EA044225B1

EA044225B1 - APPLICATION OF A CLEANING AGENT BASED ON DENDRONS N-ACETYLGALACTOSAMINE IN PRE-TARGETED RADIOIMMUNOTHERAPY WITH DOTA CHELATOR

Info

Publication number: EA044225B1
Application number: EA202190117
Authority: EA
Inventors: Оуатек Оуэрфелли; Гуанбинь Ян; Сара М. Чил; Стив Ларсон
Original assignee: Мемориал Слоан Кеттеринг Кэнсер Сентер
Priority date: 2018-07-13
Filing date: 2019-07-10
Publication date: 2023-08-01

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявкиCross reference to related applications

Изобретение испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №The invention claims priority under U.S. Provisional Patent Application No.

62\697956, поданной 13 июля 2018 г., содержание которой полностью включено в изобретение посредством ссылки.62\697956, filed July 13, 2018, the contents of which are incorporated by reference in their entirety.

Область техникиField of technology

Изобретение в целом относится к композициям, включающим новые очищающие агенты на основе дендронов N-ацетилгалактозамина, и к способам их применения в предварительно направленной радиоиммунотерапии.The invention generally relates to compositions comprising new scavenging agents based on N-acetylgalactosamine dendrons, and to methods for their use in pre-targeted radioimmunotherapy.

Заявление о государственной поддержкеApplication for state support

Изобретение выполнено при финансовой поддержке правительства США в рамках контракта CA86438, заключенного Национальными институтами здравоохранения США. Правительство имеет определенные права на изобретение.The invention was made with financial support from the US government under contract CA86438, awarded by the US National Institutes of Health. The government has certain rights to an invention.

Уровень техникиState of the art

Следующее описание уровня техники настоящего изобретения предоставляется в помощь исключительно для понимания настоящего изобретения и не является описанием или сущностью известных технических решений настоящего изобретения.The following description of the prior art of the present invention is provided solely to assist in understanding the present invention and is not a description or summary of the prior art of the present invention.

Радиомеченые агенты применялись на протяжении более 50 лет в качестве средств доставки ионизирующего излучения к определенным пораженным участкам (Larson SM. Cancer 67:1253-1260 (1991); Britton KE. Nucl Med Commun. 18:992-1007 (1997)). Было рассмотрено большое количество молекул, применямых при адресной доставке радиоизотопов, включая радиомеченые антитела, фрагменты антител, альтеративные каркасы и малые молекулы (Tolmachev V, et al., Cancer Res. 67:2773-2782 (2007); BirchlerMT, et al., Otolaryngol Head Neck Surg. 136:543-548 (2007); Reubi JC, Maecke HR. J Nucl Med. 49:1735-1738 (2008)). Применение антител для направленного разрушения опухоли, например, в радиоиммунотерапии (РИТ) с направленно конъюгированными антителами, является сложной задачей, отчасти ввиду субоптимальной дозы облучения опухоли и терапевтического индекса (ТИ). Кроме того, ввиду неизбежного поражения здоровых тканей повышение дозы невозможно, и поэтому такая терапия приводит к ограниченному противоопухолевому эффекту. Более того, антитела характеризуются длительным периодом полураспада в крови, что является следствием малой величины отношения поглощения опухоли к фоновому излучению. Фрагменты антител и другие связывающие каркасы меньшего размера характеризуются более быстрым выведением из крови, однако они накапливаются в большом количестве в почках и/или печени. Радиомеченые низкомолекулярные лиганды в основном харкатеризуются более быстрым выведением из крови и более низким фоновым излучением по сравнению с антителами и фрагментами антител, но обычно приводят к слабой специфичности ввиду относительно низкой аффинности к желаемой мишени.Radiolabeling agents have been used for over 50 years as a means of delivering ionizing radiation to specific lesions (Larson SM. Cancer 67:1253-1260 (1991); Britton KE. Nucl Med Commun. 18:992-1007 (1997)). A large number of molecules have been reviewed for use in targeted radioisotope delivery, including radiolabeled antibodies, antibody fragments, alterative scaffolds, and small molecules (Tolmachev V, et al., Cancer Res. 67:2773-2782 (2007); BirchlerMT, et al., Otolaryngol Head Neck Surg 136:543-548 (2007) Reubi JC, Maecke HR J Nucl Med 49:1735-1738 (2008) The use of antibodies for targeted tumor destruction, such as in radioimmunotherapy (RIT) with targeted conjugated antibodies, is challenging, in part due to the suboptimal tumor dose and therapeutic index (TI). In addition, due to the inevitable damage to healthy tissue, increasing the dose is not possible, and therefore such therapy leads to a limited antitumor effect. Moreover, antibodies have a long half-life in the blood, which is a consequence of the low ratio of tumor absorption to background radiation. Smaller antibody fragments and other binding scaffolds are cleared more quickly from the blood, but they accumulate in large quantities in the kidneys and/or liver. Radiolabeled small molecule ligands are generally characterized by faster clearance from the blood and lower background radiation compared to antibodies and antibody fragments, but generally result in poor specificity due to relatively low affinity for the desired target.

При предварительно направленной радиоиммунотерапии (ПРИТ, англ.: pretargeted radioimmunotherapy (PRIT)) вводят нерадиоактивное бифункциональное антитело со специфичностью как к опухолевому антигену, так и к низкомолекулярному гаптену, и дают ему возможность локализоваться в опухоли (опухолях). После выведения антитела из крови в достаточном количестве вводят малую молекулу с радиоактивной меткой, которая захватывается предварительно направленным антителом. Однако многие малые пептидные и металлохелатные гаптены, применяемые в системах ПРИТ, характеризуются длительным удержанием в организме, что приводит к нежелательной фоновой активности, которая ограничивает величины отношения сигнала к фону при визуализации и способствует неспецифическому излучению, которое ограничивает максимально переносимую дозу для терапевтических применений. (Orcutt et al., Mol Imaging Biol 13:215-221 (2011)).In pretargeted radioimmunotherapy (PRIT), a non-radioactive bifunctional antibody with specificity for both a tumor antigen and a low molecular weight hapten is administered and allowed to localize to the tumor(s). After the antibody has been cleared from the blood in sufficient quantities, a small molecule with a radioactive label is administered, which is captured by the pre-targeted antibody. However, many small peptide and metal chelate haptens used in PRIT systems exhibit prolonged retention in the body, resulting in undesirable background activity that limits signal-to-background ratio values in imaging and contributes to nonspecific emission that limits the maximum tolerated dose for therapeutic applications. (Orcutt et al., Mol Imaging Biol 13:215-221 (2011)).

Таким образом, существует потребность в новых молекулах, которые обеспечивают (а) эффективную предварительно направленную радиоиммунотерапию солидных опухолей in vivo и (б) быстрое удаление меченных радиоактивными изотопами малых молекул из неопухолевой ткани.Thus, there is a need for new molecules that provide (a) effective pretargeted radioimmunotherapy of solid tumors in vivo and (b) rapid clearance of radiolabeled small molecules from non-tumor tissue.

Краткое описание изобретенияBrief description of the invention

Согласно одному аспекту настоящее изобретение обеспечивает соединение видаIn one aspect, the present invention provides a compound of the form

- 1 044225- 1 044225

- 2 044225- 2 044225

или его фармацевтически приемлемую соль и/или сольват, в котором X¹, X², X³, X⁴, X⁵, X⁶, X⁷, X⁸, X⁹, X¹⁰, X¹¹, X¹², X¹³, X¹⁴, X¹⁵, X¹⁶, X¹⁷, X¹⁸, X¹⁹, X²⁰ каждый независимо представляет собой H или неподеленную пару электронов (т.е. обеспечивает анион кислорода); Y¹, Y², Y³, Y⁴, Y⁵ каждый независимо представляет собой О или S; x равен 1, 2 или 3; y равен 1, 2, 3 или 4.or a pharmaceutically acceptable salt and/or solvate thereof, in which X ¹ , X ² , X ³ , X ⁴ , X ⁵ , X ⁶ , X ⁷ , X ⁸ , X ⁹ , X 10 , X ¹¹ , X ¹² , ^X ¹³ , X ¹⁴ , X ¹⁵ , X ¹⁶ , X ¹⁷ , X ¹⁸ , X ¹⁹ , X ²⁰ each independently represent H or a lone pair of electrons (i.e. provide an oxygen anion); Y ¹ , Y ² , Y ³ , Y ⁴ , Y ⁵ are each independently O or S; x is 1, 2 or 3; y is 1, 2, 3 or 4.

Согласно любому варианту реализации соединение может представлять собой очищающий агент видаIn any embodiment, the compound may be a cleaning agent of the form

- 3 044225- 3 044225

- 4 044225- 4 044225

или его фармацевтически приемлемую соль и/или сольват, в котором М¹, М², М³, М⁴, М⁵ каждый независимо представляет собой Lu³⁺, Sc³⁺, Ga³⁺, Y³⁺, In³⁺, La³⁺, Ce³⁺, Eu³⁺, Tb³⁺, или Gd³⁺; X¹, X², X³, X⁴, X⁵, X⁶, X⁷, X⁸, X⁹, X¹⁰, X¹¹, X¹², X¹³, X¹⁴, X¹⁵, X¹⁶, X¹⁷, X¹⁸, X¹⁹, X²⁰ каждый независимо представляет собой H или неподеленную пару электронов (т.е. обеспечивает анион кислорода); Y¹, Y², Y³, Y⁴, Y⁵ каждый независимо представляет собой О или S; x равен 1, 2 или 3; y равен 1, 2, 3 или 4.or a pharmaceutically acceptable salt and/or solvate thereof, in which M ¹ , M ² , M ³ , M ⁴ , M ⁵ are each independently Lu ³⁺ , Sc ³⁺ , Ga ³⁺ , Y ³⁺ , In ³⁺ , La ³⁺ , Ce ³⁺ , Eu ³⁺ , Tb ³⁺ , or Gd ³⁺ ; X ¹ , X ² , X 3, X ⁴ , X ⁵ , X ⁶ , ^{X 7} ^, X ⁸ , X 9, X ¹⁰ , X ¹¹ , X ¹² , X ¹³ , X ¹⁴ , X ¹⁵ , ^{X 16} ^, X ¹⁷ , X ¹⁸ , X ¹⁹ , X ²⁰ each independently represents H or a lone pair of electrons (ie, provides an oxygen anion); Y ¹ , Y ² , Y ³ , Y ⁴ , Y ⁵ are each independently O or S; x is 1, 2 or 3; y is 1, 2, 3 or 4.

Согласно любому варианту реализации может оказаться, что М¹, М², М³, М⁴, М⁵ каждый независимо не является радионуклидом. Согласно любому варианту реализации может оказаться, что Y¹, Y², Y³, Y⁴, Y⁵ каждый независимо представляет собой S. Согласно любому варианту реализации может оказать- 5 044225 ся, что x равен 1 или 2. Согласно любому варианту реализации может оказаться, что у равен 2 или 3.According to any embodiment, it may turn out that M ¹ , M ² , M ³ , M ⁴ , M ⁵ are each independently not a radionuclide. In any embodiment, it may be that Y ¹ , Y ² , Y ³ , Y ⁴ , Y ⁵ are each independently S. In any embodiment, it may be that x is 1 or 2. In any embodiment it may turn out that y is equal to 2 or 3.

Согласно родственному аспекту предложена композиция, которая включает одно или более соединений согласно любому варианту реализации соединения, описаному выше, и фармацевтически приемлемый носитель.In a related aspect, there is provided a composition that includes one or more compounds according to any embodiment described above and a pharmaceutically acceptable carrier.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение обеспечивает способ повышения чувствительности опухоли к лучевой терапии у субъекта с диагнозом рак, включающий (а) введение субъекту в эффективном количестве биспецифического антитела анти-DOTA, причем биспецифическое антитело антиDOTA выполнено с возможностью локализации в опухоли, экспрессирующей мишень опухолевого антигена; (б) введение субъекту в эффективном количестве очищающего агента согласно настоящему изобретению; (в) введение субъекту в эффективном количестве радиомеченого гаптена DOTA, причем гаптен DOTA выполнен с возможностью образования комплекса с биспецифическим антителом анти-DOTA.In another aspect, the present invention provides a method of sensitizing a tumor to radiation therapy in a subject diagnosed with cancer, comprising (a) administering to the subject an effective amount of an anti-DOTA bispecific antibody, wherein the anti-DOTA bispecific antibody is configured to localize to a tumor expressing a target tumor antigen; (b) administering to the subject an effective amount of a cleansing agent according to the present invention; (c) administering to the subject an effective amount of a radiolabeled DOTA hapten, wherein the DOTA hapten is configured to form a complex with an anti-DOTA bispecific antibody.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение обеспечивает способ лечения рака у нуждающегося в этом субъекта, включающий (а) введение субъекту в эффективном количестве биспецифического антитела анти-DOTA, причем биспецифическое антитело анти-DOTA выполнено с возможностью локализации в опухоли, экспрессирующей мишень опухолевого антигена; (б) введение субъекту в эффективном количестве очищающего агента согласно настоящему изобретению; (в) введение субъекту в эффективном количестве радиомеченого гаптена DOTA, причем гаптен DOTA выполнен с возможностью образования комплекса с биспецифическим антителом анти-DOTA. Способы лечения рака могут дополнительно включать последовательное, раздельное или одновременное введение субъекту по меньшей мере одного химиотерапевтического агента, выбранного из группы, состоящей азотистых ипритов, производных этиленимина, алкилсульфонатов, нитрозомочевин, гемцитабина, триазенов, аналогов фолиевой кислоты, антрациклинов, таксанов, ингибиторов ЦОГ-2 (англ. COX-2 inhibitors), аналогов пиримидина, аналогов пурина, антибиотиков, ингибиторов ферментов, эпиподофиллотоксинов, координационных комплексов платины, алкалоидов барвинка, замещенных мочевин, производных метилгидразина, адренокортикальных супрессоров, антагонистов гормонов, эндостатина, таксолов, камптотецинов, SN-38, доксорубицина, аналогов доксорубицина, антиметаболитов, алкилирующих агентов, антимитотиков, антиангиогенных агентов, ингибиторов тирозинкиназы, ингибиторов mTOR, ингибиторов белка теплового шока (HSP90), ингибиторов протеосом, ингибиторов HDAC, проапоптотических агентов, метотрексата, СРТ11.In another aspect, the present invention provides a method of treating cancer in a subject in need thereof, comprising (a) administering to the subject an effective amount of an anti-DOTA bispecific antibody, wherein the anti-DOTA bispecific antibody is configured to localize to a tumor expressing a target tumor antigen; (b) administering to the subject an effective amount of a cleansing agent according to the present invention; (c) administering to the subject an effective amount of a radiolabeled DOTA hapten, wherein the DOTA hapten is configured to form a complex with an anti-DOTA bispecific antibody. Methods of treating cancer may further include sequential, separate, or simultaneous administration to a subject of at least one chemotherapeutic agent selected from the group consisting of nitrogen mustards, ethyleneimine derivatives, alkylsulfonates, nitrosoureas, gemcitabine, triazenes, folic acid analogues, anthracyclines, taxanes, COX inhibitors, 2 (English COX-2 inhibitors), pyrimidine analogues, purine analogues, antibiotics, enzyme inhibitors, epipodophyllotoxins, platinum coordination complexes, vinca alkaloids, substituted ureas, methylhydrazine derivatives, adrenocortical suppressors, hormone antagonists, endostatin, taxols, camptothecins, SN- 38, doxorubicin, doxorubicin analogs, antimetabolites, alkylating agents, antimitotics, antiangiogenic agents, tyrosine kinase inhibitors, mTOR inhibitors, heat shock protein (HSP90) inhibitors, proteasome inhibitors, HDAC inhibitors, proapoptotic agents, methotrexate, CPT11.

Дополнительно или в другом варианте, согласно некоторым вариантам реализации способов, раскрытых в настоящем изобретении, мишень опухолевого антигена выбрана из группы, состоящей из GPA33, HER2/neu, GD2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, MUM-1, CDK4, Nацетилглюкозаминилтрансферазы, р15, gp75, бета-катенина, ErbB2, ракового антигена 125 (СА-125), карциноэмбрионального антигена (СЕА), RAGE, MART (антигена меланомы), MUC-1, MUC-2, MUC-3, MUC-4, MUC-5ac, MUC-16, MUC-17, тирозиназы, Pmel 17 (gp100), последовательности интрона GnT-V подтипа V (последовательности V интрона N-ацетилглюкоаминилтрансферазы подтипа V), рака простаты psm, PRAME (антигена меланомы), β-катенина, EBNA (ядерного антигена вируса Эпштейна-Барра) 16, р53, белка устойчивости рака легких к противоопухолевым препаратам (LRP) Bcl-2, простатоспецифического антигена (PSA), Ki-67, CEACAM6, специфического антигена-p толстой кишки (CSAp), HLA-DR, CD40, CD74, CD138, EGFR, EGP-1, EGP-2, VEGF, P1GF, инсулиноподобного фактора роста (ILGF), тенасцина, тромбоцитарного фактора роста, IL-6, CD20, CD19, PSMA, CD33, CD123, MET, DLL4, Ang-2, HER3, IGF-1R, CD30, TAG-72, SPEAP, CD45, L1-CAM, антигена Льюиса Y (Ley), E-кадгерина, Vкадгерина, ЕрСАМ.Additionally or alternatively, according to some embodiments of the methods disclosed herein, the tumor antigen target is selected from the group consisting of GPA33, HER2/neu, GD2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE- 2, MUM-1, CDK4, Nacetylglucosaminyltransferase, p15, gp75, beta-catenin, ErbB2, cancer antigen 125 (CA-125), carcinoembryonic antigen (CEA), RAGE, MART (melanoma antigen), MUC-1, MUC-2 , MUC-3, MUC-4, MUC-5ac, MUC-16, MUC-17, tyrosinase, Pmel 17 (gp100), GnT-V subtype V intron sequences (N-acetylglucoaminyltransferase subtype V intron V sequences), prostate cancer psm , PRAME (melanoma antigen), β-catenin, EBNA (Epstein-Barr virus nuclear antigen) 16, p53, lung cancer resistance protein (LRP) Bcl-2, prostate-specific antigen (PSA), Ki-67, CEACAM6, colon specific antigen-p (CSAp), HLA-DR, CD40, CD74, CD138, EGFR, EGP-1, EGP-2, VEGF, P1GF, insulin-like growth factor (ILGF), tenascin, platelet-derived growth factor, IL-6 , CD20, CD19, PSMA, CD33, CD123, MET, DLL4, Ang-2, HER3, IGF-1R, CD30, TAG-72, SPEAP, CD45, L1-CAM, Lewis antigen Y (Ley), E-cadherin, Vcadherina, ErCAM.

Дополнительно или в другом варианте, согласно некоторым вариантам реализации способов, раскрытых в настоящем изобретении, биспецифическое антитело анти-DOTA, очищающий агент и/или радиомеченый гаптен DOTA вводят внутривенно, внутримышечно, внутриартериально, интратекально, интракапсулярно, внутриглазнично, внутрикожно, внутрибрюшинно, транстрахеально, подкожно, интрацеребровентрикулярно, перорально или интраназально.Additionally or alternatively, according to some embodiments of the methods disclosed herein, the anti-DOTA bispecific antibody, scavenging agent, and/or radiolabeled DOTA hapten are administered intravenously, intramuscularly, intraarterially, intrathecally, intracapsularly, intraorbitally, intradermally, intraperitoneally, transtracheally, subcutaneously, intracerebroventricularly, orally or intranasally.

Дополнительно или в другом варианте, согласно некоторым вариантам реализации способов, раскрытых в настоящем изобретении, рак выбран из группы, состоящей из рака груди, колоректального рака, рака шейки матки, рака яичников, рака печени, рака мочевого пузыря, гепатомы, гепатоцеллюлярной карциномы, рака мозга, рака легких, рака желудочно-кишечного тракта или рака желудка, рака поджелудочной железы, рака щитовидной железы, рака почек, рака простаты, меланомы, саркомы, карциномы, опухоли Вильмса, рака эндометрия, глиобластомы, плоскоклеточного рака, астроцитомы, карциномы слюнной железы, рака вульвы, карциномы полового члена, рака головы и шеи.Additionally or alternatively, according to some embodiments of the methods disclosed herein, the cancer is selected from the group consisting of breast cancer, colorectal cancer, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, hepatoma, hepatocellular carcinoma, cancer brain, lung cancer, gastrointestinal or stomach cancer, pancreatic cancer, thyroid cancer, kidney cancer, prostate cancer, melanoma, sarcoma, carcinoma, Wilms tumor, endometrial cancer, glioblastoma, squamous cell carcinoma, astrocytoma, salivary gland carcinoma , vulvar cancer, penile carcinoma, head and neck cancer.

Рак головного мозга может представлять собой аденому гипофиза, менингиому, нейробластому или краниофарингиому.Brain cancer can be a pituitary adenoma, meningioma, neuroblastoma, or craniopharyngioma.

Дополнительно или в другом варианте, согласно некоторым вариантам реализации способов, раскрытых в настоящем изобретении, радиомеченый DOTA-гаптен включает один или несколько компонентов из Proteus-DOTA, S-2-(R-аминобензил)-1,4,7,10-тетраазациклододекантетрауксусной кислоты (DOTA-Bn), DOTA-Bn-биотина, BAD (((S)-2-(4-(2-бром)αцетамидо)бензил)-DOTA), NBD ((S)-2-(4нитробензил)-DOTA), DOTA-RGD, DOTA-PEG-E(c(RGDyK))₂, DOTA-8-AOC-BBN, p-NO₂-Bn-DOTA,Additionally or alternatively, according to some embodiments of the methods disclosed herein, the radiolabeled DOTA hapten comprises one or more components of Proteus-DOTA, S-2-(R-aminobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecanetetraacetic acids (DOTA-Bn), DOTA-Bn-biotin, BAD (((S)-2-(4-(2-bromo)αcetamido)benzyl)-DOTA), NBD ((S)-2-(4nitrobenzyl)- DOTA), DOTA-RGD, DOTA-PEG-E(c(RGDyK)) ₂ , DOTA-8-AOC-BBN, p-NO ₂ -Bn-DOTA,

- 6 044225- 6 044225

DOTA-PESIN, DOTA-биотин-саркозина (DOTA-биотин), моно 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10тетрауксусной кислоты (сложный эфир N-гидроксисукцинимида) (DOTA-NHS) или DOTATyrLysDOTA.DOTA-PESIN, DOTA-biotin-sarcosine (DOTA-biotin), mono 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10tetraacetic acid (N-hydroxysuccinimide ester) (DOTA-NHS) or DOTATyrLysDOTA.

Радиомеченый гаптен DOTA может быть помечен радионуклидом, выбранным из группы, состоящей из ²¹³Bi, ²¹¹At, ²²⁵Ac, ¹⁵²Dy, ²¹²Bi, ²²³Ra, ²¹⁹Rn, ²¹⁵Po, ²¹¹Bi, ²²¹Fr, ²¹⁷At, ²⁵⁵Fm, ⁸⁶Y, ⁹⁰Y, ⁸⁹Sr, ¹⁶⁵Dy, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁷⁷Lu, ⁶⁷Cu, ¹ⁿIn, ⁶⁷Ga, ⁵¹Cr, ⁵⁸Co, ^99mTc, ^103mRh, ^195mPt, ¹¹⁹Sb, ¹⁶¹Ho, ^189mOs, ¹⁹²Ir, ²⁰¹Tl, ²⁰³Pb, ⁶⁸Ga, ²²⁷Th, ⁶⁴Cu.The radiolabeled DOTA hapten may be labeled with a radionuclide selected from the group consisting of ²¹³ Bi, ²¹¹ At, ²²⁵ Ac, ¹⁵² Dy, ²¹² Bi, ²²³ Ra, ²¹⁹ Rn, ²¹⁵ Po, ²¹¹ Bi, ²²¹ Fr, ²¹⁷ At, ²⁵⁵ Fm, ⁸⁶ Y, ⁹⁰ Y, ⁸⁹ Sr, ¹⁶⁵ Dy, ¹⁸⁶ Re, ¹⁸⁸ Re, ¹⁷⁷ Lu, 67 Cu, ¹ⁿ ^In , ⁶⁷ Ga, ⁵¹ Cr, ⁵⁸ Co, ^99m Tc, ^103m Rh, ^195m Pt, ¹¹⁹ Sb, ¹⁶¹ Ho , ^189m Os, ¹⁹² Ir, ²⁰¹ Tl, ²⁰³ Pb, ⁶⁸ Ga, ²²⁷ Th, ⁶⁴ Cu.

Дополнительно или в другом варианте, согласно некоторым вариантам реализации способов, раскрытых в настоящем изобретении, уровни радиоактивности, испускаемой комплексом радиомеченого гаптена DOTA и биспецифического антитела анти-DOTA, выявляются между 4 и 24 часами после введения радиомеченого гаптена DOTA. Уровни радиоактивности, испускаемой данным комплексом, можно выразить в виде процента введенной дозы на грамм ткани (% ВД/г). Эталонное значение может быть рассчитано путем измерения уровней радиоактивности, присутствующей в неопухолевых (здоровых) тканях, и вычисления средних уровней радиоактивности, присутствующей в неопухолевых (здоровых) тканях ± стандартное отклонение. Согласно некоторым вариантам реализации эталонное значение представляет собой стандартное значение поглощения (СЗП, англ.: standard uptake value (SUV)). См. Thie JA, J Nucl Med. 45(9): 1431-4 (2004). Терапевтическая эффективность такого комплекса может быть определена путем вычисления отношения площади под фармакокинетической кривой опухоли к площади под фармакокинетической кривой здоровой ткани. Согласно некоторым вариантам реализации данный комплекс обеспечивает отношение площади под фармакокинетической кривой опухоли к площади под фармакокинетической кривой здоровой ткани примерно 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1 или 100:1. Дополнительно или в другом варианте, согласно некоторым вариантам реализации способов, раскрытых в настоящем изобретении, отношение уровней радиоактивности опухоли к уровням радиоактивности здоровой ткани составляет примерно 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1 или 100:1.Additionally or alternatively, according to some embodiments of the methods disclosed herein, the levels of radioactivity emitted by the complex of the radiolabeled DOTA hapten and the anti-DOTA bispecific antibody are detected between 4 and 24 hours after administration of the radiolabeled DOTA hapten. The levels of radioactivity emitted by a given complex can be expressed as a percentage of the administered dose per gram of tissue (% ID/g). The reference value can be calculated by measuring the levels of radioactivity present in non-tumor (healthy) tissues and calculating the average levels of radioactivity present in non-neoplastic (healthy) tissues ± standard deviation. In some embodiments, the reference value is a standard uptake value (SUV). See Thie JA, J Nucl Med. 45(9): 1431-4 (2004). The therapeutic efficacy of such a complex can be determined by calculating the ratio of the area under the pharmacokinetic curve of the tumor to the area under the pharmacokinetic curve of healthy tissue. In some embodiments, the complex provides a tumor AUC to healthy tissue AUC ratio of approximately 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9 :1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1 , 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1 or 100:1. Additionally or alternatively, according to some embodiments of the methods disclosed herein, the ratio of tumor radioactivity levels to healthy tissue radioactivity levels is about 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7: 1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1 or 100:1.

В настоящем изобретении также раскрыты наборы, содержащие компоненты, пригодные для лечения рака у пациента. Согласно одному аспекту наборы содержат очищающий агент согласно настоящему изобретению и инструкции по применению. Наборы согласно настоящему изобретению могут дополнительно содержать по меньшей мере одно биспецифическое антитело анти-DOTA и/или гаптен DOTA, который необязательно мечен одним или несколькими радионуклидами. Примеры подходящих радионуклидов включают ²¹³Bi, ²¹¹At, ²²⁵Ac, ¹⁵²Dy, ²¹²Bi, ²²³Ra, ²¹⁹Rn, ²¹⁵Po, ²¹¹Bi, ²²¹Fr, ²¹⁷At, ²⁵⁵Fm, ⁸⁶Y, ⁹⁰Y, ⁸⁹Sr, ¹⁶⁵Dy, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁷⁷Lu, ⁶⁷Cu, ¹ⁿIn, ⁶⁷Ga, ⁵¹Cr, ⁵⁸Co, ^99mTc, ^103mRh, ^195mPt, ¹¹⁹Sb, ¹⁶¹Ho, ^189mOs, ¹⁹²Ir, ²⁰¹Tl, ²⁰³Pb, ⁶⁸Ga, ²²⁷Th, ⁶⁴Cu, но не ограничиваются ими. Дополнительно или в другом варианте, согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере одно биспецифическое антитело анти-DOTA связано с мишенью опухолевого антигена, выбранного из группы, состоящей из GPA33, HER2/neu, GD2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, MUM-1, CDK4, N-ацетилглюкозаминилтрансферазы, р15, gp75, бета-катенина, ErbB2, ракового антигена 125 (СА-125), карциноэмбрионального антигена (СЕА), RAGE, MART (антигена меланомы), MUC-1, MUC-2, MUC-3, MUC-4, MUC-5ac, MUC-16, MUC-17, тирозиназы, Pmel 17 (gp100), последовательности интрона GnT-V подтипа V (последовательности V интрона Nацетилглюкоаминилтрансферазы подтипа V), рака простаты psm, PRAME (антигена меланомы), βкатенина, EBNA (ядерного антигена вируса Эпштейна-Барра) 1-6, р53, белка устойчивости рака легких к противоопухолевым препаратам (LRP) Bcl-2, простатоспецифического антигена (PSA), Ki-67, CEACAM6, специфического антигена-р толстой кишки (CSAp), HLA-DR, CD40, CD74, CD138, EGFR, EGP-1, EGP-2, VEGF, P1GF, инсулиноподобного фактора роста (ILGF), тенасцина, тромбоцитарного фактора роста, IL-6, CD20, CD19, PSMA, CD33, CD123, MET, DLL4, Ang-2, HER3, IGF-1R, CD30, TAG72, SPEAP, CD45, L1-CAM, антигена Льюиса Y (Le^y), Е-кадгерина, V-кадгерина, ЕрСАМ.The present invention also discloses kits containing components useful for treating cancer in a patient. In one aspect, the kits contain a cleaning agent according to the present invention and instructions for use. The kits of the present invention may further contain at least one anti-DOTA bispecific antibody and/or DOTA hapten, which is optionally labeled with one or more radionuclides. Examples of suitable radionuclides include ²¹³ Bi, ²¹¹ At, ²²⁵ Ac, ¹⁵² Dy, ²¹² Bi, ²²³ Ra, ²¹⁹ Rn, ²¹⁵ Po, ²¹¹ Bi, ²²¹ Fr, ²¹⁷ At, ²⁵⁵ Fm, ⁸⁶ Y, ⁹⁰ Y, ⁸⁹ Sr, ¹⁶⁵ Dy, ¹⁸⁶ Re, ¹⁸⁸ Re, ¹⁷⁷ Lu, ⁶⁷ Cu, ¹ⁿ In, ⁶⁷ Ga, ⁵¹ Cr, ⁵⁸ Co, ^99m Tc, ^103m Rh, ^195m Pt, ¹¹⁹ Sb, ¹⁶¹ Ho, ^189m Os, ¹⁹² Ir, ²⁰¹ Tl, ²⁰³ Pb, ⁶⁸ Ga, ²²⁷ Th, ⁶⁴ Cu, but not limited to them. Additionally or alternatively, in some embodiments, the at least one anti-DOTA bispecific antibody is coupled to a tumor antigen target selected from the group consisting of GPA33, HER2/neu, GD2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE -1, GAGE-2, MUM-1, CDK4, N-acetylglucosaminyltransferase, p15, gp75, beta-catenin, ErbB2, cancer antigen 125 (CA-125), carcinoembryonic antigen (CEA), RAGE, MART (melanoma antigen), MUC-1, MUC-2, MUC-3, MUC-4, MUC-5ac, MUC-16, MUC-17, tyrosinase, Pmel 17 (gp100), GnT-V subtype V intron sequences (Nacetylglucoaminyltransferase subtype V intron V sequences ), prostate cancer psm, PRAME (melanoma antigen), βcatenin, EBNA (Epstein-Barr virus nuclear antigen) 1-6, p53, lung cancer resistance protein (LRP) Bcl-2, prostate-specific antigen (PSA), Ki -67, CEACAM6, colon specific antigen-p (CSAp), HLA-DR, CD40, CD74, CD138, EGFR, EGP-1, EGP-2, VEGF, P1GF, insulin-like growth factor (ILGF), tenascin, platelet-derived factor growth, IL-6, CD20, CD19, PSMA, CD33, CD123, MET, DLL4, Ang-2, HER3, IGF-1R, CD30, TAG72, SPEAP, CD45, L1-CAM, Lewis Y antigen (Le ^y ), E-cadherin, V-cadherin, EpCAM.

Краткое описание чертежейBrief description of drawings

На фиг. 1 показано влияние очищающего агента, раскрытого в настоящем изобретении, на циркуляцию in vivo биспецифического антитела ¹³¹I Атимическим здоровым мышам (без опухолей) внутривенно вводили при t=0 биспецифическое антитело ¹³¹I (19-21 мкКи; 250 мкг; 1,19 нмоль) с последующим введением либо несущей среды (физиологический раствор), либо очищающего агента на основе дендронов (25 мкг; 2,76 нмоль) через t=24 ч. Серийный забор крови проводился в различные моменты времени при t=1-28 ч. Данные представлены в виде среднего значения (±) среднеквадратичной погрешности.In fig. 1 shows the effect of the scavenging agent disclosed in the present invention on the in vivo circulation of bispecific antibody ¹³¹ I. Athymic healthy mice (without tumors) were intravenously administered at t=0 bispecific antibody ¹³¹ I (19-21 μCi; 250 μg; 1.19 nmol) followed by the introduction of either a carrier medium (saline solution) or a dendron-based cleansing agent (25 μg; 2.76 nmol) after t = 24 hours. Serial blood sampling was carried out at various time points at t = 1-28 hours. Data presented as the average value (±) root mean square error.

На фиг. 2 показаны результаты предварительно направленного действия на опухоли, полученные с помощью очищающего агента CCA-16-DOTA-Y3+ согласно настоящему изобретению.In fig. 2 shows the results of tumor pre-targeting obtained with the clearing agent CCA-16-DOTA-Y3+ according to the present invention.

На фиг. 3 показано влияние очищающего агента CCA-16-DOTA-Y³⁺ на поглощение опухолью в зависимости от дозы. **Р<0,01 по сравнению с группой 25 мкг.In fig. Figure 3 shows the effect of scavenging agent CCA-16-DOTA-Y ³⁺ on tumor uptake as a function of dose. **P<0.01 compared with the 25 μg group.

На фиг. 4 показано сравнение результатов предварительно направленного действия на опухоль, полученных с применением варианта реализации очищающего агента согласно настоящему изобретению по сравнению с отсутствием очищающего агента (несущая среда), а также с применением очищающего агента на основе конъюгата декстрана и гаптена DOTA в количестве 500 кДа.In fig. 4 shows a comparison of the tumor pre-targeting results obtained using an embodiment of the scavenging agent of the present invention versus no scavenging agent (carrier medium) as well as using a 500 kDa dextran-hapten DOTA scavenging agent.

На фиг. 5А показано сравнение биораспределения предварительно направленных радиоактивныхIn fig. Figure 5A shows a comparison of the biodistribution of pre-targeted radioactive

- 7 044225 индикаторов [²²⁵Ac]Proteus-DOTA (n=3) или [¹ⁿIn]Proteus-DOTA (n=5) в группах бестимусных мышей с опухолью SW1222 через 24 ч после введения. После внутривенных (через боковую хвостовую вену) инъекций антитела huA33-С825 (0,25 мг; 1,19 нмоль), очищающего агента и радиомеченых гаптенов DOTA животные были умерщвлены спустя 24 ч с целью изъятия органов и измерения уровня радиоактивности. *Р<0,05; ***Р<0,001. Данные представлены в виде среднего значения (±) среднеквадратичной погрешности.- 7 044225 indicators [ ²²⁵ Ac]Proteus-DOTA (n=3) or [ ¹ⁿ In]Proteus-DOTA (n=5) in groups of nude mice with SW1222 tumor 24 hours after administration. Following intravenous (lateral tail vein) injections of huA33-C825 antibody (0.25 mg, 1.19 nmol), clearing agent, and radiolabeled DOTA haptens, animals were sacrificed 24 h later for organ harvesting and radioactivity measurements. *P<0.05;***P<0.001. Data are presented as mean (±) standard error.

На фиг. 5Б показано абсолютное поглощение опухолью предварительно направленных радиомеченых гаптенов DOTA спустя 24 ч после введения в зависимости от введенного количества радиоактивного индикатора (моль); n=1-7 для каждой точки данных.In fig. 5B shows the absolute tumor uptake of pretargeted radiolabeled DOTA haptens 24 hours after administration as a function of the amount of radiotracer administered (mol); n=1-7 for each data point.

На фиг. 6А показаны результаты предварительно направленного действия на опухоль у животных, которым вводили 172 пмоль/1,67 МБк [45 мкКи] [ⁿ¹In] Proteus-DOTA (n=4) или 790 пмоль/7,66 МБк [207 мкКи] [ⁿ¹In] Proteus-DOTA (n=1).In fig. Figure 6A shows the results of tumor pre-targeting in animals administered 172 pmol/1.67 MBq [45 μCi] [ ⁿ¹ In] Proteus-DOTA (n=4) or 790 pmol/7.66 MBq [207 μCi] [ ⁿ¹ In] Proteus-DOTA (n=1).

На фиг. 6Б показано статистическое сравнение действия предварительно направленных [²²⁵Ас] Proteus-DOTA и [¹¹¹In] Proteus-DOTA с действием предварительно направленного анти-GPA33-DOTA.In fig. 6B shows a statistical comparison of the effects of pretargeted [ ²²⁵ Ac]Proteus-DOTA and [ ¹¹¹ In]Proteus-DOTA with the effects of pretargeted anti-GPA33-DOTA.

На фиг. 7 показаны изображения ОФЭКТ/КТ приблизительно через 24 ч после введения предварительно направленного [¹¹¹In] Proteus-DOTA на опухоль колоректального рака человека SW1222 у бестимусных мышей. Ксенотрансплантат SW1222 четко заметен в боковой области живота. На основании анализа изображения отдельных участков тела таких, как опухоль, почка (левая), сердце и печень были получены концентрации активности (значение среднеквадратичной погрешности ±1 стандартное отклонение; процент введенной дозы на грамм) 6,89 ± 4,68; 0,46 ± 0,47; 0,20 ± 0,24; 0,22 ± 0,27 соответственно.In fig. 7 shows SPECT/CT images approximately 24 hours after administration of pretargeted [ ¹¹¹ In]Proteus-DOTA to human colorectal cancer tumor SW1222 in nude mice. The SW1222 xenograft is clearly visible in the lateral abdominal region. Based on image analysis of individual areas of the body such as the tumor, kidney (left), heart and liver, activity concentrations were obtained (standard error value ± 1 standard deviation; percentage of dose administered per gram) of 6.89 ± 4.68; 0.46 ± 0.47; 0.20 ± 0.24; 0.22 ± 0.27, respectively.

На фиг. 8 представлена структура Proteus-DOTA (химическая формула: C₅₀H₈₀LuN₁₁O₁₉S^3-; точная масса: 1345,48; молекулярная масса: 1346,28). Часть молекулы, заключенная в рамку, представляет собой нерадиоактивный гаптен бензил-DOTA (Lu), который распознается одноцепочечным вариабельным фрагментом С825 антитела гаптена анти-DOTA при Kd=10 пМ. Несвязанная трехлепестковая часть молекулы DOTA может притягивать различные радиометаллы, применяемые в терапии и/или визуализации, включая ²²⁵Ас, ⁶⁸Ga и ⁶⁴Cu.In fig. Figure 8 shows the structure of Proteus-DOTA (chemical formula: C ₅₀ H ₈₀ LuN ₁₁ O ₁₉ S ^3- ; exact mass: 1345.48; molecular mass: 1346.28). The framed portion of the molecule is the non-radioactive benzyl-DOTA hapten (Lu), which is recognized by the single chain variable fragment C825 of the anti-DOTA hapten antibody at Kd=10 pM. The unbound trilobal portion of the DOTA molecule can attract a variety of radiometals used in therapy and/or imaging, including ²²⁵ Ac, ⁶⁸ Ga and ⁶⁴ Cu.

На фиг. 9 показана активность ¹⁷⁷Lu в опухоли и различных здоровых тканях, определенная согласно оценке биораспределения после ПРИТ с применением huA33-C825 (по 0,25 мг на мышь), очищающего агента на основе дендронов CCA-16-DOTA-Y3+ (25 мкг; 2,76 нмоль) и 3,7 МБк (20 пмоль) ¹⁷⁷Luаминобензила DOTA ([¹⁷⁷Lu]LuDOTA-Bn). Количество животных в группе n=5. Данные представлены в виде процента введенной дозы на грамм (% ВД/г); значение среднеквадратичной погрешности: ±1 стандартное отклонение.In fig. Figure 9 shows the activity of ¹⁷⁷ Lu in the tumor and various healthy tissues, determined by biodistribution assessment after PRIT using huA33-C825 (0.25 mg per mouse), a dendron scavenging agent CCA-16-DOTA-Y3+ (25 μg; 2 .76 nmol) and 3.7 MBq (20 pmol) ¹⁷⁷ Luaminobenzyl DOTA ([ ¹⁷⁷ Lu]LuDOTA-Bn). Number of animals in group n=5. Data are presented as percentage of dose administered per gram (% ID/g); root mean square error: ±1 standard deviation.

На фиг. 10 показаны кривые биораспределения активности ¹⁷⁷Lu с учетом корректировки по распаду для опухолей SW1222, а также для выбранных здоровых тканей спустя 1-48 ч после инъекции с последующей ПРИТ с применением huA33-C825+ [¹⁷⁷Lu]LuDOTA-Bn (3,7 МБк, 20 пмоль) и очищающего агента на основе дендронов CCA-16-DOTA-Y³⁺ (25 мкг; 2,76 нмоль). Данные представлены в виде процента введенной дозы на грамм (% ВД/г); значение среднеквадратичной погрешности: ±1 стандартное отклонение.In fig. Figure 10 shows the biodistribution curves of ¹⁷⁷ Lu activity, taking into account decay correction for SW1222 tumors, as well as for selected healthy tissues 1-48 hours after injection followed by PRIT using huA33-C825+ [ ¹⁷⁷ Lu]LuDOTA-Bn (3.7 MBq, 20 pmol) and dendron-based cleansing agent CCA-16-DOTA-Y ³⁺ (25 μg; 2.76 nmol). Data are presented as percentage of dose administered per gram (% ID/g); root mean square error: ±1 standard deviation.

На фиг. 11 показаны дозы поглощения предварительно направленных [¹⁷⁷Lu]LuDOTA-Bn и антиGPA33-DOTA с применением очищающего агента на основе дендронов CCA-16-DOTA-Y³⁺ у бестимусных мышей с подкожным введением опухоли GPA33(+) SW1222. Терапевтический индекс определяли как расчетное отношение дозы, поглощенной опухолью, к дозе, поглощенной здоровыми тканями.In fig. Figure 11 shows the uptake doses of pretargeted [ ¹⁷⁷ Lu]LuDOTA-Bn and anti-GPA33-DOTA using the dendron-based scavenging agent CCA-16-DOTA-Y ³⁺ in nude mice subcutaneously injected with the GPA33(+) SW1222 tumor. The therapeutic index was determined as the calculated ratio of the dose absorbed by the tumor to the dose absorbed by healthy tissues.

Подробное описание изобретенияDetailed Description of the Invention

Следует принимать во внимание, что некоторые аспекты, режимы, варианты реализации, отличия и особенности настоящих способов описаны ниже с различными уровнями детализации с целью обеспечения устойчивого понимания настоящего изобретения.It should be appreciated that certain aspects, modes, embodiments, differences and features of the present methods are described below at various levels of detail in order to provide a clear understanding of the present invention.

При осуществлении настоящих способов на практике применяют многие традиционные методы молекулярной биологии, биохимии белков, клеточной биологии, микробиологии и рекомбинантной ДНК. Например,The present methods are practiced using many traditional techniques from molecular biology, protein biochemistry, cell biology, microbiology and recombinant DNA. For example,

- 8 044225 см. Sambrook and Russell eds. (2001)- 8 044225 see Sambrook and Russell eds. (2001)

Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3-е издание; серию Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology, серию Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach, Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual, Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5-е издание; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis', патент США № 4683195; Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization', Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization', Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning', Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Herzenberg etal. eds (1996) Weir’s Handbook of Experimental Immunology.Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; series by Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology, Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach, Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual, Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis', US Patent No. 4683195; Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization', Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization', Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning', Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Herzenberg et al. eds (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology.

Система DOTA-ПРИТ, раскрытая в настоящем изобретении, предполагает трехэтапную стратегию предварительного нацеливания, включающую введение (1) конструкции IgG (IgG-scFv) биспецифического антитела с одноцепочечным вариабельным фрагментом (scFv), содержащей последовательности антитела с высокой аффинностью к антителу антиопухолевого антигена (часть IgG) и одноцепочечный вариабельный фрагмент scFv гаптена анти-DOTA (например, С825); применение (2) очищающего агента согласно настоящему изобретению с целью быстрого выведения циркулирующего биспецифического антитела по прошествии достаточного количества времени, отведенного для накопления биспецифического антитела в антиген-положительной опухоли; применение (3) композиции гаптена DOTA с радиоактивной меткой (например, ¹⁷⁷Lu-DOTA-Bn).The DOTA-PRIT system disclosed in the present invention involves a three-step pre-targeting strategy comprising the introduction of (1) an IgG (IgG-scFv) bispecific antibody construct with a single chain variable fragment (scFv) containing antibody sequences with high affinity to the antitumor antigen antibody (part IgG) and single chain variable fragment scFv of anti-DOTA hapten (eg, C825); using (2) a scavenging agent of the present invention to rapidly clear circulating bispecific antibody after sufficient time has passed for the bispecific antibody to accumulate in the antigen-positive tumor; use of (3) a radiolabeled DOTA hapten composition (eg, ¹⁷⁷ Lu-DOTA-Bn).

Композиции согласно настоящему изобретению включают новые очищающие агенты на основе дендронов N-ацетилгалактозамина, которые могут быть применены в ПРИТ (например, радиоиммунотерапия альфа-частицами). Композиции очищающих агентов, раскрытые в настоящем изобретении, демонстрируют более эффективное выведение из крови радиомеченого биспецифического антитела (BsAb) при DOTA-ПРИТ и улучшают терапевтический индекс (ТИ) при DOTA-ПРИТ. Например, в течение 5 мин после однократного введения избыточной дозы очищающего агента на основе дендронов согласно настоящему изобретению (молярное отношение введенного биспецифического антитела ¹³¹I к очищающему агенту составляет 1:2,3), активность ¹³¹I в крови снизилась на 64% по сравнению с исходным уровнем, от 6,7% ВД/г до 2,4% ВД/г. Исследования DOTA-ПРИТ на модели мыши с ксенотрансплантатом колоректального рака показали зависимое от дозы очищающего агента отношение поглощения опухолью к поглощению кровью ¹⁷⁷Lu-DOTA-Bn спустя 24 ч после введения активности ¹⁷⁷Lu (например, среднее отношение поглощения опухолью к поглощению кровью составляло 2,9, 26 и 59 при 0 мкг (несущая среда), 15 мкг или 20 мкг для очищающего агента на основе дендронов соответственно). Доза очищающего агента на основе дендронов в 25 мкг привела к среднему отношению поглощения опухолью к поглощению кровью 76, что почти идентично ранее оптимизированному дозированию очищающего агента на основе декстрана (среднее отношение поглощения опухолью к поглощению кровью - 77). В совокупности данные результаты предполагают, что очищающий агент на основе дендронов согласно настоящему изобретению пригоден для увеличения терапевтического индекса при DOTA-ПРИТ.The compositions of the present invention include novel N-acetylgalactosamine dendron-based scavenging agents that can be used in PRIT (eg, alpha particle radioimmunotherapy). The clearing agent compositions disclosed in the present invention demonstrate more effective clearance of radiolabeled bispecific antibody (BsAb) from the blood in DOTA-PRIT and improve the therapeutic index (TI) in DOTA-PRIT. For example, within 5 minutes after a single overdose of the dendron-based scavenging agent of the present invention (the molar ratio of administered bispecific antibody ¹³¹ I to scavenging agent is 1:2.3), the activity of ¹³¹ I in the blood decreased by 64% compared to baseline, from 6.7% ID/g to 2.4% ID/g. DOTA-PRIT studies in a colorectal cancer xenograft mouse model showed a dose-dependent scavenging agent tumor to blood uptake ratio of ¹⁷⁷ Lu-DOTA-Bn 24 h after administration of ¹⁷⁷ Lu activity (e.g., mean tumor to blood uptake ratio was 2. 9, 26, and 59 at 0 μg (carrier), 15 μg, or 20 μg for dendron-based clearing agent, respectively). A 25 μg dose of dendron-based scavenging agent resulted in an average tumor to blood uptake ratio of 76, which is almost identical to the previously optimized dosage of dextran-based scavenging agent (average tumor to blood uptake ratio of 77). Taken together, these results suggest that the dendron-based cleansing agent of the present invention is useful for increasing the therapeutic index of DOTA-HRIT.

Определения.Definitions.

Если не указано иное, все технические и научные термины, применяемые в настоящем изобретении, в основном имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в области, к которой принадлежит настоящее изобретение. В настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают в себя ссылки на формы множественного числа, если содержание явно не указывает иное. Например, ссылка на клетку включает комбинацию двух или более клеток и т.п. В целом используемая в настоящем изобретении номенклатура и лабораторные процедуры в культивировании клеток, молекулярной генетике, органической химии, аналитической химии, химии нуклеиновых кислот и гибридизации, описанные ниже, хорошо известны и обычно применяемы в данной области.Unless otherwise specified, all technical and scientific terms used in the present invention have essentially the same meaning as commonly understood by one skilled in the art to which the present invention belongs. In the present specification and the accompanying claims, the singular forms include references to the plural forms unless the content clearly indicates otherwise. For example, a reference to a cell includes a combination of two or more cells, etc. In general, the nomenclature and laboratory procedures used in the present invention in cell culture, molecular genetics, organic chemistry, analytical chemistry, nucleic acid chemistry and hybridization described below are well known and commonly used in the art.

Применяемый в настоящем изобретении термин примерно в отношении числа в целом включает числа, которые попадают в диапазон 1, 5 или 10% в любом направлении (больше или меньше) от числа, если не указано иное или иное не очевидно из контекста (за исключением случаев, когда такое число меньше 0 или превышает 100% от возможного значения).As used herein, the term approximately, with respect to a number as a whole, includes numbers that fall within the range of 1, 5, or 10% in either direction (more or less) of the number, unless otherwise indicated or otherwise obvious from the context (unless when such a number is less than 0 or exceeds 100% of the possible value).

Фармацевтически приемлемые соли соединений, описанных в настоящем изобретении, входят в объем настоящего изобретения и включают аддукты соединений с кислотами или основаниями (acid or base addition salts), которые сохраняют желаемую фармакологическую активность и не являются нежелательными с биологической точки зрения (например, соль не является чрезмерно токсичной, аллергенной или раздражающей, и является биодоступной). Если соединение согласно настоящему изобретению соPharmaceutically acceptable salts of the compounds described herein are within the scope of the present invention and include acid or base addition salts that retain the desired pharmacological activity and are not biologically undesirable (e.g., the salt is not excessively toxic, allergenic or irritant, and is bioavailable). If the connection according to the present invention with

- 9 044225 держит основную группу, такую как, например, аминогруппа, фармацевтически приемлемые соли могут быть образованы с применением неорганических кислот (таких как соляная кислота, борная кислота, азотная кислота, серная кислота и фосфорная кислота), органических кислот (например, альгинат, муравьиная кислота, уксусная кислота, бензойная кислота, глюконовая кислота, фумаровая кислота, щавелевая кислота, винная кислота, молочная кислота, малеиновая кислота, лимонная кислота, янтарная кислота, яблочная кислота, метансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, нафталинсульфоновая кислота и п-толуолсульфоновая кислота) или кислых аминокислот (таких как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота). Если соединение согласно настоящему изобретению содержит кислотную группу, такую как, например, группа карбоновой кислоты, оно может образовывать соли с металлами, такими как щелочные и щелочноземельные металлы (например, Na⁺, Li⁺, K⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, Zn²⁺), аммиаком или органическими аминами (например, дициклогексиламин, триметиламин, триэтиламин, пиридин, пиколин, этаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин) или основными аминокислотами (например, аргинин, лизин и орнитин). Такие соли могут быть получены in situ во время выделения и очистки соединений или путем отдельной реакции очищенного соединения в форме свободного основания или свободной кислоты с соответствующей кислотой или основанием с выделением образованной таким образом соли.- 9 044225 contains a basic group such as, for example, an amino group, pharmaceutically acceptable salts can be formed using inorganic acids (such as hydrochloric acid, boric acid, nitric acid, sulfuric acid and phosphoric acid), organic acids (such as alginate, formic acid, acetic acid, benzoic acid, gluconic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, lactic acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, naphthalenesulfonic acid and p-toluenesulfonic acid) or acidic amino acids (such as aspartic acid and glutamic acid). If the compound of the present invention contains an acidic group, such as, for example, a carboxylic acid group, it can form salts with metals such as alkali and alkaline earth metals (for example, Na ⁺ , Li ⁺ , K ⁺ , Ca ²⁺ , Mg ²⁺ , Zn ²⁺ ), ammonia or organic amines (eg dicyclohexylamine, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine) or basic amino acids (eg arginine, lysine and ornithine). Such salts may be prepared in situ during the isolation and purification of compounds or by separately reacting a purified compound in free base or free acid form with a corresponding acid or base to isolate the salt thus formed.

Применяемый в настоящем изобретении термин введение агента или лекарственного средства субъекту включает любой путь введения или доставки субъекту соединения для выполнения предполагаемой функции. Введение может осуществляться любым приемлемым путем, включая пероральный, интраназальный, парентеральный (внутривенный, внутримышечный, внутрибрюшинный или подкожный), ректальный или местный. Введение включает в себя самостоятельное введение препарата и введение препарата другим лицом.As used herein, the term administration of an agent or drug to a subject includes any route of administration or delivery to a subject of a compound to perform its intended function. Administration can be by any suitable route, including oral, intranasal, parenteral (intravenous, intramuscular, intraperitoneal or subcutaneous), rectal or topical. Administration includes self-administration of the drug and administration of the drug by another person.

Применяемый в настоящем изобретении термин антитело в совокупности относится к иммуноглобулинам или иммуноглобулиноподобным молекулам, включая в качестве примера IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, но не ограничиваясь ими, их комбинации, а также аналогичные молекулы, продуцируемые во время иммунного ответа у любого позвоночного, например, у млекопитающих, таких как люди, козы, кролики и мыши, а также у видов, не относящихся к млекопитающим, таких как иммуноглобулины акул. В данном контексте антитела (включая интактные иммуноглобулины) и антигенсвязывающие фрагменты специфически связываются с представляющей интерес молекулой (или группой очень похожих представляющих интерес молекул), по существу исключая связывание с другими молекулами (например, антитела и фрагменты антител, которые имеют константу связывания для представляющей интерес молекулы, которая примерно в 103 М^-1 раз больше, примерно в 10⁴ М^-1 раз больше или примерно в 10⁵ М^-1раз больше, чем константа связывания для других молекул в биологическом образце). Термин антитело также включает генно-инженерные формы, такие как химерные антитела (например, гуманизированные мышиные антитела), гетероконъюгированные антитела (такие как биспецифические антитела). См. также Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, 111.); Kuby, J., Immunology, 3^rdEd., W.H. Freeman & Co., New York, 1997.As used herein, the term antibody collectively refers to immunoglobulins or immunoglobulin-like molecules, including by way of example, but not limited to IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, combinations thereof, as well as similar molecules produced during an immune response in any vertebrate , for example, in mammals such as humans, goats, rabbits and mice, as well as in non-mammalian species such as shark immunoglobulins. In this context, antibodies (including intact immunoglobulins) and antigen-binding fragments specifically bind to a molecule of interest (or a group of very similar molecules of interest), substantially excluding binding to other molecules (for example, antibodies and antibody fragments that have a binding constant for the molecule of interest molecule that is about 103 M ^-1 times larger, about 10 ⁴ M ^-1 times larger, or about 10 ⁵ M ^-1 times larger than the binding constant for other molecules in the biological sample). The term antibody also includes genetically engineered forms such as chimeric antibodies (eg, humanized murine antibodies), heteroconjugated antibodies (such as bispecific antibodies). See also Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, 111.); Kuby, J., Immunology, ^3rd Ed., W. H. Freeman & Co., New York, 1997.

В более конкретном смысле антитело относится к полипептидному лиганду, содержащему по меньшей мере вариабельную область иммуноглобулина легкой цепи или вариабельную область иммуноглобулина тяжелой цепи, которая специфически распознает и связывает эпитоп антигена. Антитела состоят из тяжелой и легкой цепи, каждая из которых имеет вариабельную область, называемую вариабельной областью тяжелой цепи (VH) и вариабельной областью легкой цепи (VL). Совместно область V_Hи область V_L ответственны за связывание антигена, распознаваемого антителом. Обычно иммуноглобулин имеет тяжелые (H) цепи и легкие (L) цепи, соединенные дисульфидными связями. Существует два типа легкой цепи: лямбда (λ) и каппа (к). Существует пять основных классов тяжелых цепей (или изотипов), которые определяют функциональную активность молекулы антитела: IgM, IgD, IgG, IgA и IgE. Каждая тяжелая и легкая цепь содержит константную область и вариабельную область (области также известны как домены). В комбинации вариабельные области тяжелой и легкой цепей специфически связывают антиген. Вариабельные области легкой и тяжелой цепей содержат каркасную область, прерванную тремя гипервариабельными областями, также известную как область, определяющая комплементарность (CDR). Степень каркасной области и области, определяющей комплементарность, была определена (см. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991, содержание включено в настоящее изобретение посредством ссылки). База данных Kabat теперь ведется онлайн. Последовательности каркасных областей различных легких или тяжелых цепей относительно консервативны в пределах одного вида. Каркасная область антитела, которая представляет собой комбинированные каркасные области составляющих легкой и тяжелой цепей, в значительной степени принимает конформацию β-складок, а области, определяющие комплементарность, образуют петли, которые соединяют и в некоторых случаях образуют часть структуры β-складок. Таким образом, каркасные области действуют, образуя каркас, который обеспечивает правильную ориентацию области, определяющей комплементарность, за счет межцепочечных нековалентных взаимодействий.More specifically, an antibody refers to a polypeptide ligand comprising at least an immunoglobulin light chain variable region or an immunoglobulin heavy chain variable region that specifically recognizes and binds an epitope of an antigen. Antibodies are composed of a heavy and a light chain, each of which has a variable region called a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL). Together, the V _H region and the V _L region are responsible for binding the antigen recognized by the antibody. Typically, immunoglobulin has heavy (H) chains and light (L) chains connected by disulfide bonds. There are two types of light chain: lambda (λ) and kappa (k). There are five main classes of heavy chains (or isotypes) that determine the functional activity of an antibody molecule: IgM, IgD, IgG, IgA and IgE. Each heavy and light chain contains a constant region and a variable region (regions are also known as domains). In combination, the heavy and light chain variable regions specifically bind antigen. The light and heavy chain variable regions contain a framework region interrupted by three hypervariable regions, also known as the complementarity determining region (CDR). The extent of the framework region and complementarity determining region has been determined (see Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, 1991, incorporated herein by reference). The Kabat database is now maintained online. The framework sequences of different light or heavy chains are relatively conserved within a species. The antibody framework region, which is the combined framework regions of the light and heavy chain constituents, largely adopts a β-sheet conformation, and the complementarity determining regions form loops that connect and in some cases form part of the β-sheet structure. Thus, the framework regions act to form a scaffold that ensures the correct orientation of the complementarity determining region through interchain non-covalent interactions.

В первую очередь область, определяющая комплементарность, ответственна за связывание с эпитопом антигена. Области, определяющие комплементарность, (CDR) каждой цепи обычно обозначают какThe complementarity determining region is primarily responsible for binding to the epitope of the antigen. The complementarity determining regions (CDRs) of each chain are usually designated as

- 10 044225- 10 044225

CDR1, CDR2 и CDR3, нумеруют последовательно, начиная с N-конца, и также обычно идентифицируют по цепи, в которой расположена конкретная CDR. Таким образом, VH CDR3 находится в вариабельном домене тяжелой цепи антитела, в котором она обнаружена, тогда как V_L CDR1 представляет собой CDR1 из вариабельного домена легкой цепи антитела, в котором она обнаружена. Антитело, которое связывает целевой белок (например, GPA33) или молекулу (например, DOTA или гаптен DOTA), будет иметь специфическую область V_H и последовательность области V_L и, следовательно, специфические последовательности CDR. Антитела с разной специфичностью (т.е. с разными паратопами для разных антигенов) имеют разные CDR. Хотя именно CDR варьируются от антитела к антителу, только ограниченное количество аминокислотных положений в пределах CDR непосредственно участвует в связывании антигена. Эти положения в CDR называются остатками, определяющими специфичность (SDR). Примеры антител включают моноклональные антитела, поликлональные антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, рекомбинантные антитела, мультиспецифические антитела, биспецифические антитела и фрагменты антител. Антитело специфически связано с антигеном.CDR1, CDR2 and CDR3 are numbered sequentially starting from the N-terminus and are also usually identified by the strand on which a particular CDR is located. Thus, VH CDR3 is located in the variable domain of the antibody heavy chain in which it is found, while V _L CDR1 is CDR1 from the variable domain of the light chain of the antibody in which it is found. An antibody that binds a target protein (eg, GPA33) or molecule (eg, DOTA or DOTA hapten) will have a specific V _H region and V _L region sequence and, therefore, specific CDR sequences. Antibodies with different specificities (i.e., different paratopes for different antigens) have different CDRs. Although CDRs vary from antibody to antibody, only a limited number of amino acid positions within a CDR are directly involved in antigen binding. These positions in the CDR are called specificity determining residues (SDRs). Examples of antibodies include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, humanized antibodies, chimeric antibodies, recombinant antibodies, multispecific antibodies, bispecific antibodies and antibody fragments. An antibody binds specifically to an antigen.

Биспецифическое антитело представляет собой антитело, которое может быть одновременно связанно с двумя разными антигенами. Биспецифические антитела (BsAb) и фрагменты биспецифических антител (BsFab) могут иметь по меньшей мере одно плечо, которое специфически связывается, например, с опухоль-ассоциированным антигеном (например, GPA33), и по меньшей мере другое плечо, которое специфически связывается с целевым конъюгатом, несущим терапевтический или диагностический агент (например, гаптен DOTA, связанный с радионуклидом). В данной области техники известно множество различных структур биспецифических антител. Согласно некоторым вариантам реализации каждый связывающий фрагмент в биспецифическом антителе содержит область VH и/или V_L из разных моноклональных антител. Согласно некоторым вариантам реализации биспецифическое антитело включает молекулу иммуноглобулина, содержащую области VH и/или VL, которые содержат CDR от первого моноклонального антитела, и фрагмент антитела (например, Fab, F(ab'), F(ab')₂, Fd, Fv, dAB, scFv и т.д.), содержащий области VH и/или VL, которые содержат CDR от второго моноклонального антитела.A bispecific antibody is an antibody that can be simultaneously bound to two different antigens. Bispecific antibodies (BsAb) and bispecific antibody fragments (BsFab) may have at least one arm that specifically binds, for example, to a tumor-associated antigen (eg, GPA33), and at least another arm that specifically binds to a target conjugate , carrying a therapeutic or diagnostic agent (for example, a DOTA hapten bound to a radionuclide). Many different bispecific antibody structures are known in the art. In some embodiments, each binding moiety in the bispecific antibody comprises a VH and/or _VL region from a different monoclonal antibody. In some embodiments, the bispecific antibody includes an immunoglobulin molecule comprising VH and/or VL regions that contain CDRs from the first monoclonal antibody, and an antibody fragment (e.g., Fab, F(ab'), F(ab') ₂ , Fd, Fv , dAB, scFv, etc.) containing VH and/or VL regions that contain the CDR from the second monoclonal antibody.

Применяемый в настоящем изобретении термин диатела относится к небольшим фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими участками, причем эти фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L) в той же самой полипептидной цепи (V_H V_L). При использовании линкера, который является слишком коротким для образования пары между двумя доменами в одной цепи, домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и формировать два антигенсвязывающих участка. Диатела описаны более подробно, например, в EP 404097; WO 93/11161; 30 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).As used herein, the term diabodies refers to small antibody fragments with two antigen-binding regions, these fragments containing a heavy chain variable domain (V _H ) linked to a light chain variable domain (V _L ) in the same polypeptide chain (V _H V _L ). When using a linker that is too short to pair between two domains on one chain, the domains are forced to pair with complementary domains on the other chain and form two antigen-binding sites. Diabodies are described in more detail, for example, in EP 404097; WO 93/11161; 30 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).

Применяемые в настоящем изобретении термины одноцепочечные антитела или одноцепочечный Fv (scFv) относятся к слитой молекуле антитела двух доменов фрагмента Fv, V_L и V_H. Молекулы одноцепочечных антител могут включать полимер с рядом отдельных молекул, например, димер, тример или другие полимеры. Кроме того, несмотря на то, что два домена фрагмента Fv, V_L и V_H кодируются отдельными генами, они могут быть соединены рекомбинантными способами с помощью синтетического линкера, который позволяет им находиться в виде единой белковой цепи, которая содержит V_L и пару областей V_H с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv)). Bird et al. (1988) Science 242:423-426 и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:5879-5883. Такие одноцепочечные антитела могут быть получены рекомбинантными способами или ферментативным или химическим расщеплением интактных антител.As used herein, the terms single chain antibody or single chain Fv (scFv) refer to the fusion of an antibody molecule of two Fv fragment domains, V _L and V _H . Single chain antibody molecules may include a polymer with a number of individual molecules, such as a dimer, trimer, or other polymers. In addition, although the two domains of the Fv fragment, V _L and V _H are encoded by separate genes, they can be joined recombinantly using a synthetic linker that allows them to reside as a single protein chain that contains the V _L and a pair of regions V _H to form monovalent molecules (known as single-chain Fv (scFv)). Bird et al. (1988) Science 242:423-426 and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:5879-5883. Such single-chain antibodies can be produced by recombinant methods or by enzymatic or chemical digestion of intact antibodies.

Применяемые в настоящем изобретении термины интактное антитело или интактный иммуноглобулин обозначают антитело или иммуноглобулин, которые содержат по меньшей мере два полипептида тяжелой (Н) цепи и два полипептида легкой (L) цепи, соединенные дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно HCVR или VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов: CH1, CH₂ и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно LCVR или V_L) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена C_L. Области VH и V_L могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR), с вкраплениями более консервативных областей, которые называются каркасными областями (FR). Каждая V_H и V_L состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца до карбоксильного конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR₃, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (Clq) классической системы комплемента.As used herein, the terms intact antibody or intact immunoglobulin refer to an antibody or immunoglobulin that contains at least two heavy (H) chain polypeptides and two light (L) chain polypeptides linked by disulfide bonds. Each heavy chain consists of a heavy chain variable region (abbreviated HCVR or VH) and a heavy chain constant region. The heavy chain constant region consists of three domains: CH1, _CH2 and CH3. Each light chain consists of a light chain variable region (abbreviated LCVR or V _L ) and a light chain constant region. The light chain constant region consists of a single C _L domain. The VH and _VL regions can be further subdivided into regions of hypervariability called complementarity determining regions (CDRs), interspersed with more conserved regions called framework regions (FRs). Each V _H and V _L consists of three CDRs and four FRs, located from the amino terminus to the carboxyl terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR ₃ , CDR3, FR4. The heavy and light chain variable regions contain a binding domain that interacts with the antigen. Antibody constant regions can mediate the binding of immunoglobulin to host tissues or factors, including various cells of the immune system (eg, effector cells) and the first component (Clq) of the classical complement system.

Применяемый в настоящем изобретении термин антиген относится к молекуле, с которой антитело может избирательно связываться. Антиген-мишень может представлять собой белок (например, антигенный пептид), углевод, нуклеиновую кислоту, липид, гаптен или другое встречающееся в природе или синтетическое соединение. Антиген можно также вводить животному-субъекту для создания иммунного ответа у субъекта.As used herein, the term antigen refers to a molecule to which an antibody can selectively bind. The target antigen may be a protein (eg, an antigenic peptide), carbohydrate, nucleic acid, lipid, hapten, or other naturally occurring or synthetic compound. The antigen can also be administered to an animal subject to create an immune response in the subject.

- 11 044225- 11 044225

Применяемый в настоящем изобретении термин антигенсвязывающий фрагмент относится к фрагменту полной структуры иммуноглобулина, который содержит часть полипептида, ответственного за связывание с антигеном. Примеры антигенсвязывающего фрагмента, применяемого в настоящем изобретении, включают scFv, (scFv)2, scFvFc, Fab, Fab' и F(ab')2, диатела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител; мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.As used herein, the term antigen-binding fragment refers to a fragment of the entire immunoglobulin structure that contains part of the polypeptide responsible for binding to the antigen. Examples of the antigen binding fragment used in the present invention include scFv, (scFv)2, scFvFc, Fab, Fab' and F(ab')2, diabodies; linear antibodies; single chain antibody molecules; multispecific antibodies formed from antibody fragments.

Под аффинностью связывания понимают силу общих нековалентных взаимодействий между одним участком связывания молекулы (например, антитела) и ее партнером по связыванию (например, антигеном). Аффинность молекулы X к ее партнеру Y обычно можно представить константой диссоциации (Kd). Аффинность можно измерить стандартными способами, известными в данной области, включая описанные в настоящем изобретении. Комплекс с низкой аффинностью содержит антитело, которое обычно легко диссоциирует от антигена, тогда как комплекс с высокой аффинностью содержит антитело, которое обычно остается связанным с антигеном в течение более длительного времени.Binding affinity refers to the strength of the overall non-covalent interactions between one binding site of a molecule (for example, an antibody) and its binding partner (for example, an antigen). The affinity of a molecule X for its partner Y can usually be represented by the dissociation constant (Kd). Affinity can be measured by standard methods known in the art, including those described in the present invention. A low affinity complex contains an antibody that usually dissociates easily from the antigen, whereas a high affinity complex contains an antibody that usually remains associated with the antigen for a longer time.

В контексте настоящего описания очищающий агент представляет собой агент, который связывается с избытком бифункциональных антител, присутствующих в компартменте крови субъекта, для облегчения быстрого выведения через почки. Применение очищающего агента перед введением радиотерапевтического средства на основе DOTA способствует лучшему соотношению поглощения опухолью к фоновому излучению в системах ПРИТ.As used herein, a scavenging agent is an agent that binds to excess bifunctional antibodies present in the blood compartment of a subject to facilitate rapid renal clearance. The use of a scavenging agent prior to the administration of DOTA radiotherapy promotes a better ratio of tumor uptake to background radiation in PRIT systems.

Применяемый в настоящем изобретении термин контрольный образец представляет собой альтернативный образец, используемый в эксперименте с целью сравнения. Контрольный образец может быть положительным или отрицательным. Например, если целью эксперимента является определение корреляции эффективности терапевтического агента для лечения конкретного типа заболевания или состояния, обычно применяют положительный контрольный образец (соединение или композиция, о которых известно, что они проявляют желаемый терапевтический эффект) и отрицательный контрольный образец (субъект или образец, которые не получают терапию или получают плацебо).As used herein, the term control sample is an alternative sample used in an experiment for comparison purposes. The control sample can be positive or negative. For example, if the purpose of an experiment is to determine the correlation of the effectiveness of a therapeutic agent for treating a particular type of disease or condition, it is common to use a positive control sample (a compound or composition known to exhibit the desired therapeutic effect) and a negative control sample (a subject or sample that is not receiving therapy or receiving placebo).

Применяемый в настоящем изобретении термин эффективное количество композиции означает количество, достаточное для достижения желаемого профилактического или терапевтического эффекта, например, количество, которое приводит к уменьшению симптомов, связанных с заболеванием, которое излечивает, например, заболевания или патологические состояния, связанные с целевым полипептидом (например, рак груди, колоректальный рак, рак мозга и т.д.). Количество композиции согласно настоящему изобретению, вводимой субъекту, будет зависеть от степени, типа и серьезности заболевания и от характеристик индивидуума, таких как общее состояние здоровья, возраст, пол, масса тела и толерантность к лекарствам. Квалифицированный специалист сможет определить подходящие дозировки в зависимости от этих и других факторов. Композиции согласно настоящему изобретению также можно вводить в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтическими соединениями.As used herein, the term effective amount of a composition means an amount sufficient to achieve the desired prophylactic or therapeutic effect, e.g., an amount that results in a reduction in symptoms associated with the disease being treated, e.g., diseases or conditions associated with the target polypeptide (e.g. , breast cancer, colorectal cancer, brain cancer, etc.). The amount of the composition of the present invention administered to a subject will depend on the extent, type and severity of the disease and on the characteristics of the individual, such as general health, age, sex, body weight and drug tolerance. A qualified practitioner will be able to determine appropriate dosages based on these and other factors. The compositions of the present invention may also be administered in combination with one or more additional therapeutic compounds.

Применяемый в настоящем изобретении термин эпитоп означает антигенную детерминанту, способную специфически связываться с антителом. Эпитопы обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул и обычно имеют определенные трехмерные структурные характеристики, а также определенные зарядовые характеристики.As used herein, the term epitope means an antigenic determinant capable of specifically binding to an antibody. Epitopes usually consist of chemically active surface moieties of molecules and usually have certain three-dimensional structural characteristics as well as certain charge characteristics.

Применяемый в настоящем изобретении термин образец относится к клиническим образцам, полученным от субъекта или выделенных микроорганизмов. Согласно некоторым вариантам реализации образец получают из биологического источника (т.е. биологического образца), такого как ткань, физиологическая жидкость или микроорганизмы, взятые у субъекта. Источники образцов включают слизь, мокроту, бронхиальный альвеолярный лаваж (BAL), бронхиальный промыв (BW), цельную кровь, физиологические жидкости, спинномозговую жидкость (CSF), мочу, плазму, сыворотку или ткань, но не ограничиваются ими.As used herein, the term sample refers to clinical samples obtained from a subject or isolated microorganisms. In some embodiments, the sample is obtained from a biological source (ie, a biological sample), such as tissue, body fluid, or microorganisms collected from a subject. Sample sources include, but are not limited to, mucus, sputum, bronchial alveolar lavage (BAL), bronchial wash (BW), whole blood, body fluids, cerebrospinal fluid (CSF), urine, plasma, serum, or tissue.

Применяемый в настоящем изобретении термин раздельное терапевтическое применение относится к введению по меньшей мере двух активных ингредиентов одновременно или по существу в одно и то же время разными путями.As used herein, the term separate therapeutic administration refers to the administration of at least two active ingredients simultaneously or at substantially the same time by different routes.

Применяемый в настоящем изобретении термин последовательное терапевтическое применение относится к введению по меньшей мере двух активных ингредиентов в разное время, причем пути введения идентичны или различаются. Более конкретно, последовательное применение относится к полному введению одного из активных ингредиентов до начала введения другого или других. Таким образом, можно вводить один из активных ингредиентов в течение нескольких минут, часов или суток до введения другого активного ингредиента или ингредиентов. В этом случае одновременного лечения не происходит.As used herein, the term sequential therapeutic administration refers to the administration of at least two active ingredients at different times, the routes of administration being identical or different. More specifically, sequential administration refers to the complete administration of one of the active ingredients before administration of the other or others. Thus, it is possible to administer one of the active ingredients within a few minutes, hours or days before administering the other active ingredient or ingredients. In this case, simultaneous treatment does not occur.

Применяемый в настоящем изобретении термин одновременное терапевтическое применение относится к введению по меньшей мере двух активных ингредиентов одним и тем же путем и в одно и то же время или по существу в одно и то же время.As used herein, the term simultaneous therapeutic administration refers to the administration of at least two active ingredients by the same route and at the same or substantially the same time.

Применяемый в настоящем изобретении термин специфически связывает относится к молекуле (например, антителу), которая распознает и связывается с другой молекулой (например, антигеном), но по существу не распознает и не связывается с другими молекулами. Термины специфическое связывание, специфически связывается с или специфично для конкретной молекулы (например, антигенаAs used herein, the term specifically binds refers to a molecule (eg, an antibody) that recognizes and binds to another molecule (eg, an antigen) but does not substantially recognize or bind to other molecules. The terms specific binding, specifically binds to or is specific for a particular molecule (for example, antigen

- 12 044225 или эпитопа на антигене), согласно их применению в настоящем изобретении, могут относиться, например, к молекуле, имеющей K_d для молекулы, с которой он связывается, примерно 10^-4, 10^-5, 10^-6, 10^-7, 10^-8,- 12 044225 or an epitope on an antigen), as used in the present invention, may refer, for example, to a molecule having a K _d for the molecule to which it binds of about 10 ^-4 , 10 ^-5 , 10 ^-6 , 10 ^{- 7} , 10 ^-8 ,

9, 10’¹⁰, 10^-11 или 10'2 М.9, 10' ¹⁰ , 10 ^-11 or 10'2 M.

В контексте настоящего описания термины субъект, индивидуум или пациент применяются взаимозаменяемо и относятся к индивидуальному организму, позвоночному, млекопитающему или человеку. В некоторых вариантах реализации индивидуум, пациент или субъект является человеком.As used herein, the terms subject, individual, or patient are used interchangeably and refer to an individual organism, vertebrate, mammal, or human. In some embodiments, the individual, patient, or subject is a human.

Применяемый в настоящем изобретении термин терапевтический агент предназначен для обозначения соединения, применение которого в эффективном количестве производит желаемый терапевтический эффект на нуждающийся в этом субъект.As used herein, the term therapeutic agent is intended to mean a compound that, when administered in an effective amount, produces a desired therapeutic effect on a subject in need thereof.

В контексте настоящего описания термины лечение или терапия охватывают лечение заболевания или расстройства, описанного в настоящем изобретении, у субъекта, такого как человек, и включает: (i) ингибирование заболевания или расстройства (остановку его развития); (ii) облегчение заболевания или расстройства (регрессию); (iii) замедление прогрессирования расстройства; и/или (iv) ингибирование, облегчение или замедление прогрессирования одного или нескольких симптомов заболевания или расстройства. Под лечением рака подразумевается, что симптомы, вызванные раком, например, облегчаются, уменьшаются, излечиваются или находятся в состоянии ремиссии.As used herein, the terms treatment or therapy include treating a disease or disorder described herein in a subject, such as a human, and includes: (i) inhibiting the disease or disorder (stopping its progression); (ii) alleviation of disease or disorder (regression); (iii) slowing the progression of the disorder; and/or (iv) inhibiting, alleviating or slowing the progression of one or more symptoms of a disease or disorder. Cancer treatment means that the symptoms caused by the cancer are, for example, alleviated, reduced, cured or put into remission.

Также следует принимать во внимание, что различные способы лечения заболеваний, как описано в настоящем изобретении, предназначены для обозначения существенного, который включает полное, но также меньшее, чем полное лечение, и при этом достигается некоторый биологически или медицински значимый результат. Лечение может представлять собой непрерывное пролонгированное лечение хронического заболевания или однократное либо кратковременное введение препарата для лечения обострения болезни.It should also be appreciated that the various methods of treating diseases as described in the present invention are intended to represent the essential, which includes complete, but also less than complete treatment, and while achieving some biologically or medically significant result. Treatment may be continuous, long-term treatment of a chronic disease or a single or short-term administration of a drug to treat an exacerbation of the disease.

Применение очищающих агентов в предварительно направленной радиоиммунотерапии (ПРИТ).Use of clearing agents in pretargeted radioimmunotherapy (PRIT).

Терапевтический индекс (ТИ) радиоиммунотерапии (РИТ) должен быть максимальным для эффективного лечения солидных опухолей (Larson SM et al., Nature Reviews Cancer 15: 347-60 (2015)). РИТ с радиомечеными антителами IgG характеризуется низким ТИ ввиду медленной фармакокинетики носителя IgG и, следовательно, зачастую неэффективна в переносимых дозах.The therapeutic index (TI) of radioimmunotherapy (RIT) should be maximized for effective treatment of solid tumors (Larson SM et al., Nature Reviews Cancer 15: 347-60 (2015)). RIT with radiolabeled IgG antibodies has a low TI due to the slow pharmacokinetics of the IgG carrier and is therefore often ineffective at tolerated doses.

Альтернативой является применение подхода предварительно направленной РИТ (ПРИТ). Во время ПРИТ этап медленной опосредованной антителами направленной доставки терапевтического препарата в область опухоли отделен от введения радиоактивного вещества. ПРИТ является многоступенчатым процессом, который решает проблему медленного выведения из крови антител, направленных в область опухоли, что способствует нежелательной токсичности для здоровых тканей, таких как костный мозг. Во время ПРИТ радионуклид или другой диагностический или терапевтический агент присоединяется к носителю, который имеет более благоприятную фармакокинетику (например, низкомолекулярное соединение с быстрым выведением через почки и низким поглощением здоровыми тканями и удержанием в организме (Orcutt KD et al., Molecular imaging and biology 13: 215-21 (2011), такое как гаптен DOTA), и доза поглощения здоровой тканью минимизирована при направленной доставке терапевтического препарата в область опухоли. Чтобы направить радиофармпрепарат на опухоль, циркулирующий терапевтический агент (например, гаптен DOTA) захватывается локализованным внутри опухоли биспецифическим антителом или иным образом эффективно выводится через почки.An alternative is to use a pre-targeted RIT (PRIT) approach. During PRIT, the step of slow antibody-mediated targeted delivery of the therapeutic drug to the tumor site is separated from the administration of the radioactive substance. PRIT is a multi-step process that addresses the slow clearance of tumor-targeted antibodies from the blood, which contributes to unwanted toxicity to healthy tissue such as bone marrow. During PRIT, a radionuclide or other diagnostic or therapeutic agent is coupled to a carrier that has more favorable pharmacokinetics (eg, a small molecule compound with rapid renal clearance and low healthy tissue uptake and retention (Orcutt KD et al., Molecular imaging and biology 13 : 215-21 (2011), such as the DOTA hapten), and the dose uptake into healthy tissue is minimized when targeting the therapeutic drug to the tumor site. To target the radiopharmaceutical to the tumor, the circulating therapeutic agent (for example, the DOTA hapten) is captured by a tumor-localized bispecific antibody or otherwise effectively excreted through the kidneys.

Очищающие агенты могут эффективно снижать концентрацию циркулирующей биомолекулы за счет образования больших комплексов в кровотоке, которые распознаются ретикулоэндотелиальной системой (RES), или, используя соответствующие гликогаптены, могут быть направлены на рецепторы асиалогликопротеинов печени (ASPGR) (Rossin R et al., Journal Nuclear Medicine 54:1989-95 (2013)). Терапевтический индекс DOTA-ПРИТ сильно варьируется в зависимости от дозировки очищающего агента, поскольку циркулирующее биспецифическое антитело сохраняет способность связывать радиомеченый гаптен DOTA. Чтобы максимально точно направить радиомеченый гаптен DOTA на опухоль, обычно используется насыщающая доза биспецифического антитела с целью обеспечить наибольшую концентрацию доменов антител анти-DOTA для связывания впоследствии вводимого радиомеченого гаптена DOTA. На этом этапе существует проблема удаления избытка циркулирующего несвязанного биспецифического антитела перед введением цитотоксического радиомеченного гаптена DOTA с целью максимизировать терапевтический индекс. Несмотря на то, что можно использовать длительные интервалы времени для обеспечения выведения из организма биспецифического антитела, это может повлиять на связывающую способность биспецифического антитела с радиогаптеном в опухоли, поскольку биспецифическое антитело может разлагаться и/или поглощаться в зависимости от молекулярной фармакологии комплекса биспецифическое антитело и антиген.Scavenging agents can effectively reduce the concentration of circulating biomolecules by forming large complexes in the bloodstream that are recognized by the reticuloendothelial system (RES) or, using appropriate glychaptens, can be targeted to liver asialoglycoprotein receptors (ASPGR) (Rossin R et al., Journal Nuclear Medicine 54:1989-95 (2013)). The therapeutic index of DOTA-PRIT varies greatly depending on the dosage of the scavenging agent because the circulating bispecific antibody retains the ability to bind the radiolabeled DOTA hapten. To target the radiolabeled DOTA hapten to the tumor as accurately as possible, a saturating dose of the bispecific antibody is typically used to provide the highest concentration of anti-DOTA antibody domains to bind the subsequently administered radiolabeled DOTA hapten. At this stage, there is the problem of removing excess circulating unbound bispecific antibody before introducing the cytotoxic radiolabeled DOTA hapten in order to maximize the therapeutic index. Although long time intervals can be used to ensure clearance of the bispecific antibody, this may affect the binding ability of the bispecific antibody to the radiohapten in the tumor since the bispecific antibody may be degraded and/or absorbed depending on the molecular pharmacology of the bispecific antibody-antigen complex .

Конъюгат декстран и гаптен DOTA в количестве 500 кДа (Orcutt KD et al., Molecular Cancer Therapeutics 11: 1365-72 (2012)) ранее применялся для DOTA ПРИТ с применением карциноэмбрионального антигена. Очищающий агент на основе декстрана был разработан для связывания с доменами антиDOTA(M)-scFv циркулирующего биспецифического антитела посредством фрагмента молекулы DOTA(Y), отображаемого на декстрановом каркасе, и выведения несвязанного биспецифического антитела из крови посредством распознавания и катаболизма ретикулоэндотелиальной системой (РЭС). Из-за егоA 500 kDa dextran/DOTA hapten conjugate (Orcutt KD et al., Molecular Cancer Therapeutics 11: 1365-72 (2012)) has previously been used for DOTA PRIT using carcinoembryonic antigen. The dextran-based scavenging agent was designed to bind to the antiDOTA(M)-scFv domains of circulating bispecific antibody via a moiety of the DOTA(Y) molecule displayed on a dextran scaffold and clear the unbound bispecific antibody from the blood through recognition and catabolism by the reticuloendothelial system (RES). Because of him

- 13 044225 большого размера связывание очищающего агента на основе декстрана с опухоль-ассоциированным биспецифическим антителом ограничено из-за слабой внутиопухолевой экстравазации.- 13 044225 large size, the binding of the dextran-based scavenging agent to the tumor-associated bispecific antibody is limited due to poor intratumoral extravasation.

Несмотря на высокую эффективность, применение очищающего агента на основе декстрана имеет недостатки. Как полимер глюкозы природного происхождения, декстрановый каркас по своей природе полидисперсен, что создает проблемы, связанные с производством от партии к партии и применением in vivo. Кроме того, ферментативное разложение ретикулоэндотелиальной системой декстран-1,6глюкозидазы может привести к введению в кровоток его гаптен-фрагментов, которые могут конкурировать с радиогаптеном за связывание с опухолевым биспецифическим антителом. Подобные проблемы наблюдались и при применении очищающего агента на основе альбумина во время клинической стрептавидин-биотиновой ПРИТ (Knox SJ et al., Clinical Cancer Research 6: 406-14 (2000); Breitz HB et al., Journal Nuclear Medicine 41: 131-40 (2000)).Despite its high efficiency, the use of a dextran-based cleaning agent has disadvantages. As a naturally occurring glucose polymer, the dextran scaffold is polydisperse in nature, which poses challenges associated with batch-to-batch production and in vivo application. In addition, enzymatic degradation of dextran-1,6 glucosidase by the reticuloendothelial system can lead to the introduction of its hapten fragments into the bloodstream, which can compete with radiohapten for binding to the tumor bispecific antibody. Similar problems have been observed with the use of an albumin-based scavenging agent during clinical streptavidin-biotin PRRT (Knox SJ et al., Clinical Cancer Research 6: 406-14 (2000); Breitz HB et al., Journal Nuclear Medicine 41: 131- 40 (2000)).

Композиции согласно настоящему изобретению.Compositions according to the present invention.

- 14 044225- 14 044225

Согласно любому варианту реализации настоящего изобретения соединение может представлять собой очищающий агент (также называемый в настоящем изобретении очищающим агентом на основе дендронов согласно настоящему изобретению, ОА на основе дендронов согласно настоящему изобретению или т.п.) видаAccording to any embodiment of the present invention, the compound may be a cleaning agent (also referred to herein as a dendron-based cleaning agent of the present invention, a dendron-based OA of the present invention, or the like) of the form

- 15 044225- 15 044225

- 16 044225- 16 044225

или его фармацевтически приемлемую соль и/или сольват, в котором М¹, М², М³, М⁴, М⁵ каждый независимо представляет собой Lu³⁺, Sc³⁺, Ga³⁺, Y³⁺, In³⁺, La³⁺, Ce³⁺, Eu³⁺, Tb³⁺, или Gd³⁺; X¹, X², X³, X⁴, X⁵, X⁶, X⁷, X⁸, X⁹, X¹⁰, X¹¹, X¹², X¹³, X¹⁴, X¹⁵, X¹⁶, X¹⁷, X¹⁸, X¹⁹, X²⁰ каждый независимо представляет собой H или неподеленную пару электронов, (т.е. обеспечивает анион кислорода); Y¹, Y², Y³, Y⁴, Y⁵ каждый независимо представляет собой О или S; x равен 1, 2 или 3; y равен 1, 2, 3 или 4.or a pharmaceutically acceptable salt and/or solvate thereof, in which M ¹ , M ² , M ³ , M ⁴ , M ⁵ are each independently Lu ³⁺ , Sc ³⁺ , Ga ³⁺ , Y ³⁺ , In ³⁺ , La ³⁺ , Ce ³⁺ , Eu ³⁺ , Tb ³⁺ , or Gd ³⁺ ; X ¹ , X ² , X 3, X ⁴ , X ⁵ , X ⁶ , ^{X 7} ^, X ⁸ , X 9, X ¹⁰ , X ¹¹ , X ¹² , X ¹³ , X ¹⁴ , X ¹⁵ , ^{X 16} ^, X ¹⁷ , X ¹⁸ , X ¹⁹ , X ²⁰ each independently represents H or a lone pair of electrons (ie, provides an oxygen anion); Y ¹ , Y ² , Y ³ , Y ⁴ , Y ⁵ are each independently O or S; x is 1, 2 or 3; y is 1, 2, 3 or 4.

Согласно любому варианту реализации настоящего изобретения может оказаться, что М¹, М², М³, М⁴, М⁵ каждый независимо не является радионуклидом. Согласно любому варианту реализации настоящего изобретения может оказаться, что Y¹, Y², Y³, Y⁴, Y⁵ каждый независимо представляют собой S. Согласно любому варианту реализации настоящего изобретения может оказаться, что x равен 1 или 2. Согласно любому варианту реализации настоящего изобретения может оказаться, что y равен 2 или 3.According to any embodiment of the present invention, it may be that M ¹ , M ² , M ³ , M ⁴ , M ⁵ are each independently not a radionuclide. In any embodiment of the present invention, it may be that Y ¹ , Y ² , Y ³ , Y ⁴ , Y ⁵ are each independently S. In any embodiment of the present invention, x may be 1 or 2. In any embodiment of the present invention, it may turn out that y is equal to 2 or 3.

В родственном аспекте предложена композиция, которая включает один или несколько соединенийIn a related aspect, a composition is provided that includes one or more compounds

- 17 044225 из любого варианта реализации соединения, как описано выше, и фармацевтически приемлемый носитель (в совокупности такие носители, эксципиенты, наполнители и т. д. будут называться фармацевтически приемлемые носители, если не применяется более конкретный термин). Композиции можно использовать в способах и представлениях, описанных в настоящем изобретении. Настоящее изобретение также обеспечивает фармацевтические композиции и лекарственные средства, которые включают одно или несколько соединений из любого варианта реализации соединения, как описано выше, и фармацевтически приемлемый носитель. Такие фармацевтические композиции могут быть укомплектованы в единичную лекарственную форму. Фармацевтические композиции и лекарственные средства могут быть получены путем смешивания одного или нескольких соединений согласно настоящему изобретению, их фармацевтически приемлемых солей и/или их сольватов с фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами, связующими веществами, разбавителями и т.п. Например, такие композиции могут быть представлены в форме гранул, порошков, таблеток, капсул, сиропа, суппозиториев, инъекций, эмульсий, эликсиров, суспензий или растворов. Настоящие композиции могут быть составлены для различных путей введения, например, перорального, парентерального или ректального введения. Парентеральное или системное введение включает подкожные, внутривенные, внутрибрюшинные и внутримышечные инъекции, но не ограничивается ими. Следующие лекарственные формы приведены в качестве примера и не должны рассматриваться как ограничивающие настоящее изобретение.- 17 044225 of any embodiment of the compound as described above, and a pharmaceutically acceptable carrier (collectively, such carriers, excipients, excipients, etc. will be referred to as pharmaceutically acceptable carriers unless a more specific term is used). The compositions can be used in the methods and presentations described in the present invention. The present invention also provides pharmaceutical compositions and drugs that include one or more compounds of any embodiment as described above and a pharmaceutically acceptable carrier. Such pharmaceutical compositions may be packaged into a unit dosage form. Pharmaceutical compositions and drugs can be prepared by mixing one or more compounds of the present invention, pharmaceutically acceptable salts thereof and/or solvates thereof with pharmaceutically acceptable carriers, excipients, binders, diluents, and the like. For example, such compositions may be in the form of granules, powders, tablets, capsules, syrup, suppositories, injections, emulsions, elixirs, suspensions or solutions. The present compositions can be formulated for various routes of administration, for example, oral, parenteral or rectal administration. Parenteral or systemic administration includes, but is not limited to, subcutaneous, intravenous, intraperitoneal and intramuscular injections. The following dosage forms are provided by way of example and should not be construed as limiting the present invention.

Для перорального, трансбуккального и сублингвального введения порошки, суспензии, гранулы, таблетки, пилюли, капсулы, желатиновые капсулы и каплеты приемлемы в качестве твердых лекарственных форм. Они могут быть получены, например, путем смешивания одного или нескольких соединений согласно настоящему изобретению или их фармацевтически приемлемых солей или таутомеров по меньшей мере с одной добавкой, такой как крахмал или другая добавка. Приемлемыми добавками являются сахароза, лактоза, сахар целлюлозы, маннит, мальтит, декстран, крахмал, агар, альгинаты, хитины, хитозаны, пектины, трагакантовая камедь, аравийская камедь, желатины, коллагены, казеин, альбумин, синтетические или полусинтетические полимеры или глицериды. Необязательно, пероральные лекарственные формы могут содержать другие ингредиенты, способствующие введению, такие как неактивный разбавитель, или смазывающие вещества, такие как стеарат магния, или консерванты, такие как парабен или сорбиновая кислота, или антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, токоферол или цистеин, разрыхлитель, связующие агенты, загустители, буферы, подсластители, вкусовые добавки или ароматизирующие добавки. Таблетки и пилюли могут быть дополнительно обработаны подходящими покрывающими материалами, известными в данной области техники.For oral, buccal and sublingual administration, powders, suspensions, granules, tablets, pills, capsules, gelatin capsules and caplets are acceptable as solid dosage forms. They can be prepared, for example, by mixing one or more compounds of the present invention or pharmaceutically acceptable salts or tautomers thereof with at least one additive, such as starch or other additive. Acceptable additives include sucrose, lactose, cellulose sugar, mannitol, maltitol, dextran, starch, agar, alginates, chitins, chitosans, pectins, gum tragacanth, gum acacia, gelatins, collagens, casein, albumin, synthetic or semi-synthetic polymers or glycerides. Optionally, oral dosage forms may contain other ingredients to aid administration, such as an inactive diluent, or lubricants, such as magnesium stearate, or preservatives, such as paraben or sorbic acid, or antioxidants, such as ascorbic acid, tocopherol or cysteine, a disintegrant , binding agents, thickeners, buffers, sweeteners, flavoring agents or flavoring agents. Tablets and pills can be further treated with suitable coating materials known in the art.

Жидкие лекарственные формы для перорального введения могут быть представлены в форме фармацевтически приемлемых эмульсий, сиропов, эликсиров, суспензий и растворов, которые могут содержать неактивный разбавитель, такой как вода. Фармацевтические составы и лекарственные средства могут быть приготовлены в форме жидких суспензий или растворов с использованием стерильной жидкости, такой как масло, вода, спирт и их комбинации, но не ограничиваться ими. Фармацевтически приемлемые поверхностно-активные вещества, суспендирующие агенты, эмульгирующие агенты могут быть добавлены для перорального или парентерального введения.Liquid dosage forms for oral administration may be in the form of pharmaceutically acceptable emulsions, syrups, elixirs, suspensions and solutions, which may contain an inactive diluent such as water. Pharmaceutical formulations and drugs may be prepared in the form of liquid suspensions or solutions using a sterile liquid such as, but not limited to, oil, water, alcohol, and combinations thereof. Pharmaceutically acceptable surfactants, suspending agents, emulsifying agents may be added for oral or parenteral administration.

Как отмечалось выше, суспензии могут включать масла. Такие масла включают арахисовое масло, кунжутное масло, хлопковое масло, кукурузное масло и оливковое масло, но не ограничиваются ими. Препарат в виде суспензии может также содержать сложные эфиры жирных кислот, такие как этилолеат, изопропилмиристат, глицериды жирных кислот и глицериды ацетилированных жирных кислот. Составы суспензий могут включать спирты, такие как этанол, изопропиловый спирт, гексадециловый спирт, глицерин и пропиленгликоль, но не ограничиваться ими. Простые эфиры могут быть представлены полиэтиленгликолем, нефтяными углеводородами, такими как минеральное масло и вазелин, но не ограничиваться ими; вода также может использоваться в составах суспензий.As noted above, suspensions may include oils. Such oils include, but are not limited to, peanut oil, sesame oil, cottonseed oil, corn oil and olive oil. The suspension formulation may also contain fatty acid esters such as ethyl oleate, isopropyl myristate, fatty acid glycerides and acetylated fatty acid glycerides. Suspension formulations may include, but are not limited to, alcohols such as ethanol, isopropyl alcohol, hexadecyl alcohol, glycerin, and propylene glycol. Ethers may include, but are not limited to, polyethylene glycol, petroleum hydrocarbons such as mineral oil and petroleum jelly; water can also be used in suspension formulations.

Инъекционные лекарственные формы обычно включают водные суспензии или масляные суспензии, которые могут быть приготовлены с применением подходящего диспергатора или смачивающего агента и суспендирующего агента. Инъекционные формы могут находиться в фазе раствора или в форме суспензии, которую готовят с применением растворителя или разбавителя. Приемлемые растворители или несущие среды включают стерилизованную воду, раствор Рингера или изотонический водный физиологический раствор. Изотонический раствор следует понимать как изотонический по отношению к объекту. В другом варианте могут быть применены стерильные масла в качестве растворителей или суспендирующих агентов. Обычно масло или жирная кислота являются нелетучими, включая натуральные или синтетические масла, жирные кислоты, моно-, ди- или триглицериды.Injectable dosage forms typically include aqueous suspensions or oily suspensions, which can be prepared using a suitable dispersant or wetting agent and suspending agent. Injectable forms can be in the solution phase or in the form of a suspension, which is prepared using a solvent or diluent. Acceptable solvents or carrier media include sterilized water, Ringer's solution, or isotonic aqueous saline. An isotonic solution should be understood as isotonic with respect to the object. Alternatively, sterile oils may be used as solvents or suspending agents. Typically the oil or fatty acid is non-volatile, including natural or synthetic oils, fatty acids, mono-, di- or triglycerides.

Для инъекции фармацевтический состав и/или лекарственное средство могут представлять собой порошок, пригодный для восстановления приемлемым раствором, как описано выше. Их примеры включают лиофилизированные порошки, порошки, полученные роторной сушкой или порошки, полученные распылительной сушкой, аморфные порошки, гранулы, преципитаты или частицы, но не ограничиваются ими. Для инъекции составы могут необязательно содержать стабилизаторы, модификаторы pH, поверхностно-активные вещества, модификаторы биодоступности и их комбинации.For injection, the pharmaceutical composition and/or drug may be in the form of a powder suitable for reconstitution with a suitable solution as described above. Examples thereof include, but are not limited to, lyophilized powders, rotary-dried or spray-dried powders, amorphous powders, granules, precipitates or particles. For injection, the formulations may optionally contain stabilizers, pH modifiers, surfactants, bioavailability modifiers, and combinations thereof.

Помимо данных типичных лекарственных форм, описанных выше, фармацевтически приемлемыеIn addition to these typical dosage forms described above, pharmaceutically acceptable

- 18 044225 эксципиенты и носители обычно известны специалистам в данной области техники и, таким образом, включены в настоящее изобретение. Такие эксципиенты и носители описаны, например, в Remingtons- 18 044225 excipients and carriers are generally known to those skilled in the art and are thus included in the present invention. Such excipients and carriers are described, for example, in Remingtons

Pharmaceutical Sciences Mack Pub. Co., New Jersey (1991); содержание включено в настоящее изобретение посредством ссылки.Pharmaceutical Sciences Mack Pub. Co., New Jersey (1991); the contents are incorporated into the present invention by reference.

Составы согласно настоящему изобретению могут быть выполнены с возможностью короткого действия, быстрого высвобождения, длительного действия и медленного высвобождения, как описано ниже. Таким образом, фармацевтические составы также могут быть выполнены с возможностью контролируемого высвобождения или медленного высвобождения.The compositions of the present invention can be formulated as short-acting, quick-release, long-acting, and slow-release as described below. Thus, pharmaceutical formulations can also be formulated as controlled release or slow release.

Настоящие композиции могут также содержать, например, мицеллы или липосомы или некоторую другую инкапсулированную форму, или могут вводиться в форме с медленным высвобождением с возможностью длительного хранения и/или доставки. Следовательно, фармацевтические составы и лекарственные средства могут быть спрессованы в шарики или цилиндры и имплантированы внутримышечно или подкожно в виде инъекций веществ замедленного всасывания или в виде имплантатов, таких как стенты. В таких имплантатах могут использоваться известные инертные материалы, такие как силиконы и биоразлагаемые полимеры.The present compositions may also contain, for example, micelles or liposomes or some other encapsulated form, or may be administered in a slow-release form for long-term storage and/or delivery. Therefore, pharmaceutical formulations and drugs can be compressed into pellets or cylinders and implanted intramuscularly or subcutaneously as depot injections or as implants such as stents. Such implants may use known inert materials such as silicones and biodegradable polymers.

Конкретные дозировки могут быть скорректированы в зависимости от состояния заболевания, возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола и диеты субъекта, интервалов доз, путей введения, скорости выведения и комбинаций лекарственных средств. Любая из указанных выше дозированных форм, содержащих эффективные количества, находится в пределах периодических экспериментов и, следовательно, в пределах объема настоящего изобретения.Specific dosages may be adjusted depending on the disease state, age, body weight, general health, sex and diet of the subject, dosage intervals, routes of administration, rates of elimination, and drug combinations. Any of the above dosage forms containing effective amounts are within the scope of batch experiments and, therefore, within the scope of the present invention.

Терапевтические методики согласно настоящему изобретению.Therapeutic techniques according to the present invention.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение обеспечивает способ повышения чувствительности опухоли к лучевой терапии у субъекта с диагнозом рака, включающий (а) введение субъекту в эффективном количестве биспецифического антитела анти-DOTA, причем биспецифическое антитело анти-DOTA выполнено с возможностью локализации в опухоли, экспрессирующей мишень опухолевого антигена; (б) введение субъекту в эффективном количестве очищающего агента согласно настоящему изобретению; (в) введение субъекту в эффективном количестве радиомеченого гаптена DOTA, причем гаптен DOTA выполнен с возможностью образования комплекса с биспецифическим антителом антиDOTA.In one aspect, the present invention provides a method of sensitizing a tumor to radiation therapy in a subject diagnosed with cancer, comprising (a) administering to the subject an effective amount of an anti-DOTA bispecific antibody, wherein the anti-DOTA bispecific antibody is configured to localize to a tumor expressing a tumor target. antigen; (b) administering to the subject an effective amount of a cleansing agent according to the present invention; (c) administering to the subject an effective amount of a radiolabeled DOTA hapten, wherein the DOTA hapten is configured to form a complex with an anti-DOTA bispecific antibody.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение обеспечивает способ лечения рака у нуждающегося в этом субъекта, включающий (а) введение субъекту в эффективном количестве биспецифического антитела анти-DOTA, причем биспецифическое антитело анти-DOTA выполнено с возможностью локализации в опухоли, экспрессирующей мишень опухолевого антигена; (б) введение субъекту в эффективном количестве очищающего агента согласно настоящему изобретению; (в) введение субъекту в эффективном количестве радиомеченого гаптена DOTA, причем гаптен DOTA выполнен с возможностью образования комплекса с биспецифическим антителом анти-DOTA. Способы лечения рака могут дополнительно включать последовательное, раздельное или одновременное введение субъекту по меньшей мере одного химиотерапевтического агента, выбранного из группы, состоящей из азотистых ипритов, производных этиленимина, алкилсульфонатов, нитрозомочевин, гемцитабина, триазенов, аналогов фолиевой кислоты, антрациклинов, таксанов, ингибиторов ЦОГ-2, аналогов пиримидина, аналогов пурина, антибиотиков, ингибиторов ферментов, эпиподофиллотоксинов, координационных комплексов платины, алкалоидов барвинка, замещенных мочевин, производных метилгидразина, адренокортикальных супрессоров, антагонистов гормонов, эндостатина, таксолов, камптотецинов, SN-38, доксорубицина, аналогов доксорубицина, антиметаболитов, алкилирующих агентов, антимитотиков, антиангиогенных агентов, ингибиторов тирозинкиназы, ингибиторов mTOR, ингибиторов белка теплового шока (HSP90), ингибиторов протеосом, ингибиторов HDAC, проапоптотических агентов, метотрексата, СРТ-11.In another aspect, the present invention provides a method of treating cancer in a subject in need thereof, comprising (a) administering to the subject an effective amount of an anti-DOTA bispecific antibody, wherein the anti-DOTA bispecific antibody is configured to localize to a tumor expressing a target tumor antigen; (b) administering to the subject an effective amount of a cleansing agent according to the present invention; (c) administering to the subject an effective amount of a radiolabeled DOTA hapten, wherein the DOTA hapten is configured to form a complex with an anti-DOTA bispecific antibody. Methods of treating cancer may further include sequential, separate, or simultaneous administration to a subject of at least one chemotherapeutic agent selected from the group consisting of nitrogen mustards, ethyleneimine derivatives, alkylsulfonates, nitrosoureas, gemcitabine, triazenes, folic acid analogues, anthracyclines, taxanes, COX inhibitors -2, pyrimidine analogs, purine analogs, antibiotics, enzyme inhibitors, epipodophyllotoxins, platinum coordination complexes, vinca alkaloids, substituted ureas, methylhydrazine derivatives, adrenocortical suppressors, hormone antagonists, endostatin, taxols, camptothecins, SN-38, doxorubicin, doxorubicin analogs, antimetabolites, alkylating agents, antimitotics, antiangiogenic agents, tyrosine kinase inhibitors, mTOR inhibitors, heat shock protein (HSP90) inhibitors, proteasome inhibitors, HDAC inhibitors, proapoptotic agents, methotrexate, CPT-11.

Дополнительно или в другом варианте согласно некоторым вариантам реализации способов, раскрытых в настоящем изобретении, уровни радиоактивности, испускаемые комплексом радиомеченого гаптена DOTA и биспецифического антитела анти-DOTA, выявляются между 4 и 24 ч после введения радиомеченого гаптена DOTA. Уровни радиоактивности, испускаемые комплексом, могут быть выражены в виде процента введенной дозы на грамм ткани (% ВД/г). Эталонное значение может быть рассчитано путем измерения уровней радиоактивности, присутствующих в неопухолевых (здоровых) тканях, и вычисления средних уровней радиоактивности, присутствующих в неопухолевых (здоровых) тканях ± стандартное отклонение. Согласно некоторым вариантам реализации эталонное значение представляет собой стандартное значение поглощения (СЗП). См. Thie JA, J. Nucl Med. 45 (9): 1431-4 (2004). Терапевтическая эффективность такого комплекса может быть определена путем вычисления отношения площади под фармакокинетической кривой опухоли к площади под фармакокинетической кривой здоровой ткани. Согласно некоторым вариантам реализации комплекс характеризуется отношением площади под фармакокинетической кривой опухоли к площади под фармакокинетической кривой здоровой ткани примерно 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1 или 100:1. Дополнительно или в другом варианте, согласно некоторым вариантам реализации способов, раскрытых в настоящем изобретении, отношение уровней радиоак- 19 044225 тивности опухоли к уровням радиоактивности здоровой ткани составляет примерно 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1,Additionally or alternatively, according to some embodiments of the methods disclosed herein, the levels of radioactivity emitted by the complex of the radiolabeled DOTA hapten and the anti-DOTA bispecific antibody are detected between 4 and 24 hours after administration of the radiolabeled DOTA hapten. The levels of radioactivity emitted by the complex can be expressed as a percentage of the administered dose per gram of tissue (% ID/g). The reference value can be calculated by measuring the levels of radioactivity present in non-neoplastic (healthy) tissues and calculating the mean levels of radioactivity present in non-neoplastic (healthy) tissues ± standard deviation. In some embodiments, the reference value is a standard absorbance value (SAV). See Thie JA, J. Nucl Med. 45 (9): 1431-4 (2004). The therapeutic efficacy of such a complex can be determined by calculating the ratio of the area under the pharmacokinetic curve of the tumor to the area under the pharmacokinetic curve of healthy tissue. In some embodiments, the complex has a ratio of the area under the tumor pharmacokinetic curve to the area under the pharmacokinetic curve of healthy tissue of approximately 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9: 1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1 or 100:1. Additionally or alternatively, according to some embodiments of the methods disclosed herein, the ratio of tumor radioactivity levels to healthy tissue radioactivity levels is approximately 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6: 1,

7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1,7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55: 1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1,

95:1 или 100:1.95:1 or 100:1.

Дополнительно или в другом варианте, согласно некоторым вариантам реализации способов, раскрытых в настоящем изобретении, опухолевый антиген-мишень выбирается из группы, состоящей из GPA33, HER2/neu, GD2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, MUM-1, CDK4, Nацетилглюкозаминилтрансферазы, р15, gp75, бета-катенина, ErbB2, ракового антигена 125 (СА-125), карциноэмбрионального антигена (СЕА), RAGE, MART (антигена меланомы), MUC-1, MUC-2, MUC-3, MUC-4, MUC-5ac, MUC-16, MUC-17, тирозиназы, Pmel 17 (gp100), последовательности интрона GnT-V подтипа V (последовательности V интрона N-ацетилглюкоаминилтрансферазы подтипа V), рака простаты psm, PRAME (антигена меланомы), β-катенина, EBNA (ядерного антигена вируса Эпштейна-Барра) 16, р53, белка устойчивости рака легких к противоопухолевым препаратам (LRP) Bcl-2, простатоспецифического антигена (PSA), Ki-67, CEACAM6, специфического антигена-р толстой кишки (CSAp), HLA-DR, CD40, CD74, CD138, EGFR, EGP-1, EGP-2, VEGF, P1GF, инсулиноподобного фактора роста (ILGF), тенасцина, тромбоцитарного фактора роста, IL-6, CD20, CD19, PSMA, CD33, CD123, MET, DLL4, Ang-2, HER3, IGF-1R, CD30, TAG-72, SPEAP, CD45, L1-CAM, антигена Льюиса Y (Ley), E-кадгерина, Vкадгерина, ЕрСАМ.Additionally or alternatively, according to some embodiments of the methods disclosed herein, the target tumor antigen is selected from the group consisting of GPA33, HER2/neu, GD2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE -2, MUM-1, CDK4, Nacetylglucosaminyltransferase, p15, gp75, beta-catenin, ErbB2, cancer antigen 125 (CA-125), carcinoembryonic antigen (CEA), RAGE, MART (melanoma antigen), MUC-1, MUC- 2, MUC-3, MUC-4, MUC-5ac, MUC-16, MUC-17, tyrosinase, Pmel 17 (gp100), GnT-V subtype V intron sequences (N-acetylglucoaminyltransferase subtype V intron V sequences), prostate cancer psm, PRAME (melanoma antigen), β-catenin, EBNA (Epstein-Barr virus nuclear antigen) 16, p53, lung cancer resistance protein (LRP) Bcl-2, prostate-specific antigen (PSA), Ki-67, CEACAM6 , colon specific antigen-p (CSAp), HLA-DR, CD40, CD74, CD138, EGFR, EGP-1, EGP-2, VEGF, P1GF, insulin-like growth factor (ILGF), tenascin, platelet-derived growth factor, IL- 6, CD20, CD19, PSMA, CD33, CD123, MET, DLL4, Ang-2, HER3, IGF-1R, CD30, TAG-72, SPEAP, CD45, L1-CAM, Lewis antigen Y (Ley), E-cadherin , Vcadherina, ErCAM.

Дополнительно или в другом варианте, согласно некоторым вариантам реализации способов, раскрытых в настоящем изобретении, рак выбран из группы, состоящей из рака груди, колоректального рака, рака шейки матки, рака яичников, рака печени, рака мочевого пузыря, гепатомы, гепатоцеллюлярной карциномы, рака мозга, рака легких, рака желудочно-кишечного тракта или рака желудка, рака поджелудочной железы, рака щитовидной железы, рака почек, рака простаты, меланомы, саркомы, карциномы, опухоли Вильмса, рака эндометрия, глиобластомы, плоскоклеточного рака, астроцитомы, карциномы слюнной железы, рака вульвы, карциномы полового члена, рака головы и шеи. Рак головного мозга может представлять собой аденому гипофиза, менингиому, нейробластому или краниофарингиому.Additionally or alternatively, according to some embodiments of the methods disclosed herein, the cancer is selected from the group consisting of breast cancer, colorectal cancer, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, hepatoma, hepatocellular carcinoma, cancer brain, lung cancer, gastrointestinal or stomach cancer, pancreatic cancer, thyroid cancer, kidney cancer, prostate cancer, melanoma, sarcoma, carcinoma, Wilms tumor, endometrial cancer, glioblastoma, squamous cell carcinoma, astrocytoma, salivary gland carcinoma , vulvar cancer, penile carcinoma, head and neck cancer. Brain cancer can be a pituitary adenoma, meningioma, neuroblastoma, or craniopharyngioma.

Дополнительно или в другом варианте, согласно некоторым вариантам реализации способов, раскрытых в настоящем изобретении, радиомеченый гаптен DOTA включает одно или несколько из соединений, таких как Proteus-DOTA, S-2-(R-аминобензил)-1,4,7,10-тетраазациклододекантетрауксусная кислота (DOTA-Bn), DOTA-Bn-биотин, BAD (((S)-2-(4-(2-бром)ацетамидо)бензил)-DOTA), NBD ((S)-2-(4нитробензил)-DOTA), DOTA-RGD, DOTA-PEG-E(c(RGDyK))₂, DOTA-8-AOC-BBN, p-NO₂-Bn-DOTA, DOTA-PESIN, DOTA-биотин-саркозин (DOTA-биотин), моно 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10тетрауксусной кислоты (сложный эфир N-гидроксисукцинимида) (DOTA-NHS) или DOTATyrLysDOTA. Альтернативно, любой радиомеченый гаптен DOTA, известный в данной области техники, может быть применен в способах, раскрытых в настоящем изобретении. Радиомеченый гаптен DOTA может быть помечен радионуклидом, выбранным из группы, состоящей из ²¹³Bi, ²¹¹At, ²²⁵Ac, ¹⁵²Dy, ²¹²Bi, ²²³Ra, ²¹⁹Rn, ²¹⁵Po, ²¹¹Bi, ²²¹Fr, ²¹⁷At, ²⁵⁵Fm, ⁸⁶Y, ⁹⁰Y, ⁸⁹Sr, ¹⁶⁵Dy, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁷⁷Lu, ⁶⁷Cu, ¹ⁿIn, ⁶⁷Ga, ⁵¹Cr, ⁵⁸Co, ^99mTc, ^103mRh, ^195mPt, ¹¹⁹Sb, ¹⁶¹Ho, ^189mOs, ¹⁹²Ir, ²⁰¹Tl, ²⁰³Pb, ⁶⁸Ga, ²²⁷Th, ⁶⁴Cu.Additionally or alternatively, according to some embodiments of the methods disclosed herein, the radiolabeled DOTA hapten includes one or more of Proteus-DOTA, S-2-(R-aminobenzyl)-1,4,7,10 -tetraazacyclododecanetetraacetic acid (DOTA-Bn), DOTA-Bn-biotin, BAD (((S)-2-(4-(2-bromo)acetamido)benzyl)-DOTA), NBD ((S)-2-(4nitrobenzyl )-DOTA), DOTA-RGD, DOTA-PEG-E(c(RGDyK)) ₂ , DOTA-8-AOC-BBN, p-NO ₂ -Bn-DOTA, DOTA-PESIN, DOTA-biotin-sarcosine (DOTA -biotin), mono 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10tetraacetic acid (N-hydroxysuccinimide ester) (DOTA-NHS) or DOTATyrLysDOTA. Alternatively, any radiolabeled DOTA hapten known in the art can be used in the methods disclosed in the present invention. The radiolabeled DOTA hapten may be labeled with a radionuclide selected from the group consisting of ²¹³ Bi, ²¹¹ At, ²²⁵ Ac, ¹⁵² Dy, ²¹² Bi, ²²³ Ra, ²¹⁹ Rn, ²¹⁵ Po, ²¹¹ Bi, ²²¹ Fr, ²¹⁷ At, ²⁵⁵ Fm, ⁸⁶ Y, ⁹⁰ Y, ⁸⁹ Sr, ¹⁶⁵ Dy, ¹⁸⁶ Re, ¹⁸⁸ Re, ¹⁷⁷ Lu, 67 Cu, ¹ⁿ ^In , ⁶⁷ Ga, ⁵¹ Cr, ⁵⁸ Co, ^99m Tc, ^103m Rh, ^195m Pt, ¹¹⁹ Sb, ¹⁶¹ Ho , ^189m Os, ¹⁹² Ir, ²⁰¹ Tl, ²⁰³ Pb, ⁶⁸ Ga, ²²⁷ Th, ⁶⁴ Cu.

В любом из описанных выше вариантов реализации способов, раскрытых в настоящем изобретении, субъектом является человек. Биспецифическое антитело анти-DOTA вводят в условиях и в течение периода времени (например, в соответствии с режимом дозирования), достаточных для насыщения опухолевых клеток, и любое несвязанное биспецифическое антитело анти-DOTA выводится из кровотока после введения биспецифического антитела анти-DOTA. Согласно некоторым вариантам реализации радиомеченый гаптен DOTA вводят по истечении периода времени, который может быть достаточным для выведения несвязавшегося биспецифического антитела анти-DOTA.In any of the above-described embodiments of the methods disclosed in the present invention, the subject is a human. The anti-DOTA bispecific antibody is administered under conditions and for a period of time (eg, according to a dosage regimen) sufficient to saturate the tumor cells, and any unbound anti-DOTA bispecific antibody is cleared from the bloodstream following administration of the anti-DOTA bispecific antibody. In some embodiments, the radiolabeled DOTA hapten is administered after a period of time that may be sufficient to clear the unbound anti-DOTA bispecific antibody.

Дополнительно или в другом варианте, согласно некоторым вариантам реализации способов, раскрытых в настоящем изобретении, очищающий агент и радиомеченый гаптен DOTA вводят без дальнейшего введения биспецифического антитела анти-DOTA. Например, согласно некоторым вариантам реализации биспецифическое антитело анти-DOTA вводят в соответствии с режимом, который включает по меньшей мере один цикл: (i) введение биспецифического антитела анти-DOTA (насыщение соответствующих опухолевых клеток необязательно); (ii) введение очищающего агента согласно настоящему изобретению и радиомеченого гаптена DOTA; (iii) необязательное дополнительное введение радиомеченого гаптена DOTA и/или очищающего агента без дополнительного введения биспецифического антитела анти-DOTA. Согласно некоторым вариантам реализации способ может включать несколько таких циклов (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более циклов).Additionally or alternatively, according to some embodiments of the methods disclosed herein, the scavenging agent and radiolabeled DOTA hapten are administered without further administration of the anti-DOTA bispecific antibody. For example, in some embodiments, the anti-DOTA bispecific antibody is administered according to a regimen that includes at least one cycle of: (i) administering the anti-DOTA bispecific antibody (saturation of the appropriate tumor cells is optional); (ii) introducing a cleaning agent according to the present invention and a radiolabeled DOTA hapten; (iii) optionally additional administration of a radiolabeled DOTA hapten and/or a scavenging agent without additional administration of an anti-DOTA bispecific antibody. In some embodiments, the method may include multiple such cycles (eg, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more cycles).

Радиомеченый гаптен DOTA может быть введен в любое время от 1 мин до 4 или более суток после введения биспецифического антитела анти-DOTA. Например, согласно некоторым вариантам реализации радиомеченый гаптен DOTA вводят через 1 мин, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 мин, 1 ч,The radiolabeled DOTA hapten can be administered at any time from 1 minute to 4 days or more after administration of the anti-DOTA bispecific antibody. For example, in some embodiments, the radiolabeled DOTA hapten is administered at 1 minute, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 minutes, 1 hour,

- 20 044225- 20 044225

1,25, 1,5, 1,75, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,1.25, 1.5, 1.75, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,

21, 22, 23, 24, 48, 72, 96 ч или любой их диапазон после введения биспецифического антитела антиDOTA. Альтернативно, радиомеченый гаптен DOTA может быть введен в любое время через 4 или более суток после введения биспецифического антитела анти-DOTA.21, 22, 23, 24, 48, 72, 96 hours or any range thereof after administration of the anti-DOTA bispecific antibody. Alternatively, radiolabeled DOTA hapten can be administered at any time 4 or more days after administration of the anti-DOTA bispecific antibody.

Дополнительно или в другом варианте, согласно некоторым вариантам реализации способов, раскрытых в настоящем изобретении, радиомеченый гаптен DOTA может быть введен в любое время от 1 минуты до 4 или более суток после введения очищающего агента. Например, согласно некоторым вариантам реализации радиомеченый гаптен DOTA вводят через 1 мин, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 мин, 1 ч, 1,25, 1,5, 1,75, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 48, 72, 96 ч или любой их диапазон после введения очищающего агента. Альтернативно, радиомеченый гаптен DOTA может быть введен в любое время через 4 или более суток после введения очищающего агента.Additionally or alternatively, according to some embodiments of the methods disclosed herein, the radiolabeled DOTA hapten may be administered at any time from 1 minute to 4 days or more after administration of the cleansing agent. For example, in some embodiments, the radiolabeled DOTA hapten is administered at 1 minute, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 minutes, 1 hour, 1.25, 1.5, 1.75, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 48, 72, 96 hours or any range thereof after administration of the cleansing agent . Alternatively, radiolabeled DOTA hapten can be administered at any time 4 or more days after administration of the clearing agent.

Наборы.Sets.

Настоящее изобретение обеспечивает наборы, содержащие компоненты, пригодные для лечения рака у пациента. Согласно одному аспекту наборы содержат очищающий агент согласно настоящему изобретению и инструкции по применению. Наборы могут дополнительно содержать по меньшей мере одно биспецифическое антитело анти-DOTA. Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере одно биспецифическое антитело анти-DOTA связывается с опухолевым антигеном-мишенью, выбранным из группы, состоящей из GPA33, HER2/neu, GD2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, MUM-1, CDK4, N-ацетилглюкозаминилтрансферазы, р15, gp75, бета-катенина, ErbB2, ракового антигена 125 (СА-125), карциноэмбрионального антигена (СЕА), RAGE, MART (антигена меланомы), MUC-1, MUC-2, MUC-3, MUC-4, MUC-5ac, MUC-16, MUC-17, тирозиназы, Pmel 17 (gp100), последовательности интрона GnT-V подтипа V (последовательности V интрона N-ацетилглюкоаминилтрансферазы подтипа V), рака простаты psm, PRAME (антигена меланомы), β-катенина, EBNA (ядерного антигена вируса Эпштейна-Барра) 1-6, р53, белка устойчивости рака легких к противоопухолевым препаратам (LRP) Bcl-2, простатоспецифического антигена (PSA), Ki-67, CEACAM6, специфического антигена-р толстой кишки (CSAp), HLA-DR, CD40, CD74, CD138, EGFR, EGP-1, EGP-2, VEGF, P1GF, инсулиноподобного фактора роста (ILGF), тенасцина, тромбоцитарного фактора роста, IL-6, CD20, CD19, PSMA, CD33, CD123, MET, DLL4, Ang-2, HER3, IGF-1R, CD30, TAG-72, SPEAP, CD45, LI-CAM, антигена Льюиса Y (Ley), Eкадгерина, V-кадгерина, EpCAM. По меньшей мере одно биспецифическое антитело анти-DOTA может быть представлено в виде предварительно наполненного шприца или автоинъекционной ручки, содержащей стерильный жидкий состав или лиофилизированный препарат антитела (например, Kivitz et al., Clin. Ther. 28:1619-29 (2006)).The present invention provides kits containing components useful for treating cancer in a patient. In one aspect, the kits contain a cleaning agent according to the present invention and instructions for use. The kits may further contain at least one anti-DOTA bispecific antibody. In some embodiments, at least one anti-DOTA bispecific antibody binds to a target tumor antigen selected from the group consisting of GPA33, HER2/neu, GD2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE- 2, MUM-1, CDK4, N-acetylglucosaminyltransferase, p15, gp75, beta-catenin, ErbB2, cancer antigen 125 (CA-125), carcinoembryonic antigen (CEA), RAGE, MART (melanoma antigen), MUC-1, MUC -2, MUC-3, MUC-4, MUC-5ac, MUC-16, MUC-17, tyrosinase, Pmel 17 (gp100), GnT-V subtype V intron sequences (N-acetylglucoaminyltransferase subtype V intron V sequences), cancer prostate psm, PRAME (melanoma antigen), β-catenin, EBNA (Epstein-Barr virus nuclear antigen) 1-6, p53, lung cancer resistance protein (LRP) Bcl-2, prostate-specific antigen (PSA), Ki- 67, CEACAM6, colon specific antigen-p (CSAp), HLA-DR, CD40, CD74, CD138, EGFR, EGP-1, EGP-2, VEGF, P1GF, insulin-like growth factor (ILGF), tenascin, platelet-derived growth factor , IL-6, CD20, CD19, PSMA, CD33, CD123, MET, DLL4, Ang-2, HER3, IGF-1R, CD30, TAG-72, SPEAP, CD45, LI-CAM, Lewis Y antigen (Ley), Ecadherin, V-cadherin, EpCAM. The at least one anti-DOTA bispecific antibody may be presented in the form of a prefilled syringe or autoinjector pen containing a sterile liquid formulation or lyophilized antibody preparation (e.g., Kivitz et al., Clin. Ther. 28:1619-29 (2006)) .

Дополнительно или в другом вариант, согласно некоторым вариантам реализации, наборы дополнительно содержат гаптен DOTA, который необязательно может быть помечен одним или несколькими радионуклидами. Примеры гаптенов DOTA включают соединения, такие как Proteus-DOTA, S-2-(Rаминобензил)-1,4,7,10-тетраазациклододекантетрауксусная кислота (DOTA-Bn), DOTA-Bn-биотин, BAD (((S)-2-(4-(2-бром)-ацетамидо)-бензил)-DOTA), NBD ((S)-2-(4-нитробензил)-DOTA), DOTA-RGD, DOTAPEG-E(c(RGDyK))₂, DOTA-8-AOC-BBN, p-NO₂-Bn-DOTA, DOTA-PESIN, DOTA-биотин-саркозин (DOTA-биотин), моно 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты (сложный эфир Nгидроксисукцинимида) (DOTA-NHS) или DOTATyrLysDOTA и т.п., но не ограничиваются ими. Дополнительно или в другом варианте, согласно некоторым вариантам реализации наборов согласно настоящему изобретению один или несколько радионуклидов выбраны из группы, состоящей из ²¹³Bi, ²¹¹At, ²²⁵Ac, ¹⁵²Dy, ²¹²Bi, ²²³Ra, ²¹⁹Rn, ²¹⁵Po, ²¹¹Bi, ²²¹Fr, ²¹⁷At, ²⁵⁵Fm. Дополнительно или в другом варианте, согласно некоторым вариантам реализации один или несколько радионуклидов выбраны из группы, состоящей из ⁸⁶Y, ⁹⁰Y, ⁸⁹Sr, ¹⁶⁵Dy, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁷⁷Lu, ⁶⁷Cu, ⁿ¹In, ⁶⁷Ga, ⁵¹Cr, ⁵⁸Co, ^99mTc, ^103mRh, ^195mPt, ¹¹⁹Sb, ¹⁶¹Ho, ^189mOs, ¹⁹²Ir, ²⁰¹Tl, ²⁰³Pb, ⁶⁸Ga, ²²⁷Th, ⁶⁴Cu.Additionally or alternatively, in some embodiments, the kits further contain a DOTA hapten, which may optionally be labeled with one or more radionuclides. Examples of DOTA haptens include compounds such as Proteus-DOTA, S-2-(Raminobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecanetetraacetic acid (DOTA-Bn), DOTA-Bn-biotin, BAD (((S)-2 -(4-(2-bromo)-acetamido)-benzyl)-DOTA), NBD ((S)-2-(4-nitrobenzyl)-DOTA), DOTA-RGD, DOTAPEG-E(c(RGDyK)) ₂ , DOTA-8-AOC-BBN, p-NO ₂ -Bn-DOTA, DOTA-PESIN, DOTA-biotin-sarcosine (DOTA-biotin), mono 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7, 10-Tetraacetic acid (Nhydroxysuccinimide ester) (DOTA-NHS) or DOTATyrLysDOTA, etc., but not limited to. Additionally or alternatively, according to some embodiments of the kits of the present invention, one or more radionuclides are selected from the group consisting of ²¹³ Bi, ²¹¹ At, ²²⁵ Ac, ¹⁵² Dy, ²¹² Bi, ²²³ Ra, ²¹⁹ Rn, ²¹⁵ Po, ²¹¹ Bi , ²²¹ Fr, ²¹⁷ At, ²⁵⁵ Fm. Additionally or alternatively, in some embodiments, the one or more radionuclides are selected from the group consisting of ⁸⁶ Y, ⁹⁰ Y, ⁸⁹ Sr, ¹⁶⁵ Dy, ¹⁸⁶ Re, ¹⁸⁸ Re, ¹⁷⁷ Lu, ⁶⁷ Cu, ⁿ¹ In, ⁶⁷ Ga, ⁵¹ Cr, ⁵⁸ Co, ^99m Tc, ^103m Rh, ^195m Pt, ¹¹⁹ Sb, ¹⁶¹ Ho, ^189m Os, ¹⁹² Ir, ²⁰¹ Tl, ²⁰³ Pb, ⁶⁸ Ga, ²²⁷ Th, ⁶⁴ Cu.

Если компоненты набора не составлены для перорального введения, может быть включено устройство, способное доставлять компоненты набора каким-либо другим путем. Примеры таких устройств включают шприцы (для парентерального введения) или ингаляционные устройства.If the kit components are not formulated for oral administration, a device capable of delivering the kit components by some other route may be included. Examples of such devices include syringes (for parenteral administration) or inhalation devices.

Компоненты набора могут быть упакованы совместно или разделены на два или более контейнеров. Согласно некоторым вариантам реализации контейнеры могут представлять собой флаконы, содержащие стерильные лиофилизированные составы очищающего агента, раскрытого в настоящем изобретении, гаптена DOTA и/или композиции анти-DOTA и биспецифическое антитело, которые являются пригодными для восстановления. Набор также может содержать один или несколько буферов, которые являются пригодными для восстановления и/или разбавления других реагентов. Другие контейнеры, которые могут быть применены, включают саше, кювету, коробку, пробирку и т.п., но не ограничиваются ими. Компоненты набора могут быть упакованы и сохранены в стерильных контейнерах.Kit components may be packaged together or divided into two or more containers. In some embodiments, the containers may be vials containing sterile lyophilized formulations of a cleaning agent disclosed herein, a DOTA hapten and/or an anti-DOTA composition and a bispecific antibody that are suitable for reconstitution. The kit may also contain one or more buffers that are suitable for reconstitution and/or dilution of other reagents. Other containers that may be used include, but are not limited to, a sachet, a cuvette, a box, a test tube, and the like. The kit components can be packaged and stored in sterile containers.

ПримерыExamples

Пример 1. Иллюстративный пример синтеза соединений согласно настоящему изобретению.Example 1 Illustrative example of the synthesis of compounds according to the present invention.

Основные положения. Изотиоцианат DOTA-Bn (p-SCN-Bn-DOTA) был приобретен у компании Macrocyclics, Inc. (г. Плано, штат Техас, США); амин-PEG4-DOTA был приобретен у компании CheBasic provisions. DOTA-Bn isothiocyanate (p-SCN-Bn-DOTA) was purchased from Macrocyclics, Inc. (Plano, Texas, USA); amine-PEG4-DOTA was purchased from Che

- 21 044225- 21 044225

Matech (г. Дижон, Франция). Соляная кислота марки Optima™ была приобретена у компании Thermo Fisher Scientific (г. Уолтем, штат Массачусетс, США). Смола Chelex-100, 200-400 меш была приобретена у компании Bio-Rad Laboratories (г. Геркулес, штат Калифорния, США). Эксклюзионные колонны для гель-фильтрации PD-10 (содержащие по 8,3 мл смолы марки Sephadex™ G-25 на колонну) были приобретены у компании GE Healthcare Life Sciences (г. Питтсбург, штат Пенсильвания, США). Все остальные реагенты и химические вещества синтетической чистоты были приобретены у компании Sigma-Aldrich (г. Сент-Луис, штат Миссури, США) и были использованы без дополнительной очистки. Все растворители, применяемые для анализа ВЭЖХ (степень чистоты ВЭЖХ) и очистки соединений, также были приобретены у компании Thermo Fisher Scientific (г. Уолтем, штат Массачусетс, США). Все буферы и растворы были приготовлены с применением ультрачистой воды (удельное сопротивление: 18 МОм-см).Matech (Dijon, France). Optima™ hydrochloric acid was purchased from Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Chelex-100 resin, 200-400 mesh, was purchased from Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA). PD-10 size exclusion gel filtration columns (containing 8.3 mL Sephadex™ G-25 resin per column) were purchased from GE Healthcare Life Sciences (Pittsburgh, PA, USA). All other reagents and synthetic grade chemicals were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) and were used without further purification. All solvents used for HPLC analysis (HPLC grade) and purification of compounds were also purchased from Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). All buffers and solutions were prepared using ultrapure water (resistivity: 18 MΩ-cm).

Все данные жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (ЖХ/МС) были получены с использованием системы Waters Autopure (г. Милфорд, штат Массачусетс, США), содержащей следующие приборы: 2767 программа управления образцами, 2545 модуль бинарного градиента, струйный органайзер системы, 2424 испарительный детектор светорассеяния, 2998 фотодиодный матричный детектор, 3100 масс-детектор. Растворители для ВЭЖХ (растворитель А, 0,05% раствор трифторуксусной кислоты в воде; растворитель В, 0,05% раствор трифторуксусной кислоты в ацетонитриле) фильтровали перед применением. Аналитический метод: 5-25% растворителя В, время - 10 мин, скорость потока - 1,2 мл/мин. Аналитические колонны: Waters XBridge BEH300 (г. Милфорд, штат Массачусетс, США), С4, 3,5 мкм, 4,6x50 мм и С18, 4 мкм, 4,6x50 мм. Препаративный метод: 5-25% растворителя В, время - 30 мин, скорость потока - 20 мл/мин. Препаративная колонна: Waters XBridge Prep (г. Милфорд, штат Массачусетс, США) С18, 4 мкм, оптимальная плотность слоя, 19x150 мм.All liquid chromatography-mass spectrometry (LC/MS) data were acquired using a Waters Autopure system (Milford, Massachusetts, USA) containing the following instrumentation: 2767 sample management program, 2545 binary gradient module, inkjet system organizer, 2424 evaporative light scattering detector, 2998 photodiode array detector, 3100 mass detector. HPLC solvents (solvent A, 0.05% trifluoroacetic acid in water; solvent B, 0.05% trifluoroacetic acid in acetonitrile) were filtered before use. Analytical method: 5-25% solvent B, time - 10 min, flow rate - 1.2 ml/min. Analytical columns: Waters XBridge BEH300 (Milford, Massachusetts, USA), C4, 3.5 µm, 4.6x50 mm and C18, 4 µm, 4.6x50 mm. Preparative method: 5-25% solvent B, time - 30 minutes, flow rate - 20 ml/min. Preparative column: Waters XBridge Prep (Milford, Massachusetts, USA) C18, 4 µm, optimal layer density, 19x150 mm.

Все данные ЯМР были получены с помощью инструментов Bruker AV500 или AV600 (компания Bruker, г. Биллерика, штат Массачусетс, США) при температуре окружающей среды. Были использованы следующие сокращения: синглет (s), широкий синглет (bs), дублет (d), триплет (t), квартет (q), пентет (р), дублет дублета (dd), мультиплет (iii).All NMR data were acquired using Bruker AV500 or AV600 instruments (Bruker, Billerica, MA, USA) at ambient temperature. The following abbreviations were used: singlet (s), broad singlet (bs), doublet (d), triplet (t), quartet (q), pentet (p), doublet doublet (dd), multiplet (iii).

Все эксперименты с применением молекул с высокой способностью к комплексообразованию с металлами, таких как DOTA, проводили в стеклянной посуде, которую предварительно промывали не содержащей металлов HCl, ополаскивали водой высокой чистоты (например, водой, дистиллированной в стеклянном сосуде) и сушили в печи. Хроматографию проводили на стеклянных колоннах с ручной насадкой во избежание реакции комплексообразующего агента с металлом, выщелоченным или извлеченным из металлических стенок колонны. Обращенно-фазовую очистку проводили на чистых стеклянных колоннах, не содержащих металлов, которые вручную заполняли рыхлым силикагелем С-18. Содержание воды в полученных комплексах не измеряли.All experiments using molecules with high metal complexing properties, such as DOTA, were carried out in glassware that was first washed with metal-free HCl, rinsed with high purity water (eg water distilled in a glass jar) and dried in an oven. Chromatography was carried out on hand-packed glass columns to avoid reaction of the complexing agent with metal leached or recovered from the metal walls of the column. Reversed phase purification was performed on clean, metal-free glass columns that were manually filled with loose C-18 silica gel. The water content of the resulting complexes was not measured.

ССА-16-метиловый эфир-NHBoc (проиллюстрирован ниже) и 5-((третбутоксикарбонил)амино)пентил-2-ацетамидо-2-дезокси-1-тио-3,4,6-три-О-ацетил-α-D-галактопиранозид (моноперацетил-сахар-NHBoc) получали в соответствии с аналогичными способами и протоколами, как описано в Yoo, В. et al., N-Acetylgalactosamino Dendrons as Clearing Agents to Enhance Liver Targeting of Model Antibody-Fusion Protein, Bioconjugate Chem. 2013, 24, 2088-2103 (включая сопутствующую вспомогательную информацию) и Cheal, S.M. et al., Evaluation of Glycodendron and Synthetically Modified Dextran Clearing Agents for Multistep Targeting of Radioisotopes for Molecular Imaging and Radioimmunotherapy, Mol. Pharmaceutics 2014, 11, 400-16 (включая сопутствующую вспомогательную информацию), содержание которых включено в настоящее изобретение посредством ссылки. Соответствующие характеристические данные для ССА-16-метилового эфира-NHBoc и моноперацетил-сахар-NHBoc приведены ниже.CCA-16-methyl ether-NHBoc (illustrated below) and 5-((tert-butoxycarbonyl)amino)pentyl-2-acetamido-2-deoxy-1-thio-3,4,6-tri-O-acetyl-α-D -galactopyranoside (monoperacetyl-sugar-NHBoc) was prepared according to similar methods and protocols as described in Yoo, B. et al., N-Acetylgalactosamino Dendrons as Clearing Agents to Enhance Liver Targeting of Model Antibody-Fusion Protein, Bioconjugate Chem. 2013, 24, 2088-2103 (including related supporting information) and Cheal, S.M. et al., Evaluation of Glycodendron and Synthetically Modified Dextran Clearing Agents for Multistep Targeting of Radioisotopes for Molecular Imaging and Radioimmunotherapy, Mol. Pharmaceutics 2014, 11, 400-16 (including related supporting information), the contents of which are incorporated herein by reference. The corresponding characteristic data for CCA-16-methyl ether-NHBoc and monoperacetyl-sugar-NHBoc are given below.

ССА-16-метиловый эфир-NHBoc.CCA-16-methyl ether-NHBoc.

- 22 044225- 22 044225

Ή ЯМР (600 МГц, D2O) δ: 3.68, 3.66 (2s, 48Н, OCH3), 3,30-3,26 (m, 32Н), 3,22-3,19 (m, 32Н), 2,83 (bs, NCH₃), 2,35-2,25 (m, 64Н), 1,69-1,51 (m, 128Н), 1,44 (s, 9 Н, С(СН₃)₃), 1,34-1,29 (m, 64Н). ¹³С ЯМР (125 МГц, D2O) δ: 174,10, 173,87, 172,10, 51,57, 51,48, 47,86, 47,79, 45,78, 45,70, 33,95, 33,84, 33,83, 33,05, 32,89, 29,21, 28,90, 28,50, 27,70, 27,48, 27,46, 26,99, 26,84, 26,55, 26,42, 25,23, 25,13, 24,68, 24,64.Ή NMR (600 MHz, D2O) δ: 3.68, 3.66 (2s, 48H, OCH3), 3.30-3.26 (m, 32H), 3.22-3.19 (m, 32H), 2.83 (bs, NCH ₃ ), 2.35-2.25 (m, 64H), 1.69-1.51 (m, 128H), 1.44 (s, 9 H, C(CH ₃ ) ₃ ), 1.34-1.29 (m, 64H). ¹³ C NMR (125 MHz, D2O) δ: 174.10, 173.87, 172.10, 51.57, 51.48, 47.86, 47.79, 45.78, 45.70, 33.95 , 33.84, 33.83, 33.05, 32.89, 29.21, 28.90, 28.50, 27.70, 27.48, 27.46, 26.99, 26.84, 26 .55, 26.42, 25.23, 25.13, 24.68, 24.64.

Моноперацетил-caxap-NHBoc (5-((трет-бутоксикарбонил)амино) пентил-2-ацетамидо-2-дезокси-1 тио-3,4,6-три-O-ацетил-α-О-галактопиранозид): 1Н ЯМР (600 МГц, D2O) δ: 5,57 (d, 1Н, J=7,4 Гц), 5,49 (d, 1Н, J=4,4 Гц), 5,38 (d, 1Н, J=2,4 Гц), 5,05 (dd, 1Н, J=2,4 Гц, J=7,4 Гц), 4,80-4,74 (m, 1Н), 4,58 (bs, 1Н), 4,54 (t, 1Н, J=5,4 Гц), 4,13 (dd, 1Н, J=9,6 Гц, J=5,4 Гц), 4,09 (dd, 1Н, J=9,6 Гц, J=5,4 Гц), 3,14-3,08 (m, 2Н), 2,662,55 (m, 2Н), 2,16, 2,05, 2,01, 1,98 (4s, 12Н, COCH₃), 1,67-1,61 (m, 2Н), 1,44 (s, 9Н, С(СН₃)₃), 1,41-1,38 (m, 2Н). ¹³С ЯМР (125 МГц, D2O) δ: 171,00, 170,39, 170,28, 170,15, 155,98, 84,93, 68,54, 67,34, 67,24, 61,83, 48,33, 40,38, 30,97, 29,62, 29,28, 28,43, 25,94, 23,34, 20,75, 20,71.Monoperacetyl-caxap-NHBoc (5-((tert-butoxycarbonyl)amino)pentyl-2-acetamido-2-deoxy-1 thio-3,4,6-tri-O-acetyl-α-O-galactopyranoside): 1H NMR (600 MHz, D2O) δ: 5.57 (d, 1H, J=7.4 Hz), 5.49 (d, 1H, J=4.4 Hz), 5.38 (d, 1H, J= 2.4 Hz), 5.05 (dd, 1H, J=2.4 Hz, J=7.4 Hz), 4.80-4.74 (m, 1H), 4.58 (bs, 1H) , 4.54 (t, 1H, J=5.4 Hz), 4.13 (dd, 1H, J=9.6 Hz, J=5.4 Hz), 4.09 (dd, 1H, J= 9.6 Hz, J=5.4 Hz), 3.14-3.08 (m, 2H), 2.662.55 (m, 2H), 2.16, 2.05, 2.01, 1.98 (4s, 12H, COCH ₃ ), 1.67-1.61 (m, 2H), 1.44 (s, 9H, C(CH ₃ ) ₃ ), 1.41-1.38 (m, 2H) . ¹³ C NMR (125 MHz, D2O) δ: 171.00, 170.39, 170.28, 170.15, 155.98, 84.93, 68.54, 67.34, 67.24, 61.83 , 48.33, 40.38, 30.97, 29.62, 29.28, 28.43, 25.94, 23.34, 20.75, 20.71.

Иллюстративный пример синтеза кислота ССА-16.An illustrative example of the synthesis of SCA-16 acid.

- 23 044225- 23 044225

В ССА-16-метиловый эфир-NHBoc (2,1 г, 0,54 ммоль), содержащийся в МеОН (60 мл), добавляли NaOH (10 н., 16 мл) и воду (16 мл). Полученную смесь взбалтывали при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем pH доводили до 5,0 с помощью 2,0 н. HCl и раствор загружали в делительную воронку. Далее проводили экстракцию смесью дихлорметантрет-бутанол (3/1, об./об.), 150 млх5, и объединенные органические слои кратковременно сушили с применением Na₂SO₄. После фильтрации через слой целита фильтрат упаривали при пониженном давлении, а остаток дополнительно сушили под высоким вакуумом в течение 2 ч, получая 2,0 г бесцветного густого масла. Продукт имел достаточную чистоту для непо средственного применения на следующем этапе.To CCA-16-methyl ether-NHBoc (2.1 g, 0.54 mmol) contained in MeOH (60 ml), NaOH (10 N, 16 ml) and water (16 ml) were added. The resulting mixture was shaken at room temperature for 1 hour. The pH was then adjusted to 5.0 with 2.0 N. HCl and solution were loaded into a separatory funnel. Next, extraction was carried out with a mixture of dichloromethane tert-butanol (3/1, v/v), 150 mlx5, and the combined organic layers were briefly dried using Na ₂ SO ₄ . After filtration through a pad of celite, the filtrate was evaporated under reduced pressure and the residue was further dried under high vacuum for 2 hours to obtain 2.0 g of a colorless thick oil. The product was of sufficient purity for immediate use in the next step.

CCA-16-caxap-NHBoc.CCA-16-caxap-NHBoc.

Кислоту CCA-16 (2,0 г, 0,54 ммоль) разбавляли в диметилформамиде (80 мл) перед очисткой с применением 1-бис(диметиламино)метилен-1H-1,2,3-триазоло-4,5-b пиридиний-3-оксид-гексафторфосфата (HATU) (4,0 г, 10,5 ммоль) и 5-амино-1-пентил-а-тио-тетраацетилгалактозамина (5,6 г, 9,9 ммоль). Полученную смесь взбалтывали при комнатной температуре в течение 20 мин перед добавлением диизопропилэтиламина (8,0 мл). Спустя 1 ч добавляли дихлорметан (200 мл) и реакционную смесь промывали водой (2x100 мл). Затем органический слой кратковременно сушили с применением Na₂SO₄, фильтровали через слой целита и фильтрат концентрировали под вакуумом. Очистка с применением колоночной флэш-хроматографии с градиентом от 0 до 15% МеОН в дихлорметане (об./об.) давала CCA-16-caxapNHBoc, 4,9 г, выход 85%. 1Н ЯМР (600 МГц, D2O) δ: 7,95 (bs, 12Н, NH), 5,64-5,61 (m, 16Н), 5,47-5,46 (d, 16Н, J=2,8 Hz), 5,06 (dd, 16 Н, J=11,8 Hz), 4,64-4,60 (m, 32H), 4,18-4,12 (m, 32H), 3,35 (m, 32H), 3,21-3,19 (m, 36H), 3,02, 2,88 (2s, 3H, NCH₃), 2,86-2,84 (bs, 4H), 2,70-2,61 (m, 32H), 2,41-2,38 (m, 36H), 2,24 (m, 32H), 2,21, 2,06, 1,98, 1,97 (4s, 192H, COCH₃), 1,69-1,64 (m, 128H, 1,59-1,53 (m, 70H), 1,48 (s, 9H, OC(CH₃), 1,48-1,46 (m, 32), 1,40-1,33 (m, 70H).¹³C ЯМР (125 МГц, D2O) δ: 174,60, 174,38, 174,30, 173,41, 172,23, 172,14, 170,66, 170,34, 84,07, 68,23, 67,23, 66,80, 61,78, 53,46, 45,67, 39,01, 38,88, 35,73, 35,63, 35,58, 32,59, 32,51, 30,03, 29,06, 28,66, 28,54, 27,57, 27,08, 26,37, 26,28, 26,22, 26,10, 25,83, 25,45, 25,36, 25,18, 25,10, 21,26, 21,22, 19,44, 19,37, 19,24.CCA-16 acid (2.0 g, 0.54 mmol) was diluted in dimethylformamide (80 ml) before purification using 1-bis(dimethylamino)methylene-1H-1,2,3-triazolo-4,5-b pyridinium -3-oxide-hexafluorophosphate (HATU) (4.0 g, 10.5 mmol) and 5-amino-1-pentyl-a-thio-tetraacetylgalactosamine (5.6 g, 9.9 mmol). The resulting mixture was shaken at room temperature for 20 minutes before adding diisopropylethylamine (8.0 ml). After 1 hour, dichloromethane (200 ml) was added and the reaction mixture was washed with water (2x100 ml). The organic layer was then briefly dried using Na ₂ SO ₄ , filtered through a pad of celite, and the filtrate was concentrated in vacuo. Purification using flash column chromatography with a gradient of 0 to 15% MeOH in dichloromethane (v/v) gave CCA-16-caxapNHBoc, 4.9 g, 85% yield. 1H NMR (600 MHz, D2O) δ: 7.95 (bs, 12H, NH), 5.64-5.61 (m, 16H), 5.47-5.46 (d, 16H, J=2, 8 Hz), 5.06 (dd, 16 N, J=11.8 Hz), 4.64-4.60 (m, 32H), 4.18-4.12 (m, 32H), 3.35 (m, 32H), 3.21-3.19 (m, 36H), 3.02, 2.88 (2s, 3H, NCH ₃ ), 2.86-2.84 (bs, 4H), 2, 70-2.61 (m, 32H), 2.41-2.38 (m, 36H), 2.24 (m, 32H), 2.21, 2.06, 1.98, 1.97 (4s , 192H, COCH ₃ ), 1.69-1.64 (m, 128H, 1.59-1.53 (m, 70H), 1.48 (s, 9H, OC(CH ₃ ), 1.48- 1.46 (m, 32), 1.40-1.33 (m, 70H) ¹³ C NMR (125 MHz, D2O) δ: 174.60, 174.38, 174.30, 173.41, 172 ,23, 172.14, 170.66, 170.34, 84.07, 68.23, 67.23, 66.80, 61.78, 53.46, 45.67, 39.01, 38.88 , 35.73, 35.63, 35.58, 32.59, 32.51, 30.03, 29.06, 28.66, 28.54, 27.57, 27.08, 26.37, 26 ,28, 26.22, 26.10, 25.83, 25.45, 25.36, 25.18, 25.10, 21.26, 21.22, 19.44, 19.37, 19.24 .

CCA-16-перацетил-а-тиогал актозамин-NH₂·ТФУ.CCA-16-peracetyl-a-thiogal actosamine-NH ₂ ·TFA.

- 24 044225- 24 044225

мг ССА-16-перацетил-α-тиогалактозамин-NHBoc (1,9 мкмоль) растворяли в 0,8 мл 20% трифторуксусной кислоты (ТФУ) и дихлорметане (об./об.), затем взбалтывали при комнатной температуре в течение 60 мин. Далее смесь упаривали при пониженном давлении с целью очистки от трифторуксусной кислоты и дихлорметана. За развитием реакции наблюдали с помощью ЖХМС, которую проводили с помощью системы саммочистки Autopure System (фирма Waters) с использованием С4 (Xbridge, Waters, 4,6x50 мм) с градиентом 5-95 об./об.% ацетонитрила в воде, содержащей 0,05% трифторуксусной кислоты, в течение 10 мин. Обнаружение было обеспечено одновременной работой масс-спектрометра, диодной матрицы и испарительного детектора светорассеяния. Остаток (20 мг) дополнительно сушили в течение ночи под высоким вакуумом и применяли непосредственно на следующем этапе.mg CCA-16-peracetyl-α-thiogalactosamine-NHBoc (1.9 μmol) was dissolved in 0.8 ml of 20% trifluoroacetic acid (TFA) and dichloromethane (v/v), then shaken at room temperature for 60 min. . Next, the mixture was evaporated under reduced pressure to remove trifluoroacetic acid and dichloromethane. The reaction progress was monitored by LCMS, which was carried out using an Autopure System (Waters) using C4 (Xbridge, Waters, 4.6x50 mm) with a gradient of 5-95% v/v acetonitrile in water containing 0 .05% trifluoroacetic acid, for 10 minutes. Detection was achieved by simultaneous operation of a mass spectrometer, a diode array, and an evaporative light scattering detector. The residue (20 mg) was further dried overnight under high vacuum and used directly in the next step.

ССА-16-перацетил-α-тиогалактозамин-NHCSNMe-Bn-DOTA.CCA-16-peracetyl-α-thiogalactosamine-NHCSNMe-Bn-DOTA.

- 25 044225- 25 044225

Неочищенную соль аммония (ССА-16-перацетил-α-тиогалактозамин-NH₂·ТФУ) и P-SCN-Bn-DOTA (2,5 мг, 3,8 мкмоль, 2 экв.) растворяли в диметилформамиде (0,3 мл) и затем добавляли триэтиламин (Et₃N) (6 мкл). Полученную гомогенную смесь взбалтывали при комнатной температуре в течение 4 ч; летучие вещества удаляли под высоким вакуумом при комнатной температуре с целью получения пены достаточной чистоты, которую применяли на следующем этапе. Оценку ЖХМС проводили с помощью той же системы, что и на предыдущем этапе, но вместо этого использовали колонну XBridge C18 (4,6x150 мм) с градиентом 40-95 об./об.% ацетонитрила в воде, содержащей 0,05% трифторуксусной ки слоты.Crude ammonium salt (CCA-16-peracetyl-α-thiogalactosamine-NH ₂ ·TFA) and P-SCN-Bn-DOTA (2.5 mg, 3.8 μmol, 2 eq.) were dissolved in dimethylformamide (0.3 ml ) and then triethylamine (Et ₃ N) (6 µl) was added. The resulting homogeneous mixture was shaken at room temperature for 4 hours; volatiles were removed under high vacuum at room temperature to obtain a foam of sufficient purity, which was used in the next step. LCMS evaluation was performed using the same system as the previous step, but instead used an XBridge C18 column (4.6 x 150 mm) with a gradient of 40-95% v/v acetonitrile in water containing 0.05% trifluoroacetic acid. slots.

ССА-16-α-тио-перацетилгалактозамин-DOTA-Y³⁺.CCA-16-α-thio-peracetylgalactosamine-DOTA-Y ³⁺ .

Сырьевой материал из предыдущего этапа ССА-16-перацетил-α-тиогалактозамин-NHCSNMe-BnDOTA добавляли к раствору YCl₃-6H₂O (6 мг) в 0,05 М HCl (0,2 мл) и 0,5 М NH₄OAc (0,2 мл). Смесь взбалтывали в течение 4 ч. Попытки очищения с помощью ВЭЖХ на данном этапе не увенчались успехом. Однако аналитический контроль показал, что реакция проходит с приемлемой чистотой. ЖХМС проводили на колонне XBridge C18 с градиентом 5-95 об./об.% ацетонитрила в воде (оба содержат 0,05% трифторуксусной кислоты) в течение 10 мин. Остаток использовали на следующем и последнем этапе. Результаты, полученные с помощью тандемной масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (ESI-MS) (m/z) были следующими: [М+6Н]⁶⁺ выч. 1847,55, эксп.1847,86.The raw material from the previous step CCA-16-peracetyl-α-thiogalactosamine-NHCSNMe-BnDOTA was added to a solution of YCl ₃ -6H ₂ O (6 mg) in 0.05 M HCl (0.2 ml) and 0.5 M NH ₄ OAc (0.2 ml). The mixture was shaken for 4 hours. Attempts at purification using HPLC at this stage were unsuccessful. However, analytical control showed that the reaction proceeded with acceptable purity. LCMS was performed on an XBridge C18 column with a gradient of 5-95% v/v acetonitrile in water (both containing 0.05% trifluoroacetic acid) over 10 min. The remainder was used in the next and final step. The results obtained by electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS) (m/z) were as follows: [M+6H] ⁶⁺ cal. 1847.55, exp. 1847.86.

CCA-16-DOTA-Y³⁺.CCA-16-DOTA-Y ³⁺ .

- 26 044225- 26 044225

Неочищенный ССА-16-α-тио-перацетилгалактозамин-DOTA-Y³⁺ растворяли в МеОН (0,5 мл) и к раствору добавляли дегазированный NaOH (0,2 н., 400 мкл). Через 30 мин реакционную смесь упаривали досуха, растворяли в минимальном количестве воды и подвергали ВЭЖХ (XBridge С18, 20-70 об./об.% с градиентом ацетонитрила в воде (оба содержат 0,05% трифторуксусной кислоты) в течение 10 мин). Соответствующие фракции объединяли и лиофилизировали с получением 22 мг целевого соединения в виде белой пены с общим выходом 64%, исходя из ССА-16-метилового эфира-NHBoc. 1Н ЯМР (600 МГц, D2O) δ: 7,21-7,24 (m, 4Н, Ph), 5,43 (d, 16 Н, J=5,2 Гц, НСахар-1), 4,27 (dd, 16Н, J=5,2 Гц, J=11,2 Гц, НСахар-2), 4,17-4,14 (m, 16 Н, Нсахар-5), 3,96 (d, 16 Н, J=2,7 Гц, Нсахар-4), 3,75 (dd, 16Н, J=2,7 Гц, J=11,2 Гц, Нсахар-3), 3,68 (d, 32Н, J=6.0 Гц, Нсахар-6), 3,23 (bs, 64Н), 3,15-3,08 (m, 36Н), 3,00 and 2,85 (2s, 3Н, NCH3), 2,58-2,47 (m, 34Н), 2,30 (bs, 32Н), 2,16-2,13 (m, 34Н), 1,96 (s, 48 Н, NHCOCH3), 1,55-1,30 (m, 198Н), 1,23-1,15 (m, 102Н). ¹³С ЯМР (125 МГц, D2O) δ: 175,94, 174,24, 163,04, 162,81, 117,31, 115,38, 83,84, 71,62, 68,46, 67,77, 61,07, 50,29, 48,22, 45,86, 39,19, 35,78, 32,74, 30,26, 28,77, 28,24, 27,13, 26,90, 26,22, 25,86, 25,80, 25,51, 25,39, 22,09. Результаты, полученные с помощью тандемной масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (ESI-MS) (m/z) были следующими: [М+5Н]⁵⁺ выч. 1812,2, эксп.1813,1; [М+6Н]⁶⁺ выч. 1510,3, эксп. 1511,2.Crude CCA-16-α-thio-peracetylgalactosamine-DOTA-Y ³⁺ was dissolved in MeOH (0.5 ml) and degassed NaOH (0.2 N, 400 μl) was added to the solution. After 30 min, the reaction mixture was evaporated to dryness, dissolved in a minimum amount of water and subjected to HPLC (XBridge C18, 20-70% v/v with a gradient of acetonitrile in water (both containing 0.05% trifluoroacetic acid) for 10 min). The appropriate fractions were combined and lyophilized to obtain 22 mg of the title compound as a white foam with an overall yield of 64% based on CCA-16-methyl ester-NHBoc. 1H NMR (600 MHz, D2O) δ: 7.21-7.24 (m, 4H, Ph), 5.43 (d, 16 H, J=5.2 Hz, HChar-1), 4.27 ( dd, 16H, J=5.2 Hz, J=11.2 Hz, NSahar-2), 4.17-4.14 (m, 16 N, NSahar-5), 3.96 (d, 16 H, J=2.7 Hz, Nsahar-4), 3.75 (dd, 16H, J=2.7 Hz, J=11.2 Hz, Nsahar-3), 3.68 (d, 32H, J=6.0 Hz, Nsuhar-6), 3.23 (bs, 64H), 3.15-3.08 (m, 36H), 3.00 and 2.85 (2s, 3H, NCH3), 2.58-2, 47 (m, 34H), 2.30 (bs, 32H), 2.16-2.13 (m, 34H), 1.96 (s, 48 H, NHCOCH3), 1.55-1.30 (m , 198Н), 1.23-1.15 (m, 102Н). ¹³ C NMR (125 MHz, D2O) δ: 175.94, 174.24, 163.04, 162.81, 117.31, 115.38, 83.84, 71.62, 68.46, 67.77 , 61.07, 50.29, 48.22, 45.86, 39.19, 35.78, 32.74, 30.26, 28.77, 28.24, 27.13, 26.90, 26 ,22, 25.86, 25.80, 25.51, 25.39, 22.09. The results obtained using electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS) (m/z) were as follows: [M+5H] ⁵⁺ cal. 1812.2, exp. 1813.1; [M+6N] ⁶⁺ calc. 1510.3, exp. 1511.2.

Пример 2. Иллюстративный пример экспериментальных материалов и способов биологических исследований.Example 2. Illustrative example of experimental materials and methods of biological research.

Материалы. Биспецифическое антитело αнти-GPA33 для DOTA-ПРИТ (huA33-C825) получали согласно способу, описанному ранее в WO 2016/130539. Клеточная линия колоректального рака человека SW1222 GPA33(+) была предоставлена Институтом исследования рака им. Людвига (г. Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, США) и поддерживалась в минимальной питательной среде с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки, 2,0 мМ глутамина, 100 единиц/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.Materials. Bispecific antibody αanti-GPA33 for DOTA-PRIT (huA33-C825) was prepared according to the method previously described in WO 2016/130539. The human colorectal cancer cell line SW1222 GPA33(+) was provided by the Institute for Cancer Research. Ludwig (New York, NY, USA) and maintained in minimal culture medium supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, 2.0 mM glutamine, 100 units/ml penicillin, and 100 μg/ml streptomycin.

Радиойодирование биспецифического антитела. Изотоп ¹³¹I был предоставлен компанией Nordion (г. Оттава, провинция Онтарио, Канада). Пробирки, предварительно покрытые йодогеном, были предоставлены компанией Thermo Fisher Scientific (г. Уолтем, штат Массачусетс, США). Предварительно заполненные колонны Sephadex G-25 (колонны PD10) были предоставлены компанией GE Healthcare Life Sciences (г. Питтсбург, штат Пенсильвания, США). Аликвоты биспецифического антитела анти-GPA33 подвергали радиоактивному йодированию в соответствии с методом IODO-GEN (Salacinski PR et al., Analytical biochemistry 117: 136-46 (1981); Harlow E, Lane D. USING ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL. Cold Spring Harbor, N.Y. (1999)) с последующей очисткой гель-фильтрацией с помощью предварительно заполненных промышленных колонн PD10 (смола Sephadex G-25). Было определено, что радиохимическая чистота составляет >98% с применением эксклюзионной жидкостной хроматографии при высоком давлении в сочетании с радиодетекцией. Вкратце, для получения ¹³¹I-huA33-C825 100 мкг смешивали с 80 мкл 0,2 М фосфата натрия, pH 7,4, в предварительно покрытой йодогеном пробирке. Затем добавляли 400 мкКи изотопа ¹³¹I. Через 5 мин при комнатной температуре реакционную смесь переноси- 27 044225 ли в новую пробирку, содержащую 50 мкл йодоген-останавливающего буфера [10 мг/мл тирозина (насыщенного), 10% глицерина, 0,1% ксилолциланола в фосфатно-солевом буферном растворе] и очищали с помощью колонны PD10, которая была предварительно выдержана и элюирована физиологическим раствором с добавлением бычьего сывороточного альбумина в количестве 1 мас./об.%.Radioiodination of bispecific antibodies. The ^131I isotope was provided by Nordion (Ottawa, Ontario, Canada). Iodogen precoated tubes were provided by Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Prefilled Sephadex G-25 columns (PD10 columns) were provided by GE Healthcare Life Sciences (Pittsburgh, PA, USA). Aliquots of anti-GPA33 bispecific antibody were radioiodinated according to the IODO-GEN method (Salacinski PR et al., Analytical biochemistry 117: 136-46 (1981); Harlow E, Lane D. USING ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL. Cold Spring Harbor , NY (1999)) followed by gel filtration purification using commercially prefilled PD10 columns (Sephadex G-25 resin). The radiochemical purity was determined to be >98% using high pressure size exclusion liquid chromatography coupled with radiodetection. Briefly, to prepare ¹³¹ I-huA33-C825, 100 μg was mixed with 80 μl of 0.2 M sodium phosphate, pH 7.4, in an iodogen-precoated tube. Then 400 μCi of the isotope ¹³¹ I was added. After 5 min at room temperature, the reaction mixture was transferred to a new tube containing 50 μl of iodogen stopping buffer [10 mg/ml tyrosine (saturated), 10% glycerol, 0.1% xylene cylanol in phosphate-buffered saline] and purified using a PD10 column that had been pre-conditioned and eluted with saline supplemented with 1 w/v% bovine serum albumin.

Модельные животные. Самки бестимусных мышей (в возрасте 6-8 недель) были предоставлены компанией Harlan (г. Индианаполис, штат Индиана, США) и компанией Envigo (г. Хантингдон, Соединенное Королевство). Мышей акклиматизировали минимум за 1 неделю. Для определения влияния очищающего агента на основе дендронов CCA-16-DOTA-Y³⁺ на выведение биспецифического антитела ¹³¹¹из крови использовали здоровых (не имеющих опухолей) мышей. Для экспериментов по биораспределению при DOTA-ПРИТ использовали группы мышей с введенными под кожу ксенотрансплантатами колоректального рака человека SW1222. Чтобы внедрить опухоль SW1222, мышам прививали 5.0x106 клеток в 200 мкл клеточной суспензии смеси сред 1:1 с восстановленной базальной мембраной (BD Matrigel, Collaborative Biomedical Products Inc., г. Бедфорд, штат Массачусетс, США) на нижнюю часть живота посредством подкожной инъекции, и сформировавшиеся опухоли (100-300 мм³) наблюдались в течение 7-10 суток.Model animals. Female nude mice (6–8 weeks old) were provided by Harlan (Indianapolis, IN, USA) and Envigo (Huntingdon, UK). Mice were acclimatized for at least 1 week. Healthy (tumor-free) mice were used to determine the effect of the dendron-based scavenging agent CCA-16-DOTA-Y ³⁺ on the clearance of bispecific antibody ¹³¹¹ from the blood. For DOTA-PRIT biodistribution experiments, groups of mice with subcutaneously injected human colorectal cancer SW1222 xenografts were used. To introduce the SW1222 tumor, mice were inoculated with 5.0 x 106 cells in 200 μl of a cell suspension of a 1:1 mixture of basement membrane-reconstituted media (BD Matrigel, Collaborative Biomedical Products Inc., Bedford, MA, USA) into the lower abdomen by subcutaneous injection , and formed tumors (100-300 mm ³ ) were observed for 7-10 days.

Выведение биспецифического антитела ¹³¹I из крови. Радиоактивный индикатор антител готовили для инъекции путем смешивания биспецифического антитела ¹³¹I с дополнительным носителем антител до достижения 250 мкг (1,19 нмоль) на дозу. Все заборы крови и инъекции производились через хвостовую вену. Здоровым мышам (n=15) при t=0 внутривенно вводили 250 мкг (1,19 нмоль) биспецифического антитела ¹³¹I, а также либо несущую среду (физиологический раствор; n=3), либо 25 мкг очищающего агента (приготовленного в 250 мкл физиологического раствора; n=12) при t=24 ч. Для исследования несущей среды брали пробы крови (30-40 мкл; n=3 на пробу) при t=1,2,3, 4, 24, 25, 26, 27 и 28 ч. Для исследования очищающего агента брали пробы крови (30-40 мкл; n=3 на пробу) при t=1, 2, 3, 4, 24, 24,1 (5 мин после введения очищающего агента), 24,3 (15 мин после введения очищающего агента), 24,5, 25, 26, 27 и 28 ч. Концентрации радиоактивности определяли для каждого образца путем подсчета на гамма-счетчике (PerkinElmer Life Sciences Wallac Wizard 3). Скорости счета были скорректированы с учетом фона и затухания, преобразованы в активности с применением коэффициента калибровки системы, специфичного для изотопа, нормированы на введенную активность и выражены в процентах введенной дозы/г (ВД/г). Процентные изменения активности крови по сравнению с исходным уровнем (т.е. непосредственно перед введением очищающего агента; y1) через интервалы времени после инъекции очищающего агента (у2) рассчитывали по формуле ((y2-y1)/y1)x100.Removal of bispecific antibody ¹³¹ I from the blood. Radioactive antibody tracer was prepared for injection by mixing bispecific antibody ¹³¹ I with additional antibody carrier to achieve 250 μg (1.19 nmol) per dose. All blood draws and injections were performed through the tail vein. Healthy mice (n=15) at t=0 were intravenously injected with 250 μg (1.19 nmol) of bispecific antibody ¹³¹ I, as well as either vehicle (saline; n=3) or 25 μg of clearing agent (prepared in 250 μl physiological solution; n=12) at t=24 hours. To study the carrier medium, blood samples were taken (30-40 μl; n=3 per sample) at t=1,2,3, 4, 24, 25, 26, 27 and 28 hours. To study the cleansing agent, blood samples were taken (30-40 μl; n=3 per sample) at t=1, 2, 3, 4, 24, 24.1 (5 min after administration of the cleansing agent), 24. 3 (15 min after administration of the scavenging agent), 24.5, 25, 26, 27 and 28 h. Radioactivity concentrations were determined for each sample by counting on a gamma counter (PerkinElmer Life Sciences Wallac Wizard 3). Count rates were corrected for background and attenuation, converted to activities using the isotope-specific system calibration factor, normalized to the administered activity, and expressed as percent dose/g administered (ID/g). Percentage changes in blood activity from baseline (i.e., immediately before injection of the cleansing agent; y1) at time intervals after injection of the cleansing agent (y2) were calculated using the formula ((y2-y1)/y1)x100.

Оптимизация дозы очищающего агента на основе дендронов CCA-16-DOTA-Y³⁺ при DOTA-ПРИТ. Группам мышей с опухолью (n=4 в группе) вводили биспецифическое антитело (250 мкг, 1,19 нмоль; t=28 ч) с последующим введением различных количеств CCA-16-DOTA-Y³⁺ (0-25 мкг; 0-2,76 нмоль; t=4 ч). Дополнительной группе животных с опухолью для сравнения вводили очищающий агент на основе дендронов (Y)DOTA (62,5 мкг; 0,125 нмоль; 7,625 нмоль) вместо очищающего агента на основе дендронов CCA-16-DOTA-Y³⁺. Через 4 ч после введения очищающего агента мышам вводили ¹⁷⁷Lu-DOTA-Bn (150-167 мкКи; 30-33 пмоль). Мышей умерщвляли через 48 ч после введения ¹⁷⁷Lu; органы изымали для анализа концентраций радиоактивности согласно способу, описанному выше. Эти органы включали кровь, опухоль, сердце, печень, селезенку, желудок, тонкий кишечник, толстый кишечник, почки, мышцы, кости и хвост (место инъекции). Также были рассчитаны отношения поглощения опухолью к поглощению неопухолевыми тканями в процентах введенной дозы на грамм.Optimization of the dose of the dendron-based cleaning agent CCA-16-DOTA-Y ³⁺ in DOTA-PRIT. Groups of tumor-bearing mice (n=4 per group) were treated with bispecific antibody (250 μg, 1.19 nmol; t=28 h) followed by various amounts of CCA-16-DOTA-Y ³⁺ (0-25 μg; 0- 2.76 nmol; t=4 h). An additional group of tumor-bearing animals for comparison was administered the dendron-based scavenging agent (Y)DOTA (62.5 μg; 0.125 nmol; 7.625 nmol) instead of the dendron-based scavenging agent CCA-16-DOTA-Y ³⁺ . 4 h after administration of the scavenging agent, mice were injected with ¹⁷⁷ Lu-DOTA-Bn (150-167 µCi; 30-33 pmol). Mice were sacrificed 48 h after administration of ¹⁷⁷ Lu; organs were removed for analysis of radioactivity concentrations according to the method described above. These organs included blood, tumor, heart, liver, spleen, stomach, small intestine, large intestine, kidney, muscle, bone, and tail (injection site). Ratios of tumor uptake to non-tumor tissue uptake as a percentage of administered dose per gram were also calculated.

Получение [111In] Proteus-DOTA. На фиг. 8 показана структура Proteus-DOTA (химическая формула: C₅₀H₈₀LuN₁₁O₁₉S³’; точная масса: 1345,48; молекулярная масса: 1346,28). См. также заявку на патент США № 18/40911, поданную 5 июля 2018 г., содержание которой полностью включено в настоящее изобретение посредством ссылки. Для исследований ПРИТ с хелатором DOTA [¹ⁿIn] Proteus-DOTA был приготовлен с применением изотопа [111In] хлорида индия (153 МБк [4,14 мКи]) и 1 мкл Proteus-DOTA с концентрацией 10 мг/мл (10 мкг; 7,42 нмоль). Выход [111In] Proteus-DOTA составил 44%, а результирующая удельная активность (УА) составила 7178 ГБк/г [194 Ки/г] или 9,67 Е6 ГБк/моль [2,61 Е5 Ки/моль]. [¹ⁿIn] Proteus-DOTA очищали с помощью картриджа Strata™ -X перед введением мышам (полимерная обращенная фаза С-18, 33 мкм, 30 мг/1 мл # 8B-S1OO-TAK, компания Phenomenex® Inc., г. Торранс, штат Калифорния, США), и радиохимическая чистота была оценена >98% либо с помощью анализа связывания in vitro с избытком биспецифического антитела, либо с помощью аналитической ВЭЖХ с обращенной фазой в сочетании с радиодетекцией.Obtaining [111In] Proteus-DOTA. In fig. Figure 8 shows the structure of Proteus-DOTA (chemical formula: C ₅₀ H ₈₀ LuN ₁₁ O ₁₉ S ³ '; exact mass: 1345.48; molecular mass: 1346.28). See also US Patent Application No. 18/40911, filed July 5, 2018, the contents of which are incorporated by reference in their entirety. For PRIT studies with the DOTA chelator [ ¹ⁿ In], Proteus-DOTA was prepared using the isotope [111In] indium chloride (153 MBq [4.14 mCi]) and 1 μl of Proteus-DOTA at a concentration of 10 mg/ml (10 μg; 7 .42 nmol). The [111In] Proteus-DOTA yield was 44% and the resulting specific activity (SA) was 7178 GBq/g [194 Ci/g] or 9.67 E6 GBq/mol [2.61 E5 Ci/mol]. [ ¹ⁿ In] Proteus-DOTA was purified using a Strata™ -X cartridge prior to administration to mice (Polymer Reverse Phase C-18, 33 µM, 30 mg/1 ml #8B-S1OO-TAK, Phenomenex® Inc., Torrance , California, USA), and radiochemical purity was assessed to be >98% either by in vitro binding assay with excess bispecific antibody or by analytical reverse phase HPLC coupled with radiodetection.

Статистический анализ. Различия между средними значениями определяли с помощью непарных параметрических t-критериев Стьюдента.Statistical analysis. Differences between means were determined using unpaired parametric Student's t tests.

ОФЭКТ/КТ визуализация. Для ОФЭКТ/КТ визуализации и исследований биораспределения после направленного действия in vivo анти-GPA33-DOTA-ПРИТ с введением [¹ⁿIn] Proteus-DOTA у мышей с опухолью SW1222, которые получали инъекции биспецифического антитела huA33-C825 и CCA-16DOTA-Y³⁺; 25 мкг; 2,76 нмоль) вводили 172 пмоль/1,67 МБк [45 мкКи] [¹ⁿIn] 1 (n=4) или 790 пмоль/7,66 МБк [207 мкКи] [¹ⁿIn] 1 (n=1). На следующий день единственную мышь, получившую более высокуюSPECT/CT imaging. For SPECT/CT imaging and biodistribution studies following in vivo targeting of anti-GPA33-DOTA-PRIT with [ ¹ⁿ In]Proteus-DOTA in SW1222 tumor-bearing mice that received injections of bispecific antibodies huA33-C825 and CCA-16DOTA-Y ^{3 +} ; 25 mcg; 2.76 nmol) 172 pmol/1.67 MBq [45 μCi] [ ¹ⁿ In] 1 (n=4) or 790 pmol/7.66 MBq [207 μCi] [ ¹ⁿ In] 1 (n=1) were administered. The next day, the only mouse that received a higher

- 28 044225 введенную активность [¹¹¹In] Proteus-DOTA исследовали с помощью ОФЭКТ/КТ через 20 ч после введения, и всех животных умерщвляли через 24 ч после введения для оценки биораспределения.- 28 044225 administered [ ¹¹¹ In]Proteus-DOTA activity was examined by SPECT/CT 20 hours after administration, and all animals were sacrificed 24 hours after administration to assess biodistribution.

Пример 3. Улучшение выведения из крови радиомеченого биспецифического антитела (BsAb) in vivo с помощью очищающих агентов согласно настоящему изобретению.Example 3 Improvement of clearance of radiolabeled bispecific antibody (BsAb) from blood in vivo using scavenging agents of the present invention.

Оценка выведения биспецифического антитела ¹³¹I из крови (¹³¹I-huA33-C825). Эксперименты in vivo проводили на здоровых (без опухолей) бестимусных мышах с целью оценки влияния однократной избыточной дозы очищающего агента на основе дендронов согласно настоящему изобретению на выведение биспецифического антитела ¹³¹I из крови.Evaluation of the removal of bispecific antibody ¹³¹ I from the blood ( ¹³¹ I-huA33-C825). In vivo experiments were performed on healthy (tumor-free) nude mice to evaluate the effect of a single overdose of the dendron-based scavenging agent of the present invention on the clearance of bispecific antibody ¹³¹ I from the blood.

Первоначально группам животных вводили 250 мкг биспецифического антитела ¹³¹I (дозу биспецифического антитела, ранее оптимизированную для ПРИТ с хелатором DOTA). Спустя 24 ч мышам вводили очищающий агент на основе дендронов согласно настоящему изобретению (25 мкг, 2,76 нмоль) или несущую среду. Серийный сбор крови выполняли в разное время вплоть до 4 ч после введения очищающего агента (или 28 ч после введения биспецифического антитела ¹³¹I), и концентрацию активности ¹³¹I определяли в каждом образце с помощью анализа на гамма-счетчике.Groups of animals were initially treated with 250 μg of bispecific antibody ¹³¹ I (a dose of bispecific antibody previously optimized for PRIT with the DOTA chelator). After 24 hours, mice were administered the dendron-based clearing agent of the present invention (25 μg, 2.76 nmol) or vehicle medium. Serial blood collections were performed at various times up to 4 hours after administration of the clearing agent (or 28 hours after administration of the ^131I bispecific antibody), and the concentration of ^131I activity was determined in each sample using gamma counter analysis.

Как показано на фиг. 1, изначально не проявлялось значительных различий в активности ¹³¹I в крови на исходном уровне (через 24 ч после введения) между группами очищающего агента и несущей среды. Очищающий агент показал эффективность выведения из крови циркулирующего биспецифического антитела ¹³¹I, поскольку средняя концентрация активности в крови значительно снизилась на 64% через 5 мин после введения с 6,7% ВД/г до 2,4% ВД/г. Через 1 ч после введения очищающего агента или несущей среды средняя активность крови составляла 5,8 (-13%) или 1,3% ВД/г (-81%), соответственно.As shown in FIG. 1, initially there were no significant differences in ¹³¹ I activity in the blood at baseline (24 hours after administration) between the cleansing agent and carrier medium groups. The scavenging agent was effective in clearing circulating bispecific antibody ^131I from the blood, as the mean blood activity concentration was significantly reduced by 64% 5 min after administration from 6.7% VD/g to 2.4% VD/g. 1 hour after administration of the cleansing agent or carrier medium, the average blood activity was 5.8 (-13%) or 1.3% ID/g (-81%), respectively.

Данные результаты показывают, что очищающие агенты согласно настоящему изобретению могут быть применимы в способах повышения чувствительности опухоли к лучевой терапии и/или лечения рака у нуждающегося в этом субъекта.These results indicate that the scavenging agents of the present invention may be useful in methods of sensitizing a tumor to radiation therapy and/or treating cancer in a subject in need thereof.

Пример 4. Применимость очищающих агентов настоящего изобретения при ПРИТ с хелатором DOTA.Example 4: Applicability of the cleansing agents of the present invention in PRPT with DOTA chelator.

Результаты предварительно направленного действия на опухоль, достигнутые с применением различных доз CCA-16-DOTA-Y3+, показаны на фиг. 2. Доза очищающего агента на основе дендронов 5-25 мкг приводила к среднему поглощению ¹⁷⁷Lu-DOTA-Bn опухолью 27-41%. ВД/г через 24 ч после инъекции активности ¹⁷⁷Lu, которая была сопоставима с поглощением ¹⁷⁷Lu-DOTA-Bn опухолью, наблюдаемым в случае с группами очищающего агента на основе декстрана и несущей среды (~35% ВД/г). Доза 25 мкг очищающего агента на основе дендронов (CCA-16-DOTA-Y3+) давала такое отношение поглощения опухолью к поглощению кровью, которое было сравнимо с наблюдаемым при дозе 62,5 мкг очищающего агента на основе декстрана. Влияние очищающего агента на основе дендронов Nацетилгалактозамина CCA-16-DOTA-Y3+ на поглощение опухолью зависело от дозы (см. фиг. 3). Кроме того, на фиг. 4 показано сравнение результатов предварительно направленного действия на опухоль, полученных с применением очищающего агента согласно настоящему изобретению, с результатами, полученными без применения очищающего агента (несущая среда), а также с конъюгатом очищающий агент на основе декстрана и очищающий агент на основе гаптена DOTA в количестве 500 кДа. Величины отношения поглощения опухолью к поглощению здоровыми тканями, полученные с применением CCA-16DOTA-Y3+, были сравнимы с таковыми, полученными с применением очищающего агента на основе декстрана.The tumor pre-targeting results achieved with different doses of CCA-16-DOTA-Y3+ are shown in FIG. 2. A dose of 5-25 μg of dendron-based scavenging agent resulted in an average tumor uptake of ¹⁷⁷ Lu-DOTA-Bn of 27-41%. ID/g at 24 h post-injection, ¹⁷⁷ Lu activity was comparable to the tumor uptake of ¹⁷⁷ Lu-DOTA-Bn observed with the dextran clearing agent and vehicle groups (~35% ID/g). A dose of 25 μg of dendron-based scavenging agent (CCA-16-DOTA-Y3+) produced a tumor to blood uptake ratio that was comparable to that observed with a dose of 62.5 μg of dextran-based scavenging agent. The effect of the dendron scavenging agent Nacetylgalactosamine CCA-16-DOTA-Y3+ on tumor uptake was dose dependent (see Fig. 3). In addition, in FIG. 4 shows a comparison of the tumor pretargeting results obtained using a scavenging agent according to the present invention with those obtained without the use of a scavenging agent (carrier medium), as well as with a conjugate of a dextran scavenging agent and a DOTA hapten scavenging agent in an amount 500 kDa. The tumor to healthy tissue uptake ratio values obtained using CCA-16DOTA-Y3+ were comparable to those obtained using the dextran-based clearing agent.

Чтобы продемонстрировать применимость [²²⁵Ас] Proteus-DOTA в комбинации с ПРИТ с хелатором DOTA с целью эффективного предварительно направленного действия на опухоль in vivo, группе бестимусных мышей со вживленными GPA33 экспрессирующими ксенотрансплантатами SW1222 вводили внутривенно биспецифическое антитело huA33-C825 (250 мкг; 1,19 нмоль) за 28 ч до введения [²²⁵Ас] Proteus-DOTA, а также вводили внутривенно очищающий агент (62,5 мкг; 0,125 нмоль декстрана; 7,625 нмоль (Y)DOTA) за 4 ч до введения [²²⁵Ас] Proteus-DOTA (182 пмоль, 1,85 кБк [50 нКи]). Этих мышей умерщвляли через 24 ч после введения [²²⁵Ас] Proteus-DOTA для оценки биораспределения. Это исследование было также повторено с применением [¹¹¹In] Proteus-DOTA (172 пмоль/1,67 МБк [45 мкКи] [¹¹¹In] Proteus-DOTA (n=4) или 790 пмоль/7,66 МБк [207 мкКи] [¹¹¹In] Proteus- DOTA (n=1) с применением CCA-16-DOTA-Y³⁺ (25 мкг; 2,76 нмоль)). На следующий день единственную мышь, получившую большую введенную активность [¹¹¹In] Proteus-DOTA, исследовали с помощью ОФЭКТ/КТ через 20 ч после введения, и всех животных умерщвляли через 24 ч после введения для оценки биораспределения.To demonstrate the utility of [ ^225Ac ]Proteus-DOTA in combination with PRIT with the DOTA chelator for effective tumor pre-targeting in vivo, a group of nude mice implanted with GPA33-expressing SW1222 xenografts were intravenously administered the bispecific antibody huA33-C825 (250 μg; 1. 19 nmol) 28 hours before administration of [ ²²⁵ Ac] Proteus-DOTA, and a clearing agent (62.5 μg; 0.125 nmol dextran; 7.625 nmol (Y)DOTA) was also administered intravenously 4 hours before administration of [ ²²⁵ Ac] Proteus- DOTA (182 pmol, 1.85 kBq [50 nCi]). These mice were sacrificed 24 hours after administration of [ ^225Ac ]Proteus-DOTA to assess biodistribution. This study was also repeated using [ ¹¹¹ In] Proteus-DOTA (172 pmol/1.67 MBq [45 μCi] [ ¹¹¹ In] Proteus-DOTA (n=4) or 790 pmol/7.66 MBq [207 μCi] [ ¹¹¹ In] Proteus-DOTA (n=1) using CCA-16-DOTA-Y ³⁺ (25 μg; 2.76 nmol)). The next day, the single mouse that had received the highest [ ¹¹¹ In]Proteus-DOTA activity administered was examined by SPECT/CT 20 hours after administration, and all animals were sacrificed 24 hours after administration to assess biodistribution.

Как показано на фиг. 5А, для тех животных, которые проходили предварительно направленную радиоиммунотерапию с [²²⁵Ас] Proteus-DOTA, поглощение кровью, опухолью и почками (как процент введенной активности на грамм ткани;% ВД/г) через 24 ч после введения составляли 0,94 ± 0,26, 16,71 ± 2,95 и 1,08 ± 0,55 соответственно, что соответствовало отношениям активности в опухоли к активности в органах примерно 18:1 и 16:1 для крови и почек, соответственно. Поглощение [¹¹¹In] Proteus-DOTA кровью, опухолью и почками через 24 ч после введения составляло 0,76 ± 0,09, 13,18 ± 0,97 и 1,02 ± 0,06, соответственно, что соответствует отношениям активности в опухоли к активности в органах примерно 17:1 и 13:1 для крови и почек, соответственно. Никаких существенных различий между применением [²²⁵Ас]As shown in FIG. 5A, for those animals that received pre-targeted radioimmunotherapy with [ ²²⁵ Ac]Proteus-DOTA, blood, tumor and kidney uptake (as a percentage of administered activity per gram of tissue; % ID/g) 24 hours after administration was 0.94 ± 0.26, 16.71 ± 2.95, and 1.08 ± 0.55, respectively, corresponding to tumor to organ activity ratios of approximately 18:1 and 16:1 for blood and kidney, respectively. The uptake of [ ¹¹¹ In]Proteus-DOTA by blood, tumor and kidney 24 h after administration was 0.76 ± 0.09, 13.18 ± 0.97 and 1.02 ± 0.06, respectively, which corresponds to the activity ratios in tumor to organ activity is approximately 17:1 and 13:1 for blood and kidneys, respectively. No significant differences between the use of [ ²²⁵ Ac]

- 29 044225- 29 044225

Proteus-DOTA и [^u1In] Proteus-DOTA не наблюдалось, за исключением поглощения печенью, которое было примерно в 3 раза выше при применении [²²⁵Ас] Proteus-DOTA (1,40 ± 0,47 и 0,46 ± 0,05 при применении [²²⁵Ас] Proteus-DOTA или [¹ⁿIn] Proteus-DOTA, соответственно; Р<0,05) и поглощением костями, которое было выше при применении [¹¹¹In] Proteus-DOTA (нет данных и 0,15 ± 0,01 для [²²⁵Ас] Proteus-DOTA или [¹ⁿIn] Proteus -DOTA соответственно; Р<0,001). Эти отношения активности в опухоли к активности в органах аналогичны предыдущим исследованиям биораспределения, проведенным с применением анти-GPA33-DOTA с использованием радиоактивного индикатора ¹⁷⁷Lu-DOTA-Bn или ⁸⁶YDOTA-Bn на той же животной модели, в которой среднее поглощение опухолью для обоих гаптенов DOTA составляли ~8% ВД/г ((1,85-8,8 МБк; 10-50 пмоль для любого гаптена M-DOTA-Bn) через 24 ч после введения (см. Cheal, S. M. et al., Eur J Nucl Med Mol Imaging 43:925-937 (2016)), предполагая, что аффинность С825 к [²²⁵Ас] Proteus-DOTA была аналогичной (см. фиг. 5Б).Proteus-DOTA and [ ^u1In ]Proteus-DOTA were not observed, except for liver uptake, which was approximately 3 times higher with [ ²²⁵ Ac]Proteus-DOTA (1.40 ± 0.47 and 0.46 ± 0. 05 with [ ²²⁵ Ac] Proteus-DOTA or [ ¹ⁿ In] Proteus-DOTA, respectively; P < 0.05) and bone absorption, which was higher with [ ¹¹¹ In] Proteus-DOTA (no data and 0.15 ± 0.01 for [ ^225Ac ]Proteus-DOTA or [ ^1nIn ]Proteus-DOTA, respectively; P<0.001). These ratios of tumor activity to organ activity are similar to previous biodistribution studies performed with anti-GPA33-DOTA using the radiotracer ¹⁷⁷ Lu-DOTA-Bn or ⁸⁶ YDOTA-Bn in the same animal model, in which average tumor uptake for both DOTA haptens were ~8% WD/g ((1.85-8.8 MBq; 10-50 pmol for any M-DOTA-Bn hapten) 24 hours after administration (see Cheal, SM et al., Eur J Nucl Med Mol Imaging 43:925–937 (2016)), suggesting that the affinity of C825 for [ ²²⁵ Ac]Proteus-DOTA was similar (see Fig. 5B).

На фиг. 6А показаны результаты предварительно направленного действия на опухоль, полученные в группе животных, которым вводили 172 пмоль/1,67 МБк [45 мкКи] [ⁿ¹In] Proteus-DOTA (n=4) или 790 пмоль/7,66 МБк [207 мкКи] [¹¹¹In] Proteus-DOTA (n=1). Отношение поглощения опухолью к поглощению здоровой тканью обычно было выше у животных, получавших более высокую дозу [¹¹¹In] Proteus-DOTA (см. фиг. 6А и 7).In fig. Figure 6A shows tumor pre-targeting results obtained in a group of animals administered 172 pmol/1.67 MBq [45 μCi] [ ⁿ¹ In] Proteus-DOTA (n=4) or 790 pmol/7.66 MBq [207 μCi ] [ ¹¹¹ In] Proteus-DOTA (n=1). The ratio of tumor uptake to healthy tissue uptake was generally higher in animals receiving a higher dose of [ ¹¹¹ In]Proteus-DOTA (see Figs. 6A and 7).

Как показано на фиг. 6Б, результаты ПРИТ с применением анти-GPA33-DOTA, полученные с введением [²²⁵Ас] Proteus-DOTA (применяют в комбинации с очищающим агентом на основе декстрана) и [¹¹¹In] Proteus-DOTA (применяют в комбинации с очищающим агентом на основе дендронов CCA-16DOTA-Y3+) были сопоставимы.As shown in FIG. 6B, PRIT results using anti-GPA33-DOTA obtained with the administration of [ ²²⁵ Ac] Proteus-DOTA (used in combination with a dextran-based scavenging agent) and [ ¹¹¹ In] Proteus-DOTA (used in combination with a dextran-based scavenging agent). dendrons CCA-16DOTA-Y3+) were comparable.

Пример 5. Применение очищающего агента на основе дендронов N-аиетилгалактозамина в предварительно направленной радиоиммунотерапии с хелатором DOTA.Example 5: Use of dendron-based scavenging agent N-aietylgalactosamine in pretargeted radioimmunotherapy with DOTA chelator.

Была проверена основная гипотеза о том, что анти-GPA33 ПРИТ с введением ¹⁷⁷Lu-аминобензил DOTA ([¹⁷⁷Lu] LuDOTA-Bn), включая очищающий агент на основе дендронов CCA-16-DOTA-Y3+, можно применять для достижения высоких терапевтических индексов (ТИ) вместо очищающих агентов на основе декстрана. Терапевтический индекс определяется в данном случае как расчетное отношение дозы, поглощенной опухолью, к дозе, поглощенной здоровыми тканями.The main hypothesis was tested that anti-GPA33 PRIT with ¹⁷⁷ Lu-aminobenzyl DOTA ([ ¹⁷⁷ Lu]LuDOTA-Bn), including the dendron-based scavenging agent CCA-16-DOTA-Y3+, can be used to achieve high therapeutic indices (TI) instead of dextran-based cleaning agents. The therapeutic index is defined in this case as the calculated ratio of the dose absorbed by the tumor to the dose absorbed by healthy tissues.

Оценки поглощенных доз для ПРИТ с введением [¹⁷⁷Lu] LuDOTA-Bn, включая очищающий агент на основе дендронов CCA-16-DOTA-Y3+. Для расчета поглощенных доз для ПРИТ с введением [¹⁷⁷Lu] LuDOTA-Bn, включая очищающий агент на основе дендронов (очищающий агент согласно настоящему изобретению) группам бестимусных мышей с вживленными GPA33-экспрессирующими ксенотрансплантатами SW1222 (n=5 на группу), вводили внутривенно биспецифическое антитело huA33-C825 (250 мкг; 1,19 нмоль) за 28 ч до введения, а также вводили внутривенно очищающий агент на основе дендронов, CCA-16-DOTA-Y3+ (25 мкг; 2,76 нмоль) за 4 ч до введения [¹⁷⁷Lu] LuDOTA-Bn (20 пмоль, 3,7 МБк [100 мкКи]). Мышей умерщвляли через 1, 4, 24 или 48 ч после введения [¹⁷⁷Lu] LuDOTA-Bn для анализа биораспределения. Для каждой ткани зависимости концентрации активности от времени без корректировки по распаду были аппроксимированы с помощью Excel к однокомпонентной, двухкомпонентной или более сложной экспоненциальной функции, в зависимости от ситуации, и аналитически интегрированы для расчета активности накопленной концентрации на единицу введенной активности (МБк-ч/г на МБк). Константа равновесной дозы ¹⁷⁷Lu для непроникающего излучения (8,49 г-сГр/МБк-ч) использовалась для оценки от опухоли к опухоли и выбора самопоглощаемых доз от органа к органу, предполагая полное локальное поглощение только ¹⁷⁷Lu β-лучей, и игнорируя вклад у-лучей и других доз. Данные, полученные в результате этих исследований, показаны на фиг. 9.Absorbed dose estimates for PRIT administered with [ ¹⁷⁷ Lu]LuDOTA-Bn, including the dendron-based scavenging agent CCA-16-DOTA-Y3+. To calculate absorbed doses for PRIT with [ ¹⁷⁷ Lu]LuDOTA-Bn, including a dendron-based scavenging agent (the scavenging agent of the present invention), groups of nude mice implanted with GPA33-expressing SW1222 xenografts (n=5 per group) were administered i.v. huA33-C825 antibody (250 μg; 1.19 nmol) 28 h before administration, and intravenous dendron-based clearing agent, CCA-16-DOTA-Y3+ (25 μg; 2.76 nmol) 4 h before administration [ ¹⁷⁷ Lu]LuDOTA-Bn (20 pmol, 3.7 MBq [100 µCi]). Mice were sacrificed 1, 4, 24, or 48 h after administration of [ ¹⁷⁷ Lu]LuDOTA-Bn for biodistribution analysis. For each tissue, activity concentration-time relationships without decay correction were fitted using Excel to a one-component, two-component, or more complex exponential function, as appropriate, and analytically integrated to calculate the accumulated concentration activity per unit of administered activity (MBq-h/g per MBq). The ¹⁷⁷ Lu equilibrium dose constant for non-penetrating radiation (8.49 g-cGy/MBq-h) was used for tumor-to-tumor estimation and selection of organ-to-organ self-absorbed doses, assuming total local absorption of only ¹⁷⁷ Lu β-rays, and ignoring the contribution y-rays and other doses. Data obtained from these studies are shown in FIG. 9.

Кривая зависимости активности от времени с корректировкой по распаду через 48 ч после введения [¹⁷⁷Lu] LuDOTA-Bn для опухоли, крови, печени, селезенки, почек и мышц, показана на фиг. 10. На фиг. 11 показаны поглощенные дозы (сГр/МБк) и терапевтические индексы для различных тканей. Как показано на фиг. 11, расчетные поглощенные дозы [¹⁷⁷Lu] LuDOTA-Bn для крови, опухоли, печени, селезенки и почек составляли 11,7, 468,4, 9,97, 5,49 и 13,3 сГр/МБк соответственно. Отношение оценок поглощенной дозы опухолью к оценкам поглощенной дозы выбранными здоровыми тканями (т.е. ТИ) варьировалось от примерно 40 (например, для крови и почек) до примерно 550 для мышц (фиг. 11).The decay-adjusted activity-time curve 48 hours after administration of [ ¹⁷⁷ Lu]LuDOTA-Bn for tumor, blood, liver, spleen, kidney, and muscle is shown in FIG. 10. In FIG. Figure 11 shows absorbed doses (cGy/MBq) and therapeutic indices for various tissues. As shown in FIG. 11, the calculated absorbed doses of [ ¹⁷⁷ Lu]LuDOTA-Bn for blood, tumor, liver, spleen and kidney were 11.7, 468.4, 9.97, 5.49 and 13.3 cGy/MBq, respectively. The ratio of tumor absorbed dose estimates to selected healthy tissue absorbed dose estimates (ie, TI) ranged from about 40 (eg, blood and kidney) to about 550 for muscle (Fig. 11).

Для оптимизированного ПРИТ с введением [¹⁷⁷Lu] LuDOTA-Bn, включая очищающий агент на основе декстрана, расчетные поглощенные дозы (сГр/МБк) опухолью, кровью, печенью, селезенкой и почками за один цикл составляли 65,8, 0,9 (ТИ 73), 6,3 (ТИ 10), 6,6 (ТИ 10) и 5,3 (ТИ 12) соответственно. См. Cheal et al., Eur J Nucl Med Mol Imaging 43: 925 (2016). Было продемонстрировано, что эффективное лечение без каких-либо серьезных токсических эффектов, связанных с лечением (например, 111,0 МБк, доставленные в качестве фракционированной дозы, вызывают полную ремиссию со 100% частотой, включая выживаемость более 140 дней у двух из девяти мышей; поглощенные дозы 7304,100 и 588 сГр опухолью, кровью и почками). Cheal et al., Eur J Nucl Med Mol Imaging 43:925 (2016).For optimized PRIT with administration of [ ¹⁷⁷ Lu]LuDOTA-Bn including dextran-based scavenging agent, the calculated absorbed doses (cGy/MBq) to tumor, blood, liver, spleen and kidney per cycle were 65.8, 0.9 (TI 73), 6.3 (TI 10), 6.6 (TI 10) and 5.3 (TI 12), respectively. See Cheal et al., Eur J Nucl Med Mol Imaging 43: 925 (2016). Effective treatment without any serious treatment-related toxicities (e.g., 111.0 MBq delivered as a fractionated dose has been demonstrated to induce complete remission with a 100% rate, including survival of more than 140 days in two of nine mice; absorbed doses of 7304,100 and 588 cGy by tumor, blood and kidneys). Cheal et al., Eur J Nucl Med Mol Imaging 43:925 (2016).

- 30 044225- 30 044225

Основываясь на оценках переносимости дозы излучения здоровых тканей человека, полученных из клинических наблюдений (Marks, et al., Int J Radiat Oncol Biol Phys. 76:S10-9 (2010)), максимально переносимые дозы (MTD) составляют 250 сГр для костного мозга, 1500 сГр для легких, 3000 сГр для печени и 2000 сГр для почек. Следовательно, для оптимизированной ПРИТ с введением [¹⁷⁷Lu] LuDOTA-Bn, включая очищающий агент на основе декстрана, максимальная переносимая предварительно направленная активность [¹⁷⁷Lu] LuDOTA-Bn составляет 278 МБк, с костным мозгом в качестве ограничивающего дозу органа. При этой активности предполагаемая поглощенная доза, доставленная в опухоль, составляет 18292 сГр (183 Гр), из которых 250 сГр приходятся на кровь (костный мозг) и 1473 сГр приходятся на почки.Based on estimates of radiation dose tolerance for healthy human tissue obtained from clinical observations (Marks, et al., Int J Radiat Oncol Biol Phys. 76:S10-9 (2010)), the maximum tolerated dose (MTD) is 250 cGy to bone marrow , 1500 cGy for the lungs, 3000 cGy for the liver and 2000 cGy for the kidneys. Therefore, for optimized PRPT with administration of [ ^177Lu ]LuDOTA-Bn, including a dextran-based scavenging agent, the maximum tolerated pretargeting activity of [ ^177Lu ]LuDOTA-Bn is 278 MBq, with bone marrow as the dose-limiting organ. With this activity, the estimated absorbed dose delivered to the tumor is 18,292 cGy (183 Gy), of which 250 cGy is delivered to the blood (bone marrow) and 1,473 cGy is delivered to the kidneys.

Для вышеприведенного примера ПРИТ с введением [¹⁷⁷Lu] LuDOTA-Bn, включая очищающий агент на основе дендронов CCA-16-DOTA-Y³⁺, максимальная переносимая предварительно направленная активность [¹⁷⁷Lu] LuDOTA-Bn составляет 21 МБк для костного мозга, применяемого в качестве дозолимитирующего органа. При этой активности расчетная поглощенная доза, доставленная в опухоль, составляет 9836 сГр (98 Гр), из которых 246 сГр приходятся на кровь (костный мозг) и 280 сГр - на почки. Таким образом, эффективная и безопасная терапия колоректальной карциномы прогнозируется в ксенотрансплантатах у мышей, учитывая поглощенную опухолью дозу ~73 Гр, которая может быть достигнута при введенной активности 15,6 МБк (183 сГр для крови (костный мозг) и 207 сГр для почек).For the above example of PRPT with administration of [ ^177Lu ]LuDOTA-Bn, including the dendron-based scavenging agent CCA-16-DOTA-Y ³⁺ , the maximum tolerated pre-targeting activity of [ ^177Lu ]LuDOTA-Bn is 21 MBq for the bone marrow administered as a dose-limiting organ. With this activity, the estimated absorbed dose delivered to the tumor is 9836 cGy (98 Gy), of which 246 cGy is delivered to the blood (bone marrow) and 280 cGy to the kidneys. Thus, effective and safe therapy for colorectal carcinoma is predicted in xenografts in mice, given the tumor uptake dose of ~73 Gy, which can be achieved with an administered activity of 15.6 MBq (183 cGy for blood (bone marrow) and 207 cGy for kidneys).

В конечном итоге, данные показывают, что очищающий агент на основе дендронов может быть применен для лечения колоректальной карциномы человека (например, 70 Гр на опухоль) на мышиных моделях с меньшей введенной активностью ¹⁷⁷Lu по сравнению с очищающим агентом на основе декстрана с различиями в дозиметрии для критических тканей (например, с уменьшением дозы для почек).Ultimately, the data indicate that a dendron-based scavenging agent can be used to treat human colorectal carcinoma (eg, 70 Gy per tumor) in mouse models with less ¹⁷⁷ Lu activity administered compared to a dextran-based scavenging agent with differences in dosimetry for critical tissues (for example, with a reduced dose for the kidneys).

Эквиваленты.Equivalents.

Настоящее изобретение не должно ограничиваться конкретными вариантами реализации, описанными в настоящем изобретении, которые предназначены как отдельные иллюстрации отдельных аспектов настоящего изобретения. Многие модификации и вариации настоящего изобретения могут быть выполнены без отступления от ее существа и объёма, что будет очевидно специалистам в данной области техники. Функционально эквивалентные способы и устройства в рамках настоящего изобретения, в дополнение к перечисленным в настоящем изобретении, будут очевидны специалистам в данной области техники из предшествующего описания. Предполагается, что такие модификации и вариации входят в объем настоящего изобретения. Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными способами, реагентами, соединениями, композициями или биологическими системами, которые, очевидно, могут варьироваться. Также следует понимать, что применяемая в настоящем изобретении терминология предназначена только для описания конкретных вариантов реализации и не претендует на то, чтобы быть ограничивающей.The present invention should not be limited to the specific embodiments described in the present invention, which are intended as separate illustrations of certain aspects of the present invention. Many modifications and variations of the present invention can be made without departing from its spirit and scope, as will be apparent to those skilled in the art. Functionally equivalent methods and devices within the scope of the present invention, in addition to those listed herein, will be apparent to those skilled in the art from the foregoing description. Such modifications and variations are intended to be within the scope of the present invention. It should be understood that the present invention is not limited to specific methods, reagents, compounds, compositions or biological systems, which, of course, may vary. It should also be understood that the terminology used in the present invention is intended to describe specific embodiments only and is not intended to be limiting.

Кроме того, если признаки или аспекты раскрытия описаны в терминах групп Маркуша, специалисты в данной области техники поймут, что признаки или аспекты раскрытия также описаны в терминах любого отдельного члена или подгруппы членов группы Маркуша.Moreover, if features or aspects of the disclosure are described in terms of Markush groups, those skilled in the art will understand that features or aspects of the disclosure are also described in terms of any individual member or subset of members of the Markush group.

Как будет понятно специалисту в данной области техники, по всем вопросам, особенно с точки зрения предоставления письменного описания, все диапазоны, раскрытые в настоящем изобретении, также охватывают любые и все возможные поддиапазоны и их комбинации. Любой указанный диапазон можно легко охарактеризовать как достаточно описывающий и позволяющий разбить один и тот же диапазон, по меньшей мере, на равные половины, трети, четверти, пятые, десятые и т.д. В качестве неограничивающего примера каждый обсуждаемый в настоящем изобретении диапазон может быть легко разбит на нижнюю треть, среднюю треть, верхнюю треть и т.д. Как будет также понятно специалисту в данной области техники, все термины, такие как до, по меньшей мере, более чем, менее чем и т.д., включают указанное число и относятся к диапазонам, которые впоследствии могут быть разбиты на поддиапазоны, как описано выше. Наконец, как будет понятно специалисту в данной области техники, диапазон включает каждый отдельный элемент. Таким образом, например, группа, имеющая 1-3 клетки, относится к группам, имеющим 1, 2 или 3 клетки. Аналогичным образом группа, имеющая 1-5 клеток, относится к группам, имеющим 1, 2, 3, 4 или 5 клеток и т.п.As will be understood by one skilled in the art, for all purposes, especially from the point of view of providing a written description, all ranges disclosed in the present invention also cover any and all possible sub-ranges and combinations thereof. Any specified range can easily be characterized as sufficiently descriptive to allow the same range to be broken down into at least equal halves, thirds, quarters, fifths, tenths, etc. As a non-limiting example, each range discussed in the present invention can be easily broken down into a lower third, a middle third, an upper third, etc. As will also be understood by one skilled in the art, all terms such as up to, at least more than, less than, etc. include the number indicated and refer to ranges that can subsequently be broken down into subranges as described higher. Finally, as one skilled in the art will appreciate, the range includes each individual element. Thus, for example, a group having 1-3 cells refers to groups having 1, 2 or 3 cells. Likewise, a group having 1-5 cells refers to groups having 1, 2, 3, 4 or 5 cells, etc.

Все патенты, заявки на патенты, предварительные заявки и публикации, на которые имеется ссылка или цитируемые в настоящем изобретении, полностью включены посредством ссылки, включая все фигуры и таблицы, в той степени, в которой они не противоречат явным идеям данного описания.All patents, patent applications, provisional applications and publications referenced or cited in the present invention are incorporated by reference in their entirety, including all figures and tables, to the extent they do not conflict with the express teachings of this specification.

Claims

1. Соединение, выбранное из1. Connection selected from

- 32 044225- 32 044225

или его фармацевтически приемлемая соль, в которомor a pharmaceutically acceptable salt thereof, in which

X¹, X², X³, X⁴, X⁵, X⁶, X⁷, X⁸, X⁹, X¹⁰, X¹¹, X¹², X¹³, X¹⁴, X¹⁵, X¹⁶, X¹⁷, X¹⁸, X¹⁹ и X²⁰ каждый независимо представляет собой Н;X ¹ , X ² , X 3, X ⁴ , X ⁵ , X ⁶ , ^{X 7} ^, X ⁸ , X 9, X ¹⁰ , X ¹¹ , X ¹² , X ¹³ , X ¹⁴ , X ¹⁵ , ^{X 16} ^, X ¹⁷ , X ¹⁸ , X ¹⁹ and X ²⁰ are each independently H;

Y¹, Y², Y³, Y⁴ и Y⁵ каждый независимо представляет собой О или S;Y ¹ , Y ² , Y ³ , Y ⁴ and Y ⁵ are each independently O or S;

x равен 1; и y равен 1.x is 1; and y is 1.

2. Соединение очищающего агента, выбранное из2. A cleaning agent compound selected from

- 33 044225- 33 044225

- 34 044225- 34 044225

или его фармацевтически приемлемая соль, в котором М¹, М², М³, М⁴ и М⁵ каждый независимо представляет собой Lu³⁺, Sc³⁺, Ga³⁺, Y³⁺, In³⁺, La³⁺, Ce³⁺, Eu³⁺, Tb³⁺ или Gd³⁺;or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein M ¹ , M ² , M ³ , M ⁴ and M ⁵ are each independently Lu ³⁺ , Sc ³⁺ , Ga ³⁺ , Y ³⁺ , In ³⁺ , La ³⁺ , Ce ³⁺ , Eu ³⁺ , Tb ³⁺ or Gd ³⁺ ;

x равен 1;x is 1;

yравен 1.yequals 1.

- 35 044225- 35 044225

3. Соединение по любому из пп.1, 2, в котором Y¹, Y², Y³, Y⁴ и Y⁵ каждый независимо представляет собой S.3. A compound according to any one of claims 1, 2, wherein Y ¹ , Y ² , Y ³ , Y ⁴ and Y ⁵ are each independently S.

4. Способ увеличения чувствительности опухоли к лучевой терапии у субъекта с диагнозом рак, включающий:4. A method of increasing the sensitivity of a tumor to radiation therapy in a subject diagnosed with cancer, comprising:

(а) введение субъекту в эффективном количестве биспецифического антитела анти-DOTA, причем биспецифическое антитело анти-DOTA выполнено с возможностью локализации в опухоли, экспрессирующей мишень опухолевого антигена;(a) administering to the subject an effective amount of an anti-DOTA bispecific antibody, wherein the anti-DOTA bispecific antibody is configured to localize to a tumor expressing the target tumor antigen;

(б) введение субъекту в эффективном количестве соединения очищающего агента по любому из пп.2, 3;(b) administering to the subject an effective amount of the cleansing agent compound of any one of claims 2, 3;

(в) введение субъекту в эффективном количестве радиомеченого гаптена DOTA, причем гаптен DOTA выполнен с возможностью образования комплекса с биспецифическим антителом анти-DOTA.(c) administering to the subject an effective amount of a radiolabeled DOTA hapten, wherein the DOTA hapten is configured to form a complex with an anti-DOTA bispecific antibody.

5. Способ лечения рака у нуждающегося в этом субъекта, включающий:5. A method of treating cancer in a subject in need thereof, comprising:

6. Способ по п.5, дополнительно включающий последовательное, раздельное или одновременное введение субъекту по меньшей мере одного химиотерапевтического агента, выбранного из группы, состоящей из азотистых ипритов, производных этиленимина, алкилсульфонатов, нитрозомочевин, гемцитабина, триазенов, аналогов фолиевой кислоты, антрациклинов, таксанов, ингибиторов ЦОГ-2, аналогов пиримидина, аналогов пурина, антибиотиков, ингибиторов ферментов, эпиподофиллотоксинов, координационных комплексов платины, алкалоидов барвинка, замещенных мочевин, производных метилгидразина, адренокортикальных супрессоров, антагонистов гормонов, эндостатина, таксолов, камптотецинов, SN-38, доксорубицина, аналогов доксорубицина, антиметаболитов, алкилирующих агентов, антимитотиков, антиангиогенных агентов, ингибиторов тирозинкиназы, ингибиторов mTOR, ингибиторов белка теплового шока (HSP90), ингибиторов протеосом, ингибиторов HDAC, проапоптотических агентов, метотрексата и СРТ-11.6. The method of claim 5, further comprising sequential, separate or simultaneous administration to the subject of at least one chemotherapeutic agent selected from the group consisting of nitrogen mustards, ethyleneimine derivatives, alkyl sulfonates, nitrosoureas, gemcitabine, triazenes, folic acid analogues, anthracyclines, taxanes, COX-2 inhibitors, pyrimidine analogs, purine analogs, antibiotics, enzyme inhibitors, epipodophyllotoxins, platinum coordination complexes, vinca alkaloids, substituted ureas, methylhydrazine derivatives, adrenocortical suppressors, hormone antagonists, endostatin, taxols, camptothecins, SN-38, doxorubicin , doxorubicin analogs, antimetabolites, alkylating agents, antimitotics, antiangiogenic agents, tyrosine kinase inhibitors, mTOR inhibitors, heat shock protein (HSP90) inhibitors, proteasome inhibitors, HDAC inhibitors, proapoptotic agents, methotrexate and CPT-11.

7. Способ по любому из пп.4-6, в котором мишень опухолевого антигена выбрана из группы, состоящей из GPA33, HER2/neu, GD2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, MUM-1, CDK4, Nацетилглюкозаминилтрансферазы, р15, др75, бета-катенина, ErbB2, ракового антигена 125 (СА-125), карциноэмбрионального антигена (СЕА), RAGE, MART (антигена меланомы), MUC-1, MUC-2, MUC-3, MUC-4, MUC-5ac, MUC-16, MUC-17, тирозиназы, Pmel 17 (gp100), последовательности интрона GnT-V подтипа V (последовательности V интрона N-ацетилглюкоаминилтрансферазы подтипа V), рака простаты psm, PRAME (антигена меланомы), β-катенина, EBNA (ядерного антигена вируса Эпштейна-Барра) 16, р53, белка устойчивости рака легких к противоопухолевым препаратам (LRP) Bcl-2, простатоспецифического антигена (PSA), Ki-67, CEACAM6, специфического антигена-р толстой кишки (CSAp), HLA-DR, CD40, CD74, CD138, EGFR, EGP-1, EGP-2, VEGF, PIGF, инсулиноподобного фактора роста (ILGF), тенасцина, тромбоцитарного фактора роста, IL-6, CD20, CD19, PSMA, CD33, CD123, MET, DLL4, Ang-2, HER3, IGF-1R, CD30, TAG-72, SPEAP, CD45, L1-CAM, антигена Льюиса Y (Ley), Е-кадгерина, Vкадгерина и ЕрСАМ.7. The method according to any one of claims 4-6, in which the tumor antigen target is selected from the group consisting of GPA33, HER2/neu, GD2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, MUM -1, CDK4, Nacetylglucosaminyltransferase, p15, dr75, beta-catenin, ErbB2, cancer antigen 125 (CA-125), carcinoembryonic antigen (CEA), RAGE, MART (melanoma antigen), MUC-1, MUC-2, MUC- 3, MUC-4, MUC-5ac, MUC-16, MUC-17, tyrosinase, Pmel 17 (gp100), GnT-V subtype V intron sequences (N-acetylglucoaminyltransferase subtype V intron V sequences), prostate cancer psm, PRAME ( melanoma antigen), β-catenin, EBNA (Epstein-Barr virus nuclear antigen) 16, p53, lung cancer resistance protein (LRP) Bcl-2, prostate-specific antigen (PSA), Ki-67, CEACAM6, specific antigen- colon p (CSAp), HLA-DR, CD40, CD74, CD138, EGFR, EGP-1, EGP-2, VEGF, PIGF, insulin-like growth factor (ILGF), tenascin, platelet-derived growth factor, IL-6, CD20, CD19, PSMA, CD33, CD123, MET, DLL4, Ang-2, HER3, IGF-1R, CD30, TAG-72, SPEAP, CD45, L1-CAM, Lewis Y antigen (Ley), E-cadherin, Vcadherin and EpCAM .

8. Способ по любому из пп.4-7, в котором биспецифическое антитело анти-DOTA вводят внутривенно, внутримышечно, внутриартериально, интратекально, интракапсулярно, внутриглазнично, внутрикожно, внутрибрюшинно, транстрахеально, подкожно, интрацеребровентрикулярно, перорально или интраназально; и/или в котором радиомеченый гаптен DOTA и/или очищающий агент вводят внутривенно, внутримышечно, внутриартериально, интратекально, интракапсулярно, внутриглазнично, внутрикожно, внутрибрюшинно, транстрахеально, подкожно, интрацеребровентрикулярно, перорально или интраназально.8. The method according to any one of claims 4-7, in which the bispecific anti-DOTA antibody is administered intravenously, intramuscularly, intraarterially, intrathecally, intracapsularly, intraorbitally, intradermally, intraperitoneally, transtracheally, subcutaneously, intracerebroventricularly, orally or intranasally; and/or wherein the radiolabeled DOTA hapten and/or clearing agent is administered intravenously, intramuscularly, intraarterially, intrathecally, intracapsularly, intraorbitally, intradermally, intraperitoneally, transtracheally, subcutaneously, intracerebroventricularly, orally or intranasally.

9. Способ по любому из пп.4-8, в котором рак выбран из группы, состоящей из рака груди, колоректального рака, рака шейки матки, рака яичников, рака печени, рака мочевого пузыря, гепатомы, гепатоцеллюлярной карциномы, рака мозга, рака легких, рака желудочно-кишечного тракта или рака желудка, рака поджелудочной железы, рака щитовидной железы, рака почек, рака простаты, меланомы, саркомы, карциномы, опухоли Вильмса, рака эндометрия, глиобластомы, плоскоклеточного рака, астроцитомы, карциномы слюнной железы, рака вульвы, карциномы полового члена, рака головы и шеи, где необязательно рак головного мозга представляет собой аденому гипофиза, менингиому, нейробластому или краниофарингиому.9. The method according to any one of claims 4 to 8, wherein the cancer is selected from the group consisting of breast cancer, colorectal cancer, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, hepatoma, hepatocellular carcinoma, brain cancer, cancer lung, gastrointestinal or stomach cancer, pancreatic cancer, thyroid cancer, kidney cancer, prostate cancer, melanoma, sarcoma, carcinoma, Wilms tumor, endometrial cancer, glioblastoma, squamous cell carcinoma, astrocytoma, salivary gland carcinoma, vulvar cancer , penile carcinoma, head and neck cancer, wherein the brain cancer is not necessarily a pituitary adenoma, meningioma, neuroblastoma or craniopharyngioma.

10. Способ по любому из пп.4-9, в котором субъект демонстрирует отношение поглощения опухолью к поглощению здоровой тканью примерно 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1 или 100:1.10. The method of any one of claims 4 to 9, wherein the subject exhibits a tumor to healthy tissue uptake ratio of about 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8: 1, 9:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1 or 100:1.

11. Способ по любому из пп.4-10, в котором радиомеченый гаптен DOTA помечен радионуклидом,11. The method according to any one of claims 4 to 10, in which the radiolabeled DOTA hapten is labeled with a radionuclide,

- 36 044225 выбранным из группы, состоящей из ²¹³Bi, ²¹¹At, ²²⁵Ac, ¹⁵²Dy, ²¹²Bi, ²²³Ra, ²¹⁹Rn, ²¹⁵Po, ²¹¹Bi, ²²¹Fr, ²¹⁷At, ²⁵⁵Fm, ⁸⁶Y, ⁹⁰Y, ⁸⁹Sr, ¹⁶⁵Dy, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁷⁷Lu, ⁶⁷Cu, ^1HIn, ⁶⁷Ga, ⁵¹Cr, ⁵⁸Co, ^99mTc, ^103mRh, ^195mPt, ¹¹⁹Sb, ¹⁶¹Ho, ^189mOs, ¹⁹²Ir, ²⁰¹Tl, ²⁰³Pb, ⁶⁸Ga, ²²⁷Th, ⁶⁴Cu и, необязательно, в котором радиомеченый гаптен DOTA включает один или несколько компонентов из Proteus-DOTA, S-2-(R-аминобензил)-1,4,7,10тетраазациклододекантетрауксусной кислоты (DOTA-Bn), DOTA-Bn-биотина, BAD (((S)-2-(4-(2бром)ацетамидо)бензил)-DOTA), NBD ((S)-2-(4-нитробензил)-DOTA), DOTA-RGD, DOTA-PEGE(c(RGDyK))₂, DOTA-8-AOC-BBN, p-NO₂-Bn-DOTA, DOTA-PESIN, DOTA-биотин-саркозина (DOTAбиотин), моно 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты (сложный эфир Nгидроксисукцинимида) (DOTA-NHS) или DOTATyrLysDOTA.- 36 044225 selected from the group consisting of ²¹³ Bi, ²¹¹ At, ²²⁵ Ac, ¹⁵² Dy, ²¹² Bi, ²²³ Ra, ²¹⁹ Rn, ²¹⁵ Po, ²¹¹ Bi, ²²¹ Fr, ²¹⁷ At, ²⁵⁵ Fm, ⁸⁶ Y, ⁹⁰ Y , ⁸⁹ Sr, ¹⁶⁵ Dy, ¹⁸⁶ Re, ¹⁸⁸ Re, ¹⁷⁷ Lu, ⁶⁷ Cu, ^1H In, ⁶⁷ Ga, ⁵¹ Cr, ⁵⁸ Co, ^99m Tc, ^103m Rh, ^195m Pt, ¹¹⁹ Sb, ¹⁶¹ Ho, ^189m Os, ¹⁹² Ir, ²⁰¹ Tl, ²⁰³ Pb, ⁶⁸ Ga, ²²⁷ Th, ⁶⁴ Cu and, optionally, wherein the radiolabeled DOTA hapten includes one or more components of Proteus-DOTA, S-2-(R-aminobenzyl)-1,4,7 ,10tetraazacyclododecanetetraacetic acid (DOTA-Bn), DOTA-Bn-biotin, BAD (((S)-2-(4-(2bromo)acetamido)benzyl)-DOTA), NBD ((S)-2-(4-nitrobenzyl )-DOTA), DOTA-RGD, DOTA-PEGE(c(RGDyK)) ₂ , DOTA-8-AOC-BBN, p-NO ₂ -Bn-DOTA, DOTA-PESIN, DOTA-biotin-sarcosine (DOTAbiotin), mono 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (Nhydroxysuccinimide ester) (DOTA-NHS) or DOTATyrLysDOTA.