EA042519B1 - ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus mojavensis PS17 ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ УРОЖАЙНОСТИ И ЗАЩИТЫ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ ОТ ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ - Google Patents

Description

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, в частности к производству биологических препаратов для защиты растений от фитопатогенных грибов, и может быть использовано для создания биологических фунгицидов для стимуляции роста и повышения урожайности сельскохозяйственных культур и представляет собой штамм бактерии Bacillus mojavensis

PS17.

Многие фитопатогенные грибы наносят существенный ущерб урожаю и качественным характеристикам сельскохозяйственных культур [1]. Для защиты растений от болезней, вызываемых грибами, используются химические и биологические препараты - фунгициды [2]. Применение химических фунгицидов имеет ряд негативных моментов, связанных с экологическими проблемами и развитием у фитопатогенов устойчивости (резистентности) к ним [3]. В связи с этим, важное значение приобретает эффективная биологическая защита растений [4]. Для решения данной задачи наиболее часто используются биологические препараты на основе различных микроорганизмов. В качестве микроорганизмов биологических агентов биопрепаратов для защиты от болезней широко используются бактерии родов Bacillus и Pseudomonas [5], многие из которых являются частью природной микрофлоры растений, взаимовыгодно взаимодействуя с ними. Несмотря на то, что многие микроорганизмы способны стимулировать рост растения и защищать его от воздействия фитопатогенных организмов, с точки зрения удобства применения спорообразующие бактерии рода Bacillus имеют преимущество, поскольку их споры могут длительно храниться, что позволяет биопрепаратам на их основе длительно сохранять свою активность и разрабатывать эффективные промышленные технологии их производства [6]. Установлено положительное влияние штаммов бактерий рода Bacillus на рост и развитие растений, снижение развития болезней и повышение урожайности [7]. В связи с этим, поиску эффективных штаммов бактерий рода Bacillus уделяется пристальное внимание.

Известны штаммы бактерий рода Bacillus, обладающих способностью подавлять рост фитопатогенных грибов и стимулировать формирование урожая сельскохозяйственных культур. В частности, это Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 и биопрепарат Фитоспорин, созданный на основе этого штамма [8]; В. subtilis Б 93 ВИЗР [9], В. subtilis BZR 517 [10] и др.

Недостатком всех вышеперечисленных штаммов является недостаточная биологическая активность в отношении подавления фитопатогенов и недостаточно изученное влияние на урожайность сельскохозяйственных культур.

Одним из ценных источников для поиска биологических агентов для создания биопрепаратов для защиты от болезней являются эндофитные бактерии [11].

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является штамм Bacillus mojavensis Lhv-97, обладающий фунгицидной и бактерицидной активностями и выделенный из ризосферной почвы [12].

Задачей изобретения является выявление штамма, пригодного для получения биологического препарата с высокой активностью в подавлении фитопатогенных грибов и повышающего урожайность сельскохозяйственных культур, позволяющего расширить набор средств биологической защиты растений от болезней.

Поставленная задача решается тем, что выделен штамм Bacillus mojavensis PS17, пригодный для получения биопрепарата против фитопатогенных грибов и повышения урожайности сельскохозяйственных культур.

Новый штамм выделен из семян пшеницы сорта Садокат (Республика Таджикистан) и депонирован в Национальном Биоресурсном Центре Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ Курчатовский институт - ГосНИИгенетика, под регистрационным номером ВКПМВ-13415.

Основными критериями отбора служили подавление роста фитопатогенных грибов, положительное влияние на продуктивность растений, отсутствие патогенности к теплокровным животным и совместимость с другими микроорганизмами. Видовая принадлежность определялась с использованием молекулярно-генетических методов по последовательности нуклеотидов в 16S рРНК, а также амплификацией видоспецифичного фрагмента, характерного для бактерий вида Bacillus mojavensis в НИЦ Курчатовский институт - ГосНИИгенетика.

Штамм характеризуется следующими морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими признаками.

Клетки штамма представляют собой грамположительные аэробные спорообразующие прямые палочки с закругленными концами размером 1,5-2,5х0,5-0,7 мкм; располагаются, как правило, парами или одиночно, цепочки встречаются реже. При спорообразовании клетки не раздуваются, споры эллипсовидные, расположены центрально.

На мясо-пептонном агаре (МПА) через 2 суток образует округлые колонии с фестончатым краем, 56 мм в диаметре; с преимущественно зернистой поверхностью, матовые, непрозрачные, цвет - белый с зеленоватыми оттенками. Колонии имеют выпуклое основание, рельефные складки и значительно приподнятый центральный кратер; обладают вязкой, тягучей консистенцией, при этом имеют наружный мягкий кожистый слой, в агар не врастают.

Bacillus mojavensis PS17 является аэробной, хемоорганогетеротрофной бактерией, не нуждающейся

- 1 042519 в факторах роста. Растет в диапазоне температур от 10 до 47°С с оптимальным диапазоном 28-32°С, при значениях рН среды от 4,5 до 8,5 с оптимумом 7,0-7,5, при концентрации хлорида натрия до 5%.

Проявляет активность триптофандеаминазы и желатиназы. Активность β-галактозидазы (ортонитрофенил-βD-галактопиранозидазы), аргининдигидролазы, лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы, уреазы не выявлена. Не продуцирует индол и сероводород и восстанавливает нитраты. Реакция Фогес-Проскауэра (продукция ацетоина) положительная.

В качестве источника углерода и энергии утилизирует D-глюкозу, D-фруктозу, D-ксилозу, Dрибозу, L-арабинозу, D-маннозу, D-маннит, инозит, D-сорбит, метил-αD-маннопиранозид, метил-aDглюкопиранозид, D-мальтозу, D-целлобиозу, D-лактозу, амигдалин, арбутин, эскулин, салицин, Dмелибиозу, D-сахарозу, D-трегалозу, D-раффинозу, гентибиозу, глицерин, цитрат.

Не утилизирует эритритол, D-арабинозу, D-адонитол, D-галактозу, L-ксилозу, L-сорбозу, Lрамнозу, метил-βD-ксилопиранозид, дульцитол, N-ацетилглюкозамин, инулин, D-мелецитозу, ксилит, Dтуранозу, D-ликсозу, D-тагатозу, D-фукозу, D-арабит, L-арабит, глюконат калия, 2-кетоглюконат калия, 5-кетоглюконат калия.

Штамм хранится при 4-6°С в пробирках с полужидким агаром в минеральной среде (состав: калия фосфат двузамещенный 5,8 г/л, калия фосфат однозамещенный 3 г/л, аммоний сернокислый 1 г/л, глицерин 2 г/л с добавлением 0,7% агара, рН среды 7,0-7,2) под вазелиновым маслом, которое наливается в пробирки по истечении 2 суток роста культуры. В таких условиях срок хранения штамма без пересева составляет не менее 1 года.

Штамм хорошо растет на МПА, КингБ, среде LB, сусло-агаре (состав: концентрат сусла пивного неохмеленного, разбавленный дистиллированной водой до общей концентрации Сахаров 10% (10° Баллинга), рН 7,0-7,2 с добавлением 2,0% агар-агара), среде Громыко, среде Гаузе №2 (состав: триптон - 2,5 г; пептон - 5,0 г; NaCl - 5,0 г; глюкоза - 10,0 г; агар-агар - 20 г; вода водопроводная - 1000 мл; рН - 7,07,4) и минеральной среде (состав: калия фосфат двузамещенный 5,8 г/л, калия фосфат однозамещенный 3 г/л, аммоний сернокислый 1 г/л, глицерин 10 г/л с добавлением 0,7% агара, рН среды 7,0-7,2). Ферментация осуществляется на смеси равных объемов мясо-пептонного бульона и 6°Б неохмеленного пивного сусла (рН 6,9-7,2) при 30°С до 95% спорообразования. Количество КОЕ составляет не менее 5x109 в 1 мл.

Исследование патогенности заявляемого штамма для теплокровных животных были проведены в ГБОУ ВПО Казанском Федеральном университете, в результате которых было получено заключение о том, что по показателям вирулентности, диссеминации, токсичности и токсигенности штамм Bacillus mojavensis PS17 не патогенен для теплокровных животных и удовлетворяет требованиям, предъявляемым к промышленным микроорганизмам.

Пример 1. Исследование антагонистической активности штамма Bacillus mojavensis PS17.

Исследование антагонистической активности штамма Bacillus mojavensis PS17 проводили с использованием конфронтационный метод. В центр чашек Петри со средой КингБ выкладывали блок с мицелием тестируемого гриба, на расстоянии 2-3 см уколом высевали штамм Bacillus mojavensis PS17, в качестве негативного контроля использовали штамм Pseudomonas putida PCL1760, который высевался также уколом, который не выделяет какие-либо антагонистические вещества, подавляющие развитие микромицетов (фиг. 1-5). Чашки Петри помещали на 48-72 часа в термостаты при температуре 25°С для того, чтобы микромицеты и бактерии могли развиваться. Наблюдения проводили на 2-5 сутки в зависимости от скорости роста фитопатогена.

Этот способ определения антагонистической активности принято считать качественным, где о наличии или отсутствии антагонистических свойств судят по появлению зон подавления роста тесткультур вокруг колоний тестируемых микроорганизмов. Это связано с тем, что при такой постановке опыта антагонизм между микроорганизмами реализуется за счет продукции ими различных антимикробных метаболитов. В свою очередь, эти метаболиты диффундируют в питательную среду, поэтому накопление их в конкретной точке питательной среды и, соответственно, размер области, где наблюдаются проявления антагонизма, зависят от объема среды, а также от качества и плотности агара.

Результаты определения антагонистической активности штамма Bacillus mojavensis PS17 представлены на фиг. 1-5. На котором в качестве вариантов представлены: 1) штамм Bacillus mojavensis PS17, 2) Pseudomonas putida PCL1760. В качестве тест-культуры микромицетов использованы: фиг. 1 - Trichoderma asperellum RECB-74F, фиг. 2 - Fusarium equisety, фиг. 3 - Penicillum sp., фиг. 4 - Fusarium sporotrichoides, фиг. 5 - Fusarium oxysporum ZUM2407.

Результаты определения антагонистической активности показали, что все использованные в исследовании тест-культуры микромицетов проявили чувствительность к метаболитам штамма Bacillus mojavensis PS17, что проявлялось как появление зон подавления роста тест-культур. Согласно представленной информации, штамм Bacillus mojavensis PS17 является антагонистом и обладает широким спектром активности.

Пример 2. Лабораторные испытания фитотоксичности и ростостимулирующей активности штамма Bacillus mojavensis PS17.

Для испытания фитотоксичности и ростостимулирующих свойств штамма Bacillus mojavensis PS17

- 2 042519 были использованы зерна пшеницы сорта Симбирпит. Для этого зерна замачивали в суспензии клеток, выращенной на богатой среде LB, которая состоит из 10 г/л бактотриптона, 5 г/л дрожжевого экстракта и 10 г/л хлорида натрия. Готовую среду стерилизовали 40 минут при 110°С, после замачивания семена выкладывали в кювету на фильтровальную бумагу, смоченную водопроводной водой. Семена проращивали 7 дней при температуре 23 °С при длине светового дня 16 часов. Растения собирали и измеряли длину корней. По результатам экспериментов было показано, что штамм Bacillus mojavensis PS17 увеличивал длину стеблей и корней пшеницы (табл. 1).

Таблица 1

Влияние Bacillus mojavensis PS17 на биометрические показатели растений пшеницы сорта Симбирцит

Вариант	Эксперимент 1	Эксперимент 2
Ростки пшеницы
Контроль	142.9±2.9	141.6±3.6
Bacillus mojavensis PS 17	146.5+14.9	151.6+6.3
Корни пшеницы
Контроль	100.9±5.8	102.5±2.4
Bacillus mojavensis PS 17	127.5±7.7	126.0±8.9

Пример 3. Совместимость с полезными микроорганизмами.

Проведено исследование совместимости штамма Bacillus mojavensis PS17 с полезными бактериями Pseudomonas fluorescens RECB-14B, Streptomyces resistomycificus RECB-31B, Pseudomonas fluorescens RECB-44-B, Bacillus mojavensis RECB-50B, Trichoderma asperellum RECB-74F на богатой и минимальной средах. В результате конфронтапионных тестов было показано, что из указанного списка полезных микроорганизмов штамм Bacillus mojavensis PS17 подавляет рост штамма Trichoderma asperellum RECB-74B, Streptomyces resistomycificus RECB-31B и Bacillus amyloliquifaciens RECB-95B. В то же время рост штамма Bacillus mojavensis PS17 был подавлен штаммами Streptomyces resistomycificus RECB-31B и Bacillus amyloliquifaciens RECB-95B. Отсутствие подавления роста штаммов Pseudomonas fluorescens RECB-14B и Pseudomonas fluorescens RECB44B штаммом Bacillus mojavensis PS17 и наоборот отсутствие подавления роста Bacillus mojavensis PS17 штаммами Pseudomonas fluorescens RECB-14B и RECB44B указывает на возможность применения этого микроорганизма с другими биопрепаратами на основе псевдомонад.

Пример 4. Оценка эффективности обработки растений яровой пшеницы штаммом Bacillus mojavensis PS17 в полевых условиях.

Исследования проводились на опытных полях Казанского государственного аграрного университета. Объектом исследования выступал сорт яровой пшеницы Экада 66. Изучалась эффективность опрыскивания растений в период вегетации. В качестве экспериментального варианта выступал биопрепарат на основе Bacillus mojavensis PS17 с нормой 1,0 л/га. Производство биопрепарата проводилось на лабораторной качалке Innova 40R (Eppendorf) при температуре 37°С, время инкубации - 17 часов при ротации 180 об/мин. Среда для получения препаратов - жидкая питательная среда LB, Лурия бульон. Титр не менее 2,5х10⁹ КОЕ/л. В качестве контроля выступал вариант без обработки. Стандартом был зарегистрированный биологический препарат Ризоплан на основе Pseudomonas fluorescens штамм АР-33 с нормой расхода - 1 л/га. Агротехнология возделывания яровой пшеницы - общепринятая для зоны Предкамья Республики Татарстан (Россия). Расход рабочей жидкости - 200 л/га. Обработку проводили дважды - в фазу колошения и в фазу цветения пшеницы.

Применение различных вариантов обработки оказало влияние на развитие листовых микозов (табл. 2) и пораженность колосьев (табл. 3) болезнями.

- 3 042519

Таблица 2

Развитие листовых болезней и биологическая эффективность их контроля при применении биоагентов на яровой пшенице (через 14 дней после обработки), %, 2018 г.

Вариант	Развитие болезни, %	Биологическая эффективность, %
септориоз листьев	настоящая мучниста роса	септори- оз листь- ев	настоящая мучниста роса
Контроль	13,0	2,5
Ризоплан	15,1	1,0	0	60,0
Bacillus mojavensis PS 17	10,0	0,5	23,1	80,0

С точки зрения контроля листовых болезней, использование Bacillus mojavensis PS17 оказало более выраженное влияние на снижение развития септориоза листьев и настоящей мучнистой росы в сравнении со стандартным биофунгицидом Ризоплан.

Таблица 3

Распространенность болезней колоса и биологическая эффективность их контроля при применении биоагентов на яровой пшенице в фазу восковой спелости, %, 2018 г.

Вариант	Развитие болезни, %	Биологическая эффективность, %8
чернь колоса	Септориоз	чернь колоса	септориоз
Контроль	2,0	5,1
Ризоплан	1,5	2,1	25,0	58,8
Bacillus mojavensis PS 17	1,1	1,8	45,0	64,7

С точки зрения контроля болезней колоса, препарат на основе Bacillus mojavensis PS17 значительно превосходил по эффективности контроля микозов стандартный биофунгицид Ризоплан.

Обработка растений Bacillus mojavensis PS17 достоверно увеличила урожайность яровой пшеницы на 0,53 т/га, что значительно превышает результаты, полученные при использовании стандартного биофунгицида Ризоплан (табл. 4).

Таблица 4

Урожайность яровой пшеницы сорта Экада 66, т/га, 2018 г.

Вариант	Урожайность, т/га	Прибавка урожая
т/га	%
Контроль	2,48
Ризоплан	2,57	0,09	3,8
Bacillus mojavensis PS 17	3,01	0,53	21,3
НСР05	0,08

Таким образом, применение дважды в период вегетации культуры эндофитных бактерий Bacillus mojavensis PS17 с нормой 1 л/га оказывает выраженное влияние на снижение поражения растений яровой пшеницы основными болезнями, приводит к росту урожайности.

Пример 5. Оценка эффективности предпосадочной обработки клубней картофеля штаммом Bacillus mojavensis PS17 в полевых условиях.

Объект исследования - картофель сорта Венета, репродукция суперэлита. Изучались варианты обработки клубней перед посадкой. Схема опыта: 1. Контроль - без обработки. 2. Химический препарат стандарт - 290 кс (имидаклоприд + пенцикурон) Престиж (0,7 л/т). 3. Биологический препарат - Ризоплан на основе Pseudomonas fluorescens AP-33 (1 л/т). 4. Биопрепарат на основе эндофитной бактерии Bacillus mojavensis PS 17 (1,0 л/т). Повторность в опытах - четырехкратная. Норма расхода рабочей жидкости - 20 л/т. Клубни обрабатывались непосредственно перед посадкой.

Результаты оценки влияния обработки на пораженность ростков ризоктониозом представлены в табл. 6.

- 4 042519

Таблица 6

Поражение ростков картофеля ризоктониозом и биологическая эффективность контроля при применении обработки клубней, %, 2018 г.

Вариант	Показатель учета бо- лезни	Биологическая эффективность, %
р*	р**	Р	R
Контроль	27,4	6,4
Престиж	5,1	0,6	81,4	90,6
Ризоплан	12,1	2,4	55,8	62,5
Bacillus mojavensis PS 17	5,5	0,7	79,9	89,1

Примечание: * Р - распространенность болезни, %; ** R - развитие болезни, %. По эффективности контроля ризоктониоза препарат на основе Bacillus mojavensis PS17 превосходил стандартных биофунгицид Ризоплан и незначительно уступал показателям для химического препарата - Престиж.

Наибольшая урожайность (табл. 7) была получена при применении препарата на основе Bacillus mojavensis PS17. Если по сравнению с химическим стандартом достоверных различий по урожайности в данном варианте не обнаружилось, то в сравнении со стандартным биофунгицидом Ризопланом прирост общей урожайности составил 3,1 т/га.

Таблица 7

Урожайность картофеля сорта Венета при применении обработки клубней, т/га, 2018 г.

Вариант	Урожайность, т/га	Прибавка к контролю
т/га	%
Контроль	15,5
Престиж	23,3	7,8	50,2
Ризоплан	20,6	5,1	33,0
Bacillus mojavensis PS 17	23,7	8,2	53,0
НСР05	0,08

Таким образом, штамм бактерий Bacillus mojavensis PS17 обладает фунгицидной активностью в отношении фитопатогенных грибов и повышает урожайность сельскохозяйственных культур, что позволит расширить спектр средств биологической защиты растений от болезней.

Список использованной литературы

1. Чумаков, А.Е. Вредоносность болезней сельскохозяйственных куль- тур / А.Е. Чумаков, Т.И. Захарова. - М.: Агропромиздат, 1990. - 127 с.

2. Шкаликов, В.А. Защита растений от болезней: учебник / В.А. Шкаликов, О. О. Белошапкина, Д. Д. Букреев и др.; Под ред. В.А.Шкаликова. М.: Колосс, 2010. - 404 с.

3. Тютерев, С.Л. Механизмы действия фунгицидов на фитопатогенные грибы/ С. Л. Тютерев; Российская акад. с.-х. наук, Всероссийский науч,исслед. ин-т защиты растений. - Санкт-Петербург: Нива, 2010. - 170 с.

4. Штерншис, М.В. Биологическая защита растений: Учебник/М.В. Штерншис, И.В. Андреева, О.Г. Томилова. - Спб.: Издательство «Лань», 2019.-332 с.

- 5 042519

5. Штерншис, М.В. Тенденции развития биотехнологии микробных средств защиты растений в России/М.В. Штерншис // Вестник Томского государственного университета. Биология. - 2012. - № 2 (18). - С. 92-100.

6. Хомяк, А.И. Оптимальные условия культивирования новых бактерий рода Bacillus, перспективных для разработки на их основе биофунгицидов / А.И. Хомяк, А.М. Асатурова, Т.М. Сидорова // В сборнике: Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем . Материалы докладов, представленных на 8-ю Международную конференцию. - 2014. - С. 298301.

7. Асатурова А.М. Изучение влияния бактеризации семян на рост и развитие растений озимой пшеницы / А.М. Асатурова, В.Д. Надыкта, В.Я. Исмаилов и др. // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. - 2013. -№ 85. - С. 43-56.

8. Патент № 2099947 Россия, A01N63/00, C12N1/20, C12N1/20, C12R1:125. Биопрепарат фитоспорин для защиты растений от болезней / Смирнов В.В., Сорокулова И.Б., Бережницкая Т. Г., Ваньянц Г.М., Менликиев М.Я., Недорезков В.Д., Минеев М.И., Вахитов В.А., Байгузина Ф. А. -№ 96121980/13; Заявл. 15.11.1996; Опубл. 27.12.1997.

9. Патент № 2538157 Россия, C12N 1/20 A01N 63/00 C12R 1/125. Штамм бактерий Bacillus subtilis Б 93 ВИЗР для защиты картофеля от болезней при хранении / Новикова И.И., Бойкова И.В., Павлюшин В.А., Зейрук В.Н. -№2013152716/10; Заявл. 27.11.2013; Опубл. 10.01.2015.

10. Патент № 2552146 Россия, C12N 1/20 A01N 63/02 C12R 1/125. Штамм бактерий Bacillus subtilis BZR 517 для получения биопрепарата против фитопатогенных грибов/ Асатурова А.М., Дубяга В.М. - № 2013151375/10; Заявл. 20.11.2013; Опубл. 10.06.2015.

11. Патент № 2648163 Россия, C12N 1/20. Штамм Bacillus mojavensis Lhv-97, обладающий фунгицидной и бактерицидной активностью/ Дунайцев И.А., Лев И.О., Клыкова М.В., Жиглецова С.К., Сосна И.М., Торгонина И.В., Варламова Т.А., Зайцева С.Д. -№ 2017128916; Заявл. 15.08.2017; Опубл. 22.03.2018.

12. Чеботарь В.К., Заплаткин А.Н., Щербаков А.В., и др. Микробные препараты на основе эндофитных и ризобактерий, которые перспективны для повышения продуктивности и эффективности использования минеральных удобрений у ярового ячменя (Hordeum vulgare L.) и овощных культур // Сельскохозяйственная биология. - 2016. - Т. 51 —№ 3. - С. 335-342.

Claims (1)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   Штамм бактерий Bacillus mojavensis PS17, обладающий фунгицидной активностью в отношении фитопатогенных грибов и повышающий урожайность сельскохозяйственных культур, позволяет расширить спектр средств биологической защиты растений от болезней, депонирован в Национальном Биоресурсном Центре Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ Курчатовский институт - ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ В-13415.