EA042982B1

EA042982B1 - MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST THE HUMAN TRBV9 BETA CHAIN

Info

Publication number: EA042982B1
Application number: EA202191813
Authority: EA
Inventors: Ольга Владимировна Британова; Дмитрий Борисович Староверов; Анна Валентиновна Евстратьева; Алексей Константинович Мисорин; Тимофей Александрович Неманкин; Мария Александровна Щемелева; Анна Константиновна Владимирова; Арина Витальевна Аникина; Роман Алексеевич Иванов; Дмитрий Валентинович Морозов; Павел Андреевич Яковлев; Сергей Анатольевич Лукьянов
Original assignee: Закрытое Акционерное Общество "Биокад"
Priority date: 2018-12-25
Filing date: 2020-02-20
Publication date: 2023-04-12

Description

Предшествующий уровень техникиPrior Art

Причиной возникновения аутоиммунных заболеваний являются аутореактивные Т-лимфоциты (Haroon N. et al., Arthritis Rheum, 2013 Oct, 65(10):2645-54; Duarte J. et al., PloS One, 2010 May 10, 5(5):e10558; Konig M. et al., Front Immunol., 2016 Jan 25, 7:11). Из уровня техники известно, что маркером, позволяющим идентифицировать клон Т-лимфоцитов, вовлеченный в патогенез аутоиммунного заболевания, является последовательность Т-клеточного рецептора (ТКР). Субъединицы Т-клеточных рецепторов структурно относятся к суперсемейству иммуноглобулинов и формируются из нескольких генных сегментов. Вариабельные участки ТКР образуют антигенсвязывающий центр ТКР. Это означает, что они клоноспецифичны, т.е. отличаются у Т-лимфоцитов, реагирующих на разные антигены.Autoimmune diseases are caused by autoreactive T-lymphocytes (Haroon N. et al., Arthritis Rheum, 2013 Oct, 65(10):2645-54; Duarte J. et al., PloS One, 2010 May 10, 5(5) :e10558; Konig M. et al., Front Immunol., 2016 Jan 25, 7:11). It is known from the prior art that the T-cell receptor (TCR) sequence is a marker for identifying a T-lymphocyte clone involved in the pathogenesis of an autoimmune disease. Subunits of T-cell receptors are structurally related to the immunoglobulin superfamily and are formed from several gene segments. The variable regions of the TCR form the antigen-binding center of the TCR. This means that they are clone-specific, i.e. differ in T-lymphocytes that react to different antigens.

По аминокислотной гомологии вариабельных (V) генных сегментов, входящих в состав вариабельного домена ТКР, Т-клеточные рецепторы подразделяют на различные семейства. Согласно номенклатуре IMGT для бета-цепи выделяют 26 различных семейств, а для альфа-цепи - 41 семейство (Turner S.J. et al., Nature Reviews Immunology, 2006, vol. 6, 883-894). Для определения семейства цепи ТКР используют множественное выравнивание тестируемой аминокислотной последовательности с известными последовательностями цепей ТКР, информация о которых суммирована в базе данных IMGT (The international ImMunoGeneTics information system, Lefranc M-P., Nucl. Acids. Res., 2001, 29:207-209), доступной в сети Интернет по адресу: http://www.imgt.org. Множественное выравнивание и определение семейства цепи ТКР может быть осуществлено с помощью пакета программ IgBlast.According to the amino acid homology of the variable (V) gene segments that make up the TCR variable domain, T-cell receptors are divided into different families. According to the IMGT nomenclature, there are 26 different families for the beta chain and 41 families for the alpha chain (Turner S.J. et al., Nature Reviews Immunology, 2006, vol. 6, 883-894). To determine the TCR chain family, multiple alignment of the tested amino acid sequence with known TCR chain sequences is used, information about which is summarized in the IMGT database (The international ImMunoGeneTics information system, Lefranc M-P., Nucl. Acids. Res., 2001, 29:207-209 ) available on the Internet at: http://www.imgt.org. Multiple alignment and TCR chain family determination can be performed using the IgBlast software package.

Описаны моноклональные антитела W112 и 2D1 к участкам бета-цепи вариабельных доменов Т-рецептора человека, относящихся к семействам TRBV5-3 TRBV8-1 (WO 9006758), предложенные в качестве инструмента для диагностики и терапии ревматоидного артрита. Данные моноклональные антитела узнают соответственно 0.3-5% периферических Т-лимфоцитов, несущих TRBV5-3 и 0.5-13%, периферических Т-лимфоцитов, несущих TRBV8-1. Основанием для использования моноклональных антител специфичных к участкам бета-цепей Т-рецепторов послужили результаты многих исследований, демонстрирующие вовлеченность Т-лимфоцитов в патогенез ревматоидного артрита. В частности, данные статьи F.M. Brennan et al., Clin. Exp. Immunol., 1988 Sep, 73(3):417-423, где было продемонстрировано увеличение процентного содержания Т-лимфоцитов, несущих TRBV5 TRBV8 в синовиальных образцах пациентов, страдающих ревматоидным артритом, по сравнению со здоровыми донорами. Также для диагностики и терапии ревматоидного артрита описаны моноклональные антитела, взаимодействующие с эпитопом вариабельной области VB3.1 Т-клеточного рецептора человека (WO 9405801), которые взаимодействуют с подсемейством ТКР V(бета)3.1.Monoclonal antibodies W112 and 2D1 to regions of the beta chain of the human T receptor variable domains belonging to the TRBV5-3 TRBV8-1 families (WO 9006758) proposed as a tool for the diagnosis and therapy of rheumatoid arthritis are described. These monoclonal antibodies recognize, respectively, 0.3-5% of peripheral T-lymphocytes carrying TRBV5-3 and 0.5-13% of peripheral T-lymphocytes carrying TRBV8-1. The basis for the use of monoclonal antibodies specific to the regions of beta-chains of T-receptors was the results of many studies demonstrating the involvement of T-lymphocytes in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. In particular, these articles by F.M. Brennan et al., Clin. Exp. Immunol., 1988 Sep, 73(3):417-423, which demonstrated an increase in the percentage of TRBV5-TRBV8-bearing T lymphocytes in synovial samples from rheumatoid arthritis patients compared to healthy donors. Also described for the diagnosis and therapy of rheumatoid arthritis are monoclonal antibodies that interact with the epitope of the VB3.1 variable region of the human T-cell receptor (WO 9405801), which interact with the TCR V(beta)3.1 subfamily.

Также описаны моноклональные антитела, специфично узнающие бета-цепь 13-го семейства ТРК крысы. На модельных животных показано, что с помощью этих антител возможно превентивное удаление небольшой популяции Т-клеток, Т-рецептор которых содержит бета-цепь VB13 (VB13+ Т-клетки), и показано, что такая процедура защищает от развития диабета I типа у крыс предрасположенной к этому заболеванию линии, а также значительно снижает риск развития вирус-индуцированного диабета (Zhijun Liu et al., Diabetes, 2012 May, 61(5):1160-1168). В то же время удаление Т-клеток, Т-рецептор которых содержит другое семейство бета-цепи (VB16), не отличается по результату от контрольных групп. Важно отметить, что уже первое введение моноклонального антитела против VB13 приводит к 60% снижению количества VB13+ Т-клеток в селезенке крыс.Also described are monoclonal antibodies that specifically recognize the beta chain of the 13th rat TRK family. In animal models, these antibodies have been shown to be able to preventively eliminate a small population of T cells whose T receptor contains the VB13 beta chain (VB13+ T cells), and this procedure has been shown to protect against the development of type I diabetes in predisposed rats. to this lineage disease, and also significantly reduces the risk of developing virus-induced diabetes (Zhijun Liu et al., Diabetes, 2012 May, 61(5):1160-1168). At the same time, the removal of T cells whose T receptor contains a different beta chain family (VB16) did not differ in result from the control groups. It is important to note that even the first administration of a monoclonal antibody against VB13 leads to a 60% decrease in the number of VB13+ T cells in the spleen of rats.

Описан консенсусный вариант аутоиммунных ТКР при анкилозирующем спондилите (АС или болезнь Бехтерева); показано, что он представлен у больных АС в синовиальной жидкости и периферической крови и отсутствует при той же глубине анализа у здоровых доноров независимо от статуса по аллелю HLA*B27 (Faham M. et al., Arthritis Rheumatol., 2017, 69(4):774-784; Komech E. et al., 12th EJI-EFIS Tatra Immunology Conference, 2016 Sep 3-7; Strbske Pleso, Slovakia, Abstract book p. 39). Указанные ТКР относятся к TRBV9 семейству (согласно номенклатуре IMGT). Показано, что Т-клеточные рецепторы, несущие бета-цепи семейства TRBV9, вовлечены также в развитие такого аутоиммунного заболевания как целиакия (Petersen J. et al., J. Immunol., 2015, 194(12):6112-22). Также они обнаруживаются на поверхности Т-клеток, подверженных маглинизации в случае Т-клеточных лимфом и Т-клеточных лейкемий, в том числе Т-клеточной лимфомы, вызванной вирусом Эпштейн-Барр (EBV) (Toyabe S. et al., Clin. Exp. Immunol., 2003, 134(1):92-97).A consensus variant of autoimmune TCR in ankylosing spondylitis (AS or Bechterew's disease) has been described; it has been shown that it is present in the synovial fluid and peripheral blood in patients with AS and is absent at the same depth of analysis in healthy donors, regardless of the status of the HLA*B27 allele (Faham M. et al., Arthritis Rheumatol., 2017, 69(4) :774-784; Komech E. et al., 12th EJI-EFIS Tatra Immunology Conference, 2016 Sep 3-7; Strbske Pleso, Slovakia, Abstract book p. 39). These TCRs belong to the TRBV9 family (according to the IMGT nomenclature). It has been shown that T-cell receptors carrying beta-chains of the TRBV9 family are also involved in the development of such an autoimmune disease as celiac disease (Petersen J. et al., J. Immunol., 2015, 194(12):6112-22). They are also found on the surface of T cells prone to magnification in T-cell lymphomas and T-cell leukemias, including Epstein-Barr virus (EBV) T-cell lymphoma (Toyabe S. et al., Clin. Exp Immunol., 2003, 134(1):92-97).

Недавно описаны химерные моноклональные антитела, обладающие способностью специфически связываться с участком бета-цепи семейства TRBV9 Т-рецептора человека, которые могут использоваться при терапии аутоиммунных и онкологических заболеваний, в патогенез которых вовлечены ТКР, относя- 1 042982 щиеся к TRBV9 семейству, например АС, целиакии и некоторых Т-клеточных лимфом и Т-клеточных лейкемий (заявка на изобретение РФ 2017145662).Chimeric monoclonal antibodies have recently been described that have the ability to specifically bind to the beta chain region of the TRBV9 family of the human T receptor, which can be used in the treatment of autoimmune and oncological diseases, the pathogenesis of which involves TCR belonging to the TRBV9 family, for example, AC, celiac disease and some T-cell lymphomas and T-cell leukemias (application for the invention of the Russian Federation 2017145662).

Указанные антитела являются единственными известными сегодня антителами, которые могут быть использованы для элиминации Т-клеток, несущих ТКР семейства TRBV9. Основным недостатком указанных антител является их относительно низкая степень гуманизации; они содержат свойственные человеку константные области и структурные компоненты, но имеют вариабельный домен, свойственный крысе. Степень гуманизации вариабельного фрагмента тяжелой цепи указанных антител составляет 72%, а вариабельного фрагмента легкой цепи - 69%.These antibodies are the only antibodies known today that can be used to eliminate T cells carrying TCRs from the TRBV9 family. The main disadvantage of these antibodies is their relatively low degree of humanization; they contain human constant regions and structural components, but have a rat-specific variable domain. The degree of humanization of the variable fragment of the heavy chain of these antibodies is 72%, and the variable fragment of the light chain - 69%.

Вышеуказанное родительское моноклональное антитело, включаетThe above parent monoclonal antibody includes

1) вариабельный домен их тяжелой цепи (VH), который содержит 3 гипервариабельных участка HCDR1, HCDR2 и HCDR3, где1) their heavy chain variable domain (VH), which contains 3 hypervariable regions HCDR1, HCDR2 and HCDR3, where

HCDR1 (согласно номенклатуре Kabat) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1;HCDR1 (according to Kabat nomenclature) has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;

HCDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2;HCDR2 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;

HCDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3;HCDR3 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3;

2) вариабельный домен их легкой цепи (VL), который содержит 3 гипервариабельных участка LCDR1, LCDR2 и LCDR3, в которых2) their light chain variable domain (VL), which contains 3 hypervariable regions LCDR1, LCDR2 and LCDR3, in which

LCDR1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;LCDR1 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;

LCDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5;LCDR2 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5;

LCDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.LCDR3 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.

Вышеуказанное родительское моноклональное антитело включает вариабельные домены тяжелой и легкой цепей, которые имеют аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 8 и 10.The above parental monoclonal antibody includes heavy and light chain variable domains that have the amino acid sequences shown in SEQ ID NOS: 8 and 10.

Вышеуказанное родительское моноклональное антитело включает легкую цепь, которая имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 12, и тяжелую цепь антитела, которая имеет аминокислотную последовательность - SEQ ID NO: 14.The above parental monoclonal antibody comprises a light chain which has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 and an antibody heavy chain which has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14.

Примеры нуклеотидных последовательностей, кодирующих указанные аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей вышеуказанного родительского антитела, приведены в SEQ ID NO: 13 и 11.Examples of nucleotide sequences encoding the indicated heavy and light chain amino acid sequences of the above parent antibody are shown in SEQ ID NOS: 13 and 11.

Изобретение направлено на создание моноклонального антитела, которое может быть использовано для элиминации Т-клеток, несущих ТКР семейства TRBV9, в частности, для терапии АС, целиакии и злокачественных заболеваний крови, в патогенез которых вовлечены ТКР семейства TRBV9, и которое отличается высокой степенью гуманизации. Гуманизация в тоже время часто приводит к критическому снижению аффинности и/или растворимости антител. Таким образом, получение гуманизированных функциональных антител является актуальной задачей.The invention is directed to the creation of a monoclonal antibody that can be used to eliminate T cells carrying TCRs of the TRBV9 family, in particular, for the treatment of AS, celiac disease and malignant blood diseases, in the pathogenesis of which TCRs of the TRBV9 family are involved, and which is characterized by a high degree of humanization. Humanization at the same time often leads to a critical decrease in the affinity and/or solubility of antibodies. Thus, obtaining humanized functional antibodies is an urgent task.

Краткое описание изобретенияBrief description of the invention

Настоящее изобретение относится к гуманизированному моноклональному антителу и его антигенсвязывающему фрагменту, которые обладают способностью с высокой аффинностью специфически связываться с участком бета-цепи семейства TRBV9 Т-рецептора человека. Антитело согласно изобретению может использоваться в качестве лекарственного средства для лечения аутоиммунных и онкологических заболеваний, в патогенез которых вовлечены ТКР, относящиеся к TRBV9 семейству, например АС, целиакии и некоторых Т-клеточных лимфом и Т-клеточных лейкемий.The present invention relates to a humanized monoclonal antibody and antigen-binding fragment thereof, which have the ability to specifically bind to the beta chain region of the TRBV9 family of the human T receptor with high affinity. The antibody according to the invention can be used as a drug for the treatment of autoimmune and oncological diseases, the pathogenesis of which involves TCR belonging to the TRBV9 family, such as AS, celiac disease and some T-cell lymphomas and T-cell leukemias.

В преимущественных воплощениях антитело настоящего изобретения содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH) с тремя гипервариабельными участками:In preferred embodiments, an antibody of the present invention comprises a heavy chain variable domain (VH) with three hypervariable regions:

1) HCDR 1 (согласно номенклатуре Kabat) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1;1) HCDR 1 (according to Kabat nomenclature) has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;

2) HCDR 2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2;2) HCDR 2 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;

3) HCDR 3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3;3) HCDR 3 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3;

вариабельный домен легкой цепи (VL) с тремя гипервариабельными участками LCDR1, LCDR2 и LCDR3, в которыхlight chain variable domain (VL) with three hypervariable regions LCDR1, LCDR2 and LCDR3, in which

LCDR 1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;LCDR 1 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;

LCDR 2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5;LCDR 2 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5;

LCDR 3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.LCDR 3 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.

Здесь и далее при определении CDR антител используется известная номенклатура Kabat, если отдельно не оговорено иное.Hereinafter, when determining the CDR of antibodies, the known nomenclature of Kabat is used, unless otherwise specified.

При этом вариабельные домены тяжелой и легкой цепей антитела содержат аминокислотные замены в FR фрагментах вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей, повышающие степень гуманизации антитела по сравнению с родительским антителом.At the same time, the variable domains of the heavy and light chains of the antibody contain amino acid substitutions in the FR fragments of the variable domains of the heavy and light chains, which increase the degree of humanization of the antibody compared to the parent antibody.

В преимущественных воплощениях вариабельный домен тяжелой цепи антитела настоящего изобретения имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 16, и отличается от вариабельного домена тяжелой цепи родительского антитела, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID NO: 8, наличием гуманизирующих аминокислотных замен.In preferred embodiments, the heavy chain variable domain of an antibody of the present invention has the sequence shown in SEQ ID NO: 16 and differs from the heavy chain variable domain of the parent antibody, the amino acid sequence of which is shown in SEQ ID NO: 8, by the presence of humanizing amino acid substitutions.

В некоторых воплощениях вариабельный домен тяжелой цепи антитела настоящего изобретения содержит дополнительные аминокислотные замены, не влияющие на специфичность антитела.In some embodiments, the heavy chain variable domain of an antibody of the present invention contains additional amino acid substitutions that do not affect the specificity of the antibody.

В преимущественных воплощениях вариабельный домен легкой цепи антитела настоящего изобре- 2 042982 тения имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 18, и отличается от вариабельного домена тяжелой цепи родительского антитела, аминокислотная последовательность которого показана вIn preferred embodiments, the light chain variable domain of an antibody of the present invention has the sequence shown in SEQ ID NO: 18 and is different from the heavy chain variable domain of the parent antibody, the amino acid sequence of which is shown in SEQ ID NO: 18.

SEQ ID NO: 10, наличием гуманизирующих аминокислотных замен.SEQ ID NO: 10, the presence of humanizing amino acid substitutions.

В некоторых воплощениях вариабельный домен легкой цепи антитела настоящего изобретения содержит дополнительные аминокислотные замены, не влияющие на специфичность антитела.In some embodiments, the light chain variable domain of an antibody of the present invention contains additional amino acid substitutions that do not affect the specificity of the antibody.

В некоторых воплощениях моноклональные антитела по изобретению являются полноразмерными антителами IgG человека, например IgG1, или IgG2, или IgG3, или IgG4.In some embodiments, the monoclonal antibodies of the invention are full-length human IgG antibodies, such as IgG1 or IgG2 or IgG3 or IgG4.

В некоторых воплощениях антитело согласно изобретению включает тяжелую цепь, аминокислотная последовательность которой идентична по крайней мере на 85%, или идентична по крайней мере на 90%, или идентична по крайней мере на 91%, или идентична по крайней мере на 92%, или идентична по крайней мере на 93%, или по крайней мере на 94%, или по крайней мере на 95%, или по крайней мере на 96%, или по крайней мере на 97%, или по крайней мере на 98%, или по крайней мере на 99%, или идентична на 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20.In some embodiments, an antibody of the invention comprises a heavy chain whose amino acid sequence is at least 85% identical, or at least 90% identical, or at least 91% identical, or at least 92% identical, or identical to at least 93% or at least 94% or at least 95% or at least 96% or at least 97% or at least 98% or at least at least 99%, or 100% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.

В некоторых воплощениях антитело согласно изобретению включает легкую цепь, аминокислотная последовательность которой идентична по крайней мере на 85%, или идентична по крайней мере на 90%, или идентична по крайней мере на 91%, или идентична по крайней мере на 92%, или идентична по крайней мере на 93%, или по крайней мере на 94%, или по крайней мере на 95%, или по крайней мере на 96%, или по крайней мере на 97%, или по крайней мере на 98%, или по крайней мере на 99%, или идентична на 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 22.In some embodiments, an antibody of the invention comprises a light chain whose amino acid sequence is at least 85% identical, or at least 90% identical, or at least 91% identical, or at least 92% identical, or identical to at least 93% or at least 94% or at least 95% or at least 96% or at least 97% or at least 98% or at least at least 99%, or 100% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22.

В некоторых воплощениях антитело имеет легкую цепь, аминокислотная последовательность которой показана в SEQ ID NO: 22, и тяжелую цепь, аминокислотная последовательность которой показана в SEQ ID NO: 20.In some embodiments, the antibody has a light chain, the amino acid sequence of which is shown in SEQ ID NO: 22, and a heavy chain, the amino acid sequence of which is shown in SEQ ID NO: 20.

Также обеспечиваются нуклеиновые кислоты, которые кодируют вариабельные домены тяжелой и легкой цепей антитела согласно изобретению, нуклеиновые кислоты, кодирующие тяжелую и легкую цепи антител согласно изобретению и функциональные фрагменты антител.Also provided are nucleic acids that encode the heavy and light chain variable domains of an antibody of the invention, nucleic acids that encode the heavy and light chains of antibodies of the invention, and functional antibody fragments.

Также обеспечиваются кассеты экспрессии и экспрессионные векторы, включающие нуклеиновую кислоту настоящего изобретения и регуляторные элементы, необходимые для экспрессии нуклеиновой кислоты в выбранной клетке-хозяине. Вектор или кассета экспрессии могут находиться в клетке-хозяине как внехромосомный элемент или интегрироваться в геном клетки в результате введения (путем трансфекции) указанной кассеты экспрессии или вектора в клетку.Also provided are expression cassettes and expression vectors comprising the nucleic acid of the present invention and the regulatory elements necessary for the expression of the nucleic acid in the selected host cell. The expression vector or cassette can be present in the host cell as an extrachromosomal element or integrated into the cell's genome by introducing (by transfection) said expression cassette or vector into the cell.

Кроме того, обеспечиваются клетки и стабильные клеточные линии, включающие нуклеиновые кислоты, векторы или экспрессионные кассеты настоящего изобретения, а также способы их получения.In addition, cells and stable cell lines are provided, including nucleic acids, vectors or expression cassettes of the present invention, as well as methods for their preparation.

Также обеспечивается способ получения вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, заключающийся в культивировании вышеуказанной клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, обеспечивающих продукцию указанного антитела. В некоторых воплощениях способ включает последующее выделение и очистку полученного антитела.Also provided is a method for producing the above antibody or its antigen-binding fragment, which consists in culturing the above host cell in a culture medium under conditions that ensure the production of the specified antibody. In some embodiments, the method includes subsequent isolation and purification of the resulting antibody.

Также обеспечивается фармацевтическая композиция для профилактики или лечения заболевания или нарушения, опосредуемого участком бета-цепи семейства TRBV9 Т-рецептора человека, содержащая вышеуказанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами.Also provided is a pharmaceutical composition for preventing or treating a disease or disorder mediated by the beta chain region of the TRBV9 family of the human T receptor, comprising the above antibody or antigen-binding fragment thereof, in combination with one or more pharmaceutically acceptable excipients.

В одном из вариантов фармацевтическая композиция предназначена для профилактики или лечения заболевания или нарушения, выбранного из следующей группы: анкилозирующий спондилит, целиакия, Т-клеточный лейкоз, Т-клеточная лимфома.In one embodiment, the pharmaceutical composition is for the prevention or treatment of a disease or disorder selected from the following group: ankylosing spondylitis, celiac disease, T-cell leukemia, T-cell lymphoma.

Также обеспечивается фармацевтическая комбинация для профилактики или лечения заболевания или нарушения, опосредуемого Т-клеточным рецептором человека, несущим бета-цепь семейства TRBV9, содержащая вышеуказанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и по меньшей мере одно другое терапевтически активное соединение.Also provided is a pharmaceutical combination for the prevention or treatment of a disease or disorder mediated by a human T-cell receptor carrying a beta chain of the TRBV9 family, containing the above antibody or antigen-binding fragment and at least one other therapeutically active compound.

В одном из вариантов фармацевтическая комбинация предназначена для профилактики или лечения заболевания или нарушения, выбранного из следующей группы: анкилозирующий спондилит, целиакия, Т-клеточный лейкоз, Т-клеточная лимфома.In one embodiment, the pharmaceutical combination is for the prevention or treatment of a disease or disorder selected from the following group: ankylosing spondylitis, celiac disease, T-cell leukemia, T-cell lymphoma.

В одном из вариантов фармацевтическая комбинация или композиция включают другое терапевтически активное соединение, которое выбирают из малой молекулы, антитела или стероидных гормонов, например кортикостероидов.In one embodiment, the pharmaceutical combination or composition comprises another therapeutically active compound selected from a small molecule, an antibody, or steroid hormones, such as corticosteroids.

Также обеспечивается способ ингибирования биологической активности Т-клеточного рецептора, бета-цепь которого относится к семейству TRBV9, у субъекта, нуждающегося в таком ингибировании, включающий введение субъекту эффективного количества вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.Also provided is a method for inhibiting the biological activity of a T cell receptor whose beta chain belongs to the TRBV9 family in a subject in need of such inhibition, comprising administering to the subject an effective amount of the above antibody or antigen-binding fragment thereof.

Также обеспечивается способ лечения заболевания или нарушения, опосредованного Т-клеточным рецептором человека, несущим бета-цепь семейства TRBV9, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или вышеуказанной фармацевтической композиции, в терапевтически эффективном количестве.Also provided is a method for treating a disease or disorder mediated by a human T-cell receptor carrying a beta chain of the TRBV9 family, comprising administering to a subject in need of such treatment, the above antibody or antigen-binding fragment or the above pharmaceutical composition, in a therapeutically effective amount.

В одном из вариантов способа лечения заболевания или нарушения заболевание или нарушение вы- 3 042982 брано из следующей группы: анкилозирующий спондилит, целиакия, Т-клеточный лейкоз, Т-клеточная лимфома.In one embodiment of the method for treating a disease or disorder, the disease or disorder is selected from the following group: ankylosing spondylitis, celiac disease, T-cell leukemia, T-cell lymphoma.

Также обеспечивается применение вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или вышеуказанной фармацевтической композиции для лечения у субъекта, нуждающегося в таком лечении, заболевания или нарушения, опосредуемого Т-клеточным рецептором человека, несущим бета-цепь семейства TRBV9.Also provided is the use of the above antibody, or an antigen-binding fragment thereof, or the above pharmaceutical composition for the treatment, in a subject in need of such treatment, of a disease or disorder mediated by a human T-cell receptor carrying the beta chain of the TRBV9 family.

В одном из вариантов применения заболевание выбрано из следующей группы: анкилозирующий спондилит, целиакия, Т-клеточный лейкоз, Т-клеточная лимфома.In one application, the disease is selected from the following group: ankylosing spondylitis, celiac disease, T-cell leukemia, T-cell lymphoma.

Технический результат настоящего изобретения состоит в получении антител с повышенной степенью гуманизации, которые специфически с высокой аффинностью связываются с ТКР, бета-цепь которых относится к TRBV9 семейству и могут быть использованы для терапии аутоиммунных и онкологических заболеваний, в патогенез которых вовлечены ТКР, бета-цепь которых относится к TRBV9 семейству.The technical result of the present invention is to obtain antibodies with a high degree of humanization that specifically bind with high affinity to TCR, the beta chain of which belongs to the TRBV9 family and can be used for the treatment of autoimmune and oncological diseases, the pathogenesis of which involves TCR, the beta chain which belongs to the TRBV9 family.

В преимущественных воплощениях вариабельный фрагмент тяжелой цепи антитела характеризуется степенью гуманизации 84%. В преимущественных воплощениях вариабельный фрагмент легкой цепи антитела характеризуется степенью гуманизации 85%.In preferred embodiments, the antibody heavy chain variable fragment has a degree of humanization of 84%. In preferred embodiments, the antibody light chain variable fragment has a degree of humanization of 85%.

Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention

Настоящее изобретение относится к изолированным моноклональным антителам и их функциональным фрагментам, обладающим способностью специфически связываться с участком бета-цепи семейства TRBV9 Т-рецептора человека с повышенной степенью гуманизации относительно аналогов.The present invention relates to isolated monoclonal antibodies and their functional fragments, which have the ability to specifically bind to the region of the beta chain of the TRBV9 family of the human T receptor with an increased degree of humanization relative to analogues.

Также обеспечиваются нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела и их фрагменты по изобретению, кассеты экспрессии и экспрессионные векторы, включающие нуклеиновую кислоту настоящего изобретения и регуляторные элементы, необходимые для экспрессии нуклеиновой кислоты в выбранной клетке-хозяине.Also provided are nucleic acids encoding antibodies and fragments thereof of the invention, expression cassettes, and expression vectors comprising the nucleic acid of the invention and the regulatory elements necessary for expression of the nucleic acid in a selected host cell.

Кроме того, обеспечиваются клетки и стабильные клеточные линии, включающие нуклеиновые кислоты, векторы или экспрессионные кассеты настоящего изобретения.In addition, cells and stable cell lines are provided that include the nucleic acids, vectors, or expression cassettes of the present invention.

Также обеспечиваются способ получения моноклонального антитела или его функционального фрагмента, фармацевтическая композиция и фармацевтическая комбинация, содержащая в эффективном количестве антитело настоящего изобретения, в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами, разбавителями или носителями и способы диагностики и терапии АС и иных заболеваний с использованием антител настоящего изобретения.Also provided are a method for producing a monoclonal antibody or a functional fragment thereof, a pharmaceutical composition and a pharmaceutical combination containing an antibody of the present invention in an effective amount in combination with one or more pharmaceutically acceptable excipients, diluents or carriers, and methods for diagnosing and treating AS and other diseases using antibodies. of the present invention.

Определения.Definitions.

С целью более легкого понимания изобретения сначала определяются некоторые термины.For the purpose of easier understanding of the invention, some terms are first defined.

Следует понимать, что материалы и способы, предлагаемые в данном документе, не ограничиваются конкретными композициями или этапами способа, поскольку они могут варьироваться. Указано, что, как используется в данном описании и приложенной формуле изобретения, формы единственного числа включают и соответствующие формы во множественном числе, если контекст явно не предписывает иное.It should be understood that the materials and methods provided herein are not limited to specific compositions or method steps, as they may vary. It is indicated that, as used in this specification and the appended claims, the singular forms include the corresponding plural forms, unless the context clearly dictates otherwise.

Т-клеточный рецептор, также указанный как ТРК, Т-рецептор или TCR человека представляет собой гетеродимерный белковый комплекс, расположенный на поверхности Т-лимфоцита. Т-рецептор присутствует только на Т-лимфоцитах. Основная функция ТКР заключается в специфическом распознавании процессированных антигенов, связанных с молекулами главного комплекса гистосовместимости (HLA).The T cell receptor, also referred to as TRK, T receptor or human TCR, is a heterodimeric protein complex located on the surface of the T lymphocyte. The T receptor is present only on T lymphocytes. The main function of TCR is the specific recognition of processed antigens associated with major histocompatibility complex (HLA) molecules.

ТКР человека состоит из двух субъединиц, α и β либо γ и δ цепей, связанных между собой дисульфидной связью и закрепленных в клеточной мембране. Каждая из цепей ТКР имеет N-концевой вариабельный (V) домен, соединительный домен и константный (С) домен, соединенный с трансмембранным доменом, закрепляющим рецептор в плазматической мембране Т-лимфоцита. Протяженность константного домена альфа- и бета-цепей составляет 91 и 129 аминокислотных остатков соответственно. Длина соединительного и трансмембранного домена альфа-цепи - 30 и 17 аминокислотных остатков (а.о.), а у бета-цепи - 21 и 22 а.о. Протяженность вариабельных доменов Т-рецепторов варьирует от 104 до 125 а.о.Human TCR consists of two subunits, α and β or γ and δ chains, linked by a disulfide bond and anchored in the cell membrane. Each of the TCR chains has an N-terminal variable (V) domain, a junction domain, and a constant (C) domain connected to a transmembrane domain that anchors the receptor in the T-lymphocyte plasma membrane. The length of the constant domain of the alpha and beta chains is 91 and 129 amino acid residues, respectively. The length of the connecting and transmembrane domain of the alpha chain is 30 and 17 amino acid residues (a.a.), while the length of the beta chain is 21 and 22 a.a. The length of the variable domains of T receptors varies from 104 to 125 a.a.

Небольшая фракция Т-лимфоцитов располагает Т-рецепторами типа γ/δ. По своему устройству они аналогичны α/β рецепторам, но отличаются по первичной структуре и имеют ряд функциональных особенностей. Их вариабельность гораздо ниже (ограниченная клоноспецифичность), они распознают антигены в комплексе с неклассическими (не МНС) антигенпредставляющими молекулами или даже свободные антигены.A small fraction of T-lymphocytes has T-receptors of the γ/δ type. In their structure, they are similar to α/β receptors, but differ in their primary structure and have a number of functional features. Their variability is much lower (limited clone specificity), they recognize antigens in combination with non-classical (non-MHC) antigen-presenting molecules or even free antigens.

Т-рецептор взаимодействует с комплексом МНС-антиген шестью участками, определяющими его комплементарность (CDR): три участка альфа-цепи и три бета-цепи. Эти CDR представляют собой гипервариабельные участки, петли вариабельных доменов Т-клеточного рецептора - Va и Ve.The T receptor interacts with the MHC-antigen complex through six complementarity determining regions (CDRs): three alpha chain regions and three beta chain regions. These CDRs are hypervariable regions, loops of the T-cell receptor variable domains Va and Ve.

Термины TRBV9 или семейство TRBV9 относятся к девятому семейству бета-цепей Т-клеточных рецепторов, выделяемому согласно номенклатуре IMGT, которое характеризуется тем, что аминокислотная последовательность их вариабельного домена включает уникальные мотивы CDR1 (по- 4 042982 следовательность аминокислот - S-G-D-L-S) и CDR2 (последовательность аминокислот - Y-Y-N-G-E-E).The terms TRBV9 or the TRBV9 family refer to the ninth family of T-cell receptor beta chains, defined according to the IMGT nomenclature, which is characterized in that the amino acid sequence of their variable domain includes the unique motifs CDR1 (amino acid sequence - S-G-D-L-S) and CDR2 (sequence amino acids - Y-Y-N-G-E-E).

Термин ТКР семейства TRBV9 обозначает Т-клеточный рецептор, бета-цепь которого относится кThe term TCR of the TRBV9 family denotes a T-cell receptor whose beta chain refers to

TRBV9 семейству.TRBV9 family.

Термин патологический по отношению к Т-лимфоцитам или ТКР означает, что данное ТКР или Т-лимфоцит, его несущий, ассоциированы с заболеванием или патологией, и/или являются причиной заболевания, и/или способствуют развитию заболевания.The term pathological in relation to T-lymphocytes or TCR means that a given TCR, or a T-lymphocyte carrying it, is associated with a disease or pathology, and / or is the cause of the disease, and / or contributes to the development of the disease.

Термин аутоиммунный по отношению к ТКР означает, что данное ТКР вовлечено в развитие аутоиммунного заболевания.The term autoimmune in relation to TCR means that this TCR is involved in the development of an autoimmune disease.

Термин антитело, используемый здесь, предназначен для определения молекулы иммуноглобулина, состоящей из четырех полипептидных цепей (две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи), связанных дисульфидными связями. Легкие цепи классифицируют как каппа или лямбда. Тяжелые цепи классифицируют как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон, и они определяют изотип антитела, такой как IgG, IgM, IgA, IgD и IgE соответственно, и несколько из них могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), например IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Каждый тип тяжелой цепи характеризуется конкретным константным участком.The term antibody as used herein is intended to refer to an immunoglobulin molecule consisting of four polypeptide chains (two heavy (H) chains and two light (L) chains) linked by disulfide bonds. Light chains are classified as kappa or lambda. Heavy chains are classified as gamma, mu, alpha, delta or epsilon and they define the isotype of an antibody such as IgG, IgM, IgA, IgD and IgE respectively, and several of these can be further divided into subclasses (isotypes) such as IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2. Each type of heavy chain is characterized by a particular constant region.

Каждая тяжелая цепь содержит вариабельный участок тяжелой цепи (сокращенный здесь как HCVR или VH) и константный участок тяжелой цепи. Константный участок тяжелой цепи содержит три домена CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь содержит вариабельный участок легкой цепи (сокращенный здесь как LCVR или VL) и константный участок легкой цепи. Константный участок легкой цепи содержит один домен CL. Участки VH и VL могут далее подразделяться на участки гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность участками (CDR), окруженные участками, которые являются более консервативными, называемыми скелетными участками (FR). Каждая из VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR участков, расположенных от амино- до карбоксильного конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.Each heavy chain contains a heavy chain variable region (abbreviated here as HCVR or VH) and a heavy chain constant region. The heavy chain constant region contains three domains CH1, CH2 and CH3. Each light chain contains a light chain variable region (abbreviated here as LCVR or VL) and a light chain constant region. The light chain constant region contains one CL domain. The VH and VL regions can be further subdivided into regions of hypervariability, called complementarity determining regions (CDRs), surrounded by regions that are more conserved, called skeletal regions (FRs). Each of VH and VL consists of three CDRs and four FR regions, arranged from amino to carboxyl terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

В данной заявке 3 CDR тяжелые цепи обозначены как HCDR1, HCDR2 и HCDR3, а 3 CDR легкой цепи обозначены как LCDR1, LCDR2 и LCDR3. CDR содержат большинство остатков, которые образуют специфические взаимодействия с антигеном. Нумерацию и позиционирование CDR-аминокислотных остатков в пределах HCVR и LCVR участков антител согласно данному изобретению осуществляют с хорошо известной номенклатурой Kabat, если не указано иного. В настоящей заявке используется, если не указано иного, общепринятые буквенные обозначения аминокислот.In this application, the 3 heavy chain CDRs are referred to as HCDR1, HCDR2, and HCDR3, and the 3 light chain CDRs are referred to as LCDR1, LCDR2, and LCDR3. CDRs contain most of the residues that form specific interactions with the antigen. The numbering and positioning of the CDR-amino acid residues within the HCVR and LCVR regions of the antibodies of this invention is carried out with the well-known Kabat nomenclature, unless otherwise indicated. This application uses, unless otherwise indicated, conventional letter designations for amino acids.

Термины анти-TRBV9-антитело, антитело к TRBV9, антитело, специфически связывающееся с бета-цепью семейства TRBV9 или антитело против бета-цепи семейства TRBV9 и им подобные являются взаимозаменяемыми в контексте настоящей заявки и относятся к антителу, которое специфически связывается с эпитопом бета-цепи семейства TRBV9 Т-клеточного рецептора человека.The terms anti-TRBV9 antibody, anti-TRBV9 antibody, antibody specifically binding to the beta chain of the TRBV9 family, or anti-beta chain antibody of the TRBV9 family and the like are used interchangeably in the context of this application and refer to an antibody that specifically binds to an epitope of beta- chains of the TRBV9 family of the human T-cell receptor.

Кроме того, моноклональное антитело, как используется в данной заявке, может быть одноцепочечным Fv-фрагментом, который может быть получен путем связывания ДНК, кодирующей LCVR и HCVR, с линкерной последовательностью (см. Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, p. 269-315, 1994). Подразумевается, что вне зависимости от того, указаны ли фрагменты или части, термин антитело, как используется в данной заявке, включает такие фрагменты или части, а также одноцепочечные формы. До тех пор, пока белок сохраняет способность специфического или предпочтительного связывания своей мишени (например, эпитопа или антигена), он относится к термину антитело. Антитела могут быть гликозилированными или не быть таковыми и входят в рамки изобретения.In addition, the monoclonal antibody as used herein may be a single chain Fv fragment, which may be obtained by linking the DNA encoding LCVR and HCVR to a linker sequence (see Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315, 1994). Regardless of whether fragments or portions are indicated, the term antibody, as used in this application, is intended to include such fragments or portions as well as single chain forms. As long as a protein retains the ability to specifically or preferentially bind to its target (eg, an epitope or antigen), it is referred to as an antibody. Antibodies may or may not be glycosylated and are within the scope of the invention.

Термины антитело и моноклональное антитело для нужд настоящей заявки относятся к моноклональному антителу против ТКР семейства TRBV9. Как используется в настоящей заявке моноклональное антитело относится к антителу грызуна, семейства приматов или Camelidae, предпочтительно к антителу мыши, макаки, верблюда или ламы, химерному антителу, гуманизированному антителу или полностью человеческому антителу, если не указано иное.The terms antibody and monoclonal antibody for the purposes of this application refer to the anti-TCR monoclonal antibody of the TRBV9 family. As used herein, a monoclonal antibody refers to a rodent, primate, or Camelidae antibody, preferably a mouse, macaque, camel, or llama antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody, or a fully human antibody, unless otherwise indicated.

Популяция моноклональных антител относится к гомогенной или по существу гомогенной популяции антител (т.е. по крайней мере приблизительно 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96%, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 97 или 98% или еще более предпочтительно по крайней мере 99% антител в популяции будут конкурировать в анализе ELISA за тот же антиген или эпитоп или более предпочтительно антитела являются идентичными в аминокислотной последовательности). Антитела могут быть, а могут и не быть гликолизированными и все еще подпадать в объем изобретения.A monoclonal antibody population refers to a homogeneous or substantially homogeneous antibody population (i.e., at least about 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, more preferably at least about 97% or 98% or more more preferably at least 99% of the antibodies in the population will compete in the ELISA for the same antigen or epitope or more preferably the antibodies are identical in amino acid sequence). Antibodies may or may not be glycosylated and still fall within the scope of the invention.

Моноклональные антитела могут быть гомогенными, если они имеют идентичную аминокислотную последовательность, хотя они могут отличаться по посттрансляционной модификации, например паттерн гликолизации.Monoclonal antibodies may be homogeneous if they have an identical amino acid sequence, although they may differ in post-translational modification, such as glycolization pattern.

Вариабельные участки каждой из пар легкая/тяжелая цепь образуют антигенсвязывающие сайты антитела. Как используется в данной заявке, антигенсвязывающая часть, или антигенсвязывающий участок, или антигенсвязывающий домен, или антигенсвязывающий центр относятся взаимозаменяемо к такой части молекулы антитела, которая содержит аминокислотные остатки, взаимодействующие с антигеном и придающие антителу его специфичность и аффинность по отношению к антигену. ЭтаThe variable regions of each of the light/heavy chain pairs form the antigen-binding sites of the antibody. As used herein, an antigen-binding portion, or an antigen-binding site, or an antigen-binding domain, or an antigen-binding site refer interchangeably to that portion of an antibody molecule that contains amino acid residues that interact with the antigen and confer on the antibody its specificity and affinity for the antigen. This

- 5 042982 часть антитела включает каркасные аминокислотные остатки, необходимые для поддержания надлежащей конформации антигенсвязывающих остатков.- 5 042982 part of the antibody includes framework amino acid residues necessary to maintain the proper conformation of antigen-binding residues.

Термин человеческое антитело, используемый здесь, означает антитело, в котором последовательности вариабельных и константных доменов происходят от человеческих последовательностей. Человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут включать остатки аминокислот, нехарактерные для человека (например, мутации, интродуцированные ненаправленным или сайт-специфическим мутагенезом in vitro или соматической мутацией in vivo), например, в CDR и особенно в CDR3.The term human antibody as used herein means an antibody in which the variable and constant domain sequences are derived from human sequences. Human antibodies of the invention may include non-human amino acid residues (eg, mutations introduced by non-targeted or site-directed mutagenesis in vitro or somatic mutation in vivo), for example, in CDRs and especially in CDR3.

Термин гуманизированные по отношению к антителам используются для обозначения антител, которые характеризуются наличием свойственных человеку константных областей и структурных компонентов, но имеют обусловливающие комплементарность участки (CDR), которые свойственны иммуноглобулинам иного происхождения или соответствующим фрагментам модифицированных антител.The term humanized in relation to antibodies is used to refer to antibodies that are characterized by the presence of human constant regions and structural components, but have complementarity-determining regions (CDRs) that are characteristic of immunoglobulins of other origin or corresponding fragments of modified antibodies.

Родительское антитело в данной заявке - это антитело, кодированное аминокислотной последовательностью, которая используется для получения варианта. Родительское антитело может быть из грызуна, ламы, химерным, гуманизированным или человеческим антителом.The parent antibody in this application is an antibody encoded by the amino acid sequence that is used to obtain the variant. The parent antibody may be from a rodent, llama, chimeric, humanized or human antibody.

Термин степень гуманизации по отношению к антителам используются для обозначения процента идентичности последовательности каркасного участка гуманизированного антитела относительно первичного человеческого акцепторного каркасного участка, который был использован для создания гуманизированного антитела и который доступен из человеческой библиотеки. Предпочтительно антитело изобретения содержит каркасный участок с идентичностью не менее 80%, обычно не менее 82%, чаще не менее 83%, например не менее 84%, или не менее 85%, или не менее 86%, или не менее 87% идентичностью в отношении к каркасному участку, полученному из человеческой библиотеки.The term degree of humanization with respect to antibodies is used to denote the percentage sequence identity of a humanized antibody framework relative to the primary human acceptor framework that was used to generate the humanized antibody and is available from the human library. Preferably, the antibody of the invention contains a framework region with at least 80% identity, usually at least 82%, more often at least 83%, for example at least 84%, or at least 85%, or at least 86%, or at least 87% identity in relation to the framework plot obtained from the human library.

Термин гуманизирующие замены относятся к аминокислотным заменам, которые увеличивают степень гуманизации антитела или его фрагмента.The term humanizing substitutions refers to amino acid substitutions that increase the degree of humanization of an antibody or fragment thereof.

Термин химерные по отношению к антителам настоящего изобретения используются для обозначения антител, которые характеризуются наличием свойственных человеку константных областей, но имеют вариабельные домены иного происхождения. В таких антителах вариабельные домены легких и/или тяжелых цепей, имеющие нечеловеческое происхождение (например, взятые из крысы), оказываются оперативно связаны с константными доменами соответствующих цепей человеческого происхождения.The term chimeric in relation to antibodies of the present invention is used to refer to antibodies that are characterized by the presence of human constant regions, but have variable domains of a different origin. In such antibodies, light and/or heavy chain variable domains of non-human origin (eg, taken from rats) are operably linked to the constant domains of the corresponding human chains.

Термин оперативно связанный или ему подобный при описании антител относиться к полипептидным последовательностям, которые находятся в физической (ковалентной, если не указано иного) и функциональной связи одна с другой. В наиболее предпочтительных воплощениях функции полипептидных компонентов химерной молекулы не изменены по сравнению с функциональными свойствами выделенных полипептидных компонентов.The term operably linked or similar when describing antibodies refers to polypeptide sequences that are in physical (covalent unless otherwise indicated) and functional relationship with one another. In the most preferred embodiments, the functions of the polypeptide components of the chimeric molecule are unchanged from those of the isolated polypeptide components.

Термин оперативно связанный или ему подобный при описании нуклеиновых кислот означает, что нуклеиновые кислоты ковалентно связаны таким образом, что в местах их соединения отсутствуют сбойки рамки считывания и стоп-кодоны. Как очевидно для любого специалиста в данной области техники, нуклеотидные последовательности, кодирующие химерный белок, включающий оперативно связанные компоненты (белки, полипептиды, линкерные последовательности, белковые домены и т.д.), состоят из фрагментов, кодирующих указанные компоненты, где эти фрагменты ковалентно связаны таким образом, что в ходе трансляции и транскрипции нуклеотидной последовательности продуцируется полноразмерный химерный белок, например химерное антитело согласно изобретению.The term operatively linked or similar when describing nucleic acids means that nucleic acids are covalently linked in such a way that there are no frame breaks and stop codons at their junctions. As is obvious to any person skilled in the art, nucleotide sequences encoding a chimeric protein, including operably linked components (proteins, polypeptides, linker sequences, protein domains, etc.), consist of fragments encoding these components, where these fragments are covalently linked in such a way that during translation and transcription of the nucleotide sequence, a full length chimeric protein is produced, for example a chimeric antibody of the invention.

Как здесь используется, термины изолированный и выделенный означают молекулу или клетку, которые находятся в среде, отличной от среды, в которой молекула или клетка находятся в естественных условиях.As used here, the terms isolated and isolated mean a molecule or cell that is in an environment different from the environment in which the molecule or cell is in natural conditions.

В преимущественных воплощениях антитела настоящего изобретения являются рекомбинантными, т.е. полученными с помощью техники рекомбинантных ДНК.In preferred embodiments, the antibodies of the present invention are recombinant, i. obtained using recombinant DNA technology.

Термин рекомбинантное антитело, используемый здесь, включает все антитела, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены рекомбинантными средствами, такие как антитела, экспрессированные с использованием рекомбинантного экспрессирующего вектора, введенного в клеткухозяин, антитела, выделенные из набора известных рекомбинантных комбинаторных человеческих антител, антитела, выделенные из животного, которое является трансгенным в отношении генов человеческого иммуноглобулина (см., например, Taylor L.D. et al. (1992), Nucl. Acids Res., 20:6287-6295). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные человеческие антитела подвергают мутагенезу in vitro (или, если используют животное, трансгенное по последовательностям Ig человека соматическому мутагенезу in vivo) и таким образом аминокислотные последовательности участков VH и VL рекомбинантных антител являются последовательностями, которые, поскольку они выделены из последовательностей зародышевых VH и VL человека и близки к ним, не могут в естественных условиях существовать в зародышевом наборе антител человека in vivo.The term recombinant antibody as used herein includes all antibodies that are made, expressed, generated or isolated by recombinant means, such as antibodies expressed using a recombinant expression vector introduced into a host cell, antibodies isolated from a set of known recombinant combinatorial human antibodies, antibodies, isolated from an animal that is transgenic for human immunoglobulin genes (see, for example, Taylor L. D. et al. (1992), Nucl. Acids Res., 20:6287-6295). In some embodiments, recombinant human antibodies are subjected to in vitro mutagenesis (or, if an animal transgenic for human Ig sequences is used, somatic in vivo mutagenesis) and thus the amino acid sequences of the VH and VL regions of the recombinant antibodies are sequences that, because they are isolated from germline sequences Human VH and VL and close to them cannot naturally exist in the human germline in vivo.

Термин специфически связывает, как используется в данной заявке, относится к той ситуации, при которой один участник пары специфического связывания не связывает в значительной степени молекулы, отличные от его партнера (партнеров) по специфическому связыванию.The term specifically binds, as used herein, refers to that situation in which one member of a specific binding pair does not significantly bind molecules other than its specific binding partner(s).

- 6 042982- 6 042982

Термин также применим, когда, например, антигенсвязывающий домен антитела по изобретению является специфическим для конкретного эпитопа, который переносится рядом антигенов, в таком случае специфическое антитело, имеющее антигенсвязывающий домен, будет способно к специфическому связыванию различных антигенов, несущих эпитоп. Соответственно моноклональное антитело по изобретению специфически связывает эпитоп бета-цепи Т-клеточного рецептора человека, относящегося к семейству TRBV9, в то время как оно специфически не связывает бета-цепи ТКР других семейств и альфа-цепи ТКР.The term is also applicable when, for example, the antigen-binding domain of an antibody of the invention is specific for a particular epitope that is carried by a number of antigens, in which case the specific antibody having the antigen-binding domain will be capable of specifically binding to different epitope-bearing antigens. Accordingly, the monoclonal antibody of the invention specifically binds an epitope of the beta chain of the human T cell receptor belonging to the TRBV9 family, while it does not specifically bind the beta chains of TCRs of other families and the alpha chains of TCRs.

Термин эпитоп относится к той части молекулы, которая способна распознаваться и связываться с антителом в одном или более антигенсвязывающих участках антитела. Эпитопы часто состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или сахарные боковые цепи, и обладают специфическими трехмерными структурными характеристиками, а также специфическими зарядовыми характеристиками.The term epitope refers to that portion of a molecule that is capable of being recognized by and bound to an antibody at one or more antigen-binding sites on the antibody. Epitopes often consist of reactive surface groups of molecules, such as amino acids or sugar side chains, and have specific three-dimensional structural characteristics as well as specific charge characteristics.

Термин эпитоп, как используется в данной заявке, кроме того, относится к части полипептида, которая обладает антигенной и/или иммуногенной активностью у животного, предпочтительно млекопитающего, например мыши, крысы или человека. Термин антигенный эпитоп, как используется в данной заявке, определяется как часть полипептида, с которой может специфически связываться антитело, определенная любым способом, хорошо известным из уровня техники, например, при помощи традиционного иммунного анализа. Антигенные эпитопы не обязательно должны быть иммуногенными, но могут также быть иммуногенными. Иммуногенный эпитоп, как используется в данной заявке, определяется как часть полипептида, который вызывает отклик антитела у животного, как устанавливается любым способом, известным из уровня техники. Нелинейный эпитоп или конформационный эпитоп содержат несмежные полипептиды (или аминокислоты) в пределах антигенного протеина, с которым антитело, специфическое к эпитопу, связывается.The term epitope as used herein also refers to a portion of a polypeptide that has antigenic and/or immunogenic activity in an animal, preferably a mammal, such as a mouse, rat or human. The term antigenic epitope, as used herein, is defined as the portion of a polypeptide to which an antibody can specifically bind, as determined by any method well known in the art, such as by conventional immunoassay. Antigenic epitopes need not be immunogenic, but may also be immunogenic. An immunogenic epitope, as used herein, is defined as the portion of a polypeptide that elicits an antibody response in an animal, as determined by any method known in the art. A non-linear epitope or conformational epitope comprises non-contiguous polypeptides (or amino acids) within an antigenic protein to which an epitope-specific antibody binds.

Выражения биологическое свойство или биологическая характеристика или термины активность или биоактивность по отношению к антителу и его функциональным фрагментам по изобретению используются в данной заявке как взаимозаменяемые и включают, но не ограничиваются приведенными, эпитоп/антигенную аффинность и специфичность, способность ингибировать или быть антагонистом активности ТКР, в состав которого входит бета-цепь, принадлежащая к семейству TRBV9.The expressions biological property or biological characteristic or the terms activity or bioactivity with respect to an antibody and its functional fragments of the invention are used interchangeably in this application and include, but are not limited to, epitope/antigenic affinity and specificity, the ability to inhibit or antagonize TCR activity, which includes a beta chain belonging to the TRBV9 family.

Остальные идентифицируемые из уровня техники биологические свойства или характеристики антитела включают, например, перекрестную реактивность (т.е. с нечеловеческими гомологами пептидамишени или с остальными протеинами или мишенями, в общем) и способность сохранять высокие уровни экспрессии протеина в клетках млекопитающих. Вышеуказанные свойства или характеристики могут наблюдаться, измеряться или оцениваться с использованием методик, признанных в уровне техники, включая, но не ограничиваясь приведенными, анализ ELISA, конкурентный анализ ELISA, BIACORE или анализ поверхностного плазмонного резонанса KINEXA, анализы ингибирования in vitro или in vivo без ограничений рецепторного связывания, продуцирования и/или секреции цитокина или фактора роста, сигнальную трансдукцию и иммуногистохимию срезов тканей, полученных из различных источников, включая человека, примата или любой другой источник.Other biological properties or characteristics of an antibody identifiable in the art include, for example, cross-reactivity (i.e., with non-human homologues of the target peptide or with other proteins or targets in general) and the ability to maintain high levels of protein expression in mammalian cells. The above properties or characteristics may be observed, measured, or evaluated using techniques recognized in the art, including, but not limited to, ELISA assay, competitive ELISA, BIACORE or KINEXA surface plasmon resonance assay, in vitro or in vivo inhibition assays, without limitation. receptor binding, production and/or secretion of a cytokine or growth factor, signal transduction, and immunohistochemistry of tissue sections obtained from various sources, including human, primate, or any other source.

Термины ингибировать или нейтрализовать, как используется в данной заявке, по отношению к активности антитела по изобретению, означают способность в значительной степени противодействовать, препятствовать, предотвращать, ограничивать, замедлять, прерывать, уничтожать, прекращать, уменьшать, например, развитие или тяжесть того, что ингибируют, включая, но не ограничиваясь вышеприведенными, биологическую активность антитела или свойство, заболевание или состояние.The terms inhibit or neutralize, as used herein, in relation to the activity of an antibody of the invention, means the ability to substantially antagonize, interfere with, prevent, limit, slow down, interrupt, eradicate, stop, reduce, for example, the development or severity of what inhibit, including, but not limited to, the biological activity of an antibody or property, disease, or condition.

Как здесь используется, термин мутант или вариант относится к антителу, раскрытому в настоящем изобретении, в котором одна или более аминокислот добавлены, и/или замещены, и/или удалены (делетированы), и/или вставлены (инсертированы) в N-конец и/или С-конец, и/или в пределах нативных аминокислотных последовательностей антител настоящего изобретения или их фрагментов. Как здесь используется, термин мутант также относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует мутантный белок. Кроме того, термин мутант относится к любому варианту, который короче или длиннее белка или нуклеиновой кислоты.As used herein, the term mutant or variant refers to an antibody of the present invention in which one or more amino acids are added and/or substituted and/or deleted (deleted) and/or inserted (inserted) at the N-terminus and /or the C-terminus, and/or within the native amino acid sequences of the antibodies of the present invention or fragments thereof. As used here, the term mutant also refers to a nucleic acid molecule that encodes a mutated protein. In addition, the term mutant refers to any variant that is shorter or longer than a protein or nucleic acid.

Термин гомология используется для описания взаимосвязи последовательностей нуклеотидов или аминокислот с другими последовательностями нуклеотидов или аминокислот, которая определена степенью идентичности и/или сходства между указанными сравниваемыми последовательностями.The term homology is used to describe the relationship of nucleotide or amino acid sequences to other nucleotide or amino acid sequences, as determined by the degree of identity and/or similarity between said compared sequences.

Как здесь используется, аминокислотная или нуклеотидная последовательности по существу сходны или по существу такие же как референсная последовательность, если аминокислотная или нуклеотидная последовательности имеют по крайней мере 85% идентичности с указанной последовательностью внутри выбранного для сравнения региона. Таким образом, по существу сходные последовательности включают те, которые имеют, например, по крайней мере 90% идентичности, или по крайней мере 91% идентичности, или по крайней мере 92% идентичности, или по крайней мере 93% идентичности, или по крайней мере 94% идентичности, или по крайней мере 95% идентичности, или по крайней мере 96% идентичности, или по крайней мере 97% идентичности, или по крайней мере 98% идентичности, или по крайней мере 99% идентичности. Две последовательности, которые идентичны одна другой, также поAs used herein, an amino acid or nucleotide sequence is substantially similar or substantially the same as a reference sequence if the amino acid or nucleotide sequence shares at least 85% identity with the specified sequence within the region selected for comparison. Thus, substantially similar sequences include those that have, for example, at least 90% identity, or at least 91% identity, or at least 92% identity, or at least 93% identity, or at least 94% identity, or at least 95% identity, or at least 96% identity, or at least 97% identity, or at least 98% identity, or at least 99% identity. Two sequences that are identical to one another are also

- 7 042982 существу сходны.- 7 042982 essentially similar.

Идентичность последовательностей определяется на основании референсной последовательности. Алгоритмы для анализа последовательности известны в данной области, такие как IgBLAST, описанный в Ye et al., Nucleic. Acids. Res., 2013, W34-40. Для целей настоящего изобретения для определения уровня идентичности и сходства между нуклеотидными последовательностями и аминокислотными последовательностями может быть использовано сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, производимое с помощью пакета программ IgBLAST, предоставляемого National Center for Biotechnology Information (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) с использованием содержащего разрывы выравнивания со стандартными параметрами. Для вычисления процента идентичности используется полная длина референсной последовательности, например, вариабельного региона.Sequence identity is determined based on the reference sequence. Algorithms for sequence analysis are known in the art, such as IgBLAST as described in Ye et al., Nucleic. Acids. Res., 2013, W34-40. For the purposes of the present invention, comparison of nucleotide and amino acid sequences using the IgBLAST software package provided by the National Center for Biotechnology Information (https://www.ncbi.nlm.nih) can be used to determine the level of identity and similarity between nucleotide sequences and amino acid sequences. .gov/igblast/) using discontinuous alignment with default settings. The full length of the reference sequence, such as the variable region, is used to calculate percent identity.

Ссылка на нуклеотидную последовательность кодирующую полипептид означает, что с нуклеотидной последовательности в ходе трансляции и транскрипции мРНК продуцируется этот полипептид. При этом может быть указана как кодирующая цепь, идентичная мРНК и обычно используемая в списке последовательностей, так и комплементарная цепь, которая используется как матрица при транскрипции. Как очевидно для любого специалиста в данной области техники, термин также включает любые вырожденные нуклеотидные последовательности, кодирующие одинаковую аминокислотную последовательность. Нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептид, включают последовательности, содержащие интроны.Reference to a nucleotide sequence encoding a polypeptide means that this polypeptide is produced from the nucleotide sequence during translation and transcription of the mRNA. In this case, both the coding strand, identical to mRNA and usually used in the sequence listing, and the complementary strand, which is used as a template for transcription, can be indicated. As is obvious to any person skilled in the art, the term also includes any degenerate nucleotide sequences encoding the same amino acid sequence. Nucleotide sequences encoding a polypeptide include sequences containing introns.

Антитела.Antibodies.

Как указано выше, настоящее изобретение относится к изолированным моноклональным гуманизированным антителам и их функциональным фрагментам, обладающим способностью специфически связываться с участком бета-цепи семейства TRBV9 Т-рецептора человека.As stated above, the present invention relates to isolated humanized monoclonal antibodies and functional fragments thereof, which are capable of specifically binding to the beta chain region of the TRBV9 family of the human T receptor.

Антитела согласно изобретению могут быть химерными, гуманизированными или человеческими антителами или их антигенсвязывающими фрагментами и могут использоваться в качестве лекарственного средства для лечения АС и других заболеваний, в патогенез которых вовлечены ТКР, относящиеся к TRBV9 семейству, например целиакии или Т-клеточной лимфомы.The antibodies of the invention may be chimeric, humanized or human antibodies or antigen-binding fragments thereof and may be used as a drug for the treatment of AS and other diseases in which TCRs belonging to the TRBV9 family are involved, such as celiac disease or T-cell lymphoma.

Антитело согласно изобретению является моноклональным. Моноклональные антитела по изобретению могут быть получены с использованием, например, гибридомных методик, хорошо известных из уровня техники, а также рекомбинантных технологий, технологий фагового дисплея, синтетических технологий или комбинаций таких технологий или других технологий, хорошо известных из уровня техники. Термин моноклональное антитело, используемый в данной заявке, относится к антителу, полученному из единой копии или клона, включая, например, любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон, а не к способу его получения.The antibody of the invention is monoclonal. Monoclonal antibodies of the invention can be prepared using, for example, hybridoma techniques well known in the art, as well as recombinant techniques, phage display techniques, synthetic techniques or combinations of such techniques, or other techniques well known in the art. The term monoclonal antibody, as used in this application, refers to an antibody obtained from a single copy or clone, including, for example, any eukaryotic, prokaryotic or phage clone, and not to the method of obtaining it.

Гуманизированные и химерные антитела могут быть получены пептидным синтезом или с использованием техники рекомбинантных ДНК, как описано ниже в разделе Нуклеиновые кислоты.Humanized and chimeric antibodies can be produced by peptide synthesis or using recombinant DNA techniques, as described below in the Nucleic Acids section.

В некоторых воплощениях антитела настоящего изобретения являются химерными и характеризуются тем, что имеют вариабельные домены легкой и тяжелой цепей нечеловеческого происхождения (например, крысиного или мышиного), а константные домены, характерные для человека.In some embodiments, the antibodies of the present invention are chimeric and are characterized in that they have light and heavy chain variable domains of non-human origin (eg, rat or mouse) and human constant domains.

Антитело настоящего изобретения содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH) с тремя гипервариабельными участкамиAn antibody of the present invention contains a heavy chain variable domain (VH) with three hypervariable regions

1) HCDR1 (согласно номенклатуре Kabat) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1;1) HCDR1 (according to Kabat nomenclature) has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;

2) HCDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2;2) HCDR2 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;

3) HCDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3;3) HCDR3 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3;

LC DR 1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;LC DR 1 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;

LC DR 2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5;LC DR 2 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5;

LC DR 3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.LC DR 3 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.

Во всех воплощениях вариабельные домены легкой и тяжелой цепей антитела настоящего изобретения гуманизированы и отличаются от вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей родительского антитела гуманизирующими аминокислотными заменами, при этом вариабельные домены тяжелой и легкой цепей антитела содержат аминокислотные замены в FR фрагментах вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей, повышающие степень гуманизации антитела по сравнению с родительским антителом.In all embodiments, the variable domains of the light and heavy chains of an antibody of the present invention are humanized and differ from the variable domains of the light and heavy chains of the parent antibody by humanizing amino acid substitutions, while the variable domains of the heavy and light chains of the antibody contain amino acid substitutions in the FR fragments of the heavy and light chain variable domains, enhancing the degree of humanization antibodies compared to the parent antibody.

В преимущественных воплощениях вариабельный домен тяжелой цепи антитела настоящего изобретения имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 16, и отличается от вариабельного домена тяжелой цепи родительского антитела, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID NO: 8, наличием гуманизирующих аминокислотных замен.In preferred embodiments, the heavy chain variable domain of an antibody of the present invention has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 and differs from the heavy chain variable domain of the parent antibody, the amino acid sequence of which is shown in SEQ ID NO: 8, by the presence of humanizing amino acid substitutions.

- 8 042982- 8 042982

В преимущественных воплощениях вариабельный домен легкой цепи антитела настоящего изобретения содержит аминокислотные замены, имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 18, и отличается от вариабельного домена тяжелой цепи родительского антитела, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID NO: 10, наличием гуманизирующих аминокислотных замен.In preferred embodiments, the light chain variable domain of an antibody of the present invention contains amino acid substitutions, has the sequence shown in SEQ ID NO: 18, and differs from the heavy chain variable domain of the parent antibody, the amino acid sequence of which is shown in SEQ ID NO: 10, by the presence of humanizing amino acid substitutions .

Из уровня техники известно, что в последовательности антител, включая вариабельные домены, могут быть внесены мутации, которые не затрагивают по существу способность антитела связываться с антигеном. Антитела согласно настоящему изобретению могут также содержать дополнительные мутации, которые не приводят к потере способности антитела связывать бета-цепь ТКР семейства TRBV9, но могут приводить к снижению антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности или увеличению аффинности или других биологических свойств антител. В частности, из уровня техники хорошо известно, что в последовательности антител могут быть внесены консервативные замены аминокислот. Под консервативной заменой в контексте заявки подразумевается замена, при которой остаток аминокислоты замещается другим остатком аминокислоты, имеющим близкую боковую цепь. Семейства остатков аминокислот, имеющих близкие боковые цепи, определены в уровне техники, в том числе основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислые боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), β-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Предпочтительно в участки CDR3 в доменах VL и/или VH делают не более пяти консервативных замен аминокислот, чаще не более трех консервативных замен. Как правило, консервативные замены не делают в положениях аминокислот, критических для связывания эпитопа бета-цепи семейства TRBV9.It is known in the art that mutations can be introduced in antibody sequences, including variable domains, that do not substantially affect the ability of the antibody to bind to an antigen. The antibodies of the present invention may also contain additional mutations that do not result in the loss of the ability of the antibody to bind the TRBV9 family TCR beta chain, but may result in a decrease in antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity or an increase in affinity or other biological properties of the antibodies. In particular, it is well known in the art that conservative amino acid substitutions can be made in antibody sequences. By conservative substitution in the context of the application is meant a substitution in which an amino acid residue is replaced by another amino acid residue having a close side chain. Families of amino acid residues having close side chains are defined in the art, including basic side chains (e.g., lysine, arginine, histidine), acidic side chains (e.g., aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar side chains (e.g., glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), nonpolar side chains (e.g. alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), β-branched side chains (e.g. threonine, valine, isoleucine) and aromatic side chains (eg tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine). Preferably, no more than five conservative amino acid substitutions are made in the CDR3 regions in the VL and/or VH domains, more often no more than three conservative substitutions. As a general rule, conservative substitutions are not made at amino acid positions critical for binding of the TRBV9 family beta chain epitope.

Описанные выше варианты (мутанты) антител согласно изобретению могут быть получены пептидным синтезом или с использованием техники рекомбинантных ДНК, как описано ниже в разделе Нуклеиновые кислоты.The above-described variants (mutants) of antibodies according to the invention can be obtained by peptide synthesis or using recombinant DNA techniques, as described below in the section Nucleic acids.

В предпочтительных воплощениях антитело содержит константный участок тяжелой цепи, такой как константный участок IgG1, IgG2, IgGS, IgG4, IgA, IgE, IgM, IgD человека. Предпочтительно константным участком тяжелой цепи является константный участок тяжелой цепи IgG1 человека. Более того, антитело может содержать либо константный участок легкой, цепи либо каппа-константный участок легкой цепи, либо лямбда-константный участок легкой цепи. Предпочтительно антитело содержит каппа-константный участок легкой цепи.In preferred embodiments, the antibody comprises a heavy chain constant region, such as a human IgG1, IgG2, IgGS, IgG4, IgA, IgE, IgM, IgD constant region. Preferably, the heavy chain constant region is a human IgG1 heavy chain constant region. Moreover, the antibody may contain either a light chain constant region or a light chain kappa constant region or a light chain lambda constant region. Preferably, the antibody contains a light chain kappa constant region.

Также обеспечиваются антигенсвязывающие фрагменты антител настоящего изобретения.Antigen-binding fragments of antibodies of the present invention are also provided.

Термин антигенсвязывающий фрагмент антитела (или функциональный фрагмент антитела, или активный фрагмент антитела), используемый здесь, относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связывать антиген. Показано, что антигенсвязывающая функция антитела может быть осуществлена фрагментами антитела полной длины.The term antigen-binding antibody fragment (or functional antibody fragment, or active antibody fragment) as used herein refers to one or more antibody fragments that retain the ability to specifically bind an antigen. It has been shown that the antigen-binding function of an antibody can be performed by full-length antibody fragments.

Примеры связывающих фрагментов, охватываемые термином антигенсвязывающий фрагмент антитела, включают (а) фрагмент Fab, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и СН1;Examples of binding fragments encompassed by the term antibody antigen-binding fragment include (a) a Fab fragment, a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL, and CH1 domains;

- 9 042982 (б) фрагмент F(ab')₂, бивалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, связанные дисульфидным мостиком в районе петли;- 9 042982 (b) a F(ab') ₂ fragment, a bivalent fragment containing two Fab fragments connected by a disulfide bridge in the region of the loop;

(в) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и СН1;(c) Fd fragment consisting of VH and CH1 domains;

(г) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела;(d) an Fv fragment consisting of the VL and VH domains of one antibody arm;

(д) фрагмент dAb (Ward et al. (1989), Nature, 341:544-546), который состоит из домена VH; и (е) выделенный участок (CDR), определяющий комплементарность.(e) a dAb fragment (Ward et al. (1989), Nature, 341:544-546) which consists of a VH domain; and (e) a dedicated region (CDR) that determines complementarity.

Более того, хотя два домена фрагмента Fv, VL и VH, кодируются отдельными генами, они могут быть рекомбинантными способами связаны с помощью синтетического линкера, который обеспечивает их получение в виде одной белковой цепи, в которой участки VL и VH спарены с образованием моновалентных молекул (известных как Fv одной цепи (scFv); см., например, Bird et al. (1988), Science, 242:423-426; Huston et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:5879-5883). Предполагается, что такие антитела из одной цепи также охватываются термином антигенсвязывающий фрагмент антитела. К ним относятся также другие формы антител из одной цепи, такие как диатела. Диатела являются бивалентными, биспецифическими антителами, в которых домены VH и VL экспрессируются на одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, который является слишком коротким, чтобы позволять спаривание двух доменов на одной и той же цепи, что заставляет домены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих сайта (см., например, Holliger P. et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:6444-6448; Poljak R.J. et al. (1994), Structure, 2:1121-1123).Moreover, although the two domains of the Fv fragment, VL and VH, are encoded by separate genes, they can be recombinantly linked using a synthetic linker, which provides them with a single protein chain, in which the VL and VH regions are paired to form monovalent molecules ( known as single chain Fvs (scFv), see for example Bird et al (1988) Science 242:423-426 Huston et al (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85 :5879-5883). It is contemplated that such single chain antibodies are also encompassed by the term antigen-binding antibody fragment. They also include other forms of single chain antibodies, such as diabodies. Diabodies are bivalent, bispecific antibodies in which the VH and VL domains are expressed on the same polypeptide chain, but using a linker that is too short to allow pairing of the two domains on the same chain, which causes the domains to pair with the complementary domains of the other chain. and create two antigen binding sites (see, for example, Holliger P. et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:6444-6448; Poljak R. J. et al. (1994), Structure, 2 :1121-1123).

Фрагменты антител, такие как Fab и F(ab')₂, могут быть получены из целых антител с использованием принятых способов, таких как разложение папаином или пепсином соответственно целых антител. Более того, антитела, фрагменты антител и молекулы иммуноадгезии могут быть получены с использованием стандартных способов с применением рекомбинантной ДНК.Antibody fragments such as Fab and F(ab') ₂ can be prepared from whole antibodies using conventional methods such as papain or pepsin digestion, respectively, of whole antibodies. Moreover, antibodies, antibody fragments and immunoadhesion molecules can be produced using standard methods using recombinant DNA.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть частью более крупных молекул иммуноадгезии, образованных ковалентной или нековалентной связью антитела или фрагмента антитела с одним или более белком или пептидом. Примеры таких молекул иммуноадгезии включают использование участка ядра стрептавидина для получения тетрамерной молекулы scFv (Kipriyanov S.M. et al. (1995), Human Antibodies and Hybridomas, 6:93-101) и использование остатка цистеина, маркерного пептида и С-концевой полигистидиновой метки для получения бивалентных и уменьшенных биомолекул scFv (Kipriyanov S.M. et al. (1994), Mol. Immunol., 31:1047-1058). Другие химические связывания фрагментов антител также хорошо известны из уровня техники.An antibody or antigen-binding fragment thereof may be part of larger immunoadhesion molecules formed by covalent or non-covalent bonding of an antibody or antibody fragment to one or more proteins or peptides. Examples of such immunoadhesion molecules include the use of a streptavidin core region to obtain a tetrameric scFv molecule (Kipriyanov S.M. et al. (1995), Human Antibodies and Hybridomas, 6:93-101) and the use of a cysteine residue, a marker peptide, and a C-terminal polyhistidine tag to obtain bivalent and reduced scFv biomolecules (Kipriyanov S.M. et al. (1994), Mol. Immunol., 31:1047-1058). Other chemical bindings of antibody fragments are also well known in the art.

Антитела и их функциональные фрагменты согласно изобретению находятся в изолированной форме, т.е. это означает, что данный белок по существу свободен от присутствия других белков или других природных биологических молекул, таких как олигосахариды, нуклеиновые кислоты и их фрагменты и т.п., где термин по существу свободен в данном случае означает, что менее чем 70%, обычно менее чем 60% и чаще менее чем 50% указанной композиции, содержащей выделенный белок, представляет собой другую природную биологическую молекулу.Antibodies and their functional fragments according to the invention are in isolated form, i. this means that the protein is essentially free from the presence of other proteins or other natural biological molecules such as oligosaccharides, nucleic acids and their fragments, etc., where the term is essentially free in this case means that less than 70%, typically less than 60% and more often less than 50% of said isolated protein composition is another naturally occurring biological molecule.

В некоторых вариантах указанные белки присутствуют по существу в очищенной форме, где термин по существу очищенная форма обозначает чистоту, равную по меньшей мере 95%, обычно равную по меньшей мере 97% и чаще равную по меньшей мере 99%.In some embodiments, said proteins are present in a substantially purified form, wherein the term substantially purified form means a purity of at least 95%, typically at least 97%, and more often at least 99%.

Способы очистки антитела, полученного путем рекомбинантной или гибридомной технологии хорошо известны из уровня техники, например очистка может быть осуществлена путем хроматографии (например, ионообменной, аффинной, особенно аффинной для специфичных антигенов - белка А или белка G, а также колоночной хроматографией размеров), центрифугирования, дифференциальной растворимости или любой другой стандартной методики для очистки белков. Кроме того, антитела по технологии в соответствии с настоящим изобретением или их фрагменты могут быть слиты с гетерологичными полипептидными последовательностями (например, гистидиновой меткой) для облегчения очистки.Methods for purifying an antibody obtained by recombinant or hybridoma technology are well known in the art, for example, purification can be carried out by chromatography (for example, ion exchange, affinity, especially affinity for specific antigens - protein A or protein G, as well as column chromatography of sizes), centrifugation , differential solubility, or any other standard technique for protein purification. In addition, antibodies according to the technology in accordance with the present invention, or fragments thereof, can be fused with heterologous polypeptide sequences (eg, a histidine tag) to facilitate purification.

Аффинность антитела можно определять с применением стандартного анализа через определение константы диссоциации (KD). KD вычисляется через уравнениеThe affinity of an antibody can be determined using a standard assay through the determination of the dissociation constant (KD). KD is calculated through the equation

KD=kdis/kon, где kdis - экспериментально вычисляемая константа скорости диссоциации, и kon - экспериментально вычисляемая константа скорости ассоциации комплекса антитело-антиген.KD=kdis/kon, where kdis is the experimentally calculated dissociation rate constant and kon is the experimentally calculated association rate constant of the antibody-antigen complex.

Предпочтительными антителами являются те, которые связывают антиген человека со значением KD не более чем приблизительно 1х10^-7 М; предпочтительно не более чем приблизительно 1х10’⁸ M; чаще не более чем приблизительно 1х10’⁹ М; более предпочтительно не более чем приблизительно 1х10’¹⁰ М и наиболее предпочтительно не более чем приблизительно 1х10^-11 М, например не более чем приблизительно 1х10^-12 М.Preferred antibodies are those that bind a human antigen with a KD value of no more than about 1 x 10 ^-7 M; preferably no more than about 1x10' ⁸ M; more often no more than about 1x10' ⁹ M; more preferably no more than about 1 x 10' ¹⁰ M, and most preferably no more than about 1 x 10 ^-11 M, such as no more than about 1 x 10 ^-12 M.

Антитела и их фрагменты, которые можно использовать в настоящих композициях и способах, являются биологически активными антителами и фрагментами, т.е. способны связывать желаемые антигенные эпитопы и проявлять биологический эффект непосредственно или опосредованно.Antibodies and fragments thereof that can be used in the present compositions and methods are biologically active antibodies and fragments, i. able to bind the desired antigenic epitopes and exert a biological effect directly or indirectly.

Антитела и их функциональные фрагменты согласно изобретению способны специфически связывать эпитоп (участок) бета-цепи семейства TRBV9. В преимущественных воплощениях в результате ихAntibodies and their functional fragments according to the invention are capable of specifically binding to an epitope (region) of the beta chain of the TRBV9 family. In preferred embodiments, as a result of their

- 10 042982 специфического связывания с бета-цепью семейства TRBV9 происходит ингибирование активности ТКР, включающих указанную бета-цепь. Как правило, ингибирование составляет предпочтительно, по крайней мере приблизительно, 20, или 30, или 40, или 50, или 60, или 70, или 80, или 90, или 95% или выше.- 10 042982 specific binding to the beta chain of the TRBV9 family inhibits the activity of TCR, including the specified beta chain. In general, inhibition is preferably at least about 20% or 30% or 40% or 50% or 60% or 70% or 80% or 90% or 95% or more.

В некоторых вариантах осуществления антитело против бета-цепи семейства TRBV9 согласно изобретению или его фрагмент может элиминировать Т-лимфоциты, несущие ТКР, содержащий бета-цепь семейства TRBV9. В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент согласно изобретению может обеспечивать по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% или приблизительно 100% элиминацию Т-лимфоцитов.In some embodiments, an anti-TRBV9 family beta chain antibody of the invention, or a fragment thereof, can eliminate T lymphocytes carrying a TCR containing a TRBV9 family beta chain. In some embodiments, an antibody or fragment thereof of the invention may provide at least about 20%, at least about 30%, at least about 40%, at least about 50%, at least about 60%, at least about 70%, at least about 80%, at least about 90%, at least about 95%, or about 100% elimination of T-lymphocytes.

В преимущественном варианте изобретения антитело представляет собой антитело МА-043.In a preferred embodiment of the invention, the antibody is a MA-043 antibody.

Антитело МА-043 включает вариабельные домены тяжелой и легкой цепей, которые имеют аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 16 и 18.The MA-043 antibody includes heavy and light chain variable domains that have the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 16 and 18.

Антитело МА-043 включает тяжелую и легкую цепи, которые имеют аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 20 и 22 соответственно.The MA-043 antibody includes heavy and light chains, which have the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 20 and 22, respectively.

Нуклеиновые кислоты.Nucleic acids.

Настоящее изобретение обеспечивает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие тяжелую и легкую цепи антитела настоящего изобретения, их функциональные фрагменты и вариабельные домены, которые могут быть использованы для получения химерных антител, включающих вариабельные домены по изобретению, оперативно слитые с известными константными доменами антител человека.The present invention provides nucleic acid molecules encoding the heavy and light chains of an antibody of the present invention, functional fragments and variable domains thereof, which can be used to produce chimeric antibodies comprising the variable domains of the invention operatively fused to known constant domains of human antibodies.

В преимущественных воплощениях нуклеиновая кислота по изобретению кодирует тяжелую цепь антитела, вариабельный домен которой содержит 3 гипервариабельных участка HCDR1, HCDR2 и HCDR3, гдеIn preferred embodiments, the nucleic acid of the invention encodes an antibody heavy chain whose variable domain contains the 3 hypervariable regions HCDR1, HCDR2 and HCDR3, where

HCDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.HCDR3 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.

В преимущественных воплощениях нуклеиновая кислота по изобретению кодирует легкую цепь антитела, вариабельный домен которой содержит 3 гипервариабельных участка LCDR1, LCDR2 и LCDR3, в которыхIn preferred embodiments, the nucleic acid of the invention encodes an antibody light chain, the variable domain of which contains 3 hypervariable regions LCDR1, LCDR2 and LCDR3, in which

В преимущественных воплощениях нуклеиновая кислота по изобретению кодирует вариабельные домены тяжелой и легкой цепей антитела, которые содержат аминокислотные замены в FR фрагментах вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей, повышающие степень гуманизации антитела по сравнению с родительским антителом.In preferred embodiments, the nucleic acid of the invention encodes heavy and light chain variable domains of an antibody that contain amino acid substitutions in the FR fragments of the heavy and light chain variable domains that enhance the degree of humanization of the antibody relative to the parent antibody.

Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие гомологи и мутанты указанных цепей антител, их функциональных фрагментов и доменов также находятся в рамках настоящего изобретения.Nucleic acid molecules encoding homologues and mutants of said antibody chains, their functional fragments and domains are also within the scope of the present invention.

В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота кодирует тяжелую цепь антитела, вариабельный домен которой имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16.In some embodiments, the nucleic acid encodes an antibody heavy chain whose variable domain has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.

В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота кодирует легкую цепь антитела, вариабельный домен которой имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.In some embodiments, the nucleic acid encodes an antibody light chain whose variable domain has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18.

В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота кодирует тяжелую цепь антитела, аминокислотная последовательность которой идентична по крайней мере на 85%, или идентична по крайней мере на 90%, или идентична по крайней мере на 91%, или идентична по крайней мере на 92%, или идентична по крайней мере на 93%, или по крайней мере на 94%, или по крайней мере на 95%, или по крайней мере на 96%, или по крайней мере на 97%, или по крайней мере на 98%, или по крайней мере на 99%, или идентична на 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20.In some embodiments, the nucleic acid encodes an antibody heavy chain whose amino acid sequence is at least 85% identical, or at least 90% identical, or at least 91% identical, or at least 92% identical, or identical to at least 93% or at least 94% or at least 95% or at least 96% or at least 97% or at least 98% or at least at least 99%, or 100% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.

В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота кодирует легкую цепь антитела, аминокислотная последовательность которой идентична по крайней мере на 85%, или идентична по крайней мере на 90%, или идентична по крайней мере на 91%, или идентична по крайней мере на 92%, или идентична по крайней мере на 93%, или по крайней мере на 94%, или по крайней мере на 95%, или по крайней мере на 96%, или по крайней мере на 97%, или по крайней мере на 98%, или по крайней мере на 99%, или идентична на 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 22.In some embodiments, the nucleic acid encodes an antibody light chain whose amino acid sequence is at least 85% identical, or at least 90% identical, or at least 91% identical, or at least 92% identical, or identical to at least 93% or at least 94% or at least 95% or at least 96% or at least 97% or at least 98% or at least at least 99%, or 100% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22.

Примеры нуклеиновых кислот, кодирующих легкие и тяжелые цепи по изобретению показаны в SEQ ID NO: 19 и 21.Examples of nucleic acids encoding the light and heavy chains of the invention are shown in SEQ ID NOS: 19 and 21.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие вариабельные домены легкой и тяжелой цепей антитела также представляют интерес. Нуклеиновые кислоты, кодирующих вариабельные домены тяжелой и легкой цепей антитела, могут быть использованы для оперативного слияния с нуклеиновыми кислотами, кодирующими соответствующие константные домены антител.Nucleic acids encoding the variable domains of the light and heavy chains of the antibody are also of interest. Nucleic acids encoding the heavy and light chain variable domains of an antibody can be used for operational fusion with nucleic acids encoding the corresponding antibody constant domains.

В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота кодирует вариабельный домен тяжелой цепи анти- 11 042982 тела, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID NO: 16.In some embodiments, the nucleic acid encodes an anti-body heavy chain variable domain, the amino acid sequence of which is shown in SEQ ID NO: 16.

В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота кодирует вариабельный домен легкой цепи антитела, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID NO: 18.In some embodiments, the nucleic acid encodes an antibody light chain variable domain, the amino acid sequence of which is shown in SEQ ID NO: 18.

Примеры нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельные домены тяжелой и легкой цепей антитела, показаны в SEQ ID NO: 15 и 17.Examples of nucleic acids encoding the heavy and light chain variable domains of the antibody are shown in SEQ ID NOS: 15 and 17.

Как здесь используется, молекула нуклеиновой кислоты или нуклеиновая кислота - это молекула ДНК, такая как геномная ДНК или кДНК молекула, или молекула РНК, такая как молекула мРНК. В некоторых воплощениях молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения - это ДНК (или кДНК) молекула, содержащая открытую рамку считывания, которая кодирует антитело или фрагмент антитела настоящего изобретения и способна в подходящих условиях (например, физиологические внутриклеточные условия) быть использована для экспрессии в гетерологической системе экспрессии.As used here, a nucleic acid molecule or nucleic acid is a DNA molecule, such as a genomic DNA or cDNA molecule, or an RNA molecule, such as an mRNA molecule. In some embodiments, a nucleic acid molecule of the present invention is a DNA (or cDNA) molecule containing an open reading frame that encodes an antibody or antibody fragment of the present invention and is capable, under appropriate conditions (e.g., physiological intracellular conditions), of being used for expression in a heterologous expression system .

В некоторых воплощениях молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения получена методами генной инженерии. Способы получения нуклеиновых кислот хорошо известны из области техники.In some embodiments, the nucleic acid molecule of the present invention is obtained by genetic engineering. Methods for obtaining nucleic acids are well known in the art.

Например, доступность информации о последовательности аминокислот или информации о нуклеотидной последовательности дает возможность изготовить выделенные молекулы нуклеиновых кислот настоящего изобретении с помощью олигонуклеотидного синтеза.For example, the availability of amino acid sequence information or nucleotide sequence information makes it possible to prepare the isolated nucleic acid molecules of the present invention using oligonucleotide synthesis.

В случае информации о последовательности аминокислот может быть синтезировано несколько нуклеиновых кислот, отличающихся друг от друга вследствие вырожденности генетического кода. Методы выбора вариантов кодонов для требуемого хозяина хорошо известны в данной области.In the case of amino acid sequence information, several nucleic acids can be synthesized that differ from each other due to the degeneracy of the genetic code. Methods for selecting codon variants for a desired host are well known in the art.

Синтетические олигонуклеотиды могут быть приготовлены с помощью фосфорамидитного метода, и полученные конструкты могут быть очищены с помощью методов хорошо известных в данной области, таких как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) или других методов как описано, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, и по инструкции, описанной в, например, United States Dept. of HHS, National Institute of Health (NIH), Guidelines for Recombinant DNA Research. Длинные двухцепочечные молекулы ДНК настоящего изобретения могут быть синтезированы следующим образом: могут быть синтезированы несколько меньших фрагментов с необходимой комплементарностью, которые содержат подходящие концы, способные к когезии с соседним фрагментом. Соседние фрагменты могут быть сшиты с помощью ДНК-лигазы или метода, основанного на ПЦР.Synthetic oligonucleotides can be prepared using the phosphoramidite method and the resulting constructs can be purified using methods well known in the art such as high performance liquid chromatography (HPLC) or other methods as described, for example, in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, and according to the instructions described in, for example, United States Dept. of HHS, National Institute of Health (NIH), Guidelines for Recombinant DNA Research. Long double-stranded DNA molecules of the present invention can be synthesized as follows: several smaller fragments can be synthesized with the necessary complementarity, which contain suitable ends capable of cohesion with an adjacent fragment. Adjacent fragments can be ligated using DNA ligase or a PCR based method.

Молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению могут быть также клонированы из биологических источников.The nucleic acid molecules of the present invention may also be cloned from biological sources.

Настоящее изобретение также охватывает нуклеиновые кислоты, которые гомологичны, по существу сходны, идентичны или получены из нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды настоящего изобретения.The present invention also encompasses nucleic acids that are homologous, substantially similar, identical, or derived from nucleic acids encoding the polypeptides of the present invention.

Нуклеиновые кислоты изобретения находятся в среде, отличной от среды, в которой они находятся в естественных условиях, например они выделены, представлены в увеличенном количестве, находятся или экспрессированы в системах in vitro или в клетках или организмах, отличных от тех, в которой они находятся в естественных условиях.Nucleic acids of the invention are found in an environment different from the environment in which they are naturally found, for example, they are isolated, present in increased abundance, found or expressed in in vitro systems, or in cells or organisms other than those in which they are found in natural conditions.

Изменения или различия в нуклеотидной последовательности между высоко сходными нуклеотидными последовательностями могут представлять нуклеотидные замены в последовательности, которые возникают в процессе нормальной репликации или дупликации. Другие замены могут быть специально рассчитаны и вставлены в последовательность для определенных целей, таких как изменение кодонов определенных аминокислот или нуклеотидной последовательности регуляторного региона. Такие специальные замены могут быть произведены in vitro с помощью различных технологий мутагенеза или получены в организмах-хозяевах, находящихся в специфических селекционных условиях, которые индуцируют или отбирают эти изменения. Такие специально полученные варианты последовательности могут быть названы мутантами или производными исходной последовательности.Changes or differences in the nucleotide sequence between highly similar nucleotide sequences may represent nucleotide substitutions in the sequence that occur during normal replication or duplication. Other substitutions may be specifically calculated and inserted into the sequence for specific purposes, such as changing the codons of certain amino acids or the nucleotide sequence of a regulatory region. Such specific substitutions can be made in vitro using various mutagenesis techniques or obtained in host organisms under specific breeding conditions that induce or select for these changes. Such tailor-made sequence variants may be referred to as mutants or derivatives of the original sequence.

Мутантные или производные нуклеиновые кислоты или варианты нуклеиновых кислот могут быть получены на матричной нуклеиновой кислоте, выбранной из вышеописанных нуклеиновых кислот, путем модификации, делеции или добавления одного или более нуклеотидов в матричной последовательности или их комбинации, для получения варианта матричной нуклеиновой кислоты. Модификации, добавления или делеции могут быть выполнены любым способом, известным в данной области (см., например, Gustin et al., Biotechniques (1993), 14:22; Barany, Gene (1985), 37:111-123; и Colicelli et al., Mol. Gen. Genet. (1985), 199:537-539; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), CSH Press, p. 15.3-15.108), включая подверженный ошибкам ПЦР (error-prone PCR), shuffling, олигонуклеотид-направленный мутагенез, ПЦР со сборкой, парный ПЦР мутагенез, мутагенез in vivo, кассетный мутагенез, рекурсивный множественный мутагенез, экспоненциальный множественный мутагенез, сайт-специфический мутагенез, случайный мутагенез, генная реассемблирование (gene reassembly), генный сайт-насыщающий мутагенез (GSSM), искусственное перестройку с лигированием (SLR) или их комбинации. Модификации, добавления или делеции могут быть также выполнены методом, включающим рекомбинацию, рекурсивную рекомбинацию последовательностей, фосфотиоат-модифицированный мутагенез ДНК, мутагенез на урацил-содержащей матрице, мутагенез с двойным пропуском, точечный восстановительный по рассо- 12 042982 гласованию мутагенез, мутагенез штамма, дефицитного по восстановлениям, химический мутагенез, радоактивный мутагенез, делетационный мутагенез, рестрикционно-избирательный мутагенез, рестрикционный мутагенез с очисткой, синтез искусственных генов, множественный мутагенез, создание химерных множественных нуклеиновых кислот и их комбинации.Mutant or derived nucleic acids or nucleic acid variants can be generated on a template nucleic acid selected from the nucleic acids described above by modifying, deleting or adding one or more nucleotides in the template sequence, or a combination thereof, to produce a template nucleic acid variant. Modifications, additions or deletions can be made by any method known in the art (see, for example, Gustin et al., Biotechniques (1993), 14:22; Barany, Gene (1985), 37:111-123; and Colicelli et al., Mol. Gen. Genet. (1985), 199:537-539; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), CSH Press, p. 15.3-15.108), including error-prone PCR ( error-prone PCR), shuffling, oligonucleotide-directed mutagenesis, assembly PCR, pairwise PCR mutagenesis, in vivo mutagenesis, cassette mutagenesis, recursive multiple mutagenesis, exponential multiple mutagenesis, site-specific mutagenesis, random mutagenesis, gene reassembly , gene site-saturation mutagenesis (GSSM), artificial rearrangement with ligation (SLR), or combinations thereof. Modifications, additions, or deletions can also be performed by a technique including recombination, recursive sequence recombination, phosphothioate-modified DNA mutagenesis, uracil-containing template mutagenesis, double-skip mutagenesis, spot mismatch reduction mutagenesis, mutagenesis of strain deficient reduction, chemical mutagenesis, radioactive mutagenesis, deletion mutagenesis, restriction selective mutagenesis, restriction mutagenesis with purification, artificial gene synthesis, multiple mutagenesis, chimeric multiple nucleic acid generation, and combinations thereof.

Также обеспечиваются вырожденные варианты нуклеиновых кислот, которые кодируют белки настоящего изобретения. Вырожденные варианты нуклеиновых кислот включают замены кодонов нуклеиновой кислоты на другие кодоны, кодирующие те же самые аминокислоты. В частности, вырожденные варианты нуклеиновых кислот создаются, чтобы увеличить экспрессию в клетке-хозяине. В этом воплощении кодоны нуклеиновой кислоты, которые не являются предпочтительными или являются менее предпочтительными в генах клетки-хозяина, заменены кодонами, которые обильно представлены в кодирующих последовательностях генов в клетке-хозяине, где указанные замененные кодоны кодируют ту же самую аминокислоту.Also provided are degenerate variants of nucleic acids that encode the proteins of the present invention. Degenerate nucleic acid variants include substitutions of nucleic acid codons with other codons encoding the same amino acids. In particular, degenerate nucleic acid variants are designed to increase expression in the host cell. In this embodiment, nucleic acid codons that are not or less preferred in the genes of the host cell are replaced with codons that are abundant in the coding sequences of the genes in the host cell, where said changed codons encode the same amino acid.

Вышеуказанные модификации не изменяют по существу свойства антител и их функциональных фрагментов, но могут облегчать белковый фолдинг в клетке-хозяине, снижать способность к агрегации или модулировать другие биохимические свойства белков, например полупериод распада. В некоторых воплощениях эти модификации не изменяют биохимические свойства белка. В некоторых воплощениях эти модификации приводят к уменьшению иммуногенности антител. Все виды модификаций и мутаций, указанные выше, осуществляются на уровне нуклеиновой кислоты.The above modifications do not substantially change the properties of antibodies and their functional fragments, but may facilitate protein folding in the host cell, reduce the ability to aggregate, or modulate other biochemical properties of proteins, such as half-life decay. In some embodiments, these modifications do not change the biochemical properties of the protein. In some embodiments, these modifications result in a decrease in the immunogenicity of the antibodies. All kinds of modifications and mutations mentioned above are carried out at the level of nucleic acid.

Заявленные нуклеиновые кислоты могут быть выделены и получены по существу в очищенной форме. По существу очищенная форма означает, что нуклеиновые кислоты являются по меньшей мере приблизительно на 50% чистыми, обычно по меньшей мере приблизительно на 90% чистыми, и обычно являются рекомбинантными, т.е. фланкированы одним или более нуклеотидами, с которыми она обычно не связана в хромосоме, встречающейся в природе в ее естественном организме-хозяине.The claimed nucleic acids may be isolated and obtained in substantially purified form. Substantially purified form means that the nucleic acids are at least about 50% pure, typically at least about 90% pure, and are typically recombinant, ie. flanked by one or more nucleotides to which it is not normally associated on a naturally occurring chromosome in its natural host.

Также обеспечиваются нуклеиновые кислоты, которые кодируют слитые белки, включающие белок настоящего изобретения, или их фрагменты, которые ниже рассматриваются более детально. Нуклеиновые кислоты, кодирующие вариабельные домены по изобретению, могут быть оперативно слиты с нуклеиновыми кислотами, кодирующими соответствующие константные домены легкой и тяжелой цепей антитела. Нуклеиновые кислоты, кодирующие легкую и тяжелую цепи антитела, могут быть оперативно слиты с нуклеиновыми кислотами, кодирующими лидерный (сигнальный) пептид, обеспечивающий транспорт продуктов экспрессии из клетки-хозяина. Лидерный пептид впоследствии отщепляется во время созревания полипептида.Also provided are nucleic acids that encode fusion proteins comprising the protein of the present invention, or fragments thereof, which are discussed in more detail below. Nucleic acids encoding the variable domains of the invention can be operatively fused to nucleic acids encoding the corresponding antibody light and heavy chain constant domains. Nucleic acids encoding the light and heavy chains of an antibody can be operatively fused to nucleic acids encoding a leader (signal) peptide that ensures the transport of expression products from the host cell. The leader peptide is subsequently cleaved off during polypeptide maturation.

Вектор.Vector.

Также обеспечиваются вектор и другие конструкции нуклеиновой кислоты, содержащие заявленные нуклеиновые кислоты. Термин вектор включает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она оперативно связана. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены, в то время как остальные векторы могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина и таким образом реплицированы наряду с геномом-хозяином. Более того, определенные векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они оперативно связаны. Такие векторы имеют в данной заявке название векторы рекомбинантной экспрессии (или упрощенно векторы экспрессии или экспрессионные векторы), а иллюстративные векторы хорошо известны из уровня техники. Подходящие векторы включают вирусные и невирусные векторы, плазмиды, космиды, фаги и т.д., предпочтительно плазмиды, и используются для клонирования, амплификации, экспрессии, переноса и т.д. последовательности нуклеиновой кислоты настоящего изобретения в подходящего хозяина. Выбор подходящего вектора является понятным для квалифицированного специалиста в данной области.A vector and other nucleic acid constructs containing the claimed nucleic acids are also provided. The term vector includes a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which it is operably linked. Certain vectors are capable of autonomous replication in the host cell into which they are introduced, while other vectors can be integrated into the genome of the host cell and thus replicated along with the host genome. Moreover, certain vectors are capable of directing the expression of genes to which they are operably linked. Such vectors are referred to herein as recombinant expression vectors (or simply expression vectors or expression vectors), and illustrative vectors are well known in the art. Suitable vectors include viral and non-viral vectors, plasmids, cosmids, phages, etc., preferably plasmids, and are used for cloning, amplification, expression, transfer, and the like. nucleic acid sequences of the present invention in a suitable host. The choice of an appropriate vector is within the purview of one skilled in the art.

Полноразмерная нуклеиновая кислота или ее часть обычно вставляются в вектор посредством прикрепления ДНК-лигазой к расщепленному ферментами рестрикции сайту в векторе. Альтернативно желательная нуклеотидная последовательность может быть вставлена гомологичной рекомбинацией in vivo, обычно присоединением гомологичных участков к вектору на флангах желательной нуклеотидной последовательности. Гомологичные участки добавляются лигированием олигонуклеотидов или полимеразной цепной реакцией с использованием праймеров, включающих, например, как гомологичные участки, так и часть желательной нуклеотидной последовательности.The full-length nucleic acid, or a portion thereof, is typically inserted into a vector by attachment by DNA ligase to a restriction enzyme-cleaved site in the vector. Alternatively, the desired nucleotide sequence can be inserted by in vivo homologous recombination, typically by adding homologous regions to the vector on the flanks of the desired nucleotide sequence. Homologous regions are added by oligonucleotide ligation or polymerase chain reaction using primers including, for example, both the homologous regions and a portion of the desired nucleotide sequence.

Вектор, как правило, имеет ориджин репликации, обеспечивающий его размножение в клеткаххозяевах в результате его введения в клетку как внехромосомного элемента. Вектор также может содержать регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине и получение целевого полипептида. В экспрессионном векторе указанная нуклеиновая кислота является оперативно связанной с регуляторной последовательностью, которая может включать промоторы, энхансеры, терминаторы, операторы, репрессоры и индукторы, а также стартовый кодон полипептида. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота по изобретению также оперативно связана с лидерным пептидом, обеспечивающим выделение продукта экспрессии из клетки-хозяина во внеклеточное пространство.The vector, as a rule, has an origin of replication, which ensures its reproduction in host cells as a result of its introduction into the cell as an extrachromosomal element. The vector may also contain regulatory elements that allow the expression of the nucleic acid in the host cell and the production of the target polypeptide. In an expression vector, said nucleic acid is operably linked to a regulatory sequence, which may include promoters, enhancers, terminators, operators, repressors, and inducers, as well as a polypeptide start codon. In some embodiments, the nucleic acid of the invention is also operatively linked to a leader peptide to allow release of the expression product from the host cell to the extracellular space.

Также обеспечиваются кассеты экспрессии или системы, использованные inter alia для получения заявленных полипептидов (например, легкой и тяжелой цепей антитела по изобретению или вариабель- 13 042982 ных доменов легкой и тяжелой цепей антитела по изобретению) на их основе или для репликации заявленных молекул нуклеиновой кислоты.Also provided are expression cassettes or systems used, inter alia, to produce the claimed polypeptides (e.g., the light and heavy chains of an antibody of the invention or the variable domains of the light and heavy chains of an antibody of the invention) based on them or to replicate the claimed nucleic acid molecules.

Кассета экспрессии может существовать как внехромосомный элемент или может быть включена в геном клетки в результате введения указанной кассеты экспрессии в клетку. Для экспрессии белковый продукт, кодируемый нуклеиновой кислотой изобретения, экспрессируется в любой удобной системе экспрессии, включая, например, бактериальные системы, дрожжи, растения, насекомых, земноводных или клетки млекопитающих. В кассете экспрессии целевая нуклеиновая кислота оперативно соединяется с регуляторными последовательностями, которые могут включать промоторы, энхансеры, терминирующие последовательности, операторы, репрессоры и индукторы, а также стартовый кодон полипептида. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота по изобретению также оперативно связана с лидерным пептидом, обеспечивающим выделение продукта экспрессии из клетки-хозяина во внеклеточное пространство. Способы получения кассет или систем экспрессии, способных экспрессировать желательный продукт, известны специалистам в данной области.The expression cassette may exist as an extrachromosomal element or may be incorporated into the cell's genome by introducing said expression cassette into the cell. For expression, the protein product encoded by the nucleic acid of the invention is expressed in any convenient expression system, including, for example, bacterial systems, yeast, plants, insects, amphibians, or mammalian cells. In the expression cassette, the target nucleic acid is operatively linked to regulatory sequences, which may include promoters, enhancers, termination sequences, operators, repressors, and inducers, as well as the start codon of the polypeptide. In some embodiments, the nucleic acid of the invention is also operatively linked to a leader peptide to allow release of the expression product from the host cell to the extracellular space. Methods for obtaining expression cassettes or systems capable of expressing the desired product are known to those skilled in the art.

Клетка-хозяин.Host cell.

Вышеописанные системы экспрессии могут использоваться в прокариотических или эукариотических хозяевах. Для получения белка могут использоваться клетки-хозяева, такие как Е.coli, В. subtilis, S. cerevisiae, клетки насекомого в комбинации с бакуловирусными векторами, или клетки высшего организма, такие как клетки дрожжей, клетки растений, клетки позвоночных, клетки млекопитающего, клетки человека, например СНО клетки (например, АТСС CRL-9096), NS0 клетки, SP2/0 клетки, HEK293 клетки, COS клетки (например, АТСС CRL-1650, CRL-1651) и HeLa (например, АТСС CCL-2).The expression systems described above can be used in prokaryotic or eukaryotic hosts. For protein production, host cells such as E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, insect cells in combination with baculovirus vectors, or higher organism cells such as yeast cells, plant cells, vertebrate cells, mammalian cells, human cells, e.g. CHO cells (e.g. ATCC CRL-9096), NS0 cells, SP2/0 cells, HEK293 cells, COS cells (e.g. ATCC CRL-1650, CRL-1651) and HeLa cells (e.g. ATCC CCL-2) .

Для получения антитела по изобретению клетка-хозяин ко-трансформируется экспрессионным вектором, включающим нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, и экспрессионным вектором, включающим нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела. В некоторых воплощениях используется один экспрессионный вектор, в который внедрены нуклеиновые кислоты, кодирующие и легкую, и тяжелую цепи антитела.To obtain an antibody of the invention, a host cell is co-transformed with an expression vector comprising a nucleic acid encoding an antibody light chain and an expression vector comprising a nucleic acid encoding an antibody heavy chain. In some embodiments, a single expression vector is used in which nucleic acids encoding both the light and heavy chains of the antibody are introduced.

Для экспрессии легкой и тяжелой цепей экспрессионным(и) вектором(ами), кодирующим(и) тяжелую и легкую цепи, трансформируют (ко-трансформируют) в клетку-хозяина таким образом, что легкая и тяжелая цепи экспрессируются в клетке-хозяине и предпочтительно выделяются в среду, в которой культивируют клетки-хозяива, из этой среды могут быть выделены антитела. Различные трактовки термина трансформация предназначены для включения широкого ряда способов, обычно используемых при интродукции экзогенной ДНК в прокариотную или эукариотную клетку-хозяина, например электропорацию, преципитацию фосфатом кальция, трансфекцию с помощью DEAE-декстрана и др., как описано Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel F.M. et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates (1989).For expression of the light and heavy chains, the expression vector(s) encoding the heavy and light chains are transformed (co-transformed) into a host cell such that the light and heavy chains are expressed in the host cell and are preferably isolated. into the medium in which the host cells are cultured, antibodies can be isolated from this medium. Various interpretations of the term transformation are intended to include a wide range of methods commonly used in the introduction of exogenous DNA into a prokaryotic or eukaryotic host cell, such as electroporation, calcium phosphate precipitation, transfection with DEAE-dextran, etc., as described by Sambrook, Fritsch and Maniatis ( eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel F.M. et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates (1989).

Когда рекомбинантные экспрессирующие векторы, содержащие нуклеиновые кислоты антитела, интродуцируют в клетки-хозяева, антитела образуются при культивировании клеток-хозяев в течение периода времени, который достаточен для экспрессии антитела в клетке-хозяине, или (более предпочтительно) секреции антитела в культуральную среду, в которой выращивают клетки-хозяива. Антитела могут быть выделены из культуральной среды с использованием стандартных способов очистки белков. Условия культивирования различных клеток хорошо известны специалистам в данной области и описаны, например, в Current Protocols in Cell Biology, под ред. Bonifacino J.S., Dasso M., Harford J.B., Lippincott-Schwartz J. и Yamada K.M., изд-во John Wiley & Sons, Inc., 2000.When recombinant expression vectors containing antibody nucleic acids are introduced into host cells, antibodies are generated by culturing the host cells for a period of time that is sufficient for expression of the antibody in the host cell, or (more preferably) secretion of the antibody into the culture medium, in in which host cells are grown. Antibodies can be isolated from the culture medium using standard protein purification methods. Culture conditions for various cells are well known to those skilled in the art and are described, for example, in Current Protocols in Cell Biology, ed. Bonifacino J.S., Dasso M., Harford J.B., Lippincott-Schwartz J. and Yamada K.M., John Wiley & Sons, Inc., 2000.

Если используется любая вышеупомянутая клетка-хозяин или другие подходящие клетки-хозяева или организмы для репликации и/или экспрессии нуклеиновых кислот изобретения, то полученная реплицированная нуклеиновая кислота, экспрессированный белок или полипептид находятся в рамках притязания изобретения как продукт клетки-хозяина или организма. Продукт может быть выделен подходящим способом, известным в данной области.If any of the aforementioned host cells or other suitable host cells or organisms are used to replicate and/or express the nucleic acids of the invention, then the resulting replicated nucleic acid, expressed protein or polypeptide is within the scope of the invention as the product of the host cell or organism. The product may be isolated in a suitable manner known in the art.

Клеточные линии, которые устойчиво экспрессируют белки настоящего изобретения, могут быть выбраны способами, известными в данной области (например, ко-трансфекция с селектируемым маркером, таким как dhfr, gpt, неомицин, гигромицин, что делает возможным выявление и выделение транфецированных клеток, которые содержат ген, включенный в геном).Cell lines that stably express the proteins of the present invention can be selected by methods known in the art (e.g., co-transfection with a selectable marker such as dhfr, gpt, neomycin, hygromycin, which makes it possible to identify and isolate transfected cells that contain gene included in the genome).

Молекулы нуклеиновых кислот настоящего изобретения также могут применяться для определения экспрессии гена в биологическом образце. Способ, в котором исследуются клетки на наличие специфических нуклеотидных последовательностей, таких как геномная ДНК или РНК, хорошо отработан в данной области. Кратко, выделяют ДНК или мРНК из образца клетки. мРНК может быть амплифицирована ОТ-ПЦР с использованием обратной транскриптазы для формирования комплементарной цепочки ДНК с последующей амплификацией с помощью полимеразной цепной реакцией с использованием праймеров, специфических для заявленных последовательностей ДНК. Альтернативно образец мРНК отделяют с помощью гель-электрофореза, переносят на подходящий носитель, например нитроцеллюлозу, нейлон и т.д., и затем тестируют фрагментом заявленной ДНК в качестве пробы. Могут также использоваться другие способы, такие как анализы сшивания олигонуклеотидов, гибридизация in situ и гибридизацияThe nucleic acid molecules of the present invention can also be used to determine the expression of a gene in a biological sample. The method in which cells are examined for the presence of specific nucleotide sequences, such as genomic DNA or RNA, is well established in the art. Briefly, DNA or mRNA is isolated from a cell sample. mRNA can be amplified by RT-PCR using reverse transcriptase to form a complementary strand of DNA followed by polymerase chain reaction amplification using primers specific for the claimed DNA sequences. Alternatively, the mRNA sample is separated by gel electrophoresis, transferred to a suitable carrier such as nitrocellulose, nylon, etc., and then tested with a DNA fragment of the claimed DNA as a sample. Other methods may also be used, such as oligonucleotide crosslinking assays, in situ hybridization, and hybridization.

- 14 042982- 14 042982

ДНК-пробами, иммобилизованными на твердый чип. Обнаружение мРНК, гибридизующейся с заявленной последовательностью, указывает на экспрессию гена в образце.DNA samples immobilized on a solid chip. The detection of mRNA hybridizing to the claimed sequence indicates the expression of the gene in the sample.

Терапевтическое применение антител по изобретению.Therapeutic Use of Antibodies of the Invention.

В одном аспекте антитело или его активный фрагмент по данному изобретению применяется в лечении нарушений, которые связаны с активностью патологических Т-лимфоцитов, несущих на поверхности ТКР семейства TRBV9, например с активностью аутоиммунных Т-лимфоцитов при АС, целиакии, Т-клеточных лимфомах.In one aspect, the antibody or active fragment thereof of the present invention is used in the treatment of disorders that are associated with the activity of pathological T-lymphocytes bearing on the surface of the TRBV9 family of TCRs, for example, with the activity of autoimmune T-lymphocytes in AS, celiac disease, T-cell lymphomas.

Термин пациент в данной заявке относится к млекопитающему, включая, но не ограничиваясь приведенными, мышей, обезьян, людей, млекопитающих сельскохозяйственных животных, млекопитающих спортивных животных и млекопитающих комнатных животных; предпочтительно термин относится к людям. В определенном из вариантов осуществления пациент дополнительно характеризуется заболеванием, или расстройством, или состоянием, опосредованными наличием в его организме ТКР, бета-цепь которого относится к семейству TRBV9. Из уровня техники известно, что ТКР, бета-цепь которого относится к семейству TRBV9, ассоциированы с АС и целиакией. Также ТКР, бета-цепь которого относится к семейству TRBV9, могут быть связаны с развитием ряда заболеваний крови, таких как Т-клеточная лимфома, вызванная вирусом Эпштейна-Барр.The term patient in this application refers to a mammal, including, but not limited to, mice, monkeys, humans, mammalian farm animals, mammalian sports animals, and mammalian pets; preferably the term refers to humans. In a certain embodiment, the patient is further characterized by a disease or disorder or condition mediated by the presence in his body of TCR, the beta chain of which belongs to the TRBV9 family. It is known from the prior art that TCR, the beta chain of which belongs to the TRBV9 family, is associated with AS and celiac disease. Also, TCR, the beta chain of which belongs to the TRBV9 family, may be associated with the development of a number of blood diseases, such as T-cell lymphoma caused by the Epstein-Barr virus.

Используемые в данном документе термины совместное назначение, совместно назначенный и в сочетании с относящиеся антителу с одним или более другими терапевтическими агентами, как предполагается, означают, ссылаются или включаютAs used herein, the terms co-administration, co-administration, and in combination with referring to an antibody with one or more other therapeutic agents are intended to mean, refer to, or include

1) одновременное введение такой комбинации антитела по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы вместе в одной лекарственной форме, из которой указанные компоненты высвобождаются практически одновременно указанному пациенту;1) simultaneous administration of such a combination of an antibody of the present invention and a therapeutic agent to a patient in need of treatment, when such components are formulated together in a single dosage form from which said components are released substantially simultaneously to said patient;

2) одновременное введение такой комбинации антитела по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы отдельно в разных лекарственных формах, введение которых происходит практически в одно и то же время указанному пациенту, после чего указанные компоненты высвобождаются практически одновременно указанному пациенту;2) simultaneous administration of such a combination of an antibody of this invention and a therapeutic agent to a patient in need of treatment, when such components are formulated separately in different dosage forms, the administration of which occurs at almost the same time to said patient, after which these components are released almost simultaneously the specified patient;

3) последовательное введение такой комбинации антитела по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы отдельно друг от друга в отдельных лекарственных формах, которые принимаются в последовательно по времени указанным пациентом со значимым временным интервалом между каждым введением, после чего указанные компоненты высвобождаются в практически разное время указанному пациенту; а также3) sequential administration of such a combination of an antibody of this invention and a therapeutic agent to a patient in need of treatment, when such components are formulated separately from each other in separate dosage forms that are taken in sequential time by the indicated patient with a significant time interval between each administration, after whereby said components are released at substantially different times to said patient; and

4) последовательное введение такой комбинации антитела по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы вместе в единый лекарственной форме, из которой высвобождение указанных компонентов происходит контролируемым образом, после чего они одновременно, последовательно или совместно высвобождаются в одно и то же время и/или разное время указанному пациенту, где каждая часть может быть введена одним или разными путями.4) sequential administration of such a combination of an antibody of this invention and a therapeutic agent to a patient in need of treatment, when such components are formulated together in a single dosage form from which the release of these components occurs in a controlled manner, after which they are simultaneously, sequentially or jointly released into one and the same time and/or different time to the specified patient, where each part can be entered in one or different ways.

Антитело по данному изобретению может назначаться без дополнительного терапевтического лечения, т.е. в качестве самостоятельной терапии.The antibody of this invention can be administered without additional therapeutic treatment, i. as a standalone therapy.

Кроме того, лечение антителом по данному изобретению может включать по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое лечение (комбинированная терапия).In addition, treatment with an antibody of this invention may include at least one additional therapeutic treatment (combination therapy).

В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело может вводиться совместно или быть сформулировано с другим медикаментом/препаратом для аутоиммунного или онкологического заболевания, в патогенез которого вовлечены ТКР, содержащие бета-цепь TRBV9, например АС, целиакия, Т-клеточная лимфома, Т-клеточный лейкоз.In some embodiments, the antibody may be co-administered or formulated with another drug/drug for an autoimmune or oncological disease in which TCRs containing the TRBV9 beta chain are involved, e.g., AS, celiac disease, T-cell lymphoma, T-cell leukemia .

Дозы и пути введения.Doses and routes of administration.

Антитело по данному изобретению будет вводиться в количестве, эффективном для лечения состояния, о котором идет речь, т.е. в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого результата.The antibody of this invention will be administered in an amount effective to treat the condition in question, i. in doses and for periods of time necessary to achieve the desired result.

Терапевтически эффективное количество может изменяться в зависимости от таких факторов, как конкретное состояние, по поводу которого проводится лечение, возраста, пола и веса пациента, а также является ли введение антитела самостоятельным лечением или оно проводится в комбинации с одним или более дополнительных иммуносупрессивных или противовоспалительных методов лечения.The therapeutically effective amount may vary depending on factors such as the particular condition being treated, the age, sex, and weight of the patient, and whether administration of the antibody is alone or in combination with one or more additional immunosuppressive or anti-inflammatory therapies. treatment.

Схемы приема лекарственных средств можно регулировать, чтобы обеспечить оптимальный желаемый ответ. Например, может быть введен один болюс, несколько разделенных доз могут быть введены в течение некоторого времени или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена в зависимости от остроты терапевтической ситуации. Особенно полезным является изготовление парентеральных композиций в стандартной лекарственной форме для простоты введения и однородности дозирования. Стандартная лекарственная форма при использовании в данном документе относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве единичных доз для пациентов/субъектов, подлежащихDrug regimens can be adjusted to provide the optimal desired response. For example, a single bolus may be administered, several divided doses may be administered over time, or the dose may be proportionally reduced or increased depending on the severity of the therapeutic situation. Especially useful is the formulation of parenteral compositions in unit dosage form for ease of administration and uniformity of dosing. Dosage unit form as used herein refers to physically discrete units suitable as unit doses for patients/subjects to be

- 15 042982 лечению; каждая единица содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем.- 15 042982 treatment; each unit contains a predetermined amount of the active compound calculated to produce the desired therapeutic effect in combination with the required pharmaceutical carrier.

Спецификация для стандартных лекарственных форм по настоящему изобретению, как правило, диктуется и непосредственно зависит от (а) уникальных характеристик химиотерапевтического агента и конкретного терапевтического или профилактического эффекта, которые должны быть достигнуты; и (b) ограничений, присущих в технике компаундирования такого активного соединения для лечения чувствительности у субъектов.The specification for unit dosage forms of the present invention is generally dictated by and directly dependent on (a) the unique characteristics of the chemotherapeutic agent and the particular therapeutic or prophylactic effect to be achieved; and (b) inherent limitations in the art of compounding such an active compound for the treatment of sensitivity in subjects.

Таким образом, квалифицированным специалистам понятно исходя из раскрытия, представленного в данном документе, что дозы и режим дозирования корректируются в соответствии со способами, хорошо известными в терапевтической области. Это означает, что может быть легко установлена максимально переносимая доза и может быть также определено эффективное количество, обеспечивающее обнаруживаемый терапевтический эффект для пациента, также как и требования ко времени введения каждого агента для достижения видимого терапевтического эффекта для пациента. Таким образом, хотя некоторые дозы и схемы режима введения приведены в качестве примеров в данном документе, эти примеры никоим образом не ограничивают дозы и режимы введения, которые могут понадобиться для пациента в практике применения настоящего изобретения.Thus, those skilled in the art will appreciate from the disclosure provided herein that doses and dosing regimens are adjusted in accordance with methods well known in the therapeutic field. This means that the maximum tolerated dose can be easily set and the effective amount that provides a detectable therapeutic effect for the patient can also be determined, as well as the time requirements for the administration of each agent to achieve a visible therapeutic effect for the patient. Thus, although some doses and regimens of administration are given as examples in this document, these examples in no way limit the doses and regimens of administration that may be needed for a patient in the practice of the present invention.

Следует отметить, что значения дозировки могут изменяться в зависимости от типа и тяжести состояния, которое следует облегчить, и может включать одну или более доз. Кроме того, необходимо понимать, что для любого конкретного пациента конкретные схемы введения должны быть скорректированы через некоторое время согласно индивидуальной потребности и на усмотрение медицинского работника, который осуществляет введение или контролирует введение композиций и что диапазоны концентрации, приведенные в данном описании, приведены только в качестве примера и не предназначены для ограничения объема или практики заявленных композиций. Кроме того, режим дозирования с композициями по данному изобретению может быть основан на различных факторах, включая тип заболевания, возраст, вес, пол, состояния здоровья пациента, тяжесть состояния, путь введения и конкретное используемое антитело. Таким образом, режим дозирования может широко варьироваться, но может определяться регулярно с помощью стандартных методов. Например, дозы могут быть скорректированы на основе фармакокинетических и фармакодинамических параметров, которые могут включать клинические эффекты, такие как токсические эффекты или лабораторные значения. Таким образом, настоящее изобретение охватывает индивидуальное повышение дозы, которое определяется квалифицированным специалистом. Определение необходимой дозы и режимы хорошо известны в соответствующей области техники и будут понятны специалисту в данной области после ознакомления с идеями, раскрытыми в данном документе.It should be noted that dosage values may vary depending on the type and severity of the condition to be alleviated, and may include one or more doses. In addition, it should be understood that for any particular patient, specific administration schedules will need to be adjusted over time according to individual need and at the discretion of the healthcare professional who administers or controls administration of the compositions, and that the concentration ranges given herein are provided as a guide only. example and are not intended to limit the scope or practice of the claimed compositions. In addition, the dosage regimen with the compositions of this invention may be based on various factors, including the type of disease, age, weight, sex, health status of the patient, severity of the condition, route of administration, and the specific antibody used. Thus, the dosing regimen may vary widely, but may be determined regularly using standard methods. For example, doses may be adjusted based on pharmacokinetic and pharmacodynamic parameters, which may include clinical effects such as toxic effects or laboratory values. Thus, the present invention encompasses individual dose escalation as determined by the skilled artisan. Determination of the required dose and modes are well known in the relevant field of technology and will be clear to a person skilled in the art after reading the ideas disclosed in this document.

Примеры подходящих способов введения предусмотрены выше.Examples of suitable routes of administration are provided above.

Предполагается, что подходящая доза антитела по данному изобретению будет в диапазоне от 0,1-200 мг/кг, предпочтительно 0,1-100 мг/кг, в том числе около 0,5-50 мг/кг, например около 1-20 мг/кг. Антитело может быть введено, например, в дозе по меньшей мере 0,25 мг/кг, например по меньшей мере 0,5 мг/кг, в том числе не менее 1 мг/кг, например по меньшей мере 1,5 мг/кг, например также как не менее 2 мг/кг, например по меньшей мере 3 мг/кг, в том числе по меньшей мере 4 мг/кг, например по меньшей мере 5 мг/кг; и, например, вплоть до максимально 50 мг/кг, в том числе вплоть до максимально 30 мг/кг, например вплоть до максимально 20 мг/кг, в том числе вплоть до максимально 15 мг/кг. Введение будет повторяться обычно в подходящие промежутки времени, например раз в неделю, раз в две недели, один раз каждые три недели или один раз каждые четыре недели, и так долго, как будет сочтено целесообразным ответственным врачом, который может в некоторых случаях увеличить или уменьшить дозу при необходимости.It is contemplated that a suitable dose of an antibody of this invention will be in the range of 0.1-200 mg/kg, preferably 0.1-100 mg/kg, including about 0.5-50 mg/kg, such as about 1-20 mg/kg. The antibody may be administered, for example, at a dose of at least 0.25 mg/kg, such as at least 0.5 mg/kg, including at least 1 mg/kg, such as at least 1.5 mg/kg eg also at least 2 mg/kg, eg at least 3 mg/kg, including at least 4 mg/kg, eg at least 5 mg/kg; and, for example, up to a maximum of 50 mg/kg, including up to a maximum of 30 mg/kg, for example up to a maximum of 20 mg/kg, including up to a maximum of 15 mg/kg. The administration will be repeated usually at suitable intervals, for example once a week, once every two weeks, once every three weeks, or once every four weeks, and for as long as is deemed appropriate by the physician in charge, who may in some cases increase or decrease dose if necessary.

Фармацевтическая композиция.Pharmaceutical composition.

Антитело по изобретению может быть включено в фармацевтическую композицию, пригодную для введения пациенту. Антитела по изобретению могут быть введены отдельно или в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем и/или наполнителем в однократных или многократных дозах. Фармацевтические композиции для введения разработаны таким образом, чтобы соответствовать выбранному режиму введения, а фармацевтически приемлемые разбавители, носители и/или наполнители, такие как диспергирующие агенты, буфера, поверхностно-активные вещества, консерванты, солюбилизирующие агенты, изотонические агенты, стабилизаторы и т.п. использованы должным образом. Указанные композиции разработаны в соответствии с традиционными методами, приведенными в, например, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995, где описаны различные методы получения композиций, в общем известных специалистам.The antibody of the invention may be included in a pharmaceutical composition suitable for administration to a patient. The antibodies of the invention may be administered alone or in combination with a pharmaceutically acceptable carrier, diluent and/or excipient in single or multiple doses. Pharmaceutical compositions for administration are designed to suit the selected mode of administration, and pharmaceutically acceptable diluents, carriers and/or excipients such as dispersing agents, buffers, surfactants, preservatives, solubilizing agents, isotonic agents, stabilizers, and the like . used properly. Said compositions have been formulated according to conventional methods as found in, for example, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995, which describes various methods for preparing compositions, in generally known to those skilled in the art.

Лекарственное средство (препарат) - вещество или смесь веществ в виде фармацевтической композиции в виде таблеток, капсул, порошков, лиофилизатов, инъекций, инфузий, мазей и др. готовых форм, предназначенное для восстановления, исправления или изменения физиологических функций у человека и животных, а также для лечения и профилактики болезней, диагностики, анестезии, контра- 16 042982 цепции, косметологии и прочего. Любой способ введения пептидов, белков или антител, принятый в данной области, может соответствующим образом использоваться для антитела по данному изобретению.Medicinal product (preparation) - a substance or mixture of substances in the form of a pharmaceutical composition in the form of tablets, capsules, powders, lyophilisates, injections, infusions, ointments and other ready-made forms, intended to restore, correct or change physiological functions in humans and animals, and also for the treatment and prevention of diseases, diagnostics, anesthesia, contraception, cosmetology and others. Any method of administering peptides, proteins, or antibodies accepted in the art can be appropriately used for an antibody of this invention.

Термин фармацевтически приемлемый означает один или несколько совместимых жидких или твердых компонентов, которые подходят для введения млекопитающему, предпочтительно человеку.The term pharmaceutically acceptable means one or more compatible liquid or solid components that are suitable for administration to a mammal, preferably a human.

Термин эксципиент или вспомогательное вещество используется в данном документе для описания любого компонента, отличающегося от ранее описанных по данному изобретению. Это вещества неорганического или органического происхождения, используемые в процессе производства, изготовления лекарственных препаратов для придания им необходимых физико-химических свойств.The term excipient or excipient is used herein to describe any component other than those previously described in this invention. These are substances of inorganic or organic origin used in the manufacturing process, the manufacture of medicines to give them the necessary physical and chemical properties.

Под термином буфер, буферная композиция, буферный агент понимается раствор, способный сохранять значение рН, благодаря взаимодействию кислотных и щелочных компонентов, входящих в его состав, который дает возможность препарату антитела проявлять устойчивость к изменениям рН. В общем случае преимущественными являются значения рН фармацевтической композиции от 4,0 до 8,0. В качестве буферных агентов могут быть использованы, например, ацетатный, фосфатный, цитратный, гистидиновый, сукцинатный и т.п. буферные растворы, но без ограничения ими.The term buffer, buffer composition, buffer agent is understood as a solution capable of maintaining the pH value due to the interaction of the acidic and alkaline components that make up its composition, which enables the antibody preparation to be resistant to changes in pH. In general, the pH values of the pharmaceutical composition are from 4.0 to 8.0. As buffer agents, for example, acetate, phosphate, citrate, histidine, succinate, and the like can be used. buffer solutions, but without limitation.

Термины тонический агент, осмолитик или осмотический агент в том виде, как они здесь использованы, относятся к эксципиенту, который может подводить осмотическое давление жидкого препарата антитела. Изотоничный препарат представляет собой препарат, который имеет осмотическое давление, эквивалентное давлению человеческой крови. Изотоничные препараты обычно имеют осмотическое давление от примерно 250 до 350 мОсм/кг. В качестве изотонических агентов могут быть использованы полиолы, моно- и дисахара, аминокислоты, соли металлов, например хлорид натрия, и т.п., но без ограничения ими.The terms tonic agent, osmolytic, or osmotic agent, as used herein, refer to an excipient that can supply the osmotic pressure of a liquid antibody preparation. An isotonic preparation is a preparation that has an osmotic pressure equivalent to that of human blood. Isotonic formulations typically have an osmotic pressure of about 250 to 350 mOsm/kg. As isotonic agents, polyols, mono- and disaccharides, amino acids, metal salts such as sodium chloride, and the like can be used, but are not limited to.

Под стабилизатором понимается вспомогательное вещество или смесь двух и более вспомогательных веществ, которые обеспечивают физическую и/или химическую стабильность активного агента. В качестве стабилизаторов могут быть использованы аминокислоты, например аргинин, гистидин, глицин, лизин, глутамин, пролин, но без ограничения ими;A stabilizer is understood to be an excipient or a mixture of two or more excipients which provide the physical and/or chemical stability of the active agent. As stabilizers can be used amino acids, such as arginine, histidine, glycine, lysine, glutamine, proline, but without limitation;

поверхностно-активные вещества, например полисорбат 20 (торговое наименование Tween 20), полисорбат 80 (торговое наименование Tween 80), полиэтилен-полипропилен гликоль и его кополимеры (торговые наименования Полоксамер (Poloxaner), Плуроник (Pluronic)), натрия додецилсульфат (SDS), но без ограничения ими;surfactants such as polysorbate 20 (trade name Tween 20), polysorbate 80 (trade name Tween 80), polyethylene-polypropylene glycol and its copolymers (trade names Poloxaner, Pluronic), sodium dodecyl sulfate (SDS) , but without limitation;

антиоксиданты, например метионин, ацетилцистеин, аскорбиновая кислота, монотиоглицерол, соли серистых кислот и т.п., но без ограничения ими;antioxidants, such as, but not limited to, methionine, acetylcysteine, ascorbic acid, monothioglycerol, sulfuric acid salts, and the like;

хелатирующие агенты, например этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), диэтилентриаминпентауксусная кислота (ДТПА), цитрат натрия и т.п., но без ограничения ими.chelating agents such as, but not limited to, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), sodium citrate, and the like.

Фармацевтическая композиция является стабильной, если активный агент сохраняет свою физическую стабильность, и/или химическую стабильность, и/или биологическую активность в течение заявленного срока годности при температуре хранения, например при 2-8°C. Предпочтительно, чтобы активный агент сохранял и физическую стабильность, и химическую стабильность, а также биологическую активность. Период хранения выбирается на основании результатов исследования стабильности при ускоренном и естественном хранении.A pharmaceutical composition is stable if the active agent retains its physical stability and/or chemical stability and/or biological activity during the stated shelf life at storage temperature, for example at 2-8°C. Preferably, the active agent retains both physical stability and chemical stability, as well as biological activity. The storage period is selected based on the results of a stability study with accelerated and natural storage.

Фармацевтическая композиция, содержащая моноклональное антитело по изобретению, может быть введена пациенту, имеющему патологии, как описано в данной заявке, с использованием стандартных методов введения, включая пероральное, внутривенное, интраперитонеальное, подкожное, легочное, трансдермальное, внутримышечное, интраназальное, буккальное, сублингвальное или при помощи суппозиториев.A pharmaceutical composition containing a monoclonal antibody of the invention may be administered to a patient having the pathologies as described herein using standard methods of administration, including oral, intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, pulmonary, transdermal, intramuscular, intranasal, buccal, sublingual, or using suppositories.

Фармацевтическая композиция по изобретению предпочтительно содержит или является терапевтически эффективным количеством антитела по изобретению. Терапевтически эффективное количество относится к количеству, эффективному при дозировках и на протяжении периодов времени, необходимого для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела может варьироваться в зависимости от таких факторов, как состояние болезни, возраст, пол и вес индивидуума, и способности антитела или части антитела вызывать желательную реакцию у индивидуума. Терапевтически эффективное количество также представляет собой количество, при котором терапевтически полезный эффект антитела преобладает над токсическим или вредным эффектом. Профилактически эффективное количество относится к количеству, эффективному при дозировках и на протяжении периодов времени, необходимых для достижения желательного профилактического результата. Поскольку профилактическую дозу используют для индивидуумов до или на ранней стадии заболевания, то типично профилактически эффективное количество может быть меньшим, чем терапевтически эффективное количество.The pharmaceutical composition of the invention preferably contains or is a therapeutically effective amount of an antibody of the invention. A therapeutically effective amount refers to an amount effective at dosages and over periods of time necessary to achieve the desired therapeutic result. A therapeutically effective amount of an antibody may vary depending on factors such as the disease state, age, sex, and weight of the individual, and the ability of the antibody or antibody portion to elicit the desired response in the individual. A therapeutically effective amount is also the amount at which the therapeutically beneficial effect of the antibody outweighs the toxic or deleterious effect. A prophylactically effective amount refers to an amount effective at dosages and for periods of time necessary to achieve the desired prophylactic result. Since a prophylactic dose is used in individuals before or at an early stage of the disease, the typically prophylactically effective amount may be less than the therapeutically effective amount.

Терапевтически эффективное или профилактически эффективное количество представляет собой по крайней мере минимальную дозу, но меньшую, чем токсическая доза активного агента, необходимая для обеспечения терапевтической пользы пациенту. С другой стороны, терапевтически эффективное количе- 17 042982 ство антитела по изобретению представляет собой количество, которое у млекопитающих, предпочтительно людей, снижает биологическую активность аутоиммунных клонов, например, через связывание ТКР, бета-цепь которого относится к семейству TRBV9, где присутствие этих клонов вызывает или способствует нежелательным патологическим эффектам, или снижение уровней ТКР, бета-цепь которого относится к семейству TRBV9, вызывает благоприятный терапевтический эффект у млекопитающего, предпочтительно человека.A therapeutically effective or prophylactically effective amount is at least the minimum dose, but less than the toxic dose of the active agent, necessary to provide a therapeutic benefit to the patient. On the other hand, a therapeutically effective amount of an antibody of the invention is an amount which, in mammals, preferably humans, reduces the biological activity of autoimmune clones, for example, through binding of TCR, the beta chain of which belongs to the TRBV9 family, where the presence of these clones causes or contributes to undesirable pathological effects, or a decrease in the levels of TCR, the beta chain of which belongs to the TRBV9 family, causes a beneficial therapeutic effect in a mammal, preferably a human.

Путь введения антитела по изобретению может быть пероральным, парентеральным, путем ингаляции или местным. Предпочтительно антитела по изобретению могут быть включены в фармацевтическую композицию, пригодную для парентерального введения. Термин парентеральный, как используется в данной заявке, включает внутривенное, внутримышечное, подкожное, ректальное, вагинальное или интраперитонеальное введение. Преимущественным является введение путем внутривенной, или интраперитонеальной, или подкожной инъекции. Подходящие носители для таких инъекций непосредственно известны из уровня техники.The route of administration of an antibody of the invention may be oral, parenteral, inhaled, or topical. Preferably, the antibodies of the invention may be formulated into a pharmaceutical composition suitable for parenteral administration. The term parenteral as used in this application includes intravenous, intramuscular, subcutaneous, rectal, vaginal or intraperitoneal administration. Advantageously, administration is by intravenous or intraperitoneal or subcutaneous injection. Suitable carriers for such injections are directly known in the art.

Фармацевтическая композиция, как указано в соответствующих руководствах, должна быть стерильной и стабильной в условиях производства и хранения в контейнере, который обеспечивается, включая, например, герметично закрытый флакон (ампулу) или шприц. Поэтому фармацевтические композиции могут быть стерильно профильтрованными после получения состава либо сделаны микробиологически пригодными иным образом. Типичная композиция для внутривенной инфузии может иметь объем в 250-1000 мл жидкости, такой как стерильный раствор Рингера, физиологический раствор, раствор декстрозы и раствор Хенка, и терапевтически эффективную дозу (например, 1-100 мг/мл или более) концентрации антитела. Доза может варьировать в зависимости от вида и тяжести заболевания. Как хорошо известно из уровня техники в области медицины, дозировки для любого из пациентов зависят от многих факторов, включая размеры пациента, площадь поверхности тела, возраст, конкретное соединение, предназначенное для введения, пол, время и путь введения, общее состояние здоровья и другие лекарства, которые вводят одновременно. Типичная доза может находиться, например, в диапазоне 0,001-1000 мкг; однако предвидятся дозы, находящиеся ниже или выше этого иллюстративного диапазона, особенно учитывая вышеуказанные факторы. Режим дозировок ежедневного парентерального введения может составлять от 0,1 мкг/кг до 100 мг/кг от общей массы тела, предпочтительно от 0,3 мкг/кг до 10 мг/кг и более предпочтительно от 1 мкг/кг до 1 мг/кг, даже более предпочтительно от 0,5 до 10 мг/кг массы тела в день.The pharmaceutical composition, as specified in the relevant guidelines, must be sterile and stable under the conditions of manufacture and storage in a container that is provided, including, for example, a sealed vial (ampoule) or syringe. Therefore, pharmaceutical compositions may be sterile filtered after formulation or otherwise rendered microbiologically acceptable. A typical intravenous infusion composition may have a volume of 250-1000 ml of liquid, such as sterile Ringer's solution, saline, dextrose solution and Hank's solution, and a therapeutically effective dose (for example, 1-100 mg/ml or more) of the antibody concentration. The dose may vary depending on the type and severity of the disease. As is well known in the art, dosages for any given patient depend on many factors, including patient size, body surface area, age, particular compound to be administered, sex, time and route of administration, general health, and other medications. that are entered at the same time. A typical dose may be, for example, in the range of 0.001-1000 μg; however, doses below or above this exemplary range are contemplated, especially given the above factors. The dosage regimen for daily parenteral administration may be 0.1 µg/kg to 100 mg/kg based on total body weight, preferably 0.3 µg/kg to 10 mg/kg, and more preferably 1 µg/kg to 1 mg/kg , even more preferably 0.5 to 10 mg/kg of body weight per day.

Процесс лечения можно контролировать путем периодической оценки состояния пациента. Для повторного введения в течение нескольких дней или дольше в зависимости от состояния пациента лечение повторяют до достижения желаемого ответа или подавления симптомов болезни. Однако также могут применяться другие режимы дозировок, которые не описаны в данной заявке. Желаемая дозировка может быть введена путем одноболюсного введения, множественных болюсных введений или путем непрерывного инфузионного введения антитела в зависимости от образца фармакокинетического распада, которого хочет достигнуть практикующий специалист.The treatment process can be monitored by periodically assessing the patient's condition. For repeated administration for several days or longer, depending on the condition of the patient, the treatment is repeated until the desired response is achieved or the symptoms of the disease are suppressed. However, other dosage regimens that are not described in this application may also be used. The desired dosage may be administered by single bolus administration, multiple bolus administrations, or by continuous infusion of the antibody, depending on the pharmacokinetic degradation pattern that the practitioner wishes to achieve.

Эти предположительные количества антитела в сильной степени зависят от решения терапевта. Ключевым фактором выбора соответствующей дозы и режима является желаемый результат. Факторы, рассматриваемые в данном контексте, включают конкретное заболевание, которое лечат, конкретное млекопитающее, которое лечат, клиническое состояние отдельного пациента, причину расстройства, место введения антитела, конкретный вид антитела, способ введения, режим введения и остальные факторы, известные практикующим специалистам-медикам.These estimated amounts of antibody are highly dependent on the judgment of the therapist. The key factor in selecting the appropriate dose and regimen is the desired outcome. Factors considered in this context include the particular disease being treated, the particular mammal being treated, the clinical condition of the individual patient, the cause of the disorder, the site of administration of the antibody, the particular type of antibody, route of administration, mode of administration, and other factors known to medical practitioners. .

Терапевтические агенты по изобретению могут быть заморожены либо лиофилизированы и восстановлены перед применением в подходящем стерильном носителе. Лиофилизирование и восстановление могут приводить к различным степеням потери активности антитела. Дозировки могут быть скорректированы для компенсации этой потери. В общем случае преимущественными являются значения рН фармацевтической композиции от 6 до 8.Therapeutic agents of the invention may be frozen or lyophilized and reconstituted in a suitable sterile vehicle prior to use. Lyophilization and reconstitution can result in varying degrees of loss of antibody activity. Dosages may be adjusted to compensate for this loss. In general, pH values of the pharmaceutical composition are between 6 and 8.

Изделие (продукты) и наборы.Product(s) and kits.

Следующим вариантом осуществления изобретения является изделие, которое содержит продукты, применяемые для лечения аутоиммунных заболеваний и родственных состояний и злокачественных заболеваний крови, в патогенез которых вовлечены ТКР, несущие бета-цепь семейства TRBV9. К таким заболеваниям относятся, например, АС, целиакия, Т-клеточный лейкоз, Т-клеточная лимфома и другие.A further embodiment of the invention is an article of manufacture which contains products useful in the treatment of autoimmune diseases and related conditions and malignant blood diseases in which TCRs carrying the beta chain of the TRBV9 family are involved. Such diseases include, for example, AS, celiac disease, T-cell leukemia, T-cell lymphoma, and others.

Изделие представляет собой контейнер с этикеткой и листовкой-вкладышем, которые могут быть размещены в блистере и/или пачке. Приемлемыми контейнерами являются, например, флаконы, ампулы, шприцы и т.д. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или полимерные материалы. Контейнер содержит композицию, эффективную для лечения определенного состояния, и может иметь стерильный входной канал. По меньшей мере одно действующее вещество в композиции представляет собой антитело, предлагаемое в изобретении. На этикетке и листовкевкладыше в упаковке указано, что лекарственное средство применяют для лечения конкретного состояния. Этикетка и/или листовка-вкладыш в упаковке дополнительно должны содержать инструкции по введению композиции антитела пациенту, в том числе информацию о показаниях, применении, дозе,The product is a container with a label and leaflet, which can be placed in a blister and / or pack. Suitable containers are, for example, vials, ampoules, syringes, etc. The containers can be made from various materials such as glass or polymeric materials. The container contains a composition effective for treating a particular condition and may have a sterile inlet. At least one active ingredient in the composition is an antibody of the invention. The label and package insert indicate that the drug is used to treat a specific condition. The label and/or package insert must additionally contain instructions for administering the antibody composition to a patient, including indications, use, dosage,

- 18 042982 пути введения, противопоказаниях и/или мерах предосторожности, касающихся применения таких терапевтических продуктов. В одном из вариантов осуществления изобретения на листовке-вкладыше в упаковке указано, что композицию применяют для лечения.- 18 042982 routes of administration, contraindications and/or precautions regarding the use of such therapeutic products. In one of the embodiments of the invention, the package insert indicates that the composition is used for treatment.

Кроме того, изделие может включать другие продукты, необходимые с коммерческой точки зрения и с точки зрения потребителя, например растворители, разбавители, фильтры, иглы и шприцы, но без ограничения ими.In addition, the product may include other products required from a commercial and consumer point of view, such as solvents, diluents, filters, needles and syringes, but without limitation.

Изобретение относится также к наборам, которые можно применять для различных целей, например для оценки способности уничтожать Т-клетки, несущие ТКР семейства TRBV9, для очистки или иммунопреципитации рецептора TRBV9 из клеток. Для выделения и очистки набор может содержать антитело, связанное с гранулами (например, сефарозными гранулами). Набор содержит контейнер, и этикетку, и листовку-вкладыш в упаковке.The invention also relates to kits that can be used for various purposes, for example, to assess the ability to kill T cells bearing TRBV9 family TCRs, to purify or immunoprecipitate the TRBV9 receptor from cells. For isolation and purification, the kit may contain an antibody bound to beads (eg, Sepharose beads). The kit contains a container, and a label, and a package leaflet.

Диагностическое использование.diagnostic use.

Антитела по настоящему изобретению также используются в диагностических целях (например, in vitro, ex vivo). Например, антитело может использоваться для обнаружения или измерения уровня Т-лимфоцитов, содержащих ТКР семейства TRBV9 в образцах, полученных от пациента, например образец ткани или образец жидкости тела, такой как воспалительный экссудат, кровь, жидкость кишечника, слюна или моча. Подходящие методы обнаружения и измерения включают иммунологические методы, такие как проточная цитометрия, твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), хемилюминесцентный анализ, радиоиммуноанализ и иммуногистология. Изобретение далее включает наборы, например диагностические наборы, содержащие антитела, описанные в данном документе.The antibodies of the present invention are also used for diagnostic purposes (eg, in vitro, ex vivo). For example, the antibody can be used to detect or measure the level of T lymphocytes containing TCRs of the TRBV9 family in samples obtained from a patient, such as a tissue sample or a body fluid sample such as inflammatory exudate, blood, intestinal fluid, saliva, or urine. Suitable detection and measurement methods include immunological methods such as flow cytometry, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), chemiluminescent assay, radioimmunoassay, and immunohistology. The invention further includes kits, such as diagnostic kits, containing the antibodies described herein.

Для наилучшего понимания изобретения приводятся следующие примеры. Эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не должны толковаться как ограничивающие сферу применения изобретения в любой форме.For a better understanding of the invention, the following examples are given. These examples are provided for illustrative purposes only and should not be construed as limiting the scope of the invention in any form.

Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные в этой спецификации, включены в данный документ путем отсылки. Хотя вышеупомянутое изобретение было довольно подробно описано путем иллюстрации и примера в целях исключения двусмысленного толкования, специалистам в данной области на основе идей, раскрытых в данном изобретении, будет вполне понятно, что могут быть внесены определенные изменения и модификации без отклонения от сущности и объема прилагаемых вариантов осуществления изобретения.All publications, patents, and patent applications referenced in this specification are incorporated herein by reference. Although the above invention has been described in some detail by way of illustration and example in order to avoid ambiguous interpretation, it will be quite clear to those skilled in the art based on the ideas disclosed in this invention that certain changes and modifications can be made without deviating from the essence and scope of the attached options. implementation of the invention.

Экспериментальная частьexperimental part

Пример 1. In silico гуманизация последовательностей вариабельных доменов антитела.Example 1 In silico humanization of antibody variable domain sequences.

В качестве родительских (опорных) использовались последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей антитела анти-TRBV9-2, аминокислотные последовательности которого показаны в SEQ ID NO: 8 и 10.The sequences of the heavy and light chain variable domains of the anti-TRBV9-2 antibody, the amino acid sequences of which are shown in SEQ ID NOs: 8 and 10, were used as parental (reference) sequences.

Аминокислотные последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей сравнивали с пулом гермлайн-последовательностей вариабельных доменов иммуноглобулинов человека, гермлайнпоследовательностей вариабельных доменов иммуноглобулинов крысы, последовательностей зрелых антител человека и крысы, полученных как из открытых источников, так и из донорской библиотеки, предоставленной компанией Биокад (Россия). Для анализа использовался пакет программного обеспечения Ylab (Биокад, Россия).Amino acid sequences of heavy and light chain variable domains were compared with a pool of germline sequences of human immunoglobulin variable domains, germline sequences of rat immunoglobulin variable domains, sequences of mature human and rat antibodies obtained both from open sources and from a donor library provided by Biocad (Russia) . The Ylab software package (Biocad, Russia) was used for analysis.

В ходе анализа в последовательностях вариабельных доменов анализируемых антител были установлены позиции и их сочетания, наиболее характерные для животных и не характерные для человека. В то же время были установлены сочетания аминокислот, наиболее часто представленные в антителах человека в данных позициях. На основании полученных данных был осуществлен дизайн искусственных последовательностей вариабельных доменов, содержащих замены, повышающие степень гуманизации антитела.During the analysis, in the sequences of the variable domains of the analyzed antibodies, the positions and their combinations were established that are most characteristic of animals and not characteristic of humans. At the same time, the combinations of amino acids that are most often present in human antibodies at these positions were established. Based on the data obtained, the design of artificial sequences of variable domains containing substitutions that increase the degree of humanization of the antibody was carried out.

Также была проведена кодон-оптимизация нуклеотидных последовательностей, кодирующих предложенные аминокислотные варианты, для осуществления экспрессии гуманизированного антитела в клеточной линии СНО.Codon optimization of the nucleotide sequences encoding the proposed amino acid variants was also carried out in order to express the humanized antibody in the CHO cell line.

Гуманизированные нуклеотидные последовательности HCVR и LCVR (SEQ ID NO: 15 и 17) были синтезированы de novo и клонированы в вектора рЕЕ-НС, pEE-CK, формат IgG1 (Xu et al., Front. Chem. Sci. Eng., 2015, 9(3):376-380) по сайтам рестрикции SalI/NheI и SalI/BsiWI соответственно.Humanized nucleotide sequences of HCVR and LCVR (SEQ ID NOs: 15 and 17) were synthesized de novo and cloned into vectors pEE-HC, pEE-CK, IgG1 format (Xu et al., Front. Chem. Sci. Eng., 2015, 9(3):376-380) at the SalI/NheI and SalI/BsiWI restriction sites, respectively.

Последовательности нуклеиновых полученных легкой и тяжелой цепей проверяли путем секвенирования по методу Сенгера.The resulting light and heavy chain nucleic acid sequences were verified by Sanger sequencing.

Для дальнейшей работы было отобрано антитело МА-043, аминокислотные и нуклеотидные последовательности легкой и тяжелой цепей которого показаны в SEQ ID NO: 19-22.For further work, the MA-043 antibody was selected, the amino acid and nucleotide sequences of the light and heavy chains of which are shown in SEQ ID NO: 19-22.

Степень гуманизации вариабельного домена тяжелой цепи антитела МА-043 составила 84%, а степень гуманизации вариабельного домена легкой цепи - 85% (табл. 1). Константный домен тяжелой цепи представлен форматом IgG1 аллотип Gm3.The degree of humanization of the heavy chain variable domain of the MA-043 antibody was 84%, and the degree of humanization of the light chain variable domain was 85% (Table 1). The heavy chain constant domain is represented by the IgG1 allotype Gm3 format.

- 19 042982- 19 042982

Таблица 1Table 1

Сравнение степени гуманизации вариабельных доменов родительского антитела и антитела МА-043Comparison of the degree of humanization of the variable domains of the parent antibody and antibody MA-043

Антитело Antibody Степень гуманизации HCVR, % Degree of humanization of HCVR, % Степень гуманизации LCVR, % Degree of humanization LCVR, % TRBV9-2 TRBV9-2 72 72 69 69 МА-043 MA-043 84 84 85 85

Пример 2. Получение рекомбинантного антитела и определение его аффинности.Example 2 Obtaining a recombinant antibody and determining its affinity.

Векторы, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие легкую и тяжелую цепи антитела МА-043, полученные как описано в примере 1, нарабатывали в клетках E.coli, очищали при помощи набора реактивов для очистки плазмидной ДНК производства фирмы Qiagen (Германия) и использовали для трансфекции клеточной линии CHO-Fut8 с помощью линейного полиэтиленимина (ПЭИ MAX, Polysciences, США) согласно инструкции производителя. Полученные реакционные смеси инкубировали при 37°C на качалке. Через 9 дней после трансфекции культуральную жидкость отделяли от клеток фильтрацией через фильтр с размером пор 0,5/0,22 мкм. Культуральную жидкость после фильтрации использовали для выделения антител с помощью аффинной хроматографии на колонках PreDictor RoboColumn MabSelect SuRe объемом 0,2 мл (GE Healthcare, США), уравновешенную фосфатно-солевым буфером (ФСБ, рН 7,4). Затем колонку промывали 5 объемами ФСБ. Связанный с носителем белок элюировали, используя 0,1 М глициновый буфер рН 3. Собирали основной пик, содержащий белок и доводили рН до нейтрального с помощью 1 М буфера Tris (рН 7,5). Все стадии проводили при скорости потока 110 см/ч. Далее белок переводили в ФСБ (рН 7,4) с помощью диализа, фильтровали через фильтр диаметром 0,22 мкм, переносили в новые стерильные пробирки. Качество выделения оценивали с помощью 12% ПААГ-электрофореза в денатурирующих условиях.Vectors containing nucleic acids encoding the light and heavy chains of the MA-043 antibody, obtained as described in example 1, were generated in E. coli cells, purified using a kit for purification of plasmid DNA manufactured by Qiagen (Germany) and used for transfection of cell CHO-Fut8 line using linear polyethyleneimine (PEI MAX, Polysciences, USA) according to the manufacturer's instructions. The resulting reaction mixtures were incubated at 37°C on a shaker. 9 days after transfection, the culture fluid was separated from the cells by filtration through a filter with a pore size of 0.5/0.22 μm. The culture fluid after filtration was used to isolate antibodies using affinity chromatography on PreDictor RoboColumn MabSelect SuRe columns of 0.2 ml (GE Healthcare, USA) equilibrated with phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4). The column was then washed with 5 volumes of PBS. The carrier-bound protein was eluted using 0.1 M glycine buffer pH 3. The main peak containing the protein was collected and the pH was adjusted to neutral with 1 M Tris buffer (pH 7.5). All stages were carried out at a flow rate of 110 cm/h. Next, the protein was transferred into PBS (pH 7.4) using dialysis, filtered through a filter with a diameter of 0.22 μm, and transferred into new sterile tubes. The quality of isolation was assessed using 12% PAGE electrophoresis under denaturing conditions.

Количественную оценку проводили с помощью измерения на микроспектрофотометре NanoDrop2000 при 280А. Выделенный белок хранили при -70°C. Определение аффинности антитела проводили на приборе OctetRed 96 (ForteBio, США). Антиген в концентрации 20 мкг/мл иммобилизовали на поверхность AR2G сенсоров (ForteBio) по стандартному протоколу согласно инструкции производителя. Анализ проводили при 30°C с использованием ФСБ, содержащим 0,1% Твин-20 и 0,1% БСА в качестве рабочего буфера. После того как в буферном растворе прописывали базовую линию сенсоры погружали в лунки с раствором антител на 300 с, где происходила ассоциация комплекса. Затем детектировали диссоциацию комплекса в буферном растворе в течение 600 с. Кривые связывания с вычетом референсного сигнала анализировали с помощью программы Octet Data Analysis (версия 9.0) согласно стандартной процедуре с использованием модели взаимодействия 1: 1 Global.Quantification was carried out by measuring on a NanoDrop2000 microspectrophotometer at 280A. The isolated protein was stored at -70°C. The antibody affinity was determined using an OctetRed 96 instrument (ForteBio, USA). The antigen at a concentration of 20 μg/mL was immobilized on the surface of AR2G sensors (ForteBio) according to the standard protocol according to the manufacturer's instructions. The analysis was carried out at 30°C using PBS containing 0.1% Tween-20 and 0.1% BSA as working buffer. After the baseline was written in the buffer solution, the sensors were immersed in the wells with the antibody solution for 300 s, where the association of the complex occurred. Then, the dissociation of the complex in the buffer solution was detected for 600 s. Reference signal subtracted binding curves were analyzed with Octet Data Analysis software (version 9.0) according to a standard procedure using a 1:1 Global interaction model.

Полученные данные (табл. 2) показали, что антитело специфически и с высокой аффинностью связывается с антигеном человека.The data obtained (Table 2) showed that the antibody specifically and with high affinity binds to the human antigen.

Таблица 2table 2

Характеристика аффинности антитела МА-043Affinity characterization of the MA-043 antibody

Антитело Antibody KD (М) KD (M) kon(l/Ms) kon(l/Ms) kdis(l/s) kdis(l/s) Full R^A2Full R ^A 2 МА-043 MA-043 <1.0Е-12 <1.0E-12 3,29Е+05 3.29E+05 <1.0Е-07 <1.0E-07 0,955 0.955

Пример 3. Получение клеточной линии, стабильно продуцирующей антитело в формате IgG1, и наработка антитела.Example 3. Obtaining a cell line that stably produces an antibody in IgG1 format, and the production of antibodies.

Последовательности тяжелой и легкой цепей антитела МА-043 были получены, как описано в примере 1, и клонированы в векторы pSX по сайтам рестрикции HindIII, XbaI. Полученные плазмиды нарабатывали в клетках Е.сой и выделяли с помощью прибора BenchPro 2000 (Life Technology, США) согласно инструкции производителя в количестве 600-700 мкг. Плазмиды линеаризовали в течение ночи с помощью эндонуклеазы PvuI, затем осаждали этанолом, осадок растворяли в воде, концентрация в конечном объеме составляла 900-1100 нг/мкл. Клеточную линию CHO-K1-S культивировали в среде Ham's F12 Gibco (Thermo, США).The heavy and light chain sequences of the MA-043 antibody were obtained as described in Example 1 and cloned into pSX vectors at the HindIII, XbaI restriction sites. The resulting plasmids were generated in E.coy cells and isolated using a BenchPro 2000 device (Life Technology, USA) according to the manufacturer's instructions in an amount of 600-700 μg. Plasmids were linearized overnight with PvuI endonuclease, then precipitated with ethanol, the precipitate was dissolved in water, the concentration in the final volume was 900-1100 ng/μl. The CHO-K1-S cell line was cultivated in Ham's F12 Gibco medium (Thermo, USA).

Трансфекцию генетическими конструкциями, содержащими кодирующие последовательности цепей МА-043, проводили с помощью электропорации на приборе Nucleofector™ (Lonza, Швейцария) согласно протоколу производителя. На следующий день после трансфекции в течение 24 дней проводили антибиотическую селекцию трансфецированных клеток, добавляя в среду пуромицин (конечная концентрация 7,2 мкг/мл) и гигромицин Б (конечная концентрация 640 мкг/мл). Далее были отобраны гомогенные по структуре устойчивые к антибиотикам клеточные клоны, экспрессирующие на высоком уровне МА-043.Transfection with genetic constructs containing the coding sequences of MA-043 chains was performed using electroporation on a Nucleofector™ instrument (Lonza, Switzerland) according to the manufacturer's protocol. The next day after transfection, antibiotic selection of transfected cells was carried out for 24 days by adding puromycin (final concentration 7.2 μg/ml) and hygromycin B (final concentration 640 μg/ml) to the medium. Next, structurally homogeneous, antibiotic-resistant cell clones expressing MA-043 at a high level were selected.

Для культивирования CHO-K1-S экспрессирующие МА-043 использовали бессывороточную среду Ham's F12 Gibco (Thermo, США) с добавлением 25-100 мкМ 2-дезокси-2-фтор-L-фукозы (CarboSynth, Великобритания).CHO-K1-S expressing MA-043 were cultured using Ham's F12 Gibco serum-free medium (Thermo, USA) supplemented with 25-100 µM 2-deoxy-2-fluoro-L-fucose (CarboSynth, UK).

- 20 042982- 20 042982

Наработку моноклонального антитела МА-043 для доклинических исследований проводили в ферментере HyClone single-use bioreactor (Thermo Fisher Scientific) рабочим объемом 50 л. Удаление клеток продуцентов из культуральной жидкости проводили с помощью глубинного фильтра Millistak C0HC (Merck-Millipore, США). Первичную очистку антитела из осветленной культуральной жидкости проводили на аффинном сорбенте с белком А. Специфическую элюцию целевого белка проводили в кислых условиях рН 3.3-3.8 в глициновом буфере. Полученный элюат выдерживали в кислом рН в течение 30-60 мин для вирусной инактивации, а затем нейтрализовали 1 М раствором Tris-HCl до значения рН 6.5-7.0. Для удаления возможных примесей (ДНК, белков клеток продуцента, отщепленного лиганда аффинного сорбента, агрегатов и фрагментов антител) финальную хроматографическую очистку в режиме проскока проводили на сорбенте CaptoAdhere (GE HealthCare LifeSciences, США). Для этого раствор белка пропускали через подготовленный сорбент, уравновешенный трис-буфером с рН 6,5-7,0 при низком значении кондуктивности (<3 мС/см²).The production of monoclonal antibody MA-043 for preclinical studies was carried out in a HyClone single-use bioreactor fermenter (Thermo Fisher Scientific) with a working volume of 50 liters. Producer cells were removed from the culture liquid using a Millistak C0HC depth filter (Merck-Millipore, USA). The primary purification of the antibody from the clarified culture liquid was carried out on an affinity sorbent with protein A. Specific elution of the target protein was carried out under acidic conditions pH 3.3–3.8 in glycine buffer. The resulting eluate was kept in acidic pH for 30-60 min for viral inactivation, and then neutralized with 1 M Tris-HCl solution to pH 6.5-7.0. To remove possible impurities (DNA, producer cell proteins, cleaved affinity sorbent ligand, antibody aggregates and fragments), final chromatographic purification in the breakthrough mode was performed on a CaptoAdhere sorbent (GE HealthCare LifeSciences, USA). To do this, the protein solution was passed through the prepared sorbent equilibrated with Tris buffer pH 6.5-7.0 at a low conductivity value (<3 mS/cm ² ).

Очищенный белок подвергали противовирусной фильтрации с использованием набора фильтров Viresolve PRO (Millipore, США), концентрированию и диафильтрации против конечного буфера, содержащего ацетатный буфер (рН 5,0-5,5) и трегалозу.The purified protein was subjected to antiviral filtration using a Viresolve PRO filter kit (Millipore, USA), concentration and diafiltration against a final buffer containing acetate buffer (pH 5.0-5.5) and trehalose.

Пример 4. Применение антитела для специфического связывания с фрагментом бета-цепи Т-клеточного рецептора семейства рецепторов TRBV9.Example 4 Use of an antibody for specific binding to a fragment of the beta chain of the T-cell receptor of the TRBV9 receptor family.

Моноклональные антитела МА-043, полученные как описано в примере 3, использовали для сортировки субпопуляций лифоцитов. Антитела метили флуоресциином с помощью реагента флуоресциин изотиоцианат (Sigma, США) по протоколу производителя. Контроль количества флуорофоров, вступивших в реакцию с молекулами антитела, осуществляли по соотношению спектра поглощения при длинах волн 495/280 нм.Monoclonal antibodies MA-043, obtained as described in example 3, were used to sort subpopulations of lymphocytes. Antibodies were labeled with fluorescein using the fluorescein isothiocyanate reagent (Sigma, USA) according to the manufacturer's protocol. The amount of fluorophores that reacted with antibody molecules was controlled by the ratio of the absorption spectrum at wavelengths of 495/280 nm.

Т-лимфоциты получали из периферической крови здорового донора. Кровь собирали в пробирки Vacuette с EDTA (по 2x9 мл), мононуклеарную фракцию согласно стандартной методике, описанной в (Ковальчук Л.В. и др., Иммунология: практикум, 2010, 176 с.). После выделения клетки переносили в фосфатно-солевой буфер (PBS), содержащий 0.5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 2 mM ЭДТА. Суммарное количество клеток и их жизнеспособность определяли по методу окрашивания с трипановым синим, как описано Лангом Н.Р. (Стимуляция лимфоцитов, М., Медицина, 1976, 288 с.). К клеточной суспензии добавляли равный объем 0,1% раствора трипанового синего, далее проводили подсчет окрашенных (мертвых) и неокрашенных синих клеток в камере Горяева. На основании этих данных делался вывод о проценте мертвых клеток в исследуемом образце.T-lymphocytes were obtained from the peripheral blood of a healthy donor. Blood was collected in Vacuette tubes with EDTA (2x9 ml each), mononuclear fraction according to the standard method described in (Kovalchuk L.V. et al., Immunology: workshop, 2010, 176 p.). After isolation, the cells were transferred into phosphate buffered saline (PBS) containing 0.5% bovine serum albumin (BSA) and 2 mM EDTA. The total number of cells and their viability was determined by the method of staining with trypan blue, as described by Lang H.R. (Stimulation of lymphocytes, M., Medicine, 1976, 288 p.). An equal volume of 0.1% trypan blue solution was added to the cell suspension, then stained (dead) and unstained blue cells were counted in the Goryaev chamber. Based on these data, a conclusion was made about the percentage of dead cells in the test sample.

Для подтверждения селективности связывания МА-043 с целевой популяцией Т-лимфоцитов, несущих на своей мембране ТКР, относящийся к семейству TRBV9, аликвоты клеток по 500 тыс. из мононуклеарной фракции, добавляли к буферу PBS, содержащему 0.5% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 2 mM ЭДТА рН8, антитела МА-043, меченые FITC, CD3-eFluor405 (маркер Т-лимфоцитов) (eBioscience, США) и CD45-PC5 (eBioscience, США) (общий лейкоцитарный маркер) в концентрации 100 нг/мл. Реакционные смеси объемом 50 мкл инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин, после этого клетки промывали буфером PBS с 0.5% БСА 2тМ ЭДТА. Клетки после процедуры окрашивания использовали для сортировки с помощью проточной цитометрии (FACSARIA III, США). Использование этих маркеров при покраске позволило изолировать клетки целевой популяции, которые несли на своей поверхность TRBV9+, CD3+, CD45+, а также получить клетки из негативной популяции, т.е. соответствующие иммунофенотипу TRBV9-, CD3+, CD45+.To confirm the selectivity of MA-043 binding to the target population of T-lymphocytes carrying TCR belonging to the TRBV9 family on their membrane, 500 thousand cell aliquots from the mononuclear fraction were added to PBS buffer containing 0.5% bovine serum albumin (BSA), 2 mM EDTA pH8, MA-043 antibodies labeled with FITC, CD3-eFluor405 (T-lymphocyte marker) (eBioscience, USA) and CD45-PC5 (eBioscience, USA) (total leukocyte marker) at a concentration of 100 ng/ml. Reaction mixtures with a volume of 50 μL were incubated at room temperature for 30 min, after which the cells were washed with PBS buffer with 0.5% BSA 2tM EDTA. Cells after the staining procedure were used for sorting using flow cytometry (FACSARIA III, USA). The use of these markers for staining made it possible to isolate cells of the target population that carried TRBV9+, CD3+, CD45+ on their surface, and also to obtain cells from the negative population, i.e. corresponding to the immunophenotype TRBV9-, CD3+, CD45+.

Полученные в двух повторностях клетки из популяций TRBV9+ и TRBV9- использовали для выделения суммарной РНК и секвенирования последовательностей бета-цепей ТКР. Полученные фракции клеток помещали в RLT-буфер (Quagen, Германия) и выделяли из них РНК с помощью набора реактивов Quiagen RNAeasy mini kit #217004 (Quagen) согласно протоколу производителя. На матрице выделенной РНК синтезировали кДНК и амплифицировали фрагменты бета-цепи Т-рецептора по протоколу, описанному Britanova et al. (J. Immunol., 2016, 196 (12), 5005-5013) с использованием набора реактивов Mint cDNA synthesis kit (Евроген, Россия). К наработанным ампликонам лигировали адапторы Illumina (США) и секвенировали на платформе MiSeq Illumina согласно протоколу производителя секвенатора. Данные секвенирования анализировали с помощью программ MiGEC, MiXCR и VDJtools, представленных на сайте в сети Интернет: https://milaboratory.com. Анализ полученных репертуаров бета-цепей ТКР показал, что библиотеки, полученные в результате сортировки с помощью антитела МА-043, были обогащены на 91% последовательностями, которые кодировались генным сегментом TRBV9. Тогда как в репертуарах бета-цепей негативной фракции TRBV9- последовательностей, содержащих TRBV9, обнаружено не было.Cells obtained in duplicate from the TRBV9+ and TRBV9- populations were used for total RNA isolation and sequencing of TCR beta chain sequences. The resulting cell fractions were placed in RLT buffer (Quagen, Germany) and RNA was isolated from them using Quiagen RNAeasy mini kit #217004 (Quagen) according to the manufacturer's protocol. cDNA was synthesized on the isolated RNA template, and fragments of the T-receptor beta chain were amplified according to the protocol described by Britanova et al. (J. Immunol., 2016, 196 (12), 5005-5013) using Mint cDNA synthesis kit (Evrogen, Russia). Illumina adapters (USA) were ligated to the accumulated amplicons and sequenced on the MiSeq Illumina platform according to the protocol of the sequencer manufacturer. Sequencing data was analyzed using the MiGEC, MiXCR, and VDJtools programs available on the website: https://milaboratory.com. Analysis of the obtained repertoires of TCR beta chains showed that the libraries obtained as a result of sorting with the help of the MA-043 antibody were enriched by 91% with the sequences encoded by the TRBV9 gene segment. Whereas in the repertoires of the beta chains of the TRBV9 negative fraction, sequences containing TRBV9 were not found.

Пример 5. Функциональная активность антитела МА-043.Example 5. Functional activity of the MA-043 antibody.

Моноклональное антитело МА-043 получали, как описано в примере 3. Мононуклеарную фракцию крови человека получали, как описано в примере 4.Monoclonal antibody MA-043 was obtained as described in example 3. Mononuclear fraction of human blood was obtained as described in example 4.

Дополнительно из части мононуклеарной фракции осуществляли выделение естественных киллеров с помощью набора реагентов для выделения NK клеток человека #130-092-657 (Miltenyi Biotec,Additionally, natural killer cells were isolated from part of the mononuclear fraction using a set of reagents for the isolation of human NK cells #130-092-657 (Miltenyi Biotec,

- 21 042982- 21 042982

США). Использовали протокол производителей. Качество выделения NK клеток оценивали с помощью цитофлуометрии (BD FACS ARIA III, США) с использованием меченных антител CD16- FITC, CD56-PE,USA). Manufacturers' protocol was used. The quality of NK cell isolation was assessed by cytofluorometry (BD FACS ARIA III, USA) using labeled antibodies CD16-FITC, CD56-PE,

CD3-VioBlue. Обогащение NK клетками составляло 85-95%.CD3-VioBlue. The enrichment of NK cells was 85-95%.

Для оценки цитотоксичности к аликвоте мононуклеарной фракции, содержащей 1х10⁶ клеток, добавляли антитела МА-043 до конечной концентрации 500 нг/мл. В качестве негативного контроля использовали антитела ремикэйд в такой же концентрации, как и МА-043. К контрольной аликвоте клеток (положительный контроль) антитела не добавляли. Также во все реакционные смеси добавляли по 10⁵ NK клеток. Конечный объем реакции составлял 100 мкл. Реакционные смеси инкубировали при комнатной температуре 1 ч, далее клетки отмывали несколько раз от антител и разносили по лункам 96-луночного круглодонного планшета на столе.To assess cytotoxicity, MA-043 antibodies were added to an aliquot of the mononuclear fraction containing 1x10 ⁶ cells to a final concentration of 500 ng/ml. Remicade antibodies were used as a negative control at the same concentration as MA-043. No antibodies were added to the control cell aliquot (positive control). Also, 10 ⁵ NK cells were added to all reaction mixtures. The final reaction volume was 100 μl. The reaction mixtures were incubated at room temperature for 1 h, then the cells were washed several times to remove antibodies and spread over the wells of a 96-well round bottom plate on the table.

Через 6 дней клетки собирали из лунок и использовали для иммунофенотипического анализа с помощью проточной цитометрии. Для детекции Т-лимфоцитов были использованы следующие антитела: anti-CD3-eFluor450 (клон OKT3, eBioscience); anti-CD8-PC7 (клон SFCI21Thy2D3, Beckman Coulter, США); МА-043, меченые Fitc.After 6 days, cells were harvested from the wells and used for immunophenotypic analysis by flow cytometry. The following antibodies were used to detect T-lymphocytes: anti-CD3-eFluor450 (clone OKT3, eBioscience); anti-CD8-PC7 (clone SFCI21Thy2D3, Beckman Coulter, USA); MA-043 labeled with Fitch.

После окрашивания клетки отмывали и анализировали на приборе BD FACSARIA III. Т-лимфоциты CD3+ МА-043+ в образцах, подвергшихся инкубации с МА-043 антителами настоящего изобретения, не обнаруживаются.After staining, the cells were washed and analyzed on a BD FACSARIA III instrument. CD3+ MA-043+ T lymphocytes were not detected in samples incubated with MA-043 antibodies of the present invention.

В то же время в контрольном образце без добавления антитела (ноль-контроль), а также с добавлением терапевтических антител ремикейд детекция двойных позитивных Т-лимфоцитов по маркерам CD3+ МА-043+ сохраняется, что подтверждает специфическую элиминацию Т-клеток TRBV9+ при добавлении антител против TRBV9.At the same time, in the control sample without the addition of antibodies (null control), as well as with the addition of therapeutic antibodies remicade, the detection of double positive T-lymphocytes for markers CD3+ MA-043+ is preserved, which confirms the specific elimination of TRBV9+ T cells when antibodies against TRBV9.

В дополнительном негативном контроле, где вместо МА-043 антител настоящего изобретения использовались нецитотоксические антитела против CD6, целевая популяция CD3+CD6+ не менялась по сравнению с ноль-контролем. Это указывает, что экранирования эпитопа не меченными антителами на 6 день не происходит и подтверждает способность МА-043 антител элиминировать клетки, несущие ТКР семейства TRBV9.In an additional negative control, where non-cytotoxic anti-CD6 antibodies were used in place of the MA-043 antibodies of the present invention, the CD3+CD6+ target population did not change compared to the null control. This indicates that epitope shielding by unlabelled antibodies does not occur on day 6 and confirms the ability of MA-043 antibodies to eliminate cells carrying TCRs of the TRBV9 family.

Пример 6. Получение фармацевтической композиции, содержащей антитело согласно изобретению.Example 6 Preparation of a pharmaceutical composition containing an antibody according to the invention.

Фармацевтическую композицию получали стандартными методами, которые известны из уровня техники.The pharmaceutical composition was obtained by standard methods, which are known from the prior art.

Компоненты фармацевтической композиции показаны в табл. 3.The components of the pharmaceutical composition are shown in table. 3.

Таблица 3Table 3

Концентрации компонентов фармацевтической композицииThe concentration of the components of the pharmaceutical composition

Компонент Component Концентрация Concentration Антитело МА-043 Antibody MA-043 10-50 мг/мл 10-50 mg/ml Буфер цитратный 10 мМ до pH Citrate buffer 10 mM to pH 6,0-7,0 6.0-7.0 Хлорид натрия Sodium chloride 50-150 мМ 50-150 mM Сахароза, трегалоза sucrose, trehalose 0,3-0,5% 0.3-0.5% Вода для инъекций Water for injections до 1 мл up to 1 ml

Пример 7. Набор, содержащий фармацевтическую композицию с антителами.Example 7 A kit containing a pharmaceutical composition with antibodies.

Для выпуска наборов с лекарственной формой, содержащей композицию с антителом МА-043, фармацевтическую композицию, полученную согласно примеру 6, запаивают в ампулы или шприцы объемом 1 мл в стерильных условиях, маркируют и упаковывают в контейнеры из пластикового или картонного материала.For the production of kits with a dosage form containing the composition with the MA-043 antibody, the pharmaceutical composition obtained according to example 6 is sealed into 1 ml ampoules or syringes under sterile conditions, labeled and packaged in containers made of plastic or cardboard material.

Также в контейнер с ампулой вкладывают инструкцию по применению.Also, instructions for use are included in the container with the ampoule.

Claims

1. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с участком бета-цепи семейства TRBV-9 Т-клеточного рецептора человека, включающее вариабельный домен тяжелой цепи, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID NO: 16, и вариабельный домен легкой цепи, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID NO: 18.1. A monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a region of the beta chain of the TRBV-9 family of the human T-cell receptor, comprising a heavy chain variable domain, the amino acid sequence of which is shown in SEQ ID NO: 16, and a light chain variable domain, the amino acid sequence of which is shown in SEQ ID NO: 18.

2. Моноклональное антитело по п.1, которое включает тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.2. A monoclonal antibody according to claim 1, which includes a heavy chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 and a light chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22.

3. Моноклональное антитело по любому из пп.1 и 2, которое представляет собой полноразмерное антитело IgG.3. A monoclonal antibody according to any one of claims 1 and 2, which is a full length IgG antibody.

4. Нуклеиновая кислота, которая кодирует тяжелую цепь антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-3, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с участком бета-цепи семейства TRBV9 Т-рецептора человека.4. A nucleic acid that encodes the heavy chain of an antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 3, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof specifically binds to the beta chain region of the TRBV9 family of the human T receptor.

5. Нуклеиновая кислота, которая кодирует легкую цепь антитела или его антигенсвязывающего5. Nucleic acid that encodes the light chain of an antibody or its antigen-binding

- 22 042982 фрагмента по любому из пп.1-3, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с участком бета-цепи семейства TRBV9 Т-рецептора человека.- 22 042982 fragment according to any one of claims 1 to 3, where the antibody or its antigen-binding fragment specifically binds to the region of the beta chain of the TRBV9 family of the human T receptor.

6. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.4.6. An expression vector containing the nucleic acid according to claim 4.

7. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.5.7. An expression vector containing the nucleic acid according to claim 5.

8. Способ получения клетки-хозяина для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-3, включающий ко-трансформирование клетки вектором по п.6 и вектором по п.7.8. A method for producing a host cell for producing an antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 3, including co-transforming the cell with the vector of claim 6 and the vector of claim 7.

9. Клетка-хозяин для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-3, содержащая нуклеиновую кислоту по п.4 и нуклеиновую кислоту по и.5.9. A host cell for producing an antibody or an antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 3, comprising a nucleic acid according to claim 4 and a nucleic acid according to claim 5.

10. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-3, заключающийся в культивировании клетки-хозяина по п.9 в культуральной среде в условиях, обеспечивающих продукцию указанного антитела, с последующим выделением и очисткой полученного антитела.10. A method for producing an antibody or its antigen-binding fragment according to any one of claims 1 to 3, which consists in cultivating the host cell according to claim 9 in a culture medium under conditions that ensure the production of said antibody, followed by isolation and purification of the resulting antibody.

11. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения заболевания или нарушения, опосредуемого участком бета-цепи семейства TRBV9 Т-клеточного рецептора человека, содержащая в терапевтически эффективном количестве антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-3 в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами.11. Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of a disease or disorder mediated by the region of the beta chain of the TRBV9 family of the human T-cell receptor, containing in a therapeutically effective amount an antibody or antigen-binding fragment according to any one of claims 1-3 in combination with one or more pharmaceutical acceptable excipients.

12. Фармацевтическая композиция по п.11, где указанное заболевание или нарушение выбирают из следующей группы: анкилозирующий спондилит, целиакия, Т-клеточный лейкоз, Т-клеточная лимфома.12. The pharmaceutical composition according to claim 11, wherein said disease or disorder is selected from the following group: ankylosing spondylitis, celiac disease, T-cell leukemia, T-cell lymphoma.

13. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения заболевания или нарушения, опосредуемого Т-клеточным рецептором человека, несущим бета-цепь семейства TRBV9, содержащая в терапевтически эффективном количестве антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-3 и, по меньшей мере, другое терапевтически активное соединение в терапевтически эффективном количестве.13. Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of a disease or disorder mediated by a human T-cell receptor carrying a beta chain of the TRBV9 family, containing in a therapeutically effective amount an antibody or antigen-binding fragment according to any one of claims 1 to 3 and at least another therapeutically active compound in a therapeutically effective amount.

14. Фармацевтическая композиция по п.13, где указанное заболевание или нарушение выбирают из следующей группы: анкилозирующий спондилит, целиакия, Т-клеточный лейкоз, Т-клеточная лимфома.14. The pharmaceutical composition according to claim 13, wherein said disease or disorder is selected from the following group: ankylosing spondylitis, celiac disease, T-cell leukemia, T-cell lymphoma.

15. Фармацевтическая композиция по любому из пп.13 и 14, где другое терапевтически активное соединение выбирают из малой молекулы, антитела или стероидных гормонов.15. Pharmaceutical composition according to any one of claims 13 and 14, wherein the other therapeutically active compound is selected from small molecule, antibody, or steroid hormones.

16. Способ ингибирования биологической активности Т-клеточного рецептора, бета-цепь которого относится к семейству TRBV9, у субъекта, нуждающегося в таком ингибировании, включающий введение субъекту эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-3.16. A method for inhibiting the biological activity of a T cell receptor whose beta chain belongs to the TRBV9 family in a subject in need of such inhibition, comprising administering to the subject an effective amount of an antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1-3.

17. Способ лечения заболевания или нарушения, опосредованного Т-клеточным рецептором человека, несущим бета-цепь семейства TRBV9, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-3, или фармацевтической композиции по любому из пп.11-15 в терапевтически эффективном количестве.17. A method of treating a disease or disorder mediated by a human T-cell receptor carrying a beta chain of the TRBV9 family, comprising administering to a subject in need of such treatment, an antibody, or an antigen-binding fragment thereof, according to any one of claims 1 to 3, or a pharmaceutical composition according to any of claims 11-15 in a therapeutically effective amount.

18. Способ лечения заболевания или нарушения по п.17, где заболевание или нарушение выбрано из следующей группы: анкилозирующий спондилит, целиакия, Т-клеточный лейкоз, Т-клеточная лимфома.18. A method of treating a disease or disorder according to claim 17, wherein the disease or disorder is selected from the following group: ankylosing spondylitis, celiac disease, T-cell leukemia, T-cell lymphoma.

19. Применение антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-3, или фармацевтической композиции по любому из пп.11-15 для лечения у субъекта, нуждающегося в таком лечении, заболевания или нарушения, опосредуемого Т-клеточным рецептором человека, несущим бета-цепь семейства TRBV9.19. The use of an antibody, or an antigen-binding fragment thereof, according to any one of claims 1 to 3, or a pharmaceutical composition according to any one of claims 11 to 15, for treating a human T-cell receptor-mediated disease or disorder in a subject in need of such treatment, bearing the beta chain of the TRBV9 family.

20. Применение по п.19, где заболевание выбрано из следующей группы: анкилозирующий спондилит, целиакия, Т-клеточный лейкоз, Т-клеточная лимфома.20. Use according to claim 19, wherein the disease is selected from the following group: ankylosing spondylitis, celiac disease, T-cell leukemia, T-cell lymphoma.