EA044887B1

EA044887B1 - COMBINATION TREATMENT USING HUMAN GROWTH AND DIFFERENTIATION FACTOR 15 (GDF-15) INHIBITORS AND IMMUNE CHECKPOINT BLOCKERS

Info

Publication number: EA044887B1
Application number: EA201890850
Authority: EA
Inventors: Йорг Вишхузен; Маркус Хааке; Райнхард Думмер; Маттиас Мелинг; Тина Шефер; Мартина Зелле
Original assignee: Юлиус-Максимилианс-Универзитет Вюрцбург
Priority date: 2015-10-02
Filing date: 2016-09-30
Publication date: 2023-10-09

Description

Область изобретенияField of invention

Настоящее изобретение относится к применению ингибиторов человеческого фактора роста и дифференцировки 15 (GDF-15), и к комбинированному применению таких ингибиторов с блокаторами контрольных точек иммунного ответа при лечении солидных злокачественных опухолей.The present invention relates to the use of human growth and differentiation factor 15 (GDF-15) inhibitors, and to the combined use of such inhibitors with immune checkpoint blockers in the treatment of solid cancers.

Предшествующий уровень техникиPrior Art

В настоящее время многие злокачественные опухоли по-прежнему остаются областями неудовлетворенных медицинских потребностей, и, таким образом, необходимы способы для более эффективного лечения злокачественных опухолей.At present, many cancers still remain areas of unmet medical need, and thus, methods for more effectively treating cancers are needed.

Известно, что многие типы злокачественных опухолей экспрессируют факторы роста, в том числе такие факторы, как VEGF, PDGF, TGF-β и GDF-15.Many types of malignant tumors are known to express growth factors, including factors such as VEGF, PDGF, TGF-β and GDF-15.

GDF-15, фактор роста и дифференцировки-15, является отличающимся членом суперсемейства TGF-β. Это белок, который экспрессируется внутриклеточно в виде предшественника, затем процессируется и, наконец, секретируется из клетки в окружающую ее среду. Обе формы, активную, полностью процессированную, (зрелую) форму и предшественник GDF-15 можно найти вне клеток. Предшественник ковалентно связывается при помощи СООН-конца своей аминокислотной последовательности с внеклеточным матриксом (Bauskin AR et al., Cancer Research 2005) и, таким образом, располагается на внешней стороне клетки. Активная, полностью процессированная (зрелая) форма GDF-15 является растворимой и встречается в сыворотке крови. Таким образом, процессированная форма GDF-15 может потенциально воздействовать на любую клетку-мишень в организме, которая соединена с системным кровотоком, при условии, что потенциальная клетка-мишень экспрессирует рецептор для растворимого лиганда GDF-15.GDF-15, growth and differentiation factor-15, is a distinct member of the TGF-β superfamily. It is a protein that is expressed intracellularly as a precursor, then processed and finally secreted from the cell into its environment. Both the active, fully processed, (mature) form and the precursor of GDF-15 can be found outside cells. The precursor covalently binds via the COOH terminus of its amino acid sequence to the extracellular matrix (Bauskin AR et al., Cancer Research 2005) and is thus located on the outside of the cell. The active, fully processed (mature) form of GDF-15 is soluble and occurs in blood serum. Thus, the processed form of GDF-15 can potentially affect any target cell in the body that is connected to the systemic circulation, provided that the potential target cell expresses a receptor for a soluble GDF-15 ligand.

Во время беременности, GDF-15 в физиологических условиях встречается в плаценте. Однако, многие злокачественные опухоли (особенно агрессивные злокачественные опухоли головного мозга, меланома, рак легких, желудочно-кишечные опухоли, рак толстого кишечника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы и рак молочной железы (Mimeault М и Batra SK, J. Cell Physiol 2 010)) демонстрируют повышенные уровни GDF-15 в опухоли, а также в сыворотке крови. Также были описаны корреляции между высокой экспрессией GDF-15 и устойчивостьюю к химиотерапии (Huang CY et al., Clin. Cancer Res. 2009) и между высокой экспрессией GDF-15 и неблагоприятным прогнозом, соответственно (Brown ДА et al., Clin. Cancer Res. 2009).During pregnancy, GDF-15 is found physiologically in the placenta. However, many malignant tumors (especially aggressive malignant brain tumors, melanoma, lung cancer, gastrointestinal tumors, colon cancer, pancreatic cancer, prostate cancer and breast cancer (Mimeault M and Batra SK, J. Cell Physiol 2 010)) demonstrate increased levels of GDF-15 in the tumor as well as in the serum. Correlations have also been described between high GDF-15 expression and chemotherapy resistance (Huang CY et al., Clin. Cancer Res. 2009) and between high GDF-15 expression and poor prognosis, respectively (Brown DA et al., Clin. Cancer Res. 2009).

GDF-15 экспрессируется в глиомах различной степени дифференцировки по критериям ВОЗ при оценке при помощи иммуногистохимии (Roth et al., Clin. Cancer Res. 2010). Дополнительно, Roth et al. получили стабильно экспрессирующиеся конструкции ДНК, которые экспрессировали или короткошпилечную РНК, нацеленную на эндогенный GDF-15, или контрольные конструкции в клетках глиомы SMA560. При использовании этих заранее созданных стабильных клеточных линий они наблюдали, что образование опухолей у мышей с клетками SMA560 с нокдауном GDF-15 было замедлено по сравнению с мышами с контрольными конструкциями.GDF-15 is expressed in gliomas of varying grade according to WHO criteria when assessed by immunohistochemistry (Roth et al., Clin. Cancer Res. 2010). Additionally, Roth et al. obtained stably expressed DNA constructs that expressed either short hairpin RNA targeting endogenous GDF-15 or control constructs in SMA560 glioma cells. Using these pre-established stable cell lines, they observed that tumor formation in mice with GDF-15 knockdown SMA560 cells was delayed compared to mice with control constructs.

Патентные заявки WO 2005/099746 и WO 2009/021293 относятся к антителу к человеческому GDF15 (Mab26), способному проявлять эффекты антагониста человеческого GDF-15 (hGDF-15) по отношению к потере массы, вызванной опухолью, у мышей in vivo. Аналогично, Johnen H et al. (Nature Medicine, 2007) описали воздействие моноклонального антитела к человеческому GDF-15 на анорексию и потерю массы, вызванные злокачественной опухолью, но не наблюдали никаких воздействий антитела к человеческому GDF-15 на размер опухоли, сформированной злокачественной опухолью.Patent applications WO 2005/099746 and WO 2009/021293 relate to an anti-human GDF15 antibody (Mab26) capable of exerting antagonistic effects of human GDF-15 (hGDF-15) on tumor-induced weight loss in mice in vivo. Similarly, Johnen H et al. (Nature Medicine, 2007) described the effects of anti-human GDF-15 monoclonal antibody on anorexia and weight loss caused by cancer, but did not observe any effects of anti-human GDF-15 antibody on cancer tumor size.

WO 2014/049087 и РСТ/ЕР2015/056654 относятся к моноклональным антителам к hGDF-15 и их применению в медицине.WO 2014/049087 and PCT/EP2015/056654 relate to monoclonal antibodies to hGDF-15 and their use in medicine.

Недавно разработанный подход к терапии злокачественных опухолей представляет собой применение блокаторов контрольных точек иммунного ответа, таких как ингибиторы человеческого PD-1 и ингибиторы человеческого PD-L1. Обоснованием использования этих блокаторов контрольных точек иммунного ответа является то, что при блокировании контрольных точек иммунного ответа, которые предотвращают нацеливание иммунной системы на антигены злокачественных опухолей и соответствующие злокачественные клетки, иммунный ответ на злокачественную опухоль может быть более эффективным. Хотя было показано, что блокаторы контрольных точек иммунного ответа, а также определенные сочетания блокаторов контрольных точек иммунного ответа улучшают выживаемость у пациентов с меланомой (Cully M, Combinations with checkpoint inhibitors at wavefront of cancer immunotherapy, Nat Rev Drug Discov. 2015 Jun;14(6):374-5), не все пациенты с меланомой демонстрируют полный ответ, и еще не описаны результаты для многих других злокачественных опухолей, а также есть причины (например, такие как мутационная нагрузка), которые позволяют предположить, что результаты при других показаниях к применению будут менее благоприятными.A recently developed approach to cancer therapy is the use of immune checkpoint blockers, such as human PD-1 inhibitors and human PD-L1 inhibitors. The rationale for the use of these immune checkpoint blockers is that by blocking immune checkpoints that prevent the immune system from targeting cancer antigens and corresponding cancer cells, the immune response to the cancer may be more effective. Although immune checkpoint blockers, as well as certain combinations of immune checkpoint blockers, have been shown to improve survival in patients with melanoma (Cully M, Combinations with checkpoint inhibitors at wavefront of cancer immunotherapy, Nat Rev Drug Discov. 2015 Jun;14( 6):374-5), not all patients with melanoma demonstrate complete response, and results for many other malignancies have not yet been described, and there are reasons (eg, such as mutational load) that suggest that results in other indications will be less favorable for use.

Таким образом, на сегодняшний день в данной области все еще существует потребность в способах для более эффективного лечения злокачественной опухоли. Более конкретно, все еще существует недостаток средств, которые можно использовать для более эффективной иммунотерапии злокачественных опухолей.Thus, there is still a need in the art today for methods to more effectively treat cancer. More specifically, there is still a lack of tools that can be used for more effective immunotherapy of malignant tumors.

- 1 044887- 1 044887

Описание изобретенияDescription of the invention

Настоящее изобретение удовлетворяет вышеуказанным потребностям и решает вышеуказанные проблемы в данной области, предоставляя варианты осуществления, описанные далее.The present invention satisfies the above needs and solves the above problems in the field by providing the embodiments described below.

В частности, с целью выявления способов для эффективного лечения злокачественной опухоли, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что вероятность ответа на лечение блокаторами контрольных точек иммунного ответа значительно снижается с увеличением уровней hGDF-15 в сыворотке пациента. Таким образом, по изобретению, можно использовать ингибитор hGDF-15 для ингибирования негативных воздействий hGDF-15 на ответы пациентов на лечение блокаторами контрольных точек иммунного ответа, и для улучшения ответов пациентов на лечение блокаторами контрольных точек иммунного ответа.In particular, with the aim of identifying methods for effectively treating cancer, the present inventors have unexpectedly discovered that the likelihood of response to treatment with immune checkpoint blockers decreases significantly with increasing levels of hGDF-15 in the patient's serum. Thus, according to the invention, an hGDF-15 inhibitor can be used to inhibit the negative effects of hGDF-15 on patient responses to immune checkpoint blocker treatment, and to improve patient responses to immune checkpoint blocker treatment.

Неожиданно, авторы изобретения также обнаружили, что существует обратная корреляция hGDF15 с процентным содержанием CD8+ Т-лимфоцитов в метастазах злокачественной опухоли. Это заслуживает внимания, поскольку присутствие CD8+ Т-лимфоцитов, в частности, необходимо для регрессии опухоли после ингибирования контрольной точки иммунного ответа антителом к PD-1. Таким образом, по изобретению, терапевтическое ингибирование hGDF-15 можно использовать для повышения процентного содержания CD8+ T-лимфоцитов в солидных злокачественных опухолях, в том числе в опухолевых метастазах. Это увеличение числа CD8+ Т-лимфоцитов в солидных злокачественных опухолях может быть благоприятно использовано для терапии, в частности, иммунотерапии, солидных злокачественных опухолей. Таким образом, в неограничивающем аспекте изобретения, в частности, благоприятная терапевтическая комбинация представляет собой комбинацию ингибитора hGDF-15 с блокатором контрольных точек иммунного ответа. Преимущественным эффектом этой комбинации является то, что ингибирование hGDF-15 будет повышать процентное содержание CD8+ Т-лимфоцитов в солидных злокачественных опухолях и, таким образом, приводить к синергическому терапевтическому эффекту с ингибированием контрольной точки иммунного ответа.Surprisingly, we also found that there was an inverse correlation of hGDF15 with the percentage of CD8+ T cells in cancer metastases. This is noteworthy because the presence of CD8+ T cells in particular is required for tumor regression following immune checkpoint inhibition by anti-PD-1 antibody. Thus, according to the invention, therapeutic inhibition of hGDF-15 can be used to increase the percentage of CD8+ T lymphocytes in solid malignant tumors, including tumor metastases. This increase in the number of CD8+ T lymphocytes in solid cancers can be beneficially used for therapy, in particular immunotherapy, of solid cancers. Thus, in a non-limiting aspect of the invention, a particularly advantageous therapeutic combination is a combination of an hGDF-15 inhibitor with an immune checkpoint blocker. The advantageous effect of this combination is that inhibition of hGDF-15 will increase the percentage of CD8+ T lymphocytes in solid malignancies and thus lead to a synergistic therapeutic effect with immune checkpoint inhibition.

Чтобы дополнительно прояснить, как ингибиторы hGDF-15 могут повышать процентное содержание CD8+ Т-лимфоцитов в солидных злокачественных опухолях, авторы изобретения обнаружили, что hGDF-15 снижает адгезию Т-клеток к эндотелиальным клеткам. Таким образом, по изобретению, лечение ингибиторами hGDF-15 можно использовать для повышения адгезии Т-клеток, в том числе CD8⁺ Tклеток, к эндотелиальным клеткам. Такое лечение по изобретению будет увеличивать проникновение CD8+ Т-клеток из кровотока в солидные злокачественные опухоли. Повышенное процентное содержание CD8+ Т-клеток в солидных злокачественных опухолях, которое является результатом такого лечения ингибиторами hGDF-15, является выгодным и может использоваться для терапии злокачественных опухолей, например, иммунотерапии злокачественных опухолей. Поскольку проникновение CD8+ Т-клеток в солидные злокачественные опухоли и присутствие этих CD8+ Т-клеток в солидных злокачественных опухолях особенно благоприятно для терапевтического применения с использованием блокаторов контрольных точек иммунного ответа, особенно предпочтительным применением ингибиторов hGDF-15 по изобретению является их применение в комбинации с блокаторами контрольных точек иммунного ответа.To further clarify how hGDF-15 inhibitors can increase the percentage of CD8+ T cells in solid cancers, we found that hGDF-15 reduces T cell adhesion to endothelial cells. Thus, according to the invention, treatment with hGDF-15 inhibitors can be used to increase the adhesion of T cells, including CD8 ⁺ T cells, to endothelial cells. Such treatment according to the invention will increase the penetration of CD8+ T cells from the bloodstream into solid malignant tumors. The increased percentage of CD8+ T cells in solid cancers that results from such treatment with hGDF-15 inhibitors is beneficial and can be used for cancer therapy, such as cancer immunotherapy. Since the infiltration of CD8+ T cells into solid malignancies and the presence of these CD8+ T cells in solid malignancies is particularly favorable for therapeutic use using immune checkpoint blockers, a particularly preferred use of the hGDF-15 inhibitors of the invention is their use in combination with blockers immune response checkpoints.

Таким образом, настоящее изобретение относится к улучшенным способам для терапии злокачественных опухолей, обеспечивая предпочтительные варианты осуществления, описанные далее:Thus, the present invention relates to improved methods for the treatment of malignant tumors, providing the preferred embodiments described below:

1. Ингибитор hGDF-15 для применения в способе для повышения процентного содержания CD8+ Тклеток в солидной злокачественной опухоли у пациента-человека, где ингибитор hGDF-15 предназначен для введения пациенту-человеку.1. An hGDF-15 inhibitor for use in a method for increasing the percentage of CD8+ T cells in a solid cancer in a human patient, wherein the hGDF-15 inhibitor is for administration to the human patient.

2. Ингибитор hGDF-15 для применения по пункту 1, где пациент представляет собой пациента, который имеет уровень hGDF-15 в сыворотке, по меньшей мере, 1,2 нг/мл до начала введения ингибитора hGDF-15, где пациент предпочтительно представляет собой пациента, который имеет уровень hGDF-15 в сыворотке, по меньшей мере, 1,5 нг/мл до начала введения ингибитора hGDF-15, и где пациент более предпочтительно представляет собой пациента, который имеет уровень hGDF-15 в сыворотке, по меньшей мере, 1,8 нг/мл до начала введения ингибитора hGDF-15.2. An hGDF-15 inhibitor for use according to claim 1, wherein the patient is a patient who has a serum hGDF-15 level of at least 1.2 ng/ml before administration of the hGDF-15 inhibitor, wherein the patient is preferably a patient who has a serum hGDF-15 level of at least 1.5 ng/ml before administration of the hGDF-15 inhibitor, and wherein the patient is more preferably a patient who has a serum hGDF-15 level of at least , 1.8 ng/ml before starting hGDF-15 inhibitor administration.

3. Ингибитор hGDF-15 для применения по любому из пунктов от 1 до 2, где злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из меланомы, колоректального рака, рака предстательной железы, рака головы и шеи, уротелиального рака, рака желудка, рака поджелудочной железы, рака печени, рака яичек, рака яичников, рака эндометрия, рака шейки матки, рака головного мозга, рака молочной железы, рака желудка, почечноклеточной карциномы, саркомы Юинга, немелкоклеточного рака легких и мелкоклеточного рака легких, где злокачественная опухоль предпочтительно выбрана из группы, состоящей из меланомы, колоректального рака, рака предстательной железы, рака головы и шеи, уротелиального рака, рака желудка, рака поджелудочной железы, рака печени, рака яичек, рака яичников, рака эндометрия и рака шейки матки, и где злокачественная опухоль более предпочтительно выбрана из группы, состоящей из меланомы, колоректального рака, рака предстательной железы, рака головы и шеи, уротелиального рака и рака желудка.3. An hGDF-15 inhibitor for use as claimed in any one of claims 1 to 2, wherein the cancer is selected from the group consisting of melanoma, colorectal cancer, prostate cancer, head and neck cancer, urothelial cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, liver cancer, testicular cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, cervical cancer, brain cancer, breast cancer, gastric cancer, renal cell carcinoma, Ewing's sarcoma, non-small cell lung cancer and small cell lung cancer, wherein the malignant tumor is preferably selected from the group consisting of of melanoma, colorectal cancer, prostate cancer, head and neck cancer, urothelial cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, liver cancer, testicular cancer, ovarian cancer, endometrial cancer and cervical cancer, and wherein the malignant tumor is more preferably selected from the group , consisting of melanoma, colorectal cancer, prostate cancer, head and neck cancer, urothelial cancer and gastric cancer.

4. Ингибитор hGDF-15 для применения по любому из предшествующих пунктов, где злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из меланомы, плоскоклеточной карциномы полости рта, ко4. An hGDF-15 inhibitor for use as claimed in any one of the preceding claims, wherein the cancer is selected from the group consisting of melanoma, oral squamous cell carcinoma,

- 2 044887 лоректального рака и рака предстательной железы.- 2 044887 lorectal cancer and prostate cancer.

5. Ингибитор hGDF-15 для применения по любому из предшествующих пунктов, где злокачественная опухоль является меланомой.5. An hGDF-15 inhibitor for use as claimed in any of the preceding claims, wherein the cancer is melanoma.

6. Ингибитор hGDF-15 для применения по любому из предшествующих пунктов, где ингибитор представляет собой моноклональное антитело, способное связываться с hGDF-15, или его антигенсвязывающую часть.6. An hGDF-15 inhibitor for use according to any of the preceding claims, wherein the inhibitor is a monoclonal antibody capable of binding to hGDF-15, or an antigen-binding portion thereof.

7. Ингибитор hGDF-15 для применения по пункту 6, где связывание представляет собой связывание с конформационным или прерывистым эпитопом на hGDF-15, и где конформационный или прерывистый эпитоп состоит из аминокислотных последовательностей SEQ ID No: 25 и SEQ ID No: 26.7. An hGDF-15 inhibitor for use according to claim 6, wherein the binding is binding to a conformational or discontinuous epitope on hGDF-15, and wherein the conformational or discontinuous epitope consists of the amino acid sequences SEQ ID No: 25 and SEQ ID No: 26.

8. Ингибитор hGDF-15 для применения по пункту б или 7, где антитело или его антигенсвязывающая часть содержит вариабельный домен тяжелой цепи, который включает область CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, область CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и область CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и где антитело или его антигенсвязывающая часть содержит вариабельный домен легкой цепи, который включает область CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, область CDR2, содержащую аминокислотную последовательность ser-ala-ser, и область CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.8. An hGDF-15 inhibitor for use according to paragraph b or 7, where the antibody or antigen-binding portion contains a heavy chain variable domain, which includes a CDR1 region containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 3, a CDR2 region containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 4, and a CDR3 region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and wherein the antibody or antigen binding portion thereof comprises a light chain variable domain which includes a CDR1 region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, a CDR2 region containing the amino acid sequence ser- ala-ser, and a CDR3 region containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 7.

9. Ингибитор hGDF-15 для применения по любому из пунктов от 1 до 5, где ингибитор представляет собой малую интерферирующую РНК или шпилечную конструкцию миРНК.9. An hGDF-15 inhibitor for use as claimed in any one of claims 1 to 5, wherein the inhibitor is a small interfering RNA or a hairpin siRNA construct.

10. Ингибитор hGDF-15 для применения по любому из предшествующих пунктов, где способ представляет собой способ для лечения злокачественной опухоли.10. An hGDF-15 inhibitor for use according to any of the preceding claims, wherein the method is a method for treating a malignant tumor.

11. Ингибитор hGDF-15 для применения по пункту 10, где способ для лечения злокачественной опухоли представляет собой способ для лечения злокачественной опухоли путем иммунотерапии злокачественной опухоли.11. An hGDF-15 inhibitor for use according to claim 10, wherein the method for treating a cancer is a method for treating a cancer by immunotherapy of the cancer.

12. Ингибитор hGDF-15 для применения по любому из предшествующих пунктов, где способ представляет собой способ для лечения метастазов злокачественной опухоли.12. An hGDF-15 inhibitor for use according to any of the preceding claims, wherein the method is a method for treating metastases of a malignant tumor.

13. Ингибитор hGDF-15 для применения по любому из предшествующих пунктов, где ингибитор hGDF-15 повышает процентное содержание CD8⁺Т-клеток в злокачественной опухоли за счет повышения адгезии CD8⁺Т-клеток к эндотелиальным клеткам и, таким образом, повышения проникновения CD8⁺Т-клеток из кровотока в злокачественную опухоль.13. An hGDF-15 inhibitor for use as claimed in any one of the preceding claims, wherein the hGDF-15 inhibitor increases the percentage of CD8 ⁺ T cells in a malignant tumor by increasing CD8 ⁺ T cell adhesion to endothelial cells and thereby increasing CD8 entry ⁺ T cells from the bloodstream into the malignant tumor.

14. Ингибитор hGDF-15 для применения по любому из предшествующих пунктов, где применение представляет собой применение в комбинации с блокатором контрольных точек иммунного ответа.14. An hGDF-15 inhibitor for use as defined in any of the preceding claims, wherein the use is in combination with an immune checkpoint blocker.

15. Ингибитор hGDF-15 для применения по любому из предшествующих пунктов, где блокатор контрольных точек иммунного ответа выбран из одной или нескольких следующих групп, состоящих из:15. An hGDF-15 inhibitor for use as claimed in any one of the preceding claims, wherein the immune checkpoint blocker is selected from one or more of the following groups consisting of:

i) ингибитора человеческого PD-1, ингибитор предпочтительно является моноклональным антителом или его антигенсвязывающей частью, способными связываться с человеческим PD-1; и ii) ингибитора человеческого PD-L1, ингибитор предпочтительно является моноклональным антителом или его антигенсвязывающей частью, способными связываться с человеческим PD-L1.i) an inhibitor of human PD-1, the inhibitor is preferably a monoclonal antibody or antigen-binding portion thereof capable of binding to human PD-1; and ii) an inhibitor of human PD-L1, the inhibitor is preferably a monoclonal antibody or antigen-binding portion thereof capable of binding to human PD-L1.

16. Ингибитор hGDF-15 для применения по пункту 15, где блокатор контрольных точек иммунного ответа включает моноклональное антитело, способное связываться с человеческим PD-1, или его антигенсвязывающую часть.16. An hGDF-15 inhibitor for use according to claim 15, wherein the immune checkpoint blocker comprises a monoclonal antibody capable of binding to human PD-1, or an antigen-binding portion thereof.

17. Ингибитор hGDF-15 для применения по пункту 15 или 16, где блокатор контрольных точек иммунного ответа включает моноклональное антитело, способное связываться с человеческим PD-L1, или его антигенсвязывающую часть.17. An hGDF-15 inhibitor for use according to claim 15 or 16, wherein the immune checkpoint blocker comprises a monoclonal antibody capable of binding to human PD-L1, or an antigen-binding portion thereof.

18. Композиция, которая содержит ингибитор hGDF-15 и блокатор контрольных точек иммунного ответа.18. A composition that contains an hGDF-15 inhibitor and an immune checkpoint blocker.

19. Композиция по пункту 18, где ингибитор hGDF-15 представляет собой ингибитор в соответствии с определением по любому из пунктов от 6 до 9.19. The composition of claim 18, wherein the hGDF-15 inhibitor is an inhibitor as defined in any of claims 6 to 9.

20. Композиция по пункту 18 или 19, где блокатор контрольных точек иммунного ответа представляет собой блокатор в соответствии с определением по любому из пунктов от 15 до 17.20. The composition of claim 18 or 19, wherein the immune checkpoint blocker is a blocker as defined in any of claims 15 to 17.

21. Композиция по любому из пунктов от 18 до 20 для применения в медицине.21. The composition according to any of paragraphs 18 to 20 for use in medicine.

22. Набор, который содержит ингибитор hGDF-15 и, по меньшей мере, один блокатор контрольных точек иммунного ответа.22. A kit that contains an hGDF-15 inhibitor and at least one immune checkpoint blocker.

23. Набор по пункту 22, где ингибитор hGDF-15 представляет собой ингибитор по любому из пунктов от 6 до 9.23. The kit of claim 22, wherein the hGDF-15 inhibitor is an inhibitor of any one of claims 6 to 9.

24. Набор по пункту 22 или 23, где блокатор контрольных точек иммунного ответа представляет собой блокатор в соответствии с определением по любому из пунктов от 15 до 17.24. The kit of claim 22 or 23, wherein the immune checkpoint blocker is a blocker as defined in any of claims 15 to 17.

25. Набор по любому из предшествующих пунктов, где ингибитор hGDF-15 и один, или несколько, или все из блокаторов контрольных точек иммунного ответа содержатся в раздельных контейнерах или в одном контейнере.25. The kit as claimed in any one of the preceding claims, wherein the hGDF-15 inhibitor and one, or more, or all of the immune checkpoint blockers are contained in separate containers or in the same container.

26. Набор или композиция для применения в медицине по любому из пунктов от 21 до 25 для применения в способе лечения солидной злокачественной опухоли.26. The kit or composition for medical use according to any one of claims 21 to 25 for use in a method of treating a solid malignant tumor.

- 3 044887- 3 044887

27. Набор или композиция для применения в медицине по пункту 26, где способ представляет собой способ для иммунотерапии злокачественной опухоли.27. A kit or composition for medical use according to claim 26, where the method is a method for immunotherapy of a malignant tumor.

28. Набор или композиция для применения в медицине по пункту 27, где злокачественная опухоль представляет собой опухоль в соответствии с определением по пункту 3, 4 или 5.28. The kit or composition for medical use according to claim 27, wherein the malignant tumor is a tumor as defined in claim 3, 4 or 5.

29. Ингибитор hGDF-15 для применения в способе лечения солидной злокачественной опухоли при помощи блокатора контрольных точек иммунного ответа у пациента-человека, где ингибитор hGDF-15 предназначен для введения пациенту-человеку.29. An hGDF-15 inhibitor for use in a method of treating a solid cancer with an immune checkpoint blocker in a human patient, wherein the hGDF-15 inhibitor is for administration to a human patient.

30. Ингибитор hGDF-15 для применения по пункту 29, где способ представляет собой способ для иммунотерапии злокачественной опухоли.30. An hGDF-15 inhibitor for use according to claim 29, where the method is a method for immunotherapy of a malignant tumor.

31. Ингибитор hGDF-15 для применения по пункту 29 или 30, где пациент представляет собой пациента в соответствии с определением по пункту 2.31. An hGDF-15 inhibitor for use under claim 29 or 30, wherein the patient is a patient as defined in claim 2.

32. Ингибитор hGDF-15 для применения по любому из пунктов от 29 до 31, где злокачественная опухоль представляет собой опухоль в соответствии с определением по пункту 3, 4 или 5.32. An hGDF-15 inhibitor for use according to any one of claims 29 to 31, wherein the cancer is a tumor as defined in claim 3, 4 or 5.

33. Ингибитор hGDF-15 для применения по любому из пунктов от 29 до 32, где ингибитор hGDF-15 представляет собой ингибитор в соответствии с определением по любому из пунктов от 6 до 9.33. An hGDF-15 inhibitor for use as defined in any one of claims 29 to 32, wherein the hGDF-15 inhibitor is an inhibitor as defined in any one of claims 6 to 9.

34. Ингибитор hGDF-15 для применения по любому из пунктов от 29 до 33, где блокатор контрольных точек иммунного ответа представляет собой блокатор в соответствии с определением по любому из пунктов от 15 до 17.34. An hGDF-15 inhibitor for use as defined in any one of claims 29 to 33, wherein the immune checkpoint blocker is a blocker as defined in any of claims 15 to 17.

35. Ингибитор hGDF-15 для применения по любому из пунктов от 29 до 34, где ингибитор hGDF-15 повышает процентное содержание CD8+ Т-клеток в злокачественной опухоли.35. An hGDF-15 inhibitor for use as claimed in any one of claims 29 to 34, wherein the hGDF-15 inhibitor increases the percentage of CD8+ T cells in the cancer.

36. Ингибитор hGDF-15 для применения по пункту 35, где ингибитор hGDF-15 повышает процентное содержание CD8+ Т-клеток в злокачественной опухоли за счет повышения адгезии CD8⁺Т-клеток к эндотелиальным клеткам или прокатывания CD8+ Т-клеток на эндотелиальных клетках и, таким образом, повышения проникновения CD8⁺Т-клеток из кровотока в злокачественную опухоль.36. An hGDF-15 inhibitor for use according to claim 35, wherein the hGDF-15 inhibitor increases the percentage of CD8+ T cells in a malignant tumor by increasing CD8 ⁺ T cell adhesion to endothelial cells or CD8+ T cell rolling on endothelial cells and, thus increasing the penetration of CD8 ⁺ T cells from the bloodstream into the malignant tumor.

37. Комбинация ингибитора hGDF-15 и блокатора контрольных точек иммунного ответа для применения в способе лечения солидной злокачественной опухоли у пациента-человека, где ингибитор hGDF-15 и блокатор контрольных точек иммунного ответа предназначены для введения пациентучеловеку.37. A combination of an hGDF-15 inhibitor and an immune checkpoint blocker for use in a method of treating a solid cancer in a human patient, wherein the hGDF-15 inhibitor and the immune checkpoint blocker are for administration to a human patient.

38. Комбинация ингибитора hGDF-15 и блокатора контрольных точек иммунного ответа для применения по пункту 36, где способ представляет собой способ для иммунотерапии злокачественной опухоли.38. A combination of an hGDF-15 inhibitor and an immune checkpoint blocker for use according to claim 36, wherein the method is a method for immunotherapy of a malignant tumor.

39. Комбинация ингибитора hGDF-15 и блокатора контрольных точек иммунного ответа для применения по любому из предшествующих пунктов, где пациент представляет собой пациента в соответствии с определением по пункту 2.39. A combination of an hGDF-15 inhibitor and an immune checkpoint blocker for use as claimed in any of the preceding claims, wherein the patient is a patient as defined in claim 2.

40. Комбинация ингибитора hGDF-15 и блокатора контрольных точек иммунного ответа для применения по любому из предшествующих пунктов, где злокачественная опухоль представляет собой опухоль в соответствии с определением по пункту 3, 4 или 5.40. A combination of an hGDF-15 inhibitor and an immune checkpoint blocker for use as claimed in any of the preceding claims, wherein the cancer is a tumor as defined in claim 3, 4 or 5.

41. Комбинация ингибитора hGDF-15 и блокатора контрольных точек иммунного ответа для применения по любому из предшествующих пунктов, где ингибитор hGDF-15 представляет собой ингибитор в соответствии с определением по любому из пунктов от 6 до 9.41. A combination of an hGDF-15 inhibitor and an immune checkpoint blocker for use as claimed in any one of the preceding claims, wherein the hGDF-15 inhibitor is an inhibitor as defined in any of claims 6 to 9.

42. Комбинация ингибитора hGDF-15 и блокатора контрольных точек иммунного ответа для применения по любому из предшествующих пунктов, где блокатор контрольных точек иммунного ответа представляет собой блокатор в соответствии с определением по любому из пунктов от 15 до 17.42. A combination of an hGDF-15 inhibitor and an immune checkpoint blocker for use as claimed in any one of the preceding claims, wherein the immune checkpoint blocker is a blocker as defined in any of claims 15 to 17.

43. Комбинация ингибитора hGDF-15 и блокатора контрольных точек иммунного ответа для применения по любому из предшествующих пунктов, где ингибитор hGDF-15 повышает процентное содержание CD8+ Т-клеток в злокачественной опухоли.43. A combination of an hGDF-15 inhibitor and an immune checkpoint blocker for use as claimed in any one of the preceding claims, wherein the hGDF-15 inhibitor increases the percentage of CD8+ T cells in a cancer.

44. Комбинация ингибитора hGDF-15 и блокатора контрольных точек иммунного ответа для применения по пункту 43, где ингибитор hGDF-15 повышает процентное содержание CD8+ Т-клеток в злокачественной опухоли за счет повышения адгезии CD8⁺Т-клеток к эндотелиальным клеткам, и, таким образом, повышения проникновения CD8⁺Т-клеток из кровотока в злокачественную опухоль, и где предпочтительно, указанное повышение адгезии CD8⁺T-клеток к эндотелиальным клеткам повышает прокатывание CD8+ T-клеток на эндотелиальных клетках таким образом, что повышается указанное проникновение CD8⁺Т-клеток из кровотока в солидную злокачественную опухоль.44. A combination of an hGDF-15 inhibitor and an immune checkpoint blocker for use as in claim 43, wherein the hGDF-15 inhibitor increases the percentage of CD8+ T cells in a malignant tumor by increasing the adhesion of CD8 ⁺ T cells to endothelial cells, and thus thereby increasing the penetration of CD8 ⁺ T cells from the bloodstream into the malignant tumor, and where preferably, said increase in the adhesion of CD8 ⁺ T cells to endothelial cells increases the rolling of CD8 + T cells onto endothelial cells such that said penetration of CD8 ⁺ T- cells is increased cells from the bloodstream into a solid malignant tumor.

45. Способ in vitro для определения того, является ли вещество, представляющее интерес, ингибитором hGDF-15; способ, включающий:45. An in vitro method for determining whether a substance of interest is an hGDF-15 inhibitor; a method including:

a) активацию эндотелиальных клеток;a) activation of endothelial cells;

b) инкубацию первого образца, содержащего Т-клетки, в присутствии раствора, содержащего hGDF-15, и в присутствии вещества, представляющего интерес;b) incubating the first sample containing T cells in the presence of a solution containing hGDF-15 and in the presence of a substance of interest;

c) измерение адгезии эндотелиальных клеток, активированных на этапе а) к указанным Т-клеткам из указанного первого образца для получения первого результата измерения адгезии; иc) measuring the adhesion of endothelial cells activated in step a) to said T cells from said first sample to obtain a first adhesion measurement result; And

d) на основании первого результата измерения адгезии на этапе с) определение того, является ли вещество, представляющее интерес, ингибитором hGDF-15.d) based on the first adhesion measurement result in step c) determining whether the substance of interest is an hGDF-15 inhibitor.

- 4 044887- 4 044887

46. Способ по пункту 45, где эндотелиальные клетки представляют собой эндотелиальные клетки пупочной вены человека.46. The method of claim 45, wherein the endothelial cells are human umbilical vein endothelial cells.

47. Способ по любому из предшествующих пунктов, где эндотелиальные клетки представляют собой эндотелиальные клетки человека.47. The method according to any one of the preceding claims, wherein the endothelial cells are human endothelial cells.

48. Способ по любому из предшествующих пунктов, где эндотелиальные клетки активированы посредством TNF-α и IFN-γ, и где на этапе активации, TNF-α и IFN-γ предпочтительно присутствуют в среде в конечной концентрации 5-20 нг/мл TNF-α и 5-20 нг/мл IFN-γ, более предпочтительно в среде в конечной концентрации 10 нг/мл TNF-α и 10 нг/мл IFN-γ.48. The method according to any of the preceding claims, wherein the endothelial cells are activated by TNF-α and IFN-γ, and wherein during the activation step, TNF-α and IFN-γ are preferably present in the medium at a final concentration of 5-20 ng/ml TNF-γ α and 5-20 ng/ml IFN-γ, more preferably in the medium at a final concentration of 10 ng/ml TNF-α and 10 ng/ml IFN-γ.

49. Способ по любому из предшествующих пунктов, где вещество, представляющее интерес, является веществом, способным связываться с hGDF-15, предпочтительно антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, способным связываться с hGDF-15.49. The method according to any of the preceding claims, wherein the substance of interest is a substance capable of binding to hGDF-15, preferably an antibody or antigen binding fragment thereof capable of binding to hGDF-15.

50. Способ по любому из предшествующих пунктов, где на этапе с) указанные эндотелиальные клетки и указанные Т-клетки применяют в числовом соотношении от 1:2 до 2:1, предпочтительно в числовом соотношении 1:1.50. The method according to any of the preceding claims, wherein in step c) said endothelial cells and said T cells are used in a numerical ratio of 1:2 to 2:1, preferably in a numerical ratio of 1:1.

51. Способ по любому из предшествующих пунктов, где во время этапа с) эндотелиальные клетки присутствуют на покрытой поверхности для культивирования клеток, предпочтительно на поверхности для культивирования клеток, покрытой фибронектином.51. The method according to any of the preceding claims, wherein during step c) the endothelial cells are present on a coated cell culture surface, preferably on a cell culture surface coated with fibronectin.

52. Способ по любому из предшествующих пунктов, где во время этапа с), hGDF-15 присутствует в концентрации от 50 до 200 нг/мл, предпочтительно в концентрации 100 нг/мл.52. The method according to any of the preceding claims, wherein during step c), hGDF-15 is present at a concentration of 50 to 200 ng/ml, preferably at a concentration of 100 ng/ml.

53. Способ по любому из предшествующих пунктов, где на этапе с) адгезию измеряют путем подсчета числа прокатывающихся Т-клеток.53. The method according to any one of the preceding claims, wherein in step c) adhesion is measured by counting the number of rolling T cells.

54. Способ по любому из предшествующих пунктов, где на этапе с) адгезию измеряют путем подсчета числа прикрепившихся Т-клеток.54. The method according to any one of the preceding claims, wherein in step c) adhesion is measured by counting the number of adherent T cells.

55. Способ по любому из предшествующих пунктов, где на этапе с) адгезию измеряют путем измерения скорости прокатывания Т-клеток.55. The method according to any one of the preceding claims, wherein in step c) adhesion is measured by measuring the rolling speed of the T cells.

56. Способ по любому из предшествующих пунктов, где на этапе d) вещество, представляющее интерес, определяют как ингибитор hGDF-15, если оно повышает указанную адгезию.56. The method according to any one of the preceding claims, wherein in step d) the substance of interest is determined to be an hGDF-15 inhibitor if it increases said adhesion.

57. Способ по любому из предшествующих пунктов, где на этапе d) вещество, представляющее интерес, определяют как не ингибитор hGDF-15, если оно не повышает указанную адгезию.57. The method according to any of the preceding claims, wherein in step d) the substance of interest is determined to be a non-hGDF-15 inhibitor if it does not increase said adhesion.

58. Способ по любому из предшествующих пунктов, где на этапе b), второй образец инкубируют в присутствии указанного раствора, содержащего hGDF-15 и в отсутствие указанного вещества, представляющего интерес, при этом второй образец содержит Т-клетки, где этап с) дополнительно содержит измерение адгезии эндотелиальных клеток, активированных на этапе а), к указанным Т-клеткам из указанного второго образца для получения второго результата измерения адгезии, и где на этапе d), вещество, представляющее интерес, определяют как ингибитор hGDF-15, если указанный первый результат измерения адгезии повышен по сравнению с указанным вторым результатом измерения адгезии.58. The method as claimed in any one of the preceding claims, wherein in step b), the second sample is incubated in the presence of said solution containing hGDF-15 and in the absence of said substance of interest, wherein the second sample contains T cells, wherein step c) further comprises measuring the adhesion of endothelial cells activated in step a) to said T cells from said second sample to obtain a second adhesion measurement result, and where in step d), the substance of interest is determined to be an hGDF-15 inhibitor if said first the adhesion measurement result is increased compared to the second adhesion measurement result.

59. Способ по любому из предшествующих пунктов, где на этапе b), третий образец инкубируют в отсутствие указанного раствора, содержащего hGDF15 и в отсутствие указанного вещества, представляющего интерес, при этом третий образец содержит Тклетки, где этап с) дополнительно содержит измерение адгезии эндотелиальных клеток, активированных на этапе а), к указанным Т-клеткам из третьего образца для получения третьего результата измерения адгезии, и где на этапе d), третий результат измерения адгезии применяют в качестве референтного результата измерения адгезии, указывающего на полное ингибирование hGDF-15.59. The method as claimed in any one of the preceding claims, wherein in step b), the third sample is incubated in the absence of said solution containing hGDF15 and in the absence of said substance of interest, wherein the third sample contains T cells, wherein step c) further comprises measuring endothelial adhesion cells activated in step a) to said T cells from the third sample to obtain a third adhesion measurement result, and where in step d), the third adhesion measurement result is used as a reference adhesion measurement result indicating complete inhibition of hGDF-15.

60. Способ по любому из предшествующих пунктов, где Т-клетки представляют собой CD8+ Тклетки.60. The method of any one of the preceding claims, wherein the T cells are CD8+ T cells.

61. Способ по любому из пунктов 45-59, где Т-клетки представляют собой пан-Т-клетки.61. The method of any one of claims 45-59, wherein the T cells are pan-T cells.

62. Способ по любому из предшествующих пунктов, где Т-клетки представляют собой человеческие Т-клетки.62. The method of any one of the preceding claims, wherein the T cells are human T cells.

63. Ингибитор hGDF-15 для применения по любому из пунктов 1-17, где применение представляет собой применение в комбинации с полиинозиновой:полицитидиловой кислотой, или комбинацию ингибитора hGDF-15 и блокатора контрольных точек иммунного ответа для применения по любому из пунктов 37-44, где комбинация представляет собой комбинацию с полиинозиновой:полицитидиловой кислотой.63. An hGDF-15 inhibitor for use as defined in any one of claims 1 to 17, wherein the use is a combination with polyinosinic:polycytidylic acid, or a combination of an hGDF-15 inhibitor and an immune checkpoint blocker for use as defined in any of claims 37 to 44 wherein the combination is a combination with polyinosinic:polycytidylic acid.

64. Ингибитор hGDF-15 для применения по любому из пунктов 1-17 и 63, где применение представляет собой применение в комбинации с антителом к человеческому CD40, предпочтительно моноклональным антителом к человеческому CD40, или комбинацию для применения по любому из пунктов64. An hGDF-15 inhibitor for use according to any one of claims 1-17 and 63, where the use is use in combination with an anti-human CD40 antibody, preferably an anti-human CD40 monoclonal antibody, or a combination for use according to any one of claims

- 5 044887- 5 044887

37-44 и 63, где комбинация представляет собой комбинацию с антителом к человеческому CD40, предпочтительно моноклональным антителом к человеческому CD40.37-44 and 63, where the combination is a combination with an anti-human CD40 antibody, preferably an anti-human CD40 monoclonal antibody.

65. Комбинация ингибитора hGDF-15 и любого одного из следующих:65. Combination of an hGDF-15 inhibitor and any one of the following:

a) полиинозиновая:полицитидиловая кислота;a) polyinosinic:polycytidylic acid;

b) антитело к человеческому CD40, предпочтительно моноклональное антитело к человеческому CD40; илиb) an anti-human CD40 antibody, preferably a monoclonal anti-human CD40 antibody; or

c) полиинозиновая:полицитидиловая кислота и антитело к человеческому CD40, предпочтительно моноклональное антитело к человеческому CD40, для применения в способе лечения солидной злокачественной опухоли у пациента-человека, где комбинация необязательно включает блокатор контрольных точек иммунного ответа.c) polyinosinic:polycytidylic acid and an anti-human CD40 antibody, preferably a monoclonal anti-human CD40 antibody, for use in a method of treating a solid cancer in a human patient, wherein the combination optionally includes an immune checkpoint blocker.

Краткое описание фигурBrief description of the figures

Фиг. 1. Эта фигура показывает сывороточные уровни GDF-15 для пациентов, ответивших и не ответивших на схему лечения.Fig. 1. This figure shows serum GDF-15 levels for responders and non-responders to the treatment regimen.

Фиг. 2. Эта фигура показывает число ответивших и не ответивших на лечение в группах пациентов с сывороточными уровнями hGDF-15 <1,8 нг/мл, 1,8-4,2 нг/мл, и >4,2 нг/мл, соответственно.Fig. 2. This figure shows the number of responders and non-responders to treatment in groups of patients with serum hGDF-15 levels <1.8 ng/ml, 1.8-4.2 ng/ml, and >4.2 ng/ml, respectively. .

Фиг. 3. Вероятность ответа на лечение (ответивший на лечение 1), предсказанная обобщенной линейной моделью с использованием GDF-15 в качестве непрерывного предиктора. Круги показывают данные, кривая показывает модель. Вертикальная линия указывает на концентрацию GDF-15, где вероятность ответа на лечение составляет 0,5.Fig. 3. Probability of treatment response (responder 1) predicted by the generalized linear model using GDF-15 as a continuous predictor. The circles show the data, the curve shows the model. The vertical line indicates the concentration of GDF-15, where the probability of response to treatment is 0.5.

Фиг. 4. Кривые Каплана-Мейера для выживаемости в трех группах, определенных по сывороточному уровню GDF-15 (<1,8, 1,8-4,2, >4,2 нг/мл).Fig. 4. Kaplan-Meier curves for survival in three groups defined by serum GDF-15 levels (<1.8, 1.8-4.2, >4.2 ng/ml).

Фиг. 5: фиг. 5А. Вероятность ответа на лечение (ответивший на лечение 1), предсказанная обобщенной линейной моделью с использованием ЛДГ в качестве непрерывного предиктора Круги показывают данные, кривая показывает модель. Вертикальная линия указывает на концентрацию ЛДГ, где вероятность ответа на лечение составляет 0,5. Когорта пациентов была идентичной. Однако не удалось надежно определить уровни ЛДГ у четырех пациенты из-за гемолиза. Фиг. 5В. Графическое представление пациентов, отвечающих и не отвечающих на лечение, и их соответствующие уровни hGDF-15 и ЛДГ. Когда пороговые значения были выбраны для того чтобы включать всех отвечающих на лечение, тестирование на основании GDF-15 позволило выявить 6 (из 9) не отвечающих на лечение, в то время как анализ на основе уровней ЛДГ может выявить только 4 (из 9) не отвечающих на лечение. Для тестирования ЛДГ, 4 гемолитических образца были исключены, что вызвало потерю данных.Fig. 5: fig. 5A. Probability of treatment response (responder 1) predicted by the generalized linear model using LDH as a continuous predictor. Circles show data, curve shows model. The vertical line indicates the LDH concentration, where the probability of response to treatment is 0.5. The patient cohort was identical. However, LDH levels could not be reliably measured in four patients due to hemolysis. Fig. 5V. Graphical representation of responders and nonresponders to treatment and their corresponding hGDF-15 and LDH levels. When thresholds were chosen to include all responders, GDF-15-based testing identified 6 (of 9) non-responders, while LDH-based testing could identify only 4 (of 9) non-responders. responding to treatment. For LDH testing, 4 hemolytic samples were excluded, causing data loss.

Фиг. 6. Эта фигура показывает примеры тканевых срезов из метастазов меланомы в головной мозг без иммунореактивности (верхняя панель) или с высокой иммунореактивностью (нижняя панель) GDF15, которые окрашивали при помощи иммуногистохимии для GDF-15 и для маркерных белков Т-клеток CD3 и CD8, соответственно, как показано на фигуре. CD3- и CD8-положительные клетки показаны стрелками в образцах с высоким GDF-15. Окрашивания CD3 и CD8 производили из той же самой области серийных срезов (однако не из идентичного среза).Fig. 6. This figure shows examples of tissue sections from melanoma brain metastases with no (top panel) or high GDF15 immunoreactivity (bottom panel) that were stained by immunohistochemistry for GDF-15 and for the T cell marker proteins CD3 and CD8. respectively, as shown in the figure. CD3- and CD8-positive cells are indicated by arrows in GDF-15-high samples. CD3 and CD8 stainings were performed from the same area of serial sections (however not from an identical section).

Фиг. 7. Эта фигура показывает график процентного содержания CD3+ клеток по сравнению с оценкой GDF-15 в различных метастазах меланомы в головной мозг (7А) и график процентного содержания CD8+ клеток по сравнению с оценкой GDF-15 в различных метастазах меланомы в головной мозг (7В).Fig. 7. This figure shows a plot of the percentage of CD3+ cells compared to the GDF-15 score in various melanoma brain metastases (7A) and a plot of the percentage of CD8+ cells compared to the GDF-15 score in various melanoma brain metastases (7B). .

Фиг. 8. Эта фигура показывает график оценки GDF-15 по сравнению с процентным содержанием CD8+ и CD3+ Т-клеток, соответственно, в метастазах в головном мозге из различных опухолей (меланома, колоректальный рак (CRC), почечноклеточная карцинома (RCC), немелкоклеточный рак легкого (NSCLC) и мелкоклеточный рак легкого (SCLC).Fig. 8. This figure shows a plot of GDF-15 scores versus the percentage of CD8+ and CD3+ T cells, respectively, in brain metastases from various tumors (melanoma, colorectal cancer (CRC), renal cell carcinoma (RCC), non-small cell lung cancer (NSCLC) and small cell lung cancer (SCLC).

Фиг. 9. Фиг. 9А показывает число катящихся Т-клеток на поле зрения в су. Данные получали из канала # 3 (GDF-15) и канала #2 (контроль). Фиг. 9В показывает скорость качения Т-клеток (измеренную в пикселях за 0,2 сы). Данные получали из канала # 3 (GDF-15) и канала #2 (контроль). Фиг. 9С показывает число прикрепленных клеток в поле зрения. Данные получали из канала # 3 (GDF-15) и канала #2 (контроль). Фиг. 9D показывает число прикрепленных клеток в поле зрения. Данные получали из канала # 3 (GDF-15) и канала #2 (контроль).Fig. 9. Fig. 9A shows the number of rolling T cells per field of view in su. Data was obtained from channel #3 (GDF-15) and channel #2 (control). Fig. 9B shows the rolling speed of T cells (measured in pixels per 0.2 sys). Data was obtained from channel #3 (GDF-15) and channel #2 (control). Fig. 9C shows the number of attached cells per field of view. Data was obtained from channel #3 (GDF-15) and channel #2 (control). Fig. 9D shows the number of attached cells per field of view. Data was obtained from channel #3 (GDF-15) and channel #2 (control).

Фиг. 10. Фиг. 10А показывает число катящихся Т-клеток в поле зрения в су. Данные получали из канала # 1 (контрольные Т-клетки на нестимулированных HUVEC в качестве отрицательного контроля), канала # 2 (контрольные Т-клетки на стимулированных HUVEC в качестве положительного контроля), канала # 3 (GDF-15), канала # 4 (UACC 257: Т-клетки, культивируемые в супернатанте клеток меланомы UACC 257, содержащем секретируемый GDF-15) и канала # 5 (UACC257+анти-hGDF15: Т-клетки, культивируемые в супернатанте клеток меланомы UACC 257, очищенном от секретируемого GDF-15 при помощи антитела к hGDF-15 B1-23 в качестве ингибитора hGDF-15). Фиг. 10В. Анализ потока/адгезии проводили, как описано в примере 3. Т-клетки предварительно инкубировали с 100 нг/мл GDF-15 в течение 1 ч или с 100 нг/мл GDF-15, который был предварительно инкубирован с 10 мкг/мл антитело в течение 1 ч, как указано. Применяли следующие антитела к GDF-15: H1L5 (Гуманизированное B1-23), 01G06 и 03G05 (Гуманизированные антитела к GDF-15, сконструированные с соответствии с последовательностями из WO 2014/100689). Результаты показаны на фигуре, которая изображает числоFig. 10. Fig. 10A shows the number of rolling T cells per field of view in su. Data was obtained from channel #1 (control T cells on unstimulated HUVECs as a negative control), channel #2 (control T cells on stimulated HUVECs as a positive control), channel #3 (GDF-15), channel #4 ( UACC 257: T cells cultured in UACC 257 melanoma cell supernatant containing secreted GDF-15) and channel #5 (UACC257+anti-hGDF15: T cells cultured in UACC 257 melanoma cell supernatant purified of secreted GDF-15 using anti-hGDF-15 antibody B1-23 as an hGDF-15 inhibitor). Fig. 10V. The flow/adhesion assay was performed as described in Example 3. T cells were preincubated with 100 ng/ml GDF-15 for 1 h or with 100 ng/ml GDF-15 that had been preincubated with 10 μg/ml antibody in for 1 hour as directed. The following anti-GDF-15 antibodies were used: H1L5 (Humanized B1-23), 01G06 and 03G05 (Humanized anti-GDF-15 constructed according to sequences from WO 2014/100689). The results are shown in the figure, which represents the number

- 6 044887 катящихся клеток в поле зрения за 20 с.- 6,044,887 rolling cells in the field of view in 20 s.

Фиг. 11. Мышам C57BL/6J подкожно вводили 2x105 клеток толстой кишки MC38^tghGDF-15. Лечение антителом к GDF-15 (20 мг/кг of масса тела) начинали на сутки 0 и повторяли на сутки 3, 7, 10, 14, 17 и 21. На сутки 13, у животных с опухолями примерно одинакового размера (100-150 мм³) либо лечили, либо не лечили Поли-ICLC (также сокращается как Поли-IC) и антителом к CD40. Мыши, у которых не развились ранее пересаженные опухоли, находились под наблюдением в течение 57 суток. Мышей с опухолями умерщвляли в соответствии с критериями гуманного обращения с животными.Fig. 11. C57BL/6J mice were injected subcutaneously with 2x105 MC38 ^tghGDF-15 colon cells. Anti-GDF-15 antibody treatment (20 mg/kg body weight) was started on day 0 and repeated on days 3, 7, 10, 14, 17 and 21. On day 13, animals with tumors of approximately the same size (100-150 mm ³ ) were either treated or not treated with Poly-ICLC (also abbreviated as Poly-IC) and anti-CD40 antibody. Mice that did not develop previously transplanted tumors were observed for 57 days. Mice with tumors were sacrificed according to humane animal treatment criteria.

Фиг. 12. Суммарная выживаемость в группах пациентов с уровнями GDF-15 <1,5 нг/мл и>1,5 нг/мл, соответственно.Fig. 12. Overall survival in groups of patients with GDF-15 levels <1.5 ng/ml and >1.5 ng/ml, respectively.

Фиг. 13. Суммарная выживаемость в группах пациентов с высокими уровнями GDF-15 (т.е. 50 пациентов с наиболее высокими уровнями GDF-15) и низкими уровнями GDF-15 (т.е. 49 пациентов с наиболее низкими уровнями GDF-15), соответственно (разделение медианы общей когорты исследования).Fig. 13. Cumulative survival in groups of patients with high GDF-15 levels (i.e. 50 patients with the highest GDF-15 levels) and low GDF-15 levels (i.e. 49 patients with the lowest GDF-15 levels), respectively (dividing the median of the overall study cohort).

Фиг. 14. Сывороточные уровни hGDF-15 не коррелируют значимо с мутационной нагрузкой опухолей.Fig. 14. Serum hGDF-15 levels do not correlate significantly with the mutational load of tumors.

Уровни мРНК hGDF-15 в образцах от пациентов со злокачественными опухолями нанесли на график вместе с числом соматических мутаций, которые были выявлены в злокачественных опухолях. Соматические мутации определяли путем секвенирования экзомов. Данные анализировали с использованием веб-приложения UZH от Университетского госпиталя Цюриха (Cheng PF et al. : Data mining The Cancer Genome Atlas in the era of precision cancer medicine. Swiss Med Wkly. 2015 Sep 16;145:w14183). Фиг. 14А показывает график данных пациентов со злокачественной опухолью, полученными из Атласа ракового генома (TGCA), учитывая только пациентов с высокодифференцированной злокачественной меланомой (Атлас ракового генома описан в ссылке Cheng PF et al. : Data mining The Cancer Genome Atlas in the era of precision cancer medicine. Swiss Med Wkly. 2015 Sep 16;145:wl4183). Экспрессию GDF-15 оценивали путем нормализации с использованием пакета программного обеспечения RSEM (RNA-Seq путем максимизации ожидания) (Li В и Dewey CN: RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics. 2011 Aug 4; 12:323. doi: 10,1186/1471-2105-12323.). Фиг. 14В показывает график данных пациентов со злокачественной опухолью от 40 дополнительных пациентов с метастатической злокачественной меланомой из Университетского госпиталя Цюриха, которых анализировали отдельно.hGDF-15 mRNA levels in samples from patients with malignant tumors were plotted along with the number of somatic mutations that were identified in the malignant tumors. Somatic mutations were determined by exome sequencing. Data were analyzed using the UZH web application from the University Hospital Zurich (Cheng PF et al.: Data mining The Cancer Genome Atlas in the era of precision cancer medicine. Swiss Med Wkly. 2015 Sep 16;145:w14183). Fig. 14A shows a plot of cancer patient data obtained from The Cancer Genome Atlas (TGCA), considering only patients with high-grade malignant melanoma (The Cancer Genome Atlas is described in Cheng PF et al.: Data mining The Cancer Genome Atlas in the era of precision cancer medicine. Swiss Med Wkly. 2015 Sep 16;145:wl4183). GDF-15 expression was assessed by normalization using the RSEM (RNA-Seq by Expectation Maximization) software package (Li B and Dewey CN: RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics. 2011 Aug 4; 12:323. doi: 10.1186/1471-2105-12323.). Fig. 14B shows a graph of cancer patient data from 40 additional patients with metastatic malignant melanoma from the University Hospital Zurich who were analyzed separately.

Фиг. 15. Показаны изображения для иммуногистохимии для CD8a у мышей, несущих опухоли дикого типа или опухоли со сверхэкспрессией трансгенного (tg) hGDF15. Тканевые срезы окрашивали антителом к CD8a (разведение 1:100; антитело 4SM15, приобретенное у eBioscience).Fig. 15. Immunohistochemistry images for CD8a in mice bearing wild-type tumors or tumors overexpressing transgenic (tg) hGDF15 are shown. Tissue sections were stained with anti-CD8a antibody (1:100 dilution; 4SM15 antibody purchased from eBioscience).

Подробное описание изобретенияDetailed Description of the Invention

Определения и общие способы.Definitions and general methods.

Если далее не определено иначе, термины, используемые в настоящем изобретении, следует понимать в соответствии с их обычным значением, известным специалисту в данной области.Unless otherwise defined further, terms used in the present invention are to be understood in accordance with their ordinary meaning known to one skilled in the art.

Как применяют в настоящем документе термин антитело относится к любому функциональному антителу, которое способно к специфическому связыванию с антигеном, представляющим, как, в основном, изложено в главе 7 в Paul, W.E. (Ed.).: Fundamental Immunology 2nd Ed. Raven Press, Ltd., New York 1989, включенной в настоящий документ в качестве ссылки. Без конкретного ограничения, термин антитело включает в себя антитела из любых подходящих видов-источников, включая курицу и млекопитающее, такое как мышь, коза, не являющийся человеком примат и человек. Предпочтительно, антитело представляет собой гуманизированное антитело. Антитело предпочтительно представляет собой моноклональное антитело, которое можно получать способами, хорошо известными в данной области. Термин антитело включает в себя изотипы антитела IgG-1, -2, -3, или -4, IgE, IgA, IgM или IgD. Термин антитело включает в себя мономерные антитела (такие как IgD, IgE, IgG) или олигомерные антитела (такие как IgA или IgM). Термин антитело также включает в себя, без конкретных ограничений, выделенные антитела и модифицированные антитела, такие как генетически сконструированные антитела, например, химерные антитела.As used herein, the term antibody refers to any functional antibody that is capable of specifically binding to an antigen representing, as generally set forth in Chapter 7 of Paul, W.E. (Ed.): Fundamental Immunology 2nd Ed. Raven Press, Ltd., New York 1989, incorporated herein by reference. Without particular limitation, the term antibody includes antibodies from any suitable source species, including chicken and mammal such as mouse, goat, non-human primate and human. Preferably, the antibody is a humanized antibody. The antibody is preferably a monoclonal antibody, which can be produced by methods well known in the art. The term antibody includes antibody isotypes IgG-1, -2, -3, or -4, IgE, IgA, IgM, or IgD. The term antibody includes monomeric antibodies (such as IgD, IgE, IgG) or oligomeric antibodies (such as IgA or IgM). The term antibody also includes, without particular limitation, isolated antibodies and modified antibodies, such as genetically engineered antibodies, such as chimeric antibodies.

Номенклатура доменов антител придерживается терминов, известных в данной области. Каждый мономер антитела содержит две тяжелые цепи и две легкие цепи, как, в основном, известно в данной области. Каждая из этих легкой и тяжелой цепи содержит вариабельный домен (обозначаемый V_H для тяжелой цепи и V_L для легкой цепи), который важен для связывания с антигеном. Эти вариабельные домены легких и тяжелых цепей содержат (в направлении от N-конца к С-концу) области FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4 (FR, каркасная область; CDR, определяющая комплементарность область, которая также известна как гипервариабельная область). Идентификация и обозначение вышеуказанных областей антител в пределах последовательности антитела происходит, в основном, при помощи Kabat et al. (Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. 1983), или Chothia et al. (Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature. 1989 Dec 21-28;342(6252):877-83) или ее можно проводить с использованием программного обеспечения IMGT/V-QUEST, описанного в Giudicelli et al. (IMGT/V-QUEST, an integrated software program for immunoglobulin and T cell receptor V-J and V-D-J rearrangement analysis. NuThe nomenclature of antibody domains follows terms known in the art. Each antibody monomer contains two heavy chains and two light chains, as is generally known in the art. Each of these light and heavy chains contains a variable domain (designated V _H for the heavy chain and V _L for the light chain), which is important for binding to antigen. These light and heavy chain variable domains contain (from N-terminus to C-terminus) the regions FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 and FR4 (FR, framework region; CDR, complementarity determining region, which is also known as hypervariable region). Identification and designation of the above antibody regions within the antibody sequence occurs primarily with the help of Kabat et al. (Sequences of proteins of immunological interest, US Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. 1983), or Chothia et al. (Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature. 1989 Dec 21-28;342(6252):877-83) or it can be performed using the IMGT/V-QUEST software described in Giudicelli et al. (IMGT/V-QUEST, an integrated software program for immunoglobulin and T cell receptor VJ and VDJ rearrangement analysis. Nu

- 7 044887 cleic Acids Res. 2004 Jul 1;32 (Web Server issue):W435-40), включенной в настоящий документ в качестве ссылки. Предпочтительно, вышеуказанные области антител выявлены и обозначены с использованием программного обеспечения IMGT/V-QUEST.- 7 044887 cleic Acids Res. 2004 Jul 1;32 (Web Server issue):W435-40), incorporated herein by reference. Preferably, the above antibody regions are identified and designated using IMGT/V-QUEST software.

Моноклональное антитело представляет собой антитело из популяции антител, которая является по существу гомогенной, где антитела по существу идентичны по последовательности (т.е. идентичны за исключением небольшой фракции антител, содержащих модификации природной последовательности, такие как аминокислотные модификации на N- и С-концах). В отличие от поликлональных антител, которые содержат смесь различных антител, направленных на множество эпитопов, моноклональные антитела направлены на один и тот же эпитоп и, таким образом, являются высокоспецифичными. Термин моноклональное антитело включает (в качестве неограничивающих примеров) антитела, которые получают из моноклональной клеточной популяции, полученной из клона одной клетки, как, например, антитела, полученные гибридомным способом generated, описанным в Kohler и Milstein (Nature, 1975 Aug 7;256(5517):495-7) или Harlow и Lane (Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1988). Моноклональное антитело можно также получать любыми другими подходящими способами, включая способы фагового дисплея, такие как описанные в Clackson et al. (Nature. 1991 Aug 15; 352 (6336) : 624-8) или Marks et al. (J Mol Biol. 1991 Dec 5; 222 (3) : 581-97). Моноклональное антитело может быть антителом, которое было оптимизировано известными в данной области способами по антигенсвязывающим свойствам, таким как сниженные величины Kd, оптимизированные кинетики ассоциации и диссоциации. Например, значения Kd можно оптимизировать при помощи способов дисплея, в том числе фагового дисплея, с получением аффинно зрелых моноклональных антител. Термин моноклональное антитело не ограничен последовательностями антитела из конкретного вида происхождения или из одного вида происхождения. Таким образом, значение термина моноклональное антитело включает химерные моноклональные антитела, такие как гуманизированные моноклональные антитела.A monoclonal antibody is an antibody from a population of antibodies that is substantially homogeneous, where the antibodies are substantially identical in sequence (i.e., identical except for a small fraction of antibodies containing natural sequence modifications, such as amino acid modifications at the N- and C-termini ). Unlike polyclonal antibodies, which contain a mixture of different antibodies directed to multiple epitopes, monoclonal antibodies are directed to the same epitope and are thus highly specific. The term monoclonal antibody includes (by way of non-limiting examples) antibodies that are obtained from a monoclonal cell population derived from a clone of a single cell, such as antibodies produced by the hybridoma generated method described in Kohler and Milstein (Nature, 1975 Aug 7:256( 5517):495-7) or Harlow and Lane (Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1988). The monoclonal antibody can also be produced by any other suitable methods, including phage display methods such as those described in Clackson et al. (Nature. 1991 Aug 15; 352 (6336): 624-8) or Marks et al. (J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-97). The monoclonal antibody may be an antibody that has been optimized by methods known in the art for antigen binding properties, such as reduced Kd values, optimized association and dissociation kinetics. For example, Kd values can be optimized using display methods, including phage display, to produce affinity mature monoclonal antibodies. The term monoclonal antibody is not limited to antibody sequences from a specific species of origin or from a single species of origin. Thus, the meaning of the term monoclonal antibody includes chimeric monoclonal antibodies, such as humanized monoclonal antibodies.

Гуманизированные антитела представляют собой антитела, которые содержат человеческие последовательности и и небольшую часть последовательностей, не принадлежащих человеку, которые придают специфичность связывания к антигену, представляющему интерес (например, человеческому GDF-15). Как правило, гуманизированные антитела получают путем замещения последовательностей гипервариабельной области из акцепторного антитела человека последовательностями гипервариабельной области из не принадлежащего человеку донорного антитела (например, донорного антитела мыши, кролика, крысы), которые связываются с антигеном, представляющим интерес (например, человеческим GDF-15). В некоторых случаях, последовательности каркасной области акцепторного антитела можно также замещать соответствующими последовательностями донорного антитела. В дополнение к последовательностям, полученным из донорного и акцепторного антител, гуманизированное антитело может также содержать или не содержать другие (дополнительные или замещающие) остатки или последовательности. Такие другие остатки или последовательности могут служить для дополнительного улучшения свойств антитела, таких как связывающие свойства (например, для снижения величин Kd) и/или иммуногенные свойства (например, для снижения антигенности у людей). Неограничивающие примеры способов получения гуманизированных антител известны в данной области, например, из Riechmann et al. (Nature. 1988 Mar 24; 332 (6162):323-7) или Jones et al. (Nature. 1986 May 29-Jun 4; 321 (6069):522-5).Humanized antibodies are antibodies that contain human sequences and a small portion of non-human sequences that confer binding specificity to the antigen of interest (eg, human GDF-15). Typically, humanized antibodies are prepared by replacing hypervariable region sequences from a human acceptor antibody with hypervariable region sequences from a non-human donor antibody (eg, mouse, rabbit, rat donor antibody) that bind to an antigen of interest (eg, human GDF-15 ). In some cases, the framework sequences of the acceptor antibody may also be replaced by the corresponding sequences of the donor antibody. In addition to the sequences derived from the donor and acceptor antibodies, the humanized antibody may or may not also contain other (additional or substitutive) residues or sequences. Such other residues or sequences may serve to further improve the properties of the antibody, such as binding properties (eg, to reduce Kd values) and/or immunogenic properties (eg, to reduce antigenicity in humans). Non-limiting examples of methods for producing humanized antibodies are known in the art, for example, from Riechmann et al. (Nature. 1988 Mar 24; 332 (6162):323-7) or Jones et al. (Nature. 1986 May 29-Jun 4; 321 (6069):522-5).

Термин антитело человека относится к антителу, содержащему человеческие последовательности вариабельного и константного доменов. Это определение включает в себя антитела с человеческими последовательностями, несущими единичные замены аминокислот или модификации, которые могут служить для дополнительного улучшения свойств антитела, таких как связывающие свойства (например, для снижения величин Kd) и/или иммуногенные свойства (например, для снижения антиенности у людей). Термин антитело человека не включает гуманизированные антитела, в которых часть последовательностей, не принадлежащих человеку, придает специфичность связывания с интересующим антигеном.The term human antibody refers to an antibody containing human variable and constant domain sequences. This definition includes antibodies with human sequences bearing single amino acid substitutions or modifications that may serve to further improve the properties of the antibody, such as binding properties (for example, to reduce Kd values) and/or immunogenic properties (for example, to reduce antigenicity in of people). The term human antibody does not include humanized antibodies in which a portion of the non-human sequences confers binding specificity to the antigen of interest.

Антигенсвязывающая часть антитела, как применяют в настоящем документе, относится к части антитела, которая сохраняет способность антитела специфически связываться с антигеном (например, hGDF-15, PD-1 или PD-L1). Эту способность можно определять, например, при помощи известных в данной области способов путем определения способности антигенсвязывающей части конкурировать с антителом за специфическое связывание с антигеном. Антигенсвязывающая часть может содержать один или несколько фрагментов антитела. Без конкретного ограничения, антигенсвязывающую часть можно получать любым подходящим известным в данной области способом, включая способы рекомбинантной ДНК и получение путем химической или ферментативной фрагментации антител. Антигенсвязывающие части могут представлять собой Fab-фрагменты, F(ab') -фрагменты, F(ab')2-фрагменты, одноцепочечные антитела (scFv), однодоменные антитела, диатела или любую другую часть/части антитела, которые сохраняют способность антитела специфически связываться с антигеном.The antigen-binding portion of an antibody, as used herein, refers to the portion of the antibody that retains the ability of the antibody to specifically bind an antigen (eg, hGDF-15, PD-1, or PD-L1). This ability can be determined, for example, using methods known in the art by determining the ability of the antigen-binding moiety to compete with the antibody for specific binding to the antigen. The antigen-binding portion may contain one or more antibody fragments. Without particular limitation, the antigen binding portion can be produced by any suitable method known in the art, including recombinant DNA methods and production by chemical or enzymatic fragmentation of antibodies. Antigen-binding moieties may be Fab fragments, F(ab') fragments, F(ab')2 fragments, single chain antibodies (scFv), single domain antibodies, diabodies, or any other portion(s) of the antibody that retain the ability of the antibody to specifically bind with antigen.

Антитело (например, моноклональное антитело) или антигенсвязывающая часть могут быть производными другой молекулы или связаны с другой молекулой. Например, молекулы, которые могут быть связаны с антителом, представляют собой другие белки (например, другие антитела), молекулярThe antibody (eg, monoclonal antibody) or antigen-binding moiety may be derived from or linked to another molecule. For example, molecules that can be associated with an antibody are other proteins (eg, other antibodies), molecules

- 8 044887 ную метку (например, флуоресцентную, люминисцентную, окрашенную или радиоактивную молекулу), фармацевтический и/или токсичный агент. Антитело или антигенсвязывающиая часть может быть связана напрямую (например, в форме слияния между двумя белками), или через линкерную молекулу (например, любой подходящий тип химического линкера, известный в данной области).- 8 044887 label (for example, fluorescent, luminescent, colored or radioactive molecule), pharmaceutical and/or toxic agent. The antibody or antigen-binding moiety can be linked directly (eg, in the form of a fusion between two proteins), or through a linker molecule (eg, any suitable type of chemical linker known in the art).

Как применяют в настоящем документе, термины связывание или связываться относятся к специфическому связыванию с антигеном, представляющим интерес (например, человеческим GDF-15). Предпочтительно, величина Kd составляет менее чем 100 нМ, более предпочтительно менее чем 50 нМ, еще более предпочтительно менее чем 10 нМ, еще более предпочтительно менее чем 5 нМ и наиболее предпочтительно менее чем 2 нМ.As used herein, the terms binding or binding refer to specific binding to an antigen of interest (eg, human GDF-15). Preferably, the Kd value is less than 100 nM, more preferably less than 50 nM, even more preferably less than 10 nM, even more preferably less than 5 nM and most preferably less than 2 nM.

Как применяют в настоящем документе, антитело или его антигенсвязывающая часть, которое способно конкурировать со вторым антителом, способным связываться с человеческим GDF-15, означает, что указанное (первое) антитело или его антигенсвязывающая часть, которое способно конкурировать, способно снизить связывание 10 нМ референсного раствора второго антитела с человеческим или рекомбинантным человеческим GDF-15 на 50%. В основном, способно конкурировать означает, что концентрация (первого) антитела или его антигенсвязывающей части, которая необходима для того чтобы уменьшить связывание 10 нМ референсного раствора второго антитела с человеческим или рекомбинантным человеческим GDF-15 на 50%, составляет менее чем 1000 нМ, предпочтительно менее чем 100 нМ и более предпочтительно менее чем 10 нМ. Связывание измеряют при помощи измерений поверхностного плазмонного резонанса или при помощи измерений твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), предпочтительно при помощи измерений поверхностного плазмонного резонанса.As used herein, an antibody or antigen-binding portion thereof that is capable of competing with a second antibody capable of binding to human GDF-15 means that the (first) antibody or antigen-binding portion thereof that is capable of competing is capable of reducing the binding of 10 nM reference solution of the second antibody with human or recombinant human GDF-15 by 50%. In general, competitive means that the concentration of the (first) antibody or antigen binding portion thereof that is required to reduce the binding of a 10 nM reference solution of the second antibody to human or recombinant human GDF-15 by 50% is less than 1000 nM, preferably less than 100 nM and more preferably less than 10 nM. Binding is measured using surface plasmon resonance measurements or using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) measurements, preferably using surface plasmon resonance measurements.

Как применяют в настоящем документе термин эпитоп относится к небольшой части антигена, которая образует участок связывания для антитела.As used herein, the term epitope refers to a small part of an antigen that forms a binding site for an antibody.

В контексте настоящего изобретения, связывание или конкурентное связывание антител или их антигенсвязывающих частей с антигеном, представляющим интерес (например, человеческим GDF-15), предпочтительно измеряют с использованием измерений поверхностного плазмонного резонанса в качестве референсного стандартного анализа, как описано ниже.In the context of the present invention, the binding or competitive binding of antibodies or antigen-binding portions thereof to an antigen of interest (eg, human GDF-15) is preferably measured using surface plasmon resonance measurements as a reference standard assay, as described below.

Термины K_D или величина K_D относятся к равновесной константе диссоциации, известной в данной области. В контексте настоящего изобретения, эти термины относятся к равновесной константе диссоциации антитела в отношении конкретного антигена, представляющего интерес (например, человеческого GDF-15).The terms K _D or K _D value refer to the equilibrium dissociation constant known in the art. In the context of the present invention, these terms refer to the equilibrium dissociation constant of the antibody against a particular antigen of interest (eg, human GDF-15).

Равновесная константа диссоциации является мерой склонности комплекса (например, комплекса антиген-антитело) к обратимой диссоциации на его компоненты (например, антиген и антитело). Для антител по изобретению, значения K_D (такие, как значения для антигена человеческого GDF-15) предпочтительно определяют с использованием измерений поверхностного плазмонного резонанса, как описано ниже.The equilibrium dissociation constant is a measure of the propensity of a complex (eg, antigen-antibody complex) to reversibly dissociate into its components (eg, antigen and antibody). For antibodies of the invention, K _D values (such as those for the human GDF-15 antigen) are preferably determined using surface plasmon resonance measurements, as described below.

Выделенное антитело, как применяют в настоящем документе, представляет собой антитело, которое было идентифицировано и отделено от большинства компонентов (по массе) его исходного окружения, например, от компонентов клеточной культуры гибридомы или другой клеточной культуры, которую применяли для его выработки (например, клетки-продуценты, такие как клетки СНО, которые экспрессируют антитело рекомбинантным образом). Выделение проводят таким образом, что оно в достаточной мере удаляет компоненты, которые в ином случае могли бы препятствовать пригодности антитела для желаемых применений (например, терапевтического применения антитела по изобретению против человеческого GDF-15). Способы для получения выделенных антител известны в данной области и включают хроматографию с белком А, анионообменную хроматографию, катионообменную хроматографию, фильтрацию с удержанием вирусов и ультрафильтрацию. Предпочтительно, препарат выделенного антитела имеет, по меньшей мере, 70% чистоты (мас./мас.), более предпочтительно, по меньшей мере, 80% чистоты (мас./мас.), еще более предпочтительно, по меньшей мере, 90% чистоты (мас./мас.), еще более предпочтительно, по меньшей мере, 95% чистоты (мас./мас.), и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 99% чистоты (мас./мас.), при измерении с использованием анализа белков по Лоури.An isolated antibody, as used herein, is an antibody that has been identified and separated from most components (by weight) of its original environment, e.g., components of a hybridoma cell culture or other cell culture that was used to produce it (e.g., cells -producers, such as CHO cells, which express the antibody in a recombinant manner). The isolation is carried out in such a way that it sufficiently removes components that might otherwise interfere with the suitability of the antibody for the desired applications (eg, therapeutic use of the antibody of the invention against human GDF-15). Methods for producing isolated antibodies are known in the art and include protein A chromatography, anion exchange chromatography, cation exchange chromatography, virus retention filtration and ultrafiltration. Preferably, the isolated antibody preparation is at least 70% pure (w/w), more preferably at least 80% pure (w/w), even more preferably at least 90% pure. purity (w/w), even more preferably at least 95% purity (w/w), and most preferably at least 99% purity (w/w), when measured with using Lowry protein analysis.

Диатело, как применяют в настоящем документе, представляет собой небольшую бивалентную антигенсвязывающую часть антитела, которая содержит вариабельный домен тяжелой цепи, связанный с вариабельным доменом легкой цепи на той же самой полипептидной цепи, соединенные пептидным линкером, который слишком короткий, чтобы позволять соединение между двумя доменами той же самой цепи. Это в результате приводит к соединению комплементарных доменов с другой цепи и к сборке димерной молекулы с двумя антигенсвязывающими участками. Диатела могут быть бивалентными и моноспецифическими (такими как диатела с двумя антигенсвязывающими участками для человеческого GDF-15), или могут быть бивалентными и биспецифическими (например, диатела с двумя антигенсвязывающими участками, одним участком связывания для человеческого GDF-15, и другим участком связывания для другого антигена). Подробное описание диател можно найти в Holliger P et al. (Diabodies: small bivalent and bispecific antibody fragments. Proc Natl Acad Sci USA. 1993 Jul 15;90(14):6444-8).A diabody, as used herein, is a small bivalent antigen-binding portion of an antibody that contains a heavy chain variable domain linked to a light chain variable domain on the same polypeptide chain, connected by a peptide linker that is too short to allow connection between the two domains. the same chain. This results in the joining of complementary domains from the other chain and the assembly of a dimeric molecule with two antigen-binding sites. Diabodies may be bivalent and monospecific (such as diabodies with two antigen binding sites for human GDF-15), or may be bivalent and bispecific (such as diabodies with two antigen binding sites, one binding site for human GDF-15, and another binding site for another antigen). A detailed description of diabodies can be found in Holliger P et al. (Diabodies: small bivalent and bispecific antibody fragments. Proc Natl Acad Sci USA. 1993 Jul 15;90(14):6444-8).

Однодоменное антитело (которое также обозначают как Nanobody™), как применяют в настоящем документе, представляет собой фрагмент антитела, состоящий из одного мономерного вариабельноA single domain antibody (also referred to as Nanobody™), as used herein, is an antibody fragment consisting of a single monomeric variable

- 9 044887 го домена антитела. Структуры однодоменных антител и способы для получения однодоменных антител известны в данной области, например, из Holt LJ et al. (Domain antibodies: proteins for therapy. Trends Biotechnol. 2003 Nov; 21(11):484-90.), Saerens D et al. (Single-domain antibodies as building blocks for novel therapeutics. Curr Opin Pharmacol. 2008 Oct; 8 (5) : 600-8. Epub 2008 Aug 22.) и Arbabi Ghahroudi M et al. (Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Lett. 1997 Sep 15; 414(3):521-6).- 9 044887 th antibody domain. Single domain antibody structures and methods for preparing single domain antibodies are known in the art, for example from Holt LJ et al. (Domain antibodies: proteins for therapy. Trends Biotechnol. 2003 Nov; 21(11):484-90.), Saerens D et al. (Single-domain antibodies as building blocks for novel therapeutics. Curr Opin Pharmacol. 2008 Oct; 8 (5): 600-8. Epub 2008 Aug 22.) and Arbabi Ghahroudi M et al. (Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Lett. 1997 Sep 15; 414(3):521-6).

Термины злокачественная опухоль и злокачественная клетка применяют в настоящем документе в соответствии с их обычным значением в данной области (см., например, Weinberg R. et al. : The Biology of Cancer. Garland Science: New York 2006. 850p).The terms cancer and cancer cell are used herein in accordance with their usual meaning in the art (see, for example, Weinberg R. et al.: The Biology of Cancer. Garland Science: New York 2006. 850p).

Злокачественные опухоли для лечения по настоящему изобретению представляют собой солидные злокачественные опухоли. Солидная злокачественная опухоль представляет собой злокачественную опухоль, которая формирует одну или несколько солидных опухолей. Такие солидные злокачественные опухоли, образующие солидные опухоли, в основном, известны в данной области. Термин солидная злокачественная опухоль включает в себя и первичную опухоль, сформированную злокачественной опухолью, и возможные вторичные опухоли, которые также известны как метастазы. Предпочтительные солидные злокачественные опухоли для лечения по изобретению выбраны из группы, состоящей из меланомы, колоректального рака, рака предстательной железы, рака головы и шеи, уротелиального рака, рака желудка, рака поджелудочной железы, рака печени, рака яичек, рака яичников, рака эндометрия, рака шейки матки, рака головного мозга, рака молочной железы, рака желудка, почечноклеточной карциномы, саркомы Юинга, немелкоклеточного рака легких и мелкоклеточного рака легких, предпочтительно выбраны из группы, состоящей из меланомы, колоректального рака, рака предстательной железы, рака головы и шеи, уротелиального рака, рака желудка, рака поджелудочной железы, рака печени, рака яичек, рака яичников, рака эндометрия и рака шейки матки, более предпочтительно выбраны из группы, состоящей из меланомы, колоректального рака, рака предстательной железы, рака головы и шеи, уротелиального рака и рака желудка, и наиболее предпочтительно выбраны из группы, состоящей из меланомы, колоректального рака и рака предстательной железы.The malignant tumors to be treated according to the present invention are solid malignant tumors. A solid malignant tumor is a malignant tumor that forms one or more solid tumors. Such solid malignant tumors forming solid tumors are generally known in the art. The term solid malignant tumor includes both the primary tumor formed by the malignant tumor and possible secondary tumors, which are also known as metastases. Preferred solid cancers for treatment according to the invention are selected from the group consisting of melanoma, colorectal cancer, prostate cancer, head and neck cancer, urothelial cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, liver cancer, testicular cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, cervical cancer, brain cancer, breast cancer, gastric cancer, renal cell carcinoma, Ewing's sarcoma, non-small cell lung cancer and small cell lung cancer, preferably selected from the group consisting of melanoma, colorectal cancer, prostate cancer, head and neck cancer, urothelial cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, liver cancer, testicular cancer, ovarian cancer, endometrial cancer and cervical cancer, more preferably selected from the group consisting of melanoma, colorectal cancer, prostate cancer, head and neck cancer, urothelial cancer and gastric cancer, and most preferably selected from the group consisting of melanoma, colorectal cancer and prostate cancer.

Как упоминают в настоящем документе, термин рак головного мозга относится ко всем злокачественным опухолям головного мозга, известным в данной области. В качестве неограничивающих примеров термин включает глиому (дифференцированность по ВОЗ от I до IV), астроцитому, менингиому и медуллобластому.As referred to herein, the term brain cancer refers to all malignant brain tumors known in the art. By way of non-limiting examples, the term includes glioma (WHO grade I to IV), astrocytoma, meningioma and medulloblastoma.

Как упоминается в настоящем документе, термин рак головы и шеи относится ко всем ракам головы и шеи, известным в данной области. В качестве неограничивающих примеров термин включает карциному пищевода, плоскоклеточную карциному полости рта и гипофарингеальный рак. Особенно предпочтительный рак головы и шеи для лечения по изобретению представляет собой плоскоклеточную карциному полости рта.As referred to herein, the term head and neck cancer refers to all head and neck cancers known in the art. By way of non-limiting examples, the term includes esophageal carcinoma, oral squamous cell carcinoma, and hypopharyngeal carcinoma. A particularly preferred head and neck cancer for treatment according to the invention is oral squamous cell carcinoma.

Как применяют в настоящем документе термин рост злокачественной опухоли относится к любому измеримому росту злокачественной опухоли. Для злокачественных опухолей, формирующих солидные опухоли, рост злокачественной опухоли относится к измеримому увеличению объема опухоли с течением времени. Если злокачественная опухоль образует только одну опухоль, рост злокачественной опухоли относится только к увеличению объема одной опухоли. Если злокачественная опухоль формирует множественные опухоли, такие как метастазы, рост злокачественной опухоли относится к увеличению объема всех измеримых опухолей. Для солидных опухолей, объем опухоли можно измерять любым известным в данной области способом, включая магнитно-резонансную визуализацию и компьютерную томографию (КТ-сканирование).As used herein, the term tumor growth refers to any measurable growth of a malignant tumor. For cancers forming solid tumors, tumor growth refers to the measurable increase in tumor volume over time. If a malignant tumor forms only one tumor, the growth of the malignant tumor refers only to the increase in the volume of one tumor. If a malignant tumor forms multiple tumors, such as metastases, malignant tumor growth refers to the increase in the volume of all measurable tumors. For solid tumors, tumor volume can be measured by any method known in the art, including magnetic resonance imaging and computed tomography (CT scan).

Термины, такие как лечение злокачественной опухоли или лечить злокачественную опухоль по настоящему изобретению относятся к терапевтическому лечению. Оценку того, работает ли терапевтическое лечение или нет, можно, например, производить путем оценки того, ингибирует ли лечение рост злокачественной опухоли у пациента или пациентов, которых лечат.Terms such as treating cancer or treating cancer of the present invention refer to therapeutic treatment. An assessment of whether a therapeutic treatment works or not can, for example, be made by assessing whether the treatment inhibits the growth of a malignant tumor in the patient or patients being treated.

Предпочтительно, ингибирование является статистически значимым по оценке с помощью подходящих статистических тестов, которые известны в данной области. Ингибирование роста злокачественной опухоли можно оценивать, сравнивая рост злокачественной опухоли в группе пациентов, которых лечат в соответствии с настоящим изобретением, с контрольной группой нелеченных пациентов, или сравнивая группу пациентов, которая получала стандартное лечение злокачественных опухолей, принятое в данной области, плюс лечение по изобретению, с контрольной группой пациентов, которая получала только стандартное лечение злокачественных опухолей, принятое в данной области. Такие исследования по оценке ингибирования роста злокачественных опухолей разрабатывают в соответствии с принятыми стандартами для клинических исследований, например, двойных слепых, рандомизированных исследований с достаточной статистической мощностью. Термин лечение злокачественной опухоли включает ингибирование роста злокачественной опухоли, когда рост злокачественной опухоли ингибируется частично (т.е. когда рост злокачественной опухоли у пациента замедляется по сравнению с контрольной группой пациентов), ингибирование, когда рост злокачественной опухоли ингибируется полностью (т.е. когда рост злокачественной опухоли у пациента останавливается), и ингибирование, когда ростPreferably, the inhibition is statistically significant as assessed by suitable statistical tests that are known in the art. Inhibition of cancer growth can be assessed by comparing cancer growth in a group of patients treated in accordance with the present invention with a control group of untreated patients, or by comparing a group of patients that received standard cancer treatment in the art plus treatment according to the invention , with a control group of patients who received only the standard treatment for malignant tumors accepted in the field. Such studies evaluating tumor growth inhibition are designed in accordance with accepted standards for clinical trials, eg, double-blind, randomized studies with sufficient statistical power. The term treatment of a malignant tumor includes inhibition of the growth of a malignant tumor, when the growth of a malignant tumor is partially inhibited (i.e., when the growth of a malignant tumor in a patient is slowed down compared to a control group of patients), inhibition, when the growth of a malignant tumor is completely inhibited (i.e., when the growth of a malignant tumor in the patient stops), and inhibition when the growth

- 10 044887 злокачественной опухоли является обратимым (т.е. злокачественная опухоль уменьшается в объеме). Предпочтительно, оценку того, работает ли терапевтическое лечение или нет, можно проводить на основании классификации на отвечающих и не отвечающих на лечение с использованием критериев оценки ответа при солидных опухолях, версия 1.1 (RECIST v1.1) (Eisenhauer et al.: New response evaluation criteria in solid tumours: revised RECIST guideline (version 1.1). In: Eur. J. Cancer. 45, No. 2, January 2009, pp. 22847). Альтернативно, или дополнительно, оценку того, работает ли терапевтическое лечение или нет, можно проводить на основании известных клинических показателей прогрессирования злокачественных опухолей.- 10 044887 malignant tumor is reversible (i.e. the malignant tumor decreases in volume). Preferably, an assessment of whether a therapeutic treatment is working or not can be made based on classification into responders and non-responders using the Response Evaluation Criteria in Solid Tumors version 1.1 (RECIST v1.1) (Eisenhauer et al.: New response evaluation criteria in solid tumors: revised RECIST guideline (version 1.1). In: Eur. J. Cancer. 45, No. 2, January 2009, pp. 22847). Alternatively, or additionally, an assessment of whether a therapeutic treatment is working or not can be made based on known clinical indicators of cancer progression.

Лечение злокачественной опухоли по изобретению может быть терапией первой линии, терапией второй линии или терапией третьей линии, или терапией после терапии третьей. Значение этих терминов известно в данной области и находится в соответствии с терминологией, которая широко используется Национальным институтом рака США.Treatment of a malignant tumor according to the invention may be first-line therapy, second-line therapy or third-line therapy, or therapy after third-line therapy. The meaning of these terms is known in the art and is in accordance with terminology that is widely used by the US National Cancer Institute.

Лечение злокачественной опухоли по настоящему изобретению не исключает также возникновения у пациентов дополнительных или вторичных терапевтических выгод. Например, дополнительной или вторичной выгодой может быть воздействие на потерю массы, индуцированную злокачественной опухолью. Однако следует понимать, что первичное лечение, за чьей защитой обращаются, предназначено для лечения злокачественной опухоли самой по себе, любые вторичные или дополнительные эффекты только отражают необязательные дополнительные преимущества лечения роста злокачественной опухоли.Treatment of a malignant tumor according to the present invention also does not exclude the occurrence of additional or secondary therapeutic benefits in patients. For example, an additional or secondary benefit may be an effect on cancer-induced weight loss. However, it should be understood that the primary treatment sought for protection is intended to treat the malignant tumor itself, any secondary or additional effects only reflect the optional additional benefits of treating the growth of the malignant tumor.

Термин иммунотерапия злокачественной опухоли известен в данной области и, в основном, относится к лечению злокачественной опухоли, при котором используют иммунную систему пациента для лечения злокачественной опухоли. Злокачественные клетки несут геномные мутации, которые приводят к образованию антигенов злокачественных клеток, которые являются специфичными для злокачественных клеток и отличаются от антигенов незлокачественных клеток. Таким образом, в предпочтительном аспекте иммунотерапии злокачественной опухоли в соответствии с настоящим изобретением, иммунотерапия злокачественной опухоли представляет собой иммунотерапию злокачественной опухоли, где такие антигены злокачественных клеток распознаются иммунной системой, и где злокачественные клетки, экспрессирующие эти антигены, уничтожаются иммунной системой. В неограничивающем аспекте изобретения, такие злокачественные клетки, экспрессирующие эти антигены злокачественных клеток, могут уничтожаться CD8+ Т-клетками иммунной системы. Иммунотерапию злокачественной опухоли можно оценивать путем иммуномониторинга известными в данной области способами, например, измеряя внутриклеточную экспрессию IFN-γ (например, в CD8+ Т-клетках и/или NK-клетках) в образцах крови, измеряя экспрессию CD107a на клеточной поверхности (например, CD8+ Т-клеток и/или NK-клеток) в образцах крови, измеряя внутриклеточную экспрессию TNF-α (например, на лейкоцитах) в образцах крови, внутриклеточную экспрессию интерлейкина-2 (например, в CD8+ Т-клетках и/или в CD4+ Т-клетках) в образцах крови, экспрессию CD154 на клеточной поверхности (например, на CD8+ Т-клетках и/или на CD4+ Т-клетках) в образцах крови, окрашивая тетрамеры или декстрамеры для Т-клеток, специфических для опухолевых антигенов, в образцах крови, по активности ЦТЛ против аутологичных опухолевых клеток или по присутствию Т-клеток против опухолевых антигенов, полученых из опухолеспецифичных мутаций. Предпочтительными способами для оценки иммунотерапии злокачественной опухоли являются способы в соответствии с Gouttefangeas С et al. : Flow Cytometry in Cancer Immunotherapy: Applications, Quality Assurance and Future. (2015) In: Cancer Immunology: Translational Medicine from Bench to Bedside (N. Rezaei editor). Springer. Chapter 25: pages 471-486; и способы, согласно Van der Burg SH, et al. : Immunoguiding, the final frontier in the immunotherapy of cancer. (2014) In Cancer Immunotherapy meets oncology CM Britten, S Kreiter, M. Diken & HG Rammensee eds). Springer International Publishing Switzerland p37-51 ISBN: 978-3-319-05103-1.The term cancer immunotherapy is known in the art and generally refers to cancer treatment that uses the patient's immune system to treat the cancer. Malignant cells carry genomic mutations that lead to the formation of malignant cell antigens that are specific to malignant cells and different from antigens of non-malignant cells. Thus, in a preferred aspect of cancer immunotherapy in accordance with the present invention, cancer immunotherapy is cancer immunotherapy where such cancer cell antigens are recognized by the immune system, and where cancer cells expressing these antigens are destroyed by the immune system. In a non-limiting aspect of the invention, such cancer cells expressing these cancer cell antigens can be killed by CD8+ T cells of the immune system. Cancer immunotherapy can be assessed by immunomonitoring by methods known in the art, e.g., measuring intracellular IFN-γ expression (eg, in CD8+ T cells and/or NK cells) in blood samples, measuring cell surface expression of CD107a (eg, CD8+ T cells and/or NK cells) in blood samples, measuring intracellular expression of TNF-α (eg, on white blood cells) in blood samples, intracellular expression of interleukin-2 (eg, in CD8+ T cells and/or CD4+ T cells) cells) in blood samples, cell surface expression of CD154 (eg, on CD8+ T cells and/or CD4+ T cells) in blood samples, tetramer or dextramer staining for tumor antigen-specific T cells in blood samples, by CTL activity against autologous tumor cells or by the presence of T cells against tumor antigens derived from tumor-specific mutations. Preferred methods for evaluating cancer immunotherapy are those according to Gouttefangeas C et al. : Flow Cytometry in Cancer Immunotherapy: Applications, Quality Assurance and Future. (2015) In: Cancer Immunology: Translational Medicine from Bench to Bedside (N. Rezaei editor). Springer. Chapter 25: pages 471-486; and methods according to Van der Burg SH, et al. : Immunoguiding, the final frontier in the immunotherapy of cancer. (2014) In Cancer Immunotherapy meets oncology CM Britten, S Kreiter, M. Diken & HG Rammensee eds). Springer International Publishing Switzerland p37-51 ISBN: 978-3-319-05103-1.

Как применяют в настоящем документе, иммунотерапия злокачественной опухоли необязательно включает в себя лечение, при котором в дополнение к иммунной системе, которую используют для лечения злокачественной опухоли, применяют дополнительные механизмы лечения злокачественных опухолей. Например, ранее было показано, что ингибитор hGDF-15 можно использовать для лечения злокачественных опухолей на мышиной модельной системе, у которой иммунная система была значительно ослаблена (WO 2014/049087). Таким образом, по настоящему изобретению, иммунотерапия злокачественной опухоли ингибиторами hGDF-15 у пациентов-людей может также включать в себя дополнительные эффекты лечения ингибиторами hGDF-15, которые независимы от иммунной системы. Другим примером иммунотерапии злокачественной опухоли, где можно использовать дополнительные механизмы лечения злокачественных опухолей, является комбинированное лечение с известным химиотерапевтическим средством/средствами. Такое комбинированное лечение с известным химиотерапевтическим средством/средствами может, например, не только включать лечение злокачественной опухоли, при котором используют иммунную систему для лечения злокачественной опухоли, но может также включать лечение злокачественной опухоли, при котором злокачественные клетки непосредственно уничтожаются указанным химиотерапевтическим средством/средствами.As used herein, immunotherapy for cancer does not necessarily include treatment that employs additional mechanisms to treat cancer in addition to the immune system used to treat the cancer. For example, it was previously shown that the hGDF-15 inhibitor can be used to treat malignant tumors in a mouse model system in which the immune system was significantly weakened (WO 2014/049087). Thus, according to the present invention, cancer immunotherapy with hGDF-15 inhibitors in human patients may also include additional effects of treatment with hGDF-15 inhibitors that are independent of the immune system. Another example of cancer immunotherapy, where additional mechanisms for treating cancer can be used, is combination treatment with known chemotherapeutic agent(s). Such combination treatment with known chemotherapeutic agent(s) may, for example, not only include cancer treatment that uses the immune system to treat the cancer, but may also include cancer treatment that directly destroys the cancer cells with said chemotherapeutic agent(s).

Как применяют в настоящем документе, термин повышение процентного содержания CD8+ ТAs used herein, the term CD8+ T percentage increase

- 11 044887 клеток в солидной злокачественной опухоли относится к любому измеримому повышению в процентном содержании CD8+ Т-клеток (т.е. процентному содержанию CD8+ T-клеток, рассчитанному в отношении всех клеток) в опухоли или опухолях, образованных солидной злокачественной опухолью. Предпочтительно, повышение является статистически значимым по оценке подходящими статистическими тестами, которые известны в данной области. Повышение процентного содержания CD8+ Т-клеток в опухоли или опухолях, образованных солидной злокачественной опухолью, можно определять известными способами для анализа CD8+ Т-клеток в солидных опухолях. Такие способы включают анализ биоптатов опухоли на CD8+ Т-клетки, например, анализ таких опухолевых биоптатов путем иммуногистохимии с использованием антител против CD8 и использование окрашивания для общего числа клеток. Повышение можно оценивать, сравнивая процентное содержание CD8+ Т-клеток в опухолях в группе пациентов, которых лечили в соответствии с настоящим изобретением, с контрольной группой нелеченных пациентов или сравнивая группу пациентов, которая получала стандартное лечение злокачественных опухолей, принятое в данной области, плюс лечение по изобретению, с контрольной группой пациентов, которая получала только стандартное лечение злокачественных опухолей, принятое в данной области.- 11 044887 cells in a solid malignant tumor refers to any measurable increase in the percentage of CD8+ T cells (ie, the percentage of CD8+ T cells calculated over all cells) in the tumor or tumors formed by a solid malignant tumor. Preferably, the increase is statistically significant as assessed by suitable statistical tests that are known in the art. An increase in the percentage of CD8+ T cells in a tumor or tumors formed by a solid malignant tumor can be determined by known methods for analyzing CD8+ T cells in solid tumors. Such methods include analyzing tumor biopsies for CD8+ T cells, for example, analyzing such tumor biopsies by immunohistochemistry using anti-CD8 antibodies and using total cell count staining. The increase can be assessed by comparing the percentage of CD8+ T cells in tumors in a group of patients treated in accordance with the present invention with a control group of untreated patients or by comparing a group of patients that received standard treatment for malignancies in the art plus treatment with invention, with a control group of patients who received only standard treatment for malignant tumors accepted in the field.

Как применяют в настоящем документе, CD8+ Т-клетки предпочтительно являются клетками, которые эндогенно встречаются у пациента-человека.As used herein, CD8+ T cells are preferably cells that are found endogenously in a human patient.

Сывороточные уровни hGDF-15 можно измерять любыми известными в данной области способами. Например, предпочтительным способом измерения сывороточных уровней hGDF-15 является измерение сывороточных уровней hGDF-15 путем твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием антител к GDF-15. Такие способы ELISA представлены в примере 1. Альтернативно, сывороточные уровни hGDF-15 можно определять известными иммунологическими анализами с электрохемолюминисценцией с использованием антител к GDF-15. Например, можно использовать технологию Roche Elecsys® для таких иммунологических анализов с электрохемолюминисценцией.Serum levels of hGDF-15 can be measured by any methods known in the art. For example, a preferred method of measuring serum levels of hGDF-15 is to measure serum levels of hGDF-15 by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-GDF-15 antibodies. Such ELISA methods are presented in Example 1. Alternatively, serum levels of hGDF-15 can be determined by known electrochemoluminescence immunoassays using anti-GDF-15 antibodies. For example, Roche Elecsys® technology can be used for such electrochemoluminescence immunoassays.

Пациент для лечения по изобретению предпочтительно является пациентом с повышенными сывороточными уровнями hGDF-15. Как применяют в настоящем документе термин повышенные сывороточные уровни hGDF-15 означает, что пациент-человек имеет более высокие уровни hGDF-15 в сыворотке крови до введения ингибитора hGDF-15 по изобретению, по сравнению со средними уровнями hGDF-15 в сыворотке крови у контрольных здоровых человеческих индивидуумов в качестве референса.The patient for treatment according to the invention is preferably a patient with elevated serum levels of hGDF-15. As used herein, the term elevated serum hGDF-15 levels means that a human patient has higher serum hGDF-15 levels prior to administration of the hGDF-15 inhibitor of the invention, compared to the average hGDF-15 serum levels of controls healthy human individuals as reference.

Средний уровень в сыворотке hGDF-15 у контрольных здоровых человеческих индивидуумов составляет <0,8 нг/мл. Ожидаемый диапазон находится в пределах от 0,2 нг/мл до 1,2 нг/мл у здорового человеческого контроля (ссылка: Tanno T et al.: Growth differentiation factor 15 in erythroid health and disease Curr Opin Hematol. 2010 May; 17(3): 184-190).The average serum level of hGDF-15 in control healthy human subjects is <0.8 ng/ml. The expected range is from 0.2 ng/ml to 1.2 ng/ml in healthy human controls (Ref: Tanno T et al.: Growth differentiation factor 15 in erythroid health and disease Curr Opin Hematol. 2010 May; 17( 3): 184-190).

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления изобретения, пациент для лечения по изобретению является пациентом, который имеет уровень hGDF-15 в сыворотке, по меньшей мере, 1,2 нг/мл до начала введения ингибитора hGDF-15, предпочтительно, пациентом, который имеет уровень hGDF-15 в сыворотке, по меньшей мере, 1,5 нг/мл до начала введения ингибитора hGDF-15, и более предпочтительно, пациентом, который имеет уровень hGDF-15 в сыворотке, по меньшей мере, 1,8 нг/мл до начала введения ингибитора hGDF-15.Thus, in a preferred embodiment of the invention, the patient for treatment according to the invention is a patient who has a serum hGDF-15 level of at least 1.2 ng/ml before administration of the hGDF-15 inhibitor, preferably a patient who has a serum hGDF-15 level of at least 1.5 ng/mL prior to initiation of the hGDF-15 inhibitor, and more preferably, in a patient who has a serum hGDF-15 level of at least 1.8 ng/mL before starting hGDF-15 inhibitor administration.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления изобретения, пациент для лечения по изобретению является пациентом, который имеет уровень hGDF-15 в сыворотке, по меньшей мере, 1,2 нг/мл и не более чем 12 нг/ до начала введения ингибитора hGDF-15, предпочтительно, пациентом, который имеет уровень hGDF-15 в сыворотке, по меньшей мере, 1,5 нг/мл и не более чем 12 нг/ до начала введения ингибитора hGDF-15, и более предпочтительно, пациентом, который имеет уровень hGDF-15 в сыворотке, по меньшей мере, 1,8 нг/мл и не более чем 12 нг/ до начала введения ингибитора hGDF-15.In a further preferred embodiment of the invention, the patient for treatment according to the invention is a patient who has a serum hGDF-15 level of at least 1.2 ng/ml and no more than 12 ng/mL before administration of the hGDF-15 inhibitor, preferably , a patient who has a serum hGDF-15 level of at least 1.5 ng/mL and no more than 12 ng/mL prior to initiation of an hGDF-15 inhibitor, and more preferably, a patient who has an hGDF-15 level of serum at least 1.8 ng/ml and no more than 12 ng/ml before starting hGDF-15 inhibitor administration.

В дополнительном варианте осуществления изобретения в соответствии со всеми вышеописанными вариантами осуществления, пациент для лечения по изобретению является пациентом, который имеет уровень hGDF-15 в сыворотке, по меньшей мере, 1,2 нг/мл и не более чем 10 нг/ до начала введения ингибитора hGDF-15, предпочтительно, пациентом, который имеет уровень hGDF-15 в сыворотке, по меньшей мере, 1,5 нг/мл и не более чем 10 нг/ до начала введения ингибитора hGDF-15, и более предпочтительно, пациентом, который имеет уровень hGDF-15 в сыворотке, по меньшей мере, 1,8 нг/мл и не более чем 10 нг/ до начала введения ингибитора hGDF-15.In a further embodiment of the invention, in accordance with all of the above-described embodiments, the patient for treatment according to the invention is a patient who has a serum hGDF-15 level of at least 1.2 ng/ml and no more than 10 ng/mL prior to administration hGDF-15 inhibitor, preferably by a patient who has a serum hGDF-15 level of at least 1.5 ng/mL and no more than 10 ng/mL prior to initiation of the hGDF-15 inhibitor, and more preferably, by a patient who has a serum hGDF-15 level of at least 1.8 ng/mL and no more than 10 ng/mL prior to initiation of an hGDF-15 inhibitor.

В дополнительном варианте осуществления изобретения в соответствии со всеми вышеописанными вариантами осуществления, пациент для лечения по изобретению является пациентом, который имеет уровень hGDF-15 в сыворотке, по меньшей мере, 1,2 нг/мл и не более чем 8 нг/ до начала введения ингибитора hGDF-15, предпочтительно, пациентом, который имеет уровень hGDF-15 в сыворотке, по меньшей мере, 1,5 нг/мл и не более чем 8 нг/ до начала введения ингибитора hGDF-15, и более предпочтительно, пациентом, который имеет уровень hGDF-15 в сыворотке, по меньшей мере, 1,8 нг/мл и не более чем 8 нг/ до начала введения ингибитора hGDF-15.In a further embodiment of the invention, in accordance with all of the above-described embodiments, the patient for treatment according to the invention is a patient who has a serum hGDF-15 level of at least 1.2 ng/ml and no more than 8 ng/mL prior to administration hGDF-15 inhibitor, preferably by a patient who has a serum hGDF-15 level of at least 1.5 ng/mL and no more than 8 ng/mL prior to initiation of hGDF-15 inhibitor administration, and more preferably, by a patient who has a serum hGDF-15 level of at least 1.8 ng/mL and no more than 8 ng/mL prior to initiation of an hGDF-15 inhibitor.

В другом варианте осуществления пациент для лечения по изобретению является пациентом, который имеет уровень hGDF-15 в сыворотке, по меньшей мере, 2 нг/мл, по меньшей мере, 2,2 нг/мл, по меньшей мере, 2,4 нг/мл, по меньшей мере, 2,6 нг/мл, по меньшей мере, 2,8 нг/мл, по меньшей мере, 3,0 нг/мл, по меньшей мере, 3,2 нг/мл, по меньшей мере, 3,4 нг/мл, по меньшей мере, 3,6 нг/мл, по меньшейIn another embodiment, the patient for treatment according to the invention is a patient who has a serum hGDF-15 level of at least 2 ng/ml, at least 2.2 ng/ml, at least 2.4 ng/ ml, at least 2.6 ng/ml, at least 2.8 ng/ml, at least 3.0 ng/ml, at least 3.2 ng/ml, at least 3.4 ng/ml, at least 3.6 ng/ml, at least

- 12 044887 мере, 3,8 нг/мл, по меньшей мере, 4,0 нг/мл, или, по меньшей мере, 4,2 нг/ до начала введения ингибитора hGDF-15. В этом варианте осуществления пациент предпочтительно является пациентом, который имеет уровень hGDF-15 в сыворотке не более чем 12 нг/мл до начала введения ингибитора hGDF-15. Более предпочтительно, в этом варианте осуществления пациент является пациентом, который имеет уровень hGDF-15 в сыворотке не более чем 10 нг/мл до начала введения ингибитора hGDF-15. Наиболее предпочтительно, в этом варианте осуществления пациент является пациентом, который имеет уровень hGDF-15 в сыворотке не более чем 8 нг/мл до начала введения ингибитора hGDF-15.- 12 044887 at least 3.8 ng/ml, at least 4.0 ng/ml, or at least 4.2 ng/ before starting hGDF-15 inhibitor administration. In this embodiment, the patient is preferably a patient who has a serum hGDF-15 level of no more than 12 ng/ml before administration of the hGDF-15 inhibitor. More preferably, in this embodiment, the patient is a patient who has a serum hGDF-15 level of no more than 10 ng/ml before administration of the hGDF-15 inhibitor. Most preferably, in this embodiment, the patient is a patient who has a serum hGDF-15 level of no more than 8 ng/ml before administration of the hGDF-15 inhibitor.

Как применяют в настоящем документе термин до начала введения означает период времени непосредственно перед введением ингибитора hGDF-15 по изобретению. Предпочтительно, термин до начала введения означает период в 30 суток непосредственно перед введением; наиболее предпочтительно период в одну неделю непосредственно перед введением.As used herein, the term pre-administration means the period of time immediately before administration of the hGDF-15 inhibitor of the invention. Preferably, the term pre-administration means the period of 30 days immediately before administration; most preferably a period of one week immediately before administration.

Термины значимый, значимо, и т.д., как применяют в настоящем документе, относятся к статистически значимому отличию между величинами по оценками соответствующими, известными в данной области способами.The terms significant, significant, etc., as used herein, refer to a statistically significant difference between values as estimated by appropriate methods known in the art.

Ингибиторы hGDF-15 и блокаторы контрольных точек иммунного ответа, применяемые по изобретению, можно вводить при помощи известных в данной области способов. Такие способы будет выбирать специалист на основании хорошо известных факторов (например, в зависимости от того является ли ингибитор малой интерферирующей РНК или антителом). Введение известных блокаторов контрольных точек иммунного ответа можно производить на основании известных схем введения этих блокаторов контрольных точек иммунного ответа. Например, введение блокаторов контрольных точек иммунного ответа можно производить на основании схем введения, применяемых в исследовании KEYNOTE-006 (С. Robert et al. N Engl J Med 2015; 372:2521-2532).The hGDF-15 inhibitors and immune checkpoint blockers used in the invention can be administered using methods known in the art. Such methods will be selected by one skilled in the art based on well known factors (eg, whether the inhibitor is a small interfering RNA or an antibody). Administration of known immune checkpoint blockers can be done based on known regimens for administration of these immune checkpoint blockers. For example, administration of immune checkpoint blockers can be based on the administration regimens used in the KEYNOTE-006 study (C. Robert et al. N Engl J Med 2015; 372:2521-2532).

В соответствии с настоящим изобретением, любое появление термина содержащий необязательно можно замещать термином состоящий из.In accordance with the present invention, any occurrence of the term containing may optionally be replaced by the term consisting of.

Ингибиторы hGDF-15 для применения в соотвтетствии с изобретением.hGDF-15 inhibitors for use according to the invention.

Ингибитор hGDF-15 по изобретению может быть любой молекулой, которая способна ингибировать функцию человеческого GDF-15 (hGDF-15).The hGDF-15 inhibitor of the invention can be any molecule that is capable of inhibiting the function of human GDF-15 (hGDF-15).

Неограничивающий пример такого ингибитора hGDF-15 представляет собой молекулу, которая специфически снижает экспрессию hGDF-15 и, таким образом, ингибирует функцию hGDF-15. Например, можно использовать малую интерферирующую РНК или шпилечную конструкцию миРНК для специфического снижения экспрессии hGDF-15 и ингибирования функции hGDF-15. Правила для конструирования и отбора последовательностей малой интерферирующей РНК и шпилечной конструкции миРНК известны в данной области и, например, расматриваются у Jackson and Linsley, Recognizing and avoiding siRNA off-target effects for target identification and therapeutic application, Nat Rev Drug Discov. 2010 Jan; 9(1):57-67. Малые интерферирующие РНК и шпилечные конструкции миРНК можно доставлять пациентам-людям любыми подходящими способами, включая способы вирусной доставки (как, например, описанные у Knoepfel SA et al., Selection of RNAi-based inhibitors for anti-HIV gene therapy. World J Virol. 2012 Jun 12;1(3):79-90) и другие способы доставки, такие как способы с использованием конъюгированных групп, которые облегчают доставку внутрь клеток (как, например, описанные в Kanasty R et al., Delivery materials for siRNA therapeutics., Nat Mater. 2013 Nov; 12 (11):967-77).A non-limiting example of such an hGDF-15 inhibitor is a molecule that specifically reduces the expression of hGDF-15 and thereby inhibits the function of hGDF-15. For example, small interfering RNA or a hairpin siRNA construct can be used to specifically reduce hGDF-15 expression and inhibit hGDF-15 function. Rules for the design and selection of small interfering RNA sequences and siRNA hairpin constructs are known in the art and, for example, are discussed in Jackson and Linsley, Recognizing and avoiding siRNA off-target effects for target identification and therapeutic application, Nat Rev Drug Discov. 2010 Jan; 9(1):57-67. Small interfering RNA and hairpin siRNA constructs can be delivered to human patients by any suitable means, including viral delivery methods (such as those described in Knoepfel SA et al., Selection of RNAi-based inhibitors for anti-HIV gene therapy. World J Virol. 2012 Jun 12;1(3):79-90) and other delivery methods, such as methods using conjugated groups that facilitate delivery into cells (such as those described in Kanasty R et al., Delivery materials for siRNA therapeutics. , Nat Mater. 2013 Nov;12(11):967-77).

Является ли вещество, представляющее интерес, ингибитором hGDF-15 или нет, можно определять при помощи способов, описываемых в настоящем документе, как указано в предпочтительных вариантах осуществления. Предпочтительным способом в соответствии с предпочтительными вариантами осуществления является способ, использованный в примере 3.Whether the substance of interest is an hGDF-15 inhibitor or not can be determined using the methods described herein, as indicated in the preferred embodiments. The preferred method according to preferred embodiments is the method used in Example 3.

Ранее было показано, что на человеческий белок GDF-15 можно успешно нацеливать моноклональное антитело (WO 2014/049087), и что такое антитело имеет благоприятные свойства, в том числе высокую аффинность связывания с человеческим GDF-15, как показано равновесной константой диссоциации приблизительно 790рМ для рекомбинантного человеческого GDF-15 (см. эталонный пример 1). Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления в соответствии с изобретением, ингибитор hGDF15 для использования представляет собой антитело, способное связываться с hGDF-15, или его антигенсвязывающую часть. Предпочтительно, антитело представляет собой моноклональное антитело, способное связываться с hGDF-15, или его антигенсвязывающую часть.It has previously been shown that the human GDF-15 protein can be successfully targeted by a monoclonal antibody (WO 2014/049087), and that such an antibody has favorable properties, including high binding affinity for human GDF-15, as indicated by an equilibrium dissociation constant of approximately 790 pM for recombinant human GDF-15 (see Reference Example 1). Thus, in a preferred embodiment according to the invention, the hGDF15 inhibitor to be used is an antibody capable of binding to hGDF-15, or an antigen-binding portion thereof. Preferably, the antibody is a monoclonal antibody capable of binding to hGDF-15, or an antigen-binding portion thereof.

Таким образом, в более предпочтительном варианте осуществления ингибитор hGDF-15 в соответствии с изобретение представляет собой моноклональное антитело, способное связываться с человеческим GDF-15, или его антигенсвязывающую часть, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит область CDR3, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 5 или аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 90% идентичную этой последовательности, и где вариабельный домен легкой цепи содержит область CDR3, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 85% идентичную этой последовательности. В этом варианте осуществления предпочтительно, антитело или его антигенсвязывающая часть содержит вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит а область CDR1, включающую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 3, и область CDR2, включающую аминоThus, in a more preferred embodiment, the hGDF-15 inhibitor according to the invention is a monoclonal antibody capable of binding to human GDF-15, or an antigen binding portion thereof, wherein the heavy chain variable domain comprises a CDR3 region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO : 5 or an amino acid sequence at least 90% identical to this sequence, and wherein the light chain variable domain comprises a CDR3 region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 or an amino acid sequence at least 85% identical to this sequence . In this embodiment, preferably, the antibody or antigen binding portion thereof comprises a heavy chain variable domain which comprises a CDR1 region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a CDR2 region comprising amino

- 13 044887 кислотную последовательность из SEQ ID NO: 4, и антитело или его антигенсвязывающая часть содержит вариабельный домен легкой цепи, который содержит область CDR1, включающую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 6, и область CDR2, включающую аминокислотную последовательность ser-ala-ser.- 13 044887 the acidic sequence of SEQ ID NO: 4, and the antibody or antigen-binding portion thereof comprises a light chain variable domain that contains a CDR1 region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and a CDR2 region comprising the amino acid sequence ser-ala- ser.

Таким образом, еще в более предпочтительном варианте осуществления, ингибитор hGDF-15 в соответствии с изобретением представляет собой моноклональное антитело, способное связываться с человеческим GDF-15, или его антигенсвязывающую часть, где антитело или его антигенсвязывающая часть содержит вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит область CDR1, включающую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 3, область CDR2, включающую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 4, и область CDR3, включающую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 5, и где антитело или его антигенсвязывающая часть содержит вариабельный домен легкой цепи, который содержит область CDR1, включающую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 6, область CDR2, включающую аминокислотную последовательность ser-ala-ser, и область CDR3, включающую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 7.Thus, in an even more preferred embodiment, the hGDF-15 inhibitor according to the invention is a monoclonal antibody capable of binding to human GDF-15, or an antigen binding portion thereof, wherein the antibody or antigen binding portion thereof comprises a heavy chain variable domain that contains a CDR1 region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, a CDR2 region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and a CDR3 region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and wherein the antibody or antigen binding portion thereof comprises a variable domain light chain, which contains a CDR1 region including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, a CDR2 region including the amino acid sequence ser-ala-ser, and a CDR3 region including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.

В другом варианте осуществления в соответствии с вышеописанными вариантами осуществления моноклонального антитела, способного связываться с человеческим GDF-15, или его антигенсвязывающей части, вариабельный домен тяжелой цепи содержит область, включающую области FR1, CDR1, FR2, CDR2 и FR3 и содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 1 или последовательность на 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную этой последовательности, и вариабельный домен легкой цепи содержит область, включающую область FR1, CDR1, FR2, CDR2 и FR3 и содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 2 или последовательность на 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную этой последовательности.In another embodiment, in accordance with the above-described embodiments of a monoclonal antibody capable of binding to human GDF-15, or an antigen-binding portion thereof, the heavy chain variable domain comprises a region including the FR1, CDR1, FR2, CDR2 and FR3 regions and containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a sequence 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 or 99% identical to this sequence, and the light chain variable domain contains a region including the FR1, CDR1, FR2, CDR2 region and FR3 and containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a sequence 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 or 99% identical to this sequence.

В предпочтительном варианте осуществления в соответствии с вышеописанными вариантами осуществления моноклонального антитела, способного связываться с человеческим GDF-15, или его антигенсвязывающей части, антитело представляет собой гуманизированное антитело или его антигенсвязывающую часть. Константный домен тяжелой цепи этого моноклонального антитела или его антигенсвязывающей части может содержать аминокислотную последовательность из SEQ ID No: 29, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 85%, предпочтительно, по меньшей мере, на 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 95% идентичную этой последовательности, и константный домен легкой цепи этого моноклонального антитела или его антигенсвязывающей части может содержать аминокислотную последовательность из SEQ ID No: 32, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 85%, предпочтительно, по меньшей мере, на 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 95% идентичную этой последовательности. Более предпочтительно, константный домен тяжелой цепи этого моноклонального антитела или его антигенсвязывающей части содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID No: 29, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 98%, предпочтительно, по меньшей мере, на 99% идентичную этой последовательности, и константный домен легкой цепи этого моноклонального антитела или его антигенсвязывающей части содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID No: 32, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 98%, предпочтительно, по меньшей мере, на 99% идентичную этой последовательности. Еще более предпочтительно, константный домен тяжелой цепи этого моноклонального антитела или его антигенсвязывающей части содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID No: 29, и константный домен легкой цепи этого моноклонального антитела или его антигенсвязывающей части содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID No: 32. Вариабельный домен тяжелой цепи этого моноклонального антитела или его антигенсвязывающей части может содержать аминокислотную последовательность из SEQ ID No: 28, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 90%, предпочтительно, по меньшей мере, на 95%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 98%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 99% идентичную этой последовательности, и вариабельный домен легкой цепи этого моноклонального антитела или его антигенсвязывающей части может содержать аминокислотную последовательность из SEQ ID No: 31, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 90%, предпочтительно, по меньшей мере, на 95%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 98%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 99% идентичную этой последовательности. Наиболее предпочтительно, вариабельный домен тяжелой цепи этого моноклонального антитела или его антигенсвязывающей части содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID No: 28, и вариабельный домен легкой цепи этого моноклонального антитела или его антигенсвязывающей части содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID No: 31.In a preferred embodiment according to the above-described embodiments of the monoclonal antibody capable of binding to human GDF-15, or an antigen-binding portion thereof, the antibody is a humanized antibody or an antigen-binding portion thereof. The heavy chain constant domain of the monoclonal antibody or antigen binding portion thereof may comprise the amino acid sequence of SEQ ID No: 29, or the amino acid sequence of at least 85%, preferably at least 90%, more preferably at least 95% identical to this sequence, and the light chain constant domain of this monoclonal antibody or antigen binding portion thereof may comprise the amino acid sequence of SEQ ID No: 32, or an amino acid sequence of at least 85%, preferably at least 90%, more preferably at least 95% identical to this sequence. More preferably, the heavy chain constant domain of the monoclonal antibody or antigen binding portion thereof comprises the amino acid sequence of SEQ ID No: 29, or an amino acid sequence that is at least 98%, preferably at least 99% identical to that sequence, and the light chain constant domain of the monoclonal antibody or antigen binding portion thereof comprises the amino acid sequence of SEQ ID No: 32, or an amino acid sequence that is at least 98%, preferably at least 99% identical to that sequence. Even more preferably, the heavy chain constant domain of the monoclonal antibody or antigen binding portion thereof comprises the amino acid sequence of SEQ ID No: 29, and the light chain constant domain of the monoclonal antibody or antigen binding portion thereof comprises the amino acid sequence of SEQ ID No: 32. Heavy chain variable domain the chain of this monoclonal antibody or antigen binding portion thereof may comprise the amino acid sequence of SEQ ID No: 28, or the amino acid sequence of at least 90%, preferably at least 95%, more preferably at least 98 %, even more preferably at least 99% identical to this sequence, and the light chain variable domain of this monoclonal antibody or antigen binding portion thereof may comprise the amino acid sequence of SEQ ID No: 31, or the amino acid sequence of at least 90 %, preferably at least 95%, more preferably at least 98%, even more preferably at least 99% identical to this sequence. Most preferably, the heavy chain variable domain of the monoclonal antibody or antigen binding portion thereof comprises the amino acid sequence of SEQ ID No: 28, and the light chain variable domain of the monoclonal antibody or antigen binding portion thereof contains the amino acid sequence of SEQ ID No: 31.

В другом варианте осуществления в соответствии с вышеописанными вариантами осуществления моноклонального антитела, способного связываться с человеческим GDF-15, или его антигенсвязывающей части, вариабельный домен тяжелой цепи содержит область CDR1, включающую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 3, и область CDR2, включающую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 4, и вариабельный домен легкой цепи содержит область CDR1, включающую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 6, и область CDR2, включающую аминокислотную поIn another embodiment, consistent with the above-described embodiments of a monoclonal antibody capable of binding to human GDF-15, or an antigen-binding portion thereof, the heavy chain variable domain comprises a CDR1 region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a CDR2 region comprising the amino acid sequence sequence from SEQ ID NO: 4, and the light chain variable domain contains a CDR1 region including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and a CDR2 region including the amino acid sequence

- 14 044887 следовательность из SEQ ID NO: 7. В предпочтительном аспекте этого варианта осуществления, антитело может иметь последовательности CDR3, как определено в любом из вышеописанных вариантов осуществления изобретения.- 14 044887 sequence from SEQ ID NO: 7. In a preferred aspect of this embodiment, the antibody may have CDR3 sequences as defined in any of the above-described embodiments of the invention.

В другом варианте осуществления в соответствии с моноклональным антителом, способным связываться с человеческим GDF-15, или его антигенсвязывающей частью, антигенсвязывающая часть представляет собой однодоменное антитело (также обозначаемое как Nanobody™). В одном из аспектов этого варианта осуществления, однодоменное антитело содержит аминокислотные последовательности CDR1, CDR2, и CDR3 из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, и SEQ ID NO: 5, соответственно. В другом аспекте этого варианта осуществления, однодоменное антитело содержит аминокислотные последовательности CDR1, CDR2, и CDR3 из SEQ ID NO: 6, ser-ala-ser, и SEQ ID NO: 7, соответственно. В предпочтительном аспекте этого варианта осуществления, однодоменное антитело представляет собой гуманизированное антитело.In another embodiment, in accordance with a monoclonal antibody capable of binding to human GDF-15, or an antigen binding portion thereof, the antigen binding portion is a single domain antibody (also referred to as Nanobody™). In one aspect of this embodiment, the single domain antibody comprises the amino acid sequences CDR1, CDR2, and CDR3 of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 5, respectively. In another aspect of this embodiment, the single domain antibody comprises the amino acid sequences CDR1, CDR2, and CDR3 of SEQ ID NO: 6, ser-ala-ser, and SEQ ID NO: 7, respectively. In a preferred aspect of this embodiment, the single domain antibody is a humanized antibody.

Предпочтительно, антитела, способные связываться с человеческим GDF-15 или их антигенсвязывающие части имеют равновесную константу диссоциации для человеческого GDF-15, которая равна или составляет менее чем 100 нМ, менее чем 20 нМ, предпочтительно, менее чем 10 нМ, более предпочтительно, менее чем 5 нМ и наиболее предпочтительно в пределах от 0,1 нМ до 2 нМ.Preferably, antibodies capable of binding to human GDF-15 or antigen binding portions thereof have an equilibrium dissociation constant for human GDF-15 that is equal to or less than 100 nM, less than 20 nM, preferably less than 10 nM, more preferably less less than 5 nM and most preferably in the range from 0.1 nM to 2 nM.

В другом варианте осуществления в соответствии с вышеописанными вариантами осуществления моноклонального антитела, способного связываться с человеческим GDF-15, или его антигенсвязывающей части, антитело, способное связываться с человеческим GDF-15 или его антигенсвязывающая часть связывается с тем же самым эпитопом человеческого GDF-15, что и антитело к человеческому GDF-15, полученное из клеточной линии В1-23, депонированной Немецким собранием микроорганизмов и клеточных культур GmbH (DMSZ) с номером доступа DSM ACC3142. Как описано в настоящем документе, связывание антитела с человеческим GDF-15 в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно оценивают путем измерений поверхностного плазмонного резонанса в качестве референсного стандартного способа, в соответствии с процедурами, описанными в эталонном примере 1. Связывание с тем же самым эпитопом на человеческом GDF-15 можно оценивать аналогично при помощи поверхностного плазмонного резонанса для экспериментов конкурентного связывания для антитела к человеческому GDF-15, полученному из клеточной линии В1-23 и антитела, которое, как ожидают, будет связываться с тем же самым эпитопом на человеческом GDF-15, что и антитело к человеческому GDF-15, полученное из клеточной линии В1-23.In another embodiment, in accordance with the above-described embodiments of a monoclonal antibody capable of binding to human GDF-15, or an antigen-binding portion thereof, an antibody capable of binding to human GDF-15 or an antigen-binding portion thereof binds to the same epitope of human GDF-15, as well as the anti-human GDF-15 antibody obtained from the B1-23 cell line deposited by the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DMSZ) with DSM accession number ACC3142. As described herein, antibody binding to human GDF-15 in accordance with the present invention is preferably assessed by surface plasmon resonance measurements as a reference standard method, in accordance with the procedures described in Reference Example 1. Binding to the same epitope on human GDF-15 can be assessed similarly using surface plasmon resonance for competitive binding experiments for an antibody to human GDF-15 derived from the B1-23 cell line and an antibody that is expected to bind to the same epitope on human GDF-15 , as the anti-human GDF-15 antibody obtained from the B1-23 cell line.

В другом предпочтительном варианте осуществления антитело, способное связываться с человеческим GDF-15 или его антигенсвязывающая часть, представляет собой моноклональное антитело, способное связываться с человеческим GDF-15, или его антигенсвязывающую часть, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 39 или последовательность, которая, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 91%, по меньшей мере, на 92%, по меньшей мере, на 93%, по меньшей мере, на 94%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98% или, по меньшей мере, на 99% идентична этой последовательности, и вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 40 или последовательность, которая, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 91%, по меньшей мере, на 92%, по меньшей мере, на 93%, по меньшей мере, на 94%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98% или, по меньшей мере, на 99% идентична этой последовательности.In another preferred embodiment, the antibody capable of binding to human GDF-15 or an antigen binding portion thereof is a monoclonal antibody capable of binding to human GDF-15 or an antigen binding portion thereof, wherein the heavy chain variable domain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39 or a sequence that is at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% identical to this sequence, and variable the light chain domain contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40 or a sequence that is at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, according to at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least at least 99% identical to this sequence.

В другом предпочтительном варианте осуществления антитело, способное связываться с человеческим GDF-15 или его антигенсвязывающая часть, представляет собой моноклональное антитело, способное связываться с человеческим GDF-15, или его антигенсвязывающую часть, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 41 или последовательность, которая, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 91%, по меньшей мере, на 92%, по меньшей мере, на 93%, по меньшей мере, на 94%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98% или, по меньшей мере, на 99% идентична этой последовательности, и вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 42 или последовательность, которая, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 91%, по меньшей мере, на 92%, по меньшей мере, на 93%, по меньшей мере, на 94%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98% или, по меньшей мере, на 99% идентична этой последовательности.In another preferred embodiment, the antibody capable of binding to human GDF-15 or an antigen binding portion thereof is a monoclonal antibody capable of binding to human GDF-15 or an antigen binding portion thereof, wherein the heavy chain variable domain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41 or a sequence that is at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% identical to this sequence, and variable the light chain domain contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 or a sequence that is at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, according to at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least at least 99% identical to this sequence.

В другом предпочтительном варианте осуществления антитело способное связываться с человеческим GDF-15 или его антигенсвязывающая часть представляет собой моноклональное антитело, способное связываться с человеческим GDF-15, или его антигенсвязывающую часть, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 43 или последовательность, которая, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 91%, по меньшей мере, на 92%, по меньшей мере, на 93%, по меньшей мере, на 94%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98% или, по меньшей мере, на 99% идентична этой последовательности, и вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последоIn another preferred embodiment, the antibody capable of binding to human GDF-15 or an antigen binding portion thereof is a monoclonal antibody capable of binding to human GDF-15 or an antigen binding portion thereof, wherein the heavy chain variable domain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43 or a sequence that is at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94 %, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% identical to this sequence, and the lung variable domain chain contains an amino acid sequence

- 15 044887 вательность из SEQ ID NO: 44 или последовательность, которая, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 91%, по меньшей мере, на 92%, по меньшей мере, на 93%, по меньшей мере, на 94%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98% или, по меньшей мере, на 99% идентична этой последовательности.- 15 044887 activity from SEQ ID NO: 44 or a sequence that is at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least , 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99% identical to this sequence.

В другом предпочтительном варианте осуществления антитело, способное связываться с человеческим GDF-15 или его антигенсвязывающая часть представляет собой моноклональное антитело, способное связываться с человеческим GDF-15, или его антигенсвязывающую часть, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 45 или последовательность, которая, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 91%, по меньшей мере, на 92%, по меньшей мере, на 93%, по меньшей мере, на 94%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98% или, по меньшей мере, на 99% идентична этой последовательности, и вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 46 или последовательность, которая, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 91%, по меньшей мере, на 92%, по меньшей мере, на 93%, по меньшей мере, на 94%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98% или, по меньшей мере, на 99% идентична этой последовательности.In another preferred embodiment, the antibody capable of binding to human GDF-15 or an antigen binding portion thereof is a monoclonal antibody capable of binding to human GDF-15 or an antigen binding portion thereof, wherein the heavy chain variable domain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45 or a sequence that is at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% identical to this sequence, and the variable domain light chain contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46 or a sequence that is at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least , is 99% identical to this sequence.

В другом предпочтительном варианте осуществления антитело, способное связываться с человеческим GDF-15 или его антигенсвязывающая часть представляет собой моноклональное антитело, способное связываться с человеческим GDF-15, или его антигенсвязывающую часть, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 47 или последовательность, которая, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 91%, по меньшей мере, на 92%, по меньшей мере, на 93%, по меньшей мере, на 94%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98% или, по меньшей мере, на 99% идентична этой последовательности, и вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 48 или последовательность, которая, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 91%, по меньшей мере, на 92%, по меньшей мере, на 93%, по меньшей мере, на 94%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98% или, по меньшей мере, на 99% идентична этой последовательности.In another preferred embodiment, the antibody capable of binding to human GDF-15 or an antigen binding portion thereof is a monoclonal antibody capable of binding to human GDF-15 or an antigen binding portion thereof, wherein the heavy chain variable domain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47 or a sequence that is at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% identical to this sequence, and the variable domain light chain contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48 or a sequence that is at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least , is 99% identical to this sequence.

В другом предпочтительном варианте осуществления антитело, способное связываться с человеческим GDF-15 или его антигенсвязывающая часть представляет собой моноклональное антитело, способное связываться с человеческим GDF-15, или его антигенсвязывающую часть, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 49 или последовательность, которая, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 91%, по меньшей мере, на 92%, по меньшей мере, на 93%, по меньшей мере, на 94%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98% или, по меньшей мере, на 99% идентична этой последовательности, и вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 50 или последовательность, которая, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 91%, по меньшей мере, на 92%, по меньшей мере, на 93%, по меньшей мере, на 94%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98% или, по меньшей мере, на 99% идентична этой последовательности.In another preferred embodiment, the antibody capable of binding to human GDF-15 or an antigen binding portion thereof is a monoclonal antibody capable of binding to human GDF-15 or an antigen binding portion thereof, wherein the heavy chain variable domain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49 or a sequence that is at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% identical to this sequence, and the variable domain light chain contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50 or a sequence that is at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least , is 99% identical to this sequence.

В другом предпочтительном варианте осуществления антитело, способное связываться с человеческим GDF-15 или его антигенсвязывающая часть представляет собой моноклональное антитело, способное связываться с человеческим GDF-15, или его антигенсвязывающую часть, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 51 или последовательность, которая, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 91%, по меньшей мере, на 92%, по меньшей мере, на 93%, по меньшей мере, на 94%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98% или, по меньшей мере, на 99% идентична этой последовательности, и вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 52 или последовательность, которая, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 91%, по меньшей мере, на 92%, по меньшей мере, на 93%, по меньшей мере, на 94%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98% или, по меньшей мере, на 99% идентична этой последовательности.In another preferred embodiment, the antibody capable of binding to human GDF-15 or an antigen binding portion thereof is a monoclonal antibody capable of binding to human GDF-15 or an antigen binding portion thereof, wherein the heavy chain variable domain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51 or a sequence that is at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% identical to this sequence, and the variable domain light chain contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 or a sequence that is at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least , is 99% identical to this sequence.

В другом предпочтительном варианте осуществления антитело, способное связываться с человеческим GDF-15 или его антигенсвязывающая часть, представляет собой моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть, которое способно конкурировать с любым из антител, способных связываться с человеческим GDF-15, упомянутом в настоящем документе, за связывание с человеческим GDF15, предпочтительно за связывание с рекомбинантным человеческим GDF-15.In another preferred embodiment, the antibody capable of binding to human GDF-15 or an antigen-binding portion thereof is a monoclonal antibody or antigen-binding portion thereof that is capable of competing with any of the antibodies capable of binding to human GDF-15 mentioned herein for binding to human GDF15, preferably binding to recombinant human GDF-15.

В более предпочтительном варианте осуществления, антитело, способное связываться с человеческим GDF-15, или его антигенсвязывающая часть представляет собой гуманизированное моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть. Для любой данной не принадлежащее человеку последовательности антитела в соответствии с изобретением (т.е. последовательности донорного антитела), гуманизированные моноклональные антитела к человеческому GDF-15 по изобретению или их антигенIn a more preferred embodiment, the antibody capable of binding to human GDF-15, or an antigen-binding portion thereof, is a humanized monoclonal antibody or an antigen-binding portion thereof. For any given non-human antibody sequence of the invention (i.e., donor antibody sequence), the humanized anti-human GDF-15 monoclonal antibody of the invention, or an antigen thereof

- 16 044887 связывающие части можно получать в соответствии со способами, известными в данной области, как описано выше.- 16 044887 connecting parts can be obtained in accordance with methods known in the art, as described above.

В более предпочтительном варианте осуществления, антитело способное связываться с человеческим GDF-15 или его антигенсвязывающая часть представляет собой моноклональное антитело, способное связываться с человеческим GDF-15, или его антигенсвязывающую часть, где связывание представляет собой связывание с конформационным или прерывистым эпитопом на человеческом GDF-15, состоящем из аминокислотных последовательностей из SEQ ID No: 25 и SEQ ID No: 26. В предпочтительном аспекте этого варианта осуществления, антитело или его антигенсвязывающая часть представляет собой антитело или его антигенсвязывающую часть, как определено последовательностями по любому из вышеизложенных вариантов осуществления.In a more preferred embodiment, the antibody capable of binding to human GDF-15 or an antigen-binding portion thereof is a monoclonal antibody capable of binding to human GDF-15 or an antigen-binding portion thereof, wherein the binding is binding to a conformational or discontinuous epitope on human GDF-15. 15, consisting of the amino acid sequences of SEQ ID No: 25 and SEQ ID No: 26. In a preferred aspect of this embodiment, the antibody or antigen binding portion thereof is an antibody or antigen binding portion thereof as defined by the sequences of any of the foregoing embodiments.

Антитело, способное связываться с человеческим GDF-15, или его антигенсвязывающая часть может быть связана с лекарственным средством. В неограничивающих аспектах этого варианта осуществления, лекарственное средство может быть известным средством против злокачественных опухолей и/или иммуностимулирующей молекулой. Известные средства против злокачественных опухолей включают алкилирующие средства, такие как цисплатин, карбоплатин, оксалиплатин, мехлоретамин, циклофосфамид, хлорамбуцил, и ифосфамид; антиметаболиты, такие как азатиоприн и меркаптопурин; алкалоиды, такие как алкалоиды барвинка (например, винкристин, винбластин, винорелбин, и виндезин), таксаны (например, паклитаксел, доцетаксел) этопозид и тенипозид; ингибиторы топоизомеразы, такие как камптотецины (например, иринотекан и топотекан); цитотоксические антибиотики, такие как актиномицин, антрациклины, доксорубицин, даунорубицин, валрубицин, идарубицин, эпирубицин, блеомицин, пликамицин и митомицин; и радиоактивные изотопы.An antibody capable of binding to human GDF-15, or an antigen-binding portion thereof, may be associated with a drug. In non-limiting aspects of this embodiment, the drug may be a known anti-cancer agent and/or an immunostimulatory molecule. Known anti-cancer agents include alkylating agents such as cisplatin, carboplatin, oxaliplatin, mechlorethamine, cyclophosphamide, chlorambucil, and ifosfamide; antimetabolites such as azathioprine and mercaptopurine; alkaloids such as vinca alkaloids (eg, vincristine, vinblastine, vinorelbine, and vindesine), taxanes (eg, paclitaxel, docetaxel), etoposide and teniposide; topoisomerase inhibitors such as camptothecins (eg, irinotecan and topotecan); cytotoxic antibiotics such as actinomycin, anthracyclines, doxorubicin, daunorubicin, valrubicin, idarubicin, epirubicin, bleomycin, plicamycin and mitomycin; and radioactive isotopes.

В дополнительном варианте осуществления в соответствии с вышеописанными вариантами осуществления, антитело, способное связываться с человеческим GDF-15, или его антигенсвязывающая часть модифицированы аминокислотной меткой. Неограничивающие примеры таких меток включают полигистидиновые (His-) метки, FLAG-метку, гемагглютининовую (НА) метку, метку с гликопротеином D (gD), и метку с с-тус. Метки можно использовать для различных целей. Например, их можно использовать для облегчения очистки антитела, способного связываться с человеческим GDF-15 или его антигенсвязывающей части. Предпочтительно, такие метки присутствуют на С-конце или N-конце антитела, способного связываться с человеческим GDF-15, или его антигенсвязывающей части.In a further embodiment in accordance with the above-described embodiments, an antibody capable of binding to human GDF-15 or an antigen binding portion thereof is modified with an amino acid tag. Non-limiting examples of such tags include polyhistidine (His) tags, FLAG tags, hemagglutinin (HA) tags, glycoprotein D (gD) tags, and c-myc tags. Tags can be used for a variety of purposes. For example, they can be used to facilitate the purification of an antibody capable of binding to human GDF-15 or an antigen-binding portion thereof. Preferably, such tags are present at the C-terminus or N-terminus of an antibody capable of binding to human GDF-15, or an antigen-binding portion thereof.

Блокаторы контрольных точек иммунного ответа для использования в соответствии с изобретением.Immune checkpoint blockers for use in accordance with the invention.

Злокачественные клетки несут геномные мутации, которые приводят к образованию антигенов злокачественных клеток, которые являются специфичными для злокачественных клеток и отличаются от антигенов незлокачественных клеток. Таким образом, интактная иммунная система, которая не ингибирована, будет распознавать эти антигены злокачественных клеток, таким образом, будет возникать иммунный ответ против этих антигенов. Однако, большинство злокачественных опухолей выработали механизмы иммунологической толерантности против этих антигенов. Одним из классов таких механизмов, посредством которого злокачественные клетки достигают такой иммунологической толерантности, является использование контрольных точек иммунного ответа. Контрольная точка иммунного ответа, как применяют в настоящем документе, в основном, означает иммунологический механизм, путем которого подавляется иммунный ответ. Более конкретно, контрольная точка иммунного ответа представляет собой механизм, который характеризуется тем, что молекула иммунной системы (или группа молекул иммунной системы) подавляет иммунный ответ за счет ингибирования активации клеток иммунной системы. Такая молекула (или группа молекул) иммунной системы, которая подавляет (подавляют) иммунный ответ за счет ингибирования активации клеток иммунной системы также известна/известны как молекула/молекулы контрольных точек.Malignant cells carry genomic mutations that lead to the formation of malignant cell antigens that are specific to malignant cells and different from antigens of non-malignant cells. Thus, an intact immune system that is not inhibited will recognize these malignant cell antigens, thus generating an immune response against these antigens. However, most malignant tumors have developed mechanisms of immunological tolerance against these antigens. One class of such mechanisms by which malignant cells achieve such immunological tolerance is the use of immune checkpoints. An immune checkpoint, as used herein, generally refers to an immunological mechanism by which an immune response is suppressed. More specifically, an immune checkpoint is a mechanism that is characterized by an immune system molecule (or group of immune system molecules) suppressing the immune response by inhibiting the activation of immune system cells. Such an immune system molecule (or group of molecules) that suppresses the immune response by inhibiting the activation of cells of the immune system is also known as a checkpoint molecule/molecules.

Как применяют в настоящем документе, блокатор контрольных точек иммунного ответа представляет собой молекулу, которая способна блокировать контрольную точку иммунного ответа. Хотя следует понимать, что ингибитор hGDF-15, как применяют по изобретению, оказывает воздействие на иммунную систему, включая воздействия на CD8+ Т-клетки, как применяют в настоящем документе термин блокатор контрольных точек иммунного ответа не относится к ингибитору hGDF-15, но означает молекулу, которая отличается от ингибитора hGDF-15.As used herein, an immune checkpoint blocker is a molecule that is capable of blocking an immune checkpoint. While it should be understood that an hGDF-15 inhibitor, as used herein, has effects on the immune system, including effects on CD8+ T cells, as used herein, the term immune checkpoint blocker does not refer to an hGDF-15 inhibitor, but refers to a molecule that is different from the hGDF-15 inhibitor.

Наиболее распространенные блокаторы контрольных точек иммунного ответа, известные на сегодняшний день, представляют собой молекулы-ингибиторы контрольной точки иммунного ответа, такие как ингибиторы человеческого PD-1 и ингибиторы человеческого PD-L1. Дополнительные блокаторы контрольных точек иммунного ответа представляют собой анти-LAG-3, анти-В7Н3, анти-TIM3, антиVISTA, анти-TIGIT, анти-KIR, анти-CD27, анти-CD137, а также ингибиторы IDO. Таким образом, как применяют в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительной формой блокатора контрольных точек иммунного ответа является молекула-ингибитор контрольной точки иммунного ответа. Альтернативно, блокатор контрольных точек иммунного ответа может быть активатором костимулирующего сигнала, который подавляет контрольную точку иммунного ответа.The most common immune checkpoint blockers known today are immune checkpoint inhibitor molecules, such as human PD-1 inhibitors and human PD-L1 inhibitors. Additional immune checkpoint blockers include anti-LAG-3, anti-B7H3, anti-TIM3, anti-VISTA, anti-TIGIT, anti-KIR, anti-CD27, anti-CD137, and IDO inhibitors. Thus, as used in accordance with the present invention, the preferred form of immune checkpoint blocker is an immune checkpoint inhibitor molecule. Alternatively, an immune checkpoint blocker may be an activator of a co-stimulatory signal that inhibits an immune checkpoint.

Способы для измерения активности блокаторов контрольных точек иммунного ответа включаютMethods for measuring the activity of immune checkpoint blockers include

- 17 044887 анализы связывания in vitro, первичные анализы высвобождения цитокинов на основе Т-клеток, и модельные системы in vivo. Дополнительно, Promega сейчас разработала коммерчески доступную биолюминисцентную репортерную систему для PD-1/PD-L1, которая, например, описана в Mei Cong, Ph.D. et al.: Advertorial: Novel Bioassay to Assess PD-1/PD-L1 Therapeutic Antibodies in Development for Immunotherapy Bioluminescent Reporter-Based PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay. (http://www.genengnews.com/genarticles/advertorial-novel-bioassay-to-assess-pd-1-pd-l1-therapeutic-antibodies-in-development-forimmun/5511/).- 17 044887 in vitro binding assays, primary T cell-based cytokine release assays, and in vivo model systems. Additionally, Promega has now developed a commercially available bioluminescent reporter system for PD-1/PD-L1, which is, for example, described in Mei Cong, Ph.D. et al.: Advertorial: Novel Bioassay to Assess PD-1/PD-L1 Therapeutic Antibodies in Development for Immunotherapy Bioluminescent Reporter-Based PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay. (http://www.genengnews.com/genarticles/advertorial-novel-bioassay-to-assess-pd-1-pd-l1-therapeutic-antibodies-in-development-forimmun/5511/).

Предпочтительные блокаторы контрольных точек иммунного ответа представляют собой ингибиторы человеческого PD-1 и ингибиторы человеческого PD-L1. В одном из предпочтительных вариантов осуществления в соответствии со всеми вариантами осуществления изобретения, блокатор контрольных точек иммунного ответа не является ингибитором человеческого CTLA4.Preferred immune checkpoint blockers are human PD-1 inhibitors and human PD-L1 inhibitors. In one preferred embodiment, in accordance with all embodiments of the invention, the immune checkpoint blocker is not an inhibitor of human CTLA4.

Как применяют в настоящем документе, ингибитор человеческого PD-1 может быть любой молекулой, которая способна специфически ингибировать функцию человеческого PD-1.As used herein, a human PD-1 inhibitor can be any molecule that is capable of specifically inhibiting the function of human PD-1.

Неограничивающие примеры таких молекул представляют собой антитела, способные связываться с человеческим PD-1, и DARPins (сконструированные белки с анкириновыми повторами), способные связываться с человеческим PD-1. Предпочтительно, ингибитор PD-1 для применения в соответствии с изобретением, представляет собой антитело, способное связываться с человеческим PD-1, более предпочтительно, моноклональное антитело, способное связываться с человеческим PD-1. Наиболее предпочтительно, моноклональное антитело, способное связываться с человеческим PD-1, выбрано из группы, состоящей из ниволумаба, пембролизумаба, пидилизумаба и АМФ-224.Non-limiting examples of such molecules are antibodies capable of binding to human PD-1 and DARPins (engineered ankyrin repeat proteins) capable of binding to human PD-1. Preferably, the PD-1 inhibitor for use in accordance with the invention is an antibody capable of binding to human PD-1, more preferably a monoclonal antibody capable of binding to human PD-1. Most preferably, the monoclonal antibody capable of binding to human PD-1 is selected from the group consisting of nivolumab, pembrolizumab, pidilizumab and AMP-224.

Как применяют в настоящем документе, ингибитор человеческого PD-L1 может быть любой молекулой, которая способна специфически ингибировать функцию человеческого PD-L1. Неограничивающие примеры таких молекул представляют собой антитела, способные связываться с человеческим PD-L1, и DARPins (сконструированные белки с анкириновыми повторами), способные связываться с человеческим PD-L1. Предпочтительно, ингибитор человеческого PD-L1 для применения в соответствии с изобретением, представляет собой антитело, способное связываться с человеческим PD-L1, более предпочтительно, моноклональное антитело, способное связываться с человеческим PD-L1. Наиболее предпочтительно, моноклональное антитело, способное связываться с человеческим PD-L1, выбрано из группы, состоящей из BMS-936559, MPDL3280A, MEDI4736 и MSB0010718C.As used herein, a human PD-L1 inhibitor can be any molecule that is capable of specifically inhibiting the function of human PD-L1. Non-limiting examples of such molecules are antibodies capable of binding to human PD-L1 and DARPins (engineered ankyrin repeat proteins) capable of binding to human PD-L1. Preferably, the human PD-L1 inhibitor for use in accordance with the invention is an antibody capable of binding to human PD-L1, more preferably a monoclonal antibody capable of binding to human PD-L1. Most preferably, the monoclonal antibody capable of binding to human PD-L1 is selected from the group consisting of BMS-936559, MPDL3280A, MEDI4736 and MSB0010718C.

Способы и технологии.Methods and technologies.

В основном, если не определено иначе в настоящем документе, способы, применяемые в настоящем изобретении (например, способы клонирования или способы, относящиеся к антителам), проводят в соответствии со способами, известными в данной области, например, способами, описанными в Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1989), Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology Greene Publishing Associates and Wiley Interscience; New York 1992), и Harlow and Lane (Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1988), все содержание которых включено в настоящий документ в качестве ссылки.In general, unless otherwise specified herein, the methods used in the present invention (e.g., cloning methods or antibody-related methods) are carried out in accordance with methods known in the art, for example, the methods described in Sambrook et al . (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ^2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1989), Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology Greene Publishing Associates and Wiley Interscience; New York 1992), and Harlow and Lane (Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1988), all contents of which are included herein as a reference.

Связывание антител с их соответствующими белками можно оценивать при помощи способов, известных в данной области. Связывание моноклональных антител с их соответствующими мишенями предпочтительно оценивают путем измерений поверхностного плазмонного резонанса. Эти измерения предпочтительно проводят с использованием системы Biorad ProteOn XPR36 и сенсорных чипов Biorad GLC, как показано в качестве примера для антитела к человеческому GDF-15 mAb-B1-23 в эталонном примере 1.The binding of antibodies to their corresponding proteins can be assessed using methods known in the art. The binding of monoclonal antibodies to their respective targets is preferably assessed by surface plasmon resonance measurements. These measurements are preferably performed using the Biorad ProteOn XPR36 system and Biorad GLC sensor chips, as exemplified for the anti-human GDF-15 antibody mAb-B1-23 in Reference Example 1.

Выравнивания последовательностей из последовательностей по изобретению проводят с использованием алгоритма BLAST (см. Altschul et al.(1990) Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology 215. p. 403-410.; Altschul et al.: (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.). Предпочтительно, используют следующие параметры: максимальные последовательности-мишени 10; размер слова 3; матрица BLOSUM 62; штрафы за пропуск: штраф за открытие 11, расширение 1; условная композиционная корректировка оценки матрицы. Таким образом, при использовании по отношению к последовательностям, термины, такие как идентичность или идентичный относятся к величине идентичности, полученной с использованием алгоритма BLAST.Sequence alignments from the sequences of the invention are performed using the BLAST algorithm (see Altschul et al. (1990) Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology 215. p. 403-410.; Altschul et al.: (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.). Preferably, the following parameters are used: maximum target sequences 10; word size 3; matrix BLOSUM 62; penalties for missing: penalty for opening 11, expansion 1; conditional compositional adjustment of matrix estimation. Thus, when used in relation to sequences, terms such as identity or identical refer to the value of identity obtained using the BLAST algorithm.

Моноклональные антитела по изобретению можно получать любым известным в данной области способом, включая в качестве неограничивающих примеров, способы, упомянутые в Siegel DL DL (Recombinant monoclonal antibody technology Transfus Clin Biol. 2002 Jan;9(1):15-22). В одном из вариантов осуществления антитело по изобретению производится гибридомной клеточной линией В1-23, хранящейся в Немецком собрании микроорганизмов и клеточных культур GmbH (DMSZ) под номером доступа DSM ACC3142, в соответствии с Будапештским договором. Депонирование было произведено 29 сентября 2011 года.The monoclonal antibodies of the invention can be produced by any method known in the art, including, but not limited to, the methods mentioned in Siegel DL DL (Recombinant monoclonal antibody technology Transfus Clin Biol. 2002 Jan;9(1):15-22). In one embodiment, the antibody of the invention is produced by the hybridoma cell line B1-23, deposited at the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DMSZ) under accession number DSM ACC3142, in accordance with the Budapest Treaty. The deposit was made on September 29, 2011.

Клеточную пролиферацию можно измерять подходящими известными в данной области способами, включая (но не ограничиваясь) световую микроскопию, метаболические анализы, такие как измерениеCell proliferation can be measured by suitable methods known in the art, including (but not limited to) light microscopy, metabolic assays such as

- 18 044887 митохондриального восстановительного потенциала (например, анализ с МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид); окрашивание резацурином, которое также известно как анализ Alamar Blue®), окрашивание известных маркеров эндогенной пролиферации (например, Ki-67), и способы, измеряющие синтез клеточной ДНК (например, анализы включения BrdU и [³Н]-тимидина).- 18 044887 mitochondrial reduction potential (e.g. MTT assay (3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide); resatsurin staining, which is also known as the Alamar Blue® assay), staining for known endogenous markers proliferation (eg, Ki-67), and methods that measure cellular DNA synthesis (eg, BrdU and [ ³ H]-thymidine incorporation assays).

Уровни человеческого GDF-15 (hGDF-15) можно измерять любым известным в данной области способом, включая измерения уровней белка hGDF-15 способами, включающими (но не ограничиваясь ими) масс-спектрометрию для белков или пептидов, полученных из человеческого GDF-15, вестернблоттинг с использованием антител, специфичных к человеческому GDF-15, проточную цитометрию с использованием антител, специфичных к человеческому GDF-15, тестовые полоски с использованием антител, специфичных к человеческому GDF-15, или иммуноцитохимию с использованием антител, специфичных к человеческому GDF-15. Предпочтительным способом измерения сывороточных уровней hGDF-15 является измерение сывороточных уровней hGDF-15 путем твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием антител к GDF-15. Такие способы с ELISA приведены в Примере 1. Альтернативно, сывороточные уровни hGDF-15 можно определять известными иммунологическими анализами с электрохемолюминисценцией с использованием антител к GDF-15. Например, можно использовать технологию Roche Elecsys® для таких иммунологических анализов с электрохемолюминисценциеи.Human GDF-15 (hGDF-15) levels can be measured by any method known in the art, including measuring hGDF-15 protein levels by methods including, but not limited to, mass spectrometry for proteins or peptides derived from human GDF-15, Western blotting using antibodies specific for human GDF-15, flow cytometry using antibodies specific for human GDF-15, test strips using antibodies specific for human GDF-15, or immunocytochemistry using antibodies specific for human GDF-15 . The preferred method for measuring serum levels of hGDF-15 is to measure serum levels of hGDF-15 by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-GDF-15 antibodies. Such ELISA methods are described in Example 1. Alternatively, serum levels of hGDF-15 can be determined by known electrochemoluminescence immunoassays using anti-GDF-15 antibodies. For example, Roche Elecsys® technology can be used for such electrochemoluminescence immunoassays.

Получение композиций по изобретению.Preparation of compositions according to the invention.

Композиции в соответствии с настоящим изобретением получают в соответствии с известными стандартами для получения фармацевтических композиций.The compositions in accordance with the present invention are prepared in accordance with known standards for the preparation of pharmaceutical compositions.

Например, композиции получают путем, при котором они могут храниться и вводиться соответствующим образом, например, с использованием фармацевтически приемлемых компонентов, таких как носители, эксципиенты или стабилизаторы.For example, the compositions are prepared in a manner in which they can be stored and administered in an appropriate manner, for example, using pharmaceutically acceptable components such as carriers, excipients or stabilizers.

Такие фармацевтически приемлемые компоненты не являются токсичными в количествах, используемых при введении фармацевтической композиции пациенту. Фармацевтически приемлемые компоненты, добавляемые к фармацевтическим композициям, могут зависеть от химической природы ингибиторов, присутствующих в композиции (например, зависеть от того, являются ли ингибиторы антителами, шпилечными конструкциями миРНК или малыми интерферирующими РНК), конкретного назначаемого применения фармацевтических композиций и пути введения.Such pharmaceutically acceptable components are not toxic in the amounts used when administering the pharmaceutical composition to a patient. Pharmaceutically acceptable components added to pharmaceutical compositions may depend on the chemical nature of the inhibitors present in the composition (eg, whether the inhibitors are antibodies, siRNA hairpin constructs, or small interfering RNAs), the specific intended use of the pharmaceutical compositions, and the route of administration.

В основном, фармацевтически приемлемые компоненты, используемые в связи с настоящим изобретением, применяют в соответствии со знанием, доступным в данной области, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, Ed. AR Gennaro, 20^th edition, 2000, Williams & Wilkins, PA, USA.In general, pharmaceutically acceptable components used in connection with the present invention are used in accordance with the knowledge available in the art, for example, Remington's Pharmaceutical Sciences, Ed. AR Gennaro, ^20th edition, 2000, Williams & Wilkins, PA, USA.

Терапевтические способы и продукты для применения в этих способах.Therapeutic methods and products for use in these methods.

Настоящее изобретение относится к ингибиторам hGDF-15 для применения, как определено выше.The present invention relates to hGDF-15 inhibitors for use as defined above.

Дополнительно, и в соответствии с этими ингибиторами hGDF-15 и их применением, настоящее изобретение также относится к соответствующим терапевтическим способам.Additionally, and in accordance with these hGDF-15 inhibitors and their use, the present invention also relates to corresponding therapeutic methods.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретение относится к способу для повышения процентного содержания CD8⁺ Т-клеток в солидной злокачественной опухоли у пациентачеловека, к способу, включающему этап введения ингибитора hGDF-15 пациенту-человеку.Thus, in one embodiment, the invention provides a method for increasing the percentage of CD8 ⁺ T cells in a solid cancer in a human patient, the method comprising the step of administering an hGDF-15 inhibitor to the human patient.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу лечения солидной злокачественной опухоли блокатором контрольных точек иммунного ответа у пациента-человека, к способу, включающему этап введения ингибитора hGDF-15 пациенту-человеку и этап введения блокатора контрольных точек иммунного ответа пациенту-человеку.In another embodiment, the invention provides a method of treating a solid cancer with an immune checkpoint blocker in a human patient, the method comprising the step of administering an hGDF-15 inhibitor to the human patient and the step of administering the immune checkpoint blocker to the human patient.

Предпочтительные варианты осуществления этих способов являются вариантами, определенными выше для ингибиторов hGDF-15 для применения по изобретению.Preferred embodiments of these methods are those defined above for hGDF-15 inhibitors for use in the invention.

В другом варианте осуществления вышеуказанных способов, ингибиторов hGDF-15 для применения, наборов, композиций, или композиций для применения, ингибитор hGDF-15 является единственным ингредиентом, который фармацевтически активен против злокачественной опухоли.In another embodiment of the above methods, hGDF-15 inhibitors for use, kits, compositions, or compositions for use, the hGDF-15 inhibitor is the only ingredient that is pharmaceutically active against cancer.

В альтернативном варианте осуществления вышеуказанных способов, ингибиторов hGDF-15 для применения, наборов, композиций, или композиций для применения, ингибитор hGDF-15 и блокатор контрольных точек иммунного ответа являются единсственными ингредиентами, которые фармацевтически активны против злокачественной опухоли.In an alternative embodiment of the above methods, hGDF-15 inhibitors for use, kits, compositions, or compositions for use, the hGDF-15 inhibitor and the immune checkpoint blocker are the only ingredients that are pharmaceutically active against cancer.

В альтернативном варианте осуществления вышеуказанных способов, ингибиторов hGDF-15 для применения, наборов, композиций, или композиций для применения, ингибитор hGDF-15 применяют в комбинации с одним или несколькими дополнительными ингредиентами, фармацевтически активными против злокачественной опухоли. В одном из аспектов этого варианта осуществления, один или несколько дополнительных ингредиентов, фармацевтически активных против злокачественной опухоли, представляют собой известное средство против злокачественных опухолей и/или иммуностимулирующую молекулу. Известные средства против злокачественных опухолей в качестве неограничивающих примеров включают алкилирующие средства, такие как цисплатин, карбоплатин, оксалиплатин, мехлоретамин, циклофосфамид, хлорамбуцил, и ифосфамид; антиметаболиты, такие как азатиоприн и меркаптопурин;In an alternative embodiment of the above methods, hGDF-15 inhibitors for use, kits, compositions, or compositions for use, the hGDF-15 inhibitor is used in combination with one or more additional ingredients that are pharmaceutically active against cancer. In one aspect of this embodiment, the one or more additional ingredients that are pharmaceutically active against cancer are a known anti-cancer agent and/or an immunostimulatory molecule. Known anti-cancer agents include, but are not limited to, alkylating agents such as cisplatin, carboplatin, oxaliplatin, mechlorethamine, cyclophosphamide, chlorambucil, and ifosfamide; antimetabolites such as azathioprine and mercaptopurine;

- 19 044887 алкалоиды, так как алкалоиды барвинка (например, винкристин, винбластин, винорелбин, и виндезин), таксаны (например, паклитаксел, доцетаксел) этопозид и тенипозид; ингибиторы топоизомеразы, такие как камптотецины (например, иринотекан и топотекан); цитотоксические антибиотики, такие как актиномицин, антрациклины, доксорубицин, даунорубицин, валрубицин, идарубицин, эпирубицин, блеомицин, пликамицин и митомицин; и радиоактивные изотопы. Следующие ингредиенты, фармацевтически активные против злокачественной опухоли, являются особенно предпочтительными для использования в комбинации с ингибитором hGDF-15: иммуностимулирующие молекулы включают анти-LAG-3, антиВ7Н3, анти-TIM3, анти-VISTA, анти-TIGIT, анти-KIR, анти-CD27, анти-CD137, анти-Ох40, анти-4-1ВВ, анти-GITR, анти-CD28, анти-CD40 или IDO-ингибиторы. Кроме того, другая терапия антителами, такими как анти-Her2, анти-EGFR, анти-клаудин, или их гликооптимизированными преемниками также является особенно предпочтительной, поскольку они будут полезны в комбинации с ингибитором hGDF-15, например, в связи с повышенной инфильтрацией иммунных клеток в солидной злокачественной опухоли, вызванной ингибитором hGDF-15.- 19 044887 alkaloids, such as vinca alkaloids (eg vincristine, vinblastine, vinorelbine, and vindesine), taxanes (eg paclitaxel, docetaxel) etoposide and teniposide; topoisomerase inhibitors such as camptothecins (eg, irinotecan and topotecan); cytotoxic antibiotics such as actinomycin, anthracyclines, doxorubicin, daunorubicin, valrubicin, idarubicin, epirubicin, bleomycin, plicamycin and mitomycin; and radioactive isotopes. The following ingredients, pharmaceutically active against malignancy, are particularly preferred for use in combination with an hGDF-15 inhibitor: immunostimulatory molecules include anti-LAG-3, anti-B7H3, anti-TIM3, anti-VISTA, anti-TIGIT, anti-KIR, anti -CD27, anti-CD137, anti-Ox40, anti-4-1BB, anti-GITR, anti-CD28, anti-CD40 or IDO inhibitors. In addition, other antibody therapies such as anti-Her2, anti-EGFR, anti-claudin, or their glycooptimized successors are also particularly preferred as they will be useful in combination with an hGDF-15 inhibitor, for example due to increased immune infiltration cells in hGDF-15 inhibitor-induced solid malignancy.

Аналогично, подходы с вакцинацией (например, при помощи пептидов или дендритных клеток) или адоптивной клеточной терапией, опухоль-реактивными Т-клетками или дендритными клетками также являются особенно предпочтительными, поскольку они будут полезны в комбинации с ингибитором hGDF-15. Кроме того, следующее:Likewise, vaccination approaches (eg, peptides or dendritic cells) or adoptive cell therapy, tumor-reactive T cells or dendritic cells are also particularly preferred as they will be useful in combination with an hGDF-15 inhibitor. In addition the following:

лечение будет также особенно предпочтительным, поскольу оно оказывает синергистичное действие с ингибитором hGDF-15:the treatment would also be particularly advantageous because it has a synergistic effect with the hGDF-15 inhibitor:

лечение антителами или антителоподобными молекулами, имеющих одну или несколько специфичностей для опухолевых и иммунных клеток (например, Bites, DARTS, DARPINS, катумаксомаб);treatment with antibodies or antibody-like molecules having one or more specificities for tumor and immune cells (for example, Bites, DARTS, DARPINS, catumaxomab);

лечение иммунотерапией на основе вакцин против опухоль-ассоциированных пептидов, например при помощи мультипептидных вакцин, таких как IMA901, ISA203 или при помощи вакцин на основе РНК (например, CV9104), и/или лечение веществами, активирующими иммунные клетки (например, производные FAA для активации макрофагов, или лиганды для толл-подобных рецепторов, такие как конъюгаты SLP-AMPLIVANT).treatment with immunotherapy based on tumor-associated peptide vaccines, for example with multipeptide vaccines such as IMA901, ISA203 or with RNA-based vaccines (for example, CV9104), and/or treatment with substances that activate immune cells (for example, FAA derivatives for macrophage activation, or ligands for toll-like receptors such as SLP-AMPLIVANT conjugates).

Комбинации для применения по изобретению.Combinations for use according to the invention.

Настоящее изобретение относится к комбинациям ингибитора hGDF-15 и блокатора контрольных точек иммунного ответа для применения в способе лечения солидной злокачественной опухоли у пациента-человека, где ингибитор hGDF-15 и блокатор контрольных точек иммунного ответа предназначены для введения пациенту-человеку. Эти комбинации и их предпочтительные варианты осуществления определены выше.The present invention relates to combinations of an hGDF-15 inhibitor and an immune checkpoint blocker for use in a method of treating a solid cancer in a human patient, wherein the hGDF-15 inhibitor and the immune checkpoint blocker are for administration to a human patient. These combinations and their preferred embodiments are defined above.

Комбинация ингибитора hGDF-15 и блокатора контрольных точек иммунного ответа может вводиться совместно или по раздельности.The combination of an hGDF-15 inhibitor and an immune checkpoint blocker may be administered together or separately.

Например, в одном из предпочтительных вариантов осуществления, введение ингибитора hGDF-15 начинают до начала введения блокатора контрольных точек иммунного ответа. Этот параметр позволяет выгодно увеличить процентное содержание Т-клеток, и, в частности, процентное содержание CD8+ Тклеток в солидной злокачественной опухоли, таким образом, что последующее лечение блокатором контрольных точек иммунного ответа может быть более эффективным из-за повышенного начального процентного содержания CD8+ Т-клеток в солидной злокачественной опухоли.For example, in one preferred embodiment, administration of the hGDF-15 inhibitor is started before administration of the immune checkpoint blocker. This parameter allows for a beneficial increase in the percentage of T cells, and in particular the percentage of CD8+ T cells in a solid malignant tumor, such that subsequent treatment with an immune checkpoint blocker may be more effective due to the increased initial percentage of CD8+ T cells. cells in a solid malignant tumor.

Наборы.Sets.

Настоящее изобретение также относится к набору, содержащему ингибитор hGDF-15 и, по меньшей мере, один блокатор контрольных точек иммунного ответа, как определено выше.The present invention also provides a kit containing an hGDF-15 inhibitor and at least one immune checkpoint blocker as defined above.

Ингибитор hGDF-15 и один или несколько, или все из блокаторов контрольных точек иммунного ответа могут содержаться в раздельных контейнерах или в одном контейнере.The hGDF-15 inhibitor and one or more or all of the immune checkpoint blockers may be contained in separate containers or in a single container.

Используемый контейнер может быть любым типом контейнера, который подходит для хранения ингибитора hGDF-15 и/или, по меньшей мере, одного блокатора контрольных точек иммунного ответа. Неограничивающими примерами таких контейнеров являются флаконы и заполненные шприцы.The container used may be any type of container that is suitable for storing an hGDF-15 inhibitor and/or at least one immune checkpoint blocker. Non-limiting examples of such containers include vials and filled syringes.

В дополнение к ингибитору hGDF-15 и, по меньшей мере, одному блокатору контрольных точек иммунного ответа, набор может содержать дополнительные терапевтические средства. Например, набор может содержать один или несколько дополнительных ингредиентов, которые являются фармацевтически активными против злокачественной опухоли. Один или несколько дополнительных ингредиентов, которые являются фармацевтически активными против злокачественной опухоли, могут быть такими, как определено выше. Такие дополнительные ингредиенты, фармацевтически активные против злокачественной опухоли, можно использовать в способах по изобретению вместе с ингибитором hGDF-15 и, по меньшей мере, одним блокатором контрольных точек иммунного ответа.In addition to the hGDF-15 inhibitor and at least one immune checkpoint blocker, the kit may contain additional therapeutic agents. For example, the kit may contain one or more additional ingredients that are pharmaceutically active against cancer. One or more additional ingredients that are pharmaceutically active against cancer may be as defined above. Such additional ingredients that are pharmaceutically active against cancer can be used in the methods of the invention together with an hGDF-15 inhibitor and at least one immune checkpoint blocker.

Предпочтительно, набор по изобретению дополнительно содержит инструкции по применению. Последовательности.Preferably, the kit according to the invention further contains instructions for use. Sequences.

Аминокислотные последовательности, упомянутые в настоящем изобретении, являются следующими (в направлении от N-конца до С-конца; представлены в виде однобуквенного аминокислотного кода):The amino acid sequences mentioned in the present invention are as follows (in the direction from N-terminus to C-terminus; represented as a single letter amino acid code):

SEQ ID No: 1 (область вариабельного домена тяжелой цепи, включающая области FR1, CDR1, FR2,SEQ ID No: 1 (heavy chain variable domain region including regions FR1, CDR1, FR2,

- 20 044887- 20 044887

CDR2 и FR3 из полипептидной последовательности моноклонального антитела к человеческому GDF-15 mAb-B1-23):CDR2 and FR3 from the polypeptide sequence of the monoclonal antibody to human GDF-15 mAb-B1-23):

QVKLQQSGPGILQSSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKQVKLQQSGPGILQSSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDK

RYNPTLKSRLTISKDPSRNQVFLKITSVDTADTATYYCRYNPTLKSRLTISKDPSRNQVFLKITSVDTADTATYYC

SEQ ID No: 2 (область вариабельного домена легкой цепи, включающая области FR1, CDR1, FR2, CDR2 и FR3 из полипептидной последовательности моноклонального антитела к человеческому GDF-15 mAb-B1-23):SEQ ID No: 2 (light chain variable domain region comprising the FR1, CDR1, FR2, CDR2 and FR3 regions from the polypeptide sequence of the monoclonal antibody to human GDF-15 mAb-B1-23):

DIVLTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWFLQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDIVLTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWFLQKPGQSPKALIYSASYRYSGVP

DRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFC

SEQ ID No: 3 (область CDR1 тяжелой цепи пептидной последовательности моноклонального антитела к человеческому GDF-15 mAb-B1-23):SEQ ID No: 3 (CDR1 region of the heavy chain peptide sequence of the monoclonal antibody to human GDF-15 mAb-B1-23):

GFSLSTSGMGGFSLSTSGMG

SEQ ID No: 4 (область CDR2 тяжелой цепи пептидной последовательности моноклонального антитела к человеческому GDF-15 mAb-B1-23):SEQ ID No: 4 (CDR2 region of the heavy chain peptide sequence of the monoclonal antibody to human GDF-15 mAb-B1-23):

IYWDDDKIYWDDK

SEQ ID No: 5 (область CDR3 тяжелой цепи пептидной последовательности моноклонального антитела к человеческому GDF-15 mAb-B1-23):SEQ ID No: 5 (CDR3 region of the heavy chain peptide sequence of the monoclonal antibody to human GDF-15 mAb-B1-23):

ARSSYGAMDYARSSYGAMDY

SEQ ID No: 6 (область CDR1 легкой цепи пептидной последовательности моноклонального антитела к человеческому GDF-15 mAb-B1-23):SEQ ID No: 6 (CDR1 region of the light chain peptide sequence of the monoclonal antibody to human GDF-15 mAb-B1-23):

QNVGTN область CDR2 легкой цепи пептидной последовательности моноклонального антитела к человеческому GDF-15 mAb-B1-23:QNVGTN region CDR2 of the light chain peptide sequence of the monoclonal antibody to human GDF-15 mAb-B1-23:

SASSAS

SEQ ID No: 7 (область CDR3 легкой цепи пептидной последовательности моноклонального антитела к человеческому GDF-15 mAb-B1-23):SEQ ID No: 7 (CDR3 region of light chain peptide sequence of monoclonal antibody to human GDF-15 mAb-B1-23):

QQYNNFPYTQQYNNFPYT

SEQ ID No: 8 (рекомбинантный зрелый белок человеческого GDF-15):SEQ ID No: 8 (recombinant mature human GDF-15 protein):

GSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMGSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANM

HAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCIHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI

SEQ ID No: 9 (белок-предшественник человеческого GDF-15):SEQ ID No: 9 (human GDF-15 precursor protein):

MPGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGALSLAEASRASFPGPSELHSEDSRFRELRKRMPGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGALLSLAEASRASFPGPSELHSEDSRFRELRKR

YEDLLTRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPEASRLHRAYEDLLTRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPEASRLHRA

LFRLSPTASRSWDVTRPLRRQLSLARPQAPALHLRLSPPPSQSDQLLAESSSARPQLELHLRPQLFRLSPTASRSWDVTRPLRRQLSLARPQAPALHLRLLSPPPSQSDQLLAESSSARPQLELHLRPQ

AARGRRRARARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAAAARGRRRARARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAA

NMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCINMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI

SEQ ID No: 10 (белок-предшественник человеческого GDF-15+Nконцевой и С-концевой линкер GSGS):SEQ ID No: 10 (human GDF-15 precursor protein+N-terminal and C-terminal GSGS linker):

GSGSGSGMPGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGALSLAEASRASFPGPSELHSEDSR FRELRKRYEDLLTRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPE ASRLHRALFRLSPTASRSWDVTRPLRRQLSLARPQAPALHLRLSPPPSQSDQLLAESSSARPQL ELHLRPQAARGRRRARARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGAC PSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI GSGSGSGGSGSGSGMPGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGALLSLAEASRASFPGPSELHSEDSR FRELRKRYEDLLTRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPE ASRLHRALFRLSPTASRSWDVTRPLRRQLSLARPQAPALHLRLSPPPSQSDQLLAESSSARPQL ELHLRPQAARGRRRARARNGDHCPLGPGRCC RLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGAC PSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI GSGSGSG

SEQ ID No: 11 (Flag-пептид): DYKDDDDKGGSEQ ID No: 11 (Flag peptide): DYKDDDDKGG

SEQ ID No: 12 (НА-пептид): YPYDVPDYAGSEQ ID No: 12 (HA-peptide): YPYDVPDYAG

SEQ ID No: 13 (пептид, полученный из человеческого GDF-15): ELHLRPQAARGRRSEQ ID No: 13 (peptide derived from human GDF-15): ELHLRPQAARGRR

SEQ ID No: 14 (пептид, полученный из человеческого GDF-15): LHLRPQAARGRRRSEQ ID No: 14 (peptide derived from human GDF-15): LHLRPQAARGRRR

SEQ ID No: 15 (пептид, полученный из человеческого GDF-15): HLRPQAARGRRRASEQ ID No: 15 (peptide derived from human GDF-15): HLRPQAARGRRRA

SEQ ID No: 16 (пептид, полученный из человеческого GDF-15): LRPQAARGRRRARSEQ ID No: 16 (peptide derived from human GDF-15): LRPQAARGRRRAR

SEQ ID No: 17 (пептид, полученный из человеческого GDF-15): RPQAARGRRRARASEQ ID No: 17 (peptide derived from human GDF-15): RPQAARGRRRARA

SEQ ID No: 18 (пептид, полученный из человеческого GDF-15): PQAARGRRRARARSEQ ID No: 18 (peptide derived from human GDF-15): PQAARGRRRARAR

SEQ ID No: 19 (пептид, полученный из человеческого GDF-15): QAARGRRRARARNSEQ ID No: 19 (peptide derived from human GDF-15): QAARGRRRARARN

- 21 044887- 21 044887

SEQ ID No: 20 (пептид, полученный из человеческого GDF-15) : MHAQIKTSLHRLKSEQ ID No: 20 (peptide derived from human GDF-15): MHAQIKTSLHRLK

SEQ ID No: 25 (пептид GDF-15, включающий часть эпитопа GDF-15, которая связывается с В1-23):SEQ ID No: 25 (GDF-15 peptide comprising the portion of the GDF-15 epitope that binds B1-23):

EVQVTMCIGACPSQFREVQVTMCIGACPSQFR

SEQ ID No: 26 (пептид GDF-15, включающий часть эпитопа GDF-15, которая связывается с В1-23):SEQ ID No: 26 (GDF-15 peptide comprising the portion of the GDF-15 epitope that binds B1-23):

TDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI.TDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI.

Последовательности нуклеиновой кислоты, упомянутые в настоящем изобретении, являются следующими (в направлении от 5' to 3'; представлены в соответствии со стандартным кодом нуклеиновых кислот):The nucleic acid sequences mentioned in the present invention are as follows (in the 5' to 3' direction; presented in accordance with the standard nucleic acid code):

SEQ ID No: 21 (нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID No: 1):SEQ ID No: 21 (DNA nucleotide sequence encoding the amino acid sequence defined in SEQ ID No: 1):

CAAGTGAAGCTGCAGCAGTCAGGCCCTGGGATATTGCAGTCCTCCCAGACCCTCAGTCTCAAGTGAAGCTGCAGCAGTCAGGCCCTGGGATATTGCAGTCCTCCCAGACCCTCAGTCT

GACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGTACTTCTGGTATGGGTGTGAGCTGGATTCGTCAGGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGTACTTCTGGTATGGGTGTGAGCTGGATTCGTCAG

CCTTCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTACTGGGATGATGACAAGCGCTATAACCCCTTCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTACTGGGATGATGACAAGCGCTATAACC

CAACCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATCCCTCCAGAAACCAGGTATTCCTCAAGATCAACCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATCCCTCCAGAAACCAGGTATTCCCTCAAGAT

GAG GAG T G T G GAGAC T G CAGATAC T G С CACATAC TAC T G TGAG GAG T G T G GAGAC T G CAGATAC T G C CACATAC TAC T G T

SEQ ID No: 22 (нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID No: 2):SEQ ID No: 22 (DNA nucleotide sequence encoding the amino acid sequence defined in SEQ ID No: 2):

GACAT T G T G С T СAC С CAG T С T С СAAAAT T CAT G T С CACAT GAG TAG GAGACAG G G T GAGGACAT T G T G C T CAC C CAG T C T C CAAAAT T CAT G T C CACAT GAG TAG GAGACAG G G T GAG

CGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTGGCCTGGTTTCTACAGAAACCAGGGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTGGCCTGGTTTCTACAGAAACCAGGG

CAATCTCCTAAAGCACTTATTTACTCGGCATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAATCTCCTAAAGCACTTATTTACTCGGCATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCA

CAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAACGTGCAGTCTGAAGACTTGGCCAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAACGTGCAGTCTGAAGACTTGGC

AGAGTATTTCTGTAGAGTATTTCTGT

SEQ ID No: 23 (нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID No: 5):SEQ ID No: 23 (DNA nucleotide sequence encoding the amino acid sequence defined in SEQ ID No: 5):

SEQ ID No: 24 (нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID No: 7):SEQ ID No: 24 (DNA nucleotide sequence encoding the amino acid sequence defined in SEQ ID No: 7):

CAGCAATATAACAAC T T T С C G TACAC GCAGCAATATAACAAC T T T C C G TACAC G

Дополнительные аминокислотные последовательности являются следующими (в направлении от Nконца до С-конца; представлены в виде однобуквенного аминокислотного кода):Additional amino acid sequences are as follows (in the direction from N-terminus to C-terminus; represented as a single-letter amino acid code):

SEQ ID No: 27 (аминокислотная последовательность тяжелой цепи гуманизированного антитела В1-23 к GDF-15 H1L5):SEQ ID No: 27 (amino acid sequence of heavy chain of humanized antibody B1-23 to GDF-15 H1L5):

QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKQITLKESGPTLVKPTQTLLTTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDK

RYNPTLKSRLTITKDPSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSSYGAMDYWGQGTLVTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGKRYNPTLKSRLTITKDPSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSSYGAMDYWGQGTLVTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LM ISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGK

SEQ ID No: 28 (аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи гуманизированного антитела В1-23 к GDF-15 H1L5):SEQ ID No: 28 (amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the humanized antibody B1-23 to GDF-15 H1L5):

RYNPTLKSRLTITKDPSKNQWLTMTNMDPVDTATYYCARSSYGAMDYWGQGTLVTVSSRYNPTLKSRLTITKDPSKNQWLMTTNMDPVDTATYYCARSSYGAMDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID No: 29 (аминокислотная последовательность константного домена тяжелой цепи гуманизированного антитела В1-23 к GDF-15 H1L5):SEQ ID No: 29 (amino acid sequence of the heavy chain constant domain of the humanized antibody B1-23 to GDF-15 H1L5):

- 22 044887- 22 044887

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS

SGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV

FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWS

VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL

VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL

HNHYTQKSLSLSPGKHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID No: 30 (аминокислотная последовательность легкой цепи гуманизированного антитела В123 к GDF-15 H1L5):SEQ ID No: 30 (amino acid sequence of light chain of humanized antibody B123 to GDF-15 H1L5):

DIVLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGTNVAWFQQKPGKSPKALIYSASYRYSGVPDIVLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGTNVAWFQQKPGKSPKALIYSASYRYSGVP

DRFTGSGSGTEFTLTISSLQPEDFAAYFCQQYNNFPYTFGGGTKLEIKRAPSVFIFPPSDEQLKDRFTGSGSGTEFTLTISSLQPEDFAAYFCQQYNNFPYTFGGGTKLEIKRAPSVFIFPPSDEQLK

SGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK

VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID No: 31 (аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи гуманизированного антитела В1-23 к GDF-15 H1L5):SEQ ID No: 31 (amino acid sequence of the light chain variable domain of the humanized antibody B1-23 to GDF-15 H1L5):

DRFTGSGSGTEFTLTISSLQPEDFAAYFCQQYNNFPYTFGGGTKLEIKRDRFTGSGSGTEFTLTISSLQPEDFAAYFCQQYNNFPYTFGGGTKLEIKR

SEQ ID No: 32 (аминокислотная последовательность константного домена легкой цепи гуманизированного антитела В1-23 к GDF-15 H1L5):SEQ ID No: 32 (amino acid sequence of the light chain constant domain of the humanized antibody B1-23 to GDF-15 H1L5):

APSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD

STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID No: 33 (аминокислотная последовательность тяжелой цепи химерного антитела В1-23 к GDF-15):SEQ ID No: 33 (amino acid sequence of anti-GDF-15 chimeric antibody B1-23 heavy chain):

RYNPTLKSRLTISKDPSRNQVFLKITSVDTADTATYYCARSSYGAMDYWGQGTSVTVSSASTKGRYNPTLKSRLTISKDPSRNQVFLKITSVDTADTATYYCARSSYGAMDYWGQGTSVTVSSASTKG

PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW

TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT

LMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWL

NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIANGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA

VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS

LSPGKLSPGK

SEQ ID No: 34 (аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи химерного антитела В1-23 к GDF-15):SEQ ID No: 34 (amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the chimeric antibody B1-23 to GDF-15):

RYNPTLKSRLTISKDPSRNQVFLKITSVDTADTATYYCARSSYGAMDYWGQGTSVTVSSRYNPTLKSRLTISKDPSRNQVFLKITSVDTADTATYYCARSSYGAMDYWGQGTSVTVSS

SEQ ID No: 35 (аминокислотная последовательность константного домена тяжелой цепи химерного антитела В1-23 к GDF-15) :SEQ ID No: 35 (amino acid sequence of the heavy chain constant domain of the chimeric antibody B1-23 to GDF-15):

HNHYTQKSLSLSPGKHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID No: 36 (аминокислотная последовательность легкой цепи химерного антитела В1-23 к GDF15):SEQ ID No: 36 (amino acid sequence of anti-GDF15 chimeric antibody B1-23 light chain):

- 23 044887- 23 044887

DRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNNFPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNNFPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDE

QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE

KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID No: 37 (аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи химерного антитела В1-23 к GDF-15) :SEQ ID No: 37 (amino acid sequence of the light chain variable domain of the chimeric antibody B1-23 to GDF-15):

DRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNNFPYTFGGGTKLEIKRTVADRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNNFPYTFGGGTKLEIKRTVA

SEQ ID No: 38 (аминокислотная последовательность константного домена легкой цепи химерного антитела В1-23 к GDF-15):SEQ ID No: 38 (amino acid sequence of the light chain constant domain of the chimeric antibody B1-23 to GDF-15):

SEQ ID No: 39 (аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела 01G06):SEQ ID No: 39 (amino acid sequence of antibody heavy chain variable domain 01G06):

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQSLEWMGQINPNNGLIFQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQSLEWMGQINPNNGLIF

FNQKFQGRVTLTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAREAITTVGAMDYWGQGTLVTVSSFNQKFQGRVTLTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAREAITTVGAMDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID No: 40 (аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела 01G06):SEQ ID No: 40 (amino acid sequence of antibody light chain variable domain 01G06):

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENLHNYLAWYQQKPGKSPKLLIYDAKTLADGVPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENLHNYLAWYQQKPGKSPKLLIYDAKTLADGVP

SRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWSDPYTFGQGTKLEIKSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWSDPYTFGQGTKLEIK

SEQ ID No: 41 (аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела 03G05):SEQ ID No: 41 (amino acid sequence of antibody heavy chain variable domain 03G05):

QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWIHWVNQRPGQGLEWIGDINPSNGRSKQVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWIHWVNQRPGQGLEWIGDINPSNGRSK

YNEKFKNKATMTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVLDGAMDYWGQGTSVTVSSYNEKFKNKATMTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVLDGAMDYWGQGTSVTVSS

SEQ ID No: 42 (аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела 03G05):SEQ ID No: 42 (amino acid sequence of antibody light chain variable domain 03G05):

DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASNQGDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASNQG

SGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPWTFGGGSKLEIKSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPWTFGGGSKLEIK

SEQ ID No: 43 (аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела 04F08):SEQ ID No: 43 (amino acid sequence of antibody heavy chain variable domain 04F08):

QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTYGMGVTWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTYGMGVTWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDK

RYNPSLKSRLTISKDTSNNQVFLKITSVDTADTATYYCAQTGYSNLFAYWGQGTLVTVSARYNPSLKSRLTISKDTSNNQVFLKITSVDTADTATYYCAQTGYSNLFAYWGQGTLVTVSA

SEQ ID No: 44 (аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела 04F08):SEQ ID No: 44 (amino acid sequence of antibody light chain variable domain 04F08):

DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKLGQSPKTLIYSASYRYSGVPDIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKLGQSPKTLIYSASYRYSGVP

DRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNSYPYTFGGGTKLEIKDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNSYPYTFGGGTKLEIK

SEQ ID No: 45 (аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела 06С11):SEQ ID No: 45 (amino acid sequence of the variable domain of the heavy chain of antibody 06C11):

QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLNTYGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLNTYGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDK

RYNPSLKSRLTISKflASNNRVFLKITSVDTADTATYYCAQRGYDDYWGYWGQGTLVTISARYNPSLKSRLTISKflASNNRVFLKITSVDTADTATYYCAQRGYDDYWGYWGQGTLVTISA

SEQ ID No: 46 (аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела 06С11):SEQ ID No: 46 (amino acid sequence of the light chain variable domain of antibody 06C11):

DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWFQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWFQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVP

DRFTGSGSGTDFILTISNVQSEDLAEYFCQQYNNYPLTFGAGTKLELKDRFTGSGSGTDFILTISNVQSEDLAEYFCQQYNNYPLTFGAGTKLELK

SEQ ID No: 47 (аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела 08G01):SEQ ID No: 47 (amino acid sequence of antibody heavy chain variable domain 08G01):

EVLLQQSGPEWKPGASVKIPCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGEINPNNGGTFEVLLQQSGPEWKPGASVKIPCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGEINPNNGGTF

YNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCAREAITTVGAMDYWGQGTSVTVSSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCAREAITTVGAMDYWGQGTSVTVSS

SEQ ID No: 48 (аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела 08G01):SEQ ID No: 48 (amino acid sequence of antibody light chain variable domain 08G01):

- 24 044887- 24 044887

DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPDIQMTQSPASLSSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVP

SRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSSPYTFGGGTKLEIKSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSSPYTFGGGTKLEIK

SEQ ID No: 49 (аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела 14F11):SEQ ID No: 49 (amino acid sequence of antibody heavy chain variable domain 14F11):

QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTYGMGVGWIRQPSGKGLEWLADIWWDDDKQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTYGMGVGWIRQPSGKGLEWLADIWWDDDK

YYNPSLKSRLTISKDTSSNEVFLKIAIVDTADTATYYCARRGHYSAMDYWGQGTSVTVSSYYNPSLKSRLTISKDTSSNEVFLKIAIVDTADTATYYCARRGHYSAMDYWGQGTSVTVSS

SEQ ID No: 50 (аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела 14F11):SEQ ID No: 50 (amino acid sequence of antibody light chain variable domain 14F11):

DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKALIYSPSYRYSGVPDIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKALIYSPSYRYSGVP

DRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNSYPHTFGGGTKLEMKDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNSYPHTFGGGTKLEMK

SEQ ID No: 51 (аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела 17В11):SEQ ID No: 51 (amino acid sequence of the variable domain of the heavy chain of antibody 17B11):

QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHNDWDDDKQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHNDWDDDK

RYKSSLKSRLTISKDTSRNQVFLKITSVDTADTATYYCARRVGGLEGYFDYWGQGTTLTVSSRYKSSLKSRLTISKDTSRNQVFLKITSVDTADTATYYCARRVGGLEGYFDYWGQGTTLTVSS

SEQ ID No: 52 (аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела 17В11):SEQ ID No: 52 (amino acid sequence of the light chain variable domain of antibody 17B11):

DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASQSVSTSRFSYMHWFQQKPGQAPKLLIKYASNLEDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASQSVSTSRFSYMHWFQQKPGQAPKLLIKYASNLE

SGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEGEDTATYYCQHSWEIPYTFGGGTKLEIKSGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEGEDTATYYCQHSWEIPYTFGGGTKLEIK

Примеры.Examples.

Эталонные примеры 1 до 3 иллюстрируют ингибитор hGDF-15, который можно использовать в композициях, наборах, способах и применениях по изобретению. Этот ингибитор hGDF-15 представляет собой моноклональное антитело, которое известно из WO 2014/049087, включенного в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.Reference Examples 1 to 3 illustrate an hGDF-15 inhibitor that can be used in the compositions, kits, methods and applications of the invention. This hGDF-15 inhibitor is a monoclonal antibody, which is known from WO 2014/049087, incorporated herein by reference in its entirety.

Эталонный пример 1. Получение и характетристика антитела В1-23 к GDF-15.Reference Example 1. Preparation and Characterization of Anti-GDF-15 Antibody B1-23.

Антитело В1-23 получали у мыши с нокаутом GDF-15. В качестве иммуногена использовали рекомбинантный человеческий GDF-15 (SEQ ID No: 8).Antibody B1-23 was obtained from a GDF-15 knockout mouse. Recombinant human GDF-15 (SEQ ID No: 8) was used as the immunogen.

Гибридомная клеточная линия В1-23, производящая mAb-B1-23, была депонирована Вюрцбургским университетом Юлиуса-Максимилиана, Sanderring 2, 97070 Вюрцбург, Германия, при помощи Немецкого собрания микроорганизмов и клеточных культур GmbH (DMSZ) под номером доступа DSM ACC3142, в соответствии с Будапештским договором.The hybridoma cell line B1-23 producing mAb-B1-23 was deposited by the Julius Maximilian University of Würzburg, Sanderring 2, 97070 Würzburg, Germany, with the help of the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DMSZ) under DSM accession number ACC3142, according to with the Treaty of Budapest.

При помощи коммерчески доступной системы тест-полосок изотип В1-23 был идентифицирован как IgG2a (цепь каппа). С использованием измерений поверхностного плазмонного резонанса константу диссоциации (Kd) определяли следующим образом:Using a commercially available test strip system, the B1-23 isotype was identified as IgG2a (kappa chain). Using surface plasmon resonance measurements, the dissociation constant (Kd) was determined as follows:

связывание моноклонального антитела к человеческому GDF-15 mAb-B1-23 по изобретению измеряли с использованием измерений поверхностного плазмонного резонанса при помощи системы Biorad ProteOn XPR36 и сенсорных чипов Biorad GLC.The binding of the anti-human GDF-15 monoclonal antibody mAb-B1-23 of the invention was measured using surface plasmon resonance measurements using the Biorad ProteOn XPR36 system and Biorad GLC sensor chips.

Для подготовки биосенсоров рекомбинантный зрелый человеческий белок GDF-15 иммобилизовали в проточной ячейке 1 и 2. В одной проточной ячейке использовали рекомбинантный GDF-15, полученный из клеток насекомых, трансфицированных бакуловирусом (клетки насекомых HighFive), а в другой использовали рекомбинантный белок, полученный при экспрессии в Е. coli. Сенсорный чип GLC активировали с использованием Sulfo-NHS (N-гидроксисульфосукцинимида) и EDC (1-этил-3-[3диметиламинопропил]карбодиимид гидрохлорида) (Biorad ProteOn Амин Coupling Набор) в соответствии с рекомендациями производителя, поверхность сенсора потом нагружали белками до плотности приблизительно 600RU (1Ru=1пг·мм^-2). He прореагировавшие связывающие группы затем гасили промыванием 1М этаноламином рН 8,5, и уравновешивали биосенсор, промывая чип электродным буфером (10М HEPES, 150 мМ NaCl, 3,4 мМ ЭДТА, 0,005% Tween-20, рН 7,4, обозначаемый как HBS150B качестве контроля использовали две проточных ячейки, одну пустую без связанного белка и одну, связанную нефизиологическим белковым партнером (человеческим интерлейкином-5), который был иммобилизован с использованием такой же химии связывания и такой же плотности связывания. Для измерения взаимодействия антитело к человеческому GDF-15 mAb-B1-23 растворяли в HBS150 и использовали в шести различных концентрациях в качестве анализируемого вещества (концентрация: 0,4, 0,8, 3, 12, 49 и 98 нМ). Анализируемое вещество наливали на биосенсор с использованием установки для однократной кинетики для того чтобы избежать промежуточной регенерации, все измерения проводили при 25°С и скорости потока 100 мкл-мин^-1. Для обработки эффекта поверхности и неспецифического связывания с матрицей сенсора вычитали данные SPR из пустой проточной ячейки (проточная ячейка 3) из всех остальных данных SPR. Полученную сенсограмму анализировали при помощи программного обеспечения ProteOn Manager версии 3.0. Для анализа кинетики связывания предполагали взаимодействие 1:1 по типуTo prepare the biosensors, recombinant mature human GDF-15 protein was immobilized in flow cells 1 and 2. One flow cell used recombinant GDF-15 obtained from insect cells transfected with baculovirus (HighFive insect cells), and the other used recombinant protein obtained from expression in E. coli. The GLC sensor chip was activated using Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) and EDC (1-ethyl-3-[3dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride) (Biorad ProteOn Amine Coupling Kit) according to the manufacturer's recommendations, the sensor surface was then loaded with proteins to a density of approx. 600RU (1Ru=1pg mm ^-2 ). Unreacted binding groups were then quenched by washing with 1 M ethanolamine pH 8.5, and the biosensor was equilibrated by washing the chip with electrode buffer (10 M HEPES, 150 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, 0.005% Tween-20, pH 7.4, designated HBS150B Two flow cells were used as controls, one empty with no bound protein and one bound with a non-physiological protein partner (human interleukin-5) that was immobilized using the same binding chemistry and the same binding density.Anti-human GDF-15 antibody was used to measure the interaction mAb-B1-23 was dissolved in HBS150 and used at six different concentrations as the analyte (concentration: 0.4, 0.8, 3, 12, 49 and 98 nM) The analyte was poured onto the biosensor using a single-shot kinetics setup To avoid intermediate regeneration, all measurements were performed at 25°C and a flow rate of 100 μl min ^-1 To handle surface effects and non-specific binding to the sensor matrix, SPR data from an empty flow cell (flow cell 3) was subtracted from all other data SPR. The resulting sensorgram was analyzed using ProteOn Manager software version 3.0. To analyze the binding kinetics, we assumed a 1:1 interaction of the type

- 25 044887 модели Лэнгмюра. Могут быть определены значения для константы скорости ассоциации 5,4±0, 06х10⁵-М^-1'^с-1 (kon) и для константы скорости диссоциации 4,3±0, 03х10^-4'^с-1 (koff) (значения приведены для взаимодействия mAb-В1-23 против GDF-15 с GDF-15, полученным при экспрессии в клетках насекомых). Равновесную константу диссоциации рассчитывали из уравнения K_D=ko_ff/ko_n и получали значение приблизительно 790 пМ. Значения аффинности для взаимодействия GDF-15, полученного при экспрессии Е. Coli, и антитела к человеческому GDF-15 mAb-B1-23 различались менее чем в два раза, константы скорости для GDF-15, полученного из клеток насекомых и Е. coli отклоняются приблизительно на 45% и, таким образом, находятся в пределах точности измерений SPR, и, по всей видимости, не отражают действительного различия в аффинности. При использованных условиях mAb-B1-23 к человеческому GDF15 не связывалось с человеческим интерлейкином-5 и, таким образом, подтвердило специфичность данных взаимодействия и специфичность mAb-Bl-23 к человеческому GDF-15.- 25 044887 Langmuir model. Values can be determined for the association rate constant of 5.4±0.06x10 ⁵ -M ^-1 ' ^s-1 (kon) and for the dissociation rate constant of 4.3±0.03x10 ^-4 ' ^s-1 (koff) (values shown for the interaction of mAb-B1-23 against GDF-15 with GDF-15 obtained when expressed in insect cells). The equilibrium dissociation constant was calculated from the equation K _D =ko _ff /ko _n and a value of approximately 790 pM was obtained. The affinity values for the interaction of GDF-15 obtained by expression of E. coli and the antibody to human GDF-15 mAb-B1-23 differed by less than twofold, the rate constants for GDF-15 obtained from insect cells and E. coli deviated approximately 45% and are thus within the precision of the SPR measurements and do not appear to reflect true differences in affinity. Under the conditions used, mAb-B1-23 to human GDF15 did not bind to human interleukin-5 and thus confirmed the specificity of the interaction data and the specificity of mAb-Bl-23 to human GDF-15.

Аминокислотная последовательность рекомбинантного человеческого GDF-15 (экспрессировавшегося в клетках насекомых, трансфицированных бакуловирусом) была:The amino acid sequence of recombinant human GDF-15 (expressed in insect cells transfected with baculovirus) was:

HAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID No: 8)HAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID No: 8)

Таким образом, с использованием измерений поверхностного плазмонного резонанса, определяли константу диссоциации (Kd) как 790 пМ. В качестве сравнения: терапевтически применяемое антитело Ритуксимаб имеет значительно более низкую аффинность (Kd=8 нМ).Thus, using surface plasmon resonance measurements, the dissociation constant (Kd) was determined to be 790 pM. By comparison, the therapeutically used antibody Rituximab has a significantly lower affinity (Kd=8 nM).

Ранее было показано, что mAb B1-23 ингибирует пролиферацию злокачественных клеток in vitro, и что mAb B1-23 ингибирует рост опухолей in vivo (WO 2014/049087).It was previously shown that mAb B1-23 inhibits the proliferation of malignant cells in vitro, and that mAb B1-23 inhibits tumor growth in vivo (WO 2014/049087).

Эталонный пример 2. mAb B1-23 распознает конформационный или прерывистый эпитоп человеческого GDF-15.Reference Example 2: mAb B1-23 recognizes a conformational or discontinuous epitope of human GDF-15.

Картирование эпитопа: моноклональное мышиное антитело к GDF-15 против 13-мерных линейных пептидов, полученных из GDF-15.Epitope mapping: anti-GDF-15 mouse monoclonal antibody against 13-mer linear peptides derived from GDF-15.

Антиген: GDF-15:Antigen: GDF-15:

GSGSGSGMPGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGALSLAEASRASFPGPSELHSEDSRGSGSGSGMPGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGALLSLAEASRASFPGPSELHSEDSR

FRELRKRYEDLLTRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPEFRELRKRYEDLLTRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPE

ASRLHRALFRLSPTASRSWDVTRPLRRQLSLARPQAPALHLRLSPPPSQSDQLLAESSSARPQL ELHLRPQAARGRRRARARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGAC PSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI GSGSGSG (322 аминокислоты с линкером)(SEQ ID No: 10)ASRLHRALFRLSPTASRSWDVTRPLRRQLSLARPQAPALHLRLSPPPSQSDQLLAESSSARPQL ELHLRPQAARGRRRARARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGAC PSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI GSGSGSG (322 amino acids with linker)(SEQ ID No: 10)

Последовательность белка была транслирована в 13-мерные пептиды со сдвигом на одну аминокислоту. С- и N-концы были удлинены нейтральным линкером GSGS для того чтобы избежать получения укороченных пептидов (буквы жирным шрифтом).The protein sequence was translated into 13-mer peptides with a one amino acid shift. The C- and N-termini were extended with the neutral linker GSGS to avoid the production of truncated peptides (letters in bold).

Контрольные пептиды:Control peptides:

Flag: DYKDDDDKGG (SEQ ID No:13), 78 точек; НА: YPYDVPDYAG (SEQ ID No:14), 78 точек (каждая копия анализа).Flag: DYKDDDDKGG (SEQ ID No:13), 78 points; ON: YPYDVPDYAG (SEQ ID No:14), 78 points (each copy of the analysis).

Идентификатор пептидного чипа:Peptide Chip ID:

000264_01 (10/90, линкер Ala2Asp).000264_01 (10/90, Ala2Asp linker).

Условия окрашивания.Staining conditions.

Стандартный буфер: PBS, рН 7,4+0,05% Tween 20.Standard buffer: PBS, pH 7.4 + 0.05% Tween 20.

Блокирующий буфер: блокирующий буфер Rockland MB-070.Blocking Buffer: Rockland MB-070 Blocking Buffer.

Буфер для инкубации: стандартный буфер с 10% блокирующим буфером Rockland MB-070.Incubation Buffer: Standard buffer with 10% Rockland MB-070 blocking buffer.

Первичный образец: моноклональное мышиное антитело к GDF-15 (1 мкг/мкл): окрашивание в буфере для инкубации в течение 16 ч при 4°С с разведением 1:100 и легким покачиванием при 500 об./мин.Primary sample: mouse monoclonal antibody to GDF-15 (1 μg/μl): staining in incubation buffer for 16 hours at 4°C with a dilution of 1:100 and gentle shaking at 500 rpm.

Вторичное антитело: Козлиный анти-мышиный IgG (H+L) IRDye680, окрашивание в буфере для инкубации с разведением 1:5000 в течение 30 мин при комнатной температуре (RT).Secondary antibody: Goat anti-mouse IgG (H+L) IRDye680, stained in incubation buffer diluted 1:5000 for 30 min at room temperature (RT).

Контрольные антитела: моноклональное анти-НА (12CA5)-LL-Atto 680 (1:1000), моноклональное анти-FLAG(М2)-FluoProbes752 (1:1000); окрашивание в буфере для инкубации в течение 1 ч при RTControl antibodies: monoclonal anti-HA (12CA5)-LL-Atto 680 (1:1000), monoclonal anti-FLAG(M2)-FluoProbes752 (1:1000); staining in incubation buffer for 1 h at RT

Сканер.Scanner.

Система визуализации Odyssey, LI-COR Biosciences.Odyssey Imaging System, LI-COR Biosciences.

Настройки: смещение: 1 мм; разрешение: 21 мкм; интенсивность зеленый/красный: 7/7.Settings: offset: 1mm; resolution: 21 microns; intensity green/red: 7/7.

Результаты.Results.

После 30 мин предварительного набухания в стандартном буфере и 30 мин в блокирующем буфере, пептидный чип с 10-, 12-и 15-мерными линейными пептидами, полученными из В7Н3 инкубировали со вторичным козлиным антимышиным антителом IgG (H+L) IRDye680 только в разведении 1:5000 в течеAfter 30 min of preswelling in standard buffer and 30 min in blocking buffer, the peptide chip with 10-, 12-, and 15-mer linear peptides derived from B7H3 was incubated with secondary goat anti-mouse IgG antibody (H+L) IRDye680 only at a dilution of 1 :5000 in progress

- 26 044887 ние 1 ч при комнатной температуре для анализа фоновых взаимодействий со вторичным антителом. PEPperCHIP® отмывали 2 раза по 1 мине стандартным буфером, промывали дистиллированной водой и сушили в потоке воздуха. Чтение проводили при помощи системы визуализации Odyssey с разрешением 21 мкм и интенсивностями зеленый/красный 7/7. Мы наблюдали слабое взаимодействие пептидов, богатых аргинином (ELHLRPQAARGRR (SEQ ID No:15), LHLRPQAARGRRR (SEQ ID No:16), HLRPQAARGRRRA (SEQ ID No:17), LRPQAARGRRRAR (SEQ ID No:18), RPQAARGRRRARA (SEQ ID No:19), PQAARGRRRARAR (SEQ ID No:20) и QAARGRRRARARN (SEQ ID No:21)), которые известны как часто связывающиеся вещества, и с основным пептидом MHAQIKTSLHRLK (SEQ ID No:22) из-за ионных взаимодействий с заряженной краской антитела.- 26 044887 1 hour at room temperature to analyze background interactions with the secondary antibody. PEPperCHIP® was washed 2 times for 1 min each with standard buffer, washed with distilled water and dried in a stream of air. Reading was performed using an Odyssey imaging system with a resolution of 21 μm and green/red intensities of 7/7. We observed weak interactions of arginine-rich peptides (ELHLRPQAARGRR (SEQ ID No:15), LHLRPQAARGRRR (SEQ ID No:16), HLRPQAARGRRRA (SEQ ID No:17), LRPQAARGRRRAR (SEQ ID No:18), RPQAARGRRRARA (SEQ ID No :19), PQAARGRRRARAR (SEQ ID No:20) and QAARGRRRARARN (SEQ ID No:21)), which are known to bind frequently, and with the main peptide MHAQIKTSLHRLK (SEQ ID No:22) due to ionic interactions with the charged dye antibodies.

После предварительного набухания в течение 10 мин в стандартном буфере, пептидный микрочип инкубировали в течение ночи при 4°С с моноклональным мышиным антителом к GDF-15 в разведении 1:100. После повторного промывания стандартным буфером (2 раза по 1 мине) проводили инкубацию в течение 30 мин со вторичным антителом в разведении 1:5000 при комнатной температуре. После промывания в стандартном буфере 2 раза по 10 с и короткого ополаскивания дистилированной водой, PEPperCHIP® сушили в потоке воздуха Чтение проводили при помощи системы визуализации Odyssey с разрешением 21 мкм и интенсивностями зеленый/красный 7/7 до и после окрашивания контрольных пептидов антителами к НА и антителами к FLAG(M2).After pre-swelling for 10 min in standard buffer, the peptide microchip was incubated overnight at 4°C with a monoclonal mouse antibody to GDF-15 at a dilution of 1:100. After repeated washing with standard buffer (2 times for 1 min), incubation was carried out for 30 min with a secondary antibody diluted 1:5000 at room temperature. After washing in standard buffer 2 times for 10 s and a short rinse with distilled water, PEPperCHIP® was dried in a stream of air. Reading was performed using an Odyssey imaging system with a resolution of 21 μm and green/red intensities of 7/7 before and after staining of control peptides with anti-HA antibodies and antibodies to FLAG(M2).

Показано, что ни один из линейных 13-мерных пептидов, полученных из GDF-15, не взаимодействовал с моноклональным мышиным антителом к GDF-15 даже при чрезмерно высокой интенсивности. Окрашивание контрольных пептидов с Flag и НА, которые заключали чип в рамку, однако, привело к хорошим и гомогенным интенсивностям пятен.It was shown that none of the linear 13-mer peptides derived from GDF-15 interacted with the mouse monoclonal antibody to GDF-15, even at excessively high intensities. Staining of control peptides with Flag and HA, which framed the chip, however, resulted in good and homogeneous spot intensities.

Подведение итогов.Summarizing.

Картирование эпитопов для моноклонального мышиного антитела против GDF-15 не выявило ни одного эпитопа из 13-мерных пептидов, полученных из антигена. Согласно этому открытию, весьма вероятно, что моноклональное мышиное антитело к GDF-15 распознает конформационный или прерывистый эпитоп с низкой аффинностью для частичных эпитопов. Из-за полного отсутствия какого-либо сигнала GDF-15 выше фонового окрашивания только со вторичным антителом, количественная оценка интенсивности пятен при помощи PepSlide® Analyzer и последующая аннотация пептидов были опущены.Epitope mapping for the mouse monoclonal antibody against GDF-15 did not identify any epitope from the 13-mer peptides derived from the antigen. According to this finding, it is highly likely that the mouse monoclonal antibody to GDF-15 recognizes a conformational or discontinuous epitope with low affinity for partial epitopes. Due to the complete absence of any GDF-15 signal above background staining with secondary antibody alone, quantification of spot intensities using the PepSlide® Analyzer and subsequent peptide annotation were omitted.

Эталонный пример 3: Структурная идентификация пептидных лигандных эпитопов путем массспектрометрического вырезания эпитопа и выделения эпитопа.Reference Example 3: Structural identification of peptide ligand epitopes by mass spectrometric epitope excision and epitope extraction.

Эпитоп рекомбинантного человеческого GDF-15, который связывается с антителом В1-23, был идентифицирован путем способа вырезания эпитопов и способа выделения эпитопов (Suckau et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1990 December; 87(24): 9848-9852.; R.Stefanescu et al., Eur.J.Mass Spectrom. 13, 69-75 (2007)).The epitope of recombinant human GDF-15 that binds to antibody B1-23 was identified by an epitope excision method and an epitope isolation method (Suckau et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1990 December; 87(24): 9848-9852.; R Stefanescu et al., Eur J Mass Spectrom 13, 69-75 (2007).

Для получения колонки с антителом, антитело В1-23 добавляли к сефарозе, активированной NHS и соединенной с 6-аминогексановой кислотой. Соединенное с сефарозой антитело В1-23 затем загружали в 0,8 мл микроколонку и промывали блокирующим и отмывающим буферами.To prepare the antibody column, antibody B1-23 was added to NHS activated Sepharose coupled with 6-aminohexanoic acid. Sepharose-coupled antibody B1-23 was then loaded onto a 0.8 ml microcolumn and washed with blocking and wash buffers.

Эксперимент по выделению эпитопов.Epitope isolation experiment.

Рекомбинантный человеческий GDF-15 расщепляли трипсином в течение 2 ч при 37°С (в растворе), получая различные пептиды, в соответствии с участками расщепления трипсина в белке. После полного расщепления, пептиды загружали на аффинную колонку, содержащую иммобилизованное антитело В123. Несвязавшиеся, а также потенциально связавшиеся пептиды GDF-15 использовали для массспектрометрического анализа. Идентификация пептидов способами масс-спектрометрии была невозможна. Это был еще один показатель того, что связывающая область GDF-15 в иммунном комплексе В123 содержит прерывистый или конформационный эпитоп. В случае непрерывного линейного эпитопа, пептиды после расщепления должны были связываться со своим партнером по взаимодействию, если только участок расщепления пептида не располагался в эпитопном пептиде. Прерывистый или конформационный эпитоп можно подтвержать способом вырезания эпитопов, описанным в следующей части.Recombinant human GDF-15 was digested with trypsin for 2 hours at 37°C (in solution), yielding different peptides according to the trypsin cleavage sites in the protein. After complete digestion, the peptides were loaded onto an affinity column containing immobilized antibody B123. Unbound as well as potentially bound GDF-15 peptides were used for mass spectrometry analysis. Identification of peptides by mass spectrometry was impossible. This was another indication that the GDF-15 binding region of the B123 immune complex contains a discontinuous or conformational epitope. In the case of a continuous linear epitope, the cleavage peptides were expected to bind to their interaction partner unless the peptide cleavage site was located within the epitope peptide. A discontinuous or conformational epitope can be confirmed by the epitope excision method described in the next part.

Эксперимент по вырезанию эпитопов.Epitope excision experiment.

Иммобилизованное антитело В1-23 на аффинной колонке затем инкубировали с рекомбинантным GDF-15 в течение 2 ч. Образовавшийся иммунный комплекс на аффинной колонке затем инкубировали с трипсином в течение 2 ч при 37°С. Расщепление привело к различным пептидам, полученным из рекомбинантного GDF-15. Само по себе иммобилизованное антитело является протеолитически стабильным. Полученные пептиды из расщепленного белка GDF-15, которые были закрыты антителом и, таким образом, защищены от протеолитического расщепления, элюировали при кислых условиях (ТФУ, рН=2), собирали и идентифицировали путем масс-спектрометрии.The immobilized B1-23 antibody on the affinity column was then incubated with recombinant GDF-15 for 2 hours. The resulting immune complex on the affinity column was then incubated with trypsin for 2 hours at 37°C. The cleavage resulted in various peptides derived from recombinant GDF-15. The immobilized antibody itself is proteolytically stable. The resulting peptides from the digested GDF-15 protein, which were capped with antibody and thus protected from proteolytic digestion, were eluted under acidic conditions (TFA, pH=2), collected and identified by mass spectrometry.

Способ вырезания эпитопов с использованием MS/MS идентификации привел к следующим пептидам:The epitope excision method using MS/MS identification resulted in the following peptides:

- 27 044887- 27 044887

Пептид Peptide Положение в последовательн ости Position in sequentially awns Масса Weight Ион/заряд Ion/charge EVQVTMCIGACPSQ FR EVQVTMCIGACPSQ FR 40-55 40-55 1769,91 1769.91 590,50(3+) 590.50(3+) (SEQ ID No: 25) (SEQ ID No: 25) TDTGVSLQTYDDLL AKDCHCI (SEQ ID No : 2 6) TDTGVSLQTYDDLL AKDCHCI (SEQ ID No: 2 6) 94-114 94-114 2310,96 2310.96 771:33(3+) 771:33(3+)

Часть человеческого GDF-15, которая связывается с антителом В1-23, содержит прерывистый или конформационный эпитоп. Масс-спектрометрия выявила 2 пептида в белке GDF-15, которые отвечают за формирование иммунного комплекса. Эти пептиды ограничены положениями 40-55 (EVQVTMCIGACPSQFR) и 94-114 (TDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI) в аминокислотной последовательности GDF-15. Таким образом, эти два пептиды содержат эпитоп белка GDF-15, который связывается с антителом В123.The portion of human GDF-15 that binds to antibody B1-23 contains a discontinuous or conformational epitope. Mass spectrometry identified 2 peptides in the GDF-15 protein that are responsible for the formation of the immune complex. These peptides are limited to positions 40-55 (EVQVTMCIGACPSQFR) and 94-114 (TDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI) in the amino acid sequence of GDF-15. Thus, these two peptides contain an epitope of the GDF-15 protein that binds to the B123 antibody.

Настоящее изобретение иллюстрируется следующими неограничивающими примерами:The present invention is illustrated by the following non-limiting examples:

Пример 1. У людей-пациентов с меланомой, которые получали предварительное лечение ипилимумабом (моноклональным антителом к CTLA4) и не показали полного ответа на лечение, и которые получали лечение пембролизумабом (моноклональным антителом к PD-1), сывороточные уровни hGDF-15 коррелируют с плохим ответом на лечение во временной точке через четыре месяца после начала лечения пембролизумабом.Example 1: In human melanoma patients who were pretreated with ipilimumab (an anti-CTLA4 monoclonal antibody) and did not show a complete response to treatment, and who were treated with pembrolizumab (an anti-PD-1 monoclonal antibody), serum hGDF-15 levels correlated with poor response to treatment at a time point of four months after initiation of pembrolizumab treatment.

Авторы настоящего изобретения решили исследовать, могут ли пациенты со злокачественной опухолью, получающие блокаторы контрольных точек иммунного ответа, получить пользу от ингибирования hGDF-15. Для того чтобы исследовать эту возможность, сыворотку от пациентов с меланомой, которые получали предварительное лечение ипилимумабом (моноклональным антителом к CTLA4) и получали лечение пембролизумабом (моноклональным антителом к PD-1) в клиническом исследовании, анализировали на сывороточные уровни hGDF-15. Для того чтобы исследовать, влияет ли hGDF-15 на ответ пациентов на блокаторы контрольных точек иммунного ответа, полученные сывороточные уровни hGDF-15 затем коррелировали с ответами пациентов на лечение. Сыворотку брали у пациентов до начала лечения пембролизумабом.The present inventors decided to investigate whether cancer patients receiving immune checkpoint blockers could benefit from hGDF-15 inhibition. To investigate this possibility, sera from melanoma patients who were pretreated with ipilimumab (an anti-CTLA4 monoclonal antibody) and treated with pembrolizumab (an anti-PD-1 monoclonal antibody) in a clinical trial were analyzed for serum hGDF-15 levels. To examine whether hGDF-15 influences patient responses to immune checkpoint blockers, obtained serum hGDF-15 levels were then correlated with patient responses to treatment. Serum was collected from patients before initiation of pembrolizumab treatment.

Исследование и последующий анализ проводили следующим образом.The study and subsequent analysis were carried out as follows.

Критерии включения в клиническое исследование: Приемлемые пациенты были в возрасте 18 лет и старше и имели гистологически или цитологически подтвержденную неоперабельную меланому стадии III или IV, не поддающуюся местной терапии; подтвержденное прогрессирование заболевания в пределах 24 недель с последней дозы ипилимумаба (минимум две дозы, 3 мг/кг раз в 3 недели); предшествующая терапия ингибитором BRAF или МЕК или обоими (если положительный по мутации BRAFV600); разрешение или улучшение побочных явлений, связанных с ипилимумабом до степени 0-1 и доза преднизона 10 мг/сутки или меньше в течение, по меньшей мере, 2 недель до первой дозы исследуемого лекарственного средства; общее состояние по шкале Восточной объединенной группы онкологов (ECOG) 0 или 1; измеряемое заболевание по Критериям оценки ответа при солидных опухолях, версия 1.1 (RECIST v1.1); и значения в пределах заданного диапазона для абсолютного числа нейтрофилов (>1500 клеток на мл), тромбоцитов (>100000 клеток на мл), гемоглобина (>90 г/л), сывороточного креатинина (<1-5 верхней границы нормы [ULN]), общий билирубин сыворотки (<1-5 ULN или прямой билирубин<ULN для пациентов с общей концентрацией билирубина >1-5 ULN), аспартат и аланин аминотрансферазы (<2-5 ULN или <5 ULN для пациентов метастазами в печени), международное нормализованное соотношение или протромбиновое время (<1-5 ULN без использования антикоагулянтов), и активированное частичное тромбопластиновое время (<1-5 ULN без использования антикоагулянтов). У пациентов был отмывочный период, по меньшей мере, 4 недели между последней дозой самой последней терапии и первой дозой пембролизумаба. Пациенты с известными метастазами головного мозга или карциноматозным менингитом в стадии обострения, аутоиммунным заболеванием в стадии обострения, инфекцией в стадии обострения, требующей системной терапии, инфекцией ВИЧ в анамнезе, инфекцией вируса гепатита В или вируса гепатита С в стадии обострения, с побочными эффектами степени 4, связанными с ипилимумабом, или побочными эффектами степени 3, связанными с ипилимумабом в анамнезе, длящимися дольше 12 недель, или предшествующим лечением любой другой терапией против PD-1 или против PD-L1 были исключены из исследования.Inclusion criteria for the clinical trial: Eligible patients were 18 years of age or older and had histologically or cytologically confirmed stage III or IV unresectable melanoma not amenable to local therapy; confirmed disease progression within 24 weeks of the last dose of ipilimumab (minimum two doses, 3 mg/kg every 3 weeks); previous therapy with a BRAF or MEK inhibitor or both (if BRAFV600 mutation positive); resolution or improvement of ipilimumab-related adverse events to grade 0-1 and a prednisone dose of 10 mg/day or less for at least 2 weeks before the first dose of study drug; Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) performance status 0 or 1; disease measurable by Response Evaluation Criteria in Solid Tumors version 1.1 (RECIST v1.1); and values within the specified range for absolute neutrophil count (>1500 cells per mL), platelet count (>100,000 cells per mL), hemoglobin (>90 g/L), serum creatinine (<1-5 upper limit of normal [ULN]) , serum total bilirubin (<1-5 ULN or direct bilirubin<ULN for patients with total bilirubin concentration >1-5 ULN), aspartate and alanine aminotransferase (<2-5 ULN or <5 ULN for patients with liver metastases), international normalized ratio or prothrombin time (<1-5 ULN without the use of anticoagulants), and activated partial thromboplastin time (<1-5 ULN without the use of anticoagulants). Patients had a washout period of at least 4 weeks between the last dose of the most recent therapy and the first dose of pembrolizumab. Patients with known brain metastases or carcinomatous meningitis in the acute stage, autoimmune disease in the acute stage, infection in the acute stage requiring systemic therapy, history of HIV infection, hepatitis B virus or hepatitis C virus infection in the acute stage, with grade 4 adverse effects ipilimumab-related, or grade 3 adverse events associated with a history of ipilimumab lasting longer than 12 weeks, or previous treatment with any other anti-PD-1 or anti-PD-L1 therapy were excluded from the study.

Лечение пациентов.Treatment of patients.

- 28 044887- 28 044887

Пациенты-люди с меланомой, которые удовлетворяли критериям включения, определенным выше (с двумя исключениями) уже получали лечение ипилимумабом (моноклональным антителом к CTLA4) и не показали полного ответа на лечение. Пембролизумаб (моноклональное антитело к PD-1) давали или по 2 мг/кг массы тела или по 10 мг/кг массы тела. Поскольку не наблюдали никаких дозозависимых эффектов между двумя группами лечения, пациентов, получавших лечение, оценивали совместно.Human patients with melanoma who met the inclusion criteria defined above (with two exceptions) had already been treated with ipilimumab (an anti-CTLA4 monoclonal antibody) and had not shown a complete response to treatment. Pembrolizumab (an anti-PD-1 monoclonal antibody) was given at either 2 mg/kg body weight or 10 mg/kg body weight. Because no dose-related effects were observed between the two treatment groups, patients treated were evaluated together.

Критерии ответа.Response criteria.

Отвечающие и не отвечающие на лечение, а также текущие ответы классифицировали при помощи Критериев оценки ответа при солидных опухолях, версия 1.1 (RECIST v1.1) (Eisenhauer et al. : New response evaluation criteria in solid tumours: revised RECIST guideline (version 1.1). In: Eur. J. Cancer. 45, No. 2, January 2009, pp 228-47).Responders, non-responders and ongoing responses were classified using the Response Evaluation Criteria in Solid Tumors, version 1.1 (RECIST v1.1) (Eisenhauer et al.: New response evaluation criteria in solid tumors: revised RECIST guideline (version 1.1) In: Eur. J. Cancer. 45, No. 2, January 2009, pp. 228-47).

Анализ сывороточных уровней hGDF-15 путем твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).Analysis of serum hGDF-15 levels by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Сывороточные уровни человеческого GDF-15 измеряли путем твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).Serum levels of human GDF-15 were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Буферы и реагенты.Buffers and reagents.

Забуференный блокирующий раствор: 1% BSA (фракция V рН 7,0, РАА) в PBS.Buffered blocking solution: 1% BSA (Fraction V pH 7.0, PAA) in PBS.

Отмывающий раствор: PBS-Tween (0,05%).Washing solution: PBS-Tween (0.05%).

Стандарт: человеческий GDF-15 (стоковая концентрация 120 мкг/мл, от R&D Systems).Standard: human GDF-15 (stock concentration 120 µg/ml, from R&D Systems).

Захватывающее антитело: MAb к человеческому GDF-15 (клон 147627) от R&D Systems, мышиный IgG2B (каталожный #МАВ957, от R&D Systems, стоковая концентрация 360 мкг/мл).Capture antibody: MAb to human GDF-15 (clone 147627) from R&D Systems, mouse IgG2B (catalog #MAB957, from R&D Systems, stock concentration 360 μg/ml).

Детектирующее антитело: биотинилированное, аффинно очищенное Pab к человеческому GDF-15, козий IgG (каталожный #BAF940, от R&D Systems, стоковая концентрация 9 мкл/мл).Detection antibody: biotinylated, affinity purified Pab to human GDF-15, goat IgG (catalog #BAF940, from R&D Systems, stock concentration 9 µl/ml).

Стрептавидин-HRP (каталожный #DY998, из R&D Systems).Streptavidin-HRP (catalog #DY998, from R&D Systems).

Раствор субстрата: 10 мл 0,1 М NaOAc рН6,0+100 мкл ТМВ+2 мкл Н2О2Substrate solution: 10 ml 0.1 M NaOAc pH 6.0 + 100 µl TMB + 2 µl H2O2

Останавливающий раствор: 1 М H2SO4.Stopping solution: 1 M H2SO4.

Процедура анализа.Analysis procedure.

1. Получение планшета.1. Receiving a tablet.

a. Захватывающее антитело разбавляли до рабочей концентрации 2 мкг/мл в PBS. 96-луночный микропланшет (Nunc maxisorp®) сразу же покрывали разведенным захватывающим антителом по 50 мкл на лунку, за исключением внешних рядов (А и Н). Ряды А и Н заполняли буфером, чтобы избежать испарения образцов во время эксперимента. По планшету легонько постукивали, чтобы убедиться, что дно каждой лунки полностью покрыто. Планшет помещали во влажную камеру и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре (RT).a. Capture antibody was diluted to a working concentration of 2 μg/ml in PBS. A 96-well microplate (Nunc maxisorp®) was immediately coated with diluted capture antibody at 50 μl per well, except for the outer rows (A and H). Rows A and H were filled with buffer to avoid evaporation of the samples during the experiment. The plate was gently tapped to ensure that the bottom of each well was completely covered. The plate was placed in a humid chamber and incubated overnight at room temperature (RT).

b. Отбирали содержимое каждой лунки и промывали ее три раза PBS-Tween (0,05%).b. The contents of each well were collected and washed three times with PBS-Tween (0.05%).

c. Добавляли к каждой лунке 150 мкл блокирующего раствора, с последующей инкубацией при RT в течение 1 ч.c. 150 μL of blocking solution was added to each well, followed by incubation at RT for 1 h.

d. Отбирали содержимое каждой лунки и промывали ее три раза PBS-Tween (0,05%).d. The contents of each well were collected and washed three times with PBS-Tween (0.05%).

2. Процедура анализа.2. Analysis procedure.

a. Готовили стандарты. GDF-15 разбавляли в забуференном блокирующем растворе до конечной концентрации 1 нг/мл (4,17 мкл GDF+496 мкл забуференного блокирующего раствора). Готовили серийные разведения 1:2.a. Prepared standards. GDF-15 was diluted in buffered blocking solution to a final concentration of 1 ng/ml (4.17 μl GDF + 496 μl buffered blocking solution). Serial dilutions 1:2 were prepared.

b. Получали дублирующие образцы 1:20 (6 мкл+114 мкл забуференного блокирующего раствора).b. Duplicate samples were prepared 1:20 (6 μl + 114 μl buffered blocking solution).

c. Добавляли на лунку 50 мкл разведенных образцов или стандартов, с последующей инкубацией при RT в течение 1 ч.c. 50 μl of diluted samples or standards were added per well, followed by incubation at RT for 1 h.

1 1 2 2 з h 4 4 5 5 h h 1 1 з h g g 10 10 11 eleven 12 12 А A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 В IN si si s2 s2 s12 s12 С WITH $1 $1 s2 s2 s12 s12 D D s13 s13 s14 s14 s24 s24 Е E s13 s13 s14 s14 s24 s24 F G F G Серийные разведения стандартов Serial dilutions of standards Н N И AND « " « " θ θ « " « " 0 0 θ θ 0 0 « " θ θ « "

a. Отбирали содержимое каждой лунки и промывали ее три раза PBS-Tween (0,05%).a. The contents of each well were collected and washed three times with PBS-Tween (0.05%).

b. Детектирующее антитело разбавляли до конечной концентрации 50 нг/мл (56 мкл+10 мл блокирующего буфера). 50 мкл разведенного детектирующего антитела добавляли к каждой лунке, с последующей инкубацией при RT в течение 1 ч.b. The detection antibody was diluted to a final concentration of 50 ng/ml (56 μl + 10 ml blocking buffer). 50 μl of diluted detection antibody was added to each well, followed by incubation at RT for 1 h.

c. Отбирали содержимое каждой лунки и промывали ее три раза PBS-Tween (0,05%).c. The contents of each well were collected and washed three times with PBS-Tween (0.05%).

d. Стрептавидин-HRP разбавляли 1:200 (50 мкл+10 мл блокирующего буфера). 50 мкл рабочего расd. Streptavidin-HRP was diluted 1:200 (50 μl + 10 ml blocking buffer). 50 µl of working solution

- 29 044887 твора Стрептавидин-HRP добавляли к каждой лунке, с последующей инкубацией при RT в течение 20 мин.- 29 044887 Streptavidin-HRP solution was added to each well, followed by incubation at RT for 20 minutes.

e. Отбирали содержимое каждой лунки и промывали ее три раза PBS-Tween (0,05%).e. The contents of each well were collected and washed three times with PBS-Tween (0.05%).

f. Получали раствор субстрата. 50 мкл раствора субстрата добавляли к каждой лунке, с последующей инкубацией при RT в течение 20 мин.f. A substrate solution was obtained. 50 μl of substrate solution was added to each well, followed by incubation at RT for 20 min.

g. К каждой лунке добавляли 50 мкл останавливающего раствора.g. 50 μl of stopping solution was added to each well.

h. Сразу же определяли оптическую плотность каждой лунки с использованием микроспектрофотометра для чтения планшетов, установленного на 450 нм.h. The absorbance of each well was immediately determined using a microplate reader set at 450 nm.

3. Расчет титра GDF-15 в сыворотке.3. Calculation of GDF-15 titer in serum.

a. Каждый образец/разведение стандарта GDF-15 наносили в двух повторениях. Для определения титра GDF-15, рассчитывали среднее двух повторов и вычитали фон (образец без GDF-15).a. Each sample/dilution of GDF-15 standard was applied in duplicate. To determine the GDF-15 titer, the average of two replicates was calculated and the background (sample without GDF-15) was subtracted.

b. Для получения стандартной кривой значения из линейного диапазона наносили на диаграмму XY (ось X: концентрация GDF-15, ось Y: OD450), и делали подгонку линейной кривой. Титр GDF-15 в сыворотке тестируемых образцов рассчитывали путем интерполяции значений OD450 стандартных разведений с известной концентрацией.b. To obtain a standard curve, values from the linear range were plotted on an XY plot (X-axis: GDF-15 concentration, Y-axis: OD450) and a linear curve fit was performed. The titer of GDF-15 in the serum of test samples was calculated by interpolating the OD450 values of standard dilutions of known concentration.

с. Для расчета конечной концентрации GDF-15 в образцах учитывали определенный коэффициент разведения. Образцы, показывающие значения OD ниже или выше стандартного диапазона анализировали заново при соответствующих разведениях.With. To calculate the final concentration of GDF-15 in the samples, a certain dilution factor was taken into account. Samples showing OD values below or above the standard range were reassayed at appropriate dilutions.

Сравнение сывороточных уровней hGDF-15 с данными пациентов.:Comparison of serum hGDF-15 levels with patient data:

Затем, измеренные сывороточные уровни hGDF-15 сравнивали с данными ответов пациентов на лечение, полученными в исследовании.Next, measured serum levels of hGDF-15 were compared with patient response data obtained in the study.

На фиг. 1 представлены сывороточные уровни GDF-15 для отвечающих и не-отвечающих на схему лечения. Как можно видеть на фигуре, большинство из неотвечающих имеют более высокие сывороточные уровни GDF-15, чем все отвечающие.In fig. Figure 1 shows serum GDF-15 levels for responders and non-responders to the treatment regimen. As can be seen in the figure, most of the non-responders have higher serum GDF-15 levels than all of the responders.

Этот результат также отражен на фиг. 2, которая показывает число отвечающих и не-отвечающих среди пациентов с сывороточными уровнми hGDF-15 <1,8 нг/мл, 1,8-4,2 нг/мл, и >4,2 нг/мл, соответственно.This result is also shown in FIG. 2, which shows the number of responders and non-responders among patients with serum hGDF-15 levels <1.8 ng/ml, 1.8-4.2 ng/ml, and >4.2 ng/ml, respectively.

Эти данные свидетельствуют о том, что высоки уровни GDF-15 связыаны с плохим ответом на лечение. Поэтому, эти данные тестировали по статистической значимости:These data suggest that high levels of GDF-15 are associated with poor response to treatment. Therefore, these data were tested for statistical significance:

Статистическая корреляция сывороточных уровней hGDF-15 с данными пациентов.Statistical correlation of serum hGDF-15 levels with patient data.

Данные.Data.

Анализ данных проводили на основании файла с данными, содержащего данные из образцов для 35 пациентов, включающие колонки (переменные) обозначение образца, GDF-15 (нг/мл), отвечающие/не отвечающие, суток (до смерти или цензурирования), и продолжение (индексная переменная для текущей жизни). Классификация этих данных на отвечающих/не отвечающих проводили в одной временной точке через четыре месяца после начала лечения пембролизумабом. Поскольку некоторые образцы сыворотки были получены только незадолго перед анализом, ответ можно было оценить только у 29 пациентов. Один частично ответивший (>30% уменьшения размера опухоли) рассматривался как ответивший. Для определения ЛДГ, 4 образцы были исключены из-за гемолиза. Выходные параметры (конечные точки):Data analysis was based on a data file containing data from samples for 35 patients, including columns (variables) sample designation, GDF-15 (ng/ml), responder/non-responder, days (until death or censoring), and continuation ( index variable for current life). Classification of these data into responder/non-responder was performed at a single time point, four months after initiation of pembrolizumab treatment. Because some serum samples were obtained only shortly before analysis, response could only be assessed in 29 patients. One partial responder (>30% reduction in tumor size) was considered a responder. For LDH determination, 4 samples were excluded due to hemolysis. Output parameters (endpoints):

a. Общая выживаемость (время до смерти). Эта конечная точка состояла из индикатора события смерти (1=умер/0=жив), который получали из файла с данными, и времени до смерти или цензурирования (последняя точка времени, когда было известно, что пациент жив), соответствующего переменной сутки.a. Overall survival (time to death). This end point consisted of a death event indicator (1=died/0=alive), which was obtained from the data file, and time to death or censoring (the last time point at which the patient was known to be alive) corresponding to the day variable.

b. Ответ на лечение, например, отвечал ли пациент на лечение или нет (кодировали как 1=отвечал, 0=не отвечал). Частично отвечающие рассматривались как отвечающие.b. Treatment response, such as whether the patient responded to treatment or not (coded as 1=responded, 0=did not respond). Partial respondents were considered as responsive.

- 30 044887- 30 044887

Обозначен ие образца Sample designation GDF-15 (нг/мл) GDF-15 (ng/ml) ЛДГ[Е д/л] LDH[E d/l] Отвечающие (R) /не отвечающие (NR) Responders (R)/not responders (NR) Суток с начала лечения против PD-1 Days from initiation of anti-PD-1 treatment Предшеств ующее лечение ипилимума б ом Previous treatment of ipilimum b om Продол жающий ся ответ Continued answer HG12.950 HG12.950 2,010 2,010 398 398 NR NR 72 72 X X HG13.1002 HG13.1002 0,479 0.479 340 340 R R 538 538 X X HG13.1012 HG13.1012 12,010 12,010 3734 3734 NR NR 71 71 X X HG13.1067 HG13.1067 9, 173 9, 173 591 591 NR NR 83 83 X X HG13.1069 HG13.1069 4, 635 4,635 2419 2419 NR NR 53 53 X X HG13.1099 HG13.1099 1,285 1.285 370 370 R R 693 693 X X X X HG13.1202 HG13.1202 1, 641 1,641 480 480 R R 575 575 X X HG13.1341 HG13.1341 4,595 4,595 1930 1930 NR NR 15 15 X X HG13.1377 HG13.1377 0,539 0.539 388 388 R R 269 269 X X HG13.1419 HG13.1419 0, 914 0.914 317 317 R R 617 617 X X HG13.1432 HG13.1432 1, 195 1, 195 269 269 R R 611 611 X X X X HG13.1458 HG13.1458 0,433 0.433 453 453 R R 605 605 X X X X HG13.1557 HG13.1557 4,045 4.045 564 564 R R 293 293 X X HG13.1587 HG13.1587 0,345 0.345 371 371 R R 186 186 X X HG13.1663 HG13.1663 1,320 1,320 гемо л из hemo l from R R 176 176 X X HG13.516 HG13.516 0, 641 0.641 342 342 R R 264 264 X X HG13.578 HG13.578 2,841 2,841 1143 1143 R R 266 266 X X HG13.596 HG13.596 1,085 1.085 гемо л из hemo l from R R 772 772 X X X X HG13.757 HG13.757 3,310 3,310 гемо л из hemo l from NR NR 117 117 X X HG13.811 HG13.811 4,029 4,029 763 763 R R 596 596 X X X X HG14.1080 HG14.1080 5, 979 5,979 1359 1359 NR NR 43 43 X X HG14.1108 HG14.1108 0, 979 0.979 555 555 R R 206 206 X X X X HG14.1147 HG14.1147 2,084 2,084 227 227 R R 154 154 X X X X HG14.1159 HG14.1159 2,150 2,150 333 333 R R 227 227 X X X X HG14.161 HG14.161 0, 889 0.889 343 343 108 108 X X X X HG14.557 HG14.557 2,014 2,014 368 368 R R 317 317 X X X X HG14.707 HG14.707 2,783 2,783 442 442 NR NR 71 71 X X HG14.853 HG14.853 0, 846 0.846 343 343 NR NR 71 71 X X HG14.885 HG14.885 0, 874 0.874 гемо л из hemo l from PR PR 63 63 X X HG15.299 HG15.299 0,412 0.412 354 354 86 86 X X X X HG15.47 HG15.47 1,465 1.465 475 475 80 80 X X X X HG15.49 HG15.49 3, 912 3,912 631 631 93 93 X X X X HG15.546 HG15.546 0,358 0.358 гемо л из hemo l from 23 23 X X X X HG15.560 HG15.560 2,389 2,389 768 768 21 21 X X X X HG15.59 HG15.59 8,122 8.122 588 588 NR NR 23 23 X X

Анализ данных.Data analysis.

- 31 044887- 31 044887

Общую выживаемость анализировали путем моделей выживаемости Кокса с пропорциональными рисками. Одна модель была снабжена GDF-15 (нг/мл) в качестве непрерывного предиктора, и другая модель была с группирующей переменной на основании GDF-15 в качестве категориального предиктора (группы были: <1,8 нг/мл, 1,8-4,2 нг/мл, >4,2 нг/мл GDF-15). Всего данные о выживании были доступны у 35 пациентов.Overall survival was analyzed by Cox proportional hazards survival models. One model was fitted with GDF-15 (ng/ml) as a continuous predictor, and the other model was with a grouping variable based on GDF-15 as a categorical predictor (groups were: <1.8 ng/ml, 1.8-4 .2 ng/ml, >4.2 ng/ml GDF-15). A total of 35 patients had survival data available.

Ответ на лечение (бинарная переменная) анализировали при помощи обобщенных линейных моделей (GLM) с биномиальным распределением ошибки и функцией логит-связи (логистическая регрессия). Для ответов на лечение по оценке критериев RECIST1.1 через 4 месяца модель была снабжена GDF-15 (нг/мл) в качестве непрерывного предиктора. Посколько никто из пациентов в группе с GDF-15 >4,2 нг/мл не ответил на лечение, оценка отношения шансов для этой группы по сравнению с группой с GDF15 <1,8 нг/мл была бы очень большой, с очень широким доверительным интервалом. Вместо использования другой модели с группирующей переменной на основании GDF-15 в качестве категориального предиктора, для сравнения групп применяли тест хи-квадрат (χ ) (проверка равенства доли отвечающих). Поскольку число отвечающих / неотвечающих было иногда довольно маленьким (<5), кроме этого проводили анализ чувствительности при помощи точного теста Фишера. Пациентов, которые получали только терапию против PD-1 в течение последних 4 месяцев, еще нельзя было классифицировать как отвечающих или не-отвечающих. Таким образом, только у 29 пациентов можно было оценить ответ на терапию.Treatment response (binary variable) was analyzed using generalized linear models (GLM) with a binomial error distribution and a logit link function (logistic regression). For treatment responses as assessed by RECIST1.1 criteria at 4 months, the model was fitted with GDF-15 (ng/mL) as a continuous predictor. Since none of the patients in the group with GDF-15 >4.2 ng/mL responded to treatment, the estimated odds ratio for this group compared with the group with GDF15 <1.8 ng/mL would be very large, with a very wide confidence level interval. Instead of using another model with a grouping variable based on the GDF-15 as a categorical predictor, the chi-square (χ ) test (test for equality of response rate) was used to compare groups. Since the number of responders/non-responders was sometimes quite small (<5), sensitivity analysis was also performed using Fisher's exact test. Patients who received only anti-PD-1 therapy in the past 4 months could not yet be classified as responders or non-responders. Thus, only 29 patients could be assessed for response to therapy.

Анализ данных проводили с использованием статистического программного обеспечения R (R Core Team, 2014, версия 3.1.0).Data analysis was performed using R statistical software (R Core Team, 2014, version 3.1.0).

Результаты.Results.

Табл. 1-2 показывают результаты моделей с GDF-15 в качестве непрерывного предиктора. Риск смерти был значимо повышен для более высоких концентраций GDF-15 (HR >1, табл. 1) в то время как вероятность ответа на лечение значительно снижена, на что указывает отношение шансов (OR) (OR <1, табл. 2). На фиг. 3 представлены соответствующие данные по отвечающим/не-отвечающим, а также вероятность ответа на лечение, предсказанная при помощи модели.Table Figures 1-2 show the results of models with GDF-15 as a continuous predictor. The risk of death was significantly increased for higher concentrations of GDF-15 (HR >1, Table 1), while the likelihood of response to treatment was significantly reduced, as indicated by the odds ratio (OR) (OR <1, Table 2). In fig. Figure 3 presents the corresponding data for responders/non-responders, as well as the probability of response to treatment predicted by the model.

Табл. 3 показывает результат по модели пропорциональных рисков Кокса с группой на основании GDF-15 в качестве категориального предиктора. Группа с GDF-15 <1,8 нг/мл используют в качестве референсной группы (не показана в таблице). Два отношения рисков в таблице 3 представляют сравнение группы с GDF-15 между 1,8 и 4,2 и группы с GDF-15 >4,2 с референсной группой. Риск смерти повышен в обеих этих группах (по сравнению с референсной группой), но в большей степени в группе с GDF-15 >4,2. На фиг. 4 представлены кривые Каплана-Мейера для выживаемости в трех группах.Table Figure 3 shows the result from the Cox proportional hazards model with group based on GDF-15 as the categorical predictor. The group with GDF-15 <1.8 ng/ml is used as a reference group (not shown in the table). The two hazard ratios in Table 3 compare the group with GDF-15 between 1.8 and 4.2 and the group with GDF-15 >4.2 with the reference group. The risk of death was increased in both of these groups (compared to the reference group), but to a greater extent in the group with GDF-15 >4.2. In fig. Figure 4 shows Kaplan-Meier curves for survival in the three groups.

Доля отвечающих значимо различалась между группами (отвечающий 1: X2_df=₂=16, 04, Р=0,0003). Этот результат был подтвержден результатами точного теста Фишера (Р=0,0003). Число смертей и отвечающих на группу приведено в табл. 4. Кроме того, табл. 5 показывает некоторую описательную статистику GDF-15 для каждой группы.The proportion of respondents differed significantly between groups (responder 1: X2 _df = ₂ =16.04, P = 0.0003). This result was confirmed by the results of Fisher's exact test (P=0.0003). The number of deaths and responders per group is given in Table. 4. In addition, table. Figure 5 shows some descriptive statistics of the GDF-15 for each group.

Таблица 1 ____ _{95{/ С1} GDF-15 1.27 [1.10.1.47 3.27 0.00109Table 1 ____ _{95{/ C1} GDF-15 1.27 [1.10.1.47 3.27 0.00109

Табл. 1 показывает оценки отношения рисков (HR) из модели пропорциональных рисков Кокса с общей выживаемостью (время до смерти) в качестве выходного параметра и GDF-15 в качестве непрерывного предиктора. Анализ включал образцы от 35 пациентов.Table Figure 1 shows hazard ratio (HR) estimates from the Cox proportional hazards model with overall survival (time to death) as the output parameter and GDF-15 as a continuous predictor. The analysis included samples from 35 patients.

Таблица 2table 2

Оценка(ОН) Ш (Ί / р Ί.ΉΟΤ^- 25.2SI -1.219.361.950] 2.94 0.111)321Score(ON) Ш (Ί / р Ί.ΉΟΤ ^- 25.2SI -1.219.361.950] 2.94 0.111)321

GDF-15 (I.3S9 ' 11.159,0.698] -2.51 0.ЩГ20GDF-15 (I.3S9 ' 11.159,0.698] -2.51 0.ShG20

Табл. 2 показывает оценки отношения шансов (OR) из обобщенных линейных моделей с ответом на лечение (ответивший 1) в качестве выходного параметра и GDF-15 в качестве непрерывного предиктора. Анализ включал образцы от 29 пациентов.Table Figure 2 shows odds ratio (OR) estimates from generalized linear models with treatment response (responder 1) as the output parameter and GDF-15 as a continuous predictor. The analysis included samples from 29 patients.

Таблица 3Table 3

HR HR 95У CI 95U CI z z P P GDF^15_Wynn^l.8.4.2jGDF^15 _Wynn ^l.8.4.2j 1.54 1.54 [0.48.4.92] [0.48.4.92] 0.73 0.73 0.46(3 0.46(3 GDF^15^^4.2.13]^J GDF^15^^4.2.13] ^J 21.52 21.52 [5.20.89.06] [5.20.89.06] 4.24 4.24 <0.001 <0.001

Табл. 3 показывает оценки отношения рисков (HR) из модели пропорциональных рисков Кокса (время до смерти) в качестве выходного параметра и группы на основании GDF-15 в качестве непрерывного предиктора. Анализ включал образцы от 35 пациентов.Table Figure 3 shows hazard ratio (HR) estimates from the Cox proportional hazards model (time to death) as the output parameter and GDF-15 group as a continuous predictor. The analysis included samples from 35 patients.

- 32 044887- 32 044887

Таблица 4Table 4

Уровни Levels ^п[0Д.8] ⁿ [0D.8] ^П(1ЛЛ.21 ^P (1LL.21 Τ1Λ1.2] Τ1Λ1.2] ^П(4.2.1Д ^P (4.2.1D ^{4.2.13 ^{4.2.13 йвее Yvee 'ill 'ill 0 0 11 eleven 61.1 61.1 6 6 64.0 64.0 0 0 0.0 0.0 н n 48.6 48.6 1 1 7 7 38.9 38.9 5 5 45.5 45.5 6 6 100.0 100.0 18 18 51.4 51.4 18 18 100.0 100.0 11 eleven 100.0 100.0 6 6 100.0 100.0 35 35 100.0 100.0 отвечал#! answered #! 0 0 1 1 7.1 7.1 3 3 33.3 33.3 6 6 100.0 100.0 10 10 34.5 34.5 1 1 13 13 92.9 92.9 6 6 66.7 66.7 0 0 0.0 0.0 19 19 65.5 65.5 14 14 юо.о..... yuo.o..... ............. 9 ............. 9 ..............100.0 ...............100.0 ........... 6 .......... 6 100.0 100.0 ........29 .......29 100.0 100.0

Табл. 4 показывает число смертей и отвечающих (отвечающий1) в трех группах, определенных по GDF-15 (<1,8, 1,8-4,2, >4,2 нг/мл).Table 4 shows the number of deaths and responders (responder1) in the three groups defined by GDF-15 (<1.8, 1.8-4.2, >4.2 ng/ml).

Таблица 5Table 5

Переменная Variable Уровни Levels 11 eleven X X X X S S Min Min Max Max GDF-15 GDF-15 [0,1.8] [0,1.8] 18 18 0.9 0.9 0.9 0.9 0.4 0.4 0.3 0.3 1.6 1.6 (1-8,4.2] (1-8,4.2] 11 eleven 2.8 2.8 2.9 2.9 0.8 0.8 2.0 2.0 4.0 4.0 (4-2,13] (4-2.13] 6 6 7.1 7.1 7.4 7.4 2.9 2.9 4.6 4.6 12.0 12.0 see see 35 35 1.6 1.6 2.6 2.6 2.7 2.7 0.3 0.3 12.0 12.0

Табл. 5: непрерывная предикторная переменная GDF-15 (нг/мл) в трех группах, определенных по GDF-15 (<1,8, 1,8-4,2, >4,2 нг/мл). Показаны число пациентов (n), медиана (X), среднее (X), стандартное отклонение (s), минимум (Min) и максимум (Мах).Table 5: continuous predictor variable GDF-15 (ng/ml) in three groups defined by GDF-15 (<1.8, 1.8-4.2, >4.2 ng/ml). Number of patients (n), median (X), mean (X), standard deviation (s), minimum (Min) and maximum (Max) are shown.

Далее, для того чтобы сравнить статистические результаты, полученные для уровней GDF-15, также проводили статистический анализ для уровней известного прогностического фактора лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в сыворотке пациентов.Next, in order to compare the statistical results obtained for GDF-15 levels, statistical analysis was also performed for the levels of the known prognostic factor lactate dehydrogenase (LDH) in the patients' serum.

Лактатдегидрогеназа считается прогностически значимым маркером для солидных опухолей. Это было недавно подтверждено комплексным метаанализом, основанным на большой совокупности клинических исследований (31857 пациентов). Постоянное влияние повышенной ЛДГ на общую выживаемость (HR=1,48, 95% ДИ=от 1,43 до 1,53) был обнаружено во всех подгруппах и стадиях заболевания. Кроме того, наблюдалась тенденция к более сильной прогностической ценности ЛДГ при метастатическом заболевании по сравнению с неметастатическим заболеванием, которое, как полагали, отражает большую опухолевую нагрузку. Хотя точный механизм остается неизвестным и может также быть связан с гипоксией и метаболическим перепрограммированием через эффект Варбурга, ЛДГ можно интерпретировать как отражение высокой опухолевой нагрузки или агрессивности опухоли (Zhang, J., Yao, Y.-H., Li, B.-G., Yang, Q., Zhang, P.-Y., and Wang, H.-T. (2015). Prognostic value of pretreatment serum lactate dehydrogenase level in patients with solid tumors: a systematic review and meta-analysis. Scientific Reports 5, 9800). Поскольку сывороточные уровни ЛДГ были включены в хему определения стадии меланомы, этот показатель обычно измеряется во время клинической диагностики в экспертной лаборатории универси тета.Lactate dehydrogenase is considered a prognostic marker for solid tumors. This was recently confirmed by a comprehensive meta-analysis based on a large population of clinical trials (31,857 patients). A consistent effect of elevated LDH on overall survival (HR=1.48, 95% CI=1.43 to 1.53) was found across all disease subgroups and stages. In addition, there was a trend towards a stronger prognostic value of LDH in metastatic disease compared with non-metastatic disease, which was thought to reflect a higher tumor burden. Although the exact mechanism remains unknown and may also be related to hypoxia and metabolic reprogramming through the Warburg effect, LDH can be interpreted as reflecting high tumor burden or tumor aggressiveness (Zhang, J., Yao, Y.-H., Li, B.-G. ., Yang, Q., Zhang, P.-Y., and Wang, H.-T. (2015). Prognostic value of pretreatment serum lactate dehydrogenase level in patients with solid tumors: a systematic review and meta-analysis. Scientific Reports 5, 9800). Since serum LDH levels have been included in the melanoma staging scheme, this indicator is usually measured during clinical diagnosis in an expert university laboratory.

Таблица 6Table 6

GDF-15 (нг/мл) GDF-15 (ng/ml) LDH (Ед/л) LDH (U/l) Отвечающие (п=19) Responders (n=19) Не отвечающие (п=10) Not responders (n=10) Отвечающие (п=9) Responders (n=9) Не отвечающие (п=16) Not responding (n=16) Медиана Median 1,2 1.2 4, 6 4, 6 371 371 591 591 Среднее Average 1,7 1.7 5, 6 5, 6 455 455 1312 1312 Стандартное отклонение Standard deviation 1,2 1.2 3, 6 3, 6 218 218 1108 1108 t-тест(2сторонний, тип 3) t-test(2-tailed, type 3) 0, 012 0.012 0, 061 0.061

Табл. 6: GDF-15 и ЛДГ у отвечающих по сравнению с не отвечающими.Table 6: GDF-15 and LDH in responders versus non-responders.

Определение ЛДГ было невозможно в четырех образцах крови из-за гемолиза.LDH determination was not possible in four blood samples due to hemolysis.

Табл. 7 является аналогом табл. 2, за исключением того, что в качестве непрерывного предиктора ответа на лечение (ответивший1) применяли ЛДГ вместо GDF-15. Вероятность ответа на лечение минимально значимо снизилась с повышением уровней ЛДГ (OR <1, р <0,1). На фиг. 5 представлены соответствующие данные на отвечающих/не отвечающих, а также вероятность ответа на лечение, предсказаннаяTable 7 is analogous to table. 2, except that LDH was used instead of GDF-15 as a continuous predictor of treatment response (responder1). The odds of response to treatment decreased marginally significantly with increasing LDH levels (OR <1, p <0.1). In fig. Figure 5 presents the corresponding data on responders/non-responders, as well as the probability of response to treatment predicted

- 33 044887 по модели.- 33 044887 according to model.

Для того чтобы определить, является ли GDF-15 лучшим прогностическим фактором ответа на лечение (ответивший1), чем ЛДГ, были использованы две дополнительные модели: модель, включающая оба маркера в качестве предикторов (которая автоматически включала только пациентов с измерениями обоих маркеров), и модель с GDF-15 в качестве единственного предиктора, которая также использовала пациентов с измерениями ЛДГ. Затем для всех трех моделей рассчитывали информационный критерий Акаике (AIC) (табл. 8). Наименьший AIC указывает на более эффективную модель. Фактически, AIC модели с GDF-15 был меньше, чем AIC модели с ЛДГ в качестве предиктора. Модель с GDF-15 имеет даже меньший AIC, чем модель с обоими предикторами, что указывает на то, что ЛДГ как дополнительный предиктор не улучшает модель. Разумеется, модель с обоими предикторами не может хуже объяснять ответ на лечение, но как мера эффективности модели, AIC штрафует модели с предикторами, которые не улучшают модель значительно и отдает предпочтение более простым моделям. Альтернативное сравнение моделей проводилось путем анализа отклонения (аналогично анализу дисперсии, но для обобщенных линейных моделей), т.е. сравнение разницы в объясненных отклонениях, между более сложной моделью с обоими предикторами и обеими более простыми моделями только с одним из предикторов (соответствующее упрощенной модели либо с ЛДГ, либо с GDF-15). Удаление GDF-15 из более сложной модели привело к значимому уменьшению объясненного отклонения (Р =0,02), тогда как удаление LDH не привело (Р =0,41).To determine whether GDF-15 was a better predictor of treatment response (responder1) than LDH, two additional models were used: a model including both markers as predictors (which automatically included only patients with measurements of both markers), and model with GDF-15 as the only predictor, which also used patients with LDH measurements. The Akaike information criterion (AIC) was then calculated for all three models (Table 8). The smallest AIC indicates a more efficient model. In fact, the AIC of the model with GDF-15 was smaller than the AIC of the model with LDH as a predictor. The model with GDF-15 has an even smaller AIC than the model with both predictors, indicating that LDH as an additional predictor does not improve the model. Of course, a model with both predictors cannot do a worse job of explaining treatment response, but as a measure of model performance, AIC penalizes models with predictors that do not significantly improve the model and favors simpler models. An alternative comparison of models was carried out using analysis of variance (similar to analysis of variance, but for generalized linear models), i.e. comparison of the difference in explained variance between the more complex model with both predictors and both simpler models with only one of the predictors (corresponding to the simplified model with either LDH or GDF-15). Removing GDF-15 from the more complex model resulted in a significant reduction in explained variance (P = 0.02), whereas removing LDH did not (P = 0.41).

Таблица 7Table 7

Оценка (OR) Rating (OR) 95% CI 95% CI z z Р R (Постоянное слагаемое) (Constant term) 9.741 9.741 [2.055,89.308] [2.055,89.308] 2.44 2.44 0.0146 0.0146 ЛДГ LDH 0.997 0.997 [0.994,0.999] [0.994,0.999] -1.79 -1.79 0.0727 0.0727

Табл. 7: оценки отношения шансов (OR) из обобщенных линейных моделей с ответом на лечение (ответивший 1, как определено в файле А) в качестве выходного параметра и ЛДГ в качестве непрерывного предиктора. Анализ включал образцы от 25 пациентов.Table 7: Odds ratio (OR) estimates from generalized linear models with treatment response (responder 1, as defined in File A) as the output parameter and LDH as a continuous predictor. The analysis included samples from 25 patients.

Таблица 8 df AICTable 8 df AIC

Модель Model с ЛДГ и GDF-15 with LDH and GDF-15 3.00 3.00 25.10 25.10 Модель Model только с ЛДГ only with LDH 2.00 2.00 28.55 28.55 Модель Model только с GDF-15 only with GDF-15 2.00 2.00 23.77 23.77

Таблица 8: Сравнение моделей на основании информационного критерия Акаике (AIC), в котором более малые величины указывают на более эффективную модель, df: степени свободы. Все модели включали образцы от 25 пациентов.Table 8: Comparison of models based on Akaike Information Criterion (AIC), in which smaller values indicate a more efficient model, df: degrees of freedom. All models included samples from 25 patients.

Фиг. 5А показывает вероятность ответа на лечение (ответивший 1), как предсказано обобщенной линейной моделью с использованием ЛДГ в качестве непрерывного предиктора. Круги показывают данные, кривые показывают модель. Вертикальная линия указывает концентрацию ЛДГ, при которой вероятность ответа на лечение составляет 0,5. Когорта пациентов была идентичной. Однако не удалось надежно определить уровни ЛДГ у четырех пациенты из-за гемолиза. Фиг. 5В показывает графическое представление пациентов, отвечающих и не отвечающих на лечение, и их соответствующие уровние hGDF-15 и ЛДГ. Когда пороговые значения выбраны для того чтобы включать всех отвечающих, тестирование на основании GDF-15 позволило выявить 6 (из 9) не отвечающих на лечение, в то время как анализ на основе уровней ЛДГ может выявить только 4 (из 9) не отвечающих на лечение. Для тестирования ЛДГ, 4 гемолитических образца были исключены, что вызвало потерю данных.Fig. Figure 5A shows the probability of response to treatment (responder 1) as predicted by the generalized linear model using LDH as a continuous predictor. Circles show data, curves show model. The vertical line indicates the LDH concentration at which the probability of response to treatment is 0.5. The patient cohort was identical. However, LDH levels could not be reliably measured in four patients due to hemolysis. Fig. 5B shows a graphical representation of responders and non-responders and their corresponding hGDF-15 and LDH levels. When thresholds are selected to include all responders, testing based on GDF-15 identified 6 (of 9) non-responders, while testing based on LDH levels could identify only 4 (of 9) non-responders . For LDH testing, 4 hemolytic samples were excluded, causing data loss.

Подведение итогов.Summarizing.

В совокупности приведенные выше статистические результаты примера 1 показали, что вероятность ответа на лечение значимо снижается с увеличением уровней hGDF-15 в сыворотках пациентов. Например, отношение шансов 0,389, показанное в табл. 2, показывает, что если сывороточные уровни hGDF-15 увеличиваются на 1 нг/мл, вероятность ответа на лечение уменьшается до 0,389-кратного значения исходной величины, т.е. она уменьшается примерно на 60%. Если сывороточные уровни hGDF-15 увеличиваются на 2 нг/мл, вероятность ответа на лечение снижается до 0,389 х 0,389-кратное=0,151кратное значение исходной величины, т.е. она уменьшается примерно на 85%.Taken together, the statistical results of Example 1 above showed that the likelihood of response to treatment decreased significantly with increasing levels of hGDF-15 in patient sera. For example, the odds ratio of 0.389 shown in Table. 2 shows that if serum hGDF-15 levels increase by 1 ng/ml, the probability of response to treatment decreases to 0.389 times the baseline value, i.e. it decreases by about 60%. If serum hGDF-15 levels increase by 2 ng/ml, the probability of response to treatment decreases to 0.389 x 0.389 times = 0.151 times the baseline value, i.e. it is reduced by approximately 85%.

Результаты примера 1 позволяют предположить, что hGDF-15 отрицательно влияет на ответы пациентов на лечение с блокаторами контрольных точек иммунного ответа. Таким образом, по изобретению, ингибитор hGDF-15 будет полезен для ингибирования отрицательных эффектов hGDF-15 на ответы пациентов на лечение с блокаторами контрольных точек иммунного ответа, и для улучшения ответов пациенты на лечение с блокаторами контрольных точек иммунного ответа не только при меланоме, но и при всех солидных злокачественных опухолях, упоминаемых в настоящем документе.The results of Example 1 suggest that hGDF-15 negatively affects patient responses to immune checkpoint blocker treatment. Thus, according to the invention, an hGDF-15 inhibitor will be useful for inhibiting the negative effects of hGDF-15 on patient responses to immune checkpoint blocker treatment, and for improving patient responses to immune checkpoint blocker treatment, not only in melanoma, but and for all solid malignant tumors mentioned herein.

Пример 2. Уровни GDF-15 обратно коррелируют с CD8+ лимфоцитами, инфильтрирующими опу- 34 044887 холь (TIL), в метастазах из различных форм опухолей.Example 2 GDF-15 levels inversely correlate with CD8+ tumor infiltrating lymphocytes (TILs) in metastases from various tumor forms.

Для выявления механизма hGDF-15, который способствует отрицательному воздействию hGDF-15 на ответы пациентов, анализировали метастазы в головной мозг из разных солидных опухолей на экспрессию hGDF-15 и на наличие клеток иммунной системы.To identify the mechanism that contributes to the negative effects of hGDF-15 on patient responses, brain metastases from various solid tumors were analyzed for hGDF-15 expression and the presence of immune cells.

Образцы и обработка ткани.Fabric samples and processing.

Анализировали фиксированную формалином и погруженную в парафин (FFPE) ткань из архивных метастазов головного мозга, которую собирали и обрабатывали как матричные мультитканевые блоки (ТМА). Все образцы получали или из банка опухолей UCT (Университет Гете, Франкфурт-на-Майне, Германия, член Немецкого консорциума по раку (DKTK), Гейдельберг, Германия, и Немецкий исследовательский центр рака (DKFZ), Гейдельберг, Германия) или из ракового регистра банка опухолей Blutund Gewebebank zur Erforschung des malignen Melanoms (Отделение дерматоонкологии, Университетский госпиталь Тюбингена, Германия). Это исследование было одобрено двумя независимыми этическими комитетами (Этический комитет UCT Франкфурта/ Университет Гете, Франкфурт-на-Майне, Германия: номера проектов: GS 4/09; SNO_01-12; номер проекта в этическом комитете университета Тюбингена: 408/2013ВО2). Всего было исследовано 190 пациентов с метастазами в головной мозг, в том числе: меланома (n=98), NSCLC (n=33), карцинома молочной железы (n=18), RCC (n=10), SCLC (n=7), колоректальная карцинома (n=7), карциномы без дополнительных уточнений (карцинома NOS n=11) и образцы редких опухолей, обобщенные, как прочие (n=6). Собирали данные выживаемости у 155 пациентов (время выживания после удаления опухоли), дополнительно анализировали число метастазов в головной мозг у 169 пациентов и размер метастазов в головной мозг в субкогорте из 55 пациентов с меланомой.Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue from archival brain metastases was analyzed and collected and processed as matrix multitissue blocks (TMAs). All samples were obtained either from the UCT tumor bank (Goethe University, Frankfurt am Main, Germany, member of the German Cancer Consortium (DKTK), Heidelberg, Germany, and the German Cancer Research Center (DKFZ), Heidelberg, Germany) or from the cancer registry tumor bank Blutund Gewebebank zur Erforschung des malignen Melanoms (Department of Dermato-Oncology, University Hospital Tübingen, Germany). This study was approved by two independent ethics committees (Ethics Committee UCT Frankfurt/Goethe University, Frankfurt am Main, Germany: project numbers: GS 4/09; SNO_01-12; project number in the ethics committee of the University of Tübingen: 408/2013BO2). A total of 190 patients with brain metastases were studied, including: melanoma (n=98), NSCLC (n=33), breast carcinoma (n=18), RCC (n=10), SCLC (n=7 ), colorectal carcinoma (n=7), carcinomas not otherwise specified (NOS carcinoma n=11), and rare tumor samples generalized as others (n=6). Survival data were collected from 155 patients (time to survive after tumor removal), and the number of brain metastases in 169 patients and the size of brain metastases in a subcohort of 55 melanoma patients were further analyzed.

Иммуногистохимия.Immunohistochemistry.

Иммуногистохимию для всех антител проводили с использованием предметных стекол толщиной 3 мм и стандартных протоколов на автоматической окрашивающей системе для ИГХ Discovery XT (Roche/Ventana, Tucson, Arizona, USA). Использовали следующие антитела: к GDF-15 (HPA011191, разведение 1:50, Sigma/Atlas, протокол #730), к CD3 (клон А0452, разведение 1:500, DAKO, Glostrup,Denmark), к CD8 (клон С8/144В, разведение 1:100, DAKO, Glostrup, Denmark), к PD-1 (клон NAT105; разведение 1:50; Abcam, Cambridge, United Kingdom), к PD-L1 (E1L3N; разведение 1:200; Cell Signaling, Boston, U.S.A.), к FOXP3 (клон 236A/E7; разведение 1:100; eBioscience, San Diego, U.S.A.). Предметные стекла контрастно окрашивали гематоксилином и готовили препараты.Immunohistochemistry for all antibodies was performed using 3 mm thick glass slides and standard protocols on a Discovery XT automated IHC staining system (Roche/Ventana, Tucson, Arizona, USA). The following antibodies were used: to GDF-15 (HPA011191, dilution 1:50, Sigma/Atlas, protocol #730), to CD3 (clone A0452, dilution 1:500, DAKO, Glostrup, Denmark), to CD8 (clone C8/144B , dilution 1:100, DAKO, Glostrup, Denmark), to PD-1 (clone NAT105; dilution 1:50; Abcam, Cambridge, United Kingdom), to PD-L1 (E1L3N; dilution 1:200; Cell Signaling, Boston , U.S.A.), to FOXP3 (clone 236A/E7; dilution 1:100; eBioscience, San Diego, U.S.A.). The slides were counterstained with hematoxylin and slides were prepared.

Статистические анализы.Statistical analyses.

Все образцы оценивали по частоте положительных клеток, по отношению ко всем клеткам (как процентное содержание) на окрашенном ядре ТМА. Для экспрессии hGDF-15 использовали оценку, описанную ранее подробно [21,22]: частота 0-1%, 0 баллов; 1-10%, 1 балл; 10-25%, 2 балла; 25-50%, 3 балла; >50%, 4 балла; кроме того, оценку частоты умножали на интенсивность окрашивания (1 слабое окрашивание, 2 умеренное окрашивание, 3 сильное окрашивание), что в итоге привело к порядковой оценочной шкале hGDF-15 (0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 12). Порядковые масштабированные переменные сравнивались непараметрическим методом Вилкоксона/Крускал-Уоллис и Данна для поправки на множественное тестирование. Для непрерывных переменных сравнивали средние между метастазами в головной мозг различного происхождения, используя ANOVA, а затем ретроспективный анализ с HSD критерием ТьюкиКрамера. Для корреляционного анализа размеров метастазов в головной мозг и экспрессии маркеров проводилась линейная корреляция, за которой следовал ANOVA, в случае порядковых масштабированных переменных применялся корреляционный анализ с коэффициентом Спирмана. Для всех статистических анализов был установлен уровень значимости р <0,05.All samples were scored for the frequency of positive cells, relative to all cells (as a percentage) on the stained TMA core. For hGDF-15 expression, a score previously described in detail was used [21,22]: frequency 0-1%, 0 points; 1-10%, 1 point; 10-25%, 2 points; 25-50%, 3 points; >50%, 4 points; In addition, the frequency score was multiplied by the staining intensity (1 weak staining, 2 moderate staining, 3 strong staining), resulting in an ordinal hGDF-15 rating scale (0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9 , 12). Ordinal scaled variables were compared using the nonparametric Wilcoxon/Kruskal-Wallis and Dunn method to adjust for multiple testing. For continuous variables, means were compared between brain metastases of different origins using ANOVA followed by post hoc analysis with Tukey-Kramer's HSD test. For correlation analysis of brain metastasis size and marker expression, linear correlation was performed followed by ANOVA; in case of ordinal scaled variables, correlation analysis with Spearman's coefficient was used. All statistical analyzes were set to a significance level of p < 0.05.

Все статистические анализы проводили с использованием JMP8 и JMP11 (SAS, Cary, U.S.A.), дополнительные графики получали при помощи Prism 6 (программное обеспечение GraphPad, La Jolla, U.S.A.).All statistical analyzes were performed using JMP8 and JMP11 (SAS, Cary, U.S.A.), and additional graphs were generated using Prism 6 (GraphPad software, La Jolla, U.S.A.).

Результаты.Results.

На фиг. 6 представлены примеры тканевых срезов из метастазов меланомы в головной мозг без высокой (верхняя панель) или с высокой (нижняя панель) иммунореактивностью GDF-15, которые окрашивали посредством иммуногистохимии на GDF-15 и маркерные белки Т-клеток - CD3 и CD8, соответственно, как указано на фигуре. В разделе без экспрессии GDF-15, многочисленные инфильтрирующие иммунные клетки видны в виде темных пятен. На снимке, показывающем метастазы, экспрессирующие высокие уровни GDF-15, немногочисленные инфильтрирующие иммунные клетки обозначены стрелками (CD3- и CD8-позитивные клетки обозначены стрелками). Как можно видеть на фигуре, было неожиданно установлено, что в тканевом срезе с высокой иммунореактивностью hGDF-15 (нижняя панель) количество CD3+ и CD8+ клеток было сильно снижено по сравнению с тканевым срезом без иммунореактивности hGDF-15 (верхняя панель). Следует отметить, что другие окрашенные маркеры, такие как PD-L1, PD-1, все показали положительную корреляцию с количеством CD3+ и CD8+ Т-клеток, инфильтрирующих опухоль.In fig. Figure 6 shows examples of tissue sections from melanoma brain metastases without high (top panel) or high (bottom panel) GDF-15 immunoreactivity that were stained by immunohistochemistry for GDF-15 and the T cell marker proteins CD3 and CD8, respectively. as indicated in the figure. In the section without GDF-15 expression, numerous infiltrating immune cells are visible as dark spots. In the image showing metastases expressing high levels of GDF-15, the few infiltrating immune cells are indicated by arrows (CD3- and CD8-positive cells are indicated by arrows). As can be seen in the figure, it was surprisingly found that in the tissue section with high hGDF-15 immunoreactivity (lower panel), the number of CD3+ and CD8+ cells was greatly reduced compared to the tissue section without hGDF-15 immunoreactivity (upper panel). Of note, other stained markers such as PD-L1, PD-1 all showed positive correlation with the number of CD3+ and CD8+ T cells infiltrating the tumor.

Таким образом, затем было проанализировано, существует ли обратная корреляция между уровнями hGDF-15 и процентным содержанием CD3+ Т-клеток в разных метастазах меланомы в головной мозг.Therefore, it was then analyzed whether there was an inverse correlation between hGDF-15 levels and the percentage of CD3+ T cells in different melanoma brain metastases.

- 35 044887- 35 044887

Фиг. 7А показывает график процентного содержания CD3+ клеток по сравнению с оценкой GDF-15 (полученной, как описано выше, в разделе статистические анализы). Как указано на фиг. 7А, была статистически значимая обратная корреляция между процентным содержанием CD3+ клеток и оценкой GDF15 (р=0,0015).Fig. 7A shows a plot of the percentage of CD3+ cells compared to the GDF-15 score (obtained as described above in the statistical analyzes section). As indicated in FIG. 7A, there was a statistically significant inverse correlation between the percentage of CD3+ cells and the GDF15 score (p=0.0015).

Аналогичным образом было также проанализировано, существует ли обратная корреляция между уровнями hGDF-15 и процентным содержанием CD8+ Т-клеток в разных метастазах меланомы в головной мозг. Фиг. 7В показывает график процентного содержания клеток CD8+ по сравнению с оценкой GDF-15 (полученной, как описано выше, в разделе статистические анализы). Как показано на фиг. 7В, была статистически значимая обратная корреляция между процентным содержанием CD8+ клеток и оценкой GDF-15 (р=0,0038).Similarly, it was also analyzed whether there was an inverse correlation between hGDF-15 levels and the percentage of CD8+ T cells in different melanoma brain metastases. Fig. 7B shows a graph of the percentage of CD8+ cells compared to the GDF-15 score (obtained as described above in the statistical analyzes section). As shown in FIG. 7B, there was a statistically significant inverse correlation between the percentage of CD8+ cells and the GDF-15 score (p=0.0038).

Корреляция GDF-15 с FOXP3, напротив, не дала статистически значимого результата согласно тесту коэффициентов кореляции рангов Спирмена (rho) (p=0,8495 среди различных форм опухолей; р=0,2455 при оценке метастазов только меланомы).The correlation of GDF-15 with FOXP3, in contrast, did not produce a statistically significant result according to the Spearman rank correlation coefficient (rho) test (p=0.8495 among different tumor forms; p=0.2455 when assessing melanoma metastases only).

Наконец, было также проанализировано, существует ли обратная корреляция между уровнями hGDF-15 и процентным содержанием CD8+ и CD3+ Т-клеток в метастазах в головной мозг из различных форм опухолей. На фиг. 8 представлен график оценки GDF-15 против процентного содержания CD8+ и CD3+ Т-клеток, соответственно, в 168 (для CD3) или, соответственно, 169 (для CD8) метастазах в головной мозг из разных опухолевых образований (меланома, CRC, RCC, рак молочной железы, NSCLC и SCLC). График получали, как описано выше, в разделе статистические анализы. Как указано на фиг. 8, была статистически значимая обратная корреляция между процентным содержанием CD8+ клеток и оценкой GDF-15 (р=0,0311), а также статистически значимая обратная корреляция между процентным содержанием CD3+ клеток и оценкой GDF-15 (р=0,0093). Другие маркеры (PD-L1, PD-1, FOXP3) снова показали положительные корреляции с инфильтрацией CD3 и CD8 Т-клетками.Finally, it was also analyzed whether there is an inverse correlation between hGDF-15 levels and the percentage of CD8+ and CD3+ T cells in brain metastases from different tumor forms. In fig. Figure 8 shows a graph of GDF-15 versus the percentage of CD8+ and CD3+ T cells, respectively, in 168 (for CD3) or, respectively, 169 (for CD8) brain metastases from different tumor entities (melanoma, CRC, RCC, cancer breast, NSCLC and SCLC). The graph was obtained as described above in the statistical analyzes section. As indicated in FIG. 8, there was a statistically significant inverse correlation between the percentage of CD8+ cells and the GDF-15 score (p=0.0311), as well as a statistically significant inverse correlation between the percentage of CD3+ cells and the GDF-15 score (p=0.0093). Other markers (PD-L1, PD-1, FOXP3) again showed positive correlations with CD3 and CD8 T cell infiltration.

Подведение итогов.Summarizing.

Вышеприведенные результаты показывают, что существует не только обратная корреляция hGDF15 с процентным содержанием Т-клеток, экспрессирующих общий Т-клеточный маркерный белок CD3, в метастазах, но и обратная корреляция с процентным содержанием CD8+T- лимфоцитов в метастазах. Это следует отметить, поскольку ранее было показано, что присутствие CD8+ Т-лимфоцитов особенно необходимо для регрессии опухоли после ингибирования контрольной точки иммунного ответа антителом к PD-1 (Tumeh et al., Nature. 2014 November 27; 515 (7528):568-71.).The above results indicate that there is not only an inverse correlation of hGDF15 with the percentage of T cells expressing the common T cell marker protein CD3 in metastases, but also an inverse correlation with the percentage of CD8+ T lymphocytes in metastases. This is noteworthy because it has previously been shown that the presence of CD8+ T cells is particularly required for tumor regression following immune checkpoint inhibition by anti-PD-1 antibody (Tumeh et al., Nature. 2014 November 27; 515 (7528):568- 71.).

Таким образом, по изобретению, терапевтическое ингибирование hGDF-15 можно использовать для увеличения процентного содержания CD8+ Т-лимфоцитов в солидных опухолях, включая опухолевые метастазы. Это увеличение CD8+ Т-лимфоцитов в солидных опухолях можно использовать для терапии солидных опухолей. В неограничивающем аспекте изобретения особенно благоприятной терапевтической комбинацией является комбинация ингибитора hGDF-15 с блокатором контрольных точек иммунного ответа. Преимущественным эффектом этой комбинации является то, что ингибирование hGDF-15 увеличит процентное содержание CD8+ Т-лимфоцитов в солидных опухолях и тем самым приведет к синергическому терапевтическому эффекту с ингибированием контрольной точки иммунного ответа. Изобретение может таким образом быть применимо ко всем солидным опухолям, упомянутым в предпочтительных вариантах осуществления.Thus, according to the invention, therapeutic inhibition of hGDF-15 can be used to increase the percentage of CD8+ T lymphocytes in solid tumors, including tumor metastases. This increase in CD8+ T cells in solid tumors can be used for solid tumor therapy. In a non-limiting aspect of the invention, a particularly advantageous therapeutic combination is the combination of an hGDF-15 inhibitor with an immune checkpoint blocker. The advantageous effect of this combination is that inhibition of hGDF-15 will increase the percentage of CD8+ T cells in solid tumors and thereby lead to a synergistic therapeutic effect with immune checkpoint inhibition. The invention may thus be applicable to all solid tumors mentioned in the preferred embodiments.

Пример 3. GDF-15 снижает адгезию Т-клеток к эндотелиальным клеткам.Example 3: GDF-15 reduces T cell adhesion to endothelial cells.

Авторы изобретения далее определили, как hGDF-15 влияет на процентное содержание Т-клеток в солидных опухолях.We further determined how hGDF-15 affects the percentage of T cells in solid tumors.

Шаг, необходимый для вторжения Т-клеток из потока крови в ткань опухоли, заключается в том, что Т-клетки должны сначала прикрепиться к эндотелию, прежде чем они смогут проникнуть в опухоль. Чтобы смоделировать этот шаг и оценить, может ли на этот шаг повлиять hGDF-15, авторы изобретения использовали модельную систему, которая измеряет адгезию Т-клеток к эндотелиальным клеткам пупочной вены человека (HUVEC).The step required for T cells to invade from the bloodstream into tumor tissue is that the T cells must first attach to the endothelium before they can enter the tumor. To model this step and evaluate whether this step could be affected by hGDF-15, we used a model system that measures T cell adhesion to human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).

Эксперимент с потоком/адгезией Т-клеток (на HUVEC).T cell flow/adhesion experiment (on HUVEC).

Сутки 1.Day 1.

a. μ-стекла VI 0,4 (ibidi GmbH, Germany) покрывали фибронектином (100 мкг/мл): 30 мкл через загрузочное отверстие. Их инкубировали в течение 1 ч при 37°С (или использовали предварительно покрытые стекла).a. μ-glasses VI 0.4 (ibidi GmbH, Germany) were coated with fibronectin (100 μg/ml): 30 μl through the loading port. They were incubated for 1 h at 37°C (or precoated slides were used).

b. Фибронектин удаляли, с последующей промывкой средой для HUVEC.b. Fibronectin was removed, followed by washing with HUVEC media.

c. HUVEC трипсинизировали с 6-луночного планшета (количество: 2х105/мл (всего 2 мл)).c. HUVEC were trypsinized from a 6-well plate (number: 2x105/ml (2 ml total)).

d. Их отмывали и разводили до 1x106 клеток/мл.d. They were washed and diluted to 1x106 cells/ml.

e. 30 мкл HUVEC наносили через загрузочное отверстие на μ-стекло VI и проверяли под микроскопом.e. 30 μL of HUVEC was applied through the loading port onto μ-glass VI and examined under a microscope.

f. μ-стекло VI накрывали крышкой и инкубировали при 37°С, 5%СО₂.f. μ-glass VI was covered with a lid and incubated at 37°C, 5% CO ₂ .

Сутки 2.Day 2.

a. HUVEC активировали TNFa (10 нг/мл) и IFNy (10 нг/мл) в каналах 2-5 (см. табл. ниже): Всю среa. HUVEC were activated by TNFa (10 ng/ml) and IFNy (10 ng/ml) in channels 2-5 (see table below): Whole environment

- 36 044887 ду отбирали из каналов и замещали цитокин-содержащей предварительно прогретой средой.- 36 044887 DU were taken from the channels and replaced with a cytokine-containing preheated medium.

Сутки 3.Day 3.

a. Выделяли Т-клетки (негативное изолирование из пан-Т-клеток).a. T cells were isolated (pan T cell negative isolation).

b. Т-клетки предварительно инкубировали в лунке 1 (1х10⁶ клеток/мл) в присутствии или в отсутствие GDF-15 (100 нг/мл) в течение 1 ч.b. T cells were preincubated in well 1 (1 x 10 ⁶ cells/ml) in the presence or absence of GDF-15 (100 ng/ml) for 1 hour.

c. HUVEC предварительно инкубировали в каналах 4 и 5 с GDF-15 (100 нг/мл) в течение 1 ч: всю среду в загрузочных отверстиях удаляли, и оба загрузочных отверстия заполняли предварительно прогретой средой, содержащей GDF15.c. HUVEC were preincubated in channels 4 and 5 with GDF-15 (100 ng/ml) for 1 h: all media in the loading holes was removed and both loading holes were filled with prewarmed medium containing GDF15.

d. Инкубатор для предметного столика микроскопа предварительно прогревали, и присоединяли газовую смесь (5% СО2, 16% О2, 79% N2).d. The incubator for the microscope stage was preheated, and a gas mixture (5% CO2, 16% O2, 79% N2) was added.

e. Получали 3 шприца по 50 мл.e. We received 3 syringes of 50 ml each.

i. Т-клетки (1 х 10⁶ клеток/мл): 1 мл.i. T cells (1 x 10 ⁶ cells/ml): 1 ml.

ii. Т-клетки с GDF15 (1х10⁶ клеток/мл): 1 мл.ii. T cells with GDF15 (1x10 ⁶ cells/ml): 1 ml.

iii. Среда.iii. Wednesday.

a. Шприц 1 соединяли с каналом 1 (см. таблицу ниже) и запускали поток (0,5 дин/см²: 0,38 мл/мин=22,8 мл/ч).a. Syringe 1 was connected to channel 1 (see table below) and the flow was started (0.5 dyne/cm ² : 0.38 ml/min=22.8 ml/h).

b. Т-клетки протекали в течение 3 мин и за это время, 10 полей зрения были предопределены под микроскопом.b. T cells were processed for 3 min and during this time, 10 fields of view were predetermined under the microscope.

c. Каждое поле зрения видеорегистрировалось в течение 5 с.c. Each visual field was video recorded for 5 s.

d. Остальные каналы оценивали по аналогии с каналом 1 (f-h) с образцами Т-клеток, как указано ниже в таблице.d. The remaining channels were evaluated similarly to channel 1 (f-h) with T cell samples, as indicated in the table below.

Номер канала Number channel Эндотелиальные клетки Endothelial cells Т-клетки в потоке T cells in flow Комментарии Comments 1 1 Нестимулированные HUVEC Unstimulated HUVECs Т-клетки T cells [отрицательный контроль] [negative control] 2 2 Стимулированные HUVEC Stimulated HUVECs Т-клетки T cells [положительный контроль] [positive control] 3 3 Стимулированные HUVEC Stimulated HUVECs Т-клетки с GDF-15 T cells with GDF-15 4 4 HUVEC, стимулированные GDF-15 HUVEC stimulated GDF-15 Т-клетки T cells 5 5 HUVEC, стимулированные GDF-15 HUVEC stimulated GDF-15 Т-клетки с GDF-15 T cells with GDF-15

Рекомбинантный GDF-15 получали от Invigate GmbH, Jena, Germany.Recombinant GDF-15 was obtained from Invigate GmbH, Jena, Germany.

Статистический анализ.Statistical analysis.

Все данные сравнивали с использованием теста Манна-Уитни для тестирования данных без нормального распределения. Значения р<0,05 считали статистически значимыми.All data were compared using the Mann-Whitney test to test data not normally distributed. P values <0.05 were considered statistically significant.

Результаты.Results.

Результаты эксперимента показаны на фиг. 9. Эта фигура показывает анализ нескольких параметров адгезии, а именно:The results of the experiment are shown in Fig. 9. This figure shows the analysis of several adhesion parameters, namely:

a) число катящихся Т-клеток в поле зрения в су (9А; данные получали из канала # 3 (GDF-15) и канала #2 (контроль)), которое отражает форму умеренной адгезии Т-клеток к эндотелиальным клеткам,a) the number of rolling T cells per field of view in cy (9A; data obtained from channel #3 (GDF-15) and channel #2 (control)), which reflects the form of moderate adhesion of T cells to endothelial cells,

b) скорость качения Т-клеток (измеренную в пикселях за 0,2 с) (9В; данные получали из канала # 3 (GDF-15) и и канала #2 (контроль), которая повышается с уменьшением адгезии между Т-клетками и эндотелиальными клетками, иb) T cell rolling speed (measured in pixels per 0.2 s) (9V; data obtained from channel #3 (GDF-15) and channel #2 (control), which increases with decreasing adhesion between T cells and endothelial cells, and

с) . число прикрепленных клеток в поле зрения (9С; данные получали из канала # 3 (GDF-15) и канала #2 (контроль); и 9D).With) . number of attached cells in the field of view (9C; data obtained from channel #3 (GDF-15) and channel #2 (control); and 9D).

Как видно на фиг. 9С, выявлено, что обработка Т-клеток hGDF-15 значительно снижает адгезию к эндотелиальным клеткам, что отражается в количестве прикрепленных клеток на поле зрения. Аналогичные результаты получали при анализе адгезии путем подсчета числа катящихся Т-клеток (фиг. 9А). Кроме того, и в соответствии с приведенными выше результатами, выявлено, что обработка Т-клеток с hGDF-15 значительно увеличивает скорость качения, что указывает на уменьшение времени взаимодействия между Т-клетками и эндотелиальными клетками, а также указывает на снижение адгезии между Тклетками и эндотелиальными клетками (фиг. 9В).As can be seen in FIG. 9C, it was found that treatment of T cells with hGDF-15 significantly reduced adhesion to endothelial cells, which is reflected in the number of adherent cells per field of view. Similar results were obtained in the adhesion assay by counting the number of rolling T cells (Fig. 9A). In addition, and consistent with the above results, treatment of T cells with hGDF-15 significantly increased rolling speed, indicating a decrease in the interaction time between T cells and endothelial cells, and also indicating a decrease in adhesion between T cells and endothelial cells. endothelial cells (Fig. 9B).

Далее авторы изобретения проанализировали, на какие клетки был нацелен hGDF-15 (фиг. 9D). В образце, где только HUVEC обрабатывали hGDF-15, наблюдали умеренное снижение адгезии Т-клеток к эндотелиальным клеткам (HUVEC). Напротив, сильное снижение адгезии Т-клеток к эндотелиальнымWe next analyzed which cells were targeted by hGDF-15 (Fig. 9D). In a sample where only HUVECs were treated with hGDF-15, a modest reduction in T cell adhesion to endothelial cells (HUVECs) was observed. On the contrary, a strong decrease in the adhesion of T cells to endothelial

- 37 044887 клеткам (HUVEC) наблюдали, когда либо только Т-клетки обрабатывали hGDF-15, либо когда и Тклетки, и эндотелиальные клетки (HUVEC) обрабатывали hGDF-15. Эти результаты показывают, что hGDF-15 действует как на Т-клетки, так и на эндотелиальные клетки, но они также указывают на то, что основной адгезионный эффект hGDF-15 представляет собой воздействие на Т-клетки.- 37 044887 cells (HUVEC) were observed when either T cells alone were treated with hGDF-15 or when both T cells and endothelial cells (HUVEC) were treated with hGDF-15. These results indicate that hGDF-15 acts on both T cells and endothelial cells, but they also indicate that the main adhesion effect of hGDF-15 is on T cells.

Далее авторы изобретения проверили, может ли влияние hGDF-15, который секретируется опухолевыми клетками, на адгезию Т-клеток ингибироваться ингибиторами hGDF-15. Чтобы проверить это, авторы изобретения использовали hGDF-15-секретирующую клеточную линию меланомы, UACC257.We next tested whether the effect of hGDF-15, which is secreted by tumor cells, on T cell adhesion could be inhibited by hGDF-15 inhibitors. To test this, we used an hGDF-15-secreting melanoma cell line, UACC257.

Эксперимент с потоком/адгезией Т-клеток (на HUVEC) в присутствии или отсутствие GDF-15 в супернатанте опухолевых клеток.T cell flow/adhesion experiment (on HUVECs) in the presence or absence of GDF-15 in tumor cell supernatant.

Сутки 1.Day 1.

a. Одно μ-стекло VI 0,4 (ibidi GmbH, Germany, с этого момента обозначаемое как μ-стекло) покрывали фибронектином (100 мкг/мл): 30 мкл через загрузочное отверстие. Их инкубировали в течение 1 ч при 37°С (или использовали предварительно покрытое стекло).a. One μ-glass VI 0.4 (ibidi GmbH, Germany, from now on referred to as μ-glass) was coated with fibronectin (100 μg/ml): 30 μl through the loading hole. They were incubated for 1 h at 37°C (or pre-coated glass was used).

e. 30 мкл HUVECs наносили через загрузочные отверстия на μ-стекло и проверяли под микроскопом.e. 30 μL of HUVECs were applied through loading holes onto μ-glass and examined under a microscope.

f. μ-стекло накрывали крышкой и инкубировали при 37°С, 5%СО₂.f. The μ-glass was covered with a lid and incubated at 37°C, 5% CO ₂ .

Сутки 2.Day 2.

a. HUVEC активировали TNFa (10 нг/мл) и IFNy (10 нг/мл) в каналах 2-5 μ-стекла (см. таблицу ниже): всю среду отбирали из каналов и замещали цитокин-содержащей предварительно прогретой средой.a. HUVEC were activated with TNFa (10 ng/ml) and IFNy (10 ng/ml) in 2-5 μ-glass channels (see table below): all medium was withdrawn from the channels and replaced with cytokine-containing prewarmed medium.

Сутки 3.Day 3.

b. В параллельном режиме 2 4 лунки на 96-луночном планшете для ELISA (Nunc maxisorb) покрывали 200 мкл антитела к GDF-15 (10 мкг/мл, разведенного в PBS), инкубировали в течение 45 мин, а затем промывали PBS.b. In parallel mode, 2 4 wells of a 96-well ELISA plate (Nunc maxisorb) were coated with 200 μl of anti-GDF-15 antibody (10 μg/ml, diluted in PBS), incubated for 45 min, and then washed with PBS.

c. Для истощения супернатанта из клеточной линии меланомы UACC257, которая секретирует GDF-15 (данные не показаны), по GDF-15, супернатант инкубировали в лунках планшета для ELISA (см. b), которые были предварительно покрыты антителом к GDF-15.c. To deplete the supernatant from the melanoma cell line UACC257, which secretes GDF-15 (data not shown), by GDF-15, the supernatant was incubated in wells of an ELISA plate (see b) that had been precoated with anti-GDF-15 antibody.

d. В качестве контроля супернатант из клеточной линии меланомы UACC257 инкубировали в лунках планшета для ELISA (см. b), которые не были предварительно покрыты антителом к GDF-15d. As a control, supernatant from the melanoma cell line UACC257 was incubated in wells of an ELISA plate (see b) that were not precoated with anti-GDF-15 antibody

e. Т-клетки предварительно инкубировали в 12-луночном планшете для клеточных культур (1x106 клеток/мл) с GDF-15 (100 нг/мл), без GDF-15, в супернатанте из клеточной линии меланомы UACC257, истощенном по GDF-15 (см. с) или в супернатанте из клеточной линии меланомы UACC257, содержащем GDF-15 (см. d) в течение 1 ч.e. T cells were preincubated in a 12-well cell culture plate (1x106 cells/ml) with GDF-15 (100 ng/ml), without GDF-15, in supernatant from the GDF-15-depleted melanoma cell line UACC257 (see c) or in the supernatant from the UACC257 melanoma cell line containing GDF-15 (see d) for 1 hour.

f. Инкубатор для предметного столика микроскопа предварительно прогревали, и присоединяли газовую смесь (5% СО₂, 16% О₂, 79% N₂).f. The incubator for the microscope stage was preheated and a gas mixture (5% CO ₂ , 16% O ₂ , 79% N ₂ ) was added.

g. Получали 4 пробирки по 2 мл для микрофлюидной проточной системы.g. We received 4 tubes of 2 ml each for the microfluidic flow system.

i. Т-клетки (1x106 клеток/мл): 1 мл ii. Т-клетки с GDF15 (1x106 клеток/мл): 1 мл iii. Т-клетки с UACC 257 (содержащие GDF-15) iv. Т-клетки UACC 2 57, истощенные по GDF-15.i. T cells (1x106 cells/ml): 1 ml ii. T cells with GDF15 (1x106 cells/ml): 1 ml iii. T cells with UACC 257 (containing GDF-15) iv. UACC 2 57 T cells depleted of GDF-15.

a. Пробирку 1 соединяли с каналом 1 (см. таблицу ниже) и запускали поток (0,4 мл/мин=24 мл/ч).a. Tube 1 was connected to channel 1 (see table below) and flow was started (0.4 ml/min=24 ml/h).

b. Т-клетки протекали в течение 3 мин и за это время, 5 полей зрения были предопределены под микроскопом.b. T cells were processed for 3 min and during this time, 5 fields of view were predetermined under the microscope.

- 38 044887- 38 044887

Номер канала Number channel Эндотелиальные клетки Endothelial cells Т-клетки в потоке T cells in flow Комментарии Comments 1 1 Нестимулированные HUVEC Unstimulated HUVEC Т-клетки T cells [отрицательный контроль] [negative control] 2 2 Стимулированные HUVEC Stimulated HUVEC Т-клетки T cells [положительный контроль] [positive control] 3 3 Стимулированные HUVEC Stimulated HUVEC Т-клетки с GDF-15 T cells with GDF-15 4 4 Стимулированные HUVEC Stimulated HUVEC Т-клетки с UACC 257 T cells with UACC 257 5 5 Стимулированные HUVEC Stimulated HUVEC Т-клетки с UACC 257, истощенными по GDF-15 при помощи T cells with UACC 257, exhausted by GDF-15 using антитела к GDF-15 antibodies to GDF-15

Результаты.Results.

Результаты эксперимента показаны на фиг. 10А. Эта фигура показывает анализ числа катящихся Т-клеток на поле зрения в су. Данные получали из канала # 1 (контрольные Т-клетки на нестимулированных HUVEC в качестве отрицательного контроля), канала # 2 (контрольные Т-клетки на стимулированных HUVEC в качестве положительного контроля), канала # 3 (GDF-15), канала # 4 (UACC 257: Т-клетки, культивируемые в супернатанте клеток меланомы UACC 2 57, содержащем секретируемый GDF-15) и канала # 5 (UACC257+анти-hGDF-15: Т-клетки, культивируемые в супернатанте клеток меланомы UACC 257, очищенном от секретируемого GDF-15 при помощи антитела к hGDF-15 B1-23).The results of the experiment are shown in Fig. 10A. This figure shows an analysis of the number of rolling T cells per field of view in su. Data was obtained from channel #1 (control T cells on unstimulated HUVECs as a negative control), channel #2 (control T cells on stimulated HUVECs as a positive control), channel #3 (GDF-15), channel #4 ( UACC 257: T cells cultured in supernatant of UACC 2 57 melanoma cells containing secreted GDF-15) and channel #5 (UACC257+anti-hGDF-15: T cells cultured in supernatant of UACC 257 melanoma cells purified of secreted GDF-15 using anti-hGDF-15 antibody B1-23).

По сравнению с Т-клетками, протекавшими над нестимулированными HUVEC (отрицательный контроль, медиана=28 катящихся клеток в поле зрения за су), протекание Т-клеток по стимулированным HUVEC (положительный контроль) увеличило количество катящихся клеток в поле зрения за су (медиана=46). Обработка Т-клеток hGDF-15 по существу уменьшает количество катящихся клеток в поле зрения за су (медиана=29). Кроме того, предварительная инкубация Т-клеток с супернатантом клеточной линии меланомы UACC257, которая секретирует GDF-15, по существу, уменьшает количество катящихся клеток в поле зрения за су (медиана=36) по сравнению с Т-клетками, протекающими по стимулированным HUVEC (положительный контроль). В отличие от этого, предварительная инкубация Т-клеток с супернатантом клеточной линии меланомы UACC257, обедненным секретируемым GDF-15 при помощи антитела к GDF-15 В1-23, привела к количествам катящихся клеток в поле зрения за су (медиана=45), которые были сопоставимы с Т-клетками, протекающими по стимулированным HUVEC (положительный контроль).Compared with T cells flowing over unstimulated HUVECs (negative control, median=28 rolling cells per visual field per sy), T cell flowing over stimulated HUVECs (positive control) increased the number of rolling cells per visual field per su (median= 46). Treatment of T cells with hGDF-15 substantially reduced the number of rolling cells per visual field per su (median=29). Additionally, preincubation of T cells with supernatant of the melanoma cell line UACC257, which secretes GDF-15, substantially reduced the number of rolling cells per visual field per su (median=36) compared to T cells streaming on stimulated HUVECs ( positive control). In contrast, preincubation of T cells with supernatant of the melanoma cell line UACC257 depleted of secreted GDF-15 using the anti-GDF-15 antibody B1-23 resulted in numbers of rolling cells per visual field per sy (median = 45) that were comparable to T cells flowing through stimulated HUVECs (positive control).

Таким образом, по изобретению, ингибиторы hGDF-15 можно использовать для повышения адгезии Т-клеток, включая CD8+ клетки, к эндотелиальным клеткам, например, при лечении солидных злокачественных опухолей.Thus, according to the invention, hGDF-15 inhibitors can be used to enhance the adhesion of T cells, including CD8+ cells, to endothelial cells, for example, in the treatment of solid malignancies.

Кроме того, вышеописанный анализ обеспечивает простую систему in vitro, которую можно использовать для определения того является ли вещество, представляющее интерес ингибитором hGDF-15.In addition, the above assay provides a simple in vitro system that can be used to determine whether a substance of interest is an hGDF-15 inhibitor.

Подведение итогов.Summarizing.

Этот пример показывает, что GDF-15, включая GDF-15, секретируемый опухолевыми клетками, снижает адгезию Т-клеток к эндотелиальным клеткам. Таким образом, по изобретению, лечение с ингибиторами hGDF-15 можно использовать для увеличения адгезии Т-клеток, включая CD8+ Т-клетки, к эндотелиальным клеткам. Такое лечение увеличит проникновение Т-клеток, включая CD8+ Т-клетки, из потока крови в солидные злокачественные опухоли. Повышенное процентное содержание CD8+ Тклеток в солидных злокачественных опухолях, которое будет являться результатом такого лечения с ингибиторами hGDF-15, является преимуществом, и его можно использовать в терапии злокачественной опухоли, например, иммунотерапии злокачественной опухоли. Поскольку введение CD8+ Т-клеток в солидные злокачественные опухоли и наличие этих CD8+ Т-клеток в солидных злокачественных опухолях особенно выгодно для терапевтических подходов с использованием блокаторов контрольных точек иммунного ответа, особенно выгодное использование ингибиторов hGDF-15 по изобретению представляет собой их использование в комбинации с блокаторами контрольных точек иммунного ответа.This example shows that GDF-15, including GDF-15 secreted by tumor cells, reduces T cell adhesion to endothelial cells. Thus, according to the invention, treatment with hGDF-15 inhibitors can be used to increase the adhesion of T cells, including CD8+ T cells, to endothelial cells. This treatment will increase the influx of T cells, including CD8+ T cells, from the bloodstream into solid malignancies. The increased percentage of CD8+ T cells in solid cancers that would result from such treatment with hGDF-15 inhibitors is advantageous and can be used in cancer therapy, such as cancer immunotherapy. Since the introduction of CD8+ T cells into solid cancers and the presence of these CD8+ T cells in solid cancers is particularly advantageous for therapeutic approaches using immune checkpoint blockers, a particularly advantageous use of the hGDF-15 inhibitors of the invention is their use in combination with immune checkpoint blockers.

Анализ потока/адгезии, включающий нейтрализацию антителами посредством антитела H1L5 (гуманизированное В1-23) и 01G06, и 03G05 (гуманизированные антитела к GDF-15, сконструированные согласно последовательностям из WO 2014/100689).Flow/adhesion assay including antibody neutralization via antibody H1L5 (humanized B1-23) and 01G06 and 03G05 (humanized anti-GDF-15 antibodies constructed according to sequences from WO 2014/100689).

Этот эксперимент проводили для дальнейшего подтверждения наблюдаемых выше эффектов, включая обнаружение того, что ингибиторы hGDF-15 можно использовать для увеличения адгезии ТThis experiment was performed to further confirm the effects observed above, including the discovery that hGDF-15 inhibitors can be used to increase T adhesion

- 39 044887 клеток к эндотелиальным клеткам или качения Т-клеток.- 39 044887 cells to endothelial cells or rolling T cells.

Экспериментальные процедуры.Experimental procedures.

Анализ потока/адгезии проводили, как описано выше в настоящем примере. Т-клетки предварительно инкубировали с 100 нг/мл GDF-15 в течение 1 ч или с 100 нг/мл GDF-15, который был предварительно инкубирован с 10 мкг/мл антитела в течение 1 ч. Применяли следующие антитела к GDF-15: H1L5 (гуманизированное B1-23), 01G06 и 03G05 (гуманизированные антитела к GDF-15, сконструированные согласно последовательностям из WO 2014/100689).The flow/adhesion assay was performed as described above in this example. T cells were preincubated with 100 ng/ml GDF-15 for 1 hour or with 100 ng/ml GDF-15 that had been preincubated with 10 μg/ml antibody for 1 hour. The following anti-GDF-15 antibodies were used: H1L5 (humanized B1-23), 01G06 and 03G05 (humanized antibodies to GDF-15, constructed according to the sequences from WO 2014/100689).

Результаты.Results.

Результаты показаны на фиг. 10В. По сравнению с Т-клетками, протекавшими над нестимулированными HUVEC (отрицательный контроль), протекание Т-клеток по стимулированным HUVEC (положительный контроль) увеличило количество катящихся клеток в поле зрения за 20 с. Обработка Тклеток hGDF-15 по существу уменьшила количество количество катящихся клеток в поле зрения за 20 с. В отличие от этого, предварительная инкубация Т-клеток с hGDF-15, который была предварительно инкубирован с антителами к GDF-15 H1L5 (гуманизированное B1-23), 01G06 или 03G05, привела к количеству катящихся клеток в поле зрения за 20 с, которое были по существу повышено по сравнению с образцом, где не добавляли антитело к GDF-15. Этот эффект присутствовал для всех исследуемых антител к GDF-15 и был наиболее выражен для антитела H1L5 (гуманизированное В1-23), которое почти полностью обратило вспять влияние hGDF-15 на качение Т-клеток.The results are shown in Fig. 10V. Compared with T cells flowing over unstimulated HUVECs (negative control), T cells flowing over stimulated HUVECs (positive control) increased the number of rolling cells in the visual field at 20 s. Treatment of T cells with hGDF-15 essentially reduced the number of rolling cells in the field of view within 20 s. In contrast, preincubation of T cells with hGDF-15 that was preincubated with anti-GDF-15 antibodies H1L5 (humanized B1-23), 01G06, or 03G05 resulted in a number of rolling cells per field of view at 20 s that were substantially increased compared to the sample where anti-GDF-15 antibody was not added. This effect was present for all GDF-15 antibodies tested and was most pronounced for the H1L5 antibody (humanized B1-23), which almost completely reversed the effect of hGDF-15 on T-cell rolling.

Выводы.Conclusions.

Таким образом, по изобретению, ингибиторы hGDF-15 можно использовать для увеличения адгезии Т-клеток, включая CD8+ клетки, к эндотелиальным клеткам, или качения указанных Т-клеток, включая CD8+ клетки. В соответствии с изобретением ингибиторы hGDF-15 будут увеличивать процентное содержание CD8+ клеток в солидных злокачественных опухолях и их можно использовать для лечения этих злокачественных опухолей. Эти ингибиторы hGDF-15 могут быть (но не ограничиваются ими) любыми известными антителами к GDF-15, такими как антитела H1L5 (гуманизированное B1-23), 01G06 и 03G05.Thus, according to the invention, hGDF-15 inhibitors can be used to increase the adhesion of T cells, including CD8+ cells, to endothelial cells, or the rolling of these T cells, including CD8+ cells. According to the invention, hGDF-15 inhibitors will increase the percentage of CD8+ cells in solid cancers and can be used to treat these cancers. These hGDF-15 inhibitors can be, but are not limited to, any known anti-GDF-15 antibodies, such as antibodies H1L5 (humanized B1-23), 01G06 and 03G05.

Пример 4. Оценка противоопухолевой эффективности исследуемого антитела в комбинации с адъювантной иммунизацией у сингенных MC38^{tg hGDF-15+} мышей с опухолями.Example 4. Evaluation of the antitumor efficacy of the test antibody in combination with adjuvant immunization in syngeneic MC38 ^{tg hGDF-15+} mice with tumors.

Для того чтобы оценить, может ли ингибирование человеческого фактора роста дифференцировки (GDF)-15 улучшить ответ на иммунотерапию, и, в частности, ответ на иммунотерапию, которая требует присутствия CD8+ Т-клеток в опухоли, мышиные клетки рака толстого кишечника МС38 трансфицировали для экспрессии человеческого GDF-15 на уровнях, подобных тем, которые были найдены в человеческих линиях злокачественных клеток. По оценке твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA, R&D Systems, Mouse GDF-15 DuoSet ELISA), клетки МС38 не экспрессировали детектируемые уровни мышиного GDF-15 (предел детекции: 7,81 пг/мл).To evaluate whether inhibition of human growth differentiation factor (GDF)-15 could improve response to immunotherapy, and in particular response to immunotherapy that requires the presence of CD8+ T cells in the tumor, murine MC38 colon cancer cells were transfected to express human GDF-15 at levels similar to those found in human malignant cell lines. As assessed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA, R&D Systems, Mouse GDF-15 DuoSet ELISA), MC38 cells did not express detectable levels of mouse GDF-15 (detection limit: 7.81 pg/ml).

На сутки 0, 9-недельных самок мышей C57BL/6J (предоставленных Charles River Laboratories, BP 0109, F 69592 L'Arbresle, Cedex) анестезировали и подкожно вводили 2x105 клеток MC38^{tg hGDF-15}. Лечение антителом к GDF-15 (20 мг/кг массы тела, т.е. примерно 400 мкг на мышь в 100 мкл фосфатносолевого буфера с 0,5% бычьего сывороточного альбумина) было начато на сутки 0 (приблизительно через 6 ч после внесения опухолевых клеток) и повторено на сутки 3, 7, 10, 14, 17 и 21. В сутки 13, когда опухоли достигли объема в пределах 100-150 мм³, животные были рандомизированы по различным группам лечения, и соответствующим животным вводили внутрибрюшинную инъекцию с адъювантом (100 мкг полиинозиновой:полицитидиловой кислоты (полиомиелиновой кислоты) (поли-ICLC (Hiltonol®, Oncovir, Washington D.C., USA)), и 50 мкг антитела к мышиному (m)CD40 InVivoMAb (клон FGK4.5/FGK45)) в общем объеме 50 мкл фосфатно-солевого буфера.On day 0, 9-week-old female C57BL/6J mice (provided by Charles River Laboratories, BP 0109, F 69592 L'Arbresle, Cedex) were anesthetized and injected subcutaneously with 2x105 MC38 ^{tg hGDF-15} cells. Treatment with anti-GDF-15 antibody (20 mg/kg body weight, i.e., approximately 400 μg per mouse in 100 μl of phosphate-buffered saline with 0.5% bovine serum albumin) was started on day 0 (approximately 6 hours after the addition of tumor cells). cells) and repeated on days 3, 7, 10, 14, 17 and 21. On day 13, when the tumors had reached a volume of 100-150 mm ³ , the animals were randomized to different treatment groups, and the corresponding animals were given an intraperitoneal injection with adjuvant (100 μg polyinosinic:polycytidylic acid (polyomyelic acid) (poly-ICLC (Hiltonol®, Oncovir, Washington DC, USA)), and 50 μg anti-mouse (m)CD40 InVivoMAb (clone FGK4.5/FGK45)) total volume of 50 μl of phosphate-buffered saline.

Из-за своего структурного сходства с двухцепочечной РНК, которая присутствует в некоторых вирусах и стимулирует TLR3, поли-ICLC имитирует инфекцию. Антитело-агонист к CD40 предоставляет дополнительный сигнал антигенпредставляющим клеткам. Лицензирование дендритных клеток посредством стимуляции CD40 поддерживает активацию антигенспецифических CD8+ Т-клеток. Адъювантное лечение, таким образом, служит для индуцирования опухолеспецифичных иммунных клеток у мышей, содержащихся в особых условиях без патогенов (Yadav M et al., Nature. 2014 Nov 27; 515 (7528):572-6).Due to its structural similarity to double-stranded RNA, which is present in some viruses and stimulates TLR3, poly-ICLC mimics infection. An agonist antibody to CD40 provides an additional signal to antigen presenting cells. Licensing of dendritic cells through CD40 stimulation supports activation of antigen-specific CD8+ T cells. Adjuvant treatment thus serves to induce tumor-specific immune cells in mice maintained under specific pathogen-free conditions (Yadav M et al., Nature. 2014 Nov 27; 515 (7528):572-6).

Это адъювантное лечение, таким образом, представляет собой модельную систему для иммунотерапии злокачественной опухоли, которая требует присутствия иммунных клеток в опухоли, и, в частности, CD8+Т-клеток в опухоли. Таким образом, это модельная система, которая подходит для дополнительного подтверждения того, что лечение с ингибитором hGDF-15, так как антитело к hGDF-15 синергично с иммунотерапией злокачественной опухоли, в том числе, иммунотерапией злокачественной опухоли, которая требует присутствия CD8+ Т-клеток в опухоли.This adjuvant treatment thus provides a model system for cancer immunotherapy, which requires the presence of immune cells in the tumor, and in particular CD8+ T cells in the tumor. Thus, this is a model system that is suitable for further confirmation that treatment with an hGDF-15 inhibitor, since hGDF-15 antibody is synergistic with cancer immunotherapy, including cancer immunotherapy that requires the presence of CD8+ T cells in the tumor.

Резюмируя, были исследованы следующие группы животных (10 мыши на группу):To summarize, the following groups of animals were studied (10 mice per group):

группа, принимавшая носитель без иммунизации адъювантом;vehicle group without adjuvant immunization;

группа, которую лечили антителом к hGDF-15 без иммунизации адъювантом;a group treated with anti-hGDF-15 antibody without immunization with adjuvant;

- 40 044887 группа, принимавшая носитель с иммунизацией адъювантом;- 40 044887 group receiving vehicle with adjuvant immunization;

группа, которую лечили антителом к hGDF-15 с иммунизацией адъювантом.group treated with anti-hGDF-15 antibody with adjuvant immunization.

Размер опухоли измеряли 3 раза в неделю путем измерения циркулем длины и ширины опухоли.Tumor size was measured 3 times a week by measuring the length and width of the tumor with a caliper.

Мышей умерщвляли, когда их объем опухоли превышал 2000 мм³, при расчете по формуле V=длина х ширина²/2. Аналогично, мышей умерщвляли, когда их ухудшение их состояния выходило за пределы общепринятые для благосостояния животных (потеря массы>15%, потеря подвижности, обессиленное поведение, плохое состояние меха).Mice were sacrificed when their tumor volume exceeded 2000 mm ³ , calculated using the formula V=length x width ² /2. Similarly, mice were sacrificed when their condition deteriorated beyond what is generally accepted for animal welfare (weight loss >15%, loss of mobility, exhausted behavior, poor fur condition).

Для выживших мышей наличие опухолей определялось медицинским осмотром до 57 суток после инокуляции опухоли. Результаты показаны на фиг. 11.For surviving mice, the presence of tumors was determined by medical examination up to 57 days after tumor inoculation. The results are shown in Fig. eleven.

В предыдущем исследовании, проведенном авторами изобретения, было показано, что лечение антителом к GDF-15 само по себе может быть выгодно использовано для лечения злокачественной опухоли, но не полностью уничтожает опухоли, т.е. не вылечивает злокачественную опухоль. Аналогичным образом, на фиг. 11 не были вылечены ни мыши, обработанные носителем, ни мыши, которых обрабатывали только антителом к hGDF-15. Лечение с помощью адъюванта (т.е. с поли-ICLC и антителом к CD40) вылечило 3 из 10 мышей. Примечательно, что когда лечение с адъювантом объединялось с лечением антителом к hGDF-15, 8 из 10 мышей были вылечены. Таким образом, лечение с антителом к hGDF-15 сильно синергично с лечением с адъювантом.In a previous study conducted by the inventors, it was shown that treatment with an antibody to GDF-15 alone can be used beneficially for the treatment of malignant tumors, but does not completely eradicate tumors, i.e. does not cure a malignant tumor. Likewise, in FIG. 11 Neither vehicle-treated mice nor mice treated with hGDF-15 antibody alone were cured. Treatment with an adjuvant (i.e., poly-ICLC and anti-CD40 antibody) cured 3 of 10 mice. Notably, when adjuvant treatment was combined with anti-hGDF-15 antibody treatment, 8 out of 10 mice were cured. Thus, treatment with anti-hGDF-15 antibody is highly synergistic with treatment with an adjuvant.

Выводы.Conclusions.

Результаты, полученные на этой модельной системе, еще раз подтверждают, что ингибиторы hGDF15 синергичны с иммунотерапией злокачественной опухоли, и, в частности, с иммунотерапией злокачественной опухоли, которая требует активации иммунных клеток, таких как CD8+ Т-клетки, которые затем оказывают цитотоксическую активность в ткани опухоли. Результаты также дополнительно подтверждают, что увеличение процентного содержания CD8+ Т-клеток в злокачественной опухоли, которое вызвано использованием ингибиторов hGDF-15 по изобретению, может благоприятно использоваться в терапии злокачественной опухоли.The results obtained in this model system further confirm that hGDF15 inhibitors are synergistic with cancer immunotherapy, and in particular with cancer immunotherapy that requires activation of immune cells such as CD8+ T cells, which then exert cytotoxic activity in tumor tissue. The results also further confirm that the increase in the percentage of CD8+ T cells in a cancer, which is caused by the use of hGDF-15 inhibitors of the invention, can be beneficially used in cancer therapy.

В выбранных экспериментальных условиях мышиная модель иммунной системы имеет очень мало времени для накопления антигенспецифического ответа CD8+ Т-клеток на быстрорастущую злокачественную опухоль. Таким образом, адъювант применяли для дополнительной поддержки спонтанного иммунного ответа в мышиной системе. Напротив, у пациентов-людей, у которых злокачественные опухоли развиваются в течение более длительного периода времени (например, несколько лет), антигенспецифические Т-клетки, направленные против антигенов злокачественных опухолей, как правило, уже присутствуют при постановке диагноза, т.е. праймирование иммунного ответа, как правило, происходит даже до того, как диагностируется злокачественная опухоль. Эти специфические по отношению к опухолевым антигенам CD8+ Т-клетки уже существуют у людей, но в гораздо меньшей степени в мышиной модельной системе. Таким образом, по изобретению, использование ингибиторов hGDF-15 будет еще более эффективным у людей, чем в нынешней модельной мышиной системе. Таким образом, ингибиторы hGDF-15 могут эффективно использоваться для лечения пациентов-людей со злокачественными опухолями по изобретению, например, для увеличения процентного содержания CD8+ Т-клеток в солидной злокачественной опухоли, и они будут действовать синергически с другиой иммунотерапией злокачественных опухолей у людей, и, в частности, с иммунотерапией злокачественных опухолей, которая требует присутствия CD8+ Т-клеток в злокачественной опухоли, в том числе с иммунотерапией злокачественных опухолей с блокаторами контрольных точек иммунного ответа, такими как антитела к PD-1 и антитела к PD-L1.Under the selected experimental conditions, the mouse model of the immune system has very little time for the accumulation of an antigen-specific CD8+ T cell response to a rapidly growing malignant tumor. Thus, the adjuvant was used to further support the spontaneous immune response in the murine system. In contrast, in human patients in whom malignant tumors develop over a longer period of time (eg, several years), antigen-specific T cells directed against malignant tumor antigens are typically already present at diagnosis, i.e. Priming of the immune response usually occurs even before a malignant tumor is diagnosed. These tumor antigen-specific CD8+ T cells already exist in humans, but to a much lesser extent in the mouse model system. Thus, according to the invention, the use of hGDF-15 inhibitors will be even more effective in humans than in the current mouse model system. Thus, hGDF-15 inhibitors can be effectively used to treat human patients with cancers of the invention, for example, to increase the percentage of CD8+ T cells in a solid cancer, and they will act synergistically with other immunotherapies for human cancers, and , in particular with cancer immunotherapy, which requires the presence of CD8+ T cells in the cancer, including cancer immunotherapy with immune checkpoint blockers, such as anti-PD-1 antibodies and anti-PD-L1 antibodies.

Пример 5. Сывороточные уровни GDF-15 определяют выживаемость пациентов с меланомой, которых лечат антителом к PD-1.Example 5 Serum levels of GDF-15 determine survival of melanoma patients treated with anti-PD-1 antibody.

Исследование в этом примере проводили для дальнейшей проверки результатов, полученных в исследовании примера 1, например, подтверждение того, что hGDF-15 влияет на ответ пациентов на блокаторы контрольных точек иммунного ответа, путем дополнительного независимого исследования.The study in this example was conducted to further validate the results obtained in the study of example 1, for example, confirming that hGDF-15 affects the response of patients to immune checkpoint blockers, through an additional independent study.

Следующие термины применяли в связи с этим исследованием.The following terms were used in connection with this study.

Цензурированный=пациента удаляли из исследуемой когорты, когда при наблюдении не были доступны дополнительные данные.Censored=patient was removed from the study cohort when no additional data were available at follow-up.

Событие=пациент умер.Event=patient died.

Выживание=пациент был жив при наблюдении.Survival=patient was alive at follow-up.

Пациенты из отделения дерматологии универститета Тюбингена, Германия, с гистологически подтвержденной меланомой были идентифицированы в базе данных центрального реестра по злокачественной меланоме (CMMR), который проспективно регистрирует пациентов из более чем 60 дерматологических центров в Германии. Выбрали 99 пациентов, с (а) архивированными образцами сыворотки, (b) доступными последующими данными, (с) историей или наличием локального регионального или отдаленного метастаза в момент забора крови и (d) экспериментальным лечением антителом к PD-1. Цели и способы сбора данных CMMR были ранее опубликованы в деталях (Lasithiotakis, KG et al., Cancer/107/1331-9. 2006). Данные, полученные для каждого пациента, включали возраст, пол, дату последнего наблюдения,Patients from the Department of Dermatology of the University of Tübingen, Germany, with histologically confirmed melanoma were identified in the Central Malignant Melanoma Registry (CMMR) database, which prospectively enrolls patients from more than 60 dermatology centers in Germany. Ninety-nine patients were selected with (a) archived serum samples, (b) available follow-up data, (c) history or presence of localized regional or distant metastasis at the time of blood draw, and (d) experimental anti-PD-1 antibody treatment. The purposes and methods of CMMR data collection have been previously published in detail (Lasithiotakis, KG et al., Cancer/107/1331-9. 2006). Data obtained for each patient included age, gender, date of last follow-up,

- 41 044887 и дату и причину смерти, при наличии. Все пациенты дали письменное информированное согласие на запись клинических данных в реестр CMMR. Институциональный комитет по этике Тюбингена одобрил исследование (этическая резолюция 125/2015ВО2). Приемлемые пациенты были в возрасте 18 лет и старше и имели гистологически или цитологически подтвержденную неоперабельную меланому стадии III или IV, не поддающуюся местной терапии; и показали прогрессирование заболевания, несмотря на то, что они получали предшествующую терапию в соответствии с современными рекомендациями. Пациенты с опухолями с мутацией BRAFV600 получали рекомендованную терапию первой линии или экспериментальное лечение, включающее ингибитор BRAF или МЕК, или оба. Предшествующее лечение ипилимумабом, при наличии, считалось неудачным, если пациенты получили минимум две дозы, 3 мг/кг раз в 3 недели, но продемонстрировали подтвержденное прогрессирование заболевания в течение 24 недель от последней дозы ипилимумаба. Перед введением антитела к PD-1 требовалось разрешение или улучшение побочных явлений, связанных с ипилимумабом до степени 0-1 и доза преднизона 10 мг/сутки или меньше в течение, по меньшей мере, 2 недель до первой дозы исследуемого лекарственного средства. Приемлемые пациенты имели общее состояние по шкале Восточной объединенной группы онкологов (ECOG) 0 или 1; измеряемое заболевание по Критериям оценки ответа при солидных опухолях, версия 1.1 (RECIST v1.1); и значения в пределах заданного диапазона для абсолютного числа нейтрофилов (>1500 клеток на мл), тромбоцитов (>100000 клеток на мл), гемоглобина (>90 г/л), сывороточного креатинина (<1-5 верхней границы нормы [ULN]), общий билирубин сыворотки (<1-5 ULN или прямой билирубин<ULN для пациентов с общей концентрацией билирубина >1-5 ULN), аспартат и аланин аминотрансферазы (<2-5 ULN или<5 ULN для пациентов метастазами в печени), международное нормализованное соотношение или протромбиновое время (<1-5 ULN без использования антикоагулянтов), и активированное частичное тромбопластиновое время (<1-5 ULN без использования антикоагулянтов). У пациентов был отмывочный период, по меньшей мере, 4 недели между последней дозой самой последней терапии и первой дозой пембролизумаба или ниволумаба.- 41 044887 and date and cause of death, if available. All patients provided written informed consent for clinical data to be recorded in the CMMR registry. The institutional ethics committee of Tübingen approved the study (ethical resolution 125/2015BO2). Eligible patients were 18 years of age or older and had histologically or cytologically confirmed stage III or IV unresectable melanoma refractory to local therapy; and showed disease progression despite receiving prior therapy in accordance with current guidelines. Patients with BRAFV600-mutant tumors received recommended first-line therapy or an experimental treatment that included a BRAF inhibitor or a MEK inhibitor, or both. Prior treatment with ipilimumab, if present, was considered failure if patients received a minimum of two doses, 3 mg/kg every 3 weeks, but demonstrated documented disease progression within 24 weeks of the last dose of ipilimumab. Prior to anti-PD-1 antibody administration, resolution or improvement of grade 0-1 ipilimumab-related adverse events and a prednisone dose of 10 mg/day or less for at least 2 weeks prior to the first dose of study drug were required. Eligible patients had an Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) performance status of 0 or 1; disease measurable by Response Evaluation Criteria in Solid Tumors version 1.1 (RECIST v1.1); and values within the specified range for absolute neutrophil count (>1500 cells per mL), platelet count (>100,000 cells per mL), hemoglobin (>90 g/L), serum creatinine (<1-5 upper limit of normal [ULN]) , serum total bilirubin (<1-5 ULN or direct bilirubin<ULN for patients with total bilirubin concentration >1-5 ULN), aspartate and alanine aminotransferase (<2-5 ULN or <5 ULN for patients with liver metastases), international normalized ratio or prothrombin time (<1-5 ULN without the use of anticoagulants), and activated partial thromboplastin time (<1-5 ULN without the use of anticoagulants). Patients had a washout period of at least 4 weeks between the last dose of the most recent therapy and the first dose of pembrolizumab or nivolumab.

Буферы и реагенты.Buffers and reagents.

Забуференный блокирующий раствор: 1% BSA (фракция V рН 7,0, РАА, Pasching, Austria) в PBS Отмывающий раствор: PBS-Tween (0,05%).Buffered blocking solution: 1% BSA (fraction V pH 7.0, PAA, Pasching, Austria) in PBS Wash solution: PBS-Tween (0.05%).

Раствор субстрата: 10 мл 0,1 М NaOAc рН6,0+100 мкл ТМВ+2 мкл Н₂О₂.Substrate solution: 10 ml 0.1 M NaOAc pH 6.0 + 100 µl TMB + 2 µl H ₂ O ₂ .

Останавливающий раствор: 1 М H₂SO₄.Stopping solution: 1 M H ₂ SO ₄ .

Процедура анализа.Analysis procedure.

1. Получение планшета.1. Receiving a tablet.

a. Захватывающее антитело разбавляли до рабочей концентрации 2 мкг/мл в PBS. 96-луночный микропланшет (Nunc maxisorp®) сразу же покрывали разведенным захватывающим антителом по 50 мкл на лунку, за исключением внешних рядов (А и Н) . Ряды А и Н заполняли буфером, чтобы избежать испарения образцов во время эксперимента. По планшету легонько постукивали, чтобы убедиться, что дно каждой лунки полностью покрыто. Планшет помещали во влажную камеру и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре (RT).a. Capture antibody was diluted to a working concentration of 2 μg/ml in PBS. A 96-well microplate (Nunc maxisorp®) was immediately coated with diluted capture antibody at 50 μl per well, except for the outer rows (A and H). Rows A and H were filled with buffer to avoid evaporation of the samples during the experiment. The plate was gently tapped to ensure that the bottom of each well was completely covered. The plate was placed in a humid chamber and incubated overnight at room temperature (RT).

2. Процедура анализа:2. Analysis procedure:

- 42 044887- 42 044887

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 122 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 $1 $1 s2 s2 s12 s12 s1 s1 s2 s2 s12 s12 s13 s13 s14 s14 s24 s24 s13 s13 s14 s14 s24 s24 Серийные разведения стандартов Serial dilutions of standards « " « " » » 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

а. Отбирали содержимое каждой лунки и промывали ее три раза PBS-Tween (0,05%).A. The contents of each well were collected and washed three times with PBS-Tween (0.05%).

d. Стрептавидин-HRP разбавляли 1:200 (50 мкл+10 мл блокирующего буфера). 50 мкл рабочего раствора Стрептавидин-HRP добавляли к каждой лунке, с последующей инкубацией при RT в течение 20 мин.d. Streptavidin-HRP was diluted 1:200 (50 μl + 10 ml blocking buffer). 50 μl of Streptavidin-HRP working solution was added to each well, followed by incubation at RT for 20 min.

3. Расчет титра GDF-15 в сыворотке:3. Calculation of GDF-15 titer in serum:

c. Для расчета конечной концентрации GDF-15 в образцах учитывали определенный коэффициент разведения. Образцы, показывающие значения OD ниже или выше стандартного диапазона анализировали заново при соответствующих разведениях.c. To calculate the final concentration of GDF-15 in the samples, a certain dilution factor was taken into account. Samples showing OD values below or above the standard range were reassayed at appropriate dilutions.

Сравнение сывороточных уровней hGDF-15 с данными пациентов.Comparison of serum hGDF-15 levels with patient data.

Затем измеренные сывороточные уровни hGDF-15 сравнивали с данными ответов пациентов на лечение, полученными в исследовании.Measured serum hGDF-15 levels were then compared with patient response data from the study.

Статистическая корреляция сывороточных уровней hGDF-15 с данными пациентов:Statistical correlation of serum hGDF-15 levels with patient data:

Данные.Data.

Анализ данных проводили на основании файла с данными, содержащего данные из образцов для 99 пациентов, включающие колонки (переменные) обозначение образца, GDF-15 (нг/мл), отвечающие/не отвечающие, суток (до смерти или цензурирования), и продолжение (индексная переменная для текущей жизни).Data analysis was based on a data file containing data from samples for 99 patients, including columns (variables) sample designation, GDF-15 (ng/ml), responder/non-responder, days (until death or censoring), and continuation ( index variable for current life).

Выходные параметры (конечные точки):Output parameters (endpoints):

а. Общая выживаемость (время до смерти). Эта конечная точка состояла из индикатора события смерти (1=умер/0=жив), который получали из файла с данными, и времени до смерти или цензурирования (последняя точка времени, когда было известно, что пациент жив), соответствующего переменной сутки.A. Overall survival (time to death). This end point consisted of a death event indicator (1=died/0=alive), which was obtained from the data file, and time to death or censoring (the last time point at which the patient was known to be alive) corresponding to the day variable.

b. Ответ на лечение, например, отвечал ли пациент на лечение или нет (кодировали как 1=отвечал).b. Treatment response, such as whether the patient responded to treatment or not (coded as 1=responded).

Анализ данных.Data analysis.

Период последующего наблюдения для анализа выживаемости определяли с даты отбора проб крови до последнего наблюдения (т.е. последней информации, полученной от пациента) или смерти. Все образцы крови брали в течение суток до лечения антителом к PD1. Для анализа общей выживаемости пациенты, которые были живы при последнем наблюдении, подвергались цензурированию, а пациенты, которые умерли, считались событием. Кумулятивные вероятности выживания по Каплану-Мейеру рассчитывали вместе с 95% доверительными интервалами (CI) и сравнивали с использованием двухсторонних логарифмических ранговых критериев, р-значения для общей выживаемости рассчитываются по двухсторонним логарифмическим ранговым критериям. Одна модель была с групповой переменной на основе GDF-15 как категориального предиктора (группы: <1,5 нг/мл (n=62), >1,5 нг/мл (n=37) или GDF15^низкий (n=49), GDF-15^{высокИй} (n=50), на основании расщепления медианы). Полученные кривые КапланаМейера показаны на фигурах 12 и 13, где цензурирование обозначено вертикальными линиями. Дополнительно, следующие таблицы содержат краткое изложение случаев (табл. 9), данные о выживании паThe follow-up period for survival analysis was defined from the date of blood sampling until the last follow-up (i.e., the last information received from the patient) or death. All blood samples were collected within 24 hours before anti-PD1 antibody treatment. For overall survival analyses, patients who were alive at last follow-up were censored, and patients who died were considered an event. Kaplan-Meier cumulative probabilities of survival were calculated along with 95% confidence intervals (CIs) and compared using two-sided log-rank tests, and p-values for overall survival were calculated using two-sided log-rank tests. One model was with a group variable based on GDF-15 as a categorical predictor (groups: <1.5 ng/ml (n=62), >1.5 ng/ml (n=37) or GDF15 ^low (n=49) , GDF-15 ^HIGH (n=50), based on median split). The resulting Kaplan-Meier curves are shown in Figures 12 and 13, where censoring is indicated by vertical lines. Additionally, the following tables provide a summary of cases (Table 9), survival data

- 43 044887 циентов для групп пациентов, имеющих уровни GDF-15 <1,5 нг/мл и >1,5 нг/мл (табл. 10 и 11) и общие статистические сравнения групп пациентов, имеющих уровни GDF-15 <1,5 нг/мл и >1,5 нг/мл (табл. 12).- 43 044887 patients for groups of patients with GDF-15 levels <1.5 ng/ml and >1.5 ng/ml (Tables 10 and 11) and general statistical comparisons of groups of patients with GDF-15 levels <1, 5 ng/ml and >1.5 ng/ml (Table 12).

Таблица 9Table 9

Краткое изложение случаевSummary of cases

Число Number Число событий Number of events Цензурированные Censored И* AND* % выживания % survival GDF-15 <1,5 нг/мл GDF-15 <1.5 ng/ml 62 62 11 eleven 51 51 82,3% 82.3% GDF-15 >1,5 нг/мл GDF-15 >1.5 ng/ml 37 37 18 18 19 19 51,4% 51.4% Всего Total 99 99 29 29 70 70 70,7% 70.7%

*Н=без события.*N=no event.

Таблица 10Table 10

Среднее и медиана для выживаемости (число суток выживания)Mean and median for survival (number of days surviving)

Среднее^а Average ^a Медиана Median Оценка Grade Стандарт ная ошибка Standard Naya error 95%доверительный интервал 95% confidence interval Оценка Grade Стандартная ошибка Standard error Нижний предел Lower limit Верхний предел Upper limit <1,5нг/мл <1.5ng/ml 701,928 701,928 44,172 44.172 615,350 615,350 788,506 788.506 n/d. n/d. n/d. n/d. >1,5нг/мл >1.5ng/ml 381,683 381,683 48,882 48,882 285,875 285.875 477,491 477.491 309,000 309,000 127,570 127,570 Всего Total 569,056 569,056 44,477 44,477 481,882 481,882 656,231 656.231 n/d. n/d. n/d. n/d.

а. После цензурирования оценка ограничена наиболее долгим известным выживанием.A. After censoring, the estimate is limited to the longest known survival.

n/d: невозможно рассчитать медиану данных выживаемости из-за наличия менее >50% выживших в группе.n/d: Median survival data cannot be calculated due to less than >50% survivors in the cohort.

Таблица 11Table 11

Среднее и медиана для длительности выживания (число суток выживания)Mean and median for survival duration (number of days surviving)

Медиана^а Median ^a 95%-доверительный интервал 95% confidence interval Нижний предел lower limit Верхний предел Upper limit <1,5нг/мл <1.5ng/ml n/d. n/d. n/d. n/d. >1,5нг/мл >1.5ng/ml 58,963 58,963 559,037 559,037 ВСего Total n/d. n/d. n/d. n/d.

Таблица 12Table 12

Общие сравненияGeneral comparisons

Хи-квадрат Chi-square df* df* Значимость Significance Логарифмический критерий Мантеля) Logarithmic Mantel test) (Кокса- (Cox- 8, 129 8, 129 1 1 .004 .004

*df=степени свободы.*df=degrees of freedom.

Тест на равное распределение выживаемости для различных уровней GDF-15 <1,5нг/мл, >1,5нг/мл).Test for equal survival distribution for different GDF-15 levels <1.5ng/ml, >1.5ng/ml).

Результаты и выводы.Results and conclusions.

- 44 044887- 44 044887

Вышеуказанные статистические результаты этого примера дополнительно подтвердили результаты примера 1. Например, они подтверждают, что вероятность ответа на лечение, на что указывает выживаемость пациентов, значительно снижается с увеличением уровней hGDF-15 в сыворотках пациентов. Например, табл. 12 показывает, что выживаемость между двумя группами пациентов, имеющими уровни GDF-15 <1,5нг/мл и >1,5нг/мл, соответственно, значимо различалась, о чем свидетельствует уровень значимости 0,004. Аналогичным образом, табл. 9 демонстрирует, что в группе, имеющей уровни GDF-15 <1,5нг/мл, выжило более высокое процентное содержание пациентов (82,3%), и табл. 10 и 11, и фиг. 12 и 13 демонстрируют, что для пациентов с уровнями GDF-15 <1,5нг/мл, время выживания было заметно длиннее, чем у пациентов с уровнями GDF-15>1,5нг/мл.The above statistical results of this example further confirmed the results of example 1. For example, they confirm that the likelihood of response to treatment, as indicated by patient survival, decreases significantly with increasing levels of hGDF-15 in patient sera. For example, table. 12 shows that survival between the two groups of patients having GDF-15 levels <1.5 ng/ml and >1.5 ng/ml, respectively, was significantly different, as indicated by a significance level of 0.004. Similarly, table. Table 9 demonstrates that in the group with GDF-15 levels <1.5 ng/ml, a higher percentage of patients survived (82.3%), and table. 10 and 11, and figs. 12 and 13 demonstrate that for patients with GDF-15 levels <1.5 ng/mL, survival time was markedly longer than for patients with GDF-15 levels >1.5 ng/mL.

Таким образом, результаты этого примера дополнительно подтверждают, что hGDF-15 оказывает негативное влияние на ответы пациентов на лечение блокаторами контрольных точек иммунного ответа. Таким образом, по изобретению, ингибитор hGDF-15 будет полезен для ингибирования отрицательных эффектов hGDF-15 на ответы пациентов на лечение блокаторами контрольных точек иммунного ответа, и для улучшения ответов пациентов на лечение блокаторами контрольных точек иммунного ответа не только при меланоме, но и при всех солидных злокачественных опухолях, упоминаемых в настоящем документе.Thus, the results of this example further support that hGDF-15 has a negative impact on patient responses to immune checkpoint blocker treatment. Thus, according to the invention, an hGDF-15 inhibitor will be useful for inhibiting the negative effects of hGDF-15 on patient responses to immune checkpoint blocker treatment, and for improving patient responses to immune checkpoint blocker treatment, not only in melanoma, but also in all solid malignant tumors mentioned in this document.

Пример 6. При немелкоклеточном раке легких человека (NSCLC).Example 6: For human non-small cell lung cancer (NSCLC).

пациентов лечили антителом к PD1; медианы сывороточных уровней hGDF-15 у пациентов с прогрессирующим заболеванием были выше, чем у пациентов, демонстрирующих частичный ответ.patients were treated with anti-PD1 antibody; The median serum hGDF-15 levels in patients with progressive disease were higher than in patients demonstrating a partial response.

Этот пример проводили с целью дальнейшей проверки результатов, полученных в исследовании из примера 1, например, подтверждение того, что hGDF-15 влияет на реакцию пациентов на блокаторы контрольных точек иммунного ответа, в дополнительном самостоятельном исследовании при другой солидной злокачественной опухоли.This example was conducted to further validate the results obtained in the study of example 1, for example, confirmation that hGDF-15 influences the response of patients to immune checkpoint blockers, in an additional independent study in another solid tumor.

Пациенты.Patients.

Пациентов с NSCLC лечили антителами к PD1 в соответствии с с одобренной инструкцией по применению антител к PD1. Пациенты включали пациентов, которых ранее лечили другой терапией против злокачественной опухоли. В связи с тем фактом, что у пациентов с NSCLC редко наблюдается полный ответ, группа пациентов включала пациентов, демонстрирующих прогрессирующее заболевание и показывающих частичный ответ при лечении против PD-1, но не пациентов, показывающих полный ответ при лечении против PD-1.Patients with NSCLC were treated with anti-PD1 antibodies according to the approved label for anti-PD1 antibodies. Patients included patients who had previously been treated with other cancer therapy. Due to the fact that patients with NSCLC rarely experience a complete response, the patient cohort included patients demonstrating progressive disease and showing a partial response with anti-PD-1 treatment, but not patients showing a complete response with anti-PD-1 treatment.

Образцы сыворотки.Serum samples.

Образцы сыворотки брали у пациентов перед лечением антителами к PD1.Serum samples were collected from patients before anti-PD1 antibody treatment.

Сывороточные уровни hGDF-15 в образцах сыворотки анализировали путем твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), как описано в примере 1.Serum levels of hGDF-15 in serum samples were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) as described in Example 1.

Результаты.Results.

Получали сывороточные уровни hGDF-15 у 5 пациентов, показывающих частичный ответ при лечении с анти-PD-1, и у 5 пациентов, показывающих прогрессирующее заболевание при лечении с помощью αнтu-PD-1. Примечательно, что средний уровень hGDF-15 в сыворотке у пациентов с частичным ответом составлял 0,55 нг/мл, тогда как средний уровень hGDF-15 в сыворотке у пациентов с прогрессирующим заболеванием составлял 1,56 нг/мл. Таким образом, средний уровень hGDF-15 в сыворотке у пациентов, демонстрирующих прогрессирующее заболевание, был приблизительно в 2,8 раза выше, чем у пациентов, проявляющих частичный ответ.Serum hGDF-15 levels were obtained from 5 patients showing partial response when treated with anti-PD-1 and 5 patients showing progressive disease when treated with αntu-PD-1. Notably, the mean serum hGDF-15 level in patients with partial response was 0.55 ng/mL, whereas the mean serum hGDF-15 level in patients with progressive disease was 1.56 ng/mL. Thus, the mean serum hGDF-15 level in patients demonstrating progressive disease was approximately 2.8 times higher than in patients demonstrating a partial response.

Выводы.Conclusions.

Результаты этого примера дополнительно подтверждают, что уровни hGDF-15 отрицательно коррелируют с ответом пациентов на блокаторы контрольных точек иммунного ответа. Результаты этого примера также подтверждают, что hGDF-15 оказывает отрицательное влияние на ответы пациентов на лечение блокаторами контрольных точек иммунного ответа, таких как PD-1. Таким образом, по изобретению, ингибитор hGDF-15 будет полезен для ингибирования отрицательных эффектов hGDF-15 на ответы пациентов на лечение блокаторами контрольных точек иммунного ответа, и для улучшения ответов пациентов на лечение блокаторами контрольных точек иммунного ответа не только при меланоме, но и при раке легких, таком как NSCLC, и при всех других солидных злокачественных опухолях, упоминаемых в настоящем документе.The results of this example further confirm that hGDF-15 levels negatively correlate with patient response to immune checkpoint blockers. The results of this example also confirm that hGDF-15 has a negative impact on patient responses to treatment with immune checkpoint blockers such as PD-1. Thus, according to the invention, an hGDF-15 inhibitor will be useful for inhibiting the negative effects of hGDF-15 on patient responses to immune checkpoint blocker treatment, and for improving patient responses to immune checkpoint blocker treatment, not only in melanoma, but also in lung cancer such as NSCLC, and all other solid malignancies mentioned herein.

Пример 7. Сывороточные уровни hGDF-15 не коррелируют значимо с мутационной нагрузкой опухолей.Example 7 Serum levels of hGDF-15 do not correlate significantly with the mutational load of tumors.

Мутационная нагрузка является известным положительным прогностическим фактором для ответа пациентов со злокачественной опухолью на блокаторы контрольных точек иммунного ответа. Как правило, злокачественные клетки несут геномные мутации, которые приводят к образованию антигенов злокачественных клеток, которые являются специфичными для злокачественных клеток и отличаются от антигенов незлокачественных клеток. Высокая мутационная нагрузка приводит к большому числу такихMutation load is a known positive prognostic factor for the response of patients with cancer to immune checkpoint blockers. Typically, malignant cells carry genomic mutations that lead to the formation of malignant cell antigens that are specific to malignant cells and different from antigens of non-malignant cells. A high mutational load leads to a large number of such

- 45 044887 опухолеспецифических антигенов. В злокачественных опухолях, несущих такое большое количество антигенов, специфических для злокачественных клеток, стимуляция иммунного ответа блокаторами контрольных точек иммунного ответа считается особенно эффективной, поскольку больше антигенов, специфических для злокачественных клеток, доступны в качестве целевых антигенов для иммунного ответа.- 45 044887 tumor-specific antigens. In malignant tumors that harbor such a large number of malignant cell-specific antigens, stimulation of the immune response with immune checkpoint blockers is considered particularly effective because more malignant cell-specific antigens are available as target antigens for the immune response.

Чтобы еще раз подтвердить, что hGDF-15 не только является суррогатным маркером мутационной нагрузки опухолей, и для того, чтобы еще раз подтвердить, что лечение ингибиторами hGDF-15 действует через механизм, который не зависит от мутационной нагрузки опухоли, уровни мРНК hGDF-15 в образцах злокачественной опухоли от пациентов со злокачественной опухолью были сопоставлены с количеством соматических мутаций, выявленных в злокачественных опухолях. Соматические мутации определяли путем использования секвенирования экзомов. Данные анализировали с использованием вебинструмента UZH из университетской больницы Цюриха (Cheng PF et al. : Data mining The Cancer Genome Atlas in the era of precision cancer medicine. Swiss Med Wkly. 2015 Sep 16;145:w14183.). Результаты показаны на фиг. 14. Фиг. 14А показывает график данных пациентов со злокачественной опухолью, полученными из Атласа ракового генома (TGCA), учитывая только пациентов с высокодифференцированной злокачественной меланомой (Атлас ракового генома описан в ссылке Cheng PF et al. : Data mining The Cancer Genome Atlas in the era of precision cancer medicine. Swiss Med Wkly. 2015 Sep 16;145:w14183). Экспрессию GDF-15 оценивали путем нормализации с использованием пакета программного обеспечения RSEM (RNA-Seq путем максимизации ожидания) (Li В и Dewey CN: RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics. 2011 Aug 4; 12:323. doi: 10,118 6/1471-2105-12-323.). Фиг. 14В показывает график данных пациентов со злокачественной опухолью от 40 дополнительных пациентов с метастатической злокачественной меланомой из Университетского госпиталя Цюриха, которых анализировали отдельно.To further confirm that hGDF-15 is not only a surrogate marker of tumor mutational burden, and to further confirm that treatment with hGDF-15 inhibitors acts through a mechanism that is independent of tumor mutational burden, hGDF-15 mRNA levels in malignant tumor samples from patients with malignant tumors were compared with the number of somatic mutations identified in malignant tumors. Somatic mutations were determined using exome sequencing. Data were analyzed using the UZH web tool from the University Hospital of Zurich (Cheng PF et al.: Data mining The Cancer Genome Atlas in the era of precision cancer medicine. Swiss Med Wkly. 2015 Sep 16;145:w14183.). The results are shown in Fig. 14. Fig. 14A shows a plot of cancer patient data obtained from The Cancer Genome Atlas (TGCA), considering only patients with high-grade malignant melanoma (The Cancer Genome Atlas is described in Cheng PF et al.: Data mining The Cancer Genome Atlas in the era of precision cancer medicine. Swiss Med Wkly. 2015 Sep 16;145:w14183). GDF-15 expression was assessed by normalization using the RSEM (RNA-Seq by Expectation Maximization) software package (Li B and Dewey CN: RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics. 2011 Aug 4; 12:323. doi: 10.118 6/1471-2105-12-323.). Fig. 14B shows a graph of cancer patient data from 40 additional patients with metastatic malignant melanoma from the University Hospital Zurich who were analyzed separately.

Примечательно, что обе фиг. 14А и 14В показывают значение р 0,5, что указывает на отсутствие значимой корреляции между мутационной нагрузкой в злокачественных опухолях и уровнями hGDF-15. Эти результаты еще раз подтверждают, что hGDF-15 не только является суррогатным маркером мутационной нагрузки опухолей, а что лечение с ингибиторами hGDF-15 действует через механизм, который не зависит от мутационной нагрузки опухоли.It is noteworthy that both figs. 14A and 14B show a p value of 0.5, indicating that there is no significant correlation between mutational load in cancers and hGDF-15 levels. These results further confirm that hGDF-15 is not only a surrogate marker of tumor mutational burden, but that treatment with hGDF-15 inhibitors acts through a mechanism that is independent of tumor mutational burden.

Пример 8. Инфильтрация CD8+ Т-клетками опухолей дикого типа или опухолей, (сверх)экспрессирующих человеческий GDF-15.Example 8 CD8+ T cell infiltration of wild-type tumors or tumors (over)expressing human GDF-15.

В пилотном исследовании с использованием клеток рака толстого кишечника МС38 или дикого типа, или (сверх)экспрессирующих человеческий GDF-15, имплантированных в правый бок иммунокомпетентных сингенных мышей C57BL/6, сверхэкспрессия GDF-15 была ассоциирована со сниженной инфильтрацией иммунными клетками. Изображения иммуноцитохимии для CD8a у мышей, умерщвленных через 29 суток носительства опухолей дикого типа или опухолей, сверхэкспрессирующих трансгенный (tg) hGDF15, показаны на фиг. 15. Как видно на фигуре, опухоли дикого типа содержат больше CD8а-положительных клеток, чем опухоли, сверхэкспрессирующие трансгенный (tg) hGDF15.In a pilot study using either wild-type or (over)expressing human GDF-15 MC38 colon cancer cells implanted into the right flank of immunocompetent syngeneic C57BL/6 mice, GDF-15 overexpression was associated with reduced immune cell infiltration. Immunocytochemistry images for CD8a in mice sacrificed after 29 days of carrying wild-type tumors or tumors overexpressing transgenic (tg) hGDF15 are shown in FIG. 15. As can be seen in the figure, wild-type tumors contain more CD8a-positive cells than tumors overexpressing transgenic (tg) hGDF15.

Эти результаты дополнительно подтверждают данные о том, что по настоящему изобретению, hGDF-15 уменьшает процентное содержание CD8+ Т-клеток в солидных злокачественных опухолях, и что наоборот, ингибиторы hGDF-15, такие как антитела к GDF-15, можно использовать для увеличения процентного содержание CD8+ Т-клеток в солидной злокачественной опухоли у пациента-человека.These results further support the findings that, according to the present invention, hGDF-15 reduces the percentage of CD8+ T cells in solid cancers, and that conversely, hGDF-15 inhibitors, such as anti-GDF-15 antibodies, can be used to increase the percentage CD8+ T cell content in a solid malignant tumor in a human patient.

Промышленная применимость.Industrial applicability.

Комбинации ингибиторов, композиции и наборы по настоящему человека могут быть промышленно произведены и проданы как продукты для заявленных способов и применений (например, для лечения злокачественной опухоли, как определено в настоящем документе), в соответствии с известными стандартами для получения фармацевтических препаратов. Таким образом, настоящее изобретение имеет промышленную применимость.The inhibitor combinations, compositions and kits herein can be manufactured and marketed as products for the claimed methods and uses (eg, for the treatment of cancer as defined herein), in accordance with known standards for the production of pharmaceuticals. Thus, the present invention has industrial applicability.

- 46 044887- 46 044887

Ссылки.Links.

Arbabi Ghahroudi M et al.: Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Lett. 1997 Sep 15;414 (3) :521-6.Arbabi Ghahroudi M et al.: Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Lett. 1997 Sep 15;414(3):521-6.

Ausubel et al.: Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates and Wiley Interscience; New York 1992 .Ausubel et al.: Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates and Wiley Interscience; New York 1992.

Bauskin AR et al.: The propeptide mediates formation of stromal stores of PROMIC-1: role in determining prostate cancer outcome. Cancer Res. 2005 Mar 15; 65 ( 6) :2330-6.Bauskin AR et al.: The propeptide mediates formation of stromal stores of PROMIC-1: role in determining prostate cancer outcome. Cancer Res. 2005 Mar 15; 65(6):2330-6.

Brown DA et al.: Macrophage inhibitory cytokine 1: a new prognostic marker in prostate cancer. Clin Cancer Res. 2009 Nov 1; 15(21) :6658-64 .Brown DA et al.: Macrophage inhibitory cytokine 1: a new prognostic marker in prostate cancer. Clin Cancer Res. 2009 Nov 1; 15(21):6658-64.

Cheng PF et al.: Data mining The Cancer Genome Atlas in the era of precision cancer medicine. Swiss Med Wkly. 2015 Sep 16;145:wl4183.Cheng PF et al.: Data mining The Cancer Genome Atlas in the era of precision cancer medicine. Swiss Med Wkly. 2015 Sep 16;145:wl4183.

Chothia C et al.: Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature. 1989 Dec 21-28;342 ( 6252) :877-83 .Chothia C et al.: Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature. 1989 Dec 21-28;342(6252):877-83.

Clackson T et al.: Making antibody fragments using phage display libraries. Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-8.Clackson T et al.: Making antibody fragments using phage display libraries. Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-8.

Mei Cong, Ph.D. et al.: Advertorial: Novel Bioassay to Assess PD-1/PD-L1 Therapeutic Antibodies in Development for Immunotherapy Bioluminescent Reporter-Based PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay. (http://www.genengnews. com/gen-articles/advertorialnovel-bioassay-to-assess-pd-1-pd-11-therapeutic-antibodies-indevelopment-for-immun/5511/).Mei Cong, Ph.D. et al.: Advertorial: Novel Bioassay to Assess PD-1/PD-L1 Therapeutic Antibodies in Development for Immunotherapy Bioluminescent Reporter-Based PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay. (http://www.genengnews.com/gen-articles/advertorialnovel-bioassay-to-assess-pd-1-pd-11-therapeutic-antibodies-indevelopment-for-immun/5511/).

Cully M: Combinations with checkpoint inhibitors at wavefront of cancer immunotherapy. Nat Rev Drug Discov. 2015 Jun;14(6):374-5.Cully M: Combinations with checkpoint inhibitors at wavefront of cancer immunotherapy. Nat Rev Drug Discov. 2015 Jun;14(6):374-5.

Eisenhauer et al.: New response evaluation criteria in solid tumours: revised RECIST guideline (version 1.1) . Eur. J. Cancer. 45, No. 2, January 2009, pp 228-47.Eisenhauer et al.: New response criteria evaluation in solid tumors: revised RECIST guideline (version 1.1). Eur. J. Cancer. 45, No. 2, January 2009, pp. 228-47.

Giudicelli V et al.: IMGT/V-QUEST, an integrated software program for immunoglobulin and T cell receptor V-J and V-D-J rearrangement analysis. Nucleic Acids Res. 2004 Jul 1;32(Web Server issue) :W4 3 5-40.Giudicelli V et al.: IMGT/V-QUEST, an integrated software program for immunoglobulin and T cell receptor V-J and V-D-J rearrangement analysis. Nucleic Acids Res. 2004 Jul 1;32(Web Server issue) :W4 3 5-40.

Gouttefangeas C et al.: Flow Cytometry in Cancer Immunotherapy: Applications, Quality Assurance and Future. (2015) In: Cancer Immunology: Translational Medicine from Bench to Bedside (N. Rezaei editor). Springer. Chapter 25: pages 471486; и способы в соответствии сGouttefangeas C et al.: Flow Cytometry in Cancer Immunotherapy: Applications, Quality Assurance and Future. (2015) In: Cancer Immunology: Translational Medicine from Bench to Bedside (N. Rezaei editor). Springer. Chapter 25: pages 471486; and methods in accordance with

Harlow and Lane: Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1988 .Harlow and Lane: Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1988.

Holliger P et al.: Diabodies: small bivalent and bispecific antibody fragments. Proc Natl Acad Sci USA. 1993Holliger P et al.: Diabodies: small bivalent and bispecific antibody fragments. Proc Natl Acad Sci USA. 1993

- 47 044887- 47 044887

Jul 15; 90(14) :6444-8 .Jul 15; 90(14):6444-8.

Holt LJ et al.: Domain antibodies: proteins for therapy. Trends Biotechnol. 2003 Nov;21(11):484-90.Holt LJ et al.: Domain antibodies: proteins for therapy. Trends Biotechnol. 2003 Nov;21(11):484-90.

Huang CY et al.: Molecular alterations in prostate carcinomas that associate with in vivo exposure to chemotherapy: identification of a cytoprotective mechanism involving growth differentiation factor 15. Clin Cancer Res. 2007 Oct 1; 13 (19) :5825-33 .Huang CY et al.: Molecular alterations in prostate carcinomas that associate with in vivo exposure to chemotherapy: identification of a cytoprotective mechanism involving growth differentiation factor 15. Clin Cancer Res. 2007 Oct 1; 13(19):5825-33.

Jackson and Linsley: Recognizing and avoiding siRNA offtarget effects for target identification and therapeutic application. Nat Rev Drug Discov. 2010 Jan; 9(1):57-67.Jackson and Linsley: Recognizing and avoiding siRNA offtarget effects for target identification and therapeutic application. Nat Rev Drug Discov. 2010 Jan; 9(1):57-67.

Johnen H et al.: Tumor-induced anorexia and weight loss are mediated by the TGF-beta superfamily cytokine MIC-1. Nat Med. 2007 Nov;13(11):1333-40.Johnen H et al.: Tumor-induced anorexia and weight loss are mediated by the TGF-beta superfamily cytokine MIC-1. Nat Med. 2007 Nov;13(11):1333-40.

Jones PT et al.: Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse. Nature. 1986 May 29-Jun 4;321 ( 6069) :522-5.Jones PT et al.: Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse. Nature. 1986 May 29-Jun 4;321 (6069):522-5.

Rabat et al.: Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Dept, of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. 1983.Rabat et al.: Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Dept., of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. 1983.

Kanasty R et al., Delivery materials for siRNA therapeutics., Nat Mater. 2013 Nov; 12(11):967-77.Kanasty R et al., Delivery materials for siRNA therapeutics., Nat Mater. 2013 Nov; 12(11):967-77.

Knoepfel SA et al., Selection of RNAi-based inhibitors for anti-HIV gene therapy. World J Virol. 2012 Jun 12,-1(3):79-90.Knoepfel SA et al., Selection of RNAi-based inhibitors for anti-HIV gene therapy. World J Virol. 2012 Jun 12,-1(3):79-90.

Kohler G and Milstein C: Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975 Aug 7,-256(5517) :495-7.Kohler G and Milstein C: Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975 Aug 7, -256(5517) :495-7.

Lasithiotakis, KG et al., Cancer/107/1331-9. 2006.Lasithiotakis, K. G. et al., Cancer/107/1331-9. 2006.

Li В and Dewey CN: RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics. 2011 Aug 4,-12:323. doi: 10.1186/1471-2105-12323.Li B and Dewey CN: RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics. 2011 Aug 4, -12:323. doi:10.1186/1471-2105-12323.

Marks JD et al.: By-passing immunization. Human antibodiesMarks JD et al.: By-passing immunization. Human antibodies

- 48 044887 from V-gene libraries displayed on phage. J Mol Biol. 1991 Dec 5;222 (3) :581-97 .- 48 044887 from V-gene libraries displayed on phage. J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-97.

Mimeault M and Batra SK: Divergent molecular mechanisms underlying the pleiotropic functions of macrophage inhibitory cytokine-1 in cancer. J Cell Physiol. 2010 Sep;224 (3) :626-35.Mimeault M and Batra SK: Divergent molecular mechanisms underlying the pleiotropic functions of macrophage inhibitory cytokine-1 in cancer. J Cell Physiol. 2010 Sep;224 (3):626-35.

Paul, W.E. (Ed.) .: Fundamental Immunology 2nd Ed. Raven Press, Ltd., New York 1989.Paul, W. E. (Ed.): Fundamental Immunology 2nd Ed. Raven Press, Ltd., New York 1989.

Remington's Pharmaceutical Sciences, Ed. AR Gennaro, 20th edition, 2000, Williams & Wilkins, PA, USA.Remington's Pharmaceutical Sciences, Ed. AR Gennaro, 20th edition, 2000, Williams & Wilkins, PA, USA.

R Core Team (2014) . R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. URL http://www.R-project.org/.R Core Team (2014). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. URL http://www.R-project.org/.

Riechmann L et al.: Reshaping human antibodies for therapy. Nature. 1988 Mar 24,-332(6162):323-7.Riechmann L et al.: Reshaping human antibodies for therapy. Nature. 1988 Mar 24,-332(6162):323-7.

C. Robert et al. N Engl J Med 2015; 372:2521-2532.C. Robert et al. N Engl J Med 2015; 372:2521–2532.

Roth P et al.: GDF-15 contributes to proliferation and immune escape of malignant gliomas. Clin Cancer Res. 2010 Aug 1,-16(15) : 3851-9.Roth P et al.: GDF-15 contributes to proliferation and immune escape of malignant gliomas. Clin Cancer Res. 2010 Aug 1, -16(15) : 3851-9.

Saerens D et al.: Single-domain antibodies as building blocks for novel therapeutics. Curr Opin Pharmacol. 2008 Oct;8(5):600-8. Epub 2008 Aug 22.Saerens D et al.: Single-domain antibodies as building blocks for novel therapeutics. Curr Opin Pharmacol. 2008 Oct;8(5):600-8. Epub 2008 Aug 22.

Sambrook et al.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1989.Sambrook et al.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1989.

Siegel DL: Recombinant monoclonal antibody technology. Transfus Clin Biol. 2002 Jan;9(1) :15-22 .Siegel DL: Recombinant monoclonal antibody technology. Transfus Clin Biol. 2002 Jan;9(1):15-22.

Stefanescu R. et al., Eur.J.Mass Spectrom. 13, 69-75 (2007)Stefanescu R. et al., Eur. J. Mass Spectrom. 13, 69-75 (2007)

Suckau et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1990 December; 87 (24) : 9848-9852.Suckau et al. Proc Natl Acad Sci USA. December 1990; 87 (24): 9848-9852.

Tumeh et al., PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature. 2014 Nov. 27; 515(7528):56871.Tumeh et al., PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature. 2014 Nov. 27; 515(7528):56871.

Van der Burg SH, et al.: Immunoguiding, the final frontier in the immunotherapy of cancer. (2014) In Cancer ImmunotherapyVan der Burg SH, et al.: Immunoguiding, the final frontier in the immunotherapy of cancer. (2014) In Cancer Immunotherapy

--

Claims

meets oncology (CM Britten, S Kreiter, M. Diken & HG Rammensee eds) . Springer International Publishing Switzerland p37-51 ISBN: 978-3-319-05103-1.meets oncology (CM Britten, S Kreiter, M. Diken & HG Rammensee eds) . Springer International Publishing Switzerland p37-51 ISBN: 978-3-319-05103-1.

Weinberg R. et al.: The Biology of Cancer. Garland Science:Weinberg R. et al.: The Biology of Cancer. Garland Science:

New York 2006. 850p.New York 2006. 850p.

Yadav M et al.: Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature. 2014Yadav M et al.: Predicting immunogenic tumor mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature. 2014

Nov 27,-515 (7528) :572-6.Nov 27, -515 (7528) :572-6.

Zhang, J., Yao, Y.-H., Li, B.-G., Yang, Q. , Zhang, P.-Y., and Wang, H.-T. (2015). Prognostic value of pretreatment serum lactate dehydrogenase level in patients with solid tumors: a systematic review and meta-analysis. Scientific Reports 5, 9800Zhang, J., Yao, Y.-H., Li, B.-G., Yang, Q., Zhang, P.-Y., and Wang, H.-T. (2015). Prognostic value of pretreatment serum lactate dehydrogenase level in patients with solid tumors: a systematic review and meta-analysis. Scientific Reports 5, 9800

Zhou et al. Growth differentiation factor-15 suppresses maturation and function of dendritic cells and inhibits tumorspecific immune response. PLoS One. 2013 Nov 13;8 (11) :e78618.Zhou et al. Growth differentiation factor-15 suppresses maturation and function of dendritic cells and inhibits tumor-specific immune response. PLoS One. 2013 Nov 13;8 (11):e78618.

WO 2005/099746WO 2005/099746

WO 2009/021293WO 2009/021293

WO 2014/049087WO 2014/049087

PCT/EP2015/056654PCT/EP2015/056654

WO 2014/100689WO 2014/100689

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM

1. Применение ингибитора hGDF-15 для повышения процентного содержания CD8+ Т-клеток в солидной злокачественной опухоли у пациента-человека, где применение представляет собой применение для лечения злокачественной опухоли путем иммунотерапии злокачественной опухоли, где ингибитор представляет собой моноклональное антитело, способное связываться с hGDF-15, или его hGDF-15связывающую часть, где применение представляет собой применение в комбинации с блокатором контрольных точек иммунного ответа, и где блокатор контрольных точек иммунного ответа выбирают из одной или более следующих групп, состоящих из:1. The use of an hGDF-15 inhibitor to increase the percentage of CD8+ T cells in a solid cancer in a human patient, where the use is the use for treating the cancer by immunotherapy of the cancer, where the inhibitor is a monoclonal antibody capable of binding to hGDF-15. 15, or an hGDF-15 binding portion thereof, wherein the use is use in combination with an immune checkpoint blocker, and wherein the immune checkpoint blocker is selected from one or more of the following groups consisting of:

i) ингибитора человеческого PD-1, причем ингибитор является моноклональным антителом, способным связываться с человеческим PD-1, или его частью, связывающейся с человеческим PD-1; и ii) ингибитора человеческого PD-L1, причем ингибитор является моноклональным антителом, способным связываться с человеческим PD-L1, или его частью, связывающейся с человеческим PD-L1..i) an inhibitor of human PD-1, wherein the inhibitor is a monoclonal antibody capable of binding to human PD-1, or a portion thereof that binds to human PD-1; and ii) an inhibitor of human PD-L1, wherein the inhibitor is a monoclonal antibody capable of binding to human PD-L1, or a portion thereof that binds to human PD-L1.

2. Применение по п.1, где пациент представляет собой пациента, который имеет уровень hGDF-15 в сыворотке, по меньшей мере, 1,2 нг/мл до начала введения ингибитора hGDF-15, где пациент предпочтительно представляет собой пациента, который имеет уровень hGDF-15 в сыворотке, по меньшей мере, 1,5 нг/мл до начала введения ингибитора hGDF-15, и где пациент более предпочтительно представляет собой пациента, который имеет уровень hGDF-15 в сыворотке, по меньшей мере, 1,8 нг/мл до начала введения ингибитора hGDF-15.2. Use according to claim 1, wherein the patient is a patient who has a serum hGDF-15 level of at least 1.2 ng/ml before administration of the hGDF-15 inhibitor, wherein the patient is preferably a patient who has a serum hGDF-15 level of at least 1.5 ng/ml before administration of the hGDF-15 inhibitor, and wherein the patient is more preferably a patient who has a serum hGDF-15 level of at least 1.8 ng/ml before starting hGDF-15 inhibitor administration.

3. Применение по п.1 или 2, где злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из меланомы, колоректального рака, рака предстательной железы, рака головы и шеи, уротелиального рака, рака желудка, рака поджелудочной железы, рака печени, рака яичек, рака яичников, рака эндометрия, рака шейки матки, рака головного мозга, рака молочной железы, рака желудка, почечноклеточной карциномы, саркомы Юинга, немелкоклеточного рака легких и мелкоклеточного рака легких, где злокачественная опухоль предпочтительно выбрана из группы, состоящей из меланомы, колоректального рака, рака предстательной железы, рака головы и шеи, уротелиального рака, рака желудка, рака поджелудочной железы, рака печени, рака яичек, рака яичников, рака эндометрия и рака шейки матки, и где злокачественная опухоль более предпочтительно выбрана из группы, состоящей из меланомы, колоректального рака, рака предстательной железы, рака головы и шеи, уротелиального рака и рака желудка.3. Use according to claim 1 or 2, wherein the malignant tumor is selected from the group consisting of melanoma, colorectal cancer, prostate cancer, head and neck cancer, urothelial cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, liver cancer, testicular cancer, cancer ovarian cancer, endometrial cancer, cervical cancer, brain cancer, breast cancer, gastric cancer, renal cell carcinoma, Ewing's sarcoma, non-small cell lung cancer and small cell lung cancer, wherein the malignant tumor is preferably selected from the group consisting of melanoma, colorectal cancer, cancer prostate, head and neck cancer, urothelial cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, liver cancer, testicular cancer, ovarian cancer, endometrial cancer and cervical cancer, and wherein the malignant tumor is more preferably selected from the group consisting of melanoma, colorectal cancer , prostate cancer, head and neck cancer, urothelial cancer and gastric cancer.

4. Применение по любому из предшествующих пунктов, где злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из меланомы, плоскоклеточной карциномы полости рта, колоректального рака и рака предстательной железы.4. Use as claimed in any one of the preceding claims, wherein the cancer is selected from the group consisting of melanoma, oral squamous cell carcinoma, colorectal cancer and prostate cancer.

5. Применение по любому из предшествующих пунктов, где злокачественная опухоль является меланомой.5. Use according to any of the preceding claims, wherein the malignant tumor is melanoma.

6. Применение по любому из предшествующих пунктов, где связывание представляет собой связы6. Application according to any of the preceding paragraphs, where the binding is a connection

- 50 044887 вание с конформационным или прерывистым эпитопом на hGDF-15, и где конформационный или прерывистый эпитоп состоит из аминокислотных последовательностей SEQ ID No: 25 и SEQ ID No: 26.- 50 044887 with a conformational or discontinuous epitope on hGDF-15, and wherein the conformational or discontinuous epitope consists of the amino acid sequences of SEQ ID No: 25 and SEQ ID No: 26.

7. Применение по п. 5 или 6, где антитело или его антигенсвязывающая часть содержит вариабельный домен тяжелой цепи, который включает область CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, область CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и область CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и где антитело или его антигенсвязывающая часть содержит вариабельный домен легкой цепи, который включает область CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, область CDR2, содержащую аминокислотную последовательность ser-ala-ser, и область CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.7. Use according to claim 5 or 6, wherein the antibody or antigen-binding portion thereof comprises a heavy chain variable domain which includes a CDR1 region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, a CDR2 region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and a region CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and wherein the antibody or antigen-binding portion comprises a light chain variable domain that includes a CDR1 region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, a CDR2 region containing the amino acid sequence ser-ala-ser, and a CDR3 region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.

8. Применение по любому из предшествующих пунктов, где применение представляет собой применение для лечения метастазов злокачественной опухоли.8. Use according to any of the preceding claims, where the use is for the treatment of metastases of a malignant tumor.

9. Применение по любому из предшествующих пунктов, где ингибитор hGDF-15 повышает процентное содержание CD8+ Т-клеток в злокачественной опухоли за счет повышения адгезии CD8+ Тклеток к эндотелиальным клеткам и, таким образом, повышения проникновения CD8+ Т-клеток из кровотока в злокачественную опухоль.9. Use as claimed in any one of the preceding claims, wherein the hGDF-15 inhibitor increases the percentage of CD8+ T cells in a malignant tumor by increasing the adhesion of CD8+ T cells to endothelial cells and thereby increasing the penetration of CD8+ T cells from the bloodstream into the malignant tumor.

10. Применение по любому из предшествующих пунктов, где блокатор контрольных точек иммунного ответа содержит моноклональное антитело, способное связываться с человеческим PD-1, или его антигенсвязывающую часть.10. Use as claimed in any one of the preceding claims, wherein the immune checkpoint blocker comprises a monoclonal antibody capable of binding to human PD-1, or an antigen-binding portion thereof.

11. Применение по любому из предшествующих пунктов, где блокатор контрольных точек иммунного ответа содержит моноклональное антитело, способное связываться с человеческим PD-L1, или его антигенсвязывающую часть.11. Use as claimed in any one of the preceding claims, wherein the immune checkpoint blocker comprises a monoclonal antibody capable of binding to human PD-L1, or an antigen-binding portion thereof.

12. Композиция для лечения солидной злокачественной опухоли, где композиция содержит ингибитор hGDF-15 и блокатор контрольных точек иммунного ответа, где ингибитор представляет собой моноклональное антитело, способное связываться с hGDF-15, или его hGDF-15-связывающую часть, где блокатор контрольных точек иммунного ответа выбирают из одной или более следующих групп, состоящих из:12. A composition for the treatment of a solid malignant tumor, where the composition contains an hGDF-15 inhibitor and an immune checkpoint blocker, where the inhibitor is a monoclonal antibody capable of binding to hGDF-15, or an hGDF-15-binding part thereof, where the checkpoint blocker immune response is selected from one or more of the following groups consisting of:

i) ингибитора человеческого PD-1, причем ингибитор является моноклональным антителом, способным связываться с человеческим PD-1, или его частью, связывающейся с человеческим PD-1; и ii) ингибитора человеческого PD-L1, причем ингибитор является моноклональным антителом, способным связываться с человеческим PD-L1, или его частью, связывающейся с человеческим PD-L1.i) an inhibitor of human PD-1, wherein the inhibitor is a monoclonal antibody capable of binding to human PD-1, or a portion thereof that binds to human PD-1; and ii) an inhibitor of human PD-L1, wherein the inhibitor is a monoclonal antibody capable of binding to human PD-L1, or a portion thereof that binds to human PD-L1.

13. Композиция по п.12, где ингибитор hGDF-15 такой, как определено в п.6 или 7.13. The composition according to claim 12, wherein the hGDF-15 inhibitor is as defined in claim 6 or 7.

14. Композиция по п.12 или 13, где блокатор контрольных точек иммунного ответа такой, как определено в п.10 или 11.14. The composition of claim 12 or 13, wherein the immune checkpoint blocker is as defined in claim 10 or 11.

15. Применение композиции по любому из пп.12-14 для лечения солидной злокачественной опухоли.15. Use of a composition according to any one of claims 12 to 14 for the treatment of a solid malignant tumor.

16. Набор для лечения солидной злокачественной опухоли, где набор содержит ингибитор hGDF-15 и по меньшей мере один блокатор контрольных точек иммунного ответа, где ингибитор представляет собой моноклональное антитело, способное связываться с hGDF-15, или его hGDF-15-связывающую часть, где блокатор контрольных точек иммунного ответа выбирают из одной или более следующих групп, состоящих из:16. A kit for the treatment of a solid malignant tumor, where the kit contains an hGDF-15 inhibitor and at least one immune checkpoint blocker, where the inhibitor is a monoclonal antibody capable of binding to hGDF-15, or an hGDF-15-binding portion thereof, wherein the immune checkpoint blocker is selected from one or more of the following groups consisting of:

17. Набор по п.16, где ингибитор hGDF-15 такой, как определено в п.6 или 7.17. The kit according to claim 16, wherein the hGDF-15 inhibitor is as defined in claim 6 or 7.

18. Набор по п.16 или 17, где блокатор контрольных точек иммунного ответа такой, как определено в п.10 или 11.18. The kit of claim 16 or 17, wherein the immune checkpoint blocker is as defined in claim 10 or 11.

19. Набор по любому из пп.16-18, где ингибитор hGDF-15 и один, или несколько, или все из блокаторов контрольных точек иммунного ответа содержатся в раздельных контейнерах или в одном контейнере.19. The kit according to any one of claims 16 to 18, wherein the hGDF-15 inhibitor and one, or more, or all of the immune checkpoint blockers are contained in separate containers or in the same container.

20. Применение набора или композиции по любому из пп.15-19 для лечения солидной злокачественной опухоли.20. Use of a kit or composition according to any one of claims 15 to 19 for the treatment of a solid malignant tumor.

21. Применение по п.20, где применение представляет собой применение для иммунотерапии злокачественной опухоли.21. Use according to claim 20, where the use is use for immunotherapy of a malignant tumor.

22. Применение по п.21, где злокачественная опухоль такая, как определено в п.3, 4 или 5.22. Use according to claim 21, wherein the malignant tumor is as defined in claim 3, 4 or 5.

23. Применение ингибитора hGDF-15 для иммунотерапии злокачественной опухоли, при этом применение представляет собой применение для лечения солидной злокачественной опухоли при помощи блокатора контрольных точек иммунного ответа у пациента-человека, где ингибитор представляет собой моноклональное антитело, способное связываться с hGDF-15, или его hGDF-15-связывающую часть, где блокатор контрольных точек иммунного ответа выбирают из одной или более следующих групп, состоящих из:23. Use of an hGDF-15 inhibitor for immunotherapy of a cancer, wherein the use is for the treatment of a solid tumor with an immune checkpoint blocker in a human patient, wherein the inhibitor is a monoclonal antibody capable of binding to hGDF-15, or an hGDF-15 binding portion thereof, wherein the immune checkpoint blocker is selected from one or more of the following groups consisting of:

- 51 044887- 51 044887

24. Применение по п.23, где пациент такой, как определено в п.2.24. Use according to claim 23, where the patient is as defined in claim 2.

25. Применение по п.23 или 24, где злокачественная опухоль такая как определено в п.3, 4 или 5.25. Use according to claim 23 or 24, wherein the malignant tumor is as defined in claim 3, 4 or 5.

26. Применение по любому из пп.23-25, где ингибитор hGDF-15 такой как определено в п.6 или 7.26. Use according to any one of claims 23 to 25, wherein an hGDF-15 inhibitor such as defined in claim 6 or 7.

27. Применение по любому из пп.23-26, где блокатор контрольных точек иммунного ответа такой, как определено в п.10 или 11.27. Use according to any one of claims 23 to 26, wherein the immune checkpoint blocker is as defined in claim 10 or 11.

28. Применение по любому из пп.23-27, где ингибитор hGDF-15 повышает процентное содержание CD8+ Т-клеток в злокачественной опухоли.28. Use according to any one of claims 23 to 27, wherein the hGDF-15 inhibitor increases the percentage of CD8+ T cells in the malignant tumor.

29. Применение по п.28, где ингибитор hGDF-15 повышает процентное содержание CD8+ Т-клеток в злокачественной опухоли за счет повышения адгезии CD8+ Т-клеток к эндотелиальным клеткам или прокатывания CD8+ Т-клеток на эндотелиальных клетках и, таким образом, повышения проникновения CD8+ Т-клеток из кровотока в злокачественную опухоль.29. Use according to claim 28, wherein the hGDF-15 inhibitor increases the percentage of CD8+ T cells in a malignant tumor by increasing the adhesion of CD8+ T cells to endothelial cells or rolling CD8+ T cells on endothelial cells and thereby increasing penetration CD8+ T cells from the bloodstream into the malignant tumor.

30. Применение комбинации ингибитора hGDF-15 и блокатора контрольных точек иммунного ответа для лечения солидной злокачественной опухоли у пациента-человека, где применение представляет собой применение для иммунотерапии злокачественной опухоли, где ингибитор представляет собой моноклональное антитело, способное связываться с hGDF-15, или его hGDF-15-связывающую часть, где блокатор контрольных точек иммунного ответа выбирают из одной или более следующих групп, состоящих из:30. The use of a combination of an hGDF-15 inhibitor and an immune checkpoint blocker for the treatment of a solid cancer in a human patient, where the use is a use for immunotherapy of the cancer, where the inhibitor is a monoclonal antibody capable of binding to hGDF-15, or its an hGDF-15 binding moiety, wherein the immune checkpoint blocker is selected from one or more of the following groups consisting of:

31. Применение комбинации ингибитора hGDF-15 и блокатора контрольных точек иммунного ответа по п.30, где пациент такой, как определено в п.2.31. Use of a combination of an hGDF-15 inhibitor and an immune checkpoint blocker according to claim 30, wherein the patient is as defined in claim 2.

32. Применение комбинации ингибитора hGDF-15 и блокатора контрольных точек иммунного ответа по п.30 или 31, где злокачественная опухоль такая, как определено в п.3, 4 или 5.32. Use of a combination of an hGDF-15 inhibitor and an immune checkpoint blocker according to claim 30 or 31, wherein the malignancy is as defined in claim 3, 4 or 5.

33. Применение комбинации ингибитора hGDF-15 и блокатора контрольных точек иммунного ответа по любому из пп.30-32, где ингибитор hGDF-15 такой, как определено в п.6 или 7.33. Use of a combination of an hGDF-15 inhibitor and an immune checkpoint blocker according to any one of claims 30 to 32, wherein the hGDF-15 inhibitor is as defined in claim 6 or 7.

34. Применение комбинации ингибитора hGDF-15 и блокатора контрольных точек иммунного ответа по любому из пп.30-33, где блокатор контрольных точек иммунного ответа такой, как определено в п.10 или 11.34. Use of a combination of an hGDF-15 inhibitor and an immune checkpoint blocker according to any one of claims 30 to 33, wherein the immune checkpoint blocker is as defined in claim 10 or 11.

35. Применение комбинации ингибитора hGDF-15 и блокатора контрольных точек иммунного ответа по любому из пп.30-34, где ингибитор hGDF-15 повышает процентное содержание CD8+ Т-клеток в злокачественной опухоли.35. Use of a combination of an hGDF-15 inhibitor and an immune checkpoint blocker according to any one of claims 30 to 34, wherein the hGDF-15 inhibitor increases the percentage of CD8+ T cells in a malignant tumor.

36. Применение комбинации ингибитора hGDF-15 и блокатора контрольных точек иммунного ответа по п.35, где ингибитор hGDF-15 повышает процентное содержание CD8+ Т-клеток в злокачественной опухоли за счет повышения адгезии CD8⁺Т-клеток к эндотелиальным клеткам, и, таким образом, повышения проникновения CD8+ Т-клеток из кровотока в злокачественную опухоль, и где предпочтительно, указанное повышение адгезии CD8+ T-клеток к эндотелиальным клеткам повышает прокатывание CD8+ T-клеток на эндотелиальных клетках таким образом, что повышается указанное проникновение CD8+ Т-клеток из кровотока в солидную злокачественную опухоль.36. Use of a combination of an hGDF-15 inhibitor and an immune checkpoint blocker according to claim 35, wherein the hGDF-15 inhibitor increases the percentage of CD8+ T cells in a malignant tumor by increasing the adhesion of CD8 ⁺ T cells to endothelial cells, and thus thereby increasing the penetration of CD8+ T cells from the bloodstream into the malignant tumor, and where preferably, said increase in CD8+ T cell adhesion to endothelial cells increases the rolling of CD8+ T cells onto the endothelial cells such that said penetration of CD8+ T cells from the bloodstream is increased into a solid malignant tumor.

37. Применение по любому из пп.1-11, которое представляет собой применение в комбинации с полиинозиновой:полицитидиловой кислотой, или применение комбинации ингибитора hGDF-15 и блокатора контрольных точек иммунного ответа по любому из пп.30-36, где комбинация представляет собой комбинацию с полиинозиновой:полицитидиловой кислотой.37. Use according to any one of claims 1 to 11, which is use in combination with polyinosinic:polycytidylic acid, or use of a combination of an hGDF-15 inhibitor and an immune checkpoint blocker according to any one of claims 30 to 36, wherein the combination is combination with polyinosinic:polycytidylic acid.

38. Применение по любому из пп.1-11 и 37, которое представляет собой применение в комбинации с иммуностимулирующим антителом к человеческому CD40, предпочтительно иммуностимулирующим моноклональным антителом к человеческому CD40, или применение комбинации по любому из пунктов 30-37, где комбинация представляет собой комбинацию с иммуностимулирующим антителом к человеческому CD40, предпочтительно иммуностимулирующим моноклональным антителом к человеческому CD40.38. Use according to any one of claims 1 to 11 and 37, which is use in combination with an immunostimulating anti-human CD40 antibody, preferably an immunostimulating monoclonal antibody to human CD40, or use of a combination according to any one of claims 30 to 37, wherein the combination is combination with an anti-human CD40 immunostimulatory antibody, preferably an anti-human CD40 immunostimulatory monoclonal antibody.

39. Применение комбинации ингибитора hGDF-15 и любого одного из следующих:39. Use of a combination of an hGDF-15 inhibitor and any one of the following:

b) иммуностимулирующее антитело к человеческому CD40, предпочтительно иммуностимулирующее моноклональное антитело к человеческому CD40; илиb) an anti-human CD40 immunostimulatory antibody, preferably an anti-human CD40 immunostimulatory monoclonal antibody; or

c) полиинозиновая:полицитидиловая кислота и иммуностимулирующее антитело к человеческому CD40, предпочтительно иммуностимулирующее моноклональное антитело к человеческому CD40, для лечения солидной злокачественной опухоли у пациента-человека, где комбинация включает блокатор контрольных точек иммунного ответа, выбранный из одной или более следующих групп, соc) polyinosinic:polycytidylic acid and an anti-human CD40 immunostimulatory antibody, preferably an anti-human CD40 immunostimulatory monoclonal antibody, for the treatment of a solid malignant tumor in a human patient, wherein the combination includes an immune checkpoint blocker selected from one or more of the following groups, with

--