EA044650B1 - GLP1-FC FUSION PROTEIN AND ITS CONJUGATE - Google Patents
GLP1-FC FUSION PROTEIN AND ITS CONJUGATE Download PDFInfo
- Publication number
- EA044650B1 EA044650B1 EA202190744 EA044650B1 EA 044650 B1 EA044650 B1 EA 044650B1 EA 202190744 EA202190744 EA 202190744 EA 044650 B1 EA044650 B1 EA 044650B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- glp
- seq
- glp1
- sortase
- fusion protein
- Prior art date
Links
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims description 103
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 111
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 99
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 97
- 102100040918 Pro-glucagon Human genes 0.000 claims description 88
- DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N Glucagon-like peptide 1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N 0.000 claims description 85
- 101800000224 Glucagon-like peptide 1 Proteins 0.000 claims description 84
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 50
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 36
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 claims description 34
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 claims description 34
- 108010005794 dulaglutide Proteins 0.000 claims description 30
- 229960005175 dulaglutide Drugs 0.000 claims description 30
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 27
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 229940089838 Glucagon-like peptide 1 receptor agonist Drugs 0.000 claims description 19
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 18
- 239000003877 glucagon like peptide 1 receptor agonist Substances 0.000 claims description 18
- 108090000250 sortase A Proteins 0.000 claims description 16
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 claims description 13
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 11
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 claims description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 6
- 108090000251 Sortase B Proteins 0.000 claims description 5
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 claims description 5
- 108010011459 Exenatide Proteins 0.000 claims description 3
- 108010019598 Liraglutide Proteins 0.000 claims description 3
- YSDQQAXHVYUZIW-QCIJIYAXSA-N Liraglutide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCNC(=O)CC[C@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 YSDQQAXHVYUZIW-QCIJIYAXSA-N 0.000 claims description 3
- XVVOERDUTLJJHN-UHFFFAOYSA-N Lixisenatide Chemical compound C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1C(CCC1)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CO)C(=O)NCC(=O)NC(C)C(=O)N1C(CCC1)C(=O)N1C(CCC1)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CCCCN)C(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CCCNC(N)=N)NC(=O)C(NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(CCSC)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC(O)=O)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(NC(=O)C(CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)C(NC(=O)CNC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)C(N)CC=1NC=NC=1)C(C)O)C(C)O)C(C)C)CC1=CC=CC=C1 XVVOERDUTLJJHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- DLSWIYLPEUIQAV-UHFFFAOYSA-N Semaglutide Chemical compound CCC(C)C(NC(=O)C(Cc1ccccc1)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(CCCCNC(=O)COCCOCCNC(=O)COCCOCCNC(=O)CCC(NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O)C(O)=O)NC(=O)C(C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(Cc1ccc(O)cc1)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(O)=O)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(NC(=O)C(Cc1ccccc1)NC(=O)C(NC(=O)CNC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C)(C)NC(=O)C(N)Cc1cnc[nH]1)C(C)O)C(C)O)C(C)C)C(=O)NC(C)C(=O)NC(Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O DLSWIYLPEUIQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- OGWAVGNOAMXIIM-UHFFFAOYSA-N albiglutide Chemical compound O=C(O)C(NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)CNC(=O)C(N)CC=1(N=CNC=1))CCC(=O)O)C(O)C)CC2(=CC=CC=C2))C(O)C)CO)CC(=O)O)C(C)C)CO)CO)CC3(=CC=C(O)C=C3))CC(C)C)CCC(=O)O)CCC(=O)N)C)C)CCCCN)CCC(=O)O)CC4(=CC=CC=C4))C(CC)C)C)CC=6(C5(=C(C=CC=C5)NC=6)))CC(C)C)C(C)C)CCCCN)CCCNC(=N)N OGWAVGNOAMXIIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960004733 albiglutide Drugs 0.000 claims description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 3
- JUFFVKRROAPVBI-PVOYSMBESA-N chembl1210015 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO[C@]3(O[C@@H](C[C@H](O)[C@H](O)CO)[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C3)C(O)=O)O2)O)[C@@H](CO)O1)NC(C)=O)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 JUFFVKRROAPVBI-PVOYSMBESA-N 0.000 claims description 3
- 229960001519 exenatide Drugs 0.000 claims description 3
- 229960002701 liraglutide Drugs 0.000 claims description 3
- 108010004367 lixisenatide Proteins 0.000 claims description 3
- 229960001093 lixisenatide Drugs 0.000 claims description 3
- 108700027806 rGLP-1 Proteins 0.000 claims description 3
- 108010060325 semaglutide Proteins 0.000 claims description 3
- 229950011186 semaglutide Drugs 0.000 claims description 3
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 claims description 2
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 54
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 54
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 50
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 45
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 45
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 43
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 33
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 32
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 31
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 31
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 27
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 27
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 27
- 239000000047 product Substances 0.000 description 27
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 26
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 24
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 24
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 24
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 22
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 22
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 22
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 22
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 21
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 21
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 17
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 17
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 16
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 12
- 238000007446 glucose tolerance test Methods 0.000 description 11
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 9
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 9
- 230000004044 response Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 9
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- -1 2,3-diaminopropionic acid N-ethylglycine Chemical compound 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- 125000003412 L-alanyl group Chemical group [H]N([H])[C@@](C([H])([H])[H])(C(=O)[*])[H] 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 6
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 5
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 5
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 5
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 208000016261 weight loss Diseases 0.000 description 5
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 5
- 102000007446 Glucagon-Like Peptide-1 Receptor Human genes 0.000 description 4
- 108010086246 Glucagon-Like Peptide-1 Receptor Proteins 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 4
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 4
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 4
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 102100025012 Dipeptidyl peptidase 4 Human genes 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101800000221 Glucagon-like peptide 2 Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 125000000570 L-alpha-aspartyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[C@]([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 3
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 3
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 229920000547 conjugated polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000000081 effect on glucose Effects 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- TWSALRJGPBVBQU-PKQQPRCHSA-N glucagon-like peptide 2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)[C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 TWSALRJGPBVBQU-PKQQPRCHSA-N 0.000 description 3
- 230000004153 glucose metabolism Effects 0.000 description 3
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 3
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 229920001897 terpolymer Polymers 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N (+/-)-1,3-Butanediol Chemical compound CC(O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoisobutyric acid Chemical compound CC(C)(N)C(O)=O FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RDFMDVXONNIGBC-UHFFFAOYSA-N 2-aminoheptanoic acid Chemical compound CCCCCC(N)C(O)=O RDFMDVXONNIGBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 2
- 102000003779 Dipeptidyl-peptidases and tripeptidyl-peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108090000194 Dipeptidyl-peptidases and tripeptidyl-peptidases Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 2
- 101000930822 Giardia intestinalis Dipeptidyl-peptidase 4 Proteins 0.000 description 2
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 2
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 2
- 108091016366 Histone-lysine N-methyltransferase EHMT1 Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 125000003440 L-leucyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 125000002842 L-seryl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- KSPIYJQBLVDRRI-UHFFFAOYSA-N N-methylisoleucine Chemical compound CCC(C)C(NC)C(O)=O KSPIYJQBLVDRRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 2
- 108010058003 Proglucagon Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 2
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 2
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 2
- QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N alpha-aminobutyric acid Chemical compound CCC(N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003472 antidiabetic agent Substances 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- IADUEWIQBXOCDZ-UHFFFAOYSA-N azetidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CCN1 IADUEWIQBXOCDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- GBFLZEXEOZUWRN-UHFFFAOYSA-N carbocisteine Chemical compound OC(=O)C(N)CSCC(O)=O GBFLZEXEOZUWRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 2
- 125000000000 cycloalkoxy group Chemical group 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 2
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000030136 gastric emptying Effects 0.000 description 2
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 2
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 2
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N preproglucagon 78-108 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N 0.000 description 2
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 2
- 239000013636 protein dimer Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BJBUEDPLEOHJGE-UHFFFAOYSA-N (2R,3S)-3-Hydroxy-2-pyrolidinecarboxylic acid Natural products OC1CCNC1C(O)=O BJBUEDPLEOHJGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DDYAPMZTJAYBOF-ZMYDTDHYSA-N (3S)-4-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-4-amino-1-[[(2S,3R)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-4-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-4-amino-1-[[(2S)-4-amino-1-[[(2S,3S)-1-[[(1S)-1-carboxyethyl]amino]-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,4-dioxobutan-2-yl]amino]-1,4-dioxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,4-dioxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-1,4-dioxobutan-2-yl]amino]-4-methylsulfanyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]hexanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical class [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DDYAPMZTJAYBOF-ZMYDTDHYSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JHTPBGFVWWSHDL-UHFFFAOYSA-N 1,4-dichloro-2-isothiocyanatobenzene Chemical compound ClC1=CC=C(Cl)C(N=C=S)=C1 JHTPBGFVWWSHDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JNOZGFXJZQXOSU-UHFFFAOYSA-N 1-chloro-2-methylpropan-2-ol Chemical compound CC(C)(O)CCl JNOZGFXJZQXOSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XXMFJKNOJSDQBM-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trifluoroacetic acid;hydrate Chemical compound [OH3+].[O-]C(=O)C(F)(F)F XXMFJKNOJSDQBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AHLFJIALFLSDAQ-UHFFFAOYSA-N 2-(pentylazaniumyl)acetate Chemical compound CCCCCNCC(O)=O AHLFJIALFLSDAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TXHAHOVNFDVCCC-UHFFFAOYSA-N 2-(tert-butylazaniumyl)acetate Chemical compound CC(C)(C)NCC(O)=O TXHAHOVNFDVCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 2-aminoadipic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CCCC(O)=O OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XABCFXXGZPWJQP-UHFFFAOYSA-N 3-aminoadipic acid Chemical compound OC(=O)CC(N)CCC(O)=O XABCFXXGZPWJQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SWLAMJPTOQZTAE-UHFFFAOYSA-N 4-[2-[(5-chloro-2-methoxybenzoyl)amino]ethyl]benzoic acid Chemical class COC1=CC=C(Cl)C=C1C(=O)NCCC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 SWLAMJPTOQZTAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M Acrylate Chemical compound [O-]C(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N Acrylic acid Chemical compound OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 1
- 229940077274 Alpha glucosidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 101100437118 Arabidopsis thaliana AUG1 gene Proteins 0.000 description 1
- IADUEWIQBXOCDZ-VKHMYHEASA-N Azetidine-2-carboxylic acid Natural products OC(=O)[C@@H]1CCN1 IADUEWIQBXOCDZ-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 229940123208 Biguanide Drugs 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241001631457 Cannula Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 101800001982 Cholecystokinin Proteins 0.000 description 1
- 102100025841 Cholecystokinin Human genes 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000005636 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Human genes 0.000 description 1
- 108010045171 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 208000002249 Diabetes Complications Diseases 0.000 description 1
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 208000008279 Dumping Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000030814 Eating disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 208000019454 Feeding and Eating disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108010088406 Glucagon-Like Peptides Proteins 0.000 description 1
- 101800004266 Glucagon-like peptide 1(7-37) Proteins 0.000 description 1
- 102400000324 Glucagon-like peptide 1(7-37) Human genes 0.000 description 1
- 208000002705 Glucose Intolerance Diseases 0.000 description 1
- 102000017011 Glycated Hemoglobin A Human genes 0.000 description 1
- 108010014663 Glycated Hemoglobin A Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102100035043 Histone-lysine N-methyltransferase EHMT1 Human genes 0.000 description 1
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 1
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 1
- 101000684208 Homo sapiens Prolyl endopeptidase FAP Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- LCWXJXMHJVIJFK-UHFFFAOYSA-N Hydroxylysine Natural products NCC(O)CC(N)CC(O)=O LCWXJXMHJVIJFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 206010021518 Impaired gastric emptying Diseases 0.000 description 1
- 102000003746 Insulin Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 description 1
- 208000031773 Insulin resistance syndrome Diseases 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHNVWZDZSA-N L-allo-Isoleucine Chemical compound CC[C@@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- 125000001176 L-lysyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(N([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N L-methionine (R)-S-oxide Chemical compound C[S@@](=O)CC[C@H]([NH3+])C([O-])=O QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N 0.000 description 1
- UCUNFLYVYCGDHP-BYPYZUCNSA-N L-methionine sulfone Chemical compound CS(=O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O UCUNFLYVYCGDHP-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N L-methionine sulphoxide Natural products CS(=O)CCC(N)C(O)=O QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- HXEACLLIILLPRG-YFKPBYRVSA-N L-pipecolic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]1CCCC[NH2+]1 HXEACLLIILLPRG-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- DZLNHFMRPBPULJ-VKHMYHEASA-N L-thioproline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CSCN1 DZLNHFMRPBPULJ-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 125000000769 L-threonyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])[C@](O[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 description 1
- 125000003580 L-valyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 101710141347 Major envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- GDFAOVXKHJXLEI-VKHMYHEASA-N N-methyl-L-alanine Chemical compound C[NH2+][C@@H](C)C([O-])=O GDFAOVXKHJXLEI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AKCRVYNORCOYQT-YFKPBYRVSA-N N-methyl-L-valine Chemical compound CN[C@@H](C(C)C)C(O)=O AKCRVYNORCOYQT-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108090000279 Peptidyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 239000004264 Petrolatum Substances 0.000 description 1
- 229920002732 Polyanhydride Polymers 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 229920001710 Polyorthoester Polymers 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 208000032395 Post gastric surgery syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102000035554 Proglucagon Human genes 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 1
- 206010049416 Short-bowel syndrome Diseases 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N Streptozotocin Natural products O=NN(C)C(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 229940100389 Sulfonylurea Drugs 0.000 description 1
- 229940123464 Thiazolidinedione Drugs 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- PMZXXNPJQYDFJX-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;2,2,2-trifluoroacetic acid Chemical compound CC#N.OC(=O)C(F)(F)F PMZXXNPJQYDFJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003888 alpha glucosidase inhibitor Substances 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 229920005603 alternating copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000010775 animal oil Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229940127003 anti-diabetic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000883 anti-obesity agent Substances 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 125000002102 aryl alkyloxo group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004104 aryloxy group Chemical group 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 150000004283 biguanides Chemical class 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N but-3-enoic acid;ethene Chemical compound C=C.OC(=O)CC=C DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I calcium;potassium;disodium;(2s)-2-hydroxypropanoate;dichloride;dihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[Na+].[Na+].[Cl-].[Cl-].[K+].[Ca+2].C[C@H](O)C([O-])=O BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229960001631 carbomer Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940107137 cholecystokinin Drugs 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 230000020176 deacylation Effects 0.000 description 1
- 238000005947 deacylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N delta-DL-hydroxylysine Natural products NCC(O)CCC(N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- 235000014632 disordered eating Nutrition 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 229940029980 drug used in diabetes Drugs 0.000 description 1
- 230000008482 dysregulation Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 239000008393 encapsulating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N erythro-5-hydroxy-L-lysine Chemical compound NC[C@H](O)CC[C@H](N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 230000006126 farnesylation Effects 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000035611 feeding Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- 239000003629 gastrointestinal hormone Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 108010063245 glucagon-like peptide 1 (7-36)amide Proteins 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- QJHBJHUKURJDLG-UHFFFAOYSA-N hydroxy-L-lysine Natural products NCCCCC(NO)C(O)=O QJHBJHUKURJDLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 1
- 229940102213 injectable suspension Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 1
- RGXCTRIQQODGIZ-UHFFFAOYSA-O isodesmosine Chemical compound OC(=O)C(N)CCCC[N+]1=CC(CCC(N)C(O)=O)=CC(CCC(N)C(O)=O)=C1CCCC(N)C(O)=O RGXCTRIQQODGIZ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- HXEACLLIILLPRG-RXMQYKEDSA-N l-pipecolic acid Natural products OC(=O)[C@H]1CCCCN1 HXEACLLIILLPRG-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 125000003717 m-cresyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(O*)=C([H])C(=C1[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-methyl-PhOH Natural products CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001427 mPEG Polymers 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 229950004994 meglitinide Drugs 0.000 description 1
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 235000020925 non fasting Nutrition 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- 235000003170 nutritional factors Nutrition 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 229940066842 petrolatum Drugs 0.000 description 1
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000008063 pharmaceutical solvent Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N phenyl(114C)methanol Chemical compound O[14CH2]C1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005222 photoaffinity labeling Methods 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- HXEACLLIILLPRG-UHFFFAOYSA-N pipecolic acid Chemical compound OC(=O)C1CCCCN1 HXEACLLIILLPRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000233 poly(alkylene oxides) Polymers 0.000 description 1
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920001281 polyalkylene Polymers 0.000 description 1
- 229920005644 polyethylene terephthalate glycol copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 229920001444 polymaleic acid Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical group 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 230000000291 postprandial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 201000009104 prediabetes syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 229920005604 random copolymer Polymers 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 125000000185 sucrose group Chemical group 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000006277 sulfonation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001467 thiazolidinediones Chemical class 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-WHFBIAKZSA-N threo-5-hydroxy-L-lysine Chemical compound NC[C@@H](O)CC[C@H](N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- BJBUEDPLEOHJGE-IMJSIDKUSA-N trans-3-hydroxy-L-proline Chemical compound O[C@H]1CC[NH2+][C@@H]1C([O-])=O BJBUEDPLEOHJGE-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 238000004260 weight control Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 230000003820 β-cell dysfunction Effects 0.000 description 1
Description
Перекрестная ссылка на родственные заявкиCross reference to related applications
Данная заявка испрашивает приоритет китайской патентной заявки № 201811125762.9, поданной 26 сентября 2018 года и озаглавленной СЛИТЫЙ БЕЛОК GLP1-FC И ЕГО КОНЪЮГАТ, раскрытие которой включено в данное описание изобретения посредством ссылки во всей полноте.This application claims the benefit of Chinese Patent Application No. 201811125762.9, filed on September 26, 2018, entitled GLP1-FC FUSION PROTEIN AND ITS CONJUGATE, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety.
Область изобретенияField of invention
Настоящее изобретение относится к биологически активным полипептидным слитым белкам и к их полимерным конъюгатам, имеющим пролонгированный период полувыведения in vivo, особенно к агонистам рецепторов GLP-1 (глюкагоноподобный пептид 1), имеющим пролонгированный период полувыведения in vivo, к фармацевтическим композициям, содержащим их, и к их применениям в снижении уровня глюкозы в крови (особенно в лечении диабета, в частности диабета II типа) и для контроля за массой тела.The present invention relates to biologically active polypeptide fusion proteins and their polymeric conjugates having an extended half-life in vivo, especially GLP-1 (glucagon-like peptide 1) receptor agonists having an extended half-life in vivo, pharmaceutical compositions containing them, and to their applications in lowering blood glucose levels (especially in the treatment of diabetes, particularly type II diabetes) and for weight control.
Предшествующий уровень техникиPrior Art
С развитием экономики, увеличением средней продолжительности жизни населения и изменением образа жизни диабет стал серьезной проблемой здравоохранения во всем мире. Как в развитых, так и в развивающихся странах заболеваемость диабетом резко растет. В 2007 году в мире насчитывалось около 246 миллионов больных диабетом, и один больной диабетом умирал каждые 10 секунд. Подсчитано, что к 2025 году число больных сахарным диабетом в мире достигнет 333 миллионов. Китай стал эпицентром диабета с 40 миллионами больных диабетом в настоящее время и примерно 5% уровнем заболеваемости диабетом, и он является второй крупнейшей страной в мире по диабету (первой является Индия). Существует два типа диабета: инсулинозависимый диабет (диабет I типа) и инсулинонезависимый диабет (диабет II типа), где на диабет II типа приходится более 90% пациентов с диабетом. Диабет II типа характеризуется как дисрегуляция секреции или эффекта инсулина, и дисфункция β-клеток, что приводит к нарушению обмена жиров, углеводов и белков, и в свою очередь к хронической гипергликемии и, в конечном итоге, вызывает различные микрососудистые, макрососудистые осложнения и осложнения в различных органах. В настоящее время имеются два типа лекарственных средств для борьбы с диабетом: 1) лекарственные средства, стимулирующие секрецию инсулина, такие как сульфонилмочевины, меглитиниды, ингибиторы дипептидилпептидазы и аналоги GLP-1; и 2) лекарственные средства, не стимулирующие секрецию инсулина, такие как инсулин, ингибиторы а-глюкозидазы, бигуаниды, тиазолидиндионы, аналоги инсулина и т.д. В настоящее время многие традиционные лекарственные средства для лечения диабета, используемые клинически, неэффективны для пациентов с диабетом II типа. Эти лекарственные средства не способны сдерживать прогрессирующее ухудшение состояния островковых β-клеток, снижать уровень гликозилированного гемоглобина (HbA1c) в крови или предотвращать осложнения диабета, такие как болезни сердца и почечная недостаточность, кроме того, эти лекарственные средства сопровождаются различными степенями побочных эффектов. Поэтому необходимо разработать новое лекарственное средство для лечения диабета II типа.With economic development, increasing life expectancy and changing lifestyles, diabetes has become a major health problem worldwide. The incidence of diabetes is rising sharply in both developed and developing countries. In 2007, there were approximately 246 million diabetics worldwide, and one diabetic died every 10 seconds. It is estimated that by 2025, the number of people with diabetes worldwide will reach 333 million. China has become the epicenter of diabetes with 40 million people currently suffering from diabetes and an estimated 5% incidence rate of diabetes, and it is the second largest country in the world for diabetes (the first being India). There are two types of diabetes: insulin-dependent diabetes (type I diabetes) and non-insulin-dependent diabetes (type II diabetes), where type II diabetes accounts for more than 90% of diabetic patients. Type II diabetes is characterized by dysregulation of insulin secretion or effect, and β-cell dysfunction, which leads to impaired metabolism of fats, carbohydrates and proteins, and in turn to chronic hyperglycemia and ultimately causes various microvascular, macrovascular complications and complications in various organs. There are currently two types of drugs available to control diabetes: 1) drugs that stimulate insulin secretion, such as sulfonylureas, meglitinides, dipeptidyl peptidase inhibitors, and GLP-1 analogues; and 2) drugs that do not stimulate insulin secretion, such as insulin, α-glucosidase inhibitors, biguanides, thiazolidinediones, insulin analogues, etc. Currently, many traditional diabetes medications used clinically are ineffective for patients with type II diabetes. These drugs are not able to control the progressive deterioration of islet beta cells, reduce glycosylated hemoglobin (HbA1c) levels in the blood, or prevent diabetes complications such as heart disease and kidney failure, and these drugs are associated with varying degrees of side effects. Therefore, it is necessary to develop a new drug for the treatment of type II diabetes.
Гормон желудочно-кишечного тракта, глюкагоноподобный пептид-1 (GLP-1), идентифицированный в 1985 году, экспрессируется геном проглюкагона после еды и в основном секретируется Lклетками слизистой оболочки кишечника. GLP-1 может стимулировать островковые β-клетки секретировать инсулин (J Med Chem, 47, 4128-4134, 2004) и играет важную роль в стабилизации уровней глюкозы в крови. Экзогенное введение GLP-1 может нормализовать уровень глюкозы в крови у пациентов с сахарным диабетом II типа (Diabetes Care, 15, 270-276, 1992; Lancet, 359, 824-830, 2002; Endoer. Rev, 16, 390-410, 1996; и Diabetologia, 28, 565-573, 1985). GLP-1 обладает следующими функциями: воздействие на островковые β-клетки глюкозозависимым образом, стимулирование транскрипции гена инсулина, повышение биосинтеза и секреции инсулина, стимулирование пролиферации и дифференцировки βклеток, ингибирование апоптоза β-клеток и в результате этого увеличение количества островковых βклеток, ингибирование секреции глюкагона, повышение чувствительности инсулиновых рецепторов периферических клеток, снижение HbA1c, подавление аппетита и кормления, и задержка опорожнения желудка (Diabetic Med, 18, 144-149, 2001; Diabetes, 51, 1443-1452, 2002; Diabetologia, 45, 1263-1273, 2002; Diabetes, 50, 525-529, 2001; Diabetes, 50, 725, 2001; Diabetes, 52, 365-371, 2003; Recent Prog. Hormne Res. 56, 377-399, 2001; Disbetologia, 39, 1546-1553, 1996; Am. J. Physicl Endocrinol. Metab, 281, E242-247, 2001; US patent 477967, 478017, 478425; Diabetes Care, 22, 403-408, 1999; J. Clin. Endocrinology and Metabolism, 88, 3082-3089, 2003; и Diabetes, 44, 1295, 1995). Однако, GLP-1 легко расщепляется дипептидилпептидазой (DPPIV) in vivo с периодом полувыведения менее 2 мин и поэтому вряд ли может стать эффективным антидиабетическим лекарственным средством.The gastrointestinal hormone glucagon-like peptide-1 (GLP-1), identified in 1985, is expressed by the proglucagon gene after meals and is primarily secreted by L cells of the intestinal mucosa. GLP-1 can stimulate islet β cells to secrete insulin (J Med Chem, 47, 4128-4134, 2004) and plays an important role in stabilizing blood glucose levels. Exogenous administration of GLP-1 can normalize blood glucose levels in patients with type II diabetes mellitus (Diabetes Care, 15, 270-276, 1992; Lancet, 359, 824-830, 2002; Endoer. Rev, 16, 390-410, 1996; and Diabetologia, 28, 565-573, 1985). GLP-1 has the following functions: influences islet β-cells in a glucose-dependent manner, stimulates transcription of the insulin gene, increases insulin biosynthesis and secretion, stimulates β-cell proliferation and differentiation, inhibits β-cell apoptosis and, as a result, increases the number of islet β-cells, inhibits glucagon secretion , increased sensitivity of peripheral insulin receptors, decreased HbA1c, suppressed appetite and feeding, and delayed gastric emptying (Diabetic Med, 18, 144-149, 2001; Diabetes, 51, 1443-1452, 2002; Diabetologia, 45, 1263-1273, 2002; Diabetes, 50, 525-529, 2001; Diabetes, 50, 725, 2001; Diabetes, 52, 365-371, 2003; Recent Prog. Hormne Res. 56, 377-399, 2001; Disbetologia, 39, 1546- 1553, 1996; Am. J. Physicl Endocrinol. Metab, 281, E242-247, 2001; US patent 477967, 478017, 478425; Diabetes Care, 22, 403-408, 1999; J. Clin. Endocrinology and Metabolism, 88, 3082-3089, 2003; and Diabetes, 44, 1295, 1995). However, GLP-1 is readily cleaved by dipeptidyl peptidase (DPPIV) in vivo with a half-life of less than 2 min and is therefore unlikely to be an effective antidiabetic drug.
Из-за короткого периода полувыведения и плохой физической и химической стабильности пептидные лекарственные средства легко разлагаются различными протеазами in vivo, так что обычно требуются их многократные инъекции в течение дня, что является для пациентов физической, умственной и финансовой нагрузкой и ограничивает соблюдение ими схемы приема лекарственного средства. Следовательно, в данной области существует острая потребность в лекарственных средствах с новыми структурами для удлинения их циркулирования в плазме и увеличения их системного лекарственного воздействия.Because of their short half-life and poor physical and chemical stability, peptide drugs are easily degraded by various proteases in vivo, so they typically require multiple injections throughout the day, placing a physical, mental, and financial burden on patients and limiting their compliance with medication regimens. facilities. Therefore, there is an urgent need in the field for drugs with new structures to prolong their plasma circulation and increase their systemic drug exposure.
- 1 044650- 1 044650
Краткое изложение сущности изобретенияSummary of the invention
После многолетних исследований и длительных экспериментов авторы настоящего изобретения обнаружили, что после слияния полипептида с партнером по слиянию (например с Fc-фрагментом, альбумином, XTEN или трансферрином), который способен увеличить период полувыведения полипептида, с получением слитого белка и дополнительного конъюгирования с гидрофильным полимером (таким как полиалкиленглико ль, в частности PEG (полиэтиленгликоль)), можно эффективно повысить in vivo стабильность биологически активных полипептидов и увеличить эффективность лекарственных средств. Настоящее изобретение было выполнено на основании вышеуказанных полученных данных.After many years of research and extensive experimentation, the inventors of the present invention have discovered that after fusion of a polypeptide with a fusion partner (eg Fc fragment, albumin, XTEN or transferrin), which is capable of increasing the half-life of the polypeptide, producing a fusion protein and additional conjugation to a hydrophilic polymer (such as polyalkylene glycol, in particular PEG (polyethylene glycol)), can effectively improve the in vivo stability of biologically active polypeptides and increase the effectiveness of drugs. The present invention has been completed based on the above findings.
В первом аспекте настоящего изобретения предложен слитый белок агониста рецептора GLP-1, содержащий агонист рецептора GLP-1 и партнер по слиянию (FP), способный увеличивать период полувыведения слитого белка in vivo, где агонист рецептора GLP-1 и партнер по слиянию связаны напрямую или через первый линкер L1.In a first aspect of the present invention, there is provided a GLP-1 receptor agonist fusion protein comprising a GLP-1 receptor agonist and a fusion partner (FP) capable of increasing the half-life of the fusion protein in vivo, wherein the GLP-1 receptor agonist and the fusion partner are linked directly or via the first linker L1.
Предпочтительно, первый линкер L1 представляет собой пептид, содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более аминокислот.Preferably, the first L1 linker is a peptide containing 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more amino acids.
Более предпочтительно, первый линкер L1 представляет собой гибкий пептид, содержащий А, Т, G и/или S, такой как (GS)n, где η представляет собой целое число от 1 до 50, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10.More preferably, the first linker L1 is a flexible peptide containing A, T, G and/or S, such as (GS)n, where η is an integer from 1 to 50, for example 1, 2, 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9 or 10.
Наиболее предпочтительно, первый линкер L1 выбран из группы, состоящей из:Most preferably, the first linker L1 is selected from the group consisting of:
GSGGGSGGGGSGGGGS (SEQ Ш NO: 9),GSGGGSGGGGSGGGGS (SEQ Ш NO: 9),
GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ Ш NO: 10),GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ Ш NO: 10),
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 11),GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 11),
GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ Ш NO: 12),GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ Ш NO: 12),
GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 13),GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 13),
PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 14),PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 14),
SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 15),SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 15),
SSSSKAPPPS (SEQ ID NO: 16),SSSSKAPPPS (SEQ ID NO: 16),
SRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 17) иSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 17) and
GGGGSGGGGSGGGGSA (SEQ ID NO: 18).GGGGSGGGGSGGGGSA (SEQ ID NO: 18).
В одном воплощении, агонист рецептора GLP-1 является полноразмерным, усеченным или вариантом GLP-1 или аналогом GLP-1, например представляет собой эксендин-4, GLP-l(l-36), GLP-l(l-37), GLP-l(7-36), GLP-l(7-37), лираглутид, ликсисенатид, альбиглутид, дулаглутид или семаглутид.In one embodiment, the GLP-1 receptor agonist is a full-length, truncated or variant of GLP-1 or a GLP-1 analog, for example exendin-4, GLP-l(l-36), GLP-l(l-37), GLP -l(7-36), GLP-l(7-37), liraglutide, lixisenatide, albiglutide, dulaglutide or semaglutide.
В другом воплощении партнер по слиянию (FP) является полноразмерным, усеченным или вариантом Fc-фрагмента иммуноглобулина, альбумином, XTEN или трансферрином; предпочтительно, Fcфрагмент является производным от Fc-фрагмента иммуноглобулина человека; предпочтительно Fcфрагмент состоит из одного-четырех доменов, выбранных из группы, состоящей из домена СН1, домена СН2, домена СНЗ и домена СН4; предпочтительно, Fc-фрагмент является производным от Fc-фрагмента IgG, IgA, IgD, IgE или IgM, более предпочтительно Fc-фрагмента IgG; более предпочтительно, Fcфрагмент является производным Fc-фрагмента IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4, и более предпочтительно, Fcфрагмент IgG имеет сниженный эффект ADCC (антителозависимая клеточная цитотоксичность) и/или CDC (комплементзависимая цитотоксичность) и/или повышенную аффинность связывания с FcRn.In another embodiment, the fusion partner (FP) is a full-length, truncated or variant immunoglobulin Fc fragment, albumin, XTEN or transferrin; preferably, the Fc fragment is derived from the Fc fragment of human immunoglobulin; preferably the Fc fragment consists of one to four domains selected from the group consisting of a CH1 domain, a CH2 domain, a CH3 domain and a CH4 domain; preferably the Fc fragment is derived from an IgG, IgA, IgD, IgE or IgM Fc fragment, more preferably an IgG Fc fragment; more preferably, the Fc fragment is derived from an IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 Fc fragment, and more preferably, the IgG Fc fragment has a reduced ADCC (antibody dependent cellular cytotoxicity) and/or CDC (complement dependent cytotoxicity) effect and/or increased binding affinity to FcRn.
В еще одном воплощении партнер по слиянию (FP) также связан прямо или через второй линкер L2 с последовательностью ST, содержащей сайт распознавания сортазы, и где сортаза представляет собой, например, сортазу А или сортазу В; предпочтительно ST содержит коровый сайт распознавания LPXTG сортазы А, где X представляет собой любую аминокислоту и ST представляет собой, например LPETG, LPETGG или LPETGGG; более предпочтительно, ST дополнительно содержит аффинную метку, связанную с сайтом распознавания сортазы, и ST представляет собой, например, LPETGGHHHHHH или LPETGGWSHPQFEK.In yet another embodiment, the fusion partner (FP) is also linked directly or through a second linker L2 to an ST sequence containing a sortase recognition site, and wherein the sortase is, for example, sortase A or sortase B; preferably ST contains a sortase A core recognition site LPXTG, where X is any amino acid and ST is, for example, LPETG, LPETGG or LPETGGG; more preferably, the ST further contains an affinity tag associated with the sortase recognition site, and the ST is, for example, LPETGGHHHHHH or LPETGGWSHPQFEK.
При этом второй линкер L2 представляет собой пептид, содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более аминокислот.In this case, the second linker L2 is a peptide containing 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more amino acids.
Более предпочтительно, второй линкер L2 представляет собой гибкий пептид, содержащий А, Т, G и/или S, такой как (GS)n, где η является целым числом от 1 до 50, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10; и более предпочтительно, второй линкер L2 выбран из группы, состоящей из:More preferably, the second linker L2 is a flexible peptide containing A, T, G and/or S, such as (GS) n , where η is an integer from 1 to 50, for example 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10; and more preferably, the second linker L2 is selected from the group consisting of:
GSGGGSGGGGSGGGGS (SEQ Ш NO: 9),GSGGGSGGGGSGGGGS (SEQ Ш NO: 9),
GGGGSGGGGSGGGGSA (SEQ Ш NO: 18),GGGGSGGGGSGGGGSA (SEQ Ш NO: 18),
GGGGS (SEQ ID NO: 19),GGGGS (SEQ ID NO: 19),
GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 20) иGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 20) and
GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 21).GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 21).
-2044650-2044650
В другом воплощении слитый белок имеет структуру GLP-1-L1-FP-L2-ST, где GLP-1 представляет собой агонист рецептора GLP-1, и агонист рецептора GLP-1, L1, L2, FP и ST имеют такое же определение, как описано выше, и где один или оба из L1 и L2 могут отсутствовать.In another embodiment, the fusion protein has the structure GLP-1-L1-FP-L2-ST, where GLP-1 is a GLP-1 receptor agonist, and GLP-1 receptor agonist, L1, L2, FP and ST have the same definition, as described above, and where one or both of L1 and L2 may be missing.
В конкретном воплощении аминокислотная последовательность слитого белка представлена в SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 или 22; или слитый белок кодируется нуклеиновокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 или 23.In a specific embodiment, the amino acid sequence of the fusion protein is shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 or 22; or the fusion protein is encoded by the nucleic acid sequence presented in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 23.
Во втором аспекте настоящего изобретения представлен конъюгат, в котором один, два или более гидрофильных полимера прикреплены к концу слитого белка из первого аспекта, предпочтительно, гидрофильный полимер прикреплен к сайту распознавания сортазы посредством реакции транспептидации, в частности, слитый белок может находиться в форме мономера или димера.A second aspect of the present invention provides a conjugate in which one, two or more hydrophilic polymers are attached to the end of the fusion protein of the first aspect, preferably the hydrophilic polymer is attached to the sortase recognition site through a transpeptidation reaction, in particular the fusion protein may be in the form of a monomer or dimer.
В одном воплощении один, два или более гидрофильных полимера независимо выбирают из полисахарида и полиалкиленгликоля, такого как полипропиленгликоль и полиэтиленгликоль; полиалкиленгликоль может иметь концевую группу, например, иметь концевую алкоксигруппу, такую как метоксигруппа, и/или полиалкиленгликоль является линейным или разветвленным, и, например, полиалкиленовая группа является разветвленной, такой как разветвленный полиэтиленгликоль, особенно разветвленный полиэтиленгликоль с концевой метоксигруппой; молекулярная масса полиалкиленгликоля может составлять больше или равна 1, больше или равна 10, больше или равна 20, больше или равна 30, больше или равна 40, больше или равна 50, больше или равна 60, больше или равна 70, больше или равна 80, больше или равна 90, больше или равна 100, больше или равна 110, больше или равна 120, больше или равна 130, больше или равна 140, больше или равна 150 или больше или равна 160 кДа, например 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 кДа, или иметь значение между любыми этими двумя значениями; и предпочтительно молекулярная масса гидрофильного полимера составляет 20 кДа или 40 кДа.In one embodiment, the one, two or more hydrophilic polymers are independently selected from a polysaccharide and a polyalkylene glycol, such as polypropylene glycol and polyethylene glycol; the polyalkylene glycol may have a terminal group, for example, have a terminal alkoxy group, such as a methoxy group, and/or the polyalkylene glycol is linear or branched, and, for example, the polyalkylene group is branched, such as a branched polyethylene glycol, especially a branched polyethylene glycol with a terminal methoxy group; the molecular weight of polyalkylene glycol may be greater than or equal to 1, greater than or equal to 10, greater than or equal to 20, greater than or equal to 30, greater than or equal to 40, greater than or equal to 50, greater than or equal to 60, greater than or equal to 70, greater than or equal to 80, greater than or equal to 90, greater than or equal to 100, greater than or equal to 110, greater than or equal to 120, greater than or equal to 130, greater than or equal to 140, greater than or equal to 150 or greater than or equal to 160 kDa, for example 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 or 100 kDa, or any value between these two values; and preferably the molecular weight of the hydrophilic polymer is 20 kDa or 40 kDa.
В третьем аспекте настоящего изобретения предложен способ получения конъюгата, описанного во втором аспекте, который включает приведение слитого белка, описанного в первом аспекте, в контакт с сортазой (такой как сортаза А или сортаза В) и гидрофильным полимером, где один конец гидрофильного полимера имеет аминогруппу, которая может быть амидирована сортазой.A third aspect of the present invention provides a method for preparing the conjugate described in the second aspect, which includes contacting the fusion protein described in the first aspect with a sortase (such as sortase A or sortase B) and a hydrophilic polymer, wherein one end of the hydrophilic polymer has an amino group , which can be amidated by sortase.
В одном воплощении один конец гидрофильного полимера содержит poly-Gly, например GGGAA.In one embodiment, one end of the hydrophilic polymer contains a poly-Gly, such as GGGAA.
В четвертом аспекте настоящего изобретения предлагается фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество слитого белка, описанного в первом аспекте, и/или конъюгата, описанного во втором аспекте, и возможно фармацевтически приемлемый носитель.In a fourth aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising an effective amount of a fusion protein described in the first aspect and/or a conjugate described in the second aspect, and optionally a pharmaceutically acceptable carrier.
В одном воплощении фармацевтическая композиция предназначена для снижения уровня глюкозы в крови или массы тела, например, в лечении диабета, более конкретно в лечении диабета I типа и/или диабета II типа, особенно в лечении диабета II типа.In one embodiment, the pharmaceutical composition is intended to reduce blood glucose levels or body weight, for example, in the treatment of diabetes, more particularly in the treatment of type I diabetes and/or type II diabetes, especially in the treatment of type II diabetes.
В другом воплощении фармацевтическая композиция находится в форме жидкого препарата или лиофилизированного препарата.In another embodiment, the pharmaceutical composition is in the form of a liquid preparation or a lyophilized preparation.
В пятом аспекте настоящего изобретения предложено применение слитого белка, описанного в первом аспекте, или конъюгата, описанного во втором аспекте, для изготовления лекарственного средства для снижения уровня глюкозы в крови или массы тела, например лекарственного средства, предназначенного для использования в лечении диабета, включая диабет I типа и диабет II типа, особенно диабет II типа.A fifth aspect of the present invention provides the use of a fusion protein described in the first aspect or a conjugate described in the second aspect for the manufacture of a drug for reducing blood glucose or body weight, for example a drug for use in the treatment of diabetes, including diabetes Type I and type II diabetes, especially type II diabetes.
В шестом аспекте настоящего изобретения предложен способ снижения уровня глюкозы в крови или массы тела, включающий введение слитого белка, описанного в первом аспекте, или конъюгата, описанного во втором аспекте, субъекту, нуждающемуся в этом, например, для лечения диабета, включая диабет I типа и диабет II типа, особенно диабет II типа.A sixth aspect of the present invention provides a method for reducing blood glucose or body weight, comprising administering a fusion protein described in the first aspect or a conjugate described in the second aspect to a subject in need thereof, for example, for the treatment of diabetes, including type I diabetes and type II diabetes, especially type II diabetes.
Седьмой аспект настоящего изобретения заключается в предложении набора, содержащего слитый белок, описанный в первом аспекте, конъюгат, описанный во втором аспекте, и/или фармацевтическую композицию, описанную в четвертом аспекте, и возможно инструкции по применению.A seventh aspect of the present invention is to provide a kit comprising the fusion protein described in the first aspect, the conjugate described in the second aspect, and/or the pharmaceutical composition described in the fourth aspect, and optionally instructions for use.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что конъюгат GLP-1-Fc по настоящему изобретению может обеспечить неожиданно длительный гипогликемический эффект. Кроме того, по сравнению с существующими аналогичными лекарственными средствами, конъюгат GLP-1-Fc по настоящему изобретению может значительно снизить быструю потерю массы тела, вызванную приемом гипогликемических препаратов, так что клиническая безопасность препаратов значительно улучшается, и поэтому он имеет большое значение для клинического применения.The present inventors have discovered that the GLP-1-Fc conjugate of the present invention can provide an unexpectedly long-lasting hypoglycemic effect. In addition, compared with existing similar drugs, the GLP-1-Fc conjugate of the present invention can significantly reduce the rapid weight loss caused by hypoglycemic drugs, so that the clinical safety of the drugs is greatly improved, and therefore it is of great importance for clinical application .
Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials
На фиг. 1А показана структура эукариотического экспрессионного вектора слитого белка GLP-1 и на фиг. 1В показаны результаты теста в виде кривой роста и жизнеспособности клеток стабильной клеточной линии GLP1-L1-Fc2-L2-ST (номер клона: P1-3G3C2) во время ферментации.In fig. 1A shows the structure of a eukaryotic GLP-1 fusion protein expression vector and FIG. 1B shows the test results in the form of a growth curve and cell viability of the stable cell line GLP1-L1-Fc2-L2-ST (clone number: P1-3G3C2) during fermentation.
На фиг. 2 показаны результаты микроскопического исследования стабильной клеточной линии GLP1-L1-Fc2-L2-ST (номер клона: P1-3G3C2) в разные моменты во время ферментации. На фиг. 2А представлено изображение клеток на 5-е сутки культивирования и на фиг. 2В показаны собранные клетки (13 сутки).In fig. Figure 2 shows the results of microscopic examination of the stable cell line GLP1-L1-Fc2-L2-ST (clone number: P1-3G3C2) at different points during fermentation. In fig. 2A shows an image of cells on the 5th day of cultivation and FIG. Figure 2B shows collected cells (day 13).
На фиг. 3 показан метаболизм глюкозы в супернатанте культуры стабильной клеточной линииIn fig. Figure 3 shows glucose metabolism in the culture supernatant of a stable cell line.
- 3 044650- 3 044650
GLP1-L1-Fc2-L2-ST (номер клона: P1-3G3C2) во время ферментации.GLP1-L1-Fc2-L2-ST (clone number: P1-3G3C2) during fermentation.
На фиг. 4 показан метаболизм NH4 + и лактозы (Lac) в супернатанте культуры стабильной клеточной линии GLP1-L1-Fc2-L2-ST (номер клона: P1-3G3C2) во время ферментации.In fig. 4 shows the metabolism of NH 4 + and lactose (Lac) in the culture supernatant of the stable cell line GLP1-L1-Fc2-L2-ST (clone number: P1-3G3C2) during fermentation.
На фиг. 5 показаны результаты электрофореза белка GLP1-L1-Fc2-L2-ST в невосстанавливающем геле (слева: М/1/2/3) и в восстанавливающем геле (справа: 4/5/6/М). 1 и 6: супернатант бульона конечной ферментации; 3 и 4: образцы после очистки; 2 и 5: образцы ферментационного бульона на 10 сутки.In fig. Figure 5 shows the results of electrophoresis of the GLP1-L1-Fc2-L2-ST protein in a non-reducing gel (left: M/1/2/3) and in a reducing gel (right: 4/5/6/M). 1 and 6: final fermentation broth supernatant; 3 and 4: samples after cleaning; 2 and 5: fermentation broth samples on day 10.
На фиг. 6 показаны результаты теста SDS (додецилсульфат натрия) электрофореза (А) и анализа SEC (гель-проникающая хроматография) (В) очищенного белка GLP1-L1-Fc2-L2-ST.In fig. 6 shows the results of SDS electrophoresis (A) and SEC analysis (B) of purified GLP1-L1-Fc2-L2-ST protein.
На фиг. 7 показаны результаты SDS электрофореза и RPC (обращенно-фазовая хроматография) уровня поперечного связывания двух белков. На фиг. 7А и фиг. 7С представлен SDS гель белка GLP1L1-Fc2-L2-ST поперечно сшитого с 20 и 40 кДа PEG соответственно; на фиг. 7В и фиг. 7D представлены результаты RPC белка GLP1-L1-Fc2-L2-ST, поперечно сшитого с 20 и 40 кДа PEG соответственно; и на фиг. 7Е представлен результат RPC белка GLP1-L1-Fc2-ST, поперечно сшитого с 40 кДа PEG.In fig. Figure 7 shows the results of SDS electrophoresis and RPC (reverse phase chromatography) of the cross-linking level of two proteins. In fig. 7A and FIG. 7C shows an SDS gel of GLP1L1-Fc2-L2-ST protein cross-linked with 20 and 40 kDa PEG, respectively; in fig. 7B and FIG. 7D shows the results of RPC of GLP1-L1-Fc2-L2-ST protein cross-linked with 20 and 40 kDa PEG, respectively; and in fig. 7E shows the result of RPC of GLP1-L1-Fc2-ST protein cross-linked to 40 kDa PEG.
На фиг. 8 показаны результаты анионообменной хроматографии (А) и теста RPC (В) GLP1-L1-Fc2L2-ST после поперечного связывания.In fig. 8 shows the results of anion exchange chromatography (A) and RPC test (B) of GLP1-L1-Fc2L2-ST after cross-linking.
На фиг. 9 показаны результаты теста активности GLP1-L1-Fc2-L2-ST, поперечно сшитого с 20 и 40 кДа PEG соответственно. По сравнению с дулаглутидом, относительная активность несшитого субстрата (GLP1-Fc) составляет 98,10%. Активность обоих PEG-сшитых продуктов снизилась, при этом относительная активность продукта, сшитого с 20 кДа PEG (PEG (20 кДа)-GLP1-Fc), составляет 40,38%, а относительная активность продукта, сшитого с 40 кДа PEG (PEG (40 кДа)-GLP1-Fc), составляет 32,85%.In fig. 9 shows the results of the GLP1-L1-Fc2-L2-ST activity assay cross-linked with 20 and 40 kDa PEG, respectively. Compared to dulaglutide, the relative activity of the non-crosslinked substrate (GLP1-Fc) is 98.10%. The activity of both PEG-cross-linked products decreased, with the relative activity of the product cross-linked with 20 kDa PEG (PEG (20 kDa)-GLP1-Fc) being 40.38%, and the relative activity of the product cross-linked with 40 kDa PEG (PEG ( 40 kDa)-GLP1-Fc), is 32.85%.
На фиг. 10А показана кривая ответа глюкозотолерантного теста у мышей C57BL/6 через 24 ч после введения; на фиг. 10В показан эффект через 24 ч после введения на толерантность к глюкозе в мышиной модели C57BL/6 (AUC); На фиг. 10С показана кривая ответа глюкозотолерантного теста у мышей C57BL/6 через 144 ч после введения; На фиг. 10D показан эффект через 144 ч после введения на толерантность к глюкозе в мышиной модели C57BL/6 (AUC); На фиг. 10Е показана кривая ответа глюкозотолерантного теста у мышей C57BL/6 через 168 ч после введения; На фиг. 10F показан эффект через 168 ч после введения на толерантность к глюкозе у мышей C57BL/6 (AUC); На фиг. 10G показана кривая ответа глюкозотолерантного теста у мышей C57BL/6 через 192 ч после введения; на фиг. 10Н показан эффект через 192 ч после введения на толерантность к глюкозе в мышиной модели C57BL/6 (AUC); на фиг. 10I показана кривая ответа глюкозотолерантного теста у мышей C57BL/6 через 216 ч после введения; на фиг. 10J показан эффект через 216 ч после введения на толерантность к глюкозе у мышей C57BL/6 (AUC); на фиг. 10K показана кривая ответа глюкозотолерантного теста у мышей C57BL/6 через 240 ч после введения; на фиг. 10L показан эффект через 240 ч после введения на толерантность к глюкозе у мышей C57BL/6 (AUC); и на фиг. 10М показаны изменения массы тела у мышей C57BL/6 после введения.In fig. 10A shows the glucose tolerance test response curve in C57BL/6 mice 24 hours after administration; in fig. 10B shows the effect 24 hours after administration on glucose tolerance in the C57BL/6 mouse model (AUC); In fig. 10C shows the glucose tolerance test response curve in C57BL/6 mice 144 hours after administration; In fig. 10D shows the effect 144 hours after administration on glucose tolerance in the C57BL/6 mouse model (AUC); In fig. 10E shows the glucose tolerance test response curve in C57BL/6 mice 168 hours after administration; In fig. 10F shows the effect 168 hours after administration on glucose tolerance in C57BL/6 mice (AUC); In fig. 10G shows the glucose tolerance test response curve in C57BL/6 mice 192 hours after administration; in fig. 10H shows an effect 192 hours after administration on glucose tolerance in the C57BL/6 mouse model (AUC); in fig. 10I shows the glucose tolerance test response curve in C57BL/6 mice 216 hours after administration; in fig. 10J shows the effect 216 hours after administration on glucose tolerance in C57BL/6 mice (AUC); in fig. 10K shows the response curve of the glucose tolerance test in C57BL/6 mice 240 hours after administration; in fig. 10L shows the effect 240 hours after administration on glucose tolerance in C57BL/6 mice (AUC); and in fig. 10M shows changes in body weight in C57BL/6 mice after administration.
На фиг. 11 показана кривая роста и жизнеспособность клеток стабильной клеточной линии GLP1L1-Fc4-L2-STG3 (номер клона: Р1-Р132С7) во время ферментации с подпиткой.In fig. 11 shows the growth curve and cell viability of the stable cell line GLP1L1-Fc4-L2-STG3 (clone number: P1-P132C7) during fed-batch fermentation.
На фиг. 12 показаны микроскопические изображения стабильной клеточной линии GLP1-L1-Fc4L2-STG3 (номер клона: Р1-Р132С7) в разные моменты во время ферментации с подпиткой. На фиг. 12А показаны клетки на 5 сутки культивирования и на фиг. 12В показаны собранные клетки (13 сутки).In fig. 12 shows microscopic images of the stable cell line GLP1-L1-Fc4L2-STG3 (clone number: P1-P132C7) at different times during fed-batch fermentation. In fig. 12A shows cells on day 5 of culture and FIG. 12B shows collected cells (day 13).
На фиг. 13 показан метаболизм глюкозы в супернатанте культуры стабильной клеточной линии GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 (номер клона: Р1-Р132С7) во время ферментации с подпиткой.In fig. 13 shows glucose metabolism in the culture supernatant of the stable cell line GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 (clone number: P1-P132C7) during fed-batch fermentation.
На фиг. 14 показана кривая изменения рН во времени для стабильной клеточной линии GLP1-L1Fc4-L2-STG3 (номер клона: Р1-Р132С7) в 15 л биореакторе во время ферментации с подпиткой.In fig. 14 shows a pH-time curve for the stable cell line GLP1-L1Fc4-L2-STG3 (clone number: P1-P132C7) in a 15 L bioreactor during fed-batch fermentation.
На фиг. 15 показаны результаты SDS-PAGE электрофореза целевого белка GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 в супернатанте 15 л бульона от ферментации с подпиткой. Полоса 1 представляет собой очищенный образец, полоса 2 - белковый маркер, а полосы 3, 4 и 5 представляют собой супернатант ферментационного бульона на 12-е, 13-е и 14-е сутки.In fig. 15 shows the results of SDS-PAGE electrophoresis of the target protein GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 in the supernatant of 15 L of fed-batch fermentation broth. Lane 1 is the purified sample, lane 2 is the protein marker, and lanes 3, 4, and 5 are the fermentation broth supernatant on days 12, 13, and 14.
На фиг. 16 показаны результаты SDS-PAGE электрофореза (А) и SEC анализа (В) очищенного белка GLP1-L1-Fc4-L2-STG3.In fig. 16 shows the results of SDS-PAGE electrophoresis (A) and SEC analysis (B) of purified GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 protein.
На фиг. 17 показаны результаты SDS-PAGE электрофореза и анализа RPC уровня поперечного сшивания двух белков. На фиг. 17А представлен SDS-тест белка GLP1-L1-Fc4-L2-STG3, поперечно связанного с 40 кДа PEG, а на фиг. 17В представлен RPC-тест белка GLP1-L1-Fc4-L2-STG3, поперечно связанного с 40 кДа PEG.In fig. 17 shows the results of SDS-PAGE electrophoresis and RPC analysis of the cross-linking level of two proteins. In fig. 17A shows an SDS test of the GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 protein cross-linked to a 40 kDa PEG, and FIG. 17B shows an RPC assay of the GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 protein cross-linked to a 40 kDa PEG.
На фиг. 18 показаны результаты анионообменной хроматографии (А) и SEC- теста (В, С) of GLP1L1-Fc4-L2-STG3 после поперечного сшивания.In fig. 18 shows the results of anion exchange chromatography (A) and SEC test (B, C) of GLP1L1-Fc4-L2-STG3 after cross-linking.
На фиг. 19 показаны результаты определения активности GLP1-L1-Fc4-L2-STG3, поперечно связанного с 40 кДа PEG. Относительная активность несшитого субстрата (GLP1-Fc) по отношению к дулаглутиду составляет 112,24%. Активность PEG-сшитого продукта снижалась, при этом относительная активность GLP1-L1-Fc4-L2-STG3, сшитого с 40 кДа PEG (PEG (40 кДа)-GLP1-Fc), составляет 21,51%.In fig. 19 shows the results of determining the activity of GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 cross-linked to 40 kDa PEG. The relative activity of the non-crosslinked substrate (GLP1-Fc) towards dulaglutide is 112.24%. The activity of the PEG-cross-linked product decreased, and the relative activity of GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 cross-linked with 40 kDa PEG (PEG (40 kDa)-GLP1-Fc) was 21.51%.
На фиг. 20А показана толерантность к глюкозе мышей C57BL/6 (AUC) через 1-8 суток после введения и на фиг. 20В показаны изменения массы тела мышей C57BL/6 после введения.In fig. 20A shows glucose tolerance of C57BL/6 mice (AUC) 1-8 days after administration and FIG. 20B shows changes in body weight of C57BL/6 mice after administration.
- 4 044650- 4 044650
На фиг. 21А показано влияние на уровень глюкозы в крови у мышей с STZ(стрептозотоцин)индуцированным диабетом II типа через 1-12 суток после введения, и на фиг. 21В показаны изменения массы тела мышей с диабетом II типа после введения.In fig. 21A shows the effect on blood glucose levels in STZ(streptozotocin)-induced type II diabetic mice 1-12 days after administration, and FIG. 21B shows changes in body weight of type II diabetic mice after administration.
Подробное описание изобретенияDetailed Description of the Invention
Термин, используемый в этой заявке, имеет то же значение, что и в предшествующем уровне техники. Чтобы определить значение используемых терминов, конкретные значения некоторых терминов в этой заявке приведены ниже. Если определение в настоящем документе вступает в противоречие с общепринятым значением этого термина, то определение, содержащееся в настоящем документе, имеет преимущество.The term used in this application has the same meaning as in the prior art. To define the meaning of the terms used, the specific meanings of certain terms in this application are set forth below. If a definition herein conflicts with the generally accepted meaning of that term, the definition contained herein shall control.
При использовании здесь термин аминокислота относится к природным аминокислотам, неприродным аминокислотам, аналогам аминокислот и ко всем их D- и L-стереоизомерам. Неприродные аминокислоты включают, без ограничения ими, азетидин-2-карбоновую кислоту, 2-аминоадипат, 3аминоадипат, β-аланин, аминопропионовую кислоту, 2-аминомасляную кислоту, 4-аминомасляную кислоту, 6-аминокапроновую кислоту, 2-аминогептановую кислоту, 2-аминоизомасляную кислоту, 3аминоизомасляную кислоту, 2-аминопимелиновую кислоту, трет-бутилглицин, 2,4-диаминоизомасляную кислоту, 2,2'-диаминопимелиновую кислоту, 2,3-диаминопропионовую кислоту N-этилглицин, Nэтиласпарагин, гомопролин, гидроксилизин, алло-гидроксилизин, 3-гидроксипролин, 4-гидроксипролин, изодесмозин, алло-изолейцин, N-метилаланин, N-метилглицин, N-метилизолейцин, N-метилпентил глицин, N-метилвалин, нафталанин, норвалин, норлейцин, орнитин, пентилглицин, пипеколиновую кислоту и тиопролин. Аналоги аминокислот включают природные аминокислоты и неприродные аминокислоты, у которых С-концевая карбоксильная группа, N-концевая аминогруппа или группа боковой цепи химически обратимо или необратимо блокирована концевой группой, или химически модифицирована в другую функциональную группу, такую как метионинсульфоксид, метионинсульфон, S-(карбоксиме тил)-цистеин, S-(карбоксиметил)-цистеинсульфоксид и S-(карбоксиметил)-цистеинсульфон.As used herein, the term amino acid refers to naturally occurring amino acids, unnatural amino acids, amino acid analogues, and all D- and L-stereoisomers thereof. Unnatural amino acids include, but are not limited to, azetidine-2-carboxylic acid, 2-aminoadipate, 3-aminoadipate, β-alanine, aminopropionic acid, 2-aminobutyric acid, 4-aminobutyric acid, 6-aminocaproic acid, 2-aminoheptanoic acid, 2- aminoisobutyric acid, 3-aminoisobutyric acid, 2-aminoisobutyric acid, tert-butylglycine, 2,4-diaminoisobutyric acid, 2,2'-diaminopimelic acid, 2,3-diaminopropionic acid N-ethylglycine, Nethylasparagine, homoproline, hydroxylysine, allo-hydroxylysine, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline, isodesmosine, allo-isoleucine, N-methylalanine, N-methylglycine, N-methylisoleucine, N-methylpentyl glycine, N-methylvaline, naphthalanine, norvaline, norleucine, ornithine, pentylglycine, pipecolic acid and thioproline. Amino acid analogues include naturally occurring amino acids and unnatural amino acids in which the C-terminal carboxyl group, N-terminal amino group or side chain group is chemically reversibly or irreversibly capped with a terminal group, or chemically modified to another functional group such as methionine sulfoxide, methionine sulfone, S-( carboxymethyl)-cysteine, S-(carboxymethyl)-cysteine sulfoxide and S-(carboxymethyl)-cysteine sulfone.
Термин полипептид или белок, используемые здесь взаимозаменяемо, относится к соединению из по меньшей мере двух аминокислотных остатков, соединенных друг с другом ковалентными связями (такими как пептидные связи), которые могут быть рекомбинантными полипептидами, природными полипептидами или синтетическими полипептидами. Кроме того, полипептид или белок по настоящему изобретению также относится к его вариантам или аналогам, то есть к полипептидам, отличающихся по аминокислотной последовательности одной или несколькими заменами, делециями, вставками, слияниями, усечениями или любой их комбинацией. Полипептидный вариант может быть полностью функциональным или может быть лишен одной или нескольких активностей. Полностью функциональные варианты могут содержать, например, только консервативные замены или изменения в некритичных остатках или в некритичных областях. Функциональные варианты могут также содержать замены похожих аминокислот, которые приводят к неизменным или незначительным изменениям функции. Аминокислоты, необходимые для функционирования, могут быть идентифицированы методами, известными в данной области, такими как сайт-направленный мутагенез или глицин-сканирующий мутагенез. (Cunningham, В. and Wells, J., Science, 244: 1081-1085, 1989). Ключевые сайты для полипептидной активности могут быть определены, например, с помощью структурного анализа, такого как кристаллизация, ядерный магнитный резонанс или фотоаффинная метка (Smith, L., et al., J. Mol. Biol., 224:899-904, 1992; и de Vos, A. et al., Science, 255: 306-312, 1992).The term polypeptide or protein, used interchangeably herein, refers to a compound of at least two amino acid residues linked together by covalent bonds (such as peptide bonds), which may be recombinant polypeptides, naturally occurring polypeptides, or synthetic polypeptides. In addition, the polypeptide or protein of the present invention also refers to variants or analogs thereof, that is, polypeptides that differ in amino acid sequence by one or more substitutions, deletions, insertions, fusions, truncations, or any combination thereof. The polypeptide variant may be fully functional or may lack one or more activities. Fully functional variants may contain, for example, only conservative substitutions or changes in non-critical residues or in non-critical regions. Functional variants may also contain substitutions of similar amino acids that result in unchanged or minor changes in function. Amino acids required for function can be identified by methods known in the art, such as site-directed mutagenesis or glycine scanning mutagenesis. (Cunningham, W. and Wells, J., Science, 244: 1081-1085, 1989). Key sites for polypeptide activity can be determined, for example, by structural analysis such as crystallization, nuclear magnetic resonance, or photoaffinity labeling (Smith, L., et al., J. Mol. Biol., 224:899-904, 1992 ; and de Vos, A. et al., Science, 255: 306-312, 1992).
Термин конъюгат при использовании здесь, относится к продукту, образованному полипептидом или полипептидным вариантом, ковалентно или нековалентно связанным с описанной здесь модифицирующей группой.The term conjugate as used herein refers to a product formed by a polypeptide or polypeptide variant covalently or non-covalently linked to a modifying group described herein.
Как правило, термин полимер, используемый здесь, имеет значение, обычно подразумеваемое специалистами обычной квалификации в данной области, и относится как к самому полимеру, так и к его терминально-модифицированным производным, если явно не указано иное.In general, the term polymer as used herein has the meaning commonly understood by those of ordinary skill in the art and refers to both the polymer itself and its terminally modified derivatives, unless expressly stated otherwise.
Кроме того, для полимеров, таких как полиэтиленгликоль, существует множество способов определения их молекулярной массы. Поскольку полимеры состоят из молекул с разными степенями полимеризации в определенном диапазоне распределения, молекулярные массы полимеров обычно представляют посредством их средней молекулярной массы, в частности среднечисловой молекулярной массы или средневесовой молекулярной массы. Хотя среднечисловая молекулярная масса и средневесовая молекулярная масса могут иметь некоторые отклонения, когда степень полимеризации полимеров значительно отличается, для полимеров с узким диапазоном распределения они, как правило, равны. Если не указано иное, для полимеров, таких как полиэтиленгликоль, упомянутый здесь, когда речь идет о его молекулярной массе, это может быть либо средневесовая молекулярная масса, либо среднечисловая молекулярная масса.In addition, for polymers such as polyethylene glycol, there are many ways to determine their molecular weight. Because polymers are composed of molecules with different degrees of polymerization over a certain distribution range, the molecular weights of polymers are usually represented by their average molecular weight, particularly number-average molecular weight or weight-average molecular weight. Although number average molecular weight and weight average molecular weight may have some deviation when the degree of polymerization of polymers differs significantly, for polymers with a narrow distribution range they are generally equal. Unless otherwise specified, for polymers such as polyethylene glycol mentioned herein, when referring to its molecular weight, it can be either weight average molecular weight or number average molecular weight.
Агонист рецептора GLP-1.GLP-1 receptor agonist.
Глюкагоноподобные пептиды включают глюкагоноподобный пептид-1 (GLP-1) и глюкагоноподобный пептид-2 (GLP-2), оба из которых являются производными проглюкагона, который состоит из 158 аминокислот и может расщепляться на разные пептидные цепи. Поскольку GLP-1 обладает фармаколо- 5 044650 гическими эффектами стимулирования секреции инсулина, защиты островковых β-клеток, ингибирования секреции глюкагона и опорожнения желудка, а также снижения аппетита, он может быть клинически использован в лечении диабета II типа и ожирения. GLP-2 представляет собой пищевой фактор, который способствует росту тонкой кишки, ингибирует апоптоз клеток, способствует опорожнению желудка и повышает аппетит, поэтому он может быть клинически использован в лечении синдрома короткого кишечника. Биологически активным GLP-1 в организме человека является в основном GLP-1(7-36) амид и GLP-1(7-37). Природный GLP-1 (с период полувыведения менее 5 мин) легко гидролизуется и инактивируется дипептидилпептидазой IV (DPP-IV), поэтому его трудно использовать в клинике.Glucagon-like peptides include glucagon-like peptide-1 (GLP-1) and glucagon-like peptide-2 (GLP-2), both of which are derivatives of proglucagon, which consists of 158 amino acids and can be cleaved into different peptide chains. Because GLP-1 has the pharmacological effects of stimulating insulin secretion, protecting islet β cells, inhibiting glucagon secretion and gastric emptying, and reducing appetite, it can be clinically used in the treatment of type II diabetes and obesity. GLP-2 is a nutritional factor that promotes small intestinal growth, inhibits cell apoptosis, promotes gastric emptying, and increases appetite, so it may be clinically used in the treatment of short bowel syndrome. The biologically active GLP-1 in humans is mainly GLP-1(7-36) amide and GLP-1(7-37). Natural GLP-1 (with a half-life of less than 5 min) is easily hydrolyzed and inactivated by dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV), making it difficult to use clinically.
Термин агонист рецептора GLP-1 относится к молекуле, способной активировать рецептор GLP-1, такой как природный GLP-1, полученный из разных источников, таких как человек или животные, и функциональные варианты, фрагменты и аналоги, образованные посредством одной или более (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более) аминокислотных замен, делеций и/или добавлений в последовательности дикого типа природных агонистов рецепторов GLP-1 (таких как GLP-1 и эксендин-4), например лираглутид, ликсисенатид, альбиглутид, дулаглутид, семаглутид и т.д.The term GLP-1 receptor agonist refers to a molecule capable of activating the GLP-1 receptor, such as natural GLP-1 obtained from various sources, such as humans or animals, and functional variants, fragments and analogues formed through one or more (eg 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 or more) amino acid substitutions, deletions and/or additions in the wild type sequence of natural GLP-1 receptor agonists (such as GLP-1 and exendin-4), for example liraglutide, lixisenatide, albiglutide, dulaglutide, semaglutide, etc.
Слитый белок GLP-1.GLP-1 fusion protein.
Агонист рецептора GLP-1 (такой как GLP-1 и его функциональные варианты и фрагменты) связан с партнером по слиянию, способным увеличивать период полувыведения, например с Fc-фрагментом человеческого иммуноглобулина, с образованием слитого белка. Слитые белки по настоящему изобретению упоминаются как слитый белок с активностью агониста рецептора GLP-1 или слитый белок GLP1.A GLP-1 receptor agonist (such as GLP-1 and functional variants and fragments thereof) is linked to a fusion partner capable of increasing its half-life, such as the Fc portion of a human immunoglobulin, to form a fusion protein. The fusion proteins of the present invention are referred to as GLP-1 receptor agonist activity fusion protein or GLP1 fusion protein.
Человеческий иммуноглобулин IgG состоит из четырех полипептидов (две идентичные копии легкой цепи и тяжелой цепи), ковалентно связанных дисульфидными связями. При протеолизе молекул IgG папаином образуются два Fab-фрагмента и один Fc-фрагмент. Фрагмент Fc состоит из двух полипептидов, связанных между собой дисульфидными связями. Каждый полипептид, от N - до С-конца, состоит из шарнирной области, домена СН2 и домена СН3. Структура Fc-фрагмента практически одинакова у всех субтипов иммуноглобулина человека. IgG является одним из наиболее многочисленных белков в крови человека, составляющим от 70 до 75% общего иммуноглобулина в сыворотке крови человека.Human immunoglobulin IgG consists of four polypeptides (two identical copies of a light chain and a heavy chain) covalently linked by disulfide bonds. When IgG molecules are proteolyzed by papain, two Fab fragments and one Fc fragment are formed. The Fc fragment consists of two polypeptides linked by disulfide bonds. Each polypeptide, from N to C terminus, consists of a hinge region, a CH2 domain, and a CH3 domain. The structure of the Fc fragment is almost the same in all subtypes of human immunoglobulin. IgG is one of the most abundant proteins in human blood, making up 70 to 75% of the total immunoglobulin in human serum.
Период полувыведения IgG из кровотока, который является самым длинным среди всех пяти типов иммуноглобулинов, может достигать 21 суток. Сообщалось о комбинировании Fc-области IgG с другими белками (такими как различные цитокины и растворимые рецепторы) с образованием слитых белков (Capon et al., Nature, 337:525-531, 1989; Chamow et al., Trends Biotechnol., 14: 52-60, 1996; и патенты США 5116964 и 5541087). Типичный слитый белок представляет собой димерный белок, связанный остатками цистеина в шарнирной области IgG Fc с образованием молекулы, подобной IgG, но лишенной домена СН1 и легкой цепи. Благодаря структурной гомологии, in vitro фармакокинетические свойства слитого Fc-белка очень похожи на изотип IgG человека. Поэтому конструирование hGH слитых белков, связанных с Fc-областью человеческого IgG, поможет увеличить период полувыведения hGH при циркулировании в крови и/или увеличить его биологическую активность.The half-life of IgG from the bloodstream, which is the longest among all five types of immunoglobulins, can reach 21 days. The Fc region of IgG has been reported to combine with other proteins (such as various cytokines and soluble receptors) to form fusion proteins (Capon et al., Nature, 337:525-531, 1989; Chamow et al., Trends Biotechnol., 14: 52-60, 1996; and US patents 5116964 and 5541087). A typical fusion protein is a dimeric protein linked by cysteine residues in the hinge region of an IgG Fc to form a molecule similar to IgG but lacking the CH1 domain and light chain. Due to structural homology, the in vitro pharmacokinetic properties of the Fc fusion protein are very similar to the human IgG isotype. Therefore, the construction of hGH fusion proteins linked to the Fc region of human IgG will help increase the circulating half-life of hGH and/or increase its biological activity.
Область Fc иммуноглобулина безопасна для использования в качестве фармацевтического носителя, поскольку она представляет собой биоразлагаемый полипептид, который может метаболизироваться в организме. Кроме того, по сравнению со всей молекулой иммуноглобулина, Fc-область иммуноглобулина имеет относительно низкую молекулярную массу, что является благоприятным для приготовления, очистки и получения конъюгата. Поскольку Fc-область иммуноглобулина не содержит Fab-фрагмента (его аминокислотная последовательность меняется в зависимости от подкласса антител и поэтому является в высокой степени гетерогенной), ожидается, что Fc-область иммуноглобулина может значительно повысить однородность вещества и иметь низкую антигенность.The Fc region of immunoglobulin is safe for use as a pharmaceutical carrier because it is a biodegradable polypeptide that can be metabolized in the body. In addition, compared with the entire immunoglobulin molecule, the Fc region of the immunoglobulin has a relatively low molecular weight, which is favorable for preparation, purification and conjugate production. Since the Fc region of an immunoglobulin does not contain a Fab fragment (its amino acid sequence varies depending on the antibody subclass and is therefore highly heterogeneous), it is expected that the Fc region of an immunoglobulin can significantly increase the homogeneity of the substance and have low antigenicity.
Термин Fc-область иммуноглобулина или Fc-фрагмент, при использовании в настоящем изобретении, относится к белку, содержащему константную область тяжелой цепи 2 (СН2) и константную область тяжелой цепи 3 (СН3), но не вариабельную область тяжелой цепи и легкой цепи, константную область тяжелой цепи 1 (СН1) и константную область легкой цепи 1 (CL1). Он также может содержать шарнирную область в константной области тяжелой цепи. Кроме того, Fc-фрагмент, используемый в настоящем изобретении, может содержать часть или всю Fc-область, содержащую константную область тяжелой цепи 1 (СН1) и/или константную область легкой цепи 1 (CL1) без вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи, если он имеет физиологическую функцию, которая в основном аналогична или лучше, чем у природного белка. Кроме того, это может быть Fc-фрагмент с относительно длинной делецией аминокислотных последовательностей СН2 и/или СН3. Следовательно, Fc-область иммуноглобулина, используемая в настоящем изобретении, может включать 1) домен СН1, домен СН2, домен СН3 и домен СН4; 2) домен СН1 и домен СН2; 3) домен СН1 и домен СН3; 4) домен СН2 и домен СН3; 5) комбинацию одного или более доменов с шарнирной областью иммуноглобулина (с частью или со всей); или 6) димер любых доменов константной области тяжелой цепи и константной области легкой цепи.The term immunoglobulin Fc region or Fc fragment, as used in the present invention, refers to a protein containing a heavy chain constant region 2 (CH2) and a heavy chain constant region 3 (CH3), but not a heavy chain variable region and a light chain constant region. heavy chain region 1 (CH1) and light chain constant region 1 (CL1). It may also contain a hinge region in the heavy chain constant region. In addition, the Fc fragment used in the present invention may contain part or all of the Fc region containing the heavy chain constant region 1 (CH1) and/or the light chain constant region 1 (CL1) without the heavy chain and light chain variable regions, if it has a physiological function that is substantially similar to or better than that of the naturally occurring protein. In addition, it may be an Fc fragment with a relatively long deletion of the amino acid sequences CH2 and/or CH3. Therefore, the immunoglobulin Fc region used in the present invention may include 1) a CH1 domain, a CH2 domain, a CH3 domain, and a CH4 domain; 2) CH1 domain and CH2 domain; 3) CH1 domain and CH3 domain; 4) CH2 domain and CH3 domain; 5) a combination of one or more domains with the hinge region of an immunoglobulin (part or all); or 6) a dimer of any heavy chain constant region and light chain constant region domains.
Кроме того, Fc-область иммуноглобулина по настоящему изобретению содержит природную аминокислотную последовательность и ее производные (мутанты). Вследствие одной или более делеций,In addition, the Fc region of the immunoglobulin of the present invention contains a natural amino acid sequence and its derivatives (mutants). Due to one or more deletions,
- 6 044650 вставок, неконсервативных или консервативных замен аминокислотных остатков или их комбинаций, производная аминокислотная последовательность может иметь последовательность, отличную от природной аминокислотной последовательности. Например, для Fc IgG, аминокислотные остатки в положениях 214-238, 297-299, 318-322 или 327-331, которые, как известно, имеют решающее значение для связывания, можно использовать в качестве подходящих мишеней для модификации. Область Fc иммуноглобулина по настоящему изобретению может также содержать множество других производных, включая те, которые не имеют области, способной образовывать дисульфидные связи; те, которые имеют делецию нескольких аминокислотных остатков на N-конце природного Fc; или те, которые имеют дополнительные остатки метионина на N-конце природного Fc. Кроме того, чтобы удалить эффекторные функции, делеция может быть произведена на сайте связывания комплемента, таком как сайт связывания dq и сайт ADCC (антителозависимой клеточной цитотоксичности). Методики получения таких производных Fc-области иммуноглобулина раскрыты в WO 97/34631 и WO 96/32478.- 6 044650 insertions, non-conservative or conservative substitutions of amino acid residues or combinations thereof, the derived amino acid sequence may have a sequence different from the natural amino acid sequence. For example, for Fc IgG, amino acid residues at positions 214-238, 297-299, 318-322 or 327-331, which are known to be critical for binding, can be used as suitable targets for modification. The Fc region of the immunoglobulin of the present invention may also contain a variety of other derivatives, including those that do not have a region capable of forming disulfide bonds; those that have a deletion of several amino acid residues at the N-terminus of the natural Fc; or those that have additional methionine residues at the N-terminus of the natural Fc. In addition, to remove effector functions, deletion can be made at a complement binding site such as the dq binding site and the ADCC (antibody dependent cellular cytotoxicity) site. Methods for preparing such immunoglobulin Fc region derivatives are disclosed in WO 97/34631 and WO 96/32478.
Для белков и пептидов известны аминокислотные замены, которые обычно не изменяют молекулярную активность (H.Neurath, RL Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). Наиболее распространенными заменами являются Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu и Asp/Gly в обоих направлениях.For proteins and peptides, amino acid substitutions are known that usually do not change molecular activity (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). The most common substitutions are Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/ Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu and Asp/Gly in both directions.
При необходимости, Fc-область может быть модифицирована, например посредством фосфорилирования, сульфирования, акрилата, гликозилирования, метилирования, фарнезилирования, ацетилирования и амидирования.If necessary, the Fc region can be modified, for example, by phosphorylation, sulfonation, acrylate, glycosylation, methylation, farnesylation, acetylation and amidation.
Производные Fc обладают такой же биологической активностью, что и Fc-область по настоящему изобретению, или имеют улучшенную структурную стабильность (такую как структурная устойчивость к нагреванию, рН и т.д.), чем их соответствующая Fc-область.The Fc derivatives have the same biological activity as the Fc region of the present invention, or have improved structural stability (such as structural stability to heat, pH, etc.) than their corresponding Fc region.
Кроме того, эти Fc-области могут быть получены из природных форм, выделенных из человека и других животных, включающих крупный рогатый скот, козу, свинью, мышь, кролика, хомяка, крысу и морскую свинку, или происходить из рекомбинантных или производных трансформированных животных клеток или микроорганизмов. При этом Fc-область может быть получена из природного иммуноглобулина путем выделения интактного иммуноглобулина из организмов человека или животных и обработки его протеолитическими ферментами. Папаин переваривает природный иммуноглобулин с образованием Fab- и Fc-областей, в то время как обработка пепсином приводит к образованию фрагментов pFc' и F(ab')2. Фрагменты Fc или pFc' могут быть выделены, например посредством эксклюзионной хроматографии.In addition, these Fc regions may be derived from natural forms isolated from humans and other animals, including cattle, goat, porcine, mouse, rabbit, hamster, rat and guinea pig, or derived from recombinant or transformed animal cell derivatives or microorganisms. In this case, the Fc region can be obtained from natural immunoglobulin by isolating intact immunoglobulin from human or animal organisms and treating it with proteolytic enzymes. Papain digests natural immunoglobulin to form Fab and Fc regions, while treatment with pepsin leads to the formation of pFc' and F(ab') 2 fragments. Fc or pFc' fragments can be isolated, for example, by size exclusion chromatography.
Кроме того, Fc-область иммуноглобулина по настоящему изобретению может представлять собой форму, имеющую природные сахарные цепи, или увеличенные или уменьшенные сахарные цепи по сравнению с естественной формой, или может представлять собой дегликозилированную форму. Увеличение, уменьшение или удаление сахарных цепей Fc иммуноглобулина может быть осуществлено способами, обычно используемыми в данной области техники, такими как химические методы, ферментативные методы и методы генной инженерии с использованием микроорганизмов. Удаление сахарных цепей из Fc-фрагмента приводит к значительному снижению аффинности связывания с комплементом (C1q) и к снижению или потере антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности или комплементзависимой цитотоксичности, и, тем самым, нежелательные in vivo иммунные реакции не будут индуцироваться. Ввиду этого, Fc-область иммуноглобулина в дегликозилированной или негликозилированной форме может быть более подходящей для целей настоящего изобретения при использовании в качестве лекарственного средства.In addition, the Fc region of the immunoglobulin of the present invention may be a form having natural sugar chains, or increased or decreased sugar chains compared to the natural form, or may be a deglycosylated form. Increasing, decreasing, or removing immunoglobulin Fc sugar chains can be accomplished by methods commonly used in the art, such as chemical methods, enzymatic methods, and genetic engineering methods using microorganisms. Removal of sugar chains from the Fc moiety results in a significant reduction in complement binding affinity (C1q) and a reduction or loss of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity or complement-dependent cytotoxicity, and thus unwanted in vivo immune responses will not be induced. In view of this, the Fc region of an immunoglobulin in a deglycosylated or non-glycosylated form may be more suitable for the purposes of the present invention when used as a drug.
Термин дегликозилирование, используемый в настоящем изобретении, означает ферментативное удаление сахарных фрагментов из области Fc, а термин негликозилированный означает, что Fc-область продуцируется в агликозилированной форме (например, в эукариотических клетках, таких как клетки млекопитающих, или в прокариотах, таких как E.coli).The term deglycosylation as used herein means the enzymatic removal of sugar moieties from the Fc region, and the term non-glycosylated means that the Fc region is produced in an aglycosylated form (for example, in eukaryotic cells such as mammalian cells or prokaryotes such as E. coli).
Кроме того, Fc-область иммуноглобулина может быть Fc-областью, полученной из IgG, IgA, IgD, IgE и IgM, или полученной из их комбинации или гибрида. Предпочтительно, она происходит из IgG или IgM (двух наиболее многочисленных белков в крови человека), наиболее предпочтительно из IgG (который, как известно, увеличивает период полувыведения лиганд-связывающего белка).In addition, the Fc region of an immunoglobulin may be an Fc region derived from IgG, IgA, IgD, IgE and IgM, or derived from a combination or hybrid thereof. Preferably, it is derived from IgG or IgM (the two most abundant proteins in human blood), most preferably from IgG (which is known to increase the half-life of ligand binding protein).
Термин комбинация, используемый в настоящем изобретении, означает димер или мультимер, образованный двумя или более одноцепочечными полипептидами, которые связаны вместе, где одноцепочечные полипептиды могут происходить из одной или разных областей Fc иммуноглобулина. То есть димер или мультимер может быть образован двумя или более фрагментами, выбранными из группы, состоящей из Fc-фрагмента IgG, Fc-фрагмента IgA, Fc-фрагмента IgM, Fc-фрагмента IgD и Fc-фрагмента IgE.The term combination as used in the present invention means a dimer or multimer formed by two or more single chain polypeptides that are linked together, where the single chain polypeptides may be derived from the same or different Fc regions of an immunoglobulin. That is, the dimer or multimer may be formed by two or more fragments selected from the group consisting of an IgG Fc fragment, an IgA Fc fragment, an IgM Fc fragment, an IgD Fc fragment and an IgE Fc fragment.
В другом воплощении слитый белок GLP-1 по настоящему изобретению является гомодимером.In another embodiment, the GLP-1 fusion protein of the present invention is a homodimer.
В другом воплощении слитый белок GLP-1 дополнительно связан с фрагментом, содержащим сайт распознавания сортазы, то есть с фрагментом ST, описанным в настоящем изобретении.In another embodiment, the GLP-1 fusion protein is further linked to a fragment containing a sortase recognition site, that is, an ST fragment described in the present invention.
Термин сортаза, включающий сортазу А и сортазу В, был впервые обнаружен, как имеющий функцию прикрепления бактериальных поверхностных белков на клеточной стенке. Было установлено,The term sortase, including sortase A and sortase B, was first discovered to have the function of attaching bacterial surface proteins to the cell wall. It was found,
- 7 044650 что сигнал распознавания поверхностных белков состоит, в большинстве случаев, из трех основных частей: последовательности LPXTG, гидрофобной последовательности и хвоста из положительно заряженных остатков. Последовательность LPXTG является очень консервативной и может быть распознана сортазой, затем цистеин (Cys) транспептидазы действует как нуклеофильная группа, атакующая пептидную связь между треонином и глицином С-концевого мотива LPXTG субстрата (такого как поверхностный белок), вызывая расщепление пептидной связи (ацилирование), которое, в свою очередь, производит ацилазное промежуточное соединение, и, наконец, пептид ковалентно связан с клеточной стенкой или субъединицей фимбрий для функционирования (деацилирования).- 7 044650 that the recognition signal of surface proteins consists, in most cases, of three main parts: the sequence LPXTG, a hydrophobic sequence and a tail of positively charged residues. The LPXTG sequence is highly conserved and can be recognized by sortase, the transpeptidase's cysteine (Cys) then acts as a nucleophilic group attacking the peptide bond between the threonine and glycine of the C-terminal LPXTG motif of the substrate (such as a surface protein), causing cleavage of the peptide bond (acylation), which in turn produces an acylase intermediate, and finally the peptide is covalently linked to the cell wall or fimbriae subunit for function (deacylation).
В одном воплощении настоящего изобретения сортаза А используется для сайт-направленного присоединения PEG. В конкретном воплощении используют коровые сайты распознавания сортазы A LPETG, LPETGG и LPETGGG. В другом конкретном воплощении к сайту распознавания могут быть добавлены разные аффинные метки, такие как LPETGGHHHHHH, LPETGGWSHPQFEK и т.д.In one embodiment of the present invention, sortase A is used for site-directed attachment of PEGs. In a specific embodiment, the sortase A core recognition sites LPETG, LPETGG and LPETGGG are used. In another specific embodiment, various affinity tags such as LPETGGHHHHHH, LPETGGWSHPQFEK, etc. can be added to the recognition site.
В другом воплощении слитый белок GLP-1 по настоящему изобретению получают рекомбинантными методами, включающими, например, экспрессию белка в подходящей прокариотической или эукариотической клетке-хозяине и выделение слитого белка GLP-1 по настоящему изобретению обычными методами. Например, нуклеотидная последовательность, кодирующая пептид, может быть сначала синтезирована методом химического синтеза, а затем последовательность может быть клонирована в подходящий экспрессионный вектор для экспрессии под контролем подходящего промотора. Альтернативно, методы мутагенеза, такие как ПЦР-мутагенез, могут быть использованы для получения нуклеотидной последовательности, кодирующей GLP-1, из GLP-1 дикого типа, и тогда эта последовательность и последовательность других элементов для построения слитого белка может быть клонирована в подходящий экспрессионный вектор для экспрессии под контролем подходящего промотора. Эти методики полностью входят в сферу компетенции специалистов в данной области техники, и существует множество руководств в предшествующем уровне техники.In another embodiment, the GLP-1 fusion protein of the present invention is produced by recombinant methods, including, for example, expressing the protein in a suitable prokaryotic or eukaryotic host cell and isolating the GLP-1 fusion protein of the present invention by conventional methods. For example, a nucleotide sequence encoding a peptide may first be synthesized by chemical synthesis, and then the sequence may be cloned into a suitable expression vector for expression under the control of a suitable promoter. Alternatively, mutagenesis techniques, such as PCR mutagenesis, can be used to obtain the nucleotide sequence encoding GLP-1 from wild-type GLP-1, and then this sequence and the sequence of other elements for constructing the fusion protein can be cloned into a suitable expression vector for expression under the control of a suitable promoter. These techniques are entirely within the scope of those skilled in the art, and there is much guidance in the prior art.
Подходящие эукариотические клетки-хозяева включают клетки млекопитающих, такие как СНО (яичника китайского хомячка), COS (африканской зеленой мартышки), HEK293, BHK (клетки почки новорожденного хомячка), SK-Hep и HepG2. Клетки предпочтительно выращивают в условиях, пригодных для экспрессии слитого белка GLP-1 по настоящему изобретению. Что касается реагентов и условий, используемых для получения или выделения слитого белка GLP-1 по настоящему изобретению, то особых ограничений нет, и может быть применена любая система, известная в данной области техники или имеющаяся в продаже. В предпочтительном воплощении слитый белок GLP-1 получают способами, описанными в данной области.Suitable eukaryotic host cells include mammalian cells such as CHO (Chinese hamster ovary), COS (African green monkey), HEK293, BHK (neonatal hamster kidney cells), SK-Hep and HepG2. The cells are preferably grown under conditions suitable for expression of the GLP-1 fusion protein of the present invention. With regard to the reagents and conditions used to prepare or isolate the GLP-1 fusion protein of the present invention, there are no particular restrictions, and any system known in the art or commercially available can be used. In a preferred embodiment, the GLP-1 fusion protein is produced by methods described in the art.
Существует множество экспрессионных векторов, которые могут быть использованы для получения слитого белка GLP-1, который может быть выбран из эукариотических и прокариотических экспрессионных векторов. Прокариотические экспрессионные векторы могут включать, например, плазмиды, такие как pRSET, pET и pBAD, где промоторы, которые могут быть использованы, включают, например, lac, trc, trp, recA или araBAD. Эукариотические экспрессионные векторы включают: (1) векторы, используемые для экспрессии в дрожжах, такие как pAO, pPIC, pYES и рМЕТ, в которых могут быть использованы такие промоторы, как АОХ1, GAP, GAL1, AUG1 и т.д.; (2) векторы, используемые для экспрессии в клетках насекомых, такие как рМТ, pAc[delta], plB, pMIB, рВАС и т.д., в которых могут быть использованы такие промоторы, как РН, р10, МТ, Ас5, OplE2, gp64, polh и т.д; и (3) векторы, используемые для экспрессии в клетках млекопитающих, такие как pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV и т.д., и векторы, происходящие из вирусных систем, таких как вирус осповакцины, адено-ассоциированный вирус, вирус герпеса, ретровирус и тому подобное, в которых могут быть использованы такие промоторы, как CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV и β-актин. В предпочтительном воплощении слитый белок GLP-1 экспрессируется в прокариотической или эукариотической клеточной системе и используются кодон-оптимизированные кодирующие последовательности. В предпочтительном воплощении последовательность для экспрессии слитого белка GLP-1 содержит лидерный пептид и/или сигнальный пептид для облегчения секреции слитого белка GLP-1 из клетки наружу для разделения и очистки. В другом предпочтительном воплощении последовательность, экспрессирующая слитый белок GLP-1, не содержит лидерный пептид и/или сигнальный пептид, и вместо того, чтобы секретироваться вне клетки, слитый белок GLP-1 получают посредством лизиса клетки для разделения и очистки.There are a variety of expression vectors that can be used to produce a GLP-1 fusion protein, which can be selected from eukaryotic and prokaryotic expression vectors. Prokaryotic expression vectors may include, for example, plasmids such as pRSET, pET and pBAD, where promoters that can be used include, for example, lac, trc, trp, recA or araBAD. Eukaryotic expression vectors include: (1) vectors used for expression in yeast, such as pAO, pPIC, pYES and pMET, which may use promoters such as AOX1, GAP, GAL1, AUG1, etc.; (2) vectors used for expression in insect cells, such as pMT, pAc[delta], plB, pMIB, pBAC, etc., in which promoters such as PH, p10, MT, Ac5, OplE2 can be used , gp64, polh, etc.; and (3) vectors used for expression in mammalian cells, such as pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV, etc., and vectors derived from viral systems such as vaccinia virus, adeno-associated virus, herpes virus, retrovirus and the like, in which promoters such as CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV and β-actin can be used. In a preferred embodiment, the GLP-1 fusion protein is expressed in a prokaryotic or eukaryotic cell system and codon-optimized coding sequences are used. In a preferred embodiment, the sequence for expressing a GLP-1 fusion protein comprises a leader peptide and/or a signal peptide to facilitate secretion of the GLP-1 fusion protein from the cell to the outside for separation and purification. In another preferred embodiment, the GLP-1 fusion protein expression sequence does not contain a leader peptide and/or signal peptide, and rather than being secreted outside the cell, the GLP-1 fusion protein is produced by cell lysis for separation and purification.
В другом воплощении в слитом белке по настоящему изобретению белок GLP-1 и Fc-фрагмент связаны непосредственно. В другом воплощении белок GLP-1 и Fc-фрагмент связаны через первый линкер L1. В другом воплощении Fc-фрагмент и фрагмент, содержащий последовательность распознавания сортазы, связаны непосредственно. В другом воплощении Fc-фрагмент и фрагмент, содержащий последовательность распознавания сортазы, связаны через второй линкер L2.In another embodiment, in the fusion protein of the present invention, the GLP-1 protein and the Fc moiety are directly linked. In another embodiment, the GLP-1 protein and the Fc moiety are linked through a first L1 linker. In another embodiment, the Fc fragment and the fragment containing the sortase recognition sequence are directly linked. In another embodiment, the Fc fragment and the fragment containing the sortase recognition sequence are linked through a second linker L2.
В предпочтительном воплощении первый линкер L1 и/или второй линкер L2 представляет собой пептид, содержащий 1, 2, 3 или более аминокислот. Более предпочтительно, первый линкер L1 и/или второй линкер L2 представляет собой гибкий пептид, содержащий А, Т, G и/или S, такой как (GS)n, где n представляет собой целое число от 1 до 50, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10.In a preferred embodiment, the first linker L1 and/or the second linker L2 is a peptide containing 1, 2, 3 or more amino acids. More preferably, the first linker L1 and/or the second linker L2 is a flexible peptide containing A, T, G and/or S, such as (GS) n , where n is an integer from 1 to 50, for example 1, 2 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10.
Например, первый линкер L1 выбран из группы, состоящей из:For example, the first linker L1 is selected from the group consisting of:
- 8 044650- 8 044650
GSGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 9),GSGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 9),
GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 10),GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 10),
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ Ш NO: 11),GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ Ш NO: 11),
GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 12),GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 12),
GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ Ш NO: 13),GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ Ш NO: 13),
PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 14),PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 14),
SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 15),SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 15),
SSSSKAPPPS (SEQ ID NO: 16),SSSSKAPPPS (SEQ ID NO: 16),
SRLPGPSDTPILPQ (SEQ Ш NO: 17) иSRLPGPSDTPILPQ (SEQ Ш NO: 17) and
GGGGSGGGGSGGGGSA (SEQ ID NO: 18).GGGGSGGGGSGGGGSA (SEQ ID NO: 18).
Например, второй линкер L2 выбран из группы, состоящей из:For example, the second linker L2 is selected from the group consisting of:
GSGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ГО NO: 9),GSGGGSGGGGSGGGGS (SEQ GO NO: 9),
GGGGSGGGGSGGGGSA (SEQ ID NO: 18),GGGGSGGGGSGGGGSA (SEQ ID NO: 18),
GGGGS (SEQ ID NO: 19),GGGGS (SEQ ID NO: 19),
GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 20) andGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 20) and
GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 21).GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 21).
Конъюгаты слитого белка GLP-1.GLP-1 fusion protein conjugates.
Слитый белок GLP-1 по настоящему изобретению может быть конъюгирован с одной или более полимерными группами с получением конъюгата слитого белка GLP-1, где полимер конъюгирован с концом слитого белка, такими как N-конец или С-конец. Используемый здесь полимер предпочтительно является физиологически приемлемым, что включает растворимость в водном растворе или суспензии и отсутствие негативных эффектов, таких как побочные эффекты на млекопитающих после введения конъюгата слитого белка GLP-1 в фармацевтически эффективном количестве. Полимеры, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, конкретно не ограничены. Полимеры обычно предпочтительно имеют от 2 до примерно 3000 повторяющихся единиц. Полимерная группа может быть выбрана из природных или синтетических полимеров, примеры которых включают, без ограничения ими, например, полисахариды, полиалкиленгликоли, такие как полиэтиленгликоль (PEG), полипропиленгликоль (PPG), полиэтиленоксид (РЕО), сополимер этиленгликоля и пропиленгликоля, поливиниловый спирт и любую их комбинацию. В предпочтительном воплощении конъюгат слитого белка GLP-1 по настоящему изобретению конъюгирован с одной или более группами PEG для модификации.The GLP-1 fusion protein of the present invention can be conjugated to one or more polymer groups to form a GLP-1 fusion protein conjugate, wherein the polymer is conjugated to an end of the fusion protein, such as the N-terminus or the C-terminus. The polymer used herein is preferably physiologically acceptable, which includes solubility in an aqueous solution or suspension and absence of negative effects such as side effects in mammals following administration of a GLP-1 fusion protein conjugate in a pharmaceutically effective amount. The polymers that can be used in the present invention are not particularly limited. Polymers generally preferably have from 2 to about 3000 repeat units. The polymer group may be selected from natural or synthetic polymers, examples of which include, but are not limited to, polysaccharides, polyalkylene glycols such as polyethylene glycol (PEG), polypropylene glycol (PPG), polyethylene oxide (PEO), ethylene glycol-propylene glycol copolymer, polyvinyl alcohol and any combination of them. In a preferred embodiment, the GLP-1 fusion protein conjugate of the present invention is conjugated to one or more PEG groups for modification.
В настоящем изобретении полимер не ограничен конкретной структурой, он может быть линейным (таким как алкокси-PEG или бифункциональный PEG), разветвленным или многолучевым (например раздвоенным PEG или PEG, связанным с полиольным ядром), дендритным, или может иметь легко разрушающиеся связи. Кроме того, внутренняя структура полимера может быть организована в любое количество разных структур, которые могут быть выбраны из гомополимеров, чередующихся сополимеров, случайных сополимеров, блок-сополимеров, чередующихся терполимеров, случайных терполимеров, блок-терполимеров и тому подобного. Полимеры также могут включать поли(алкиленоксид)ные полимеры, полималеиновую кислоту, поли(D,L-аланин) и тому подобное.In the present invention, the polymer is not limited to a particular structure, it may be linear (such as alkoxy-PEG or bifunctional PEG), branched or multi-armed (for example, bifurcated PEG or PEG linked to a polyol core), dendritic, or may have easily broken bonds. In addition, the internal structure of the polymer may be organized into any number of different structures, which may be selected from homopolymers, alternating copolymers, random copolymers, block copolymers, alternating terpolymers, random terpolymers, block terpolymers, and the like. The polymers may also include poly(alkylene oxide) polymers, polymaleic acid, poly(D,L-alanine) and the like.
В некоторых воплощениях полимер представляет собой полиэтиленгликоль (PEG) или его производные, такие как метоксиполиэтиленгликоль (mPEG). В данном описании изобретения, если конкретно не указано, полиэтиленгликоли (PEG) включают те, которые имеют либо гидроксильные группы в качестве терминальной группы, либо другие группы в качестве терминальной группы. Другие группы включают, без ограничения ими, алкокси, циклоалкокси, циклоалкилокси, алкенил, арилокси или аралкилокси. Эти молекулярные типы PEG известны в уровне техники и обычно используются в модификации полипептидов. Боковая цепь PEG может быть линейной, разветвленной, раздвоенной или состоять из нескольких ветвей. Разные полиэтиленгликоли могут иметь разную длину полимерных цепей и разные структуры полимеров.In some embodiments, the polymer is polyethylene glycol (PEG) or derivatives thereof, such as methoxy polyethylene glycol (mPEG). As used herein, unless specifically stated, polyethylene glycols (PEGs) include those having either hydroxyl groups as a terminal group or other groups as a terminal group. Other groups include, but are not limited to, alkoxy, cycloalkoxy, cycloalkyloxy, alkenyl, aryloxy or aralkyloxy. These molecular types of PEGs are known in the art and are commonly used in the modification of polypeptides. The PEG side chain can be linear, branched, bifurcated or multi-branched. Different polyethylene glycols may have different polymer chain lengths and different polymer structures.
В настоящем изобретении нет особых ограничений по молекулярной массе PEG, и его молекулярная масса может варьировать от 0,1 до 200 кДа, например от 1 до 150 кДа, от 2 до 100 кДа, от 3 до 80 кДа, от 4 до 50 кДа или от 5 до 40 кДа. Другие полезные PEG включают, например, те, которые раскрыты в WO 03/040211, US 6566506, US 6864350 и US 6455639. В частности, PEG имеет общую формулу HOCH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH, где диапазон n составляет от примерно 5 до 4000. Как упоминалось выше, PEG по настоящему изобретению включает PEG с другими терминальными группами, такой как метокси-PEG, разветвленный PEG, раздвоенный PEG и подобное. Подходящие разветвленные PEG могут быть получены, как описано в патенте US 5932462, полное раскрытие которого включено в данное описание посредством ссылки. Раздвоенный PEG относится к PEG, который имеет ветвь около одного конца полимерной цепи, и основная цепь раздвоенного PEG может быть линейной или разветвленной.In the present invention, there is no particular limitation on the molecular weight of PEG, and its molecular weight may vary from 0.1 to 200 kDa, such as 1 to 150 kDa, 2 to 100 kDa, 3 to 80 kDa, 4 to 50 kDa, or from 5 to 40 kDa. Other useful PEGs include, for example, those disclosed in WO 03/040211, US 6566506, US 6864350 and US 6455639. In particular, PEG has the general formula HOCH 2 CH 2 O-(CH 2 CH 2 O) n -CH 2 CH 2 -OH, where the range of n is from about 5 to 4000. As mentioned above, the PEG of the present invention includes PEG with other terminal groups, such as methoxy-PEG, branched PEG, bifurcated PEG and the like. Suitable branched PEGs can be prepared as described in US Pat. No. 5,932,462, the entire disclosure of which is incorporated herein by reference. Forked PEG refers to a PEG that has a branch near one end of the polymer chain, and the main chain of a forked PEG can be linear or branched.
- 9 044650- 9 044650
Специалистам в данной области известно, что в биологически активной молекуле конъюгированной с полимерной группой, по мере увеличения молекулярной массы полимерной группы биологическая активность конъюгата постепенно снижается. (Bailon et al. Rational design of potent, long-lasting form of interferon: A 40 kDa branched polyethylene glycol-conjugated interferon a-2a for the treatment of hepatitis C. Bioconjugate Chem 2001; 12: 195-202; Bowen et al. Relationship between molecular mass and duration of activity of polyethylene glycol conjugated granulocyte colony-stimulating factor mutein. Experimental Hematology 1999; 27: 425-32; and Bailon et al. PEG-modified biopharmaceuticals. Expert Opin Deliv. 2009; 6: 1-16). Специалистам также известно, что по мере увеличения молекулярной массы полимерной группы, соответственно увеличивается биологический период полувыведения и/или полупериод существования в плазме.Those skilled in the art know that in a biologically active molecule conjugated to a polymer group, as the molecular weight of the polymer group increases, the biological activity of the conjugate gradually decreases. (Bailon et al. Rational design of potent, long-lasting form of interferon: A 40 kDa branched polyethylene glycol-conjugated interferon a-2a for the treatment of hepatitis C. Bioconjugate Chem 2001; 12: 195-202; Bowen et al. Relationship between molecular mass and duration of activity of polyethylene glycol conjugated granulocyte colony-stimulating factor mutein. Experimental Hematology 1999; 27: 425-32; and Bailon et al. PEG-modified biopharmaceuticals. Expert Opin Deliv. 2009; 6: 1-16 ). Those skilled in the art also know that as the molecular weight of a polymer group increases, the biological half-life and/or plasma half-life increases accordingly.
Чтобы обеспечить стабильный терапевтический эффект в течение длительного периода и снизить частоту введения для улучшения соблюдения пациентом режима лечения, желательно как можно больше увеличить биологический период полувыведения конъюгата слитого белка GLP-1 при сохранении значительной активности агониста рецептора GLP-1. Таким образом, в одном воплощении настоящего изобретения предлагаются конъюгаты слитого белка GLP-1 с увеличенным биологическим периодом полувыведения и значительной активностью агониста рецептора GLP-1.To ensure a stable therapeutic effect over a long period and reduce the frequency of administration to improve patient compliance, it is desirable to increase the biological half-life of the GLP-1 fusion protein conjugate as much as possible while maintaining significant GLP-1 receptor agonist activity. Thus, one embodiment of the present invention provides GLP-1 fusion protein conjugates with increased biological half-life and significant GLP-1 receptor agonist activity.
В конкретном воплощении в конъюгате слитого белка GLP-1 по настоящему изобретению молекулярная масса одной или более полимерных групп (например PEG) больше или равна 1, больше или равна 10, больше или равна 20, больше или равна 30, больше или равна 40, больше или равна 50, больше или равна 60, больше или равна 70, больше или равна 80, больше или равна 90, больше или равна 100, больше или равна 110, больше или равна 120, больше или равна 130, больше или равна 140, больше или равна 150, или больше или равна 160 кДа, например 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 кДа, или имеет значение между любыми двумя из вышеперечисленных значений. Следует отметить, что при описании молекулярной массы конъюгированной полимерной группы в конъюгате слитого белка GLP-1, при наличии нескольких конъюгированных полимерных групп в этом конъюгате, подсчитывают сумму молекулярных масс всех конъюгированных полимерных групп в конъюгате, если не указано иное.In a specific embodiment, the GLP-1 fusion protein conjugate of the present invention has a molecular weight of one or more polymeric moieties (eg, PEG) greater than or equal to 1, greater than or equal to 10, greater than or equal to 20, greater than or equal to 30, greater than or equal to 40, greater or equal to 50, greater than or equal to 60, greater than or equal to 70, greater than or equal to 80, greater than or equal to 90, greater than or equal to 100, greater than or equal to 110, greater than or equal to 120, greater than or equal to 130, greater than or equal to 140, greater or equal to 150, or greater than or equal to 160 kDa, for example 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 or 100 kDa, or a value between any two of the above. It should be noted that when describing the molecular weight of a conjugated polymer group in a GLP-1 fusion protein conjugate, when there are multiple conjugated polymer groups in that conjugate, the sum of the molecular weights of all conjugated polymer groups in the conjugate is calculated unless otherwise noted.
Полимер, используемый в настоящем изобретении, известен в уровне техники, и его можно получить различными способами, включая, например, коммерческие способы, такие как CarboMer, Inc., JT Baker, The Dow Chemical Company и т.д., или его можно приготовить самостоятельно в соответствии со способами, известными в данной области техники, например, как описано в ЕР 1245608. Настоящее изобретение не ограничено полимерами, полученными каким-либо конкретным способом.The polymer used in the present invention is known in the art and can be produced by various methods, including, for example, commercial methods such as CarboMer, Inc., JT Baker, The Dow Chemical Company, etc., or it can be prepared independently in accordance with methods known in the art, for example as described in EP 1245608. The present invention is not limited to polymers obtained by any particular method.
После реакции конъюгации, конъюгат может быть выделен подходящим методом, включающим, например, ультрафильтрацию, диализ или хроматографию и т.д., все из которых известны специалистам обычной квалификации в данной области.After the conjugation reaction, the conjugate can be isolated by a suitable method including, for example, ultrafiltration, dialysis or chromatography, etc., all of which are known to those of ordinary skill in the art.
Фармацевтическая композиция.Pharmaceutical composition.
Слитый белок GLP-1 или конъюгат слитого белка GLP-1 по настоящему изобретению могут иметь несколько применений, в том числе, например, применение в снижении уровня глюкозы в крови. Следовательно, в настоящем изобретении также предлагается фармацевтическая композиция для снижения глюкозы в крови, которая содержит терапевтически эффективное количество слитого белка или конъюгата по настоящему изобретению и возможно фармацевтически приемлемый носитель. Предпочтительно, эту фармацевтическую композицию можно использовать для лечения диабета, более предпочтительно для лечения диабета I типа и/или диабета II типа, и особенно предпочтительно для лечения диабета II типа.The GLP-1 fusion protein or GLP-1 fusion protein conjugate of the present invention may have several uses, including, for example, use in lowering blood glucose levels. Accordingly, the present invention also provides a pharmaceutical composition for lowering blood glucose that contains a therapeutically effective amount of a fusion protein or conjugate of the present invention and optionally a pharmaceutically acceptable carrier. Preferably, this pharmaceutical composition can be used for the treatment of diabetes, more preferably for the treatment of type I diabetes and/or type II diabetes, and especially preferably for the treatment of type II diabetes.
Терапевтически эффективное количество слитого белка или конъюгата по настоящему изобретению зависит от пути введения, типа субъекта и физических характеристик конкретного рассматриваемого млекопитающего. Эти факторы и их связь с определением количества хорошо известны специалистам в области медицины. Количество и способ введения могут быть подобраны для достижения оптимальной эффективности доставки пептида субъекту, но в зависимости от факторов, хорошо известных специалистам в области медицины, таких как масса тела, диета, сопутствующие лекарственные средства и другие факторы.The therapeutically effective amount of the fusion protein or conjugate of the present invention depends on the route of administration, the type of subject and the physical characteristics of the particular mammal in question. These factors and their relationship to quantification are well known to those skilled in the medical field. The amount and route of administration can be adjusted to achieve optimal efficiency of delivery of the peptide to the subject, but depending on factors well known to those skilled in the art, such as body weight, diet, concomitant medications and other factors.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить в составе комбинированной терапии, то есть в комбинации с одним или более другими агентами, где фармацевтическую композицию и другие агенты вводят вместе или последовательно. В других воплощениях другие агенты можно вводить до, во время или после введения одного или более из слитого белка, конъюгата или их фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Другие агенты, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают, например, агенты, способные снижать уровень глюкозы в крови, такие как инсулин, аналоги инсулина, агонисты декстрина и холецистокинин, и/или другие соединения или композиции для лечения заболеваний. Предпочтительно, такое комбинированное введение позволяет достичь комбинированного или даже синергического эффекта.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered as part of a combination therapy, that is, in combination with one or more other agents, where the pharmaceutical composition and the other agents are administered together or sequentially. In other embodiments, other agents may be administered before, during, or after administration of one or more of the fusion protein, conjugate, or pharmaceutical composition thereof of the present invention. Other agents that may be used in the present invention include, for example, agents capable of lowering blood glucose levels, such as insulin, insulin analogs, dextrin agonists and cholecystokinin, and/or other compounds or compositions for the treatment of diseases. Preferably, such combined administration allows a combined or even synergistic effect to be achieved.
Используемые здесь термины фармацевтически приемлемый носитель или физиологически приемлемый носитель могут использоваться взаимозаменяемо, включая одну или более из любых физиологически совместимых солей, растворителей, дисперсионных сред, покрытий, антибактериальных и проAs used herein, the terms pharmaceutically acceptable carrier or physiologically acceptable carrier may be used interchangeably, including one or more of any physiologically compatible salts, solvents, dispersion media, coatings, antibacterial or antibacterial agents.
- 10 044650 тивогрибковых средств, изотонических и задерживающих абсорбцию агентов и т.д. В некоторых воплощениях носитель подходит для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинномозгового или эпидермального введения (например посредством инъекции или инфузии). В зависимости от способа введения терапевтическое средство может быть покрыто определенными материалами для защиты терапевтического средства от действия кислот и других природных условий, которые могут инактивировать это терапевтическое средство.- 10 044650 antifungal agents, isotonic and absorption delaying agents, etc. In some embodiments, the carrier is suitable for intravenous, intramuscular, subcutaneous, parenteral, spinal, or epidermal administration (eg, by injection or infusion). Depending on the route of administration, the therapeutic agent may be coated with certain materials to protect the therapeutic agent from acids and other environmental conditions that may inactivate the therapeutic agent.
При введении фармацевтического препарата по настоящему изобретению его вводят в фармацевтически приемлемом количестве в фармацевтически приемлемой композиции. Термин фармацевтически приемлемый означает нетоксичное вещество, которое не затрагивает биологически активную эффективность активных компонентов. Такие препараты обычно содержат соли, буферы, консерванты, совместимые носители и возможно другие терапевтические агенты, такие как дополнительные усилители иммунитета, включая адъюванты, хемокины и цитокины. При использовании в лекарственных средствах соль должна быть фармацевтически приемлемой. Однако фармацевтически неприемлемые соли могут быть успешно использованы для получения их фармацевтически приемлемых солей, поэтому они не исключены из объема настоящего изобретения.When administered, the pharmaceutical preparation of the present invention is administered in a pharmaceutically acceptable amount in a pharmaceutically acceptable composition. The term pharmaceutically acceptable means a non-toxic substance that does not affect the biologically active effectiveness of the active components. Such preparations typically contain salts, buffers, preservatives, compatible carriers and possibly other therapeutic agents such as additional immune enhancers, including adjuvants, chemokines and cytokines. When used in medicinal products, the salt must be pharmaceutically acceptable. However, pharmaceutically unacceptable salts can be successfully used to prepare their pharmaceutically acceptable salts, so they are not excluded from the scope of the present invention.
Если необходимо, слитый белок GLP-1 или конъюгат слитого белка GLP-1 по настоящему изобретению может быть объединен с фармацевтически приемлемыми носителями. При использовании здесь термин фармацевтически приемлемые носители относится к одному или более совместимым твердым или жидким наполнителям, разбавителям или инкапсулирующим веществам, которые подходят для введения млекопитающим, таким как человек. Термин носитель означает органические или неорганические, природные или синтетические компоненты, которые объединяю с активными компонентами для облегчения применения. Компоненты фармацевтической композиции также могут быть смешаны в такой форме, в которой отсутствуют взаимодействия, способные существенно нарушить терапевтический эффект нужного лекарственного средства.If desired, the GLP-1 fusion protein or GLP-1 fusion protein conjugate of the present invention can be combined with pharmaceutically acceptable carriers. As used herein, the term pharmaceutically acceptable carriers refers to one or more compatible solid or liquid excipients, diluents or encapsulating agents that are suitable for administration to mammals, such as humans. The term carrier means organic or inorganic, natural or synthetic components that are combined with active ingredients to facilitate administration. The components of the pharmaceutical composition may also be mixed in a form in which there are no interactions that could significantly interfere with the therapeutic effect of the desired drug.
Предпочтительно, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать буферную систему, и предпочтительно буферная система представляет собой ацетатный буферный раствор с рН от примерно 3,0 до примерно 6,0, или фосфатный буферный раствор с рН от примерно 5,0 до примерно 9,0. В некоторых конкретных воплощениях, подходящие буферы включают ацетат, цитрат, борат и фосфат.Preferably, the pharmaceutical composition of the present invention may contain a buffer system, and preferably the buffer system is an acetate buffer solution with a pH of about 3.0 to about 6.0, or a phosphate buffer solution with a pH of about 5.0 to about 9.0 . In some specific embodiments, suitable buffers include acetate, citrate, borate and phosphate.
Возможно, фармацевтическая композиция может также содержать подходящие консерванты, такие как бензалкония хлорид, хлор-трет-бутанол, парабены и тимеросал.Optionally, the pharmaceutical composition may also contain suitable preservatives such as benzalkonium chloride, chloro-tert-butanol, parabens and thimerosal.
Фармацевтическая композиция может быть удобно представлена в стандартной лекарственной форме и может быть получена любым способом, известным в области фармакологии. Такой способ включает стадию объединения активного агента с носителем, который содержит один или более вспомогательных ингредиентов. Как правило, композицию готовят путем непосредственного комбинирования активного соединения с одним или обоими из жидкого носителя и мелкодисперсного твердого носителя с последующим формированием продукта, если это необходимо.The pharmaceutical composition may be conveniently presented in unit dosage form and may be prepared by any method known in the art of pharmacology. Such a method includes the step of combining the active agent with a carrier that contains one or more auxiliary ingredients. Typically, the composition is prepared by directly combining the active compound with one or both of a liquid carrier and a particulate solid carrier, then forming a product if desired.
Фармацевтическими композициями, подходящими для парентерального введения, могут быть стерильные водные или неводные композиции, содержащие один или более слитых белков или конъюгатов. В некоторых воплощениях композиция изотонична крови субъекта. Этот препарат может быть получен в соответствии с известными методами с использованием подходящих диспергирующих или увлажняющих агентов и суспендирующих агентов. Стерильный инъекционный препарат может также представлять собой стерильный инъекционный раствор или суспензию в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например раствор в 1,3-бутандиоле. Приемлемые носители и растворители, которые могут быть использованы, включают воду, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, стерильные нелетучие масла обычно используют в качестве растворителей или суспензионных сред. По этой причине можно использовать любое мягкое нелетучее масло, включая синтетические моно- или ди-глицериды. Кроме того, жирные кислоты, такие как олеиновая кислота, могут быть использованы в качестве инъекционных композиций. Составы носителей, подходящие для перорального, подкожного, внутривенного, внутримышечного и т.д. введения, можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA.Pharmaceutical compositions suitable for parenteral administration may be sterile aqueous or non-aqueous compositions containing one or more fusion proteins or conjugates. In some embodiments, the composition is isotonic with the subject's blood. This preparation can be prepared in accordance with known methods using suitable dispersing or wetting agents and suspending agents. The sterile injectable preparation may also be a sterile injectable solution or suspension in a non-toxic parenterally acceptable diluent or solvent, for example a solution in 1,3-butanediol. Acceptable vehicles and solvents that may be used include water, Ringer's solution and isotonic sodium chloride solution. In addition, sterile fixed oils are commonly used as solvents or suspension media. For this reason, any soft, fixed oil can be used, including synthetic mono- or di-glycerides. In addition, fatty acids such as oleic acid can be used as injectable compositions. Carrier compositions suitable for oral, subcutaneous, intravenous, intramuscular, etc. introduction, can be found in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA.
Слитый белок или конъюгат по настоящему изобретению может быть приготовлен с носителями, которые защищают его от быстрого высвобождения, например в виде композиции с контролируемым высвобождением, включая имплантаты, трансдермальные пластыри и микрокапсулированные системы доставки. Можно использовать биоразлагаемые и биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие способы получения таких композиций известны в уровне техники, см., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978, и т.п.The fusion protein or conjugate of the present invention can be formulated with carriers that protect it from rapid release, for example, in the form of a controlled release composition, including implants, transdermal patches and microencapsulated delivery systems. Biodegradable and biocompatible polymers such as ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters and polylactic acid can be used. Many methods for preparing such compositions are known in the art, see, for example, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978, etc.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить любым обычным путем, включая инъекцию или постепенную инфузию в течение времени. Например, введение может быть пероральным, внутривенным, внутрибрюшинным, внутримышечным, внутриполостным, внутриопухоThe pharmaceutical composition of the present invention can be administered by any conventional route, including injection or gradual infusion over time. For example, administration may be oral, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intracavitary, intratumoral
- 11 044650 левым или трансдермальным.- 11 044650 left or transdermal.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению вводят в эффективном количестве. Эффективное количество представляет собой количество любого слитого белка или конъюгата, представленного здесь, одного или с дополнительными дозами и/или другими терапевтическими агентами, вызывающими необходимый ответ (например снижение уровней глюкозы в крови у субъектов). Это может включать только временное замедление развития диабета или в некоторых воплощениях, долговременную остановку развития диабета.The pharmaceutical composition of the present invention is administered in an effective amount. An effective amount is the amount of any fusion protein or conjugate provided herein, alone or with additional doses and/or other therapeutic agents that produce the desired response (eg, a decrease in blood glucose levels in subjects). This may involve only temporarily slowing the progression of diabetes or, in some embodiments, long-term stopping the progression of diabetes.
Конечно, такое количество зависит от конкретного заболевания, подлежащего лечению, тяжести заболевания, индивидуальных параметров пациента (включая возраст, физическое состояние, рост и массу тела), продолжительности лечения, характера сопутствующего лечения (если таковое имеется), конкретного пути введения и подобных факторов в пределах знаний специалистов в области медицины и здравоохранения. Эти факторы хорошо известны специалистам в данной области и их можно узнать с использованием только рутинных экспериментов. Обычно предпочтительно использовать максимальную дозу каждого компонента или их комбинации, то есть самую высокую безопасную дозу, основанную на разумном медицинском суждении. Однако специалисты в данной области понимают, что пациентам могут потребоваться более низкие дозы или допустимые дозы по медицинским, психологическим или, в сущности, любым другим причинам.Of course, such amount will depend on the specific disease being treated, the severity of the disease, individual patient characteristics (including age, physical condition, height and weight), duration of treatment, nature of concomitant treatment (if any), specific route of administration and similar factors in within the knowledge of specialists in the field of medicine and healthcare. These factors are well known to those skilled in the art and can be learned using only routine experimentation. It is generally preferable to use the maximum dose of each component or combination thereof, that is, the highest safe dose based on reasonable medical judgment. However, those skilled in the art understand that patients may require lower doses or tolerable doses for medical, psychological, or indeed any other reasons.
Фармацевтическая композиция, используемая в предыдущем способе, предпочтительно является стерильной и содержит эффективное количество слитого белка или конъюгата, одного или в комбинации с другим препаратом в единице массы или единице объема, пригодной для введения пациентам для получения необходимого ответа, такого как снижение уровня глюкозы в крови.The pharmaceutical composition used in the previous method is preferably sterile and contains an effective amount of the fusion protein or conjugate, alone or in combination with another drug, per unit mass or unit volume, suitable for administration to patients to obtain the desired response, such as lowering blood glucose levels .
Доза слитого белка или конъюгата, вводимая субъекту, может быть выбрана в соответствии с разными параметрами, особенно в соответствии со способом введения и состоянием субъекта. Другие факторы включают необходимый период лечения. Если реакция субъекта на начальную применяемую дозу недостаточна, может быть применена более высокая доза (или эффективная более высокая доза, достигаемая другим, более локальным путем доставки) в пределах толерантности пациента.The dose of the fusion protein or conjugate administered to the subject may be selected according to various parameters, especially according to the route of administration and the condition of the subject. Other factors include the required treatment period. If the subject's response to the initial dose administered is insufficient, a higher dose (or an effective higher dose achieved by another, more local route of delivery) may be administered within the patient's tolerance.
В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит 0,20 мг/мл ~ 5 мг/мл слитого белка GLP-1 и/или 4 мг/мл ~ 40 мг/мл конъюгата слитого белка GLP-1, предпочтительно 0,20 мг/мл ~ 5 мг/мл слитого белка GLP-1 и/или 4 мг/мл ~ 40 мг/мл конъюгата слитого белка GLP-1, более предпочтительно 0,5 мг/мл ~ 2 мг/мл слитого белка GLP-1 и/или 10 мг/мл ~ 20 мг/мл конъюгата слитого белка GLP-1. Как правило, доза слитого белка GLP-1 или конъюгата слитого белка GLP-1 по настоящему изобретению может варьировать от примерно 10 мкг/кг массы тела пациента до примерно 100000 мкг/кг массы тела пациента. В некоторых воплощениях доза может варьировать от примерно 0,1 мг/кг до примерно 20 мг/кг. В других воплощениях доза может варьировать от примерно 0,1 мг/кг до 5 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 10 мг/кг, или от 0,1 мг/кг до 15 мг/кг. В других воплощениях доза может варьировать от примерно 1 мг/кг до 5 мг/кг, от 5 мг/кг до 10 мг/кг, от 10 мг/кг до 15 мг/кг или от 15 мг/кг до 20 мг/кг. В других воплощениях доза составляет примерно 0,1 мг/кг, 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 5 мг/кг, 7 мг/кг, 10 мг/кг, 12 мг/кг, 15 мг/кг, 17 мг/кг, 20 мг/кг, 25 мг/кг или 30 мг/кг. В другом воплощении доза составляет примерно 1 мг/кг, 3 мг/кг, 5 мг/кг или 6 мг/кг. Исходя из свойств композиции, доза может доставляться непрерывно (например, с помощью непрерывного насоса) или с периодическими интервалами. В некоторых воплощениях, при внутривенном введении, доза слитого белка GLP-1 или конъюгата слитого белка GLP-1 по настоящему изобретению может быть от 0,1 до 20 мг/кг или иметь любое значение в этом интервале. Идеальный интервал времени для многократного введения конкретной композиции может быть определен специалистами в данной области без излишних экспериментов. Другие режимы дозирования предложенной композиции известны специалистам в данной области, где доза, режим введения, место введения, способ введения и т.д. могут отличаться от вышеуказанных. В одном воплощении дозу вводят внутривенно. В другом воплощении режим приёма лекарственного средства представляет собой однократное внутривенное введение.In some embodiments, the pharmaceutical composition of the present invention contains 0.20 mg/ml ~ 5 mg/ml GLP-1 fusion protein and/or 4 mg/ml ~ 40 mg/ml GLP-1 fusion protein conjugate, preferably 0.20 mg/ml ml ~ 5 mg/ml GLP-1 fusion protein and/or 4 mg/ml ~ 40 mg/ml GLP-1 fusion protein conjugate, more preferably 0.5 mg/ml ~ 2 mg/ml GLP-1 fusion protein and/ or 10 mg/ml ~ 20 mg/ml GLP-1 fusion protein conjugate. Typically, the dose of the GLP-1 fusion protein or GLP-1 fusion protein conjugate of the present invention may range from about 10 μg/kg of patient body weight to about 100,000 μg/kg of patient body weight. In some embodiments, the dose may vary from about 0.1 mg/kg to about 20 mg/kg. In other embodiments, the dose may vary from about 0.1 mg/kg to 5 mg/kg, from 0.1 mg/kg to 10 mg/kg, or from 0.1 mg/kg to 15 mg/kg. In other embodiments, the dose may vary from about 1 mg/kg to 5 mg/kg, from 5 mg/kg to 10 mg/kg, from 10 mg/kg to 15 mg/kg, or from 15 mg/kg to 20 mg/kg . In other embodiments, the dose is about 0.1 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 12 mg/kg, 15 mg/kg, 17 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, or 30 mg/kg. In another embodiment, the dose is about 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, or 6 mg/kg. Based on the properties of the composition, the dose may be delivered continuously (eg, using a continuous pump) or at periodic intervals. In some embodiments, when administered intravenously, the dose of the GLP-1 fusion protein or GLP-1 fusion protein conjugate of the present invention may be from 0.1 to 20 mg/kg or any value in this range. The ideal time interval for repeated administration of a particular composition can be determined by those skilled in the art without undue experimentation. Other dosage regimens of the proposed composition are known to those skilled in the art, including dose, mode of administration, site of administration, route of administration, etc. may differ from the above. In one embodiment, the dose is administered intravenously. In another embodiment, the drug dosage regimen is a single intravenous administration.
Набор, содержащий слитый белок GLP-1 или конъюгат слитого белка GLP-1 (например, в фармацевтической композиции) и инструкции по применению также входят в объем настоящего изобретения. Набор может дополнительно содержать по меньшей мере один другой агент, например один или более других агентов, снижающих уровень глюкозы в крови. В другом воплощении набор может включать носитель, который разделен на отсеки для крепкого удержания одного или более контейнеров или ряда контейнеров (таких как пробирки, канюли, колбы, бутылки, шприцы и т.д.). Компоненты набора могут быть упакованы в водной среде или в лиофилизированной форме.A kit containing a GLP-1 fusion protein or a GLP-1 fusion protein conjugate (eg, in a pharmaceutical composition) and instructions for use are also within the scope of the present invention. The kit may further contain at least one other agent, for example one or more other agents that lower blood glucose levels. In another embodiment, the kit may include a carrier that is divided into compartments to securely hold one or more containers or a number of containers (such as tubes, cannulas, flasks, bottles, syringes, etc.). The components of the kit can be packaged in aqueous media or in lyophilized form.
Композиция может быть представлена в лиофилизированной форме или в водной среде.The composition can be presented in lyophilized form or in an aqueous medium.
Предпочтительно, субъект является позвоночным, более предпочтительно млекопитающим, наиболее предпочтительно человеком, но субъект также может быть и другим животным, таким как домашние животные (например собаки, кошки и т.д.), домашний скот (например крупный рогатый скот, овцы и козы, свиньи, лошади и т.д.) или экспериментальные животные (например обезьяны, крысы, мыши, кролики, морские свинки и т.д.).Preferably, the subject is a vertebrate, more preferably a mammal, most preferably a human, but the subject may also be other animals such as domestic animals (eg dogs, cats, etc.), livestock (eg cattle, sheep and goats , pigs, horses, etc.) or experimental animals (eg monkeys, rats, mice, rabbits, guinea pigs, etc.).
Слитый белок GLP-1 и/или конъюгат слитого белка GLP-1 по настоящему изобретению можно вво- 12 044650 дить самостоятельно, но предпочтительно его вводят в виде фармацевтической композиции, которая обычно содержит подходящие фармацевтические эксципиенты, растворители или носители, выбранные в соответствии с запланированным путем введения, и он может быть применен к пациенту/субъекту, нуждающемуся в лечении, любым подходящим способом. Точная дозировка будет зависеть от ряда факторов, включающих точную природу слитого белка GLP-1 и конъюгата слитого белка GLP-1.The GLP-1 fusion protein and/or GLP-1 fusion protein conjugate of the present invention can be administered alone, but is preferably administered in the form of a pharmaceutical composition, which typically contains suitable pharmaceutical excipients, solvents or carriers selected as intended. by administration, and it can be applied to the patient/subject in need of treatment in any suitable manner. The exact dosage will depend on a number of factors, including the exact nature of the GLP-1 fusion protein and the GLP-1 fusion protein conjugate.
Некоторые подходящие способы введения включают (без ограничения) пероральное, ректальное, назальное, местное (включая буккальное и сублингвальное), трансдермальное, вагинальное или парентеральное (включая подкожное, внутримышечное, внутривенное, внутрикожное, интратекальное и эпидуральное) введение.Some suitable routes of administration include, but are not limited to, oral, rectal, nasal, topical (including buccal and sublingual), transdermal, vaginal or parenteral (including subcutaneous, intramuscular, intravenous, intradermal, intrathecal and epidural) administration.
В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит изотонический модификатор и/или консервант, предпочтительно изотонический модификатор представляет собой один или более из сахарозы, маннита, хлорида натрия и глицерина, и консервант выбирают из м-крезола, бензилового спирта, мети-n-гидроксибензоата, этил-n-гидроксибензоата, пропил-nгидроксибензоата и бутил-n-гидроксибензоата. Специалисты в данной области способны приготовить растворы, подходящие для слитого белка GLP-1 или конъюгата слитого белка GLP-1 по настоящему изобретению, используя, например, изотонические эксципиенты, такие как физиологический раствор, раствор Рингера для инъекций и лактатный раствор Рингера для инъекций. В соответствии с требованиями также могут быть добавлены стабилизаторы, буферы, антиоксиданты и/или другие добавки. Фармацевтическая композиция для перорального применения может быть в виде таблеток, капсул, порошков или пероральных жидкостей. Таблетки могут содержать твердые носители, такие как желатин или адъюванты. Жидкие фармацевтические композиции обычно включают жидкий носитель, такой как вода, вазелин, животное или растительное масло, минеральное масло или синтетическое масло, и они могут также включать физиологический раствор, глюкозу или другие растворы Сахаров или гликоли, такие как этиленгликоль, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция находится в виде жидкого препарата и/или лиофилизированного препарата. Предпочтительно, лиофилизированный препарат содержит лиопротектор, и более предпочтительно лиопротектор выбран из сахарозы, лактозы, маннита, трегалозы и других сахаров.In some embodiments, the pharmaceutical composition of the present invention contains an isotonic modifier and/or a preservative, preferably the isotonic modifier is one or more of sucrose, mannitol, sodium chloride and glycerol, and the preservative is selected from m-cresol, benzyl alcohol, methyl-n-hydroxybenzoate , ethyl n-hydroxybenzoate, propyl n-hydroxybenzoate and butyl n-hydroxybenzoate. Those skilled in the art are able to prepare solutions suitable for the GLP-1 fusion protein or GLP-1 fusion protein conjugate of the present invention using, for example, isotonic excipients such as saline, Ringer's solution for injection and lactated Ringer's solution for injection. Stabilizers, buffers, antioxidants and/or other additives may also be added as required. The pharmaceutical composition for oral administration may be in the form of tablets, capsules, powders or oral liquids. Tablets may contain solid carriers such as gelatin or adjuvants. Liquid pharmaceutical compositions typically include a liquid carrier such as water, petrolatum, animal or vegetable oil, mineral oil or synthetic oil, and they may also include saline, glucose or other sugar solutions or glycols such as ethylene glycol, propylene glycol or polyethylene glycol. In some embodiments, the pharmaceutical composition is in the form of a liquid preparation and/or a lyophilized preparation. Preferably, the lyophilized preparation contains a lyoprotectant, and more preferably the lyoprotectant is selected from sucrose, lactose, mannitol, trehalose and other sugars.
Слитый белок GLP-1 и/или конъюгат слитого белка GLP-1, описанные здесь, предпочтительно вводят субъекту в терапевтически эффективном количестве или эффективном количестве. Композицию предпочтительно вводят субъекту в терапевтически эффективном количестве, и терапевтически эффективное количество или эффективное количество достаточно, чтобы оказать пользу субъекту. Фактическое введенное количество, а также скорость и продолжительность курса введения будут зависеть от состояния и тяжести заболевания пациента, подлежащего лечению. Назначение лечения (такое как определение дозы) определяется медицинским персоналом, и, как правило, учитывают заболевание, подлежащее лечению, состояние отдельного пациента, место доставки, путь введения и другие факторы, известные врачам.The GLP-1 fusion protein and/or GLP-1 fusion protein conjugate described herein is preferably administered to a subject in a therapeutically effective amount or effective amount. The composition is preferably administered to a subject in a therapeutically effective amount, and the therapeutically effective amount or effective amount is sufficient to provide benefit to the subject. The actual amount administered, as well as the rate and duration of the course of administration, will depend on the condition and severity of the disease of the patient being treated. Treatment assignments (such as dosage determination) are determined by medical personnel and typically take into account the disease being treated, the individual patient's condition, delivery site, route of administration, and other factors known to physicians.
В некоторых воплощениях диапазон дозы слитого белка GLP-1 и/или конъюгата слитого белка GLP-1 может составлять от 30 мг/кг массы тела/сутки до 0,00001 мг/кг массы тела/сутки, от 3 мг/кг/сутки до 0,0001 мг/кг/сутки или от 0,3 мг/кг/сутки до 0,01 мг/кг/сутки.In some embodiments, the dosage range of the GLP-1 fusion protein and/or GLP-1 fusion protein conjugate may be from 30 mg/kg body weight/day to 0.00001 mg/kg body weight/day, from 3 mg/kg/day to 0.0001 mg/kg/day or from 0.3 mg/kg/day to 0.01 mg/kg/day.
В настоящем изобретении также предложен способ лечения заболеваний, включающий введение терапевтически эффективного количества слитого белка GLP-1 и/или конъюгата слитого белка GLP-1 субъекту, нуждающемуся в этом. В некоторых воплощениях заболевание выбрано из группы, состоящей из: постпрандиального демпинг-синдрома, постпрандиальной гипергликемии, нарушения толерантности к глюкозе, ожирения, расстройств пищевого поведения, синдрома инсулинорезистентности, диабета и гипергликемии. В предпочтительном воплощении заболевание представляет собой диабет II типа.The present invention also provides a method for treating diseases comprising administering a therapeutically effective amount of a GLP-1 fusion protein and/or a GLP-1 fusion protein conjugate to a subject in need thereof. In some embodiments, the disease is selected from the group consisting of: postprandial dumping syndrome, postprandial hyperglycemia, impaired glucose tolerance, obesity, eating disorders, insulin resistance syndrome, diabetes, and hyperglycemia. In a preferred embodiment, the disease is type II diabetes.
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими примерами, которые не следует рассматривать как какие-либо дополнительные ограничения. Содержание всех ссылок, приведенных в настоящей заявке (включая ссылки на статьи, выданные патенты, опубликованные патентные заявки и находящиеся на рассмотрении патентные заявки), прямо включено в настоящий документ посредством ссылки. В следующих примерах, если конкретно не указано, используемые реагенты и вещества являются имеющимися в продаже продуктами с по меньшей мере аналитической чистотой или эквивалентными уровнями чистоты.The present invention is further illustrated by the following examples, which should not be construed as further limiting. The contents of all references contained in this application (including references to articles, issued patents, published patent applications and pending patent applications) are expressly incorporated herein by reference. In the following examples, unless specifically noted, the reagents and substances used are commercially available products of at least analytical grade or equivalent levels of purity.
ПримерыExamples
Пример 1. Получение слитого белка GLP-1.Example 1: Preparation of GLP-1 Fusion Protein.
1. Конструирование эукариотического экспрессионного вектора слитого белка GLP-1.1. Construction of a eukaryotic GLP-1 fusion protein expression vector.
Слитый белок GLP-1, конструируемый в этом примере, имеет структуру GLP-1-L1-Fc-L2-ST, где GLP-1 представляет собой различные формы GLP-1 или его аналоги, предпочтительно последовательность GLP-1 является такой же, как дулаглутид (Trulicity™). L1 и L2 представляют собой первый и второй линкеры соответственно, где последовательность L1 представляет собой GGGGSGGGGSGGGGSA, и последовательность L2 представляет собой GGGGSGGGGS, GGGGSGGGGSGGGGS или GSGGGSGGGGSGGGGS, либо L2 отсутствует. Fc представляет Fc-область иммуноглобулина, которая происходит из человеческого IgG2 (также представлен как Fc2 в настоящем изобретении) или IgG4 (так- 13 044650 же представлен как Fc4 в настоящем изобретении). Предпочтительно, Fc-область является такой же, как дулаглутид (Trulicity™), который является вариантом человеческого IgG4 (Fc4). ST представляет собой сайт распознавания сортазы А с ST последовательностью LPETG или LPETGGG.The GLP-1 fusion protein constructed in this example has the structure GLP-1-L1-Fc-L2-ST, where GLP-1 is various forms of GLP-1 or analogs thereof, preferably the sequence of GLP-1 is the same as dulaglutide (Trulicity™). L1 and L2 are the first and second linkers, respectively, where the sequence of L1 is GGGGSGGGGSGGGGSA and the sequence of L2 is GGGGSGGGGS, GGGGSGGGGSGGGGS or GSGGGSGGGGSGGGGS, or L2 is absent. Fc represents an immunoglobulin Fc region that is derived from human IgG2 (also represented as Fc2 in the present invention) or IgG4 (also represented as Fc4 in the present invention). Preferably, the Fc region is the same as dulaglutide (Trulicity™), which is a variant of human IgG4 (Fc4). ST is a sortase A recognition site with the ST sequence LPETG or LPETGGG.
Аминокислотные последовательности разных слитых белков GLP-1 были обратно транслированы в нуклеотидные последовательности в соответствии с предпочтением кодонов для клеток СНО. Полноразмерный фрагмент ДНК слитого белка GLP-1 был получен посредством синтеза целого гена и ПЦРамплификации, и затем клонирован в эукариотический экспрессионный вектор pFRL-DHFR через сайты рестрикции HindIII-EcoRI на обоих концах. Вектор pFRL-DHFR содержал промотор цитомегаловируса человека (промотор hCMV-MIE), SV40 polyA, DHFR (дигидрофолатредуктазу) и другие элементы, которые могут способствовать эффективной и стабильной экспрессии чужеродных генов в эукариотических клетках (фиг. 1А).The amino acid sequences of the different GLP-1 fusion proteins were back translated into nucleotide sequences according to the codon preference of CHO cells. The full-length DNA fragment of the GLP-1 fusion protein was obtained through whole gene synthesis and PCR amplification, and then cloned into the eukaryotic expression vector pFRL-DHFR through HindIII-EcoRI restriction sites at both ends. The pFRL-DHFR vector contained the human cytomegalovirus promoter (hCMV-MIE promoter), SV40 polyA, DHFR (dihydrofolate reductase), and other elements that can promote efficient and stable expression of foreign genes in eukaryotic cells (Fig. 1A).
Таблица 1. Список разных слитых белков GLP-1, сконструированных в ПримереTable 1. List of different GLP-1 fusion proteins constructed in the Example
Таблица 1. Характеристики аминокислотных последовательностей разных слитых белков GLP-1Table 1. Characteristics of the amino acid sequences of various GLP-1 fusion proteins
1. Аминокислотная последовательность GLP1-L1-Fc4-ST1. Amino acid sequence GLP1-L1-Fc4-ST
HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPC PPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGLPETG (SEQ Ш NO: 1) Нуклеотидная последовательность GLP1-L1-Fc4-ST:HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPC PPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPR EPQVYTLP PSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGLPETG (SEQ Ш NO: 1) Nucleotide sequence of GLP1-L1-Fc4-ST:
CACGGCGAGGGCACTTTCACATCCGACGTGTCTAGCTACTTGGAAGAGCAGGCC GCTAAGGAGTTCATCGCTTGGCTCGTGAAGGGAGGTGGTGGTGGAGGTGGATCTGGC GGAGGAGGATCTGGAGGTGGAGGAAGCGCCGAGTCCAAGTACGGACCTCCATGCCC ACCTTGCCCAGCACCAGAGGCCGCTGGCGGCCCATCTGTGTTCCTGTTCCCACCAAA GCCAAAGGACACACTCATGATTAGCCGGACCCCTGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGA CGTGTCTCAGGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGG TGCACAACGCTAAGACCAAGCCACGCGAGGAGCAGTTCAACAGCACATACCGGGTG GTGAGCGTGCTGACTGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTG CAAGGTGTCTAACAAGGGCCTGCCTAGCTCTATTGAAAAGACTATTTCTAAGGCTAAG GGCCAGCCTAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCACCTTCTCAGGAGGAGATGACA AAGAACCAGGTGTCCCTGACTTGCCTCGTGAAGGGCTTCTACCCATCCGACATCGCT GTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACTACTCCTCCAGT GCTCGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAGACTCACAGTGGACAAGTCCCG TTGGCAGGAGGGCAACGTGTTCTCTTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTCCACAACCA CTACACTCAGAAGTCCCTGTCTCTGTCCCTGGGCCTGCCCGAAACTGGG (SEQ Ш NO: 2)CACGGCGAGGGCACTTTCACATCCGACGTGTCTAGCTACTTGGAAGAGCAGGCC GCTAAGGAGTTCATCGCTTGGCTCGTGAAGGGAGGTGGTGGTGGAGGTGGATCTGGC GGAGGAGGATCTGGAGGTGGAGGAAGCGCCGAGTCCAAGTACGGACCTCCATGCCC ACCTTGCCCAGCACCAGAGGCCGCTGGCGGCCCATCTGTGTTCCTGTTCCCACCAAA GCCAAAGGACACACTCATGATT AGCCGGACCCCTGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGA CGTGTCTCAGGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGG TGCACAACGCTAAGACCAAGCCACGCGAGGAGCAGTTCAACAGCACATACCGGGTG GTGAGCGTGCTGACTGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTG CAAGGTGTCTAACAAGGGCCTGCCTAGCTCTAT TGAAAAGACTATTTCTAAGGCTAAG GGCCAGCCTAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCACCTTCTCAGGAGGAGATGACA AAGAACCAGGTGTCCCTGACTTGCCTCGTGAAGGGCTTCTACCCATCCGACATCGCT GTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACTACTCCTCCAGT GCTCGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAGACTCACAGTG GACAAGTCCCG TTGGCAGGAGGGCAACGTGTTCTCTTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTCCACAACCA CTACACTCAGAAGTCCCTGTCTCTGTCCCTGGGCCTGCCCGAAACTGGG (SEQ Ш NO: 2)
- 14 044650- 14 044650
2. Аминокислотная последовательность GLP1-L1-Fc4-L2-ST.2. Amino acid sequence GLP1-L1-Fc4-L2-ST.
HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPC PPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSGGGGSGGGGSL PETG (SEQ ID NO: 3)HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPC PPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPR EPQVYTLP PSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSGGGGSGGGGSL PETG (SEQ ID NO: 3)
Нуклеотидная последовательность GLP1-L1-Fc4-L2-ST:Nucleotide sequence of GLP1-L1-Fc4-L2-ST:
CACGGCGAGGGCACTTTCACATCCGACGTGTCTAGCTACTTGGAAGAGCAGGCC GCTAAGGAGTTCATCGCTTGGCTCGTGAAGGGAGGTGGTGGTGGAGGTGGATCTGGC GGAGGAGGATCTGGAGGTGGAGGAAGCGCCGAGTCCAAGTACGGACCTCCATGCCC ACCTTGCCCAGCACCAGAGGCCGCTGGCGGCCCATCTGTGTTCCTGTTCCCACCAAA GCCAAAGGACACACTCATGATTAGCCGGACCCCTGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGA CGTGTCTCAGGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGG TGCACAACGCTAAGACCAAGCCACGCGAGGAGCAGTTCAACAGCACATACCGGGTG GTGAGCGTGCTGACTGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTG CAAGGTGTCTAACAAGGGCCTGCCTAGCTCTATTGAAAAGACTATTTCTAAGGCTAAG GGCCAGCCTAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCACCTTCTCAGGAGGAGATGACA AAGAACCAGGTGTCCCTGACTTGCCTCGTGAAGGGCTTCTACCCATCCGACATCGCT GTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACTACTCCTCCAGT GCTCGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAGACTCACAGTGGACAAGTCCCG TTGGCAGGAGGGCAACGTGTTCTCTTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTCCACAACCA CTACACTCAGAAGTCCCTGTCTCTGTCCCTGGGCGGAGGTGGCGGCTCTGGAGGCGG AGGTAGTGGTGGCGGCGGTTCACTGCCCGAAACTGGG(SEQ IDNO: 4) 3. Аминокислотная последовательность GLP1-L1-Fc2-L2-ST.CACGGCGAGGGCACTTTCACATCCGACGTGTCTAGCTACTTGGAAGAGCAGGCC GCTAAGGAGTTCATCGCTTGGCTCGTGAAGGGAGGTGGTGGTGGAGGTGGATCTGGC GGAGGAGGATCTGGAGGTGGAGGAAGCGCCGAGTCCAAGTACGGACCTCCATGCCC ACCTTGCCCAGCACCAGAGGCCGCTGGCGGCCCATCTGTGTTCCTGTTCCCACCAAA GCCAAAGGACACACTCATGATT AGCCGGACCCCTGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGA CGTGTCTCAGGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGG TGCACAACGCTAAGACCAAGCCACGCGAGGAGCAGTTCAACAGCACATACCGGGTG GTGAGCGTGCTGACTGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTG CAAGGTGTCTAACAAGGGCCTGCCTAGCTCTAT TGAAAAGACTATTTCTAAGGCTAAG GGCCAGCCTAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCACCTTCTCAGGAGGAGATGACA AAGAACCAGGTGTCCCTGACTTGCCTCGTGAAGGGCTTCTACCCATCCGACATCGCT GTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACTACTCCTCCAGT GCTCGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAGACTCACAGTG GACAAGTCCCG TTGGCAGGAGGGCAACGTGTTCTCTTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTCCACAACCA CTACACTCAGAAGTCCCTGTCTCTGTCCCTGGGCGGAGGTGGCGGCTCTGGAGGCGG AGGTAGTGGTGGCGGCGGTTCACTGCCCGAAACTGGG(SEQ IDNO: 4) 3. Amino acid sequence GLP1-L1-Fc2-L2-ST.
HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGGSGGGGSGGGGSAVECPPCPAP PVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGSGGGSGGGGSGGGGSLPETG (SEQIDNO: 5)HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGGSGGGGSGGGGSAVECPPCPAP PVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLSPGGSGGGSGGGGSGGGGSLPETG (SEQIDNO: 5)
Нуклеотидная последовательность GLP1-L1-Fc2-L2-ST:Nucleotide sequence of GLP1-L1-Fc2-L2-ST:
CACGGCGAGGGAACATTCACCAGCGACGTGTCCAGCTACCTGGAGGAGCAGGC CGCCAAGGAGTTTATCGCCTGGCTCGTGAAAGGAGGCGGCGGCGGAGGAGGTTCTG GCGGCGGCGGCTCCGGCGGAGGCGGATCCGCTGTTGAATGTCCTCCATGTCCAGCTC CACCAGTTGCTGGGCCTTCCGTCTTCCTATTCCCCCCAAAGCCTAAGGACACCCTGAT GATATCTCGTACCCCTGAGGTGACCTGTGTCGTAGTGGATGTGAGTCATGAAGATCCA GAAGTGCAGTTCAACTGGTATGTGGATGGTGTCGAAGTGCATAATGCTAAGACCAAG CCACGAGAGGAGCAGTTTAACTCAACCTTTAGGGTTGTGAGTGTGTTGACTGTCGTC CATCAAGATTGGTTAAACGGTAAAGAATACAAGTGTAAAGTCTCCAACAAGGGATTG CCTGCCCCTATTGAGAAGACCATTTCCAAGACGAAAGGCCAACCACGTGAGCCTCAA GTGTATACTCTACCCCCAAGTCGAGAGGAGATGACTAAGAATCAAGTCTCACTTACGT GTCTTGTCAAAGGTTTCTACCCATCAGACATTGCCGTGGAGTGGGAGTCAAATGGTC AACCCGAGAATAATTATAAGACCACTCCCCCCATGTTAGACTCAGACGGTTCTTTCTT CTTGTACTCTAAACTTACTGTCGACAAATCCCGATGGCAACAAGGCAATGTGTTCTCC TGTTCCGTCATGCACGAGGCCTTACACAATCACTATACCCAGAAATCCTTGTCTTTGTC TCCAGGGGGTTCTGGCGGTGGCTCCGGTGGAGGCGGAAGCGGCGGTGGAGGATCAC TGCCCGAAACTGGG (SEQ ID NO: 6)CACGGCGAGGGAACATTCACCAGCGACGTGTCCAGCTACCTGGAGGAGCAGGC CGCCAAGGAGTTTATCGCCTGGCTCGTGAAAGGAGGCGGCGGCGGAGGAGGTTCTG GCGGCGGCGGCTCCGGCGGAGGCGGATCCGCTGTTGAATGTCCTCCATGTCCAGCTC CACCAGTTGCTGGGCCTTCCGTCTTCCTATTCCCCCCAAAGCCTAAGGACACCCTGAT GATATCTCGTAC CCCTGAGGTGACCTGTGTCGTAGTGGATGTGAGTCATGAAGATCCA GAAGTGCAGTTCAACTGGTATGTGGATGGTGTCGAAGTGCATAATGCTAAGACCAAG CCACGAGAGGAGCAGTTTAACTCAACCTTTAGGGTTGTGAGTGTGTTGACTGTCGTC CATCAAGATTGGTTAAACGGTAAAGAATACAAGTGTAAAGTCTCCAACAAGGATTG CCTGCCCCTATTGAGAAG ACCATTTCCAAGACGAAAGGCCAACCACGTGAGCCTCAA GTGTATACTCTACCCCCAAGTCGAGAGGAGATGACTAAGAATCAAGTCTCACTTACGT GTCTTGTCAAAGGTTTCTACCCATCAGACATTGCCGTGGAGTGGGAGTCAAATGGTC AACCCGAGAATAATTATAAGACCACTCCCCCCATGTTAGACTCAGACGGTTCTTTCTT CTTGTACTCTAAACTTACTGTCGACAAATC CCGATGGCAACAAGGCAATGTGTTCTCC TGTTCCGTCATGCACGAGGCCTTACACAATCACTATACCCAGAAATCCTTGTCTTTGTC TCCAGGGGGTTCTGGCGGTGGCTCCGGTGGAGGCGGAAGCGGCGGTGGAGGATCAC TGCCCGAAACTGGG (SEQ ID NO: 6)
- 15 044650- 15 044650
4. Аминокислотная последовательность GLP1-L1-Fc2-ST.4. Amino acid sequence GLP1-L1-Fc2-ST.
HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGGSGGGGSGGGGSAVECPPCPAP PVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKLPETG (SEQ ID NO: 7) Нуклеотидная последовательность GLP1-L1-Fc2-ST:HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGGSGGGGSGGGGSAVECPPCPAP PVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKLPETG (SEQ ID NO: 7) Nucleotide sequence of GLP1-L1-Fc2-ST:
CACGGCGAGGGAACATTCACCAGCGACGTGTCCAGCTACCTGGAGGAGCAGGC CGCCAAGGAGTTTATCGCCTGGCTCGTGAAAGGAGGCGGCGGCGGAGGAGGTTCTG GCGGCGGCGGCTCCGGCGGAGGCGGATCCGCTGTTGAATGTCCTCCATGTCCAGCTC CACCAGTTGCTGGGCCTTCCGTCTTCCTATTCCCCCCAAAGCCTAAGGACACCCTGAT GATATCTCGTACCCCTGAGGTGACCTGTGTCGTAGTGGATGTGAGTCATGAAGATCCA GAAGTGCAGTTCAACTGGTATGTGGATGGTGTCGAAGTGCATAATGCTAAGACCAAG CCACGAGAGGAGCAGTTTAACTCAACCTTTAGGGTTGTGAGTGTGTTGACTGTCGTC CATCAAGATTGGTTAAACGGTAAAGAATACAAGTGTAAAGTCTCCAACAAGGGATTG CCTGCCCCTATTGAGAAGACCATTTCCAAGACGAAAGGCCAACCACGTGAGCCTCAA GTGTATACTCTACCCCCAAGTCGAGAGGAGATGACTAAGAATCAAGTCTCACTTACGT GTCTTGTCAAAGGTTTCTACCCATCAGACATTGCCGTGGAGTGGGAGTCAAATGGTC AACCCGAGAATAATTATAAGACCACTCCCCCCATGTTAGACTCAGACGGTTCTTTCTT CTTGTACTCTAAACTTACTGTCGACAAATCCCGATGGCAACAAGGCAATGTGTTCTCC TGTTCCGTCATGCACGAGGCCTTACACAATCACTATACCCAGAAATCCTTGTCTTTGTC TCCAGGGAAACTGCCCGAAACTGGG (SEQ ID NO: 8)CACGGCGAGGGAACATTCACCAGCGACGTGTCCAGCTACCTGGAGGAGCAGGC CGCCAAGGAGTTTATCGCCTGGCTCGTGAAAGGAGGCGGCGGCGGAGGAGGTTCTG GCGGCGGCGGCTCCGGCGGAGGCGGATCCGCTGTTGAATGTCCTCCATGTCCAGCTC CACCAGTTGCTGGGCCTTCCGTCTTCCTATTCCCCCCAAAGCCTAAGGACACCCTGAT GATATCTCGTAC CCCTGAGGTGACCTGTGTCGTAGTGGATGTGAGTCATGAAGATCCA GAAGTGCAGTTCAACTGGTATGTGGATGGTGTCGAAGTGCATAATGCTAAGACCAAG CCACGAGAGGAGCAGTTTAACTCAACCTTTAGGGTTGTGAGTGTGTTGACTGTCGTC CATCAAGATTGGTTAAACGGTAAAGAATACAAGTGTAAAGTCTCCAACAAGGATTG CCTGCCCCTATTGAGAAG ACCATTTCCAAGACGAAAGGCCAACCACGTGAGCCTCAA GTGTATACTCTACCCCCAAGTCGAGAGGAGATGACTAAGAATCAAGTCTCACTTACGT GTCTTGTCAAAGGTTTCTACCCATCAGACATTGCCGTGGAGTGGGAGTCAAATGGTC AACCCGAGAATAATTATAAGACCACTCCCCCCATGTTAGACTCAGACGGTTCTTTCTT CTTGTACTCTAAACTTACTGTCGACAAATC CCGATGGCAACAAGGCAATGTGTTCTCC TGTTCCGTCATGCACGAGGCCTTACACAATCACTATACCCAGAAATCCTTGTCTTTGTC TCCAGGGAAACTGCCCGAAACTGGG (SEQ ID NO: 8)
5. Аминокислотная последовательность GLP1-L1-Fc4-L2-STG3.5. Amino acid sequence GLP1-L1-Fc4-L2-STG3.
HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPC PPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSGGGGSLPETGG G (SEQ ID NO: 22)HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPC PPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPR EPQVYTLP PSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSGGGGSLPETGG G (SEQ ID NO: 22)
Нуклеотидная последовательность GLP1-L1-Fc4-L2-STG3:Nucleotide sequence of GLP1-L1-Fc4-L2-STG3:
CACGGCGAGGGCACTTTCACATCCGACGTGTCTAGCTACTTGGAAGAGCAGGCCGCT AAGGAGTTCATCGCTTGGCTCGTGAAGGGAGGTGGTGGTGGAGGTGGATCTGGCGG AGGAGGATCTGGAGGTGGAGGAAGCGCCGAGTCCAAGTACGGACCTCCATGCCCAC CTTGCCCAGCACCAGAGGCCGCTGGCGGCCCATCTGTGTTCCTGTTCCCACCAAAGC CAAAGGACACACTCATGATTAGCCGGACCCCTGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGACG TGTCTCAGGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTG CACAACGCTAAGACCAAGCCACGCGAGGAGCAGTTCAACAGCACATACCGGGTGGT GAGCGTGCTGACTGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCA AGGTGTCTAACAAGGGCCTGCCTAGCTCTATTGAAAAGACTATTTCTAAGGCTAAGGG CCAGCCTAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCACCTTCTCAGGAGGAGATGACAAA GAACCAGGTGTCCCTGACTTGCCTCGTGAAGGGCTTCTACCCATCCGACATCGCTGTG GAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACTACTCCTCCAGTGCT CGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAGACTCACAGTGGACAAGTCCCGTTG GCAGGAGGGCAACGTGTTCTCTTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTCCACAACCACTA CACTCAGAAGTCCCTGTCTCTGTCCCTGGGCGGAGGAGGTGGATCTGGTGGAGGCGG ATCTCTGCCCGAAACTGGGGGTGGA (SEQ ID NO: 23)CACGGCGAGGGCACTTTCACATCCGACGTGTCTAGCTACTTGGAAGAGCAGGCCGCT AAGGAGTTCATCGCTTGGCTCGTGAAGGGAGGTGGTGGTGGAGGTGGATCTGGCGG AGGAGGATCTGGAGGTGGAGGAAGCGCCGAGTCCAAGTACGGACCTCCATGCCCAC CTTGCCCAGCACCAGAGGCCGCTGGCGGCCCATCTGTGTTCCTGTTCCCACCAAAGC CAAAGGACACACTCAT GATTAGCCGGACCCCTGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGACG TGTCTCAGGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTG CACAACGCTAAGACCAAGCCACGCGAGGAGCAGTTCAACAGCACATACCGGGTGGT GAGCGTGCTGACTGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCA AGGTGTCTAACAAGGGCCTGCCTAG CTCTATTGAAAAGACTATTTCTAAGGCTAAGGG CCAGCCTAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCACCTTCTCAGGAGGAGATGACAAA GAACCAGGTGTCCCTGACTTGCCTCGTGAAGGGCTTCTACCCATCCGACATCGCTGTG GAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACTACTCCTCCAGTGCT CGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAGACTCACAG TGGACAAGTCCCGTTG GCAGGAGGGCAACGTGTTCTCTTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTCCACAACCACTA CACTCAGAAGTCCCTGTCTCTGTCCCTGGGCGGAGGAGGTGGATCTGGTGGAGGCGG ATCTCTGCCCGAAACTGGGGGTGGA (SEQ ID NO: 23)
2. Скрининг и ферментация стабильных клеточных линий.2. Screening and fermentation of stable cell lines.
2.1. Скрининг стабильных клеточных линий.2.1. Screening of stable cell lines.
- 16 044650- 16 044650
Каждую сконструированную выше плазмиду трансфицировали в клетку-хозяина СНО DG44 посредством электротрансфекции с плотностью клеток 6x106 клетки/мл, в объеме 0,8 мл и с количеством плазмиды 40 мкг. Плазмиду и клетки осторожно перемешивали, а затем добавляли в электропорационные кюветы (Bio-Rad, 4 мм). Электропоратор, используемый здесь, был от Bio-Rad (GENE PULSER XCELL), и параметры электропорации были следующими: напряжение 290 В и длительность импульса 20 мс.Each plasmid constructed above was transfected into a CHO DG44 host cell by electrotransfection at a cell density of 6x106 cells/ml, in a volume of 0.8 ml and with a plasmid amount of 40 μg. The plasmid and cells were mixed gently and then added to electroporation cuvettes (Bio-Rad, 4 mm). The electroporator used here was from Bio-Rad (GENE PULSER XCELL), and the electroporation parameters were as follows: voltage 290 V and pulse duration 20 ms.
После электропорации клетки переносили в чашки Петри, содержащие 15 мл восстановительной среды, на 48 ч культивирования и затем инокулировали в 96-луночные планшеты со средой для скрининга, содержащей 50 нМ МТХ (метотрексат). Когда конфлюентность клеток достигала более 50%, в клеточных линиях проводили скрининг на высокую экспрессию посредством метода дот-блоттинг с использованием козлиных античеловеческих IgG Fc. Отобранные клоны с относительно высокими уровнями экспрессии последовательно переносили на 24-луночные планшеты, 6-луночные планшеты, колбы для культивирования клеток Т25 и колбы для встряхивания клеточных культур для размножения.After electroporation, cells were transferred to Petri dishes containing 15 ml of reducing medium for 48 h of culture and then inoculated into 96-well plates with screening medium containing 50 nM MTX (methotrexate). When cell confluency reached more than 50%, the cell lines were screened for high expression by dot blot analysis using goat anti-human IgG Fc. Selected clones with relatively high expression levels were sequentially transferred to 24-well plates, 6-well plates, T25 cell culture flasks, and cell culture shake flasks for expansion.
Чтобы увеличить выход слитого белка, клетки культивировали под давлением с увеличением концентрации метотрексата. С помощью ингибирования гена DHFR метотрексатом была реализована коамплификация гена DHFR и гена слитого белка.To increase the yield of the fusion protein, cells were cultured under pressure with increasing concentrations of methotrexate. By inhibiting the DHFR gene with methotrexate, coamplification of the DHFR gene and the fusion protein gene was achieved.
2.2. Ферментация.2.2. Fermentation.
Клетки инокулировали в объем 8 л и с плотностью 0,8-1,6x106 клеток/мл в 15 л биореактор (Applikon, Biobundle 15L). Параметры культивирования были установлены следующим образом: рН 6,95±0,15, DO 45%, подача кислорода: большая пузырьковая вентиляция, и скорость вращения: 80-140 об-мин. При плотности клеток примерно 10-12x106 клеток/мл на 5-е сутки культивирования, температуру культивирования снижали до 33°C. Питание начинали с четвертых суток культивирования, и остаточное содержание глюкозы измеряли каждые сутки. Сахар добавляли до достижения концентрации 3 г/л каждые сутки до понижения температуры и 4 г/л после понижения температуры. Во время культивирования количество клеток и жизнеспособность измеряли каждые сутки. На 13-е сутки клетки собирали, когда жизнеспособность составляла примерно 90%.Cells were inoculated in a volume of 8 L and at a density of 0.8-1.6 x 106 cells/ml in a 15 L bioreactor (Applikon, Biobundle 15L). The culture parameters were set as follows: pH 6.95±0.15, DO 45%, oxygen supply: high bubble ventilation, and rotation speed: 80-140 rpm. At a cell density of approximately 10-12x106 cells/ml on the 5th day of cultivation, the culture temperature was reduced to 33°C. Feeding began on the fourth day of cultivation, and the residual glucose content was measured every day. Sugar was added until a concentration of 3 g/l was reached every day before the temperature was lowered and 4 g/l after the temperature was lowered. During cultivation, cell number and viability were measured every day. On day 13, cells were harvested when viability was approximately 90%.
На фиг. 1В-4 показана кривая роста, жизнеспособность клеток, результаты микроскопического исследования и различные параметры процесса для стабильной клеточной линии GLP1-L1-Fc2-L2-ST (номер клона: P1-3G3C2) во время фермантации. Как видно из фиг. 1В, на девятые сутки ферментации плотность клеток была самой высокой и составляла 20,5х106/мл, и на 13-е сутки, когда клетки собирали, плотность клеток составляла 15,5х106/мл и жизнеспособность клеток составляла 86,6%. Микроскопические исследования показали, что морфология клеток была хорошей без явных мертвых клеток (фиг. 2А и фиг. 2В). На фиг. 3 и фиг. 4 показан метаболизм глюкозы, NH4+ и молочной кислоты (Lac) во время ферментации.In fig. 1B-4 shows the growth curve, cell viability, microscopic examination results and various process parameters for the stable cell line GLP1-L1-Fc2-L2-ST (clone number: P1-3G3C2) during fermentation. As can be seen from Fig. 1B, on the ninth day of fermentation, the cell density was highest at 20.5 x 10 6 /ml, and on the 13th day, when the cells were harvested, the cell density was 15.5 x 10 6 /ml and the cell viability was 86.6%. Microscopic examination showed that cell morphology was good with no obvious dead cells (Fig. 2A and Fig. 2B). In fig. 3 and fig. Figure 4 shows the metabolism of glucose, NH4+ and lactic acid (Lac) during fermentation.
На фиг. 11-14 показана кривая роста, жизнеспособность клеток, результаты микроскопических исследований и различные параметры процесса для GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 во время ферментации с подпиткой. Из фиг. 11В видно, что на 8 сутки ферментации клеточная плотность была самой большой и составляла 19,9x106 клеток/мл, и на 14-е сутки, когда клетки собирали, плотность клеток составляла 16,0x106 клеток/мл и жизнеспособность клеток составляла 92%. Микроскопические исследования показали, что морфология клеток была хорошей без явных мертвых клеток (фиг. 12А и фиг. 12В). На фиг. 13 и фиг. 14 показан метаболизм глюкозы и изменения рН во время ферментации.In fig. 11-14 show the growth curve, cell viability, microscopic results and various process parameters for GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 during fed-batch fermentation. From fig. 11B shows that on the 8th day of fermentation, the cell density was the highest at 19.9 x 106 cells/ml, and on the 14th day, when the cells were harvested, the cell density was 16.0 x 106 cells/ml and the cell viability was 92%. Microscopic examination showed that cell morphology was good with no obvious dead cells (Fig. 12A and Fig. 12B). In fig. 13 and fig. Figure 14 shows glucose metabolism and pH changes during fermentation.
Содержание белка GLP1-L1-Fc2-L2-ST в ферментационном супернатанте составляло 1,8 г/л и содержание GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 составляло 1,19 г/л согласно определению инструментом с молекулярным взаимодействием (Pall Life Science, Qke). SDS-PAGE электрофорез использовали для определения целостности белка GLP1-L1-Fc2-L2-ST. GLP1-L1-Fc2-L2-ST представляет собой слитый белок Fc с двойной цепью с молекулярной массой 61,6 кДа (без сахарных цепочек). Как показано на фиг. 5, молекулярная масса GLP1-L1-Fc2-L2-ST была в основном такой же, как теоретическая молекулярная масса в невосстановленном и восстановленном состоянии. В то же время SDS-PAGE электрофорез использовали для определения изменений белка GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 (фиг. 15). Видно, что выход целевого белка значительно увеличился с 12 по 14-ые сутки культивирования и в супернатанте целевой белок составлял большинство, и оставалось только небольшое количество примеси. Экспрессированный белок был идентифицирован методом ELISA (иммуносорбентный анализ), и результат был положительным.The protein content of GLP1-L1-Fc2-L2-ST in the fermentation supernatant was 1.8 g/L and the content of GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 was 1.19 g/L as determined by a molecular interaction tool (Pall Life Science, Qke). SDS-PAGE electrophoresis was used to determine the integrity of the GLP1-L1-Fc2-L2-ST protein. GLP1-L1-Fc2-L2-ST is a double chain Fc fusion protein with a molecular weight of 61.6 kDa (no sugar chains). As shown in FIG. 5, the molecular weight of GLP1-L1-Fc2-L2-ST was basically the same as the theoretical molecular weight of the unreduced and reduced states. At the same time, SDS-PAGE electrophoresis was used to determine the changes in the GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 protein (Fig. 15). It can be seen that the yield of the target protein increased significantly from the 12th to the 14th day of cultivation and in the supernatant the target protein constituted the majority, and only a small amount of impurity remained. The expressed protein was identified by ELISA (linked immunosorbent assay) and the result was positive.
2.3. Очистка и определение.2.3. Purification and determination.
GLP1-L1-Fc2-L2-ST и GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 в супернатанте ферментационного бульона очищали в две стадии: с помощью аффинной хроматографии (Uni mab, NanoMicro) и анионообменной хроматографии (QHP, BXK). Очищенный белок определяли с помощью SDS-PAGE и SEC. Согласно результатам SDS-PAGE (фиг. 6А и фиг. 16А), размер целевого белка был в основном таким же, как теоретическая молекулярная масса. SEC выполняли на Agilent Advancebio SEC 300A, 2,7 мкм, 7,8x300 мм колонка, градиентное элюирование проводили с использованием 50 мМ Tris + 150 мМ NaCl + 10% ацетонитрил, рН 7,0 (температура колонки: 30°C, скорость потока: 0,5 мл/мин, температура инжектора образца: 4,0°C, объем инжектора образца: 50 мкг, и время анализа образца: 35 мин). На фиг. 6В видно, что время удер- 17 044650 живания белка GLP1-L1-Fc2-L2-ST составляло 14,6 мин, и чистота после двухступенчатой очистки составляла 97,2%. На фиг. 16В видно, что время удерживания белка GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 составлялоGLP1-L1-Fc2-L2-ST and GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 in the fermentation broth supernatant were purified in two steps: affinity chromatography (Uni mab, NanoMicro) and anion exchange chromatography (QHP, BXK). Purified protein was determined by SDS-PAGE and SEC. According to the SDS-PAGE results (Fig. 6A and Fig. 16A), the size of the target protein was essentially the same as the theoretical molecular weight. SEC was performed on an Agilent Advancebio SEC 300A, 2.7 µm, 7.8 x 300 mm column, gradient elution was performed using 50 mM Tris + 150 mM NaCl + 10% acetonitrile, pH 7.0 (column temperature: 30°C, flow rate : 0.5 ml/min, sample injector temperature: 4.0°C, sample injector volume: 50 μg, and sample analysis time: 35 min). In fig. 6B shows that the retention time of the GLP1-L1-Fc2-L2-ST protein was 14.6 minutes, and the purity after two-step purification was 97.2%. In fig. 16B shows that the retention time of the GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 protein was
14,49 мин, и чистота после двухступенчатой очистки составляла 98,412%.14.49 min, and the purity after two-step purification was 98.412%.
Пример 2. Связывание 20 и 40 кДа PEG со слитым белком GLP1-Fc.Example 2. Binding of 20 and 40 kDa PEG to GLP1-Fc fusion protein.
С-концы всех сконструированных слитых белков GLP1-Fc содержали коровую последовательность распознавания LPETG сортазы А, которая может быть специфически распознана сортазой А. Под действием сортазы А, амидная связь между Т и G была разорвана и Т реагировал с сульфгидрильной группой С в положении сортазы 184 с образованием промежуточной тиоэфирной связи, которую затем атаковали GGGAA-PEG с poly-Gly на N-конце. Наконец, PEG с разной молекулярной массой связывали с С-концом белка.The C-termini of all constructed GLP1-Fc fusion proteins contained the core LPETG recognition sequence of sortase A, which can be specifically recognized by sortase A. Under the action of sortase A, the amide bond between T and G was broken and T reacted with the sulfhydryl group of C at sortase position 184 to form a thioester bond intermediate, which was then attacked by GGGAA-PEG with poly-Gly at the N-terminus. Finally, PEGs of different molecular weights were bound to the C-terminus of the protein.
Системы реакции пегилирования белков GLP1-L1-Fc2-L2-ST и GLP1-L1-Fc2-ST были следующими: 20 или 40 кДа GGGAA-PEG (GGGAA был приобретен у Shanghai GL Biochem Co., Ltd., a 20 или 40 кДа GGGAA-PEG был синтезирован Beijing JenKem Technology Co., Ltd.) растворяли в буферном растворе и доводили рН до 8,0, и затем белок добавляли к буферной системе 50 мМ Tris, 150 мМ NaCl, рН 8,0 при соотношении питания 1:15 и 1:10 соответственно. Затем добавляли сортазу А и 10 мМ CaCl2. Отбор проб проводили в разные моменты времени реакции, и через 90 мин добавляли ЭДТА, чтобы остановить реакцию.The PEGylation reaction systems for the GLP1-L1-Fc2-L2-ST and GLP1-L1-Fc2-ST proteins were as follows: 20 or 40 kDa GGGAA-PEG (GGGAA was purchased from Shanghai GL Biochem Co., Ltd., a 20 or 40 kDa GGGAA-PEG was synthesized by Beijing JenKem Technology Co., Ltd.) was dissolved in a buffer solution and adjusted to pH 8.0, and then the protein was added to a buffer system of 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8.0 at a feeding ratio of 1: 15 and 1:10 respectively. Then sortase A and 10 mM CaCl 2 were added. Sampling was carried out at different reaction times, and EDTA was added after 90 min to stop the reaction.
Система реакции пегилирования белка GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 была следующей: 40 кДа GGGAAPEG (GGGAA приобретали у Shanghai GL Biochem Co., Ltd., и 40 кДа GGGAA-PEG синтезировали в Beijing JenKem Technology Co., Ltd.) растворяли в буферном растворе и доводили рН до 7,0 и затем добавляли белок и PEG к буферной системе 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl, рН 7,0 при соотношении питания 1:15 (молярное соотношение). Затем добавляли сортазу А и CaCl2 (10 мм), 50 ME фермента на мг целевого белка, и конечная концентрация целевого белка составляла 6 мг/мл. Через 30 мин добавляли ЭДТА, чтобы остановить реакцию.The GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 protein PEGylation reaction system was as follows: 40 kDa GGGAAPEG (GGGAA was purchased from Shanghai GL Biochem Co., Ltd., and 40 kDa GGGAA-PEG was synthesized from Beijing JenKem Technology Co., Ltd.) was dissolved in a buffer solution and adjusted the pH to 7.0 and then added protein and PEG to a buffer system of 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.0 at a feed ratio of 1:15 (molar ratio). Sortase A and CaCl 2 (10 mM) were then added, 50 IU of enzyme per mg of target protein, and the final concentration of target protein was 6 mg/ml. After 30 min, EDTA was added to stop the reaction.
Вышеупомянутые продукты после связывания анализировали с помощью SDS-PAGE и обращённофазовой хроматографии (RPC) для определения уровня связывания (уровень сшивания). Одиночное сшивание означает, что только один мономер димера слитого белка связан с PEG, а двойное сшивание означает, что оба мономера димера слитого белка связаны с PEG. Тест посредством обращенной фазовой хроматографии проводили на Waters Xbridge®protein ВЕН С4, 3,5 мкм, 4,6x250 мм хроматографической колонке с градиентным элюированием 0,1% TFA вода и 0,1% TFA ацетонитрил, в условиях: температура колонки 50°C, длина волны обнаружения 280 нм, скорость потока 0,5 мл/мин, температура инжектора образца 4,0°C, объем инжектора образца 20 мкг и время анализа образца 50 мин. Результаты тестирования белков GLP1-L1-Fc2-L2-ST и GLP1-L1-Fc2-ST показаны на фиг. 7. По мере увеличения времени реакции продукты пегилирования с 20 или 40 кДа PEG постепенно увеличивались. Через 90 мин продукты пегилирования достигали максимума, и реакцию прекращали, и в это время общий уровень сшивки белка GLP1-L1-Fc2-L2-ST с 20 кДа PEG составлял 75,62%, из которых однократная сшивка составляла 55,57%, а двойная 20,05%. Общий уровень сшивки белка GLP1-L1-Fc2-L2-ST с 40 кДа PEG составлял 40,15%, из которых одинарная сшивка составляла 36,36%, а двойная 3,79%. Общий уровень сшивки белка GLP1-L1-Fc2-ST с 40% PEG составлял 60,83%, из которых одинарная скорость сшивки составила 48,46%, а двойная 12,37%. Из результатов сшивки с 40 кДа PEG видно, что при тех же условиях реакции эффективность сшивки GLP1-L1-Fc2-ST была значительно выше, чем у GLP1-L1-Fc2-L2-ST.The above products, after binding, were analyzed by SDS-PAGE and reverse phase chromatography (RPC) to determine the level of binding (cross-linking level). Single cross-linking means that only one monomer of the fusion protein dimer is bound to PEG, and double cross-linking means that both monomers of the fusion protein dimer are bound to PEG. The reverse phase chromatography test was performed on a Waters Xbridge®protein BEH C4, 3.5 µm, 4.6x250 mm chromatography column with a gradient elution of 0.1% TFA water and 0.1% TFA acetonitrile, under conditions: column temperature 50°C , detection wavelength 280 nm, flow rate 0.5 mL/min, sample injector temperature 4.0 °C, sample injector volume 20 μg, and sample analysis time 50 min. The results of testing the GLP1-L1-Fc2-L2-ST and GLP1-L1-Fc2-ST proteins are shown in FIG. 7. As the reaction time increased, the PEGylation products with 20 or 40 kDa PEG gradually increased. After 90 min, the PEGylation products reached a maximum and the reaction was stopped, at which time the total level of cross-linking of the GLP1-L1-Fc2-L2-ST protein with 20 kDa PEG was 75.62%, of which single cross-linking was 55.57%, and double 20.05%. The overall level of cross-linking of the GLP1-L1-Fc2-L2-ST protein with 40 kDa PEG was 40.15%, of which single cross-linking was 36.36% and double cross-linking was 3.79%. The overall cross-linking rate of GLP1-L1-Fc2-ST protein with 40% PEG was 60.83%, of which single cross-linking rate was 48.46% and double cross-linking rate was 12.37%. From the results of cross-linking with 40 kDa PEG, it can be seen that under the same reaction conditions, the cross-linking efficiency of GLP1-L1-Fc2-ST was significantly higher than that of GLP1-L1-Fc2-L2-ST.
Результаты теста белка GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 показаны на фиг. 17. По мере увеличения времени реакции 40 кДа-пегилирование продукта постепенно увеличивалось. Через 30 мин продукт пегилирования достигал максимума и реакция была прекращена, и в это время общий уровень сшивки белка GLP1L1-Fc4-L2-STG3 с 40 кДа PEG составлял 80,86%, из них одинарная сшивка составляла 44,087% с временем пика 10,543 мин, а двойная сшивка 36,782% с пиковым временем 9,698 мин.The results of the GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 protein test are shown in FIG. 17. As the reaction time increased, the 40 kDa PEGylation of the product gradually increased. After 30 min, the PEGylation product reached its maximum and the reaction was stopped, and at this time the overall level of cross-linking of the GLP1L1-Fc4-L2-STG3 protein with 40 kDa PEG was 80.86%, of which single cross-linking accounted for 44.087% with a peak time of 10.543 min. and double cross-linking is 36.782% with a peak time of 9.698 min.
Очистка и обнаружение после сшивания.Cleaning and detection after cross-linking.
После сшивания с 40 кДа PEG, GLP1-L1-Fc2-L2-ST подвергали Butyl HP гидрофобной хроматографии для удаления непрореагировавшего GGGAA-PEG и сортазы А, и анионообменной хроматографии для удаления несшитого субстратного белка, для контроля остаточного количества субстрата в пределах 1%. Как показано на фиг. 8А, GLP1-L1-Fc2-L2-ST, сшитый с 40 кДа PEG, можно разделить на два пика Р1 и Р2 с помощью анионообменной хроматографии. Результаты теста RPC показывают (фиг. 8В), что пик Р1 соответствует, в основном, двойным сшитым продуктам (двойной сшитый продукт 90,84%, одиночный сшитый продукт 8,4%, субстрат 0,15%), а Р2 пик соответствует, в основном, одиночным сшитым продуктам (двойной сшитый продукт 8,56%, одиночный сшитый продукт 90,12%, субстрат 0,73%). Время удерживания несшитого GLP1-L1-Fc2-L2-ST составляло 17,3 мин, а время удерживания одиночных и двойных сшитых продуктов составляло 22,5 и 23,2 мин, соответственно.After cross-linking with 40 kDa PEG, GLP1-L1-Fc2-L2-ST was subjected to Butyl HP hydrophobic chromatography to remove unreacted GGGAA-PEG and sortase A, and anion exchange chromatography to remove uncross-linked substrate protein, to control the residual amount of substrate within 1%. As shown in FIG. 8A, GLP1-L1-Fc2-L2-ST cross-linked with 40 kDa PEG can be separated into two peaks P1 and P2 by anion exchange chromatography. The results of the RPC test show (Fig. 8B) that peak P1 corresponds mainly to double cross-linked products (double cross-linked 90.84%, single cross-linked 8.4%, substrate 0.15%), and peak P2 corresponds to mainly single cross-linked products (double cross-linked product 8.56%, single cross-linked product 90.12%, substrate 0.73%). The retention time of uncrosslinked GLP1-L1-Fc2-L2-ST was 17.3 min, and the retention time of single and double cross-linked products was 22.5 and 23.2 min, respectively.
После сшивания с 40 кДа PEG, GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 можно разделить на одиночные сшитые, двойные сшитые и субстраты посредством анионообменной хроматографии (SuperQ 5PW, TOSOH). Хроматограмма показана на фиг. 18А. Согласно результатам теста посредством SEC (гель-проникающая хроматография) (фиг. 18В и С), пик Р1 был, в основном, двойным сшитым продуктом (двойной сшитый продукт составлял 97,172%, одиночный сшитый продукт 2,766%, субстрат 0%), а Р2 пик был, главнымAfter cross-linking with 40 kDa PEG, GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 can be separated into single cross-linked, double cross-linked and substrates by anion exchange chromatography (SuperQ 5PW, TOSOH). The chromatogram is shown in Fig. 18A. According to the results of the SEC (gel permeation chromatography) test (Fig. 18B and C), peak P1 was mainly double cross-linked product (double cross-linked product was 97.172%, single cross-linked product was 2.766%, substrate was 0%), and P2 the peak was the main one
- 18 044650 образом, одиночным сшитым продуктом (двойной сшитый продукт составлял 19,722%, одиночный сшитый продукт 79,754%, субстрат 0,158%). Время удерживания одиночных и двойных сшитых продуктов составляло 10,63 и 9,8 мин соответственно.- 18 044650 way, single cross-linked product (double cross-linked product was 19.722%, single cross-linked product 79.754%, substrate 0.158%). The retention times of single and double cross-linked products were 10.63 and 9.8 min, respectively.
Пример 3. Определение активности сшитого белка GLP1-L1-Fc2-L2-ST.Example 3. Determination of the activity of the cross-linked protein GLP1-L1-Fc2-L2-ST.
GLP-1 может активировать аденилатциклазу (АЦ) посредством связывания с рецептором GLP-1 (GLP-1R) с получением цАМФ, а цАМФ дополнительно активирует цАМФ-зависимый транскрипционный фактор, то есть элемент ответа цАМФ активирующего белка (CREB), который активирует транскрипцию ниже расположенных генов после связывания с элементом ответа цАМФ (CRE).GLP-1 can activate adenylate cyclase (AC) by binding to the GLP-1 receptor (GLP-1R) to produce cAMP, and cAMP further activates a cAMP-dependent transcription factor, i.e., cAMP activating protein response element (CREB), which activates downstream transcription located genes after binding to the cAMP response element (CRE).
Определение в этом примере включает следующие стадии: клетки HEK293/CRE-Luc/GLP1R (приобретали у GenScript, #M00562) культивировали до логарифмической фазы роста, переваривали трипсином и ресуспендировали в полной среде с доведением плотности клеток до 1x106 клеток/мл, а затем клетки добавляли в белые 96-луночные планшеты, 50 мкл/лунка. Дулаглутид и тестируемое вещество разбавляли полной средой до 400 нг/мл и затем разбавляли в 4-кратном соотношении с получением в общей сложности 9 градиентов и затем добавляли к клеткам, 50 мкл/лунка. Клетки инкубировали при 37°C, 5% CO2 в течение 5 ч. Позднее добавляли люциферазу Bright-Glo Luciferase (promega) по 100 мкл в лунку и защищали от света в течение 10 мин. Для измерения величины флуоресценции использовался полнополосный считыватель флуоресцентных микропланшетов (TECAN, 200PRO).The determination in this example involves the following steps: HEK293/CRE-Luc/GLP1R cells (purchased from GenScript, #M00562) were cultured to logarithmic growth phase, trypsinized and resuspended in complete medium to bring the cell density to 1x106 cells/ml, and then the cells added to white 96-well plates, 50 µl/well. Dulaglutide and test substance were diluted with complete medium to 400 ng/ml and then diluted 4-fold for a total of 9 gradients and then added to the cells, 50 μl/well. Cells were incubated at 37°C, 5% CO 2 for 5 hours. Later, Bright-Glo Luciferase (promega) was added at a dose of 100 μl per well and protected from light for 10 minutes. A full-band fluorescence microplate reader (TECAN, 200PRO) was used to measure the fluorescence value.
Данные обрабатывали в соответствии с четырехпараметрическим уравнением с помощью программного обеспечения Softmax analysis, при этом значения флуоресценции стандартных и тестируемых веществ были ординатами, а логарифмическое значение концентраций было абсциссами. Относительную активность исследуемого вещества рассчитывали согласно следующему уравнению:The data were processed according to a four-parameter equation using Softmax analysis software, with the fluorescence values of standard and test substances being the ordinate and the logarithmic value of the concentrations being the abscissa. The relative activity of the test substance was calculated according to the following equation:
ЕС50 стандартного веществаEU 50 standard substance
Относительная активность тестируемого вещества= ___Relative activity of test substance = ___
ЕС50 тестируемого веществаEC50 of test substance
На фиг. 9 показаны результаты теста активности GLP1-L1-Fc2-L2-ST, сшитого с 20 и 40 кДа PEG соответственно. По сравнению с дулаглутидом относительная активность несшитого субстрата (GLP1Fc) составляла 98,10%. Активность обоих PEG-сшитых продуктов уменьшалась, когда относительная активность продукта, сшитого с 20 кДа PEG (указанного как PEG (20 кДа)-GLP1-Fc на фигуре) составляла 40,38% и относительная активность 40 кДа сшитого продукта (указанного как PEG (40 кДа)-GLP1-Fc на фигуре) составляла 32,85%.In fig. 9 shows the results of the GLP1-L1-Fc2-L2-ST activity assay cross-linked with 20 and 40 kDa PEG, respectively. Compared to dulaglutide, the relative activity of the non-crosslinked substrate (GLP1Fc) was 98.10%. The activity of both PEG-cross-linked products decreased when the relative activity of the 20 kDa PEG cross-linked product (indicated as PEG (20 kDa)-GLP1-Fc in the figure) was 40.38% and the relative activity of the 40 kDa cross-linked product (indicated as PEG ( 40 kDa)-GLP1-Fc in the figure) was 32.85%.
На фиг. 19 показаны результаты теста активности GLP1-L1-Fc4-L2-STG3, сшитого с 40 кДа PEG. Аналогично PEG-конъюгированному GLP1-L1-Fc2-L2-ST, по сравнению с дулаглутидом, активность 40 кДа PEG-конъюгированного GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 (указанного как PEG (40 кДа)-GLP1-Fc) на фигуре) была снижена, с относительной активностью 21,51%.In fig. 19 shows the results of the GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 activity assay cross-linked with 40 kDa PEG. Similar to PEG-conjugated GLP1-L1-Fc2-L2-ST, compared to dulaglutide, the activity of 40 kDa PEG-conjugated GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 (indicated as PEG (40 kDa)-GLP1-Fc) in the figure) was reduced, with a relative activity of 21.51%.
Пример 4. In vivo гипогликемическая активность слитого белка GLP-1 или его PEG конъюгата.Example 4 In vivo hypoglycemic activity of a GLP-1 fusion protein or its PEG conjugate.
C57BL/6 мыши (приобретенные у Beijing Vital River Co., Ltd.) выращивали по 5 мышей в клетке, кормили нормальным мышиным кормом и питьевой водой в свободном доступе. Светлое время составляло 12 ч (08:00am-20:00pm), а темное время составляло 12 ч (20:00pm-08:00am).C57BL/6 mice (purchased from Beijing Vital River Co., Ltd.) were raised 5 mice per cage and fed normal mouse chow and drinking water ad libitum. Light time was 12 hours (08:00am-20:00pm) and dark time was 12 hours (20:00pm-08:00am).
(1) Экспериментальные результаты для GLP1-L1-Fc2-L2-ST.(1) Experimental results for GLP1-L1-Fc2-L2-ST.
здоровых самцов мышей C57BL/6 в возрасте 6-8 недель были разделены на 5 групп по 8 мышей в каждой. Эти группы включали: (1) группу GLP1-Fc (GLP-1-L1-Fc2-L2-ST субстрата до сшивания); (2) группу дулаглутида; (3) группу 40 кДа PEG GLP1-Fc (GLP-1-L1-Fc2-L2-ST, сшитую с 40 кДа PEG); (4) группу 20 кДа PEG GLP1-Fc (GLP-1-L1-Fc2-L2-ST, сшитую с 20 кДа PEG); и (5) контрольную группу. Группам (1)-(4) вводили по 3 мг/кг, а контрольной группе давали нормальный физиологический раствор. Эксперимент IPGTT выполняли через 24, 144, 168, 192, 216 и 240 ч после введения. Экспериментальная процедура была следующей. Мыши голодали в течение 6 часов, у них измеряли уровень глюкозы в крови и массу тела. В период голодания мыши имели свободный доступ к воде. Через 6 ч мышам вводили 2,0 г/кг раствора глюкозы объемом 10 мл/кг внутрибрюшинно и измеряли значения глюкозы крови через 10, 30, 60, 90, 120 мин после глюкозной нагрузки. По этим значениям строили кривую толерантности к глюкозе и вычисляли площадь под кривой (AUC) глюкозы крови. Данные были представлены в виде среднего ± стандартная ошибка (Mean ±SEM) и проанализированы с помощью статистического программного обеспечения Graphpad prism7.0. Различия были проанализированы с помощью статистики Манна-Уитни.healthy male C57BL/6 mice aged 6-8 weeks were divided into 5 groups of 8 mice each. These groups included: (1) GLP1-Fc group (GLP-1-L1-Fc2-L2-ST substrate before cross-linking); (2) dulaglutide group; (3) a 40 kDa PEG group GLP1-Fc (GLP-1-L1-Fc2-L2-ST cross-linked to a 40 kDa PEG); (4) a 20 kDa PEG group GLP1-Fc (GLP-1-L1-Fc2-L2-ST cross-linked to a 20 kDa PEG); and (5) control group. Groups (1)-(4) were given 3 mg/kg, and the control group was given normal saline. The IPGTT experiment was performed at 24, 144, 168, 192, 216, and 240 h postadministration. The experimental procedure was as follows. The mice were fasted for 6 hours and their blood glucose levels and body weight were measured. During the fasting period, mice had free access to water. After 6 hours, mice were injected with 2.0 g/kg of glucose solution in a volume of 10 ml/kg intraperitoneally and blood glucose values were measured 10, 30, 60, 90, 120 minutes after the glucose load. Using these values, a glucose tolerance curve was constructed and the area under the curve (AUC) of blood glucose was calculated. Data were presented as mean ± standard error (Mean ± SEM) and analyzed using Graphpad prism7.0 statistical software. Differences were analyzed using Mann-Whitney statistics.
Как показано на фиг. 10А, 10В, 10С, 10D, 10Е и 10F, как уровень глюкозы в крови, так и площадь под кривой (AUC) в глюкозотолерантном тесте каждой экспериментальной группы значительно снизились по сравнению со значениями в контрольной группе в течение 6 суток после однократного введения. Через 7 суток не было достоверной разницы между группами дулаглутида, GLP1-Fc и контрольной группой, что указывает на то, что эффективность GLP1-Fc и дулаглутида может поддерживаться в течение 6 суток. Как показано на фиг. 10G, 10Н, 10I, 10J, 10K и 10L, PEG (20 кДа)-GLP1-Fc все еще оказывал значительный эффект в отношении толерантности к глюкозе на 8-е сутки после однократного введения. Через 9 суток площадь под кривой (AUC) глюкозотолерантного теста не отличалась от контрольной группы, указывая, что эффект лекарственного средства может сохраняться в течение 8 суток. PEG (40 кДа)GLP1-Fc все еще оказывал значительный эффект в отношении толерантности к глюкозе вплоть до 9-хAs shown in FIG. 10A, 10B, 10C, 10D, 10E and 10F, both the blood glucose level and the area under the curve (AUC) in the glucose tolerance test of each experimental group decreased significantly compared with the values in the control group within 6 days after a single dose. After 7 days, there was no significant difference between the dulaglutide, GLP1-Fc and control groups, indicating that the efficacy of GLP1-Fc and dulaglutide could be maintained for 6 days. As shown in FIG. 10G, 10H, 10I, 10J, 10K and 10L, PEG (20 kDa)-GLP1-Fc still had a significant effect on glucose tolerance on day 8 after a single dose. After 9 days, the area under the curve (AUC) of the glucose tolerance test did not differ from the control group, indicating that the effect of the drug may persist for 8 days. PEG (40 kDa)GLP1-Fc still had a significant effect on glucose tolerance up to 9
- 19 044650 суток после однократного введения. Через 10 дней площадь под кривой (AUC) глюкозотолерантного теста не отличалась от контрольной группы, указывая на то, что эффект лекарственного средства может сохраняться в течение 9 суток.- 19 044650 days after a single administration. After 10 days, the area under the curve (AUC) of the glucose tolerance test did not differ from the control group, indicating that the effect of the drug may persist for 9 days.
На фиг. 10М показаны суточные изменения массы тела мышей C57BL/6J после введения. По сравнению с контрольной группой масса тела мышей в каждой группе снижалась в течение 24 ч, особенно в группе дулаглутида и группе GLP1-Fc, не сшитого с PEG. Стоит отметить, что как PEG (20 кДа)-GLP1Fc, так и PEG (40 кДа)-GLP1-Fc могут значительно снизить быструю потерю массы тела, вызванную лекарственными средствами, указывая, что пегилирование может значительно облегчить побочные эффекты таких лекарственных средств при клинических применениях и, таким образом, они обладают лучшими свойствами безопасности.In fig. 10M shows daily changes in body weight of C57BL/6J mice after administration. Compared with the control group, the body weight of mice in each group decreased within 24 hours, especially in the dulaglutide group and the non-PEG-linked GLP1-Fc group. It is worth noting that both PEG(20 kDa)-GLP1Fc and PEG(40 kDa)-GLP1-Fc can significantly reduce drug-induced rapid weight loss, indicating that PEGylation can significantly alleviate the side effects of such drugs in clinical trials. applications and thus have better safety properties.
(2) Экспериментальные результаты для GLP1-L1-Fc4-L2-STG3.(2) Experimental results for GLP1-L1-Fc4-L2-STG3.
здоровых самцов мышей C57BL/6 в возрасте 8-10 недель были разделены на 3 группы по 6 мышей в каждой. Группы включали: (1) контрольную группу; (2) группу дулаглутида; и (3) группу PEG (40 кДа)-GLP1-Fc (GLP1-L1-Fc4-L2-STG3, сшитый с 40 кДа PEG). Группам (2) и (3) вводили одинаковую активность (то есть выполняли пересчет массы на основании in vitro активности, определенной на фиг. 19), где доза дулаглутида составляла 0,76 мг/кг, доза PEG (40 кДа)-GLP1-Fc составляла 3,5 мг/кг, а контрольной группе давали физиологический раствор. Эксперимент IPGTT проводили через 1, 5, 6, 7 и 8 суток после введения, и экспериментальная процедура заключалась в следующем. Мыши голодали в течение 6 часов, и у них измеряли уровень глюкозы в крови и массу тела. В период голодания мыши имели свободный доступ к воде. Через 6 мышам вводили внутрибрюшинно 2,0 г/кг раствора глюкозы объемом 10 мл/кг и измеряли значения глюкозы крови через 10, 30, 60, 90, 120 мин после глюкозной нагрузки. По полученным значениям рассчитывали площадь под кривой (AUC) глюкозы крови. Данные были представлены в виде среднего ± стандартная ошибка (Mean±SEM) и проанализированы с помощью статистического программного обеспечения Graphpad prism7.0. Различия были проанализированы с помощью статистики Манна-Уитни.healthy male C57BL/6 mice aged 8-10 weeks were divided into 3 groups of 6 mice each. The groups included: (1) control group; (2) dulaglutide group; and (3) a PEG group (40 kDa)-GLP1-Fc (GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 cross-linked with 40 kDa PEG). Groups (2) and (3) were administered the same activity (ie, weight conversion was performed based on in vitro activity determined in Fig. 19), where the dose of dulaglutide was 0.76 mg/kg, the dose of PEG (40 kDa)-GLP1- Fc was 3.5 mg/kg, and the control group was given saline. The IPGTT experiment was carried out at 1, 5, 6, 7 and 8 days after administration, and the experimental procedure was as follows. The mice fasted for 6 hours and their blood glucose levels and body weight were measured. During the fasting period, mice had free access to water. After 6 minutes, mice were injected intraperitoneally with 2.0 g/kg glucose solution with a volume of 10 ml/kg and blood glucose values were measured 10, 30, 60, 90, 120 minutes after the glucose load. Based on the obtained values, the area under the curve (AUC) of blood glucose was calculated. Data were presented as mean ± standard error (Mean ± SEM) and analyzed using Graphpad prism7.0 statistical software. Differences were analyzed using Mann-Whitney statistics.
Как показано на фиг. 20А, и глюкоза в крови, и площадь под кривой (AUC) глюкозотолерантного теста для мышей в каждой экспериментальной группе значительно снижались по сравнению со значениями в контрольной группе в течение 5 суток после однократного введения. Через 5 суток не было значимой разницы между дулаглутидной и контрольной группой, что указывало на то, что эффективность дулаглутида может сохраняться в течение 5 суток. PEG (40 кДа)-GLP1-Fc все еще оказывал значительный эффект в отношении толерантности к глюкозе до 7-х суток после однократного введения. Через 8 суток площадь под кривой (AUC) глюкозотолерантного теста не имела отличий по сравнению с контрольной группой, что указывает на то, что эффективность PEG (40 кДа) -GLP1-Fc может поддерживаться в течение 7 суток.As shown in FIG. 20A, both blood glucose and the area under the curve (AUC) of the glucose tolerance test for mice in each experimental group decreased significantly compared to the values in the control group within 5 days after a single dose. After 5 days, there was no significant difference between the dulaglutide and control groups, indicating that the effectiveness of dulaglutide could be maintained beyond 5 days. PEG (40 kDa)-GLP1-Fc still had a significant effect on glucose tolerance up to 7 days after a single dose. After 8 days, the area under the curve (AUC) of the glucose tolerance test was no different compared with the control group, indicating that the effectiveness of PEG (40 kDa)-GLP1-Fc could be maintained for 7 days.
На фиг. 20В показаны изменения массы тела мышей C57BL/6 после введения. По сравнению с контрольной группой масса тела мышей в обеих группах снижалась в течение 24 часов, особенно в группе дулаглутида. Стоит отметить, что PEG (40 кДа)-GLP1-Fc также может значительно уменьшать быструю потерю массы тела, вызванную лекарственными средствами, что дополнительно показывает то, что пегилирование может значительно облегчить побочные эффекты таких лекарственных средств - агонистов рецепторов GLP-1 при клинических применениях.In fig. 20B shows changes in body weight of C57BL/6 mice after administration. Compared to the control group, the body weight of mice in both groups decreased within 24 hours, especially in the dulaglutide group. It is worth noting that PEG(40 kDa)-GLP1-Fc can also significantly reduce drug-induced rapid weight loss, which further demonstrates that PEGylation can significantly alleviate the side effects of such GLP-1 receptor agonist drugs in clinical applications. .
Пример 5. Определение гипогликемической активности сшитого GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 у мышей с STZ-индуцированным диабетом II типа.Example 5. Determination of the hypoglycemic activity of cross-linked GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 in mice with STZ-induced type II diabetes.
Создание мышиной модели диабета II типа.Development of a mouse model of type II diabetes.
Мышей C57BL/6 (приобретенных у Beijing Vital River Co., Ltd.) выращивали по 5 мышей в клетке, кормили нормальным кормом для роста мышей и питьевой водой в свободном доступе. Светлое время составляло 12 ч (08:00am-20:00pm) и темное время составляло 12 ч (20:00pm-08:00am). 30 здоровых самок мышей C57BL/6 в возрасте 8-10 недель обрабатывали 60 мг/кг STZ, который вводили непрерывно в течение 4 суток, а через 2 недели измеряли значения глюкозы в крови. Мыши со значениями глюкозы крови не натощак больше или равными 16,7 ммоль/л считались мышами с успешно установленным диабетом II типа.C57BL/6 mice (purchased from Beijing Vital River Co., Ltd.) were raised 5 mice per cage and fed normal mouse growth chow and drinking water ad libitum. Light time was 12 hours (08:00am-20:00pm) and dark time was 12 hours (20:00pm-08:00am). 30 healthy female C57BL/6 mice aged 8-10 weeks were treated with 60 mg/kg STZ, which was administered continuously for 4 days, and blood glucose values were measured after 2 weeks. Mice with nonfasting blood glucose values greater than or equal to 16.7 mmol/L were considered mice with successfully established type II diabetes.
Протокол.Protocol.
мыши с диабетом II типа были разделены на 4 группы по 6 мышей в каждой. Эти группы включали: (1) контрольную группу; (2) группу дулаглутид-1 мг/кг; (3) группу PEG (40 кДа)-GLP1-Fc (GLP1L1-Fc4-L2-STG3, сшитый с 40 кДа PEG)-1 мг/кг; и (4) группу PEG (40 кДа)-GLP1-Fc (GLP1-L1-Fc4-L2STG3, сшитый с 40 кДа PEG)-3 мг/кг. Доза дулаглутида составляла 1 мг/кг, доза PEG (40 кДа)-GLP1-Fc составляла 1 мг/кг или 3 мг/кг, а контрольной группе давали нормальный физиологический раствор. Уровень глюкозы в крови и массу тела в сутки 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 и 12 измеряли не натощак и с питьем в свободном доступе. Данные были представлены в виде среднего ± стандартная ошибка (Mean ±SEM) и проанализированы с помощью статистического программного обеспечения Graphpad prism7.0. Различия были проанализированы с помощью статистики Манна-Уитни.mice with type II diabetes were divided into 4 groups of 6 mice each. These groups included: (1) control group; (2) dulaglutide-1 mg/kg group; (3) group PEG (40 kDa)-GLP1-Fc (GLP1L1-Fc4-L2-STG3, cross-linked with 40 kDa PEG) -1 mg/kg; and (4) PEG group (40 kDa)-GLP1-Fc (GLP1-L1-Fc4-L2STG3 cross-linked with 40 kDa PEG)-3 mg/kg. The dose of dulaglutide was 1 mg/kg, the dose of PEG (40 kDa)-GLP1-Fc was 1 mg/kg or 3 mg/kg, and the control group was given normal saline. Blood glucose levels and body weight on days 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 and 12 were measured without fasting and while drinking freely. Data were presented as mean ± standard error (Mean ± SEM) and analyzed using Graphpad prism7.0 statistical software. Differences were analyzed using Mann-Whitney statistics.
Результаты.Results.
- 20 044650- 20 044650
Как показано на фиг. 21А, уровень глюкозы в крови мышей в каждой экспериментальной группе значительно снижался по сравнению со значениями в контрольной группе после однократного введения.As shown in FIG. 21A, the blood glucose level of mice in each experimental group decreased significantly compared with the values in the control group after a single dose.
Разница в уровне глюкозы в крови между группой дулаглутид-1 мг/кг и контрольной группой все еще была значимой (Р=0,0022) на 6-е сутки, но к 7-м суткам значимой разницы не было (P=0,9654), что указывает на то, что гипогликемический эффект дулаглутида может сохраняться вплоть до 6 суток.The difference in blood glucose levels between the dulaglutide-1 mg/kg group and the control group was still significant (P=0.0022) on day 6, but there was no significant difference by day 7 (P=0.9654 ), which indicates that the hypoglycemic effect of dulaglutide can last up to 6 days.
С другой стороны, после однократного введения PEG (40 кДа)-GLP1-Fc-1 мг/кг все еще оказывал значительный гипогликемический эффект до 10-ых суток (Р=0,0381), результат которого не был близок к контрольной группе до 11-ых суток (Р=0,1143); и PEG (40 кДа)-GLP1-Fc-3 мг/кг все еще оказывал значительный гипогликемический эффект на 11-е сутки после однократного введения (Р=0,0381), и разница между которым и контрольной группой не была существенной до 12-ых суток (P=0,0762). Приведенные выше результаты показали, что PEG (40 кДа)-GLP1-Fc оказывал значительно более долгосрочный гипогликемический эффект и может быть использован в лечении диабета II типа.On the other hand, after a single dose of PEG (40 kDa)-GLP1-Fc-1 mg/kg still had a significant hypoglycemic effect until the 10th day (P=0.0381), the result of which was not close to the control group until the 11th day. th day (P=0.1143); and PEG (40 kDa)-GLP1-Fc-3 mg/kg still had a significant hypoglycemic effect on the 11th day after a single dose (P=0.0381), and the difference between which and the control group was not significant until the 12th day. days (P=0.0762). The above results showed that PEG (40 kDa)-GLP1-Fc had a significantly longer-term hypoglycemic effect and could be used in the treatment of type II diabetes.
Кроме того, также наблюдали изменения массы тела у диабетических мышей после введения. Как показано на рис. 21В, масса тела мышей во всех экспериментальных группах снижалась по сравнению с массами в контрольной группе, особенно в группе дулаглутида, где масса тела мышей снижалась не более чем на 2,5 г по сравнению с контрольной группой. Две дозовые группы PEG (40 кДа)-GLP1-Fc оказывали гораздо меньшее влияние на массу тела, где масса тела мышей в группе PEG (40 кДа)-GLP1-Fc-1 мг/кг снижалась не более чем на 0,3 г по сравнению с контрольной группой и масса тела мышей в группе PEG (40 кДа)-GLP1-3 мг/кг снижалась не более чем на 1,1 г по сравнению с контрольной группой. Эти результаты показывают, что PEG (40 кДа)-GLP1-Fc в различных дозах может значительно улучшать быструю потерю массы тела, вызванную лекарственными средствами при использовании в лечении диабета, указывая, что модификации пегилированием могут значительно улучшить облегчить побочные эффекты таких лекарственных средств в клинических применениях и в то же время эффективно улучшить соблюдение пациентом режима лечения.In addition, changes in body weight in diabetic mice after administration were also observed. As shown in Fig. 21B, the body weight of mice in all experimental groups decreased compared to the weights in the control group, especially in the dulaglutide group, where the body weight of mice decreased by no more than 2.5 g compared to the control group. The two dose groups of PEG (40 kDa)-GLP1-Fc had a much smaller effect on body weight, where the body weight of mice in the PEG (40 kDa)-GLP1-Fc-1 mg/kg group was reduced by no more than 0.3 g by compared with the control group, and the body weight of mice in the PEG (40 kDa)-GLP1-3 mg/kg group decreased by no more than 1.1 g compared to the control group. These results indicate that PEG (40 kDa)-GLP1-Fc at various doses can significantly improve drug-induced rapid weight loss when used in the treatment of diabetes, indicating that PEGylation modifications can significantly improve the side effects of such drugs in clinical settings. applications and at the same time effectively improve patient compliance with treatment regimen.
Таким образом, пегилированный GLP1-Fc может стимулировать секрецию инсулина островковыми β-клетками, ингибировать временное повышение уровня глюкозы в крови, вызванное экзогенным потреблением глюкозы, и способствовать утилизации глюкозы. После PEG-модификации, белок GLP1-Fc демонстрирует более длительный гипогликемический эффект и меньшее количество побочных эффектов, что предотвращает быструю потерю массы тела, часто вызываемую GLP-1-подобными, снижающими массу тела лекарственными средствами, и имеет хорошую перспективу клинического применения.Thus, PEGylated GLP1-Fc can stimulate insulin secretion by islet β-cells, inhibit the transient increase in blood glucose levels caused by exogenous glucose consumption, and promote glucose utilization. After PEG modification, the GLP1-Fc protein exhibits a longer-lasting hypoglycemic effect and fewer side effects, which prevents the rapid weight loss often caused by GLP-1-like weight-loss drugs and has good prospects for clinical application.
Настоящее изобретение было проиллюстрировано различными конкретными воплощениями. Однако специалистам в данной области понятно, что настоящее изобретение не ограничено конкретными воплощениями и специалисты могут делать различные модификации и вариации в рамках объема настоящего изобретения, не отходя от сущности и объема настоящего изобретения. Все эти модификации и вариации входят в объем настоящего изобретения.The present invention has been illustrated by various specific embodiments. However, those skilled in the art will appreciate that the present invention is not limited to specific embodiments, and those skilled in the art may make various modifications and variations within the scope of the present invention without departing from the spirit and scope of the present invention. All of these modifications and variations are within the scope of the present invention.
--
Claims (7)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811125762.9 | 2018-09-26 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA044650B1 true EA044650B1 (en) | 2023-09-20 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2019349201B2 (en) | GLP1-Fc fusion protein and conjugate thereof | |
JP6412183B2 (en) | Modified polypeptides with increased duration of action | |
EP2423223B1 (en) | Novel exendin variant and conjugate thereof | |
KR20200018526A (en) | An insulin conjugate using an immunoglobulin fragment | |
TWI784914B (en) | Composition for treating diabetes comprising long-acting insulin analogue conjugate and long-acting insulinotropic peptide conjugate | |
TWI630214B (en) | A liquid formulation of long-acting insulin and insulinotropic peptide | |
KR101424550B1 (en) | Composition for Treating Diabetes Comprising Long-acting Insulin Conjugate and Long-acting Insulinotropic Peptide Conjugate | |
EA039770B1 (en) | Fusion protein for treating diabetes mellitus | |
RU2624129C2 (en) | Method for producing physiologically active polypeptide complex | |
KR102185311B1 (en) | A site specific conjugate of insulin | |
EA044650B1 (en) | GLP1-FC FUSION PROTEIN AND ITS CONJUGATE |