EA045156B1 - CEREAL PLANTS WITH IMPROVED CELL WALL PROPERTIES - Google Patents
CEREAL PLANTS WITH IMPROVED CELL WALL PROPERTIES Download PDFInfo
- Publication number
- EA045156B1 EA045156B1 EA202091565 EA045156B1 EA 045156 B1 EA045156 B1 EA 045156B1 EA 202091565 EA202091565 EA 202091565 EA 045156 B1 EA045156 B1 EA 045156B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- barley
- csif6
- mutant
- kernels
- seq
- Prior art date
Links
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 title claims description 162
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 title claims description 11
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 claims description 466
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 claims description 185
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 168
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 161
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 claims description 143
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 136
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 134
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 122
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 94
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 94
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 94
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 67
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 28
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 25
- 241000209219 Hordeum Species 0.000 claims description 21
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 14
- 239000004464 cereal grain Substances 0.000 claims description 13
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 claims description 12
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 11
- 150000002333 glycines Chemical class 0.000 claims description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 9
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 8
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 7
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 6
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 5
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims description 4
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 claims description 4
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 claims description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 2
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 claims 1
- 235000011303 Brassica alboglabra Nutrition 0.000 claims 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 claims 1
- 235000011302 Brassica oleracea Nutrition 0.000 claims 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 claims 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims 1
- 229940085127 phytase Drugs 0.000 claims 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 142
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 109
- 238000000034 method Methods 0.000 description 109
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 49
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 48
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 47
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 42
- 239000000047 product Substances 0.000 description 37
- 230000008569 process Effects 0.000 description 35
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 34
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 32
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 32
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 32
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 26
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 25
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 23
- 238000004890 malting Methods 0.000 description 22
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 21
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 21
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 21
- 238000005360 mashing Methods 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 239000003570 air Substances 0.000 description 16
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 14
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 14
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 14
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 14
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 13
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 13
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 11
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 11
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 10
- FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N (2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,4r,5r,6s)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(2r,4r,5r,6s)-4,5,6-trihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1[C@@H](CO)O[C@@H](OC2[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N 0.000 description 9
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 9
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 108010019077 beta-Amylase Proteins 0.000 description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 8
- 229920000945 Amylopectin Polymers 0.000 description 8
- 235000008694 Humulus lupulus Nutrition 0.000 description 8
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 8
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 8
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 8
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 8
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 8
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 238000000643 oven drying Methods 0.000 description 8
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 7
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 7
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 7
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 7
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 6
- 108010076363 licheninase Proteins 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 6
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 6
- 101710130006 Beta-glucanase Proteins 0.000 description 5
- 102100025386 Oxidized low-density lipoprotein receptor 1 Human genes 0.000 description 5
- 101710199789 Oxidized low-density lipoprotein receptor 1 Proteins 0.000 description 5
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 5
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 4
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- -1 Leu Chemical group 0.000 description 4
- 102100033353 Lipopolysaccharide-responsive and beige-like anchor protein Human genes 0.000 description 4
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 4
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 4
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 4
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 4
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 4
- 235000015107 ale Nutrition 0.000 description 4
- 108010050181 aleurone Proteins 0.000 description 4
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 4
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 4
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 239000004458 spent grain Substances 0.000 description 4
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 3
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 3
- 241000209149 Zea Species 0.000 description 3
- 239000012080 ambient air Substances 0.000 description 3
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 235000019985 fermented beverage Nutrition 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- 150000003588 threonines Chemical class 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 101710118538 Protease Proteins 0.000 description 2
- 241000209056 Secale Species 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 2
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 235000013334 alcoholic beverage Nutrition 0.000 description 2
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-DVKNGEFBSA-N alpha-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-DVKNGEFBSA-N 0.000 description 2
- 229920000617 arabinoxylan Polymers 0.000 description 2
- 229940098396 barley grain Drugs 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 2
- 238000013124 brewing process Methods 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 101150038500 cas9 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 231100000502 fertility decrease Toxicity 0.000 description 2
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 2
- 150000002519 isoleucine derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 235000015095 lager Nutrition 0.000 description 2
- 235000020022 lambic Nutrition 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 235000021577 malt beverage Nutrition 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 2
- 235000015105 pale ale Nutrition 0.000 description 2
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 2
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 235000014214 soft drink Nutrition 0.000 description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 2
- 230000037436 splice-site mutation Effects 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- JKMPXGJJRMOELF-UHFFFAOYSA-N 1,3-thiazole-2,4,5-tricarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1=NC(C(O)=O)=C(C(O)=O)S1 JKMPXGJJRMOELF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CHHHXKFHOYLYRE-UHFFFAOYSA-M 2,4-Hexadienoic acid, potassium salt (1:1), (2E,4E)- Chemical compound [K+].CC=CC=CC([O-])=O CHHHXKFHOYLYRE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BKUKXOMYGPYFJJ-UHFFFAOYSA-N 2-ethylsulfanyl-1h-benzimidazole;hydrobromide Chemical group Br.C1=CC=C2NC(SCC)=NC2=C1 BKUKXOMYGPYFJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005781 Avena Nutrition 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- 235000020020 Berliner weiße Nutrition 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 description 1
- 108050008938 Glucoamylases Proteins 0.000 description 1
- 241001523162 Helle Species 0.000 description 1
- 244000202745 Hordeum vulgare ssp spontaneum Species 0.000 description 1
- 235000004594 Hordeum vulgare ssp. spontaneum Nutrition 0.000 description 1
- 235000017335 Hordeum vulgare subsp spontaneum Nutrition 0.000 description 1
- 241001299819 Hordeum vulgare subsp. spontaneum Species 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-HWQSCIPKSA-N L-arabinofuranose Chemical compound OC[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 1
- 241001123227 Saccharomyces pastorianus Species 0.000 description 1
- 241000228160 Secale cereale x Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 235000019714 Triticale Nutrition 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 101000872823 Xenopus laevis Probable histone deacetylase 1-A Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGXQOOQUZRUVSS-ZZXKWVIFSA-N [5-[3,5-dihydroxy-2-(1,3,4-trihydroxy-5-oxopentan-2-yl)oxyoxan-4-yl]oxy-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl (e)-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2-enoate Chemical compound OC1C(OC(CO)C(O)C(O)C=O)OCC(O)C1OC1C(O)C(O)C(COC(=O)\C=C\C=2C=CC(O)=CC=2)O1 UGXQOOQUZRUVSS-ZZXKWVIFSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 102000016679 alpha-Glucosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 1
- 108010052439 arabinoxylanase Proteins 0.000 description 1
- 150000004783 arabinoxylans Chemical class 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229940069780 barley extract Drugs 0.000 description 1
- 229940067467 barley malt syrup Drugs 0.000 description 1
- 235000019998 barley wine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 235000020008 bock Nutrition 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 235000015044 brown ale Nutrition 0.000 description 1
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000014171 carbonated beverage Nutrition 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 108010040093 cellulose synthase Proteins 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 235000020010 doppelbock Nutrition 0.000 description 1
- 230000034431 double-strand break repair via homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 235000020026 dunkelweizenbier Nutrition 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 235000020011 eisbock Nutrition 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 1
- 108010041969 feruloyl esterase Proteins 0.000 description 1
- 239000005452 food preservative Substances 0.000 description 1
- 235000019249 food preservative Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 125000005640 glucopyranosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 235000020021 gose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000009499 grossing Methods 0.000 description 1
- 235000020024 hefeweizen Nutrition 0.000 description 1
- 239000012676 herbal extract Substances 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007641 inkjet printing Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 235000020009 maibock Nutrition 0.000 description 1
- 235000020429 malt syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 235000020014 märzen Nutrition 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 235000019520 non-alcoholic beverage Nutrition 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000020001 old ale Nutrition 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 235000015047 pilsener Nutrition 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 238000005498 polishing Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 235000010241 potassium sorbate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004302 potassium sorbate Substances 0.000 description 1
- 229940069338 potassium sorbate Drugs 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 229930182852 proteinogenic amino acid Natural products 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000009790 rate-determining step (RDS) Methods 0.000 description 1
- 230000003134 recirculating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 235000020015 schwarzbier Nutrition 0.000 description 1
- 235000020003 scotch ale Nutrition 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000015096 spirit Nutrition 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 235000015106 stout Nutrition 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-L sulfite Chemical class [O-]S([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 101150065190 term gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- UONOETXJSWQNOL-UHFFFAOYSA-N tungsten carbide Chemical compound [W+]#[C-] UONOETXJSWQNOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013522 vodka Nutrition 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 235000020023 weizenbier Nutrition 0.000 description 1
- 235000020013 weizenbock Nutrition 0.000 description 1
- 235000015041 whisky Nutrition 0.000 description 1
- 235000020985 whole grains Nutrition 0.000 description 1
- 235000020019 witbier Nutrition 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Description
Область техники изобретенияTechnical field of the invention
Настоящее изобретение относится к растениям ячменя, имеющим улучшенные свойства клеточной стенки. В частности, изобретение относится к растениям ячменя, обладающим свойствами клеточной стенки, пригодными для производства напитков на основе ячменя, например пива. Кроме того, изобретение дополнительно относится к способам производства напитков на основе ячменя, а также к продуктам, полученным из растений ячменя по изобретению.The present invention relates to barley plants having improved cell wall properties. In particular, the invention relates to barley plants having cell wall properties suitable for the production of barley-based beverages, such as beer. In addition, the invention further relates to methods for producing barley-based beverages, as well as products obtained from barley plants according to the invention.
Уровень техникиState of the art
В коммерческих процессах солодования зерна ячменя проращивают или солодуют, в контролируемых условиях, которые позволяют частично мобилизовать запасы крахмала и белка крахмального эндосперма в течение от 4 до 6 дней. Процесс солодования обычно инициируется погружением сухого зерна ячменя в воду. Данный процесс известен как замачивание, где целью является не только очистка зерна, но и повышение его влажности до от около 40 до 45% мас./мас., с тем чтобы последующая стадия мобилизации эндосперма происходила быстрее. Во время замачивания воду один раз сливают, чтобы обеспечить повторную аэрацию зерна. Данная стадия известна как воздушная пауза и считается необходимой, в первую очередь, потому что погруженное в воду зерно ощущает недостаток в кислороде через около 16 ч. После воздушной паузы длительностью около 8 ч зерно снова погружают в воду, чтобы завершить обработку замачиванием в течение еще 8-часового периода или серии повторных замачиваний. Двухступенчатый процесс замачивания для увеличения содержания влаги в сухом зерне до 40% или выше занимает в целом около 32 ч.In commercial malting processes, barley grains are germinated, or malted, under controlled conditions that allow partial mobilization of starch and starch endosperm protein reserves over a period of 4 to 6 days. The malting process is usually initiated by immersing dry barley grains in water. This process is known as soaking, where the goal is not only to clean the grain, but also to increase its moisture content to about 40 to 45% w/w so that the subsequent stage of endosperm mobilization occurs more quickly. During soaking, the water is drained once to re-aerate the grain. This stage is known as an air rest and is considered necessary primarily because the grain submerged in water becomes starved of oxygen after about 16 hours. After an air rest of about 8 hours, the grain is immersed again in water to complete the treatment by soaking for another 8 hours. - an hour period or a series of repeated soakings. The two-step soaking process to increase the moisture content of dry grain to 40% or higher takes approximately 32 hours in total.
Замоченное зерно рассыпают для прорастания, во время которого ферменты, секретируемые из алейроновых и скутеллярных эпителиальных клеток, вместе с некоторыми ферментами, которые уже присуствуют в крахмалистых клетках эндосперма, разлагают клеточные стенки, крахмал и белок. Солодовник обычно имеет целью индукцию высоких уровней ферментов, которые разлагают полисахариды клеточной стенки в зерне ячменя, в частности, (1,3;1,4)-в-глюканы и арабиноксиланы. Не полностью разложившиеся (1,3;1,4)-в-глюканы могут быть особенно неприятными для пивоваров, поскольку они могут быть эктрагированы из солода в растворимых формах, которые образуют высоковязкие водные растворы, которые замедляют процессы фильтрации на пивоваренном заводе и способствуют нежелательному помутнению в готовом пиве. Кроме того, было показано, что пивоварение при высоком содержании (1,3;1,4)-в-глюканов отрицательно влияет на уровень солодового экстракта. Таким образом, низкие уровни растворимых (1,3;1,4)-в-глюканов представляют собой важный параметр качества солодования, по причине чего высокие уровни (1,3;1,4)-в-глюканазных ферментов остаются важными показателями качества солода. Кроме того, солодовник стремится быстро стимулировать синтез в зернах как можно большего количества ферментов, разрушающих крахмал. Разлагающие крахмал ферменты которые включают α- и β-амилазы, ферменты, расщепляющие молекулы крахмала в местах разветвления (например, предельная декстриназа), и α-глюкозидазы - частично деполимеризуют запасы крахмала зерна до моносахаридов, олигосахаридов и глюкозы. Продукты деполимеризации крахмала впоследствии используются дрожжевыми клетками в качестве источника углерода и сбраживаются в пивной спирт.The soaked grain is scattered for germination, during which enzymes secreted from the aleurone and scutellar epithelial cells, together with some enzymes already present in the starchy endosperm cells, decompose the cell walls, starch and protein. Malthouse typically aims to induce high levels of enzymes that degrade cell wall polysaccharides in barley grain, particularly (1,3;1,4)-β-glucans and arabinoxylans. Incompletely degraded (1,3;1,4)-glucans can be particularly troublesome for brewers because they can be extracted from the malt in soluble forms, which form highly viscous aqueous solutions that slow down brewery filtration processes and contribute to unwanted cloudiness in finished beer. Additionally, brewing at high levels of (1,3;1,4)-β-glucans has been shown to negatively impact malt extract levels. Thus, low levels of soluble (1,3;1,4)-β-glucans represent an important parameter of malt quality, which is why high levels of (1,3;1,4)-β-glucanase enzymes remain important indicators of malt quality . In addition, the maltster strives to quickly stimulate the synthesis in grains of as many enzymes as possible that destroy starch. Starch-degrading enzymes, which include α- and β-amylases, enzymes that break down starch molecules at branch sites (eg, limiting dextrinase), and α-glucosidases, partially depolymerize grain starch reserves into monosaccharides, oligosaccharides, and glucose. The products of starch depolymerization are subsequently used by yeast cells as a carbon source and fermented into beer alcohol.
Как отмечено выше, процесс проращивания обычно занимает около 5 дней. После контролируемых стадий проращивания влажный солод сушат, при этом содержание влаги уменьшается от около 40% до от 4 до 5%. Данный процесс сушки, называемый печной сушкой, является очень энергоемким и представляет собой большую часть производственных расходов. Весь процесс, включая печную сушку, обычно занимает от 6 до 7 дней.As noted above, the germination process usually takes about 5 days. After controlled germination stages, the wet malt is dried, reducing the moisture content from about 40% to 4 to 5%. This drying process, called oven drying, is very energy intensive and represents a large portion of production costs. The entire process, including oven drying, usually takes 6 to 7 days.
На пивоваренном заводе высушенный в печи солод измельчают, чтобы разбить зерно, и полученное содержимое экстрагируют горячей водой в процессе, известном как затирание. Извлеченный материал включает частично расщепившиеся молекулы крахмала, белка и клеточной стенки, как описано выше, и они дополнительно расщепляются эндогенными ферментами зерна, которые были извлечены из солода. На данной стадии некоторые пивовары добавляют дополнительные и, как правило, более дешевые источники углерода (добавки), чтобы поддержать последующий процесс брожения дрожжей и снизить затраты на солод. Указанные добавки могут представлять собой ячменную, рисовую, пшеничную или другую зерновую муку из непроросшего зерна, но их добавление может потребовать сопутствующего добавления гидролитических ферментов, поскольку в солоде недостаточно эндогенных ферментов, чтобы расщеплять компоненты добавки. Добавленные ферменты обычно получают из неочищенных и относительно дешевых экстрактов грибковых и/или бактериальных культур. Добавление экзогенных ферментов не разрешено в некоторых странах, особенно, когда пиво должно производиться в строго регулируемых условиях.At the brewery, kiln-dried malt is crushed to break down the grain, and the resulting contents are extracted with hot water in a process known as mashing. The extracted material includes partially digested starch, protein and cell wall molecules as described above, and these are further digested by endogenous grain enzymes that have been extracted from the malt. At this stage, some brewers add additional and usually cheaper carbon sources (additives) to support subsequent yeast fermentation and reduce malt costs. These additives may be barley, rice, wheat or other unsprouted grain flours, but their addition may require the concomitant addition of hydrolytic enzymes since there are not enough endogenous enzymes in the malt to break down the additive components. Added enzymes are usually obtained from crude and relatively cheap extracts of fungal and/or bacterial cultures. The addition of exogenous enzymes is not permitted in some countries, especially when the beer must be produced under highly regulated conditions.
Дальнейшая деградация крахмала и других компонентов эндосперма, экстрагированных в горячей воде, происходит в процессе, известном как осахаривание. После затирания экстракты отфильтровывают, часто в фильтрационном чане, и охлаждают. Экстракт может кипятиться в присутствии хмеля или экстрактов хмеля, с добавлением после его охлаждения дрожжевых культур для сбраживания высвобождаемых Сахаров в спирт. Производимое таким образом пиво обычно созревает и фильтруется перед розливом в бутылки. Пиво также может быть газировано углекислотой перед розливом в бутылки.Further degradation of starch and other endosperm components extracted in hot water occurs in a process known as saccharification. After mashing, the extracts are filtered, often in a lauter tun, and cooled. The extract may be boiled in the presence of hops or hop extracts, with yeast cultures added after it has cooled to ferment the released sugars into alcohol. The beer produced in this way is usually aged and filtered before bottling. Beer can also be carbonated with carbon dioxide before bottling.
- 1 045156- 1 045156
Ячмень является самой популярной зерновой культурой, используемой для производства пива. Именно большое количество крахмала, содержащегося в его ядрах, сделало ячмень очень привлекательным сырьем для пивоваренной промышленности. Для обеспечения полного использования потенциала зерна ячменя в пивоварении крайне важно обеспечивать оптимальную деградацию структур клеточной стенки, охватывающих гранулы крахмала. В упрощенном представлении его архитектуры ядро ячменя, в основном, состоит из крахмалистого эндосперма, окруженного алейроновым слоем. Клеточные стенки алейрона и эндосперма ядра ячменя, в основном, состоят из некрахмальных полисахаридов (non-starch polysaccharides (NSP)). Крахмалистый эндосперм состоит на 75% из (1-3,1-4)-в-глюканов (BGL) и на 20% из арабиноксилана (arabinoxylan (АХ)), в то время как алейрон состоит на 71% их АХ и на 26% из BGL. BGL ячменя представляют собой неразветвленные, длинные линейные цепи остатков глюкозы, связанные как β-(1-3), так и в-(1-4)-связями. АХ ячменя состоит из молекулярного остова D-ксиланопиранозила, связанного β-(1-4) связями, случайным образом соединенными с L-арабинофуранозой α-(1-2) и α-(1-3) связями.Barley is the most popular grain crop used for beer production. It is the large amount of starch contained in its kernels that has made barley a very attractive raw material for the brewing industry. To ensure the full potential of barley grains is utilized in brewing, it is essential to ensure optimal degradation of the cell wall structures enclosing the starch granules. In a simplified representation of its architecture, the barley kernel consists primarily of starchy endosperm surrounded by an aleurone layer. The cell walls of the aleurone and endosperm of the barley kernel are mainly composed of non-starch polysaccharides (NSP). The starchy endosperm consists of 75% (1-3,1-4)-β-glucans (BGL) and 20% arabinoxylan (ACh), while the aleurone consists of 71% ACh and 26 % from BGL. Barley BGLs are unbranched, long linear chains of glucose residues linked by both β-(1-3) and β-(1-4) bonds. Barley ACh consists of a molecular backbone of D-xylanopyranosyl linked by β-(1-4) bonds, randomly connected to L-arabinofuranose by α-(1-2) and α-(1-3) bonds.
Сущность изобретенияThe essence of the invention
Как указано выше, одной из стадий производства пива, требующей больших затрат времени и энергии, является солодование. Ограничивающей скорость стадией в процедуре солодования является снижение содержания (1,3;1,4)-в-глюканов в прорастающих ядрах ячменя до приемлемо низких уровней. Соответственно существует необходимость в предоставлении материалов и способов, которые могут сократить время, необходимое для солодования. В частности, существует потребность в растениях ячменя с низким уровнем (1,3;1,4)-в-глюканов. Тем не менее растения ячменя, у которых (1,3;1,4)-в-глюканы полностью отсутствуют, характеризуются понижением высоты, мощности и урожайности (до приблизительно 70% от контроля) (Taketa et al., 2012). Фактически Taketa et al. приходит к выводу, что поскольку агрономические характеристики снижаются, полезность мутантов bgl для солодования может быть не очень большой.... Hu et al. (2014) описывает мутант ячменя m351, содержащий очень низкие уровни βглюканов со смешанной связью (1-3,1-4) (<1,6%). Однако, мутант m351 характеризовался пониженной твердостью зерна, о чем свидетельствует более чем четырехкратное увеличение разрушаемости зерна по сравнению с родительским растением, и чувствительность к солям, что приводило к более слабому прорастанию в условиях 400 мМ соли.As stated above, one of the stages of beer production that requires a lot of time and energy is malting. The rate-limiting step in the malting procedure is the reduction of (1,3;1,4)-β-glucans in the germinating barley kernels to acceptably low levels. Accordingly, there is a need to provide materials and methods that can reduce the time required for malting. In particular, there is a need for barley plants with low levels of (1,3;1,4)-β-glucans. However, barley plants that completely lack (1,3;1,4)-β-glucans are characterized by reduced height, vigor, and yield (to approximately 70% of control) (Taketa et al., 2012). In fact, Taketa et al. concludes that as agronomic performance is reduced, the utility of bgl mutants for malting may not be very great.... Hu et al. (2014) describe the barley mutant m351 containing very low levels of mixed linkage (1-3,1-4) β-glucans (<1.6%). However, the m351 mutant was characterized by reduced grain hardness, as evidenced by a more than fourfold increase in grain breakage compared to the parent plant, and sensitivity to salts, which led to poorer germination under 400 mM salt conditions.
Соответственно существует потребность в растениях ячменя с низким уровнем (1,3;1,4)-βглюканов, которые в то же время имеют хорошие агрономические характеристики и твердость зерна.Accordingly, there is a need for barley plants with low levels of (1,3;1,4)-β-glucans, which at the same time have good agronomic characteristics and grain hardness.
(1,3;1,4)-в-глюканы ячменя содержат целлотриозильные (DP3) и целлотетраозильные (DP4) остатки в соотношениях, которые обычно находятся в диапазоне от 2,5 до 4. Соотношение DP3/DP4 оказывает влияние на свойства (1,3;1,4)-в-глюканов.Barley (1,3;1,4)-β-glucans contain cellotriosyl (DP3) and cellotetraosyl (DP4) residues in ratios that typically range from 2.5 to 4. The DP3/DP4 ratio influences the properties of (1 ,3;1,4)-β-glucans.
В одном варианте осуществления изобретение относится к растениям ячменя, имеющим низкий уровень (1,3;1,4)-в-глюканов с соотношением DP3/DP4, сравнимым с соотношением DP3/DP4 ячменя дикого типа. Такие растения ячменя могут иметь агрономическое значение и иметь зерна ячменя с пониженной склонностью к поломке. Одной из технических проблем, решаемых с помощью настоящего изобретения, является обеспечение растениями ячменя, имеющими низкий уровень (1,3;1,4)-в-глюканов, при этом растения ячменя в то же время имеют приемлемые агрономические признаки, приемлемую частоту разрушения зерен (например, менее чем в 2 раза по сравнению с растением дикого типа, не имеющим мутации CsIF6, но в остальном имеющего тот же генотип) и в дополнение соотношение DP3/DP4, похожее на таковое у ячменя дикого типа.In one embodiment, the invention provides barley plants having low levels of (1,3;1,4)-β-glucans with a DP3/DP4 ratio comparable to the DP3/DP4 ratio of wild-type barley. Such barley plants may be of agronomic importance and have barley grains with a reduced tendency to break. One of the technical problems solved by the present invention is the provision of barley plants having low levels of (1,3;1,4)-β-glucans, while the barley plants at the same time have acceptable agronomic traits, acceptable frequency of grain destruction (e.g., less than 2-fold compared to a wild-type plant that does not have the CsIF6 mutation but otherwise has the same genotype) and in addition a DP3/DP4 ratio similar to that of wild-type barley.
В одном варианте осуществления изобретение относится к растениям ячменя, имеющим низкий уровень (1,3;1,4)-в-глюканов с высоким или низким соотношением DP3/DP4. Такие растения ячменя могут иметь агрономически приемлемые зерна, и они могут иметь более высокий уровень нерастворимых (1,3;1,4)-в-глюканов. Нерастворимые (1,3;1,4)-в-глюканы потенциально могут быть удалены в процессе пивоварения, и, таким образом, являются в некоторых вариантах осуществления предпочтительными. Burton & Fincher 2014 предположил, что растворимость молекул (1,3;1,4)-в-глюканов может быть предсказана из соотношения DP3:DP4, и что высокие и низкие соотношения могут привести в результате к более нерастворимым агрегатам.In one embodiment, the invention relates to barley plants having low levels of (1,3;1,4)-β-glucans with a high or low DP3/DP4 ratio. Such barley plants may have agronomically acceptable grains, and they may have higher levels of insoluble (1,3;1,4)-β-glucans. Insoluble (1,3;1,4)-β-glucans can potentially be removed during the brewing process, and are thus preferred in some embodiments. Burton & Fincher 2014 suggested that the solubility of (1,3;1,4)-glucan molecules can be predicted from the DP3:DP4 ratio, and that high and low ratios may result in more insoluble aggregates.
Jobling et al. (2015) описывают экспрессию CSLF в искусственной системе в табачном листе, и описывают, что одна аминокислота (Ile757) в четвертом трансмембранном домене CSLF контролирует соотношение DP3:DP4, однако не описано, что модификация данного домена и соотношение DP3:DP4 коррелируют с количеством (1,3;1,4)-в-глюканов.Jobling et al. (2015) describe the expression of CSLF in an artificial system in the tobacco leaf, and describe that one amino acid (Ile757) in the fourth transmembrane domain of CSLF controls the DP3:DP4 ratio, but do not describe that modification of this domain and the DP3:DP4 ratio correlate with the amount of ( 1,3;1,4)-β-glucans.
Одной из технических проблем, решаемых настоящим изобретением, является обеспечение растений ячменя, имеющих низкий уровень (1,3;1,4)-в-глюканов, при этом растения ячменя в то же время имеют приемлемые агрономические признаки и, кроме того, полезное соотношение DP3:DP4.One of the technical problems solved by the present invention is the provision of barley plants having low levels of (1,3;1,4)-β-glucans, while the barley plants at the same time have acceptable agronomic traits and, in addition, a beneficial ratio DP3:DP4.
В одном аспекте изобретение относится к растениям ячменя, несущим мутацию отдельных аминокислот в трансмембранных доменах. Изобретение неожиданно демонстрирует, что такие растения ячменя содержат низкий уровень (1,3;1,4)-в-глюканов (обычно в диапазоне от 1,7 до 5%), являются жизнеспособными, агрономически приемлемыми и имеют урожайность, сопоставимую с другими сортами ячменя. Такие растения ячменя особенно полезны для способов производства напитков на основе зерновыхIn one aspect, the invention relates to barley plants bearing mutations of individual amino acids in transmembrane domains. The invention unexpectedly demonstrates that such barley plants contain low levels of (1,3;1,4)-β-glucans (typically in the range of 1.7 to 5%), are viable, agronomically acceptable and have yields comparable to other varieties barley. Such barley plants are particularly useful for cereal-based beverage production processes
- 2 045156 с уменьшенным временем прорастания.- 2 045156 with reduced germination time.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способам и приспособлениям для обеспечения растений ячменя с тонко регулируемым содержанием (1,3;1,4)-в-глюканов. Таким образом, растения ячменя по изобретению не только имеют низкое содержание (1,3;1,4)-в-глюканов, но также позволяют контролировать соотношение DP3:DP4 у данных растений ячменя.In addition, the present invention relates to methods and apparatus for providing barley plants with a finely controlled content of (1,3;1,4)-β-glucans. Thus, the barley plants of the invention not only have a low content of (1,3;1,4)-β-glucans, but also make it possible to control the DP3:DP4 ratio of these barley plants.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к растению ячменя или его части, где ядра указанного растения ячменя имеют пониженное содержание (1,3;1,4)-в-глюканов, и где указанное растение ячменя несет мутацию в гене CsIF6, где указанный мутированный ген CsIF6 кодирует мутантный полипептид CsIF6, где указанный мутантный CsIF6 представляет собой CsIF6 последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 за исключением того, что мутантный CsIF6 содержит замену одной аминокислоты в локализованном в мембране домене CsIF6. где указанная замена представляет собой замещение неполярной аминокислоты на заряженную аминокислоту или замещение полярной аминокислоты на неполярную аминокислоту, где локализованные в мембране домены CsIF6 состоят из аминокислот от 109 до 128, от 137 до 158, от 700 до 731, от 741 до 758, от 835 до 857 и от 864 до 882 последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3.In one aspect, the present invention relates to a barley plant or part thereof, wherein the kernels of said barley plant have a reduced content of (1,3;1,4)-β-glucans, and wherein said barley plant carries a mutation in the CsIF6 gene, wherein said mutated gene CsIF6 encodes a mutant CsIF6 polypeptide, wherein the mutant CsIF6 is the CsIF6 of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 except that the mutant CsIF6 contains a single amino acid substitution in the membrane-localized domain of CsIF6. wherein said substitution is a substitution of a non-polar amino acid for a charged amino acid or a substitution of a polar amino acid for a non-polar amino acid, wherein the membrane-localized CsIF6 domains consist of amino acids 109 to 128, 137 to 158, 700 to 731, 741 to 758, 835 to 857 and 864 to 882 of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
Также аспектом изобретения является обеспечение растительных продуктов, приготовленных из указанного растения ячменя, а также способов приготовления растительных продуктов из указанного растения ячменя. Растения ячменя по настоящему изобретению предпочтительно могут быть использованы для приготовления растительных продуктов, например, сусла, с пониженной вязкостью по сравнению с суслом, приготовленным из ядер растения ячменя, несущего ген CsIF6 дикого типа, но в остальном имеющего тот же генотип растения ячменя что и растения ячменя по изобретению.It is also an aspect of the invention to provide plant products prepared from said barley plant, as well as methods for preparing plant products from said barley plant. The barley plants of the present invention may preferably be used to prepare plant products, e.g., wort, with reduced viscosity compared to wort prepared from the kernels of a barley plant carrying the wild type CsIF6 gene, but otherwise having the same barley plant genotype as the plants barley according to the invention.
Описание чертежейDescription of drawings
На фиг. 1 показано содержание (1,3;1,4)-в-глюканов (сокращенно β-глюкан или BGL) в мутантах, идентифицированных либо способом цифровой идентификации мутаций (Digital Mutation Identification (DMI)) (Мут1, 2, 3 и 4 с соответствующим эталоном 1), либо секвенированием (Мут5 и соответствующий эталон). Столбцы показывают±стандартное отклонение (standart deviation, SD).In fig. Figure 1 shows the content of (1,3;1,4)-β-glucans (abbreviated β-glucan or BGL) in mutants identified either by Digital Mutation Identification (DMI) (Mut1, 2, 3 and 4 with the corresponding standard 1), or sequencing (Mut5 and the corresponding standard). Columns show ±standard deviation (SD).
На фиг. 2 показано соотношение DP3:DP4 у мутантов, идентифицированных либо способом DMI (Мут1, 2, 3, 4 с соответствующим эталоном 1), либо секвенированием (Мут5 и соответствующий эталон).In fig. Figure 2 shows the DP3:DP4 ratio in mutants identified either by DMI (Mut1, 2, 3, 4 with the corresponding reference 1) or by sequencing (Mut5 and the corresponding reference).
На фиг. 3 показана модель белка CsIF6, встроенного в плазматическую мембрану. Указанные мутации представляют собой DMI-мутанты.In fig. Figure 3 shows a model of the CsIF6 protein embedded in the plasma membrane. These mutations are DMI mutants.
На фиг. 4 показан пример оборудования, применяемого для приготовления зеленого солода. Оборудование содержит резервуар (2), в котором зерна можно погружать в водный раствор и непрерывно аэрировать. Оборудование содержит впускное отверстие для зерен зерновых культур (1), резервуар, например, резервуар для замачивания (2); впускные отверстия для газа, например, через пористые камни вулканического происхождения (sinter stone) (3); насос, например, воздушный насос (4); выпускное отверстие для зерен зерновых культур (5); зерновой насос (6); оборудование для мелкого раздробления зерен зерновых культур, например, мельница (7); впускное отверстие (8); емкость, например, емкость для затирания (9), и; выпускное отверстие (10).In fig. Figure 4 shows an example of equipment used to prepare green malt. The equipment contains a tank (2) in which the grains can be immersed in an aqueous solution and continuously aerated. The equipment contains an inlet for grains of grain crops (1), a reservoir, for example, a soaking reservoir (2); gas inlets, for example through porous sinter stones (3); a pump, for example an air pump (4); outlet for grain grains (5); grain pump (6); equipment for finely crushing grains of grain crops, for example, a mill (7); inlet (8); a container, for example a mash container (9), and; outlet (10).
На фиг. 5 показаны активности α-амилазы (а), β-амилазы (b) и свободной предельной декстриназы (с), измеренные в зернах мутанта 2 (мутант) и в зернах сорта Paustian (эталон) во время солодования.In fig. 5 shows the activities of α-amylase (a), β-amylase (b) and free limiting dextrinase (c) measured in grains of mutant 2 (mutant) and in grains of the Paustian variety (reference) during malting.
На фиг. 6 показано содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в зернах мутанта 2 (мутант) и в сорт Paustian (эталон) в созревших зернах ячменя (0 день) и в зеленом солоде на 1, 2, 3, 4, 5, 6 дни, а также в обжаренном солоде (7 день).In fig. Figure 6 shows the content of (1,3;1,4)-β-glucans in the grains of mutant 2 (mutant) and the Paustian variety (standard) in ripened barley grains (day 0) and in green malt on days 1, 2, 3, 4 , 5, 6 days, as well as in roasted malt (7 day).
На фиг. 7 показана вязкость (мПа-с) фильтрованного сусла CW-3a, Paustian, CW-4 и Quench.In fig. Figure 7 shows the viscosity (mPa-s) of filtered wort CW-3a, Paustian, CW-4 and Quench.
Подробное описаниеDetailed description
Определения.Definitions.
Как используется в данном документе, неопределенный артикль а может означать один или несколько, в зависимости от контекста, в котором он используется.As used herein, the indefinite article a can mean one or more, depending on the context in which it is used.
Используемый в данном документе термин добавка относится к источникам богатого углеродом сырья, добавляемым во время приготовления пива. Добавкой может быть непророщенное зерно злаков, которое может быть измельчено вместе с пророщенными зернами, приготовленными согласно изобретению. Добавкой также может быть сироп, сахар или т.п.As used herein, the term additive refers to sources of carbon-rich raw materials added during the preparation of beer. The additive may be unsprouted cereal grains, which can be ground together with sprouted grains prepared according to the invention. The additive may also be syrup, sugar or the like.
Используемый в данном документе термин аминокислота относится к протеиногенной аминокислоте. Предпочтительно протеиногенные аминокислоты представляют собой одну из 20 аминокислот, кодируемых стандартным генетическим кодом. Одно- и трехбуквенные коды согласно номенклатуре IUPAC используются для названия аминокислот.As used herein, the term amino acid refers to a proteinogenic amino acid. Preferably, the proteinogenic amino acids are one of the 20 amino acids encoded by the standard genetic code. One- and three-letter codes according to IUPAC nomenclature are used to name amino acids.
Термин аминокислота, соответствующая X используется в данном документе для описания аминокислот данного полипептида (например, мутантного полипептида CsIF6) по отношению к аминокислотам эталонного полипептида (например, CsIF6 последовательности SEQ ID NO: 1). После выравнивания указанного полипептида с эталонным полипептидом аминокислота соответствует X, если она находится в том же положении, что и X в указанном выравнивании.The term amino acid corresponding to X is used herein to describe the amino acids of a given polypeptide (eg, a CsIF6 mutant polypeptide) relative to the amino acids of a reference polypeptide (eg, CsIF6 of SEQ ID NO: 1). After aligning said polypeptide with a reference polypeptide, an amino acid matches X if it is in the same position as X in said alignment.
- 3 045156- 3 045156
Термин амилоза относится к гомополимерам a-D-глюкозы. Амилоза имеет линейную молекулярную структуру, так как ее глюкозные звенья почти исключительно связаны а-1-4-гликозидными связями.The term amylose refers to homopolymers of a-D-glucose. Amylose has a linear molecular structure because its glucose units are almost exclusively linked by α-1-4 glycosidic bonds.
Термин амилопектин относится к гомополимерам a-D-глюкозы. Молекулы амилопектина содержат частые а-1-6-гликозидные связи. Это приводит к появлению точек ветвления в а-1-4-связанных глюкозных цепях, в результате чего образуются кластеры параллельных цепей через равные промежутки вдоль оси молекулы.The term amylopectin refers to homopolymers of a-D-glucose. Amylopectin molecules contain frequent α-1-6-glycosidic bonds. This leads to the appearance of branch points in α-1-4-linked glucose chains, resulting in the formation of clusters of parallel chains at regular intervals along the axis of the molecule.
Термин приблизительно при использовании в данном описании в отношении числовых значений предпочтительно означает ±10%, более предпочтительно ±5%, еще более предпочтительно ±1%.The term approximately when used herein in relation to numerical values preferably means ±10%, more preferably ±5%, even more preferably ±1%.
Термин ячмень применительно к процессу приготовления напитков на основе ячменя, таких как пиво, особенно когда он используется для описания процесса солодования, означает ядра ячменя. Во всех других случаях, если не указано иное, ячмень означает растение ячменя (Hordeum vulgare, L.), включая любую селекционную линию, сорт или разновидность сорта, тогда как часть растения ячменя может быть любой частью растения ячменя, например, любой тканью или любыми клетками.The term barley, when applied to the process of making barley-based beverages such as beer, especially when used to describe the malting process, refers to the kernels of barley. In all other cases, unless otherwise specified, barley means the barley plant (Hordeum vulgare, L.), including any breeding line, cultivar or variety, while a barley plant part may be any part of the barley plant, such as any tissue or any cells.
Используемый в данном документе термин ячменная мука относится к измельченным ядрам ячменя.As used herein, the term barley flour refers to ground barley kernels.
Зерновое растение, как определено в настоящем документе, является членом семейства растений Роасеае, культивируемых, главным образом, для их содержащих крахмал семян или ядер. Зерновые растения включают, но не ограничиваются ими, ячмень (Hordeum), пшеницу (Triticum), рис (Oryza), кукурузу (Zea), рожь (Secale), овес (Avena), сорго (Sorghum) и Triticale, гибрид пшеница-рожь.A cereal plant, as defined herein, is a member of the plant family Poaceae, cultivated primarily for its starchy seeds or kernels. Grain plants include, but are not limited to, barley (Hordeum), wheat (Triticum), rice (Oryza), corn (Zea), rye (Secale), oats (Avena), sorghum (Sorghum) and Triticale, a wheat-rye hybrid .
Используемый в данном документе термин заряженная аминокислота относится к аминокислотам с электрически заряженными боковыми цепями. Предпочтительно, заряженная аминокислота выбрана из группы, состоящей из Arg, His, Lys, Asp и Glu. Отрицательно заряженные аминокислоты предпочтительно выбраны из группы, состоящей из Asp и Glu.As used herein, the term charged amino acid refers to amino acids with electrically charged side chains. Preferably, the charged amino acid is selected from the group consisting of Arg, His, Lys, Asp and Glu. The negatively charged amino acids are preferably selected from the group consisting of Asp and Glu.
Используемый в данном документе термин росток относится к эмбриональному растущему зародышу, который виден во время фазы проращивания зерна злаков. Термин α-амилазаAs used herein, the term sprout refers to the embryonic growing embryo that is visible during the germination phase of a cereal grain. Term α-amylase
Используемый в данном документе термин DP относится к степени полимеризации и указывает на количество а-1,4-связанных единиц глюкозы в боковых цепях амилопектина. Таким образом, в качестве примера, DP3 относится к боковым цепям амилопектина, состоящим из последовательности трех а1,4-связанных единиц глюкозы. Аналогичным образом, DP-4 относится к боковым цепям амилопектина, состоящим из последовательности четырех а-1,4-связанных единиц глюкозы. Термин соотношение DP3:DP4 (1,3;1,4)-в-глюканов, как используется в данном описании, относится к соотношению боковых цепей амилопектина, состоящих из последовательности трех а-1,4-связанных единиц глюкозы, и боковых цепей амилопектина, состоящих из последовательности четырех а-1,4-связанных единиц глюкозы, в указанных (1,3;1,4)-в-глюканах. Соотношение DP3:DP4 может быть определено путем расщепления (1,3;1,4)-в-глюканов лихеназой с последующим количественным определением высвобожденных олигомеров DP3 и DP4, например, с помощью HPAEC-PAD. В частности, соотношение DP3:DP4 может быть определено, как описано в примере 3.As used herein, the term DP refers to the degree of polymerization and indicates the number of α-1,4-linked glucose units in the side chains of amylopectin. Thus, as an example, DP3 refers to the side chains of amylopectin, consisting of a sequence of three α1,4-linked glucose units. Similarly, DP-4 refers to the side chains of amylopectin, consisting of a sequence of four α-1,4-linked glucose units. The term DP3:DP4 (1,3;1,4)-β-glucan ratio, as used herein, refers to the ratio of amylopectin side chains, consisting of a sequence of three α-1,4-linked glucose units, and amylopectin side chains , consisting of a sequence of four α-1,4-linked glucose units, in the indicated (1,3;1,4)-β-glucans. The DP3:DP4 ratio can be determined by digestion of (1,3;1,4)-β-glucans with lichenase followed by quantification of the released DP3 and DP4 oligomers, for example, using HPAEC-PAD. In particular, the DP3:DP4 ratio can be determined as described in Example 3.
Под кодированием или кодированным в контексте указанной нуклеиновой кислоты подразумевается включение информации для трансляции в указанный белок. Нуклеиновая кислота или полинуклеотид, кодирующий белок, может содержать нетранслируемые последовательности, например, интроны, в транслирируемых областях нуклеиновой кислоты или может не иметь таких промежуточных нетранслируемых последовательностей, например, в кДНК. Информация, с помощью которой кодируется белок, определяется использованием кодонов.By encoding or encoded in the context of the specified nucleic acid is meant the inclusion of information for translation into the specified protein. A nucleic acid or polynucleotide encoding a protein may contain untranslated sequences, such as introns, in the translated regions of the nucleic acid, or may not have such intervening untranslated sequences, such as in cDNA. The information with which a protein is encoded is determined by the use of codons.
Используемый в данном документе термин экспрессия в контексте нуклеиновых кислот следует понимать как транскрипцию и накопление мРНК. Экспрессия, используемая в контексте белков, относится к трансляции мРНК в полипептид.As used herein, the term expression in the context of nucleic acids should be understood as the transcription and accumulation of mRNA. Expression, as used in the context of proteins, refers to the translation of mRNA into a polypeptide.
Термин ген означает сегмент ДНК, участвующий в продуцировании полипептидной цепи; он включает области, предшествующие кодирующей области и следующие за кодирующей областью (промотор и терминатор). Кроме того, гены растений обычно состоят из экзонов, прерываемых нитронами.The term gene means a segment of DNA involved in the production of a polypeptide chain; it includes the regions preceding the coding region and following the coding region (promoter and terminator). In addition, plant genes typically consist of exons interrupted by nitrons.
Используемый в данном документе термин проросшее зерно относится к зерну, имеющему видимый росток и видимый стебель.As used herein, the term sprouted grain refers to a grain that has a visible sprout and a visible stem.
Используемый в данном документе термин инициирование проращивания относится к моменту времени, когда зерна ячменя с содержанием воды менее 15% контактируют с достаточным количеством воды для инициирования проращивания.As used herein, the term germination initiation refers to the point in time when barley grains with less than 15% water content are contacted with sufficient water to initiate germination.
Используемый в данном документе термин β-глюканаза относится к ферментам, способным деполимеризировать зерновой β-глюкан. Соответственно, если не указано иное, термин β-глюканаза относится к эндо- или экзоферменту или их смеси, характеризующейся (1,3;1,4)-β- и/или (1,4)-βглюканазной активностью.As used herein, the term β-glucanase refers to enzymes capable of depolymerizing cereal β-glucan. Accordingly, unless otherwise specified, the term β-glucanase refers to an endo- or exoenzyme or mixture thereof characterized by (1,3;1,4)-β- and/or (1,4)-β-glucanase activity.
Содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в данном описании может быть определено любым применимым способом. Предпочтительно, содержание (1,3;1,4)-в-глюканов определяется как сумма содержа- 4 045156 ния олигомеров Glc-e-(1^4)-Glc-e-(1^3)-Glc (DP3) и Glc-e-(1^4)-Glc-e-(1^4)-Glc-e-(1^3)-Glc (DP4). Содержание олигомеров DP3 и DP4 можно, например, определить путем расщепления лихеназой (1,3;1,4)—в—глюканов с последующим количественным определением, например, высокоэффективной анионообменной хроматографией с импульсным амперометрическим детектированием (Highperformance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD)). Предпочтительно, содержание (1,3;1,4)-в-глюканов определяют, как описано ниже в примере 3.The content of (1,3;1,4)-β-glucans as used herein can be determined by any applicable method. Preferably, the content of (1,3;1,4)-β-glucans is determined as the sum of the content of Glc-e-(1^4)-Glc-e-(1^3)-Glc (DP3) oligomers Glc-e-(1^4)-Glc-e-(1^4)-Glc-e-(1^3)-Glc (DP4). The content of oligomers DP3 and DP4 can, for example, be determined by lichenase digestion of (1,3;1,4)-β-glucans followed by quantitative determination, for example, high performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection ( HPAEC-PAD)). Preferably, the content of (1,3;1,4)-β-glucans is determined as described below in Example 3.
Термин (1,3;1,4)-в-глюкансинтаза, как используется в данном документе, следует рассматривать как любой белок, который катализирует синтез (1,3;1,4)-в-глюканов и, необязательно, катализирует полимеризацию глюкопиранозильных мономеров. Например, (1,3;1,4)-в-глюкансинтаза может быть полипептидом, кодируемым геном CsIF или его функциональным гомологом.The term (1,3;1,4)-β-glucan synthase, as used herein, should be considered to mean any protein that catalyzes the synthesis of (1,3;1,4)-β-glucans and, optionally, catalyzes the polymerization of glucopyranosyl monomers. For example, (1,3;1,4)-β-glucan synthase may be a polypeptide encoded by the CsIF gene or a functional homologue thereof.
Термин ядро определяется как включающее зерновой кариопсис, также обозначаемый как внутреннее семя. Кроме того, ядро может содержать лемму и палеу. У большинства сортов ячменя лемма и палеа прилипают к кариопсису и являются частью ядра после обмолота. Однако, встречаются и голые сорта ячменя. В них кариопсис свободен от леммы и палеи и вымывается свободно, как в пшенице. Термины ядро и зерно используются здесь взаимозаменяемым образом.The term kernel is defined to include the grain karyopsis, also referred to as the inner seed. In addition, the core may contain a lemma and a paleu. In most barley varieties, the lemma and palea adhere to the karyopsis and are part of the kernel after threshing. However, naked varieties of barley are also found. In them, karyopsis is free from lemma and palea and is washed out freely, as in wheat. The terms kernel and grain are used interchangeably here.
Используемый в данном документе термин солодование относится к контролируемому проращиванию зерен злаков (в частности, зерен ячменя), происходящему в контролируемых условиях окружающей среды. В некоторых вариантах осуществления солодование может дополнительно включать стадию сушки указанных пророщенных зерен злаков, например, печной сушки.As used herein, the term malting refers to the controlled germination of cereal grains (particularly barley grains) occurring under controlled environmental conditions. In some embodiments, malting may further include the step of drying said germinated cereal grains, such as oven drying.
Используемый в данном документе термин зеленый солод относится к пророщенным зернам злаков, которые не подвергались стадии печной сушки. В целом указанные зерна злаков прорастали в контролируемых условиях окружающей среды. В некоторых вариантах осуществления зеленый солод представляет собой измельченный зеленый солод.As used herein, the term green malt refers to sprouted cereal grains that have not been kilned. In general, these cereal grains germinated under controlled environmental conditions. In some embodiments, the green malt is ground green malt.
Используемый в данном документе термин высушенный в печи солод относится к пророщенным зернам зерновых, которые были высушены печной сушкой. В целом, указанные зерна злаков прорастали в контролируемых условиях окружающей среды. В некоторых вариантах осуществления высушенный в печи солод представляет собой измельченный высушенный в печи солод.As used herein, the term kiln-dried malt refers to sprouted grain grains that have been kiln-dried. In general, these cereal grains germinated under controlled environmental conditions. In some embodiments, the kiln-dried malt is ground kiln-dried malt.
Затирание представляет собой инкубацию измельченного солода (например, зеленый солод или высушенный в печи солод) и/или непроросших зерен злаков в воде. Затирание предпочтительно проводится при определенной температуре(ах) и в определенном объеме воды.Mashing involves incubating ground malt (such as green malt or kiln-dried malt) and/or unsprouted cereal grains in water. Mashing is preferably carried out at a certain temperature(s) and in a certain volume of water.
Мутации включают делеции, вставки, замены, трансверсии и точечные мутации в кодирующих и некодирующих областях гена. Делеции могут быть всего гена или только части гена. Точечные мутации могут касаться изменений одной пары оснований и могут приводить в результате к преждевременным стоп-кодонам, мутациям со сдвигом рамки, мутации сайта сплайсинга или аминокислотным заменам. Ген, содержащий мутацию, может упоминаться как мутантный ген. Если указанный мутантный ген кодирует полипептид с последовательностью, отличной от дикого типа, указанный полипептид может упоминаться как мутантный полипептид.Mutations include deletions, insertions, substitutions, transversions, and point mutations in the coding and noncoding regions of the gene. Deletions can be of an entire gene or just part of a gene. Point mutations may involve single base pair changes and may result in premature stop codons, frameshift mutations, splice site mutations, or amino acid substitutions. The gene containing the mutation may be referred to as a mutant gene. If the specified mutant gene encodes a polypeptide with a sequence different from the wild type, the specified polypeptide may be referred to as a mutant polypeptide.
Термин измельченный относится к материалу (например, ядрам ячменя или солоду), который был тонко измельчен, например, путем резки, помола, измельчения или дробления. Ядра ячменя можно измельчать во влажном состоянии, например, с помощью измельчителя или мельницы мокрого помола. Измельченные ядра ячменя или измельченный солод достаточно тонко измельчены, чтобы сделать материал пригодным для водных экстрактов. Измельченные ядра ячменя или солод не могут быть регенерированы в целое растение по существу биологическими способами.The term milled refers to material (such as barley kernels or malt) that has been finely ground, such as by cutting, grinding, crushing or crushing. Barley kernels can be ground wet, for example using a chopper or wet grinder. Ground barley kernels or ground malt are ground sufficiently finely to make the material suitable for aqueous extracts. Ground barley kernels or malt cannot be regenerated into a whole plant by essentially biological means.
Используемый в данном документе термин неполярная аминокислота относится к аминокислотам с гидрофобными боковыми цепями. Предпочтительно, неполярная аминокислота выбрана из группы, состоящей из Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp и Gly, более предпочтительно из группы, состоящей из Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Trp и Gly.As used herein, the term nonpolar amino acid refers to amino acids with hydrophobic side chains. Preferably, the non-polar amino acid is selected from the group consisting of Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp and Gly, more preferably from the group consisting of Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Trp and Gly .
Под термином растительный продукт подразумевается продукт, полученный в результате обработки растения или растительного материала. Таким растительным продуктом может быть, например, зеленый солод, высушенный в печи солод, сусло, ферментированный или неферментированный напиток, пищевой продукт или кормовой продукт.The term plant product refers to the product obtained by processing a plant or plant material. Such a plant product may be, for example, green malt, kiln-dried malt, wort, fermented or non-fermented beverage, food product or feed product.
Используемый в данном документе термин полярная аминокислота относится к аминокислотам с полярными, незаряженными боковыми цепями. Предпочтительно, полярная аминокислота выбрана из группы, состоящей из Ser, Thr, Asn и Gln.As used herein, the term polar amino acid refers to amino acids with polar, uncharged side chains. Preferably, the polar amino acid is selected from the group consisting of Ser, Thr, Asn and Gln.
Используемый в данном документе термин потомство означает растение, которое прямо или косвенно является потомством данного растения. Таким образом, потомство не ограничивается прямым потомком, но также включает и потомков в многочисленных поколениях. Как правило, потомство растения ячменя, несущего специфическую мутацию, также несет данную специфическую мутацию. Таким образом, потомство растения ячменя, несущее специфическую мутацию в гене CsIF6, также несет данную специфическую мутацию.As used herein, the term progeny means a plant that is directly or indirectly the progeny of a given plant. Thus, offspring is not limited to direct descendants, but also includes descendants through numerous generations. Typically, the offspring of a barley plant that carries a specific mutation will also carry that specific mutation. Thus, the progeny of a barley plant that carries a specific mutation in the CsIF6 gene also carries this specific mutation.
Используемый в данном документе термин идентичность последовательности относится к %As used herein, the term sequence identity refers to %
- 5 045156 идентичных аминокислот или нуклеотидов между последовательностью-кандидатом и эталонной последовательностью после выравнивания. Таким образом, последовательность-кандидат, имеющая 80%-ную идентичность аминокислот с эталонной последовательностью, требует, чтобы, после выравнивания, 80% аминокислот в последовательности-кандидате были идентичны соответствующим аминокислотам в эталонной последовательности. Идентичность в соответствии с настоящим изобретением определяется с помощью компьютерного анализа, такого как, без ограничений, компьютерная программа выравнивания Clustal Omega для выравнивания полипептидных последовательностей (Sievers et al. (2011 October 11), Molecular Systems Biology, 7:539, PMID: 21988835; Li et al. (2015 April 06), Nucleic Acids Research, 43(W1):W580-4, PMID: 25845596; McWilliam et al. (2013 May 13), Nucleic Acids Research, 41 (Web Server issue):W597-600, PMD: 23671338 и предлагаемые в ней параметры по умолчанию. Программное обеспечение Clustal Omega доступно на веб-сайте EMBL-EBI по адресу https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/. При использовании данной программы с настройками по умолчанию, зрелая (биоактивная) часть запроса и эталонный полипептид выравниваются. Число полностью консервативных остатков подсчитывается и делится на длину эталонного полипептида. Для выравнивания нуклеотидных последовательностей могут быть использованы алгоритмы MUSCLE или MAFFT. Идентичности последовательностей можно рассчитывать аналогично тому, как указано для аминокислотных последовательностей. Таким образом, идентичность последовательности, обеспеченная в данном документе, рассчитывается по всей длине эталонной последовательности.- 5,045,156 identical amino acids or nucleotides between the candidate sequence and the reference sequence after alignment. Thus, a candidate sequence having 80% amino acid identity with a reference sequence requires that, after alignment, 80% of the amino acids in the candidate sequence are identical to the corresponding amino acids in the reference sequence. Identity in accordance with the present invention is determined using computer analysis, such as, without limitation, the Clustal Omega computer alignment program for polypeptide sequence alignment (Sievers et al. (2011 October 11), Molecular Systems Biology, 7:539, PMID: 21988835; Li et al. (2015 April 06), Nucleic Acids Research, 43(W1):W580-4, PMID: 25845596; McWilliam et al. (2013 May 13), Nucleic Acids Research, 41 (Web Server issue):W597- 600, PMD: 23671338 and the default parameters it offers.Clustal Omega software is available on the EMBL-EBI website at https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/. When using this program With default settings, the mature (bioactive) part of the query and the reference polypeptide are aligned.The number of completely conserved residues is counted and divided by the length of the reference polypeptide.The MUSCLE or MAFFT algorithms can be used to align nucleotide sequences. Sequence identities can be calculated in a similar manner as indicated for amino acid sequences. Thus, the sequence identity provided herein is calculated over the entire length of the reference sequence.
Используемый в данном документе термин крахмал относится к композиции одной или обеих дискретных макромолекул: амилозы и амилопектина.As used herein, the term starch refers to the composition of one or both of the discrete macromolecules amylose and amylopectin.
Используемый в данном документе термин замачивание относится к процессу увеличения содержания воды злакового ядра.As used herein, the term soaking refers to the process of increasing the water content of the cereal kernel.
Используемый в данном документе термин содержание воды зерна относится к % H2O мас./мас., в указанном зерне.As used herein, the term grain water content refers to the % H 2 O w/w in said grain.
Используемый в данном документе термин CsIF6 дикого типа относится к гену, кодирующему полипептид последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3.As used herein, the term wild-type CsIF6 refers to a gene encoding a polypeptide of the sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
Ферментативные активности злаковых зерен в контексте настоящего описания относятся к активностям, измеренным в муке, приготовленной из указанного типа зерна. Например, 10 ед./г активности β-амилазы на грамм злакового зерна относятся к указанной активности β-амилазы (10 ед.), измеренной в водном экстракте, полученном из 1 г муки (сухого вещества) из указанного зерна. Активность α-амилазы определяют с помощью K-CERA 01/12 (протокол и набор доступны от Megazyme, Ирландия). Активность β-амилазы определяют с помощью К-ВЕТАЗ (протокол и набор доступны от Megazyme, Ирландия). Активность предельной декстриназы определяют с помощью T-LDZ1OOO (протокол и набор доступны от Megazyme, Ирландия).Enzymatic activities of cereal grains in the context of the present description refer to the activities measured in flour prepared from the specified type of grain. For example, 10 U/g β-amylase activity per gram of cereal grain refers to the specified β-amylase activity (10 U) measured in an aqueous extract obtained from 1 g of flour (dry matter) from said grain. α-Amylase activity was determined using K-CERA 01/12 (protocol and kit available from Megazyme, Ireland). β-Amylase activity was determined using K-BETASE (protocol and kit available from Megazyme, Ireland). Limiting dextrinase activity was determined using T-LDZ1OOO (protocol and kit available from Megazyme, Ireland).
Объем газа, указанный в данном документе, относится к объему указанного газа при 1 атм и 20°С.The volume of gas indicated in this document refers to the volume of the specified gas at 1 atm and 20°C.
Объем О2, как указано в данном документе, относится к объему O2 при 1 атм и 20°С. В вариантах осуществления изобретения, где O2 содержится в смеси газов, тогда может быть определен общий объем газовой смеси, и объем O2 может быть рассчитан как процент от общего объема, составляющий O2. Например, атмосферный воздух содержит 21% O2. Таким образом, объем O2 в атмосферном воздухе, используемый в данном документе, составляет 21% от общего объема атмосферного воздуха.The volume of O 2 as defined herein refers to the volume of O 2 at 1 atm and 20°C. In embodiments of the invention where O2 is contained in a mixture of gases, then the total volume of the gas mixture can be determined, and the volume of O2 can be calculated as the percentage of the total volume that is O2. For example, atmospheric air contains 21% O 2 . Thus, the volume of O 2 in ambient air used in this document is 21% of the total volume of ambient air.
Под термином сусло подразумевается жидкий экстракт солода и/или злаковых ядер, таких как измельченный солод и/или измельченные злаковые ядра и необязательно дополнительные добавки. Сусло, как правило, получают путем затирания, необязательно с последующим барботированием, в процессе извлечения остаточных Сахаров и других соединений из отработанного зерна после затирания горячей водой. Барботирование, как правило, проводят в барабане-отстойнике, фильтре для затирания или в другом устройстве, чтобы обеспечить отделение извлеченной воды от отработанного зерна. Сусло, приготовленное после затирания, обычно называют первым суслом, тогда как сусло, приготовленное после барботирования, обычно называют вторым суслом. Если не указано, термин сусло может быть первым суслом, вторым суслом или их комбинацией. При обычном производстве пива сусло варят вместе с хмелем. Сусло без хмеля может также упоминаться как сладкое сусло, тогда как сусло, сваренное с хмелем, может упоминаться как вареное сусло или просто как сусло.By the term wort is meant a liquid extract of malt and/or cereal kernels, such as ground malt and/or ground cereal kernels and optionally additional additives. Wort is typically produced by mashing, optionally followed by sparging, the process of extracting residual sugars and other compounds from the spent grain after mashing with hot water. Sparging is typically done in a settling drum, mash screen, or other device to ensure that the recovered water is separated from the spent grain. The wort prepared after mashing is usually called the first wort, while the wort prepared after sparging is usually called the second wort. If not specified, the term wort may be first wort, second wort, or a combination thereof. In conventional beer production, the wort is boiled together with hops. Wort without hops may also be referred to as sweet wort, while wort brewed with hops may be referred to as boiled wort or simply wort.
CsIF6.CsIF6.
Настоящее изобретение обеспечивает растение ячменя или его часть, где ядро указанного растения ячменя имеет пониженное содержание (1,3;1,4)-в-глюканов и где указанное растение ячменя несет мутацию в гене CsIF6, причем указанный мутированный ген CsIF6 кодирует мутантный полипептид CsIF6.The present invention provides a barley plant or a portion thereof, wherein the core of said barley plant has a reduced content of (1,3;1,4)-β-glucans and wherein said barley plant carries a mutation in a CsIF6 gene, wherein said mutated CsIF6 gene encodes a mutant CsIF6 polypeptide .
Последовательность полной кодирующей последовательности целлюлозосинтазаподобного гена CsIF6 (CsIF6) дикого типа из сорта Sloop ячменя Hordeum vulgare представлена здесь как SEQ ID NO: 2.The complete coding sequence of the wild-type cellulose synthase-like gene CsIF6 (CsIF6) from the barley cultivar Sloop Hordeum vulgare is provided here as SEQ ID NO: 2.
Последовательность последовательности целлюлозосинтазаподобного полипептида CsIF6 дикого типа из сорта Sloop ячменя Hordeum vulgare представлена здесь как SEQ ID NO: 1. В дополнение к последовательности, представленной здесь как SEQ ID NO: 1, полипептид CsIF6 дикого типа также может нести полиморфизм А590Т (Taketa et al. (2012)). Соответственно CsIF6 полипептид дикого типа такжеThe sequence sequence of the wild-type cellulose synthase-like polypeptide CsIF6 from the barley cultivar Sloop Hordeum vulgare is presented here as SEQ ID NO: 1. In addition to the sequence presented here as SEQ ID NO: 1, the wild-type CsIF6 polypeptide can also carry the A590T polymorphism (Taketa et al. (2012)). Accordingly, the wild-type CsIF6 polypeptide is also
- 6 045156 может иметь последовательность, представленную в настоящем описании как SEQ ID NO: 3.- 6045156 may have the sequence shown herein as SEQ ID NO: 3.
Несмотря на предпринятые исследователями значительные усилия, конкретные функции отдельных генов CsI в значительной степени неизвестны. Гены CsI были подразделены на восемь групп, обозначенных от CsIA до CsIH. В соответствии с настоящим изобретением было обнаружено, что (1,3;1,4)-βглюкансинтазы кодируются членами семейства гена CsIF.Despite considerable research efforts, the specific functions of individual CsI genes are largely unknown. The CsI genes were classified into eight groups, designated CsIA to CsIH. In accordance with the present invention, it has been discovered that (1,3;1,4)-β-glucan synthases are encoded by members of the CsIF gene family.
Растение ячменя, несущее мутацию в гене CsIF6.A barley plant carrying a mutation in the CsIF6 gene.
Настоящее изобретение обеспечивает растение ячменя или его часть, где ядро указанного растения ячменя имеет пониженное содержание (1,3;1,4)-в-глюканов, где указанное растение ячменя несет мутацию в гене CsIF6 и где указанный мутированный ген CsIF6 кодирует мутантный полипептид CsIF6. Мутация в гене CsIF6 может представлять собой любую из мутаций, описанных в данном документе, однако, в предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения мутация представляет собой точечную мутацию в кодирующей области гена CsIF6.The present invention provides a barley plant or part thereof, wherein the core of said barley plant has a reduced content of (1,3;1,4)-β-glucans, wherein said barley plant carries a mutation in a CsIF6 gene, and wherein said mutated CsIF6 gene encodes a mutant CsIF6 polypeptide . The mutation in the CsIF6 gene may be any of the mutations described herein, however, in preferred embodiments of the present invention, the mutation is a point mutation in the coding region of the CsIF6 gene.
Мутантный полипептид CsIF6, кодируемый указанным мутантным геном CsIF6, может представлять собой любой мутантный полипептид CsIF6, однако, предпочтительно указанный мутантный полипептид CsIF6 содержит одно аминокислотное замещение.The mutant CsIF6 polypeptide encoded by said mutant CsIF6 gene may be any mutant CsIF6 polypeptide, however, preferably said mutant CsIF6 polypeptide contains a single amino acid substitution.
В частности, мутантный полипептид CsIF6 может включать замену одной аминокислоты в локализованном в мембране домене CsIF6. Мутантный полипептид CsIF6 может предпочтительно включать одно или несколько из следующих замещений в локализованном в мембране домене:In particular, a mutant CsIF6 polypeptide may involve a single amino acid substitution in the membrane-localized domain of CsIF6. The mutant CsIF6 polypeptide may preferably include one or more of the following substitutions in the membrane-localized domain:
замещение неполярной аминокислоты на заряженную аминокислоту; и замещение полярной аминокислоты на неполярную аминокислоту.substitution of a non-polar amino acid with a charged amino acid; and replacing a polar amino acid with a non-polar amino acid.
Используемые в данном документе термины замещение аминокислоты XX на аминокислоту YY или замещение аминокислоты XX аминокислотой YY относятся к аминокислоте XX в эталонной последовательности (обычно последовательность CsIF6 дикого типа), заменяемой аминокислотой YY.As used herein, the terms substitution of amino acid XX for amino acid YY or substitution of amino acid XX for amino acid YY refers to amino acid XX in the reference sequence (typically the wild-type CsIF6 sequence) being replaced by amino acid YY.
В одном варианте осуществления изобретения мутантный полипептид CsIF6 может включать замену одной аминокислоты в одном из локализованных в мембране доменов CsIF6. Локализованные в мембране домены CsIF6 показаны в данном документе в табл. 3.In one embodiment of the invention, the mutant CsIF6 polypeptide may include a single amino acid substitution in one of the membrane-localized domains of CsIF6. The membrane-localized domains of CsIF6 are shown herein in Table. 3.
В одном варианте осуществления изобретения мутантный полипептид CsIF6 может включать замену неполярной аминокислоты на заряженную аминокислоту в одном или более из следующих локализованных в мембране доменов CsIF6: аминокислоты от 109 до 128, от 137 до 158, от 700 до 731, от 741 до 758, от 835 до 857 и от 864 до 882 в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3.In one embodiment of the invention, the mutant CsIF6 polypeptide may include the replacement of a non-polar amino acid with a charged amino acid in one or more of the following membrane-localized domains of CsIF6: amino acids 109 to 128, 137 to 158, 700 to 731, 741 to 758, 835 to 857 and 864 to 882 in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
В одном варианте осуществления изобретения растение ячменя несет мутацию в гене CsIF6, что приводит в результате к мутантному гену CsIF6, кодирующему мутантный полипептид CsIF6, включающий замещение, причем замещением может быть замещение неполярной аминокислоты на заряженную аминокислоту, в одном или более из следующих локализованных в мембране доменов CsIF6: аминокислоты от 109 до 128, от 137 до 158, от 700 до 731, от 741 до 758, от 835 до 857 и от 864 до 882 последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3.In one embodiment of the invention, the barley plant carries a mutation in the CsIF6 gene, resulting in a mutant CsIF6 gene encoding a mutant CsIF6 polypeptide comprising a substitution, wherein the substitution may be a substitution of a non-polar amino acid with a charged amino acid, in one or more of the following membrane-localized CsIF6 domains: amino acids 109 to 128, 137 to 158, 700 to 731, 741 to 758, 835 to 857 and 864 to 882 sequences SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
В одном варианте осуществления мутантный полипептид CsIF6 может представлять собой CsIF6 с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 за исключением того, что мутантный CsIF6 содержит замену одной аминокислоты в трансмембранном домене, состоящем из аминокислот от 835 до 857 из CsIF6, где указанная замена представляет собой замещение неполярной аминокислоты на заряженную аминокислоту. Указанная неполярная аминокислота может, например, представлять собой любую из аминокислот от 835 до 857, которые подчеркнуты в табл. 3. Например, указанная замена может представлять собой замещение неполярной аминокислоты на отрицательно заряженную аминокислоту.In one embodiment, the mutant CsIF6 polypeptide may be CsIF6 of the sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 except that the mutant CsIF6 contains a single amino acid substitution in the transmembrane domain consisting of amino acids 835 to 857 of CsIF6, where this substitution is the replacement of a non-polar amino acid with a charged amino acid. Said non-polar amino acid may, for example, be any of amino acids 835 to 857, which are underlined in the table. 3. For example, the substitution may be a substitution of a non-polar amino acid with a negatively charged amino acid.
Например, мутантный полипептид CsIF6 может представлять собой CsIF6 с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 за исключением того, что мутантный CsIF6 содержит замену аминокислоты 847 на заряженную аминокислоту. Например, указанная замена может представлять собой замещение глицина (G) в положении 847 на отрицательно заряженную аминокислоту, например, Glu или Asp.For example, a mutant CsIF6 polypeptide may be CsIF6 of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 except that the mutant CsIF6 contains a substitution of amino acid 847 for a charged amino acid. For example, the substitution may be a substitution of glycine (G) at position 847 with a negatively charged amino acid, such as Glu or Asp.
Предпочтительно мутантный полипептид CsIF6 может представлять собой CsIF6 с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 за исключением того, что мутантный CsIF6 содержит замену аминокислоты 847, где указанная замена представляет собой замещение глицина (G) в положении 847 на глутаминовую кислоту. (Е).Preferably, the mutant CsIF6 polypeptide may be CsIF6 of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 except that the mutant CsIF6 contains a substitution at amino acid 847, wherein the substitution is a substitution of glycine (G) at position 847 with glutamic acid. (E).
В одном варианте осуществления мутантный полипептид CsIF6 может представлять собой CsIF6 с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 за исключением того, что мутантный CsIF6 содержит замену одной аминокислоты в трансмембранном домене, состоящем из аминокислот от 741 до 758 из CsIF6, где замена представляет собой замещение неполярной аминокислоты на заряженную аминокислоту. Указанная неполярная аминокислота может, например, представлять собой любую из аминокислот от 741 до 758, которые подчеркнуты в табл. 3. Например, указанная замена может представлять собой замещение неполярной аминокислоты на отрицательно заряженную аминокислоту.In one embodiment, the mutant CsIF6 polypeptide may be CsIF6 of the sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 except that the mutant CsIF6 contains a single amino acid substitution in the transmembrane domain consisting of amino acids 741 to 758 of CsIF6, wherein a substitution is the replacement of a nonpolar amino acid with a charged amino acid. Said non-polar amino acid may, for example, be any of amino acids 741 to 758, which are underlined in the table. 3. For example, the substitution may be a substitution of a non-polar amino acid with a negatively charged amino acid.
Например, мутантный полипептид CsIF6 может представлять собой CsIF6 с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 за исключением того, что мутантный CsIF6 содержит замену аминокислоты 748 на заряженную аминокислоту. Например, указанная замена может представлять собой замеще- 7 045156 ние глицина (G) в положении 748 на отрицательно заряженную аминокислоту, например, Glu или Asp. Предпочтительно мутантный полипептид CsIF6 может представлять собой CsIF6 с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 за исключением того, что мутантный CsIF6 содержит замену аминокислоты 748, где указанная замена представляет собой замещение глицина (G) в положении 748 на аспарагиновую кислоту (D). Таким образом, растение ячменя может нести мутированный ген HvCsIF6, кодирующий мутантный белок HvCsIF6, содержащий Gly^Asp мутацию аминокислоты 748 в SEQ ID NO: 1.For example, a mutant CsIF6 polypeptide may be CsIF6 of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 except that the mutant CsIF6 contains a substitution of amino acid 748 for a charged amino acid. For example, the substitution may be a substitution of glycine (G) at position 748 with a negatively charged amino acid such as Glu or Asp. Preferably, the mutant CsIF6 polypeptide may be CsIF6 of the sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 except that the mutant CsIF6 contains a substitution at amino acid 748, wherein said substitution is a substitution of glycine (G) at position 748 with aspartic acid ( D). Thus, a barley plant may carry a mutated HvCsIF6 gene encoding a mutant HvCsIF6 protein containing a Gly^Asp mutation at amino acid 748 in SEQ ID NO: 1.
В одном варианте осуществления изобретения растение ячменя может нести Gly^Asp мутацию нуклеотида 2243 в кодирующей последовательности гена HvCsIF6 (SEQ ID NO: 2).In one embodiment of the invention, a barley plant may carry a Gly^Asp mutation at nucleotide 2243 in the coding sequence of the HvCsIF6 gene (SEQ ID NO: 2).
В одном варианте осуществления мутантный полипептид CsIF6 может включать замену одной аминокислоты в любом локализованном в мембране домене полипептида CsIF6. Например, замена может представлять собой замещение полярной аминокислоты на неполярную аминокислоту в одном или нескольких следующих локализованных в мембране доменах CsIF6: аминокислоты от 109 до 128, от 137 до 158, от 700 до 731, от 741 до 758, от 835 до 857 и от 864 до 882 в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3.In one embodiment, the mutant CsIF6 polypeptide may include a single amino acid substitution in any membrane-localized domain of the CsIF6 polypeptide. For example, the substitution may be a substitution of a polar amino acid for a nonpolar amino acid in one or more of the following membrane-localized domains of CsIF6: amino acids 109 to 128, 137 to 158, 700 to 731, 741 to 758, 835 to 857, and 864 to 882 in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
Мутантный полипептид CsIF6 может представлять собой CsIF6 с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 за исключением того, что мутантный CsIF6 содержит замену одной аминокислоты в трансмембранном домене, состоящем из аминокислот от 700 до 731 из CsIF6, где указанная замена представляет собой замещение полярной аминокислоты на неполярную аминокислоту. Указанная полярная аминокислота может, например, представлять собой любую из аминокислот от 700 до 731, что подчеркнуто в табл. 3.The mutant CsIF6 polypeptide may be CsIF6 of the sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 except that the mutant CsIF6 contains a single amino acid substitution in the transmembrane domain consisting of amino acids 700 to 731 of CsIF6, wherein said substitution is replacement of a polar amino acid with a non-polar amino acid. Said polar amino acid may, for example, be any of amino acids 700 to 731, as highlighted in Table. 3.
Например, мутантный полипептид CsIF6 может представлять собой CsIF6 с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 за исключением того, что мутантный CsIF6 содержит замену аминокислоты 709 на неполярную аминокислоту.For example, a mutant CsIF6 polypeptide may be CsIF6 of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 except that the mutant CsIF6 contains a substitution of amino acid 709 for a nonpolar amino acid.
Предпочтительно мутантный полипептид CsIF6 может представлять собой CsIF6 с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 за исключением того, что мутантный CsIF6 содержит замену аминокислоты 709, где указанная замена представляет собой замещение треонина (Т) в положении 709 на изолейцин (I).Preferably, the mutant CsIF6 polypeptide may be CsIF6 of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 except that the mutant CsIF6 contains a substitution at amino acid 709, wherein said substitution is a substitution of threonine (T) at position 709 for isoleucine (I ).
Для целей настоящей заявки на патент семена растения ячменя (Hordeum vulgare), обозначенные как мутант 2, были депонированы в NCIMB Ltd. Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA Scotland в соответствии с положениями Будапештского договора. Растение ячменя мутант 2 был депонировано 12 ноября 2018 г. и получило регистрационный номер NCIMB 43273.For the purposes of this patent application, seeds of a barley plant (Hordeum vulgare), designated mutant 2, have been deposited with NCIMB Ltd. Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA Scotland in accordance with the provisions of the Treaty of Budapest. Barley plant mutant 2 was deposited on November 12, 2018 and received NCIMB accession number 43273.
В одном варианте осуществления изобретения растение ячменя по настоящему изобретению представляет собой растение ячменя (Hordeum vulgare), депонированное 12 октября 2018 г. в NCIMB под номером NCIMB 43273, и упоминается как мутант 2; или его потомство. Таким образом, растение ячменя по настоящему изобретению может представлять собой растение ячменя мутант 2, депонированное в NCIMB 12 октября 2018 г. и имеющее регистрационный номер NCIMB 43273, или любое растение ячменя, являющееся его потомством, где растение ячменя несет Gly^Asp мутацию нуклеотида 2243 кодирующей последовательности гена HvCsIF6 (SEQ ID NO: 2) и/или где ген HvCsIF6 из указанного растения ячменя кодирует мутантный белок HvCsIF6, содержащий Gly^Asp мутацию аминокислоты 748 в SEQ ID NO: 1.In one embodiment, the barley plant of the present invention is a barley plant (Hordeum vulgare) deposited on October 12, 2018 in NCIMB under NCIMB number 43273, and is referred to as mutant 2; or his offspring. Thus, the barley plant of the present invention may be a barley plant mutant 2 deposited with NCIMB on October 12, 2018 and having NCIMB accession number 43273, or any barley plant progeny thereof, where the barley plant carries the Gly^Asp nucleotide 2243 mutation the coding sequence of the HvCsIF6 gene (SEQ ID NO: 2) and/or wherein the HvCsIF6 gene from said barley plant encodes a mutant HvCsIF6 protein containing a Gly^Asp mutation at amino acid 748 in SEQ ID NO: 1.
Интересно, что растение ячменя, несущее мутацию в гене CsIF6, ведущую в результате к мутантному гену CsIF6, кодирующему мутантный полипептид CsIF6, несущий мутацию за пределами локализованных в мембране аминокислот (G732D), не показало какого-либо значительного снижения содержания (1,3;1,4)-в-глюканов. В растении ячменя, содержащем мутацию в гене CsIF6, ведущую в результате к преждевременному стоп-кодону (T676Stop), уровни (1,3;1,4)-в-глюканов были чрезвычайно низкими, и такие растения ячменя не обладали хорошими агрономическими свойствами. Таким образом, такие растения характеризовались значительно сниженными плодовитостью и растительным ростом.Interestingly, a barley plant carrying a mutation in the CsIF6 gene resulting in a mutant CsIF6 gene encoding a mutant CsIF6 polypeptide carrying a mutation beyond the membrane-localized amino acids (G732D) did not show any significant reduction in (1.3; 1,4)-β-glucans. In barley plants containing a mutation in the CsIF6 gene resulting in a premature stop codon (T676Stop), levels of (1,3;1,4)-β-glucans were extremely low and such barley plants did not have good agronomic properties. Thus, such plants were characterized by significantly reduced fertility and plant growth.
Растение ячменя.Barley plant.
Растение ячменя по изобретению может представлять собой любое растение вида Hordeum vulgare, включая любую селекционную линию, сорт или разновидность сорта.The barley plant of the invention may be any plant of the species Hordeum vulgare, including any breeding line, variety or variety of variety.
Дикий ячмень, Hordeum vulgare ssp. spontaneum, считается прародителем современных культивируемых форм ячменя. Одомашненные, но неоднородные смеси ячменя называются местными сортами ячменя. В настоящее время, большинство местных сортов были вытеснены в передовых земледельческих хозяйствах чистыми линейными сортами. По сравнению с местными сортами, современные сорта ячменя обладают множеством улучшенных свойств (Nevo, 1992; Pelger et al., 1992).Wild barley, Hordeum vulgare ssp. spontaneum, is considered the progenitor of modern cultivated forms of barley. Domesticated but heterogeneous mixtures of barley are called local barley varieties. Currently, most local varieties have been replaced in advanced farming by pure linear varieties. Compared to local varieties, modern barley varieties have many improved properties (Nevo, 1992; Pelger et al., 1992).
В рамках настоящего изобретения термин растение ячменя включает любое растение ячменя, такое как местные сорта ячменя или современные сорта ячменя. Таким образом, изобретение относится к любому растению ячменя, содержащему мутацию в гене CsIF6.For the purposes of the present invention, the term barley plant includes any barley plant, such as landraces of barley or modern varieties of barley. Thus, the invention relates to any barley plant containing a mutation in the CsIF6 gene.
Однако предпочтительными растениями ячменя для использования в настоящем изобретении являются современные сорта ячменя или чистые линии. Сорт ячменя, используемый в настоящем изобретении, может быть выбран, например, из группы, состоящей изHowever, preferred barley plants for use in the present invention are modern barley varieties or pure lines. The barley variety used in the present invention may be selected, for example, from the group consisting of
- 8 045156- 8 045156
Paustian, Sebastian, Quench, Celeste, Lux, Prestige, Saloon, Neruda,Paustian, Sebastian, Quench, Celeste, Lux, Prestige, Saloon, Neruda,
Harrington, Klages, Manley, Schooner, Stirling, Clipper, Franklin, Alexis, Blenheim, Ariel, Lenka, Maresi, Steffi, Gimpel, Cheri, Krona, Camargue, Chariot, Derkado, Prisma, Union, Века, Kym, Asahi 5, KOU A, Swan Hals, Kanto Nakate Gold, Hakata No. 2, Kirin - choku No. 1, Kanto late Variety Gold, Fuji Nijo, New Golden, SatukioNijo, SeijoNo. 17, Akagi Nijo, Azuma Golden, Amagi Nijpo, Nishino Gold, Misato golden, Haruna Nijo, Scarlett, Rosalina и Jersey, предпочтительно из группы, состоящей изHarrington, Klages, Manley, Schooner, Stirling, Clipper, Franklin, Alexis, Blenheim, Ariel, Lenka, Maresi, Steffi, Gimpel, Cheri, Krona, Camargue, Chariot, Derkado, Prisma, Union, Century, Kym, Asahi 5, KOU A, Swan Hals, Kanto Nakate Gold, Hakata No. 2, Kirin - choku No. 1, Kanto late Variety Gold, Fuji Nijo, New Golden, SatukioNijo, SeijoNo. 17, Akagi Nijo, Azuma Golden, Amagi Nijpo, Nishino Gold, Misato golden, Haruna Nijo, Scarlett, Rosalina and Jersey, preferably from the group consisting of
HarunaNijo, Sebastian, Quench, Celeste, Lux, Prestige, Saloon, Neruda and Power, предпочтительно из группы, состоящей изHarunaNijo, Sebastian, Quench, Celeste, Lux, Prestige, Saloon, Neruda and Power, preferably from a group consisting of
Paustian, Harrington, Klages, Manley, Schooner, Stirling, Clipper, Franklin, Alexis, Blenheim,Paustian, Harrington, Klages, Manley, Schooner, Stirling, Clipper, Franklin, Alexis, Blenheim,
Ariel, Lenka, Maresi, Steffi, Gimpel, Cheri, Krona, Camargue, Chariot, Derkado, Prisma, Union, Века, Kym, Asahi 5, KOU A, Swan Hals, Kanto Nakate Gold, Hakata No. 2, Kirin choku No. 1, Kanto late Variety Gold, Fuji Nijo, New Golden, Satukio Nijo, Seijo No. 17, Akagi Nijo, Azuma Golden, Amagi Nijpo, Nishino Gold, Misato golden, Haruna Nijo, Scarlett and Jersey, предпочтительно из группы, состоящей из Paustian, Haruna Nijo, Sebastian,Ariel, Lenka, Maresi, Steffi, Gimpel, Cheri, Krona, Camargue, Chariot, Derkado, Prisma, Union, Century, Kym, Asahi 5, KOU A, Swan Hals, Kanto Nakate Gold, Hakata No. 2, Kirin choku No. 1, Kanto late Variety Gold, Fuji Nijo, New Golden, Satukio Nijo, Seijo No. 17, Akagi Nijo, Azuma Golden, Amagi Nijpo, Nishino Gold, Misato golden, Haruna Nijo, Scarlett and Jersey, preferably from the group consisting of Paustian, Haruna Nijo, Sebastian,
Tangent, Lux, Prestige, Saloon, Neruda, Power, Quench, NFC Tipple, Barke, Class, Vintage,Tangent, Lux, Prestige, Saloon, Neruda, Power, Quench, NFC Tipple, Barke, Class, Vintage,
Applaus, Bowie, Broadway, Champ, Chanson, Charles, Chimbon, Cosmopolitan, Crossway, Dragoon, Ellinor, Embrace, Etoile, Evergreen, Flair, Highway, KWS Beckie, KWS Cantton, KWS Coralie, KWS Fantex, KWS Irina, KWS Josie, KWS Kellie, LG Diablo, LG Figaro, LG Nabuco, LG Tomahawk, Laureate, Laurikka, Lauxana, Luther, Odyssey, Ovation, Prospect, RGT Elysium, RGT Observer, RGT Planet, Rotator, Sarbi, Scholar, Subway и Golden Promise.Applaus, Bowie, Broadway, Champ, Chanson, Charles, Chimbon, Cosmopolitan, Crossway, Dragoon, Ellinor, Embrace, Etoile, Evergreen, Flair, Highway, KWS Beckie, KWS Cantton, KWS Coralie, KWS Fantex, KWS Irina, KWS Josie, KWS Kellie, LG Diablo, LG Figaro, LG Nabuco, LG Tomahawk, Laureate, Laurikka, Lauxana, Luther, Odyssey, Ovation, Prospect, RGT Elysium, RGT Observer, RGT Planet, Rotator, Sarbi, Scholar, Subway and Golden Promise.
Растение ячменя может быть в любой подходящей форме. Например, растение ячменя согласно изобретению может представлять собой жизнеспособное растение ячменя, высушенное растение, гомогенизированное растение или измельченное ядро ячменя. Растение может быть зрелым растением, зародышем, ядром, пророщенным ядром, солодовым ядром (например, в форме зеленого солода или высушенного в печи солода), измельченным солодовым ядром, измельченным ядром или т.п.The barley plant can be in any suitable form. For example, the barley plant of the invention may be a viable barley plant, a dried plant, a homogenized plant, or a ground barley kernel. The plant may be a mature plant, a bud, a kernel, a sprouted kernel, a malt kernel (eg, in the form of green malt or kiln-dried malt), milled malt kernel, crushed kernel, or the like.
Части растений ячменя могут представлять собой любую подходящую часть растения, такую как ядра, зародыши, листья, стебли, корни, цветы или их фракции. Фракция может представлять собой, например, часть ядра, эмбриона, листа, стебля, корня или цветка. Части растений ячменя также могут представлять собой фракцию гомогената или фракцию измельченного растения ячменя или ядра.The barley plant parts may be any suitable part of the plant, such as kernels, buds, leaves, stems, roots, flowers, or fractions thereof. The fraction may be, for example, part of a kernel, embryo, leaf, stem, root or flower. The barley plant parts may also be a homogenate fraction or a crushed barley plant or kernel fraction.
В одном варианте осуществления изобретения частями растений ячменя могут быть клетки указанного растения ячменя, такие как жизнеспособные клетки, которые могут размножаться in vitro в тканевых культурах. В других вариантах осуществления, однако, части растений ячменя могут быть жизнеспособными клетками, которые не способны созревать в целое растение ячменя, т.е. клетками, которые не являются репродуктивным материалом.In one embodiment of the invention, the barley plant parts may be cells of said barley plant, such as viable cells that can be propagated in vitro in tissue culture. In other embodiments, however, the barley plant parts may be viable cells that are unable to mature into a whole barley plant, i.e. cells that are not reproductive material.
Характеристики растений ячменя, несущих мутацию в CsIF6.Characteristics of barley plants carrying a mutation in CsIF6.
Изобретение обеспечивает растения ячменя, несущие мутацию в гене CsIF6. Одно из главных преимуществ таких растений ячменя является то, что ядра указанного растения ячменя имеют пониженное содержание (1,3;1,4)-в-глюканов.The invention provides barley plants carrying a mutation in the CsIF6 gene. One of the main advantages of such barley plants is that the kernels of said barley plant have a reduced content of (1,3;1,4)-β-glucans.
Одно преимущество, обеспечиваемое растениями ячменя, несущими мутацию в гене CsIF6 и имеющими пониженное содержание (1,3;1,4)-в-глюканов, является то, что более низкое содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в зерне может быть полезным в процессе пивоварения, так как может помочь обеспечить оптимальное количество Сахаров, доступное для дрожжевого брожения в конце затирания и, следовательно, уменьшить общую стоимость сырья. Другое преимущество, обеспечиваемое растениями ячменя, несущими мутацию в гене CsIF6 и имеющими пониженное содержание (1,3;1,4)-в-глюканов, является то, что растение ячменя с низким содержанием (1,3;1,4)-в-глюканов может улучшить промышленные процедуры, такие как фильтруемость. Кроме того, такие растения ячменя особенно полезны для энергосберегающих процессов солодования. В то время как снижение содержания (1,3;1,4)-в-глюканов может быть полезным, слишком низкие уровни содержание (1,3;1,4)-β-глюканов также могут быть проблематичными и могут привести к ухудшению агрономических свойств.One advantage provided by barley plants carrying a mutation in the CsIF6 gene and having a reduced content of (1,3;1,4)-β-glucans is that the lower content of (1,3;1,4)-β-glucans in grain can be beneficial in the brewing process as it can help ensure the optimal amount of Sugars is available for yeast fermentation at the end of the mash and therefore reduce the overall cost of raw materials. Another advantage provided by barley plants carrying a mutation in the CsIF6 gene and having a reduced content of (1,3;1,4)-β-glucans is that a barley plant with a low content of (1,3;1,4)-β -glucans can improve industrial procedures such as filterability. In addition, such barley plants are especially useful for energy-saving malting processes. While reducing (1,3;1,4)-β-glucans can be beneficial, too low levels of (1,3;1,4)-β-glucans can also be problematic and may lead to poor agronomic performance. properties.
Таким образом, в одном варианте осуществления растение ячменя, несущее мутацию в гене CsIF6, может представлять собой растение ячменя с ядрами, имеющими содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в диа- 9 045156 пазоне от 1 до 3% общей массы сухого вещества ядер.Thus, in one embodiment, a barley plant carrying a mutation in the CsIF6 gene may be a barley plant with kernels having a (1,3;1,4)-β-glucan content ranging from 1 to 3% total dry matter mass of kernels.
Растения ячменя по изобретению, несущие мутацию в гене CsIF6 и имеющие ядра с пониженным содержанием (1,3;1,4)-в-глюканов, дополнительно характеризуются хорошими агрономическими качествами, такими как агрономические качества, сравнимые с диким типом.Barley plants of the invention carrying a mutation in the CsIF6 gene and having kernels with a reduced content of (1,3;1,4)-β-glucans are additionally characterized by good agronomic qualities, such as agronomic qualities comparable to the wild type.
Растение ячменя может представлять собой растение ячменя с ядрами, имеющими содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в диапазоне от 1 до 5% общей массы сухого вещества ядер, например, от 1 до 3% общей массы сухого вещества ядер, такое как от 1,3 до 4% общей массы сухого вещества ядер, например, от 1,3 до 3% общей массы сухого вещества ядер, предпочтительно от 1,3 до 2% общей массы сухого вещества ядер.The barley plant may be a barley plant with kernels having a (1,3;1,4)-β-glucan content in the range of 1 to 5% of the total dry matter weight of the kernels, for example, from 1 to 3% of the total dry matter weight of the kernels , such as from 1.3 to 4% of the total dry matter weight of the kernels, for example from 1.3 to 3% of the total dry matter weight of the kernels, preferably from 1.3 to 2% of the total dry matter weight of the kernels.
В одном варианте осуществления растение ячменя может представлять собой растение ячменя, несущее мутацию в гене CsIF6 и кодирующее мутантный полипептид CsIF6, где полипептид CsIF6 представляет собой полипептид CsIF6 с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 за исключением того, что мутантный CsIF6 содержит замену одной аминокислоты в одном или нескольких из следующих локализованных в мембране доменов CsIF6: аминокислоты от 109 до 128, от 137 до 158, от 700 до 731, от 741 до 758, от 835 до 857 и от 864 до 882 в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3, где замена представляет собой замещение неполярной аминокислоты на заряженную аминокислоту или замещение полярной аминокислоты на неполярную аминокислоту и где ядра указанного растения ячменя могут иметь содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в диапазоне от 1,0 до 3,0% общей массы сухого вещества ядер, например, содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в диапазоне от 1,0 до 3,0% общей массы сухого вещества ядер, такое как содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в диапазоне от 1,0 до 2,5% общей массы сухого вещества ядер, предпочтительно содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в диапазоне от 1,0 до 2,0% общей массы сухого вещества ядер, например, содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в диапазоне от 1,3 до 3,0% общей массы сухого вещества ядер, такое как содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в диапазоне от 1,5 до 3,0% общей массы сухого вещества ядер, предпочтительно содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в диапазоне от 1,7 до 3,0% общей массы сухого вещества ядер.In one embodiment, the barley plant may be a barley plant carrying a mutation in the CsIF6 gene and encoding a mutant CsIF6 polypeptide, wherein the CsIF6 polypeptide is a CsIF6 polypeptide of the sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 except that the mutant CsIF6 contains a single amino acid substitution in one or more of the following membrane-localized domains of CsIF6: amino acids 109 to 128, 137 to 158, 700 to 731, 741 to 758, 835 to 857, and 864 to 882 in SEQ ID NO : 1 or SEQ ID NO: 3, wherein the substitution is a substitution of a non-polar amino acid for a charged amino acid or a substitution of a polar amino acid for a non-polar amino acid and wherein the kernels of said barley plant may have a (1,3;1,4)-β-glucan content in the range from 1.0 to 3.0% of the total dry matter weight of the kernels, for example, the content of (1,3;1,4)-β-glucans in the range from 1.0 to 3.0% of the total dry matter weight of the kernels, such as content of (1.3;1.4)-β-glucans in the range from 1.0 to 2.5% of the total mass of dry matter of the kernels, preferably the content of (1.3;1.4)-β-glucans in the range from 1 .0 to 2.0% of the total dry matter weight of the kernels, for example, the content of (1.3;1.4)-glucans in the range of 1.3 to 3.0% of the total dry matter weight of the kernels, such as the content of ( 1,3;1,4)-β-glucans in the range from 1.5 to 3.0% of the total dry matter weight of the kernels, preferably the content of (1,3;1,4)-β-glucans in the range from 1.7 up to 3.0% of the total mass of dry matter of kernels.
В одном варианте осуществления растение ячменя может представлять собой растение ячменя, несущее мутацию в гене CsIF6 и кодирующее мутантный полипептид CsIF6, где полипептид CsIF6 представляет собой полипептид CsIF6 с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 за исключением того, что мутантный CsIF6 содержит замену аминокислоты 847, где указанная замена представляет собой замещение глицина (G) на глутаминовую кислоту (Е), и ядра указанного растения ячменя могут иметь содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в диапазоне от 1,0 до 3,0% общей массы сухого вещества ядер, например, содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в диапазоне от 1,0 до 3,0% общей массы сухого вещества ядер, таких как содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в диапазоне от 1,0 до 2,5% общей массы сухого вещества ядер, предпочтительно содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в диапазоне от 1,0 до 2,0% общей массы сухого вещества ядер, например, содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в диапазоне от 1,3 до 3,0% общей массы сухого вещества ядер, такое как содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в диапазоне от 1,5 до 3,0% общей массы сухого вещества ядер, предпочтительно содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в диапазоне от 1,7 до 3,0% общей массы сухого вещества ядер.In one embodiment, the barley plant may be a barley plant carrying a mutation in the CsIF6 gene and encoding a mutant CsIF6 polypeptide, wherein the CsIF6 polypeptide is a CsIF6 polypeptide of the sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 except that the mutant CsIF6 contains a substitution at amino acid 847, wherein said substitution is a substitution of glycine (G) for glutamic acid (E), and the kernels of said barley plant may have a (1,3;1,4)-β-glucan content ranging from 1.0 to 3.0% of the total dry matter weight of the kernels, for example, the content of (1,3;1,4)-β-glucans in the range from 1.0 to 3.0% of the total dry matter weight of the kernels, such as the content of (1,3 ;1,4)-β-glucans in the range from 1.0 to 2.5% of the total dry matter weight of the kernels, preferably the content of (1,3;1,4)-β-glucans in the range from 1.0 to 2, 0% of the total dry matter weight of the kernels, for example, the content of (1,3;1,4)-β-glucans in the range of 1.3 to 3.0% of the total dry matter weight of the kernels, such as the content of (1,3;1 ,4)-β-glucans in the range from 1.5 to 3.0% of the total dry matter weight of the kernels, preferably the content of (1,3;1,4)-β-glucans in the range from 1.7 to 3.0% total dry matter mass of kernels.
В одном варианте осуществления растение ячменя может представлять собой растение ячменя, несущее мутацию в гене CsIF6 и кодирующее мутантный полипептид CsIF6, где полипептид CsIF6 представляет собой полипептид CsIF6 с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 за исключением того, что мутантный CsIF6 содержит замену аминокислоты 748, где указанная замена представляет собой замещение глицина (G) на аспарагиновую кислоту (D), и ядра указанного растения ячменя могут иметь содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в диапазоне от 1,0 до 3,0 общей массы сухого вещества ядер, например, содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в диапазоне от 1,0 до 3,0% общей массы сухого вещества ядер, таких как содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в диапазоне от 1,0 до 2,5% общей массы сухого вещества ядер, предпочтительно содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в диапазоне от 1,0 до 2,0% общей массы сухого вещества ядер, например, содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в диапазоне от 1,3 до 3,0% общей массы сухого вещества ядер, такое как содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в диапазоне от 1,5 до 3,0% общей массы сухого вещества ядер, предпочтительно содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в диапазоне от 1,7 до 3,0% общей массы сухого вещества ядер.In one embodiment, the barley plant may be a barley plant carrying a mutation in the CsIF6 gene and encoding a mutant CsIF6 polypeptide, wherein the CsIF6 polypeptide is a CsIF6 polypeptide of the sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 except that the mutant CsIF6 contains a substitution at amino acid 748, wherein said substitution is a substitution of aspartic acid (D) for glycine (G), and the kernels of said barley plant may have a (1,3;1,4)-β-glucan content ranging from 1.0 to 3.0 of the total dry matter weight of the kernels, for example, the content of (1.3;1.4)-β-glucans in the range from 1.0 to 3.0% of the total dry matter weight of the kernels, such as the content of (1.3; 1,4)-β-glucans in the range from 1.0 to 2.5% of the total dry matter weight of the kernels, preferably the content of (1,3;1,4)-β-glucans in the range from 1.0 to 2.0 % of the total dry matter weight of the kernels, for example, the content of (1,3;1,4)-β-glucans in the range from 1.3 to 3.0% of the total dry matter weight of the kernels, such as the content of (1,3;1, 4)-β-glucans in the range from 1.5 to 3.0% of the total weight of the dry matter of the kernels, preferably the content of (1.3; 1,4)-β-glucans in the range from 1.7 to 3.0% of the total mass of dry matter of kernels.
В одном варианте осуществления растение ячменя может представлять собой растение ячменя, несущее мутацию в гене CsIF6 и кодирующее мутантный полипептид CsIF6, где полипептид CsIF6 представляет собой полипептид CsIF6 с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 за исключением того, что мутантный CsIF6 содержит замену аминокислоты 709, где указанная замена представляет собой замещение треонина (Т) на изолейцин (I), и ядра указанного растения ячменя могут иметь содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в диапазоне от 1,0 до 3,0% общей массы сухого вещества ядер, например, содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в диапазоне от 1,0 до 3,0% общей массы сухого вещества ядер, таких как содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в диапазоне от 1,0 до 2,5% общей массы сухого вещества ядер, предпочтительно содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в диапазоне от 1,0 до 2,0% общей массы сухого веще- 10 045156 ства ядер, например, содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в диапазоне от 1,0 до 1,7% общей массы сухого вещества ядер, например, содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в диапазоне от 1,2 до 3,0% общей массы сухого вещества ядер, такое как содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в диапазоне от 1,5 до 3,0% общей массы сухого вещества ядер, предпочтительно содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в диапазоне от 1,3 до 3,0% общей массы сухого вещества ядер.In one embodiment, the barley plant may be a barley plant carrying a mutation in the CsIF6 gene and encoding a mutant CsIF6 polypeptide, wherein the CsIF6 polypeptide is a CsIF6 polypeptide of the sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 except that the mutant CsIF6 contains a substitution of amino acid 709, wherein said substitution is a substitution of isoleucine (I) for threonine (T), and the kernels of said barley plant may have a (1,3;1,4)-β-glucan content ranging from 1.0 to 3 .0% of the total dry matter weight of the kernels, for example, the content of (1.3;1.4)-β-glucans in the range from 1.0 to 3.0% of the total dry matter weight of the kernels, such as the content of (1.3; 1,4)-β-glucans in the range from 1.0 to 2.5% of the total dry matter weight of the kernels, preferably the content of (1,3;1,4)-β-glucans in the range from 1.0 to 2.0 % of the total dry matter mass of kernels, for example, the content of (1.3;1.4)-glucans in the range from 1.0 to 1.7% of the total dry matter mass of the kernels, for example, the content of (1. 3;1,4)-β-glucans in the range from 1.2 to 3.0% of the total dry matter weight of the kernels, such as (1,3;1,4)-β-glucans content in the range from 1.5 to 3.0% of the total dry matter weight of the kernels, preferably the content of (1,3;1,4)-β-glucans in the range from 1.3 to 3.0% of the total dry matter weight of the kernels.
В одном варианте осуществления изобретения растение ячменя может иметь содержание (1,3;1,4)β-глюканов в ядрах, сниженное до не более чем 70%, предпочтительно не более чем 60%, например, не более чем 55% от содержания (1,3;1,4)-в-глюканов в ядрах ячменя, содержащего CsIF6 ген дикого типа, но в остальном имеющего тот же генотип.In one embodiment of the invention, the barley plant may have the (1,3;1,4)β-glucan content in the kernels reduced to no more than 70%, preferably no more than 60%, for example no more than 55% of the ( 1,3;1,4)-β-glucans in the kernels of barley containing the wild-type CsIF6 gene, but otherwise having the same genotype.
Растение ячменя может представлять собой растение ячменя, имеющее содержание (1,3;1,4)-βглюканов в ядрах, сниженное до по меньшей мере 30% и не более чем 60%, предпочтительно по меньшей мере 40% и не более чем 60%, например по меньшей мере 40% и не более чем 55% от содержания (1,3;1,4)-в-глюканов в ядрах ячменя, содержащего CsIF6 ген дикого типа, но в остальном имеющего тот же генотип.The barley plant may be a barley plant having a (1,3;1,4)-β-glucan content in the kernels reduced to at least 30% and not more than 60%, preferably at least 40% and not more than 60% , for example at least 40% and not more than 55% of the (1,3;1,4)-β-glucan content in the kernels of barley containing the wild-type CsIF6 gene, but otherwise having the same genotype.
В одном варианте осуществления растение ячменя может представлять собой растение ячменя, имеющее содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в ядрах, сниженное до по меньшей мере 30% и не более чем 60%, предпочтительно по меньшей мере 40% и не более чем 60%, например, по меньшей мере 40% и не более чем 55% от содержания (1,3;1,4)-в-глюканов в ядрах растения ячменя сорта Paustian.In one embodiment, the barley plant may be a barley plant having a (1,3;1,4)-β-glucan content in the kernels reduced to at least 30% and no more than 60%, preferably at least 40% and not more than 60%, for example, at least 40% and not more than 55% of the (1,3;1,4)-β-glucan content in the kernels of the Paustian barley plant.
В одном варианте осуществления растение ячменя может представлять собой растение ячменя, несущее мутацию в гене CsIF6 и кодирующее мутантный полипептид CsIF6, где полипептид CsIF6 представляет собой полипептид CsIF6 с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 за исключением того, что мутантный CsIF6 содержит замену аминокислоты 847, где указанная замена представляет собой замещение глицина (G) на глутаминовую кислоту (Е), и ядра указанного растения ячменя могут иметь содержание (1,3;1,4)-в-глюканов, сниженное до по меньшей мере 30% и не более чем 60%, например по меньшей мере 40% и не более чем 60% от содержания (1,3;1,4)-в-глюканов в ядрах ячменя, содержащего CsIF6 ген дикого типа, но в остальном имеющего тот же генотип.In one embodiment, the barley plant may be a barley plant carrying a mutation in the CsIF6 gene and encoding a mutant CsIF6 polypeptide, wherein the CsIF6 polypeptide is a CsIF6 polypeptide of the sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 except that the mutant CsIF6 contains a substitution of amino acid 847, wherein said substitution is a substitution of glycine (G) for glutamic acid (E), and the kernels of said barley plant may have a (1,3;1,4)-β-glucan content reduced to at least 30 % and not more than 60%, for example at least 40% and not more than 60% of the content of (1,3;1,4)-β-glucans in the kernels of barley containing the wild-type CsIF6 gene, but otherwise having that the same genotype.
В одном варианте осуществления растение ячменя может представлять собой растение ячменя, несущее мутацию в гене CsIF6 и кодирующее мутантный полипептид CsIF6, где полипептид CsIF6 представляет собой полипептид CsIF6 с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 за исключением того, что мутантный CsIF6 содержит замену аминокислоты 748, где указанная замена представляет собой замещение глицина (G) на аспарагиновую кислоту (D), и ядра указанного растения ячменя могут иметь содержание (1,3;1,4)-в-глюканов, сниженное до по меньшей мере 30% и не более чем 60%, например, по меньшей мере 40% и не более чем 60% от содержания (1,3;1,4)-в-глюканов в ядрах ячменя, содержащего CsIF6 ген дикого типа, но в остальном имеющего тот же генотип.In one embodiment, the barley plant may be a barley plant carrying a mutation in the CsIF6 gene and encoding a mutant CsIF6 polypeptide, wherein the CsIF6 polypeptide is a CsIF6 polypeptide of the sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 except that the mutant CsIF6 contains a substitution of amino acid 748, wherein said substitution is a substitution of glycine (G) for aspartic acid (D), and the kernels of said barley plant may have a (1,3;1,4)-β-glucan content reduced to at least 30 % and not more than 60%, for example at least 40% and not more than 60% of the content of (1,3;1,4)-β-glucans in the kernels of barley containing the wild-type CsIF6 gene, but otherwise having the same genotype.
В одном варианте осуществления растение ячменя может представлять собой растение ячменя, несущее мутацию в гене CsIF6 и кодирующее мутантный полипептид CsIF6, где полипептид CsIF6 представляет собой полипептид CsIF6 с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 за исключением того, что мутантный CsIF6 содержит замену аминокислоты 709, где указанная замена представляет собой замещение треонина (Т) на изолейцин (I), и ядра указанного растения ячменя могут иметь содержание (1,3;1,4)-в-глюканов, сниженное до по меньшей мере 30% и не более чем 60%, например, по меньшей мере 40% и не более чем 60% от содержания (1,3;1,4)-в-глюканов в ядрах ячменя, содержащего CsIF6 ген дикого типа, но в остальном имеющего тот же генотип.In one embodiment, the barley plant may be a barley plant carrying a mutation in the CsIF6 gene and encoding a mutant CsIF6 polypeptide, wherein the CsIF6 polypeptide is a CsIF6 polypeptide of the sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 except that the mutant CsIF6 contains a substitution of amino acid 709, wherein said substitution is a substitution of threonine (T) for isoleucine (I), and the kernels of said barley plant may have a (1,3;1,4)-β-glucan content reduced to at least 30% and not more than 60%, for example at least 40% and not more than 60% of the (1,3;1,4)-β-glucan content in the kernels of barley containing the wild-type CsIF6 gene, but otherwise having that the same genotype.
Растения ячменя по изобретению, несущие мутации в гене CsIF6 и кодирующие мутированный полипептид CsIF6, и имеющие ядра с пониженным содержанием (1,3;1,4)-в-глюканов, могут дополнительно характеризоваться ядрами с заданным соотношением DP3:DP4, например соотношением DP3:DP4 ниже, чем соотношение DP3:DP4 для растения дикого типа, или выше, чем соотношение DP3:DP4 для растения дикого типа, или аналогично соотношению DP3:DP4 для растения дикого типа.Barley plants of the invention carrying mutations in the CsIF6 gene and encoding a mutated CsIF6 polypeptide, and having kernels with a reduced content of (1,3;1,4)-β-glucans, can further be characterized by kernels with a given DP3:DP4 ratio, for example a DP3 ratio :DP4 is lower than the DP3:DP4 ratio for a wild-type plant, or higher than the DP3:DP4 ratio for a wild-type plant, or similar to the DP3:DP4 ratio for a wild-type plant.
В зависимости от различных факторов, могут быть желательны различные DP3:DP4.Depending on various factors, different DP3:DP4 may be desirable.
Растения ячменя дикого типа обычно характеризуются соотношением DP3:DP4 в диапазоне от 2,5 до 4.Wild-type barley plants typically have a DP3:DP4 ratio ranging from 2.5 to 4.
В одном варианте осуществления растения ячменя по изобретению содержат (1,3;1,4)-в-глюкан в ядрах, имеющие соотношение DP3:DP4 не более чем 2,5, например не более чем 2,2, например, в диапазоне от 1,0 до 2,2.In one embodiment, the barley plants of the invention contain (1,3;1,4)-β-glucan in the kernels having a DP3:DP4 ratio of no more than 2.5, for example no more than 2.2, for example ranging from 1.0 to 2.2.
В одном варианте осуществления растение ячменя может представлять собой растение ячменя, несущее мутацию в гене CsIF6 и кодирующее мутантный полипептид CsIF6, где полипептид CsIF6 представляет собой полипептид CsIF6 с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 за исключением того, что мутантный CsIF6 содержит замену аминокислоты 847, где указанная замена представляет собой замещение глицина (G) на глутаминовую кислоту (Е), и ядра указанного растения ячменя могут иметь соотношение DP3:DP4 не более чем 2,5, такое как не более чем 2,2, например, в диапазоне от 1,0 до 2,2.In one embodiment, the barley plant may be a barley plant carrying a mutation in the CsIF6 gene and encoding a mutant CsIF6 polypeptide, wherein the CsIF6 polypeptide is a CsIF6 polypeptide of the sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 except that the mutant CsIF6 contains a substitution of amino acid 847, wherein said substitution is a substitution of glycine (G) for glutamic acid (E), and the kernels of said barley plant may have a DP3:DP4 ratio of no more than 2.5, such as no more than 2.2, for example , ranging from 1.0 to 2.2.
В одном варианте осуществления ядра указанного растения ячменя могут иметь соотношениеIn one embodiment, the kernels of said barley plant may have the ratio
- 11 045156- 11 045156
DP3:DP4 в диапазоне от 2,5 до 4.DP3:DP4 in the range from 2.5 to 4.
В одном варианте осуществления растение ячменя может представлять собой растение ячменя, несущее мутацию в гене CsIF6 и кодирующее мутантный полипептид CsIF6, где полипептид CsIF6 представляет собой полипептид CsIF6 с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 за исключением того, что мутантный CsIF6 содержит замену аминокислоты 748, где указанная замена представляет собой замещение глицина (G) на аспарагиновую кислоту (D), и ядра указанного растения ячменя могут иметь соотношение DP3:DP4 в диапазоне от 2,5 до 4.In one embodiment, the barley plant may be a barley plant carrying a mutation in the CsIF6 gene and encoding a mutant CsIF6 polypeptide, wherein the CsIF6 polypeptide is a CsIF6 polypeptide of the sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 except that the mutant CsIF6 contains a substitution at amino acid 748, wherein said substitution is a substitution of glycine (G) for aspartic acid (D), and the kernels of said barley plant may have a DP3:DP4 ratio ranging from 2.5 to 4.
В одном варианте осуществления ядра указанного растения ячменя могут иметь соотношение DP3:DP4, равное по меньшей мере 3,5, например по меньшей мере 4,0, например по меньшей мере 4,5, например, в диапазоне от 4 до 6.In one embodiment, the kernels of said barley plant may have a DP3:DP4 ratio of at least 3.5, such as at least 4.0, such as at least 4.5, such as in the range of 4 to 6.
В одном варианте осуществления растение ячменя может представлять собой растение ячменя, несущее мутацию в гене CsIF6 и кодирующее мутантный полипептид CsIF6, где полипептид CsIF6 представляет собой полипептид CsIF6 с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 за исключением того, что мутантный CsIF6 содержит замену аминокислоты 709, где указанная замена представляет собой замещение треонина (Т) на изолейцин (I), и ядра указанного растения ячменя могут иметь соотношение DP3:DP4, равное по меньшей мере 3,5, такое как по меньшей мере 4,0, например по меньшей мере 4,5, например, в диапазоне от 4 до 6.In one embodiment, the barley plant may be a barley plant carrying a mutation in the CsIF6 gene and encoding a mutant CsIF6 polypeptide, wherein the CsIF6 polypeptide is a CsIF6 polypeptide of the sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 except that the mutant CsIF6 contains a substitution of amino acid 709, wherein said substitution is a substitution of threonine (T) for isoleucine (I), and the kernels of said barley plant may have a DP3:DP4 ratio of at least 3.5, such as at least 4.0, for example at least 4.5, for example in the range from 4 to 6.
(1,3;1,4)-в-глюкан является компонентом клеточной стенки, и снижение уровня (1,3;1,4)-βглюканов может повлиять на растения ячменя. Например, снижение уровня (1,3;1,4)-в-глюканов и/или изменение соотношения DP3/DP4 (1,3;1,4)-в-глюканов может привести к появлению хрупких зерен ячменя с высоким процентом битых зерен.(1,3;1,4)-β-glucan is a component of the cell wall, and decreased levels of (1,3;1,4)-β-glucan can affect barley plants. For example, a decrease in the level of (1,3;1,4)-β-glucans and/or a change in the DP3/DP4 ratio of (1,3;1,4)-β-glucans can lead to brittle barley grains with a high percentage of broken grains .
В одном варианте осуществления предпочтительно, чтобы растения ячменя по изобретению имели ядра с приемлемой твердостью зерна. Таким образом, в одном варианте осуществления растения ячменя могут иметь ядра с частотой битого зерна менее 5%, например менее 3%, при определении, как описано в примере 6, приведенном ниже.In one embodiment, it is preferred that the barley plants of the invention have kernels of acceptable grain hardness. Thus, in one embodiment, barley plants may have kernels with a broken grain rate of less than 5%, such as less than 3%, when determined as described in Example 6 below.
В частности, предпочтительно, чтобы частота битых зерен после обмолота зерен растений ячменя по изобретению была не более чем в 3 раза выше, более предпочтительно не более чем в 2 раза выше, чем частота битых зерен после обмолота зерен растения ячменя, не несущего мутацию в гене CsIF6, но в остальном идентичного. Так, например, растения ячменя, несущие мутации в гене CsIF6, кодирующем мутантный белок HvCsIF6, содержащий мутацию (например, Gly^Asp) аминокислоты 748 в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3, имеют частоту битых зерен после обмолота зерна, которая не более чем в 3 раза выше, более предпочтительно не более чем в 2 раза выше, чем частота битых зерен после обмолота зерен растения ячменя, не несущего указанной мутации, но в остальном идентичного. Частоту битых зерен предпочтительно определяют, как описано в примере 6, приведенном ниже.In particular, it is preferable that the frequency of broken grains after threshing grains of barley plants according to the invention is no more than 3 times higher, more preferably no more than 2 times higher, than the frequency of broken grains after threshing grains of barley plants that do not carry a mutation in the gene CsIF6, but otherwise identical. For example, barley plants carrying mutations in the CsIF6 gene encoding a mutant HvCsIF6 protein containing a mutation (e.g., Gly^Asp) at amino acid 748 in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 have a frequency of broken grains after grain threshing, which is no more than 3 times higher, more preferably no more than 2 times higher, than the frequency of broken grains after threshing grains of a barley plant that does not carry the specified mutation, but is otherwise identical. The frequency of broken grains is preferably determined as described in Example 6 below.
Растения ячменя, содержащие более одной мутации.Barley plants containing more than one mutation.
В дополнение к описанным в данном документе мутациям растения ячменя могут также содержать одну или несколько дополнительных мутаций. Соответственно растение ячменя может содержать одну или несколько следующих мутаций.In addition to the mutations described herein, barley plants may also contain one or more additional mutations. Accordingly, a barley plant may contain one or more of the following mutations.
В дополнение к одной или нескольким мутациям, описанным выше, растение ячменя может также содержать мутацию в гене, кодирующем LOX-1, что приводит к полной потере функционального LOX-1. Указанная мутация может, например, представлять собой любую из мутаций, описанных в международной заявке на патент WO 2005/087934. Например, растение ячменя может содержать ген, кодирующий LOX-1, содержащий преждевременный стоп-кодон, причем указанный кодон соответствует номерам оснований от 3572 до 3574 SEQ ID NO: 2 из WO 2005/087934, или мутацию сайта сплайсинга, причем указанная мутация соответствует номеру основания 2311 в SEQ ID NO: 6 из SEQ ID NO: 2 в WO 2005/087934.In addition to one or more of the mutations described above, a barley plant may also contain a mutation in the gene encoding LOX-1, resulting in a complete loss of functional LOX-1. Said mutation may, for example, be any of the mutations described in international patent application WO 2005/087934. For example, a barley plant may contain a gene encoding LOX-1 containing a premature stop codon, wherein said codon corresponds to base numbers 3572 to 3574 of SEQ ID NO: 2 of WO 2005/087934, or a splice site mutation, wherein said mutation corresponds to base number base 2311 in SEQ ID NO: 6 from SEQ ID NO: 2 in WO 2005/087934.
В дополнение к одной или нескольким мутациям, описанным выше, растение ячменя может также содержать мутацию в гене, кодирующем LOX-2, что приводит к полной потере функционального LOX-2. Указанная мутация может, например, представлять собой любую из мутаций, описанных в международной заявке на патент WO 2010/075860. Например, растение ячменя может содержать ген, кодирующий LOX-2, содержащий мутацию в положении нуклеотида 2689 в SEQ ID NO: 1 в WO 2010/075860, приводящую в результате к образованию преждевременного стоп-кодона.In addition to one or more of the mutations described above, a barley plant may also contain a mutation in the gene encoding LOX-2, resulting in a complete loss of functional LOX-2. Said mutation may, for example, be any of the mutations described in international patent application WO 2010/075860. For example, a barley plant may contain a gene encoding LOX-2 containing a mutation at nucleotide position 2689 in SEQ ID NO: 1 in WO 2010/075860, resulting in a premature stop codon.
В дополнение к одной или нескольким мутациям, описанным выше, растение ячменя может также содержать мутацию в гене, кодирующем ММТ, что приводит в результате к полной потере функционального ММТ. Указанная мутация может, например, представлять собой любую из мутаций, описанных в международной заявке на патент WO 2010/063288. Например, растение ячменя может содержать ген, кодирующий ММТ, содержащий мутацию GoA основания № 3076 в SEQ ID NO: 3 в WO 2010/063288, или ген, кодирующий ММТ, содержащий мутацию G^A основания № 1462 в SEQ ID NO: 16 в WO 2010/063288.In addition to one or more of the mutations described above, a barley plant may also contain a mutation in the gene encoding MMT, resulting in a complete loss of functional MMT. Said mutation may, for example, be any of the mutations described in international patent application WO 2010/063288. For example, a barley plant may contain a gene encoding MMT containing the GoA mutation of base no. 3076 in SEQ ID NO: 3 in WO 2010/063288, or a gene encoding MMT containing the G^A mutation of base no. 1462 in SEQ ID NO: 16 in WO 2010/063288.
В дополнение к одной или нескольким мутациям, описанным выше, растение ячменя также может содержать любую из мутаций, приводящих к повышенной активности альфа-амилазы, описанной в одновременно рассматриваемой заявке под названием Ячмень с повышенной активностью гидролитического фермента (Barley with increased hydrolytic enzyme activity), назначенной тому же заявителю и с той жеIn addition to one or more of the mutations described above, a barley plant may also contain any of the mutations resulting in increased alpha-amylase activity described in the co-pending application entitled Barley with increased hydrolytic enzyme activity. assigned to the same applicant and with the same
- 12 045156 датой подачи, что и настоящая заявка.- 12 045156 with the same filing date as this application.
Растительные продукты.Plant products.
Настоящее изобретение также относится к растительным продуктам, получаемым из растения ячменя с пониженным содержанием (1,3;1,4)-в-глюканов и несущего мутацию в гене CsIF6, или его потомства, где указанный мутированный ген CsIF6 кодирует мутантный полипептид CsIF6, например, любого из растений ячменя, описанных в данном документе.The present invention also relates to plant products obtained from a barley plant with a reduced content of (1,3;1,4)-β-glucans and carrying a mutation in the CsIF6 gene, or its progeny, where the specified mutated CsIF6 gene encodes a mutant CsIF6 polypeptide, for example , any of the barley plants described herein.
Растительный продукт может представлять собой любой продукт, приготовленный из растения ячменя, например пищу, корм или напиток. Таким образом, растительный продукт может представлять собой любой из напитков, описанных ниже в разделе Напиток и способ его производства. Растительный продукт также может представлять собой водный экстракт растения ячменя и/или солод, приготовленный из зерен указанного растения ячменя, например, растительный продукт может представлять собой сусло. Указанный водный экстракт может, например, быть приготовлен, как описано ниже в разделе Водный экстракт и способы его получения.The plant product can be any product made from the barley plant, such as food, feed or drink. Thus, the plant product may be any of the beverages described below in the Beverage and Method of Production section below. The plant product may also be an aqueous extract of a barley plant and/or malt prepared from the grains of said barley plant, for example the plant product may be a wort. Said aqueous extract may, for example, be prepared as described below under Aqueous Extract and Methods for its Preparation.
В одном варианте осуществления растительный продукт может представлять собой солод, например, зеленый солод или высушенный в печи солод, такой как любой из солодов, описанных в настоящем документе ниже в разделе Зеленый солод, высушенный в печи солод и способы его получения, или основанный на солоде продукт, такой как солодовые напитки. Хотя, в основном, солод используется для производства напитков, его также можно использовать в других промышленных процессах, например, в качестве источника ферментов в хлебопекарной промышленности или в пищевой промышленности в качестве ароматизатора и красителя, например, в виде солода или солодовой муки или опосредованно, как солодовый сироп и т.д. Таким образом, растительный продукт по изобретению может представлять собой любой из вышеупомянутых продуктов.In one embodiment, the plant product may be malt, such as green malt or kiln-dried malt, such as any of the malts described herein below under Green Malt, Kiln-Kiln Malt and Methods for Making The Same, or malt-based product such as malt beverages. Although malt is primarily used in the beverage industry, it can also be used in other industrial processes, for example as a source of enzymes in the baking industry or in the food industry as a flavoring and coloring agent, for example in the form of malt or malt flour or indirectly, like malt syrup, etc. Thus, the herbal product of the invention may be any of the above-mentioned products.
В одном варианте осуществления изобретения растительный продукт представляет собой ячменную муку, т.е. ячменную муку, приготовленную из зерен растения ячменя согласно изобретению.In one embodiment of the invention, the plant product is barley flour, i.e. barley flour prepared from the grains of the barley plant according to the invention.
В другом аспекте растительные продукты согласно изобретению содержат или даже состоят из сиропа, такого как ячменный сироп или сироп ячменного солода. Растительный продукт также может представлять собой экстракт ячменя или солода. Таким образом, растительный продукт может представлять собой сусло.In another aspect, the plant products of the invention contain or even consist of a syrup, such as barley syrup or barley malt syrup. The plant product may also be barley or malt extract. Thus, the plant product may be a wort.
Зеленый солод, высушенный в печи солод и способы их производства.Green malt, kiln-dried malt and methods for their production.
Изобретение также относится к солоду, полученному из растения ячменя, несущего мутацию в гене CsIF6, например, любого из растений ячменя, описанных в данном документе. Указанный солод может представлять собой зеленый солод или высушенный в печи солод, приготовленный из зерен ячменя из растения ячменя, несущего мутацию в гене CsIF6, или его потомства. Указанная мутация может представлять собой любую из мутаций в гене CsIF6, описанную в данном документе выше.The invention also relates to malt obtained from a barley plant carrying a mutation in the CsIF6 gene, for example, any of the barley plants described herein. The malt may be green malt or kiln-dried malt made from barley grains from a barley plant carrying a mutation in the CsIF6 gene or its progeny. The mutation may be any of the mutations in the CsIF6 gene described above herein.
Зеленый солод может быть приготовлен путем солодования, т.е. путем проращивания зерновых культур в контролируемых условиях окружающей среды. Как правило, упомянутое проращивание может включать стадию замачивания ядер ячменя, за которой следует стадия проращивания. Замачивание и проращивание также могут выполняться одновременно или частично одновременно. В некоторых вариантах осуществления производство солода может включать стадию сушки пророщенных зерен. Указанная стадия сушки предпочтительно может представлять собой печную сушку пророщенных ядер при повышенных температурах. Таким образом, высушенный в печи солод можно приготовить, подвергнув зеленый солод стадии печной сушки.Green malt can be prepared by malting, i.e. by germinating grain crops under controlled environmental conditions. Typically, said sprouting may include a step of soaking the barley kernels, followed by a sprouting step. Soaking and sprouting can also be done simultaneously or partially simultaneously. In some embodiments, the production of malt may include the step of drying the sprouted grains. Said drying step may preferably be oven drying of the germinated kernels at elevated temperatures. Thus, kiln-dried malt can be prepared by subjecting green malt to a kiln-drying stage.
Таким образом, в одном варианте осуществления способ солодования может включать стадии (a) обеспечения ядер растения ячменя, в частности, растения ячменя, несущего мутацию в гене CsIF6;Thus, in one embodiment, a malting method may include the steps of (a) providing kernels to a barley plant, in particular, a barley plant carrying a mutation in the CsIF6 gene;
(b) замачивания указанных ядер ячменя;(b) soaking said barley kernels;
(c) проращивания указанного ядра ячменя; и (d) высушивания указанных пророщенных ядер ячменя, предпочтительно печной сушкой.(c) germinating said barley kernel; and (d) drying said germinated barley kernels, preferably by oven drying.
Пророщенные зерна ячменя могут быть получены способом, включающим стадии (a) обеспечения ядер растения ячменя, в частности растения ячменя, несущего мутацию в гене CsIF6;Sprouted barley grains can be produced by a method comprising the steps of (a) providing kernels of a barley plant, in particular a barley plant carrying a mutation in the CsIF6 gene;
(b) замачивания указанных ядер ячменя;(b) soaking said barley kernels;
(c) проращивания указанного ядра ячменя.(c) germinating said barley kernel.
Стадии замачивания и проращивания могут выполняться последовательно, одновременно или частично одновременно.The soaking and germination steps can be performed sequentially, simultaneously or partially simultaneously.
В одном предпочтительном варианте осуществления замачивание и проращивание проводят одновременно в процессе проращивания, который включает инкубацию зерен ячменя в водном растворе, обычно при аэрации, в течение не более чем 72 ч.In one preferred embodiment, soaking and sprouting are carried out simultaneously in a sprouting process that involves incubating the barley grains in an aqueous solution, usually with aeration, for no more than 72 hours.
Замачивание может быть выполнено любым обычным способом, известным специалисту. Один неограничивающий пример включает выдерживание при температуре в диапазоне от 10 до 25°С с чередованием сухих и влажных условий. Например, во время замачивания ядра ячменя можно инкубировать во влажных условиях в течение от 30 мин до 3 ч, а затем инкубировать в сухих условиях в течение от 30 минSoaking can be performed by any conventional method known to one skilled in the art. One non-limiting example includes holding at temperatures ranging from 10 to 25°C with alternating dry and wet conditions. For example, during soaking, barley kernels can be incubated under humid conditions for 30 minutes to 3 hours, and then incubated under dry conditions for 30 minutes.
- 13 045156 до 3 ч и при необходимости повторять указанную схему инкубации в диапазоне от 2 до 5 раз. Конечное содержание воды после замачивания может составлять, например, от 40 до 50%, например от 40 до 45%.- 13 045156 up to 3 hours and, if necessary, repeat the specified incubation scheme in the range from 2 to 5 times. The final water content after soaking may be, for example, 40 to 50%, for example 40 to 45%.
Растения ячменя, обеспеченные в настоящем изобретении, характеризуются наличием мутации в гене CsIF6 и, таким образом, кодированием мутантного полипептида CsIF6. Одно из главных преимуществ таких растений ячменя заключается в том, что ядра имеют пониженное содержание (1,3;1,4)-βглюканов и адекватное соотношение DP3:DP4. Зерна таких растений ячменя с пониженным содержанием (1,3;1,4)-в-глюканов могут успешно прорастать в процессе короткого проращивания. Примеры применимых процессов короткого проращивания описаны в международной заявке на патент РСТ/ЕР2О17/О65498, которая включена в настоящее описание посредством ссылки. Одним из примеров применимого процесса короткого проращивания является процесс проращивания, включающий стадию, где зерна ячменя инкубируют в водном растворе, как правило, при аэрации, причем весь процесс проращивания выполняется в течение не более чем 72 ч. Фактически во время проращивания (1,3;1,4)-βглюканы обычно, по меньшей мере, частично гидролизуются ферментами, такими как β-глюканаза. Гидролитические ферменты, специфичные для (1,3;1,4)-в-глюканов, обычно присутствуют в небольшом количестве в начале процесса проращивания. Присутствие гидролитических ферментов, специфичных для (1,3;1,4)-в-глюканов, увеличивается с продолжением процесса проращивания. Процесс проращивания, проводимый в течение не более чем 72 ч в общем не обеспечивает достаточного времени для гидролиза (1,3;1,4)-в-глюканов до желаемого низкого уровня, если содержание (1,3;1,4)-в-глюканов является высоким с самого начала. Однако, растения ячменя по изобретению уже имеют низкий уровень (1,3;1,4)-βглюканов с самого начала и, таким образом, гидролиз (1,3;1,4)-в-глюканов s во время проращивания менее критичен.The barley plants provided in the present invention are characterized by the presence of a mutation in the CsIF6 gene and thus encoding a mutant CsIF6 polypeptide. One of the main advantages of such barley plants is that the kernels have a reduced content of (1,3;1,4)-β-glucans and an adequate DP3:DP4 ratio. The grains of such barley plants with a reduced content of (1,3;1,4)-β-glucans can successfully germinate during a short germination process. Examples of applicable short germination processes are described in international patent application PCT/EP2O17/O65498, which is incorporated herein by reference. One example of a useful short germination process is a germination process involving a step where barley grains are incubated in an aqueous solution, typically with aeration, and the entire germination process is carried out in no more than 72 hours. In fact, during germination (1.3; 1,4)-β-glucans are usually at least partially hydrolyzed by enzymes such as β-glucanase. Hydrolytic enzymes specific for (1,3;1,4)-β-glucans are usually present in small quantities at the beginning of the germination process. The presence of hydrolytic enzymes specific for (1,3;1,4)-β-glucans increases with the continuation of the germination process. A germination process carried out for no more than 72 hours generally does not provide sufficient time for (1,3;1,4)-glucans to be hydrolyzed to the desired low level if the (1,3;1,4)-g content -glucans are high from the start. However, the barley plants of the invention already have low levels of (1,3;1,4)-β-glucans to begin with and thus hydrolysis of (1,3;1,4)-β-glucans during germination is less critical.
Как описано выше, проращивание может включать стадию инкубации зерен растения ячменя, несущих мутацию в гене CsIF6, в водном растворе при аэрации. Зерна ячменя могут инкубироваться в указанном водном растворе в течение достаточного времени, чтобы позволить проращивание большинства из указанных зерен ячменя. Зерна ячменя также могут инкубироваться в указанном водном растворе в течение периода времени, достаточного для того, чтобы получить содержание воды, составляющее по меньшей мере 35%, предпочтительно по меньшей мере 37%, например, в диапазоне от 35 до 60%. Обычно, зерна ячменя инкубируют в водном растворе в течение по меньшей мере 20 ч, например по меньшей мере 24 ч. Обычно зерна инкубируют в указанном водном растворе не более чем 72 ч, например не более чем 60 ч, например не более чем 48 ч. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления зерна ячменя инкубируют в указанном водном растворе в течение от 20 до 72 ч, например в течение от 20 до 60 ч, например от 20 до 48 ч, например, в диапазоне от 20 до 30 ч, например в диапазоне от 22 до 26 ч.As described above, germination may include the step of incubating grains of a barley plant carrying a mutation in the CsIF6 gene in an aqueous solution under aeration. The barley grains may be incubated in said aqueous solution for a sufficient time to allow germination of most of the said barley grains. The barley grains may also be incubated in said aqueous solution for a period of time sufficient to obtain a water content of at least 35%, preferably at least 37%, for example in the range of 35 to 60%. Typically, the barley grains are incubated in the aqueous solution for at least 20 hours, such as at least 24 hours. Typically, the grains are incubated in said aqueous solution for no more than 72 hours, such as no more than 60 hours, such as no more than 48 hours. Thus, in some embodiments, the barley grains are incubated in said aqueous solution for 20 to 72 hours, e.g., 20 to 60 hours, e.g., 20 to 48 hours, e.g., 20 to 30 hours, e.g. range from 22 to 26 hours.
Может быть предпочтительным, чтобы зерна ячменя были полностью покрыты указанным водным раствором в течение всей инкубации.It may be preferable that the barley grains are completely covered with said aqueous solution throughout the incubation.
Указанные ячменя зерна часто инкубируют в указанном водном растворе, в то время как через водный раствор пропускают О2. Указанный O2 может быть добавлен к указанному водному раствору в виде чистого О2. Однако, часто указанный О2 содержится в газовой смеси. В одном варианте осуществления указанный O2 содержится в атмосферном воздухе.Said barley grains are often incubated in said aqueous solution while O 2 is passed through the aqueous solution. Said O 2 may be added to said aqueous solution in the form of pure O 2 . However, often the specified O 2 is contained in the gas mixture. In one embodiment, said O2 is contained in ambient air.
Обычно, по меньшей мере 2 л, предпочтительно, по меньшей мере 3 л, более предпочтительно по меньшей мере 4 л, еще более предпочтительно по меньшей мере 5 л, еще более предпочтительно по меньшей мере 6 л O2 проходят через указанный водный раствор на кг зерна ячменя в час. Масса указанных зерен ячменя представляет собой массу сухого вещества. Например, в диапазоне от 2 до 100 л, например в диапазоне от 2 до 75 л, например в диапазоне от 2 до 50 л, например в диапазоне от 4 до 100 л, например в диапазоне от 4 до 75 л, например в диапазоне от 4 до 50 л, например в диапазоне от 6 до 100 л, например в диапазоне от 6 до 75 л, например в диапазоне от 6 до 50 л О2 проходит через указанную смесь водный раствор/зерна ячменя на кг зерен ячменя (масса сухого вещества) в час.Typically at least 2 L, preferably at least 3 L, more preferably at least 4 L, even more preferably at least 5 L, even more preferably at least 6 L O 2 pass through said aqueous solution per kg barley grains per hour. The weight of these barley grains is the weight of dry matter. For example, in the range from 2 to 100 l, for example in the range from 2 to 75 l, for example in the range from 2 to 50 l, for example in the range from 4 to 100 l, for example in the range from 4 to 75 l, for example in the range from 4 to 50 l, for example in the range from 6 to 100 l, for example in the range from 6 to 75 l, for example in the range from 6 to 50 l O 2 passes through the specified mixture of aqueous solution/barley grains per kg of barley grains (dry matter weight ) at one o'clock.
Как отмечалось выше, часто атмосферный воздух пропускается через водный раствор. Таким образом, способ может включать пропускание по меньшей мере 10 л, предпочтительно по меньшей мере 15 л, более предпочтительно по меньшей мере 20 л, еще более предпочтительно по меньшей мере 25 л, еще более предпочтительно по меньшей мере 30 л атмосферного воздуха через указанный водный раствор на кг зерен ячменя в час. Масса указанных зерен ячменя представляет собой массу сухого вещества. Например, в диапазоне от 10 до 500 л, например в диапазоне от 10 до 375 л, например в диапазоне от 10 до 250 л, например в диапазоне от 20 до 500 л, например в диапазоне от 20 до 375 л, например в диапазоне от 20 до 250 л, например в диапазоне от 30 до 500 л, например в диапазоне от 30 до 375 л, например в диапазоне от 30 до 250 л, атмосферного воздуха пропускается через указанный водный раствор на кг зерен ячменя (масса сухого вещества) в час.As noted above, often atmospheric air is passed through the aqueous solution. Thus, the method may include passing at least 10 L, preferably at least 15 L, more preferably at least 20 L, even more preferably at least 25 L, even more preferably at least 30 L of atmospheric air through said aqueous solution per kg of barley grains per hour. The weight of these barley grains is the weight of dry matter. For example, in the range from 10 to 500 l, for example in the range from 10 to 375 l, for example in the range from 10 to 250 l, for example in the range from 20 to 500 l, for example in the range from 20 to 375 l, for example in the range from 20 to 250 l, for example in the range from 30 to 500 l, for example in the range from 30 to 375 l, for example in the range from 30 to 250 l, atmospheric air is passed through the specified aqueous solution per kg of barley grains (dry matter weight) per hour .
В некоторых вариантах осуществления стадия проращивания включаетIn some embodiments, the germination step includes
a) по меньшей мере одну стадию инкубации указанных ядер в водном растворе, где по меньшей мере 2 л O2 на кг массы сухого вещества ядер ячменя пропускают через указанный водный раствор в час; иa) at least one step of incubating said kernels in an aqueous solution, wherein at least 2 liters of O 2 per kg dry matter weight of barley kernels are passed through said aqueous solution per hour; And
b) по меньшей мере одну стадию инкубации указанных ядер ячменя на воздухе.b) at least one step of incubating said barley kernels in air.
В некоторых вариантах осуществления после инкубации зерен ячменя в указанном водном раствореIn some embodiments, after incubating the barley grains in said aqueous solution
- 14 045156 содержание воды в ячмене составляет по меньшей мере 20%, предпочтительно по меньшей мере 30%, например в диапазоне от 30 до 60%, например в диапазоне от 30 до 50%, например в диапазоне от до 60%, например в диапазоне от 30 до 50%.- 14 045156 the water content of barley is at least 20%, preferably at least 30%, for example in the range from 30 to 60%, for example in the range from 30 to 50%, for example in the range from to 60%, for example in the range from 30 to 50%.
Во время указанной стадии инкубации указанных зерен ячменя на воздухе, через указанные ядра ячменя в час можно пропускать по меньшей мере 2 л O2 на кг массы сухого вещества ячменя. Например, во время инкубации на воздухе через ядра ячменя может быть пропущено такое же количество O2, что и во время инкубации в указанном водном растворе, как описано выше.During said stage of incubation of said barley grains in air, at least 2 liters of O 2 per kg dry matter weight of barley can be passed through said barley kernels per hour. For example, during incubation in air, the same amount of O 2 can be passed through the barley kernels as during incubation in the specified aqueous solution, as described above.
Пророщенные ядра ячменя, полученные данным способом, также называются в данном документе зеленым солодом.Sprouted barley kernels produced by this process are also referred to herein as green malt.
Содержание воды в зернах ячменя может быть определено путем определения массы зерен ячменя с последующей сушкой указанных зерен ячменя и определения массы высушенных зерен ячменя. Разница в массе влажных и сухих зерен ячменя считается водой, и содержание воды представлено как масса воды, деленная на общую массу зерен ячменя (влажных зерен ячменя). Содержание воды в %, таким образом, является % мас./мас. (по массе).The water content of barley grains can be determined by determining the weight of the barley grains, then drying said barley grains and determining the weight of the dried barley grains. The difference in the weight of wet and dry barley grains is considered water, and the water content is represented as the weight of water divided by the total weight of the barley grains (wet barley grains). The water content in % is therefore % w/w. (by weight).
Зерно ячменя можно инкубировать при любой применимой температуре, однако, может быть предпочтительным, чтобы инкубация проводилась при температуре, достаточно высокой, чтобы обеспечить быстрое увеличение содержания воды.Barley grain can be incubated at any applicable temperature, however, it may be preferable that the incubation be carried out at a temperature high enough to allow a rapid increase in water content.
В частности, в вариантах осуществления изобретения, в которых зерна ячменя инкубируют при температуре в диапазоне от 20 до 30°С, тогда указанные зерна ячменя можно инкубировать в течение от 20 до 48 ч.In particular, in embodiments of the invention in which barley grains are incubated at a temperature in the range of 20 to 30°C, then said barley grains can be incubated for 20 to 48 hours.
Проращивание зерен также может быть выполнено любым обычным способом, известным специалисту в данной области техники. Один неограничивающий пример включает проращивание при температуре в диапазоне от 10 до 25°С, необязательно с изменением температуры в диапазоне от 1 до 4 дней.Germination of grains can also be carried out by any conventional method known to one skilled in the art. One non-limiting example includes germination at a temperature in the range of 10 to 25°C, optionally with a temperature variation in the range of 1 to 4 days.
Как упомянуто выше в некоторых вариантах осуществления изобретения, пророщенные зерна ячменя (т.е. зеленый солод) могут быть высушены в печи. В некоторых вариантах осуществления предпочтительно, чтобы зеленый солод не сушился в печи. В частности, предпочтительно, что когда зеленый солод получают путем проращивания, включающего стадию инкубации указанных зерен ячменя в водном растворе при аэрировании, тогда зеленый солод не сушат в печи.As mentioned above, in some embodiments of the invention, sprouted barley grains (ie, green malt) can be oven dried. In some embodiments, it is preferable that the green malt is not kiln dried. In particular, it is preferred that when green malt is produced by germination, including the step of incubating said barley grains in an aqueous solution under aeration, then the green malt is not oven dried.
Если зеленый солод сушат в печи, это может быть сделано при обычных температурах, таких как, по меньшей мере 75°С, например, в диапазоне от 80 до 90°С, например, в диапазоне от 80 до 85°С. Таким образом, солод, например, может быть получен любым из способов, описанных Hough et al. (1982). Однако, любой другой подходящий способ получения солода также может быть использован с настоящим изобретением, такой как способы производства специального солода, включая, но не ограничиваясь ими, способы обжаривания солода.If green malt is kiln dried, this may be done at conventional temperatures, such as at least 75°C, for example in the range of 80 to 90°C, for example in the range of 80 to 85°C. Thus, malt, for example, can be produced by any of the methods described by Hough et al. (1982). However, any other suitable method for producing malt can also be used with the present invention, such as methods for producing specialty malt, including, but not limited to, methods for roasting malt.
Высушенный в печи солод и зеленый солод могут быть дополнительно обработаны, например, путем измельчения. Таким образом, растительный продукт согласно изобретению может представлять собой любой вид солода, такой как необработанный солод или измельченный солод, такой как мука. Таким образом, растительный продукт может представлять собой, например, измельченный, высушенный в печи солод или измельченный зеленый солод. Измельченный солод и его мука содержат химические компоненты солода и мертвых клеток, которые не обладают способностью повторно прорастать.Kiln-dried malt and green malt can be further processed, for example by grinding. Thus, the plant product of the invention may be any type of malt, such as raw malt or ground malt such as flour. Thus, the plant product may be, for example, milled, kiln-dried malt or milled green malt. Milled malt and its flour contain chemical components of malt and dead cells that do not have the ability to germinate again.
В некоторых вариантах осуществления ячмень представляет собой шелушеный ячмень, и способ включает стадию удаления, по меньшей мере, части указанной оболочки перед инкубацией указанных ядер в водном растворе. Шелушеные зерна злаков можно обработать, чтобы удалить оболочку, подвергнув зерна злаков физической обработке, удаляющей оболочку. Указанная физическая обработка может быть выбрана, например, из группы, состоящей из полировки, шлифования, шелушения и разглаживания. Предпочтительно, физическая обработка приводит к потере оболочки. Потеря оболочки может быть определена как общая потеря массы. Таким образом, физическая обработка предпочтительно приводит к потере в диапазоне от 1 до 4%, например, к потере в диапазоне от 1,5 до 3,0% от общей массы зерновых культур.In some embodiments, the barley is hulled barley, and the method includes the step of removing at least a portion of said hull before incubating said kernels in an aqueous solution. Hulled cereal grains can be processed to remove the hull by subjecting the cereal grain to a physical treatment that removes the hull. Said physical treatment may be selected, for example, from the group consisting of polishing, grinding, peeling and smoothing. Preferably, physical processing results in loss of the shell. Shell loss can be defined as total mass loss. Thus, physical processing preferably results in a loss in the range of 1 to 4%, for example, a loss in the range of 1.5 to 3.0% of the total weight of the crop.
Водный экстракт и способы его получения.Aqueous extract and methods for its preparation.
Изобретение обеспечивает напитки на основе ячменя, а также способы приготовления напитков на основе ячменя, где растение ячменя или его потомство несет мутацию в гене CsIF6. Изобретение также обеспечивает водные экстракты ядер растений ячменя, несущие мутацию в гене CsIF6. Указанный водный экстракт может, например, быть приготовлен из зеленого солода или высушенного в печи солода.The invention provides barley-based drinks, as well as methods for preparing barley-based drinks, where the barley plant or its progeny carries a mutation in the CsIF6 gene. The invention also provides aqueous extracts of barley plant kernels carrying a mutation in the CsIF6 gene. Said aqueous extract may, for example, be prepared from green malt or kiln-dried malt.
Часто способы приготовления напитка включают стадию приготовления водного экстракта зерен растений ячменя по изобретению и/или солода, полученного из растений ячменя по изобретению.Often, methods of preparing the beverage include the step of preparing an aqueous extract of barley plant grains of the invention and/or malt obtained from barley plants of the invention.
Водный экстракт, как правило, может быть приготовлен путем инкубации ячменной муки, муки из зеленого солода и/или муки из высушенного в печи солода в воде или в водном растворе. Упомянутый водный раствор также упоминается как раствор для затирания в данном документе. В частности, водный экстракт может быть приготовлен путем затирания.An aqueous extract can typically be prepared by incubating barley flour, green malt flour and/or kiln-dried malt flour in water or an aqueous solution. Said aqueous solution is also referred to as a mash solution herein. In particular, the aqueous extract can be prepared by mashing.
Настоящее изобретение также относится к способу получения водного экстракта, причем указанный способ включает следующие стадии:The present invention also relates to a method for producing an aqueous extract, said method comprising the following steps:
- 15 045156- 15 045156
а) получение ядер растения ячменя, где указанное растение ячменя имеет пониженное содержание (1,3;1,4)-в-глюканов и несет мутацию в гене CsIF6, как описано в данном документе;a) obtaining the kernels of a barley plant, wherein said barley plant has a reduced content of (1,3;1,4)-β-glucans and carries a mutation in the CsIF6 gene, as described herein;
b) подвергание ядер ячменя стадии проращивания, получая при этом пророщенные ядра, причем указанная стадия проращивания включает инкубацию указанных ядер в водном растворе не более чем 72 ч;b) subjecting the barley kernels to a germination stage, thereby obtaining germinated kernels, said germination stage comprising incubating said kernels in an aqueous solution for no more than 72 hours;
c) мелкое раздробление указанных пророщенных зерен, тогда как указанные пророщенные ядра имеют содержание воды по меньшей мере 20%, при условии, что указанные ядра ячменя не имеют содержания воды ниже 20 в любое время между стадиями b) и с);c) finely crushing said sprouted grains, while said sprouted kernels have a water content of at least 20%, provided that said barley kernels do not have a water content below 20 at any time between stages b) and c);
d) приготовление водного экстракта указанных измельченных пророщенных ядер, тем самым получая водный экстракт ячменя.d) preparing an aqueous extract of said crushed germinated kernels, thereby obtaining an aqueous extract of barley.
Стадия проращивания подробно описана в приведенном выше разделе Зеленый солод, высушенный в печи солод и способ их производства.The germination stage is described in detail in the above section Green malt, kiln-dried malt and the method of their production.
Как правило, указанный раствор для затирания может представлять собой воду, такую как водопроводная вода, в которую может быть добавлено одно или несколько добавочных компонентов. Добавочные компоненты могут присутствовать в водном растворе с самого начала или они могут добавляться в процессе приготовления водного экстракта. Указанные добавочные компоненты могут быть ферментами. Таким образом, раствор для затирания может содержать один или несколько ферментов. Указанные ферменты могут быть добавлены в водный раствор с самого начала или впоследствии во время процесса.Typically, said mash solution may be water, such as tap water, to which one or more additional components may be added. Additional components may be present in the aqueous solution from the very beginning, or they may be added during the preparation of the aqueous extract. Said additional components may be enzymes. Thus, the mash solution may contain one or more enzymes. These enzymes can be added to the aqueous solution from the very beginning or subsequently during the process.
Указанные ферменты могут, например, представлять собой один или несколько гидролитических ферментов. Подходящие ферменты включают липазы, ферменты, разлагающие крахмал (например, амилазы), глюканазы [предпочтительно (1-4)- и/или (1,3;1,4)-в-глюканазы], и/или ксиланазы (такие как арабиноксиланазы), и/или протеазы, или смеси ферментов, содержащие один или несколько вышеупомянутых ферментов, например, Cereflo, Ultraflo или Ondea Pro (Novozymes). Например, водный раствор может содержать один или несколько гидролитических ферментов, выбранных из группы, состоящей из αамилазы, β-амилазы, предельной декстриназы, пуллуланазы, β-глюканазы (например эндо-(1,3;1,4)-вглюканазы или эндо-1,4-в-глюканазы), ксиланазы (например, эндо- или экзо-1,4-ксиланазы, арабинофуранозидазы или эстеразы феруловой кислоты), глюкоамилазы и протеазы.Said enzymes may, for example, be one or more hydrolytic enzymes. Suitable enzymes include lipases, starch-degrading enzymes (eg amylases), glucanases [preferably (1-4)- and/or (1,3;1,4)-β-glucanases], and/or xylanases (such as arabinoxylanases ), and/or proteases, or enzyme mixtures containing one or more of the above enzymes, for example Cereflo, Ultraflo or Ondea Pro (Novozymes). For example, the aqueous solution may contain one or more hydrolytic enzymes selected from the group consisting of α-amylase, β-amylase, limit dextrinase, pullulanase, β-glucanase (for example, endo-(1,3;1,4)-glucanase or endo-glucanase 1,4-β-glucanases), xylanases (eg endo- or exo-1,4-xylanases, arabinofuranosidases or ferulic acid esterases), glucoamylases and proteases.
В одном варианте осуществления к указанному раствору для затирания β-глюканаза не добавляется или добавляется только в ограниченном количестве.In one embodiment, no or only a limited amount of β-glucanase is added to said mash solution.
Указанные добавочные компоненты, предпочтительно пищевого качества, также могут представлять собой соль, например CaCl2, или кислоту, например Н3РО4.Said additive components, preferably food grade, may also be a salt, for example CaCl 2 , or an acid, for example H 3 PO 4 .
Водный экстракт обычно готовят инкубацией ячменной муки, муки из зеленого солода и/или муки из высушенного в печи солода в растворе для затирания при одной или нескольких заранее заданных температурах. Указанная заданная температура также может упоминаться в данном документе как температура затирания. Указанные температуры затирания могут быть, например, обычными температурами, используемыми для затирания. Температура затирания, как правило, либо поддерживается постоянной (изотермическое затирание), либо постепенно увеличивается, например, повышается последовательно. В любом случае растворимые вещества в зернах ячменя и/или солоде высвобождаются в указанный раствор для затирания, образуя водный экстракт.The aqueous extract is typically prepared by incubating barley flour, green malt flour and/or kiln-dried malt flour in a mash solution at one or more predetermined temperatures. Said target temperature may also be referred to herein as the mash temperature. Said mashing temperatures may be, for example, normal temperatures used for mashing. The mash temperature is typically either kept constant (isothermal mashing) or gradually increased, e.g. incrementally. In either case, the soluble substances in the barley grains and/or malt are released into said mash liquor to form an aqueous extract.
Температура(ы) затирания обычно представляют собой температуру(ы) в диапазоне от 30 до 90°С, например, в диапазоне от 40 до 85°С, например в диапазоне от 50 до 85°С. Температуры затирания могут быть выбраны в соответствии с используемым типом ячменя. В частности, может использоваться относительно низкая температура затирания, например, температура в диапазоне от 50 до 60°С. Часто инкубация в растворе для затирания включает заключительную стадию нагревания до более высокой температуры, например до температуры в диапазоне от 75 до 80°С.The mash temperature(s) is typically a temperature(s) in the range of 30 to 90°C, for example in the range of 40 to 85°C, for example in the range of 50 to 85°C. Mashing temperatures can be selected according to the type of barley used. In particular, a relatively low mash temperature may be used, for example a temperature in the range of 50 to 60°C. Often the mash incubation includes a final step of heating to a higher temperature, for example a temperature in the range of 75 to 80°C.
После инкубации в водном растворе, например, в сосуде для затирания, водный раствор может быть перенесен в другой контейнер, например в фильтрационный чан, и выдержан в течение дополнительного времени при повышенной температуре.After incubation in an aqueous solution, such as a mash vessel, the aqueous solution may be transferred to another container, such as a lauter tun, and held for additional time at elevated temperature.
Неограничивающие примеры применимых протоколов затирания можно найти в литературе по солодованию, например, в Hough et al. (выше).Non-limiting examples of applicable mashing protocols can be found in the malting literature, such as Hough et al. (higher).
Затирание (т.е. инкубация ячменной муки, муки из зеленого солода и/или муки из высушенного в печи солода в растворе для затирания) может происходить в присутствии добавок, которые, как считается, включают любой источник углеводов, кроме солода или пророщенных зерен ячменя, таких как, но не ограничиваясь ими, ячмень, ячменные сиропы или кукуруза или рис - или как целые зерна, или в виде обработанных продуктов, таких как крупы, сиропы или крахмал. Все вышеупомянутые добавки могут использоваться, главным образом, в качестве дополнительного источника экстракта (сиропы обычно дозируют во время нагревания сусла). Требования к обработке добавки на пивоваренном заводе зависят от состояния и типа используемой добавки.Mashing (i.e. incubating barley flour, green malt flour and/or kiln-dried malt flour in a mashing solution) can occur in the presence of additives, which are considered to include any source of carbohydrates other than malt or sprouted barley grains such as, but not limited to, barley, barley syrups or corn or rice - either as whole grains or in the form of processed products such as cereals, syrups or starches. All of the above additives can be used primarily as an additional source of extract (syrups are usually dosed while the wort is heating). The additive handling requirements at the brewery depend on the condition and type of additive used.
После инкубации в растворе для затирания водный экстракт обычно может быть разделен, например, путем фильтрации на водный экстракт и остаточные нерастворенные твердые частицы, последние также обозначены как отработанное зерно. Фильтрация может выполняться, например, в фильтрационном чане. В качестве альтернативы, фильтрация может представлять собой фильтрацию через затворныйAfter incubation in the mash solution, the aqueous extract can usually be separated, for example by filtration, into the aqueous extract and residual undissolved solids, the latter also referred to as spent grain. Filtration can be carried out, for example, in a filtration tank. Alternatively, the filtration may be gate filtration
- 16 045156 фильтр. Полученный таким образом водный экстракт также может быть обозначен как первое сусло. Дополнительная жидкость, такая как вода, может быть добавлена к отработанным зернам во время процесса, также обозначенного как барботирование. После барботирования и фильтрации можно получить второе сусло. Дальнейшее сусло может быть приготовлено путем повторения процедуры. Таким образом, водный экстракт может представлять собой сусло, например, первое сусло, второе сусло, дополнительное сусло или их комбинацию.- 16 045156 filter. The aqueous extract thus obtained can also be designated as the first wort. Additional liquid, such as water, can be added to the spent grains during a process also referred to as sparging. After bubbling and filtering, you can get a second wort. Further wort can be prepared by repeating the procedure. Thus, the aqueous extract may be a wort, such as a first wort, a second wort, an additional wort, or a combination thereof.
Способ приготовления водного экстракта в одном варианте осуществления может быть выполнен с использованием любого из устройств, описанных в международной заявке на патент РСТ/ЕР2О17/О65498, например, любого из устройств, описанных в ней на с. 20-22. Неограничивающий пример применимого устройства представлен в данном документе на фиг. 4.The method for preparing an aqueous extract in one embodiment can be performed using any of the devices described in international patent application PCT/EP2O17/O65498, for example, any of the devices described therein on p. 20-22. A non-limiting example of a useful device is shown herein in FIG. 4.
Неполностью деградированные (1,3;1,4)-в-глюканы могут быть особенно неприятными для пивоваров, потому что они могут быть извлечены из солода в растворимых формах, которые образуют высоковязкие водные растворы, которые замедляют процессы фильтрации на пивоваренном заводе. Интересно, что растения ячменя по изобретению имеют низкий уровень (1,3;1,4)-β-глюканов, и, таким образом, сусло, приготовленное из таких растений ячменя, обычно имеет низкую вязкость. В одном варианте осуществления изобретение относится к суслу, полученному из растения ячменя, несущего мутацию в гене CsIF6, причем указанное сусло имеет более низкую вязкость по сравнению с суслом, полученным из растения ячменя, несущего ген CsIF6 дикого типа, но в остальном имеющего тот же генотип растения ячменя, раскрытого в данном документе. Указанное сусло обычно получают экстракцией зерен ячменя и/или солода.Incompletely degraded (1,3;1,4)-glucans can be particularly troublesome to brewers because they can be extracted from the malt in soluble forms, which form highly viscous aqueous solutions that slow filtration processes in the brewery. Interestingly, the barley plants of the invention have low levels of (1,3;1,4)-β-glucans, and thus wort prepared from such barley plants typically has low viscosity. In one embodiment, the invention relates to wort obtained from a barley plant carrying a mutation in the CsIF6 gene, wherein the wort has a lower viscosity compared to wort obtained from a barley plant carrying the wild type CsIF6 gene, but otherwise having the same genotype barley plants disclosed herein. Said wort is usually obtained by extracting barley grains and/or malt.
В одном варианте осуществления изобретение относится к суслу, где указанное сусло получают из растения ячменя, несущего любую из мутаций в гене CsIF6, описанном в данном документе, где указанное сусло имеет вязкость в диапазоне от 0,5 до 1,0 мПа-с ниже, например, в диапазоне от 0,5 до 0,8 мПа-с ниже, чем вязкость сусла, полученного таким же образом из растения ячменя, несущего ген CsIF6 дикого типа, но в остальном имеющего тот же генотип. В одном варианте осуществления изобретение относится к суслу, в котором указанное сусло получают из растения ячменя, несущего любую из мутаций в гене CsIF6, описанном в данном документе, и указанное сусло имеет вязкость в диапазоне от 1,7 до 2,5 мПа-с, такую как в диапазоне от 1,8 до 2,5 мПа-с, например, от 2,0 до 2,5 мПа-с, такую как от 2,1 до 2,5 мПа-с, например, от 1,8 до 2,2 мПа-с, такую как около 2 мПа-с, например, около 2,1 мПа-с, такую как около 2,2 мПа-с. В частности, растение ячменя может нести мутированный ген HvCsIF6, кодирующий мутантный белок HvCsIF6, содержащий мутацию (например, Gly^Asp) аминокислоты 748 в SEQ ID NO: 1.In one embodiment, the invention relates to wort, wherein said wort is obtained from a barley plant carrying any of the mutations in the CsIF6 gene described herein, wherein said wort has a viscosity in the range of 0.5 to 1.0 mPa-s below, for example, in the range of 0.5 to 0.8 mPa-s lower than the viscosity of wort obtained in the same way from a barley plant carrying the wild-type CsIF6 gene, but otherwise having the same genotype. In one embodiment, the invention relates to a wort, wherein said wort is obtained from a barley plant carrying any of the mutations in the CsIF6 gene described herein, and wherein said wort has a viscosity in the range of 1.7 to 2.5 mPa-s, such as in the range from 1.8 to 2.5 mPa-s, for example from 2.0 to 2.5 mPa-s, such as from 2.1 to 2.5 mPa-s, for example from 1.8 up to 2.2 mPa-s, such as about 2 mPa-s, for example, about 2.1 mPa-s, such as about 2.2 mPa-s. In particular, a barley plant may carry a mutated HvCsIF6 gene encoding a mutant HvCsIF6 protein containing a mutation (e.g., Gly^Asp) at amino acid 748 in SEQ ID NO: 1.
В одном варианте осуществления изобретение относится к суслу, где указанное сусло получают из солода, полученного из растения ячменя, несущего любую из мутаций в гене CsIF6, описанном в данном документе, где указанное сусло имеет вязкость не более чем 2,2 мПа-с.In one embodiment, the invention relates to wort, wherein said wort is obtained from malt obtained from a barley plant carrying any of the mutations in the CsIF6 gene described herein, wherein said wort has a viscosity of no more than 2.2 mPas.
Вязкость сусла, приготовленного из стандартного солода, приготовленного путем замачивания в течение от 1 до 2 дней и проращивания в течение от 5 до 7 дней с последующей печной сушкой, составляет около 2 мПа-с.The viscosity of wort made from standard malt prepared by soaking for 1 to 2 days and sprouting for 5 to 7 days followed by oven drying is about 2 mPa-s.
Напиток и способ его производства.Drink and method of its production.
Настоящее изобретение также относится к напиткам на основе ячменя и способам производства таких напитков, где растение ячменя или его потомство имеет пониженный уровень (1,3;1,4)-в-глюканов и несет мутацию в гене CsIF6. Изобретение также относится к напиткам на основе ячменя, приготовленным из растений ячменя, несущих мутацию в гене CsIF6, или их потомства.The present invention also relates to barley-based beverages and methods for producing such beverages, wherein the barley plant or its progeny has a reduced level of (1,3;1,4)-β-glucans and carries a mutation in the CsIF6 gene. The invention also relates to barley-based drinks prepared from barley plants carrying a mutation in the CsIF6 gene or their progeny.
Указанный напиток может представлять собой алкогольные напитки на основе ячменя или безалкогольные напитки на основе ячменя. Алкогольные напитки на основе ячменя могут представлять собой, например, пиво или дистиллированный спирт.Said beverage may be barley-based alcoholic beverages or barley-based soft drinks. Barley-based alcoholic beverages can be, for example, beer or distilled alcohol.
Указанное пиво может представлять собой любой вид пива, например, лагер или эль. Таким образом, пиво может быть выбрано, например, из группы, состоящей из altbier, Amber ale, Barley wine, Berliner Weisse, Biere de Garde, Bitter, Blonde Ale, Bock, Brown ale,Said beer may be any type of beer, such as lager or ale. Thus, the beer can be selected, for example, from the group consisting of altbier, Amber ale, Barley wine, Berliner Weisse, Biere de Garde, Bitter, Blonde Ale, Bock, Brown ale,
California Common, Cream Ale, Dortmunder Export, Doppelbock, Dunkel, Dunkelweizen,California Common, Cream Ale, Dortmunder Export, Doppelbock, Dunkel, Dunkelweizen,
Eisbock, Fruit lambic, Golden Ale, Gose, Gueuze, Hefeweizen, Helles, India pale ale, Kolsch, Lambic, Light ale, Maibock, Malt liquor, Mild, Marzenbier, Old ale, Oud bruin, Pale ale, Pilsener, Porter, Red ale, Roggenbier, Saison, Scotch ale, Steam beer, Stout, Schwarzbier, lager, Witbier, Weissbier и Weizenbock.Eisbock, Fruit lambic, Golden Ale, Gose, Gueuze, Hefeweizen, Helles, India pale ale, Kolsch, Lambic, Light ale, Maibock, Malt liquor, Mild, Marzenbier, Old ale, Oud bruin, Pale ale, Pilsener, Porter, Red ale, Roggenbier, Saison, Scotch ale, Steam beer, Stout, Schwarzbier, lager, Witbier, Weissbier and Weizenbock.
Указанный дистиллированный спирт может представлять собой любой дистиллированный спирт. В частности, дистиллированный спирт может быть на основе ячменя, например, ячменного солода. Неограничивающие примеры такого дистиллированного спирта включают виски и водку.Said distilled alcohol may be any distilled alcohol. In particular, the distilled alcohol may be barley based, for example barley malt. Non-limiting examples of such distilled spirits include whiskey and vodka.
Напиток может представлять собой безалкогольный напиток, такой как безалкогольный напиток на основе ячменя, например, безалкогольное пиво или безалкогольные солодовые напитки, такие как мальтина.The beverage may be a non-alcoholic beverage, such as a barley-based soft drink, such as a non-alcoholic beer or a non-alcoholic malt beverage such as a malt.
Напиток может, например, быть приготовлен способом, включающим стадии:The beverage may, for example, be prepared by a method comprising the steps of:
(i) обеспечения ядер растения ячменя по изобретению и/или зеленого солода и/или высушенного в(i) providing barley plant kernels according to the invention and/or green malt and/or dried in
- 17 045156 печи солода, приготовленного из ядер растения ячменя по изобретению;- 17 045156 kilns of malt prepared from the kernels of a barley plant according to the invention;
(ii) приготовления водного экстракта из указанных ядер и/или указанного солода, например, как описано в данном документе выше в разделе, посвященном приготовлению водного экстракта;(ii) preparing an aqueous extract from said kernels and/or said malt, for example as described herein above in the section on preparing an aqueous extract;
(iii) переработки указанного водного экстракта в напиток.(iii) processing said aqueous extract into a beverage.
Водный экстракт можно кипятить с хмелем или без него, после чего его можно назвать вареным суслом. Первое, второе и дополнительные сусла могут быть объединены, а затем подвергнуты кипячению. Водный экстракт можно кипятить в течение любого подходящего периода времени, например, в диапазоне от 60 до 120 мин.The aqueous extract can be boiled with or without hops, after which it can be called boiled wort. The first, second and additional worts can be combined and then boiled. The aqueous extract can be boiled for any suitable period of time, for example in the range of 60 to 120 minutes.
Стадия (iii) может содержатьStep (iii) may contain
a) нагревание указанного водного экстракта необязательно в присутствии хмеля или экстракта хмеля;a) heating said aqueous extract optionally in the presence of hops or hop extract;
b) охлаждение водного экстракта;b) cooling the aqueous extract;
c) сбраживание указанного водного экстракта с дрожжами с получением ферментированного напитка.c) fermenting said aqueous extract with yeast to produce a fermented beverage.
Стадия (iii) может, в частности, включать сбраживание указанного водного экстракта, например, путем сбраживания сусла. Таким образом, напиток может быть приготовлен путем сбраживания водного экстракта с дрожжами.Step (iii) may in particular comprise fermenting said aqueous extract, for example by fermenting wort. Thus, the drink can be prepared by fermenting the water extract with yeast.
После приготовления водного экстракта его можно перерабатывать в пиво любым способом, включая обычные способы пивоварения. Неограниченные описания примеров подходящих способов пивоварения можно найти, например, в публикациях Hough et al. (1982). Доступны многочисленные, регулярно обновляемые способы анализа продуктов из ячменя и пива, например, но не ограничиваясь ими, Американская ассоциация химиков-зерновиков (American Association of Cereal Chemists) (1995), Американское общество солодованных химиков (American Society of Brewing Chemists) (1992), Европейская конвенция о солодовании (European Brewery Convention) (1998) и Институт солодования (Institute of Brewing) (1997). Признано, что для определенной пивоварни используется много специфических процедур, причем наиболее значительные различия касаются предпочтений местного потребителя. Любой такой способ производства пива может быть использован с настоящим изобретением.Once the aqueous extract is prepared, it can be processed into beer by any method, including conventional brewing methods. Unlimited descriptions of examples of suitable brewing methods can be found, for example, in the publications of Hough et al. (1982). Numerous, regularly updated methods for analyzing barley and beer products are available, such as, but not limited to, American Association of Cereal Chemists (1995), American Society of Brewing Chemists (1992) , European Brewery Convention (1998) and Institute of Brewing (1997). It is recognized that many specific procedures are used for a given brewery, with the most significant differences being local consumer preferences. Any such beer production method can be used with the present invention.
Первая стадия производства пива из водного экстракта предпочтительно включает кипячение указанного водного экстракта, как описано в данном документе выше, с последующей фазой охлаждения и, необязательно, вихревой ванны. Одно или несколько добавочных соединений могут быть добавлены к водному экстракту, например, одно или несколько добавочных соединений, описанных ниже в разделе Добавочные соединения. После охлаждения водный экстракт можно перенести в бродильные чаны, содержащие дрожжи, например, пивные дрожжи, такие как S. pastorianus или S. cerevisiae. Водный экстракт может быть подвергнут сбраживанию в течение любого подходящего периода времени, обычно в диапазоне от 1 до 20 дней, например от 1 до 10 дней. Сбраживание проводят при любой применимой температуре, например, при температуре в диапазоне от 10 до 20°С. Способы могут также включать добавление одного или нескольких ферментов, например, один или несколько ферментов могут быть добавлены в сусло до или во время сбраживания. В частности, указанный фермент может представлять собой пролин-специфическую эндопротеазу. Неограничивающими примерами пролин-специфической эндопротеазы является Brewer's Clarex, доступная от DSM. В других вариантах осуществления экзогенные ферменты не добавляют во время проведения способов.The first stage of producing beer from an aqueous extract preferably involves boiling said aqueous extract as described above herein, followed by a cooling phase and optionally a whirlpool bath. One or more additional compounds may be added to the aqueous extract, for example, one or more additional compounds described below under Additional Compounds. After cooling, the aqueous extract can be transferred to fermentation tanks containing yeast, for example brewer's yeast such as S. pastorianus or S. cerevisiae. The aqueous extract may be fermented for any suitable period of time, typically ranging from 1 to 20 days, for example 1 to 10 days. Fermentation is carried out at any applicable temperature, for example at a temperature in the range from 10 to 20°C. The methods may also include adding one or more enzymes, for example, one or more enzymes may be added to the wort before or during fermentation. In particular, said enzyme may be a proline-specific endoprotease. Non-limiting examples of proline-specific endoprotease include Brewer's Clarex, available from DSM. In other embodiments, exogenous enzymes are not added during the methods.
Во время процесса сбраживания продолжительностью в несколько дней сахар превращается в спирт и CO2 одновременно с образованием некоторых ароматических веществ. Сбраживание может быть прекращена в любое желаемое время, например, если не наблюдается дальнейшего снижения % Р.During the fermentation process, which lasts several days, sugar is converted into alcohol and CO 2 at the same time as some aromatic substances are formed. Fermentation can be stopped at any desired time, for example if there is no further decrease in %R.
Впоследствии пиво может быть дополнительно переработано, например, охлаждено. Оно также может быть отфильтровано и/или выдержано (lagered) - процесс, при котором приобретается приятный аромат и уменьшается привкус дрожжей. Также могут быть добавлены добавки. Кроме того, может быть добавлен CO2. Наконец, пиво может быть пастеризовано и/или отфильтровано перед упаковкой (например, перенесено в контейнеры или кеги, разлито в бутылки или консервировано). Пиво также можно пастеризовать стандартными способами.Subsequently, the beer can be further processed, for example, cooled. It can also be filtered and/or lagered, a process that develops a pleasant aroma and reduces the yeast taste. Additives may also be added. In addition, CO2 can be added. Finally, the beer may be pasteurized and/or filtered before packaging (eg, transferred to containers or kegs, bottled, or canned). Beer can also be pasteurized using standard methods.
Добавочные соединения.Additional connections.
Способы по изобретению могут включать стадию добавления одного или нескольких добавочных соединений. Указанные добавочные соединения могут, например, представлять собой ароматизирующее соединение, консервант, функциональный ингредиент, краситель, подсластитель, средство, регулирующее pH, или соль. Средство, регулирующее pH, может, например, представлять собой буфер или кислоту, такую как фосфорная кислота.The methods of the invention may include the step of adding one or more additional compounds. Said additive compounds may, for example, be a flavoring compound, a preservative, a functional ingredient, a coloring agent, a sweetener, a pH adjusting agent, or a salt. The pH adjusting agent may, for example, be a buffer or an acid such as phosphoric acid.
Функциональными ингредиентами может быть любой ингредиент, добавленный для достижения заданной функции. Предпочтительно функциональный ингредиент делает напиток более здоровым. Неограничивающие примеры функциональных ингредиентов включают витамины или минералы.Functional ingredients can be any ingredient added to achieve a given function. Preferably, the functional ingredient makes the drink healthier. Non-limiting examples of functional ingredients include vitamins or minerals.
Консервант может представлять собой любым пищевой консервант, например, он может представлять собой бензойную кислоту, сорбиновую кислоту, сорбаты (например, сорбат калия), сульфиты и/или их соли.The preservative may be any food preservative, for example it may be benzoic acid, sorbic acid, sorbates (eg potassium sorbate), sulfites and/or salts thereof.
Добавочное соединение также может представлять собой CO2. В частности, CO2 может быть добав- 18 045156 лен для получения газированного напитка.The additional compound may also be CO 2 . In particular, CO 2 can be added to produce a carbonated drink.
Вкусовое соединение, используемое в настоящем изобретении, может представлять собой любое применимое вкусовое соединение. Вкусовое соединение может быть выбрано, например, из группы, состоящей из ароматических добавок, растительных экстрактов, растительных концентратов, частей растения и настоев из трав. В частности, вкусовые соединения могут быть хмелем.The flavor compound used in the present invention may be any suitable flavor compound. The flavor compound may be selected, for example, from the group consisting of flavors, herbal extracts, herbal concentrates, plant parts, and herbal infusions. In particular, the flavor compounds may be hops.
Способ получения растения ячменя с мутацией в CsIF6.Method for obtaining a barley plant with a mutation in CsIF6.
Растения ячменя, несущие мутацию в CsIF6, например, любую из специфических мутаций, описанных в данном документе, могут быть получены любым применимым способом.Barley plants carrying a mutation in CsIF6, for example, any of the specific mutations described herein, can be obtained by any applicable method.
Например, такие растения ячменя могут быть получены способом, включающим стадии подвергания множества растений ячменя или ядер ячменя случайному мутагенезу, например, облучением или химической обработкой, например обработкой азидом натрия;For example, such barley plants can be produced by a process comprising the steps of subjecting a plurality of barley plants or barley kernels to random mutagenesis, for example, by irradiation or chemical treatment, for example by treatment with sodium azide;
идентификации растений ячменя или ядер ячменя, несущих мутацию в CsIF6.identification of barley plants or barley kernels carrying a mutation in CsIF6.
Такие способы могут также включать одну или несколько стадий воспроизводства указанных растений ячменя/ядер ячменя для того, чтобы получить множество растений растений/ядер ячменя, каждое из которых несет случайные мутации.Such methods may also include one or more steps of propagating said barley plants/barley kernels to produce a plurality of plant plants/barley kernels, each of which carries random mutations.
В частности, растения ячменя, несущие определенную мутацию в CsIF6, могут быть получены и идентифицированы, по существу, как описано в международной патентной заявке РСТ/ЕР2О17/О65516, с использованием праймеров и зондов, предназначенных для идентификации мутации в гене CsIF6. Примеры праймеров и зондов, применимых для идентификации растения ячменя, несущего мутацию в гене CsIF6, в результате чего указанный ген кодирует мутантный белок CsIF6, несущий одну из мутаций G847E или G748D, представлены в табл. 2. Специалисты на основе общих знаний и/или руководства, предоставленного в международной заявке на патент РСТ/ЕР2О17/О65516, которая включена в настоящий документ в качестве ссылки, смогут разработать приемлемые праймеры и зонды для идентификации других мутантов.In particular, barley plants carrying a particular mutation in CsIF6 can be obtained and identified essentially as described in international patent application PCT/EP2O17/O65516, using primers and probes designed to identify a mutation in the CsIF6 gene. Examples of primers and probes useful for identifying a barley plant carrying a mutation in the CsIF6 gene, resulting in the gene encoding a mutant CsIF6 protein carrying one of the G847E or G748D mutations, are presented in Table. 2. Those skilled in the art, based on general knowledge and/or guidance provided in international patent application PCT/EP2O17/O65516, which is incorporated herein by reference, will be able to develop suitable primers and probes for identifying other mutants.
Растения ячменя, несущие мутацию в гене CsIF6, также могут быть получены с использованием различных способов сайт-направленного мутатогенеза, которые, например, могут быть сконструированы на основе последовательности гена CsIF6, представленной в настоящем документе. В одном варианте осуществления изобретения растение ячменя получают с использованием любого из CRISPR, TALEN, цинкового пальца, мегануклеазы и ДНК-разрезающего (DNA-cutting) антибиотика, как описано в WO 2017/138986. В одном варианте осуществления растение ячменя получают с использованием технологии CRISPR/cas9, например, с использованием РНК-Направляющей нуклеазы Cas9. Это может быть сделано, как описано в Lawrenson et al., Genome Biology (2015), 16:258, DOI: 10.1186/sl30 59-015-0826-7, за исключением того, что последовательность одиночной направляющей РНК сконструирована на основе обеспеченных в данном документе последовательностей генов. В одном варианте осуществления изобретения растение ячменя получают, используя комбинацию обоих способов TALEN и CRISPR/cas9, например, с помощью РНК-направляющей нуклеазы Cas9. Это может быть сделано, как описано в Holme et al., Plant. Mol. Biol. (2017), 95:111-121, DOI: 10.1007/s11103-017-0640-6 за исключением того, что TALEN и последовательность одиночной направляющей РНК сконструированы на основе последовательностей генов, обеспеченных в данном документе.Barley plants carrying a mutation in the CsIF6 gene can also be produced using various site-directed mutatogenesis methods, which, for example, can be designed based on the CsIF6 gene sequence presented herein. In one embodiment of the invention, a barley plant is produced using any of CRISPR, TALEN, zinc finger, meganuclease and DNA-cutting antibiotic, as described in WO 2017/138986. In one embodiment, a barley plant is produced using CRISPR/cas9 technology, for example, using Cas9 Guide RNA nuclease. This can be done as described in Lawrenson et al., Genome Biology (2015), 16:258, DOI: 10.1186/sl30 59-015-0826-7, except that the single guide RNA sequence is designed based on those provided in this gene sequence document. In one embodiment of the invention, a barley plant is produced using a combination of both TALEN and CRISPR/cas9 methods, for example using the Cas9 RNA guide nuclease. This can be done as described in Holme et al., Plant. Mol. Biol. (2017), 95:111-121, DOI: 10.1007/s11103-017-0640-6 except that the TALEN and single guide RNA sequence are designed based on the gene sequences provided herein.
В одном варианте осуществления изобретения зерновое растение получают с использованием направляемой гомологией репарации, комбинации ДНК-разрезающей нуклеазы и фрагмента донорной ДНК. Это может быть сделано, как описано в Sun et al., Molecular Plant (2016), 9:628-631, DOI: https://doi.org/10.1016/j.molp.2016.01.001 за исключением того, что ДНК-разрезающая нуклеаза разработана на основе обеспеченных в данном документе последовательностей генов и фрагмент донорной ДНК разработан на основе кодирующей последовательности варианта мутировавшего злака, обеспеченной в данном документе.In one embodiment of the invention, a cereal plant is produced using homology-directed repair, a combination of a DNA cutting nuclease and a donor DNA fragment. This can be done as described in Sun et al., Molecular Plant (2016), 9:628-631, DOI: https://doi.org/10.1016/j.molp.2016.01.001 except that the DNA The -cutting nuclease is designed based on the gene sequences provided herein, and the donor DNA fragment is designed based on the coding sequence of the mutated cereal variant provided herein.
В одном варианте осуществления изобретения цель состоит в том, чтобы обеспечить агрономически применимые растения ячменя, несущие мутацию в гене CsIF6. В дополнение к мутации в гене CsIF6 существуют и другие факторы, которые также могут учитываться при создании коммерческого сорта ячменя, применимого для солодования и/или пивоварения и/или в качестве основы для напитков, например, урожай и размер ядра, и другие параметры, которые относятся к производительности солодования или производительности пивоварения. Поскольку многие, если не все, соответствующие признаки, как было показано, находятся под генетическим контролем, настоящее изобретение также относится к современным, гомозиготным, высокоурожайным сортам для солодования, которые могут быть получены от скрещивания с растениями ячменя, которые раскрыты в настоящей публикации. Специалистселекционер, занимающийся выведением ячменя, сможет отбирать и выращивать растения ячменя, которые после скрещивания с другими растениями ячменя приведут к превосходящим по качеству сортам. Альтернативно, селекционер может использовать растения по настоящему изобретению для дальнейшего мутагенеза с целью получения новых сортов, несущих дополнительные мутации в дополнение к мутации гена CsIF6.In one embodiment of the invention, the object is to provide agronomically useful barley plants carrying a mutation in the CsIF6 gene. In addition to the mutation in the CsIF6 gene, there are other factors that may also be considered when developing a commercial barley variety useful for malting and/or brewing and/or as a beverage base, such as yield and kernel size, and other parameters that refer to malting performance or brewing performance. Since many, if not all, of the relevant traits have been shown to be under genetic control, the present invention also relates to modern, homozygous, high-yielding malting varieties that can be obtained from crosses with the barley plants disclosed herein. A specialist barley breeder will be able to select and grow barley plants that, when crossed with other barley plants, will result in superior varieties. Alternatively, the plant breeder may use the plants of the present invention for further mutagenesis to produce new varieties carrying additional mutations in addition to the CsIF6 gene mutation.
Изобретение также включает растения ячменя, несущие мутацию в гене CsIF6, полученные способом селекции растений, включая способы самоопыления, обратного скрещивания, скрещивания с попу- 19 045156 ляциями и т.п. Способы обратного скрещивания могут быть использованы с настоящим изобретением для введения в другой сорт мутации гена CsIF6.The invention also includes barley plants carrying a mutation in the CsIF6 gene, obtained by plant breeding methods, including methods of selfing, backcrossing, crossing with populations, and the like. Backcrossing methods can be used with the present invention to introduce a CsIF6 gene mutation into another variety.
В одном варианте осуществления изобретение относится к потомству растения ячменя, депонированному 12-11-2018 г. в NCIMB под регистрационным номером NCIMB 43273 и именуемому мутант 2. Указанное потомство может быть получено любым применимым способом, включая, но не ограничиваясь ими, самоопыление, возвратное скрещивание или скрещивание с другими популяциями. В частности, указанное потомство может также нести G^A мутацию нуклеотида 2243 в кодирующей последовательности гена HvCsIF6 (SEQ ID NO: 2).In one embodiment, the invention relates to the progeny of a barley plant deposited on 12-11-2018 with NCIMB under NCIMB registration number 43273 and referred to as mutant 2. Said progeny can be produced by any applicable method, including, but not limited to, selfing, recurrent interbreeding or interbreeding with other populations. In particular, said progeny may also carry a G^A mutation at nucleotide 2243 in the coding sequence of the HvCsIF6 gene (SEQ ID NO: 2).
Способ ускорения процесса селекции растений заключается в первоначальном размножении генерируемых мутантов путем применения способов культивирования тканей и регенерации. Таким образом, другой аспект настоящего изобретения заключается в создании клеток, которые при росте и дифференцировке продуцируют растения ячменя, несущие мутацию гена CsIF6. Например, селекция может включать традиционные скрещивания, подготовку плодородных растений, полученных из пыльников, или использование культуры микроспор.A way to speed up the plant breeding process is to initially propagate the generated mutants through the use of tissue culture and regeneration techniques. Thus, another aspect of the present invention is to create cells that, when grown and differentiated, produce barley plants carrying a mutation in the CsIF6 gene. For example, breeding may involve traditional crossbreeding, the preparation of fertile plants derived from anthers, or the use of microspore culture.
В одном варианте осуществления растение ячменя по изобретению не было получено исключительно при помощи по существу биологического способа. Потомство растения ячменя, полученного с помощью технического способа, рассматривается в данном документе как не исключительно полученное при помощи по существу биологического способа, поскольку исходное растение получают техническим способом.In one embodiment, the barley plant of the invention was not obtained solely using an essentially biological method. The progeny of a barley plant obtained by a technical method is considered herein as not exclusively obtained by an essentially biological method, since the parent plant is obtained by a technical method.
В одном варианте осуществления растение ячменя несет мутацию в гене CsIF6, где указанная мутация индуцирована химическими и/или физическими средствами.In one embodiment, the barley plant carries a mutation in the CsIF6 gene, where the mutation is induced by chemical and/or physical means.
В одном варианте осуществления растение ячменя было получено способом, включающим стадию индуцированного мутагенеза, или указанное растение является потомством растения, полученного способом, включающим стадию индуцированного мутагенеза. Таким образом, растение ячменя может представлять собой растение ячменя, полученное способом, включающим следующие стадии, или потомство растения, полученное способом, включающим следующую стадию: мутагенез растения ячменя или их части, например, с помощью химического мутагенизирующего агента, такого как NaN3 In one embodiment, the barley plant was produced by a process including an induced mutagenesis step, or said plant is a progeny of a plant produced by a process including an induced mutagenesis step. Thus, the barley plant may be a barley plant produced by a process comprising the following steps, or a progeny plant produced by a process comprising the following step: mutagenesis of the barley plant or part thereof, for example using a chemical mutagenizing agent such as NaN 3
Отбор растений ячменя, несущих одну из вышеупомянутых мутаций в гене CsIF6.Selection of barley plants carrying one of the above-mentioned mutations in the CsIF6 gene.
В одном варианте осуществления указанная мутация гена CsIF6 приводит в результате к мутантному гену CsIF6, кодирующему мутантный полипептид CsIF6, где указанный мутантный полипептид CsIF6 представляет собой CsIF6 с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 за исключением того, что мутантный CsIF6 содержит замену аминокислоты 847 на заряженную аминокислоту, например, на глутаминовую кислоту. В частности, указанный мутантный ген CsIF6 может нести G^A мутацию нуклеотида 2243 в кодирующей последовательности гена HvCsIF6 (SEQ ID NO:2).In one embodiment, said mutation of the CsIF6 gene results in a mutant CsIF6 gene encoding a mutant CsIF6 polypeptide, wherein said mutant CsIF6 polypeptide is CsIF6 of the sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 except that the mutant CsIF6 contains replacing amino acid 847 with a charged amino acid, such as glutamic acid. In particular, said mutant CsIF6 gene may carry a G^A mutation at nucleotide 2243 in the coding sequence of the HvCsIF6 gene (SEQ ID NO:2).
Пункты.Items.
Изобретение может быть дополнительно определено следующими пунктами.The invention may be further defined by the following points.
1. Растение ячменя или его часть, где ядра указанного растения ячменя имеют пониженное содержание (1,3;1,4)-в-глюканов, и где указанное растение ячменя несет мутацию в гене CsIF6, где указанный мутированный ген CsIF6 кодирует мутантный полипептид CsIF6, где указанный мутантный CsIF6 представляет собой CsIF6 последовательности SEQ ID NO: 1 за исключением того, что мутантный CsIF6 содержит замену одной аминокислоты в локализованном в мембране домене в CsIF6, где указанная замена представляет собой замещение неполярной аминокислоты на заряженную аминокислоту или замещение полярной аминокислоты на неполярную аминокислоту, где локализованные в мембране домены CsIF6 состоят из аминокислот от 109 до 128, от 137 до 158, от 700 до 731, от 741 до 758, от 835 до 857 и от 864 до 882 из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3.1. A barley plant or part thereof, where the kernels of said barley plant have a reduced content of (1,3;1,4)-β-glucans, and where said barley plant carries a mutation in the CsIF6 gene, where the specified mutated CsIF6 gene encodes a mutant CsIF6 polypeptide wherein said mutant CsIF6 is the CsIF6 of SEQ ID NO: 1 except that the mutant CsIF6 contains a single amino acid substitution in the membrane-localized domain of CsIF6, wherein said substitution is a substitution of a non-polar amino acid for a charged amino acid or a substitution of a polar amino acid for a non-polar amino acid amino acid, wherein the membrane-localized CsIF6 domains consist of amino acids 109 to 128, 137 to 158, 700 to 731, 741 to 758, 835 to 857, and 864 to 882 of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO : 3.
2. Растение ячменя или его часть, где ядра указанного растения ячменя имеют пониженное содержание (1,3;1,4)-в-глюканов и где указанное растение ячменя несет мутацию в гене CsIF6, где указанный мутированный ген CsIF6 кодирует мутантный полипептид CsIF6, где указанный мутантный CsIF6 представляет собой CsIF6 последовательности SEQ ID NO: 1 за исключением того, что мутантный CsIF6 содержит одну замену аминокислоты в локализованном в мембране домене в CsIF6, где указанная замена представляет собой замещение неполярной аминокислоты на заряженную аминокислоту или замещение полярной аминокислоты на неполярную аминокислоту, где локализованный в мембране домен выбран из группы, состоящей из локализованных в мембране доменов CsIF6, состоящих из аминокислот от 835 до 857 или аминокислот от 700 до 731 или аминокислот от 741 до 775 в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3.2. A barley plant or part thereof, where the kernels of said barley plant have a reduced content of (1,3;1,4)-β-glucans and where said barley plant carries a mutation in the CsIF6 gene, where said mutated CsIF6 gene encodes a mutant CsIF6 polypeptide, wherein said mutant CsIF6 is the CsIF6 of SEQ ID NO: 1 except that the mutant CsIF6 contains one amino acid substitution in the membrane-localized domain in CsIF6, wherein said substitution is a substitution of a non-polar amino acid for a charged amino acid or a substitution of a polar amino acid for a non-polar amino acid wherein the membrane-localized domain is selected from the group consisting of membrane-localized CsIF6 domains consisting of amino acids 835 to 857 or amino acids 700 to 731 or amino acids 741 to 775 in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
3. Растение ячменя по любому из предшествующих пунктов, где указанное растение ячменя имеет содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в диапазоне от 1 до 5% общей массы сухого вещества ядер, например, от 1,3 до 3% общей массы сухого вещества ядер, предпочтительно от 1,3 до 2% общей массы сухого вещества ядер.3. The barley plant according to any one of the preceding claims, wherein said barley plant has a (1,3;1,4)-β-glucan content in the range of 1 to 5% of the total dry matter weight of the kernels, for example, from 1,3 to 3 % of the total dry matter weight of the kernels, preferably from 1.3 to 2% of the total dry matter weight of the kernels.
4. Растение ячменя по любому из предшествующих пунктов, где ядра указанного растения ячменя имеют содержание (1,3;1,4)-в-глюканов, составляющее по меньшей мере 30% и не более чем 60%, предпочтительно не менее 40% и не более чем 60% от содержания (1,3;1,4)-в-глюканов растения ячменя, не-4. The barley plant according to any one of the preceding claims, wherein the kernels of said barley plant have a (1,3;1,4)-β-glucan content of at least 30% and not more than 60%, preferably not less than 40% and no more than 60% of the content of (1,3;1,4)-β-glucans of the barley plant, non-
- 20 045156 сущего ген CsIF6 дикого типа, но в остальном имеющего тот же генотип.- 20 045156 existing wild-type CsIF6 gene, but otherwise having the same genotype.
5. Растение ячменя по любому из предшествующих пунктов, где ядра указанного растения ячменя имеют содержание (1,3;1,4)-в-глюканов, составляющее по меньшей мере 30% и не более чем 60%, предпочтительно по меньшей мере 40% и не более чем 60% от содержания (1,3;1,4)-в-глюканов растения ячменя, несущего ген CsIF6 дикого типа, но в остальном имеющего тот же генотип.5. The barley plant according to any one of the preceding claims, wherein the kernels of said barley plant have a (1,3;1,4)-β-glucan content of at least 30% and not more than 60%, preferably at least 40% and not more than 60% of the content of (1,3;1,4)-β-glucans of a barley plant carrying the wild-type CsIF6 gene, but otherwise having the same genotype.
6. Растение ячменя по любому из предыдущих пунктов, где растение ячменя содержит зерна с частотой битых зерен после обмолота, которая не более чем в 3 раза превышает частоту битых зерен после обмолота зерен растения ячменя, не несущего мутацию в гене CsIF6a, но в остальном имеющего тот же генотип.6. The barley plant according to any of the previous paragraphs, where the barley plant contains grains with a frequency of broken grains after threshing that is no more than 3 times higher than the frequency of broken grains after threshing grains of a barley plant that does not carry a mutation in the CsIF6a gene, but otherwise has the same genotype.
7. Растение ячменя по любому из предшествующих пунктов, где растение ячменя содержит зерна с частотой битых зерен после обмолота, которая не более чем в 2 раза превышает частоту битых зерен после обмолота зерен растения ячменя, не несущего мутацию в гене CsIF6a, но в остальном имеющего тот же генотип.7. The barley plant according to any of the preceding claims, wherein the barley plant contains grains with a broken grain frequency after threshing that is no more than 2 times higher than the frequency of broken grains after threshing grains of a barley plant that does not carry a mutation in the CsIF6a gene, but otherwise has the same genotype.
8. Растение ячменя по любому из предшествующих пунктов, где замена представляет собой замещение неполярной аминокислоты на заряженную аминокислоту.8. The barley plant of any one of the preceding claims, wherein the substitution is a substitution of a non-polar amino acid for a charged amino acid.
9. Растение ячменя по любому из предшествующих пунктов, где указанный мутантный полипептид CsIF6 представляет собой CsIF6 с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 за исключением того, что мутантный CsIF6 содержит замену одной аминокислоты в трансмембранном домене, состоящем из аминокислот от 835 до 857 в CsIF6, где указанная замена представляет собой замещение неполярной аминокислоты на заряженную аминокислоту.9. The barley plant of any one of the preceding claims, wherein said mutant CsIF6 polypeptide is CsIF6 of the sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 except that the mutant CsIF6 contains a single amino acid substitution in a transmembrane domain consisting of amino acids from 835 to 857 in CsIF6, where the substitution is a substitution of a non-polar amino acid for a charged amino acid.
10. Растение ячменя по любому из предыдущих пунктов, где указанный мутантный полипептид CsIF6 представляет собой CsIF6 с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 за исключением того, что мутантный CsIF6 содержит замену аминокислоты 847 на заряженную аминокислоту.10. The barley plant of any one of the preceding claims, wherein said mutant CsIF6 polypeptide is CsIF6 of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 except that the mutant CsIF6 contains a substitution of amino acid 847 for a charged amino acid.
11. Растение ячменя по любому из предшествующих пунктов, где указанный мутантный полипептид CsIF6 представляет собой CsIF6 с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 за исключением того, что мутантный CsIF6 содержит замену аминокислоты 847, где указанная замена представляет собой замещение глицина (G) на глутаминовую кислоту (Е).11. The barley plant of any one of the preceding claims, wherein said mutant CsIF6 polypeptide is CsIF6 of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 except that the mutant CsIF6 contains a substitution at amino acid 847, wherein said substitution is a glycine substitution (G) to glutamic acid (E).
12. Растение ячменя по любому из предшествующих пунктов, где указанное растение ячменя несет мутацию в гене CsIF6, где указанный мутированный ген CsIF6 кодирует мутантный полипептид CsIF6 последовательности SEQ ID NO: 27.12. The barley plant according to any one of the preceding claims, wherein said barley plant carries a mutation in the CsIF6 gene, wherein said mutated CsIF6 gene encodes a mutant CsIF6 polypeptide of the sequence SEQ ID NO: 27.
13. Растение ячменя по любому из предшествующих пунктов, где указанное растение ячменя несет G^A мутацию нуклеотида 2243 в кодирующей последовательности гена HvCsIF6.13. The barley plant according to any one of the preceding claims, wherein said barley plant carries a G^A mutation at nucleotide 2243 in the coding sequence of the HvCsIF6 gene.
14. Растение ячменя по п.13, где кодирующая последовательность гена HvCsIF6 представляет собой SEQ ID NO:2.14. The barley plant according to claim 13, wherein the coding sequence of the HvCsIF6 gene is SEQ ID NO:2.
15. Растение ячменя по любому из предшествующих пунктов, где растение ячменя представляет собой мутант 2, депонированный в NCIMB под регистрационным номером NCIMB 43273, или его потомство.15. The barley plant of any one of the preceding claims, wherein the barley plant is mutant 2 deposited with NCIMB under NCIMB accession number 43273, or a progeny thereof.
16. Растение ячменя или его потомство или его части, где геном указанного растения содержит ген CsIF6 растения ячменя мутант 2, депонированного в NCIMB под регистрационным номером NCIMB 43273.16. A barley plant or its progeny or parts thereof, wherein the genome of said plant contains the barley plant CsIF6 gene mutant 2, deposited with NCIMB under NCIMB accession number 43273.
17. Растение ячменя по любому из предшествующих пунктов, где ядра указанного растения ячменя имеют содержание β-глюканов в диапазоне от 1,7 до 5,0% общей массы сухого вещества ядер.17. The barley plant according to any one of the preceding claims, wherein the kernels of said barley plant have a β-glucan content ranging from 1.7 to 5.0% of the total dry matter weight of the kernels.
18. Растение ячменя по любому из предыдущих пунктов, где ядра указанного растения ячменя имеют соотношение DP3:DP4 не более чем 2,5, например не более чем 2,1, например, в диапазоне от 1,0 до 2,1.18. The barley plant according to any of the previous claims, wherein the kernels of said barley plant have a DP3:DP4 ratio of no more than 2.5, for example no more than 2.1, for example in the range of 1.0 to 2.1.
19. Растение ячменя по любому из предшествующих пунктов, где указанный мутантный полипептид CsIF6 представляет собой CsIF6 с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 за исключением того, что мутантный CsIF6 содержит замену одной аминокислоты в трансмембранном домене, состоящем из аминокислот от 741 до 758 в CsIF6, где указанная замена представляет собой замещение неполярной аминокислоты на заряженную аминокислоту.19. The barley plant of any one of the preceding claims, wherein said mutant CsIF6 polypeptide is CsIF6 with the sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 except that the mutant CsIF6 contains a single amino acid substitution in a transmembrane domain consisting of amino acids from 741 to 758 in CsIF6, where the substitution is a substitution of a non-polar amino acid for a charged amino acid.
20. Растение ячменя по любому из пп.1-8 и п.19, где указанный мутантный полипептид CsIF6 представляет собой CsIF6 с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 за исключением того, что мутантный CsIF6 содержит замену аминокислоты 748 на заряженную аминокислоту.20. The barley plant according to any one of claims 1 to 8 and claim 19, wherein said mutant CsIF6 polypeptide is CsIF6 with the sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 except that the mutant CsIF6 contains a replacement of amino acid 748 by charged amino acid.
21. Растение ячменя по любому из пп.1-8 и 19, 20, где указанный мутантный полипептид CsIF6 представляет собой CsIF6 с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 за исключением того, что мутантный CsIF6 содержит замену аминокислоты 748, где указанная замена представляет собой замещение глицина (G) на аспарагиновую кислоту (D).21. The barley plant according to any one of claims 1-8 and 19, 20, wherein said mutant CsIF6 polypeptide is CsIF6 with the sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 except that the mutant CsIF6 contains a substitution of amino acid 748, wherein said substitution is a substitution of aspartic acid (D) for glycine (G).
22. Растение ячменя по любому из пп.1-8 и 19-21, где ядра указанного растения ячменя имеют содержание β-глюканов в диапазоне от 1,7 до 3% общей массы сухого вещества ядер.22. The barley plant according to any one of claims 1-8 and 19-21, wherein the kernels of said barley plant have a β-glucan content ranging from 1.7 to 3% of the total dry matter weight of the kernels.
23. Растение ячменя по любому из пп.1-8 и 19-22, где ядра указанного растения ячменя имеют соотношение DP3:DP4 в диапазоне от 2,5 до 4.23. The barley plant according to any one of claims 1-8 and 19-22, wherein the kernels of said barley plant have a DP3:DP4 ratio ranging from 2.5 to 4.
24. Растение ячменя по любому из пп.1-8, где указанный мутантный полипептид CsIF6 представля-24. The barley plant according to any one of claims 1 to 8, wherein said mutant CsIF6 polypeptide is
- 21 045156 ет собой CsIF6 с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 за исключением того, что мутантный CsIF6 содержит замену одной аминокислоты в трансмембранном домене, состоящем из аминокислот от 700 до 731 из CsIF6, где указанная замена представляет собой замещение полярной аминокислоты на неполярную аминокислоту.- 21 045156 is CsIF6 with the sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 except that the mutant CsIF6 contains a single amino acid substitution in the transmembrane domain consisting of amino acids 700 to 731 of CsIF6, wherein said substitution represents a substitution polar amino acid to non-polar amino acid.
25. Растение ячменя по любому из пп.1-8 и 24, где указанный мутантный полипептид CsIF6 представляет собой CsIF6 с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 за исключением того, что мутантный CsIF6 содержит замену одной аминокислоты в локализованном в мембране домене, состоящем из аминокислот от 700 до 711 из CsIF6, где указанная замена представляет собой замещение полярной аминокислоты на неполярную аминокислоту.25. The barley plant according to any one of claims 1 to 8 and 24, wherein said mutant CsIF6 polypeptide is CsIF6 with the sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 except that the mutant CsIF6 contains a single amino acid substitution located in membrane domain consisting of amino acids 700 to 711 of CsIF6, wherein said substitution is a substitution of a polar amino acid for a non-polar amino acid.
26. Растение ячменя по любому из пп.1-8 и 24, 25, где указанный мутантный полипептид CsIF6 представляет собой CsIF6 с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 за исключением того, что мутантный CsIF6 содержит замену аминокислоты 709 на неполярную аминокислоту.26. The barley plant according to any one of claims 1-8 and 24, 25, wherein said mutant CsIF6 polypeptide is CsIF6 with the sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 except that the mutant CsIF6 contains a substitution of amino acid 709 by non-polar amino acid.
27. Растение ячменя по любому из пп.1-8 и 24-26, где указанный мутантный полипептид CsIF6 представляет собой CsIF6 с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 за исключением того, что мутантный CsIF6 содержит замену аминокислоты 709, где указанная замена представляет собой замещение треонина (Т) на изолейцин (I).27. The barley plant according to any one of claims 1-8 and 24-26, wherein said mutant CsIF6 polypeptide is CsIF6 with the sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 except that the mutant CsIF6 contains a substitution of amino acid 709, wherein said substitution is a substitution of isoleucine (I) for threonine (T).
28. Растение ячменя по любому из пп.1-8 и 24-27, где ядра указанного растения ячменя имеют содержание β-глюканов в диапазоне от 1,3 до 3% общей массы сухого вещества ядер.28. The barley plant according to any one of claims 1-8 and 24-27, wherein the kernels of said barley plant have a β-glucan content ranging from 1.3 to 3% of the total dry matter weight of the kernels.
29. Растение ячменя по любому из пп.1-8 и 24-28, где ядра указанного растения ячменя имеют соотношение DP3:DP4, составляющее по меньшей мере 3,5, такое как по меньшей мере 4,0, например, по меньшей мере 4,5, такое как в диапазоне от 4 до 6.29. The barley plant according to any one of claims 1-8 and 24-28, wherein the kernels of said barley plant have a DP3:DP4 ratio of at least 3.5, such as at least 4.0, for example at least 4.5, such as in the range from 4 to 6.
30. Растение ячменя по любому из предыдущих пунктов или его потомство, где указанное растение ячменя не было получено исключительно биологическим способом.30. The barley plant of any of the previous paragraphs or its progeny, where said barley plant was not obtained exclusively by biological means.
31. Растение ячменя по любому из предшествующих пунктов или его потомство, где растение ячменя получено способом, включающим следующие стадии: мутагенез растений ячменя или их частей, например, с помощью химического мутагенизирующего агента отбор растений ячменя, несущих любую из вышеупомянутых мутаций в гене CsIF6.31. The barley plant according to any of the preceding paragraphs or its progeny, where the barley plant is obtained by a method including the following steps: mutagenesis of barley plants or parts thereof, for example, using a chemical mutagenizing agent, selection of barley plants carrying any of the above-mentioned mutations in the CsIF6 gene.
32. Растительный продукт, содержащий растение ячменя по любому из предыдущих пунктов, или его часть.32. A plant product containing a barley plant according to any of the previous paragraphs, or a part thereof.
33. Растительный продукт по п.32, где растительный продукт представляет собой зеленый солод или высушенный в печи солод, полученные из ядер указанного растения ячменя.33. The plant product of claim 32, wherein the plant product is green malt or kiln-dried malt obtained from the kernels of said barley plant.
34. Растительный продукт по п.32, где растительный продукт представляет собой сусло, приготовленное из ядер указанного растения ячменя и/или из зеленого солода или высушенного в печи солода, содержащее обработанное ядро(а) указанного растения ячменя.34. The plant product of claim 32, wherein the plant product is a wort prepared from the kernels of said barley plant and/or from green malt or kiln-dried malt, containing processed kernel(s) of said barley plant.
35. Растительный продукт по любому из пп.32-34, где растительный продукт представляет собой сусло и где указанное сусло имеет вязкость не более чем 2,5 мПа-с, предпочтительно не более чем 2,2 мПа-с.35. The plant product according to any one of claims 32 to 34, wherein the plant product is a wort and wherein said wort has a viscosity of not more than 2.5 mPa-s, preferably not more than 2.2 mPa-s.
36. Растительный продукт по п.32, где растительный продукт представляет собой напиток, приготовленный из указанного растения ячменя его частей.36. The plant product of claim 32, wherein the plant product is a beverage prepared from said barley plant parts thereof.
37. Напиток по п.32, где указанный напиток получают из зерен указанного растения ячменя и/или из солода, содержащего обработанное ядро(а) указанного растения ячменя.37. The beverage according to claim 32, wherein said beverage is obtained from grains of said barley plant and/or from malt containing processed kernel(s) of said barley plant.
38. Напиток по любому из пп.36, 37, где напиток представляет собой пиво.38. The drink according to any one of claims 36, 37, where the drink is beer.
39. Способ приготовления зеленого солода, причем указанный способ включает стадии39. A method for preparing green malt, said method comprising the steps
a) обеспечения ядер растения ячменя по любому из пп.1-31;a) providing barley plant kernels according to any one of claims 1 to 31;
b) замачивания указанных ядер;b) soaking said kernels;
c) проращивания замоченных ядер в заданных условиях.c) germination of soaked kernels under specified conditions.
40. Способ приготовления высушенного в печи солода, причем указанный способ включает стадии40. A method for preparing kiln-dried malt, said method comprising the steps
a) обеспечения ядер растения ячменя по любому из пп.1-31;a) providing barley plant kernels according to any one of claims 1 to 31;
b) замачивания указанных ядер;b) soaking said kernels;
c) проращивания замоченных ядер в заданных условиях;c) germination of soaked kernels under specified conditions;
d) сушки указанных пророщенных ядер.d) drying said germinated kernels.
41. Способ производства напитка, причем указанный способ включает стадии41. A method for producing a drink, wherein said method includes the stages
a) Обеспечения ядер растения ячменя по любому из пп.1-31 и/или солода в соответствии с п.33;a) Providing barley plant kernels according to any one of claims 1 to 31 and/or malt in accordance with claim 33;
b) Приготовления водного экстракта указанных ядер и/или указанного солода;b) Preparation of an aqueous extract of said kernels and/or said malt;
c) обработки указанного водного экстракта в напиток.c) processing said aqueous extract into a beverage.
42. Способ получения водного экстракта, причем указанный способ включает стадии42. A method for producing an aqueous extract, wherein said method includes the stages
a) обеспечения ядер растения ячменя по любому из пп.1-31;a) providing barley plant kernels according to any one of claims 1 to 31;
b) подвергания ядер ячменя стадии проращивания, получая при этом пророщенные ядра, причем указанная стадия проращивания включает инкубацию указанных ядер в водном растворе в течение не более чем 72 ч;b) subjecting the barley kernels to a germination stage, thereby obtaining germinated kernels, said germination stage comprising incubating said kernels in an aqueous solution for no more than 72 hours;
c) мелкого раздробления указанных пророщенных ядер, тогда как указанные пророщенные ядраc) finely crushing said sprouted kernels, while said sprouted kernels
- 22 045156 имеют содержание воды, составляющее по меньшей мере 20%, при условии, что указанные ядра ячменя не имеют содержания воды ниже 20% в любое время между стадиями b) и с);- 22 045156 have a water content of at least 20%, provided that said barley kernels do not have a water content below 20% at any time between stages b) and c);
d) приготовления водного экстракта указанных измельченных пророщенных ядер, тем самым получая водный экстракт ячменя.d) preparing an aqueous extract of said crushed germinated kernels, thereby obtaining an aqueous extract of barley.
43. Способ получения водного экстракта, причем указанный способ включает стадии:43. A method for producing an aqueous extract, wherein said method includes the steps of:
a) обеспечения ядер растения ячменя по любому из пп.1-31;a) providing barley plant kernels according to any one of claims 1 to 31;
b) подвергания ядер ячменя стадии проращивания, получая при этом пророщенные ядра, причем указанная стадия проращивания включает инкубацию указанных ядер в водном растворе в течение не более чем 72 ч;b) subjecting the barley kernels to a germination stage, thereby obtaining germinated kernels, said germination stage comprising incubating said kernels in an aqueous solution for no more than 72 hours;
c) мелкого раздробления указанных пророщенных зерен, тогда как указанные пророщенные ядра имеют содержание воды, составляющее по меньшей мере 20%, при условии, что указанные ядра ячменя не имеют содержания воды ниже 20% в любое время после проращивания и до точного разделения пророщенных ядер;c) finely crushing said sprouted grains while said sprouted kernels have a water content of at least 20%, provided that said barley kernels do not have a water content below 20% at any time after germination and until the sprouted kernels are precisely separated;
d) приготовления водного экстракта указанных измельченных пророщенных ядер, тем самым получая водный экстракт ячменя.d) preparing an aqueous extract of said crushed germinated kernels, thereby obtaining an aqueous extract of barley.
44. Способ по любому из п.42 и 43, где стадия проращивания (b) включает инкубирование указанных ядер в водном растворе до тех пор, пока содержание воды ядер не составит по меньшей мере 30%, при этом через указанный водный раствор пропускается по меньшей мере 2 л O2 на кг массы сухого вещества зерен ячменя в час.44. The method according to any one of claims 42 and 43, wherein the germination step (b) includes incubating said kernels in an aqueous solution until the water content of the kernels is at least 30%, while passing at least at least 2 l O 2 per kg of dry matter weight of barley grains per hour.
45. Способ по любому из пп.42-44, где ядра ячменя погружены в водном растворе в течение всей стадии проращивания.45. The method according to any one of claims 42-44, where the barley kernels are immersed in an aqueous solution during the entire germination stage.
46. Способ по любому из пп.42-45, где стадия проращивания содержит46. The method according to any one of claims 42-45, where the germination step comprises
а) по меньшей мере одну стадию инкубации указанных ядер в водном растворе, где через указанный водный раствор пропускается по меньшей мере 2 л O2 на кг массы сухого вещества зерен ячменя в час; иa) at least one stage of incubating said kernels in an aqueous solution, where at least 2 liters of O2 per kg dry matter weight of barley grains per hour are passed through said aqueous solution; And
b) по меньшей мере одну стадию инкубации указанных ядер ячменя на воздухе.b) at least one step of incubating said barley kernels in air.
47. Способ по любому из пп.42-46, где по меньшей мере 3 л, более предпочтительно по меньшей мере 4 л, еще более предпочтительно, по меньшей мере 5 л, еще более предпочтительно по меньшей мере 6 л O2 на кг массы сухого вещества зерен ячменя пропускается через указанный водный раствор в час.47. Method according to any one of claims 42-46, where at least 3 l, more preferably at least 4 l, even more preferably at least 5 l, even more preferably at least 6 l O 2 per kg weight dry matter of barley grains is passed through the specified aqueous solution per hour.
48. Способ по любому из пп.42-47, где указанный O2 содержится в газовой смеси, причем газовая смесь представляет собой атмосферный воздух.48. The method according to any one of claims 42-47, where the specified O 2 is contained in a gas mixture, and the gas mixture is atmospheric air.
49. Способ по любому из пп.42-48, где вся стадия проращивания не превышает 72 ч, более предпочтительно не превышает 60 ч, еще более предпочтительно не превышает 54 ч.49. The method according to any one of claims 42-48, where the entire germination stage does not exceed 72 hours, more preferably does not exceed 60 hours, even more preferably does not exceed 54 hours.
50. Способ по любому из пп.42-49, где ячмень представляет собой шелушеный ячмень, и способ включает стадию удаления, по меньшей мере, части указанной оболочки перед инкубацией указанных ядер в водном растворе.50. The method according to any one of claims 42 to 49, wherein the barley is hulled barley, and the method includes the step of removing at least a portion of said hull before incubating said kernels in an aqueous solution.
51. Способ производства напитка, причем указанный способ включает стадии51. A method for producing a drink, wherein said method includes the stages
a) приготовления водного экстракта способом по любому из пп.42-50;a) preparing an aqueous extract by the method according to any one of claims 42-50;
b) обработки указанного экстракта в напиток.b) processing said extract into a beverage.
52. Способ по п.51, где стадия b) содержит стадии52. The method according to claim 51, where stage b) contains the stages
a) нагревания указанного водного экстракта необязательно в присутствии хмеля или экстракта хмеля;a) heating said aqueous extract, optionally in the presence of hops or hop extract;
b) охлаждения водного экстракта;b) cooling the aqueous extract;
c) сбраживания указанного водного экстракта с дрожжами с получением ферментированного напитка.c) fermenting said aqueous extract with yeast to produce a fermented beverage.
53. Способ по любому из п.51 до 52, где напиток представляет собой пиво.53. The method according to any one of claims 51 to 52, wherein the beverage is beer.
54. Способ получения растения ячменя с содержанием β-глюкана в диапазоне от 1 до 5% сухой массы от общего количества ядер, причем способ включает стадии54. A method for producing barley plants with a β-glucan content in the range from 1 to 5% dry weight of the total number of kernels, the method comprising the stages
a) обеспечения ядер ячменя; иa) providing barley kernels; And
b) подвергания случайному мутагенезу указанных ядра ячменя, тем самым вводя мутацию в ген CsIF6, где указанный мутированный ген CsIF6 кодирует мутантный полипептид CsIF6, где указанный мутантный CsIF6 представляет собой CsIF6 с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 за исключением того, что мутант CsIF6 содержит замену одной аминокислоты в трансмембранном домене CsIF6, где указанная замена представляет собой замещение неполярной аминокислоты на заряженную аминокислоту или замещение полярной аминокислоты на неполярную аминокислоту, где трансмембранный домен CsIF6 состоит из аминокислот от 109 до 128, от 137 до 158, от 700 до 731, от 741 до 758, от 835 до 857 и от 864 до 882; иb) subjecting said barley kernels to random mutagenesis, thereby introducing a mutation into the CsIF6 gene, wherein said mutated CsIF6 gene encodes a mutant CsIF6 polypeptide, wherein said mutant CsIF6 is CsIF6 with the sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 except that the CsIF6 mutant contains a single amino acid substitution in the CsIF6 transmembrane domain, where the substitution is a substitution of a non-polar amino acid with a charged amino acid or a substitution of a polar amino acid with a non-polar amino acid, where the CsIF6 transmembrane domain consists of amino acids 109 to 128, 137 to 158, 700 to 731, 741 to 758, 835 to 857 and 864 to 882; And
c) отбора ядер ячменя или его потомства, несущих мутированный ген CsIF6.c) selection of barley kernels or its progeny carrying the mutated CsIF6 gene.
55. Способ по п.54, где растение ячменя или мутация таковы, как определено в любом из пп.1-31.55. The method of claim 54, wherein the barley plant or mutation is as defined in any one of claims 1 to 31.
56. Растение ячменя по любому из пп.1-31, где растение ячменя содержит мутацию в одном или нескольких дополнительных генах, например, одну или несколько из следующих мутаций:56. The barley plant according to any one of claims 1 to 31, wherein the barley plant contains a mutation in one or more additional genes, for example one or more of the following mutations:
a) мутация в гене, кодирующем LOX-1, приводящая в результате к полной потере функционального LOX-1;a) a mutation in the gene encoding LOX-1, resulting in complete loss of functional LOX-1;
- 23 045156- 23 045156
b) мутация в гене, кодирующем LOX-2, приводящая в результате к полной потере функциональногоb) a mutation in the gene encoding LOX-2, resulting in a complete loss of functionality
LOX-2;LOX-2;
c) мутация в гене, кодирующем ММТ, приводящая в результате к полной потере функционального ММТ.c) a mutation in the gene encoding MMT, resulting in complete loss of functional MMT.
Последовательности >SEQ ID NO: 1, последовательность целлюлозосинтазаподобного CsIF6 (на основе номера GenBank NCBI: EU267181.1).Sequences >SEQ ID NO: 1, cellulose synthase-like CsIF6 sequence (based on GenBank NCBI number: EU267181.1).
MAPAVAGGGRVRSNEPVAAAAAAPAASGKPCVCGFQVCACTGSAAVASAASSLDMDIVAMGQIGAVNDESWVGVE LGEDGETDESGAAVDDRPVFRTEKIKGVLLHPYRVLIFVRLIAFTLFVIWRISHKNPDAMWLWVTSICGEFWFGF SWLLDQLPKLNPINRVPDLAVLRQRFDRPDGTSTLPGLDIFVTTADPIKEPILSTANSVLSILAADYPVDRNTCY VSDDSGMLLTYEALAESSKFATLWVPFCRKHGIEPRGPESYFELKSHPYMGRAQDEFVNDRRRVRKEYDEFKARI NSLEHDIKQRNDGYNAAIAHSQGVPRPTWMADGTQWEGTWVDASENHRRGDHAGIVLVLLNHPSHRRQTGPPASA DNPLDLSGVDVRLPMLVYVSREKRPGHDHQKKAGAMNALTRASALLSNSPFILNLDCDHYINNSQALRAGICFMV GRDSDTVAFVQFPQRFEGVDPTDLYANHNRIFFDGTLRALDGMQGPIYVGTGCLFRRITVYGFDPPRINVGGPCF PRLAGLFAKTKYEKPGLEMTTAKAKAAPVPAKGKHGFLPLPKKTYGKSDAFVDTIPRASHPSPYAAAAEGIVADE ATIVEAVNVTAAAFEKKTGWGKEIGWVYDTVTEDWTGYRMHIKGWRSRYCSIYPHAFIGTAPINLTERLFQVLR WSTGSLEIFFSKNNPLFGSTYLHPLQRVAYINITTYPFTAIFLIFYTTVPALSFVTGHFIVQRPTTMFYVYLGIV LSTLLVIAVLEVKWAGVTVFEWFRNGQFWMTASCSAYLAAVCQVLTKVIFRRDISFKLTSKLPSGDEKKDPYADL YWRWTPLMITPIIIIFVNIIGSAVAFAKVLDGEWTHWLKVAGGVFFNFWVLFHLYPFAKGILGKHGKTPVWLV WWAFTFVITAVLYINIPHMHTSGGKHTTVHGHHGKKLVDTGLYGWLH >SEQ ID NO: 2, Hordeum vulgare целлюлозосинтазаподобный CsIF6 (CsIF6), полный cds (на основе номера GenBank NCBI: EU267181.1).MAPAVAGGGRVRSNEPVAAAAAAPAASGKPCVCGFQVCACTGSAAVASAASSLDMDIVAMGQIGAVNDESWVGVE LGEDGETDESGAAVDDRPVFRTEKIKGVLLHPYRVLIFVRLIAFTLFVIWRISHKNPDAMWLWVTSICGEFWFGF SWLLDQLPKLNPINRVPDLAVLRQRFDRPDGTSTLPGLDIFVTTADPIKEPILSTANSV LSILAADYPVDRNTCY VSDDSGMLLTYEALAESSKFATLWVPFCRKHGIEPRGPESYFELKSHPYMGRAQDEFVNDRRRVRKEYDEFKARI NSLEHDIKQRNDGYNAAIAHSQGVPRPTWMADGTQWEGTWVDASENHRRGDHAGIVLVLLNHPSHRRQTGPPASA DNPLDLSGVDVRLPMLVYVSREKRPGHDHQKKA GAMNALTRASALLSNSPFILNLDCDHYINNSQALRAGICFMV GRDSDTVAFVQFPQRFEGVDPTDLYANHNRIFFDGTLRALDGMQGPIYVGTGCLFRRITVYGFDPPRINVGGPCF PRLAGLFAKTKYEKPGLEMTTAKAKAAPVPAKGKHGFLPLPKKTYGKSDAFVDTIPRASHPSPYAAAAEGIVADE ATIVEAVNVTAAAFEKK TGWGKEIGWVYDTVTEDWTGYRMHIKGWRSRYCSIYPHAFIGTAPINLTERLFQVLR WSTGSLEIFFSKNNPLFGSTYLHPLQRVAYINITTYPFTAIFLIFYTTVPALSFVTGHFIVQRPTTMFYVYLGIV LSTLLVIAVLEVKWAGVTVFEWFRNGQFWMTASCSAYLAAVCQVLTKVIFRRDISFKLTSKLPSG DEKKDPYADL YWRWTPLMITPIIIIFVNIIGSAVAFAKVLDGEWTHWLKVAGGVFFNFWVLFHLYPFAKGILGKHGKTPVWLV WWAFTFVITAVLYINIPHMHTSGGKHTTVHGHHGKKLVDTGLYGWLH >SEQ ID NO: 2, Hordeum vulgare cellulose synthase-like CsIF6 (CsIF6), full cds ( based on GenBank NCBI number: EU267181.1).
ATGGCGCCAGCGGTGGCCGGAGGGGGCCGCGTGCGGAGCAATGAGCCGGTTGCTGCTGCTGCCGCCGCGCCGGCG GCCAGCGGCAAGCCCTGCGTGTGCGGCTTCCAGGTTTGCGCCTGCACGGGGTCGGCCGCGGTGGCCTCCGCCGCC TCGTCGCTGGACATGGACATCGTGGCCATGGGGCAGATCGGCGCCGTCAACGACGAGAGCTGGGTGGGCGTGGAG CTCGGCGAAGATGGCGAGACCGACGAAAGCGGTGCCGCCGTTGACGACCGCCCCGTATTCCGCACCGAGAAGATC AAGGGTGTCCTCCTCCACCCCTACCGGGTGCTGATTTTCGTTCGTCTGATCGCCTTCACGCTGTTCGTGATCTGG CGTATCTCCCACAAGAACCCAGACGCGATGTGGCTGTGGGTGACATCCATCTGCGGCGAGTTCTGGTTCGGTTTC TCGTGGCTGCTAGATCAGCTGCCCAAGCTGAACCCCATCAACCGCGTGCCGGACCTGGCGGTGCTGCGGCAGCGC TTCGACCGCCCCGACGGCACCTCCACGCTCCCGGGGCTGGACATCTTCGTCACCACGGCCGACCCCATCAAGGAG CCCATCCTCTCCACCGCCAACTCGGTGCTCTCCATCCTGGCCGCCGACTACCCCGTGGACCGCAACACATGCTAC GTCTCCGACGACAGTGGCATGCTGCTCACCTACGAGGCCCTGGCAGAGTCCTCCAAGTTCGCCACGCTCTGGGTG CCCTTCTGCCGCAAGCACGGGATCGAGCCCAGGGGTCCGGAGAGCTACTTCGAGCTCAAGTCACACCCTTACATG GGGAGAGCCCAGGACGAGTTCGTCAACGACCGCCGCCGCGTTCGCAAGGAGTACGACGAGTTCAAGGCCAGGATC AACAGCCTGGAGCATGACATCAAGCAGCGCAACGACGGGTACAACGCCGCCATTGCCCACAGCCAAGGCGTGCCC CGGCCCACCTGGATGGCGGACGGCACCCAGTGGGAGGGCACATGGGTCGACGCCTCCGAGAACCACCGCAGGGGC GACCACGCCGGCATCGTACTGGTGCTGCTGAACCACCCGAGCCACCGCCGGCAGACGGGCCCGCCGGCGAGCGCT GACAACCCACTGGACTTGAGCGGCGTGGATGTGCGTCTCCCCATGCTGGTGTACGTGTCCCGTGAGAAGCGCCCC GGGCACGACCACCAGAAGAAGGCCGGTGCCATGAACGCGCTTACCCGCGCCTCGGCGCTGCTCTCCAACTCCCCC TTCATCCTCAACCTCGACTGCGATCATTACATCAACAACTCCCAGGCCCTTCGCGCCGGCATCTGCTTCATGGTG GGACGGGACAGCGACACGGTTGCCTTCGTCCAGTTCCCGCAGCGCTTCGAGGGCGTCGACCCCACCGACCTCTAC GCCAACCACAACCGCATCTTCTTCGACGGCACCCTCCGTGCCCTGGACGGCATGCAGGGCCCCATCTACGTCGGC ACTGGGTGTCTCTTCCGCCGCATCACCGTCTACGGCTTCGACCCGCCGAGGATCAACGTCGGCGGTCCCTGCTTC CCCAGGCTCGCCGGGCTCTTCGCCAAGACCAAGTACGAGAAGCCCGGGCTCGAGATGACCACGGCCAAGGCCAAG GCCGCGCCCGTGCCCGCCAAGGGTAAGCACGGCTTCTTGCCACTGCCCAAGAAGACGTACGGCAAGTCGGACGCC TTCGTGGACACCATCCCGCGCGCGTCGCACCCGTCGCCCTACGCCGCGGCGGCTGAGGGGATCGTGGCCGACGAG GCGACCATCGTCGAGGCGGTGAACGTGACGGCCGCCGCGTTCGAGAAGAAGACCGGCTGGGGCAAAGAGATCGGC TGGGTGTACGACACCGTCACGGAGGACGTGGTCACCGGCTACCGGATGCATATCAAGGGGTGGCGGTCACGCTAC TGCTCCATCTACCCACACGCCTTCATCGGCACCGCCCCCATCAACCTCACGGAGAGGCTCTTCCAGGTGCTCCGC TGGTCCACGGGATCCCTCGAGATCTTCTTCTCCAAGAACAACCCGCTCTTCGGCAGCACATACCTCCACCCGCTG CAGCGCGTCGCCTACATCAACATCACCACTTACCCCTTCACCGCCATCTTCCTCATCTTCTACACCACCGTGCCG GCGCTATCCTTCGTCACCGGCCACTTCATCGTGCAGCGCCCGACCACCATGTTCTACGTCTACCTGGGCATCGTG CTATCCACGCTGCTCGTCATCGCCGTGCTGGAGGTCAAGTGGGCCGGGGTCACAGTCTTCGAGTGGTTCAGGAAC GGCCAGTTCTGGATGACAGCAAGTTGCTCCGCCTACCTCGCCGCCGTCTGCCAGGTGCTGACCAAGGTGATATTC CGGCGGGACATCTCCTTCAAGCTCACATCCAAGCTACCCTCGGGAGACGAGAAGAAGGACCCCTACGCCGACCTC TACGTGGTGCGCTGGACGCCGCTCATGATTACACCCATCATCATCATCTTCGTCAACATCATCGGATCCGCCGTG GCCTTCGCCAAGGTTCTCGACGGCGAGTGGACGCACTGGCTCAAGGTCGCCGGCGGCGTCTTCTTCAACTTCTGG GTGCTCTTCCACCTCTACCCCTTCGCCAAGGGCATCCTGGGGAAGCACGGAAAGACGCCAGTCGTGGTGCTCGTC TGGTGGGCATTCACCTTCGTCATCACCGCCGTGCTCTACATCAACATCCCCCACATGCATACCTCGGGAGGCAAG CACACAACGGTGCATGGTCACCATGGCAAGAAGTTGGTCGACACAGGGCTCTATGGCTGGCTCCATTGAATGGCGCCAGCGGTGGCCGGAGGGGGCCGCGTGCGGAGCAATGAGCCGGTTGCTGCTGCTGCCGCCGCGCCGGCG GCCAGCGGCAAGCCCTGCGTGTGCGGCTTCCAGGTTTGCGCCTGCACGGGGTCGGCCGCGGTGGCCTCCGCCGCC TCGTCGCTGGACATGGACATCGTGGCCATGGGGCAGATCGGCGCCGTCAACGACGAGAGCTGGGTGGGCGTGGAG CTCGGCGAAGATG GCGAGACCGACGAAAGCGGTGCCGCCGTTGACGACCGCCCCGTATTCCGCACCGAGAAGATC AAGGGTGTCCTCCTCCACCCCTACCGGGTGCTGATTTTCGTTCGTCTGATCGCCTTCACGCTGTTCGTGATCTGG CGTATCTCCCACAAGAACCCAGACGCGATGTGGCTGTGGGTGACATCCATCTGCGGCGAGTTCTGGTTCGGTTTC TCGTGGCTGCTAGATCAGCTGCCCAAG CTGAACCCCATCAACCGCGTGCCGGACCTGGCGGTGCTGCGGCAGCGC TTCGACCGCCCCGACGGCACCTCCACGCTCCCGGGGCTGGACATCTTCGTCACCACGGCCGACCCCATCAAGGAG CCCATCCTCTCCACCGCCAACTCGGTGCTCTCCATCCTGGCCGCCGACTACCCCGTGGACCGCAACACATGCTAC GTCTCCGACGACAGTGGCATGCTGCTCACCTACGAGGCCCTGGCAGAG TCCTCCAAGTTCGCCACGCTCTGGGTG CCCTTCTGCCGCAAGCACGGGATCGAGCCCAGGGGTCCGGAGAGCTACTTCGAGCTCAAGTCACACCCTTACATG GGGAGAGCCCAGGACGAGTTCGTCAACGACCGCCGCCGCGTTCGCAAGGAGTACGACGAGTTCAAGGCCAGGATC AACAGCCTGGAGCATGACATCAAGCAGCGCAACGACGGGTACAACGCCGCCATTGCCCA CAGCCAAGGCGTGCCC CGGCCCACCTGGATGGCGGACGGCACCCAGTGGGAGGGCACATGGGTCGACGCCTCCGAGAACCACCGCAGGGGC GACCACGCCGGCATCGTACTGGTGCTGCTGAACCACCCGAGCCACCGCCGGCAGACGGGCCCGCCGGCGAGCGCT GACAACCCACTGGACTTGAGCGGCGTGGATGTGCGTCTCCCCATGCTGGTGTACGTGTCCCGTGAGAAGCG CCCC GGGCACGACCACCAGAAGAAGGCCGGTGCCATGAACGCGCTTACCCGCGCCTCGGCGCTGCTCTCCAACTCCCCC TTCATCCTCAACCTCGACTGCGATCATTACATCAACAACTCCCAGGCCCTTCGCGCCGGCATCTGCTTCATGGTG GGACGGGACAGCGACACGGTTGCCTTCGTCCAGTTCCCGCAGCGCTTCGAGGGCGTCGACCCCACCGACCTCTAC GCCAACCACA ACCGCATCTTCTTCGACGGCACCCTCCGTGCCCTGGACGGCATGCAGGGCCCCATCTACGTCGGC ACTGGGTGTCTCTTCCGCCGCATCACCGTCTACGGCTTCGACCCGCCGAGGATCAACGTCGGCGGTCCCTGCTTC CCCAGGCTCGCCGGGCTCTTCGCCAAGACCAAGTACGAGAAGCCCGGGCTCGAGATGACCACGGCCAAGGCCAAG GCCGCGCCCGTGCCCGCCAAGGGTA AGCACGGCTTCTTGCCACTGCCCAAGAAGACGTACGGCAAGTCGGACGCC TTCGTGGACACCATCCCGCGCGTCGCACCCGTCGCCCTACGCCGCGGCGGCTGAGGGGATCGTGGCCGACGAG GCGACCATCGTCGAGGCGGTGAACGTGACGGCCGCCGCGTTCGAGAAGAAGACCGGCTGGGGCAAAGAGATCGGC TGGGTGTACGACACCGTCACGGAGGACGTGGTCAC CGGCTACCGGATGCATATCAAGGGGTGGCGGTCACGCTAC TGCTCCATCTACCCACACGCCTTCATCGGCACCGCCCCCATCAACCTCACGGAGAGGCTCTTCCAGGTGCTCCGC TGGTCCACGGGATCCCTCGAGATCTTCTTCTCCAAGAACAACCCGCTCTTCGGCAGCACATACCTCCACCCGCTG CAGCGCGTCGCCTACATCAACATCACCACTTACCCCTTCACCGCCATCTTCCTCATCT TCTACACCACCGTGCCG GCGCTATCCTTCGTCACCGGCCACTTCATCGTGCAGCGCCCGACCACCATGTTCTACGTCTACCTGGGCATCGTG CTATCCACGCTGCTCGTCATCGCCGTGCTGGAGGTCAAGTGGGCCGGGGTCACAGTCTTCGAGTGGTTCAGGAAC GGCCAGTTCTGGATGACAGCAAGTTGCTCCGCCTACCTCGCCGCCGTCTGCCAGGTGCTGACCAA GGTGATATTC CGGCGGGACATCTCCTTCAAGCTCACATCCAAGCTACCCTCGGGACGAGAAGAAGGACCCCTACGCCGACCTC TACGTGGTGCGCTGGACGCCGCTCATGATTACACCCATCATCATCTTCGTCAACATCATCGGATCCGCCGTG GCCTTCGCCAAGGTTCTCGACGGCGAGTGGACGCACTGGCTCAAGGTCGCCGGCGGCGTCTTCTTCAACTTCTGG GTGCTCTT CCACCTCTACCCCTTCGCCAAGGGCATCCTGGGGAAGCACGAAAGACGCCAGTCGTGGTGCTCGTC TGGTGGGCATTCACCTTCGTCATCACCGCCGTGCTCTACATCAACATCCCCCACATGCATACCTCGGGAGGCAAG CACACAACGGTGCATGGTCACCATGGCAAGAAGTTGGTCGACACAGGGCTCTATGGCTGGCTCCATTGA
- 24 045156 >SEQ ID NO: 3, последовательность целлюлозосинтазаподобного CsIF6 (содержащая полиморфизм А590Т).- 24 045156 >SEQ ID NO: 3, sequence of cellulose synthase-like CsIF6 (containing the A590T polymorphism).
MAPAVAGGGRVRSNEPVAAAAAAPAASGKPCVCGFQVCACTGSAAVASAASSLDMDIVAMGQIGAVNDESWVGVEMAPAVAGGGRVRSNEPVAAAAAAPAASGKPCVCGFQVCACTGSAAVASAASSLDMDIVAMGQIGAVNDESWVGVE
LGEDGETDESGAAVDDRPVFRTEKIKGVLLHPYRVLIFVRLIAFTLFVIWRISHKNPDAMWLWVTSICGEFWFGFLGEDGETDESGAAVDDRPVFRTEKIKGVLLHPYRVLIFVRLIAFTLFVIWRISHKNPDAMWLWVTSICGEFWFGF
SWLLDQLPKLNPINRVPDLAVLRQRFDRPDGTSTLPGLDIFVTTADPIKEPILSTANSVLSILAADYPVDRNTCYSWLLDQLPKLNPINRVPDLAVLRQRFDRPDGTSTLPGLDIFVTTADPIKEPILSTANSVLSILAADYPVDRNTCY
VSDDSGMLLTYEALAESSKFATLWVPFCRKHGIEPRGPESYFELKSHPYMGRAQDEFVNDRRRVRKEYDEFKARIVSDDSGMLLTYEALAESSKFATLWVPFCRKHGIEPRGPESYFELKSHPYMGRAQDEFVNDRRRVRKEYDEFKARI
NSLEHDIKQRNDGYNAAIAHSQGVPRPTWMADGTQWEGTWVDASENHRRGDHAGIVLVLLNHPSHRRQTGPPASANSLEHDIKQRNDGYNAAIAHSQGVPRPTWMADGTQWEGTWVDASENHRRGDHAGIVLVLLNHPSHRRQTGPPASA
DNPLDLSGVDVRLPMLVYVSREKRPGHDHQKKAGAMNALTRASALLSNSPFILNLDCDHYINNSQALRAGICFMVDNPLDLSGVDVRLPMLVYVSREKRPGHDHQKKAGAMNALTRASALLSNSPFILNLDCDHYINNSQALRAGICFMV
GRDSDTVAFVQFPQRFEGVDPTDLYANHNRIFFDGTLRALDGMQGPIYVGTGCLFRRITVYGFDPPRINVGGPCFGRDSDTVAFVQFPQRFEGVDPTDLYANHNRIFFDGTLRALDGMQGPIYVGTGCLFRRITVYGFDPPRINVGGPCF
PRLAGLFAKTKYEKPGLEMTTAKAKAAPVPAKGKHGFLPLPKKTYGKSDAFVDTIPRASHPSPYTAAAEGIVADEPRLAGLFAKTKYEKPGLEMTTAKAKAAPVPAKGKHGFLPLPKKTYGKSDAFVDTIPRASHPSPYTAAAEGIVADE
ATIVEAVNVTAAAFEKKTGWGKEIGWVYDTVTEDWTGYRMHIKGWRSRYCSIYPHAFIGTAPINLTERLFQVLRATIVEAVNVTAAAFEKKTGWGKEIGWVYDTVTEDWTGYRMHIKGWRSRYCSIYPHAFIGTAPINLTERLFQVLR
WSTGSLEIFFSKNNPLFGSTYLHPLQRVAYINITTYPFTAIFLIFYTTVPALSFVTGHFIVQRPTTMFYVYLGIVWSTGSLEIFFSKNNPLFGSTYLHPLQRVAYINITTYPFTAIFLIFYTTVPALSFVTGHFIVQRPTTMFYVYLGIV
LSTLLVIAVLEVKWAGVTVFEWFRNGQFWMTASCSAYLAAVCQVLTKVIFRRDISFKLTSKLPSGDEKKDPYADLLSTLLVIAVLEVKWAGVTVFEWFRNGQFWMTASCSAYLAAVCQVLTKVIFRRDISFKLTSKLPSGDEKKDPYADL
YWRWTPLMITPI111FVNIIGSAVAFAKVLDGEWTHWLKVAGGVFFNFWVLFHLYPFAKGILGKHGKTPVWLVYWRWTPLMITPI111FVNIIGSAVAFAKVLDGEWTHWLKVAGGVFFNFWVLFHLYPFAKGILGKHGKTPVWLV
WWAFTFVITAVLYINIPHMHTSGGKHTTVHGHHGKKLVDTGLYGWLH >SEQ ID NO: 27, Cell Wall мутант 2 (CW3a) на основе SEQ ID NO: 1, последовательность целлюлозосинтазаподобного CsIF6 (на основе номера GenBank NCBI:EU267181.1).WWAFTFVITAVLYINIPHMHTSGGKHTTVHGHHGKKLVDTGLYGWLH >SEQ ID NO: 27, Cell Wall mutant 2 (CW3a) based on SEQ ID NO: 1, cellulose synthase-like CsIF6 sequence (based on GenBank number NCBI:EU267181.1).
MAPAVAGGGRVRSNEPVAAAAAAPAASGKPCVCGFQVCACTGSAAVASAASSLDMDIVAMGQIGAVNDESWVGVEMAPAVAGGGRVRSNEPVAAAAAAPAASGKPCVCGFQVCACTGSAAVASAASSLDMDIVAMGQIGAVNDESWVGVE
LGEDGETDESGAAVDDRPVFRTEKIKGVLLHPYRVLIFVRLIAFTLFVIWRISHKNPDAMWLWVTSICGEFWFGFLGEDGETDESGAAVDDRPVFRTEKIKGVLLHPYRVLIFVRLIAFTLFVIWRISHKNPDAMWLWVTSICGEFWFGF
SWLLDQLPKLNPINRVPDLAVLRQRFDRPDGTSTLPGLDIFVTTADPIKEPILSTANSVLSILAADYPVDRNTCYSWLLDQLPKLNPINRVPDLAVLRQRFDRPDGTSTLPGLDIFVTTADPIKEPILSTANSVLSILAADYPVDRNTCY
VSDDSGMLLTYEALAESSKFATLWVPFCRKHGIEPRGPESYFELKSHPYMGRAQDEFVNDRRRVRKEYDEFKARIVSDDSGMLLTYEALAESSKFATLWVPFCRKHGIEPRGPESYFELKSHPYMGRAQDEFVNDRRRVRKEYDEFKARI
NSLEHDIKQRNDGYNAAIAHSQGVPRPTWMADGTQWEGTWVDASENHRRGDHAGIVLVLLNHPSHRRQTGPPASANSLEHDIKQRNDGYNAAIAHSQGVPRPTWMADGTQWEGTWVDASENHRRGDHAGIVLVLLNHPSHRRQTGPPASA
DNPLDLSGVDVRLPMLVYVSREKRPGHDHQKKAGAMNALTRASALLSNSPFILNLDCDHYINNSQALRAGICFMVDNPLDLSGVDVRLPMLVYVSREKRPGHDHQKKAGAMNALTRASALLSNSPFILNLDCDHYINNSQALRAGICFMV
GRDSDTVAFVQFPQRFEGVDPTDLYANHNRIFFDGTLRALDGMQGPIYVGTGCLFRRITVYGFDPPRINVGGPCFGRDSDTVAFVQFPQRFEGVDPTDLYANHNRIFFDGTLRALDGMQGPIYVGTGCLFRRITVYGFDPPRINVGGPCF
PRLAGLFAKTKYEKPGLEMTTAKAKAAPVPAKGKHGFLPLPKKTYGKSDAFVDTIPRASHPSPYAAAAEGIVADEPRLAGLFAKTKYEKPGLEMTTAKAKAAPVPAKGKHGFLPLPKKTYGKSDAFVDTIPRASHPSPYAAAAEGIVADE
ATIVEAVNVTAAAFEKKTGWGKEIGWVYDTVTEDWTGYRMHIKGWRSRYCSIYPHAFIGTAPINLTERLFQVLRATIVEAVNVTAAAFEKKTGWGKEIGWVYDTVTEDWTGYRMHIKGWRSRYCSIYPHAFIGTAPINLTERLFQVLR
WSTGSLEIFFSKNNPLFGSTYLHPLQRVAYINITTYPFTAIFLIFYTTVPALSFVTGHFIVQRPTTMFYVYLDIVWSTGSLEIFFSKNNPLFGSTYLHPLQRVAYINITTYPFTAIFLIFYTTVPALSFVTGHFIVQRPTTMFYVYLDIV
LSTLLVIAVLEVKWAGVTVFEWFRNGQFWMTASCSAYLAAVCQVLTKVIFRRDISFKLTSKLPSGDEKKDPYADLLSTLLVIAVLEVKWAGVTVFEWFRNGQFWMTASCSAYLAAVCQVLTKVIFRRDISFKLTSKLPSGDEKKDPYADL
YWRWTPLMITPIIIIFVNIIGSAVAFAKVLDGEWTHWLKVAGGVFFNFWVLFHLYPFAKGILGKHGKTPVWLVYWRWTPLMITPIIIIFVNIIGSAVAFAKVLDGEWTHWLKVAGGVFFNFWVLFHLYPFAKGILGKHGKTPVWLV
WWAFTFVITAVLYINIPHMHTSGGKHTTVHGHHGKKLVDTGLYGWLHWWAFTFVITAVLYINIPHMHTSGGKHTTVHGHHGKKLVDTGLYGWLH
ПримерыExamples
Пример 1.Example 1.
Разработка зондов для цифровой идентификации мутантов.Development of probes for digital identification of mutants.
Кодирующая последовательность гена HvCsIF6 с регистрационным номером АВ621332 была получена из Национального центра биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information (NCBI)). Данная последовательность была использована для BLAST-поиска на сайте: http://webblast.ipk-gatersleben.de/barley/. Последовательности гена и транскрипта HvCsIF6 с регистрационным номером MLOC_57200 были отобраны с использованием: http://plants.ensembl.org/Hordeum_vulgare/. Зонды для цифровой идентификации мутантов были разработаны на основе последовательности MLOC_57200.2, кодирующей ДНК и белок.The coding sequence of the HvCsIF6 gene with accession number AB621332 was obtained from the National Center for Biotechnology Information (NCBI). This sequence was used for a BLAST search on the website: http://webblast.ipk-gatersleben.de/barley/. HvCsIF6 gene and transcript sequences with accession number MLOC_57200 were selected using: http://plants.ensembl.org/Hordeum_vulgare/. Digital mutant identification probes were designed based on the DNA and protein coding sequence MLOC_57200.2.
Пример 2.Example 2.
Скрининг мутантов ячменя со специфическими мутациями в гене целлюлозосинтазаподобного CsIF6.Screening of barley mutants with specific mutations in the cellulose synthase-like CsIF6 gene.
Всего было идентифицировано 5 мутантов со специфической мутацией, ведущей к замещению аминокислотного остатка в целлюлозосинтазаподобном CsIF6 (HvCsIF6) (табл. 1).A total of 5 mutants were identified with a specific mutation leading to the substitution of an amino acid residue in cellulose synthase-like CsIF6 (HvCsIF6) (Table 1).
- 25 045156- 25 045156
Таблица 1Table 1
Идентифицированные мутантыIdentified mutants
Мутант 1, мутант 2, мутант 3 и мутант 4 были идентифицированы с использованием способа скрининга ddPCR по существу, как описано в международной заявке на патент РСТ/ЕР2О17/О65516. Более конкретно, был приготовлен пул случайно мутагенизированных зерен ячменя с последующей подготовкой упорядоченной библиотеки, как описано в международной заявке на патент РСТ/ЕР2О17/065516 в WS1 и WS2 на с. 66-69, а также в примерах от 1 до 2. Мутант 1, мутант 2, мутант 3 и мутант 4 были идентифицированы и выбраны, как описано в международной патентной заявке РСТ/ЕР2О17/О65516 в WS3 и WS4 на стр. 67-72, а также в примерах от 3 до 15, с использованием праймеров и зондов, указанных в табл. 2 ниже. В частности, скрининг был выполнен по существу, как описано в международной заявке на патент РСТ/ЕР2017/065516 в WS3 и в примерах от 3 до 7, с использованием праймеров и зондов, указанных в табл. 2 ниже. Отдельные зерна ячменя, несущие мутацию гена, были идентифицированы по существу, как описано в международной патентной заявке РСТ/ЕР2О17/О65516 в WS4 (с. 69-72) и в примерах от 8 до 15, с использованием праймеров и зондов, указанных в табл. 2 ниже. Праймеры и зонды, которые были разработаны специально для идентификации специфических мутантов в локусе HvCsIF6, описаны в табл. 2.Mutant 1, mutant 2, mutant 3 and mutant 4 were identified using the ddPCR screening method essentially as described in international patent application PCT/EP2O17/O65516. More specifically, a pool of randomly mutagenized barley grains was prepared, followed by the preparation of an ordered library, as described in international patent application PCT/EP2O17/065516 in WS1 and WS2 on p. 66-69, as well as in Examples 1 to 2. Mutant 1, Mutant 2, Mutant 3 and Mutant 4 were identified and selected as described in international patent application PCT/EP2O17/O65516 in WS3 and WS4 on pages 67-72 , as well as in examples from 3 to 15, using the primers and probes indicated in table. 2 below. Specifically, screening was performed essentially as described in international patent application PCT/EP2017/065516 in WS3 and Examples 3 to 7, using the primers and probes listed in Table 1. 2 below. Individual barley grains carrying the gene mutation were identified essentially as described in international patent application PCT/EP2O17/O65516 in WS4 (pages 69-72) and in examples 8 to 15, using the primers and probes specified in table . 2 below. Primers and probes that were designed specifically to identify specific mutants at the HvCsIF6 locus are described in Table. 2.
Таблица 2table 2
Праймеры и зонды, предназначенные для конкретных мутантовPrimers and probes designed for specific mutants
Мутант 5 был идентифицирован с использованием способа прямого секвенирования 6000 мутагенизированных мутантов ячменя М3 с использованием специфических праймеров (прямой праймерMutant 5 was identified using direct sequencing of 6000 mutagenized M3 barley mutants using specific primers (forward primer
- 26 045156- 26 045156
5'-ACTGCTCCATCTACCCACAC-3'; обратный праймер 5'-GATGACGAAGGTGAATGCCC-3') дЛЯ амплификации частей локуса HvCsIF6.5'-ACTGCTCCATCTACCCACAC-3'; reverse primer 5'-GATGACGAAGGTGAATGCCC-3') for amplification of parts of the HvCsIF6 locus.
Мутант 1, мутант 2, мутант 3, мутант 4 и мутант 5 в настоящем документе также упоминаются какMutant 1, Mutant 2, Mutant 3, Mutant 4 and Mutant 5 are also referred to herein as
Мут1, Мут2, Мут3, Мут4 и Мут5 соответственно.Mut1, Mut2, Mut3, Mut4 and Mut5 respectively.
Для визуализации местоположения мутаций была использована программа Swissprot (swissmodel.expasy.org/) для моделирования белка CsIF6. Сначала вся последовательность белка загружается в функцию построения модели (model building feature), и затем модель рассчитывается на основе доступных данных. Для последовательности белка CsIF6 признано, что она имеет встроенную в последовательность структуру, напоминающую субъединицу целлюлозосинтазы А. Затем программа использует распознанную последовательность (позиция полипептида 109-883) для построения модели. На данной стадии программа SwissProt не распознает, что белок связан с мембраной, хотя спирали располагаются в одной стороне модели. В литературе указывается, что белок CsIF6 является связанным с мембраной. Таким образом, для дальнейшей проверки была использована функция QMEANBrane в SwissProt. Данная программа моделирования использует PDB-файл, охватывающий позицию 109-883, созданный во время первого моделирования, и затем создается новая структура, моделирующая вместе мембрану и выбранную часть белка CsIF6. Две пунктирные серые плоскости обозначают двухслойную мембрану. Все три мутации, обеспечивающие низкое содержание (1,3;1,4)-в-глюканов, находятся в спиральных структурах, встроенных в мембрану (T709I, G748D, G847E), тогда как мутация, не влияющая на содержание (1,3;1,4)β-глюканов (G732D), находится в линкерной последовательности, обращенной наружу и соединяющей два трансмембранных домена (рис. 3). Локализованные в мембране аминокислоты в CsIF6 указаны в табл. 3.To visualize the location of mutations, the Swissprot program (swissmodel.expasy.org/) was used to model the CsIF6 protein. First, the entire protein sequence is loaded into the model building feature, and then the model is calculated based on the available data. The CsIF6 protein sequence is recognized to have an embedded sequence structure resembling the cellulose synthase A subunit. The program then uses the recognized sequence (polypeptide position 109-883) to build the model. At this stage, the SwissProt program does not recognize that the protein is membrane bound, although the helices are located on one side of the model. The literature indicates that the CsIF6 protein is membrane associated. Therefore, the QMEANBrane function in SwissProt was used for further verification. This simulation program uses the PDB file covering position 109-883 created during the first simulation and then creates a new structure that models the membrane and a selected part of the CsIF6 protein together. The two dotted gray planes indicate a two-layer membrane. All three mutations that provide low content of (1,3;1,4)-β-glucans are located in helical structures embedded in the membrane (T709I, G748D, G847E), while the mutation that does not affect the content of (1,3; 1,4)β-glucans (G732D), is located in the outward-facing linker sequence connecting the two transmembrane domains (Fig. 3). The membrane-localized amino acids in CsIF6 are listed in Table. 3.
Таблица 3Table 3
Локализация локализованных в мембране аминокислотных последовательностей в белке CsIF6Localization of membrane-localized amino acid sequences in the CsIF6 protein
Пример 3.Example 3.
Содержание (1,3;1,4)-в-глюканов и соотношение DP3:DP4 зрелых мутантных зерен мутанты, идентифицированные, как описано в примере 1, выращивали до зрелости, и гомозиготные зерна высевали в ряды. В зрелом возрасте растения собирали, и зерна использовали для размножения на небольших участках в несколько квадратных метров. Мутанты 1, 2, 4 и 5 все хорошо показали себя в полевых условиях, давая выходы, аналогичные эталонам. Соответственно данные мутанты имеют приемлемые агрономические признаки. Эталоном был сорт Paustian для мутантов 1, 2, 3 и 4, и сорт Quench для мутанта 5). Мутант 3 демонстрировал существенно пониженную плодовитость и поэтому не был включен в испытания урожайности.(1,3;1,4)-β-glucan content and DP3:DP4 ratio of mature mutant grains. The mutants identified as described in Example 1 were grown to maturity and homozygous grains were sown in rows. When mature, the plants were harvested and the grains used for propagation in small plots of a few square meters. Mutants 1, 2, 4 and 5 all performed well in the field, producing yields similar to the standards. Accordingly, these mutants have acceptable agronomic traits. The reference was the Paustian variety for mutants 1, 2, 3 and 4, and the Quench variety for mutant 5). Mutant 3 showed significantly reduced fertility and was therefore not included in the yield trials.
Табл. 4 показывает среднюю урожайность не менее четырех участков размером 7,5 м2. Ячмень высажен в Nr Aaby в 2017 г.Table 4 shows the average yield of at least four plots measuring 7.5 m 2 . Barley was planted in Nr Aaby in 2017.
- 27 045156- 27 045156
Таблица 4Table 4
Собранные зерна были проанализированы на общее содержание (1,3;1,4)-в-глюканов и было определено соотношение DP3:DP4. Десять мл зерен ячменя были размолоты в циклонной мельнице Retch. Все образцы были проанализированы в трех повторах. 20 мг Муки высыпали в пробирки типа Эппендорф объемом 2 мл, нагревали в течение 2 ч при 100°С в печи, затем охлаждали до комнатной температуры. Всего добавляли 500 мкл 50% водного метанола и образец встряхивали при 1400 об/мин в течение 1 ч. После центрифугирования при 16000 g в течение 10 мин супернатант отбрасывали и образец сушили в течение ночи. Затем 400 мкл 20 мМ NaHPO4 при pH 6,5 с Ш/мл лихеназы (Megazyme, International, Ireland) добавляли на 10 мг муки и инкубировали при 50°С в течение 2,5 ч. Образец центрифугировали при 16000 g в течение 10 мин и супернатант фильтровали через фильтры с размером пор 0,45 мкм, и высвобожденные олигомеры Glc-e-(1^4)-Glc-3-(1^3)-Glc (DP3) и Glc-e-(1^4)-Glc-e-(1^4)-Glc-e-(1^3)-Glc (DP4) количественно определяли высокоэффективной анионообменной хроматографией с импульсным амперометрическим обнаружением (HPAEC-PAD). Олигомеры Glc-e-(1^4)-Glc-e-(1^3)-Glc (DP3) и Glc-e-(1 ^4)-Glc-e-(1 ^4)-Glc-3-(1 ^3)-Glc (DP4) количественно определяли с HPAEC-PAD с использованием системы Dionex ICS 5000+ DC, снабженной 4 мкм СА-10 колонкой с размерами 2x250 мм и преколонкой. Условия прогона были 0,4 мл/мин, температура колонки 40°С, изократический элюент 100 мМ NaOH в течение 15 мин. Стандарт для количественного определения производили путем расщепления 1 ед/мл лихеназы (Megazyme International, Ирландия) известных количеств средневязких (1,3;1,4)-βглюканов (Megazyme International, Ирландия) в 20 мМ NaHPO4, pH 6,5, предполагая равное молярное соотношение ответов PAD между DP3 и DP4. Общее содержание (1,3;1,4)-в-глюканов рассматривалось как сумма содержания олигомеров DP3 и DP4.The collected grains were analyzed for total (1,3;1,4)-β-glucans content and the DP3:DP4 ratio was determined. Ten ml of barley grains were ground in a Retch cyclone mill. All samples were analyzed in triplicate. 20 mg of flour was poured into 2 ml Eppendorf tubes, heated for 2 hours at 100°C in an oven, then cooled to room temperature. A total of 500 μl of 50% aqueous methanol was added and the sample was shaken at 1400 rpm for 1 h. After centrifugation at 16,000 g for 10 min, the supernatant was discarded and the sample was dried overnight. Then, 400 μl of 20 mM NaHPO 4 at pH 6.5 C/ml lichenase (Megazyme, International, Ireland) was added to 10 mg of flour and incubated at 50°C for 2.5 hours. The sample was centrifuged at 16,000 g for 10 min and the supernatant was filtered through 0.45 µm filters, and the oligomers Glc-e-(1^4)-Glc-3-(1^3)-Glc (DP3) and Glc-e-(1^4) were released )-Glc-e-(1^4)-Glc-e-(1^3)-Glc (DP4) was quantified by high-performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD). Oligomers Glc-e-(1^4)-Glc-e-(1^3)-Glc (DP3) and Glc-e-(1^4)-Glc-e-(1^4)-Glc-3- (1^3)-Glc(DP4) was quantified with HPAEC-PAD using a Dionex ICS 5000+ DC system equipped with a 4 μm CA-10 2x250 mm column and precolumn. The run conditions were 0.4 mL/min, column temperature 40°C, isocratic eluent 100 mM NaOH for 15 min. The standard for quantitation was produced by digesting 1 U/ml lichenase (Megazyme International, Ireland) with known amounts of medium-viscosity (1,3;1,4)-β-glucans (Megazyme International, Ireland) in 20 mM NaHPO4, pH 6.5, assuming equal molar ratio of PAD responses between DP3 and DP4. The total content of (1,3;1,4)-β-glucans was considered as the sum of the content of DP3 and DP4 oligomers.
Результаты. Содержание (1,3;1,4)-в-глюканов у мутантов 1, 2 и 5 были все в диапазоне от 1,4 до 2%, тогда как мутант 3 почти не имел (1-3;1-4)-в-глюкана (фиг. 1 и табл. 6). Изучение соотношений DP3:DP4 у мутанта 1 показало более низкое соотношение, чем у эталонов, мутант 2 был аналогичен эталонам, соотношение у мутантов 3 и 4 было немного выше, чем у эталона, и мутант 5 показал намного более высокое соотношение DP3:DP4 (фиг. 2 и табл. 6).Results. The contents of (1,3;1,4)-β-glucans in mutants 1, 2 and 5 were all in the range from 1.4 to 2%, while mutant 3 had almost no (1-3;1-4)- β-glucan (Fig. 1 and Table 6). Examination of the DP3:DP4 ratios of mutant 1 showed a lower ratio than the references, mutant 2 was similar to the references, the ratio of mutants 3 and 4 was slightly higher than the reference, and mutant 5 showed a much higher DP3:DP4 ratio (Fig. 2 and table 6).
Пример 4.Example 4.
Содержание (1,3;1,4)-β-глюканов мутантных зерен при ускоренном проращивании зерна мутантов 1, 2 и 4, а также эталона (эталоном для сравнения мутантов 1, 2, 3 и 4 был сорт Paustian и сорт Quanch для мутанта 5) подвергались одностадийному замачиванию и проращиванию в резервуаре, по существу, как описано в примере 1 международной заявки на патент РСТ/ЕР2О17/О65498. Образцы прорастающих зерен отбирали через 24 ч и 48 ч.The content of (1,3;1,4)-β-glucans of mutant grains during accelerated germination of grains of mutants 1, 2 and 4, as well as the standard (the standard for comparing mutants 1, 2, 3 and 4 was the Paustian variety and the Quanch variety for the mutant 5) were subjected to a one-step soaking and germination in a tank, essentially as described in example 1 of the international patent application PCT/EP2O17/O65498. Samples of germinating grains were collected after 24 hours and 48 hours.
Все образцы были проанализированы с использованием способа комплексного микроматричного профилирования полимеров (Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP)) (Moller et al., 2007). Каждый образец анализировали в трех повторах по 20 мг, последовательно экстрагированных 1 мл H2O при 85°С в течение 1 ч при 1000 об/мин и 1 мл 4 М NaOH с 0,1% по объему NaBH4 при 20°С в течение 2 ч при 1000 об/мин. Каждую экстракцию проводили в пробирках типа Эппендорф объемом 2 мл со стеклянным шариком 3 мм с последующим центрифугированием в течение 10 мин при 10000 g и собирали супернатант.All samples were analyzed using Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Moller et al., 2007). Each sample was analyzed in triplicate of 20 mg, sequentially extracted with 1 ml of H2O at 85°C for 1 hour at 1000 rpm and 1 ml of 4 M NaOH with 0.1% by volume NaBH 4 at 20°C for 2 h at 1000 rpm. Each extraction was carried out in 2 ml Eppendorf tubes with a 3 mm glass bead, followed by centrifugation for 10 min at 10,000 g, and the supernatant was collected.
Экстракты смешивали 50/50 с матричным струйным буфером для печати (55,2% глицерина, 44% воды, 0,8% Тритона Х-100) и наносили на нитроцеллюлозную мембрану с размером пор 0,45 мкм (Whatman, Maidstone, UK) с использованием Arrayjet Sprint (Arrayjey, Roslin, UK). Каждый образец был напечатан с четырьмя техническими повторностями и 3 пятикратными разведениями и исследован, как описано в (Pedersen et al., 2012). Массивы сканировали с использованием планшетного сканера (CanoScan 9000 Markll, Canon, S0borg, Denmark) с разрешением 2400 dpi и количественно определяли с использованием прибора Array-Pro Analyzer 6,3 (Media Cybernetics, Rockville, MD, USA). Для каждого образца среднее значение было рассчитано на основе четырех разведений и четырех технических повторов, что привело к 16 измерениям для каждого значения сигнала повторения образца. Наибольшее значение в наборе данных было установлено равным 100, и остальные скорректированы соответствующим образом. Данные представлены в табл. 5 показывают среднее значение из трех повторов образцов.Extracts were mixed 50/50 with matrix inkjet printing buffer (55.2% glycerol, 44% water, 0.8% Triton X-100) and applied to a 0.45 μm nitrocellulose membrane (Whatman, Maidstone, UK). using Arrayjet Sprint (Arrayjey, Roslin, UK). Each sample was printed with four technical replicates and 3 fivefold dilutions and assayed as described in (Pedersen et al., 2012). Arrays were scanned using a flatbed scanner (CanoScan 9000 Markll, Canon, S0borg, Denmark) at 2400 dpi and quantified using an Array-Pro Analyzer 6.3 (Media Cybernetics, Rockville, MD, USA). For each sample, the average value was calculated based on four dilutions and four technical replicates, resulting in 16 measurements for each sample replicate signal value. The largest value in the data set was set to 100 and the rest were adjusted accordingly. The data is presented in table. 5 shows the average of triplicate samples.
- 28 045156- 28 045156
Таблица 5Table 5
Содержание (1,3;1,4)-в-глюканов у мутантов ячменя и эталоновContent of (1,3;1,4)-β-glucans in barley mutants and standards
Наибольшее значение в момент времени 24 ч было установлено на 100, и остальные скорректированы соответствующим образом.The highest value at 24 h was set to 100, and the others were adjusted accordingly.
Анализ показывает, что мутанты 1 и 2 имеют более низкое содержание (1,3;1,4)-в-глюканов через 24 и 48 ч во время проращивания в резервуаре, снабженном воздухом, по сравнению с эталоном, и мутант 4 служит для удостоверения присущего мутантам 1 и 2 более низкого содержания (1,3;1,4)-βглюканов.The analysis shows that mutants 1 and 2 have lower (1,3;1,4)-β-glucans content after 24 and 48 h during germination in an air tank compared to the standard, and mutant 4 serves to confirm the lower content of (1,3;1,4)-β-glucans inherent in mutants 1 and 2.
Пример 5.Example 5.
Анализ прочности зерна.Analysis of grain strength.
Мутанты 1, 2, 3, 4 и 5, а также эталонные линии сорта Paustian и сорта Quench выращивались в поле на участках размером 7,5 м2. Их собирали с помощью селекционного комбайна Wintersteiger Classic (Wintersteiger (WINTERSTEIGER AG, Johann-Michael-Dimmelstrasse 94910 Ried im Innkreis, Austria). Дальнейшую очистку зерна проводили на очистителе для образцов Pfeuffer, модель SLN4 (Pfeuffer GmbH, FlugplatzstraOe, 70, 97318, Kitzingen, Germany) с использованием сита в 2,5 мм. Битые зерна подсчитывали в четырех случайным образом выбранных образцах массой приблизительно 10 г и рассчитывали количество битых зерен относительно массы. Количество битых зерен после обмолота (тест Wintersteiger) и перед скринингом является показателем прочности зерна. Уровень битых зерен после обмолота рассчитывали как кратное увеличение битых зерен в мутантных растениях по отношению к эталонным растениям дикого типа (опорные растения указаны в табл. 6а).Mutants 1, 2, 3, 4 and 5, as well as reference lines of cultivar Paustian and cultivar Quench, were grown in the field in 7.5 m 2 plots. They were collected using a Wintersteiger Classic breeding combine (Wintersteiger (WINTERSTEIGER AG, Johann-Michael-Dimmelstrasse 94910 Ried im Innkreis, Austria). Further grain purification was carried out on a Pfeuffer sample cleaner, model SLN4 (Pfeuffer GmbH, FlugplatzstraOe, 70, 97318, Kitzingen , Germany) using a 2.5 mm sieve. Broken grains were counted in four randomly selected samples weighing approximately 10 g and the number of broken grains was calculated relative to weight. The number of broken grains after threshing (Wintersteiger test) and before screening is an indicator of grain strength. The level of broken grains after threshing was calculated as the fold increase in broken grains in the mutant plants relative to the wild-type reference plants (reference plants are listed in Table 6a).
Таблица 6аTable 6a
Сводка характеристик мутантных зеренSummary of characteristics of mutant grains
Аналогичное определение процентного содержания битых зерен (уровень повреждения после обмолота) было выполнено на образцах растений ячменя массой 50 г, выращенных в Новой Зеландии в 2016-2017 гг. (Мут1; Мут2; Мут4; Мут5) и в Дании 2018 (Мут2). Частоту битых зерен после обмолота (уровень повреждения после обмолота) определяли, как описано выше, и сравнивали с частотой для эталонных растений ячменя дикого типа (сорт Paustian для Мут1, Мут2 и Мут4 и сорт Quench для Мут5). Кратность увеличения по сравнению с эталонными растениями ячменя дикого типа указана в табл. 6b ниже.A similar determination of the percentage of broken kernels (the level of damage after threshing) was carried out on 50 g samples of barley plants grown in New Zealand in 2016-2017. (Mut1; Mut2; Mut4; Mut5) and in Denmark 2018 (Mut2). The frequency of broken kernels after threshing (level of damage after threshing) was determined as described above and compared with the frequency for reference wild-type barley plants (cv. Paustian for Mut1, Mut2 and Mut4 and cv. Quench for Mut5). The fold increase compared to reference wild-type barley plants is shown in Table. 6b below.
Таблица 6bTable 6b
Интересно, что Hu et al., 2014 раскрывает линию ячменя (m351), несущую мутацию в гене CsIF6, приводящую в результате к мутации А849Т белка CsIF6. Указанная линия ячменя имеет превышение в 4,2 раза уровня битых зерен по сравнению с контролем дикого типа.Interestingly, Hu et al., 2014 disclose a barley line (m351) carrying a mutation in the CsIF6 gene, resulting in the A849T mutation of the CsIF6 protein. This barley line has a 4.2-fold increase in the level of broken grains compared to the wild-type control.
Пример 6. Гидролитическая ферментативная активность в образцах солода.Example 6. Hydrolytic enzymatic activity in malt samples.
Ядра ячменя мутанта 2 и эталона (сорта Paustian) были обработаны в трех повторах по 50 г каждогоBarley kernels of mutant 2 and standard (Paustian variety) were processed in triplicate, 50 g each
- 29 045156 образца. Мутант 2 был таким, как описано в примере 2 выше. Сухие ядра ячменя, помещенные в стаканы из нержавеющей стали, микросолодовали в соответствии со стандартными способами. Вкратце ядра ячменя выдерживали с принудительным помещением в пресную воду в пресной воде при 15°С в течение около 7 ч в первый день, 3 ч во второй день и 1 ч в третий день, чтобы достичь содержания воды 35, 40 и 45% соответственно в конце каждого замачивания. После каждого замачивания стаканы из нержавеющей стали, содержащие образцы, перемещали в ящик для проращивания при 15°С и хранили там до следующей стадии процесса. После последнего дренажа замочной воды образцы выдерживали в течение 120 ч (дни от 3 до 7) в ящиках для проращивания, уравновешенных до 45% воды, и опрыскивали водой для преодоления потери воды при дыхании.- 29 045156 sample. Mutant 2 was as described in example 2 above. Dried barley kernels placed in stainless steel glasses were micromalted according to standard methods. Briefly, barley kernels were forced into fresh water in fresh water at 15°C for about 7 h on the first day, 3 h on the second day and 1 h on the third day to achieve a water content of 35, 40 and 45%, respectively, in at the end of each soak. After each soak, the stainless steel beakers containing the samples were transferred to a germination box at 15°C and stored there until the next stage of the process. After the final soak water drainage, samples were kept for 120 h (days 3 to 7) in germination boxes equilibrated to 45% water and sprayed with water to overcome water loss through respiration.
В конце процесса проращивания (день 7) образцы высушивали в сушильном шкафу из нержавеющей стали в инкубаторе Termaks в течение 21 ч, используя следующую программу температурного изменения: 25-55°С (2°С/ч), 55-85°С (4°С/ч), 85°С в течение 1,5 ч.At the end of the germination process (day 7), the samples were dried in a stainless steel oven in a Termaks incubator for 21 hours using the following temperature program: 25-55°C (2°C/h), 55-85°C (4 °C/h), 85°C for 1.5 hours.
Стадии проращивания и печной сушки выполняли с рециркуляционным потоком воздуха, составляющим 80% свежего воздуха.The germination and oven drying steps were performed with a recirculating air flow of 80% fresh air.
В конце каждого дня микросолодования образцы собирали для анализа в трех повторах и лиофилизировали в течение 48 ч.At the end of each micromalting day, samples were collected for analysis in triplicate and lyophilized for 48 h.
Перед анализом ферментативной активности образцы солода размалывали с использованием стандартной мельницы Foss Cyclotech, снабженной шлифовальным кольцом из карбида вольфрама (Foss 10004463), никелированным рабочим колесом (Foss 1000 2666) и выходным ситом 1 мм (Foss 10001989). Все измерения ферментативной активности ячменного солода были выполнены в течение 48 ч после измельчения сухого образца. Анализы активности альфа-амилазы выполняли с использованием набора Ceralpha (K-CERA) от Megazyme с использованием стандартного лабораторного оборудования. Анализы амилазы были сделаны в соответствии с протоколом производителя (K-CERA 01/12). Расчет активности амилазы был основан на формуле в протоколе Megazyme (K-CERA 01/12). Анализы активности бетаамилазы выполняли с использованием набора Betamyl (K-BETA3) от Megazyme с использованием стандартного лабораторного оборудования. Анализы амилазы были сделаны в соответствии с протоколом производителя (K-BETA3 10/10). Расчет активности бета-амилазы основывался на формуле в протоколе Megazyme (K-BETA3 10/10). Анализы предельной активности декстриназы выполняли с использованием набора для анализа пуллуланазы/предельной декстриназы (способ PullG6) (K-PullG6) от Megazyme с использованием стандартного лабораторного оборудования. Анализы предельной декстриназы проводили в соответствии с протоколом производителя (K-PullG6 05/17). Расчет активности предельной декстриназы был основан на формуле в протоколе Megazyme (K-PullG6 05/17).Prior to enzymatic activity analysis, malt samples were ground using a standard Foss Cyclotech mill equipped with a tungsten carbide grinding ring (Foss 10004463), a nickel-plated impeller (Foss 1000 2666) and a 1 mm outlet screen (Foss 10001989). All measurements of the enzymatic activity of barley malt were carried out within 48 hours after grinding the dry sample. Alpha-amylase activity assays were performed using the Ceralpha kit (K-CERA) from Megazyme using standard laboratory equipment. Amylase assays were done according to the manufacturer's protocol (K-CERA 01/12). Calculation of amylase activity was based on the formula in the Megazyme protocol (K-CERA 01/12). Beta-amylase activity assays were performed using the Betamyl (K-BETA3) kit from Megazyme using standard laboratory equipment. Amylase assays were done according to the manufacturer's protocol (K-BETA3 10/10). Calculation of beta-amylase activity was based on the formula in the Megazyme protocol (K-BETA3 10/10). Limiting dextrinase activity assays were performed using the pullulanase/limiting dextrinase (PullG6 method) assay kit (K-PullG6) from Megazyme using standard laboratory equipment. Limiting dextrinase assays were performed according to the manufacturer's protocol (K-PullG6 05/17). Calculation of limiting dextrinase activity was based on the formula in the Megazyme protocol (K-PullG6 05/17).
Результаты.Results.
Суммарные ферментативные активности, измеренные для α-амилазы, β-амилазы и свободной предельной декстриназы следуют одному и тому же паттерну в мутанте 2 и эталонной линии ячменя (фиг. 5). Удивительно, что активность предельной декстриназы, по-видимому, немного выше у мутанта, начиная с 3-го дня, хотя экспрессия гена предельной декстриназы была несколько ниже.Total enzymatic activities measured for α-amylase, β-amylase, and free limiting dextrinase followed the same pattern in mutant 2 and the barley reference line (Fig. 5). Surprisingly, limiting dextrinase activity appeared to be slightly higher in the mutant starting at day 3, although limiting dextrinase gene expression was slightly lower.
Пример 7. Содержание (1,3;1,4)-в-глюканов.Example 7. Content of (1,3;1,4)-glucans.
Пророщенные зерна, полученные, как описано в примере 6, анализировали на общее содержание (1,3;1,4)-в-глюканов. Десять мл зерна ячменя были размолоты в циклонной мельнице Retch. Все образцы были проанализированы в трех повторах. Двадцать мг муки высыпали в пробирки типа Эппендорф объемом 2 мл, нагревали в течение 2 ч при 100°С в сушильном шкафу с последующим охлаждением до комнатной температуры. Всего добавляли 500 мкл 50% водного метанола и образцы встряхивали при 1400 об/мин в течение 1 ч. После центрифугирования при 16000xg в течение 10 мин супернатант отбрасывали и образцы сушили в течение ночи. Затем 400 мкл 20 мМ NaHPO4 при pH 6,5 с Ш/мл лихеназы (Megazyme, International, Ireland) добавляли на 10 мг муки и инкубировали при 50°С в течение 2,5 ч. Образец центрифугировали при 16000xg в течение 10 мин супернатант фильтровали через фильтры с размером пор 0,45 мкм, и высвобожденные олигомеры Glc-e-(1^4)-Glc-e-(1^3)-Glc (DP3) и Glc-e-(1^4)Glc-e-(1 ^4)-Glc-P-(1 ^3)-Glc (DP4) количественно определяли высокоэффективной анионообменной хроматографией с импульсным амперометрическим обнаружением (HPAEC-PAD). Олигомеры Glc-β(1^4)-Glc-e-(1^3)-Glc (DP3) и Glc-e-(1^4)-Glc-e-(1^4)-Glc-e-(1^3)-Glc (DP4) количественно определяли с HPAEC-PAD с использованием системы Dionex ICS 5000+ DC, снабженной 4 мкм СА-10 колонкой с размерами 2x250 мм и пре-колонкой. Условия прогона были 0,4 мл/мин, температура колонки 40°С, изократический элюент 100 мМ NaOH в течение 15 мин. Стандарт для количественного определения производили путем расщепления 1 ед/мл лихеназы (Megazyme International, Ирландия) известных количеств средневязких (1,3;1,4)-в-глюканов (Megazyme International, Ирландия) в 20 мМ NaHPO4, pH 6,5, предполагая равное молярное соотношение ответов PAD между DP3 и DP4. Общее содержание (1,3;1,4)-в-глюканов расчитывали как сумму олигомеров DP3 и DP4.Sprouted grains obtained as described in example 6 were analyzed for the total content of (1,3;1,4)-β-glucans. Ten ml of barley grains were ground in a Retch cyclone mill. All samples were analyzed in triplicate. Twenty mg of flour was poured into 2 ml Eppendorf tubes, heated for 2 hours at 100°C in an oven, followed by cooling to room temperature. A total of 500 μl of 50% aqueous methanol was added and the samples were shaken at 1400 rpm for 1 h. After centrifugation at 16000xg for 10 min, the supernatant was discarded and the samples were dried overnight. Then, 400 μl of 20 mM NaHPO 4 at pH 6.5 s / ml lichenase (Megazyme, International, Ireland) was added to 10 mg of flour and incubated at 50 ° C for 2.5 hours. The sample was centrifuged at 16000xg for 10 min the supernatant was filtered through 0.45 μm filters, and the oligomers Glc-e-(1^4)-Glc-e-(1^3)-Glc (DP3) and Glc-e-(1^4)Glc were released -e-(1^4)-Glc-P-(1^3)-Glc (DP4) was quantified by high-performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD). Oligomers Glc-β(1^4)-Glc-e-(1^3)-Glc (DP3) and Glc-e-(1^4)-Glc-e-(1^4)-Glc-e-( 1^3)-Glc (DP4) was quantified with HPAEC-PAD using a Dionex ICS 5000+ DC system equipped with a 4 μm CA-10 2x250 mm column and a pre-column. The run conditions were 0.4 mL/min, column temperature 40°C, isocratic eluent 100 mM NaOH for 15 min. The quantitation standard was produced by digestion of 1 U/ml lichenase (Megazyme International, Ireland) with known amounts of medium-viscosity (1.3;1.4)-β-glucans (Megazyme International, Ireland) in 20 mM NaHPO 4 , pH 6.5 , assuming an equal molar ratio of PAD responses between DP3 and DP4. The total content of (1,3;1,4)-β-glucans was calculated as the sum of DP3 and DP4 oligomers.
Результаты.Results.
Содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в мутанте 2 (мутант) и в сорте Paustian (эталон) контролировали в ячмене и в зеленом солоде в дни 1, 2, 3, 4, 5, 6 процедуры солодования (фиг. 6), а также в высушенных вThe content of (1,3;1,4)-β-glucans in mutant 2 (mutant) and in the Paustian variety (reference) was controlled in barley and in green malt on days 1, 2, 3, 4, 5, 6 of the malting procedure ( Fig. 6), as well as in dried
- 30 045156 печи солодах (день 7 на фиг. 6). В течение всего процесса солодования содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в мутанте 2 составляло только 50% от эталонного, и на 5-й день содержание (1,3;1,4)-в-глюканов в мутанте было похоже на эталонный солод, высушенный в печи.- 30 045156 malt ovens (day 7 in Fig. 6). During the entire malting process, the content of (1,3;1,4)-β-glucans in mutant 2 was only 50% of the reference value, and on the 5th day the content of (1,3;1,4)-β-glucans in the mutant was similar to the kiln-dried reference malt.
Пример 8. Вязкость.Example 8: Viscosity.
Солодование.Malting.
Образцы ячменя солодовали в двух повторах, используя 50 г ячменя на чашку для образцов. Образцы ячменя замачивали принудительным помещением в воду с температурой 15°С в закрытой камере с решеткой для образцов. Процедуру замачивания выполняли в течение первых трех дней, чтобы в конце каждого замачивания содержание воды составляло соответственно 35, 40 и 45%. Образцы хранили в течение следующих трех дней при 15°С в ящиках для проращивания и уравновешивали до 45% воды и корректировали путем опрыскивания водой для преодоления потери воды при дыхании. После данных шести дней образцы подвергали печной сушке в течение 21 ч в инкубаторе Termaks и обрабатывали с использованием ручной системы удаления корней. В течение трех дней получали зеленый солод, после третьего дня солодования образцы подвергали лиофильной сушке до 4%-ного содержания воды.Barley samples were malted in duplicate using 50 g of barley per sample cup. Barley samples were soaked by forced placement in water at a temperature of 15°C in a closed chamber with a sample grid. The soaking procedure was carried out for the first three days so that at the end of each soak the water content was 35, 40 and 45% respectively. Samples were stored for the next three days at 15°C in germination boxes and equilibrated to 45% water and adjusted by spraying with water to overcome water loss through respiration. After these six days, the samples were oven dried for 21 hours in a Termaks incubator and processed using a manual root removal system. Green malt was produced within three days; after the third day of malting, the samples were freeze-dried to 4% water content.
Затирание.Mashing.
Перед затиранием образцы измельчали до мелкого порошка. 70 г сухого вещества смешивали в соотношении вода:крупка 5:1 и растирали в затирающем оборудовании Lochner в соответствии со следующей программой затирания: 10 мин при 52°С, 50 мин при 65°С и 5 мин при 78°С, разнесенные температурным изменением на 1°/мин. Образцы были собраны во время выполнения программы затирания.Before mashing, the samples were ground to a fine powder. 70 g of dry matter was mixed at a water:grit ratio of 5:1 and mashed in a Lochner mash according to the following mash program: 10 min at 52°C, 50 min at 65°C and 5 min at 78°C, spaced by temperature change by 1°/min. Samples were collected during the mash program.
После затирания сусло фильтруют через бумажный фильтр MN 614 1/4, диаметр 320 мм (MachereyNagel). Реологическое поведение отфильтрованного сусла измеряется на ротационном реометре RheolabQC (Anton Paar GmbH) с поддерживающей температурной системой Пельтье (C-PTD 180/AIR/QC) и двухзонными измерительными системами (C-DG42/SS, Anton Paar GmbH).After mashing, the wort is filtered through a paper filter MN 614 1/4 , diameter 320 mm (MachereyNagel). The rheological behavior of the filtered wort is measured on a RheolabQC rotary rheometer (Anton Paar GmbH) with a Peltier temperature support system (C-PTD 180/AIR/QC) and dual-zone measuring systems (C-DG42/SS, Anton Paar GmbH).
Результаты.Results.
Вязкость трехдневного сусла (ячмень после 3 дней солодования) подвергнутых микросолодованию мутантов Мут2 и Мут5 определяли и сравнивали с эталоном (3-дневное сусло подвергнутых микросолодованию зерен дикого типа сорта Paustian и сорта Quench). Вязкость значительно ниже у сусла, приготовленного из любого мутанта, по сравнению с эталонами, как показано в табл. 7 и на фиг. 6. Плато (Plato) были сравнимы в суслах, приготовленных из мутантов или эталонов.The viscosity of the 3-day wort (barley after 3 days of malting) of the micromalted Mut2 and Mut5 mutants was determined and compared with the reference (3-day wort of micromalted wild-type grains of the Paustian variety and the Quench variety). The viscosity is significantly lower for wort prepared from any mutant compared to the standards, as shown in table. 7 and fig. 6. Plato were comparable in worts prepared from mutants or references.
Вязкость сусла, приготовленного из стандартного солода, приготовленного путем замачивания в течение от 1 до 2 дней и проращивания в течение от 5 до 7 дней с последующей печной сушкой, составляет около 2 мПа· с.The viscosity of wort made from standard malt prepared by steeping for 1 to 2 days and sprouting for 5 to 7 days followed by oven drying is about 2 mPa s.
Таблица 7Table 7
--
Claims (7)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP17210954.8 | 2017-12-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045156B1 true EA045156B1 (en) | 2023-10-31 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6007174B2 (en) | Energy-saving brewing method | |
| US11690341B2 (en) | Cereal plants with improved cell wall properties | |
| JP2024037991A (en) | Fast methods for preparing cereal extracts | |
| JP7410030B2 (en) | Barley with increased hydrolytic enzyme activity | |
| EA045156B1 (en) | CEREAL PLANTS WITH IMPROVED CELL WALL PROPERTIES | |
| WO2019134962A1 (en) | Cereal comprising starch with low gelatinisation temperature | |
| CN115297717B (en) | Barley plants with high limit dextrinase activity | |
| CN111801007B (en) | Barley with increased hydrolase activity | |
| EP3785529A1 (en) | Barley plants with altered protein content in grains | |
| EA045303B1 (en) | FAST WAYS FOR OBTAINING GRAIN CROPS EXTRACTS | |
| OA20828A (en) | Barley plants with high limit dextrinase activity | |
| EA043494B1 (en) | BARLEY WITH INCREASED HYDROLYTIC ENZYME ACTIVITY | |
| BR112020013218B1 (en) | QUICK METHODS FOR PREPARING CEREAL EXTRACTS |