EA043526B1 - Способ получения иммуноглобулина g для внутривенного введения - Google Patents

Description

Область техники

Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения иммуноглобулинов из плазмы крови человека, и может быть использовано при производстве лекарственных препаратов.

Описание предшествующего уровня техники

Препараты иммуноглобулина человека нормального для внутривенного введения, применяющиеся в терапевтических целях, представляют собой полиспецифичные иммуноглобулины класса G (IgG), изготовленные из плазмы крови здоровых доноров. Иммуноглобулины человека используются при большом количестве (несколько сотен) иммунологических и неврологических заболеваний [Brand A. Brand A, De Angelis V, Vuk T, Garraud О, Lozano M, Politis D; European Mediterranean Initiative for Transfusion Medicine. Review of indications for immunoglobulin (IG) use: Narrowing the gap between supply and demand. Transfus Clin Biol. 2021 Feb;28(l):96-122. doi: 10.1016/j.tracli.2020.12.005. Epub 2020 Dec 13. PMID: 33321210.].

Показания к терапии препаратами иммуноглобулина человека различаются в зависимости от региона/страны. Основными нозологиями, при которых показаны иммуноглобулины являются первичный иммунодефицит, хроническая воспалительная демиелинизирующая полирадикулонейропатия (ХВДП), синдром Гийена-Барре и другие [Goddard, E.A. Intravenous immunoglobulin [Text]/E.A. Goddard// Current Allergy and Clinical Immunology. - 2008. - Vol. 21. - р. 26-31]. Расширение показаний к применению препаратов иммуноглобулина стало возможным благодаря росту их качества, появлению препаратов с сохраненной Fc-функцией молекулы, прошедших дополнительные стадии очистки и вирусинактивации, обеспечивающие удаление и/или инактивацию вирусов. Условно такие препараты называют иммуноглобулины четвертого поколения [Донюш Е.К. Использование внутривенных иммуноглобулинов в клинической практике // Вопросы современной педиатрии. - 2011. - Т. 10. - № 2. - с. 49-63.].

Наиболее востребованными за счет удобства применения (скорость введения, более низкие нагрузки объемом введения препарата и др.) являются внутривенные иммуноглобулины с дозировкой 100 мг/1 мл (10%) и выше. Учитывая, что потребность в препаратах иммуноглобулина для внутривенного введения во всем мире растет примерно на 6-8% в год, разработка универсальной вирусбезопасной технологии производства препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения четвертого поколения, отвечающего всем современным требованиям качества, является актуальной.

Известен способ получения иммуноглобулина, раскрытый в патенте РФ на изобретение № 2372939 (опубл. 17.12.2007). Известный способ включает очистку раствора иммуноглобулина, выделенного спиртовым фракционированием по методу Кона, обработку сольвент-детергентной смесью, в качестве которой используют 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, содержащий 1 мас.% три-нбутилфосфата и 1 мас.% полисорбата 80 при перемешивании, с последующим разбавлением 0,05 М ацетатным буферным раствором при рН 5,5, содержащим 1 мас.% октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л, после чего иммуноглобулин иммобилизируют на сульфопропилкатионитном сорбенте и осуществляют промывание в две стадии с помощью колоночной хроматографии с последующей элюцией, причем на первой стадии промывания используют 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, содержащий 1 мас.% октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л.

Недостатком известного способа является отсутствие возможности проведения эффективной очистки иммуноглобулина из необогащенной фракции - осадка А (по Кону) при обеспечении высокого выхода целевого продукта.

Известен способ очистки иммуноглобулина, раскрытый в патенте РФ на изобретение № 2332247 (опубл. 01.06.2007). Известный способ включает ее растворение в буферном растворе, вирусную сольвент-детергентную инактивацию и хроматографическую очистку, осуществляемую путем пропускания раствора через систему из трех последовательно соединенных колонок, заполненных анионитом, гидрофобным сорбентом и катионитом, соответственно, с промывкой системы колонок, элюированием иммуноглобулина с катионита буферным раствором, и направлением на регенерацию анионита и гидрофобного сорбента.

Недостатком известного способа является невысокая чистота произведенного иммуноглобулина из осадка А (по Кону). Это обусловлено тем, что полученный препарат содержит значительное количество других белковых примесей, примеси липидов. Помимо этого, способ не предусматривает стадий гарантированной очистки препарата от анти-А и анти-В изоагглютининов и инактивации безоболочечных вирусов.

Известен способ хроматографического выделения иммуноглобулина, раскрытый в патенте РФ на изобретение № 2467783 (опубл. 27.11.2012) - прототип. Известный способ включает растворение в буферном растворе белковой фракции плазмы крови, в качестве которой используют осадок А спиртового фракционирования плазмы крови по Кону. Производят предварительную очистку полученного раствора в двух последовательно соединенных колонках, заполненных гидрофобным сорбентом и анионитом, соответственно, с последующим пропусканием через упомянутые две колонки буферного раствора. После сбора предварительно очищенной жидкой фракции, содержащей иммуноглобулин, ее направляют на вирусную сольвент-детергентную инактивацию, а затем на хроматографическую очистку, осуществляемую

- 1 043526 в системе из трех последовательно соединенных колонок, заполненных анионитом, гидрофобным сорбентом и катионитом, соответственно. Проводят элюирование иммуноглобулина с колонки, заполненной катионитом, а колонки с анионитом и гидрофобным сорбентом направляют на регенерацию.

Недостатком прототипа является сравнительно невысокая чистота произведенного препарата иммуноглобулина G. Это обусловлено тем, что производственный процесс не содержит стадий очистки препарата от анти-А и анти-В изоагглютининов, а также стадий инактивации безоболочечных вирусов. При этом прототип характеризуется длительным технологическим циклом получения продукта. Продолжительность цикла обусловлена тем, что хроматографическая очистка сырья проводится в два этапа и требует длительного уравновешивания хроматографических колонн буферным раствором. Это приводит к тому, что способ позволяет получить недостаточно очищенный продукт при достаточно длительном процессе производства. В совокупности описанные недостатки позволяют говорить о том, что прототип характеризуется недостаточной эффективностью производственного процесса.

Раскрытие сущности изобретения

Техническая задача, положенная в основу изобретения, заключается в создании эффективного технологического процесса производства высокоочищенного вирусбезопасного иммуноглобулина G на основе методов хроматографии.

Технический результат, достигаемый при осуществлении настоящего изобретения, заключается в повышении чистоты произведенного иммуноглобулина G.

Дополнительный технический результат - сокращение продолжительности технологического цикла получения иммуноглобулина G.

В качестве изобретения заявлен способ получения иммуноглобулина G для внутривенного введения, включающий растворение осадка II+III спиртового фракционирования плазмы крови по Кону в буферном растворе, вирусную сольвент-детергентную инактивацию раствора и его хроматографическую очистку через систему из трех последовательно соединенных колонн, заполненных соответственно гидрофобным, анионообменным и катионообменными сорбентами, с последующим элюированием иммуноглобулина G с колонны, заполненной катионообменным сорбентом. В отличие от прототипа перед хроматографической очисткой проводят фильтрацию вирусинактивированного раствора через глубинный фильтр с задерживающим рейтингом 0,65-4,0 мкм, при этом после элюирования полученный раствор иммуноглобулина G подвергают последовательным стадиям очистки через колонну, заполненную сорбентом для аффинной хроматографии, нанонфильтрации под давлением воздуха через систему из последовательно соединенных фильтров с задерживающим рейтингом 0,2 мкм и 20 нм, диафильтрации против раствора глицина, концентрирования, стерилизующей фильтрации и выдерживании раствора при низком значении рН, причем перед нанонфильтрацией устанавливают содержание белка в растворе иммуноглобулина до 25-31 мг/мл, а перед стерилизующей фильтрацией раствор концентрируют до достижения содержания белка 50-120 мг/мл.

В частности, в качестве гидрофобного сорбента используют агарозу с фенильными функциональными группами и размером частиц 45-165 мкм.

В частности, в качестве анионообменного сорбента используют поперечно-сшитый полистиролдивинилбензол с функциональными группами четвертичного полиэтиленимина, средним размером частиц 50 мкм, размером пор не менее 500 и не более 10000 А.

В частности, в качестве катионообменного сорбента используют поперечно-сшитый полистиролдивинилбензол с сульфопропильными функциональными группами, средним размером частиц 50 мкм, размером пор не менее 500 и не более 10000 А.

В частности, в качестве сорбента для аффинной хроматографии используют смесь аффинных сорбентов, которая содержит полиметакрилатные гранулы, ковалентно связанные с трисахаридным лигандом антигена А крови, и полиметакрилатные гранулы, ковалентно связанные с трисахаридным лигандом антигена В крови, с размером частиц 65 мкм.

Настоящее изобретение иллюстрируется следующими сопроводительными материалами:

в табл. 1 представлена сравнительная характеристика этапов хроматографической очистки иммуноглобулина G в соответствии с прототипом и заявленным изобретением;

в табл. 2 представлены результаты сравнительной характеристики продолжительности производственного цикла получения препаратов иммуноглобулина G в соответствии с прототипом и заявленным изобретением;

в табл. 3 представлены результаты оценки эффективности вирусной редукции препаратов иммуноглобулина G для внутривенного введения, произведенного в соответствии с заявленным изобретением;

в табл. 4 представлены показатели качества произведенных препаратов иммуноглобулина G для внутривенного введения в сравнении с требованиями Государственной Фармакопеи Российской Федерации и Европейской Фармакопеи.

В соответствии с данными, представленными в табл. 1, заявленный способ в сравнении с прототипом обладает рядом преимуществ в части эффективности производственного цикла препарата. Предложенная последовательность действий способа позволяет сократить продолжительность стадии хроматографической очистки в 6,9 раз с учетом включения дополнительной стадии очистки с применением аф- 2 043526 финных сорбентов. При этом удалось исключить из процесса стадию предварительной хроматографической очистки иммуноглобулина на двух колоннах, которая по продолжительности составляла 16 ч, а с учетом уравновешивания колонн - около 130 ч. Помимо этого, выбор носителей для использования в хроматографических колоннах в качестве гидрофобного, анионообменного и катионнообменного сорбентов, позволил добиться снижения требуемого объема сорбента в 1,5-2 раза. Дополнительно увеличена линейная скорость потока при уравновешивании, сорбции и элюировании, уменьшен требуемый объем буферного раствора, используемого при уравновешивании колонн, сорбции и промывке.

В соответствии с данными, представленными в табл. 2, общая продолжительность процесса получения иммуноглобулина сократилась более чем в 7 раз по сравнению с прототипом, даже с учетом включения дополнительных стадий при подготовке раствора для хроматографической очистки и противовирусной фильтрации.

В соответствии с данными, представленными в табл. 3, результаты исследований полученных препаратов иммуноглобулина G с использованием модельных вирусов указывают на снижение вирусной нагрузки. Установлено снижение вирусной нагрузки на более 10 log для оболочечных и более 5 log для безоболочечных вирусов. Это объясняется наличием в заявленном способе стадий обработки сырья смесью сольвент-детергента, анионообменной хроматографией, нанофильтрацией и выдерживанием при низком значении рН. Помимо этого, вирусная нагрузка дополнительно может быть снижена следующими мероприятиями: отбором и обследованием доноров, тестированием плазмы для фракционирования на маркеры гемотрансмиссивных инфекций.

В соответствии с данными, представленными в табл. 4, основные показатели полученных препаратов иммуноглобулина G полностью соответствует требованиям, установленным Государственной Фармакопеей Российской Федерации и Европейской Фармакопеи.

Описание вариантов осуществления изобретения

Пример 1.

8.5 кг осадка II+III спиртового фракционирования плазмы крови по Кону растворяют в 10 мМ натрий-ацетатном буферном растворе с рН 4,65, кондуктивностью 700 мкСм/см в соотношении 1:10 при температуре (5±3)°С. Объем раствора осадка II+III составляет 85 л. После чего в растворе осадка II+III устанавливают рН 4,00 и перемешивают в течение 1-2 ч при температуре (20±5)°С. Раствор после перемешивания осветляют с помощью центрифугирования.

Центрифугат (около 83,5 л) подвергают вирусной сольвент-детергентной инактивации в присутствии смеси вирусинактивирующих агентов (сольвент-детергента), в качестве которых используют твин-80 и трибутилфосфат. Концентрация твин-80 и трибутилфосфата в растворе осадка II+III составляет 1.0 % и 0,3% соответственно. Полученный раствор перемешивают при температуре (20±5)°С в течение 6-16 ч. Скорость перемешивания устанавливают такой, чтобы исключить вспенивание раствора.

Далее проводят коррекцию рН вирусинактивированного раствора до значений рН 5,30, кондуктивности 1400 мкСм/см, выдерживают при температуре (20±5)°С в течение 3 ч и фильтруют через глубинный фильтр с задерживающим рейтингом 0,65-4,0 мкм.

Затем раствор пропускают через три последовательно соединенные хроматографические колонны, которые заполнены различными типами сорбентов (гидрофобным, анионообменным и катионообменным). Первая колонна заполнена 15 л гидрофобного сорбента на основе агарозы с фенильными функциональными группами и размером частиц 45-165 мкм; вторая колонна заполнена 15 л анионообменного сорбента на основе поперечно-сшитого полистиролдивинилбензола с функциональными группами четвертичного полиэтиленимина, средним размером частиц 50 мкм и размером пор 500-10000 А; третья колонна заполнена 10 л катионообменного сорбента на основе поперечно-сшитого полистиролдивинилбензола с сульфопропильными функциональными группами, средним размером частиц 50 мкм, размером пор 500-10000 А.

Перед процессом сорбции хроматографические колонны уравновешивают натрий-ацетатным буферным раствором с концентрацией 10 мМ, рН 4,65, кондуктивностью 700 мкСм/см. Раствор пропускают с линейной скоростью 55 см/ч. На первой колонне происходит удаление пирогенов и связывание трибутилфосфата, липопротеидов и других примесей. На второй колонне происходит удаление пирогенов, ДНК-, РНК-примесей, белковых агрегатов, трансферрина, церулоплазмина, иммуноглобулинов М и А. На третьей колонне происходит сорбция иммуноглобулина G. После завершения процесса сорбции первые две колонны отключают и передают на регенерацию, а третью колонну промывают 2 объемами колонны натрий-ацетатным буферным раствором, затем 1% раствором твин-80 (10 объемов колонны); 20% раствором этилового спирта (5 объемов колонны), затем 5 объемами колонны натрий-ацетатного буферного раствора концентрацией 10 мМ, рН 4,65, кондуктивностью 700 мкСм/см.

Далее проводят элюирование иммуноглобулина G с хроматографической колонны, заполненной катионообменным сорбентом. Элюирование иммуноглобулина G проводят 0,2 М натрий-ацетатным буферным раствором с рН 4,80, кондуктивностью 14,0 мСм/см с линейной скоростью 21,0 см/ч. Полученный раствор пропускают через колонку, заполненную сорбентом для аффинной хроматографии, который представляет собой смесь аффинных сорбентов, содержащую полиметакрилатные гранулы, ковалентно

- 3 043526 связанные с трисахаридным лигандом антигена А крови, и полиметакрилатные гранулы, ковалентно связанные с трисахаридным лигандом антигена В крови, с размером частиц 65 мкм. На колонке происходит сорбция изоагглютининов типа А и В, иммуноглобулин G проходит через колонку транзитом в режиме фильтрации. Раствор пропускают с линейной скоростью 100 см/ч. Объем раствора иммуноглобулина после хроматографической очистки составляет 20-30 л, концентрация белка составляет 30 мг/мл.

Далее в растворе после хроматографической очистки устанавливают содержание белка 25 мг/мл с помощью 0,2М натрий-ацетатного буферного раствора с рН 4,95, кондуктивностью 12,5 мСм/см и проводят нанофильтрацию раствора иммуноглобулина под давлением воздуха через систему из последовательно соединенных фильтров с задерживающим рейтингом 0,2 мкм и 20 нм. Первый фильтр в системе предназначен для предварительной очистки раствора, а второй для удаления вирусных частиц. Объем раствора иммуноглобулина после противовирусной нанофильтрации составляет 24-36 л.

Проводят диафильтрацию раствора иммуноглобулина против глицинового буферного раствора с концентрацией глицина 2,0% и рН 3,95 при температуре (20±5)°С с использованием модулей из ацетата целлюлозы с порогом отсечения 30 кДа. После диафильтрации получают раствор иммуноглобулина с концентрацией белка 50-120 г/л, рН 4,0-4,5, концентрацией глицина 2,0%. Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации и проводят дополнительную инактивацию вирусов путем выдерживания раствора при рН 4,0-4,5, температуре 36,0-38,0°С в течение 24-48 ч.

При получении иммуноглобулина G в соответствии с заявленным способом выход продукта составляет 4,4 г с 1 л плазмы.

Пример 2.

9,5 кг осадка II+III спиртового фракционирования плазмы крови по Кону растворяют в 30 мМ натрий-ацетатном буферном растворе с рН 5,65, кондуктивностью 2100 мкСм/см в соотношении 1:10 при температуре (5±3)°С. Объем раствора осадка II+III составляет 95 л. После чего в растворе осадка II+III устанавливают рН 5,30 и перемешивают в течение 1-2 ч при температуре (20±5)°С. Раствор после перемешивания осветляют с помощью центрифугирования.

Центрифугат (около 93,5 л) подвергают вирусной сольвент-детергентной инактивации в присутствии смеси вирусинактивирующих агентов (сольвент-детергента), в качестве которых используют твин-80 и трибутилфосфат. Концентрация твин-80 и трибутилфосфата в растворе осадка II+III составляет 1.0% и 0,35% соответственно. Полученный раствор перемешивают при температуре (20±5)°С в течение 6-16 ч. Скорость перемешивания устанавливают такой, чтобы исключить вспенивание раствора.

Далее проводят коррекцию рН вирусинактивированного раствора до значений рН 5,65, кондуктивности 2100 мкСм/см, выдерживают при температуре (20±5)°С в течение 3 ч и фильтруют через глубинный фильтр с задерживающим рейтингом 0,65-4,0 мкм.

Затем раствор пропускают через три последовательно соединенные хроматографические колонны. Хроматографические колонны заполняют сорбентом таким же образом, как это было описано в примере 1.

Перед процессом сорбции хроматографические колонны уравновешивают натрий-ацетатным буферным раствором с концентрацией 30 мМ, рН 5,65, кондуктивностью 2100 мкСм/см. Раствор пропускают с линейной скоростью 85 см/ч. После завершения процесса сорбции первые две колонны отключают и передают на регенерацию, а третью колонну промывают 2 объемами колонны натрий-ацетатным буферным раствором, затем 1% раствором твин-80 (10 объемов колонны); 20% раствором этилового спирта (5 объемов колонны), затем 5 объемами колонны натрий-ацетатного буферного раствора концентрацией 30 мМ, рН 5,65, кондуктивностью 2100 мкСм/см.

Далее проводят элюирование иммуноглобулина G с хроматографической колонны, заполненной катионообменным сорбентом. Элюирование иммуноглобулина G проводят 0,35 М натрий-ацетатным буферным раствором с рН 5,80, кондуктивностью 17,0 мСм/см с линейной скоростью 42,5 см/ч. Полученный раствор пропускают через колонку, заполненную сорбентом для аффинной хроматографии как указано в примере 1. Объем раствора иммуноглобулина после хроматографической очистки составляет 2030 л.

Далее в растворе после хроматографической очистки устанавливают содержание белка 31 мг/мл с помощью 0,35 М натрий-ацетатного буферного раствора с рН 5,65, кондуктивностью 15,5 мСм/см и проводят нанофильтрацию раствора иммуноглобулина под давлением воздуха через систему из последовательно соединенных фильтров с задерживающим рейтингом 0,2 мкм и 20 нм. Первый фильтр в системе предназначен для предварительной очистки раствора, а второй для удаления вирусных частиц. Объем раствора иммуноглобулина после противовирусной нанофильтрации составляет 30-40 л.

- 4 043526

Проводят диафильтрацию раствора иммуноглобулина против глицинового буферного раствора с концентрацией глицина 3,0% и рН 4,05 при температуре (20±5)°С с использованием модулей из ацетата целлюлозы с порогом отсечения 30 кДа. После диафильтрации получают раствор иммуноглобулина с концентрацией белка 50-120 г/л, рН 4,5, концентрацией глицина 3,0%. Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации и проводят дополнительную инактивацию вирусов путем выдерживания раствора при рН 4,5, температуре 36,0-38,0°С в течение 24-48 ч.

При получении иммуноглобулина G в соответствии с заявленным способом выход продукта составляет 4,8 г с 1 л плазмы.

Claims (5)

1. Способ получения иммуноглобулина G для внутривенного введения, включающий растворение осадка II+III спиртового фракционирования плазмы крови по Кону в буферном растворе, вирусную сольвент-детергентную инактивацию раствора и его хроматографическую очистку через систему из трех последовательно соединенных колонн, заполненных соответственно гидрофобным, анионообменным и катионообменными сорбентами, с последующим элюированием иммуноглобулина G с колонны, заполненной катионообменным сорбентом, отличающийся тем, что перед хроматографической очисткой проводят фильтрацию вирусинактивированного раствора через глубинный фильтр с задерживающим рейтингом 0,65-4,0 мкм, при этом после элюирования полученный раствор иммуноглобулина G подвергают последовательным стадиям очистки через колонну, заполненную сорбентом для аффинной хроматографии, нанонфильтрации под давлением воздуха через систему из последовательно соединенных фильтров с задерживающим рейтингом 0,2 мкм и 20 нм, диафильтрации раствора иммуноглобулина против раствора глицина, стерилизующей фильтрации и выдерживании раствора при низком значении рН, причем перед нанонфильтрацией устанавливают содержание белка в растворе иммуноглобулина до 25-31 мг/мл, а перед стерилизующей фильтрацией раствор концентрируют до достижения содержания белка 50-120 мг/мл.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве гидрофобного сорбента используют агарозу с фенильными функциональными группами и размером частиц 45-165 мкм.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве анионообменного сорбента используют поперечно-сшитый полистиролдивинилбензол с функциональными группами четвертичного полиэтиленимина, средним размером частиц 50 мкм, размером пор не менее 500 и не более 10000 А.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве катионообменного сорбента используют поперечно-сшитый полистиролдивинилбензол с сульфопропильными функциональными группами, средним размером частиц 50 мкм, размером пор не менее 500 и не более 10000 А.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве сорбента для аффинной хроматографии используют смесь аффинных сорбентов, которая содержит полиметакрилатные гранулы, ковалентно связанные с трисахаридным лигандом антигена А крови, и полиметакрилатные гранулы, ковалентно связанные с трисахаридным лигандом антигена В крови, с размером частиц 65 мкм.