EA043759B1 - Антитела с повышенной аффинностью к рецептору эпидермального фактора роста и происходящие из них фрагменты - Google Patents
Антитела с повышенной аффинностью к рецептору эпидермального фактора роста и происходящие из них фрагменты Download PDFInfo
- Publication number
- EA043759B1 EA043759B1 EA202091328 EA043759B1 EA 043759 B1 EA043759 B1 EA 043759B1 EA 202091328 EA202091328 EA 202091328 EA 043759 B1 EA043759 B1 EA 043759B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- seq
- mabs
- mab
- nimotuzumab
- cdr2
- Prior art date
Links
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title description 41
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 title description 2
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 title description 2
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 claims description 27
- 102100035361 Cerebellar degeneration-related protein 2 Human genes 0.000 claims description 23
- 101000737796 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related protein 2 Proteins 0.000 claims description 23
- 101000851181 Homo sapiens Epidermal growth factor receptor Proteins 0.000 claims description 21
- 101000737793 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related antigen 1 Proteins 0.000 claims description 20
- 101100123850 Caenorhabditis elegans her-1 gene Proteins 0.000 claims description 17
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 claims description 13
- 229950010203 nimotuzumab Drugs 0.000 description 52
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 44
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 43
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 43
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 30
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 23
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 20
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 14
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 11
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 9
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 8
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 7
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 7
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 102000045108 human EGFR Human genes 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 201000008274 breast adenocarcinoma Diseases 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 2
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 2
- 229960001972 panitumumab Drugs 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 210000004910 pleural fluid Anatomy 0.000 description 2
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 2
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N (4S)-4-[[(4R,7S,10S,16S,19S,25S,28S,31R)-31-[[(2S)-2-[[(1R,6R,9S,12S,18S,21S,24S,27S,30S,33S,36S,39S,42R,47R,53S,56S,59S,62S,65S,68S,71S,76S,79S,85S)-47-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-18-(4-aminobutyl)-27,68-bis(3-amino-3-oxopropyl)-36,71,76-tribenzyl-39-(3-carbamimidamidopropyl)-24-(2-carboxyethyl)-21,56-bis(carboxymethyl)-65,85-bis[(1R)-1-hydroxyethyl]-59-(hydroxymethyl)-62,79-bis(1H-imidazol-4-ylmethyl)-9-methyl-33-(2-methylpropyl)-8,11,17,20,23,26,29,32,35,38,41,48,54,57,60,63,66,69,72,74,77,80,83,86-tetracosaoxo-30-propan-2-yl-3,4,44,45-tetrathia-7,10,16,19,22,25,28,31,34,37,40,49,55,58,61,64,67,70,73,75,78,81,84,87-tetracosazatetracyclo[40.31.14.012,16.049,53]heptaoctacontane-6-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-7-(3-carbamimidamidopropyl)-25-(hydroxymethyl)-19-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-28-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15,18,21,24,27,30-nonaoxo-16-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14,17,20,23,26,29-nonazacyclodotriacontane-4-carbonyl]amino]-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-3-carboxy-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(1S)-1-carboxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H]3NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]4CCCN4C(=O)[C@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc3ccccc3)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N3CCC[C@H]3C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@H](Cc2c[nH]cn2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc2c[nH]cn2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc2ccc(O)cc2)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N 0.000 description 1
- 102100038778 Amphiregulin Human genes 0.000 description 1
- 108010033760 Amphiregulin Proteins 0.000 description 1
- 241001244729 Apalis Species 0.000 description 1
- 101800001382 Betacellulin Proteins 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 241000867607 Chlorocebus sabaeus Species 0.000 description 1
- 101800000155 Epiregulin Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000851176 Homo sapiens Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 208000001894 Nasopharyngeal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010061306 Nasopharyngeal cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010061534 Oesophageal squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 102100039467 P3 protein Human genes 0.000 description 1
- 101710117080 P3 protein Proteins 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 102100029837 Probetacellulin Human genes 0.000 description 1
- 102100025498 Proepiregulin Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 102100032350 Protransforming growth factor alpha Human genes 0.000 description 1
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 1
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000036765 Squamous cell carcinoma of the esophagus Diseases 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- 239000012445 acidic reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012382 advanced drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000035578 autophosphorylation Effects 0.000 description 1
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000005889 cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006552 constitutive activation Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 230000008482 dysregulation Effects 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940082789 erbitux Drugs 0.000 description 1
- 208000007276 esophageal squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- 208000025402 neoplasm of esophagus Diseases 0.000 description 1
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 238000009522 phase III clinical trial Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000002818 protein evolution Methods 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 231100000004 severe toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 1
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000440 toxicity profile Toxicity 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
Description
Область техники
Изобретение относится к областям биотехнологии и медицины, в частности к вариантам моноклонального антитела (mAb) нимотузумаба и происходящим из них антигенсвязывающим фрагментам, которые имеют мутации в CDR1 и CDR2 вариабельной области тяжелой цепи и распознают внеклеточную область рецептора эпидермального фактора роста человека (hEGFR) с большей аффинностью, а также их диагностическое и терапевтическое применение.
Уровень техники
EGFR представляет собой трансмембранный гликопротеин, который имеет внеклеточную лигандсвязывающую область и внутриклеточную область, имеющую тирозинкиназную активность. Указанные лиганды включают: эпидермальный фактор роста (EGF), амфирегулин, трансформирующий фактор роста а, бетацеллюлин, эпирегулин и гепаринсвязывающий EGF (Olayioye, M.y et al., The EMBO Journal, 19: 3159-3167, 2000; Yarden, Y. and Sliwkowski, M., Nature Reviews, 2: 127-137, 2001). Связывание лигандов с рецептором вызывает конформационные изменения и изменения расположения во внеклеточной области, которые вызывают димеризацию и активацию рецептора (Ogiso, H. et al., Cell 110: 775-787, 2002). Данный рецептор участвует в различных клеточных процессах, которые способствуют поддержанию и выживанию эпителиальных клеток. Однако нарушение регуляции пути EGFR/EGF вследствие избыточной экспрессии или конститутивной активации способствует пролиферации опухолевых клеток, инвазии, и связана с плохим прогнозом при многих злокачественных новообразованиях (Yarden Y. and Sliwkowski, M., Nature Reviews. 2: 127-137, 2001). По этой причине EGFR считают ассоциированным с опухолью антигеном (АГ), который очень важен для разработки противоопухолевой терапии.
В настоящее время на рынке присутствуют три mAb против EGFR: цетуксимаб (Erbitux), панитумумаб (Vectibix) и нимотузумаб (TheraCIM) (Reichert, J., MAbs.4: 413-415, 2012), и еще семь находятся в фазах I-III клинических испытаний (Reichert, J. and Dhimolea, Е., Drug Discovery Today, 17: 954-963, 2012). Они были специально разработаны для распознавания внеклеточной области EGFR, конкурентного ингибирования связывания лигандов и димеризации рецептора и, таким образом, ингибирования аутофосфорилирования рецептора и сигнального каскада, который приводит к его активации (Burgess, А. и др., Molecular Cell, 12: 541 -552, 2003).
Нимотузумаб (mAb R3) представляет собой гуманизированное mAb изотипа IgG1, которое распознает hEGFR, полученное путем клонирования ДНК гипервариабельных областей мышиных mAb ior egf/r3 и каркасов вариабельных и константных областей тяжелых и легких цепей человека (REI и NEWN соответственно) (Mateo, С. et al., Immunotechnology 3: 71-8, 1997). MAb R3 распознает EGFR с аналогичной аффинностью и обладает такой же способностью ингибировать связывание EGF с рецептором, что и его мышиный предшественник. Данный вариант является менее иммуногенным, чем химерный вариант mAb ior egf/r3 (Mateo, С. et al., Immunotechnology 3: 71-8, 1997). Нимотузумаб распознает эпитоп в домене III внеклеточной области EGFR, который перекрывается с сайтом связывания лигандов в этом домене, что объясняет его способность блокировать связывание лиганда и последующую активацию рецептора (Tundidor, Y. et al., MAbs 6: 1013-1025, 2014). Эффективность нимотузумаба была продемонстрирована в клинических испытаниях на пациентах с опухолью головы и шеи (Crombet, Т. et al., J Clin Oncol 22: 16461654, 2004), глиомой (Ramos, Т. et al., Cancer Biol. Ther.5: 375-379, 2006; MacDonald, T. et al., Neuro Oncol., 13: 1049-1058, 2011) и опухолью пищевода (Ramos-Suzarte, M. et al., Cancer Biology & Therapy 13: 600-605, 2012). Данное антитело (AT) находится в фазе III клинических испытаний при раке носоглотки, локально прогрессирующем раке пищевода и плоскоклеточной карциноме пищевода (Galluzzi, L. et al., Oncolmmunology, 1: 28-37, 2012).
В отличие от других AT, направленных против EGFR, как в доклинических испытаниях на зеленых обезьянах Cercopithecus aethiops sabaeus (Arteaga, M. и др., Cancer Biology & Therapy. 6: 1390-1395, 2007), так и в клинических испытаниях (Crombet, Т. et al. J Clin Oncol 22: 1646-1654, 2004; Ramos T. et al., Cancer Biol Ther 5: 375-379, 2006; Ramos-Suzarte M. et al., Cancer Biology & Therapy 13: 600-605, 2012; Strumberg, D. et al., Invest New Drugs, 30: 1138-1143, 2010) нимотузумаба не было обнаружено никаких признаков тяжелой токсичности, обычно связанных с препаратами, направленными против этого АГ. Эти данные свидетельствуют о том, что нимотузумаб является единственным анти-EGFR агентом, который можно применять на постоянной основе (Allan, D., The Oncologist, 10: 760-761, 2005). Профиль низкой токсичности, но с противоопухолевым эффектом, данного mAb может быть обусловлен его средней аффинностью (10-8) (Crombet, Т. et al., J Clin Oncol 22: 1646-1654, 2004). Авторы предполагают, что mAb с промежуточной аффинностью должны обладать высоким противоопухолевым эффектом и низкой токсичностью, поскольку усвоение в опухоли (высокая экспрессия EGFR) преобладает над усвоением в нормальной кани (низкая экспрессия EGFR). С другой стороны, высокоаффинные mAb (такие как цетуксимаб) будут захвачены как опухолевыми, так и нормальными клетками; и низкая аффинность mAb будет иметь небольшой эффект из-за низкого включения в опухоли (Crombet, Т. et al., J Clin Oncol 22: 16461654, 2004). Однако было описано, что противоопухолевый эффект нимотузумаба зависит от экспрессии EGFR, поскольку его эффективность снижается в опухолях со средней или низкой экспрессией этого рецептора (Akashi, Y. et al., British Journal of Cancer, 98: 749-755, 2008). Следовательно, получение варианта нимотузумаба с умерено увеличенной аффинностью к рецептору может обеспечить получение ан- 1 043759 титела (AT) с более сильным противоопухолевым эффектом, но в то же время сохраненной низкой токсичностью. Получение этого варианта нимотузумаба со средней аффинностью и сохранение его точной специфичности к эпитопу (которая является уникальной среди терапевтических AT против EGFR) (Tundidor, Y. et al., MAbs 6: 1013-1025, 2014) будет способствовать сохранению ценных свойств исходного антитела.
Аффинное созревание AT представляет собой процесс, который происходит естественным образом; однако с развитием комбинаторной биологии это явление было воспроизведено в лаборатории. Такие технологии направленной эволюции требуют разных этапов: мутации, отображения (дисплея), селекции и амплификации (Wark, K. and Hudson, P., Advanced Drug Delivery Reviews, 58: 657-670, 2006). Технология фагового дисплея обеспечивает мощную платформу для создания новых AT человека, а также для улучшения их аффинности in vitro (Hoogenboom, H., Nat Biotechnol, 23: 1105-1116, 2005).
Авторы настоящего изобретения обнаружили отображенные на фагах мутантные варианты нимотузумаба с повышенной способностью связываться с внеклеточной областью hEGFR. Набор мутаций, которыми обладают эти варианты, ранее не был описан и не может быть предсказан, исходя из анализа кристаллической структуры антигенсвязывающего фрагмента (Fab) нимотузумаба. Следовательно, новизна настоящего изобретения заключается в обеспечении новых фрагментов и mAb, которые распознают hEGFR с более высокой аффинностью (в 3-4 раза выше), таким образом, указанные фрагменты и mAb могут распознавать линии со средней экспрессией EGFR более эффективно, чем нимотузумаб. Аналогично, данные mAb показали большую способность ингибировать лиганд-опосредованное фосфорилирование EGFR по сравнению с нимотузумабом, что указывает на то, что они обладают более сильным противоопухолевым эффектом, чем нимотузумаб. Все вышеперечисленное подтверждает возможность применения этих фрагментов и mAb в диагностике или лечении опухолей со средней экспрессией EGFR.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к рекомбинантным mAb, которые распознают внеклеточную область hEGFR Her1 и обладают более, чем 95% идентичностью по отношению к антителу нимотузумаб.
В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к mAb, где последовательности области, определяющей комплементарность (CDR), CDR2 вариабельной области тяжелых цепей, выбраны из группы, включающей:
SEQ ID NO. 20 и
SEQ ID NO. 21, последовательности CDR1 и CDR3 тяжелых цепей представляют собой SEQ ID NO. 9 и SEQ ID NO. 3 соответственно, и последовательности CDR вариабельной области легких цепей представляют собой:
CDR 1 SEQ ID NO. 22,
CDR 2 SEQ ID NO. 23,
CDR 3 SEQ ID NO. 24.
В другом варианте реализации рекомбинантные mAb согласно настоящему изобретению характеризуются тем, что последовательность CDR2 вариабельной области тяжелых цепей выбрана из группы, включающей:
SEQ ID NO. 10,
SEQ ID NO. 11,
SEQ ID NO. 12,
SEQ ID NO. 17,
SEQ ID NO. 18 и
SEQ ID NO. 29, последовательность CDR1 представляет собой SEQ ID NO. 9, и последовательность CDR3 представляет собой SEQ ID NO.3 в указанных тяжелых цепях, и последовательности CDR вариабельной области легких цепей представляют собой:
CDR 1 SEQ ID NO. 22,
CDR 2 SEQ ID NO. 23,
CDR 3 SEQ ID NO. 24.
Другой вариант реализации настоящего изобретения относится к mAb, где последовательность CDR2 вариабельной области тяжелых цепей выбрана из группы, включающей:
SEQ ID NO. 2 и
SEQ ID NO. 8, последовательности CDR1 и CDR3 тяжелых цепей представляют собой SEQ ID NO. 1 и SEQ ID NO. 3, соответственно, и последовательности CDR вариабельной области легких цепей представляют собой:
CDR 1 SEQ ID NO. 22,
CDR 2 SEQ ID NO. 23,
CDR 3 SEQ ID NO. 24.
В дополнительном варианте реализации mAb согласно настоящему изобретению характеризуются тем, что последовательность CDR1 вариабельной области тяжелых цепей выбрана из группы, включающей:
- 2 043759
SEQ ID NO. 13 и
SEQ ID NO. 19, последовательности CDR2 и CDR3 тяжелых цепей представляют собой SEQ ID NO. 14 и SEQ ID
NO. 3, соответственно, и последовательности CDR вариабельной области легких цепей представляют собой:
CDR 1 SEQ ID NO. 22,
CDR 2 SEQ ID NO. 23,
CDR 3 SEQ ID NO. 24.
В частности, настоящее изобретение относится к mAb, характеризующемуся наличием следующей последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепей:
Тяжелая цепь
CDR1 SEQ ID NO. 15,
CDR2 SEQ ID NO. 16,
CDR3 SEQ ID NO. 3,
Легкая цепь
CDR 1 SEQ ID NO. 22,
CDR 2 SEQ ID NO. 23,
CDR 3 SEQ ID NO. 24.
Настоящее изобретение включает все вышеуказанные mAb, в которых при этом каркасные области (FW) вариабельной области тяжелой и легкой цепей имеют следующие последовательности:
Тяжелая цепь
FW 1 SEQ ID NO. 4,
FW 2 SEQ ID NO. 5,
FW 3 SEQ ID NO. 6,
FW 4 SEQ ID NO. 7,
Легкая цепь
FW 1 SEQ ID NO. 25,
FW 2 SEQ ID NO. 26,
FW 3 SEQ ID NO. 27,
FW 4 SEQ ID NO. 28.
Кроме того, раскрытые AT включают константные области тяжелой цепи IgG1 человека и области легкой цепи каппа человека.
В конкретном варианте реализации настоящее изобретение относится к фрагментам, полученным из вышеуказанных AT, где указанные фрагменты могут быть Fab-типа, (Fab)2 и одноцепочечными фрагментами вариабельной области.
В другом варианте реализации настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, которую можно применять при лечении рака, которая в качестве активного начала имеет раскрытые в настоящей заявке mAb или их фрагменты в диапазоне от 50 до 400 мг, и фармацевтически приемлемый носитель. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, которую можно применять в диагностике опухолей, активным началом которой являются раскрытые в настоящей заявке mAb или их фрагменты в диапазоне от 1 до 9 мг, и фармацевтически приемлемый носитель.
В другом варианте реализации настоящее изобретение относится к применению раскрытых в настоящей заявке mAb и их фрагментов для лечения опухолей, которые экспрессируют EGFR; а также при диагностике опухолей, несущих EGFR, при этом указанные mAb и фрагменты конъюгированы с соответствующим маркером. Настоящее изобретение также относится к применению указанных mAb и их фрагментов для направления иммунного ответа против EGFR-положительных опухолей, при этом указанные mAb и фрагменты конъюгированы с белками или белковыми доменами, представляющими иммунологический интерес.
Подробное описание изобретения
Получение фрагментов с повышенной способностью связываться с внеклеточной областью EGFR человека, происходящих из нимотузумаба.
Настоящее изобретение относится к 13 фрагментам, происходящим из нимотузумаба, которые имеют более 97% идентичности с его аминокислотной последовательностью и обладают повышенной способностью связываться с внеклеточной областью hEGFR. Мутации в вариантах, описанные в настоящем изобретении, приводят к получению вариантов нимотузумаба со способностью распознавать большее количество клеток человека со средней экспрессией EGFR по сравнению с исходным Fab нимотузумаба.
Фрагменты, описанные в настоящем изобретении, благодаря их способности связываться с внеклеточной областью hEGFR, могут быть получены путем отбора мутантных вариантов Fab нимотузумаба из библиотек, содержащих более 107 молекул, отображенных на нитчатых фагах. Соответствующие этим вариантам гены могут быть встроены в векторы экспрессии фагмидного типа (слиты с одним из генов, кодирующих белки капсида нитчатого фага) и применены для получения вирусных частиц, которые экс- 3 043759 понируют на своей поверхности варианты белков. Исходные библиотеки могут включать различную степень многообразия в наборе позиций областей, определяющих комплементарность (CDR), что может позволить тщательно изучить эту область, которая функционально важна для взаимодействия АГ-АТ. Каждый из исходных остатков в этих положениях может быть заменен комбинацией из 20 аминокислот, заранее определенным набором остатков, которые обладают некоторым(и) общими физикохимическим(и) свойством(ами), таким(и) как гидрофобность, ароматический характер, суммарный заряд и/или размер, или подвергаться небольшой случайной рандомизации путем введения незначительной доли случайной комбинации нуклеотидов в каждой соответствующей позиции кодона (что будет поддерживать преобладание исходной последовательности). Выбранные позиции могут быть варьировать одновременно в одной библиотеке или в нескольких отдельных библиотеках. Эти библиотеки могут содержать различные пропорции молекул с одной или несколькими мутациями, консервативными или нет, по отношению к исходному Fab нимотузумаба.
Отбор аналогичных фрагментов и mAb нимотузумаба с повышенной способностью связывания с внеклеточной областью hEGFR.
Отбор фагов, имеющих варианты с повышенной способностью связываться с внеклеточной областью hEGFR, может быть основан на инкубации смесей фагов из библиотек в контакте с иммобилизованным на твердой поверхности АГ hEGFR, удалении не связавшихся фагов путем промывания и элюировании связанных фагов в условиях, которые мешают взаимодействию белков. Несколько последовательных циклов селекции можно выполнять в одинаковых условиях. Анализ последовательностей ДНК, встроенных в выбранные фагмиды, может выявить закономерности, приводящие к выявлению наиболее распространенной замены, которая может быть связана с увеличенной способностью к связыванию с EGFR. Обнаруженные повторяющиеся мутации, будь то индивидуальные модификации или комбинации изменений, выбранные непосредственно из библиотек, могут быть объединены между собой для формирования новых вариантов и обеспечения дополнительного увеличения способности к связыванию с EGFR.
Способность к связыванию с hEGFR каждого из вариантов, выбранных непосредственно из библиотек или спроектированных и сконструированных позже, может быть оценена иммунохимическими методами с использованием преимуществ формата фагового дисплея, который позволяет одновременно характеризовать несколько вариантов.
В качестве альтернативы, фрагменты согласно настоящему изобретению могут быть получены путем использования других платформ комбинаторной биологии, таких как рибосомы или дрожжевые дисплеи.
Кроме того, гены, которые кодируют новые вариабельные области, могут быть клонированы в векторы экспрессии клеток млекопитающих и могут производить рекомбинантные mAb, содержащие новые мутации. Также можно подтвердить, что при использовании данного формата полученные mAb по сравнению с нимотузумабом сохраняют способность преимущественно распознавать внеклеточную область hEGFR посредством измерений аффинности на основе поверхностного плазмонного резонанса (BIAcore).
Демонстрация функционального превосходства новых mAb и их фрагментов, происходящих из нимотузумаба.
Функциональное превосходство каждого из вариантов фрагментов, выбранных непосредственно из библиотек или впоследствии сконструированных в виде фрагментов или в формате полных AT, может быть продемонстрировано в анализах in vitro или in vivo. Для каждого варианта распознавание клеточных линий с различной экспрессией EGFR можно оценить с помощью проточной цитометрии, удостоверившись, что новые варианты распознают более высокий процент положительных клеток и с более высокой средней интенсивностью флуоресценции; и этот эффект более выражен в линиях со средней или низкой экспрессией EGFR. Для этой цели будут применять клетки со следующими характеристиками:
высокая экспрессия EGFR: такая как плоскоклеточная карцинома А431 человеческого происхождения, аденокарцинома молочной железы MDA-MB-468 с метастазами в плевральную жидкость человеческого происхождения, не ограничиваясь указанными;
средняя экспрессия EGFR: аденокарцинома легкого Н125 и Н292 человеческого происхождения, не ограничиваясь указанными;
низкая экспрессия EGFR: мелкоклеточный рак легкого U1906 человеческого происхождения, аденокарцинома молочной железы MDA-MB-231 человеческого происхождения, карцинома яичника SKOV3, рак молочной железы SKBR3, не ограничиваясь указанными.
Способность каждого mAb или его фрагмента ингибировать фосфорилирование EGFR, опосредованное его лигандом (EGF), также можно оценивать при различных концентрациях и в клеточных линиях с различной экспрессией EGFR. Анализы ингибирования пролиферации с помощью Alamar blue также можно проводить на линиях с различной экспрессией рецептора. Кроме того, способность каждого mAb индуцировать АТ-зависимую клеточную цитотоксичность может быть определена в линиях с различной экспрессией рецептора. Во всех случаях можно ожидать, что варианты с более высокой аффинностью демонстрируют больший эффект и что он будет более выражен в линиях со средней или низкой экспрессией EGFR.
- 4 043759
С другой стороны, может быть измерен противоопухолевый эффект mAb или их фрагментов у бестимусных мышей, несущих человеческие опухоли, с различной экспрессией EGFR, где будет измеряться задержка роста опухоли.
Кроме того, фрагменты или mAb с радиоактивными изотопами или флуорофорами могут быть помечены и инокулированы в бестимусных мышей, несущих человеческие опухоли, с различной экспрессией EGFR. Это позволяет оценить способность фрагментов распознавать опухоли in vivo, что подтверждает их применение в качестве инструментов для диагностики рака путем получения изображений.
Терапевтическое применение и способы лечения новыми mAb и происходящими из них фрагментами.
Новые mAb и их фрагменты, полученные в настоящем изобретении, имеют более высокую аффинность, чем нимотузумаб, что позволяет применять их в сценариях, где у нимотузумаба есть ограничения, например, в клетках с низкой или средней экспрессией EGFR. Указанные mAb могут быть применены при лечении пациентов с опухолями головы и шеи, глиомой, раком пищевода, легких и поджелудочной железы.
Для терапевтического применения mAb и их фрагменты должны быть введены субъекту, имеющему заболевание, либо независимо, либо в сочетании с традиционными способами лечения рака, такими как лучевая терапия или химиотерапия, для усиления их терапевтического действия. Путь введения может быть любым из описанных в уровне техники для парентерального введения лекарств, предпочтительно внутривенным или подкожным путем.
Чтобы получить желаемый терапевтический эффект, mAb и их фрагменты согласно настоящему изобретению следует вводить в дозах, которые находятся в диапазоне концентраций, в которых они оказывают противоопухолевое действие без токсических проявлений. Диапазон исследуемых доз может варьировать от 50 до 400 мг на пациента в течение 6 недельных циклов лечения. Лечение новыми вариантами с более высокой аффинностью может быть скорректировано для введения более низких доз и поддержания эффекта, подобного действию нимотузумаба, или можно применять рекомендованную дозу для нимотузумаба (200 мг), показав больший противоопухолевый эффект, который будет зависеть от профиля токсичности новых mAb и их фрагментов.
MAb и их фрагменты согласно настоящему изобретению могут найти применение в диагностике EGFR-положительных опухолей путем их конъюгирования с радиоизотопами или флуорофорами; поскольку они обладают большей аффинностью и способностью распознавать клетки со средней или низкой экспрессией EGFR, что является преимуществом по сравнению с нимотузумабом в диагностике опухолей с этой особенностью.
Чтобы применять их в качестве инструментов для детекции, указанные mAb и их фрагменты должны быть введены пациентам с опухолями для идентификации их путем визуализации местоположения опухоли или возможных метастазов, положительных по EGFR. mAb и их фрагменты, конъюгированные с радиоизотопами или флуорофорами, следует вводить в дозах в диапазоне концентраций, для которых кинетика распределения в тканях и их выведение позволяют быстро получать изображения высокого качества. Этот диапазон может составлять от 0,5 до 9 мг на пациента, предпочтительно 3 мг.
Кроме того, фрагменты, раскрытые в настоящем изобретении, могут быть слиты с белками или белковыми доменами, представляющими иммунологический интерес, с целью направления иммунного ответа на EGFR-положительные опухолевые клетки. Данное применение имеет преимущество, так как комбинирует потенциальные возможности обеих терапевтических средств по отдельности, концентрируя ответ в области опухоли; Fab-фрагменты обеспечивают специфичность в отношении опухолевых клеток, которые экспрессируют АГ, в то время как белки или слитые белковые домены играют свою иммунологическую роль, что может иметь превосходящий эффект по сравнению с монотерапией.
Фармацевтические композиции.
Описанные в настоящем изобретении mAb и их фрагменты вводят как часть фармацевтической композиции, которую можно применять для лечения рака. Предпочтительно, настоящее изобретение охватывает фармацевтические композиции, содержащие фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемые носители включают, но не ограничиваются перечисленным: солевой раствор, фосфатно-солевой буферный раствор и тому подобное. Другие буферные агенты, диспергирующие агенты и нетоксичные инертные вещества, подходящие для введения пациенту, могут быть включены в композиции согласно настоящему изобретению. Композиции обычно стерильны и не содержат нежелательных частиц.
Настоящее изобретение дополнительно поясняется следующими примерами и чертежами. Однако эти примеры не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения.
Краткое описание фигур
Фиг. 1. Оценка методом ELISA распознавания нитчатых фагов, отображающих FabR3. Различные препараты очищенных фагов доводили до концентрации, эквивалентной 1012 вирусных частиц/мл. Поглощение измеряли при 490 нм.
Фиг. 2. Оценка методом ELISA реакционной способности смеси фагов, несущих библиотеку FabR3, после трех раундов селекции против внеклеточной области EGFR человека. Различные очищенные пре- 5 043759 параты фага доводили до концентрации, эквивалентной 1011 вирусных частиц/мл. Поглощение измеряли при 490 нм.
Фиг. 3. Выравнивание аминокислотной последовательности трех CDR вариабельной области тяжелой цепи (VH) нимотузумаба и 11 вариантов FabR3 с уникальными последовательностями после трех раундов селекции библиотеки против внеклеточной области EGFR человека. Черточки показывают, что исходная аминокислота сохранялась в этой позиции. Количество раз, когда последовательность повторялась, указано в скобках.
Фиг. 4. Оценка методом ELISA распознавания отображенных на фагах вариантов FabR3 с уникальными последовательностями, полученными из библиотеки путем небольшой рандомизации после трех раундов селекции против внеклеточной области EGFR человека. Препараты фагов предварительно нормализовали в соответствии с отображаемым количеством белка. (А) Варианты, включенные в группу 1, имеют мутации только в CDR2 VH. (Б) Варианты группы 2, присутствуют мутации в CDR1 и CDR2 VH. Поглощение измеряли при 490 нм.
Фиг. 5. Варианты FabR3 на фагах, сконструированные из комбинации наиболее повторяющейся мутации CDR1 и мутаций CDR2 лучших вариантов FabR3 группы 1. (А) Выравнивание аминокислотной последовательности трех CDR VH исходного нимотузумаба и двух сконструированных вариантов. (Б) Оценка методом ELISA распознавания сконструированных вариантов. Поглощение измеряли при 490 нм.
Фиг. 6. Распознавание клеток линии Н125 с помощью Fab mAb K4 и K5, происходящих из нимотузумаба. (А) Точечная диаграмма, показывающая процент распознанных EGFR-положительных клеток. (Б) Гистограммы средней интенсивности флуоресценции (EGFR-положительные клетки).
Фиг. 7. Ингибирование фосфорилирования EGFR, опосредованного EGF и индуцированного нимотузумабом и mAb K4 и K5. (А) Линия H125, которая имеет среднюю экспрессию EGFR. (Б) линия MDAMB-468 с высокой экспрессией EGFR.
Примеры
Пример 1: Успешное отображение на нитчатом фаге М13 антигенсвязывающего фрагмента нимотузумаба (FabR3).
Гены, кодирующие вариабельные области легкой (VL) и тяжелой (VH) цепей нимотузумаба, фланкированные сайтами рестрикции ApaLI/XhoI и SfiI/BstEII, соответственно, амплифицировали с помощью ПЦР. Фрагменты обоих генов VL и VH клонировали в вектор pCES1 (Haard, H., Methods in Molecular Biology. 178: 87-100, 2002), после чего следовали гены, кодирующие константную область легкой цепи каппа (CK) и константную область тяжелой цепи (CH1), соответственно. Ген, кодирующий область CH1, связан с геном, кодирующим пептидную метку с-тус, и следует за геном III. Эта генетическая конструкция кодировала АГ-связывающий фрагмент, происходящий из нимотузумаба (FabR3). Компетентные бактерии штамма TG1 вида Escherichia coli трансформировали полученными генетическими конструкциями и применяли для получения и очистки отображенного на фаге FabR3, слитого с белком Р3 вирусного капсида, в объеме 50 мл (Marks, J. et al. J. Mol. Biol. 222: 581-597, 1991). Специфическое распознавание очищенных отображенных на фагах молекул оценивали с помощью ELISA (фиг. 1). С этой целью полистироловые планшеты (MaxiSorp, США) покрывали АГ нимотузумаба, внеклеточной областью EGFR человека (Her1) (Ramirez, В. et al., Int. J. Cancer, 119: 2190-2199, 2006), антителом к метке c-myc mAb 9E10 (Центр генной инженерии и биотехнологии Sancti Spiritus, Куба) и BSA в качестве несвязанной молекулы. Связанные фаги обнаруживали с помощью mAb против М13, конъюгированного с пероксидазой хрена (GE Healthcare, США), и соответствующего субстрата фермента. Как показано на фиг. 1, отображенный на фагах FabR3 имел правильный фолдинг, что измерили распознаванием mAb 9E10, которые показывают уровни отображения, и потому сохранил способность нимотузумаба к специфическому распознаванию Her1.
Пример 2. Отбор и характеристика отображенных на нитчатых фагах фрагментов вариантов FabR3 с большей реакционной способностью по отношению к внеклеточной области EGFR человека.
Разработали стратегию небольшой рандомизации из 25 остатков, расположенных в выступающих сегментах трех CDR (согласно определению AbM) тяжелой цепи нимотузумаба. Большинство из них (24/25) заменили комбинацией, которая потенциально содержала все 20 аминокислот, но сохраняла первоначальный остаток в большинстве молекул библиотеки. С этой целью вводили вырожденные кодоны, которые сохранили исходный нуклеотид в 90% в каждой позиции, в то время как оставшиеся 10% соответствовали эквимолярной смеси трех других нуклеотидов. Другой остаток (F29) заменяли только другими гидрофобными остатками (I, L, М, V), хотя исходный остаток преобладал в большинстве молекул библиотеки. Чтобы сделать это, применяли вырожденный кодон, в положениях 1 и 3 триплета в 90% случаев содержался исходный нуклеотид (Т и С соответственно), в то время как оставшиеся 10% случаев соответствовали эквимолярной смеси трех других нуклеотидов, вторую позицию триплета (Т) не модифицировали. Разработанную библиотеку конструировали в формате Fab путем клонирования вариабельных областей в вектор pCES-1. Таким образом, создавали библиотеку вариантов Fab нимотузумаба, состоящую из 1,5х107 членов.
Фаги, полученные из библиотеки, очищали осаждением с полиэтиленгликолем в соответствии с ра
- 6 043759 нее установленными процедурами (Marks, J. et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597, 1991). Для выделения функциональных отображенных на фаге мутированных вариантов FabR3, обладающих большей способностью связываться с их антигеном, вирусные частицы инкубировали на иммунотрубках (Nunc, Дания), покрытых Her1. После удаления не связавшихся фагов с помощью промывки, связавшиеся фаги элюировали инкубацией с основным раствором триэтиламина. Бактерий штамма TG1 инфицировали отобранными фагами, которые амплифицировали фагом-помощником M13KO7, и применяли в качестве исходного материала для нового раунда селекции. Проводили три раунда селекции фагов и наблюдали увеличение реакционной способности смеси фагов в отношении Her1 по мере увеличения числа циклов (фиг. 2). Секвенирование генов, встроенных в отобранную фагмиду, полученную в третьем цикле селекции, выявило 11 уникальных последовательностей, разделенных на две группы (фиг. 3). Первая группа состояла из вариантов, в которых рандомизировали только CDR2, и вторая группа включала молекулы, в которых появились мутации в CDR1 и CDR2.
Пример 3: Демонстрация повышения реактивности новых отображенных на нитевидных фагах вариантов FabR3 по отношению к внеклеточной области hEGFR.
Компетентных бактерий штамма E.coli TG1 трансформировали выявленными после трех раундов селекции генетическими конструкциями, которые содержали уникальные последовательности, отличные от последовательности исходного нимотузумаба. На основании этих последовательностей получали и очищали фаги, отображающие варианты FabR3. Для определения реакционной способности этих новых вариантов в отношении Her1 определяли распознавание препаратов фагов препаратов при различных концентрациях вирусных частиц с помощью ELISA. Все оцененные варианты, 6 с мутациями исключительно в CDR2 (фиг. 4А) и 5 с мутациями в CDR1 и CDR2 (фиг. 4Б), показали более высокую реактивность по отношению к Her1, чем исходный FabR3 при различных протестированных концентрациях. Кроме того, с помощью мутагенеза по Кункелю сконструировали два новых варианта, сочетавшие мутации CDR2, которые больше всего повышали реактивность, и наиболее часто повторявшуюся мутацию CDR1 (фиг. 5А). Распознавание этих новых вариантов оценивали с помощью ELISA. Комбинация мутаций была совместима, потому что оба варианта показали более высокую реактивность к Her1, чем исходный FabR3, отображенный на фаге (фиг. 5Б).
Пример 4. Демонстрация повышенной аффинности новых вариантов нимотузумаба, продуцируемых в виде растворимого белка в клетках млекопитающих.
Гены, кодирующие исходный VH нимотузумаба (R3 mAb) и VH двух сконструированных вариантов нимотузумаба с мутациями в CDR1 и CDR2, как описано в примере 3 (фиг. 5А), которые были названы K4 и K5, а также исходную вариабельную область легкой цепи каппа (VK) нимотузумаба клонировали в векторы экспрессии клеток млекопитающих pSV-gpt и pSV-hyg соответственно (Orlandi, R. et al., PNAS: 3833-3837, 1989). Векторы с представляющими интерес генами линеаризировали ферментом Pvu I и осаждали в присутствии этанола. ДНК, восстановленную в фосфатно-солевом буферном растворе, применяли для электропорации клеток NS0. Для получения клонов, продуцирующих mAb R3, K4 и K5, ко-трансфицировали 4 мкг вектора pSV-gpt с соответствующим VH (табл. 1) и 8 мкг вектора pSV-hyg-VK исходного нимотузумаба. Процедуру получения стабильных клонов проводили с использованием ксантина, гипоксантина и микофеноловой кислоты в качестве агентов для селекции. Эта методология позволила получить три представляющие интерес молекулы, такие как AT изотипа IgG1 и с легкой цепью каппа. Полученные AT очищали от супернатанта с помощью аффинной хроматографии с белком А.
Таблица 1
Описание генов VH и VL,примененных в ко-трансфекции клеток NS0 с целью получения mAb R3, K4 и K5
| pSV-gpt-VH | pSV-hyg-Vk | |
| Моно- AT R3 | Исходный | Исходный |
| MAb К4 | Мутированный 3AS4+3AS22 | Исходный |
| MAb К5 | Мутированный 3AS4+3AS30 | Исходный |
Чтобы продемонстрировать, что мутации, полученные на фагах, которые в этом формате проявляли большую реактивность по отношению к Her1, вызывали тот же эффект в полноразмерных AT, было принято решение измерить аффинность по Biacore. Во-первых, Fab, полученные из mAb R3, K4 и K5, получали ферментативным расщеплением папаином и последующим разделением белком А. Как показано в табл. 2, новые mAb K4 и K5 показали увеличение аффинности в 3 и 3,6 раз, соответственно, по отношению к mAb R3.
- 7 043759
Таблица 2
Увеличение аффинности mAb K4 и K5 по отношению к нимотузумабу
| Ka (1/Ms) | Kd (1/s) | KD (Μ) | Возрастание | |
| MAb R3 | 1,879*104 | 12,483* ΙΟ'4 | 6,643* ΙΟ'8 | - |
| MAb К4 | 2,743*104 | 6,019*10'4 | 2,194* ΙΟ'8 | 3Χ |
| MAb К5 | 3,305*104 | 6,098* ΙΟ'4 | 1,845*10'8 | 3,6Χ |
Пример 5. Fab, полученный из mAb K4 и K5, продуцируемых в клетках млекопитающих, показал большее распознавание линии клеток аденокарциномы легкого Н125 человека, чем Fab, полученный из нимотузумаба.
Определили способность Fab, происходящих из mAb K4 и K5, распознавать молекулу Her1. В этом случае распознавание Her1 оценивали с помощью проточной цитометрии в клеточной линии, в естественном контексте этой молекулы. С этой целью Fab, происходящие из mAb R3, K4 и K5, инкубировали в концентрации 1,25 мкг/мл с клеточной линией аденокарциномы легкого Н125 человека, которая имеет среднюю экспрессию рецептора. Fab, связанные с Her1 на мембране клеток, детектировали с помощью мышиных mAb против легкой цепи каппа человека, конъюгированных с фикоэритрином. Как показано на фиг. 6А, Fab, происходящий из mAb K4 и K5, распознавали более высокий процент Her1положительных клеток и с более высокой средней интенсивностью флуоресценции (FMI) (фиг. 6Б) по сравнению с Fab, происходящим из mAb R3.
Пример 6: Увеличение аффинности mAb K4 и K5 приводило к большей способности этих AT ингибировать EGF-опосредованное фосфорилирование EGFR.
Чтобы определить способность новых mAb ингибировать EGF-опосредованное фосфорилирование, проводили анализ методом вестерн-блоттинга. Применяли две клеточные линии:
линия клеток аденокарциномы легкого человека Н125 (средняя экспрессия EGFR);
аденокарцинома молочной железы с метастазами в плевральную жидкость человеческого происхождения MDA-MB-468 (высокая экспрессия EGFR).
Клетки обрабатывали в течение 2 часов mAb R3, K4 и K5 в концентрациях 10 мкг/мл, 5 мкг/мл и 2,5 мкг/мл. Затем среду удаляли для элиминации не связавшихся с клетками mAb, добавляли свежую среду с EGF человека в течение 10 минут, чтобы вызвать фосфорилирование рецептора. Затем в буфере RIPA данные клетки, подвергнутые различным видам обработки, подвергали лизису. Концентрацию белка определяли количественно в соответствии с инструкциями набора реагентов для бицинхониновой кислоты (Pierce). 25 мкг белка из лизата наносили в 9% SDS-PAGE гель и белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Первичные AT против pEGFR (Y1068) полученные в кролике, применяли для обнаружения фосфорилированного EGFR (Phospho-EGFR). Содержание белка визуализировали с помощью вторичных антител против антител кролика, связанных с флуорофором HRP, с последующим добавлением хемилюминесцентного субстрата (Pierce). На графиках показан сигнал, полученный с помощью PhosphoEGFR, который показывает количество данного белка в клеточном лизате. Как показано на фиг. 7, при всех оцененных концентрациях mAb K4 и K5 показали большую способность ингибировать EGFопосредованное фосфорилирование EGFR в обеих клеточных линиях по сравнению с нимотузумабом. Кроме того, оба mAb при самой низкой протестированной концентрации имеют больший или тот же эффект, что и нимотузумаб при самой высокой оцененной концентрации (в 4 раза более концентрированной). Хотя для всех mAb ингибирование больше в линии MDA-MB-468 с более высокой экспрессией рецептора (фиг. 7Б), важно подчеркнуть, что ингибирующий эффект mAb K4 и K5 не теряется в клеточной линии с более низкой экспрессией рецептора (фиг. 7А), как это происходит с нимотузумабом. Вышеуказанное обеспечивает преимущество применения таких новых mAb, полученных путем включения мутаций в вариабельную область нимотузумаба, которые приводят к большей аффинности к его лиганду и более высокой биологической активности.
-
Claims (6)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Рекомбинантное моноклональное антитело (mAb), которое распознает внеклеточную область рецептора эпидермального фактора роста человека (Her1), характеризующееся тем, что последовательность CDR2 вариабельной области тяжелых цепей выбрана из группы, содержащей:SEQ ID NO. 17,SEQ ID NO. 18,SEQ ID NO. 10,SEQ ID NO. 11,SEQ ID NO. 12 иSEQ ID NO. 29, последовательность CDR1 представляет собой SEQ ID NO. 9, и последовательность CDR3 представляет собой SEQ ID NO. 3 в указанных тяжелых цепях, и последовательности CDR вариабельной области легких цепей представляют собой:CDR1 SEQ ID NO. 22,CDR2 SEQ ID NO. 23,CDR3 SEQ ID NO. 24.
- 2. mAb, которое распознает Her1, которое характеризуется тем, что последовательность CDR2 вариабельной области тяжелых цепей выбрана из группы, содержащей:SEQ ID NO. 2 иSEQ ID NO. 8, последовательность CDR1 представляет собой SEQ ID NO. 1, и последовательность CDR3 представляет собой SEQ ID NO. 3 в указанных тяжелых цепях, и последовательности CDR вариабельной области легких цепей показаны ниже:CDR1 SEQ ID NO. 22,CDR2 SEQ ID NO. 23,CDR3 SEQ ID NO. 24.
- 3. mAb, которое распознает Her1, которое характеризуется тем, что последовательность CDR1 вариабельной области тяжелых цепей выбрана из группы, содержащей:SEQ ID NO. 13 иSEQ ID NO. 19, последовательность CDR2 представляет собой SEQ ID NO. 14, и последовательность CDR3 представляет собой SEQ ID NO. 3 в указанных тяжелых цепях, и последовательности CDR вариабельной области легких цепей представляют собой:CDR1 SEQ ID NO. 22,CDR2 SEQ ID NO. 23,CDR3 SEQ ID NO. 24.
- 4. mAb, которое распознает Her1, которое характеризуется тем, что CDR вариабельной области тяжелой и легкой цепей содержит следующие последовательности:тяжелая цепь:CDR1 SEQ ID NO. 15,CDR2 SEQ ID NO. 16,CDR3 SEQ ID NO. 3;легкая цепь:CDR1 SEQ ID NO. 22,CDR2 SEQ ID NO. 23,CDR3 SEQ ID NO. 24.
- 5. mAb по пп.1-4, отличающееся тем, что каркасные области (FW) вариабельной области тяжелой и легкой цепей имеют следующие последовательности:тяжелая цепь:FW 1 SEQ ID NO. 4;FW 2 SEQ ID NO. 5;FW 3 SEQ ID NO. 6;FW 3 SEQ ID NO. 7;легкая цепь:FW 1 SEQ ID NO. 25;FW 2 SEQ ID NO. 26;FW 3 SEQ ID NO. 27;FW4 SEQ ID NO. 28.
- 6. mAb по пп.1-5, отличающееся тем, что последовательность константных областей тяжелой цепи представляет собой области IgG1 человека.-
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CU2017-0148 | 2017-11-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA043759B1 true EA043759B1 (ru) | 2023-06-21 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6359372B2 (ja) | ＤＡＲＰｉｎを含む二重特異キメラ蛋白質 | |
| CN110305213B (zh) | 一种抗b7-h3抗体及其制备方法、其偶联物和应用 | |
| JP6967853B2 (ja) | ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３に結合する抗体 | |
| US9505843B2 (en) | Anti-Her3 scFV fragment and bispecific anti-c-Met/anti-Her3 antibodies comprising the same | |
| TWI426083B (zh) | 重組抗表皮生長因子受體抗體組成物 | |
| US9808507B2 (en) | Anti-c-Met/anti-Ang2 bispecific antibody | |
| CN111094351A (zh) | 结合EGFR和cMET的抗体 | |
| US9840561B2 (en) | Human anti-human epidermal growth factor receptor antibody and encoding gene and application thereof | |
| US10000569B2 (en) | Anti-cMet/anti-EGFR/anti-HER3 multispecific antibodies and use thereof | |
| Lee et al. | Multi-paratopic VEGF decoy receptor have superior anti-tumor effects through anti-EGFRs and targeted anti-angiogenic activities | |
| CA3013584C (en) | Antibody against egfrviii and use thereof | |
| US11718676B2 (en) | Antibodies with increased affinity for the epidermal growth factor receptor and fragments derived therefrom | |
| EA043759B1 (ru) | Антитела с повышенной аффинностью к рецептору эпидермального фактора роста и происходящие из них фрагменты | |
| KR20150097304A (ko) | 항 EGFR DARPin을 포함하는 EGFR/HER2 이중 특이 항체 | |
| CN110637032B (zh) | 抗dr5抗体及其用途 | |
| JP6502619B2 (ja) | 標的特異的な細胞膜タンパク質除去用組成物 | |
| WO2023086998A2 (en) | Compositions and methods for rare heparan sulfate glycan-targeted cancer treatment | |
| KR20230161759A (ko) | Ccr7의 활성 조절 항체 |