EA043756B1

EA043756B1 - Анти-pfrh5 антитела и их антигенсвязывающие фрагменты

Info

Publication number: EA043756B1
Application number: EA202092281
Authority: EA
Inventors: Лиза Перселл
Original assignee: Ридженерон Фармасьютикалз, Инк.
Priority date: 2018-03-26
Filing date: 2019-03-22
Publication date: 2023-06-20

Description

Область техники

Данное изобретение частично относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые специфически связываются с PfRH5, а также к способам их применения для лечения или профилактики инфекций, вызываемых Plasmodium falciparum.

Уровень техники

Инвазия эритроцитов хозяина представляет собой важный этап жизненного цикла Plasmodium falciparum и патологии малярии. Многие противомалярийные препараты направлены на бесполые стадии в кровеносном русле, однако их эффективности угрожает появление штаммов, резистентных к лекарственным препаратам (Arrow et al., Saving Lives, Buying Time: Economics of Malaria Drugs in an Age of Resistance. National Academies Press (US). 254-266 (2004). PMID:25009879; и Wright et al., Structure of malaria invasion protein RH5 with erythrocyte basigin and blocking antibodies, Nature: 515:427-430 (2014). PMID: 25132548). Кроме того, противомалярийные препараты обладают разными фармакокинетическими свойствами. Некоторые противомалярийные препараты, такие как артемизинин и хинин, быстро выводятся из организма в течение одного жизненного цикла паразита. С другой стороны, гидрофобные и липофильные противомалярийные препараты выводятся медленно, но они характеризуются различной скоростью всасывания в зависимости от количества потребляемых жиров (Arrow et al.).

Ретикулоцитсвязывающий белок-гомолог 5 Plasmodium falciparum (PfRH5) является членом суперсемейства лигандов эритроцитов, называемых ретикулоцитсвязывающими подобными белками (RBL). PfRH5 связывает эритроциты, вероятно, необходим для роста паразита на стадии в кровеносном русле и участвует в видовом тропизме инвазии эритроцитов. Данные свидетельствуют о том, что рецептором для PfRH5 на эритроцитах является антиген группы крови Ok, базигин (BSG; CD147).

Краткое описание сущности изобретения

В данном изобретении представлен антигенсвязывающий белок (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент), который (i) специфически связывается с тем же самым эпитопом на ретикулоцитсвязывающем белке-гомологе 5 Plasmodium falciparum (PfRH5), что и; или (ii) конкурирует за связывание с полипептидом PfRH5 с: антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, который содержит (а) тяжелую цепь иммуноглобулина, которая содержит CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 234, 242, 250, 258, 266, 274, 282, 290, 298, 314, 322, 330, 338, 346 или 354; и/или (b) легкую цепь иммуноглобулина, которая содержит CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218 или 306. Например, в варианте осуществления данного изобретения анти-PfRH5 антигенсвязывающий белок (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент) содержит (i) тяжелую цепь иммуноглобулина, которая содержит CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 234, 242, 250, 258, 266, 274, 282, 290, 298, 314, 322, 330, 338, 346 или 354; и/или (ii) легкую цепь иммуноглобулина, которая содержит CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218 или 306. Например, в варианте осуществления данного изобретения антигенсвязывающий белок (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент) содержит: (а) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 234, 242, 250, 258, 266, 274, 282, 290, 298, 314, 322, 330, 338, 346 или 354; и/или (b) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218 или 306. В варианте осуществления данного изобретения антигенсвязывающий белок (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент) содержит (а) тяжелую цепь иммуноглобулина, содержащую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 234, 242, 250, 258, 266, 274, 282, 290, 298, 314, 322, 330, 338, 346 или 354, и имеющей по меньшей мере 90% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, изложенной в NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 234, 242, 250,

- 1 043756

258, 266, 274, 282, 290, 298, 314, 322, 330, 338, 346 или 354; и/или (b) легкую цепь иммуноглобулина, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 легкой цепи иммуноглобулина, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218 или 306, и имеющей по меньшей мере 90% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218 или 306. Данное изобретение также включает антигенсвязывающий белок (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент), содержащий: тяжелую цепь иммуноглобулина, которая содержит CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GYSFTSYW (SEQ ID NO: 4); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: IYPGDSDT (SEQ ID NO: 6); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ARQDITGTTGFDY (SEQ ID NO: 8); или CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GFTFSSYA (SEQ ID NO: 20); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: ISYDGSNK (SEQ ID NO: 22); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: AKERLFGVVSYYGMDV (SEQ ID NO: 24); или CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GGSISSSSYY (SEQ ID NO: 36); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: IYYSGST (SEQ ID NO: 38); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ARQDREALFDY (SEQ ID NO: 40); или CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GFRFDDYA (SEQ ID NO: 52); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: I NWNSGGK (SEQ ID NO: 54); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: А KDRGIAARLLSRDAFDM (SEQ ID NO: 56); или CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: SFTFSSYG (SEQ ID NO: 68); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: ISYDGSNK (SEQ ID NO: 70); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: AREVRRYYYYGMD

V (SEQ ID NO: 72); или CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GF Т F D D Y A (SEQ ID NO: 84); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: ISWNSGDI (SEQ ID NO: 86); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: AKDTLSGTGTTWYYFDY (SEQ ID NO: 88); или CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GFTFSSYG (SEQ ID NO: 100); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: ISYDGSNK (SEQ ID NO: 102); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: AQDGSSAIYYFYGMDV (SEQ ID NO: 104); или CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GFTFSSYG (SEQ ID NO: 116); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: IWYDGSNK (SEQ ID NO: 118); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ARGEHYYGSGPFDP (SEQ ID NO: 120); или CDRH1, содержащую аминокислотную последовательность: GGSISSFG

YY (SEQ ID NO: 132); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: IYYSGSI (SEQ ID NO: 134); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ARERDYGDYFDY (SEQ ID NO: 136); или CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GFTFSSYG (SEQ ID NO: 148); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: IWYDGSNK (SEQ ID NO: 150); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ARDQDYYGSGSSYGMDV (SEQ ID NO: 152); или CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GFT

FSTYG (SEQ ID NO: 164); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: IWYDGTNK (SEQ ID NO: 166); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ARDPSGGDHYYYYGMDV (SEQ ID NO: 168); или CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GFTFSSYG (SEQ ID NO: 180); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: ISFDERNK (SEQ ID NO: 182); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ASEVGYSFGH DAFDI (SEQ ID NO: 184); или CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GFTFNNYA (SEQ ID NO: 196); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: ISGSGDST (SEQ ID NO: 198); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: AKDQGLYYYGSGSFDY (SEQ ID NO: 200); или CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GFAFSDSA (SEQ ID NO: 212); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: IRNKANRFAT (SEQ ID NO: 214); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ARHGHDTLTEGYGMDV (SEQ ID NO: 216); или CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GGTFSSYT (SEQ ID NO: 228); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: IIPLYGTA (SEQ ID NO: 230); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ASTLELRAFDAFDI (SEQ ID NO: 232); или CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GGSISSGGYY (SEQ ID NO: 236); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: IYYSGST (SEQ ID NO: 238); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ARAPPYNWFDY (SEQ ID NO: 240); или CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GFTFSDYY (SEQ ID NO: 244); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: ISNSGNTQ (SEQ ID NO: 246); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: TREGLEYSSSEPFDY (SEQ ID NO: 248); или CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GYTFTAYY (SEQ ID NO: 252); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: INPNNGDT (SEQ ID NO: 254); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ARDDLAAAGIGWFDS (SEQ ID NO: 256); или CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GFTFDDYA (SEQ ID NO: 260); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: ISWNSESI (SEQ ID NO: 262); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность:

- 2 043756

AKAPYSGTYFEYFRH (SEQ ID NO: 264); или CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GFTFSSYG (SEQ ID NO: 268); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: ISYDGSNK (SEQ ID NO: 270); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: AKDDWNYDAFDI (SEQ ID NO: 272); или CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GGSISSSGYY (SEQ ID NO: 276); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: IYYSGST (SEQ ID NO: 278); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ARVDYGSGSSFDY (SEQ ID NO: 280); или CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GYTFTSYG (SEQ ID NO: 284); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: ISGFNGRT (SEQ ID NO: 286); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ARDGLEKLGDY (SEQ ID NO: 288); или CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GFTFSNSG (SEQ ID NO: 292); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: IWHDGSYK (SEQ ID NO: 294); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ARDDYYASGTSVDV (SEQ ID NO: 296); или CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GYTFTGYY (SEQ ID NO: 300); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: INPNSGGT (SEQ ID NO: 302); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: AREEVDDFWSGYLDY (SEQ ID NO: 304); или CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GFAVNGDY (SEQ ID NO: 316); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: IYSSGNT (SEQ ID NO: 318); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ARDFPPMSGADY (SEQ ID NO: 320); или CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GYTLTELS (SEQ ID NO: 324); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: FDPEHGKI (SEQ ID NO: 326); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: А TFYNWNSYYFGMDV (SEQ ID NO: 328); или CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GFTFSSYA (SEQ ID NO: 332); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: VSGSADIT (SEQ ID NO: 334); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: AKDKVYNWNYGIYYGMDV (SEQ ID NO: 336); или CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GGSISSSSYY (SEQ ID NO: 340); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: IYYSGST (SEQ ID NO: 342); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ARQGRWERENFDY (SEQ ID NO: 344); или CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: DESFSDYY (SEQ ID NO: 348); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: ITHSGST (SEQ ID NO: 350); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ARGGDYGGLLDY (SEQ ID NO: 352); и/или вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QSIRNY (SEQ ID NO: 12); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: AAS (SEQ ID NO: 14); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQSYSTPFT (SEQ ID NO: 16); или CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QDINRD (SEQ ID NO: 28); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: DAS (SEQ ID NO: 30); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQYKNLPYT (SEQ ID NO: 32); или CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QRIGSS (SEQ ID NO: 44); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: YAS (SEQ ID NO: 46); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: HQSSTLPT (SEQ ID NO: 48); или CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QDVSSY (SEQ ID NO: 60); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: AAS (SEQ ID NO: 62); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QHLNTYPYT (SEQ ID NO: 64); или CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QDISNY (SEQ ID NO: 76); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: DAS (SEQ ID NO: 78); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQYNNLPLT (SEQ ID NO: 80); или CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QGISSY (SEQ ID NO: 92); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: AAS (SEQ ID NO: 94); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQVNSYPLT (SEQ ID NO: 96); или CDRL1, содержащую аминокислотную последовательность: QDINNY (SEQ ID NO: 108); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: AAS (SEQ ID NO: 110); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: LQYNSYHPT (SEQ ID NO: 112); или CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QSISNY (SEQ ID NO: 124); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: AAS (SEQ ID NO: 126); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQSYSSPLT (SEQ ID NO: 128); или CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QSVSSN (SEQ ID NO: 140); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: GAS (SEQ ID NO: 142); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQYNNWPLT (SEQ ID NO: 144); или CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QSISSY (SEQ ID NO: 156); CDRL2, содержащую аминокислотную последовательность: AAS (SEQ ID NO: 158); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 160); или CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QDISNY (SEQ ID NO: 172); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: DAS (SEQ ID NO: 174); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQYDNIPIT (SEQ ID NO: 176); или CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QDISNY (SEQ ID NO: 188); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: DAS (SEQ ID NO: 190); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQYDNFPLT (SEQ ID NO:

- 3 043756

192); или CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QSISSY (SEQ ID NO: 204); CDRL2, содержащую аминокислотную последовательность: AAS (SEQ ID NO: 206); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQSYSTPFT (SEQ ID NO: 208); или CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QSISSY (SEQ ID NO: 220); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: AAS (SEQ ID NO: 222); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQSYSTPPIT (SEQ ID NO: 224); или CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QSVSSSY (SEQ ID NO: 308); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: GAS (SEQ ID NO: 310); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQYGSSPWT (SEQ ID NO: 312). В одном варианте осуществления данного изобретения антигенсвязывающий белок (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент) содержит (1) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GYSFTSYW (SEQ ID NO: 4); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: IYPGDSDT (SEQ ID NO: 6); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ARQDITGTTGFDY (SEQ ID NO: 8); и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QSIRNY (SEQ ID NO: 12); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: AAS (SEQ ID NO: 14); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQSYSTPFT (SEQ ID NO: 16); (2) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GFTFSSYA (SEQ ID NO: 20); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: ISYDGSNK (SEQ ID NO: 22); CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: AKERLFGVVSYYGMDV (SEQ ID NO: 24); и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QDINRD (SEQ ID NO: 28); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: DAS (SEQ ID NO: 30); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQYKNLPYT (SEQ ID NO: 32); (3) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GGSISSSSYY (SEQ ID NO: 36); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: IYYSGST (SEQ ID NO: 38); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ARQDREALFDY (SEQ ID NO: 40); и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QRIGSS (SEQ ID NO: 44); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: YAS (SEQ ID NO: 46); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: HQSSTLPT (SEQ ID NO: 48); (4) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GFRFDDYA (SEQ ID NO: 52); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: INWNSGGK (SEQ ID NO: 54); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: AKDRGIAARLLSRDAFDM (SEQ ID NO: 56); и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QDVSSY (SEQ ID NO: 60); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: AAS (SEQ ID NO: 62); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QHLNTYPYT (SEQ ID NO: 64); (5) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: SFTFSSYG (SEQ ID NO: 68); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: ISYDGSNK (SEQ ID NO: 70); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: AREVRRYYYYGMDV (SEQ ID NO: 72); и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QDISNY (SEQ ID NO: 76); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: DAS (SEQ ID NO: 78); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQYNNLPLT (SEQ ID NO: 80); (6) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GFTFDDYA (SEQ ID NO: 84); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: ISWNSGDI (SEQ ID NO: 86); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: AKDTLSGTG TTWYYFDY (SEQ ID NO: 88); и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QGISSY (SEQ ID NO: 92); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: AAS (SEQ ID NO: 94); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQVNSYPLT (SEQ ID NO: 96); (7) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GFTFSSYG (SEQ ID NO: 100); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: ISYDGSNK (SEQ ID NO: 102); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: AQDGSSAIYYFYGMDV (SEQ ID NO: 104); и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QDINNY (SEQ ID NO: 108); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: AAS (SEQ ID NO: 110); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: LQYNSYHPT (SEQ ID NO: 112); (8) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GFTFSSYG (SEQ ID NO: 116); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: IWYDGSNK (SEQ ID NO: 118); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ARGEHYYGSGPFDP (SEQ ID NO: 120); и вариабельную область легкой цепи

- 4 043756 иммуноглобулина, которая содержит: CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QSISNY (SEQ ID NO: 124); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: AAS (SEQ ID NO: 126); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQSYSSPLT (SEQ ID NO: 128); (9) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GGSISSFGYY (SEQ ID NO: 132); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: IYYSGSI (SEQ ID NO: 134); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ARERDYGDYFDY (SEQ ID NO: 136); и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QSVSSN (SEQ ID NO: 140); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: GAS (SEQ ID NO: 142); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQYNNWPLT (SEQ ID NO: 144); (10) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GFTFSSYG (SEQ ID NO: 148); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: IWYDGSNK (SEQ ID NO: 150); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ARDQDYYGSGSSYGMDV (SEQ ID NO: 152); и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QSISSY (SEQ ID NO: 156); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: AAS (SEQ ID NO: 158); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 160); (11) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GFTFSTYG (SEQ ID NO: 164); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: IWYDGTNK (SEQ ID NO: 166); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ARDPSGGDHYYYYGMDV (SEQ ID NO: 168); и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QDISNY (SEQ ID NO: 172); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: DAS (SEQ ID NO: 174); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQYDNIPIT (SEQ ID NO: 176); (12) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GFTFSSYG (SEQ ID NO: 180); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: ISFDERNK (SEQ ID NO: 182); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ASEVGYSFGHDAFDI (SEQ ID NO: 184); и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QDISNY (SEQ ID NO: 188); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: DAS (SEQ ID NO: 190); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQYDNFPLT (SEQ ID NO: 192); (13) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GFTFNNYA (SEQ ID NO: 196); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: ISGSGDST (SEQ ID NO: 198); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: AKDQGLYYYGSGSFDY (SEQ ID NO: 200); и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QSISSY (SEQ ID NO: 204); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: AAS (SEQ ID NO: 206); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQSYSTPFT (SEQ ID NO: 208); (14) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GFAFSDSA (SEQ ID NO: 212); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: IRNKANRFAT (SEQ ID NO: 214); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ARHGHDTLTEGYGMDV (SEQ ID NO: 216); и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QSISSY (SEQ ID NO: 220); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: AAS (SEQ ID NO: 222); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQSYSTPPIT (SEQ ID NO: 224); (15) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GGTFSSYT (SEQ ID NO: 228); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: IIPLYGTA (SEQ ID NO: 230); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ASTLELRAFDAFDI (SEQ ID NO: 232); и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QSISSY (SEQ ID NO: 220); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: AAS (SEQ ID NO: 222); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQSYSTPPIT (SEQ ID NO: 224); (16) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GGSISSGGYY (SEQ ID NO: 236); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: IYYSGST (SEQ ID NO: 238); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ARAPPYNWFDY (SEQ ID NO: 240); и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QSISSY (SEQ ID NO: 220); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: AAS (SEQ ID NO: 222); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQSYSTPPIT (SEQ ID NO: 224); (17) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GFTFSDYY (SEQ ID NO: 244); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: ISNSGNTQ (SEQ ID NO: 246); и CDR-H3, содержащую аминокислот

- 5 043756 ную последовательность: TREGLEYSSSEPFDY (SEQ ID NO: 248); и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QSISSY (SEQ ID NO: 220); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: AAS (SEQ ID NO: 222); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQSYSTPPIT (SEQ ID NO: 224); (18) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GYTFTAYY (SEQ ID NO: 252); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: INPNNGDT (SEQ ID NO: 254); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ARDDLAAAGIGWFDS (SEQ ID NO: 256); и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QSISSY (SEQ ID NO: 220); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: AAS (SEQ ID NO: 222); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQSYSTPPIT (SEQ ID NO: 224); (19) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GFTFDDYA (SEQ ID NO: 260); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: ISWNSESI (SEQ ID NO: 262); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: AKAPYSGTYFEYFR Н (SEQ ID NO: 264); и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QSISSY (SEQ ID NO: 220); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: AAS (SEQ ID NO: 222); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQSYSTPPIT (SEQ ID NO: 224); (20) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GFTFSSYG (SEQ ID NO: 268); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: ISYDGSNK (SEQ ID NO: 270); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: AKDDWNYDAFDI (SEQ ID NO: 272); и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QSI SSY (SEQ ID NO: 220); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: AAS (SEQ ID NO: 222); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQSYSTPPIT (SEQ ID NO: 224); (21) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GGSISSSGYY (SEQ ID NO: 276); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: IYYSGST (SEQ ID NO: 278); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ARVDYGSGSSFDY (SEQ ID NO: 280); и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QSISSY (SEQ ID NO: 220); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: AAS (SEQ ID NO: 222); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQSYSTPPIT (SEQ ID NO: 224); (22) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GYTFTSYG (SEQ ID NO: 284); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: ISGFNGRT (SEQ ID NO: 286); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ARDGLEKLGDY (SEQ ID NO: 288); и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QSISSY (SEQ ID NO: 220); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: AAS (SEQ ID NO: 222); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQSYSTPPIT (SEQ ID NO: 224); (23) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GFTFSNSG (SEQ ID NO: 292); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: IWHDGSYK (SEQ ID NO: 294); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ARDDYYASGTSVDV (SEQ ID NO: 296); и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QSISSY (SEQ ID NO: 220); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: AAS (SEQ ID NO: 222); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQSYSTPPIT (SEQ ID NO: 224); (24) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GYTFTGYY (SEQ ID NO: 300); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: INPNSGGT (SEQ ID NO: 302); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: AREEVDDFWSGYLDY (SEQ ID NO: 304); и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QSVSSSY (SEQ ID NO: 308); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: GAS (SEQ ID NO: 310); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQYGSSPWT (SEQ ID NO: 312); (25) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GFAVNGDY (SEQ ID NO: 316); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: IYSSGNT (SEQ ID NO: 318); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ARDFPPMSGADY (SEQ ID NO: 320); и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QSVSSSY (SEQ ID NO: 308); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: GAS (SEQ ID NO: 310); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQYGSSPWT (SEQ ID NO: 312); (26) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GYTLTELS (SEQ ID NO: 324); CDR-H2, содержащую аминокислотную последова

- 6 043756 тельность: FDPEHGKI (SEQ ID NO: 326); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ATFYNWNSYYFGMDV (SEQ ID NO: 328); и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QSVSSSY (SEQ ID NO: 308); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: GAS (SEQ ID NO: 310); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQYGSSPWT (SEQ ID NO: 312); (27) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GFTFSSYA (SEQ ID NO: 332); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: VSGSADIT (SEQ ID NO: 334); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: AKDKVYNWNYGIYYGMDV (SEQ ID NO: 336); и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QSVSSSY (SEQ ID NO: 308); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: GAS (SEQ ID NO: 310); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQYGSSPWT (SEQ ID NO: 312); (28) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: GGSISSSSYY (SEQ ID NO: 340); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: IYYSGST (SEQ ID NO: 342); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ARQGRWERENFDY (SEQ ID NO: 344); и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QSVSSSY (SEQ ID NO: 308); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: GAS (SEQ ID NO: 310); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQYGSSPWT (SEQ ID NO: 312); и/или (29) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: DESFSDYY (SEQ ID NO: 348); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: ITHSGST (SEQ ID NO: 350); и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: ARGGDYGGLLDY (SEQ ID NO: 352); и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит: CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: QSVSSSY (SEQ ID NO: 308); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: GAS (SEQ ID NO: 310); и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: QQYGSSPWT (SEQ ID NO: 312). Например, в варианте осуществления данного изобретения антигенсвязывающий белок (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент) содержит (а) тяжелую цепь иммуноглобулина, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 234, 242, 250, 258, 266, 274, 282, 290, 298, 314, 322, 330, 338, 346 или 354; и/или (b) легкую цепь иммуноглобулина, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218 или 306. В варианте осуществления данного изобретения антигенсвязывающий белок является мультиспецифическим (например, биспецифическим, мультипаратопным или бипаратопным).

В варианте осуществления данного изобретения антигенсвязывающий белок (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент) включает одно или несколько из следующих свойств: подавляет рост Plasmodium falciparum в эритроцитах человека; подавляет рост штаммов D10, Dd2, 7G8, W2-mef, 3D7, НВ3, FCR-1/FVO, Cam3.II или RF7 Plasmodium falciparum в эритроцитах человека; блокирует связывание полипептида PfRH5 с полипептидом базигином; например, в концентрации около 6,67 микромоль вызывает максимальное подавление роста (например, in vitro) Plasmodium falciparum (например, штамм FCR-1/FVO) в инактивированной нагреванием сыворотке крови человека или обезьяны Aotus (например, при измерении по активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) паразита), которое на около 1-10% (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10%) (по сравнению с неинфицированными эритроцитами) выше, чем в неинактивированной нагреванием сыворотке крови человека или обезьяны Aotus, соответственно; при воздействии указанного антигенсвязывающего белка не вызывает мутации PfRH5 в Plasmodium falciparum (например, штамме 3D7), например, in vitro после около 45 суток постепенного увеличения концентрации антител, например, от около 1ХЕС₅₀ до около 110ХЕС₅₀; и/или связывается cPfRH5, не содержащим аминоконцевые остатки M1-Y139 и включающим остатки K140-Q526, но не содержащим K247L295 и имеющим, например, мутации Т216А и Т299А, где антигенсвязывающий белок содержит аминокислотную последовательность данном документе.

Данное изобретение также включает комплекс, содержащий антигенсвязывающий белок (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент), связанный с полипептидом ретикулоцитсвязывающим белком-гомологом 5 Plasmodium falciparum (PfRH5). Например, PfRH5 находится на поверхности клетки, такой как Plasmodium falciparum (например, мерозоитов Plasmodium falciparum), например, в организме субъекта (например, человека). В одном варианте осуществления данного изобретения PfRH5 находится на поверхности Plasmodium falciparum, например, мерозоите в эритроците.

В данном изобретении также представлен способ получения анти-PfRH5 антигенсвязывающего белка (например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента), изложенного в данном документе, или его иммуноглобулиновой цепи, включающий: (а) введение одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих иммуноглобулиновую цепь указанного антигенсвязывающего белка в клетку-хозяина (например, клетку яичника китайского хомячка); (b) культивирование клетки-хозяина в условиях, благоприятных для экспрессии полинуклеотида; и (с) необязательно выделение антигенсвязывающего белка или

- 7 043756 иммуноглобулиновой цепи из клетки-хозяина и/или среды, в которой клетка-хозяин выращивается. Антигенсвязывающий белок или иммуноглобулиновая цепь, которые являются продуктом такого способа, также составляют часть данного изобретения.

Тест-полоска на наличие антигенов для иммунохроматографического анализа, содержащая антигенсвязывающий белок анти-PfRH5, изложенный в данном документе (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент), является частью данного изобретения. Способы обнаружения Plasmodium falciparum в образце крови от субъекта и/или из организма субъекта с использованием тест-полоски также являются частью данного изобретения.

Полипептид, содержащий: (a) CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина иммуноглобулиновой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 234, 242, 250, 258, 266, 274, 282, 290, 298, 314, 322, 330, 338, 346 или 354; или (b) CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина иммуноглобулиновой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218 или 306 также являются частью данного изобретения. Полинуклеотиды (например, ДНК или РНК), кодирующие такой полипептид, также являются частью данного изобретения вместе с вектором, который содержит полинуклеотид.

В данном изобретении также представлена клетка-хозяин (например, клетка яичника китайского хомячка), содержащая антигенсвязывающий белок (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент) или иммуноглобулиновую цепь, или полипептид, или полинуклеотид, или вектор, которые изложены в данном документе.

В данном изобретении также представлена композиция или набор, которые содержат один или несколько (например, 1, 2, 3 или 4) анти-PfRH5 антигенсвязывающих белков (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент), изложенных в данном документе, необязательно в сочетании с дополнительным терапевтическим агентом (например, противопаразитарным препаратом, хлорохином, атоваквоном, прогуанилом, артеметером, люмефантрином, мефлохином, хинином, хинидином, доксициклином (необязательно в комбинации с хинином), клиндамицином, вакциной, противомалярийной вакциной или RTS, S/AS01). В данном изобретении также представлена фармацевтическая композиция, содержащая анти-PfRH5 антигенсвязывающий белок, изложенный в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель и необязательно дополнительный терапевтический агент.

В данном изобретении также представлен сосуд или инъекционное устройство (например, автоинъектор или предварительно заполненный шприц), содержащие анти-PfRH5 антигенсвязывающий белок (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент) или композицию (например, фармацевтическую композицию), изложенные в данном документе.

В данном изобретении представлен способ лечения или профилактики инфекции Plasmodium falciparum (например, малярии) у субъекта (например, человека), нуждающегося в этом, включающий введение (например, парентерально) терапевтически эффективного количества анти-PfRH5 антигенсвязывающего белка, обсуждаемого в данном документе, необязательно в сочетании с дополнительным терапевтическим агентом. В варианте изобретения субъекта диагностируют как страдающего инфекцией Plasmodium falciparum (например, малярией), до начала лечения. Например, в варианте осуществления данного изобретения субъекта диагностируют с помощью тест-полоски для хроматографического анализа, как изложено в данном документе. В одном варианте осуществления данного изобретения субъект не инфицирован Plasmodium falciparum, но ему вводят терапевтически эффективное количество анти-PfRH5 антигенсвязывающего белка профилактически, т.е. для предупреждения такой инфекции.

В данном изобретении также представлен способ диагностики инфекции Plasmodium falciparum у субъекта, включающий приведение в контакт анти-PfRH5 антигенсвязывающего белка по данному изобретению с образцом (например, кровью) от указанного субъекта и, если комплекс между антигенсвязывающим белком и полипептидом PfRH5 в образце обнаруживают, определение, что субъект инфицирован Plasmodium falciparum. Например, указанный комплекс может быть образован на тест-полоске для хроматографического анализа, как изложено в данном документе, содержащей анти-PfRH5 антигенсвязывающий белок по данному изобретению и полипептид PfRH5 (из образца субъекта).

В данном изобретении представлен способ введения анти-PfRH5 антигенсвязывающего белка (например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента), изложенного в данном документе, в организм субъекта (например, человека), включающий инъекцию антигенсвязывающего белка в организм субъекта, необязательно в сочетании с дополнительным терапевтическим агентом, например, подкожно, внутривенно или внутримышечно.

Данное изобретение также охватывает любой полипептид или полинуклеотид иммуноглобулина, изложенный в данном документе, например, содержащий любую аминокислотную последовательность члене, выбранном из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 146, 148, 150,

152, 154, 156, 158, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 194, 196, 198, 200,

202, 204, 206, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248,

- 8 043756

250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358 и 360; или полинуклеотид, содержащий любую нуклеотидную последовательность члене, выбранном из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189,

193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237,239,

241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281,283,

285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327,329,

331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357 и 359.

Краткое описание графических материалов

На чертеже изображено выравнивание последовательностей PfRH5, соответствующих каждому PfRH5-специфическому антителу, через 45 дней после постепенного увеличения давления антитела (от 1 χ ЕС50 до 110 χ EC50).

Подробное описание сущности изобретения

Plasmodium falciparum представляет собой простейшего паразита, одного из видов Plasmodium, которые вызывают малярию у людей, которая может передаваться самками комара Anopheles. Малярия, вызываемая этим видом (которую можно назвать злокачественной трехдневной малярией), представляет собой очень опасную форму малярии с высоким уровнем осложнений и смертности. См., например, Gardner et al., Genome sequence of the human malaria parasite Plasmodium falciparum, Nature 419(6906): 498511 (2002). Plasmodium falciparum включает любой его штамм, который проявляет чувствительность к антигенсвязывающему белку по данному изобретению, например, D10, Dd2, 7G8, W2-mef, 3D7, НВ3, FCR-1/FVO, Cam3.II или RF7. Инфекция Plasmodium falciparum относится к инвазии и размножению Plasmodium falciparum в организме субъекта. В данном изобретении представлены различные антигенсвязывающие белки, которые являются эффективными для лечения или профилактики инфекции Plasmodium falciparum.

Анти-PfRH5 антигенсвязывающий белок представляет собой отдельный полипептид (например, ScFv (одноцепочечный вариабельный фрагмент)) или комплекс из более чем одного полипептида (например, тетрамерное антитело IgG), который специфически связывается с полипептидом PfRH5, например, анти-PfRH5 антитело или антигенсвязывающий фрагмент, вне зависимости от того, являются ли они моноспецифическими или мультиспецифическими (например, биспецифическими), моновалентными или мультивалентными (например, бивалентными). Моновалентный антигенсвязывающий белок имеет один антигенсвязывающий домен, в то время как бивалентный антигенсвязывающий белок имеет два антигенсвязывающих домена.

Базигин (BSG, индуктор металлопротеиназы внеклеточного матрикса, EMMPRIN, CD147) представляет собой полипептид, который представляет собой мишень на эритроцитах, с которой связывается PfRH5. В варианте осуществления данного изобретения аминокислотная последовательность базигина изложена под номером доступа Uniprot Q54A51. См., например, Crosnier et al, Basigin is a receptor essential for erythrocyte invasion by Plasmodium falciparum, Nature. 2011 Nov 9; 480(7378):534-7. В одном варианте осуществления данного изобретения антигенсвязывающий белок по данному изобретению блокирует связывание между PfRH5 и BSG.

Ретикулоцитсвязывающий белок-гомолог 5 Plasmodium falciparum (PfRH5)

Ретикулоцитсвязывающий белок-гомолог 5 Plasmodium falciparum (PfRH5) является членом суперсемейства лигандов эритроцитов, называемых ретикулоцитсвязывающими подобными белками (RBL). Данные свидетельствуют о том, что PfRH5 необходим для распространения инфекции Plasmodium falciparum на стадии в кровеносном русле. PfRH5 связывает эритроциты и участвует в видовом тропизме при инвазии эритроцитов. См., например, Bustamante et al., Vaccine. 2013 Jan 2; 31(2):373-379.

В варианте осуществления данного изобретения PfRH5 содержит аминокислотную последовательность:

- 9 043756

MIRIKKKLIL TIIYIHLFIL NRLSFENAIK KTKNQENNLT LLPIKSTEEE KDDIKNGKDI

KKEIDNDKEN	IKTNNAKDHS	TYIKSYLNTN	VNDGLKYLFI	PSHNSFIKKY
SVFNQINDGM LLNEKNDVKN	NEDYKNVDYK	NVNFLQYHFK	ELSNYNIANS	IDILQEKEGH
LDFVIIPHYT FLDYYKHLSY	NSIYHKSSTY	GKCIAVDAFI	KKINETYDKV	I<SI<CNDII<ND
LIATIKKLEH PYDINNKNDD	SYRYDISEEI	DDKSEETDDE	TEEVEDSIQD	TDSNHTPSNK
KKNDLMNRTF KKMMDEYNTK	KKKLIKCIKN	HENDFNKICM	DMKNYGTNLF	EQLSCYNNNF
CNTNGIRYHY DEYIHKLILS	VKSKNLNKDL	SDMTNILQQS	ELLLTNLNKK	MGSYIYIDTI

KFIHKEMKHI

FNRIEYHTKIINDKTKIIQD KIKLNIWRTF QKDELLKRIL DMSNEYSLFI TSDHLRQMLY NTFYSKEKHL NNIFHHLIYV LQMKFNDVPI KMEYFQTYKK NKPLTQ (SEQ ID NO: 361)

Полипептид PfRH5ANL.6his (PfRH5 (K140-Q526; del M1-Y139; del K247-L295; T216A; T299A)), в котором отсутствуют N-концевые остатки 1-139 и остатки 247-295 и имеются мутации Т216А и Т299А, а также С-концевая метка His₆, является частью данного изобретения совместно с полинуклеотидами, кодирующими полипептид. В варианте изобретения полипептид PfRH5ANL.6his содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 362:

KNVNFLQYHFKELSNYNIANSIDILQEKEGHLDFVIIPHYTFLDYYKHLSYNSIYH KSSTYGKYIAVDAFIKKINEAYDKVKSKCNDIKNDLIATIKKLEHPYDINNMNRAFKKM MDEYNTKKKKLIKCIKNHENDFNKICMDMKNYGTNLFEQLSCYNNNFCNTNGIRYHYD EYIHKLILSVKSKNLNKDLSDMTNILQQSELLLTNLNKKMGSYIYIDTIKFIHKEMKHIFN RIEYHTKIINDKTKIIQDKIKLNIWRTFQKDELLKRILDMSNEYSLFITSDHLRQMLYNTFY SKEKHLNNIFHHLIYVLQMKFNDVPII<MEYFQTYI<KNI<PLTQHHHHHH

В варианте осуществления данного изобретения полипептид находится в кристаллизованной форме или в некристаллизованной форме.

Антитела и антигенсвязывающие фрагменты

В данном изобретении представлены антигенсвязывающие белки, такие как антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с белком PfRH5 или его антигенным фрагментом. Иммуноглобулиновые цепи по данному изобретению описаны в данном документе в примере 1 в табл. 1-1.

Термин антитело, используемый в данном документе, относится к иммуноглобулиновым молекулам, содержащим четыре полипептидные цепи, две тяжелые цепи (НС) и две легкие цепи (LC), соединенные между собой дисульфидными связями (т.е., молекулы полноразмерных антител), а также их мультимерам (например, IgM), например, Н1Н29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29125Р; Н1Н29127Р; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2; Н1Н29183Р2; Н1Н29187Р2; Н1Н29192Р2; Н1Н29196Р2; Н1Н29198Р2; Н1Н29207Р2; Н1Н29209Р2, Н1Н29214Р2; или Н1Н29215Р2. Каждая тяжелая цепь (НС) содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR или VH) (например, SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 234, 242, 250, 258, 266, 274, 282, 290, 298, 314, 322, 330, 338, 346 или 354) и константную область тяжелой цепи (состоящую из доменов C_H1, CH2 и С_Н3). Каждая легкая цепь (LC) состоит из вариабельной области легкой цепи (LCVR или VL) (например, SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218 или 306) и константной области легкой цепи (CL). V_H- и VL-области могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR), которые разделены областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и V_L содержит три CDR и четыре FR, расположенные от аминоконца до карбоксиконца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения FR антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента) являются идентичными последовательностям зародышевой линии человека или могут быть естественно или искусственно модифицированы.

В типичном случае вариабельные домены как тяжелой, так и легкой цепей иммуноглобулина содержат три гипервариабельные области, также называемые областями, определяющими комплементарность (CDR), расположенные внутри относительно консервативных каркасных областей (FR). Как правило, от N-конца до С-конца вариабельные домены как легкой, так и тяжелой цепей содержат FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. В варианте осуществления данного изобретения назначение аминокислот каждому домену соответствует определениям Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, et al.; National Institutes of Health, Bethesda, Md.; 5^th ed.; NIHPubl. No. 91-3242 (1991); Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75; Kabat, et al., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616; Chothia, et al., (1987) J Mol. Biol. 196:901-917 or Chothia, et al., (1989) Nature 342:878-883.

- 10 043756

В данном изобретении представлены моноклональные анти-PfRH5 антигенсвязывающие белки, например, антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, а также моноклональные композиции, содержащие множество выделенных моноклональных антигенсвязывающих белков. Термин моноклональное антитело, используемый в данном документе, относится к популяции по сути гомогенных антител, т.е., молекулы антитела, составляющие популяцию, являются идентичными по аминокислотной последовательности, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Множество таких моноклональных антител и фрагментов в композиции относится к концентрации идентичных (т.е., как обсуждалось выше, по аминокислотной последовательности, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах) антител и фрагментов, которое выше того, которое обычно встречается в природе, например, в крови организма-хозяина, такого как мышь или человек.

В варианте осуществления данного изобретения анти-PfRH5 антигенсвязывающий белок, например, антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержит константный домен тяжелой цепи, например, типа IgA (например, IgA1 или IgA2), IgD, IgE, IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4) или IgM. В варианте осуществления данного изобретения антигенсвязывающий белок, например, антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержит константный домен легкой цепи, например, типа каппа или лямбда.

Термин человеческий антигенсвязывающий белок, такой как антитело или антигенсвязывающий фрагмент, используемый в данном документе, включает антитела и фрагменты, имеющие вариабельные и константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека, будь то в клетке человека или привитые в отличную от человеческой клетку, например, клетку мыши. См., например, US 8502018, US 6596541 или US 5789215. Человеческие моноклональные антитела (мАт) по данному изобретению могут содержать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии человека (например, мутации, введенные путем случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или соматической мутации in vivo), например, в CDR и, в частности, в CDR3. В то же время термин человеческое антитело, используемый в данном документе, не предполагает включение мАт, в которых последовательности CDR, происходящие из зародышевой линии других видов млекопитающих (например, мыши), были привиты к FR последовательностям человека. Указанный термин включает антитела, рекомбинантно продуцируемые в млекопитающем, отличном от человека, или в клетках млекопитающего, отличного от человека. Указанный термин не предназначен для включения антител, выделенных или созданных у субъекта-человека.

Данное изобретение включает анти-PfRH5 химерные антигенсвязывающие белки, например, антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, и способы их применения. Используемый в данном документе термин химерное антитело представляет собой антитело, имеющее вариабельный домен первого антитела и константный домен второго антитела, где первое и второе антитела относятся к разным видам, (см., например, US4816567; и Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855).

Термин рекомбинантные антигенсвязывающие белки, такие как антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, относится к таким молекулам, созданным, экспрессируемым, выделенным или полученным с помощью технологий или способов, известных в данной области техники, такой, как технология рекомбинантных ДНК, которая включает, например, сплайсинг ДНК и трансгенную экспрессию. Термин включает антитела, экспрессируемые в организме млекопитающих, отличных от человека (в том числе трансгенных млекопитающих, отличных от человека, например, трансгенных мышей), или в клеточной (например, клетки СНО) экспрессионной системе, или выделенные из комбинаторной библиотеки рекомбинантных человеческих антител.

Рекомбинантные анти-PfRH5 антигенсвязывающие белки, например, антитела и антигенсвязывающие фрагменты, раскрываемые в данном документе, также могут быть получены в экспрессионной системе Е. coli/T7'. В этом варианте осуществления нуклеиновые кислоты, кодирующие иммуноглобулиновые молекулы анти-PfRH5 антител по данному изобретению (например, Н1Н29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29125Р; Н1Н29127Р; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2; Н1Н29183Р2; Н1Н29187Р2; Н1Н29192Р2; Н1Н29196Р2; Н1Н29198Р2; Н1Н29207Р2; Н1Н29209Р2, Н1Н29214Р2 или Н1Н29215Р2), могут быть вставлены в плазмиду на основе рЕТ и экспрессированы в системе Е. coli/T7'. Например, данное изобретение включает способы экспрессии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или его иммуноглобулиновой цепи в клетке-хозяине (например, бактериальной клетке-хозяине, такой как Е.coli, такой как BL21 или BL21DE3), включающие экспрессию РНК-полимеразы Т7 в клетке, которая также содержит полинуклеотид, кодирующий иммуноглобулиновую цепь, которая функционально связана с промотором Т7. Например, в варианте осуществления данного изобретения бактериальная клетка-хозяин, такая как Е. coli, содержит полинуклеотид, кодирующий ген РНК-полимеразы Т7, функционально связанный с промотором lac, и экспрессия полимеразы и цепи индуцируется инкубацией клетки-хозяина с IPTG (изопропил-бета-О-тиогалактопиранозидом). См. US4952496 и US5693489 или Studier & Moffatt, Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes, J. Mol. Biol. 1986 May

- 11 043756

5;189(1): 113-30.

Существует несколько способов получения рекомбинантных антител, которые известны в данной области техники. Один пример способа рекомбинантного получения антител раскрыт в US 4816567.

Трансформация может осуществляться любым известным способом введения полинуклеотидов в клетку-хозяина. Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны в данной области техники и включают опосредованную декстраном трансфекцию, преципитацию фосфатом кальция, опосредованную полибреном трансфекцию, слияние протопластов, электропорацию, инкапсуляцию полинуклеотида (полинуклеотидов) в липосомы, биолистическую инъекцию и прямую микроинъекцию ДНК в ядра. Кроме того, молекулы нуклеиновой кислоты могут быть введены в клетки млекопитающих с помощью вирусных векторами. Способы трансформации клеток хорошо известны в данной области техники. См., например, патенты США №№ 4399216; 4912040; 4740461 и 4959455.

Полинуклеотиды, кодирующие иммуноглобулины, изложенные в данном документе (например, содержащие нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 145, 147, 149, 151,

153, 155, 157, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 193, 195, 197, 199,201,

203, 205, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247,249,

251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291,293,

295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337,339,

341, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357 и 359), которые находятся в векторе и/или функционально связаны с последовательностью контроля экспрессии, такой как промотор, составляют часть данного изобретения. Промотор может представлять собой, например, промотор CMV (например, основной немедленно-ранний промотор (MIE) цитомегаловируса человека (CMV) или промотор CMV мыши) или промотор SV40 (например, ранний промотор SV40). Вектор может представлять собой плазмиду (например, кольцевую плазмиду или линеаризованную плазмиду) или вирусный вектор, который может эктопически поддерживаться в клетке-хозяине или интегрироваться в хромосому хозяина. Такие клетки-хозяева составляют часть данного изобретения.

Полинуклеотид является функционально связанным, когда он находится в функциональной связи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности. Как правило, хотя и не всегда, функционально связанный означает, что связываемые последовательности ДНК являются смежными, а в случае секреторной лидерной последовательности, смежными и находятся в фазе считывания. В то же время, энхансеры не обязательно должны быть смежными.

Таким образом, данное изобретение включает рекомбинантные способы получения анти-PfRH5 антигенсвязывающего белка, такого как антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению, или его иммуноглобулиновую цепь, включающие (i) введение одного или нескольких полинуклеотидов (например, в том числе нуклеотидной последовательности в любой одной или нескольких из SEQ ID NO: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 97, 105, 113, 121, 129, 137, 145, 153, 161, 169, 177, 185, 193, 201, 209, 217, 225, 233, 241, 249, 257, 265, 273, 281, 289, 297, 305, 313, 321, 329, 337, 345 и/или 353), кодирующих легкие и/или тяжелые иммуноглобулиновые цепи антигенсвязывающего белка, например, Н1Н29О89Р; Н1Н29О94Р; Н1Н291ООР; Н1Н291О4Р; Н1Н291О6Р; Н1Н291О9Р; Н1Н29125Р; Н1Н29127Р; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2; Н1Н29183Р2; Н1Н29187Р2; Н1Н29192Р2; Н1Н29196Р2; Н1Н29198Р2; Н1Н292О7Р2; Н1Н292О9Р2, Н1Н29214Р2 или Н1Н29215Р2, например, где полинуклеотид находится в векторе; и/или интегрирован в хромосому клетки-хозяина и/или функционально связан с промотором; (ii) культивирование клетки-хозяина (например, СНО или Pichia или Pichia pastoris) в условиях, благоприятных для экспрессии полинуклеотида, и (iii) необязательно выделение антигенсвязывающего белка (например, антитела или фрагмента) или цепи из клетки-хозяина и/или среды, в которой выращивается клетка-хозяин. При создании антигенсвязывающего белка (например, антитела или антигенсвязывающего фрагмента), содержащего более одной иммуноглобулиновой цепи, например, антитела, которое содержит две тяжелые иммуноглобулиновые цепи и две легкие иммуноглобулиные цепи, коэкспрессия цепей в одной клетке-хозяине приводит к ассоциации цепей, например, в клетке или на поверхности клетки или вне клетки, если такие цепи секретируются таким образом, чтобы образовать антигенсвязывающий белок (например, антитело или антигенсвязывающий фрагмент). Способы по данному изобретению включают в себя таковые, в которых в клетке экспрессируется только тяжелая цепь иммуноглобулина или только легкая цепь иммуноглобулина (например, любая из обсуждаемых в данном документе, в том числе зрелые фрагменты и/или их вариабельные домены). Такие одиночные цепи пригодны, например, в качестве посредников при экспрессии антитела или антигенсвязывающего фрагмента, который содержит такую цепь. Например, данное изобретение также включает анти-PfRH5 антигенсвязывающие белки, такие как антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие иммуноглобулин тяжелой цепи (или его вариабельный домен или содержащие

- 12 043756 его CDR), кодируемый полинуклеотидом, содержащим нуклеотидные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 233, 241, 249, 257, 265, 273, 281, 289, 297, 313, 321, 329, 337, 345 или 353, и иммуноглобулин легкой цепи (или его вариабельный домен или содержащие его CDR), кодируемый нуклеотидной последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217 или 305, которые являются продуктом таких способов получения, и необязательно, способов очистки, изложенных в данном документе. Например, в варианте осуществления данного изобретения продукт способа представляет собой анти-PfRH5 антигенсвязывающий белок, который представляет собой антитело или фрагмент, содержащий VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 234, 242, 250, 258, 266, 274, 282, 290, 298, 314, 322, 330, 338, 346 или 354, и Vl, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218 или 306.

В варианте осуществления данного изобретения способ создания анти-PfRH5 антигенсвязывающего белка, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включает в себя способ очистки антигенсвязывающего белка, например, с помощью колоночной хроматографии, преципитации, и/или фильтрации. Продукт такого способа также составляет часть настоящего изобретения.

Эукариотические и прокариотические клетки-хозяева, в том числе клетки млекопитающих, можно использовать в качестве хозяев для экспрессии анти-PfRH5 антигенсвязывающего белка (например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента). Такие клетки-хозяева хорошо известны в данной области техники, и многие из них доступны из Американской коллекции типовых культур (АТСС). Эти клетки-хозяева включают, среди прочего, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки NSO, SP2, клетки HeLa, клетки почек детенышей хомячка (BHK), клетки почек обезьян (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Hep G2), клетки А549, клетки 3Т3, клетки HEK-293 и ряд других клеточных линий. Клетки-хозяева млекопитающих включают клетки человека, мыши, крысы, собаки, обезьяны, свиньи, козы, крупного рогатого скота, лошади и хомяка. Другие линии клеток, которые можно использовать, представляют собой линии клеток насекомых (например, Spodoptera frugiperda или Trichoplusia ni), клетки амфибий, бактериальные клетки, клетки растений и клетки грибов. Клетки грибов включают в себя клетки дрожжевых и нитчатых грибов, в том числе, например, Pichia, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenulapolymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Physcomitrellapatens и Neurospora crassa. Данное изобретение включает выделенную клетку-хозяина (например, клетку СНО), содержащую антигенсвязывающий белок, такой как Н1Н29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29125Р; Н1Н29127Р; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2; Н1Н29183Р2; Н1Н29187Р2; Н1Н29192Р2; Н1Н29196Р2; Н1Н29198Р2; Н1Н29207Р2; Н1Н29209Р2, Н1Н29214Р2 или Н1Н29215Р2; или один или несколько полинуклеотидов, кодирующих иммуноглобулиновую цепь или его цепи.

Данное изобретение также включает в себя клетку Plasmodium falciparum, которая экспрессирует PfRH5, который связывается антигенсвязывающим белком по данному изобретению, например, Н1Н29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29125Р; Н1Н29127Р; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2; Н1Н29183Р2; Н1Н29187Р2; Н1Н29192Р2; Н1Н29196Р2; Н1Н29198Р2; Н1Н29207Р2; Н1Н29209Р2, Н1Н29214Р2 или Н1Н29215Р2, например, где клетка находится в организме субъекта или находится in vitro.

Термин специфически связывается относится к тем антигенсвязывающим белкам (например, мАт), имеющим аффинность связывания с антигеном, таким как белок PfRH5 (например, PfR.H5ANL.6his), выражаемую в виде K_D, по меньшей мере, около 10^-8 М (например, любую K_D указанную в табл. 5-1 или 5-2 в данном документе), как измеряется в анализе безмаркерной биослойной интерферометрии в реальном времени, например, при 25°С или 37°С, например, с помощью биосенсора Octet® HTX, или с помощью поверхностного плазмонного резонанса, например, BIACORE™, или с помощью ELISA (твердофазного иммуноферментного анализа). Данное изобретение включает в себя антигенсвязывающие белки, которые специфически связываются с белком PfRH5. В варианте осуществления данного изобретения антигенсвязывающий белок имеет К_а, K_d и/или t_1/2, как изложено в табл. 5-1 или 5-2 в данном документе.

Термины антигенсвязывающая часть антитела или антигенсвязывающий фрагмент антитела и т.п., используемые в данном документе, включают в себя любой встречающийся в природе, ферментативно полученный, синтетический или генетически сконструированный полипептид или гликопротеин,

- 13 043756 который специфически связывает антиген с образованием комплекса. Неограничивающие примеры антигенсвязывающих фрагментов включают: (i) Fab-фрагменты; (ii) P(ab')₂-фрагменты; (iii) Fd-фрагменты; (iv) Fv-фрагменты; (v) одноцепочечные молекулы Fv (scFv); (vi) dAb-фрагменты и (vii) пептиды с ограниченной конформационной свободой FR3-CDR3-FR4 (например, содержащие FR3, FR4 и CDR-H3 или CDR-L3, как изложено в данном документе). Другие сконструированные молекулы, такие как доменноспецифичное антитела, однодоменные антитела, доменно-делеционные антитела, химерные антитела, CDR-привитые антитела, диатела, триатела, тетратела, минитела и малые модульные иммунофармацевтические препараты (SMIP) также охватываются выражением антигенсвязывающий фрагмент, как используется в данном документе. В варианте осуществления данного изобретения антигенсвязывающий фрагмент содержит три или более CDR из Н1Н29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29125Р; Н1Н29127Р; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2; Н1Н29183Р2; Н1Н29187Р2; Н1Н29192Р2; Н1Н29196Р2; Н1Н29198Р2; Н1Н29207Р2; Н1Н29209Р2, Н1Н29214Р2; или Н1Н29215Р2 (например, CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3; и/или CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3).

В варианте осуществления антигенсвязывающий фрагмент антитела обычно будет содержать по меньшей мере один вариабельный домен. Вариабельный домен может иметь любой размер или аминокислотный состав и, как правило, будет содержать по меньшей мере одну CDR, которая находится рядом или в рамке с одной или несколькими каркасными последовательностями. В антигенсвязывающих фрагментах, имеющих VH-домен, ассоциированный с VL-доменом, VH- и VL-домены могут располагаться относительно друг друга в любом подходящем взаиморасположении. Например, вариабельная область может быть димерной и содержать V_H - VH-, V_H - V_L- или V_L - V_L-димеры. В качестве альтернативы, антигенсвязывающий фрагмент антитела может содержать мономерный VH- или VL-домен.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент антитела может содержать по меньшей мере один вариабельный домен, ковалентно связанный с по меньшей мере одним константным доменом. Неограничивающие иллюстративные конфигурации вариабельных и константных доменов, которые могут быть обнаружены в антигенсвязывающем фрагменте антитела по данному изобретению, включают: (i) Vh-Ch1; (ii) Vh-Ch2; (iii) Vh-Ch3; (iv) Vh-Ch1-Ch2; (v) Vh-Ch1-Ch2-Ch3; (vi) Vh-Ch2Ch3; (vii) Vh-Cl; (viii) Vl-Ch1; (ix) Vl-Ch2; (x) Vl-Ch3; (xi) Vl-Ch1-Ch2; (xii) Vl-Ch1-Ch2-Ch3; (xiii) VlC_h2-C_h3; и (xiv) V_l-C_l. В любой конфигурации вариабельных и константных доменов, в том числе любой из иллюстративных конфигураций, перечисленных выше, вариабельные и константные домены могут быть или непосредственно связаны друг с другом, или могут быть связаны полной или частичной шарнирной или линкерной областью. Шарнирная область может состоять из по меньшей мере 2 (например, 5, 10, 15, 20, 40, 60 или более) аминокислот, что приводит к гибкой или полугибкой связи между соседними вариабельными и/или константными доменами в одной полипептидной молекуле. Кроме того, антигенсвязывающий фрагмент антитела по данному изобретению может содержать гомодимер или гетеродимер (или другой мультимер) любой из конфигураций вариабельного и константного доменов, перечисленных выше, в нековалентной ассоциации друг с другом и/или с одним или несколькими мономерными VH- или V_L-доменами (например, с помощью дисульфидной (дисульфидных) связи (связей)).

Антигенсвязывающие белки (например, антитела и антигенсвязывающие фрагменты) могут быть моноспецифическими или мультиспецифическими (например, биспецифическими). Мультиспецифические антигенсвязывающие белки обсуждаются в данном документе дополнительно.

В варианте осуществления данного изобретения антигенсвязывающие белки по данному изобретению (например, антитело или фрагмент антитела) могут быть конъюгированы с фрагментом, таким как терапевтический фрагмент (иммуноконъюгат), таким как противомалярийный препарат, второе антиPfRH5 антитело или любой другой терапевтический фрагмент, пригодный для лечения инфекции Plasmodium falciparum (См., например, ниже).

Данное изобретение также относится к комплексу, содержащему анти-PfRH5 антигенсвязывающий белок, например, антитело или антигенсвязывающий фрагмент, обсуждаемый в данном документе, в комплексе с полипептидом PfRH5 или его антигенным фрагментом и/или с вторичным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом (например, детектируемое меченое вторичное антитело), которое специфически связывается с анти-PfRH5 антителом или фрагментом. В варианте осуществления данного изобретения комплекс находится in vitro (например, иммобилизован на твердом субстрате) или находится в организме субъекта. В варианте осуществления данного изобретения PfRH5 иммобилизован на твердом субстрате (например, тест-полоске для хроматографического анализа) или находится на поверхности клетки, такой как Plasmodium falciparum. Иммобилизованные анти-PfRH5 антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые ковалентно связаны с нерастворимым матричным материалом (например, стеклом или полисахаридом, таким как агароза или сефароза, например, их гранулой или другой частицей), также являются частью данного изобретения; при этом необязательно, где иммобилизованное антитело образует комплекс с PfRH5 или его антигенным фрагментом или вторичным антителом или его фрагментом.

Выделенные антигенсвязывающие белки (например, антитела или их антигенсвязывающие фраг

- 14 043756 менты), полипептиды, полинуклеотиды и векторы, по меньшей мере, частично не содержат других биологических молекул из клеток или клеточной культуры, из которых они получены. Такие биологические молекулы включают нуклеиновые кислоты, белки, другие антитела или антигенсвязывающие фрагменты, липиды, углеводы или другой материал, такой как продукты распада клеток и среду для роста. Выделенный антигенсвязывающий белок может, кроме того, по меньшей мере частично не содержать компонентов экспрессионной системы, таких как биологические молекулы из клетки-хозяина или ее среды для роста. Как правило, термин выделенный не предназначен для обозначения полного отсутствия таких биологических молекул или отсутствия воды, буферов или солей, или компонентов фармацевтического состава, который содержит антигенсвязывающие белки (например, антитела или антигенсвязывающие фрагменты).

Данное изобретение включает антигенсвязывающие белки, например, антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с тем же эпитопом, что и антигенсвязывающий белок по данному изобретению (например, НШ29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29125Р; Н1Н29127Р; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2: Н1Н29183Р2: Н1Н29187Р2: Н1Н29192Р2: Н1Н29196Р2: Н1Н29198Р2: Н1Н29207Р2; Н1Н29209Р2, Н1Н29214Р2 или Н1Н29215Р2). Например, данное изобретение включает антигенсвязывающие белки, которые связываются с эпитопом варианта PfRH5 (например, PfRH5ANL.6his), не имеющим аминокислот M1-Y139 и содержащим остатки K140-Q526, но не содержащим K247-L295 и имеющим мутации Т216А и Т299А (необязательно в том числе метку HisX6).

Термин эпитоп относится к антигенной детерминанте (например, на полипептиде PfRH5), которая взаимодействует со специфическим антигенсвязывающим сайтом антигенсвязывающего белка, например, вариабельной областью молекулы антитела, известной как паратоп. Один антиген может иметь более одного эпитопа. Таким образом, разные антитела могут связываться с различными участками антигена и могут иметь разные биологические эффекты. Термин эпитоп может также относиться к сайту на антигене, на который отвечают В- и/или Т-клетки, и/или к участку антигена, который связывается антителом. Эпитопы могут быть определены как структурные или функциональные. Функциональные эпитопы, как правило, представляют собой подмножество структурных эпитопов и имеют те остатки, которые непосредственно способствуют аффинности взаимодействия. Эпитопы также могут быть конформационными, т.е., состоять из нелинейных аминокислот. В определенных вариантах осуществления эпитопы могут включать детерминанты, которые представляют собой химически активные поверхностные группировки молекул, такие как аминокислоты, боковые цепи сахара, фосфорильные группы или сульфонильные группы, и, в некоторых вариантах осуществления, могут иметь конкретные трехмерные структурные характеристики и/или характеристики удельного заряда.

Способы определения эпитопа антигенсвязывающего белка, например, антитела или фрагмента или полипептида, включают сканирующий аланиновый мутационный анализ, анализ пептидов блотом (Reineke (2004) Methods Mol. Biol. 248: 443-63), анализ расщепления пептидов, кристаллографические исследования ЯМР-анализ. Кроме того, могут применяться такие способы, как удаление эпитопа, экстракция эпитопа и химическая модификация антигенов (Tomer (2000) Prot. Sci. 9:487-496). Другим способом, который можно применять для идентификации аминокислот в полипептиде, с которым взаимодействует антигенсвязывающий белок (например, антитело или фрагмент, или полипептид), является водород/дейтериевый обмен, обнаруживаемый с помощью масс-спектрометрии (См., например, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267:252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A).

Данное изобретение включает антигенсвязывающие белки, которые конкурируют за связывание с PfRH5, например, эпитопом варианта PfRH5, как обсуждается в данном документе, с антигенсвязывающим белком по данному изобретению, например, Н1Н29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29125Р; Н1Н29127Р; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2: Н1Н29183Р2: Н1Н29187Р2: Н1Н29192Р2: Н1Н29196Р2: Н1Н29198Р2: Н1Н29207Р2; Н1Н29209Р2, Н1Н29214Р2 или Н1Н29215Р2. Термин конкурирует, используемый в данном документе, относится к антигенсвязывающему белку (например, антителу или его антигенсвязывающему фрагменту), который связывается с антигеном (например, PfRH5 или PfRH5ANL.6his) и подавляет или блокирует связывание другого антигенсвязывающего белка (например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента) с антигеном. Термин также включает конкуренцию между двумя антигенсвязывающими белками, например, антителами в обеих ориентациях, т.е., первым антителом, которое связывает и блокирует связывание второго антитела, и наоборот. В определенных вариантах осуществления первый антигенсвязывающий фрагмент (например, антитело) и второй антигенсвязывающий фрагмент (например, антитело) могут связываться с одним и тем же эпитопом. В качестве альтернативы, первый и второй антигенсвязывающие белки (например, антитела) могут связываться с разными, но, например, перекрывающимися эпитопами, при этом связывание одного из них подавляет или блокирует связывание второго антитела, например, посредством стерического препятствия. Конкуренцию между

- 15 043756 антигенсвязывающими белками (например, антителами) можно измерить способами, известными в данной области техники, например, путем безмаркерной биослойной интерферометрии в реальном времени. В варианте осуществления данного изобретения конкуренция между первым и вторым анти-PfRH5 антигенсвязывающим белком (например, антителом) определяется путем измерения способности иммобилизованного первого анти-PfRH5 антигенсвязывающего белка (например, антитела) (изначально не образующего комплекс с белком PfRH5) связываться с белком PfRH5 или его фрагментом, образующим комплекс со вторым анти-PfRH5 антигенсвязывающим белком (например, антителом). Снижение способности первого анти-PfRH5 антигенсвязывающего белка (например, антитела) связываться с образующим комплекс белком PfRH5 по сравнению с не образующим комплекс белком PfRH5 указывает на то, что первый и второй анти-PfRH5 антигенсвязывающие белки (например, антитела) конкурируют. Степень конкуренции может быть выражена в виде процента уменьшения связывания. Такую конкуренцию можно измерить путем безмаркерной биослойной интерферометрии в реальном времени, например, на биосенсоре Octet RED384 (Pall ForteBio Corp.), посредством ELISA (твердофазного иммуноферментного анализа) или SPR (поверхностного плазмонного резонанса).

Конкуренция за связывание между анти-PfRH5 антигенсвязывающими белками (например, моноклональными антителами (mAb)) может быть определена путем безмаркерной биослойной интерферометрии в реальном времени на биосенсоре Octet RED384 (Pall ForteBio Corp.). Например, чтобы определить конкуренцию между двумя анти-PfRH5 моноклональными антителами, анти-PfRH5 mAb можно сначала захватить на наконечники биосенсора Octet, покрытые анти-hFc антителами (Pall ForteBio Corp., № 18-5060), погрузив кончики в раствор анти-PfRH5 mAb (далее обозначаемого mAb1). В качестве положительного контроля для блокирования наконечники биосенсора, захваченные антителом, затем можно насытить известным блокирующим изотипическим контрольным mAb (впоследствии обозначаемым блокирующее mAb) путем погружения в раствор блокирующего mAb. Для определения того, конкурирует ли mAb2 с mAb1, наконечники биосенсора затем можно погрузить в образующий комплекс раствор полипептида PfRH5 и второго анти-PfRH5 mAb (впоследствии обозначаемого mAb2), которые предварительно инкубировали в течение некоторого время, и можно определить связывание mAb1 с полипептидом PfRH5. Наконечники биосенсора можно промывать в буфере между каждой стадией эксперимента. Реакцию связывания в реальном времени можно контролировать в течение эксперимента, а ответ при связывании можно фиксировать в конце каждой стадии.

В варианте осуществления данного изобретения конкурентный анализ проводят на платформе биосенсора (например, Octet HTX), где одно антитело связывается/образует комплекс с полипептидом PfRH5, который был связан с кончиком сенсора, и затем оценивают связывание второго антитела с PfRH5. Можно оценивать способность второго антитела связываться с предварительно образующим комплекс полипептидом PfRH5, и, если обнаружено снижение связывания (например, по сравнению с PfRH5, не образующим комплекс с первым антителом) или отсутствие связывания второго антитела, то определяют, что первое и второе антитела конкурируют за связывание полипептида PfRH5. В варианте осуществления данного изобретения анализ проводят при 25°С и рН около 7, например 7,4, например, в присутствии буфера (например, HEPES), соли (например, NaCl), EDTA, поверхностно-активного вещества (например, Tween-20) и/или неспецифического белка (например, бычьего сывороточного альбумина). В одном из вариантов данного изобретения связывание с вариантом PfRH5 (например, PfRH5ANL.6his) оценивается в конкурентном анализе, например, где вариант представляет собой PfRH5, не имеющий аминокислот M1-Y139 и содержащий остатки K140-Q526, но не имеющий K247-L295 и имеющий мутации Т216А и Т299А (необязательно в том числе метку HisX6). Метка HisX6 или His₆представляет собой метку, которая содержит НННННН (SEQ ID NO: 365).

В типичном случае антитело или антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению, который модифицирован каким-либо образом, сохраняет способность специфически связываться с PfRH5, например, сохраняет по меньшей мере 10% своей связывающей активности в отношении PfRH5 (по сравнению с исходным антителом), если эта активность выражается на молярной основе. Предпочтительно антитело или антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению сохраняет по меньшей мере 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% или 100% или более аффинности связывания в отношении PfRH5 от исходного антитела. Также предполагается, что антитело или антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению могут содержать консервативные или неконсервативные аминокислотные замены (обозначаемые консервативными вариантами или функционально консервативными вариантами антитела), которые по сути не изменяют его биологическую активность.

Анти-PfRH5 антигенсвязывающие белки по данному изобретению могут содержать варианты иммуноглобулиновых цепей, аминокислотные и нуклеотидные последовательности которых конкретно изложены в данном документе.

Вариант полипептида, такой как иммуноглобулиновая цепь (например, VH, VL, НС или LC Н1Н29О89Р; Н1Н29О94Р; Н1Н291ООР; Н1Н291О4Р; Н1Н291О6Р; Н1Н291О9Р; Н1Б29125Р; Н1Н29127Р; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2; Н1Н29183Р2;

- 16 043756

Н1Н29187Р2; Н1Н29192Р2; Н1Н29196Р2; Н1Н29198Р2; Н1Н29207Р2; Н1Н29209Р2; Н1Н29214Р2; или Н1Н29215Р2) относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере около 70-99,9% (например, 70, 72, 74, 75, 76, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,9%) идентична или аналогична упомянутой аминокислотной последовательности, которая изложена в данном документе (например, SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 234, 242, 250, 258, 266, 274, 282, 290, 298, 314, 322, 330, 338, 346, 354, 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218 или 306); если сравнение выполняется с помощью алгоритма BLAST, в котором параметры алгоритма выбираются так, чтобы получить наибольшее совпадение между соответствующими последовательностями по всей длине соответствующих эталонных последовательностей (например, ожидаемое пороговое значение: 10; размер слова: 3; максимальное совпадение в диапазоне запроса: 0; матрица BLOSUM 62; штрафы за гэпы: наличие 11, продление 1; условная корректировка матрицы композиционных вкладов).

Вариант полинуклеотида относится к полинуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность, которая на по меньшей мере около 70-99,9% (например, 70, 72, 74, 75, 76, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,9%) идентична упомянутой нуклеотидной последовательности, которая изложена в данном документе (например, SEQ ID NO: 1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 233, 241, 249, 257, 265, 273, 281, 289, 297, 313, 321, 329, 337, 345, 353, 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217 или 305); если сравнение выполняется с помощью алгоритма BLAST, в котором параметры алгоритма выбираются так, чтобы получить наибольшее совпадение между соответствующими последовательностями по всей длине соответствующих эталонных последовательностей (например, ожидаемое пороговое значение: 10; размер слова: 28; максимальное совпадение в диапазоне запроса: 0; оценка соответствия/несоответствия: 1, -2; штрафы за разрыв: линейные).

Анти-Р£ЛН5 антигенсвязывающие белки, например, антитела и их антигенсвязывающие фрагменты по данному изобретению, в варианте осуществления данного изобретения содержат вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющую по меньшей мере 70% (например, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%) идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью тяжелой цепи иммуноглобулина, аминокислотная последовательность которой изложена в данном документе, например, в SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 234, 242, 250, 258, 266, 274, 282, 290, 298, 314, 322, 330, 338, 346 или 354; и/или вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, имеющую по меньшей мере 70% (например, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%) идентичность аминокислотной последовательности с легкой цепью иммуноглобулина, аминокислотная последовательность которой изложена в данном документе, например, в SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218 или 306.

Кроме того, анти-PfRH5 антигенсвязывающий белок по данному изобретению может включать полипептид иммуноглобулина варианта, содержащий аминокислотную последовательность, которая изложена в данном документе, за исключением одной или нескольких (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) мутаций, таких как, например, миссенс-мутации (например, консервативные замены), несмысловые мутации, делеции или вставки. Например, данное изобретение включает антигенсвязывающие белки, которые включают вариант легкой цепи иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218 или 306, но имеющий одну или несколько таких мутаций и/или вариант тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 234, 242, 250, 258, 266, 274, 282, 290, 298, 314, 322, 330, 338, 346 или 354, но имеющий одну или несколько таких мутаций. В варианте осуществления данного изобретения анти-PfRH5 антигенсвязывающий белок содержит вариант легкой цепи иммуноглобулина, содержащий CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где одна или несколько (например, 1, 2 или 3) таких CDR имеют одну или несколько таких мутаций (например, консервативные замены) по сравнению с последовательностью, которая конкретно изложена в данном документе, и/или вариант тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где одна или несколько (например, 1 или 2 или 3) таких CDR имеют одну или несколько таких мутаций (например, консервативные замены) по сравнению с последовательностью, которая конкретно изложена в данном документе.

В данном изобретении также представлены анти-PfRH5 антигенсвязывающие белки вариантов, например, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие один или несколько CDR вариантов (например, любую одну или несколько из CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR -H1, CDR-H2 и/или CDR-H3), которые изложены в данном документе, с по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 99,9% идентичностью или сходством последовательности с ними.

Варианты осуществления данного изобретения также включают анти-PfRH5 антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат V_H и V_L вариантов иммуноглобулина; или НС и LC, которые содержат аминокислотную последовательность, имеющую 70% или более (например, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% или 99%) общую идентичность или сходство аминокислотной последовательности с аминокислотными последовательностями, соответствующими V_H, V_L, НС или LC, конкретно изложенные в

- 17 043756 данном документе, однако где CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 таких иммуноглобулинов не являются вариантами и содержат аминокислотные последовательности, изложенные в данном документе. Таким образом, в таких вариантах осуществления CDR в таких антигенсвязывающих белках сами по себе не являются вариантами.

Консервативно модифицированный вариант или консервативная замена относится к варианту, в котором имеется одна или несколько замен аминокислот в полипептиде другими аминокислотами, имеющими аналогичные характеристики (например, заряд, размер боковой цепи, гидрофобность/гидрофильность, конформацию и жесткость остова и т.д.). Такие изменения часто можно выполнить без значительного нарушения биологической активности антитела или фрагмента. Специалисты в данной области техники признают, что, как правило, замены отдельных аминокислот в несущественных областях полипептида существенно не изменяют биологическую активность (см., например, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4^th Ed.)). Кроме того, замены структурно или функционально аналогичных аминокислот с меньшей вероятностью существенно нарушат биологическую активность. Анти-РЖН5 антигенсвязывающие белки по данному изобретению могут содержать иммуноглобулиновые цепи, имеющие аминокислотную последовательность данном документе, но имеющие один или несколько консервативно модифицированных вариантов.

Примеры групп аминокислот, которые имеют боковые цепи с аналогичными химическими свойствами, включают 1) алифатические боковые цепи: глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; 2) алифатически-гидроксильные боковые цепи: серии и треонин; 3) амидсодержащие боковые цепи: аспарагин и глутамин; 4) ароматические боковые цепи: фенилаланин, тирозин и триптофан; 5) основные боковые цепи: лизин, аргинин и гистидин; 6) кислотные боковые цепи: аспартат и глутамат и 7) серосодержащие боковые цепи: цистеин и метионин. Предпочтительными группами консервативных аминокислотных замен являются: валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутамат-аспартат и аспарагин-глутамин. В качестве альтернативы, консервативной заменой является любое изменение, имеющее положительное значение в матрице логарифмического правдоподобия РАМ250, раскрытой в Gonnet et al. (1992) Science 256:1443 45.

В варианте осуществления данного изобретения анти-PfRH5 антигенсвязывающий белок по данному изобретению, например, содержащий иммуноглобулиновую цепь, содержащую вариант аминокислотной последовательности, изложенной в данном документе, проявляет одно или несколько из следующих функциональных свойств:

Подавляет in vitro или in vivo рост Plasmodium falciparum в эритроцитах человека, например, при измерении по активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) паразита (например, со скоростью от около 51 до около 69% или до 100% включительно (например, когда анти-PfRH5 антигенсвязывающий белок инкубируют с клетками в течение 96 часов (по сравнению с неинфицированными эритроцитами), например, когда антигенсвязывающий белок представляет собой Н1Н29100Р, Н1Н29104Р, Н1Н29127Р, Н1Н29143Р или любую их комбинацию из двух таких белков (см., например, табл. 2-1).

Подавляет рост in vitro или in vivo штамма 3D7 или 7G8 Plasmodium falciparum в эритроцитах человека, например, при измерении с помощью активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) паразита ЛДГ, например, в присутствии хлорохинфосфата (CQ) (например, в концентрации около 4,81 нМ или 6,58 нМ), например, со скоростью от около 34 до 61% в отсутствие CQ, от около 32 до 51% в присутствии 4,81 нМ CQ или от около 20 до 75% в присутствии 6,58 нМ CQ.

Связывается с полипептидом PfRH5 или его антигенным фрагментом, например, PfRH5ANL.6his, с KD от около 4,72 пМ до около 1,67 нМ при 25°С и/или от около 1,10 пМ до около 1,10 нМ при 37°С, например, как изложено в табл. 5-1 и 5-2 в данном документе.

Подавляет рост in vitro или in vivo штамма D10, Dd2, 7G8, W2-mef, 3D7, HB3, FCR-1/FVO, Cam3.II или RF7 Plasmodium falciparum в эритроцитах человека, например, при измерении с помощью активности лактатдегидрогеназы паразита (ЛДГ), например, в концентрации около 666,67 нМ со скоростью, изложенной в табл. 4-2, по сравнению с неинфицированными эритроцитами.

Блокирует связывание полипептида PfRH5 (например, PfRH5ANL.6his, например, в концентрации около 0,5 нМ или 2,0 нМ) с полипептидом базигином (например, на около 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или 100%), например, связывание PfRH5 с базигином, который связан с твердым матриксом (например, планшетом для ELISA), в котором анти-PfRH5 антигенсвязывающий белок присутствует в количестве около 100 нМ. Например, при этом базигин представлен аминокислотами Thr25-His205, например, экспрессируемыми с помощью С-концевого линкера, DIEGRMD (SEQ ID NO: 363), за которым следует часть IgG1 человека (Pro100-Lys330) и 6Х гистидиновая метка.

Связывается с тем же самым эпитопом, что и Н1Н29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29125Р; Н1Н29127Р; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2; Н1Н29183Р2; Н1Н29187Р2; Н1Н29192Р2; Н1Н29196Р2; Н1Н29198Р2; Н1Н29207Р2; Н1Н29209Р2; Н1Н29214Р2; или Н1Н29215Р2, например, связывается с PfRH5, не имеющим аминоконцевых остатков M1-Y139 и содержащим остатки K140-Q526, но не имеющим K247-L295 и

- 18 043756 имеющим мутации Т216А и Т299А (PfRH5ANL.6his), например, дополнительно включающие Сконцевую гексагистидиновую метку, например, при измерении поверхностного плазмонного резонанса.

Конкурирует с Н1Н29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29125Р; Н1Н29127Р; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2; Н1Н29183Р2; Н1Н29187Р2; Н1Н29192Р2; Н1Н29196Р2; Н1Н29198Р2; Н1Н29207Р2; Н1Н29209Р2, Н1Н29214Р2; или Н1Н29215Р2 за связывание с полипептидом PfRH5, например, PfRH5ANL.6his.

Данное изобретение включает отличного от человека примата (NHP) (например, обезьяну, такую как обезьяна Aotus), организм которого содержит анти-PfRH5 антигенсвязывающий белок (например, антитело или антигенсвязывающий фрагмент), такой как Н1Н29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29125Р; Н1Н29127Р; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2; Н1Н29183Р2; Н1Н29187Р2; Н1Н29192Р2; Н1Н29196Р2; Н1Н29198Р2; Н1Н29207Р2; Н1Н29209Р2; Н1Н29214Р2; или Н1Н29215Р2. Например, отличному от человека примату может быть введен антигенсвязывающий белок, или он может быть сконструирован для экспрессии этого белка. В варианте осуществления данного изобретения отличным от человека приматом является Aotus nancymaae. В варианте осуществления данного изобретения отличный от человека примат (например, обезьяна), инфицирован Plasmodium falciparum (например, штаммом 3D7).

Данное изобретение включает нейтрализующие или антагонистические анти-PfRH5 антигенсвязывающие белки, например, антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые включают молекулы, которые подавляют активность PfRH5 до любой определяемой степени. Например, нейтрализующий анти-PfRH5 антигенсвязывающий белок может подавлять рост Plasmodium falciparum и/или блокировать связывание PfRH5/BSG.

Н1Н29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29125Р; Н1Н29127Р; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2;

Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2; Н1Н29183Р2; Н1Н29187Р2; Н1Н29192Р2; Н1Н29196Р2;

Н1Н29198Р2; Н1Н29207Р2; Н1Н29209Р2; Н1Н29214Р2; или Н1Н29215Р2 относятся к антигенсвязывающим белкам, например, антителам и их антигенсвязывающим фрагментам (в том числе мультиспецифическим антигенсвязывающим белкам), содержащим вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина (VH; или ее вариант) и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина (VL; или ее вариант), которые изложены в данном документе в табл. 1-1; или которые содержат V_H; которая содержит их CDR (CDR-H1 (или ее вариант), CDR-H2 (или ее вариант) и CDR-H3 (или ее вариант)) и/или V_L;которая содержит их CDR (CDR-L1 (или ее вариант), CDR-L2 (или ее вариант) и CDR-L3 (или ее вариант)), например, где вариабельные области и/или CDR иммуноглобулиновых цепей содержат конкретные аминокислотные последовательности, описанные ниже. В варианте осуществления данного изобретения VH связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина (например, IgG, такого как IgG1 или IgG4) и/или VL связана с константной областью легкой цепи иммуноглобулина (например, каппа или лямбда).

Антитела и антигенсвязывающие фрагменты по данному изобретению содержат иммуноглобулиновые цепи, содержащие аминокислотные последовательности, изложенные в данном документе, а также клеточные и посттрансляционные модификации in vitro антитела или фрагмента. Например, данное изобретение включает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с PfRH5, содержащие аминокислотные последовательности тяжелой и/или легкой цепи, изложенные в данном документе (например, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и/или CDR-L3), а также антитела и фрагменты, в которых один или несколько аминокислотных остатков гликозилированы, один или несколько остатков Asn деамидированы, один или несколько остатков (например, Met, Trp и/или His) окислены, N-концевой Gln представляет собой пироглутамат (пироЕ) и/или С-концевой лизин отсутствует.

В данном изобретении представлен сосуд (например, пластиковый или стеклянный флакон, например, с крышкой или хроматографической колонкой, иглой с полым отверстием или цилиндром шприца), содержащий анти-PfRH5 антигенсвязывающий белок по данному изобретению, например, Н1Н29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29125Р; Н1Н29127Р; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2; Н1Н29183Р2; Н1Н29187Р2; Н1Н29192Р2; Н1Н29196Р2; Н1Н29198Р2; Н1Н29207Р2; Н1Н29209Р2; Н1Н29214Р2 или Н1Н29215Р2.

Данное изобретение также относится к инъекционному устройству, содержащему один или несколько антигенсвязывающих белков (например, антитело или антигенсвязывающий фрагмент), которые специфически связываются с PfRH5, например, Н1Н29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29125Р; Н1Н29127Р; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2;

- 19 043756

Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2; Н1Н29183Р2; Н1Н29187Р2; Н1Н29192Р2; Н1Н29196Р2; Н1Н29198Р2; Н1Н29207Р2; Н1Н29209Р2; Н1Н29214Р2; или Н1Н29215Р2, или их фармацевтическую композицию. Инъекционное устройство может быть упаковано в набор. Инъекционное устройство представляет собой устройство, которое вводит вещество в организм субъекта парентеральным путем, например, внутримышечно, подкожно или внутривенно. Например, инъекционное устройство может представлять собой шприц (например, предварительно заполненный фармацевтической композицией, такой как автоинжектор), который, например, включает в себя цилиндр или цилиндр для удержания вводимой жидкости (например, содержащей антитело или его фрагмент, или фармацевтическую композицию), иглу для прокалывания кожи и/или кровеносных сосудов для введения жидкости; и плунжер для выталкивания жидкости из цилиндра через отверстие иглы.

Данное изобретение также относится к способам введения анти-PfRH5 антигенсвязывающего белка по данному изобретению, например, НШ29089Р; НШ29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29125Р; Н1Н29127Р; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2; Н1Н29183Р2; Н1Н29187Р2; Н1Н29192Р2; Н1Н29196Р2; Н1Н29198Р2; Н1Н29207Р2; Н1Н29209Р2; Н1Н29214Р2 или Н1Н29215Р2, субъекту, включающим введение антигенсвязывающего белка в организм субъекта (например, человека), например, парентерально. Например, способ включает прокалывание тела субъекта иглой шприца и введение антигенсвязывающего белка в организм субъекта, например, в вену, артерию, опухоль, мышечную ткань или подкожный слой субъекта.

Получение человеческих антител

Способы получения человеческих антител у трансгенных мышей известны в данной области техники. Любые такие известные способы могут быть использованы в контексте данного изобретения для получения человеческих антител, которые специфически связываются с PfRH5. Иммуноген, содержащий любое из следующего, может быть использован для образования антител, которые специфически связываются с PfRH5. В определенных вариантах осуществления данного изобретения антитела по данному изобретению получают от мышей, иммунизированных полноразмерным нативным PfRH5, или живым аттенуированным или инактивированным вирусом, или ДНК, кодирующей белок или его фрагмент. В качестве альтернативы, белок PfRH5 или его фрагмент могут быть получены с использованием стандартных биохимических методик, модифицированы и использованы в качестве иммуногена. В одном варианте осуществления данного изобретения иммуноген представляет собой рекомбинантно полученный белок PfRH5 или его фрагмент. В определенных вариантах осуществления данного изобретения иммуноген может представлять собой вакцину полипептида PfRH5. В определенных вариантах осуществления можно вводить одну или несколько бустерных инъекций. В определенных вариантах осуществления иммуноген может представлять собой рекомбинантный полипептид PfRH5, экспрессируемый в Е. coli, или в любых других эукариотических клетках или клетках млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомячка (СНО).

С помощью технологии VELOCIMMUNE® (см., например, US 6596541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®) могут быть изначально выделены высокоаффинные химерные антитела к PfRH5, имеющие вариабельные человеческие области и константные мышиные области. Технология VELOCIMMUNE® включает в себя создание трансгенной мыши, имеющей геном, содержащий вариабельные области тяжелой и легкой цепи человека, функционально связанные с локусами эндогенной константной области мыши, так что мышь вырабатывает антитело, содержащее вариабельную область человека и константную область мыши, в ответ на антигенную стимуляцию. ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой и легкой цепей антитела, выделяют и функционально связывают с ДНК, кодирующей человеческие константные области тяжелой и легкой цепи. Затем ДНК экспрессируется в клетке, способной экспрессировать полностью человеческое антитело.

Как правило, мышь VELOCIMMUNE® заражают интересующим антигеном, и лимфатические клетки (такие как В-клетки) выделяют у мышей, которые экспрессируют антитела. Лимфатические клетки могут быть слиты с линией клеток миеломы для получения линий клеток бессмертной гибридомы, и такие линии клеток гибридомы подвергаются скринингу и отбираются для идентификации линий клеток гибридомы, которые продуцируют антитела, специфичные к антигену, представляющему интерес. ДНК, кодирующая вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи, может быть выделена и связана с необходимыми изотипическими константными областями тяжелой цепи и легкой цепи. Такой белок антитела может быть продуцирован в клетке, такой как клетка СНО. В качестве альтернативы, ДНК, кодирующая антигенспецифичное химерное антитело или вариабельные домены легкой и тяжелой цепей, может быть выделена непосредственно из антигенспецифичных лимфоцитов.

Антитела, представляющие интерес, могут быть также выделены из В-клеток мыши. Вкратце, спленоциты собирают у каждой мыши и В-клетки сортируют (как описано, например, в US 2007/0280945A1) путем FACS с использованием антигена, представляющего интерес, в качестве реагента сортировки, который связывает и идентифицирует реактивные антитела (антиген-положительные В-клетки). Различные способы идентификации и сортировки антиген-положительных В-клеток, а также конструирование кас- 20 043756 сет экспрессии генов иммуноглобулина с помощью ПЦР для получения клеток, экспрессирующих рекомбинантные антитела, хорошо известны в данной области техники. См., например, WO 20141460741, патент США № 7884054В2, и Liao, et al. June 2009. High-Throughput Isolation of Immunoglobulin Genes from Single Human В Cells and Expression as Monoclonal Antibodies. J Virol Methods 158(1-2): 171-9.

Изначально выделяли высокоаффинные химерные антитела, имеющие человеческую вариабельную область и мышиную константную область. Антитела характеризуются и отбираются по необходимым характеристикам, в том числе аффинности, селективности, эпитопу и т.д. Мышиные константные области заменяют необходимой человеческой константной областью для образования полностью человеческого антитела по данному изобретению, например, дикого типа или модифицированного IgG1 или IgG4. В то время как выбранная константная область может варьироваться в зависимости от конкретного применения, характеристики высокоаффинной антигенсвязывающей и целевой специфичности находятся в вариабельной области.

AHTu-PfRH5 антитела, содержащие Fc-варианты

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления данного изобретения представлены антиPfRH5 антигенсвязывающие фрагменты, содержащие Fc-домен, содержащий одну или несколько мутаций, которые, например, усиливают или уменьшают связывание антитела с FcRn-рецептором, например, при кислотном рН по сравнению с нейтральным рН. Например, данное изобретение включает антиPfRH5 антитела, содержащие мутацию в С_Н2- или С_Н3-области Fc-домена, где мутация (мутации) увеличивает (увеличивают) аффинность Fc-домена к FcRn в кислой среде (например, в эндосоме, при этом рН находится в диапазоне от около 5,5 до около 6,0). Такие мутации могут приводить к увеличению периода полужизни антитела в сыворотке крови при введении животному. Неограничивающие примеры таких модификаций Fc включают, например, модификацию в положении 250 (например, Е или Q); 250 и 428 (например, L или F); 252 (например, L/Y/F/W или Т), 254 (например, S или Т) и 256 (например, S/R/Q/E/D или Т); или модификацию в положении 428 и/или 433 (например, H/L/R/S/P/Q или K) и/или 434 (например, A, W, H, F или Y [N434A, N434W, N434H, N434F или N434Y]); или модификацию в положении 250 и/или 428; или модификацию в положении 307 или 308 (например, 308F, V308F) и 434. В одном варианте осуществления модификация содержит модификацию 428L (например, M428L) и 434S (например, N434S); модификацию 428L, 259I (например, V259I) и 308F (например, V308F); 43зК (например, Н433К) и 434 (например, 434Y); модификацию 252, 254 и 256 (например, 252Y, 254Т и 256е); модификацию 250Q и 428L (например, T250Q и M428L); и модификацию 307 и/или 308 (например, 308F или 308Р). В еще одном варианте осуществления модификация содержит модификацию 265А (например, D265A) и/или модификацию 297А (например, N297A).

Например, данное изобретение включает анти-PfRH5 антигенсвязывающие белки, например, антитела или антигенсвязывающие фрагменты, содержащие Fc-домен, содержащий одну или несколько пар или групп мутаций, выбранных из группы, состоящей из: 250Q и 248L (например, T250Q и M248L); 252Y, 254Т и 256Е (например, M252Y, S254T и Т256Е); 428L и 434S (например, M428L и N434S); 257I и 311I (например, P257I и Q311I); 257I и 434Н (например, P257I и N434H); 376В и 434Н (например, D376V и N434H); 307А, 380А и 434А (например, Т307А, Е380А и N434A); и 433K и 434F (например, Н433К и N434F).

Анти-PfRH5 антигенсвязывающие белки, например антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат V_H и/или V_L, как изложено в данном документе, содержащие любые возможные комбинации вышеупомянутых мутаций Fc-домена, рассматриваются в объеме данного изобретения.

Данное изобретение также включает анти-PfRH5 антигенсвязывающие белки, антитела или антигенсвязывающие фрагменты, содержащие VH, изложенную в данном документе, и химерную константную область тяжелой цепи (C_H), при этом химерная C_H-область содержит сегменты, полученные из C_Hобластей более чем одного изотипа иммуноглобулина. Например, антитела по данному изобретению могут содержать химерную CH-область, содержащую часть или весь Cн2-домен, полученный из молекулы IgG1 человека, IgG2 человека или IgG4 человека, в сочетании с частью или всем C_H3-доменом, полученным из молекулы IgG1 человека, IgG2 человека или IgG4 человека. В соответствии с определенным вариантами осуществления антитела по данному изобретению содержат химерную C_H-область, имеющую химерную шарнирную область. Например, химерный шарнир может содержать аминокислотную последовательность верхнего шарнира (аминокислотные остатки в положениях с 216 по 227 согласно нумерации EU), полученную из области петли IgG1 человека, IgG2 человека или IgG4 человека, в сочетании с последовательностью нижней петли (аминокислотные остатки в положениях 228-236 согласно нумерации EU), полученной из шарнирной области IgG1 человека, IgG2 человека или IgG4 человека. В соответствии с определенными вариантами осуществления химерная шарнирная область содержит аминокислотные остатки, полученные из верхнего шарнира IgG1 человека или IgG4 человека, и аминокислотные остатки, полученные из нижнего шарнира IgG2 человека. Антитело, содержащее химерную C_H-область, как описано в данном документе, может в некоторых вариантах осуществления проявлять модифицированные эффекторные функции Fc без неблагоприятного воздействия на терапевтические или фармакокинетические свойства антитела. (См., например, WO 2014/022540).

- 21 043756

Мультиспецифические антигенсвязывающие белки

Данное изобретение включает анти-PfRH5 антигенсвязывающие белки, например, антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, а также способы их применения и способы создания таких антигенсвязывающих белков. Термин анти-PfRH5 антигенсвязывающие белки, например, антитела или антигенсвязывающие фрагменты, включает мультиспецифические (например, биспецифические или бипаратопные) молекулы, которые содержат по меньшей мере один первый антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с PfRH5 (например, антиген-связывающий домен из Н1Н29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29125Р; Н1Н29127Р; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2; Н1Н29183Р2; Н1Н29187Р2; Н1Н29192Р2; Н1Н29196Р2; Н1Н29198Р2; Н1Н29207Р2; Н1Н29209Р2; Н1Н29214Р2 или Н1Н29215Р2) и по меньшей мере один второй антигенсвязывающий домен, который связывается с другим антигеном или с эпитопом в PfRH5, который отличается от первого антигенсвязывающего домена (например, CD3, CD16, BSG (базигин), EXP1, MSP1, MSP2, MSPMSP3, MSP4, MSP5, MSP6, MSP7, MSP9, MSP10 GLURP, Sera, RAMA, SEA, AMA1, MTRAP, PTRAMP, ASP, RH1, RH2a, RH2b, RH4, RAP1, RAPH2, RAP3, Rhop, RhopH3, EMA175, EMA140 и/или ЕВА181). В варианте осуществления данного изобретения первый и второй эпитопы перекрываются. В другом варианте осуществления данного изобретения первый и второй эпитопы не перекрываются.

В варианте осуществления данного изобретения мультиспецифический антигенсвязывающий белок связывается с PfRH5 и с антигеном, который вызывает активацию иммунных клеток, таких как цитотоксические Т-клетки, NK-клетки, мононуклеарные фагоциты или нейтрофилы, например, CD3 или CD16.

Н1Н29198Р2; Н1Н29207Р2; Н1Н29214Р2; или Н1Н29215Р2 включает мультиспецифические молекулы, например антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат HCDR и LCDR, V_Hи VL или НС и LC Н1Н29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29125Р; Н1Н29127Р; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2; Н1Н29183Р2; Н1Н29187Р2; Н1Н29192Р2; Н1Н29196Р2; Н1Н29198Р2; Н1Н29207Р2; Н1Н29209Р2; Н1Н29214Р2 или Н1Н29215Р2 соответственно (в том числе их варианты, как изложено в данном документе), и один или несколько антигенсвязывающих доменов, которые связываются с другим эпитопом.

В варианте осуществления данного изобретения антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с PfRH5, который может быть включен в мультиспецифическую молекулу, содержит:

(1) (i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, которая содержит CDR-H1, CDRH2 и CDR-H3 из тяжелой цепи иммуноглобулина, выбранной из: Н1Н29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29125Р; Н1Н29127Р; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2; Н1Н29183Р2; Н1Н29187Р2; Н1Н29192Р2; Н1Н29196Р2; Н1Н29198Р2; Н1Н29207Р2; Н1Н29209Р2; Н1Н29214Р2 и Н1Н29215Р2, и (ii) последовательность вариабельного домена легкой цепи, которая содержит CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 из тяжелой цепи иммуноглобулина, выбранной из: Н1Н29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29125Р; Н1Н29127Р; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2; Н1Н29183Р2; Н1Н29187Р2; Н1Н29192Р2; Н1Н29196Р2; Н1Н29198Р2; Н1Н29207Р2; Н1Н29209Р2; Н1Н29214Р2 и Н1Н29215Р2 соответственно; или (2) (i) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), выбранную из Н1Н29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29125Р; Н1Н29127Р; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2; Н1Н29183Р2; Н1Н29187Р2; Н1Н29192Р2; Н1Н29196Р2; Н1Н29198Р2; Н1Н29207Р2; Н1Н29209Р2; Н1Н29214Р2 и Н1Н29215Р2; и (ii) последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL), выбранную из: Н1Н29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29125Р; Н1Н29127Р; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2; Н1Н29183Р2; Н1Н29187Р2; Н1Н29192Р2; Н1Н29196Р2; Н1Н29198Р2; Н1Н29207Р2; Н1Н29209Р2; Н1Н29214Р2 и Н1Н29215Р2 соответственно;

и один или несколько антигенсвязывающих доменов, которые связываются с другим эпитопом.

В варианте осуществления данного изобретения мультиспецифическое антитело или фрагмент содержит более двух различных специфичностей связывания (например, триспецифическую молекулу), например, один или несколько дополнительных антигенсвязывающих доменов, которые являются таки

- 22 043756 ми же или отличными от первого и/или второго антигенсвязывающего домена.

В одном варианте осуществления данного изобретения биспецифический антигенсвязывающий фрагмент содержит первый scFv (например, содержащий VH и V_L Н1Н29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29125Р; Н1Н29127Р; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2; Н1Н29183Р2; Н1Н29187Р2; Н1Н29192Р2; Н1Н29196Р2; Н1Н29198Р2; Н1Н29207Р2; Н1Н29209Р2; Н1Н29214Р2 и Н1Н29215Р2), имеющий специфичность связывания к первому эпитопу (например, PfRH5), и второй scFv, имеющий специфичность связывания к второму, другому эпитопу. Например, в варианте осуществления данного изобретения первый и второй scFv связаны с линкером, например пептидным линкером (например, линкером GS, таким как (GGGGS)_n (SEQ ID NO: 364), где n составляет, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10). Другие биспецифические антигенсвязывающие фрагменты включают F(ab)₂ биспецифического антитела IgG, который содержит CDR тяжелой и легкой цепей Н1Н29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29125Р; Н1Н29127Р; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2;

Н1Н29183Р2; Н1Н29187Р2; Н1Н29192Р2; Н1Н29196Р2; Н1Н29198Р2; Н1Н29207Р2; Н1Н29209Р2;

Н1Н29214Р2 и Н1Н29215Р2, и другого антитела, которое связывается с другим эпитопом.

Иммуноконъюгаты

Данное изобретение охватывает анти-PfRH5 антигенсвязывающие белки, например антитела или антигенсвязывающие фрагменты, конъюгированные с другим фрагментом, например, терапевтическим фрагментом (иммуноконъюгат), таким как токсоид (например, дифтерийный токсоид или столбнячный токсоид), или противопаразитарным препаратом для лечения инфекции Plasmodium falciparum. В одном варианте данного изобретения анти-PfRH5 антитело или фрагмент конъюгируют с любым из дополнительных терапевтических агентов, изложенных в данном документе. Используемый в данном документе термин иммуноконъюгат относится к антигенсвязывающему белку, например, антителу или антигенсвязывающему фрагменту, который химически или биологически связан с другой молекулой.

Способы лечения

Данное изобретение относится к способам лечения или предупреждения инфекции Plasmodium falciparum (например, малярии) путем введения терапевтически эффективного количества анти-PfRH5 антигенсвязывающего белка, например, антитела или антигенсвязывающего фрагмента (например, Н1Н29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29125Р; Н1Н29127Р; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2; Н1Н29183Р2; Н1Н29187Р2; Н1Н29192Р2; Н1Н29196Р2; Н1Н29198Р2; Н1Н29207Р2; Н1Н29209Р2; Н1Н29214Р2 или Н1Н29215Р2) субъекту (например, человеку), нуждающемуся в таком лечении или предупреждении. Малярия представляет собой заболевание, часто передающееся при укусе инфицированной самки комара (например, комара Anopheles), вызываемое инфицированием хозяина паразитом Plasmodium falciparum. Термин инфекция, вызываемая Plasmodium falciparum относится к инвазии в организм субъекта Plasmodium falciparum и включает малярию.

Эффективная или терапевтически эффективная доза анти-PfRH5 антигенсвязывающего белка, например, антитела или антигенсвязывающего фрагмента (например, Н1Н29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29125Р; Н1Н29127Р; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2; Н1Н29183Р2; Н1Н29187Р2; Н1Н29192Р2; Н1Н29196Р2; Н1Н29198Р2; Н1Н29207Р2; Н1Н29209Р2; Н1Н29214Р2 или Н1Н29215Р2), для лечения или предупреждения инфекции Plasmodium falciparum относится к количеству антитела или фрагмента, достаточному для облегчения одного или нескольких признаков и/или симптомов инфекции у подвергающегося лечению субъекта, как путем индукции регресса или устранения таких признаков и/или симптомов, так путем подавления прогрессирования таких признаков и/или симптомов. Размер дозы может варьироваться в зависимости от возраста и размера субъекта, которому будут производить введение, целевого заболевания, патологических состояний, пути введения и т.п. В варианте осуществления данного изобретения эффективная или терапевтически эффективная доза анти-PfRH5 антигенсвязывающего белка, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по данному изобретению для лечения или предупреждения инфекции Plasmodium falciparum, например, у взрослого субъекта-человека составляет от около 1 до 150 мг/кг. В зависимости от тяжести инфекции, частота и продолжительность лечения могут быть скорректированы. В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий белок по данному изобретению можно вводить в начальной дозе с последующей одной или несколькими вторичными дозами. В определенных вариантах осуществления за начальной дозой может следовать введение второй или множества последующих доз антигенсвязывающего белка в количестве, которое может быть приблизительно таким же или меньшим, чем количество начальной дозы, при этом последующие дозы разделяются не менее чем 1-3 днями; не менее чем одной неделей, не менее чем 2 неделями; не менее чем 3 неделями; не менее чем 4 неделями; не менее чем 5 неделями; не менее чем 6 неделями; не менее

- 23 043756 чем 7 неделями; не менее чем 8 неделями; не менее чем 9 неделями; не менее чем 10 неделями; не менее чем 12 неделями; или по меньшей мере 14 неделями.

Используемый в данном документе термин субъект относится к млекопитающему (например, крысе, мыши, кошке, собаке, корове, овце, лошади, козе, кролику), предпочтительно человеку, например, нуждающемуся в предупреждении и/или лечении инфекции, вызываемой Plasmodium falciparum. Субъект может иметь инфекцию, вызываемую Plasmodium falciparum, или быть предрасположенным к развитию инфекции Plasmodium falciparum, или иметь повышенный риск развития такой инфекции. Субъекты, предрасположенные к развитию инфекции Plasmodium falciparum, или субъекты, которые могут иметь повышенный риск заражения инфекцией Plasmodium falciparum, включают субъектов с ослабленной иммунной системой, например, из-за аутоиммунного заболевания, лиц, получающих иммуносупрессивную терапию, лиц, страдающих синдром иммунодефицита человека (ВИЧ) или синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), с определенными формами анемии, которые истощают или разрушают лейкоциты, лиц, получающие лучевую терапию или химиотерапию, или лиц, страдающих воспалительным заболеванием. Кроме того, могут быть предрасположены субъекты очень молодого или пожилого возраста. Любой человек, вступающий в контакт с комарами или в непосредственной близости от них, особенно в тропиках, Южной Америке, Центральной Америке, Африке, Юго-Восточной Азии и ВосточноСредиземноморском регионе имеет повышенный риск развития инфекции Plasmodium falciparum.

Лечить или лечение означает введение анти-PfRH5 антигенсвязывающего белка, например, антитела или антигенсвязывающего фрагмента по данному изобретению (например, Н1Н29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29125; Н1Н29125; Н1Н29125; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2; Н1Н29183Р2; Н1Н29187Р2; Н1Н29192Р2; Н1Н29196Р2; Н1Н29198Р2; Н1Н29207Р2; Н1Н29209Р2; Н1И29214Р2 или НШ29215Р2), субъекту, имеющему инфекцию Plasmodium falciparum, таким образом, что один или несколько признаков или симптомов инфекции у субъекта уменьшаются или устраняются, например, когда Plasmodium falciparum ослабляется или по сути устраняется (например, полностью устраняется) из организма субъекта.

Признаки и симптомы инфекции Plasmodium falciparum включают анемию; кровавый стул; озноб, жар, потливость; кому; судороги; головную боль; желтуху; боль в мышцах; тошноту и рвоту; увеличение селезенки; желтуху; увеличение печени; учащенное дыхание; Plasmodium falciparum в кровотоке, печени или эритроцитах; анемию; гемолиз; свободный гемоглобин в кровотоке; гемоглобинурию; острую почечную недостаточность; острый респираторный дистресс-синдром (ARDS); низкое кровяное давление; метаболический ацидоз и гипогликемию.

Данное изобретение также включает профилактическое введение анти-PfRH5 антигенсвязывающего белка, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по данному изобретению (например, Н1Н29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29109125; Н1Н29109Р; Н1Н29109Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2; Н1Н29183Р2; Н1Н29187Р2; Н1Н29192Р2; Н1Н29196Р2; Н1Н29198Р2; Н1Н29207Р2; Н1Н29209Р2; Н1И29214Р2 или НШ29215Р2) субъекту, который находится в группе риска (например, предрасположен или подвержен повышенному риску) инфекции Plasmodium falciparum, с тем, чтобы предупредить такую инфекцию. Предупредить или предупреждение означает введение анти-PfRH5 антигенсвязывающего белка, например, антитела или антигенсвязывающего фрагмента по данному изобретению, субъекту, который не инфицирован Plasmodium falciparum, таким образом, что проявление инфекции в организме субъекта подавляется, или уменьшается вероятность или уменьшается тяжесть, если инфекция действительно имеет место.

Комбинации и фармацевтические композиции

Данное изобретение относится к композициям, которые включают анти-PfRH5 антигенсвязывающие белки и один или несколько ингредиентов; а также способы их применения и способы создания таких композиций.

Для получения фармацевтических композиций анти-PfRH5 антигенсвязывающих белков, например, антител и их антигенсвязывающих фрагментов (например, Н1Н29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29125Р; Н1Н129Н129Р; Н1Н129127Р; Н1Н129127; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2; Н1Н29183Р2; Н2Н229Н2; Н1Н2291Р2; Н1Н29183Р2; Н1Н229Н2198; Н1Н29209Р2; Н1Н29214Р2 или Н1Н29215Р2), антигенсвязывающий белок смешивают с фармацевтически приемлемым носителем или эксципиентом. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences и US Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA. (1984); Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y.; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.)

- 24 043756 (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000)

Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y. В варианте осуществления данного изобретения фармацевтическая композиция является стерильной. Такие композиции являются частью данного изобретения.

Фармацевтические композиции по данному изобретению содержат фармацевтически приемлемые носители, разбавители, эксципиенты и/или стабилизаторы, такие как, например, воду, буферные агенты, стабилизирующие агенты, консерванты, изотонификаторы, неионные детергенты, антиоксиданты и/или другие различные добавки.

Объем данного изобретения включает высушенные, например, лиофилизированные композиции, содержащие анти-PfRH5 антигенсвязывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (например, Н1Н29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29109Р; Н1Н29109Р; Н1Н29125Р; Н1Н29127Р; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2; Н1Н29183Р2; Н1Н29187Р2; Н1Н29192Р2; Н1Н29196Р2; Н1Н29198Р2; Н1Н29207Р2; Н1Н29209Р2; Н1Н29214Р2 или НШ29215Р2), или их фармацевтическую композицию, которая содержит фармацевтически приемлемый носитель, но по сути не содержит воды.

В дополнительном варианте осуществления данного изобретения дополнительный терапевтический агент, который вводят субъекту в сочетании с анти-PfRH5 антигенсвязывающим белком, например антителом или его антигенсвязывающим фрагментом (например, Н1Н29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29125Р; Н1Н29127Р; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2; Н1Н29183Р2; Н1Н29187Р2; Н1Н29192Р2; Н1Н29196Р2; Н1Н29198Р2; Н1Н29207Р2; Н1Н29209Р2; Н1Н29214Р2; или Н1Н29215Р2), раскрываемый в данном документе, вводят субъекту в соответствии с Physicians' Desk Reference 2003 (Thomson Healthcare; 57^th edition (Nov. 1, 2002)).

Способ введения антигенсвязывающего белка или его композиции может варьироваться. Пути введения включают пероральный, ректальный, чрезслизистый, кишечный, парентеральный; внутримышечный, подкожный, внутрикожный, интрамедуллярный, интратекальный, прямой внутрижелудочковый, внутривенный, внутрибрюшинный, интраназальный, внутриглазной, ингаляционный, инсуффляционный, местный, кожный, трансдермальный или внутриартериальный.

В данном изобретении представлены способы введения анти-PfRH5 антигенсвязывающего белка, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента (например, Н1Н29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н2912529Р; Н1Н2912529Р; Н1Н2912529Р; Н1Н2912529Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2; НШ229Н2183Р2; НШ229Н2183Р2; НШ229Н2183Р2; Н1Н29209Р2; Н1Н29214Р2 или Н1Н29215Р2) субъекту, включающие введение белка или фармацевтической композиции или их комбинации в организм субъекта. Например, способ включает прокалывание тела субъекта иглой шприца и введение антигенсвязывающего белка или фармацевтической композиции, или их комбинации в организм субъекта, например, в вену, артерию, опухоль, мышечную ткань или подкожный слой субъекта.

В данном изобретении представлен сосуд (например, пластмассовый или стеклянный флакон, например, с крышкой или хроматографической колонкой, иглой с полым отверстием или цилиндром шприца), содержащий любой из анти-PfRH5 антигенсвязывающих белков, например антитела или их антигенсвязывающие фрагменты (например, Н1Н29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29125Р; Н1Н29127Р; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2; Н1Н29183Р2; Н1Н29187Р2; Н1Н29192Р2; Н1Н29196Р2; Н1Н29198Р2; Н1Н29207Р2; Н1Н29209Р2; Н1Н29214Р2 или Н1Н29215Р2) или фармацевтическую композицию, содержащую фармацевтически приемлемый носитель или их комбинацию.

Данное изобретение включает комбинации, включающие анти-PfRH5 антигенсвязывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению (например, Н1Н29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29125Р; Н1Н29127Р; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2; Н1Н29183Р2; Н1Н29187Р2; Н1Н29192Р2; Н1Н29196Р2; Н1Н29198Р2; Н1Н29207Р2; Н1Н29209Р2; Н1Н29214Р2 или Н1Н29215Р2), в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами. Анти-PfRH5 антигенсвязывающий белок и дополнительный терапевтический агент могут находиться в одной композиции или в отдельных композициях. Например, в варианте осуществления данного изобретения дополнительный терапевтический агент представляет собой противопаразитарный или противомалярийный терапевтический агент. В варианте осуществления данного изобретения дополнительный терапевтический агент представляет собой хлорохин, атовакон и/или прогуанил, артеметер и/или люмефантрин, мефлохин, хинин, хинидин, доксициклин (необязательно в комбинации с хинином) и/или клинда

- 25 043756 мицин (необязательно в комбинации с хинином). В варианте осуществления данного изобретения дополнительным терапевтическим агентом является вакцина, такая как противомалярийная вакцина, например, RTS, S/AS01 (находится в продаже в виде Mosquirix). Способы лечения или предупреждения инфекции Plasmodium falciparum у субъекта, нуждающегося в указанном лечении или предупреждении, путем введения Н1Н29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29125Р; Н1Н29127Р; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2;

Н1Н29214Р2 или Н1Н29215Р2 в сочетании с другим терапевтическим агентом являются частью данного изобретения.

Данное изобретение включает комбинацию, включающую два или более (например, 2, 3 или 4) антигенсвязывающих белка по данному изобретению (например, антитело или антигенсвязывающий белок) в сочетании друг с другом. Например, если Н1Н29О89Р представляет собой Ab1; если Н1Н29094Р представляет собой Ab2; если Н1Н29100Р представляет собой Ab1; если Н1Н29104Р представляет собой Ab4; если Н1Н29106Р представляет собой Ab5; если Н1Н29109Р представляет собой Ab6; если Н1Н29125Р представляет собой Ab7; если Н1Н29127Р представляет собой Ab8; если Н1Н29131Р представляет собой Ab9; если Н1Н29134Р представляет собой Ab10; если Н1Н29138Р представляет собой Ab11; если Н1Н29141Р представляет собой Ab12; если Н1Н29143Р представляет собой Ab13; если НШ29146Р2 представляет собой Ab14; если НШ29147Р2 представляет собой Ab15; если Н1Н29149Р2 представляет собой Ab16; если Н1Н29151Р2 представляет собой Ab17; если НШ29163Р2 представляет собой Ab18; если Н1Н29166Р2 представляет собой Ab19; если Н1Н29171Р2 представляет собой Ab20; если Н1Н29179Р2 представляет собой Ab21; если НШ29183Р2 представляет собой Ab22; если НШ29187Р2 представляет собой Ab23; если Н1Н29192Р2 представляет собой Ab24; если Н1Н29196Р2 представляет собой Ab25; если Н1Н29198Р2 представляет собой Ab26; если Н1Н29207Р2 представляет собой Ab27; если Н1Н29214Р2 представляет собой Ab28; если Н1Н29215Р2 представляет собой Ab29 и если Н1Н29209Р представляет собой Ab30, то такие композиции по данному изобретению включают комбинации, включающие следующие антигенсвязывающие белки по данному изобретению (например, антитела и/или антигенсвязывающие белки) в сочетании друг с другом:

- 26 043756

Abi

и

Abi

и

АЬ2 и

АЬЗ

и

АЬЗ

и

АЬ4

и

АЬ5

и

АЬб

и

АЬ7 и

АЬ8

и

Ab2

АЬ22

АЫ5

АЬ9

АЬ29

АЬ24

АЬ20

АЫ7

АЫ5

АЫ4

Abi

и

Abi

и

АЬ2 и

АЬЗ

и

АЬ4

и

АЬ4

и

АЬ5

и

АЬб

и

АЬ7 и

АЬ8

и

Ab3

АЬ23

АЫ6

АМО

АЬ5

АЬ25

АЬ21

АЫ8

АЫ6

АЫ5

Abi

и

Abi

и

АЬ2 и

АЬЗ

и

АЬ4

и

АЬ4

и

АЬ5

и

АЬб

и

АЬ7 и

АЬ8

и

Ab4

АЬ24

АЫ7

АЫ1

АЬб

АЬ26

АЬ22

АЫ9

АЫ7

АЫ6

Abi

и

Abi

и

АЬ2 и

АЬЗ

и

АЬ4

и

АЬ4

и

АЬ5

и

АЬб

и

АЬ7 и

АЬ8

и

Ab5

АЬ25

АЫ8

АЫ2

АЬ7

АЬ27

АЬ23

АЬ20

АЫ8

АЫ7

Abi

и

Abi

и

АЬ2 и

АЬЗ

и

АЬ4

и

АЬ4

и

АЬ5

и

АЬб

и

АЬ7 и

АЬ8

и

Ab6

АЬ26

АЫ9

АЫЗ

АЬ8

АЬ28

АЬ24

АЬ21

АЫ9

АЫ8

Abi

и

Abi

и

АЬ2 и

АЬЗ

и

АЬ4

и

АЬ4

и

АЬ5

и

АЬб

и

АЬ7 и

АЬ8

и

Ab7

АЬ27

АЬ20

АЫ4

АЬ9

АЬ29

АЬ25

АЬ22

АЬ20

АЫ9

Abi

и

Abi

и

АЬ2 и

АЬЗ

и

АЬ4

и

АЬ5

и

АЬ5

и

АЬб

и

АЬ7 и

АЬ8

и

Ab8

АЬ28

АЬ21

АЫ5

АМО

АЬб

АЬ26

АЬ23

АЬ21

АЬ20

Abi

и

Abi

и

АЬ2 и

АЬЗ

и

АЬ4

и

АЬ5

и

АЬ5

и

АЬб

и

АЬ7 и

АЬ8

и

Ab9

АЬ29

АЬ22

АЫ6

АЫ1

АЬ7

АЬ27

АЬ24

АЬ22

АЬ21

Abi

и

АЬ2

и

АЬ2 и

АЬЗ

и

АЬ4

и

АЬ5

и

АЬ5

и

АЬб

и

АЬ7 и

АЬ8

и

AblO

АЬЗ

АЬ23

АЫ7

АЫ2

АЬ8

АЬ28

АЬ25

АЬ23

АЬ22

Abi

и

АЬ2

и

АЬ2 и

АЬЗ

и

АЬ4

и

АЬ5

и

АЬ5

и

АЬб

и

АЬ7 и

АЬ8

и

Abll

АЬ4

АЬ24

АЫ8

АЫЗ

АЬ9

АЬ29

АЬ26

АЬ24

АЬ23

Abi

и

АЬ2

и

АЬ2 и

АЬЗ

и

АЬ4

и

АЬ5

и

АЬб

и

АЬб

и

АЬ7 и

АЬ8

и

Ab 12

АЬ5

АЬ25

АЫ9

АЫ4

АЫО

АЬ7

АЬ27

АЬ25

АЬ24

Abi

и

АЬ2

и

АЬ2 и

АЬЗ

и

АЬ4

и

АЬ5

и

АЬб

и

АЬб

и

АЬ7 и

АЬ8

и

АЫЗ

АЬб

АЬ26

АЬ20

АЫ5

АЫ1

АЬ8

АЬ28

АЬ26

АЬ25

Abi

и

АЬ2

и

АЬ2 и

АЬЗ

и

АЬ4

и

АЬ5

и

АЬб

и

АЬб

и

АЬ7 и

АЬ8

и

Ab 14

АЬ7

АЬ27

АЬ21

АЫ6

АЫ2

АЬ9

АЬ29

АЬ27

АЬ26

Abi

и

АЬ2

и

АЬ2 и

АЬЗ

и

АЬ4

и

АЬ5

и

АЬб

и

АЬ7

и

АЬ7 и

АЬ8

и

АЫ5

АЬ8

АЬ28

АЬ22

АЫ7

АЫЗ

АЫО

АЬ8

АЬ28

АЬ27

Abi

и

АЬ2

и

АЬ2 и

АЬЗ

и

АЬ4

и

АЬ5

и

АЬб

и

АЬ7

и

АЬ7 и

АЬ8

и

АЫ6

АЬ9

АЬ29

АЬ23

АЫ8

АЫ4

АЫ1

АЬ9

АЬ29

АЬ28

Abi

и

АЬ2

и

АЬЗ и

АЬЗ

и

АЬ4

и

АЬ5

и

АЬб

и

АЬ7

и

АЬ8 и

АЬ8

и

АЫ7

АЫО

АЬ4

АЬ24

АЫ9

АЫ5

АЫ2

АЫО

АЬ9

АЬ29

Abi

и

АЬ2

и

АЬЗ и

АЬЗ

и

АЬ4

и

АЬ5

и

АЬб

и

АЬ7

и

АЬ8 и

АЬ9

и

АЫ8

Abll

АЬ5

АЬ25

АЬ20

АЫ6

АЫЗ

АЫ1

АЫО

Abi

и

АЬ2

и

АЬЗ и

АЬЗ

и

АЬ4

и

АЬ5

и

АЬб

и

АЬ7

и

АЬ8 и

АЬ9

и

АЫ9

АЫ2

АЬб

АЬ26

АЬ21

АЫ7

АЫ4

АЫ2

АЫ1

Abi

и

АЬ2

и

АЬЗ и

АЬЗ

и

АЬ4

и

АЬ5

и

АЬб

и

АЬ7

и

АЬ8 и

АЬ9

и

Ab20

АЫЗ

АЬ7

АЬ27

АЬ22

АЫ8

АЫ5

АЫЗ

АЫ2

Abi

и

АЬ2

и

АЬЗ и

АЬЗ

и

АЬ4

и

АЬ5

и

АЬб

и

АЬ7

и

АЬ8 и

АЬ9

и

Ab21

АЫ4

АЬ8

АЬ28

АЬ23

АЫ9

АЫ6

АЫ4

АЫЗ

- 27 043756

АЬ9	и	AblO и	АЫ1 и	АЫ2 и	АЫЗ и	АЫ4 и	АЫ6 и	АЫ8и	АЫ9и	АЬ22 и
Ab 14		АЫ5	АЫ7	АЬ20	АЬ24	АЬ29	АЬ22	АЫ9	АЬ29	АЬ25
Ab9	и	AblO и	АЫ1 и	АЫ2 и	АЫЗ и	АЫ5 и	АЫ6 и	АЫ8и	АЬ20 и	АЬ22 и
АЫ5		АЫ6	АЫ8	АЬ21	АЬ25	АЫ6	АЬ23	АЬ20	АЬ21	АЬ26
Ab9	и	AblO и	АЫ1 и	АЫ2 и	АЫЗ и	АЫ5 и	АЫ6 и	АЫ8 и	АЬ20 и	АЬ22 и
АЫ6		АЫ7	АЫ9	АЬ22	АЬ26	АЫ7	АЬ24	АЬ21	АЬ22	АЬ27
Ab9	и	AblO и	АЫ1 и	АЫ2 и	АЫЗ и	АЫ5 и	АЫ6 и	АЫ8 и	АЬ20 и	АЬ22 и
АЫ7		АЫ8	АЬ20	АЬ23	АЬ27	АЫ8	АЬ25	АЬ22	АЬ23	АЬ28
Ab9	и	AblO и	АЫ1 и	АЫ2 и	АЫЗ и	АЫ5 и	АЫ6 и	АЫ8и	АЬ20 и	АЬ22 и
АЫ8		АЫ9	АЬ21	АЬ24	АЬ28	АЫ9	АЬ26	АЬ23	АЬ24	АЬ29
Ab9	и	AblO и	АЫ1 и	АЫ2 и	АЫЗ и	АЫ5 и	АЫ6 и	АЫ8и	АЬ20 и	АЬ23 и
АЫ9		АЬ20	АЬ22	АЬ25	АЬ29	АЬ20	АЬ27	АЬ24	АЬ25	АЬ24
Ab9	и	AblO и	АЫ1 и	АЫ2 и	АЫ4 и	АЫ5 и	АЫ6 и	АЫ8и	АЬ20 и	АЬ23 и
Ab20		АЬ21	АЬ23	АЬ26	АЫ5	АЬ21	АЬ28	АЬ25	АЬ26	АЬ25
Ab9	и	AblO и	АЫ1 и	АЫ2 и	АЫ4 и	АЫ5 и	АЫби	АЫ8и	АЬ20 и	АЬ23 и
Ab21		АЬ22	АЬ24	АЬ27	АЫ6	АЬ22	АЬ29	АЬ26	АЬ27	АЬ26
Ab9	и	АЬЮ и	АЫ1 и	АЫ2 и	АЫ4 и	АЫ5 и	АЫ7 и	АЫ8и	АЬ20 и	АЬ23 и
Ab22		АЬ23	АЬ25	АЬ28	АЫ7	АЬ23	АЫ8	АЬ27	АЬ28	АЬ27
Ab9	и	АЬЮ и	АЫ1 и	АЫ2 и	АЫ4 и	АЫ5 и	АЫ7 и	АЫ8и	АЬ20 и	АЬ23 и
Ab23		АЬ24	АЬ26	АЬ29	АЫ8	АЬ24	АЫ9	АЬ28	АЬ29	АЬ28
Ab9	и	АЫО и	АЫ1 и	АЫЗ и	АЫ4 и	АЫ5 и	АЫ7 и	АЫ8и	АЬ21 и	АЬ23 и
Ab24		АЬ25	АЬ27	АЫ4	АЫ9	АЬ25	АЬ20	АЬ29	АЬ22	АЬ29
Ab9	и	АЫО и	АЫ1 и	АЫЗ и	АЫ4 и	АЫ5 и	АЫ7 и	АЫ9и	АЬ21 и	АЬ24 и
Ab25		АЬ26	АЬ28	АЫ5	АЬ20	АЬ26	АЬ21	АЬ20	АЬ23	АЬ25
Ab9	и	АЫО и	АЫ1 и	АЫЗ и	АЫ4 и	АЫ5 и	АЫ7 и	АЫ9 и	АЬ21 и	АЬ24 и
Ab26		АЬ27	АЬ29	АЫ6	АЬ21	АЬ27	АЬ22	АЬ21	АЬ24	АЬ26
Ab9	и	АЫО и	АЫ2 и	АЫЗ и	АЫ4 и	АЫ5 и	АЫ7 и	АЫ9 и	АЬ21 и	АЬ24 и
Ab27		АЬ28	АЫЗ	АЫ7	АЬ22	АЬ28	АЬ23	АЬ22	АЬ25	АЬ27
Ab9	и	АЫО и	АЫ2 и	АЫЗ и	АЫ4 и	АЫ5 и	АЫ7 и	АЫ9и	АЬ21 и	АЬ24 и
Ab28		АЬ29	АЫ4	АЫ8	АЬ23	АЬ29	АЬ24	АЬ23	АЬ26	АЬ28
Ab9	и	АЫ1 и	АЫ2 и	АЫЗ и	АЫ4 и	АЫ6 и	АЫ7 и	АЫ9 и	АЬ21 и	АЬ24 и
Ab29		АЫ2	АЫ5	АЫ9	АЬ24	АЫ7	АЬ25	АЬ24	АЬ27	АЬ29
AblO	и	АЫ1 и	АЫ2 и	АЫЗ и	АЫ4 и	АЫ6 и	АЫ7 и	АЫ9 и	АЬ21 и	АЬ25 и
Abll		АЫЗ	АЫ6	АЬ20	АЬ25	АЫ8	АЬ26	АЬ25	АЬ28	АЬ26
AblO и	АЫ1 и	АЫ2и	АЫЗ и	АЫ4и	АЫ6 и	АЫ7 и	АЫ9и	АЬ21 и	АЬ25 и
Ab 12		АЫ4	АЫ7	АЬ21	АЬ26	АЫ9	АЬ27	АЬ26	АЬ29	АЬ27
AblO	и	АЫ1 и	АЫ2 и	АЫЗ и	АЫ4 и	АЫ6 и	АЫ7 и	АЫ9 и	АЬ22 и	АЬ25 и
АЫЗ		АЫ5	АЫ8	АЬ22	АЬ27	АЬ20	АЬ28	АЬ27	АЬ23	АЬ28
AblO и	АЫ1 и	АЫ2 и	АЫЗ и	АЫ4 и	АЫби	АЫ7 и	АЫ9и	АЬ22 и	АЬ25 и
Ab 14		АЫ6	АЫ9	АЬ23	АЬ28	АЬ21	АЬ29	АЬ28	АЬ24	АЬ29

- 28 043756

АЬ26	и	АЫ5	и
АЬ27		АЬЗО
АЬ26	и	АЫ6	и
АЬ28		АЬЗО
АЬ26 и	АЫ7	и
АЬ29		АЬЗО
АЬ27	и	АЫ8	и
АЬ28		АЬЗО
АЬ27	и	АЫ9	и
АЬ29		АЬЗО
АЬ28	и	АЬ20	и
АЬ29		АЬЗО
АЫ	и	АЬ21	и
АЬЗО		АЬЗО
АЬ2	и	АЬ22	и
АЬЗО		АЬЗО
АЬЗ	и	АЬ23	и
АЬЗО		АЬЗО
АЬ4	и	АЬ24	и
АЬЗО		АЬЗО
АЬ5	и	АЬ25	и
АЬЗО		АЬЗО
АЬ6	и	АЬ26	и
АЬЗО		АЬЗО
АЬ7	и	АЬ27	и
АЬЗО		АЬЗО
АЬ8	и	АЬ28	и
АЬЗО		АЬЗО
АЬ9	и	АЬ29	и
АЬЗО		АЬЗО
АЫО	и
АЬЗО
АЫ1	и
АЬЗО
АЫ2	и
АЬЗО
АЫЗ	и
АЬЗО
АЫ4	и
АЬЗО

В одном варианте осуществления данного изобретения композиция содержит два или более неконкурирующих антигенсвязывающих белка. Перекрестная конкуренция между анти-PfRH5 антителами по данному изобретению представлена в обобщенном виде ниже в табл. 6-1.

Термин в сочетании с указывает на то, что компоненты, анти-PfRH5 антигенсвязывающий белок, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению, вместе с другим агентом, таким как хлорохин, могут быть составлены в единую композицию, например, для одновременной доставки или составлены отдельно в две или более композиции (например, набор, включающий каждый компонент). Каждый компонент можно вводить субъекту в другое время по сравнению с тем, когда вводится другой компонент; например, каждое введение можно выполнять не одновременно (например, отдельно или последовательно) с интервалами в течение заданного периода времени. Более того, отдельные компоненты можно вводить субъекту тем же самым или другим путем.

Тестирование и диагностика

Ранняя диагностика малярии способствует получению положительного клинического результата. В данном изобретении представлены способы лечения инфекции Plasmodium falciparum (например, малярии) у субъекта, включающие диагностику инфекции у субъекта и в случае, если у субъекта диагностирована инфекция, введение терапевтически эффективного количества анти-PfRH5 антигенсвязывающего белка, например, антитела или антигенсвязывающего фрагмента, субъекту. См., например, Moody, Rapid Diagnostic Tests for Malaria Parasites, Clinical Microbiology Reviews 15 (1):66-78 (2002).

Инфекцию Plasmodium falciparum можно диагностировать под микроскопом (например, с помощью флуоресцентной микроскопии). Например, Plasmodium falciparum можно идентифицировать, исследуя под микроскопом каплю крови субъекта, например, распространенную в виде мазка крови на предметном стекле микроскопа (например, толстый мазок крови или тонкий мазок крови). Перед исследованием образец можно окрасить (например, красителем Гимза). Данное изобретение включает способы лечения

- 29 043756 инфекции Plasmodium falciparum (как обсуждается в данном документе), при которых инфекция диагностируется микроскопически.

В одном варианте осуществления данного изобретения присутствие Plasmodium falciparum в образце, взятом у субъекта, обнаруживается путем обнаружения лактатдегидрогеназы Plasmodium falciparum. Если ЛДГ обнаруживается в исследуемом образце выше, чем в контрольном образце известного неинфицированного образца, то определяется, что исследуемый образец содержит Plasmodium falciparum. См., например, Miura, H. Zhou, A. Diouf, SE. Moretz, MP. Fay, LH. Miller, LB. Martin, MA. Pierce, RD. Ellis, GED. Mullen, CA. Long. Anti-Apical-Membrane-Antigen-1 antibody is more effective than anti-42-kilodaltonMerozoite-Surface-Protein-1 antibody in inhibiting Plasmodium falciparum growth, as determined by the in vitro growth inhibition assay. Clin Vaccine Immunol. 16, 963-968 (2009). PMID: PMC2708396.

Присутствие нуклеиновых кислот Plasmodium falciparum также может быть обнаружено, например, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обнаружением, например, генов малой субъединицы 18S рРНК и/или циркумспорозоитов (ЦС).

Инфекцию Plasmodium falciparum также можно диагностировать путем обнаружения антигенов паразита в организме субъекта. Например, в одном варианте данного изобретения антиген определяют иммуногенно, например, с помощью экспресс-диагностического теста. См., например, Van der Palen et al. Test characteristics of two rapid antigen detection tests (SD FK50 and SD FK60) for the diagnosis of malaria in returned travelers, Malaria Journal 8:90 (2009); или патент США № 5712170.

Анти-PfRH5 антигенсвязывающие белки, например, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты по данному изобретению (например, Н1Н29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29125Р; Н1Н29127Р; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2; Н1Н29183Р2; Н1Н29187Р2; Н1Н29192Р2; Н1Н29196Р2; Н1Н29198Р2; Н1Н29207Р2; Н1Н29209Р2; Н1Н29214Р2 или НШ29215Р2), можно использовать для обнаружения и/или измерения PfRH5 (например, клетки Plasmodium falciparum, которая содержит белок PfRH5) в образце (например, жидкости организма, такой как кровь). Примеры анализов на PfRH5 могут включать, например, приведение в контакт образца с анти-PfRH5 антигенсвязывающим белком по данному изобретению, где, например, анти-PfRH5 антигенсвязывающий белок помечен детектируемой меткой или репортерной молекулой. Если обнаруживается анти-PfRH5 антигенсвязывающий белок в комплексе с PfRH5, то это указывает на присутствие PfRH5 в образце и/или присутствие Plasmodium falciparum в образце и в организме субъекта.

Например, данное изобретение включает способы обнаружения полипептида PfRH5 или клетки, содержащей такой полипептид (например, Plasmodium falciparum), с использованием иммунохроматографического теста обнаружения антигена. Такие хроматографические тесты основаны на захвате детектируемых меченных антигенсвязывающих белков (например, антител и их антигенсвязывающих фрагментов) с получением видимой полосы на полоске субстрата. В диагностических тестах на малярию Plasmodium falciparum меченый антигенсвязывающий белок сначала связывается с антигеном паразита, PfRH5, и полученный комплекс захватывается на полоске полосой связанного антигенсвязывающего белка, образуя видимую линию (тестовая линия). Контрольная линия дает информацию о целостности конъюгата антитело-метка, однако не подтверждает способность обнаруживать антиген паразита.

В данном изобретении представлена хроматографическая тест-полоска для обнаружения присутствия PfRH5 (например, клетки Plasmodium falciparum) в образце, содержащем субстрат (например, нитроцеллюлозу), которая содержит следующие области, расположенные латерально вдоль субстрата:

(i) место для ввода образца (зона образца);

(ii) прокладку конъюгата, которая содержит первый анти-PfRH5 антигенсвязывающий белок (например, Н1Н29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29125Р; Н1Н29127Р; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2; Н1Н29183Р2; Н1Н29187Р2; Н1Н29192Р2; Н1Н29196Р2; Н1Н29198Р2; Н1Н29207Р2; Н1Н29209Р2; Н1Н29214Р2 или Н1Н29215Р2), который является детектируемым образом меченым, например, красителем, но не иммобилизован на субстрате;

(iii) тестовую линию, содержащую второй анти-PfRH5 антигенсвязывающий белок, который не является детектируемымым образом меченым и не конкурирует в значительной степени с первым антиPfRH5 антигенсвязывающим белком за связывание с PfRH5, но иммобилизован на субстрате; и (iv) контрольную линию, содержащую вторичный антигенсвязывающий белок, иммобилизованный на субстрате, который связывается с первым анти-PfRH5 антигенсвязывающим белком (например, антителом или антигенсвязывающим фрагментом, или белком А).

В варианте осуществления данного изобретения:

(i) после того, как образец, содержащий жидкость, помещен на прокладку для образца, образец (и любой содержащийся в нем полипептид PfRH5) диффундирует за счет капиллярного действия через субстрат на прокладку для конъюгации, затем в тестовую линию, а затем в контрольную линию;

(ii) полипептид PfRH5, который достигает прокладки конъюгата, образует комплекс с детектируе-

- 30 043756 мым образом меченым первым анти-Р1КН5 антигенсвязывающим белком, и комплекс далее диффундирует в тестовую линию, где образуется дополнительный комплекс со вторым анти-PfRH5 антигенсвязывающим белком (образующим тройной комплекс, в котором PfRH5 связан указанными первым и вторым антигенсвязывающими белками и иммобилизован внутри тестовой линии);

(iii) любой избыток первого анти-PfRH5 антигенсвязывающего белка, который не иммобилизуется на тестовой линии, продолжает диффундировать в контрольную линию и связывается со вторичным антигенсвязывающим белком, тем самым становясь иммобилизованным в контрольной линии; и/или (iv) положительный тест, указывающий на присутствие PfRH5 в образце, определяется наличием детектируемой метки в тестовой линии; отрицательный результат теста, указывающий на отсутствие детектируемых уровней PfRH5 в образце, определяется отсутствием детектируемой метки в тестовой линии; а обнаруживаемая метка в контрольной линии указывает, что тестовая система работает правильно.

В варианте осуществления данного изобретения детектируемая метка представляет собой краситель (например, синий индиго), фермент, ферритин, флуоресцентную или окрашенную микрочастицу/гранулу или наночастицу/гранулу или коллоидный металл (например, золото, селеновый краситель (например, в липосомах) или серебро, например, его коллоидную частицу). В варианте осуществления данного изобретения детектируемая метка обнаруживается визуально.

В варианте осуществления данного изобретения субстрат представляет собой нерастворимый материал, способный поддерживать поток жидкости, например, фильтровальную бумагу из стекловолокна; натуральные полимерные материалы, материалы на основе целлюлозы, фильтровальную бумагу, хроматографическую бумагу, нитроцеллюлозу, ацетат целлюлозы, поли(винилхлорид), полиакриламид или сшитый декстран.

В данном изобретении также представлен способ определения того, содержит ли образец (например, биологическая жидкость, такая как, например, кровь) PfRH5 (например, клетку, содержащую PfRH5, такую как Plasmodium falciparum), включающий приведение в контакт зоны образца устройства, основанного на принципе растекания жидкости в радиальном направлении, как изложено в данном документе, с образцом, ожидание капиллярного потока для переноса образца через субстрат к контрольной линии, необязательно ожидание в течение некоторого времени, и наблюдение за тестовой и контрольной линиями, при этом наличие детектируемой метки в тестовой линии указывает на то, что образец содержал PfRH5, а наличие детектируемой метки в контрольной линии указывает на то, что хроматографическая тест-полоска функционирует правильно. Отсутствие детектируемой метки в тестовой линии при наличии детектируемой метки в контрольной линии указывает на отсутствие PfRH5 в образце. В варианте осуществления данного изобретения способ дополнительно включает лечение субъекта, у которого был взят образец, терапевтически эффективным количеством анти-PfRH5 антигенсвязывающего белка (например, антитела или антигенсвязывающего фрагмента), если тест показывает наличие PfRH5 в образце и хроматографическая тест-полоска функционирует правильно.

Примеры

Следующие примеры приведены для того, чтобы предоставить специалистам в данной области техники полное раскрытие и описание того, как разрабатывать и применять способы и композиции по данному изобретению, и не предназначены для ограничения объема того, что изобретатели считают своим изобретением. Были предприняты усилия для обеспечения точности в отношении используемых чисел (например, количества, температуры и т.д.), однако следует учитывать некоторые экспериментальные ошибки и отклонения. Если не указано иное, части представляют собой части по массе, молекулярная масса представляет собой среднюю молекулярную массу, температура приведена в градусах Цельсия, комнатная температура составляет около 25°С, а давление равно атмосферному или близко к нему.

Пример 1. Получение человеческих антител, которые связываются с PfRH5.

Человеческие антитела к RH5 P. falciparum (PfRH5) получали у мышей VELOCIMMUNE®, содержащих ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой и каппа-легкой цепи иммуноглобулина человека. Мышей иммунизировали рекомбинантным белком RH5 (P1RH5ANL). Некоторых мышей иммунизировали рекомбинантным белком PfRH5 (PfRH5®NL.6his) с последующей бустерной вакциной мерозоитов P. falciparum, выделенных из штамма 3D7. Иммунный ответ антитела контролировали с помощью PfRH5-специфического иммунологического анализа. В случае, если необходимого иммунного ответа достигали, спленоциты извлекали и антитела выделяли непосредственно из антиген-позитивных Вклеток мыши без слияния с клетками миеломы, как описано в патенте США № 2007/0280945А1, явным образом включенном в данный документ посредством ссылки в полном объеме. С помощью этого способа получали несколько полностью человеческих анти-PfRH5 антител (т.е., антител, обладающих человеческими вариабельными доменами и человеческими константными доменами); иллюстративные антитела, полученные таким образом, обозначали как Н1Н29089Р; Н1Н29094Р; Н1Н29100Р; Н1Н29104Р; Н1Н29106Р; Н1Н29109Р; Н1Н29125Р; Н1Н29127Р; Н1Н29131Р; Н1Н29134Р; Н1Н29138Р; Н1Н29141Р; Н1Н29143Р; Н1Н29146Р2; Н1Н29147Р2; Н1Н29149Р2; Н1Н29151Р2; Н1Н29163Р2; Н1Н29166Р2; Н1Н29171Р2; Н1Н29179Р2; Н1Н29183Р2; Н1Н29187Р2; Н1Н29192Р2; Н1Н29196Р2; Н1Н29198Р2;

- 31 043756

Н1Н29207Р2; Н1Н29209Р2; Н1Н29214Р2 и Н1Н29215Р2.

Биологические свойства иллюстративных антител, полученных в соответствии со способами этого примера, подробно описаны в разделе Примеры, изложенном ниже. Последовательности иммуноглобулиновых цепей антител изложены ниже.

Таблица 1-1. Последовательности иммуноглобулиных цепей по данному изобретению*

Антитело		V		CDR-H1	CDR-H2	CDR-H3	V_L	CDR-L1	CDR-L2	CDR-L3
№	Название	ДНК	ПЕП	ДНК	ПЕП	ДНК	ПЕП	ДНК	ПЕП	ДНК	ПЕП	ДНК	ПЕП	ДНК	ПЕП	ДНК	ПЕП
1	Н1Н29089Р	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16
2	Н1Н29094Р	17	18	19	20	21	22	23	24	25	26	27	28	29	30	31	32
3	Н1Н29100Р	33	34	35	36	37	38	39	40	41	42	43	44	45	46	47	48
4	Н1Н29104Р	49	50	51	52	53	54	55	56	57	58	59	60	61	62	63	64
5	Н1Н29106Р	65	66	67	68	69	70	71	72	73	74	75	76	77	78	79	80
6	Н1Н29109Р	81	82	83	84	85	86	87	88	89	90	91	92	93	94	95	96
7	Н1Н29125Р	97	98	99	100	101	102	103	104	105	106	107	108	109	110	111	112
8	Н1Н29127Р	113	114	115	116	117	118	119	120	121	122	123	124	125	126	127	128
9	Н1Н29131Р	129	130	131	132	133	134	135	136	137	138	139	140	141	142	143	144
10	Н1Н29134Р	145	146	147	148	149	150	151	152	153	154	155	156	157	158	159	160
11	Н1Н29138Р	161	162	163	164	165	166	167	168	169	170	171	172	173	174	175	176
12	Н1Н29141Р	177	178	179	180	181	182	183	184	185	186	187	188	189	190	191	192
13	Н1Н29143Р	193	194	195	196	197	198	199	200	201	202	203	204	205	206	207	208
14	Н1Н29146Р2	209	210	211	212	213	214	215	216	217	218	219	220	221	222	223	224
15	Н1Н29147Р2	225	226	227	228	229	230	231	232	217	218	219	220	221	222	223	224
16	Н1Н29149Р2	233	234	235	236	237	238	239	240	217	218	219	220	221	222	223	224
17	Н1Н29151Р2	241	242	243	244	245	246	247	248	217	218	219	220	221	222	223	224
18	Н1Н29163Р2	249	250	251	252	253	254	255	256	217	218	219	220	221	222	223	224
19	Н1Н29166Р2	257	258	259	260	261	262	263	264	217	218	219	220	221	222	223	224
20	Н1Н29171Р2	265	266	267	268	269	270	271	272	217	218	219	220	221	222	223	224
21	Н1Н29179Р2	273	274	275	276	277	278	279	280	217	218	219	220	221	222	223	224
22	Н1Н29183Р2	281	282	283	284	285	286	287	288	217	218	219	220	221	222	223	224
23	Н1Н29187Р2	289	290	291	292	293	294	295	296	217	218	219	220	221	222	223	224
24	Н1Н29192Р2	297	298	299	300	301	302	303	304	305	306	307	308	309	310	311	312
25	Н1Н29196Р2	313	314	315	316	317	318	319	320	305	306	307	308	309	310	311	312
26	Н1Н29198Р2	321	322	323	324	325	326	327	328	305	306	307	308	309	310	311	312
27	Н1Н29207Р2	329	330	331	332	333	334	335	336	305	306	307	308	309	310	311	312
28	Н1Н29214Р2	337	338	339	340	341	342	343	344	305	306	307	308	309	310	311	312
29	Н1Н29215Р2	345	346	347	348	349	350	351	352	305	306	307	308	309	310	311	312
30	Н1Н29209Р2	353	354	355	356	357	358	359	360	305	306	307	308	309	310	311	312

Числа, соответствующие VH, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, VL, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, относятся к SEQ ID NO, изложенным в данном документе. ПЕП относится к аминокислотной последовательности; ДНК относится к нуклеотидной последовательности.

Иммуноглобулиновые последовательности и их соответствующие SEQ ID NO, которые представлены в обобщенном виде в табл. 1-1, представлены ниже. Приведенные ниже последовательности также находятся в Перечне последовательностей, который включен в данный документе посредством ссылки.

- 32 043756

SEQ ID NO: 1

GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCT CTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATA

CAGCTTTACCAGTTACTGGATCGTCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGC CTGGAGTGGATGGGGATCATCTATCCTG

GTGACTCTGATACCAGATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTC AGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTAC

CTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGA GACAAGATATAACTGGAACTACGGGGTT

TGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA;

SEQ ID NO: 2

EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIVWVRQMPGKGLEWMGIIYPG DSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAY

LQWS SLKASDTAMYYC ARQDITGTTGFD YWGQGTLVT VS S;

SEQ ID NO: 3

GGA TAC AGO TTT ACC AGT TAC TGG;

SEQ ID NO: 4

GYSFTSYW;

SEQ ID NO: 5

АТС TAT CCT GGT GAC TCT GAT ACC;

SEQ ID NO: 6

I YPGD SDT;

SEQ ID NO: 7

GCG AGA CAA GAT ATA ACT GGA ACT ACG GGG TTT GAC TAC;

SEQ ID NO: 8

ARQDITGTTGFD Y;

SEQ ID NO: 9

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAG AGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCA

GAGCATTAGGAACTATTTGAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCT AAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTT

TGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTT CACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCT

GAAGATTTTGCAACTTATTTCTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCATTCACTTT CGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAA

ACGA;

- 33 043756

SEQ ID NO: 10

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP

EDFATYFCQQSYSTPFTFGPGTKVDIKR;

SEQ ID NO: 11

CAG AGC ATT AGG AAC TAT;

SEQ ID NO: 12

Q SIRN Y;

SEQ ID NO: 13

GCT GCA TCC;

SEQ ID NO: 14

A AS;

SEQ ID NO: 15

CAA CAG AGT TAC AGT ACC CCA TTC ACT;

SEQ ID NO: 16

QQSYSTPFT;

SEQ ID NO: 17

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCC TGCGACTCTCCTGTTCAGGCACTGGATT

CACCTTCAGTAGCTATGCCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGA CTGGAATGGGTGGCACTTATATCATATG

ATGGAAGTAATAAATATTATGGAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCGTCTC CAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTCT

CTGCAAATGAACAGCCTGAAAACTGAGGACACGGCGATATATTACTGTGCGA AAGAGAGGCTTTTTGGAGTGGTCTCTTA

TTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA;

SEQ ID NO: 18

QVQLVESGGDVVQPGRSLRLSCSGTGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVALISY DGSNKYYGDSVKGRFTVSRDNSKNTLS

LQMNSLKTEDTAIYYCAKERLFGVVSYYGMDVWGQGTTVTVSS;

SEQ ID NO: 19

GGA TTC ACC TTC AGT AGC TAT GCC;

SEQ ID NO: 20

GFTFSSYA;

SEQ ID NO: 21

ATA TCA TAT GAT GGA AGT AAT AAA;

SEQ ID NO: 22

I S Y D G S Ν K;

SEQ ID NO: 23

GCG AAA GAG AGG CTT TTT GGA GTG GTC TCT TAT TAC GGT ATG GAC GTC;

- 34 043756

SEQ ID NO: 24

AKERLFGVVSYYGMDV;

SEQ ID NO: 25

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAG AGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCA

GGACATTAATAGGGATCTAAATTGGTATCAGCAGAAATCAGGGAAAGGCCCC AAACTCCTGATCTACGATGCATCCAATT

TGGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAATAGATTTGGGACAGATTT TACTTTCACCATCAGCAGACTGCAGCCT

GAAGATATTGCAACATATTTCTGTCAACAGTATAAAAATCTCCCGTACACTTT TGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAA

ACGA;

SEQ ID NO: 26

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDINRDLNWYQQKSGKGPKLLIYDASNLE TGVPSRFSGNRFGTDFTFTISRLQP

EDIATYFCQQYKNLPYTFGQGTKLEIKR;

SEQ ID NO: 27

CAG GAC ATT AAT AGG GAT;

SEQ ID NO: 28

QDINRD;

SEQ ID NO: 29

GAT GCA TCC;

SEQ ID NO: 30

DAS;

SEQ ID NO: 31

CAA CAG TAT AAA AAT CTC CCG TAC ACT;

SEQ ID NO: 32

QQYKNLPYT;

SEQ ID NO: 33

CAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCC TGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGG

CTCCATCAGCAGTAGTAGTTACTACTGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGG AAGGGCCTGGAGTGGATTGGGATTATCT

ATTATAGTGGGAGCACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCAT TTCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTC

TCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCTGTGTATTACTGTGC GAGACAGGACAGGGAGGCCCTCTTTGA

CTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA;

SEQ ID NO: 34

- 35 043756

QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCT VSGGSIS S S S YYWGWIRQPPGKGLEWIGIIYYS GSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQF

SLKLS S VTAADTAVYYCARQDREALFDYWGQGTL VTVS S;

SEQ ID NO: 35

GGT GGC ТСС АТС AGC AGT AGT AGT ТАС TAC;

SEQ ID NO: 36

GGSISSSSYY;

SEQ ID NO: 37

АТС TAT TAT AGT GGG AGC ACC;

SEQ ID NO: 38

I Y Y S G S T;

SEQ ID NO: 39

GCG AGA CAG GAC AGG GAG GCC СТС TTT GAC TAC;

SEQ ID NO: 40

ARQDREALFDY;

SEQ ID NO: 41

GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAGA AAGTCACCATCACCTGCCGGGCCAGTCA

GCGCATTGGTAGTAGCTTACACTGGTACCAGCAGAAACCAGATCAGTCTCCA AAGCTCCTCATCAAGTATGCTTCCCAGT

CCTTCTCAGGGGTCCCCTCGAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTC ACCCTCACCATCAATAGCCTGGAAGCT

GAAGATGCTGCAACGTATTACTGTCATCAGAGTAGTACTTTACCCACCTTCGG CCAAGGGACACGACTGGAGATTAAACG

A;

SEQ ID NO: 42

EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQRIGSSLHWYQQKPDQSPKLLIKYASQSFS GVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEA

EDAATYYCHQSSTLPTFGQGTRLEIKR;

SEQ ID NO: 43

CAG CGC ATT GGT AGT AGC;

SEQ ID NO: 44

QRIGS S;

SEQ ID NO: 45

TAT GCT TCC;

SEQ ID NO: 46

YAS;

SEQ ID NO: 47

CAT CAG AGT AGT ACT TTA CCC ACC;

SEQ ID NO: 48

- 36 043756

HQSSTLPT;

SEQ ID NO: 49

GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTACAGCCTGGCAGGTCCC TGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATT

CAGGTTTGACGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAAGCTCCAGGGAAGGGC CTGGAATGGGTCTCAGGTATTAATTGGA

ATAGTGGTGGCAAAGGCTATGCGGACTCTGTGCAGGGCCGATTCACCATCTC CAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTTTAT

CTGCAAATGAACAGTCTGAGAACTGAGGACACGGCCTTGTATTATTGTGCAA AAGATAGGGGTATAGCAGCTCGTCTTCT

CTCTCGTGATGCTTTTGATATGTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTT CA;

SEQ ID NO: 50

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFRFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGIN WNSGGKGYADSVQGRFTISRDNAKNSLY

LQMNSLRTEDTALYYCAKDRGIAARLLSRDAFDMWGQGTMVTVSS;

SEQ ID NO: 51

GGA TTC AGG TTT GAC GAT TAT GCC;

SEQ ID NO: 52

GFRFDDYA;

SEQ ID NO: 53

ATT AAT TGG AAT AGT GGT GGC AAA;

SEQ ID NO: 54

IN W N S G G K;

SEQ ID NO: 55

GCA AAA GAT AGG GGT ATA GCA GCT CGT CTT СТС TCT CGT GAT GCT TTT GAT ATG;

SEQ ID NO: 56

AKDRGIAARLLSRDAFDM;

SEQ ID NO: 57

GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAG AGTCACCATCACTTGCTGGGCCAGTCA

GGACGTTAGCAGTTATTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAATCCCCT AAGCTCCTAATCTTTGCTGCATCCACTT

TGCAAGGTGGGATCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATT CACTCTCACAATCAGCAGCCTGCGGCCT

GAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACACCTTAATACTTACCCGTACACTTT TGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAA

ACGA;

SEQ ID NO: 58

- 37 043756

DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCWASQDVSSYLAWYQQKPGKSPKLLIFAASTLQ GGIPSRFSGSGSGTEFTLTISSLRP

EDFATYYCQHLNTYPYTFGQGTKLEIKR;

SEQ ID NO: 59

CAG GAC GTE AGC AGT TAT;

SEQ ID NO: 60

Q D V S S Y;

SEQ ID NO: 61

GCT GCA TCC;

SEQ ID NO: 62

A AS;

SEQ ID NO: 63

CAA САС CTT AAT ACT TAC CCG TAC ACT;

SEQ ID NO: 64

QHLNTYPYT;

SEQ ID NO: 65

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGTCTGGGAGGTCCC TGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTTCATT

CACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGGCAAGGGG CTGGAGTGGGTGGCAGTTATAAGTTATG

ATGGAAGTAATAAATACTATGGAGACTTCGTGAGGGGCCGATTCACCATCTC CAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT

CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTATGTATTATTGTGCGA GAGAAGTTCGTCGCTACTATTATTACGG

TATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA;

SEQ ID NO: 66

QVQLVESGGGVVQSGRSLRLSCAASSFTFSSYGMHWVRQSPGKGLEWVAVISY DGSNKYYGDFVRGRFTISRDNSKNTLY

LQMNSLRAEDTAMYYCAREVRRYYYYGMDVWGQGTTVTVSS;

SEQ ID NO: 67

TCA TTC ACC TTC AGT AGC TAT GGC;

SEQ ID NO: 68

SFTFSSYG;

SEQ ID NO: 69

ATA AGT TAT GAT GGA AGT AAT AAA;

SEQ ID NO: 70

I S Y D G S Ν K;

SEQ ID NO: 71

GCG AGA GAA GTT CGT CGC TAC TAT TAT TAC GGT ATG GAC GTC;

SEQ ID NO: 72

- 38 043756

AREVRRYYYYGMDV;

SEQ ID NO: 73

GGACATTAGTAATTATTTAAATTGGTATCTGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCT AAGCTCCTGATCTCCGATGCATCCAATT

TGGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTT TACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCT

GAAGATATTGCAACATATTACTGTCAACAGTATAATAATCTCCCGCTCACTTT CGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAA

ACGA;

SEQ ID NO: 74

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYLQKPGKAPKLLISDASNLET GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQP

EDIATYYCQQYNNLPLTFGGGTKVEIKR;

SEQ ID NO: 75

CAG GAC ATT AGT AAT TAT;

SEQ ID NO: 76

Q D I S Ν Y;

SEQ ID NO: 77

GAT GCA TCC;

SEQ ID NO: 78

DAS;

SEQ ID NO: 79

CAA CAG TAT AAT AAT CTC CCG CTC ACT;

SEQ ID NO: 80

QQYNNLPLT;

SEQ ID NO: 81

GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCC TGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGATT

CACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGC CTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGA

ATAGTGGTGACATAGACTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATTTC CAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTAT

CTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAA AAGATACCCTCTCAGGGACTGGAACTAC

GTGGTACTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA;

SEQ ID NO: 82

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAVSGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISW NSGDIDYADSVKGRFTISRDNAKNSLY

- 39 043756

LQMNSLRAEDTALYYCAKDTLSGTGTTWYYFDYWGQGTLVTVSS;

SEQ ID NO: 83

GGA TTC ACC TTT GAT GAT TAT GCC;

SEQ ID NO: 84

GFTFDDYA;

SEQ ID NO: 85

ATT AGT TGG AAT AGT GGT GAC ATA;

SEQ ID NO: 86

I S W N S G D I;

SEQ ID NO: 87

GCA AAA GAT ACC CTC TCA GGG ACT GGA ACT ACG TGG TAC TAT TTT GAC TAC;

SEQ ID NO: 88

AKDTLSGTGTTWYYFDY;

SEQ ID NO: 89

GGGTATTAGCAGTTATTTAATCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCT AAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTT

TGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATT CACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCT

GAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGGTGAATAGTTACCCTCTCACTTT

CGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAA

ACGA;

SEQ ID NO: 90

DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCWASQGISSYLIWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQP

EDFATYYCQQVNSYPLTFGGGTKVEIKR;

SEQ ID NO: 91

CAG GGT ATT AGC AGT TAT;

SEQ ID NO: 92

QGISSY;

SEQ ID NO: 93

GCT GCA TCC;

SEQ ID NO: 94

A AS;

SEQ ID NO: 95

CAA CAG GTG AAT AGT TAC CCT CTC ACT;

SEQ ID NO: 96

QQVNSYPLT;

- 40 043756

SEQ ID NO: 97

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCC TGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATT

CACCTTCAGTAGTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGA CTGGAGTGGATGGCAGTTATATCATATG

ATGGAAGTAATAAATATTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTC CAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTTT

CTGCAAATGAACAGCCTGAGACCTGAAGACACGGCTGTATATTACTGTGCGC AAGATGGCAGCTCGGCGATTTACTATTT

CTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA;

SEQ ID NO: 98

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWMAVISY DGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLF

LQMNSLRPEDTAVYYC AQDGS S AIYYF YGMD VWGQGTT VT VS S;

SEQ ID NO: 99

GGA TTC ACC TTC AGT AGT TAT GGC;

SEQ ID NO: 100

GFTFSSYG;

SEQ ID NO: 101

ATA TCA TAT GAT GGA AGT AAT AAA;

SEQ ID NO: 102

I S Y D G S Ν K;

SEQ ID NO: 103

GCG CAA GAT GGC AGC TCG GCG ATT TAC TAT TTC TAC GGT ATG GAC GTC;

SEQ ID NO: 104

AQDGSSAIYYFYGMDV;

SEQ ID NO: 105

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTGTCTGCATCTATAGGAGACA GAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCA

GGACATCAACAATTATTTAGCCTGGTTTCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCT AAGTCCCTGATCTATGCTGCATCCAGTT

TGCAAAGTGGGGTCCCATCAAAGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTT CACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCT

GAAGATTTTGCAACTTATTACTGCCTTCAGTATAATAGTTACCATCCCACTTT TGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAA

ACGA;

SEQ ID NO: 106

DIQMTQSPSSLSASIGDRVTITCRASQDINNYLAWFQQKPGKAPKSLIYAASSLQS GVPSKFSGSGSGTDFTLTISSLQP

EDFATYYCLQYNSYHPTFGQGTKLEIKR;

- 41 043756

SEQ ID NO: 107

CAG GAC АТС AAC AAT TAT;

SEQ ID NO: 108

QDINN Y;

SEQ ID NO: 109

GCT GCA TCC;

SEQ ID NO: 110

A AS;

SEQ ID NO: 111

CTT CAG TAT AAT AGT TAC CAT CCC ACT;

SEQ ID NO: 112

LQ YNS YHPT;

SEQ ID NO: 113

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCC

TGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATT

CACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGG

CTGGAGTGGGTGGCAGCTATATGGTATG

ATGGAAGTAATAAATATTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTC

CAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT

CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTTCTGTGCGA

GAGGGGAACATTACTATGGTTCGGGGCC

GTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA;

SEQ ID NO: 114

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAAIW

YDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLY

LQMNSLRAEDTAVYFCARGEHYYGSGPFDPWGQGTLVTVSS;

SEQ ID NO: 115

GGA TTC ACC TTC AGT AGC TAT GGC;

SEQ ID NO: 116

GFTFSSYG;

SEQ ID NO: 117

ATA TGG TAT GAT GGA AGT AAT AAA;

SEQ ID NO: 118

IW Y D G S Ν K;

SEQ ID NO: 119

GCG AGA GGG GAA CAT TAC TAT GGT TCG GGG CCG TTC GAC CCC;

SEQ ID NO: 120

ARGEHYYGSGPFDP;

SEQ ID NO: 121

- 42 043756

GAGCATTAGCAACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCT AAGCTCCTGATCTTTGCTGCATCCAGTT

TACAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTT CACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCT

GAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTTCCCCGCTCACTTT CGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAA

ACGA;

SEQ ID NO: 122

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQQKPGKAPKLLIFAASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP

EDFATYYCQQSYSSPLTFGGGTKVEIKR;

SEQ ID NO: 123

CAG AGC ATT AGC AAC TAT;

SEQ ID NO: 124

Q S I S Ν Y;

SEQ ID NO: 125

GCT GCA TCC;

SEQ ID NO: 126

A AS;

SEQ ID NO: 127

CAA CAG AGT TAC AGT TCC CCG CTC ACT;

SEQ ID NO: 128

QQSYSSPLT;

SEQ ID NO: 129

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGGCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCC TGTCCCTCACCTGCACTGTCTCAGGTGG

CTCCATCAGCAGTTTTGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCACCCAGGG AAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCT

ATTACAGTGGGAGCATCGACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAATTACCAT ATCAGTCGACACGTCTAAGAACCAGTTC

TCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGC GAGAGAAAGGGACTACGGTGACTACTT

TGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA;

SEQ ID NO: 130

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSFGYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYY SGSIDYNPSLKSRITISVDTSKNQF

SLKLS S VT AADT AVY YC ARERD YGD YFD YWGQGTL VT VS S;

SEQ ID NO: 131

- 43 043756

GGT GGC ТСС АТС AGC AGT TTT GGT TAC TAC;

SEQ ID NO: 132

GGSISSFGYY;

SEQ ID NO: 133

АТС TAT TAC AGT GGG AGC АТС;

SEQ ID NO: 134

I Y Y S G S I;

SEQ ID NO: 135

GCG AGA GAA AGG GAC TAC GGT GAC TAC TTT GAC TAC;

SEQ ID NO: 136

ARERD YGD YFD Y;

SEQ ID NO: 137

GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTCTCTCCAGGGGAAA

GAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCA

GAGTGTTAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCC

AGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCA

GGGCCACTGGTGTCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTT

CACTCTCACCATCAGCAGTTTGCAGTCT

GAGGATTTTGCAGTTTATTCCTGTCAGCAGTATAATAACTGGCCTCTCACTTT

CGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAA

ACGA;

SEQ ID NO: 138

EIVMTQ SPATES VSPGERATLSCRASQ S VS SNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRA

TGVPARFSGSGSGTEFTLTISSLQS

EDFAVYSCQQYNNWPLTFGGGTKVEIKR;

SEQ ID NO: 139

CAG AGT GTT AGC AGC AAC;

SEQ ID NO: 140

Q S V S S N;

SEQ ID NO: 141

GGT GCA TCC;

SEQ ID NO: 142

GAS;

SEQ ID NO: 143

CAG CAG TAT AAT AAC TGG CCT CTC ACT;

SEQ ID NO: 144

QQYNNWPLT;

SEQ ID NO: 145

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCC

TGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATT

- 44 043756

CACCTTCAGTAGCTATGGCATACACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGG CTGGAGTGGGTGGCACTTATATGGTATG

ATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTC CAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT

CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGA GAGATCAGGATTACTATGGTTCGGGGAG

TTCCTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA;

SEQ ID NO: 146

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGIHWVRQAPGKGLEWVALIWY DGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLY

LQMNSLRAEDTAVYYC ARDQD YYGSGS S YGMD VWGQGTTVT VS S;

SEQ ID NO: 147

GGA TTC ACC TTC AGT AGC TAT GGC;

SEQ ID NO: 148

GFTFSSYG;

SEQ ID NO: 149

ATA TGG TAT GAT GGA AGT AAT AAA;

SEQ ID NO: 150

IW Y D G S Ν K;

SEQ ID NO: 151

GCG AGA GAT CAG GAT TAC TAT GGT TCG GGG AGT ТСС TAC GGT ATG GAC GTC;

SEQ ID NO: 152

ARDQDYYGSGSSYGMDV;

SEQ ID NO: 153

GACATCCAGATGACCCAGTCGCCAGCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACA GAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCA

GAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCT AAGCGCCTGATCTATGCTGCATCCAGTT

GAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCTCTCACTTT TGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAA

ACGA;

SEQ ID NO: 154

DIQMTQSPASLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP

EDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKLEIKR;

SEQ ID NO: 155

CAG AGC ATT AGC AGC TAT;

- 45 043756

SEQ ID NO: 156 Q S I S S Y; SEQ ID NO: 157 GCT GCA TCC; SEQ ID NO: 158 A AS; SEQ ID NO: 159 CAA CAG AGT TAC AGT ACC CCT CTC ACT; SEQ ID NO: 160 QQSYSTPLT; SEQ ID NO: 161 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCC

TGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATT

CACCTTCAGTACCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGG

CTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATG

ATGGAACTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTC

CAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT

CTGCAAATGATCAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGA

GAGACCCCTCAGGTGGGGACCACTACTA

TTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA; SEQ ID NO: 162 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIW

YDGTNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLY

	LQMISLRAEDTAVYYCARDPSGGDHYYYYGMDVWGQGTTVTVSS; SEQ ID NO: 163 GGA TTC ACC TTC AGT ACC TAT GGC; SEQ ID NO: 164 GFTFSTYG; SEQ ID NO: 165 ATA TGG TAT GAT GGA ACT AAT AAA; SEQ ID NO: 166 IW YDGTNK; SEQ ID NO: 167 GCG AGA GAC CCC TCA GGT GGG GAC CAC TAC TAT TAC TAC GGT ATG GAC
GTC;	SEQ ID NO: 168 ARDPSGGDHYYYYGMDV; SEQ ID NO: 169 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAG

AATCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCA

- 46 043756

GGACATTAGCAACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCT AACCTCCTGATCTCCGATGCATCCGATT

GAAGATTTTGCAACATATTACTGTCAACAGTATGATAATATACCGATCACCTT CGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAA

ACGA;

SEQ ID NO: 170

DIQMTQSPSSLSASVGDRITITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPNLLISDASDLET GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQP

EDFATYYCQQYDNIPITFGQGTRLEIKR;

SEQ ID NO: 171

CAG GAC ATT AGC AAC TAT;

SEQ ID NO: 172

Q D I S Ν Y;

SEQ ID NO: 173

GAT GCA TCC;

SEQ ID NO: 174

DAS;

SEQ ID NO: 175

CAA CAG TAT GAT AAT ATA CCG АТС ACC;

SEQ ID NO: 176

Q Q Y D ΝIP I T;

SEQ ID NO: 177

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCAGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCC CTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATT

CACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGG CTGGAGTGGGTGACATTTATATCATTTG

ATGAAAGGAATAAATACTATGCAGACTCCGTTAAGGGCCGATTCACCATCTC CAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT

CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTATGTATTACTGTGCGA GCGAAGTCGGGTACAGTTTTGGTCATGA

TGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA;

SEQ ID NO: 178

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVTFISFD ERNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLY

LQMNSLRAEDTAMYYCASEVGYSFGHDAFDIWGQGTMVTVSS;

SEQ ID NO: 179

GGA TTC ACC TTC AGT AGC TAT GGC;

SEQ ID NO: 180

- 47 043756

GFTFSSYG;

SEQ ID NO: 181

ATA TCA TTT GAT GAA AGG AAT AAA;

SEQ ID NO: 182

ISFDERNK;

SEQ ID NO: 183

GCG AGC GAA GTC GGG TAC AGT TTT GGT CAT GAT GCT TTT GAT АТС;

SEQ ID NO: 184

ASEVGYSFGHDAFDI;

SEQ ID NO: 185

GGACATTAGCAACTATTTAAATTGGTATCAGAAGAAACCAGGGAAAGCCCCT AAACTCCTGATCTACGATGCATCCAATT

TGGAAACAGGGGTCCCGTCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTT TACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCT

GAAGATATTGCAACATATTACTGTCAACAGTATGATAATTTCCCGCTCACTTT CGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAA

ACGA;

SEQ ID NO: 186

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQKKPGKAPKLLIYDASNLE TGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQP

EDIATYYCQQYDNFPLTFGGGTKVEIKR;

SEQ ID NO: 187

CAG GAC ATT AGC AAC TAT;

SEQ ID NO: 188

QDISNY;

SEQ ID NO: 189

GAT GCA TCC;

SEQ ID NO: 190

DAS;

SEQ ID NO: 191

CAA CAG TAT GAT AAT TTC CCG CTC ACT;

SEQ ID NO: 192

QQYDNFPLT;

SEQ ID NO: 193

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCC TGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATT

CACCTTTAACAACTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAGGGGG CTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTA

- 48 043756

GTGGTGATAGCACATACTACTCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTC CAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT

CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGA AAGATCAGGGCCTGTATTACTATGGTTC

GGGGAGTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA;

SEQIDNO: 194

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYAMSWVRQAPGRGLEWVSAISG SGDSTYYSDSVKGRFTISRDNSKNTLY

LQMNSLRAEDTAVYYCAKDQGLYYYGSGSFDYWGQGTLVTVSS;

SEQIDNO: 195

GGA TTC ACC TTT AAC AAC TAT GCC;

SEQIDNO: 196

GFTFNNYA;

SEQIDNO: 197

ATT AGT GGT AGT GGT GAT AGC АСА;

SEQIDNO: 198

ISGSGDST;

SEQIDNO: 199

GCG AAA GAT CAG GGC CTG TAT TAC TAT GGT TCG GGG AGT TTT GAC TAC;

SEQIDNO: 200

AKDQGLYYYGSGSFDY;

SEQIDNO: 201

GAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCT AAGCTCCTGATCCAAGCTGCATCCAGTT

TGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATAT CACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCC

GAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCATTCACTTT CGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAA

ACGA;

SEQIDNO: 202

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIQAASSLQS GVPSRFSGSGSGTDITLTISSLQP

EDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIKR;

SEQIDNO: 203

CAG AGC ATT AGC AGC TAT;

SEQIDNO: 204

Q S I S S Y;

SEQIDNO: 205

- 49 043756

GCT GCA ТСС;

SEQ ID NO: 206

A AS;

SEQ ID NO: 207

CAA CAG AGT TAC AGT ACC CCA TTC ACT;

SEQ ID NO: 208

QQSYSTPFT;

SEQ ID NO: 209

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCC TGCAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGGTT

TGCCTTCAGCGACTCTGCTATATACTGGGTCCGCCAGGCTTCCGGGAAAGGG CTGGAGTGGGTTGGCCGCATTAGAAACA

AAGCTAATAGGTTCGCGACAGCATATGGTGCGTCGGTGAAAGGCAGGTTCAG CATACACAGAGATGATTCAAAGAACACG

GCGTATCTACAAATGAACAGCCTGAAAACCGAGGACACGGCCGTGTATTACT GTGCCAGACATGGACACGATACTTTGAC

TGAGGGCTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCC TCA;

SEQ ID NO: 210

EVQLVESGGGLVQPGGSLQLSCAASGFAFSDSAIYWVRQASGKGLEWVGRIRNK ANRFATAYGASVKGRFSIHRDDSKNT

AYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGHDTLTEGYGMDVWGQGTTVTVSS;

SEQ ID NO: 211

GGG TTT GCC TTC AGC GAC TCT GCT;

SEQ ID NO: 212

GFAFSDSA;

SEQ ID NO: 213

ATT AGA AAC AAA GCT AAT AGG TTC GCG АСА;

SEQ ID NO: 214

IRNKANRF AT;

SEQ ID NO: 215

GCC AGA CAT GGA CAC GAT ACT TTG ACT GAG GGC TAC GGT ATG GAC GTC;

SEQ ID NO: 216

ARHGHDTLTEGYGMDV;

Легкая цепь №1 - SEQ ID NO: 217

GAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCT AAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTT

- 50 043756

TGCAAAGTGGGGTCCCGTCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTT CACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCT

GAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCTCCGATCAC CTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGAT

TAAA;

Легкая цепь №1-SEQ ID NO: 218

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP

EDFATYYCQQSYSTPPITFGQGTRLEIK;

SEQ ID NO: 219

CAG AGC ATT AGC AGC TAT;

SEQ ID NO: 220

Q S I S S Y;

SEQ ID NO: 221

GCT GCA TCC;

SEQ ID NO: 222

A AS;

SEQ ID NO: 223

CAA CAG AGT TAC AGT ACC CCT CCG АТС ACC;

SEQ ID NO: 224

QQSYSTPPIT;

SEQ ID NO: 225

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTAAAGAACCCTGGGTCCTCGG TGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGG

CACCTTCAGCAGTTATACTATCAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGG CTTGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTC

TCTATGGAACAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGCCAGAGTCACGATTTC CACGGACGAATCCACGAACACAGCCTAC

ATGGAACTGAGCAACCTGAGATTTGAAGACACGGCCGTGTATTTCTGTGCGA GTACACTGGAACTACGGGCTTTTGATGC

CTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA;

SEQ ID NO: 226

QVQLVQSGAEVKNPGSSVKVSCKASGGTFSSYTINWVRQAPGQGLEWMGGIIPL YGTANYAQKFQARVTISTDESTNTAY

MELSNLRFEDTAVYFCASTLELRAFDAFDIWGQGTMVTVSS;

SEQ ID NO: 227

GGA GGC ACC TTC AGC AGT TAT ACT;

SEQ ID NO: 228

GGTFSSYT;

SEQ ID NO: 229

- 51 043756

АТС АТС ССТ СТС ТАТ GGA АСА GCA;

SEQIDNO: 230

Р L Y G Т А;

SEQIDNO: 231

GCG AGT АСА CTG GAA СТА CGG GCT ТТТ GAT GCC ТТТ GAT АТС;

SEQIDNO: 232

ASTLELRAFDAFDI;

SEQIDNO: 233

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCC TGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGG

CTCCATCAGCAGTGGTGGTTACTACTGGAACTGGATCCGCCAGCACCCAGGG AAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCT

ATTACAGTGGAAGCACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCAT ATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTC

TCCCTGAAGCTGGGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGC GCGAGCTCCTCCTTATAACTGGTTTGA

CTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA;

SEQIDNO: 234

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGGYYWNWIRQHPGKGLEWIGYIYY SGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQF

SLKLGSVTAADTAVYYCARAPPYNWFDYWGQGTLVTVSS;

SEQIDNO: 235

GGT GGC ТСС АТС AGC AGT GGT GGT TAC TAC;

SEQ ID NO: 236

GGSISSGGYY;

SEQIDNO: 237

АТС TAT TAC AGT GGA AGC ACC;

SEQIDNO: 238

IY Y S G S T;

SEQIDNO: 239

GCG CGA GCT ССТ CCT TAT AAC TGG TTT GAC TAC;

SEQIDNO: 240

ARAPP YNWFD Y;

SEQIDNO: 241

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCC TGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATT

CACCTTCAGTGACTACTACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGG CTGGAATGGGTTTCATACATTAGTAATA

GTGGTAATACCCAATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTC CAGGGACAATGCCAAGAACTCCCTGTTT

- 52 043756

CTGCAAATGAACAGCCTGCGAGCCGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTACGA GAGAGGGACTCGAATATAGCAGCTCGGA

GCCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA;

SEQ ID NO: 242

QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMNWVRQAPGKGLEWVSYISN SGNTQYYADSVKGRFTISRDNAKNSLF

LQMNSLRAEDTAVYYCTREGLEYSSSEPFDYWGQGTLVTVSS;

SEQ ID NO: 243

GGA TTC ACC TTC AGT GAC ТАС TAC;

SEQ ID NO: 244

GFTFSDYY;

SEQ ID NO: 245

ATT AGT AAT AGT GGT AAT ACC CAA;

SEQ ID NO: 246

ISNSGNTQ;

SEQ ID NO: 247

ACG AGA GAG GGA CTC GAA TAT AGC AGC TCG GAG CCC TTT GAC TAC;

SEQ ID NO: 248

TREGLEYSSSEPFDY;

SEQ ID NO: 249

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAAGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAG TGAAGGTCTCCTGCAAGACTTCTGGATA

CACCTTCACCGCCTACTACATACACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGG CTTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTA

ACAATGGTGACACAAACTATGCACTGAGGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGAC CAGGGACATGTCCATCAACACAGCCTAC

ATGGAGCTGCGCGGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTATTGTGCGA GAGATGATCTAGCAGCAGCGGGTATCGG

CTGGTTCGACTCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA;

SEQ ID NO: 250

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTAYYIHWVRQAPGQGLEWMGWIN PNNGDTNYALRFQGRVTMTRDMSINTAY

MELRGLRSDDTAVYYCARDDLAAAGIGWFDSWGQGTLVTVSS;

SEQ ID NO: 251

GGA TAC ACC TTC ACC GCC TAC TAC;

SEQ ID NO: 252

GYTFTAYY;

SEQ ID NO: 253

АТС AAC CCT AAC AAT GGT GAC АСА;

SEQ ID NO: 254

- 53 043756

IΝ Ρ Ν N G D Τ;

SEQ ID NO: 255

GCG AGA GAT GAT СТА GCA GCA GCG GGT АТС GGC TGG TTC GAC TCC;

SEQ ID NO: 256

ARDDLAAAGIGWFDS;

SEQ ID NO: 257

GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGCTACAGCCTGGCAGGTCCC TGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATT

CACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGC CTGGAGTGGGTCTCAGGAATTAGTTGGA

ATAGTGAAAGTATAGGCTATGCGGACTCTGTGAGGGGCCGATTCACCATTTC CAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTAT

CTCCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAA AAGCCCCGTATAGTGGGACCTACTTCGA

ATACTTCCGCCACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA;

SEQ ID NO: 258

EVQLVESGGGLLQPGRSLRLSCVASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISW NSESIGYADSVRGRFTISRDNAKNSLY

LQMNSLRAEDTALYYCAKAPYSGTYFEYFRHWGQGTLVTVSS;

SEQ ID NO: 259

GGA TTC ACC TTT GAT GAT TAT GCC;

SEQ ID NO: 260

GFTFDDYA;

SEQ ID NO: 261

ATT AGT TGG AAT AGT GAA AGT ATA;

SEQ ID NO: 262

I S W N S E S I;

SEQ ID NO: 263

GCA AAA GCC CCG TAT AGT GGG ACC TAC TTC GAA TAC TTC CGC CAC;

SEQ ID NO: 264

AKAPYSGTYFEYFRH;

SEQ ID NO: 265

CACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGG CTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATG

CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGA AAGATGACTGGAACTACGACGCCTTTGA

- 54 043756

TATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA;

SEQ ID NO: 266

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISY DGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLY

LQMNSLRAEDTAVYYCAKDDWNYDAFDIWGQGTMVTVSS;

SEQ ID NO: 267

GGA TTC ACC TTC AGT AGC TAT GGC;

SEQ ID NO: 268

GFTFSSYG;

SEQ ID NO: 269

ATA TCA TAT GAT GGA AGT AAT AAA;

SEQ ID NO: 270

I S Y D G S N K;

SEQ ID NO: 271

GCG AAA GAT GAC TGG AAC TAC GAC GCC TTT GAT АТС;

SEQ ID NO: 272

AKDDWNYDAFDI;

SEQ ID NO: 273

CTCCATCAGCAGTAGTGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCACCCAGGG AGGGGCCTGGAGTGGATTGGATACATCT

ATTACAGTGGGAGCACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCAT ATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTC

TCCCTGAAGCTGAACTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGC GAGAGTGGACTATGGTTCGGGGAGTTC

GTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA;

SEQ ID NO: 274

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSSGYYWSWIRQHPGRGLEWIGYIYY SGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQF

SLKLNS VT AADT AVYYC ARVD YGSGS SFD YWGQGTL VT VS S;

SEQ ID NO: 275

GGT GGC ТСС АТС AGC AGT AGT GGT TAC TAC;

SEQ ID NO: 276

GGSISSSGYY;

SEQ ID NO: 277

АТС TAT TAC AGT GGG AGC ACC;

SEQ ID NO: 278

IY Y S G S T;

SEQ ID NO: 279

- 55 043756

GCG AGA GTG GAC TAT GGT TCG GGG AGT TCG TTT GAC TAC;

SEQ ID NO: 280

ARVDYGSGSSFDY;

SEQ ID NO: 281

CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGACCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAG TGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTA

CACCTTTACCAGCTATGGCATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGG CTTGAGTGGCTGGGATGGATCAGCGGTT

TCAATGGTAGAACAGACTATACAGAGAAGCTCCAGGACAGAATCACCATGA CCACAGACAGATCCTCGAGCACAGCCTAC

ATGGAACTGAGGAGCCTGAGATATGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGA GAGATGGACTGGAAAAACTTGGTGACTA

CTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA;

SEQ ID NO: 282

QVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWLGWISG FNGRTDYTEKLQDRITMTTDRSSSTAY

MELRSLRYDDTAVYYCARDGLEKLGDYWGQGTLVTVSS;

SEQ ID NO: 283

GGT TAC ACC TTT ACC AGC TAT GGC;

SEQ ID NO: 284

GYTFTSYG;

SEQ ID NO: 285

АТС AGC GGT TTC AAT GGT AGA АСА;

SEQ ID NO: 286

ISGFNGRT;

SEQ ID NO: 287

GCG AGA GAT GGA CTG GAA AAA CTT GGT GAC TAC;

SEQ ID NO: 288

ARDGLEKLGD Y;

SEQ ID NO: 289

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCGGGGAGGTTCC TGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATT

CACCTTCAGTAACTCTGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGG CTGGAGTGGGTGGCAGGAATATGGCATG

ATGGAAGTTATAAATATTATGTAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTC CAGAGACAATTCTAAGAACACGCTGTTT

CTGCAAATGAACAGCCTGCGAGCCGAGGACACGGCTGTATATTATTGTGCGA GAGATGATTACTATGCTTCGGGGACCAG

CGTGGACGTATGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA;

SEQ ID NO: 290

- 56 043756

QVQLVESGGGVVQPGRFLRLSCAASGFTFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAGIW HDGSYKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLF

LQMNSLRAEDTAVYYCARDDYYASGTSVDVWGQGTTVTVSS;

SEQ ID NO: 291

GGA TTC ACC TTC AGT AAC TCT GGC;

SEQ ID NO: 292

GFTFSNSG;

SEQ ID NO: 293

ATA TGG CAT GAT GGA AGT TAT AAA;

SEQ ID NO: 294

IW H D G S Y K;

SEQ ID NO: 295

GCG AGA GAT GAT TAC TAT GCT TCG GGG ACC AGC GTG GAC GT A;

SEQ ID NO: 296

ARDDYYASGTSVDV;

SEQ ID NO: 297

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAG TGAGGGTCTCCTGCATGGCCTCTGGATA

CACCTTCACCGGCTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGG CTTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTA

ACAGTGGTGGCACAAAATATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGAC CAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTAC

ATGGAGCTGAGCAGACTGAGATCTGACGACACGGCCGTATATTACTGTGCGA GAGAAGAAGTCGACGATTTTTGGAGTGG

TTACCTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA;

SEQ ID NO: 298

QVQLVQSGAEVKKPGASVRVSCMASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWI NPNSGGTKYAQKFQGRVTMTRDTSISTAY

MELSRLRSDDTAVYYCAREEVDDFWSGYLDYWGQGTLVTVSS;

SEQ ID NO: 299

GGA TAC ACC TTC ACC GGC TAC TAT;

SEQ ID NO: 300

GYTFTGYY;

SEQ ID NO: 301

АТС AAC CCT AAC AGT GGT GGC АСА;

SEQ ID NO: 302

INPNSGGT;

SEQ ID NO: 303

GCG AGA GAA GAA GTC GAC GAT TTT TGG AGT GGT TAC CTT GAC TAC;

SEQ ID NO: 304

- 57 043756

AREEVDDFWSGYLDY;

Легкая цепь №2 - SEQ ID NO: 305

GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAA GAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCA

GAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCT CCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCA

GCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGA CTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAG

CCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCTTGGAC GTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAAT

CAAA;

Легкая цепь №2 - SEQ ID NO: 306

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRA TGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLE

PEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK;

SEQ ID NO: 307

CAG AGT GTT AGC AGC AGC TAC;

SEQ ID NO: 308

Q S V S S S Y;

SEQ ID NO: 309

GGT GCA TCC;

SEQ ID NO: 310

GAS;

SEQ ID NO: 311

CAG CAG TAT GGT AGC TCA CCT TGG ACG;

SEQ ID NO: 312

QQYGSSPWT;

SEQ ID NO: 313

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGACTTGGTCCAGCCGGGGGGGTCCC TGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGGTT

CGCCGTCAATGGCGACTATTTTAGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGG CTGGAGTGGATCTCAGTTATTTATAGCA

GTGGTAACACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAG ACACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTT

CAAATGAGCAGCCTAAGACCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAG ACTTCCCTCCAATGTCTGGTGCGGACTA

CTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA;

SEQ ID NO: 314

EVQLVESGGDL VQPGGSLRLSC AASGF AVNGD YF SWVRQ APGKGLEWIS VIYS S GNTYYADSVKGRFTISRHNSKNTLYL

- 58 043756

QMSSLRPEDTAVYYCARDFPPMSGADYWGQGTLVTVSS;

SEQ ID NO: 315

GGG TTC GCC GTC AAT GGC GAC TAT;

SEQ ID NO: 316

GF A VNGD Y;

SEQ ID NO: 317

ATT TAT AGC AGT GGT AAC АСА;

SEQ ID NO: 318

IYSSGNT;

SEQ ID NO: 319

GCG AGA GAC TTC CCT CCA ATG TCT GGT GCG GAC TAC;

SEQ ID NO: 320

ARDFPPMSGADY;

SEQ ID NO: 321

CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAG TGAAGGTCTCCTGCAAGGTTTCCGGATA

CACCCTCACTGAATTGTCCATGCACTGGGTGCGACAGGCTCCTGGAAAAGGG CTTGAATGGATGGGAGGTTTTGATCCTG

AACATGGTAAAATAATCTACGCACAGAAATTCCAGGGCAGAGTCACCATGAC CGAGGACACATCTACAGACACAGCCTAC

ATGGAACTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTGCAA CATTTTATAACTGGAACTCCTACTACTT

CGGTATGGACGTCTGGGGCCACGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA;

SEQ ID NO: 322

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFD PEHGKIIYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAY

MELS SLRSEDTAVYYC ATFYNWNS YYFGMD VWGHGTT VT VS S;

SEQ ID NO: 323

GGA TAC ACC CTC ACT GAA TTG TCC;

SEQ ID NO: 324

GYTLTELS;

SEQ ID NO: 325

TTT GAT CCT GAA CAT GGT AAA ATA;

SEQ ID NO: 326

FDPEHGKI;

SEQ ID NO: 327

GCA АСА TTT TAT AAC TGG AAC TCC TAC TAC TTC GGT ATG GAC GTC;

SEQ ID NO: 328

ATFYNWNSYYFGMDV;

SEQ ID NO: 329

- 59 043756

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCGGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCC CTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATT

CACCTTTAGCAGCTATGCCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGA CTGGAGTGGGTCTCAGCTGTTAGTGGAA

GTGCTGATATCACAAACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTC CAGAGACAATTCCAAACACACGCTGTAT

CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGA AGGATAAAGTGTATAACTGGAACTACGG

GATCTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCC TCA;

SEQ ID NO: 330

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSAVSG SADITNYADSVKGRFTISRDNSKHTLY

LQMNSLRAEDT A VYYC AKDK VYNWNYGIYYGMD VWGQGTT VT VS S;

SEQ ID NO: 331

GGA TTC ACC TTT AGC AGC TAT GCC;

SEQ ID NO: 332

GFTFSSYA;

SEQ ID NO: 333

GTT AGT GGA AGT GCT GAT АТС АСА;

SEQ ID NO: 334

VSGS ADIT;

SEQ ID NO: 335

GCG AAG GAT AAA GTG TAT AAC TGG AAC TAC GGG АТС ТАС ТАС GGT ATG GAC GTC;

SEQ ID NO: 336

AKDKVYNWNYGIYYGMDV;

SEQ ID NO: 337

CTCCATCAGCAGTAGTAGTTACTACTGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGG AAGGGACTAGAGTGGATTGGGAGTATCT

ATTATAGTGGGAGCACCTACTACAATCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCAT ATCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTC

TCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCTGTGTATTACTGTGC GAGACAAGGGAGGTGGGAGCGAGAAAA

CTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA;

SEQ ID NO: 338

QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYS GSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQF

- 60 043756

SLKLS S VTAADTAVYYCARQGRWERENFDYWGQGTLVT VS S;

SEQ ID NO: 339

GGT GGC ТСС АТС AGC AGT AGT AGT TAC TAC;

SEQ ID NO: 340

GGSISSSSYY;

SEQ ID NO: 341

АТС TAT TAT AGT GGG AGC ACC;

SEQ ID NO: 342

I Y Y S G S T;

SEQ ID NO: 343

GCG AGA CAA GGG AGG TGG GAG CGA GAA AAC TTT GAC TAC;

SEQ ID NO: 344

ARQGRWERENFDY;

SEQ ID NO: 345

CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTATTGAAGCCTTCGGAGACCC TGTCCCTCACCTGCGCTGTCTCTGATGA

GTCCTTCAGTGATTACTACTGGACCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGG CTGGAGTGGATTGGGGAAATTACTCATA

GTGGAAGTACCCACTACAACCCGTCCCTCAAGAGCCGAGTCACCCTGTCAGT TGACACGTCCAAGAACCACTTCTCCCTG

AGCCTCAACTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTATTTATTACTGTGCGAGAG GCGGTGACTACGGTGGTTTACTTGACTA

CTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA;

SEQ ID NO: 346

QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVSDESFSDYYWTWIRQPPGKGLEWIGEITHS GSTHYNPSLKSRVTLSVDTSKNHFSL

SLNSVTAADTAIYYCARGGDYGGLLDYWGQGTLVTVSS;

SEQ ID NO: 347

GAT GAG TCC TTC AGT GAT TAC TAC;

SEQ ID NO: 348

DESFSDYY;

SEQ ID NO: 349

ATT ACT CAT AGT GGA AGT ACC;

SEQ ID NO: 350

ITHSGST;

SEQ ID NO: 351

GCG AGA GGC GGT GAC TAC GGT GGT TTA CTT GAC TAC;

SEQ ID NO: 352

ARGGD YGGLLD Y;

SEQ ID NO: 353

- 61 043756

CAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGGAGACCC TGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGG CTCCATCAGCAGTAGGAGTCACTACTGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGG AAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAGTATCT ATTATAGTGGGAGCACCTATTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCAT ATCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTC TCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCTGTGTATTACTGTGC GAGACTTGGCTGGTACGCAGAGGAGGC

TTTTGAAATCTGGGGTCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA;

SEQ ID NO: 354

QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSRSHYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYS GSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQF

SLKLS S VTAADTAVYYCARLGWYAEEAFEIWGQGTMVT VS S;

SEQ ID NO: 355

GGT GGC ТСС АТС AGC AGT AGG AGT CAC TAC;

SEQ ID NO: 356

GGSISSRSHY;

SEQ ID NO: 357

АТС TAT TAT AGT GGG AGC ACC;

SEQ ID NO: 358 I Y Y S G S T; SEQ ID NO: 359 GCG AGA CTT GGC TGG TAC GCA GAG GAG GCT TTT GAA АТС; SEQ ID NO: 360 ARLGW Y AEE AFEI

Пример 2. Анализ подавления роста для оценки способности анти-PfRH5 антител ингибировать инвазию in vitro эритроцитов человека и рост паразитов Р. falciparum.

В этом примере набор из четырех PfRH5-специфических mAb по данному изобретению тестировали отдельно и в комбинации в стандартном анализе подавления роста с одним штаммом Plasmodium falciparum (Dd2).

Экспериментальная процедура

Штамм P.falciparum, Dd2 (BEI Resources) сначала синхронизировали с 5% D-сорбитом в соответствии со стандартными протоколами при гематокрите 3-5% и паразитемии 1-2% за 20-24 ч до начала анализа. Инфицированные эритроциты человека получали при исходной паразитемии 0,4-0,7% и гематокрите 2%. Инфицированные эритроциты объединяли с PfRH5-специфическими или контрольными антителами, начиная с концентрации 666,67 нМ при последовательном разведении 1:5 для каждого антитела или комбинации антител. Все использованные антитела представляли собой IgG1 человека. Паразитов выращивали в течение 40-48 ч до достижения стадии шизонта (один полный жизненный цикл). Рост паразитов останавливали тремя промывками холодным ФСБ. Окончательную паразитемию определяли путем измерения активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) паразита (Miura, H. Zhou, A. Diouf, SE. Moretz, MP. Fay, LH. Miller, LB. Martin, MA. Pierce, RD. Ellis, GED. Mullen, CA. Long. Anti-Apical-MembraneAntigen-1 antibody is more effective than anti-42-kilodalton-Merozoite-Surface-Protein-1 antibody in inhibiting Plasmodium falciparum growth, as determined by the in vitro growth inhibition assay. Clin Vaccine Immunol. 16, 963-968 (2009). PMID: PMC2708396). Процент подавления роста выражается по сравнению с неинфицированными эритроцитами.

Обобщенные результаты и выводы

PfRH5-специфические антитела получали и тестировали in vitro в анализе подавления роста в адаптированном для лаборатории штамме, как описано выше. В табл. 2-1 показан максимальный процент подавления роста для подгруппы PfRH5-специфических антител и комбинаций PfRH5-специфических антител. Индивидуальные антитела и комбинации антител демонстрировали аналогичный процент максимального подавления роста в диапазоне приблизительно 51-69%.

- 62 043756

Таблица 2-1. Обобщенные результаты максимальной ингибирующей активности антител против

PfRH5 в отношении роста штамма Plasmodium falciparum Dd2.*

Максимальное подавление роста (%)

mAb/комбинация mAb	Dd2
H1H29127P+H1H29100P	66,33
H1H29127P+H1H29143P	51,37
H1H29127P+H1H29104P	56,96
H1H29100P+H1H29143P	68,70
H1H29100P+H1H29104P	54,04
H1H29143P+H1H29104P	58,54
H1H29100P	65,73
H1H29104P	54,12
H1H29127P	56,87
H1H29143P	56,00
антитело отрицательного контроля IgGl человека, специфическое к антигену аллергии на кошек - Fei d 1	-0,93

*Максимальное подавление роста антителами против PfRH5 по сравнению с неинфицированными эритроцитами человека. Анализ подавления роста проводили на эритроцитах, инфицированных P. falciparum (зрелый трофозоит или ранний шизонт), при 0,4-0,7% паразитемии. Антитела объединяли с инфицированными эритроцитами.

Паразитов выращивали в течение 40-48 ч (время зависело от штамма паразита) до достижения стадии шизонта. Рост паразитов останавливали тремя промывками холодного PBS. Активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) паразита измеряли непосредственно после промывки. Процент подавления роста выражали по отношению к неинфицированным эритроцитам. Результаты одного типичного анализа подавления роста показаны выше.

Пример 3. Анализ подавления роста для оценки способности анти-PfRH5 антител подавлять инвазию in vitro эритроцитов человека и рост паразитов Р. falciparum в комбинации с хлорохином.

В этом примере подмножество четырех PfRH5-специфических mAb по данному изобретению тестировали отдельно и в комбинации с хлорохином (CQ), широко распространенным противомалярийным лекарственным препаратом, в стандартном анализе подавления роста с двумя лабораторными штаммами. Один штамм паразита Plasmodium falciparum, 3D7, является чувствительным к хлорохину, в то время как штамм 7G8 является устойчивым к этому лекарственному препарату.

Экспериментальная процедура

Каждый штамм P.falciparum (BEI Resources) сначала синхронизировали с 5% D-сорбитом в соответствии со стандартными протоколами при гематокрите 3-5% и паразитемии 1-2% за 20-24 ч до начала анализа. Инфицированные эритроциты человека получали при исходной паразитемии 0,4-0,7% и гематокрите 2%. Инфицированные эритроциты объединяли с PfRH5-специфическими или контрольными антителами, начиная с концентрации 666,67 нМ при последовательном разведении 1:5 для каждого антитела IgG1 и хлорохина в одной из двух концентраций 4,91 или 6,58 нМ. Две концентрации выбирали на основе IC₂₅, 4,91 нМ, и IC₅₀, 6,58 нМ хлорохина с чувствительным штаммом 3D7. Паразитов выращивали в течение 40-48 ч до достижения стадии шизонта (один полный жизненный цикл). Рост паразитов останавливали тремя промывками холодного PBS. Окончательную паразитемию определяли путем измерения активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) паразита. Процент подавления роста выражали по отношению к неинфицированным эритроцитам.

Обобщенные результаты и выводы

В табл. 3-1 показан максимальный процент подавления роста для каждого антитела отдельно и комбинации антитело/хлорохин. Комбинирование хлорохина с PfRH5-специфическими антителами дополнительно увеличивало процент максимального подавления роста, полученного с использованием только антител, в штамме 3D7. Максимальное подавление роста с использованием только антитела составляло приблизительно от 34 до 61%, в то время как добавление 4,81 нМ CQ к mAb приводило к аналогичному максимальному ингибированию роста (от 32 до 51%). Добавление 6,58 нМ CQ к mAb увеличивало диапазон подавления роста по меньшей мере с 20% до 59-75%. С другой стороны, отдельные антитела и комбинации антитело/лекарственный препарат демонстрировали аналогичный процент максимального подавления роста со штаммом 7G8 (только mAb: 47-51%; mAb+4,81 нМ CQ: 44-53%; mAb+6,58 нМ CQ: 30-52%).

- 63 043756

Таблица 3-1. Обобщенные результаты максимальной ингибирующей активности антител против

PfRH5 в отношении роста различных штаммов Plasmodium falciparum. *

Максимальное подавление роста (%)

Хлорохина фосфат	mAb	3D7	7G8
Нет данных	Н1Н29089Р	61,06	51,10
Н1Н29100Р	58,02	48,85
Н1Н29147Р2	34,93	47,34
Н1Н29187Р2	47,58	49,30
4,81 нМ	Н1Н29089Р	51,32	48,69
Н1Н29100Р	46,64	53,76
Н1Н29147Р2	31,45	44,22
Н1Н29187Р2	44,53	48,70
6,58 нМ	Н1Н29089Р	75,59	52,78
Н1Н29100Р	71,21	50,67
Н1Н29147Р2	59,11	29,96
Н1Н29187Р2	71,20	38,95

*Максимальное подавление роста антителами против PfRH5 по сравнению с неинфицированными эритроцитами человека. Анализ подавления роста проводили на эритроцитах, инфицированных P. falciparum (зрелый трофозоит или ранний шизонт), при 0,4-0,7% паразитемии. Антитела объединяли с инфицированными эритроцитами. Паразитов выращивали в течение 40-48 ч (в зависимости от штамма паразита) до достижения стадии шизонта. Рост паразитов останавливали тремя промывками холодного PBS. Активность лактатдегидрогеназы паразита измеряли непосредственно после промывки. Процент подавления роста выражали по отношению к неинфицированным эритроцитам. Результаты одного типичного анализа подавления роста показаны выше.

Пример 4. Анализ подавления роста для оценки способности анти-PfRH5 антител подавлять инвазию in vitro эритроцитов человека и рост паразитов Р. falciparum.

В этом примере набор из 30 PfRH5-специфических mAb по данному изобретению тестировали в стандартном анализе подавления роста против ряда распространенных лабораторных штаммов (как чувствительных, так и устойчивых к различным противомалярийным препаратам) и клинических линий с множественной лекарственной устойчивостью.

Экспериментальная процедура

Каждый штамм Р. falciparum (BEI Resources) сначала синхронизировали с 5% D-сорбитом в соответствии со стандартными протоколами при гематокрите 3-5% и паразитемии 1-2% за 20-24 ч до начала анализа. Инфицированные эритроциты человека получали при исходной паразитемии 0,4-0,7% и гематокрите 2%. Инфицированные эритроциты объединяли с PfRH5-специфическими или контрольными антителами IgG1, начиная с концентрации 666,67 нМ при последовательном разведении 1:5 для каждого антитела. Паразитов выращивали в течение 40-48 ч до достижения стадии шизонта (один полный жизненный цикл). Рост паразитов останавливали тремя промывками холодного PBS. Окончательную паразитемию определяли путем измерения активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) паразита (Miura et al., Clin Vaccine Immunol. 16: 963-968 (2009). PMID: PMC2708396). Процент подавления роста выражали по отношению к неинфицированным эритроцитам.

Обобщенные результаты и выводы

В табл. 4-1 показан максимальный процент подавления роста для каждого из 30 PfRH5специфических mAb, тестируемых при 666,67 нМ. Применение нескольких антител приводило к снижению роста во всех тестируемых лабораторно адаптированных и клинических штаммах P. falciparum.

- 64 043756

Таблица 4-1. Обобщенные результаты максимальной ингибирующей активности антител против

PfRH5 в отношении роста различных штаммов Plasmodium falciparum.*

Максимальное подавление роста (%)

mAb	D10	Dd2	7G8	W2- mef	3D7	нвз	FCR- 1/FV О	Cam3.I I	RF7
Н1Н29089Р	82,32	71,29	70,09	66,39	67,59	59,15	65,98	56,16	28,95
Н1Н29094Р	35,86	41,58	29,95	34,94	14,38	45,39	51,23	26,18	15,23
Н1Н29100Р	81,73	64,60	66,40	67,29	61,80	62,61	66,89	52,44	17,02
Н1Н29104Р	55,70	61,31	35,16	47,40	34,42	39,81	67,38	50,02	23,62
Н1Н29106Р	74,86	53,97	55,49	48,93	57,97	48,36	54,28	51,68	27,41
Н1Н29109Р	44,79	42,05	39,04	37,92	32,22	32,24	56,74	35,91	8,24
Н1Н29125Р	75,39	51,39	46,96	64,57	51,14	52,09	67,62	42,69	20,99
Н1Н29127Р	74,44	64,67	61,19	53,61	63,90	59,36	61,13	47,00	25,68
Н1Н29131Р	63,00	68,75	50,30	63,16	50,61	59,45	71,77	50,18	26,66
Н1Н29134Р	50,59	39,99	34,84	26,89	40,72	28,21	41,17	28,53	16,69
Н1Н29138Р	57,06	74,44	57,36	66,44	58,45	51,38	84,07	48,69	51,37
Н1Н29141Р	50,01	65,27	54,63	56,19	48,20	49,98	74,25	49,31	32,06
Н1Н29143Р	79,41	62,70	61,87	58,27	60,27	60,87	67,19	53,25	28,21
Н1Н29146Р2	10,78	26,90	19,07	0,57	8,57	33,87	7,32	8,18	5,97
Н1Н29147Р2	81,44	65,31	65,20	64,71	60,27	64,85	70,32	51,93	31,44
Н1Н29149Р2	66,03	50,32	41,38	42,77	44,15	40,01	57,98	36,22	14,74
Н1Н29151Р2	38,66	57,97	47,52	53,90	35,49	31,74	53,70	26,34	18,26
Н1Н29163Р2	71,83	61,17	62,62	63,66	55,62	56,45	64,52	46,72	10,73
Н1Н29166Р2	70,94	60,02	54,60	61,87	53,11	54,93	69,69	55,90	19,41
Н1Н29171Р2	10,60	7,71	17,03	0,74	4,04	0,52	11,67	5,45	12,52
Н1Н29179Р2	62,50	13,49	34,11	22,88	24,24	40,86	49,01	33,41	-2,99
Н1Н29183Р2	6,79	0,68	17,83	-0,55	5,68	4,92	16,05	8,66	-6,27
Н1Н29187Р2	79,61	66,02	71,80	67,28	70,71	63,91	72,16	49,22	32,73
Н1Н29192Р2	8,70	15,16	12,42	4,35	-1,03	5,62	15,10	-3,38	-7,69
Н1Н29196Р2	14,33	-1,65	23,44	17,00	6,72	26,76	21,94	6,09	3,78
Н1Н29198Р2	4,38	10,13	5,31	-3,61	-5,40	15,53	11,08	14,66	1,53
Н1Н29207Р2	73,90	61,30	58,68	65,21	61,84	49,30	69,23	45,30	31,06
Н1Н29209Р2	72,66	38,09	49,89	39,61	48,32	52,40	19,16	47,26	11,91
Н1Н29214Р2	76,52	47,21	56,74	52,72	52,09	59,09	13,05	46,67	11,18
Н1Н29215Р2	35,80	22,79	33,23	37,23	19,97	30,11	54,03	27,22	11,28

- 65 043756

Антитело отрицательного контроля IgGl человека, специфическое к антигену аллергии на кошек - Fei d 1

-1,42

11,02

11,68

6,66

13,18

27,50

4,04

-0,41

-6,62

^Максимальное подавление роста антителами против PfRH5 по сравнению с неинфицированными эритроцитами человека. Анализ подавления роста проводили на эритроцитах, инфицированных P. falciparum (зрелый трофозоит или ранний шизонт), при 0,4-0,7% паразитемии. Антитела объединяли с инфицированными эритроцитами. Паразитов выращивали в течение 40-48 часов (в зависимости от штамма паразита) до достижения стадии шизонта. Рост паразитов останавливали тремя промывками холодного PBS. Активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) паразита измеряли непосредственно после промывки. Процент подавления роста выражается по сравнению с неинфицированными эритроцитами. Результаты одного типичного анализа подавления роста для каждого штамма P. falciparum показаны выше.

Пример 5. Кинетика связывания согласно Biacore для связывания анти-PfRH5 моноклональных антител с PfRH5ΔNL.his при 25 и 37°С.

В этом примере определяли кинетику связывания различных анти-PfRH5 антител по данному изобретению.

Константы равновесной диссоциации (K_D) для различных реагентов PfRH5, связывающихся с очищенными анти-PfRH5 моноклональными антителами, определяли с использованием биосенсора Biacore T200 на основе поверхностного плазмонного резонанса в реальном времени. Все исследования связывания выполняли в рабочем буфере 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA и 0,05% об./об. поверхностно-активного вещества Tween-20, pH 7,4 (HBS-ET) при 25 и 37°С. Поверхность сенсорного чипа Biacore CM4 сначала дериватизировали путем иммобилизации по аминогруппе с козьим анти-Fcy человека специфическим поликлональным антителом (Jackson ImmunoResearch Laboratories, № по каталогу 109-005098) или кроличьим анти-Fc мыши специфическим поликлональным антителом (GE Healthcare № по каталогу BR100838) для захвата анти-PfRH5 моноклональных антител IgG1. Исследования связывания проводили на рекомбинантном PfRH5 с удалением аминоконца M1-Y139 и содержащим остатки K140Q526, но не имеющим K247-L295, и Т216А и Т299А экспрессируемыми с помощью С-концевой гексагистидиновой метки (PfRH5ΔNL.6his). Различные концентрации PfRH5ΔNL.6his (3,125-50 нМ; 2-кратное последовательное разведение или 0,48-60 нМ; 5-кратное последовательное разведение) сначала получали в рабочем буфере HBS-ET и вводили над поверхностью анти-Fcy человека или анти-Fc мыши захваченного анти-PfRH5 моноклонального антитела в течение четырех минут при скорости потока 50 мкл/мин, в то время как диссоциацию связанного с моноклональным антителом реагента PfRH5 контролировали в течение десяти минут в рабочем буфере HBS-ET. Константы скорости ассоциации (k_α) и скорости диссоциации (kd) определяли путем подгонки сенсограмм связывания в реальном времени к модели связывания 1:1с ограничением массопереноса с использованием программного обеспечения для построения кривой Scrubber 2.0с. Константу равновесия диссоциации связывания (K_D) и период полураспада диссоциации (t1/2) рассчитывали на основе кинетических скоростей как kd In (2)

K_D (Μ) = ^ka , И 1½ (мин) = GO^kd

Кинетические параметры связывания PfRH5ΔNL.6his с различными анти-PfRH5 моноклональными антителами по данному изобретению при 25°С и 37°С показаны в табл. 5-1-5-2 соответственно.

При 25°С все анти-PfRH5 моноклональные антитела по данному изобретению связывались с PfRH5ΔNL.6his со значениями KD в диапазоне от 4,72 пМ до 1,67 нМ, как показано в табл. 5-1. При 37°С все анти-PfRH5 моноклональные антитела по данному изобретению связывались с PrRH5ΔNL.6his со значениями KD в диапазоне от 1,10 пМ до 1,10 нМ, как показано в табл. 5-2.

- 66 043756

Таблица 5-1. Параметры кинетики связывания для связывания PfRH5ΔNL.6his с aнти-PfRH5 моноклональными антителами при 25 °С

Антитело	Уровень захвата mAb (RU)	100 нМ связанного Ag(RU)	к_а (1/Ms)	Ml/s)	K_D(M)	С/2 (мин)
Н1Н29141Р	62,8±4,0	29,9	2,75Е+06	1, ЗОЕ-05	4,72Е-12	888
Н1Н29209Р2	152,6±0,6	79,5	1,54Е+06	1,37Е-05	9,09Е-12	843
Н1Н29125Р	175,4±1,3	88,3	8Д0Е+05	1,00Е- 05*	1,23Е-11	1155
Н1Н29138Р	118,1±0,4	61,2	1,98Е+07	4,04Е-04	2,04Е-11	28,6
Н1Н29106Р	109,4±4,0	49,3	6,31Е+06	9,93Е-04	1,57Е-10	И,6
Н1Н29134Р	147,7±0,6	68,3	7,98Е+05	1,00Е- 05*	1,25Е-11	1155
Н1Н29109Р	70,4±4,4	36,7	2Д7Е+06	1,01Е-03	4,68Е-10	И,4
Н1Н29100Р	163,2±1,1	83,3	2,49Е+06	1,96Е-04	7,87Е-11	59,1
Н1Н29127Р	177,5±0,3	88,1	1,91Е+06	9Д2Е-04	4,76Е-10	12,7
Н1Н29089Р	180,4±0,9	96	1,46Е+06	3,99Е-04	2,73Е-10	29
Н1Н29094Р	186,1±0,9	87,2	1,07Е+06	5,ЗОЕ-04	4,98Е-10	21,8
Н1Н29179Р2	171,7±1,0	66,3	1,83Е+06	4,88Е-03	2,66Е-09	2,4
Н1Н29214Р2	115,5±2,9	59,9	1,71Е+06	2Д7Е-04	1,27Е-10	53,3
Н1Н29131Р	103,8±5,1	52,4	ЗД4Е+06	2,23Е-03	7Д1Е-10	5,2
Н1Н29215Р2	74,5±0,4	34,6	1,56Е+06	1,52Е-03	9,74Е-10	7,6
Н1Н29147Р2	91,5±4,5	43,2	3,29Е+06	1,67Е-03	5,07Е-10	6,9
Н1Н29163Р2	93,6±0,2	38	3,02Е+06	2,00Е-03	6,63Е-10	5,8
Н1Н29187Р2	108,1±1,3	53,2	2Д8Е+06	2Д9Е-04	1,01Е-10	52,8
Н1Н29149Р2	195,6±1,6	82,9	1,51Е+06	4,4Е-04	2,74Е-10	27,9
Н1Н29207Р2	204,0±2,0	104,9	1,68Е+06	1,72Е-03	1,03Е-09	6,7
Н1Н29104Р	139,4±2,6	58,4	1,24Е+06	1, ЗОЕ-ОЗ	1,05Е-09	8,9
Н1Н29196Р2	138,3±0,9	61	1,22Е+06	2,21Е-03	1,80Е-09	5,2
Н1Н29183Р2	156,6±1,0	23	1,59Е+05	1,00Е- 05*	6,28Е-11	1155
Н1Н29143Р	110,8±0,3	53,4	3,41Е+06	2,77Е-03	8ДЗЕ-10	4,2
Н1Н29166Р2	102,5±6,6	28	4,27Е+06	3,56Е-03	8,34Е-10	3,2
Н1Н29151Р2	122,4±0,2	26	1,48Е+07	2,47Е-02	1,67Е-09	0,5
Н1Н29192Р2	148,3±0,6	-0,4	С.о?	С.о?	С.о?	С.о?
Н1Н29198Р2	121,7±0,3	-0,8	С.о?	С.о?	С.о?	С.о?
Н1Н29146Р2	143,2±0,4	-1,5	С.о?	С.о?	С.о?	С.о?
Н1Н29171Р2	144,2±0,4	0,4	С.о?	С.о?	С.о?	С.о?
Изотипически й контроль hlgGl	165,3±0,9	-1,3	С.о?	С.о?	С.о?	С.о?

* указывает на то, что в текущих экспериментальных условиях не наблюдали диссоциации PfRH5ANL.6his, а значение kd фиксировали самостоятельно при 1,00Е-05 при подборе данных.

$ указывает на то, что в текущих экспериментальных условиях связывания не наблюдали.

С.о. означает, что связывание отсутствует.

- 67 043756

Таблица 5-2. Параметры кинетики связывания для связывания PfRH5ANL.6his с aHmu-PfRH5 моноклональными антителами при 37 °С

Антитело	Уровень захвата шАЬ (RU)	100 нМ связанного Ag (RU)	к_а (1/Ms)	kd (1/s)	K_D (Μ)	1½ (мин)
Н1Н29141Р	38,8+1,3	18,8	9,11Е+06	1,00Е- 05*	Ι,ΙΟΕ-12	1155
Н1Н29209Р2	66,7+0,8	28,6	2,11Е+06	1,00Е- 05*	4,74Ε-12	1155
Н1Н29125Р	65,8+2,6	19,9	1,58Е+06	Ι,ΟΟΕ05*	6,34Ε-12	1155
Н1Н29138Р	40,3+0,2	18,7	4,26Е+07	6,87Ε-04	1,61Ε-11	16,8
Н1Н29106Р	58,6+6,5	17,3	1,60Е+07	6,36Ε-04	3,97Ε-11	18,2
Н1Н29134Р	58,9+0,6	19,8	2,71Е+07	1Д8Е-03	4,37Ε-11	9,8
Н1Н29109Р	40,5+8,0	19,7	1,20Е+07	5,51Ε-04	4,58Ε-11	21
Н1Н29100Р	72,4+1,1	33,2	4,03Е+06	2,10Ε-04	5,21Ε-11	55
Н1Н29127Р	67,3+0,6	27,3	1,29Е+07	7,02Ε-04	5,46Ε-11	16,4
Н1Н29089Р	76,0+1,9	32,7	4,04Е+06	2,33Ε-04	5,77Ε-11	49,5
Н1Н29094Р	72,1+2,1	21,2	2,05Е+06	1Д9Е-04	5,79Ε-11	97,2
Н1Н29179Р2	79,6+1,1	15,3	2Д4Е+07	1,26Ε-03	5,88Ε-11	9,2
Н1Н29214Р2	59,0+0,7	22,9	2,70Е+06	1,63Ε-04	6,04Ε-11	70,9
Н1Н29131Р	64,8+0,4	26,6	1,31Е+07	8,66Ε-04	6,61Ε-11	13,3

Η1Η29215Ρ2	41,9+3,3	9,9	1,40Е+07	l,21E-03	8,64E-11	9,5
Η1Η29147Ρ2	54,6+1,5	24,9	l,24E+07	1Д2Е-03	9,01E-ll	10,3
Η1Η29163Ρ2	32,7+0,2	13	l,54E+07	l,68E-03	l,09E-10	6,9
Η1Η29187Ρ2	76,4+8,6	29	3,19E+06	6,87E-04	2Д6Е-10	16,8
Η1Η29149Ρ2	117,5+4,1	33,9	l,49E+06	6,47E-04	4,36E-10	17,9
Η1Η29207Ρ2	111,6+3,9	40,8	2,61E+06	l,23E-03	4,72E-10	9,4
Η1Η29104Ρ	110,3+11,5	23	l,91E+06	9,38E-04	4,92E-10	12,3
Η1Η29196Ρ2	73,6+1,6	14,1	2,50E+06	2,74E-03	l,10E-09	4,2
Η1Η29183Ρ2	78,4+1,7	3,5	H.o.^#	H.o^#	H.o^#	H.o.^#
Η1Η29143Ρ	41,5+0,2	12,3	H.o.^#	H.o^#	H.o^#	H.o.^#
Η1Η29166Ρ2	59,0+1,0	23,5	H.o.^#	H.o^#	H.o^#	H.o.^#
Η1Η29151Ρ2	45,0+0,2	2,7	C.o.^$	C.o.^$	C.o.^$	C.o.^$
Η1Η29192Ρ2	60,3+0,8	-1,2	C.o.^$	C.o.^$	C.o.^$	C.o.^$
Η1Η29198Ρ2	46,4+1,6	-3,2	C.o.^$	C.o.^$	C.o.^$	C.o.^$
Η1Η29146Ρ2	52,6+0,4	-2,6	C.o.^$	C.o.^$	C.o.^$	C.o.^$
Η1Η29171Ρ2	52,0+0,3	-5,6	C.o.^$	C.o.^$	C.o.^$	C.o.^$
Изотипический контроль hlgGl	74,3+1,0	-1,2	C.o.^$	C.o.^$	C.o.^$	C.o.^$

* указывает, что связывание наблюдали в текущих экспериментальных условиях, однако кинетические значения не соответствуют табличным.

Н.о. означает неоднозначные результаты.

С.о. означает, что связывание отсутствует.

Пример 6. Перекрестная конкуренция согласно Octet между различными анти-PfRH5 моноклональными антителами

Конкуренцию за связывание между панелью анти-PfRH5 моноклональных антител определяли с помощью анализа безмаркерной биослойной интерферометрии в реальном времени на платформе биосенсора Octet HTX (Pall ForteBio Corp.).

Эксперимент проводили при 25°С в буфере 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТА, 0,05% об./об. поверхностно-активного вещества Tween-20 и 1 мг/мл BSA, рН 7,4 (HBS-EBT) с планшетом при встряхивании со скоростью 1000 об./мин. Для оценки того, способны ли два антитела конкурировать друг с другом за связывание со своими соответствующими эпитопами на рекомбинантном PfRH5 с удалением аминоконца M1-Y139 и содержащим остатки K140-Q526, но не имеющим K247-L295, и Т216А и Т299А, экспрессированными с С-концевой гексагистидиновой меткой (PfRH5ANL.6his; SEQ ID: 362), примерно 1,4-2,0 нм PfRH5ANL.6his сначала захватывали на наконечники биосенсора Octet, покрытые анти-PentaHis антителом (Fortebio Inc, № 18-5122), путем погружения наконечников биосенсора в течение 60 с в лунки, содержащие 20 мкг/мл раствора PfRH5ANL.6his. Захваченные антигеном наконечники биосенсора затем насыщали первым анти-PfRH5 моноклональным антителом (впоследствии обозначаемым mAb-1) путем погружения в лунки, содержащие 50 мкг/мл раствора mAb-1, в течение 3 мин. Используемые антитела представляли собой IgG1. Затем наконечники биосенсора погружали в лунки, содержащие 50 мкг/мл раствора второго анти-PfRH5 моноклонального антитела (впоследствии обозначаемого mAb-2), в течение 3 мин. Наконечники биосенсора промывали в буфере HBS-ET в промежутке между каждой ста- 68 043756 дией эксперимента. Реакцию связывания в реальном времени контролировали в течение всего эксперимента, а ответ при связывании в конце каждой стадии фиксировали. Реакцию связывания mAb-2 с

PfRH5ΔNL.6h, предварительно образовавшим комплекс с mAb-1, сравнивали и определяли конкурентное/неконкурентное поведение различных анти-PfRH5 моноклональных антител, как показано в табл. 6-1. Таблица 6-1. Перекрестная конкуренция между анти-PfRH5 моноклональными антителами

mAb-Ι	mAb-2, которое конкурирует с mAb-Ι
Н1Н29127Р	Н1Н29106Р
Н1Н29134Р
Н1Н29106Р	Н1Н29127Р
Н1Н29134Р
Н1Н29134Р	Н1Н29106Р
Н1Н29127Р
Н1Н29143Р	Н1Н29187Р2
Н1Н29187Р2	Н1Н29143Р
Н1Н29151Р2
Н1Н29183Р2	mAb отсутствует
Н1Н29104Р	mAb отсутствует
Н1Н29207Р2	Н1Н29109Р
Н1Н29147Р2
Н1Н29166Р2
Н1Н29171Р2
Н1Н29163Р2
Н1Н29109Р	Н1Н29207Р2
Н1Н29147Р2
Н1Н29166Р2
Н1Н29171Р2

- 69 043756

	H1H29163P2
H1H29147P2	H1H29207P2
H1H29109P
H1H29166P2
H1H29171P2
H1H29163P2
H1H29131P
H1H29166P2	H1H29207P2
H1H29109P
H1H29147P2
H1H29171P2
H1H29163P2
H1H29131P
H1H29171P2	H1H29207P2
H1H29109P
H1H29147P2
H1H29166P2
H1H29163P2
H1H29131P
H1H29094P
H1H29163P2	H1H29207P2
H1H29109P
H1H29147P2
H1H29166P2
H1H29171P2
H1H29131P
H1H29094P
H1H29215P2
H1H29131P	H1H29147P2
H1H29166P2
H1H29171P2
H1H29163P2
H1H29094P
H1H29215P2
H1H29094P	H1H29171P2
H1H29163P2

- 70 043756

	H1H29131P
H1H29215P2
H1H29151P2
H1H29138P
H1H29215P2	H1H29163P2
H1H29131P
H1H29094P
H1H29151P2
H1H29125P
H1H29151P2	H1H29187P2
H1H29094P
H1H29215P2
H1H29198P2
H1H29125P	H1H29215P2
H1H29149P2	H1H29100P
H1H29209P2
H1H29179P2
H1H29214P2
H1H29089P
H1H29100P	H1H29149P2
H1H29209P2
H1H29179P2
H1H29214P2
H1H29089P
H1H29209P2	H1H29149P2
H1H29100P
H1H29179P2
H1H29214P2
H1H29089P
H1H29179P2	H1H29149P2
H1H29100P
H1H29209P2
H1H29214P2
H1H29089P
H1H29214P2	H1H29149P2
H1H29100P
H1H29209P2
	H1H29179P2
H1H29089P
H1H29089P	H1H29149P2
H1H29100P
H1H29209P2
H1H29179P2
H1H29214P2
H1H29138P	H1H29094P
H1H29141P	mAb отсутствует
H1H29196P2	mAb отсутствует
H1H29198P2	H1H29151P2
H1H29146P2	mAb отсутствует

Пример 7. Многоцикловый анализ подавления роста для оценки образующихся паразитов после давления анти-PfRH5 антитела

Специфические к RH5 Plasmodium falciparum антитела подавляют инвазию эритроцитов человека в течение нескольких циклов репликации и не вызывают мутации в гене PfRH5. Инвазия эритроцитов хозяина является важным этапом жизненного цикла Plasmodium falciparum (P. falciparum) и патологии малярии. Множественные противомалярийные препараты нацелены на бесполые стадии в кровяном русле, однако их эффективность находится под угрозой из-за появления штаммов, устойчивых к лекарственным препаратам (Arrow et al., Saving Lives, Buying Time: Economics of Malaria Drugs in the Age of Resistance. National Acamies Press (US). 254-266 (2004); Blasco et al., Antimalarial drug resistance: linking Plasmodium falciparum parasite biology to the clinic. Nature Medicine. 23, 917-928 (2017)). Кроме того, противомалярийные препараты обладают разными фармакокинетическими свойствами. Некоторые противомалярийные препараты, такие как артемизинин и хинин, быстро выводятся из организма в течение одного жизненного цикла паразита. С другой стороны, гидрофобные и липофильные противомалярийные препараты выводятся медленно, но они характеризуются различной скоростью всасывания в зависимости от количества потребляемых жиров (Arrow et al., Saving Lives, Buying Time: Economics of Malaria Drugs in an Age of

- 71 043756

Resistance. National Acamies Press (US). 254-266 (2004)).

Нацеливание на ретикулоцитсвязывающий белок-гомолог (RH5) с помощью поликлональных (пАт) и моноклональных антител (мАт) эффективно блокирует паразитарную инвазию нескольких штаммов P. falciparum в эритроциты человека in vitro (Wright et al., Structure of malaria invasion protein RH5 with erythrocyte basigin and blocking antibodies. Nature. 515, 427-430 (2014); Galaway et al., PI 13 is a merozoite surface protein that binds the N-terminus of Plasmodium falciparum RH5. Nature Communications. 8, 14333 (2017)). Нацеливание на белок RH5 с помощью одного антитела или коктейля антител может быть необходимым для создания противоположного давления отбора на одну и ту же мишень.

Кроме того, антитела могут компенсировать короткий период полувыведения распространенных противомалярийных препаратов.

Наконец, паразит Plasmodium разработал способы ускользания иммунного ответа хозяина, который пытается блокировать развитие паразита, такие как полиморфизм генов. Это генетическое разнообразие часто является результатом иммунного давления (Renia и Goh, Malaria Parasites: The Great Escape. Front Immunol. 7,463 (2016). PMC5098170). Полногеномное секвенирование более 300 клинических изолятов или лабораторных штаммов P. falciparum выявило только 15 несинонимичных SNP PfRH5 в пределах возможных эпитопов mAb, что свидетельствует о консервативной природе и важности белка. Иммунное давление на консервативные области белка может ограничивать способность паразита развивать механизмы ускользания (Bustamante et ah, A full-length recombinant Plasmodium falciparum PfRH5 protein induces inhibitory antibodies that are effective across common PfRH5 genetic variants, Vaccine, 31, 373-9 (2013)).

В этом примере набор из четырех (4) RH5-специфических моноклональных антител, каждое с hlgG1, по данному изобретению тестировали отдельно в анализе ускользающих мутантов с одним штаммом Plasmodium falciparum (3D7).

Использовали моноклональные антитела НШ29089Р, Н1Н291ООР, Н1Н29147Р2, Н1Н29187Р2 и REGN1932.

Экспериментальная процедура (в том числе описание соответствующих клеточных линий, белков, реагентов, а также типа и модели устройств): штамм 3D7 Р. falciparum (BEI Resources) выращивали в соответствии со стандартными протоколами при гематокрите 4% и паразитемии 0,5%. Инфицированные эритроциты объединяли с PfRH5-специфическими или контрольными антителами в концентрации, соответствующей их соответствующему значению IC₅₀ в отношении штамма P. falciparum, описанного выше. Концентрация антител постепенно увеличивалась каждые 7-14 дней до конечной концентрации, соответствующей 110Х их соответствующих значений IC₅₀. Среду для выращивания, содержащую антитело, обновляли каждые 48 ч, а свежую кровь добавляли в культуру еженедельно.

Каждую неделю РНК паразита экстрагировали путем лизиса инфицированных эритроцитов тризолом и очищали с помощью набора Qiagen RNeasy. Обратную транскрипцию завершали с помощью высокопроизводительного набора для обратной транскрипции кДНК (Applied Biosystems). Амплификацию гена RH5 проводили с использованием PfRH5-специфических праймеров. Продукты ПЦР анализировали на 1,5% агарозном геле и клонировали в клонирующий вектор ТОРО ТА (Life Technologies). Секвенирование RH5 осуществляли с помощью прямого и обратного праймеров для секвенирования М13.

Обобщенные результаты и выводы Несколько групп сообщили, что нацеливание на ретикулоцитсвязывающий белок-гомолог 5 (PfRH5) может эффективно блокировать паразитарную инвазию в эритроциты человека in vitro с участием P. falciparum. Постепенное увеличение давления PfRH5специфических антител на паразитов 3D7 Р. falciparum не приводило к полиморфизмам PfRH5 по сравнению с давлением антитела изотипического контроля. В табл. 7-1 показан процент показателей идентичности последовательностей PfRH5 каждого образца по сравнению со всеми другими секвенированными образцами через 45 дней постепенного увеличения давления антител (от 1 х ЕС₅₀ до 110 х ЕС₅₀). Все последовательности были на 100% идентичны на всех участках. На фиг. 1 изображено выравнивание последовательностей PfRH5, соответствующих каждому PfRH5-специфическому антителу, через 45 дней после постепенного увеличения давления антитела (от 1 х ЕС₅₀ до 110 х ЕС₅₀), показывающее отсутствие различий последовательностей на нуклеотидном уровне.

- 72 043756

Таблица 7-1. Процент показателей идентичности последовательностей PfRH5 каждого образца по сравнению со всеми другими секвенированными образцами через 45 дней постепенного увеличения давления антител (от 1 х ЕС₅₀ до 110 х ЕС₅₀)

Пример 8. Анализ подавления роста для оценки способности анти-PfRH5 антител подавлять инвазию in vitro эритроцитов человека и рост паразитов Р. falciparum в присутствии сыворотки крови

Специфические антитела к RH5 Plasmodium falciparum подавляют инвазию эритроцитов человека в анализе подавления роста на основе пЛДГ в присутствии сыворотки крови.

Одна группа предположила, что активация комплемента на поверхности мерозоитов усиливает способность паразита вторгаться в эритроциты (Biryukov et al., Complement and Antibody-mediated Enhancement of Red Blood Cell Invasion and Growth of Malaria Parasites. EBioMedicine. 9, 207-216 (2016)). В то же время, другие исследования указывают на то, что присутствие сыворотки крови с активным комплементом приводит к уменьшенному или сопоставимому росту паразитов по сравнению с сывороткой крови с неактивным комплементом (Boyle et al, Human antibodies fix complement to inhibit Plasmodium falciparum invasion of erythrocytes and are associated with protection against malaria. Immunity. 42, 580-90 (2015); Chulay et al., Inhibition of in vitro growth of Plasmodium falciparum by immune serum from monkeys. J Infect Dis. 144, 270-278). Кроме того, во всех случаях вакцинации у людей мерозоитными антигенами (или любыми малярийными антигенами) отсутствуют задокументированные случаи антителозависимого увеличения паразитемии.

В этом примере набор из четырех (4) RH5-специфических mAb (каждое с hlgG1 (обозначено префиксом H1H) или hIgG4 (обозначено префиксом Н4Н)) по данному изобретению тестировали отдельно и в комбинации с нормальной сывороткой крови обезьян Aotus (ANS), инактивированной нагреванием сывороткой крови обезьян Aotus (AHIS), нормальной сывороткой крови человека (HNS) или инактивированной нагреванием сывороткой крови человека (HHIS) в стандартном анализе подавления роста с одним штаммом Plasmodium falciparum (FCR-1/FVO).

Применяемые моноклональные антитела были следующими: Н1Н29О89Р, Н1Н29100Р,

Н1Н29147Р2, Н1Н29187Р2, Н4Н29089Р, Н4Н29100Р, Н4Н29147Р2, Н4Н29187Р2, REGN1932 (анти-Fel d1 (IgG1 человека)) и REGN1945 (анти-Fel d1 (IgG4 человека)).

Экспериментальная процедура (в том числе описание соответствующих клеточных линий, белков, реагентов, а также типа и модели устройств). Штамм FCR-1/FVO P. falciparum (BEI Resources) сначала синхронизировали с 5% D-сорбитом в соответствии со стандартными протоколами при гематокрите 35% и паразитемии 1-2% за 20-24 ч до начала анализа. Инфицированные эритроциты человека получали при исходной паразитемии 0,4-0,7% и гематокрите 2%. Инфицированные эритроциты объединяли с RH5специфическими или контрольными антителами в концентрации 6,67 мкМ в присутствии 10% нормальной сыворотки крови Aotus, инактивированной нагреванием сыворотки крови Aotus, нормальной сыворотки крови человека или инактивированной нагреванием сыворотки крови. Паразитов выращивали в течение 40-48 ч до достижения стадии шизонта (один полный жизненный цикл). Рост паразитов останавливали тремя промывками холодного PBS. Конечную паразитемию определяли путем измерения активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) паразита (Miura et al., Anti-Apical-Membrane-Antigen-1 antibody is more effective than anti-42-kilodalton-Merozoite-Surface-Protein-1 antibody in inhibiting Plasmodium falciparum growth, as determined by the in vitro growth inhibition assay. Clin Vaccine Immunol. 16, 963-968 (2009)). Процент подавления роста выражается по сравнению с неинфицированными эритроцитами.

Обобщенные результаты и выводы

Нацеливание на ретикулоцитсвязывающий белок-гомолог 5 (RH5) эффективно блокирует паразитарную инвазию эритроцитов человека in vitro с участием P. falciparum. Были опубликованы противоречивые данные о роли комплемента в инвазии мерозоитов в эритроциты. RH5-специфические антитела получали и тестировали в присутствии Aotus или сыворотки крови человека in vitro в анализе подавления роста в штамме P. falciparum, как описано выше. В табл. 8-1 показан процент максимального подавления

- 73 043756 роста для каждого RH5-специфического антитела (оба формата hlgG1 и hIgG4) с активным или неактивным комплементом сыворотки крови. Отдельные антитела и комбинации активной или неактивной сыворотки крови показали аналогичный процент максимального подавления роста, находящийся в диапазоне приблизительно 67-86%.

Таблица 8-1. Обобщенные результаты максимальной активности подавления роста PfRH5-антител в присутствии 10% сыворотки крови Aotus или человека

Процент максимального подавления роста

mAb	mAb (6,67 мкМ) + ANS (10%)	mAb (6,67 мкМ) + AHIS (10%)	mAb (6,67 мкМ) + HNS (10%)	mAb (6,67 мкМ) + HHIS (10%)	mAb (6,67 mkM) + без сыворотк и крови
Н1Н29089Р	75,7	84,3	85,0	85,2	85,3
Н1Н29100Р	73,2	82,5	82,4	81,9	83,9
Н1Н29147Р 2	80,3	86,2	85,6	83,4	84,1
Н1Н29187Р 2	80,1	89,4	85,9	85,4	85,3
Н4Н29089Р	75,7	82,4	85,3	86,2	84,8
Н4Н29100Р	67,7	79,8	75,5	79,6	83,9
Н4Н29147Р 2	67,0	76,8	73,0	75,5	82,4
Н4Н29187Р 2	69,9	82,9	77,0	77,8	84,0
REGN1932	0	0	0	0	0
REGN1945	0	0	0	0	0

Максимальное подавление роста антител против PfRH5 по сравнению с неинфицированными эритроцитами человека. Анализ подавления роста проводили на эритроцитах, инфицированных P. falciparum (зрелый трофозоит или ранний шизонт), при 0,4-0,7% паразитемии. Антитела и сыворотки объединяли с инфицированными эритроцитами. Паразитов выращивали в течение 40-48 ч (время зависело от штамма паразита) до достижения стадии шизонта. Рост паразитов останавливали тремя промывками холодного PBS. Активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) паразита измеряли непосредственно после промывки. Процент подавления роста выражается по сравнению с неинфицированными эритроцитами. Результаты одного типичного анализа подавления роста показаны выше. ANS: нормальная сыворотка крови обезьяны Aotus, AHIS: инактивированная нагреванием сыворотка крови Aotus, HNS: нормальная сыворотка крови человека, HHIS: инактивированная нагреванием сыворотка крови человека.

********************

Все цитируемые в данном документе литературные источники включены посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, запись в базе данных (например, последовательности Genbank или записи GeneID), патентная заявка или патент были явным образом и отдельно указаны для включения посредством ссылки. Указанное заявление о включении посредством ссылки предназначено заявителями для того, чтобы обращаться к каждой отдельной публикации, записи в базе данных (например, последовательностям Genbank или записям GeneID), заявке на патент или патенту, даже если такая ссылка не является непосредственно смежной со специальным заявлением включения посредством ссылки. Включение в описание специальных заявлений о включении посредством ссылки, если таковые имеются, никоим образом не ослабляет указанное общее заявление о включении посредством ссылки. Цитирование литературных источников в данном документе не предназначено в качестве признания того, что литературный источник относится к предшествующему уровню техники, и не является признанием содержания или даты этих публикаций или документов.

Claims

1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с полипептидом ретиколицитсвязывающего белка-гомолога 5 Plasmodium falciparum (PfRH5), где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит три определяющих комплементарность области тяжелой цепи HCDR1, HCDR2 и HCDR3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4, 6 и 8 соответственно, и три определяющих комплементарность области легкой цепи LCDR1, LCDR2 и LCDR3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 12, 14 и 16 соответственно.

2. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую аминокислотную после-

- 74 043756 довательность SEQ ID NO: 2.

3. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.

4. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит HCVR, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и LCVR, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.

5. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-4, который является мультиспецифическим .

6. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-5, который включает одно или несколько из следующих свойств:

по давляет рост Plasmodium falciparum в эритроцитах человека;

подавляет рост штаммов Plasmodium falciparum D10, Dd2, 7G8, W2-mef, 3D7, HB3, FCR-1/FVO, Cam3.II или RF7 в эритроцитах человека;

связывается с полипептидом PfRH5 или его антигенным фрагментом с K_D от около 4,72 пМ до около 1,67 нМ при 25°С и/или от около 1,10 пМ до около 1,10 нМ при 37°С при измерении с помощью поверхностного плазмонного резонанса;

бл окирует связывание полипептида PfRH5 с полипептидом базигина;

связывается с PfRH5, не имеющим аминоконцевых остатков M1-Y139 и содержащим остатки K140Q526, но не содержащим K247-L295, и имеющим мутации Т216А и Т299А; и/или вы зывает максимальное подавление роста Plasmodium falciparum в инактивированной нагреванием сыворотке крови человека или обезьяны Aotus, которое на около 1-10% выше, чем в неинактивированной нагреванием сыворотке крови человека или обезьяны Aotus соответственно;

при воздействии указанного антигенсвязывающего белка не вызывает мутации PfRH5 в Plasmodium falciparum.

7. Комплекс, содержащий антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, связанный с полипептидом ретикулоцитсвязывающего белка-гомолога 5 (PfRH5) Plasmodium falciparum.

8. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-6, включающий:

(a) введение одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих антитело или антигенсвязывающий фрагмент, в клетку-хозяина и (b) культивирование клетки-хозяина в условиях, благоприятных для экспрессии одного или более полинуклеотидов.

9. Способ по п.8, дополнительно включающий (с) выделение антитела или антигенсвязывающего фрагмента из клетки-хозяина и/или среды, в которой выращивается клетка-хозяин.

10. Способ по п.8 или 9, где клетка-хозяин представляет собой клетку яичника китайского хомячка.

11. Тест-полоска на наличие антигенов для иммунохроматографического анализа, содержащая антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6.

12. Полинуклеотид, кодирующий антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6.

13. Вектор, содержащий полинуклеотид по п.12.

14. Клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид по п.12 или вектор по п.13.

15. Набор, содержащий антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6.

16. Набор по п.15, дополнительно содержащий терапевтический агент.

17. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6 и фармацевтически приемлемый носитель.

18. Фармацевтическая композиция по п.17, дополнительно содержащая терапевтический агент.

19. Композиция или набор по п.16 или 18, где дополнительный терапевтический агент представляет собой противопаразитарное лекарственное средство или вакцину.

20. Композиция или набор по любому из пп.15-19, отличающиеся тем, что дополнительный терапевтический агент является членом, выбранным из группы, состоящей из хлорохина, атоваквона, прогуанила, артеметера, люмефантрина, мефлохина, хинина, хинидина, доксициклина, клиндамицина, вакцины и противомалярийной вакцины.

21. Сосуд или инъекционное устройство, содержащие антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6 или композицию по любому из пп.17-20.

22. Способ лечения или профилактики инфекции Plasmodium falciparum у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение терапевтически эффективного количества антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-6 или фармацевтической композиции по любому из пп.17-20.

23. Способ по п.22, где субъект болен малярией или имеет повышенный риск заражения, или предрасположен к заболеванию малярией.

24. Способ по п.22 или 23, где перед введением антигенсвязывающего белка у субъекта диагностируют наличие инфекции Plasmodium falciparum.

25. Способ диагностики инфекции Plasmodium falciparum у субъекта, включающий приведение в

- 75 043756 контакт антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-6 с образцом от указанного субъекта и, если в образце выявлен комплекс между антителом или антигенсвязывающим фрагментом и полипептидом PfRH5, определение того, что субъект инфицирован Plasmodium falciparum.

26. Способ по п.25, где указанный комплекс образуется на тест-полоске для иммунохроматографического анализа, содержащей антигенсвязывающий белок и полипептид PfRH5.

27. Способ введения антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-6 в организм субъекта, включающий инъекцию антитела или антигенсвязывающего фрагмента в организм субъекта.

28. Способ по п.27, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент вводят в организм субъекта подкожно, внутривенно или внутримышечно.