводили до 9,25 с использованием 0,2 М триэтиламина и перемешивали в течение 3 мин при комнатной температуре (RT). Усеченный PspA1 (4,0 мл с концентрацией 15,0 мг/мл) добавляли к активированному серотипу 6А в соотношении 1:1 (усеченный PspA1: серотип 6А).Serotype 6A (6.0 mL PS, 10 mg/mL concentration) and CDAP (100 mg/mL in acetonitrile (w/v) in an approximate size ratio of 1:1 were mixed in a glass vial and stirred for 1 min. The pH of pneumococcal polysaccharide serotype 6A was adjusted to 9.25 using 0.2 M triethylamine and stirred for 3 min at room temperature (RT). Truncated PspA1 (4.0 ml at a concentration of 15.0 mg/ml) was added to the activated serotype 6A in a 1:1 ratio (truncated PspA1: serotype 6A).
рН реакционной смеси доводили приблизительно до 9,05 с использованием 0,2 М триэтиламина, и реакцию продолжали при перемешивании в течение 5 ч при комнатной температуре, и, наконец, реакцию гасили добавлением избыточной концентрации глицина.The pH of the reaction mixture was adjusted to approximately 9.05 using 0.2 M triethylamine, and the reaction was continued with stirring for 5 hours at room temperature, and finally the reaction was quenched by adding excess glycine.
Реакционную смесь подвергали диафильтрации, используя мембрану с порогом отсечения по молекулярной массе 100 кДа, и очищали с помощью эксклюзионной хроматографии, где сплошная линия соответствует полисахаридам, и пунктирная линия соответствует усеченному PspA1, и 5-часовая реакция представлена пунктирной линией на хроматограмме В (фиг. 7). Фракции анализировали антроновым методом SEC-MALLS, и фракции, содержащие конъюгаты, объединяли и стерилизовали фильтроваением с использованием фильтров 0,2 мкм. Далее данный материал называется моновалентным конъюгатом (конъюгат серотип 6А-усеченный PspA1).The reaction mixture was diafiltered using a 100 kDa molecular weight cutoff membrane and purified by size exclusion chromatography, where the solid line represents polysaccharides and the dotted line represents truncated PspA1, and the 5 hour reaction is represented by the dotted line in chromatogram B (Fig. 7). Fractions were analyzed by the anthrone SEC-MALLS method, and fractions containing conjugates were pooled and filter sterilized using 0.2 μm filters. Hereafter, this material is called a monovalent conjugate (serotype 6A-truncated PspA1 conjugate).
Активация серотипа 6В и конъюгация с усеченным PspA1.Activation of serotype 6B and conjugation to truncated PspA1.
Серотип 6В (6,0 мл PS, концентрация 10 мг/мл) и CDAP (100 мг/мл в ацетонитриле (мас./об.) в приблизительном соотношении по размеру 1:1 смешивали в стеклянном флаконе и перемешивали в течение 1 мин. рН пневмококкового полисахарида серотипа 6В доводили до 9,25 с использованием 0,2 М триэтиламина и перемешивали в течение 3 мин при комнатной температуре (RT). Усеченный PspA1 (4,0 мл с концентрацией 15,0 мг/мл) добавляли к активированному серотипу 6В в соотношении 1:1 (усеченный PspA1: серотип 6В).Serotype 6B (6.0 mL PS, 10 mg/mL concentration) and CDAP (100 mg/mL in acetonitrile (w/v) in an approximate size ratio of 1:1 were mixed in a glass vial and stirred for 1 min. The pH of pneumococcal polysaccharide serotype 6B was adjusted to 9.25 using 0.2 M triethylamine and stirred for 3 min at room temperature (RT). Truncated PspA1 (4.0 ml at a concentration of 15.0 mg/ml) was added to the activated serotype 6B in a 1:1 ratio (truncated PspA1: serotype 6B).
рН реакционной смеси доводили до 9,05 с использованием 0,2 М триэтиламина, и реакцию продолжали при перемешивании в течение 5 ч при комнатной температуре, и, наконец, реакцию гасили добавлением избыточной концентрации глицина.The pH of the reaction mixture was adjusted to 9.05 using 0.2 M triethylamine, and the reaction was continued with stirring for 5 hours at room temperature, and finally the reaction was quenched by adding excess glycine.
Реакционную смесь подвергали диафильтрации с использованием мембраны с порогом отсечения по молекулярной массе 100 кДа и очищали с помощью эксклюзионной хроматографии, где сплошная линия соответствует полисахаридам, и пунктирная линия соответствует усеченному PspA1, и 5-ч реакция представлена пунктирной линией на хроматограмме С (фиг. 7). Фракции анализировали антроновым методом SEC-MALLS, и фракции, содержащие конъюгаты, объединяли и стерилизовали фильтрованием с использованием 0,2 мкм фильтров. Далее данный материал называется моновалентным конъюгатом (конъюгат серотип 6В-усеченный PspA1).The reaction mixture was diafiltered using a 100 kDa molecular weight cutoff membrane and purified by size exclusion chromatography, where the solid line represents polysaccharides and the dotted line represents truncated PspA1, and the 5-h reaction is represented by the dotted line in chromatogram C (Figure 7 ). Fractions were analyzed by the anthrone SEC-MALLS method, and fractions containing conjugates were pooled and filter sterilized using 0.2 μm filters. Hereafter, this material is called a monovalent conjugate (serotype 6B-truncated PspA1 conjugate).
Пример 5. Исследование иммуногенности конъюгированной вакцины.Example 5. Study of the immunogenicity of a conjugate vaccine.
Готовили два состава, содержащие 2,2 или 4,4 мкг серотипов 3, 6А и 6В, каждый конъюгированный с усеченным PspA1, содержащих 2,2 мкг серотипов 1, 4, 5, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, каждый конъюгированный с CRM197. Эти конъюгаты были адсорбированы на А1-гидрогеле.Two formulations were prepared containing 2.2 or 4.4 μg of serotypes 3, 6A and 6B, each conjugated to truncated PspA1, containing 2.2 μg of serotypes 1, 4, 5, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F and 33F, each conjugated to CRM 197 . These conjugates were adsorbed onto Al hydrogel.
Кроликов с массой тела 1,5-2 кг разделяли на группы по 7 животных в каждой и иммунизировали вышеуказанными составами конъюгатов. Образцы сыворотки крови анализировали до и после иммунизации. Сыворотку, полученную от иммунизированных кроликов, анализировали на наличие полисахарид-специфических антител в непрямом ELISA.Rabbits weighing 1.5-2 kg were divided into groups of 7 animals each and immunized with the above conjugate compositions. Serum samples were analyzed before and after immunization. Serum obtained from immunized rabbits was analyzed for the presence of polysaccharide-specific antibodies in an indirect ELISA.
Титр сывороточных антител у иммунизированных кроликов определяли с использованием непрямого ELISA. Планшеты для микротитрования, покрытые специфическими полисахаридами, подвергали взаимодействию с сывороточными антителами. Сыворотку кроликов до иммунизации, после 1 и 2 дозы использовали для анализа, где на оси Y представлен титр антител, полученный с использованием обратного значения максимального разведения, которое дало ELISA OD450 выше порогового значения. Титр сывороточных антител у кроликов до иммунизации был ниже предела обнаружения. Пустые столбцы указывают титр после введения первой дозы вакцины, и черные сплошные столбцы указывают титр антител после введения второй дозы вакцины (фиг. 8 и 9). Наблюдали дозозависимое увеличение титров как серотипа, конъюгированного с усеченным PspA1, так и для серотипа конъюгированного с CRM197. Титры антител на полисахарид, конъюгированный с CRM197, не ингибировались присутствием конъюгатов с усеченным PspA1 и наоборот. Это указывает на то, что усеченный PspA1 можно использовать в качестве альтернативного белка-носителя для полисахарид-белковой конъюгированной вакцины.Serum antibody titers in immunized rabbits were determined using indirect ELISA. Microtiter plates coated with specific polysaccharides were reacted with serum antibodies. Rabbit sera before immunization, after doses 1 and 2 were used for the assay, where the Y axis represents the antibody titer obtained using the reciprocal of the maximum dilution that gave the ELISA OD 450 above the cutoff value. The serum antibody titer in rabbits before immunization was below the detection limit. Empty bars indicate the titer after the first dose of vaccine, and black solid bars indicate the antibody titer after the second dose of vaccine (Figs. 8 and 9). A dose-dependent increase in titers was observed for both the truncated PspA1-conjugated serotype and the CRM-conjugated serotype 197 . Antibody titers to the polysaccharide conjugated to CRM 197 were not inhibited by the presence of conjugates with truncated PspA1 and vice versa. This indicates that truncated PspA1 can be used as an alternative carrier protein for polysaccharide-protein conjugate vaccine.
Claims (15)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IN201841007814 | 2018-03-01 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045199B1 true EA045199B1 (en) | 2023-10-31 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6636546B2 (en) | Expression system | |
| KR100316004B1 (en) | Method and plasmid for production of crm protein and diphtheria toxin | |
| US20230322871A1 (en) | Expression of pneumococcal surface protein a (pspa) | |
| JP7042305B2 (en) | Codon-optimized polynucleotide for high-level expression of CRM197 | |
| US20080219960A1 (en) | Novel Efficient Production Process for Capsular Polysaccharides of Pathogenic Grampositive Bacteria by Heterologous Expression and Secretion of Complex Polysaccharides in Non-Pathogenic, Non-Invasive Gram-Positive Bacteria | |
| EA006232B1 (en) | Streptococcus antigens | |
| PT778781E (en) | VACCINES OF CONJUGATES OF PNEUMOCOCCUS-PNEUMOCOCHINE POLYNOSIS RECOMBINANT FOR IMMUNIZATION AGAINST PNEUMOCOCCAL INFECTIONS | |
| KR100338894B1 (en) | Vaccine compositions | |
| TW593678B (en) | Live attenuated bacteria of the species actinobacillus pleuropneumoniae | |
| CA2235445A1 (en) | Clostridium perfringens vaccine | |
| EP0810283A2 (en) | Live attenuated RTX-procucing bacteria of the family Pasteurellaceae | |
| Frey et al. | Cloning and characterization of an Actinobacillus pleuropneumoniae outer membrane protein belonging to the family of PAL lipoproteins | |
| EA045199B1 (en) | EXPRESSION OF PNEUMOCOCCAL SURFACE PROTEIN A (PspA) | |
| US20040202678A1 (en) | Actinobacillus pleuropneumoniae subunit vaccine | |
| US6770275B1 (en) | Live attenuated RTC-producing bacteria of the family | |
| OA20033A (en) | Expression of Pneumococcal Surface Protein A (PSPA). | |
| RU2745161C1 (en) | Method of obtainig an attenuated plasmid-free strain of f.tularensis 15 cmsa, synthesizing mycobacterial antigen superoxide dismutase a | |
| Cho et al. | Active Immunity and Passive Protective Antibody against Pseudomonas Exotoxin A Intoxication | |
| MXPA98002798A (en) | Live attenuated bacteria of the species actinobacillus pleuropneumon |