EA045169B1

EA045169B1 - SERUM-FREE CELL CULTURE MEDIUM

Info

Publication number: EA045169B1
Application number: EA202190326
Authority: EA
Inventors: Шадиа Ошоди; Эми Джонсон; Шаун Лоуренс
Original assignee: Регенерон Фарматютикалз, Инк.
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-14
Publication date: 2023-10-31

Description

Область техники, к которой относится настоящее изобретениеField of technology to which the present invention relates

Изобретение относится к средам для культивирования клеток и для получения рекомбинантных белков. Изобретение конкретно относится к не содержащим сыворотки средам для культивирования рекомбинантных клеток СНО для получения белковых биотерапевтических средств.The invention relates to media for cell culture and for the production of recombinant proteins. The invention specifically relates to serum-free media for culturing recombinant CHO cells for the production of protein biotherapeutics.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION

Среды для культивирования клеток, содержащие компоненты сыворотки или гидролизата белков (т.е. пептоны и триптоны) имеют длительную историю применения в получении рекомбинантных белков из культивируемых клеток. Эти компоненты содержат факторы роста и широкий спектр других неохарактеризованных элементов, благоприятных для роста и культуры клеток. Однако они также содержат ^охарактеризованные элементы, которые уменьшают рост или иным образом отрицательно воздействуют на продукцию рекомбинантного белка. Они также могут являться нежелательным потенциальным источником вариабельности. Несмотря на их недостатки, преимущества использования сывороток и гидролизатов перевешивают определенные недостатки и их широко использовали во многих применениях культур клеток.Cell culture media containing whey or protein hydrolyzate components (i.e., peptones and tryptones) have a long history of use in the production of recombinant proteins from cultured cells. These components contain growth factors and a wide range of other uncharacterized elements beneficial for cell growth and culture. However, they also contain characterized elements that reduce growth or otherwise adversely affect recombinant protein production. They may also be an undesirable potential source of variability. Despite their disadvantages, the advantages of using serums and hydrolysates outweigh certain disadvantages and they have been widely used in many cell culture applications.

Как правило, биологические терапевтические средства (биофармацевтические средства) для человека получают в культурах клеток млекопитающих, в частности в культуре клеток СНО. Присутствие неохарактеризованных или частично охарактеризованных компонентов в этих культурах клеток для получения биофармацевтических средств для применения для человека крайне нежелательно. Использование таких неохарактеризованных или частично охарактеризованных компонентов не только вносит производственные и нормативные несоответствия, но и повышает возможность вирусной или грибковой инфекции продуцирующей культуры.Typically, biological therapeutic agents (biopharmaceuticals) for humans are produced in mammalian cell cultures, in particular in CHO cell cultures. The presence of uncharacterized or partially characterized components in these cell cultures for the production of biopharmaceuticals for human use is highly undesirable. The use of such uncharacterized or partially characterized components not only introduces manufacturing and regulatory inconsistencies, but also increases the possibility of viral or fungal infection of the producing crop.

Другим важным фактором при выборе с культивирования является снижение вариабельности состава и выхода лекарственного продукта от партии к партии. Сыворотки, гидролизаты и другие неопределенные элементы вносят вариабельность в выход, состав и качество партии биофармацевтических препаратов. Качество и чистота элементов среды также может влиять на выход, так как титры лекарственных средств часто частично зависят от поддержания конкретного баланса питательных веществ. Когда относительные количества питательных веществ варьируют от одной партии среды к другой, выход лекарственного средства может варьировать и эта вариабельность может являться неприемлемой или невыгодной.Another important factor when choosing from cultivation is to reduce batch-to-batch variability in the composition and yield of the drug product. Serums, hydrolysates and other unidentified elements introduce variability in the yield, composition and quality of biopharmaceutical batches. The quality and purity of media elements can also influence yield, as drug titers are often dependent in part on maintaining a specific nutrient balance. When the relative amounts of nutrients vary from one batch of media to another, drug yield may vary and this variability may be unacceptable or disadvantageous.

Использование сред, содержащих сыворотку, или сред на основе гидролизатов вносит трудности в дальнейшую переработку. Концентрация желаемого биофармацевтического средства в культуре, как правило, составляет порядка нескольких грамм на литр. Присутствие сыворотки и гидролизатов в средах может добавлять более 10 г/л неохарактеризованных пептидов и белков, которые необходимо удалить на последующих этапах обработки. Также сыворотка и гидролизаты могут вносить вариабельность в количество металлов и других микроэлементах в средах. Таким образом, удаление сыворотки и гидролизатов из сред для культивирования устраняет эти вариации и потенциальные препятствия для получения и обработки лекарственного вещества.The use of whey-containing or hydrolysate-based media introduces difficulties in further processing. The concentration of the desired biopharmaceutical in culture is typically on the order of several grams per liter. The presence of whey and hydrolysates in media can add more than 10 g/L of uncharacterized peptides and proteins that must be removed in subsequent processing steps. Also, whey and hydrolysates can introduce variability in the amount of metals and other trace elements in the media. Thus, removing serum and hydrolysates from culture media eliminates these variations and potential barriers to drug substance production and processing.

Наряду с другими преимущества использования не содержащих сывороток и гидролизатов сред включают снижение стоимости, снижение вариабельности между партиями лекарственных средств и минимизация риска внесения непредусмотренных средств из неопределенных и неочищенных компонентов. Кроме того, когда среды при запуске разных партий являются определенными и одинаковыми, подобным образом можно минимизировать оценочные запуски для тестирования новых партий сред по отношению к используемым средам. Таким образом, в данной области существует необходимость в средах для культивирования клеток млекопитающих, где среды являются химически определенными и не содержат сывороток и гидролизатов, или среды не содержат сывороток и содержат низкие контролируемые уровни гидролизатов, и при этом обеспечивают значительный и активный рост и поддержание клеток и продукцию биофармацевтических лекарственных веществ с высокими титрами.Among other benefits, the use of serum- and hydrolysate-free media includes reduced cost, reduced batch-to-batch variability, and minimized risk of introducing unintended agents from unidentified and impure components. In addition, when the environments are defined and the same across batches, evaluation runs to test new batches of environments against existing environments can be minimized in this way. Thus, there is a need in the art for mammalian cell culture media where the media are chemically defined and free of serums and hydrolysates, or the media are serum free and contain low, controlled levels of hydrolysates, while still allowing for significant and robust cell growth and maintenance. and production of high titer biopharmaceutical drug substances.

Краткое раскрытие настоящего изобретенияBrief Disclosure of the Present Invention

Авторы изобретения сделали неожиданное открытие, что добавление орнитина, с путресцином или без, в среды для культивирования клеток, которые не содержат сыворотки (OS среды) увеличивает жизнеспособность и плотность клеток, уменьшает время удвоения клеток и обеспечивает продукцию белка этими клетками с высокими титрами. Авторы изобретения также выявили, что OS среды, которые содержат низкие или следовые количества белковых гидролизатов или химически определены (например, не содержат белковых гидролизатов), в частности обеспечивают жизнеспособность и плотность восстановленных клеток, время удвоения клеток и продукцию белка с высоким титром.The inventors made the unexpected discovery that the addition of ornithine, with or without putrescine, to cell culture media that do not contain serum (OS media) increases cell viability and density, reduces cell doubling time, and allows these cells to produce high titers of protein. The inventors have also discovered that OS media that contain low or trace amounts of protein hydrolysates or are chemically defined (eg, do not contain protein hydrolysates) particularly provide reconstituted cell viability and density, cell doubling time, and high titer protein production.

В одном из аспектов изобретение относится к среде для культивирования клеток, которая не содержит сыворотки и содержит по меньшей мере 0,09 мМ ± 0,014 мМ орнитина. В одном из вариантов осуществления орнитин присутствует в среде в концентрации в диапазоне от 0,09 ± 0,014 мМ до 0,9 ± 0,14 мМ, такой как 0,09 ± 0,014 мМ, 0,3 ± 0,05 мМ, 0,6 ± 0,09 мМ или 0,9 ± 0,14 мМ орнитина. В определенных вариантах осуществления среда также содержит по меньшей мере 0,20 ± 0,03 мМ путресцина. В определенных вариантах осуществления дополнительный путресцин содержится в концентрации в диапа- 1 045169 зоне от 0,20 ± 0,03 мМ до 0,714 ± 0,11 мМ, такой как 0,20 ± 0,03 мМ, 0,35 ± 0,06 или 0,714 ± 0,11 мМ путресцина. В определенных вариантах осуществления среда содержит < 7,5 г/л гидролизата. В определенных вариантах осуществления среда не содержит никакого гидролизата.In one aspect, the invention provides a cell culture medium that is serum-free and contains at least 0.09 mM ± 0.014 mM ornithine. In one embodiment, ornithine is present in the medium at a concentration ranging from 0.09 ± 0.014 mM to 0.9 ± 0.14 mM, such as 0.09 ± 0.014 mM, 0.3 ± 0.05 mM, 0. 6 ± 0.09 mM or 0.9 ± 0.14 mM ornithine. In certain embodiments, the medium also contains at least 0.20 ± 0.03 mM putrescine. In certain embodiments, the additional putrescine is contained at a concentration ranging from 0.20 ± 0.03 mM to 0.714 ± 0.11 mM, such as 0.20 ± 0.03 mM, 0.35 ± 0.06 or 0.714 ± 0.11 mM putrescine. In certain embodiments, the medium contains <7.5 g/L hydrolyzate. In certain embodiments, the medium does not contain any hydrolyzate.

В одном из вариантов осуществления среда содержит основную среду, которая химически определена, такую как самостоятельно разработанный состав или коммерчески доступная основная среда. В одном из вариантов осуществления полная среда является химически определенной, не содержащей сыворотки и не содержащей гидролизата.In one embodiment, the medium comprises a basic medium that is chemically defined, such as a proprietary formulation or a commercially available basic medium. In one embodiment, the complete medium is chemically defined, serum-free, and hydrolyzate-free.

В определенных вариантах осуществления среда, которая находится в ее пригодной концентрации (например, 1х), содержит по меньшей мере 40 ± 6 мМ или по меньшей мере 70 ± 10,5 мМ смеси аминокислот или солей аминокислот. В одном из вариантов осуществления среда содержит по меньшей мере 40 мМ смеси аминокислот. В этом или другом варианте осуществления среда содержит по меньшей мере 70 мМ смеси аминокислот. В одном из вариантов осуществления смесь аминокислот (с заметным исключением глутамина, который можно добавлять обратно в среду в качестве добавки в момент использования) содержит аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутаминовую кислоту, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин и валин.In certain embodiments, the medium, which is at its suitable concentration (eg, 1x), contains at least 40 ± 6 mM or at least 70 ± 10.5 mM of a mixture of amino acids or amino acid salts. In one embodiment, the medium contains at least 40 mM of a mixture of amino acids. In this or another embodiment, the medium contains at least 70 mM of a mixture of amino acids. In one embodiment, the amino acid mixture (with the notable exception of glutamine, which can be added back to the medium as a point-of-use supplement) contains alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine , methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine and valine.

В определенных вариантах осуществления среда содержит одну или несколько жирных кислот. В одном конкретном варианте осуществления среда содержит смесь жирных кислот (или производных жирных кислот) и альфа-токоферол. Жирные кислоты или производные жирных кислот выбраны из группы, состоящей из линолевой кислоты, линоленовой кислоты, липоевой кислоты, олеиновой кислоты, пальмитиновой кислоты, стеариновой кислоты, арахидиновой кислоты, кислоты, лауриновой кислоты, бегеновой кислоты, каприловой кислоты, лауриновой кислоты, гексановой кислоты, лигноцериновой кислоты, миристиновой кислоты, и октановой кислоты.In certain embodiments, the medium contains one or more fatty acids. In one specific embodiment, the medium contains a mixture of fatty acids (or fatty acid derivatives) and alpha-tocopherol. The fatty acids or fatty acid derivatives are selected from the group consisting of linoleic acid, linolenic acid, lipoic acid, oleic acid, palmitic acid, stearic acid, arachidic acid, acid, lauric acid, behenic acid, caprylic acid, lauric acid, hexanoic acid, lignoceric acid, myristic acid, and octanoic acid.

В определенных вариантах осуществления среда содержит смесь нуклеозидов. В одном из вариантов осуществления среда содержит аденозин, гуанозин, цитидин, уридин, тимидин и гипоксантин.In certain embodiments, the medium contains a mixture of nucleosides. In one embodiment, the medium contains adenosine, guanosine, cytidine, uridine, thymidine and hypoxanthine.

В определенных вариантах осуществления среда содержит смесь солей. Соли включают двухвалентные катионы, такие как кальций и магний. В одном из вариантов осуществления среда содержит хлорид кальция и сульфат магния. Другие соли могут включать соли фосфата.In certain embodiments, the medium contains a mixture of salts. Salts include divalent cations such as calcium and magnesium. In one embodiment, the medium contains calcium chloride and magnesium sulfate. Other salts may include phosphate salts.

В конкретном варианте осуществления среда (1) содержит < 7,5 г/л гидролизата, (2) не содержит сыворотки, (3) содержит 0,09 ± 0,014 мМ, 0,3 ± 0,05 мМ, 0,6 ± 0,09 мМ или 0,9 ± 0,14 мМ орнитина, (4) необязательно дополнительно содержит 0,20 ± 0,03 мМ, 0,35 ± 0,06 или 0,714 ± 0,11 мМ путресцина, (5) содержит по меньшей мере приблизительно 40 мМ или по меньшей мере приблизительно 70 мМ смеси аминокислот, включая аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутаминовую кислоту, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин и валин, (6) содержит токоферол и смесь жирных кислот, (7) содержит смесь нуклеозидов, включая аденозин, гуанозин, цитидин, уридин, тимидин и гипоксантин и (8) содержит соли кальция, магния и фосфата.In a specific embodiment, the medium (1) contains <7.5 g/L hydrolyzate, (2) does not contain serum, (3) contains 0.09 ± 0.014 mM, 0.3 ± 0.05 mM, 0.6 ± 0 .09 mM or 0.9 ± 0.14 mM ornithine, (4) optionally additionally contains 0.20 ± 0.03 mM, 0.35 ± 0.06 or 0.714 ± 0.11 mM putrescine, (5) contains at least about 40 mM or at least about 70 mM a mixture of amino acids, including alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine and valine, (6) contains tocopherol and a mixture of fatty acids, (7) contains a mixture of nucleosides including adenosine, guanosine, cytidine, uridine, thymidine and hypoxanthine and (8) contains calcium, magnesium and phosphate salts.

В другом аспекте изобретение относится к способу культивирования клеток в среде для культивирования клеток, такой как любой вариант осуществления среды, описанный в указанном выше аспекте. В одном из вариантов осуществления в способе используют этапы размножения или поддержания клетки или клеток в среде, которая (1) содержит < 7,5 г/л гидролизата или не содержит гидролизата, (2) не содержит сыворотки, (3) содержит орнитин в концентрации по меньшей мере 0,09 мМ ± 0,014 мМ (4) и необязательно содержит путресцин, например, по меньшей мере 0,20 ± 0,03 мМ.In another aspect, the invention relates to a method of culturing cells in a cell culture medium, such as any embodiment of the medium described in the above aspect. In one embodiment, the method involves the steps of propagating or maintaining a cell or cells in a medium that (1) contains <7.5 g/L hydrolysate or does not contain hydrolysate, (2) does not contain serum, (3) contains ornithine at a concentration at least 0.09 mM ± 0.014 mM (4) and optionally contains putrescine, for example at least 0.20 ± 0.03 mM.

В определенных вариантах осуществления клетка или клетки представляют собой клетки млекопитающих, клетки птиц, клетки насекомых, клетки дрожжей или клетки бактерий. В одном из вариантов осуществления клетки представляют собой клетки млекопитающих, пригодные для получения рекомбинантных белков, такие как клетки CHO или производные CHO-K1. В определенных вариантах осуществления клетки экспрессируют представляющий интерес белок, такой как биотерапевтический белок. Биотерапевтический белок может представлять собой антигенсвязывающий белок, который может содержать Fc-домен. В определенных вариантах осуществления представляющий интерес белок представляет собой слитый белок рецептор-Fc, такой как молекула scFv или молекула-ловушка. Молекулы-ловушки включают белки ловушки VEGF и ловушки IL-1. В определенных вариантах осуществления представляющий интерес белок представляет собой антитело, такое как гуманизированное моноклональное антитело, биспецифическое антитело или фрагмент антитела.In certain embodiments, the cell or cells are mammalian cells, avian cells, insect cells, yeast cells, or bacterial cells. In one embodiment, the cells are mammalian cells suitable for producing recombinant proteins, such as CHO cells or CHO-K1 derivatives. In certain embodiments, the cells express a protein of interest, such as a biotherapeutic protein. The biotherapeutic protein may be an antigen binding protein, which may contain an Fc domain. In certain embodiments, the protein of interest is a receptor-Fc fusion protein, such as a scFv molecule or a decoy molecule. Decoy molecules include VEGF decoy and IL-1 decoy proteins. In certain embodiments, the protein of interest is an antibody, such as a humanized monoclonal antibody, a bispecific antibody, or an antibody fragment.

Принимая во внимание положительное действие на рост клеток добавления в не содержащие сыворотки среды орнитина или комбинации орнитина и путресцина, время удвоения клеток, культивируемых этим способом, составляет не более 30 ч. В одном из вариантов осуществления время удвоения клеток составляет не более 24 ч. В одном из вариантов осуществления при сравнении роста клеток в средах, которые содержит менее 0,09 ± 0,014 мМ орнитина (или менее 0,09 ± 0,014 мМ орнитина и менее 0,2 ± 0,03 мМ путресцина), время удвоения при росте клеток по этому способу составляет по меньшей мере одну треть от времени удвоения сравниваемой контрольной культуры.Considering the positive effect on cell growth of adding ornithine or a combination of ornithine and putrescine to serum-free media, the doubling time of cells cultured by this method is no more than 30 hours. In one embodiment, the cell doubling time is no more than 24 hours. In one embodiment, when comparing cell growth in media that contains less than 0.09 ± 0.014 mM ornithine (or less than 0.09 ± 0.014 mM ornithine and less than 0.2 ± 0.03 mM putrescine), the doubling time for cell growth according to This method is at least one third of the doubling time of the compared control culture.

- 2 045169- 2 045169

Подобным образом, добавление орнитина, отдельно или комбинации орнитина и путресцина, в не содержащие сыворотки среды позволяет культивируемым клеткам достигать более высокой плотности количества жизнеспособных клеток, чем без добавления орнитина или комбинации орнитина и путресцина. В одном из вариантов осуществления не содержащей сыворотки и не содержащей гидролизата OS среды культура клеток способна достигать плотности количества жизнеспособных клеток, которая по меньшей мере на 15% выше, чем у сходной культуры клеток в сходной среде для культивирования клеток, которая содержит менее 0,09 ± 0,014 мМ орнитина (или менее 0,09 ± 0,014 мМ орнитина и менее 0,2 ± 0,03 мМ путресцина). В другом варианте осуществления не содержащей сыворотки и не содержащей гидролизата OS среды культура клеток способна достигать плотности количества жизнеспособных клеток, которая по меньшей мере в 3 раза выше, чем у сходной культуры клеток в сходной среде для культивирования клеток, которая содержит менее 0,09 ± 0,014 мМ орнитина (или менее 0,09 ± 0,014 мМ орнитина и менее 0,2 ± 0,03 мМ путресцина).Likewise, the addition of ornithine, alone or a combination of ornithine and putrescine, to serum-free media allows cultured cells to achieve higher viable cell number densities than without the addition of ornithine or the combination of ornithine and putrescine. In one embodiment of the serum-free, hydrolysate-free OS medium, the cell culture is capable of achieving a viable cell count density that is at least 15% higher than that of a similar cell culture in a similar cell culture medium that contains less than 0.09 ± 0.014 mM ornithine (or less than 0.09 ± 0.014 mM ornithine and less than 0.2 ± 0.03 mM putrescine). In another embodiment of the serum-free, digestate-free OS medium, the cell culture is capable of achieving a viable cell count density that is at least 3 times higher than that of a similar cell culture in a similar cell culture medium that contains less than 0.09 ± 0.014 mM ornithine (or less than 0.09 ± 0.014 mM ornithine and less than 0.2 ± 0.03 mM putrescine).

В другом варианте осуществления способ включает этап добавления в среду для культивирования клеток одной или нескольких добавок в момент использования. В определенных вариантах осуществления добавка в момент использования представляет собой любое одно или несколько из NaHCO₃, глутамина, инсулина, глюкозы, CuSO₄, ZnSO₄, FeCl₃, NiSO₄, Na₄ ЭДТА и цитрата Na₃. В одном из вариантов осуществления в способе используют этап добавления каждого из приведенных ниже химических веществ, добавляемых в момент использования в среду для культивирования клеток: NaHCO₃, глутамин, инсулин, глюкоза, CuSO4, ZnSO4, FeCl3, NiSO4, Na4 ЭДТА и цитрат Na3. В определенных вариантах осуществления добавки в момент использования можно добавлять в среду изначально.In another embodiment, the method includes the step of adding one or more additives to the cell culture medium at the time of use. In certain embodiments, the point-of-use additive is any one or more of NaHCO ₃ , glutamine, insulin, glucose, CuSO ₄ , ZnSO ₄ , FeCl ₃ , NiSO ₄ , Na ₄ EDTA, and Na ₃ citrate. In one embodiment, the method includes the step of adding each of the following chemicals added at the time of use to the cell culture medium: NaHCO ₃ , glutamine, insulin, glucose, CuSO 4 , ZnSO 4 , FeCl 3 , NiSO 4 , Na 4 EDTA, and Na 3 citrate. In certain embodiments, point-of-use additives may be added to the medium initially.

В конкретном варианте осуществления, в одном из аспектов предоставлен способ культивирования клеток в не содержащей сыворотки среде, которая содержит (1) орнитин в любой концентрации из 0,09 ± 0,014 мМ, 0,3 ± 0,05 мМ, 0,6 ± 0,09 мМ или 0,9 ± 0,14 мМ в среде для культивирования клеток; (2) необязательно дополнительно путресцин в любой концентрации из 0,20 ± 0,03 мМ, 0,35 ± 0,06 или 0,714 ± 0,11 мМ; (3) по меньшей мере приблизительно 40 мМ или по меньшей мере приблизительно 70 мМ смеси аминокислот, содержащей аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутаминовую кислоту, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин и валин; (4) токоферол и смесь жирных кислот; (6) смесь нуклеозидов, содержащую аденозин, гуанозин, цитидин, уридин, тимидин и гипоксантин, и (9) соли кальция, магния и фосфата, где среднее время удвоения клеток, культивируемых этим способом, составляет не более 24 ч или по меньшей мере одну треть время удвоения сравниваемой контрольной культуры; и культивируемые клетки способны к достижению плотность количества жизнеспособных клеток, которая по меньшей мере на 15% выше или по меньшей мере в 3 раза выше, чем у сходной культуры клеток в сходной среде для культивирования клеток, которая содержит менее 0,09 ± 0,015 мМ орнитина (или менее 0,09 ± 0,014 мМ орнитина и менее 0,2 ± 0,03 мМ путресцина). В другом варианте осуществления культура клеток способна достигать плотности количества жизнеспособных клеток, которая по меньшей мере в 3 раза выше, чем у сходной культуры клеток в сходной среде для культивирования клеток, которая содержит менее 0,09 ± 0,014 мМ орнитина (или менее 0,09 ± 0,014 мМ орнитина и менее 0,2 ± 0,03 мМ путресцина). В одном из вариантов осуществления среда содержит < 7,5 г/л гидролизата; а в другом варианте осуществления не содержит гидролизатов.In a specific embodiment, in one aspect, a method is provided for culturing cells in a serum-free medium that contains (1) ornithine at any concentration of 0.09 ± 0.014 mM, 0.3 ± 0.05 mM, 0.6 ± 0 .09 mM or 0.9 ± 0.14 mM in cell culture medium; (2) optionally additional putrescine at any concentration of 0.20 ± 0.03 mM, 0.35 ± 0.06, or 0.714 ± 0.11 mM; (3) at least about 40 mM or at least about 70 mM an amino acid mixture containing alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine and valine; (4) tocopherol and a mixture of fatty acids; (6) a mixture of nucleosides containing adenosine, guanosine, cytidine, uridine, thymidine and hypoxanthine, and (9) calcium, magnesium and phosphate salts, wherein the average doubling time of cells cultured by this method is not more than 24 hours or at least one third is the doubling time of the compared control culture; and the cultured cells are capable of achieving a viable cell count density that is at least 15% higher or at least 3 times higher than that of a similar cell culture in a similar cell culture medium that contains less than 0.09 ± 0.015 mM ornithine (or less than 0.09 ± 0.014 mM ornithine and less than 0.2 ± 0.03 mM putrescine). In another embodiment, the cell culture is capable of achieving a viable cell number density that is at least 3 times higher than that of a similar cell culture in a similar cell culture medium that contains less than 0.09 ± 0.014 mM ornithine (or less than 0.09 ± 0.014 mM ornithine and less than 0.2 ± 0.03 mM putrescine). In one embodiment, the medium contains <7.5 g/L hydrolysate; and in another embodiment does not contain hydrolysates.

В другом аспекте изобретение относится к способу получения представляющего интерес белка с использованием этапов (1) введения в клетку последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющей интерес белок; (2) отбора клеток, несущих эту последовательность нуклеиновой кислоты; (3) культивирования отобранных клеток в одном из вариантов осуществления не содержащей сыворотки среда для культивирования клеток, описанной в первом аспекте или по любому варианту осуществления способа, описанного во втором аспекте; и (4) экспрессия представляющего интерес белка в клетках, где представляющий интерес белок секретируется в среду. В определенных вариантах осуществления клетки, используемые для получения белка, представляют собой клетки млекопитающих, способные к продукции биотерапевтического средства, такие как клетки CHO, 293 и BHK или любое их производное. В одном из вариантов осуществления клетки представляют собой клетки CHO, такие как клетки CHO-K1.In another aspect, the invention relates to a method for producing a protein of interest using the steps of (1) introducing into a cell a nucleic acid sequence encoding the protein of interest; (2) selecting cells carrying this nucleic acid sequence; (3) culturing the selected cells in one embodiment of the serum-free cell culture medium described in the first aspect or any embodiment of the method described in the second aspect; and (4) expression of the protein of interest in cells, where the protein of interest is secreted into the medium. In certain embodiments, the cells used to produce the protein are mammalian cells capable of producing the biotherapeutic, such as CHO, 293 and BHK cells or any derivative thereof. In one embodiment, the cells are CHO cells, such as CHO-K1 cells.

В определенных вариантах осуществления представляющий интерес белок представляет собой антигенсвязывающий белок. В определенных вариантах осуществления представляющий интерес белок представляет собой белок, содержащий Fc-домен. В некоторых случаях, эти два представляющих интерес белка могут перекрываться, например, так как в случае слитого белка рецептор-Fc, антитела и белка ScFv. Таким образом, в определенных вариантах осуществления представляющий интерес белок представляет собой антитело, такое как антитело человека или гуманизированное антитело, фрагмент антитела, такой как Fab или F(ab')2, биспецифическое антитело, молекула-ловушка, такая как ловушка VEGF или ловушка IL-1, молекула ScFv, слитый белок растворимого TCR-Fc или т.п.In certain embodiments, the protein of interest is an antigen binding protein. In certain embodiments, the protein of interest is an Fc domain-containing protein. In some cases, these two proteins of interest may overlap, such as in the case of a receptor-Fc fusion protein, an antibody, and a ScFv protein. Thus, in certain embodiments, the protein of interest is an antibody, such as a human or humanized antibody, an antibody fragment, such as a Fab or F(ab')2, a bispecific antibody, a decoy molecule, such as a VEGF decoy or an IL decoy -1, ScFv molecule, soluble TCR-Fc fusion protein or the like.

В одном из вариантов осуществления представляющий интерес белок способен продуцироваться при среднем семидневном титре, который по меньшей мере на 7% выше, по меньшей мере на 14% выше,In one embodiment, the protein of interest is capable of being produced at a seven-day average titer that is at least 7% higher, at least 14% higher,

- 3 045169 по меньшей мере на 80% выше, по меньшей мере в два раза выше или по меньшей мере в три раза выше, чем средний семидневный титр, получаемый у сходных клеток в не содержащей сыворотки среде для культивирования клеток, которая содержит менее 0,09 ± 0,014 мМ орнитина (или менее 0,09 ± 0,014 мМ орнитина и менее 0,2 ± 0,03 мМ путресцин) (не OS среды).- 3 045169 at least 80% higher, at least two times higher or at least three times higher than the seven-day average titer obtained from similar cells in a serum-free cell culture medium that contains less than 0. 09 ± 0.014 mM ornithine (or less than 0.09 ± 0.014 mM ornithine and less than 0.2 ± 0.03 mM putrescine) (not OS media).

В конкретном варианте осуществления представляющий интерес белок продуцируют посредством (1) введения в клетку СНО последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес белок, такой как антитело или другой антигенсвязывающий белок; (2) отбора клеток, несущих эту последовательность нуклеиновой кислоты; (3) культивирования отобранных клеток в не содержащей сыворотки среде для культивирования клеток, которая содержит (а) орнитин в любой концентрации из 0,09 ± 0,014, 0,3 ± 0,05 мМ, 0,6 ± 0,09 мМ или 0,9 ± 0,14 мМ; (b) необязательно дополнительно путресцин в любой концентрации из 0,20 ± 0,03 мМ, 0,35 ± 0,06 или 0,714 ± 0,11 мМ; (с) по меньшей мере 40 мМ или по меньшей мере 70 мМ смеси аминокислот, содержащей: аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутаминовую кислоту, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин и валин; (d) токоферол и смесь жирных кислот; (е) смесь нуклеозидов, содержащую аденозин, гуанозин, цитидин, уридин, тимидин и гипоксантин, и (f) соли кальция, магния и фосфата; и (d) экспрессии представляющего интерес белка в клетках СНО, где представляющий интерес белок секретируется в среду. В определенных вариантах осуществления не содержащая сыворотки среда для культивирования клеток может содержать < 7,5 г/л гидролизатов или в других вариантах осуществления вообще не содержать гидролизатов.In a specific embodiment, the protein of interest is produced by (1) introducing into a CHO cell a nucleic acid sequence encoding the protein of interest, such as an antibody or other antigen binding protein; (2) selecting cells carrying this nucleic acid sequence; (3) culturing the selected cells in a serum-free cell culture medium that contains (a) ornithine at any concentration of 0.09 ± 0.014, 0.3 ± 0.05 mM, 0.6 ± 0.09 mM, or 0 .9 ± 0.14 mM; (b) optionally additional putrescine at any concentration of 0.20 ± 0.03 mM, 0.35 ± 0.06, or 0.714 ± 0.11 mM; (c) at least 40 mM or at least 70 mM of an amino acid mixture containing: alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine , threonine, tryptophan, tyrosine and valine; (d) tocopherol and a mixture of fatty acids; (f) a mixture of nucleosides containing adenosine, guanosine, cytidine, uridine, thymidine and hypoxanthine, and (f) calcium, magnesium and phosphate salts; and (d) expressing the protein of interest in CHO cells, where the protein of interest is secreted into the medium. In certain embodiments, the serum-free cell culture medium may contain <7.5 g/L of hydrolysates, or in other embodiments, no hydrolysates at all.

Подробное раскрытие настоящего изобретенияDetailed Disclosure of the Present Invention

Заявители сделали неожиданное открытие, что добавление орнитина или комбинации орнитина и путресцина (OS среда) улучшает плотность жизнеспособных клеток, время удвоения клеток и продукцию белка клетками в культуре клеток относительно не содержащей сыворотки среды, которая содержит очень мало или не содержит орнитина или очень мало или не содержит комбинации орнитина и путресцина (не OS среда).Applicants have made the unexpected discovery that the addition of ornithine or a combination of ornithine and putrescine (OS medium) improves viable cell density, cell doubling time, and protein production of cells in cell culture relative to serum-free medium that contains very little or no ornithine or very little or no ornithine. does not contain a combination of ornithine and putrescine (not OS medium).

Перед описанием культур клеток и способов по настоящему изобретению, следует понять, что это изобретение не ограничено описанными конкретными способами и экспериментальными условия, так как такие способы и условия могут варьировать. Также следует понимать, что терминология, используемая в настоящем документе, предназначена только для целей описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения.Before describing the cell cultures and methods of the present invention, it should be understood that this invention is not limited to the specific methods and experimental conditions described, as such methods and conditions may vary. It should also be understood that the terminology used herein is for purposes of describing specific embodiments only and is not intended to be limiting.

Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют то же значение, которое обычно понимает специалист в области, к которой принадлежит данное изобретение. Хотя в практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения можно использовать любые способы и материалы, подобные или эквивалентные способам и материалам, описанным в настоящей заявке, далее описаны определенные конкретные способы и материалы. Единицы, префиксы и символы могут быть указаны в их принятых в СИ формах. Числовые диапазоны, указываемые в настоящем документе, являются открытыми, что означает, что они включают числа, определяющие диапазон. Если не указано иначе, формы единственного числа следует понимать, как означающие по меньшей мере один из. Заглавия разделов, используемые в настоящем документе, предназначены только для организационных целей, и их не следует рассматривать, как ограничивающие описанный объект изобретения. Способы и указания, описываемые в настоящем документе, как правило, осуществляют общепринятыми известными в данной области способами и как описано в различных общих и более специализированных ссылках, которые цитированы и описаны на всем протяжении настоящего описания, если не указано иначе. См., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^rded., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001), и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), и Julio E. Celis, Cell Biology: A Laboratory Handbook, 2^nd ed., Academic Press, New York, N.Y. (1998) и Dieffenbach and Dveksler, PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1995). Все публикации, указанные на всем протяжении этого описания, полностью включены в настоящий документ в качестве ссылки.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used in this application have the same meaning as commonly understood by one skilled in the art to which this invention belongs. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein may be used in the practice or testing of the present invention, certain specific methods and materials are described below. Units, prefixes and symbols may be specified in their SI forms. The numeric ranges specified in this document are open, meaning that they include numbers that define the range. Unless otherwise indicated, singular forms should be understood to mean at least one of. The section headings used herein are for organizational purposes only and should not be construed as limiting the subject matter described. The methods and instructions described herein are generally carried out by methods generally known in the art and as described in the various general and more specialized references that are cited and described throughout this specification unless otherwise indicated. See, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ^3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001), and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1990), and Julio E. Celis, Cell Biology: A Laboratory Handbook, ^2nd ed., Academic Press , New York, NY (1998) and Dieffenbach and Dveksler, PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1995). All publications identified throughout this specification are incorporated herein by reference in their entirety.

Определения.Definitions.

Как используют в настоящем документе пептид, полипептид и белок на всем протяжении описания используют взаимозаменяемо, и они означают молекулу, содержащую два или более аминокислотных остатка, связанные друг с другом пептидной связью. Пептиды, полипептиды и белки также могут включать модификации, такие как гликозилирование, присоединение липидов, сульфатирование, гамма-карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты, алкилирование, гидроксилирование и АДФрибозилирование. Пептиды, полипептиды и белки могут представлять научный или коммерческий интерес, включая основанные на белках лекарственные средства. В частности, пептиды, полипептиды и белки включают антитела и химерные или слитые белки. Пептиды, полипептиды и белки получают посредством рекомбинантных линий клеток животных с использованием способов культивирования клеток.As used herein, peptide, polypeptide and protein are used interchangeably throughout the description, and they mean a molecule containing two or more amino acid residues linked to each other by a peptide bond. Peptides, polypeptides and proteins may also include modifications such as glycosylation, lipid addition, sulfation, gamma-carboxylation of glutamic acid residues, alkylation, hydroxylation and ADPribosylation. Peptides, polypeptides and proteins may be of scientific or commercial interest, including protein-based drugs. In particular, peptides, polypeptides and proteins include antibodies and chimeric or fusion proteins. Peptides, polypeptides and proteins are produced through recombinant animal cell lines using cell culture techniques.

- 4 045169- 4 045169

Как используют в настоящем документе, термин гетерологичная полинуклеотидная последовательность относится к полимерам нуклеиновых кислот, кодирующих представляющие интерес белки, такие как химерные белки (такие как молекулы-ловушки), антитела или части антител (например, VH, VL, CDR3), которые получают в качестве биофармацевтического лекарственного вещества. Гетерологичную полинуклеотидную последовательность (например, такую как последовательность, кодирующую химерный белок или последовательность с оптимизированными кодонами, не содержащая интронов последовательность и т.д.) можно получать способами генетической инженерии и вводить в клетку, где она может находиться в качестве эписомы или интегрироваться в геном клетки. Гетерологичная полинуклеотидная последовательность может представлять собой природную последовательность, которую вводят в эктопическую область в геноме продуцирующей клетки. Гетерологичная полипептидная последовательность может представлять собой природную последовательность другого организма, такую как последовательность, кодирующая ортолог человека.As used herein, the term heterologous polynucleotide sequence refers to polymers of nucleic acids encoding proteins of interest, such as chimeric proteins (such as decoy molecules), antibodies, or portions of antibodies (eg, VH, VL, CDR3) that are produced in as a biopharmaceutical drug. A heterologous polynucleotide sequence (e.g., such as a chimeric protein coding sequence or a codon-optimized sequence, an intronless sequence, etc.) can be genetically engineered and introduced into a cell, where it can reside as an episome or be integrated into the genome cells. The heterologous polynucleotide sequence may be a naturally occurring sequence that is introduced into an ectopic region in the genome of the producing cell. The heterologous polypeptide sequence may be a naturally occurring sequence from another organism, such as a sequence encoding a human ortholog.

Антитело относится к молекуле иммуноглобулина, состоящей из четырех полипептидных цепей, двух тяжелых (Н) цепей и двух легких (L) цепей, связанных между собой дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR или VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит три домена, CH1, CH2 и СН3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена (CL). Области VH и VL можно дополнительно подразделить на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), чередуемыми с областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от N-конца к С-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Термин антитело включает указание на гликозилированные и негликозилированные иммуноглобулины любого изотипа или подкласса. Термин антитело включает молекулы антител, получаемые, экспрессируемые, производимые или выделяемые рекомбинантными способами, такие как антитела, выделяемые из клеток-хозяев, трансфицированных для экспрессии антитела. Термин антитело также включает биспецифическое антитело, которое включает гетеротетрамерный иммуноглобулин, который может связываться более чем с одним различными эпитопами.An antibody refers to an immunoglobulin molecule consisting of four polypeptide chains, two heavy (H) chains and two light (L) chains linked by disulfide bonds. Each heavy chain contains a heavy chain variable region (HCVR or VH) and a heavy chain constant region. The heavy chain constant region contains three domains, CH1, CH2 and CH3. Each light chain contains a light chain variable region and a light chain constant region. The light chain constant region consists of a single domain (CL). The VH and VL regions can be further subdivided into regions of hypervariability called complementarity determining regions (CDRs), interspersed with regions that are more conserved called framework regions (FRs). Each VH and VL consists of three CDRs and four FRs, arranged from N-terminus to C-terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. The term antibody includes reference to glycosylated and non-glycosylated immunoglobulins of any isotype or subclass. The term antibody includes antibody molecules produced, expressed, produced or isolated by recombinant methods, such as antibodies isolated from host cells transfected to express the antibody. The term antibody also includes a bispecific antibody, which includes a heterotetrameric immunoglobulin that can bind to more than one different epitopes.

Биспецифические антитела в основном описаны в публикации патентной заявки США № 2010/0331527, которая включена в настоящую заявку в качестве ссылки.Bispecific antibodies are generally described in US Patent Application Publication No. 2010/0331527, which is incorporated herein by reference.

Термин антигенсвязывающая часть антитела (или фрагмент антитела) относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность к специфическому связыванию антигена. Примеры связывающих фрагментов, включаемых в термин антигенсвязывающая часть антитела, включают (i) фрагмент Fab, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) фрагмент F(ab')₂, двухвалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела, (v) фрагмент dAb (Ward et al. (1989) Nature 241:544-546), который состоит из домена VH, (vi) выделенная CDR и (vii) scFv, который состоит из двух доменов фрагмента Fv, VL и VH, соединенных синтетическим линкером с формированием одной белковой цепи, в которой области VL и VH спариваются с формированием одновалентных молекул. В термин антитела также включены другие формы одноцепочечных антител, такие как диатела (см. например, Holliger et al. (1993) PNAS USA 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2:1121-1123).The term antigen-binding portion of an antibody (or antibody fragment) refers to one or more antibody fragments that retain the ability to specifically bind antigen. Examples of binding fragments included in the term antigen-binding moiety of an antibody include (i) a Fab fragment, a monovalent fragment consisting of VL, VH, CL and CH1 domains; (ii) F(ab') ₂ fragment, a divalent fragment containing two Fab fragments linked by a disulfide bridge in the hinge region; (iii) Fd fragment consisting of VH and CH1 domains; (iv) an Fv fragment consisting of the VL and VH domains of one arm of the antibody, (v) a dAb fragment (Ward et al. (1989) Nature 241:544-546) which consists of a VH domain, (vi) a dedicated CDR and ( vii) scFv, which consists of two Fv fragment domains, VL and VH, connected by a synthetic linker to form a single protein chain in which the VL and VH regions are paired to form monovalent molecules. The term antibodies also includes other forms of single chain antibodies, such as diabodies (see, for example, Holliger et al. (1993) PNAS USA 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2:1121-1123).

Кроме того, антитело или его антигенсвязывающая часть могут быть частью более крупной молекулы иммуноадгезии, формируемой посредством ковалентной или нековалентной ассоциации антитела или части антитела с одним или несколькими другими белками или пептидами. Примеры таких молекул иммуноадгезии включают использование области сердцевины стрептавидина с получением тетрамерной молекулы scFv (Kipriyanov et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) и использование остатка цистеина, маркерного пептида и С-концевой полигистидиновой метки с получением двухвалентной и биотинилированной молекулы scFv (Kipriyanov et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Части антител, такие как фрагменты Fab и F(ab')₂, можно получать из целых антител общепринятыми способами, такими как расщепление целых антител папаином или пепсином. Кроме того, антитела, части антител и молекулы иммуноадгезии можно получать с использованием стандартных технологий рекомбинантной ДНК, широко известных в данной области (см. Sambrook et al., 1989).In addition, the antibody or antigen-binding portion thereof may be part of a larger immunoadhesion molecule formed through the covalent or non-covalent association of the antibody or antibody portion with one or more other proteins or peptides. Examples of such immunoadhesion molecules include the use of the streptavidin core region to produce a tetrameric scFv molecule (Kipriyanov et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) and the use of a cysteine residue, a marker peptide, and a C-terminal polyhistidine tag to produce a divalent and biotinylated scFv molecules (Kipriyanov et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Parts of antibodies, such as Fab and F(ab') ₂ fragments, can be obtained from whole antibodies by conventional methods, such as digestion of whole antibodies with papain or pepsin. In addition, antibodies, antibody portions, and immunoadhesion molecules can be produced using standard recombinant DNA technologies well known in the art (see Sambrook et al., 1989).

Термин антитело человека предназначен для включения антител с вариабельными и константными областями, происходящими из последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии человека. Антитела человека по изобретению могут включать остатки аминокислот, не кодируемые последовательностями иммуноглобулинов зародышевой линией человека (например, мутации, вносимые посредством случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или посредством соматических мутаций in vivo), например, в CDR и в частности CDR3. Однако, как используют в настоящем документе, термин антитело человека не предназначен для включения антител, в которых на каркасные последовательности человека привиты последовательности CDR, происходящие из зародышевой линии другого вида млекопитающих, такого как мышь.The term human antibody is intended to include antibodies with variable and constant regions derived from human germline immunoglobulin sequences. The human antibodies of the invention may include amino acid residues not encoded by human germline immunoglobulin sequences (e.g., mutations introduced through random or site-specific mutagenesis in vitro or through somatic mutations in vivo), for example, in the CDR and in particular CDR3. However, as used herein, the term human antibody is not intended to include antibodies in which human framework sequences are grafted with CDR sequences derived from the germ line of another mammalian species, such as a mouse.

- 5 045169- 5 045169

Как используют в настоящем документе, термин рекомбинантное антитело человека предназначен для включения всех антител человека, которые получают, экспрессируют, производят или выделяют рекомбинантными способами, такие как антитела, экспрессируемые с использованием рекомбинантного экспрессирующего вектора, трансфицируемого в клетки-хозяева, антитела, выделяемые из библиотеки рекомбинантных, комбинаторных антител человека, антитела, выделяемые у животных (например, мышей), которые являются трансгенными по генам иммуноглобулинов человека (см. например, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295), или антитела получаемые, экспрессируемые, производимые или выделяемые любыми другими способами, которые включают сплайсинг последовательностей генов иммуноглобулинов человека с другими последовательностями ДНК. Такое рекомбинантное антитело человека содержит вариабельные и константные области, происходящие из последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии человека. Однако в определенных вариантах осуществления такие рекомбинантные антитела человека подвергают мутагенезу in vitro (или, когда используют животного, трансгенного по последовательностям Ig человека, соматическому мутагенезу in vivo), и, таким образом, последовательности аминокислот областей VH и VL рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя и получены из последовательностей VH и VL зародышевой линии человека и родственны им, в природе могут не присутствовать в репертуаре зародышевой линии антител человека in vivo.As used herein, the term recombinant human antibody is intended to include all human antibodies that are produced, expressed, produced or isolated by recombinant methods, such as antibodies expressed using a recombinant expression vector transfected into host cells, antibodies isolated from a library recombinant, combinatorial human antibodies, antibodies isolated from animals (eg, mice) that are transgenic for human immunoglobulin genes (see, for example, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295), or antibodies produced, expressed, produced or released by any other means that involve splicing human immunoglobulin gene sequences with other DNA sequences. Such a recombinant human antibody contains variable and constant regions derived from human germline immunoglobulin sequences. However, in certain embodiments, such recombinant human antibodies are subject to in vitro mutagenesis (or, when an animal transgenic for human Ig sequences is used, in vivo somatic mutagenesis), and thus the amino acid sequences of the VH and VL regions of the recombinant antibodies are sequences that , although derived from and related to human germline VH and VL sequences, may not be naturally present in the human germline antibody repertoire in vivo.

Слитые с Fc белки содержат часть или целиком два или более белков, один из которых представляет собой часть Fc молекулы иммуноглобулина, которые иначе в природе вместе не встречаются. Получение слитых белков, содержащих определенные гетерологичные полипептиды, слитые с различными частями полученных из антител полипептидов (включая домен Fc), описано, например, в Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 88: 10535, 1991; Byrn et al., Nature 344:677, 1990; и Hollenbaugh et al., Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins, в Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10,19,1 10,19,11, 1992. Слитые белки рецептора и Fc содержат один или несколько внеклеточных доменов рецептора, связанные с молекулой Fc, которая в определенных вариантах осуществления содержит шарнирную область с последующими доменами иммуноглобулина СН2 и СН3. В определенных вариантах осуществления слитый с Fc белок содержит две или более цепей различных рецепторов, которые связываются с одним или несколькими лигандами. Например, слитый с Fc белок представляет собой ловушку, такую как, например, ловушка IL-1 (например, рилонацепт, который содержит связывающую лиганд IL1RAcP область, слитую с внеклеточной областью IL-1R1, слитую с Fc hIgG1; см. патент США № 6927004), или ловушка VEGF (например, афлиберцепт, который содержит домен 2 Ig рецептора VEGF Flt1, слитый с доменом 3 Ig рецептора VEGF Flk1, слитый с Fc hIgG1; см. патенты США №№ 7087411 и 7279159).Fc fusion proteins contain part or all of two or more proteins, one of which is the Fc part of an immunoglobulin molecule, that do not otherwise occur together in nature. The production of fusion proteins containing certain heterologous polypeptides fused to various portions of antibody-derived polypeptides (including the Fc domain) is described, for example, in Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 88: 10535, 1991; Byrn et al., Nature 344:677, 1990; and Hollenbaugh et al., Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins, in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10,19,1 10,19,11, 1992. Receptor-Fc fusion proteins comprise one or more extracellular receptor domains associated with an Fc molecule, which in certain embodiments comprises a hinge region followed by immunoglobulin CH2 and CH3 domains. In certain embodiments, the Fc fusion protein comprises two or more different receptor chains that bind to one or more ligands. For example, the Fc fusion protein is a decoy protein, such as, for example, an IL-1 decoy (e.g., rilonacept, which contains the IL1RAcP ligand binding region fused to the extracellular region of IL-1R1 fused to the hIgG1 Fc; see US Pat. No. 6,927,004 ), or a VEGF decoy (eg, aflibercept, which contains VEGF receptor Flt1 Ig domain 2 fused to VEGF receptor Flk1 Ig domain 3 fused to hIgG1 Fc; see US Pat. Nos. 7,087,411 and 7,279,159).

Среды.Wednesdays.

Настоящее изобретение относится к не содержащей сыворотки среде, которая пригодна для культивирования клеток и продукции биофармацевтического лекарственного вещества. Не содержащая сыворотки используют для среды для культивирования клеток, которая не содержит сывороток животных, таких как эмбриональная телячья сыворотка. Не содержащие сыворотки среды могут содержать < 7,5 г/л гидролизатов, таких как соевый гидролизат. Настоящее изобретение также относится к химическим средам определенного состава, которые не только не содержат сывороток, но также не содержат и гидролизата. Не содержащие гидролизата используют для сред для культивирования клеток, которые не содержат экзогенных белковых гидролизатов, таких как гидролизаты животных или растительных белков, например, такие как пептоны, триптоны и т.п.The present invention relates to a serum-free medium that is useful for cell culture and biopharmaceutical drug production. Serum-free is used for cell culture media that does not contain animal serum, such as fetal bovine serum. Whey-free media may contain <7.5 g/L hydrolysates such as soy hydrolysate. The present invention also relates to chemical media of defined composition that are not only serum-free, but also hydrolyzate-free. Hydrolyzate-free is used for cell culture media that do not contain exogenous protein hydrolysates, such as animal or plant protein hydrolysates, such as peptones, tryptones, and the like.

Удаление сыворотки и уменьшение количества или удаление гидролизатов из среды для культивирования клеток при снижении вариабельности от партии к партии и улучшении последующих этапов обработки к сожалению ослабляет рост, жизнеспособность клеток и экспрессию ими белка. Таким образом, химически определенные не содержащие сыворотки и содержащие мало или не содержащие гидролизатов среды для улучшения роста клеток и продукции белка нуждаются в дополнительных ингредиентах. Среды для культивирования клеток по изобретению можно обогащать дополнительными ингредиентами, такими как полиамины или увеличенными концентрациями таких компонентов, как аминокислоты, соли, сахара, витамины, гормоны, факторы роста, буферы, антибиотики, липиды, микроэлементы и т.п., в зависимости от требований культивируемых клеток или желаемых параметров культуры клеток. Например, среда для культивирования клеток по настоящему документу для улучшения роста клеток, жизнеспособности клеток и продукции рекомбинантного белка обогащена орнитином, путресцином или обоими (OS среды).Removing serum and reducing or eliminating hydrolysates from cell culture media, while reducing batch-to-batch variability and improving downstream processing steps, unfortunately weakens cell growth, cell viability, and protein expression. Thus, chemically defined serum-free and low- or no-hydrolysate media require additional ingredients to improve cell growth and protein production. The cell culture media of the invention can be enriched with additional ingredients such as polyamines or increased concentrations of components such as amino acids, salts, sugars, vitamins, hormones, growth factors, buffers, antibiotics, lipids, trace elements, etc., depending on the requirements of the cultured cells or desired cell culture parameters. For example, the cell culture medium herein is enriched with ornithine, putrescine, or both (OS media) to improve cell growth, cell viability, and recombinant protein production.

В определенных вариантах осуществления OS среда содержит орнитин в концентрации (выражаемой в микромолях на литр) по меньшей мере приблизительно 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400,450,In certain embodiments, the OS medium contains ornithine at a concentration (expressed in micromoles per liter) of at least about 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450,

500, 540, 545, 550, 555, 560, 565, 568, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579,580,500, 540, 545, 550, 555, 560, 565, 568, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579,580,

581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601,602,581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601,602,

603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 620, 625, 630, 635, 640,645,603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 620, 625, 630, 635, 640,645,

650, 700, 750, 800, 850 или 900 мкМ.650, 700, 750, 800, 850 or 900 µM.

В определенных вариантах осуществления среды содержит орнитин в концентрации приблизитель- 6 045169 но 85, 90, 95, 100, 105, 110, 113 или 115 мкМ. В одном из вариантов осуществления среда содержит 100 мкМ ± 15 мкМ орнитина. В одном из вариантов осуществления среда содержит 15 мг/л ± 2,25 мг/л орнитина · HCl.In certain embodiments, the media contains ornithine at a concentration of approximately 85, 90, 95, 100, 105, 110, 113, or 115 μM. In one embodiment, the medium contains 100 μM ± 15 μM ornithine. In one embodiment, the medium contains 15 mg/L ± 2.25 mg/L ornithine HCl.

В определенных вариантах осуществления среды содержит орнитин в концентрации приблизительно 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340 или 345 мкМ. В одном из вариантов осуществления среда содержит 300 мкМ ± 45 мкМ орнитина. В одном из вариантов осуществления среда содержит 50 мг/л ± 7,5 мг/л орнитина • HCl.In certain embodiments, the media contains ornithine at a concentration of approximately 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, or 345 μM. In one embodiment, the medium contains 300 μM ± 45 μM ornithine. In one embodiment, the medium contains 50 mg/L ± 7.5 mg/L ornithine • HCl.

В определенных вариантах осуществления среды содержит орнитин в концентрации приблизительно 510, 515, 520, 525, 530, 535, 540, 545, 550, 555, 560, 565,In certain embodiments, the media contains ornithine at a concentration of approximately 510, 515, 520, 525, 530, 535, 540, 545, 550, 555, 560, 565,

570, 575, 580, 585, 590, 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685 или 690 мкМ. В одном из вариантов осуществления среда содержит 600 мкМ ± 90 мкМ орнитина. В одном из вариантов осуществления среда содержит 100 мг/л ±15 мг/л орнитина • HCl.570, 575, 580, 585, 590, 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685 or 6 90 µM . In one embodiment, the medium contains 600 μM ± 90 μM ornithine. In one embodiment, the medium contains 100 mg/L ±15 mg/L ornithine • HCl.

В определенных вариантах осуществления среды содержит орнитин в концентрации 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895, 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995, 1000, 1005, 1010, 1015, 1020, 1025, 1030 или 1035 мкМ. В одном из вариантов осуществления среда содержит 900 мкМ ± 135 мкМ орнитина. В одном из вариантов осуществления среда содержит 150 мг/л ± 22,5 мг/л орнитина • HCl.In certain embodiments, the media contains ornithine at a concentration of 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865 , 870, 875, 880, 885, 890, 895, 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990 , 995, 1000, 1005, 1010, 1015, 1020, 1025, 1030 or 1035 µM. In one embodiment, the medium contains 900 μM ± 135 μM ornithine. In one embodiment, the medium contains 150 mg/L ± 22.5 mg/L ornithine • HCl.

В обогащенные орнитином среды необязательно можно добавлять путресцин. Путресцин в очень низких концентрациях включали в качестве компонента в определенные составы сред для культивирования клеток; см. например, WO 2005/028626, в котором описаны 0,02-0,08 мг/л путресцина; патент США № 5426699 (0,08 мг/л); патент США № RE30,985 (0,16 мг/л); патент США № 5811299 (0,27 мг/л); патент США № 5122469 (0,5635 мг/л); патент США № 5063157 (1 мг/1); WO 2008/154014 (»100 мкМ - »1000 мкМ); патентную заявку США № 2007/0212770 (0,5 -30 мг/л полиамина; 2 мг/л путресцина; 2 мг/л путресцина + 2 мг/л орнитина; 2 мг/л путресцина + 10 мг/л орнитина).Putrescine may optionally be added to ornithine-enriched media. Putrescine has been included at very low concentrations as a component in certain cell culture media formulations; see for example WO 2005/028626, which describes 0.02-0.08 mg/l putrescine; US Patent No. 5426699 (0.08 mg/l); US Patent No. RE30,985 (0.16 mg/L); US Patent No. 5811299 (0.27 mg/l); US Patent No. 5122469 (0.5635 mg/l); US Patent No. 5,063,157 (1 mg/1); WO 2008/154014 (»100 µM - »1000 µM); US Patent Application No. 2007/0212770 (0.5 -30 mg/L polyamine; 2 mg/L putrescine; 2 mg/L putrescine + 2 mg/L ornithine; 2 mg/L putrescine + 10 mg/L ornithine).

В определенных вариантах осуществления среды содержат комбинацию орнитина и путресцина, где путресцин может находиться в комбинации по меньшей мере приблизительно 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 260, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405 или 410 мкМ.In certain embodiments, the media contain a combination of ornithine and putrescine, where putrescine may be in a combination of at least about 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220 , 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345 , 350, 355, 260, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405 or 410 µM.

В определенных вариантах осуществления среды содержат путресцин в концентрации приблизительно 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225 или 230 мкМ. В одном из вариантов осуществления среда содержит 200 мкМ ± 30 мкМ путресцина в дополнение к > 90 мкМ ± 14 мкМ орнитина. В одном из вариантов осуществления среда содержит 30 мг/л ± 4,5 мг/л путресцина • 2HCl в дополнение к > 15 мг/л ± 2,25 мг/л орнитина • HCl.In certain embodiments, the media contain putrescine at a concentration of approximately 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, or 230 μM. In one embodiment, the medium contains 200 μM ± 30 μM putrescine in addition to >90 μM ± 14 μM ornithine. In one embodiment, the medium contains 30 mg/L ± 4.5 mg/L putrescine • 2HCl in addition to >15 mg/L ± 2.25 mg/L ornithine • HCl.

В определенных вариантах осуществления среды содержат путресцин в концентрации приблизительно 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400 или 405 мкМ. В одном из вариантов осуществления среда содержит 350 мкМ ± 52,5 мкМ путресцина в дополнение к > 90 мкМ ± 14 мкМ орнитина. В одном из вариантов осуществления среда содержит 57 мг/л ± 8,55 мг/л путресцина • 2HCl в дополнение к > 15 мг/л ± 2,25 мг/л орнитина • HCl.In certain embodiments, the media contain putrescine at a concentration of approximately 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400 or 405 µM. In one embodiment, the medium contains 350 μM ± 52.5 μM putrescine in addition to >90 μM ± 14 μM ornithine. In one embodiment, the medium contains 57 mg/L ± 8.55 mg/L putrescine • 2HCl in addition to > 15 mg/L ± 2.25 mg/L ornithine • HCl.

В определенных вариантах осуществления среды содержат путресцин в концентрации приблизительно 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800 или 805 мкМ. В одном из вариантов осуществления среда содержит 714 мкМ ± 105 мкМ путресцина в дополнение к > 90 мкМ ± 14 мкМ орнитина. В одном из вариантов осуществления среда содержит 115 мг/л ± 17,25 мг/л путресцина • 2HCl в дополнение к > 15 мг/л ± 2,25 мг/л орнитина • HCl.In certain embodiments, the media contain putrescine at a concentration of approximately 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800 or 805 µM. In one embodiment, the medium contains 714 μM ± 105 μM putrescine in addition to >90 μM ± 14 μM ornithine. In one embodiment, the medium contains 115 mg/L ± 17.25 mg/L putrescine • 2HCl in addition to >15 mg/L ± 2.25 mg/L ornithine • HCl.

В определенных вариантах осуществления среды содержат попарную комбинацию любых концентраций путресцина и орнитина, перечисленных выше. В определенных вариантах осуществления среды содержат любую попарную комбинацию приблизительно 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750,In certain embodiments, the media contain a pairwise combination of any of the putrescine and ornithine concentrations listed above. In certain embodiments, the media comprise any pairwise combination of approximately 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750,

755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800 или 805 мкМ путресцина и приблизительно 510, 515, 520,755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800 or 805 µM putrescine and approximately 510, 515, 520,

525, 530, 535, 540, 545, 550, 555, 560, 565, 570, 575, 580, 585, 590, 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630,525, 530, 535, 540, 545, 550, 555, 560, 565, 570, 575, 580, 585, 590, 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630,

635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685 или 690 мкМ орнитина. Например, в одном из вариан- тов осуществления среды содержат приблизительно 700 мкМ путресцина и любую одну из 510, 511, 512 мкМ и последующие орнитина; или 701 мкМ путресцина и любую одну из 510, 511, 512 мкМ и последующие орнитин и т.д. Также, например, среды в одном из вариантов осуществления содержит приблизительно 600 мкМ орнитина и любую одну из 700, 701, 702 мкМ и последующие путресцина; или 601 мкМ орнитина и любую одну из 700, 701, 702 мкМ и последующие путресцина и т.д. В определенных вариантах осуществления среды содержат 702 мкМ ±106 мкМ путресцина + 593 мкМ ± 89 мкМ орнитина. В одном конкретном варианте осуществления среды содержат приблизительно 714 мкМ путресцина и635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685 or 690 µM ornithine. For example, in one embodiment, the media contain approximately 700 μM putrescine and any one of 510, 511, 512 μM, or thereafter; or 701 µM putrescine and any one of 510, 511, 512 µM and subsequent ornithine, etc. Also, for example, the media in one embodiment contains approximately 600 µM ornithine and any one of 700, 701, 702 µM and subsequent putrescine; or 601 µM ornithine and any one of 700, 701, 702 µM and subsequent putrescine, etc. In certain embodiments, the media contain 702 μM ± 106 μM putrescine + 593 μM ± 89 μM ornithine. In one specific embodiment, the media contains approximately 714 μM putrescine and

- 7 045169- 7 045169

593 мкМ орнитина. В одном из вариантов осуществления среды содержат 115 мг/л ± 17 мг/л путресцина • 2HCl и 100 мг/л ± 15 мг/л орнитина · HCl. В одном конкретном варианте осуществления среды содержат 115 мг/л путресцина • 2HCl и 100 мг/л орнитина • HCl.593 µM ornithine. In one embodiment, the media contain 115 mg/L ± 17 mg/L putrescine · 2HCl and 100 mg/L ± 15 mg/L ornithine · HCl. In one particular embodiment, the media contain 115 mg/L putrescine • 2HCl and 100 mg/L ornithine • HCl.

В одном из вариантов осуществления и в дополнение к добавлению орнитина или путресцина среды содержат смесь нуклеозидов в суммарной концентрации по меньшей мере 50 мкМ, по меньшей мере 60 мкМ, по меньшей мере 70 мкМ, по меньшей мере 80 мкМ, по меньшей мере 90 мкМ, по меньшей мере 100 мкМ, по меньшей мере 110 мкМ, по меньшей мере 115 мкМ, по меньшей мере 120 мкМ, по меньшей мере 125 мкМ, по меньшей мере 130 мкМ, по меньшей мере 135 мкМ, по меньшей мере 140 мкМ, по меньшей мере 145 мкМ, по меньшей мере 150 мкМ, по меньшей мере 155 мкМ, по меньшей мере 160 мкМ, по меньшей мере 165 мкМ или по меньшей мере 170 мкМ. В одном из вариантов осуществления среды содержат приблизительно 174 мкМ ± 26 мкМ нуклеозидов. В одном из вариантов осуществления среды содержат пуриновые производные в суммарной концентрации по меньшей мере 40 мкМ, по меньшей мере 45 мкМ, по меньшей мере 50 мкМ, по меньшей мере 55 мкМ, по меньшей мере 60 мкМ, по меньшей мере 65 мкМ, по меньшей мере 70 мкМ, по меньшей мере 75 мкМ, по меньшей мере 80 мкМ, по меньшей мере 85 мкМ, по меньшей мере 90 мкМ, по меньшей мере 95 мкМ, по меньшей мере 100 мкМ или по меньшей мере 105 мкМ. В одном из вариантов осуществления среды содержат приблизительно 106 мкМ ± 5 мкМ пуриновых производных. Пуриновые производные включают нуклеозиды гипоксантин и аденозин и гуанозин. В одном из вариантов осуществления среды содержат пиримидиновые производные в суммарной концентрации по меньшей мере 30 мкМ, по меньшей мере 35 мкМ, по меньшей мере 40 мкМ, по меньшей мере 45 мкМ, по меньшей мере 50 мкМ, по меньшей мере 55 мкМ, по меньшей мере 60 мкМ или по меньшей мере 65 мкМ. В одном из вариантов осуществления среды содержат приблизительно 68 мкМ ± 5 мкМ пиримидиновых производных. Пиримидиновые производные включают нуклеозиды тимидин, уридин и цитидин. В одном конкретном варианте осуществления среды содержат аденозин, гуанозин, цитидин, уридин, тимидин и гипоксантин.In one embodiment, and in addition to the addition of ornithine or putrescine, the media contain a mixture of nucleosides in a total concentration of at least 50 μM, at least 60 μM, at least 70 μM, at least 80 μM, at least 90 μM, at least 100 µM, at least 110 µM, at least 115 µM, at least 120 µM, at least 125 µM, at least 130 µM, at least 135 µM, at least 140 µM, at least at least 145 µM, at least 150 µM, at least 155 µM, at least 160 µM, at least 165 µM or at least 170 µM. In one embodiment, the media contain approximately 174 μM ± 26 μM nucleosides. In one embodiment, the media contain purine derivatives in a total concentration of at least 40 μM, at least 45 μM, at least 50 μM, at least 55 μM, at least 60 μM, at least 65 μM, at least at least 70 μM, at least 75 μM, at least 80 μM, at least 85 μM, at least 90 μM, at least 95 μM, at least 100 μM or at least 105 μM. In one embodiment, the media contain approximately 106 μM ± 5 μM purine derivatives. Purine derivatives include the nucleosides hypoxanthine and adenosine and guanosine. In one embodiment, the media contain pyrimidine derivatives in a total concentration of at least 30 μM, at least 35 μM, at least 40 μM, at least 45 μM, at least 50 μM, at least 55 μM, at least at least 60 µM or at least 65 µM. In one embodiment, the media contain approximately 68 μM ± 5 μM pyrimidine derivatives. Pyrimidine derivatives include the nucleosides thymidine, uridine and cytidine. In one particular embodiment, the media contain adenosine, guanosine, cytidine, uridine, thymidine and hypoxanthine.

В дополнение к добавлению орнитина или путресцина в одном из вариантов осуществления среды также содержат аминокислоты в суммарной концентрации по меньшей мере 40 мМ, где в расчет общ сумма не включено количество глутамина. В одном из вариантов осуществления глутамин в среды не добавлен, но его можно добавить в среды в качестве добавки в момент использования при культивировании клеток, например, при продукции белка. Таким образом, в определенных вариантах осуществления, таких как в способе культивирования клеток или способе получения представляющего интерес белка, среды можно обогащать глутамином в качестве добавки в момент использования. В одном из таких вариантов осуществления глутамин добавляют в количестве менее чем приблизительно 40 мМ, менее чем приблизительно 35 мМ, менее чем приблизительно 30 мМ, менее чем приблизительно 25 мМ, менее чем приблизительно 20 мМ, менее чем приблизительно 15 мМ, менее чем приблизительно 10 мМ, менее чем приблизительно 8 мМ, менее чем приблизительно 7 мМ, менее чем приблизительно 6 мМ, менее чем приблизительно 5 мМ, менее чем приблизительно 4 мМ, менее чем приблизительно 3 мМ или менее чем приблизительно 2,5 мМ. В одном из вариантов осуществления количество глутамина в средах, которые обогащали глутамином, составляет приблизительно 2 мМ ± 0,5 мМ.In addition to the addition of ornithine or putrescine, in one embodiment, the media also contain amino acids in a total concentration of at least 40 mM, where the amount of glutamine is not included in the calculation of the total amount. In one embodiment, glutamine is not added to the media, but may be added to the media as an additive at the time of use in cell culture, such as protein production. Thus, in certain embodiments, such as in a cell culture method or a method for producing a protein of interest, the media may be fortified with glutamine as a point-of-use supplement. In one such embodiment, glutamine is added in an amount of less than about 40 mM, less than about 35 mM, less than about 30 mM, less than about 25 mM, less than about 20 mM, less than about 15 mM, less than about 10 mM, less than about 8 mM, less than about 7 mM, less than about 6 mM, less than about 5 mM, less than about 4 mM, less than about 3 mM, or less than about 2.5 mM. In one embodiment, the amount of glutamine in media that have been enriched with glutamine is approximately 2 mM ± 0.5 mM.

В одном из вариантов осуществления в дополнение к добавлению орнитина или комбинации орнитина и путресцина среды также содержат аминокислоты с неполярными боковыми группами в концентрации по меньшей мере 15 мМ, по меньшей мере 24 мМ, по меньшей мере 25 мМ, по меньшей мере 26 мМ, по меньшей мере 27 мМ, по меньшей мере 28 мМ, по меньшей мере 29 мМ или по меньшей мере 30 мМ. В одном из вариантов осуществления среды содержат приблизительно 30 мМ аминокислот с неполярными боковыми группами. В одном из вариантов осуществления на моль общего количества аминокислот, содержащегося в средах, по меньшей мере 32%, по меньшей мере 33%, по меньшей мере 34%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 36%, по меньшей мере 37%, по меньшей мере 38%, по меньшей мере 39%, по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 41% представляют собой аминокислоты с неполярными боковыми группами. В одном из вариантов осуществления на моль аминокислот в средах приблизительно 42% ± 1% представляют собой аминокислоты с неполярными боковыми группами. Аминокислоты с неполярными боковыми группами включают аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин.In one embodiment, in addition to adding ornithine or a combination of ornithine and putrescine, the media also contains amino acids with non-polar side groups at a concentration of at least 15 mM, at least 24 mM, at least 25 mM, at least 26 mM, at least 27 mM, at least 28 mM, at least 29 mM or at least 30 mM. In one embodiment, the media contain approximately 30 mM amino acids with non-polar side groups. In one embodiment, per mole of total amino acids contained in the media, at least 32%, at least 33%, at least 34%, at least 35%, at least 36%, at least 37% at least 38%, at least 39%, at least 40%, or at least 41% are amino acids with non-polar side groups. In one embodiment, per mole of amino acids in the media, approximately 42% ± 1% are amino acids with non-polar side groups. Amino acids with non-polar side groups include alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, tryptophan and methionine.

В одном из вариантов осуществления в дополнение к добавлению орнитина или комбинации орнитина и путресцина среды также содержат аминокислоты с незаряженными полярными боковыми группами в концентрации приблизительно от 10 мМ до 34 мМ, приблизительно от 11 мМ до 33 мМ, приблизительно от 12 мМ до 32 мМ, приблизительно от 13 мМ до 31 мМ, приблизительно от 14 мМ до 30 мМ, приблизительно от 15 мМ до 29 мМ, приблизительно от 16 мМ до 28 мМ, приблизительно от 17 мМ до 27 мМ, приблизительно от 18 мМ до 26 мМ, приблизительно от 19 мМ до 25 мМ, приблизительно от 20 мМ до 24 мМ, приблизительно от 21 мМ до 23 мМ или приблизительно 22 мМ. В одном из вариантов осуществления среда содержит приблизительно 22 мМ аминокислот с незаряженными полярными боковыми группами. В другом варианте осуществления среда содержит приблизительно 12 мМ аминокислот с незаряженными полярными боковыми группами. В одном из вариантов осуществления на моль общегоIn one embodiment, in addition to adding ornithine or a combination of ornithine and putrescine, the media also contains amino acids with uncharged polar side groups at a concentration of about 10 mM to 34 mM, about 11 mM to 33 mM, about 12 mM to 32 mM, about 13 mM to 31 mM, about 14 mM to 30 mM, about 15 mM to 29 mM, about 16 mM to 28 mM, about 17 mM to 27 mM, about 18 mM to 26 mM, about 19 mM to 25 mM, about 20 mM to 24 mM, about 21 mM to 23 mM, or about 22 mM. In one embodiment, the medium contains approximately 22 mM amino acids with uncharged polar side groups. In another embodiment, the medium contains approximately 12 mM amino acids with uncharged polar side groups. In one embodiment, per mole of total

- 8 045169 количества аминокислот, содержащегося в средах приблизительно от 14% до 46%, приблизительно от 15% до 45%, приблизительно от 16% до 44%, приблизительно от 17% до 43%, приблизительно от 18% до 42%, приблизительно от 19% до 41%, приблизительно от 20% до 40%, приблизительно от 21% до 39%, приблизительно от 22% до 38%, приблизительно от 23% до 37%, приблизительно от 24% до 36%, приблизительно от 25% до 35%, приблизительно от 26% до 34%, приблизительно от 27% до 33%, приблизительно от 28% до 32%, приблизительно от 29% до 31% или приблизительно 30% представляют собой аминокислоты с незаряженными полярными боковыми группами. В одном из вариантов осуществления на моль аминокислот в средах приблизительно 30% ± 3% представляют собой аминокислоты с незаряженными полярными боковыми группами. Аминокислоты с незаряженными полярными боковыми группами включают глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин.- 8 045169 amount of amino acids contained in media from approximately 14% to 46%, from approximately 15% to 45%, from approximately 16% to 44%, from approximately 17% to 43%, from approximately 18% to 42%, approximately 19% to 41%, approximately 20% to 40%, approximately 21% to 39%, approximately 22% to 38%, approximately 23% to 37%, approximately 24% to 36%, approximately 25 % to 35%, about 26% to 34%, about 27% to 33%, about 28% to 32%, about 29% to 31%, or about 30% are amino acids with uncharged polar side groups. In one embodiment, per mole of amino acids in the media, approximately 30% ± 3% are amino acids with uncharged polar side groups. Amino acids with uncharged polar side groups include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine and glutamine.

В одном из вариантов осуществления в дополнение к добавлению орнитина или комбинации орнитина и путресцина среды также содержат аминокислоты с отрицательным зарядом при рН 6 (например, кислые аминокислоты) в концентрации приблизительно от 4 мМ до 14 мМ, приблизительно от 5 мМ до 13 мМ, приблизительно от 6 мМ до 12 мМ, приблизительно от 7 мМ до 11 мМ, приблизительно от 8 мМ до 10 мМ, приблизительно 9 мМ или приблизительно 4 мМ. В одном из вариантов осуществления среды содержат приблизительно 9 мМ кислых аминокислот. В одном из вариантов осуществления среды содержат 9 мМ ± 1 мМ кислых аминокислот. В одном из вариантов осуществления на моль общего количества аминокислот, содержащихся в средах приблизительно от 8% до 18%, приблизительно от 9% до 17%, приблизительно от 10% до 16%, приблизительно от 11% до 15%, приблизительно от 12% до 14% или приблизительно 13% представляют собой кислые аминокислоты. В одном из вариантов осуществления на моль аминокислот в средах приблизительно 12,6% ± 1% представляют собой кислые аминокислоты. Кислые аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту.In one embodiment, in addition to adding ornithine or a combination of ornithine and putrescine, the media also contains amino acids with a negative charge at pH 6 (e.g., acidic amino acids) at a concentration of about 4 mM to 14 mM, about 5 mM to about 13 mM, about 6 mM to 12 mM, about 7 mM to 11 mM, about 8 mM to 10 mM, about 9 mM, or about 4 mM. In one embodiment, the media contain approximately 9 mM acidic amino acids. In one embodiment, the media contain 9 mM ± 1 mM acidic amino acids. In one embodiment, per mole of total amino acids contained in the media, about 8% to 18%, about 9% to 17%, about 10% to 16%, about 11% to 15%, about 12% up to 14% or approximately 13% are acidic amino acids. In one embodiment, per mole of amino acids in the media, approximately 12.6% ± 1% are acidic amino acids. Acidic amino acids include aspartic acid and glutamic acid.

В одном из вариантов осуществления в дополнение к добавлению орнитина или комбинации орнитина и путресцина среды также содержат аминокислоты с положительным зарядом при рН 6 (например, основные аминокислоты) в концентрации по меньшей мере 3,5 мМ, по меньшей мере 4 мМ, по меньшей мере 5 мМ, по меньшей мере 6 мМ, по меньшей мере 7 мМ, по меньшей мере 8 мМ, по меньшей мере 9 мМ, по меньшей мере 10 мМ или по меньшей мере 11 мМ. В одном из вариантов осуществления среды содержат приблизительно 11 мМ основных аминокислот. В одном из вариантов осуществления среды содержат приблизительно 11,42 мМ ± 1 мМ основных аминокислот. В одном из вариантов осуществления на моль общего количества аминокислот, содержащихся в средах по меньшей мере 5%, по меньшей мере 6%, по меньшей мере 7%, по меньшей мере 8%, по меньшей мере 9%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 11%, по меньшей мере 12%, по меньшей мере 13%, по меньшей мере 14% или по меньшей мере 15% представляют собой основные аминокислоты. В одном из вариантов осуществления на моль аминокислот в средах приблизительно 16% представляют собой основные аминокислоты. В одном из вариантов осуществления на моль аминокислот в средах приблизительно 15,8% ± 2,4% представляют собой основные аминокислоты. В одном из вариантов осуществления на моль аминокислот в средах приблизительно 21% ± 3,2% представляют собой основные аминокислоты. Основные аминокислоты включают лизин, аргинин и гистидин.In one embodiment, in addition to adding ornithine or a combination of ornithine and putrescine, the media also contains amino acids with a positive charge at pH 6 (e.g., basic amino acids) at a concentration of at least 3.5 mM, at least 4 mM, at least 5 mM, at least 6 mM, at least 7 mM, at least 8 mM, at least 9 mM, at least 10 mM or at least 11 mM. In one embodiment, the media contain approximately 11 mM of essential amino acids. In one embodiment, the media contain approximately 11.42 mM ± 1 mM basic amino acids. In one embodiment, per mole of total amino acids contained in the media is at least 5%, at least 6%, at least 7%, at least 8%, at least 9%, at least 10%, at least 11%, at least 12%, at least 13%, at least 14%, or at least 15% are essential amino acids. In one embodiment, per mole of amino acids in the media, approximately 16% are basic amino acids. In one embodiment, per mole of amino acids in the media, approximately 15.8% ± 2.4% are basic amino acids. In one embodiment, per mole of amino acids in the media, approximately 21% ± 3.2% are basic amino acids. Essential amino acids include lysine, arginine and histidine.

В одном из вариантов осуществления в дополнение к добавлению орнитина или комбинации орнитина и путресцина среды также содержат приблизительно 30 мМ неполярных аминокислот, приблизительно 22 мМ незаряженных полярных аминокислот, приблизительно 9 мМ кислых аминокислот и приблизительно 11 мМ основных аминокислот. В одном из вариантов осуществления на моль аминокислот в средах приблизительно 42% представляют собой неполярные аминокислоты, приблизительно 30% представляют собой незаряженные полярные аминокислоты, приблизительно 13% представляют собой кислые аминокислоты и приблизительно 16% представляют собой основные аминокислоты.In one embodiment, in addition to adding ornithine or a combination of ornithine and putrescine, the media also contains approximately 30 mM nonpolar amino acids, approximately 22 mM uncharged polar amino acids, approximately 9 mM acidic amino acids, and approximately 11 mM basic amino acids. In one embodiment, per mole of amino acids in the media, approximately 42% are non-polar amino acids, approximately 30% are uncharged polar amino acids, approximately 13% are acidic amino acids, and approximately 16% are basic amino acids.

В дополнение к добавлению орнитина или комбинации орнитина и путресцина в одном из вариантов осуществления среды содержат микромолярные количества жирных кислот (или производных жирных кислот) и токоферол. В одном из вариантов осуществления жирные кислоты включают любую одну или несколько из линолевой кислоты, линоленовой кислоты, липоевой кислоты, олеиновой кислоты, пальмитиновой кислоты, стеариновой кислоты, арахидиновой кислоты, арахидоновой кислоты, лауриновой кислоты, бегеновой кислоты, каприловой кислоты, лауриновой кислоты, гексановой кислоты, лигноцериновой кислоты, миристиновой кислоты и октановой кислоты. В одном из вариантов осуществления среды содержат токоферол, линолевую кислоту и липоевую кислоту.In addition to the addition of ornithine or a combination of ornithine and putrescine, in one embodiment, the media contain micromolar amounts of fatty acids (or fatty acid derivatives) and tocopherol. In one embodiment, the fatty acids include any one or more of linoleic acid, linolenic acid, lipoic acid, oleic acid, palmitic acid, stearic acid, arachidic acid, arachidonic acid, lauric acid, behenic acid, caprylic acid, lauric acid, hexanoic acid acid, lignoceric acid, myristic acid and octanoic acid. In one embodiment, the media contain tocopherol, linoleic acid and lipoic acid.

В одном из вариантов осуществления среды также содержат смесь витаминов, которая включает другие питательные вещества и незаменимые питательные вещества, в суммарной концентрации по меньшей мере приблизительно 700 мкМ или по меньшей мере приблизительно 2 мМ. В одном из вариантов осуществления смесь витаминов содержит один или несколько из D-биотина, хлорида холина, фолиевой кислоты, миоинозитола, амида никотиновой кислоты, пиридоксина HCl, D-пантотеновой кислоты (hemiCa), рибофлавина, тиамина HCl, витамина В12 и т.п. В одном из вариантов осуществления смесь витаминов включает все из D-биотина, хлорида холина, фолиевой кислота, миоинозитола, амида никотиновой кислоты, пиридоксина HCl, D-пантотеновой кислоты (hemiCa), рибофлавина, тиамина HCl и витаIn one embodiment, the media also contains a vitamin mixture that includes other nutrients and essential nutrients in a total concentration of at least about 700 μM or at least about 2 mM. In one embodiment, the vitamin mixture contains one or more of D-biotin, choline chloride, folic acid, myoinositol, niacin amide, pyridoxine HCl, D-pantothenic acid (hemiCa), riboflavin, thiamine HCl, vitamin B12, and the like . In one embodiment, the vitamin mixture includes all of D-biotin, choline chloride, folic acid, myoinositol, niacin amide, pyridoxine HCl, D-pantothenic acid (hemiCa), riboflavin, thiamine HCl, and vitamin

- 9 045169 мина В12.- 9 045169 mine B12.

Различные варианты осуществления сред по изобретению включают любую из комбинаций описанных выше вариантов осуществления, включая химически определенные, не содержащие гидролизатов, не содержащие сывороток среды, содержащие орнитин или путресцин в указанных количествах и, в числе прочего, (а) аминокислоты; (b) необязательно нуклеозиды; (с) соли двухвалентных катионов; (d) жирные кислоты и токоферол и (е) витамины. В определенных вариантах осуществления во все OS среды можно добавлять небольшие количества гидролизатов.Various embodiments of the media of the invention include any combination of the embodiments described above, including chemically defined, hydrolysate-free, serum-free media containing ornithine or putrescine in specified amounts and, without limitation, (a) amino acids; (b) optionally nucleosides; (c) salts of divalent cations; (d) fatty acids and tocopherol and (e) vitamins. In certain embodiments, small amounts of hydrolysates may be added to all OS media.

Заявители полагают, что в практическом осуществлении настоящего изобретения можно использовать любые одну или несколько из множества основных сред или их сочетаний, в которые добавляют орнитин или комбинацию орнитина и путресцина. Основные среды общеизвестны в данной области и в числе прочего включают МЕМЕ (минимальную поддерживающую среду) Игла (Eagle, Science, 1955, 112(3168):501-504), F12 Хэма (Ham, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 1965, 53:288-293), среду F-12 K, среду Дульбекко, модифицированную Дульбекко среду Игла (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1952 August; 38(8): 747-752), среды DMEM/Хэма F12 1:1, T8 Троуэла, среды А2 Холмса и Вольфа, Biophys. Biochem. Cytol., 1961, 10:389-401), среды Вэймота (Davidson and Waymouth, Biochem. J., 1945, 39(2): 188-199), среды Е Вильямса (William's et al., Exp. Cell Res., 1971, 69:105 et seq.), RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc, 1967, 199:519-524), среды MCDB 104/110 (Bettger et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 1981, 78(9):55885592), среды Вентре HL-1, среды с альбумином-глобулином (Orr et al., Appl. Microbiol., 1973, 25(l):4954), среду RPMI-1640, среду RPMI-1641, модифицированную Исков среду Дульбекко, среду Маккоя 5 А, среду Лейбовица L-15 и не содержащие сыворотки среды, такие как EX-CELL™ 300 Series (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas), среды с протамином-цинком-инсулином (Weiss et al., 1974, US 4072565), среды с биотином-фолатом (Cartaya, 1978, US Re30,985), среды с трансферрином-жирными кислотами (Baker, 1982, US 4560655), среды с трансферрином-EGF (Hasegawa, 1982, US 4615977; Chessebeuf, 1984, US 4786599) и другие комбинации сред (см. Inlow, US 6048728; Drapeau, US 7294484; Mather, US 5122469; Furukawa, uS 5976833; Chen, uS 6180401; Chen, US 5856179; Etcheverry, US 5705364; Etcheverry, US 7666416; Ryll, US 6528286; Singh, US 6924124; Luan, US 7429491 и т.п.).Applicants believe that any one or more of a variety of base media or combinations thereof may be used in the practice of the present invention to which ornithine or a combination of ornithine and putrescine is added. Basic media are well known in the art and include, but are not limited to, MEME (Eagle, Science, 1955, 112(3168):501-504), Ham's F12 (Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 1965, 53:288-293), F-12 K medium, Dulbecco's medium, Dulbecco's modified Eagle's medium (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1952 August; 38(8): 747-752), media DMEM/Ham's F12 1:1, Trowell's T8, Holmes and Wolff's A2 media, Biophys. Biochem. Cytol., 1961, 10:389-401), Waymouth's medium (Davidson and Waymouth, Biochem. J., 1945, 39(2): 188-199), Williams' E medium (William's et al., Exp. Cell Res. , 1971, 69:105 et seq.), RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc, 1967, 199:519-524), MCDB 104/110 media (Bettger et al., Proc. Nat 'l. Acad. Sci. USA, 1981, 78(9):55885592), Ventre HL-1 media, albumin-globulin media (Orr et al., Appl. Microbiol., 1973, 25(l):4954) , RPMI-1640 medium, RPMI-1641 medium, Iscove's modified Dulbecco's medium, McCoy's 5 A medium, Leibovitz's L-15 medium, and serum-free media such as EX-CELL™ 300 Series (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas) media with protamine-zinc-insulin (Weiss et al., 1974, US 4072565), biotin-folate media (Cartaya, 1978, US Re30.985), transferrin-fatty acid media (Baker, 1982, US 4560655), media with transferrin-EGF (Hasegawa, 1982, US 4615977; Chessebeuf, 1984, US 4786599) and other combinations of media (see Inlow, US 6048728; Drapeau, US 7294484; Mather, US 5122469; Furukawa, uS 5976833; Chen, uS 6180401; Chen, US 5856179; Etcheverry, US 5705364; Etcheverry, US 7666416; Ryll, US 6528286; Singh, US 6924124; Luan, US 7429491, etc.).

В конкретном варианте осуществления среда является химически определенной и в дополнение к орнитину или комбинации орнитина и путресцина содержит: CaCl₂ 2Н2О; буфер HEPES, KCl; MgSO4; NaCl; Na₂HPO₄ или другие фосфатные соли; пируват; L-аланин; L-аргинин HCl; L-аспарагин Н₂О; Lаспарагиновую кислоту; L-цистеин HCl Н₂О; L-глутаминовую кислоту; глицин; L-гистидин HCl Н₂О; Lизолейцин; L-лейцин; L-лизин HCl; L-метионин; L-орнитин HCl; L-фенилаланин; L-пролин; L-серин; Lтреонин; L-триптофан; L-тирозин 2Na 2Н2О; L-валин; D-биотин; хлорид холина; фолиевую кислоту; миоинозитол; амид никотиновой кислоты; пиридоксин HCl; D-пантотеновую кислоту; рибофлавин; тиамин HCl; витамин В12; ρ-аминобензойную кислоту; этаноламин HCl; плюроник F68; DL-a-токоферола фосфат; линолевую кислоту; Na₂SeO₃; липоевую кислоту и глюкозу и необязательно аденозин; гуанозин; цитидин; уридин; тимидин и гипоксантин 2Na.In a specific embodiment, the medium is chemically defined and, in addition to ornithine or a combination of ornithine and putrescine, contains: CaCl ₂ 2H2O; HEPES buffer, KCl; MgSO4; NaCl; Na ₂ HPO ₄ or other phosphate salts; pyruvate; L-alanine; L-arginine HCl; L-asparagine H ₂ O; L-aspartic acid; L-cysteine HCl H ₂ O; L-glutamic acid; glycine; L-histidine HCl H ₂ O; L-soleucine; L-leucine; L-lysine HCl; L-methionine; L-ornithine HCl; L-phenylalanine; L-proline; L-serine; Lthreonine; L-tryptophan; L-tyrosine 2Na 2H2O; L-valine; D-biotin; choline chloride; folic acid; myoinositol; nicotinic acid amide; pyridoxine HCl; D-pantothenic acid; riboflavin; thiamine HCl; vitamin B12; ρ-aminobenzoic acid; ethanolamine HCl; Pluronic F68; DL-a-tocopherol phosphate; linoleic acid; Na ₂ SeO ₃ ; lipoic acid and glucose and optionally adenosine; guanosine; cytidine; uridine; thymidine and hypoxanthine 2Na.

В одном из вариантов осуществления исходная осмолярность сред по изобретению составляет 200500, 250-400, 275-350 или приблизительно 300 мОсм. В течение роста клеток в средах по изобретению и, в частности, после любой подачи питательных веществ по протоколу периодической подпитки, осмолярность культуры может увеличиваться приблизительно до 350, 400, 450 или до 500 мОсм.In one embodiment, the starting osmolarity of the media of the invention is 200500, 250-400, 275-350, or approximately 300 mOsm. During cell growth in the media of the invention and, in particular, after any nutrient supply under the fed-batch protocol, the osmolarity of the culture can increase to approximately 350, 400, 450 or up to 500 mOsm.

В определенных вариантах осуществления, где осмолярность среды определенного состава составляет менее чем приблизительно 300, осмолярность доводят приблизительно до 300, добавляя одну или несколько солей свыше указанного количества. В одном из вариантов осуществления осмолярность увеличивают до желаемого уровня, добавляя один или несколько осмолитов, выбранных из хлорида натрия, хлорида калия, соли магния, соли кальция, кислой соли амина, соли жирной кислоты, бикарбоната натрия, карбоната натрия, карбоната калия, хелатора, который представляет собой соль, сахар (например, галактозу, глюкозу, сахарозу, фруктозу, фукозу и т.д.) и их сочетания. В одном из вариантов осуществления осмолит добавляют в дополнение к его концентрации в компоненте, уже присутствующем в среде определенного состава (например, сахар добавляют в дополнение к концентрации, указанной для компонента сахара).In certain embodiments, where the osmolarity of the medium of a particular composition is less than about 300, the osmolarity is adjusted to about 300 by adding one or more salts in excess of the specified amount. In one embodiment, the osmolarity is increased to the desired level by adding one or more osmolytes selected from sodium chloride, potassium chloride, magnesium salt, calcium salt, amine acid salt, fatty acid salt, sodium bicarbonate, sodium carbonate, potassium carbonate, chelator, which is salt, sugar (eg galactose, glucose, sucrose, fructose, fucose, etc.) and combinations thereof. In one embodiment, the osmolyte is added in addition to its concentration in a component already present in the medium of a particular composition (eg, sugar is added in addition to the concentration specified for the sugar component).

Любой и каждый из вариантов осуществления сред, описанных выше, а также любых других не содержащих сыворотки сред, содержащих по меньшей мере приблизительно 90 мкМ орнитина (или содержащих комбинацию по меньшей мере приблизительно 100 мкМ орнитина и по меньшей мере приблизительно 200 мкМ путресцина) далее в настоящем изобретении обозначают как обогащенные орнитином (OS) среды. И наоборот, среды, не содержащие орнитина (или не содержащие комбинации орнитина/путресцина), или среды, содержащие менее 100 мкМ орнитина (или среды, содержащие менее 100 мкМ орнитина и менее 200 мкМ путресцина), далее в настоящем документе обозначают как не обогащенные орнитином (не OS) среды.Any and each of the embodiments of the media described above, as well as any other serum-free media containing at least about 90 μM ornithine (or containing a combination of at least about 100 μM ornithine and at least about 200 μM putrescine) further in herein referred to as ornithine enriched (OS) media. Conversely, media containing no ornithine (or no ornithine/putrescine combination) or media containing less than 100 μM ornithine (or media containing less than 100 μM ornithine and less than 200 μM putrescine) are hereinafter referred to as unfortified ornithine (not OS) medium.

Культура клеток.Cell culture.

Настоящее изобретение относится к культуре клеток, содержащей линию клеток, экспрессирующую представляющий интерес белок в OS среде, как описано выше. В одном из вариантов осуществлеThe present invention relates to a cell culture containing a cell line expressing a protein of interest in an OS environment as described above. In one of the options

- 10 045169 ния культура клеток содержит инсулин, который можно добавлять в среды в качестве ингредиента в момент использования или можно включать в составы сред. В одном из вариантов осуществления линия клеток содержит клетки, способные к продукции биотерапевтического белка. Примеры линий клеток, которые как правило используют для продукции белковых биотерапевтических средств, включают в числе прочего первичные клетки, клетки BSC, клетки HeLa, клетки HepG2, клетки LLC-MK, клетки CV1, клетки COS, клетки VERO, клетки MDBK, клетки MDCK, клетки CRFK, клетки RAF, клетки RK, клетки TCMK-1, клетки LLCPK, клетки PK15, клетки LLC-RK, клетки MDOK, клетки BHK, клетки BHK21, клетки СНО, клетки CHO-K1, клетки NS-1, клетки MRC-5, клетки WI-38, клетки BHK, клетки 3Т3, клетки 293, клетки RK, клетки Per.C6 и клетки куриных эмбрионов. В одном из вариантов осуществления линия клеток представляет собой линию клеток СНО или одну или несколько из нескольких конкретных вариантов клеток СНО, оптимизированных для продукции белка в большом масштабе, например, CHO-K1.- 10 045169 The cell culture contains insulin, which can be added to the media as an ingredient at the time of use or can be included in media formulations. In one embodiment, the cell line contains cells capable of producing a biotherapeutic protein. Examples of cell lines that are typically used for the production of protein biotherapeutics include, but are not limited to, primary cells, BSC cells, HeLa cells, HepG2 cells, LLC-MK cells, CV1 cells, COS cells, VERO cells, MDBK cells, MDCK cells, CRFK cells, RAF cells, RK cells, TCMK-1 cells, LLCPK cells, PK15 cells, LLC-RK cells, MDOK cells, BHK cells, BHK21 cells, CHO cells, CHO-K1 cells, NS-1 cells, MRC- cells 5, WI-38 cells, BHK cells, 3T3 cells, 293 cells, RK cells, Per.C6 cells and chick embryo cells. In one embodiment, the cell line is a CHO cell line or one or more of several specific variants of CHO cells optimized for large scale protein production, for example, CHO-K1.

Культура клеток или культура означает рост и размножение клеток вне многоклеточного организма или ткани. Подходящие условия культивирования для клеток млекопитающих известны в данной области. См. например. Animal cell culture: A Practical Approach, D. Rickwood, ed., Oxford University Press, New York (1992). Клетки млекопитающих можно культивировать в суспензии или прикрепленными к твердому субстрату. Для культур клеток млекопитающих доступны биореакторы с псевдоожиженным слоем, биореакторы с пористыми волокнами, биореакторы с роллерными флаконами, встряхиваемыми колбами или смесительными баками с микроносители или без и функционирующие в периодическом режиме, в периодическом режиме с подпиткой, непрерывном, полунепрерывном режиме или режиме с орошением. В течение культивирования в культуру непрерывно или с интервалами можно добавлять среды для культивирования клеток или концентрированные питательные среды. Например, культуру можно подпитывать раз в сутки, через сутки, каждые трое суток или можно подпитывать, когда концентрация конкретного компонента среда, который подвергают контролю, падает ниже желаемого диапазона.Cell culture or culture means the growth and reproduction of cells outside a multicellular organism or tissue. Suitable culture conditions for mammalian cells are known in the art. See for example. Animal cell culture: A Practical Approach, D. Rickwood, ed., Oxford University Press, New York (1992). Mammalian cells can be cultured in suspension or attached to a solid substrate. For mammalian cell cultures, fluidized bed bioreactors, porous fiber bioreactors, roller bottle, shake flask, or mixing tank bioreactors with or without microcarriers are available and operate in batch, fed-batch, continuous, semi-continuous, or reflux mode. During cultivation, cell culture media or concentrated nutrient media can be added to the culture continuously or at intervals. For example, the culture can be fed once a day, every other day, every three days, or can be fed when the concentration of a particular component of the medium that is being monitored falls below the desired range.

Животные клетки, такие как клетки СНО, можно культивировать в культурах малого масштаба, например, в 125 мл контейнерах, содержащих приблизительно 25 мл среды, 250 мл контейнерах, содержащих приблизительно от 50 до 100 мл среды, 500 мл контейнерах, содержащих приблизительно от 100 до 200 мл среды. Альтернативно, культуры могут быть крупномасштабными, такими как, например, 1000 мл контейнеры, содержащие приблизительно от 300 до 1000 мл среды, 3000 мл контейнеры, содержащие приблизительно от 500 мл до 3000 мл среды, 8000 мл контейнеры, содержащие приблизительно от 2000 мл до 8000 мл среды и 15000 мл контейнеры, содержащие от 4000 мл до 15000 мл среды. Культуры для производства могут содержать 10000 л среды или более. Крупномасштабные культуры клеток, такие как для клинического производства белковых терапевтических средства, как правило, поддерживают в течение нескольких суток или даже недель, при этом клетки продуцируют желаемый белок(и). В течение этого времени культуру можно обогащать концентрированной питательной средой, содержащей такие компоненты, как питательные вещества и аминокислоты, которые расходуются в течение культивирования. Концентрированная питательная среда может быть основана на любых составах сред для культивирования клеток. Такая концентрированная питательная среда может содержать большинство компонентов среды для культивирования клеток, например, приблизительно в количестве 5х, 6х, 7х, 8х, 9х, 10х, 12х, 14х, 16х, 20х, 30х, 50х, 100х, 200х, 400х, 600х, 800х или даже приблизительно 1000х от их нормального пригодного количества. Концентрированные питательные среды часто используют в процессах культивирования с периодической подпиткой.Animal cells, such as CHO cells, can be cultured in small scale cultures, for example, 125 ml containers containing approximately 25 ml of medium, 250 ml containers containing approximately 50 to 100 ml of medium, 500 ml containers containing approximately 100 to 200 ml of medium. Alternatively, the cultures may be large scale, such as, for example, 1000 ml containers containing from about 300 to 1000 ml of medium, 3000 ml containers containing from about 500 ml to 3000 ml of medium, 8000 ml containers containing from about 2000 ml to 8000 ml of medium and 15,000 ml containers containing from 4,000 ml to 15,000 ml of medium. Production cultures may contain 10,000 L of medium or more. Large-scale cell cultures, such as those for the clinical production of protein therapeutics, are typically maintained for days or even weeks while the cells produce the desired protein(s). During this time, the culture can be enriched with a concentrated nutrient medium containing components such as nutrients and amino acids that are consumed during cultivation. The concentrated nutrient medium can be based on any composition of cell culture media. Such a concentrated culture medium may contain most of the components of the cell culture medium, for example, in amounts of approximately 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 12x, 14x, 16x, 20x, 30x, 50x, 100x, 200x, 400x, 600x, 800x or even approximately 1000x of their normal usable amount. Concentrated nutrient media are often used in fed-batch culture processes.

В определенных вариантах осуществления среды для культивирования клеток в течение роста клеток или продукции белка обогащают добавками в момент использования, также известными как добавки, ингредиенты, добавляемые в момент использования, или химические вещества, добавляемые в момент использования. Добавки в момент использования включают один или несколько из факторов роста или других белков, буферов, источников энергии, солей, аминокислот, металлов и хелаторов. Другие белки включают трансферрин и альбумин. Факторы роста, которые включают цитокины и хемокины, в основном известны в данной области и известно, что они стимулируют рост клеток или, в некоторых случаях, дифференцировку клеток. Как правило, фактор роста представляет собой белок (например, инсулин), небольшой пептид или стероидный гормон, такой как эстроген, DHEA, тестостерон и т.п.В некоторых случаях, фактор роста может представляет собой искусственное химическое вещество, которое стимулирует клеточную пролиферацию или продукцию белка, такое как, например, тетрагидрофолат (THF), метотрексат и т.п.Неограничивающие примеры белковых и пептидных факторов роста включают ангиопоэтины, морфогенетические белки кости (BMP), выделенный из головного мозга нейротрофический фактор (BDNF), эпидермальный фактор роста (EGF), эритропоэтин (ЕРО), фактор роста фибробластов (FGF), выделенный из линий глиальных клеток нейротрофический фактор (GDNF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), ростовой фактор дифференцировки 9 (GDF9), фактор роста гепатоцитов (HGF), выделенный из гепатомы фактор роста (HDGF), инсулин, инсулиноподобный фактор роста (IGF), факторIn certain embodiments, cell culture media are fortified during cell growth or protein production with point-of-use additives, also known as additives, point-of-use ingredients, or point-of-use chemicals. Supplements at the point of use include one or more of growth factors or other proteins, buffers, energy sources, salts, amino acids, metals and chelators. Other proteins include transferrin and albumin. Growth factors, which include cytokines and chemokines, are generally known in the art and are known to stimulate cell growth or, in some cases, cell differentiation. Typically, the growth factor is a protein (eg, insulin), a small peptide, or a steroid hormone such as estrogen, DHEA, testosterone, etc. In some cases, the growth factor may be a man-made chemical that stimulates cell proliferation or protein products such as, for example, tetrahydrofolate (THF), methotrexate, and the like. Non-limiting examples of protein and peptide growth factors include angiopoietins, bone morphogenetic proteins (BMPs), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), epidermal growth factor ( EGF), erythropoietin (EPO), fibroblast growth factor (FGF), glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), growth differentiation factor 9 (GDF9), hepatocyte growth factor (HGF), hepatoma-derived growth factor (HDGF), insulin, insulin-like growth factor (IGF), factor

- 11 045169 стимуляции миграции, миостатин (GDF-8), фактор роста нервов (NGF) и другие нейротрофины, выделенный из тромбоцитов фактор роста (PDGF), тромбопоэтин (ТРО), трансформирующий фактор роста альфа (TGF-α), трансформирующий фактор роста бета (TGF-β), фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), агонисты путь передачи сигнала wnt, плацентарный фактор роста (PlGF), эмбриональный телячий соматотрофин (FBS), интерлейкин-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 и т.п. В одном из вариантов осуществления среду для культивирования клеток обогащают добавляемым в момент использования фактором роста инсулином. В одном из вариантов осуществления концентрация инсулина в средах, например, количество инсулина в средах для культивирования клеток после добавления, составляет приблизительно от 0,1 мкМ до 10 мкМ. Также в составы сред по определенным вариантам осуществления можно включать одну или несколько добавок в момент использования.- 11 045169 stimulation of migration, myostatin (GDF-8), nerve growth factor (NGF) and other neurotrophins, platelet-derived growth factor (PDGF), thrombopoietin (TPO), transforming growth factor alpha (TGF-α), transforming growth factor beta (TGF-β), tumor necrosis factor alpha (TNF-α), vascular endothelial growth factor (VEGF), wnt signaling pathway agonists, placental growth factor (PlGF), fetal bovine somatotrophin (FBS), interleukin-1 (IL -1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, etc. In one embodiment, the cell culture medium is enriched with insulin, a growth factor added at the time of use. In one embodiment, the concentration of insulin in the media, eg, the amount of insulin in the cell culture media after addition, is from about 0.1 μM to 10 μM. Also, media formulations in certain embodiments may include one or more additives at the point of use.

Буферы общеизвестны в данной области. Изобретение не ограничено каким-либо конкретным буфером или буферами, и любой специалист в данной области может выбрать соответствующие буфер или буферную систему для использования с конкретной линией клеток, продуцирующей конкретный белок. В одном из вариантов осуществления буфер, добавляемый в момент использования, представляет собой NaHCO₃. В одном из вариантов осуществления буфер, добавляемый в момент использования, содержит NaHCO₃. В другом варианте осуществления буфер представляет собой HEPES.Buffers are well known in the art. The invention is not limited to any particular buffer or buffers, and one skilled in the art can select an appropriate buffer or buffer system for use with a particular cell line producing a particular protein. In one embodiment, the buffer added at the time of use is NaHCO ₃ . In one embodiment, the buffer added at the time of use contains NaHCO ₃ . In another embodiment, the buffer is HEPES.

Источники энергии для применения в качестве добавки в момент использования в культуре клеток также хорошо известны в данной области. Без ограничения в одном из вариантов осуществления источник энергии, добавляемый в момент использования, представляет собой глюкозу. Учитывая конкретные и определенные требования конкретных линии клеток и продуцируемого белка, в одном из вариантов осуществления глюкозу в среды можно добавлять в концентрации приблизительно от 1 до 20 мМ. В определенных случаях глюкозу можно добавлять на высоких уровнях вплоть до 10 г/л.Energy sources for use as a supplement at the time of use in cell culture are also well known in the art. Without limitation, in one embodiment, the energy source added at the time of use is glucose. Given the specific and specific requirements of the particular cell line and protein being produced, in one embodiment, glucose may be added to the media at concentrations of from about 1 to 20 mM. In certain cases, glucose can be added at high levels up to 10 g/l.

Также в области культуры клеток и продукции белка хорошо известны хелаторы. Двумя стандартными хелаторами, используемыми в данной области, являются дигидрат ЭДТА натрия и цитрат, хотя в практическом осуществлении настоящего изобретения можно использовать другие хелаторы. В одном из вариантов осуществления хелатор, добавляемый в момент использования, представляет собой дигидрат ЭДТА натрия. В одном из вариантов осуществления хелатор, добавляемый в момент использования, представляет собой цитрат, такой как Na₃C₆H₅O₇.Also chelators are well known in the field of cell culture and protein production. Two standard chelators used in the art are sodium EDTA dihydrate and citrate, although other chelators may be used in the practice of the present invention. In one embodiment, the chelator added at the point of use is sodium EDTA dihydrate. In one embodiment, the chelator added at the point of use is a citrate, such as Na ₃ C ₆ H ₅ O ₇ .

В одном из вариантов осуществления культуру клеток можно обогащать одной или несколькими аминокислотами, добавляемыми в момент использования, например, такими как глутамин. В одном из вариантов осуществления среда для культивирования клеток обогащена глутамином, добавляемым в момент использования в конечной концентрации приблизительно от 1 мМ до 13 мМ. другие добавки в момент использования включают одну или несколько из различных солей металлов, такие как соли железа, никеля, цинка и меди. В одном из вариантов осуществления среды для культивирования клеток обогащают любым одним или несколькими из сульфата меди, сульфата цинка, хлорида железа и сульфата никеля.In one embodiment, the cell culture can be enriched with one or more amino acids added at the point of use, such as glutamine, for example. In one embodiment, the cell culture medium is enriched with glutamine, added at the time of use in a final concentration of approximately 1 mM to 13 mM. other point-of-use additives include one or more of various metal salts, such as iron, nickel, zinc and copper salts. In one embodiment, the cell culture media is enriched with any one or more of copper sulfate, zinc sulfate, ferric chloride and nickel sulfate.

В одном из вариантов осуществления среды для культивирования клеток обогащают любой одной или несколькими или всеми из указанных ниже добавок в момент использования: приблизительно 29,8 мМ NaHCO₃, приблизительно 2 мМ глутамин, приблизительно 0,86 мкМ инсулин, приблизительно 11,1 мМ глюкоза, приблизительно 6,54 мкМ сульфат цинка, приблизительно 0,168 мкМ сульфат меди, приблизительно 75 мкМ хлорид железа, приблизительно 0,639 мкМ сульфат никеля, приблизительно 85 мкМ ЭДТА и приблизительно 50 мкМ цитрат.In one embodiment, the cell culture media is fortified with any one or more or all of the following additives at the time of use: about 29.8 mM NaHCO ₃ , about 2 mM glutamine, about 0.86 μM insulin, about 11.1 mM glucose , approximately 6.54 μM zinc sulfate, approximately 0.168 μM copper sulfate, approximately 75 μM ferric chloride, approximately 0.639 μM nickel sulfate, approximately 85 μM EDTA and approximately 50 μM citrate.

В одном из вариантов осуществления среды обогащают с интервалами в течение культивирования клеток в соответствии с процессом с периодической подпиткой. Культивирование с периодической подпиткой общеизвестно в данной области и применяется для оптимизированной продукции белка (см. Y.M. Huang et al., Biotechnol Prog. 2010 Sep-Oct;26(5):1400-10).In one embodiment, the media is enriched at intervals during cell culture in accordance with a fed-batch process. Fed-batch culture is well known in the art and is used for optimized protein production (see Y.M. Huang et al., Biotechnol Prog. 2010 Sep-Oct;26(5):1400-10).

Относительно роста клеток в культуре без орнитина или путресцина жизнеспособность клеток, плотность жизнеспособных клеток и удвоение клеток улучшены. Относительно жизнеспособности клеток, клетки, растущие в OS средах демонстрирует жизнеспособность, которая по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере, 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 100% или по меньшей мере в 3 раза выше, чем жизнеспособность сходных или идентичных клеток, растущих не в OS средах.Relative to cell growth in culture without ornithine or putrescine, cell viability, viable cell density, and cell doubling were improved. Regarding cell viability, cells growing in OS media demonstrate a viability that is at least 10%, at least 15%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, according to at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 99%, at least 100% or at least 3 times higher than the viability of similar or identical cells growing in non-OS environments.

В определенных вариантах осуществления скорость удвоения жизнеспособных клеток млекопитающих в OS средах по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 6%, по меньшей мере на 7%, по меньшей мере на 8%, по меньшей мере на 9%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 11%, по меньшей мере на 12%, по меньшей мере на 13%, по меньшей мере на 14%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 16%, по меньшей мере на 17%, по меньшей мере на 18%, по меньшей мере на 19%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 21%, по меньшей мере на 22%, по меньшей мере на 23%, поIn certain embodiments, the doubling rate of viable mammalian cells in OS environments is at least 5%, at least 6%, at least 7%, at least 8%, at least 9%, at least by 10%, by at least 11%, by at least 12%, by at least 13%, by at least 14%, by at least 15%, by at least 16%, by at least 17%, at least 18%, at least 19%, at least 20%, at least 21%, at least 22%, at least 23%, according to

- 12 045169 меньшей мере на 24%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 26%, по меньшей мере на 27%, по меньшей мере на 28%, по меньшей мере на 29%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 100% или по меньшей мере в 3 раза выше, чем скорость удвоения клеток млекопитающих, культивируемых не в OS средах. В определенных вариантах осуществления скорость удвоения жизнеспособных клеток млекопитающих в OS средах приблизительно на 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29% или 30% выше, чем скорость удвоения клеток млекопитающих не в OS средах.- 12 045169 by at least 24%, at least 25%, at least 26%, at least 27%, at least 28%, at least 29%, at least 30% , at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 100%, or at least 3 times higher than the doubling rate of mammalian cells cultured in non-OS media. In certain embodiments, the doubling rate of viable mammalian cells in OS environments is approximately 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, or 30% higher than the doubling rate of mammalian cells in non-OS environments.

В определенных вариантах осуществления время удвоения активно проходящих цикл клеток млекопитающих в OS средах составляет менее 30 ч, менее 29 ч, менее 28 ч, менее 27 ч, менее 26 ч, менее 25 ч, менее 24 ч, менее 23 ч, менее 22 ч, менее 21 ч, менее 20 ч, менее 19 ч или менее 18 ч. В определенных вариантах осуществления время удвоения активно растущих клеток млекопитающих в OS средах составляет менее 28 ч. В определенных вариантах осуществления время удвоения клеток млекопитающих в OS средах составляет приблизительно 27 ± 1 ч, приблизительно 26 ± 1 ч, приблизительно 25 ± 1 ч, приблизительно 24 ± 1 ч, приблизительно 23 ± 1 ч, приблизительно 22 ± 1 ч или приблизительно 21 ± 1 ч. В определенных вариантах осуществления время удвоения активно проходящих цикл клеток млекопитающих в OS средах составляет приблизительно 24 ± 1 ч. В определенных вариантах осуществления время удвоения активно делящихся клеток, культивируемых в OS средах по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 16%, по меньшей мере на 17%, по меньшей мере на 18%, по меньшей мере на 19%, по меньшей мере на 20% или по меньшей мере на 25% меньше, чем время удвоения активно проходящих цикл клеток, культивируемых не в OS средах.In certain embodiments, the doubling time of actively cycling mammalian cells in OS media is less than 30 hours, less than 29 hours, less than 28 hours, less than 27 hours, less than 26 hours, less than 25 hours, less than 24 hours, less than 23 hours, less than 22 hours , less than 21 hours, less than 20 hours, less than 19 hours, or less than 18 hours. In certain embodiments, the doubling time of actively growing mammalian cells in OS environments is less than 28 hours. In certain embodiments, the doubling time of mammalian cells in OS environments is approximately 27 ± 1 hour, about 26 ± 1 hour, about 25 ± 1 hour, about 24 ± 1 hour, about 23 ± 1 hour, about 22 ± 1 hour, or about 21 ± 1 hour. In certain embodiments, the doubling time of actively cycling mammalian cells in OS media is approximately 24 ± 1 hour. In certain embodiments, the doubling time of actively dividing cells cultured in OS media is at least 15%, at least 16%, at least 17%, at least 18 %, at least 19%, at least 20%, or at least 25% less than the doubling time of actively cycling cells cultured in non-OS media.

Продукция белка.Protein production.

В дополнение к химически определенным OS средам и способам культивирования клеток в OS средах, настоящее изобретение относится к способам продукции белков, таких как терапевтически эффективное антитело или другое биофармацевтическое лекарственное вещество, в клетках, культивируемых в OS средах.In addition to chemically defined OS media and methods for culturing cells in OS media, the present invention provides methods for producing proteins, such as a therapeutically effective antibody or other biopharmaceutical drug, in cells cultured in OS media.

В определенных вариантах осуществления скорость продукции белка клетками млекопитающих, культивируемыми в OS средах, по меньшей мере на 5%, 10%, 15% или 20% выше, чем скорость продукции белка идентичными клетками млекопитающих, культивируемыми не в OS средах. В определенных вариантах осуществления скорость продукции белка в клетках, культивируемых в OS средах, составляет по меньшей мере 1 пкг/клетку/сутки (PCD), по меньшей мере 2 PCD, по меньшей мере 3 PCD, по меньшей мере 4 PCD, по меньшей мере 5 PCD, по меньшей мере 6 PCD, по меньшей мере 7 PCD, по меньшей мере 8 PCD, по меньшей мере 9 PCD, по меньшей мере 10 PCD, по меньшей мере 15 PCD, по меньшей мере 20 PCD, по меньшей мере 25 PCD, по меньшей мере 30 PCD, по меньшей мере 35 PCD, по меньшей мере 40 PCD, по меньшей мере 45 PCD, по меньшей мере 50 PCD, по меньшей мере 75 PCD или по меньшей мере 100 PCD.In certain embodiments, the protein production rate of mammalian cells cultured in OS media is at least 5%, 10%, 15%, or 20% higher than the protein production rate of identical mammalian cells cultured in non-OS media. In certain embodiments, the rate of protein production in cells cultured in OS media is at least 1 pg/cell/day (PCD), at least 2 PCD, at least 3 PCD, at least 4 PCD, at least 5 PCD, at least 6 PCD, at least 7 PCD, at least 8 PCD, at least 9 PCD, at least 10 PCD, at least 15 PCD, at least 20 PCD, at least 25 PCD , at least 30 PCD, at least 35 PCD, at least 40 PCD, at least 45 PCD, at least 50 PCD, at least 75 PCD or at least 100 PCD.

В определенных вариантах осуществления выход или титр продукции белка, которые можно выражать в граммах белкового продукта на литр среды для культивирования, из клеток, культивируемых в OS средах, составляет по меньшей мере 100 мг/л, по меньшей мере 1 г/л, по меньшей мере 1,2 г/л, по меньшей мере 1,4 г/л, по меньшей мере 1,6 г/л, по меньшей мере 1,8 г/л, по меньшей мере 2 г/л, по меньшей мере 2,5 г/л, по меньшей мере 3 г/л, по меньшей мере, 3,5 г/л, по меньшей мере 4 г/л, по меньшей мере 4,5 г/л, по меньшей мере 5 г/л, по меньшей мере 5,5 г/л, по меньшей мере 6 г/л, по меньшей мере 6,5 г/л, по меньшей мере 7 г/л, по меньшей мере 7,5 г/л, по меньшей мере 8 г/л, по меньшей мере 8,5 г/л, по меньшей мере 9 г/л, по меньшей мере 9,5 г/л, по меньшей мере 10 г/л или по меньшей мере 20 г/л.In certain embodiments, the protein production yield or titer, which can be expressed in grams of protein product per liter of culture medium, from cells cultured in OS media is at least 100 mg/L, at least 1 g/L, at least at least 1.2 g/l, at least 1.4 g/l, at least 1.6 g/l, at least 1.8 g/l, at least 2 g/l, at least 2 .5 g/l, at least 3 g/l, at least 3.5 g/l, at least 4 g/l, at least 4.5 g/l, at least 5 g/l , at least 5.5 g/l, at least 6 g/l, at least 6.5 g/l, at least 7 g/l, at least 7.5 g/l, at least 8 g/l, at least 8.5 g/l, at least 9 g/l, at least 9.5 g/l, at least 10 g/l or at least 20 g/l.

В определенных вариантах осуществления белковый продукт (представляющий интерес белок) представляет собой антитело, антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, моноклональное антитело, полиспецифическое антитело, биспецифическое антитело, антигенсвязывающий фрагмент антитела, одноцепочечное антитело, диатело, триотело или тетратело, фрагмент Fab или фрагмент F(ab')₂, антитело IgD, антитело IgE, антитело IgM, антитело IgG, антитело IgG1, антитело IgG2, антитело IgG3 или антитело IgG4. В одном из вариантов осуществления антитело представляет собой антитело IgG1. В одном из вариантов осуществления антитело представляет собой антитело IgG2. В одном из вариантов осуществления антитело представляет собой антитело IgG4.In certain embodiments, the protein product (protein of interest) is an antibody, human antibody, humanized antibody, chimeric antibody, monoclonal antibody, multispecific antibody, bispecific antibody, antigen binding antibody fragment, single chain antibody, diabody, tribody or tetrabody, Fab fragment or fragment F(ab') ₂ , IgD antibody, IgE antibody, IgM antibody, IgG antibody, IgG1 antibody, IgG2 antibody, IgG3 antibody, or IgG4 antibody. In one embodiment, the antibody is an IgG1 antibody. In one embodiment, the antibody is an IgG2 antibody. In one embodiment, the antibody is an IgG4 antibody.

В определенных вариантах осуществления представляющий интерес белок представляет собой рекомбинантный белок, который содержит молекулу Fc и другой домен (например, слитый с Fc белок). В определенных вариантах осуществления слитый с Fc белок представляет собой слитый белок рецепторFc, который содержит один или несколько из одного или нескольких внеклеточных доменов рецептора, связанных с молекулой Fc. В определенных вариантах осуществления молекула Fc содержит шарнирную область с последующими доменами СН2 и СН3 IgG. В определенных вариантах осуществления слитый белок рецептор-Fc содержит два или более различных рецепторных цепи, которые связываются с одним лигандом или несколькими лигандами. Например, слитый с Fc белок представляет собой ловушку, на- 13 045169 пример, такую как ловушка IL-1 (например, рилонацепт, который содержит связывающую лиганд ILIRAcP область, слитую с внеклеточной областью IL-1R1, слитую с Fc hIgG1; см. патент США №In certain embodiments, the protein of interest is a recombinant protein that contains an Fc molecule and another domain (eg, an Fc fusion protein). In certain embodiments, the Fc fusion protein is a receptor Fc fusion protein that contains one or more of one or more extracellular receptor domains linked to an Fc molecule. In certain embodiments, the Fc molecule comprises a hinge region followed by the CH2 and CH3 domains of an IgG. In certain embodiments, the receptor-Fc fusion protein contains two or more different receptor chains that bind to one ligand or more ligands. For example, the Fc fusion protein is a decoy protein, such as an IL-1 decoy (eg, rilonacept, which contains an ILIRAcP ligand binding region fused to an IL-1R1 extracellular region fused to an hIgG1 Fc; see patent US No.

6927004, который полностью включен в настоящий документ в качестве ссылки) ловушка VEGF (например, афлиберцепт, который содержит домен 2 Ig рецептора VEGF Flt1, слитый с доменом 3 Ig рецептора6,927,004, which is incorporated herein by reference in its entirety) VEGF decoy (e.g., aflibercept, which contains VEGF receptor Flt1 Ig domain 2 fused to Ig receptor domain 3

VEGF Flk1, слитый с Fc hIgG1; см. патенты США №№ 7087411 и 7279159).VEGF Flk1 fused to Fc hIgG1; see US Pat. Nos. 7,087,411 and 7,279,159).

Настоящее изобретение для продукции белка не ограничено конкретным типом клеток. Примеры типов клеток, подходящих для продукции белка, включают клетки млекопитающих, клетки насекомых, клетки птиц, клетки бактерий и клетки дрожжей. Клетки могут представлять собой стволовые клетки или рекомбинантные клетки, трансформированные вектором для рекомбинантной экспрессии генов, или клетки, трансфицированные вирусом для продукции вирусных продуктов. Клетки могут содержать рекомбинантную гетерологичную полинуклеотидную конструкцию, кодирующую представляющий интерес белок. Эта конструкция может представлять собой эписому, или она может представлять собой элемент, который физически интегрирован в геном клетки. Также клетки могут продуцировать представляющий интерес белок без кодирования этого белка гетерологичной полипептидной конструкцией. Другими словами, клетка может кодировать представляющий интерес белок в природе, например, В-клетка, продуцирующая антитело. Клетки также могут являться первичными клетками, такими как клетки куриного эмбриона или первичными линиями клеток. Примеры пригодных клеток включают клетки BSC, клетки LLC-MK, клетки CV-1, клетки COS, клетки VERO, клетки MDBK, клетки MDCK, клетки CRFK, клетки RAF, клетки RK, клетки TCMK-1, клетки LLCPK, клетки PK15, клетки LLC-RK, клетки MDOK, клетки BHK-21, курица embryo клетки, клетки NS-1, клетки MRC-5, клетки WI-38, клетки BHK, клетки 293, клетки RK, клетки Per.C6 и клетки СНО. В различных вариантах осуществления линия клеток представляет собой производное клеток СНО, такое как мутантные линии CHO-K1, СНО DUX В-11, СНО DG-44, Veggie-CHO, GS-CHO, S-CHO или СНО lec.The present invention for protein production is not limited to a particular cell type. Examples of cell types suitable for protein production include mammalian cells, insect cells, avian cells, bacterial cells and yeast cells. The cells may be stem cells or recombinant cells transformed with a vector for recombinant gene expression, or cells transfected with a virus to produce viral products. The cells may contain a recombinant heterologous polynucleotide construct encoding a protein of interest. This construct may be an episome, or it may be an element that is physically integrated into the cell's genome. Cells can also produce a protein of interest without encoding the protein with a heterologous polypeptide construct. In other words, the cell may encode a protein of interest in nature, such as a B cell producing an antibody. The cells may also be primary cells, such as chick embryo cells or primary cell lines. Examples of suitable cells include BSC cells, LLC-MK cells, CV-1 cells, COS cells, VERO cells, MDBK cells, MDCK cells, CRFK cells, RAF cells, RK cells, TCMK-1 cells, LLCPK cells, PK15 cells, LLC-RK cells, MDOK cells, BHK-21 cells, chicken embryo cells, NS-1 cells, MRC-5 cells, WI-38 cells, BHK cells, 293 cells, RK cells, Per.C6 cells and CHO cells. In various embodiments, the cell line is a derivative of CHO cells, such as CHO-K1, CHO DUX B-11, CHO DG-44, Veggie-CHO, GS-CHO, S-CHO, or CHO lec mutant lines.

В одном из вариантов осуществления клетка, которая представляет собой клетку СНО, экспрессирует белок эктопически. В одном из вариантов осуществления белок содержит область тяжелой цепи иммуноглобулина, такую как область CH1, CH2 или СН3. В одном из вариантов осуществления белок содержит область СН2 и СН3 иммуноглобулина человека или грызуна. В одном из вариантов осуществления белок содержит область CH1, CH2 и СН3 иммуноглобулина человека или грызуна. В одном из вариантов осуществления белок содержит шарнирную область и область CH1, CH2 и СН3. В конкретном варианте осуществления белок содержит вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина. В конкретном варианте осуществления белок содержит вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина. В конкретном варианте осуществления белок содержит вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина и вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина. В конкретном варианте осуществления белок представляет собой антитело, такое как антитело человека, антитело грызуна или химерное антитело человека/грызуна (например, человека/мыши, человека/крысы или человека/хомяка).In one embodiment, the cell, which is a CHO cell, expresses the protein ectopically. In one embodiment, the protein comprises an immunoglobulin heavy chain region, such as a CH1, CH2, or CH3 region. In one embodiment, the protein comprises the CH2 and CH3 region of human or rodent immunoglobulin. In one embodiment, the protein comprises the CH1, CH2 and CH3 region of human or rodent immunoglobulin. In one embodiment, the protein comprises a hinge region and a CH1, CH2 and CH3 region. In a specific embodiment, the protein comprises an immunoglobulin heavy chain variable domain. In a specific embodiment, the protein comprises an immunoglobulin light chain variable domain. In a specific embodiment, the protein comprises an immunoglobulin heavy chain variable domain and an immunoglobulin light chain variable domain. In a specific embodiment, the protein is an antibody, such as a human antibody, a rodent antibody, or a human/rodent chimeric antibody (eg, human/mouse, human/rat, or human/hamster).

Фазу продукции можно проводить в культуре любого масштаба от отдельных колб и колб на шейкере или одноразовых реакторов Wave bags, до однолитровых биореакторов и до крупномасштабных промышленных биореакторы. Крупномасштабный процесс можно проводить в объеме приблизительно от 100 литров до 20000 литров или более. Для контроля продукции белка можно использовать одно или несколько средств, таких как температурный сдвиг или химическая индукция. Фаза роста может происходить при более высокой температуре, чем фаза продукции. Например, фаза роста может происходить при одной температуре приблизительно от 35°C до 38°C, а фаза продукции может происходить при другой температуре приблизительно от 29°C до 37°C, необязательно приблизительно от 30°C до 36°C или приблизительно от 30°C до 34°C. Кроме того, вместе, до или после температурного сдвига можно добавлять химические индукторы продукции белка, такие как кофеин, бутират, тамоксифен, эстроген, тетрациклин, доксициклин и бисацетамид гексаметилена (НМВА). Если индукторы добавляют после температурного сдвига, их можно добавлять в пределах от одного часа доя пяти суток после температурного сдвига, например, в пределах от одних до двух суток после температурного сдвига. Продуцирующие культуры клеток можно запускать в качестве непрерывной подпитываемой системы культивирования, как в хемостате (см. С. Altamirano et al., Biotechnol Prog. 2001 Nov-Dec; 17(6): 1032-41), или в соответствии с процессом с периодической подпиткой (Huang, 2010).The production phase can be carried out in any size culture from individual flasks and shaker flasks or single-use Wave bags reactors, to one-liter bioreactors and to large-scale industrial bioreactors. A large scale process can be carried out in volumes ranging from approximately 100 liters to 20,000 liters or more. One or more means, such as temperature shift or chemical induction, can be used to control protein production. The growth phase can occur at a higher temperature than the production phase. For example, the growth phase may occur at one temperature of about 35°C to 38°C, and the production phase may occur at another temperature of about 29°C to 37°C, optionally about 30°C to 36°C, or about 30°C to 34°C. In addition, chemical inducers of protein production such as caffeine, butyrate, tamoxifen, estrogen, tetracycline, doxycycline and hexamethylene bisacetamide (HMBA) can be added together, before or after the temperature shift. If the inductors are added after the temperature shift, they can be added within one hour to five days after the temperature shift, for example, within one to two days after the temperature shift. Production cell cultures can be started as a continuous fed-batch culture system, as in a chemostat (see C. Altamirano et al., Biotechnol Prog. 2001 Nov-Dec; 17(6): 1032-41), or according to a batch process. recharge (Huang, 2010).

Изобретение пригодно для улучшения продукции белка способами культивирования клеток. Линии клеток, используемые по изобретению, можно генетически конструировать для экспрессии полипептида, представляющего коммерческий или научный интерес. Генетическая инженерия линий клеток включает трансфекцию, трансформацию или трансдукцию клеток рекомбинантной полинуклеотидной молекулой или иной способ изменения (например, посредством гомологичной рекомбинации и активации генов или слияния рекомбинантной клетки с нерекомбинантной клеткой) для того, чтобы вызвать экспрессию клеткой-хозяином желаемого рекомбинантного полипептида. Способы и векторы для генетической инженерии клеток или линий клеток для экспрессии представляющего интерес полипептида хорошо известны специалистам в данной области; например, различные способы проиллюстрированы в Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel et al., eds. (Wiley & Sons, New York, 1988 и ежеквартальные обновления); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press, 1989);The invention is suitable for improving protein production by cell culturing methods. The cell lines used in the invention can be genetically engineered to express a polypeptide of commercial or scientific interest. Genetic engineering of cell lines involves transfecting, transforming or transducing cells with a recombinant polynucleotide molecule or otherwise altering it (for example, through homologous recombination and gene activation or fusion of a recombinant cell with a non-recombinant cell) to cause the host cell to express the desired recombinant polypeptide. Methods and vectors for genetically engineering cells or cell lines to express a polypeptide of interest are well known to those skilled in the art; for example, various methods are illustrated in Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel et al., eds. (Wiley & Sons, New York, 1988 and quarterly updates); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press, 1989);

- 14 045169- 14 045169

Kaufman, R. J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 15-69. Широкий спектр линий клеток, подходящий для выращивания в культуре, доступен в American Type Culture Collection (Manassas, Va.) и у коммерческих поставщиков. Примеры линий клеток, широко используемых в промышленности, включают клетки VERO, BHK, HeLa, CVl (включая Cos), MDCK, 293, 3Т3, клетки миеломных линий (например, NSO, NSl), PC12, клетки WI38 и клетки яичника китайского хомяка (СНО). Клетки СНО широко используют для получения комплексных рекомбинантных белков, таких как цитокины, факторы свертывания крови и антитела (Brasel et al. (1996), Blood 88:2004-2012; Kaufman et al. (1988), J.Biol Chem 263:6352-6362; McKinnon et al. (1991), J Mol Endocrinol 6:231-239; Wood et al. (1990), J Immunol. 145:3011-3016). Желательными линиями клеток-хозяев СНО являются мутантные линии клеток с дефицитом дигидрофолатредуктазы (DHFR) (Urlaub et al. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220), DXB1 1 и DG-44, так как эффективная система селекции и амплификации экспрессии гена на основе DHFR обеспечивает высокий уровень экспрессии рекомбинантного белка в этих клетках (Kaufman RJ. (1990), Meth Enzymol 185:537-566). Кроме того, с этими клетками легко обращаться в качестве адгезивных или суспензионных культур, и они демонстрируют относительно хорошую генетическую стабильность. Клетки СНО и белки, рекомбинантно экспрессируемые ими, всесторонне охарактеризованы и одобрены для применения в клиническом и коммерческом производстве органами регулирования. В определенных вариантах осуществления линии клеток СНО представляют собой линии клеток, как описано в публикациях патентных заявок США №№ 2010/0304436 А1, 2009/0162901 А1 и 2009/0137416 А1 и патентах США №№ 7455988 В2, 7435553 В2 и 7105348 В2.Kaufman, R. J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 15-69. A wide range of cell lines suitable for culture are available from the American Type Culture Collection (Manassas, Va.) and from commercial suppliers. Examples of cell lines commonly used in industry include VERO, BHK, HeLa, CVl (including Cos), MDCK, 293, 3T3 cells, myeloma cell lines (eg, NSO, NSl), PC12, WI38 cells, and Chinese hamster ovary cells ( SNO). CHO cells are widely used to produce complex recombinant proteins such as cytokines, coagulation factors and antibodies (Brasel et al. (1996), Blood 88:2004-2012; Kaufman et al. (1988), J. Biol Chem 263:6352 -6362; McKinnon et al. (1991), J Mol Endocrinol 6:231-239; Wood et al. (1990), J Immunol. 145:3011-3016). Desirable CHO host cell lines are dihydrofolate reductase (DHFR) deficient mutant cell lines (Urlaub et al. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220), DXB1 1 and DG-44, since an efficient DHFR-based gene expression selection and amplification system ensures high levels of recombinant protein expression in these cells (Kaufman RJ. (1990), Meth Enzymol 185:537-566). In addition, these cells are easy to handle as adherent or suspension cultures and exhibit relatively good genetic stability. CHO cells and the proteins they recombinantly express have been extensively characterized and approved for use in clinical and commercial production by regulatory authorities. In certain embodiments, the CHO cell lines are cell lines as described in US Patent Application Publications Nos. 2010/0304436 A1, 2009/0162901 A1 and 2009/0137416 A1 and US Patent Nos. 7455988 B2, 7435553 B2 and 7105348 B2.

Настоящее изобретение не ограничено объемом указанных вариантов осуществления, описываемых в настоящем документе, которые предназначены для иллюстрации отдельных аспектов или вариантов осуществления изобретения. В объем изобретения входят функционально эквивалентные способы и компоненты.The present invention is not limited in scope by the embodiments described herein, which are intended to illustrate certain aspects or embodiments of the invention. The invention includes functionally equivalent methods and components.

Специалистам в данной области из приведенного выше описания и сопровождающих фигур в дополнение к описанному в настоящем документе очевидны различные модификации изобретения. Такие модификации находятся в объеме изобретения.Various modifications of the invention will be apparent to those skilled in the art from the above description and the accompanying figures in addition to those described herein. Such modifications are within the scope of the invention.

Изобретение частично основано на открытии, что добавление орнитина или комбинации орнитина и путресцина в не содержащие сыворотки среды для культивирования клеток приводит к увеличенным росту клеток, жизнеспособности и продукции полипептидов в рекомбинантно сконструированных линиях клеток животных (или природных клеток), экспрессирующих представляющий интерес белок, таким образом, увеличивая надежность культуры, улучшая выход представляющего интерес полипептида.The invention is based in part on the discovery that the addition of ornithine or a combination of ornithine and putrescine to serum-free cell culture media results in increased cell growth, viability and polypeptide production in recombinantly engineered animal (or natural cell) cell lines expressing a protein of interest, such thus increasing the reliability of the culture, improving the yield of the polypeptide of interest.

Пример 1: увеличенная плотность культуры жизнеспособных клеток.Example 1: Increased viable cell culture density.

В 250 мл встряхиваемую колбу проводили инокуляцию из затравочной культуры линии рекомбинантных продуцирующих антитела клеток, происходящих из CHO K1. Инокулированные клетки выращивали при 36,5°C в течение семи суток и подпитывали глюкозой на сутки три и пять. Клетки выращивали в каждой из двух раздельных химически определенных (не содержащих гидролизата и не содержащих сыворотки) средах. Первая среда содержала приблизительно 75 мМ аминокислот (среда 1), вторая среда содержала приблизительно 40 мМ аминокислот (среда 2), и оба состава содержали не более 2,5 мкМ (0,4 мг/л) путресцина. Другую группу условий среды получали, добавляя в среду 2 соевый гидролизат в концентрации 7,5 г/л. В каждую из трех контрольных сред добавляли приблизительно 593 мкМ орнитина (в виде 100 мг/л L-орнитина · HCl) или комбинация приблизительно 593 мкМ орнитина (в виде 100 мг/л L-орнитина · HCl) и приблизительно 714 мкМ путресцина (в виде 115 мг/л путресцина · 2HCl). На сутки 3, 5 и 7 отбирали аликвоты по 3 мл культур и подсчет количества жизнеспособных клеток проводили с использованием исключения трипанового синего на устройстве BioProfile FLEX™ (Nova Biomedical). В начальные сутки все культуры содержали 0,8х10⁶ жизнеспособных клеток на мл. Для данных сред (среда 1, среда 2 или среда 2 + соя) количества жизнеспособных клеток через период семь суток продемонстрировали, что у клеток СНО, растущих в средах, дополненных орнитином или орнитином и путресцином, повышена плотность жизнеспособных клеток. Эффект в течение семисуточного периода был особенно выражен в не содержащих гидролизатов средах (например, от 2-кратного до 4-кратного или более возрастание плотности жизнеспособных клеток). Не содержащая гидролизата OS среда 2 действовала сравнимо с содержащей сою не OS средой 2, что указывает на то, что преимущество соевого гидролизата для роста клеток можно воспроизвести посредством замены на орнитин. Также наблюдали увеличенную плотность клеток при добавлении орнитина или орнитина и путресцин в среду 2 + соя. Результаты представлены в табл. 1.A 250 ml shake flask was inoculated from a seed culture of a recombinant antibody-producing cell line derived from CHO K1. The inoculated cells were grown at 36.5°C for seven days and fed with glucose on days three and five. Cells were grown in each of two separate chemically defined (digestive-free and serum-free) media. The first medium contained approximately 75 mM amino acids (medium 1), the second medium contained approximately 40 mM amino acids (medium 2), and both formulations contained no more than 2.5 μM (0.4 mg/L) putrescine. Another group of environmental conditions was obtained by adding soybean hydrolyzate to medium 2 at a concentration of 7.5 g/L. Each of the three control media was supplemented with approximately 593 μM ornithine (as 100 mg/L L-ornithine HCl) or a combination of approximately 593 μM ornithine (as 100 mg/L L-ornithine HCl) and approximately 714 μM putrescine (as form of 115 mg/l putrescine 2HCl). On days 3, 5, and 7, 3-ml aliquots of cultures were collected and viable cell counts were performed using trypan blue exclusion on a BioProfile FLEX™ device (Nova Biomedical). On the initial day, all cultures contained 0.8 x 10 ⁶ viable cells per ml. For these media (medium 1, media 2, or media 2 + soy), viable cell counts after a period of seven days demonstrated that CHO cells growing in media supplemented with ornithine or ornithine and putrescine had increased viable cell density. The effect over a seven-day period was particularly pronounced in hydrolysate-free media (eg, 2-fold to 4-fold or more increase in viable cell density). Non-hydrolyzate OS medium 2 performed comparable to soy-containing non-OS medium 2, indicating that the cell growth benefit of soy hydrolyzate can be replicated by substituting ornithine. Increased cell density was also observed when ornithine or ornithine and putrescine were added to 2+soy medium. The results are presented in table. 1.

- 15 045169- 15 045169

Таблица 1Table 1

Средняя плотность жизнеспособных клеток в культуре (10⁶ клеток на миллилитр) и кратность увеличе________________ния по сравнению с исходным уровнем*________________Average density of viable cells in culture (10 ⁶ cells per milliliter) and fold increase________________ compared to the initial level*________________

Добавка: Additive: Время Time Без добавок Without additives Орнитин Ornithine Орнитин + путресцин Ornithine + putrescine Среда 1 Wednesday 1 3 суток 3 days 2,4/1х 2.4/1x 6,1 /2,5х 6.1/2.5x 5,0 / 2,1х 5.0 / 2.1x 5 суток 5 days 3,4/1х 3.4/1x 12,6/3,7х 12.6/3.7x 12,4 /3,6х 12.4 / 3.6x 7 суток 7 days 3,6/1х 3.6/1x 7,0/1,9х 7.0/1.9x 6,8/ 1,9х 6.8/1.9x Среда 2 Wednesday 2 3 суток 3 days 1,7 / 1х 1.7 / 1x 5,1 /3,Οχ 5.1/3.Οχ 5,2/ЗДх 5.2/ZDx 5 суток 5 days 2,0/1х 2.0/1x 7,6/3,8χ 7.6/3.8χ 8,0/4,Οχ 8.0/4.Οχ 7 суток 7 days 1,6 / 1х 1.6 / 1x 5,9/3,7х 5.9/3.7x 5,8 / 3,6х 5.8 / 3.6x Среда 2 + соевый гидролизат Medium 2 + soy hydrolysate 3 суток 3 days 5,2/1х 5.2/1x 5,4/ 1х 5.4/ 1x 4,7 / 0,9х 4.7 / 0.9x 5 суток 5 days 7,7/1х 7.7/1x 9,3 / 1,2х 9.3 / 1.2x 9,3 / 1,2х 9.3 / 1.2x 7 суток 7 days н.д. n.d. 9,6 / н.д. 9.6/n.a. 9,1 / н.д. 9.1/n.a.

*Исходный уровень представляет собой среды без добавок для данного состава среда на данные сутки.*The initial level represents media without additives for a given media composition on a given day.

Авторы также изучили действие различных количеств орнитина · HCl (например, 50 мг/мл, 100 мг/мл и 150 мг/мл) на плотность жизнеспособных клеток в среде 3, которая содержит приблизительно 75 мМ аминокислот и 0,4 мг/л путресцина HCl (среда 3). Для инокуляции 50 мл биореакторов TubeSpin® (ТРР) при 0,4х10⁶ клеток/мл в рабочем объеме 15 мл использовали одну культуру из системы посевных ферментеров линии рекомбинантных продуцирующих антитела клеток, происходящих из CHO K1. Клетки выращивали в инкубаторе при 37°C в течение трех суток. На сутки 3 отбирали аликвоты по 3 мл культур и определение количеств жизнеспособных клеток проводили с использованием исключения трипанового синего на устройстве BioProfile FLEX™ (Nova Biomedical). Все три уровня орнитина улучшали плотность клеток в среднем (N=3) немногим более чем в два раза. Результаты представлены в табл. 2.The authors also studied the effect of different amounts of ornithine HCl (e.g., 50 mg/mL, 100 mg/mL, and 150 mg/mL) on viable cell density in medium 3, which contains approximately 75 mM amino acids and 0.4 mg/L putrescine HCl (Wednesday 3). A single culture from a seed fermenter system of a recombinant antibody-producing cell line derived from CHO K1 was used to inoculate 50 mL of TubeSpin® Bioreactors (TPP) at 0.4 x 10 ⁶ cells/mL in a working volume of 15 mL. Cells were grown in an incubator at 37°C for three days. On day 3, 3-ml aliquots of cultures were collected and viable cell counts were performed using trypan blue exclusion on a BioProfile FLEX™ device (Nova Biomedical). All three levels of ornithine improved cell density on average (N=3) by slightly more than twofold. The results are presented in table. 2.

Таблица 2table 2

Плотность жизнеспособных клеток в культуре (10⁶ клеток на миллилитр) и кратность увеличения по ____________________сравнению с исходным уровнем*____________________Density of viable cells in culture (10 ⁶ cells per milliliter) and fold increase in ____________________compared to the initial level*____________________

Контроль Control Орнитин НС1 Ornithine NS1 Концентрация (мг/мл) Concentration (mg/ml) 0 0 50 50 100 100 150 150 Плотность жизнеспособных клеток (10⁶ клетки/мл)Viable cell density (10 ⁶ cells/ml) 1,3 1.3 3,2 3.2 3,1 3.1 3,1 3.1 Кратность увеличения по сравнению с контролем Multiplicity of increase compared to control 1х 1x 2,5х 2.5x 2,4х 2.4x 2,4χ 2.4χ

*Исходный уровень представляет собой среду 3 без добавок.*Baseline is Medium 3 without additives.

Пример 2: улучшенное время удвоения культуры клеток.Example 2: Improved cell culture doubling time.

В условиях различных сред для культивирования клеток определяли время удвоения линии рекомбинантных продуцирующих антитела клеток, происходящих из клеток CHO K1, в логарифмической фазе роста. Культуры из системы посевных ферментеров пересевали при 36,5°C в 250 мл встряхиваемые колбы в течение периода 14 суток в каждой из трех отдельных сред: в среде 1, среде 2 и среде 2, содержащей соевый гидролизат (среда 2 + соя). На сутки 0 и во время пересева в системе посевных ферментеров (каждые 2 или 3 суток) для каждого условия отбирали аликвоты по 1 мл и определение количеств жизнеспособных клеток проводили с использованием исключения трипанового синего на устройстве CDV™ (Nova Biomedical). Среду 1 тестировали без добавок или обогащенную орнитином • HCl в концентрации 100 мг/л или путресцином · 2HCl в концентрации 115 мг/л и орнитином · HCl в концентрации 100 мг/л. Среду 2 с низким содержанием путресцина • 2HCl (0,4 мг/л) тестировали без добавок или обогащенную орнитином • HCl в концентрации 100 мг/л или путресцином • 2HCl в концентрации 115 мг/л и орнитином • HCl в концентрации 100 мг/л. Результаты приведены в табл. 3 и 4. Для достижения значительного роста было необходимо обогащение среды 1 орнитином с путресцином или без. Обогащение не содержащей гидролизата среды 2 орнитином или орнитином + путресцин уменьшало время удвоения клеток приблизительно на величину от 25% до 30%. Также времена удвоения уменьшались после добавления орнитина или орнитина + путресцин в содержащую гидролизат среду 2 хоть и в меньшей степени.The doubling time of a recombinant antibody-producing cell line derived from CHO K1 cells was determined in logarithmic growth phase under different cell culture media conditions. Cultures from the seed fermenter system were subcultured at 36.5°C in 250 ml shake flasks over a period of 14 days in each of three separate media: medium 1, medium 2 and medium 2 containing soy hydrolysate (medium 2 + soy). On day 0 and at the time of subculture in the seed fermenter system (every 2 or 3 days), 1 ml aliquots were removed for each condition and viable cell counts were performed using trypan blue exclusion on a CDV™ device (Nova Biomedical). Medium 1 was tested without additives or supplemented with ornithine • HCl at a concentration of 100 mg/l or putrescine • 2HCl at a concentration of 115 mg/l and ornithine • HCl at a concentration of 100 mg/l. Medium 2 low in putrescine • 2HCl (0.4 mg/L) was tested without additives or supplemented with ornithine • HCl at a concentration of 100 mg/L or putrescine • 2HCl at a concentration of 115 mg/L and ornithine • HCl at a concentration of 100 mg/L . The results are shown in table. 3 and 4. To achieve significant growth, it was necessary to enrich the medium with 1 ornithine with or without putrescine. Enrichment of hydrolyzate-free medium 2 with ornithine or ornithine + putrescine decreased cell doubling time by approximately 25% to 30%. Also, doubling times decreased after the addition of ornithine or ornithine + putrescine to hydrolyzate-containing medium 2, although to a lesser extent.

- 16 045169- 16 045169

Таблица 3Table 3

Время удвоения клеток (часы) и приблизительный процент уменьшения времени удвоения относительно ________________________исходного уровня* в среде 1 _____________________Cell doubling time (hours) and approximate percentage decrease in doubling time relative to ________________________initial level* in medium 1 _____________________

Добавка Additive Среда 1 Wednesday 1 * Отсутствует * Absent 75 75 Орнитин Ornithine 23 23 69% 69% Путресцин + орнитин Putrescine + ornithine 21 21 72% 72%

*Исходный уровень представляет собой среду 1 без добавок.*Baseline is Medium 1 without additives.

Таблица 4 Время удвоения клеток (часы) и приблизительный процент уменьшения времени удвоения относительно ________________________исходного уровня* в среде 2________________________Table 4 Cell doubling time (hours) and the approximate percentage decrease in doubling time relative to ________________________initial level* in medium 2________________________

Добавка Additive Среда 2 Wednesday 2 Среда 2 + соя Wednesday 2 + soy *Без добавок *Without additives 27 27 22,5 22.5 Орнитин Ornithine 21 21 22% 22% 20,5 20.5 8,9% 8.9% Путресцин + орнитин Putrescine + ornithine 19,5 19.5 28% 28% 21 21 6,7% 6.7%

*Исходный уровень представляет собой среду 2 без добавок.*Baseline is Medium 2 without additives.

Пример 3: увеличенные титры антител.Example 3: increased antibody titers.

После установления того, что добавление орнитина или орнитина + путресцин улучшает клеточную пролиферацию и плотность жизнеспособных клеток в культуре авторы дополнительно исследовали влияние этих условий на титры продуцируемых рекомбинантных белков. Авторы исследовали экспрессию и секрецию рекомбинантного IgG происходящей из CHO-K1 линией клеток. В этом эксперименте средний титр антител в культуре определяли на сутки семь в различных форматах сред. Как указано выше, тестировали среду 1 с низким содержанием путресцина (0,4 мг/л путресцина · 2HCl), орнитина (100 мг/л орнитина · HCl) и с орнитином и путресцином (100 мг/л орнитина · HCl /115 мг/л путресцина · 2HCl). Также тестировали среду 2 и среду 2 + соя с низким уровнем путресцина (0,4 мг/л путресцина • 2HCl), орнитина (100 мг/л орнитина · HCl) и с орнитином и путресцином (100 мг/л орнитина · HCl /115 мг/л путресцина · 2HCl). Во всех случаях добавление орнитина или орнитин и путресцин на уровне выше 0,4 мг/л приводило к значительно более высоким титрам белка, например, по меньшей мере приблизительно в два раза более высоким титрам. Результаты представлены в табл. 5.After establishing that the addition of ornithine or ornithine + putrescine improved cell proliferation and viable cell density in culture, we further examined the effect of these conditions on the titers of recombinant proteins produced. We examined the expression and secretion of recombinant IgG by a CHO-K1-derived cell line. In this experiment, the average titer of antibodies in the culture was determined on day seven in various media formats. As indicated above, medium 1 was tested with a low content of putrescine (0.4 mg/l putrescine 2HCl), ornithine (100 mg/l ornithine HCl) and with ornithine and putrescine (100 mg/l ornithine HCl /115 mg/ l putrescine 2HCl). We also tested medium 2 and medium 2 + soy with low putrescine (0.4 mg/l putrescine • 2HCl), ornithine (100 mg/l ornithine HCl) and with ornithine and putrescine (100 mg/l ornithine HCl /115 mg/l putrescine 2HCl). In all cases, addition of ornithine or ornithine and putrescine at levels greater than 0.4 mg/L resulted in significantly higher protein titers, eg at least approximately twice the titers. The results are presented in table. 5.

Таблица 5Table 5

Средние семисуточные титры антител и приблизительная кратность увеличения (х) титров относительно исходного уровня*Average seven-day antibody titers and approximate fold increase (x) in titers relative to baseline*

Добавка Additive среда 1 Wednesday 1 среда 2 Wednesday 2 среда 2 + соя medium 2 + soy Без добавок* Without additives* 0,31 г/л 0.31 g/l 1х 1x 0,29 г/л 0.29 g/l 1х 1x 0,54 г/л 0.54 g/l 1х 1x Орнитин Ornithine 0,94 г/л 0.94 g/l 3,0χ 3.0χ 0,65 г/л 0.65 g/l 2,2χ 2.2χ 0,98 г/л 0.98 g/l 1,8х 1.8x Путресцин + орнитин Putrescine + ornithine 0,95 г/л 0.95 g/l ЗД^Х ZD ^X 0,64 г/л 0.64 g/l 2,2х 2.2x 1,07 г/л 1.07 g/l 2х 2x

* Исходный уровень установлен на титр в средах каждого типа без добавок.*The initial level is set to titer in each type of media without additives.

Авторы также исследовали влияние различных количеств орнитина · HCl (например, 50 мг/мл, 100 мг/мл и 150 мг/мл) в среде 3 на продукцию антител. Для инокуляции 50 мл биореакторов TubeSpin® (ТРР) при 0,4х10⁶ клеток/мл в рабочем объеме 15 мл использовали одну культуру из системы посевных ферментеров линии рекомбинантных продуцирующих антитела клеток, происходящих из CHO K1. Клетки выращивали в инкубаторе при 37°C в течение трех суток. Все три уровня добавляемого орнитина улучшали титры антител в среднем (N=3) немногим более 50%. Результаты приведены в табл. 6.The authors also examined the effect of different amounts of ornithine HCl (eg, 50 mg/mL, 100 mg/mL, and 150 mg/mL) in medium 3 on antibody production. A single culture from a seed fermenter system of a recombinant antibody-producing cell line derived from CHO K1 was used to inoculate 50 mL of TubeSpin® Bioreactors (TPP) at 0.4 x 10 ⁶ cells/mL in a working volume of 15 mL. Cells were grown in an incubator at 37°C for three days. All three levels of ornithine supplementation improved antibody titers by an average (N=3) of slightly more than 50%. The results are shown in table. 6.

Таблица 6Table 6

Т итры антител (грамм на литр) и кратность увеличения титров по сравнению с исходным уровнем*Antibody titers (grams per liter) and the fold increase in titers compared to the initial level*

Контроль Control Орнитин НС1 Ornithine NS1 Концентрация добавки (мг/мл) Additive concentration (mg/ml) 0 0 50 50 100 100 150 150 Титр антитела (мг/мл) Antibody titer (mg/ml) 79 79 120 120 127 127 124 124 Кратность увеличения относительно контроля Magnification factor relative to control 1х 1x 1,5^х 1.5 ^x 1,6х 1.6x 1,6х 1.6x

--

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM

1. Способ культивирования CHO-K1 клеток, включающий этапы: (а) предоставления среды для культивирования клеток, которая не содержит сыворотки, содержащей 0,6±0,09 мМ (79,3±11,9 мг/л) орнитина и 0,714±0,11 мМ (62,9±9,7 мг/л) путресцина, и (b) размножения или поддержания клеток в среде для культивирования клеток с получением культуры клеток, где клетка экспрессирует представляющий интерес белок.1. A method for culturing CHO-K1 cells, comprising the steps of: (a) providing a cell culture medium that does not contain serum containing 0.6±0.09 mM (79.3±11.9 mg/L) ornithine and 0.714 ±0.11 mM (62.9 ± 9.7 mg/L) putrescine, and (b) expanding or maintaining cells in cell culture medium to obtain a cell culture where the cell expresses the protein of interest.

2. Способ по п.1, где среда для культивирования клеток не содержит гидролизата.2. The method according to claim 1, where the cell culture medium does not contain hydrolyzate.

3. Способ по любому из пп. 1 или 2, где:3. Method according to any one of paragraphs. 1 or 2, where:

(a) среда для культивирования клеток содержит > 40±6 мМ смеси аминокислот или их солей;(a) the cell culture medium contains > 40 ± 6 mM of a mixture of amino acids or their salts;

(b) среда для культивирования клеток содержит одну или несколько жирных кислот;(b) the cell culture medium contains one or more fatty acids;

(c) среда для культивирования клеток содержит смесь нуклеозидов;(c) the cell culture medium contains a mixture of nucleosides;

(d) среда для культивирования клеток содержит аденозин, гуанозин, цитидин, уридин, тимидин и гипоксантин; и/или (e) среда для культивирования клеток содержит один или несколько двухвалентных катионов.(d) the cell culture medium contains adenosine, guanosine, cytidine, uridine, thymidine and hypoxanthine; and/or (e) the cell culture medium contains one or more divalent cations.

4. Способ по п.3, где смесь аминокислот состоит из аланина, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глутаминовой кислоты, глицина, гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, фенилаланина, пролина, серина, треонина, триптофана, тирозина и валина.4. The method according to claim 3, where the mixture of amino acids consists of alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine and valine.

5. Способ по п.3, где одна или несколько жирных кислот выбраны из группы, состоящей из линолевой кислоты, линоленовой кислоты, липоевой кислоты, олеиновой кислоты, пальмитиновой кислоты, стеариновой кислоты, арахидиновой кислоты, арахидоновой кислоты, лауриновой кислоты, бегеновой кислоты, каприловой кислоты, лауриновой кислоты, гексановой кислоты, лигноцериновой кислоты, миристиновой кислоты и октановой кислоты.5. The method according to claim 3, where one or more fatty acids is selected from the group consisting of linoleic acid, linolenic acid, lipoic acid, oleic acid, palmitic acid, stearic acid, arachidic acid, arachidonic acid, lauric acid, behenic acid, caprylic acid, lauric acid, hexanoic acid, lignoceric acid, myristic acid and octanoic acid.

6. Способ по п.3, где смесь нуклеозидов содержит один или несколько нуклеозидов, выбранных из группы, состоящей из аденозина, гуанозина, цитидина, уридина, тимидина и гипоксантина.6. The method of claim 3, wherein the nucleoside mixture contains one or more nucleosides selected from the group consisting of adenosine, guanosine, cytidine, uridine, thymidine and hypoxanthine.

7. Способ по п.3, где двухвалентный катион представляет собой Са²⁺, Mg²⁺ или оба.7. The method of claim 3, wherein the divalent cation is Ca ²⁺ , Mg ²⁺ or both.

8. Способ по любому из пп.1-7, где:8. Method according to any one of claims 1-7, where:

(а) представляющий интерес белок представляет собой антигенсвязывающий белок;(a) the protein of interest is an antigen binding protein;

(b) представляющий интерес белок содержит домен Fc; и/или (c) представляющий интерес белок представляет собой слитый белок рецептор-Fc.(b) the protein of interest contains an Fc domain; and/or (c) the protein of interest is a receptor-Fc fusion protein.

9. Способ по п.8, где слитый белок рецептор-Fc представляет собой белок-ловушку.9. The method of claim 8, wherein the receptor-Fc fusion protein is a decoy protein.

10. Способ по п.9, где белок-ловушка представляет собой антагонист IL-1 или антагонист VEGF.10. The method of claim 9, wherein the decoy protein is an IL-1 antagonist or a VEGF antagonist.

11. Способ по п.8, где представляющий интерес белок представляет собой антитело или фрагмент антитела.11. The method of claim 8, wherein the protein of interest is an antibody or antibody fragment.

12. Способ по п.11, где антитело или фрагмент антитела представляют собой рекомбинантное антитело человека или его фрагмент.12. The method of claim 11, wherein the antibody or antibody fragment is a recombinant human antibody or fragment thereof.

13. Способ по любому из пп.1-12, где:13. Method according to any one of claims 1-12, where:

(a) среднее время удвоения клеток составляет < 30 ч;(a) the average cell doubling time is <30 h;

(b) среднее время удвоения клеток составляет < 24 ч;(b) the average cell doubling time is <24 h;

(c) среднее время удвоения клеток снижалось по меньшей мере на одну треть от времени удвоения клеток, выращиваемых в среде для культивирования клеток, которая содержит менее 0,3±0,045 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина;(c) the average cell doubling time was reduced by at least one-third of the doubling time of cells grown in cell culture medium that contained less than 0.3 ± 0.045 mM ornithine and less than 0.2 ± 0.03 mM putrescine;

(d) культура клеток способна достигать плотности количества жизнеспособных клеток, которая по меньшей мере на 15% больше, чем у сходной культуры клеток, культивируемой в сходной среде для культивирования клеток, которая содержит менее 0,09±0,014 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина;(d) the cell culture is capable of achieving a viable cell density that is at least 15% greater than that of a similar cell culture cultured in a similar cell culture medium that contains less than 0.09 ± 0.014 mM ornithine and less than 0.2 ±0.03 mM putrescine;

(e) культура клеток способна достигать плотности количества жизнеспособных клеток, которая по меньшей мере в 3 раза выше, чем у сходной культуры клеток, культивируемой в сходной среде для культивирования клеток, которая содержит менее 0,09±0,014 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина; и/или (f) этап добавления в среду для культивирования клеток одной или нескольких добавок в момент использования.(e) the cell culture is capable of achieving a viable cell density that is at least 3 times higher than that of a similar cell culture cultured in a similar cell culture medium that contains less than 0.09 ± 0.014 mM ornithine and less than 0.2 ±0.03 mM putrescine; and/or (f) the step of adding one or more additives to the cell culture medium at the time of use.

14. Способ по п.13, где одна или несколько добавок в момент использования содержат одно или несколько из NaHCO₃, глутамина, инсулина, глюкозы, CuSO₄, ZnSO₄, FeCl₃, NiSO₄, Na₄ ЭДТА и цитрат Na₃и/или каждый из NaHCO₃, глутамина, инсулина, глюкозы, CuSO₄, ZnSO₄, FeCl₃, NiSO4, Na₄ ЭДТА и цитрата Na₃.14. The method according to claim 13, where one or more additives at the time of use contain one or more of NaHCO ₃ , glutamine, insulin, glucose, CuSO ₄ , ZnSO ₄ , FeCl ₃ , NiSO ₄ , Na ₄ EDTA and Na ₃ citrate and /or each of NaHCO ₃ , glutamine, insulin, glucose, CuSO ₄ , ZnSO ₄ , FeCl ₃ , NiSO4, Na ₄ EDTA and Na ₃ citrate.

15. Способ по любому из пп.1-14, где:15. Method according to any one of claims 1-14, where:

(а) представляющий интерес белок получают со средним 7-суточным титром, который по меньшей мере на 7% выше, чем средний 7-суточный титр, получаемый посредством сходных клеток в среде для культивирования клеток, которая содержит менее 0,09±0,014 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина;(a) the protein of interest is obtained with a 7-day average titer that is at least 7% higher than the 7-day average titer obtained by similar cells in a cell culture medium that contains less than 0.09 ± 0.014 mM ornithine and less than 0.2±0.03 mM putrescine;

- 18 045169 (b) представляющий интерес белок получают со средним 7-суточным титром, который по меньшей мере на 14% выше, чем средний 7-суточный титр, получаемый посредством сходных клеток в среде для культивирования клеток, которая содержит менее 0,09±0,014 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина;- 18 045169 (b) the protein of interest is obtained with a 7-day average titer that is at least 14% higher than the 7-day average titer obtained by similar cells in a cell culture medium that contains less than 0.09± 0.014 mM ornithine and less than 0.2 ± 0.03 mM putrescine;

(c) представляющий интерес белок получают со средним 7-суточным титром, который по меньшей мере на 80% выше, чем средний 7-суточный титр, получаемый посредством сходных клеток в среде для культивирования клеток, которая содержит менее 0,09±0,014 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина;(c) the protein of interest is obtained with a 7-day average titer that is at least 80% higher than the 7-day average titer obtained by similar cells in a cell culture medium that contains less than 0.09 ± 0.014 mM ornithine and less than 0.2±0.03 mM putrescine;

(d) представляющий интерес белок получают со средним 7-суточным титром, который по меньшей мере в 2 раза выше, чем средний 7-суточный титр, получаемый посредством сходных клеток в среде для культивирования клеток, которая содержит менее 0,09±0,014 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина; и/или (e) представляющий интерес белок получают со средним 7-суточным титром, который по меньшей мере в 3 раза выше, чем средний 7-суточный титр, получаемый посредством сходных клеток в среде для культивирования клеток, которая содержит менее 0,09±0,014 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина.(d) the protein of interest is obtained with a 7-day average titer that is at least 2 times higher than the 7-day average titer obtained by similar cells in a cell culture medium that contains less than 0.09 ± 0.014 mM ornithine and less than 0.2±0.03 mM putrescine; and/or (e) the protein of interest is obtained with a 7-day average titer that is at least 3 times higher than the 7-day average titer obtained by similar cells in a cell culture medium that contains less than 0.09± 0.014 mM ornithine and less than 0.2 ± 0.03 mM putrescine.

16. Способ получения афлиберцепта, включающий этапы: (а) культивирования клеток СНО, экспрессирующих афлиберцепт в среде для культивирования клеток, которая не содержит сыворотки, содержащей 0,6±0,09 мМ (79,3±11,9 мг/л) орнитина и 0,714±0,11 мМ (62,9±9,7 мг/л) путресцина, и (b) экспрессии афлиберцепта в клетках, где афлиберцепт секретируется в среду для культивирования клеток.16. A method for producing aflibercept, comprising the steps of: (a) culturing CHO cells expressing aflibercept in a cell culture medium that does not contain serum containing 0.6 ± 0.09 mM (79.3 ± 11.9 mg/l) ornithine and 0.714 ± 0.11 mM (62.9 ± 9.7 mg/L) putrescine, and (b) expression of aflibercept in cells where aflibercept is secreted into the cell culture medium.

17. Способ по п.16, где клетки СНО представляют собой CHO-K1, СНО DUX В-11, СНО DG-44, Veggie-CHO, GS-CHO, S-CHO, СНО lec мутантные клетки.17. The method according to claim 16, wherein the CHO cells are CHO-K1, CHO DUX B-11, CHO DG-44, Veggie-CHO, GS-CHO, S-CHO, CHO lec mutant cells.

18. Способ по п.16 или 17, где среда для культивирования клеток не содержит гидролизата.18. The method according to claim 16 or 17, where the cell culture medium does not contain hydrolyzate.

19. Способ по любому из пп.16-18, где:19. Method according to any one of claims 16-18, where:

20. Способ по п.19, где смесь аминокислот состоит из аланина, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глутаминовой кислоты, глицина, гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, фенилаланина, пролина, серина, треонина, триптофана, тирозина и валина.20. The method according to claim 19, where the mixture of amino acids consists of alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine and valine.

21. Способ по п.19, где одна или несколько жирных кислот выбраны из группы, состоящей из линолевой кислоты, линоленовой кислоты, липоевой кислоты, олеиновой кислоты, пальмитиновой кислоты, стеариновой кислоты, арахидиновой кислоты, арахидоновой кислоты, лауриновой кислоты, бегеновой кислоты, каприловой кислоты, лауриновой кислоты, гексановой кислоты, лигноцериновой кислоты, миристиновой кислоты и октановой кислоты.21. The method according to claim 19, where one or more fatty acids is selected from the group consisting of linoleic acid, linolenic acid, lipoic acid, oleic acid, palmitic acid, stearic acid, arachidic acid, arachidonic acid, lauric acid, behenic acid, caprylic acid, lauric acid, hexanoic acid, lignoceric acid, myristic acid and octanoic acid.

22. Способ по п.19, где смесь нуклеозидов содержит один или несколько нуклеозидов, выбранных из группы, состоящей из аденозина, гуанозина, цитидина, уридина, тимидина и гипоксантина.22. The method of claim 19, wherein the nucleoside mixture contains one or more nucleosides selected from the group consisting of adenosine, guanosine, cytidine, uridine, thymidine and hypoxanthine.

23. Способ по п.19, где двухвалентный катион представляет собой Са²⁺, Mg²⁺ или оба.23. The method of claim 19, wherein the divalent cation is Ca ²⁺ , Mg ²⁺ , or both.

24. Способ по любому из пп.16-23, где:24. Method according to any one of claims 16-23, where:

(a) среднее время удвоения клеток составляет > 30 ч;(a) the average cell doubling time is > 30 h;

(b) среднее время удвоения клеток составляет > 24 ч;(b) the average cell doubling time is >24 h;

(c) среднее время удвоения клеток снижалось по меньшей мере на две трети по сравнению с временем удвоения клеток, выращиваемых в среде для культивирования клеток, которая содержит менее 0,3±0,045 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина; и/или (d) культура клеток способна достигать плотности количества жизнеспособных клеток, которая по меньшей мере на 15% больше, чем у сходной культуры клеток, культивируемой в сходной среде для культивирования клеток, которая содержит менее 0,09±0,014 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина; и/или (e) культура клеток способна достигать плотности количества жизнеспособных клеток, которая по меньшей мере в 3 раза выше, чем у сходной культуры клеток, культивируемой в сходной среде для культивирования клеток, которая содержит менее 0,09±0,014 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина; и/или (f) этап добавления в среду для культивирования клеток одной или нескольких добавок в момент использования.(c) the average cell doubling time was reduced by at least two-thirds compared to the doubling time of cells grown in cell culture medium that contains less than 0.3 ± 0.045 mM ornithine and less than 0.2 ± 0.03 mM putrescine; and/or (d) the cell culture is capable of achieving a viable cell density that is at least 15% greater than that of a similar cell culture cultured in a similar cell culture medium that contains less than 0.09 ± 0.014 mM ornithine 0.2±0.03 mM putrescine; and/or (e) the cell culture is capable of achieving a viable cell density that is at least 3 times higher than that of a similar cell culture cultured in a similar cell culture medium that contains less than 0.09 ± 0.014 mM ornithine 0.2±0.03 mM putrescine; and/or (f) the step of adding one or more additives to the cell culture medium at the time of use.

25. Способ по любому из пп.16-25, где добавки в момент использования содержат один или несколько из NaHCO₃, глутамина, инсулина, глюкозы, CuSO₄, ZnSO₄, FeCl₃, NiSO₄, Na₄ ЭДТА и цитрат Na₃и/или каждый из NaHCO₃, глутамина, инсулина, глюкозы, CuSO₄, ZnSO₄, FeCl₃, NiSO4, Na₄ ЭДТА и цитрата Na3.25. The method according to any one of claims 16-25, where the additives at the time of use contain one or more of NaHCO ₃ , glutamine, insulin, glucose, CuSO ₄ , ZnSO ₄ , FeCl ₃ , NiSO ₄ , Na ₄ EDTA and Na ₃ citrate and/or each of NaHCO ₃ , glutamine, insulin, glucose, CuSO ₄ , ZnSO ₄ , FeCl ₃ , NiSO 4 , Na ₄ EDTA and Na 3 citrate.

- 19 045169- 19 045169

26. Способ по любому из пп. 16-25, где:26. Method according to any one of paragraphs. 16-25, where:

(а) афлиберцепт получают со средним 7-суточным титром, который по меньшей мере на 7% выше, чем средний 7-суточный титр, получаемый посредством сходных клеток в среде для культивирования клеток, которая содержит менее 0,09±0,014 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина;(a) aflibercept is obtained with an average 7-day titer that is at least 7% higher than the average 7-day titer obtained by similar cells in a cell culture medium that contains less than 0.09 ± 0.014 mM ornithine 0.2±0.03 mM putrescine;

(Ь) афлиберцепт получают со средним 7-суточным титром, который по меньшей мере на 14% выше, чем средний 7-суточный титр, получаемый посредством сходных клеток в среде для культивирования клеток, которая содержит менее 0,09±0,014 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина;(b) aflibercept is obtained with an average 7-day titer that is at least 14% higher than the average 7-day titer obtained by similar cells in a cell culture medium that contains less than 0.09 ± 0.014 mM ornithine or less 0.2±0.03 mM putrescine;

(с) афлиберцепт получают со средним 7-суточным титром, который по меньшей мере на 80% выше, чем средний 7-суточный титр, получаемый посредством сходных клеток в среде для культивирования клеток, которая содержит менее 0,09±0,014 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина;(c) aflibercept is obtained with a 7-day average titer that is at least 80% higher than the 7-day average titer obtained by similar cells in a cell culture medium that contains less than 0.09 ± 0.014 mM ornithine 0.2±0.03 mM putrescine;

(d) афлиберцепт получают со средним 7-суточным титром, который по меньшей мере в 2 раза выше чем средний 7-суточный титр, получаемый посредством сходных клеток в среде для культивирования клеток, которая содержит менее 0,09±0,014 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина; и/или (е) афлиберцепт получают со средним 7-суточным титром, который по меньшей мере в 3 раза выше, чем средний 7-суточный титр, получаемый посредством сходных клеток в среде для культивирования клеток, которая содержит менее 0,09±0,014 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина.(d) aflibercept is obtained with a 7-day average titer that is at least 2 times higher than the 7-day average titer obtained by similar cells in a cell culture medium that contains less than 0.09 ± 0.014 mM ornithine and less than .2±0.03 mM putrescine; and/or (f) aflibercept is obtained with a 7-day average titer that is at least 3 times higher than the 7-day average titer obtained by similar cells in a cell culture medium that contains less than 0.09 ± 0.014 mM ornithine and less than 0.2±0.03 mM putrescine.

-20Евразийская патентная организация, ЕАПВ-20Eurasian Patent Organization, EAPO

Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2Russia, 109012, Moscow, Maly Cherkassky lane, 2