EA042707B1 - ANTIBODY TO PD1, METHODS OF ITS PRODUCTION AND APPLICATION FOR THE TREATMENT OF MALIGNANT NEOPLASMS - Google Patents

Description

Область техники, к которой относится изобретениеThe field of technology to which the invention belongs

Настоящее изобретение относится к новым молекулам антител к PD1 и к LAG3. Изобретение относится также к нуклеиновым кислотам, кодирующим такие молекулы антител; к способам приготовления таких молекул антител; к клеткам-хозяевам, экспрессирующим или способным экспрессировать такие молекулы антител; к композициям, содержащим такие молекулы антител; и к применениям таких молекул антител или таких композиций, в особенности, для терапевтических целей в области злокачественных заболеваний.The present invention relates to novel anti-PD1 and anti-LAG3 antibody molecules. The invention also relates to nucleic acids encoding such antibody molecules; to methods for preparing such antibody molecules; host cells expressing or capable of expressing such antibody molecules; to compositions containing such antibody molecules; and to the uses of such antibody molecules or such compositions, especially for therapeutic purposes in the field of cancer.

Предпосылки создания изобретенияPrerequisites for the creation of the invention

Злокачественное новообразование представляет собой заболевание, которое характеризуется аномально локализованным клеточным ростом с потенциалом распространения в организме. В экономически развитых странах он является второй наиболее распространенной причиной смертности. Наиболее распространенными типами злокачественных новообразований у мужчин являются рак легких, рак предстательной железы, рак ободочной и прямой кишки, и рак желудка, и у женщин, наиболее распространенными типами являются рак молочной железы, рак ободочной и прямой кишки, рак легких, и рак шейки матки. Несмотря на то, что шансы на выживание зависят главным образом от типа злокачественного новообразования и стадии на момент идентификации, для рака легких суммарный 10-ти летний коэффициент выживаемости составляет около 5%.A malignant neoplasm is a disease characterized by abnormally localized cell growth with the potential to spread throughout the body. In economically developed countries, it is the second most common cause of death. The most common types of cancers in men are lung cancer, prostate cancer, colon cancer, and stomach cancer, and in women, the most common types are breast cancer, colon cancer, lung cancer, and cervical cancer. . Although the chances of survival depend mainly on the type of cancer and stage at the time of identification, for lung cancer the overall 10-year survival rate is about 5%.

Ранее, наиболее частыми методами лечения опухолевых злокачественных новообразований (объединенных термином онкология) являлись непосредственная хирургия, лучевая терапия или применение химиотерапевтических лекарственных средств. Тем не менее, за несколько последних лет, иммунотерапия злокачественных новообразований часто зарекомендовала себя как более перспективная в качестве метода терапии для онкологии.Previously, the most common treatments for neoplastic malignancies (collectively termed oncology) were direct surgery, radiation therapy, or the use of chemotherapy drugs. However, over the past few years, cancer immunotherapy has often proven to be more promising as a therapeutic option for oncology.

Иммунотерапия злокачественных новообразований является направлением в онкологии, в котором иммунную систему используют для лечения злокачественного новообразования, что кардинально отличается от существующих общепринятых методов лечения, при которых опухоль непосредственно иссекают или лечат. Эта терапевтическая концепция основана на идентификации различных белков на поверхности Т-клеток, которые действуют путем ингибирования иммунной функции этих клеток. К таким белкам относятся PD1.Cancer immunotherapy is a branch of oncology in which the immune system is used to treat a malignant neoplasm, which is fundamentally different from existing conventional therapies in which the tumor is directly excised or treated. This therapeutic concept is based on the identification of various proteins on the surface of T cells that act by inhibiting the immune function of these cells. These proteins include PD1.

PD1 (Запрограммированная гибель клеток 1) представляет собой белок рецептора клеточной поверхности, экспрессируемого на Т-клетках. Этот белок функционирует в качестве ингибитора контрольной точки иммунного ответа, т.е. он действует путем модуляции активности клеток в иммунной системе таким образом, чтобы регулировать и ограничивать аутоиммунные заболевания. В последнее время было установлено, что многие злокачественные новообразования могут защищать себя от иммунной системы путем модификации ингибиторов контрольной точки иммунного ответа и таким образом избегать обнаружения.PD1 (Programmed Cell Death 1) is a cell surface receptor protein expressed on T cells. This protein functions as a checkpoint inhibitor of the immune response, ie. it works by modulating the activity of cells in the immune system in a way that regulates and limits autoimmune diseases. Recently, it has been found that many cancers can protect themselves from the immune system by modifying immune checkpoint inhibitors and thus evade detection.

По отношению к PD1, этот белок имеет два лиганда, PD-L1 и PD-L2, которые взаимодействуют с рецептором клеточной поверхности. При связывании, PD-1 индуцирует внутриклеточный сигнал, который отрицательно регулирует Т-клеточный ответ.In relation to PD1, this protein has two ligands, PD-L1 and PD-L2, which interact with the cell surface receptor. Upon binding, PD-1 induces an intracellular signal that negatively regulates the T cell response.

Как подробно обсуждалось выше, PD1 является ключевым регулятором активности Т-клеток. Недавно было показано в различных злокачественных параметрах, что молекулы антагонистических антител к PD-1 ниволумаб и пембролизумаб могут использоваться для стимуляции иммунной системы, и, следовательно, лечения злокачественного новообразования.As discussed in detail above, PD1 is a key regulator of T cell activity. It has recently been shown in various malignant settings that the anti-PD-1 antagonist antibody molecules nivolumab and pembrolizumab can be used to stimulate the immune system, and hence the treatment of malignancy.

Ген, активирующий лимфоциты-3 (LAG3; CD223), представляет собой трансмембранный белок I типа, экспрессируемый главным образом на клеточной поверхности активированных Т-клеток, но также он был обнаружен на поднаборах NK и дендритных клеток LAG3 тесно связан с CD4, который является ко-рецептором для активации Т-хелперных клеток. Обе молекулы имеют четыре внеклеточных Igподобных домена и для их функциональной активности, должны связываться с их лигандом, из класса II главного комплекса гистосовместимости (МНС). При связывании с МНС-II, LAG3 индуцирует внутриклеточный сигнал, который отрицательно регулирует Т-клеточную ответную реакцию. В недавних исследованиях было показано, что LAG3 и PD1 совместно экпрессируются в лимфоцитах, инфильтрующих опухоли (TIL), что свидетельствует о том, что они могут способствовать опосредуемой опухолью иммунной супрессии. Полагают, что хроническое воздействие антигенов приводит к прогрессирующей инактивации Т-клеток посредством процесса, обозначаемого термином истощение. Истощенные Тклетки часто совместно экспрессируют отрицательные регуляторные рецепторы, такие как PD1 и LAG3.The lymphocyte activating gene-3 (LAG3; CD223) is a type I transmembrane protein expressed primarily on the cell surface of activated T cells, but it has also been found on subsets of NK and LAG3 dendritic cells and is closely associated with CD4, which is -receptor for the activation of T-helper cells. Both molecules have four extracellular Ig-like domains and, for their functional activity, must bind to their class II ligand, the major histocompatibility complex (MHC). When bound to MHC-II, LAG3 induces an intracellular signal that negatively regulates the T cell response. Recent studies have shown that LAG3 and PD1 are co-expressed in tumor infiltrating lymphocytes (TIL), suggesting that they may contribute to tumor-mediated immune suppression. I believe that chronic exposure to antigens leads to progressive inactivation of T cells through a process referred to as depletion. Depleted T cells often co-express negative regulatory receptors such as PD1 and LAG3.

Несмотря на обнадеживающие клинические результаты для антагонистических к PD1 моноклональных антител ниволумаба и пембролизумаба, вплоть до 70% леченных пациентов не отвечают на лечение. Данные доклинических исследований на основании Т-клеток, полученных от пациентов, а также на моделях сингенных опухолей у мышей было показано, что Т-клетки, имеющие происхождение из опухолей, часто экспрессируют другие ингибиторные рецепторы, дополнительно к PD1. При комбинированной нейтрализации PD1 и LAG3, используя антагонистические моноклональные молекулы антител, повышается реактивация Т-клеток и улучшается отторжение опухоли по сравнению с PD1 нейтрализацией отдельно, на моделях in vitro и in vivo. На основании этих результатов, полагают, что нейтрализация LAG3 будет усиливать эффективности антагонистических PD1 mAb.Despite encouraging clinical results for the PD1-antagonistic monoclonal antibodies nivolumab and pembrolizumab, up to 70% of treated patients fail to respond to treatment. Preclinical data from patient-derived T cells as well as mouse syngeneic tumor models have shown that tumor-derived T cells often express other inhibitory receptors in addition to PD1. Combined neutralization of PD1 and LAG3 using antagonistic monoclonal antibody molecules increases T cell reactivation and improves tumor rejection compared to PD1 neutralization alone, in in vitro and in vivo models. Based on these results, it is believed that LAG3 neutralization will enhance the efficacy of PD1 antagonist mAbs.

- 1 042707- 1 042707

Тем не менее, для представленных молекул антител к PD1 существуют проблемы, связанные с неспособностью большей части пациентов отвечать на лечение. Следовательно, существует потрубность идентификации более эффективных PD1 антагонистических моноклональных антител с контролируемыми профилями побочных эффектов по сравнению с известными из уровня техники существующими лекарственными средствами на основании антител, при использовании отдельно или в комбинации с другими терапевтическими молекулами, в особенности, дополнительными антагонистическими молекулами к дальнейшим ингибиторам контрольных точек Т-клеток.However, there are problems with the presented anti-PD1 antibody molecules due to the inability of the majority of patients to respond to treatment. Therefore, there is a need to identify more effective PD1 antagonistic monoclonal antibodies with controlled side effect profiles compared to existing antibody-based drugs known in the art, when used alone or in combination with other therapeutic molecules, especially additional antagonistic molecules to further inhibitors. T-cell checkpoints.

На основании этих предпосылок, изобретатели предполагают создать дальнейшие антитела к PD1 и к LAG3, имеющие улучшенный терапевтический профиль по сравнению с известными молекулами.Based on these premises, the inventors contemplate creating further anti-PD1 and anti-LAG3 antibodies having an improved therapeutic profile compared to known molecules.

Краткое изложение сущности изобретенияBrief summary of the invention

В соответствии с первым аспектом, обеспечиваются молекулы антител к PD1. Как описано далее в настоящей заявке, молекулы антител к PD1 в соответствии с настоящим изобретением имеют неожиданные и благоприятные свойства по сравнению с другими антителами к PD1. В особенности, они проявляют улучшенную активацию Т-клеток и более длительный конечный период полувыведения по сравнению с эталонными молекулами антител к PD1. Следует иметь в виду, что такие свойства являются желательными для молекул антител к PD1 для применения для лечения злокачественных новообразований.According to a first aspect, anti-PD1 antibody molecules are provided. As described hereinafter, the anti-PD1 antibody molecules of the present invention have unexpected and advantageous properties over other anti-PD1 antibodies. In particular, they exhibit improved T cell activation and a longer terminal half-life compared to reference anti-PD1 antibody molecules. It should be appreciated that such properties are desirable for anti-PD1 antibody molecules for use in the treatment of cancer.

Также обеспечиваются молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие молекулы антител к PD1, экспрессионные векторы, клетки-хозяева и способы получения молекул антител к PD1 согласно изобретению. Также обеспечиваются фармацевтические композиции, содержащие молекулы антител к PD1 согласно изобретению. Молекулы антител к PD-1, описанные в настоящей заявке, можно использовать для лечения злокачественных нарушений, включая солидные опухоли и опухоли мягких тканей.Also provided are nucleic acid molecules encoding anti-PD1 antibody molecules, expression vectors, host cells, and methods for producing anti-PD1 antibody molecules of the invention. Also provided are pharmaceutical compositions containing anti-PD1 antibody molecules of the invention. The anti-PD-1 antibody molecules described herein can be used to treat malignant disorders including solid tumors and soft tissue tumors.

Более специфически, молекула антитела к PD1 согласно изобретению включает: (a) CDR тяжелой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 (hcCDR1), SEQ ID NO: 2 (hcCDR2) и SEQ ID NO: 3 (hcCDR3) и которая имеет CDR легкой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4 (lcCDR1), SEQ ID NO: 5 (lcCDR2) и SEQ ID NO: 6 (lcCDR3); или б) CDR тяжелой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7 (hcCDR1), SEQ ID NO: 8 (hcCDR2) и SEQ ID NO: 9 (hcCDR3) и которая имеет CDR легкой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10 (lcCDR1), SEQ ID NO: 11 (lcCDR2) и SEQ ID NO: 12 (lcCDR3); или (в) CDR тяжелой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13 (hcCDR1), SEQ ID NO: 14 (hcCDR2) и SEQ ID NO: 15 (hcCDR3) и которая имеет CDR легкой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16 (lcCDR1), SEQ ID NO: 17 (lcCDR2) и SEQ ID NO: 18 (lcCDR3).More specifically, an anti-PD1 antibody molecule of the invention comprises: (a) heavy chain CDRs comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (hcCDR1), SEQ ID NO: 2 (hcCDR2), and SEQ ID NO: 3 (hcCDR3) and which has a light chain CDR containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 (lcCDR1), SEQ ID NO: 5 (lcCDR2) and SEQ ID NO: 6 (lcCDR3); or b) a heavy chain CDR containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 (hcCDR1), SEQ ID NO: 8 (hcCDR2) and SEQ ID NO: 9 (hcCDR3) and which has a light chain CDR containing the amino acid sequence, shown in SEQ ID NO: 10 (lcCDR1), SEQ ID NO: 11 (lcCDR2) and SEQ ID NO: 12 (lcCDR3); or (c) a heavy chain CDR comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 (hcCDR1), SEQ ID NO: 14 (hcCDR2) and SEQ ID NO: 15 (hcCDR3) and which has a light chain CDR containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 (lcCDR1), SEQ ID NO: 17 (lcCDR2) and SEQ ID NO: 18 (lcCDR3).

В соответствии с дальнейшим аспектом осуществления изобретения, также обеспечиваются молекулы антител к LAG3. Как описано далее в настоящей заявке, молекулы антител к LAG3 в соответствии с настоящим изобретением имеют неожиданные и благоприятные свойства по сравнению с другими молекулами антител к LAG3. В особенности, они проявляют улучшенную активацию Т-клеток при использовании в комбинации с молекулами антител к PD1 в соответствии с настоящим изобретением по сравнению с эталонными молекулами антител к PD1 и молекулами антител к LAG3. Следует иметь в виду, что такие свойства являются желательными для молекул антител к LAG3 для применения для лечения злокачественных новообразований.According to a further aspect of the invention, anti-LAG3 antibody molecules are also provided. As described hereinafter, the anti-LAG3 antibody molecules of the present invention have unexpected and advantageous properties over other anti-LAG3 antibody molecules. In particular, they show improved T cell activation when used in combination with anti-PD1 antibody molecules of the present invention compared to reference anti-PD1 antibody molecules and anti-LAG3 antibody molecules. It should be appreciated that such properties are desirable for anti-LAG3 antibody molecules for use in the treatment of cancer.

Также обеспечиваются молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие молекулы антител, экспрессионные векторы, клетки-хозяева и способы получения молекул антител к LAG3. Также обеспечиваются фармацевтические композиции, содержащие молекулы антител к LAG3 согласно изобретению. Молекулы антител к LAG3, описанные в настоящей заявке, можно использовать для лечения злокачественных нарушений, включая солидные опухоли и опухоли мягких тканей.Also provided are nucleic acid molecules encoding antibody molecules, expression vectors, host cells, and methods for producing anti-LAG3 antibody molecules. Also provided are pharmaceutical compositions containing anti-LAG3 antibody molecules of the invention. The anti-LAG3 antibody molecules described herein can be used to treat malignant disorders including solid tumors and soft tissue tumors.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, молекула антитела к LAG3 согласно изобретению связывает эпитоп LAG3 человека, содержащий аминокислотную последовательность LLRRAGVT (SEQ ID NO: 111) и/или YRAAVHLRDRA (SEQ ID NO: 112). Способы определения эпитопа, с которым связывается антитело, представлены в настоящей заявке.According to a preferred embodiment, the LAG3 antibody molecule of the invention binds a human LAG3 epitope comprising the amino acid sequence LLRRAGVT (SEQ ID NO: 111) and/or YRAAVHLRDRA (SEQ ID NO: 112). Methods for determining the epitope to which the antibody binds are presented in this application.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, молекула антитела к LAG3 согласно изобретению включает (a) CDR тяжелой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 39 (hcCDR1), SEQ ID NO: 40 (hcCDR2) и SEQ ID NO: 41 (hcCDR3) и которая имеет CDR легкой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 42 (lcCDR1), SEQ ID NO: 43 (lcCDR2) и SEQ ID NO: 44 (lcCDR3); или (б) CDR тяжелой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 45 (hcCDR1), SEQ ID NO: 46 (hcCDR2) и SEQ ID NO: 47 (hcCDR3) и которая имеет CDR легкой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 48 (lcCDR1), SEQ ID NO: 49 (lcCDR2) и SEQ ID NO: 50 (lcCDR3).According to a preferred embodiment, an anti-LAG3 antibody molecule of the invention comprises (a) heavy chain CDRs comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 39 (hcCDR1), SEQ ID NO: 40 (hcCDR2) and SEQ ID NO: 41 (hcCDR3) and which has a light chain CDR containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 42 (lcCDR1), SEQ ID NO: 43 (lcCDR2) and SEQ ID NO: 44 (lcCDR3); or (b) a heavy chain CDR containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 45 (hcCDR1), SEQ ID NO: 46 (hcCDR2) and SEQ ID NO: 47 (hcCDR3) and which has a light chain CDR containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 48 (lcCDR1), SEQ ID NO: 49 (lcCDR2) and SEQ ID NO: 50 (lcCDR3).

В соответствии с дальнейшим аспектом осуществления изобретения, также обеспечиваются способы лечения злокачественных новообразований, в которых молекулы антител к PD1 согласно изобретению могут использоваться в комбинации с молекулами антител к LAG3 согласно изобретению. ВарианAccording to a further aspect of the invention, methods of treating cancer are also provided, in which the anti-PD1 antibody molecules of the invention can be used in combination with the anti-LAG3 antibody molecules of the invention. Varian

- 2 042707 ты осуществления этих аспектов изобретения включают, когда антитело к LAG3 вводят одновременно, конкурентно, последовательно, один за другим, альтернативно или раздельно, с молекулами антител к PD1. Дальнейшие варианты осуществления этих аспектов изобретения включают, когда молекулы антител к PD1 вводят одновременно, конкурентно, последовательно, один за другим, альтернативно или раздельно, с молекулами антител к LAG3. Дальнейшие варианты осуществления этих аспектов изобретения включают, когда указанные применения молекул антител согласно изобретению можно комбинировать с другими лекарственными средствами.- 2 042707 These aspects of the invention include when the anti-LAG3 antibody is administered simultaneously, competitively, sequentially, one after the other, alternatively or separately, with the anti-PD1 antibody molecules. Further embodiments of these aspects of the invention include when the anti-PD1 antibody molecules are administered simultaneously, competitively, sequentially, one after the other, alternatively or separately, with the anti-LAG3 antibody molecules. Further embodiments of these aspects of the invention include when said uses of the antibody molecules of the invention can be combined with other drugs.

Дальнейшие аспекты, варианты осуществления, применения и способы, задействующие молекулы антител согласно изобретению, будут становиться понятными на основании последующего подробного описания изобретения и из пунктов приложенной формулы изобретения.Further aspects, embodiments, uses, and methods employing the antibody molecules of the invention will become apparent from the following detailed description of the invention and from the claims of the appended claims.

Изобретение обеспечивает новые молекулы антител, которые предоставляют возможность более эффективного лечения некоторых типов злокачественных новообразований, таких как рак легких, в особенности NSCLC.The invention provides novel antibody molecules that enable more effective treatment of certain types of cancer such as lung cancer, especially NSCLC.

Условные обозначения на фигурахSymbols on the figures

Фиг. 1. Аминокислотные последовательности вариабельного домена молекул антител к PD1. 77Е11 является названием мышиного предшественника антитела. PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 и PD1-5 представляют собой антитела к PD1, как определено в настоящей заявке. CDR последовательности подчеркнуты. VK 77E11 (SEQ ID NO: 113); VK PD1-1 (SEQ ID NO: 20); VK PD1-2; (SEQ ID NO: 22); VK PD1-3 (SEQ ID NO: 24); VK PD1-4, (SEQ ID NO: 26); VK PD1-5 (SEQ ID NO: 28); VH 77E11 (SEQ ID NO: 114); VH PD1-1 (SEQ ID NO: 19); VH PD1-2; (SEQ ID NO: 21); VH PD1-3 (SEQ ID NO: 23); VH PD1-4, (SEQ ID NO: 25); VH PD1-5 (SEQ ID NO: 27).Fig. 1. Amino acid sequences of the variable domain of anti-PD1 antibodies. 77E11 is the name of the mouse antibody precursor. PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 and PD1-5 are anti-PD1 antibodies as defined herein. CDR sequences are underlined. VK 77E11 (SEQ ID NO: 113); VK PD1-1 (SEQ ID NO: 20); VK PD1-2; (SEQ ID NO: 22); VK PD1-3 (SEQ ID NO: 24); VK PD1-4, (SEQ ID NO: 26); VK PD1-5 (SEQ ID NO: 28); VH 77E11 (SEQ ID NO: 114); VH PD1-1 (SEQ ID NO: 19); VH PD1-2; (SEQ ID NO: 21); VH PD1-3 (SEQ ID NO: 23); VH PD1-4, (SEQ ID NO: 25); VH PD1-5 (SEQ ID NO: 27).

Фиг. 2. Ингибирование связывания PD1-L1/L2 человека с PD1 с помощью молекул антител к PD1. (А) Представленные антитела к PD1 согласно изобретению индуцируют блокаду связывания PD-L1 с PD1 человека, экспрессируемым на поверхности СНО клеток. (В) Представленные антитела к PD1 согласно изобретению индуцируют блокаду связывания PD-L2 с PD-1 человека, экспрессируемым на поверхности СНО клеток.Fig. 2. Inhibition of human PD1-L1/L2 binding to PD1 by anti-PD1 antibody molecules. (A) The present anti-PD1 antibodies of the invention induce blockade of PD-L1 binding to human PD1 expressed on the surface of CHO cells. (B) The present anti-PD1 antibodies of the invention induce blockade of PD-L2 binding to human PD-1 expressed on the surface of CHO cells.

Фиг. 3. Стимуляция антиген-специфического Т-клеточного ответа с помощью молекул антител к PD1. Показана способность антител к PD1 согласно изобретению стимулировать продукцию интерферон-гамма (ИФН-гамма) специфическими к столбняку CD4 Т-клетками памяти от четырех индивидуальных доноров. Для этого исследования, Т-клетки имеющие происхождение из РВМС здоровых доноров выращивали в присутствии столбнячного анатоксина и совместно культивировали с аутологическими зрелыми дендритными клетками (DC), загруженными с помощью столбнячного анатоксина в течение 2 дней. Стадию совместного культивирования повторяли второй раз сходным образом в присутствии PD11 и PD1-3. После окончания второй стадии совместного культивирования супернатанты анализировали для определения уровней ИФН-гамма с помощью ELISA.Fig. 3. Stimulation of an antigen-specific T-cell response using anti-PD1 antibody molecules. The ability of antibodies to PD1 according to the invention to stimulate the production of interferon-gamma (IFN-gamma) by tetanus-specific CD4 memory T-cells from four individual donors was shown. For this study, PBMC derived T cells from healthy donors were grown in the presence of tetanus toxoid and co-cultured with autologous mature dendritic cells (DC) loaded with tetanus toxoid for 2 days. The co-culture step was repeated a second time in a similar manner in the presence of PD11 and PD1-3. After the end of the second stage of co-cultivation, the supernatants were analyzed to determine the levels of IFN-gamma using ELISA.

Фиг. 4. Эффективность in vivo молекул антител к PD1 на hPD-1 модели нокин у мышей. Представлены индивидуальные кривые роста опухолей у мышей, несущих клеточную линию карциномы толстой кишки (МС38). Мышей лечили с помощью (A) PBS q3or4d, (В) Изотип q3or4d, (С) PD1-3 q3or4d или (D) PD1-3 в виде однократной дозы. PD1-3 и Изотип дозировали в количестве 10 мг/кг.Fig. 4. In vivo efficacy of anti-PD1 antibody molecules in the hPD-1 knockin model in mice. Shown are individual tumor growth curves in mice harboring the colon carcinoma (MC38) cell line. Mice were treated with (A) PBS q3or4d, (B) Isotype q3or4d, (C) PD1-3 q3or4d, or (D) PD1-3 as a single dose. PD1-3 and Isotype were dosed at 10 mg/kg.

Фиг. 5. Доклинические фармакокинетики молекул антител к PD1. Доклинические параметры PD1 антител при внутривенном дозировании, представленные графически по отношению к дозам, вводимым яванским макакам. (А) Площадь под кривой (AUC), (В) максимальная концентрация в плазме (c_max), (С), клиренс из плазмы (CL), (D) период полувыведения в конечной фазе (t_1/2,_z).Fig. 5. Preclinical pharmacokinetics of anti-PD1 antibody molecules. Preclinical parameters of PD1 antibodies at intravenous dosing, plotted against doses administered to cynomolgus monkeys. (A) Area under the curve (AUC), (B) maximum plasma concentration (c _max ), (C), plasma clearance (CL), (D) terminal phase half-life (t _1/2 , _z ).

Фиг. 6. Аминокислотные последовательности вариабельного домена молекул антител к LAG3. 496G6 является названием мышиного предшественника антитела. LAG3-1, LAG3-2, LAG3-3, LAG3-4 и LAG3-5 представляют собой антитела к LAG3, как определено в настоящей заявке. VK 496G6 (SEQ ID NO: 117); VK LAG3-1 (SEQ ID NO: 52); VK LAG3-2; (SEQ ID NO: 54); VK LAG3-3 (SEQ ID NO: 56); VK LAG3-4, (SEQ ID NO: 58); VK LAG3-5 (SEQ ID NO: 60); VH 496G6 (SEQ ID NO: 118); VH LAG3 -1 (SEQ ID NO: 51); VH LAG3-2; (SEQ ID NO: 53); VH LAG3-3 (SEQ ID NO: 55); VH LAG3-4, (SEQ ID NO: 57); VH LAG3-5 (SEQ ID NO: 59).Fig. 6. Amino acid sequences of the variable domain of anti-LAG3 antibody molecules. 496G6 is the name of the mouse antibody precursor. LAG3-1, LAG3-2, LAG3-3, LAG3-4 and LAG3-5 are anti-LAG3 antibodies as defined herein. VK 496G6 (SEQ ID NO: 117); VK LAG3-1 (SEQ ID NO: 52); VK LAG3-2; (SEQ ID NO: 54); VK LAG3-3 (SEQ ID NO: 56); VK LAG3-4, (SEQ ID NO: 58); VK LAG3-5 (SEQ ID NO: 60); VH 496G6 (SEQ ID NO: 118); VH LAG3 -1 (SEQ ID NO: 51); VH LAG3-2; (SEQ ID NO: 53); VH LAG3-3 (SEQ ID NO: 55); VH LAG3-4, (SEQ ID NO: 57); VH LAG3-5 (SEQ ID NO: 59).

Фиг. 7. Ингибирование связывания LAG3 человека с MHCII с помощью молекул антител к LAG3. Представлена специфическая активность указанных LAG3 mAb и контрольных mAb блокировать связывание рекомбинантного LAG3 с MHCII, экспрессируемого на поверхности Raji клеток.Fig. 7. Inhibition of human LAG3 binding to MHCII by anti-LAG3 antibody molecules. The specific activity of these LAG3 mAbs and control mAbs is shown to block the binding of recombinant LAG3 to MHCII expressed on the surface of Raji cells.

Фиг. 8. Стимуляция антиген-специфического Т-клеточного ответа с помощью молекул антител к PD1 и к LAG3. (А) Представлен % кратности повышения PD1/LAG3 mAb комбинаций относительно насыщающих количеств пембролизумаба (Keytruda(R)). Фиксированные 100 нМ концентрации PD1-3 и ниволумаба (Opdivo(R)) комбинировали с возрастающим количеством LAG3 mAb (LAG3-1 представлено в виде черной линии или сравнительная молекула антитела, имеющая такую же аминокислотную последовательность, как и BMS-986016, представлена в виде пунктирной линии, антагонистическое LAG3 антитело). (В) Представлен % кратности повышения комбинаций PD1/LAG3 mAb молекул согласно изобретению по сравнению с активностью пембролизумаба (Keytruda(R)). Уровень активности комбинации mAb оценивали при 100 нМ для PD1 и 200 нМ для LAG3 mAb. Статистическое тестирование осуществ- 3 042707 ляли с использованием Graph Pad Prism путем однофакторного дисперсионного анализа с последующим ретроспективным анализом с критерием Тьюки.Fig. 8. Stimulation of an antigen-specific T-cell response using anti-PD1 and anti-LAG3 antibody molecules. (A) Shows % fold increase in PD1/LAG3 mAb combinations relative to saturating amounts of pembrolizumab (Keytruda(R)). Fixed 100 nM concentrations of PD1-3 and nivolumab (Opdivo(R)) were combined with increasing amounts of LAG3 mAb (LAG3-1 is shown as a black line or a reference antibody molecule having the same amino acid sequence as BMS-986016 is shown as dotted line, LAG3 antagonistic antibody). (B) Shows the % fold increase of PD1/LAG3 mAb combinations of the molecules of the invention compared to pembrolizumab activity (Keytruda(R)). The activity level of the mAb combination was assessed at 100 nM for PD1 and 200 nM for LAG3 mAb. Statistical testing was performed using Graph Pad Prism by one-way analysis of variance followed by retrospective analysis with Tukey's test.

Фиг. 9. Эффективность in vivo комбинированной терапии с использованием PD1 и LAG3 антител на моделях сингенной опухоли. Представлены индивидуальные кривые роста опухолей у мышей, которые лечили с помощью наборов антител два раза в неделю в дозе 10 мг/кг. (А) Мышей, несущих карциному толстой кишки (МС38), лечили с помощью PBS, анти-LAG3, анти-PD1 или комбинации анти-PD1 и анtu-LAG3. Мышей, несущих меланому (B16-F10) (В), карциному легких (LL/2) (С), карциному толстой кишки (Ободочная кишка-26) (D) или рак молочной железы (4Т1) (Е) опухоль, лечили с помощью PD1 Изотипа, анти-PD1 или комбинации анти-PD1 и анти-LAG3.Fig. 9. In vivo efficacy of combination therapy using PD1 and LAG3 antibodies in syngeneic tumor models. Shown are individual growth curves of tumors in mice treated with antibody kits twice a week at a dose of 10 mg/kg. (A) Mice bearing colon carcinoma (MC38) were treated with PBS, anti-LAG3, anti-PD1, or a combination of anti-PD1 and antu-LAG3. Mice carrying melanoma (B16-F10) (B), lung carcinoma (LL/2) (C), colon carcinoma (Colon-26) (D) or breast cancer (4T1) (E) tumor were treated with using a PD1 isotype, anti-PD1, or a combination of anti-PD1 and anti-LAG3.

Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention

Определения.Definitions.

Описанные выше и другие аспекты и варианты осуществления изобретения будут понятным на основании дальнейшего описания, представленного в настоящей заявке.The above and other aspects and embodiments of the invention will be clear on the basis of the further description presented in this application.

Если не указано или определено иное, то все применяемые понятия употребляются в их обычном значении, принятом в данной области, которое очевидно специалистам в данной области. В качестве ссылки можно указать, например, стандартные руководства, такие как Sambrook и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2-е изд.), тома 1-3, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, Genes IV, изд-во Oxford University Press, New York, (1990), и Roitt и др., Immunology (2-е изд.), изд-во Gower Medical Publishing, London, New York (1989), а также документы, касающиеся общего уровня техники, процитированные в настоящем описании. Кроме того, если не указано иное, все методы, стадии, процессы и манипуляции, которые не описаны конкретно в деталях, можно осуществлять и их осуществляли хорошо известными методами, что должно быть очевидно специалисту в данной области. И в этом случае также в качестве ссылки можно, например, указать на известные руководства, сведения, касающиеся общего уровня техники, указанные выше, и дополнительные процитированные в них ссылки.Unless otherwise indicated or defined, all terms used are used in their usual meaning, accepted in this field, which is obvious to experts in this field. Reference may be made to, for example, standard manuals such as Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Volumes 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, Genes IV, Oxford University Press, New York, (1990), and Roitt et al., Immunology (2nd ed.), Gower Medical Publishing, London, New York (1989), and also the documents relating to the general level of technology cited in the present description. In addition, unless otherwise indicated, all methods, steps, processes and manipulations that are not specifically described in detail can be carried out and were carried out by well-known methods, which should be obvious to a person skilled in the art. In this case, too, reference can be made, for example, to known manuals, the prior art information referred to above and the additional references cited therein.

Как используется в настоящей заявке, формы единственного числа относятся к одному или более чем одному (например, по меньшей мере одному) из указанных грамматических объектов.As used herein, the singular refers to one or more than one (eg, at least one) of the specified grammatical entities.

Термин или используется в настоящей заявке, обозначает и используется взаимозаменяемо с термином и/или, если из контекста не очевидно другое.The term or is used in this application, denotes and is used interchangeably with the term and/or, unless the context is clear otherwise.

Приблизительно и около будет обозначать приемлемую степень погрешности измеренной величины, представленной в природе или точности измерений. Типичные степени погрешностей находятся в пределах 20 процентов (%), типично, в пределах 10%, и более типично, в пределах 5% данного значения или диапазона значений.Approximately and about will denote an acceptable degree of error in the measured quantity, given the nature or accuracy of the measurements. Typical error rates are within 20 percent (%), typically within 10%, and more typically within 5% of a given value or range of values.

Молекулы антител или антитела (используются синонимично в настоящей заявке) представляют собой гаммаглобулиновые белки, которые можно обнаружить в крови или других жидкостях организмов позвоночных, и которые используются иммунной системой для идентификации и нейтрализации чужеродных объектов, таких как бактерии и вирусы. Они типично состоят из основных структурных единиц - каждое из двух больших тяжелых цепей и двух небольших легких цепей - с образованием, например, мономеров с одной единицей, двумеров с двумя единицами или пентамеров с пятью единицами. Молекулы антител могут связываться, путем нековалентного взаимодействия, с другими молекулами или структурами, известными как антигены. Это связывание является специфическим в том значении, что молекула антитела будет связываться только со специфической структурой с высокой аффинностью. Уникальная часть антигена, распознаваемая молекулой антитела, называется этитопом или антигенной детерминантой. Часть молекулы антитела, связывающаяся с эпитопом, иногда называется паратоп и остатки в так называемом вариабельном домене, или вариабельном участке (Fv) антитела. Вариабельный домен включает три так называемых участка, определяющих комплементарность (CDR), разделенные каркасными участками (FR).Antibody molecules or antibodies (used synonymously in this application) are gamma globulin proteins that can be found in the blood or other body fluids of vertebrates and are used by the immune system to identify and neutralize foreign objects such as bacteria and viruses. They typically consist of basic building blocks - each of two large heavy chains and two small light chains - to form, for example, one unit monomers, two unit twomers, or five unit pentamers. Antibody molecules can bind, by non-covalent interaction, to other molecules or structures, known as antigens. This binding is specific in the sense that the antibody molecule will only bind to a specific structure with high affinity. The unique part of an antigen recognized by an antibody molecule is called an etytope or antigenic determinant. The portion of an antibody molecule that binds to an epitope is sometimes referred to as a paratope and residues in the so-called variable domain, or variable region (Fv) of an antibody. The variable domain comprises three so-called complementarity determining regions (CDRs) separated by framework regions (FRs).

В контексте настоящей заявки, ссылка на CDR основывается на определении (Chothia и Lesk, J. Mol. Biol. 1987, 196: 901-917), совместно с Kabat (E.A. Kabat, Т.Т. Wu, H. Bilofsky, M. Reid-Miller и Н. Perry, Sequence of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda (1983)).In the context of the present application, reference to CDR is based on the definition (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 1987, 196: 901-917), in conjunction with Kabat (E. A. Kabat, T. T. Wu, H. Bilofsky, M. Reid-Miller and H. Perry, Sequence of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda (1983)).

В некоторых вариантах осуществления, молекула антитела имеет константную область тяжелой цепи, выбранную из, например, константных областей тяжелой цепи IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD и IgE; в особенности, выбранную из, например, (например, человеческих) константных областей тяжелой цепи IgG1, IgG2, IgG3, и IgG4. В другом варианте осуществления, молекула антитела имеет константную область легкой цепи, выбранную из, например, (например, человеческих) константных областей легкую цепь каппа или лямбда. Константная область может быть изменена, например, мутирована, для модификации свойств антитела (например, для повышения или снижения одного или нескольких из: связывание Fc рецептора, гликозилирование антитела, количества цистеиновых остатков, эффекторной клеточной функции и/или функции комплемента). В некоторых вариантах осуществления, антитело имеет эффекторную функцию и может фиксировать комплемент. В других вариантах осуществления, антитело не захватывает эффекторные клетки или не фиксирует комплемент. В определенных вариантах осуществления, антитело имеет уменьшенную способность или не имеет способности связывать Fc ре- 4 042707 цептор. Например, оно может представлять собой изотип или подтип, фрагмент или другой мутант, который не поддерживает связывания с Fc рецептором, например, оно имеет мутированный или делетированный участок связывания Fc рецептора.In some embodiments, the antibody molecule has a heavy chain constant region selected from, for example, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, and IgE heavy chain constant regions; in particular selected from, for example, (eg human) IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 heavy chain constant regions. In another embodiment, the antibody molecule has a light chain constant region selected from, for example, (eg, human) kappa or lambda light chain constant regions. The constant region can be altered, such as mutated, to modify the properties of the antibody (eg, to increase or decrease one or more of: Fc receptor binding, antibody glycosylation, cysteine residue count, effector cellular function, and/or complement function). In some embodiments, the antibody has an effector function and can fix complement. In other embodiments, the antibody does not capture effector cells or fix complement. In certain embodiments, the antibody has reduced or no ability to bind to the Fc receptor. For example, it may be an isotype or subtype, fragment, or other mutant that does not support binding to the Fc receptor, for example, it has a mutated or deleted Fc receptor binding site.

Константный участок антитела изменяют в некоторых вариантах осуществления. Методы изменения константного участка антитела хорошо известны в данной области техники. Антитела с измененной функцией, например, измененной аффинностью к эффекторному лиганду, такому как FcR на клетке, или С1 компоненту комплемента могут быть получены путем замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка в константном участке антитела на другой остаток (см., например, ЕР 388, 151 A1, U.S. Pat. No. 5,624,821 и U.S. Pat. No. 5,648,260, содержание всех источников таким образом полностью включено в качестве ссылки). Также охватываются аминокислотные мутации, которые стабилизируют структуру антитела, такие как S228P (EU номенклатура, S241P в номенклатуре Kabat) в IgG4 человека. Сходные типы изменений могут быть описаны, которые, если применяются к мышиным или другим видам иммуноглобулинов, будут уменьшать или элиминировать эти функции.The constant region of an antibody is changed in some embodiments. Techniques for altering the constant region of an antibody are well known in the art. Antibodies with an altered function, such as an altered affinity for an effector ligand such as an FcR on a cell, or the C1 complement component, can be generated by substituting at least one amino acid residue in the antibody constant region with another residue (see, for example, EP 388, 151 A1, U.S. Pat. No. 5,624,821 and U.S. Pat. No. 5,648,260, the contents of all sources are hereby incorporated by reference in their entirety). Also covered are amino acid mutations that stabilize the antibody structure, such as S228P (EU nomenclature, S241P in Kabat nomenclature) in human IgG4. Similar types of changes can be described which, if applied to murine or other types of immunoglobulins, will reduce or eliminate these functions.

Термин вариабельный домен, как используется в настоящей заявке, обозначает участок молекулы антитела, который по существу состоит из четырех каркасных участков, как они определены в данной области, и обозначены ниже как каркасный участок 1 или FR1; каркасный участок 2 или FR2; каркасный участок 3 или FR3; и каркасный участок 4 или FR4, соответственно; указанные каркасные участки перемежаются тремя гипервариабельными участками или CDR, как они определены в данной области, и обозначены ниже как гипервариабельный участок 1 или CDR1; гипервариабельный участок 2 или CDR2; и гипервариабельный участок 3 или CDR3, соответственно. Таким образом, общую структуру или последовательность вариабельного домена иммуноглобулина можно обозначить следующим образом: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Именно вариабельный(е) домен(ы) иммуноглобулина придает(ют) специфичность антителу в отношении антигена, поскольку он(они) несут антиген-связывающий сайт.The term variable domain, as used herein, refers to a region of an antibody molecule that essentially consists of four framework regions as defined in the art, and referred to below as framework region 1 or FR1; frame region 2 or FR2; frame region 3 or FR3; and framework region 4 or FR4, respectively; said framework regions are interspersed with three hypervariable regions or CDRs as defined in the art and referred to below as hypervariable region 1 or CDR1; hypervariable region 2 or CDR2; and hypervariable region 3 or CDR3, respectively. Thus, the general structure or sequence of the variable domain of an immunoglobulin can be designated as follows: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. It is the variable domain(s) of an immunoglobulin that confer(s) specificity to an antibody for an antigen because it(they) carry an antigen-binding site.

Термины вариабельный тяжелый (или VH) и вариабельный легкий (или VL) относится к вариабельным доменам из тяжелых или легких цепей, соответственно, молекулы антитела.The terms variable heavy (or VH) and variable light (or VL) refer to the heavy or light chain variable domains, respectively, of an antibody molecule.

В данной области дополнительно были разработаны молекулы антител и из них получены универсальные средства в медицине и технологии. Таким образом, в контексте настоящего изобретения, термины молекула антитела или антитело не только включают антитела, как они могут быть обнаружены в природе, содержащие, например, две легкие цепи и две или тяжелые цепи, но также дополнительно охватывают все молекулы, содержащие по меньшей мере один паратоп со специфичностью связывания с антигеном и со структурным сходством с вариабельным доменом молекулы антитела.In addition, antibody molecules have been developed in this area and universal agents in medicine and technology have been obtained from them. Thus, in the context of the present invention, the terms antibody molecule or antibody not only include antibodies, as they can be found in nature, containing, for example, two light chains and two or heavy chains, but also further cover all molecules containing at least one paratope with antigen binding specificity and structural similarity to the variable domain of an antibody molecule.

Таким образом, молекула антитела в соответствии с изобретением включает моноклональное антитело, антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, фрагмент антитела, в особенности Fv, Fab, Fab', или F(ab')₂ фрагмент, одноцепочечное антитело, в особенности одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), малые модульные иммунофармацевтические средства (SMIP), домен антитела, нанотело, диатело.Thus, an antibody molecule according to the invention includes a monoclonal antibody, a human antibody, a humanized antibody, a chimeric antibody, an antibody fragment, especially an Fv, Fab, Fab', or F(ab') ₂ fragment, a single chain antibody, especially a single chain variable fragment (scFv), small modular immunopharmaceuticals (SMIP), antibody domain, nanobody, diabody.

Моноклональные антитела (mAb) представляют собой моноспецифические антитела, которые являются идентичными по аминокислотной последовательности. Они могут быть получены с помощью гибридомной технологии из гибридной клеточной линии (называемые гибридомой), представляющие собой клон слияния специфической антитело-продуцирующей В-клетки с миеломной клеткой (Вклеточный рак) (Kohler G, Milstein С. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 1975;256:495-7.). Альтернативно, моноклональные антитела могут быть получены путем рекомбинантной экспрессии в клетках-хозяевах (Norderhaug L, Olafsen T, Michaelsen ТЕ, Sandlie I. (May 1997). Versatile vectors for transient and stable expression of recombinant antibody molecules in mammalian cells.. J Immunol Methods 204 (1): 77-87.Monoclonal antibodies (mAbs) are monospecific antibodies that are identical in amino acid sequence. They can be obtained using hybridoma technology from a hybrid cell line (called a hybridoma) that is a clone of the fusion of a specific antibody-producing B cell with a myeloma cell (B cell carcinoma) (Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity Nature 1975;256:495-7.). Alternatively, monoclonal antibodies can be generated by recombinant expression in host cells (Norderhaug L, Olafsen T, Michaelsen TE, Sandlie I. (May 1997). Versatile vectors for transient and stable expression of recombinant antibody molecules in mammalian cells.. J Immunol Methods 204 (1): 77-87.

Для применения у людей, часто является желательным уменьшить иммуногенность антител, изначально имеющих происхождение из других видов, таких как мыши. Это может быть осуществлено путем конструирования химерных антител, или с помощью процесса, называемого гуманизацией. В этом контексте, химерное антитело понимается как антитело, содержащее часть последовательности (например, вариабельный домен), имеющее происхождение из одних видов (например, мыши), слитое с частью последовательности (например, константные домены), имеющие происхождение из других видов (например, человека). Гуманизированное антитело представляет собой антитело, содержащее вариабельный домен, изначально имеющий происхождение из нечеловеческих видов, где определенные аминокислоты были мутированы для придания суммарной последовательности такого вариабельного домена более тесного сходства с последовательностью вариабельного домена человека. Методы химеризации и гуманизации антител хорошо известны в данной области техники (Billetta R, Lobuglio AF. Chimeric antibodies. Int Rev Immunol. 1993; 10(2-3): 165-76; Riechmann L, Clark M, Waldmann H, Winter G (1988). Reshaping human antibody for therapy. Nature: 332:323.).For use in humans, it is often desirable to reduce the immunogenicity of antibodies originally derived from other species, such as mice. This can be done by constructing chimeric antibodies, or by a process called humanization. In this context, a chimeric antibody is understood as an antibody containing a portion of a sequence (e.g., a variable domain) originating in one species (e.g., mice) fused to a portion of a sequence (e.g., constant domains) originating in another species (e.g., person). A humanized antibody is an antibody containing a variable domain originally derived from a non-human species, where certain amino acids have been mutated to bring the overall sequence of such variable domain closer to that of a human variable domain. Methods for chimerization and humanization of antibodies are well known in the art (Billetta R, Lobuglio AF. Chimeric antibodies. Int Rev Immunol. 1993; 10(2-3): 165-76; Riechmann L, Clark M, Waldmann H, Winter G ( 1988) Reshaping human antibody for therapy Nature: 332:323.

Кроме того, были разработаны технологии для создания антител на основании последовательностей, имеющих происхождение из генома человека, например, путем фагового дисплея или применения трансгенных животных (WO 90/05144; D. Marks, H.R. Hoogenboom, T.P. Bonnert, J.In addition, technologies have been developed to generate antibodies based on sequences derived from the human genome, for example, by phage display or the use of transgenic animals (WO 90/05144; D. Marks, H.R. Hoogenboom, T.P. Bonnert, J.

- 5 042707- 5 042707

McCafferty, A.D. Griffiths и G. Winter (1991) By-passing immunisation. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage. J.Mol.Biol., 222, 581-597; Knappik и др., J. Mol. Biol. 296: 57-86, 2000; S. Carmen и L. Jermutus, Concepts in antibody phage display. Briefings in Functional Genomics and Proteomics 2002 1(2): 189-203; Lonberg N, Huszar D. Human antibodies from transgenic mice. Int Rev Immunol. 1995; 13(l): 65-93.; Bruggemann M, Taussig MJ. Production of humantibody repertoires in transgenic mice. Curr Opin Biotechnol. 1997 Aug;8(4):455-8.). Такие антитела представляют собой антитела человека в контексте настоящего изобретения.McCafferty, A.D. Griffiths and G. Winter (1991) By-passing immunization. Human antibodies from V-gene libraries displayed on page. J. Mol. Biol., 222, 581-597; Knappik et al., J. Mol. Biol. 296:57-86, 2000; S. Carmen and L. Jermutus, Concepts in antibody phage display. Briefings in Functional Genomics and Proteomics 2002 1(2): 189-203; Lonberg N, Huszar D. Human antibodies from transgenic mice. Int Rev Immunol. 1995; 13(l): 65-93.; Bruggemann M, Taussig MJ. Production of humantibody repertoires in transgenic mice. Curr Opin Biotechnol. 1997 Aug;8(4):455-8.). Such antibodies are human antibodies in the context of the present invention.

Молекулы антител в соответствии с настоящим изобретением также включают фрагменты молекул, которые сохраняют антигенсвязывающие свойства, такие как Fab, Fab', или F(ab')₂ фрагменты. Такие фрагменты могут быть получены путем фрагментации молекул антител, например, путем протеолитического расщепления или путем рекомбинантной экспрессии таких фрагментов. Например, расщепление молекул антител может быть осуществлено с помощью рутинных технологий, например, используя папаин или пепсин (WO 94/29348). При расщеплении антител с помощью папаина типично получают два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, так называемые Fab фрагменты, каждый с единичным антигенсвязывающим сайтом, и оставшийся Fc фрагмент. При расщеплении пепсином получают F(ab')₂. В Fab молекулах, вариабельные домены каждый слит с константным доменом иммуноглобулина, предпочтительно человеческого происхождения. Таким образом, вариабельный домен тяжелой цепи может быть слит с CH1 доменом (так называемый Fd фрагмент), и вариабельный домен легкой цепи может быть слит с CL доменом. Fab молекулы могут быть получены путем рекомбинантной экспрессии соответствующих нуклеиновых кислот в клетках-хозяевах, см. ниже.The antibody molecules of the present invention also include fragments of molecules that retain antigen-binding properties, such as Fab, Fab', or F(ab') ₂ fragments. Such fragments can be obtained by fragmentation of antibody molecules, for example by proteolytic cleavage or by recombinant expression of such fragments. For example, cleavage of antibody molecules can be carried out using routine techniques, for example using papain or pepsin (WO 94/29348). Digestion of antibodies with papain typically produces two identical antigen-binding fragments, so-called Fab fragments, each with a single antigen-binding site, and the remaining Fc fragment. Pepsin digestion yields F(ab') ₂ . In Fab molecules, the variable domains are each fused to an immunoglobulin constant domain, preferably of human origin. Thus, a heavy chain variable domain can be fused to a CH1 domain (so-called Fd fragment), and a light chain variable domain can be fused to a CL domain. Fab molecules can be obtained by recombinant expression of the appropriate nucleic acids in host cells, see below.

Были разработаны различные технологии для помещения вариабельных доменов молекул антител, или молекул, имеющих происхождение из таких вариабельных доменов, в различных молекулярный контекст. Их также следует рассматривать как антитела в соответствии с настоящим изобретением. В целом, такие молекулы антител являются меньшими по размеру по сравнению с природными молекулами антител, и могут содержать единственную аминокислотную цепь или несколько аминокислотных цепей. Например, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) представляет собой слияние вариабельных участков тяжелых и легких цепей молекул антител, соединенных вместе коротким линкером, обычно серином (S) или глицином (G) (WO 88/01649; WO 91/17271; Huston и др.; International Reviews of Immunology, том 10, 1993, 195-217). Однодоменные антитела или нанотела заякоривают антигенсвязывающий сайт в единичном Ig-подобном домене (WO 94/04678; WO 03/050531, Ward и др., Nature. 1989 Oct 12; 341(6242): 544-6; Revets и др., Expert Opin Biol Ther. 5(1): 111-24, 2005). Один или несколько единичных доменов антител со связывающей специфичностью к одному и тому же или различным антигенам могут быть соединены вместе. Диатела представляют собой двухвалентные молекулы антител, состоящие из двух аминокислотных цепей, содержащих два вариабельных домена (WO 94/13804, Holliger и др., Proc Natl Acad Sci USA. 1993 Jul 15; 90(14): 6444-8). Другими примерами антителоподобных молекул являются иммуноглобулиновое суперсемейство антител (IgSF; Srinivasan и Roeske, Current Protein Pept. Sci. 2005, 6(2): 185-96). Другая концепция привела к созданию так называемого малого модульного иммунофармацевтического средства (SMIP), которое содержит Fv домен, связанный с одноцепочечным петлевым и эффекторными доменами, лишенный константного домена CH1 (WO 02/056910).Various technologies have been developed to place the variable domains of antibody molecules, or molecules derived from such variable domains, in different molecular contexts. They should also be considered as antibodies in accordance with the present invention. In general, such antibody molecules are smaller than natural antibody molecules, and may contain a single amino acid chain or multiple amino acid chains. For example, a single chain variable fragment (scFv) is a fusion of heavy and light chain variable regions of antibody molecules linked together by a short linker, usually serine (S) or glycine (G) (WO 88/01649; WO 91/17271; Huston et al. ; International Reviews of Immunology, Volume 10, 1993, 195-217). Single domain antibodies or nanobodies anchor an antigen binding site in a single Ig-like domain (WO 94/04678; WO 03/050531, Ward et al., Nature. 1989 Oct 12; 341(6242): 544-6; Revets et al., Expert Opin Biol Ther 5(1): 111-24, 2005). One or more single antibody domains with binding specificity for the same or different antigens can be linked together. Diabodies are divalent antibody molecules consisting of two amino acid chains containing two variable domains (WO 94/13804, Holliger et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1993 Jul 15; 90(14): 6444-8). Other examples of antibody-like molecules are the immunoglobulin antibody superfamily (IgSF; Srinivasan and Roeske, Current Protein Pept. Sci. 2005, 6(2): 185-96). Another concept has led to the creation of a so-called small modular immunopharmaceutical (SMIP) which contains an Fv domain associated with single chain loop and effector domains, devoid of the CH1 constant domain (WO 02/056910).

Молекула антитела может быть слита (в качестве слитого белка) или другим образом связана (с помощью ковалентных или нековалентных связей) с другими молекулярными структурами, оказывающими желательное влияние на свойства молекулы антитела. Например, может быть желательным улучшать фармакокинетические свойства молекул антител, стабильность, например, в жидкостях организма, таких как кровь, в особенности в случае одноцепочечного антитела или домена антитела. Для этого были разработаны различные технологии, в особенности для пролонгирования периода полужизни таких молекул антител в кровообращении, такие как пегилирование (WO 98/25971; WO 98/48837; WO 2004081026), слияние или другим способом ковалентное присоединение молекулы антитела к другой молекуле антитела, имеющей аффинность к сывороточному белку, такому как альбумин (WO 2004041865; WO 2004003019), или экспрессия молекул антитела в качестве слитого белка со всеми или частью сывороточного белка, такого как альбумин или трансферрин (WO 01/79258).An antibody molecule can be fused (as a fusion protein) or otherwise linked (via covalent or non-covalent bonds) to other molecular structures that have the desired effect on the properties of the antibody molecule. For example, it may be desirable to improve the pharmacokinetic properties of antibody molecules, stability, for example, in body fluids such as blood, especially in the case of a single chain antibody or antibody domain. For this, various technologies have been developed, in particular for prolonging the half-life of such antibody molecules in the circulation, such as pegylation (WO 98/25971; WO 98/48837; WO 2004081026), fusion or otherwise covalently attaching an antibody molecule to another antibody molecule, having affinity for a serum protein such as albumin (WO 2004041865; WO 2004003019) or expressing the antibody molecules as a fusion protein with all or part of a serum protein such as albumin or transferrin (WO 01/79258).

Термины эпитоп и антигенная детерминанта, которые можно применять взаимозаменяемо, относятся к части макромолекулы, такой как полипептид, которая распознается антиген-связывающими молекулами, такими как молекулы антител согласно изобретению, и более предпочтительно, антигенсвязывающим сайтом указанных молекул. Эпитопы определяются как минимальный сайт связывания для молекулы антитела, и поэтому представляют собой специфическую мишень молекулы антитела.The terms epitope and antigenic determinant, which may be used interchangeably, refer to the portion of a macromolecule, such as a polypeptide, that is recognized by antigen-binding molecules, such as the antibody molecules of the invention, and more preferably by the antigen-binding site of said molecules. Epitopes are defined as the minimum binding site for an antibody molecule and therefore represent the specific target of an antibody molecule.

Считают, что молекула антитела, которая может связывать, связываться с, специфически связывать, или специфически связываться с, которая имеет аффинность к и/или которая имеет специфичность к определенному эпитопу, антигену или белку (или к по меньшей мере его одной части, фрагменту или эпитопу) действует против или нацелена к указанному эпитопу, антигену или белку или является связывающей молекулой по отношению к такому эпитопу, антигену или белку.An antibody molecule that can bind, bind to, specifically bind, or specifically bind to, that has affinity for and/or that has specificity for a particular epitope, antigen, or protein (or at least one portion, fragment, or epitope) acts against or targets said epitope, antigen or protein, or is a binding molecule for such epitope, antigen or protein.

Как правило, термин специфичность относится к ряду антигенов или эпитопов различных типов, с которыми конкретная антиген-связывающая молекула или антиген-связывающий белок (такая как имGenerally, the term specificity refers to a range of different types of antigens or epitopes with which a particular antigen-binding molecule or antigen-binding protein (such as

- 6 042707 муноглобулин, антитело, единичный вариабельный домен иммуноглобулина) может связываться. Специфичность антиген-связывающего белка может быть определена на основании его аффинности и/или авидности. Аффинность, характеризующаяся константной равновесия реакции диссоциации антигена от антиген-связывающего белка (KD), является мерой силы связывания между эпитопом и антигенсвязывающим сайтом на антиген-связывающем белке: чем меньше величина K_D, тем выше сила связывания между эпитопом и антиген-связывающей молекулой (альтернативно, аффинность может быть выражена как константа аффинности (KA), которая представляет собой 1/K_D). Как должно быть очевидно специалисту в данной области (например, после ознакомления с представленным ниже дополнительным описанием), аффинность можно определить с помощью метода, известного per se, в зависимости от специфичности антигена, представляющего интерес. Авидность представляет собой меру силы связывания между антигенсвязывающей молекулой (такой как антитело согласно изобретению) и соответствующим антигеном. Авидность связана как с аффинностью между эпитопом и его антиген-связывающим сайтом на антиген-связывающей молекуле, так и количеством соответствующих связывающих сайтом, присутствующих на антиген-связывающей молекуле.- 6 042707 munoglobulin, antibody, immunoglobulin single variable domain) can bind. The specificity of an antigen binding protein can be determined based on its affinity and/or avidity. Affinity, which is characterized by the equilibrium constant of the dissociation reaction of an antigen from an antigen-binding protein (KD), is a measure of the strength of binding between an epitope and an antigen-binding site on an antigen-binding protein: the smaller the K _D value, the higher the binding strength between the epitope and the antigen-binding molecule ( alternatively, affinity can be expressed as an affinity constant (KA) which is 1/K _D ). As will be apparent to one of skill in the art (eg, upon reading the additional description below), affinity can be determined by a method known per se, depending on the specificity of the antigen of interest. Avidity is a measure of the strength of binding between an antigen-binding molecule (such as an antibody of the invention) and the corresponding antigen. Avidity is related to both the affinity between an epitope and its antigen-binding site on an antigen-binding molecule and the number of corresponding binding sites present on an antigen-binding molecule.

Типично, антиген-связывающие белки (такие как молекулы антител согласно изобретению) будут связвать с константой диссоциации (K_D) от 10Е-5 до 10Е-14 моль/литр (М) или меньше, и предпочтительно от 10Е-7 до 10Е-14 моль/литр (М) или меньше, более предпочтительно от 10Е-8 до 10Е-14 моль/литр, и еще более предпочтительно от 10Е-11 до 10Е-13 (как измеряется, например, в анализе Kinexa; известном в данной области техники), и/или с константой ассоциации (KA) по меньшей мере 10Е7 МЕ-1, предпочтительно по меньшей мере 10Е8 МЕ-1, более предпочтительно по меньшей мере 10Е9 МЕ-1, такой, как по меньшей мере 10Е11 МЕ-1. Любое значение K_D больше, чем 10Е-4 М, обычно рассматривается как показатель неспецифического связывания. Предпочтительно антитело согласно изобретению будут связываться с желательным антиген с KD меньше чем 500 нМ, предпочтительно меньше чем 200 нМ, более предпочтительно меньше чем 10 нМ, например меньше чем 500 пМ. Специфическое связывание антиген-связывающего белка с антигеном или эпитопом может быть определено с помощью любого подходящего способа, известного per se, включая, например, исследования, описанные в настоящей заявке, анализ Скэтчарда и/или анализы конкурентного связывание, такие как радиоиммуноанализы (RIA), ферментативные иммуноанализы (EIA) и сэндвич-конкурентные анализы, и их различные вариации, известные per se в данной области техники.Typically, antigen-binding proteins (such as antibody molecules of the invention) will bind with a dissociation constant (K _D ) of 10E-5 to 10E-14 mol/liter (M) or less, and preferably 10E-7 to 10E-14 mol/liter (M) or less, more preferably from 10E-8 to 10E-14 mol/liter, and even more preferably from 10E-11 to 10E-13 (as measured, for example, in the Kinexa assay; known in the art ), and/or with an association constant (KA) of at least 10E7 IU-1, preferably at least 10E8 IU-1, more preferably at least 10E9 IU-1, such as at least 10E11 IU-1. Any value of K _D greater than 10E-4 M, is usually considered as an indicator of non-specific binding. Preferably, an antibody of the invention will bind to the desired antigen with a KD of less than 500 nM, preferably less than 200 nM, more preferably less than 10 nM, eg less than 500 pM. The specific binding of an antigen-binding protein to an antigen or epitope can be determined using any suitable method known per se, including, for example, the assays described herein, the Scatchard assay, and/or competitive binding assays such as radioimmunoassays (RIA), enzymatic immunoassays (EIA) and sandwich competition assays, and their various variations known per se in the art.

Связывающая аффинность молекулы антитела может быть усилена с помощью процесса, известного как созревание аффинности (Marks и др., 1992, Biotechnology 10: 779-783; Barbas, и др., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813; Shier и др., 1995, Gene 169: 147-155). Следовательно, аффинность зрелого антитела также охватывается в настоящем изобретении.The binding affinity of an antibody molecule can be enhanced by a process known as affinity maturation (Marks et al., 1992, Biotechnology 10: 779-783; Barbas, et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809 -3813; Shier et al., 1995, Gene 169: 147-155). Therefore, mature antibody affinity is also covered by the present invention.

Термины конкурирует или перекрестно-конкурирует используются взаимозаменяемо в настоящей заявке для обозначения способности молекулы антитела препятствовать связыванию молекулы антитела, например, молекула антитела к PD1 или к LAG3 согласно изобретению, с мишенью, например, PD1 или LAG3 человека. Препятствование связыванию может быть прямым или опосредованным (например, путем аллостерической модуляции молекулы антитела или мишени). Степень, до которой молекула антитела способна препятствовать связыванию другой молекулы антитела с мишенью, и, следовательно, можно ли сказать, что она является конкурентом, можно определить, используя анализ конкурентного связывания, например, FACS анализ, ELISA или BIACORE анализ. В некоторых вариантах осуществления, анализ конкурентного связывания представляет собой количественный конкурентный анализ. В некоторых вариантах осуществления, первая молекула антитела к PD1 или к LAG3 конкурирует за связывание с мишенью со второй молекулой антитела к PD1 или к LAG3, если связывание первой молекулы антитела с мишенью уменьшается на 10% или больше, например, 20% или больше, 30% или больше, 40% или больше, 50% или больше, 55% или больше, 60% или больше, 65% или больше, 70% или больше, 75% или больше, 80% или больше, 85% или больше, 90% или больше, 95% или больше, 98% или больше, 99% или больше в анализ конкурентного связывания (например, в конкурентном анализе, описанном в настоящей заявке).The terms compete or cross-compete are used interchangeably herein to refer to the ability of an antibody molecule to prevent binding of an antibody molecule, e.g., an anti-PD1 or anti-LAG3 antibody molecule of the invention, to a target, e.g., human PD1 or LAG3. Interfering with binding can be direct or indirect (eg, by allosteric modulation of the antibody or target molecule). The extent to which an antibody molecule is able to prevent another antibody molecule from binding to a target, and therefore whether it can be said to be a competitor, can be determined using a competitive binding assay, such as a FACS assay, ELISA, or BIACORE assay. In some embodiments, the competitive binding assay is a quantitative competitive assay. In some embodiments, a first anti-PD1 or anti-LAG3 antibody molecule competes for target binding with a second anti-PD1 or anti-LAG3 antibody molecule if the binding of the first antibody molecule to the target is reduced by 10% or more, e.g., 20% or more, 30 % or more, 40% or more, 50% or more, 55% or more, 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90 % or more, 95% or more, 98% or more, 99% or more in a competitive binding assay (eg, in a competitive assay described herein).

Композиции и методы, описанные в настоящей заявке, охватывают полипептиды и нуклеиновые кислоты, имеющие указанные последовательности, или последовательности существенно идентичные или сходные с ними, например, последовательности по меньшей мере на 85, 90, 95% идентичные или больше к указанной последовательности. В контексте аминокислотной последовательности, термин существенно идентичные используется в настоящей заявке для обозначения первой аминокислоты, которая содержит достаточное или минимальное количество аминокислотных остатков, которые I) идентичны к, или II) консервативные замены выровненных аминокислотных остатков во второй аминокислотной последовательности, таким образом, что первая и вторая аминокислотные последовательности могут иметь общий структурный домен и/или общую функциональную активность. Например, аминокислотные последовательности, которые содержат общий структурный домен, имеющие по меньшей мере приблизительно 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности к референс-последовательности, например, последовательности, раскрытой в настоящей заявке. В контексте нуклеотидной последовательности, термин существенно идентичные используется в настоящей заявке по отношению к первойThe compositions and methods described in this application cover polypeptides and nucleic acids having the specified sequences, or sequences substantially identical or similar to them, for example, sequences at least 85%, 90%, 95% identical or greater to the specified sequence. In the context of amino acid sequence, the term substantially identical is used herein to refer to the first amino acid that contains a sufficient or minimum number of amino acid residues that are i) identical to, or ii) conservative substitutions of aligned amino acid residues in the second amino acid sequence such that the first and the second amino acid sequence may have a common structural domain and/or a common functional activity. For example, amino acid sequences that contain a common structural domain having at least about 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identity to a reference sequence, such as the sequence disclosed in this application. In the context of a nucleotide sequence, the term substantially identical is used in this application in relation to the first

- 7 042707 последовательности нуклеиновых кислот, которая содержит достаточное или минимальное количество нуклеотидов, идентичная выровненным нуклеотидам во второй последовательности нуклеиновых кислот таким образом, что первая и вторая нуклеотидные последовательности кодируют полипептид, имеющий общую функциональную активность, или кодируют общий структурный полипептидный домен или общую функциональную полипептидную активность. Например, нуклеотидные последовательности, имеющие по меньшей мере приблизительно 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности к референс-последовательности.- 7 042707 a nucleic acid sequence that contains a sufficient or minimum number of nucleotides identical to the aligned nucleotides in the second nucleic acid sequence in such a way that the first and second nucleotide sequences encode a polypeptide having a common functional activity, or encode a common structural polypeptide domain or a common functional polypeptide activity. For example, nucleotide sequences having at least about 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identity to the reference sequence.

Термины идентичные или процент идентичности, в контексте двух или больше нуклеотидных или полипептидных последовательностей, относятся к двум или больше последовательностям или субпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют указанный процент нуклеотидов или аминокислотных остатков, которые являются одинаковыми, при сравнении и выравнивании для максимального соответствия. Для определения процента идентичности, последовательности выравнивают для возможностей оптимального сравнения (например, могут быть введены гэпы в последовательность первых аминокислот или последовательность нуклеиновых кислот для оптимального выравнивания со второй аминокислотной или нуклеотидной последовательностью). После этого сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих аминокислотных положениях или нуклеотидных положениях. Если положение в первой последовательности занято таким же аминокислотным остатком или нуклеотидом, как и в соответствующем положении во второй последовательности, то молекулы являются идентичными в этом положении. Процент идентичности для двух последовательностей является функцией количества идентичных положений, общих для последовательностей (т.е. % идентичности=№ идентичных положений/общее № положений (например, перекрывающиеся положения) х 100). В некоторых вариантах осуществления, две последовательности, которые сравниваются, имеют одинаковую длину после введения гэпов в последовательности, если это является подходящим (например, исключая дополнительную последовательность, выходящую за пределы последовательностей, подлежащие сравнению). Например, если сравнивают вариабельные участки последовательностей, то лидерные последовательности и/или последовательности константного домена не рассматривают. Для сравнения последовательностей между двумя последовательностями, соответствующий CDR относится к CDR в том же расположении в обеих последовательностях (например, CDR-H1 каждой последовательности).The terms identical or percent identity, in the context of two or more nucleotide or polypeptide sequences, refers to two or more sequences or subsequences that are the same or have a specified percentage of nucleotides or amino acid residues that are the same when compared and aligned for maximum match. To determine percent identity, sequences are aligned for optimal comparison opportunities (eg, gaps can be introduced into the first amino acid sequence or nucleic acid sequence for optimal alignment with a second amino acid or nucleotide sequence). Thereafter, amino acid residues or nucleotides are compared at the corresponding amino acid positions or nucleotide positions. If a position in the first sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding position in the second sequence, then the molecules are identical at that position. The percent identity for the two sequences is a function of the number of identical positions shared by the sequences (ie, % identity=No. of identical positions/total No. of positions (eg, overlapping positions) x 100). In some embodiments, the two sequences that are compared are the same length after gapping the sequences, if appropriate (eg, excluding an additional sequence that is outside the sequences to be compared). For example, if variable regions of sequences are compared, then leader sequences and/or constant domain sequences are not considered. For sequence comparisons between two sequences, the corresponding CDR refers to the CDR at the same location in both sequences (eg, CDR-H1 of each sequence).

Определение процента идентичности или процента сходства между двумя последовательностями можно осуществлять, используя математический алгоритм. Предпочтительным, неограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения двух последовательностей, является алгоритм Karlin и Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, модифицированный Karlin и Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877. Такой алгоритм включен в программы NBLAST и XBLAST от Altschul и др., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410. BLAST поиск нуклеотидов можно осуществлять с программой NBLAST, шкала=100, длина слова=12, для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных к нуклеиновой кислоте, кодирующий белок, представляющий интерес. BLAST поиск белков можно осуществлять с помощью программы XBLAST, шкала=50, длина слова=3, для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных белку, представляющему интерес. Для получения гэповых выравниваний для сравнений, можно использовать Gapped BLAST, как описано в Altschul и др., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. Альтернативно, можно использовать PSI-Blast для осуществления итерационного поиска, который определяет отдаленные взаимоотношения между молекулами (там же). При использовании программ BLAST, Gapped BLAST и PSI-Blast, можно использовать параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST). Другим предпочтительным, неограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения последовательностей, является алгоритм Myers и Miller, CABIOS (1989). Такой алгоритм включен в программу ALIGN (версия 2.0), которая являются частью программного обеспечения выравнивания GCG последовательности. При использовании программы ALIGN для сравнения аминокислотных последовательностей, можно использовать РАМ120 таблицу весов замен остатков, штраф за продление гэпа 12, и штраф за гэп 4. Дополнительные алгоритмы для анализа последовательностей известны в данной области техники и включают ADVANCE и ADAM, как описано в Torellis и Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5; и FASTA, описанные в Pearson и Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8. Для FASTA, ktup представляет собой контрольную опцию, которая устанавливает чувствительность и скорость поиска. Если ktup=2, то сходные участки в двух сравниваемых последовательностей обнаруживают путем поиска пар выравненных остатков; если ktup=1, то исследуют единичные выравненные аминокислоты, ktup может быть установлена на 2 или 1 для белковых последовательности, или от 1 до 6 для последовательностей ДНК. По умолчанию, если не указано, то ktup равен 2 для белков и 6 для ДНК. Альтернативно, выравнивание белковых последовательностей можно осуществлять, используя CLUSTAL W алгоритм, как описано Higgins и др., 1996, Methods Enzymol. 266: 383-402.Determining the percent identity or percent similarity between two sequences can be done using a mathematical algorithm. A preferred, non-limiting example of a mathematical algorithm used to compare two sequences is that of Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. sci. USA 87: 2264-2268, modified by Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. sci. USA 90: 5873-5877. Such an algorithm is included in the NBLAST and XBLAST programs from Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410. BLAST nucleotide searches can be performed with the NBLAST program, scale=100, wordlength=12, to obtain nucleotide sequences homologous to the nucleic acid encoding the protein of interest. BLAST searches for proteins can be performed using the XBLAST program, scale=50, wordlength=3, to obtain amino acid sequences homologous to the protein of interest. To obtain gapped alignments for comparisons, Gapped BLAST can be used as described in Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Alternatively, PSI-Blast can be used to perform an iterative search that determines distant relationships between molecules (ibid.). When using the BLAST, Gapped BLAST and PSI-Blast programs, you can use the default settings of the respective programs (eg XBLAST and NBLAST). Another preferred, non-limiting example of a mathematical algorithm used for sequence comparison is that of Myers and Miller, CABIOS (1989). Such an algorithm is included in the ALIGN program (version 2.0), which is part of the GCG sequence alignment software. When using the ALIGN program to compare amino acid sequences, a PAM120 residue substitution weight table, a gap extension penalty of 12, and a gap penalty of 4 can be used. Additional algorithms for sequence analysis are known in the art and include ADVANCE and ADAM, as described in Torellis and Robotti, 1994, Comput. Appl. biosci. 10:3-5; and FASTA described in Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. sci. USA 85:2444-8. For FASTA, ktup is a control option that sets the sensitivity and search speed. If ktup=2, then similar regions in the two compared sequences are found by searching for pairs of aligned residues; if ktup=1, then single aligned amino acids are examined, ktup can be set to 2 or 1 for protein sequences, or 1 to 6 for DNA sequences. By default, if not specified, ktup is 2 for proteins and 6 for DNA. Alternatively, protein sequence alignment can be performed using the CLUSTAL W algorithm as described by Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402.

Аминокислотные остатки можно обозначать в соответствии со стандартным трехбуквенным или однобуквенным кодом аминокислот, что хорошо известно и является общепринятым в данной области. При сравнении двух аминокислотных последовательностей, термин различие в аминокислотах относится к инсерциям, делециям или заменам указанного количества аминокислотных остатков в указанномAmino acid residues can be designated according to the standard three-letter or one-letter amino acid code, as is well known and is generally accepted in the art. When comparing two amino acid sequences, the term amino acid difference refers to insertions, deletions, or substitutions of a specified number of amino acid residues in a specified

- 8 042707 положении референс-последовательности, по сравнению со второй последовательностью. В случае замен(ы), указанные(ая) замены(а) предпочтительно должны(а) представлять собой консервативные(ую) аминокислотные(ную) замены(у), это означает, что аминокислотный остаток заменяют на другой аминокислотный остаток сходного химического строения, который оказывает незначительное влияние или практически не оказывает влияния на функцию, активность или другие биологические свойства полипептида. Такие консервативные аминокислотные замены хорошо известны в данной области техники, например, из WO 1998/49185, где консервативные аминокислотные замены предпочтительно представляют собой замены, при которых одну аминокислоту в пределах следующих групп (I)-(V) заменяют на другой аминокислотный остаток, входящий в эту же группу: (I) небольшие алифатические неполярные или имеющие невысокую полярность остатки: Ala, Ser, Thr, Pro и Gly; (II) полярные отрицательно заряженные остатки и их (незаряженные) амиды: Asp, Asn, Glu и Gln; (III) полярные положительно заряженные остатки: His, Arg и Lys; (IV) крупные алифатические неполярные остатки: Met, Leu, Ile, Val и Cys; и (V) ароматические остатки: Phe, Tyr и Trp. Наиболее предпочтительными являются следующие аминокислотные замены: Ala на Gly или на Ser; Arg на Lys; Asn на Gln или на His; Asp на Glu; Cys на Ser; Gln на Asn; Glu на Asp; Gly на Ala или на Pro; His на Asn или на Gln; Ile на Leu или на Val; Leu на Ile или на Val; Lys на Arg, на Gln или на Glu; Met на Leu, на Tyr или на Ile; Phe на Met, на Leu или на Tyr; Ser на Thr; Thr на Ser; Trp на Tyr; Tyr на Trp или на Phe; Val на Ile или на Leu.- 8 042707 position of the reference sequence, compared with the second sequence. In the case of substitution(s), said substitution(s) should preferably be conservative amino acid substitution(s), which means that the amino acid residue is replaced by another amino acid residue of similar chemical structure, which has little or no effect on the function, activity, or other biological properties of the polypeptide. Such conservative amino acid substitutions are well known in the art, for example from WO 1998/49185, where conservative amino acid substitutions are preferably substitutions in which one amino acid within the following groups (I)-(V) is replaced with another amino acid residue included in the same group: (I) small aliphatic nonpolar or low polarity residues: Ala, Ser, Thr, Pro and Gly; (II) polar negatively charged residues and their (uncharged) amides: Asp, Asn, Glu and Gln; (III) polar positively charged residues: His, Arg and Lys; (IV) large aliphatic non-polar residues: Met, Leu, Ile, Val and Cys; and (V) aromatic residues: Phe, Tyr and Trp. Most preferred are the following amino acid substitutions: Ala to Gly or Ser; Arg to Lys; Asn to Gln or to His; Asp to Glu; Cys to Ser; Gln to Asn; Glu to Asp; Gly on Ala or Pro; His to Asn or to Gln; Ile on Leu or on Val; Leu to Ile or to Val; Lys to Arg, to Gln or to Glu; Met on Leu, on Tyr or on Ile; Phe to Met, to Leu or to Tyr; Ser to Thr; Thr to Ser; Trp to Tyr Tyr to Trp or to Phe; Val on Ile or on Leu.

Термины полипептид, пептид и протеин (если одноцепочечный) используются взаимозаменяемо в настоящей заявке.The terms polypeptide, peptide and protein (if single chain) are used interchangeably in this application.

Термины нуклеиновая кислота, последовательность нуклеиновых кислот нуклеотидная последовательность, или полинуклеотидная последовательность, и полинуклеотид используются взаимозаменяемо.The terms nucleic acid, nucleic acid sequence, nucleotide sequence, or polynucleotide sequence, and polynucleotide are used interchangeably.

Термин выделенный, как используется в настоящей заявке, относится к материалу, который был удален из его исходной или нативной окружающей среды (например, природной окружающей среды, если он встречается в природе). Например, встречающийся в природе полинуклеотид или полипептид, присутствующий в живом организме, не является выделенным, но тот же самый полинуклеотид или полипептид, отделенный путем вмешательства человека от некоторых или всех материалов, с которым он совместно существует в природной системе, является выделенным. Такие полинуклеотиды могут быть частью вектора и/или такие полинуклеотиды или полипептиды могут быть частью композиции, и все еще могут быть выделенными в том отношении, что такой вектор или композиция не являются частью окружающей среды, в которой они находятся в природе.The term isolated, as used herein, refers to material that has been removed from its original or native environment (eg, the natural environment if it occurs naturally). For example, a naturally occurring polynucleotide or polypeptide present in a living organism is not isolated, but the same polynucleotide or polypeptide separated by human intervention from some or all of the materials with which it co-exists in the natural system is isolated. Such polynucleotides may be part of a vector and/or such polynucleotides or polypeptides may be part of a composition and may still be isolated in that such a vector or composition is not part of the environment in which it occurs naturally.

Предпочтительно, нуклеиновая кислота будет составлять часть экспрессионного вектора, где указанная молекула нуклеиновой кислоты функционально связанна с по меньшей мере одной регуляторной последовательностью, где такая регуляторная последовательность может представлять собой промоторную, энхансерную, или терминирующую последовательность, и наиболее предпочтительно гетерологичную промоторную, энхансерную, или терминирующую последовательность.Preferably, the nucleic acid will form part of an expression vector, wherein said nucleic acid molecule is operably linked to at least one regulatory sequence, where such regulatory sequence may be a promoter, enhancer, or termination sequence, and most preferably a heterologous promoter, enhancer, or termination sequence. subsequence.

Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention

Варианты осуществления изобретения, относящиеся к антителам к PD1.Embodiments of the Invention Relating to Anti-PD1 Antibodies.

Как подробно обсуждалось выше, PD1 играет важную роль в регуляции активности Т-клеток и, следовательно, активности иммунной системы. На моделях различных злокачественных новообразований было показано, что антагонистическое молекулы антител к PD1 могут повышать активность Тклеток, таким образом активируя иммунную систему для нападения на опухоли и, следовательно, лечения злокачественного новообразования.As discussed in detail above, PD1 plays an important role in the regulation of T cell activity and hence the activity of the immune system. It has been shown in various cancer models that anti-PD1 antagonistic antibody molecules can increase T cell activity, thus activating the immune system to attack tumors and hence treat cancer.

Тем не менее, существующие молекулы антител к PD1 страдают от проблем, связанных с побочными эффектами, и также наличием большого количества пациентов, неспособных отвечать на лечение. Таким образом, существует потребность идентифицировать альтернативные молекулы антител к PD1, которые имеют улучшенный терапевтический индекс по сравнению в известными из уровня техники. Такие молекулы можно использовать для монотерапии, а также в комбинации с дополнительными лекарственными средствами, в особенности другими модуляторами активности Т-клеток.However, existing anti-PD1 antibody molecules suffer from problems associated with side effects, as well as the presence of a large number of patients who are unable to respond to treatment. Thus, there is a need to identify alternative anti-PD1 antibody molecules that have an improved therapeutic index over those known in the art. Such molecules can be used for monotherapy as well as in combination with additional drugs, especially other modulators of T cell activity.

Принимая во внимание данные обстоятельства, изобретатели стремились создать дополнительные антитела к PD1. Используя в качестве исходной предшественник мышиного антитела к PD1 (обозначаемую как 77Е11), они приготовили 5 гуманизированных производных, которые являются заявляемыми молекулами антител к PD1 в соответствии с настоящим изобретением. Молекулы антител к PD1 в соответствии с настоящим изобретением обозначаются как PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 и PD1-5.Given these circumstances, the inventors sought to create additional antibodies to PD1. Using a mouse anti-PD1 antibody precursor (referred to as 77E11) as a starting point, they prepared 5 humanized derivatives that are claimed anti-PD1 antibody molecules of the present invention. Molecules of antibodies to PD1 in accordance with the present invention are referred to as PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 and PD1-5.

Используя исследование активации Т-клеток in-vitro (дополнительно описанное в примере 4), они исследовали функциональные характеристики репрезентативных антител к PD1 в соответствии с настоящим изобретением. Как можно увидеть в примере 12 и фиг. 8, тестируемые антитела способны индуцировать активацию Т-клеток на более высоком уровне при комбинировании с антителами к LAG3 по сравнению с эталонной комбинацией антител к PD1/LAG3, что подтверждает факт о том, что они имеют более желательную терапевтическую активность, чем сравнительные антитела к PD1.Using an in-vitro T cell activation assay (described further in Example 4), they tested the performance of representative anti-PD1 antibodies of the present invention. As can be seen in Example 12 and FIG. 8, the test antibodies are able to induce T cell activation at a higher level when combined with anti-LAG3 antibodies compared to the reference combination of anti-PD1/LAG3 antibodies, confirming that they have a more desirable therapeutic activity than the reference anti-PD1 antibodies. .

Как можно понять, эта неожиданная способность антител к PD1 в соответствии с настоящим изобретением более эффективно индуцировать активацию Т-клеток по сравнению с сравнительным антите- 9 042707 лом к PD1 из уровня техники свидетельствует о том, что их можно использовать для лечения злокачественного новообразования при более низком уровне дозирования, чем сравнительное антитело к PD1 из уровня техники, что может предоставлять терапевтическое применение с меньшим количеством нежелательных побочных эффектов.As can be understood, this unexpected ability of the anti-PD1 antibodies of the present invention to more effectively induce T cell activation compared to the reference anti-PD1 antibody of the prior art suggests that they can be used to treat cancer at more than lower dosage level than the comparative anti-PD1 antibody of the prior art, which may provide therapeutic applications with fewer undesirable side effects.

Стимулируемые этими данными, изобретатели дополнительно исследовали различные другие функциональные характеристики молекул антител к PD1 в соответствии с настоящим изобретением. В эту оценку было включено определение фармакокинетических свойств in vivo. Как изложено в примере 7 и показано на фиг. 5, как определяли на яванских макаках, период полувыведения в конечной фазе, наблюдаемый для примера антител к PD1 в соответствии с настоящим изобретением при внутривенной дозе 1 мг/кг, был в 1,5-2 раза выше, чем таковой у сравнительных антител к PD1 из уровня техники.Stimulated by these data, the inventors further explored various other functional characteristics of the anti-PD1 antibody molecules of the present invention. This evaluation included the determination of pharmacokinetic properties in vivo. As set out in Example 7 and shown in FIG. 5, as determined in cynomolgus monkeys, the terminal phase half-life observed for the exemplary anti-PD1 antibody according to the present invention at a 1 mg/kg intravenous dose was 1.5 to 2-fold higher than that of the comparative anti-PD1 antibodies. from the state of the art.

В отличие от антител к PD1, известных из уровня техники, это свидетельствует о том, что антитела к PD1 согласно изобретению имеют период полужизни в сыворотке 11 дней. Это противоречит известным сравнительным молекулам антител к PD1, которые типично имеют период полужизни от 4 до 6 дней в диапазоне дозирования 0,3-3 мг/кг, как можно увидеть из сопровождающих примеров. Эта неожиданная характерная особенность заявляемых молекул антител может предоставить возможность пациенту, подвергаться лечению с применением антител согласно изобретению, менее часто по сравнению с известными антителами из уровня техники, что может привести к уменьшению количества антитела, которое следует вводить, либо в форме уменьшенной частоты введения или в уменьшении используемого количества антитела. Принимая во внимание, что молекулы антител к PD1 могут индуцировать нежелательные побочные эффекты у пациентов, как обсуждалось выше, то антитела к PD1 согласно изобретению могут иметь существенное и неожиданное клиническое преимущество по сравнению с известным уровнем техники.In contrast to the prior art anti-PD1 antibodies, this indicates that the anti-PD1 antibodies of the invention have a serum half-life of 11 days. This is in contrast to known comparative anti-PD1 antibody molecules, which typically have a half-life of 4 to 6 days in the dosage range of 0.3-3 mg/kg, as can be seen from the accompanying examples. This unexpected characteristic of claimed antibody molecules may allow a patient to be treated with the antibodies of the invention less frequently than prior art antibodies, which may result in a reduction in the amount of antibody to be administered, either in the form of a reduced frequency of administration or in reducing the amount of antibody used. Given that anti-PD1 antibody molecules can induce unwanted side effects in patients, as discussed above, anti-PD1 antibodies of the invention may have a significant and unexpected clinical advantage over the prior art.

Следовательно, первый аспект изобретения обеспечивает молекулы антител к PD1, содержащие:Therefore, the first aspect of the invention provides anti-PD1 antibody molecules comprising:

(а) CDR тяжелой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 (hcCDR1), SEQ ID NO: 2 (hcCDR2) и SEQ ID NO: 3 (hcCDR3) и которая имеет CDR легкой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4 (lcCDR1), SEQ ID NO: 5 (lcCDR2) и SEQ ID NO: 6 (lcCDR3); или (б) CDR тяжелой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7 (hcCDR1), SEQ ID NO: 8 (hcCDR2) и SEQ ID NO: 9 (hcCDR3) и которая имеет CDR легкой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10 (lcCDR1), SEQ ID NO: 11 (lcCDR2) и SEQ ID NO: 12 (lcCDR3); или (в) CDR тяжелой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13 (hcCDR1), SEQ ID NO: 14 (hcCDR2) и SEQ ID NO: 15 (hcCDR3) и которая имеет CDR легкой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16 (lcCDR1), SEQ ID NO: 17 (lcCDR2) и SEQ ID NO: 18 (lcCDR3).(a) a heavy chain CDR containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (hcCDR1), SEQ ID NO: 2 (hcCDR2) and SEQ ID NO: 3 (hcCDR3) and which has a light chain CDR containing the amino acid sequence, shown in SEQ ID NO: 4 (lcCDR1), SEQ ID NO: 5 (lcCDR2) and SEQ ID NO: 6 (lcCDR3); or (b) a heavy chain CDR containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 (hcCDR1), SEQ ID NO: 8 (hcCDR2) and SEQ ID NO: 9 (hcCDR3) and which has a light chain CDR containing the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 10 (lcCDR1), SEQ ID NO: 11 (lcCDR2) and SEQ ID NO: 12 (lcCDR3); or (c) a heavy chain CDR comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 (hcCDR1), SEQ ID NO: 14 (hcCDR2) and SEQ ID NO: 15 (hcCDR3) and which has a light chain CDR containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 (lcCDR1), SEQ ID NO: 17 (lcCDR2) and SEQ ID NO: 18 (lcCDR3).

Как было изложено выше, молекулы антител к PD1 в соответствии с настоящим изобретением обозначаются как PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 и PD1-5. В настоящей заявке представлена таблица с последовательностями, которая предоставляет возможность легкой идентификации индивидуальных аминокислотных последовательностей для специфических молекул антител к PD1 в соответствии с настоящим изобретением. Обобщенные данные приведены в табл. 1 в примере 2.As stated above, the anti-PD1 antibody molecules of the present invention are referred to as PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 and PD1-5. The present application provides a table of sequences, which allows easy identification of individual amino acid sequences for specific anti-PD1 antibody molecules in accordance with the present invention. Summarized data are given in table. 1 in example 2.

Дополнительно к CDR последовательностям, как изложено в настоящей заявке, молекулы антител согласно изобретению включают последовательности каркасного участка (FR) иммуноглобулина. Эти последовательности предпочтительно не являются иммуногенными у людей, и, следовательно, предпочтительно представляют собой человеческие или гуманизированные FR последовательности. Подходящие человеческие или гуманизированные FR последовательности известны из уровня техники. Специфически предпочтительные FR последовательности можно получить на основании вариантов осуществления изобретения, описанных в настоящей заявке, раскрывающие полные молекулы антител и, следовательно, CDR последовательности, а также FR последовательности.In addition to the CDR sequences as set forth herein, the antibody molecules of the invention include immunoglobulin framework region (FR) sequences. These sequences are preferably not immunogenic in humans, and therefore preferably are human or humanized FR sequences. Suitable human or humanized FR sequences are known in the art. Specifically preferred FR sequences can be obtained based on the embodiments of the invention described in this application, revealing complete antibody molecules and, therefore, CDR sequences, as well as FR sequences.

Способы приготовления молекул антител первого аспекта изобретения хорошо известны в данной области техники, и квалифицированный специалист в данной области техники легко может приготовить молекулу антитела, имеющую характерные особенности первого аспекта изобретения. Примеры таких методов представлены далее в настоящей заявке.Methods for preparing antibody molecules of the first aspect of the invention are well known in the art, and one skilled in the art can easily prepare an antibody molecule having the characteristics of the first aspect of the invention. Examples of such methods are presented later in this application.

Для получения антител, содержащих две полные тяжелые и две полные легкие цепи, такие как цепи IgG1 или IgG4 типа, см. Norderhaug и др., J Immunol Methods 1997, 204 (1): 77-87; Kipriyanow и Le Gall, Molecular Biotechnology 26: 39-60, 2004; Shukla и др., 2007, J. Chromatography B, 848(1): 28-39.For antibodies containing two complete heavy and two complete light chains, such as IgG1 or IgG4 type chains, see Norderhaug et al., J Immunol Methods 1997, 204 (1): 77-87; Kipriyanow and Le Gall, Molecular Biotechnology 26: 39-60, 2004; Shukla et al., 2007, J. Chromatography B, 848(1): 28-39.

Также известны способы приготовления scFv антител путем рекомбинантной экспрессии нуклеиновых кислот, кодирующих scFv конструкции в клетках-хозяевах (такие как клеточные линии Е. coli, Pichia pastoris, или млекопитающих, например, СНО или NS0), получая функциональные scFv молекулы (Rippmann и др., Applied and Environmental Microbiology 1998, 64(12): 4862-4869; Yamawaki и др., J. Biosci. Bioeng. 2007, 104(5): 403-407; Sonoda и др., Protein Expr. Purif. 2010, 70(2): 248-253).Methods are also known for preparing scFv antibodies by recombinantly expressing nucleic acids encoding scFv constructs in host cells (such as E. coli, Pichia pastoris, or mammalian cell lines, such as CHO or NS0), producing functional scFv molecules (Rippmann et al. , Applied and Environmental Microbiology 1998, 64(12): 4862-4869; Yamawaki et al., J. Biosci. Bioeng. 2007, 104(5): 403-407; Sonoda et al., Protein Expr. Purif. 2010, 70(2): 248-253).

Для исключения неопределенности, каждый из специфических вариантов осуществления, перечисленный ниже для первого аспекта изобретения также может рассматриваться как независимые аспекты согласно изобретению.For the avoidance of doubt, each of the specific embodiments listed below for the first aspect of the invention may also be considered as independent aspects according to the invention.

- 10 042707- 10 042707

Предпочтительный вариант первого аспекта изобретения представляет вариант, где указанная молекула антитела представляет собой молекулу гуманизированного антитела.A preferred embodiment of the first aspect of the invention is where said antibody molecule is a humanized antibody molecule.

Дальнейший предпочтительный вариант осуществления первого аспекта изобретения представляет собой вариант, где указанная молекула антитела представляет собой моноклональное антитело, Fab,A further preferred embodiment of the first aspect of the invention is where said antibody molecule is a monoclonal antibody, Fab,

F(ab')₂, Fv или scFv.F(ab') ₂ , Fv or scFv.

Термины гуманизированный, Fab, F(ab')₂, Fv и scFv хорошо известны в данной области техники и дополнительно обсуждаются в настоящей заявке в разделе описания Определения.The terms humanized, Fab, F(ab') ₂ , Fv and scFv are well known in the art and are further discussed in the definitions section of this application.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 имеет константную область тяжелой цепи, выбранную из группы, включающей константные области IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA и IgE. Предпочтительно константная область тяжелой цепи представляет собой IgG4 с S241P мутацией.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule has a heavy chain constant region selected from the group consisting of IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, and IgE constant regions. Preferably the heavy chain constant region is IgG4 with the S241P mutation.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 имеет константную область легкой цепи, которая представляет собой каппа или лямбду.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule has a light chain constant region that is kappa or lambda.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 имеет вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную любой из SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25 и 27. Предпочтительно, указанная молекула антитела имеет вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25 и 27.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule has a heavy chain variable domain comprising an amino acid sequence at least 85% identical to any of SEQ ID NOs: 19, 21, 23, 25, and 27. Preferably, said antibody molecule has a heavy chain variable domain. heavy chain containing the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 19, 21, 23, 25 and 27.

В предпочтительном варианте осуществления молекулы антител к PD1 имеет вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную любой из SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26 и 28. Предпочтительно, указанная молекула антитела имеет вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26 и 28.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule has a light chain variable domain comprising an amino acid sequence at least 85% identical to any of SEQ ID NOs: 20, 22, 24, 26, and 28. Preferably, said antibody molecule has a light chain variable domain. a chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 20, 22, 24, 26 and 28.

Способы расчета идентичностей аминокислотных последовательностей хорошо известны в данной области техники и дополнительно обсуждаются в настоящей заявке в разделе описания Определения.Methods for calculating amino acid sequence identities are well known in the art and are further discussed in the definitions section of this application.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 имеет вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule has a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 имеет тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 29.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule has a heavy chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 29.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 имеет вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule has a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 имеет тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 31.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule has a heavy chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 имеет вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule has a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 имеет тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 33.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule has a heavy chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 имеет вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 25.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule has a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 25.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 имеет тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule has a heavy chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 35.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 имеет вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule has a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 имеет тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule has a heavy chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 37.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 имеет вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 20.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule has a light chain variable domain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 имеет легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 30.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule has a light chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 имеет вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule has a light chain variable domain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 имеет легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 32.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule has a light chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 имеет вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule has a light chain variable domain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 имеет легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule has a light chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 34.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 имеет вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 26.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule has a light chain variable domain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 имеет легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 36.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule has a light chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 36.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 имеет вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 28.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule has a light chain variable domain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28.

- 11 042707- 11 042707

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 имеет легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 38.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule has a light chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 38.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 имеет вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19 и вариабельный домен легкой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 20.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule has a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19 and a light chain variable domain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 имеет вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21 и вариабельный домен легкой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule has a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 21 and a light chain variable domain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 22.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 имеет вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23 и вариабельный домен легкой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule has a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 23 and a light chain variable domain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 имеет вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 25 и вариабельный домен легкой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 26.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule has a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25 and a light chain variable domain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 имеет вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27 и вариабельный домен легкой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 28.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule has a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 27 and a light chain variable domain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 28.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 имеет тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 29 и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 30.In a preferred embodiment, the PD1 antibody molecule has a heavy chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 29 and a light chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 имеет тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 31 и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 32.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule has a heavy chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31 and a light chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 имеет тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 33 и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule has a heavy chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33 and a light chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 34.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 имеет тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35 и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 36.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule has a heavy chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 35 and a light chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 36.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 имеет тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37 и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 38.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule has a heavy chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 37 and a light chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 38.

Для всех вышеописанных вариантов осуществления, следует понимать, что при использовании термина содержащий, также охватывает вариант осуществления изобретения, в котором соответствующий домен или молекула состоит из аминокислотной последовательности, как указано.For all of the above embodiments, it should be understood that when using the term comprising, it also covers an embodiment of the invention in which the corresponding domain or molecule consists of the amino acid sequence as indicated.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 способна связываться с PD1 человека с константой диссоциации (K_D) меньше, чем 10 нМ.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule is capable of binding to human PD1 with a dissociation constant (K _D ) of less than 10 nM.

В некоторых вариантах осуществления, молекула антитела к PD1 способна связываться с PD1 человека и PD1 яванских макак с высокой аффинностью. В некоторых вариантах осуществления, высокая аффинность относится к KD меньше, чем 10 нМ, например, 9, 8, 7, 6 или ниже, как определено с помощью SPR. Протокол для определения KD, используя SPR, представлен в сопровождающих примерах.In some embodiments, the anti-PD1 antibody molecule is capable of binding to human PD1 and cynomolgus monkey PD1 with high affinity. In some embodiments, high affinity refers to a KD of less than 10 nM, eg, 9, 8, 7, 6, or lower, as determined by SPR. The protocol for determining KD using SPR is presented in the accompanying examples.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 не связывается с мышиным PD1.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule does not bind to mouse PD1.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 способна уменьшать связывание PD-L1/L2 человека с PD1 человека. Анализ для определения связывания PD-L1/L2 человека с PD1 человека обеспечивается в сопровождающих примерах.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule is capable of reducing the binding of human PD-L1/L2 to human PD1. An assay to determine the binding of human PD-L1/L2 to human PD1 is provided in the accompanying examples.

В некоторых вариантах осуществления, молекула антитела к PD1 способна ингибировать связывание лигандов PD-L1 и PD-L2 с PD1 с IC₉₀ меньше, чем 10, 9, 8, 7, 6, 5 или 4 нМ или ниже. Протокол для определения IC₉₀ обеспечивается в сопровождающих примерах.In some embodiments, the anti-PD1 antibody molecule is capable of inhibiting the binding of PD-L1 and PD-L2 ligands to PD1 with an IC ₉₀ of less than 10, 9, 8, 7, 6, 5, or 4 nM or less. A protocol for determining IC ₉₀ is provided in the accompanying examples.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к PD1 способна усиливать антиген-специфический Т-клеточный ответ. Анализ для определения антиген-специфического Т-клеточного ответа описан в примере 4.In a preferred embodiment, the anti-PD1 antibody molecule is capable of enhancing an antigen-specific T cell response. An assay to determine the antigen-specific T cell response is described in Example 4.

Дальнейший аспект настоящего изобретения обеспечивает выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельный домен тяжелой цепи и/или вариабельный домен легкой цепи молекулы антитела к PD1 любого из первых аспектов осуществления изобретения.A further aspect of the present invention provides isolated nucleic acid molecules encoding a heavy chain variable domain and/or a light chain variable domain of an anti-PD1 antibody molecule of any of the first aspects of the invention.

Предпочтительно молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 71, 73, 75, 77 или 79 соответственно, кодирующую вариабельный домен тяжелой цепи SEQPreferably, the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 71, 73, 75, 77, or 79, respectively, encoding the heavy chain variable domain of SEQ

- 12 042707- 12 042707

ID NO: 19, 21, 23, 25 или 27. Предпочтительно молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 72, 74, 76, 78 или 80 соответственно, кодирующую вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26 или 28.ID NO: 19, 21, 23, 25, or 27. Preferably, the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 72, 74, 76, 78, or 80, respectively, encoding the light chain variable domain of SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26 or 28.

Дальнейший аспект изобретения обеспечивает экспрессионный вектор, содержащий молекулу ДНК содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельный домен тяжелой цепи и/или вариабельный домен легкой цепи молекулы антитела к PD1 согласно изобретению. Предпочтительно экспрессионный вектор содержит молекулу ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 71 и/или SEQ ID NO: 72, или содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 73 и/или SEQ ID NO: 74, или содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 75 и/или SEQ ID NO: 76, или содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 77 и/или SEQ ID NO: 78 или содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 79 и/или SEQ ID NO: 80.A further aspect of the invention provides an expression vector comprising a DNA molecule comprising a nucleotide sequence encoding a heavy chain variable domain and/or a light chain variable domain of an anti-PD1 antibody molecule of the invention. Preferably, the expression vector contains a DNA molecule containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 71 and/or SEQ ID NO: 72, or containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 73 and/or SEQ ID NO: 74, or containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 75 and/or SEQ ID NO: 76, or containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 77 and/or SEQ ID NO: 78, or containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 79 and/or SEQ ID NO: 80.

Предпочтительно экспрессионный вектор включает, дополнительно, молекулу нуклеиновой кислоты, предпочтительно молекулу ДНК, кодирующую константные домены тяжелой цепи и/или константный домен легкой цепи, соответственно, связанную с молекулой нуклеиновой кислоты, предпочтительно молекулу ДНК, кодирующую вариабельный домен тяжелой цепи и/или вариабельный домен легкой цепи, соответственно.Preferably, the expression vector further comprises a nucleic acid molecule, preferably a DNA molecule encoding heavy chain constant domains and/or light chain constant domain, respectively, linked to a nucleic acid molecule, preferably a DNA molecule encoding a heavy chain variable domain and/or variable domain light chain, respectively.

В специфическом предпочтительном варианте осуществления, можно использовать два экспрессионных вектора, один из них для экспрессии тяжелой цепи, а второй для экспрессии легкой цепи, затем два экспрессионных вектора оба могут быть трансфектированы в клетку-хозяина для экспрессии рекомбинантного белка.In a specific preferred embodiment, two expression vectors can be used, one for heavy chain expression and one for light chain expression, then the two expression vectors can both be transfected into a host cell to express the recombinant protein.

Предпочтительно, экспрессионный вектор будет представлять собой вектор, содержащий указанную(ые) молекулу или молекулы нуклеиновой кислоты, функционально связанную с по меньшей мере одной регуляторной последовательностью, где такая регуляторная последовательность может представлять собой промоторную, энхансерную, или терминирующую последовательность, и наиболее предпочтительно гетерологичную промоторную, энхансерную, или терминирующую последовательность.Preferably, the expression vector will be a vector containing the specified nucleic acid molecule or molecules operably linked to at least one regulatory sequence, where such regulatory sequence may be a promoter, enhancer, or termination sequence, and most preferably a heterologous promoter , enhancer, or termination sequence.

Нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут быть приготовлены или получены с помощью метода, известного per se (например, путем автоматизированного синтеза ДНК и/или рекомбинантных ДНК технологий), на основании информации относительно аминокислотных последовательностей для антител согласно изобретению, представленных в данной заявке.Nucleic acids according to the invention can be prepared or obtained using a method known per se (for example, by automated DNA synthesis and/or recombinant DNA technologies), based on the information regarding the amino acid sequences for antibodies according to the invention presented in this application.

В другом аспекте, изобретение относится к клетке-хозяину, имеющей экспрессионный вектор, кодирующий тяжелую цепь молекулы антитела к PD1 согласно изобретению и экспрессионный вектор, кодирующий легкую цепь молекулы антитела к PD1 согласно изобретению.In another aspect, the invention provides a host cell having an expression vector encoding the heavy chain of an anti-PD1 antibody molecule of the invention and an expression vector encoding the light chain of an anti-PD1 antibody molecule of the invention.

В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления, указанные клетки-хозяева представляют собой эукариотические клетки, такие как клетки млекопитающих. В другом варианте осуществления, такие клетки-хозяева представляют собой бактериальные клетки. Другие пригодные клетки представляют собой клетки дрожжей или другие грибковые клетки.According to a particularly preferred embodiment, said host cells are eukaryotic cells, such as mammalian cells. In another embodiment, such host cells are bacterial cells. Other suitable cells are yeast cells or other fungal cells.

Подходящие клетки млекопитающих включают, например, СНО клетки, BHK клетки, HeLa клетки, COS клетки, и другие. Тем не менее, также можно использовать клетки земноводных, клетки насекомых, клетки растений и любые другие клетки, используемые в данной области техники для экспрессии гетерологичного белка.Suitable mammalian cells include, for example, CHO cells, BHK cells, HeLa cells, COS cells, and others. However, amphibian cells, insect cells, plant cells, and any other cell used in the art to express a heterologous protein can also be used.

Варианты осуществления изобретения, относящиеся к молекулам антител к LAGS и комбинации с антителами к PD1.Embodiments of the invention relating to anti-LAGS antibody molecules and combination with anti-PD1 antibodies.

Как подробно обсуждалось выше, PD1 играет важную роль в регуляции активности Т-клеток и, следовательно, активности иммунной системы. На моделях различных злокачественных новообразований было показано, что антагонистические молекулы антител к PD1 могут повышать активность Тклеток, таким образом активируя иммунную систему для нападения на опухоли и, следовательно, лечения злокачественного новообразования.As discussed in detail above, PD1 plays an important role in the regulation of T cell activity and hence the activity of the immune system. It has been shown in various cancer models that anti-PD1 antagonistic antibody molecules can increase T cell activity, thus activating the immune system to attack tumors and hence treat cancer.

Также было показано, что комбинации антагонистических антител к PD1 с молекулами антител, которые нацеливают другие ингибиторы контрольной точки иммунных клеток ингибиторы контрольной точки, могут потенциировать противораковые свойства антагонистических антител к PD1. Один такой ингибитор контрольной точки называется LAG3.It has also been shown that combinations of anti-PD1 antagonist antibodies with antibody molecules that target other immune cell checkpoint inhibitors, checkpoint inhibitors, can potentiate the anti-cancer properties of anti-PD1 antagonist antibodies. One such checkpoint inhibitor is called LAG3.

Как и в случае с PD1, полагают, что LAG3 играет роль в опосредовании активности Т-клеток. Кроме того, в данной области техники известно, что дуальная блокада PD1 пути и LAG3 является более эффективность для противоопухолевого иммунитета, чем блокировка любой молекулы отдельно.As with PD1, LAG3 is believed to play a role in mediating T cell activity. In addition, it is known in the art that dual blockade of the PD1 pathway and LAG3 is more effective for antitumor immunity than blocking either molecule alone.

Принимая во внимание данные обстоятельства, изобретатели стремились создать дополнительные молекулы антител к LAG3, которые могут использоваться либо отдельно или в комбинации с молекулами антител к PD1 в соответствии с настоящим изобретением. Используя в качестве исходной предшественник мышиного антитела к LAG3 (обозначаемый как 496G6), они приготовили пять гуманизированных производных, которые являются заявляемыми молекулами антител к LAG3 в соответствии с настоящим изобретением. Молекулы антител к LAG3 в соответствии с настоящим изобретением обозначаются как LAG3-1, LAG3-2, LAG3-3, LAG3-4 и LAG3-5.In view of these circumstances, the inventors sought to create additional anti-LAG3 antibody molecules that can be used either alone or in combination with anti-PD1 antibody molecules in accordance with the present invention. Using a murine anti-LAG3 antibody precursor (referred to as 496G6) as a starting point, they prepared five humanized derivatives that are claimed anti-LAG3 antibody molecules of the present invention. Anti-LAG3 antibody molecules according to the present invention are referred to as LAG3-1, LAG3-2, LAG3-3, LAG3-4 and LAG3-5.

Используя анализ активации in-vitro Т-клеток (дополнительно описанный в примере 12), они иссле- 13 042707 довали функциональные характеристики репрезентативных молекул антител к LAG3 в соответствии с настоящим изобретением. Как можно увидеть в примере 12 и на фиг. 8, комбинация молекулы антитела кUsing an in-vitro T cell activation assay (described further in Example 12), they tested the performance of representative anti-LAG3 antibody molecules of the present invention. As can be seen in Example 12 and FIG. 8, combination of anti-antibody molecule

LAG3 в соответствии с настоящим изобретением с молекулой антитела к PD1 в соответствии с настоящим изобретением неожиданно является лучше по сравнению с комбинацией антител к PD1/LAG3, известной из уровня техники.LAG3 according to the present invention with an anti-PD1 antibody molecule according to the present invention is surprisingly superior compared to the combination of anti-PD1/LAG3 antibodies known in the art.

Как можно понять, это преимущество комбинации молекул антител к LAG3 в соответствии с настоящим изобретением с молекулами антител к PD1 в соответствии с настоящим изобретением свидетельствует о том, что они могут применяться для лечения злокачественного новообразования при более низком уровне дозирования по сравнению с известными из уровня техники терапевтическими антителами, что может предоставлять для терапевтического применения меньше нежелательных побочных эффектов.As can be understood, this advantage of combining the anti-LAG3 antibody molecules of the present invention with the anti-PD1 antibody molecules of the present invention suggests that they can be used to treat cancer at a lower dosage level than those known in the art. therapeutic antibodies, which may provide fewer undesirable side effects for therapeutic use.

Принимая во внимание, что молекулы антител к PD1 и к LAG3 могут индуцировать нежелательные побочные эффекты у пациентов, как обсуждалось выше, то антитела к PD1 и антитела к LAG3 согласно изобретению могут иметь существенное и неожиданное клиническое преимущество по сравнению с известным уровнем техники путем применения меньших дозировок и/или менее частых схем введения.Whereas anti-PD1 and anti-LAG3 antibody molecules can induce unwanted side effects in patients as discussed above, the anti-PD1 antibodies and anti-LAG3 antibodies of the invention can have a significant and unexpected clinical advantage over the prior art by using less dosages and/or less frequent dosing regimens.

Учитывая обнадеживающие данные, изобретатели дополнительно исследовали различные другие функциональные характеристики молекул антител к LAG3 согласно изобретению. В эту оценку было включено определение эпитопа, связываемого примерами молекул антител к LAG3 в соответствии с настоящим изобретением. Как можно увидеть в примере 11, изобретатели определили, что молекулы антител к LAG3 согласно изобретению могут связываться с двумя разными участками LAG-3 человека, LLRRAGVT (SEQ ID NO: 111) и/или YRAAVHLRDRA (SEQ ID NO: 112).Given the encouraging data, the inventors further explored various other functional characteristics of the anti-LAG3 antibody molecules of the invention. Included in this evaluation was the determination of the epitope bound by exemplary anti-LAG3 antibody molecules of the present invention. As can be seen in Example 11, the inventors have determined that the anti-LAG3 antibody molecules of the invention can bind to two different regions of human LAG-3, LLRRAGVT (SEQ ID NO: 111) and/or YRAAVHLRDRA (SEQ ID NO: 112).

По имеющимся сведениям у изобретателей, ни одно из известных из уровня техники антител к LAG3 не имело такого же профиля связывания эпитопа, что и молекулы антител к LAG3 согласно изобретению. Не желая ограничиваться какой-либо конкретной теорией, изобретатели предполагают, что неожиданное улучшение эффективностей комбинации молекул антител к LAG3 в соответствии с настоящим изобретением с антителами к PD1 в соответствии с настоящим изобретением при сравнении с известными молекулами из уровня техники может быть обусловлено профилем связывания эпитопа молекул антител к LAG3 согласно изобретению.To the inventors' knowledge, none of the prior art anti-LAG3 antibodies had the same epitope binding profile as the anti-LAG3 antibody molecules of the invention. Without wishing to be bound by any particular theory, the inventors believe that the unexpected improvement in the efficiencies of the combination of anti-LAG3 antibody molecules of the present invention with anti-PD1 antibodies of the present invention when compared to prior art molecules may be due to the epitope binding profile of the molecules antibodies to LAG3 according to the invention.

Следовательно, дальнейший аспект изобретения обеспечивает выделенную молекулу антитела к LAG3, где указанная молекула антитела к LAG3 связывает эпитоп LAG3 человека, содержащий аминокислотную последовательность LLRRAGVT (SEQ ID NO: 111) и/или YRAAVHLRDRA (SEQ ID NO: 112). Такие молекулы обозначаются в настоящей заявке как молекулы антител к LAG3 в соответствии с настоящим изобретением.Therefore, a further aspect of the invention provides an isolated anti-LAG3 antibody molecule, wherein said anti-LAG3 antibody molecule binds a human LAG3 epitope comprising the amino acid sequence LLRRAGVT (SEQ ID NO: 111) and/or YRAAVHLRDRA (SEQ ID NO: 112). Such molecules are referred to herein as anti-LAG3 antibody molecules according to the present invention.

Способы приготовления молекул антител к LAG3, имеющие характеристики связывания эпитопа согласно изобретению, хорошо известны в данной области техники.Methods for preparing anti-LAG3 antibody molecules having the epitope binding characteristics of the invention are well known in the art.

Способы создания антител и фрагментов антител хорошо известны в данной области техники. Например, антитела могут быть созданы с помощью любого из различных методов, в котором применяют индукцию in vivo продукции молекул антител, скрининг библиотек иммуноглобулинов (Orlandi и др., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 3833-3837; Winter и др. 1991, Nature 349: 293-299) или создание моноклональных молекул антител с помощью клеточных линий в культуре. Они включают, но не ограничиваясь только ими, гибридомную технологию, гибридомную технологию В-клеток человека, и вирус Эпштейна-Барра (EBV)-гибридомную технологию (Kohler и др. 1975. Nature 256: 4950497; Kozbor и др. 1985. J. Immunol. Methods 81: 31-42; Cote и др. 1983. Proc. Nail. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030; Cole и др. 1984. Mol. Cell. Biol. 62: 109-120).Methods for generating antibodies and antibody fragments are well known in the art. For example, antibodies can be generated using any of a variety of methods that utilize in vivo induction of antibody molecule production, screening of immunoglobulin libraries (Orlandi et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 3833-3837; Winter et al. 1991, Nature 349: 293-299) or the creation of monoclonal antibody molecules using cell lines in culture. These include, but are not limited to, hybridoma technology, human B cell hybridoma technology, and Epstein-Barr virus (EBV) hybridoma technology (Kohler et al. 1975. Nature 256: 4950497; Kozbor et al. 1985. J. Immunol Methods 81: 31-42 Cote et al 1983 Proc Nail Acad Sci USA 80: 2026-2030 Cole et al 1984 Mol Cell Biol 62: 109-120

Используя эти методы, для квалифицированного специалиста в данной области техники будет понятным, как приготовить антитела, имеющие сайт связывания с необходимой специфичностью для LAG3. После этого кандидатные молекулы антител можно подвергать скринингу, используя картирование эпитопов для определения того, будут ли они связываться с теми же самыми эпитопными последовательностями, как и требуемые антитела к LAG3 в соответствии с настоящим изобретением. Такие методы картирования эпитопов хорошо известны и используются в данной области техники и легко могут быть адаптированы квалифицированным специалистом в данной области техники. Кроме того, пример такой методологии описан в примере 11 в настоящей заявке.Using these methods, it will be clear to one skilled in the art how to prepare antibodies having a binding site with the desired specificity for LAG3. Thereafter, candidate antibody molecules can be screened using epitope mapping to determine if they will bind to the same epitope sequences as the desired anti-LAG3 antibodies of the present invention. Such epitope mapping techniques are well known and used in the art and can easily be adapted by one of skill in the art. In addition, an example of such a methodology is described in example 11 in this application.

Для исключения неопределенности, каждый из специфических вариантов осуществления, перечисленный ниже для антитела к LAG3 в соответствии с настоящим изобретением также может рассматриваться как независимые аспекты согласно изобретению.For the avoidance of doubt, each of the specific embodiments listed below for an anti-LAG3 antibody of the present invention may also be considered as independent aspects of the invention.

Предпочтительный вариант первого аспекта изобретения представляет вариант, где указанная молекула антитела представляет собой молекулу гуманизированного антитела.A preferred embodiment of the first aspect of the invention is where said antibody molecule is a humanized antibody molecule.

Дальнейшим предпочтительным вариантом осуществления является вариант, где указанная молекула антитела представляет собой моноклональное антитело, Fab, F(ab')₂, Fv или scFv.A further preferred embodiment is where said antibody molecule is a monoclonal antibody, Fab, F(ab') ₂ , Fv or scFv.

Термины гуманизированное, Fab, F(ab')₂, Fv и scFv хорошо известны в данной области техники и дополнительно обсуждаются в настоящей заявке в разделе описания Определения.The terms humanized, Fab, F(ab') ₂ , Fv and scFv are well known in the art and are further discussed in the definitions section of this application.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 имеет константную об- 14 042707 ласть тяжелой цепи, выбранную из группы, включающей константные области IgGl, IgG2, IgG3, IgG4,In a preferred embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule has a heavy chain constant region selected from the group consisting of IgG1, IgG2, IgG3, IgG4,

IgM, IgA и IgE. Предпочтительно, константная область тяжелой цепи представляет собой IgG4 с S241P мутацией.IgM, IgA and IgE. Preferably, the heavy chain constant region is IgG4 with the S241P mutation.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 имеет константную область легкой цепи, которая представляет собой каппа или лямбду.In a preferred embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule has a light chain constant region that is kappa or lambda.

Дальнейшим предпочтительным вариантом осуществления является вариант, где указанная молекула антитела к LAG3 включает:A further preferred embodiment is one wherein said anti-LAG3 antibody molecule comprises:

(а) CDR тяжелой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 39 (hcCDR1), SEQ ID NO: 40 (hcCDR2) и SEQ ID NO: 41 (hcCDR3) и которая имеет CDR легкой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 42 (lcCDR1), SEQ ID NO: 43 (lcCDR2) и SEQ ID NO: 44 (lcCDR3); или (б) CDR тяжелой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 45 (hcCDR1), SEQ ID NO: 46 (hcCDR2) и SEQ ID NO: 47 (hcCDR3) и которая имеет CDR легкой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 48 (lcCDR1), SEQ ID NO: 49 (lcCDR2) и SEQ ID NO: 50 (lcCDR3).(a) heavy chain CDRs containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 39 (hcCDR1), SEQ ID NO: 40 (hcCDR2) and SEQ ID NO: 41 (hcCDR3) and which has light chain CDRs containing the amino acid sequence, shown in SEQ ID NO: 42 (lcCDR1), SEQ ID NO: 43 (lcCDR2) and SEQ ID NO: 44 (lcCDR3); or (b) a heavy chain CDR containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 45 (hcCDR1), SEQ ID NO: 46 (hcCDR2) and SEQ ID NO: 47 (hcCDR3) and which has a light chain CDR containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 48 (lcCDR1), SEQ ID NO: 49 (lcCDR2) and SEQ ID NO: 50 (lcCDR3).

Как было изложено выше, молекулы антител к LAG3 в соответствии с настоящим изобретением обозначаются как LAG3-1, LAG3-2, LAG3-3, LAG3-4 и LAG3-5. В настоящей заявке описана таблица с последовательностями, которая предоставляет возможность легкой идентификации индивидуальных аминокислотных последовательностей для специфических молекул антител к LAG3 в соответствии с настоящим изобретением. Обобщенные данные приведены в табл. 6 в примере 9.As stated above, the anti-LAG3 antibody molecules of the present invention are referred to as LAG3-1, LAG3-2, LAG3-3, LAG3-4 and LAG3-5. The present application describes a table of sequences that allows easy identification of individual amino acid sequences for specific anti-LAG3 antibody molecules in accordance with the present invention. Summarized data are given in table. 6 in example 9.

Способы приготовления молекул антител к LAG3 в соответствии с настоящим изобретением хорошо известны в данной области техники, и квалифицированный специалист в данной области техники легко может приготовить молекулу антитела. Примеры таких методов представлены выше по отношению к первому аспекту изобретения.Methods for preparing anti-LAG3 antibody molecules in accordance with the present invention are well known in the art, and an antibody molecule can easily be prepared by one skilled in the art. Examples of such methods are presented above with respect to the first aspect of the invention.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 имеет вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную любой из SEQ ID NO: 51, 53, 55, 57 и 59. Предпочтительно, указанная молекула антитела имеет вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 51, 53, 55, 57 и 59.In a preferred embodiment, the LAG3 antibody molecule has a heavy chain variable domain comprising an amino acid sequence at least 85% identical to any of SEQ ID NOs: 51, 53, 55, 57, and 59. Preferably, said antibody molecule has a heavy chain variable domain. heavy chain containing the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 51, 53, 55, 57 and 59.

В предпочтительном варианте осуществления молекула антитела к LAG3 имеет вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную любой из SEQ ID NO: 52, 54, 56, 58 и 60. Предпочтительно, указанная молекула антитела имеет вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 52, 54, 56, 58 и 60.In a preferred embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule has a light chain variable domain comprising an amino acid sequence at least 85% identical to any of SEQ ID NOs: 52, 54, 56, 58, and 60. Preferably, said antibody molecule has a light chain variable domain. a chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 52, 54, 56, 58 and 60.

Способы расчета идентичностей аминокислотных последовательностей хорошо известны в данной области техники и дополнительно обсуждаются в настоящей заявке в разделе описания Определения.Methods for calculating amino acid sequence identities are well known in the art and are further discussed in the definitions section of this application.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 имеет вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 51.In a preferred embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule has a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 51.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 имеет тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 61.In a preferred embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule has a heavy chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 61.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 имеет вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 53.In a preferred embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule has a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 53.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 имеет тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 63.In a preferred embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule has a heavy chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 63.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 имеет вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 55.In a preferred embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule has a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 55.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 имеет тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 65.In a preferred embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule has a heavy chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 65.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 имеет вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 57.In a preferred embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule has a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 57.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 имеет тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 67.In a preferred embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule has a heavy chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 67.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 имеет вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 59.In a preferred embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule has a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 59.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 имеет тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 69.In a preferred embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule has a heavy chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 69.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 имеет вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 52.In a preferred embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule has a light chain variable domain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 52.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 имеет легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 62.In a preferred embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule has a light chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 62.

В предпочтительном варианте осуществления, антитело к LAG3 имеет вариабельный домен легкойIn a preferred embodiment, the anti-LAG3 antibody has a light variable domain.

- 15 042707 цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54.- 15 042707 chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 54.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 имеет легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 64.In a preferred embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule has a light chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 64.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 имеет вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 56.In a preferred embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule has a light chain variable domain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 56.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 имеет легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 66.In a preferred embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule has a light chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 66.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 имеет вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 58.In a preferred embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule has a light chain variable domain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 58.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 имеет легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 68.In a preferred embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule has a light chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 68.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 имеет вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 60.In a preferred embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule has a light chain variable domain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 60.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 имеет легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 70.In a preferred embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule has a light chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 70.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 имеет вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 51 и вариабельный домен легкой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 52.In a preferred embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule has a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 51 and a light chain variable domain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 52.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 имеет вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 53 и вариабельный домен легкой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54.In a preferred embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule has a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 53 and a light chain variable domain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 54.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 имеет вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 55 и вариабельный домен легкой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 56.In a preferred embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule has a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 55 and a light chain variable domain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 56.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 имеет вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 57 и вариабельный домен легкой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 58.In a preferred embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule has a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 57 and a light chain variable domain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 58.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 имеет вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 59 и вариабельный домен легкой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 60.In a preferred embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule has a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 59 and a light chain variable domain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 60.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 имеет тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 61 и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 62.In a preferred embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule has a heavy chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 61 and a light chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 62.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 имеет тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 63 и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 64.In a preferred embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule has a heavy chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 63 and a light chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 64.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 имеет тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 65 и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 66.In a preferred embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule has a heavy chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 65 and a light chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 66.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 имеет тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 67 и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 68.In a preferred embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule has a heavy chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 67 and a light chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 68.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 имеет тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 69 и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 70.In a preferred embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule has a heavy chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 69 and a light chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 70.

Во всех вышеописанных вариантах осуществления изобретения, следует понимать, что при использовании термина содержащий, он также охватывает вариант осуществления, в котором соответствующая молекула или домен состоит из аминокислотной последовательности, как указано.In all of the above embodiments of the invention, it should be understood that when using the term containing, it also covers the embodiment in which the corresponding molecule or domain consists of the amino acid sequence as indicated.

В предпочтительном варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 способна связываться с LAG3 человека с константой диссоциации (KD) меньше, чем 1 нМ.In a preferred embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule is capable of binding to human LAG3 with a dissociation constant (KD) of less than 1 nM.

В некоторых вариантах осуществления, молекула антитела к LAG3 способна связываться с LAG3 человека и LAG3 яванских макак с высокой аффинностью. В некоторых вариантах осуществления, высокая аффинность относится к KD меньше, чем 0,5 нМ, например, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1, 0,09, 0,08, 0,07 или ниже, как определено с помощью SPR. Протокол для определения KD, используя SPR, представлен в сопровождающих примерах.In some embodiments, the anti-LAG3 antibody molecule is capable of binding to human LAG3 and cynomolgus monkey LAG3 with high affinity. In some embodiments, high affinity refers to a KD of less than 0.5 nM, such as 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.09, 0.08, 0.07, or lower, as determined by SPR. The protocol for determining KD using SPR is presented in the accompanying examples.

В дальнейшем варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 не связывается с мышиным LAG3.In a further embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule does not bind to mouse LAG3.

- 16 042707- 16 042707

В дальнейшем варианте осуществления, молекула антитела к LAG3 способна проявлять одно или несколько из следующих свойств: (I) связывание с LAG3 яванских макак; (II) отсутствие связывания с мышиным LAG3; (III) ингибирование связывания LAG3 с МНС II; и (IV) стимулирование иммунного ответа.In a further embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule is capable of exhibiting one or more of the following properties: (i) binding to cynomolgus monkey LAG3; (ii) no binding to mouse LAG3; (III) inhibition of LAG3 binding to MHC II; and (iv) stimulating an immune response.

Дальнейший аспект изобретения обеспечивает молекулу антитела к LAG3 согласно изобретению для применения в медицине.A further aspect of the invention provides an anti-LAG3 antibody molecule of the invention for use in medicine.

Дальнейший аспект настоящего изобретения обеспечивает выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельный домен тяжелой цепи и/или вариабельный домен легкой цепи молекулы антитела к LAG3 согласно изобретению. Предпочтительно молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 91, 93, 95, 97 или 99 соответственно, кодирующую вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO: 51, 53, 55, 57 или 59. Предпочтительно молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 92, 94, 96, 98 или 100 соответственно, кодирующую вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO: 52, 54, 56, 58 или 60.A further aspect of the present invention provides isolated nucleic acid molecules encoding a heavy chain variable domain and/or a light chain variable domain of an anti-LAG3 antibody molecule of the invention. Preferably, the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 91, 93, 95, 97, or 99, respectively, encoding the heavy chain variable domain of SEQ ID NO: 51, 53, 55, 57, or 59. Preferably, the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 92, 94, 96, 98, or 100, respectively, encoding a light chain variable domain of SEQ ID NO: 52, 54, 56, 58, or 60.

Дальнейший аспект изобретения обеспечивает экспрессионный вектор, содержащий молекулу ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь и/или легкую цепь молекулы антитела к LAG3 согласно изобретению. Предпочтительно экспрессионный вектор содержит молекулу ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 101 и/или SEQ ID NO: 102, или содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 103 и/или SEQ ID NO: 104, или содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 105 и/или SEQ ID NO: 106, или содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 107 и/или SEQ ID NO: 108 или содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 109 и/или SEQ ID NO: 110.A further aspect of the invention provides an expression vector containing a DNA molecule containing a nucleotide sequence encoding the heavy chain and/or light chain of an anti-LAG3 antibody molecule of the invention. Preferably, the expression vector contains a DNA molecule containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 101 and/or SEQ ID NO: 102, or containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 103 and/or SEQ ID NO: 104, or containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 105 and/or SEQ ID NO: 106, or containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 107 and/or SEQ ID NO: 108, or containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 109 and/or SEQ ID NO: 110.

В специфическом предпочтительном варианте осуществления, можно использовать два экспрессионных вектора, один из них для экспрессии тяжелой цепи, а второй для экспрессии легкой цепи, затем два экспрессионных вектора оба могут быть трансфектированы в клетку-хозяина для экспрессии рекомбинантного белка.In a specific preferred embodiment, two expression vectors can be used, one for heavy chain expression and one for light chain expression, then the two expression vectors can both be transfected into a host cell to express the recombinant protein.

Предпочтительно, экспрессионный вектор будет представлять собой вектор, содержащий указанную(ые) молекулу или молекулы нуклеиновой кислоты, функционально связанную с по меньшей мере одной регуляторной последовательностью, где такая регуляторная последовательность может представлять собой промоторную, энхансерную, или терминирующую последовательность, и наиболее предпочтительно гетерологичную промоторную, энхансерную, или терминирующую последовательность.Preferably, the expression vector will be a vector containing the specified nucleic acid molecule or molecules operably linked to at least one regulatory sequence, where such regulatory sequence may be a promoter, enhancer, or termination sequence, and most preferably a heterologous promoter , enhancer, or termination sequence.

Нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут быть приготовлены или получены с помощью метода, известного per se (например, путем автоматизированного синтеза ДНК и/или рекомбинантных ДНК технологий), на основании информации относительно аминокислотных последовательностей для антител согласно изобретению, представленных в данной заявке, как описано дополнительно выше по отношению к антителам к PD1 в соответствии с настоящим изобретением.Nucleic acids according to the invention can be prepared or obtained using a method known per se (for example, by automated DNA synthesis and/or recombinant DNA technologies), based on the information regarding the amino acid sequences for antibodies according to the invention presented in this application, as described further higher in relation to antibodies to PD1 in accordance with the present invention.

В другом аспекте, изобретение относится к клетке-хозяину, имеющей экспрессионный вектор, кодирующий тяжелую цепь молекулы антитела к LAG3 согласно изобретению и экспрессионный вектор, кодирующий легкую цепь молекулы антитела к LAG3 согласно изобретению.In another aspect, the invention provides a host cell having an expression vector encoding the heavy chain of an anti-LAG3 antibody molecule of the invention and an expression vector encoding the light chain of an anti-LAG3 antibody of the invention.

В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления, указанные клетки-хозяева представляют собой эукариотические клетки, такие как клетки млекопитающих, например, те, которые были уже описаны выше в связи с вариантом осуществления антител к PD1. В другом варианте осуществления, такие клетки-хозяева представляют собой бактериальные клетки. Другие пригодные клетки представляют собой клетки дрожжей или другие грибковые клетки.According to a particularly preferred embodiment, said host cells are eukaryotic cells, such as mammalian cells, such as those already described above in connection with the anti-PD1 antibody embodiment. In another embodiment, such host cells are bacterial cells. Other suitable cells are yeast cells or other fungal cells.

Варианты осуществления изобретения, относящиеся к фармацевтическим композициям, включающим антитела к PD1 и к LAG3, набор частей, способы и применения.Embodiments of the Invention Relating to Pharmaceutical Compositions Comprising Anti-PD1 and Anti-LAG3 Antibodies, Kit Parts, Methods and Uses.

Дальнейший аспект изобретения обеспечивает набор, содержащий молекулу антитела к PD1 согласно изобретению и молекулу антитела к LAG3. Предпочтительно молекула антитела к LAG3 представляет собой молекулу антитела к LAG3 согласно изобретению.A further aspect of the invention provides a kit comprising an anti-PD1 antibody molecule of the invention and an anti-LAG3 antibody molecule. Preferably, the anti-LAG3 antibody molecule is an anti-LAG3 antibody molecule according to the invention.

Дальнейший аспект изобретения обеспечивает набор, содержащий молекулу антитела к LAG3 согласно изобретению и молекула антитела к PD1. Предпочтительно молекула антитела к PD1 представляет собой молекулу антитела к PD1 согласно изобретению. Альтернативно, другое антитело к PD1, такое как пембролизумаб или ниволумаб, может использоваться в таком наборе частей.A further aspect of the invention provides a kit comprising an anti-LAG3 antibody molecule of the invention and an anti-PD1 antibody molecule. Preferably, the anti-PD1 antibody molecule is an anti-PD1 antibody molecule of the invention. Alternatively, another anti-PD1 antibody, such as pembrolizumab or nivolumab, can be used in such a set of parts.

Дальнейший аспект изобретения обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую молекулу антитела к PD1 согласно изобретению. Обеспечивается вариант осуществления изобретения, в котором фармацевтическая композиция дополнительно включает молекулу антитела к LAG3. Предпочтительно молекула антитела к LAG3 представляет собой молекулу антитела к LAG3 согласно изобретению.A further aspect of the invention provides a pharmaceutical composition comprising an anti-PD1 antibody molecule according to the invention. An embodiment of the invention is provided wherein the pharmaceutical composition further comprises an anti-LAG3 antibody molecule. Preferably, the anti-LAG3 antibody molecule is an anti-LAG3 antibody molecule according to the invention.

Дальнейший аспект изобретения обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую молекулу антитела к LAG3 согласно изобретению. Обеспечивается вариант осуществления изобретения, в котором фармацевтическая композиция дополнительно включает молекулу антитела к PD1. Предпочтительно молекула антитела к PD1 представляет собой молекулу антитела к PD1 согласно изобретению. Альтернативно, другое антитело к PD1, такое как пембролизумаб или ниволумаб, может использоваться в такой фармацевтической композиции.A further aspect of the invention provides a pharmaceutical composition comprising an anti-LAG3 antibody molecule according to the invention. An embodiment of the invention is provided wherein the pharmaceutical composition further comprises an anti-PD1 antibody molecule. Preferably, the anti-PD1 antibody molecule is an anti-PD1 antibody molecule of the invention. Alternatively, another anti-PD1 antibody such as pembrolizumab or nivolumab can be used in such a pharmaceutical composition.

- 17 042707- 17 042707

Для квалифицированного специалиста в данной области техники будет понятным, что на основании изложенного выше, также в настоящей заявке раскрываются фармацевтические композиции для лечения заболевания (как более подробно описано ниже), используя молекулы антител согласно изобретению, описанные выше, а также способы лечения заболевания (как более подробно описано ниже) с применением таких фармацевтических композиций или молекул антител согласно изобретению.It will be understood by those skilled in the art that, based on the foregoing, also disclosed herein are pharmaceutical compositions for the treatment of a disease (as described in more detail below) using the antibody molecules of the invention described above, as well as methods for treating a disease (as described in more detail below) using such pharmaceutical compositions or antibody molecules of the invention.

Для исключения неопределенности, набор и фармацевтическая композиция согласно изобретению может содержать любую из специфических молекул антител к PD1 согласно изобретению и/или молекул антитела к LAG3 согласно изобретению, как описано выше.For the avoidance of doubt, the kit and pharmaceutical composition of the invention may contain any of the specific anti-PD1 antibody molecules of the invention and/or the anti-LAG3 antibody molecules of the invention as described above.

Если молекула антитела к PD1 согласно изобретению и молекула антитела к LAG3 согласно изобретению вводятся одновременно с помощью одного и того же пути введения, то они могут вводиться в качестве различных фармацевтических препаратов или композиций или в виде части комбинированного фармацевтического препарата или композиции. Также, если молекулу антитела к PD1 согласно изобретению и молекулу антитела к LAG3 согласно изобретению используют в качестве части комбинированной схемы лечения, то каждое из антител может вводиться в таком же количестве и в соответствии с такой же схемой, как используется, когда одно из антител используется самостоятельно, и такое комбинированное применение может приводить или может не приводить к синергетическому эффекту. Тем не менее, если комбинированное применение антител приводит к синергетическому эффекту, то также может быть возможно уменьшать количество одного или обоих антител, при этом все еще достигается желательное терапевтическое действие. Это может быть пригодно, например, для избегания, ограничения или уменьшения любых нежелательных побочные действий, которые связаны с применением одного или нескольких веществ или начал, когда они используются в их общепринятых количествах, при этом все еще получая желательный фармакологический или терапевтический эффект.If an anti-PD1 antibody molecule according to the invention and an anti-LAG3 antibody molecule according to the invention are administered simultaneously via the same route of administration, they may be administered as different pharmaceuticals or compositions or as part of a combined pharmaceutical preparation or composition. Also, if an anti-PD1 antibody molecule according to the invention and an anti-LAG3 antibody molecule according to the invention are used as part of a combination treatment regimen, then each of the antibodies can be administered in the same amount and according to the same schedule as used when one of the antibodies is used. alone, and such combined use may or may not result in a synergistic effect. However, if the combined use of antibodies results in a synergistic effect, then it may also be possible to reduce the amount of one or both antibodies while still achieving the desired therapeutic effect. This may be useful, for example, to avoid, limit or reduce any undesirable side effects that are associated with the use of one or more substances or principles when they are used in their conventional amounts, while still obtaining the desired pharmacological or therapeutic effect.

Фармацевтические композиции, способы введения, дозировки.Pharmaceutical compositions, routes of administration, dosages.

Изобретение дополнительно относится к фармацевтическим композициям для лечения заболеваний (как более подробно описано ниже), где такие композиции содержат по меньшей мере одну молекулу антитела согласно изобретению. Изобретение дополнительно охватывает способы лечения заболевания (как более подробно описано ниже) с использованием по меньшей мере одной молекулы антитела согласно изобретению или фармацевтической композиции, как описано ранее, и дополнительно охватывает применение лекарственного средства для лечения такого заболевания путем применения такой(их) молекулы (молекул) антитела согласно изобретению или фармацевтической композиции.The invention further relates to pharmaceutical compositions for the treatment of diseases (as described in more detail below), where such compositions contain at least one antibody molecule according to the invention. The invention further encompasses methods for treating a disease (as described in more detail below) using at least one antibody molecule of the invention or a pharmaceutical composition as previously described, and further encompasses the use of a medicament for the treatment of such disease by using such molecule(s). ) an antibody according to the invention or a pharmaceutical composition.

Молекулы антител согласно изобретению и/или композиции, которые их содержат, могут вводиться пациенту, который в этом нуждается, любым подходящим образом, в зависимости от специфического(ой) используемого(ой) фармацевтического препарата или композиции. Таким образом, молекулы антител согласно изобретению и/или композиции, которые их содержат, могут вводиться, например, внутривенно (в/в), подкожно (п/к), внутримышечно (в/м), внутрибрюшинно (в/б), чрескожно, перорально, подъязычно (например, в форме сублингвальной таблетки, спрея или капель, помещаемых под язык и абсорбируемых через слизистые мембраны в сеть капилляров под языком), (интра-)назально (например, в форме назального спрея и/или в виде аэрозоля), местно, с помощью суппозитория, путем ингаляции, или с помощью любого другого подходящего способа в эффективном количестве или дозе.The antibody molecules of the invention and/or the compositions containing them may be administered to a patient in need thereof in any suitable manner, depending on the specific pharmaceutical preparation or composition used. Thus, the antibody molecules of the invention and/or compositions containing them can be administered, for example, intravenously (IV), subcutaneously (SC), intramuscularly (IM), intraperitoneally (IP), transdermal , orally, sublingually (eg, as a sublingual tablet, spray or drops placed under the tongue and absorbed through the mucous membranes into the network of capillaries under the tongue), (intra-)nasally (eg, as a nasal spray and/or aerosol) , topically, by suppository, by inhalation, or by any other suitable method in an effective amount or dose.

Молекулы антител согласно изобретению и/или композиции, которые их содержат, вводятся в соответствии со схемой лечения, которая является подходящей для лечения и/или ослабления заболевания, нарушения или состояния, подлежащего лечению или ослаблению. Лечащий врач обычно может определить подходящую схему лечения, в зависимости от таких факторов, как заболевание, нарушение или состояние, подлежащее лечению или ослаблению, тяжесть заболевания, тяжесть его симптомов, специфических используемых молекул антител согласно изобретению, специфического пути введения и используемого фармацевтического препарата или композиции, возраста, пола, веса, питания, общего состояния пациента, и сходных факторов, хорошо известных лечащему врачу. В целом, схема лечения будет включать введение одной или нескольких молекул антител согласно изобретению, или одной или нескольких композиции, содержащих такие антитела, в терапевтически эффективных количествах или дозах.The antibody molecules of the invention and/or compositions containing them are administered in accordance with a treatment regimen that is suitable for the treatment and/or amelioration of the disease, disorder or condition being treated or ameliorated. The attending physician can usually determine the appropriate treatment regimen, depending on such factors as the disease, disorder or condition being treated or ameliorated, the severity of the disease, the severity of its symptoms, the specific antibody molecules used according to the invention, the specific route of administration, and the pharmaceutical preparation or composition used. , age, sex, weight, nutrition, general condition of the patient, and similar factors well known to the attending physician. In general, the treatment regimen will include the administration of one or more antibody molecules of the invention, or one or more compositions containing such antibodies, in therapeutically effective amounts or doses.

В целом, для лечения и/или ослабления заболеваний, нарушений и состояний, указанных в настоящей заявке, и в зависимости от специфического заболевания, нарушения или состояния, подвергаемого лечению, эффективности используемой специфической молекулы антитела согласно изобретению, специфического пути введения и специфического используемого фармацевтического препарата или композиции, молекулы антител согласно изобретению обычно будут вводить в количестве в диапазоне от 0,005 до 20,0 мг на кг веса тела и дозе, предпочтительно в диапазоне от 0,05 до 10,0 мг/кг/дозу, и более предпочтительно в диапазоне от 0,5 до 10 мг/кг/дозу, либо непрерывно (например, путем инфузии) или более предпочтительно в виде однократных доз (таких как, например, два раза в неделю, недельных, или месячных доз; см. ниже), но могут существенно изменяться, в особенности, в зависимости от вышеуказанных параметров. Таким образом, в некоторых случаях, может быть достаточным применить дозу, меньшую, чем минимальная доза, указанная выше, в то время как в других случаях верхний предел может быть превышен. При введении больших количеств, может быть желательным разделить их на несколько меньших доз, распределенных в течение суток.In general, for the treatment and/or amelioration of the diseases, disorders and conditions described in this application, and depending on the specific disease, disorder or condition being treated, the effectiveness of the specific antibody molecule according to the invention used, the specific route of administration and the specific pharmaceutical preparation used or compositions, the antibody molecules of the invention will generally be administered in an amount in the range of 0.005 to 20.0 mg per kg of body weight and dose, preferably in the range of 0.05 to 10.0 mg/kg/dose, and more preferably in the range 0.5 to 10 mg/kg/dose, either continuously (eg by infusion) or more preferably in single doses (such as, for example, twice weekly, weekly, or monthly doses; see below), but may vary significantly, in particular depending on the above parameters. Thus, in some cases, it may be sufficient to apply a dose less than the minimum dose indicated above, while in other cases the upper limit may be exceeded. When large amounts are administered, it may be desirable to divide them into several smaller doses distributed throughout the day.

- 18 042707- 18 042707

В зависимости от специфической молекулы антитела согласно изобретению и ее специфических фармакокинетических и других свойств, она может вводиться раз в сутки, каждый второй, третий, четвертый, пятый или шестой день, еженедельно, ежемесячно и др. Схема введения может включать длительное, продолжающееся неделями, лечение. Длительное обозначает по меньшей мере две недели и предпочтительно длительность составляет месяцы или годы.Depending on the specific antibody molecule according to the invention and its specific pharmacokinetic and other properties, it can be administered once a day, every second, third, fourth, fifth or sixth day, weekly, monthly, etc. The regimen of administration may include long, lasting weeks, treatment. Long refers to at least two weeks and preferably the duration is months or years.

Эффективность молекул антител согласно изобретению и композиций, которые их содержат, можно тестировать, используя любые подходящие исследования в условиях in vitro, анализы на основании клеток, анализы in vivo и/или на животных моделях, известные per se, или любые их комбинации, в зависимости от специфического вовлеченного заболевания. Подходящие анализы и животные модели будут понятными для квалифицированного специалиста в данной области техники, и например, включают анализы и животные модели, используемые в примерах ниже.The efficacy of the antibody molecules of the invention and compositions containing them can be tested using any suitable in vitro assays, cell-based assays, in vivo assays and/or animal models known per se, or any combination thereof, depending from the specific disease involved. Suitable assays and animal models will be understood by those skilled in the art, and include, for example, the assays and animal models used in the examples below.

Препараты.Preparations.

Для фармацевтического применения, молекулы антител согласно изобретению могут быть приготовлены в виде фармацевтического препарата, содержащего (I) по меньшей мере одно антитело согласно изобретению (т.е. антитело к PD1 согласно изобретению или антитело к LAG3 согласно изобретению или оба типа антител согласно изобретению совместно) и (II) по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель, наполнитель, адъювант, и/или стабилизатор, и (III) необязательно один или несколько дополнительных фармакологически активных полипептидов и/или соединений. Фармацевтически приемлемый обозначает, что соответствующий материал не проявляет какого-либо биологического или других нежелательных побочных эффектов, при введении индивидууму и не взаимодействует отрицательным образом с любыми другими компонентами фармацевтической композиции (такими как, например, фармацевтически активный компонент), в которой он содержится. Специфические примеры можно найти в стандартных пособиях, таких как, например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-ое изд., изд-во Mack Publishing Company, USA (1990). Например, антитела согласно изобретению могут быть приготовлены в виде препарата и вводиться с помощью любого способа, известного per se, для общепринятых антител и фрагментов антител и других фармацевтически активных белков. Таким образом, в соответствии с дальнейшим вариантом осуществления, изобретение относится к фармацевтической композиции или препарату, которая(ый) содержит по меньшей мере одно из антител согласно изобретению и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель, наполнитель, адъювант и/или стабилизатор, и необязательно один или несколько дополнительных фармакологически активных веществ.For pharmaceutical use, the antibody molecules of the invention may be formulated into a pharmaceutical formulation comprising (I) at least one antibody of the invention (i.e., an anti-PD1 antibody of the invention or an anti-LAG3 antibody of the invention, or both types of antibodies of the invention together ) and (II) at least one pharmaceutically acceptable carrier, diluent, excipient, adjuvant, and/or stabilizer, and (III) optionally one or more additional pharmacologically active polypeptides and/or compounds. Pharmaceutically acceptable means that the material in question does not exhibit any biological or other undesirable side effects when administered to an individual and does not adversely interact with any other components of the pharmaceutical composition (such as, for example, the pharmaceutically active ingredient) in which it is contained. Specific examples can be found in standard manuals such as, for example, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Company, USA (1990). For example, antibodies of the invention may be formulated and administered by any method known per se for conventional antibodies and antibody fragments and other pharmaceutically active proteins. Thus, in accordance with a further embodiment, the invention relates to a pharmaceutical composition or preparation, which(th) contains at least one of the antibodies according to the invention and at least one pharmaceutically acceptable carrier, diluent, excipient, adjuvant and/or stabilizer, and optionally one or more additional pharmacologically active substances.

Фармацевтические препараты для парентерального введения, такого как внутривенная, внутримышечная, подкожная инъекция или внутривенная инфузия, могут представлять собой, например, стерильные растворы, суспензии, дисперсии, эмульсии, или порошки, которые содержат активный компонент и которые являются подходящими, необязательно после дополнительной стадии растворения или разведения, для инфузии или инъекции. Подходящие носители или разбавители для таких препаратов включают, например, без ограничений, стерильную воду и фармацевтически приемлемые водные буферы и такие растворы, как физиологический фосфатно-солевой буферный раствор, растворы Рингера, раствор декстрозы, и раствор Хенска; водные масла; глицерин; этанол; гликоли, такие как пропиленгликоль, а также минеральные масла, животные масла и растительные масла, например, арахисовое масло, соевое масло, а также их подходящие смеси.Pharmaceutical preparations for parenteral administration, such as intravenous, intramuscular, subcutaneous injection or intravenous infusion, may be, for example, sterile solutions, suspensions, dispersions, emulsions, or powders which contain the active ingredient and which are suitable, optionally after an additional dissolution step or dilution, for infusion or injection. Suitable carriers or diluents for such preparations include, for example, without limitation, sterile water and pharmaceutically acceptable aqueous buffers and solutions such as physiological phosphate buffered saline, Ringer's solutions, dextrose solution, and Hensk's solution; aqueous oils; glycerol; ethanol; glycols such as propylene glycol, as well as mineral oils, animal oils and vegetable oils such as peanut oil, soybean oil, and suitable mixtures thereof.

Растворы молекул антител согласно изобретению также могут содержать консервант для предотвращения роста микроорганизмов, такой как антибактериальные и противогрибковые агенты, например, п-гидроксибензоаты, парабены, хлорбутанол, фенол, сорбиновая кислота, тиомерсаль, (соли щелочных металлов) этилендиамин тетрауксусной кислоты, и другие. Во многих случаях, будет являться желательным включать изотонические агенты, например, сахара, буферы или хлорид натрия. Необязательно, можно использовать эмульсификаторы и/или диспергирующие вещества. Можно поддерживать надлежащую текучесть, например, путем образования липосом, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии или путем применения поверхностно-активных веществ. Также можно добавлять другие агенты, замедляющие абсорбцию, например, моностеарат алюминия и желатин. Растворы можно заполнять во флаконы для инъекций, ампулы, сосуды для инфузий, и другие.The antibody molecule solutions of the invention may also contain a preservative to prevent the growth of microorganisms, such as antibacterial and antifungal agents, for example, p-hydroxybenzoates, parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thiomersal, (alkali metal salts) ethylenediamine tetraacetic acid, and others. In many cases, it will be desirable to include isotonic agents such as sugars, buffers or sodium chloride. Optionally, emulsifiers and/or dispersants can be used. Proper fluidity can be maintained, for example, by formation of liposomes, by maintaining the required particle size in the case of a dispersion, or by the use of surfactants. Other absorption delaying agents may also be added, such as aluminum monostearate and gelatin. Solutions can be filled into injection vials, ampoules, infusion vessels, and others.

Во всех случаях, конечная дозированная форма должна быть стерильной, жидкой и стабильной в условиях изготовления и хранения. Стерильные растворы для инъекций приготавливают путем включения активного соединения в необходимом количестве в подходящем растворителе с различными другими компонентами, перечисленными выше, при необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций, предпочтительными методами приготовления является технологии сушки в вакууме и лиофильной сушки, с помощью которых получают порошок активного компонента плюс любой дополнительный желательный компонент, присутствующий в предварительно профильтрованных стерилизацией растворах.In all cases, the final dosage form must be sterile, fluid and stable under the conditions of manufacture and storage. Sterile injectable solutions are prepared by incorporating the active compound in the required amount in a suitable solvent with various other components listed above, if necessary, followed by filtered sterilization. In the case of sterile powders for the preparation of sterile injectable solutions, the preferred methods of preparation are vacuum-drying and freeze-drying techniques, which yield a powder of the active ingredient plus any additional desired ingredient present in the pre-filtered sterilization solutions.

Обычно, предпочтительными являются водные растворы или суспензии. Как правило, подходящие препараты для терапевтических белков, таких как антитела согласно изобретению, представляют собой забуференые белковые растворы, такие как растворы, включающие белок в подходящей концентрацииGenerally, aqueous solutions or suspensions are preferred. Typically, suitable formulations for therapeutic proteins, such as antibodies of the invention, are buffered protein solutions, such as solutions containing the protein at a suitable concentration.

- 19 042707 (такой как, от 0,001 до 400 мг/мл, предпочтительно от 0,005 до 200 мг/мл, более предпочтительно от 0,01 до 200 мг/мл, более предпочтительно 1,0-100 мг/мл, например 1,0 мг/мл (в/в введение) или 100 мг/мл (п/к введение) и водный буфер, такой как:- 19 042707 (such as 0.001 to 400 mg/ml, preferably 0.005 to 200 mg/ml, more preferably 0.01 to 200 mg/ml, more preferably 1.0-100 mg/ml, e.g. 1, 0 mg/ml (i.v.) or 100 mg/ml (s.c.) and an aqueous buffer such as:

фосфатно-солевую забуференый раствор, рН 7,4, другие фосфатные буферы, рН от 6,2 до 8,2, ацетатные буферы, рН от 3,2 до 7,5, предпочтительно рН от 4,8 до 5,5, гистидиновые буферы, рН от 5,5 до 7,0, сукцинатные буферы, рН от 3,2 до 6,6, и цитратные буферы, рН от 2,1 до 6,2, и, необязательно, соли (например, NaCl) и/или сахара (такие как, например, сахароза и трегалоза) и/или другие полиспирты (такие как, например, маннит и глицерин) для обеспечения изотоничности раствора.phosphate buffered saline, pH 7.4, other phosphate buffers, pH 6.2 to 8.2, acetate buffers, pH 3.2 to 7.5, preferably pH 4.8 to 5.5, histidine buffers, pH 5.5 to 7.0, succinate buffers, pH 3.2 to 6.6, and citrate buffers, pH 2.1 to 6.2, and optionally salts (e.g., NaCl) and /or sugars (such as, for example, sucrose and trehalose) and/or other polyalcohols (such as, for example, mannitol and glycerin) to ensure that the solution is isotonic.

Предпочтительными буферными белковыми растворами являются растворы, включающие приблизительно 0,05 мг/мл антитела согласно изобретению, растворенного в 25 мМ фосфатного буфера, рН 6,5, доведенного до изотоничности путем добавления 220 мМ трегалозы. Дополнительно, в такие растворы можно включать другие агенты, такие как детергент, например, 0,02% Твин-20 или Твин-80. Препараты для подкожного введения могут включать существенно более высокие концентрации антитела согласно изобретению, такие как вплоть до 100 мг/мл или даже выше 100 мг/мл. Тем не менее, для квалифицированного специалиста в данной области техники будет понятным, что компоненты и их количества, как описано выше, представляют только один, предпочтительный вариант. Их альтернативы и вариации будут легко понятными для квалифицированного специалиста в данной области техники, или легко могут быть представлены, на основании вышеприведенного раскрытия.Preferred buffered protein solutions are those containing approximately 0.05 mg/ml of an antibody of the invention dissolved in 25 mM phosphate buffer, pH 6.5, adjusted to isotonicity with 220 mM trehalose. Additionally, other agents such as a detergent such as 0.02% Tween-20 or Tween-80 may be included in such solutions. Formulations for subcutaneous administration may include substantially higher concentrations of the antibody of the invention, such as up to 100 mg/ml or even above 100 mg/ml. However, those skilled in the art will appreciate that the components and their amounts as described above represent only one, preferred option. Alternatives and variations thereof will be readily understood by those skilled in the art, or readily represented, based on the above disclosure.

В соответствии с дальнейшим аспектом осуществления изобретения, молекула антитела согласно изобретению может использоваться в комбинации с устройством, пригодным для введения антитела, таким как шприц, шприц-ручка, микронасос или другое устройство.According to a further aspect of the invention, the antibody molecule of the invention may be used in combination with a device suitable for administering the antibody, such as a syringe, pen, micropump, or other device.

Терапевтические применения.Therapeutic applications.

Дальнейший аспект изобретения обеспечивает способ лечения злокачественного новообразования, включающий введение пациенту, который в этом нуждается, терапевтически эффективного количества молекулы антитела к PD1 согласно изобретению. В предпочтительном варианте осуществления способ дополнительно включает введение такому пациенту молекулы антитела к LAG3. Предпочтительно молекула антитела к LAG3 представляет собой молекулу антитела к LAG3 согласно изобретению.A further aspect of the invention provides a method of treating cancer comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of an anti-PD1 antibody molecule of the invention. In a preferred embodiment, the method further comprises administering to such a patient an anti-LAG3 antibody molecule. Preferably, the anti-LAG3 antibody molecule is an anti-LAG3 antibody molecule according to the invention.

Дальнейший аспект изобретения обеспечивает молекулу антитела к PD1 согласно изобретению для применения в способе лечения злокачественного новообразования. В предпочтительном варианте осуществления, дальнейший аспект включает дополнительное применение молекулы антитела к LAG3. Предпочтительно молекула антитела к LAG3 представляет собой молекулу антитела к LAG3 согласно изобретению.A further aspect of the invention provides an anti-PD1 antibody molecule of the invention for use in a method of treating cancer. In a preferred embodiment, a further aspect comprises the additional use of an anti-LAG3 antibody molecule. Preferably, the anti-LAG3 antibody molecule is an anti-LAG3 antibody molecule according to the invention.

Дальнейший аспект изобретения представляет собой применение молекулы антитела к PD1 согласно изобретению для приготовления фармацевтической композиции для лечения злокачественного новообразования. В предпочтительном варианте осуществления, дальнейший аспект включает дополнительное применение молекулы антитела к LAG3. Предпочтительно молекула антитела к LAG3 представляет собой молекулу антитела к LAG3 согласно изобретению.A further aspect of the invention is the use of an anti-PD1 antibody molecule according to the invention for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of cancer. In a preferred embodiment, a further aspect comprises the additional use of an anti-LAG3 antibody molecule. Preferably, the anti-LAG3 antibody molecule is an anti-LAG3 antibody molecule according to the invention.

В варианте осуществления, молекулу антитела к PD1 вводят одновременно, конкурентно, последовательно, один за другим, альтернативно или раздельно, с молекулой антитела к LAG3.In an embodiment, the anti-PD1 antibody molecule is administered simultaneously, competitively, sequentially, one after the other, alternatively, or separately, with the anti-LAG3 antibody molecule.

Дальнейший аспект изобретения обеспечивает способ лечения злокачественного новообразования, включающий введение пациенту, который в этом нуждается, терапевтически эффективного количества молекулы антитела к LAG3 согласно изобретению. В предпочтительном варианте осуществления способ дополнительно включает введение такому пациенту молекулы антитела к PD1. Предпочтительно молекула антитела к LAG3 представляет собой молекулу антитела к PD1 согласно изобретению.A further aspect of the invention provides a method of treating cancer comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of an anti-LAG3 antibody molecule of the invention. In a preferred embodiment, the method further comprises administering to such a patient an anti-PD1 antibody molecule. Preferably, the anti-LAG3 antibody molecule is an anti-PD1 antibody molecule according to the invention.

Дальнейший аспект изобретения обеспечивает молекулу антитела к LAG3 согласно изобретению для применения в способе лечения злокачественного новообразования. В предпочтительном варианте осуществления, дальнейший аспект включает дополнительное применение молекулы антитела к PD1. Предпочтительно молекула антитела к PD1 представляет собой молекулу антитела к PD1 согласно изобретению.A further aspect of the invention provides an anti-LAG3 antibody molecule of the invention for use in a method of treating cancer. In a preferred embodiment, a further aspect comprises the additional use of an anti-PD1 antibody molecule. Preferably, the anti-PD1 antibody molecule is an anti-PD1 antibody molecule of the invention.

Дальнейший аспект изобретения представляет собой применение молекулы антитела к LAG3 согласно изобретению для приготовления фармацевтической композиции для лечения злокачественного новообразования. В предпочтительном варианте осуществления, дальнейший аспект включает дополнительное применение молекулы антитела к PD1. Предпочтительно молекула антитела к PD1 представляет собой молекулу антитела к PD1 согласно изобретению.A further aspect of the invention is the use of an anti-LAG3 antibody molecule according to the invention for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of cancer. In a preferred embodiment, a further aspect comprises the additional use of an anti-PD1 antibody molecule. Preferably, the anti-PD1 antibody molecule is an anti-PD1 antibody molecule of the invention.

В варианте осуществления, молекулу антитела к LAG3 вводят одновременно, конкурентно, последовательно, один за другим, альтернативно или раздельно, с молекулой антитела к PD1.In an embodiment, the anti-LAG3 antibody molecule is administered simultaneously, competitively, sequentially, one after the other, alternatively, or separately, with the anti-PD1 antibody molecule.

Для исключения неопределенности, аспекты медицинских применений согласно изобретению могут включать любые их специфических молекула антител к PD1 согласно изобретению и/или молекулFor the avoidance of doubt, aspects of the medical uses of the invention may include any of the invention's specific anti-PD1 antibody molecule and/or

- 20 042707 антитела к LAG3 согласно изобретению, как описано выше.- 20 042707 antibodies to LAG3 according to the invention, as described above.

Благодаря их биологическим свойствам, антитела согласно изобретению пригодны для лечения заболеваний, характеризующихся чрезмерной или атипичной пролиферацией клеток, таких как злокачественное новообразование.Due to their biological properties, the antibodies of the invention are useful in the treatment of diseases characterized by excessive or atypical cell proliferation, such as cancer.

Как используется в настоящей заявке, термин злокачественное новообразование охватывает все типы злокачественного роста или онкогенных процессов, метастатических тканей или злокачественно трансформированных клеток, тканей или органов, независимо от гистопатологического типа или стадии инвазивности. Примеры злокачественных нарушений включают, но не ограничиваясь только ими, солидные опухоли, гематологические злокачественные опухоли, опухоли мягких тканей и метастатические поражения. Примеры солидных опухолей включают злокачественные образования, например, саркомы, и карциномы (включая аденокарциномы и плоскоклеточные карциномы) различных систем органов, такие как те, которые поражают печень, легкие, молочную железу, лимфоидную систему, желудочнокишечный тракт (например, ободочную кишку), мочеполовой тракт (например, почечные, уротелиальные клетки), предстательной железы и глотки. Аденокарциномы включают злокачественные образования, такие как главным образом, рак ободочной кишки, рак прямой кишки, почечно-клеточную карциному, рак печени, немелкоклеточный рак легких, рак тонкого кишечника и рак пищевода. Плоскоклеточные карциномы включают злокачественные образования, например, в легких, пищеводе, коже, области головы и шеи, ротовой полости, анального отверстия и шейки матки. В одном варианте осуществления, злокачественное новообразование представляет собой меланому, например, меланому на поздней стадии. Метастатические поражения вышеуказанных злокачественных новообразований также можно лечить или предотвращать, используя способы и композиции, описанные в настоящей заявке.As used in this application, the term malignancy encompasses all types of malignant growth or oncogenic processes, metastatic tissues or malignantly transformed cells, tissues or organs, regardless of the histopathological type or stage of invasiveness. Examples of malignant disorders include, but are not limited to, solid tumors, hematologic malignancies, soft tissue tumors, and metastatic lesions. Examples of solid tumors include malignancies such as sarcomas and carcinomas (including adenocarcinomas and squamous cell carcinomas) of various organ systems such as those affecting the liver, lungs, breast, lymphoid system, gastrointestinal tract (eg colon), urogenital tract (eg, renal, urothelial cells), prostate, and pharynx. Adenocarcinomas include malignancies such as mainly colon cancer, rectal cancer, renal cell carcinoma, liver cancer, non-small cell lung cancer, small intestine cancer, and cancer of the esophagus. Squamous cell carcinomas include malignancies in, for example, the lungs, esophagus, skin, head and neck, mouth, anus, and cervix. In one embodiment, the cancer is a melanoma, such as advanced melanoma. Metastatic lesions of the above malignancies can also be treated or prevented using the methods and compositions described in this application.

Типичные злокачественные новообразования, рост которых можно ингибировать, используя молекулы антител, описанные в настоящей заявке, включают злокачественные новообразования, типично отвечающие на иммунотерапию.Typical malignant neoplasms, the growth of which can be inhibited using the antibody molecules described in this application, include malignant neoplasms that typically respond to immunotherapy.

Например, можно лечить следующие злокачественные новообразования, опухоли и другие пролиферативные заболевания с помощью антител в соответствии с изобретением, но не ограничиваясь только ими.For example, the following cancers, tumors, and other proliferative diseases can be treated with antibodies according to the invention, but not limited to.

Злокачественные новообразования головы и шеи; злокачественные новообразования легких, такие как, например, немелкоклеточный рак легких (NSCLC) и мелкоклеточный рак легких (SCLC); опухоли средостения, такие как, например, нейрогенные опухоли и мезенхимальные опухоли; злокачественные новообразования желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), такие как, например, злокачественные новообразования пищевода, желудка (рак желудка), поджелудочной железы, печени и желчных проток (включая, например, гепато-целлюлярную карциному (НСС)), и тонкого и толстого кишечника (включая, например, рак ободочной и прямой кишки); рак предстательной железы; рак яичек; злокачественные новообразования женских половых органов, такие как, например, злокачественные новообразования яичников; злокачественные новообразования молочной железы, такие как, например, карцинома молочной железы, гормон-рецептор-положительный рак молочной железы, Her2 положительный рак молочной железы, и трижды негативный рак молочной железы; злокачественные новообразования эндокринной системы; саркомы мягких тканей, такие как, например, фибросаркома, рабдомиосаркома, ангиосаркома, саркома Капоши; саркомы костей, такие как, например, миелома, остеосаркома, опухоль Юинга, фибросаркома, остеохондрома, осетобластома, и хондробластома; мезотелиомы;Malignant neoplasms of the head and neck; lung cancers such as, for example, non-small cell lung cancer (NSCLC) and small cell lung cancer (SCLC); mediastinal tumors such as, for example, neurogenic tumors and mesenchymal tumors; malignant neoplasms of the gastrointestinal tract (GIT), such as, for example, malignant neoplasms of the esophagus, stomach (gastric cancer), pancreas, liver, and bile ducts (including, for example, hepatocellular carcinoma (HCC)), and thin and thick intestines (including, for example, cancer of the colon and rectum); prostate cancer; testicular cancer; malignant neoplasms of the female genital organs, such as, for example, malignant neoplasms of the ovaries; breast cancers such as, for example, breast carcinoma, hormone receptor positive breast cancer, Her2 positive breast cancer, and triple negative breast cancer; malignant neoplasms of the endocrine system; soft tissue sarcomas such as, for example, fibrosarcoma, rhabdomyosarcoma, angiosarcoma, Kaposi's sarcoma; bone sarcomas such as, for example, myeloma, osteosarcoma, Ewing's tumor, fibrosarcoma, osteochondroma, osetoblastoma, and chondroblastoma; mesothelioma;

злокачественные новообразования кожи, такие как, например, базальноклеточная карцинома, плоскоклеточная карцинома, карцинома из клеток Меркеля, и меланома; новообразования центральной нервной системы и головного мозга, такие как, например, астроцитома, глиобластома, глиомы нейробластомы, и ретинобластомы; лимфомы и лейкозы такие как, например, неходжкинские В-клеточные лимфомы (NHL), неходжкинские Т-клеточные лимфомы, хронический В-клеточный лимфоцитарный лейкоз (BCLL), хронический Т-клеточный лимфоцитарный лейкоз (T-CLL), болезнь Ходжкина (HD), лейкоз из больших зернистых лимфоцитов (LGL), хронический миелоидный лейкоз (CML), острый миелогенный/ миелоидный лейкоз (AML), острый лимфатический/лимфобластный лейкоз (ALL), множественная миелома (ММ), плазмацитома и миелодиспластические синдромы (MDS); и злокачественные новообразования неизвестного первичного участка.skin cancers such as, for example, basal cell carcinoma, squamous cell carcinoma, Merkel cell carcinoma, and melanoma; neoplasms of the central nervous system and brain, such as, for example, astrocytoma, glioblastoma, neuroblastoma gliomas, and retinoblastomas; lymphomas and leukemias such as, for example, non-Hodgkin's B-cell lymphomas (NHL), non-Hodgkin's T-cell lymphomas, chronic B-cell lymphocytic leukemia (BCLL), chronic T-cell lymphocytic leukemia (T-CLL), Hodgkin's disease (HD) , large granular lymphocyte leukemia (LGL), chronic myeloid leukemia (CML), acute myelogenous/myeloid leukemia (AML), acute lymphatic/lymphoblastic leukemia (ALL), multiple myeloma (MM), plasmacytoma and myelodysplastic syndromes (MDS); and malignancies of unknown primary site.

В предпочтительном варианте осуществления согласно изобретению злокачественное новообразование представляет собой рак легких, предпочтительно немелкоклеточный рак легких (NSCLC).In a preferred embodiment according to the invention, the malignancy is lung cancer, preferably non-small cell lung cancer (NSCLC).

Все злокачественные новообразования, опухоли, неоплазмы и т.д., указанные выше, которые характеризуются их специфической локализацией/происхождением в организме, охватывают как первичные опухоли, так и метастатические опухоли, имеющие происхождение из них.All malignant neoplasms, tumors, neoplasms, etc., mentioned above, which are characterized by their specific location/origin in the body, cover both primary tumors and metastatic tumors derived from them.

Представляется возможным, что пациент более вероятно отвечает на лечение с применением молекулы антитела согласно изобретению (как описано в настоящей заявке), если пациент имеет злокачественное новообразование, которое характеризуется наличием высокой экспрессии PD-L1, и/или где злокачественное новообразование собой инфильтровано противоопухолевыми иммунными клетками, например, лимфоцитами, инфильтрующими опухоль. В данном случае, обеспечивается вариант осуществ- 21 042707 ления изобретения, в котором пациент, подвергаемый лечению, имеет злокачественное новообразование, которое характеризуется наличием высокой экспрессии PD-L1 и/или где злокачественное новообразование инфильтровано противоопухолевыми иммунными клетками.It is possible that a patient is more likely to respond to treatment with an antibody molecule of the invention (as described herein) if the patient has a cancer that is characterized by high expression of PD-L1 and/or where the cancer is infiltrated with antitumor immune cells. , for example, lymphocytes infiltrating the tumor. Here, an embodiment of the invention is provided wherein the patient being treated has a cancer that is characterized by high expression of PD-L1 and/or where the cancer is infiltrated with antitumor immune cells.

Кроме того, представляется возможным, что пациент более вероятно отвечает на лечение с применением молекулы антитела согласно изобретению (как описано в настоящей заявке), если пациент имеет злокачественное новообразование, которое характеризуется наличием высокой мутационной нагрузки Примеры, как может быть оценена высокая мутационная нагрузка, включают определение того, будет ли злокачественное новообразование характеризоваться наличием микросателлитных нестабильностей, или плохими эффективностями репарации ошибочно спаренных оснований ДНК. Полагают, что такие злокачественные новообразования являются более иммуногенными и, следовательно, более вероятно отвечают на лечение с применением иммуномодуляторных терапевтических схем, таких как молекула антитела согласно изобретению. В данном случае, обеспечивается вариант осуществления изобретения, в котором пациент, подвергаемый лечению, имеет злокачественное новообразование, которое характеризуется наличием высокой мутационной нагрузки.It is also possible that a patient is more likely to respond to treatment with an antibody molecule of the invention (as described herein) if the patient has a cancer that is characterized by the presence of a high mutation load. Examples of how a high mutation load can be assessed include determining whether the malignancy will be characterized by the presence of microsatellite instabilities, or poor DNA mismatch repair efficiencies. Such cancers are believed to be more immunogenic and therefore more likely to respond to treatment with immunomodulatory therapeutic regimens such as an antibody molecule of the invention. Here, an embodiment of the invention is provided wherein the patient being treated has a cancer that is characterized by having a high mutation load.

Молекулы антител согласно изобретению могут использоваться в терапевтических схемах в контексте лечения первой линий, второй линии, или любой дальнейшей линии лечения.The antibody molecules of the invention may be used in therapeutic regimens in the context of first line treatment, second line treatment, or any further line of treatment.

Молекулы антител согласно изобретению могут использоваться для предотвращения, кратковременного или продолжительного лечения вышеуказанных заболеваний, необязательно также в комбинации с лучевой терапией и/или хирургией.The antibody molecules according to the invention can be used for the prevention, short-term or long-term treatment of the above diseases, optionally also in combination with radiation therapy and/or surgery.

Несомненно, описанное выше также включает применение молекул антител согласно изобретению в различных способах лечения вышеописанных заболеваний путем введения терапевтически эффективной дозы пациенту, который в этом нуждается, а также применения этих молекул антител для приготовления лекарственных средств для лечения таких заболеваний, а также фармацевтических композиций, включающих такие молекулы антител согласно изобретению, а также препараты и/или приготовление лекарственных средств, включающих такие антитела согласно изобретению, и др.Undoubtedly, the above also includes the use of antibody molecules according to the invention in various methods of treating the above diseases by administering a therapeutically effective dose to a patient in need, as well as the use of these antibody molecules for the preparation of drugs for the treatment of such diseases, as well as pharmaceutical compositions, including such antibody molecules according to the invention, as well as preparations and/or preparation of medicines, including such antibodies according to the invention, etc.

Комбинации с другими активными веществами или лечениями.Combinations with other active substances or treatments.

Молекула антитела согласно изобретению, или комбинация антитела к PD1 согласно изобретению и антитела к LAG3 согласно изобретению, может использоваться самостоятельно или в комбинации с одним или несколькими дополнительными лекарственными средствами, в особенности выбранными из химиотерапевтических средств, таких как средства, повреждающие ДНК, или терапевтически активных соединений, которые ингибируют ангиогенез, пути передачи сигналов или митотические контрольные точки в раковых клетках.An antibody molecule of the invention, or a combination of an anti-PD1 antibody of the invention and an anti-LAG3 antibody of the invention, may be used alone or in combination with one or more additional drugs, in particular selected from chemotherapeutic agents such as DNA damaging agents or therapeutically active agents. compounds that inhibit angiogenesis, signaling pathways, or mitotic checkpoints in cancer cells.

Дополнительное терапевтическое средство может вводиться одновременно с, необязательно в качестве компонента одного и того же фармацевтического препарата, или перед или после введения молекулы антитела.The additional therapeutic agent may be administered simultaneously with, optionally as a component of the same pharmaceutical formulation, or before or after administration of the antibody molecule.

В определенных вариантах осуществления, дополнительное терапевтическое средство может представлять собой, без ограничений, один или несколько ингибиторов, выбранных из группы ингибиторов EGFR, VEGFR, HER2-neu, Her3, AuroraA, AuroraB, PLK и PI3 киназы, FGFR, PDGFR, Raf, Ras, KSP, PDK1, PTK2, IGF-R или IR.In certain embodiments, the additional therapeutic agent may be, without limitation, one or more inhibitors selected from the group of inhibitors of EGFR, VEGFR, HER2-neu, Her3, AuroraA, AuroraB, PLK and PI3 kinase, FGFR, PDGFR, Raf, Ras , KSP, PDK1, PTK2, IGF-R or IR.

Дальнейшими примерами дополнительных лекарственных средств являются ингибиторы CDK, Akt, src/bcr abl, cKit, cMet/HGF, c-Myc, Flt3, HSP90, hedgehog антагонисты, ингибиторы JAK/STAT, Mek, mTor, NFкаппаВ, протеасомы, Rho, ингибитор wnt передачи сигналов или ингибитор пути убиквитинилирования или другой ингибитор Notch пути передачи сигналов.Further examples of additional drugs are CDK inhibitors, Akt, src/bcr abl, cKit, cMet/HGF, c-Myc, Flt3, HSP90, hedgehog antagonists, JAK/STAT inhibitors, Mek, mTor, NFkappaB, proteasome, Rho, wnt inhibitor signaling or an inhibitor of the ubiquitinylation pathway, or another inhibitor of the Notch signaling pathway.

Примерами ингибиторы Aurora являются, без ограничений, РНА-739358, AZD-1152, AT 9283, CYC116, R-763, VX-680, VX-667, MLN-8045, PF-3814735.Examples of Aurora inhibitors are, without limitation, PHA-739358, AZD-1152, AT 9283, CYC116, R-763, VX-680, VX-667, MLN-8045, PF-3814735.

Примером для PLK ингибитор является GSK-461364.An example for a PLK inhibitor is GSK-461364.

Примерами для raf ингибиторов являются BAY-73-4506 (также VEGFR ингибитор), PLX 4032, RAF-265 (также дополнительно VEGFR ингибитор), сорафениб (также дополнительно VEGFR ингибитор), и XL 281.Examples for raf inhibitors are BAY-73-4506 (also a VEGFR inhibitor), PLX 4032, RAF-265 (also an optional VEGFR inhibitor), sorafenib (also an optional VEGFR inhibitor), and XL 281.

Примерами для KSP ингибиторы являются испинесиб, ARRY-520, AZD-4877, CK-1122697, GSK 246053A, GSK-923295, MK-0731, и SB-743921.Examples for KSP inhibitors are ispinesib, ARRY-520, AZD-4877, CK-1122697, GSK 246053A, GSK-923295, MK-0731, and SB-743921.

Примерами для src и/или bcr-abl ингибиторов являются дазатиниб, AZD-0530, бозутиниб, XL 228 (также IGF-1R ингибитор), нилотиниб (также PDGFR и cKit ингибитор), иматиниб (также cKit ингибитор), и NS-187.Examples of src and/or bcr-abl inhibitors are dasatinib, AZD-0530, bosutinib, XL 228 (also an IGF-1R inhibitor), nilotinib (also a PDGFR and cKit inhibitor), imatinib (also a cKit inhibitor), and NS-187.

Примером для PDK1 ингибитора является ВХ-517.An example for a PDK1 inhibitor is BX-517.

Примером для Rho ингибитора является ВА-210.An example for a Rho inhibitor is BA-210.

Примерами для ингибиторов PI3 киназы являются РХ-866, BEZ-235 (также mTor ингибитор), XL 418 (также Akt ингибитор), XL-147, и XL 765 (также mTor ингибитор).Examples for PI3 kinase inhibitors are PX-866, BEZ-235 (also an mTor inhibitor), XL 418 (also an Akt inhibitor), XL-147, and XL 765 (also an mTor inhibitor).

Примерами для ингибиторов cMet или HGF являются XL-184 (также ингибитор VEGFR, cKit, Flt3), PF-2341066, MK-2461, XL-880 (также ингибитор VEGFR), MGCD-265 (также ингибитор VEGFR, Ron, Tie2), SU-11274, PHA-665752, AMG-102, и AV-299.Examples for cMet or HGF inhibitors are XL-184 (also VEGFR inhibitor, cKit, Flt3), PF-2341066, MK-2461, XL-880 (also VEGFR inhibitor), MGCD-265 (also VEGFR inhibitor, Ron, Tie2), SU-11274, PHA-665752, AMG-102, and AV-299.

Примером для с-Мус ингибитора является СХ-3543.An example for a c-Mus inhibitor is CX-3543.

- 22 042707- 22 042707

Примерами для Flt3 ингибиторов являются АС-220 (также ингибитор cKit и PDGFR), KW 2449, лестауртиниб (также ингибитор VEGFR, PDGFR, PKC), TG-101348 (также ингибитор JAK2), XL-999 (также ингибитор cKit, FGFR, PDGFR и VEGFR), сунитиниб (также ингибитор PDGFR, VEGFR и cKit), и тандутиниб (также ингибитор PDGFR, и cKit).Examples of Flt3 inhibitors are AC-220 (also a cKit and PDGFR inhibitor), KW 2449, lestaurtinib (also a VEGFR, PDGFR, PKC inhibitor), TG-101348 (also a JAK2 inhibitor), XL-999 (also a cKit, FGFR, PDGFR inhibitor). and VEGFR), sunitinib (also an inhibitor of PDGFR, VEGFR, and cKit), and tandutinib (also an inhibitor of PDGFR, and cKit).

Примерами для HSP90 ингибиторов являются танеспимицин, алвеспимицин, IPI-504 и CNF 2024.Examples for HSP90 inhibitors are tanespimycin, alvespimycin, IPI-504 and CNF 2024.

Примерами для JAK/STAT ингибиторов являются CYT-997 (также взаимодействующий с тубулином), TG 101348 (также ингибитор Flt3), и XL-019.Examples for JAK/STAT inhibitors are CYT-997 (also interacting with tubulin), TG 101348 (also an Flt3 inhibitor), and XL-019.

Примерами для Mek ингибиторов являются ARRY-142886, PD-325901, AZD-8330, и XL 518.Examples for Mek inhibitors are ARRY-142886, PD-325901, AZD-8330, and XL 518.

Примерами для mTor ингибиторы являются темсиролимус, АР-23573 (который также действует в качестве VEGF ингибитора), эверолимус (VEGF ингибитор дополнительно). XL-765 (также PI3 киназа ингибитор), и BEZ-235 (также ингибитор PI3 киназы).Examples for mTor inhibitors are temsirolimus, AP-23573 (which also acts as a VEGF inhibitor), everolimus (an additional VEGF inhibitor). XL-765 (also a PI3 kinase inhibitor), and BEZ-235 (also a PI3 kinase inhibitor).

Примерами для Akt ингибиторов являются перифозин, GSK-690693, RX-0201, и трицирибин.Examples for Akt inhibitors are perifosine, GSK-690693, RX-0201, and triciribine.

Примерами для cKit ингибиторов являются АВ-1010, OSI-930 (также действует в качестве VEGFR ингибитора), АС-220 (также ингибитор Flt3 и PDGFR), тандутиниб (также ингибитор Flt3 и PDGFR), акситиниб (также ингибитор VEGFR и PDGFR), XL-999 (также ингибитор Flt3, PDGFR, VEGFR, fGfR), сунитиниб (также ингибитор Flt3, PDGFR, VEGFR), и XL-820 (также действует в качестве VEGFR- и PDGFR ингибитор), иматиниб (также bcr-abl ингибитор), нилотиниб (также ингибитор bcr-abl и PDGFR).Examples for cKit inhibitors are AB-1010, OSI-930 (also acts as a VEGFR inhibitor), AC-220 (also an Flt3 and PDGFR inhibitor), tandutinib (also an Flt3 and PDGFR inhibitor), axitinib (also a VEGFR and PDGFR inhibitor), XL-999 (also an Flt3, PDGFR, VEGFR, fGfR inhibitor), sunitinib (also an Flt3, PDGFR, VEGFR inhibitor), and XL-820 (also acts as a VEGFR- and PDGFR inhibitor), imatinib (also a bcr-abl inhibitor) , nilotinib (also a bcr-abl and PDGFR inhibitor).

Примерами для hedgehog антагонистов являются IPI-609 и CUR-61414.Examples for hedgehog antagonists are IPI-609 and CUR-61414.

Примерами для CDK ингибиторов являются селициклиб, АТ-7519, Р-276, ZK-CDK (также ингибирующий VEGFR2 и PDGFR), PD-332991, R-547, SNS-032, РНА-690509, и AG 024322.Examples for CDK inhibitors are seliciclib, AT-7519, P-276, ZK-CDK (also inhibitory of VEGFR2 and PDGFR), PD-332991, R-547, SNS-032, PHA-690509, and AG 024322.

Примерами для ингибиторов протеасомы являются бортезомиб, карфилзомиб, и NPI-0052 (также ингибитор NFкаппаВ).Examples for proteasome inhibitors are bortezomib, carfilzomib, and NPI-0052 (also an NFkappaB inhibitor).

Примером для ингибитора NFкаппаВ пути является NPI-0052.An example for an NFkappaB pathway inhibitor is NPI-0052.

Примером для ингибитора пути убиквитинилирования является НВХ-41108.An example for an inhibitor of the ubiquitinylation pathway is HBX-41108.

В предпочтительных вариантах осуществления, дополнительное терапевтическое средство представляет собой антиангиогенное средство.In preferred embodiments, the additional therapeutic agent is an anti-angiogenic agent.

Примерами антиангиогенных средств являются ингибиторы FGFR, PDGFR и VEGFR или соответствующие лиганды (например, VEGF ингибиторы, такие как пегаптаниб или анти-VEGF антитело бевацизумаб), и талидомиды, такие агенты выбирают из, но не ограничиваясь только ими, нинтеданиб, бевацизумаб, мотезаниб, CDP-791, SU-14813, телатиниб, KRN-951, ZK-CDK (также ингибитор CDK), ABT869, BMS-690514, RAF-265, IMC-KDR, IMC-18F1, IMiD (иммуномодулирующие лекарственные средства), производное талидомида СС-4047, леналидомид, ENMD 0995, IMC-D11, Ki 23057, бриваниб, цедираниб, XL-999 (также ингибитор cKit и Flt3), 1B3, СР 868596, IMC 3G3, R-1530 (также ингибитор Flt3), сунитиниб (также ингибитор cKit и Flt3), акситиниб (также ингибитор cKit), лестауртиниб (также ингибитор Flt3 и PKC), ваталаниб, тандутиниб (также ингибитор Flt3 и cKit), пазопаниб, GW 786034, PF337210, IMC-1121B, AVE-0005, AG-13736, E-7080, CHIR 258, сорафениб тозилат (также ингибитор Raf), RAF-265 (также ингибитор Raf), вандетаниб, СР-547632, OSI-930, АЕЕ-788 (также ингибитор EGFR и Her2), BAY-57-9352 (также ингибитор Raf), BAY-73-4506 (также ингибитор Raf), XL 880 (также ингибитор cMet), XL-647 (также ингибитор EGFR и EphB4), XL 820 (также ингибитор cKit), и нилотиниб (также ингибитор cKit и brc-abl).Examples of anti-angiogenic agents are FGFR, PDGFR, and VEGFR inhibitors or corresponding ligands (e.g., VEGF inhibitors such as pegaptanib or the anti-VEGF antibody bevacizumab), and thalidomides, such agents are selected from, but not limited to, nintedanib, bevacizumab, motezanib, CDP-791, SU-14813, Telatinib, KRN-951, ZK-CDK (also a CDK inhibitor), ABT869, BMS-690514, RAF-265, IMC-KDR, IMC-18F1, IMiD (immunomodulating drugs), thalidomide derivative CC-4047, lenalidomide, ENMD 0995, IMC-D11, Ki 23057, brivanib, cediranib, XL-999 (also cKit and Flt3 inhibitor), 1B3, CP 868596, IMC 3G3, R-1530 (also Flt3 inhibitor), sunitinib ( also cKit and Flt3 inhibitor), axitinib (also cKit inhibitor), lestaurtinib (also Flt3 and PKC inhibitor), vatalanib, tandutinib (also Flt3 and cKit inhibitor), pazopanib, GW 786034, PF337210, IMC-1121B, AVE-0005, AG -13736, E-7080, CHIR 258, sorafenib tosylate (also Raf inhibitor), RAF-265 (also Raf inhibitor), vandetanib, CP-547632, OSI-930, AEE-788 (also EGFR and Her2 inhibitor), BAY- 57-9352 (also a Raf inhibitor), BAY-73-4506 (also a Raf inhibitor), XL 880 (also a cMet inhibitor), XL-647 (also an EGFR and EphB4 inhibitor), XL 820 (also a cKit inhibitor), and nilotinib ( also an inhibitor of cKit and brc-abl).

Дополнительное терапевтическое средство также может выбрано из EGFR ингибиторов, оно может представлять собой низкомолекулярный EGFR ингибитор или анти-EGFR антитело. Примерами для анти-EGFR антитела, без ограничений, являются цетуксимаб, панитумумаб, матузумаб; примерами для низкомолекулярного EGFR ингибитора, без ограничений, являются гефитиниб, афатиниб, осимертиниб и олмутиниб. Другим примером для EGFR модулятора является EGF слитый токсин.The additional therapeutic agent may also be selected from EGFR inhibitors and may be a small molecule EGFR inhibitor or an anti-EGFR antibody. Examples for anti-EGFR antibodies, without limitation, are cetuximab, panitumumab, matuzumab; examples for a small molecule EGFR inhibitor include, without limitation, gefitinib, afatinib, osimertinib, and olmutinib. Another example for an EGFR modulator is the EGF fusion toxin.

В качестве EGFR и Her2 ингибиторов, пригодных для комбинации с молекулой антитела согласно изобретению, можно указать лапатиниб, гефитиниб, эрлотиниб, цетуксимаб, трастузумаб, нимотузумаб, залутумумаб, вандетаниб (также ингибитор VEGFR), пертузумаб, XL-647, HKI-272, BMS-599626 ARRY334543, AV 412, mAB-806, BMS-690514, JNJ-26483327, АЕЕ-788 (также ингибитор VEGFR), ARRY333786, IMC-11F8, Zemab.As EGFR and Her2 inhibitors suitable for combination with an antibody molecule of the invention, lapatinib, gefitinib, erlotinib, cetuximab, trastuzumab, nimotuzumab, zalutumumab, vandetanib (also a VEGFR inhibitor), pertuzumab, XL-647, HKI-272, BMS -599626 ARRY334543, AV 412, mAB-806, BMS-690514, JNJ-26483327, AEE-788 (also a VEGFR inhibitor), ARRY333786, IMC-11F8, Zemab.

Другими агентами, которые благоприятно могут комбинироваться в терапии с молекулами антител согласно изобретению, являются тозитумумаб и ибритумомаб тиуксетан (два радиоактивно-меченных анти-CD20 антитела), алемтузумаб (анти-CD52 антитело), денозумаб, (ингибитор лиганда фактора дифференциации остеокластов), галиксимаб (CD80 антагонист), офатумумаб (CD20 ингибитор), зинолимумаб (CD4 антагонист), SGN40 (модулятор рецептора CD40 лиганда), ритуксимаб (CD20 ингибитор) или мапатумумаб (агонист TRAIL-1 рецептора).Other agents that can be beneficially combined in therapy with the antibody molecules of the invention are tositumumab and ibritumomab tiuxetan (two radiolabeled anti-CD20 antibodies), alemtuzumab (anti-CD52 antibody), denosumab, (osteoclast differentiation factor ligand inhibitor), galiximab (CD80 antagonist), ofatumumab (CD20 inhibitor), zinolimumab (CD4 antagonist), SGN40 (CD40 ligand receptor modulator), rituximab (CD20 inhibitor), or mapatumumab (TRAIL-1 receptor agonist).

Другие химиотерапевтические средства, которые могут использоваться в комбинации с молекулам антител в соответствии с настоящим изобретением выбирают из, но не ограничиваясь только ими: гормоны, аналоги гормонов и антигормоны (например, тамоксифен, торемифен, ралоксифен, фулвестрант, мегестрол ацетат, флутамид, нилутамид, бикалутамид, ацетат ципротерона, финастерид, ацетат бусерелина, флудрокортизон, флуоксиместрон, медроксипрогестерон, октреотид, арзоксифен, пазиреотид, вапреотид), ингибиторы ароматазы (например, анастрозол, летрозол, лиарозол, эксеместан, атаместан,Other chemotherapeutic agents that can be used in combination with antibody molecules of the present invention are selected from, but not limited to: hormones, hormone analogs, and antihormones (e.g., tamoxifen, toremifene, raloxifene, fulvestrant, megestrol acetate, flutamide, nilutamide, bicalutamide, cyproterone acetate, finasteride, buserelin acetate, fludrocortisone, fluoxymestron, medroxyprogesterone, octreotide, arzoxifene, pasireotide, vapreotide), aromatase inhibitors (eg anastrozole, letrozole, liarozole, exemestane, atamestane,

- 23 042707 форместан), агонисты и антагонисты LHRH (например, ацетат гозерелина, лупролид, абареликс, цетрореликс, деслорелин, гистрелин, трипторелин), антиметаболиты (например, антифолаты, такие как метотрексат, пеметрексед, аналоги пиримидина, такие, как 5 фтороурацил, капецитабин, децитабин, неларабин и гемцитабин, аналоги пурина и аденозина, такие как меркаптопурин тиогуанин, кладрибин и пентостатин, цитарабин, флударабин); противоопухолевые антибиотики (например, антрациклины, такие, как доксорубицин, даунорубицин, эпирубицин и идарубицин, митомицин-С, блеомицин дактиномицин, пликамицин, митоксантрон, пиксантрон, стрептозоцин); производные платины (например, цисплатин, оксалиплатин, карбоплатин, лобаплатин, сатраплатин); алкилирующие агенты (например, эстрамустин, мехлорэтамин, мелфалан, хлорамбуцил, бусульфан, дакарбазин, циклофосфамид, ифосфамид, гидроксимочевина, темозоломид, нитрозомочевины, такие, как кармустин и ломустин, тиотепа); антимитотические агенты (например, алкалоиды барвинка, такие, как винбластин, виндезин, винорелбин, винфлунин и винкристин; и таксаны, такие, как паклитаксел, доцетаксел и их препараты, ларотаксел; симотаксел, и эпотилоны, такие, как иксабепилон, патупилон, ZK-EPO); ингибиторы топоизомеразы (например, эпидофиллотоксины, такие, как этопозид и этопофос, тенипозид, амсакрин, топотекан, иринотекан) и различные химиотерапевтические агенты, такие, как амифостин, анагрелид, интерферон альфа, прокарбазин, митотан, и порфимер, бексаротен, целекоксиб.- 23 042707 formestane), LHRH agonists and antagonists (e.g. goserelin acetate, luprolide, abarelix, cetrorelix, deslorelin, gistrelin, triptorelin), antimetabolites (e.g. antifolates such as methotrexate, pemetrexed, pyrimidine analogs such as 5 fluorouracil, capecitabine, decitabine, nelarabine and gemcitabine, purine and adenosine analogs such as mercaptopurine thioguanine, cladribine and pentostatin, cytarabine, fludarabine); antitumor antibiotics (eg anthracyclines such as doxorubicin, daunorubicin, epirubicin and idarubicin, mitomycin-C, bleomycin dactinomycin, plicamycin, mitoxantrone, pixantrone, streptozocin); platinum derivatives (eg cisplatin, oxaliplatin, carboplatin, lobaplatin, satraplatin); alkylating agents (eg estramustine, mechlorethamine, melphalan, chlorambucil, busulfan, dacarbazine, cyclophosphamide, ifosfamide, hydroxyurea, temozolomide, nitrosoureas such as carmustine and lomustine, thiotepa); antimitotic agents (for example, vinca alkaloids such as vinblastine, vindesine, vinorelbine, vinflunine and vincristine; and taxanes such as paclitaxel, docetaxel and their preparations, larotaxel; simotaxel, and epothilones such as ixabepilone, patupilone, ZK- EPO); topoisomerase inhibitors (eg epidophyllotoxins such as etoposide and etopophos, teniposide, amsacrine, topotecan, irinotecan); and various chemotherapeutic agents such as amifostine, anagrelide, interferon alfa, procarbazine, mitotane, and porfimer, bexarotene, celecoxib.

В определенных вариантах осуществления, дополнительное терапевтическое средство может представлять собой дополнительное иммунотерапевтическое средство, такое, как модуляторы следующих ингибиторов контрольной точки: TIM3, PD-L1 (например, атезолизумаб, авелумаб или дурвалумаб), PDL2, CTLA-4, VISTA, BTLA, TIGIT, CD160, LAIR1, 2В4, СЕАСАМ.In certain embodiments, the additional therapeutic agent may be an additional immunotherapeutic agent, such as modulators of the following checkpoint inhibitors: TIM3, PD-L1 (e.g., atezolizumab, avelumab, or durvalumab), PDL2, CTLA-4, VISTA, BTLA, TIGIT , CD160, LAIR1, 2B4, SEACAM.

В других вариантах осуществления, иммунотерапевтическое средство может представлять собой противораковую вакцину.In other embodiments, the immunotherapeutic agent may be a cancer vaccine.

Если два или более веществ или начала используются в качестве части комбинированной схемы лечения, то они могут вводиться с помощью одного и того же пути введения или с помощью различных путей введения, по существу в одно и то же время (т.е. одновременно, конкурентно) или в разное время (например, последовательно, один за другим, попеременно, поочередно, или в соответствии с любым другим типом чередующейся схемы).When two or more substances or agents are used as part of a combined treatment regimen, they may be administered via the same route of administration or via different routes of administration, substantially at the same time (i.e. simultaneously, competitively). ) or at different times (for example, sequentially, one after the other, alternately, alternately, or according to any other type of alternating pattern).

Если вещества или начала вводятся одновременно с помощью одного и того же пути введения, то они могут вводиться в виде различных фармацевтических препаратов или композиций или в виде части комбинированного фармацевтического препарата или композиции. Также, если два или более активных веществ или начал используются в виде части комбинированной схемы лечения, то каждое из этих веществ или начал может вводиться в одном и том же количестве и в соответствии с такой же схемой, которая используется, если соединение или начало используется самостоятельно, и такие комбинированные применения могут приводить или могут не приводить к синергетическим эффектам. Тем не менее, если комбинированное применение двух или более активных веществ или начал приводит к синергетическому эффекту, то также может быть возможно уменьшать количество одного, нескольких или всех вводимых веществ или начал, при этом все еще достигается желательное терапевтическое действие. Это может быть пригодно, например, для избегания, ограничения или уменьшения любых нежелательных побочные действий, которые связаны с применением одного или нескольких веществ или начал, когда они используются в их общепринятых количествах, при этом все еще получая желательный фармакологический или терапевтический эффект.If the substances or principles are administered simultaneously via the same route of administration, they may be administered as different pharmaceutical preparations or compositions or as part of a combined pharmaceutical preparation or composition. Also, if two or more active substances or initiations are used as part of a combined treatment regimen, then each of these substances or initiations may be administered in the same amount and according to the same regimen as used if the compound or initiation is used alone. , and such combined uses may or may not result in synergistic effects. However, if the combined use of two or more active substances or principles results in a synergistic effect, then it may also be possible to reduce the amount of one, several or all of the substances or principles administered, while still achieving the desired therapeutic effect. This may be useful, for example, to avoid, limit or reduce any undesirable side effects that are associated with the use of one or more substances or principles when they are used in their conventional amounts, while still obtaining the desired pharmacological or therapeutic effect.

Несомненно, описанное выше включает препараты, и способы приготовления, антитела согласно изобретению для комбинированного применения с вышеописанными партнерами комбинации. Также охватываются препарат, и способы приготовления, вышеописанных партнеров комбинации для комбинированного применения с антителами согласно изобретению.Undoubtedly, what is described above includes preparations, and methods of preparing, antibodies according to the invention for combined use with the combination partners described above. Also covered are the preparation, and methods of preparation, of the above described combination partners for combined use with the antibodies of the invention.

Молекулы антител согласно изобретению могут использоваться самостоятельно или в комбинации с другими схемами лечения, например, хирургическим вмешательством и/или лучевой терапией.The antibody molecules of the invention may be used alone or in combination with other treatment regimens such as surgery and/or radiation therapy.

Наборы и способы приготовления и очистки.Sets and methods of preparation and cleaning.

Изобретение также охватывает наборы, содержащие по меньшей мере одно антитело согласно изобретению и один или несколько других компонентов, выбранных из группы, включающей другие лекарственные средства, используемые для лечения заболеваний и нарушений, как описано выше.The invention also encompasses kits containing at least one antibody of the invention and one or more other components selected from the group consisting of other drugs used to treat diseases and disorders as described above.

В одном варианте осуществления, набор включает композицию, содержащую эффективное количество молекулы антитела к PD1 согласно изобретению в единичной дозированной форме. В другом варианте осуществления, набор включает композицию, содержащую эффективное количество молекулы антитела к LAG3 согласно изобретению в единичной дозированной форме. В дальнейшем варианте осуществления, набор включает как композицию, содержащую эффективное количество молекулы антитела к PD1 согласно изобретению в единичной дозированной форме, так и композицию, содержащую эффективное количество молекулы антитела к LAG3 согласно изобретению в единичной дозированной форме.In one embodiment, the kit comprises a composition comprising an effective amount of an anti-PD1 antibody molecule of the invention in unit dosage form. In another embodiment, the kit comprises a composition comprising an effective amount of an anti-LAG3 antibody molecule of the invention in unit dosage form. In a further embodiment, the kit comprises both a composition comprising an effective amount of an anti-PD1 antibody molecule of the invention in unit dosage form and a composition comprising an effective amount of an anti-LAG3 antibody molecule of the invention in unit dosage form.

В некоторых вариантах осуществления, набор включает стерильный контейнер, который содержит такую композицию; такие контейнеры могут представлять собой коробки, ампулы, бутылки, флаконы, пробирки, пакеты, мешочки, блистер-пакеты, или другие подходящие формы контейнеров, известные из уровня техники. Такие контейнеры могут быть изготовлены из пластика, стекла, ламинированной бума- 24 042707 ги, металлической фольги или других материалов, подходящих для удерживания лекарственных средств.In some embodiments, the kit includes a sterile container that contains such a composition; such containers may be boxes, ampoules, bottles, vials, test tubes, pouches, pouches, blister packs, or other suitable container forms known in the art. Such containers may be made of plastic, glass, laminated paper, metal foil, or other materials suitable for holding drugs.

Если это является желательным, то молекула антитела согласно изобретению, или комбинация обоих типов антител согласно изобретению, обеспечиваются совместно с инструкцией по введению антитела/антител субъекту, имеющему злокачественное новообразование. Инструкции обычно будут включать информацию относительно применение композиции для лечения или предотвращения злокачественного новообразования. В других вариантах осуществления, инструкции включают по меньшей мере одно из следующих: описание терапевтического средства; схема дозирования и введения для лечения или предотвращения злокачественного новообразования или его симптомов; предосторожности; предупреждения; показания; противопоказания; информация о передозировке; побочные реакции; фармакология на животных; клинические исследования; и/или ссылки. Инструкции могут быть напечатаны непосредственно на контейнере (если он есть), или в виде наклейки, наклеенной на контейнер, или в виде отдельного листа, брошюры, карты, или проспекта, поставляемых в или с контейнером.If desired, an antibody molecule of the invention, or a combination of both types of antibodies of the invention, is provided along with instructions for administering the antibody/antibodies to a subject having a cancer. The instructions will typically include information regarding the use of the composition to treat or prevent cancer. In other embodiments, the instructions include at least one of the following: a description of the therapeutic agent; a dosing and administration regimen for the treatment or prevention of cancer or its symptoms; precautions; warnings; indications; contraindications; overdose information; adverse reactions; pharmacology in animals; clinical researches; and/or links. The instructions may be printed directly on the container (if any), or as a sticker affixed to the container, or as a separate sheet, brochure, card, or prospectus supplied in or with the container.

Изобретение дополнительно обеспечивает способы приготовления молекулы антитела согласно изобретению, такие способы обычно включают стадии:The invention further provides methods for preparing an antibody molecule according to the invention, such methods typically include the steps of:

культивирование клеток-хозяев, содержащих экспрессионный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу антитела согласно изобретению в условиях, которые предоставляют возможность образования антитела согласно изобретению; и восстановление молекулы антитела, экспрессируемой клетками-хозяевами из культуры; и необязательно дополнительную очистку и/или модификацию и/или приготовление препарата молекулы антитела согласно изобретению.culturing host cells containing an expression vector containing a nucleic acid molecule encoding an antibody molecule of the invention under conditions that allow formation of an antibody of the invention; and restoring the antibody molecule expressed by the host cells from the culture; and optionally further purification and/or modification and/or formulation of an antibody molecule according to the invention.

Нуклеиновая кислота согласно изобретению может представлять собой, например, молекулу ДНК, содержащую кодирующие последовательности, а также регуляторные последовательности и необязательно природные или искусственные интроны, или может представлять собой молекулу кДНК. Она может иметь свои исходные кодоны или могут иметь оптимизированные используемые кодоны, которые были специфически адаптированы для экспрессии в предназначенной клетке-хозяине или организмехозяине. В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, нуклеиновая кислота согласно изобретению по существу находится в выделенной форме, как определено выше.A nucleic acid according to the invention may, for example, be a DNA molecule containing coding sequences as well as regulatory sequences and optionally natural or artificial introns, or may be a cDNA molecule. It may have its original codons or may have optimized codons in use that have been specifically adapted for expression in the intended host cell or host organism. In accordance with one embodiment of the invention, the nucleic acid according to the invention is essentially in an isolated form, as defined above.

Нуклеиновую кислоту согласно изобретению типично инкорпорируют в экспрессионный вектор, т.е. в вектор, который может обеспечивать экспрессию полипептида, при трансфекции в подходящей клетке-хозяине или другой экпрессионной системе.The nucleic acid of the invention is typically incorporated into an expression vector, ie. into a vector that can express the polypeptide when transfected into a suitable host cell or other expression system.

Для приготовления антител согласно изобретению, квалифицированный специалист в данной области техники может выбирать из различных экспрессионных систем, хорошо известных в данной области техники, например, тех, которые описаны в обзоре Kipriyanow и Le Gall, 2004.For the preparation of antibodies according to the invention, one skilled in the art may choose from various expression systems well known in the art, such as those described in Kipriyanow and Le Gall, 2004.

Экспрессионные векторы включают плазмиды, ретровирусы, космиды, EBV производные эписом и другие. Экспрессионный вектор и последовательности, контролирующие экспрессию, выбирают таким образом, чтобы они были совместимыми с клеткой-хозяином. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть вставлены в отдельные векторы. В определенных вариантах осуществления, обе последовательности ДНК инсертируют в тот же самый экспрессионный вектор.Expression vectors include plasmids, retroviruses, cosmids, EBV derivatives of episomes, and others. The expression vector and expression control sequences are chosen to be compatible with the host cell. The antibody light chain gene and the antibody heavy chain gene can be inserted into separate vectors. In certain embodiments, both DNA sequences are inserted into the same expression vector.

Общепринятые векторы представляют собой такие векторы, которые кодируют функционально полные СН (константную тяжелую) или CL (константную легкую) последовательности иммуноглобулина человека, с подходящими рестрикционными сайтами, конструируют таким образом, чтобы любую VH (вариабельную тяжелую) или VL (вариабельную легкую) последовательность легко можно было вставить и экспрессировать, как описано выше. Для тяжелой цепи антитела, она может представлять собой, без ограничений, любой IgG изотип (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) или другие иммуноглобулины, включая аллельные варианты.Conventional vectors are those that encode functionally complete CH (constant heavy) or CL (constant light) human immunoglobulin sequences, with suitable restriction sites, designed such that any VH (variable heavy) or VL (variable light) sequence is easily could be inserted and expressed as described above. For an antibody heavy chain, it can be, without limitation, any IgG isotype (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) or other immunoglobulins, including allelic variants.

Рекомбинантный экспрессионный вектор также может кодировать сигнальный пептид, который облегчает секрецию цепи антитела из клетки-хозяина. ДНК, кодирующая цепь антитела, может быть клонирована в векторе таким образом, что сигнальный пептид связан в рамке с аминоконцом ДНК цепи зрелого антитела. Сигнальный пептид может представлять собой иммуноглобулиновый сигнальный пептид или гетерологичный пептид из неиммуноглобулинового белка. Альтернативно, ДНК последовательность, кодирующая цепь антитела, уже может содержать последовательность сигнального пептида.The recombinant expression vector may also encode a signal peptide that facilitates secretion of the antibody chain from the host cell. The DNA encoding the antibody chain can be cloned into a vector such that the signal peptide is linked in frame to the amino terminus of the mature antibody chain DNA. The signal peptide may be an immunoglobulin signal peptide or a heterologous peptide from a non-immunoglobulin protein. Alternatively, the DNA sequence encoding the antibody chain may already contain a signal peptide sequence.

Дополнительно к ДНК последовательности цепи антитела, рекомбинантные экспрессионные векторы типично несут регуляторные последовательности, необязательно гетерологичные регуляторные последовательности, включая промоторы, энхансеры, сигналы терминации и полиаденилирования и другие элементы, контролирующие экспрессию, которые контролируют экспрессию цепи антитела в клеткехозяине. Примерами для промоторных последовательностей (иллюстрирующие экспрессию в клетках млекопитающих) являются промоторы и/или энхансеры, имеющие происхождение из CMV (такие как CMV вирус обезьян 40 (SV40) промотор/энхансер), аденовирус, (например, основной поздний промотор аденовируса (AdMLP)), полиома и сильные промоторы млекопитающих, такие как нативный иммуноглобулиновый и актиновый промоторы. Примерами для сигналов полиаденилирования являются BGH polyA, SV40 поздний или ранний polyA; альтернативно, можно использовать 3'UTR генов иммуноглобулинов, и т.д.In addition to the DNA sequence of the antibody chain, recombinant expression vectors typically carry regulatory sequences, optionally heterologous regulatory sequences, including promoters, enhancers, termination and polyadenylation signals, and other expression control elements that control the expression of the antibody chain in the host cell. Examples for promoter sequences (illustrating expression in mammalian cells) are promoters and/or enhancers derived from CMV (such as CMV simian virus 40 (SV40) promoter/enhancer), adenovirus, (e.g. adenovirus major late promoter (AdMLP)) , polyoma, and strong mammalian promoters such as native immunoglobulin and actin promoters. Examples for polyadenylation signals are BGH polyA, SV40 late or early polyA; alternatively, the 3'UTR of immunoglobulin genes can be used, etc.

- 25 042707- 25 042707

Рекомбинантные экспрессионные векторы также могут нести последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, точки начала репликации) и селектируемые маркерные гены. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие тяжелую цепь или ее антигенсвязывающую часть и/или легкую цепь или ее антиген-связывающую часть антитела согласно изобретению, и векторы, содержащие такие молекулы ДНК, могут быть интродуцированы в клетки-хозяева, например, бактериальные клетки или клетки высших эукариот, например, клетки млекопитающих, в соответствии с методами трансфекции, хорошо известными в данной области техники, включая опосредованную липосомами трансфекцию, опосредованную поликатионами трансфекцию, слияние протопластов, микроинъекции, осаждение с помощью фосфата кальция, электропорацию или перенос вирусными векторами.Recombinant expression vectors can also carry sequences that regulate replication of the vector in host cells (eg, origins of replication) and selectable marker genes. Nucleic acid molecules encoding the heavy chain or antigen-binding portion thereof and/or the light chain or antigen-binding portion thereof of an antibody of the invention and vectors containing such DNA molecules can be introduced into host cells, for example bacterial or higher eukaryotic cells. for example, mammalian cells, according to transfection methods well known in the art, including liposome-mediated transfection, polycation-mediated transfection, protoplast fusion, microinjection, calcium phosphate precipitation, electroporation, or viral vector transfer.

Предпочтительно, молекулы ДНК, кодирующие тяжелую цепь и легкую цепь, присутствуют в двух экспрессионных векторах, которые совместно трансфектируют в клетку-хозяин, предпочтительно клетку млекопитающего.Preferably, the DNA molecules encoding the heavy chain and the light chain are present in two expression vectors that are co-transfected into a host cell, preferably a mammalian cell.

Линии клеток млекопитающих, доступные в качестве хозяев для экспрессии, хорошо известны в данной области техники и включают, в частности, клетки яичника китайского хомячка (СНО), NS0, SP2/0 клетки, HeLa клетки, клетки почки новорожденного хомяка (BHK), клетки почки обезьяны (COS), клетки карциномы человека (например, Hep G2 и А-549 клетки), 3T3 клетки или производные/потомства любой такой клеточной линии. Можно использовать другие клетки млекопитающих, включая, но не ограничиваясь только ими, клеточные линии человека, мыши, крысы, обезьяны и грызунов, или другие эукариотические клетки, включая, но не ограничиваясь только ими, клетки дрожжей, насекомых и растений, или прокариотические клетки, такие как бактериальные.Mammalian cell lines available as hosts for expression are well known in the art and include, but are not limited to, Chinese Hamster Ovary (CHO) cells, NS0, SP2/0 cells, HeLa cells, Newborn Hamster Kidney (BHK) cells, monkey kidney (COS), human carcinoma cells (eg, Hep G2 and A-549 cells), 3T3 cells, or derivatives/progeny of any such cell line. Other mammalian cells may be used, including, but not limited to, human, mouse, rat, monkey, and rodent cell lines, or other eukaryotic cells, including, but not limited to, yeast, insect, and plant cells, or prokaryotic cells, such as bacterial.

Молекулы антител согласно изобретению продуцируются путем культивирования клеток-хозяев в течение периода времени, достаточном для предоставления возможности экспрессии молекул антитела в клетках-хозяевах. Молекулы антител предпочтительно восстанавливают из культуральной среды в виде секретируемого полипептида или они могут быть восстановлены из лизатов клеток-хозяев, если, например, они экспрессируются без секреторного сигнала. Также необходимо очищать молекулы антител, используя стандартные методы очистки белков, используемые для рекомбинантных белков и белков клеток-хозяев таким образом, чтобы получить по существу гомогенные препараты антитела. В качестве примера, ультрасовременные методы очистки в данной области техники, пригодные для получения молекул антител согласно изобретению, включают, в качестве первой стадии, удаление клеток и/или корпускулярного клеточного дебриса из культуральной среды или лизата. После этого антитело очищают от загрязняющих растворимых белков, полипептидов и нуклеиновых кислот, например, путем фракционирования на иммуноаффинных или ионо-обменных колонках, осаждением этанолом, ВЭЖХ с обращенной фазой, сефадексовой хроматографии, хроматографии на диоксиде кремния или на катионо-обменной смоле. В качестве конечной стадии в процессе получения препарата молекулы антитела, очищенную молекула антитела можно высушивать, например, лиофилизировать, как описано ниже, для терапевтических применений.The antibody molecules of the invention are produced by culturing the host cells for a period of time sufficient to allow expression of the antibody molecules in the host cells. Antibody molecules are preferably recovered from the culture medium as a secreted polypeptide, or they can be recovered from host cell lysates if, for example, they are expressed without a secretory signal. It is also necessary to purify antibody molecules using standard protein purification methods used for recombinant proteins and host cell proteins so as to obtain substantially homogeneous antibody preparations. By way of example, state-of-the-art purification methods in the art suitable for preparing the antibody molecules of the invention include, as a first step, the removal of cells and/or particulate cell debris from the culture medium or lysate. The antibody is then purified from contaminating soluble proteins, polypeptides, and nucleic acids, for example, by fractionation on immunoaffinity or ion exchange columns, ethanol precipitation, reverse phase HPLC, Sephadex chromatography, silica chromatography, or cation exchange resin. As a final step in the preparation of an antibody molecule, the purified antibody molecule may be dried, eg, lyophilized, as described below, for therapeutic applications.

ПримерыExamples

Пример 1. Создание мышиных антител, которые связываются с PD1 и блокируют связывание PDL-1 с PD1.Example 1 Generation of mouse antibodies that bind to PD1 and block the binding of PDL-1 to PD1.

Синтезировали внеклеточный домен (ECD) белка PD1 человека (аминокислоты 21-170 номер доступа GenBank AAO63583.1) и приготавливали в качестве иммуногена. После этого мышей иммунизировали и затем бустировали с PD1 ECD белком человека с последующими стандартными лабораторными методиками иммунизации.The extracellular domain (ECD) of the human PD1 protein (amino acids 21-170 GenBank accession number AAO63583.1) was synthesized and prepared as an immunogen. Thereafter, mice were immunized and then boosted with human PD1 ECD protein, followed by standard laboratory immunization procedures.

После этого у иммунизированных мышей отбирали образцы плазмы и подвергали скринингу для идентификации особей с достаточным титром иммуноглобулина к PD1. После осуществления стандартных лабораторных методов, собирали лимфоциты от отобранных мышей и сливали с мышиными миеломными клетками для создания гибридом. Впоследствии эти гибридомы подвергали скринингу для идентификации гибридомных линий, которые продуцируют молекулы антител, которые проявляют связывание в нМ диапазоне низкой аффинности с PD1 человека (ECD), и также блокируют связывание PDL1 человека с PD1, используя анализы, описанные в настоящей заявке ниже.After that, plasma samples were taken from immunized mice and subjected to screening to identify individuals with a sufficient titer of anti-PD1 immunoglobulin. Following standard laboratory procedures, lymphocytes were harvested from selected mice and fused with mouse myeloma cells to create hybridomas. These hybridomas were subsequently screened to identify hybridoma lines that produce antibody molecules that exhibit low affinity nM binding to human PD1 (ECD) and also block human PDL1 binding to PD1 using the assays described herein below.

Отбирали некоторые гибридомы, продуцирующие антитела, которые связываются с PD1 человека и блокируют связывание с PD-L1 человека, вариабельные домены антител выделяли и клонировали, используя стандартные наборы ПЦР праймеров.Some hybridomas were selected to produce antibodies that bind to human PD1 and block binding to human PD-L1, the antibody variable domains were isolated and cloned using standard PCR primer sets.

С помощью этого исследования, идентифицировали мышиную гибридомную линию, обозначаемую как 77Е11, которая продуцирует моноклональные антитела, проявляющие низкие нМ аффинности связывания с PD1 человека (ECD) и также блокируют связывание PD-L1 с PD1.Using this assay, a mouse hybridoma line, referred to as 77E11, was identified that produces monoclonal antibodies exhibiting low nM human PD1 (ECD) binding affinities and also block PD-L1 binding to PD1.

Аминокислотная последовательность вариабельного домена моноклонального антитела, продуцируемого 77Е11, представлена на фиг. 1.The amino acid sequence of the variable domain of the monoclonal antibody produced by 77E11 is shown in FIG. 1.

Пример 2. Создание гуманизированных антител к PD1.Example 2 Generation of Humanized Anti-PD1 Antibodies.

V-гены мышиной 77Е11 гибридомной клеточной линии идентифицировали с помощью ПЦР и протоколов секвенирования, хорошо известных в данной области техники. После этого V-гены сливали сThe V genes of the mouse 77E11 hybridoma cell line were identified by PCR and sequencing protocols well known in the art. After that, the V-genes were fused with

- 26 042707 наиболее близкими подходящими генами зародышевой линии человека, используя стандартные техники молекулярной биологии. В случае 77Е11, это приводит к получению химерных мышиных/человеческих молекул антител, имеющих мышиные Vk и Vh аминокислотные остатки, слитые с человеческими Ck и- 26 042707 the closest suitable human germline genes using standard molecular biology techniques. In the case of 77E11, this results in chimeric mouse/human antibody molecules having mouse Vk and Vh amino acid residues fused to human Ck and

Ch1 аминокислотными остатками.Ch1 amino acid residues.

После приготовления, впоследствии химерное мышиное/человеческое антитело подвергали протоколам гуманизации. В данном случае, приготавливали мутированные аминокислотные библиотеки химерных 77Е11 Fab клонов. Дополнительные положения библиотек также приготавливали таким образом, чтобы удалить препятствующие последовательности (т.е. аминокислотные остатки, которые, как известно, являются иммуногенными или создают потенциальные проблемы при производстве). Эти мутированные библиотеки обычно имеют от 5 до 10 бинарных (мышиных отн. человеческих) положений на Vучасток. Некоторые небольшие библиотеки могут быть построены для маркировки специфических проблем в более комплексных V-участках. Такие библиотеки приготавливают, используя стандартные методы в данной области техники, и легко могут использоваться квалифицированным специалистом.Once prepared, the chimeric mouse/human antibody was subsequently subjected to humanization protocols. In this case, mutated amino acid libraries of chimeric 77E11 Fab clones were prepared. Additional library positions were also prepared to remove interfering sequences (ie, amino acid residues known to be immunogenic or pose potential manufacturing problems). These mutated libraries typically have 5 to 10 binary (mouse versus human) positions per V site. Some small libraries can be built to flag specific problems in more complex V-plots. Such libraries are prepared using standard methods in the art and can be easily used by the skilled person.

После завершения этой стадии, приготавливали несколько различных гуманизированных Fabs, имеющих происхождение из исходной мышиной 77Е11 Fab последовательности. Эти гуманизированные Fabs тестировали для определения их способности связываться с PD1 человека и блокировать взаимодействие PD-L1 с PD1. Впоследствии отбирали генетически сконструированные Fabs, которые проявляют активность равную с, или лучше, чем, соответствующие химерные Fab. Их аминокислотную последовательность анализировали для определения доли человеческой последовательности, возможной иммуногености, и удаления проблемных последовательностей.After this step was completed, several different humanized Fabs were prepared, derived from the original mouse 77E11 Fab sequence. These humanized Fabs were tested to determine their ability to bind to human PD1 and block the interaction of PD-L1 with PD1. Subsequently, genetically engineered Fabs were selected that exhibit activity equal to, or better than, the corresponding chimeric Fabs. Their amino acid sequence was analyzed to determine the proportion of human sequence, possible immunogenicity, and the removal of problematic sequences.

После отбора наиболее благоприятных гуманизированных Fabs, их затем помещали в формат человеческого IgG4 (Pro) или IgG1KO иммуноглобулина. IgG4 (Pro) отличается от канонической последовательности IgG4 человека путем наличия серина 241, замененного на пролин, было показано, что это изменение минимизирует динамический обмен Fab-фрагментами между молекулами IgG4. IgG1KO отличается от канонической последовательности IgG1 человека двумя аминокислотными заменами (L234A, L235A), для которых известна минимизация эффекторной функции молекул антител.After selecting the most favorable humanized Fabs, they were then placed in human IgG4 (Pro) or IgG1KO immunoglobulin format. IgG4 (Pro) differs from the canonical human IgG4 sequence by having serine 241 replaced by proline, this change has been shown to minimize the dynamic exchange of Fab fragments between IgG4 molecules. IgG1KO differs from the canonical human IgG1 sequence by two amino acid substitutions (L234A, L235A) known to minimize the effector function of antibody molecules.

После завершения этого исследования, приготавливали 5 различных гуманизированных версий исходного химерного мышиного/человеческого 77Е11 Fab. Их обозначали: PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 и PD1-5.After completion of this study, 5 different humanized versions of the original chimeric mouse/human 77E11 Fab were prepared. They were designated: PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 and PD1-5.

Аминокислотная последовательность CDR для PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 и PD1-5, VH и VL последовательности и полноразмерных НС и LC последовательности представлены в таблице в конце данной заявки. Для исключения неопределенности, корреляция между антителами и их SEQ ID номером также представлена в таблице ниже.The amino acid sequence of the CDRs for PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 and PD1-5, VH and VL sequences and full-length HC and LC sequences are presented in the table at the end of this application. To eliminate uncertainty, the correlation between antibodies and their SEQ ID number is also presented in the table below.

Таблица 1. SEQ ID NO для антител к PD1 согласно изобретениюTable 1. SEQ ID NO for Anti-PD1 Antibodies of the Invention

Антитело к PD1 Antibody to PD1 CDR последовательности CDR sequences VH последовательности VH sequences VL последовательности VL sequences НС последовательности NS sequence LC последовательности LC sequences PD1-1 PD1-1 1-6 1-6 19 19 20 20 29 29 30 thirty PD1-2 PD1-2 7-12 7-12 21 21 22 22 31 31 32 32 PD1-3 PD1-3 13-18 13-18 23 23 24 24 33 33 34 34 PD1-4 PD1-4 13-18 13-18 25 25 26 26 35 35 36 36 PD1-5 PD1-5 13-18 13-18 27 27 28 28 37 37 38 38

Пример 3. Связывание антитела с PD1 человека и блокирование взаимодействия PD1 лиганда.Example 3 Binding of an antibody to human PD1 and blocking PD1 ligand interaction.

Определяли связывание репрезентативных гуманизированных антител к PD1, имеющих происхождение из мышиной 77Е11 гибридомы (как описано в примере 2) с PD1 человека.The binding of representative humanized anti-PD1 antibodies derived from mouse 77E11 hybridoma (as described in Example 2) to human PD1 was determined.

Аффинности связывания с рекомбинантным мономерным PD1 человека измеряли с помощью SPR, используя прибор ProteOn XPR36. PD1-1, PD1-2 и PD1-3 антитела захватывали на Белок A/G поверхности, которые были амино-связаны с поверхностью. PD1 человека ECD инъецировали над захваченными антителами в течение 600 с при скорости потока 30 мкл/мин и диссоциации в течение 1200 с. Концентрации PD1 человека ECD составляли 0, 6,25, 12,5, 25, 50, и 100 нМ. Фоновые значения отнимали от необработанных данных и затем сенсограммы подгоняли универсально к 1:1 связыванию Ленгмюра для получения значений аффинности (KD).Binding affinities to recombinant monomeric human PD1 were measured by SPR using a ProteOn XPR36 instrument. PD1-1, PD1-2 and PD1-3 antibodies were captured on the Protein A/G surface, which were amino-linked to the surface. Human PD1 ECD was injected over the captured antibodies for 600 s at a flow rate of 30 μl/min and a dissociation for 1200 s. Human PD1 ECD concentrations were 0, 6.25, 12.5, 25, 50, and 100 nM. Background values were subtracted from the raw data and then sensograms were fitted universally to 1:1 Langmuir binding to obtain affinity (KD) values.

Используя этот протокол, было определено, что антитела PD1-1, PD1-2 и PD1-3 связываются с PD1 человека, как представлено в таблице ниже.Using this protocol, PD1-1, PD1-2 and PD1-3 antibodies were determined to bind to human PD1 as shown in the table below.

Таблица 2. Связывание с рекомбинантным PD1 человека (KD, нМ)Table 2. Binding to recombinant human PD1 (KD, nM)

Антитело Antibody K_D, нМK _D , nM PD1-1 PD1-1 16,6 16.6 PD1-2 PD1-2 61,8 61.8 PD1-3 PD1-3 6,0 6.0

После этого PD1 антитела согласно изобретению тестировали для определения способности блокировать связывание PD-L1 человека/2 с PD1 человека, экспрессируемых на поверхности СНО клеток.Thereafter, the PD1 antibodies of the invention were tested to determine the ability to block the binding of human PD-L1/2 to human PD1 expressed on the surface of CHO cells.

- 27 042707- 27 042707

PD1-экспрессирующие CHO клетки инкубировали с фиксированной концентрацией рекомбинантных меченных биотином PD-L1 или PD-L2 в присутствии антител к PD1 согласно изобретению (PD1 до PD15). Смесь инкубировали в течение 1 ч при 37 градусах Цельсия. Клетки, связанные с PD-L1/L2, обнаруживали с помощью меченного европием стрептавидина и флуоресценцию измеряли, используя Perkin Elmer Victor Х4 планшет-ридер. Данные представляли в виде процента ингибирования. 0% ингибирование определяли как значение флуоресценции клеток, инкубированных с лигандом без антител, и 100% ингибирование определяли как сигнал, полученный с чистыми клетками без меченных лигандов и антител. Значения процентов ингибирования рассчитывали в Excel и подгонку кривых осуществляли с помощью GraphPad Prism. Экспериментальные точки на кривой представляют собой средние значения измерений в трех повторах.PD1-expressing CHO cells were incubated with a fixed concentration of recombinant biotin labeled PD-L1 or PD-L2 in the presence of anti-PD1 antibodies according to the invention (PD1 to PD15). The mixture was incubated for 1 hour at 37°C. PD-L1/L2 bound cells were detected with europium labeled streptavidin and fluorescence was measured using a Perkin Elmer Victor X4 plate reader. Data are presented as percent inhibition. 0% inhibition was defined as the fluorescence value of cells incubated with ligand without antibodies, and 100% inhibition was defined as the signal obtained with pure cells without labeled ligands and antibodies. Percent inhibition values were calculated in Excel and curve fitting was performed using GraphPad Prism. The experimental points on the curve are the average values of measurements in three repetitions.

Кривые ингибирования и mAb концентрации, необходимые для достижения 90% ингибирования (IC90) блокирования лиганда, представлены на фиг. 2 и табл. 3.Curves of inhibition and mAb concentration required to achieve 90% inhibition (IC90) of ligand blocking are shown in FIG. 2 and table. 3.

Таблица 3. Активности блокирования лиганда PD1 mAbsTable 3. PD1 ligand blocking activities of mAbs

Антитело Antibody PD-L1 1С₉₀ (нМ)PD-L1 1C ₉₀ (nM) PD-L2 1С₉₀ (нМ)PD-L2 1C ₉₀ (nM) PD1-1 PD1-1 2,12 2.12 2,09 2.09 PD1-2 PD1-2 2,97 2.97 3,64 3.64 PD1-3 PD1-3 1,68 1.68 1,95 1.95 PD1-4 PD1-4 2,04 2.04 2,71 2.71 PD1-5 PD1-5 2,09 2.09 3,31 3.31

Из этого анализа становится очевидным, что гуманизированные PD1 антитела согласно изобретению проявляют сильные связывающие свойства к PD1, и также эффективно ингибируют взаимодействие PD-1 с PD-L1 и PD-L2.From this analysis, it becomes apparent that the humanized PD1 antibodies of the invention exhibit strong binding properties to PD1, and also effectively inhibit the interaction of PD-1 with PD-L1 and PD-L2.

Пример 4. Стимуляция антиген-специфического Т-клеточного ответа с помощью антитела к PD1.Example 4 Stimulation of an antigen-specific T-cell response with an anti-PD1 antibody.

Гуманизированные антитела к PD1, приготовленные в соответствии со способами, описанными выше, впоследствии тестировали для определения их способности стимулировать продукцию цитокинов специфическими к столбняку CD4 Т-клетками памяти.Humanized anti-PD1 antibodies prepared according to the methods described above were subsequently tested to determine their ability to stimulate cytokine production by tetanus-specific CD4 memory T cells.

Для этого исследования Т-клетки, имеющие происхождение из РВМС здоровых доноров, выращивали в присутствии столбнячного анатоксина и совместно культивировали с аутологическими зрелыми дендритными клетками (DC), загруженными с помощью столбнячного анатоксина в течение 2 дней. Стадию совместного культивирования повторяли второй раз сходным образом в присутствии репрезентативных антител к PD1 согласно изобретению. После окончания второй стадии совместного культивирования, супернатанты анализировали для определения ИФН-гамма с помощью ELISA и результаты представлены на фиг. 3.For this study, T cells derived from healthy PBMC donors were grown in the presence of tetanus toxoid and co-cultured with autologous mature dendritic cells (DC) loaded with tetanus toxoid for 2 days. The co-culture step was repeated a second time in a similar manner in the presence of representative anti-PD1 antibodies of the invention. After the end of the second co-culture step, the supernatants were analyzed for IFN-gamma by ELISA and the results are shown in FIG. 3.

Все тестированные PD1 антитела согласно изобретению проявили четкую дозозависимую очень сильную активацию Т-клеток, как измеряли с помощью высвобождения ИФН-гамма. Когда PD1 антитела согласно изобретению комбинировали с антителами к LAG3, еще более высокую активность можно наблюдать при сравнении с комбинациями эталонных антител к PD1, известных из уровня техники (см. пример 12 и фиг. 8).All tested PD1 antibodies according to the invention showed a clear dose-dependent very strong activation of T cells, as measured by the release of IFN-gamma. When PD1 antibodies of the invention are combined with anti-LAG3 antibodies, even higher activity can be observed when compared to combinations of reference anti-PD1 antibodies known in the art (see Example 12 and FIG. 8).

Пример 5. Картирование эпитопов гуманизированных моноклональных антител к PD1.Example 5 Epitope Mapping of Humanized Anti-PD1 Monoclonal Antibodies.

Эпитоп репрезентативного антитела к PD1 согласно изобретению и сравнительной молекулы антитела из уровня техники, имеющей такую же аминокислотную последовательность, как и ниволумаб, анализировали с помощью экспериментов водородно-дейтериевого обмена (HDX), которые обнаруживают отличия эпитопов на уровне индивидуальных аминокислот в эпитопах антител.The epitope of a representative anti-PD1 antibody of the invention and a comparative prior art antibody molecule having the same amino acid sequence as nivolumab was analyzed by hydrogen-deuterium exchange (HDX) experiments, which detect epitope differences at the individual amino acid level in antibody epitopes.

HDX анализ показал, что антитело к PD1 согласно изобретению и сравнительная молекула антитела из уровня техники связываются со сходными и перекрывающимися участками PD1 человека. Тем не менее, эпитопы не являются идентичными, с репрезентативным PD 1 антителом согласно изобретению, связываясь с дополнительным элементом последовательности, как подробно представлено в табл. 4.HDX analysis showed that the anti-PD1 antibody of the invention and the reference antibody molecule of the prior art bind to similar and overlapping regions of human PD1. However, the epitopes are not identical, with a representative PD 1 antibody of the invention binding to an additional sequence element, as detailed in Table 1. 4.

Таблица 4. Картирование эпитопов молекул антител к PD1 с помощью масс-спектрометрии водородно-дейтериевого обменаTable 4. Epitope mapping of anti-PD1 antibody molecules using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry

Антитело Antibody PD-1 Участки связывания (ак *) PD-1 Binding sites (ak*) Эпитоп epitope сравнительное антитело для ниволумаба comparative antibody for nivolumab 125-138 125-138 A₁₂₅ISLAPKAQIKESL ** (SEQ ID NO: 115)A ₁₂₅ ISLAPKAQIKESL ** (SEQ ID NO: 115) PD1-3 PD1-3 80-95, 125-138 80-95, 125-138 AAFPEDRSQPGQDCRF (SEQ ID NO: 116) a₁₂₅islapkaqikesl ** (SEQ ID NO: 115)AAFPEDRSQPGQDCRF (SEQ ID NO: 116) a ₁₂₅ islapkaqikesl ** (SEQ ID NO: 115)

* PD1 использовали для нумерации: GenBank ААО63583.1, ** Аминокислоты, задействованные в связывание, показаны жирным шрифтом, отличия подчеркнуты.* PD1 used for numbering: GenBank AAO63583.1, ** Amino acids involved in binding are shown in bold, differences are underlined.

Пример 6. Эффективность in vivo молекул антител к PD1 согласно изобретению на hPD-Ι моделиExample 6 In Vivo Efficacy of Anti-PD1 Antibody Molecules According to the Invention in the hPD-Ι Model

-28042707 нокин у мышей.-28042707 knockin in mice.

Целью исследования являлось измерение эффективности молекул антител к PD1 согласно изобретению, используя полностью иммунокомпетентную мышь, заякоривающей генетическую модификацию, которая заменяет внеклеточный домен мыши PD1 на соответствующий участок PD1 человека. Мышь C57BL/6NTac-PDCD1^{tm(PDCD1)Arte}, используемую в этом эксперименте, получали от ISIS INNOVATION LIMITED, Оксфорд, Англия и обозначали в дальнейшем как hPD1 нокин мышь.The aim of the study was to measure the efficacy of the anti-PD1 antibody molecules of the invention using a fully immunocompetent mouse anchoring a genetic modification that replaces the mouse extracellular domain of PD1 with the corresponding region of human PD1. The C57BL/6NTac-PDCD1 ^{tm(PDCD1)Arte} mouse used in this experiment was obtained from ISIS INNOVATION LIMITED, Oxford, England and hereinafter referred to as the hPD1 knockin mouse.

МС-38 клетки подкожно инъецировали в лапу hPDl нокин мышам и лечение начинали в день 6 после инъекции клеток. Мыши получали PBS, изотипный контроль или молекулу антитела к PD1 согласно изобретению в дозе 10 мг/кг два раза в неделю (q3or4d) или PD1-3 вводили только один раз.MC-38 cells were subcutaneously injected into the paw of hPDl knockin mice and treatment started on day 6 after cell injection. Mice received PBS, an isotype control or an anti-PD1 antibody molecule according to the invention at a dose of 10 mg/kg twice a week (q3or4d) or PD1-3 was administered only once.

На фиг. 4 представлен объем опухоли в динамике во времени для индивидуальных hPD1 нокин мышей, которым имплантировали МС38, и в табл. 5 обобщено ингибирование роста опухоли (TGI) в день 23 после инъекции клеток и полные ответы, наблюдаемые при окончании исследования.In FIG. 4 shows tumor volume over time for individual hPD1 knockin mice implanted with MC38, and Table. 5 summarizes tumor growth inhibition (TGI) at day 23 post-cell injection and overall responses observed at the end of the study.

Полный ответ (CR) определяли, если (I) размер опухоли был таким же или меньшим по сравнению с первым измерением и (II) при визуальном осмотре остаточного материала носителя (матригеля) не обнаруживали опухолевой ткани. Может быть продемонстрировано, что однократная схема дозирования PD1-3 показала сильные и противоопухолевые эффекты (TGI=90%; с 2 мышами, у которых проявился CR), эквивалентные по сравнению со схемой дозирования два раза в неделю. В этом исследовании было показано, что даже однократной дозы молекулы антитела к PD1 согласно изобретению достаточно для достижения эффективности, что может быть следствием более длительного периода полужизни.A complete response (CR) was determined if (i) the size of the tumor was the same or smaller than the first measurement and (ii) no tumor tissue was found on visual examination of the residual carrier material (matrigel). It can be demonstrated that a single PD1-3 dosing schedule showed potent and anti-tumor effects (TGI=90%; with 2 mice showing CR) equivalent compared to a twice weekly dosing schedule. In this study, it was shown that even a single dose of the anti-PD1 antibody molecule of the invention is sufficient to achieve efficacy, which may be due to the longer half-life.

Таблица 5. TGI для PD1Table 5. TGI for PD1

TGI [%] TGI [%] CR [п/10] CR [p/10] PBS PBS - - 0 0 PD-1 Изотип PD-1 Isotype 12 12 0 0 PD1-3 (q3or4d) PD1-3 (q3or4d) 83 83 3 3 PD1-3 (один раз) PD1-3 (once) 90 90 2 2

Пример 7. Доклинические фармакокинетики молекул антител к PD1 согласно изобретению.Example 7 Preclinical pharmacokinetics of anti-PD1 antibody molecules according to the invention.

Фармакокинетические (PK) свойства молекулы антитела к PD1 согласно изобретению определяли в в/в PK исследовании с однократной дозой на яванских макаках.The pharmacokinetic (PK) properties of the anti-PD1 antibody molecule of the invention were determined in a single dose intravenous PK study in cynomolgus monkeys.

Молекула антителу к PD1 согласно изобретению, которую вводили в дозе 1 мг/кг в/в, проявляла средний клиренс из плазмы (CL) 0,28 мл/ч/кг. Средний объем распределения (Vss) для PD1-3 составил 58 мл/кг. Средний конечный период полувыведения для PD1-3 составил 11 дней.The anti-PD1 antibody molecule of the invention, administered at a dose of 1 mg/kg iv, exhibited a mean plasma clearance (CL) of 0.28 ml/h/kg. The mean volume of distribution (Vss) for PD1-3 was 58 ml/kg. The mean terminal half-life for PD1-3 was 11 days.

AUC и C_max PD1-3 в дозе 1 мг/кг у яванских макак были практически идентичными соответствующим параметрам IgG4Pro PD-1 антитела ниволумаб (BMS-936558, опубликованный в Wang, С. и др., Cancer Immunol. Res. 2:846-856, 2014) и пембролизумаб (MK-3475, опубликованный в FDA BLA документе 125514Orig1 s000 Pharmacology Review, 2014) в сопоставимым диапазоне доз.The AUC and C _{max of} PD1-3 at 1 mg/kg in cynomolgus monkeys were nearly identical to the corresponding parameters of the IgG4Pro PD-1 antibody nivolumab (BMS-936558 published in Wang, C. et al., Cancer Immunol. Res. 2:846 -856, 2014) and pembrolizumab (MK-3475 published in FDA BLA document 125514 Orig1 s000 Pharmacology Review, 2014) over a comparable dose range.

Неожиданно и непредсказуемо, конечный период полужизни, наблюдаемый для PD1-3, был в 1,5-2 раз выше, чем таковой для ниволумаба, как показано на фиг. 5. Это свидетельствует о том, что антитела к PD1 согласно изобретению имеют период полужизни в сыворотке 11 дней. Это отличается от известных сравнительных молекул антител к PD1, которые типично имеют период полужизни от 4 до 6 дней в диапазоне дозирования 0,3-3 мг/кг. Это неожиданная характерная особенность молекул антител согласно изобретению может предоставлять возможность пациенту подвергаться лечению с применением молекул антител согласно изобретению менее часто, по сравнению с таковыми из уровня техники, что может привести к уменьшению количества антитело, которое следует принимать, либо в форме уменьшенной частоты введения или в уменьшенной частоты используемого антитела. Принимая во внимания, что молекулы антител к PD1 могут индуцировать нежелательные побочные эффекты у пациентов, как обсуждалось выше, то антитела к PD1 согласно изобретению могут иметь существенное и неожиданное клиническое преимущество по сравнению с уровнем техники.Surprisingly and unpredictably, the terminal half-life observed for PD1-3 was 1.5-2 times higher than that for nivolumab, as shown in FIG. 5. This indicates that the anti-PD1 antibodies of the invention have a serum half-life of 11 days. This is in contrast to known reference anti-PD1 antibody molecules, which typically have a half-life of 4 to 6 days over the 0.3-3 mg/kg dosage range. This unexpected characteristic of the antibody molecules of the invention may allow the patient to be treated with the antibody molecules of the invention less frequently than those of the prior art, which may result in a reduction in the amount of antibody to be taken, either in the form of a reduced frequency of administration or at a reduced frequency of the antibody used. Given that anti-PD1 antibody molecules can induce unwanted side effects in patients, as discussed above, anti-PD1 antibodies of the invention may have a significant and unexpected clinical advantage over the prior art.

Пример 8. Идентификация связывания мышиных антител с LAG3.Example 8 Identification of mouse antibody binding to LAG3.

Синтезировали внеклеточный домен (ECD) белка LAG3 человека (аминокислоты 23-450 номер доступа GenBank NP_002277) и приготавливали в качестве иммуногена. После этого мышей иммунизировали и затем бустировали с помощью белка LAG3 ECD человека с последующими стандартными лабораторными методиками иммунизации.The extracellular domain (ECD) of the human LAG3 protein (amino acids 23-450 GenBank accession number NP_002277) was synthesized and prepared as an immunogen. Mice were then immunized and then boosted with human LAG3 ECD protein followed by standard laboratory immunization procedures.

После этого у иммунизированных мышей отбирали образцы плазмы и подвергали скринингу для идентификации особей с достаточным титром иммуноглобулина к LAG3. После осуществления стандартных лабораторных методов, собирали лимфоциты от отобранных мышей и сливали с мышиными миеломными клетками для создания гибридом.After that, plasma samples were taken from immunized mice and subjected to screening to identify individuals with a sufficient titer of anti-LAG3 immunoglobulin. Following standard laboratory procedures, lymphocytes were harvested from selected mice and fused with mouse myeloma cells to create hybridomas.

Отбирали некоторые гибридомы, продуцирующие антитела, которые специфически связываются с LAG3 человека, выделяли вариабельные домены антител и клонировали, используя стандартные наборы ПЦР праймеров.Some hybridomas producing antibodies that specifically bind to human LAG3 were selected, antibody variable domains isolated, and cloned using standard PCR primer sets.

С помощью этого исследования идентифицировали мышиную гибридомную линию, обозначаемую как 496G6, которые продуцируют моноклональные антитела, проявляющие низкие нМ аффинности свя- 29 042707 зывания с LAG3 (ECD) человека и отбирали для дальнейшего исследования.Using this assay, a mouse hybridoma line, referred to as 496G6, was identified that produces monoclonal antibodies exhibiting low nM binding affinities for human LAG3 (ECD) and selected for further study.

Аминокислотная последовательность вариабельного домена моноклонального антитела, продуцируемого 496G6, представлена на фиг. 6.The amino acid sequence of the variable domain of the monoclonal antibody produced by 496G6 is shown in FIG. 6.

Пример 9. Создание гуманизированных антител к LAG3.Example 9 Generation of humanized anti-LAG3 antibodies.

В этом примере, обеспечивали способы и результаты для разработки гуманизированных производных моноклонального антитела, продуцируемого мышиной гибридомной линией 496G6, описанной в примере 8.In this example, methods and results were provided for the development of humanized derivatives of the monoclonal antibody produced by the mouse hybridoma line 496G6 described in Example 8.

V-гены мышиной 496G6 гибридомы идентифицировали с помощью ПЦР и протоколов секвенирования, хорошо известных в данной области техники. Затем V-гены сливали с наиболее близкими подходящими генами зародышевой линии человека, используя стандартные техники молекулярной биологии. В случае 496G6, это приводит к химерному мышиному/человеческому антителу, имеющему мышиные Vk и Vh аминокислотные остатки, слитые с человеческими Ck и Ch1 аминокислотные остатки.Mouse 496G6 hybridoma V genes were identified using PCR and sequencing protocols well known in the art. The V genes were then fused to the closest suitable human germline genes using standard molecular biology techniques. In the case of 496G6, this results in a chimeric mouse/human antibody having mouse Vk and Vh amino acid residues fused to human Ck and Ch1 amino acid residues.

После приготовления, химерное мышиное/человеческое антитело затем подвергали стандартным протоколам гуманизации, хорошо известных в данной области техники. В этом методе, приготавливали мутированные аминокислотные библиотеки химерных 496G6 Fab клонов. Дополнительные положения библиотек также приготавливали таким образом, чтобы удалить препятствующие последовательности (т.е. аминокислотные остатки, которые, как известно, являются иммуногенными или создают потенциальные проблемы при производстве). Эти мутированные библиотеки обычно имеют от 5 до 10 бинарных (мышиных отн. человеческих) положений на V-участок. Некоторые небольшие библиотеки могут быть построены для маркировки специфических проблем в более комплексных V-участках. Такие библиотеки приготавливают, используя стандартные методы в данной области техники, и легко могут использоваться квалифицированным специалистом.Once prepared, the chimeric mouse/human antibody was then subjected to standard humanization protocols well known in the art. In this method, mutated amino acid libraries of chimeric 496G6 Fab clones were prepared. Additional library positions were also prepared to remove interfering sequences (ie, amino acid residues known to be immunogenic or pose potential manufacturing problems). These mutated libraries typically have 5 to 10 binary (mouse versus human) positions per V region. Some small libraries can be built to flag specific problems in more complex V-plots. Such libraries are prepared using standard methods in the art and can be easily used by the skilled person.

После завершения этой стадии, приготавливали несколько различных гуманизированных Fabs, имеющих происхождение из исходной мышиной 496G6 Fab последовательность. Эти гуманизированные Fabs тестировали для определения их способности связываться с LAG3 человека и блокировать взаимодействие MHCII с LAG3. Впоследствии отбирали генетически сконструированные Fabs, которые проявляют активность равную с, или лучше, чем, соответствующие химерные Fab. Их аминокислотную последовательность анализировали для определения доли человеческой последовательности, возможной иммуногености, и удаления проблемных последовательностей.After this step was completed, several different humanized Fabs were prepared, derived from the original mouse 496G6 Fab sequence. These humanized Fabs were tested to determine their ability to bind to human LAG3 and block the interaction of MHCII with LAG3. Subsequently, genetically engineered Fabs were selected that exhibit activity equal to, or better than, the corresponding chimeric Fabs. Their amino acid sequence was analyzed to determine the proportion of human sequence, possible immunogenicity, and the removal of problematic sequences.

После отбора наиболее благоприятных гуманизированных Fabs, их затем помещали в формат IgG4 (Pro) иммуноглобулина человека. IgG4 (Pro) отличается от канонической последовательности IgG4 человека путем наличия серина 241, замененного на пролин, было показано, что это изменение минимизирует динамический обмен Fab-фрагментами между молекулами IgG4.After selecting the most favorable humanized Fabs, they were then placed in IgG4 (Pro) human immunoglobulin format. IgG4 (Pro) differs from the canonical human IgG4 sequence by having serine 241 replaced by proline, this change has been shown to minimize the dynamic exchange of Fab fragments between IgG4 molecules.

После завершения этого исследования, приготавливали 5 различных версий гуманизированного антитела исходного химерного мышиного/человеческого 496G6 Fab. Их обозначали: LAG3-1, LAG3-2, LAG3-3, LAG3-4 и LAG3-5.After completion of this study, prepared 5 different versions of humanized antibodies of the original chimeric mouse/human 496G6 Fab. They were designated: LAG3-1, LAG3-2, LAG3-3, LAG3-4 and LAG3-5.

Аминокислотная последовательность CDR для LAG3-1, LAG3-2, LAG3-3, LAG3-4, LAG3-5, VH и VL последовательности и полноразмерные НС и LC последовательности представлены в таблице в конце данной заявки. Для исключения неопределенности, корреляция между антителами и их SEQ ID номером также представлена в таблице ниже.The amino acid sequence of the CDRs for LAG3-1, LAG3-2, LAG3-3, LAG3-4, LAG3-5, VH and VL sequences and full length HC and LC sequences are shown in the table at the end of this application. To eliminate uncertainty, the correlation between antibodies and their SEQ ID number is also presented in the table below.

Таблица 6. SEQ ID NO для антител к LAG3 согласно изобретениюTable 6. SEQ ID NO for Anti-LAG3 Antibodies of the Invention

анти- LAG3 антитело anti- LAG3 antibody CDR последовательности CDR sequences VH последовательности VH sequences VL последовательности VL sequences НС последовательности NS sequence LC последовательности LC sequences LAG3-1 LAG3-1 39-44 39-44 51 51 52 52 61 61 62 62 LAG3-2 LAG3-2 39-44 39-44 53 53 54 54 63 63 64 64 LAG3-3 LAG3-3 39-44 39-44 55 55 56 56 65 65 66 66 LAG3-4 LAG3-4 39-44 39-44 57 57 58 58 67 67 68 68 LAG3-5 LAG3-5 45-50 45-50 59 59 60 60 69 69 70 70

Пример 10. Связывание антитела с LAG3 человека и блокирование взаимодействия LAG3 лиганда.Example 10 Antibody Binding to Human LAG3 and Blocking LAG3 Ligand Interaction.

Определяли аффинности связывания с рекомбинантным мономерным LAG3 человека, используя SPR.Binding affinities to recombinant monomeric human LAG3 were determined using SPR.

LAG3-1, LAG3-2, LAG3-3, LAG3-4 и LAG3-5 антитела захватывали на Белок A/G поверхности. LAG3 ECD-Fc человека инъецировали над захваченными антителами в течение 300 с при скорости потока 30 мкл/мин и диссоциации в течение 1800 с. Концентрации LAG3 человека ECD составляли 0, 0,625, 1,25, 2,5 и 5 нМ. Фоновые значения отнимали от необработанных данных и затем сенсограммы подгоняли универсально к 1:1 связыванию Ленгмюра для получения значений аффинности (K_D).LAG3-1, LAG3-2, LAG3-3, LAG3-4 and LAG3-5 antibodies were captured on the Protein A/G surface. Human LAG3 ECD-Fc was injected over the captured antibodies for 300 s at a flow rate of 30 μl/min and a dissociation for 1800 s. Human ECD LAG3 concentrations were 0, 0.625, 1.25, 2.5, and 5 nM. Background values were subtracted from the raw data and then sensograms were fitted universally to 1:1 Langmuir binding to obtain affinity (K _D ) values.

Используя этот протокол, определили, что антитела LAG3-1, LAG3-2, LAG3-3, LAG3-4 и LAG-3-5 связываются с LAG-3 человека с высокой аффинностью, как представлено в таблице ниже.Using this protocol, antibodies LAG3-1, LAG3-2, LAG3-3, LAG3-4, and LAG-3-5 were determined to bind to human LAG-3 with high affinity, as shown in the table below.

- 30 042707- 30 042707

Таблица 7. Связывание с рекомбинантным LAG3 человека (K_D, нМ)Table 7 Binding to recombinant human LAG3 (K _D , nM)

Антитело Antibody K_D, нМK _D , nM LAG3-1 LAG3-1 0,125 0.125 LAG3-2 LAG3-2 0,09 0.09 LAG3-3 LAG3-3 0,12 0.12 LAG3-4 LAG3-4 0,1 0.1 LAG3-5 LAG3-5 0,07 0.07

LAG3 антитела согласно изобретению тестировали для определения блокирования связывания рекомбинантный LAG3 белка человека с Raji клетками, экспрессирующими его лиганд МНС II, используя FACS. Рекомбинантный человеческий LAG3 внеклеточный домен, слитый с Fc человека (hLAG3-hIgFc), инкубировали с LAG3 антителами LAG3-1, LAG3-2, LAG3-3, LAG3-4 и LAG3-5 в течение 15 минут при комнатной температуре (КТ) перед добавлением к Raji клеткам, с последующей дальнейшей инкубацией в течение 30 мин при 4°C. Клетки промывали 3 раза. Определяли HLAG3-mIgFc связывание с Raji клетками, используя РЕ меченные анти-человеческие IgG. Анализ HLAG3-mIgFc связывания осуществляли с помощью FACS Canto I (BD Bioscience). Результаты обобщены на фиг. 7 и они свидетельствуют о том, что все тестированные LAG3 антитела согласно изобретению селективно и эффективно ингибируют связывание LAG3 с МНС II.LAG3 antibodies of the invention were tested to determine the blocking of binding of human recombinant LAG3 protein to Raji cells expressing its MHC II ligand using FACS. Recombinant human LAG3 extracellular domain fused to human Fc (hLAG3-hIgFc) was incubated with LAG3 antibodies LAG3-1, LAG3-2, LAG3-3, LAG3-4 and LAG3-5 for 15 minutes at room temperature (RT) before addition to Raji cells, followed by further incubation for 30 min at 4°C. Cells were washed 3 times. HLAG3-mIgFc binding to Raji cells was determined using PE labeled anti-human IgG. HLAG3-mIgFc binding analysis was performed using FACS Canto I (BD Bioscience). The results are summarized in FIG. 7 and they indicate that all tested LAG3 antibodies according to the invention selectively and effectively inhibit the binding of LAG3 to MHC II.

Пример 11. Картирование эпитопов гуманизированных моноклональных антител к LAG3.Example 11 Epitope Mapping of Humanized Anti-LAG3 Monoclonal Antibodies.

Анализировали эпитоп репрезентативного антитела к LAG3 согласно изобретению и сравнительную молекулу антитела, имеющую такую же аминокислотную последовательность, что и BMS-986016 (сравнительная молекула антитела к LAG3 из уровня техники), используя анализ конкурентного связывания. Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии конкуренции за связывание с LAG3, что указывает на то, что антитело к LAG3 согласно изобретению связывается с другим эпитопом, чем сравнительная молекула антитела к LAG3 из уровня техники.An epitope of a representative anti-LAG3 antibody of the invention and a reference antibody molecule having the same amino acid sequence as BMS-986016 (a reference anti-LAG3 antibody molecule of the prior art) were analyzed using competitive binding assay. The results show no competition for binding to LAG3, indicating that the anti-LAG3 antibody of the invention binds to a different epitope than the reference anti-LAG3 antibody molecule of the prior art.

Эпитоп репрезентативного антитела к LAG3 согласно изобретению дополнительно корректировали с помощью экспериментов водородно-дейтериевого обмена (HDX), которые выявляют отличия эпитопов на уровне индивидуальных аминокислот в эпитопах антител.The epitope of a representative anti-LAG3 antibody of the invention was further adjusted using hydrogen-deuterium exchange (HDX) experiments, which reveal epitope differences at the level of individual amino acids in antibody epitopes.

HDX анализ показал, что репрезентативное антитело к LAG3 согласно изобретению связывается с двумя различными участками LAG3 человека, что подробно указано в табл. 8.HDX analysis showed that a representative anti-LAG3 antibody of the invention binds to two different regions of human LAG3, as detailed in Table 1. 8.

Таблица 8. Картирование эпитопов анти-LAGS mAbs с помощью масс-спектрометрии водородно-дейтериевого обменаTable 8. Epitope mapping of anti-LAGS mAbs by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry

Антитело Antibody LAG3 Участки связывания (ак*) LAG3 Binding sites (ak*) Эпитоп epitope LAG3-1 LAG3-1 33-40 и 125-135 33-40 and 125-135 LLRRAGVT (SEQ ID NO: 111) и YRAAVHLRDRA (SEQ ID NO: 112) LLRRAGVT (SEQ ID NO: 111) and YRAAVHLRDRA (SEQ ID NO: 112)

*LAG-3 использовали для нумерации: GenBank NP_002277.*LAG-3 used for numbering: GenBank NP_002277.

Пример 12. Стимуляция антиген-специфического Т-клеточного ответа с помощью антител к PD1 и к LAG3.Example 12 Stimulation of an antigen-specific T-cell response with anti-PD1 and anti-LAG3 antibodies.

Индивидуальные антитела к PD1 и к LAG3 согласно изобретению, и комбинации этих антител, тестировали для определения их способности стимулировать продукцию цитокинов специфическими к столбняку CD4 Т-клетками памяти с применением ELISA и сравнивали с известными из уровня техники антителами к PD1 и к LAG3Individual antibodies to PD1 and to LAG3 according to the invention, and combinations of these antibodies, were tested to determine their ability to stimulate the production of cytokines by tetanus-specific CD4 memory T-cells using ELISA and compared with prior art antibodies to PD1 and to LAG3

Для этого исследования, Т-клетки из РВМС здоровых доноров выращивали в присутствии столбнячного анатоксина и совместно культивировали с аутологическими зрелыми дендритными клетками (DC), загруженными с помощью столбнячного анатоксина в течение 2 дней. Стадию совместного культивирования повторяли второй раз сходным образом в присутствии αнти-PD1, анти-LAG3 и комбинация молекул антител к PD1 и к LAG3, используя фиксированное количество анти-PD1 mAb (200 нМ) с возрастающими количествами антител к LAG3. После окончания второй стадии совместного культивирования супернатанты анализировали для определения секреции ИФН-гамма.For this study, T cells from healthy donor PBMCs were grown in the presence of tetanus toxoid and co-cultured with autologous mature dendritic cells (DC) loaded with tetanus toxoid for 2 days. The co-culture step was repeated a second time in a similar manner in the presence of αanti-PD1, anti-LAG3, and a combination of anti-PD1 and anti-LAG3 antibody molecules using a fixed amount of anti-PD1 mAb (200 nM) with increasing amounts of anti-LAG3 antibodies. After the end of the second stage of co-cultivation, the supernatants were analyzed to determine the secretion of IFN-gamma.

С помощью этого анализа, комбинацию антител к PD1 и к LAG3 согласно изобретению сравнивали с ниволумабом (Opdivo (R)) (PD1 mAb) плюс антитело, имеющее такую же аминокислотную последовательность, как и BMS-986016 (LAG3 mAb) у 4 различных доноров. Возрастающие количества антител к LAG3 использовали в комбинации с фиксированной дозой анти-PD1 mAbs.Using this assay, the combination of anti-PD1 and anti-LAG3 antibodies of the invention was compared with nivolumab (Opdivo (R)) (PD1 mAb) plus an antibody having the same amino acid sequence as BMS-986016 (LAG3 mAb) from 4 different donors. Increasing amounts of anti-LAG3 antibodies were used in combination with a fixed dose of anti-PD1 mAbs.

Представленные данные нормализовали к антителу к PD1, используемому при насыщающей концентрации, указанной как 100% и результаты представлены на фиг. 8.The data presented was normalized to the anti-PD1 antibody used at the saturation concentration indicated as 100% and the results are shown in FIG. 8.

Эти данные свидетельствуют о том, что комбинация антител к PD1 и к LAG3 согласно изобретению приводит к повышению в 1,5-2 раза продукции ИФН-гамма по сравнению с анти-PD1 mAb отдельно. Неожиданно комбинация антител к PD1 и к LAG3 согласно изобретению является лучше, чем такая комбинация антител к PD1 и к LAG3 из уровня техники.These data indicate that the combination of anti-PD1 and anti-LAG3 antibodies according to the invention results in a 1.5-2 fold increase in IFN-gamma production compared to an anti-PD1 mAb alone. Surprisingly, the combination of antibodies to PD1 and to LAG3 according to the invention is better than such a combination of antibodies to PD1 and to LAG3 from the prior art.

Кроме того, полученные данные свидетельствуют о том, что у 3 из 4 доноров анти-PD1-3 (предста- 31 042707 витель PD1 антитела согласно изобретению) является лучшим за ниволумаб (Opdivo (R)), что можно наблюдать по более высоким уровням секреции ИФН-гамма при очень низких уровнях анти-LAG3 mAB (фиг. 8).In addition, the data indicate that in 3 out of 4 donors, anti-PD1-3 (representative of the PD1 antibody of the invention) is superior to nivolumab (Opdivo (R)), as can be seen from the higher levels of secretion IFN-gamma at very low levels of anti-LAG3 mAB (FIG. 8).

Как можно понять, это преимущество комбинации молекул антител к LAG3 в соответствии с настоящим изобретением с молекулами антител к PD1 в соответствии с настоящим изобретением свидетельствует о том, что из можно использовать для лечения злокачественного новообразования при очень низком уровне дозирования по сравнению с лекарственными средствами на основании антител из уровня техники, что может предоставить терапевтическое применение с меньшим количеством нежелательных побочных действий.As can be understood, this advantage of combining the anti-LAG3 antibody molecules of the present invention with the anti-PD1 antibody molecules of the present invention indicates that they can be used in the treatment of cancer at a very low dosage level compared to drugs based on antibodies of the prior art, which may provide therapeutic applications with fewer unwanted side effects.

Учитывая тот факт, что молекулы антител к PD1 и к LAG3 могут индуцировать нежелательные побочные эффекты у пациентов, как обсуждалось выше, то антитела к PD1 и антитела к LAG3 согласно изобретению могут иметь существенное и неожиданное клиническое преимущество по сравнению с известным уровнем техники путем применения меньших дозировок и/или схем введения с меньшей частотой.Given the fact that anti-PD1 and anti-LAG3 antibody molecules can induce undesirable side effects in patients, as discussed above, the anti-PD1 antibodies and anti-LAG3 antibodies of the invention can have a significant and unexpected clinical advantage over the prior art by using less dosages and/or administration schedules with less frequency.

Пример 13. Эффективность in vivo комбинированной терапии с применением антител к PD1 и к LAG3 на моделях сингенных опухолей.Example 13 In vivo efficacy of anti-PD1 and anti-LAG3 antibody combination therapy in syngeneic tumor models.

Для тестирования, будет ли лечение с применением комбинации антител к PD1 и к LAG3 согласно изобретению обеспечивать лучшие результаты эффективности in vivo, некоторые доклинические модели опухолей у мышей лечили с применением анти-PD1 и анти-LAG3 mAbs. Всем мышам с опухолевыми клеточными линиями (МС38, Ободочная кишка-26 ободочная кишка-, B16F10 меланома, LL/2 (LLC1) легкого Льюиса- и 4Т1 рак молочной железы) инъецировали подкожно либо C57BL/6 или BALB/c в зависимости от происхождения мышиной опухолевой клеточной линии. В день 3 после инъекции клеток, мышей лечили внутрибрюшинно (в/б) с последующим дозированием два раза в неделю. Все антитела дозировали в количестве 10 мг/кг и комбинацию антител к LAG3 и к PD1 согласно изобретению дозировали в количестве 10 мг/кг каждого. Антитела, используемые в этом исследовании, все получали от BioXCell, West Lebanon, NH, США. Контрольная группа получала лечение с применением крысиного IgG2a антитела (клон 2A3), используемое антитело к PD1 имело крысиную IgG2a Fc часть (клон RMP114) и используемое анти-LAG3 в исследовании имело на IgG1 крысиную Fc часть (клон C9B7W). Размер опухоли измеряли по меньшей мере три раза в неделю в двух измерениях (длинах ширину) и рассчитывали объемы опухолей. Животных умертвляли, если размер опухоли достигал 1500 мм или если опухоли изъязвлялись.To test whether treatment with the combination of anti-PD1 and anti-LAG3 antibodies of the invention would provide better in vivo efficacy results, several preclinical mouse tumor models were treated with anti-PD1 and anti-LAG3 mAbs. All mice with tumor cell lines (MC38, Colon-26 colon-, B16F10 melanoma, LL/2 (LLC1) Lewis lung- and 4T1 breast cancer) were injected subcutaneously with either C57BL/6 or BALB/c depending on the origin of the mouse tumor cell line. On day 3 after cell injection, mice were treated intraperitoneally (ip) followed by dosing twice a week. All antibodies were dosed at 10 mg/kg and the combination of anti-LAG3 and anti-PD1 antibodies according to the invention were dosed at 10 mg/kg each. The antibodies used in this study were all obtained from BioXCell, West Lebanon, NH, USA. The control group was treated with a rat IgG2a antibody (clone 2A3), the anti-PD1 antibody used had a rat IgG2a Fc moiety (clone RMP114) and the anti-LAG3 used in the study had a rat IgG1 Fc moiety (clone C9B7W). Tumor size was measured at least three times per week in two dimensions (lengths width) and tumor volumes were calculated. Animals were sacrificed if the tumor size reached 1500 mm or if the tumors were ulcerated.

Результаты для TGI и CR, обобщены в табл. 9 и на фиг. 9, показывают объем опухоли в динамике для индивидуальных мышей. В заключение, это исследование свидетельствует о том, что анти-PD 1 лечение отдельно проявляет эффективность на МС 38, но не на других тестируемых моделях. Тем не менее, за исключением LL/2 модели, комбинированное лечение с применением антител к PD1 и к LAG3 согласно изобретению существенно улучшает эффективность анти-PD1 монотерапии и у нескольких мышей не обнаруживалось опухоли при окончании исследования на модели МС-38, Ободочная кишка-26 и 4Т1 модели. Следует особенно отметить, что на PD1 резистентной 4Т1 модели, комбинация проявляет лучший эффект на рост опухоли и 3 из 5 мышей полностью не имели опухолей.The results for TGI and CR are summarized in Table. 9 and in FIG. 9 show tumor volume over time for individual mice. In conclusion, this study suggests that anti-PD 1 treatment alone is effective on MC 38 but not on the other models tested. However, with the exception of the LL/2 model, the combination treatment with anti-PD1 and anti-LAG3 antibodies according to the invention significantly improves the efficacy of anti-PD1 monotherapy and several mice showed no tumor at the end of the study in model MC-38, Colon-26 and 4T1 models. Of particular note is that in the PD1 resistant 4T1 model, the combination showed the best effect on tumor growth and 3 out of 5 mice were completely tumor free.

Таблица 9. Обобщенные данные ингибирования роста опухоли для всех тестированных сингенных моделейTable 9 Summary of tumor growth inhibition data for all tested syngeneic models

Клеточная линия cell line МС38 MS38 B16-F10 B16-F10 LL/2 (LLC1) LL/2 (LLC1) Ободочная кишка-26 Colon-26 4Т1 4T1 Штамм мышей Mice strain C57BL/6 C57BL/6 C57BL/6 C57BL/6 C57BL/6 C57BL/6 BALB/c BALB/c BALB/c BALB/c День расчета TGI Day of TGI calculation 19 19 22 22 22 22 24 24 31 31 TGI [%] для PD1 TGI [%] for PD1 81 81 38 38 0 0 42 42 5 5 TGI [%] для LAG3 TGI [%] for LAG3 47 47 Не тестировали Not tested Не тестировали Not tested Не тестировали Not tested Не тестировали Not tested TGI [%] для PD 1 + LAG3 TGI [%] for PD 1 + LAG3 99 99 58 58 29 29 99 99 99 99 CR для PD1 CR for PD1 1 (Ю) 1 (U) 0(Ю) 0(S) 0(Ю) 0(S) 1 (Ю) 1 (U) 0(Ю) 0(S) CR для LAG3 CR for LAG3 0(Ю) 0(S) Не тестировали Not tested Не тестировали Not tested Не тестировали Not tested Не тестировали Not tested CR для PD-1 + LAG3 CR for PD-1 + LAG3 4(Ю) 4(S) 0(10) 0(10) 0(10) 0(10) з (5) h (5) з (5) h (5)

Пример 14. Фармацевтический препарат для подкожного введения.Example 14 Pharmaceutical formulation for subcutaneous administration.

Любые из вышеприведенных молекул антител согласно изобретению можно отбирать для приготовления фармацевтического препарата для подкожного введения, имеющего следующий состав.Any of the above antibody molecules according to the invention can be selected for the preparation of a pharmaceutical preparation for subcutaneous administration having the following composition.

- 32 042707- 32 042707

Лекарственное вещество: 100 мг/мл (1-3 нмоль/мл)Drug substance: 100 mg/ml (1-3 nmol/ml)

Ацетатный буфер: 25 мМAcetate buffer: 25 mM

Трегалоза: 220 мМTrehalose: 220 mM

Твин-20: 0,02 %Twin-20: 0.02%

Лекарственное вещество приготавливали в виде препарата в растворе, имеющий вышеописанный состав, стерилизовали и хранили при температуре от 2 до 8°C.The drug substance was formulated into a solution having the composition described above, sterilized and stored at 2 to 8°C.

Пример 15. Фармацевтический препарат для в/в введения.Example 15. Pharmaceutical preparation for intravenous administration.

Любые из вышеприведенных молекул антител согласно изобретению можно отбирать для приготовления фармацевтического препарата для в/в введения.Any of the above antibody molecules according to the invention can be selected for the preparation of a pharmaceutical preparation for intravenous administration.

Примером подходящего фармацевтического препарата для антитела согласно изобретению являют ся следующие составы.An example of a suitable pharmaceutical formulation for an antibody of the invention are the following formulations.

Флакон объемом 20 мл содержит 20 мг/мл антитела к PD1 согласно изобретению, в буфере, состоящем из 21,5 мМ ацетата натрия, 3,5 мМ уксусной кислоты, 240 мМ трегалоза, 0,67 мМ L-метионин, 0,04% мас./об. полисорбата 20, и воды для инъекций (ВДИ).The 20 ml vial contains 20 mg/ml of the anti-PD1 antibody according to the invention in a buffer consisting of 21.5 mM sodium acetate, 3.5 mM acetic acid, 240 mM trehalose, 0.67 mM L-methionine, 0.04% w/v polysorbate 20, and water for injection (WFI).

Флакон объемом 20 мл содержит 20 мг/мл антитела к LAG3 согласно изобретению в буфере, состоящем из 25 мМ ацетата, 240 мМ трегалозы, 0,67 мМ метионина, 0,04% (мас./об.) полисорбата 20, рН 5,5, и воды для инъекций (ВДИ).The 20 ml vial contains 20 mg/ml of the anti-LAG3 antibody of the invention in a buffer consisting of 25 mM acetate, 240 mM trehalose, 0.67 mM methionine, 0.04% (w/v) polysorbate 20, pH 5, 5, and water for injection (WFI).

Пример 16. Фармацевтическое применение у людей.Example 16 Pharmaceutical use in humans.

Растворы, изложенные в примере 15 выше, применяют для пациента, который в этом нуждается, например, человека, страдающего от злокачественного новообразования, путем внутривенной инфузии (дозировка от 100 до 200 мг) каждые две - четыре недели.The solutions set forth in Example 15 above are administered to a patient in need, such as a person suffering from cancer, by intravenous infusion (100 to 200 mg dosage) every two to four weeks.

ПоследовательностиSequences

НОМЕР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQUENCE NUMBER НАЗВАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQUENCE NAME ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ SUBSEQUENCE 1 1 PD1-1HCDR1 PD1-1HCDR1 GFTFSASAMS GFTFSASAMS 2 2 PD1-1HCDR2 PD1-1HCDR2 YISGGGGDTYYSSSVKG YISGGGGDTYYSSSVKG 3 3 PD1-1HCDR3 PD1-1HCDR3 HSNVNYYAMDY HSNVNYYAMDY 4 4 PD1-1LCDR1 PD1-1LCDR1 RASENIDTSGISFMN RASENIDTSGISFMN 5 5 PD1-1LCDR2 PD1-1LCDR2 VASNQGS VASNQGS 6 6 PD1-1LCDR3 PD1-1LCDR3 QQSKEVPWT QQSKEVPWT 7 7 PD1-2HCDR1 PD1-2HCDR1 GFTFSASAMS GFTFSASAMS 8 8 PD1-2HCDR2 PD1-2HCDR2 YISGGGGDTYYSSSVKG YISGGGGDTYYSSSVKG 9 9 PD1-2HCDR3 PD1-2HCDR3 HSNPNYYAMDY HSNPNYYAMDY 10 10 PD1-2LCDR1 PD1-2LCDR1 RASENIDTSGISFMN RASENIDTSGISFMN 11 eleven PD1-2LCDR2 PD1-2LCDR2 VASNQGS VASNQGS 12 12 PD1-2LCDR3 PD1-2LCDR3 QQSKEVPWT QQSKEVPWT 13 13 PD1-3HCDR1 PD1-3HCDR1 GFTFSKSAMS GFTFSKSAMS 14 14 PD1-3HCDR2 PD1-3HCDR2 YISGGGGDTYYSSSVKG YISGGGGDTYYSSSVKG 15 15 PD1-3HCDR3 PD1-3HCDR3 HSNVNYYAMDY HSNVNYYAMDY 16 16 PD1-3LCDR1 PD1-3LCDR1 RASENIDVSGISFMN RASENIDVSGISFMN 17 17 PD1-3LCDR2 PD1-3LCDR2 VASNQGS VASNQGS 18 18 PD1-3LCDR3 PD1-3LCDR3 QQSKEVPWT QQSKEVPWT 19 19 PD1VH1 PD1VH1 EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSASAMSWVR QAPGKGLEWVAYISGGGGDTYYSSSVKGRFTISRDNAK EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSASAMSWVR QAPGKGLEWVAYISGGGGDTYYSSSVKGRFTISRDNAK

- 33 042707- 33 042707

NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSNVNYYAMDYWGQ GTLVTVSS NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSNVNYYAMDYWGQ GTLVTVSS 20 20 PD1VL1 PD1VL1 EIVLTQSPATLSLSPGERATMSCRASENIDTSGISFMNW YQQKPGQAPKLLIYVASNQGSGIPARFSGSGSGTDFTLT ISRLEPEDFAVYYCQQSKEVPWTFGQGTKLEIK EIVLTQSPATLSLSPGERATMSCRASENIDTSGISFMNW YQQKPGQAPKLLIYVASNQGSGIPARFSGSGSGTDFTLT ISRLEPEDFAVYYCQQSKEVPWTFGQGTKLEIK 21 21 PD1VH2 PD1VH2 EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSASAMSWVR QAPGKGLEWVAYISGGGGDTYYSSSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSNPNYYAMDYWGQ GTLVTVSS EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSASAMSWVR QAPGKGLEWVAYISGGGGDTYYSSSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSNPNYYAMDYWGQ GTLVTVSS 22 22 PD1VL2 PD1VL2 EIVLTQSPATLSLSPGERATMSCRASENIDTSGISFMNW YQQKPGQAPKLLIYVASNQGSGIPARFSGSGSGTDFTLT ISRLEPEDFAVYYCQQSKEVPWTFGQGTKLEIK EIVLTQSPATLSLSPGERATMSCRASENIDTSGISFMNW YQQKPGQAPKLLIYVASNQGSGIPARFSGSGSGTDFTLT ISRLEPEDFAVYYCQQSKEVPWTFGQGTKLEIK 23 23 PD1VH3 PD1VH3 EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSKSAMSWVR QAPGKGLEWVAYISGGGGDTYYSSSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSNVNYYAMDYWGQ GTLVTVSS EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSKSAMSWVR QAPGKGLEWVAYISGGGGDTYYSSSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSNVNYYAMDYWGQ GTLVTVSS 24 24 PD1VL3 PD1VL3 EIVLTQSPATLSLSPGERATMSCRASENIDVSGISFMNW YQQKPGQAPKLLIYVASNQGSGIPARFSGSGSGTDFTLT ISRLEPEDFAVYYCQQSKEVPWTFGQGTKLEIK EIVLTQSPATLSLSPGERATMSCRASENIDVSGISFMNW YQQKPGQAPKLLIYVASNQGSGIPARFSGSGSGTDFTLT ISRLEPEDFAVYYCQQSKEVPWTFGQGTKLEIK 25 25 PD1VH4 PD1VH4 EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSKSAMSWVR QAPGKGLEWVAYISGGGGDTYYSSSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSNVNYYAMDYWGQ GTLVTVSS EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSKSAMSWVR QAPGKGLEWVAYISGGGGDTYYSSSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSNVNYYAMDYWGQ GTLVTVSS 26 26 PD1VL4 PD1VL4 EIVLTQSPATLSLSPGERATMSCRASENIDVSGISFMNW YQQKPGQAPKLLIYVASNQGSGIPARFSGSGSGTDFTLT ISRLEPEDFAVYYCQQSKEVPWTFGQGTKLEIK EIVLTQSPATLSLSPGERATMSCRASENIDVSGISFMNW YQQKPGQAPKLLIYVASNQGSGIPARFSGSGSGTDFTLT ISRLEPEDFAVYYCQQSKEVPWTFGQGTKLEIK 27 27 PD1VH5 PD1VH5 EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSKSAMSWVR QAPGKGLEWVAYISGGGGDTYYSSSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSNVNYYAMDYWGQ GTLVTVSS EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSKSAMSWVR QAPGKGLEWVAYISGGGGDTYYSSSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSNVNYYAMDYWGQ GTLVTVSS 28 28 PD1VL5 PD1VL5 EIVLTQSPATLSLSPGERATMSCRASENIDVSGISFMNW YQQKPGQAPKLLIYVASNQGSGIPARFSGSGSGTDFTLT ISRLEPEDFAVYYCQQSKEVPWTFGQGTKLEIK EIVLTQSPATLSLSPGERATMSCRASENIDVSGISFMNW YQQKPGQAPKLLIYVASNQGSGIPARFSGSGSGTDFTLT ISRLEPEDFAVYYCQQSKEVPWTFGQGTKLEIK 29 29 PD1HC1 PD1HC1 EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSASAMSWVR QAPGKGLEWVAYISGGGGDTYYSSSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSNVNYYAMDYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPP CPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS QEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSASAMSWVR QAPGKGLEWVAYISGGGGDTYYSSSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSNVNYYAMDYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPP CPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS QEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG 30 thirty PD1LC1 PD1LC1 EIVLTQSPATLSLSPGERATMSCRASENIDTSGISFMNW YQQKPGQAPKLLIYVASNQGSGIPARFSGSGSGTDFTLT ISRLEPEDFAVYYCQQSKEVPWTFGQGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC EIVLTQSPATLSPGERATMSCRASENIDTSGISFMNW YQQKPGQAPKLLIYVASNQGSGIPARFSGSGSGTDFTLT ISRLEPEDFAVYYCQQSKEVPWTFGQGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTKTLSKADYRGNGSSFKVYACEVACEVACE 31 31 PD1HC2 PD1HC2 EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSASAMSWVR QAPGKGLEWVAYISGGGGDTYYSSSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSNPNYYAMDYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPP EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSASAMSWVR QAPGKGLEWVAYISGGGGDTYYSSSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSNPNYYAMDYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTES VPSSSLGTKTYKVPPKKY

-34042707-34042707

CPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS QEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG CPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS QEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRGSLWQ EGNHTLWQ 32 32 PD1LC2 PD1LC2 EIVLTQSPATLSLSPGERATMSCRASENIDTSGISFMNW YQQKPGQAPKLLIYVASNQGSGIPARFSGSGSGTDFTLT ISRLEPEDFAVYYCQQSKEVPWTFGQGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC EIVLTQSPATLSPGERATMSCRASENIDTSGISFMNW YQQKPGQAPKLLIYVASNQGSGIPARFSGSGSGTDFTLT ISRLEPEDFAVYYCQQSKEVPWTFGQGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTKTLSKADYRGNGSSFKVYACEVACEVACE 33 33 PD1HC3 PD1HC3 EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSKSAMSWVR QAPGKGLEWVAYISGGGGDTYYSSSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSNVNYYAMDYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPP CPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS QEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSKSAMSWVR QAPGKGLEWVAYISGGGGDTYYSSSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSNVNYYAMDYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPP CPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS QEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG 34 34 PD1LC3 PD1LC3 EIVLTQSPATLSLSPGERATMSCRASENIDVSGISFMNW YQQKPGQAPKLLIYVASNQGSGIPARFSGSGSGTDFTLT ISRLEPEDFAVYYCQQSKEVPWTFGQGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC EIVLTQSPATLSPGERATMSCRASENIDVSGISFMNW YQQKPGQAPKLLIYVASNQGSGIPARFSGSGSGTDFTLT ISRLEPEDFAVYYCQQSKEVPWTFGQGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTKTLSKADYRGNGSSFKVYACEVESF 35 35 PD1HC4 PD1HC4 EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSKSAMSWVR QAPGKGLEWVAYISGGGGDTYYSSSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSNVNYYAMDYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPP CPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS QEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSKSAMSWVR QAPGKGLEWVAYISGGGGDTYYSSSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSNVNYYAMDYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPP CPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS QEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG 36 36 PD1LC4 PD1LC4 EIVLTQSPATLSLSPGERATMSCRASENIDVSGISFMNW YQQKPGQAPKLLIYVASNQGSGIPARFSGSGSGTDFTLT ISRLEPEDFAVYYCQQSKEVPWTFGQGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC EIVLTQSPATLSPGERATMSCRASENIDVSGISFMNW YQQKPGQAPKLLIYVASNQGSGIPARFSGSGSGTDFTLT ISRLEPEDFAVYYCQQSKEVPWTFGQGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTKTLSKADYRGNGSSFKVYACEVESF 37 37 PD1HC5 PD1HC5 EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSKSAMSWVR QAPGKGLEWVAYISGGGGDTYYSSSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSNVNYYAMDYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPP CPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS QEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQ EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSKSAMSWVR QAPGKGLEWVAYISGGGGDTYYSSSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSNVNYYAMDYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPP CPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS QEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQ

- 35 042707- 35 042707

PREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG PREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG 38 38 PD1LC5 PD1LC5 EIVLTQSPATLSLSPGERATMSCRASENIDVSGISFMNW YQQKPGQAPKLLIYVASNQGSGIPARFSGSGSGTDFTLT ISRLEPEDFAVYYCQQSKEVPWTFGQGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC EIVLTQSPATLSPGERATMSCRASENIDVSGISFMNW YQQKPGQAPKLLIYVASNQGSGIPARFSGSGSGTDFTLT ISRLEPEDFAVYYCQQSKEVPWTFGQGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTKTLSKADYRGNGSSFKVYACEVESF 39 39 LAG-1HCDR1 LAG-1HCDR1 GFSLSTSDMGVG GFSLSTSDMGVG 40 40 LAG-1HCDR2 LAG-1HCDR2 HIWWDDVKRYNPALKS HIWWDDVKRYNPALKS 41 41 LAG-1HCDR3 LAG-1HCDR3 IEDYGVSYYFDY IEDYGVSYYFDY 42 42 LAG-1LCDR1 LAG-1LCDR1 KASQDVSTAVA KASQDVSTAVA 43 43 LAG-1LCDR2 LAG-1LCDR2 SASYRYT SASYRYT 44 44 LAG-1LCDR3 LAG-1LCDR3 QQHYSIPLT QQHYSIPLT 45 45 LAG-2HCDR1 LAG-2HCDR1 GFSLSTSDMGVG GFSLSTSDMGVG 46 46 LAG-2HCDR2 LAG-2HCDR2 HIWWDDVKRYNPALKS HIWWDDVKRYNPALKS 47 47 LAG-2HCDR3 LAG-2HCDR3 IVDYGVSYYFDY IVDYGVSYYFDY 48 48 LAG-2LCDR1 LAG-2LCDR1 KASQDVSTAVA KASQDVSTAVA 49 49 LAG-2LCDR2 LAG-2LCDR2 SASYRYT SASYRYT 50 50 LAG-2LCDR3 LAG-2LCDR3 QQHYSIPLT QQHYSIPLT 51 51 LAGVH1 LAGVH1 QVTLVESGGGVVQPGRSLRLSCAFSGFSLSTSDMGVGW IRQAPGKGLEWVAHIWWDDVKRYNPALKSRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARIEDYGVSYYFDYWG QGTTVTVSS QVTLVESGGGVVQPGRSLRLSCAFSGFSLSTSDMGVGW IRQAPGKGLEWVAHIWWDDVKRYNPALKSRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARIEDYGVSYYFDYWG QGTTVTVSS 52 52 LAGVL1 LAGVL1 DIQMTQSPSFLSASVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQ KPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQHYSIPLTFGQGTKLEIK DIQMTQSPSFLSASVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQ KPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQHYSIPLTFGQGTKLEIK 53 53 LAGVH2 LAGVH2 QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCSFSGFSLSTSDMGVGWI RQPPGKALEWLAHIWWDDVKRYNPALKSRLTITKDTS KNQVVLTMTNMDPVDTATYFCARIEDYGVSYYFDYW GQGTTVTVSS QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCSFSGFSLSTSDMGVGWI RQPPGKALEWLAHIWWDDVKRYNPALKSRLTITKDTS KNQVVLTMTNMDPVDTATYFCARIEDYGVSYYFDYW GQGTTVTVSS 54 54 LAGVL2 LAGVL2 DIQMTQSPSFLSASVGDRVTFTCKASQDVSTAVAWYQQ KPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQHYSIPLTFGQGTKLEIK DIQMTQSPSFLSASVGDRVTFTCKASQDVSTAVAWYQQ KPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQHYSIPLTFGQGTKLEIK 55 55 LAGVH3 LAGVH3 QVTLVESGGGVVQPGRSLSLSCAFSGFSLSTSDMGVGW VRQPPGKGLEWVAHIWWDDVKRYNPALKSRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCARIEDYGVSYYFDYW GQGTTVTVSS QVTLVESGGGVVQPGRSLSLSCAFSGFSLSTSDMGVGW VRQPPGKGLEWVAHIWWDDVKRYNPALKSRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCARIEDYGVSYYFDYW GQGTTVTVSS 56 56 LAGVL3 LAGVL3 DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQ KPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQHYSIPLTFGAGTKLEIK DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQ KPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQHYSIPLTFGAGTKLEIK 57 57 LAGVH4 LAGVH4 QVTLVESGGGVVQPGRSLRLSCAFSGFSLSTSDMGVGW IRQAPGKGLEWVAHIWWDDVKRYNPALKSRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRAEDTATYFCARIEDYGVSYYFDYWG QGTTVTVSS QVTLVESGGGVVQPGRSLRLSCAFSGFSLSTSDMGVGW IRQAPGKGLEWVAHIWWDDVKRYNPALKSRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRAEDTATYFCARIEDYGVSYYFDYWG QGTTVTVSS 58 58 LAGVL4 LAGVL4 DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQ KPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQHYSIPLTFGQGTKLEIK DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQ KPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQHYSIPLTFGQGTKLEIK 59 59 LAGVH5 LAGVH5 QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCSFSGFSLSTSDMGVGWI RQPPGKALEWLAHIWWDDVKRYNPALKSRLTITKDTS KNQVVLTMTNMDPVDTATYFCARIVDYGVSYYFDYW GQGTTVTVSS QVTLKESGPTLVKPTQTLLTTCSFSGFSLSTSDMGVGWI RQPPGKALEWLAHIWWDDVKRYNPALKSRLTITKDTS KNQVVLTMTNMDPVDTATYFCARIVDYGVSYYFDYW GQGTTVTVSS 60 60 LAGVL5 LAGVL5 DIQMTQSPSFLSASVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQ KPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFAVYYCQQHYSIPLTFGQGTKLEIK DIQMTQSPSFLSASVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQ KPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFAVYYCQQHYSIPLTFGQGTKLEIK

-36042707-36042707

61 61 LAGHC1 LAGHC1 QVTLVESGGGVVQPGRSLRLSCAFSGFSLSTSDMGVGW IRQAPGKGLEWVAHIWWDDVKRYNPALKSRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARIEDYGVSYYFDYWG QGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV T VP S S SLGTKT YTCN VDHKP SNTK VDKRVE SKYGPP CP PCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS QEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG QVTLVESGGGVVQPGRSLRLSCAFSGFSLSTSDMGVGW IRQAPGKGLEWVAHIWWDDVKRYNPALKSRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARIEDYGVSYYFDYWG QGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV T VP S S SLGTKT YTCN VDHKP SNTK VDKRVE SKYGPP CP PCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS QEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG 62 62 LAGLC1 LAGLC1 DIQMTQSPSFLSASVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQ KPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQHYSIPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC DIQMTQSPSFLSASVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQ KPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQHYSIPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKECDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEV 63 63 LAGHC2 LAGHC2 QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCSFSGFSLSTSDMGVGWI RQPPGKALEWLAHIWWDDVKRYNPALKSRLTITKDTS KNQVVLTMTNMDPVDTATYFCARIEDYGVSYYFDYW GQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPC PPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVV S VLT VLHQD WLNGKEYKCKVSNKGLPS SIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCSFSGFSLSTSDMGVGWI RQPPGKALEWLAHIWWDDVKRYNPALKSRLTITKDTS KNQVVLTMTNMDPVDTATYFCARIEDYGVSYYFDYW GQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPC PPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVV S VLT VLHQD WLNGKEYKCKVSNKGLPS SIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG 64 64 LAGLC2 LAGLC2 DIQMTQSPSFLSASVGDRVTFTCKASQDVSTAVAWYQQ KPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQHYSIPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC DIQMTQSPSFLSASVGDRVTFTCKASQDVSTAVAWYQQ KPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQHYSIPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKECDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEV 65 65 LAGHC3 LAGHC3 QVTLVESGGGVVQPGRSLSLSCAFSGFSLSTSDMGVGW VRQPPGKGLEWVAHIWWDDVKRYNPALKSRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCARIEDYGVSYYFDYW GQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPC PPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG QVTLVESGGGVVQPGRSLSLSCAFSGFSLSTSDMGVGW VRQPPGKGLEWVAHIWWDDVKRYNPALKSRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCARIEDYGVSYYFDYW GQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPC PPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG 66 66 LAGLC3 LAGLC3 DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQ KPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQHYSIPLTFGAGTKLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQ KPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQHYSIPLTFGAGTKLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKGLSSPV 67 67 LAGHC4 LAGHC4 QVTLVESGGGVVQPGRSLRLSCAFSGFSLSTSDMGVGW IRQAPGKGLEWVAHIWWDDVKRYNPALKSRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRAEDTATYFCARIEDYGVSYYFDYWG QVTLVESGGGVVQPGRSLRLSCAFSGFSLSTSDMGVGW IRQAPGKGLEWVAHIWWDDVKRYNPALKSRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRAEDTATYFCARIEDYGVSYYFDYWG

- 37 042707- 37 042707

QGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV T VP S S SLGTKT YTCN VDHKP SNTK VDKRVE SKYGPP CP PCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS QEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WE SNGQPENNYKTTPP VLD SD GSFFL Y SRLT VDK SR WQ EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG QGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV T VP S S SLGTKT YTCN VDHKP SNTK VDKRVE SKYGPP CP PCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS QEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WE SNGQPENNYKTTPP VLD SD GSFFL Y SRLT VDK SR WQ EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG 68 68 LAGLC4 LAGLC4 DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQ KPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQHYSIPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQ KPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQHYSIPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKSSPV 69 69 LAGHC5 LAGHC5 QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCSFSGFSLSTSDMGVGWI RQPPGKALEWLAHIWWDDVKRYNPALKSRLTITKDTS KNQVVLTMTNMDPVDTATYFCARIVDYGVSYYFDYW GQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VT VP S S SLGTKT YTCN VDHKP SNTK VDKRVE SKYGPP C PPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WE SNGQPENNYKTTPP VLD SD GSFFL Y SRLT VDK SR WQ EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCSFSGFSLSTSDMGVGWI RQPPGKALEWLAHIWWDDVKRYNPALKSRLTITKDTS KNQVVLTMTNMDPVDTATYFCARIVDYGVSYYFDYW GQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VT VP S S SLGTKT YTCN VDHKP SNTK VDKRVE SKYGPP C PPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WE SNGQPENNYKTTPP VLD SD GSFFL Y SRLT VDK SR WQ EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG 70 70 LAGLC5 LAGLC5 DIQMTQSPSFLSASVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQ KPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFAVYYCQQHYSIPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL Q S GNSQE S VTEQD SKD S TY SL S STLTL SK AD YEKHK VY ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC DIQMTQSPSFLSASVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQ KPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFAVYYCQQHYSIPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL Q S GNSQE S VTEQD SKD S VTEQD SKD S SGQQ SL STKRGTH SKEVGLV AD 71 71 nPDIVHl nPDIVHl GAGGTGATGCTGGTCGAGAGCGGCGGCGGTCTCGTG CAGCCAGGCGGTAGCCTGCGCCTCAGCTGCACCGCCA GCGGCTTCACCTTCAGCGCTAGCGCCATGAGCTGGGT GCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGC CTACATCAGCGGCGGCGGCGGCGACACCTACTACAG CTCCAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGAC AACGCCAAAAACAGCCTGTACCTGCAAATGAACAGC CTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCC GCCACAGCAACGTCAACTACTACGCCATGGACTACTG GGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC GAGGTGATGCTGGTCGAGAGCGGCGGCGGTCTCGTG CAGCCAGGCGGTAGCCTGCGCCTCAGCTGCACCGCCA GCGGCTTCACCTTCAGCGCTAGCGCCATGAGCTGGGT GCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGC CTACATCAGCGGCGGCGGCGGCGACACCTACTACAG CTCCAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGAC AACGCCAAAAACAGCCTGTACCTGCAAATGAACAGC CTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCC GCCACAGCAACGTCAACTACTACGCCATGGACTACTG GGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC 72 72 nPDIVLl nPDIVLl GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGCCACCCTGAGC CTGAGCCCAGGCGAGCGCGCCACCATGAGCTGCCGC GCCAGCGAGAACATCGACACCAGCGGCATCAGCTTC ATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCA AAGCTGCTGATCTACGTGGCCAGCAACCAGGGCAGC GGCATCCCAGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGC ACCGACTTCACCCTGACCATCAGCCGCCTGGAGCCAG AGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAGCAAGG AAGTCCCATGGACCTTCGGCCAAGGTACTAAGCTGGA GATCAAG GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGCCACCCTGAGC CTGAGCCCAGGCGAGCGCGCCACCATGAGCTGCCGC GCCAGCGAGAACATCGACACCAGCGGCATCAGCTTC ATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCA AAGCTGCTGATCTACGTGGCCAGCAACCAGGGCAGC GGCATCCCAGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGC ACCGACTTCACCCTGACCATCAGCCGCCTGGAGCCAG AGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAGCAAGG AAGTCCCATGGACCTTCGGCCAAGGTACTAAGCTGGA GATCAAG 73 73 nPDlVH2 nPDlVH2 GAGGTGATGCTGGTCGAGAGCGGCGGCGGTCTCGTG CAGCCAGGCGGTAGCCTGCGCCTCAGCTGCACCGCCA GCGGCTTCACCTTCAGCGCTAGCGCCATGAGCTGGGT GCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGC GAGGTGATGCTGGTCGAGAGCGGCGGCGGTCTCGTG CAGCCAGGCGGTAGCCTGCGCCTCAGCTGCACCGCCA GCGGCTTCACCTTCAGCGCTAGCGCCATGAGCTGGGT GCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGC

-38042707-38042707

CTACATCAGCGGCGGCGGCGGCGACACCTACTACAG CTCCAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGAC AACGCCAAAAACAGCCTGTACCTGCAAATGAACAGC CTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCC GCCACAGCAACCCAAACTACTACGCCATGGACTACTG GGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC CTACATCAGCGGCGGCGGCGGCGACACCTACTACAG CTCCAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGAC AACGCCAAAAACAGCCTGTACCTGCAAATGAACAGC CTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCC GCCACAGCAACCCAAACTACTACGCCATGGACTACTG GGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC 74 74 nPDlVL2 nPDlVL2 GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGCCACCCTGAGC CTGAGCCCAGGCGAGCGCGCCACCATGAGCTGCCGC GCCAGCGAGAACATCGACACCAGCGGCATCAGCTTC ATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCA AAGCTGCTGATCTACGTGGCCAGCAACCAGGGCAGC GGCATCCCAGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGC ACCGACTTCACCCTGACCATCAGCCGCCTGGAGCCAG AGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAGCAAGG AAGTCCCATGGACCTTCGGCCAAGGTACTAAGCTGGA GATCAAG GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGCCACCCTGAGC CTGAGCCCAGGCGAGCGCGCCACCATGAGCTGCCGC GCCAGCGAGAACATCGACACCAGCGGCATCAGCTTC ATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCA AAGCTGCTGATCTACGTGGCCAGCAACCAGGGCAGC GGCATCCCAGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGC ACCGACTTCACCCTGACCATCAGCCGCCTGGAGCCAG AGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAGCAAGG AAGTCCCATGGACCTTCGGCCAAGGTACTAAGCTGGA GATCAAG 75 75 nPDlVH3 nPDlVH3 GAGGTGATGCTGGTCGAGAGCGGCGGCGGTCTCGTG CAGCCAGGCGGTAGCCTGCGCCTCAGCTGCACCGCCA GCGGCTTCACCTTCAGCAAGAGCGCCATGAGCTGGGT GCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGC CTACATCAGCGGCGGCGGCGGCGACACCTACTACAG CTCCAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGAC AACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAAATGAACAGC CTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCC GCCACAGCAACGTCAACTACTACGCCATGGACTACTG GGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC GAGGTGATGCTGGTCGAGAGCGGCGGCGGTCTCGTG CAGCCAGGCGGTAGCCTGCGCCTCAGCTGCACCGCCA GCGGCTTCACCTTCAGCAAGAGCGCCATGAGCTGGGT GCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGC CTACATCAGCGGCGGCGGCGGCGACACCTACTACAG CTCCAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGAC AACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAAATGAACAGC CTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCC GCCACAGCAACGTCAACTACTACGCCATGGACTACTG GGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC 76 76 nPDlVL3 nPDlVL3 GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGCCACCCTAAGC CTGAGCCCAGGCGAGCGCGCCACCATGAGCTGCCGC GCCAGCGAGAACATCGACCACAGCGGCATCAGCTTC ATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCA AAGCTGCTGATCTACGTGGCCAGCAACCAGGGCAGC GGCATCCCAGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGC ACCGACTTCACCCTGACCATCAGCCGCCTGGAGCCAG AGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAGCAAGG AAGTCCCATGGACCTTCGGCCAAGGTACTAAGCTGGA GATCAAG GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGCCACCCTAAGC CTGAGCCCAGGCGAGCGCGCCACCATGAGCTGCCGC GCCAGCGAGAACATCGACCACAGCGGCATCAGCTTC ATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCA AAGCTGCTGATCTACGTGGCCAGCAACCAGGGCAGC GGCATCCCAGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGC ACCGACTTCACCCTGACCATCAGCCGCCTGGAGCCAG AGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAGCAAGG AAGTCCCATGGACCTTCGGCCAAGGTACTAAGCTGGA GATCAAG 77 77 nPDlVH4 nPDlVH4 GAGGTGATGCTGGTCGAGAGCGGCGGCGGTCTCGTG CAGCCAGGCGGTAGCCTGCGCCTCAGCTGCACCGCCA GCGGCTTCACCTTCAGCAAGAGCGCCATGAGCTGGGT GCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGC CTACATCAGCGGCGGCGGCGGCGACACCTACTACAG CTCCAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGAC AACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAAATGAACAGC CTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCC GCCACAGCAACGTCAACTACTACGCCATGGACTACTG GGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC GAGGTGATGCTGGTCGAGAGCGGCGGCGGTCTCGTG CAGCCAGGCGGTAGCCTGCGCCTCAGCTGCACCGCCA GCGGCTTCACCTTCAGCAAGAGCGCCATGAGCTGGGT GCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGC CTACATCAGCGGCGGCGGCGGCGACACCTACTACAG CTCCAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGAC AACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAAATGAACAGC CTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCC GCCACAGCAACGTCAACTACTACGCCATGGACTACTG GGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC 78 78 nPDlVL4 nPDlVL4 GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGCCACCCTAAGC CTGAGCCCAGGCGAGCGCGCCACCATGAGCTGCCGC GCCAGCGAGAACATCGACCACAGCGGCATCAGCTTC ATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCA AAGCTGCTGATCTACGTGGCCAGCAACCAGGGCAGC GGCATCCCAGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGC ACCGACTTCACCCTGACCATCAGCCGCCTGGAGCCAG AGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAGCAAGG AAGTCCCATGGACCTTCGGCCAAGGTACTAAGCTGGA GATCAAG GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGCCACCCTAAGC CTGAGCCCAGGCGAGCGCGCCACCATGAGCTGCCGC GCCAGCGAGAACATCGACCACAGCGGCATCAGCTTC ATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCA AAGCTGCTGATCTACGTGGCCAGCAACCAGGGCAGC GGCATCCCAGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGC ACCGACTTCACCCTGACCATCAGCCGCCTGGAGCCAG AGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAGCAAGG AAGTCCCATGGACCTTCGGCCAAGGTACTAAGCTGGA GATCAAG 79 79 nPD!VH5 nPD!VH5 GAGGTGATGCTGGTCGAGAGCGGCGGCGGTCTCGTG GAGGTGATGCTGGTCGAGAGCGGCGGCGGTCTCGTG

- 39 042707- 39 042707

CAGCCAGGCGGTAGCCTGCGCCTCAGCTGCACCGCCA GCGGCTTCACCTTCAGCAAGAGCGCCATGAGCTGGGT GCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGC CTACATCAGCGGCGGCGGCGGCGACACCTACTACAG CTCCAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGAC AACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAAATGAACAGC CTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCC GCCACAGCAACGTCAACTACTACGCCATGGACTACTG GGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC CAGCCAGGCGGTAGCCTGCGCCTCAGCTGCACCGCCA GCGGCTTCACCTTCAGCAAGAGCGCCATGAGCTGGGT GCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGC CTACATCAGCGGCGGCGGCGGCGACACCTACTACAG CTCCAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGAC AACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAAATGAACAGC CTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCC GCCACAGCAACGTCAACTACTACGCCATGGACTACTG GGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC 80 80 nPDlVL5 nPDlVL5 GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGCCACCCTGAGC CTGAGCCCAGGCGAGCGCGCCACCATGAGCTGCCGC GCCAGCGAGAACATCGACGTAAGCGGCATCAGCTTC ATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCA AAGCTGCTGATCTACGTGGCCAGCAACCAGGGCAGC GGCATCCCAGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGC ACCGACTTCACCCTGACCATCAGCCGCCTGGAGCCAG AGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAGCAAGG AAGTCCCATGGACCTTCGGCCAAGGTACTAAGCTGGA AATCAAG GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGCCACCCTGAGC CTGAGCCCAGGCGAGCGCGCCACCATGAGCTGCCGC GCCAGCGAGAACATCGACGTAAGCGGCATCAGCTTC ATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCA AAGCTGCTGATCTACGTGGCCAGCAACCAGGGCAGC GGCATCCCAGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGC ACCGACTTCACCCTGACCATCAGCCGCCTGGAGCCAG AGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAGCAAGG AAGTCCCATGGACCTTCGGCCAAGGTACTAAGCTGGA AATCAAG 81 81 nPDIHCl nPDIHCl GAGGTGATGCTGGTCGAGAGCGGCGGCGGTCTCGTG CAGCCAGGCGGTAGCCTGCGCCTCAGCTGCACCGCCA GCGGCTTCACCTTCAGCGCTAGCGCCATGAGCTGGGT GCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGC CTACATCAGCGGCGGCGGCGGCGACACCTACTACAG CTCCAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGAC AACGCCAAAAACAGCCTGTACCTGCAAATGAACAGC CTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCC GCCACAGCAACGTCAACTACTACGCCATGGACTACTG GGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCCTC CACAAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCTTGC TCCCGGTCCACCTCCGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCT GCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGT GTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCAC ACCTTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTC CCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCCTCCTCTAGCCTGG GCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGACCACAAGC CCTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAATCTA AGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGA ATTTCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCAA AGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGA AGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAAGA TCCCGAGGTCCAGTTTAATTGGTACGTGGACGGCGTG GAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAA CAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGA CCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGT ACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCTCCA GCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGC CCCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCTCCAAGCCA GGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTG TCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTG GAATGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTAC AAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCT TCTTCCTGTACTCTCGGCTGACCGTGGACAAGTCCCG GTGGCAGGAAGGCAACGTCTTCTCCTGCTCCGTGATG CACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCC CTGTCCCTGAGCCTGGGC GAGGTGATGCTGGTCGAGAGCGGCGGCGGTCTCGTG CAGCCAGGCGGTAGCCTGCGCCTCAGCTGCACCGCCA GCGGCTTCACCTTCAGCGCTAGCGCCATGAGCTGGGT GCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGC CTACATCAGCGGCGGCGGCGGCGACACCTACTACAG CTCCAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGAC AACGCCAAAAACAGCCTGTACCTGCAAATGAACAGC CTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCC GCCACAGCAACGTCAACTACTACGCCATGGACTACTG GGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCCTC CACAAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCTTGC TCCCGGTCCACCTCCGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCT GCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGT GTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCAC ACCTTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTC CCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCCTCCTCTAGCCTGG GCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGACCACAAGC CCTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAATCTA AGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGA ATTTCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCAA AGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGA AGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAAGA TCCCGAGGTCCAGTTTAATTGGTACGTGGACGGCGTG GAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAA CAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGA CCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGT ACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCTCCA GCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGC CCCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCTCCAAGCCA GGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTG TCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTG GAATGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTAC AAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCT TCTTCCTGTACTCTCGGCTGACCGTGGACAAGTCCCG GTGGCAGGAAGGCAACGTCTTCTCCTGCTCCGTGATG CACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCC CTGTCCCTGAGCCTGGGC 82 82 nPDILCI nPDILCI GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGCCACCCTGAGC GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGCCACCCCTGAGC

- 40 042707- 40 042707

CTGAGCCCAGGCGAGCGCGCCACCATGAGCTGCCGC GCCAGCGAGAACATCGACACCAGCGGCATCAGCTTC ATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCA AAGCTGCTGATCTACGTGGCCAGCAACCAGGGCAGC GGCATCCCAGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGC ACCGACTTCACCCTGACCATCAGCCGCCTGGAGCCAG AGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAGCAAGG AAGTCCCATGGACCTTCGGCCAAGGTACTAAGCTGGA GATCAAGCGTACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAATTGAAATCTGGAACTG CCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGA GAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTC CAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAG GACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAA GTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCT CGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT CTGAGCCCAGGCGAGCGCGCCACCATGAGCTGCCGC GCCAGCGAGAACATCGACACCAGCGGCATCAGCTTC ATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCA AAGCTGCTGATCTACGTGGCCAGCAACCAGGGCAGC GGCATCCCAGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGC ACCGACTTCACCCTGACCATCAGCCGCCTGGAGCCAG AGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAGCAAGG AAGTCCCATGGACCTTCGGCCAAGGTACTAAGCTGGA GATCAAGCGTACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAATTGAAATCTGGAACTG CCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGA GAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTC CAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAG GACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAA GTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCT CGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT 83 83 nPDlHC2 nPDlHC2 GAGGTGATGCTGGTCGAGAGCGGCGGCGGTCTCGTG CAGCCAGGCGGTAGCCTGCGCCTCAGCTGCACCGCCA GCGGCTTCACCTTCAGCGCTAGCGCCATGAGCTGGGT GCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGC CTACATCAGCGGCGGCGGCGGCGACACCTACTACAG CTCCAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGAC AACGCCAAAAACAGCCTGTACCTGCAAATGAACAGC CTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCC GCCACAGCAACCCAAACTACTACGCCATGGACTACTG GGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCCTC CACAAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCTTGC TCCCGGTCCACCTCCGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCT GCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGT GTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCAC ACCTTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTC CCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCCTCCTCTAGCCTGG GCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGACCACAAGC CCTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAATCTA AGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGA ATTTCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCAA AGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGA AGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAAGA TCCCGAGGTCCAGTTTAATTGGTACGTGGACGGCGTG GAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAA CAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGA CCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGT ACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCTCCA GCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGC CCCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCTCCAAGCCA GGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTG TCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTG GAATGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTAC AAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCT TCTTCCTGTACTCTCGGCTGACCGTGGACAAGTCCCG GTGGCAGGAAGGCAACGTCTTCTCCTGCTCCGTGATG CACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCC CTGTCCCTGAGCCTGGGC GAGGTGATGCTGGTCGAGAGCGGCGGCGGTCTCGTG CAGCCAGGCGGTAGCCTGCGCCTCAGCTGCACCGCCA GCGGCTTCACCTTCAGCGCTAGCGCCATGAGCTGGGT GCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGC CTACATCAGCGGCGGCGGCGGCGACACCTACTACAG CTCCAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGAC AACGCCAAAAACAGCCTGTACCTGCAAATGAACAGC CTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCC GCCACAGCAACCCAAACTACTACGCCATGGACTACTG GGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCCTC CACAAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCTTGC TCCCGGTCCACCTCCGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCT GCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGT GTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCAC ACCTTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTC CCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCCTCCTCTAGCCTGG GCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGACCACAAGC CCTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAATCTA AGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGA ATTTCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCAA AGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGA AGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAAGA TCCCGAGGTCCAGTTTAATTGGTACGTGGACGGCGTG GAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAA CAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGA CCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGT ACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCTCCA GCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGC CCCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCTCCAAGCCA GGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTG TCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTG GAATGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTAC AAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCT TCTTCCTGTACTCTCGGCTGACCGTGGACAAGTCCCG GTGGCAGGAAGGCAACGTCTTCTCCTGCTCCGTGATG CACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCC CTGTCCCTGAGCCTGGGC 84 84 nPD!LC2 nPD!LC2 GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGCCACCCTGAGC CTGAGCCCAGGCGAGCGCGCCACCATGAGCTGCCGC GCCAGCGAGAACATCGACACCAGCGGCATCAGCTTC GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGCCACCCCTGAGC CTGAGCCCAGGCGAGCGCGCCACCATGAGCTGCCGC GCCAGCGAGAACATCGACACCAGCGGCATCAGCTTC

- 41 042707- 41 042707

ATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCA AAGCTGCTGATCTACGTGGCCAGCAACCAGGGCAGC GGCATCCCAGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGC ACCGACTTCACCCTGACCATCAGCCGCCTGGAGCCAG AGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAGCAAGG AAGTCCCATGGACCTTCGGCCAAGGTACTAAGCTGGA GATCAAGCGTACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAATTGAAATCTGGAACTG CCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGA GAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTC CAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAG GACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAA GTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCT CGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT ATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCA AAGCTGCTGATCTACGTGGCCAGCAACCAGGGCAGC GGCATCCCAGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGC ACCGACTTCACCCTGACCATCAGCCGCCTGGAGCCAG AGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAGCAAGG AAGTCCCATGGACCTTCGGCCAAGGTACTAAGCTGGA GATCAAGCGTACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAATTGAAATCTGGAACTG CCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGA GAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTC CAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAG GACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAA GTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCT CGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT 85 85 nPDlHC3 nPDlHC3 GAGGTGATGCTGGTCGAGAGCGGCGGCGGTCTCGTG CAGCCAGGCGGTAGCCTGCGCCTCAGCTGCACCGCCA GCGGCTTCACCTTCAGCAAGAGCGCCATGAGCTGGGT GCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGC CTACATCAGCGGCGGCGGCGGCGACACCTACTACAG CTCCAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGAC AACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAAATGAACAGC CTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCC GCCACAGCAACGTCAACTACTACGCCATGGACTACTG GGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCCTC CACAAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCTTGC TCCCGGTCCACCTCCGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCT GCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGT GTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCAC ACCTTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTC CCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCCTCCTCTAGCCTGG GCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGACCACAAGC CCTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAATCTA AGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGA ATTTCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCAA AGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGA AGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAAGA TCCCGAGGTCCAGTTTAATTGGTACGTGGACGGCGTG GAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAA CAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGA CCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGT ACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCTCCA GCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGC CCCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCTCCAAGCCA GGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTG TCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTG GAATGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTAC AAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCT TCTTCCTGTACTCTCGGCTGACCGTGGACAAGTCCCG GTGGCAGGAAGGCAACGTCTTCTCCTGCTCCGTGATG CACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCC CTGTCCCTGAGCCTGGGC GAGGTGATGCTGGTCGAGAGCGGCGGCGGTCTCGTG CAGCCAGGCGGTAGCCTGCGCCTCAGCTGCACCGCCA GCGGCTTCACCTTCAGCAAGAGCGCCATGAGCTGGGT GCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGC CTACATCAGCGGCGGCGGCGGCGACACCTACTACAG CTCCAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGAC AACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAAATGAACAGC CTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCC GCCACAGCAACGTCAACTACTACGCCATGGACTACTG GGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCCTC CACAAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCTTGC TCCCGGTCCACCTCCGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCT GCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGT GTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCAC ACCTTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTC CCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCCTCCTCTAGCCTGG GCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGACCACAAGC CCTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAATCTA AGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGA ATTTCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCAA AGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGA AGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAAGA TCCCGAGGTCCAGTTTAATTGGTACGTGGACGGCGTG GAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAA CAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGA CCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGT ACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCTCCA GCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGC CCCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCTCCAAGCCA GGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTG TCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTG GAATGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTAC AAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCT TCTTCCTGTACTCTCGGCTGACCGTGGACAAGTCCCG GTGGCAGGAAGGCAACGTCTTCTCCTGCTCCGTGATG CACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCC CTGTCCCTGAGCCTGGGC 86 86 nPD!LC3 nPD!LC3 GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGCCACCCTGAGC CTGAGCCCAGGCGAGCGCGCCACCATGAGCTGCCGC GCCAGCGAGAACATCGACGTAAGCGGCATCAGCTTC ATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCA AAGCTGCTGATCTACGTGGCCAGCAACCAGGGCAGC GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGCCACCCCTGAGC CTGAGCCCAGGCGAGCGCGCCACCATGAGCTGCCGC GCCAGCGAGAACATCGACGTAAGCGGCATCAGCTTC ATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCA AAGCTGCTGATCTACGTGGCCAGCAACCAGGGCAGC

- 42 042707- 42 042707

GGCATCCCAGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGC ACCGACTTCACCCTGACCATCAGCCGCCTGGAGCCAG AGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAGCAAGG AAGTCCCATGGACCTTCGGCCAAGGTACTAAGCTGGA AATCAAGCGTACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAATTGAAATCTGGAACTG CCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGA GAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTC CAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAG GACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAA GTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCT CGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT GGCATCCCAGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGC ACCGACTTCACCCTGACCATCAGCCGCCTGGAGCCAG AGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAGCAAGG AAGTCCCATGGACCTTCGGCCAAGGTACTAAGCTGGA AATCAAGCGTACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAATTGAAATCTGGAACTG CCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGA GAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTC CAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAG GACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAA GTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCT CGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT 87 87 nPDlHC4 nPDlHC4 GAGGTGATGCTGGTCGAGAGCGGCGGCGGTCTCGTG CAGCCAGGCGGTAGCCTGCGCCTCAGCTGCACCGCCA GCGGCTTCACCTTCAGCCGCAGCGCCATGAGCTGGGT GCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGC CTACATCAGCGGCGGCGGCGGCGACACCTACTACAG CGTCAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGAC AACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAAATGAACAGC CTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCC GCCACAGCAACTACAACTACTACGCCATGGACTACTG GGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCCTC CACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCCTCC TCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGC TGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGG TGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCA CACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTAC TCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCT TGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAA GCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGCGCGTTGAGCC CAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGC CCAGCACCTGAAGCCGCTGGGGGACCGTCAGTCTTCC TCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTC CCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTG AGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTAC GTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAG CCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTG GTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAG CCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGC CAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCT GCCCCCATCCCGCGAGGAGATGACCAAGAACCAGGT AAGTTTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGC GACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCG GAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGT GGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTC ATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTAC ACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT GAGGTGATGCTGGTCGAGAGCGGCGGCGGTCTCGTG CAGCCAGGCGGTAGCCTGCGCCTCAGCTGCACCGCCA GCGGCTTCACCTTCAGCCGCAGCGCCATGAGCTGGGT GCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGC CTACATCAGCGGCGGCGGCGGCGACACCTACTACAG CGTCAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGAC AACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAAATGAACAGC CTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCC GCCACAGCAACTACAACTACTACGCCATGGACTACTG GGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCCTC CACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCCTCC TCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGC TGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGG TGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCA CACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTAC TCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCT TGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAA GCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGCGCGTTGAGCC CAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGC CCAGCACCTGAAGCCGCTGGGGGACCGTCAGTCTTCC TCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTC CCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTG AGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTAC GTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAG CCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTG GTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAG CCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGC CAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCT GCCCCCATCCCGCGAGGAGATGACCAAGAACCAGGT AAGTTTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGC GACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCG GAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGT GGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTC ATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTAC ACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT 88 88 nPDlLC4 nPDlLC4 GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGCCACCCTAAGC CTGAGCCCAGGCGAGCGCGCCACCATGAGCTGCCGC GCCAGCGAGAACATCGACCACAGCGGCATCAGCTTC ATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCA AAGCTGCTGATCTACGTGGCCAGCAACCAGGGCAGC GGCATCCCAGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGC ACCGACTTCACCCTGACCATCAGCCGCCTGGAGCCAG GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGCCACCCTAAGC CTGAGCCCAGGCGAGCGCGCCACCATGAGCTGCCGC GCCAGCGAGAACATCGACCACAGCGGCATCAGCTTC

- 43 042707- 43 042707

AGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAGCAAGG AAGTCCCATGGACCTTCGGCCAAGGTACTAAGCTGGA GATCAAGCGTACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAATTGAAATCTGGAACTG CCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGA GAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTC CAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAG GACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAA GTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCT CGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT AGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAGCAAGG AAGTCCCATGGACCTTCGGCCAAGGTACTAAGCTGGA GATCAAGCGTACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAATTGAAATCTGGAACTG CCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGA GAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTC CAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAG GACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAA GTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCT CGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT 89 89 nPDlHC5 nPDlHC5 GAGGTGATGCTGGTCGAGAGCGGCGGCGGTCTCGTG CAGCCAGGCGGTAGCCTGCGCCTCAGCTGCACCGCCA GCGGCTTCACCTTCAGCCGCAGCGCCATGAGCTGGGT GCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGC CTACATCAGCGGCGGCGGCGGCGACACCTACTACAG CGTCAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGAC AACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAAATGAACAGC CTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCC GCCACAGCAACTACAACTACTACGCCATGGACTACTG GGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCCTC CACAAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCTTGC TCCCGGTCCACCTCCGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCT GCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGT GTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCAC ACCTTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTC CCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCCTCCTCTAGCCTGG GCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGACCACAAGC CCTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAATCTA AGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGA ATTTCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCAA AGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGA AGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAAGA TCCCGAGGTCCAGTTTAATTGGTACGTGGACGGCGTG GAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAA CAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGA CCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGT ACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCTCCA GCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGC CCCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCTCCAAGCCA GGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTG TCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTG GAATGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTAC AAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCT TCTTCCTGTACTCTCGGCTGACCGTGGACAAGTCCCG GTGGCAGGAAGGCAACGTCTTCTCCTGCTCCGTGATG CACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCC CTGTCCCTGAGCCTGGGC GAGGTGATGCTGGTCGAGAGCGGCGGCGGTCTCGTG CAGCCAGGCGGTAGCCTGCGCCTCAGCTGCACCGCCA GCGGCTTCACCTTCAGCCGCAGCGCCATGAGCTGGGT GCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGC CTACATCAGCGGCGGCGGCGGCGACACCTACTACAG CGTCAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGAC AACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAAATGAACAGC CTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCC GCCACAGCAACTACAACTACTACGCCATGGACTACTG GGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCCTC CACAAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCTTGC TCCCGGTCCACCTCCGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCT GCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGT GTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCAC ACCTTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTC CCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCCTCCTCTAGCCTGG GCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGACCACAAGC CCTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAATCTA AGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGA ATTTCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCAA AGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGA AGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAAGA TCCCGAGGTCCAGTTTAATTGGTACGTGGACGGCGTG GAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAA CAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGA CCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGT ACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCTCCA GCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGC CCCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCTCCAAGCCA GGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTG TCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTG GAATGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTAC AAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCT TCTTCCTGTACTCTCGGCTGACCGTGGACAAGTCCCG GTGGCAGGAAGGCAACGTCTTCTCCTGCTCCGTGATG CACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCC CTGTCCCTGAGCCTGGGC 90 90 nPDlLC5 nPDlLC5 GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGCCACCCTAAGC CTGAGCCCAGGCGAGCGCGCCACCATGAGCTGCCGC GCCAGCGAGAACATCGACCACAGCGGCATCAGCTTC ATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCA AAGCTGCTGATCTACGTGGCCAGCAACCAGGGCAGC GGCATCCCAGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGC ACCGACTTCACCCTGACCATCAGCCGCCTGGAGCCAG AGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAGCAAGG AAGTCCCATGGACCTTCGGCCAAGGTACTAAGCTGGA GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGCCACCCTAAGC CTGAGCCCAGGCGAGCGCGCCACCATGAGCTGCCGC GCCAGCGAGAACATCGACCACAGCGGCATCAGCTTC ATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCA AAGCTGCTGATCTACGTGGCCAGCAACCAGGGCAGC GGCATCCCAGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGC ACCGACTTCACCCTGACCATCAGCCGCCTGGAGCCAG AGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAGCAAGG AAGTCCCATGGACCTTCGGCCAAGGTACTAAGCTGGA

- 44 042707- 44 042707

GATCAAGCGTACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAATTGAAATCTGGAACTG CCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGA GAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTC CAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAG GACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAA GTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCT CGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT GATCAAGCGTACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAATTGAAATCTGGAACTG CCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGA GAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTC CAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAG GACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAA GTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCT CGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT 91 91 nLAGVHl nLAGVHl CAGGTCACCCTGAAGGAGAGCGGCCCAACCCTGGTG AAGCCAACCCAGACCCTGACCCTGACCTGCAGCTTCA GCGGCTTCTCCCTGAGCACCAGCGACATGGGCGTGGG CTGGATTCGCCAACCACCAGGCAAGGCCCTGGAGTG GCTGGCCCACATCTGGTGGGACGACGTGAAGCGCTA CAACCCAGCCCTGAAGAGCCGCCTGACCATCACCAA GGACACCAGCAAGAACCAGGTGGTGCTGACCATGAC C CAGGTCACCCCTGAAGGAGAGCGGCCCAACCCTGGTG AAGCCAACCCAGACCCTGACCCTGACCTGCAGCTTCA GCGGCTTCTCCCTGAGCACCAGCGACATGGGCGTGGG CTGGATTCGCCAACCACCAGGCAAGGCCCTGGAGTG GCTGGCCCACATCTGGGACGACGTGAAGCGCTA 92 92 nLAGVLl nLAGVLl GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTTCCTGAGCG CCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCTTCACCTGCAAGGC CAGCCAGGACGTGAGCACCGCCGTCGCCTGGTATCA GCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTA CAGCGCCAGCTACCGCTACACCGGCGTGCCAGACCG CTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTG ACCATCAGCAGCCTGCAACCAGAGGACTTCGCCACC GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTTCCTGAGCG CCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCTTCACCTGCAAGGC CAGCCAGGACGTGAGCACCGCCGTCGCCTGGTATCA GCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTA CAGCGCCAGCTACCGCTACACCGGCGTGCCAGACCG CTTCAGCGGCAGCGGCACCGGCACCGACTTCACCCTG ACCATCAAGGCAGCCTGCATCCC 93 93 nLAGVH2 nLAGVH2 CAGGTGACCCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCGTCGTG CAGCCAGGCCGCAGCCTGAGCCTGAGCTGCGCTTTCA GCGGCTTCAGCCTCAGCACCAGCGACATGGGCGTGG GCTGGGTCCGCCAACCACCAGGCAAGGGCCTGGAGT GGGTGGCCCACATCTGGTGGGACGACGTGAAGCGCT ACAACCCAGCCCTGAAGAGCCGCTTTACCATCAGCCG CGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAA C CAGGTGACCCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCGTCGTG CAGCCAGGCCGCAGCCTGAGCCTGAGCTGCGCTTTCA GCGGCTTCAGCCTCAGCACCAGCGACATGGGCGTGG GCTGGGTCCGCCAACCACCAGGCAAGGGCCTGGAGT GGGTGGCCCACATCTGGTGGGACGACGTGAAGCGCT ACAACCCAGCCCTGAAGACCAGCCTTTACCATCAGCCGCG 94 94 nLAGVL2 nLAGVL2 ACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTTCCTGAGCGC CAGCGTCGGCGACCGCGTGACGATCACCTGCAAGGC CAGCCAGGACGTGAGCACCGCCGTCGCCTGGTATCA GCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTA CAGCGCCAGCTACCGCTACACCGGCGTGCCAGACCG CTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTG ACCATCAGCAGCCTGCAACCAGAGGACTTCGCCACC ACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTTCCTGAGCGC CAGCGTCGGCGACCGCGTGACGATCACCTGCAAGGC CAGCCAGGACGTGAGCACCGCCGTCGCCTGGTATCA GCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTA CAGCGCCAGCTACCGCTACACCGGCGTGCCAGACCG CTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCAGCGACTTCACCCTG ACCATCAGCAGCCTGCAACCC 95 95 nLAGVH3 nLAGVH3 CAGGTGACCCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCGTCGTG CAGCCAGGCCGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCTTTCA GCGGCTTCAGCCTCAGCACCAGCGACATGGGCGTGG GCTGGATCCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGT GGGTGGCCCACATCTGGTGGGACGACGTGAAGCGCT ACAACCCAGCCCTGAAGAGCCGCTTTACCATCAGCCG CGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAA C CAGGTGACCCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCGTCGTG CAGCCAGGCCGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCTTTCA GCGGCTTCAGCCTCAGCACCAGCGACATGGGCGTGG GCTGGATCCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGT GGGTGGCCCACATCTGGTGGGACGACGTGAAGCGCT 96 96 nLAGVL3 nLAGVL3 GACATCGTGATGACCCAGAGCCCTAGCTTCCTGAGCG CCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGCAAGG CCAGCCAGGACGTGAGCACCGCCGTCGCCTGGTATCA GCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTA CAGCGCCAGCTACCGCTACACCGGCGTGCCAGACCG CTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTG ACCATCAGCAGCCTGCAACCAGAGGACTTCGCCACC GACATCGTGATGACCCAGAGCCCTAGCTTCCTGAGCG CCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGCAAGG CCAGCCAGGACGTGAGCACCGCCGTCGCCTGGTATCA GCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTA CAGCGCCAGCTACCGCTACACCGGCGTGCCAGACCG CTTCAGCGGCAGCGGCACCACCCGACTTCACCCTG ACCATCAAGGCAGCCTGCATCCC 97 97 nLAGVH4 nLAGVH4 CAGGTGACCCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCGTCGTG CAGCCAGGCCGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCTTTCA GCGGCTTCAGCCTCAGCACCAGCGACATGGGCGTGG CAGGTGACCCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCGTCGTG CAGCCAGGCCGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCTTTCA GCGGCTTCAGCCTCAGCACCAGCGACATGGGCGTGG

- 45 042707- 45 042707

GCTGGATCCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGT GGGTGGCCCACATCTGGTGGGACGACGTGAAGCGCT ACAACCCAGCCCTGAAGAGCCGCTTTACCATCAGCCG CGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAA C GCTGGATCCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGT GGGTGGCCCACATCTGGTGGGACGACGTGAAGCGCT ACAACCCAGCCCTGAAGCCGCTTTACCATCAGCCG CGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAA C 98 98 nLAGVL4 nLAGVL4 GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTTCCTGAGCG CCAGCGTCGGCGACCGCGTGAGCATCACCTGCAAGG CCAGCCAGGACGTGAGCACCGCCGTCGCCTGGTATCA GCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTA CAGCGCCAGCTACCGCTACACCGGCGTGCCAGACCG CTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTG ACCATCAGCAGCCTGCAACCAGAGGACTTCGCCACC GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTTCCTGAGCG CCAGCGTCGGCGACCGCGTGAGCATCACCTGCAAGG CCAGCCAGGACGTGAGCACCGCCGTCGCCTGGTATCA GCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTA CAGCGCCAGCTACCGCTACACCGGCGTGCCAGACCG CTTCAGCGGCAGCGGCACCACCCGACTTCACCCTG ACCATCAAGGCAGCCTGCATCCC 99 99 nLAGVH5 nLAGVH5 CAGGTCACCCTGAAGGAGAGCGGCCCAACCCTGGTG AAGCCAACCCAGACCCTGACCCTGACCTGCAGCTTCA GCGGCTTCTCCCTGAGCACCAGCGACATGGGCGTGGG CTGGATTCGCCAACCACCAGGCAAGGCCCTGGAGTG GCTGGCCCACATCTGGTGGGACGACGTGAAGCGCTA CAACCCAGCCCTGAAGAGCCGCCTGACCATCACCAA GGACACCAGCAAGAACCAGGTGGTGCTGACCATGAC C CAGGTCACCCCTGAAGGAGAGCGGCCCAACCCTGGTG AAGCCAACCCAGACCCTGACCCTGACCTGCAGCTTCA GCGGCTTCTCCCTGAGCACCAGCGACATGGGCGTGGG CTGGATTCGCCAACCACCAGGCAAGGCCCTGGAGTG GCTGGCCCACATCTGGGACGACGTGAAGCGCTA 100 100 nLAGVL5 nLAGVL5 GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTTCCTGAGCG CCAGCGTCGGCGACCGCGTGAGCATCACCTGCAAGG CCAGCCAGGACGTGAGCACCGCCGTCGCCTGGTATCA GCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTA CAGCGCCAGCTACCGCTACACCGGCGTGCCAGACCG CTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTG ACCATCAGCAGCCTGCAACCAGAGGACTTCGCCGTG GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTTCCTGAGCG CCAGCGTCGGCGACCGCGTGAGCATCACCTGCAAGG CCAGCCAGGACGTGAGCACCGCCGTCGCCTGGTATCA GCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTA CAGCGCCAGCTACCGCTACACCGGCGTGCCAGACCG CTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTCGGCACCCTG ACCATCAAGGCAGCCTGCATC 101 101 nLAGHCl nLAGHCl CAGGTCACCCTGAAGGAGAGCGGCCCAACCCTGGTG AAGCCAACCCAGACCCTGACCCTGACCTGCAGCTTCA GCGGCTTCTCCCTGAGCACCAGCGACATGGGCGTGGG CTGGATTCGCCAACCACCAGGCAAGGCCCTGGAGTG GCTGGCCCACATCTGGTGGGACGACGTGAAGCGCTA CAACCCAGCCCTGAAGAGCCGCCTGACCATCACCAA GGACACCAGCAAGAACCAGGTGGTGCTGACCATGAC CAACATGGACCCAGTGGACACCGCCACCTACTTCTGC GCCCGCATCGAGGACTACGGCGTGAGCTACTACTTCG ACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCA GCGCCTCCACAAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCCCTGGC CCCTTGCTCCCGGTCCACCTCCGAGTCTACCGCCGCT CTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCG TGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCCGG CGTGCACACCTTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGC CTGTACTCCCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCCTCCTC TAGCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGAC CACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTG GAATCTAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCCTGCCCTG CCCCTGAATTTCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTC CCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGA CCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCA GGAAGATCCCGAGGTCCAGTTTAATTGGTACGTGGAC GGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGA GAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCG TGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCA AAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGC CCTCCAGCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGG GCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCTCC AAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCT CAGGTCACCCTGAAGGAGAGCGGCCCAACCCTGGTG AAGCCAACCCAGACCCTGACCCTGACCTGCAGCTTCA GCGGCTTCTCCCTGAGCACCAGCGACATGGGCGTGGG CTGGATTCGCCAACCACCAGGCAAGGCCCTGGAGTG GCTGGCCCACATCTGGTGGGACGACGTGAAGCGCTA CAACCCAGCCCTGAAGAGCCGCCTGACCATCACCAA GGACACCAGCAAGAACCAGGTGGTGCTGACCATGAC CAACATGGACCCAGTGGACACCGCCACCTACTTCTGC GCCCGCATCGAGGACTACGGCGTGAGCTACTACTTCG ACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCA GCGCCTCCACAAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCCCTGGC CCCTTGCTCCCGGTCCACCTCCGAGTCTACCGCCGCT CTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCG TGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCCGG CGTGCACACCTTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGC CTGTACTCCCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCCTCCTC TAGCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGAC CACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTG GAATCTAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCCTGCCCTG CCCCTGAATTTCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTC CCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGA CCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCA GGAAGATCCCGAGGTCCAGTTTAATTGGTACGTGGAC GGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGA GAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCG TGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCA AAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGC CCTCCAGCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGG GCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCTCC AAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCT

- 46 042707- 46 042707

GACCTGTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATC GCCGTGGAATGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAAC AACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACG GCTCCTTCTTCCTGTACTCTCGGCTGACCGTGGACAA GTCCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTTCTCCTGCTCC GTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAG AAGTCCCTGTCCCTGAGCCTGGGC GACCTGTCTGGTCAAGGCTTCTACCCCTCCGATATC GCCGTGGAATGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAAC AACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACG 102 102 nLAGLCl nLAGLCl GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTTCCTGAGCG CCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCTTCACCTGCAAGGC CAGCCAGGACGTGAGCACCGCCGTCGCCTGGTATCA GCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTA CAGCGCCAGCTACCGCTACACCGGCGTGCCAGACCG CTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTG ACCATCAGCAGCCTGCAACCAGAGGACTTCGCCACCT ACTACTGCCAGCAGCACTACAGCATCCCACTGACCTT TGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACTGT GGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATG AGCAATTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCT GCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACA GTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCC CAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGC ACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAA GCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAA GTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGA GCTTCAACAGGGGAGAGTGT GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTTCCTGAGCG CCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCTTCACCTGCAAGGC CAGCCAGGACGTGAGCACCGCCGTCGCCTGGTATCA GCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTA CAGCGCCAGCTACCGCTACACCGGCGTGCCAGACCG CTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTG ACCATCAGCAGCCTGCAACCAGAGGACTTCGCCACCT ACTACTGCCAGCAGCACTACAGCATCCCACTGACCTT TGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACTGT GGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATG AGCAATTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCT GCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACA GTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCC CAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGC ACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAA GCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAA GTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGA GCTTCAACAGGGGAGAGTGT 103 103 nLAGHC2 nLAGHC2 CAGGTGACCCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCGTCGTG CAGCCAGGCCGCAGCCTGAGCCTGAGCTGCGCTTTCA GCGGCTTCAGCCTCAGCACCAGCGACATGGGCGTGG GCTGGGTCCGCCAACCACCAGGCAAGGGCCTGGAGT GGGTGGCCCACATCTGGTGGGACGACGTGAAGCGCT ACAACCCAGCCCTGAAGAGCCGCTTTACCATCAGCCG CGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAA CAGCCTGCGCGCCGAGGACACCGCCACCTACTACTGC GCCCGCATCGAGGACTACGGCGTGAGCTACTACTTCG ACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCA GCGCCTCCACAAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCCCTGGC CCCTTGCTCCCGGTCCACCTCCGAGTCTACCGCCGCT CTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCG TGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCCGG CGTGCACACCTTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGC CTGTACTCCCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCCTCCTC TAGCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGAC CACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTG GAATCTAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCCTGCCCTG CCCCTGAATTTCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTC CCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGA CCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCA GGAAGATCCCGAGGTCCAGTTTAATTGGTACGTGGAC GGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGA GAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCG TGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCA AAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGC CCTCCAGCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGG GCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCTCC AAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCT GACCTGTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATC GCCGTGGAATGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAAC CAGGTGACCCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCGTCGTG CAGCCAGGCCGCAGCCTGAGCCTGAGCTGCGCTTTCA GCGGCTTCAGCCTCAGCACCAGCGACATGGGCGTGG GCTGGGTCCGCCAACCACCAGGCAAGGGCCTGGAGT GGGTGGCCCACATCTGGTGGGACGACGTGAAGCGCT ACAACCCAGCCCTGAAGAGCCGCTTTACCATCAGCCG CGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAA CAGCCTGCGCGCCGAGGACACCGCCACCTACTACTGC GCCCGCATCGAGGACTACGGCGTGAGCTACTACTTCG ACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCA GCGCCTCCACAAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCCCTGGC CCCTTGCTCCCGGTCCACCTCCGAGTCTACCGCCGCT CTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCG TGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCCGG CGTGCACACCTTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGC CTGTACTCCCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCCTCCTC TAGCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGAC CACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTG GAATCTAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCCTGCCCTG CCCCTGAATTTCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTC CCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGA CCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCA GGAAGATCCCGAGGTCCAGTTTAATTGGTACGTGGAC GGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGA GAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCG TGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCA AAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGC CCTCCAGCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGG GCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCTCC AAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCT GACCTGTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATC GCCGTGGAATGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAAC

- 47 042707- 47 042707

AACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACG GCTCCTTCTTCCTGTACTCTCGGCTGACCGTGGACAA GTCCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTTCTCCTGCTCC GTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAG AAGTCCCTGTCCCTGAGCCTGGGC AACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACG GCTCCTTCTTCCTGTACTCTCGGCTGACCGTGGACAA GTCCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTTCTCCTGCTCC GTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAG AAGTCCCTGTCCCTGAGCCTGGGC 104 104 nLAGLC2 nLAGLC2 GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTTCCTGAGCG CCAGCGTCGGCGACCGCGTGACGATCACCTGCAAGG CCAGCCAGGACGTGAGCACCGCCGTCGCCTGGTATCA GCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTA CAGCGCCAGCTACCGCTACACCGGCGTGCCAGACCG CTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTG ACCATCAGCAGCCTGCAACCAGAGGACTTCGCCACCT ACTACTGCCAGCAGCACTACAGCATCCCACTGACCTT TGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACTGT GGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATG AGCAATTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCT GCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACA GTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCC CAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGC ACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAA GCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAA GTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGA GCTTCAACAGGGGAGAGTGT GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTTCCTGAGCG CCAGCGTCGGCGACCGCGTGACGATCACCTGCAAGG CCAGCCAGGACGTGAGCACCGCCGTCGCCTGGTATCA GCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTA CAGCGCCAGCTACCGCTACACCGGCGTGCCAGACCG CTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTG ACCATCAGCAGCCTGCAACCAGAGGACTTCGCCACCT ACTACTGCCAGCAGCACTACAGCATCCCACTGACCTT TGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACTGT GGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATG AGCAATTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCT GCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACA GTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCC CAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGC ACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAA GCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAA GTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGA GCTTCAACAGGGGAGAGTGT 105 105 nLAGHC3 nLAGHC3 CAGGTGACCCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCGTCGTG CAGCCAGGCCGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCTTTCA GCGGCTTCAGCCTCAGCACCAGCGACATGGGCGTGG GCTGGATCCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGT GGGTGGCCCACATCTGGTGGGACGACGTGAAGCGCT ACAACCCAGCCCTGAAGAGCCGCTTTACCATCAGCCG CGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAA CAGCCTGCGCGCCGAGGACACCGCCACCTACTTCTGC GCCCGCATCGAGGACTACGGCGTGAGCTACTACTTCG ACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCA GCGCCTCCACAAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCCCTGGC CCCTTGCTCCCGGTCCACCTCCGAGTCTACCGCCGCT CTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCG TGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCCGG CGTGCACACCTTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGC CTGTACTCCCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCCTCCTC TAGCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGAC CACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTG GAATCTAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCCTGCCCTG CCCCTGAATTTCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTC CCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGA CCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCA GGAAGATCCCGAGGTCCAGTTTAATTGGTACGTGGAC GGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGA GAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCG TGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCA AAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGC CCTCCAGCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGG GCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCTCC AAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCT GACCTGTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATC GCCGTGGAATGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAAC AACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACG GCTCCTTCTTCCTGTACTCTCGGCTGACCGTGGACAA CAGGTGACCCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCGTCGTG CAGCCAGGCCGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCTTTCA GCGGCTTCAGCCTCAGCACCAGCGACATGGGCGTGG GCTGGATCCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGT GGGTGGCCCACATCTGGTGGGACGACGTGAAGCGCT ACAACCCAGCCCTGAAGAGCCGCTTTACCATCAGCCG CGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAA CAGCCTGCGCGCCGAGGACACCGCCACCTACTTCTGC GCCCGCATCGAGGACTACGGCGTGAGCTACTACTTCG ACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCA GCGCCTCCACAAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCCCTGGC CCCTTGCTCCCGGTCCACCTCCGAGTCTACCGCCGCT CTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCG TGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCCGG CGTGCACACCTTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGC CTGTACTCCCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCCTCCTC TAGCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGAC CACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTG GAATCTAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCCTGCCCTG CCCCTGAATTTCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTC CCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGA CCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCA GGAAGATCCCGAGGTCCAGTTTAATTGGTACGTGGAC GGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGA GAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCG TGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCA AAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGC CCTCCAGCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGG GCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCTCC AAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCT GACCTGTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATC GCCGTGGAATGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAAC AACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACG GCTCCTTCTTCCTGTACTCTCGGCTGACCGTGGACAA

- 48 042707- 48 042707

GTCCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTTCTCCTGCTCC GTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAG AAGTCCCTGTCCCTGAGCCTGGGC GTCCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTTCTCCTGCTCC GTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAG AAGTCCCTGTCCCTGAGCCTGGGC 106 106 nLAGLC3 nLAGLC3 GACATCGTGATGACCCAGAGCCCTAGCTTCCTGAGCG CCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGCAAGG CCAGCCAGGACGTGAGCACCGCCGTCGCCTGGTATCA GCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTA CAGCGCCAGCTACCGCTACACCGGCGTGCCAGACCG CTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTG ACCATCAGCAGCCTGCAACCAGAGGACTTCGCCACCT ACTACTGCCAGCAGCACTACAGCATCCCACTGACCTT TGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACTGT GGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATG AGCAATTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCT GCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACA GTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCC CAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGC ACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAA GCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAA GTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGA GCTTCAACAGGGGAGAGTGT GACATCGTGATGACCCAGAGCCCTAGCTTCCTGAGCG CCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGCAAGG CCAGCCAGGACGTGAGCACCGCCGTCGCCTGGTATCA GCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTA CAGCGCCAGCTACCGCTACACCGGCGTGCCAGACCG CTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTG ACCATCAGCAGCCTGCAACCAGAGGACTTCGCCACCT ACTACTGCCAGCAGCACTACAGCATCCCACTGACCTT TGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACTGT GGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATG AGCAATTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCT GCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACA GTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCC CAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGC ACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAA GCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAA GTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGA GCTTCAACAGGGGAGAGTGT 107 107 nLAGHC4 nLAGHC4 CAGGTGACCCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCGTCGTG CAGCCAGGCCGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCTTTCA GCGGCTTCAGCCTCAGCACCAGCGACATGGGCGTGG GCTGGATCCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGT GGGTGGCCCACATCTGGTGGGACGACGTGAAGCGCT ACAACCCAGCCCTGAAGAGCCGCTTTACCATCAGCCG CGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAA CAGCCTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTTCTGC GCCCGCATCGAGGACTACGGCGTGAGCTACTACTTCG ACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCA GCGCCTCCACAAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCCCTGGC CCCTTGCTCCCGGTCCACCTCCGAGTCTACCGCCGCT CTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCG TGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCCGG CGTGCACACCTTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGC CTGTACTCCCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCCTCCTC TAGCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGAC CACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTG GAATCTAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCCTGCCCTG CCCCTGAATTTCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTC CCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGA CCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCA GGAAGATCCCGAGGTCCAGTTTAATTGGTACGTGGAC GGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGA GAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCG TGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCA AAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGC CCTCCAGCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGG GCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCTCC AAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCT GACCTGTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATC GCCGTGGAATGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAAC AACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACG GCTCCTTCTTCCTGTACTCTCGGCTGACCGTGGACAA GTCCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTTCTCCTGCTCC GTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAG CAGGTGACCCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCGTCGTG CAGCCAGGCCGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCTTTCA GCGGCTTCAGCCTCAGCACCAGCGACATGGGCGTGG GCTGGATCCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGT GGGTGGCCCACATCTGGTGGGACGACGTGAAGCGCT ACAACCCAGCCCTGAAGAGCCGCTTTACCATCAGCCG CGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAA CAGCCTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTTCTGC GCCCGCATCGAGGACTACGGCGTGAGCTACTACTTCG ACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCA GCGCCTCCACAAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCCCTGGC CCCTTGCTCCCGGTCCACCTCCGAGTCTACCGCCGCT CTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCG TGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCCGG CGTGCACACCTTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGC CTGTACTCCCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCCTCCTC TAGCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGAC CACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTG GAATCTAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCCTGCCCTG CCCCTGAATTTCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTC CCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGA CCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCA GGAAGATCCCGAGGTCCAGTTTAATTGGTACGTGGAC GGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGA GAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCG TGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCA AAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGC CCTCCAGCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGG GCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCTCC AAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCT GACCTGTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATC GCCGTGGAATGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAAC AACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACG GCTCCTTCTTCCTGTACTCTCGGCTGACCGTGGACAA GTCCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTTCTCCTGCTCC GTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAG

- 49 042707- 49 042707

AAGTCCCTGTCCCTGAGCCTGGGC AAGTCCCTGTCCCTGAGCCTGGGC 108 108 nLAGLC4 nLAGLC4 GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTTCCTGAGCG CCAGCGTCGGCGACCGCGTGAGCATCACCTGCAAGG CCAGCCAGGACGTGAGCACCGCCGTCGCCTGGTATCA GCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTA CAGCGCCAGCTACCGCTACACCGGCGTGCCAGACCG CTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTG ACCATCAGCAGCCTGCAACCAGAGGACTTCGCCACCT ACTACTGCCAGCAGCACTACAGCATCCCACTGACCTT TGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACTGT GGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATG AGCAATTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCT GCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACA GTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCC CAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGC ACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAA GCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAA GTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGA GCTTCAACAGGGGAGAGTGT GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTTCCTGAGCG CCAGCGTCGGCGACCGCGTGAGCATCACCTGCAAGG CCAGCCAGGACGTGAGCACCGCCGTCGCCTGGTATCA GCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTA CAGCGCCAGCTACCGCTACACCGGCGTGCCAGACCG CTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTG ACCATCAGCAGCCTGCAACCAGAGGACTTCGCCACCT ACTACTGCCAGCAGCACTACAGCATCCCACTGACCTT TGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACTGT GGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATG AGCAATTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCT GCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACA GTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCC CAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGC ACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAA GCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAA GTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGA GCTTCAACAGGGGAGAGTGT 109 109 nLAGHC5 nLAGHC5 CAGGTCACCCTGAAGGAGAGCGGCCCAACCCTGGTG AAGCCAACCCAGACCCTGACCCTGACCTGCAGCTTCA GCGGCTTCTCCCTGAGCACCAGCGACATGGGCGTGGG CTGGATTCGCCAACCACCAGGCAAGGCCCTGGAGTG GCTGGCCCACATCTGGTGGGACGACGTGAAGCGCTA CAACCCAGCCCTGAAGAGCCGCCTGACCATCACCAA GGACACCAGCAAGAACCAGGTGGTGCTGACCATGAC CAACATGGACCCAGTGGACACCGCCACCTACTTCTGC GCCCGCATCGTGGACTACGGCGTGAGCTACTACTTCG ACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCA GCGCCTCCACAAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCCCTGGC CCCTTGCTCCCGGTCCACCTCCGAGTCTACCGCCGCT CTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCG TGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCCGG CGTGCACACCTTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGC CTGTACTCCCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCCTCCTC TAGCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGAC CACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTG GAATCTAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCCTGCCCTG CCCCTGAATTTCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTC CCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGA CCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCA GGAAGATCCCGAGGTCCAGTTTAATTGGTACGTGGAC GGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGA GAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCG TGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCA AAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGC CCTCCAGCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGG GCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCTCC AAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCT GACCTGTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATC GCCGTGGAATGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAAC AACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACG GCTCCTTCTTCCTGTACTCTCGGCTGACCGTGGACAA GTCCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTTCTCCTGCTCC GTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAG AAGTCCCTGTCCCTGAGCCTGGGC CAGGTCACCCTGAAGGAGAGCGGCCCAACCCTGGTG AAGCCAACCCAGACCCTGACCCTGACCTGCAGCTTCA GCGGCTTCTCCCTGAGCACCAGCGACATGGGCGTGGG CTGGATTCGCCAACCACCAGGCAAGGCCCTGGAGTG GCTGGCCCACATCTGGTGGGACGACGTGAAGCGCTA CAACCCAGCCCTGAAGAGCCGCCTGACCATCACCAA GGACACCAGCAAGAACCAGGTGGTGCTGACCATGAC CAACATGGACCCAGTGGACACCGCCACCTACTTCTGC GCCCGCATCGTGGACTACGGCGTGAGCTACTACTTCG ACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCA GCGCCTCCACAAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCCCTGGC CCCTTGCTCCCGGTCCACCTCCGAGTCTACCGCCGCT CTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCG TGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCCGG CGTGCACACCTTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGC CTGTACTCCCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCCTCCTC TAGCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGAC CACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTG GAATCTAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCCTGCCCTG CCCCTGAATTTCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTC CCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGA CCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCA GGAAGATCCCGAGGTCCAGTTTAATTGGTACGTGGAC GGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGA GAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCG TGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCA AAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGC CCTCCAGCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGG GCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCTCC AAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCT GACCTGTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATC GCCGTGGAATGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAAC AACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACG GCTCCTTCTTCCTGTACTCTCGGCTGACCGTGGACAA GTCCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTTCTCCTGCTCC GTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAG AAGTCCCTGTCCCTGAGCCTGGGC ПО BY nLAGLC5 nLAGLC5 GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTTCCTGAGCG GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTTCCTGAGCG

--

Claims (17)

CCAGCGTCGGCGACCGCGTGAGCATCACCTGCAAGG CCAGCCAGGACGTGAGCACCGCCGTCGCCTGGTATCA GCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTA CAGCGCCAGCTACCGCTACACCGGCGTGCCAGACCG CTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTG ACCATCAGCAGCCTGCAACCAGAGGACTTCGCCGTGT ACTACTGCCAGCAGCACTACAGCATCCCACTGACCTT TGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACTGT GGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATG AGCAATTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCT GCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACA GTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCC CAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGC ACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAA GCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAA GTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGA GCTTCAACAGGGGAGAGTGTCCAGCGTCGGCGACCGCGTGAGCATCACCTGCAAGG CCAGCCAGGACGTGAGCACCGCCGTCGCCTGGTATCA GCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTA CAGCGCCAGCTACCGCTACACCGGCGTGCCAGACCG CTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTG ACCATCAGCAGCCTGCAACCAGAGGACTTCGCCGTGT ACTACTGCCAGCAGCACTACAGCATCCCACTGACCTT TGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACTGT GGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATG AGCAATTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCT GCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACA GTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCC CAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGC ACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAA GCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAA GTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGA GCTTCAACAGGGGAGAGTGT 111 LAG3 эпитоп 1 LLRRAGVT111 LAG3 epitope 1 LLRRAGVT 112 LAG3 эпитоп2 YRAAVHLRDRA112 LAG3 epitope2 YRAAVHLRDRA 113 77Е11 VK DIVLTQSPASLAVSLGQRATMSCRASENIDNSGISFMNW FQQKPGQPPKLLIYVASNQGSGVPARFSGSGSGTDFRLT IHPLEEDDTAMYFCQQSKEVPWTFGGGTKLEIK113 77E11 VK DIVLTQSPASLAVSLGQRATMSCRASENIDNSGISFMNW FQQKPGQPPKLLIYVASNQGSGVPARFSGSGSGTDFRLT IHPLEEDDTAMYFCQQSKEVPWTFGGGTKLEIK 114 77Е11 VH EVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCTASGFTFSNSAMSWVR QTPERRLEWVAYISGGGGDTYYSDSVKGRFTISRDNAK DTLYLHMSSLRSEDTALHYCARHSNSNYYAMDYWGQ GTSVTVSS114 77E11 VH EVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCTASGFTFSNSAMSWVR QTPERRLEWVAYISGGGGDTYYSDSVKGRFTISRDNAK DTLYLHMSSLRSEDTALHYCARHSNSNYYAMDYWGQ GTSVTVSS 115 PD1 эпитоп AISLAPKAQIKESL115 PD1 epitope AISLAPKAQIKESL 116 PD1 эпитоп AAFPEDRSQPGQDCRF116 PD1 epitope AAFPEDRSQPGQDCRF 117 496G6 VK DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSFTCKASQDVNTAVAWYQ QKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISS VQAEDLALYYCQQHYSIPLTFGAGTKLELK117 496G6 VK DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSFTCKASQDVNTAVAWYQ QKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISS VQAEDLALYYCQQHYSIPLTFGAGTKLELK 118 496G6 VH QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSDMGVGWIR QPSGKGLEWLAHIWWDDVKRYNPALKSRLTISKDTSSS QVFLMIASVDTADTATYFCARIEDYGVSYYFDYWGQG TTLTVSS118 496G6 VH QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSDMGVGWIR QPSGKGLEWLAHIWWDDVKRYNPALKSRLTISKDTSSS QVFLMIASVDTADTATYFCARIEDYGVSYYFDYWGQG TTLTVSS ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM 1. Молекула антитела к PD1, содержащая:1. An anti-PD1 antibody molecule containing: (а) CDRs тяжелой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 (hcCDR1), SEQ ID NO: 2 (hcCDR2) и SEQ ID NO: 3 (hcCDR3), и которая имеет CDRs легкой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4 (lcCDR1), SEQ ID NO: 5 (lcCDR2) и SEQ ID NO: 6 (lcCDR3); или (б) CDRs тяжелой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7 (hcCDR1), SEQ ID NO: 8 (hcCDR2) и SEQ ID NO: 9 (hcCDR3) и которая имеет CDRs легкой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10 (lcCDR1), SEQ ID NO: 11 (lcCDR2) и SEQ ID NO: 12 (lcCDR3); или (в) CDRs тяжелой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13 (hcCDR1), SEQ ID NO: 14 (hcCDR2) и SEQ ID NO: 15 (hcCDR3), и которая имеет CDRs легкой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16 (lcCDR1), SEQ ID NO: 17 (lcCDR2) и SEQ ID NO: 18 (lcCDR3).(a) Heavy chain CDRs containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (hcCDR1), SEQ ID NO: 2 (hcCDR2), and SEQ ID NO: 3 (hcCDR3), and which have light chain CDRs containing the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 4 (lcCDR1), SEQ ID NO: 5 (lcCDR2) and SEQ ID NO: 6 (lcCDR3); or (b) heavy chain CDRs containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 (hcCDR1), SEQ ID NO: 8 (hcCDR2) and SEQ ID NO: 9 (hcCDR3) and which has light chain CDRs containing the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 10 (lcCDR1), SEQ ID NO: 11 (lcCDR2) and SEQ ID NO: 12 (lcCDR3); or (c) heavy chain CDRs containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 (hcCDR1), SEQ ID NO: 14 (hcCDR2), and SEQ ID NO: 15 (hcCDR3), and which has light chain CDRs containing the amino acid the sequence shown in SEQ ID NO: 16 (lcCDR1), SEQ ID NO: 17 (lcCDR2) and SEQ ID NO: 18 (lcCDR3). 2. Молекула антитела к PD1 по п.1, которая содержит константную область тяжелой цепи, выбранную из группы, включающей константные области IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA и IgE.2. An anti-PD1 antibody molecule according to claim 1, which contains a heavy chain constant region selected from the group consisting of IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA and IgE constant regions. 3. Молекула антитела к PD1 по п.2, где константная область тяжелой цепи представляет собой IgG4, предпочтительно IgG4 с S241P мутацией.3. An anti-PD1 antibody molecule according to claim 2, wherein the heavy chain constant region is IgG4, preferably IgG4 with the S241P mutation. 4. Молекула антитела к PD1 по любому из предыдущих пунктов, где указанная молекула антитела имеет вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 20, или вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, или вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24, или вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 25, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 26, или вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 28.4. An anti-PD1 antibody molecule according to any one of the preceding claims, wherein said antibody molecule has a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19 and a light chain variable domain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20, or a heavy chain variable domain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21 and a light chain variable domain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22, or a heavy chain variable domain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23 and a light chain variable domain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24, or a heavy chain variable domain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 25 and a light chain variable domain containing the amino acid the sequence shown in SEQ ID NO: 26, or a heavy chain variable domain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27 and a light chain variable domain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28. 5. Молекула антитела к PD1 по любому из предыдущих пунктов, где указанная молекула антитела 5. An anti-PD1 antibody molecule according to any one of the preceding claims, wherein said antibody molecule - 51 042707 имеет тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 29, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 30, или тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 31, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 32, или тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 33, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34, или тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 36, или тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 38.- 51 042707 has a heavy chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 29 and a light chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30 or a heavy chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31 , and a light chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32, or a heavy chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33 and a light chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 34, or a heavy chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 35 and a light chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 36, or a heavy chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 37 and a light chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 38. 6. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи молекулы антитела по любому из пп.1-5.6. An isolated nucleic acid molecule encoding a heavy chain variable domain and a light chain variable domain of an antibody molecule according to any one of claims 1 to 5. 7. Экспрессионный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, включающую нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи молекулы антитела по любому из пп.1-5.7. An expression vector containing a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding a heavy chain variable domain and a light chain variable domain of an antibody molecule according to any one of claims 1 to 5. 8. Клетка-хозяин, которая содержит экспрессионный вектор, включающий последовательность, кодирующую тяжелую цепь молекулы антитела по любому из пп.1-5, и экспрессионный вектор, включающий последовательность, кодирующую легкую цепь молекулы антитела по любому из пп.1-5.8. A host cell that contains an expression vector comprising a sequence encoding the heavy chain of an antibody molecule according to any one of claims 1 to 5 and an expression vector comprising a sequence encoding a light chain of an antibody molecule according to any one of claims 1 to 5. 9. Способ получения молекулы антитела по любому из пп.1-5, который включает стадии: культивирования клетки-хозяина по п.8 в условиях, которые предоставляют возможность образования молекулы антитела в соответствии с любым из пп.1-5; и выделения указанной молекулы антитела.9. A method of obtaining an antibody molecule according to any one of claims 1 to 5, which includes the steps: culturing the host cell according to claim 8 under conditions that allow the formation of an antibody molecule in accordance with any of claims 1 to 5; and isolating said antibody molecule. 10. Способ по п.9, дополнительно включающий стадию очистки указанной молекулы антитела.10. The method of claim 9, further comprising the step of purifying said antibody molecule. 11. Применение молекулы антитела к PD1 по любому из пп.1-5 для лечения злокачественного новообразования.11. Use of an anti-PD1 antibody molecule according to any one of claims 1 to 5 for the treatment of cancer. 12. Способ лечения злокачественного новообразования с помощью молекулы антитела к PD1 по любому пп.1-5, который включает введение молекулы антитела к PD1 по любому пп.1-5 и молекулы антитела к LAG3.12. A method of treating cancer with an anti-PD1 antibody molecule according to any one of claims 1-5, which comprises administering an anti-PD1 antibody molecule according to any one of claims 1-5 and an anti-LAG3 antibody molecule. 13. Способ по п.12, где молекулу антитела к PD1 вводят одновременно или раздельно, с указанной молекулой антитела к LAG3.13. The method of claim 12, wherein the anti-PD1 antibody molecule is administered simultaneously or separately with said anti-LAG3 antibody molecule. 14. Фармацевтическая композиция для лечения злокачественного новообразования, содержащая антитело к PD1 по любому из пп.1-5, и фармацевтически приемлемый носитель.14. A pharmaceutical composition for the treatment of cancer, comprising an anti-PD1 antibody according to any one of claims 1 to 5 and a pharmaceutically acceptable carrier. 15. Фармацевтическая композиция по п.14, которая дополнительно содержит молекулу антитела к LAG3.15. A pharmaceutical composition according to claim 14, which further comprises an anti-LAG3 antibody molecule. 16. Набор для лечения злокачественного новообразования, содержащий антитело к PD1 по любому из пп.1-5 и молекулу антитела к LAG3.16. A cancer treatment kit comprising an anti-PD1 antibody according to any one of claims 1 to 5 and an anti-LAG3 antibody molecule. 17. Композиция или набор по любому из пп.14-16, которая(ый) дополнительно содержит один или несколько дополнительных лекарственных средств.17. Composition or kit according to any one of claims 14-16, which additionally contains one or more additional drugs. --