EA042661B1 - AN IMMUNOCOMPETE CELL THAT EXPRESSES A CELL SURFACE MOLECULE SPECIFICALLY RECOGNIZING HUMAN MESOTHELIN, IL-7 AND CCL19 - Google Patents

Description

Область техники изобретенияField of invention

Настоящее изобретение относится к иммунокомпетентной клетке, которая экспрессирует молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, интерлейкин 7 (IL-7) и лиганд 19 хемокина (мотив С-С) (CCL19), к фармацевтической композиции, содержащей иммунокомпетентную клетку, вектору экспрессии, содержащему нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую мезотелин, нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, а также к способу получения иммунокомпетентной клетки, которая экспрессирует молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, IL-7 и CCL19, включающему в себя введение в иммунокомпетентную клетку нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, и нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19.The present invention relates to an immunocompetent cell that expresses a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, interleukin 7 (IL-7) and chemokine ligand 19 (C-C motif) (CCL19), to a pharmaceutical composition containing an immunocompetent cell, an expression vector, containing a nucleic acid encoding a cell surface molecule that specifically recognizes mesothelin, a nucleic acid encoding IL-7, and a nucleic acid encoding CCL19, as well as a method for producing an immunocompetent cell that expresses a cell surface molecule that specifically recognizes human mesothelin, IL-7 and CCL19 comprising introducing into an immunocompetent cell a nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, a nucleic acid encoding IL-7, and a nucleic acid encoding CCL19.

Уровень техники изобретенияState of the art invention

Злокачественные опухоли - это заболевания, которые поражают многих людей в мире; для их лечения, как правило, широко используют химиотерапию, радиотерапию или хирургическое лечение. Тем не менее существуют разные проблемы, такие как наличие побочных реакций, потеря некоторых функций, а также рецидивирование или метастазирование, которое не поддается лечению. Соответственно в последние годы проводится разработка иммунно-клеточной терапии с целью поддержания более высокого качества жизни (КЖ) пациентов. Указанная иммунно-клеточная терапия представляет собой терапевтический способ, который включает в себя сбор иммунокомпетентных клеток у пациента, проведение процедур для усиления иммунных функций иммунокомпетентных клеток, амплификацию клеток и возвращение этих клеток пациенту. А именно известен терапевтический способ, включающий в себя сбор Т-клеток у пациента, введение в Т-клетки нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный рецептор антигена (далее также называемый CAR), и возвращение Т-клеток обратно пациенту (см. непатентный документ 1). Указанный терапевтический способ в настоящее время проходит клинические испытания во всем мире, результаты которых свидетельствуют об эффективности, например, при злокачественных опухолях кроветворных органов, таких как лейкемия или лимфома.Malignant tumors are diseases that affect many people in the world; for their treatment, as a rule, chemotherapy, radiotherapy or surgical treatment is widely used. However, there are various problems, such as the presence of adverse reactions, the loss of some functions, as well as recurrence or metastasis, which cannot be treated. Accordingly, in recent years, the development of immune cell therapy has been carried out in order to maintain a higher quality of life (QoL) of patients. Said immune cell therapy is a therapeutic method that includes harvesting immunocompetent cells from a patient, performing procedures to enhance the immune functions of immunocompetent cells, amplifying the cells, and returning these cells to the patient. Namely, a therapeutic method is known, including collecting T cells from a patient, introducing a nucleic acid encoding a chimeric antigen receptor (hereinafter also referred to as CAR) into T cells, and returning the T cells back to the patient (see Non-Patent Document 1). This therapeutic method is currently undergoing clinical trials throughout the world, the results of which indicate effectiveness, for example, in malignant tumors of the hematopoietic organs, such as leukemia or lymphoma.

Между тем авторы настоящего изобретения предлагают терапию с использованием иммунных клеток, обеспечивающую заметное подавление солидного рака путем совместной экспрессии IL-7 и CCL19 (см. патентные документы 1 и 2). Этот способ позволяет усиливать активацию эндогенных иммунокомпетентных клеток или их способность накапливаться на опухолевых клетках.In the meantime, the present inventors propose an immune cell therapy capable of remarkably suppressing solid cancer by co-expressing IL-7 and CCL19 (see Patent Documents 1 and 2). This method allows to enhance the activation of endogenous immunocompetent cells or their ability to accumulate on tumor cells.

Известно, что мезотелин экспрессируется в клетках рака, такого как мезотелиома, колоректальный рак (рак прямой кишки и рак толстой кишки), рак поджелудочной железы, рак яичника, рак легких, рак молочной железы или рак головы и шеи. Описаны клетки CAR-T, специфичные к мезотелину (см. патентные документы 3 и 4).Mesothelin is known to be expressed in cancer cells such as mesothelioma, colorectal cancer (rectal and colon cancer), pancreatic cancer, ovarian cancer, lung cancer, breast cancer or head and neck cancer. Mesothelin specific CAR-T cells have been described (see Patent Documents 3 and 4).

Документы предшествующего уровня техники.Prior Art Documents.

Патентные документы.Patent Documents.

Патентный документ 1: международная публикация № WO 2016/056228.Patent Document 1: International Publication No. WO 2016/056228.

Патентный документ 2: международная публикация № WO 2017/159736.Patent Document 2: International Publication No. WO 2017/159736.

Патентный документ 3: заявка на патент США, публикация № 2014/0301993.Patent Document 3: US Patent Application Publication No. 2014/0301993.

Патентный документ 4: не прошедшая экспертизу патентная заявка Японии, публикация № 2017-518053.Patent Document 4: Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2017-518053.

Непатентные документы.non-patent documents.

Непатентный документ 1: Yozo Nakazawa, The Shinshu, Medical Journal, 61 (4): 197-203 (2013).Non-Patent Document 1: Yozo Nakazawa, The Shinshu, Medical Journal, 61 (4): 197-203 (2013).

Сущность изобретенияThe essence of the invention

Цель изобретения.The purpose of the invention.

Разработку способов, которые могут быть адаптированы для лечения солидного рака, при котором обычная иммунная клеточная терапия не дает достаточных терапевтических эффектов, осуществляют путем разработки терапии на основе иммунокомпетентных клеток с использованием CAR-экспрессирующих Т-клеток, TCR-экспрессирующих Т-клеток и т.п., которые совместно экспрессируют IL-7 и CCL19, как описано выше, с заметным улучшением способности иммунокомпетентных клеток размножаться, способности иммунокомпетентных клеток выживать или способности иммунокомпетентных клеток хозяина накапливаться. С другой стороны, разработка CAR-экспрессирующих иммунокомпетентных клеток, специфичных к мезотелину, экспрессируемых на высоком уровне в раковых клетках (например, в клетках мезотелиомы и рака поджелудочной железы), еще не дала удовлетворительных клинических результатов изза недостаточного локального накопления иммунокомпетентных клеток на раковой опухоли и риска рецидивирования опухоли, связанного с кратковременным проявлением противоопухолевых эффектов и т.д. Соответственно целью настоящего изобретения является создание новой иммунокомпетентной клетки, специфичной к мезотелину.The development of methods that can be adapted for the treatment of solid cancer, in which conventional immune cell therapy does not provide sufficient therapeutic effects, is carried out by developing immunocompetent cell-based therapies using CAR-expressing T cells, TCR-expressing T cells, etc. which co-express IL-7 and CCL19 as described above, with a marked improvement in the ability of immunocompetent cells to proliferate, the ability of immunocompetent cells to survive, or the ability of host immunocompetent cells to accumulate. On the other hand, the development of CAR-expressing mesothelin-specific immunocompetent cells, expressed at a high level in cancer cells (for example, in mesothelioma and pancreatic cancer cells), has not yet yielded satisfactory clinical results due to insufficient local accumulation of immunocompetent cells on a cancerous tumor and the risk of tumor recurrence associated with a short-term manifestation of antitumor effects, etc. Accordingly, the aim of the present invention is to create a new immunocompetent cell specific for mesothelin.

Средства достижения цели.Means to achieve the goal.

Авторы настоящего изобретения изучили дополнительные возможности собственных ранее разработанных Т-клеток, которые экспрессируют CAR, IL-7 и CCL19. В результате авторы настоящего изобретения завершили настоящее изобретение, обнаружив, что CAR, содержащий одноцепочечное антите- 1 042661 ло, специфически связывающееся с человеческим мезотелином и содержащее определенную аминокислотную последовательность, специфически распознающую человеческий мезотелин, в качестве молекулы клеточной поверхности, может селективно проявлять цитотоксическую активность против раковых клеток, экспрессирующих мезотелин, и подавлять снижение выживаемости, вызванное опухолью, образованной раковыми клетками, экспрессирующими мезотелин.The authors of the present invention have studied the additional possibilities of their own previously developed T-cells that express CAR, IL-7 and CCL19. As a result, the present inventors have completed the present invention by finding that a CAR containing a single-chain antibody specifically binding to human mesothelin and containing a certain amino acid sequence specifically recognizing human mesothelin as a cell surface molecule can selectively exhibit cytotoxic activity against cancer cells expressing mesothelin, and to suppress the decline in survival caused by a tumor formed by cancer cells expressing mesothelin.

А именно настоящее изобретение включает в себя следующие пункты.Namely, the present invention includes the following items.

1. Иммунокомпетентная клетка, которая экспрессирует молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, интерлейкин 7 (IL-7) и лиганд 19 хемокина (С-С мотив) (CCL19).1. An immunocompetent cell that expresses a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, interleukin 7 (IL-7), and chemokine ligand 19 (C-C motif) (CCL19).

2. Иммунокомпетентная клетка по п.1, где иммунокомпетентная клетка представляет собой иммунокомпетентную клетку, выделенную из живого организма.2. An immunocompetent cell according to claim 1, wherein the immunocompetent cell is an immunocompetent cell isolated from a living organism.

3. Иммунокомпетентная клетка по п.1 или 2, где иммунокомпетентная клетка содержит экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19.3. An immunocompetent cell according to claim 1 or 2, wherein the immunocompetent cell comprises an exogenous nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, an exogenous nucleic acid encoding IL-7, and an exogenous nucleic acid encoding CCL19.

4. Иммунокомпетентная клетка по п.3, где экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, и экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, представляют собой экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую человеческий IL-7, и экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую человеческий CCL19.4. An immunocompetent cell according to claim 3, wherein the exogenous nucleic acid encoding IL-7 and the exogenous nucleic acid encoding CCL19 are an exogenous nucleic acid encoding human IL-7 and an exogenous nucleic acid encoding human CCL19.

5. Иммунокомпетентная клетка по п.3 или 4, где экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, и экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, интегрированы в геном.5. An immunocompetent cell according to claim 3 or 4, wherein an exogenous nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, an exogenous nucleic acid encoding IL-7, and an exogenous nucleic acid encoding CCL19 are integrated into the genome.

6. Иммунокомпетентная клетка по любому из пп.1-5, где молекула клеточной поверхности, специфически распознающая человеческий мезотелин, представляет собой химерный рецептор антигена (CAR), содержащий одноцепочечное антитело, трансмембранный участок и сигнальный участок, который индуцирует активацию иммунокомпетентной клетки.6. An immunocompetent cell according to any one of claims 1 to 5, wherein the cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin is a chimeric antigen receptor (CAR) containing a single chain antibody, a transmembrane region, and a signal region that induces activation of the immunocompetent cell.

7. Иммунокомпетентная клетка по п.6, где одноцепочечное антитело, входящее в состав CAR, представляет собой одно из следующих одноцепочечных антител:7. An immunocompetent cell according to claim 6, where the single chain antibody included in the CAR is one of the following single chain antibodies:

(1-1) одноцепочечное антитело, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит CDR1 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 13, CDR2 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 14, и CDR3 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 15, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит CDR1 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 16, CDR2 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 17, и CDR3 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 18;(1-1) a single chain antibody containing a heavy chain variable region that contains a heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 13, a heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 14, and a heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 15 and a light chain variable region that contains a light chain CDR1 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 16, a light chain CDR2 consisting of the amino acid the sequence described in SEQ ID NO: 17, and a light chain CDR3 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 18;

(2-1) одноцепочечное антитело, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит CDR1 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 13, CDR2 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 14, и CDR3 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 15, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит CDR1 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 19, CDR2 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 17, и CDR3 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 18; и (3-1) одноцепочечное антитело, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит CDR1 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 20, CDR2 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 21, и CDR3 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 22, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит CDR1 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 23, CDR2 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 24, и CDR3 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 25.(2-1) a single chain antibody containing a heavy chain variable region that contains a heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 13, a heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 14, and a heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 15 and a light chain variable region that contains a light chain CDR1 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 19, a light chain CDR2 consisting of the amino acid the sequence described in SEQ ID NO: 17, and a light chain CDR3 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 18; and (3-1) a single chain antibody comprising a heavy chain variable region that comprises a heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 20, a heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 21 , and a heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 22, and a light chain variable region that contains a light chain CDR1 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 23, a light chain CDR2 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 24 and a light chain CDR3 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 25.

8. Иммунокомпетентная клетка по п.6 или 7, где одноцепочечное антитело, входящее в состав CAR, представляет собой одно из следующих одноцепочечных антител:8. An immunocompetent cell according to claim 6 or 7, where the single chain antibody included in the CAR is one of the following single chain antibodies:

(1 -2) одноцепочечное антитело, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, на 85% или более идентичной аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1, и вариабельный участок легкой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, на 85% или более идентичной аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 2;(1-2) a single chain antibody comprising a heavy chain variable region that consists of an amino acid sequence 85% or more identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, and a light chain variable region that consists of an amino acid sequence of 85% or more identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2;

(2- 2) одноцепочечное антитело, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, на 85% или более идентичной аминокислотной последователь-(2-2) single-chain antibody containing a heavy chain variable region, which consists of an amino acid sequence that is 85% or more identical to the amino acid sequence -

- 2 042661 ности, описанной в SEQ ID NO: 3, и вариабельный участок легкой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, на 85% или более идентичной аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 4;- 2 042661 the property described in SEQ ID NO: 3, and the variable region of the light chain, which consists of an amino acid sequence 85% or more identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4;

(3- 2) одноцепочечное антитело, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, на 85% или более идентичной аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 5, и вариабельный участок легкой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, на 85% или более идентичной аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 6;(3-2) a single chain antibody comprising a heavy chain variable region that consists of an amino acid sequence 85% or more identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 5, and a light chain variable region that consists of an amino acid sequence of 85% or more identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6;

(4- 2) одноцепочечное антитело, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, на 85% или более идентичной аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1, и вариабельный участок легкой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, на 85% или более идентичной аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 4; и (5- 2) одноцепочечное антитело, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, на 85% или более идентичной аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 3, и вариабельный участок легкой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, на 85% или более идентичной аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 2.(4-2) a single chain antibody comprising a heavy chain variable region that consists of an amino acid sequence 85% or more identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, and a light chain variable region that consists of an amino acid sequence of 85% or more identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4; and (5-2) a single chain antibody comprising a heavy chain variable region, which consists of an amino acid sequence 85% or more identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3, and a light chain variable region, which consists of an amino acid sequence, 85% or more identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2.

9. Иммунокомпетентная клетка по любому из пп.6-8, где одноцепочечное антитело, входящее в состав CAR, представляет собой одно из следующих одноцепочечных антител:9. An immunocompetent cell according to any one of claims 6 to 8, wherein the single chain antibody constituting the CAR is one of the following single chain antibodies:

(1- 3) одноцепочечное антитело, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1, и вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 2;(1-3) a single chain antibody comprising a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2;

(2- 3) одноцепочечное антитело, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 3, и вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 4;(2-3) a single chain antibody comprising a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4;

(3- 3) одноцепочечное антитело, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 5, и вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 6;(3-3) a single chain antibody comprising a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 5 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6;

(4- 3) одноцепочечное антитело, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1, и вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 4; и (5- 3) одноцепочечное антитело, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 3, и вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 2.(4-3) a single chain antibody comprising a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4; and (5-3) a single chain antibody comprising a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2.

10. Иммунокомпетентная клетка по любому из пп.6-9, где трансмембранный участок CAR содержит аминокислотную последовательность, на 85% или более идентичную аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 7.10. An immunocompetent cell according to any one of claims 6 to 9, wherein the CAR transmembrane region contains an amino acid sequence that is 85% or more identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 7.

11. Иммунокомпетентная клетка по любому из пп.6-10, где сигнальный участок CAR, который индуцирует активацию иммунокомпетентной клетки, содержит аминокислотные последовательности, описанные в SEQ ID NO: 8, 9 и 10.11. An immunocompetent cell according to any one of claims 6-10, wherein the CAR signaling region that induces activation of the immunocompetent cell contains the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 8, 9 and 10.

12. Иммунокомпетентная клетка по любому из пп.7-11, где вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи соединены пептидным линкером, состоящим из 2-30 аминокислот.12. An immunocompetent cell according to any one of claims 7-11, wherein the heavy chain variable region and the light chain variable region are connected by a peptide linker consisting of 2-30 amino acids.

13. Иммунокомпетентная клетка по п.12, где пептидный линкер состоит из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 26 или SEQ ID NO: 27.13. An immunocompetent cell according to claim 12, wherein the peptide linker consists of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 26 or SEQ ID NO: 27.

14. Иммунокомпетентная клетка по любому из пп.6-13, где одноцепочечное антитело, входящее в состав CAR, представляет собой одно из следующих одноцепочечных антител:14. An immunocompetent cell according to any one of claims 6 to 13, wherein the single chain antibody constituting the CAR is one of the following single chain antibodies:

(1- 4) одноцепочечное антитело, последовательно содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1, пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 26, и вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 2;(1-4) a single chain antibody, sequentially comprising a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, a peptide linker consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 26, and a light chain variable region, consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2;

(2- 4) одноцепочечное антитело последовательно содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 3, пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 26, и вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 4;(2-4) a single chain antibody sequentially comprising a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3, a peptide linker consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 26, and a light chain variable region consisting of from the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4;

(3- 4) одноцепочечное антитело, последовательно содержащее вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 2, пептидный линкер состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 26, и вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1;(3-4) a single chain antibody sequentially comprising a light chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, a peptide linker consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 26, and a heavy chain variable region consisting of from the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1;

(4- 4) одноцепочечное антитело, последовательно содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1, пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 27, и вариабельный участок(4-4) a single-chain antibody sequentially comprising a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, a peptide linker consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 27, and a variable region

- 3 042661 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 2;- 3 042661 light chain, consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2;

(5-4) одноцепочечное антитело, последовательно содержащее вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 2, пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 27, и вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1;(5-4) a single chain antibody sequentially comprising a light chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, a peptide linker consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 27, and a heavy chain variable region, consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1;

(6- 4) одноцепочечное антитело, последовательно содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 5, пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 26, и вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 6;(6-4) a single chain antibody sequentially comprising a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 5, a peptide linker consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 26, and a light chain variable region, consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6;

(7- 4) одноцепочечное антитело, последовательно содержащее вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 6, пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 26, и вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 5;(7-4) a single chain antibody sequentially comprising a light chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6, a peptide linker consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 26, and a heavy chain variable region, consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 5;

(8- 4) одноцепочечное антитело, последовательно содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 5, пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 27, и вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 6; и (9- 4) одноцепочечное антитело, последовательно содержащее вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 6, пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 27, и вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 5.(8-4) a single chain antibody sequentially comprising a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 5, a peptide linker consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 27, and a light chain variable region, consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6; and (9-4) a single chain antibody sequentially comprising a light chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6, a peptide linker consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 27, and a heavy chain variable region , consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 5.

15. Иммунокомпетентная клетка по любому из пп.6-14, где сигнальный участок CAR, который индуцирует активацию иммунокомпетентной клетки, содержит полипептид внутриклеточного участка CD28, полипептид внутриклеточного участка 4-1ВВ, и полипептид внутриклеточного участка CD3Z.15. An immunocompetent cell according to any one of claims 6-14, wherein the CAR signaling region that induces activation of the immunocompetent cell comprises a CD28 intracellular region polypeptide, a 4-1BB intracellular region polypeptide, and a CD3Z intracellular region polypeptide.

16. Иммунокомпетентная клетка по любому из пп.1-15, где иммунокомпетентная клетка представляет собой Т-клетку.16. An immunocompetent cell according to any one of claims 1 to 15, wherein the immunocompetent cell is a T cell.

17. Иммунокомпетентная клетка по любому из пп.1-16, где иммунокомпетентную клетку получают из организма человека, или иммунокомпетентная клетка представляет собой Т-клетку, выделенную из организма человека.17. An immunocompetent cell according to any one of claims 1 to 16, wherein the immunocompetent cell is derived from a human body, or the immunocompetent cell is a T cell isolated from a human body.

18. Фармацевтическая композиция, содержащая иммунокомпетентную клетку по любому из пп.1-17 и фармацевтически приемлемую добавку.18. A pharmaceutical composition containing an immunocompetent cell according to any one of claims 1 to 17 and a pharmaceutically acceptable additive.

19. Фармацевтическая композиция по п.18 для применения в способе лечения рака.19. A pharmaceutical composition according to claim 18 for use in a method of treating cancer.

20. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19.20. An expression vector containing a nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, a nucleic acid encoding IL-7, and a nucleic acid encoding CCL19.

21. Способ получения иммунокомпетентной клетки, которая экспрессирует молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, IL-7 и CCL19, включающий в себя введение в иммунокомпетентную клетку нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19.21. A method for producing an immunocompetent cell that expresses a cell surface molecule that specifically recognizes human mesothelin, IL-7 and CCL19, which includes introducing into the immunocompetent cell a nucleic acid encoding a cell surface molecule that specifically recognizes human mesothelin, a nucleic acid encoding IL- 7 and a nucleic acid encoding CCL19.

Эффект изобретения.Invention effect.

Иммунокомпетентная клетка по настоящему изобретению обладает цитотоксической активностью в отношении раковых клеток, экспрессирующих человеческий мезотелин, и способна подавлять образование опухоли, экспрессирующей человеческий мезотелин. Кроме того, иммунокомпетентная клетка по настоящему изобретению подавляет рецидивирование раковых клеток.The immunocompetent cell of the present invention has cytotoxic activity against human mesothelin-expressing cancer cells and is capable of suppressing the formation of a human mesothelin-expressing tumor. In addition, the immunocompetent cell of the present invention suppresses the recurrence of cancer cells.

Краткое описание чертежейBrief description of the drawings

На фиг. 1 приведена диаграмма, показывающая структуру (а) и аминокислотные последовательности (b) 9 типов scFv против человеческого мезотелина, полученных в примере 1.In FIG. 1 is a diagram showing the structure (a) and amino acid sequences (b) of 9 types of anti-human mesothelin scFv obtained in Example 1.

На фиг. 2 приведена диаграмма, показывающая результаты определения экспрессии CAR в Т-клетках против человеческого мезотелина, экспрессирующих CAR-IL-7/CCL19, как описано в примере 2. На фиг. 2(а) показаны результаты для Т-клеток, не экспрессирующих CAR, IL-7 и CCL19 (неинфицированных), а на фиг. 2(b-d) показаны результаты для Т-клеток против человеческого мезотелина, экспрессирующих CAR-IL-7/CCL19, содержащих соответственно VH07(15)VL07 (сигнальный пептид Т), VH07(15)VL07 (сигнальный пептид Р) и VH36(15)VL36 в качестве участка scFv.In FIG. 2 is a graph showing the results of determining CAR expression in anti-human mesothelin T cells expressing CAR-IL-7/CCL19 as described in Example 2. FIG. 2(a) shows the results for T cells not expressing CAR, IL-7 and CCL19 (uninfected) and FIG. 2(b-d) shows results for anti-human mesothelin T cells expressing CAR-IL-7/CCL19 containing VH07(15)VL07 (T signal peptide), VH07(15)VL07 (P signal peptide), and VH36(15) respectively. )VL36 as a scFv region.

На фиг. 3 приведена диаграмма, показывающая результаты определения экспрессии CAR в Т-клетках против человеческого мезотелина, экспрессирующих CAR-IL-7/CCL19, как описано в примере 2. На фиг. 3(а) показаны результаты для Т-клеток, не экспрессирующих CAR, IL-7 и CCL19 (неинфицированных), а на фиг. 3(b-е) показаны результаты для Т-клеток против человеческого мезотелина, экспрессирующих CAR-IL-7/CCL19, содержащих соответственно VH07(15)VL07, VL07(15)VH07, VH07(25)VL07 и VL07(25)VH07 в качестве участка scFv.In FIG. 3 is a graph showing the results of determining CAR expression in anti-human mesothelin T cells expressing CAR-IL-7/CCL19 as described in Example 2. FIG. 3(a) shows the results for T cells not expressing CAR, IL-7 and CCL19 (uninfected) and FIG. 3(b-e) shows results for anti-human mesothelin T cells expressing CAR-IL-7/CCL19 containing VH07(15)VL07, VL07(15)VH07, VH07(25)VL07 and VL07(25)VH07, respectively. as a scFv region.

На фиг. 4 приведена диаграмма, подтверждающая уровень экспрессии мезотелина в линиях опухолевых клеток по результатам, полученным с помощью проточного цитометра, как описано в примере 3.In FIG. 4 is a graph confirming the level of expression of mesothelin in tumor cell lines from the results obtained using a flow cytometer, as described in example 3.

- 4 042661- 4 042661

На фиг. 5 приведена иллюстративная диаграмма, демонстрирующая результаты тестирования совместного культивирования Т-клеток против человеческого мезотелина, экспрессирующих CAR-IL-7/CCL19, и линии мезотелин-положительных опухолевых клеток или линии мезотелин-отрицательных опухолевых клеток, как описано в примере 4.In FIG. 5 is an illustrative diagram showing the results of co-culture testing of anti-human mesothelin T cells expressing CAR-IL-7/CCL19 and a mesothelin positive tumor cell line or a mesothelin negative tumor cell line as described in Example 4.

На фиг. 6A приведена диаграмма, демонстрирующая результаты измерения выживания опухолевых клеток ACC-MESO-1 методом проточной цитометрии, как описано в примере 4.In FIG. 6A is a graph showing the results of measuring the survival of ACC-MESO-1 tumor cells by flow cytometry as described in Example 4.

На фиг. 6В приведена диаграмма, демонстрирующая результаты измерения выживания опухолевых клеток NCI-H2052 методом проточной цитометрии, как описано в примере 4.In FIG. 6B is a graph showing the results of NCI-H2052 tumor cell survival measured by flow cytometry as described in Example 4.

На фиг. 6С приведена диаграмма, демонстрирующая результаты измерения выживания опухолевых клеток А498 методом проточной цитометрии, как описано в примере 4.In FIG. 6C is a graph showing the results of measuring the survival of A498 tumor cells by flow cytometry as described in Example 4.

На фиг. 7А приведена диаграмма, демонстрирующая результаты измерения продукции IFN-γ после совместного культивирования Т-клеток против человеческого мезотелина, экспрессирующих CAR-IL-7/CCL19, и мезотелин-положительных опухолевых клеток ACC-MESO-1, как описано в примере 4.In FIG. 7A is a graph showing the results of measuring IFN-γ production after co-culture of anti-human mesothelin T cells expressing CAR-IL-7/CCL19 and mesothelin-positive ACC-MESO-1 tumor cells as described in Example 4.

На фиг. 7В приведена диаграмма, демонстрирующая результаты измерения продукции IFN-γ после совместного культивирования Т-клеток против человеческого мезотелина, экспрессирующих CAR-IL-7/CCL19, и мезотелин-положительных опухолевых клеток NCI-H2052, как описано в примере 4.In FIG. 7B is a graph showing the results of measuring IFN-γ production after co-culture of anti-human mesothelin T cells expressing CAR-IL-7/CCL19 and mesothelin positive NCI-H2052 tumor cells as described in Example 4.

На фиг. 7С приведена диаграмма, демонстрирующая результаты измерения продукции IFN-γ после совместного культивирования Т-клеток против человеческого мезотелина, экспрессирующих CAR-IL-7/CCL19, и мезотелин-отрицательных опухолевых клеток А498, как описано в примере 4.In FIG. 7C is a graph showing the results of measuring IFN-γ production after co-culture of anti-human mesothelin T cells expressing CAR-IL-7/CCL19 and mesothelin-negative A498 tumor cells as described in Example 4.

На фиг. 8 приведена диаграмма, демонстрирующая результаты измерения выживания лейкоцитов (числа лейкоцитов) или опухолевых клеток PAN02 методом проточной цитометрии, как описано в примере 5.In FIG. 8 is a graph showing the results of measuring leukocyte survival (WBC count) or PAN02 tumor cells by flow cytometry as described in Example 5.

На фиг. 9 приведена диаграмма, демонстрирующая результаты измерения продукции IFN-γ после совместного культивирования Т-клеток против мезотелина, экспрессирующих CAR-IL-7/CCL19, и опухолевых клеток PAN02, как описано в примере 5.In FIG. 9 is a graph showing the results of measuring IFN-γ production after co-culture of anti-mesothelin T cells expressing CAR-IL-7/CCL19 and PAN02 tumor cells as described in Example 5.

На фиг. 10 приведена диаграмма, демонстрирующая результаты измерения уровня выживаемости после введения Т-клеток против мезотелина, экспрессирующих CAR-мышиный IL-7/мышиный CCL19, мышиной модели опухоли, как описано в примере 6.In FIG. 10 is a graph showing the results of measuring the survival rate after administration of anti-mesothelin T cells expressing CAR-mouse IL-7/mouse CCL19 in a mouse tumor model as described in Example 6.

На фиг. 11 приведена диаграмма, демонстрирующая результаты измерения объема опухоли после введения Т-клеток против мезотелина, экспрессирующих CAR-мышиный IL-7/мышиный CCL19, мышиной модели опухоли, как описано в примере 6.In FIG. 11 is a graph showing the results of measuring tumor volume after injection of anti-mesothelin T cells expressing CAR-mouse IL-7/mouse CCL19, mouse tumor model, as described in Example 6.

На фиг. 12А приведена диаграмма, демонстрирующая результаты фотографирования мышей на 1, 3, 7, 10, 14, 21, 31 и 38 дни с временем выдержки экспозиции 30 с, как описано в примере 7, причем день, когда вводят ACC-MESO-1-GFP-Luc, определяют как день 1.In FIG. 12A is a graph showing the results of photographing mice on days 1, 3, 7, 10, 14, 21, 31 and 38 with exposure times of 30 seconds as described in Example 7, the day on which ACC-MESO-1-GFP was administered -Luc, defined as day 1.

На фиг. 12В приведена диаграмма, демонстрирующая результаты фотографирования мышей на 45, 59, 73, 87, 101, 115, 129 и 143 дни с временем выдержки экспозиции 30 с, как описано в примере 7, причем день, когда вводят ACC-MESO-1-GFP-Luc, определяют как день 1. Фотографию второго индивидуума слева, полученную на 129 день, опускают по причине смерти индивидуума.In FIG. 12B is a graph showing the results of photographing mice at 45, 59, 73, 87, 101, 115, 129 and 143 days with exposure times of 30 seconds as described in Example 7, the day on which ACC-MESO-1-GFP was administered -Luc, defined as day 1. The photograph of the second individual from the left, obtained on day 129, is omitted due to the death of the individual.

На фиг. 13 приведен график, демонстрирующий зависимость выживаемости мышей от числа дней после введения, как описано в примере 7.In FIG. 13 is a graph showing mouse survival versus number of days after administration as described in Example 7.

На фиг. 14 приведен график, демонстрирующий зависимость общего количества флуоресценции от числа дней после введения, как описано в примере 7.In FIG. 14 is a graph showing total fluorescence versus number of days after administration, as described in Example 7.

Способ осуществления изобретенияMethod for carrying out the invention

Иммунокомпетентная клетка по настоящему изобретению может представлять собой любую иммунокомпетентную клетку, которая экспрессирует молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, IL-7 и CCL19; предпочтительно она представляет собой иммунокомпетентную клетку, содержащую экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19. Указанная иммунокомпетентная клетка способна подавлять рост опухоли, образованной раковыми клетками, экспрессирующими человеческий мезотелин.The immunocompetent cell of the present invention may be any immunocompetent cell that expresses a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, IL-7 and CCL19; preferably, it is an immunocompetent cell comprising an exogenous nucleic acid encoding a cell surface molecule, an exogenous nucleic acid encoding IL-7, and an exogenous nucleic acid encoding CCL19. Said immunocompetent cell is capable of inhibiting the growth of a tumor formed by cancer cells expressing human mesothelin.

Человеческий мезотелин.Human mesothelin.

Человеческий мезотелин, белок размером 40 кДа, крайне редко экспрессируется в нормальных клетках, но интенсивно экспрессируется в раковых клетках (например, в клетках мезотелиомы и клетках рака поджелудочной железы). Информацию о последовательности человеческого мезотелина можно соответственно получить путем поиска в публично известном документе или в публично известной базе данных, такой как NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/). Примеры информации по аминокислотной последовательности человеческого мезотелина могут включать последовательность с номером доступа в GenBank NP_037536.2, AAV87530.1 и ее изоформы.Human mesothelin, a 40 kDa protein, is extremely rarely expressed in normal cells, but is highly expressed in cancer cells (eg, mesothelioma cells and pancreatic cancer cells). Sequence information for human mesothelin can be suitably obtained by searching a publicly known document or a publicly known database such as the NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/). Examples of human mesothelin amino acid sequence information may include GenBank accession number NP_037536.2, AAV87530.1, and isoforms thereof.

Молекула клеточной поверхности.cell surface molecule.

Примеры молекулы клеточной поверхности, специфически распознающей человеческий мезотелин, могут включать в себя молекулу или фактор, которые после экспрессии на клеточной поверхности спо- 5 042661 собны специфически распознавать человеческий мезотелин, такие как CAR, специфически распознающий человеческий мезотелин, Т-клеточный рецептор (TCR), специфически распознающий пептид, полученный из человеческого мезотелина, и белок или нуклеиновую кислоту, способные специфически связываться с человеческим мезотелином. CAR представляет собой искусственный химерный белок, содержащий одноцепочечное антитело (scFv), распознающее клеточный поверхностный антиген на раковых клетках, гибридизованное с сигнальным участком, индуцирующим активацию Т-клеток.Examples of a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin may include a molecule or factor that, when expressed on the cell surface, is capable of specifically recognizing human mesothelin, such as the CAR specifically recognizing human mesothelin, the T cell receptor (TCR) , specifically recognizing a peptide derived from human mesothelin and a protein or nucleic acid capable of specifically binding to human mesothelin. CAR is an artificial chimeric protein containing a single chain antibody (scFv) that recognizes cell surface antigen on cancer cells, hybridized to a signaling region that induces T cell activation.

Молекула клеточной поверхности предпочтительно локализована на поверхности иммунокомпетентной клетки при посредстве сигнального пептида (лидерной последовательности). Примеры сигнального пептида могут включать полипептиды, состоящие из тяжелой цепи иммуноглобулина, легкой цепи иммуноглобулина, CD8, α- и β-цепей Т-клеточного рецептора, CD3Z, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, и полученного из GITR сигнального пептида (лидерной последовательности). Его конкретные примеры могут включать полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности, на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более, идентичной аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 11 или 12, и обладает активностью, эквивалентной активности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11 или 12, а также полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности, полученной из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 11 или 12, путем делеции, замены, вставки и/или добавления одной или нескольких аминокислот, и обладает активностью, эквивалентной активности аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 11 или 12. Сигнальный пептид удаляется из зрелого белка после завершения локализации.The cell surface molecule is preferably located on the surface of the immunocompetent cell via a signal peptide (leader sequence). Examples of a signal peptide may include polypeptides consisting of an immunoglobulin heavy chain, an immunoglobulin light chain, CD8, T cell receptor α and β chains, CD3Z, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, and a GITR-derived signal peptide (leader sequence). Specific examples thereof may include a polypeptide that consists of an amino acid sequence that is 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more, identical to the amino acid sequence described in SEQ. ID NO: 11 or 12, and has an activity equivalent to that of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 or 12, as well as a polypeptide that consists of an amino acid sequence derived from the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 11 or 12 by deletion , substitutions, insertions and/or additions of one or more amino acids, and has an activity equivalent to that of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 11 or 12. The signal peptide is removed from the mature protein after localization is complete.

В настоящем описании термин аминокислотная последовательность, полученная путем делеции, замены, вставки и/или добавления одного или нескольких аминокислотных остатков охватывает аминокислотную последовательность, содержащую делеции, замены, вставки и/или добавления аминокислотных остатков, число которых, например, находится в диапазоне от 1 до 30 остатков, предпочтительно в диапазоне от 1 до 20 остатков, более предпочтительно в диапазоне от 1 до 15 остатков, еще более предпочтительно в диапазоне от 1 до 10 остатков, более предпочтительно в диапазоне от 1 до 5 остатков, более предпочтительно в диапазоне от 1 до 3 остатков, более предпочтительно в диапазоне от 1 до 2 остатков. Указанные изменения в аминокислотном составе можно осуществлять с помощью любого метода, известного специалистам в данной области, такого как химический синтез, генно-инженерный метод или мутагенез.In the present description, the term amino acid sequence obtained by deletion, substitution, insertion and/or addition of one or more amino acid residues encompasses an amino acid sequence containing deletions, substitutions, insertions and/or additions of amino acid residues, the number of which, for example, is in the range of 1 up to 30 residues, preferably in the range of 1 to 20 residues, more preferably in the range of 1 to 15 residues, even more preferably in the range of 1 to 10 residues, more preferably in the range of 1 to 5 residues, more preferably in the range of 1 up to 3 residues, more preferably in the range of 1 to 2 residues. These changes in amino acid composition can be carried out using any method known to those skilled in the art, such as chemical synthesis, genetic engineering or mutagenesis.

В настоящем описании термин идентичность относится к степени подобия полипептидных или полинуклеотидных последовательностей (которую определяют путем соответственного сравнения искомой последовательности и другой последовательности (нуклеотидной или белковой последовательности), предпочтительно последовательности такого же типа). Предпочтительные примеры компьютерных программ для расчета и определения идентичности могут включать GCG BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215: 403-410; Altschul et al., Nucleic Acids Res., 1997, 25: 3389-3402; and Devereux et al., Nucleic. Acids Res., 1984, 12:387), BLASTN 2.0 (Gish W., http://blast.Wustl.edu, 1996-2002), FASTA (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., uSa, 1988, 85: 2444-2448) и GCGGelMerge, которые определяют пары контигов с перекрыванием максимальной длины (Wilbur and Lipman, SIAM, J. Appl. Math., 1984, 44: 557-567; и Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 1970, 48: 443-453).As used herein, the term identity refers to the degree of similarity between polypeptide or polynucleotide sequences (determined by correspondingly comparing the target sequence and another sequence (nucleotide or protein sequence), preferably one of the same type). Preferred examples of computer programs for calculating and determining identity may include GCG BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215: 403-410; Altschul et al., Nucleic Acids Res. , 1997, 25: 3389-3402; and Devereux et al., Nucleic Acids Res., 1984, 12:387), BLASTN 2.0 (Gish W., http://blast.Wustl.edu, 1996-2002), FASTA (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., uSa, 1988, 85: 2444-2448) and GCGGelMerge, which define pairs of overlapping contigs of maximum length (Wilbur and Lipman, SIAM, J. Appl. Math., 1984, 44: 557-567 and Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 1970, 48: 443-453).

Одноцепочечное антитело, специфически распознающее человеческий мезотелин.Single chain antibody specifically recognizing human mesothelin.

Если молекула клеточной поверхности представляет собой CAR, одноцепочечное антитело (scFv), специфически распознающее человеческий мезотелин, предпочтительно входит в его состав в качестве молекулы, специфически распознающей человеческий мезотелин. В одноцепочечном антителе, специфически распознающем человеческий мезотелин, вариабельный участок тяжелой цепи (VH) и вариабельный участок легкой цепи (VL) антитела, специфически распознающего человеческий мезотелин, могут соединяться через пептидный линкер, соединяющий вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи. Примеры сочетаний вариабельного участка тяжелой цепи и вариабельного участка легкой цепи в составе одноцепочечного антитела, специфически распознающего человеческий мезотелин, могут включать приведенные ниже сочетания. Вариабельный участок легкой цепи может располагаться выше (на стороне N-конца) или ниже (на стороне С-конца) вариабельного участка тяжелой цепи.If the cell surface molecule is CAR, a single chain antibody (scFv) specifically recognizing human mesothelin is preferably included as a molecule specifically recognizing human mesothelin. In a single chain antibody specifically recognizing human mesothelin, the heavy chain variable region (VH) and the light chain variable region (VL) of an antibody specifically recognizing human mesothelin can be connected via a peptide linker connecting the heavy chain variable region and the light chain variable region. Examples of combinations of a heavy chain variable region and a light chain variable region in a single chain antibody specifically recognizing human mesothelin may include the following combinations. The light chain variable region can be located upstream (on the N-terminal side) or downstream (on the C-terminal side) of the heavy chain variable region.

(1-1) Сочетание вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего CDR (участок, определяющий комплементарность) 1 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 13, CDR2 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 14, и CDR3 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 15, и вариабельного участка легкой цепи, содержащего CDR1 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 16, CDR2 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 17, и CDR3 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 18;(1-1) The combination of a heavy chain variable region containing a heavy chain CDR (complementarity determining region) 1 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 13, a heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO : 14, and a heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 15 and a light chain variable region containing a light chain CDR1 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 16, a light chain CDR2 consisting from the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 17 and a light chain CDR3 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 18;

- 6 042661 (2-1) сочетание вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего CDR1 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 13, CDR2 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 14, и CDR3 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 15, и вариабельного участка легкой цепи, содержащего CDR1 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 19, CDR2 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 17, и CDR3 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 18; и (3-1) сочетание вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего CDR1 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 20, CDR2 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 21, и CDR3 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 22, и вариабельного участка легкой цепи, содержащего CDR1 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 23, CDR2 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 24, и CDR3 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 25.- 6 042661 (2-1) a combination of a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 13, a heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 14, and A heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 15 and a light chain variable region comprising a light chain CDR1 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 19, a light chain CDR2 consisting of the amino acid sequence, described in SEQ ID NO: 17, and a light chain CDR3 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 18; and (3-1) a combination of a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 20, a heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 21, and a heavy chain CDR3 chain consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 22 and a light chain variable region containing a light chain CDR1 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 23, a light chain CDR2 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 24, and a light chain CDR3 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 25.

Кроме того, CDR вариабельного участка тяжелой цепи и вариабельного участка легкой цепи, специфически распознающие человеческий мезотелин, идентифицируют в соответствии с системой нумерации IMGT, Kabat, Chothia, North или Contact и др. на основе аминокислотных последовательностей вариабельного участка тяжелой цепи и вариабельного участка легкой цепи публично известного антитела, специфически распознающего человеческий мезотелин, описанного, например, в нижеследующих документах (патент США № 8357783 и публикации не прошедшей экспертизу патентной заявки Японии (перевод заявки PCT) № 2017-518053). Примеры сочетаний также могут включать сочетание вариабельного участка тяжелой цепи и вариабельного участка легкой цепи, содержащих такие CDR. CDR можно идентифицировать на веб-сайте AbodyBuilder (http://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/sabdab-sabpred/Modelling.php).In addition, the CDRs of the heavy chain variable region and the light chain variable region specifically recognizing human mesothelin are identified according to the IMGT, Kabat, Chothia, North or Contact, etc. numbering system based on the amino acid sequences of the heavy chain variable region and the light chain variable region. a publicly known antibody specifically recognizing human mesothelin as described, for example, in the following documents (U.S. Patent No. 8,357,783 and Japanese Unexamined Patent Application Publication (PCT Application Translation) No. 2017-518053). Examples of combinations may also include a combination of a heavy chain variable region and a light chain variable region containing such CDRs. CDRs can be identified on the AbodyBuilder website (http://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/sabdab-sabpred/Modelling.php).

Примеры сочетания вариабельного участка тяжелой цепи и вариабельного участка легкой цепи в составе одноцепочечного антитела специфически распознающего человеческий мезотелин, также могут включать следующие сочетания:Examples of the combination of a heavy chain variable region and a light chain variable region in a single chain antibody specifically recognizing human mesothelin may also include the following combinations:

(1-2) сочетание вариабельного участка тяжелой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентичной аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1, и вариабельного участка легкой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентичной аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 2;(1-2) a combination of a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence of 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, and a light chain variable region consisting of an amino acid sequence of 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more amino acid sequence identical described in SEQ ID NO: 2;

(2-2) сочетание вариабельного участка тяжелой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентичной аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 3, и вариабельного участка легкой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентичной аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 4;(2-2) a combination of a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence of 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3, and a light chain variable region consisting of an amino acid sequence of 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more amino acid sequence identical described in SEQ ID NO: 4;

(3-2) сочетание вариабельного участка тяжелой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентичной аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 5, и вариабельного участка легкой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентичной аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 6;(3-2) a combination of a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence of 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 5, and a light chain variable region consisting of an amino acid sequence of 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more amino acid sequence identical described in SEQ ID NO: 6;

(4-2) сочетание вариабельного участка тяжелой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентичной аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1, и вариабельного участка легкой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентичной аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 4; и (5-2) сочетание вариабельного участка тяжелой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентичной аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 3, и вариабельного участка легкой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентичной аминокислотной последовательно(4-2) the combination of a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence of 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, and a light chain variable region consisting of an amino acid sequence of 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more amino acid sequence identical described in SEQ ID NO: 4; and (5-2) combining a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence of 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more amino acid sequence identical, described in SEQ ID NO: 3, and a light chain variable region consisting of an amino acid sequence of 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more identical amino acid successively

- 7 042661 сти, описанной в SEQ ID NO: 2.- 7 042661 as described in SEQ ID NO: 2.

Кроме того, сочетание может представлять собой сочетание вариабельного участка тяжелой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентичной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи публично известного антитела, специфически распознающего человеческий мезотелин, описанного, например, в нижеследующих документах (патент США № 8357783 и публикация не прошедшей экспертизу патентной заявки Японии (перевод заявки PCT) № 2017-518053), и вариабельного участка легкой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентичной последовательности вариабельного участка легкой цепи публично известного антитела, специфически распознающего человеческий мезотелин.In addition, the combination may be a combination of a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence of 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more sequence identical to the variable a heavy chain region of a publicly known antibody specifically recognizing human mesothelin as described, for example, in the following documents (U.S. Patent No. 8,357,783 and Japanese Unexamined Patent Application Publication (PCT Application Translation) No. 2017-518053), and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence, 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more identical to the light chain variable region sequence of a publicly known antibody specifically recognizing human mesothelin.

Другие примеры сочетания вариабельного участка тяжелой цепи и вариабельного участка легкой цепи в составе одноцепочечного антитела, специфически распознающего человеческий мезотелин, также могут включать следующие сочетания:Other examples of combining a heavy chain variable region and a light chain variable region in a single chain antibody specifically recognizing human mesothelin may also include the following combinations:

(1-3) сочетание вариабельного участка тяжелой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1, и вариабельного участка легкой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 2;(1-3) a combination of a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2;

(2-3) сочетание вариабельного участка тяжелой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 3, и вариабельного участка легкой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 4;(2-3) a combination of a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4;

(3-3) сочетание вариабельного участка тяжелой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 5, и вариабельного участка легкой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 6;(3-3) a combination of a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 5 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6;

(4-3) сочетание вариабельного участка тяжелой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1, и вариабельного участка легкой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 4; и (5-3) сочетание вариабельного участка тяжелой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 3, и вариабельного участка легкой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 2.(4-3) a combination of a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4; and (5-3) a combination of a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2.

Кроме того, сочетание может представлять собой сочетание вариабельного участка тяжелой цепи и вариабельного участка легкой цепи публично известного антитела, специфически распознающего человеческий мезотелин, описанного, например, в нижеследующих документах (патент США № 8357783 и публикация не прошедшей экспертизу патентной заявки Японии (перевод заявки PCT) № 2017-518053).In addition, the combination may be a combination of a heavy chain variable region and a light chain variable region of a publicly known antibody specifically recognizing human mesothelin as described, for example, in the following documents (US Patent No. 8357783 and Japanese Unexamined Patent Application Publication (PCT Application) ) No. 2017-518053).

Пептидный линкер.peptide linker.

Вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи соединяются через пептидный линкер. Длина пептидного линкера составляет от 2 до 30, предпочтительно от 15 до 25, более предпочтительно 15 или 25. Конкретно его предпочтительные примеры могут включать полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, которая на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентична аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 26 или 27, содержащей непрерывную последовательность глицин-серин, и обладает активностью, эквивалентной активности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 26 или 27, а также полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности, полученной из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 26 или 27, путем делеции, замены, вставки и/или добавления одной или нескольких аминокислот, и обладает активностью, эквивалентной активности аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 26 или 27.The heavy chain variable region and the light chain variable region are connected via a peptide linker. The length of the peptide linker is 2 to 30, preferably 15 to 25, more preferably 15 or 25. Specifically, its preferred examples may include a polypeptide consisting of an amino acid sequence that is 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 26 or 27, containing a contiguous sequence of glycine-serine, and has an activity equivalent to that of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26 or 27 , as well as a polypeptide that consists of an amino acid sequence derived from the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 26 or 27, by deletion, substitution, insertion and / or addition of one or more amino acids, and has an activity equivalent to that of the amino acid sequence, described in SEQ ID NO: 26 or 27.

Примеры сочетания вариабельного участка тяжелой цепи, вариабельного участка легкой цепи и пептидного линкера в составе одноцепочечного антитела, специфически распознающего человеческий мезотелин, могут также включать приведенные ниже сочетания. Термин последовательно, описанный ниже, обозначает порядок расположения от N-концевой стороны.Examples of the combination of a heavy chain variable region, a light chain variable region, and a peptide linker in a single chain antibody specifically recognizing human mesothelin may also include the following combinations. The term sequentially, described below, denotes the order from the N-terminal side.

(1-4) Сочетание, последовательно содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1, пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 26, и вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 2;(1-4) A combination sequentially comprising a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, a peptide linker consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 26, and a light chain variable region consisting of from the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2;

(2-4) сочетание, последовательно содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 3, пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 26, и вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 4;(2-4) a combination sequentially comprising a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3, a peptide linker consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 26, and a light chain variable region consisting of from the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4;

(3-4) сочетание, последовательно содержащее вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 2, пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 26, и вариабельный участок тяжелой цепи,(3-4) a combination sequentially comprising a light chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, a peptide linker consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 26, and a heavy chain variable region,

- 8 042661 состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1;- 8 042661 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1;

(4-4) сочетание, последовательно содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1, пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 27, и вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 2;(4-4) a combination sequentially comprising a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, a peptide linker consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 27, and a light chain variable region consisting of from the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2;

(5-4) сочетание, последовательно содержащее вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 2, пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 27, и вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1;(5-4) a combination sequentially comprising a light chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, a peptide linker consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 27, and a heavy chain variable region consisting of from the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1;

(6-4) сочетание, последовательно содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 5, пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 26, и вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 6;(6-4) a combination sequentially comprising a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 5, a peptide linker consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 26, and a light chain variable region consisting of from the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6;

(7-4) сочетание, последовательно содержащее вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 6, пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 26, и вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 5;(7-4) a combination sequentially comprising a light chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6, a peptide linker consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 26, and a heavy chain variable region consisting of from the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 5;

(8-4) сочетание, последовательно содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 5, пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 27, и вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 6; и (9-4) сочетание, последовательно содержащее вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 6, пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 27, и вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 5.(8-4) a combination sequentially comprising a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 5, a peptide linker consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 27, and a light chain variable region consisting of from the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6; and (9-4) a combination sequentially comprising a light chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6, a peptide linker consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 27, and a heavy chain variable region, consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 5.

IL-7 и CCL19.IL-7 and CCL19.

IL-7 представляет собой цитокин, необходимый для выживания Т-клеток, который продуцируется негемопоэтическими клетками, такими как стромальные клетки костного мозга, тимуса или лимфоидного органа или лимфоидной ткани. С другой стороны, Т-клетки сами по себе редко способны продуцировать IL-7.IL-7 is a T cell survival cytokine that is produced by non-hematopoietic cells such as stromal cells in the bone marrow, thymus, or lymphoid organ or lymphoid tissue. On the other hand, T cells alone are rarely capable of producing IL-7.

CCL19 в основном продуцируется дендритными клетками или макрофагами лимфатических узлов и выполняет функцию, которая заключается в инициации миграции Т-клеток, В-клеток или зрелых дендритных клеток через рецептор CCR7.CCL19 is mainly produced by dendritic cells or macrophages of the lymph nodes and has the function of initiating the migration of T cells, B cells or mature dendritic cells through the CCR7 receptor.

Организм, из которого получают IL-7 или CCL19 особо не ограничивается и предпочтительно представляет собой организм человека. Аминокислотные последовательности указанных белков можно найти в публично известной базе данных последовательностей, такой как GenBank. Примеры аминокислотной последовательности человеческого IL-7 могут включать последовательность, зарегистрированную в GenBank под номером доступа NM_000880.3 (SEQ ID NO: 28) и ее изоформы. Примеры аминокислотной последовательности человеческого CCL19 могут включать последовательность, зарегистрированную в GenBank под номером доступа NM_006274.2 (SEQ ID NO: 29) и ее изоформы. Хотя IL-7 и CCL19 могут содержать сигнальный пептид, в зрелых белках он отсутствует. Например, в аминокислотной последовательности человеческого IL-7, описанной в SEQ ID NO: 28, последовательность, занимающая положения 1-25, соответствует сигнальному пептиду. Например, в аминокислотной последовательности человеческого CCL19, описанной в SEQ ID NO: 29, последовательность, занимающая положения 1-21, соответствует сигнальному пептиду.The organism from which IL-7 or CCL19 is obtained is not particularly limited, and is preferably a human body. The amino acid sequences of these proteins can be found in a publicly known sequence database such as GenBank. Examples of the amino acid sequence of human IL-7 may include the sequence registered in GenBank accession number NM_000880.3 (SEQ ID NO: 28) and its isoforms. Examples of the amino acid sequence of human CCL19 may include GenBank accession number NM_006274.2 (SEQ ID NO: 29) and isoforms thereof. Although IL-7 and CCL19 may contain a signal peptide, it is absent in mature proteins. For example, in the amino acid sequence of human IL-7 described in SEQ ID NO: 28, the sequence at positions 1-25 corresponds to a signal peptide. For example, in the amino acid sequence of human CCL19 described in SEQ ID NO: 29, the sequence at positions 1-21 corresponds to a signal peptide.

IL-7 или CCL19 может представлять собой вариант природного белка, как описано выше. Примеры варианта IL-7 могут включать полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности, на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентичной аминокислотной последовательности человеческого IL-7, описанной в SEQ ID NO: 28, и обладает способностью увеличивать скорость пролиферации клеток или степень выживания клеток под действием IL-7, и полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности, полученной из аминокислотной последовательности человеческого IL-7, описанной в SEQ ID NO: 28, путем делеции, замены, вставки и/или добавления одной или нескольких аминокислот, и обладает способностью увеличивать скорость пролиферации клеток или степень выживания клеток под действием IL-7. Примеры вариантов человеческого CCL19 могут включать полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности, на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентичной аминокислотной последовательности человеческого CCL19, описанной в SEQ ID NO: 29, и обладает способностью стимулировать миграцию клеток, как и CCL19, а также полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности, полученной из аминокислотной последовательности человеческого CCL19, описанной в SEQ ID NO: 29, путем делеции, замены, вставки и/или добавления одной или нескольких аминокислот, и обладает способностью стимулировать миграцию клеток, как и CCL19.IL-7 or CCL19 may be a natural protein variant as described above. Examples of an IL-7 variant may include a polypeptide that consists of an amino acid sequence that is 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more amino acid sequence identical to human IL- 7 described in SEQ ID NO: 28 and has the ability to increase the rate of cell proliferation or the degree of cell survival under the action of IL-7, and a polypeptide that consists of an amino acid sequence derived from the amino acid sequence of human IL-7 described in SEQ ID NO : 28, by deletion, substitution, insertion and/or addition of one or more amino acids, and has the ability to increase the rate of cell proliferation or the degree of survival of cells under the action of IL-7. Examples of human CCL19 variants may include a polypeptide that consists of an amino acid sequence that is 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more identical to the amino acid sequence of human CCL19 described in SEQ ID NO: 29, and has the ability to stimulate cell migration, like CCL19, as well as a polypeptide that consists of an amino acid sequence derived from the amino acid sequence of human CCL19 described in SEQ ID NO: 29, by deletion, substitution, insertion and /or adding one or more amino acids, and has the ability to stimulate cell migration, like CCL19.

- 9 042661- 9 042661

Другой фактор, регулирующий иммунную функцию.Another factor regulating immune function.

Иммунокомпетентная клетка по настоящему изобретению может также экспрессировать другой фактор, регулирующий иммунную функцию, такой как IL-15, CCL21, IL-2, IL-4, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IP-10, интерферон-γ, MIP-1-альфа, GM-CSF, M-CSF, TGF-бета или TNF-альфа. Другой фактор, регулирующий иммунную функцию, предпочтительно представляет собой фактор, регулирующий иммунную функцию, отличный от IL-12.The immunocompetent cell of the present invention may also express another immune function regulating factor such as IL-15, CCL21, IL-2, IL-4, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IP-10 , interferon-γ, MIP-1-alpha, GM-CSF, M-CSF, TGF-beta, or TNF-alpha. The other immune regulating factor is preferably an immune regulating factor other than IL-12.

Трансмембранный участок.transmembrane region.

Примеры трансмембранного участка по настоящему изобретению могут включать полипептиды трансмембранных участков CD8, α- и β-цепей Т-клеточного рецептора, CD3Z, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154 и GITR. Предпочтительные примеры трансмембранного участка могут включать полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентичную аминокислотной последовательности трансмембранного участка человеческого CD8, описанной в SEQ ID NO: 7, и обладает активностью, эквивалентной активности аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 7, а также полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности, полученной из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 7, путем делеции, замены, вставки и/или добавления одной или нескольких аминокислот, и обладает активностью, эквивалентной активности аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 7. CAR заякоривается в клеточной мембране Т-клеток посредством такого трансмембранного участка.Examples of the transmembrane region of the present invention may include transmembrane region polypeptides of CD8, T cell receptor α and β chains, CD3Z, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154 and GITR. Preferred examples of the transmembrane region may include a polypeptide that contains an amino acid sequence that is 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more identical to the amino acid sequence of the transmembrane region of human CD8, described in SEQ ID NO: 7, and has an activity equivalent to that of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 7, as well as a polypeptide that consists of an amino acid sequence derived from the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 7, by deletion , substitutions, insertions and/or additions of one or more amino acids, and has an activity equivalent to that of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 7. CAR is anchored in the cell membrane of T cells through such a transmembrane region.

Трансмембранный участок может включать шарнирный участок, который состоит из произвольного олигопептида или полипептида и имеет длину от 1 до 100 аминокислот, предпочтительно от 10 до 70 аминокислот. Примеры шарнирного участка могут включать шарнирный участок человеческого CD8.The transmembrane region may include a hinge region, which consists of an arbitrary oligopeptide or polypeptide and is 1 to 100 amino acids in length, preferably 10 to 70 amino acids in length. Examples of the hinge region may include the human CD8 hinge region.

Сигнальный участок, активирующий иммунокомпетентные клетки.Signaling site that activates immunocompetent cells.

Сигнальный участок, активирующий иммунокомпетентные клетки представляет собой участок, способный передавать сигналы клеткам, если молекула клеточной поверхности распознает мезотелин. Сигнальный участок, активирующий иммунокомпетентные клетки, предпочтительно содержит по меньшей мере один или несколько элементов, выбранных из внутриклеточных участков полипептидов CD28, 4-1ВВ (CD137), GITR, CD27, ОХ40, HVEM, CD2Z или Fc-рецептор-ассоциированной γ-цепи, более предпочтительно он содержит три полипептида, например, полипептид внутриклеточного участка CD28, полипептид внутриклеточного участка 4-1ВВ и полипептид внутриклеточного участка CD3Z. Примеры аминокислотной последовательности внутриклеточного участка CD28 могут включать полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентичную аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 8, и обладает активностью, эквивалентной активности аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 8, а также полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности полученной из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 8, путем делеции, замены, вставки и/или добавления одной или нескольких аминокислот, и обладает активностью, эквивалентной активности аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 8. Примеры аминокислотной последовательности внутриклеточного участка 4-1ВВ могут включать полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентичную аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 9, и обладает активностью, эквивалентной активности аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 9, а также полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности, полученной из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 9, путем делеции, замены, вставки и/или добавления одной или нескольких аминокислот, и обладает активностью, эквивалентной активности аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 9. Примеры аминокислотной последовательности внутриклеточного участка CD3Z могут включать полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентичную аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 10, и обладает активностью, эквивалентной активности аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 10, а также полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности, полученной из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 10, путем делеции, замены, вставки и/или добавления одной или нескольких аминокислот, и обладает активностью, эквивалентной активности аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 10. Если в качестве иммунокомпетентной клетки используют Т-клетку, можно выбрать полипептид, способный передавать сигналы Т-клетке. Если используют другие иммунокомпетентные клетки, можно выбрать полипептиды, способные передавать сигналы в иммунокомпетентные клетки. Если в качестве иммунокомпетентной клетки используют Т-клетку, примеры сигнального участка, активирующего иммунокомпетентную клетку, могут включать полипептид, содержащийThe signaling site that activates immunocompetent cells is a site capable of transmitting signals to cells if the cell surface molecule recognizes mesothelin. The signaling region that activates immunocompetent cells preferably contains at least one or more elements selected from intracellular regions of CD28, 4-1BB (CD137), GITR, CD27, OX40, HVEM, CD2Z or Fc-receptor-associated γ-chain polypeptides, more preferably it contains three polypeptides, for example, a CD28 intracellular region polypeptide, a 4-1BB intracellular region polypeptide, and a CD3Z intracellular region polypeptide. Examples of the amino acid sequence of the intracellular region of CD28 may include a polypeptide that contains an amino acid sequence that is 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 8, and has an activity equivalent to that of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 8, as well as a polypeptide that consists of an amino acid sequence derived from the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 8, by deletion, substitution, insertion and/or addition of one or more amino acids, and has an activity equivalent to that of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 8. Examples of the amino acid sequence of the intracellular region 4-1BB may include a polypeptide that contains an amino acid sequence of 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 9, and has an activity equivalent to that of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 9, as well as a polypeptide that consists of an amino acid sequence derived from the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 9, by deletion, substitution, insertion and / or addition of one or more amino acids, and has an activity equivalent to that of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 9. Examples of the amino acid sequence of the CD3Z intracellular region may include a polypeptide that contains an amino acid sequence of 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 10, and has an activity equivalent to that of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 10, as well as a polypeptide that consists of an amino acid sequence derived from the amino acid sequence described in SEQ ID NO: : 10 by deletion, substitution, insertion and/or addition of one or more amino acids, and has an activity equivalent to that of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 10. If a T cell is used as an immunocompetent cell, a polypeptide capable of send signals to the T cell. If other immunocompetent cells are used, polypeptides capable of transmitting signals to the immunocompetent cells can be selected. If a T cell is used as the immunocompetent cell, examples of the signaling region that activates the immunocompetent cell may include a polypeptide containing

- 10 042661 аминокислотные последовательности, описанные в SEQ ID NOs: 8, 9 и 10, предпочтительно они могут включать полипептид, содержащий аминокислотные последовательности, описанные в SEQ ID NO: 8, 9 и- 10 042661 amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 8, 9 and 10, preferably they may include a polypeptide containing the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 8, 9 and

10, в направлении от N-концевой стороны.10, away from the N-terminal side.

Внеклеточный шарнирный участок и спейсер.Extracellular hinge region and spacer.

Внеклеточный шарнирный участок, состоящий из произвольного олигопептида или полипептида, может быть расположен между молекулой клеточной поверхности, распознающей мезотелин, и трансмембранным участком. Длина внеклеточного шарнирного участка может составлять от 1 до 100 аминокислотных остатков, предпочтительно от 10 до 70 аминокислотных остатков. Примеры такого внеклеточного шарнирного участка могут включать шарнирные участки, полученные из CD8, CD28 и CD4, а также шарнирные участки иммуноглобулинов.An extracellular hinge region, consisting of an arbitrary oligopeptide or polypeptide, may be located between the mesothelin-recognizing cell surface molecule and the transmembrane region. The length of the extracellular hinge region may be from 1 to 100 amino acid residues, preferably from 10 to 70 amino acid residues. Examples of such an extracellular hinge may include hinges derived from CD8, CD28 and CD4, as well as immunoglobulin hinges.

Спейсерный участок, состоящий из произвольного олигопептида или полипептида, может быть расположен между трансмембранным участком и сигнальным участком, активирующим иммунокомпетентную клетку. Длина спейсерного участка может составлять, например, от 1 до 100 аминокислотных остатков, предпочтительно от 10 до 50 аминокислотных остатков. Примеры такого спейсерного участка могут включать непрерывную последовательность глицин-серин.A spacer region, consisting of an arbitrary oligopeptide or polypeptide, may be located between the transmembrane region and the signal region that activates the immunocompetent cell. The length of the spacer region may be, for example, from 1 to 100 amino acid residues, preferably from 10 to 50 amino acid residues. Examples of such a spacer site may include a contiguous sequence of glycine-serine.

Расположение каждого участка.Location of each lot.

В CAR описанные выше участки могут располагаться в следующем порядке: одноцепочечное антитело, трансмембранный участок и сигнальный участок, активирующий иммунокомпетентную клетку, в направлении от N-конца. Конкретные примеры могут включать CAR, в котором одноцепочечное антитело, специфически распознающее человеческий мезотелин, внеклеточный шарнирный участок человеческого CD8, трансмембранный участок человеческого CD8, сигнальный участок человеческого CD28, активирующий Т-клетки, сигнальный участок человеческого 4-1ВВ, активирующий Т-клетки, и сигнальный участок человеческого CD3Z, активирующий Т-клетки, располагаются по порядку в направлении от N-концевой стороны.In a CAR, the regions described above can be arranged in the following order: single chain antibody, transmembrane region, and signal region that activates an immunocompetent cell, in the direction from the N-terminus. Specific examples may include CAR, wherein a single chain antibody specifically recognizing human mesothelin, human CD8 extracellular hinge, human CD8 transmembrane region, human CD28 T-cell activating signaling region, human T-cell activating signaling region 4-1BB, and the T-cell activating signaling region of human CD3Z is located in order in the direction from the N-terminal side.

Белок, экспрессируемый суицидальным геном.A protein expressed by the suicide gene.

Иммунокомпетентная клетка по настоящему изобретению может экспрессировать белок, функция которого заключается в уничтожении собственной клетки, такой как тимидинкиназа вируса простого герпеса (HSV-TK) или индуцируемая каспаза 9 (белок, экспрессируемый суицидальным геном). Экспрессия такого белка суицидальным геном непосредственно или косвенно индуцирует вещество, которое обладает клеточной токсичностью и может выполнять функцию уничтожения собственной клетки. Следовательно, например, иммунокомпетентную клетку по настоящему изобретению, присутствующую в живом организме, можно контролировать путем введения лекарственного средства, активирующего функцию, после исчезновения опухоли вследствие курса лечения опухоли. А именно риск синдрома высвобождения цитокинов можно при необходимости эффективно снизить для иммунокомпетентной клетки по настоящему изобретению.The immunocompetent cell of the present invention can express a protein whose function is to kill its own cell, such as herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK) or inducible caspase 9 (a protein expressed by a suicide gene). Expression of such a protein by a suicide gene directly or indirectly induces a substance that has cellular toxicity and can perform the function of destroying its own cell. Therefore, for example, an immunocompetent cell of the present invention present in a living body can be controlled by administering a function-activating drug after the disappearance of a tumor due to a course of tumor treatment. Namely, the risk of cytokine release syndrome can be effectively reduced for the immunocompetent cell of the present invention, if necessary.

Примеры лекарственного средства, активирующего функцию тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV-TK) или индуцируемой каспазы 9, могут включать ганцикловир для первой и АР1903, обеспечивающий химическую индукцию димеризации (CID), для последней (Cooper L.J. et al., Cytotherapy, 2006; 8 (2): 105-17; Jensen M.C. et al., Biol Blood Marrow Transplant, 2010 Sep; 16 (9): 1245-56; Jones B.S., Front Pharmacol., 2014, Nov 27; 5: 254; Minagawa K., Pharmaceuticals (Basel), 2015 May 8, 8 (2): 230-49; и Bole-Richard E., Front Pharmacol., 2015, Aug 25, 6: 174).Examples of a drug that activates the function of herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK) or inducible caspase 9 may include ganciclovir for the former and AP1903, which provides chemical induction of dimerization (CID), for the latter (Cooper L. J. et al., Cytotherapy, 2006; 8 (2): 105-17; Jensen M. C. et al., Biol Blood Marrow Transplant, 2010 Sep; 16 (9): 1245-56; Jones B. S., Front Pharmacol., 2014, Nov 27; 5: 254; Minagawa K. , Pharmaceuticals (Basel), 2015 May 8, 8 (2): 230-49; and Bole-Richard E., Front Pharmacol., 2015, Aug 25, 6: 174).

Тип иммунокомпетентной клетки.Type of immunocompetent cell.

Тип иммунокомпетентной клетки особо не ограничивается при условии, что клетка участвует в иммунном ответе и может экспрессировать молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, IL-7 и CCL19, после введения нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, и нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19. Клетка предпочтительно представляет собой иммунокомпетентную клетку, выделенную из живого организма. Ее примеры могут включать лимфоидную клетку, такую как Т-клетка, натуральная клетка-киллер (NK-клетка) и В-клетка, антигенпрезентирующую клетку, такую как моноцит, макрофаг и дендритная клетка, и гранулоцит, такой как нейтрофил, эозинофил, базофил и тучная клетка, выделенные из живого организма. В частности, ее предпочтительные примеры могут включать Т-клетки, полученные или выделенные из организма млекопитающего, такого как человек, собака, кошка, свинья или мышь, а также Т-клетки, полученные или выделенные из организма человека. Т-клетка, полученная от млекопитающего, такого как человек, собака, кошка, свинья или мышь, включает в себя Т-клетку, полученную путем искусственного культивирования ex vivo Т-клетки, выделенной (собранной) из организма млекопитающего, такого как человек, собака, кошка, свинья или мышь, или Т-клетку, полученную путем субкультивированная такой Т-клетки. Выделенная Т-клетка может представлять собой популяцию клеток, содержащую в основном Т-клетки. Такая клеточная популяция может содержать другие клетки, отличные от Т-клеток, и, кроме того, она может содержать Т-клетки в соотношении 50% или более, предпочтительно 60% или более, более предпочтительно 70% или более, еще более предпочтительно 80% или более, наиболее предпочтительно 90% или более. Т-клетку можно получить путем выделения популяции клеток, содержащей иммунокомпе- 11 042661 тентную клетку из жидкости организма, такой как кровь или жидкость костного мозга, ткани, такой как ткань селезенки, вилочковой железы или лимфатического узла, или иммунокомпетентную клетку, инфильтрующую раковую ткань, такую как первичная опухоль, метастатическая опухоль или раковый асцит. Чтобы увеличить долю Т-клеток, содержащихся в клеточной популяции, Т-клетку можно дополнительно выделить или очистить, если это необходимо, из выделенной клеточной популяции с помощью стандартного метода. Клетку, полученную из клетки ES или клетки iPS, можно использовать в качестве иммунокомпетентной клетки. Примеры таких Т-клеток могут включать альфа-бета-Т-клетки, гаммадельта-Т-клетки, Т-клетки CD8+, Т-клетки CD4+, Т-клетки, инфильтрующие опухоль, Т-клетки памяти, наивные Т-клетки и NKT-клетки. Иммунокомпетентная клетка может быть получена из такого же индивидуума, как и индивидуум, получающий введение, или из другого индивидуума. Если индивидуум, получающий введение, представляет собой человека, в качестве иммунокомпетентной клетки можно использовать аутологичную клетку, собранную у самого пациента, как у индивидуума, получающего введение, или в качестве иммунокомпетентной клетки можно использовать аллогенную клетку, собранная у другого человека. В частности, донор и реципиент необязательно, но предпочтительно являются одинаковыми.The type of immunocompetent cell is not particularly limited as long as the cell participates in the immune response and can express a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, IL-7 and CCL19, after administration of a nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, nucleic acid , encoding IL-7, and a nucleic acid encoding CCL19. The cell is preferably an immunocompetent cell isolated from a living organism. Examples thereof may include a lymphoid cell such as a T cell, a natural killer (NK) cell and a B cell, an antigen presenting cell such as a monocyte, a macrophage and a dendritic cell, and a granulocyte such as a neutrophil, eosinophil, basophil and mast cell isolated from a living organism. In particular, its preferred examples may include T cells derived from or isolated from a mammalian body such as a human, dog, cat, pig or mouse, as well as T cells derived from or isolated from a human body. A T cell derived from a mammal such as a human, dog, cat, pig or mouse includes a T cell obtained by ex vivo artificial cultivation of a T cell isolated (harvested) from a mammal such as a human, dog , cat, pig or mouse, or a T cell obtained by subculturing such a T cell. An isolated T cell may be a population of cells containing primarily T cells. Such a cell population may contain other cells than T cells, and in addition, it may contain T cells in a ratio of 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, even more preferably 80% or more, most preferably 90% or more. A T cell can be obtained by isolating a population of cells containing an immunocompetent cell from a body fluid such as blood or bone marrow fluid, tissue such as spleen, thymus, or lymph node tissue, or an immunocompetent cell infiltrating cancerous tissue, such as primary tumor, metastatic tumor or cancerous ascites. To increase the proportion of T cells contained in the cell population, the T cell can be further isolated or purified, if necessary, from the isolated cell population using a standard method. A cell derived from an ES cell or an iPS cell can be used as an immunocompetent cell. Examples of such T cells may include alpha-beta T cells, gamma-delta T cells, CD8+ T cells, CD4+ T cells, tumor infiltrating T cells, memory T cells, naïve T cells, and NKT- cells. The immunocompetent cell may be obtained from the same individual as the individual receiving the administration, or from a different individual. If the individual receiving the administration is a human, an autologous cell collected from the patient himself can be used as the immunocompetent cell, as from the individual receiving the administration, or an allogeneic cell collected from another person can be used as the immunocompetent cell. In particular, the donor and recipient are optionally but preferably the same.

Способ получения иммунокомпетентной клетки.Method for obtaining immunocompetent cells.

Примеры способа получения иммунокомпетентной клетки по настоящему изобретению могут включать способ получения, основанный на введении в иммунокомпетентную клетку нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу клеточной поверхности, нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, и нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, предпочтительно они могут включать в себя способ получения, основанный на введении в иммунокомпетентную клетку вектора экспрессии по настоящему изобретению, упоминающийся далее как способ, описанный, например, в патентном документе 1 или 2. Альтернативные примеры могут включать способ выделения и получения иммунокомпетентной клетки из трансгенного млекопитающего, полученного путем имплантации вектора, обеспечивающего экспрессию молекулы клеточной поверхности, специфически распознающей человеческий мезотелин, IL-7 и/или CCL19, в оплодотворенную яйцеклетку, и способ получения, дополнительно включающий введение, если это необходимо, вектора, обеспечивающего экспрессию молекулы клеточной поверхности, специфически распознающей человеческий мезотелин, IL-7 и/или CCL19, в иммунокомпетентную клетку, выделенную и полученную из трансгенного млекопитающего.Examples of the production method of an immunocompetent cell of the present invention may include a production method based on introducing into an immunocompetent cell a nucleic acid encoding a cell surface molecule, a nucleic acid encoding an IL-7, and a nucleic acid encoding a CCL19, preferably they may include a production method , based on the introduction into an immunocompetent cell of the expression vector of the present invention, hereinafter referred to as the method described, for example, in patent document 1 or 2. Alternative examples may include a method for isolating and obtaining an immunocompetent cell from a transgenic mammal obtained by implanting an expression vector a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, IL-7 and/or CCL19, into a fertilized ovum, and a method of preparation, further comprising introducing, if necessary, a vector allowing the expression of a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, IL-7 and /or CCL19, into an immunocompetent cell isolated and obtained from a transgenic mammal.

В случае введения нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу клеточной поверхности, нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, и нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, или вектора по настоящему изобретению, упомянутого ниже, в иммунокомпетентную клетку, способ введения нуклеиновых кислот или вектора может представлять собой любой способ введения нуклеиновых кислот или вектора в иммунокомпетентную клетку. Его примеры могут включать в себя такой способ, как электропорация (Cytotechnology, 3, 133 (1990)), кальций-фосфатный метод (публикация не прошедшей экспертизу патентной заявки Японии № 2-227075), липофекция (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)), и инфицирование вирусом. Примеры инфицирования вирусом могут включать трансфекцию пакующей клетки, такой как клетка GP2-293 (произведенная Takara Bio Inc.), клетка Plat-GP (произведенная Cosmo Bio Co., Ltd.), клетка PG13 (ATCC CRL-10686) или клетка PA317 (ATCC CRL-9078), вектором, подлежащим введению, и пакующей плазмидой с получением рекомбинантного вируса, и инфицирование иммунокомпетентной клетки рекомбинантным вирусом (патентный документ 2).In the case of introducing a nucleic acid encoding a cell surface molecule, a nucleic acid encoding IL-7, and a nucleic acid encoding CCL19 or the vector of the present invention mentioned below into an immunocompetent cell, the method for introducing the nucleic acids or the vector may be any method introducing nucleic acids or a vector into an immunocompetent cell. Examples thereof may include a method such as electroporation (Cytotechnology, 3, 133 (1990)), calcium phosphate method (Japan Unexamined Patent Application Publication No. 2-227075), lipofection (Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 84, 7413 (1987)), and virus infection. Examples of virus infection may include transfection of a packaging cell such as a GP2-293 cell (manufactured by Takara Bio Inc.), a Plat-GP cell (manufactured by Cosmo Bio Co., Ltd.), a PG13 cell (ATCC CRL-10686), or a PA317 cell ( ATCC CRL-9078), a vector to be introduced, and a packaging plasmid to obtain a recombinant virus, and infecting an immunocompetent cell with the recombinant virus (patent document 2).

В случае получения иммунокомпетентной клетки, которая экспрессирует молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, IL-7 и CCL19 с использованием вектора, иммунокомпетентную клетку можно получить с помощью любого из следующих способов:In the case of obtaining an immunocompetent cell that expresses a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, IL-7 and CCL19 using a vector, an immunocompetent cell can be obtained using any of the following methods:

(1) способ введения вектора, обеспечивающего экспрессию молекулы клеточной поверхности, специфически распознающей человеческий мезотелин, IL-7 и CCL19, который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7 и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, в иммунокомпетентную клетку;(1) a method for introducing a vector for expressing a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, IL-7 and CCL19, which contains a nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, a nucleic acid encoding IL-7 and a nucleic acid, encoding CCL19, into an immunocompetent cell;

(2) способ введения одновременно или последовательно двух типов векторов, т.е. вектора, обеспечивающего экспрессию молекулы клеточной поверхности, специфически распознающей человеческий мезотелин, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, и вектора, обеспечивающего экспрессию IL-7 и CCL19, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7 и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, в иммунокомпетентную клетку;(2) a method of introducing two types of vectors simultaneously or sequentially, i.e. a vector providing the expression of a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, containing a nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, and a vector providing the expression of IL-7 and CCL19, containing a nucleic acid encoding IL-7 and a nucleic acid, encoding CCL19, into an immunocompetent cell;

(3) способ введения одновременно или последовательно двух типов векторов, т.е. вектора, обеспечивающего экспрессию молекулы клеточной поверхности, специфически распознающей человеческий мезотелин и IL-7, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, и нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и вектора, обеспечивающего экспрессию CCL19, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, в иммунокомпетентную клетку;(3) a method of introducing two types of vectors simultaneously or sequentially, i.e. a vector for expressing a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin and IL-7, containing a nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin and a nucleic acid encoding IL-7, and a vector for expressing CCL19 containing the nucleic acid encoding CCL19 into an immunocompetent cell;

(4) способ введения одновременно или последовательно двух типов векторов, т.е. вектора, обеспе-(4) a method of introducing two types of vectors simultaneously or sequentially, i.e. vector, provide

- 12 042661 чивающего экспрессию молекулы клеточной поверхности, специфически распознающей человеческий мезотелин и CCL19, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, и нуклеиновую кислоту, кодирующую- 12 042661 which enhances the expression of a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin and CCL19, containing a nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, and a nucleic acid encoding

CCL19, и вектора, обеспечивающего экспрессию IL-7, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующуюCCL19 and an IL-7 expression vector containing a nucleic acid encoding

IL-7, в иммунокомпетентную клетку;IL-7, into an immunocompetent cell;

(5) способ введения одновременно или последовательно двух типов векторов, т.е. вектора, обеспечивающего экспрессию молекулы клеточной поверхности, специфически распознающей человеческий мезотелин и IL-7, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, и нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и вектора, обеспечивающего экспрессию молекулы клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин и CCL19, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, в иммунокомпетентную клетку;(5) a method of introducing two types of vectors simultaneously or sequentially, i.e. a vector for expressing a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin and IL-7, containing a nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin and a nucleic acid encoding IL-7, and a vector for expressing a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin and CCL19 containing a nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin and a nucleic acid encoding CCL19 into an immunocompetent cell;

(6) способ введения одновременно или последовательно двух типов векторов, т.е. вектора, обеспечивающего экспрессию молекулы клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин и IL-7, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, и нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и вектора, обеспечивающего экспрессию IL-7 и CCL19, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, в иммунокомпетентную клетку;(6) a method of introducing two types of vectors simultaneously or sequentially, i.e. a vector for expressing a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin and IL-7, containing a nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin and a nucleic acid encoding IL-7, and a vector for expressing IL-7 and CCL19 containing a nucleic acid encoding IL-7 and a nucleic acid encoding CCL19 into an immunocompetent cell;

(7) способ введения одновременно или последовательно двух типов векторов, т.е. вектора, обеспечивающего экспрессию молекулы клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин и CCL19, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и вектора, обеспечивающего экспрессию IL-7 и CCL19, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, в иммунокомпетентную клетку; и (8) способ введения одновременно или последовательно трех типов векторов, т.е. вектора, обеспечивающего экспрессию молекулы клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, вектора, обеспечивающего экспрессию IL-7, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и вектора, обеспечивающего экспрессию CCL19, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, в иммунокомпетентную клетку.(7) a method of introducing two types of vectors simultaneously or sequentially, i.e. a vector for expressing a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin and CCL19, containing a nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, and a nucleic acid encoding CCL19, and a vector for expressing IL-7 and CCL19, containing the nucleic acid , encoding IL-7, and a nucleic acid encoding CCL19, in an immunocompetent cell; and (8) a method of introducing the three types of vectors simultaneously or sequentially, i.e. a vector providing the expression of a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, containing a nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, a vector providing the expression of IL-7 containing a nucleic acid encoding IL-7, and a vector providing the expression of CCL19 containing a nucleic acid encoding CCL19 into an immunocompetent cell.

В случае получения иммунокомпетентной клетки, которая экспрессирует молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, IL-7 и CCL19, с использованием вектора иммунокомпетентную клетку, которая экспрессирует молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, получают заблаговременно, причем иммунокомпетентную клетку можно получить с помощью одного из нижеследующих способов с использованием указанной иммунокомпетентной клетки, которая экспрессирует молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин:In the case of obtaining an immunocompetent cell that expresses a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, IL-7 and CCL19 using a vector, an immunocompetent cell that expresses a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin is obtained in advance, and the immunocompetent cell can be obtained using one of the following methods using said immunocompetent cell that expresses a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin:

(1) способ введения вектора, обеспечивающего экспрессию IL-7 и CCL19, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, в иммунокомпетентную клетку, которая экспрессирует молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин; и (2) способ введения, одновременно или последовательно, двух типов векторов, т.е. вектора, обеспечивающего экспрессию IL-7, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и вектора, обеспечивающего экспрессию CCL19, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, в иммунокомпетентную клетку, которая экспрессирует молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин.(1) a method of introducing an IL-7 and CCL19 expression vector comprising a nucleic acid encoding IL-7 and a nucleic acid encoding CCL19 into an immunocompetent cell that expresses a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin; and (2) a method of introducing, simultaneously or sequentially, the two types of vectors, i.e. a vector for expressing IL-7 containing a nucleic acid encoding IL-7; and a vector for expressing CCL19 containing a nucleic acid encoding CCL19 in an immunocompetent cell that expresses a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin.

В случае применения каждой из описанных выше иммунокомпетентных клеток можно использовать культуры иммунокомпетентных клеток, содержащие иммунокомпетентную клетку. В целях применения нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, можно интегрировать в геном иммунокомпетентной клетки, или не интегрировать в геном (например, они могут находиться в эписомах). В случае применения каждой из описанных выше иммунокомпетентных клеток можно использовать смесь иммунокомпетентной клетки, в которой нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, интегрируют в геном иммунокомпетентной клетки, и иммунокомпетентной клетки, в которой нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, не интегрируют в геном.In the case of using each of the immunocompetent cells described above, cultures of immunocompetent cells containing the immunocompetent cell can be used. For use, a nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, a nucleic acid encoding IL-7, and a nucleic acid encoding CCL19 may or may not be integrated into the genome of an immunocompetent cell (for example, they may be located in episomes). In the case of using each of the immunocompetent cells described above, an immunocompetent cell mixture can be used in which a nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, a nucleic acid encoding IL-7, and a nucleic acid encoding CCL19 are integrated into the genome of the immunocompetent cell. , and an immunocompetent cell, in which a nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, a nucleic acid encoding IL-7, and a nucleic acid encoding CCL19 are not integrated into the genome.

Иммунокомпетентную клетку, которая экспрессирует молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, IL-7 и CCL19, как описано выше, можно получить путемAn immunocompetent cell that expresses a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, IL-7 and CCL19 as described above can be obtained by

- 13 042661 интеграции нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, и нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, в геном клетки, так чтобы они экспрессировались под контролем подходящего промотора с помощью публично известного метода редактирования генома. Примеры публично известного метода редактирования генома включают метод с использованием эндонуклеазы, такой как нуклеаза с цинковыми пальцами, TALEN (эффекторная нуклеаза, подобная активаторам транскрипции), системы CRISPR (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные груnпами)-Cas. Чтобы иммунокомпетентная клетка, которая экспрессирует, например, CAR, специфически распознающий человеческий мезотелин (CAR против человеческого мезотелина), экспрессировала другой экзогенный белок, полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую другой экзогенный белок, можно подобным образом интегрировать в геном клетки, чтобы он экспрессировался под контролем подходящего промотора, с помощью метода редактирования генома. Конкретные примеры такого метода включают в себя интеграцию полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую CAR против человеческого мезотелина (или другой белок), функционально связанный с подходящим промотором, в некодирующий участок или т.п. клеточного генома; и интеграцию полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую CAR против человеческого мезотелина (или другой белок), ниже эндогенного промотора клеточного генома.- 13 042661 integrating a nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, a nucleic acid encoding IL-7, and a nucleic acid encoding CCL19 into the cell genome so that they are expressed under the control of a suitable promoter using a publicly known editing method genome. Examples of the publicly known genome editing method include that using an endonuclease such as zinc finger nuclease, TALEN (effector nuclease like transcription activators), CRISPR (regularly arranged short palindromic repeats)-Cas systems. In order for an immunocompetent cell that expresses, for example, a CAR specifically recognizing human mesothelin (CAR against human mesothelin) to express another exogenous protein, a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a different exogenous protein can be similarly integrated into the cell's genome so that it is expressed under control of a suitable promoter, using a genome editing method. Specific examples of such a method include integrating a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding an anti-human mesothelin CAR (or other protein) operably linked to a suitable promoter into a non-coding region or the like. cell genome; and integrating a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding an anti-human mesothelin CAR (or other protein) downstream of an endogenous promoter of the cellular genome.

Примеры эндогенного промотора включают промоторы TCRa и TCRe.Examples of an endogenous promoter include the TCRa and TCRe promoters.

Субъект, подлежащий введению.The subject to be injected.

Предпочтительные примеры субъекта, подлежащего введению, могут включать млекопитающее и клетку млекопитающего. Более предпочтительные примеры указанного млекопитающего могут включать человека, мышь, собаку, крысу, морскую свинку, кролика, птицу, овцу, свинью, представителя крупного рогатого скота, лошадь, кошку, мартышку и шимпанзе, особенно предпочтительно человека.Preferred examples of a subject to be administered may include a mammal and a mammalian cell. More preferred examples of said mammal may include human, mouse, dog, rat, guinea pig, rabbit, bird, sheep, pig, bovine, horse, cat, marmoset and chimpanzee, particularly preferably human.

Вектор экспрессии.Expression vector.

Вектор экспрессии по настоящему изобретению может представлять собой любой вектор или его предшественник, который можно вводить в иммунокомпетентную клетку, так чтобы конкретный, кодируемый им белок (полипептид) мог экспрессироваться в иммунокомпетентной клетке, с получением иммунокомпетентной клетки по настоящему изобретению. Вектор экспрессии по настоящему изобретению конкретно не ограничивается вариантом осуществления. Специалисты в данной области могут сконструировать и получить вектор экспрессии, который обеспечивает экспрессию целевого белка (полипептида) в иммунокомпетентных клетках. Примеры вектора экспрессии по настоящему изобретению, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, могут включать приведенные ниже векторы экспрессии (а)-(е), обеспечивающие получение иммунокомпетентной клетки по настоящему изобретению (далее также называемые векторы против человеческого мезотелина, экспрессирующие IL-7/CCL19). Термин два вектора экспрессии, описанный ниже, относится к набору, содержащему векторы экспрессии двух типов, а термин три вектора экспрессии относится к набору, содержащему векторы экспрессии трех типов.The expression vector of the present invention may be any vector or precursor thereof that can be introduced into an immunocompetent cell so that the specific protein (polypeptide) encoded by it can be expressed in the immunocompetent cell to produce an immunocompetent cell of the present invention. The expression vector of the present invention is not specifically limited to the embodiment. Those skilled in the art can design and produce an expression vector that allows expression of the target protein (polypeptide) in immunocompetent cells. Examples of an expression vector of the present invention containing a nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, a nucleic acid encoding IL-7, and a nucleic acid encoding CCL19 may include the following expression vectors (a) to (e), producing an immunocompetent cell of the present invention (hereinafter also referred to as anti-human mesothelin vectors expressing IL-7/CCL19). The term two expression vectors, described below, refers to a set containing two types of expression vectors, and the term three expression vectors refers to a set containing three types of expression vectors.

(a) Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19;(a) An expression vector containing a nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, a nucleic acid encoding IL-7, and a nucleic acid encoding CCL19;

(b) два нижеследующих вектора экспрессии (b-1) и (b-2):(b) the following two expression vectors (b-1) and (b-2):

(b-1) вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин; и (b-2) вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19;(b-1) an expression vector containing a nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin; and (b-2) an expression vector containing a nucleic acid encoding IL-7 and a nucleic acid encoding CCL19;

(c) два нижеследующих вектора экспрессии (с-1) и (с-2):(c) the following two expression vectors (c-1) and (c-2):

(с-1) вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, и нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7; и (с-2) вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19;(c-1) an expression vector containing a nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin and a nucleic acid encoding IL-7; and (c-2) an expression vector containing a nucleic acid encoding CCL19;

(d) два нижеследующих вектора экспрессии (d-1) и (d-2):(d) the following two expression vectors (d-1) and (d-2):

(d-1) вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7; и (d-2) вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19;(d-1) an expression vector containing a nucleic acid encoding IL-7; and (d-2) an expression vector containing a nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin and a nucleic acid encoding CCL19;

(e) два нижеследующих вектора экспрессии (е-1) и (е-2):(e) the following two expression vectors (e-1) and (e-2):

(е-1) вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, и нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7; и (е-2) вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной по-(e-1) an expression vector containing a nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin and a nucleic acid encoding IL-7; and (e-2) an expression vector containing a nucleic acid encoding a cell membrane molecule.

- 14 042661 верхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19;- 14 042661 a surface specifically recognizing human mesothelin and a nucleic acid encoding CCL19;

(f) два нижеследующих вектора экспрессии (f-1) и (f-2):(f) the following two expression vectors (f-1) and (f-2):

(f-1) вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, и нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7; и (f-2) вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19;(f-1) an expression vector containing a nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin and a nucleic acid encoding IL-7; and (f-2) an expression vector containing a nucleic acid encoding IL-7 and a nucleic acid encoding CCL19;

(g) два нижеследующих вектора экспрессии (g-1) и (g-2):(g) the following two expression vectors (g-1) and (g-2):

(g-1) вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19; и (g-2) вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19; и (h) три нижеследующих вектора экспрессии (h-1), (h-2) и (h-3):(g-1) an expression vector containing a nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin and a nucleic acid encoding CCL19; and (g-2) an expression vector containing a nucleic acid encoding IL-7 and a nucleic acid encoding CCL19; and (h) the following three expression vectors (h-1), (h-2) and (h-3):

(h-1) вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин;(h-1) an expression vector containing a nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin;

(h-2) вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7; и (h-3) вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19.(h-2) an expression vector containing a nucleic acid encoding IL-7; and (h-3) an expression vector containing a nucleic acid encoding CCL19.

Вектор против человеческого мезотелина, экспрессирующий IL-7/CCL19, может дополнительно содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую другой фактор, контролирующий иммунную функцию, такой как IL-15, CCL21, IL-2, IL-4, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IP-10, интерферон-γ, MIP-1альфа, GM-CSF, M-CSF, TGF-β, TNF-α или антитело, ингибирующее контрольные точки, или его фрагмент. Нуклеиновая кислота, кодирующая другой фактор, контролирующий иммунную функцию, предпочтительно представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую фактор, контролирующий иммунную функцию, отличный от IL-12.An anti-human mesothelin vector expressing IL-7/CCL19 may further comprise a nucleic acid encoding another factor that controls immune function such as IL-15, CCL21, IL-2, IL-4, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IP-10, interferon-γ, MIP-1alpha, GM-CSF, M-CSF, TGF-β, TNF-α or checkpoint inhibitory antibody or fragment thereof. The nucleic acid encoding another immune function controlling factor is preferably a nucleic acid encoding an immune function controlling factor other than IL-12.

Нуклеиновая кислота.Nucleic acid.

В настоящем описании нуклеиновая кислота может представлять собой любую молекулу из полимеризованных нуклеотидов и/или молекул, обладающих функциями, эквивалентными функциям нуклеотидов. Их примеры могут включать РНК, которая представляет собой полимер рибонуклеотидов, ДНК, которая представляет собой полимер дезоксирибонуклеотидов, смешанный полимер рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов, и нуклеотидный полимер, содержащий аналог нуклеотида. Альтернативно можно использовать нуклеотидный полимер, содержащий производное нуклеиновой кислоты. Нуклеиновая кислота может представлять собой одноцепочечную нуклеиновую кислоту или двухцепочечную нуклеиновую кислоту. Двухцепочечная нуклеиновая кислота также включает в себя двухцепочечную нуклеиновую кислоту, в которой одна из цепей гибридизуется в жестких условиях с другой цепью.As used herein, a nucleic acid may be any molecule of polymerized nucleotides and/or molecules having functions equivalent to those of nucleotides. Examples thereof may include RNA, which is a polymer of ribonucleotides, DNA, which is a polymer of deoxyribonucleotides, a mixed polymer of ribonucleotides and deoxyribonucleotides, and a nucleotide polymer containing a nucleotide analog. Alternatively, a nucleotide polymer containing a nucleic acid derivative can be used. The nucleic acid may be a single stranded nucleic acid or a double stranded nucleic acid. A double-stranded nucleic acid also includes a double-stranded nucleic acid in which one of the strands hybridizes under stringent conditions with the other strand.

Аналог нуклеотида может представлять собой любую молекулу при условии, что молекула представляет собой рибонуклеотид, дезоксирибонуклеотид, РНК или ДНК, модифицированные так, чтобы повысить или стабилизировать устойчивость к нуклеазе, повысить сродство к комплементарной цепи нуклеиновой кислоты, повысить способность к проникновению в клетки или чтобы визуализировать молекулу по сравнению с РНК или ДНК. Аналог нуклеотида может представлять собой природную молекулу или неприродную молекулу. Его примеры включают аналог нуклеотида с модифицированным сахарным фрагментом и аналог нуклеотида с модифицированной фосфодиэфирной связью.The nucleotide analog may be any molecule, provided that the molecule is a ribonucleotide, deoxyribonucleotide, RNA, or DNA modified to increase or stabilize nuclease resistance, increase affinity for the complementary nucleic acid strand, increase cellular entry, or to visualize molecule compared to RNA or DNA. The nucleotide analog may be a natural molecule or a non-natural molecule. Examples thereof include a nucleotide analog with a modified sugar moiety and a nucleotide analog with a modified phosphodiester bond.

Аналог нуклеотида с модифицированным сахарным фрагментом может представлять собой любую молекулу, полученную путем добавления вещества с произвольной химической структурой к химической структуре сахара или замены этим веществом фрагмента или всей структуры сахара, входящего в состав нуклеотида. Его конкретные примеры включают аналог нуклеотида, замещенного 2'-Oметилрибозой, аналог нуклеотида, замещенного 2'-О-пропилрибозой, аналог нуклеотида, замещенного 2'-метоксиэтоксирибозой, аналог нуклеотида, замещенного 2'-О-метоксиэтилрибозой, аналог нуклеотида, замещенного 2'-О-[2-(гуанидин)этил]рибозой, аналог нуклеотида, замещенного 2'-фторрибозой, мостиковую нуклеиновую кислоту (BNA), содержащую две циклические структуры в результате введения мостиковой структуры в сахарный фрагмент, более конкретно закрытую нуклеиновую кислоту (LNA), содержащую атом кислорода в положении 2' и атом углерода в положении 4', соединенные метиленом, и содержащую этиленовый мостик нуклеиновую кислоту (ENA) [Nucleic Acid Research, 32, е175 (2004)], и может дополнительно включать пептидно-нуклеиновую кислоту (PNA) [Acc. Chem. Res., 32, 624 (1999)], оксипептидно-нуклеиновую кислоту (OPNA) [J. Am. Chem. Soc., 123, 4653 (2001)], и пептиднорибонуклеиновую кислоту (PRNA) [J. Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)].A nucleotide analogue with a modified sugar moiety can be any molecule obtained by adding a substance with an arbitrary chemical structure to the chemical structure of sugar or replacing with this substance a fragment or all of the sugar structure that is part of the nucleotide. Specific examples thereof include a nucleotide analog substituted with 2'-O-methylribose, a nucleotide analog substituted with 2'-O-propylribose, a nucleotide analog substituted with 2'-methoxyethoxyribose, a nucleotide analog substituted with 2'-O-methoxyethylribose, a nucleotide analog substituted with 2' -O-[2-(guanidine)ethyl]ribose, a nucleotide analog substituted with 2'-fluororibose, a bridging nucleic acid (BNA) containing two cyclic structures as a result of the introduction of a bridging structure into a sugar moiety, more specifically a closed nucleic acid (LNA) , containing an oxygen atom at position 2' and a carbon atom at position 4', connected by methylene, and containing an ethylene bridge nucleic acid (ENA) [Nucleic Acid Research, 32, e175 (2004)], and may further include a peptide nucleic acid ( PNA) [Acc. Chem. Res., 32, 624 (1999)], oxypeptide nucleic acid (OPNA) [J. Am. Chem. Soc., 123, 4653 (2001)], and peptide ribonucleic acid (PRNA) [J. Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)].

Аналог нуклеотида с модифицированной фосфодиэфирной связью может представлять собой любую молекулу, полученную в результате добавления вещества с произвольной химической структурой к химической структуре фосфодиэфирной связи или замены этим веществом фрагмента или всей структу- 15 042661 ры фосфодиэфирной связи, входящей в состав нуклеотида. Его конкретные примеры могут включать аналог нуклеотида, замещенный фосфоротиоатной связью, и аналог нуклеотида, замещенный N3'-P5'фосфорамидатной связью [Cell Engineering, 16, 1463-1473 (1997)] [RNAi Method and Antisense Method,A nucleotide analog with a modified phosphodiester bond can be any molecule obtained by adding a substance with an arbitrary chemical structure to the chemical structure of a phosphodiester bond or replacing with this substance a fragment or the entire structure of a phosphodiester bond that is part of the nucleotide. Specific examples thereof may include a nucleotide analog substituted with a phosphorothioate bond and a nucleotide analog substituted with an N3'-P5' phosphoramidate bond [Cell Engineering, 16, 1463-1473 (1997)] [RNAi Method and Antisense Method,

Kodansha Ltd. (2005)].Kodansha Ltd. (2005)].

Производное нуклеиновой кислоты может представлять собой любую молекулу при условии, что молекула представляет собой нуклеиновую кислоту, содержащую другое химическое вещество, добавленное к ней для того, чтобы повысить или стабилизировать устойчивость к нуклеазе, повысить сродство к комплементарной цепи нуклеиновой кислоты, повысить способность к проникновению в клетки или чтобы визуализировать молекулу по сравнению с нуклеиновой кислотой. Его конкретные примеры могут включать производное, полученное путем добавления 5'-полиамина, производное, полученное путем добавления холестерина, производное, полученное путем добавления стероида, производное, полученное путем добавления желчной кислоты, производное, полученное путем добавления витамина, производное, полученное путем добавления Cy5, производное, полученное путем добавления Cy3, производное, полученное путем добавления 6-FAM, и производное, полученное путем добавления биотина.The nucleic acid derivative may be any molecule, as long as the molecule is a nucleic acid containing another chemical added to it in order to increase or stabilize nuclease resistance, increase affinity for the complementary nucleic acid strand, increase the ability to penetrate into cells or to visualize a molecule versus a nucleic acid. Specific examples thereof may include a derivative obtained by adding 5'-polyamine, a derivative obtained by adding cholesterol, a derivative obtained by adding steroid, a derivative obtained by adding bile acid, a derivative obtained by adding vitamin, a derivative obtained by adding Cy5 , a derivative obtained by adding Cy3, a derivative obtained by adding 6-FAM, and a derivative obtained by adding biotin.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, IL-7, CCL19 и др.Nucleic acids encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, IL-7, CCL19, etc.

Примеры нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, и нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, могут включать соответствующие нуклеиновые кислоты, полученные из млекопитающего, и могут предпочтительно включать соответствующие нуклеиновые кислоты, полученные из организма человека. Каждая из нуклеиновых кислот может быть соответственно выбрана в зависимости от типа клетки, в которую вводят вектор экспрессии по настоящему изобретению. Информацию о последовательности каждой из нуклеиновых кислот можно соответственно получить путем поиска в публично известном документе или публично известной базе данных, такой как NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/).Examples of a nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, a nucleic acid encoding IL-7, and a nucleic acid encoding CCL19 may include corresponding nucleic acids derived from a mammal, and may preferably include corresponding nucleic acids derived from an organism person. Each of the nucleic acids can be appropriately selected depending on the type of cell into which the expression vector of the present invention is introduced. Sequence information for each of the nucleic acids can suitably be obtained by searching a publicly known document or a publicly known database such as NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/).

Примеры нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, могут включать нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, специфически распознающий человеческий мезотелин.Examples of a nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin may include a nucleic acid encoding a CAR specifically recognizing human mesothelin.

Конкретные примеры нуклеиновой кислоты, кодирующей одноцепочечное антитело, содержащееся в CAR, специфически распознающем человеческий мезотелин, могут включать нижеследующие нуклеиновые кислоты (1-1D)-(3-1D):Specific examples of a nucleic acid encoding a single chain antibody contained in a CAR specifically recognizing human mesothelin may include the following nucleic acids (1-1D)-(3-1D):

(1-1D) нуклеиновую кислоту, кодирующую одноцепочечное антитело, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит CDR1 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 13, CDR2 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 14, и CDR3 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 15, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит CDR1 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 16, CDR2 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 17, и CDR3 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 18;(1-1D) a nucleic acid encoding a single chain antibody comprising a heavy chain variable region, which contains a heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 13, a heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 14, and a heavy chain CDR3, consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 15, and a light chain variable region, which contains a light chain CDR1, consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 16, light chain CDR2 , consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 17, and a light chain CDR3, consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 18;

(2-1D) нуклеиновую кислоту, кодирующую одноцепочечное антитело, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит CDR1 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 13, CDR2 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 14, и CDR3 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 15, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит CDR1 легкой цепи состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 19, CDR2 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 17, и CDR3 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 18; и (3-1D) нуклеиновую кислоту, кодирующую одноцепочечное антитело, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит CDR1 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 20, CDR2 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 21, и CDR3 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 22, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит CDR1 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 23, CDR2 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 24, и CDR3 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 25.(2-1D) a nucleic acid encoding a single chain antibody containing a heavy chain variable region, which contains a heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 13, a heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 14, and a heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 15, and a light chain variable region that contains a light chain CDR1 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 19, light chain CDR2, consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 17 and a light chain CDR3 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 18; and (3-1D) a nucleic acid encoding a single chain antibody comprising a heavy chain variable region, which contains a heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 20, a heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 21, and a heavy chain CDR3, consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 22, and a light chain variable region, which contains a light chain CDR1, consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 23, light chain CDR2 a chain consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 24 and a light chain CDR3 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 25.

Конкретные примеры дополнительной формы 1 нуклеиновой кислоты, кодирующей одноцепочечное антитело, содержащееся в CAR, специфически распознающем человеческий мезотелин, могут включать нижеследующие нуклеиновые кислоты (1-2D)-(5-2D):Specific examples of an additional Form 1 nucleic acid encoding a single chain antibody contained in a CAR specifically recognizing human mesothelin may include the following nucleic acids (1-2D)-(5-2D):

(1-2D) нуклеиновую кислоту, кодирующую одноцепочечное антитело, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентичной аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1, и вариабельный участок легкой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, на 85%(1-2D) a nucleic acid encoding a single chain antibody comprising a heavy chain variable region which consists of an amino acid sequence of 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% % or more identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, and the variable region of the light chain, which consists of the amino acid sequence, by 85%

- 16 042661 или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентичной аминокислотной последовательности, описанной в- 16 042661 or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more identical to the amino acid sequence described in

SEQ ID NO: 2;SEQ ID NO: 2;

(2-2D) нуклеиновую кислоту, кодирующую одноцепочечное антитело, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентичной аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 3, и вариабельный участок легкой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентичной аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 4;(2-2D) a nucleic acid encoding a single chain antibody comprising a heavy chain variable region that consists of an amino acid sequence of 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% % or more identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3, and a light chain variable region that consists of an amino acid sequence of 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4;

(3-2D) нуклеиновую кислоту, кодирующую одноцепочечное антитело, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентичной аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 5, и вариабельный участок легкой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентичной аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 6;(3-2D) a nucleic acid encoding a single chain antibody comprising a heavy chain variable region that consists of an amino acid sequence of 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% % or more identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 5, and a light chain variable region that consists of an amino acid sequence of 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6;

(4-2D) нуклеиновую кислоту, кодирующую одноцепочечное антитело, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентичной аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1, и вариабельный участок легкой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентичной аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 4; и (5-2D) нуклеиновую кислоту, кодирующую одноцепочечное антитело, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентичной аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 3, и вариабельный участок легкой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентичной аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 2.(4-2D) a nucleic acid encoding a single chain antibody comprising a heavy chain variable region that consists of an amino acid sequence of 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% % or more identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, and a light chain variable region that consists of an amino acid sequence of 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4; and (5-2D) a nucleic acid encoding a single chain antibody comprising a heavy chain variable region that consists of an amino acid sequence of 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 95% or more. 98% or more identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3, and a light chain variable region that consists of an amino acid sequence of 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2.

Конкретные примеры дополнительной формы 2 нуклеиновой кислоты, кодирующей одноцепочечное антитело, входящее в состав CAR, специфически распознающего человеческий мезотелин, могут включать нижеследующие нуклеиновые кислоты (1-3D)-(5-3D):Specific examples of an additional form 2 nucleic acid encoding a single chain antibody that is part of a CAR specifically recognizing human mesothelin may include the following nucleic acids (1-3D)-(5-3D):

(1-3D) нуклеиновую кислоту, кодирующую одноцепочечное антитело, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1, и вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 2;(1-3D) a nucleic acid encoding a single chain antibody comprising a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2;

(2-3D) нуклеиновую кислоту, кодирующую одноцепочечное антитело, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 3, и вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 4;(2-3D) a nucleic acid encoding a single chain antibody comprising a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4;

(3-3D) нуклеиновую кислоту, кодирующую одноцепочечное антитело, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 5, и вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 6;(3-3D) a nucleic acid encoding a single chain antibody comprising a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 5 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6;

(4-3D) нуклеиновую кислоту, кодирующую одноцепочечное антитело, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1, и вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 4; и (5-3D) нуклеиновую кислоту, кодирующую одноцепочечное антитело, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 3, и вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 2.(4-3D) a nucleic acid encoding a single chain antibody comprising a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4; and (5-3D) a nucleic acid encoding a single chain antibody comprising a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 .

Конкретные примеры дополнительной формы 3 нуклеиновой кислоты, кодирующей одноцепочечное антитело, входящее в состав CAR, специфически распознающего человеческий мезотелин, могут включать нижеследующие нуклеиновые кислоты (1-4D)-(9-4D):Specific examples of an additional form 3 nucleic acid encoding a single chain antibody that is part of a CAR specifically recognizing human mesothelin may include the following nucleic acids (1-4D)-(9-4D):

(1-4D) нуклеиновую кислоту, кодирующую одноцепочечное антитело, последовательно содержа-(1-4D) nucleic acid encoding a single-stranded antibody, sequentially containing

- 17 042661 щее вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1, пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в- 17 042661 containing a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, a peptide linker consisting of the amino acid sequence described in

SEQ ID NO: 26, и вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 2;SEQ ID NO: 26, and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2;

(2-4D) нуклеиновую кислоту, кодирующую одноцепочечное антитело, последовательно содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 3, пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 26, и вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 4;(2-4D) a nucleic acid encoding a single chain antibody sequentially comprising a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3, a peptide linker consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 26, and the variable a light chain region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4;

(3-4D) нуклеиновую кислоту, кодирующую одноцепочечное антитело, последовательно содержащее вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 2, пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 26, и вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1;(3-4D) a nucleic acid encoding a single chain antibody sequentially comprising a light chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, a peptide linker consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 26, and the variable the plot of the heavy chain, consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1;

(4-4D) нуклеиновую кислоту, кодирующую одноцепочечное антитело, последовательно содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1, пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 27, и вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 2;(4-4D) a nucleic acid encoding a single chain antibody sequentially comprising a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, a peptide linker consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 27, and the variable a light chain region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2;

(5-4D) нуклеиновую кислоту, кодирующую одноцепочечное антитело, последовательно содержащее вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 2, пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 27, и вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1;(5-4D) a nucleic acid encoding a single chain antibody sequentially comprising a light chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, a peptide linker consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 27, and the variable the plot of the heavy chain, consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1;

(6-4D) нуклеиновую кислоту, кодирующую одноцепочечное антитело, последовательно содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 5, пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 26, и вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 6;(6-4D) a nucleic acid encoding a single chain antibody sequentially comprising a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 5, a peptide linker consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 26, and a variable a light chain region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6;

(7-4D) нуклеиновую кислоту, кодирующую одноцепочечное антитело, последовательно содержащее вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 6, пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 26, и вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 5;(7-4D) a nucleic acid encoding a single chain antibody sequentially comprising a light chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6, a peptide linker consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 26, and a variable a heavy chain plot consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 5;

(8-4D) нуклеиновую кислоту, кодирующую одноцепочечное антитело, последовательно содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 5, пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 27, и вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 6; и (9-4D) нуклеиновую кислоту, кодирующую одноцепочечное антитело, последовательно содержащее вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 6, пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 27, и вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 5.(8-4D) a nucleic acid encoding a single chain antibody sequentially comprising a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 5, a peptide linker consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 27, and the variable a light chain region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6; and (9-4D) a nucleic acid encoding a single chain antibody sequentially comprising a light chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6, a peptide linker consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 27, and a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 5.

Примеры нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид трансмембранного участка, входящего в состав CAR, могут включать нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид трансмембранного участка человеческого CD8, который содержит аминокислотную последовательность, на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентичную аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 7. Примеры нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды внутриклеточных участков CD28, 4-1ВВ и CD3Z сигнального участка, активирующего иммунокомпетентную клетку, входящего в состав CAR, могут включать нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентичную аминокислотной последовательности внутриклеточного участка человеческого CD28, описанной в SEQ ID NO: 8, и обладает активностью, эквивалентной активности аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 8, нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентичную аминокислотной последовательности внутриклеточного участка человеческого 4-1ВВ, описанной в SEQ ID NO: 9, и обладает активностью, эквивалентной активности аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 9, и нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, на 85% или более, пред- 18 042661 почтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентичную аминокислотной последовательности внутриклеточного участка человеческого CD3Z, описанной в SEQ ID NO: 10, и обладает активностью, эквивалентной активности аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 10, а также их сочетание, предпочтительно нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид внутриклеточного участка человеческого CD28, описанный в SEQ ID NO: 8, нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид внутриклеточного участка человеческого 4-1ВВ, описанный в SEQ ID NO: 9, и нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид внутриклеточного участка человеческого CD3Z, описанный в SEQ ID NO: 10, в направлении от стороны, находящейся выше по ходу считывания (5'-концевой стороны).Examples of a nucleic acid encoding a transmembrane region polypeptide constituting a CAR may include a nucleic acid encoding a human CD8 transmembrane region polypeptide that contains an amino acid sequence of 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably, 98% or more identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 7. Examples of nucleic acids encoding polypeptides of intracellular regions CD28, 4-1BB and CD3Z of the signaling region that activates the immunocompetent cell, which is part of the CAR, can include a nucleic acid encoding a polypeptide that contains an amino acid sequence that is 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more identical to the amino acid sequence of the intracellular region of human CD28 described in SEQ ID NO: 8, and has an activity equivalent to that of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 8, a nucleic acid encoding a polypeptide that contains an amino acid sequence of 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more identical to the amino acid sequence of the intracellular region of human 4-1BB described in SEQ ID NO: 9, and has an activity equivalent to that of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 9, and a nucleic acid encoding a polypeptide that contains an amino acid sequence that is 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more identical to the amino acid sequence of the intracellular region of the human CD3Z described in SEQ ID NO: 10 and has an activity equivalent to that of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 10, as well as a combination thereof, preferably a nucleic acid encoding a polypeptide of the human CD28 intracellular region described in SEQ ID NO: 8 , a nucleic acid encoding a human 4-1BB intracellular region polypeptide as described in SEQ ID NO: 9, and a nucleic acid encoding a human CD3Z intracellular region polypeptide as described in SEQ ID NO: 10, from the upstream side (5' end side).

Примеры нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, могут включать нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентичную аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 28, и обладает активностью, эквивалентной активности аминокислотной последовательности, описанной вExamples of a nucleic acid encoding IL-7 may include a nucleic acid encoding a polypeptide that contains an amino acid sequence of 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 28, and has an activity equivalent to that of the amino acid sequence described in

SEQ ID NO: 28, а именно нуклеиновую кислоту, состоящую из нуклеотидной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 30. Нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, может представлять собой нуклеиновую кислоту, на 80% или более, предпочтительно на 85% или более, более предпочтительно на 90% или более, еще более предпочтительно на 95% или более, наиболее предпочтительно на 98% или более идентичную нуклеиновой кислоте, состоящей из нуклеотидной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 30, при условии, что нуклеиновая кислота способна повышать скорость пролиферации или степень выживания клеток после воздействия IL-7. Примеры нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, могут включать нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 98% или более идентичную аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 29, и обладает активностью, эквивалентной активности аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 29, а именно нуклеиновую кислоту, состоящую из нуклеотидной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 31. Можно использовать нуклеиновую кислоту, на 80% или более, предпочтительно на 85% или более, более предпочтительно на 90% или более, еще более предпочтительно на 95% или более, наиболее предпочтительно на 98% или более идентичную нуклеиновой кислоте, состоящей из нуклеотидной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 31, при условии, что нуклеиновая кислота способна оказывать такое же действие на миграцию клеток, как и CCL19.SEQ ID NO: 28, namely, a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 30. The nucleic acid encoding IL-7 may be a nucleic acid, 80% or more, preferably 85% or more , more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, most preferably 98% or more identical to a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 30, provided that the nucleic acid is capable of increasing the rate of proliferation or degree of survival of cells after exposure to IL-7. Examples of a nucleic acid encoding CCL19 may include a nucleic acid encoding a polypeptide that contains an amino acid sequence that is 85% or more identical, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more identical. amino acid sequence described in SEQ ID NO: 29 and has an activity equivalent to that of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 29, namely, a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 31. A nucleic acid can be used , 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, most preferably 98% or more identical to a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 31, provided that the nucleic acid is able to have the same effect on cell migration as CCL19.

Суицидальный ген.suicidal gene.

Вектор экспрессии по настоящему изобретению может содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую суицидальный ген. Суицидальный ген представляет собой ген, который непосредственно или косвенно индуцирует вещество, которое обладает клеточной токсичностью и выполняет функцию уничтожения собственной клетки. Благодаря вектору экспрессии по настоящему изобретению, содержащему нуклеиновую кислоту, кодирующую суицидальный ген, например иммунокомпетентную клетку, присутствующую в живом организме, можно контролировать путем введения лекарственного средства, активирующего функцию суицидального гена после исчезновения опухоли, обусловленного курсом лечения рака. IL-7 или CCL19, в отличие от других цитокинов, с меньшей вероятностью вызывают такие побочные реакции, как синдром высвобождения цитокинов или канцерогенная трансформация трансфицированных клеток. Однако усиление функций иммунокомпетентных клеток, несущих вектор экспрессии по настоящему изобретению, может приводить к неожиданному влиянию на соседние ткани цитокинов и др., высвобождаемых после воздействия на целевую раковую ткань. В таком случае нуклеиновая кислота, кодирующая суицидальный ген, входящая в состав вектора экспрессии по настоящему изобретению, может надежно уменьшать риск синдрома высвобождения цитокинов.The expression vector of the present invention may contain a nucleic acid encoding a suicide gene. A suicide gene is a gene that directly or indirectly induces a substance that has cellular toxicity and has the function of killing one's own cell. With the expression vector of the present invention containing a nucleic acid encoding a suicide gene, for example, an immunocompetent cell present in a living body can be controlled by administration of a drug that activates the function of the suicide gene after tumor disappearance due to a course of cancer treatment. IL-7 or CCL19, unlike other cytokines, are less likely to cause side effects such as cytokine release syndrome or carcinogenic transformation of transfected cells. However, enhancing the functions of immunocompetent cells carrying the expression vector of the present invention may lead to an unexpected effect on neighboring tissues of cytokines and others released after exposure to the target cancer tissue. In such a case, the nucleic acid encoding the suicide gene contained in the expression vector of the present invention can reliably reduce the risk of cytokine release syndrome.

Примеры суицидального гена могут включать ген, кодирующий тимидинкиназу вируса простого герпеса (HSV-TK) или индуцируемую каспазу 9, описанный в приведенном ниже документе. Примеры лекарственного средства, активирующего функцию такого гена, могут включать ганцикловир для первого и АР1903, обеспечивающий химическую индукцию димеризации (CID) для последнего.Examples of a suicide gene may include the gene encoding herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK) or inducible caspase 9, described in the document below. Examples of a drug that activates the function of such a gene may include ganciclovir for the former and AP1903 providing chemical induction of dimerization (CID) for the latter.

Получение информации по нуклеотидной последовательности и нуклеиновой кислоты.Obtaining information on the nucleotide sequence and nucleic acid.

Каждая из нуклеиновых кислот, содержащихся в векторе экспрессии по настоящему изобретению, может представлять собой природную нуклеиновую кислоту или искусственно синтезированную нуклеиновую кислоту и может быть соответственно выбрана в зависимости от типа клетки, в которую вводят вектор экспрессии по настоящему изобретению. Информацию по последовательностям таких нуклеиновых кислот можно соответственно получить путем поиска в публично известном документе или публично известной базе данных, такой как NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/).Each of the nucleic acids contained in the expression vector of the present invention may be a natural nucleic acid or an artificially synthesized nucleic acid, and may be appropriately selected depending on the type of cell into which the expression vector of the present invention is introduced. Sequence information for such nucleic acids can suitably be obtained by searching a publicly known document or a publicly known database such as the NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/).

Каждую из нуклеиновых кислот можно получить путем публично известного метода, такого как метод химического синтеза или метод амплификации ПЦР, на основе информации по нуклеотидной последовательности каждой из нуклеиновых кислот. Кодоны, выбранные для кодирования аминокислот,Each of the nucleic acids can be obtained by a publicly known method such as a chemical synthesis method or a PCR amplification method based on the nucleotide sequence information of each of the nucleic acids. The codons chosen to code for the amino acids

- 19 042661 можно сконструировать, чтобы оптимизировать экспрессию нуклеиновой кислоты в представляющей интерес клетке-хозяине.- 19 042661 can be designed to optimize expression of the nucleic acid in the host cell of interest.

Расположение каждой нуклеиновой кислоты.The location of each nucleic acid.

Если вектор экспрессии по настоящему изобретению представляет собой вектор экспрессии, (а) содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, одна из нуклеиновых кислот может располагаться выше или ниже других нуклеиновых кислот. А именно, если вектор экспрессии содержит, например, нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR против человеческого мезотелина, в качестве нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, нуклеиновые кислоты могут располагаться в следующем порядке:If the expression vector of the present invention is an expression vector (a) containing a nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, a nucleic acid encoding IL-7, and a nucleic acid encoding CCL19, one of the nucleic acids may be located upstream or below other nucleic acids. Namely, if the expression vector contains, for example, a nucleic acid encoding an anti-human mesothelin CAR as a nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, the nucleic acids can be arranged in the following order:

нуклеиновая кислота, кодирующая CAR против человеческого мезотелина, нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, и нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19; или нуклеиновая кислота, кодирующая CAR против человеческого мезотелина, нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, и нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7; или нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, и нуклеиновая кислота, кодирующая CAR против человеческого мезотелина; или нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, нуклеиновая кислота, кодирующая CAR против мезотелина, и нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19; или нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, нуклеиновая кислота, кодирующая CAR против мезотелина, и нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7; или нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, и нуклеиновая кислота, кодирующая CAR против человеческого мезотелина, начиная от стороны, находящейся выше по ходу считывания (5'-концевой стороны).a nucleic acid encoding an anti-human mesothelin CAR, a nucleic acid encoding IL-7, and a nucleic acid encoding CCL19; or a nucleic acid encoding an anti-human mesothelin CAR, a nucleic acid encoding CCL19, and a nucleic acid encoding IL-7; or a nucleic acid encoding IL-7, a nucleic acid encoding CCL19, and a nucleic acid encoding anti-human mesothelin CAR; or a nucleic acid encoding IL-7, a nucleic acid encoding an anti-mesothelin CAR, and a nucleic acid encoding CCL19; or a nucleic acid encoding CCL19, a nucleic acid encoding an anti-mesothelin CAR, and a nucleic acid encoding IL-7; or a nucleic acid encoding CCL19, a nucleic acid encoding IL-7, and a nucleic acid encoding anti-human mesothelin CAR starting from the upstream side (5'end side).

В векторе экспрессии по настоящему изобретению (b-2), (f-2) или (g-2), содержащем нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, расположение нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, и нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, конкретно не ограничивается. Нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, может находиться выше или ниже нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7.In the expression vector of the present invention (b-2), (f-2) or (g-2) containing a nucleic acid encoding IL-7 and a nucleic acid encoding CCL19, the location of the nucleic acid encoding IL-7, and nucleic acid encoding CCL19 is not specifically limited. The nucleic acid encoding CCL19 may be upstream or downstream of the nucleic acid encoding IL-7.

В векторе экспрессии по настоящему изобретению (с-1), (е-1) или (f-1), содержащем нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, и нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, расположение нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, и нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, конкретно не ограничивается. Нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, может находиться выше или ниже нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин.In the expression vector of the present invention (c-1), (e-1) or (f-1) containing a nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin and a nucleic acid encoding IL-7, the location of the nucleic acid , encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, and a nucleic acid encoding IL-7, is not particularly limited. The nucleic acid encoding IL-7 may be upstream or downstream of the nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin.

В векторе экспрессии по настоящему изобретению (d-2), (е-2) или (g-1), содержащем нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, расположение нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин, и нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, конкретно не ограничивается. Нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, может находиться выше или ниже нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую человеческий мезотелин.In the expression vector of the present invention (d-2), (e-2) or (g-1) containing a nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin and a nucleic acid encoding CCL19, the location of the nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin and a nucleic acid encoding CCL19 is not particularly limited. The nucleic acid encoding CCL19 may be upstream or downstream of the nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin.

Транскрипция.Transcription.

Нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую мезотелин, нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, и нуклеиновая кислота, кодирующая суицидальный ген, могут транскрибироваться под управлением разных промоторов, или они могут транскрибироваться под управлением одного промотора с использованием внутреннего участка посадки рибосомы (IRES) или саморасщепляющегося пептида 2А.A nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing mesothelin, a nucleic acid encoding IL-7, a nucleic acid encoding CCL19, and a nucleic acid encoding a suicide gene may be transcribed under the control of different promoters, or they may be transcribed under the control of a single promoter with using an internal ribosome entry site (IRES) or self-cleaving peptide 2A.

Произвольная нуклеиновая кислота может находиться между нуклеиновой кислотой, кодирующей IL-7, и нуклеиновой кислотой, кодирующей CCL19, в случае транскрибирования указанных нуклеиновых кислот под управлением одного промотора с использованием внутреннего участка посадки рибосомы (IRES) или саморасщепляющегося пептида 2А, или между нуклеиновой кислотой, кодирующей молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую мезотелин, и нуклеиновой кислотой, кодирующей IL-7, и нуклеиновой кислотой, кодирующей CCL19, в случае присутствия нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу клеточной поверхности, специфически распознающую мезотелин, при условии, что все нуклеиновые кислоты могут экспрессироваться. Соединение предпочтительно осуществляют через последовательность, кодирующую саморасщепляющийся пептид (пептид 2А) или IRES, предпочтительно последовательность, кодирующую пептид 2А. Соединение посредством такой последовательности обеспечивает эффективную экспрессию каждой нуклеиновой кислоты.An arbitrary nucleic acid can be between a nucleic acid encoding IL-7 and a nucleic acid encoding CCL19 when these nucleic acids are transcribed under the same promoter using an internal ribosome entry site (IRES) or self-cleaving peptide 2A, or between a nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing mesothelin, and a nucleic acid encoding IL-7 and a nucleic acid encoding CCL19 when a nucleic acid encoding a cell surface molecule specifically recognizing mesothelin is present, provided that all nucleic acids can be expressed. The connection is preferably carried out through a sequence encoding a self-cleaving peptide (peptide 2A) or IRES, preferably a sequence encoding peptide 2A. Connecting through such a sequence ensures efficient expression of each nucleic acid.

Пептид 2А представляет собой полученный из вируса саморасщепляющийся пептид, который характеризуется тем, что аминокислотная последовательность, описанная в SEQ ID NO: 32, расщепляетсяPeptide 2A is a virus-derived self-cleaving peptide which is characterized in that the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 32 is cleaved

- 20 042661 по G-P (положение одного остатка от С-конца) в эндоплазматическом ретикулуме (Szymczak et al., Expert- 20 042661 at G-P (position of one residue from the C-terminus) in the endoplasmic reticulum (Szymczak et al., Expert

Opin. Biol. Ther., 5 (5): 627-638 (2005)). Следовательно, каждая из нуклеиновых кислот, фланкирующих пептид 2А, экспрессируется независимо в клетке посредством пептида 2А.Opin. Biol. Ther., 5 (5): 627-638 (2005)). Therefore, each of the nucleic acids flanking the 2A peptide is expressed independently in the cell via the 2A peptide.

Пептид 2А предпочтительно представляет собой пептид 2А, полученный из пикорнавируса, ротавируса, вируса насекомых, афтовируса или вируса трипаносомы, более предпочтительно пептид 2А, полученный из пикорнавируса (F2A), описанный в SEQ ID NO: 33.Peptide 2A is preferably peptide 2A derived from picornavirus, rotavirus, insect virus, aphthovirus or trypanosome virus, more preferably peptide 2A derived from picornavirus (F2A) described in SEQ ID NO: 33.

Тип вектора.Vector type.

Тип вектора экспрессии по настоящему изобретению может включать в себя линейную форму или циклическую форму и может представлять собой невирусный вектор, такой как плазмида, вирусный вектор или вектор на основе транспозона. Такой вектор может содержать регуляторную последовательность, такую как промотор или терминатор, или последовательность селектируемого маркера, такого как ген устойчивости к лекарственному средству, или репортерный ген. Нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, располагают в функциональной зависимости от промоторной последовательности, так чтобы каждая нуклеиновая кислота могла эффективно транскрибироваться.The type of expression vector of the present invention may include a linear form or a cyclic form, and may be a non-viral vector such as a plasmid, a viral vector or a transposon vector. Such a vector may contain a regulatory sequence, such as a promoter or terminator, or a selectable marker sequence, such as a drug resistance gene or a reporter gene. The nucleic acid encoding IL-7 and the nucleic acid encoding CCL19 are positioned in functional dependence on the promoter sequence so that each nucleic acid can be efficiently transcribed.

Примеры промотора могут включать вирусный промотор, такой как промотор LTR ретровируса, ранний промотор SV40, промотор цитомегаловируса и промотор тимидинкиназы вируса простого герпеса; и промотор млекопитающего, такой как промотор фосфоглицераткиназы (PGK), промотор Xist, промотор β-актина и промотор РНК-полимеразы II.Examples of a promoter may include a viral promoter such as the retrovirus LTR promoter, the SV40 early promoter, the cytomegalovirus promoter, and the herpes simplex virus thymidine kinase promoter; and a mammalian promoter such as the phosphoglycerate kinase (PGK) promoter, the Xist promoter, the β-actin promoter, and the RNA polymerase II promoter.

Альтернативно можно использовать тетрациклин-чувствительный промотор, который индуцируется тетрациклином, промотор Mx1, который индуцируется интерферон, и т.п. Применение промотора, который индуцируется конкретным веществом, в векторе экспрессии по настоящему изобретению обеспечивает контроль индукции экспрессии IL-7 и CCL19 в соответствии с курсом лечения рака, например, если иммунокомпетентную клетку, содержащую вектор по настоящему изобретению, используют в качестве фармацевтической композиции для применения в способе лечения рака.Alternatively, a tetracycline-sensitive promoter that is induced by tetracycline, an Mx1 promoter that is induced by interferon, and the like can be used. The use of a promoter that is inducible by a particular substance in the expression vector of the present invention provides control of the induction of expression of IL-7 and CCL19 in accordance with the course of cancer treatment, for example, if an immunocompetent cell containing the vector of the present invention is used as a pharmaceutical composition for use in way to treat cancer.

Примеры вирусного вектора могут включать ретровирусный вектор, лентивирусный вектор, аденовирусный вектор и вектор из аденоассоциированного вируса, предпочтительно они могут включать ретровирусный вектор, более предпочтительно вектор pMSGV (Tamada K. et al., Clin. Cancer. Res., 18: 64366445 (2002)) и вектор pMSCV (произведенный Takara Bio Inc.). Применение ретровирусного вектора обеспечивает длительную и стабильную экспрессию трансгена, поскольку трансген интегрируется в геном клетки-хозяина.Examples of a viral vector may include a retroviral vector, a lentiviral vector, an adenoviral vector and an adeno-associated virus vector, preferably they may include a retroviral vector, more preferably a pMSGV vector (Tamada K. et al., Clin. Cancer. Res., 18: 64366445 (2002 )) and pMSCV vector (manufactured by Takara Bio Inc.). The use of a retroviral vector ensures long-term and stable expression of the transgene, since the transgene is integrated into the genome of the host cell.

Чтобы подтвердить локализацию вектора экспрессии по настоящему изобретению в иммунокомпетентной клетке, можно определить, например, экспрессию CAR методом проточной цитометрии, нозернблоттинга, саузерн-блоттинга, ПЦР, такой как ОТ-ПЦР, ИФА или вестерн-блоттинга, если вектор экспрессии содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, а если вектор экспрессии содержит маркерный ген, можно определить экспрессию маркерного гена, введенного в состав вектора экспрессии по настоящему изобретению.To confirm the localization of the expression vector of the present invention in an immunocompetent cell, for example, CAR expression can be determined by flow cytometry, Northern blot, Southern blot, PCR such as RT-PCR, ELISA, or Western blot if the expression vector contains a nucleic acid, coding CAR, and if the expression vector contains a marker gene, the expression of the marker gene introduced into the expression vector of the present invention can be determined.

Фармацевтическая композиция.Pharmaceutical composition.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению не ограничивается при условии, что фармацевтическая композиция содержит иммунокомпетентную клетку по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемую добавку. Примеры добавки могут включать физиологический раствор, забуференный физиологический раствор, среду для культивирования клеток, декстрозу, воду для инъекций, глицерин, этанол и их сочетания, стабилизатор, солюбилизатор и поверхностно-активное вещество, буфер и антисептик, средство, регулирующее тоничность, наполнитель и смазывающее средство. Поскольку иммунокомпетентная клетка, входящая в состав фармацевтической композиции по настоящему изобретению, содержит сигнальный участок, который вызывает активацию иммунокомпетентной клетки, фармацевтическая композиция по настоящему результату может служить фармацевтической композицией для применения в способе лечения рака. Такая фармацевтическая композиция для применения в способе лечения рака может содержать вкладыш в упаковку, этикетку, упаковку и т.п. с указанием способа применения и т.д. при лечении рака. Поскольку иммунокомпетентная клетка, входящая в состав фармацевтической композиции по настоящему изобретению, подавляет рецидив опухоли, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно использовать для подавления рецидива опухоли. Такая фармацевтическая композиция для подавления рецидива опухоли может содержать вкладыш в упаковку, этикетку, упаковку или т.п. с указанием способа применения и т.д. при подавлении рецидива опухоли.The pharmaceutical composition of the present invention is not limited as long as the pharmaceutical composition contains an immunocompetent cell of the present invention and a pharmaceutically acceptable additive. Examples of the additive may include saline, buffered saline, cell culture medium, dextrose, water for injection, glycerol, ethanol, and combinations thereof, stabilizer, solubilizer, and surfactant, buffer, and antiseptic, tonicity agent, filler, and lubricant. means. Since the immunocompetent cell included in the pharmaceutical composition of the present invention contains a signaling site that causes the activation of the immunocompetent cell, the pharmaceutical composition of the present result can serve as a pharmaceutical composition for use in a cancer treatment method. Such a pharmaceutical composition for use in a method of treating cancer may comprise a package insert, a label, a package insert, and the like. indicating the method of application, etc. in the treatment of cancer. Since the immunocompetent cell included in the pharmaceutical composition of the present invention suppresses tumor recurrence, the pharmaceutical composition of the present invention can be used to suppress tumor recurrence. Such a pharmaceutical composition for suppressing tumor recurrence may include a package insert, label, package or the like. indicating the method of application, etc. suppression of tumor recurrence.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить тестируемому индивидууму, нуждающемуся в этом, с помощью способа, известного специалистам в данной области. Примеры способа введения могут включать внутривенную, внутриопухолевую, внутрикожную, подкожную, внутримышечную, внутрибрюшинную, внутриартериальную, интрамедуллярную, внутрисердечную, внутрисуставную, интрасиновиальную, внутричерепную, интратекальную и субарахноидальную (в спинномозговую жидкость) инъекции.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a test subject in need thereof by a method known to those skilled in the art. Examples of the route of administration may include intravenous, intratumoral, intradermal, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal, intraarterial, intramedullary, intracardiac, intraarticular, intrasynovial, intracranial, intrathecal, and subarachnoid (cerebrospinal fluid) injections.

В иллюстративном способе фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можноIn an illustrative method, the pharmaceutical composition of the present invention can be

- 21 042661 независимо вводить одной порцией или несколькими разделенными порциями 4 раза, 3 раза, 2 раза или раз в день с интервалом 1, 2, 3, 4 или 5 дней, один раз в неделю, с интервалом 7, 8 или 9 дней, два раза в неделю, один раз в месяц или два раза в месяц.- 21 042661 independently administered in one dose or several divided doses 4 times, 3 times, 2 times or once a day with an interval of 1, 2, 3, 4 or 5 days, once a week, with an interval of 7, 8 or 9 days, twice a week, once a month or twice a month.

Тип рака, который можно лечить с помощью фармацевтической композиции по настоящему изобретению, конкретно не ограничивается и предпочтительно представляет собой тип рака, характеризующийся экспрессией мезотелина в раковой ткани, или тип рака, получаемый из раковых клеток, экспрессирующих мезотелин. Примеры рака могут включать такой рак, как мезотелиома, колоректальный рак (рак толстой кишки или рак прямой кишки), рак поджелудочной железы, рак тимуса, рак желчных протоков, рак легких (аденокарцинома, плоскоклеточный рак, аденосквамозный рак, недифференцированный рак, крупноклеточный рак и мелкоклеточный рак), рак кожи, рак молочной железы, рак простаты, рак мочевого пузыря, рак влагалища, рак шеи, рак матки, рак печени, рак почки, рак поджелудочной железы, рак селезенки, рак трахеи, рак бронхов, рак толстой кишки, рак тонкой кишки, рак желудка, рак пищевода, рак желчного пузыря, рак яичка и рак яичника;The type of cancer that can be treated with the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and is preferably a type of cancer characterized by expression of mesothelin in cancer tissue, or a type of cancer derived from cancer cells expressing mesothelin. Examples of cancers may include cancers such as mesothelioma, colorectal cancer (colon or rectal cancer), pancreatic cancer, thymus cancer, bile duct cancer, lung cancer (adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, adenosquamous cancer, undifferentiated cancer, large cell carcinoma, and small cell carcinoma), skin cancer, breast cancer, prostate cancer, bladder cancer, vaginal cancer, neck cancer, uterine cancer, liver cancer, kidney cancer, pancreatic cancer, spleen cancer, tracheal cancer, bronchial cancer, colon cancer, small bowel cancer, stomach cancer, esophageal cancer, gallbladder cancer, testicular cancer, and ovarian cancer;

рак костной ткани, хрящевой ткани, жировой ткани, мышечной ткани, сосудистой ткани и кроветворной ткани;cancer of bone tissue, cartilage tissue, adipose tissue, muscle tissue, vascular tissue and hematopoietic tissue;

саркому, такую как хондросаркому, саркому Юинга, злокачественную гемангиоэндотелиому, злокачественную шванному, остеосаркому и саркому мягких тканей;sarcoma such as chondrosarcoma, Ewing's sarcoma, malignant hemangioendothelioma, malignant schwannoma, osteosarcoma and soft tissue sarcoma;

бластому, такую как гепатобластома, медуллобластома, нефробластома, нейробластома, панкреатобластома, плевропульмональная бластома и ретинобластома; и эмбрионально-клеточную опухоль.blastoma such as hepatoblastoma, medulloblastoma, nephroblastoma, neuroblastoma, pancreatoblastoma, pleuropulmonary blastoma and retinoblastoma; and embryonic cell tumor.

Доза фармацевтической композиции для введения может представлять собой терапевтически эффективное количество. Примеры дозы могут предпочтительно включать от 1х10⁴ до 1х10¹⁰ клеток, предпочтительно от 1x105 до 1x109 клеток, более предпочтительно от 5х10⁶ до 5х10⁸ клеток в пересчете на число клеток, вводимых в одной дозе.The dosage of the pharmaceutical composition for administration may be a therapeutically effective amount. Dosage examples may preferably include 1x10 ⁴ to 1x10 ¹⁰ cells, preferably 1x105 to 1x10 9 cells, more preferably 5x10 ⁶ to 5x10 ⁸ cells, based on the number of cells administered per dose.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно использовать в сочетании с другим противораковым средством. Примеры другого противоракового средства могут включать алкилирующее средство, такое как циклофосфамид, бендамустин, ифосфамид и дакарбазин; антиметаболит, такой как пентостатин, флударабин, кладрибин, метотрексат, 5-фторурацил, 6-меркаптопурин и эноцитабин;The pharmaceutical composition of the present invention can be used in combination with another anticancer agent. Examples of another anticancer agent may include an alkylating agent such as cyclophosphamide, bendamustine, ifosfamide, and dacarbazine; an antimetabolite such as pentostatin, fludarabine, cladribine, methotrexate, 5-fluorouracil, 6-mercaptopurine and enocytabine;

лекарственное средство молекулярной направленности, такое как ритуксимаб, цетуксимаб и трастузумаб;a molecular drug such as rituximab, cetuximab, and trastuzumab;

ингибитор киназы, такой как иматиниб, гефитиниб, эрлотиниб, афатиниб, дазатиниб, сунитиниб и траметиниб;a kinase inhibitor such as imatinib, gefitinib, erlotinib, afatinib, dasatinib, sunitinib and trametinib;

ингибитор протеасомы, такой как бортезомиб;a proteasome inhibitor such as bortezomib;

препарат, ингибирующий кальциневрин, такой как циклоспорин и такролимус;a calcineurin inhibitory drug such as cyclosporine and tacrolimus;

противораковый антибиотик, такой как идарубицин, доксорубицин и митомицин С;an anticancer antibiotic such as idarubicin, doxorubicin and mitomycin C;

растительный алкалоид, такой как иринотекан и этопозид;a plant alkaloid such as irinotecan and etoposide;

платиносодержащее лекарственное средство, такое как цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин;a platinum-containing drug such as cisplatin, oxaliplatin and carboplatin;

гормональное терапевтическое средство, такое как тамоксифен и бикалутамид; и иммунорегуляторный препарат, такой как интерферон, ниволумаб и пембролизумаб.a hormone therapeutic such as tamoxifen and bicalutamide; and an immunoregulatory drug such as interferon, nivolumab, and pembrolizumab.

Примеры способа применения фармацевтической композиции по настоящему изобретению в сочетании с другим противораковым средством могут включать способ применения другого противоракового средства в процессе использования фармацевтической композиции по настоящему изобретению и после него, способ одновременного использования фармацевтической композиции по настоящему изобретению и другого противоракового средства, а также способ использования фармацевтической композиции по настоящему изобретению в процессе использования другого противоракового средства и после него. Комбинированное использование фармацевтической композиции по настоящему изобретению в способе лечения рака другим противораковым средством дополнительно улучшает терапевтическое воздействие на рак и может уменьшать побочные реакции каждого противоракового средства путем уменьшения частоты введения или дозы противоракового средства. Альтернативно другое противораковое средство может входить в состав фармацевтической композиции по настоящему изобретению.Examples of the method of using the pharmaceutical composition of the present invention in combination with another anticancer agent may include a method of using another anticancer agent during and after using the pharmaceutical composition of the present invention, a method of using the pharmaceutical composition of the present invention and another anticancer agent simultaneously, and a method of using pharmaceutical composition of the present invention during and after use of another anticancer agent. The combined use of the pharmaceutical composition of the present invention in a method of treating cancer with another anticancer agent further improves the therapeutic effect on cancer and can reduce the side effects of each anticancer agent by reducing the frequency of administration or dose of the anticancer agent. Alternatively, another anti-cancer agent may be included in the pharmaceutical composition of the present invention.

Другие аспекты по настоящему изобретению.Other aspects of the present invention.

Примеры дополнительного аспекта 1 по настоящему изобретению могут включатьExamples of additional aspect 1 of the present invention may include

1) способ лечения рака, включающий введение иммунокомпетентной клетки по настоящему изобретению пациенту, нуждающемуся в лечении рака;1) a method for treating cancer, comprising administering an immunocompetent cell of the present invention to a patient in need of cancer treatment;

2) иммунокомпетентную клетку по настоящему изобретению для применения в качестве фармацевтической композиции; и2) an immunocompetent cell of the present invention for use as a pharmaceutical composition; And

3) применение иммунокомпетентной клетки по настоящему изобретению для получения фармацевтической композиции.3) use of the immunocompetent cell of the present invention to obtain a pharmaceutical composition.

Примеры дополнительного аспекта 2 по настоящему изобретению могут включать химерный ре- 22 042661 цептор антигена (CAR), содержащий одно из приведенных ниже одноцепочечных антител, трансмембранной участок и сигнальный участок, который индуцирует активацию иммунокомпетентной клетки.Examples of additional aspect 2 of the present invention may include a chimeric antigen receptor (CAR) containing one of the following single chain antibodies, a transmembrane region and a signal region that induces activation of an immunocompetent cell.

Такой CAR после экспрессии в иммунокомпетентной клетке способен активировать иммунокомпетентную клетку в результате стимуляции человеческим мезотелином.Such a CAR, once expressed in an immunocompetent cell, is capable of activating the immunocompetent cell as a result of stimulation with human mesothelin.

(1 -1) Одноцепочечное антитело, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит CDR1 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 13, CDR2 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 14, и CDR3 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 15, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит CDR1 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 16, CDR2 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 17, и CDR3 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 18;(1-1) A single chain antibody containing a heavy chain variable region, which contains a heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 13, a heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 14, and a heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 15 and a light chain variable region that contains a light chain CDR1 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 16, a light chain CDR2 consisting of the amino acid the sequence described in SEQ ID NO: 17, and a light chain CDR3 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 18;

(2 -1) одноцепочечное антитело, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит CDR1 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 13, CDR2 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 14, и CDR3 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 15, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит CDR1 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 19, CDR2 легкой цепи состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 17, и CDR3 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 18; и (3-1) одноцепочечное антитело, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит CDR1 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 20, CDR2 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 21, и CDR3 тяжелой цепи состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 22, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит CDR1 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 23, CDR2 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 24, и CDR3 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 25.(2-1) a single chain antibody containing a heavy chain variable region that contains a heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 13, a heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 14, and a heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 15 and a light chain variable region that contains a light chain CDR1 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 19, a light chain CDR2 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 17, and a light chain CDR3 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 18; and (3-1) a single chain antibody comprising a heavy chain variable region that comprises a heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 20, a heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 21 , and a heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 22, and a light chain variable region that contains a light chain CDR1 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 23, a light chain CDR2 consisting of the amino acid the sequence described in SEQ ID NO: 24, and a light chain CDR3 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 25.

Примеры дополнительного аспекта 3 по настоящему изобретению могут включать набор для получения иммунокомпетентной клетки, содержащей вектор экспрессии по настоящему изобретению. Такой набор конкретно не ограничивается при условии, что набор содержит вектор экспрессии по настоящему изобретению. Набор может содержать инструкцию по получению иммунокомпетентной клетки по настоящему изобретению и реагент, используемый для введения вектора экспрессии по настоящему изобретению в иммунокомпетентную клетку.Examples of the additional aspect 3 of the present invention may include a kit for obtaining an immunocompetent cell containing the expression vector of the present invention. Such a kit is not particularly limited as long as the kit contains the expression vector of the present invention. The kit may contain instructions for obtaining an immunocompetent cell of the present invention and a reagent used to introduce the expression vector of the present invention into an immunocompetent cell.

Примеры дополнительного аспекта 4 по настоящему изобретению могут включать способ подавления рецидива рака, включающий введение индивидууму иммунокомпетентной клетки, которая одновременно экспрессирует молекулу клеточной поверхности (предпочтительно CAR, содержащий одноцепочечное антитело, специфически распознающее человеческий мезотелин), IL-7 и CCL19.Examples of the additional aspect 4 of the present invention may include a method for suppressing cancer recurrence, comprising administering to an individual an immunocompetent cell that simultaneously expresses a cell surface molecule (preferably a CAR containing a single chain antibody specifically recognizing human mesothelin), IL-7 and CCL19.

Далее настоящее изобретение будет описано более конкретно со ссылкой на примеры. Однако технический объем настоящего изобретения не ограничивается указанными примерами.Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.

Пример 1. Получение CAR против человеческого мезотелина.Example 1 Preparation of CAR against human mesothelin.

Синтез последовательности scFv и фрагмента ДНК CAR против человеческого мезотелина.Synthesis of scFv sequence and CAR DNA fragment against human mesothelin.

Последовательности 9 типов scFv против человеческого мезотелина, показанные на фиг. 1, конструируют для сравнения последовательностей, порядка VL и VH и типа подходящего сигнального пептида.The sequences of the 9 types of anti-human mesothelin scFv shown in FIG. 1 are designed to compare sequences, VL and VH order, and type of suitable signal peptide.

VH07(15)VL07 состоит из аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи, описанной в SEQ ID NO: 1, аминокислотной последовательности пептидного линкера, описанной в SEQ ID NO: 26, и аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи, описанной в SEQ ID NO: 2.VH07(15)VL07 consists of the amino acid sequence of the heavy chain variable region described in SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence of the peptide linker described in SEQ ID NO: 26, and the amino acid sequence of the light chain variable region described in SEQ ID NO: 2 .

VH36(15)VL36 состоит из аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи, описанной в SEQ ID NO: 3, аминокислотной последовательности пептидного линкера, описанной в SEQ ID NO: 26, и аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи, описанной в SEQ ID NO: 4.VH36(15)VL36 consists of the heavy chain variable region amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3, the peptide linker amino acid sequence described in SEQ ID NO: 26, and the light chain variable region amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 .

VL07(15)VH07 состоит из аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи, описанной в SEQ ID NO: 2, аминокислотной последовательности пептидного линкера, описанной в SEQ ID NO: 26, и аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи, описанной в SEQ ID NO: 1.VL07(15)VH07 consists of the light chain variable region amino acid sequence as described in SEQ ID NO: 2, the peptide linker amino acid sequence as described in SEQ ID NO: 26, and the heavy chain variable region amino acid sequence as described in SEQ ID NO: 1 .

VH07(25)VL07 состоит из аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи, описанной в SEQ ID NO: 1, аминокислотной последовательности пептидного линкера, описанной в SEQ ID NO: 27, и аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи, описанной в SEQ ID NO: 2.VH07(25)VL07 consists of the heavy chain variable region amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, the peptide linker amino acid sequence described in SEQ ID NO: 27, and the light chain variable region amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 .

VL07(25)VH07 состоит из аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой це- 23 042661 пи, описанной в SEQ ID NO: 2, аминокислотной последовательности пептидного линкера, описанной вVL07(25)VH07 consists of the light chain variable region amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, the peptide linker amino acid sequence described in

SEQ ID NO: 27, и аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи, описанной в SEQ ID NO: 1.SEQ ID NO: 27 and the heavy chain variable region amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1.

VHMO(15)VLMO состоит из аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи, описанной в SEQ ID NO: 5, аминокислотной последовательности пептидного линкера, описанной в SEQ ID NO: 26, и аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи, описанной в SEQ ID NO: 6.VHMO(15)VLMO consists of the amino acid sequence of the heavy chain variable region described in SEQ ID NO: 5, the amino acid sequence of the peptide linker described in SEQ ID NO: 26, and the amino acid sequence of the light chain variable region described in SEQ ID NO: 6 .

VLMO(15)VHMO состоит из аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи, описанной в SEQ ID NO: 6, аминокислотной последовательности пептидного линкера, описанной в SEQ ID NO: 26, и аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи, описанной в SEQ ID NO: 5.VLMO(15)VHMO consists of the light chain variable region amino acid sequence as described in SEQ ID NO: 6, the peptide linker amino acid sequence as described in SEQ ID NO: 26, and the heavy chain variable region amino acid sequence as described in SEQ ID NO: 5 .

VHMO(25)VLMO состоит из аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи, описанной в SEQ ID NO: 5, аминокислотной последовательности пептидного линкера, описанной в SEQ ID NO: 27, и аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи, описанной в SEQ ID NO: 6.VHMO(25)VLMO consists of the heavy chain variable region amino acid sequence as described in SEQ ID NO: 5, the peptide linker amino acid sequence as described in SEQ ID NO: 27, and the light chain variable region amino acid sequence as described in SEQ ID NO: 6 .

VLMO(25)VHMO состоит из аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи, описанной в SEQ ID NO: 6, аминокислотной последовательности пептидного линкера, описанной в SEQ ID NO: 27, и аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи, описанной в SEQ ID NO: 5.VLMO(25)VHMO consists of the light chain variable region amino acid sequence as described in SEQ ID NO: 6, the peptide linker amino acid sequence as described in SEQ ID NO: 27, and the heavy chain variable region amino acid sequence as described in SEQ ID NO: 5 .

Аминокислотные последовательности, описанные в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 3, различаются тем, что 127 аминокислота представляет собой глицин (G) в SEQ ID NO: 1 и лейцин (L) in аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 3. Аминокислотные последовательности, описанные в SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4 различаются тем, что 33 аминокислота в SEQ ID NO: 2 представляет собой тирозин (Y), который отсутствует в аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 4.The amino acid sequences described in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 differ in that amino acid 127 is glycine (G) in SEQ ID NO: 1 and leucine (L) in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3. The amino acid sequences described in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 differ in that the 33 amino acid in SEQ ID NO: 2 is tyrosine (Y), which is not present in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 .

Синтезируют фрагмент ДНК, кодирующий аминокислотную последовательность одного из scFv против человеческого мезотелина.Synthesize a DNA fragment encoding the amino acid sequence of one of the scFv against human mesothelin.

Получение вектора экспрессии CAR против человеческого мезотелина IL-7/CCL19, экспрессирующего IL-7/CCL19 и HSV-TK, и вектора экспрессии Conv. CAR против человеческого мезотелина, не экспрессирующего IL-7/CCL19.Preparation of an expression vector for IL-7/CCL19 anti-human mesothelin CAR expressing IL-7/CCL19 and HSV-TK and an expression vector for Conv. CAR against human mesothelin not expressing IL-7/CCL19.

CAR-T-клеточная терапия может вызывать системные побочные реакции, такие как синдром высвобождения цитокинов, вследствие сильного иммунного ответа на целевой антиген. Для решения этой проблемы разработана конструкция CAR, несущая ген тимидинкиназы HSV-TK вируса герпеса в качестве суицидального гена. Если Т-клетки трансфицируют конструкцией так, что CAR-экспрессирующие Тклетки экспрессируют HSV-TK, добавление терапевтического лекарственного средства против цитомегаловируса, ганцикловира, вызывает апоптоз CAR-T-клеток и убивает эти клетки. Следовательно, CARТ-клетки в организме можно контролировать введением ганцикловира.CAR-T cell therapy can cause systemic adverse reactions such as cytokine release syndrome due to a strong immune response to the target antigen. To solve this problem, a CAR construct carrying the HSV-TK thymidine kinase gene of the herpes virus as a suicide gene was developed. If T cells are transfected with the construct such that CAR-expressing T cells express HSV-TK, the addition of the cytomegalovirus therapeutic drug, ganciclovir, induces apoptosis of the CAR-T cells and kills these cells. Therefore, CART cells in the body can be controlled by administration of ganciclovir.

Вначале получают конструкцию CAR третьего поколения, последовательно содержащую scFv против человеческого мезотелина, трансмембранный участок человеческого CD8 и внутриклеточный сигнальный участок человеческого CD28-4-1BB-CD3Z, в направлении от N-конца с помощью способа, описанного в патентном документе 2. К С-концу конструкции добавляют пептид 2А F2A и затем добавляют человеческий IL-7-F2А-человеческий CCL19-F2A-HSV-TK ниже по ходу считывания. Полученную конструкцию, последовательно содержащую scFv, трансмембранный участок человеческого CD8, внутриклеточный сигнальный участок человеческого CD28-4-1BB-CD3Z, человеческий IL-7, человеческий CCL19 и HSV-TK, вставляют в ретровирусный вектор экспрессии pMSGV1 (Tamada K et al., Clin. Cancer. Res., 18: 6436-6445 (2012)) с получением вектора pMSGV, обеспечивающего экспрессию scFv против человеческого мезотелина, трансмембранного участка человеческого CD8, внутриклеточного сигнального участка человеческого CD28-4-1BB-CD3Z, человеческого IL-7, человеческого CCL19 и HSV-TK. Затем участок scFv против человеческого мезотелина в векторе pMSGV замещают путем обработки ферментом рестрикции (NcoI и NotI) и лигирования с каждым фрагментом ДНК scFv против человеческого мезотелина, синтезированным по способу, описанному в разделе Синтез последовательности scFv и фрагмента ДНК CAR против человеческого мезотелина, с получением вектора экспрессии IL-7/CCL19 CAR против человеческого мезотелина. Вектор pMSGV1 содержит сигнальный пептид Т (SEQ ID NO: 11), полученный из иммуноглобулина G, на N-концевой стороне scFv. В векторе, содержащем фрагмент ДНК VH07(15)VL07, замещенный участком scFv, сигнальный пептид Т, описанный в SEQ ID NO: 11, заменяют сигнальным пептидом Р, описанным в SEQ ID NO: 12, обеспечивающим продукцию. Кроме того, в качестве контроля получают вектор Conv. CAR против человеческого мезотелина, не экспрессирующий IL-7 и CCL19, с помощью способа, описанного выше, за исключением того, что HSV-TK используют вместо человеческий IL-7-F2А-человеческий CCL19-F2A-HSV-TK.First, a third-generation CAR construct containing the anti-human mesothelin scFv, the human CD8 transmembrane region, and the human CD28-4-1BB-CD3Z intracellular signaling region in sequence from the N-terminus is prepared using the method described in Patent Document 2. To C- peptide 2A F2A is added to the end of the construct and then human IL-7-F2A-human CCL19-F2A-HSV-TK is added downstream. The resulting construct, sequentially containing scFv, human CD8 transmembrane region, human CD28-4-1BB-CD3Z intracellular signaling region, human IL-7, human CCL19, and HSV-TK, is inserted into the pMSGV1 retroviral expression vector (Tamada K et al., Clin Cancer Res., 18: 6436-6445 (2012)) to generate the pMSGV vector expressing scFv against human mesothelin, human CD8 transmembrane region, human CD28-4-1BB-CD3Z intracellular signaling region, human IL-7, human CCL19 and HSV-TK. The anti-human mesothelin scFv region in the pMSGV vector is then replaced by restriction enzyme (NcoI and NotI) and ligation with each anti-human mesothelin scFv DNA fragment synthesized by the method described in Synthesis of the scFv sequence and anti-human mesothelin CAR DNA fragment to obtain IL-7/CCL19 CAR expression vector against human mesothelin. The pMSGV1 vector contains a T signal peptide (SEQ ID NO: 11) derived from immunoglobulin G on the N-terminal side of the scFv. In a vector containing a VH07(15)VL07 DNA fragment substituted with an scFv region, the T signal peptide as described in SEQ ID NO: 11 is replaced with the P signal peptide as described in SEQ ID NO: 12, allowing production. In addition, the vector Conv is obtained as a control. CAR against human mesothelin not expressing IL-7 and CCL19 using the method described above, except that HSV-TK is used instead of human IL-7-F2A-human CCL19-F2A-HSV-TK.

Получение ретровируса, несущего вектор экспрессии IL-7/CCL19-CAR против человеческого мезотелина или вектор Conv. CAR против человеческого мезотелина.Obtaining a retrovirus carrying the IL-7/CCL19-CAR expression vector against human mesothelin or the Conv vector. CAR against human mesothelin.

Получают ретровирус для трансфекции Т-клеток. Пакующую клеточную линию GP2-293 (произве- 24 042661 денную Takara Bio Inc.) трансфицируют вектором экспрессии IL-7/CCL19-CAR против человеческого мезотелина или вектором Conv. CAR против человеческого мезотелина и плазмидой p-Ampho (произведенной Takara Bio Inc.), используя липофектамин 3000 (произведенный Life Technologies Corp.), с получением ретровируса, несущего вектор экспрессии IL-7/CCL19-CAR против человеческого мезотелина или вектор Conv. CAR против человеческого мезотелина. Супернатант, содержащий ретровирус, извлекают через 48 ч после трансфекции.Get a retrovirus for transfection of T cells. The packaging cell line GP2-293 (manufactured by Takara Bio Inc.) was transfected with an anti-human mesothelin IL-7/CCL19-CAR expression vector or a Conv vector. CAR against human mesothelin and p-Ampho plasmid (manufactured by Takara Bio Inc.) using Lipofectamine 3000 (manufactured by Life Technologies Corp.) to obtain a retrovirus carrying the anti-human mesothelin IL-7/CCL19-CAR expression vector or the Conv vector. CAR against human mesothelin. The supernatant containing the retrovirus is recovered 48 hours after transfection.

В качестве культурального раствора для клеток GP2-293 используют DMEM, содержащую 10% FCS и 1% пенициллина-стрептомицина (произведенного Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). В качестве раствора для культивирования Т-клеток, описанного в приведенных ниже примерах, используют GT-T551, содержащий 2,0% сыворотки человеческой крови типа АВ (произведенной Sigma-Aldrich Co. LLC), 1% пенициллина-стрептомицина (произведенного Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) и 2,5 мкг/мл амфотерицина В (произведенного Bristol-Myers Squibb Company).As the culture solution for GP2-293 cells, DMEM containing 10% FCS and 1% penicillin-streptomycin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used. As the T cell culture solution described in the following examples, GT-T551 containing 2.0% human blood type AB serum (manufactured by Sigma-Aldrich Co. LLC), 1% penicillin-streptomycin (manufactured by Wako Pure Chemical) was used. Industries, Ltd.) and 2.5 μg/ml amphotericin B (manufactured by Bristol-Myers Squibb Company).

Трансдукция Т-клетки.T cell transduction.

Чтобы активировать Т-клетки, 2x10⁶ мононуклеарных клеток периферической крови, собранных из крови здорового донора, культивируют с IL-2 (произведенного PeproTech, Inc.) в инкубаторе в течение 3 дней при 37°С и 5% CO₂ на планшете, на котором иммобилизованы моноклональное антитело против CD3 (5 мкг/мл) и RetroNectin® (произведенный Takara Bio Inc., 25 мкг/мл). На 2 день после начала культивирования супернатант, содержащий полученный ретровирус, несущий вектор экспрессии IL-7/CCL19-CAR против человеческого мезотелина или вектор Conv. CAR против человеческого мезотелина, добавляют в количестве 500 мкл/лунку в необработанный 24-луночный планшет, предварительно покрытый 25 мкг/мл RetroNectin (производства Takara Bio Inc.), и центрифугируют при 2000 g в течение 2 ч с получением планшета с предварительной нагрузкой ретровируса. Всего получают два таких планшета, которые промывают 1,5% BSA/PBS после завершения центрифугирования и хранят при 4°С до использования. На 3 день культивирования активированные клетки извлекают из планшета и получают клеточную суспензию (1x105 клеток/мл). Эту клеточную суспензию добавляют по 1 мл/лунку в планшет с предварительной нагрузкой ретровируса и культивируют в присутствии IL-2 в инкубаторе в течение 24 ч при 37°С и 5% СО₂, с достижением первой инфекции ретровируса. На следующий день (4 день культивирования) клеточный лизат из каждой лунки переносят в сохраненный второй планшет с предварительной нагрузкой вируса, центрифугируют при 500 g в течение 1 мин и затем культивируют при 37°С в течение 4 ч с достижением второй инфекции. После культивирования при 37°С в течение 4 ч 1 мл клеточной суспензии из каждой лунки переносят в свежий 12-луночный планшет для культивирования клеток, разбавляют в 4 раза свежим культуральным раствором (GT-T551), содержащим IL-2, и культивируют в инкубаторе при 37°С и 5% СО₂. Культивирование продолжают 7 дней, считая от даты начала культивирования мононуклеарных клеток периферической крови, с получением Т-клеток, экспрессирующих IL7/CCL19-CAR против человеческого мезотелина в качестве Т-клеток, несущих вектор экспрессии IL7/CCL19-CAR против человеческого мезотелина, или Т-клеток, экспрессирующих CAR против человеческого мезотелина в качестве Т-клеток, несущих вектор Conv. CAR против человеческого мезотелина. Т-клетки, экспрессирующие CAR против человеческого мезотелина-IL-7/CCL19, содержат экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR против человеческого мезотелина, экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19. Т-клетки, экспрессирующие CAR против человеческого мезотелина, содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR против человеческого мезотелина, и не содержали ни экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, ни экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19. Одновременно получают Тклетки, не экспрессирующие CAR, IL-7 и CCL19 (нетрансфицированные клетки: отсутствие инфекции) в качестве CAR-отрицательных клеточных контролей путем активации мононуклеарных клеток периферической крови, полученных от того же здорового донора по описанному выше способу, но без заражения клеток ретровирусом.To activate T cells, 2x10 ⁶ peripheral blood mononuclear cells collected from the blood of a healthy donor were cultured with IL-2 (manufactured by PeproTech, Inc.) in an incubator for 3 days at 37°C and 5% CO ₂ on a plate, on in which anti-CD3 monoclonal antibody (5 μg/ml) and RetroNectin® (manufactured by Takara Bio Inc., 25 μg/ml) are immobilized. On the 2nd day after the start of cultivation, the supernatant containing the obtained retrovirus carrying the IL-7/CCL19-CAR expression vector against human mesothelin or the Conv vector. Anti-human mesothelin CAR was added at 500 µl/well to an untreated 24-well plate pre-coated with 25 µg/ml RetroNectin (manufactured by Takara Bio Inc.) and centrifuged at 2000 g for 2 h to obtain a retrovirus preload plate . A total of two such plates are obtained, which are washed with 1.5% BSA/PBS after centrifugation is complete and stored at 4°C until use. On day 3 of culture, the activated cells are removed from the plate and a cell suspension is obtained (1x105 cells/ml). This cell suspension is added at 1 ml/well to a retrovirus preload plate and cultured in the presence of IL-2 in an incubator for 24 hours at 37° C. and 5% CO ₂ to achieve the first retrovirus infection. The next day (day 4 in culture), the cell lysate from each well is transferred to the saved second virus preload plate, centrifuged at 500 g for 1 min, and then cultured at 37° C. for 4 h to achieve a second infection. After culturing at 37°C for 4 hours, 1 ml of the cell suspension from each well is transferred to a fresh 12-well cell culture plate, diluted 4-fold with fresh culture solution (GT-T551) containing IL-2, and cultured in an incubator at 37°C and 5% CO ₂ . Cultivation is continued for 7 days counting from the start date of peripheral blood mononuclear cell culture to obtain T cells expressing IL7/CCL19-CAR against human mesothelin as T cells carrying the expression vector of IL7/CCL19-CAR against human mesothelin, or T -cells expressing CAR against human mesothelin as T cells carrying the Conv vector. CAR against human mesothelin. T cells expressing the anti-human mesothelin-IL-7/CCL19 CAR contain an exogenous nucleic acid encoding an anti-human mesothelin CAR, an exogenous nucleic acid encoding IL-7, and an exogenous nucleic acid encoding CCL19. T cells expressing the anti-human mesothelin CAR contained a nucleic acid encoding an anti-human mesothelin CAR and contained neither exogenous nucleic acid encoding IL-7 nor exogenous nucleic acid encoding CCL19. Simultaneously, T cells not expressing CAR, IL-7 and CCL19 (non-transfected cells: no infection) are obtained as CAR-negative cell controls by activating peripheral blood mononuclear cells obtained from the same healthy donor as described above, but without retrovirus infection of the cells .

Описанный выше ретровирусный вектор используют для введения в Т-клетки нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR против человеческого мезотелина, нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, и нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19. Следовательно, если Т-клетки, несущие указанные нуклеиновые кислоты, пролиферируют в результате культивирования, некоторые из Т-клеток содержат ретровирусный вектор в цитоплазме. Однако в большинстве указанных Т-клеток нуклеиновая кислота, кодирующая CAR против человеческого мезотелина, нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, и нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, интегрируются в геном. Если нуклеиновая кислота, кодирующая CAR против человеческого мезотелина, нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, и нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, интегрируются в геном указанных Т-клеток, CAR против человеческого мезотелина, IL7 и CCL19 экспрессируются из экзогенной рекомбинантной конструкции, введенной в клетки.The retroviral vector described above is used to introduce into T cells a nucleic acid encoding anti-human mesothelin CAR, a nucleic acid encoding IL-7, and a nucleic acid encoding CCL19. Therefore, if T cells carrying these nucleic acids proliferate as a result of culturing, some of the T cells contain the retroviral vector in the cytoplasm. However, in most of these T cells, the nucleic acid encoding anti-human mesothelin CAR, the nucleic acid encoding IL-7, and the nucleic acid encoding CCL19 are integrated into the genome. If the nucleic acid encoding anti-human mesothelin CAR, the nucleic acid encoding IL-7, and the nucleic acid encoding CCL19 are integrated into the genome of these T cells, the anti-human mesothelin CAR, IL7, and CCL19 are expressed from the exogenous recombinant construct introduced into the cells .

Пример 2. Измерение экспрессии CAR методом проточной цитометрии.Example 2 Measurement of CAR Expression by Flow Cytometry.

Анализ методом проточной цитометрии.Analysis by flow cytometry.

Уровень экспрессии CAR, распознающего мезотелин в качестве антигена, анализируют методом проточной цитометрии. Полученные Т-клетки, экспрессирующие CAR против человеческого мезотелиThe expression level of CAR, which recognizes mesothelin as an antigen, is analyzed by flow cytometry. Generated T cells expressing CAR against human mesothelium

- 25 042661- 25 042661

Ha-IL-7/CCL19, окрашивают посредством реакции с рекомбинантным человеческим мезотелином (содержащим 6-His на С-конце) (произведенным BioLegend, Inc.), фикоэритрином (РЕ), меченным моноклональным антителом против 6-His (произведенным Abcam pic) и моноклональным антителом против CD8, меченным аллофикоцианином (АРС) (произведенным Affymetrix/Thermo Fisher Scientific Inc.). Используют проточный питометр ЕС800 (произведенный Sony Corp.). Данные анализируют с помощью программного обеспечения FlowJo (произведенного Tree Star, Inc.).Ha-IL-7/CCL19 stained by reaction with recombinant human mesothelin (containing 6-His at the C-terminus) (manufactured by BioLegend, Inc.), phycoerythrin (PE) labeled with anti-6-His monoclonal antibody (manufactured by Abcampic) and an anti-CD8 monoclonal antibody labeled with allophycocyanin (APC) (manufactured by Affymetrix/Thermo Fisher Scientific Inc.). An EC800 flow meter (manufactured by Sony Corp.) was used. The data was analyzed using FlowJo software (manufactured by Tree Star, Inc.).

Результаты.Results.

Результаты анализа методом проточной цитометрии Т-клеток, экспрессирующих CAR против человеческого мезотелина-IL-7/CCL19, содержащий VH07(15)VL07 (экспрессируемый посредством сигнального пептида Т), VH07(15)VL07 (экспрессируемый посредством сигнального пептида Р) или VH36(15)VL36 в качестве участка scFv, показаны на фиг. 2. На фиг. 2 на горизонтальной оси каждого графика отмечена экспрессия CAR, а на вертикальной оси отмечена экспрессия CD8. Как показано на фиг. 2, подтверждено, что все три типа Т-клеток, экспрессирующих CAR против человеческого мезотелина-IL-7/CCL19, экспрессируют CAR на высоком уровне по сравнению с Т-клетками, не экспрессирующими CAR, IL-7 и CCL19 (не инфицированными).Flow Cytometry Analysis of T Cells Expressing Anti-Human Mesothelin-IL-7/CCL19 CAR Containing VH07(15)VL07 (Expressed via T Signal Peptide), VH07(15)VL07 (Expressed via P Signal Peptide), or VH36( 15) VL36 as an scFv region are shown in FIG. 2. In FIG. 2, the horizontal axis of each plot shows CAR expression and the vertical axis shows CD8 expression. As shown in FIG. 2, all three types of T cells expressing CAR against human mesothelin-IL-7/CCL19 were confirmed to express CAR at a high level compared to T cells not expressing CAR, IL-7 and CCL19 (not infected).

Результаты анализа методом проточной цитометрии Т-клеток, экспрессирующих CAR против человеческого мезотелина-IL-7/CCL19, содержащий VH07(15)VL07, VL07(15)VH07, VH07(25)VL07 или VL07(25)VH07 в качестве участка scFv, показана на фиг. 3. На фиг. 3 на абсциссе каждого графика отмечена экспрессия CAR, а на ординате - экспрессия CD8. На фиг. 3(а) показаны результаты, полученные с использованием Т-клеток, не экспрессирующих CAR, IL-7 и CCL19 (не инфицированных), а на фиг. 3(b-е) показаны результаты, полученные с использованием Т-клеток, экспрессирующих CAR против человеческого мезотелина-IL-7/CCL19, содержащих каждый участок scFv. Числовые значения на чертеже обозначают процент каждой популяции. Как показано на фиг. 3(b-е), экспрессия CAR подтверждена в Т-клетках, экспрессирующих CAR против человеческого мезотелина-IL-7/CCL19.Flow Cytometry Analysis of T Cells Expressing Anti-Human Mesothelin-IL-7/CCL19 CAR Containing VH07(15)VL07, VL07(15)VH07, VH07(25)VL07, or VL07(25)VH07 as the scFv Region, shown in FIG. 3. In FIG. 3, the abscissa of each plot shows CAR expression and the ordinate shows CD8 expression. In FIG. 3(a) shows the results obtained using T cells not expressing CAR, IL-7 and CCL19 (not infected), and FIG. 3(b-e) shows results obtained using anti-human mesothelin-IL-7/CCL19 CAR-expressing T cells containing each scFv region. Numerical values in the drawing indicate the percentage of each population. As shown in FIG. 3(b-e), CAR expression was confirmed in T cells expressing anti-human mesothelin-IL-7/CCL19 CAR.

Пример 3. Экспрессия мезотелина каждой опухолевой клеткой.Example 3 Expression of mesothelin by each tumor cell.

Анализ методом проточной цитометрии.Analysis by flow cytometry.

Подтверждают уровень экспрессии мезотелина в каждой линии опухолевых клеток, чтобы убедиться, что линии опухолевых клеток экспрессируют мезотелин. Клеточные линии злокачественной мезотелиомы ACC-MESO-1, Y-MESO8A, NCI-H2052, NCI-H226 и MSTO211H и клеточную линию рака почки А498 окрашивают коммерчески доступным антителом против мезотелина (номер по каталогу FAB32652P, R&D Systems, Inc.), меченным РЕ. Экспрессию мезотелина в каждой опухолевой клетке измеряют методом проточной цитометрии. Окрашивание РЕ-меченым антителом против человеческого мезотелина проводят в образце массой 3 мкг. Используют проточный питометр ЕС800 (произведенный Sony Corp.). Данные анализируют с помощью программного обеспечения FlowJo (производства Tree Star, Inc.).The level of mesothelin expression in each tumor cell line is confirmed to ensure that the tumor cell lines express mesothelin. ACC-MESO-1, Y-MESO8A, NCI-H2052, NCI-H226 and MSTO211H malignant mesothelioma cell lines and A498 kidney cancer cell line are stained with a commercially available anti-mesothelin antibody (catalog number FAB32652P, R&D Systems, Inc.) labeled with PE . Mesothelin expression in each tumor cell is measured by flow cytometry. Staining with PE-labeled anti-human mesothelin antibody is performed on a 3 μg sample. An EC800 flow meter (manufactured by Sony Corp.) was used. The data was analyzed using FlowJo software (manufactured by Tree Star, Inc.).

Результаты.Results.

Результаты показаны на фиг. 4. Экспрессия мезотелина подтверждена в линиях клеток злокачественной мезотелиомы ACC-MeSo-1, Y-MESO8A, NCI-H2052, NCI-H226 и MSTO211H. С другой стороны, экспрессия мезотелина не подтверждена в линии клеток рака почки А498.The results are shown in FIG. 4. Mesothelin expression was confirmed in malignant mesothelioma cell lines ACC-MeSo-1, Y-MESO8A, NCI-H2052, NCI-H226 and MSTO211H. On the other hand, mesothelin expression was not confirmed in the A498 kidney cancer cell line.

Пример 4. Тест на цитотоксичность - 1.Example 4. Test for cytotoxicity - 1.

Тест с совместным культивированием.Co-cultivation test.

Число Т-клеток, экспрессирующих CAR против человеческого мезотелина-IL-7/CCL19 (участок scFv: VH07(15)VL07 или VH07(25)VL07), используемых в качестве эффектора, доводят до соотношения эффектор:опухолевые клетки 1:1, 1:3 или 1:5 (1:5: только для измерения и анализа IFN-γ), используя линию мезотелин-положительных опухолевых клеток (ACC-MESO-1 или NCI-H2052) или линию мезотелин-отрицательных опухолевых клеток (А498), на культуральном планшете и затем совместно культивируют в инкубаторе при 37°С. Эта совместная культура показана на фиг. 5. В качестве культурального раствора используют RPMI, содержащий 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), 1% пенициллина-стрептомицина (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 50 мкМ 2-ME (Gibco/Thermo Fisher Scientific Inc.) и 25 мМ HEPES (Sigma-Aldrich Co. LLC). Опухолевую клеточную линию, выжившую спустя 2 дня после начала совместного культивирования, измеряют методом проточной цитометрии, a IFN-γ, продуцируемый в культуральный супернатант, измеряют с использованием коммерчески доступного набора ELISA для IFN-γ (BioLegend, Inc.). Результаты измерения линии опухолевых клеток, выживших через 2 дня после начала совместного культивирования, с помощью проточной цитометрии, показаны на фиг. 6А-6С, а результаты измерения продуцированного IFN-γ после совместного культивирования показаны на фиг. 7А-7С. Т-клетки, не экспрессирующие CAR, IL-7 и CCL19 (неинфицированные), используют в качестве контроля при анализе Т-клеток, экспрессирующих CAR против человеческого мезотелинаIL-7/CCL19. Для проведения проточной цитометрии мертвые клетки отделяют от живых клеток путем окрашивания Zombie Yellow (BioLegend, Inc.), а Т-клетки окрашивают РЕ-меченным моноклональным антителом против CD45 (BioLegend, Inc.). Используют проточный цитометр BD LSRFortessa X-20 (BD Biosciences). Данные анализируют с помощью программного обеспечения FlowJo (Tree Star, Inc.).The number of T cells expressing the anti-human mesothelin-IL-7/CCL19 CAR (scFv region: VH07(15)VL07 or VH07(25)VL07) used as effector was adjusted to an effector:tumor cell ratio of 1:1, 1 :3 or 1:5 (1:5: for IFN-γ measurement and analysis only) using a mesothelin-positive tumor cell line (ACC-MESO-1 or NCI-H2052) or a mesothelin-negative tumor cell line (A498), on a culture plate and then co-cultured in an incubator at 37°C. This co-culture is shown in FIG. 5. RPMI containing 10% fetal calf serum (FCS), 1% penicillin-streptomycin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 50 μM 2-ME (Gibco/Thermo Fisher Scientific Inc.) and 25 mM HEPES (Sigma-Aldrich Co. LLC). Tumor cell line surviving 2 days after the start of co-culture was measured by flow cytometry, and IFN-γ produced in the culture supernatant was measured using a commercially available IFN-γ ELISA kit (BioLegend, Inc.). The results of measuring the tumor cell line that survived 2 days after the start of co-cultivation by flow cytometry are shown in FIG. 6A-6C, and the measurement results of IFN-γ produced after co-cultivation are shown in FIG. 7A-7C. T cells not expressing CAR, IL-7 and CCL19 (uninfected) are used as controls in the analysis of T cells expressing CAR against human mesothelin IL-7/CCL19. For flow cytometry, dead cells are separated from live cells by staining with Zombie Yellow (BioLegend, Inc.) and T cells are stained with PE-labeled anti-CD45 monoclonal antibody (BioLegend, Inc.). A BD LSRFortessa X-20 flow cytometer (BD Biosciences) is used. Data was analyzed using FlowJo software (Tree Star, Inc.).

- 26 042661- 26 042661

Результаты.Results.

На фиг. 6А-6С путем совместного культивирования контрольных Т-клеток, не экспрессирующих CAR, IL-7 и CCL19 (неинфицированных), с каждой опухолевой клеткой-мишенью показано, что все опухолевые клетки-мишени пролиферируют на том же уровне, что и в лунках, где присутствует только опухоль. С другой стороны, в случае Т-клеток, экспрессирующих CAR против человеческого мезотелина-IL7/CCL19, опухолевые клетки-мишени пролиферируют, как и в лунках, содержащих только опухоль, что показано путем совместного культивирования с мезотелин-отрицательными клетками-мишенями (А498: фиг. 6С), тогда как в совместной культуре с мезотелин-положительными опухолевыми клетками (ACC-MESO-1: фиг. 6А, NCI-H2052: фиг. 6В) наблюдается явно уменьшенное число опухолевых клеток по сравнению с лунками, содержащими только мезотелин-положительные опухолевые клетки, и лунками, содержащими совместную культуру с контрольными клетками. Таким образом, подтверждено, что Т-клетки, экспрессирующие CAR против человеческого мезотелина-IL-7/CCL19, повреждают опухолевые клетки в антигенспецифической манере.In FIG. 6A-6C Co-cultivation of control T cells not expressing CAR, IL-7 and CCL19 (uninfected) with each target tumor cell showed that all target tumor cells proliferated at the same level as in the wells where only tumor is present. On the other hand, in the case of T cells expressing the anti-human mesothelin-IL7/CCL19 CAR, tumor target cells proliferate as in tumor-only wells, as shown by co-culture with mesothelin-negative target cells (A498: Fig. 6C), while in co-culture with mesothelin-positive tumor cells (ACC-MESO-1: Fig. 6A, NCI-H2052: Fig. 6B) there is a clearly reduced number of tumor cells compared to wells containing only mesothelin- positive tumor cells, and wells containing co-culture with control cells. Thus, T cells expressing the anti-human mesothelin-IL-7/CCL19 CAR were confirmed to damage tumor cells in an antigen-specific manner.

Как показано на фиг. 7А-7С, ИФА анализ IFN-γ в супернатанте после совместного культивирования также подтверждает заметную продукцию IFN-γ только в супернатанте совместного культивирования Т-клеток, экспрессирующих CAR против человеческого мезотелина-IL-7/CCL19, с мезотелинположительными опухолевыми клетками (ACC-MESO-1: фиг. 7А, NCI-H2052: фиг. 7В).As shown in FIG. 7A-7C, ELISA analysis of IFN-γ in the co-culture supernatant also confirms a marked production of IFN-γ only in the co-culture supernatant of anti-human mesothelin-IL-7/CCL19 CAR-expressing T cells with mesothelin-positive tumor cells (ACC-MESO -1: Fig. 7A, NCI-H2052: Fig. 7B).

Пример 5. Тест на цитотоксичность - 2.Example 5. Test for cytotoxicity - 2.

Тест с совместным культивированием.Co-cultivation test.

По способу, описанному в примере 4, число Т-клеток, экспрессирующих CAR против человеческого мезотелина-IL-7/CCL19 (участок scFv: VHMO(15)VLMO, VLMO(15)VHMO, VHMO(25)VLMO или VLMO(25)VHMO), или Т-клеток, не экспрессирующих CAR, IL-7 и CCL19 (нетрансфицированные клетки: отсутствие инфекции), доводят до соотношения эффектор:опухолевые клетки 1:1 или 1:3, используя линию мезотелин-положительных опухолевых клеток PAN02 или линию мезотелинотрицательных опухолевых клеток, на планшете для культивирования и затем совместно культивируют при 37°С в инкубаторе. Результаты измерения лейкоцитов или линии опухолевых клеток PAN02, выживших через 3 дня или 5 дней после начала совместного культивирования, методом проточной цитометрии, показаны на фиг. 8, а результаты измерения продуцированного IFN-γ после совместного культивирования показаны на фиг. 9. Т-клетки, экспрессирующие CAR против человеческого мезотелина, IL-7 и CCL19, используемые в данном примере и в разделе Терапевтический эффект на модели опухоли из примера 5, описанного ниже, получают по способу примера 1 (далее их называют мышиные Т-клетки, экспрессирующие CAR против человеческого мезотелина-мышиный IL-7/мышиный CCL19) с использованием в качестве ретровирусного вектора экспрессии pMSGV1 ретровирусного вектора экспрессии pMSGV1, полученного путем вставки мышиный IL-7-F2А-мышиный CCL19-F2A-HSV-TK вместо человеческий IL-7-F2A-человеческий CCL19-F2A-HSV-TK и трансмембранного участка мышиного CD8 и внутриклеточного мышиного сигнального участка CD28-4-1BB-CD3Z вместо трансмембранного участка человеческого CD8 и внутриклеточного сигнального участка человеческого CD28-4-1BB-CD3Z, с использованием в качестве Т-клеток мышиных Т-клеток, полученных из селезенки и лимфоцитов. Т-клетки, не экспрессирующие CAR, IL-7 и CCL19 (нетрансфицированные клетки: отсутствие инфекции), используемые в данном примере, получают с использованием в качестве Т-клеток мышиных Т-клеток, полученных из селезенки и лимфоцитов.According to the method described in Example 4, the number of T cells expressing the anti-human mesothelin-IL-7/CCL19 CAR (scFv region: VHMO(15)VLMO, VLMO(15)VHMO, VHMO(25)VLMO or VLMO(25) VHMO), or T cells not expressing CAR, IL-7 and CCL19 (untransfected cells: no infection), adjusted to an effector:tumor cell ratio of 1:1 or 1:3 using the PAN02 mesothelin-positive tumor cell line or mesothelin-negative tumor cells on a culture plate and then co-cultured at 37° C. in an incubator. The results of the measurement of leukocytes or PAN02 tumor cell line surviving 3 days or 5 days after the start of co-cultivation by flow cytometry are shown in FIG. 8, and the measurement results of IFN-γ produced after co-cultivation are shown in FIG. 9. T cells expressing anti-human mesothelin CAR, IL-7, and CCL19 used in this example and in the Therapeutic Effect on a Tumor Model of Example 5 section below were prepared according to the method of Example 1 (hereinafter referred to as mouse T cells). expressing anti-human mesothelin-mouse IL-7/mouse CCL19 CAR) using as retroviral expression vector pMSGV1 the retroviral expression vector pMSGV1 obtained by inserting mouse IL-7-F2A-mouse CCL19-F2A-HSV-TK instead of human IL- 7-F2A-human CCL19-F2A-HSV-TK and mouse CD8 transmembrane region and CD28-4-1BB-CD3Z intracellular mouse signaling region instead of human CD8 transmembrane region and human CD28 intracellular signaling region-4-1BB-CD3Z, using in as mouse T cells derived from spleen and lymphocytes. T cells not expressing CAR, IL-7 and CCL19 (non-transfected cells: no infection) used in this example were obtained using mouse spleen and lymphocyte-derived T cells as T cells.

Результаты.Results.

Как показано на фиг. 8, подтверждено, что мышиные Т-клетки, экспрессирующие CAR против человеческого мезотелина-мышиный IL-7/мышиный CCL19, способны повреждать опухолевые клетки. Как показано на фиг. 9, ИФА IFN-γ в супернатанте после совместного культивирования также подтверждает заметную продукцию IFN-γ только в супернатанте после совместного культивирования мышиных Т-клеток, экспрессирующих CAR против человеческого мезотелина-мышиный IL-7/мышиный CCL19, с линией опухолевых клеток PAN02.As shown in FIG. 8, mouse T cells expressing anti-human mesothelin-mouse IL-7/mouse CCL19 CAR were confirmed to be able to damage tumor cells. As shown in FIG. 9, IFN-γ ELISA in the post-coculture supernatant also confirms marked production of IFN-γ only in the supernatant after co-cultivation of mouse anti-human mesothelin-mouse IL-7/mouse CCL19 CAR-expressing T cells with the PAN02 tumor cell line.

Пример 6. Терапевтический эффект на модели опухоли - 1.Example 6. Therapeutic effect on a tumor model - 1.

Введение мышиной модели опухоли Т-клеток, экспрессирующих CAR против мышиного мезотелина-IL-7/CCL19.Introduction of a mouse tumor model of T cells expressing CAR against mouse mesothelin-IL-7/CCL19.

Всем мышам C57BL/6 в возрасте от 7 до 10 недель (приобретенным у Japan SLC, Inc.) подкожно инокулируют 5x105 клеток линии рака поджелудочной железы PAN02. На 7-й день после инокуляции мышам внутрибрюшинно вводят противораковое средство циклофосфамид (СРА, 100 мг/кг). На 10-й день внутривенно вводят 1x106 мышиных Т-клеток, экспрессирующих CAR против человеческого мезотелина-мышиный IL-7/мышиный CCL19 (участок scFv: VHMO(15)VLMO, VLMO(15)VHMO, VHMO(25)VLMO или VLMO(25)VHMO), или мышиных Т-клеток, экспрессирующих CAR против человеческого мезотелина, полученных в примере 5. Результаты выживаемости мышей, несущих VHMO(15)VLMO или VHMO(25)VLMO, показаны на фиг. 10, а результаты объемов опухолей в присутствии VHMO(15)VLMO, VLMO(15)VHMO, VHMO(25)VLMO или VLMO(25)VHMO показаны на фиг. 11. На фиг. 10 на абсциссе отмечают число дней после подкожной инокуляции PAN02 (день, когда PAN02 подAll C57BL/6 mice between 7 and 10 weeks of age (purchased from Japan SLC, Inc.) are subcutaneously inoculated with 5x105 PAN02 pancreatic cancer cells. On the 7th day after inoculation, the anti-cancer agent cyclophosphamide (CPA, 100 mg/kg) was intraperitoneally injected into mice. On day 10, 1x106 mouse T cells expressing anti-human mesothelin-mouse IL-7/mouse CCL19 CAR (scFv region: VHMO(15)VLMO, VLMO(15)VHMO, VHMO(25)VLMO or VLMO( 25)VHMO), or mouse T cells expressing the anti-human mesothelin CAR obtained in Example 5. The survival results of mice carrying VHMO(15)VLMO or VHMO(25)VLMO are shown in FIG. 10, and the results of tumor volumes in the presence of VHMO(15)VLMO, VLMO(15)VHMO, VHMO(25)VLMO, or VLMO(25)VHMO are shown in FIG. 11. In FIG. 10 on the abscissa mark the number of days after the subcutaneous inoculation of PAN02 (the day when PAN02 was under

- 27 042661 кожно вводят мышам, считают за день 0), а на ординате отмечают коэффициент выживания. На фиг. 11 абсцисса показывает число дней после подкожной инокуляции PAN02, а ордината показывает объем опухоли (большая ось опухолих(малая ось опухоли)²/2 (мм³)). Группа с отсутствием лечения получает только СРА, группа Conv. получает СРА, а затем мышиные Т-клетки, экспрессирующие CAR против человеческого мезотелина, и группа 7х19 получает СРА, а затем мышиные Т-клетки, экспрессирующие CAR против человеческого мезотелина-мышиный IL-7/мышиный CCL19. Мышиные Т-клетки, экспрессирующие CAR против человеческого мезотелина получают по способу, описанному в примере 1, за исключением того, что в способе получения Т-клеток, экспрессирующих CAR против человеческого мезотелина, описанном в примере 1, ретровирусный вектор экспрессии pMSGV1, полученный в результате вставки HSV-TK вместо человеческого IL-7-F2А-человеческого CCL19-F2A-HSV-TK и трансмембранного участка мышиного CD8 и внутриклеточного сигнального мышиного участка CD28-4-1BBCD3Z вместо человеческого трансмембранного участка CD8 и внутриклеточного сигнального участка человеческого CD28-4-1BB-CD3Z используют в качестве ретровирусного вектора экспрессии pMSGV1, a в качестве Т-клеток используют мышиные Т-клетки, полученные из селезенки и лимфоцитов.- 27 042661 skin injected into mice, count for day 0), and on the ordinate note the survival rate. In FIG. 11, the abscissa shows the number of days after subcutaneous PAN02 inoculation, and the ordinate shows the tumor volume (major tumor axis (tumor minor axis) ^2/2 (mm ³ )). The no-treatment group receives only CPA, the Conv. receives CPA followed by mouse T cells expressing anti-human mesothelin CAR and the 7x19 group receives CPA followed by mouse T cells expressing anti-human mesothelin CAR-mouse IL-7/mouse CCL19. Mouse T cells expressing the anti-human mesothelin CAR are obtained by the method described in Example 1, except that in the method for obtaining T cells expressing the anti-human mesothelin CAR described in Example 1, the pMSGV1 retroviral expression vector obtained HSV-TK inserts instead of human IL-7-F2A-human CCL19-F2A-HSV-TK and mouse CD8 transmembrane region and mouse CD28-4-1BBCD3Z intracellular signaling region instead of human CD8 transmembrane region and human CD28-4-1BB intracellular signaling region -CD3Z is used as the pMSGV1 retroviral expression vector, and mouse T cells derived from spleen and lymphocytes are used as T cells.

Результаты.Results.

Как показано на фиг. 10, обнаружено, что введение Т-клеток, экспрессирующих CAR против человеческого мезотелина-IL-7/CCL19 по настоящему изобретению, значительно повышает выживаемость. Как показано на фиг. 11, обнаружено, что введение Т-клеток, экспрессирующих CAR против человеческого мезотелина-IL-7/CCL19, очевидным образом подавляет рост опухоли. Данный результат демонстрирует, что Т-клетки, экспрессирующие CAR против человеческого мезотелина-IL-7/CCL19, обладают превосходной противоопухолевой активностью на мышиной модели опухоли.As shown in FIG. 10, administration of T cells expressing the anti-human mesothelin-IL-7/CCL19 CAR of the present invention was found to significantly improve survival. As shown in FIG. 11, administration of anti-human mesothelin-IL-7/CCL19 CAR-expressing T cells was found to clearly suppress tumor growth. This result demonstrates that T cells expressing the anti-human mesothelin-IL-7/CCL19 CAR have excellent antitumor activity in a mouse tumor model.

Пример 7. Терапевтический эффект на модели опухоли - 2.Example 7. Therapeutic effect on a tumor model - 2.

Обнаружено, что Т-клетки, экспрессирующие CAR против человеческого мезотелина-IL-7/CCL19, обладают превосходной противоопухолевой активностью. Чтобы подтвердить более длительные противоопухолевые эффекты и противоопухолевое действие на рак, отличный от рака поджелудочной железы, линию клеток злокачественной мезотелиомы плевры вводят мышам с ослабленным иммунитетом для развития опухоли. Затем регистрируют наличие или отсутствие рецидива опухоли в течение 143 дней после введения или в отсутствии введения Т-клеток, экспрессирующих CAR против человеческого мезотелина-IL-7/CCL19. В данном примере используют описанные ниже способ получения линии ACC-MESO-1-GFP-Luc и способ активации Т-клеток.T cells expressing anti-human mesothelin-IL-7/CCL19 CAR have been found to have excellent antitumor activity. In order to confirm longer lasting antitumor effects and antitumor effect on cancers other than pancreatic cancer, a pleural malignant mesothelioma cell line is administered to immunocompromised mice for tumor development. Then register the presence or absence of tumor recurrence within 143 days after injection or in the absence of injection of T-cells expressing CAR against human mesothelin-IL-7/CCL19. In this example, the ACC-MESO-1-GFP-Luc line production method and T cell activation method described below are used.

Получение линии ACC-MESO-1-GFP-Luc.Obtaining the line ACC-MESO-1-GFP-Luc.

Ген зеленого флуоресцентного белка-люциферазы (GFP-Luc) вводят с использованием лентивируса в линию клеток злокачественной мезотелиомы человека ACC-MESO-1, которая представляет собой линию клеток мезотелин-положительной опухоли, любезно предоставленную доктором Йошитака Сэкидо из Исследовательского института Онкологического центра Айти.The green fluorescent luciferase protein (GFP-Luc) gene is introduced using lentivirus into the human malignant mesothelioma cell line ACC-MESO-1, which is a mesothelin-positive tumor cell line kindly provided by Dr. Yoshitaka Sekido of the Aichi Cancer Center Research Institute.

В 0 день ACC-MESO-1 высевают в количестве 1х10³ клеток/лунку в 96-луночный планшет. В качестве среды используют RPMI1640 (Gibco/Thermo Fisher Scientific Inc.), содержащую 10% FBS. В 1 день начинают трансдукцию путем добавления RediFect Red-FLuc-GFP (PerkinElmer, Inc.) частиц лентивируса для получения светоизлучающих клеток, при MOI 100. В данной связи в среду добавляют гексадиметрина бромид (Sigma-Aldrich Co., LLC) в концентрации 4 мкг/мл (конечная концентрация), чтобы повысить эффективность трансфекции. Через 24 ч после добавления вируса (во 2 день) среду, содержащую вирус, удаляют с последующей заменой среды. Культивирование продолжают и затем сортируют только клетки, экспрессирующие GFP, с использованием SH800 (Sony Corp.) с получением ACC-MESO-1, экспрессирующих GFP, т.е. ACC-MESO-1-GFP-Luc.On day 0, ACC-MESO-1 was plated at 1 x 10 ³ cells/well in a 96-well plate. The medium used was RPMI1640 (Gibco/Thermo Fisher Scientific Inc.) containing 10% FBS. On day 1, transduction is started by adding RediFect Red-FLuc-GFP (PerkinElmer, Inc.) lentivirus particles to produce light-emitting cells, at an MOI of 100. In this regard, hexadimethrin bromide (Sigma-Aldrich Co., LLC) is added to the medium at a concentration of 4 µg/ml (final concentration) to improve transfection efficiency. 24 hours after the addition of the virus (on day 2), the medium containing the virus is removed, followed by replacement of the medium. The culture is continued and then only cells expressing GFP are sorted using SH800 (Sony Corp.) to obtain ACC-MESO-1 expressing GFP, ie. ACC-MESO-1-GFP-Luc.

Получение Т-клетки, экспрессирующей CAR против человеческого мезотелина-IL-7-CCL19, и Т-клетки, экспрессирующей CAR против человеческого мезотелинаPreparation of a T cell expressing the anti-human mesothelin-IL-7-CCL19 CAR and a T cell expressing the anti-human mesothelin CAR

В данном примере 7 вектор экспрессии IL-7/CCL19- CAR против человеческого мезотелина (содержащий участок scFv, замененный фрагментом VL07(15)VL07, и сигнальный пептид Т, описанный в SEQ ID NO: 11, в качестве сигнального пептида), или Conv. вектор, экспрессирующий CAR против человеческого мезотелина (содержащий участок scFv, замененный фрагментом VL07(15)VL07, и сигнальный пептид Т, описанный в SEQ ID NO: 11, в качестве сигнального пептида), полученный в примере 1.In this example, 7 the anti-human mesothelin IL-7/CCL19-CAR expression vector (comprising the scFv region replaced by the VL07(15)VL07 fragment and the T signal peptide described in SEQ ID NO: 11 as the signal peptide), or Conv . a vector expressing the anti-human mesothelin CAR (comprising the scFv region replaced by the VL07(15)VL07 fragment and the T signal peptide described in SEQ ID NO: 11 as the signal peptide) obtained in Example 1.

Активация Т-клетки.T cell activation.

В день 0 начинают культивирование 2х10⁶ мононуклеарных клеток периферической крови, собранных у здорового донора, в присутствии IL-2 (PeproTech, Inc.) в инкубаторе при 37°С и 5% СО₂ на 6-луночном планшете для культивирования клеток, на котором иммобилизованы RetroNectin (Takara Bio Inc.), 25 мкл/мл, и моноклональное антитело против человеческого CD3 (Invitrogen Corp.), 5 мкг/мл. В качестве культурального раствора используют OpTmizer CTS (Gibco/Thermo Fisher Scientific Inc.), содержащий 2 мМ L-глутамина (Gibco/Thermo Fisher Scientific Inc.), 1% пенициллина-стрептомицина (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) и 2,5 мкг/мл фунгизона (Bristol-Myers Squibb Company). Клетки культивируют в течение 3 дней. На 3-й день морфологическое изменение Т-клеток, вызванное активацией, подтверждают с помощью микроскопа и получают активированные Т-клетки.On day 0, culture of 2×10 ⁶ peripheral blood mononuclear cells harvested from a healthy donor begins in the presence of IL-2 (PeproTech, Inc.) in an incubator at 37°C and 5% CO ₂ on a 6-well cell culture plate, on which RetroNectin (Takara Bio Inc.), 25 μl/ml, and anti-human CD3 monoclonal antibody (Invitrogen Corp.), 5 μg/ml were immobilized. OpTmizer CTS (Gibco/Thermo Fisher Scientific Inc.) containing 2 mM L-glutamine (Gibco/Thermo Fisher Scientific Inc.), 1% penicillin-streptomycin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 2, 5 μg/ml fungizone (Bristol-Myers Squibb Company). Cells are cultured for 3 days. On the 3rd day, the morphological change of T cells caused by activation is confirmed by microscope and activated T cells are obtained.

--

Claims (15)

Наблюдение рецидива опухоли.Observation of tumor recurrence. В 0 день сначала самкам мышей NSG с ослабленным иммунитетом возрастом 8-недель внутриплеврально вводят ACC-MESO-1-GFP-Luc в количестве 2x10⁶ клеток/мышь. В 1-й день приживление опухоли в плевральной полости подтверждают с использованием системы визуализации in vivo (IVIS). В 1 день Т-клетки, экспрессирующие CAR против человеческого мезотелина, и Т-клетки, экспрессирующие CAR против человеческого мезотелина-IL-7-CCL19 (участок scFv: VH07(15)VL07), получают по способу примера 1 и затем замораживают, а Т-клетки, активированные описанным выше способом, оттаивают. Т-клетки, экспрессирующие CAR против человеческого мезотелина, и Т-клетки, экспрессирующие CAR против человеческого мезотелина-IL-7-CCL19, характеризуются степенью экспрессии CAR 49,6 и 32,5% соответственно. Следовательно, активированные Т-клетки добавляют к Т-клеткам, экспрессирующим CAR против человеческого мезотелина, чтобы уравнять степени экспрессии CAR. Затем животных распределяют в группу, получающую 1x105 Т-клеток, экспрессирующих CAR против человеческого мезотелина (N=5), и в группу, получающую 1x105 Т-клеток, экспрессирующих CAR против человеческого мезотелина-IL-7-CCL19 (N=5). Введение Т-клеток, экспрессирующих CAR против человеческого мезотелина, и Т-клеток, экспрессирующих CAR против человеческого мезотелина-ГЕ-7CCL19, проводят путем внутривенного введения через хвостовую вену. На 3-й и последующие дни измеряют интенсивность флуоресценции опухоли (общий поток (фотонов/с)) с использованием IVIS. Результаты показаны на фиг. 12А и 12В. Зависимость выживаемости мышей от числа дней после введения показана в виде графика на фиг. 13, а зависимость общего количества флуоресценции (фотонов/с) от числа дней после введения показана в виде графика на фиг. 14. На фиг. 12А, 12В, 13 и 14 мыши, которые получают Т-клетки, экспрессирующие CAR против человеческого мезотелина-IL-7-CCL19, показаны как 7x19 CAR-T, а мыши, которые получают Т-клетки, экспрессирующие CAR против человеческого мезотелина, показаны как стандартные CAR-T. В этом примере 7 влияние эндогенных Т-клеток реципиентов исключается, поскольку в качестве реципиентов используют мышей NSG с ослабленным иммунитетом, характеризующихся дефицитом эндогенных Т-клеток. Таким образом, оценивают эффекты именно введенных Т-клеток, экспрессирующих CAR против человеческого мезотелина-IL-7-CCL19.On day 0, 8-week-old immunocompromised female NSG mice were first treated intrapleurally with ACC-MESO-1-GFP-Luc at 2x10 ⁶ cells/mouse. On day 1, engraftment of the tumor in the pleural space is confirmed using an in vivo imaging system (IVIS). On day 1, T cells expressing the anti-human mesothelin CAR and T cells expressing the anti-human mesothelin-IL-7-CCL19 CAR (scFv region: VH07(15)VL07) were prepared according to the method of Example 1 and then frozen, and T cells activated in the manner described above are thawed. T cells expressing the anti-human mesothelin CAR and T cells expressing the anti-human mesothelin-IL-7-CCL19 CAR have a CAR expression rate of 49.6% and 32.5%, respectively. Therefore, activated T cells are added to T cells expressing anti-human mesothelin CAR to equalize the levels of CAR expression. Animals were then assigned to a group receiving 1x105 T cells expressing the anti-human mesothelin CAR (N=5) and to a group receiving 1x105 T cells expressing the anti-human mesothelin-IL-7-CCL19 CAR (N=5). Administration of T cells expressing the anti-human mesothelin CAR and T cells expressing the anti-human mesothelin-GE-7CCL19 CAR is done by intravenous administration through the tail vein. On day 3 and following, tumor fluorescence intensity (total flux (photons/s)) is measured using IVIS. The results are shown in FIG. 12A and 12V. The survival of mice as a function of the number of days after administration is shown graphically in FIG. 13 and total fluorescence (photons/s) versus number of days after administration is plotted in FIG. 14. In FIG. 12A, 12B, 13 and 14, mice that receive T cells expressing anti-human mesothelin-IL-7-CCL19 CAR are shown as 7x19 CAR-T, and mice that receive T cells expressing anti-human mesothelin CAR are shown. like standard CAR-Ts. In this example 7, the influence of endogenous T cells of the recipients is eliminated because the recipients used are immunocompromised NSG mice characterized by a deficiency of endogenous T cells. Thus, the effects of exactly the introduced T cells expressing the anti-human mesothelin-IL-7-CCL19 CAR are evaluated. Как показано на фиг. 12А, 12В, 13 и 14, интенсивность флуоресценции опухоли редко наблюдается как у 7x19 CAR-T, так и у стандартных CAR-T на 21-й день. Флуоресценция опухоли не наблюдается у 7x19 CAR-T вплоть до 143 дня, что подтверждает полное подавление рецидива. С другой стороны, флуоресценция опухоли наблюдается у стандартных CAR-T примерно с 45 дня, причем интенсивность флуоресценции опухоли повышается на 115 день: одна мышь умерла на 129 день, а остальные четыре мыши умерли на 143 день. Данный результат свидетельствует о том, что введенные Т-клетки, экспрессирующие CAR-IL-7-CCL19 обладают цитотоксической активностью не только против рака поджелудочной железы, но и против раковых клеток (например, клеток злокачественной плевральной мезотелиомы человека), экспрессирующих человеческий мезотелин, и оказывают долгосрочные противоопухолевые эффекты.As shown in FIG. 12A, 12B, 13 and 14, tumor fluorescence intensity is rarely observed in both 7x19 CAR-T and standard CAR-T on day 21. Tumor fluorescence is not observed in 7x19 CAR-T up to day 143, which confirms the complete suppression of recurrence. On the other hand, tumor fluorescence is observed in standard CAR-Ts from around day 45, with tumor fluorescence increasing at day 115: one mouse died on day 129 and the remaining four mice died on day 143. This result indicates that the injected T cells expressing CAR-IL-7-CCL19 have cytotoxic activity not only against pancreatic cancer, but also against cancer cells (for example, human malignant pleural mesothelioma cells) expressing human mesothelin, and have long-term antitumor effects. Настоящая заявка основана на патентной заявке Японии № 2017-247109, поданной 24 декабря 2017 г., содержание которой полностью включено в настоящий документ.This application is based on Japanese Patent Application No. 2017-247109, filed December 24, 2017, the contents of which are incorporated herein in their entirety. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM 1. Иммунокомпетентная клетка, которая экспрессирует химерный рецептор антигена (CAR), специфически распознающий человеческий мезотелин, интерлейкин 7 (IL-7) и лиганд 19 хемокина (мотив С-С) (CCL19), где CAR содержит одноцепочечное антитело, трансмембранный участок и сигнальный участок, который индуцирует активацию иммунокомпетентной клетки, где одноцепочечное антитело в CAR представляет собой (1-1) одноцепочечное антитело, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит CDR1 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 13, CDR2 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 14, и CDR3 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 15, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит CDR1 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 16, CDR2 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 17, и CDR3 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 18.1. An immunocompetent cell that expresses a chimeric antigen receptor (CAR) that specifically recognizes human mesothelin, interleukin 7 (IL-7) and chemokine ligand 19 (C-C motif) (CCL19), where CAR contains a single-chain antibody, a transmembrane region and a signal a region that induces activation of an immunocompetent cell, wherein the single chain antibody in CAR is a (1-1) single chain antibody containing a heavy chain variable region that contains a heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 13, heavy chain CDR2 chain, consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 14, and a heavy chain CDR3, consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 15, and a light chain variable region, which contains a light chain CDR1, consisting of the amino acid sequence, described in SEQ ID NO: 16, a light chain CDR2 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 17, and a light chain CDR3 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 18. 2. Иммунокомпетентная клетка по п.1, где иммунокомпетентная клетка представляет собой иммунокомпетентную клетку, выделенную из живого организма.2. An immunocompetent cell according to claim 1, wherein the immunocompetent cell is an immunocompetent cell isolated from a living organism. 3. Иммунокомпетентная клетка по п.1 или 2, где иммунокомпетентная клетка содержит экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, специфически распознающий человеческий мезотелин, экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19.3. An immunocompetent cell according to claim 1 or 2, wherein the immunocompetent cell comprises an exogenous nucleic acid encoding a CAR specifically recognizing human mesothelin, an exogenous nucleic acid encoding IL-7, and an exogenous nucleic acid encoding CCL19. 4. Иммунокомпетентная клетка по п.3, где экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, и эк-4. An immunocompetent cell according to claim 3, where the exogenous nucleic acid encoding IL-7 and - 29 042661 зогенная нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, представляют собой экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую человеческий IL-7, и экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую человеческий- 29 042661 sogenic nucleic acid encoding CCL19 are an exogenous nucleic acid encoding human IL-7 and an exogenous nucleic acid encoding human CCL19.CCL19. 5. Иммунокомпетентная клетка по п.4, где экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая CAR, специфически распознающий человеческий мезотелин, экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий IL-7, и экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий CCL19, интегрируются в геном.5. An immunocompetent cell according to claim 4, wherein the exogenous nucleic acid encoding a CAR specifically recognizing human mesothelin, the exogenous nucleic acid encoding human IL-7, and the exogenous nucleic acid encoding human CCL19 are integrated into the genome. 6. Иммунокомпетентная клетка по любому из пп.1-5, где одноцепочечное антитело, входящее в состав CAR, представляет собой одноцепочечное антитело, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, на 85% или более идентичной аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1, и содержит CDR1 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 13, CDR2 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 14, и CDR3 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 15, и вариабельный участок легкой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, на 85% или более идентичной аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 2, и содержит CDR1 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 19, CDR2 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 17, и CDR3 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 18.6. An immunocompetent cell according to any one of claims 1 to 5, wherein the single chain antibody constituting the CAR is a single chain antibody containing a heavy chain variable region that consists of an amino acid sequence that is 85% or more identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, and contains a heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 13, a heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 14, and a heavy chain CDR3 consisting of the amino acid the sequence described in SEQ ID NO: 15, and a light chain variable region, which consists of an amino acid sequence 85% or more identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, and contains a light chain CDR1 consisting of the amino acid sequence, described in SEQ ID NO: 19, a light chain CDR2 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 17, and a light chain CDR3 consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 18. 7. Иммунокомпетентная клетка по любому из пп.1-6, где одноцепочечное антитело, входящее в состав CAR, представляет собой (1-3) одноцепочечное антитело, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1, и вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 2.7. An immunocompetent cell according to any one of claims 1-6, wherein the single chain antibody constituting the CAR is (1-3) a single chain antibody containing a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 , and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2. 8. Иммунокомпетентная клетка по любому из пп.1-7, где трансмембранный участок CAR содержит аминокислотную последовательность, на 85% или более идентичную аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 7, и содержит полипептид, активность которого эквивалентна активности аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 7.8. An immunocompetent cell according to any one of claims 1 to 7, wherein the CAR transmembrane region contains an amino acid sequence that is 85% or more identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 7, and contains a polypeptide whose activity is equivalent to that of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 7. 9. Иммунокомпетентная клетка по любому из пп.1-8, где сигнальный участок, который индуцирует активацию иммунокомпетентной клетки в CAR, содержит (i) полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, обладающую 85% или более идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, описанной в SEQ ID NO: 9, и имеет активность, эквивалентную активности аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 9, или полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности, полученной из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 9, путем делеции, замены, вставки и/или добавления одной или нескольких аминокислот, и обладает активностью, эквивалентной активности аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 9; и (ii) полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, обладающую 85% или более идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, описанной в SEQ ID NO: 10, и имеет активность, эквивалентную активности аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 10, или полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности, полученной из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 10, путем делеции, замены, вставки и/или добавления одной или нескольких аминокислот, и обладает активностью, эквивалентной активности аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 10.9. An immunocompetent cell according to any one of claims 1 to 8, wherein the signaling region that induces activation of the immunocompetent cell in the CAR comprises (i) a polypeptide that contains an amino acid sequence having 85% or more sequence identity with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 9, and has an activity equivalent to that of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 9, or a polypeptide that consists of an amino acid sequence derived from the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 9, by deletion, substitution, insertion and/or adding one or more amino acids, and has an activity equivalent to that of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 9; and (ii) a polypeptide that contains an amino acid sequence having 85% or more sequence identity with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 10 and has an activity equivalent to that of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 10, or a polypeptide, which consists of an amino acid sequence derived from the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 10 by deletion, substitution, insertion and/or addition of one or more amino acids, and has an activity equivalent to that of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 10 . 10. Иммунокомпетентная клетка по п.9, где сигнальный участок, который индуцирует активацию иммунокомпетентной клетки, входящий в состав CAR, дополнительно содержит аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 8.10. The immunocompetent cell according to claim 9, wherein the signaling region that induces the activation of the immunocompetent cell, which is part of the CAR, additionally contains the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 8. 11. Иммунокомпетентная клетка по любому из пп.1-10, где вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи соединены пептидным линкером, последовательность которого содержит от 2 до 30 аминокислот.11. An immunocompetent cell according to any one of claims 1 to 10, wherein the heavy chain variable region and the light chain variable region are connected by a peptide linker, the sequence of which contains from 2 to 30 amino acids. 12. Иммунокомпетентная клетка по п.11, где пептидный линкер состоит из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 26 или SEQ ID NO: 27.12. An immunocompetent cell according to claim 11, wherein the peptide linker consists of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 26 or SEQ ID NO: 27. 13. Иммунокомпетентная клетка по любому из пп.1-12, где вариабельный участок легкой цепи расположен на стороне С-конца вариабельной области тяжелой цепи.13. An immunocompetent cell according to any one of claims 1 to 12, wherein the light chain variable region is located on the C-terminal side of the heavy chain variable region. 14. Иммунокомпетентная клетка по любому из пп.6-13, где одноцепочечное антитело, входящее в состав CAR, представляет собой одноцепочечное антитело, последовательно содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1, пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 26, и вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 2.14. An immunocompetent cell according to any one of claims 6 to 13, wherein the single chain antibody constituting the CAR is a single chain antibody sequentially containing a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, a peptide linker, consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 26 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2. 15. Иммунокомпетентная клетка по любому из пп.1-14, где сигнальный участок, который индуцирует активацию иммунокомпетентной клетки, входящий в состав CAR, содержит полипептид внутриклеточного участка 4-1ВВ, и полипептид внутриклеточного участка CD3Z.15. An immunocompetent cell according to any one of claims 1 to 14, wherein the signaling region that induces the activation of the immunocompetent cell, which is part of the CAR, contains a 4-1BB intracellular region polypeptide and a CD3Z intracellular region polypeptide. --