EA045040B1

EA045040B1 - METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING DISORDERS ASSOCIATED WITH AGING

Info

Publication number: EA045040B1
Application number: EA202091057
Authority: EA
Inventors: Антон Висс-Корэй; Саул А. Вилледа; Кароли Николич
Original assignee: Зе Боард Оф Трастиз Оф Зе Леланд Стэнфорд Джуниор Юниверсити; Зе Регентс Оф Зе Юниверсити Оф Калифорния; Алкахест, Инк.; Ю. С. Говернмент Эз Репрезентид Бай Зе Департмент Оф Ветеранс Эффэйрс
Priority date: 2015-05-18
Filing date: 2016-05-17
Publication date: 2023-10-26

Description

Старение в организме сопровождается накоплением изменений со временем. В нервной системе старение сопровождается структурными и нейрофизиологическими изменениями, которые приводят к снижению когнитивных способностей и чувствительности к дегенеративным нарушениям у здоровых индивидов. (Heeden & Gabrieli, Insights into the ageing mind: a view from cognitive neuroscience, Nat. Rev. Neurosci. (2004) 5: 87-96; Raz et al., Neuroanatomical correlates of cognitive aging: evidence from structural magnetic resonance imaging, Neuropsychology (1998) 12:95-114; Mattson & Magnus, Ageing and neuronal vulnerability, Nat. Rev. Neurosci. (2006) 7: 278-294; и Rapp & Heindel, Memory systems in normal and pathological aging, Curr. Opin. Neurol. (1994) 7:294-298). В эти изменения включены в потеря синапсов и потеря функции нервной ткани, которая является ее результатом. Таким образом, несмотря на то что значительная гибель нейронов, как правило, не наблюдается при естественном процессе старения, нейроны в стареющем головном мозге уязвимы к сублетальным возрастным изменениям в структуре, целостности синапсов и процессинге молекул на синапсе, все из которых нарушают когнитивную функцию.Aging in the body is accompanied by the accumulation of changes over time. In the nervous system, aging is accompanied by structural and neurophysiological changes that lead to decreased cognitive abilities and susceptibility to degenerative disorders in healthy individuals. (Heeden & Gabrieli, Insights into the aging mind: a view from cognitive neuroscience, Nat. Rev. Neurosci. (2004) 5: 87-96; Raz et al., Neuroanatomical correlates of cognitive aging: evidence from structural magnetic resonance imaging, Neuropsychology (1998) 12:95-114; Mattson & Magnus, Aging and neuronal vulnerability, Nat. Rev. Neurosci. (2006) 7: 278-294; and Rapp & Heindel, Memory systems in normal and pathological aging, Curr. Opin Neurol (1994) 7:294-298). These changes include the loss of synapses and the loss of nerve tissue function that results from it. Thus, although significant neuronal death is not typically observed during the natural aging process, neurons in the aging brain are vulnerable to sublethal age-related changes in the structure, integrity of synapses, and processing of molecules at the synapse, all of which impair cognitive function.

Дополнительно к нормальной потере синапсов в ходе естественного старения потеря синапсов является ранним патологическим явлением, общим для многих нейродегенеративных состояний, и она наилучшим образом коррелирует с нейронным и когнитивным нарушением, ассоциированным с этими состояниями. Действительно, старение остается единственным наиболее преобладающим фактором риска для связанных с деменцией нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера (AD) (Bishop et al., Neural mechanisms of ageing and cognitive decline, Nature (2010) 464: 529-535 (2010); Heeden & Gabrieli, Insights into the ageing mind: a view from cognitive neuroscience, Nat. Rev. Neurosci. (2004) 5:87-96; Mattson & Magnus, Ageing and neuronal vulnerability, Nat. Rev. Neurosci. (2006) 7:278294).In addition to the normal loss of synapses during natural aging, synapse loss is an early pathological phenomenon common to many neurodegenerative conditions, and it best correlates with the neural and cognitive impairment associated with these conditions. Indeed, aging remains the single most predominant risk factor for dementia-related neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD) (Bishop et al., Neural mechanisms of aging and cognitive decline, Nature (2010) 464: 529-535 (2010); Heeden & Gabrieli, Insights into the aging mind: a view from cognitive neuroscience, Nat. Rev. Neurosci. (2004) 5:87-96; Mattson & Magnus, Aging and neuronal vulnerability, Nat. Rev. Neurosci. (2006) 7 :278294).

По мере того как возрастает продолжительность жизни людей, все большая часть населения страдает от когнитивных нарушений, ассоциированных со старением, что делает крайне важным выявление средств, под действием которых поддерживается целостность когнитивных процессов посредством защиты от эффектов старения или даже противодействия им (Hebert et al., Alzheimer disease in the US population: prevalence estimates using the 2000 census, Arch. Neurol. (2003) 60:1119-1122; Bishop et al., Neural mechanisms of ageing and cognitive decline, Nature (2010) 464:529-535).As people live longer, an increasing proportion of the population suffers from cognitive decline associated with aging, making it critical to identify interventions that maintain the integrity of cognitive processes by protecting against or even counteracting the effects of aging (Hebert et al. , Alzheimer disease in the US population: prevalence estimates using the 2000 census, Arch Neurol (2003) 60:1119-1122;Bishop et al., Neural mechanisms of aging and cognitive decline, Nature (2010) 464:529-535 ).

β-2-микроглобулин (B2M) представляет собой компонент главного комплекса гистосовместимости (МНС) I класса, комплекса из нескольких белков, обнаруживающегося на поверхности практически всех ядерных клеток млекопитающих. Эти комплексы функционируют посредством презентирования фрагментов чужеродных антигенов или пептидов на поверхности клетки для того, чтобы иммунная система могла распознавать и уничтожать инфицированные клетки. Белки-компоненты МНС I класса кодируются несколькими генами, каждый из которых имеет несколько аллелей, и типы экспрессируемых МНС I класса варьируют у индивидов. Вследствие того, что МНС является полиморфным, он является важным фактором, который следует учитывать при трансплантации органов, поскольку иммунная система хозяина может отторгать органы с чужеродными МНС. В злокачественных клетках экспрессия МНС может быть дефектной, что позволяет таким клеткам избегать выявления и уничтожения иммунной системой.β-2-microglobulin (B2M) is a component of major histocompatibility complex (MHC) class I, a complex of several proteins found on the surface of virtually all mammalian nucleated cells. These complexes function by presenting fragments of foreign antigens or peptides on the cell surface so that the immune system can recognize and destroy infected cells. The component proteins of MHC class I are encoded by several genes, each of which has multiple alleles, and the types of MHC class I expressed vary among individuals. Due to the fact that MHC is polymorphic, it is an important factor to consider in organ transplantation, since the host immune system can reject organs with foreign MHC. In malignant cells, MHC expression may be defective, allowing such cells to evade detection and destruction by the immune system.

Несвязанный внеклеточный B2M также обнаруживается в человеческих физиологических жидкостях, таких как сыворотка крови, моча и спинномозговая жидкость. Вследствие своего небольшого размера белок нормально фильтруется из крови, а затем реабсорбируется в некотором количестве почкой. Высокие концентрации B2M в сыворотке крови часто сопутствуют наличию нескольких заболеваний, таких как неходжкинская лимфома и менингит (Hallgren et al., Lactoferrin, lysozyme, and beta 2microglobulin levels in cerebrospinal fluid: differential indices of CNS inflammation, Inflammation (1982) 6:291-304; et al., Prognostic significance of serum beta-2 microglobulin in patients with non-Hodgkin lym- 1 045040 phoma, Oncology (2014) 87:40-7). Если он присутствует в организме в сыворотке в высоких концентрациях, белок может образовывать амилоидные фибриллы (Corland & Heegaard, В (2)-microglobulin amyloidosis, Sub-cellular Biochemistry (2012) 65:517-40). Отложение B2M в тканях и жидкостях организма как осложнение хронического заболевания почек у индивидов, проходящих диализ, подвергалось всестороннему изучению. У пациентов с пониженной функцией почек отложение ассоциировано со слабостью и болью в суставах и костях. Измеренные уровни B2M в моче указывают на повреждение почек и нарушения фильтрации (Acchiardo et al., Beta 2-microglobulin levels in patients with renal insufficiency, American Journal of Kidney Diseases (1989) 13:70-4; Astor et al., Serum Beta-2-microglobulin at discharge predicts mortality and graft loss following kidney transplantation, Kidney International (2013) 84:810-817).Unbound extracellular B2M is also found in human body fluids such as serum, urine, and cerebrospinal fluid. Because of its small size, the protein is normally filtered from the blood and then reabsorbed in some quantity by the kidney. High serum B2M concentrations often accompany the presence of several diseases, such as non-Hodgkin's lymphoma and meningitis (Hallgren et al., Lactoferrin, lysozyme, and beta 2microglobulin levels in cerebrospinal fluid: differential indicators of CNS inflammation, Inflammation (1982) 6:291- 304; et al., Prognostic significance of serum beta-2 microglobulin in patients with non-Hodgkin lymphoma, Oncology (2014) 87:40-7). If present in the body in serum at high concentrations, the protein can form amyloid fibrils (Corland & Heegaard, B(2)-microglobulin amyloidosis, Sub-cellular Biochemistry (2012) 65:517-40). B2M deposition in tissues and body fluids as a complication of chronic kidney disease in individuals undergoing dialysis has been extensively studied. In patients with reduced kidney function, the deposit is associated with weakness and pain in the joints and bones. Measured urinary B2M levels indicate kidney damage and filtration impairment (Acchiardo et al., Beta 2-microglobulin levels in patients with renal insufficiency, American Journal of Kidney Diseases (1989) 13:70-4; Astor et al., Serum Beta -2-microglobulin at discharge predicts mortality and graft loss following kidney transplantation, Kidney International (2013) 84:810-817).

Поскольку белковые агрегаты B2M играют роль в провоцировании остеоартрита, существует опасение, что белок может быть токсичным для нервных клеток, чувствительных к аномальным отложениям белков (Giorgetti et al., beta2-Microglobulin is potentially neurotoxic, but the blood brain barrier is likely to protect the brain from its toxicity, Nephrology Dialysis Transplantation (2009) 24:1176-81). Белок был вовлечен в развитие нейронов, нормальную гиппокамп-зависимую память и образование синапсов и пластичность синапсов (Bilousova et al., Major histocompatibility complex class I molecules modulate embryonic neuritogenesis and neuronal polarization, Journal of Neuroimmunology (2012) 247:1-8; Harrison et al., Human brain weight is correlated with expression of the 'housekeeping genes' beta-2-microglobulin and TATAbinding protein, Neuropathology and Applied Neurobiology (2010) 36:498-504). Изменения в белках МНС I класса, таких как бета-2-микроглобулин, могут нарушать синаптическую пластичность и приводить к когнитивным расстройствам в стареющем, поврежденном или пораженном заболеванием головном мозге (Nelson et al., MHC class I immune proteins are critical for hippocampus-dependent memory and gate NMDAR-dependent hippocampal long-term depression, Learning & Memory (2013) 20:505-17). Недостаточность B2M также может приводить в результате к потере асимметрии между левой и правой частями области гиппокампа в головном мозге (Kawahara et al., Neuronal major histocompatibility complex class I molecules are implicated in the generation of asymmetries in hippocampal circuitry, The Journal of Physiology (2013) 591:4777-91).Because B2M protein aggregates play a role in causing osteoarthritis, there is concern that the protein may be toxic to nerve cells sensitive to abnormal protein deposits (Giorgetti et al., beta2-Microglobulin is potentially neurotoxic, but the blood brain barrier is likely to protect the brain from its toxicity, Nephrology Dialysis Transplantation (2009) 24:1176–81). The protein has been implicated in neuronal development, normal hippocampus-dependent memory and synapse formation and synaptic plasticity (Bilousova et al., Major histocompatibility complex class I molecules modulate embryonic neuritogenesis and neuronal polarization, Journal of Neuroimmunology (2012) 247:1-8; Harrison et al., Human brain weight is correlated with expression of the 'housekeeping genes' beta-2-microglobulin and TATAbinding protein, Neuropathology and Applied Neurobiology (2010) 36:498-504). Alterations in MHC class I proteins, such as beta-2-microglobulin, may impair synaptic plasticity and lead to cognitive impairment in the aging, damaged, or disease-affected brain (Nelson et al., MHC class I immune proteins are critical for hippocampus-dependent memory and gate NMDAR-dependent hippocampal long-term depression, Learning & Memory (2013) 20:505-17). B2M deficiency may also result in loss of asymmetry between the left and right portions of the hippocampal region of the brain (Kawahara et al., Neuronal major histocompatibility complex class I molecules are implicated in the generation of asymmetries in hippocampal circuitry, The Journal of Physiology (2013) ) 591:4777-91).

Кроме того, B2M служит в качестве молекулярного маркера, который можно применять для определения ослабленного иммунитета или активации иммунных реакций в центральной нервной системе (Svatohova et al., Beta2-microglobulin as a diagnostic marker in cerebrospinal fluid: a follow-up study, Disease Markers (2014) 2014). Уровни белка могут указывать на степень воспалительной реакции в центральной нервной системе. В обзоре B2M и его применения в качестве маркера заболеваний говорится о том, что повышенные уровни B2M в спинномозговой жидкости отражают рассеянный склероз, поражение нервной системы при болезни Бехчета, саркоидоз, комплекс синдром приобретенного иммунодефицита-деменция и метастазы злокачественных опухолей в оболочки головного мозга (Adachi, Beta-2microglobulin levels in the cerebrospinal fluid: their value as a disease marker. A review of the recent literature, European Neurology (1991) 31:181-5). Другие исследования говорят о том, что B2M потенциально может служить в качестве клинического маркера для риска когнитивного нарушения или в качестве инструмента для прогнозирования развития заболевания у индивидов, страдающих от ряда заболеваний, в том числе почечной недостаточности, ВИЧ-инфекции и болезни Альцгеймера (Almeida, Cognitive impairment and major depressive disorder in HIV infection and cerebrospinal fluid biomarkers, Arquivos de NeuroPsiquiatria (2013) 71:689-92; Annunziata et al., Serum beta-2-microglobulin levels and cognitive function in chronic dialysis patients, Clinica Chimica Acta (1991) 201:139-41; Doecke et al., Blood-based protein biomarkers for diagnosis of Alzheimer disease, Archives of Neurology (2012) 69:1318-25; Isshiki et al., Cerebral blood flow in patients with peritoneal dialysis by an easy Z-score imaging system for brain perfusion single photon emission tomography, Therapeutic Apheresis and Dialysis (2014) 18:291-6).In addition, B2M serves as a molecular marker that can be used to identify weakened immunity or activation of immune responses in the central nervous system (Svatohova et al., Beta2-microglobulin as a diagnostic marker in cerebrospinal fluid: a follow-up study, Disease Markers (2014) 2014). Protein levels may indicate the extent of the inflammatory response in the central nervous system. A review of B2M and its use as a disease marker suggests that elevated levels of B2M in the cerebrospinal fluid reflect multiple sclerosis, nervous system involvement in Behçet's disease, sarcoidosis, acquired immunodeficiency syndrome-dementia complex, and meningeal metastases from malignant tumors (Adachi , Beta-2microglobulin levels in the cerebrospinal fluid: their value as a disease marker. A review of the recent literature, European Neurology (1991) 31:181-5). Other studies suggest that B2M could potentially serve as a clinical marker for the risk of cognitive impairment or as a tool for predicting disease progression in individuals suffering from a range of diseases, including kidney failure, HIV infection and Alzheimer's disease (Almeida, Cognitive impairment and major depressive disorder in HIV infection and cerebrospinal fluid biomarkers, Arquivos de NeuroPsiquiatria (2013) 71:689-92; Annunziata et al., Serum beta-2-microglobulin levels and cognitive function in chronic dialysis patients, Clinica Chimica Acta ( 1991) 201:139-41; Doecke et al., Blood-based protein biomarkers for diagnosis of Alzheimer disease, Archives of Neurology (2012) 69:1318-25; Isshiki et al., Cerebral blood flow in patients with peritoneal dialysis by an easy Z-score imaging system for brain perfusion single photon emission tomography, Therapeutic Apheresis and Dialysis (2014) 18:291-6).

Повышенные уровни в сыворотке имеют особую значимость для прогнозирования у взрослых людей множественной миеломы, лимфоцитарного лейкоза и лимфомы (Kantarjian et al., Prognostic significance of elevated serum beta 2-microglobulin levels in adult acute lymphocytic leukemia, The American Journal of Medicine (1992) 93:599-604; Wu et al., Prognostic significance of serum beta-2 microglobulin in patients with non-Hodgkin lymphoma, Oncology (2014) 87:40-7). Во все большем количестве исследований продолжают изучать воздействия аномальных уровней B2M в сыворотке и тканях на развитие злокачественной опухоли, сердечно-сосудистого заболевания, шизофрении и активности системных заболеваний (Chittiprol et al., Longitudinal study of beta2-microglobulin abnormalities in schizophrenia, International Immunopharmacology (2009) 9:1215-7). В некоторых случаях B2M являлся мишенью при терапии заболеваний (Morabito et al., Analysis and clinical relevance of human leukocyte antigen class I, heavy chain, and beta2-microglobulin down regulation in breast cancer, Human Immunology (2009) 70:492-5; Yang et al., Identification of beta2-microglobulin as a potential target for ovarian cancer, Cancer Biology & Therapy (2009) 8:232-8).Elevated serum levels are of particular significance in predicting multiple myeloma, lymphocytic leukemia, and lymphoma in adults (Kantarjian et al., Prognostic significance of elevated serum beta 2-microglobulin levels in adult acute lymphocytic leukemia, The American Journal of Medicine (1992) 93 :599-604; Wu et al., Prognostic significance of serum beta-2 microglobulin in patients with non-Hodgkin lymphoma, Oncology (2014) 87:40-7). An increasing number of studies continue to examine the effects of abnormal levels of B2M in serum and tissue on the development of malignancy, cardiovascular disease, schizophrenia, and systemic disease activity (Chittiprol et al., Longitudinal study of beta2-microglobulin abnormalities in schizophrenia, International Immunopharmacology (2009) ) 9:1215-7). In some cases, B2M has been a target for disease therapy (Morabito et al., Analysis and clinical relevance of human leukocyte antigen class I, heavy chain, and beta2-microglobulin down regulation in breast cancer, Human Immunology (2009) 70:492-5; Yang et al., Identification of beta2-microglobulin as a potential target for ovarian cancer, Cancer Biology & Therapy (2009) 8:232-8).

- 2 045040- 2 045040

Краткое раскрытие настоящего изобретенияBrief Disclosure of the Present Invention

Предполагаются способы лечения взрослого млекопитающего от нарушения, ассоциированного со старением. Аспекты способов включают в себя снижение уровня в2-микроглобулина (B2M) у млекопитающего в степени, достаточной для лечения млекопитающего от нарушения, ассоциированного со старением. Ряд нарушений, ассоциированных со старением, можно лечить посредством практического осуществления способов, причем данные нарушения включают в себя когнитивные нарушения.Methods are provided for treating an adult mammal for a disorder associated with aging. Aspects of the methods include reducing β2-microglobulin (B2M) levels in a mammal to an extent sufficient to treat the mammal for a disorder associated with aging. A number of disorders associated with aging can be treated by the practice of the methods, these disorders including cognitive impairment.

Краткое описание фигурBrief description of the figures

Фиг. 1a-1k. B2M представляет собой компонент подвергающейся старению системной среды, который нарушает гиппокамп-зависимую когнитивную функцию и нейрогенез во взрослом возрасте. Фиг. 1а и 1с, схематическое изображение сравнения не объединенных в пару молодых и старых мышей (фиг. 1а) и сравнение молодых изохронных и гетерохронных парабионтов (фиг. 1с). Фиг. 1b и 1с, изменения концентрации B2M в плазме крови с возрастом в 3, 6, 12, 18 и 24 месяца (фиг. 1b) и у молодых изохронных и молодых гетерохронных парабионтов спустя пять недель после парабиоза (фиг. 1d). Данные от 5 мышей на группу. Фиг. 1е и 1f, изменения концентраций B2M в плазме крови (фиг. 1e; r=0,51; р<0,0001; 95% доверительный интервал=0,19-0,028) и CSF (спинномозговая жидкость) (фиг. 1f) с возрастом у здоровых субъектов-людей. Фиг. 1g и 1k, молодым взрослым (3 месяца) мышам вводили инъекцией интраорбитально B2M или контроль в виде PBS (среда) пять раз за 12 суток. Фиг. 1g, схематическое изображение, иллюстрирующее хронологический порядок, используемый для обработки B2M и тестирования когнитивных способностей. Фиг. 1h и 1i, гиппокампальное обучение и память оценивали с помощью RAWM (фиг. 1h) и контекстуального замирания (фиг. 1i). Фиг. 1h, количество ошибочных входов в рукав лабиринта перед нахождением платформы. i, время замирания в процентах через 24 ч после тренировки. Данные от 9-10 мышей на группу. Фиг. 1j, типичное поле зрения с Dcx-положительными клетками для каждой группы обработки (масштабная метка: 100 мкм). Фиг. 1k, количественный анализ нейрогенеза в зубчатой извилине (DG) после обработки. Данные от 7-8 мышей на группу. Все данные представлены в виде точечных диаграмм для среднего значения или столбчатых графиков для среднего значения ±SEM; *Р<0,05; **Р<0,01; ***Р<0,001, используется t-критерий (фиг. 1d, 1f, 1i и 1k), ANOVA, апостериорный критерий Тьюки (фиг. 1b), U-критерий Манна-Уитни (е), и для повторных измерений используется ANOVA, апостериорный критерий Бонферрони (фиг. 1k).Fig. 1a-1k. B2M is a component of the aging systemic environment that impairs hippocampus-dependent cognitive function and neurogenesis in adulthood. Fig. 1a and 1c, schematic representation of the comparison of unpaired young and old mice (Fig. 1a) and the comparison of young isochronic and heterochronic parabionts (Fig. 1c). Fig. 1b and 1c, changes in plasma B2M concentrations with age at 3, 6, 12, 18 and 24 months (Fig. 1b) and in young isochronic and young heterochronic parabionts five weeks after parabiosis (Fig. 1d). Data from 5 mice per group. Fig. 1e and 1f, changes in plasma concentrations of B2M (Fig. 1e; r=0.51; p<0.0001; 95% confidence interval=0.19-0.028) and CSF (cerebrospinal fluid) (Fig. 1f) with age in healthy human subjects. Fig. 1g and 1k, young adult (3 months) mice were injected intraorbitally with B2M or PBS control (medium) five times over 12 days. Fig. 1g is a schematic diagram illustrating the chronological order used for B2M processing and cognitive ability testing. Fig. 1h and 1i, hippocampal learning and memory were assessed using RAWM (Fig. 1h) and contextual freezing (Fig. 1i). Fig. 1h, number of incorrect entries into the maze arm before finding the platform. i, percent freezing time 24 h after training. Data from 9-10 mice per group. Fig. 1j, Representative field of view with Dcx-positive cells for each treatment group (scale bar: 100 μm). Fig. 1k, Quantitative analysis of neurogenesis in the dentate gyrus (DG) after treatment. Data from 7-8 mice per group. All data are presented as scatter plots for the mean or bar plots for the mean ±SEM; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001, t test (Figures 1d, 1f, 1i and 1k), ANOVA, Tukey's post hoc test (Figure 1b), Mann-Whitney U test (e), and ANOVA for repeated measures , Bonferroni post hoc test (Fig. 1k).

Фиг. 2а-2е. Гиппокамп-зависимое обучение и память. Фиг. 2а-2е, обучение и память оценивали в ходе нормального старения у молодых животных (возрастом 3 месяца) в сравнении со старыми животными (возрастом 18 месяцев) с использованием моделей RAWM (фиг. 2а и 2b) и контекстуального замирания (фиг. 2с и 2е). n=10 на группу. Фиг. 2а, старые мыши демонстрируют нарушенное обучение и память в отношении местоположения платформы в ходе фазы тестирования в задаче RAWM. Ослабление когнитивных способностей количественно определяли в виде количества ошибочных входов в рукав лабиринта, совершаемых перед нахождением целевой платформы. Фиг. 2b, выявляли отсутствие различий в скоростях плавания между молодыми и старыми животными. Фиг. 2с, молодые и старые животные проявляли подобное исходное время замирания в ходе тренировки условно-рефлекторного замирания. Фиг. 2d, при контекстуальном замирании старые мыши демонстрируют уменьшенное время замирания в ходе тестирования контекстуальной памяти. Фиг. 2е, выявляли отсутствие различий в памяти, обусловленной сигналом, через 24 ч после тренировки. Данные представлены в виде среднего значения ±s.e.m.; *Р<0,05; **Р<0,01; n.s. - не значимое; t-критерий (фиг. 2а-2с и 2е), для повторных измерений использовался ANOVA, апостериорный критерий Бонферрони (фиг. 2d).Fig. 2a-2e. Hippocampus-dependent learning and memory. Fig. 2a-2e, learning and memory were assessed during normal aging in young animals (3 months old) versus aged animals (18 months old) using RAWM models (Figures 2a and 2b) and contextual freezing (Figures 2c and 2e ). n=10 per group. Fig. 2a, aged mice show impaired learning and memory for platform location during the test phase of the RAWM task. Cognitive decline was quantified as the number of erroneous entries into the maze arm made before finding the target platform. Fig. 2b revealed no differences in swimming speeds between young and old animals. Fig. 2c, young and old animals exhibited similar initial freezing times during conditioned freezing training. Fig. 2d, In contextual freezing, aged mice exhibit reduced freezing time during contextual memory testing. Fig. 2e revealed no differences in cue-conditioned memory 24 hours after training. Data are presented as mean ±s.e.m.; *P<0.05; **P<0.01; n.s. - not significant; t-test (Figs. 2a-2c and 2e), ANOVA was used for repeated measures, Bonferroni post hoc test (Fig. 2d).

Фиг. 3a-3d. Масса, скорости плавания и память, обусловленная сигналом, не изменяются при системном введении B2M. Фиг. 3a-3d, молодым взрослым (3 месяца) мышам вводили инъекцией интраорбитально B2M или контроль в виде PBS (среда) пять раз за 12 суток перед исследованием поведения. Фиг. 3а, средняя масса мышей в группах, обработанных B2M и средой. Фиг. 3b, скорости плавания мышей, которым вводили инъекцией B2M или среду в ходе фазы тестирования в RAWM. Фиг. 3с и 3d, условнорефлекторная реакция страха проявлялась в виде замирания. Фиг. 3с, животные из всех групп обработки проявляли подобное исходное время замирания в ходе тренировки. Фиг. 3d, отсутствие различий в памяти, обусловленной сигналом, между группами выявляли при повторном воздействии условнорефлекторного стимула (звук и свет) в новом контексте через 24 ч после тренировки. Данные от 9 мышей на группу. Все данные представлены в виде среднего значения+SEM; n.s. - не значимое; t-критерий.Fig. 3a-3d. Mass, swimming speeds, and cue-mediated memory are not altered by systemic administration of B2M. Fig. 3a-3d, young adult (3 months) mice were injected intraorbitally with B2M or PBS control (medium) five times 12 days before behavioral testing. Fig. 3a, Average weight of mice in groups treated with B2M and medium. Fig. 3b, swimming speeds of mice injected with B2M or medium during the testing phase of RAWM. Fig. 3c and 3d, the conditioned reflex reaction of fear manifested itself in the form of freezing. Fig. 3c, animals from all treatment groups exhibited similar initial freezing times during training. Fig. 3d, no differences in cue-conditioned memory between groups were detected when the conditioned stimulus (sound and light) was re-exposed in a new context 24 hours after training. Data from 9 mice per group. All data are presented as mean+SEM; n.s. - not significant; t-test.

Фиг. 4а и 4b. Системное введение B2M снижает нейрогенез в DG у молодых животных. Фиг. 4а и 4b, молодым взрослым мышам (3-4 месяца) вводили инъекцией B2M или контроль в виде PBS (среда) посредством интраорбитальных инъекций пять раз за 12 суток. Перед умерщвлением бромдезоксиуридин (BrdU) вводили посредством интраперитонеальных инъекций в течение трех суток. Количественное определение МСМ2-положительных и BrdU-положительных клеток в зубчатой извилине (DG) после обработки. Данные от 5 мышей на группу. Все данные представлены в виде среднего значения +SEM; *Р<0,05; **Р<0,01; t-критерий.Fig. 4a and 4b. Systemic administration of B2M reduces neurogenesis in the DG in young animals. Fig. 4a and 4b, young adult mice (3-4 months) were injected with B2M or PBS control (medium) via intraorbital injections five times over 12 days. Before sacrifice, bromodeoxyuridine (BrdU) was administered by intraperitoneal injection for three days. Quantification of MCM2-positive and BrdU-positive cells in the dentate gyrus (DG) after treatment. Data from 5 mice per group. All data are presented as mean +SEM; *P<0.05; **P<0.01; t-test.

Фиг. 5a-5h. Локальная экспрессия B2M повышается в гиппокампе в ходе старения и нарушает гиппокамп-зависимую когнитивную функцию и нейрогенез во взрослом возрасте. Фиг. 5а и 5b, типичныйFig. 5a-5h. Local B2M expression increases in the hippocampus during aging and impairs hippocampus-dependent cognitive function and neurogenesis in adulthood. Fig. 5a and 5b, typical

- 3 045040 вестерн-блот и количественный анализ лизатов гиппокампов, меченных антителами к B2M и к актину, от молодых (3 месяца) и старых (18 месяцев) животных, не объединенных в пары (фиг. 5а), или молодых изохронных и молодых гетерохронных парабионтов через пять недель после парабиоза (фиг. 5b). Фиг. 5с-5е, молодым взрослым (3 месяца) мышам дикого типа (WT) и мышам, нокаутным по транспортеру 1, связанному с процессингом антигена (Tap1’/’), вводили посредством унилатеральных стереотаксических инъекций B2M или контроль в виде среды. Фиг. 5с, типичное поле зрения с Dcx-положительными клетками в смежных сторонах DG в пределах одного и того же среза показано для WT и Tap1^-/’ животных из групп обработки. Фиг. 5d и 5е, количественное определение нейрогенеза в DG y WT (d) и TapA (фиг. 5е) мышей после стереотаксического введения B2M. Данные от пяти мышей на группу. Фиг. 5f-5h, молодым взрослым мышам вводили посредством билатеральных стереотаксических инъекций B2M или среду шесть суток перед исследованием поведения. Фиг. 5f, схематическое изображение, иллюстрирующее хронологический порядок, используемый для локального введения B2M и тестирования когнитивных способностей. Фиг. 5g и 5h, обучение и память оценивали с помощью RAWM (фиг. 5h) и контекстуального замирания (фиг. 5g) после стереотаксических инъекций. Данные от 10 животных на группу. Все данные представлены в виде среднего значения ±SEM; *Р<0,05; **Р<0,01; n.s. - не значимое; ANOVA, tкритерий (фиг. 5a,5b,5d,5e и 5h), для повторных измерений использовался ANOVA, апостериорный критерий Бонферрони (фиг. 5g).- 3 045040 Western blot and quantitative analysis of hippocampal lysates labeled with anti-B2M and anti-actin antibodies from young (3 months) and old (18 months) animals not paired (Fig. 5a), or young isochronous and young heterochronic parabionts five weeks after parabiosis (Fig. 5b). Fig. 5c-5e, young adult (3 months) wild-type (WT) and antigen processing-associated transporter 1 (Tap1'/') knockout mice were treated with unilateral stereotactic injections of B2M or vehicle control. Fig. 5c, a typical field of view with Dcx-positive cells in adjacent sides of the DG within the same section is shown for WT and Tap1 ^-/ ' animals from the treatment groups. Fig. 5d and 5e, quantification of neurogenesis in DG y WT (d) and TapA (Fig. 5e) mice after stereotactic administration of B2M. Data from five mice per group. Fig. 5f-5h, young adult mice were administered via bilateral stereotactic injections of B2M or medium six days before behavioral testing. Fig. 5f is a schematic diagram illustrating the chronological order used for local B2M administration and cognitive ability testing. Fig. 5g and 5h, learning and memory were assessed using RAWM (Fig. 5h) and contextual freezing (Fig. 5g) after stereotactic injections. Data from 10 animals per group. All data are presented as mean ±SEM; *P<0.05;**P<0.01; ns - not significant; ANOVA, t test (Fig. 5a, 5b, 5d, 5e and 5h), for repeated measures ANOVA, Bonferroni post hoc test was used (Fig. 5g).

Фиг. 6а-6с. Скорости плавания и память, обусловленная сигналом, не изменяются при локальном введении B2M. Фиг. 6а-6с, молодым взрослым мышам вводили посредством билатеральных стереотаксических инъекций B2M или контроль в виде PBS (среда) шесть суток перед исследованием поведения. Фиг. 6а, скорости плавания мышей, которым вводили инъекцией B2M или среду в ходе фазы тестирования в RAWM. Фиг. 6b, животные из всех групп обработки проявляли подобное исходное время замирания в ходе тренировки условно-рефлекторного замирания. Фиг. 6с, отсутствие различий в памяти, обусловленной сигналом, между группами выявляли при повторном воздействии условно-рефлекторного стимула (звук и свет) в новом контексте через 24 ч после тренировки. Данные от 10 мышей на группу. Все данные представлены в виде среднего значения +SEM; n.s. - не значимое; t-критерий.Fig. 6a-6c. Swimming speeds and cue-induced memory are not affected by local administration of B2M. Fig. 6a-6c, young adult mice were administered via bilateral stereotactic injections of B2M or PBS control (medium) six days before behavioral testing. Fig. 6a, swimming speeds of mice injected with B2M or medium during the testing phase of RAWM. Fig. 6b, animals from all treatment groups exhibited similar initial freezing times during conditioned freezing training. Fig. 6c, the absence of differences in cue-conditioned memory between groups was revealed when the conditioned stimulus (sound and light) was re-exposed in a new context 24 hours after training. Data from 10 mice per group. All data are presented as mean +SEM; n.s. - not significant; t-test.

Фиг. 7а-7е. Наблюдали отсутствие различий в нейрогенезе в DG у молодых животных, не объединенных в пары, или молодых изохронных WT и Tap1^-/’ животных. Фиг. 7а, количественное определение даблкортин (Dcx)-положительных клеток в DG молодых взрослых (3 месяца) не объединенных в пары мышей дикого типа (WT) и ТарТ/' мышей. Данные от 5 мышей на группу. Фиг. 7b, схематическое изображение молодых изохронных парабионтов WT и TapT/’. Фиг. 7с-7е, количественное определение Dcx, транскрипционного фактора T-box Tbr2 и BrdU с помощью иммуноокрашивания у молодых изохронных парабионтов WT и Tap1’’ через пять недель после парабиоза. Данные от 6-8 мышей на группу. Все данные представлены в виде среднего значения +SEM; n.s. - не значимое; t-критерий (фиг. 7а); ANOVA, апостериорный критерий Тьюки (фиг. 7с-7е).Fig. 7a-7e. No differences in neurogenesis in the DG were observed between young unpaired or young isochronous WT and Tap1 ^-/ ' animals. Fig. 7a, Quantification of doublecortin (Dcx)-positive cells in the DG of young adult (3 months) unpaired wild-type (WT) and TarT/' mice. Data from 5 mice per group. Fig. 7b, schematic representation of young isochronous parabionts WT and TapT/'. Fig. 7c-7f, Quantification of Dcx, T-box transcription factor Tbr2 and BrdU by immunostaining in young isochronous WT and Tap1'' parabionts five weeks after parabiosis. Data from 6-8 mice per group. All data are presented as mean +SEM; ns - not significant; t-test (Fig. 7a); ANOVA, Tukey's post hoc test (Fig. 7c-7e).

Фиг. 8a-8d. Снижение эндогенной экспрессии МНС I на поверхности клеток отчасти ослабляет отрицательные эффекты гетерохронного парабиоза в отношении нейрогенеза во взрослом возрасте у молодых животных. Фиг. 8а, схематическое изображение молодых изохронных парабионтов из животных дикого типа (WT) и нокаутных по Tap1 животных (Tap1’’) и молодых гетерохронных парабионтов из WT и TapT/’. Фиг. 8b и 8с, типичное поле зрения (фиг. 8b) и количественное определение (фиг. 8с) даблкортина с помощью иммуноокрашивания у молодых изохронных и гетерохронных парабионтов через пять недель после парабиоза (стрелками указаны отдельные клетки, масштабная метка: 100 мкм). Фиг. 8d, перед умерщвлением животным вводили инъекцией бромдезоксиуридин (BrdU) в течение трех суток и количественно определяли пролиферирующие клетки с включенным BrdU в DG после парабиоза. Данные от 8 молодых изохронных WT, 6 молодых изохронных Tap1’’, 8 молодых гетерохронных WT и 8 молодых гетерохронных Tap1’^/’ парабионтов. Все данные представлены в виде среднего значения ±SEM; *Р<0,05; ANOVA, апостериорный критерий Тьюки.Fig. 8a-8d. Reducing endogenous MHC I expression on the cell surface partially attenuates the negative effects of heterochronic parabiosis on adult neurogenesis in young animals. Fig. 8a, schematic representation of young isochronic parabionts from wild type (WT) and Tap1 knockout animals (Tap1'') and young heterochronic parabionts from WT and TapT/'. Fig. 8b and 8c, typical field of view (Fig. 8b) and quantification (Fig. 8c) of doublecortin by immunostaining in young isochronic and heterochronic parabionts five weeks after parabiosis (arrows indicate individual cells, scale bar: 100 μm). Fig. 8d, before sacrifice, animals were injected with bromodeoxyuridine (BrdU) for three days, and proliferating BrdU-incorporated cells in the DG after parabiosis were quantified. Data from 8 young isochronic WT, 6 young isochronic Tap1'', 8 young heterochronic WT and 8 young heterochronic Tap1' ^/ ' parabionts. All data are presented as mean ±SEM; *P<0.05; ANOVA, Tukey's post hoc test.

Фиг. 9а и 9b. Снижение эндогенной экспрессии МНС I на поверхности клеток отчасти ослабляет уменьшение количества предшественников нервных клеток у молодых мышей после гетерохронного парабиоза. Фиг. 9а, схематическое изображение молодых изохронных парабионтов из животных дикого типа (WT) и нокаутных по Tap1 животных (Tap1’’) и молодых гетерохронных парабионтов из WT и Tap1’’. Фиг. 9b, количественное определение транскрипционного фактора T-box Tbr2 с помощью иммуноокрашивания у молодых изохронных и гетерохронных парабионтов через пять недель после парабиоза. Данные от 8 молодых изохронных WT, 6 молодых изохронных Tap!/’, 8 молодых гетерохронных WT и 8 молодых гетерохронных Tap1’’ парабионтов. Все данные представлены в виде среднего значения ±SEM; *P<0,05; ANOVA, апостериорный критерий Тьюки.Fig. 9a and 9b. Reduced endogenous MHC I expression on the cell surface partially attenuates the decrease in the number of neural precursors in young mice after heterochronic parabiosis. Fig. 9a, schematic representation of young isochronic parabionts from wild type (WT) and Tap1 knockout animals (Tap1'') and young heterochronic parabionts from WT and Tap1''. Fig. 9b, Quantification of the T-box transcription factor Tbr2 by immunostaining in young isochronic and heterochronic parabionts five weeks after parabiosis. Data from 8 young isochronic WT, 6 young isochronic Tap!/’, 8 young heterochronic WT and 8 young heterochronic Tap1’’ parabionts. All data are presented as mean ±SEM; *P<0.05; ANOVA, Tukey's post hoc test.

Фиг. 10а-10j. Отсутствие эндогенного B2M улучшает гиппокамп-зависимую когнитивную функцию и нейрогенез во взрослом возрасте у старых животных. Фиг. 10а-10d, обучение и память оценивали у молодых (3 месяца) и старых (15-16 месяцев) мышей дикого типа (WT) и нокаутных по B2M мышей (B2M’ ’) с помощью RAWM (фиг. 10а, 10с) и контекстуального замирания (фиг. 10b и 10d). Данные от 10 молодых и 8-12 старых мышей на генотип. Фиг. 10е-10j, нейрогенез анализировали с помощью имму- 4 045040 ноокрашивания в отношении Dcx-положительных клеток в DG у молодых и старых WT и B2M^-/- мышей. Типичное поле зрения и результаты количественного определения Dcx-положительных клеток показаны для молодых (фиг. 10е и 10f) и старых (фиг. 10е и 10g) WT и B2M^-/- животных (стрелками указаны отдельные незрелые нейроны, масштабная метка: 100 мкм). Данные от 8 молодых и 10 старых мышей на генотип. Фиг. 10h и 10j, WT и B2M’^/_ мышам вводили BrdU посредством интраперитонеальных инъекций в течение шести суток и умерщвляли 28 суток спустя. Фиг. 10h, типичный результат конфокальной микроскопии DG на срезах головного мозга, подвергнутых иммуноокрашиванию в отношении BrdU (красный) в комбинации с NeuN (зеленый). Фиг. 10i и 10j, количественное определение относительного количества клеток, положительных как по BrdU, так и по NeuN, из общего количества BrdU-положительных клеток в DG у молодых (фиг. 10i) и старых (фиг. 10j) животных WT и B2M⁷’. Данные от 8 мышей на группу (3 среза на мышь). Все данные представлены в виде среднего значения ±SEM; *P<0,05; **P<0,01; n.s. - не существенное; t-критерий (фиг. 10b, 10d, 10f, 10i, 10j); для повторных измерений использовался ANOVA, апостериорный критерий Бонферрони (фиг. 10а, фиг. 10с).Fig. 10a-10j. Lack of endogenous B2M improves hippocampus-dependent cognitive function and adult neurogenesis in aged animals. Fig. 10a-10d, learning and memory were assessed in young (3 months) and old (15-16 months) wild-type (WT) and B2M knockout (B2M'') mice using RAWM (Figs. 10a, 10c) and contextual fading (Figs. 10b and 10d). Data from 10 young and 8-12 old mice per genotype. Fig. 10e-10j, neurogenesis was analyzed by immunostaining for Dcx-positive cells in the DG of young and old WT and B2M ^-/- mice. Typical field of view and quantification results of Dcx-positive cells are shown for young (Figs. 10e and 10f) and old (Figs. 10e and 10g) WT and B2M ^-/- animals (arrows indicate individual immature neurons, scale bar: 100 µm) . Data from 8 young and 10 old mice per genotype. Fig. 10h and 10j, WT and B2M' ^/_ mice were administered BrdU by intraperitoneal injection for six days and sacrificed 28 days later. Fig. 10h, Typical DG confocal microscopy result on brain sections immunostained for BrdU (red) in combination with NeuN (green). Fig. 10i and 10j, quantification of the relative number of cells positive for both BrdU and NeuN from the total number of BrdU-positive cells in the DG in young (Fig. 10i) and old (Fig. 10j) WT and B2M ⁷ ' animals. Data from 8 mice per group (3 sections per mouse). All data are presented as mean ±SEM; *P<0.05;**P<0.01; ns - not significant; t-test (Fig. 10b, 10d, 10f, 10i, 10j); ANOVA, Bonferroni post hoc test was used for repeated measures (Fig. 10a, Fig. 10c).

Фиг. 11a-11f. Скорости плавания и память, обусловленная сигналом, не изменяются у старых B2M- животных. Фиг. 11a-11f, гиппокампальное обучение и память оценивали у старых взрослых (17 месяцев) животных WT в ходе фазы тестирования в RAWM. Животные проявляли подобное исходное время замирания в ходе тренировки условно-рефлекторного замирания вне зависимости от генотипа. Отсутствие различий в памяти, обусловленной сигналом, между генотипами выявляли при повторном воздействии на мышей условно-рефлекторного стимула (звук и свет) в новом контексте через 24 ч после тренировки. Данные от 12 WT и 8 B2M’/’ мышей. Все данные представлены в виде среднего значения+SEM; n.s. - не значимое; t-критерий.Fig. 11a-11f. Swimming speeds and cue-induced memory are unchanged in aged B2M animals. Fig. 11a–11f, hippocampal learning and memory were assessed in old adult (17 months) WT animals during the testing phase of RAWM. Animals exhibited similar initial freezing times during conditioned freezing training, regardless of genotype. The absence of differences in cue-conditioned memory between genotypes was revealed when mice were repeatedly exposed to a conditioned reflex stimulus (sound and light) in a new context 24 h after training. Data from 12 WT and 8 B2M'/' mice. All data are presented as mean+SEM; n.s. - not significant; t-test.

Фиг. 12а-12е. Отсутствие эндогенного B2M повышает пролиферацию, но не дифференцировку астроцитов зависимым от возраста образом in vivo. Фиг. 12а-12с, для оценки пролиферации молодым (3 месяца) и старым (15-16 месяцев) мышам дикого типа (WT) и нокаутным по B2M мышам (B2M’^/_) вводили BrdU посредством интраперитонеальных инъекций в течение трех суток перед умерщвлением. Фиг. 12b и 12с, иммуноокрашивание BrdU-положительных клеток количественно оценивали в DG у молодых (фиг. 12b) и старых (фиг. 12с) животных. Данные от 8 молодых и 10 старых мышей на генотип. Фиг. 12с12е, для оценки дифференцировки астроцитов WT и B2M’^/’мышам вводили BrdU посредством интраперитонеальных инъекций в течение шести суток и умерщвляли 28 суток спустя. Фиг. 12с, типичный результат конфокальной микроскопии DG в срезах головного мозга, подвергнутых иммуноокрашиванию в отношении BrdU (красный) в комбинации с GFAP (синий). Фиг. 12d и 12е, количественное определение относительного количества клеток, положительных как по BrdU, так и по GFAP, из общего количества BrdU-положительных клеток в DG у молодых (фиг. 12d) и старых (фиг. 12е) животных WT и B2M⁷’. Данные от 8 мышей на группу (3 среза на мышь). Все данные представлены в виде среднего значения +SEM; **Р<0,01; n.s. - незначимое; t-критерий.Fig. 12a-12e. The absence of endogenous B2M increases astrocyte proliferation but not differentiation in an age-dependent manner in vivo. Fig. 12a-12c, to assess proliferation, young (3 months) and old (15-16 months) wild-type (WT) and B2M knockout (B2M' ^/_ ) mice were administered BrdU via intraperitoneal injection for three days before sacrifice. Fig. 12b and 12c, immunostaining of BrdU-positive cells was quantified in the DG of young (Fig. 12b) and old (Fig. 12c) animals. Data from 8 young and 10 old mice per genotype. Fig. 12c12e, to assess WT and B2M' ^/ 'astrocyte differentiation, mice were administered BrdU via intraperitoneal injection for six days and sacrificed 28 days later. Fig. 12c, Typical confocal microscopy result of DG in brain sections immunostained for BrdU (red) in combination with GFAP (blue). Fig. 12d and 12e, quantification of the relative number of cells positive for both BrdU and GFAP out of the total number of BrdU-positive cells in the DG in young (Fig. 12d) and old (Fig. 12e) WT and B2M ⁷ ' animals. Data from 8 mice per group (3 sections per mouse). All data are presented as mean +SEM; **P<0.01; ns - not significant; t-test.

Фиг. 13. Относительные уровни бета-2-микроглобулина определяли в образцах плазмы крови здоровых мужчин-доноров возрастом 18, 30, 45, 55 и 66 лет с помощью протеомного анализа SomaScan (Somalogic, Inc, Boulder, CO). Для каждой возрастной группы плазму крови от 40 индивидов анализировали в виде 8 пулов из 5 индивидов на группу. Статистический анализ выполняли с использованием двухстороннего t-критерия Стьюдента с логарифмическим преобразованием значений, в также с помощью анализа тенденций изменения для непреобразованных данных с использованием критерия Джонкхиера-Терпстра. Наблюдаемые изменения считались высоко значимыми, когда p-значение с t-критерием составляло 1,1 х10’⁴ (возраст 66 лет в сравнении возрастом 18 лет), и p-значение для JT-критерия составляло 1,3х10’⁷ (все возрастные группы). (RFU относится к относительным единицам флуоресценции в протеомном анализе SomaScan).Fig. 13. Relative beta-2-microglobulin levels were determined in plasma samples from healthy male donors aged 18, 30, 45, 55, and 66 years using the SomaScan proteomic assay (Somalogic, Inc, Boulder, CO). For each age group, blood plasma from 40 individuals was analyzed in 8 pools of 5 individuals per group. Statistical analysis was performed using a two-tailed Student's t test with log-transformed values, and trend analysis for untransformed data using the Jonckheere-Terpstra test. Observed changes were considered highly significant when the t-test p-value was 1.1 x ^10'4 (age 66 vs. age 18) and the JT-test p-value was 1.3 x ^10'7 (all age groups ). (RFU refers to relative fluorescence units in SomaScan proteomic analysis).

Подробное раскрытие настоящего изобретенияDetailed Disclosure of the Present Invention

Перед тем как данные способы и композиции будут описаны, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретным описанным способом или композицией, поскольку они, конечно, могут изменяться. Также следует понимать, что терминология, используемая в данном документе, предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления, и не предполагается ограничение ею, поскольку объем настоящего изобретения будет ограничиваться только пунктами прилагаемой формулы изобретения.Before these methods and compositions are described, it should be understood that the present invention is not limited to the specific method or composition described, as they are, of course, subject to change. It should also be understood that the terminology used herein is intended to describe specific embodiments only and is not intended to be limiting thereof, as the scope of the present invention will be limited only by the claims appended hereto.

В случае, когда представлен диапазон значений, следует понимать, что также специально раскрыто каждое промежуточное значение между верхним и нижним пределами этого диапазона до десятых долей единицы в нижнем пределе, если контекст явно не предписывает иное. Каждый меньший диапазон между любым изложенным значением или промежуточное значение в изложенном диапазоне и любое другоеWhere a range of values is presented, it should be understood that each intermediate value between the upper and lower limits of that range up to tenths of a unit at the lower limit is also specifically disclosed, unless the context clearly dictates otherwise. Each lesser range between any stated value or an intermediate value within the stated range and any other

- 5 045040 изложенное или промежуточное значение в этом изложенном диапазоне охватываются настоящим изобретением. Верхний и нижний пределы в этих меньших диапазонах могут быть независимо включены в диапазон или исключены из него, и каждый диапазон, в котором один из пределов, ни один из пределов или оба из пределов включены в меньшие диапазоны, также охватывается настоящим изобретением с учетом любого специально исключенного предела в изложенном диапазоне. В случае, когда изложенный диапазон включает в себя один или оба из пределов, диапазоны, исключающие любой из этих включенных пределов или оба из них, также включены в настоящее изобретение.- 5 045040 the stated value or an intermediate value in this stated range are covered by the present invention. Upper and lower limits in these smaller ranges may be independently included in or excluded from the range, and each range in which one of the limits, neither of the limits, or both of the limits is included in the smaller ranges is also covered by the present invention, subject to any specifically excluded limit within the stated range. In the case where the stated range includes one or both of the limits, ranges excluding either or both of these included limits are also included in the present invention.

Если не указано иное, все технические и научные термины, применяемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понятно квалифицированному специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Несмотря на то что любые способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в данном документе, можно применять при практическом осуществлении или испытании настоящего изобретения, далее будут описаны некоторые возможные и предпочтительные способы и материалы. Все публикации, упомянутые в данном документе, включены в данный документ посредством ссылки с раскрытием и описанием способов и/или материалов, в связи с которыми цитируются публикации. Понятно, что настоящее раскрытие заменяет собой любое раскрытие из включенной публикации в той мере, в которой существует противоречие.Unless otherwise specified, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one skilled in the art to which the present invention relates. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein may be used in the practice or testing of the present invention, some possible and preferred methods and materials will now be described. All publications referred to herein are incorporated herein by reference with disclosure and description of the manner and/or materials in connection with which the publications are cited. It is understood that this disclosure supersedes any disclosure in the included publication to the extent of any conflict.

Как будет понятно специалисту в данной области техники при изучении настоящего раскрытия, каждый из отдельных вариантов осуществления, описанных и проиллюстрированных в данном документе, имеет отдельные компоненты и признаки, которые могут быть легко отделены или объединены с признаками любого из нескольких других вариантов осуществления без отступления от объема или идеи настоящего изобретения. Любой изложенный способ можно выполнять в изложенном порядке действий или в любом другом порядке, который является возможным с точки зрения логики.As one skilled in the art will appreciate upon examination of the present disclosure, each of the individual embodiments described and illustrated herein has distinct components and features that can be readily separated from or combined with features of any of several other embodiments without departing from the scope or idea of the present invention. Any stated method can be performed in the stated order of actions or in any other order that is logically possible.

Следует отметить, что при использовании в данном документе и прилагаемой формуле изобретения формы в единственном числе включают в себя соответствующие формы во множественном числе, если контекст явно не предписывает иное. Таким образом, например, упоминание клетки включает в себя множество таких клеток, и упоминание пептида включает в себя упоминание одного или нескольких пептидов и их эквивалентов, например, полипептидов, известных специалистам в данной области техники, и т.д.It should be noted that, as used herein and in the accompanying claims, the singular forms include the corresponding plural forms unless the context clearly dictates otherwise. Thus, for example, reference to a cell includes a plurality of such cells, and reference to a peptide includes reference to one or more peptides and their equivalents, e.g., polypeptides known to those skilled in the art, etc.

Публикации, обсуждаемые в данном документе, представлены исключительно для их раскрытия до даты подачи данной заявки. Ничто в данном документе не следует толковать как допущение, что настоящему изобретению может быть противопоставлена такая публикация в силу более раннего изобретения. Кроме того, представленные даты публикации могут отличаться от фактических дат публикации, которые могут нуждаться в независимом подтверждении.The publications discussed herein are presented solely for their disclosure prior to the filing date of this application. Nothing herein should be construed as suggesting that the present invention may be prejudiced by such publication by virtue of an earlier invention. In addition, publication dates presented may differ from actual publication dates, which may require independent confirmation.

СпособыMethods

Как кратко изложено выше, аспекты настоящего изобретения включают в себя способы лечения нарушения, ассоциированного со старением, у взрослого млекопитающего. Нарушение, ассоциированное со старением, может проявляться различным образом, например, в виде ассоциированного со старением когнитивного нарушения и/или физиологического нарушения, например, в форме повреждения центральных или периферических органов организма, как например, без ограничения, поражение клеток, повреждение ткани, дисфункция органа, ассоциированное со старением сокращение продолжительности жизни и канцерогенез, при этом конкретные органы и ткани, представляющие интерес, включают в себя, без ограничения, кожу, нервную ткань, мышцу, поджелудочную железу, головной мозг, почку, легкое, желудок, кишечник, селезенку, сердце, жировую ткань, семенники, яичник, матку, печень и кость; в форме уменьшенного нейрогенеза и т.д.As summarized above, aspects of the present invention include methods for treating a disorder associated with aging in an adult mammal. An aging-associated disorder may manifest itself in a variety of ways, such as aging-associated cognitive impairment and/or physiological impairment, such as damage to central or peripheral organs of the body, such as, but not limited to, cellular damage, tissue damage, dysfunction organs, aging-associated shortening of lifespan, and carcinogenesis, with specific organs and tissues of interest including, but not limited to, skin, nervous tissue, muscle, pancreas, brain, kidney, lung, stomach, intestine, spleen , heart, adipose tissue, testes, ovary, uterus, liver and bone; in the form of reduced neurogenesis, etc.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления нарушение, ассоциированное со старением, представляет собой ассоциированное со старением нарушение когнитивной способности у индивида, т.е. когнитивное нарушение, ассоциированное со старением. Под когнитивной способностью или когнитивной деятельностью подразумеваются умственные процессы, которые включают в себя внимание и концентрацию, обучение сложным задачам и понятиям, память (усвоение, сохранение и воспроизведение новой информации в короткий и/или длительный срок), обработку информации (касается информации, собранной при помощи пяти чувств), функцию пространственного зрения (зрительное восприятие, восприятие глубины, использование мысленного представления, копирование рисунков, конструирование объектов или форм), воспроизведение и понимание речи, плавность речи (поиск слов), решение проблем, принятие решений и управляющие функции (планирование и расстановка приоритетов). Под снижением когнитивных способностей подразумевается прогрессирующее снижение одной или нескольких из этих способностей, например, ухудшение памяти, речи, мышления, способности к оценке ситуации и т.д. Под нарушением когнитивной способности и когнитивным нарушением подразумевается снижение когнитивной способности по сравнению со здоровым индивидом, например, здоровым индивидом того же возраста, или по сравнению со способностью этого же индивида в более ранние моменты времени, например, за 2 недели, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 6 месяцев, 1 год, 2 года, 5 лет или 10 лет до этого или раньше. Когнитивные нарушения, ассоциированные со старением, включают в себя нарушения когнитивной способности, которые, как правило, являются ассоциированными со старением, в том числе, наIn accordance with some embodiments, the aging-associated disorder is an aging-associated impairment of cognitive ability in the individual, i.e. cognitive impairment associated with aging. Cognitive ability or cognitive activity refers to mental processes that include attention and concentration, learning complex tasks and concepts, memory (learning, storing and reproducing new information in the short and/or long term), information processing (relates to information collected through five senses), spatial vision (visual perception, depth perception, using mental representation, copying pictures, constructing objects or shapes), speech production and understanding, speech fluency (word search), problem solving, decision making, and executive functions (planning and prioritization). A decline in cognitive abilities refers to a progressive decline in one or more of these abilities, for example, deterioration in memory, speech, thinking, ability to assess a situation, etc. Impairment of cognitive ability and cognitive impairment refers to a decrease in cognitive ability compared to a healthy individual, for example, a healthy individual of the same age, or compared to the ability of the same individual at earlier points in time, for example, 2 weeks, 1 month, 2 months , 3 months, 6 months, 1 year, 2 years, 5 years or 10 years before or before. Cognitive impairment associated with aging includes impairments in cognitive ability that are typically associated with aging, including

- 6 045040 пример, когнитивное нарушение, ассоциированное с естественным процессом старения, например, умеренное когнитивное нарушение (M.C.I.); и когнитивное нарушение, ассоциированное с нарушением, ассоциированным со старением, то есть нарушением, которое наблюдается с возрастающей частотой при дальнейшем старении, например, с нейродегенеративным состоянием, таким как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, лобно-височная деменция, болезнь Хантингтона, боковой амиотрофический склероз, рассеянный склероз, глаукома, миотоническая дистрофия, сосудистая деменция и т.п.- 6 045040 example, cognitive impairment associated with the natural aging process, for example mild cognitive impairment (M.C.I.); and cognitive impairment associated with an aging-associated disorder, that is, a disorder that occurs with increasing frequency with further aging, for example, with a neurodegenerative condition such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, frontotemporal dementia, Huntington's disease, amyotrophic lateral sclerosis , multiple sclerosis, glaucoma, myotonic dystrophy, vascular dementia, etc.

Под лечением подразумевается, что достигается по меньшей мере ослабление одного или нескольких симптомов, ассоциированных с нарушением, ассоциированным со старением, которое поражает взрослое млекопитающее, причем ослабление используется в широком смысле в отношении по меньшей мере снижения величины параметра, например, симптома, ассоциированного с нарушением, которое подлежит лечению. Само по себе лечение также включает в себя ситуации, когда патологическое состояние или по меньшей мере симптомы, ассоциированные с ним, полностью подавляются, например, их возникновение предупреждается или останавливается, например, прекращается, в результате чего взрослое млекопитающее больше не страдает от нарушения или по меньшей мере от симптомов, которые характеризуют нарушение. В некоторых случаях лечение, осуществление лечения и т.п. относится к получению желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может быть профилактическим в виде полного или частичного предупреждения заболевания или его симптома и/или может быть терапевтическим в виде частичного или полного излечения от заболевания и/или неблагоприятного эффекта, свойственного заболеванию. Лечение может представлять собой любое лечение заболевания у млекопитающего, и оно включает в себя: (а) предупреждение возникновения заболевания у субъекта, который может быть предрасположен к заболеванию, но у которого заболевание еще не было диагностировано; (b) ингибирование заболевания, т.е. купирование его развития или (с) облегчение заболевания, т.е. обеспечение регресса заболевания. Лечение может приводить в результате к ряду разных физических проявлений, например, модуляции генной экспрессии, повышенному нейрогенезу, омоложению ткани или органов и т.д. Лечение протекающего заболевания, при котором лечение стабилизирует или снижает нежелательные клинические симптомы у пациента, осуществляется в соответствии с некоторыми вариантами осуществления. Такое лечение может осуществляться до полной потери функции у пораженных тканей. Терапию субъекту можно назначать во время симптоматической стадии заболевания и в некоторых случаях после симптоматической стадии заболевания.By treating is meant to achieve at least an improvement in one or more symptoms associated with an aging-associated disorder that affects an adult mammal, wherein attenuation is used broadly to refer to at least a decrease in the magnitude of a parameter, for example, a symptom associated with the disorder which is subject to treatment. Treatment itself also includes situations where the pathological condition, or at least the symptoms associated with it, is completely suppressed, for example, its occurrence is prevented or stopped, for example, ceased, with the result that the adult mammal no longer suffers from the disorder or at least from the symptoms that characterize the disorder. In some cases, treatment, implementation of treatment, etc. refers to obtaining the desired pharmacological and/or physiological effect. The effect may be prophylactic in the form of complete or partial prevention of a disease or symptom thereof and/or may be therapeutic in the form of partial or complete cure of a disease and/or an adverse effect inherent in the disease. Treatment may be any treatment of a disease in a mammal and includes: (a) preventing the occurrence of the disease in a subject who may be predisposed to the disease but in whom the disease has not yet been diagnosed; (b) inhibiting the disease, i.e. stopping its development or (c) alleviating the disease, i.e. ensuring regression of the disease. Treatment may result in a number of different physical manifestations, such as modulation of gene expression, increased neurogenesis, tissue or organ rejuvenation, etc. Treatment of an ongoing disease, in which the treatment stabilizes or reduces undesirable clinical symptoms in a patient, is carried out in accordance with some embodiments. Such treatment can be carried out until the affected tissues completely lose function. Therapy may be administered to a subject during the symptomatic stage of the disease and in some cases after the symptomatic stage of the disease.

В некоторых случаях, когда нарушение, ассоциированное со старением, представляет собой ассоциированное со старением снижение когнитивных способностей, лечение с помощью способов согласно настоящему раскрытию замедляет или уменьшает прогрессирование ассоциированного со старением снижения когнитивных способностей. Иными словами, когнитивные способности у индивида снижаются медленнее, если они вообще снижаются, после лечения с помощью раскрытых способов, чем до лечения или в отсутствие лечения с помощью раскрытых способов. В некоторых случаях лечение с помощью способов согласно настоящему раскрытию стабилизирует когнитивные способности у индивида. Например, прогрессирование снижения когнитивных способностей у индивида, страдающего от ассоциированного со старением снижения когнитивных способностей, останавливается после лечения с помощью раскрытых способов. В качестве другого примера, снижение когнитивных способностей у индивида, например, у индивида возрастом 40 лет или старше, который, как предполагается, страдает от ассоциированного со старением снижения когнитивных способностей, предупреждается после лечения с помощью раскрытых способов. Иными словами, не наблюдается (дальнейшего) когнитивного нарушения. В некоторых случаях лечение с помощью способов согласно настоящему раскрытию снижает когнитивное нарушение или вызывает его регресс, например, что можно наблюдать по улучшению когнитивных способностей у индивида, страдающего от ассоциированного со старением снижения когнитивных способностей. Иными словами, когнитивные способности у индивида, страдающего от ассоциированного со старением снижения когнитивных способностей, после лечения с помощью раскрытых способов становятся лучше, чем они были до лечения с помощью раскрытых способов, т.е. они улучшаются при лечении. В некоторых случаях лечение с помощью способов согласно настоящему раскрытию устраняет когнитивное нарушение. Иными словами, когнитивные способности у индивида, страдающего от ассоциированного со старением снижения когнитивных способностей, восстанавливаются, например, до их уровня, когда индивид был в возрасте приблизительно 40 лет или менее, после лечения с помощью раскрытых способов, например, что подтверждается улучшенными когнитивными способностями у индивида, страдающего от ассоциированного со старением снижения когнитивных способностей.In some cases where the disorder associated with aging is age-associated cognitive decline, treatment with the methods of the present disclosure slows or reduces the progression of age-associated cognitive decline. In other words, an individual's cognitive abilities decline more slowly, if at all, after treatment with the disclosed methods than before treatment or in the absence of treatment with the disclosed methods. In some cases, treatment with the methods of the present disclosure stabilizes cognitive abilities in an individual. For example, the progression of cognitive decline in an individual suffering from aging-associated cognitive decline is reversed following treatment using the disclosed methods. As another example, decline in cognitive ability in an individual, for example, an individual 40 years of age or older, who is believed to suffer from aging-associated cognitive decline, is prevented after treatment using the disclosed methods. In other words, there is no (further) cognitive impairment. In some cases, treatment with the methods of the present disclosure reduces or causes regression of cognitive impairment, for example, as may be observed by an improvement in cognitive performance in an individual suffering from aging-associated cognitive decline. In other words, the cognitive abilities of an individual suffering from aging-associated cognitive decline, after treatment using the disclosed methods, become better than they were before treatment using the disclosed methods, i.e. they improve with treatment. In some cases, treatment with the methods of the present disclosure reverses the cognitive impairment. In other words, the cognitive abilities of an individual suffering from aging-associated cognitive decline are restored, for example, to their level when the individual was approximately 40 years of age or less, after treatment using the disclosed methods, for example, as evidenced by improved cognitive abilities in an individual suffering from aging-associated cognitive decline.

В некоторых случаях лечение взрослого млекопитающего в соответствии с данными способами приводит в результате к изменению в центральном органе, например, органе центральной нервной системы, таком как головной мозг, спинной мозг и т.д., причем изменение может проявляться различным образом, например, как более подробно описано ниже, в том числе, без ограничения, на молекулярном, структурном и/или функциональном уровне, например, в форме усиленного нейрогенеза.In some cases, treating an adult mammal in accordance with these methods results in a change in a central organ, for example, an organ of the central nervous system such as the brain, spinal cord, etc., and the change can manifest itself in various ways, such as described in more detail below, including, without limitation, at the molecular, structural and/or functional level, for example, in the form of enhanced neurogenesis.

Как кратко изложено выше, способы, описанные в данном документе, представляют собой способы лечения нарушения, ассоциированного со старением, например, которое описано выше, у взрослого млекопитающего. Под взрослым млекопитающим подразумевают млекопитающее, которое достигло зрелоAs summarized above, the methods described herein are methods of treating a disorder associated with aging, such as that described above, in an adult mammal. By adult mammal we mean a mammal that has reached adulthood

- 7 045040 сти, т.е. которое является полностью развитым. В связи с этим взрослые млекопитающие не являются ювенильными. Виды млекопитающих, которые могут получать лечение с применением данных способов, включают в себя собак и кошек; лошадей; коров; овец и т.д., а также приматов, в том числе людей. Заявленные способы, композиции и реактивы также можно применять к модельным животным, в том числе мелким млекопитающим, например, мышам, зайцеобразным и т.д., например, в экспериментальных исследованиях. Приведенное ниже обсуждение будет фокусироваться на применении заявленных способов, композиций, реактивов, устройств и наборов в отношении людей, но квалифицированному специалисту в данной области техники будет понятно, что такие описания можно легко модифицировать для других млекопитающих, представляющих интерес, с учетом знаний, доступных в уровне техники.- 7 045040 sti, i.e. which is fully developed. In this regard, adult mammals are not juveniles. Species of mammals that can be treated using these methods include dogs and cats; horses; cows; sheep, etc., as well as primates, including humans. The claimed methods, compositions and reagents can also be applied to model animals, including small mammals, for example, mice, lagomorphs, etc., for example, in experimental studies. The following discussion will focus on the application of the claimed methods, compositions, reagents, devices and kits to humans, but one skilled in the art will appreciate that such disclosures can be easily modified for other mammals of interest, taking into account the knowledge available in the art. level of technology.

Возраст взрослого млекопитающего может варьировать в зависимости от типа млекопитающего, которое получает лечение. В случае, когда взрослое млекопитающее представляет собой человека, возраст человека обычно составляет 18 лет или старше. В некоторых случаях взрослое млекопитающее представляет собой индивида, страдающего от нарушения, ассоциированного со старением, или имеющего риск нарушения, такого как ассоциированное со старением когнитивное нарушение, причем взрослое млекопитающее может представлять собой таковое, для которого было определено, например, в форме постановки диагноза, что оно страдает от нарушения, ассоциированного со старением, или имеет риск нарушения, такого как ассоциированное со старением когнитивное нарушение. Фраза индивид, страдающий от ассоциированного со старением когнитивного нарушения, или имеющий риск такого нарушения относится к индивиду, который возрастом приблизительно 50 лет или старше, например, 60 лет или старше, 70 лет или старше, 80 лет или старше и иногда не старше чем 100 лет, как например, 90 лет, т.е. возрастом приблизительно от 50 до 100 лет, например, возрастом 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или приблизительно 90 лет. Индивид может страдать от состояния, ассоциированного со старением, например, когнитивного нарушения, ассоциированного с естественным процессом старения, например, M.C.I. В качестве альтернативы, индивид может иметь возраст 50 лет или старше, например, 60 лет или старше, 70 лет или старше, 80 лет или старше, 90 лет или старше и иногда не старше чем 100 лет, т.е. возрастом приблизительно от 50 до 100, например, возрастом 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или приблизительно 100 лет, и у него еще не начали проявляться симптомы состояния, ассоциированного со старением, например, когнитивного нарушения. В соответствии с другими вариантами осуществления индивид может иметь любой возраст, причем индивид страдает от когнитивного нарушения, обусловленного ассоциированным со старением заболеванием, например, болезнью Альцгеймера, болезнью Паркинсона, лобно-височной деменцией, болезнью Хантингтона, боковым амиотрофическим склерозом, рассеянным склерозом, глаукомой, миотонической дистрофией, деменцией и т.п. В некоторых случаях индивид представляет собой индивида любого возраста, у которого было диагностировано заболевание, ассоциированное со старением, которое, как правило, сопровождается когнитивным нарушением, например, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, лобно-височная деменция, прогрессирующий надъядерный паралич, болезнь Хантингтона, боковой амиотрофический склероз, спинальная мышечная атрофия, рассеянный склероз, мультисистемная атрофия, глаукома, атаксия, миотоническая дистрофия, деменция и т.п., причем у индивида еще не начали проявляться симптомы когнитивного нарушения.The age of the adult mammal may vary depending on the type of mammal being treated. In the case where the adult mammal is a human, the human's age is typically 18 years or older. In some cases, the adult mammal is an individual suffering from, or at risk of a disorder associated with aging, such as an aging-associated cognitive impairment, and the adult mammal may be one for which it has been determined, for example, in the form of a diagnosis, that it suffers from or is at risk of a disorder associated with aging, such as aging-associated cognitive impairment. The phrase an individual suffering from, or at risk of, age-associated cognitive impairment refers to an individual who is approximately 50 years of age or older, for example, 60 years or older, 70 years or older, 80 years or older, and sometimes no older than 100 years, such as 90 years, i.e. between approximately 50 and 100 years of age, for example, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, or approximately 90 years of age. The individual may suffer from a condition associated with aging, such as cognitive impairment associated with the natural aging process, such as M.C.I. Alternatively, the individual may be 50 years of age or older, such as 60 years or older, 70 years or older, 80 years or older, 90 years or older, and sometimes no older than 100 years, i.e. between approximately 50 and 100 years of age, e.g., 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, or approximately 100 years of age, and has not yet begun to exhibit symptoms of a condition associated with aging, e.g. cognitive impairment. In other embodiments, the individual may be of any age, wherein the individual suffers from cognitive impairment due to an aging-associated disease, for example, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, frontotemporal dementia, Huntington's disease, amyotrophic lateral sclerosis, multiple sclerosis, glaucoma, myotonic dystrophy, dementia, etc. In some cases, the individual is an individual of any age who has been diagnosed with a disease associated with aging, which is usually accompanied by cognitive impairment, for example, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, frontotemporal dementia, progressive supranuclear palsy, Huntington's disease, lateral amyotrophic sclerosis, spinal muscular atrophy, multiple sclerosis, multiple system atrophy, glaucoma, ataxia, myotonic dystrophy, dementia, etc., and the individual has not yet begun to exhibit symptoms of cognitive impairment.

Как кратко изложено выше, аспекты способов включают в себя снижение уровня β2микроглобулина (B2M) у млекопитающего в степени, достаточной для лечения связанного со старением нарушения у млекопитающего, например, которое описано выше. Под снижением уровня B2M подразумевают снижение количества B2M у млекопитающего, как например, количества внеклеточного B2M у млекопитающего. Несмотря на то что величина снижения может варьировать, в некоторых случаях величина снижения является 2-кратной или большей, как например, 5-кратной или большей, в том числе 10кратной или большей, например, 15-кратной или большей, 20-кратной или большей, 25-кратной или большей (по сравнению с подходящим контролем), причем в некоторых случаях величина является такой, что количество выявляемого несвязанного B2M в кровеносной системе индивида составляет 50% или менее, как например, 25% или менее, в том числе 10% или менее, например, 1% или менее, по сравнению с количеством, которое выявлялось перед вмешательством в соответствии с настоящим изобретением, и в некоторых случаях после вмешательства количество является невыявляемым.As summarized above, aspects of the methods include reducing the level of β2microglobulin (B2M) in a mammal to an extent sufficient to treat an aging-related disorder in the mammal, such as that described above. By reducing B2M is meant reducing the amount of B2M in a mammal, such as the amount of extracellular B2M in a mammal. Although the amount of reduction may vary, in some cases the amount of reduction is 2 times or greater, such as 5 times or greater, including 10 times or greater, such as 15 times or greater, 20 times or greater , 25-fold or greater (compared to a suitable control), and in some cases the value is such that the amount of detectable unbound B2M in the circulatory system of the individual is 50% or less, such as 25% or less, including 10% or less, for example, 1% or less, compared to the amount that was detected before the intervention in accordance with the present invention, and in some cases after the intervention the amount is undetectable.

Уровень B2M можно снижать с использованием любого удобного протокола. В некоторых случаях уровень B2M снижают посредством удаления системного B2M из взрослого млекопитающего, например, посредством удаления B2M из кровеносной системы взрослого млекопитающего. В таких случаях можно использовать любой удобный протокол для удаления циркулирующего B2M. Например, кровь может быть получена от взрослого млекопитающего и подвергнута экстракорпоральной обработке для удаления B2M из крови с получением обедненной B2M крови, причем данную полученную в результате обедненную B2M кровь можно затем вернуть во взрослое млекопитающее. В таких протоколах может использоваться ряд разных методик с целью удаления B2M из полученной крови. Например, полученную кровь можно приводить в контакт с фильтрующим компонентом, например, мембраной и т.д., который обеспечивает возможность прохождения B2M, но препятствует прохождению других компонентов крови, например, клеток и т.д. В некоторых случаях полученную кровь можно приводить в контакт с абсорбирующим B2M компонентом, например, композицией пористых гранул или частиц, которая абсорбируетThe B2M level can be reduced using any convenient protocol. In some cases, the level of B2M is reduced by removing systemic B2M from the adult mammal, for example, by removing B2M from the circulatory system of the adult mammal. In such cases, any convenient protocol can be used to remove circulating B2M. For example, blood can be obtained from an adult mammal and subjected to extracorporeal processing to remove B2M from the blood to produce B2M-depleted blood, which resulting B2M-depleted blood can then be returned to the adult mammal. Such protocols may use a number of different techniques to remove B2M from the collected blood. For example, the resulting blood may be brought into contact with a filter component, such as a membrane, etc., which allows the passage of B2M, but prevents the passage of other blood components, such as cells, etc. In some cases, the resulting blood may be contacted with a B2M absorbent component, such as a porous bead or particulate composition that absorbs

- 8 045040- 8 045040

B2M из крови. В других случаях полученную кровь можно приводить в контакт со связывающим элементом для B2M, устойчиво ассоциированным с твердой подложкой, в результате чего B2M связывается со связывающим элементом и благодаря этому иммобилизируется на твердой подложке, тем самым обеспечивая отделение B2M от других составляющих крови. Используемый протокол может быть сконфигурирован для селективного удаления B2M из полученной крови, если это желательно, или же он может не быть сконфигурирован для этой цели. Известен ряд различных технологий для удаления B2M из крови, и они могут быть использованы в вариантах осуществления настоящего изобретения, причем такие технологии включают в себя описанные в патентах США №№ 4872983; 5240614; 6416487; 6419830; 6423024; 6855121; 7066900; 8211310; 8349550; а также опубликованные в публикации заявки на патент США №20020143283 и опубликованные в РСТ публикации международных заявок № WO/1999/006098 и № WO/2003/020403; причем раскрытия данных заявок включены в данный документ посредством ссылки.B2M from blood. In other cases, the resulting blood may be brought into contact with a B2M binding element stably associated with a solid support, whereby the B2M is bound to the binding element and thereby immobilized on the solid support, thereby allowing the B2M to be separated from other blood constituents. The protocol used may be configured to selectively remove B2M from the obtained blood if desired, or it may not be configured for this purpose. A number of different technologies are known for removing B2M from blood, and they can be used in embodiments of the present invention, and such technologies include those described in US patent No. 4872983; 5240614; 6416487; 6419830; 6423024; 6855121; 7066900; 8211310; 8349550; as well as published in the publication of US patent application No. 20020143283 and published in the PCT publication of international applications No. WO/1999/006098 and No. WO/2003/020403; and the disclosures of these applications are incorporated herein by reference.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления уровень B2M снижают посредством введения млекопитающему эффективного количества средства, снижающего уровень B2M. В связи с этим, при практическом осуществлении способов в соответствии с этими вариантами осуществления настоящего изобретения взрослое млекопитающее обеспечивается эффективным количеством активного средства, например, модулирующего B2M средства.In accordance with some embodiments, the B2M level is reduced by administering to the mammal an effective amount of a B2M level-lowering agent. In this regard, when practicing the methods in accordance with these embodiments of the present invention, the adult mammal is provided with an effective amount of an active agent, for example, a B2M modulating agent.

В зависимости от конкретных практически осуществляемых вариантов осуществления можно использовать ряд различных типов активных средств. В некоторых случаях средство модулирует экспрессию РНК и/или белка с гена таким образом, чтобы это неким образом меняло экспрессию РНК или белка с гена-мишени. В этих случаях средство может изменять экспрессию РНК или белка различными способами. В соответствии с определенными вариантами осуществления средство представляет собой средство, которое снижает, в том числе ингибирует, экспрессию белка B2M. Ингибирование экспрессии белка B2M можно осуществлять с применением любых подходящих средств, в том числе с применением средства, которое ингибирует экспрессию белка B2M, как например, без ограничения, средства для RNAi, средства на основе антисмысловых молекул, средства, которые препятствуют связыванию транскрипционных факторов с промоторной последовательностью гена B2M, или посредством инактивации гена B2M, например, с помощью методик на основе применения рекомбинантной ДНК и т.д.Depending on the particular embodiments being practiced, a number of different types of active agents can be used. In some cases, the agent modulates the expression of RNA and/or protein from a gene in such a way that it in some way changes the expression of RNA or protein from a target gene. In these cases, the agent can alter RNA or protein expression in a variety of ways. In accordance with certain embodiments, the agent is an agent that reduces, including inhibits, the expression of the B2M protein. Inhibition of B2M protein expression can be accomplished using any suitable means, including the use of an agent that inhibits B2M protein expression, such as, but not limited to, RNAi agents, antisense molecule-based agents, agents that interfere with the binding of transcription factors to the promoter. sequence of the B2M gene, or by inactivating the B2M gene, for example, using recombinant DNA techniques, etc.

Например, уровень транскрипции белка B2M можно регулировать посредством сайленсинга гена с применением средств для RNAi, например, двухцепочечной РНК (см., например, Sharp, Genes and Development (1999) 13: 139-141). Методики RNAi, как например, интерференция двухцепочечной РНК (dsRNAi) или малой интерферирующей РНК (siRNA), были всесторонне описаны в документах на нематоде С. elegans (Fire, et al., Nature (1998) 391:806-811) и обычно применяются для нокдауна генов в различных системах. Средства для RNAi могут представлять собой dsRNA или матрицу для транскрипции интерферирующей рибонуклеиновой кислоты, которую можно применять для продуцирования dsRNA в клетке. В соответствии с этими вариантами осуществления матрица для транскрипции может представлять собой ДНК, которая кодирует интерферирующую рибонуклеиновую кислоту. Способы и процедуры, связанные с RNAi, также описаны в РСТ публикациях международных заявок № WO 03/010180 и № WO 01/68836, причем раскрытия данных заявок включены в данный документ посредством ссылки. dsRNA можно получить в соответствии с любым из ряда способов, которые известны в уровне техники, в том числе in vitro и in vivo способов, а также с помощью подходов химического синтеза. Примеры таких способов включают в себя, без ограничения, способы, описанные в Sadher et al., Biochem. Int. (1987) 14:1015; Bhattacharyya, Nature (1990) 343:484; и в патенте США № 5795715, раскрытия которых включены в данный документ посредством ссылки. Одноцепочечную РНК также можно получить с применением комбинации ферментативного и органического синтеза или с помощью только органического синтеза. Применение способов химического синтеза обеспечивает возможность введения желаемых модифицированных нуклеотидов или нуклеотидных аналогов в dsRNA. dsRNA также можно получить in vivo согласно ряду хорошо известных способов (см., например, Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd ed.; Transcription and Translation (B. D. Hames, and S. J. Higgins, Eds., 1984); DNA Cloning, volumes I and II (D. N. Glover, Ed., 1985); и Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, Ed., 1984, причем каждый из источников включен в данный документ посредством ссылки). Ряд вариантов можно использовать для доставки dsRNA в клетку или популяцию клеток, как например, в клеточную культуру, ткань, орган или эмбрион. Например, РНК может быть введена непосредственно внутрь клетки. В таких случаях обычно используются различные физические способы, такие как введение посредством микроинъекции (см., например, Zernicka-Goetz, et al., Development (1997) 124:1133-1137; и Wianny, et al., Chromosoma (1998) 107: 430-439). Другие варианты для доставки в клетки включают в себя пермеабилизацию клеточной мембраны и электропорацию в присутствии dsRNA, опосредованную липосомами трансфекцию или трансфекцию с применением химических соединений, таких как фосфат кальция. Ряд широко известных методик генной терапии также можно использовать для введения dsRNA в клетку. Посредством введения вирусной конструкции внутри вирусной частицы, например, можно достичь эффективного введения экспрессионной конструкции в клетку и транскрипции РНК, кодируемой конструкцией. Конкретные примеры средств для RNAi, которые можно использовать с целью снижения экспрессии B2M, включают в себя,For example, the level of transcription of the B2M protein can be regulated by gene silencing using RNAi agents, such as double-stranded RNA (see, for example, Sharp, Genes and Development (1999) 13: 139-141). RNAi techniques, such as double-stranded RNA interference (dsRNAi) or small interfering RNA (siRNA), have been extensively documented in the nematode C. elegans (Fire, et al., Nature (1998) 391:806-811) and are commonly used for gene knockdown in various systems. The RNAi agents may be dsRNA or an interfering ribonucleic acid transcription template that can be used to produce dsRNA in a cell. In accordance with these embodiments, the transcription template may be DNA that encodes an interfering ribonucleic acid. Methods and procedures related to RNAi are also described in PCT Publication Publications No. WO 03/010180 and No. WO 01/68836, the disclosures of these applications being incorporated herein by reference. dsRNA can be prepared according to any of a number of methods that are known in the art, including in vitro and in vivo methods, as well as chemical synthesis approaches. Examples of such methods include, without limitation, those described in Sadher et al., Biochem. Int. (1987) 14:1015; Bhattacharyya, Nature (1990) 343:484; and US Pat. No. 5,795,715, the disclosures of which are incorporated herein by reference. Single-stranded RNA can also be produced using a combination of enzymatic and organic synthesis or using organic synthesis alone. The use of chemical synthesis methods makes it possible to introduce the desired modified nucleotides or nucleotide analogues into dsRNA. dsRNA can also be produced in vivo according to a number of well known methods (see, for example, Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ^2nd ed.; Transcription and Translation (BD Hames, and SJ Higgins, Eds. , 1984); DNA Cloning, volumes I and II (DN Glover, Ed., 1985); and Oligonucleotide Synthesis (MJ Gait, Ed., 1984, each of which is incorporated herein by reference). A number of options can be used to delivery of dsRNA into a cell or population of cells, such as a cell culture, tissue, organ or embryo. For example, the RNA can be introduced directly into the cell. In such cases, various physical methods are usually used, such as administration by microinjection (see, for example , Zernicka-Goetz, et al., Development (1997) 124:1133-1137; and Wianny, et al., Chromosoma (1998) 107: 430-439).Other options for delivery to cells include permeabilization of the cell membrane and electroporation in the presence of dsRNA, liposome-mediated transfection, or transfection using chemical compounds such as calcium phosphate. A number of well-known gene therapy techniques can also be used to introduce dsRNA into a cell. By introducing a viral construct within a viral particle, for example, efficient introduction of the expression construct into a cell and transcription of the RNA encoded by the construct can be achieved. Specific examples of RNAi agents that can be used to reduce B2M expression include,

- 9 045040 без ограничения, dsRNA и короткую интерферирующую РНК (siRNA), соответствующую B2M со следующими смысловой и антисмысловой последовательностями (смысловая)- 9 045040 without limitation, dsRNA and short interfering RNA (siRNA) corresponding to B2M with the following sense and antisense sequences (sense)

5'-GAUUCAGGUUUACUCACGUdTdT-3' (SEQ ID NO: 01) и (антисмысловая)5'-GAUUCAGGUUUACUCACGUdTdT-3' (SEQ ID NO: 01) and (antisense)

5'-ACGUGAGUAAACCUGAAUCdTdT-3’ (SEQ ID NO: 02) (которые описаны в Matin, et al., Specific knockdown of Oct4 and beta2-microglobulin expression by RNA interference in human embryonic stem cells and embryonic carcinoma cells, Stem Cells (2004) 22: 659-68) и в международной заявке № WO/2004/085654; shRNA (GCCACTCCCACCCTTTCTCAT) (SEQ ID NO: 03) (которая раскрыта в Goyos, et al., Involvement of nonclassical MHC class Ib molecules in heat shock protein-mediated anti-tumor responses, (2007) 37: 1494-501); а также средства для RNAi, раскрытые в Figueiredo, et al., Generation of HLA-deficient platelets from hematopoietic progenitor cells, Transfusion (2010) 50: 1690-701, Bhatt, et al., Knockdown of beta2-microglobulin perturbs the subcellular distribution of HFE and hepcidin, Biochemical and Biophysical Research Communications (2009) 378: 727-31, Elders, et al., Targeted knockdown of canine KIT (stem cell factor receptor) using RNA interference, Veterinary Immunology and Immunopathology (2011) 141:151-6, Heikkila, et al., Internalization of coxsackievirus A9 is mediated by beta 2-microglobulin, dynamin, and Arf6 but not by caveolin-1 or clathrin, (2010) 84:3666-81, Figueiredo, et al., Class-, gene-, and groupspecific HLA silencing by lentiviral shRNA delivery (2006) 84:425-37, в международной заявке № WO/2004/020586, заявках на патент США № US20040127445 и № US20130096370.5'-ACGUGAGUAAACCUGAAUCdTdT-3' (SEQ ID NO: 02) (which are described in Matin, et al., Specific knockdown of Oct4 and beta2-microglobulin expression by RNA interference in human embryonic stem cells and embryonic carcinoma cells, Stem Cells (2004 ) 22: 659-68) and in international application No. WO/2004/085654; shRNA (GCCACTCCCACCCTTTCTCAT) (SEQ ID NO: 03) (which is disclosed in Goyos, et al., Involvement of nonclassical MHC class Ib molecules in heat shock protein-mediated anti-tumor responses, (2007) 37: 1494-501); as well as the RNAi agents disclosed in Figueiredo, et al., Generation of HLA-deficient platelets from hematopoietic progenitor cells, Transfusion (2010) 50: 1690-701, Bhatt, et al., Knockdown of beta2-microglobulin perturbs the subcellular distribution of HFE and hepcidin, Biochemical and Biophysical Research Communications (2009) 378: 727-31, Elders, et al., Targeted knockdown of canine KIT (stem cell factor receptor) using RNA interference, Veterinary Immunology and Immunopathology (2011) 141:151 -6, Heikkila, et al., Internalization of coxsackievirus A9 is mediated by beta 2-microglobulin, dynamin, and Arf6 but not by caveolin-1 or clathrin, (2010) 84:3666-81, Figueiredo, et al., Class -, gene-, and group-specific HLA silencing by lentiviral shRNA delivery (2006) 84:425-37, in international application No. WO/2004/020586, US patent applications No. US20040127445 and No. US20130096370.

В некоторых случаях антисмысловые молекулы можно применять для понижающей регуляции экспрессии гена B2M в клетке. Реактив на основе антисмысловой последовательности может представлять собой антисмысловые олигодезоксинуклеотиды (ODN), в особенности, синтетические ODN, имеющие химические модификации относительно нативных нуклеиновых кислот, или конструкции нуклеиновой кислоты, которые экспрессируют такие антисмысловые молекулы в виде РНК. Антисмысловая последовательность является комплементарной мРНК белка-мишени и ингибирует экспрессию белка-мишени. Антисмысловые молекулы ингибируют экспрессию гена посредством различных механизмов, например, посредством снижения количества мРНК, доступной для трансляции, посредством активации РНКазы H или стерического затруднения. Можно вводить одну антисмысловую молекулу или комбинацию антисмысловых молекул, причем комбинация может включать в себя несколько разных последовательностей.In some cases, antisense molecules can be used to down-regulate B2M gene expression in a cell. The antisense sequence reagent may be antisense oligodeoxynucleotides (ODNs), particularly synthetic ODNs having chemical modifications to native nucleic acids, or nucleic acid constructs that express such antisense molecules as RNA. The antisense sequence is complementary to the target protein mRNA and inhibits the expression of the target protein. Antisense molecules inhibit gene expression through various mechanisms, such as by reducing the amount of mRNA available for translation, by activating RNase H, or by steric hindrance. A single antisense molecule or a combination of antisense molecules may be administered, and the combination may include several different sequences.

Антисмысловые молекулы могут продуцироваться при экспрессии всей последовательности генамишени или ее части в соответствующем векторе, причем точка инициации транскрипции сориентирована таким образом, чтобы антисмысловая цепь продуцировалась в виде молекулы РНК. В качестве альтернативы, антисмысловая молекула представляет собой синтетический олигонуклеотид. Антисмысловые олигонуклеотиды, в целом, будут иметь длину по меньшей мере приблизительно 7, обычно по меньшей мере приблизительно 12, как правило, по меньшей мере приблизительно 20 нуклеотидов и не более чем приблизительно 500, обычно не более чем приблизительно 50, как правило, не более чем приблизительно 35 нуклеотидов, причем длина определяется эффективностью ингибирования, специфичностью, в том числе отсутствием перекрестной реактивности и т.п. Короткие олигонуклеотиды, имеющие длину от 7 до 8 оснований, могут быть сильными и селективными ингибиторами экспрессии гена (см. Wagner et al., Nature Biotechnol. (1996)14:840-844).Antisense molecules can be produced by expressing all or part of a target gene sequence in an appropriate vector, with the transcription initiation point oriented such that the antisense strand is produced as an RNA molecule. Alternatively, the antisense molecule is a synthetic oligonucleotide. Antisense oligonucleotides will generally be at least about 7, typically at least about 12, typically at least about 20 nucleotides in length and no more than about 500, typically no more than about 50, typically no more than approximately 35 nucleotides, the length being determined by the efficiency of inhibition, specificity, including lack of cross-reactivity, etc. Short oligonucleotides, 7 to 8 bases in length, can be potent and selective inhibitors of gene expression (see Wagner et al., Nature Biotechnol. (1996)14:840-844).

Выбирают специфический участок или участки эндогенной смысловой цепи последовательности мРНК, чтобы антисмысловая последовательность была комплементарна этому участку (участкам). При выборе специфической последовательности для олигонуклеотида можно применять эмпирический способ, при котором несколько последовательностей-кандидатов подвергают анализу в отношении ингибирования экспрессии гена-мишени in vitro или в животной модели. Также можно применять комбинацию последовательностей, где для комплементарного взаимодействия с антисмысловой последовательностью выбраны несколько участков последовательности мРНК.A specific region or regions of the endogenous sense strand of the mRNA sequence are selected so that the antisense sequence is complementary to that region(s). When selecting a specific sequence for an oligonucleotide, an empirical method may be used in which several candidate sequences are tested for inhibition of target gene expression in vitro or in an animal model. It is also possible to use a combination of sequences, where several regions of the mRNA sequence are selected for complementary interaction with the antisense sequence.

Антисмысловые олигонуклеотиды могут быть химически синтезированы с помощью способов, известных в уровне техники (см. Wagner et al. (1993), выше). Олигонуклеотиды могут подвергаться химической модификации относительно нативной фосфодиэфирной структуры с целью повышения их внутриклеточной стабильности и аффинности связывания. В литературе был описан ряд таких модификаций, которые изменяют химический состав остова, сахара или гетероциклические основания. К числу полезных изменений в химическом составе остова относятся фосфоротиоаты; фосфородитиоаты, в которых оба из атомов кислорода, не участвующих в образовании мостиковых связей, заменены серой; фосфороамидиты; алкил-фосфотриэфиры и боранофосфаты. Ахиральные фосфатные производные включают в себя 3'-О-5'-S-фосфоротиоат, 3'-S-5'-О-фосфоротиоат, 3'-CH₂-5'-О-фосфонат и 3'-NH-5'-Oфосфороамидат. В пептидо-нуклеиновых кислотах весь рибозо-фосфодиэфирный остов заменен пептидной связью. Модификации сахаров также применяют для повышения стабильности и аффинности. Можно применять α-аномер дезоксирибозы, в котором основание инвертировано в сравнении с природным βаномером. 2'-ОН в рибозном сахаре может быть изменена с образованием 2'-О-метил-или 2'-О-аллилсахаров, что обеспечивает устойчивость к разрушению, не затрагивая аффинность. Модификация гетероциклических оснований должна поддерживать надлежащее спаривание оснований. Некоторые полезные замены включают в себя замену дезоксиуридином дезокситимидина; замену 5-метил-2'дезоксицитидином и 5-бром-2'-дезоксицитидином дезоксицитидина. Было показано, что 5-пропинил-2'- 10 045040 дезоксиуридин и 5-пропинил-2'-дезоксицитидин повышают аффинность и биологическую активность в случае, когда они заменяют дезокситимидин и дезоксицитидин, соответственно. Конкретные примеры средств на основе антисмысловых молекул, которые могут использоваться для снижения экспрессииAntisense oligonucleotides can be chemically synthesized using methods known in the art (see Wagner et al. (1993), supra). Oligonucleotides can be chemically modified relative to the native phosphodiester structure to increase their intracellular stability and binding affinity. A number of such modifications have been described in the literature, which alter the chemistry of the backbone, sugars, or heterocyclic bases. Beneficial changes to the backbone chemistry include phosphorothioates; phosphorodithioates, in which both of the oxygen atoms not involved in the formation of bridging bonds are replaced by sulfur; phosphoramidites; alkyl phosphotriesters and boranophosphates. Achiral phosphate derivatives include 3'-O-5'-S-phosphorothioate, 3'-S-5'-O-phosphorothioate, 3'-CH ₂ -5'-O-phosphonate and 3'-NH-5' -Ophosphoroamidate. In peptide nucleic acids, the entire ribose-phosphodiester backbone is replaced by a peptide bond. Sugar modifications are also used to improve stability and affinity. The α-anomer of deoxyribose, in which the base is inverted compared to the natural β-anomer, can be used. The 2'-OH in the ribose sugar can be modified to form 2'-O-methyl- or 2'-O-allyl sugars, which provides resistance to degradation without affecting affinity. Modification of heterocyclic bases must maintain proper base pairing. Some useful substitutions include substituting deoxythymidine for deoxyuridine; replacement of 5-methyl-2'deoxycytidine and 5-bromo-2'-deoxycytidine deoxycytidine. 5-propynyl-2'-10 045040 deoxyuridine and 5-propynyl-2'-deoxycytidine have been shown to increase affinity and biological activity when they replace deoxythymidine and deoxycytidine, respectively. Specific examples of antisense molecule-based agents that can be used to reduce expression

B2M, включают в себя, без ограничения:B2M include, without limitation:

Код Code Олигонуклеотид Oligonucleotide МВ-00027 MV-00027 PA*pG*dT*dT*dG*dC*dC*dA*dG*dC*dC*dC*dT*pz*pz PA*pG*dT*dT*dG*dC*dC*dA*dG*dC*dC*dC*dT*pz*pz МВ-00540 MV-00540 Eru*SS*pA*pG*dT*dT*dG*dC*dC*dA*dG*dC*dC*dC*dT*pz*pz Eru*SS*pA*pG*dT*dT*dG*dC*dC*dA*dG*dC*dC*dC*dT*pz*pz МВ-00541 MV-00541 Myr*SS*pA*pG*dT*dT*dG*dC*dC*dA*dG*dC*dC*dC*dT*pz*pz Myr*SS*pA*pG*dT*dT*dG*dC*dC*dA*dG*dC*dC*dC*dT*pz*pz МВ-00542 MV-00542 Dier*SS*pA*pG*dT*dT*dG*dC*dC*dA*dG*dC*dC*dC*dT*pz*pz Dier*SS*pA*pG*dT*dT*dG*dC*dC*dA*dG*dC*dC*dC*dT*pz*pz МВ-00543 MV-00543 Ermy*SS*pA*pG*dT*dT*dG*dC*dC*dA*dG*dC*dC*dC*dT*pz*pz Ermy*SS*pA*pG*dT*dT*dG*dC*dC*dA*dG*dC*dC*dC*dT*pz*pz

(SEQ ID NO: 04-08), которые описаны в международной заявке № WO/2004/004575; а также средства на основе антисмысловых молекул, описанные в: Lichtenstein, et al., Effects of beta-2 microglobulin anti-sense oligonucleotides on sensitivity of HER2/neu oncogene-expressing and nonexpressing target cells to lymphocyte-mediated lysis, Cell Immunology (1992) 141: 219-32, Ogretmen, et al., Molecular mechanisms of loss of beta 2-microglobulin expression in drug-resistant breast cancer sublines and its involvement in drug resistance, Biochemistry (1998) 37:11679-91, в международных заявках № WO/2004/020586; № WO/2006/130949; в документах 7553484 и 8715654.(SEQ ID NO: 04-08), which are described in international application No. WO/2004/004575; as well as antisense molecule-based agents described in: Lichtenstein, et al., Effects of beta-2 microglobulin anti-sense oligonucleotides on sensitivity of HER2/neu oncogene-expressing and nonexpressing target cells to lymphocyte-mediated lysis, Cell Immunology (1992 ) 141: 219-32, Ogretmen, et al., Molecular mechanisms of loss of beta 2-microglobulin expression in drug-resistant breast cancer sublines and its involvement in drug resistance, Biochemistry (1998) 37:11679-91, in international applications No. WO/2004/020586; No. WO/2006/130949; in documents 7553484 and 8715654.

В качестве альтернативы антисмысловым ингибиторам для ингибирования экспрессии гена можно применять каталитические соединения нуклеиновых кислот, например, рибозимы, антисмысловые конъюгаты и т.д. Рибозимы можно синтезировать in vitro и вводить пациенту, или они могут быть закодированы в экспрессионном векторе, с которого рибозим синтезируется в клетке-мишени (например, см. публикацию международной патентной заявки № WO 9523225, и Beigelman et al., Nucl. Acids Res. (1995) 23:4434-42). Примеры олигонуклеотидов с каталитической активностью описаны в международной заявке № WO 9506764. Конъюгаты антисмысловых ODN с комплексными соединениями металлов, например, терпиридил-Си(П), способные опосредовать гидролиз мРНК, описаны в Bashkin et al., Appl. Biochem. Biotechnol. (1995) 54:43-56.As an alternative to antisense inhibitors, catalytic nucleic acid compounds, such as ribozymes, antisense conjugates, etc., can be used to inhibit gene expression. Ribozymes can be synthesized in vitro and administered to a patient, or they can be encoded in an expression vector from which the ribozyme is synthesized in the target cell (for example, see International Patent Application Publication No. WO 9523225, and Beigelman et al., Nucl. Acids Res. (1995) 23:4434-42). Examples of oligonucleotides with catalytic activity are described in international application No. WO 9506764. Conjugates of antisense ODNs with complex metal compounds, for example, terpyridyl-Cu(P), capable of mediating the hydrolysis of mRNA, are described in Bashkin et al., Appl. Biochem. Biotechnol. (1995) 54:43–56.

В соответствии с другим вариантом осуществления ген B2M инактивируют таким образом, чтобы он больше не экспрессировал функциональный белок. Под инактивацией подразумевается то, что ген, например, его кодирующая последовательность и/или регуляторные элементы, подвергают генетической модификации таким образом, чтобы он больше не экспрессировал функциональный белок B2M, например, функциональный по меньшей мере в отношении активности B2M при нарушении, связанном со старением. Изменение или мутация могут принимать ряд различных форм, например, посредством делеции одного или нескольких нуклеотидных остатков, посредством изменения одного или нескольких нуклеотидных остатков и т.п. Одним из средств для создания таких изменений в кодирующей последовательности является гомологичная рекомбинация. Способы создания модификаций в гене-мишени посредством гомологичной рекомбинации являются известными в уровне техники, в том числе способы, описанные в патентах США №№ 6074853; 5998209; 5998144; 5948653; 5925544; 5830698; 5780296; 5776744; 5721367; 5614396; 5612205; причем раскрытия данных патентов включены в данный документ посредством ссылки.In another embodiment, the B2M gene is inactivated such that it no longer expresses a functional protein. By inactivation is meant that a gene, for example its coding sequence and/or regulatory elements, is genetically modified such that it no longer expresses a functional B2M protein, for example, functional for at least B2M activity in an aging disorder . The change or mutation can take a number of different forms, for example, by deleting one or more nucleotide residues, by changing one or more nucleotide residues, and the like. One means of creating such changes in the coding sequence is homologous recombination. Methods for creating modifications in a target gene through homologous recombination are known in the art, including methods described in US patent No. 6074853; 5998209; 5998144; 5948653; 5925544; 5830698; 5780296; 5776744; 5721367; 5614396; 5612205; and the disclosures of these patents are incorporated herein by reference.

В соответствии с определенными вариантами осуществления интерес также представляют доминантные отрицательные мутанты белков B2M, причем экспрессия таких мутантов в клетке приводит в результате к модуляции, например, снижению, опосредованного B2M нарушения, связанного со старением. Доминантные отрицательные мутанты B2M представляют собой мутантные белки, которые проявляют доминантную отрицательную активность B2M. Используемый в контексте данного документа термин доминантная отрицательная активность B2M или доминантная отрицательная активность относится к ингибированию, подавлению или снижению определенных конкретных активностей B2M и, в частности, опосредованного B2M нарушения, связанного со старением. Доминантные отрицательные мутации легко создаются для соответствующих белков. Они могут действовать посредством нескольких различных механизмов, включающих в себя мутации в субстрат-связывающем домене; мутации в каталитическом домене; мутации в белок-связывающем домене (например, в доменах, участвующих в образовании мультимеров, эффекторных или связывающих активирующий белок доменах); мутации в домене клеточной локализации и т.д. Мутантный полипептид может взаимодействовать с полипептидами дикого типа (образующимися с другого аллеля) и образовывать нефункциональный мультимер. В соответствии с определенными вариантами осуществления мутантный полипептид будет продуцироваться в избыточном количестве. Производят точковые мутации, которые оказывают такое воздействие. Кроме того, слияние разных полипептидов различной длины с концом белка или делеция специфических доменов может давать в результате доминантных отрицательных мутантов. Доступны общие стратегии получения доминантных отрицательных мутантов (см., например, Herskowitz, Nature (1987) 329:219, и источники, цити- 11 045040 руемые выше). Такие методики применяют для создания мутаций с потерей функции, которые являются полезными для определения функции белка. Способы, которые являются хорошо известными специалистам в данной области техники, можно применять для конструирования экспрессионных векторов, содержащих кодирующие последовательности и соответствующие сигналы управления транскрипцией и трансляцией для повышенной экспрессии экзогенного гена, введенного в клетку. Эти способы включают в себя, например, осуществляемые in vitro методики на основе использования рекомбинантной ДНК, методики синтеза и осуществляемую in vivo генетическую рекомбинацию. В качестве альтернативы, РНК, способную кодировать последовательности генного продукта, можно синтезировать химически, например, с применением синтезаторов. См., например, методики, описанные в Oligonucleotide Synthesis, 1984, Gait, M. J. ed., IRL Press, Oxford.In certain embodiments, dominant negative mutants of B2M proteins are also of interest, wherein expression of such mutants in a cell results in modulation, eg, reduction, of B2M-mediated impairment associated with aging. B2M dominant negative mutants are mutant proteins that exhibit dominant negative B2M activity. As used herein, the term B2M dominant negative activity or dominant negative activity refers to the inhibition, suppression or reduction of certain specific B2M activities and, in particular, B2M-mediated impairment associated with aging. Dominant negative mutations are easily created for the corresponding proteins. They can act through several different mechanisms, including mutations in the substrate-binding domain; mutations in the catalytic domain; mutations in the protein-binding domain (eg, in the domains involved in the formation of multimers, effector or activating protein-binding domains); mutations in the cellular localization domain, etc. The mutant polypeptide can interact with wild-type polypeptides (derived from a different allele) and form a nonfunctional multimer. In accordance with certain embodiments, the mutant polypeptide will be produced in excess. They produce point mutations that have this effect. In addition, fusion of different polypeptides of different lengths to the end of the protein or deletion of specific domains can result in dominant negative mutants. General strategies for generating dominant negative mutants are available (see, for example, Herskowitz, Nature (1987) 329:219, and the sources cited above). Such techniques are used to create loss-of-function mutations that are useful in determining protein function. Methods that are well known to those skilled in the art can be used to construct expression vectors containing coding sequences and appropriate transcriptional and translational control signals for increased expression of an exogenous gene introduced into a cell. These methods include, for example, in vitro recombinant DNA techniques, synthesis techniques, and in vivo genetic recombination. Alternatively, RNA capable of encoding gene product sequences can be synthesized chemically, for example, using synthesizers. See, for example, the procedures described in Oligonucleotide Synthesis, 1984, Gait, M. J. ed., IRL Press, Oxford.

В соответствии с другими вариантами осуществления средство представляет собой средство, которое модулирует, например, ингибирует, активность B2M посредством связывания B2M и/или ингибирования связывания B2M со вторым белком, например, белком-членом МНС1. Например, интерес представляют малые молекулы, которые связываются с B2M и ингибируют его активность. Встречающиеся в естественных условиях или синтетические соединения-малые молекулы, представляющие интерес, включают в себя многочисленные химические классы, такие как органические молекулы, например, малые органические молекулы, имеющие молекулярную массу более чем 50 и менее чем приблизительно 2500 дальтон. Средства-кандидаты содержат функциональные группы для структурного взаимодействия с белками, в особенности, для образования водородных связей, и, как правило, функциональные группы включают в себя по меньшей мере аминную, карбонильную, гидроксильную или карбоксильную группу, предпочтительно, по меньшей мере две из функциональных химических групп. Средства-кандидаты могут включать в себя циклические углеродные или гетероциклические структуры и/или ароматические или полиароматические структуры, замещенные одной или несколькими вышеуказанными функциональными группами. Средства-кандидаты также обнаруживаются среди биологических молекул, в том числе пептидов, сахаридов, жирных кислот, стероидов, пуринов, пиримидинов, производных, структурных аналогов или их комбинаций. Такие молекулы могут быть идентифицированы, среди прочих способов, посредством использования протоколов скрининга, описанных ниже. Конкретные примеры средств на основе малых молекул, которые могут использоваться для снижения экспрессии B2M, включают в себя, без ограничения: риамицин SV: (7S,9E,11S,12R,13S,14R,15R,16R,17S,18S,19E,21Z)-2,15,17,27,29пентагидрокси-11-метокси-3,7,12,14,16,18,22-гептаметил-26-{(Е)-[(4-метилпиперазин-1ил)имино]метил}-6,23-диоксо-8,30-диокса-24-азатетрацикло[23.3.1.14,7.05,28]триаконта1(28),2,4,9,19,21,25(29),26-октаен-13-ил-ацетат (который раскрыт в Woods, et al., Ligand binding to distinct states diverts aggregation of an amyloid-forming protein Nature Chemical Biology (2011) 7: 730-9); меклоциклин, доксициклин, 4-эпи-окситетрациклин, ролитетрациклин, ангидрохлортетрациклин, метациклин и окситетрациклин (который описан в Giorgetti, et al., Effect of tetracyclines on the dynamics of formation and destructuration of beta2-microglobulin amyloid fibrils, The Journal of Biological Chemistry (2011) 286:2121-31); пептиды D-TLKIVW, D-TWKLVL, D-YVIIER и D-DYYFEF (которые описаны в документе № 8754034); а также средства, описанные в: Morozov, et al., Survey of small molecule and ion binding to beta 2-microglobulin-possible relation to BEN, (1991) 34:S85-8, Regazzoni, et al., Screening of fibrillogenesis inhibitors of B2-microglobulin: integrated strategies by mass spectrometry capillary electrophoresis and in silico simulations, Analytica Chimica Acta (2011) 685:153-61, Quaglia, et al., Search of ligands for the amyloidogenic protein beta2-microglobulin by capillary electrophoresis and other techniques, Electrophoresis (2005) 26:4055-63, Ozawa, et al., Inhibition of beta2-microglobulin amyloid fibril formation by alpha2macroglobulin, The Journal of Biological Chemistry (2011) 286:9668-9676, Pullara and Emanuele, Early stages of beta2-microglobulin aggregation and the inhibiting action of alphaB-crystallin, (2008) 73: 1037-46, Wanchu, et al., Suppression of beta 2 microglobulin by pentoxiphylline therapy in asymptomatic HIV infected individuals, (2001) 113: 75-7, Brancolini, et al., Can small hydrophobic gold nanoparticles inhibit B2microglobulin fibrillation?, Nanoscale (2014) 6:7903-11, в заявках на патент США № US20040127445 и № US20130331327.In other embodiments, the agent is an agent that modulates, eg inhibits, the activity of B2M by binding B2M and/or inhibiting the binding of B2M to a second protein, eg an MHC1 member protein. For example, small molecules that bind to B2M and inhibit its activity are of interest. Naturally occurring or synthetic small molecule compounds of interest include numerous chemical classes, such as organic molecules, for example, small organic molecules having a molecular weight of greater than 50 and less than about 2500 daltons. Candidate agents contain functional groups to interact structurally with proteins, particularly to form hydrogen bonds, and typically the functional groups include at least an amine, carbonyl, hydroxyl or carboxyl group, preferably at least two of the functional groups chemical groups. Candidate agents may include cyclic carbon or heterocyclic structures and/or aromatic or polyaromatic structures substituted with one or more of the above functional groups. Candidate agents are also found among biological molecules, including peptides, saccharides, fatty acids, steroids, purines, pyrimidines, derivatives, structural analogues, or combinations thereof. Such molecules can be identified, among other methods, through the use of screening protocols described below. Specific examples of small molecule agents that can be used to reduce B2M expression include, but are not limited to: Riamycin SV: (7S,9E,11S,12R,13S,14R,15R,16R,17S,18S,19E,21Z )-2,15,17,27,29pentahydroxy-11-methoxy-3,7,12,14,16,18,22-heptamethyl-26-{(E)-[(4-methylpiperazin-1yl)imino]methyl }-6,23-dioxo-8,30-dioxa-24-azatetracyclo[23.3.1.14,7.05,28]triaconta1(28),2,4,9,19,21,25(29),26-octaene- 13-yl-acetate (which is disclosed in Woods, et al., Ligand binding to distinct states diversifies aggregation of an amyloid-forming protein Nature Chemical Biology (2011) 7: 730-9); meclocycline, doxycycline, 4-epi-oxytetracycline, rolitetracycline, anhydrochlortetracycline, metacycline, and oxytetracycline (which is described in Giorgetti, et al., Effect of tetracyclines on the dynamics of formation and destruction of beta2-microglobulin amyloid fibrils, The Journal of Biological Chemistry ( 2011) 286:2121-31); peptides D-TLKIVW, D-TWKLVL, D-YVIIER and D-DYYFEF (which are described in document No. 8754034); as well as the agents described in: Morozov, et al., Survey of small molecule and ion binding to beta 2-microglobulin-possible relation to BEN, (1991) 34:S85-8, Regazzoni, et al., Screening of fibrillogenesis inhibitors of B2-microglobulin: integrated strategies by mass spectrometry capillary electrophoresis and in silico simulations, Analytica Chimica Acta (2011) 685:153-61, Quaglia, et al., Search of ligands for the amyloidogenic protein beta2-microglobulin by capillary electrophoresis and others techniques, Electrophoresis (2005) 26:4055-63, Ozawa, et al., Inhibition of beta2-microglobulin amyloid fibril formation by alpha2macroglobulin, The Journal of Biological Chemistry (2011) 286:9668-9676, Pullara and Emanuele, Early stages of beta2-microglobulin aggregation and the inhibiting action of alphaB-crystallin, (2008) 73: 1037-46, Wanchu, et al., Suppression of beta 2 microglobulin by pentoxiphylline therapy in asymptomatic HIV infected individuals, (2001) 113: 75-7 , Brancolini, et al., Can small hydrophobic gold nanoparticles inhibit B2microglobulin fibrillation?, Nanoscale (2014) 6:7903-11, in US Patent Applications No. US20040127445 and No. US20130331327.

В соответствии с определенными вариантами осуществления вводимое активное средство представляет собой B2M-специфический связывающий элемент. В целом, подходящие B2M-специфические связывающие элементы, проявляют аффинность (K_d) в отношении целевого B2M, такого как человеческий B2M, которая является достаточной для обеспечения желаемого снижения активности B2M, связанной с нарушением, ассоциированным со старением. При использовании в контексте данного документа термин аффинность относится к константе равновесия для обратимого связывания двух средств; аффинность может быть выражена в виде константы диссоциации (Kd). Аффинность может быть по меньшей мере 1-кратно большей, по меньшей мере 2-кратно большей, по меньшей мере 3-кратно большей, по меньшей мере 4-кратно большей, по меньшей мере 5-кратно большей, по меньшей мере 6-кратно большей, по меньшей мере 7-кратно большей, по меньшей мере 8-кратно большей, по меньшей мере 9кратно большей, по меньшей мере 10-кратно большей, по меньшей мере 20-кратно большей, по меньшей мере 30-кратно большей, по меньшей мере 40-кратно большей, по меньшей мере 50-кратно большей, по меньшей мере 60-кратно большей, по меньшей мере 70-кратно большей, по меньшей мере 80-кратноIn accordance with certain embodiments, the active agent administered is a B2M-specific binding element. In general, suitable B2M-specific binding elements exhibit an affinity (K _d ) for a target B2M, such as human B2M, that is sufficient to provide the desired reduction in B2M activity associated with an aging disorder. As used herein, the term affinity refers to the equilibrium constant for the reversible binding of two agents; affinity can be expressed as a dissociation constant (Kd). The affinity can be at least 1-fold greater, at least 2-fold greater, at least 3-fold greater, at least 4-fold greater, at least 5-fold greater, at least 6-fold greater , at least 7 times greater, at least 8 times greater, at least 9 times greater, at least 10 times greater, at least 20 times greater, at least 30 times greater, at least 40 times larger, at least 50 times larger, at least 60 times larger, at least 70 times larger, at least 80 times larger

- 12 045040 большей, по меньшей мере 90-кратно большей, по меньшей мере 100-кратно большей или по меньшей мере 1000-кратно большей или более, чем аффинность антитела в отношении нерелевантных аминокислотных последовательностей. Аффинность специфического связывающего элемента в отношении белкамишени может составлять, например, от приблизительно 100 наномоль/литр (нМ) до приблизительно 0,1 нМ, от приблизительно 100 нМ до приблизительно 1 пикомоль/литр (пМ) или от приблизительно 100 нМ до приблизительно 1 фемтомоль/литр (фМ) или более. Термин связывание относится к непосредственной ассоциации между двумя молекулами, обусловленной, например, ковалентными, электростатическими, гидрофобными и ионными взаимодействиями и/или взаимодействиями с образованием водородных связей, включая такие взаимодействия, как солевые мостики и водные мостики. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления антитела связывают человеческий B2M с наномолярной аффинностью или пикомолярной аффинностью. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления антитела связывают человеческий B2M с K_d, составляющей менее приблизительно 100 нМ, 50 нМ, 20 нМ, 20 нМ или 1 нМ.- 12 045040 greater than, at least 90 times greater, at least 100 times greater, or at least 1000 times greater or greater than the affinity of the antibody for irrelevant amino acid sequences. The affinity of the specific binding element for the target proteins may be, for example, from about 100 nanomol/liter (nM) to about 0.1 nM, from about 100 nM to about 1 picomol/liter (pM), or from about 100 nM to about 1 femtomole /liter (fM) or more. The term binding refers to the direct association between two molecules due to, for example, covalent, electrostatic, hydrophobic, ionic and/or hydrogen bonding interactions, including interactions such as salt bridges and water bridges. In accordance with some embodiments, the antibodies bind human B2M with nanomolar affinity or picomolar affinity. In some embodiments, the antibodies bind human B2M with a K _d of less than about 100 nM, 50 nM, 20 nM, 20 nM, or 1 nM.

Примеры B2M-специфических связывающих элементов включают в себя антитела к B2M и их связывающие фрагменты. Неограничивающие примеры таких антител включают в себя антитела, направленные на любой эпитоп B2M. Также охватываются биспецифические антитела, т.е. антитела, в которых каждый из двух связывающих доменов распознает отличающийся связывающий эпитоп. Аминокислотная последовательность человеческого B2M раскрыта в Cunningham, et al., The complete amino acid sequence of beta-2-microglobulin, Biochemistry (1973) 12:4811-4821.Examples of B2M-specific binding elements include anti-B2M antibodies and binding fragments thereof. Non-limiting examples of such antibodies include antibodies directed to any B2M epitope. Also covered are bispecific antibodies, i.e. antibodies in which each of the two binding domains recognizes a different binding epitope. The amino acid sequence of human B2M is disclosed in Cunningham, et al., The complete amino acid sequence of beta-2-microglobulin, Biochemistry (1973) 12:4811-4821.

Специфические связывающие элементы на основе антител, которые можно использовать, включают в себя полные антитела или иммуноглобулины любого изотипа, а также фрагменты антител, которые сохраняют специфическое связывание с антигеном, в том числе, без ограничения, Fab, Fv, scFv и Fd фрагменты, химерные антитела, гуманизированные антитела, одноцепочечные антитела и слитые белки, содержащие антигенсвязывающую часть антитела и белок, отличный от антитела. Антитела могут быть помечены выявляемой меткой, например, радиоизотопом, ферментом, который образует выявляемый продукт, флуоресцентным белком и т.п. Антитела могут быть дополнительно конъюгированы с другими фрагментами, такими как члены пар, специфически связывающиеся друг с другом, например, с биотином (членом член пары специфически связывающихся молекул биотин-стрептавидин) и т.п. Термином также охватываются Fab', Fv, F(ab')2 и/или другие фрагменты антител, которые сохраняют специфическое связывание с антигеном, и моноклональные антитела. Антитело может быть моновалентным или бивалентным.Specific antibody binding elements that can be used include full antibodies or immunoglobulins of any isotype, as well as antibody fragments that retain specific antigen binding, including, but not limited to, Fab, Fv, scFv and Fd fragments, chimeric antibodies, humanized antibodies, single-chain antibodies and fusion proteins containing the antigen-binding portion of the antibody and a protein other than the antibody. Antibodies can be labeled with a detectable label, for example, a radioisotope, an enzyme that forms the detectable product, a fluorescent protein, or the like. Antibodies can be further conjugated to other moieties, such as members of pairs that specifically bind to each other, for example, biotin (a member of a pair of specifically binding biotin-streptavidin molecules) and the like. The term also includes Fab', Fv, F(ab')2 and/or other antibody fragments that retain specific antigen binding, and monoclonal antibodies. The antibody may be monovalent or bivalent.

Фрагменты антител содержат часть интактного антитела, например, антигенсвязывающего или вариабельного участка интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают в себя Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv фрагменты; диатела; линейные антитела (Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)); одноцепочечные молекулы антител; и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. Расщепление антител папаином дает два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемых Fab фрагментами, каждый из которых имеет один антигенсвязывающий сайт, и остаточный Fc фрагмент, причем данное обозначение отражает его способность легко кристаллизоваться. Обработка пепсином дает на выходе F(ab')₂ фрагмент, который имеет два антигенсвязывающих активных центра антитела и при этом все еще способен к перекрестному связыванию с антигеном.Antibody fragments contain a portion of an intact antibody, such as an antigen binding or variable region of an intact antibody. Examples of antibody fragments include Fab, Fab', F(ab') ₂ and Fv fragments; diabodies; linear antibodies (Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)); single-chain antibody molecules; and multispecific antibodies formed from antibody fragments. Papain digestion of antibodies produces two identical antigen-binding fragments, called Fab fragments, each having one antigen-binding site, and a residual Fc fragment, this designation reflecting its ability to readily crystallize. Treatment with pepsin produces an F(ab') ₂ fragment that has two antigen-binding active sites of the antibody and is still capable of cross-linking with antigen.

Fv представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный сайт распознавания и связывания антигена. Этот участок состоит из димера одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи в прочной нековалентной ассоциации. Для данной конфигурации характерно, что три CDR в каждом вариабельном домене взаимодействуют, определяя сайт связывания антигена на поверхности димера VH-VL. В совокупности шесть CDR придают антителу специфичность связывания антигена. Тем не менее, даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфические в отношении антигена) обладает способностью к распознаванию и связыванию антигена, хотя и с более низкой аффинностью, чем полный сайт связывания.Fv is the minimal antibody fragment that contains the complete antigen recognition and binding site. This region consists of a dimer of one heavy chain variable domain and one light chain variable domain in a tight, non-covalent association. Characteristic of this configuration is that three CDRs in each variable domain interact to define an antigen binding site on the surface of the VH-VL dimer. Collectively, the six CDRs give the antibody antigen binding specificity. However, even a single variable domain (or half of an Fv containing only three antigen-specific CDRs) has the ability to recognize and bind antigen, although with lower affinity than the complete binding site.

Fab фрагмент также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (СН1) тяжелой цепи. Fab фрагменты отличаются от Fab' фрагментов добавлением нескольких остатков на карбоксильном конце СН1 домена тяжелой цепи, в том числе одного или нескольких цистеинов из шарнирного участка антитела. Fab'-SH представляет собой обозначение в данном документе для Fab', в котором цистеиновый остаток(цистеиновые остатки) в константных доменах несут свободную тиольную группу. F(ab')₂ фрагменты антител первоначально получали в виде пар Fab' фрагментов, которые имели между собой цистеины из шарнирного участка. Также известны другие молекулы, полученные в результате химического связывания фрагментов антител.The Fab fragment also contains a light chain constant domain and a first heavy chain constant domain (CH1). Fab fragments differ from Fab' fragments by the addition of several residues at the carboxyl terminus of the CH1 domain of the heavy chain, including one or more cysteines from the antibody hinge region. Fab'-SH is the designation herein for Fab' in which the cysteine residue(s) in the constant domains bear a free thiol group. F(ab') ₂ antibody fragments were initially produced as pairs of Fab' fragments that shared hinge region cysteines. Other molecules obtained by chemical coupling of antibody fragments are also known.

Легкие цепи антител (иммуноглобулинов) из любого вида позвоночных можно отнести к одному из двух явно отличающихся типов, называемых каппа и лямбда, исходя из аминокислотных последовательностей их константных доменов. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей иммуноглобулины можно отнести к разным классам. Существует пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2.Antibody light chains (immunoglobulins) from any vertebrate species can be classified into one of two distinct types, called kappa and lambda, based on the amino acid sequences of their constant domains. Depending on the amino acid sequence of the constant domain of their heavy chains, immunoglobulins can be classified into different classes. There are five main classes of immunoglobulins: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, and some of them can be further divided into subclasses (isotypes), such as IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA and IgA2.

- 13 045040- 13 045040

Одноцепочечные Fv или sFv фрагменты антител содержат VH и VL домены антитела, причем эти домены присутствуют в одной полипептидной цепи. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления полипептид Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между VH и VL доменами, который обеспечивает возможность образования sFv необходимой структуры для связывания с антигеном. Для обзора sFv см. Pluckthun в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).Single-chain Fv or sFv antibody fragments contain the VH and VL domains of the antibody, and these domains are present in the same polypeptide chain. In accordance with some embodiments, the Fv polypeptide further comprises a polypeptide linker between the VH and VL domains, which allows the sFv to form the required structure for binding to the antigen. For a review of sFv, see Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

Таким образом, антитела, которые можно применять вместе с данным раскрытием, охватывают моноклональные антитела, поликлональные антитела, биспецифические антитела, Fab фрагменты антител, F(ab)₂ фрагменты антител, Fv фрагменты антител (например, VH или VL), одноцепочечные Fv фрагменты антител и dsFv фрагменты антител. Более того, молекулы антител могут представлять собой полностью человеческие антитела, гуманизированные антитела или химерные антитела. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления молекулы антител представляют собой моноклональные полностью человеческие антитела.Thus, antibodies that can be used in conjunction with this disclosure include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, bispecific antibodies, Fab antibody fragments, F(ab) ₂ antibody fragments, Fv antibody fragments (eg, VH or VL), single chain Fv antibody fragments and dsFv antibody fragments. Moreover, the antibody molecules may be fully human antibodies, humanized antibodies, or chimeric antibodies. In accordance with some embodiments, the antibody molecules are fully human monoclonal antibodies.

Антитела, которые можно применять вместе с данным раскрытием, могут включать в себя вариабельный участок любого антитела, зрелого или не подвергшегося процессингу, связанный с константным участком любого иммуноглобулина. Если вариабельный участок легкой цепи связан с константным участком, тот может представлять собой константный участок каппа-цепи. Если вариабельный участок тяжелой цепи связан с константным участком, тот может представлять собой человеческий константный участок гамма 1, гамма 2, гамма 3 или гамма 4, более предпочтительно, гамма 1, гамма 2 или гамма 4 и еще более предпочтительно гамма 1 или гамма 4.Antibodies that can be used in conjunction with this disclosure may include the variable region of any antibody, mature or unprocessed, linked to the constant region of any immunoglobulin. If the light chain variable region is linked to a constant region, it may be a kappa chain constant region. If the heavy chain variable region is linked to a constant region, it may be a human constant region gamma 1, gamma 2, gamma 3 or gamma 4, more preferably gamma 1, gamma 2 or gamma 4 and even more preferably gamma 1 or gamma 4.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления полностью человеческие моноклональные антитела, направленные против B2M, получают с применением трансгенных мышей, несущих части человеческой иммунной системы, вместо мышиной иммунной системы.In some embodiments, fully human monoclonal antibodies directed against B2M are produced using transgenic mice carrying portions of the human immune system instead of the murine immune system.

Незначительные вариации в аминокислотных последовательностях антител или молекул иммуноглобулинов охватываются настоящим изобретением при условии, что вариации в аминокислотной последовательности сохраняют по меньшей мере 75%, например, по меньшей мере 80, 90, 95 или 99% последовательности. В частности, предполагаются консервативные аминокислотные замены. Консервативные замены представляют собой такие, которые имеют место в пределах семейств аминокислот, которые являются близкими по своим боковым цепям. Приводит ли изменение аминокислоты к функциональному пептиду, можно легко определить посредством анализа специфической активности производного полипептида. Фрагменты (или аналоги) антител или молекул иммуноглобулинов могут быть легко получены квалифицированным специалистом в данной области техники. Предпочтительные амино- и карбоксиконцы фрагментов или аналогов находятся возле границ функциональных доменов. Структурные и функциональные домены можно идентифицировать посредством сравнения данных о нуклеотидной и/или аминокислотной последовательности с общедоступными или проприетарными базами данных с последовательностями. Предпочтительно, компьютеризованные методы сравнения применяют для идентификации мотивов последовательности или прогнозируемых конформационных доменов белка, которые находятся в других белках с известной структурой и/или функцией. Способы идентификации последовательностей белков, которые сворачиваются в известную трехмерную структуру, являются известными. Мотивы последовательности и структурные конформации можно применять для определения структурных и функциональных доменов в соответствии с настоящим изобретением.Minor variations in the amino acid sequences of antibodies or immunoglobulin molecules are covered by the present invention, provided that the variations in the amino acid sequence retain at least 75%, for example, at least 80, 90, 95 or 99% of the sequence. In particular, conservative amino acid substitutions are expected. Conservative substitutions are those that occur within families of amino acids that are similar in their side chains. Whether the amino acid change results in a functional peptide can be readily determined by analyzing the specific activity of the derived polypeptide. Fragments (or analogues) of antibodies or immunoglobulin molecules can be easily obtained by one skilled in the art. Preferred amino and carboxy termini of the moieties or analogues are located near the boundaries of the functional domains. Structural and functional domains can be identified by comparing nucleotide and/or amino acid sequence data with publicly available or proprietary sequence databases. Preferably, computerized comparison methods are used to identify sequence motifs or predicted protein conformational domains that are found in other proteins of known structure and/or function. Methods for identifying protein sequences that fold into a known three-dimensional structure are known. Sequence motifs and structural conformations can be used to define structural and functional domains in accordance with the present invention.

Конкретные примеры средств на основе антител, которые могут использоваться для снижения экспрессии B2M, включают в себя, без ограничения: антитело к B2m B1-1G6 (иммуноглобулин G2a [IgG2]), В2-62-2 (IgG2a) и С21-48А (IgG2b) от Immunotech S.A. (Марсель, Франция); антитело к B2m MAb HC11151-1 (IgG1) (которое раскрыто в Corbeau, et al., An early postinfection signal mediated by monoclonal antibeta 2 microglobulin antibody is responsible for delayed production of human immunodeficiency virus type 1 in peripheral blood mononuclear cells, Journal of Virology (1990) 64:1459-64); клон В2, мышиный IgG1 (Serotec Ltd., Оксфорд, Великобритания); мышиные mAb к человеческому B2M, которые раскрыты в Yang, et al., Targeting beta(2)-microglobulin for induction of tumor apoptosis in human hematological malignancies, (2006) 10: 295-307; 1B749 (IgG2a) и НВ28 (IgG2b) (которые раскрыты в Pokrass, et al., Activation of complement by monoclonal antibodies that target cell-associated B2-microglobulin: implications for cancer immunotherapy, (2013) 56: 549-60); антитело к В2-микроглобулину (антитело ВВМ.1) (которое раскрыто в Brodsky, et al., Characterization of a monoclonal anti-beta 2-microglobulin antibody and its use in the genetic and biochemical analysis of major histocompatibility antigens, European Journal of Immunology (1979) 9: 536-45; BBM-1 (которое раскрыто в Korkolopoulou, Loss of antigen-presenting molecules (MHC class I and TAP-1) in lung cancer, British Journal of Cancer (1996) 73: 148-53; антитела B1.1G6, C23.24.2, B2.62.2 и С21.48А1 (которые раскрыты в Liabeuf, et al., An antigenic determinant of human beta 2-microglobulin masked by the association with HLA heavy chains at the cell surface: analysis using monoclonal antibodies, Journal of Immunology (1981) 127: 1542-8); а также те средства на основе антител, описанные в: Zhang, et al., Anti-B2M monoclonal antibodies kill myeloma cells via cell- and complement-mediated cytotoxicity, International Journal of Cancer (2014) 135: 1132-41, Yang, et al., Anti beta2-microglobulin monoclonal antibodies induce apoptosis in myeloma cells by recruiting MHC class I to and excluding growth and survival cytokine receptors from lipidSpecific examples of antibody-based agents that can be used to reduce B2M expression include, but are not limited to: anti-B2m antibody B1-1G6 (immunoglobulin G2a [IgG2]), B2-62-2 (IgG2a), and C21-48A (IgG2b ) from Immunotech S.A. (Marseille, France); anti-B2m MAb HC11151-1 (IgG1) (which is disclosed in Corbeau, et al., An early postinfection signal mediated by monoclonal antibeta 2 microglobulin antibody is responsible for delayed production of human immunodeficiency virus type 1 in peripheral blood mononuclear cells, Journal of Virology (1990) 64:1459-64); clone B2, mouse IgG1 (Serotec Ltd., Oxford, UK); mouse mAbs to human B2M, which are disclosed in Yang, et al., Targeting beta(2)-microglobulin for induction of tumor apoptosis in human hematological malignancies, (2006) 10: 295-307; 1B749 (IgG2a) and HB28 (IgG2b) (which are disclosed in Pokrass, et al., Activation of complement by monoclonal antibodies that target cell-associated B2-microglobulin: implications for cancer immunotherapy, (2013) 56: 549-60); antibody to B2-microglobulin (antibody BBM.1) (which is disclosed in Brodsky, et al., Characterization of a monoclonal anti-beta 2-microglobulin antibody and its use in the genetic and biochemical analysis of major histocompatibility antigens, European Journal of Immunology (1979) 9: 536-45; BBM-1 (which is disclosed in Korkolopoulou, Loss of antigen-presenting molecules (MHC class I and TAP-1) in lung cancer, British Journal of Cancer (1996) 73: 148-53; antibodies B1.1G6, C23.24.2, B2.62.2 and C21.48A1 (which are disclosed in Liabeuf, et al., An antigenic determinant of human beta 2-microglobulin masked by the association with HLA heavy chains at the cell surface: analysis using monoclonal antibodies, Journal of Immunology (1981) 127: 1542-8); as well as those antibody-based agents described in: Zhang, et al., Anti-B2M monoclonal antibodies kill myeloma cells via cell- and complement-mediated cytotoxicity, International Journal of Cancer (2014) 135: 1132–41, Yang, et al., Anti beta2-microglobulin monoclonal antibodies induce apoptosis in myeloma cells by recruiting MHC class I to and excluding growth and survival cytokine receptors from lipid

- 14 045040 rafts, Blood (2007) 110: 3028-35, Josson, et al., Inhibition of B2-microglobulin/hemochromatosis enhances radiation sensitivity by induction of iron overload in prostate cancer cells, (2013) 8:e68366, Par and Falus, Serum beta 2-microglobulin (beta 2m) and anti-beta 2m antibody in chronic hepatitis, Acta Medica Hungarica (1986) 43:343-9, Huang, et al., Androgen receptor survival signaling is blocked by anti-beta2-microglobulin monoclonal antibody via a MAPK/lipogenic pathway in human prostate cancer cells, The Journal of Biological Chemistry (2010) 285: 7947-56, Tam and Messner, Differential inhibition of mitogenic responsiveness by monoclonal antibodies to beta 2-microglobulin, (1991) 133: 219-33, Domanska, et al., Atomic structure of a nanobody-trapped domain-swapped dimer of an amyloidogenic beta2-microglobulin variant, Proc Natl Acad Sci USA. (2011) 108(4): 1314-9, Falus, et al., Prevalence of anti-beta-2 microglobulin autoantibodies in sera of rheumatoid arthritis patients with extra-articular manifestations, Annals of the Rheumatic Diseases, (1981) 40: 409-413, Shabunina, et al., Immunosorbent for Removal of B2-microglobulin from Human Blood Plasma, Bulletin of Experimental Biology and Medicine (2001) 132: 984-986), в патентных документах №№ WO/2010/017443, 7341721, WO/1996/002278, WO/2003/079023 и WO/1990/013657.- 14 045040 rafts, Blood (2007) 110: 3028-35, Josson, et al., Inhibition of B2-microglobulin/hemochromatosis enhances radiation sensitivity by induction of iron overload in prostate cancer cells, (2013) 8:e68366, Par and Falus, Serum beta 2-microglobulin (beta 2m) and anti-beta 2m antibody in chronic hepatitis, Acta Medica Hungarica (1986) 43:343-9, Huang, et al., Androgen receptor survival signaling is blocked by anti-beta2- microglobulin monoclonal antibody via a MAPK/lipogenic pathway in human prostate cancer cells, The Journal of Biological Chemistry (2010) 285: 7947-56, Tam and Messner, Differential inhibition of mitogenic responsiveness by monoclonal antibodies to beta 2-microglobulin, (1991) 133: 219-33, Domanska, et al., Atomic structure of a nanobody-trapped domain-swapped dimer of an amyloidogenic beta2-microglobulin variant, Proc Natl Acad Sci USA. (2011) 108(4): 1314-9, Falus, et al., Prevalence of anti-beta-2 microglobulin autoantibodies in sera of rheumatoid arthritis patients with extra-articular manifestations, Annals of the Rheumatic Diseases, (1981) 40: 409-413, Shabunina, et al., Immunosorbent for Removal of B2-microglobulin from Human Blood Plasma, Bulletin of Experimental Biology and Medicine (2001) 132: 984-986), in patent documents nos. WO/2010/017443, 7341721 , WO/1996/002278, WO/2003/079023 and WO/1990/013657.

В соответствии с теми вариантами осуществления, в которых активное средство вводят взрослому млекопитающему, активное средство(активные средства) можно вводить взрослому млекопитающему с применением любого подходящего протокола введения, способного обеспечить в результате желаемую активность. Следовательно, средство может быть включено в ряд составов, например, в фармацевтически приемлемые среды, для терапевтического введения. Более конкретно, средства согласно настоящему изобретению могут быть составлены в фармацевтические композиции посредством объединения с соответствующими фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями, и они могут быть составлены в препараты в твердой, полужидкой, жидкой или газообразной формах, такие как таблетки, капсулы, порошки, гранулы, мази (например, кремы для кожи), растворы, суппозитории, инъекционные растворы, препараты для ингаляции и аэрозоли. В связи с этим, введение средств может осуществляться различными путями, в том числе посредством перорального, буккального, ректального, парентерального, интраперитонеального, интрадермального, трансдермального, интратрахеального введения и т.д.In accordance with those embodiments in which the active agent is administered to an adult mammal, the active agent(s) can be administered to the adult mammal using any suitable administration protocol capable of resulting in the desired activity. Accordingly, the agent can be included in a number of formulations, for example, pharmaceutically acceptable vehicles, for therapeutic administration. More specifically, the agents of the present invention can be formulated into pharmaceutical compositions by combining with appropriate pharmaceutically acceptable carriers or diluents, and they can be formulated into preparations in solid, semi-liquid, liquid or gaseous forms, such as tablets, capsules, powders, granules, ointments (eg skin creams), solutions, suppositories, injections, inhalants and aerosols. In this regard, the administration of agents can be carried out in various ways, including through oral, buccal, rectal, parenteral, intraperitoneal, intradermal, transdermal, intratracheal administration, etc.

В фармацевтических лекарственных формах средства можно вводить в виде их фармацевтически приемлемых солей, или их также можно применять отдельно или в соответствующем сочетании, а также в комбинации с другими фармацевтически активными соединениями. Следующие способы и вспомогательные вещества являются только иллюстративными и не предполагают какого-либо ограничения.In pharmaceutical dosage forms, the agents can be administered as their pharmaceutically acceptable salts, or they can also be used alone or in appropriate combination, as well as in combination with other pharmaceutically active compounds. The following methods and excipients are illustrative only and are not intended to be limiting in any way.

В случае пероральных препаратов средства можно применять отдельно или в комбинации с соответствующими добавками для получения таблеток, порошков, гранул или капсул, например, с традиционными добавками, такими как лактоза, маннит, кукурузный крахмал или картофельный крахмал; со связующими средствами, такими как кристаллическая целлюлоза, производные целлюлозы, камедь, кукурузный крахмал или желатины; с разрыхлителями, такими как кукурузный крахмал, картофельный крахмал или карбоксиметилцеллюлоза натрия; со смазывающими средствами, такими как тальк или стеарат магния; и, если это желательно, с разбавителями, буферными средствами, увлажняющими средствами, консервантами и ароматизаторами.In the case of oral preparations, the agents can be used alone or in combination with appropriate additives to form tablets, powders, granules or capsules, for example with traditional additives such as lactose, mannitol, corn starch or potato starch; with binders such as crystalline cellulose, cellulose derivatives, gums, corn starch or gelatins; with raising agents such as corn starch, potato starch or sodium carboxymethylcellulose; with lubricants such as talc or magnesium stearate; and, if desired, with diluents, buffers, humectants, preservatives and flavorings.

Средства можно составить в препараты для инъекции посредством их растворения, суспендирования или эмульгирования в водном или неводном растворителе, таком как растительное или другие подобные масла, синтетические глицериды алифатических кислот, сложные эфиры высших алифатических кислот или пропиленгликоля; и, если это необходимо, смешивания с общепринятыми добавками, такими как солюбилизаторы, средства, обеспечивающие изотоничность, суспендирующие средства, эмульгирующие средства, стабилизаторы и консерванты.The agents can be formulated for injection by dissolving, suspending or emulsifying them in an aqueous or non-aqueous solvent such as vegetable or other similar oils, synthetic aliphatic acid glycerides, higher aliphatic acid esters or propylene glycol; and, if necessary, mixing with conventional additives such as solubilizers, isotonicizing agents, suspending agents, emulsifying agents, stabilizers and preservatives.

Средства можно использовать в составе в виде аэрозоля, введение которого осуществляют посредством ингаляции. Соединения согласно настоящему изобретению можно составлять с подходящими газами-вытеснителями, находящимися под давлением, такими как дихлордифторметан, пропан, азот и т.п.The products can be used in the form of an aerosol, which is administered by inhalation. The compounds of the present invention can be formulated with suitable pressurized propellant gases such as dichlorodifluoromethane, propane, nitrogen and the like.

Более того, средства могут быть превращены в суппозитории посредством смешивания с рядом оснований, таких как эмульгирующие основания или водорастворимые основания. Соединения согласно настоящему изобретению можно вводить ректально посредством суппозитория. Суппозиторий может включать в себя среды, такие как какао-масло, карбоваксы и полиэтиленгликоли, которые тают при температуре тела, находясь в твердой форме при комнатной температуре.Moreover, the agents can be formulated into suppositories by mixing with a number of bases, such as emulsifying bases or water-soluble bases. The compounds of the present invention can be administered rectally by means of a suppository. The suppository may include media such as cocoa butter, carbowax and polyethylene glycols, which melt at body temperature while in solid form at room temperature.

Могут быть обеспечены единичные лекарственные формы для перорального или ректального введения, такие как сиропы, эликсиры и суспензии, в которых каждая дозированная единица, например, чайная ложка, столовая ложка, таблетка или суппозитории, содержит предварительно определенное количество композиции, содержащей один или несколько ингибиторов. Аналогичным образом, единичные лекарственные формы для инъекции или внутривенного введения могут содержать ингибитор(ингибиторы) в композиции в виде раствора в стерильной воде, нормальном солевом растворе или другом фармацевтически приемлемом носителе.Unit dosage forms for oral or rectal administration may be provided, such as syrups, elixirs and suspensions, in which each dosage unit, for example, teaspoon, tablespoon, tablet or suppository, contains a predetermined amount of a composition containing one or more inhibitors. Likewise, unit dosage forms for injection or intravenous administration may contain the inhibitor(s) in the composition as a solution in sterile water, normal saline or other pharmaceutically acceptable carrier.

Используемый в контексте данного документа термин единичная лекарственная форма относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных доз для субъектов-людей и субъектов-животных, причем каждая единица содержит предварительно определенное количество соединений согласно настоящему изобретению, которое согласно расчетам является количеством, достаточнымAs used herein, the term unit dosage form refers to physically discrete units suitable as unitary dosages for human and animal subjects, each unit containing a predetermined amount of the compounds of the present invention, which is calculated to be an amount sufficient

- 15 045040 для получения желаемого эффекта, совместно с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем или средой. Характеристики новых единичных лекарственных форм согласно настоящему изобретению зависят от конкретного используемого соединения и от эффекта, которого нужно достичь, а также от фармакодинамических характеристик, ассоциированных с каждым соединением у хозяина.- 15 045040 to obtain the desired effect, together with a pharmaceutically acceptable diluent, carrier or medium. The characteristics of the new unit dosage forms of the present invention depend on the specific compound used and the effect to be achieved, as well as the pharmacodynamic characteristics associated with each compound in the host.

Фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, такие как среды, вспомогательные средства, носители или разбавители, общедоступны из открытых источников. Более того, фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, такие как средства, корректирующие pH, и буферные средства, средства, регулирующие тоничность, стабилизаторы, смачивающие средства и т.п., общедоступны из открытых источников.Pharmaceutically acceptable excipients, such as vehicles, excipients, carriers or diluents, are publicly available from public sources. Moreover, pharmaceutically acceptable excipients such as pH adjusters and buffers, tonicity adjusters, stabilizers, wetting agents, etc. are publicly available from public sources.

В случае, когда средство представляет собой полипептид, полинуклеотид, их аналог или миметик, его можно вводить в ткани или клетки-хозяева с помощью любого количества путей, в том числе с помощью вирусной инфекции, микроинъекции или слияния пузырьков. Безыгольную инъекцию также можно применять для внутримышечного введения, как описано в Furth et al., Anal Biochem. (1992) 205:365-368. ДНК может быть нанесена в виде покрытия на золотые микрочастицы и доставлена интрадермально с помощью устройства для бомбардировки частицами или генной пушки, как описано в литературе (см., например, Tang et al., Nature (1992) 356:152-154), где на золотые микрочастицы наносят в виде покрытия ДНК, а затем бомбардируют ими клетки кожи. В случае терапевтических средств на основе нуклеиновых кислот находит применение ряд различных сред для доставки, в том числе вирусные и невирусные векторные системы, которые являются известными в уровне техники.Where the agent is a polypeptide, polynucleotide, analog or mimetic thereof, it can be introduced into host tissues or cells via any number of routes, including viral infection, microinjection or vesicle fusion. The needle-free injection can also be used for intramuscular administration as described in Furth et al., Anal Biochem. (1992) 205:365–368. The DNA can be coated onto gold microparticles and delivered intradermally using a particle bombardment device or gene gun as described in the literature (see, for example, Tang et al., Nature (1992) 356:152-154), where DNA is coated onto gold microparticles and then bombarded into skin cells. In the case of nucleic acid-based therapeutics, a number of different delivery media are used, including viral and non-viral vector systems that are known in the art.

Специалист в данной области техники легко поймет, что уровни дозы могут варьировать в зависимости от конкретного соединения, природы среды для доставки и т.п. Предпочтительные дозировки для заданных соединений могут быть легко определены специалистом в данной области техники с помощью ряда средств.One skilled in the art will readily appreciate that dosage levels may vary depending on the particular compound, the nature of the delivery medium, and the like. Preferred dosages for given compounds can be readily determined by one skilled in the art by a number of means.

В соответствии с теми вариантами осуществления, в которых эффективное количество активного средства вводят взрослому млекопитающему, количество или дозировка являются эффективными при введении в течение подходящего периода времени, такого как одна неделя или более, в том числе две недели или более, как например, 3 недели или более, 4 недели или более, 8 недель или более и т.д., для того, чтобы доказать ослабление нарушения, например, снижения когнитивных способностей, и/или улучшение когнитивных способностей у взрослого млекопитающего. Например, эффективная доза представляет собой дозу, которая при введении в течение подходящего периода времени, такого как по меньшей мере приблизительно одна неделя и, возможно, приблизительно две недели или более, вплоть до периода, составляющего приблизительно 3, 4, 8 недель или более, будет замедлять, например, приблизительно на 20% или более, например, на 30% или более, на 40% или более или на 50% или более, в некоторых случаях на 60% или более, на 70% или более, на 80% или более или на 90% или более, например, будет останавливать снижение когнитивных способностей у пациента, страдающего от естественного старения или нарушения, ассоциированного со старением. В некоторых случаях эффективное количество или доза активного средства будет не только замедлять или останавливать прогрессирование болезненного состояния, но также будет индуцировать регресс состояния, т.е. будет вызывать улучшение когнитивной способности. Например, в некоторых случаях эффективное количество представляет собой количество, которое при введении в течении подходящего периода времени, обычно по меньшей мере приблизительно одной недели и, возможно, приблизительно две недели или более, вплоть до периода, составляющего приблизительно 3, 4, 8 недель или более, будет улучшать когнитивные способности индивида, страдающего от ассоциированного со старением когнитивного нарушения, например, 1,5-кратно, 2-кратно, 3-кратно, 4-кратно, 5-кратно, в некоторых случаях 6-кратно, 7-кратно, 8-кратно, 9-кратно или 10-кратно или более в сравнении с когнитивной способностью до введения препарата крови.In accordance with those embodiments in which an effective amount of the active agent is administered to an adult mammal, the amount or dosage is effective when administered over a suitable period of time, such as one week or more, including two weeks or more, such as 3 weeks or more, 4 weeks or more, 8 weeks or more, etc., in order to demonstrate mitigation of impairment, such as cognitive decline, and/or improvement of cognitive ability in an adult mammal. For example, an effective dose is a dose that, when administered over a suitable period of time, such as at least about one week and possibly about two weeks or more, up to a period of about 3, 4, 8 weeks or more, will slow down, for example, about 20% or more, for example, 30% or more, 40% or more, or 50% or more, in some cases 60% or more, 70% or more, 80% or more or 90% or more, for example, will stop the decline of cognitive abilities in a patient suffering from natural aging or a disorder associated with aging. In some cases, an effective amount or dose of the active agent will not only slow or stop the progression of the disease state, but will also induce regression of the condition, i.e. will cause improvement in cognitive ability. For example, in some cases, an effective amount is an amount that, when administered over a suitable period of time, typically at least about one week and possibly about two weeks or more, up to a period of about 3, 4, 8 weeks, or further, will improve the cognitive abilities of an individual suffering from aging-associated cognitive impairment, for example, 1.5-fold, 2-fold, 3-fold, 4-fold, 5-fold, in some cases 6-fold, 7-fold , 8-fold, 9-fold, or 10-fold or more compared to cognitive ability before administration of the blood product.

При желании эффективность лечения можно оценить с применением любого подходящего протокола. Тесты когнитивных способностей и тест IQ (показатель умственного развития) для измерения когнитивной способности, например, внимания и концентрации, способности к обучению сложным задачам и понятиям, памяти, обработки информации, функции пространственного зрения, способности к воспроизведению и пониманию речи, способности к решению сложных проблем и принятию решений, а также способности к выполнению управляющих функций являются хорошо известными в уровне техники, любой из них можно применять для измерения когнитивной способности индивида перед лечением и/или во время и после лечения субъекта препаратом крови, например, для подтверждения того, что было введено эффективное количество. Они включают в себя, например, тест для оценки врачом общей практики когнитивных способностей (General Practitioner Assessment of Cognition) (GPCOG), скрининг нарушения памяти (Memory Impairment Screen), краткую шкалу оценки психического статуса (Mini Mental State Examination) (MMSE), калифорнийский тест на слухо-речевую память (California Verbal Learning Test) во второй редакции и короткой форме для оценки памяти, тест Делис-Каплан на оценку управляющих функций (Delis-Kaplan Executive Functioning System test), шкалу оценки когнитивных функций при болезни Альцгеймера (Alzheimer's Disease Assessment Scale) (ADAS-Cog), психогериатрическую оценочную шкалу (Psychogeriatric Assessment Scale) (PAS) и т.п. Прогресс функциональных улучшений в головном мозге можно выявить с помощью методик визуализации головного мозга, таких как магнитно- 16 045040 резонансная томография (МРТ) или позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) и т.п. Широкий спектр дополнительных методов функциональной оценки можно применять для мониторинга повседневной деятельности, управляющих функций, подвижности и т.д. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способ предусматривает стадию измерения когнитивной способности и выявления пониженной скорости снижения когнитивных способностей, стабилизации когнитивной способности и/или повышения когнитивной способности после введения препарата крови по сравнению с когнитивной способностью индивида до того, как препарат крови был введен. Такие измерения можно производить спустя неделю или более после введения препарата крови, например, спустя 1, 2, 3 недели или более, например, 4, 6 или 8 недель или более, например, 3, 4, 5 или 6 месяцев или более.If desired, the effectiveness of treatment can be assessed using any suitable protocol. Cognitive ability tests and IQ test to measure cognitive ability, such as attention and concentration, ability to learn complex tasks and concepts, memory, information processing, spatial vision, speech production and understanding, and problem solving ability. problems and decision making, as well as executive function abilities are well known in the art, any of which can be used to measure the cognitive ability of an individual before treatment and/or during and after treatment of a subject with a blood product, for example, to confirm that an effective amount has been administered. These include, for example, the General Practitioner Assessment of Cognition (GPCOG), Memory Impairment Screen, Mini Mental State Examination (MMSE), California Verbal Learning Test, second edition and short form for memory assessment, Delis-Kaplan Executive Functioning System test, Alzheimer's Disease Cognitive Assessment Scale Disease Assessment Scale) (ADAS-Cog), Psychogeriatric Assessment Scale (PAS), etc. Progress of functional improvements in the brain can be detected using brain imaging techniques such as magnetic resonance imaging (MRI) or positron emission tomography (PET), etc. A wide range of additional functional assessment methods can be used to monitor activities of daily living, executive functions, mobility, etc. In some embodiments, the method includes the step of measuring cognitive ability and detecting a reduced rate of cognitive decline, stabilization of cognitive ability, and/or increase in cognitive ability after administration of the blood product compared to the individual's cognitive ability before the blood product was administered. Such measurements can be made a week or more after administration of the blood product, for example, after 1, 2, 3 weeks or more, for example, 4, 6 or 8 weeks or more, for example, 3, 4, 5 or 6 months or more.

С биохимической точки зрения под эффективным количеством или эффективной дозой активного средства подразумевается количество активного средства, которое будет ингибировать, противодействовать, уменьшать, снижать или подавлять снижение синаптической пластичности и потерю синапсов, которые происходят в ходе естественного процесса старения или в ходе прогрессирования нарушения, ассоциированного со старением, приблизительно на 20% или более, например, на 30% или более, на 40% или более или на 50% или более, в некоторых случаях на 60% или более, на 70% или более, на 80% или более или на 90% или более, в некоторых случаях приблизительно на 100%, т.е. до перенебрежимо малых величин, а в некоторых случаях будет вызывать их регресс. Иными словами, клетки, присутствующие у взрослых млекопитающих, которые получают лечение в соответствии со способами согласно настоящему изобретению, станут более восприимчивыми к сигналам, например, сигналам, обеспечивающим активность, которые способствуют образованию и поддержанию синапсов.From a biochemical point of view, an effective amount or effective dose of an active agent means an amount of an active agent that will inhibit, counteract, reduce, reduce or suppress the decline in synaptic plasticity and loss of synapses that occur during the natural aging process or during the progression of a disorder associated with aging, by about 20% or more, for example, by 30% or more, by 40% or more, or by 50% or more, in some cases by 60% or more, by 70% or more, by 80% or more, or by 90% or more, in some cases approximately by 100%, i.e. to negligibly small values, and in some cases will cause their regression. In other words, cells present in adult mammals that are treated in accordance with the methods of the present invention will become more responsive to signals, such as activity signals, that promote the formation and maintenance of synapses.

Результаты способов согласно настоящему изобретению, например, которые описаны выше, могут проявляться в виде улучшений наблюдаемой синаптической пластичности как in vitro, так и in vivo в виде индукции долговременной потенциации. Например, индукция LTP в нервных цепях может наблюдаться у просыпающихся индивидов, например, посредством осуществления методик неинвазивной стимуляции на просыпающихся индивидах с целью индукции LTP-подобных долговременных изменений локализованной нейронной активности (Cooke SF, Bliss TV (2006) Plasticity in the human central nervous system. Brain. 129(Pt 7):1659-73); картирования пластичности и повышенной активности нервных цепей у индивидов, например, с помощью применения позитронно-эмиссионной томографии, функциональной магнитно-резонансной томографии и/или транскраниальной магнитной стимуляции (Cramer and Bastings, Mapping clinically relevant plasticity after stroke, Neuropharmacology (2000)39:842-51); и посредством выявления нейронной пластичности после обучения, т.е. улучшений памяти, например, посредством анализа активности головного мозга, связанной с воспроизведением информации (Buchmann et al., Prion protein M129V polymorphism affects retrieval-related brain activity, Neuropsychologia. (2008) 46:2389-402), или, например, посредством визуализации ткани головного мозга с помощью функциональной магнитнорезонансной томографии (фМРТ) после повторения воздействия с использованием знакомых и незнакомых объектов (Soldan et al., Global familiarity of visual stimuli affects repetition-related neural plasticity but not repetition priming, Neuroimage. (2008) 39:515-26; Soldan et al., Aging does not affect brain patterns of repetition effects associated with perceptual priming of novel objects, J. Cogn. Neurosci. (2008) 20:1762-76). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способ включает в себя стадию измерения синаптической пластичности и выявления пониженной скорости потери синаптической пластичности, стабилизации синаптической пластичности и/или повышения синаптической пластичности после введения препарата крови по сравнению с синаптической пластичностью у индивида до того, как препарат крови был введен. Такие измерения можно производить спустя неделю или более после введения препарата крови, например, спустя 1, 2, 3 недели или более, например, 4, 6 или 8 недель или более, например, 3, 4, 5 или 6 месяцев или более.The results of the methods of the present invention, for example those described above, can be manifested in the form of improvements in observed synaptic plasticity both in vitro and in vivo in the form of induction of long-term potentiation. For example, induction of LTP in neural circuits can be observed in waking individuals, for example, by implementing non-invasive stimulation techniques on waking individuals to induce LTP-like long-term changes in localized neural activity (Cooke SF, Bliss TV (2006) Plasticity in the human central nervous system Brain 129(Pt 7):1659-73); mapping plasticity and increased activity of neural circuits in individuals, for example, using positron emission tomography, functional magnetic resonance imaging and/or transcranial magnetic stimulation (Cramer and Bastings, Mapping clinically relevant plasticity after stroke, Neuropharmacology (2000)39:842 -51); and by identifying neural plasticity after learning, e.g. memory improvements, for example, by analyzing brain activity associated with retrieval of information (Buchmann et al., Prion protein M129V polymorphism affects retrieval-related brain activity, Neuropsychologia. (2008) 46:2389-402), or, for example, through imaging brain tissue using functional magnetic resonance imaging (fMRI) after repetition of stimulation using familiar and unfamiliar objects (Soldan et al., Global familiarity of visual stimuli affects repetition-related neural plasticity but not repetition priming, Neuroimage. (2008) 39:515 -26; Soldan et al., Aging does not affect brain patterns of repetition effects associated with perceptual priming of novel objects, J. Cogn. Neurosci. (2008) 20:1762-76). In accordance with some embodiments, the method includes the step of measuring synaptic plasticity and detecting a reduced rate of loss of synaptic plasticity, stabilization of synaptic plasticity, and/or increase in synaptic plasticity after administration of a blood product compared to synaptic plasticity in an individual before the blood product was administered. . Such measurements can be made a week or more after administration of the blood product, for example, after 1, 2, 3 weeks or more, for example, 4, 6 or 8 weeks or more, for example, 3, 4, 5 or 6 months or more.

В некоторых случаях способы приводят в результате к изменению уровней экспрессии одного или нескольких генов в одной или нескольких тканях хозяина, например, по сравнению с подходящим контролем (таким как описанный в разделе Экспериментальная часть, ниже). Изменение уровня экспрессии заданного гена может быть 0,5-кратным или большим, как например, 1,0-кратным или большим, в том числе 1,5-кратным или большим. Ткань может варьировать, и в некоторых случаях она представляет собой ткань нервной системы, например, ткань центральной нервной системы, в том числе ткань головного мозга, например, ткань гиппокампа. В некоторых случаях модуляция генной экспрессии в гиппокампе проявляется в виде повышенной гиппокампальной пластичности, например, по сравнению с подходящим контролем.In some cases, the methods result in changes in the expression levels of one or more genes in one or more host tissues, for example, compared to a suitable control (such as described in the Experimental Section, below). The change in the expression level of a given gene may be 0.5-fold or greater, such as 1.0-fold or greater, including 1.5-fold or greater. The tissue may vary, and in some cases it is nervous system tissue, such as central nervous system tissue, including brain tissue, such as hippocampal tissue. In some cases, modulation of gene expression in the hippocampus manifests itself as increased hippocampal plasticity, for example, compared to matched controls.

В некоторых случаях лечение приводит в результате к повышению уровней одного или нескольких белков в одной или нескольких тканях хозяина, например, по сравнению с подходящим контролем (таким как описанный в разделе Экспериментальная часть, ниже). Изменение уровня белка для заданного белка может быть 0,5-кратным или большим, как например, 1,0-кратным или большим, в том числе 1,5кратным или большим, причем в некоторых случаях уровень может приближаться к уровню у здорового организма дикого типа, например, в пределах 50% или менее, как например, 25% или менее, в том числе 10% или менее, например, 5% или менее от уровня у здорового организма дикого типа. Ткань может варьировать, и в некоторых случаях она представляет собой ткань нервной системы, например, ткань ценIn some cases, treatment results in increased levels of one or more proteins in one or more host tissues, for example, compared to a suitable control (such as those described in the Experimental Section, below). The change in protein level for a given protein can be 0.5-fold or greater, such as 1.0-fold or greater, including 1.5-fold or greater, and in some cases the level may approach that of a healthy wild-type organism , for example, within 50% or less, such as 25% or less, including 10% or less, such as 5% or less, of the level in a healthy wild-type organism. The tissue may vary, and in some cases it is nervous system tissue, such as price tissue

- 17 045040 тральной нервной системы, в том числе ткань головного мозга, например, ткань гиппокампа.- 17 045040 central nervous system, including brain tissue, for example hippocampal tissue.

В некоторых случаях способы приводят в результате к одному или нескольким структурным изменениям в одной или нескольких тканях. Ткань может варьировать, и в некоторых случаях она представляет собой ткань нервной системы, например, ткань центральной нервной системы, в том числе ткань головного мозга, например, ткань гиппокампа. Представляющие интерес изменения структуры включают в себя повышение плотности дендритных шипиков у зрелых нейронов в зубчатой извилине (DG) гиппокампа, например, по сравнению с подходящим контролем. В некоторых случаях модуляция структуры гиппокампа проявляется в виде усиленного образования синапсов, например, по сравнению с подходящим контролем. В некоторых случаях способы могут приводить в результате к усилению долговременной потенциации, например, по сравнению с подходящим контролем.In some cases, the methods result in one or more structural changes in one or more tissues. The tissue may vary, and in some cases it is nervous system tissue, such as central nervous system tissue, including brain tissue, such as hippocampal tissue. Structural changes of interest include increased dendritic spine density in mature neurons in the dentate gyrus (DG) of the hippocampus, for example, compared to matched controls. In some cases, modulation of hippocampal structure manifests itself as increased synapse formation, for example, compared to matched controls. In some cases, the methods may result in increased long-term potentiation, for example, compared to a suitable control.

В некоторых случаях практическое осуществление способов, например, описанных выше, приводит в результате к повышению нейрогенеза у взрослого млекопитающего. Повышение можно идентифицировать различными способами, например, как описано ниже в разделе Экспериментальная часть. В некоторых случаях повышение нейрогенеза проявляется в виде повышения количества Dcx-положительных незрелых нейронов, например, причем повышение может быть 2-кратным или большим. В некоторых случаях повышение нейрогенеза проявляется в виде повышения числа BrdU/NeuN-положительных клеток, причем повышение может быть 2-кратным или большим.In some cases, the practice of methods, such as those described above, results in increased neurogenesis in an adult mammal. The enhancement can be identified in various ways, for example as described below in the Experimental section. In some cases, increased neurogenesis manifests itself as an increase in the number of Dcx-positive immature neurons, for example, and the increase can be 2-fold or greater. In some cases, increased neurogenesis manifests itself as an increase in the number of BrdU/NeuN-positive cells, and the increase can be 2-fold or greater.

В некоторых случаях способы приводят в результате к улучшению обучения и памяти, например, по сравнению с подходящим контролем. Улучшение обучения и памяти можно оценить различными способами, например, с использованием моделей контекстуального замирания и/или радиального водного лабиринта с рукавами (RAWM), описанных в разделе Экспериментальная часть, ниже. При измерении с помощью модели контекстуального замирания лечение в некоторых случаях приводит в результате к повышенному замиранию в тесте контекстуальной памяти, а не в тесте памяти, обусловленной сигналом. При измерении с помощью модели RAWM лечение в некоторых случаях приводит в результате к улучшенному обучению и памяти в отношении определения местоположения платформы в ходе фазы тестирования при выполнении задачи. В некоторых случаях лечение проявляется в виде повышенного улучшения когнитивных способностей при гиппокамп-зависимом обучении и памяти, например, по сравнению с подходящим контролем.In some cases, the methods result in improved learning and memory, for example, compared to a suitable control. Improvements in learning and memory can be assessed in a variety of ways, such as using contextual freezing and/or radial arm water maze (RAWM) models, described in the Experimental Section, below. When measured using the contextual freezing model, treatment in some cases results in increased freezing on a contextual memory test rather than on a cued memory test. When measured using the RAWM model, treatment in some cases resulted in improved learning and memory for platform location during the testing phase of the task. In some cases, treatment results in increased cognitive improvement in hippocampus-dependent learning and memory, for example, compared to matched controls.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления снижение уровня B2M, например, как описано выше, можно осуществлять совместно с активным средством, обладающим активностью, подходящей для лечения когнитивного нарушения, ассоциированного со старением. Например, было показано, что ряд активных средств имеет некоторую эффективность при лечении когнитивных симптомов болезни Альцгеймера (например, потеря памяти, спутанность сознания и проблемы с мышлением и логическим рассуждением), например, ингибиторы холинэстеразы (например, донепезил, ривастигмин, галантамин, тарцин), мемантин и витамин Е. В качестве еще одного примера, было показано, что ряд средств имеет некоторую эффективность в лечении поведенческих или психиатрических симптомов болезни Альцгеймера, например, циталопрам (целекса), флуоксетин (прозак), пароксеин (паксил), сертралин (золофт), тразодон (десирел), лоразепам (ативан), оксазепам (серакс), арипипразол (абилифай), клозапин (клозарил), галоперидол (галдол), оланзапин (зипрекса), кветиапин (сероквель), рисперидон (риспердал) и зипрасидон (геодон).In some embodiments, lowering B2M levels, for example as described above, can be administered in conjunction with an active agent having activity useful for treating cognitive impairment associated with aging. For example, a number of active agents have been shown to have some effectiveness in treating the cognitive symptoms of Alzheimer's disease (eg, memory loss, confusion, and problems with thinking and reasoning), such as cholinesterase inhibitors (eg, donepezil, rivastigmine, galantamine, tarcin) , memantine, and vitamin E. As another example, a number of agents have been shown to have some effectiveness in treating behavioral or psychiatric symptoms of Alzheimer's disease, such as citalopram (Celexa), fluoxetine (Prozac), paroxeine (Paxil), sertraline (Zoloft) ), trazodone (Desirel), lorazepam (Ativan), oxazepam (Serax), aripiprazole (Abilify), clozapine (Clozaril), haloperidol (Haldol), olanzapine (Zyprexa), quetiapine (Seroquel), risperidone (Risperdal) and ziprasidone (Geodon ).

В некоторых аспектах данных способов способ дополнительно предусматривает стадию измерения когнитивной способности и/или синаптической пластичности после лечения, например, с применением способов, описанных в данном документе или известных в уровне техники, и определения того, что скорость снижения когнитивных способностей или потеря синаптической пластичности снизилась, и/или что когнитивная способность или синаптическая пластичность улучшилась у индивида. В некоторых таких случаях определение выполняют посредством сравнения результатов теста когнитивной способности или синаптической пластичности с результатами теста, осуществляемого с тем же индивидом в более ранний момент времени, например, 2 неделями ранее, 1 месяцем ранее, 2 месяцами ранее, 3 месяцами ранее, 6 месяцами ранее, 1 годом ранее, 2 годами ранее, 5 годами ранее или 10 годами ранее или более.In some aspects of these methods, the method further comprises the step of measuring cognitive ability and/or synaptic plasticity after treatment, for example, using methods described herein or known in the art, and determining that the rate of cognitive decline or loss of synaptic plasticity has decreased. , and/or that cognitive ability or synaptic plasticity has improved in the individual. In some such cases, the determination is made by comparing the results of a test of cognitive ability or synaptic plasticity with the results of a test performed on the same individual at an earlier point in time, for example, 2 weeks earlier, 1 month earlier, 2 months earlier, 3 months earlier, 6 months earlier. earlier, 1 year earlier, 2 years earlier, 5 years earlier, or 10 years earlier or more.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления данные способы дополнительно включают в себя диагностику у индивида когнитивного нарушения, например, с применением способов, описанных в данном документе или известных в уровне техники для измерения когнитивной способности и синаптической пластичности, перед введением субъекту содержащего плазму препарата крови. В некоторых случаях диагностика будет предусматривать измерение когнитивной способности и/или синаптической пластичности и сравнение результатов теста когнитивной способности или синаптической пластичности с одним или несколькими эталонными значениями, например, положительным контролем и/или отрицательным контролем. Например, эталонные значения могут представлять собой результаты теста, выполняемого одним или несколькими индивидами в соответствующей возрастной группе, которые страдают от когнитивных нарушений, ассоциированных со старением (т.е. положительные контроли), или которые не страдают от когнитивных нарушений, ассоциированных со старением (т.е. отрицательные контроли). В качестве еще одного примера, эталонные значения могут представлять собой результаты теста, выполненного тем же индивидом в более ранний момент времени, например, 2 неделямиIn some embodiments, the methods further comprise diagnosing a subject with a cognitive impairment, for example, using methods described herein or known in the art for measuring cognitive ability and synaptic plasticity, before administering a plasma-containing blood product to the subject. In some cases, the diagnosis will involve measuring cognitive ability and/or synaptic plasticity and comparing the results of the cognitive ability or synaptic plasticity test to one or more reference values, such as a positive control and/or a negative control. For example, the reference values may be the results of a test performed by one or more individuals in a relevant age group who suffer from cognitive impairment associated with aging (i.e., positive controls) or who do not suffer from cognitive impairment associated with aging ( i.e. negative controls). As another example, the reference values may be the results of a test performed by the same individual at an earlier point in time, for example, 2 weeks

- 18 045040 ранее, 1 месяцем ранее, 2 месяцами ранее, 3 месяцами ранее, 6 месяцами ранее, 1 годом ранее, 2 годами ранее, 5 годами ранее или 10 годами ранее или более.- 18 045040 earlier, 1 month earlier, 2 months earlier, 3 months earlier, 6 months earlier, 1 year earlier, 2 years earlier, 5 years earlier or 10 years earlier or more.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления данные способы дополнительно предусматривают диагностику у индивида нарушения, ассоциированного со старением, например, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, лобно-височной деменции, прогрессирующего надъядерного паралича, болезни Хантингтона, бокового амиотрофического склероза, спинальной мышечной атрофии, рассеянного склероза, мультисистемной атрофии, глаукомы, атаксии, миотонической дистрофии, деменции и т.п. Способы диагностики таких нарушений, ассоциированных со старением, являются хорошо известными в уровне техники, причем любой из них может применяться квалифицированным специалистом в данной области техники при диагностике у индивида. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления данные способы дополнительно предусматривают как диагностику у индивида нарушения, ассоциированного со старением, так и наличия когнитивного нарушения.In some embodiments, the methods further comprise diagnosing the individual with a disorder associated with aging, such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, frontotemporal dementia, progressive supranuclear palsy, Huntington's disease, amyotrophic lateral sclerosis, spinal muscular atrophy, multiple sclerosis, multisystem atrophy, glaucoma, ataxia, myotonic dystrophy, dementia, etc. Methods for diagnosing such disorders associated with aging are well known in the art, any of which can be used by one skilled in the art when diagnosing an individual. In accordance with some embodiments, the methods further comprise both diagnosing the individual with a disorder associated with aging and the presence of a cognitive impairment.

Применение.Application.

Данные способы находят применение в лечении, в том числе в предупреждении нарушений, ассоциированных со старением, и состояний, ассоциированных с ними, таких как нарушения когнитивной способности у индивидов. Индивиды, страдающие от когнитивных нарушений, ассоциированных со старением, или имеющие риск их развития, включают в себя индивидов возрастом приблизительно 50 лет или старше, например, 60 лет или старше, 70 лет или старше, 80 лет или старше, 90 лет или старше и обычно не старше 100 лет, т.е. возрастом приблизительно от 50 до 100, например, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или приблизительно 100 лет, и страдающих от когнитивного нарушения, ассоциированного с естественным процессом старения, например, умеренного когнитивного нарушения (M.C.I.); и индивидов возрастом приблизительно 50 лет или старше, например, 60 лет или старше, 70 лет или старше, 80 лет или старше, 90 лет или старше и обычно не старше 100 лет, т.е. возрастом приблизительно от 50 до 90, например, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или приблизительно 100 лет, у которых еще не начали проявляться симптомы когнитивного нарушения. Примеры когнитивных нарушений, которые обусловлены естественных старением, включают в себя следующие.These methods find use in the treatment, including the prevention of disorders associated with aging and conditions associated with them, such as cognitive impairment in individuals. Individuals suffering from, or at risk of developing, cognitive impairment associated with aging include individuals approximately 50 years of age or older, for example, 60 years or older, 70 years or older, 80 years or older, 90 years or older, and usually no older than 100 years, i.e. between approximately 50 and 100 years of age, such as 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, or approximately 100 years, and suffering from cognitive impairment associated with the natural aging process, such as mild cognitive impairment (M.C.I.); and individuals aged approximately 50 years or older, for example, 60 years or older, 70 years or older, 80 years or older, 90 years or older, and generally not older than 100 years, i.e. between approximately 50 and 90 years of age, such as 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, or approximately 100 years of age, who have not yet begun to exhibit symptoms of cognitive impairment. Examples of cognitive decline that are caused by natural aging include the following.

Умеренное когнитивное нарушение (M.C.I.) представляет собой умеренное нарушение когнитивных способностей, которое проявляется в виде проблем с памятью или другими психическими функциями, такими как планирование, следование инструкциям или принятие решений, которые ухудшаются со временем, в то время как общая психическая функция и повседневная деятельность не ухудшаются. Таким образом, несмотря на то что значительная гибель нейронов, как правило, не происходит, нейроны в стареющем головном мозге уязвимы к сублетальным возрастным изменениям в структуре, целостности синапсов и процессинге молекул на синапсе, все из которых ухудшают когнитивные функции.Mild cognitive impairment (M.C.I.) is a mild impairment of cognitive abilities that manifests itself as problems with memory or other mental functions such as planning, following instructions, or making decisions that worsen over time, while overall mental function and daily functioning are not getting worse. Thus, although significant neuronal death typically does not occur, neurons in the aging brain are vulnerable to sublethal age-related changes in the structure, integrity of synapses, and processing of molecules at the synapse, all of which impair cognitive function.

Индивиды, страдающие от когнитивного нарушения, ассоциированного со старением, или имеющие риск его развития, на которых будет оказывать благоприятное воздействие лечение данным содержащим плазму препаратом крови, например, с помощью способов, раскрытых в данном документе, также включают в себя индивидов любого возраста, которые страдают от когнитивного нарушения, обусловленного нарушением, ассоциированным со старением; и индивидов любого возраста, у которых было диагностировано нарушение, ассоциированное со старением, которое, как правило, сопровождается когнитивным нарушением, причем у индивида еще не начали присутствовать симптомы когнитивного нарушения. Примеры таких нарушений, ассоциированных со старением, включают в себя следующие.Individuals suffering from, or at risk of developing, cognitive impairment associated with aging who would benefit from treatment with a given plasma-containing blood product, for example, using the methods disclosed herein, also include individuals of any age who suffer from cognitive impairment due to a disorder associated with aging; and individuals of any age who have been diagnosed with a disorder associated with aging, which is typically accompanied by cognitive impairment, and the individual has not yet begun to exhibit symptoms of cognitive impairment. Examples of such disorders associated with aging include the following.

Болезнь Альцгеймера (AD). Болезнь Альцгеймера представляет собой прогрессирующую неуклонную потерю когнитивной функции, ассоциированную с избыточным количеством сенильных бляшек в коре больших полушарий головного мозга и подкорковом сером веществе, которое также содержит бетаамилоид и нейрофибриллярные клубки, состоящие из тау-белка. Обычная форма поражает индивидов возрастом >60 лет, и частота ее возникновения возрастает с увеличением возраста. Она составляет более 65% деменций у людей пожилого возраста.Alzheimer's disease (AD). Alzheimer's disease is a progressive, steady loss of cognitive function associated with excess senile plaques in the cerebral cortex and subcortical gray matter, which also contains beta-amyloid and neurofibrillary tangles composed of tau protein. The common form affects individuals >60 years of age and its incidence increases with increasing age. It accounts for more than 65% of dementia in older people.

Причина болезни Альцгеймера неизвестна. Заболевание встречается в семьях приблизительно в 1520% случаев. Остальные так называемые спорадические случаи имеют некоторые генетические детерминанты. Заболевание характеризуется аутосомно-доминантным характером наследования в большинстве случаев с ранним началом и в некоторых случаях с поздним началом, но варьирующей пенетрантностью в пожилом возрасте. Факторы окружения являются предметом активного изучения.The cause of Alzheimer's disease is unknown. The disease occurs in families in approximately 15-20% of cases. The remaining so-called sporadic cases have some genetic determinants. The disease is characterized by an autosomal dominant pattern of inheritance in most cases with early onset and in some cases with late onset, but variable penetrance in old age. Environmental factors are the subject of active study.

В ходе развития заболевания происходит потеря синапсов и, в конечном счете, нейронов в коре больших полушарий головного мозга, гиппокампе и подкорковых структурах (в том числе избирательная потеря клеток в базальном ядре Мейнерта), голубом пятне и дорсальном ядре шва. Потребление глюкозы головным мозгом и перфузия снижаются в некоторых областях головного мозга (в коре теменной доли и височной доли на ранних стадиях заболевания, в префронтальной коре на поздних стадиях заболевания). Нейритические или сенильные бляшки (состоящие из нейритов, астроцитов и глиальных клеток вокруг амилоидного ядра) и нейрофибриллярные клубки (состоящие из спаренных спиральных нитей) играют роль в патогенезе болезни Альцгеймера. Сенильные бляшки и нейрофибриллярные клубки возникают при нормальном старении, но они являются гораздо более распространенными у индивидов с болезнью Альцгеймера.As the disease progresses, there is loss of synapses and ultimately neurons in the cerebral cortex, hippocampus and subcortical structures (including selective cell loss in the nucleus basalis of Meynert), locus coeruleus and dorsal raphe nucleus. Brain glucose uptake and perfusion are reduced in some areas of the brain (parietal and temporal lobe cortex in early stages of the disease, prefrontal cortex in late stages of the disease). Neuritic or senile plaques (composed of neurites, astrocytes and glial cells around the amyloid core) and neurofibrillary tangles (composed of paired helical filaments) play a role in the pathogenesis of Alzheimer's disease. Senile plaques and neurofibrillary tangles occur during normal aging, but they are much more common in individuals with Alzheimer's disease.

- 19 045040- 19 045040

Болезнь Паркинсона. Болезнь Паркинсона (PD) представляет собой идиопатическое, медленно прогрессирующее дегенеративное нарушение ЦНС, характеризующееся медленной и ослабленной моторикой, ригидностью мышц, тремором в состоянии покоя и постуральной неустойчивостью. Первоначально считавшийся преимущественно двигательным нарушением, PD в настоящее время считается также поражающей когнитивные функции, поведенческие функции, сон, функцию автономной нервной системы и сенсорную функцию. Наиболее распространенные когнитивные нарушения включают в себя нарушение внимания и концентрации, кратковременной памяти, управляющей функции, воспроизведения речи и функции пространственного зрения.Parkinson's disease. Parkinson's disease (PD) is an idiopathic, slowly progressive degenerative disorder of the central nervous system characterized by slow and impaired motor skills, muscle rigidity, resting tremor, and postural instability. Originally considered primarily a movement disorder, PD is now considered to also affect cognitive function, behavioral function, sleep, autonomic nervous system function, and sensory function. The most common cognitive impairments include problems with attention and concentration, short-term memory, executive function, language production, and spatial vision.

При первичной болезни Паркинсона теряются пигментированные нейроны черного вещества, голубого пятна и другие группы дофаминергических клеток ствола головного мозга. Причина является неизвестной. Потеря нейронов черного вещества, которая переносится на хвостатое ядро и скорлупу, приводит в результате к уменьшению нейромедиатора-дофамина в этих областях. Начало заболевания обычно наступает после 40 лет с повышением частоты возникновения в более старших возрастных группах.In primary Parkinson's disease, pigmented neurons of the substantia nigra, locus coeruleus, and other groups of dopaminergic cells in the brain stem are lost. The cause is unknown. The loss of substantia nigra neurons, which carries over to the caudate nucleus and putamen, results in a decrease in the neurotransmitter dopamine in these areas. The onset of the disease usually occurs after 40 years of age, with an increase in incidence in older age groups.

Вторичный паркинсонизм является результатом потери дофамина или препятствования действию дофамина в базальных ганглиях вследствие других идиопатических дегенеративных заболеваний, действия лекарственных средств или экзогенных токсинов. Наиболее распространенной причиной вторичного паркинсонизма является прием антипсихотических лекарственных средств или резерпина, которые приводят к паркинсонизму вследствие блокирования дофаминовых рецепторов. Менее распространенные причины включают в себя отравление монооксидом углерода или марганцем, гидроцефалию, структурные повреждения (опухоли, инфаркты, повреждающие средний мозг или базальные ганглии), субдуральную гематому и дегенеративные нарушения, в том числе стриатонигральную дегенерацию.Secondary parkinsonism results from loss of dopamine or interference with dopamine action in the basal ganglia due to other idiopathic degenerative diseases, drugs, or exogenous toxins. The most common cause of secondary parkinsonism is the use of antipsychotic drugs or reserpine, which lead to parkinsonism due to blocking dopamine receptors. Less common causes include carbon monoxide or manganese poisoning, hydrocephalus, structural lesions (tumors, infarcts affecting the midbrain or basal ganglia), subdural hematoma, and degenerative disorders including striatonigral degeneration.

Лобно-височная деменция. Лобно-височная деменция (FTD) представляет собой состояние, являющееся результатом прогрессирующего повреждения лобной доли головного мозга. Со временем дегенерация может распространяться на височную долю. Уступая по распространенности только болезни Альцгеймера (AD), на долю FTD приходится 20% случаев пресенильной деменции. Симптомы классифицируют на три группы, исходя из функций пораженных лобной и височной долей: поведенческий вариант FTD (bvFTD) с симптомами включающими в себя летаргию и аспонтанность с одной стороны и расторможенность - с другой; прогрессирующую небыструю афазию (PNFA), при которой нарушение плавности речи обусловлено сложностью артикуляции, наблюдаются фонологические и/или синтаксические ошибки, но понимание слов сохраняется; и семантическую деменцию (SD), при которой пациенты сохраняют плавность речи с нормальной фонологией и синтаксисом, но испытывают возрастающие трудности с присвоением названий и пониманием слов. Другие когнитивные симптомы, общие для всех пациентов с FTD, включают в себя нарушение управляющей функции и способности к сосредоточению. Другие когнитивные способности, в том числе восприятие, навыки ориентирования в пространстве, память и праксис, как правило, остаются интактными. FTD может быть диагностирована при наблюдении проявлений атрофии лобной доли и/или передней височной доли на структурных сканограммах, полученных с помощью МРТ.Frontotemporal dementia. Frontotemporal dementia (FTD) is a condition that results from progressive damage to the frontal lobe of the brain. Over time, degeneration may spread to the temporal lobe. Second only to Alzheimer's disease (AD) in prevalence, FTD accounts for 20% of cases of presenile dementia. Symptoms are classified into three groups based on the functions of the frontal and temporal lobes affected: behavioral variant FTD (bvFTD) with symptoms including lethargy and arousal on the one hand and disinhibition on the other; progressive non-rapid aphasia (PNFA), in which speech fluency is impaired due to difficulty in articulation, phonological and/or syntactic errors are observed, but word comprehension is preserved; and semantic dementia (SD), in which patients maintain fluent speech with normal phonology and syntax but experience increasing difficulty naming and understanding words. Other cognitive symptoms common to all patients with FTD include impaired executive function and the ability to concentrate. Other cognitive abilities, including perception, spatial orientation, memory and praxis, usually remain intact. FTD can be diagnosed by observing evidence of frontal lobe and/or anterior temporal lobe atrophy on structural MRI scans.

Существует ряд форм FTD, лечение или предупреждение любой из которых можно осуществлять с применением данных способов и композиций. Например, одной формой лобно-височной деменции является семантическая деменция (SD). SD характеризуется потерей семантической памяти как в вербальной, так и в невербальной сферах. Пациенты с SD часто имеют жалобы, касающиеся затруднений с подбором слов. Клинические признаки включают в себя небыструю афазию, аномию, нарушенное понимание значения слов и ассоциативную зрительную агнозию (неспособность к подбору семантически связанных картинок или объектов). По мере прогрессирования заболевания часто наблюдаются изменения в поведении и личности, подобные наблюдаемым при лобно-височной деменции, хотя были описаны случаи чистой семантической деменции с незначительными поздними поведенческими симптомами. Визуализация структуры с помощью МРТ показывает характерные признаки атрофии в височных долях (преимущественно слева) с большим вовлечением в атрофию нижней части височной доли, нежели верхней, и передней части височной доли, нежели в задней.There are a number of forms of FTD, any of which can be treated or prevented using these methods and compositions. For example, one form of frontotemporal dementia is semantic dementia (SD). SD is characterized by loss of semantic memory in both verbal and nonverbal domains. Patients with SD often present with complaints related to difficulty finding words. Clinical features include non-rapid aphasia, anomia, impaired understanding of word meaning, and associative visual agnosia (the inability to match semantically related pictures or objects). As the disease progresses, behavioral and personality changes similar to those seen in frontotemporal dementia are often observed, although cases of pure semantic dementia with few late behavioral symptoms have been described. Imaging of the structure using MRI shows characteristic signs of atrophy in the temporal lobes (predominantly on the left) with greater atrophy involvement of the lower part of the temporal lobe than the upper part, and the anterior part of the temporal lobe than the posterior part.

В качестве еще одного примера, другая форма лобно-височной деменции представляет собой болезнь Пика (PiD, также PcD). Определяющей характеристикой заболевания является отложение таубелков в нейронах, накопление в виде окрашиваемых серебром сферических агрегатов, известных как тельца Пика. Симптомы включают в себя потерю речи (афазию) и деменцию. Пациенты с орбитофронтальной дисфункцией могут становиться агрессивными и социально неадекватными. Они могут красть или демонстрировать обсессивное или повторяющееся стереотипное поведение. Пациенты с дорсомедиальной или дорсолатеральной фронтальной дисфункцией могут демонстрировать отсутствие заинтересованности, апатию или уменьшенную непосредственность. Пациенты могут демонстрировать отсутствие самоконтроля, ненормальную поглощенность собой и неспособность к оценке значения. Пациенты с потерей серого вещества в билатеральной постеро-латеральной орбито-фронтальной коре больших полушарий и правой передней островковой доле больших полушарий головного мозга могут демонстрировать изменения в пищевом поведении, такие как патологическое пристрастие к сладкому. У пациентов с более фокальной потерей серого вещества в антеро-латеральной орбито-фронтальной кореAs another example, another form of frontotemporal dementia is Pick's disease (PiD, also PcD). The defining characteristic of the disease is the deposition of tau proteins in neurons, accumulating in silver-stained spherical aggregates known as Pick bodies. Symptoms include loss of speech (aphasia) and dementia. Patients with orbitofrontal dysfunction may become aggressive and socially inappropriate. They may steal or exhibit obsessive or repetitive behavior. Patients with dorsomedial or dorsolateral frontal dysfunction may demonstrate lack of interest, apathy, or decreased spontaneity. Patients may demonstrate a lack of self-control, abnormal self-absorption, and an inability to appreciate meaning. Patients with gray matter loss in the bilateral posterolateral orbitofrontal cortex and right anterior insula may demonstrate changes in eating behavior, such as pathological cravings for sweets. In patients with more focal gray matter loss in the anterolateral orbitofrontal cortex

- 20 045040 больших полушарий может развиваться гиперфагия. Несмотря на то что некоторые из симптомов могут быть первоначально облегчены, заболевание прогрессирует, и пациенты часто умирают в течение двухдесяти лет.- 20 045040 cerebral hemispheres may develop hyperphagia. Although some of the symptoms may be initially relieved, the disease progresses and patients often die within two decades.

Болезнь Хантингтона. Болезнь Хантингтона (HD) представляет собой наследственное прогрессирующее нейродегенеративное нарушение, характеризующееся развитием эмоциональных, поведенческих и психиатрических аномалий; потерей интеллектуальных или когнитивных функций и двигательными аномалиями (двигательными расстройствами). Классические признаки HD включают в себя развитие хореи - непроизвольных, быстрых, неупорядоченных, порывистых движений, которые могут затрагивать лицо, руки, ноги или туловище, а также снижение когнитивных способностей, в том числе постепенную потерю мыслительной деятельности и приобретенных интеллектуальных способностей. Может присутствовать нарушение памяти, абстрактного мышления и способности к оценке ситуации; неправильное восприятие времени, пространства или самосознания индивида (дезориентация); повышенное возбуждение и изменения в личности (распад личности). Несмотря на то что симптомы, как правило, становятся выраженными на четвертом или пятом десятке лет жизни, возраст начала заболевания изменяется и варьирует от раннего детского возраста до поздней зрелости (например, 70 или 80 лет).Huntington's disease. Huntington's disease (HD) is an inherited progressive neurodegenerative disorder characterized by the development of emotional, behavioral and psychiatric abnormalities; loss of intellectual or cognitive functions and movement abnormalities (movement disorders). Classic signs of HD include the development of chorea—involuntary, rapid, erratic, jerky movements that may affect the face, arms, legs, or trunk—and cognitive decline, including the gradual loss of mental functioning and acquired intellectual abilities. Impaired memory, abstract thinking, and judgment may be present; incorrect perception of time, space or the individual's self-awareness (disorientation); increased arousal and changes in personality (personality disintegration). Although symptoms typically become severe in the fourth or fifth decade of life, the age of onset varies and ranges from early childhood to late adulthood (eg, 70 or 80 years).

HD передается в семьях как аутосомно-доминантный признак. Нарушение возникает в результате аномально длинных последовательностей или повторов кодируемой информации в пределах гена на хромосоме 4 (4р16.3). Прогрессирующая потеря функции нервной системы, ассоциированная с HD, является результатом потери нейронов в определенных областях головного мозга, в том числе в базальных ганглиях и коре больших полушарий головного мозга.HD runs in families as an autosomal dominant trait. The disorder results from abnormally long sequences or repeats of encoded information within a gene on chromosome 4 (4p16.3). The progressive loss of nervous system function associated with HD results from the loss of neurons in specific areas of the brain, including the basal ganglia and cerebral cortex.

Боковой амиотрофический склероз. Боковой амиотрофический склероз (ALS) представляет собой быстро прогрессирующее, неизменно смертельное неврологическое заболевание, которое поражает двигательные нейроны. Мышечная слабость и атрофия, а также признаки дисфункции клеток передних рогов спинного мозга первоначально наиболее часто заметны в кистях рук и менее часто - в ногах. Место возникновения является случайным, и прогрессирование является асимметричным. Судороги являются обычными и могут предшествовать слабости. Редко пациент проживает 30 лет; 50% умирают в течение 3 лет от начала заболевания, 20% живут 5 лет, и 10% живут 10 лет. Диагностические признаки включают в себя возникновение заболевания в течение среднего или старшего взрослого возраста и прогрессирующее генерализованное поражение заболеванием двигательных функций без сенсорных аномалий. Скорости проведения нервного импульса являются нормальными до конца развития заболевания. Недавние исследования документально подтвердили присутствие и когнитивных нарушений, в особенности, снижение непосредственной вербальной памяти, зрительной памяти, речевой и управляющей функции.Amyotrophic lateral sclerosis. Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a rapidly progressive, invariably fatal neurological disease that affects motor neurons. Muscle weakness and atrophy, as well as signs of dysfunction of the anterior horn cells of the spinal cord, are initially most often noticeable in the hands and less often in the legs. The site of onset is random and progression is asymmetrical. Cramps are common and may precede weakness. Rarely does a patient live beyond 30 years; 50% die within 3 years of disease onset, 20% live 5 years, and 10% live 10 years. Diagnostic features include onset of the disease during middle or older adulthood and progressive generalized involvement of the disease in motor functions without sensory abnormalities. Nerve impulse conduction velocities are normal until the end of the disease. Recent studies have documented the presence of cognitive impairment, particularly declines in immediate verbal memory, visual memory, language, and executive function.

Снижение площади поверхности тела клетки, количества синапсов и общей длины синапсов наблюдалось даже в нормально выглядящих нейронах у пациентов с ALS. Предполагали, что в случае, когда пластичность активной зоны достигает своего предела, продолжающаяся потеря синапсов может приводить к функциональному нарушению. Стимулирование образования новых синапсов или предупреждение потери синапсов может поддерживать функционирование нейронов у этих пациентов.Reductions in cell body surface area, number of synapses, and total synapse length were observed even in normal-appearing neurons in ALS patients. It has been suggested that when active zone plasticity reaches its limit, continued loss of synapses may lead to functional impairment. Stimulating the formation of new synapses or preventing synapse loss may maintain neuronal function in these patients.

Рассеянный склероз. Рассеянный склероз (MS) характеризуется различными симптомами и признаками дисфункции ЦНС с периодами ремиссии и рецидивирующими обострениями. Наиболее часто присутствующими симптомами является парестезия в одной или нескольких конечностях, в туловище или на одной стороне лица; слабость или неловкость ноги или руки; или зрительные расстройства, например, частичная слепота и боль в одном глазу (ретробульбарный неврит зрительного нерва), слабость зрения или скотомы. Обычные когнитивные нарушения включают в себя нарушения памяти (усвоение, сохранение и воспроизведение новой информации), внимания и концентрации (в особенности, разделенного внимания), обработки информации, управляющих функций, функций пространственного зрения и плавности речи. Обычными ранними симптомами являются паралич глазодвигательного нерва, результатом которого является двойное зрение (диплопия), временная слабость одной или нескольких конечностей, легкая ригидность или необычная утомляемость конечности, незначительные нарушения походки, затруднение с контролем мочевого пузыря, головокружение и легкие эмоциональные расстройства; все они указывают на рассеянное поражение заболеванием ЦНС и часто возникают за месяцы или годы до того, как заболевание будет распознано. Избыточное тепло может подчеркивать симптомы и признаки.Multiple sclerosis. Multiple sclerosis (MS) is characterized by various symptoms and signs of central nervous system dysfunction with periods of remission and recurrent exacerbations. The most commonly present symptoms are paresthesia in one or more limbs, trunk, or one side of the face; weakness or clumsiness in a leg or arm; or visual disturbances, such as partial blindness and pain in one eye (retrobulbar optic neuritis), low vision, or scotomas. Common cognitive impairments include problems with memory (learning, storing, and recalling new information), attention and concentration (especially divided attention), information processing, executive functions, spatial vision, and fluency. Common early symptoms are oculomotor nerve palsy resulting in double vision (diplopia), temporary weakness of one or more limbs, mild stiffness or unusual fatigue in a limb, minor gait disturbances, difficulty controlling the bladder, dizziness, and mild emotional disturbances; all indicate diffuse central nervous system disease and often occur months or years before the disease is recognized. Excessive heat can accentuate symptoms and signs.

Течение является очень изменчивым, непредсказуемым и, у большинства пациентов, ремиттирующим. Вначале эпизоды могут разделять месяцы или годы ремиссии, особенно, когда заболевание начинается с ретробульбарного неврита зрительного нерва. Тем не менее, некоторые пациенты имеют частые приступы и быстро становятся нетрудоспособными; для небольшого количества течение заболевания может быть стремительно прогрессирующим.The course is very variable, unpredictable and, in most patients, remitting. Initially, episodes may be separated by months or years of remission, especially when the disease begins with retrobulbar optic neuritis. However, some patients have frequent attacks and quickly become disabled; For a small number, the course of the disease can be rapidly progressive.

Глаукома. Глаукома является распространенным нейродегенеративным заболеванием, которое поражает ганглионарные клетки сетчатки (RGC). Доказательства подтверждают существование компартментализированных программ дегенерации в синапсах и дендритах, в том числе в RGC. Недавние данные также указывают на корреляцию между когнитивным нарушением у взрослых людей пожилого возраста и глаукомой (Yochim BP, et al., Prevalence of cognitive impairment, depression, and anxiety symptoms among older adults with glaucoma. J Glaucoma. 2012; 21(4):250-254).Glaucoma. Glaucoma is a common neurodegenerative disease that affects retinal ganglion cells (RGCs). Evidence supports the existence of compartmentalized degeneration programs at synapses and dendrites, including RGCs. Recent evidence also suggests a correlation between cognitive impairment in older adults and glaucoma (Yochim BP, et al., Prevalence of cognitive impairment, depression, and anxiety symptoms among older adults with glaucoma. J Glaucoma. 2012; 21(4): 250-254).

- 21 045040- 21 045040

Миотоническая дистрофия. Миотоническая дистрофия (DM) представляет собой аутосомнодоминантное мультисистемное нарушение, характеризующееся дистрофической мышечной слабостью и миотонией. Молекулярный дефект представляет собой распространенный трехнуклеотидный повтор (CTG) в 3-нетранслируемом участке гена миотонин-протеинкиназы на хромосоме 19q. Симптомы могут возникать в любом возрасте, и диапазон тяжести клинических проявлений является широким. Миотония является выраженной в мышцах кистей рук, и птоз является обычным даже в легких случаях. В тяжелых случаях возникает выраженная слабость периферических мышц, часто с катарактой, преждевременным облысением, удлиненным лицом, сердечными аритмиями, атрофией семенников и эндокринными аномалиями (например, сахарным диабетом). Задержка умственного развития является обычной при тяжелых врожденных формах, в то время как связанное со старением снижение когнитивных функций, связанных с лобными и височными областями, в особенности, речевой и управляющей функций, наблюдается при более легких формах нарушения у взрослых. Индивиды с тяжелым поражением умирают в первые несколько лет после достижения 50 летнего возраста.Myotonic dystrophy. Myotonic dystrophy (DM) is an autosomal dominant multisystem disorder characterized by dystrophic muscle weakness and myotonia. The molecular defect is a common three-nucleotide repeat (CTG) in the 3-untranslated region of the myotonin protein kinase gene on chromosome 19q. Symptoms can occur at any age, and the range of severity of clinical manifestations is wide. Myotonia is prominent in the muscles of the hands, and ptosis is common even in mild cases. In severe cases, severe peripheral muscle weakness occurs, often with cataracts, premature balding, long facial features, cardiac arrhythmias, testicular atrophy, and endocrine abnormalities (eg, diabetes mellitus). Mental retardation is common in severe congenital forms, while aging-related decline in cognitive functions associated with the frontal and temporal regions, particularly language and executive function, is observed in milder forms of the disorder in adults. Severely affected individuals die within the first few years of reaching 50 years of age.

Деменция. Деменцией описывается класс нарушений, имеющих симптомы, поражающие мыслительные и социальные способности достаточно тяжело, чтобы препятствовать ежедневной деятельности. Другие примеры деменции, помимо деменции, которая наблюдаются на поздних стадиях нарушений, ассоциированных со старением, которые обсуждались выше, включают в себя сосудистую деменцию и деменцию с тельцами Леви, описанные ниже.Dementia. Dementia describes a class of disorders with symptoms that affect thinking and social abilities severely enough to interfere with daily activities. Other examples of dementia, in addition to dementia that occurs in the later stages of the disorders associated with aging discussed above, include vascular dementia and dementia with Lewy bodies, described below.

При сосудистой деменции или мультиинфарктной деменции когнитивное нарушение вызывается проблемами в снабжении головного мозга кровью, как правило, вследствие серии малых инсультов или иногда одного большого инсульта, которому предшествуют или за которым следуют другие меньшие инсульты. Повреждения сосудов могут быть результатом диффузного заболевания сосудов головного мозга, как например, заболевания малых сосудов, или очаговых поражений, или их обоих из них. У пациентов, страдающих от сосудистой деменции, присутствует когнитивное нарушение, острое или подострое, после острого цереброваскулярного нарушения, после которого наблюдается прогрессирующее снижение когнитивных способностей.In vascular dementia or multi-infarct dementia, cognitive impairment is caused by problems in the brain's blood supply, usually due to a series of small strokes or sometimes a single large stroke preceded or followed by other smaller strokes. Vascular lesions may result from diffuse cerebrovascular disease, such as small vessel disease, or focal lesions, or both. Patients suffering from vascular dementia present with cognitive impairment, either acute or subacute, following an acute cerebrovascular event, followed by a progressive decline in cognitive abilities.

Когнитивные нарушения являются подобными наблюдаемым при болезни Альцгеймера, включая нарушения речи, памяти, обработки сложных зрительных образов или управляющей функции, хотя соответствующие изменения в головном мозге обусловлены не патологией AD, а хронически уменьшенным кровотоком в головном мозге, в конечном счете приводящим в результате к деменции. Визуализацию нервной ткани с помощью однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (SPECT) и позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) можно применять для подтверждения диагноза мультиинфарктная деменция в сочетании с оценками, включающими оценку психического состояния.Cognitive impairments are similar to those seen in Alzheimer's disease, including impairments in language, memory, complex visual processing, or executive function, although the corresponding brain changes are not due to AD pathology but to chronically reduced blood flow to the brain, ultimately resulting in dementia . Imaging of neural tissue with single photon emission computed tomography (SPECT) and positron emission tomography (PET) can be used to confirm the diagnosis of multi-infarct dementia in conjunction with evaluations that include mental status.

Деменция с тельцами Леви (DLB, также известная под рядом других названий, в том числе деменция телец Леви, болезнь диффузных телец Леви, кортикальная болезнь с тельцами Леви и сенильная деменция типа Леви) представляет собой тип деменции, характеризующийся с анатомической точки зрения наличием телец Леви (сгустков белков альфа-синуклеина и убиквитина) в нейронах, выявляемых при посмертном гистологическом анализе головного мозга. Главным признаком является снижение когнитивных способностей, в особенности, выполнения управляющих функций.Dementia with Lewy bodies (DLB, also known by a number of other names, including Lewy body dementia, diffuse Lewy body disease, cortical Lewy body disease, and senile dementia of the Lewy body type) is a type of dementia characterized anatomically by the presence of Lewy bodies (clumps of alpha-synuclein and ubiquitin proteins) in neurons identified during post-mortem histological analysis of the brain. The main symptom is a decrease in cognitive abilities, especially executive functions.

Концентрация внимания и кратковременная память будут возрастать и падать. Стойкие или повторно возникающие зрительные галлюцинации с яркими и подробными картинами часто являются ранним диагностическим симптомом. DLB на ее ранних стадиях часто путают с болезнью Альцгеймера и/или сосудистой деменцией, хотя, если болезнь Альцгеймера обычно начинается достаточно постепенно, то DLB часто имеет быстрое или острое начало. Симптомы DLB также включают в себя двигательные симптомы, подобные симптомам при болезни Паркинсона. DLB отличается от деменции, которая иногда возникает при болезни Паркинсона, временными рамками, в пределах которых возникают симптомы деменции по сравнению симптомами болезни Паркинсона. Диагноз болезнь Паркинсона с деменцией (PDD) будет поставлен в том случае, когда деменция начинается более чем через год после начала болезни Паркинсона. DLB диагностируется в случае, когда когнитивные симптомы начинаются одновременно с симптомами болезни Паркинсона или в пределах г после их появления.Concentration and short-term memory will wax and wane. Persistent or recurrent visual hallucinations with vivid and detailed images are often an early diagnostic symptom. DLB in its early stages is often confused with Alzheimer's disease and/or vascular dementia, although while Alzheimer's disease usually has a fairly gradual onset, DLB often has a rapid or acute onset. Symptoms of DLB also include motor symptoms similar to those in Parkinson's disease. DLB differs from dementia, which sometimes occurs in Parkinson's disease, in the time frame within which symptoms of dementia occur compared to those of Parkinson's disease. A diagnosis of Parkinson's disease with dementia (PDD) will be made when dementia begins more than a year after the onset of Parkinson's disease. DLB is diagnosed when cognitive symptoms begin at the same time as Parkinson's disease symptoms or within a year of their onset.

Прогрессирующий надъядерный паралич. Прогрессирующий надъядерный паралич (PSP) представляет собой нарушение головного мозга, которое вызывает серьезные и прогрессирующие проблемы с контролем при ходьбе и поддержании равновесия, вместе с проблемами со сложными движениями глаз и мышлением. Одним из классических признаков заболевания является неспособность ориентировать глаза должным образом, которая возникает вследствие поражений в области головного мозга, которая координирует движения глаз. Некоторые индивиды описывают этот эффект как затуманивание. У пораженных индивидов часто проявляются изменения настроения и поведения, в том числе депрессия и апатия, а также прогрессирующая умеренная деменция. Развернутое название нарушения указывает на то, что заболевание начинается медленно, продолжает ухудшаться (прогрессирующий) и вызывает слабость (паралич) вследствие повреждения определенных частей головного мозга выше структур размером с горошину, называемых ядрами, которые контролируют движения глаз (надъядерный). PSP был впервые описан как отдельное нарушение в 1964 году, когда трое ученых опубликовали статью, в которой определи- 22 045040 ли отличия данного состояния от болезни Паркинсона. Его иногда также называют синдромом СтилаРичардсона-Олыпевского, что отражает объединенные фамилии ученых, которые определили данное нарушение. Несмотря на то что состояние больного при PSP постепенно ухудшается, ни один больной не умер от PSP самого по себе.Progressive supranuclear palsy. Progressive supranuclear palsy (PSP) is a brain disorder that causes severe and progressive problems with control of walking and balance, along with problems with complex eye movements and thinking. One of the classic signs of the disease is an inability to orient the eyes properly, which occurs due to lesions in the area of the brain that coordinates eye movements. Some individuals describe this effect as fogging. Affected individuals often exhibit changes in mood and behavior, including depression and apathy, as well as progressive mild dementia. The disorder's long name indicates that the disorder begins slowly, continues to get worse (progressive), and causes weakness (paralysis) due to damage to certain parts of the brain above the pea-sized structures called nuclei that control eye movements (supranuclear). PSP was first described as a distinct disorder in 1964, when three scientists published a paper distinguishing the condition from Parkinson's disease. It is sometimes also called Steele-Richardson-Olypevsky syndrome, reflecting the combined names of the scientists who identified this disorder. Although the patient's condition gradually worsens with PSP, no patient has died from PSP itself.

Атаксия. Люди с атаксией имеют проблемы с координацией, поскольку поражены части нервной системы, которые контролируют движение и поддержание равновесия. Атаксия может поражать пальцы, кисти рук, руки, ноги, тело, речь и движения глаз. Слово атаксия часто используют для описания симптома отсутствия координации, который может быть ассоциирован с инфекциями, повреждениями, другими заболеваниями или дегенеративными изменениями в центральной нервной системе. Термин атаксия часто используется для обозначения группы конкретных дегенеративных заболеваний нервной системы, называемых наследственными и спорадическими атаксиями, которые выделяются как основные Национальным фондом по борьбе с атаксией (National Ataxia Foundation).Ataxia. People with ataxia have problems with coordination because the parts of the nervous system that control movement and balance are affected. Ataxia can affect the fingers, hands, arms, legs, body, speech, and eye movements. The word ataxia is often used to describe a symptom of lack of coordination that may be associated with infections, injuries, other diseases, or degenerative changes in the central nervous system. The term ataxia is often used to refer to a group of specific degenerative diseases of the nervous system called hereditary and sporadic ataxias, which are identified as major by the National Ataxia Foundation.

Множественная системная атрофия. Множественная системная атрофия (MSA) представляет собой дегенеративное неврологическое нарушение. MSA является ассоциированной с дегенерацией нервных клеток в конкретных областях головного мозга. Дегенерация клеток вызывает проблемы с движением, сохранением равновесия и другими автономными функциями организма, такими как контроль мочевого пузыря или регуляция кровяного давления. Причина MSA является неизвестной, и не было идентифицировано специфических факторов риска. Около 55% случаев возникает у мужчин, причем, как правило, заболевание начинается в возрасте с последних лет десятилетнего периода после 50 лет до первых нескольких лет после 60. У MSA часто присутствуют некоторые симптомы, которые являются такими же, как и у болезни Паркинсона. Тем не менее, пациенты с MSA обычно проявляют минимальный ответ, если вообще проявляют, на дофаминовые лекарственные препараты, применяемые в случае болезни Паркинсона.Multiple system atrophy. Multiple system atrophy (MSA) is a degenerative neurological disorder. MSA is associated with degeneration of nerve cells in specific areas of the brain. Cell degeneration causes problems with movement, balance, and other autonomic functions of the body, such as bladder control or blood pressure regulation. The cause of MSA is unknown, and no specific risk factors have been identified. About 55% of cases occur in men, with the disease typically beginning in the last ten years after age 50 to the first few years after age 60. MSA often has some symptoms that are the same as Parkinson's disease. However, patients with MSA typically show minimal, if any, response to dopamine drugs used in Parkinson's disease.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления данные способы и композиции находят применение в замедлении прогрессирования когнитивного нарушения, ассоциированного со старением. Иными словами, когнитивные способности у индивида будут снижаться медленнее после лечения с помощью раскрытых способов, чем до этого или в отсутствие лечения с помощью раскрытых способов. В некоторых таких случаях данные способы лечения включают в себя измерение прогрессирования снижения когнитивных способностей после лечения и определение того, что прогрессирование снижения когнитивных способностей снизилось. В некоторых таких случаях определение производят посредством сравнения с эталонным значением, например, скоростью снижения когнитивных способностей у индивида перед лечением, например, которую определяют посредством измерения когнитивной деятельности в два или более момента времени перед введением субъекту препарата крови.In accordance with some embodiments, the methods and compositions find use in slowing the progression of cognitive impairment associated with aging. In other words, an individual's cognitive abilities will decline more slowly after treatment with the disclosed methods than before or in the absence of treatment with the disclosed methods. In some such cases, these treatments include measuring the progression of cognitive decline after treatment and determining that the progression of cognitive decline has decreased. In some such cases, the determination is made by comparison with a reference value, such as the rate of cognitive decline in an individual before treatment, for example, which is determined by measuring cognitive performance at two or more time points before administering a blood product to the subject.

Данные способы и композиции также находят применение в стабилизации когнитивных способностей индивида, например, индивида, страдающего от ассоциированного со старением снижения когнитивных способностей, или индивида с риском того, что он будет страдать от ассоциированного со старением снижения когнитивных способностей. Например, индивид может демонстрировать некоторое когнитивное нарушение, ассоциированное со старением, и прогрессирование когнитивного нарушения, наблюдаемое перед лечением с использованием раскрытых способов, будет останавливаться после лечения с помощью раскрытых способов. В качестве еще одного примера, индивид может иметь риск развития ассоциированного со старением снижения когнитивных способностей (например, индивид может иметь возраст 50 лет или более, или у него может быть диагностировано нарушение, ассоциированное со старением), и когнитивные способности индивида являются, по сути, неизменными, т.е. невозможно выявить снижение когнитивных способностей после лечения с помощью раскрытых способов по сравнению с периодом перед лечением с использованием раскрытых способов.These methods and compositions also find use in stabilizing the cognitive abilities of an individual, for example, an individual suffering from aging-associated cognitive decline or an individual at risk of suffering from aging-associated cognitive decline. For example, an individual may exhibit some cognitive impairment associated with aging, and the progression of cognitive impairment observed before treatment using the disclosed methods will be reversed after treatment using the disclosed methods. As another example, an individual may be at risk for developing aging-associated cognitive decline (eg, the individual may be 50 years of age or older or have been diagnosed with an aging-associated disorder), and the individual's cognitive abilities are essentially , unchanged, i.e. it is not possible to detect a decrease in cognitive abilities after treatment using the disclosed methods compared to the period before treatment using the disclosed methods.

Данные способы и композиции также находят применение в снижении когнитивного нарушения у индивида, страдающего от когнитивного нарушения, ассоциированного со старением. Иными словами, когнитивная способность у индивида после лечения с помощью данных способов улучшается. Например, когнитивная способность у индивида повышается, например, 2-кратно или более, 5-кратно или более, 10кратно или более, 15-кратно или более, 20-кратно или более, 30-кратно или более или 40-кратно или более, в том числе 50-кратно или более, 60-кратно или более, 70-кратно или более, 80-кратно или более, 90кратно или более или 100-кратно или более после лечения с помощью данных способов по сравнению с когнитивной способностью, которая наблюдается к индивида перед лечением с помощью данных способов. В некоторых случаях лечение с помощью данных способов и композиций восстанавливает когнитивную способность у индивида, страдающего от ассоциированного со старением снижения когнитивных способностей, например, до их уровня, когда индивид имел возраст приблизительно 40 лет или менее. Иными словами, когнитивное нарушение устраняется.These methods and compositions also find use in reducing cognitive impairment in an individual suffering from cognitive impairment associated with aging. In other words, the cognitive ability of an individual after treatment using these methods improves. For example, the individual's cognitive ability increases, for example, 2-fold or more, 5-fold or more, 10-fold or more, 15-fold or more, 20-fold or more, 30-fold or more, or 40-fold or more, including 50-fold or more, 60-fold or more, 70-fold or more, 80-fold or more, 90-fold or more, or 100-fold or more after treatment with these methods compared to the cognitive ability that is observed to the individual before treatment using these methods. In some cases, treatment with these methods and compositions restores cognitive ability in an individual suffering from aging-associated cognitive decline, for example, to a level when the individual was approximately 40 years of age or less. In other words, the cognitive impairment is eliminated.

Реактивы, устройства и наборы.Reagents, devices and kits.

Также предполагаются реактивы, устройства и наборы с ними для практического осуществления одного или нескольких из вышеописанных способов. Данные реактивы, устройства и наборы с ними могут в значительной степени варьировать. Представляющие интерес реактивы и устройства включают в себя упомянутые выше применительно к способам снижения уровней B2M у взрослого млекопитающего.Also contemplated are reagents, devices and kits therewith for the practical implementation of one or more of the methods described above. These reagents, devices and kits containing them may vary greatly. Reagents and devices of interest include those mentioned above with respect to methods for reducing B2M levels in an adult mammal.

- 23 045040- 23 045040

В дополнение к вышеуказанным компонентам данные наборы будут дополнительно включать в себя инструкции по практическому осуществлению данных способов. Эти инструкции могут присутствовать в данных наборах в различных формах, одна или несколько из которых могут присутствовать в наборе. Одна форма, в которой эти инструкции могут присутствовать, представляет собой печатную информацию на подходящем носителе или основе, например, на листке или листках бумаги, на которых распечатана информация, в упаковке набора, на листке-вкладыше в упаковке и т.д. Еще одно средство будет представлять собой машиночитаемый носитель, например, дискету, CD, портативный флэшнакопитель и т.д., на который была записана информация. Другие средства, которые могут присутствовать, представляют собой адрес веб-сайта, который можно использовать с помощью сети Интернет для доступа к информации на удаленном сайте. Любые подходящие средства могут присутствовать в наборах.In addition to the above components, these kits will further include instructions for the practical implementation of these methods. These instructions may be present in these sets in various forms, one or more of which may be present in the set. One form in which these instructions may be present is printed information on a suitable medium or support, such as a piece of paper or sheets of paper on which the information is printed, in a kit package, on a package insert, etc. Another means will be a computer readable medium, such as a floppy disk, CD, portable flash drive, etc., on which the information has been recorded. Other means that may be present are a website address that can be used over the Internet to access information on a remote site. Any suitable products may be included in the kits.

Следующие примеры представлены с целью иллюстрации, а не ограничения.The following examples are provided for purposes of illustration and not limitation.

Экспериментальная часть.Experimental part.

Следующие примеры используются для того, чтобы представить квалифицированному специалисту в данной области техники полное раскрытие и описание того, как осуществлять и применять настоящее изобретение, и они не предназначены ни для ограничения объема того, что предполагается авторами настоящего изобретения как их изобретение, ни для того, чтобы представить, что приведенные ниже эксперименты представляют собой все или единственные выполненные эксперименты. Были предприняты попытки для обеспечения точности в отношении используемых численных величин (например, количеств, температуры и т.д.), но некоторые ошибки эксперимента и отклонения следует принимать во внимание. Если не указано иное, части представляют собой массовые части, молекулярная масса представляет собой средневесовую молекулярную массу, температура выражена в градусах Цельсия, и давление равно или приблизительно равно атмосферному.The following examples are used to provide one skilled in the art with a complete disclosure and description of how to make and use the present invention, and are not intended to limit the scope of what is intended by the inventors of the present invention to be their invention, nor to to represent that the experiments below represent all or the only experiments performed. Efforts have been made to ensure accuracy with respect to the numerical quantities used (eg quantities, temperatures, etc.), but some experimental errors and deviations must be taken into account. Unless otherwise indicated, parts are parts by weight, molecular weight is weight average molecular weight, temperature is in degrees Celsius, and pressure is at or approximately atmospheric.

I. Методы.I. Methods.

А. Животные модели.A. Animal models.

Использовали следующие линии мышей: C57BL/6 (The Jackson Laboratory), старые мыши C57BL/6 (National Institutes of Aging), мутантные по в2-микроглобулину (B2M’/’) мыши и мутантные по транспортеру 1, связанному с процессингом антигена, (Тар1’/’) мыши (The Jackson Laboratory). Все исследования проводили на самцах мышей. Количество мышей, используемое для получения в результате статистически значимых различий, рассчитывали с использованием стандартных расчетов статистической мощности с α=0,05 и мощностью, составляющей 0,8. Авторами настоящего изобретения использовался онлайнинструмент (http://www.stat.uiowa.edu/~rlenth/Power/index.html) для расчета мощности и размера выборки, исходя из опыта соответствующих исследований, вариабельности анализов и различий между индивидами в пределах групп. Мышей содержали в особых условиях с отсутствием патогенов с 12-часовым циклом чередования света и темноты, и все обращение и использование животных осуществлялось в соответствии с установленными руководствами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Калифорнийского университета, Сан-Франциско, и Комитетом по исследованиям на животных VA Palo Alto Committee on Animal Research.The following mouse strains were used: C57BL/6 (The Jackson Laboratory), aged C57BL/6 mice (National Institutes of Aging), β2-microglobulin mutant (B2M'/') mice, and antigen processing-associated transporter 1 mutant mice ( Tar1'/') mice (The Jackson Laboratory). All studies were performed on male mice. The number of mice used to obtain statistically significant differences was calculated using standard statistical power calculations with α=0.05 and a power of 0.8. We used an online tool (http://www.stat.uiowa.edu/~rlenth/Power/index.html) to calculate power and sample size based on experience in relevant studies, assay variability, and differences between individuals within groups. Mice were maintained in specific pathogen-free conditions with a 12-hour light/dark cycle, and all handling and use of animals was in accordance with established guidelines approved by the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of the University of California, San Francisco, and the Committee VA Palo Alto Committee on Animal Research.

B. Парабиоз.B. Parabiosis.

Хирургическая операция по обеспечению парабиоза следовала ранее описанным процедурам (Villeda, S.A., et al., The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function, Nature (2011) 477: 90-94), (Villeda, S. A. et al., Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice, Nature medicine (2014) 20:659-663). Производили зеркально расположенные разрезы в коже на левом и правом боках и более короткие разрезы делали в стенке брюшной полости. И отверстия в брюшине у связанных парабионтов сшивали вместе. Локтевые и коленные суставы у каждого парабионта сшивали вместе, и кожу каждой мыши прикрепляли степлером (9 мм Autoclip, Clay Adams) к коже связанного парабионта. Каждой мыши вводили инъекцией подкожно антибиотик байтрил и бупренекс, целью которого является снятие боли, и подвергали мониторингу в ходе восстановления. Для оценки общего состояния здоровья и сохранения поведения несколько характеристик восстановления анализировали в различные моменты времени после хирургической операции, в том числе массу и поведение, проявляющееся в уходе за поверхностью тела, у мышей, объединенных в пары.Surgery to achieve parabiosis followed previously described procedures (Villeda, S.A., et al., The aging systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function, Nature (2011) 477: 90-94), (Villeda, S. A. et al., Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice, Nature medicine (2014) 20:659-663). Mirror incisions were made in the skin on the left and right sides and shorter incisions were made in the wall of the abdominal cavity. And the holes in the peritoneum of the associated parabionts were sewn together. The elbow and knee joints of each parabiont were sutured together, and the skin of each mouse was stapled (9 mm Autoclip, Clay Adams) to the skin of the bound parabiont. Each mouse was given a subcutaneous injection of the antibiotic Baytril and Buprenex, which aims to relieve pain, and monitored during recovery. To assess overall health and behavioral maintenance, several recovery characteristics were analyzed at different time points after surgery, including weight and grooming behavior, in paired mice.

C. Стереотаксические инъекции.C. Stereotactic injections.

Животных помещали в рамку для стереотаксических манипуляций и подвергали анестезии с использованием 2% изофлурана (скорость потока кислорода 2 л/мин), доставляемого через носовой конус для анестезии. Офтальмологическую глазную мазь (Puralube Vet Ointment, Dechra) наносили на роговицу для предотвращения высыхания во время хирургической операции. Область вокруг разреза выстригали. Растворы вводили инъекцией билатерально в DG дорсальных частей гиппокампов с использованием следующих координат: вверх (от брегмы)=-2 мм, вбок =1,5 мм, высота (от поверхности черепа)=-2,1 мм. Объем 2 мкл вводили инъекцией стереотаксически за 10 мин (скорость инъекции: 0,20 мкл/мин) с использованием шприца Hamilton на 5 мкл с иглой калибра 26s. Чтобы ограничить отток по пути инъекции, иглу поддерживали in situ в течение 8 мин, медленно вытягивали наполовину и удерживали в этом поло- 24 045040 жении в течение дополнительных двух минут. Кожу закрывали с использованием шелкового шва. Каждой мыши вводили инъекцией подкожно анальгетик бупренекс. Мышей разделяли по отдельным клеткам и подвергали мониторингу в течение периода восстановления.Animals were placed in a stereotactic frame and anesthetized using 2% isoflurane (oxygen flow rate 2 L/min) delivered through an anesthetic nose cone. Ophthalmic eye ointment (Puralube Vet Ointment, Dechra) was applied to the cornea to prevent drying during surgery. The area around the incision was trimmed. Solutions were injected bilaterally into the DG of the dorsal hippocampi using the following coordinates: up (from bregma) = -2 mm, sideways = 1.5 mm, height (from skull surface) = -2.1 mm. A volume of 2 μL was injected stereotaxically over 10 min (injection rate: 0.20 μL/min) using a 5 μL Hamilton syringe with a 26s gauge needle. To limit outflow along the injection route, the needle was held in situ for 8 minutes, slowly pulled halfway, and held in this position for an additional two minutes. The skin was closed using a silk suture. Each mouse was given a subcutaneous injection of the analgesic Buprenex. Mice were separated into individual cages and monitored during the recovery period.

D. Введение B2M.D. Introduction of B2M.

Не содержащий носителя очищенный человеческий в2-микроглобулин (Lee Biosolutions) растворяли в PBS и вводили системно (100 мкг/кг) посредством интраорбитальной инъекции молодым (3 месяца) животным дикого типа или стереотаксически (0,50 мкл; 0,1 мкг/мкл) в DG гиппокампа молодым (3 месяца) животным дикого типа и Tap1’/’ мутантам. Для гистологического анализа B2M и среду вводили в контралатеральную DG того же животного. Для поведенческого анализа B2M или среду вводили билатерально в DG и мышам позволяли восстановиться в течение шести или 30 суток перед исследованием когнитивных способностей.Vehicle-free purified human β2-microglobulin (Lee Biosolutions) was dissolved in PBS and administered systemically (100 μg/kg) by intraorbital injection to young (3 months) wild-type animals or stereotactically (0.50 μl; 0.1 μg/μl). in the hippocampal DG of young (3 months) wild-type and Tap1'/' mutant animals. For histological analysis, B2M and medium were injected into the contralateral DG of the same animal. For behavioral analysis, B2M or medium was injected bilaterally into the DG and mice were allowed to recover for six or 30 days before cognitive testing.

E. Введение и количественное определение BrdU.E. Administration and quantitation of BrdU.

Для кратковременного мечения с помощью Brdu 50 мг/кг BrdU вводили инъекцией интраперитонеально мышам один раз в сутки либо три, либо шесть суток до умерщвления. Для длительного мечения BrdU 50 мг/кг BrdU вводили инъекцией мышам каждые сутки в течение шести суток и животных умерщвляли через 28 суток после первого введения. Для оценки общего количества BrdU-положительных клеток в головном мозге авторами настоящего изобретения выполнялось окрашивание в отношении BrdU с использованием DAB (диаминобензидин) на каждом шестом срезе половины мозга из общего количества, составляющего шесть срезов. Количество BrdU-положительных клеток среди гранулярных клеток и клеток субгранулярного слоя в DG подсчитывали и умножали на 12 для оценки общего количества BrdU-положительных клеток во всей DG. Для определения судьбы делящихся клеток суммарно 200 BrdU-положительных клеток в 4-6 срезах на мышь анализировали с помощью конфокальной микроскопии в отношении коэкспрессии с NeuN и GFAP. Количество положительных по двум маркерам клеток выражали в виде процента от BrdU-положительных клеток.For short-term labeling with Brdu, 50 mg/kg BrdU was injected intraperitoneally into mice once daily either three or six days before sacrifice. For long-term BrdU labeling, 50 mg/kg BrdU was injected into mice every day for six days, and the animals were sacrificed 28 days after the first administration. To assess the total number of BrdU-positive cells in the brain, we performed BrdU staining using DAB (diaminobenzidine) on every sixth half-brain section out of a total of six sections. The number of BrdU-positive cells among granule cells and subgranular layer cells in the DG was counted and multiplied by 12 to estimate the total number of BrdU-positive cells in the entire DG. To determine the fate of dividing cells, a total of 200 BrdU-positive cells in 4-6 sections per mouse were analyzed by confocal microscopy for coexpression with NeuN and GFAP. The number of cells positive for the two markers was expressed as a percentage of BrdU-positive cells.

F. Иммуногистохимический анализ.F. Immunohistochemical analysis.

Обработку ткани и иммуногистохимический анализ осуществляли на свободноплавающих срезах, следуя стандартным опубликованным методикам (Villeda, S.A., et al., The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function, Nature (2011) 477: 90-94). Вкратце, мышей подвергали анестезии с использованием хлоральгидрата (Sigma-Aldrich) в дозе 400 мг/кг и при транскардиальной перфузии 0,9% солевым раствором. Головные мозги удаляли и фиксировали в 4% параформальдегиде, стабилизированном фосфатным буфером, pH 7,4, при 4°С в течение 48 ч перед тем, как их погружали в 30% сахарозу для криозащиты. Затем получали срезы головных мозгов вдоль венечного шва с шагом 40 мкм с использованием криомикротома (Leica Camera, Inc.) и хранили их в криозащитной среде. Первичные антитела представляли собой: козье антитело к Dcx (1:500; Santa Cruz Biotechnology; sc-8066, клон: С-18), крысиное антитело к BrdU (1:5000, Accurate Chemical and Scientific Corp.; ab6326, клон: BU1/75), мышиное антитело к нестину (1:500; Millipore; MAB353; клон: rat-401) MCM2 (1:500, BD Biosciences; 610700; клон: 46/ВМ28), куриное антитело к Tbr2 (1:500; Millipore; AB15894), мышиное антитело к NeuN (1:1000; Millipore; МАВ377; клон: А60), кроличье антитело к GFAP (1:500; DAKO; Z0334). После инкубирования в течение ночи окрашивание первичными антителами выявляли с использованием биотинилированных вторичных антител (Vector) и набора ABC (Vector) с диаминобензидином (DAB, SigmaAldrich) или вторичных антител, конъюгированных с флуоресцентной меткой (Life Technologies). Для мечения BrdU срезы головного мозга подвергали предварительной обработке 2 н HCl при 37°С в течение 30 мин. и промывали три раза стабилизированным Tris-буфером солевым раствором с Tween (TBST) перед инкубированием с первичным антителом. Для мечения нестина и Tbr2 срезы головного мозга три раза подвергали предварительной обработке 0,1 М цитратом при 95°С в течение 5 мин и промывали три раза стабилизированным Tris-буфером солевым раствором с Tween (TBST) перед инкубированием с первичным антителом. Для оценки общего количества Dcx-положительных клеток в DG положительные по иммуноокрашиванию клетки среди гранулярных клеток и субгранулярного слоя клеток DG подсчитывали в каждом шестом сделанном в направлении венечного шва срезе половины мозга через гиппокамп из общего количества шесть срезов и умножали на 12.Tissue processing and immunohistochemical analysis were performed on free-floating sections following standard published procedures (Villeda, S.A., et al., The aging systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function, Nature (2011) 477: 90-94). Briefly, mice were anesthetized using chloral hydrate (Sigma-Aldrich) at 400 mg/kg and transcardially perfused with 0.9% saline. Brains were removed and fixed in 4% paraformaldehyde stabilized with phosphate buffer, pH 7.4, at 4°C for 48 h before being immersed in 30% sucrose for cryoprotection. Brains were then sectioned along the coronal suture at 40-μm increments using a cryomicrotome (Leica Camera, Inc.) and stored in a cryoprotective environment. Primary antibodies were: goat anti-Dcx (1:500; Santa Cruz Biotechnology; sc-8066, clone: C-18), rat anti-BrdU (1:5000, Accurate Chemical and Scientific Corp.; ab6326, clone: BU1 /75), mouse anti-nestin antibody (1:500; Millipore; MAB353; clone: rat-401) MCM2 (1:500, BD Biosciences; 610700; clone: 46/BM28), chicken anti-Tbr2 antibody (1:500; Millipore; AB15894), mouse anti-NeuN antibody (1:1000; Millipore; MAB377; clone: A60), rabbit anti-GFAP antibody (1:500; DAKO; Z0334). After overnight incubation, primary antibody staining was detected using biotinylated secondary antibodies (Vector) and an ABC kit (Vector) with diaminobenzidine (DAB, SigmaAldrich) or fluorescent tag-conjugated secondary antibodies (Life Technologies). For BrdU labeling, brain sections were pretreated with 2 N HCl at 37°C for 30 min. and washed three times with Tris-buffered saline with Tween (TBST) before incubation with the primary antibody. For nestin and Tbr2 labeling, brain sections were pretreated three times with 0.1 M citrate at 95°C for 5 min and washed three times with Tris-buffered saline with Tween (TBST) before incubation with the primary antibody. To estimate the total number of Dcx-positive cells in the DG, immunostaining-positive cells among the granule cells and subgranular cell layer of the DG were counted in every sixth coronal suture section of half the brain through the hippocampus out of a total of six sections and multiplied by 12.

G. Вестерн-блоттинг анализ.G. Western blot analysis.

Гиппокампы мышей вырезали после перфузии животных, подвергали быстрому замораживанию и лизировали в лизирующем буфере RIPA (500 мМ Tris, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 0,5% дезоксихолат Na, 1% NP40, 0,1% SDS и полный набор ингибиторов протеаз; Roche). Лизаты тканей смешивали с 4х загрузочным буфером NuPage LDS (Invitrogen) и загружали на 4-12% градиентный полиакриламидный гель с SDS (Invitrogen), а затем переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Блоты блокировали в 5% молоке в стабилизированном Tris-буфером солевом растворе с Tween (TBST) и инкубировали с кроличьим антителом к актину (1:5000, Sigma; A5060) и кроличьим антителом к B2M (1:2500, Abcam; ab75853; клон: EP2978Y). Конъюгированные с пероксидазой хрена вторичные антитела (1:5000, GE Healthcare; NA934) и набор ECL (GE Healthcare/Amersham Pharmacia Biotech) использовали для выявления сигналов от белков. Несколько вариантов выдержки использовали для того, чтобы выбрать изображения в динамиче- 25 045040 ском диапазоне пленки (GE Healthcare Amersham HyperfilmTM ECL). Выбранные пленки сканировали (300 dpi) и подвергали количественному анализу с использованием программного обеспечения ImageJ (версия 1.46k). Полосы от актина использовали для нормализации.Mouse hippocampi were dissected after animal perfusion, snap frozen, and lysed in RIPA lysis buffer (500 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5% Na deoxycholate, 1% NP40, 0.1% SDS, and complete inhibitor kit protease; Roche). Tissue lysates were mixed with NuPage LDS 4x loading buffer (Invitrogen) and loaded onto a 4-12% SDS polyacrylamide gradient gel (Invitrogen) and then transferred to a nitrocellulose membrane. Blots were blocked in 5% milk in Tris-buffered saline with Tween (TBST) and incubated with rabbit anti-actin antibody (1:5000, Sigma; A5060) and rabbit anti-B2M antibody (1:2500, Abcam; ab75853; clone: EP2978Y). Horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies (1:5000, GE Healthcare; NA934) and an ECL kit (GE Healthcare/Amersham Pharmacia Biotech) were used to detect protein signals. Several shutter speeds were used to select images within the dynamic range of the film (GE Healthcare Amersham HyperfilmTM ECL). Selected films were scanned (300 dpi) and subjected to quantitative analysis using ImageJ software (version 1.46k). Actin bands were used for normalization.

H. Анализы клеточной культуры.H. Cell culture assays.

Мышиные нервные клетки-предшественники выделяли из C57BL/6 мышей или мышей с репортерным Dcx (Couillard-Despres S, et al., In vivo optical imaging of neurogenesis: watching new neurons in the intact brain. Molecular imaging. 2008; 7:28-34.), как описано ранее (Villeda, S.A., et al., The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function, Nature (2011) 477: 90-94), (Mosher KI, et al. Neural progenitor cells regulate microglia functions and activity. Nature neuroscience. 2012; 15:14851487). Мозги от недавно родившихся животных (возрастом 1 сутки) вырезали с удалением обонятельных луковиц, коры больших полушарий, мозжечка и ствола мозга. После удаления поверхностных кровеносных сосудов гиппокампы в конце разрезали на мелкие кусочки скальпелем, подвергали расщеплению в течение 30 мин при 37°С в среде DMEMB, содержащей 2,5 Ед./мл папаина (Worthington Biochemicals), 1 Ед./мл диспазы II (Boeringher Mannheim) и 250 Ед./мл ДНКазы I (Worthington Biochemicals) и механическому разъединению. NSC/предшественники очищали с использованием градиента плотности на основе 65% Percoll и высевали на непокрытые чашки для тканевых культур с плотностью, составляющей 105 клеток/см². NPC культивировали в стандартных условиях в течение 48 ч в среде NeuroBasal А, дополненной пенициллином (100 Ед./мл), стрептомицином (100 мг/мл), 2 мМ L-глутамином, добавкой из бессывороточного В27 без витамина A (Sigma-Aldrich), bFGF (20 нг/мл) и EGF (20 нг/мл). Не содержащие носителя формы человеческого рекомбинантного B2M (Vendor) растворяли в PBS и добавляли к клеточным культурам в условиях самоподдержания раз в двое суток после посева клеток. Для оценки пролиферации измеряли включение BrdU с использованием системы для анализа клеточной пролиферации, в которой используется конъюгированное с пероксидазой антитело к BrdU вместе с окрашенным субстратом для выявления (Fisher). Для анализов биолюминисценции активность Dcx-люциферазы измеряли с использованием системы для анализа люциферазы (Promega). Дифференцировку оценивали с помощью иммуногистохимического анализа с использованием мышиного антитела к МАР2 (1:1000, Sigma; M9942; клон: НМ-2) и кроличьего антитела к GFAP (1:500, DAKO; Z0334). Цитотоксичность измеряли посредством выявления лактат-дегидрогеназы (LDH) с использованием системы для анализа цитотоксичности Pierce LDH Cytotoxicity Assay system (Life Technologies).Murine neural progenitor cells were isolated from C57BL/6 mice or Dcx reporter mice (Couillard-Despres S, et al., In vivo optical imaging of neurogenesis: watching new neurons in the intact brain. Molecular imaging. 2008; 7:28- 34.), as described previously (Villeda, SA, et al., The aging systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function, Nature (2011) 477: 90-94), (Mosher KI, et al. Neural progenitor cells regulate microglia functions and activity. Nature neuroscience. 2012;15:14851487). Brains from recently born animals (1 day old) were excised with removal of the olfactory bulbs, cerebral cortex, cerebellum and brain stem. After removing the superficial blood vessels, the hippocampi were finally cut into small pieces with a scalpel and digested for 30 min at 37°C in DMEMB medium containing 2.5 U/ml papain (Worthington Biochemicals), 1 U/ml dispase II ( Boeringher Mannheim) and 250 U/ml DNase I (Worthington Biochemicals) and mechanical separation. NSC/progenitors were purified using a 65% Percoll density gradient and seeded onto uncoated tissue culture dishes at a density of 105 cells/cm ² . NPCs were cultured under standard conditions for 48 hours in NeuroBasal A medium supplemented with penicillin (100 U/ml), streptomycin (100 mg/ml), 2 mM L-glutamine, and serum-free B27 supplement without vitamin A (Sigma-Aldrich) , bFGF (20 ng/ml) and EGF (20 ng/ml). Vehicle-free forms of human recombinant B2M (Vendor) were dissolved in PBS and added to cell cultures under self-maintenance conditions every two days after cell seeding. To assess proliferation, BrdU incorporation was measured using a cell proliferation assay system that uses a peroxidase-conjugated anti-BrdU antibody along with a stained detection substrate (Fisher). For bioluminescence assays, Dcx-luciferase activity was measured using a luciferase assay system (Promega). Differentiation was assessed by immunohistochemical analysis using mouse anti-MAP2 antibody (1:1000, Sigma; M9942; clone: HM-2) and rabbit anti-GFAP antibody (1:500, DAKO; Z0334). Cytotoxicity was measured by lactate dehydrogenase (LDH) detection using the Pierce LDH Cytotoxicity Assay system (Life Technologies).

I. Контекстуальное замирание.I. Contextual fading.

В этой задаче мышей обучали устанавливать ассоциативную связь контекста окружающей среды (камера для условно-рефлекторного замирания) с отрицательным раздражителем (легкое электроболевое раздражение лап животных; безусловно-рефлекторный стимул, US), что позволяет исследовать гиппокамп-зависимое контекстуальное замирание. Поскольку контекстуальное замирание является зависимым от гиппокампа и миндалины, легкое электроболевое раздражение лап животных использовалось в паре со световым и звуковым сигналом (условно-рефлекторный стимул, CS) с целью оценки зависимого от миндалины условно-рефлекторного замирания, обусловленного сигналом. Условно-рефлекторная реакция страха проявлялась в виде замирания. Конкретные параметры тренировки были следующими: длительность звукового сигнала составляет 30 с; уровень составляет 70 дБ, 2 кГц; длительность электроболевого раздражения составляет 2 с; интенсивность составляет 0,6 мА. Эта интенсивность не является болезненной и может легко переноситься, но будет создавать неприятное ощущение. Более конкретно, в день 1 каждую мышь помещали в камеру для условно-рефлекторного замирания и позволяли изучить обстановку в течение 2 мин перед подачей 30-секундного звукового сигнала (70 дБ), заканчивающегося 2-секундным электроболевым раздражением лап животных (0,6 мА). Две минуты спустя доставляли вторую пару CS-US. В день 2 каждую мышь вначале помещали в камеру для условно-рефлекторного замирания, содержащую те же самые контекстуальные условия, но без CS или электроболевого раздражения. Замирание анализировали в течение 1-3 мин. Один час спустя мышей помещали в новые контекстуальные условия, содержащие отличающийся запах, чистящий раствор, текстуру пола, стенки и форму камеры. Животным позволяли изучить обстановку в течение 2 мин перед повторным воздействием CS. Замирание анализировали в течение 1-3 мин. Замирание измеряли с использованием системы и программного обеспечения для видео-телевизионного отслеживания FreezeScan (Cleversys, Inc).In this task, mice were trained to associate an environmental context (conditioned freezing chamber) with a negative stimulus (mild electrical pain stimulation of animal paws; unconditioned reflex stimulus, US), allowing the investigation of hippocampus-dependent contextual freezing. Because contextual freezing is hippocampus- and amygdala-dependent, mild electrical pain stimulation of animal paws was used in conjunction with a light and sound cue (conditioned stimulus, CS) to assess amygdala-dependent cue-conditioned freezing. The conditioned reflex reaction of fear manifested itself in the form of freezing. The specific training parameters were as follows: beep duration is 30 s; level is 70 dB, 2 kHz; the duration of electrical pain stimulation is 2 s; the intensity is 0.6 mA. This intensity is not painful and can be easily tolerated, but will create an unpleasant sensation. More specifically, on Day 1, each mouse was placed in a conditioned freezing chamber and allowed to explore for 2 min before a 30-second beep (70 dB) followed by a 2-second electrical painful stimulation of the animals' paws (0.6 mA). . Two minutes later the second CS-US pair was delivered. On day 2, each mouse was initially placed in a conditioned freezing chamber containing the same contextual conditions but without CS or electrical pain stimulation. Freezing was analyzed for 1–3 min. One hour later, mice were placed in a new contextual environment containing a different odor, cleaning solution, floor texture, walls, and chamber shape. Animals were allowed to explore the environment for 2 min before repeated exposure to the CS. Freezing was analyzed for 1–3 min. Freezing was measured using the FreezeScan video-television tracking system and software (Cleversys, Inc).

J. Радиальный водный лабиринт.J. Radial water maze.

Пространственное обучение и память оценивали с использованием модели радиального водного лабиринта с рукавами (RAWM), следуя протоколу, описанному Alamed et al., Nat. Protocols (2006) 1:16711679). В этой задаче расположение целевого рукава, содержащего платформу, остается постоянным в ходе фазы тренировки и тестирования, тогда как стартовый рукав изменяется во время каждого испытания. В первый день во время фазы тренировки мышей тренировали в ходе 15 испытаний, причем испытания чередовались между видимой и скрытой платформой. На второй день во время фазы тестирования, мышей тестировали в ходе 15 испытаний со скрытой платформой. Вход в неправильный рукав оценивается как ошибка, и ошибки усредняют по блокам тренировки (три последовательных испытания). Исследователи были лишены информации о генотипе и обработке при определении оценки.Spatial learning and memory were assessed using a radial arm water maze model (RAWM), following the protocol described by Alamed et al., Nat. Protocols (2006) 1:16711679). In this task, the location of the target arm containing the platform remains constant during the training and testing phases, whereas the start arm changes during each trial. On day 1, during the training phase, mice were trained on 15 trials, with trials alternating between a visible and a hidden platform. On the second day during the testing phase, mice were tested on 15 hidden platform trials. Entering the wrong arm is scored as an error, and errors are averaged across training blocks (three consecutive trials). The researchers were blinded to genotype and treatment information when determining the score.

K. Сбор плазмы и протеомный анализ.K. Plasma collection and proteomic analysis.

- 26 045040- 26 045040

Кровь мышей собирали в покрытые EDTA пробирки посредством забора крови из хвостовой вены, забора крови из нижнечелюстной вены или забора крови из полости сердца во время умерщвления. Плазму с EDTA получали посредством центрифугирования при 1000g свежесобранной крови и аликвоты хранили при -80°С до использования. Образцы человеческой плазмы и CSF получали от медицинского факультета Вашингтонского университета (University of Washington School of Medicine), исследовательского, образовательного и клинического центра психиатрических заболеваний при северо-западном отделении организации по делам ветеранов (Veterans Affairs Northwest Network Mental Illness Research, Education, and Clinical Center), Орегонского университета медицины и науки (Oregon Health Science University) и Калифорнийского университета из Сан-Диего (University of California San Diego). Субъектов выбирали на основании стандартизированных критериев включения и исключения, которые были описаны ранее (Villeda, S.A., et al., The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function, Nature (2011) 477:90-94), (Zhang, J. et al., CSF multianalyte profile distinguishes Alzheimer and Parkinson diseases, American journal of clinical pathology (2008) 129:526-529), (Li, G. et al., Cerebrospinal fluid concentration of brain-derived neurotrophic factor and cognitive function in non-demented subjects, PloS one (2009) 4:e5424) и изложены в дополнительной табл. 1. Получали информированное согласие от субъектов-людей в соответствии с руководствами экспертных советов в соответствующих центрах.Blood from mice was collected into EDTA-coated tubes by caudal vein collection, mandibular vein collection, or cardiac cavity collection at the time of sacrifice. EDTA plasma was obtained by centrifugation at 1000 g of freshly collected blood and aliquots were stored at -80°C until use. Human plasma and CSF samples were obtained from the University of Washington School of Medicine, Veterans Affairs Northwest Network Mental Illness Research, Education, and Clinical Center. Center), Oregon Health Science University and the University of California San Diego. Subjects were selected based on standardized inclusion and exclusion criteria that have been described previously (Villeda, S.A., et al., The aging systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function, Nature (2011) 477:90-94), (Zhang, J. et al., CSF multianalyte profile distinguishes Alzheimer and Parkinson diseases, American journal of clinical pathology (2008) 129:526-529), (Li, G. et al., Cerebrospinal fluid concentration of brain-derived neurotrophic factor and cognitive function in non-demented subjects, PloS one (2009) 4:e5424) and are presented in the additional table. 1. Informed consent was obtained from human subjects in accordance with the guidelines of the institutional review boards at the respective centers.

Таблица 1Table 1

Критерии включения субъектов с Критерии исключения субъектов с нормальным старением • Возраст: Субъекты соответствуют возрастным ограничениям для включения в конкретную диагностическую группу.Inclusion Criteria for Subjects with Exclusion Criteria for Subjects with Normal Aging • Age: Subjects meet age restrictions for inclusion in a specific diagnostic group.

• Лицо, предоставляющее информацию: Наличие лица, предоставляющего информацию, для всех субъектов.• Information Provider: Availability of an information provider for all subjects.

• Общее состояние здоровья: достаточно хорошее для полного завершения посещений в ходе исследования.• General health: good enough to complete the study visits.

• Индекс массы тела (BMI): 18-34 нормальным старением • Зрение и/или слух являются слишком нарушенными (даже с учетом коррекции) для того, чтобы обеспечить выполнение психометрического тестирования • Медицинские проблемы: нестабильные, плохо контролируемые или тяжелые медицинские проблемы или заболевания.• Body Mass Index (BMI): 18-34 is normal aging • Vision and/or hearing are too impaired (even with correction) to support psychometric testing • Medical problems: unstable, poorly controlled, or severe medical problems or illnesses .

• Наличие злокачественной опухоли в последние 12 месяцев (исключается плоскоклеточная СА кожи или стадия 1 СА предстательной железы).• Presence of a malignant tumor in the last 12 months (squamous cell CA of the skin or stage 1 CA of the prostate are excluded).

• Противопоказания к люмбальной пункции: нарушение свертываемости• Contraindications to lumbar puncture: bleeding disorders

- 27 045040 • Стабильный прием лекарственных препаратов в течение 4 недель до посещения с забором крови или CSF.- 27 045040 • Stable medication intake for 4 weeks prior to blood or CSF sampling visit.

• Разрешенные лекарственные препараты включают в себя: ингибиторы AChE, мемантин, HRT (эстроген +/- прогестерон, люпрон), гормон щитовидной железы, антидепрессанты, статины.• Approved medications include: AChE inhibitors, memantine, HRT (estrogen +/- progesterone, lupron), thyroid hormone, antidepressants, statins.

• Нормальные базовые лабораторные исследования: BUN (азот мочевины в крови), креатинин (будет допускаться уровень креатинина до 1,5), В12, TSH (тиреотропный гормон).• Normal basic labs: BUN (blood urea nitrogen), creatinine (creatinine level up to 1.5 will be tolerated), B12, TSH (thyroid stimulating hormone).

• MMSE>27/30 (исключения, если низкий статус обучения и контроля устанавливают при подробной оценке) • Характеристики памяти в отношении логической памяти в пределах нормального диапазона.• MMSE>27/30 (exceptions if low learning and control status is determined on detailed assessment) • Memory performance regarding logical memory is within the normal range.

• CDR = 0 • Результаты осмотра неврологом являются нормальными, т.е. нет признаков инсульта, паркинсонизма или значительных аномалий.• CDR = 0 • The results of the examination by a neurologist are normal, i.e. there is no evidence of stroke, parkinsonism or significant abnormalities.

крови, применение кумадина, гепарин или подобного антикоагулянта, тромбоциты <100000; деформация или хирургическая операция, затрагивающая поясничнокрестцовый отдел позвоночника, которые являются достаточно тяжелыми, чтобы сделать люмбальную пункцию проблематичной, кожный сепсис в пояснично-крестцовой области.blood, use of Coumadin, heparin or similar anticoagulant, platelets <100,000; deformity or surgery affecting the lumbosacral spine that is severe enough to make lumbar puncture problematic, cutaneous sepsis in the lumbosacral region.

• Неврологические нарушения: нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, CJD, FTD, PSP; инсульт в последние 12 месяцев или достаточно тяжелые остаточные эффекты более раннего инсульта с нарушением неврологической или когнитивной функции; рассеянный склероз; эпилепсия • Психиатрические нарушения: шизофрения, биполярное аффективное расстройство • Активная/ неконтролируемая депрессия: с историей болезни или с оценкой по GDS (гериатрическая шкала депрессии) • Злоупотребление наркотическими веществами или алкоголем в последние 2 года • Исключающие лекарственные препараты (за 4 недели до посещения с забором крови или CSF) • Нейролептики/ атипичные антипсихотические средства• Neurological disorders: neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, CJD, FTD, PSP; stroke in the last 12 months or sufficiently severe residual effects of an earlier stroke to impair neurological or cognitive function; multiple sclerosis; epilepsy • Psychiatric disorders: schizophrenia, bipolar disorder • Active/uncontrolled depression: with medical history or GDS (Geriatric Depression Scale) score • Substance or alcohol abuse in the past 2 years • Medication-free (4 weeks prior to appointment with blood or CSF sampling) • Antipsychotics/atypical antipsychotics

- 28 045040 • Лекарственные препараты против болезни Паркинсона (L-dopa, дофаминовые агонисты) • Стимуляторы ЦНС: модафинил, риталин • Противоэпилептические лекарственные средства (исключения для нейронтина или подобных более новых AED (противоэпилептические лекарственные средства), употребляемых для снятия боли) • Лечение инсулином • Кортизон (пероральное применение запрещено, позволяется местное применение или применение с использованием ингалятора), лекарственные средства, подавляющие иммунную систему (например, метотрексат, цитоксан, IVIg, такролимус, циклоспорин) или противоопухолевые лекарственные средства • Лекарственные препараты против ВИЧ- 28 045040 • Medicines for Parkinson's disease (L-dopa, dopamine agonists) • CNS stimulants: modafinil, Ritalin • Antiepileptic drugs (exceptions for Neurontin or similar newer AEDs (anti-epileptic drugs) used for pain relief) • Treatment insulin • Cortisone (oral use is prohibited, topical or inhaler is allowed), drugs that suppress the immune system (eg, methotrexate, cytoxan, IVIg, tacrolimus, cyclosporine) or anticancer drugs • HIV drugs

Концентрации цитокинов и сигнальных молекул в плазме крови измерялись в образцах человеческой и мышиной плазмы с использованием стандартных мультиплексных иммуноанализов на основе антител (Luminex) компанией Rules Based Medicine Inc. с оплатой исполнителю отдельных услуг. Все результаты измерений Luminex получали в слепом формате. Все анализы были разработаны и валидированы согласно руководствам Института клинических и лабораторных стандартов (Clinical Laboratory Standards Institute) (ранее NCCLS) на основании принципов иммуноанализа, которые описаны производителями.Plasma concentrations of cytokines and signaling molecules were measured in human and mouse plasma samples using standard multiplex antibody-based immunoassays (Luminex) by Rules Based Medicine Inc. with payment to the contractor for individual services. All Luminex measurements were obtained in a blinded format. All assays were developed and validated according to Clinical Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS) guidelines based on immunoassay principles as described by the manufacturers.

L. Данные и статистический анализ.L. Data and statistical analysis.

Все эксперименты рандомизировались и приводились в слепой формат независимым исследователем перед фармакологической обработкой или оценкой генетических мышиных моделей. Исследователи оставались лишенными информации в отношении принадлежности к контрольной или экспериментальной группе в ходе гистологической, биохимической и поведенческой оценок. Информацию о группах открывали в конце каждого эксперимента при статистическом анализе. Данные выражены в виде среднего значения ±SEM. Распределение данных в каждом наборе экспериментов исследовали в отношении нормальности с использованием обобщенного критерия Д'Агостино-Пирсона или критерия ШапироУилка. Отсутствие значимых различий в величине отклонения между группами выявляли с использованием F-критерия. Статистический анализ осуществляли с использованием программного обеспечения Prism 5.0 (GraphPad Software). Средние значения в двух группах сравнивали с использованием двухстороннего непарного t-критерия Стьюдента. Сравнения средних значений из нескольких групп друг с другом или с одной контрольной группой анализировали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующими соответствующими апостериорными тестами (указаны в условных обозначениях к фигурам).All experiments were randomized and blinded by an independent investigator before pharmacological treatment or evaluation of genetic mouse models. The investigators were blinded to control or treatment group status during histological, biochemical, and behavioral assessments. Group information was revealed at the end of each experiment during statistical analysis. Data are expressed as mean ±SEM. The distribution of data in each set of experiments was examined for normality using the generalized D'Agostino-Pearson test or the Shapiro-Wilk test. The absence of significant differences in the magnitude of the deviation between groups was revealed using the F-test. Statistical analysis was performed using Prism 5.0 software (GraphPad Software). The means of the two groups were compared using a two-tailed unpaired Student's t test. Comparisons of means from multiple groups with each other or with one control group were analyzed using one-way ANOVA followed by appropriate post hoc tests (indicated in the figure legends).

II. Результаты и обсуждение.II. Results and discussion.

Старение остается единственным наиболее преобладающим фактором риска для связанных с деменцией нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера (Hedden & Gabrieli, Insights into the ageing mind: a view from cognitive neuroscience, Nature reviews. Neuroscience (2004) 5:87-96; Mattson & Magnus, Ageing and neuronal vulnerability, Nature reviews. Neuroscience (2006) 7:278-294; Small et al., A pathophysiological framework of hippocampal dysfunction in ageing and disease, Nature reviews. Neuroscience (2011) 12:585-601). В связи с этим требуется крайне важным является достижение понимания сути механизмов, посредством которых проявляются фенотипы старения в головном мозге, с целью сохранения целостности когнитивных процессов в пожилом возрасте и, следовательно, противодействовать уязвимости для нейродегенеративного заболевания. Авторами настоящего изобретения, а также другими учеными было недавно показано, что системные манипуляции, такие как гетерохронныйAging remains the single most predominant risk factor for dementia-related neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (Hedden & Gabrieli, Insights into the aging mind: a view from cognitive neuroscience, Nature reviews. Neuroscience (2004) 5:87–96; Mattson & Magnus, Aging and neuronal vulnerability, Nature reviews Neuroscience (2006) 7:278-294; Small et al., A pathophysiological framework of hippocampal dysfunction in aging and disease, Nature reviews Neuroscience (2011) 12:585-601). Therefore, it is critical to gain an understanding of the mechanisms by which aging phenotypes occur in the brain in order to preserve the integrity of cognitive processes in old age and therefore counteract vulnerability to neurodegenerative disease. It has recently been shown by the present inventors, as well as others, that systemic manipulations such as heterochronic

- 29 045040 парабиоз (при котором кровеносные системы молодого и старого животных являются соединенными) или введение плазмы крови молодых животных может приводить к частичному регрессу связанной со старением потери когнитивных и регенеративных способностей в стареющем головном мозге (Katsimpardi et al., Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors, Science (2014) 344:630-634; Villeda et al., The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function, Nature (2011) 477:90-94; Villeda et al., Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice, Nature medicine (2014) 20:659-663). Интересно, что исследования с гетерохронным парабиозом выявили зависимую от возраста двунаправленность влияния системного окружения, указывая на то, что способствующие омоложению факторы в крови молодых животных вызывают омоложение, тогда как способствующие старению факторы в крови старых животных запускают старение (Katsimpardi et al., Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors, Science (2014) 344:630-634; Villeda et al., The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function, Nature (2011) 477: 90-94; Ruckh et al., Rejuvenation of regeneration in the aging central nervous system, Cell stem cell (2012) 10:96-103; Conboy et al., Rejuvenation of aged progenitor cells by exposure to a young systemic environment, Nature (2005) 433:760-764; Brack et al., Increased Wnt signaling during aging alters muscle stem cell fate and increases fibrosis, Science (2007) 317: 807-810). Был сделан прогноз, что за счет ослабления эффекта способствующих старению факторов можно также обеспечить эффективный подход к омоложению фенотипов, характерных для старения (Villeda et al., Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice, Nature medicine (2014) 20:659-663; Laviano, Young blood, The New England journal of medicine (2014) 371:573575; Bouchard & Villeda, Aging and brain rejuvenation as systemic events, Journal of neurochemistry (2014)).- 29 045040 parabiosis (in which the circulatory systems of young and old animals are connected) or the introduction of blood plasma from young animals can lead to partial regression of aging-associated loss of cognitive and regenerative abilities in the aging brain (Katsimpardi et al., Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors, Science (2014) 344:630–634; Villeda et al., The aging systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function, Nature (2011) 477:90–94; Villeda et al., Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice, Nature medicine (2014) 20:659-663). Interestingly, studies with heterochronic parabiosis have revealed an age-dependent bidirectional influence of the systemic environment, indicating that pro-aging factors in the blood of young animals trigger rejuvenation, whereas pro-aging factors in the blood of old animals trigger aging (Katsimpardi et al., Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors, Science (2014) 344:630–634; Villeda et al., The aging systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function, Nature (2011) 477: 90–94; Ruckh et al., Rejuvenation of regeneration in the aging central nervous system, Cell stem cell (2012) 10:96–103; Conboy et al., Rejuvenation of aged progenitor cells by exposure to a young systemic environment, Nature (2005) 433:760 -764; Brack et al., Increased Wnt signaling during aging alters muscle stem cell fate and increases fibrosis, Science (2007) 317: 807-810). It has been predicted that by attenuating the effects of pro-aging factors, it may also provide an effective approach to rejuvenating the phenotypes associated with aging (Villeda et al., Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice, Nature medicine (2014) ) 20:659-663; Laviano, Young blood, The New England journal of medicine (2014) 371:573575; Bouchard & Villeda, Aging and brain rejuvenation as systemic events, Journal of neurochemistry (2014)).

В своей традиционной роли B2M представляет собой легкую цепь молекул МНС I, которые образуют активную часть адаптивной иммунной системы (Zijlstra et al., Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells, Nature (1990) 344:742-746). В центральной нервной системе (ЦНС) B2M и МНС I могут действовать независимо от своей канонической иммунной функции, регулируя нормальное развитие головного мозга, синаптическую пластичность и даже поведение (Lee et al., Synapse elimination and learning rules co-regulated by MHC class I H2-Db. Nature (2014) 509:195-200; Loconto et al., Functional expression of murine V2R pheromone receptors involves selective association with the M10 and M1 families of MHC class Ib molecules, Cell (2003) 112:607-618; Boulanger & Shatz, Immune signalling in neural development, synaptic plasticity and disease, Nature reviews. Neuroscience (2004) 5:521-531; Shatz, MHC class I: an unexpected role in neuronal plasticity, Neuron (2009) 64:40-45; Huh et al., Functional requirement for class I MHC in CNS development and plasticity, Science (2000) 290:2155-2159; Goddard et al., Regulation of CNS synapses by neuronal MHC class I., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (2007) 104:6828-6833; Glynn et al., MHCI negatively regulates synapse density during the establishment of cortical connections, Nature neuroscience (2011) 14:442-451). Кроме того, в своей растворимой форме B2M накапливается в системном кровотоке в результате отсоединения от поверхности клеток. Интересно, что повышенные системные уровни B2M были вовлечены в когнитивные нарушения, ассоциированные с хроническим гемодиализом (Murray, Cognitive impairment in the aging dialysis and chronic kidney disease populations: an occult burden, Advances in chronic kidney disease (2008) 15:123-132; Corlin et al., Quantification of cleaved beta2-microglobulin in serum from patients undergoing chronic hemodialysis, Clinical chemistry (2005) 51:1177-1184). Более того, повышение уровня растворимого B2M также наблюдалось в спинномозговой жидкости (CSF) пациентов с ВИЧ-деменцией (McArthur et al., The diagnostic utility of elevation in cerebrospinal fluid beta 2-microglobulin in HIV-1 dementia. Multicenter AIDS Cohort Study, Neurology (1992) 42:1707-1712; Brew et al., Predictive markers of AIDS dementia complex: CD4 cell count and cerebrospinal fluid concentrations of beta 2-microglobulin and neopterin, The Journal of infectious diseases (1996) 174:294-298) и болезнью Альцгеймера (Carrette et al., A panel of cerebrospinal fluid potential biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease, Proteomics (2003) 3:1486-1494), что дополнительно связывает B2M с когнитивной дисфункцией.In its traditional role, B2M is a light chain of MHC I molecules that form the active part of the adaptive immune system (Zijlstra et al., Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells, Nature (1990) 344:742-746 ). In the central nervous system (CNS), B2M and MHC I may act independently of their canonical immune function to regulate normal brain development, synaptic plasticity, and even behavior (Lee et al., Synapse elimination and learning rules co-regulated by MHC class I H2 -Db Nature (2014) 509:195-200;Loconto et al., Functional expression of murine V2R pheromone receptors involves selective association with the M10 and M1 families of MHC class Ib molecules, Cell (2003) 112:607-618; Boulanger & Shatz, Immune signaling in neural development, synaptic plasticity and disease, Nature reviews. Neuroscience (2004) 5:521-531; Shatz, MHC class I: an unexpected role in neuronal plasticity, Neuron (2009) 64:40-45 ; Huh et al., Functional requirement for class I MHC in CNS development and plasticity, Science (2000) 290:2155-2159; Goddard et al., Regulation of CNS synapses by neuronal MHC class I., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (2007) 104:6828–6833; Glynn et al., MHCI negatively regulates synapse density during the establishment of cortical connections, Nature neuroscience (2011) 14:442–451). Additionally, in its soluble form, B2M accumulates in the systemic circulation as a result of detachment from the cell surface. Interestingly, elevated systemic levels of B2M have been implicated in cognitive impairment associated with chronic hemodialysis (Murray, Cognitive impairment in the aging dialysis and chronic kidney disease populations: an occult burden, Advances in chronic kidney disease (2008) 15:123–132; Corlin et al., Quantification of cleaved beta2-microglobulin in serum from patients undergoing chronic hemodialysis, Clinical chemistry (2005) 51:1177-1184). Moreover, increased levels of soluble B2M have also been observed in the cerebrospinal fluid (CSF) of patients with HIV dementia (McArthur et al., The diagnostic utility of elevation in cerebrospinal fluid beta 2-microglobulin in HIV-1 dementia. Multicenter AIDS Cohort Study, Neurology (1992) 42:1707-1712; Brew et al., Predictive markers of AIDS dementia complex: CD4 cell count and cerebrospinal fluid concentrations of beta 2-microglobulin and neopterin, The Journal of infectious diseases (1996) 174:294-298) and Alzheimer's disease (Carrette et al., A panel of cerebrospinal fluid potential biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease, Proteomics (2003) 3:1486–1494), further linking B2M to cognitive dysfunction.

Авторами настоящего изобретения были впервые охарактеризованы изменения системных уровней B2M в плазме крови мышей в ходе нормального старения (фиг. 1А,В) и в экспериментальной модели старения с использованием гетерохронного парабиоза (фиг. 1C,D). Авторами настоящего изобретения наблюдалось трехкратное повышение уровней B2M в плазме крови, полученной от старых животных, по сравнению с молодыми животными (фиг. 1В), а также было выявлено соответствующее повышение уровней B2M в плазме крови, полученной от молодых гетерохронных парабионтов после воздействия крови старых животных, по сравнению с молодыми изохронными парабионтами (фиг. 1D). Для подтверждения связи системных изменений, наблюдаемых для B2M у стареющих мышей, с системными изменениями, возникающими у людей, авторами настоящего изобретения измерялся уровень B2M в находящихся на хранении образцах плазмы крови и CSF от здоровых индивидов возрастом от 20 до 90 лет (табл. 1, выше). Авторами настоящего изобретения было выявлено связанное с возрастом повышение уровня B2M, измеренного как в плазме крови, так и в CSF, согласующееся с изменениями, наблюдаемыми у стареющих мышей (фиг. 1E,F).We first characterized changes in systemic levels of B2M in the blood plasma of mice during normal aging (Fig. 1A,B) and in an experimental model of aging using heterochronic parabiosis (Fig. 1C,D). We observed a threefold increase in B2M levels in plasma obtained from old animals compared to young animals (Fig. 1B), and also found a corresponding increase in B2M levels in plasma obtained from young heterochronic parabionts after exposure to blood from old animals. , compared to young isochronous parabionts (Fig. 1D). To confirm that the systemic changes observed for B2M in aging mice are related to the systemic changes occurring in humans, we measured B2M levels in stored plasma and CSF samples from healthy individuals ranging in age from 20 to 90 years (Table 1 higher). We found an age-related increase in B2M levels measured in both plasma and CSF, consistent with the changes observed in aging mice (Fig. 1E,F).

Идентифицировав B2M в качестве потенциального способствующего старению системного фактоIdentifying B2M as a potential systemic aging factor

- 30 045040 ра, авторы настоящего изобретения затем задались вопросом, может ли повышение уровня системного B2M вызывать когнитивные нарушения, напоминающие дисфункцию, связанную со старением. В качестве контроля авторами настоящего изобретения вначале тестировалось гиппокамп-зависимое обучение и память с использованием моделей радиального водного лабиринта с рукавами (RAWM) и контекстуального замирания в когорте молодых и старых необработанных животных, и связанные со старением когнитивные нарушения наблюдались в обеих моделях исследования поведения (фиг. 2А-Е). Затем авторы настоящего изобретения тестировали когнитивные способности молодых взрослых мышей, которым системно вводили растворимый белок B2M или среду посредством интраорбитальных инъекций (фиг. 1G). Животные не проявляли признаков болезни или потери массы независимо от обработки (фиг. 3А). В ходе фазы тренировки в задаче RAWM все мыши показывали подобные скорости плавания (фиг. 3В) и способность к обучению в отношении задачи (фиг. 1H). Тем не менее, в ходе фазы тестирования животные, получавшие B2M, проявляли нарушенное обучение и недостаточность памяти, совершая значительно большее число ошибок в определении местоположения целевой платформы, чем животные, получавшие контроль в виде среды (фиг. 1H). В ходе тренировки условно-рефлекторного замирания все мыши, независимо от обработки, не проявляли различий в исходном времени замирания (фиг. 3С). Тем не менее, мыши, получавшие B2M, демонстрировали уменьшенное время замирания в ходе тестирования контекстуальной памяти (фиг. 1I), но не тестирования памяти, обусловленной сигналом, (фиг. 3D) по сравнению с контрольными животными, получавшими обработку средой. В совокупности эти поведенческие данные демонстрируют, что системное введение экзогенного B2M может нарушать обучение и память.- 30 045040 pa, the authors of the present invention then asked whether increased levels of systemic B2M could cause cognitive impairment reminiscent of dysfunction associated with aging. As a control, we first tested hippocampus-dependent learning and memory using radial arm water maze (RAWM) and contextual freezing models in a cohort of young and old untreated animals, and aging-related cognitive decline was observed in both behavioral models (Fig. 2A-E). We then tested the cognitive abilities of young adult mice that were systemically administered soluble B2M protein or vehicle via intraorbital injections (Figure 1G). Animals showed no signs of illness or weight loss regardless of treatment (Fig. 3A). During the training phase of the RAWM task, all mice showed similar swimming speeds ( Fig. 3B ) and task learning ability ( Fig. 1H ). However, during the testing phase, B2M-treated animals exhibited impaired learning and memory deficits, making significantly more errors in locating the target platform than environment control animals ( Fig. 1H ). During conditioned freezing training, all mice, regardless of treatment, showed no difference in baseline freezing time ( Fig. 3C ). However, B2M-treated mice exhibited reduced freezing times during contextual memory testing ( Fig. 1I ) but not cued memory testing ( Fig. 3D ) compared with environment-treated controls. Taken together, these behavioral data demonstrate that systemic administration of exogenous B2M can impair learning and memory.

Нарушения в гиппокамп-зависимом обучении и памяти ранее связывали с пониженным нейрогенезом во взрослом возрасте (Clelland et al., A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation, Science (2009) 325:210-213; Kitamura et al., Adult neurogenesis modulates the hippocampusdependent period of associative fear memory, Cell (2009) 139:814-827; Zhang et al., A role for adult TLXpositive neural stem cells in learning and behaviour, Nature (2008) 451:1004-1007). Хотя причинноследственная связь между связанным со старением снижением когнитивных способностей и пониженным нейрогенезом во взрослом возрасте остается запутанной (Drapeau et al., Spatial memory performances of aged rats in the water maze predict levels of hippocampal neurogenesis, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (2003) 100:14385-14390; Merrill et al., Hippocampal cell genesis does not correlate with spatial learning ability in aged rats, The Journal of comparative neurology (2003) 459:201-207; Bizon & Gallagher, Production of new cells in the rat dentate gyrus over the lifespan: relation to cognitive decline, The European journal of neuroscience (2003) 18:215-219; Seib et al. Loss of Dickkopf-1 restores neurogenesis in old age and counteracts cognitive decline, Cell stem cell (2013) 12:204-214), недавние исследования с использованием гетерохронного парабиоза указывают на то, что когнитивные изменения, проявляющиеся под действием крови, являются ассоциированными с соответствующими изменениями в нейрогенезе во взрослом возрасте (Katsimpardi et al., Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors, Science (2014) 344:630-634; Villeda et al., The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function, Nature (2011) 477:90-94). Затем авторы настоящего изобретения исследовали, сопровождаются ли пониженные уровни нейрогенеза в гиппокампе во взрослом возрасте также и когнитивными нарушениями, проявляющимися при повышенном системном воздействии B2M. Используя иммуногистохимический анализ, авторы настоящего изобретения выявили значительное снижение количества даблкортин (Dcx)-положительных новых образовавшихся нейронов (фиг. 1J,K) и Mcm2-положительных предшественников (фиг. 4А) в DG мышей, которым системно вводили экзогенный B2M, по сравнению с мышами, которым вводили инъекцией контроль в виде среды. В соответствии с изменениями в нейрогенезе авторами настоящего изобретения было выявлено уменьшение количества пролиферирующих клеток с включенным бромдезоксиуридином (BrdU) у животных, которым вводили инъекцией B2M, по сравнению со животными, которым вводили среду (фиг. 4В). Эти данные указывают на то, что системное воздействие экзогенного B2M является достаточным для снижения нейрогенеза во взрослом возрасте.Impairments in hippocampal-dependent learning and memory have previously been associated with reduced neurogenesis in adulthood (Clelland et al., A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation, Science (2009) 325:210–213; Kitamura et al., Adult neurogenesis modulates the hippocampus-dependent period of associative fear memory, Cell (2009) 139:814–827; Zhang et al., A role for adult TLXpositive neural stem cells in learning and behavior, Nature (2008) 451:1004–1007). Although the causal relationship between aging-related cognitive decline and reduced neurogenesis in adulthood remains unclear (Drapeau et al., Spatial memory performance of aged rats in the water maze predict levels of hippocampal neurogenesis, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (2003) 100:14385-14390; Merrill et al., Hippocampal cell genesis does not correlate with spatial learning ability in aged rats, The Journal of comparative neurology (2003) 459:201-207; Bizon & Gallagher, Production of new cells in the rat dentate gyrus over the lifespan: relation to cognitive decline, The European journal of neuroscience (2003) 18:215-219; Seib et al. Loss of Dickkopf-1 restores neurogenesis in old age and counteracts cognitive decline, Cell stem cell (2013) 12:204–214), recent studies using heterochronic parabiosis indicate that blood-induced cognitive changes are associated with corresponding changes in neurogenesis in adulthood (Katsimpardi et al., Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors, Science (2014) 344:630–634; Villeda et al., The aging systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function, Nature (2011) 477:90-94). We next examined whether reduced levels of hippocampal neurogenesis in adulthood are also accompanied by cognitive impairment associated with increased systemic exposure to B2M. Using immunohistochemical analysis, we found a significant reduction in the number of doublecortin (Dcx)-positive new neurons generated (Fig. 1J,K) and Mcm2-positive progenitors (Fig. 4A) in the DG of mice systemically administered exogenous B2M compared with mice that were injected with a control medium. Consistent with changes in neurogenesis, we observed a decrease in the number of bromodeoxyuridine (BrdU)-incorporated proliferating cells in B2M-injected animals compared to medium-injected animals (Figure 4B). These data indicate that systemic exposure to exogenous B2M is sufficient to reduce neurogenesis in adulthood.

Для определения того, сопровождались ли системные связанные со старением изменения уровней B2M также локальными изменениями в головном мозге, авторами настоящего изобретения измерялись уровни B2M в гиппокампе молодых и старых животных с помощью анализа методом Вестерн-блоттинга и было выявлено связанное со старением повышение уровня белка B2M (фиг. 5А). Затем авторы настоящего изобретения задались вопросом, являются ли системные изменения уровней B2M, проявляющиеся при гетерохронном парабиозе, также ассоциироваными с соответствующими локальными изменениями в молодом гиппокампе после воздействия системного окружения старого животного. Авторами настоящего изобретения было выявлено повышение уровня экспрессии B2M белка в лизатах гиппокампа от молодых гетерохронных парабионтов по сравнению с молодыми изохронными контролями (фиг. 5В). В совокупности эти данные показывают, что связанные со старением изменения уровня B2M, наблюдаемые в системном окружении, сопровождаются соответствующими изменениями в головном мозге.To determine whether systemic aging-associated changes in B2M levels were also accompanied by local changes in the brain, we measured B2M levels in the hippocampus of young and old animals using Western blot analysis and found an aging-associated increase in B2M protein levels ( Fig. 5A). We then asked whether the systemic changes in B2M levels seen in heterochronic parabiosis are also associated with corresponding local changes in the young hippocampus following exposure to the systemic environment of the old animal. We found an increase in the expression level of B2M protein in hippocampal lysates from young heterochronic parabionts compared to young isochronic controls (Fig. 5B). Taken together, these data indicate that aging-associated changes in B2M levels observed in the systemic environment are accompanied by corresponding changes in the brain.

Для исследования эффекта локального воздействия экзогенного B2M в отношении обучения и памяти авторы настоящего изобретения вводили B2M или контроль в виде среды посредством билатеральных стереотаксических инъекций с последующим тестированием когнитивных функций с использованиTo investigate the effect of local exposure to exogenous B2M on learning and memory, we administered B2M or a vehicle control via bilateral stereotactic injections, followed by cognitive testing using

- 31 045040 ем RAWM и контекстуального замирания (фиг. 5С). Все мыши показывали подобные скорости плавания (фиг. 6А) и способность к обучению (фиг. 5D) в ходе фазы тренировки в задаче RAWM. В ходе фазы тестирования животные, получавшие B2M, совершали значительно большее количество ошибок в определении местоположения целевой платформы, чем животные, получавшие контроль в виде среды (фиг. 5D). В ходе тренировки условно-рефлекторного замирания ни одна из мышей не проявляла различий в исходном времени замирания (фиг. 6В). Тем не менее, мыши, получавшие B2M демонстрировали уменьшенное время замирания в ходе тестирования контекстуальной памяти (фиг. 5Е), но не тестирования памяти, обусловленной сигналом, (фиг. 6С). Эти данные функциональных исследований указывают на то, что локальное воздействие B2M в DG нарушает обучение и память.- 31 045040 we eat RAWM and contextual fading (Fig. 5C). All mice showed similar swimming speeds (Figure 6A) and learning abilities (Figure 5D) during the training phase of the RAWM task. During the test phase, B2M-treated animals made significantly more errors in locating the target platform than did environment control animals ( Fig. 5D ). During conditioned freezing training, neither mouse showed differences in initial freezing time ( Fig. 6B ). However, B2M-treated mice showed reduced freezing time during contextual memory testing (Figure 5E) but not cued memory testing (Figure 6C). These data from functional studies indicate that local exposure to B2M in the DG impairs learning and memory.

Для оценки эффекта локального воздействия экзогенного B2M в головном мозге, авторы настоящего изобретения вводили с помощью стереотаксической инъекции B2M в правую DG и контроль в виде среды в левую контралатеральную DG молодых взрослых мышей. Локальное воздействие B2M на DG приводило в результате к снижению количества Dcx-положительных клеток по сравнению с контралатеральной DG, обработанной контролем в виде среды (фиг. 5F,G). С учетом того, что B2M является активным компонентом комплекса МНС I за счет нековалентных взаимодействий на клеточной поверхности, авторы настоящего изобретения затем исследовали, опосредовался ли ингибирующий эффект экзогенного B2M в отношении нейрогенеза во взрослом возрасте экспрессией МНС I на клеточной поверхности. Белок-транспортер 1, связанный с процессингом антигена, (Tapi) требуется для транспорта молекул МНС I к клеточной поверхности, и отсутствие Tap1 приводит в результате к тому, что очень немногие классические молекулы МНС I достигают поверхности клетки (Boulanger & Shatz, Immune signalling in neural development, synaptic plasticity and disease, Nature reviews. Neuroscience (2004) 5:521-531; Shatz, MHC class I: an unexpected role in neuronal plasticity, Neuron (2009) 64:40-45; Van Kaer et al., TAP1 mutant mice are deficient in antigen presentation, surface class I molecules, and CD4-8+ T cells, Cell (1992) 71:1205-1214). Таким образом, для исследования того, может ли пониженная экспрессия МНС I на поверхности клетки ослаблять ингибирующий эффект экзогенного B2M, авторы настоящего изобретения вводили посредством стереотаксической инъекции молодым взрослым мышам, нокаутным по Tap1 (Tap1’^/_), B2M в правую DG и контроль в виде среды в левую контралатеральную DG. Наблюдали отсутствие различий в количестве Dcx-положительных клеток между DG, обработанной B2M, в сравнении с DG, обработанной контролем, у ТАРГ/' мышей (фиг. 5F,H). В соответствии с предыдущими сообщениями (Laguna Goya et al., Adult neurogenesis is unaffected by a functional knock-out of MHC class I in mice, Neuroreport (2010) 21:349-353) авторы настоящего изобретения наблюдали отсутствие отличий в фоновых уровнях нейрогенеза между молодыми взрослыми Tap1^-/’ животными и однопометными животными дикого типа (WT) (фиг. 7А). В совокупности эти данные говорят о том, что повышенные локальные уровни экзогенного B2M являются достаточными для снижения нейрогенеза во взрослом возрасте зависимым от классического МНС I образом.To evaluate the effect of local exposure to exogenous B2M in the brain, we stereotaxically injected B2M into the right DG and a vehicle control into the left contralateral DG of young adult mice. Local exposure of the DG to B2M resulted in a reduction in the number of Dcx-positive cells compared to the contralateral DG treated with the media control (Figure 5F,G). Given that B2M is an active component of the MHC I complex through non-covalent cell surface interactions, we next examined whether the inhibitory effect of exogenous B2M on adult neurogenesis was mediated by cell surface expression of MHC I. Antigen processing-associated transporter protein 1 (Tapi) is required for the transport of MHC I molecules to the cell surface, and the absence of Tap1 results in very few classical MHC I molecules reaching the cell surface (Boulanger & Shatz, Immune signaling in neural development, synaptic plasticity and disease, Nature reviews. Neuroscience (2004) 5:521-531; Shatz, MHC class I: an unexpected role in neuronal plasticity, Neuron (2009) 64:40-45; Van Kaer et al., TAP1 mutant mice are deficient in antigen presentation, surface class I molecules, and CD4-8+ T cells, Cell (1992) 71:1205-1214). Thus, to investigate whether reduced cell surface expression of MHC I could attenuate the inhibitory effect of exogenous B2M, we administered B2M in the right DG and control in the right DG by stereotaxic injection to young adult Tap1 knockout mice (Tap1' ^/_ ). view of the environment in the left contralateral DG. There was no difference in the number of Dcx-positive cells between B2M-treated DG compared to control-treated DG in TARG/' mice (Fig. 5F,H). Consistent with previous reports (Laguna Goya et al., Adult neurogenesis is unaffected by a functional knock-out of MHC class I in mice, Neuroreport (2010) 21:349-353), we observed no differences in background levels of neurogenesis between young adult Tap1 ^−/ ′ animals and wild-type (WT) littermates (Fig. 7A). Taken together, these data suggest that elevated local levels of exogenous B2M are sufficient to reduce neurogenesis in adulthood in a classical MHC I-dependent manner.

Затем авторы настоящего изобретения решили изучить, может ли снижение экспрессии МНС I на поверхности клеток отчасти ослаблять отрицательные эффекты крови старого животного в отношении нейрогенеза во взрослом возрасте, проявляющиеся при гетерохронном парабиозе (фиг. 8А). В соответствии с предыдущими сообщениями (Katsimpardi et al., Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors, Science (2014) 344:630-634; Villeda et al., The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function, Nature (2011) 477: 90-94) авторы настоящего изобретения наблюдали снижение количества Dcx-положительных незрелых нейронов (фиг. 8В,С), Tbr2положительных предшественников (фиг. 9А,В) и BrdU-положительных пролиферирующих клеток (фиг. 8D) у молодых гетерохронных парабионтов дикого типа по сравнению с молодыми изохронными парабионтами дикого типа. В отличие от этого, авторы настоящего изобретения не выявили сильных изменений уровней нейрогенеза у молодых TapΓ^/’гетерохронных парабионтов (фиг. 8B-D). В качестве контроля выявили отсутствие изменений нейрогенеза между молодыми изохронными парабионтами дикого типа и молодыми Tap1^-/’ изохронными парабионтами (фиг. 7B-D). В совокупности эти данные дополнительно подтверждают роль способствующих старению факторов в качестве движущих сил нарушения регенерации во взрослом головном мозге и, более того, вовлеченность молекул МНС I в этот процесс.We next decided to examine whether decreased cell surface expression of MHC I could partially attenuate the negative effects of aged blood on adult neurogenesis seen in heterochronic parabiosis (FIG. 8A). Consistent with previous reports (Katsimpardi et al., Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors, Science (2014) 344:630–634; Villeda et al., The aging systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function , Nature (2011) 477: 90-94) the present inventors observed a decrease in the number of Dcx-positive immature neurons (Fig. 8B,C), Tbr2-positive progenitors (Fig. 9A,B) and BrdU-positive proliferating cells (Fig. 8D) in young heterochronic wild-type parabionts compared with young isochronous wild-type parabionts. In contrast, we did not detect strong changes in neurogenesis levels in young TapΓ ^/ ' heterochronic parabionts (Fig. 8B-D). As a control, there was no change in neurogenesis between young isochronous wild-type parabionts and young Tap1 ^-/ ' isochronous parabionts (Fig. 7B-D). Taken together, these data further support the role of pro-aging factors as drivers of impaired regeneration in the adult brain and, furthermore, the involvement of MHC I molecules in this process.

Наконец, авторы настоящего изобретения изучали, какое потенциальное благоприятное воздействие может оказать устранение эндогенной экспрессии B2M в отношении связанного со старением снижения когнитивных способностей, наблюдаемого в ходе старения. Авторами настоящего изобретения использовались нокаутные по B2M мыши (B2M’^/_), у которых отсутствовала экспрессия белка как в системном окружении, так и локально в головном мозге. Авторами настоящего изобретения оценивалось гиппокамп-зависимое обучение и память у молодых и старых B2M⁷’ и контролей WT (дикий тип) с использованием RAWM и контекстуального замирания. У молодых животных наблюдали отсутствие различий в пространственном обучении и памяти между B2M’/’ и контролями WT в ходе тренировки или тестирования в модели RAWM (фиг. 10А). Интересно, что старые B2M’/’ мыши проявляли улучшенную способность к пространственному обучению в ходе фазы тренировки в модели RAWM, а также улучшенное обучение и память при определении местонахождения платформы в ходе фазы тестирования в задаче по сравнению с контролями WT (фиг. 10С). Животные в каждой возрастной группе не проявлялиFinally, we examined the potential beneficial effects of eliminating endogenous B2M expression on the age-related cognitive decline observed during aging. We used B2M knockout mice (B2M' ^/_ ) that lacked protein expression both systemically and locally in the brain. We assessed hippocampus-dependent learning and memory in young and old B2M ⁷ ' and WT controls using RAWM and contextual freezing. In young animals, no differences in spatial learning and memory were observed between B2M'/' and WT controls during training or testing in the RAWM model (Fig. 10A). Interestingly, aged B2M'/' mice exhibited improved spatial learning ability during the training phase of the RAWM model, as well as improved learning and memory for platform location during the testing phase of the task compared to WT controls (Fig. 10C). Animals in each age group did not show

- 32 045040 различий в скорости плавания вне зависимости от генотипа (фиг. 11A,D). В ходе тренировки с замиранием все мыши проявляли подобное исходное замирание независимо от генотипа (фиг. 11В,Е). Кроме того, отсутствие различий в замирании наблюдали у молодых B2M^-/- мышей и мышей WT в моделях контекстуального замирания (фиг. 10В) или условно-рефлекторного замирания, обусловленного сигналом (фиг. 11С). Тем не менее, старые B2M’/’ мыши демонстрировали значительно повышенное замирание в тестировании контекстуальной памяти (фиг. 10D), но не в тестировании памяти, обусловленной сигналом, (фиг. 11F) по сравнению с контролями WT. Эти данные указывают на то, что отсутствие эндогенного B2M ослабляет связанные со старением нарушения в гиппокамп-зависимом обучении и памяти у старых животных, дополнительно указывая на вовлеченность B2M в качестве способствующего старению фактора, опосредующего снижение когнитивных способностей в ходе старения.- 32 045040 differences in swimming speed regardless of genotype (Fig. 11A,D). During freezing training, all mice exhibited similar initial freezing behavior regardless of genotype (Fig. 11B,E). In addition, no differences in freezing were observed in young B2M ^−/− mice and WT mice in models of contextual freezing (Fig. 10B) or cued conditioned freezing (Fig. 11C). However, aged B2M'/' mice exhibited significantly increased freezing in the contextual memory test (Fig. 10D) but not in the cued memory test (Fig. 11F) compared to WT controls. These data indicate that the absence of endogenous B2M attenuates aging-related impairments in hippocampal-dependent learning and memory in aged animals, further implicating B2M as an aging-promoting factor mediating cognitive decline during aging.

Затем авторы настоящего изобретения изучали, может ли отсутствие эндогенного B2M также противодействовать связанному со старением снижению нейрогенеза во взрослом возрасте. Авторами настоящего изобретения оценивались изменения в нейрогенезе у молодых и старых взрослых B2M’/’ животных и однопометных животных WT с помощью иммуногистохимического анализа. Авторы настоящего изобретения наблюдали, что у молодых взрослых животных отсутствие эндогенной экспрессии B2M не оказывало эффекта на количество Dcx-положительных клеток (фиг. 10E,F). Важно, что у старых животных авторы настоящего изобретения наблюдали почти 2-кратное повышение количества Dcxположительных новых образовавшихся нейронов у B2M’^/’мышей по сравнению с однопометными животными дикого типа (фиг. 10E,G). В соответствии с полученными авторами данными относительно Dcx авторами настоящего изобретения не было выявлено изменений в пролиферации при мечении BrdU у молодых животных вне зависимости от экспрессии B2M (фиг. 12А). Тем не менее, у старых B2M’/’ животных проявлялось значительное повышение количества BrdU-положительных клеток по сравнению с контролями WT (фиг. 12В). Затем авторы настоящего изобретения оценивали дифференцировку и выживание нейронов у B2M⁷’ мышей с использованием модели с длительным включением BrdU, в которой зрелые дифференцированные нейроны экспрессируют как BrdU, так и маркер нейронов NeuN (фиг. 10Н). У молодых взрослых B2M’/’ мышей не проявлялись различия в проценте клеток, экспрессирующих как BrdU, так и NeuN, по сравнению с их аналогами WT (фиг. 10I); тогда как у старых взрослых B2M⁷’ мышей проявлялось значительное повышение процента клеток, которые экспрессировали как BrdU, так и NeuN, по сравнению с однопометными животными WT того же возраста (фиг. 10J). Авторами настоящего изобретения не было выявлено различий в дифференцировке астроцитов в любом возрасте, что количественно определялось как процент клеток, экспрессирующих маркеры BrdU и GFAP (фиг. 12С-Е). В совокупности эти данные указывают на то, что потеря эндогенного B2M повышает уровни нейрогенеза в старом головном мозге, но не в молодом головном мозге, указывая на активную роль B2M в снижении способности к регенерации в ходе старения.We next examined whether the absence of endogenous B2M could also counteract the aging-associated decline in neurogenesis in adulthood. We have assessed changes in neurogenesis in young and old adult B2M'/' animals and WT littermates using immunohistochemical analysis. We observed that in young adult animals, the absence of endogenous B2M expression had no effect on the number of Dcx-positive cells (Fig. 10E,F). Importantly, in aged animals, we observed an almost 2-fold increase in the number of Dcx-positive new neurons generated in B2M' ^/ 'mice compared to wild-type littermates (Figure 10E,G). Consistent with our findings regarding Dcx, we found no change in proliferation upon BrdU labeling in young animals, regardless of B2M expression (FIG. 12A). However, aged B2M'/' animals showed a significant increase in the number of BrdU-positive cells compared to WT controls (Fig. 12B). We then assessed neuronal differentiation and survival in B2M ⁷ ' mice using a chronic BrdU incorporation model in which mature differentiated neurons express both BrdU and the neuronal marker NeuN (Figure 10H). Young adult B2M'/' mice showed no difference in the percentage of cells expressing both BrdU and NeuN compared to their WT counterparts (Fig. 10I); whereas aged adult B2M ⁷ ' mice exhibited a significant increase in the percentage of cells that expressed both BrdU and NeuN compared to age-matched WT littermates (Figure 10J). We found no differences in astrocyte differentiation at any age, as quantified as the percentage of cells expressing BrdU and GFAP markers (Fig. 12C-E). Taken together, these data indicate that loss of endogenous B2M increases levels of neurogenesis in the aged brain, but not in the young brain, suggesting an active role for B2M in the decline in regenerative capacity during aging.

Продолжает демонстрироваться особенная вовлеченность B2M во взаимодействии с молекулами МНС I в патологический процесс в ЦНС (Lee et al., Synapse elimination and learning rules co-regulated by MHC class I H2-Db, Nature (2014) 509:195-200; Boulanger & Shatz, Immune signalling in neural development, synaptic plasticity and disease, Nature reviews. Neuroscience (2004) 5:521-531; Shatz, MHC class I: an unexpected role in neuronal plasticity, Neuron (2009) 64:40-45; Huh et al., Functional requirement for class I MHC in CNS development and plasticity, Science (2000) 290:2155-2159; Goddard et al., Regulation of CNS synapses by neuronal MHC class I, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (2007) 104:6828-6833; Glynn et al., MHCI negatively regulates synapse density during the establishment of cortical connections, Nature neuroscience (2011) 14:442-451), причем в недавних исследованиях начинают изучать лечебный эффект устранения экспрессии МНС I в моделях повреждения головного мозга, такого как инсульт (Adelson et al., Neuroprotection from stroke in the absence of MHCI or PirB, Neuron (2012) 73:1100-1107). Тем не менее, функциональное воздействие этих молекул или на ЦНС, или на периферические ткани в ходе старения все еще не исследовалось. Таким образом, данное исследование проливает свет на ранее неизвестную роль B2M в прогрессировании связанных со старением нарушений как когнитивных, так и регенеративных процессов. Более того, данное исследование также указывает на влияние экспрессии МНС I на поверхности клеток в частичном опосредовании отрицательных эффектов B2M и гетерохронного парабиоза в отношении регенеративной функции. Примечательно, что в исследованиях с полногеномным поиском ассоциаций (GWAS) обнаружили связь локуса МНС на хромосоме 6р21 с дегенеративными заболеваниями при старении, что говорит об активной роли этих молекул в возрастных нарушениях (Jeck et al., Review: a meta-analysis of GWAS and age-associated diseases, Aging cell (2012) 11:727-731). Полученные данные теперь обеспечивают функциональное подтверждение такого воздействия в фенотипах, характерных для старения. Полученные авторами настоящего изобретения данные обеспечивают понимание механизма того, как связанные со старением изменения в системном окружении запускают нарушения локально в старом головном мозге, и подчеркивают вовлеченность молекул B2M и МНС I в этот процесс. С точки зрения дальнейшего развития, полученные данные показывают, что связанная со старением когнитивная и регенеративная дисфункция, наблюдаемая в ходе старения, может быть ослаблена посредством целенаправленного воздействия на B2M в пожилом возрасте.The particular involvement of B2M in interaction with MHC I molecules in the pathological process in the central nervous system continues to be demonstrated (Lee et al., Synapse elimination and learning rules co-regulated by MHC class I H2-Db, Nature (2014) 509:195-200; Boulanger & Shatz, Immune signaling in neural development, synaptic plasticity and disease, Nature reviews. Neuroscience (2004) 5:521-531; Shatz, MHC class I: an unexpected role in neuronal plasticity, Neuron (2009) 64:40-45; Huh et al., Functional requirement for class I MHC in CNS development and plasticity, Science (2000) 290:2155–2159; Goddard et al., Regulation of CNS synapses by neuronal MHC class I, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (2007) 104:6828–6833; Glynn et al., MHCI negatively regulates synapse density during the establishment of cortical connections, Nature neuroscience (2011) 14:442–451), with recent studies beginning to examine the treatment effect eliminating MHC I expression in models of brain injury such as stroke (Adelson et al., Neuroprotection from stroke in the absence of MHCI or PirB, Neuron (2012) 73:1100-1107). However, the functional effects of these molecules on either the central nervous system or peripheral tissues during aging have not yet been investigated. In summary, this study sheds light on a previously unknown role of B2M in the progression of aging-related impairments in both cognitive and regenerative processes. Moreover, this study also indicates the influence of cell surface MHC I expression in partially mediating the negative effects of B2M and heterochronic parabiosis on regenerative function. Notably, genome-wide association studies (GWAS) have found an association of the MHC locus on chromosome 6p21 with degenerative diseases in aging, suggesting an active role for these molecules in age-related disorders (Jeck et al., Review: a meta-analysis of GWAS and age-associated diseases, Aging cell (2012) 11:727-731). The findings now provide functional support for such effects in phenotypes characteristic of aging. Our findings provide mechanistic insight into how aging-related changes in the systemic environment trigger disorders locally in the aged brain and highlight the involvement of B2M and MHC I molecules in this process. From a future development perspective, the findings suggest that age-related cognitive and regenerative dysfunction observed during aging may be attenuated by targeting B2M in old age.

- 33 045040- 33 045040

III. Определение относительных уровней B2M.III. Determination of relative B2M levels.

Относительные уровни бета-2-микроглобулина определяли в образцах плазмы крови здоровых мужчин-доноров возрастом 18, 30, 45, 55 и 66 лет с помощью протеомного анализа SomaScan (Somalogic, Inc, Boulder, CO). Для каждой возрастной группы плазму крови от 40 индивидов анализировали в виде 8 пулов из 5 индивидов на группу. Статистический анализ выполняли с использованием двухстороннего tкритерия Стьюдента с логарифмическим преобразованием значений, в также с помощью анализа тенденций изменения для непреобразованных данных с использованием критерия Джонкхиера-Терпстра. Наблюдаемые изменения считались высоко значимыми, когда р-значение с t-критерием составляло 1,1х10^-4 (возраст 66 лет в сравнении возрастом 18 лет), и р-значение для JT-критерия составляло 1,3х 10^-7(все возрастные группы). (RFU относится к относительным единицам флуоресценции в протеомном анализе SomaScan). Результаты графически проиллюстрированы на фиг. 13.Relative beta-2-microglobulin levels were determined in plasma samples from healthy male donors aged 18, 30, 45, 55, and 66 years using the SomaScan proteomic assay (Somalogic, Inc, Boulder, CO). For each age group, blood plasma from 40 individuals was analyzed in 8 pools of 5 individuals per group. Statistical analysis was performed using a two-tailed Student's t test with log-transformed values, and trend analysis for untransformed data using the Jonckheere-Terpstra test. Observed changes were considered highly significant when the t-test p-value was 1.1 x 10 ^-4 (age 66 vs. age 18) and the JT test p-value was 1.3 x 10 ^-7 (all age groups ). (RFU refers to relative fluorescence units in SomaScan proteomic analysis). The results are graphically illustrated in FIG. 13.

Безотносительно к прилагаемым пунктам, настоящее раскрытие также определяется следующими пунктами.Notwithstanding the accompanying paragraphs, this disclosure is also qualified by the following paragraphs.

1. Способ лечения взрослого млекопитающего от нарушения, ассоциированного со старением, причем способ предусматривает: снижение уровня в2-микроглобулина (B2M) у млекопитающего в степени, достаточной для лечения взрослого млекопитающего от нарушения, ассоциированного со старением.1. A method of treating an adult mammal for a disorder associated with aging, the method comprising: reducing the level of β2-microglobulin (B2M) in the mammal to an extent sufficient to treat the adult mammal for a disorder associated with aging.

2. Способ в соответствии с п.1, причем способ предусматривает снижение системного B2M у млекопитающего.2. The method according to claim 1, wherein the method involves reducing systemic B2M in a mammal.

3. Способ в соответствии с п.2, причем системный B2M у млекопитающего снижают посредством удаления B2M из крови млекопитающего.3. The method according to claim 2, wherein systemic B2M in the mammal is reduced by removing B2M from the blood of the mammal.

4. Способ в соответствии с п.3, причем способ предусматривает экстракорпоральное удаление B2M из крови млекопитающего.4. The method according to claim 3, wherein the method comprises extracorporeal removal of B2M from the blood of a mammal.

5. Способ в соответствии с п.1, причем уровень B2M снижают посредством введения млекопитающему эффективного количества средства, снижающего уровень B2M.5. The method according to claim 1, wherein the B2M level is reduced by administering to the mammal an effective amount of a B2M level-lowering agent.

6. Способ в соответствии с п.5, причем средство, снижающее уровень B2M, представляет собой средство, связывающее B2M.6. The method according to claim 5, wherein the B2M-lowering agent is a B2M-binding agent.

7. Способ в соответствии с п.6, причем средство, связывающее B2M, содержит антитело или его связывающий фрагмент.7. The method according to claim 6, wherein the B2M binding agent comprises an antibody or a binding fragment thereof.

8. Способ в соответствии с п.6, причем средство, связывающее B2M, содержит малую молекулу.8. The method according to claim 6, wherein the B2M binding agent comprises a small molecule.

9. Способ в соответствии с п.5, причем средство, снижающее уровень B2M, содержит средство, ингибирующее экспрессию B2M.9. The method according to claim 5, wherein the B2M level-lowering agent comprises an agent that inhibits B2M expression.

10. Способ в соответствии с п.9, причем средство, ингибирующее экспрессию B2M, содержит нуклеиновую кислоту.10. The method according to claim 9, wherein the agent inhibiting B2M expression contains a nucleic acid.

11. Способ в соответствии с любым из предыдущих пунктов, причем млекопитающее представляет собой примата.11. A method according to any of the preceding paragraphs, wherein the mammal is a primate.

12. Способ в соответствии с п.11, причем примат представляет собой человека.12. The method according to claim 11, wherein the primate is a human.

13. Способ в соответствии с любым из предыдущих пунктов, причем взрослое млекопитающее представляет собой пожилое млекопитающее.13. A method according to any of the preceding claims, wherein the adult mammal is an elderly mammal.

14. Способ в соответствии с п.13, причем пожилое млекопитающее представляет собой человека возрастом 60 лет или старше.14. The method according to claim 13, wherein the elderly mammal is a human being 60 years of age or older.

15. Способ в соответствии с любым из предыдущих пунктов, причем нарушение, ассоциированное со старением, включает когнитивное нарушение.15. A method according to any of the preceding claims, wherein the disorder associated with aging includes cognitive impairment.

16. Способ в соответствии с любым из предыдущих пунктов, причем взрослое млекопитающее страдает от болезненного состояния, ассоциированного со старением.16. A method according to any of the preceding claims, wherein the adult mammal suffers from a disease condition associated with aging.

17. Способ в соответствии с любым из предыдущих пунктов, причем болезненное состояние, ассоциированное со старением, представляет собой болезненное состояние со снижением когнитивных способностей.17. A method according to any of the preceding claims, wherein the disease state associated with aging is a disease state of cognitive decline.

Предшествующее описание только иллюстрирует принципы настоящего изобретения. Будет понятно, что специалисты в данной области техники будут способны разработать различные схемы, которые, хотя и не описаны явно или показаны в данном документе, воплощают принципы настоящего изобретения и включены в его идею и объем. Более того, все примеры и условные обозначения, упомянутые в данном документе, преимущественно предназначены для того, чтобы помочь лицу, изучающему заявку, в понимании принципов настоящего изобретения и идей, вклад в распространение которых в данной области техники был сделан авторами настоящего изобретения, и их следует толковать без ограничения такими специально упомянутыми примерами и условиями. Помимо этого, предполагается, что все утверждения в данном документе, излагающие принципы, аспекты и варианты осуществления настоящего изобретения, а также их конкретные примеры, охватывают как свои структурные, так и функциональные эквиваленты. Кроме того, предполагается, что такие эквиваленты включают в себя как известные в настоящее время эквиваленты, так и эквиваленты, которые будут разработаны в будущем, т.е. любые разработанные элементы, которые выполняют ту же функцию вне зависимости от структуры. Таким образом, не предполагается, что объем настоящего изобретения ограничивается иллюстративными варианта- 34 045040 ми осуществления, показанными и описанными в данном документе. Скорее, объем и идея настоящего изобретения заключены в прилагаемых пунктах формулы изобретения.The previous description only illustrates the principles of the present invention. It will be understood that those skilled in the art will be able to develop various circuits that, although not explicitly described or shown herein, embody the principles of the present invention and are included within the spirit and scope thereof. Moreover, all examples and symbols mentioned herein are primarily intended to assist the student of the application in understanding the principles of the present invention and the ideas which the inventors of the present invention have contributed to the dissemination of in the art. shall be construed without limitation to such specifically mentioned examples and conditions. In addition, all statements herein setting forth the principles, aspects and embodiments of the present invention, as well as specific examples thereof, are intended to cover both their structural and functional equivalents. In addition, it is intended that such equivalents include both currently known equivalents and equivalents that will be developed in the future, i.e. any designed elements that perform the same function regardless of structure. Thus, it is not intended that the scope of the present invention be limited to the exemplary embodiments shown and described herein. Rather, the scope and spirit of the present invention is embodied in the appended claims.

Claims

1. Способ лечения, ассоциированного со старением нейродегенеративного нарушения у взрослого млекопитающего, причем способ предусматривает экстракорпоральное удаление системного β2микроглобулина (B2M) из крови взрослого млекопитающего для лечения, ассоциированного со старением нейродегенеративного нарушения у взрослого млекопитающего.1. A method of treating an aging-associated neurodegenerative disorder in an adult mammal, the method comprising extracorporeal removal of systemic β2microglobulin (B2M) from the blood of an adult mammal to treat an aging-associated neurodegenerative disorder in an adult mammal.

2. Способ по п.1, где B2M удаляют экстракорпорально с помощью абсорбирующего B2M компонента.2. The method according to claim 1, wherein B2M is removed extracorporeally using a B2M absorbent component.

3. Способ по п.2, где абсорбирующий B2M компонент включает антитело или его связывающий фрагмент.3. The method of claim 2, wherein the B2M absorbent component comprises an antibody or a binding fragment thereof.

4. Способ по п.2, где абсорбирующий B2M компонент содержит малую молекулу.4. The method of claim 2, wherein the B2M absorbent component comprises a small molecule.

5. Способ по п.1, где B2M удаляют экстракорпорально с помощью фильтрующего B2M компонента.5. The method according to claim 1, where B2M is removed extracorporeally using a B2M filtering component.

6. Способ по п.1, в котором B2M удаляют экстракорпорально с помощью связывающего B2M элемента, устойчиво ассоциированного с твердой подложкой.6. The method of claim 1, wherein B2M is removed extracorporeally using a B2M binding element stably associated with a solid support.

7. Способ по любому из предыдущих пунктов, причем млекопитающее представляет собой примата.7. The method according to any of the previous claims, wherein the mammal is a primate.

8. Способ по п.7, причем примат представляет собой человека.8. The method according to claim 7, wherein the primate is a human.

9. Способ по любому из предыдущих пунктов, причем взрослое млекопитающее представляет собой пожилое млекопитающее.9. The method as claimed in any one of the preceding claims, wherein the adult mammal is an elderly mammal.

10. Способ по п.9, причем пожилое млекопитающее представляет собой человека возрастом 60 лет или старше.10. The method of claim 9, wherein the elderly mammal is a human being 60 years of age or older.

11. Способ по любому из предыдущих пунктов, где ассоциированное со старением нейродегенеративное нарушение дополнительно включает когнитивное нарушение.11. The method of any one of the preceding claims, wherein the aging-associated neurodegenerative disorder further includes a cognitive impairment.

12. Способ по п.11, где взрослое млекопитающее страдает от лобно-височной деменции.12. The method of claim 11, wherein the adult mammal suffers from frontotemporal dementia.

13. Способ по п.11, где взрослое млекопитающее страдает от сосудистой деменцией.13. The method according to claim 11, wherein the adult mammal suffers from vascular dementia.

14. Способ по любому из пп.1-10, где взрослое млекопитающее страдает нейродегенеративным заболеванием, выбранным из группы, состоящей из бокового амиотрофического склероза, рассеянного склероза, глаукомы, миотонической дистрофии, прогрессирующего надъядерного паралича, атаксии, мультисистемной атрофии и спинальной мышечной атрофии.14. The method according to any one of claims 1 to 10, wherein the adult mammal suffers from a neurodegenerative disease selected from the group consisting of amyotrophic lateral sclerosis, multiple sclerosis, glaucoma, myotonic dystrophy, progressive supranuclear palsy, ataxia, multiple system atrophy and spinal muscular atrophy.

15. Способ по п.14, в котором взрослое млекопитающее страдает боковым амиотрофическим склерозом.15. The method of claim 14, wherein the adult mammal suffers from amyotrophic lateral sclerosis.

16. Способ по п.14, где взрослое млекопитающее страдает рассеянным склерозом.16. The method according to claim 14, wherein the adult mammal suffers from multiple sclerosis.

17. Способ по п.14, где взрослое млекопитающее страдает глаукомой.17. The method according to claim 14, wherein the adult mammal suffers from glaucoma.

18. Способ по п.14, где взрослое млекопитающее страдает от миотонической дистрофии.18. The method of claim 14, wherein the adult mammal suffers from myotonic dystrophy.

19. Способ по п.14, где взрослое млекопитающее страдает прогрессирующим надъядерным параличом.19. The method of claim 14, wherein the adult mammal suffers from progressive supranuclear palsy.

20. Способ по п.14, где взрослое млекопитающее страдает атаксией.20. The method according to claim 14, wherein the adult mammal suffers from ataxia.

21. Способ по п.14, где взрослое млекопитающее страдает от мультисистемной атрофии.21. The method of claim 14, wherein the adult mammal suffers from multiple system atrophy.

22. Способ по п.14, где взрослое млекопитающее страдает спинальной мышечной атрофией.22. The method of claim 14, wherein the adult mammal suffers from spinal muscular atrophy.