EA042625B1

EA042625B1 - PROSTAGLANDIN F2ALFA DERIVATIVES FOR REDUCING INTRAOCULAR PRESSURE

Info

Publication number: EA042625B1
Application number: EA202092736
Authority: EA
Inventors: Владимир Виленович Безуглов; Игорь Викторович Серков; Игорь Иванович Любимов; Наталья Михайловна Грецкая
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "Гурус БиоФарм"
Priority date: 2018-05-17
Filing date: 2019-05-15
Publication date: 2023-03-06

Description

Изобретение относится к медицинской химии, конкретно - к новым биологически активным соединениям - амидным производным простагландина F_2a.The invention relates to medicinal chemistry, specifically to new biologically active compounds - amide derivatives of prostaglandin F _2a .

Простагландины представляют собой семейство полифункциональных биологически активных веществ, синтезируемых в организме из арахидоновой кислоты с помощью циклооксигеназы (COX). Эти окисленные жирные кислоты являются аутокринными и паракринными липидными медиаторами, и для них характерно проявление широкого спектра физиологической активности, например сочетание дилататорной (на гладких мышцах бронхов), констрикторной (на гладких мышцах желудочно-кишечного тракта), антиагрегационной (на тромбоцитах), гипо- или гипертензивной активностей [Nicolau A. In: Bioactive Lipids (Eds. Nicolau A., Kokotos J.) // Bridgewater: Oily Press, 2004. - 197 p]. Простагландин F_2a образуется в организме в результате окислительного метаболизма арахидоновой кислоты под действием циклоксигеназы на первой стадии и редуктазы - на второй стадии биосинтеза [Smith W.L., Marnett L.J., DeWitt D.L. Prostaglandin and thromboxane biosynthesis // Pharmacology & Therapeutics. 1991, V. 49(3), P. 153-179]. Он является эндогенным лигандом G-белок сопряженного рецептора FP, активация которого приводит к мобилизации внутриклеточного кальция [Toh H, Ichikawa A, Narumiya S. Molecular evolution of receptors for eicosanoids. // FEBS Lett. 1995, V. 361, P. 17-21].Prostaglandins are a family of polyfunctional biologically active substances synthesized in the body from arachidonic acid using cyclooxygenase (COX). These oxidized fatty acids are autocrine and paracrine lipid mediators, and they are characterized by a wide range of physiological activity, for example, a combination of dilator (on the smooth muscles of the bronchi), constrictor (on the smooth muscles of the gastrointestinal tract), antiaggregation (on platelets), hypo- or hypertensive activities [Nicolau A. In: Bioactive Lipids (Eds. Nicolau A., Kokotos J.) // Bridgewater: Oily Press, 2004. - 197 p]. Prostaglandin F _2a is formed in the body as a result of the oxidative metabolism of arachidonic acid under the action of cyclooxygenase in the first stage and reductase in the second stage of biosynthesis [Smith WL, Marnett LJ, DeWitt DL Prostaglandin and thromboxane biosynthesis // Pharmacology & Therapeutics. 1991, V. 49(3), P. 153-179]. It is an endogenous ligand of the G-protein coupled FP receptor, the activation of which leads to the mobilization of intracellular calcium [Toh H, Ichikawa A, Narumiya S. Molecular evolution of receptors for eicosanoids. // FEBS Lett. 1995, V. 361, P. 17-21].

Простагландины используются при лечении гипертензии, тромбозов, астмы, желудочных и кишечных язв, профилактики атеросклероза, а также в акушерстве. Агонисты FP-рецептора используются в клинике как агенты, снижающие внутриглазное давление [Woodward D.F., Lawrence R.A., Fairbairn C.E., Shan T., Williams L.S. Intraocular pressure effects of selective prostanoid receptor agonists involve different receptor subtypes according to radioligand binding studies. // J Lipid Mediat. 1993, V. 6(1-3), P. 545-553.]Prostaglandins are used in the treatment of hypertension, thrombosis, asthma, gastric and intestinal ulcers, the prevention of atherosclerosis, and in obstetrics. FP receptor agonists are used clinically as intraocular pressure lowering agents [Woodward D.F., Lawrence R.A., Fairbairn C.E., Shan T., Williams L.S. Intraocular pressure effects of selective prostanoid receptor agonists involve different receptor subtypes according to radioligand binding studies. // J Lipid Mediat. 1993, V. 6(1-3), P. 545-553.]

Простамиды (амиды простагландинов и этаноламида) образуются в организме путём окисления этаноламида арахидоновой кислоты (анандамида) циклооксигеназой-2 [Kozak K.R., Crews B.C., Ray J.L., Tai H.H., Morrow J.D., Marnett L.J. Metabolism of prostaglandin glycerol esters and prostaglandin ethanolamides in vitro and in vivo. // J. Biol. Chem. 2001, V.276(40), P. 36993-36998]. Оказалось, что эти производные также обладают способностью снижать внутриглазное давление. Наиболее известным препаратом этого класса является синтетический аналог простамида F2 - биматопрост, в котором остаток этаноламина заменен на остаток этиламина, а алкильная боковая цепь простамида модифицирована введением фенильного радикала [Woodward D.F., Krauss A.H., Chen J., Lai R.K., Spada C.S., Burk R.M., Andrews S.W., Shi L., Liang Y., Kedzie K.M., Chen R., Gil D.W., Kharlamb A., Archeampong A., Ling J., Madhu C., Ni J., Rix P., Usansky J., Usansky H., Weber A., Welty D., Yang W., Tang-Liu D.D., Garst M.E., Brar B., Wheeler L.A., Kaplan L.J. The pharmacology of bimatoprost (Lumigan) // Surv. Ophthalmol. 2001, V.45, Suppl 4, P. S337-S345].Prostamids (amides of prostaglandins and ethanolamide) are formed in the body by oxidation of arachidonic acid ethanolamide (anandamide) by cyclooxygenase-2 [Kozak K.R., Crews B.C., Ray J.L., Tai H.H., Morrow J.D., Marnett L.J. Metabolism of prostaglandin glycerol esters and prostaglandin ethanolamides in vitro and in vivo. // J. Biol. Chem. 2001, V.276(40), P. 36993-36998]. It turned out that these derivatives also have the ability to reduce intraocular pressure. The most famous drug of this class is a synthetic analogue of prostamide F2 - bimatoprost, in which the ethanolamine residue is replaced by an ethylamine residue, and the alkyl side chain of prostamide is modified by introducing a phenyl radical [Woodward D.F., Krauss A.H., Chen J., Lai R.K., Spada C.S., Burk R.M. , Andrews S.W., Shi L., Liang Y., Kedzie K.M., Chen R., Gil D.W., Kharlamb A., Archeampong A., Ling J., Madhu C., Ni J., Rix P., Usansky J., Usansky H., Weber A., Welty D., Yang W., Tang-Liu D.D., Garst M.E., Brar B., Wheeler L.A., Kaplan L.J. The pharmacology of bimatoprost (Lumigan) // Surv. Ophthalmol. 2001, V.45, Suppl 4, P. S337-S345].

Известны многочисленные аналоги простамидов, в которых модифицированы как простаноидная часть молекулы, так и этаноламидная. Наиболее близкими к заявляемым соединениям являются простамиды, обладающие нейрозащитным действием [Безуглов В.В., Бобров М.Ю., Грецкая Н.М., Серков И.В., Зинченко Г.Н., Акимов М.Г. Простамиды и их аналоги, обладающие нейрозащитным действием. / Патент РФ № 2474426, приоритет от 26.12.2011, публикация 10.02.2013, Бюл. № 4]. В данном патенте описаны аналоги простамида E, содержащие остатки нитроксиэтиламина, глицина, гамма-аминомасляной кислоты, гидроксиэтиламина, тирамина и дофамина. Однако в данном патенте нет описания аналогов простамида F, содержащего такие же модифицированные остатки этаноламина.Numerous analogues of prostamides are known, in which both the prostanoid part of the molecule and the ethanolamide part of the molecule are modified. Closest to the claimed compounds are prostamides with a neuroprotective effect [Bezuglov V.V., Bobrov M.Yu., Gretskaya N.M., Serkov I.V., Zinchenko G.N., Akimov M.G. Prostamids and their analogues with neuroprotective action. / Patent of the Russian Federation No. 2474426, priority dated December 26, 2011, publication February 10, 2013, Bull. No. 4]. This patent describes prostamide E analogues containing nitroxyethylamine, glycine, gamma-aminobutyric acid, hydroxyethylamine, tyramine and dopamine residues. However, this patent does not describe analogs of prostamide F containing the same modified ethanolamine residues.

Известны также аналоги простагландина F_2a, например патент [US Pat. № 7910767], в котором описаны эфиры, тиоэфиры и амиды простагландина F_2a с измененной алкильной боковой цепью, обладающие изменённой биологической активностью по сравнению с известными аналогами простагландина F_2a, применяемыми в медицине (биматопростом, травопростом и др.).Analogues of prostaglandin F _2a are also known, for example the patent [US Pat. No. 7910767], which describes esters, thioethers and amides of prostaglandin F _2a with an altered alkyl side chain, which have an altered biological activity compared to known analogs of prostaglandin F _2a used in medicine (bimatoprost, travoprost, etc.).

Известны также аналоги простагландина F_2a, содержащие нитроксигруппы.Analogues of prostaglandin F _2a containing nitroxy groups are also known.

US. Pat. № 5625083 описывает динитроглицериновые эфиры простагландинов, в том числе и простагландина F_2a, которые могут быть использованы как вазодилататоры, антигипертензивные агенты или бронходилататоры.US. Pat. No. 5625083 describes dinitroglycerol esters of prostaglandins, including prostaglandin F _2a that can be used as vasodilators, antihypertensive agents or bronchodilators.

US. Pat. № 8101658 описывает простамиды, генерирующие оксид азота, которые могут быть использованы для лечения глаукомы и повышенного внутриглазного давления.US. Pat. No. 8101658 describes prostamides that generate nitric oxide, which can be used to treat glaucoma and increased intraocular pressure.

Однако данные изобретения не содержат структур, раскрываемых в настоящем изобретении.However, these inventions do not contain the structures disclosed in the present invention.

Задача данного изобретения - расширение номенклатуры биологически активных производных простагландина F_2a, обладающих способностью понижать внутриглазное давление. Поставленная задача решается путём синтеза амидных производных простагландина F_2a, в которых амидная часть представлена аминокислотами, их нитропроизводными, циклическими аминами и замещенными этаноламинами.The objective of this invention is to expand the range of biologically active derivatives of prostaglandin F _2a with the ability to lower intraocular pressure. The problem is solved by the synthesis of amide derivatives of prostaglandin F _2a , in which the amide part is represented by amino acids, their nitro derivatives, cyclic amines and substituted ethanolamines.

Таким образом, объектом данного изобретения являются амидные производные простагландина F_2aобщей формулы (1)Thus, the object of this invention are the amide derivatives of prostaglandin F _2a of General formula (1)

- 1 042625- 1 042625

где R1=H, R²= , где n=1-4; илиwhere R1=H, R ² = where n=1-4; or

R1=H, R²=R1=H, ^R2 =

, где R³=CHMe₂, HNCH₂CH₂ONO₂, OCH₂CH₂ONO₂, OCH(CH₂ONO₂)₂; или или, where R ³ =CHMe ₂ , HNCH ₂ CH ₂ ONO ₂ , OCH ₂ CH ₂ ONO ₂ , OCH(CH ₂ ONO ₂ ) ₂ ; or or

, где R⁴=H, CHMe2; R⁵=H, OH; R⁶=H, OH, ONO2, CH2OH,, where R ⁴ =H, CHMe2; R ⁵ =H, OH; R ⁶ \u003d H, OH, ONO2, CH2OH,

CH2ONO2; илиCH2ONO2; or

R¹=H; R²=CH2CH2OC(O)NHCH2CH2ONO2; илиR ¹ =H; R ² =CH2CH2OC(O)NHCH2CH2ONO2; or

R1=H; R²=CH2CH2OC(O)OCH(CH2ONO2)2; илиR1=H; R ² =CH2CH2OC(O)OCH(CH2ONO2)2; or

-¾-¾

NR1R²=HO^ , где n=1, 2, где R¹ и R² независимо означают водород, алкил, циклоалкил, гидроксиалкил, аминокислоты, эфиры и амиды аминокислот, а также R¹ + R² могут означать гетероцикл (например, замещенный или неза мещенный пиперидин, пирролидин и др.);NR1R ² =HO^ where n=1, 2, where R ¹ and R ² are independently hydrogen, alkyl, cycloalkyl, hydroxyalkyl, amino acids, esters, and amino amides, and R ¹ + R ² may be a heterocycle (e.g., substituted or unsubstituted piperidine, pyrrolidine, etc.);

а также фармацевтически приемлемые соли для соединений общей формулы (1) со свободной карбоксильной группой; а также смеси двух или более соединений общей формулы (1) в различных соотно шениях.as well as pharmaceutically acceptable salts for compounds of general formula (1) with a free carboxyl group; as well as mixtures of two or more compounds of general formula (1) in various ratios.

Данные вещества обладают низкой цитотоксичностью и способны стимулировать образование эндогенного оксида азота в клетках млекопитающих.These substances have low cytotoxicity and are able to stimulate the formation of endogenous nitric oxide in mammalian cells.

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют тот же смысл, который общепринят в области, к которой принадлежит изобретение, и может быть понят специалистом, имеющим соответствующие навыки.Unless otherwise indicated, all technical and scientific terms used in this document have the same meaning that is generally accepted in the field to which the invention belongs, and can be understood by a specialist with the appropriate skills.

Замещенный означает, что специфическая группа или остаток включают один или более заместителей, отличных от атома водорода.Substituted means that the specific group or residue includes one or more substituents other than a hydrogen atom.

Незамещенный означает, что специфическая группа или остаток не содержат заместителей, отличных от атома водорода.Unsubstituted means that the specific group or residue does not contain substituents other than a hydrogen atom.

Алкил означает незамещенную алкильную группу с прямой или разветвленной цепью, содержащую от 1 до 6 атомов углерода.Alkyl means an unsubstituted straight or branched chain alkyl group containing from 1 to 6 carbon atoms.

Циклоалкил означает циклическую насыщенную углеводородную группу с 3-6 кольцевыми атомами углерода (например, циклопропил, циклобутил и аналогичные).Cycloalkyl means a cyclic saturated hydrocarbon group with 3-6 ring carbon atoms (eg cyclopropyl, cyclobutyl and the like).

Смесь - совместное включение двух и более веществ без образования химических связей, а физические свойства каждого из компонентов сохраняются без изменений.A mixture is the joint inclusion of two or more substances without the formation of chemical bonds, and the physical properties of each of the components remain unchanged.

Фармацевтически приемлемая соль означает, что компонент, образующий соль с карбоксильной группой заявляемых веществ не будет наносить вред организму человека.A pharmaceutically acceptable salt means that the component that forms a salt with the carboxyl group of the claimed substances will not harm the human body.

Фармацевтически приемлемый катион означает, что данный катион при образовании соли не будет наносить вред организму человека.A pharmaceutically acceptable cation means that the cation, when formed as a salt, will not harm the human body.

В общем виде вещества настоящего изобретения могут быть синтезированы методами, известными из области химии. Некоторые процессы производства конкретных веществ настоящего изобретения иллюстрируют схемы, приведённые в примерах.In General, the substances of the present invention can be synthesized by methods known from the field of chemistry. Some processes for the production of specific substances of the present invention illustrate the schemes given in the examples.

Биологические активности веществ настоящего изобретения включают: отсутствие цитотоксичности вплоть до концентрации 100 мкМ; способность снижать внутриглазное давление; способность повышать концентрацию внутриклеточного кальция, способность увеличивать продукцию оксида азота.The biological activities of the substances of the present invention include: no cytotoxicity up to a concentration of 100 μm; the ability to reduce intraocular pressure; the ability to increase the concentration of intracellular calcium, the ability to increase the production of nitric oxide.

Заявляемые вещества, являясь аналогами природного простагландина F_2a, способны взаимодействовать со специфическим простаноидным рецептором FP, что выражается в стимулировании мобилизации внутриклеточного кальция.The claimed substances, being analogs of natural prostaglandin F _2a , are able to interact with the specific prostanoid FP receptor, which is expressed in stimulating the mobilization of intracellular calcium.

Неожиданным результатом данного изобретения является способность заявляемых веществ индуцировать эндогенный синтез оксида азота в клетках млекопитающих. Такие свойства не отмечены ранее ни для одного производного простагландина F_2a. Более того, этим свойством обладали соединения, не содержащие NO-донорных групп, например амид простагландина F_2a и изопропилового эфира серина (соединение 3).An unexpected result of this invention is the ability of the claimed substances to induce the endogenous synthesis of nitric oxide in mammalian cells. Such properties have not been noted previously for any derivative of prostaglandin F _2a . Moreover, compounds that do not contain NO-donor groups, for example, amide of prostaglandin F _2a and isopropyl ester of serine (compound 3), had this property.

Таким образом, задача данного изобретения решается путём синтеза новых амидных производных простагландина F_2a общей формулы (1), обладающих способностью индуцировать эндогенный синтез оксида азота, что значительно расширяет возможности медицинского применения заявляемых веществ за счет вовлечения в механизм фармакологического эффекта эндогенного регулятора - оксида азота.Thus, the task of this invention is solved by synthesizing new amide derivatives of prostaglandin F _2a of the general formula (1), which have the ability to induce endogenous synthesis of nitric oxide, which greatly expands the possibilities of medical use of the claimed substances due to the involvement of the endogenous regulator - nitric oxide in the mechanism of the pharmacological effect.

- 2 042625- 2 042625

Нижеследующие примеры приведены в целях иллюстрирования настоящего изобретению и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.The following examples are given for the purpose of illustrating the present invention and should not be construed as limiting the scope of the invention in any way.

Пример 1. Амиды простагландина F_2a с серином и его производными, циклопропиламином и Lпролинолом.Example 1 Prostaglandin F _2a amides with serine and its derivatives, cyclopropylamine and L-prolinol.

Амид простагландина F_2a с L-нитросерином (1).Prostaglandin F _2a amide with L-nitroserine (1).

К раствору 150 мг (0.42 ммоль) простагландина F_2a в 2 мл ацетонитрила в атмосфере аргона прибавляют 76 мкл (0.55 ммоль) Et₃N, перемешивают 5 мин и прибавляют раствор 71 мкл (0.55 ммоль) изобутилхлорформиата в 500 мкл ацетонитрила. Реакционную смесь перемешивают 30 мин при 4°C, упаривают до половины объема, разбавляют 50 мл этилацетата и промывают водой (2x20 мл) и насыщенным водным раствором NaCl (20 мл) и сушат над безводным Na₂SO₄. Сушитель отфильтровывают, фильтрат упаривают на роторном испарителе в вакууме водоструйного насоса. Остаток высушивают в вакууме масляного насоса. Получают 171 мг смешанного ангидрида, желтое масло.To a solution of 150 mg (0.42 mmol) of prostaglandin F _2a in 2 ml of acetonitrile in an argon atmosphere, add 76 μl (0.55 mmol) of Et ₃ N, stir for 5 min, and add a solution of 71 μl (0.55 mmol) of isobutyl chloroformate in 500 μl of acetonitrile. The reaction mixture was stirred for 30 min at 4°C, evaporated to half volume, diluted with 50 ml of ethyl acetate and washed with water (2x20 ml) and saturated aqueous NaCl (20 ml) and dried over anhydrous Na ₂ SO ₄ . The drying agent is filtered off, the filtrate is evaporated on a rotary evaporator in the vacuum of a water jet pump. The residue is dried under oil pump vacuum. 171 mg of mixed anhydride are obtained, a yellow oil.

К раствору 104 мг (0.49 ммоль) азотнокислой соли L-нитросерина в 0.500 мл ДМФА при 4°C в атмосфере аргона прибавляют раствор полученного смешанного ангидрида в 1 мл ДМФА и 52 мкл Nметилморфолина и перемешивают полученную смесь 90 мин. Растворитель упаривают, остаток разбавляют 50 мл этилацетата и промывают 2М водным раствором NaHSO₄ (20 мл) и насыщенным водным раствором NaCl (20 мл) и сушат над безводным Na2SO4. Сушитель отфильтровывают, фильтрат упаривают на роторном испарителе в вакууме водоструйного насоса. Получают 162 мг амида простагландина F_2a и L-нитросерина, желтоватое масло, выход 70%.To a solution of 104 mg (0.49 mmol) of the nitrate salt of L-nitroserine in 0.500 ml of DMF at 4°C in an argon atmosphere, a solution of the resulting mixed anhydride in 1 ml of DMF and 52 μl of Nmethylmorpholine was added, and the resulting mixture was stirred for 90 min. The solvent was evaporated, the residue was diluted with 50 ml of ethyl acetate and washed with 2M aqueous NaHSO ₄ (20 ml) and saturated aqueous NaCl (20 ml) and dried over anhydrous Na 2 SO 4 . The drying agent is filtered off, the filtrate is evaporated on a rotary evaporator in the vacuum of a water jet pump. 162 mg of prostaglandin F _2a amide and L-nitroserine are obtained, yellowish oil, 70% yield.

ПМР: 0.90 (3H), 1.29 (6H), 1.53 (3H), 1.75 (2H), 2.18 (7H), 2.41 (2H), 2.71 (1H), 3.95 (1H), 4.14 (2H), 4.33 (1H), 4.88 (2H), 5.52 (4H). Масс-спектр: 509.2832 [M+Na]+, 441.3282 [M-NO2+Na+H]+, [a]D²⁵=36,0°, с=1, EtOH.NMR: 0.90 (3H), 1.29 (6H), 1.53 (3H), 1.75 (2H), 2.18 (7H), 2.41 (2H), 2.71 (1H), 3.95 (1H), 4.14 (2H), 4.33 (1H ), 4.88 (2H), 5.52 (4H). Mass spectrum: 509.2832 [M+Na]+, 441.3282 [M-NO2+Na+H]+, [a]D ²⁵ =36.0°, c=1, EtOH.

Амид простагландина F_2a с L-серином (2).Prostaglandin F _2a amide with L-serine (2).

Получен аналогично из простагландина F_2a и L-серина. Выход 51%.Obtained similarly from prostaglandin F _2a and L-serine. Yield 51%.

ПМР: 0.84 (3H), 1.3 (6H), 1.52 (3H), 1.95 (3H), 2.16 (6H), 2.33 (2H), 2.68 (1H), 3.89 (2H), 3.92 (1H), 4.19 (1H), 4.32 (2H), 5.34 (4H), 7.8 (1H). №25=33,5°, c=1, EtOH:H2O, 1:2.NMR: 0.84 (3H), 1.3 (6H), 1.52 (3H), 1.95 (3H), 2.16 (6H), 2.33 (2H), 2.68 (1H), 3.89 (2H), 3.92 (1H), 4.19 (1H ), 4.32 (2H), 5.34 (4H), 7.8 (1H). #25=33.5°, c=1, EtOH:H2O, 1:2.

Амид простагландина F_2a с изопропиловым эфиром L-серина (3).Prostaglandin F _2a amide with L-serine isopropyl ester (3).

Получен аналогично из простагландина F_2a и гидрохлорида изопропилового эфира L-серина. Выход 57%.Obtained similarly from prostaglandin F _2a and L-serine isopropyl ester hydrochloride. Yield 57%.

ПМР: 0.89 (3H), 1.22 (6H), 1.3 (9H), 1.76 (3H), 2.04 (6H), 2.39 (2H), 3.9 (2H), 4.03 (2H), 4.13 (1H), 4.63 (1H), 5.08 (1H), 5.45 (4H), 6.83 (1H). №25=28,4°, c=1, EtOH.NMR: 0.89 (3H), 1.22 (6H), 1.3 (9H), 1.76 (3H), 2.04 (6H), 2.39 (2H), 3.9 (2H), 4.03 (2H), 4.13 (1H), 4.63 (1H ), 5.08 (1H), 5.45 (4H), 6.83 (1H). No. 25=28.4°, c=1, EtOH.

Амид простагландина F_2a с изопропиловым эфиром D-серина (4).Prostaglandin F _2a amide with D-serine isopropyl ester (4).

Получен аналогично из простагландина F_2a и гидрохлорида изопропилового эфира D-серина. Выход 35%.Obtained similarly from prostaglandin F _2a and D-serine isopropyl ester hydrochloride. Yield 35%.

ПМР: 0.89 (3H), 1.21 (6H), 1.3 (9H), 1.74 (3H), 2.01 (6H), 2.4 (2H), 3.9 (2H), 4.0 (2H), 4.1 (1H), 4.6 (1H), 5.1 (1H), 5.43 (4H), 6.9 (1H). №25=27,2°, c=1, EtOH.NMR: 0.89 (3H), 1.21 (6H), 1.3 (9H), 1.74 (3H), 2.01 (6H), 2.4 (2H), 3.9 (2H), 4.0 (2H), 4.1 (1H), 4.6 (1H ), 5.1 (1H), 5.43 (4H), 6.9 (1H). No. 25=27.2°, c=1, EtOH.

Амид простагландина F_2a с изопропиловым эфиром L-нитросерина (5).Prostaglandin F _2a amide with L-nitroserine isopropyl ester (5).

Получен аналогично из простагландина F_2a и изопропилового эфира L-нитросерина. Выход 64%.Obtained similarly from prostaglandin F _2a and L-nitroserine isopropyl ester. Yield 64%.

ПМР: 0.84 (3H), 1.16 (6H), 1.23 (8H), 1.51 (4H), 1.96 (4H), 2.12 (4H), 3.88 (3H), 4.52 (1H), 4.9 (2H), 5.34 (5H), 7.9 (1H).NMR: 0.84 (3H), 1.16 (6H), 1.23 (8H), 1.51 (4H), 1.96 (4H), 2.12 (4H), 3.88 (3H), 4.52 (1H), 4.9 (2H), 5.34 (5H ), 7.9 (1H).

Амид простагландина F_2a с циклопропиламином (6).Prostaglandin F _2a amide with cyclopropylamine (6).

Получен аналогично из простагландина F_2a и циклопропиламина. Выход 73%.Obtained similarly from prostaglandin F _2a and cyclopropylamine. Yield 73%.

ПМР: 0.50 (2H), 0.78 (2H), 0.90 (3H), 1.31 (6H), 1.61 (4H), 1.86 (4H), 2.06 (4H), 2.36 (2H), 2.70 (1H), 4.00 (1H), 4.09 (1H), 4.20 (1H), 5.41 (1H), 5.57 (2H), 5.78 (2H). №25=38,0°, c=1, EtOH.NMR: 0.50 (2H), 0.78 (2H), 0.90 (3H), 1.31 (6H), 1.61 (4H), 1.86 (4H), 2.06 (4H), 2.36 (2H), 2.70 (1H), 4.00 (1H ), 4.09 (1H), 4.20 (1H), 5.41 (1H), 5.57 (2H), 5.78 (2H). No. 25=38.0°, c=1, EtOH.

Амид простагландина F_2a с L-пролинолом (7).Prostaglandin F _2a amide with L-prolinol (7).

Получен аналогично из простагландина F_2a и L-пролинола. Выход 61%.Obtained similarly from prostaglandin F _2a and L-prolinol. Yield 61%.

ПМР: 0.91 (3H), 1.36 (6H), 1.60 (6H), 1.89 (6H), 2.08 (4H), 2.39 (1H), 2.65 (1H), 3.2 (1H), 3.45 (1H), 3.57 (1H), 3.73 (1H), 3.90 (1H), 4.06 (1H), 4.21 (2H), 5.48 (2H), 5.69 (2H). №25=22,0°, c=1, EtOH.NMR: 0.91 (3H), 1.36 (6H), 1.60 (6H), 1.89 (6H), 2.08 (4H), 2.39 (1H), 2.65 (1H), 3.2 (1H), 3.45 (1H), 3.57 (1H ), 3.73 (1H), 3.90 (1H), 4.06 (1H), 4.21 (2H), 5.48 (2H), 5.69 (2H). No. 25=22.0°, c=1, EtOH.

- 3 042625- 3 042625

Пример 2. Амиды простагландина F_2a и производных γ-аминомасляной кислоты.Example 2 Amides of prostaglandin F _2a and γ-aminobutyric acid derivatives.

Амид простагландина F_2a и γ-аминомасляной кислоты.Amide of prostaglandin F _2a and γ-aminobutyric acid.

К раствору 103 мг (1.00 ммоль) γ-аминомасляной кислоты в 1 мл ацетонитрила прибавляют 600 мкл N,O-бис(триметилсилил) трифторацетамида и перемешивают 18 ч при 23°C.To a solution of 103 mg (1.00 mmol) of γ-aminobutyric acid in 1 ml of acetonitrile was added 600 µl of N,O-bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamide and stirred for 18 h at 23°C.

К раствору 284 мг (0.8 ммоль) простагландина F_2a в 3 мл ацетонитрила прибавляют 145 мкл (1.05 ммоль) триэтиламина и 125 мкл (0.96 ммоль) изобутилхлорформиата и перемешивают 30 мин при 23°C. Полученный смешанный ангидрид прибавляют к раствору силилированной γ-аминомасляной кислоты и перемешивают 4 ч при 23°C. К реакционной смеси прибавляют метанол (5 мл), перемешивают 20 мин и упаривают на роторном испарителе в вакууме водоструйного насоса. Остаток растворяют в этилацетате (20 мл) и промывают 2М водным раствором NaHSO₄ (20 мл) и насыщенным водным раствором NaCl (20 мл) и сушат над безводным Na₂SO₄. Сушитель отфильтровывают, фильтрат упаривают на роторном испарителе в вакууме водоструйного насоса. Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле. Получают 132 мг амида простагландина F_2a и γ-аминомасляной, прозрачное масло, выход 60%. Массспектр: 462.2888 [M+Na]+.To a solution of 284 mg (0.8 mmol) of prostaglandin F _2a in 3 ml of acetonitrile, 145 μl (1.05 mmol) of triethylamine and 125 μl (0.96 mmol) of isobutyl chloroformate were added and stirred for 30 min at 23°C. The resulting mixed anhydride was added to the silylated γ-aminobutyric acid solution and stirred for 4 hours at 23°C. Methanol (5 ml) was added to the reaction mixture, stirred for 20 min, and evaporated on a rotary evaporator under a water-jet pump vacuum. The residue was dissolved in ethyl acetate (20 ml) and washed with 2M aqueous NaHSO ₄ (20 ml) and saturated aqueous NaCl (20 ml) and dried over anhydrous Na ₂ SO ₄ . The drying agent is filtered off, the filtrate is evaporated on a rotary evaporator in the vacuum of a water jet pump. The residue was purified by silica gel column chromatography. 132 mg of prostaglandin F _2a amide and γ-aminobutyric amide are obtained, clear oil, 60% yield. Mass spectrum: 462.2888 [M+Na]+.

Амид простагландина F_2a с нитроэтаноламидом γ-аминомасляной кислоты (8).Prostaglandin F _2a amide with γ-aminobutyric acid nitroethanolamide (8).

К раствору 80 мг (0.18 ммоль) амида простагландина F_2a с γ-аминомасляной кислотой в 3 мл ацетонитрила в атмосфере аргона прибавляют 30 мкл (0.23 ммоль) Et₃N, перемешивают 5 мин и прибавляют 30 мкл (0.22 ммоль) изобутилхлорформата. Реакционную смесь перемешивают 30 мин при 4°C, прибавляют раствор 38 мг (0.37 ммоль) азотнокислой соли нитроэтаноламина и 50 мкл Et₃N в 2 мл хлористого метилена и перемешивают 12 ч при 23°C. Растворитель упаривают, остаток разбавляют 20 мл этилацетата и промывают 2М водным раствором NaHSO₄ (20 мл) и насыщенным водным раствором NaCl (20 мл) и сушат над безводным Na₂SO₄. Сушитель отфильтровывают, фильтрат упаривают на роторном испарителе в вакууме водоструйного насоса. Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле. Получают 35 мг амида простагландина F_2a и нитроэтаноламида γ-аминомасляной кислоты (8), выход 36%.To a solution of 80 mg (0.18 mmol) of prostaglandin F _2a amide with γ-aminobutyric acid in 3 ml of acetonitrile in an argon atmosphere, 30 μl (0.23 mmol) of Et ₃ N was added, stirred for 5 min, and 30 μl (0.22 mmol) of isobutyl chloroformate was added. The reaction mixture was stirred for 30 min at 4°C, a solution of 38 mg (0.37 mmol) of nitroethanolamine nitrate and 50 μl of Et ₃ N in 2 ml of methylene chloride was added, and the mixture was stirred for 12 h at 23°C. The solvent is evaporated, the residue is diluted with 20 ml of ethyl acetate and washed with 2M aqueous NaHSO ₄ (20 ml) and saturated aqueous NaCl (20 ml) and dried over anhydrous Na ₂ SO ₄ . The drying agent is filtered off, the filtrate is evaporated on a rotary evaporator in the vacuum of a water jet pump. The residue was purified by silica gel column chromatography. 35 mg of prostaglandin F _2a amide and γ-aminobutyric acid nitroethanolamide (8) are obtained, 36% yield.

ПМР: 0.88 (3H), 1.21 (6H), 1.65 (3H), 1.77 (4H), 2.11 (7H), 2.38 (1H), 2.62 (1H), 3.33 (2H), 3.55 (2H), 3.97 (1H), 4.18 (2H), 4.53 (2H), 4.68 (2H), 5.47 (4H). №25=35,2°, c=1, EtOH.NMR: 0.88 (3H), 1.21 (6H), 1.65 (3H), 1.77 (4H), 2.11 (7H), 2.38 (1H), 2.62 (1H), 3.33 (2H), 3.55 (2H), 3.97 (1H ), 4.18 (2H), 4.53 (2H), 4.68 (2H), 5.47 (4H). No. 25=35.2°, s=1, EtOH.

Амид простагландина F_2a с нитроэтиленгликолевым эфиром γ-аминомасляной кислоты (9).Prostaglandin F _2a amide with nitroethylene glycol ester of γ-aminobutyric acid (9).

К раствору 14 мкл (0.12 ммоль) нитроэтиленгликоля в 1 мл хлористого метилена прибавляют 24 мг (0.12 ммоль) гидрохлорида N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбоната, 3 мг (0.02 ммоль) диметиламинопиридина и 45 мг (0.1 ммоль) амида простагландина F_2a с γ-аминомасляной кислотой и перемешивают 90 мин при 23°C. Реакционную смесь разбавляют хлороформом (20 мл) и промывают 2М водным раствором NaHSO₄ (20 мл), водой (2x20 мл) и насыщенным водным раствором NaCl (20 мл) и сушат над безводным Na₂SO₄. Сушитель отфильтровывают, фильтрат упаривают на роторном испарителе в вакууме водоструйного насоса. Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле. Получают 20 мг амида (9), бесцветное масло, выход 37%.To a solution of 14 μl (0.12 mmol) of nitroethylene glycol in 1 ml of methylene chloride is added 24 mg (0.12 mmol) of N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethyl carbonate hydrochloride, 3 mg (0.02 mmol) of dimethylaminopyridine and 45 mg (0.1 mmol) of amide prostaglandin F _2a with γ-aminobutyric acid and stirred for 90 min at 23°C. The reaction mixture was diluted with chloroform (20 ml) and washed with 2M aqueous NaHSO ₄ (20 ml), water (2x20 ml) and saturated aqueous NaCl (20 ml) and dried over anhydrous Na ₂ SO ₄ . The drying agent is filtered off, the filtrate is evaporated on a rotary evaporator in the vacuum of a water jet pump. The residue was purified by silica gel column chromatography. 20 mg of amide (9), colorless oil, 37% yield are obtained.

ПМР: 0.89 (3H), 1.38 (11H), 1.88 (9H), 2.27 (2H), 2.87 (2H), 3.22 (2H), 3.81 (1H), 3.99 (1H), 4.07 (1H), 4.37 (2H), 4.67 (2H), 5.36 (4H), 7.57 (1H). [аЪ2⁵=24,0°, c=1, EtOH.NMR: 0.89 (3H), 1.38 (11H), 1.88 (9H), 2.27 (2H), 2.87 (2H), 3.22 (2H), 3.81 (1H), 3.99 (1H), 4.07 (1H), 4.37 (2H ), 4.67 (2H), 5.36 (4H), 7.57 (1H). [ab2 ⁵ =24.0°, c=1, EtOH.

Амид простагландина F_2a с динитроглицериновым эфиром γ-аминомасляной кислоты (10).Prostaglandin F _2a amide with γ-aminobutyric acid dinitroglycerol ester (10).

К раствору 84 мг (0.2 ммоль) амида простагландина F_2a с γ-аминомасляной кислотой в 1 мл хлористого метилена в атмосфере аргона прибавляют раствор 44 мг (0.43 ммоль) гидрохлорида N-(3диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида в 0.5 мл хлористого метилена, 5 мг (0.04 ммоль) Nдиметиламинопиридина и 42 мг (0.22 ммоль) динитрата глицерина и перемещивают 2 ч при 23°C. Растворитель упаривают, остаток разбавляют этилацетатом (20 мл) и промывают 2М водным раствором NaHSO₄ (20 мл), водой (2x20 мл) и насыщенным водным раствором NaCl (20 мл) и сушат над безводным Na2SO4. Сушитель отфильтровывают, фильтрат упаривают на роторном испарителе в вакууме водоструйного насоса. Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле. Получают 38 мг амида простагландина F_2a с динитроглицериновым эфиром γ-аминомасляной кислоты (10), выход 33%.To a solution of 84 mg (0.2 mmol) of prostaglandin F _2a amide with γ-aminobutyric acid in 1 ml of methylene chloride in an argon atmosphere, add a solution of 44 mg (0.43 mmol) of N-(3dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride in 0.5 ml of methylene chloride, 5 mg (0.04 mmol) of N-dimethylaminopyridine and 42 mg (0.22 mmol) of glycerol dinitrate and stirred for 2 h at 23°C. The solvent was evaporated, the residue was diluted with ethyl acetate (20 ml) and washed with 2M aqueous NaHSO ₄ (20 ml), water (2x20 ml) and saturated aqueous NaCl (20 ml) and dried over anhydrous Na2SO4. The drying agent is filtered off, the filtrate is evaporated on a rotary evaporator in the vacuum of a water jet pump. The residue was purified by silica gel column chromatography. 38 mg of prostaglandin F _2a amide with γ-aminobutyric acid dinitroglycerol ester (10) are obtained, 33% yield.

ПМР: 0.84 (3H), 1.43 (14 H), 1.98 (8H), 2.34 (2H), 3.04 (2H), 3.88 (2H), 4.31 (1H), 4.46 (2H), 4.77 (2H),NMR: 0.84 (3H), 1.43 (14H), 1.98 (8H), 2.34 (2H), 3.04 (2H), 3.88 (2H), 4.31 (1H), 4.46 (2H), 4.77 (2H),

- 4 042625- 4 042625

5.36 (5H), 7.75 (1H). Масс-спектр: 626.2968 [M+Na]+, 586.3943 [M+H-H₂O]+. [a]_D ²⁵=30,2°, c=1, EtOH.5.36 (5H), 7.75 (1H). Mass spectrum: 626.2968 [M+Na]+, 586.3943 [M+HH ₂ O]+. [a] _D ²⁵ =30.2°, c=1, EtOH.

Пример 3. Амид простагландина F_2a с 2-аминоэтил-[2-(нитрокси)этил]карбаматом (11).Example 3 Prostaglandin F _2a amide with 2-aminoethyl-[2-(nitroxy)ethyl]carbamate (11).

К раствору 150 мг (0.37 ммоль) амида простагландина F_2a с этаноламином в 3 мл ацетонитрила прибавляют 93 мг (0.37 ммоль) дисукцинимидилкарбоната и 52 мкл (0.37 ммоль) Et₃N и перемешивают при 23°C 1.5 ч. Затем прибавляют 62 мг (0.37 ммоль) азотнокислой соли нитроэтаноламина и 37 мг (0.37 ммоль) Et₃N и перемешивают 18 ч при 4°C. Растворитель упаривают, остаток разбавляют 20 мл этилацетата и промывают 2М водным раствором NaHSO4 (20 мл) и насыщенным водным раствором NaCl (20 мл) и сушат над безводным Na₂SO₄. Сушитель отфильтровывают, фильтрат упаривают на роторном испарителе в вакууме водоструйного насоса. Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле. Получают 38 мг амида (11), бесцветное масло, выход 19%.To a solution of 150 mg (0.37 mmol) of prostaglandin F _2a amide with ethanolamine in 3 ml of acetonitrile, 93 mg (0.37 mmol) of disuccinimidyl carbonate and 52 μl (0.37 mmol) of Et ₃ N are added and stirred at 23°C for 1.5 h. Then 62 mg ( 0.37 mmol) of nitrate salt of nitroethanolamine and 37 mg (0.37 mmol) of Et ₃ N and stirred for 18 h at 4°C. The solvent was evaporated, the residue was diluted with 20 ml of ethyl acetate and washed with 2M aqueous NaHSO4 (20 ml) and saturated aqueous NaCl (20 ml) and dried over anhydrous Na ₂ SO ₄ . The drying agent is filtered off, the filtrate is evaporated on a rotary evaporator in the vacuum of a water jet pump. The residue was purified by silica gel column chromatography. 38 mg of amide (11), colorless oil, 19% yield are obtained.

ПМР: 0.90 (3H), 1.31 (6H), 1.55 (4H), 1.76 (3H), 2.15 (5H), 2.53 (2H), 3.34 (2H), 3.53 (2H), 4.01 (1H), 4.18 (4H), 4.56 (2H), 5.40 (2H), 5.57 (2H), 5.71 (1H), 6.25 (1H). Масс-спектр: 552.2983 [M+Na]+. [a]D²⁵=34,6°, c=1, EtOH.NMR: 0.90 (3H), 1.31 (6H), 1.55 (4H), 1.76 (3H), 2.15 (5H), 2.53 (2H), 3.34 (2H), 3.53 (2H), 4.01 (1H), 4.18 (4H ), 4.56 (2H), 5.40 (2H), 5.57 (2H), 5.71 (1H), 6.25 (1H). Mass spectrum: 552.2983 [M+Na]+. [a]D ²⁵ =34.6°, c=1, EtOH.

Амид простагландина F_2a с 2-аминоэтил-2-(нитрокси)-1-[(нитрокси)метил]этилкарбонатом (12).Prostaglandin F _2a amide with 2-aminoethyl-2-(nitroxy)-1-[(nitroxy)methyl]ethyl carbonate (12).

К раствору 55 мг (0.14 ммоль) амида простагландина F_2a с этаноламином в 1.5 мл хлористого метилена прибавляют 32 мг (0.12 ммоль) дисукцинимидилкарбоната и 20 мкл (0.14 ммоль) Et₃N и перемешивают при 23°C 40 мин. Затем прибавляют 25 мг (0.14 ммоль) динитрата глицерина и 16 мг (0.14 ммоль) N-диметиламинопиридина и перемешивают 18 ч при 4°C. Растворитель упаривают, остаток разбавляют 20 мл этилацетата и промывают 2М водным раствором NaHSO₄ (20 мл) и насыщенным водным раствором NaCl (20 мл) и сушат над безводным Na₂SO₄. Сушитель отфильтровывают, фильтрат упаривают на роторном испарителе в вакууме водоструйного насоса. Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле. Получают 20 мг амида (12), бесцветное масло, выход 19%.To a solution of 55 mg (0.14 mmol) of prostaglandin F _2a amide with ethanolamine in 1.5 ml of methylene chloride, 32 mg (0.12 mmol) of disuccinimidyl carbonate and 20 μl (0.14 mmol) of Et ₃ N were added and stirred at 23°C for 40 min. Then 25 mg (0.14 mmol) of glycerol dinitrate and 16 mg (0.14 mmol) of N-dimethylaminopyridine are added and the mixture is stirred for 18 h at 4°C. The solvent is evaporated, the residue is diluted with 20 ml of ethyl acetate and washed with 2M aqueous NaHSO ₄ (20 ml) and saturated aqueous NaCl (20 ml) and dried over anhydrous Na ₂ SO ₄ . The drying agent is filtered off, the filtrate is evaporated on a rotary evaporator in the vacuum of a water jet pump. The residue was purified by silica gel column chromatography. 20 mg of amide (12), colorless oil, 19% yield are obtained.

ПМР: 0.84 (3H), 1.24-1.53 (12H), 2.01 (8H), 2.39 (1H), 2.51 (1H), 2.64 (2H), 3.64 (2H), 4.00 (2H), 4.18 (1H), 4.46 (2H), 4.81 (2H), 5.31 (5H), 7.95 (1H). Масс-спектр: 628.2770 [M+Na]+, 588.2843 [M+H-H2O]+.NMR: 0.84 (3H), 1.24-1.53 (12H), 2.01 (8H), 2.39 (1H), 2.51 (1H), 2.64 (2H), 3.64 (2H), 4.00 (2H), 4.18 (1H), 4.46 (2H), 4.81 (2H), 5.31 (5H), 7.95 (1H). Mass spectrum: 628.2770 [M+Na]+, 588.2843 [M+H-H2O]+.

Пример 4. Цитотоксическая активность производных простагландина F_2a.Example 4 Cytotoxic activity of prostaglandin F _2a derivatives.

Клетки 3T3-L1 инкубировали при 95% влажности, в атмосфере 5% CO2, при температуре 37°C. Культивирование проводили в среде DMEM, содержащей 7% FCS, 2 мМ глутамина, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0.25 мкг/мл амфотерицина B. Клетки пересевали каждые 48-72 ч. Для суспендирования клетки инкубировали в растворе Версена в течение 1 мин и в растворе Трипсин-ЭДТА в течение 1 мин (0.25%).3T3-L1 cells were incubated at 95% humidity, 5% CO2, at 37°C. Cultivation was carried out in DMEM medium containing 7% FCS, 2 mM glutamine, 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, and 0.25 μg/mL amphotericin B. Cells were subcultured every 48–72 h. for 1 min and in Trypsin-EDTA solution for 1 min (0.25%).

Оценка действия веществ на клетки.Evaluation of the action of substances on cells.

Клетки рассеивали по 30 тыс. в лунки 96-луночного планшета (монослой) в 100 мкл среды для MTT-теста. Через 24 ч культивирования к клеткам добавляли 100 мкл исследуемых веществ в среде, использующейся для культивирования клеток, с заменой культуральной среды на новую. Клетки инкубировали с исследуемыми веществами 24 ч. В качестве положительного контроля использовали клетки, к которым добавляли 100 мкл среды, использующейся для культивирования клеток.Cells were seeded 30,000 per well of a 96-well plate (monolayer) in 100 µl of MTT assay medium. After 24 hours of cultivation, 100 μl of the test substances were added to the cells in the medium used for culturing the cells, with the culture medium replaced with a new one. The cells were incubated with the test substances for 24 hours. As a positive control, cells were used, to which 100 μl of the medium used for cell cultivation was added.

Оценка выживаемости клеток в культуре с помощью MTT-теста.Evaluation of cell viability in culture using the MTT test.

После окончания инкубации из каждой лунки убирали среду и в каждую лунку добавляли по 100 мкл реактива MTT (0.5 мг/мл MTT, 3.5 мг/мл D-глюкозы в растворе Хэнкса). Планшет помещали в CO2инкубатор (Ependorf, Германия) на 1.5 ч. После этого убирали MTT и в каждую лунку добавляли по 100 мкл DMSO и перемешивали 2 мин на шейкере со скоростью 550 об/мин. После этого определяли оптическую плотность раствора при длинах волн 576 нм и 620 нм на планшетном иммуноферментном фотометре (ЭФОС 9305, ОАО МЗ Сапфир).After the end of the incubation, the medium was removed from each well, and 100 μl of the MTT reagent (0.5 mg/ml MTT, 3.5 mg/ml D-glucose in Hanks' solution) was added to each well. The plate was placed in a CO2 incubator (Ependorf, Germany) for 1.5 h. After that, MTT was removed and 100 μL of DMSO was added to each well and stirred for 2 min on a shaker at a speed of 550 rpm. After that, the optical density of the solution was determined at wavelengths of 576 nm and 620 nm on a tablet enzyme-linked immunosorbent photometer (EFOS 9305, OAO MZ Sapphire).

Все исследованные вещества не обладали заметной цитотоксичностью вплоть до концентрации 100 мкМ (табл. 1).All the studied substances did not exhibit any noticeable cytotoxicity up to a concentration of 100 μM (Table 1).

- 5 042625- 5 042625

Таблица 1 Цитотоксичность производных простагландина F_2a по отношению к культивируемым клеткам 3T3-L1 мышиTable 1 Cytotoxicity of prostaglandin F _2a derivatives against cultured mouse 3T3-L1 cells

Номер соединения Connection number Цитотоксичность, ЕС50 мкМ Cytotoxicity, EC50 μM 1 1 226,4±2 226.4±2 2 2 >200 >200 3 3 143,6±3 143.6±3 5 5 195,2±2 195.2±2 6 6 124,4±2 124.4±2 7 7 104,4±2 104.4±2 8 8 193,9±4 193.9±4 И AND 184,5±3 184.5±3 20 20 137,5±1,5 137.5±1.5

Пример 5. Снижение внутриглазного давления под действием производных простагландина F_2a.Example 5. Reduction of intraocular pressure under the action of prostaglandin F _2a derivatives.

Исследование проведено на кроликах породы Шиншилла массой 2,5-3 кг. ВГД измеряли при помощи автоматического ручного тонометра для ветеринарии Tonovet (Icare, Финляндия).The study was conducted on Chinchilla rabbits weighing 2.5-3 kg. IOP was measured using an automatic manual veterinary blood pressure monitor Tonovet (Icare, Finland).

Для исследования каждого образца использовали 2 группы кроликов:For the study of each sample, 2 groups of rabbits were used:

животных, получавших однократную инстилляцию образца в оба глаза;animals receiving a single instillation of the sample in both eyes;

животных, получавших однократную инстилляцию физраствора в оба глаза.animals that received a single instillation of saline in both eyes.

Все исследованные образцы закапывали по 2 капли одноразовой пипеткой. Измерение ВГД проводили до закапывания и далее через каждый час в течение 6 ч. Результаты представлены в табл. 2. Все исследованные вещества обладали способностью снижать внутриглазное давление у нормотензивных кроликов. Наиболее выражен этот эффект для соединений 3 и 6.All studied samples were instilled in 2 drops with a disposable pipette. Measurement of IOP was carried out before instillation and then every hour for 6 hours. The results are presented in table. 2. All studied substances had the ability to reduce intraocular pressure in normotensive rabbits. This effect is most pronounced for compounds 3 and 6.

Таблица 2table 2

Снижение внутриглазного давления у нормотензивных кроликов после инстилляции растворов производных простагландинов (максимальное значение усредненных данных по 5 животным)Decrease in intraocular pressure in normotensive rabbits after instillation of solutions of prostaglandin derivatives (maximum value of averaged data for 5 animals)

Номер соединения Connection number Снижение ВГД, мм рт.ст. Decreased IOP, mm Hg 3 3 3,20 3.20 5 5 1,20 1.20 6 6 3,30 3.30 8 8 2,00 2.00 И AND 1,50 1.50 19 19 1,90 1.90

Пример 6. Увеличение концентрации внутриклеточного кальция под действием производных простагландина F_2a.Example 6. Increase in the concentration of intracellular calcium under the action of prostaglandin F _2a derivatives.

Клетки 3T3-L1 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% сыворотки новорожденных телят (FCS), 4 мМ L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2.5 мкг/мл амфотерицина B. Клетки культивировали в атмосфере 5% CO2, 95% влажности при температуре 37°C.3T3-L1 cells were cultured in DMEM supplemented with 10% neonatal calf serum (FCS), 4 mM L-glutamine, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 2.5 µg/mL amphotericin B. The cells were cultured in an atmosphere of 5 % CO2, 95% humidity at 37°C.

Плотность клеток на момент эксперимента 7000 в лунке 96-луночного планшета, краситель Calcium Green (1.5 мМ, загрузка в 0.4% Pluronic F-62 в среде инкубации без БСА 1 ч при 37°С, троекратная промывка 200 мкл среды инкубации после загрузки), среда инкубации: раствор Хэнкса, 1 г/л D-глюкоза, 1 мг/мл обезжиренный БСА, внесение веществ в этаноле (<0.5% финальная концентрация), инкубация при 25°C, детектирование при длине волны возб. 485 нм, детектирования 535 нм.Cell density at the time of the experiment 7000 in a well of a 96-well plate, Calcium Green dye (1.5 mM, loading in 0.4% Pluronic F-62 in incubation medium without BSA for 1 h at 37°C, washing three times with 200 μl of incubation medium after loading), incubation medium: Hank's solution, 1 g/l D-glucose, 1 mg/ml defatted BSA, addition of substances in ethanol (<0.5% final concentration), incubation at 25°C, detection at excitation wavelength. 485 nm, detection 535 nm.

Результаты.Results.

При добавлении испытуемых веществ к клеткам 3T3-L1 происходит увеличение концентрации внутриклеточного кальция. Так при добавлении веществ сравнения: 67 мкМ простагландина F_2a и простамида F2 (этаноламида простагландина F_2a) флуоресценция кальциевого сенсора возрастает на 195 и 185 у.е. относительно контроля соответственно за 10 мин; тогда как в присутствии вещества 3, такое увеличение составило 405 у.е.When test substances are added to 3T3-L1 cells, an increase in intracellular calcium concentration occurs. So, when adding reference substances: 67 μM prostaglandin F _2a and prostamide F2 (ethanolamide prostaglandin F _2a ), the fluorescence of the calcium sensor increases by 195 and 185 c.u. relative to the control, respectively, for 10 minutes; while in the presence of substance 3, such an increase was 405 c.u.

Пример 7. Генерация оксида азота под действием производных простагландина F_2a.Example 7 Nitric oxide generation by prostaglandin F _2a derivatives.

Клетки 3T3-L1 инкубировали при 95% влажности, в атмосфере 5% CO2, при температуре 37°C. Культивирование проводили в среде DMEM, содержащей 7% FBS, 2 мМ глутамина, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0.25 мкг/мл амфотерицина B. Клетки пересевали каждые 48-72 ч. Для суспендирования клетки инкубировали в растворе Версена в течение 2-3 мин и в растворе ТрипсинЭДТА (0.25%).3T3-L1 cells were incubated at 95% humidity, 5% CO2, at 37°C. Cultivation was carried out in DMEM medium containing 7% FBS, 2 mM glutamine, 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, and 0.25 μg/mL amphotericin B. Cells were subcultured every 48–72 h. for 2-3 min and in TrypsinEDTA solution (0.25%).

--

Claims

Определение уровня генерации NO.Determining the level of NO generation.

Клетки рассеивали по 30 тыс. в лунки (монослой) 96-луночного планшета в 100 мкл среды. Инкубация с веществами продолжалась 20 ч. После этого из каждой лунки отбирали аликвоту среды и определяли концентрацию NO по модифицированному методу Гриса. К 75 мкл анализируемой смеси в лунках 96-луночного планшета для ИФА добавляли 12.5 мкл водного раствора 0.04% сульфаниламида, выдерживали при комнатной температуре 10 мин с защитой от света, после чего добавляли 12.5 мкл 2% раствора нафтилэтилендиамина в ЗМ НС1, выдерживали ещё 10 мин при комнатной температуре с защитой от света, после чего определяли оптическое поглощение при длине волны 540 нм.Cells were scattered 30 thousand per well (monolayer) of a 96-well plate in 100 μl of medium. The incubation with the substances lasted 20 h. After that, an aliquot of the medium was taken from each well and the NO concentration was determined by the modified Gries method. To 75 µl of the analyzed mixture in the wells of a 96-well plate for ELISA, 12.5 µl of an aqueous solution of 0.04% sulfanilamide was added, kept at room temperature for 10 min with protection from light, after which 12.5 µl of a 2% solution of naphthylethylenediamine in 3M HC1 was added, kept for another 10 min at room temperature with protection from light, after which the optical absorption was determined at a wavelength of 540 nm.

Для большинства исследованных соединений максимальную активность по индукции генерации оксида азота наблюдали при концентрации испытуемого вещества 100 мкМ. Результаты отображены в табл. 3.For most of the tested compounds, the maximum activity in induction of nitric oxide generation was observed at a concentration of the test substance of 100 μM. The results are displayed in table. 3.

Таблица 3Table 3

Генерация оксида азота (NO) клетками 3T3-L1 мыши под действием производных простагландина F_2a при концентрации 100 мкМGeneration of nitric oxide (NO) by mouse 3T3-L1 cells under the action of prostaglandin F _2a derivatives at a concentration of 100 μM

Номер соединения Генерация NO, % к контролюConnection number NO generation, % to control

1 71 7

2 252 25

3 153 15

6 56 5

7 157 15

8 228 22

11 28eleven 28

20 5720 57

Однако для амида простагландина F_2a (3) наиболее эффективной была концентрация 25 мкМ. При этой концентрации уровень оксида азота в клетках 3T3-L1 повышался на 60% по отношению к контролю, указанному на фигуре.However, for prostaglandin F _2a amide (3), the concentration of 25 μM was the most effective. At this concentration, the level of nitric oxide in 3T3-L1 cells increased by 60% relative to the control indicated in the figure.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM

1. Соединение общей формулы1. Compound of the general formula

в которой R¹⁼H, R²= , где п=1-4; илиin which R ¹⁼ H, R ² = where n=1-4; or

R=H, R²=R=H, ^R2 =

, где R³=CHMe₂, HNCH₂CH₂ONO₂, OCH₂CH₂ONO₂, OCH(CH₂ONO₂)₂; или, where R ³ =CHMe ₂ , HNCH ₂ CH ₂ ONO ₂ , OCH ₂ CH ₂ ONO ₂ , OCH(CH ₂ ONO ₂ ) ₂ ; or

R=H, R²=R=H, ^R2 =

ИЛИOR

R³ О i , где R⁴=H, CHMe2; R^S=H, OH; R⁶=H, OH, ONO2, CH₂OH,R ³ O i , where R ⁴ =H, CHMe2; R ^S = H, OH; R ⁶ \u003d H, OH, ONO2, CH ₂ OH,

CH₂ONO₂; илиCH ₂ ONO ₂ ; or

R¹⁼H; R²=CH₂CH₂OC(O)NHCH₂CH₂ONO₂; илиR ^{1 =} H; R ² =CH ₂ CH ₂ OC(O)NHCH ₂ CH ₂ ONO ₂ ; or

R=H; R²=CH₂CH₂OC(O)OCH(CH₂ONO₂)₂; илиR=H; R ² =CH ₂ CH ₂ OC(O)OCH(CH ₂ ONO ₂ ) ₂ ; or

NR¹R²=HO'' , гдеп=1,2, или его фармацевтически приемлемая соль.NR ¹ R ² =HO'', where n=1.2, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

2. Соединение по п.1, выбранное из2. The compound according to claim 1, selected from

-7 042625-7 042625

3. Применение соединения по любому из пп.1, 2 для снижения внутриглазного давления.3. Use of a compound according to any one of claims 1, 2 to reduce intraocular pressure.

--