EA044813B1 - ADENOVIRUS AND ITS APPLICATIONS - Google Patents
ADENOVIRUS AND ITS APPLICATIONS Download PDFInfo
- Publication number
- EA044813B1 EA044813B1 EA202091074 EA044813B1 EA 044813 B1 EA044813 B1 EA 044813B1 EA 202091074 EA202091074 EA 202091074 EA 044813 B1 EA044813 B1 EA 044813B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- vector
- nucleic acid
- acid sequence
- seq
- adenovirus
- Prior art date
Links
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 title description 58
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 245
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 109
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 108
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 106
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 71
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 64
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 63
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 39
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 38
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 35
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 33
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 33
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 31
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 31
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 29
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 claims description 23
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 21
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 21
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 19
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 11
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 9
- 241001135572 Human adenovirus E4 Species 0.000 claims description 7
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 7
- 241000205701 Human adenovirus 26 Species 0.000 claims description 6
- 241000701124 Human adenovirus 35 Species 0.000 claims description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 47
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 32
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 29
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 28
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 23
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 20
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 16
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 14
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 13
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 13
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 13
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 241000990167 unclassified Simian adenoviruses Species 0.000 description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 9
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 9
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 8
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 8
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 101100165660 Alternaria brassicicola bsc6 gene Proteins 0.000 description 7
- 101100499295 Bacillus subtilis (strain 168) disA gene Proteins 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 101150007210 ORF6 gene Proteins 0.000 description 7
- 101100226894 Phomopsis amygdali PaGT gene Proteins 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 241001217856 Chimpanzee adenovirus Species 0.000 description 6
- 241000282575 Gorilla Species 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 101710094396 Hexon protein Proteins 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 5
- 108700026758 Adenovirus hexon capsid Proteins 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000011510 Elispot assay Methods 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710145505 Fiber protein Proteins 0.000 description 3
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 3
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 3
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 3,3-bis(chloromethyl)oxetane Chemical compound ClCC1(CCl)COC1 CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 2
- 241000620147 Human mastadenovirus C Species 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- -1 devices Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 2
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 239000013643 reference control Substances 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 241000701242 Adenoviridae Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 101100113692 Caenorhabditis elegans clk-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 229940046168 CpG oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101150029662 E1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150005585 E3 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 1
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000963438 Gaussia <copepod> Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101000733802 Homo sapiens Apolipoprotein A-I Proteins 0.000 description 1
- 208000009602 Human Adenovirus Infections Diseases 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 101710155913 Major envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004264 Petrolatum Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100038611 Vitamin D-binding protein Human genes 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 108700010877 adenoviridae proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 210000001776 amniocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000010775 animal oil Substances 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I calcium;potassium;disodium;(2s)-2-hydroxypropanoate;dichloride;dihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[Na+].[Na+].[Cl-].[Cl-].[K+].[Ca+2].C[C@H](O)C([O-])=O BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000002298 density-gradient ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000000799 fusogenic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 229940066842 petrolatum Drugs 0.000 description 1
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920006254 polymer film Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000002064 post-exposure prophylaxis Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000010845 search algorithm Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 238000011524 similarity measure Methods 0.000 description 1
- 239000008354 sodium chloride injection Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 108010063191 vitamin D-binding protein-macrophage activating factor Proteins 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Description
Область техники, к которой относится изобретениеField of technology to which the invention relates
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Более конкретно, к области и применению, связанным с аденовирусными векторами, такими как дефектные по репликации аденовирусные векторы для доставки антигенов и индукции иммунного ответа у хозяев.The present invention relates to the field of biotechnology. More particularly, to the field and applications associated with adenoviral vectors, such as replication-defective adenoviral vectors for delivering antigens and inducing an immune response in hosts.
Предпосылки к созданию изобретенияPrerequisites for creating an invention
Векторы на основе рекомбинантных аденовирусов широко используются в связанных с генной терапией областях применения и для вакцин. Было показано, что вакцины на основе вектора AdV-5 вызывают эффективные и защитные иммунные ответы в ряде различных животных моделей (см., например, WO 2001/02607; WO 2002/22080; Shiver et al., Nature 415:331 (2002); Letvin et al., Ann. Rev. Immunol. 20:73 (2002); Shiver and Emini, Ann. Rev. Med. 55:355 (2004)). Тем не менее, применимость вакцин на основе рекомбинантного вектора AdV-5, вероятно, будет ограничена высокой серопревалентностью AdV5-специфических нейтрализующих антител (NAb) в популяциях людей. В исследованиях на мышах, макаках-резусах и людях было показано, что существование иммунитета против AdV-5 существенно подавляет иммуногенность вакцин на основе AdV-5.Recombinant adenovirus vectors are widely used in gene therapy applications and for vaccines. AdV-5 vector vaccines have been shown to induce effective and protective immune responses in a number of different animal models (see, for example, WO 2001/02607; WO 2002/22080; Shiver et al., Nature 415:331 (2002) ; Letvin et al., Ann. Rev. Immunol. 20:73 (2002); Shiver and Emini, Ann. Rev. Med. 55:355 (2004)). However, the utility of recombinant AdV-5 vector vaccines is likely to be limited by the high seroprevalence of AdV5-specific neutralizing antibodies (NAbs) in human populations. Studies in mice, rhesus monkeys and humans have shown that the existence of immunity against AdV-5 significantly suppresses the immunogenicity of AdV-5-based vaccines.
Одна перспективная стратегия, позволяющая обойти наличие предсуществующего иммунитета у индивидуумов, ранее инфицированных или получавших лечение наиболее распространенным аденовирусом человека, например AdV-5, предусматривает разработку рекомбинантных векторов на основе серотипов аденовирусов, которые не подвергаются воздействию таких предсуществующих механизмов иммунной защиты. Одна из таких стратегий основана на применении аденовирусов обезьянообразных, поскольку они, как правило, не инфицируют людей и характеризуются низкой серопревалентностью в образцах от человека. Аденовирусы обезьянообразных пригодны для применения в отношении людей, поскольку было показано, что эти вирусы могут инфицировать клетки человека in vitro (WO 2003/000283; WO 2004/037189).One promising strategy to circumvent preexisting immunity in individuals previously infected or treated with the most common human adenovirus, such as AdV-5, involves the development of recombinant vectors based on adenovirus serotypes that are not exposed to such preexisting immune defense mechanisms. One such strategy is based on the use of simian adenoviruses, since they generally do not infect humans and have low seroprevalence in human samples. Simian adenoviruses are suitable for use in humans because these viruses have been shown to infect human cells in vitro (WO 2003/000283; WO 2004/037189).
Таким образом, в данной области техники существует потребность в альтернативных аденовирусных векторах, которые можно получать в больших количествах, которые не сталкиваются с предсуществующими механизмами иммунной защиты у хозяина, но которые тем не менее характеризуются иммуногенностью и способностью индуцировать сильный иммунный ответ на антигены, кодируемые гетерологичными нуклеиновыми кислотами, вставленными в вектор.Thus, there is a need in the art for alternative adenoviral vectors that can be produced in large quantities, that do not interfere with pre-existing immune defense mechanisms in the host, but that are nonetheless immunogenic and capable of inducing potent immune responses to antigens encoded by heterologous nucleic acids inserted into the vector.
Краткое описание изобретенияBrief description of the invention
Были выделены новые аденовирусы человекообразных обезьян, которые филогенетически принадлежат той же группе, что и аденовирус человека вида С. Для удовлетворения нереализованной потребности были разработаны аденовирусные векторы, содержащие новые последовательности нуклеиновой кислоты новых изолятов аденовирусов человекообразных обезьян. Изобретение относится к последовательностям выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующим полипептиды гексона новых изолятов аденовирусов человекообразных обезьян. В некоторых вариантах осуществления полипептид гексона включает полипептид, охватывающий гипервариабельные области гексона и характеризующийся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления полипептид гексона содержит аминокислотную последовательность полипептида гексона BZ1 (SEQ ID NO: 2).New ape adenoviruses have been isolated that belong phylogenetically to the same group as human adenovirus species C. To meet an unmet need, adenoviral vectors have been developed containing new nucleic acid sequences from new isolates of ape adenoviruses. The invention relates to isolated nucleic acid sequences encoding hexon polypeptides of new isolates of great ape adenoviruses. In some embodiments, the hexon polypeptide comprises a polypeptide spanning the hexon hypervariable regions and characterized by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the hexon polypeptide comprises the amino acid sequence of the hexon BZ1 polypeptide (SEQ ID NO: 2).
Также изобретение относится к последовательностям выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующим полипептид фибры из новых изолятов аденовирусов человекообразных обезьян. В некоторых вариантах осуществления полипептид фибры содержит аминокислотную последовательность полипептида фибры BZ28 (SEQ ID NO: 3).The invention also relates to isolated nucleic acid sequences encoding fiber polypeptide from new isolates of great ape adenoviruses. In some embodiments, the fiber polypeptide comprises the amino acid sequence of a BZ28 fiber polypeptide (SEQ ID NO: 3).
Варианты осуществления настоящего изобретения также относятся к выделенным полипептидам фибры и гексона, кодируемым последовательностями нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению.Embodiments of the present invention also provide isolated fiber and hexon polypeptides encoded by the nucleic acid sequences of the present invention.
Дополнительно настоящее изобретение относится к выделенным нуклеиновым кислотам, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один из раскрытых в настоящем изобретении полипептидов гексона, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один из раскрытых в настоящем изобретении полипептидов фибры. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к векторам, содержащим описанные в настоящем изобретении выделенные нуклеиновые кислоты. В одном варианте осуществления вектор представляет собой вирусный вектор. В другом варианте осуществления вектор представляет собой вектор экспрессии. В одном предпочтительном варианте осуществления вектор представляет собой аденовирусный вектор. Более предпочтительно, вектор дополнительно содержит по меньшей мере один трансген.Additionally, the present invention provides isolated nucleic acids comprising a nucleic acid sequence encoding at least one of the hexon polypeptides disclosed herein and a nucleic acid sequence encoding at least one of the fiber polypeptides disclosed herein. In some embodiments, the present invention provides vectors containing isolated nucleic acids described herein. In one embodiment, the vector is a viral vector. In another embodiment, the vector is an expression vector. In one preferred embodiment, the vector is an adenoviral vector. More preferably, the vector further contains at least one transgene.
Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным клеткам, содержащим описанные в настоящем изобретении векторы. Такие клетки можно использовать для получения рекомбинантного белка, экспрессии рекомбинантного белка или получения векторов или вирусных частиц. Настоящее изобретение также относится к способам получения вектора. Способы включают (а) выращивание раскрытой в настоящем изобретении рекомбинантной клетки в условиях, обеспечивающих продуцирование вектора; и (b) выделение вектора из рекомбинантной клетки.The present invention also relates to recombinant cells containing the vectors described in the present invention. Such cells can be used to produce recombinant protein, express recombinant protein, or produce vectors or viral particles. The present invention also relates to methods for producing a vector. The methods include (a) growing a recombinant cell disclosed in the present invention under conditions that provide vector production; and (b) isolating the vector from the recombinant cell.
В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к иммуногенным композициям, содержащим раскрытые в настоящем изобретении векторы. Также изобретение относится к способам ин- 1 044813 дукции иммунного ответа у нуждающегося в этом субъекта, включающим введение субъекту раскрытых в настоящем изобретении иммуногенных композиций.In some embodiments, the invention relates to immunogenic compositions containing the vectors disclosed herein. The invention also relates to methods of inducing an immune response in a subject in need thereof, comprising administering to the subject the immunogenic compositions disclosed in the present invention.
В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к аденовирусным векторам, содержащим (а) по меньшей мере один трансген и (b) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид гексона в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения. Полипептид гексона может, например, включать полипептид, охватывающий гипервариабельные области гексона, характеризующийся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления полипептид гексона содержит аминокислотную последовательность полипептида гексона BZ1 (SEQ ID NO: 2) или аминокислотную последовательность полипептида гексона BZ28 (SEQ ID NO: 5).In some embodiments, the invention provides adenoviral vectors comprising (a) at least one transgene and (b) a nucleic acid sequence encoding a hexon polypeptide in accordance with embodiments of the present invention. A hexon polypeptide may, for example, include a polypeptide spanning the hypervariable regions of a hexon characterized by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the hexon polypeptide comprises the amino acid sequence of a BZ1 hexon polypeptide (SEQ ID NO: 2) or the amino acid sequence of a BZ28 hexon polypeptide ( SEQ ID NO: 5).
В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к аденовирусным векторам, содержащим (а) по меньшей мере один трансген и (b) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид фибры в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления полипептид фибры содержит аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей полипептида фибры BZ1 (SEQ ID NO: 4) или полипептида фибры BZ28 (SEQ ID NO: 3). Варианты осуществления настоящего изобретения также относятся к аденовирусным векторам, содержащим (а) по меньшей мере один трансген; (b) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид гексона в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения; и (с) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид фибры в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.In some embodiments, the invention provides adenoviral vectors comprising (a) at least one transgene and (b) a nucleic acid sequence encoding a fiber polypeptide in accordance with embodiments of the present invention. In some embodiments, the fiber polypeptide comprises an amino acid sequence selected from the BZ1 fiber polypeptide (SEQ ID NO: 4) or the BZ28 fiber polypeptide (SEQ ID NO: 3) sequences. Embodiments of the present invention also relate to adenoviral vectors containing (a) at least one transgene; (b) a nucleic acid sequence encoding a hexon polypeptide in accordance with embodiments of the present invention; and (c) a nucleic acid sequence encoding a fiber polypeptide in accordance with embodiments of the present invention.
В некоторых вариантах осуществления аденовирусные векторы, представленные в настоящем изобретении, представляют собой дефектные по репликации аденовирусные векторы (rAd). В одном варианте осуществления аденовирусные векторы могут включать делецию Е1. В некоторых вариантах осуществления представленные в настоящем изобретении аденовирусные векторы могут дополнительно включать делецию E3. Аденовирусные векторы могут являться векторами на основе аденовирусов обезьян, содержащими последовательности аденовирусной нуклеиновой кислоты от одного или нескольких аденовирусов обезьян (SAdV), таких как аденовирусы шимпанзе (например, ChAd3); аденовирусы гориллы или аденовирусы макака-резуса (например, rhAd51, rhAd52 или rhAd53). Аденовирусные векторы могут представлять собой векторы на основе аденовируса человека, содержащие аденовирусные последовательности от одного или нескольких аденовирусов человека (например, hAdV-4, hAdV-5, hAdV-26, hAdV-35). Предпочтительно аденовирусный вектор представляет собой химерный аденовирусный вектор, содержащий одну или несколько последовательностей нуклеиновой кислоты аденовируса человека. Последовательности нуклеиновой кислоты аденовируса человека могут, например, происходить от аденовируса-4 человека (hAdV-4), аденовируса-5 человека (hAdV-5), аденовируса-26 человека (hAdV-26) или аденовируса-35 человека (hAdV-35). Аденовирусные векторы могут, например, содержать orf6 и orf 6/7 Е4 аденовируса-5 человека (hAdV-5).In some embodiments, the adenoviral vectors provided in the present invention are replication-defective adenoviral (rAd) vectors. In one embodiment, adenoviral vectors may include an E1 deletion. In some embodiments, adenoviral vectors provided herein may further include an E3 deletion. Adenoviral vectors may be simian adenovirus vectors containing adenoviral nucleic acid sequences from one or more simian adenoviruses (SAdVs), such as chimpanzee adenoviruses (eg, ChAd3); gorilla adenoviruses or rhesus macaque adenoviruses (eg rhAd51, rhAd52 or rhAd53). Adenoviral vectors can be human adenovirus-based vectors containing adenoviral sequences from one or more human adenoviruses (eg, hAdV-4, hAdV-5, hAdV-26, hAdV-35). Preferably, the adenoviral vector is a chimeric adenoviral vector containing one or more human adenovirus nucleic acid sequences. Human adenovirus nucleic acid sequences may, for example, be derived from human adenovirus-4 (hAdV-4), human adenovirus-5 (hAdV-5), human adenovirus-26 (hAdV-26) or human adenovirus-35 (hAdV-35) . Adenoviral vectors may, for example, contain orf6 and orf 6/7 E4 of human adenovirus-5 (hAdV-5).
В некоторых вариантах осуществления трансген прилегает к инвертированному концевому повтору (ITR). В некоторых вариантах осуществления трансген расположен в области делеции E1 или прилегает к ней, в области делеции E3 или прилегает к ней и/или в области правого ITR или прилегает к нему (rITR).In some embodiments, the transgene is adjacent to an inverted terminal repeat (ITR). In some embodiments, the transgene is located in or adjacent to the E1 deletion region, or to the E3 deletion region, and/or in or adjacent to the right ITR region (rITR).
В некоторых вариантах осуществления аденовирусные векторы, представленные в настоящем изобретении, содержат последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10.In some embodiments, the adenoviral vectors provided herein comprise the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10.
Также изобретение относится к иммуногенным композициям или вакцинам, содержащим описанные в настоящем изобретении аденовирусные векторы и фармацевтически приемлемый носитель. Дополнительно настоящее изобретение относится к способам индукции иммунного ответа у нуждающегося в этом субъекта. Способы включают введение субъекту раскрытых в настоящем изобретении вакцин. Дополнительно настоящее изобретение относится к способам получения вакцины. Способы включают объединение раскрытого в настоящем изобретении аденовирусного вектора с фармацевтически приемлемым носителем.The invention also relates to immunogenic compositions or vaccines containing the adenoviral vectors described in the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier. Additionally, the present invention provides methods for inducing an immune response in a subject in need thereof. The methods involve administering to a subject the vaccines disclosed herein. Additionally, the present invention relates to methods for producing a vaccine. The methods include combining the adenoviral vector disclosed herein with a pharmaceutically acceptable carrier.
Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials
Вышеизложенное краткое описание, а также нижеследующее подробное описание предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения будут более понятны при их рассмотрении в сочетании с прилагаемыми графическими материалами. Следует понимать, однако, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными вариантами осуществления, показанными на графических материалах.The foregoing brief description, as well as the following detailed description of preferred embodiments of the present invention, will be better understood when considered in conjunction with the accompanying drawings. It should be understood, however, that the present invention is not limited to the specific embodiments shown in the drawings.
На фиг. 1 показаны клеточные и гуморальные иммунные ответы, индуцированные BZ1/BZ28.FLuc. На фиг. 1А показана схема эксперимента. На фиг. 1В показан клеточный иммунный ответ, индуцированный Ad26.FLuc и BZ1/BZ28.FLuc, развившийся против кодируемой вектором вставки (т. е. FLuc, люциферазы светлячка) спустя 2 недели после иммунизации, как определено с помощью анализа ELISPOT с применением интерферона гамма (TFN-γ). На фиг. 1С показан график титров FLuc-специфических антител IgG, индуцированных у мышей, спустя 2 недели после иммунизации посредством Ad26.FLuc, BZ1/BZ28.Fluc и пустым вектором Ad26.In fig. Figure 1 shows the cellular and humoral immune responses induced by BZ1/BZ28.FLuc. In fig. Figure 1A shows the experimental design. In fig. 1B shows the cellular immune response induced by Ad26.FLuc and BZ1/BZ28.FLuc generated against the vector-encoded insert (i.e., FLuc, firefly luciferase) 2 weeks after immunization, as determined by ELISPOT assay using interferon gamma (TFN -γ). In fig. 1C shows a graph of FLuc-specific IgG antibody titers induced in mice 2 weeks after immunization with Ad26.FLuc, BZ1/BZ28.Fluc, and the Ad26 empty vector.
- 2 044813- 2 044813
На фиг. 2 показаны титры нейтрализации гомологичных и гетерологичных аденовирусов, индуцированные у мышей, иммунизированных аденовирусными векторами Ad35, Ad26, Ad5, Ad4 и BZ1/BZ28.In fig. Figure 2 shows the neutralization titers of homologous and heterologous adenoviruses induced in mice immunized with adenoviral vectors Ad35, Ad26, Ad5, Ad4 and BZ1/BZ28.
На фиг. 3 показана серопревалентность для Ad26 и BZ1/BZ28 в образцах сыворотки крови, полученных от группы из 200 взрослых человек в возрасте от 18 до 55 лет, проживающих в Соединенных Штатах (США) и Европейском союзе (ЕС). Титры нейтрализации, измеренные в данных образцах сыворотки крови для каждого вектора, были разделены на четыре категории (<16 (нейтрализация отсутствовала), от 16 до 300, от 300 до 1000, от 1000 до 4000 и >4000), представленные в указанных диаграммах.In fig. Figure 3 shows the seroprevalence for Ad26 and BZ1/BZ28 in serum samples obtained from a cohort of 200 adults aged 18 to 55 years living in the United States (US) and the European Union (EU). Neutralization titers measured in these serum samples for each vector were divided into four categories (<16 (no neutralization), 16 to 300, 300 to 1000, 1000 to 4000, and >4000) presented in the charts indicated.
На фиг. 4 показана схема плазмиды pBZ1_BZ28F.In fig. Figure 4 shows a diagram of the plasmid pBZ1_BZ28F.
На фиг. 5 показана схема плазмиды pBZ1_BZ28F.5IXP.In fig. Figure 5 shows a diagram of the plasmid pBZ1_BZ28F.5IXP.
На фиг. 6 показана продуктивность в отношении нового вектора BZ1/BZ28.Fluc в линии клетокпродуцентов SPER.C6.In fig. Figure 6 shows the productivity of the new BZ1/BZ28.Fluc vector in the SPER.C6 producer cell line.
Подробное описание изобретенияDetailed Description of the Invention
Настоящее изобретение основано, по меньшей мере отчасти, на выделении и идентификации новых серотипов аденовирусов человекообразных обезьян, отнесенных к аденовирусам человека вида Е, а также на создании и оценке вакцинных векторов, содержащих нуклеиновые кислоты, кодирующие вариабельные области полипептидов гексона и фибры аденовируса человекообразных обезьян. Настоящее изобретение дополнительно основано, по меньшей мере отчасти, на создании химерных аденовирусных векторов, содержащих остов аденовируса гориллы и последовательность гексона аденовируса шимпанзе. Аденовирусные векторы способны вызывать иммунный ответ и, кроме того, имеют низкую серопревалентность у людей. Аденовирусные векторы можно составлять для получения вакцин и использовать для индукции защитного иммунитета против конкретных представляющих интерес антигенов.The present invention is based, at least in part, on the isolation and identification of new serotypes of great ape adenoviruses, referred to as human adenovirus species E, as well as on the creation and evaluation of vaccine vectors containing nucleic acids encoding the variable regions of the hexon and fiber polypeptides of the great ape adenovirus. The present invention is further based, at least in part, on the creation of chimeric adenoviral vectors containing a gorilla adenovirus backbone and a chimpanzee adenovirus hexon sequence. Adenoviral vectors are capable of inducing an immune response and, in addition, have a low seroprevalence in humans. Adenoviral vectors can be formulated to produce vaccines and used to induce protective immunity against specific antigens of interest.
Различные публикации, статьи и патенты цитируются или описываются в разделе Предпосылки изобретения и на протяжении всего описания; при этом каждый из этих литературных источников включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Обсуждение документов, актов, материалов, устройств, изделий и т. п., которое было включено в настоящее описание, предназначено для обеспечения контекста настоящего изобретения. Такое обсуждение не является признанием того, что любые или все из этих материалов являются частью предшествующего уровня техники относительно любых раскрытых или заявленных изобретений.Various publications, articles and patents are cited or described in the Background section and throughout the specification; each of these references being incorporated herein by reference in its entirety. The discussion of documents, acts, materials, devices, products, and the like that have been included herein is intended to provide context for the present invention. Such discussion is not an admission that any or all of this material is part of the prior art with respect to any disclosed or claimed inventions.
Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем изобретении, имеют то же значение, которое обычно понимает средний специалист в области техники, к которой относится настоящее изобретение. В иных случаях определенные термины, используемые в настоящем изобретении, имеют значения, изложенные в описании.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used in the present invention have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which the present invention relates. Otherwise, certain terms used in the present invention have the meanings set forth in the specification.
Следует отметить, что используемые в настоящем изобретении и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают ссылку на множественное число, если из контекста явно не следует иное.It should be noted that as used in the present invention and in the accompanying claims, the singular number includes a reference to the plural unless the context clearly requires otherwise.
Если не указано иное, любые числовые значения, такие как концентрация или диапазон концентраций, описанные в настоящем изобретении, во всех случаях следует понимать как модифицированные термином приблизительно. Таким образом, числовое значение обычно включает ±10% от указанного значения. Например, концентрация 1 мг/мл включает в себя все значения в диапазоне от 0,9 до 1,1 мг/мл. Таким же образом диапазон концентраций от 1 до 10% (вес/об.) включает в себя диапазон от 0,9% (вес/об.) до 11% (вес/об.). В данном контексте использование числового диапазона однозначно включает в себя все возможные поддиапазоны, все отдельные численные значения в этом диапазоне, включая целые числа в таких диапазонах и дробные значения, если контекст явно не указано иное.Unless otherwise indicated, any numerical values, such as concentration or concentration range, described in the present invention should in all cases be understood as modified by the term approximately. Thus, the numerical value typically includes ±10% of the specified value. For example, a concentration of 1 mg/ml includes all values in the range from 0.9 to 1.1 mg/ml. Likewise, the concentration range from 1 to 10% (w/v) includes the range from 0.9% (w/v) to 11% (w/v). As used herein, the use of a numeric range expressly includes all possible subranges, all individual numeric values within that range, including integers within such ranges, and fractional values, unless the context explicitly states otherwise.
Если не указано иное, термин по меньшей мере, предшествующий серии элементов, следует понимать как относящийся к каждому элементу в серии.Unless otherwise specified, the term at least preceding a series of elements should be understood to refer to each element in the series.
Специалистам в данной области будет известно, или же они смогут установить с помощью постановки стандартного эксперимента многие эквиваленты конкретных вариантов осуществления описанного в настоящем изобретении настоящего изобретения. Такие эквиваленты подразумеваются как охватываемые настоящим изобретением.Those skilled in the art will be aware of, or will be able to ascertain by routine experimentation, many equivalents to specific embodiments of the present invention described herein. Such equivalents are intended to be covered by the present invention.
В данном контексте подразумевается, что термины предусматривает, предусматривающий, включает, включающий, имеет, имеющий, содержит, содержащий или любые другие их вариации означают, что они охватывают указанное целое число или группу целых чисел, но не исключают любые другие целые числа или группу целых чисел, и подразумевается, что они являются неисключающими или неограничивающими. Например, композиция, смесь, процесс, способ, изделие или устройство, содержащие перечень элементов не обязательно ограничиваются только этими элементами, но могут включать другие элементы, явно не указанные или являющиеся неотъемлемой частью такой композиции, смеси, процесса, способа, изделия или устройства. Кроме того, если явно не указано иное, или относится к включающему или, а не исключающему или. Например, условию А или В отвечает любое из следующего: А истинно (или в наличии) и В ложно (или отсутствует), А ложно (или отсутствует) и В истинно (или в наличии), и оба А и В истинны (или в наличии).As used herein, the terms provides, provides, includes, comprises, has, has, contains, contains, or any other variations thereof are intended to mean that they include the specified integer or group of integers, but do not exclude any other integer or group of integers numbers and are intended to be non-exclusive or non-limiting. For example, a composition, mixture, process, method, article or device containing a list of elements is not necessarily limited to those elements, but may include other elements not expressly listed or integral to such composition, mixture, process, method, article or device. Also, unless explicitly stated otherwise, or refers to an inclusive or rather than an exclusive or. For example, the condition A or B is satisfied by any of the following: A is true (or present) and B is false (or absent), A is false (or absent) and B is true (or present), and both A and B are true (or present). availability).
Используемый в настоящем изобретении связующий термин и/или между несколькими перечисленными элементами понимают как охватывающий как индивидуальные, так и объединенные варианты.As used in the present invention, a connecting term and/or between several of the listed elements is understood to cover both individual and combined variants.
- 3 044813- 3 044813
Например, когда два элемента соединены и/или, первый вариант относится к применимости первого элемента без второго. Второй вариант относится к применимости второго элемента без первого. Третий вариант относится к применимости первого и второго элементов совместно. Любой из этих вариантов понимают как подпадающий под данное значение и, следовательно, удовлетворяющий требованию применяемого в настоящем изобретении термина и/или. Понятно, что одновременную применимость более чем одного из вариантов понимают как подпадающую под данное значение и, следовательно, удовлетворяющий требованию термина и/или.For example, when two elements are connected and/or, the first option refers to the applicability of the first element without the second. The second option refers to the applicability of the second element without the first. The third option relates to the applicability of the first and second elements together. Any of these options is understood to fall within this meaning and, therefore, satisfy the requirement of the term and/or used in the present invention. It is clear that the simultaneous applicability of more than one of the options is understood as falling within the given meaning and, therefore, satisfying the requirement of the term and/or.
Применяемый в данном контексте термин состоит из или варианты, такие как состоят из или состоящий(ие) из, используемые во всем описании или формуле изобретения, указывают на включение любого из приведенных целых чисел или группы целых чисел, но при этом дополнительное целое число или группа целых чисел не могут быть добавлены к указанному способу, структуре или композиции.As used herein, the term consists of, or variations such as consist of or consisting of, as used throughout the specification or claims, indicate the inclusion of any of the given integers or group of integers, but wherein an additional integer or group integers cannot be added to the specified method, structure, or composition.
Применяемый в данном контексте термин по сути состоит из или варианты, такие как по сути состоят из или по сути состоящий(ие) из, используемые во всем описании или формуле изобретения, указывают на включение любого из приведенных целых чисел или группы целых чисел и необязательное включение любых приведенных целого числа или группы целых чисел, которые существенным образом не меняют основные или новые признаки указанного способа, структуры или композиции. См. М.Р.Е.Р. § 2111.03.As used herein, the term essentially consists of, or variations such as essentially consist of or essentially consisting of, as used throughout the specification or claims, indicate the inclusion of any of the given integers or group of integers and the optional inclusion any given integer or group of integers that does not significantly change the basic or new features of the specified method, structure or composition. See M.R.E.R. § 2111.03.
В данном контексте субъект означает любое животное, предпочтительно млекопитающее, наиболее предпочтительно человека, которого будут вакцинировать или которое было вакцинировано согласно способу в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. В данном контексте термин млекопитающее охватывает любое млекопитающее. Примеры млекопитающих включают без ограничения коров, лошадей, овец, свиней, кошек, собак, мышей, крыс, кроликов, морских свинок, обезьян, людей и т. д., более предпочтительно человека.In this context, subject means any animal, preferably a mammal, most preferably a human, that will be vaccinated or has been vaccinated according to the method in accordance with an embodiment of the present invention. As used herein, the term mammal includes any mammal. Examples of mammals include, but are not limited to, cows, horses, sheep, pigs, cats, dogs, mice, rats, rabbits, guinea pigs, monkeys, humans, etc., more preferably humans.
Слова правый, левый, нижний и верхний обозначают направления на графических материалах, на которые делается ссылка.The words right, left, bottom and top indicate the directions in the graphic materials being referenced.
Термины приблизительно, примерно, как правило, по сути и подобные им, используемые в данном контексте в отношении размера или свойства компонента предпочтительного изобретения, следует рассматривать как указывающие на то, что описываемый размер/свойство не представляет собой строго установленное ограничение или параметр и не исключает небольшие отклонения от него, которые функционально являются идентичными или сходными, как это будет понятно специалисту в данной области техники. Как минимум, ссылки на такие числовые параметры будут включать вариации, которые при использовании математических и промышленных принципов, принятых в области техники (например, округление, ошибки измерения или другие систематические ошибки, допуски при производстве и т.п.), не будут изменять последнюю значащую цифру.The terms approximately, approximately, generally, essentially and the like when used in this context in relation to the size or property of a component of a preferred invention should be taken to indicate that the size/property described does not constitute a strictly stated limitation or parameter and does not exclude slight deviations therefrom that are functionally identical or similar, as will be understood by one skilled in the art. At a minimum, references to such numerical parameters will include variations that, using mathematical and industrial principles generally accepted in the art (e.g., rounding, measurement or other systematic errors, manufacturing tolerances, etc.), will not alter the same significant figure.
Термины идентичный или процент идентичности в контексте двух или более последовательностей нуклеиновой кислоты или полипептида (например, полипептидов гексона и фибры и полинуклеотидов, которые их кодируют) относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются одинаковыми, при сравнении и выравнивании для максимального соответствия, что измеряют с использованием одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или путем визуального изучения.The terms identical or percentage identity in the context of two or more nucleic acid or polypeptide sequences (e.g., hexon and fiber polypeptides and the polynucleotides that encode them) refer to two or more sequences or subsequences that are the same or have a certain percentage of amino acid residues or nucleotides, which are the same, when compared and aligned for maximum agreement, as measured using one of the following sequence comparison algorithms or by visual inspection.
При сравнении последовательностей обычно одна последовательность выступает в роли эталонной последовательности, с которой сравнивают тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестируемые и эталонные последовательности вводят в компьютер, при необходимости обозначают координаты подпоследовательностей, и задают программные параметры алгоритма сравнения последовательностей. Затем алгоритм сравнения последовательностей вычисляет процент идентичности последовательностей для тестируемой(тестируемых) последовательности(последовательностей) относительно эталонной последовательности на основе заданных параметров программы.When comparing sequences, usually one sequence acts as a reference sequence to which the test sequences are compared. When using a sequence comparison algorithm, the test and reference sequences are entered into the computer, the coordinates of the subsequences are designated, if necessary, and the software parameters of the sequence comparison algorithm are specified. The sequence comparison algorithm then calculates the percentage of sequence identity for the test sequence(s) relative to the reference sequence based on the specified program parameters.
Оптимальное выравнивание последовательностей для их сравнения можно проводить, например, с помощью алгоритма поиска локальной гомологии Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), с помощью алгоритма гомологичного выравнивания Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), с помощью способа поиска сходства по Пирсону-Липману, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), с помощью компьютеризированных реализаций этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в программном комплексе Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Сайенс-Драйв 575, Мэдисон, Висконсин) или с помощью визуального изучения (см., в целом, Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplement) (Ausubel)).Optimal sequence alignment for comparison can be carried out, for example, using the local homology search algorithm of Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), using the Needleman & Wunsch homologous alignment algorithm, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), using the Pearson-Lipman similarity search method, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), by computerized implementations of these algorithms (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.) or by visual inspection (see ., generally, Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplement) (Ausubel)) .
Примерами алгоритмов, которые подходят для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, которые описаны в Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 и Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 соответственно. Программное обеспечение для проведения анализов BLAST является общедоступнымExamples of algorithms that are suitable for determining percent sequence identity and sequence similarity are the BLAST and BLAST 2.0 algorithms, which are described in Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 and Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 respectively. BLAST analysis software is publicly available
- 4 044813 посредством Национального центра биотехнологической информации. Данный алгоритм предусматривает первоначальную идентификацию пар последовательностей с высоким показателем сходства (HSP) путем идентификации коротких слов с длиной W в запрашиваемой последовательности, которые либо совпадают, либо удовлетворяют некоторой положительной пороговой оценке Т при выравнивании со словом той же длины в последовательности из базы данных. Т называют порогом показателя сходства соседних слов (Altschul et al. выше). Данные начальные совпадения соседних слов выполняют роль затравок для начала поисков с целью выявления более длинных HSP, которые их содержат. Совпадения слов затем продлевают в обоих направлениях вдоль каждой последовательности настолько, насколько можно увеличить совокупный показатель выравнивания.- 4 044813 via the National Center for Biotechnology Information. This algorithm involves the initial identification of high similarity score sequence pairs (HSPs) by identifying short words of length W in the query sequence that either match or satisfy some positive threshold score T when aligned with a word of the same length in the database sequence. T is called the threshold for the similarity index of neighboring words (Altschul et al. supra). These initial matches of adjacent words serve as seeds to begin searches to identify longer HSPs that contain them. Word matches are then extended in both directions along each sequence as much as the cumulative alignment score can be increased.
В случае нуклеотидных последовательностей совокупные оценки рассчитывают с помощью параметров М (вознаграждение за пару совпадающих остатков; всегда >0) и N (штраф за несовпадающие остатки; всегда <0). В случае аминокислотных последовательностей для расчета совокупной оценки применяют матрицу замен. Продление совпадений слов в каждом направлении останавливают, когда совокупная оценка выравнивания уменьшается на величину X от ее максимального достигнутого значения; совокупная оценка падает до нуля или ниже из-за накопления одного или нескольких выравниваний остатков с отрицательной оценкой; или достигнут конец любой из последовательностей. Параметры алгоритма BLAST W, Т и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) по умолчанию используют длину слова (W), равную 11, ожидаемое значение (Е), равное 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих цепей. Для аминокислотных последовательностей в программе BLASTP применяют в качестве значений по умолчанию длину слова (W), равную 3, ожидаемое значение (Е), равное 10, и матрицу сравнения BLOSUM62 (см. Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)).For nucleotide sequences, aggregate scores are calculated using the parameters M (reward per pair of matching residues; always >0) and N (penalty for mismatched residues; always <0). For amino acid sequences, a substitution matrix is used to calculate the cumulative score. Extension of word matches in each direction is stopped when the cumulative alignment score decreases by an amount X from its maximum value achieved; the cumulative score drops to zero or below due to the accumulation of one or more balance alignments with a negative score; or the end of any of the sequences has been reached. The BLAST algorithm parameters W, T and X determine the sensitivity and speed of alignment. The BLASTN program (for nucleotide sequences) defaults to a word length (W) of 11, an expected value (E) of 10, M=5, N=-4, and a comparison of both strands. For amino acid sequences, BLASTP uses a default word length (W) of 3, an expected value (E) of 10, and a BLOSUM62 comparison matrix (see Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)).
Помимо расчета процента идентичности последовательностей алгоритм BLAST также выполняет статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Одним из показателей сходства, который выдается алгоритмом BLAST, является наименьшая суммарная вероятность (P(N)), которая указывает на вероятность, с которой совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями может произойти случайно. Например, нуклеиновая кислота считается схожей с эталонной последовательностью, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении тестируемой нуклеиновой кислоты с эталонной нуклеиновой кислотой составляет менее приблизительно 0,1, более предпочтительно менее приблизительно 0,01 и наиболее предпочтительно менее приблизительно 0,001.In addition to calculating percent sequence identity, the BLAST algorithm also performs statistical analysis of the similarity between two sequences (see, for example, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). One of the similarity measures produced by the BLAST algorithm is the lowest cumulative probability (P(N)), which indicates the probability with which a match between two nucleotide or amino acid sequences could occur by chance. For example, a nucleic acid is considered similar to a reference sequence if the lowest overall probability when comparing the test nucleic acid to the reference nucleic acid is less than about 0.1, more preferably less than about 0.01, and most preferably less than about 0.001.
Дополнительным признаком того, что две последовательности нуклеиновой кислоты или полипептидные последовательности являются по сути идентичными, является то, что полипептид, кодируемый первой нуклеиновой кислотой, является иммунологически перекрестно реактивным с полипептидом, кодируемым второй нуклеиновой кислотой, как описано ниже. Таким образом, полипептид обычно по сути идентичен второму полипептиду, например, если два пептида отличаются только консервативными заменами. Другим признаком того, что две последовательности нуклеиновой кислоты являются практически идентичными, является то, что две молекулы гибридизируются друг с другом в жестких условиях, как описано ниже.A further indication that two nucleic acid sequences or polypeptide sequences are substantially identical is that the polypeptide encoded by the first nucleic acid is immunologically cross-reactive with the polypeptide encoded by the second nucleic acid, as described below. Thus, the polypeptide is usually substantially identical to the second polypeptide, for example, if the two peptides differ only by conservative substitutions. Another indication that two nucleic acid sequences are essentially identical is that the two molecules hybridize to each other under stringent conditions, as described below.
В данном контексте термин защитный иммунитет или защитный иммунный ответ означает, что вакцинированный субъект в состоянии контролировать инфекцию, вызываемую патогенным возбудителем, в отношении которого была проведена вакцинация. Патогенный агент может, например, представлять собой антигенный продукт гена или антигенный белок или их фрагмент. Обычно у субъекта, у которого выработался защитный иммунный ответ, развиваются клинические симптомы только от легкой до умеренной степени тяжести или симптомы вовсе не развиваются. Обычно субъект, имеющий защитный иммунный ответ на определенного возбудителя или защитный иммунитет к нему, не погибает в результате инфицирования указанным возбудителем.As used herein, the term protective immunity or protective immune response means that the vaccinated subject is able to control the infection caused by the pathogen against which the vaccination was administered. The pathogenic agent may, for example, be an antigenic gene product or an antigenic protein or a fragment thereof. Typically, a subject who has developed a protective immune response will develop only mild to moderate clinical symptoms or no symptoms at all. Typically, a subject who has a protective immune response to a particular pathogen or protective immunity to it does not die as a result of infection with the specified pathogen.
Термин адъювант определяется как одно или несколько веществ, которые обуславливают стимуляцию иммунной системы. В данном контексте адъювант используют для усиления иммунного ответа на аденовирусные векторы по настоящему изобретению.The term adjuvant is defined as one or more substances that cause stimulation of the immune system. In this context, an adjuvant is used to enhance the immune response to the adenoviral vectors of the present invention.
В данном контексте термин антигенный продукт гена или его фрагмент или антигенный белок может включать бактериальный, вирусный, паразитарный или грибковый белок или его фрагмент. Антигенный белок или антигенный продукт гена предпочтительно способен обуславливать в организме хозяина защитный иммунный ответ, например, индуцировать иммунный ответ на заболевание или инфекцию (например, бактериальное, вирусное, паразитическое или грибковое заболевание или инфекцию) и/или обеспечивать выработку у субъекта иммунитета к заболеванию или инфекции (т. е. вакцинации), который защищает субъекта от заболевания или инфекции.As used herein, the term antigenic gene product or fragment thereof or antigenic protein may include a bacterial, viral, parasitic or fungal protein or fragment thereof. The antigenic protein or antigenic gene product is preferably capable of eliciting a protective immune response in a host, such as inducing an immune response to a disease or infection (e.g., a bacterial, viral, parasitic or fungal disease or infection) and/or causing the subject to develop immunity to a disease or infection (i.e. vaccination), which protects the subject from disease or infection.
Аденовирусные векторы.Adenoviral vectors.
Воздействие определенных аденовирусов приводит к выработке иммунных ответов на определенные аденовирусные серотипы, что может влиять на эффективность аденовирусных векторов. Поскольку инфекции, вызванные аденовирусами человека, распространены у людей, распространенность нейтрализующих антител к аденовирусам человека в популяциях людей является высокой. Можно ожидать, чтоExposure to certain adenoviruses results in the development of immune responses to certain adenoviral serotypes, which may influence the effectiveness of adenoviral vectors. Because human adenovirus infections are common in humans, the prevalence of neutralizing antibodies to human adenoviruses in human populations is high. It can be expected that
- 5 044813 наличие таких нейтрализующих антител у индивидуумов снизит эффективность переносящего ген вектора, в основе которого лежит остов аденовируса человека. Одним из способов преодоления снижения эффективности является замена эпитопов на аденовирусных капсидных белках, которые являются мишенями для нейтрализующих антител. Целевые последовательности на капсидных белках можно заменить белковыми последовательностями из других аденовирусов, которые имеют низкую распространенность и, следовательно, против которых нейтрализующие антитела редко встречаются в популяциях людей.- 5 044813 the presence of such neutralizing antibodies in individuals will reduce the effectiveness of the gene transfer vector, which is based on the backbone of the human adenovirus. One way to overcome reduced efficacy is to replace epitopes on adenoviral capsid proteins that are targets for neutralizing antibodies. Target sequences on capsid proteins can be replaced with protein sequences from other adenoviruses that are of low abundance and therefore against which neutralizing antibodies are rare in human populations.
Капсидный белок относится к белку на капсиде аденовируса (например, BZ1, BZ28, HAdV-4) или его функциональному фрагменту или производному, который задействуют при определении серотипа и/или тропизма конкретного аденовируса. К капсидным белкам, как правило, относятся белки фибры, пентона и/или гексона. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок представляет собой весь или полноразмерный капсидный белок аденовируса. В других вариантах осуществления капсидный белок представляет собой фрагмент или производное полноразмерного капсидного белка аденовируса. В некоторых вариантах осуществления гексон, пентон и фибра, кодируемые аденовирусным вектором по настоящему изобретению, происходят от одного и того же или различных аденовирусов (т. е. гексон BZ1 и фибра BZ28, гексон BZ1 и фибра BZ1, гексон BZ28 и фибра BZ1, гексон BZ28 и фибра BZ28 и т.д.).Capsid protein refers to a protein on the capsid of an adenovirus (eg, BZ1, BZ28, HAdV-4) or a functional fragment or derivative thereof that is involved in determining the serotype and/or tropism of a particular adenovirus. Capsid proteins typically include fiber, penton, and/or hexon proteins. In some embodiments, the capsid protein is the entire or full-length capsid protein of an adenovirus. In other embodiments, the capsid protein is a fragment or derivative of the full-length capsid protein of an adenovirus. In some embodiments, the hexon, penton, and fibre, encoded by the adenoviral vector of the present invention, are derived from the same or different adenoviruses (i.e., BZ1 hexon and BZ28 fibre, BZ1 hexon and BZ1 fibre, BZ28 hexon and BZ1 fibre, hexon BZ28 and fiber BZ28, etc.).
Полипептид гексона относится к гексоновым белкам оболочки аденовируса, их функциональным фрагментам и производным.Hexon polypeptide refers to the hexon envelope proteins of the adenovirus, their functional fragments and derivatives.
Полипептид фибры относится к белкам фибры аденовируса, их функциональным фрагментам и производным.Fiber polypeptide refers to adenovirus fiber proteins, their functional fragments and derivatives.
Одной из мишеней нейтрализующих антител к аденовирусам является основной белок оболочки, белок гексона. Замена белка гексона на белок гексона из редких аденовирусов, более предпочтительно замена вариабельных последовательностей в белке гексона, которые определяют серотип и которые связываются с нейтрализующими антителами, такими как выделенные из описанных в настоящем изобретении аденовирусов обезьянообразных, может позволить сконструировать аденовирусные векторы, которые были бы менее восприимчивы к нейтрализации антителами, обычно встречающимися у людей.One of the targets of neutralizing antibodies to adenoviruses is the major envelope protein, hexon protein. Replacing the hexon protein with a hexon protein from rare adenoviruses, more preferably replacing variable sequences in the hexon protein that define serotype and that bind to neutralizing antibodies, such as those isolated from the simian adenoviruses described herein, may allow the construction of adenoviral vectors that are less susceptible to neutralization by antibodies commonly found in humans.
Второй мишенью нейтрализующих антител к аденовирусам является белок фибры. Замена белка фибры на последовательности фибры из редких аденовирусов, которые происходят от отличного от человека животного, более предпочтительно замена вариабельных последовательностей в белке фибры, такими как выделенные из описанных в настоящем изобретении аденовирусов обезьянообразных, также может позволять конструировать аденовирусные векторы, которые были бы менее восприимчивы к нейтрализации антителами, обычно встречающимися у людей. Сочетание описанных выше замен фибр с заменами гексонов может придать дополнительную устойчивость к нейтрализации антителами, обычно присутствующими в популяциях людей.The second target of neutralizing antibodies to adenoviruses is fiber protein. Replacing the fiber protein with fiber sequences from rare adenoviruses that originate from a non-human animal, more preferably replacing variable sequences in the fiber protein, such as those isolated from the simian adenoviruses described herein, may also allow the construction of adenoviral vectors that would be less susceptible to neutralization by antibodies commonly found in humans. Combining the fiber replacements described above with hexon replacements may confer additional resistance to neutralization by antibodies commonly present in human populations.
Настоящим изобретением предусмотрены последовательности выделенных нуклеиновых кислот, кодирующие полипептиды гексона и/или фибры, полученные из выделенных серотипов аденовируса обезьян, и аденовирусные векторы, содержащие по меньшей мере одну из последовательностей выделенных нуклеиновых кислот.The present invention provides isolated nucleic acid sequences encoding hexon and/or fiber polypeptides derived from isolated simian adenovirus serotypes, and adenoviral vectors containing at least one of the isolated nucleic acid sequences.
Аденовирусный вектор относится к рекомбинантному вектору, полученному по меньшей мере из части аденовирусного генома или содержащему такую часть аденовирусного генома.Adenoviral vector refers to a recombinant vector derived from or containing at least a portion of an adenoviral genome.
В предпочтительных вариантах осуществления последовательности выделенной нуклеиновой кислоты кодируют полипептиды гексона, предусматривающие полипептид, охватывающий гипервариабельные области гексона, характеризующийся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления полипептид гексона содержит аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей полипептида гексона BZ1 (SEQ ID NO: 2) или полипептида гексона BZ28 (SEQ ID NO: 5).In preferred embodiments, the isolated nucleic acid sequences encode hexon polypeptides comprising a polypeptide spanning the hexon hypervariable regions characterized by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the hexon polypeptide comprises an amino acid sequence selected from the hexon BZ1 polypeptide sequences (SEQ ID NO : 2) or hexon polypeptide BZ28 (SEQ ID NO: 5).
В предпочтительных вариантах осуществления последовательности выделенных нуклеиновых кислот кодируют полипептиды фибры. Полипептид фибры может, например, содержать аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей полипептида фибры BZ1 (SEQ ID NO: 4) или полипептида фибры BZ28 (SEQ ID NO: 3).In preferred embodiments, the isolated nucleic acid sequences encode fiber polypeptides. The fiber polypeptide may, for example, comprise an amino acid sequence selected from the sequences of the BZ1 fiber polypeptide (SEQ ID NO: 4) or the BZ28 fiber polypeptide (SEQ ID NO: 3).
В предпочтительных вариантах осуществления предусмотрена выделенная нуклеиновая кислота, предусматривающая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один из раскрытых в настоящем изобретении полипептидов гексона, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один из раскрытых в настоящем изобретении полипептидов фибры.In preferred embodiments, an isolated nucleic acid is provided comprising a nucleic acid sequence encoding at least one of the hexon polypeptides disclosed herein and a nucleic acid sequence encoding at least one of the fiber polypeptides disclosed herein.
В предпочтительных вариантах осуществления предусмотрены векторы, предпочтительно аденовирусные векторы, содержащие по меньшей мере одну из последовательности выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид гексона, и/или последовательности выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид фибры, согласно вариантам осуществления настоящего изобретения. Аденовирусные векторы могут, например, предусматривать полипептид гексона BZ1 (SEQ ID NO: 2) или полипептид гексона BZ28 (SEQ ID NO: 5). Аденовирусные векторы могут, например, предусматривать полипептид фибры BZ1 (SEQ ID NO: 4) или полипептид фибры BZ28 (SEQ ID NO: 3). В некоторых вариантах осуществления аденовирусный вектор содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептидIn preferred embodiments, vectors are provided, preferably adenoviral vectors, comprising at least one of an isolated nucleic acid sequence encoding a hexon polypeptide and/or an isolated nucleic acid sequence encoding a fiber polypeptide, according to embodiments of the present invention. Adenoviral vectors may, for example, comprise a BZ1 hexon polypeptide (SEQ ID NO: 2) or a BZ28 hexon polypeptide (SEQ ID NO: 5). Adenoviral vectors may, for example, comprise a BZ1 fiber polypeptide (SEQ ID NO: 4) or a BZ28 fiber polypeptide (SEQ ID NO: 3). In some embodiments, the adenoviral vector contains a nucleic acid encoding a polypeptide
- 6 044813 гексона, где полипептид гексона содержит аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей полипептида гексона BZ1 (SEQ ID NO: 2) или полипептида гексона BZ28 (SEQ ID NO: 5); и нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид фибры, где полипептид фибры содержит аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей полипептида фибры BZ1 (SEQ ID NO: 4) или полипептида фибры BZ28 (SEQ ID NO: 3). Аденовирусные векторы могут, например, содержать по меньшей мере один трансген и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид гексона и/или полипептид фибры, при этом полипептид гексона предусматривает раскрытые в настоящем изобретении полипептиды, охватывающие гипервариабельные области гексона, а полипептид фибры предусматривает описанные в настоящем изобретении полипептиды фибры.- 6 044813 hexon, where the hexon polypeptide contains an amino acid sequence selected from the sequences of the BZ1 hexon polypeptide (SEQ ID NO: 2) or the BZ28 hexon polypeptide (SEQ ID NO: 5); and a nucleic acid encoding a fiber polypeptide, wherein the fiber polypeptide comprises an amino acid sequence selected from the sequences of a BZ1 fiber polypeptide (SEQ ID NO: 4) or a BZ28 fiber polypeptide (SEQ ID NO: 3). Adenoviral vectors may, for example, contain at least one transgene and a nucleic acid sequence encoding a hexon polypeptide and/or a fiber polypeptide, wherein the hexon polypeptide comprises the polypeptides disclosed herein encompassing the hexon hypervariable regions, and the fiber polypeptide comprises those described herein fiber polypeptides.
Как правило, аденовирусный вектор по настоящему изобретению содержит весь геном рекомбинантного аденовируса, например, в плазмидном, космидном или бакуловирусном векторе. Молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению могут быть представлены в виде РНК или в виде ДНК, полученных путем клонирования или изготовленных синтетическим путем. ДНК может быть двухнитевой или однонитевой.Typically, the adenoviral vector of the present invention contains the entire genome of a recombinant adenovirus, for example, in a plasmid, cosmid or baculovirus vector. The nucleic acid molecules of the present invention can be in the form of RNA or in the form of DNA, obtained by cloning or produced synthetically. DNA can be double-stranded or single-stranded.
Специалист в данной области техники поймет, что элементы, полученные из нескольких серотипов, можно объединить в одном аденовирусном векторе, например, на основе аденовируса человека или обезьян. Таким образом, можно получить химерный аденовирусный вектор, в котором сочетаются требуемые свойства от различных серотипов. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления химерный аденовирусный вектор по настоящему изобретению может сочетать отсутствие предсуществующего иммунитета к полипептидным последовательностям гексона и/или фибры аденовируса обезьян с высоким уровнем доставки антигена и презентирующей способности существующих аденовирусных векторов, таких как rAd4, rAd5, rAd26 или rAd35.One skilled in the art will appreciate that elements derived from multiple serotypes can be combined in a single adenoviral vector, for example based on human or simian adenovirus. Thus, it is possible to obtain a chimeric adenoviral vector that combines the required properties from different serotypes. Thus, in some embodiments, the chimeric adenoviral vector of the present invention may combine the lack of pre-existing immunity to simian adenovirus hexon and/or fiber polypeptide sequences with the high level of antigen delivery and presentation ability of existing adenoviral vectors such as rAd4, rAd5, rAd26 or rAd35.
Преимущества аденовирусных векторов при применении в качестве вакцин включают легкость использования, хорошую технологичность производства в широком масштабе и превосходные показатели безопасности, основанные на многолетнем опыте исследований, разработки, производства и клинических испытаний с многочисленными аденовирусными векторами, о которых сообщалось. Аденовирусные векторы, которые применяют в качестве вакцин, как правило, обеспечивают хороший иммунный ответ на белок, кодируемый трансгеном, в том числе клеточный иммунный ответ. Аденовирусный вектор в соответствии с настоящим изобретением может быть основан на любом типе аденовируса и в некоторых вариантах осуществления основан на аденовирусе человека, который может принадлежать к любой группе или любому серотипу. В предпочтительных вариантах осуществления рекомбинантный аденовирус основан на аденовирусе человека из группы А, В, С, D, E, F или G. В других предпочтительных вариантах осуществления рекомбинантный аденовирус основан на аденовирусе человека серотипа 5, 11, 26, 34, 35, 48, 49 или 50. В других вариантах осуществления он представляет собой аденовирус обезьян, такой как аденовирус шимпанзе или гориллы, который может принадлежать любому серотипу. В некоторых вариантах осуществления данный рекомбинантный аденовирус основан на аденовирусе шимпанзе типа 1, 3, 7, 8, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.1, 28.1, 29, 30, 31.1, 32, 33, 34, 35.1, 36, 37.2, 39, 40.1, 41.1, 42.1, 43, 44, 45, 46, 48, 49, 50, 67 или SA7P.The advantages of adenoviral vectors for use as vaccines include ease of use, good manufacturability on a large scale, and an excellent safety record based on many years of experience in research, development, manufacturing, and clinical trials with numerous adenoviral vectors that have been reported. Adenoviral vectors used as vaccines generally provide a good immune response to the protein encoded by the transgene, including a cellular immune response. The adenoviral vector in accordance with the present invention can be based on any type of adenovirus and in some embodiments is based on a human adenovirus, which can belong to any group or serotype. In preferred embodiments, the recombinant adenovirus is based on a human adenovirus from group A, B, C, D, E, F, or G. In other preferred embodiments, the recombinant adenovirus is based on human adenovirus serotypes 5, 11, 26, 34, 35, 48, 49 or 50. In other embodiments, it is a simian adenovirus, such as a chimpanzee or gorilla adenovirus, which may be of any serotype. In some embodiments, the recombinant adenovirus is based on chimpanzee adenovirus type 1, 3, 7, 8, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.1, 28.1, 29, 30, 31.1, 32, 33, 34, 35.1, 36, 37.2, 39, 40.1, 41.1, 42.1, 43, 44, 45, 46, 48, 49, 50, 67 or SA7P.
В более предпочтительном варианте осуществления вектор на основе аденовируса шимпанзе из второй композиции представляет собой ChAdV3. Рекомбинантный аденовирус шимпанзе серотипа 3 (ChAd3 или cAd3) представляет собой аденовирус подгруппы С со свойствами, сходными со свойствами аденовируса человека серотипа 5 (Ad5). В исследованиях на людях, в которых оценивали кандидатные вакцины к вирусу гепатита С (HCV), было показано, что ChAd3 является безопасным и иммуногенным (Barnes E, et al., 2012 Science translational medicine 4: 115ral). Сообщалось, что вакцины на основе ChAd3 были способны индуцировать иммунный ответ, сравнимый с вакциной, предусматривающей вектор на основе Ad5 человека. См., например, Peruzzi D, et al., 2009 Vaccine 27: 1293-300 и Quinn KM, et al. 2013 J Immunol 190: 2720-35; WO 2005/071093; WO 2011/0130627 и т.д.In a more preferred embodiment, the chimpanzee adenovirus vector of the second composition is ChAdV3. Recombinant chimpanzee adenovirus serotype 3 (ChAd3 or cAd3) is a subgroup C adenovirus with properties similar to human adenovirus serotype 5 (Ad5). In human studies evaluating hepatitis C virus (HCV) vaccine candidates, ChAd3 was shown to be safe and immunogenic (Barnes E, et al., 2012 Science translational medicine 4: 115ral). It was reported that ChAd3-based vaccines were able to induce an immune response comparable to a vaccine containing a human Ad5-based vector. See, for example, Peruzzi D, et al., 2009 Vaccine 27: 1293-300 and Quinn KM, et al. 2013 J Immunol 190: 2720-35; WO 2005/071093; WO 2011/0130627, etc.
Аденовирусные векторы, способы их конструирования и способы их размножения хорошо известны из уровня техники и описаны, например, в патентах США №№ 5559099, 5837511, 5846782, 5851806, 5994106, 5994128, 5965541, 5981225, 6040174, 6020191 и 6113913 и Thomas Shenk, Adenoviridae and their Replication, M. S. Horwitz, Adenoviruses, главы 67 и 68 соответственно в Virology, В. N. Fields et al., eds., 3d ed., Raven Press, Ltd., New York (1996), а также других источниках, упомянутых в настоящем изобретении. Как правило, конструирование аденовирусных векторов предусматривает использование стандартных молекулярно-биологических методик, таких как описанные, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Watson et al., Recombinant DNA, 2d ed., Scientific American Books (1992) и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, NY (1995), а также других источниках, упомянутых в настоящем изобретении.Adenoviral vectors, methods for their construction and methods for their propagation are well known in the art and are described, for example, in US patents No. 5559099, 5837511, 5846782, 5851806, 5994106, 5994128, 5965541, 5981225, 6040174, 60201 91 and 6113913 and Thomas Shenk, Adenoviridae and their Replication, M. S. Horwitz, Adenoviruses, chapters 67 and 68 respectively in Virology, B. N. Fields et al., eds., 3d ed., Raven Press, Ltd., New York (1996), and other sources mentioned in the present invention. Typically, the construction of adenoviral vectors involves the use of standard molecular biology techniques, such as those described, for example, in Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Watson et al., Recombinant DNA, 2d ed., Scientific American Books (1992) and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, NY (1995), as well as other sources cited in the present invention.
В некоторых вариантах осуществления аденовирусный вектор предусматривает делецию Е1 и/или делецию Е3. Делеция Е1 или E3 может, например, предусматривать полную делецию гена или частичную делецию, что делает продукт гена Е1 или E3 функционально дефектным. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления аденовирус является дефектным по репликации, например, потому что онIn some embodiments, the adenoviral vector includes an E1 deletion and/or an E3 deletion. A deletion of E1 or E3 may, for example, involve a complete deletion of the gene or a partial deletion, which renders the E1 or E3 gene product functionally defective. Thus, in some embodiments, the adenovirus is replication defective, for example, because it
- 7 044813 предусматривает делецию в участке Е1 генома. Как известно специалисту, в случае делеций существенно важных участков в геноме аденовируса функциональные элементы, кодируемые этими участками, должны быть обеспечены в транс-положении, предпочтительно клеткой-продуцентом, т. е. если части или целые участки E1, E2 и/или Е4 удалены из аденовируса, то они должны присутствовать в клеткепродуценте, например, быть встроенными в ее геном или находиться в виде так называемого вспомогательного аденовируса или вспомогательных плазмид. Аденовирус также может предусматривать делецию в участке E3, который не является существенным для репликации, и, следовательно, такую делецию не следует компенсировать. Одну или несколько областей Е1, Е2, E3 и Е4 также можно инактивировать другими способами, такими как вставка представляющего интерес трансгена (обычно связанного с промотором) в подлежащие инактивации области.- 7 044813 provides for a deletion in the E1 region of the genome. As is known to those skilled in the art, in the case of deletions of essential regions in the adenovirus genome, the functional elements encoded by these regions must be provided in trans position, preferably by the producing cell, i.e. if parts or entire regions of E1, E2 and/or E4 are deleted from an adenovirus, then they must be present in the producing cell, for example, be integrated into its genome or be in the form of a so-called auxiliary adenovirus or auxiliary plasmids. The adenovirus may also include a deletion in a region of E3 that is not essential for replication and, therefore, such a deletion should not be compensated for. One or more of the E1, E2, E3 and E4 regions can also be inactivated by other means, such as insertion of a transgene of interest (usually linked to a promoter) into the regions to be inactivated.
Клетка-продуцент (также иногда называемая в уровне техники и в настоящем изобретении как 'пакующая клетка' или 'дополняющая клетка'), которую можно использовать, может представлять собой любую клетку-продуцент, в которой требуемый аденовирус может быть размножен. Например, размножение векторов на основе рекомбинантного аденовируса проводят в клетках-продуцентах, которые компенсируют дефекты в аденовирусе. Предпочтительно такие клетки-продуценты содержат в своем геноме по меньшей мере последовательность Е1 аденовируса, и таким образом они способны к компенсированию дефектов рекомбинантных аденовирусов с делецией в участке Е1. Можно использовать любую Е1дополняющую клетку-продуцент, такую как клетки сетчатки глаза человека, иммортализированные с использованием Е1, например клетки 911 или PER.C6 (см. патент США № 5994128), Е1трансформированные амниоциты (см. патент EP № 1230354), Е1-трансформированные клетки А549 (см., например, WO 98/39411, патент США № 5891690), GH329:HeLa (Gao et al., 2000, Hum Gene Ther 11: 21319), 293 и т. п. В некоторых вариантах осуществления клетками-продуцентами являются, например, клетки НЕК293, или клетки PER.C6, или клетки 911, или клетки IT293SF и т. п. Продуцирование аденовирусных векторов в клетках-продуцентах описано в (Kovesdi et al., 2010, Viruses 2: 1681-703).The producer cell (also sometimes referred to in the art and in the present invention as a 'packaging cell' or 'complementary cell') that can be used can be any producer cell in which the desired adenovirus can be propagated. For example, propagation of vectors based on a recombinant adenovirus is carried out in producer cells that compensate for defects in the adenovirus. Preferably, such producer cells contain in their genome at least an adenovirus E1 sequence, and are thus capable of compensating for the defects of recombinant adenoviruses with a deletion in the E1 region. Any E1 complementary producing cell may be used, such as human retinal cells immortalized with E1, such as 911 or PER.C6 cells (see US Pat. No. 5,994,128), E1 transformed amniocytes (see EP Pat. No. 1230354), E1-transformed A549 cells (see, for example, WO 98/39411, US patent No. 5891690), GH329:HeLa (Gao et al., 2000, Hum Gene Ther 11: 21319), 293, etc. In some embodiments, the cells producers are, for example, HEK293 cells, or PER.C6 cells, or 911 cells, or IT293SF cells, etc. The production of adenoviral vectors in producer cells is described in (Kovesdi et al., 2010, Viruses 2: 1681-703) .
В некоторых вариантах осуществления аденовирусный вектор представляет собой химерный аденовирусный вектор, содержащий одну или несколько последовательностей нуклеиновой кислоты аденовируса человека. Нуклеиновые кислоты аденовируса человека могут, например, быть выбраны из аденовируса-4 человека (Ad-4), аденовируса-5 человека (Ad-5), аденовируса-26 человека (Ad-26) или аденовируса-35 человека (Ad-35). В некоторых вариантах осуществления дефектный по Е1 аденовирусный вектор содержит кодирующую последовательность E4-orf6 из аденовируса Ad5 человека. Это обеспечивает возможность размножения таких аденовирусов в хорошо известных дополняющих линиях клеток, которые экспрессируют гены Е1 из Ad5, таких как, например, клетки 293 или клетки PER.C6 (см., например, Fallaux et al., 1998, Hum Gene Ther 9: 1909-17, Havenga et al., 2006, J Gen Virol 87: 2135-43; WO 03/104467, включенные в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).In some embodiments, the adenoviral vector is a chimeric adenoviral vector comprising one or more human adenovirus nucleic acid sequences. The human adenovirus nucleic acids may, for example, be selected from human adenovirus-4 (Ad-4), human adenovirus-5 (Ad-5), human adenovirus-26 (Ad-26) or human adenovirus-35 (Ad-35) . In some embodiments, the E1-deficient adenoviral vector comprises the E4-orf6 coding sequence from human adenovirus Ad5. This allows such adenoviruses to propagate in well-known complementary cell lines that express the E1 genes from Ad5, such as, for example, 293 cells or PER.C6 cells (see, for example, Fallaux et al., 1998, Hum Gene Ther 9: 1909-17, Havenga et al., 2006, J Gen Virol 87: 2135-43; WO 03/104467, incorporated herein by reference in its entirety).
В некоторых вариантах осуществления аденовирусный вектор содержит трансген. Трансген относится к гетерологичной нуклеиновой кислоте, которая представляет собой нуклеиновую кислоту, которая в норме отсутствует в векторе, и согласно настоящему изобретению трансген может кодировать антигенный продукт гена или антигенный белок, который вызывает иммунный ответ у субъекта. Например, трансген можно вводить в вектор посредством стандартных методик молекулярной биологии. Трансген можно, например, клонировать в делетированные области Е1 или E3 аденовирусного вектора или в область между областью Е4 и rITR. Трансген обычно функционально связан с последовательностями, контролирующими экспрессию. В предпочтительных вариантах осуществления трансген вставлен в сайт вставки трансгена.In some embodiments, the adenoviral vector contains a transgene. A transgene refers to a heterologous nucleic acid, which is a nucleic acid that is not normally present in the vector, and according to the present invention, the transgene may encode an antigenic gene product or an antigenic protein that elicits an immune response in a subject. For example, a transgene can be introduced into a vector using standard molecular biology techniques. The transgene can, for example, be cloned into the deleted E1 or E3 regions of the adenoviral vector or into the region between the E4 region and the rITR. The transgene is usually operably linked to expression control sequences. In preferred embodiments, the transgene is inserted into a transgene insertion site.
При необходимости последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая гексон или фибру в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, и/или трансген, можно подвергать оптимизации в отношении кодонов для обеспечения надлежащей экспрессии у подвергаемого обработке хозяина (например, у человека). Оптимизация кодонов представляет собой технологию, широко применяемую в данной области техники.If necessary, the nucleic acid sequence encoding a hexon or fiber in accordance with embodiments of the present invention, and/or a transgene, can be codon optimized to ensure proper expression in the host being treated (eg, a human). Codon optimization is a technology widely used in the art.
Трансген может находиться под контролем происходящего из аденовируса промотора (т. е. быть функционально связан с ним) (например, главного позднего промотора) или может находиться под контролем гетерологичного промотора. Примеры подходящих гетерологичных промоторов включают промотор CMV и промотор RSV. Промотор предпочтительно расположен выше представляющего интерес гена в кассете экспрессии.The transgene may be under the control of (ie, operably linked to) an adenovirus-derived promoter (eg, a major late promoter) or may be under the control of a heterologous promoter. Examples of suitable heterologous promoters include the CMV promoter and the RSV promoter. The promoter is preferably located upstream of the gene of interest in the expression cassette.
В предпочтительных вариантах осуществления аденовирусный вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10.In preferred embodiments, the adenoviral vector contains the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10.
Иммуногенные композиции.Immunogenic compositions.
Иммуногенные композиции представляют собой композиции, содержащие иммунологически эффективное количество очищенных или частично очищенных векторов на основе аденовируса человека или обезьяны (например, гориллы) для применения в настоящем изобретении. Указанные композиции можно составлять в виде вакцины (также называемой в настоящем изобретении иммуногенной композицией) согласно способам, хорошо известным из уровня техники. Такие композиции могут включать адъюванты для усиления иммунных реакций. Оптимальные доли каждого компонента в составе можноImmunogenic compositions are compositions containing an immunologically effective amount of purified or partially purified human or simian (eg, gorilla) adenovirus vectors for use in the present invention. These compositions can be formulated as a vaccine (also referred to as an immunogenic composition in the present invention) according to methods well known in the art. Such compositions may include adjuvants to enhance immune responses. The optimal proportions of each component in the composition can be
- 8 044813 определить с помощью методик, хорошо известных специалистам в данной области в свете настоящего изобретения.- 8 044813 determined using techniques well known to those skilled in the art in light of the present invention.
Иммуногенные композиции в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения можно получать с помощью известных специалистам в данной области техники способов, принимая во внимание настоящее изобретение. Жидкие фармацевтические композиции обычно содержат жидкий носитель, такой как вода, вазелин, масла животного или растительного происхождения, минеральное масло или синтетическое масло. Могут быть включены физиологический солевой раствор, раствор декстрозы или другого сахарида или гликоли, такие как этиленгликоль, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль.Immunogenic compositions in accordance with embodiments of the present invention can be prepared using methods known to those skilled in the art, taking into account the present invention. Liquid pharmaceutical compositions typically contain a liquid carrier such as water, petrolatum, animal or vegetable oils, mineral oil or synthetic oil. Physiological saline, dextrose or other saccharide solution, or glycols such as ethylene glycol, propylene glycol, or polyethylene glycol may be included.
Иммуногенные композиции, применяемые в настоящем изобретении, могут содержать адъюванты. Адъюванты, подходящие для совместного введения в соответствии с настоящим изобретением, должны быть потенциально безопасными, хорошо переносимыми и эффективными для людей, включая QS-21, Detox-PC, MPL-SE, MoGM-CSF, TiterMax-G, CRL- 1005, GERBU, TERamide, PSC97B, Adjumer, PG-026, GSK-I, AS01, AS03, AS04, AS 15, GcMAF, В-алетин, МРС-026, Adjuvax, CpG ODN, бетафектин, квасцы и MF59.The immunogenic compositions used in the present invention may contain adjuvants. Adjuvants suitable for co-administration in accordance with the present invention must be potentially safe, well tolerated and effective in humans, including QS-21, Detox-PC, MPL-SE, MoGM-CSF, TiterMax-G, CRL-1005, GERBU , TERamide, PSC97B, Adjumer, PG-026, GSK-I, AS01, AS03, AS04, AS 15, GcMAF, B-alethine, MPC-026, Adjuvax, CpG ODN, Betafectin, Alum and MF59.
К другим адъювантам, которые можно вводить, относятся лектины, факторы роста, цитокины и лимфокины, такие как альфа-интерферон, гамма-интерферон, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (gCSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (gMCSF), фактор некроза опухоли (TNF), эпидермальный фактор роста (EGF), IL-I, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 и IL-12 или кодирующие их нуклеиновые кислоты.Other adjuvants that can be administered include lectins, growth factors, cytokines and lymphokines such as interferon alpha, interferon gamma, platelet-derived growth factor (PDGF), granulocyte colony-stimulating factor (gCSF), granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (gMCSF) , tumor necrosis factor (TNF), epidermal growth factor (EGF), IL-I, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 and IL-12 or nucleic acids encoding them.
Композиции по настоящему изобретению могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательное вещество, носитель, буфер, стабилизатор или другие материалы, хорошо известные специалистам в данной области техники. Такие материалы должны быть нетоксичными и не должны препятствовать эффективности активного ингредиента. Конкретная природа носителя или другого материала может зависеть от пути введения, например, внутримышечного, подкожного, перорального, внутривенного, кожного, внутрислизистого (например, в кишечнике), интраназального или внутрибрюшинного путей.The compositions of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable excipient, carrier, buffer, stabilizer or other materials well known to those skilled in the art. Such materials must be non-toxic and must not interfere with the effectiveness of the active ingredient. The specific nature of the carrier or other material may depend on the route of administration, for example, intramuscular, subcutaneous, oral, intravenous, cutaneous, intramucosal (eg, intestinal), intranasal, or intraperitoneal routes.
Способ индукции защитного иммунитета.Method for inducing protective immunity.
Другой общий аспект настоящего изобретения относится к способу индукции иммунного ответа у нуждающегося в этом субъекта. Способы могут, например, предусматривать введение субъекту вакцины, содержащей описанный в настоящем изобретении аденовирусный вектор и фармацевтически приемлемый носитель. Настоящим изобретением также предусмотрены способы получения вакцины. Способы предусматривают объединение описанного в настоящем изобретении аденовирусного вектора с фармацевтически приемлемым носителем.Another general aspect of the present invention relates to a method of inducing an immune response in a subject in need thereof. The methods may, for example, involve administering to the subject a vaccine comprising an adenoviral vector described herein and a pharmaceutically acceptable carrier. The present invention also provides methods for producing a vaccine. The methods involve combining an adenoviral vector described herein with a pharmaceutically acceptable carrier.
В способах по настоящему изобретению в качестве вакцины можно использовать любую из иммуногенных композиций в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, включая без ограничения описанные в настоящем изобретении.In the methods of the present invention, any of the immunogenic compositions in accordance with embodiments of the present invention, including, without limitation, those described in the present invention, can be used as a vaccine.
Введение иммуногенных композиций/вакцин, содержащих векторы, обычно осуществляют внутримышечно или подкожно. Тем не менее, также могут быть предусмотрены другие способы введения, такие как внутривенный, кожный, внутрикожный или назальный и т.д. Внутримышечное введение иммуногенных композиций можно осуществлять с помощью иглы для инъекции суспензии аденовирусного вектора. Альтернативой является применение безыгольного инъекционного устройства для введения композиции (с использованием, например, Biojector™) или лиофилизированного порошка, содержащего вакцину.Administration of immunogenic compositions/vaccines containing vectors is usually carried out intramuscularly or subcutaneously. However, other routes of administration such as intravenous, dermal, intradermal or nasal, etc. may also be contemplated. Intramuscular administration of immunogenic compositions can be carried out using a needle to inject a suspension of the adenoviral vector. An alternative is to use a needle-free injection device to administer the composition (using, for example, Biojector™) or lyophilized powder containing the vaccine.
В случае внутривенной, кожной или подкожной инъекции или инъекции в участок поражения вектор будет представлен в форме парентерально приемлемого водного раствора, который является апирогенным и характеризуется подходящим значением pH, изотоничностью и стабильностью. Специалисты в данной области техники вполне способны получить подходящие растворы с применением, например, изотонических сред-носителей, таких как раствор хлорида натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, раствор Рингера с лактатом для инъекций. При необходимости можно включать консерванты, стабилизаторы, буферы, антиоксиданты и/или другие добавки. Также можно использовать состав с замедленным высвобождением.For intravenous, dermal, subcutaneous or intralesional injection, the vector will be in the form of a parenterally acceptable aqueous solution that is pyrogen-free and has a suitable pH, isotonicity and stability. Those skilled in the art are quite capable of preparing suitable solutions using, for example, isotonic vehicles such as sodium chloride injection, Ringer's solution for injection, lactated Ringer's solution for injection. If necessary, preservatives, stabilizers, buffers, antioxidants and/or other additives may be included. A time-release formulation may also be used.
Как правило, введение будет предназначено для профилактики с целью выработки иммунного ответа к представляющему интерес антигену (например, бактериального, вирусного, паразитарного и/или грибкового патогена) до инфицирования или развития симптомов. К заболеваниям и нарушениям, которые можно лечить или предупреждать в соответствии с настоящим изобретением, относятся таковые, при которых иммунный ответ может играть защитную или терапевтическую роль. В других вариантах осуществления аденовирусные векторы можно вводить для постконтактной профилактики.Typically, administration will be for prophylaxis to generate an immune response to the antigen of interest (eg, bacterial, viral, parasitic and/or fungal pathogen) prior to infection or development of symptoms. Diseases and disorders that can be treated or prevented in accordance with the present invention include those in which the immune response can play a protective or therapeutic role. In other embodiments, adenoviral vectors can be administered for post-exposure prophylaxis.
Иммуногенные композиции, содержащие векторы на основе аденовируса человека или обезьяны (например, гориллы), вводят субъекту, вызывая иммунный ответ на представляющий интерес антиген у субъекта. Количество композиции, достаточное для индукции выявляемого иммунного ответа, определяют как иммунологически эффективную дозу или эффективное количество композиции. Иммуногенные композиции по настоящему изобретению могут индуцировать как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ. В типичном варианте осуществления иммунный ответ представляет собой защитныйImmunogenic compositions containing human or simian (eg, gorilla) adenovirus vectors are administered to a subject, causing an immune response to the antigen of interest in the subject. An amount of the composition sufficient to induce a detectable immune response is defined as an immunologically effective dose or effective amount of the composition. The immunogenic compositions of the present invention can induce both humoral and cellular immune responses. In a typical embodiment, the immune response is protective
- 9 044813 иммунный ответ.- 9 044813 immune response.
Фактическое вводимое количество, а также частота и продолжительность введения будут зависеть от природы и тяжести подлежащего лечению явления. Назначение лечения, например, принятие решений относительно дозировки и т.д., находится в пределах сферы ответственности врачей общей практики и других врачей или ветеринара в случае ветеринарной практики, и при этом, как правило, учитываются подлежащее лечению нарушение, состояние отдельного пациента, участок доставки, способ введения и другие факторы, известные практикующим врачам. Примеры методик и протоколов, упоминаемых выше, можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed., 1980.The actual amount administered, as well as the frequency and duration of administration, will depend on the nature and severity of the phenomenon being treated. Prescribing treatment, e.g. decisions regarding dosage, etc., is the responsibility of general practitioners and other medical practitioners, or the veterinarian in the case of veterinary practice, and will usually take into account the disorder being treated, the condition of the individual patient, the site delivery, route of administration and other factors known to medical practitioners. Examples of the techniques and protocols mentioned above can be found in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed., 1980.
После получения аденовирусных векторов и необязательного составления таких частиц в виде композиций векторы можно вводить индивидууму, в частности человеку или другому примату. Введение можно осуществлять людям или другому млекопитающему, например, мыши, крысе, хомяку, морской свинке, кролику, овце, козе, свинье, лошади, корове, ослу, мартышке, собаке или кошке. Доставка отличному от человека млекопитающему не обязательно может предназначаться для терапевтической цели, а может предназначаться для применения в рамках эксперимента, например, при изучении механизмов иммунных ответов на аденовирусные векторы.Once adenoviral vectors are prepared and such particles are optionally formulated into compositions, the vectors can be administered to an individual, particularly a human or other primate. Administration may be to humans or another mammal, for example, a mouse, rat, hamster, guinea pig, rabbit, sheep, goat, pig, horse, cow, donkey, monkey, dog or cat. Delivery to a non-human mammal may not necessarily be for a therapeutic purpose, but may be for experimental use, for example in studying the mechanisms of immune responses to adenoviral vectors.
В одном иллюстративном режиме аденовирусный вектор вводят (например, внутримышечно) в объеме от приблизительно 100 мкл до приблизительно 10 мл, содержащем концентрации от приблизительно 104 до 1012 вирусных частиц/мл. Предпочтительно аденовирусный вектор вводят в объеме от 0,1 до 2,0 мл. Например, аденовирусный вектор можно вводить в объеме 100 мкл, 500 мкл, 1 мл, 2 мл. Более предпочтительно, аденовирусный вектор вводят в объеме 0,5 мл. Необязательно, аденовирусный вектор можно вводить в концентрации приблизительно 107, 108, 109, 1010 в. ч/мл, 5х1010 в. ч/мл, 1011 или 1012 в. ч/мл. Как правило, аденовирусный вектор вводят в количестве от приблизительно 109 до приблизительно 1012 вирусных частиц (в. ч.) субъекту-человеку за одно введение, более типично в количестве от приблизительно 1010 до приблизительно 1012 в. ч.In one exemplary regimen, the adenoviral vector is administered (eg, intramuscularly) in a volume of about 100 μl to about 10 ml, containing concentrations of about 10 4 to 10 12 viral particles/ml. Preferably, the adenoviral vector is administered in a volume of 0.1 to 2.0 ml. For example, the adenoviral vector can be administered in a volume of 100 μl, 500 μl, 1 ml, 2 ml. More preferably, the adenoviral vector is administered in a volume of 0.5 ml. Optionally, the adenoviral vector can be administered at a concentration of approximately 10 7 , 10 8 , 10 9 , 10 10 . h/ml, 5x10 10 c. h/ml, 10 11 or 10 12 c. h/ml. Typically, the adenoviral vector is administered in an amount of from about 109 to about 1012 viral particles (vp) to a human subject per administration, more typically in an amount from about 1010 to about 1012v . h.
После начальной вакцинации может идти бустерная или вторичная инъекция вакцины/композиции, содержащей тот же аденовирусный вектор, кодирующий представляющий интерес антиген, или вакцины/композиции, содержащей другой аденовирусный вектор, кодирующий тот же представляющий интерес антиген.The initial vaccination may be followed by a booster or secondary injection of a vaccine/composition containing the same adenoviral vector encoding the antigen of interest, or a vaccine/composition containing a different adenoviral vector encoding the same antigen of interest.
Композиция может, при необходимости, быть представлена в наборе, упаковке или дозаторе, который может содержать одну или несколько стандартных лекарственных форм, содержащих активный ингредиент. Набор, например, может предусматривать металлическую фольгу или полимерную пленку, как например блистерная упаковка. Набор, упаковка или дозатор могут сопровождаться инструкциями по введению.The composition may, if desired, be presented in a kit, package or dispenser, which may contain one or more unit dosage forms containing the active ingredient. The kit, for example, may include metal foil or polymer film, such as a blister pack. The kit, package or dispenser may be accompanied by instructions for administration.
Композиции по настоящему изобретению можно вводить отдельно или в комбинации с другими средствами лечения либо одновременно, либо последовательно в зависимости от подлежащего лечению состояния.The compositions of the present invention can be administered alone or in combination with other treatments, either simultaneously or sequentially depending on the condition being treated.
Варианты осуществленияEmbodiments
Настоящим изобретением также предусмотрены следующие неограничивающие варианты осуществления.The present invention also provides the following non-limiting embodiments.
Вариант осуществления 1 представляет собой последовательность выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид гексона, предусматривающий полипептид, охватывающий гипервариабельные области гексона, характеризующийся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 1.Embodiment 1 is an isolated nucleic acid sequence encoding a hexon polypeptide comprising a polypeptide spanning the hexon hypervariable regions characterized by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
Вариант осуществления 2 представляет собой последовательность выделенной нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 1, при этом полипептид гексона содержит аминокислотную последовательность полипептида гексона BZ1 (SEQ ID NO: 2).Embodiment 2 is the isolated nucleic acid sequence of Embodiment 1, wherein the hexon polypeptide contains the amino acid sequence of the hexon BZ1 polypeptide (SEQ ID NO: 2).
Вариант 3 осуществления представляет собой последовательность выделенной нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 1 или 2, дополнительно содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид фибры.Embodiment 3 is the isolated nucleic acid sequence of embodiment 1 or 2, further comprising a nucleic acid sequence encoding a fiber polypeptide.
Вариант осуществления 4 представляет собой последовательность выделенной нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 3, при этом полипептид фибры содержит аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей полипептида фибры BZ1 (SEQ ID NO: 4) или полипептида фибры BZ28 (SEQ ID NO: 3).Embodiment 4 is the isolated nucleic acid sequence of Embodiment 3, wherein the fiber polypeptide comprises an amino acid sequence selected from the sequences of BZ1 fiber polypeptide (SEQ ID NO: 4) or BZ28 fiber polypeptide (SEQ ID NO: 3).
Вариант осуществления 5 представляет собой последовательность выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид фибры, содержащий аминокислотную последовательность полипептида фибры BZ28 (SEQ ID NO: 3).Embodiment 5 is an isolated nucleic acid sequence encoding a fiber polypeptide containing the amino acid sequence of a BZ28 fiber polypeptide (SEQ ID NO: 3).
Вариант осуществления 6 представляет собой вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из вариантов осуществления 1-5.Embodiment 6 is a vector containing the nucleic acid of any one of Embodiments 1-5.
Вариант осуществления 7 представляет собой вектор по варианту осуществления 6, представляющий собой аденовирусный вектор и дополнительно содержащий по меньшей мере один трансген.Embodiment 7 is the vector of Embodiment 6, which is an adenoviral vector and further contains at least one transgene.
Вариант осуществления 8 представляет собой рекомбинантную клетку, содержащую вектор по варианту осуществления 6 или 7.Embodiment 8 is a recombinant cell containing the vector of embodiment 6 or 7.
Вариант осуществления 9 представляет собой способ получения вектора, включающий (а) выращи- 10 044813 вание рекомбинантной клетки по варианту осуществления 8 в условиях, обеспечивающих продуцирование вектора; и (b) выделение вектора из рекомбинантной клетки.Embodiment 9 is a method of producing a vector, comprising (a) growing a recombinant cell according to Embodiment 8 under conditions allowing production of the vector; and (b) isolating the vector from the recombinant cell.
Вариант осуществления 10 представляет собой иммуногенную композицию, содержащую вектор по варианту осуществления 7.Embodiment 10 is an immunogenic composition containing the vector of Embodiment 7.
Вариант осуществления 11 представляет собой способ индукции иммунного ответа у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту иммуногенной композиции по варианту осуществления 10.Embodiment 11 is a method of inducing an immune response in a subject in need thereof, comprising administering to the subject the immunogenic composition of Embodiment 10.
Вариант осуществления 12 представляет собой аденовирусный вектор, содержащий (а) по меньшей мере один трансген и (b) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид гексона, предусматривающий полипептид, охватывающий гипервариабельные области гексона, характеризующийся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 1.Embodiment 12 is an adenoviral vector comprising (a) at least one transgene and (b) a nucleic acid sequence encoding a hexon polypeptide comprising a polypeptide spanning the hexon hypervariable regions characterized by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
Вариант осуществления 13 представляет собой аденовирусный вектор по варианту осуществления 12, при этом полипептид гексона содержит аминокислотную последовательность полипептида гексона BZ1 (SEQ ID NO: 2).Embodiment 13 is the adenoviral vector of Embodiment 12, wherein the hexon polypeptide contains the amino acid sequence of the hexon BZ1 polypeptide (SEQ ID NO: 2).
Вариант осуществления 14 представляет собой аденовирусный вектор по варианту осуществления 12 или 13, дополнительно содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид фибры.Embodiment 14 is the adenoviral vector of embodiment 12 or 13, further comprising a nucleic acid sequence encoding a fiber polypeptide.
Вариант осуществления 15 представляет собой аденовирусный вектор по варианту осуществления 14, при этом полипептид фибры содержит аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей полипептида фибры BZ1 (SEQ ID NO: 4) или полипептида фибры BZ28 (SEQ ID NO: 3).Embodiment 15 is the adenoviral vector of Embodiment 14, wherein the fiber polypeptide comprises an amino acid sequence selected from the BZ1 fiber polypeptide (SEQ ID NO: 4) or the BZ28 fiber polypeptide (SEQ ID NO: 3) sequences.
Вариант осуществления 16 представляет собой аденовирусный вектор, содержащий (а) по меньшей мере один трансген и (b) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид фибры, содержащий аминокислотную последовательность полипептида фибры BZ28 (SEQ ID NO: 3).Embodiment 16 is an adenoviral vector comprising (a) at least one transgene and (b) a nucleic acid sequence encoding a fiber polypeptide comprising the amino acid sequence of a BZ28 fiber polypeptide (SEQ ID NO: 3).
Вариант осуществления 17 представляет собой аденовирусный вектор, содержащий (а) по меньшей мере один трансген; (b) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид гексона, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей полипептида гексона BZ1 (SEQ ID NO: 2) или полипептида гексона BZ28 (SEQ ID NO: 5); и (с) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид фибры, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей полипептида фибры BZ1 (SEQ ID NO: 4) или полипептида фибры BZ28 (SEQ ID NO: 3).Embodiment 17 is an adenoviral vector containing (a) at least one transgene; (b) a nucleic acid sequence encoding a hexon polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the sequences of a BZ1 hexon polypeptide (SEQ ID NO: 2) or a BZ28 hexon polypeptide (SEQ ID NO: 5); and (c) a nucleic acid sequence encoding a fiber polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the sequences of a BZ1 fiber polypeptide (SEQ ID NO: 4) or a BZ28 fiber polypeptide (SEQ ID NO: 3).
Вариант осуществления 18 представляет собой аденовирусный вектор по любому из вариантов осуществления 12-17, при этом аденовирусный вектор дополнительно предусматривает делецию Е1.Embodiment 18 is the adenoviral vector of any one of embodiments 12-17, wherein the adenoviral vector further comprises an E1 deletion.
Вариант осуществления 19 представляет собой аденовирусный вектор по любому из вариантов осуществления 12-18, при этом аденовирусный вектор дополнительно предусматривает делецию Е3.Embodiment 19 is the adenoviral vector of any one of embodiments 12-18, wherein the adenoviral vector further comprises an E3 deletion.
Вариант осуществления 20 представляет собой аденовирусный вектор по любому из вариантов осуществления 12-19, при этом аденовирусный вектор представляет собой химерный аденовирусный вектор, содержащий одну или несколько последовательностей нуклеиновой кислоты аденовируса человека.Embodiment 20 is the adenoviral vector of any one of embodiments 12-19, wherein the adenoviral vector is a chimeric adenoviral vector containing one or more human adenovirus nucleic acid sequences.
Вариант осуществления 21 представляет собой аденовирусный вектор по варианту осуществления 20, при этом последовательности нуклеиновой кислоты аденовируса человека происходят из аденовируса-4 человека, аденовируса-5 человека, аденовируса-26 человека или аденовируса-35 человека.Embodiment 21 is the adenoviral vector of embodiment 20, wherein the human adenovirus nucleic acid sequences are derived from human adenovirus-4, human adenovirus-5, human adenovirus-26, or human adenovirus-35.
Вариант осуществления 22 представляет собой аденовирусный вектор по варианту осуществления 21, при этом аденовирусный вектор содержит orf6 E4 аденовируса-5 человека (HAdv-5).Embodiment 22 is the adenoviral vector of embodiment 21, wherein the adenoviral vector comprises human adenovirus-5 (HAdv-5) orf6 E4.
Вариант осуществления 23 представляет собой аденовирусный вектор по любому из вариантов осуществления 12-22, при этом трансген расположен в участке, прилегающем к инвертированному концевому повтору (ITR).Embodiment 23 is the adenoviral vector of any one of embodiments 12-22, wherein the transgene is located in a region adjacent to an inverted terminal repeat (ITR).
Вариант осуществления 24 представляет собой аденовирусный вектор по варианту осуществления 23, при этом трансген расположен в области делеции Е1 или прилегает к ней, в области делеции E3 или прилегает к ней и/или в участке, прилегающем к ITR.Embodiment 24 is the adenoviral vector of Embodiment 23, wherein the transgene is located at or adjacent to the E1 deletion region, to or adjacent to the E3 deletion region, and/or at a region adjacent to the ITR.
Вариант осуществления 25 представляет собой аденовирусный вектор по любому из вариантов осуществления 12-24, при этом аденовирусный вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10.Embodiment 25 is the adenoviral vector of any one of embodiments 12-24, wherein the adenoviral vector comprises a nucleic acid sequence selected from SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10.
Вариант осуществления 26 представляет собой вакцину, содержащую аденовирусный вектор по любому из вариантов осуществления 12-25 и фармацевтически приемлемый носитель.Embodiment 26 is a vaccine comprising the adenoviral vector of any one of embodiments 12-25 and a pharmaceutically acceptable carrier.
Вариант осуществления 27 представляет собой способ индукции иммунного ответа у нуждающегося в этом субъекта, при этом способ включает введение субъекту вакцины по варианту осуществления 26.Embodiment 27 is a method of inducing an immune response in a subject in need thereof, the method comprising administering the vaccine of Embodiment 26 to the subject.
Вариант осуществления 28 представляет собой способ получения вакцины, включающий объединение аденовирусного вектора по любому из вариантов осуществления 12-25 с фармацевтически приемлемым носителем.Embodiment 28 is a method of producing a vaccine comprising combining the adenoviral vector of any one of embodiments 12-25 with a pharmaceutically acceptable carrier.
Вариант осуществления 29 представляет собой выделенный полипептид гексона, предусматривающий полипептид, охватывающий гипервариабельные области гексона, характеризующийся аминокис- 11 044813 лотной последовательностью SEQ ID NO: 1.Embodiment 29 is an isolated hexon polypeptide comprising a polypeptide spanning hexon hypervariable regions having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
Вариант осуществления 30 представляет собой выделенный полипептид гексона по варианту осуществления 29, при этом полипептид гексона содержит аминокислотную последовательность полипептида гексона BZ1 (SEQ ID NO: 2).Embodiment 30 is the isolated hexon polypeptide of embodiment 29, wherein the hexon polypeptide contains the amino acid sequence of the hexon BZ1 polypeptide (SEQ ID NO: 2).
Вариант осуществления 31 представляет собой выделенный полипептид фибры, при этом полипептид фибры содержит аминокислотную последовательность полипептида фибры BZ28 (SEQ ID NO: 3).Embodiment 31 is an isolated fiber polypeptide, wherein the fiber polypeptide contains the amino acid sequence of BZ28 fiber polypeptide (SEQ ID NO: 3).
ПримерыExamples
Пример 1. Создание предусматривающих делеции Е1 и E3 векторов на основе остова нового изолята аденовируса BZ1 и содержащих последовательность фибры нового изолята аденовируса BZ28.Example 1. Creation of E1 and E3 deletion vectors based on the backbone of the new adenovirus isolate BZ1 and containing the fiber sequence of the new adenovirus isolate BZ28.
Идентифицировали новый изолят аденовируса гориллы BZ1 (также обозначаемый JAd4-WT) и полностью секвенировали его геном. Также идентифицировали новый изолят аденовируса шимпанзе BZ28 (также обозначаемый JAd5-WT) и секвенировали его ген фибры и часть его гена гексона. Обнаружили, что новые изоляты аденовируса BZ1 и BZ28 филогенетически принадлежат к виду аденовируса человека С (HAdV-C). Нуклеотидная последовательность полного генома BZ1 определена под SEQ ID NO: 6. Нуклеотидные последовательности фибры и (частично) гексона BZ28 определены под SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 5 соответственно.A new gorilla adenovirus isolate BZ1 (also designated JAd4-WT) was identified and its genome was completely sequenced. A new chimpanzee adenovirus isolate BZ28 (also designated JAd5-WT) was also identified and its fiber gene and part of its hexon gene were sequenced. The new adenovirus isolates BZ1 and BZ28 were found to belong phylogenetically to the human adenovirus C (HAdV-C) species. The nucleotide sequence of the complete genome of BZ1 is defined under SEQ ID NO: 6. The nucleotide sequences of the BZ28 fiber and (partial) hexon are defined under SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 5, respectively.
Описание системы на основе единичной плазмиды, применяемой для создания Ad-векторов на основе BZ1/BZ28 pBZ1_BZ28F (SEQ ID NO: 9; фиг. 4) и pBZ1_BZ28F.5IXP (SEQ ID NO: 10; фиг. 5) представляют собой плазмиды, каждая из которых несет полноразмерные геномы предусматривающих делеции Е1 и E3 аденовирусных векторов на основе изолята BZ1, при этом кодирующая фибру последовательность заменена на таковую из изолята BZ28. Геномные последовательности Ad-вектора на основе BZ1/BZ28, содержащиеся в этих плазмидах, приведены под SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12 соответственно. В пределах каждой из этих плазмид геном аденовирусного вектора фланкирован двумя сайтами рестрикционных ферментов SwaI (т. е. на каждом конце генома вектора расположено по одному сайту SwaI). Такие сайты SwaI предназначены для способствования вырезанию генома Ad-вектора из плазмидного остова перед спасением вируса путем трансфекции подходящих Е1-дополняющих клеток (таких как клетки НЕК293, 911 и PER.C6). Геномы Ad-вектора, содержащиеся в этих плазмидах, дополнительно несут определенные сайты рестрикционных ферментов, введенные в местоположении делеции Е1 и участок, прилегающий к правому инвертированному концевому повтору (RITR). Эти сайты рестрикционных ферментов выбирали с обеспечением их уникальности в контексте плазмид с полным геномом Ad. Они представляют собой сайты вставки трансгена, которые обеспечивают легкое конструирование с помощью стандартных методик молекулярного клонирования Ad-векторов, несущих одну или несколько содержащих трансген кассет экспрессии, вставленных в любое из указанных соответствующих местоположений или в любые их комбинации. Схемы Ad-вектора и конструкции плазмид более подробно описаны в разделах ниже.Description of the Single Plasmid System Used to Create BZ1/BZ28 Ad Vectors pBZ1_BZ28F (SEQ ID NO: 9; FIG. 4) and pBZ1_BZ28F.5IXP (SEQ ID NO: 10; FIG. 5) are plasmids, each of which carries full-length genomes of adenoviral vectors containing E1 and E3 deletions based on isolate BZ1, while the fiber-coding sequence is replaced with that from isolate BZ28. The genomic sequences of the BZ1/BZ28-based Ad vector contained in these plasmids are given under SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, respectively. Within each of these plasmids, the genome of the adenoviral vector is flanked by two SwaI restriction enzyme sites (i.e., one SwaI site is located at each end of the vector genome). Such SwaI sites are designed to facilitate excision of the Ad vector genome from the plasmid backbone prior to virus rescue by transfection of suitable E1-complementing cells (such as HEK293, 911 and PER.C6 cells). The Ad vector genomes contained in these plasmids additionally carry specific restriction enzyme sites introduced at the location of the E1 deletion and a region adjacent to the right inverted terminal repeat (RITR). These restriction enzyme sites were selected to ensure their uniqueness in the context of the complete Ad genome plasmids. They are transgene insertion sites that allow the easy construction, using standard molecular cloning techniques, of Ad vectors carrying one or more transgene-containing expression cassettes inserted at any of these appropriate locations or any combination thereof. Ad vector designs and plasmid constructions are described in more detail in the sections below.
Схема генома Ad-вектора на основе BZ1/BZ28.Genomic diagram of the BZ1/BZ28-based Ad vector.
Каждый из геномов Ad-векторов BZ1/BZ28 и BZ1/BZ28.5IXP (т. е. SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12 соответственно) разрабатывали таким образом, чтобы они предусматривали делецию Е1, делецию E3, разные сайты вставки трансгена и замену нативной открытой рамки считывания Е4 (orf) 6 и orf6/7 на таковую аденовируса-5 человека (HAdV-5). Область Е1 каждого аденовируса удаляли и заменяли сайтом вставки трансгена, содержащим последовательность сайта рестрикционного фермента AsiSI. Другой сайт вставки трансгена создавали путем вставки последовательности сайта рестрикционного фермента PacI в участок, прилегающий к правому инвертированному концевому повтору (ITR) каждого аденовируса. Геномы Ad-векторов дополнительно предусматривали замену кодирующих последовательностей orf6 и orf6/7 E4 (BZ1) на соответствующие последовательностями аденовируса-5 человека (HAdV-5). Заменяющая последовательность HAdV-5, представлена под SEQ ID NO: 7, причем она состоит из нуклеотидов 32914-34077 последовательности под номером в GenBank AC_000008.The genomes of the Ad vectors BZ1/BZ28 and BZ1/BZ28.5IXP (i.e., SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, respectively) were designed to include an E1 deletion, an E3 deletion, and different transgene insertion sites and replacement of the native E4 open reading frame (orf) 6 and orf6/7 with that of human adenovirus-5 (HAdV-5). The E1 region of each adenovirus was removed and replaced with a transgene insertion site containing the AsiSI restriction enzyme site sequence. Another transgene insertion site was created by inserting a PacI restriction enzyme site sequence into the region adjacent to the right inverted terminal repeat (ITR) of each adenovirus. The Ad vector genomes additionally included replacement of the orf6 and orf6/7 E4 (BZ1) coding sequences with the corresponding human adenovirus-5 (HAdV-5) sequences. The replacement sequence for HAdV-5 is provided under SEQ ID NO: 7, which consists of nucleotides 32914-34077 of GenBank sequence number AC_000008.
Разрабатывали и конструировали два типа делеций области Е1. Геном Ad-вектора на основе BZ1/BZ28, содержащийся в pBZ1_BZ28F, несет делецию области Е1, соответствующую удалению нуклеотидов 491-3324 из SEQ ID NO: 6. В то же время геном Ad-вектора на основе BZ1/BZ28, содержащийся в pBZ1_BZ28F.5IXP, несет большую делецию последовательности, охватывающей область Е1, которая предусматривает удаление всех кодирующих последовательностей E1 BZ1 (т. е. нуклеотидов 4913484 из SEQ ID NO: 6). Кроме того, данный последний геном Ad-вектора дополнительно разрабатывали с обеспечением того, чтобы он нес замену некодирующего участка последовательности между последовательностями, кодирующими 55К и pIX Е1В, на последовательность HAdV-5 (т. е. последовательности, соответствующие нуклеотидам 3485-3574 из SEQ ID NO: 6, заменяли на нуклеотиды 3510-3608 из GenBank AC_000008 (т. е. SEQ ID NO: 8)).Two types of E1 region deletions were designed and constructed. The genome of the BZ1/BZ28-based Ad vector contained in pBZ1_BZ28F carries a deletion of the E1 region corresponding to the removal of nucleotides 491-3324 from SEQ ID NO: 6. At the same time, the genome of the BZ1/BZ28-based Ad vector contained in pBZ1_BZ28F. 5IXP, carries a large sequence deletion spanning the E1 region, which removes all E1 BZ1 coding sequences (ie, nucleotide 4913484 of SEQ ID NO: 6). In addition, this latter Ad vector genome was further designed to carry a replacement of the non-coding sequence region between the 55K and pIX E1B coding sequences with the HAdV-5 sequence (i.e., the sequences corresponding to nucleotides 3485-3574 of SEQ ID NO: 6, replaced by nucleotides 3510-3608 from GenBank AC_000008 (i.e. SEQ ID NO: 8)).
Конструирование единичных плазмид, содержащих геномы Ad-вектора на основе BZ1/BZ28 pBZ1_BZ28F (SEQ ID NO: 9) конструировали за несколько стадий генного синтеза (который был осуществлен компанией GenScript) и стандартных процедур молекулярного клонирования. Во-первых, проводили несколько последовательных стадий синтеза и субклонирования генов, что совместно приводило к замене фрагмента EcoRI-NdeI длиной 2,3 т. п. о. из pBR322 (регистрационный номер GenBank - J01749.1)Construction of single plasmids containing the BZ1/BZ28-based Ad vector genomes pBZ1_BZ28F (SEQ ID NO: 9) were constructed through several steps of gene synthesis (which was performed by GenScript) and standard molecular cloning procedures. First, several sequential steps of gene synthesis and subcloning were carried out, which together led to the replacement of the 2.3 kb EcoRI-NdeI fragment. from pBR322 (GenBank accession number - J01749.1)
- 12 044813 на синтезированную 8,1 т. п. о. нуклеотидную последовательность, предусматривающую фланкированную сайтами рестрикции SwaI последовательность, которая содержала левую и правую концевые части разработанного генома Ad-вектора BZ1/BZ28, при этом указанная левая концевая часть охватывала вышеупомянутую делецию Е1, а указанная правая концевая часть охватывала вышеупомянутую делецию E3, замену фибры BZ28, замену orf6 и orf6/7 Е4 HAdV-5 и вставку сайта рестрикции PacI в участке, прилегающем к rITR (в правой концевой части). Нуклеотидная последовательность полученной плазмиды, промежуточной плазмиды 1 на основе BZ1/BZ28, представлена под SEQ ID NO: 13. Во-вторых, рестрикционный фрагмент NheI-AscI длиной 12,3 т. п. о. из вирусного генома BZ1 (SEQ ID NO: 6) лигировали в расщепленную посредством NheI и AscI промежуточную плазмиду 1 BZ1/BZ28, что приводило к получению промежуточной плазмиды 2 BZ1/BZ28. В-третьих, рестрикционный фрагмент NdeI-HpaI длиной 11,8 т. п. о. из вирусного генома BZ1 лигировали в расщепленную посредством NdeI и HpaI промежуточную плазмиду 2 BZ1/BZ28, что приводило к получению промежуточной плазмиды 3 BZ1/BZ28. Вчетвертых, рестрикционный фрагмент NdeI-NdeI длиной 3,3 т. п. о. из вирусного генома BZ1 лигировали в расщепленную посредством NdeI промежуточную плазмиду 3 BZ1/BZ28, что приводило к получению конечной плазмиды pBZ1_BZ28F (SEQ ID NO: 9).- 12 044813 per synthesized 8.1 kb. a nucleotide sequence comprising a sequence flanked by SwaI restriction sites, which contained the left and right terminal portions of the designed BZ1/BZ28 Ad vector genome, wherein said left terminal portion encompassed the aforementioned E1 deletion, and said right terminal portion encompassed the aforementioned E3 deletion, the BZ28 fiber replacement , replacement of orf6 and orf6/7 E4 by HAdV-5 and insertion of a PacI restriction site in the region adjacent to the rITR (right terminal part). The nucleotide sequence of the resulting plasmid, BZ1/BZ28-based intermediate plasmid 1, is shown under SEQ ID NO: 13. Secondly, a 12.3 kb NheI-AscI restriction fragment. from the BZ1 viral genome (SEQ ID NO: 6) was ligated into NheI and AscI digested intermediate plasmid 1 BZ1/BZ28, resulting in intermediate plasmid 2 BZ1/BZ28. Third, the 11.8-kb NdeI-HpaI restriction fragment. from the BZ1 viral genome was ligated into NdeI and HpaI digested intermediate plasmid 2 BZ1/BZ28, resulting in intermediate plasmid 3 BZ1/BZ28. Fourth, a 3.3 kb NdeI-NdeI restriction fragment. from the BZ1 viral genome was ligated into NdeI-digested BZ1/BZ28 intermediate plasmid 3, resulting in the final plasmid pBZ1_BZ28F (SEQ ID NO: 9).
pBZ1_BZ28F.5IXP (SEQ ID NO: 10) конструировали с помощью стандартных процедур генного синтеза и молекулярного клонирования следующим образом. Сначала 2927 п. о. фрагмент ДНК (SEQ ID NO: 14), состоящий из модифицированного фрагмента генома вектора BZ1/BZ28, содержащего определенные промоторные последовательности pIX из HAdV-5 (т. е. последовательности, представленные под SEQ ID NO: 8), синтезировали и лигировали в виде рестрикционного фрагмента AsiSI-SalI в расщепленную посредством AsiSI и SalI промежуточную плазмиду 2 BZ1/BZ28, что приводило к получению промежуточной плазмиды 1 BZ1/BZ28.5IXP. Во-вторых, рестрикционный фрагмент SalI-SalI длиной 15,2 т. п. о. из вирусного генома BZ1 (SEQ ID NO: 6) лигировали в расщепленную посредством SalI промежуточную плазмиду 1 BZ1/BZ28.5IXP, что приводило к получению промежуточной плазмиды 2 BZ1/BZ28.5IXP. В-третьих, рестрикционный фрагмент ClaI-SpeI длиной 10,0 т. п. о. из вирусного генома BZ1 лигировали в расщепленную посредством ClaI и SpeI промежуточную плазмиду 2 BZ1.BZ28.5IXP, что приводило к получению конечной плазмиды pBZ1_BZ28F.5IXP (SEQ ID NO: 10).pBZ1_BZ28F.5IXP (SEQ ID NO: 10) was constructed using standard gene synthesis and molecular cloning procedures as follows. First 2927 bp. DNA fragment (SEQ ID NO: 14), consisting of a modified fragment of the BZ1/BZ28 vector genome containing specific pIX promoter sequences from HAdV-5 (i.e., the sequences presented under SEQ ID NO: 8), was synthesized and ligated as restriction fragment AsiSI-SalI into intermediate plasmid 2 BZ1/BZ28, digested by AsiSI and SalI, resulting in intermediate plasmid 1 BZ1/BZ28.5IXP. Secondly, the 15.2 kb SalI-SalI restriction fragment. from the BZ1 viral genome (SEQ ID NO: 6) was ligated into SalI-digested intermediate plasmid 1 BZ1/BZ28.5IXP, resulting in intermediate plasmid 2 BZ1/BZ28.5IXP. Third, a 10.0 kb ClaI-SpeI restriction fragment. from the BZ1 viral genome was ligated into ClaI and SpeI digested intermediate plasmid 2 BZ1.BZ28.5IXP, resulting in the final plasmid pBZ1_BZ28F.5IXP (SEQ ID NO: 10).
pBZ1_BZ28F.Fluc (SEQ ID NO: 15) и pBZ1_BZ28F.RSVF-2A-GLuc (SEQ ID NO: 16) представляли собой плазмиды, полученные из pBZ1_BZ28F, каждая из которых несет геном Ad-вектора на основе BZ1/BZ28, снабженный трансгенной кассетой экспрессии, вставленной в местоположение делеции Е1. Последовательности генома Ad-вектора, переносимые в данных плазмидах, представлены под SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18 соответственно. pBZ1_BZ28F.Fluc несет трансгенную кассету экспрессии люциферазы светлячка (FLuc). Управление данной кассетой осуществляется главным немедленно-ранним промотором цитомегаловируса (т. е. промотором CMV) и она содержит происходящий от SV40 сигнал полиаденилирования. pBZ1_BZ28F.RSVF-2A-GLuc несет трансгенную кассету экспрессии для RSVFa2-2A-GLuc (RSVF-2A-GLuc), который представлял собой химерный белок, состоящий из фузогенного гликопротеина респираторно-синцитиального вируса штамма А2, пептида вируса ящура 2А и люциферазы Gaussia (GLuc). Как и кассета Fluc, управление данной кассетой обеспечивается промотором CMV и она несет сигнал полиаденилирования SV40. Кроме того, данная кассета содержит в своей 5'нетранслируемой области последовательность, предусматривающую интрон 2 гена аполипопротеина А1 человека. Каждую из кассет экспрессии Fluc и RSVF-2A-GLuc конструировали за несколько стандартных стадий синтеза генов и молекулярного клонирования, после чего их лигировали в уникальный сайт рестрикционного фермента AsiSI pBZ1_BZ28F, с получением pBZ1_BZ28F.Fluc и pBZ1_BZ28F.RSVF-2AGLuc соответственно.pBZ1_BZ28F.Fluc (SEQ ID NO: 15) and pBZ1_BZ28F.RSVF-2A-GLuc (SEQ ID NO: 16) were plasmids derived from pBZ1_BZ28F, each carrying a BZ1/BZ28-based Ad vector genome equipped with a transgene cassette expression inserted at the location of the E1 deletion. The Ad vector genome sequences carried in these plasmids are provided under SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18, respectively. pBZ1_BZ28F.Fluc carries a transgenic firefly luciferase (FLuc) expression cassette. This cassette is driven by the major immediate-early promoter of cytomegalovirus (ie, the CMV promoter) and contains an SV40-derived polyadenylation signal. pBZ1_BZ28F.RSVF-2A-GLuc carries a transgenic expression cassette for RSVFa2-2A-GLuc (RSVF-2A-GLuc), which was a chimeric protein consisting of fusogenic glycoprotein of respiratory syncytial virus strain A2, foot-and-mouth disease virus peptide 2A, and Gaussia luciferase ( GLuc). Like the Fluc cassette, this cassette is driven by the CMV promoter and carries the SV40 polyadenylation signal. In addition, this cassette contains in its 5'untranslated region a sequence providing intron 2 of the human apolipoprotein A1 gene. Each of the Fluc and RSVF-2A-GLuc expression cassettes were constructed through several standard gene synthesis and molecular cloning steps, after which they were ligated into the unique AsiSI restriction enzyme site pBZ1_BZ28F, yielding pBZ1_BZ28F.Fluc and pBZ1_BZ28F.RSVF-2AGLuc, respectively.
Создание и получение аденовирусных векторов на основе BZ1/BZ28.Creation and production of adenoviral vectors based on BZ1/BZ28.
Аденовирусные векторы BZ1/BZ28.Fluc (также обозначаемый JAd4C5NVT003) и BZ1/BZ28.RSVF2A-Gluc (также обозначаемый JAd4C5NVT001), которые содержали последовательности генома аденовирусного вектора (SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18 соответственно), получали путем трансфекции соответствующими плазмидами с геномом Ad-вектора (т. е. pBZ1_BZ28F.Fluc и pBZ1_BZ28F.RSVF-2AGLuc) E1-комплементарных клеток PER.C6. Перед трансфекцией клеток PER.C6, которые выращивали в качестве адгезивных культур на модифицированной по Дульбекко среде Игла (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 10 мМ MgCl2, плазмиды с геномом Ad-вектора расщепляли с помощью SwaI для высвобождения соответствующих геномов аденовирусных векторов из плазмиды. Трансфекции выполняли в соответствии со стандартными процедурами с применением реагента для трансфекции липофектамина (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния). После сбора вирусов, спасенных путем трансфекции, вирусы дополнительно размножали с помощью нескольких последовательных циклов инфицирования на культурах клеток PER.C6. Вирусы очищали из собранной неочищенной вирусной биомассы с помощью двухстадийной процедуры ультрацентрифугирования в градиенте плотности хлорида цезия (CsCl), как описано ранее (Havenga et al., Novel replication-incompetent adenoviral B-group vectors: high vector stability and yield in PER.C6 cells, J. Gen. Virol. 87(8):2135-43 (2006)). Титры вирусных частиц (в. ч.) измеряли с помощью ранее описанной спектрофотометрической процедуры (Maizel et al., The polypeptides of adenovirus: I. Evidence for multiple protein components in the virion and a comparison ofThe adenoviral vectors BZ1/BZ28.Fluc (also designated JAd4C5NVT003) and BZ1/BZ28.RSVF2A-Gluc (also designated JAd4C5NVT001), which contained the adenoviral vector genome sequences (SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18, respectively), were produced by transfection corresponding plasmids with the Ad vector genome (i.e. pBZ1_BZ28F.Fluc and pBZ1_BZ28F.RSVF-2AGLuc) of E1-complemented PER.C6 cells. Before transfection of PER.C6 cells, which were grown as adherent cultures in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 10 mM MgCl 2 , Ad vector genome plasmids were digested with SwaI to release the corresponding genomes of adenoviral vectors from the plasmid. Transfections were performed according to standard procedures using Lipofectamine transfection reagent (Invitrogen; Carlsbad, CA). After collection of viruses rescued by transfection, the viruses were further propagated through several sequential rounds of infection in PER.C6 cell cultures. Viruses were purified from collected crude viral biomass using a two-step cesium chloride (CsCl) density gradient ultracentrifugation procedure as previously described (Havenga et al., Novel replication-incompetent adenoviral B-group vectors: high vector stability and yield in PER.C6 cells , J Gen Virol 87(8):2135–43 (2006). Viral particle titers (vp) were measured using a previously described spectrophotometric procedure (Maizel et al., The polypeptides of adenovirus: I. Evidence for multiple protein components in the virion and a comparison of
- 13 044813 types 2, 7A, and 12, Virology, 36(1): 115-25 (1968)).- 13 044813 types 2, 7A, and 12, Virology, 36(1): 115-25 (1968)).
Пример 2. Клеточные и гуморальные иммунные ответы, индуцированные BZ1/BZ28.FLuc.Example 2: Cellular and Humoral Immune Responses Induced by BZ1/BZ28.FLuc.
Клеточную и гуморальную иммуногенность нового аденовирусного вектора BZ1/BZ28 оценивали с применением люциферазы светлячка (FLuc) в качестве кодируемого вектором (модельного) вакцинного антигена. Мышей Balb/C иммунизировали внутримышечно посредством Ad26.FLuc (положительный контроль) или BZ1/BZ28.FLuc (оба в количестве 10 и 10 вирусных частиц на мышь) либо посредством вектора отрицательного контроля, который не кодировал трансген (пустым Ad26, 1010 вирусных частиц на мышь). Мышей умерщвляли спустя две недели и собирали образцы крови и спленоциты (фиг. 1А).The cellular and humoral immunogenicity of the novel adenoviral vector BZ1/BZ28 was assessed using firefly luciferase (FLuc) as the vector-encoded (model) vaccine antigen. Balb/C mice were immunized intramuscularly with Ad26.FLuc (positive control) or BZ1/BZ28.FLuc (both at 10 and 10 viral particles per mouse) or with a negative control vector that did not encode a transgene (blank Ad26, 10 10 viral particles on the mouse). Mice were sacrificed two weeks later, and blood samples and splenocytes were collected (Fig. 1A).
Индукцию клеточного иммунитета к кодируемому вектором антигену оценивали с помощью анализа ELISPOT, специфичного в отношении FLuc. С этой целью выделенные спленоциты стимулировали в течение ночи 15-мерными перекрывающимися пептидами, охватывающими белок FLuc, и клеточные иммунные ответы определяли с помощью анализа ELISPOT ex-vivo, измеряя относительное количество секретирующих IFN-γ клеток (фиг. 1В). Из результатов было видно, что при иммунизации в более высоких дозах (1010) клеточные иммунные ответы, индуцированные BZ1/BZ28, были приблизительно такими же высокими, как и ответ, наблюдаемый в случае Ad26.FLuc. В отличие от этого, при иммунизации более низкой дозой (109) BZ1/BZ28.FLuc обеспечивал намного более сильный ответ, чем Ad26.FLuc.Induction of cellular immunity to vector-encoded antigen was assessed using a FLuc-specific ELISPOT assay. To this end, isolated splenocytes were stimulated overnight with 15-mer overlapping peptides spanning the FLuc protein, and cellular immune responses were determined using an ex-vivo ELISPOT assay, measuring the relative abundance of IFN-γ-secreting cells (Fig. 1B). The results showed that when immunized at higher doses (10 10 ), the cellular immune responses induced by BZ1/BZ28 were approximately as high as the response observed with Ad26.FLuc. In contrast, when immunized at a lower dose (109), BZ1/BZ28.FLuc produced a much stronger response than Ad26.FLuc.
Способность BZ1/BZ28 индуцировать гуморальный иммунитет против кодируемого им антигена оценивали путем измерения антител, выработанных к FLuc. Образцы сыворотки крови от иммунизированных мышей (собранные через 2 недели) тестировали с помощью ELISA с применением антител, специфичных к FLuc. На фиг. 1С видно, что в количестве 10 в. ч. на мышь вектор BZ1/BZ28, экспрессирующий люциферазу светлячка, обеспечивал более высокие конечные титры, чем в случае эталона Ad26.FLuc. Как и ожидалось, титры антител, специфичных к Fluc, в сыворотке крови мышей, иммунизированных пустыми векторами, не кодирующими люциферазу светлячка, обнаружены не были.The ability of BZ1/BZ28 to induce humoral immunity against its encoded antigen was assessed by measuring antibodies raised to FLuc. Serum samples from immunized mice (collected after 2 weeks) were tested by ELISA using antibodies specific for FLuc. In fig. 1C shows that in the amount of 10 v. hours per mouse, the BZ1/BZ28 vector expressing firefly luciferase provided higher final titers than the Ad26.FLuc reference. As expected, no Fluc-specific antibody titers were detected in the serum of mice immunized with empty vectors that do not encode firefly luciferase.
В целом, из данных видно, что вектор BZ1/BZ28 может индуцировать сильные клеточный и гуморальный иммунные ответы на кодируемый вектором антиген, которые характеризовались более высокой степенью, чем ответы, которые индуцировались эталонным вектором на основе HAdV-26. Эти иммунные ответы четко указывали на сильную иммуногенность вектора BZ1/BZ28 у мышей.Overall, the data show that the BZ1/BZ28 vector can induce strong cellular and humoral immune responses to the vector-encoded antigen that are higher in magnitude than those induced by the reference HAdV-26 vector. These immune responses clearly indicated the strong immunogenicity of the BZ1/BZ28 vector in mice.
Пример 3. Оценка серологической перекрестной нейтрализации среди новых и существующих аденовирусных векторов.Example 3. Evaluation of serological cross-neutralization among new and existing adenoviral vectors.
Для обеспечения своей потенциальной применимости в качестве новых аденовирусных вакцинных векторов новые аденовирусные векторы BZ1/BZ28, созданные в соответствии с настоящим документом, предпочтительно будут серологически отличаться от существующих аденовирусных векторов, которые в настоящее время уже находятся в разработке в качестве вакцинных векторов, таких как векторы на основе аденовируса человека серотипов HAdV-5 и HAdV-35. Поэтому проводили тесты перекрестной нейтрализации среди новых аденовирусных векторов BZ1/BZ28 и нескольких существующих векторов на основе HAdV-4, HAdV-5, HAdV-26 и HAdV-35. С этой целью антисыворотку мышей, каждая из которых была индуцирована в ответ на один из этих аденовирусных векторов, тестировали в отношении каждого из данных различных векторов в анализе нейтрализации аденовируса. Антисыворотку мышей, применяемую для этого анализа, собирали у мышей Balb/C через две или восемь недель после их иммунизации посредством 10 векторных частиц на мышь. Анализ нейтрализации аденовируса проводили так, как описано ранее (Spangers et al., 2003. J.Clin. Microbiol. 41:5046-5052). Вкратце, начиная с разведения 1:16, сыворотку крови серийно разводили в 2 раза, затем предварительно смешивали с аденовирусными векторами, экспрессирующими люциферазу светлячка (FLuc), а затем инкубировали в течение ночи с клетками А549 (при множественности инфицирования, составляющей 500 вирусных частиц на клетку). Уровни активности люциферазы в лизатах инфицированных клеток, измеренные через 24 ч после инфицирования, представляли собой эффективность инфицирования вектором. Титры нейтрализации к данному вектору определяли как наибольшее разведение сыворотки, способное понижать эффективность инфицирования вектором на 90%. Титры нейтрализации условно разделяли на следующие категории: <16 (нейтрализация отсутствовала), 16-200, 200-2000 и >2000.To ensure their potential utility as new adenoviral vaccine vectors, the new BZ1/BZ28 adenoviral vectors generated herein will preferably be serologically different from existing adenoviral vectors that are currently in development as vaccine vectors, such as based on human adenovirus serotypes HAdV-5 and HAdV-35. Therefore, cross-neutralization tests were performed among the new adenoviral vectors BZ1/BZ28 and several existing vectors based on HAdV-4, HAdV-5, HAdV-26 and HAdV-35. To this end, mouse antisera, each raised in response to one of these adenoviral vectors, were tested against each of these different vectors in an adenovirus neutralization assay. The mouse antiserum used for this assay was collected from Balb/C mice two to eight weeks after their immunization with 10 vector particles per mouse. The adenovirus neutralization assay was performed as previously described (Spangers et al., 2003. J. Clin. Microbiol. 41:5046-5052). Briefly, starting at a 1:16 dilution, serum was serially diluted 2-fold, then premixed with adenoviral vectors expressing firefly luciferase (FLuc) and then incubated overnight with A549 cells (at a multiplicity of infection of 500 viral particles per cell). Levels of luciferase activity in infected cell lysates measured 24 h postinfection represented the efficiency of vector infection. Neutralization titers for a given vector were determined as the highest serum dilution capable of reducing the efficiency of infection by the vector by 90%. Neutralization titers were roughly divided into the following categories: <16 (no neutralization), 16–200, 200–2000, and >2000.
Из результатов видно отсутствие перекрестной нейтрализации среди протестированных векторов (фиг. 2). BZ1/BZ28 демонстрировал гомологичный ответ с выработкой нейтрализующих антител, но не демонстрировал перекрестной нейтрализации с векторами на основе аденовируса человека, включенными в тестируемую панель, т.е. Ad26, Ad35, Ad5 и Ad4. Следовательно, новый аденовирусный вектор BZ1/BZ28 потенциально можно использовать в сочетании с одним или несколькими из этих или других отдельных аденовирусных векторов при последовательных иммунизациях, например, в контексте режима гетерологичной прайм-буст вакцинации или, альтернативно или дополнительно, в контексте серии двух или более последовательных режимов вакцинации против различных заболеваний или антигенов.The results show that there is no cross-neutralization among the tested vectors (Fig. 2). BZ1/BZ28 exhibited a homologous response with the production of neutralizing antibodies, but did not demonstrate cross-neutralization with the human adenovirus vectors included in the tested panel, i.e. Ad26, Ad35, Ad5 and Ad4. Therefore, the novel BZ1/BZ28 adenoviral vector could potentially be used in combination with one or more of these or other individual adenoviral vectors in sequential immunizations, for example, in the context of a heterologous prime-boost vaccination regimen or, alternatively or additionally, in the context of a series of two or more sequential vaccination regimens against different diseases or antigens.
Пример 4. Серопревалентность у людей новых аденовирусных векторов.Example 4. Seroprevalence of new adenoviral vectors in humans.
Важным для их потенциального применения в качестве эффективных вакцинных векторов является то, что описанные в настоящем изобретении новые аденовирусные векторы не сдерживаются высокими уровнями предсуществующего противовекторного гуморального иммунитета в целевых для вакцины популяциях. По этой причине вектор BZ1/BZ28 оценивали на его серопревалентность в образцах сыво- 14 044813 ротки крови, полученных от группы из 200 взрослых человек в возрасте от 18 до 55 лет, проживающих в Соединенных Штатах (США) и Европейском союзе (ЕС). Вектор тестировали в отношении нейтрализации образцами сыворотки крови человека, проводя стандартный анализ нейтрализации аденовируса, который был описан ранее (Sprangers et al., 2003. J.Clin. Microbiol. 41:5046-5052). Вкратце, начиная с разведения 1:16, сыворотку крови серийно разводили в 2 раза, затем предварительно смешивали с аденовирусными векторами, экспрессирующими люциферазу светлячка (FLuc), а затем инкубировали в течение ночи с клетками А549 (при множественности инфицирования, составляющей 500 вирусных частиц на клетку). Уровни активности люциферазы в лизатах инфицированных клеток, измеренные через 24 ч после инфицирования, представляли собой эффективность инфицирования вектором. Титры нейтрализации к данному вектору определяли как наибольшее разведение сыворотки, способное понижать эффективность инфицирования вектором на 90%. Титры нейтрализации условно разделяли на следующие категории: <16 (нейтрализация отсутствовала), 16-300, 300-1000, 1000-4000 и >4000. Результаты свидетельствовали, что серопревалентность BZ1/BZ28 у субъектов-людей была схожей с таковой для Ad5 (фиг. 3). Тем не менее, по сравнению с Ad5 положительные титры нейтрализующих антител, которые наблюдали в отношении нового вектора BZ1/BZ28, были, в целом, довольно низкими. Например, из всех протестированных образцов сыворотки крови более 25% характеризовались титрами нейтрализующих антител к Ad5 >1000, в то время как лишь приблизительно 3% характеризовались таким уровнем титров нейтрализующих антител к BZ1/BZ28.Important for their potential use as effective vaccine vectors is that the novel adenoviral vectors described in the present invention are not inhibited by high levels of pre-existing anti-vector humoral immunity in vaccine target populations. For this reason, the BZ1/BZ28 vector was assessed for its seroprevalence in serum samples obtained from a cohort of 200 adults aged 18 to 55 years living in the United States (US) and the European Union (EU). The vector was tested for neutralization by human serum samples using a standard adenovirus neutralization assay that has been described previously (Sprangers et al., 2003. J. Clin. Microbiol. 41:5046-5052). Briefly, starting at a 1:16 dilution, serum was serially diluted 2-fold, then premixed with adenoviral vectors expressing firefly luciferase (FLuc) and then incubated overnight with A549 cells (at a multiplicity of infection of 500 viral particles per cell). Levels of luciferase activity in infected cell lysates measured 24 h postinfection represented the efficiency of vector infection. Neutralization titers for a given vector were determined as the highest serum dilution capable of reducing the efficiency of infection by the vector by 90%. Neutralization titers were roughly divided into the following categories: <16 (no neutralization), 16–300, 300–1000, 1000–4000, and >4000. The results indicated that the seroprevalence of BZ1/BZ28 in human subjects was similar to that of Ad5 (Fig. 3). However, compared to Ad5, the positive neutralizing antibody titers observed with the new BZ1/BZ28 vector were generally quite low. For example, of all serum samples tested, more than 25% had anti-Ad5 neutralizing antibody titers >1000, while only approximately 3% had anti-BZ1/BZ28 neutralizing antibody titers at this level.
В целом, приведенные выше данные указывали на то, что предсуществующий гуморальный противовекторный иммунитет к векторам BZ1/BZ28, выраженный как уровни титров предсуществующих нейтрализующих антител к вектору, можно считать относительно низким в оцененных целевых для вакцины популяциях, что позволяло предположить, что эти векторы потенциально могут являться эффективными вакцинными векторами в этих популяциях.Overall, the above data indicated that pre-existing humoral anti-vector immunity to the BZ1/BZ28 vectors, expressed as levels of pre-existing neutralizing antibody titers to the vector, could be considered relatively low in the vaccine target populations assessed, suggesting that these vectors have the potential to may be effective vaccine vectors in these populations.
Пример 5. Продуктивность аденовирусного вектора в суспензии клеток PER.C6.Example 5. Productivity of an adenoviral vector in a PER.C6 cell suspension.
Аденовирусные векторы, подлежащие применению в клинических испытаниях и за их пределами, должны предусматривать легкое получение высоких титров в масштабируемой бессывороточной платформе для получения аденовирусов. Такой платформой являются адаптированные к суспензии клетки PER.C6®, также называемые данном документе суспендированными клетками PER.C6 или SPER.C6, поскольку было показано, что они поддерживают крупномасштабное производство аденовирусных векторов в биореакторах, обеспечивая большие количества препаратов клинического класса на основе векторов с высоким титром, например предусматривающих делецию Е1 векторов на основе HAdV-26 или HAdV-35 (ЕР 2536829 В1, EP 2350268 В1).Adenoviral vectors for use in clinical trials and beyond must be capable of easy production of high titers in a scalable, serum-free adenovirus production platform. Such a platform is suspension-adapted PER.C6® cells, also referred to herein as suspended PER.C6 or SPER.C6 cells, as they have been shown to support large-scale production of adenoviral vectors in bioreactors, providing large quantities of clinical-grade vector-based drugs. high titer, for example, E1 deletion vectors based on HAdV-26 or HAdV-35 (EP 2536829 B1, EP 2350268 B1).
В качестве первоначальной оценки того, будут ли описанные в настоящем изобретении новые векторы подходить для способов производства на основе клеток SPER.C6, проводили мелкомасштабные эксперименты по изучению продуктивности вектора на клетках SPER.C6, культивируемых в шейкерных колбах. Такие эксперименты по изучению продуктивности проводили с помощью кодирующей Fluc версии нового Ad-вектора BZ1/BZ28, описанного в примере 1. В качестве эталонного контроля использовали вектор Ad26.Fluc на основе HAdV-26. Суспензию культур клеток PER.C6, высеянных в шейкерные колбы с плотностью 1x106 клеток/мл в общем объеме 10 мл среды PERMEXCIS® (доступной от Lonza) с добавлением 4 мМ L-глутамина (Lonza), инфицировали различными векторами с различными отношениями вирусных частиц (в. ч.) на клетку, а затем инкубировали в течение 4 дней. Различные отношения в. ч. на клетку, применяемые для инфицирования, составляли 70, 150 и 900. Каждый день собирали образцы инфицированных культур клеток и определяли титры в. ч. в этих образцах с помощью протокола на основе количественной ПЦР (qPCR), который предусматривал использование праймеров и зонда, специфичных к промотору CMV (который присутствовал во всех протестированных векторах). Этот протокол предусматривал обработку ДНКазой тестируемых образцов перед проведением qPCR для удаления любой свободной векторной ДНК (т. е. векторных геномов, которые не были упакованы в вирусные частицы).As an initial assessment of whether the novel vectors described herein would be suitable for production methods based on SPER.C6 cells, small-scale vector productivity experiments were performed on SPER.C6 cells cultured in shake flasks. These productivity experiments were performed using the Fluc-encoding version of the novel BZ1/BZ28 Ad vector described in Example 1. The HAdV-26-based vector Ad26.Fluc was used as a reference control. A suspension of PER.C6 cell cultures seeded in shake flasks at a density of 1x106 cells/ml in a total volume of 10 ml of PERMEXCIS® medium (available from Lonza) supplemented with 4 mM L-glutamine (Lonza) was infected with different vectors with different ratios of viral particles ( h.p.) per cell and then incubated for 4 days. Various relationships c. hours per cell used for infection were 70, 150 and 900. Every day, samples of infected cell cultures were collected and titers were determined. h in these samples using a quantitative PCR (qPCR)-based protocol that involved the use of primers and probe specific for the CMV promoter (which was present in all vectors tested). This protocol involved DNase treatment of test samples prior to qPCR to remove any free vector DNA (i.e., vector genomes that were not packaged into viral particles).
Результаты в отношении продуктивности, полученные для нового вектора BZ1/BZ28.Fluc, показаны на фигуре 6. Для BZ1/BZ28.Fluc наблюдали более высокие титры в. ч., чем для эталонного контрольного вектора Ad26.Fluc, при всех протестированных отношениях инфицирования в. ч. на клетку и во всех протестированных моментах времени, когда производили сбор материала. Эти результаты демонстрировали хорошую продуктивность для нового вектора BZ1/BZ28 на модели бессывороточной суспензионной клеточной культуры на основе SPER.C6.The productivity results obtained for the new vector BZ1/BZ28.Fluc are shown in Figure 6. Higher titers were observed for BZ1/BZ28.Fluc. hours than for the reference control vector Ad26.Fluc, for all tested infection ratios c. hours per cell and at all tested time points when the material was collected. These results demonstrated good productivity for the new BZ1/BZ28 vector in the SPER.C6-based serum-free suspension cell culture model.
В совокупности, результаты исследований гуморального и клеточного иммунных ответов, индуцированных новыми рекомбинантными аденовирусными векторами на основе BZ1/BZ28 по настоящему изобретению, которые представлены выше, ясно указывали на сильную иммуногенность этих векторов у мышей. Кроме того, было продемонстрировано, что векторы не индуцировали перекрестные ответы нейтрализующих антител в отношении определенных существующих векторов-кандидатов аденовирусных вакцин (например, Ad26, Ad35 и Ad5) или наоборот. Более того, по сравнению с Ad5 новые векторы демонстрировали относительно низкие уровни титра предсуществующих у людей нейтрализующих анти- 15 044813 тел к вектору. Наконец, новые векторы можно легко получать с высокими показателями выхода. Сочетание низкой серопревалентности, высокой иммуногенности и продуктивности позволяет предположить, что новые аденовирусные векторы по настоящему изобретению могут быть пригодны в качестве новых кандидатов на вакцинный вектор к различным патогенам и дополнительно могут быть применимы в генной терапии и/или диагностике.Taken together, the results of the studies on the humoral and cellular immune responses induced by the novel BZ1/BZ28-based recombinant adenoviral vectors of the present invention, which are presented above, clearly indicated the strong immunogenicity of these vectors in mice. Additionally, it was demonstrated that the vectors did not induce cross-neutralizing antibody responses against certain existing adenoviral vaccine vector candidates (eg, Ad26, Ad35, and Ad5) or vice versa. Moreover, compared to Ad5, the new vectors exhibited relatively low levels of titer of pre-existing neutralizing antibodies to the vector in humans. Finally, new vectors can be easily produced with high yields. The combination of low seroprevalence, high immunogenicity and productivity suggests that the novel adenoviral vectors of the present invention may be useful as new vaccine vector candidates for various pathogens and may additionally be useful in gene therapy and/or diagnostics.
Специалистам в данной области техники будет понятно, что в описанные выше варианты осуществления могут быть внесены изменения без отступления от их общего изобретательского замысла. Таким образом, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретными раскрытыми вариантами осуществления, но предусматривает охват модификаций в рамках сущности и объема настоящего изобретения, определенных настоящим изобретением.Those skilled in the art will appreciate that changes may be made to the embodiments described above without departing from their general inventive spirit. Thus, it should be understood that the present invention is not limited to the specific embodiments disclosed, but is intended to cover modifications within the spirit and scope of the present invention as defined by the present invention.
Claims (14)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP17199354.6 | 2017-10-31 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA044813B1 true EA044813B1 (en) | 2023-10-02 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7366014B2 (en) | Adenovirus and its uses | |
| JP7285833B2 (en) | Adenovirus and its use | |
| US11459583B2 (en) | Adenovirus vectors and uses thereof | |
| US11872281B2 (en) | Adenovirus and uses thereof | |
| WO2009111738A2 (en) | Single cycle replicating adenovirus vectors | |
| EA044813B1 (en) | ADENOVIRUS AND ITS APPLICATIONS | |
| EA044526B1 (en) | ADENOVIRUS AND WAYS OF ITS APPLICATION | |
| US20220372515A1 (en) | Adenovirus vectors and uses thereof | |
| EA042952B1 (en) | ADENOVIRUS AND WAYS OF ITS APPLICATION | |
| EA045436B1 (en) | ADENOVIRAL VECTORS AND WAYS OF THEIR APPLICATION | |
| BR112020008198A2 (en) | adenovirus and its uses |