EA042923B1

EA042923B1 - Альфа-v бета-6 лиганды интегрина и варианты их применения

Info

Publication number: EA042923B1
Application number: EA201991102
Authority: EA
Inventors: Аарон Алмейда; Чжэнь ЛИ; Эрик В Буш; Тао Пэй; Ангешка Глебоцка; Энтони Николас; Джеффри Карлсон; Мэттью Фаулер-Уоттерс
Original assignee: Эрроухед Фармасьютикалс, Инк.
Priority date: 2016-11-01
Filing date: 2017-11-01
Publication date: 2023-04-05

Description

Ссылка на родственные заявки

Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой на выдачу патента США № 62/415752, поданной 1 ноября 2016 г., содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Раскрыты пептидные лиганды интегрина альфа-v бета-6 (αvβ6), способные целенаправленно воздействовать на интегрин αγβ6 и/или целенаправленно воздействовать на клетки, которые экспрессируют интегрин αvβ6. Лиганды интегрина αvβ6 могут быть конъюгированы с одной или более каргомолекулами для облегчения доставки карго-молекул в экспрессирующие интегрин αγβ6 клетки, например эпителиальные клетки.

Уровень техники

Интегрин альфа-v бета-6 (αvβ6), который экспрессируется в различных эпителиальных клетках, представляет рецептор для латентно-ассоциированного пептида (LAP) TGF-β и для (ЕСМ) белков фибронектина, витронектина и тенасцина.

С трудом обнаруживаемый в эпителии нормальных здоровых взрослых людей интегрин αvβ6 имеет повышенный уровень экспрессии во время заживления ран и при разных видах рака (например, при раке толстой кишки, яичников, эндометрия и желудка) и часто связан с плохим прогнозом рака. Было показано, что интегрин αvβ6 может стимулировать инвазию клеток и миграцию при метастазировании и ингибировать апоптоз. Интегрин αvβ6 также может регулировать экспрессию матриксных металлопротеиназ (ММР) и активировать TGF-β 1. Существует все больше доказательств, в первую очередь, из исследований in vitro, которые подтверждают, что интегрин αvβ6 может содействовать развитию рака. Таким образом, интегрин αvβ6 является привлекательным и в качестве биомаркера опухоли и потенциальной терапевтической мишени и из-за его роли в экспрессии матриксных металлопротеиназ (ММР) и активации TGF-P1.

Сущность изобретения

В настоящем документе описаны новые, сконструированные, не существующие в природе пептидные лиганды интегрина αvβ6 (также называемые лиганды αvβ6). Раскрытые в настоящем описании лиганды интегрина αvβ6 являются стабильными в сыворотке и обладают аффинностью к интегринам αvβ6 и могут специфически с ними связываться. Кроме того, в настоящем документе описаны композиции, которые содержат лиганды интегрина αvβ6, и способы применения лигандов интегрина αvβ6 и описанных в настоящем документе композиций.

Описанные в настоящем описании лиганды интегрина αvβ6 имеют улучшенную стабильность по сравнению с другими известными связывающими интегрин αvβ6 пептидами, например с натуральным пептидом RGDLATLRQL (SEQ ID NO: 1). При том что имеют повышенную стабильность в сыворотке, новые описанные в настоящем описании лиганды αvβ6 сохраняют связывание (аффинность к) интегрину αvβ6.

В первом аспекте в настоящем раскрытии представлены сконструированные, не существующие в природе лиганды интегрина αvβ6. В некоторых вариантах осуществления лиганды интегрина αvβ6 имеют общую формулу

Z-RG¹DLXaa¹Xaa²L (SEQ ID NO: 85) (Формула I), в которой Z представляет аминотерминальный кэп (например, любой из аминотерминальных кэпов, описанных в настоящем документе или известных в данной области);

R представляет L-аргинин;

G¹ представляет L-глицин или N-метилглицин;

D представляет L-аспарагиновую кислоту (L-аспартат);

L представляет L-лейцин;

Хаа¹ представляет L-α аминокислоту (например, любую из L-α аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области), L-β аминокислоту (например, любую из L-β аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области) или α,α-дизамещенную аминокислоту (например, любую из α,α-дизамещенных аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области); а

Хаа² представляет L-α аминокислоту (например, любую из L-α аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области), L-β аминокислоту (например, любую из L-β аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области) или α,α-дизамещенную аминокислоту (например, любую из α,α-дизамещенных аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области).

В некоторых вариантах осуществления лиганды интегрина αvβ6 имеют общую формулу Z-RG¹DLXaa¹Xaa²L-J-R¹ (SEQ ID NO: 86) (Формула II), в которой Z представляет аминотерминальный кэп (например, любой из аминотерминальных кэпов, описанных в настоящем документе или известных в данной области);

- 1 042923

R представляет L-аргинин;

G¹ представляет L-глицин или N-метилглицин;

L представляет L-лейцин;

Хаа¹ представляет L-α аминокислоту (например, любую из L-α аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области), L-β аминокислоту (например, любую из L-β аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области) или α,α-дизамещенную аминокислоту (например, любую из α,α-дизамещенных аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области);

Хаа² представляет L-α аминокислоту (например, любую из L-α аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области), L-β аминокислоту (например, любую из L-β аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области) или α,α-дизамещенную аминокислоту (например, любую из α,α-дизамещенных аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области);

J является необязательным, а если имеется, содержит одну или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30; или 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 5-30, 5-25, 5-20, 5-15, 5-10, 10-30, 10-25, 10-20, 10-15, 15-30, 15-25, 15-20, 20-30, 20-25 или 25-30) L-α аминокислот (например, любую из L-α аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области), L-β аминокислот (например, любую из L-β аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области), или α,α-дизамещенных аминокислот (например, любую из α,α-дизамещенных аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области), или их комбинацию; и

R¹ является необязательным, а если имеется, содержит полиэтиленгликоль (PEG) и/или связывающую группу.

В некоторых вариантах осуществления раскрытые в настоящем описании лиганды интегрина αvβ6 могут содержать реакционноспособную группу или защищенную реакционноспособную группу и имеют общую формулу

Z-RG¹DLXaa¹Xaa²L-J-R^R² (SEQ ID NO:87) (Формула III), в которой Z представляет аминотерминальный кэп (например, любой из аминотерминальных кэпов, описанных в настоящем документе или известных в данной области);

R представляет L-аргинин;

G¹ представляет L-глицин или N-метилглицин;

L представляет L-лейцин;

J является необязательным, а если имеется, содержит одну или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30; или 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 5-30, 5-25, 5-20, 5-15, 5-10, 10-30, 10-25, 10-20, 10-15, 15-30, 15-25, 15-20, 20-30, 20-25 или 25-30) L-α аминокислот (например, любую из L-α аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области), L-β аминокислот (например, любую из L-β аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области), или α,α-дизамещенных аминокислот (например, любую из α,α-дизамещенных аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области), или их комбинацию;

R¹ является необязательным, а если имеется, содержит полиэтиленгликоль (PEG) и/или связывающую группу; и

R² содержит реакционноспособную группу или защищенную реакционноспособную группу.

В некоторых вариантах осуществления лиганд интегрина αγβ6 может быть конъюгирован с одной или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30; или 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 5-30, 5-25, 5-20, 5-15, 5-10, 10-30, 10-25, 10-20, 10-15, 15-30, 15-25, 15-20, 20-30, 20-25 или 25-30) карго-молекулами (например, с любой из карго-молекул, описанных в настоящем документе или известных в данной области),

- 2 042923 при этом лиганд интегрина αvβ6 имеет общую формулу (Z-RG¹DLXaa¹Xaa²L-J- R¹) _n-R³ (SEQ ID NO: 88) (Формула IV), в которой Z представляет аминотерминальный кэп (например, любой из аминотерминальных кэпов, описанных в настоящем документе или известных в данной области);

R представляет L-аргинин;

G¹ представляет L-глицин или N-метилглицин;

L представляет L-лейцин;

R¹ является необязательным, а если имеется, содержит полиэтиленгликоль (PEG) и/или связывающую группу; n представляет число больше 0 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30; или 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 5-30, 5-25, 5-20, 515, 5-10, 10-30, 10-25, 10-20, 10-15, 15-30, 15-25, 15-20, 20-30, 20-25 или 25-30); и

R³ содержит одну или более карго-молекул.

В некоторых вариантах осуществления R³ содержит одну карго-молекулу. В некоторых вариантах осуществления R³ содержит более чем одну карго-молекулу.

В некоторых вариантах осуществления лиганд интегрина αvβ6 может быть конъюгирован с одной или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30; или 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 5-30, 5-25, 5-20, 5-15, 5-10, 10-30, 10-25, 10-20, 10-15, 15-30, 15-25, 15-20, 20-30, 20-25 или 25-30) карго-молекулами (например, с любой из карго-молекул, описанных в настоящем документе или известных в данной области), при этом лиганд интегрина αvβ6 имеет общую формулу (Z-RG¹DLXaa¹Xaa²L-J-R¹)nR⁴-(R³)P (SEQ ID NO: 89) (Формула V) _r в которой Z представляет аминотерминальный кэп (например, любой из аминотерминальных кэпов, описанных в настоящем документе или известных в данной области);

R представляет L-аргинин;

G¹ представляет L-глицин или N-метилглицин;

L представляет L-лейцин;

J является необязательным, а если имеется, содержит одну или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30; или 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 5-30, 5-25, 5-20, 5-15, 5-10, 10-30, 10-25, 10-20, 10-15, 15-30, 15-25, 15-20, 20-30, 20-25 или 25-30) L-α аминокислот (например, любую из L-α аминокислот, описанных в настоящем документе или известных

- 3 042923 в данной области), L-β аминокислот (например, любую из L-β аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области) или α,α-дизамещенных аминокислот (например, любую из α,α-дизамещенных аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области), или их комбинацию;

R¹ является необязательным, а если имеется, содержит полиэтиленгликоль (PEG) и/или связывающую группу; n представляет число больше 0 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30; или 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 5-30, 5-25, 5-20, 5-15, 5-10, 10-30, 10-25, 10-20, 10-15, 15-30, 15-25, 15-20, 20-30, 20-25 или 25-30);

R³ содержит одну или более карго-молекул;

р представляет число больше 0 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30; или 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 5-30, 5-25, 5-20, 5-15, 5-10, 10-30, 10-25, 10-20, 10-15, 15-30, 15-25, 15-20, 20-30, 20-25 или 25-30); и

R⁴ является необязательным, а если имеется, содержит каркас и/или связывающую группу, которая содержит по меньшей мере одну точку присоединения для каждого лиганда и по меньшей мере одну точку присоединения для каждой карго-молекулы.

В рамках изобретения аминотерминальный кэп (в формулах в настоящем описании показан как Z) содержит химический фрагмент, который способен увеличивать и/или иным образом улучшать характеристики устойчивости к протеазе и/или стабильности в сыворотке натурального пептида RGDLATL. Подобные улучшения можно определить, например, используя широко известные в данной области способы, включая без ограничения, например, путем определения периода полураспада лиганда интегрина ανβ6, конъюгата лиганд интегрина αvβ6-карго-молекула или содержащей лиганд интегрина ανβ6 композиции in vivo и/или in vitro. В некоторых вариантах осуществления Z предусматривает устойчивое к действию протеазы ацилирование, сульфонилирование или алкилирование N-терминального амина раскрытого в настоящем описании лиганда интегрина ανβ6. В некоторых вариантах осуществления аминотерминальным кэпом Z может быть алкил-СО, ArCO, алкил-SO₂, ArSO₂, алкильные или арильные группы. В некоторых вариантах осуществления алкильными группами могут быть либо линейные, либо разветвленные алифатические алкильные группы, а арильными группами могут быть либо ароматические, либо гетероароматические группы. В некоторых вариантах осуществления аминотерминальным кэпом Z может быть без ограничения СН3СО, СН₃СН₂СО, СН₃(СН₂)₂СО, (СН₃)₂СНСО, СН₃(СН₂)₃СО, (СН₃)₂СНСН₂СО, СН₃СН₂СН(СН₃)СО, (СН₃)₃ССО, СН₃(СН₂)₄СО, CH₃SO₂, CH₃CH₂SO₂, CH₃(CH₂)₂SO₂, (CH₃)₂CHSO₂, CH₃(CH₂)₃SO₂, (CH₃)₂CHCH₂SO₂, CH₃CH₂CH(CH₃)SO₂, (CH₃)₃CSO₂, PhCO, PhSO₂, алкильная группа, имеющая 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 атомов углерода, метил, этил, пропил, бутил, пентил, NH2NH, PEG, гуанидинил, CH3OCH2CH2OCH2CH2CO, CH3O(CH2CH2O)2CH2CH2CO, CH3O(CH2CH2O)3CH2CH2CO, CH₃O(CH₂CH₂O)₄CH₂CH₂CO, CH₃O(CH₂CH₂O)₅CH₂CH₂CO, CH₃OCH₂CH₂OCH₂CO, CH₃O(CH₂CH₂O)₂CH₂CO, CH₃O(CH₂CH₂O)₃CH₂CO, CH₃O(CH₂CH₂O)₄CH₂CO, CH₃O(CH₂CH₂O)₅CH₂CO, CH₃OCH₂CH₂OCO, CH3O(CH2CH2O)2CO, CH3O(CH2CH2O)3CO, CH3O(CH2CH2O)4CO, CH3O(CH2CH2O)5CO,

HOCH2CH2OCH2CH2CO, HO(CH2CH2O)2CH2CH2CO, HO(CH2CH2O)3CH2CH2CO, HO(CH2CH2O)4CH2CH2CO, HO(CH2CH2O)5CH2CH2CO, HOCH2CH2OCH2CO, HO(CH2CH2O)2CH2CO, HO(CH2CH2O)3CH2CO,

HO(CH2CH2O)4CH2CO, HO(CH2CH2O)5CH2CO, HOCH2CH2OCO, HO(CH2CH2O)2CO, HO(CH2CH2O)3CO, HO(CH2CH2O)4CO, HO(CH2CH2O)5CO, CH3CH2OCH2CH2OCH2CH2CO, CH3CH2O(CH2CH2O)2CH2CH2CO, CH3CH2O(CH2CH2O)3CH2CH2CO, CH3CH2O(CH2CH2O)4CH2CH2CO, CH3CH2O(CH2CH2O)5CH2CH2CO, CH3CH2OCH2CH2OCH2CO, CH3CH2O(CH2CH2O)2CH2CO, CH3CH2O(CH2CH2O)3CH2CO,

CH3CH2O(CH2CH2O)4CH2CO, CH3CH2O(CH2CH2O)5CH2CO, CH3CH2OCH2CH2OCO, CH3CH2O(CH2CH2O)2CO, CH3CH2O(CH2CH2O)3CO, CH3CH2O(CH2CH2O)4CO, CH3CH2O(CH2CH2O)5CO, CH3OCH2CH2CO,

HOCH2CH2CO или CH3CH2OCH2CH2CO.

В некоторых вариантах осуществления аминотерминальным кэпом Z является СН3СО. В некоторых вариантах осуществления аминотерминальным кэпом Z является СН₃СН₂СО. В некоторых вариантах осуществления аминотерминальным кэпом Z является CН₃(CН₂)₂CO. В некоторых вариантах осуществления аминотерминальным кэпом Z является CН₃(CН₂)₃CO. В некоторых вариантах осуществления аминотерминальным кэпом Z является CH3(CH2)4CO.

В некоторых вариантах осуществления лиганды интегрина ανβ6 имеют общую формулу Z-RG¹DLAXaa^uL (SEQ ID NO: 90) (Формула Ic) , в которой Z, R, G¹, D и L каждый соответствует определению для формулы I в настоящем описании;

А представляет L-аланин; и

Xaa^U представляет нестандартную аминокислоту.

В некоторых вариантах осуществления лиганды интегрина ανβ6 имеют общую формулу Z-RG’DLAAbuL (SEQ ID NO: 91) (Формула Id), в которой Z, R, G¹, D и L каждый соответствует определению для формулы I в настоящем описа-

- 4 042923 нии;

А представляет L-аланин; и

Abu представляет L-α-аминомαсляную кислоту (2-аминомасляную кислоту).

В некоторых вариантах осуществления лиганды интегрина αvβ6 имеют общую формулу Z-RG¹DLXaa¹Xaa²L-Xaa³Xaa⁴L-R¹ (SEQ ID NO: 92)(Формула VI), в которой Z представляет аминотерминальный кэп (например, любой из аминотерминальных кэпов, описанных в настоящем документе или известных в данной области);

R представляет L-аргинин;

G¹ представляет L-глицин или N-метилглицин;

L представляет L-лейцин;

Хаа³ представляет L-α аминокислоту (например, любую из L-α аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области), L-β аминокислоту (например, любую из L-β аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области) или α,α-дизамещенную аминокислоту (например, любую из α,α-дизамещенных аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области);

Хаа⁴ представляет L-α аминокислоту (например, любую из L-α аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области), L-β аминокислоту (например, любую из L-β аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области) или α,α-дизамещенную аминокислоту (например, любую из α,α-дизамещенных аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области); и

В некоторых вариантах осуществления лиганды интегрина αvβ6 имеют общую формулу Z-RG¹DLAXaa^uL-Xaa³Xaa⁴L-R¹ (SEQ ID NO: 93)(Формула VIb) , в которой Z, R, G¹, D, L и R¹ каждый соответствует определению для формулы VI в настоящем описании;

А представляет L-аланин;

Xaa^u представляет нестандартную аминокислоту;

Хаа³ представляет L-α аминокислоту (например, любую из L-α аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области), L-β аминокислоту (например, любую из L-β аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области) или α,α-дизамещенную аминокислоту (например, любую из α,α-дизамещенных аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области); и

Хаа⁴ представляет L-α аминокислоту (например, любую из L-α аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области), L-β аминокислоту (например, любую из L-β аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области) или α,α-дизамещенную аминокислоту (например, любую из α,α-дизамещенных аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области).

В некоторых вариантах осуществления лиганды интегрина αvβ6 имеют общую формулу Z-RG¹DLAAbuL-Xaa³Xaa⁴L-R¹ (SEQ ID NO: 94) (Формула Vic) , в которой Z, R, G¹, D, L и R¹ каждый соответствует определению для формулы VI в настоящем описании;

А представляет L-аланин;

Abu представляет L-α-аминомαсляную кислоту (2-аминомасляную кислоту);

Хаа³ представляет L-α аминокислоту (например, любую из L-α аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области), L-β аминокислоту (например, любую из L-β аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области) или α,α-дизамещенную аминокислоту (например, любую из α,α-дизамещенных аминокислот, описанных в настоящем документе

- 5 042923 или известных в данной области); и

В некоторых вариантах осуществления лиганды интегрина αvβ6 имеют общую формулу Z-RGAAXaaUL-XaaAaaA-R¹ (SEQ ID NO: 95) (Формула Vid) , в которой Z, R, G¹, D, L и R¹ каждый соответствует определению для формулы VI в настоящем описании;

А представляет L-аланин; и

В некоторых вариантах осуществления Z-R в любой из формул или лигандов в настоящем описании заменен R', причем R' представляет Dap(гуанидин)

В некоторых вариантах осуществления лиганды интегрина αvβ6 имеют общую формулу RG¹DLXaa¹Xaa²L-Xaa³Xaa⁴L-R¹ (SEQ ID NO: 96)(Формула VIII), в которой R представляет L-аргинин;

G¹ представляет L-глицин или N-метилглицин;

L представляет L-лейцин;

Хаа⁴ представляет L-α аминокислоту (например, любую из L-α аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области), L-β аминокислоту (например, любую из L-β аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области) или α,α-дизамещенную аминокислоту (например, любую из α,α-дизамещенных аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области);

R¹ является необязательным, а если имеется, содержит полиэтиленгликоль (PEG) и/или связывающую группу; и по меньшей мере один из Хаа¹, Хаа², Хаа³ и Хаа⁴ представляет нестандартную аминокислоту.

В некоторых вариантах осуществления лиганды интегрина αγβ6 имеют общую формулу RG¹DLXaa¹Xaa²L-XaaAaaA-R¹ (SEQ ID NO: 96) (Формула VIII), в которой по меньшей мере два из Хаа¹, Хаа², Хаа³ и Хаа⁴ представляют нестандартные аминокислоты.

В некоторых вариантах осуществления лиганды интегрина αγβ6 имеют общую формулу RG¹DLXaa¹Xaa²L-Xaa³Xaa⁴L-R¹ (SEQ ID NO: 96) (Формула VIII), в которой по меньшей мере три из Хаа¹, Хаа², Хаа³ и Хаа⁴ представляют нестандартные аминокислоты.

В некоторых вариантах осуществления лиганды интегрина αvβ6 имеют общую формулу

RG^LAAbuL-CitAibL-R¹ (SEQ ID NO: 97)(Формула Villa), в которой R, G¹, D, L и R¹ каждый соответствует определению для формулы VIII в настоящем опи- 6 042923 сании;

А представляет L-аланин;

Abu представляет L-a-аминомасляную кислоту (2-аминомасляную кислоту);

Cit представляет цитруллин, а Ab представляет α-аминоизомасляную кислоту (2-аминоизомасляную кислоту).

В некоторых вариантах осуществления лиганд интегрина αΎβ6 содержит, состоит из или по суще-

ству состоит из структуры по фиг. 1.

ству состоит из структуры по фиг. 2.

ству состоит из структуры по фиг. 3.

ству состоит из структуры по фиг. 4.

ству состоит из структуры по фиг. 5.

ству состоит из структуры по фиг. 6.

ству состоит из структуры по фиг. 7.

ству состоит из структуры по фиг. 8.

ству состоит из структуры по фиг. 9.

ству состоит из структуры по фиг. 10.

ству состоит из структуры по фиг. 11.

В некоторых вариантах осуществления любой из раскрытых в настоящем описании лигандов интегрина αΎβ6 может быть связан с карго-молекулой, реакционноспособной группой и/или защищенной реакционноспособной группой. Реакционноспособную группу можно использовать для облегчения конъюгации лиганда интегрина αΎβ6 с молекулой, например одной или более карго-молекул (например, с любой из карго-молекул, описанных в настоящем документе или известных в данной области). Раскрытые в настоящем описании лиганды интегрина αΎβ6 могут повысить целенаправленное воздействие карго-молекулы на интегрин αΎβ6 или на экспрессирующую интегрин αΎβ6 клетку. Карго-молекулой может быть без ограничения фармацевтически активный ингредиент или соединение, лекарственное средство, пролекарство или имеющее терапевтическое значение вещество. В некоторых вариантах осуществления карго-молекулой может быть без ограничения малая молекула, антитело, фрагмент антитела, иммуноглобулин, моноклональное антитело, метка или маркер, липид, натуральная или модифицированная нуклеиновая кислота или полинуклеотид (например, олигомерное соединение, например, антисмысловой олигонуклеотид или средство РНКи), пептид, аптамер, полимер, полиамин, белок, токсин, витамин, полиэтиленгликоль, гаптен, дигоксигенин, биотин, радиоактивный атом или молекула, или флуорофор. В некоторых вариантах осуществления карго-молекула содержит фармацевтически активный ингредиент, лекарственное средство или пролекарство. В некоторых вариантах осуществления карго-молекула в качестве фармацевтически активного ингредиента содержит олигомерное соединение. В некоторых вариантах осуществления карго-молекула в качестве фармацевтически активного ингредиента содержит средство РНКи.

В настоящем описании описано применение описанных лигандов αΎβ6 для целенаправленного воздействия карго-молекулы на экспрессирующую αΎβ6 клетку. Клетка может быть in vitro, in situ, ex vivo или in vivo.

В другом аспекте в настоящем раскрытии представлены композиции, которые содержат один или более сконструированных, не существующих в природе описанных в настоящем документе лигандов αΎβ6. Например, в некоторых вариантах осуществления композиции, содержащие один или более раскрытых в настоящем описании лигандов интегрина αΎβ6, содержат одно или более олигомерное соединение (соединения), например одно или более средство(а) РНКи, подлежащее(ие) доставке в клетку in vivo. В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе описаны композиции для доставки средства РНКи в клетку in vivo, причем средство РНКи конъюгировано с одним или более лигандами αΎβ6.

Описаны композиции, которые содержат один или более лигандов αΎβ6. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит фармацевтически приемлемое вспомогательное средство. В некоторых вариантах осуществления композиция, которая содержит один или более лигандов αΎβ6, содержит

- 7 042923 одно или более других фармацевтических веществ или фармацевтически активных ингредиентов или соединений.

В других вариантах осуществления композиции содержат лекарственные препараты, которые содержат один или более лигандов αΎβ6, которые описаны в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления лекарственный препарат, кроме того, содержит фармацевтически приемлемое вспомогательное средство.

Композиции, которые содержат один или более раскрытых в настоящем описании лигандов интегрина ave6, можно доставлять in vivo или in vitro, например, в альвеолярные эпителиальные клетки I и II типа, бокаловидные клетки, секреторные эпителиальные клетки, ресничные эпителиальные клетки, эпителиальные клетки роговицы и конъюнктивы, эпителиальные клетки кожи, холангиоциты, энтероциты, эпителиальные клетки протоков, железистые эпителиальные клетки, почечные канальцы и эпителиальные опухоли (карциномы).

В другом аспекте в настоящем раскрытии предоставлены способы, включающие применение одного или более лигандов αΎβ6 и/или композиций, которые описаны в настоящем описании, и при необходимости доставку раскрытых лигандов αΎβ6 и/или композиций в форме, подходящей для введения в качестве фармацевтического продукта. В других вариантах осуществления в раскрытии предоставлены способы получения лигандов и композиций, например лекарственных препаратов, описанных в настоящем документе.

Композиции, которые содержат один или более лигандов интегрина αΎβ6, можно вводить субъектам in vivo, используя известные в данной области пути введения, подходящие для подобного введения с учетом карго-молекулы, которую необходимо ввести, включая, например, внутривенное, подкожное, внутрибрюшинное, внутрикожное, трансдермальное, пероральное, подъязычное, местное, внутриопухолевое, интраназальное или ингаляционное (готовые формы в виде аэрозоля или сухого порошка) введение. В некоторых вариантах осуществления композиции, которые содержат один или более лигандов интегрина αΎβ6, можно вводить для системной доставки, например, путем внутривенного или подкожного введения. В некоторых вариантах осуществления композиции, которые содержат один или более лигандов интегрина αΎβ6, можно вводить для локализованной доставки, например, путем ингаляционной доставки посредством ингалятора или небулайзера сухого порошка. В некоторых вариантах осуществления композиции, которые содержат один или более лигандов интегрина αΎβ6, можно вводить для локализованной доставки путем местного введения.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки одной или более требуемой карго-молекулы (молекул) в альвеолярную эпителиальную клетку I типа in vivo, причем способы включают введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одной или более карго-молекулой.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки одной или более требуемой карго-молекулы (молекул) в альвеолярную эпителиальную клетку II типа in vivo, причем способы включают введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одной или более карго-молекулой.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки одной или более требуемой карго-молекулы (молекул) в бокаловидную клетку in vivo, причем способы включают введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одной или более карго-молекулой.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки одной или более требуемой карго-молекулы (молекул) в секреторную эпителиальную клетку in vivo, причем способы включают введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одной или более карго-молекулой. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки одной или более требуемой карго-молекулы (молекул) в ресничную эпителиальную клетку in vivo, причем способы включают введение субъекту одного или более лигандов интегрина ave6, конъюгированных с одной или более карго-молекулой.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки одной или более требуемой карго-молекулы (молекул) в роговичную эпителиальную клетку in vivo, причем способы включают введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одной или более карго-молекулой.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки одной или более требуемой карго-молекулы (молекул) в эпителиальную клетку конъюнктивы in vivo, причем способы включают введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одной или более карго-молекулой.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки одной или более требуемой карго-молекулы (молекул) в эпителиальную клетку кожи in vivo, причем способы включают введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одной или более карго-молекулой.

- 8 042923

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки одной или более требуемой карго-молекулы (молекул) в холангиоцит in vivo, причем способы включают введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одной или более каргомолекулой.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки одной или более требуемой карго-молекулы (молекул) в энтероцит in vivo, причем способы включают введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одной или более каргомолекулой.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки одной или более требуемой карго-молекулы (молекул) в эпителиальную клетку протоков in vivo, причем способы включают введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одной или более карго-молекулой.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки одной или более требуемой карго-молекулы (молекул) в железистые эпителиальные клетка in vivo, причем способы включают введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одной или более карго-молекулой.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки одной или более требуемой карго-молекулы (молекул) в почечный каналец in vivo, причем способы включают введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одной или более карго-молекулой.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки одной или более требуемой карго-молекулы (молекул) в эпителиальную опухоль (карциному) in vivo, причем способы включают введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одной или более карго-молекулой.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки олигомерного соединения в альвеолярную эпителиальную клетку I типа in vivo, причем способы включают введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одним или более олигомерным соединением. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки средства РНКи в альвеолярную эпителиальную клетку I типа in vivo, причем способы включают введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одним или более средством РНКи. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы ингибирования экспрессии целевого гена в альвеолярной эпителиальной клетке I типа in vivo, причем способы включают введение субъекту средства РНКи, конъюгированного с одним или более лигандами, обладающими аффинностью к интегрину αΎβ6.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки олигомерного соединения в альвеолярную эпителиальную клетку II типа in vivo, включающие введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одним или более олигомерным соединением. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки средства РНКи в альвеолярную эпителиальную клетку II типа in vivo, включающие введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одним или более средством РНКи. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы ингибирования экспрессии целевого гена в альвеолярной эпителиальной клетке II типа in vivo, причем способы включают введение субъекту средства РНКи, конъюгированного с одним или более лигандами, обладающими аффинностью к интегрину αΎβ6.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки олигомерного соединения в бокаловидную клетку in vivo, включающие введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одним или более олигомерным соединением. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки средства РНКи в бокаловидную клетку in vivo, включающие введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одним или более средством РНКи. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы ингибирования экспрессии целевого гена в бокаловидной клетке in vivo, причем способы включают введение субъекту средства РНКи, конъюгированного с одним или более лигандами, обладающими аффинностью к интегрину αΎβ6.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки олигомерного соединения в секреторную эпителиальную клетку in vivo, включающие введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одним или более олигомерным соединением. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки средства РНКи в секреторную эпителиальную клетку in vivo, включающие введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одним или более средством РНКи. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы ингибирования экспрессии целевого гена в секреторной эпителиальной клетке in vivo, причем способы включают введение субъекту средства РНКи,

- 9 042923 конъюгированного с одним или более лигандами, обладающими аффинностью к интегрину ανβ6.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки олигомерного соединения в ресничную эпителиальную клетку in vivo, включающие введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одним или более олигомерным соединением. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки средства РНКи в ресничную эпителиальную клетку in vivo, включающие введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одним или более средством РНКи. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы ингибирования экспрессии целевого гена в ресничной эпителиальной клетке in vivo, причем способы включают введение субъекту средства РНКи, конъюгированного с одним или более лигандами, обладающими аффинностью к интегрину αΎβ6.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки олигомерного соединения в роговичную эпителиальную клетку in vivo, включающие введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одним или более олигомерным соединением. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки средства РНКи в роговичную эпителиальную клетку in vivo, включающие введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одним или более средством РНКи. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы ингибирования экспрессии целевого гена в роговичной эпителиальной клетке in vivo, причем способы включают введение субъекту средства РНКи, конъюгированного с одним или более лигандами, обладающими аффинностью к интегрину αΎβ6.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки олигомерного соединения в эпителиальную клетку конъюнктивы in vivo, включающие введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одним или более олигомерным соединением. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки средства РНКи в эпителиальную клетку конъюнктивы in vivo, включающие введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одним или более средством РНКи. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы ингибирования экспрессии целевого гена в эпителиальной клетке конъюнктивы in vivo, причем способы включают введение субъекту средства РНКи, конъюгированного с одним или более лигандами, обладающими аффинностью к интегрину αΎβ6.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки олигомерного соединения в эпителиальную клетку кожи in vivo, включающие введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одним или более олигомерным соединением. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки средства РНКи в эпителиальную клетку кожи in vivo, включающие введение субъекту одного или более лигандов интегрина ave6, конъюгированных с одним или более средством РНКи. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы ингибирования экспрессии целевого гена в эпителиальной клетке кожи in vivo, причем способы включают введение субъекту средства РНКи, конъюгированного с одним или более лигандами, обладающими аффинностью к интегрину αΎβ6.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки олигомерного соединения в холангиоцит in vivo, включающие введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одним или более олигомерным соединением. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки средства РНКи в холангиоцит in vivo, включающие введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одним или более средством РНКи. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы ингибирования экспрессии целевого гена в холангиоците in vivo, причем способы включают введение субъекту средства РНКи, конъюгированного с одним или более лигандами, обладающими аффинностью к интегрину αΎβ6.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки олигомерного соединения в энтероцит in vivo, включающие введение субъекту одного или более лигандов интегрина ave6, конъюгированных с одним или более олигомерным соединением. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки средства РНКи в энтероцит in vivo, включающие введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одним или более средством РНКи. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы ингибирования экспрессии целевого гена в энтероците in vivo, причем способы включают введение субъекту средства РНКи, конъюгированного с одним или более лигандами, обладающими аффинностью к интегрину αΎβ6.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки олигомерного соединения в эпителиальную клетку протоков in vivo, включающие введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одним или более олигомерным соединением. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки средства РНКи в эпителиальную клетку протоков in vivo, включающие введение субъекту одного или более лигандов

- 10 042923 интегрина ανβ6, конъюгированных с одним или более средством РНКи. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы ингибирования экспрессии целевого гена в эпителиальной клетке протоков in vivo, причем способы включают введение субъекту средства РНКи, конъюгированного с одним или более лигандами, обладающими аффинностью к интегрину αΎβ6.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки олигомерного соединения в железистую эпителиальную клетку in vivo, включающие введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одним или более олигомерным соединением. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки средства РНКи в железистую эпителиальную клетку in vivo, включающие введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одним или более средством РНКи. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы ингибирования экспрессии целевого гена в железистой эпителиальной клетке in vivo, причем способы включают введение субъекту средства РНКи, конъюгированного с одним или более лигандами, обладающими аффинностью к интегрину αΎβ6.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки олигомерного соединения в почечный каналец in vivo, включающие введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одним или более олигомерным соединением. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки средства РНКи в почечный каналец in vivo, включающие введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одним или более средством РНКи. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы ингибирования экспрессии целевого гена в почечном канальце in vivo, причем способы включают введение субъекту средства РНКи, конъюгированного с одним или более лигандами, обладающими аффинностью к интегрину αΎβ6.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки олигомерного соединения в эпителиальную опухоль (карциному) in vivo, включающие введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одним или более олигомерным соединением. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы доставки средства РНКи в эпителиальную опухоль (карциному) in vivo, включающие введение субъекту одного или более лигандов интегрина αΎβ6, конъюгированных с одним или более средством РНКи. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании раскрыты способы ингибирования экспрессии целевого гена в эпителиальной опухоли (карциноме) in vivo, причем способы включают введение субъекту средства РНКи, конъюгированного с одним или более лигандами, обладающими аффинностью к интегрину αΎβ6.

В рамках изобретения термин алкил относится к насыщенной алифатической углеводородной группе, с неразветвленной или разветвленной цепью, имеющей от 1 до 10 атомов углерода, если не указано иное. Например, C₁-C₆-алкил содержит алкильные группы, имеющие 1, 2, 3, 4, 5 или 6 атомов углерода с линейным или разветвленным расположением. Неограничивающие примеры алкильных групп включают метил, этил, изопропил, трет-бутил, n-гексил. В рамках изобретения термин аминоалкил относится к алкильной группе согласно приведенному выше определению, замещенной в любой позиции одной или более аминогруппами, которые допускает нормальная валентность. Аминогруппы могут быть незамещенными, монозамещенными или дизамещенными. Неограничивающие примеры аминоалкильных групп включают аминометил, диметиламинометил и 2-аминопроп-1-ил.

В рамках изобретения термин циклоалкил означает насыщенную или ненасыщенную неароматическую углеводородную кольцевую группу, имеющую от 3 до 14 атомов углерода, если не указано иное. Неограничивающие примеры циклоалкильных групп включают без ограничения циклопропил, метилциклопропил, 2,2-диметилциклобутил, 2-этилциклопентил и циклогексил.

Циклоалкилы могут содержать множество спиро- или сочлененных колец. Циклоалкильные группы необязательно являются моно-, ди-, три-, тетра- или пента-замещенными в любой позиции, в какой допускает нормальная валентность.

В рамках изобретения термин алкенил относится к неароматическому углеводородному радикалу, неразветвленному или разветвленному, содержащему по меньшей мере одну двойную связь углеродуглерод и имеющему от 2 до 10 атомов углерода, если не указано иное. В таких группах может иметься до пяти двойных связей углерод-углерод. Например, С₂-С₆-алкенил определяется, как алкенильный радикал, имеющий от 2 до 6 атомов углерода. Примеры алкенильных групп включают без ограничения этенильную, пропенильную, бутенильную и циклогексенильную. Неразветвленная, разветвленная или циклическая часть алкенильной группы может содержать двойные связи и необязательно является моно-, ди-, три-, тетра- или пента-замещенной в любой позиции, в какой допускает нормальная валентность. Термин циклоалкенил означает моноциклическую углеводородную группу, имеющую определенное число атомов углерода и по меньшей мере одну двойную связь углерод-углерод.

В рамках изобретения термин алкинил относится к углеводородному радикалу, неразветвленному или разветвленному, содержащему от 2 до 10 атомов углерода, если не указано иное, и содержащему по меньшей мере одну тройную углерод-углеродную связь. Может иметься до 5 тройных углеродуглеродных связей. Таким образом, С₂-С₆-алкинил означает алкинильный радикал, имеющий от 2 до 6

- 11 042923 атомов углерода. Примеры алкинильных групп включают без ограничения этинильную, 2-пропинильную и 2-бутинильную. Неразветвленная или разветвленная часть алкинильной группы может быть необязательно моно-, ди-, три-, тетра- или пента- замещенной в любой позиции, в какой допускает нормальная валентность.

В рамках изобретения алкоксил или алкокси относится к -О-алкильному радикалу, имеющему указанное число атомов углерода. Например, C₁.₆-αлкокси предполагает содержание C1, С₂, С₃, С₄, С₅ и С₆-алкокси групп. Например, C₁.₈-алкоксu предполагает содержание C1, C₂, С₃, С₄, С₅, С₆, С7 и С₈-алкокси групп. Примеры алкокси включают без ограничения метокси, этокси, n-пропокси, i-пропокси, n-бутокси, s-бутокси, t-бутокси, n-пентокси, s-пентокси, n-гептокси и n-октокси.

В рамках изобретения кето относится к любой алкильной, алкенильной, алкинильной, циклоалкильной, циклоалкенильной, гетероциклильной, гетероарильной или арильной группе согласно определению в настоящем описании, соединенной посредством карбонильного мостика. Примеры кето групп включают без ограничения алканоильную (например, ацетильную, пропионильную, бутаноильную, пентаноильную или гексаноильную), алкеноильную (например, акрилоильную) алкиноильную (например, этиноильную, пропионильную, бутиноильную, пентиноильную или гексиноильную), арилоильную (например, бензоильную), гетероарилоильную (например, пирролоильную, имидазолоильную, квинолиноильную или пиридиноильную).

В рамках изобретения алкоксикарбонильная относится к любой алкокси группе согласно приведенному выше определению, соединенной посредством карбонильного мостика (т.е. -С(O)O-алкила). Примеры алкоксикарбонильных групп включают без ограничения метоксикарбонильную, этоксикарбонильную, изопропоксикарбонильную, n-пропоксикарбонильную, t-бутоксикарбонильную, бензилоксикарбонильную или n-пентоксикарбонильную.

В рамках изобретения арилоксикарбонильная относится к любой арильной группе согласно определению в настоящем описании, соединенной посредством оксикарбонильного мостика (т.е. -C(O)Oарила). Примеры арилоксикарбонильных групп включают без ограничения феноксикарбонильную и нафтилоксикарбонильную.

В рамках изобретения гетероарилоксикарбонильная относится к любой гетероарильной группе согласно определению в настоящем описании, соединенной посредством оксикарбонильного мостика (т.е. -С(О)О-гетероарила). Примеры гетероарилоксикарбонильных групп включают без ограничения 2-пиридилоксикарбонильную, 2-оксазолилоксикарбонильную, 4-тиазолилоксикарбонильную или пиримидинилоксикарбонильную.

В рамках изобретения арильное или ароматическое означает любое стабильное моноциклическое или полициклическое углеродное кольцо до 6 атомов в каждом кольце, причем по меньшей мере одно кольцо является ароматическим. Примеры арильных групп включают без ограничения фенильную, нафтильную, антраценильную, тетрагидронафтильную, инданильную и бифенильную. В случаях когда арильный заместитель бициклический, а одно кольцо неароматическое, должно быть понятно, что соединение происходит посредством ароматического кольца. Арильные группы необязательно являются моно-, ди-, три-, тетра- или пента-замещенными в любой позиции, в какой допускает нормальная валентность.

В рамках изобретения термин гетероарил отображает стабильное моноциклическое или полициклическое кольцо до 7 атомов в каждом кольце, причем по меньшей мере одно кольцо является ароматическим и содержит от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из О, N и S. Примеры гетероарильных групп включают без ограничения акридинильную, карбазолильную, циннолинильную, хиноксалинильную, пирразолильную, индолильную, бензотриазолильную, фуранильную, тиенильную, бензотиенильную, бензофуранильную, бензимидазолонильную, бензоксазолонильную, хинолинильную, изохинолинильную, дигидроизоиндолонильную, имидазопиридинильную, изоиндолонильную, индазолильную, оксазолильную, оксадиазолильную, изоксазолильную, индолильную, пиразинильную, пиридазинильную, пиридинильную, пиримидинильную, пирролильную и тетрагидрохинолиновую. Гетероарил также подразумевает содержание производного N-оксида любого азотсодержащего гетероарила. В случаях когда гетероарильный заместитель бициклический, а одно кольцо неароматическое или не содержит гетероатомы, должно быть понятно, что соединение происходит посредством ароматического кольца или посредством гетероатома, содержащего кольцо. Гетероарильные группы необязательно являются моно-, ди-, три-, тетра- или пента-замещенными в любой позиции, в какой допускает нормальная валентность.

В рамках изобретения термин гетероцикл, гетероциклический или гетероциклил означает 3-14-членный ароматический или неароматический гетероцикл, содержащий от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из О, N и S, включая полициклические группы. В рамках изобретения термин гетероциклический также считается синонимом терминам гетероцикл и гетероциклил и подразумевает также наличие тех же определений, которые изложены в настоящем описании. Гетероциклил включает упомянутые выше гетероарилы, а также его дигидро и тетрагидро аналоги. Примеры гетероциклильных групп включают без ограничения азетидинильную, бензоимидазолильную, бензофуранильную, бензофуразанильную, бензопиразолильную, бензотриазолильную, бензотиофенильную, бен- 12 042923 зоксазолильную, карбазолильную, карболинильную, циннолинильную, фуранильную, имидазолильную, индолинильную, индолильную, индолазинильную, индазолильную, изобензофуранильную, изоиндолильную, изохинолильную, изотиазолильную, изоксазолильную, нафтпиридинильную, оксадиазолильную, оксооксазолидинильную, оксазолильную, оксазолиновую, оксопиперазинильную, оксопирролидинильную, оксоморфолинильную, изоксазолиновую, оксетанильную, пиранильную, пиразинильную, пиразолильную, пиридазинильную, пиридопиридинильную, пиридазинильную, пиридильную, пиридинонильную, пиримидильную, пиримидинонильную, пирролильную, хиназолинильную, хинолильную, хиноксалинильную, тетрагидропиранильную, тетрагидрофуранильную, тетрагидротиопиранильную, тетрагидроизохинолинильную, тетразолильную, тетразолопиридильную, тиадиазолильную, тиазолильную, тиенильную, триазолильную, 1,4-диоксанильную, гексагидроазепинильную, пиперазинильную, пиперидинильную, пиридин-2-онильную, пирролидинильную, морфолинильную, тиоморфолинильную, дигидробензоимидазолильную, дигидробензофуранильную, дигидробензотиофенильную, дигидробензоксазолильную, дигидрофуранильную, дигидроимидазолильную, дигидроиндолильную, дигидроизооксазолильную, дигидроизотиазолильную, дигидрооксадиазолильную, дигидрооксазолильную, дигидропиразинильную, дигидропиразолильную, дигидропиридинильную, дигидропиримидинильную, дигидропирролильную, дигидрохинолинильную, дигидротетразолильную, дигидротиадиазолильную, дигидротиазолильную, дигидротиенильную, дигидротриазолильную, дигидроазетидинильную, диоксидотиоморфолинильную, метилендиоксибензоильную, тетрагидрофуранильную и тетрагидротиенильную и их N-оксиды. Присоединение гетероциклильного заместителя может происходить посредством атома углерода или посредством гетероатома. Гетероциклильные группы необязательно являются моно-, ди-, три-, тетра- или пента-замещенными в любой позиции, в какой допускает нормальная валентность.

В рамках изобретения термины лечить, лечение и т.п. означают способы или этапы, предпринимаемые, чтобы обеспечить освобождение или уменьшение числа, тяжести и/или частоты одного или более симптомов заболевания или состояния у субъекта.

Если не указано иное, применение символа, который использован в настоящем описании, означает, что с ним может быть связана любая группа или группы, что соответствует объему изобретений, описанных в настоящем документе.

В рамках изобретения термин изомеры относится к соединениям, которые имеют идентичные молекулярные формулы, но которые отличаются по своей природе или последовательности связывания их атомов или по расположению их атомов в пространстве. Изомеры, которые отличаются по расположению их атомов в пространстве, называются стереоизомеры.

Стереоизомеры, которые не являются зеркальными отображениями друг друга, называются диастереоизомеры, а стереоизомеры, которые являются несовпадающими при наложении зеркальными отображениями, называются энантиомеры или иногда оптические изомеры. Атом углерода, связанный с четырьмя неидентичными заместителями, называется хиральный центр.

В рамках изобретения связывающей группой является один или более атомов, которые связывают одну молекулу или часть молекулы с другой со второй молекулой или второй частью молекулы. В данной области термины связывающая группа и спейсеры иногда используют взаимозаменяемо. Аналогично, как используют в данной области, термин каркас иногда используют взаимозаменяемо со связывающей группой. В некоторых вариантах осуществления связывающая группа может содержать расщепляемую пептидом связывающую группу. В некоторых вариантах осуществления связывающая группа может содержать или состоять из пептида FCitFP (SEQ ID NO: 131).

В рамках изобретения термин связанный при ссылке на соединение между двумя молекулами означает, что две молекулы соединены ковалентной связью или что две молекулы связаны с помощью нековалентных связей (например, водородных связей или ионных связей). В некоторых примерах, где термин связанный относится к ассоциации между двумя молекулами с помощью нековалентных связей, ассоциация между двумя разными молекулами имеет K_D менее 1x10’⁴ M (например, менее чем 1x10’5 M, менее чем 1x10’6 М или менее чем 1x10’⁷ М) в физиологически приемлемом буфере (например, фосфатном буферном солевом растворе). Если не указано, термин связанный в рамках изобретения может относиться к связи между первым соединением и вторым соединением либо с любыми промежуточными атомами или группами атомов, либо без оных.

В рамках изобретения стандартные аминокислоты или натуральные аминокислоты включают аланин, цистеин, аспарагиновую кислоту (аспартат), глутаминовую кислоту (глутамат), фенилаланин, глицин, гистидин, изолейцин, лизин, лейцин, метионин, аспарагин, пролин, глутамин, аргинин, серин, треонин, валин, триптофан, тирозин.

В рамках изобретения нестандартные аминокислоты включают без ограничения селеноцистеин, пирролизин, N-формилметионин, гидроксипролин, селенометионин, α-аминоизомасляную кислоту (Aib), L-a-аминомасляную кислоту (Abu), α,γ-диаминомасляную кислоту, дегидроаланин, норлейцин, аллоизолейцин, t-лейцин, α-амино-п-гептановую кислоту, α,β-диаминопропионовую кислоту, β-N-оксалил-a,βдиаминопропионовую кислоту, аллотреонин, гомоцистеин, гомосерин, β-гомо-аланин (вЗ-hA), изовалин, норвалин (Nva), цитруллин (Cit), орнитин, α-метиласпартат (aMeD), α-метиллейцин (aMeL),

- 13 042923

N-метилаланин, N-метилглицин (NMeG), N-метиллейцин (NMeL), β-циклогексилаланин (Cha),

N-этилаланин, N,N-ε-диметиллизин (K(Me)₂), диметиларгинин (R(Me)₂), Dap(Ac), n-алкилированные L-α аминокислоты и другие аналоги аминокислот или миметики аминокислот, которые функционируют аналогично существующим в природе аминокислотам.

В рамках изобретения, если конкретно не указано, что в структуре имеется особая конформация, для каждой структуры, в которой имеются ассиметричные центры и которые, таким образом, являются причиной энантиомеров, диастереомеров или других стереоизомерных конфигураций, каждая раскрытая в настоящем описании структура предназначена представлять все подобные возможные изомеры, включая их оптически чистые и рацемические формы. Например, раскрытые в настоящем описании структуры предназначены охватывать смеси диастереомеров, а также отдельные стереоизомеры.

Рядовой специалист в данной области легко поймет и будет иметь в виду, что раскрытые в настоящем описании соединения и композиции могут иметь некоторые атомы (например, атомы N, О или S) в протонированном или депротонированном состоянии в зависимости от окружающих условий, в которых находится соединение или композиция. Соответственно в рамках изобретения раскрытые в настоящем описании структуры предусматривают, что некоторые функциональные группы, такие как, например, ОН, SH или NH, могут быть протонированными или депротонированными. Настоящее раскрытие предназначено охватывать раскрытые соединения и композиции независимо от их состояния протонирования на основе рН окружающих условий, как будет легко понятно рядовому специалисту в данной области.

Как использовано в формуле изобретения в настоящем описании, фраза состоящий из исключает любой элемент, этап или ингредиент не указанный в формуле изобретения. При использовании в формуле изобретения в настоящем описании фраза состоящий по существу из ограничивает объем формулы изобретения определенными материалы или этапами и элементами, которые не существенного влияния на основные и новые характеристику (характеристики) заявленного изобретения.

Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют то же значение, которое обычно понятно рядовому специалисту в области, к которой относится настоящее изобретение. Хотя при практическом применении или тестировании настоящего изобретения можно использовать способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем описании способам и материалам, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие упомянутые в настоящем описании ссылки полностью включены в настоящее описание посредством ссылки. В случае конфликта настоящее описание, включая определения, будет иметь преимущество. Кроме того, материалы, способы и примеры являются иллюстративными и не предназначены для ограничения.

Фармакокинетика является общей проблемой для пептидных лекарственных средств и фармацевтических композиций, которые содержат пептиды. Многие пептиды, например, циркулируют в крови не более чем несколько минут вследствие ферментативного разложения. Это часто значительно уменьшает или даже предотвращает их полезность в качестве терапевтических средств или в качестве компонентов лекарственных средств.

Исследования стабильности в различных сывороточных препаратах (например, измерение in vitro разложения пептидов в сыворотке и/или плазме) стали важными скрининговыми исследованиями при разработке пептидных лекарственных средств. Как показали, среди прочего подобные исследования, раскрытые в настоящем описании лиганды интегрина ave6, являются стабильными в сыворотке и обладают аффинностью к интегринам ave6 или могут связываться с ними.

Другие признаки и преимущества изобретения будут очевидны из следующего подробного описания и из формулы изобретения.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлена химическая структура примера раскрытого в настоящем описании лиганда интегрина ave6, синтезированного в виде сложного тетрафторфенилового (TFP) эфира. Лиганд интегрина ave6 содержит PEG₂₀ (двадцать (20) единиц этиленоксида (СН2-СН2-О)) и связывающую группу FCitFP.

На фиг. 2 представлена химическая структура примера раскрытых в настоящем описании лигандов интегрина ave6, синтезированных в виде сложного тетрафторфенилового (TFP) эфира. Лиганд интегрина ave6 содержит PEG5 (пять (5) единиц этиленоксида (СН2-СН2-О)).

На фиг. 3 представлена химическая структура примера раскрытого в настоящем описании лиганда интегрина ave6, который содержит CF3CO в качестве аминотерминального кэпа, PEG₂₀ и связывающую группу FCitFP.

На фиг. 4 представлена химическая структура примера раскрытого в настоящем описании лиганда интегрина ave6, который содержит CF3CO в качестве аминотерминального кэпа и PEG5.

На фиг. 5 представлена химическая структура примера раскрытого в настоящем описании лиганда интегрина ave6 без аминотерминального кэпа. Лиганд интегрина ave6 содержит PEG₂₀ и связывающую группу FCitFP.

На фиг. 6 представлена химическая структура примера раскрытого в настоящем описании лиганда

- 14 042923 интегрина ανβ6 без аминотерминального кэпа. Лиганд интегрина ανβ6 содержит PEG5.

На фиг. 7 представлена химическая структура примера раскрытого в настоящем описании лиганда интегрина ave6, который в качестве аминотерминального кэпа содержит СН₃СО.

На фиг. 8 представлена химическая структура примера раскрытого в настоящем описании лиганда интегрина ave6, который содержит СН₃СО в качестве аминотерминального кэпа, PEG₂₀ и связывающую группу FCitFP. Кроме того, в структуре показан фрагмент PEG 20 килодальтон (кДа).

На фиг. 9 представлена химическая структура примера раскрытого в настоящем описании лиганда интегрина αγβ6, который содержит СН₃СО в качестве аминотерминального кэпа, PEG₂₀ и связывающую группу FCitFP. Кроме того, в структуре показан фрагмент PEG 20 килодальтон (кДа) и показана структура, связанная с олигомерным соединением, таким как средство РНКи.

На фиг. 10 представлена химическая структура примера раскрытого в настоящем описании тридентатного лиганда интегрина αχβ6, который содержит СН₃СО в качестве аминотерминального кэпа и PEG5, связанный с каркасом бис-глутаминовой кислоты и реакционноспособной группой PEG-азидом.

На фиг. 11 представлена химическая структура примера раскрытого в настоящем описании тридентатного лиганда интегрина ave6, который содержит СН₃СО в качестве аминотерминального кэпа и PEG₅, связанный с каркасом бис-глутаминовой кислоты.

На фиг. 12 представлен график, показывающий тотальную экспрессию альфа-ENaC в легком крысы у крыс Sprague-Dawley со средством голой РНКи к альфа-ENaC без нацеливающего лиганда и с тем же средством РНКи к альфа-ENaC, конъюгированным с поли-L-лизиновым каркасом и с лигандом интегрина ave6, представленным структурой по фиг. 4.

Подробное описание

В настоящем документе описаны новые, сконструированные, не существующие в природе пептидные лиганды интегрина ave6, имеющие стабильность в сыворотке и аффинность к интегринам ave6. Лиганды интегрина ave6 можно использовать для целенаправленного воздействия на экспрессирующие интегрин ave6 клетки in vitro, in situ, ex vivo и/или in vivo. В некоторых вариантах осуществления лиганды интегрина ave6 могут быть конъюгированы с одной или более карго-молекулами для направления карго-молекул в экспрессирующие интегрин αγβ6 клетки in vitro, in situ, ex vivo и/или in vivo. В некоторых вариантах осуществления карго-молекулы содержат или состоят из фармацевтически активных соединений. В некоторых вариантах осуществления раскрытые в настоящем описании лиганды интегрина αγβ6 конъюгированы с карго-молекулами для направления карго-молекул в эпителиальные клетки in vivo.

В некоторых вариантах осуществления лиганды интегрина αγβ6 содержат Z-RG¹DLXaa¹Xaa²L (SEQ ID NO: 85) (Формула I) в которой Z представляет аминотерминальный кэп (например, любой из аминотерминальных кэпов, описанных в настоящем документе или известных в данной области);

R представляет L-аргинин;

G¹ представляет L-глицин или N-метилглицин;

L представляет L-лейцин;

В некоторых вариантах осуществления аминотерминальный кэп (Z) в формуле I содержит СН₃СО (также называемый в настоящем описании 'Ас'). В некоторых вариантах осуществления аминотерминальным кэпом (Z) в формуле I является СН₃СО.

В некоторых вариантах осуществления лиганды интегрина αγβ6 содержат

R’ оАьХааАааЗь (SEQ ID NO: 98) (Формула la) в которой R' представляет Dap(гуанидин); а

G¹, D, L, Хаа¹ и Хаа² каждый соответствует определению для формулы I в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления лиганды интегрина αvβ6 имеют общую формулу Z-RG¹DLXaa¹Xaa^uL (SEQ ID NO: 99) (Формула lb), в которой Z, R, G¹, D, L и Хаа¹ каждый соответствует определению для формулы I в настоящем описании; и

- 15 042923

Z-RG¹DLAXaa^uL (SEQ ID NO: 90) (Формула Ic) , в которой Z, R, G¹, D и L каждый соответствует определению для формулы I в настоящем описании;

А представляет L-аланин; а

В некоторых вариантах осуществления описаны лиганды интегрина αvβ6, содержащие Z-RG¹DLXaa¹Xaa²L-J-R¹ (SEQ ID NO: 86) (Формула II) в которой Z представляет аминотерминальный кэп (например, любой из аминотерминальных кэпов, описанных в настоящем документе или известных в данной области);

R представляет L-аргинин;

G¹ представляет L-глицин или N-метилглицин;

L представляет L-лейцин;

J является необязательным, а если имеется, содержит одну или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30; или 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 5-30, 5-25, 5-20, 5-15, 5-10, 10-30, 10-25, 10-20, 10-15, 15-30, 15-25, 15-20, 20-30, 20-25 или 25-30) L-α аминокислот (например, любую из L-α аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области), L-β аминокислот (например, любую из L-β аминокислот описанных в настоящем документе или известных в данной области) или α,α-дизамещенных аминокислот (например, любую из α,α-дизамещенных аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области), или их комбинацию; а

R¹ является необязательным, а если имеется, содержит PEG и/или связывающую группу.

В некоторых вариантах осуществления L связан с J посредством амидной связи.

В некоторых вариантах осуществления описаны лиганды интегрина αvβ6, содержащие R'G¹DLXaa¹Xaa²L-J-R¹ (SEQ ID NO: 100) (Формула Ila) в которой R' представляет Dap(гуанидин); а

G¹, D, L, Xaa¹, Xaa², J и R¹ каждый соответствует определению для формулы II в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления лиганды интегрина αvβ6 могут содержать реакционноспособную группу или защищенную реакционноспособную группу, содержащую

Z-RG¹DLXaa¹Xaa²L-J-R^R² (SEQ ID NO: 87) (Формула III) в которой Z представляет аминотерминальный кэп (например, любой из аминотерминальных кэпов, описанных в настоящем документе или известных в данной области);

R представляет L-аргинин;

G¹ представляет L-глицин или N-метилглицин;

L представляет L-лейцин;

- 16 042923

J является необязательным, а если имеется, содержит одну или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30; или 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 5-30, 5-25, 5-20, 5-15, 5-10, 10-30, 10-25, 10-20, 10-15, 15-30, 15-25, 15-20, 20-30, 20-25 или 25-30) L-α аминокислот (например, любую из L-α аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области), L-β аминокислот (например, любую из L-β аминокислот описанных в настоящем документе или известных в данной области), или α,α-дизамещенных аминокислот (например, любую из α,α-дизамещенных аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области), или их комбинацию;

R¹ является необязательным, а если имеется, содержит PEG и/или связывающую группу; а

Реакционноспособную группу или защищенную реакционноспособную группу можно использовать для соединения лиганда интегрина αvβ6 с интересующей молекулой, т.е. С карго-молекулой. В некоторых вариантах осуществления L связан с J посредством амидной связи.

В некоторых вариантах осуществления синтезируют лиганды интегрина ανβ6, имеющие реакционноспособную группу или защищенную реакционноспособную группу, имеющие формулу

R’ G¹DLXaa¹Xaa²L- J-rA² (SEQ ID NO: 101) (Формула Illa) в которой R' представляет Dap(гуанидин); а

G¹, D, L, Xaa¹, Xaa², J, R¹ и R² каждый соответствует определению для формулы III в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления один или более лиганд (лиганды) интегрина αvβ6 может быть конъюгирован с одной или более карго-молекулой (молекулами), содержащими (Z-RG¹DLXaa¹Xaa²L-J-R¹) _n-R³ (SEQ ID NO: 88) (Формула IV) в которой Z представляет аминотерминальный кэп (например, любой из аминотерминальных кэпов, описанных в настоящем документе или известных в данной области);

R представляет L-аргинин;

G¹ представляет L-глицин или N-метилглицин;

L представляет L-лейцин;

J является необязательным, а если имеется, содержит одну или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30; или 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 5-30, 5-25, 5-20, 5-15, 5-10, 10-30, 10-25, 10-20, 10-15, 15-30, 15-25, 15-20, 20-30, 20-25 или 25-30) L-α аминокислот (например, любую из L-α аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области), L-β аминокислот (например, любую из L-β аминокислот описанных в настоящем документе или известных в данной области), или α,α-дизамещенных аминокислот (например, любую из α,α-дизамещенных аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области), или их комбинацию;

R¹ является необязательным, а если имеется, содержит полиэтиленгликоль (PEG) и/или связывающую группу;

n представляет число больше 0 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30; или 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 5-30, 5-25, 5-20, 5-15, 5-10, 10-30, 10-25, 10-20, 10-15, 15-30, 15-25, 15-20, 20-30, 20-25 или 25-30); а

R³ содержит карго-молекулу.

В некоторых вариантах осуществления L связан с J посредством амидной связи. В некоторых вариантах осуществления карго-молекулой может быть любая молекула, которую требуется нацелить на экспрессирующую интегрин ανβ6 клетку. В некоторых вариантах осуществления n представляет целое число между 1 и 4. В некоторых вариантах осуществления n составляет 1. В некоторых вариантах осуществления n составляет 3. Когда n составляет 1, лиганд интегрина αγβ6 в настоящем описании может называться монодентатный лиганд интегрина ανβ6. Когда n составляет 3, лиганд интегрина ανβ6 в настоящем описании может называться тридентатный лиганд интегрина αγβ6. Когда n составляет 2, лиганд интегрина αγβ6 в настоящем описании может называться бидентатный лиганд интегрина αγβ6. Когда

- 17 042923 n составляет 4, лиганд интегрина ανβ6 в настоящем описании может называться тетрадентатный лиганд интегрина ανβ6.

В некоторых вариантах осуществления один или более лиганд (лиганды) интегрина ανβ6 может быть конъюгирован с одной или более карго-молекулой (молекулами), содержащими (R^T G¹DLXaa¹Xaa²L- J-R¹) _n-R³ (SEQ ID NO: 102) (Формула IVa) в которой R¹ представляет Dap(гуанидин); а

G¹, D, L, Xaa¹, Xaa², J, R¹, N и R³ каждый соответствует определению для формулы IV в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления L связан с J посредством амидной связи. В некоторых вариантах осуществления n представляет целое число между 1 и 4. В некоторых вариантах осуществления n составляет 3. В некоторых вариантах осуществления карго-молекулой может быть любая молекула, которую требуется нацелить на экспрессирующую интегрин ανβ6 клетку.

В некоторых вариантах осуществления один или более лигандов интегрина ανβ6 может быть конъюгирован с одной или более карго-молекулами, содержащими (Z-RG¹DLXaa¹Xaa²L-J-R¹) _n-R⁴-(R³) р (SEQ ID NO: 89) (Формула V) в которой Z представляет аминотерминальный кэп (например, любой из аминотерминальных кэпов, описанных в настоящем документе или известных в данной области);

R представляет L-аргинин;

G¹ представляет L-глицин или N-метилглицин;

L представляет L-лейцин;

R¹ является необязательным, а если имеется, содержит PEG и/или связывающую группу;

n представляет число больше 0 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30; или 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 5-30, 5-25, 5-20, 5-15, 5-10, 10-30, 10-25, 10-20, 10-15, 15-30, 15-25, 15-20, 20-30, 20-25 или 25-30);

R⁴ является необязательным, а если имеется, содержит каркас и/или связывающую группу, которая содержит по меньшей мере одну точку присоединения для каждого имеющегося лиганда (т.е. по меньшей мере число точек присоединения, равное n) и по меньшей мере одну точку присоединения для каждой имеющейся карго-молекулы (т.е. По меньшей мере число точек присоединения, равное p);

р представляет число больше 0 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30; или 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 5-30, 5-25, 5-20, 5-15, 5-10, 10-30, 10-25, 10-20, 10-15, 15-30, 15-25, 15-20, 20-30, 20-25 или 25-30); а

R³ содержит одну или более карго-молекул.

В некоторых вариантах осуществления L связан с J посредством амидной связи. В некоторых вариантах осуществления карго-молекулой может быть любая молекула, которую требуется нацелить на экспрессирующую интегрин ανβ6 клетку.

Раскрытые в настоящем описании лиганды интегрина ανβ6 могут содержать один или более каркасов. Каркасы, также иногда называемые в данной области связывающими группами или линкерами, можно использовать для облегчения связывания одной или более карго-молекул с одним или более раскрытыми в настоящем описании лигандами интегрина ανβ6. Подходящие каркасы, совместимые с раскрытыми в настоящем описании лигандами, широко известны в данной области. Неограничивающие примеры каркасов, которые можно использовать с раскрытыми в настоящем описании лигандами интег- 18 042923 рина ανβ6, включают без ограничения полимеры (например, полимеры полиакрилатов, полимеры сложных поливиниловых эфиров и т.д.), полимеры аминокислот (например, бис-глутаминовую кислоту, бислизин, поли-L-лизин PLL и т.д.) и цистеин. В некоторых вариантах осуществления каркасы могут обеспечивать дополнительные требуемые свойства в дополнение к функционированию только в качестве линкера, например, улучшая фармакокинетические (ФК) свойства.

В некоторых вариантах осуществления один или более лигандов интегрина ανβ6 может быть конъюгирован с одной или более карго-молекулами, содержащими (R'G¹DLXaa¹Xaa²L-J-R¹) n-R⁴-(R³) Р (SEQ ID NO: 103) (Формула Va) в которой R¹ представляет Dap(гуанидин); a

G¹, D, L, Xaa¹, Xaa², J, R¹, n, R⁴, p и R³ каждый соответствует определению для формулы V в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления L связан с J посредством амидной связи. Карго-молекулой может быть любая молекула, которую требуется нацелить на экспрессирующую интегрин ανβ6 клетку.

В некоторых вариантах осуществления J в любой из формул настоящего описания содержит одну, две, три или более чем три L-α аминокислоты, L-β аминокислоты или α,α-дизамещенных аминокислоты. Одна, две, три или более чем три аминокислоты представляют собой независимо существующие в природе L-α аминокислоты, существующие в природе протеиногенные аминокислоты, существующие в природе стандартные аминокислоты (т.е. 20 аминокислот, которые кодируются непосредственно кодонами универсального генетического кода, также называемые кодируемые аминокислоты канонических аминокислот), или нестандартные аминокислоты (также называемые ненатуральные, некодируемые или неканонические аминокислоты).

Стандартные или натуральные аминокислоты включают аланин, цистеин, аспарагиновую кислоту (аспартат), глутаминовую кислоту (глутамат), фенилаланин, глицин, гистидин, изолейцин, лизин, лейцин, метионин, аспарагин, пролин, глутамин, аргинин, серин, треонин, валин, триптофан и тирозин.

Нестандартные аминокислоты включают без ограничения селеноцистеин, пирролизин, N-формилметионин, гидроксипролин, селенометионин, α-аминоизомасляную кислоту (Aib), L-a-аминомасляную кислоту (Abu), α,γ-диаминомасляную кислоту, дегидроаланин, норлейцин, аллоизолейцин, t-лейцин, a-амино-n-гептановую кислоту, α,β-диаминопропионовую кислоту, β-N-оксалил-α,βдиаминопропионовую кислоту, аллотреонин, гомоцистеин, гомосерин, β-гомо-аланин ^S-hA), изовалин, норвалин (Nva), цитруллин (Cit), орнитин, α-метиласпартат (aMeD), a-метиллейцин (aMeL), N-метилаланин, N-метилглицин (N_MeG), N-метиллейцин (N_MeL), β-циклогексилаланин (Cha), N-этилаланин, N,N-ε-диметиллизин (K(Me)₂), диметиларгинин (R(Me)₂), Dap(Ac), n-алкилированные L-α аминокислоты и другие аналоги аминокислот или миметики аминокислот, которые функционируют аналогично существующим в природе аминокислотам.

В некоторых вариантах осуществления J содержит по меньшей мере одну нестандартную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления J представляет собой или содержит Aib, Cit, CitAib, CitAibL, CitE, CitF, CitG, CitK, CitP, CitQ, CitQL, EAib, FAib, KAib, PAib, QAib, RabuL, RAibL, RCitL, RDap(Ac)L, RLQ или RNvaL.

В некоторых вариантах осуществления J в любой из описанных в настоящем документе формул содержит или состоит из Xaa³Xaa⁴L, причем

L представляет L-лейцин;

В некоторых вариантах осуществления J представляет собой или содержит Хаа³Хаа⁴, причем

Хаа⁴ представляет L-α аминокислоту (например, любую из L-α аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области), L-β аминокислоту (например, любую из L-β аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области) или α,α-дизамещенную

- 19 042923 аминокислоту (например, любую из α,α-дизамещенных аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области).

В некоторых вариантах осуществления лиганды интегрина ave6 содержат

Z-RG¹DLXaa¹Xaa²LXaa³Xaa⁴L-R¹ (SEQ ID NO: 92) (Формула VI) в которой Z представляет аминотерминальный кэп (например, любой из аминотерминальных кэпов, описанных в настоящем документе или известных в данной области);

R представляет L-аргинин;

G¹ представляет L-глицин или N-метилглицин;

L представляет L-лейцин;

Хаа¹ представляет L-α аминокислоту (например, любую из L-a аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области), L-β аминокислоту (например, любую из L-β аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области) или α,α-дизамещенную аминокислоту (например, любую из α,α-дизамещенных аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области);

Хаа⁴ представляет L-α аминокислоту (например, любую из L-α аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области), L-β аминокислоту (например, любую из L-β аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области) или α,α-дизамещенную аминокислоту (например, любую из α,α-дизамещенных аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области); а

В некоторых вариантах осуществления Хаа¹ представляет L-α аминокислоту, L-β аминокислоту или α,α-дизамещенную аминокислоту. Хаа¹ может быть без ограничения встречающаяся в природе L-α аминокислота, встречающаяся в природе протеиногенная аминокислота, встречающаяся в природе стандартная аминокислота (т.е. 20 аминокислот, которые кодируются непосредственно кодонами универсального генетического кода, также называемые кодируемые аминокислоты канонических аминокислот) или нестандартная (также называемая ненатуральная, некодируемая или неканоническая) аминокислота.

В некоторых вариантах осуществления Хаа² представляет L-α аминокислоту, L-β аминокислоту или α,α-дизамещенную аминокислоту. Хаа² может быть без ограничения встречающаяся в природе L-α аминокислота, встречающаяся в природе протеиногенная аминокислота, встречающаяся в природе стандартная аминокислота (т.е. 20 аминокислот, которые кодируются непосредственно кодонами универсального генетического кода, также называемые кодируемые аминокислоты канонических аминокислот) или нестандартная (также называемая ненатуральная, некодируемая или неканоническая) аминокислота.

В некоторых вариантах осуществления Хаа³ представляет L-α аминокислоту, L-β аминокислоту или α,α-дизамещенную аминокислоту. Хаа³ может быть без ограничения встречающаяся в природе L-α аминокислота, встречающаяся в природе протеиногенная аминокислота, встречающаяся в природе стандартная аминокислота (т.е. 20 аминокислот, которые кодируются непосредственно кодонами универсального генетического кода, также называемые кодируемые аминокислоты канонических аминокислот) или нестандартная (также называемая ненатуральная, некодируемая или неканоническая) аминокислота.

В некоторых вариантах осуществления Хаа⁴ представляет L-α аминокислоту, L-β аминокислоту или α,α-дизамещенную аминокислоту. Хаа⁴ может быть без ограничения встречающаяся в природе L-α аминокислота, встречающаяся в природе протеиногенная аминокислота, встречающаяся в природе стандартная аминокислота (т.е. 20 аминокислот, которые кодируются непосредственно кодонами универсального генетического кода, также называемые кодируемые аминокислоты канонических аминокислот) или нестандартная (также называемая ненатуральная, некодируемая или неканоническая) аминокислота.

В некоторых вариантах осуществления Хаа¹ или Хаа² представляет нестандартную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления Хаа¹ представляет нестандартную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления Хаа² представляет нестандартную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления как Хаа¹, так и Хаа² представляют нестандартные аминокислоты.

В некоторых вариантах осуществления Хаа¹ и/или Хаа² представляют Abu. В некоторых вариантах

- 20 042923 осуществления Хаа¹ представляет Abu. В некоторых вариантах осуществления Хаа² представляет Abu.

В некоторых вариантах осуществления Хаа¹ или Хаа² не имеют заряда. В некоторых вариантах осуществления Хаа¹ не имеет заряда. В некоторых вариантах осуществления Хаа² не имеет заряда. В некоторых вариантах осуществления Хаа¹ и Хаа² не имеют заряда.

В некоторых вариантах осуществления Хаа¹ не имеет заряда, а Хаа² представляет нестандартную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления Хаа² не имеет заряда, а Хаа¹ представляет нестандартную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления Хаа¹ не имеет заряда, а Хаа² представляет Abu. В некоторых вариантах осуществления Хаа² не имеет заряда, а Хаа¹ представляет Abu.

В некоторых вариантах осуществления Хаа¹Хаа² представляет AAbu, KAbu, EAbu, FAbu, QAbu, GAbu, PAbu, AK, AE, AF, AQ, AG и АР, причем А представляет L-аланин, Abu представляет L-a-аминомасляную кислоту, K представляет L-лизин, Е представляет L-глутаминовую кислоту (глутамат), F представляет L-фенилаланин, Q представляет L-глутамин, G представляет L-глицин, а Р представляет L-пролин.

В некоторых вариантах осуществления RG¹DLXaa¹Xaa²L (SEQ ID NO: 117) выбирают из группы, состоящей из RGDLAAbuL (SEQ ID NO: 118), RGDLKAbuL (SEQ ID NO: 119), RGDLEAbuL (SEQ ID NO: 120), RGDLFAbuL (SEQ ID NO: 121), RGDLQAbuL (SEQ ID NO: 122), RGDLGAbuL (SEQ ID NO: 123), RGDLPAbuL (SEQ ID NO: 124), RGDLAKL (SEQ ID NO: 125), RGDLAEL (SEQ ID NO: 126), RGDLAFL (SEQ ID NO: 127), RGDLAQL (SEQ ID NO: 128), RGDLAGL (SEQ ID NO: 129) и RGDLAPL (SEQ ID NO: 130), причем

R представляет L-аргинин;

G представляет L-глицин;

D представляет L-аспарагиновую кислоту (аспартат);

L представляет L-лейцин;

А представляет L-аланин;

Abu представляет L-a-аминомасляную кислоту;

K представляет L-лизин;

Е представляет L-глутаминовую кислоту (глутамат);

F представляет L-фенилаланин;

Q представляет L-глутамин; а

Р представляет L-пролин.

В некоторых вариантах осуществления G (L-глицин) в любой из предыдущих формул заменен MeGly (N-метилглицин).

В некоторых вариантах осуществления Хаа³ или Хаа⁴ представляет нестандартную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления Хаа³ представляет нестандартную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления Хаа⁴ представляет нестандартную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления как Хаа³, так и Хаа⁴ представляют нестандартные аминокислоты.

В некоторых вариантах осуществления Хаа³ и/или Хаа⁴ представляют Cit. В некоторых вариантах осуществления Хаа³ представляет Cit. В некоторых вариантах осуществления Хаа⁴ представляет Cit.

В некоторых вариантах осуществления Хаа³ или Хаа⁴ не имеют заряда. В некоторых вариантах осуществления Хаа³ не имеет заряда. В некоторых вариантах осуществления Хаа⁴ не имеет заряда. В некоторых вариантах осуществления Хаа³ и Хаа⁴ не имеют заряда.

В некоторых вариантах осуществления Хаа³ не имеет заряда, а Хаа⁴ представляет нестандартную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления Хаа³ не имеет заряда, а Хаа⁴ представляет нестандартную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления Хаа³ представляет Aib. В некоторых вариантах осуществления Хаа⁴ представляет Aib.

В некоторых вариантах осуществления Хаа³Хаа⁴ представляет CitAib, CitE, CitF, CitG, CitK, CitP, CitQ, EAib, FAib, KAib, PAib или QAib, причем Cit представляет цитруллин, Aib представляет аминоизомасляную кислоту (a-метилаланин), K представляет L-лизин, Е представляет L-глутаминовую кислоту (глутамат), F представляет L-фенилаланин, Q представляет L-глутамин, G представляет L-глицин, а Р представляет L-пролин.

R' G¹DLXaa¹Xaa²LXaa³Xaa⁴L-R¹ (SEQ ID NO: 104) (Формула Via) в которой R¹ представляет Dap(гуанидин); а

G¹, D, L, Хаа¹, Хаа², Хаа³, Хаа⁴ и R¹ каждый соответствует определению для формулы VI в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления лиганды интегрина αγβ6 содержат реакционноспособную группу или защищенную реакционноспособную группу и содержат (Z-RG¹DLXaa¹Xaa²L-J-R¹) _n-R⁴-(R²) р (SEQ ID NO: 105) (Формула VII) в которой Z представляет аминотерминальный кэп (например, любой из аминотерминальных кэпов, описанных в настоящем документе или известных в данной области);

R представляет L-аргинин;

- 21 042923

G¹ представляет L-глицин или N-метилглицин;

L представляет L-лейцин;

R⁴ является необязательным, а если имеется, содержит каркас и/или связывающую группу, которая содержит по меньшей мере одну точку присоединения для каждого лиганда и по меньшей мере одну точку присоединения для каждой карго-молекулы;

В некоторых вариантах осуществления L связан с J посредством амидной связи. В некоторых вариантах осуществления лиганды интегрина αvβ6, которые содержат одну или более реакционноспособных групп или защищенных реакционноспособных групп, можно ввести в реакцию с карго-молекулой с образованием конъюгата лиганд интегрина αvβ6-карго-молекула.

В некоторых вариантах осуществления лиганды интегрина αvβ6 содержат реакционноспособную группу или защищенную реакционноспособную группу и содержат (R’G¹DLXaa¹Xaa²L-J-R¹) n-R⁴-(R²) Р (SEQ ID NO: 106) (Формула Vila) в которой R' представляет Dap(гуанидин); а

G¹, D, L, Хаа¹, Хаа², J, R¹, n, R⁴, р и R² каждый соответствует определению для формулы VII в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления L связан с J посредством амидной связи. Карго-молекулой может быть любая молекула, которую требуется нацелить на экспрессирующую интегрин αvβ6 клетку.

В некоторых вариантах осуществления, особенно когда требуется только локализованная доставка (например, путем ингаляции или инсуффляции порошков или аэрозолей, в том числе с помощью небулайзера, внутритрахеального, интраназального или с помощью местного введения), лиганды интегрина αvβ6 можно синтезировать без наличия аминотерминального кэпа при условии, что по меньшей мере одна или более аминокислот представляют нестандартные аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления лиганды интегрина αvβ6 содержат

RG¹DLXaa¹Xaa²L-Xaa³Xaa⁴L-R¹ (SEQ ID NO: 96) (Формула VIII) в которой R представляет L-аргинин;

G¹ представляет L-глицин или N-метилглицин;

L представляет L-лейцин;

Хаа¹ представляет L-α аминокислоту (например, любую из L-α аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области), L-β аминокислоту (например, любую из L-β аминокислот, описанных в настоящем документе или известных в данной области) или α,α-дизамещенную аминокислоту (например, любую из α,α-дизамещенных аминокислот, описанных в настоящем документе

- 22 042923 или известных в данной области);

R¹ является необязательным, а если имеется, содержит PEG и/или связывающую группу; и по меньшей мере один из Хаа¹, Хаа², Хаа³ и Хаа⁴ представляет нестандартную аминокислоту.

В некоторых вариантах осуществления лиганды интегрина αvβ6 содержат

RG¹DLXaa¹Xaa²L-Xaa³Xaa⁴L-R¹ (SEQ ID NO: 96) (Формула VIII), причем каждая переменная соответствует определению выше для формулы VIII, при этом по меньшей мере два из Хаа¹, Хаа², Хаа³ и Хаа⁴ представляют нестандартную аминокислоту.

RG¹DLXaa¹Xaa²L-Xaa³Xaa⁴L-R¹ (SEQ ID NO: 96) (Формула VIII), причем каждая переменная соответствует определению выше для формулы VIII, при этом по меньшей мере три из Хаа¹, Хаа², Хаа³ и Хаа⁴ представляют нестандартную аминокислоту.

RG¹DLXaa¹Xaa²L-Xaa³Xaa⁴L-R¹ (SEQ ID NO: 96) (Формула VIII), причем каждая переменная соответствует определению выше для формулы VIII, при этом Хаа², Хаа³ и Хаа⁴ представляют нестандартную аминокислоту.

RG¹DLAAbuLCitAibL-R¹ (SEQ ID NO: 97) (Формула Villa) в которой R представляет L-аргинин;

G¹ представляет L-глицин или N-метилглицин;

L представляет L-лейцин;

А представляет L-аланин;

Abu представляет L-α-аминомасляную кислоту;

Cit представляет цитруллин;

Aib представляет α-аминоизомасляную кислоту; а

В некоторых вариантах осуществления лиганды интегрина αvβ6 содержат реакционноспособную группу или защищенную реакционноспособную группу и содержат (RGYlAAbuLCitAibL-R¹) n-R⁴-(R²) р (SEQ ID NO: 107) (Формула VIIlb) в которой R представляет L-аргинин;

G¹ представляет L-глицин или N-метилглицин;

L представляет L-лейцин;

А представляет L-аланин;

Abu представляет L-α-аминомасляную кислоту;

Cit представляет цитруллин;

Aib представляет α-аминоизомасляную кислоту;

R¹ является необязательным, а если имеется, содержит PEG и/или связывающую группу; n представляет число больше 0 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30; или 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 5-30, 5-25, 5-20, 5-15, 5-10, 10-30, 10-25, 10-20, 10-15, 15-30, 15-25, 15-20, 20-30, 20-25 или 25-30);

R⁴ является необязательным, а если имеется, содержит каркас или связывающую группу, которая содержит по меньшей мере одну точку присоединения для каждого лиганда и по меньшей мере точку присоединения для каждой карго-молекулы;

р представляет число больше 0 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,

- 23 042923

20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30; или 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 5-30, 5-25, 5-20, 5-15, 5-10,

10-30, 10-25, 10-20, 10-15, 15-30, 15-25, 15-20, 20-30, 20-25 или 25-30); а

В некоторых вариантах осуществления одна или более карго-молекул конъюгированы с одним или более лигандами интегрина ave6 и содержат (RG^LAAbuLCitAibL-R¹) n-R⁴-(R³) р (SEQ ID NO: 108) (Формула VIlie) в которой R представляет L-аргинин;

G¹ представляет L-глицин или N-метилглицин;

L представляет L-лейцин;

R³ содержит одну или более карго-молекул.

Одной или более карго-молекулами может быть любая молекула, которую требуется нацелить на экспрессирующую интегрин ave6 клетку.

В рамках изобретения в некоторых вариантах осуществления R¹ имеется и содержит PEG группу, имеющую 1-100 единиц этиленоксида (СН2-СН2-О) (например, 1-90, 1-80, 1-70, 1-60, 1-50, 1-40, 1-30, 1-20, 1-10, 1-5, 2-100, 2-90, 2-80, 2-70, 2-60, 2-50, 2-40, 2-30, 2-20, 2-10, 2-5, 5-100, 5-90, 5-80, 5-70, 5-60, 5-50, 5-40, 5-30, 5-20, 5-10, 10-100, 10-90, 10-80, 10-70, 10-60, 10-50, 10-40, 10-30, 10-20, 20-100, 20-90, 20-80, 20-70, 20-60, 20-50, 20-40, 20-30, 30-100, 30-90, 30-80, 30-70, 30-60, 30-50, 30-40, 40-100, 40-90, 40-80, 40-70, 40-60, 40-50, 50-100, 50-90, 50-80, 50-70, 50-60, 60-100, 60-90, 60-80, 60-70, 70-100, 70-90, 7 0-80, 80-100, 80-90 или 90-100 единиц этиленоксида). В некоторых вариантах осуществления R¹ имеется и содержит PEG группу, имеющую 2-30 единиц этиленоксида. В некоторых вариантах осуществления R¹имеется и содержит PEG группу, имеющую 2-20 единиц этиленоксида. В некоторых вариантах осуществления R¹ имеется и содержит PEG группу, имеющую 2-10 единиц этиленоксида. В некоторых вариантах осуществления R¹ имеется и содержит PEG группу, имеющую 5-20 единиц этиленоксида. В некоторых вариантах осуществления R¹ имеется и содержит PEG группу, имеющую 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 единиц этиленоксида.

Реакционноспособные группы хорошо известны в данной области и обеспечивают образование ковалентных связей между двумя молекулами или реагентами. Подходящие реакционноспособные группы для использования в рамках изобретения в настоящем описании включают без ограничения аминогруппы, амидогруппы, карбонокислотные группы, азиды, алкины, пропаргиловые группы, BCN(бицикло[6,1.0]нонин, DBCO(дибензоциклооктин)тиолы, малеимидные группы, аминооксигруппы, N-гидроксисукцинимид (NHS) или другой активированный сложный эфир (например, PNP, TFP, PFP), группы брома, альдегиды, карбонаты, тозилаты, тетразины, транс-циклооктен (ТСО), гидразиды, гидроксильные группы, дисульфиды и ортопиридилдисульфидные группы.

Включение реакционноспособных групп может облегчить конъюгацию раскрытого в настоящем описании лиганда интегрина αγβ6 с карго-молекулой. Реакции конъюгации хорошо известны в данной области и обеспечивают образование ковалентных связей между двумя молекулами или реагентами. Подходящие реакции конъюгации для использования в рамках изобретения в настоящем описании включают без ограничения реакцию сочетания амида, реакцию присоединения Михаэля, реакцию образования гидразона и реакцию циклоприсоединения в клик-химии.

В некоторых вариантах осуществления раскрытые в настоящем описании целенаправленно воздействующие лиганды интегрина ave6 синтезируют в виде сложного тетрафторфенилового (TFP) эфира, который можно вытеснить реакционноспособной аминогруппой для присоединения карго-молекулы.

Защищенные реакционноспособные группы также широко используют в данной области. Защитная группа обеспечивает временное химическое преобразование реакционноспособной группы в группу, которая не вступает в реакцию в условиях, в которых незащищенная группа вступает в реакцию, например, для обеспечения хемоселективности последующей химической реакции. Подходящие защищенные реакционноспособные группы для использования в рамках изобретения в настоящем описании включают без ограничения ВОС группы (t-бутоксикарбонил), Fmoc (9-фторенилметоксикарбонил), карбоксибензильные (CBZ) группы, бензильные сложные эфиры и PBF (2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонил).

Карго-молекулой является любая молекула, для которой может быть необходимо целенаправленное

- 24 042923 воздействие на интегрин ανβ6 или экспрессирующую интегрин ανβ6 клетку. Карго-молекулой может быть без ограничения фармацевтический ингредиент, лекарственное средство, пролекарство, имеющее терапевтическое значение вещество, малая молекула, антитело, фрагмент антитела, иммуноглобулин, моноклональное антитело, метка или маркер, липид, натуральная или модифицированная нуклеиновая кислота или полинуклеотид, пептид, полимер, полиамин, белок, аптамер, токсин, витамин, PEG, гаптен, дигоксигенин, биотин, радиоактивный атом или молекула, или флуорофор. В некоторых вариантах осуществления одна или более карго-молекул (например, одинаковые или разные карго-молекулы) связывают с одним или более лигандами интегрина αΎβ6 для целенаправленного воздействия карго-молекул на экспрессирующую интегрин αΎβ6 клетку.

В некоторых вариантах осуществления одной или более карго-молекулами является фармацевтический ингредиент или фармацевтическая композиция. В некоторых вариантах осуществления одной или более карго-молекулами является олигомерное соединение. В рамках изобретения олигомерным соединением является нуклеотидная последовательность, содержащая приблизительно 10-50 (например, 10-48, 10-46, 10-44, 10-42, 10-40, 10-38, 10-36, 10-34 10-32, 10-30, 10-28, 10-26, 10-24, 10-22, 10-20, 10-18,

10-16, 10-14, 10-12, 12-50, 12-48, 12-46, 12-44, 12-42, 12-40, 12-38, 12-36, 12-34, 12-32, 12-30, 12-28, 12-26,

12-24, 12-22, 12-20, 12-18, 12-16, 12-14, 14-50, 14-48, 14-46, 14-44, 14-40, 14-42, 14-38, 14-36, 14-34, 14-32,

14-30, 14-28, 14-26, 14-24, 14-22, 14-20, 14-18, 14-16, 16-50, 16-48, 16-46, 16-44, 16-42, 16-40, 16-38, 16-36,

16-34, 16-32, 16-30, 16-28, 16-26, 16-24, 16-22, 16-20, 16-18, 18-50, 18-48, 18-46, 18-44, 18-42, 18-40, 18-38,

18-36, 18-34, 18-32, 18-30, 18-28, 18-26, 18-24 18-22, 18-20, 20-50, 20-48, 20-46, 20-44, 20-42, 20-40, 20-38,

20-36, 20-34 20-32, 20-30, 20-28, 20-26, 20-24, 20-22, 22-50, 22-48, 22-46, 22-44, 22-42, 22-40, 22-38, 22-36, 22-34, 22-32, 22-30, 22-28, 22-26, 22-24, 24-50, 24-48, 24-46, 24-44, 24-42, 24-40, 24-38, 24-36, 24-34, 24-32,

24-30, 24-28, 24-26, 26-50, 26-48, 26-46, 26-44, 26-42, 26-40, 26-38, 26-36, 26-34, 26-32, 26-30, 26-28, 28-50,

28-48, 28-46, 28-44, 28-42, 28-40, 28-38, 28-36, 28-34, 28-32, 28-30, 30-50, 30-48, 30-46, 30-44, 30-42, 30-40,

30-38, 30-36, 30-34, 30-32, 32-50, 32-48, 32-46, 32-44, 32-42, 32-40, 32-38, 32-36, 32-34, 34-50, 34-48, 34-46,

34-44, 34-42, 34-40, 34-38 34-36, 36-50, 36-48, 36-46, 36-44, 36-42, 36-40, 36-38, 38-50, 38-48, 38-46, 38-44,

38-42, 38-40, 40-50, 40-48 40-46, 40-44, 40-42, 42-50, 42-48, 42-46, 42-44, 44-50, 44-48, 44-46, 46-50, 46-48 или 48-50) нуклеотидов или пар нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах осуществления олигомерное соединение имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая по меньшей мере частично комплементарна кодирующей последовательности экспрессируемой целевой нуклеиновой кислоты или целевого гена внутри клетки. В некоторых вариантах осуществления олигомерные соединения, при доставке в клетку, экспрессирующую ген, способны ингибировать экспрессию лежащего в основе гена и в настоящем описании называются ингибирующие экспрессию олигомерные соединения. Экспрессию гена можно ингибировать in vitro или in vivo.

Олигомерные соединения включают без ограничения олигонуклеотиды, одноцепочечные олигонуклеотиды, одноцепочечные антисмысловые олигонуклеотиды, короткие интерферирующие РНК (siRNA), двухцепочечные РНК (dsRNA), микро РНК (miRNA), короткие шпилечные РНК (shRNA), рибозимы, молекулы интерферирующей РНК и субстраты дайсера. В некоторых вариантах осуществления олигомерным соединением является одноцепочечное олигомерное соединение. В некоторых вариантах осуществления олигомерным соединением является двухцепочечное олигомерное соединение.

В некоторых вариантах осуществления одной или более карго-молекулами является/являются средство РНКи, которое согласно определению в настоящем описании представляет собой средство, которое содержит РНК или РНК-подобную (например, химически модифицированную РНК) молекулу олигонуклеотида, которая способна разрушать или ингибировать трансляцию транскриптов информационной РНК (мРНК) целевой мРНК специфическим для последовательности образом. В рамках изобретения средства РНКи могут действовать посредством механизма РНК-интерференции (т.е. индуцируя РНК-интерференцию через взаимодействие с аппаратом пути РНК-интерференции (индуцируемый РНК комплекс сайленсинга или RISC) клеток млекопитающих) или посредством любого альтернативного механизма (механизмов) или пути (путей). Хотя полагают, что средства РНКи, как этой термин используется в настоящем описании, действуют в основном через механизм РНК-интерференции, раскрытые средства РНКи не связаны или не ограничены каким-либо конкретным путем или механизмом действия. Средства РНКи включают без ограничения одноцепочечные олигонуклеотиды, одноцепочечные антисмысловой олигонуклеотиды, короткие интерферирующие RNA (siRNA), двухцепочечные RNA (dsRNA), микро RNA (miRNA), короткие шпилечные РНК (shRNA) и субстраты дайсера.

Обычно средства РНКи могут состоять из по меньшей мере смысловой цепи (также называемой сопровождающая цепь), которая содержит первую последовательность, и антисмысловой цепи (также называемой направляющая цепь), которая содержит вторую последовательность. Величина каждой из смысловой и антисмысловой цепей средства РНКи может составлять 16-49 нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах осуществления смысловая и антисмысловая цепи средства РНКи независимо составляют 17-26 нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах осуществления смысловая и антисмысловая цепи независимо составляют 19-26 нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах осуществления смысловая и антисмысловая цепи независимо составляют 21-26 нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах осуще- 25 042923 ствления смысловая и антисмысловая цепи независимо составляют 21-24 нуклеотидов в длину. Смысловая и антисмысловая цепи могут иметь либо одинаковую длину, либо разную длину. Средства РНКи содержат последовательность антисмысловой цепи, которая по меньшей мере частично комплементарна последовательности целевого гена, а при доставке в клетку, экспрессирующую мишень, средство РНКи может ингибировать экспрессию одного или более целевых генов in vivo или in vitro.

Олигомерные соединения в целом, и средства РНКи конкретно могут состоять из модифицированных нуклеотидов и/или одной или более связей не на основе сложного фосфодиэфира. В рамках изобретения модифицированным нуклеотидом является нуклеотид, не являющийся рибонуклеотидом (2'-гидроксильным нуклеотидом). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 50% (например, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99 или 100%) нуклеотидов являются модифицированными нуклеотидами. В рамках изобретения модифицированный нуклеотид включает без ограничения деоксирибонуклеотиды, имитаторы нуклеотидов, нуклеотиды с удаленным азотистым основанием, 2'-модифицированные нуклеотиды, (инвертированные) нуклеотиды 3'-3' связей, ненатуральные содержащие основания нуклеотиды, мостиковые нуклеотиды, пептидные нуклеиновые кислоты, 2',3'-секо имитаторы нуклеотидов (незапертые аналоги нуклеиновых оснований, запертые нуклеотиды, нуклеотиды с 3'-О-метокси (2' интернуклеозидными связями), 2'Т-арабино нуклеотиды, 5'-Me, 2'-фтор нуклеотид, морфолино нуклеотиды, винил фосфонат деоксирибонуклеотиды, содержащие винилфосфонат нуклеотиды и содержащие циклопропилфосфонат нуклеотиды. 2'-модифицированные нуклеотиды (т.е. нуклеотид с группой, не являющейся гидроксильной группой, в 2' позиции пятичленного кольца Сахаров) включают без ограничения 2'-O-метил нуклеотиды, 2'-деокси2'-фтор нуклеотиды, 2'-деокси нуклеотиды, 2'-метоксиэтил (2'-O-2-метоксиэтил) нуклеотиды, 2'-амино нуклеотиды и 2'-алкил нуклеотиды.

Кроме того, один или более нуклеотидов олигомерного соединения, такого как средство РНКи, могут быть связаны нестандартными связями или остовами (т.е. модифицированными интернуклеозидными связями или модифицированными остовами). Модифицированной интернуклеозидной связью может быть не содержащая фосфат ковалентная интернуклеозидная связь. Модифицированные интернуклеозидные связи или остовы включают без ограничения 5'-фосфоротиоатные группы, хиральные фосфоротиоаты, тиофосфаты, фосфородитиоаты, фосфотрисложные эфиры, аминоалкилфосфотрисложные эфиры, алкилфосфонаты (например, метилфосфонаты или 3'-алкиленфосфонаты), хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты (например, 3'-аминофосфорамидат, аминоалкилфосфорамидаты или тионофосфорамидаты), тионоалкилфосфонаты, тионоалкилфосфотрисложные эфиры, морфолиновые связи, боранофосфаты, имеющие нормальные 3'-5' связи, 2'-5' связанные аналоги боранофосфатов, или боранофосфаты, имеющие обратную ориентацию, при которой соседние пары нуклеозидных единиц связаны 3'-5' с 5'-3' или 2'-5' с 5'-2'.

Необязательно, чтобы все позиции в данном соединении были однородно модифицированы. Наоборот, в одном олигомерном соединении или даже в одном его нуклеотиде может быть заключена более чем одна модификация.

Смысловые цепи и антисмысловые цепи средства РНКи можно синтезировать и/или модифицировать способами, известными в данной области. Например, раскрытие средств РНКи, направленных на ингибирование экспрессии альфа-ENaC, можно найти, например, в публикации международной патентной заявки № WO 2008/152131, которая полностью включена в настоящее описание посредством ссылки. Можно найти дополнительные раскрытия, относящиеся к средствам РНКи, например, можно найти в раскрытии модификаций, например, в международной патентной заявке № PCT/US2017/0455446 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Которая также полностью включена в настоящее описание посредством ссыл ки.

В некоторых вариантах осуществления одна или более карго-молекула (молекулы) могут содержать или состоять из фрагмента PEG, который может выступать в качестве фармакокинетического (ФК) модулятора. В некоторых вариантах осуществления одна или более карго-молекул могут содержать фрагмент PEG, имеющий приблизительно 20-900 единиц этиленоксида (СН2-СН2-О) (например, 20-850, 20-800, 20-750, 20-700, 20-650, 20-600, 20-550, 20-500, 20-450, 20-400, 20-350, 20-300, 20-250, 20-200, 20-150, 20-100, 20-75, 20-50, 100-850, 100-800, 100-750, 100-700, 100-650, 100-600, 100-550, 100-500, 100-450, 100-400, 100-350, 100-300, 100-250, 100-200, 100-150, 200-850, 200-800, 200-750, 200-700,

200-650, 200-600, 200-550, 200-500, 200-450, 200-400, 200-350, 200-300, 200-250, 250-900, 250-850,

250-800, 250-750, 250-700, 250-650, 250-600, 250-550, 250-500, 250-450, 250-400, 250-350, 250-300,

300-900, 300-850, 300-800, 300-750, 300-700, 300-650, 300-600, 300-550, 300-500, 300-450, 300-400,

300-350, 350-900, 350-850, 350-800, 350-750, 350-700, 350-650, 350-600, 350-550, 350-500, 350-450,

350-400, 400-900, 400-850, 400-800, 400-750, 400-700, 400-650, 400-600, 400-550, 400-500, 400-450,

450-900, 450-850, 450-800, 450-750, 450-700, 450-650, 450-600, 450-550, 450-500, 500-900, 500-850,

500-800, 500-750, 500-700, 500-650, 500-600, 500-550, 550-900, 550-850, 550-800, 550-750, 550-700,

550-650, 550-600, 600-900, 600-850, 600-800, 600-750, 600-700, 600-650, 650-900, 650-850, 650-800,

650-750, 650-700, 700-900, 700-850, 700-800, 700-750, 750-900, 750-850, 750-800, 800-900, 850-900 или

- 26 042923

850-900 единиц этиленоксида). В некоторых вариантах осуществления одна или более карго-молекула(ы) состоит(ят) из фрагмент PEG, имеющего приблизительно 455 единиц этиленоксида (молекулярная масса приблизительно 20 килодальтон (кДа)). В некоторых вариантах осуществления фрагмент PEG имеет молекулярную массу приблизительно 2 килодальтона. В некоторых вариантах осуществления фрагмент PEG имеет молекулярную массу приблизительно 20 килодальтон. В некоторых вариантах осуществления фрагмент PEG имеет молекулярную массу приблизительно 40 килодальтон. Фрагменты PEG, описанные в настоящем документе, могут быть линейными или разветвленными. Фрагменты PEG могут быть дискретными (монодисперсными) или недискретными (полидисперсными). Фрагменты PEG для использования в качестве улучшающей ФК карго-молекулы могут продаваться на коммерческих условиях. В некоторых вариантах осуществления одна или более карго-молекула(ы) содержит(ат) фрагмент PEG, который может выступать в качестве модулятора или усилителя ФК, а также иную карго-молекулу, например фармацевтически активный ингредиент или соединение.

Описанные лиганды интегрина ανβ6 содержат соли или их сольваты. Под сольватами лиганда ανβ6 понимают результаты соединения молекул инертного растворителя с лигандом интегрина αγβ6, которые образуются благодаря силе их взаимного притяжения. Сольватами являются, например, моно- или ди гидраты или продукты соединения со спиртами, например с метанолом или этанолом.

Свободные аминогруппы или свободные гидроксильные группы можно предоставить в виде заместителей лигандов интегрина ανβ6 с соответствующими защитными группами.

Лиганды интегрина αγβ6 также содержат, например, производные, т.е. лиганды интегрина ανβ6, модифицированные, например, алкильными или ацильными группами, сахарами или олигопептидами, которые расщепляют либо in vitro, либо в организме.

В некоторых вариантах осуществления лиганд интегрина αγβ6, раскрытый в настоящем описании, облегчает доставку карго-молекулы в цитозоль клетки, презентирующей интегрин ανβ6 на своей поверхности, либо через опосредованный лигандом эндоцитоз, пиноцитоз, либо посредством других средств. В некоторых вариантах осуществления лиганд интегрина ανβ6, раскрытый в настоящем описании, облегчает доставку карго-молекулы в цитоплазматическую мембрану клетки, презентирующей интегрин ανβ6.

В некоторых вариантах осуществления лиганд интегрина ανβ6 содержит структуру, представленную

(SEQ ID NO: 109) (Формула IX), в которой Z содержит аминотерминальный кэп (например, любой из аминотерминальных кэпов, описанных в настоящем документе или известных в данной области), а R⁵ и R⁶ представляют боковые цепи аминокислот Хаа¹ и Хаа² соответственно.

- 27 042923

В некоторых вариантах осуществления лиганды интегрина ανβ6 содержат следующие структуры, в которых Z и R¹ соответствуют определению для формулы III и формулы IV в настоящем описании, а R⁷ может быть ОН, J, J-R¹, J-R'-R² или Y-R'-R³ (как каждый из них определен для формулы III и формулы IV в настоящем описании):

(SEQ ID NO: 110) (Формула X)

(SEQ ID NO: 111) (Формула XI)

UN

(SEQ ID NO: 112) (Формула XII)

(SEQ ID NO: 113) (Формула XIII)

- 28 042923

(SEQ ID NO: 116) (Формула XVI)

В некоторых вариантах осуществления описанные лиганды ανβ6 демонстрировали повышенную стабильность в сыворотке по сравнению с существующим в природе связывающим интегрин охв6 пептидом RGDLATLRQL (SEQ ID NO: 1). Как показано в примерах в настоящем описании, только приблизительно 5% существующего в природе пептида RGDLATLRQL (SEQ ID NO: 1) можно обнаружить после инкубации 4 ч при 37°C в мышиной плазме. Пептид RGDLATLRQL (SEQ ID NO: 1) нельзя было обнаружить спустя 8 ч при 37°C в мышиной плазме. В некоторых вариантах осуществления раскрытый в настоящем описании лиганд интегрина αγβ6 демонстрирует более чем 20% оставшегося лиганда, определяемого посредством HLPC после 12-часовой инкубации при 37°C в мышиной плазме. Наряду с наличием повышенной стабильности в сыворотке от натурального пептида описанные лиганды интегрина avp6 сохраняли связывание с интегрином avp6 (аффинность к нему).

Фармацевтические композиции

В некоторых вариантах осуществления в настоящем раскрытии предоставлены фармацевтические композиции, которые содержат или состоят из или по существу состоят из одного или более раскрытых в настоящем описании лигандов интегрина αχβ6.

В рамках изобретения фармацевтическая композиция содержит фармакологически эффективное количество Активного Фармацевтического Ингредиента (API) и необязательно одно или более фармацевтически приемлемых вспомогательных средств. Фармацевтически приемлемое вспомогательное средство (вспомогательные средства) представляют собой вещества, отличающиеся от активного фармацевтического ингредиента (API, терапевтического продукта), которые специально содержатся в системе доставки лекарственных средств. Вспомогательные средства не оказывают или не предназначены оказывать терапевтическое действие в намеченной дозировке. Вспомогательные средства могут действовать для

а) помощи в обработке системы доставки лекарственных средств во время получения;

b) защиты, поддержки или повышения стабильности, биодоступности или приемлемости для пациента API;

с) содействия идентификации продукта; и/или

d) повышения любого другого признака общей безопасности, эффективности, доставки API во время хранения или применения.

Фармацевтически приемлемое вспомогательное средство может быть инертным или не инертным веществом.

Вспомогательные средства включают без ограничения усилители абсорбции, антиадгезивы, проти

- 29 042923 вовспенивающие средства, антиоксиданты, связующие вещества, буферные средства, носители, покрывающие средства, красители, улучшители доставки, полимеры для доставки, декстран, декстрозу, разбавители, разрыхлители, эмульгаторы, сухие разбавители, наполнители, ароматизаторы, скользящие вещества, увлажнители, смазывающие вещества, масла, полимеры, консерванты, солевой раствор, соли, растворители, сахара, суспендирующие вещества, матрицы с замедленным высвобождением, подсластители, загущающие средства, регуляторы тоничности, несущие среды, водоотталкивающие средства и смачивающие средства.

Описанные в настоящем документе фармацевтические композиции могут содержать другие дополнительные компоненты, часто встречающиеся в фармацевтических композициях. В некоторых вариантах осуществления дополнительным компонентом является фармацевтически-активный материал. Фармацевтически-активные материалы включают без ограничения противозудные средства, вяжущие средства, местные анестетики или противовоспалительные средства (например, антигистамин, дифенгидрамин и т.д.), низкомолекулярное лекарственное средство, антитело, фрагмент антитела, аптамеры и/или вакцину.

Фармацевтические композиции также могут содержать консервирующие средства, солюбилизирующие средства, стабилизирующие средства, смачивающие средства, эмульгаторы, подсластители, красители, пахучие вещества, соли для изменения осмотического давления, буферы, покрывающие средства или антиоксиданты. Они также могут содержать другие терапевтически значимые средства.

Фармацевтические композиции можно вводить многими способами в зависимости от того, требуется ли местное или системное лечение и от области, подлежащей лечению. Вводить можно любым способом, широко известным в данной области, например без ограничения местным (например, посредством трансдермального пластыря), пульмональным (например, путем ингаляции или инсуффляции порошков или аэрозолей, в том числе с помощью небулайзера, внутритрахеального, интраназального), эпидермальным, трансдермальным, пероральным или парентеральным. Парентеральное введение включает без ограничения внутривенную, внутриартериальную, подкожную, внутрибрюшинную или внутримышечную инъекцию или инфузию; подкожное (например, посредством имплантированного устройства), внутричерепное, интрапаренхиматозное, интратекальное и интравентрикулярное введение. В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе описаны фармацевтические композиции, вводимые посредством подкожной инъекции. Фармацевтические композиции можно вводить перорально, например, в виде таблеток, таблеток с покрытием, драже, твердых или мягких желатиновых капсул, растворов, эмульсий или суспензий. Введение также можно выполнять ректально, например, используя суппозитории; местно или чрескожно, например, используя мази, крема, гели или растворы; или парентерально, например, используя растворы для инъекций.

Фармацевтические композиции, подходящие для применения в виде инъекций, содержат стерильные водные растворы (когда растворимы в воде) или дисперсии и стерильные порошки для экстемпорального препарата стерильных инъецируемых растворов или дисперсии. Для внутривенного введения подходящие носители содержат физиологический солевой раствор, бактериостатическую воду, Кремофор ELTM (BASF, Parsippany, NJ) или фосфатный буферный солевой раствор. Он должен быть стабильным в условиях получения и хранения и должен содержать консерванты против заражающего действия микроорганизмов, например бактерий и грибов. Носителем может быть растворитель или дисперсионная среда, содержащая, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль) и их подходящие смеси. Надлежащую текучесть можно сохранять, например, за счет применения покрытия, например, лецитина, за счет сохранения требуемого размера частиц в случае дисперсии и за счет применения поверхностно-активных веществ. Во многих случаях будет предпочтительно содержание в композиции изотонических средств, например сахаров, полиспиртов, например, маннитола, сорбитола и натрия хлорида. Пролонгированное поглощение инъецируемых композиций может быть обусловлено содержанием в композиции средства, которое задерживает поглощение, например, моностеарата алюминия и желатина.

Стерильные инъецируемые растворы можно получать посредством включения в надлежащий растворитель при необходимости активного соединения в требуемом количестве с одним или комбинацией перечисленных выше ингредиентов с последующей стерилизацией фильтрованием. В целом, дисперсии получают путем включения активного соединения в стерильную несущую среду, которая содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных растворов для инъекций способы получения включают вакуумную сушку и лиофильную сушку, что дает порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный требуемый ингредиент из его ранее простерилизованного фильтрованием раствора.

Готовые формы, подходящие для внутрисуставного введения, могут быть в виде стерильного водного препарата любого из описанных в настоящем документе лигандов, которые могут быть в микрокристаллической форме, например, в виде водной микрокристаллической суспензии. Липосомные готовые формы или биоразлагаемые полимерные системы также можно использовать для предоставления любого из описанных в настоящем документе лигандов как для внутрисуставного, так и для офтальмологического введения.

Активные соединения можно получать с носителями, которые будут защищать соединение от бы

- 30 042923 строго удаления из организма, например готовой формой для регулируемого освобождения, содержащей имплантаты и микрокапсульные системы доставки. Можно использовать биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, например этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевую кислоту, коллаген, полиортосложные эфиры и полимолочную кислоту. Специалистам в данной области будут очевидны способы получения подобных готовых форм. В качестве фармацевтически приемлемых носителей также можно использовать липосомные суспензии. Их можно получать согласно способам, известным специалистам в данной области, например, как описано в патенте США № 4522811.

Фармацевтическая композиция может содержать другие дополнительные компоненты, часто встречающиеся в фармацевтических композициях. Подобные дополнительные компоненты включают без ограничения противозудные средства, вяжущие средства, местные анестетики или противовоспалительные средства (например, антигистамин, дифенгидрамин и т.д.). В рамках изобретения фармакологически эффективное количество, терапевтически эффективное количество или просто эффективное количество относится к эффективному количеству фармацевтически активного средства для получения фармакологического, терапевтического или профилактического результата.

Содержащего лиганд αΎβ6 лекарственные препараты также являются целью настоящего изобретения, также как способы получения подобных лекарственных препаратов, причем способы включают доставку одного или более содержащих лиганд αΎβ6 соединений, при необходимости одного или более других имеющих терапевтическое значение веществ, в лекарственной форме, подходящей для введения пациентам-людям.

Клетки, ткани и нечеловеческие организмы.

Предусмотрены клетки, ткани и нечеловеческие организмы, которые содержат по меньшей мере один из описанных в настоящем описании лигандов αΎβ6. Клетку, ткань или нечеловеческий организм получают посредством доставки лиганда ave6 в клетку, ткань или нечеловеческий организм с помощью любого доступного в данной области средства. В некоторых вариантах осуществления клеткой является клетка млекопитающего, включая без ограничения клетку человека.

Описанные лиганды αΎβ6 и содержащие лиганды αΎβ6 фармацевтические композиции, раскрытые в настоящем описании, могут быть упакованы или содержаться в наборе, контейнере, пакете или распылителе. Лиганды αΎβ6 и содержащие лиганды αΎβ6 фармацевтические композиции можно упаковать в предварительно заполненные шприцы или флаконы.

Предоставленные выше варианты осуществления и пункты далее проиллюстрированы с помощью следующих, неограничивающих примеров.

Примеры

Пример 1. Синтез лигандов αΎβ6 для исследований стабильности в сыворотке.

Амидную смолу Ринка Chem-Matrix поместили в пористый полипропиленовый шприц и взбалтывали в DCM в течение 30 мин перед использованием. Использовали следующие стандартные условия твердофазного синтеза пептидов. Удаление защиты Fmoc проводили посредством впитывания 40 мл раствора пиперидин:DMF (20:80 о/о) на 1 ммоль смолы в течение 20 мин. Связывание амида проводили посредством впитывания смолы с 4 молярными эквивалентами Fmoc-аминокислоты, 4 молярными эквивалентами HBTU и 10 молярными эквивалентами диизопропилэтиламина в DMF в концентрации 0,1 М Fmocаминокислоты в DMF в течение 40 мин. Для соединения хромофора DNP со смолой использовали FmocDap(DNP)-ОН и синтезировали пептид из Dap α-амина. Расщепление смолы осуществляли в растворе трифторуксусной кислоты в течение 2 ч. Растворитель восстанавливали до 10% первоначального объема посредством находящегося под давлением воздуха и осаждали, используя Et₂O. Микрорасщепление посредством TFA и аналитической HPLC-MS подтвердило идентичность продукта. Затем пептиды очищали до чистоты >95% на препаративной HPLC Shimadzu, используя элюирование в широкопористой колонке С18 Supelco Discovery BIO (25 смх21 мм, частицы 10 мкм) с линейными градиентами приблизительно 1 мл/мин. Чистоту оценивали, используя аналитическую HPLC Shimadzu, оборудованную колонкой Waters XBridge BEH130 С18 (250x6,6 мм, частицы 5 пм), с использованием 10-90% растворителя В в течение 50 мин. Растворитель А обозначает H₂O:F₃CCO₂H 100:0,1 о/о, растворитель В обозначает CH₃CN:F₃CCO₂H 100:0,1 о/о.

- 31 042923

Fmoc-Dap(DNP)-OH

Пример 2. Стабильность в сыворотке лигандов ανβ6.

Стабильность в сыворотке лигандов ave6 тестировали посредством инкубирования лигандов αγβ6 в мышиной сыворотке и анализа процентного значения нерасщепленного пептида в разные моменты времени. Нерасщепленный лиганд ave6 определяли посредством аналитической HPLC. Отдельные маточные растворы лигандов ave6 получали путем растворения пептидов в H₂O при концентрации >10 мг/мл. Концентрацию лиганда αΎβ6 оценивали, используя поглощение UV/Vis (DNP: γ=365, ε=17300 М'¹см'¹). Лиганд ave6 разбавляли до 1 мг/мл лиганда в 90% мышиной плазме и помещали в инкубаторе при 37°C. В заданные моменты времени (4, 8, 12 и 24 ч) образец инжектировали в аналитическую HPLC (Shimadzu HPLC), оборудованную колонкой Waters XBridge BEH130 С18 (250x6,6 мм, частицы 5 мкм), используя 10-90% растворитель В в течение 50 мин. Растворитель А обозначает H₂O:F₃CCO₂H 100:0,1 о/о, растворитель В обозначает CH₃CN:F₃CCO₂H 100:0,1 о/о.

Процентное значение оставшегося лиганда после инкубации сыворотки рассчитывали, используя следующее уравнение:

Оставшийся %=[(Площадь при t=x)+(Площадь при t=0)] х 100% где Площадью при t=0 была площадь под пиком лиганда сразу после разбавления лиганда в плазме, а Площадью при t=x была площадь под пиком пептида во время=х.

Каждый пептид ковалентно связывали с карго-молекулой PEG8-Dap(DNP). Затем PEG8-Dap(DNP) использовали для облегчения анализа.

Производные пептида связывали с карго-молекулой PEG8-Dap(DNP) и инкубировали в мышиной сыворотке при 37°C в течение 4, 8, 12 или 24 ч. Стабильность производных пептида измеряли посредством HPLC. Данные показаны в следующей табл. 1 (аминотерминальный кэп и Хаа1Хаа² подчеркнуты).

- 32 042923

Таблица 1

Стабильность в сыворотке лигандов ανβ6

Производное Пептида	SEQ ID NO.	Оставшийся %
t=4 ч	t=8 ч	t=12 ч	t=24 ч
RGDLATLRQL	1	5	<0, 1	<0, 1
Ac-RGDLATLTQL	2	90	67	34
RGDLAAbuLCitAibL	3	48	16	5
Ac-RGDLAAbuLCitAibL	4	94	82	72
Ac-RGDLAAbuLCitAibL	4	86	75	67	41
Ac-RGDLAAbuLCitAib	5	95	82	73	48
Ac-RGDLAAbuLCit	6	88	77	69	44
Ac-RGDLAAbuL	7	91	85	80	69
Ac-RGDLAAbuLCitAib	5			72
Ac-RGDLAAbuLCitK	8			35
Ac-RGDLAAbuLCitE	9			79
Ac-RGDLAAbuLCitF	10			22
Ac-RGDLAAbuLCitO	11	нерастворимый
Ac-RGDLAAbuLCitG	12			49
Ac-RGDLAAbuLCitAib	5			72
Ac-RGDLAAbuLKAib	13			35
Ac-RGDLAAbuLEAib	14			79
Ac-RGDLAAbuLFAib	15			22
Ac-RGDLAAbuLOAib	16	нерастворимый
Ac-RGDLAAbuLGAib	17			49
Ac-RGDLAAbuLCitAib	5			52
CfRCfECO-RGDLAAbuLCitAib	18			49
CFEtCFbECQ-RGDLAAbuLCitAib	19			49
CFEtCFbECO-RGDLAAbuLCitAib	20			58
CFEfCFbECQ-RGDLAAbuLCitAib	21			51
Ac-RGDLAAbuLCitAib	5			87
Ac-RGDLKAbuLCitAib	22			71
Ac-RGDLEAbuLCitAib	23			98
Ac-RGDLFAbuLCitAib	24			64
Ac-RGDLOAbuLCitAib	25			87
Ac-RGDLAAbuLCitAib	5			85
Ac-RGDLPAbuLCitAib	26			91
Ac-RGDLAKLCitAib	27			72
Ac-RGDLAELCitAib	28			96
Ac-RGDLAELCitAib	29			88
Ac-RGDLAAbuLCitAib	5			72
Ac-RGDLGAbuLCitAib	30			82
Ac-RGDLAGLCitAib	31			92
Ac-RGDLAPLCitAib	32			84
Ac-RGDLAAbuLCitP	33			68
Ac-RGDLAAbuLCit	6			79

Как показано в настоящем описании, наличие аминотерминального кэпа (Z) может обеспечивать повышенную стабильность в сыворотке. Кроме того, как показано в настоящем описании, наличие нестандартных аминокислот в Хаа¹, Хаа² и/или J (например, Хаа³ и Хаа⁴) в раскрытых в настоящем описании формулах, также обеспечивают повышенную стабильность в сыворотке по сравнению с натуральным пептидом SEQ ID NO: 1.

Пример 3. Связывание интегрина лигандов ανβ6.

А. Конъюгация лиганд αvβ6-карго-молекула.

Каждый лиганд ανβό соединяли с обратимо модифицированной полимерной карго-молекулой 1170-100В. Полимерную карго-молекулу 1170-100В (сополимер этоксиэтиламинакрилат:пропилакрилат 56:44, имеющую MW приблизительно 45000) метили Су5 (линкер NHS) и соединяли с альдегид-PEG₂₄ACit при массовом отношении 2:1 (полимер:альдегид-PEG₂₄-ACit) в 50 мМ буфера HEPES рН 9,0 в тече- 33 042923 ние 1 ч при RT с образованием (альдегид-PEG₂₄-ACit)_n-1170-100В, где n представляет число больше 0.

Обычно, n был приблизительно 10.

Затем альдегид-PEG₂₄-ACit-модифицированный полимер вводили в реакцию с PEG₁₂-ACit в массовом отношении 1:8 (полимер: PEG₁₂-ACit) в 50 мМ буфера HEPES, рН 9,0 в течение 1 ч при RT с образованием (альдегид-PEG₂₄-ACit)_n-1170-100B-(CitA-PEG₁₂)_m, где m представляет число больше 0.

Затем модифицированный полимер очищали, используя центрифужную колонку sephadex G-50, и определяли концентрацию флуоресценция конь. Су5 после очистки мг , ..

флуоресценция конъ. Су5 перед очисткой ^К0ИЪ- очисткой модифицировали HyNic для облегчения конъюгации с карго-молекулой.

полимер^) =

Каждый лиганд αγβ 6

Очищенный полимер соединяли с лигандом ave6-(PEG)₈-K-HyNic при массовом отношении 1:1,9 (полимер:лиганд ανβ6) в 50 мМ буфера NaOAC-HOAc, рН 5,0 при RT в течение ночи с образованием конъюгата лиганд αvβ6-полимер.

Конъюгат лиганд αγβ 6-полимер очищали, используя центрифужную колонку sephadex G-50.

- 34 042923

Лиганд ανββ-(PEG)₈-K-HyNic

Эффективность конъюгации количественно оценивали посредством измерения поглощающей способности конъюгата αγβ6-полимер при 354 нм, используя коэффициент затухания, равный 2,9x101 М-¹см-¹для бис-арилгидразоновой связи.

Молярная концентрация полимера (мМ) _ массовая концентрация полимера (мг/мл) % молекулярная масса полимера (Дальтон)

Молярная концентрация ανβό (мМ) _ /А₃₅₄(конъ.-ау$6) - А₃₅₄ (контрольный конъ. безау^б)] ⁼ 29 _ТГ о молярная концентрация otvR6 (м^А)

Количество остро на полимер =--------------------—------^! ' молярная концентрация полимера (мМ)

Для дальнейшего анализа конъюгаты αγβ6-полимер разбавляли изотоническим раствором глюкозы до требуемых концентраций.

В. Связывание лиганда αγβ6 (проточно-цитометрический анализ).

Для оценки специфичности связывания лигандов αγβ6 с интегрином αγβ6 каждый лиганд αγβ6 или пептид отрицательного контроля конъюгировали с меченым Су5 полимером (как описано выше) и оценивали на связывание с клетками. Определили, что клетки HUH7 (гепатоцеллюлярной карциномы человека) и SKOV3 (карциномы яичников человека) демонстрируют очень низкую экспрессию αγβ6 клеточной поверхностью, и их использовали в качестве клеточных линий отрицательного контроля. Клетки Н2009 (эпителиальной аденокарциномы легкого человек) и CAPAN-2 (аденокарциномы поджелудочной железы человек) служили в качестве клеточных линий положительного контроля αγβ6. Клетки отделяли от колб для культивирования с помощью аккутазы, промывали в PBS и сеяли в 5 мл полистироловые пробирки с круглым дном по 200,000 клеток в 200 мкл полной среды (среда для культивирования с добавками и эмбриональной телячьей сывороткой). Конъюгаты лиганд αγβ 6-полимер или конъюгаты полимера без лиганда добавляли по 5 пг/мл (концентрация полимер-Су5) в клетки, перемешивали и инкубировали при 37°C в течение 3 ч. Инкубация при 37°C облегчала взаимодействие лиганд/рецептор, которое может приводить к статическому связыванию с внеклеточной поверхностью клеток и/или интернализированным комплексам лиганд/рецептор. Смесь ресуспендировали с интервалами 1 ч. После 3 ч инкубации клетки промывали 2x4 мл охлажденного буфера (PBS-2% FCS) и ресуспендировали в 200 мкл буфера, содержащего 10 мкМ синего красителя SYTOX для селекции живых/мертвых клеток. Образцы анализировали на цитометре Canto II BD Biosciences, оборудованном фиолетовым (405 нм), синим (488 нм) и красным (633 нм) лазерами.

Сперва жизнеспособные клетки селектировали в виде отрицательной по синему SYTOX популяции на С детекторе с фиолетовым лазером. Затем эти жизнеспособные клетки оценивали на связывание/поглощение конъюгата с красным лазером в виде средней интенсивности флуоресценции (MFI) флуорофора Су5. Анализ данных проводили с помощью программного обеспечения FlowJo γ10.1. Конкретный коэффициент MFI (sMFIr) для каждого лиганда αγβ6 определяли по следующей формуле:

значение MFI для конкретного образца/значение MFI без лиганда.

Как показано в табл. 2 ниже, только пептид Ac-RGDLAc-LCitAibL демонстрировал умеренное связывание с клетками SKOV3. Этот пептид не показывал значительного связывания с клетками HUH7. Таким образом, ни один из тестируемых пептидов не показал неспецифическое связывание. Пептиды отрицательного контроля AcRGaMeDLAc-LCitAib, AcRGDaMeLAc-LCitAib, RGELATLRQL, AcCitGDLATLCitQL, AcK(Me)₂GDLATLRQL и AcR(Me)₂GDLATLRQL, которые не содержат RGD, не показали значительное связывание с клетками положительного контроля интегрина αγβ6, H2009 или CAPAN-2, показывая от- 35 042923 сутствие аффинности к интегрину ανβ6. Большая часть других пептидов демонстрировала связывание с клетками Н2009 или CAPAN-2, которое было сопоставимо или выше чем у натуральных пептидов,

RGDLATLRQL и RGDLATL, показывая хорошую аффинность к интегрину αγβ6.

Таблица 2

Связывание лиганда ανβ6 с экспрессирующими (Н2009 и CAPAN-2) и неэкспрессирующими (HUH7 и SKOV3) интегрин αγβ6 клетками

Пептид	SEQ ID NO	MFI
HUH7	SKOV3	H2009	CAPAN-2
Ac-RGDLAc-LCitAibL	4	l,o		3,2	7,7
Ac-RGaMeDLAc-LCitAib	34	0,9		0,9	1,0
Ac-RGDaMeLAc-LCitAib	35	0,9		0,8	0,9
Ac-RGDLAc-L	7	0,9		2,6	7,9
Ac-RGDLAc-LAib	36	0,9		3,2	8,9
RGDLATLRQL	1		1,4	4,7
RGELATLRQL (RGE контроль)	37			0,99
RGDLATLRQLEEEK-(HyNic)	38			6, 5
metа-гуанидин-бензо!c-GDLATLRQL	39			4,5
Ac-RGDLATLRQL	2			4,7
Me-RGDLATLRQL	40			4,8
Гуанидинил-RGDLATLRQL	41			4,3
MeO-PEG8-RGDLATLRQL	42			2,5
Ac-RGDLALLRQL	43			6, 06
Ac-RGDLAc-LRQL	44			6,47
Ac-RGDLAILRQL	45			6,22
Ac-RGDLAVLRQL	46			6,23
Ac-CitGDLATLRQL	47			2,45
Ac-RGDLATLCitQL	48			3,94
Ac-CitGDLATLCitQL	49			0,99
Ac-RGDLATLRAbuL	50			4,26
Ac-RGDLATLRAibL	51			3,9
Ac-RGDLATLRDap(Ac)L	52			4,18
Ac-RGDLATLRCitL	53			4,07
Ac-RGDLATLRNvaL	54			4,26
RGDLATLRQL	55			4,32
Ac-RGDLAc-LCitAibL	4		2,25	4,55
Ac-K(Me)₂GDLATLRQL	56		0,9	1,1
Ac-R(Me)₂GDLATLRQL	57		0,9	1
Dap(гуанидин)-GDLATLRQL	58		1,4	3,4
дезамино-RGDLATLRQL	59		0,8	1,1
Ac-RGDL(33-hATLRQL	60		1,2	4,5
Ac-RGDLAibTLRQL	61		1,4	4
Ac-RGDLChaTLRQL	62		1	5,1
RGDLATLRQ	63		1,6	4,7
RGDLATLR	64		1,4	4,6
RGDLATL	65		1,2	2,9
RGDLAT	66		0,9	1,3
Ac-RGDLAibAbuLCitAib	67
Ac-RGDL(33-hAc-LCitAib	68			2,34
Ac-RGDLChAc-LCitAib	69			1,6
Ac-RNMe GDLAT LRQL	70		0,97	4,61
Ac-RGDLAc-LCitAib	5			4,7
Ac-RNMeGDLAc-LCitAib	71			2,6
Ac-RGDNMeLAc-LCitAib	72			1
Ac-RGDLAc-N_MeLCitAib	73			1,3
СНз CH₂-RGDL Ac-LCit Aib	74			4,4

- 36 042923

CH₃ ( СН₂) 2-RGDLAc-LCitAib	75	3, 9
СН₃ ( СН₂) з-RGDLAc-LCitAib	76	4,7
СН₃ ( СН₂) 4-RGDLAc-LCitAib	77	4,1
Ac-RGaMeDLAc-LCitAib	34	1
Ac-RGDaMeLAc-LCitAib	35	1
Ac-RGDLKAbuLCitAib	22	3, 6
Ac-RGDLEAbuLCitAib	23	2,6
Ac-RGDLFAbuLCitAib	24	2,7
Ac-RGDLQAbuLCitAib	25	3,7
Ac-RGDLGAbuLCitAib	30	3,7
Ac-RGDLPAbuLCitAib	26	1
Ac-RGDLAKLCitAib	27	3, 6
Ac-RGDLAELCitAib	28	2,4
Ac-RGDLAFLCitAib	29	2
Ac-RGDLAQLCitAib	78	3, 6
Ac-RGDLAPLCitAib	32	2,8
Ac-RGDLAc-LCit	6	3,3
Ac-RGDL Ac-LF Aib	15	3, 6
Ac-RGDLAc-LPAib	79	1, 6
Ac-RGDLAc-LCitK	8	5,2
Ac-RGDLAc-LCitE	9	4
Ac-RGDLAc-LCitF	10	3,7
Ac-RGDLAc-LCitQ	11	4,4
Ac-RGDLAc-LCitG	12	4,8
Ac-RGDLAc-LCitAib	5	3, 8
CH₃ ( CH₂) iCO-RGDLAc-LCitAib	80	4,2
CH₃ ( CH₂) ₂CORGDLAc-LCitAib	19	4,3
CH₃ ( CH₂ ) зСО-RGDLAc-LCitAib	20	4, 1
CH₃ ( CH₂) ₄CO-RGDLAc-LCitAib	21	3, 9
CH₃0 (CH₂CH₂0) iCH₂CH₂C0-RGDLAc-LCitAib	81	3, 8
CH3O (CH₂CH₂0 ) ₂CH₂CH₂C0-RGDLAc-LCitAib	82	3, 6
CH3O (CH₂CH₂0) ₃CH₂GH₂G0-RGDLAc-LCitAib	83	3,7
CH3O (CH₂CH₂0) ₅CH₂CH₂C0-RGDLAc-LCitAib	84	1, 6
Ac-RGDLATLRQL	2	4,7
RGDLAc-LCitAibL	3	4,6
Ac-RGDLAc-LCitAibL	4	4,6
Ac-RGDLAc-L	7	2,6
Ac-RGDLAc-LAib	36	3,2
Ac-RGDLAc-LKAib	13	5,4
Ac-RGDLAc-LEAib	14	1, 9
Ac-RGDLAc-LGAib	17	4
Ac-RGDLAc-LCitP	33	4
Ac-RGDLAc-LQAib	16	4,4
Ac-RGDLAGLCitAib	31	3,8

- 37 042923

Некоторые аббревиатуры нестандартных аминокислот и других химических групп, идентифицированных в предыдущей таблице, имеют следующие химические структуры:

Aib представляет α-аминоизомасляную кислоту

Cit представляет цитруллин

Abu представляет

L-a-аминомасляную кислоту aMeD представляет α-метиласпартат

aMeL представляет а-метиллейцин

Cha представляет

Здиклогексилаланин

Nva представляет норвалин

К(Me)2 представляет

N, Ν-ε-диметиллизин

- 38 042923

гуанидиниларгинин

Пример 4. Внутритрахеальное введение In vivo средств РНКи, целенаправленно воздействующих на альфа-ENaC, конъюгированных с лигандами интегрина ανβ6 у крыс.

Композиции двухцепочечных олигонуклеотидов, которые содержали смысловую цепь и антисмысловую цепь, каждый из которых имеет менее чем 26 нуклеотидов (т.е. разновидность средства РНКи), синтезировали согласно фосфорамидитному методу на твердой фазе в соответствии с общими методиками, известными в данной области и широко используемыми в синтезе олигонуклеотидов. Синтез средств РНКи в настоящем описании проводили на твердой подложке, сделанной из поставляемого на рынок стекла с заданным размером пор (CPG, 500 А или 600 А, полученного от Prime Synthesis, Aston, PA, USA), с использованием либо MerMade96E® (Bioautomation), MerMade12® (Bioautomation) или OP Pilot 100 (GE Healthcare) для синтеза в зависимости от масштаба. Все РНК и 2'-модифицированные РНК фос

- 39 042923 форамитиды были куплены на рынок (Thermo Fisher Scientific (Milwaukee, WI, USA). Для расщепления и снятия защиты после завершения твердофазного синтеза, высушенную твердую подложку обрабатывали 40 мас.% раствора метиламина в воде и 28% раствора гидроксида аммония (Aldrich) с объемом 1:1 в течение 1,5 ч при 30°C. Раствор выпаривали и сухой остаток восстанавливали в воде. Для очистки неочищенные олигомеры очищали посредством анионообменной HPLC, используя 13 мкм колонку TSKgel SuperQ-5PW и систему Shimadzu LC-8. Буфером А был 20 мМ Tris, 5 мМ EDTA, рН 9,0 и содержал 20% ацетонитрил, а буфером В был тот же самый, что и буфер А с добавлением 1,5 М натрия хлорида. Регистрировали УФ следы при 260 нм. Надлежащие фракции объединяли, затем прогоняли на эксклюзионной HPLC, используя колонку GE Healthcare XK 26/40, заполненную мелким сефадексом G-25 с рабочим буфером из 100 мМ бикарбоната аммония, рН 6,7 и 20% ацетонитрила. Для отжига комплементарные цепи перемешивали путем соединения эквимолярных растворов РНК (смысловой и антисмысловой) в 1xPBS (фосфатно-буферном солевом растворе, 1x, Corning, Cellgro) с образованием средства РНКи.

Некоторые средства РНКи лиофилизировали и сохраняли при -15-25°C. Двойную концентрацию определяли посредством измерения поглощающей способности раствора на спектрометре UV-Vis в 1xPBS. Затем для определения двойной концентрации поглощающую способность раствора при 260 нм умножали на коэффициент преобразования и коэффициент разбавления. Если не утверждается иное, весь коэффициент преобразования составлял 0,037 мг/(мл-см). Для некоторых экспериментов коэффициент преобразования рассчитывали из экспериментально определенного коэффициента затухания.

Средства РНКи, синтезированные для примера 4, содержали антисмысловую цепь, имеющую последовательность нуклеиновых оснований, по меньшей мере частично комплементарную гену, экспрессирующему субъединицу альфа амилорид-чувсвительного эпителиального натриевого канала (широко называемого альфа-ENaC или SCNN1A). Средства РНКи к альфа-ENaC разработали с возможностью разрушения или ингибирования трансляции транскриптов информационной РНК (мРНК) альфа-ENaC специфическим для последовательности образом, ингибируя посредством этого экспрессию гена альфаENaC. Средства РНКи состояли из модифицированных нуклеотидов и более чем одной нефосфодиэфирной связи.

В 1 день и 2 день исследования самцу крысы Sprague-Dawley внутритрахеально посредством микрораспылительного устройства (Penn Century, Philadelphia, PA) вводили дозу 200 мкл, которая включала следующие группы получения лекарства (1) 5% декстрозы в водной несущей среде (D5W);

(2) 1,5 мг/кг средства РНКи к альфа-ENaC без лиганда (средства голой РНКи) в виде готовой формы с 5% декстрозой;

(3) 1,5 мг/кг средства РНКи к альфа-ENaC, конъюгированного с лигандом интегрина αγβ6 фиг. 3 (с лигандом интегрина ανβ6, конъюгированным на 5' терминальном конце смысловой цепи), в виде готовой формы с 5% декстрозой; или (4) 1,5 мг/кг средства РНКи к альфа-ENaC, конъюгированного с неактивированным лигандом интегрина αγβ6, имеющим структуру Ac-^RGELAc-L-oitAibL (seq id NO: 132), служащую в качестве лиганда отрицательного контроля. Полагают, что для связывания лиганда с рецепторами интегрина альфа-v требуется аспарагиновая кислота (D) в мотиве 'RGD', и лиганды с замещением глутаминовой кислоты (E) обладают значительно сниженной аффинностью связывания интегрина av. В группах 2, 3 и 4 использовали то же самое средство РНКи к альфа-ENaC.

Используемый лиганд интегрина αγβ6 синтезировали в виде сложного эфира TFP (как показано на фиг. 1), используя общие методы синтеза пептидов, хорошо известные в данной области и аналогичные методам, изложенным в примере 1 в настоящем описании, за исключением расщепления смолы, что достигалось при использовании 20% HFIP (гексофторизопропанола) в DCM (дихлорметане) в течение от 30 мин до одного часа, вместо расщепления TFA. 5' терминальный конец смысловой цепи средства РНКи модифицировали С₆ амином (-NH2). Затем лиганд интегрина αγβ6 TFP-сложного эфира конъюгировали с аминогруппой, расположенной на 5' терминальном конце модифицированной смысловой цепи средства РНКи, используя 3 эквивалента лиганда интегрина αγβ6 TFP-сложного эфира в DMSO:вода 9:1 и избыточное количество триэтиламина в качестве основы, при комнатной температуре. Очистку проводили путем добавления в раствор ACN для осаждения продукта и сушки при сильном разрежении.

Лечение получали по четыре (4) крысы в группе. Крыс умерщвляли на 5 день исследования и из обоих легких выделяли общую РНК после сбора и гомогенизации. Представленность мРНК альфа-ENaC количественно анализировали посредством количественной ПЦР на основе зонда, нормировали по экспрессии GAPDH и экспрессировали в виде фракции контрольной группы несущей среды (геометрическое среднее +/- 95% доверительный интервал).

- 40 042923

Таблица 3

Относительная экспрессия мРНК альфа-ENaC, нормированной по контролю примера 4

Группа	Относительная экспрессия (Геометрическое среднее)	Нижний/Верхний 95% Доверительный Интервал
(1) несущая среда 5% декстроза	1, 000	0,77/1,30
(2) Средство голой РНКи (без лиганда)	0,54	0,24/1,22
(3) конъюгат лиганд ανβ6 Фиг. 3-Средство	0,22	0,11/0,44
(4) конъюгат RGE-контрольный лиганд-	0,43	0,26/0,73

Как показано в табл. 3 выше, лиганд ave6 фиг. 3, конъюгированный со средством РНКи к альфаENaC, продемонстрировал повышенный относительный нокдаун мРНК альфа-ENaC (приблизительно 78% нокдаун) по сравнению со средством голой РНКи (46% нокдаун) и средством РНКи, конъюгированным с RGE-контрольным лигандом (57% нокдаун) альфа-ENaC мишени легкого in vivo.

Пример 5. Внутритрахеальное введение In vivo средств РНКи, целенаправленно воздействующих на альфа-ENaC, конъюгированных с лигандами интегрина ave6 у крыс.

Средства РНКи к альфа-ENaC, аналогичные средствам, описанным в примере 4, синтезировали следуя таким же методикам синтеза. В 1 день и 2 день исследования самцам крыс Sprague-Dawley посредством микрораспылительного устройства (Penn Century, Philadelphia, PA) вводили дозу 200 мкл, которая включала следующие группы получения лекарства:

(1) несущую среду D5W;

(2) 1,5 мг/кг средства РНКи без лиганда (средства голой РНКи) в виде готовой формы в D5W;

(3) 1,5 мг/кг средства РНКи к альфа-ENaC, конъюгированного с лигандом интегрина ave6 фиг. 3, в виде готовой формы в D5W; или (4) 1,5 мг/кг средства РНКи к альфа-ENaC, конъюгированного с тридентатным лигандом интегрина ave6, имеющим структуру, показанную на фиг. 11.

Средства РНКи разработали для ингибирования экспрессии гена альфа-ENaC. То же самое средство РНКи к альфа-ENaC использовали в группах 2, 3 и 4. 5' терминальный конец смысловой цепи средств РНКи модифицировали С₆ амином (-NH2), как в примере 4. Лиганды интегрина ave6 фиг. 3 синтезировали и конъюгировали со средствами РНКи к альфа-ENaC, следуя тем же методикам примера 4. При конъюгации с лигандом ave6, показанным на фиг. 11, средство РНКи к альфа-ENaC сперва функционализировали DBCO-PEG₅-сложный эфир NHS путем конъюгации с 5' амин функционализированным терминальным концом смысловой цепи, используя в качестве основы триэтиламин. Синтезировали тридентатный лиганд интегрина ave6, имеющий реакционноспособную группу PEG-азид, как показано на фиг. 10. После осаждения в системе растворителей фосфатный буферный солевой раствор/ацетонитрил тридентатный лиганд интегрина ave6 конъюгировали со средством РНКи, используя циклоприсоединение без меди.

Лечение получали по пять (5) крыс в группе. Крыс умерщвляли на 5 день исследования и после сбора и гомогенизации из обоих легких выделяли общую РНК. Представленность мРНК мишени количественно анализировали посредством количественной ПЦР на основе зонда, нормировали по экспрессии GAPDH и экспрессировали в виде фракции контрольной группы несущей среды (геометрическое среднее +/- 95% доверительный интервал).

Таблица 4

Относительная экспрессия мРНК альфа-ENaC, нормированной по контролю примера 5

Группа	Относительная экспрессия (Геометрическое среднее)	Нижний/Верхний 95% Доверительный Интервал
(1) несущая среда 5% декстроза	1,000	0,72/1,40
(2) Средство голой РНКи (без лиганда)	0,34	0,25/0,45
(3) конъюгат лиганд ανβ6 Фиг. 3-средство	0,29	0,15/0,55
(4) конъюгат [лиганд ανβ6 Фиг. 11 ((т.е. Лиганд ανβ6)з) ]-средство РНКи	0,21	0,09/0,51

Как показано в табл. 4 выше, конъюгация трех лигандов ave6 (образующих тридентатный лиганд), как показано на фиг. 11, со средством РНКи к альфа-ENaC, продемонстрировала повышенный относительный нокдаун (приблизительно 79%) по сравнению со средством РНКи, конъюгированным с од- 41 042923 ним лигандом ανβ6 (фиг. 3) (71%), и средством голой РНКи (66%) in vivo.

Пример 6. Внутритрахеальное введение средств РНКи In vivo, целенаправленно воздействующих на альфа-ENaC, конъюгированных с лигандами интегрина ave6 у крыс.

Средства РНКи к альфа-ENaC, аналогичные средствам описанным в примере 4, синтезировали следуя тем же методикам синтеза. В 1 день и 2 день исследования самцам крыс Sprague-Dawley вводили дозу 200 мкл посредством микрораспылительного устройства (Penn Century, Philadelphia, PA), которая включала следующие группы получения лекарства:

(1) несущую среду D5W;

(2) 3 мг/кг средства РНКи без лиганда (средства голой РНКи) в виде готовой формы в D5W; или (3) 3,0 мг/кг средства РНКи к альфа-ENaC, конъюгированного с лигандом интегрина αγβ6 фиг. 3 в виде готовой формы в D5W.

Средство РНКи к альфа-ENaC и лиганды интегрина av36 синтезировали и конъюгировали согласно тем же методикам, что изложены в примере 4.

Таблица 5

Относительная экспрессия мРНК альфа-ENaC, нормированной по контролю примера 6

Группа	Относительная экспрессия (Геометрическое среднее)	Нижний/Верхний 95% Доверительный Интервал
(1) несущая среда 5% декстроза	1,000	0,76/1,31
(2) Средство голой РНКи (без лиганда)	0,49	0,42/0,56
(3) конъюгат лиганд ανβ6 Фиг. 3-Средство РНКи	0,17	0,12/23

Как показано в табл. 5 выше, лиганд avp6 фиг. 3, конъюгированный со средством РНКи, демонстрировал повышенный относительный нокдаун (приблизительно 83% нокдаун), по сравнению со средством голой РНКи (приблизительно 51% нокдаун) мишени легкого in vivo.

Пример 7. Ротоглоточная аспирация In vivo средств РНКи, целенаправленно воздействующих на экспрессируемый в легком ген, конъюгированных с лигандами интегрина ave6 у крыс.

Средства РНКи к альфа-ENaC, аналогичные средствам описанным в примере 4, синтезировали следуя тем же методикам синтеза. В 1 день исследования самцам крыс Sprague-Dawley посредством ротоглоточной аспирации вводили дозу 200 мкл, которая включала следующие группы получения лекарства:

(1) изотонический солевой раствор;

(2) 0,5 мг/кг целенаправленно воздействующего на альфа-ENaC средства РНКи, конъюгированного с лигандом интегрина ave6 фиг. 3, в виде готовой формы в изотоническом солевом растворе; или (3) 0,5 мг/кг целенаправленно воздействующего на альфа-ENaC средства РНКи, конъюгированного с лигандом интегрина ave6 фиг. 5, в виде готовой формы в изотоническом солевом растворе.

Те же самые средства РНКи к альфа-ENaC использовали для групп 2 и 3. 5' терминальный конец смысловой цепи средства РНКи модифицировали С₆-амином (-NH2), как изложено в примере 4. Средство РНКи к альфа-ENaC и лиганды интегрина avp6 фиг. 3 синтезировали и конъюгировали согласно тем же методикам, что изложены в примере 4. Лиганды интегрина avP6 фиг. 5 синтезировали в виде TFP-сложного эфира, а кроме того N-конец лиганда интегрина ave6 защитили группой fmoc. Затем конъюгацию со средством РНКи выполняли таким же образом, как изложено в примере 4, с последующим снятием защиты fmoc, используя в качестве основы триэтиламин.

Лечение получали по пять (5) крыс в группе. Крыс умерщвляли на день 9 исследования и после сбора и гомогенизации из обоих легких выделяли общую РНК. Представленность мРНК мишени количественно анализировали посредством количественной ПЦР на основе зонда, нормировали по экспрессии GAPDH и экспрессировали в виде фракции контрольной группы несущей среды (геометрическое среднее +/- 95% доверительный интервал).

- 42 042923

Таблица 6

Относительная экспрессия мРНК альфа-ENaC, нормированной по контролю примера 7

Группа	Относительная экспрессия (Геометрическое среднее)	Нижний/Верхний 95% Доверительный Интервал
(1) изотонический Солевой раствор	1,000	0,85/1,17
(2) конъюгат лиганд ανβ6 Фиг. 3-Средство РНКи	0,632	0,49/0,80
(3) конъюгат лиганд ανβ6 Фиг. 5-Средство РНКи	0,592	0,50/0,70

Как показано в табл. 6 выше, оба лиганда ave6 фиг. 3 и фиг. 5, конъюгированных со средством РНКи, демонстрировали нокдаун альфа-ENaC мишени легкого in vivo.

Пример 8. Внутритрахеальное введение целенаправленно воздействующих на альфа-ENaC средств РНКи in vivo, конъюгированных с лигандами интегрина ave6 и поли-L-лизиновым каркасом у крыс.

Средства РНКи к альфа-ENaC, аналогичные описанным в примере 4 средствам, синтезировали следуя тем же методикам синтеза. В 1 день и 2 день исследования самцам крыс Sprague-Dawley посредством микрораспылительного устройства (Penn Century, Philadelphia, РА) вводили дозу 200 мкл либо (1) D5W (5% декстроза в воде); либо (2) 0,5 мг/кг средства РНКи без лиганда (средства голой РНКи) в виде готовой формы в D5W; либо (3) 1,5 мг/кг средства голой РНКи в виде готовой формы в D5W; либо (4) 5 мг/кг средства голой РНКи в виде готовой формы в D5W; либо (5) 0,5 мг/кг средства РНКи к альфа-ENaC, конъюгированного с лигандом интегрина av36 фиг. 4 посредством полu-L-лuзuнового (PLL) каркаса, в виде готовой формы в D5W; либо (6) 1,5 мг/кг средства РНКи к альфа-ENaC, конъюгированного с лигандом интегрина av36 фиг. 4 посредством PLL каркаса, в виде готовой формы в D5W; либо (7) 5 мг/кг средства РНКи к альфа-ENaC, конъюгированного с лигандом интегрина ave6 фиг. 4 посредством PLL каркаса в виде готовой формы в D5W.

Средства РНКи разработали для ингибирования экспрессии гена альфа-ENaC. То же средство РНКи к альфа-ENaC использовали в группах 2-7. Лиганд интегрина αγβ6 первоначально синтезировали в виде TFP-сложного эфира (показано на фиг. 2). PLL каркас, используемый в группах 5, 6 и 7 примера 8, приблизительно на одну сотую (100) состоял из L-лизиновых мономерных единиц (приблизительно 12 килодальтон). Поли-L-лизиновый полимер модифицировали 3 эквивалентами SMPT (4-сукцинимидилоксикарбонилальфа-метил-а(2-пиридилдитио)толуола), а 5' амин (модифицированный С₆-амин) смысловой цепи средства РНКи модифицировали SATA (N-сукцинимидил S-ацетилтиоацетатом). Далее лиганд интегрина ave6 фиг. 2 (15 эквивалентов) добавляли в виде твердого вещества и встряхивали в течение 1 ч. Затем добавляли расщепляемый протеазой функционализированный аланин-цитруллин-PEG₁₂ (10 эквивалентов; функционализированных пара-нитрофенилкарбонатом). Спустя 15 мин по каплям добавляли модифицированное SATA средство РНКи (один эквивалент), поддерживая рН 8,6. Оставшиеся лизиновые группы функционализировали расщепляемым протеазой функционализированным аланин-цитруллинPEG12. Продукт очищали фильтрованием тангенциальным потоком.

Лечение получали по пять (5) крыс в группе. Крыс умерщвляли на 5 день исследования и после сбора и гомогенизации из обоих легких выделяли общую РНК. Представленность мРНК мишени количественно анализировали посредством количественной ПЦР на основе зонда, нормировали по экспрессии GAPDH и экспрессировали в виде фракции контрольной группы несущей среды (геометрическое среднее +/- 95% доверительный интервал). Данные отражены в графике фиг. 12.

Как показано на фиг. 12, лиганд ave6 фиг. 4, конъюгированный с поли-L-лизиновым каркасом и средством РНКи, демонстрировал повышенный относительный нокдаун на всех трех уровнях дозы по сравнению со средством голой РНКи (нокдаун 68% против нокдауна 47% при дозе 0,5 мг/кг, нокдаун 78% против нокдауна 47% при дозе 1,5 мг/кг и нокдаун 86% против нокдауна 75% при дозе 5 мг/кг).

Пример 9. Избирательное поглощение меченых конъюгатов лигандов ave6 первичными эпителиальными клетками in vitro.

Первичные эпителиальные, эндотелиальные и гладкомышечные клетки легкого человека культивировали и в течение 24 ч подвергали воздействию (1) меченого Cy3 (красным) полиакрилатного полимерного каркаса без лиганда (без конъюгата лиганда); или (2) меченого Cy3 (красным) полиакрилатного полимерного каркаса, конъюгированного с лигандом интегрина αγβ6 фиг. 7 (конъюгат лиганда ave6).

- 43 042923

Клетки окрашивали FITC-фаллоидином (F-актином, зеленым) и красителем Хехест (ДНК, синим) и визуализировали посредством флуоресцентной микроскопии.

Изображения флуоресцентной микроскопии получали, используя стандартные способы, известные в данной области. Флуоресцентные изображения демонстрировали, что меченые Cy3 конъюгаты без лиганда интегрина αvβ6 не были интернализированы каким-либо типом клеток. Однако Cy3 конъюгаты с лигандом αvβ6 фиг. 7 были интернализированы первичными эпителиальными клетками легкого (как показано накоплением красного сигнала внутри эндосомальных отделов первичных эпителиальных клеток легкого на изображении), но не были интернализированы первичными эндотелиальными и гладкомышечными клетками. Это показывает, что раскрытые в настоящем описании лиганды интегрина αvβ6 допускают избирательную интернализацию эпителиальными клетками, экспрессирующими интегрин αvβ6.

Пример 10. Избирательное поглощение меченых конъюгатов лигандов ave6 эпителиальными тканями in vivo.

Мышам С57Ы/6 инъецировали внутривенную дозу 120 мкг (1) меченого Cy3 (красного) полиакрилатного полимерного каркаса без лиганда (без конъюгата лиганда); или (2) меченого Cy3 (красного) полиакрилатного полимерного каркаса, конъюгированного с лигандом интегрина avβ6 фиг. 7 (конъюгат лиганда avβ6); или (3) меченого Cy3 (красного) полиакрилатного полимерного каркаса, конъюгированного с неактивированным лигандом интегрина avβ6, имеющим структуру Ac-RGELAc-L-CitAibL (SEQ ID NO: 132) , который, как ранее описано в примере 4, используют в качестве лиганда отрицательного контроля.

Через 24 ч после инъекции мышей умерщвляли, а ткани собирали, фиксировали, обрабатывали и иссекали. Срезы тканей окрашивали FITC-фаллоидином (F-актином, зеленым) и красителем Хехест (ДНК, синим) и визуализировали посредством флуоресцентной микроскопии.

A. Бронхиолярные эпителиальные клетки легкого.

Изображения флуоресцентной микроскопии бронхиолярных эпителиальных клеток легкого у мышей примера 10 получали, используя стандартные способы. Из этих изображений меченый Cy3 конъюгаты (на изображениях показаны красными метками) с лигандом avβ6 фиг. 7 избирательно были интернализированы в эндосомальные отделы бронхиолярными эпителиальными клетками легкого in vivo, при том, что по существу не наблюдалась эпителиальная интернализация конструктами, которые не содержали лиганд или конъюгатами контрольного RGE-лиганда (т.е. на этих изображениях красного не было видно).

B. Почечные эпителиальные ткани.

Используя стандартные способы получали изображения флуоресцентной микроскопии почечных трубчатых эпителиальных тканей у мышей примера 10. Из этих изображений меченые Cy3 конъюгаты с лигандом avβ6 фиг. 7 избирательно были интернализированы в эндосомальные отделы почечными трубчатыми эпителиальными клетками in vivo (на изображениях показаны красными метками), при том что по существу не наблюдалась эпителиальная интернализация контрольными конъюгатами без лиганда.

C. Эпителиальные клетки желудочно-кишечного тракта.

Используя стандартные способы получали изображения флуоресцентной микроскопии почечных эпителиальных тканей мышей примера 10. Меченые Cy3 конъюгаты с лигандом avβ6 фиг. 7 избирательно были интернализированы в эндосомальные отделы эпителиальными клетками GI тракта in vivo как в тонком кишечнике, так и в желчном пузыре (на изображениях показаны красными метками), при том что по существу не наблюдалась эпителиальная интернализация контрольными конъюгатами без лиганда.

Другие варианты осуществления

Должно быть понятно, что, хотя изобретение было описано в сочетании с его подробным описанием, вышеизложенное описание предназначено для объяснения, а не для ограничения объема изобретения, который определяется объемом приложенной формулы изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации находятся в пределах объема следующей формулы изобретения.

Claims

1. Лиганд интегрина avβ6, содержащий

RG¹DLXaa¹Xaa²L-Xaa³Xaa⁴L-R¹ (SEQ ID NO: 96) (Формула VIII), в которой R представляет L-аргинин;

G¹ представляет L-глицин или N-метилглицин;

L представляет L-лейцин;

Хаа¹ представляет L-аланин;

Хаа² представляет L-a-аминомасляную кислоту (Abu);

Хаа³ представляет цитруллин;

- 44 042923

Хаа⁴ представляет α-аминоизомасляную кислоту (Ab);

R¹ содержит PEG и/или связывающую группу.

2. Лиганд интегрина αΎβ6 по п.1, в котором R¹ содержит полиэтиленгликоль, имеющий 2-20 единиц этиленоксида.

3. Лиганд интегрина αΎβ6 по любому из пп.1, 2, где указанный лиганд интегрина αΎβ6 содержит аминотерминальный кэп.

4. Лиганд интегрина αΎβ6 по п.3, где аминотерминальный кэп выбран из группы, состоящей из СНзСО, СН3СН2СО, СНз(СНз)₂СО, (СНз)зСНСО, СНз(СН₂)зСО, (СНз^СНСЩСО, СН₃СН2СН(СН₃)СО, (СНз)зССО, СНз(СН2)4СО, CH3SO2, CH3CH2SO2, СНз(СН₂)₂8О₂, (CH3TCHSO2, СНз(СЩ^О2, (CH₃)₂CHCH₂SO₂, CH₃CH₂CH(CH₃)SO₂, (CH₃)₃CSO₂, PhCO, PhSO₂, алкильной группы, имеющей 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 атомов углерода, метила, этила, пропила, бутила, пентила, NH2NH, PEG, гуанидинила, СН3ОСН2СН2ОСН2СН2СО, СНзОЩЩСЩО^СЩСЩСО, СНзО(СН2СН2О)зСН2СН2СО,

СНзОЩЩСЩО^СЩСЩСО, СНзОЩЩСЩОТСЩСЩСО, СН3ОСН2СН2ОСН2СО,

СНзОЩЩСЩОЬСЩСО, СНзО(СН2СН2О)зСН2СО, СНзО(СН2СН2О)4СН2СО, СНзОЩЩСЩОТСЩСО, СН3ОСН2СН2ОСО, СНзО(СН2СН2О)2СО, СНзО(СН2СН2О)зСО, СНзО(СН2СН2О)4СО, СНзО(СН2СН2О)₅СО, НОСН2СН2ОСН2СН2СО, НО(СН2СН2О)2СН2СН2СО, НО(СН2СН2О)зСН2СН2СО, НО(СН2СН2О)4СН2СН2СО, НО(СН2СН2О)5СН2СН2СО, НОСН2СН2ОСН2СО, НО(СН2СН2О)2СН2СО, НО(СН2СН2О)зСН2СО, НО(СН2СН2О)4СН2СО, НО(СН2СН2О)5СН2СО, НОСН2СН2ОСО, НО(СН2СН2О)2СО, НО(СН2СН2О)зСО, НО(СН2СН2О)4СО, НО(СН2СН2О)5СО, СН3СН2ОСН2СН2ОСН2СН2СО, СНзСН2О(СН2СН2О)2СН2СН2СО, СНзСН2О(СН2СН2О)зСН2СН2СО, СНзСЩОЩЩСЩО^СЩСЩСО, СНзСЩОЩЩСЩО^СЩСЩСО, СН3СН2ОСН2СН2ОСН2СО,

СНзСЩОЩЩСЩО^СЩСО, СНзСН2О(СН2СН2О)зСН2СО, СНзСЩОЩЩСЩО^СЩСО,

СНзСЩОЩЩСЩО^СЩСО, СН3СН2ОСН2СН2ОСО, СНзСН2О(СН2СН2О)2СО, СНзСН2О(СН2СН2О)зСО, СНзСН2О(СН2СН2О)4СО, СНзСЩОЩЩСЩО^СО, CH3OCH2CH2CO, HOCH2CH2CO или CH3CH2OCH2CH2CO.

5. Лиганд интегрина ave6 по п.4, где аминотерминальный кэп представляет собой СН_зСО.

6. Лиганд интегрина ave6 по п.1, где указанный лиганд интегрина ave6 содержит последовательность sequence SEQ ID NO: 4 (Ac-RGDLAAbuLCitAibL).

7. Лиганд интегрина αΎβ6 по любому из пп.1-6, где указанный лиганд интегрина αΎβ6 дополнительно конъюгирован с карго-молекулой.

8. Лиганд интегрина αΎβ6 по любому из пп.1-7, где указанный лиганд интегрина αΎβ6 конъюгирован с карго-молекулой, которая содержит малую молекулу, антитело, фрагмент антитела, иммуноглобулин, моноклональное антитело, метку или маркер, липид, натуральную или модифицированную нуклеиновую кислоту или полинуклеотид, пептид, аптамер, полимер, полиамин, белок, токсин, витамин, полиэтиленгликоль, гаптен, дигоксигенин, биотин, радиоактивный атом или молекулу либо флуорофор.

9. Лиганд интегрина αΎβ6 по любому из пп.1-8, где указанный лиганд интегрина αΎβ6 конъюгирован с карго-молекулой, которая содержит олигомерное соединение.

10. Лиганд интегрина αΎβ6 по п.9, где указанное олигомерное соединение представляет собой средство РНКи.

11. Фармацевтическая композиция для доставки карго-молекулы, содержащая лиганд интегрина ave6 по любому из пп.7-10 и фармацевтически приемлемое вспомогательное средство.

12. Способ доставки одной или более карго-молекул в клетку in vivo, где указанный способ включает введение субъекту лиганда, имеющего аффинность к интегрину αΎβ6, конъюгированного с одной или более карго-молекулой, где указанный лиганд интегрина αΎβ6 представляет собой лиганд интегрина ave6 по любому из пп.1-10.

13. Способ по п.12, в котором клетку выбирают из группы, состоящей из альвеолярной эпителиальной клетки I и II типа, бокаловидной клетки, секреторной эпителиальной клетки, ресничной эпителиальной клетки, эпителиальной клетки роговицы и конъюнктивы, эпителиальной клетки кожи, холангиоцита, энтероцита, эпителиальной клетки протоков, железистой эпителиальной клетки, почечного канальца и эпителиальных опухолей (карцином).

14. Способ по п.12 или 13, в котором одна или более карго-молекул содержат олигомерное соединение.

15. Способ по п.14, в котором указанное олигомерное соединение представляет собой средство РНКи.

16. Способ ингибирования экспрессии целевого гена в клетке in vivo, где указанный способ включает введение субъекту олигомерного соединения, конъюгированного с лигандом интегрина αΎβ6 по любому из пп.1-10.

17. Способ по п.16, в котором клетку выбирают из группы, состоящей из альвеолярной эпителиальной клетки I и II типа, бокаловидной клетки, секреторной эпителиальной клетки, ресничной эпителиальной клетки, эпителиальной клетки роговицы и конъюнктивы, эпителиальной клетки кожи, холангиоцита, энтероцита, эпителиальной клетки протоков, железистой эпителиальной клетки, почечного канальца и

- 45 042923 эпителиальных опухолей (карцином).

18. Способ по п.16 или 17, в котором указанное олигомерное соединение представляет собой средство РНКи.