EA042276B1 - COMPOSITION OF LACTIC BACTERIA FOR OBTAINING FERMENTED FOOD PRODUCTS WITH IMPROVED NATURAL SWEETNESS AND TASTE - Google Patents

Description

Область изобретенияField of invention

Настоящее изобретение относится к композиции для получения ферментированного молочного продукта, содержащей (1) по меньшей мере один штамм Streptococcus thermophilus (St), где данный штамм St является галактозоферментирующим, где данный штамм несет мутацию в последовательности ДНК гена glcK, кодирующего белок глюкокиназу, где данная мутация инактивирует белок глюкокиназу или имеет отрицательное влияние на экспрессию этого гена, и (2) по меньшей мере один штамм Lactobacillus delbrueckii подв. bulgaricus (Lb). Такую композицию используют для получения ферментированных молочных продуктов с улучшенным сладким вкусом.The present invention relates to a composition for producing a fermented dairy product containing (1) at least one strain of Streptococcus thermophilus (St), where this St strain is galactose-fermenting, where this strain carries a mutation in the DNA sequence of the glcK gene encoding the glucokinase protein, where this the mutation inactivates the protein glucokinase or has a negative effect on the expression of this gene, and (2) at least one strain of Lactobacillus delbrueckii sub. bulgaricus (Lb). Such a composition is used to produce fermented dairy products with improved sweet taste.

Предшествующий уровень техникиPrior Art

Чистые ферментированные молочные продукты распознают по терпкому или кислому вкусу в результате превращения лактозы до молочной кислоты молочнокислыми бактериями во время ферментации. Их, следовательно, часто подслащивают добавлением фруктов, меда, сахара или искусственных подсластителей для удовлетворения желания потребителей в отношении продукта с более сладким вкусом.Pure fermented dairy products are recognized by their tart or sour taste as a result of lactose being converted to lactic acid by lactic acid bacteria during fermentation. They are therefore often sweetened with fruit, honey, sugar or artificial sweeteners to satisfy consumer desire for a sweeter tasting product.

Пищевая промышленность имеет все более и более высокую потребность в низкокалорийных пищевых продуктах со сладким вкусом для того, чтобы помочь преодолеть проблемы лишнего веса и ожирения, которые стали такими распространенными за последние 20 лет. Сладкий вкус, обычно рассматриваемый как приятное ощущение, вызывается присутствием Сахаров и некоторых других веществ. Восприятие вкуса Сахаров является очень разным. Используя сахарозу в качестве эталона как 100, сладость лактозы составляет 16, галактозы - 32 и глюкозы - 74 (Godshall (1988). Food Technology 42(11): 71-78). Глюкоза, таким образом, воспринимается более чем в 4 раза слаще, чем лактоза, все еще имея приблизительно такой же уровень калорий.The food industry has an increasing need for low-calorie, sweet-tasting foods to help overcome the overweight and obesity problems that have become so prevalent over the past 20 years. Sweet taste, usually considered as a pleasant sensation, is caused by the presence of sugars and some other substances. The taste perception of sugars is very different. Using sucrose as a reference as 100, the sweetness of lactose is 16, galactose is 32 and glucose is 74 (Godshall (1988). Food Technology 42(11): 71-78). Glucose is thus perceived to be more than 4 times sweeter than lactose, while still having approximately the same calorie level.

Сахар в ферментированных пищевых продуктах чаще заменяют подсластителями, такими как аспартам, ацесульфам К, сукралоза и сахарин, которые могут давать сладкий вкус с меньшим потреблением калорий. Однако, применение искусственных подсластителей может приводить к постороннему привкусу, и несколько исследований, показывающих то, что потребление искусственных подсластителей связано с недостатками, такими как усиленное чувство голода, аллергии, рак и т.д., способствовало предпочтению потребителей в отношении ферментированных молочных продуктов, которые содержат только природные подсластители или, предпочтительно, не содержат добавленного подсластителя.Sugar in fermented foods is more often replaced with sweeteners such as aspartame, acesulfame K, sucralose, and saccharin, which can produce a sweet taste with fewer calories. However, the use of artificial sweeteners can lead to off-flavours, and several studies showing that the consumption of artificial sweeteners is associated with disadvantages such as increased hunger, allergies, cancer, etc. have contributed to consumer preference for fermented dairy products, which contain only natural sweeteners or preferably do not contain added sweetener.

Таким образом, особая задача состоит в разработке ферментированных молочных продуктов, у которых имеется сильный природный (собственный) сладкий вкус.Thus, it is a particular challenge to develop fermented dairy products that have a strong natural (intrinsic) sweet taste.

Кислотность ферментированных молочных продуктов в значительной степени зависит от присутствующих молочнокислых бактерий и параметров способа, используемого для приготовления ферментированного молочного продукта.The acidity of fermented dairy products is highly dependent on the lactic acid bacteria present and the process parameters used to prepare the fermented dairy product.

Ферментация дисахарида лактозы очень хорошо исследована у молочнокислых бактерий, так как она является главным источником углерода в молоке. У многих видов лактоза расщепляется после потребления β-галактозидазой на глюкозу и галактозу. Глюкоза фосфорилируется глюкокиназой до глюкозо-6-фосфата и ферментируется посредством пути Эмбдена-Мейергофа-Парнаса (гликолиз) большинством молочнокислых бактерий (см. чертеж).The fermentation of the disaccharide lactose has been very well studied in lactic acid bacteria, as it is the main source of carbon in milk. In many species, lactose is broken down after consumption by β-galactosidase into glucose and galactose. Glucose is phosphorylated by glucokinase to glucose-6-phosphate and fermented via the Embden-Meyerhof-Parnass pathway (glycolysis) by most lactic acid bacteria (see drawing).

Streptococcus thermophilus представляет собой одну из чаще всего используемых молочнокислых бактерий для промышленной термофильной ферментации молока, где данный организм обычно используют как часть смешанной заквасочной культуры, причем другим компонентом являются виды Lactobacillus, например Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus для йогурта или Lactobacillus helveticus для сыра швейцарского типа.Streptococcus thermophilus is one of the most commonly used lactic acid bacteria for industrial thermophilic fermentation of milk, where the organism is usually used as part of a mixed starter culture, with the other component being Lactobacillus species, for example Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus for yogurt or Lactobacillus helveticus for Swiss type cheese.

Стандартизованное определение йогурта во многих странах требует присутствия Streptococcus thermophilus наряду с Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus. Оба вида генерируют желательные количества ацетальдегида, который является важным вкусовым компонентом в йогурте.The standardized definition of yogurt in many countries requires the presence of Streptococcus thermophilus along with Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Both types generate desirable amounts of acetaldehyde, which is an important flavor component in yogurt.

Лактоза и сахароза легче ферментируются Streptococcus thermophilus, чем их составные моносахариды. В присутствии избытка галактозы ферментируется только глюкозная часть молекулы лактозы, и при использовании Streptococcus thermophilus в ферментированных молочных продуктах накапливается галактоза. В йогурте, где высокие концентрации кислоты ограничивают ферментацию, остается свободная галактоза, тогда как свободная галактоза, продуцируемая на ранних стадиях изготовления швейцарского сыра, позднее ферментируется Lactobacillus helveticus.Lactose and sucrose are more readily fermented by Streptococcus thermophilus than their constituent monosaccharides. In the presence of excess galactose, only the glucose portion of the lactose molecule is fermented, and when Streptococcus thermophilus is used, galactose accumulates in fermented dairy products. In yogurt, where high acid concentrations limit fermentation, free galactose remains, while the free galactose produced in the early stages of Swiss cheese making is later fermented by Lactobacillus helveticus.

Однако несколькими исследователями были описаны галактозоферментирующие штаммы и Streptococcus thermophilus, и Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus (Hutkins et al. (1986) J. Dairy Sci. 69(1): 1-8; Vaillancourt et al. (2002) J. Bacteriol. 184(3); 785-793), и в WO 2011/026863 (Chr. Hansen) описан способ получения штаммов Streptococcus thermophilus, которые являются галактозоферментирующими.However, galactose-fermenting strains of both Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus have been described by several investigators (Hutkins et al. (1986) J. Dairy Sci. 69(1): 1-8; Vaillancourt et al. (2002) J. Bacteriol. 184 (3); 785-793), and WO 2011/026863 (Chr. Hansen) describes a method for producing strains of Streptococcus thermophilus that are galactose-fermenting.

Для того чтобы удовлетворять требованиям пищевой промышленности, стало подходящим предлагать новые штаммы, в частности штаммы Streptococcus thermophilus и штаммы Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, которые дают более натуральный сладкий вкус без дополнительных калорий непосредственно в ферментированном продукте (собственный сладкий вкус) посредством выделения глюкозы.In order to meet the requirements of the food industry, it has become suitable to offer new strains, in particular strains of Streptococcus thermophilus and strains of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, which give a more natural sweet taste without additional calories directly in the fermented product (own sweet taste) through the release of glucose.

- 1 042276- 1 042276

Pool et al. (2006. Metabolic Engineering 8(5); 456-464) раскрывают штамм Lactococcus lactis, в котором метаболизм глюкозы полностью нарушен посредством делеции генов, кодирующих глюкокиназу, EII(man/glc) и недавно открытую глюкозо-PTS EII(cel). Способом конструирования является генетическая рекомбинация для получения всех мутаций, и полученный в результате штамм, следовательно, является генетически модифицированным организмом (ГМО), который в настоящее время не может быть использован в пищевых продуктах.Pool et al. (2006. Metabolic Engineering 8(5); 456-464) disclose a strain of Lactococcus lactis in which glucose metabolism is completely impaired by the deletion of genes encoding glucokinase, EII(man/glc) and the recently discovered glucose-PTS EII(cel). The design method is genetic recombination to obtain all mutations, and the resulting strain is therefore a genetically modified organism (GMO) that cannot currently be used in food.

Thompson et al. (1985. J Bacteriol. 162(1); 217-223) исследовали метаболизм лактозы у Streptococcus lactis (в настоящее время переименован в Lactococcus lactis). В данной работе использовали 2дезоксиглюкозу для получения мутанта в системе маннозо-PTS. Затем данный мутант был подвергнут мутагенезу ультрафиолетовым облучением (УФ) с последующим скринингом на глюкозоотрицательные колонии методом отпечатков. Этим методом был выделен двойной мутант (маннозо-PTS и глюкокиназа). Данный двойной мутант использовали для исследования механизмов, участвующих в регуляции ферментации лактозы заквасочными организмами. Данные мутанты имеют несколько недостатков по сравнению с их родительским штаммом, которые делают их неподходящими для включения в имеющуюся в продаже заквасочную культуру. Выход клеток мутантов составлял половину от выхода родительского штамма на моль ферментированной лактозы, и у мутантов было значительно увеличено время удвоения при выращивании на лактозе. Подобным образом, выход молочной кислоты составлял половину от выхода родительского штамма на моль ферментированной лактозы. Поведение данных штаммов в молоке не анализировали, но предполагается, что скорость подкисления была бы значительно снижена.Thompson et al. (1985. J Bacteriol. 162(1); 217-223) examined lactose metabolism in Streptococcus lactis (now renamed Lactococcus lactis). In this work, 2deoxyglucose was used to obtain a mutant in the mannose-PTS system. This mutant was then subjected to ultraviolet (UV) mutagenesis followed by fingerprint screening for glucose negative colonies. This method was used to isolate a double mutant (mannose-PTS and glucokinase). This double mutant was used to investigate the mechanisms involved in the regulation of lactose fermentation by starter organisms. These mutants have several disadvantages compared to their parental strain that make them unsuitable for inclusion in a commercially available starter culture. The cell yield of the mutants was half that of the parental strain per mole of fermented lactose, and the mutants had significantly increased doubling time when grown on lactose. Similarly, the yield of lactic acid was half that of the parent strain per mole of fermented lactose. The behavior of these strains in milk has not been analyzed, but it is expected that the rate of acidification would be significantly reduced.

Кроме того, Lactococcus lactis обычно не выбирают для продуцирования ацетальдегида, и он не способствует выполнению требований для стандартизованного определения йогурта.In addition, Lactococcus lactis is generally not selected for acetaldehyde production and does not contribute to the standardized determination of yogurt.

Chervaux et al. (2000. Appl. And Environ. Microbiol., 66, 5306-5311) исследовали физиологию штаммов Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus в новой химически определенной среде и выделили мутантов, устойчивых к 2-дезоксиглюкозе, которые были дефицитными по ферментации глюкозы. Наблюдали несколько разных фенотипов, и были описаны специфичные для штаммов эффекты.Chervaux et al. (2000. Appl. And Environ. Microbiol., 66, 5306-5311) investigated the physiology of strains of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus in a new chemically defined medium and isolated 2-deoxyglucose resistant mutants that were deficient in glucose fermentation. Several different phenotypes have been observed and strain-specific effects have been described.

В WO2013/160413 раскрыты штаммы Streptococcus thermophilus и штаммы Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus с улучшенными свойствами в отношении природного подслащивания пищевых продуктов и уменьшения содержания лактозы ферментированного молока, и способ скрининга и выделения таких штаммов.WO2013/160413 discloses Streptococcus thermophilus strains and Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus strains with improved natural food sweetening and fermented milk lactose reduction properties, and a method for screening and isolating such strains.

В WO2015/193449 раскрыт способ получения ферментированного молочного продукта с очень низкой концентрацией лактозы с использованием комбинации лактазы и молочнокислых бактерий с недостаточностью в метаболизме глюкозы.WO2015/193449 discloses a method for producing a fermented dairy product with a very low concentration of lactose using a combination of lactase and lactic acid bacteria deficient in glucose metabolism.

В WO2015/193459 раскрыт способ получения ферментированного молочного продукта с пониженным уровнем последующего закисления, в котором в одном воплощении используют смесь четырех штаммов молочнокислых бактерий с недостаточностью в метаболизме глюкозы, и в котором в другом воплощении используется смесь дефицитных по лактозе штаммов молочнокислых бактерий.WO2015/193459 discloses a process for producing a fermented dairy product with a reduced level of post acidification, which in one embodiment uses a mixture of four strains of lactic acid bacteria deficient in glucose metabolism, and which in another embodiment uses a mixture of lactose deficient strains of lactic acid bacteria.

Задача настоящего изобретения заключается в предложении композиции для получения ферментированного молочного продукта, содержащей по меньшей мере один глюкозодефицитный штамм Streptococcus thermophilus и по меньшей мере один штамм Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, где данная композиция дает ферментированный молочный продукт с улучшенным вкусом.The object of the present invention is to provide a composition for producing a fermented dairy product containing at least one glucose-deficient strain of Streptococcus thermophilus and at least one strain of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, wherein the composition provides a fermented dairy product with improved taste.

Краткое изложение сущности изобретенияBrief summary of the invention

Данная задача достигается с использованием настоящего изобретения, которое направлено на композицию для получения ферментированного молочного продукта, содержащую (1) по меньшей мере один штамм Streptococcus thermophilus (St), где данный штамм St является галактозоферментирующим, где данный штамм несет мутацию в последовательности ДНК гена glcK, кодирующей белок глюкокиназу, где данная мутация инактивирует белок глюкокиназу или имеет отрицательное влияние на экспрессию этого гена, и (2) по меньшей мере один штамм Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus (Lb), где данный штамм Lb является лактозодефицитным и способен метаболизировать нелактозный углевод.This object is achieved using the present invention, which is directed to a composition for producing a fermented dairy product containing (1) at least one strain of Streptococcus thermophilus (St), where this St strain is galactose-fermenting, where this strain carries a mutation in the DNA sequence of the glcK gene , encoding a glucokinase protein, where this mutation inactivates the glucokinase protein or has a negative effect on the expression of this gene, and (2) at least one strain of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb), where this Lb strain is lactose-deficient and is able to metabolize a non-lactose carbohydrate.

Хорошо известно, что для традиционных заквасочных культур для получения ферментированных молочных продуктов, содержащих штамм Streptococcus thermophilus и штамм Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, имеется риск формирования нежелательных привкусов, например от свободных аминокислот, например глутаминовой кислоты. Кроме того, хорошо известно, что привкусы формируются штаммом Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, и что уровень сформировавшихся привкусов зависит от уровня роста указанного штамма, который варьирует в зависимости от целого ряда факторов, таких как уровень инокуляции штамма Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, тип ростовой среды и ростовые условия ферментации, а также специфический штамм Streptococcus thermophilus и штамм Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, используемые в заквасочной культуре. Теперь обнаружили, что для заквасочных культур для получения ферментированного молочного продукта с усиленным сладким вкусом, содержащего по меньшей мере один глюкозодефицитный штамм Streptococcus thermophilus и по меньшей мере один штамм Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, формирование нежелательных привкусов находится на особенно высоком уровне. Это согласуется с тем фактом, что в таких заквасочных культурах штамм Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus вырастает до особенно большого числа клеток.It is well known that conventional starter cultures for the production of fermented dairy products containing the strain of Streptococcus thermophilus and the strain of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus run the risk of developing undesirable off-flavours, eg from free amino acids, eg glutamic acid. In addition, it is well known that off-flavors are produced by Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and that the level of off-flavors formed depends on the level of growth of said strain, which varies depending on a number of factors such as the level of inoculation of the Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus strain, the type of growth medium, and fermentation growth conditions, as well as a specific strain of Streptococcus thermophilus and a strain of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus used in starter culture. It has now been found that for starter cultures for producing a fermented dairy product with enhanced sweet taste, containing at least one glucose-deficient strain of Streptococcus thermophilus and at least one strain of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, the formation of undesirable off-flavors is at a particularly high level. This is consistent with the fact that in such starter cultures the Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus strain grows to a particularly high cell number.

- 2 042276- 2 042276

Неожиданно обнаружили, что проблема привкусов при использовании заквасочных культур с глюкозодефицитным штаммом Streptococcus thermophilus может быть решена посредством применения лактозодефицитного штамма Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, например лактозодефицитного глюкозоположительного штамма Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus. Также обнаружили, что лактозодефицитный штамм Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, используемый в композиции по изобретению, не приводит к какому-либо последующему закислению. Наконец, обнаружили, что лактозодефицитная Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus в комбинации с глюкозодефицитными штаммами Streptococcus thermophilus дают очень большое число клеток по сравнению с традиционными, т.е. лактозоположительными глюкозоположительными штаммами Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus.Surprisingly, it has been found that the problem of off-flavors when using starter cultures with a glucose-deficient strain of Streptococcus thermophilus can be solved by using a lactose-deficient strain of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, for example a lactose-deficient glucose-positive strain of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. It has also been found that the lactose-deficient strain of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus used in the composition of the invention does not lead to any subsequent acidification. Finally, it was found that lactose-deficient Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus in combination with glucose-deficient strains of Streptococcus thermophilus gave a very large number of cells compared to traditional ones, i.e. lactose-positive glucose-positive strains of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.

Весьма неожиданно то, что можно избежать формирования привкусов, например от лактозодефицитного глюкозоположительного штамма Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, и избежать последующего закисления в виду того факта, что Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus является глюкозоположительным и присутствует в ферментированном молочном продукте, содержащем глюкозу, где в теории данный штамм имел бы способность продолжать расти во время хранения ферментированного молочного продукта.It is quite surprising that it is possible to avoid the formation of off-flavours, for example from a lactose-deficient glucose-positive strain of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, and to avoid subsequent acidification in view of the fact that Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus is glucose-positive and is present in a fermented dairy product containing glucose, where in theory this the strain would have the ability to continue growing during storage of the fermented dairy product.

Кроме того, даже более неожиданным является то, что можно избежать формирования привкусов от штамма Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus и избежать последующего закисления, получая в то же время большое число клеток штамма Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, так как обычно ожидалось, что и привкусы, и последующее закисление возникают из-за роста штамма Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus.In addition, even more surprising is that it is possible to avoid the formation of off-flavors from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and to avoid subsequent acidification, while obtaining a large number of cells of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, since both off-flavors and subsequent acidification occurs due to the growth of a strain of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.

Не будучи связанными теорией полагают, что неожиданные эффекты по настоящему изобретению обусловлены различиями в метаболизме лактозодефицитной Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus по изобретению по сравнению с традиционной лактозоположительной Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus.Without being bound by theory, it is believed that the unexpected effects of the present invention are due to differences in the metabolism of the lactose-deficient Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus of the invention compared to the conventional lactose-positive Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.

Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials

На чертеже представлено схематическое изображение катаболизма лактозы у Streptococcus thermophilus. GlcK - глюкокиназа; LacS - транспортер лактозы; LacZ - β-галактозидаза; GalM - мутаротаза; GalK - галактокиназа; GalT - галактозо-1-фосфатуридилтрансфераза; GalE - УДФ-глюкозо-4-эпимераза; Gal1P - галактозо-1-фосфат.The drawing shows a schematic representation of lactose catabolism in Streptococcus thermophilus. GlcK - glucokinase; LacS - lactose transporter; LacZ - β-galactosidase; GalM - mutarotase; GalK - galactokinase; GalT - galactose-1-phosphate uridyltransferase; GalE - UDP-glucose-4-epimerase; Gal1P - galactose-1-phosphate.

Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention

Определения.Definitions.

Термин молочнокислая бактерия в том виде, в котором он здесь используется, означает грамположительную микроаэрофильную или анаэробную бактерию, которая ферментирует сахара с образованием кислот, включая молочную кислоту в качестве преимущественно продуцируемой кислоты, уксусную кислоту и пропионовую кислоту. Самые полезные с промышленной точки зрения молочнокислые бактерии находятся в пределах порядка Lactobacillales, который включает Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Enterococcus spp. и Propionibacterium spp. Молочнокислые бактерии, включающие бактерии вида Lactobacillus sp. и Streptococcus thermophilus, обычно поставляют для молочной промышленности либо в виде замороженных или лиофилизированных культур для объемного размножения закваски, либо в виде так называемых культур для прямого внесения (DVS), предназначенных для прямой инокуляции в ферментационный сосуд или чан для получения молочного продукта, такого как ферментированный молочный продукт. Такие культуры, в общем, называют заквасочные культуры или закваски.The term lactic acid bacterium as used herein means a gram-positive microaerophilic or anaerobic bacterium that ferments sugars to form acids, including lactic acid as the predominantly produced acid, acetic acid and propionic acid. The most industrially useful lactic acid bacteria are within the order Lactobacillales, which includes Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Enterococcus spp. and Propionibacterium spp. Lactic acid bacteria, including bacteria of the species Lactobacillus sp. and Streptococcus thermophilus are commonly supplied to the dairy industry either as frozen or freeze-dried cultures for bulk sourdough propagation, or as so-called direct inoculation cultures (DVS) intended for direct inoculation into a fermentation vessel or vat to produce a dairy product such as fermented dairy product. Such cultures are generally referred to as starter cultures or sourdoughs.

Применение терминов в единственном числе в контексте описания данного изобретения (особенно в контексте следующей формулы изобретения) следует истолковывать как охватывающее термины и в единственном, и во множественном числе, если здесь не указано иное, или это явно не противоречит контексту. Термины содержащий, имеющий, включающий и вмещающий следует истолковывать как открытые термины (т.е. означающие включающий, но не ограничивающийся), если не отмечено иное. Перечисление интервалов значений здесь просто предназначено для того, чтобы служить в качестве краткого способа индивидуальной ссылки на каждое отдельное значение, попадающее в данный интервал, если здесь не указано иное, и каждое отдельное значение включено в данное описание изобретения, как если бы оно было здесь индивидуально перечислено. Все описанные здесь способы можно осуществлять в любом подходящем порядке, если здесь не указано иное, или иначе явно не противоречит контексту. Применение приведенных здесь любого и всех примеров или описывающих примеры формулировок (например, такой как) предназначено просто для лучшего освещения изобретения и не накладывает ограничения на объем изобретения, если не заявлено иное. Никакие формулировки в описании изобретения не следует истолковывать как указывающие на какой-либо незаявленный элемент, существенный для практического выполнения данного изобретения.The use of terms in the singular in the context of the description of this invention (especially in the context of the following claims) should be construed as embracing the terms in both the singular and the plural, unless otherwise indicated here, or this is clearly contrary to the context. The terms containing, having, including, and containing are to be construed as open terms (i.e., meaning including, but not limited to), unless otherwise noted. The listing of ranges of values here is simply intended to serve as a shorthand way of individually referring to each individual value falling within a given range, unless otherwise noted here, and each individual value is included in this specification as if it were here individually. listed. All methods described here can be performed in any suitable order, unless otherwise indicated here, or otherwise clearly does not contradict the context. The use of any and all examples provided herein, or exemplary language (eg, such as) is merely intended to better illuminate the invention and is not intended to limit the scope of the invention unless otherwise stated. Nothing in the description of the invention should be construed as indicating any unclaimed element essential to the practice of this invention.

Применительно к настоящему изобретению, выражение усиление сладкого вкуса означает усиление сладкого вкуса по сравнению со сладким вкусом, вызываемым материнским штаммом, не несущим мутацию в последовательности ДНК гена glcK, кодирующего белок глюкокиназу, где данная мутация инактивирует белок глюкокиназу или имеет отрицательный эффект на экспрессию данного гена.In the context of the present invention, the expression "enhancement of sweet taste" means an increase in sweet taste compared to the sweet taste caused by a mother strain that does not carry a mutation in the DNA sequence of the glcK gene encoding the glucokinase protein, where this mutation inactivates the glucokinase protein or has a negative effect on the expression of this gene. .

- 3 042276- 3 042276

Выражение КОЕ означает колониеобразующие единицы.The expression CFU means colony forming units.

Штаммы Streptococcus thermoyhilus композиции по изобретению.Strains of Streptococcus thermoyhilus compositions according to the invention.

В некоторых странах стандартизованное определение йогурта требует присутствия как Streptococcus thermophilus, так и Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus. Оба вида генерируют желательные количества ацетальдегида, являющегося важным вкусовым компонентом в йогурте.In some countries, the standardized definition of yogurt requires the presence of both Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Both types generate desirable amounts of acetaldehyde, which is an important flavor component in yogurt.

Сыр, такой как моцарелла и сыр для пиццы, как и фета, также могут быть приготовлены посредством ферментации с использованием и Streptococcus thermophilus, и Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus (H0ier et al. (2010) in The Technology of Cheese making, 2^nd Ed. Blackwell Publishing, Oxford; 166-192).Cheese such as mozzarella and pizza cheese, as well as feta, can also be fermented using both Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (H0ier et al. (2010) in The Technology of Cheese making, ^2nd Ed. Blackwell Publishing, Oxford; 166-192).

Для того чтобы удовлетворять требованиям пищевой промышленности, становится желательной разработка новых штаммов, в частности, штаммов Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus и штаммов Streptococcus thermophilus, которые дают более натуральный сладкий вкус непосредственно в ферментированном продукте (собственный сладкий вкус), не давая дополнительных калорий.In order to meet the requirements of the food industry, it has become desirable to develop new strains, in particular strains of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and strains of Streptococcus thermophilus, which give a more natural sweet taste directly in the fermented product (own sweet taste) without providing additional calories.

Streptococcus thermophilus является одной из чаще всего используемых молочнокислых бактерий для коммерческой ферментации молока, где данный организм обычно используют как часть смешанной заквасочной культуры, причем другим компонентом является вид Lactobacillus, например, Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus для йогурта и Lactobacillus helveticus для сыра швейцарского типа.Streptococcus thermophilus is one of the most commonly used lactic acid bacteria for commercial milk fermentation, where the organism is usually used as part of a mixed starter culture, with the other component being a Lactobacillus species, for example, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus for yogurt and Lactobacillus helveticus for Swiss-type cheese.

Только глюкозная часть молекулы лактозы ферментируется Streptococcus thermophilus, а галактоза накапливается в ферментированных молочных продуктах при использовании Streptococcus thermophilus. В йогурте, в котором высокие концентрации кислоты лимитируют ферментацию, свободная галактоза сохраняется, тогда как свободная галактоза, продуцируемая на ранних стадиях изготовления швейцарского сыра, позднее ферментируется Lactobacillus helveticus. Lactobacillus lactis, находящаяся во многих заквасочных культурах, используемых для изготовления сыра, также способна потреблять галактозу, продуцируемую Streptococcus thermophilus.Only the glucose part of the lactose molecule is fermented by Streptococcus thermophilus, while galactose accumulates in fermented dairy products when using Streptococcus thermophilus. In yogurt, in which high acid concentrations limit fermentation, free galactose is retained, while free galactose, produced in the early stages of Swiss cheese making, is later fermented by Lactobacillus helveticus. Lactobacillus lactis, found in many starter cultures used to make cheese, is also able to consume the galactose produced by Streptococcus thermophilus.

Для обеспечения штаммов Streptococcus thermophilus с такой оптимальной эффективностью роста, какая только возможна, авторы настоящего изобретения подвергли галактозоферментирущие штаммы Streptococcus thermophilus воздействию селективного агента 2-дезоксиглюкозы. Типично мутанты, устойчивые к 2-дезоксиглюкозе, имеют мутации в гене, кодирующем глюкокиназу, и в генах, кодирующих белки транспорта глюкозы. Выделенный мутант СНСС16731, который является устойчивым к 2дезоксиглюкозе, имеет мутацию в его гене глюкокиназы (glcK). Помимо мутации в гене глюкокиназы, и СНСС16731, и СНСС19216 имеют мутацию, которая означает, что секретированная глюкоза не транспортируется снова обратно в клетки.In order to provide Streptococcus thermophilus strains with as optimal growth efficiency as possible, the present inventors exposed galactose-fermenting Streptococcus thermophilus strains to the selective agent 2-deoxyglucose. Typically, 2-deoxyglucose-resistant mutants have mutations in the gene encoding glucokinase and in the genes encoding glucose transport proteins. An isolated CHCC16731 mutant that is 2deoxyglucose resistant has a mutation in its glucokinase (glcK) gene. In addition to the mutation in the glucokinase gene, both CHCC16731 and CHCC19216 have a mutation which means that the secreted glucose is not transported back into the cells.

Неожиданным является то, что одни такие мутанты все еще полностью способны подкислять молоко, хотя время подкисления до рН 5 и задерживается на 2-5 часов. Следовательно, они, как таковые, являются полезными в применениях, связанных с ферментированным молоком, и они сохранили способность материнских штаммов к подкислению молока, что характерно для йогурта. Дополнительно обнаружили, что мутанты выделяли глюкозу с высоким уровнем при инокулировании мутантами 9,5%-ного В-молока с 0,05% сахарозы и ферментации при 40°С в течение по меньшей мере 20 часов. В то же время в ферментированном молоке сохраняются очень низкие уровни лактозы. Следовательно, применение таких штаммов для получения ферментированных молочных продуктов может быть важным для людей с непереносимостью лактозы.Surprisingly, such mutants alone are still fully capable of acidifying milk, although the acidification time to pH 5 is delayed by 2-5 hours. Therefore, as such, they are useful in fermented milk applications, and they have retained the ability of the mother strains to acidify milk, which is characteristic of yoghurt. Additionally, the mutants were found to release high levels of glucose when the mutants were inoculated into 9.5% B-milk with 0.05% sucrose and fermented at 40° C. for at least 20 hours. At the same time, very low levels of lactose are retained in fermented milk. Therefore, the use of such strains to produce fermented dairy products may be important for people with lactose intolerance.

Следовательно, конечное ферментированное молоко имеет повышенный индекс собственного сладкого вкуса, рассчитанный как описано Godshall (1988. Food Technology 42(11): 71-78).Therefore, the final fermented milk has an increased intrinsic sweetness index calculated as described by Godshall (1988. Food Technology 42(11): 71-78).

В одном аспекте настоящего изобретения штамм Streptococcus thermophilus представляет собой галактозоферментирующий мутантный штамм Streptococcus thermophilus, где данный мутантный штамм несет мутацию в последовательности ДНК гена glcK, кодирующего белок глюкокиназу, где данная мутация инактивирует кодируемый белок глюкокиназу или имеет отрицательный эффект на экспрессию данного гена. Способы измерения уровня глюкокиназной активности или уровня экспрессии гена глюкокиназы хорошо известны (Porter et al. (1982) Biochim. Biophys. Acta, 709; 178-186) и включают ферментативные анализы с имеющимися в продаже наборами и транскриптомику или количественную ПЦР (полимеразная цепная реакция) с использованием материалов, которые легко доступны.In one aspect of the present invention, the strain of Streptococcus thermophilus is a galactose-fermenting mutant strain of Streptococcus thermophilus, wherein the mutant strain carries a mutation in the DNA sequence of the glcK gene encoding the glucokinase protein, wherein the mutation inactivates the encoded glucokinase protein or has a negative effect on the expression of the gene. Methods for measuring the level of glucokinase activity or the level of expression of the glucokinase gene are well known (Porter et al. (1982) Biochim. Biophys. Acta, 709; 178-186) and include enzymatic assays with commercially available kits and transcriptomics or quantitative PCR (polymerase chain reaction ) using materials that are readily available.

В предпочтительном воплощении изобретения штамм Streptococcus thermophilus по изобретению является устойчивым к 2-дезоксиглюкозе.In a preferred embodiment of the invention, the Streptococcus thermophilus strain of the invention is 2-deoxyglucose resistant.

Бактериальный штамм в том виде, как он здесь используется, относится к бактерии, которая остается генетически неизменной при росте и размножении. Множество идентичных бактерий включено.A bacterial strain, as used herein, refers to a bacterium that remains genetically unchanged through growth and reproduction. A number of identical bacteria are included.

Термин галактозоферментирующие штаммы Streptococcus thermophilus в том виде, как он здесь используется, относится к штаммам Streptococcus thermophilus, которые способны расти на/в среде M17 плюс 2% галактозы. Галактозоферментирующие штаммы Streptococcus thermophilus определены здесь как штаммы Streptococcus thermophilus, которые снижают рН бульона M17, содержащего 2% галактозы в качестве единственного углевода, до 5,5 или ниже при инокулировании из культуры, выращенной в течение ночи, в концентрации 1% и инкубировании в течение 24 часов при 37°С.The term galactose-fermenting strains of Streptococcus thermophilus, as used herein, refers to strains of Streptococcus thermophilus that are capable of growing on/in M17 plus 2% galactose medium. Galactose-fermenting strains of Streptococcus thermophilus are defined here as strains of Streptococcus thermophilus that lower the pH of M17 broth containing 2% galactose as the only carbohydrate to 5.5 or lower when inoculated from an overnight culture at 1% and incubated for 24 hours at 37°C.

Термин мутация инактивирует белок глюкокиназу в том виде, как он здесь используется, отно- 4 042276 сится к мутации, которая приводит к инактивированному белку глюкокиназе, белку глюкокиназе, который, в случае присутствия в клетке, не способен выполнять его нормальную функцию, а также к мутациям, которые предотвращают образование белка глюкокиназы или приводят к деградации белка глюкокиназы.The term mutation inactivates the glucokinase protein, as used herein, refers to a mutation that results in an inactivated glucokinase protein, a glucokinase protein that, if present in a cell, is unable to perform its normal function, as well as mutations that prevent the formation of the glucokinase protein or lead to degradation of the glucokinase protein.

В частности, инактивированный белок глюкокиназа представляет собой белок, который по сравнению с функциональным белком глюкокиназой не способен облегчать фосфорилирование глюкозы до глюкозо-6-фосфата или облегчает фосфорилирование глюкозы до глюкозо-6-фосфата со значительно сниженной скоростью. Ген, кодирующий такой инактивированный белок глюкокиназу, по сравнению с геном, кодирующим функциональный белок глюкокиназу, содержит мутацию в открытой рамке считывания (ORF) данного гена, где указанная мутация может включать делецию, мутацию, приводящую к сдвигу рамки считывания, введение стоп-кодона или мутацию, которая приводит к замене аминокислоты, которая изменяет функциональные свойства белка, или мутацию промотора, которая уменьшает или отменяет транскрипцию или трансляцию данного гена, но не ограничена ими.In particular, an inactivated glucokinase protein is a protein that, compared to a functional glucokinase protein, is unable to facilitate the phosphorylation of glucose to glucose-6-phosphate or facilitates the phosphorylation of glucose to glucose-6-phosphate at a significantly reduced rate. The gene encoding such an inactivated glucokinase protein, as compared to the gene encoding a functional glucokinase protein, contains a mutation in the open reading frame (ORF) of that gene, where said mutation may include a deletion, a mutation leading to a reading frame shift, the introduction of a stop codon, or a mutation that results in an amino acid substitution that alters the functional properties of the protein; or a promoter mutation that reduces or abolishes transcription or translation of the gene, but is not limited to.

В предпочтительных воплощениях мутация уменьшает активность (скорость фосфорилирования глюкозы до глюкозо-6-фосфата) белка глюкокиназы по меньшей мере на 50%, например по меньшей мере на 60%, например по меньшей мере на 70%, например по меньшей мере на 80%, например по меньшей мере на 90%.In preferred embodiments, the mutation reduces the activity (rate of phosphorylation of glucose to glucose-6-phosphate) of the glucokinase protein by at least 50%, such as at least 60%, such as at least 70%, such as at least 80%, for example at least 90%.

Активность глюкокиназы можно определять посредством ферментативных анализов глюкокиназы, как описано Pool et al. (2006. Metabolic Engineering 8; 456-464).Glucokinase activity can be determined by glucokinase enzymatic assays as described by Pool et al. (2006. Metabolic Engineering 8; 456-464).

Термин функциональный белок глюкокиназа в том виде, как он здесь используется, относится к белку глюкокиназе, который, в случае присутствия в клетке, облегчает фосфорилирование глюкозы до глюкозо-6-фосфата. В частности, функциональный белок глюкокиназа может кодироваться геном, содержащим ORF, которая имеет последовательность, соответствующую положению 1-966 в SEQ ID NO: 1, или последовательность, которая имеет по меньшей мере 85%-ную идентичность, например по меньшей мере 90%-ную идентичность, например по меньшей мере 95%-ную идентичность, например по меньшей мере 98%-ную идентичность, например по меньшей мере 99%-ную идентичность по отношению к последовательности, соответствующей положению 1-966 в SEQ ID NO: 1.The term functional glucokinase protein, as used herein, refers to a glucokinase protein that, when present in a cell, facilitates the phosphorylation of glucose to glucose-6-phosphate. In particular, a functional glucokinase protein may be encoded by a gene containing an ORF that has a sequence corresponding to position 1-966 in SEQ ID NO: 1, or a sequence that has at least 85% identity, for example at least 90% a specific identity, such as at least 95% identity, such as at least 98% identity, such as at least 99% identity, to the sequence corresponding to position 1-966 in SEQ ID NO: 1.

Процент идентичности двух последовательностей может быть определен с использованием математических алгоритмов, таких как алгоритм Karlin и Altschul (1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87; 2264), модифицированный алгоритм, описанный Karlin и Altschul (1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90; 58735877); алгоритм Myers и Miller (1988. CABIOS 4; 11-17); алгоритм Needleman и Wunsch (1970. J. Mol. Biol. 48; 443-453) и алгоритм Pearson и Lipman (1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448). Также доступна компьютерная программа для определения идентичности последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислотных последовательностей на основе данных математических алгоритмов. Например, сравнение нуклеотидных последовательностей может быть проведено с использованием программы BLASTN, балл - 100, длина слова -12. Сравнение аминокислотных последовательностей может быть проведено с использованием программы BLASTX, балл - 50, длина слова - 3. В том, что касается остальных параметров программ BLAST, можно использовать параметры по умолчанию.The percent identity of two sequences can be determined using mathematical algorithms such as the algorithm of Karlin and Altschul (1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87; 2264), a modified algorithm described by Karlin and Altschul (1993. Proc. Natl. Acad Sci USA 90;58735877); the algorithm of Myers and Miller (1988. CABIOS 4; 11-17); the algorithm of Needleman and Wunsch (1970. J. Mol. Biol. 48; 443-453); and the algorithm of Pearson and Lipman (1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448). Also available is a computer program for determining the identity of nucleic acid sequences or amino acid sequences based on these mathematical algorithms. For example, comparison of nucleotide sequences can be carried out using the BLASTN program, score - 100, word length -12. Comparison of amino acid sequences can be carried out using the BLASTX program, score - 50, word length - 3. As for the remaining parameters of the BLAST programs, you can use the default parameters.

Во многих странах неприемлемо применение генетически модифицированных организмов (ГМО) для ферментированных молочных продуктов. Вместо этого в настоящем изобретении предложены встречающиеся в природе или индуцированные мутантные штаммы, которые могут обеспечивать желательное накопление глюкозы в ферментированном молочном продукте.In many countries, the use of genetically modified organisms (GMOs) for fermented dairy products is unacceptable. Instead, the present invention provides naturally occurring or induced mutant strains that can provide the desired accumulation of glucose in a fermented dairy product.

Таким образом, в еще более предпочтительном воплощении настоящего изобретения мутантный штамм представляет собой встречающегося в природе мутанта или индуцированного мутанта.Thus, in an even more preferred embodiment of the present invention, the mutant strain is a naturally occurring mutant or an induced mutant.

Термины мутантная бактерия или мутантный штамм в том виде, как они здесь используются, относятся к природной (спонтанной, встречающейся в природе) мутантной бактерии или к индуцированной мутантной бактерии, содержащей в ее геноме (ДНК) одну или более чем одну мутацию, которая отсутствует в ДНК дикого типа. Индуцированный мутант представляет собой бактерию, где мутация была индуцирована обработкой человеком, такой как обработка химическими мутагенами, УФ- или гаммаизлучением и т.д. В отличие от этого, спонтанный мутант или встречающийся в природе мутант не был мутагенизирован человеком. Мутантные бактерии здесь не являются ГМО (генетически модифицированный организм), т.е. они не модифицированы посредством технологии рекомбинантной ДНК.The terms mutant bacterium or mutant strain, as used herein, refers to a natural (spontaneous, naturally occurring) mutant bacterium or an induced mutant bacterium containing in its genome (DNA) one or more mutations that are not present in wild-type DNA. An induced mutant is a bacterium where the mutation has been induced by human treatment such as treatment with chemical mutagens, UV or gamma radiation, etc. In contrast, a spontaneous mutant or a naturally occurring mutant has not been mutagenized by humans. The mutant bacteria here are not GMOs (Genetically Modified Organisms), i.e. they are not modified by recombinant DNA technology.

Термин штамм дикого типа относится к немутировавшей форме бактерии в том виде, в котором она находится в природе.The term wild-type strain refers to the unmutated form of a bacterium as it occurs in nature.

Такие термины, как штаммы со свойством усиления сладкого вкуса, штаммы, которые могут обеспечивать желательное накопление глюкозы в ферментированном молочном продукте и штаммы с улучшенными свойствами в отношении природного усиления сладкого вкуса пищевых продуктов, используют здесь взаимозаменяемо для характеризации полезного аспекта применения штаммов по настоящему изобретению в ферментации молочных продуктов.Terms such as strains with a sweet taste enhancing property, strains that can provide a desirable accumulation of glucose in a fermented dairy product, and strains with improved natural sweet taste enhancing properties in foods are used interchangeably herein to characterize the useful aspect of using the strains of the present invention in fermentation of dairy products.

В предпочтительном воплощении мутантный штамм Streptococcus thermophilus согласно изобретению увеличивает количество глюкозы в 9,5%-ном В-молоке до по меньшей мере 5 мг/мл при инокулировании в 9,5%-ное В-молоко в концентрации 106-10⁷ КОЕ/мл и выращивании при 40°С в течение по меньIn a preferred embodiment, the mutant strain of Streptococcus thermophilus according to the invention increases the amount of glucose in 9.5% B-milk to at least 5 mg/ml when inoculated into 9.5% B-milk at a concentration of 106-10 ⁷ CFU/ ml and growing at 40°C for less

- 5 042276 шей мере 20 часов.- 5 042276 at least 20 hours.

В другом предпочтительном воплощении мутантный штамм Streptococcus thermophilus согласно изобретению увеличивает количество глюкозы в 9,5%-ном В-молоке с 0,05% сахарозы до по меньшей мере 5 мг/мл при инокулировании в 9,5%-ное В-молоко с 0,05% сахарозы в концентрации 10⁶-10⁷ КОЕ/мл и выращивании при 40°С в течение по меньшей мере 20 часов.In another preferred embodiment, the mutant strain of Streptococcus thermophilus according to the invention increases the amount of glucose in 9.5% B-milk with 0.05% sucrose to at least 5 mg/ml when inoculated into 9.5% B-milk with 0.05% sucrose at a concentration of 10 ⁶ -10 ⁷ cfu/ml and grown at 40°C for at least 20 hours.

В настоящем контексте 9,5%-ное В-молоко представляет собой кипяченое молоко, полученное с использованием восстановленного обезжиренного сухого молока с низким содержанием жира, до уровня сухого вещества 9,5% и пастеризованное при 99°С в течение 30 мин с последующим охлаждением до 40°С.In the present context, 9.5% B-milk is boiled milk made using reconstituted low-fat skimmed milk powder to a dry matter level of 9.5% and pasteurized at 99°C for 30 minutes followed by cooling up to 40°С.

В более предпочтительных воплощениях данного изобретения мутантный штамм приводит к увеличению количества глюкозы до по меньшей мере 6 мг/мл, например по меньшей мере 7 мг/мл, например по меньшей мере 8 мг/мл, например по меньшей мере 9 мг/мл, например по меньшей мере 10 мг/мл, например по меньшей мере 11 мг/мл, например по меньшей мере 12 мг/мл, например по меньшей мере 13 мг/мл, например по меньшей мере 14 мг/мл, например по меньшей мере 15 мг/мл, например по меньшей мере 20 мг/мл, например по меньшей мере 25 мг/мл.In more preferred embodiments of the invention, the mutant strain results in an increase in glucose to at least 6 mg/mL, such as at least 7 mg/mL, such as at least 8 mg/mL, such as at least 9 mg/mL, such as at least 10 mg/ml, such as at least 11 mg/ml, such as at least 12 mg/ml, such as at least 13 mg/ml, such as at least 14 mg/ml, such as at least 15 mg /ml, for example at least 20 mg/ml, for example at least 25 mg/ml.

В другом воплощении изобретения мутантный штамм Streptococcus thermophilus является устойчивым к 2-дезоксиглюкозе.In another embodiment of the invention, the mutant strain of Streptococcus thermophilus is resistant to 2-deoxyglucose.

Термин устойчивый к 2-дезоксиглюкозе определен здесь тем, что конкретный мутантный бактериальный штамм имеет способность расти до колонии при посеве штрихами на чашку среды M17, содержащую 20 мМ 2-дезоксиглюкозу, после инкубирования при 40°С в течение 20 часов. Присутствие 2дезоксиглюкозы в культуральной среде будет предотвращать рост немутировавших штаммов, тогда как рост мутировавших штаммов не подвергается влиянию или не подвергается значительному влиянию. Немутировавшие штаммы, которые можно использовать в качестве чувствительных контрольных штаммов при оценке устойчивости, предпочтительно включают штаммы СНСС14994 и СНСС11976.The term 2-deoxyglucose resistant is defined herein in that a particular mutant bacterial strain has the ability to grow to a colony when streaked onto an M17 medium plate containing 20 mM 2-deoxyglucose after incubation at 40° C. for 20 hours. The presence of 2deoxyglucose in the culture medium will prevent the growth of non-mutated strains, while the growth of mutated strains is unaffected or not significantly affected. Non-mutated strains that can be used as sensitive control strains in the evaluation of resistance preferably include strains CHCC14994 and CHCC11976.

Мутантные штаммы Streptococcus thermophilus по изобретению выделяют глюкозу в молоко при инокулировании 9,5%-ного В-молока 10⁶-10⁷ КОЕ/мл штамма Streptococcus thermophilus согласно изобретению и ферментации штаммами Streptococcus thermophilus согласно изобретению при 40°С в течение по меньшей мере 20 часов. Предпочтительно, одни такие мутантные штаммы будут выделять по меньшей мере 5 мг/мл глюкозы в В-молоко при инокулировании 9,5%-ного В-молока 10⁶-10⁷ КОЕ/мл штамма Streptococcus thermophilus согласно изобретению и ферментации штаммами Streptococcus thermophilus при 40°С в течение по меньшей мере 20 часов. Данные штаммы все еще полностью способны подкислять молоко, хотя время подкисления до рН 5 задерживается на 2-5 часов. Конечное ферментированное молоко содержит менее чем 15 мг/мл лактозы в ферментированном молоке. Конечное ферментированное молоко, следовательно, имеет более высокий индекс собственного сладкого вкуса, увеличенный приблизительно в 2 раза или более.The mutant strains of Streptococcus thermophilus according to the invention release glucose into milk upon inoculation of 9.5% B-milk with 10 ⁶ -10 ⁷ CFU/ml of the strain of Streptococcus thermophilus according to the invention and fermentation with strains of Streptococcus thermophilus according to the invention at 40°C for at least 20 hours. Preferably, such mutant strains alone will release at least 5 mg/ml glucose into B-milk when 9.5% B-milk is inoculated with 10 ⁶ -10 ⁷ CFU/ml of the Streptococcus thermophilus strain of the invention and fermented with Streptococcus thermophilus strains at 40°C for at least 20 hours. These strains are still fully capable of acidifying milk, although the acidification time to pH 5 is delayed by 2-5 hours. The final fermented milk contains less than 15 mg/ml of lactose in the fermented milk. The final fermented milk therefore has a higher intrinsic sweet taste index increased by about 2 times or more.

В еще одном воплощении мутантный штамм согласно изобретению может отличаться его картиной роста. Это иллюстрируется обнаружением того, что скорость роста мутантного штамма выше в среде M17 плюс 2% галактозы, чем в среде M17 плюс 2% глюкозы. Скорость роста измеряется как развитие оптической плотности экспоненциально растущей культуры при 600 нанометрах (ОП₆₀₀) с течением времени.In another embodiment, the mutant strain according to the invention may differ in its growth pattern. This is illustrated by the finding that the growth rate of the mutant strain is faster in M17 plus 2% galactose than in M17 plus 2% glucose. Growth rate is measured as the development of the optical density of an exponentially growing culture at 600 nanometers (OD ₆₀₀ ) over time.

В предпочтительном воплощении скорость роста по меньшей мере на 5% выше, например по меньшей мере на 10% выше, например по меньшей мере на 15% выше, например по меньшей мере на 20% выше в среде M17 плюс 2% галактозы, чем в среде M17 плюс 2% глюкозы.In a preferred embodiment, the growth rate is at least 5% faster, such as at least 10% faster, such as at least 15% faster, such as at least 20% faster in M17 plus 2% galactose medium than in M17 plus 2% glucose.

Мутация в гене glcK.Mutation in the glcK gene.

В одном предпочтительном воплощении мутация приводит к замене кодона, кодирующего глицин, кодоном, кодирующим аргинин, в положении 249 в SEQ ID NO: 2. Предпочтительно, мутация в гене glcK приводит к замене G на А в положении 745 в SEQ ID NO: 1. Штамм СНСС16731 имеет такую мутацию.In one preferred embodiment, the mutation results in the replacement of the codon encoding glycine with the codon encoding arginine at position 249 in SEQ ID NO: 2. Preferably, the mutation in the glcK gene results in the replacement of G with A at position 745 in SEQ ID NO: 1. The CHCC16731 strain has this mutation.

В предпочтительном воплощении данная мутация приводит к замене кодона, кодирующего серин, кодоном, кодирующим пролин, в положении 72 в SEQ ID NO: 2 (не показано). Предпочтительно, мутация в гене glcK приводит к замене Т на С в положении 214 в SEQ ID NO: 1 (не показано).In a preferred embodiment, this mutation results in the replacement of the codon encoding serine with the codon encoding proline at position 72 in SEQ ID NO: 2 (not shown). Preferably, a mutation in the glcK gene results in a T being replaced by a C at position 214 in SEQ ID NO: 1 (not shown).

В другом предпочтительном воплощении данная мутация приводит к замене кодона, кодирующего треонин, кодоном, кодирующим изолейцин, в положении 141 в SEQ ID NO: 2 (не показано).In another preferred embodiment, this mutation results in the replacement of the codon encoding threonine with the codon encoding isoleucine at position 141 in SEQ ID NO: 2 (not shown).

Предпочтительно, мутация в гене glcK приводит к замене С на Т в положении 422 в SEQ ID NO: 1 (не показано).Preferably, a mutation in the glcK gene results in a change from C to T at position 422 in SEQ ID NO: 1 (not shown).

Следует подчеркнуть то, что ген glcK Streptococcus thermophilus может быть инактивирован другими типами мутаций в других сайтах гена glcK.It should be emphasized that the glcK gene of Streptococcus thermophilus can be inactivated by other types of mutations at other sites of the glcK gene.

Мутация, уменьшающая транспорт глюкозы в клетку.A mutation that reduces the transport of glucose into the cell.

В предпочтительном воплощении штамм Streptococcus thermophilus несет мутацию, которая уменьшает транспорт глюкозы в клетку.In a preferred embodiment, the strain of Streptococcus thermophilus carries a mutation that reduces the transport of glucose into the cell.

Термин мутация, которая уменьшает транспорт глюкозы в клетку в том виде, как он здесь испольThe term mutation that reduces the transport of glucose into the cell as used here

- 6 042276 зуется, относится к мутации в гене, кодирующем белок, участвующий в транспорте глюкозы, которая приводит к накоплению глюкозы в среде клетки.- 6 042276 refers to a mutation in the gene encoding a protein involved in the transport of glucose, which leads to the accumulation of glucose in the cell environment.

Уровень глюкозы в культуральной среде штамма Streptococcus thermophilus может быть легко измерен способами, известными специалисту в данной области техники, также когда культуральная среда представляет собой молочный субстрат.The level of glucose in the culture medium of a strain of Streptococcus thermophilus can be easily measured by methods known to the person skilled in the art, also when the culture medium is a milky substrate.

В предпочтительных воплощениях данная мутация уменьшает транспорт глюкозы в клетку по меньшей мере на 50%, например по меньшей мере на 60%, например по меньшей мере на 70%, например по меньшей мере на 80%, например по меньшей мере на 90%.In preferred embodiments, the mutation reduces glucose transport into the cell by at least 50%, such as at least 60%, such as at least 70%, such as at least 80%, such as at least 90%.

Транспорт глюкозы в клетку может быть определен посредством анализа поглощения глюкозы, как описано Cochu et al. (2003. Appl Environ Microbiol 69(9); 5423-5432).Transport of glucose into a cell can be determined by analyzing glucose uptake as described by Cochu et al. (2003. Appl Environ Microbiol 69(9); 5423-5432).

Предпочтительно, штамм Streptococcus thermophilus несет мутацию в гене, кодирующем компонент глюкозного транспортера, где данная мутация инактивирует белок глюкозного транспортера или имеет отрицательный эффект на экспрессию данного гена.Preferably, the Streptococcus thermophilus strain carries a mutation in a gene encoding a glucose transporter component, wherein the mutation inactivates the glucose transporter protein or has a negative effect on the expression of the gene.

Данным компонентом может быть любой компонент белка глюкозного транспортера, который является критически важным для транспорта глюкозы. Например, предусмотрено, что инактивация любого компонента глюкозной/маннозной PTS в Streptococcus thermophilus будет приводить к инактивации функции глюкозного транспортера.This component can be any component of the glucose transporter protein that is critical for glucose transport. For example, it is contemplated that inactivation of any glucose/mannose PTS component in Streptococcus thermophilus will result in inactivation of glucose transporter function.

Термин мутация инактивирует глюкозный транспортер в том виде, как он здесь используется, относится к мутации, которая приводит к инактивированному глюкозному транспортеру - белку глюкозного транспортера, который, в случае присутствия в клетке, не способен выполнять его нормальную функцию, а также к мутациям, которые предотвращают образование белка глюкозного транспортера или приводят к деградации белка глюкозного транспортера.The term mutation inactivates the glucose transporter, as used herein, refers to a mutation that results in an inactivated glucose transporter, a glucose transporter protein that, if present in a cell, is unable to perform its normal function, as well as mutations that prevent the formation of the glucose transporter protein or lead to degradation of the glucose transporter protein.

В частности, инактивированный белок глюкозного транспортера представляет собой белок, который по сравнению с функциональным белком глюкозного транспортера не способен облегчать транспорт глюкозы через плазматическую мембрану или облегчает транспорт глюкозы через плазматическую мембрану со значительно сниженной скоростью. Ген, кодирующий такой инактивированный белок глюкозного транспортера, по сравнению с геном, кодирующим функциональный белок глюкозного транспортера, содержит мутацию в открытой рамке считывания (ORF) данного гена, где указанная мутация может включать делецию, мутацию, приводящую к сдвигу рамки считывания, введение стоп-кодона или мутацию, которая приводит к аминокислотной замене, которая изменяет функциональные свойства белка, или мутацию промотора, которая уменьшает или отменяет транскрипцию или трансляцию гена, но не ограничен ими.In particular, an inactivated glucose transporter protein is a protein that, compared to a functional glucose transporter protein, is unable to facilitate the transport of glucose across the plasma membrane or facilitates the transport of glucose across the plasma membrane at a significantly reduced rate. The gene encoding such an inactivated glucose transporter protein, compared to the gene encoding a functional glucose transporter protein, contains a mutation in the open reading frame (ORF) of this gene, where the specified mutation may include a deletion, a mutation leading to a reading frame shift, the introduction of a stop a codon or mutation that results in an amino acid substitution that changes the functional properties of the protein, or a promoter mutation that reduces or abolishes transcription or translation of a gene, but is not limited to.

В предпочтительных воплощениях данная мутация уменьшает активность (скорость транспорта глюкозы) белка глюкозного транспортера по меньшей мере на 50%, например по меньшей мере на 60%, например по меньшей мере на 70%, например по меньшей мере на 80%, например по меньшей мере на 90%.In preferred embodiments, the mutation reduces the activity (glucose transport rate) of the glucose transporter protein by at least 50%, such as at least 60%, such as at least 70%, such as at least 80%, such as at least by 90%.

Активность глюкозного транспортера может быть определена посредством анализа поглощения глюкозы, как описано Cochu et al. (2003. Appl Environ Microbiol 69(9); 5423-5432).Glucose transporter activity can be determined by glucose uptake assay as described by Cochu et al. (2003. Appl Environ Microbiol 69(9); 5423-5432).

Термин функциональный белок глюкозного транспортера в том виде, как он здесь используется, относится к белку глюкозного транспортера, который, в случае его присутствия в клетке, облегчает транспорт глюкозы через плазматическую мембрану.The term functional glucose transport protein, as used herein, refers to a glucose transport protein that, when present in a cell, facilitates the transport of glucose across the plasma membrane.

В предпочтительном воплощении изобретения штамм Streptococcus thermophilus по изобретению несет мутацию в последовательности ДНК гена manN, кодирующего белок IID^Man системы глюкозо/маннозофосфотрансферазы, где данная мутация инактивирует белок IIDMan или имеет отрицательный эффект на экспрессию данного гена.In a preferred embodiment of the invention, the strain of Streptococcus thermophilus of the invention carries a mutation in the DNA sequence of the manN gene encoding the protein IID ^Man of the glucose/mannose phosphotransferase system, where this mutation inactivates the IIDMan protein or has a negative effect on the expression of this gene.

СНСС16731 имеет замену треонина на пролин в положении 79 в гене manN, кодирующем белок IIDMan системы глюкозо/маннозофосфотрансферазы. Предпочтительно, данная мутация в гене manN приводит к замене А на С в положении 235 в SEQ ID NO:3.CHCC16731 has a threonine-to-proline substitution at position 79 in the manN gene encoding the IIDMan protein of the glucose/mannose phosphotransferase system. Preferably, this mutation in the manN gene results in a change from A to C at position 235 in SEQ ID NO:3.

Таким образом, в предпочтительном воплощении штамм Streptococcus thermophilus по изобретению несет мутацию в последовательности ДНК гена manN, кодирующего белок IIDMan системы глюкозо/маннозофосфотрансферазы, где данная мутация приводит к замене треонина на пролин в положении 79 SEQ ID NO: 4.Thus, in a preferred embodiment, the Streptococcus thermophilus strain of the invention carries a mutation in the DNA sequence of the manN gene encoding the protein IIDMan of the glucose/mannose phosphotransferase system, where this mutation results in the replacement of threonine by proline at position 79 of SEQ ID NO: 4.

В другом предпочтительном воплощении изобретения штамм Streptococcus thermophilus по изобретению несет мутацию в последовательности ДНК гена тапМ, кодирующего белок IIC^Man системы глюкозо/маннозофосфотрансферазы, где данная мутация инактивирует белок IIC^Man или имеет отрицательный эффект на экспрессию данного гена.In another preferred embodiment of the invention, the Streptococcus thermophilus strain of the invention carries a mutation in the DNA sequence of the tamM gene encoding ^{the Man} IIC protein of the glucose/mannose phosphotransferase system, where the mutation inactivates ^{the Man} IIC protein or has a negative effect on the expression of this gene.

В особом предпочтительном воплощении данная мутация приводит к замене кодона, кодирующего глутаминовую кислоту, на стоп-кодон в положении 209 SEQ ID NO: 6 белка IIC^Man системы глюкозо/маннозофосфотрансферазы (не показано). Предпочтительно данная мутация приводит к замене G на Т в положении 625 SEQ ID NO: 5 (не показано).In a particularly preferred embodiment, this mutation results in a replacement of the codon encoding glutamic acid with a stop codon at position 209 of SEQ ID NO: 6 of the IIC ^Man protein of the glucose/mannose phosphotransferase system (not shown). Preferably, this mutation results in a G being replaced by a T at position 625 of SEQ ID NO: 5 (not shown).

Предпочтительные штаммы Streptococcus thermophilus по изобретению.Preferred strains of Streptococcus thermophilus according to the invention.

В предпочтительном воплощении композиции по изобретению штамм Streptococcus thermophilusIn a preferred embodiment of the composition according to the invention, the Streptococcus thermophilus strain

- 7 042276 выбран из группы, состоящей из штамма СНСС19216 Streptococcus thermophilus, который был депонирован в немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур под № доступа DSM 32227, штамма СНСС16731 Streptococcus thermophilus, который был депонирован в немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Брауншвейг, Германия, 4 июня 2014 г. под № доступа DSM 28889, штамма СНСС15757 Streptococcus thermophilus, который был депонирован в немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур под № доступа DSM 25850, штамма СНСС15887 Streptococcus thermophilus, который был депонирован в Немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур под № доступа DSM 25851, штамма СНСС16404 Streptococcus thermophilus, который был депонирован в немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур под № доступа DSM 26722, и мутантного штамма, происходящего из них, где данный мутантный штамм получен с использованием одного из депонированных штаммов в качестве исходного материала, и где данный мутант имеет сохраненную или дополнительно улучшенную текстурирующую способность и способность указанного депонированного штамма секретировать глюкозу.- 7 042276 is selected from the group consisting of Streptococcus thermophilus strain CHCC19216 which has been deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures under Accession No. DSM 32227, Streptococcus thermophilus strain CHCC16731 which has been deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany, June 4, 2014, Accession No. DSM 28889, Streptococcus thermophilus strain CHCC15757, which has been deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Accession No. DSM 25850, Streptococcus thermophilus strain CHCC15887, which has been deposited with German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Accession No. DSM 25851, Streptococcus thermophilus strain CHCC16404, which was deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Accession No. DSM 26722, and a mutant strain derived therefrom, where this mutant strain is obtained using one of deposited strains as starting material, and where this mutant has retained or further improved texturing ability and the ability of the specified deposited strain to secrete glucose.

В настоящем контексте термин мутантный штамм следует понимать как штаммы, полученные, или штаммы, которые могут быть получены из штамма (или их материнского штамма) по изобретению посредством, например, генной инженерии, обработки облучением и/или химической обработки. Штаммы, полученные из них также могут быть спонтанно возникающими мутантами. Предпочтительным является то, что штаммы, полученные из них являются функционально эквивалентными мутантами, например, мутантами, которые имеют по существу одинаковые или улучшенные свойства по отношению к их материнскому штамму. Термин мутантные штаммы в особенности относится к штаммам, полученным посредством подвергания штамма по изобретению любой традиционно используемой мутагенизирующей обработке, включающей обработку химическим мутагеном, таким как этанметансульфонат (EMS) или К-метил-К'-нитро-К-нитрогуанидин (NTG), УФ светом, или к спонтанно возникающему мутанту. Мутант возможно был подвергнут нескольким мутагенизирующим обработкам (одну обработку следует понимать как одну стадию мутагенеза с последующей стадией скрининга/отбора), но в настоящее время предпочтительно, чтобы проводилось не более чем 20, или не более чем 10, или не более чем 5 обработок (или стадий скрининга/отбора). В предпочтительном в настоящем изобретении мутанте менее 1%, менее 0,1%, менее 0,01%, менее 0,001% или даже менее 0,0001% нуклеотидов в бактериальном геноме было заменено другим нуклеотидом или подвергнуто делеции по сравнению с материнским штаммом.In the present context, the term mutant strain should be understood as strains obtained, or strains that can be obtained from the strain (or their parent strain) according to the invention by, for example, genetic engineering, irradiation treatment and/or chemical treatment. Strains derived from them can also be spontaneously occurring mutants. It is preferred that the strains derived therefrom are functionally equivalent mutants, for example mutants that have substantially the same or improved properties with respect to their parent strain. The term mutant strains particularly refers to strains obtained by subjecting a strain of the invention to any conventionally used mutagenic treatment, including treatment with a chemical mutagen such as ethanemethanesulfonate (EMS) or K-methyl-K'-nitro-K-nitroguanidine (NTG), UV light, or to a spontaneously emerging mutant. The mutant may have been subjected to several mutagenization treatments (one treatment should be understood as one mutagenesis step followed by a screening/selection step), but it is currently preferred that no more than 20, or no more than 10, or no more than 5 treatments be carried out ( or screening/selection steps). In the preferred mutant of the present invention, less than 1%, less than 0.1%, less than 0.01%, less than 0.001%, or even less than 0.0001% of the nucleotides in the bacterial genome have been replaced with a different nucleotide or deleted compared to the parent strain.

Способ получения штамма Streptococcus thermophilus, усиливающего сладкий вкус.A method for producing a strain of Streptococcus thermophilus that enhances sweet taste.

В предпочтительном воплощении изобретения исходным штаммом, используемым для разработки штамма Streptococcus thermophilus, усиливающего сладкий вкус, является текстурирующий штамм Streptococcus thermophilus, который может быть получен, как описано в данном описании изобретения.In a preferred embodiment of the invention, the parent strain used to develop the sweet taste enhancing strain of Streptococcus thermophilus is a texturizing strain of Streptococcus thermophilus, which can be produced as described herein.

В предпочтительном воплощении такой текстурирующий штамм выбран из группы, состоящей из штамма СНСС11342 Streptococcus thermophilus, который был депонирован в Немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур под № доступа DSM 22932, штамма СНСС11976 Streptococcus thermophilus, который был депонирован в Немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур под № доступа DSM 22934, штамма СНСС12339 Streptococcus thermophilus, который был депонирован в Немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур под № доступа DSM 24090, и штаммов, полученных из них.In a preferred embodiment, such texturizing strain is selected from the group consisting of Streptococcus thermophilus strain CHCC11342 which has been deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures under accession no. DSM 22932, Streptococcus thermophilus strain CHCC11976 which has been deposited with the German collection of microorganisms and cell cultures under accession no. accession DSM 22934, Streptococcus thermophilus strain CHCC12339, which was deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures under Accession No. DSM 24090, and strains derived therefrom.

В качестве альтернативы, исходным штаммом, используемым для разработки штамма Streptococcus thermophilus, усиливающего сладкий вкус, является не текстурирующий штамм Streptococcus thermophilus, причем в данном случае текстурирующую способность вводят в штамм Streptococcus thermophilus, усиливающий сладкий вкус, как только он получен, т.е. штамм, усиливающий сладкий вкус, используется в качестве исходного штамма в способе получения текстурирующего штамма, описанного в данном описании изобретения.Alternatively, the starting strain used to develop the sweet taste-enhancing Streptococcus thermophilus strain is a non-texturing Streptococcus thermophilus strain, in which case the texturizing ability is introduced into the sweet taste-enhancing Streptococcus thermophilus strain as soon as it is produced, i. the sweet taste enhancing strain is used as the starting strain in the method for producing the texturizing strain described in this specification.

Первой стадией способа получения штамма Streptococcus thermophilus, усиливающего сладкий вкус, является предоставление галактозоположительного штамма, т.е. штамма, который способен использовать галактозу в качестве источника углеводов. Галактозоположительные штаммы могут быть получены способом, включающим стадию посева штрихом бактерий, подлежащих тестированию, на чашки с агаром, такие как чашки с агаром M17, содержащие определенную концентрацию, например 2%, галактозы (единственный источник углеводов), и идентификацию колоний, способных расти на данных чашках.The first step in the process for producing a sweet taste enhancing strain of Streptococcus thermophilus is to provide a galactose positive strain, i. a strain that is able to use galactose as a carbohydrate source. Galactose-positive strains can be obtained by a method comprising the step of streaking the bacteria to be tested on agar plates, such as M17 agar plates, containing a certain concentration, for example 2%, of galactose (the only source of carbohydrates), and identifying colonies capable of growing on these cups.

Для селекции бактерий, имеющих мутацию в гене глюкокиназы (glcK), используют 2дезоксиглюкозу и определение картины роста бактерий в среде M17 плюс 2% галактозы по сравнению со средой M17 плюс 2% глюкозы.For the selection of bacteria having a mutation in the glucokinase (glcK) gene, 2deoxyglucose is used and the growth pattern of bacteria in M17 plus 2% galactose medium compared to M17 plus 2% glucose medium is used.

Один способ скрининга и выделения штамма Streptococcus thermophilus с мутировавшим геном glcK включает следующие стадии:One method for screening and isolating a strain of Streptococcus thermophilus with a mutated glcK gene includes the following steps:

а) предоставление галактозоферментирующего материнского штамма Streptococcus thermophilus;a) providing a galactose-fermenting parent strain of Streptococcus thermophilus;

б) селекция и выделение из пула мутантных штаммов Streptococcus thermophilus, полученных из материнского штамма, пула мутантных штаммов Streptococcus thermophilus, которые являются устойчивыми к 2-дезоксиглюкозе; иb) selection and isolation from the pool of mutant strains of Streptococcus thermophilus obtained from the parent strain, the pool of mutant strains of Streptococcus thermophilus that are resistant to 2-deoxyglucose; And

- 8 042276- 8 042276

в) селекция и выделение из пула мутантных штаммов Streptococcus thermophilus, которые являются устойчивыми к 2-дезоксиглюкозе, мутантного штамма Streptococcus thermophilus, если скорость роста данного мутантного штамма Streptococcus thermophilus выше в среде M17 плюс 2% галактозы, чем в среде M17 плюс 2% глюкозы.c) selection and isolation from the pool of mutant strains of Streptococcus thermophilus that are resistant to 2-deoxyglucose, the mutant strain of Streptococcus thermophilus, if the growth rate of this mutant strain of Streptococcus thermophilus is higher in the medium M17 plus 2% galactose than in the medium M17 plus 2% glucose .

Термин устойчивый к 2-дезоксиглюкозе определен здесь тем, что конкретный мутировавший бактериальный штамм имеет способность вырастать до колонии при посеве штрихом на чашке со средой M17, содержащей 2% лактозы или 2% галактозы и содержащей 20 мМ 2-дезоксиглюкозы, после инкубации при 40°С в течение 20 часов. Присутствие 2-дезоксиглюкозы в культуральной среде будет предотвращать рост немутировавших штаммов, тогда как рост мутировавших штаммов не подвергается влиянию или не подвергается значимому влиянию. Немутировавшие штаммы, которые можно использовать в качестве чувствительных контрольных штаммов при оценке устойчивости, включают штамм СНСС11976.The term 2-deoxyglucose-resistant is defined herein in that a particular mutated bacterial strain has the ability to grow to a colony when streaked on a plate of M17 medium containing 2% lactose or 2% galactose and containing 20 mM 2-deoxyglucose after incubation at 40°C. C within 20 hours. The presence of 2-deoxyglucose in the culture medium will prevent the growth of non-mutated strains, while the growth of mutated strains is unaffected or not significantly affected. Non-mutated strains that can be used as sensitive control strains in the evaluation of resistance include strain CHCC11976.

В одном воплощении данный способ дополнительно включает стадию al) подвергания материнского штамма мутагенезу, например, подвергания материнского штамма воздействию химического и/или физического мутагена.In one embodiment, the method further comprises the step al) of subjecting the mother strain to mutagenesis, for example, exposing the mother strain to a chemical and/or physical mutagen.

В другом воплощении данный способ дополнительно включает стадию г) селекции и выделения штамма Streptococcus thermophilus из пула штаммов Streptococcus thermophilus, устойчивых к 2дезоксиглюкозе, происходящих из штамма Streptococcus thermophilus, отобранного на стадии в), если скорость роста штамма Streptococcus thermophilus является высокой в среде M17 плюс 2% сахарозы, но равна нулю или по меньшей мере на 0-50% снижена по сравнению со скоростью роста материнского штамма в среде M17 плюс 2% глюкозы.In another embodiment, the method further comprises the step of d) selecting and isolating the Streptococcus thermophilus strain from a pool of 2deoxyglucose resistant Streptococcus thermophilus strains derived from the Streptococcus thermophilus strain selected in step c) if the growth rate of the Streptococcus thermophilus strain is high in M17 plus medium. 2% sucrose, but equal to zero or at least 0-50% reduced compared to the growth rate of the mother strain in M17 medium plus 2% glucose.

Галактозоферментирующие материнские штаммы Streptococcus thermophilus способны расти на/в среде M17 плюс 2% галактозы и определены здесь тем, что они имеют способность снижать рН в бульоне M17, содержащем 2% галактозы в качестве единственного углевода, до 5,5 или ниже при инокуляции из культуры, выращенной в течение ночи при 1%, и инкубировании в течение 24 часов при 37°С. Такие галактозоположительные штаммы были описаны в WO2011/026863 (Chr. Hansen A/S) и WO2011/092300 (Chr. Hansen A/S).Streptococcus thermophilus galactose-fermenting parent strains are capable of growing on/in M17 plus 2% galactose medium and are defined herein in that they have the ability to lower the pH in M17 broth containing 2% galactose as the sole carbohydrate to 5.5 or lower when inoculated from culture grown overnight at 1% and incubated for 24 hours at 37°C. Such galactose positive strains have been described in WO2011/026863 (Chr. Hansen A/S) and WO2011/092300 (Chr. Hansen A/S).

В контексте настоящего изобретения термин штаммы, происходящие из следует понимать как штаммы, происходящие, или штаммы, которые могут быть получены из текстурирующих или галактозоферментирующих материнских штаммов Streptococcus thermophilus, посредством, например, генной инженерии, обработки облучением и/или химической обработки. Штаммы, происходящие из них также могут представлять собой спонтанно возникающие мутанты. Предпочтительным является то, что штаммы, происходящие из них представляют собой функционально эквивалентных мутантов, например, мутантов, которые имеют по существу такие же или улучшенные свойства (например, в отношении текстуры или ферментации галактозы), что и их материнский штамм. В особенности, термин штаммы, происходящие из них относится к штаммам, полученным посредством подвергания штамма по изобретению любой традиционно используемой мутагенизирующей обработке, включающей обработку химическим мутагеном, таким как этанметансульфонат (EMS) или К-метил-К'-нитро-К-нитрогуанидин (NTG), УФсвет, или к спонтанно возникающему мутанту. Мутант возможно был подвергнут нескольким мутагенизирующим обработкам (одну обработку следует понимать как одну стадию мутагенеза, с последующей стадией скрининга/селекции), но в настоящем изобретении предпочтительно, когда проводят не более 20, или не более 10, или не более 5 обработок (или стадий скрининга/селекции). В настоящем изобретении в предпочтительном мутанте менее 1%, менее 0,1%, менее 0,01%, менее 0,001% или даже менее 0,0001% нуклеотидов в бактериальном геноме было заменено другим нуклеотидом или подвергнуто делеции по сравнению с материнским штаммом.In the context of the present invention, the term strains derived from is to be understood as strains derived from, or strains that can be obtained from texturizing or galactose fermenting parent strains of Streptococcus thermophilus, through, for example, genetic engineering, irradiation treatment and/or chemical treatment. Strains derived from them may also be spontaneously occurring mutants. It is preferred that strains derived therefrom are functionally equivalent mutants, eg mutants that have substantially the same or improved properties (eg texture or galactose fermentation) as their parent strain. In particular, the term strains derived therefrom refers to strains obtained by subjecting the strain of the invention to any conventionally used mutagenic treatment, including treatment with a chemical mutagen such as ethanemethanesulfonate (EMS) or K-methyl-K'-nitro-K-nitroguanidine ( NTG), UV light, or to a spontaneously occurring mutant. The mutant may have been subjected to multiple mutagenization treatments (one treatment should be understood as one mutagenesis step, followed by a screening/selection step), but in the present invention it is preferred that no more than 20, or no more than 10, or no more than 5 treatments (or steps screening/selection). In the present invention, in the preferred mutant, less than 1%, less than 0.1%, less than 0.01%, less than 0.001%, or even less than 0.0001% of the nucleotides in the bacterial genome have been replaced with a different nucleotide or deleted compared to the parent strain.

В настоящем изобретении выражение ген glcK, кодирующий глюкокиназу означает любую последовательность ДНК Streptococcus thermophilus, кодирующую белок, имеющий глюкокиназную активность, включая специфическую глюкокиназу, кодируемую последовательностью ДНК SEQ ID NO: 1. Глюкокиназа катализирует реакцию, превращающую глюкозу до глюкозо-6-фосфата, см. чертеж.In the present invention, the expression glcK gene encoding glucokinase means any DNA sequence of Streptococcus thermophilus encoding a protein having glucokinase activity, including the specific glucokinase encoded by the DNA sequence of SEQ ID NO: 1. Glucokinase catalyzes the reaction that converts glucose to glucose-6-phosphate, see .drawing.

Штаммы Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus композиции по изобретению.Strains of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus of the composition of the invention.

Термины недостаточность в метаболизме лактозы и лактозодефицитные используют в контексте настоящего изобретения для характеристики LAB, которые либо частично, либо полностью теряют способность использовать лактозу в качестве источника для роста клеток или поддержания жизнеспособности клеток. Соответствующие LAB способны метаболизировать один или несколько углеводов, выбранных из сахарозы, галактозы и/или глюкозы, или другого ферментируемого углевода. Поскольку данные углеводы не присутствуют в природе в молоке в достаточных количествах для поддержки ферментации лактозодефицитными мутантами, данные углеводы необходимо добавлять в молоко. Лактозодефицитные и частично дефицитные LAB можно охарактеризовать как белые колонии на среде, содержащей лактозу и X-Gal.The terms lactose deficient and lactose deficient are used in the context of the present invention to characterize LABs that either partially or completely lose their ability to use lactose as a source for cell growth or cell viability. The respective LABs are capable of metabolizing one or more carbohydrates selected from sucrose, galactose and/or glucose, or another fermentable carbohydrate. Since these carbohydrates are not naturally present in milk in sufficient quantities to support lactose-deficient mutant fermentation, these carbohydrates must be added to milk. Lactose-deficient and partially deficient LABs can be characterized as white colonies on medium containing lactose and X-Gal.

В контексте настоящего изобретения термин X-Gal означает 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-Огалактопиранозид, который представляет собой хромогенный субстрат для бета-галактозидазы, котораяIn the context of the present invention, the term X-Gal means 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-Ogalactopyranoside, which is a chromogenic substrate for beta-galactosidase, which

- 9 042276 гидролизует X-Gal до бесцветной галактозы и 5-бром-4-хлор-индоксила, который спонтанно димеризуется с образованием синего пигмента.- 9 042276 hydrolyzes X-Gal to colorless galactose and 5-bromo-4-chloro-indoxyl, which spontaneously dimerizes to form a blue pigment.

В конкретном воплощении изобретения лактозодефицитный штамм способен метаболизировать нелактозный углевод, выбранный из группы, состоящей из сахарозы, галактозы и глюкозы, предпочтительно сахарозы. В конкретном воплощении изобретения лактозодефицитный штамм способен метаболизировать галактозу.In a specific embodiment of the invention, the lactose-deficient strain is capable of metabolizing a non-lactose carbohydrate selected from the group consisting of sucrose, galactose and glucose, preferably sucrose. In a specific embodiment of the invention, the lactose-deficient strain is capable of metabolizing galactose.

В конкретном воплощении композиции по изобретению штамм Lb выбран из группы, состоящей из штамма, депонированного в DSMZ - немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур GmbH, Inhoffenstr. 7В, D-38124 Брауншвейг, 12.06.2014 г. под № доступа DSM 28910, и мутантного штамма, полученного из DSM 28910, где данный мутантный штамм дополнительно характеризуется наличием способности образовывать белые колонии на среде, содержащей лактозу и X-Gal.In a specific embodiment of the composition of the invention, the Lb strain is selected from the group consisting of a strain deposited with the DSMZ - German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, 06/12/2014 under accession number DSM 28910, and a mutant strain derived from DSM 28910, where this mutant strain is additionally characterized by the ability to form white colonies on a medium containing lactose and X-Gal.

Лактозодефицитные штаммы могут быть получены из подходящего лактозоположительного материнского штамма посредством мутации. Лактозодефицитные штаммы были отобраны после УФмутагенеза в виде белых колоний (указывающих на лактозодефицитный фенотип) на подходящей среде, например, на чашках с MRS агаром с 1% лактозы и 200 мг/мл X-Gal. Лактозоположительные штаммы обладают β-галактозидазной активностью, и колонии лактозоположительного штамма оказываются голубыми из-за активности β-галактозидазы. В качестве лактозоположительного материнского штамма для получения лактозодефицитного штамма можно использовать Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus штамма СНСС10019, депонированного для WO2011/000879 в DSMZ - немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур GmbH, Inhoffenstr. 7В, D-38124 Брауншвейг 03.04.2007 г. под № доступа DSM 19252.Lactose-deficient strains can be obtained from a suitable lactose-positive maternal strain by mutation. Lactose-deficient strains were selected after UV mutagenesis as white colonies (indicative of a lactose-deficient phenotype) on a suitable medium, eg MRS agar plates with 1% lactose and 200 mg/ml X-Gal. The lactose-positive strains have β-galactosidase activity, and the colonies of the lactose-positive strain appear blue due to β-galactosidase activity. Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus strain CHCC10019 deposited for WO2011/000879 at DSMZ - German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig 04/03/2007 under DSM Accession No. 19252.

Композиция.Composition.

Настоящее изобретение дополнительно относится к композиции, содержащей от 10⁴ до 10¹² КОЕ (колониеобразующая единица)/г штамма Streptococcus thermophilus, например от 105 до 10¹¹ КОЕ/г, например от 106 до 10¹⁰ КОЕ/г, или например от 10⁷ до 109 КОЕ/г штамма Streptococcus thermophilus.The present invention further relates to a composition containing from 10 ⁴ to 10 ¹² CFU (colony forming unit)/g of Streptococcus thermophilus strain, for example from 105 to 10 ¹¹ CFU/g, for example from 106 to 10 ¹⁰ CFU/g, or for example from 10 ⁷ up to 109 CFU/g of Streptococcus thermophilus strain.

В предпочтительном воплощении штамм Streptococcus thermophilus данной композиции не способен подкислять 9,5%-ное В-молоко, определенное как приводящее к снижению рН менее чем на 1,0 при инокулировании 9,5%-ного В-молока 106-10⁷ КОЕ/мл штамма Streptococcus thermophilus и инкубировании в течение 14 часов при 40°С, и данная композиция дополнительно содержит количество соединения, которое может запускать подкисление 9,5%-ного В-молока штаммом СНСС16404 Streptococcus thermophilus, который был депонирован в Немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур под № доступа DSM 26722, определенное как приводящее к снижению рН на 1,0 или более при инокулировании 9,5%-ного В-молока с 106-10⁷ КОЕ/мл штамма Streptococcus thermophilus и инкубировании в течение 14 часов при 40°С.In a preferred embodiment, the Streptococcus thermophilus strain of this composition is unable to acidify 9.5% B-milk, defined as resulting in a pH decrease of less than 1.0 when 9.5% B-milk is inoculated 106-10 ⁷ CFU/ ml of Streptococcus thermophilus strain and incubation for 14 hours at 40°C, and this composition additionally contains an amount of a compound that can start the acidification of 9.5% B-milk with Streptococcus thermophilus strain CHCC16404, which was deposited in the German Collection of Microorganisms and Cellular of cultures under accession number DSM 26722, defined as resulting in a decrease in pH of 1.0 or more when inoculated with 9.5% B-milk with 106-10 ⁷ cfu/ml of a strain of Streptococcus thermophilus and incubated for 14 hours at 40° WITH.

Предпочтительно данное соединение представляет собой сахарозу.Preferably, this compound is sucrose.

Предпочтительно количество сахарозы составляет от 0,000001 до 2%, например от 0,00001 до 0,2%, например от 0,0001 до 0,1%, например от 0,001 до 0,05%.Preferably the amount of sucrose is 0.000001 to 2%, such as 0.00001 to 0.2%, such as 0.0001 to 0.1%, such as 0.001 to 0.05%.

В особенно предпочтительном воплощении данная композиция дополнительно содержит от 10⁴ до 10¹² КОЕ/г штамма Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, например от 105 до 10¹¹ КОЕ/г, например от 106 до 10¹⁰ КОЕ/г, или например от 10⁷ до 109 КОЕ/г штамма Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus.In a particularly preferred embodiment, the composition further comprises from 10 ⁴ to 10 ¹² CFU/g of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, for example from 105 to 10 ¹¹ CFU/g, for example from 106 to 10 ¹⁰ CFU/g, or for example from 10 ⁷ to 109 CFU/g strain Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.

В конкретном воплощении данного изобретения композиция содержит по меньшей мере два штамма St, предпочтительно по меньшей мере три штамма St, и более предпочтительно три штамма St. В конкретном воплощении данного изобретения композиция содержит не более чем три штамма Lb, предпочтительно не более чем два штамма Lb, и более предпочтительно один штамм Lb.In a specific embodiment of the present invention, the composition comprises at least two St strains, preferably at least three St strains, and more preferably three St strains. In a specific embodiment of the present invention, the composition contains no more than three Lb strains, preferably no more than two Lb strains, and more preferably one Lb strain.

В конкретном воплощении данного изобретения композиция содержит по меньшей мере один штамм St, выбранный из группы, состоящей из штамма СНСС16731 Streptococcus thermophilus, который был депонирован в немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7В, D-38124 Брауншвейг, Германия, 4 июня 2014 г. под № доступа DSM 28889, штамма СНСС15757 Streptococcus thermophilus, который был депонирован в Немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур под № доступа DSM 25850, и штамма СНСС16404 Streptococcus thermophilus, который был депонирован в немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур под № доступа DSM 26722, и штамма Lb, депонированного в DSMZ - немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Брауншвейг, 12.06.2014 г. под № доступа DSM 28910. Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, Streptococcus thermophilus и другие молочнокислые бактерии обычно используют в качестве заквасочных культур, служащих для технологических целей при производстве разных пищевых продуктов, например в молочной промышленности, например для ферментированных молочных продуктов. Таким образом, в другом предпочтительном воплощении данная композиция подходит в качестве заквасочной культуры.In a specific embodiment of the present invention, the composition comprises at least one St strain selected from the group consisting of the Streptococcus thermophilus strain CHCC16731, which has been deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany, June 4, 2014, Accession No. DSM 28889, Streptococcus thermophilus strain CHCC15757, which was deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Accession No. DSM 25850, and Streptococcus thermophilus strain CHCC16404, which was deposited to the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures under Accession No. DSM 26722, and the Lb strain deposited with the DSMZ - German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, 06/12/2014, DSM Accession No. 28910. Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus and other lactic acid bacteria are commonly used as starter cultures for technological purposes in the production of various food products, for example in the dairy industry. , for example for fermented dairy products. Thus, in another preferred embodiment, this composition is suitable as a starter culture.

Заквасочные культуры могут быть предоставлены в виде замороженных или высушенных заквасочных культур, помимо жидких заквасочных культур. Таким образом, в еще одном предпочтительномStarter cultures may be provided as frozen or dried starter cultures, in addition to liquid starter cultures. Thus, in another preferred

- 10 042276 воплощении композиция находится в замороженной, лиофилизированной или жидкой форме.- 10 042276 embodiment, the composition is in frozen, lyophilized or liquid form.

Как раскрыто в WO 2005/003327, полезно добавлять в заквасочную культуру определенные криопротекторы. Таким образом, композиция заквасочной культуры согласно настоящему изобретению может содержать один или более чем один криопротектор, выбранный из группы, состоящей из инозин-5'монофосфата (IMP), аденозин-5'-монофосфата (AMP), гуанозин-5'-монофосфата (GMP), уранозин-5'монофосфата (UMP), цитидин-5'-монофосфата (СМР), аденина, гуанина, урацила, цитозина, аденозина, гуанозина, уридина, цитидина, гипоксантина, ксантина, гипоксантина, оротидина, тимидина, инозина и производного любого такого соединения.As disclosed in WO 2005/003327, it is useful to add certain cryoprotectants to the starter culture. Thus, the starter culture composition of the present invention may contain one or more cryoprotectants selected from the group consisting of inosine 5'-monophosphate (IMP), adenosine 5'-monophosphate (AMP), guanosine 5'-monophosphate ( GMP), uranosine-5'monophosphate (UMP), cytidine-5'-monophosphate (CMP), adenine, guanine, uracil, cytosine, adenosine, guanosine, uridine, cytidine, hypoxanthine, xanthine, hypoxanthine, orotidine, thymidine, inosine and derivative of any such compound.

Способ получения ферментированного молочного продукта.Method for obtaining a fermented dairy product.

Данное изобретение дополнительно направлено на способ получения ферментированного молочного продукта, включающий инокулирование и ферментирование молочного субстрата композицией согласно настоящему изобретению.This invention is further directed to a process for producing a fermented dairy product, comprising inoculating and fermenting a dairy substrate with a composition according to the present invention.

Термин молоко следует понимать как секрет молочных желез, полученный доением любого животного, такого как корова, овца, коза, буйволица или верблюдица. В предпочтительном воплощении молоко представляет собой коровье молоко.The term milk should be understood as the secret of the mammary glands obtained by milking any animal such as cow, sheep, goat, buffalo or camel. In a preferred embodiment, the milk is cow's milk.

Термин молочный субстрат может относиться к любому сырому и/или переработанному молочному материалу, который может быть подвергнут ферментации согласно способу по изобретению. Таким образом, полезные молочные субстраты включают растворы/суспензии любого молока или молокоподобных продуктов, содержащие белок, такие как цельное молоко или молоко пониженной жирности, обезжиренное молоко, пахта, восстановленный молочный порошок, сгущенное молоко, сухое молоко, сыворотку, пермеат сыворотки, лактозу, маточную жидкость от кристаллизации лактозы, концентрат белка сыворотки или сливки, но не ограничиваются ими. Очевидно то, что молочный субстрат может происходить от любого млекопитающего, например, представлять собой по существу чистое молоко млекопитающего или разведенный молочный порошок.The term milk substrate can refer to any raw and/or processed milk material that can be fermented according to the process of the invention. Thus, useful dairy substrates include solutions/suspensions of any milk or milk-like products containing protein, such as whole or reduced fat milk, skim milk, buttermilk, reconstituted milk powder, condensed milk, milk powder, whey, whey permeate, lactose, lactose crystallization mother liquor, whey protein concentrate or cream, but are not limited to. Obviously, the milk substrate can be derived from any mammal, for example, be essentially pure mammalian milk or diluted milk powder.

Предпочтительно, по меньшей мере, часть белка в молочном субстрате представляет собой белки, встречающиеся в природе в молоке, такие как казеин или белок сыворотки. Однако часть белка может представлять собой белки, которые не встречаются в природе в молоке.Preferably, at least a portion of the protein in the milk substrate is a protein naturally occurring in milk, such as casein or whey protein. However, some of the protein may be proteins that do not occur naturally in milk.

До ферментации молочный субстрат может быть гомогенизирован и пастеризован согласно способам, известным в данной области техники.Prior to fermentation, the milk substrate may be homogenized and pasteurized according to methods known in the art.

Термин гомогенизация в том виде, как он здесь используется, означает интенсивное перемешивание с получением растворимой суспензии или эмульсии. При проведении гомогенизации до ферментации она может быть проведена таким образом, чтобы разбивать молочный жир до меньших размеров, так чтобы он больше не отделялся от молока. Это может быть осуществлено посредством пропускания молока через маленькие отверстия при высоком давлении.The term homogenization, as used here, means intensive mixing to obtain a soluble suspension or emulsion. When homogenization is carried out before fermentation, it can be carried out in such a way as to break up the milk fat to smaller sizes, so that it no longer separates from the milk. This can be done by passing milk through small holes at high pressure.

Термин пастеризация в том виде, как он здесь используется, означает обработку молочного субстрата для уменьшения или устранения присутствия живых организмов, таких как микроорганизмы. Предпочтительно, пастеризация достигается поддержанием конкретной температуры в течение конкретного периода времени. Данная конкретная температура обычно достигается нагреванием. Температура и продолжительность времени могут быть выбраны для того, чтобы умерщвлять или инактивировать определенные бактерии, такие как вредные бактерии. Далее может следовать стадия быстрого охлаждения.The term pasteurization as used herein means the treatment of a milk substrate to reduce or eliminate the presence of living organisms such as microorganisms. Preferably, pasteurization is achieved by maintaining a specific temperature for a specific period of time. This particular temperature is usually reached by heating. The temperature and length of time may be chosen to kill or inactivate certain bacteria, such as harmful bacteria. This may be followed by a rapid cooling step.

Ферментация в способах по настоящему изобретению означает превращение углеводов в спирты или кислоты посредством действия микроорганизма.Fermentation in the methods of the present invention means the conversion of carbohydrates into alcohols or acids through the action of a microorganism.

Предпочтительно ферментация в способах по изобретению включает превращение лактозы до молочной кислоты.Preferably, the fermentation in the methods of the invention includes the conversion of lactose to lactic acid.

Способы ферментации, предназначенные для использования в получении ферментированных молочных продуктов, являются хорошо известными, и специалист в данной области техники знает как выбирать подходящие условия процесса, такие как температура, содержание кислорода, количество и характеристики микроорганизма(ов) и время проведения процесса. Очевидно то, что условия ферментации выбирают таким образом, чтобы обеспечить выполнение настоящего изобретения, т.е. для получения молочного продукта в твердом или в жидком виде (ферментированного молочного продукта).Fermentation methods for use in making fermented dairy products are well known and one skilled in the art knows how to select suitable process conditions such as temperature, oxygen content, amount and characteristics of the microorganism(s), and process time. Obviously, the fermentation conditions are chosen in such a way as to ensure the implementation of the present invention, i. to obtain a dairy product in solid or liquid form (fermented dairy product).

Термин ферментированный молочный продукт в том виде, как он здесь используется, относится к пищевому или кормовому продукту, где приготовление пищевого или кормового продукта включает ферментацию молочного субстрата молочнокислой бактерией. Термин ферментированный молочный продукт в том виде, как он здесь используется, включает продукты, такие как термофильно ферментированные молочные продукты, например йогурт, мезофильно ферментированные молочные продукты, например сметана и пахта, а также ферментированную сыворотку, но не ограничивается ими.The term fermented dairy product as used herein refers to a food or feed product, where the preparation of the food or feed product involves the fermentation of a milk substrate with a lactic acid bacterium. The term fermented dairy product as used herein includes, but is not limited to, products such as thermophilically fermented dairy products such as yogurt, mesophilically fermented dairy products such as sour cream and buttermilk, and fermented whey.

Термин термофил здесь относится к микроорганизмам, которые лучше всего живут при температурах выше 35°С. Самые полезные с промышленной точки зрения термофильные бактерии включают виды Streptococcus и виды Lactobacillus. Термин термофильная ферментация здесь относится к ферментации при температуре выше чем примерно 35°С, например от примерно 35 до примерно 45°С. Термин термофильно ферментированный молочный продукт относится к ферментированным молочнымThe term thermophile here refers to microorganisms that live best at temperatures above 35°C. The most industrially useful thermophilic bacteria include Streptococcus spp. and Lactobacillus spp. The term thermophilic fermentation here refers to fermentation at a temperature higher than about 35°C, for example from about 35 to about 45°C. The term thermophilically fermented dairy product refers to fermented dairy products.

- 11 042276 продуктам, полученным термофильной ферментацией термофильной заквасочной культуры, и он включает такие ферментированные молочные продукты, как йогурт термостатного способа производства, йогурт с нарушенным сгустком и питьевой йогурт, например японский био-йогурт Yakult.- 11 042276 products obtained by thermophilic fermentation of thermophilic starter culture, and it includes fermented dairy products such as oven-produced yogurt, curd-disrupted yogurt, and drinking yogurt, such as Yakult Japanese bio-yogurt.

Термин мезофил здесь относится к микроорганизмам, которые лучше всего живут при умеренных температурах (15-35°С). Самые полезные с промышленной точки зрения мезофильные бактерии включают виды Lactococcus и виды Leuconostoc. Термин мезофильная ферментация здесь относится к ферментации при температуре от примерно 22 до примерно 35°С. Термин мезофильно ферментированный молочный продукт относится к ферментированным молочным продуктам, полученным мезофильной ферментацией мезофильной заквасочной культуры, и они включают такие ферментированные молочные продукты, как пахта, простокваша, сквашенное молоко, сметана, кефир и молодой сыр, такой как творог и сливочный сыр.The term mesophile here refers to microorganisms that live best at moderate temperatures (15-35°C). The most commercially useful mesophilic bacteria include Lactococcus spp. and Leuconostoc spp. The term mesophilic fermentation here refers to fermentation at a temperature of from about 22 to about 35°C. The term mesophilically fermented dairy product refers to fermented dairy products obtained by the mesophilic fermentation of a mesophilic starter culture and includes fermented dairy products such as buttermilk, curdled milk, sour milk, sour cream, kefir, and young cheese such as cottage cheese and cream cheese.

В предпочтительном воплощении концентрация инокулированных клеток Streptococcus thermophilus составляет от 10⁴ до 10⁹ КОЕ клеток Streptococcus thermophilus на мл молочного субстрата, например от 10⁴ до 10⁸ КОЕ клеток Streptococcus thermophilus на мл молочного субстрата.In a preferred embodiment, the concentration of inoculated Streptococcus thermophilus cells is from 10 ⁴ to 10 ⁹ CFU of Streptococcus thermophilus cells per ml of milk substrate, for example from 10 ⁴ to 10 ⁸ CFU of Streptococcus thermophilus cells per ml of milk substrate.

В другом предпочтительном воплощении способа по изобретению штамм Streptococcus thermophilus не способен подкислять 9,5%-ное В-молоко, что определяется как приведение к снижению рН менее чем на 1,0 при инокуляции 9,5%-ного В-молока 10⁶-10⁷ КОЕ/мл штамма Streptococcus thermophilus и инкубации в течение 14 часов при 40°С, и данный молочный субстрат добавляет эффективное количество соединения для запуска подкисления 9,5%-ного В-молока штаммом Streptococcus thermophilus, определяемого как приведение к снижению рН на 1,0 или более при инокуляции 9,5%-ного В-молока 10⁶-10⁷ КОЕ/мл штамма Streptococcus thermophilus и инкубации в течение 14 часов при 40°С.In another preferred embodiment of the method according to the invention, the strain of Streptococcus thermophilus is not able to acidify 9.5% B-milk, which is defined as resulting in a decrease in pH of less than 1.0 upon inoculation of 9.5% B-milk 10 ⁶ - 10 ⁷ cfu/ml of Streptococcus thermophilus strain and incubation for 14 hours at 40° C. and this milk substrate adds an effective amount of the compound to trigger acidification of 9.5% B-milk by Streptococcus thermophilus strain, defined as resulting in a decrease in pH by 1.0 or more when inoculated with 9.5% B-milk 10 ⁶ -10 ⁷ CFU/ml of Streptococcus thermophilus strain and incubated for 14 hours at 40°C.

Предпочтительно данное соединение представляет собой сахарозу.Preferably, this compound is sucrose.

Предпочтительно количество сахарозы составляет от 0,000001 до 2%, например от 0,00001 до 0,2%, например от 0,0001 до 0,1%, например от 0,001 до 0,05%.Preferably the amount of sucrose is 0.000001 to 2%, such as 0.00001 to 0.2%, such as 0.0001 to 0.1%, such as 0.001 to 0.05%.

В другом предпочтительном воплощении ферментированный молочный продукт представляет собой йогурт или сыр.In another preferred embodiment, the fermented dairy product is yogurt or cheese.

Примеры сыров, которые получают ферментацией с использованием Streptococcus thermophilus и Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, включают моцареллу и сыр для пиццы (H0ier et al. (2010) в The Technology of Cheesemaking, 2^nd Ed. Blackwell Publishing, Oxford; 166-192).Examples of cheeses that are fermented using Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus include mozzarella and pizza cheese (Hoier et al. (2010) in The Technology of Cheesemaking, ^2nd Ed. Blackwell Publishing, Oxford; 166-192).

Предпочтительно, ферментированный молочный продукт представляет собой йогурт.Preferably, the fermented dairy product is yogurt.

В контексте настоящего изобретения заквасочная культура йогурта представляет собой бактериальную культуру, которая содержит по меньшей мере один штамм Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus и по меньшей мере один штамм Streptococcus thermophilus. В соответствии с этим, термин йогурт относится к ферментированному молочному продукту, получаемому инокулированием и ферментированием молока композицией, содержащей штамм Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus и штамм Streptococcus thermophilus.In the context of the present invention, a yogurt starter culture is a bacterial culture that contains at least one strain of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and at least one strain of Streptococcus thermophilus. Accordingly, the term yogurt refers to a fermented dairy product obtained by inoculating and fermenting milk with a composition containing a strain of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and a strain of Streptococcus thermophilus.

Ферментированный молочный продукт.Fermented dairy product.

Настоящее изобретение дополнительно относится к ферментированному молочному продукту, содержащему композицию согласно данному изобретению.The present invention further relates to a fermented dairy product containing a composition according to the present invention.

В другом предпочтительном воплощении ферментированный молочный продукт может представлять собой йогурт, сыр, сметану и пахту, а также ферментированную сыворотку. Предпочтительно, ферментированный молочный продукт представляет собой йогурт.In another preferred embodiment, the fermented dairy product may be yogurt, cheese, sour cream and buttermilk, as well as fermented whey. Preferably, the fermented dairy product is yogurt.

Применение композиции по изобретениюThe use of the composition according to the invention

Другой аспект данного изобретения относится к применению композиции согласно изобретению для приготовления ферментированного молочного продукта.Another aspect of this invention relates to the use of the composition according to the invention for the preparation of a fermented dairy product.

Воплощения настоящего изобретения описаны ниже посредством неограничивающих примеров.Embodiments of the present invention are described below by way of non-limiting examples.

Перечень последовательностей.Sequence listing.

SEQ ID NO: 1 показывает последовательность ДНК мутировавшего гена глюкокиназы штамма СНСС16731.SEQ ID NO: 1 shows the DNA sequence of the mutated glucokinase gene of strain CHCC16731.

SEQ ID NO: 2 показывает аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 1.SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 3 показывает последовательность ДНК мутировавшего гена ManN штамма СНСС 16731.SEQ ID NO: 3 shows the DNA sequence of the mutated ManN gene of strain CHCC 16731.

SEQ ID NO: 4 показывает аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 3.SEQ ID NO: 4 shows the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 3.

SEQ ID NO: 5 показывает последовательность ДНК гена ManM (немутировавшего) штамма СНСС16731.SEQ ID NO: 5 shows the DNA sequence of the ManM gene (unmutated) strain CHCC16731.

SEQ ID NO: 6 показывает аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 5.SEQ ID NO: 6 shows the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 5.

- 12 042276- 12 042276

ПримерыExamples

Материалы и методы.Materials and methods.

Среда.Wednesday.

Для Streptococcus thermophilus используемая среда представляет собой среду M17, известную специалистам в данной области техники.For Streptococcus thermophilus, the medium used is M17 medium known to those skilled in the art.

Агаризованная среда M17 имеет следующий состав на литр Н2О:M17 agar medium has the following composition per liter of H2O:

агар - 12, 75 г аскорбиновая кислота - 0,5 г казеиновый пептон (триптический) - 2,5 г динатрия β-глицерофосфата пентагидрат - 19 г магния сульфата гидрат - 0,25 г мясной экстракт - 5 г мясной пептон (пептический) - 2,5 г соевый пептон (папаиновый) - 5 г дрожжевой экстракт - 2,5 г конечный pH 7,1 плюс/минус 0,2 (25°С);agar - 12, 75 g ascorbic acid - 0.5 g casein peptone (tryptic) - 2.5 g disodium β-glycerophosphate pentahydrate - 19 g magnesium sulfate hydrate - 0.25 g meat extract - 5 g meat peptone (peptic) - 2.5 g soy peptone (papaic) - 5 g yeast extract - 2.5 g final pH 7.1 plus/minus 0.2 (25°C);

и бульон Ml7 имеет следующий состав на литр Н₂О:and broth Ml7 has the following composition per liter of H ₂ O:

аскорбиновая кислота - 0,5 г магния сульфат - 0,25 г мясной экстракт - 5 г мясной пептон (пептический) - 2,5 г натрия глицерофосфат - 19 г соевый пептон (папаиновый) - 5 г триптон - 2,5 г дрожжевой экстракт - 2,5 г конечный pH 7,0 плюс/минус 0,2 (25°C).ascorbic acid - 0.5 g magnesium sulfate - 0.25 g meat extract - 5 g meat peptone (peptic) - 2.5 g sodium glycerophosphate - 19 g soy peptone (papaic) - 5 g tryptone - 2.5 g yeast extract - 2.5 g final pH 7.0 plus/minus 0.2 (25°C).

Добавленные источники углерода представляют собой стерильную лактозу 20 г/л, глюкозу 20 г/л или галактозу 20 г/л.Added carbon sources are sterile lactose 20 g/l, glucose 20 g/l or galactose 20 g/l.

Как известно специалисту в данной области техники, среда M17 представляет собой среду, которая считается подходящей для роста Streptococcus thermophilus. Кроме того, как понятно специалисту в данной области техники, в контексте настоящего изобретения концентрат M17 может поставляться от разных поставщиков и, независимо от конкретного поставщика (в пределах стандартного разброса измерений), здесь будет получаться тот же самый релевантный результат устойчивости к 2-дезоксиглюкозе для релевантной здесь интересующей клетки.As known to the person skilled in the art, M17 medium is a medium that is considered suitable for the growth of Streptococcus thermophilus. In addition, as one skilled in the art will understand, in the context of the present invention, the M17 concentrate can be supplied from different suppliers and, regardless of the particular supplier (within the standard range of measurements), the same relevant 2-deoxyglucose resistance result will be obtained here for the relevant cell of interest here.

Среда, использованная для культивирования Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, представляла собой среду MRS-IM. MRS-IM использовали либо в виде чашек с агаром, либо бульона.The medium used for culturing Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus was MRS-IM medium. MRS-IM was used either as agar plates or broth.

Агаризованная среда MRS-IM имела следующий состав на литр Н₂О:The MRS-IM agar medium had the following composition per liter H ₂ O:

Триптон trypton Oxoid L 42 Oxoid L 42 10,0 г 10.0 g Дрожжевой экстракт yeast extract Oxoid L 21 Oxoid L 21 5,0 г 5.0 g Tween 80 Tween 80 Merck, № 8.22187 Merck, no. 8.22187 1,0 г 1.0 g К₂НРО₄ K ₂ NRO ₄ Merck, № 105104 Merck, No. 105104 2,6 г 2.6 g Na-ацетат Na-acetate Merck, № 106267 Merck, No. 106267 5,0 г 5.0 g Диаммония гидроцитрат Diammonium hydrocitrate Merck, № 101154 Merck, No. 101154 2,0 г 2.0 g MgSO₄ 7 Н2ОMgSO ₄ 7 H2O Merck, № 105882 Merck, No. 105882 0,2 г 0.2 g MnSO₄ Н2ОMnSO ₄ H2O Merck, № 105941 Merck, No. 105941 0,05 г 0.05 g Агар agar SO-BI-GEL SO-BI-GEL 13,0 г 13.0 g

После автоклавирования pH доводили до 6,9 плюс/минус 0,1 при 25°С.After autoclaving, the pH was adjusted to 6.9 plus/minus 0.1 at 25°C.

Бульон MRS-IM, использованный для жидких культур в примерах, приведенных ниже, имел следующий состав на литр Н2О:The MRS-IM broth used for liquid cultures in the examples below had the following composition per liter of H2O:

- 13 042276- 13 042276

Триптон trypton Oxoid L 42 Oxoid L 42 10,0 г 10.0 g Дрожжевой экстракт yeast extract Oxoid L 21 Oxoid L 21 5,0 г 5.0 g Tween 80 Tween 80 Merck, № 8.22187 Merck, no. 8.22187 1,0 г 1.0 g К₂НРО₄ K ₂ NRO ₄ Merck, № 105104 Merck, No. 105104 2,6 г 2.6 g Na-ацетат Na-acetate Merck, № 106267 Merck, No. 106267 5,0 г 5.0 g Диаммония гидроцитрат Diammonium hydrocitrate Merck, № 101154 Merck, No. 101154 2,0 г 2.0 g MgSO₄ 7 Н2ОMgSO ₄ 7 H2O Merck, № 105882 Merck, No. 105882 0,2 г 0.2 g MnSO₄ Н2ОMnSO ₄ H2O Merck, № 105941 Merck, No. 105941 0,05 г 0.05 g

После автоклавирования рН доводят до 6,9 плюс/минус 0,1 при 25°С. Источники углерода - 20 г/л лактозы или 20 г/л глюкозы, сначала подвергали стерилизующей фильтрации и затем добавляли в автоклавированный бульон.After autoclaving, the pH is adjusted to 6.9 plus/minus 0.1 at 25°C. Carbon sources, 20 g/l lactose or 20 g/l glucose, were first subjected to sterilizing filtration and then added to the autoclaved broth.

Приведенные выше среды MRS-IM могут быть в некоторой степени изменены без влияния на способность данных сред поддерживать рост Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus. Кроме того, как будет понятно специалисту, концентрат MRS-IM или разные описанные выше компоненты могут быть приобретены у разных поставщиков и использованы для приготовления среды MRS-IM. Данные среды, подобным образом, будут использованы в примерах, приведенных ниже, в частности, в селекционном анализе устойчивости к 2-дезоксиглюкозе.The above MRS-IM media can be modified to some extent without affecting the ability of these media to support the growth of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. In addition, as will be appreciated by those skilled in the art, the MRS-IM concentrate or the various components described above may be purchased from various vendors and used to prepare the MRS-IM medium. These media will likewise be used in the examples below, in particular in the 2-deoxyglucose resistance selection assay.

Материнские штаммы.mother strains.

Streptococcus thermophilus CHCC11976 (галактозоферментирующий штамм с мутацией в гене GalK, как описано в WO 2011/026863).Streptococcus thermophilus CHCC11976 (galactose fermenting strain with a mutation in the GalK gene as described in WO 2011/026863).

Streptococcus thermophilus CHCC12339 (фагоустойчивый и текстурирующий, как описано в WO2011/092300).Streptococcus thermophilus CHCC12339 (phage resistant and texturizing as described in WO2011/092300).

Streptococcus thermophilus CHCC18948 (галактозоферментирующий мутант CGCC12339 с мутацией в гене GalK).Streptococcus thermophilus CHCC18948 (galactose-fermenting mutant CGCC12339 with a mutation in the GalK gene).

Штаммы, устойчивые к 2-дезоксиглюкозе.Strains resistant to 2-deoxyglucose.

Streptococcus thermophilus CHCC16165 (мутант СНСС11976, устойчивый к 2-дезоксиглюкозе).Streptococcus thermophilus CHCC16165 (CHCC11976 2-deoxyglucose resistant mutant).

Streptococcus thermophilus CHCC16731 (усиливающий сладкий вкус и текстурирующий мутант СНСС16165).Streptococcus thermophilus CHCC16731 (sweet-enhancing and texturing mutant CHCC16165).

Streptococcus thermophilus CHCC19216 (усиливающий сладкий вкус и текстурирующий мутант СНСС18948).Streptococcus thermophilus CHCC19216 (sweet-enhancing and texturing mutant CHCC18948).

Пример 1. Применение 2-дезоксиглюкозы для выделения мутанта по глюкокиназе Streptococcus thermophilus CHCC11976 с усиленным выделением глюкозы.Example 1 Use of 2-deoxyglucose to isolate a glucokinase mutant from Streptococcus thermophilus CHCC11976 with enhanced glucose release.

Для того чтобы выделить мутантов штамма СНСС11976 Streptococcus thermophilus, клетки, полученные в результате роста одной колонии, инокулировали в 10 мл бульона M17, содержащего 2% лактозы, и выращивали в течение ночи при 40°С.In order to isolate mutants of Streptococcus thermophilus strain CHCC11976, single colony cells were inoculated into 10 ml of M17 broth containing 2% lactose and grown overnight at 40°C.

На следующие сутки штаммы высевали в серийных разведениях на чашки с агаризованной M17, содержащей 2% галактозы и 20 мМ концентрацию 2-дезоксиглюкозы (СНСС11976), и инкубировали в течение 20 часов при 40°С. Устойчивые колонии сначала повторно высевали штрихом на тот же самый тип чашек с агаром, на котором они были подвергнуты селекции. Выживших использовали для инокуляции свежего бульона M17, содержащего одно из следующих: 2% лактозы, 2% галактозы или 2% глюкозы, и измеряли рост.The next day, the strains were plated in serial dilutions on plates with M17 agar containing 2% galactose and 20 mM concentration of 2-deoxyglucose (CHCC11976) and incubated for 20 hours at 40°C. Resistant colonies were first re-streaked on the same type of agar plates on which they were selected. Survivors were used to inoculate fresh M17 broth containing one of the following: 2% lactose, 2% galactose, or 2% glucose, and growth was measured.

На основе этого идентифицировали целый ряд мутантов, которые могли расти на галактозе быстрее, чем на глюкозе, как описано в примере 2. Одним таким мутантом был СНСС16165.Based on this, a number of mutants were identified that could grow faster on galactose than on glucose, as described in Example 2. One such mutant was CHCC16165.

Пример 2. Картина роста мутанта, устойчивого к 2-дезоксиглюкозе.Example 2 Growth pattern of the 2-deoxyglucose resistant mutant.

Для обеспечения отбора мутантов, устойчивых к 2-дезоксиглюкозе, которые могут расти на галактозе, использовали два штамма, которые были отобраны из набора галактозоферментирующих штаммов. В то время как данные галактозоферментирующие штаммы все еще растут по меньшей мере на 10% быстрее в экспоненциальной фазе в бульоне М17 плюс 2% глюкозы, чем в бульоне М17 плюс 2% галактозы, устойчивый к 2-дезоксиглюкозе мутант - производное СНСС11976, т.е. СНСС16165, с другой стороны, отличается более быстрым ростом в экспоненциальной фазе в бульоне M17 плюс 2% галактозы, чем в бульоне M17 плюс 2% глюкозы.To ensure the selection of 2-deoxyglucose resistant mutants that can grow on galactose, two strains were used that were selected from a set of galactose fermenting strains. While these galactose fermenting strains still grow at least 10% faster in the exponential phase in M17 broth plus 2% glucose than in M17 broth plus 2% galactose, the 2-deoxyglucose resistant mutant is a derivative of CHCC11976, i.e. . CHCC16165, on the other hand, grows faster in the exponential phase in M17 broth plus 2% galactose than in M17 broth plus 2% glucose.

Рост в экспоненциальной фазе измеряют здесь как развитие оптической плотности экспоненциально растущей культуры при 600 нанометрах (ОП₆₀₀) с течением времени при 40°С.Growth in the exponential phase is measured here as the development of the optical density of an exponentially growing culture at 600 nanometers (OP ₆₀₀ ) over time at 40°C.

Как известно специалисту в данной области техники, он может варьировать от вида к виду, когда культура находится в экспоненциальном росте. Специалисту в данной области техники известно как определять рост в экспоненциальной фазе, например в интервале ОП₆₀₀ 0,1-1,0.As one skilled in the art would know, it can vary from species to species when the culture is in exponential growth. One skilled in the art would know how to determine growth in an exponential phase, such as in the OD ₆₀₀ range of 0.1-1.0.

Оптическую плотность (ОП) культуры измеряют на спектрофотометре.The optical density (OD) of the culture is measured on a spectrophotometer.

- 14 042276- 14 042276

Заключение.Conclusion.

На основании картины роста мутанта, устойчивого к 2-дезоксиглюкозе, данного примера 2 - для конкретного интересующего штамма (например, штамма из релевантного имеющегося в продаже продукта) - специалист в данной области техники может протестировать согласно устоявшейся практике, имеет ли данный конкретный интересующий штамм подходящую картину роста, которая является свойством отобранных мутантов.Based on the growth pattern of the 2-deoxyglucose resistant mutant of this Example 2 - for a particular strain of interest (e.g., a strain from a relevant commercial product) - one skilled in the art can test, according to established practice, whether that particular strain of interest has a suitable growth pattern, which is a property of the selected mutants.

Пример 3. Отбор гиперферментирующего лактозу и секретирующего глюкозу мутанта Streptococcus thermophilus CHCC16165.Example 3 Selection of a lactose hyperfermenting and glucose secreting Streptococcus thermophilus CHCC16165 mutant.

Для того чтобы выделить гиперферментирующего лактозу и секретирующего глюкозу мутанта штамма СНСС16165 Streptococcus thermophilus, клетки, полученные в результате роста одной колонии, инокулировали в 10 мл бульона M17, содержащего 2% галактозы, и выращивали в течение ночи при 40°С.In order to isolate the lactose hyperfermenting and glucose secreting mutant of Streptococcus thermophilus strain CHCC16165, single colony cells were inoculated into 10 ml of M17 broth containing 2% galactose and grown overnight at 40°C.

На следующие сутки данный штамм высевали в серийных разведениях на чашки с агаризованной M17, содержащей 2% сахарозы и 40 мМ концентрацию 2-дезоксиглюкозы, и инкубировали в течение 20 часов при 40°С. Отбирали с чашки 10 случайных колоний и использовали для инокулирования свежего бульона M17, содержащего 2% сахарозы, и инкубировали в течение ночи при 40°С. Мутантов СНСС16165 переносили на свежие среды M17, содержащие 2% сахарозы.The next day, this strain was seeded in serial dilutions on plates with M17 agar containing 2% sucrose and 40 mm concentration of 2-deoxyglucose, and incubated for 20 hours at 40°C. 10 random colonies were selected from the dish and used to inoculate fresh M17 broth containing 2% sucrose and incubated overnight at 40°C. The CHCC16165 mutants were transferred to fresh M17 media containing 2% sucrose.

Пример 4. Анализ углеводов ферментированного молока.Example 4 Carbohydrate analysis of fermented milk.

Мутантов, полученных в Примере 3, и штамм СНСС16165 выращивали в 9,6%-ном В-молоке, содержащем 0,01% сахарозы. После скисания молоко, подкисленное СНСС16165, имело концентрацию лактозы 14,9, концентрацию галактозы 8,4 и концентрацию глюкозы 5,7. По сравнению с этим, молоко, подкисленное лучше всего работающим мутантом СНСС16165, имело концентрацию лактозы 9,3, концентрацию галактозы 10,5 и концентрацию глюкозы 9,9. Указанный лучший мутант СНСС16165 был обозначен СНСС16731 и был подвергнут дальнейшему тестированию в ферментации молока при использовании в комбинации со штаммами СНСС16159 и СНСС16160 Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus (описанными в WO2013/160413).The mutants obtained in Example 3 and the strain CHCC16165 were grown in 9.6% B-milk containing 0.01% sucrose. After souring, milk acidified with CHCC16165 had a lactose concentration of 14.9, a galactose concentration of 8.4, and a glucose concentration of 5.7. By comparison, milk acidified with the best performing CHCC16165 mutant had a lactose concentration of 9.3, a galactose concentration of 10.5, and a glucose concentration of 9.9. This superior CHCC16165 mutant was designated CHCC16731 and was further tested in milk fermentation when used in combination with Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus strains CHCC16159 and CHCC16160 (described in WO2013/160413).

Выращенные в течение ночи культуры СНСС16165 и СНСС16731 в комбинации с каждым из СНСС16159 и СНСС16160 добавляли в 200 мл образцов В-молока и вызывали скисание при 40°С.Overnight grown cultures of CHCC16165 and CHCC16731 in combination with each of CHCC16159 and CHCC16160 were added to 200 ml B-milk samples and sour at 40°C.

Результаты показаны в табл. 1.The results are shown in table. 1.

Таблица 1Table 1

Смесь штаммов Blend of Strains Лактоза мг/мл Lactose mg/ml Галактоза мг/мл Galactose mg/ml Глюкоза мг/мл Glucose mg/ml СНСС16165 + СНСС16159 SNSS16165 + SNSS16159 14,0 14.0 10,9 10.9 6,5 6.5 СНСС16165 + СНСС16160 SNSS16165 + SNSS16160 13,5 13.5 и,о and about 6,9 6.9 СНСС 16731 + СНСС16159 SNSS 16731 + SNSS16159 1,0 1.0 22,0 22.0 16,2 16.2 СНСС 16731 + СНСС16160 SNSS 16731 + SNSS16160 1,0 1.0 22,5 22.5 16,0 16.0 В-молоко B-milk 48,9 48.9 Не выявляется Not detected Не выявляется Not detected

Как видно из результатов табл. 1, СНСС16731 способен удалять почти всю лактозу из молока. Также СНСС16731 продуцирует и секретирует в молоко высокие уровни и галактозы, и глюкозы. Принимая во внимание то, что сахароза представляет собой контроль - 100, а сладость лактозы составляет 16, сладость галактозы составляет 32, и сладость глюкозы - 74,3, ферментированный молочный продукт, полученный с использованием СНСС16731, имеет значительно усиленный сладкий вкус.As can be seen from the results of Table. 1, CHCC16731 is able to remove almost all lactose from milk. CHCC16731 also produces and secretes high levels of both galactose and glucose into milk. Considering that sucrose is a control of 100, and the sweetness of lactose is 16, the sweetness of galactose is 32, and the sweetness of glucose is 74.3, the fermented dairy product obtained using CHCC16731 has a significantly enhanced sweet taste.

Пример 5. Получение галактозоположителъного мутанта Streptococcus thermophilus СНСС 12339.Example 5 Obtaining a galactose-positive mutant of Streptococcus thermophilus CHCC 12339.

Streptococcus thermophilus СНСС12339 выращивали в течение ночи в M17, содержащей 2% лактозы, при 40°С. Выращенную в течение ночи культуру высевали (100 мкл) на чашку М17, содержащую 2% галактозы, и анаэробно инкубировали при 40°С. На чашках с M17, содержащей 2% галактозы, появились 22 колонии. 16 из них повторно высевали штрихом на тот же самый тип чашек, и 8 из них переносили в жидкую M17, содержащую 2% галактозы, что в целом привело к росту, и 4 из данных культур замораживали. 2 из замороженных культур распределяли на чашки с M17, содержащей 2% галактозы и 40 мМ 2дезоксиглюкозу, и для каждой культуры отбирали 8 образующихся колоний. 16 мутантов, отобранных с 2-дезоксиглюкозой, переносили в жидкую M17, содержащую 2% лактозы и 2% галактозы, и выращивали в течение ночи при 40°С, после чего данных мутантов выращивали в жидкой M17, содержащей 2% галактозы, в течение 3 ночей, и продуцирование галактозы и глюкозы измеряли и отслеживали на протяжении роста. На основании продуцирования галактозы и глюкозы отбирали 7 культур для тестирования подкисления молока посредством добавления 2 мл культуры в 200 мл 9,5%-ного В-молока, содержащего 0,05% сахарозы. 3 мутанта имели профили подкисления, имеющие сходство с профилем подкисления материнского штамма СНСС12339, и данные 3 мутанта высевали штрихом для получения одиночных колоний и инкубировали в течение 48 часов. Затем данные колонии переносили в жидкую M17, содерStreptococcus thermophilus CHCC12339 was grown overnight in M17 containing 2% lactose at 40°C. The overnight culture was seeded (100 μl) onto an M17 plate containing 2% galactose and incubated anaerobically at 40°C. On plates with M17 containing 2% galactose, 22 colonies appeared. 16 of these were re-streaked on the same type of plates and 8 of them were transferred to liquid M17 containing 2% galactose resulting in overall growth and 4 of these cultures were frozen. 2 of the frozen cultures were spread on M17 plates containing 2% galactose and 40 mM 2 deoxyglucose, and 8 colonies formed were selected for each culture. The 16 mutants selected with 2-deoxyglucose were transferred into liquid M17 containing 2% lactose and 2% galactose and grown overnight at 40°C, after which these mutants were grown in liquid M17 containing 2% galactose for 3 nights, and the production of galactose and glucose was measured and monitored throughout growth. Based on the production of galactose and glucose, 7 cultures were selected to test milk acidification by adding 2 ml of the culture to 200 ml of 9.5% B-milk containing 0.05% sucrose. The 3 mutants had acidification profiles similar to those of the parent strain CHCC12339, and these 3 mutants were streaked to form single colonies and incubated for 48 hours. Then these colonies were transferred into liquid M17 containing

- 15 042276 жащую 2% галактозы, и рост данных 3 мутантов тестировали относительно СН12339. Отбирали мутанта, имеющего самый сильный рост, и очищали еще раз посредством посева одиночной колонии штрихом 3 раза с получением очищенного галактозоположительного штамма, названного СНСС18948 (галактозоположительный вариант СНСС12339).- 15 042276 containing 2% galactose, and the growth of these 3 mutants was tested against CH12339. The mutant having the strongest growth was selected and purified again by streaking a single colony 3 times to obtain a purified galactose-positive strain named CHCC18948 (galactose-positive variant CHCC12339).

Пример 6. Получение устойчивого к 2-дезоксиглюкозе мутанта Streptococcus thermophilus CHCC18948 с повышенным выделением глюкозы.Example 6 Preparation of 2-deoxyglucose resistant mutant of Streptococcus thermophilus CHCC18948 with increased glucose release.

100 мкл культуры СНСС18949 распределяли на чашки с M17, содержащей 2% галактозы и 20 мМ или 40 мМ 2-дезоксиглюкозу, и инкубировали в течение ночи при 40°С. Отбирали 8 колоний с чашек с 20 мМ и 8 колоний с чашек с 40 мМ и выращивали в жидкой M17, содержащей 2% галактозы и 20 мМ 2оксиглюкозу. Образованные в результате культуры замораживали и повторно высевали штрихом, и 12 из образованных колоний включали в среду M17 и использовали для подкисления В-молока. 1% выращенной в течение ночи культуры мутанта, устойчивого к 2-дезоксиглюкозе, инокулировали в 200 мл 9,5%ного В-молока, содержащего 0,05% сахарозы, и вызывали скисание при 40°С. Все 12 мутантов СНСС18948, устойчивых к 2-дезоксиглюкозе, продуцировали ферментированные молочные продукты с низкими концентрациями лактозы и высокими концентрациями галактозы и глюкозы. 7 мутантов отбирали для повторного тестирования по отдельности и для тестирования совместно со штаммами СНСС16159 Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus (описанными в WO2013/160413). Вновь 1% выращенной в течение ночи культуры мутанта, устойчивого к 2-дезоксиглюкозе, инокулировали в 200 мл 9,5%-ного В-молока, содержащего 0,05% сахарозы, и вызывали скисание при 40°С.100 μl of CHCC18949 culture was distributed on plates with M17 containing 2% galactose and 20 mm or 40 mm 2-deoxyglucose, and incubated overnight at 40°C. 8 colonies were selected from 20 mM plates and 8 colonies from 40 mM plates and grown in liquid M17 containing 2% galactose and 20 mM 2-hydroxyglucose. The resulting cultures were frozen and streaked again, and 12 of the formed colonies were included in M17 medium and used to acidify B-milk. A 1% overnight culture of the 2-deoxyglucose resistant mutant was inoculated into 200 ml of 9.5% B-milk containing 0.05% sucrose and sour at 40°C. All 12 2-deoxyglucose-resistant CHCC18948 mutants produced fermented dairy products with low lactose concentrations and high galactose and glucose concentrations. The 7 mutants were selected for retesting individually and for testing together with Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus strains CHCC16159 (described in WO2013/160413). Again, a 1% overnight culture of the 2-deoxyglucose resistant mutant was inoculated into 200 ml of 9.5% B-milk containing 0.05% sucrose and sour at 40°C.

Результаты приведены в табл. 2.The results are shown in table. 2.

Таблица 2table 2

Штамм / смесь штаммов Strain / mixture of strains Лактоза мг/мл Lactose mg/ml Галактоза мг/мл Galactose mg/ml Глюкоза мг/мл Glucose mg/ml СНСН18948-Мутант1 CHCH18948-Mutant1 Не выявляется Not detected 17,9 17.9 20,8 20.8 СНСН18948- Мутант2 CHSN18948- Mutant2 Не выявляется Not detected 18,9 18.9 23,8 23.8 СНСН18948- МутантЗ CHCH18948- Mutant3 9,5 9.5 13,6 13.6 14,5 14.5 СНСН18948- Мутант? CHSN18948- Mutant? Не выявляется Not detected 19,1 19.1 24,2 24.2 СНСН18948-Мутант 10 CHCH18948-Mutant 10 1,7 1.7 16,0 16.0 21,1 21.1 СНСН18948-Мутант 11 CHCH18948-Mutant 11 Не выявляется Not detected 17,5 17.5 22,9 22.9 СНСН18948- Мутант12 CHCH18948- Mutant12 3,6 3.6 16,9 16.9 18,7 18.7 СНСН18948- Мутант 1 + СНСС16159 CHCH18948- Mutant 1+ SNSS16159 7,9 7.9 16,7 16.7 9,6 9.6 СНСН18948- Мутант2 + СНСС16159 CHCH18948- Mutant2+ SNSS16159 9,1 9.1 18,4 18.4 10,3 10.3 СНСН18948- МутантЗ + СНСС16159 CHCH18948- Mutant3+ SNSS16159 3,5 3.5 18,6 18.6 И,9 I,9 СНСН18948- Мутант? + СНСС16159 CHSN18948- Mutant? + SNSS16159 10,7 10.7 15,1 15.1 7,7 7.7 СНСН18948- МутантЮ + СНСС16159 SNSN18948- MutantYu + SNSS16159 10,2 10.2 16,2 16.2 8,5 8.5 СНСН18948- МутантИ + СНСС16159 CHSN18948- MutantI + SNSS16159 10,5 10.5 15,9 15.9 8,4 8.4 СНСН18948- Мутант12 + СНСС16159 CHCH18948- Mutant12+ SNSS16159 3,3 3.3 19,0 19.0 10,9 10.9 В-молоко B-milk 47,1 47.1 Не выявляется Not detected Не выявляется Not detected

Тремя наилучшими мутантами являются мутанты 2, 3 и 12, и их повторно тестировали в В-молоке, содержащем 0,05% сахарозы, по отдельности и в комбинации со штаммами СНСС16159, СНСС16160 и СНСС16161 Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus (описанными в WO2013/160413).The three best mutants are mutants 2, 3 and 12 and were retested in B-milk containing 0.05% sucrose alone and in combination with Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus strains CHCC16159, CHCC16160 and CHCC16161 (described in WO2013/160413) .

Результаты приведены в табл. 3.The results are shown in table. 3.

- 16 042276- 16 042276

Таблица 3Table 3

Штамм / смесь штаммов Strain / mixture of strains Лактоза мг/мл Lactose mg/ml Галактоза мг/мл Galactose mg/ml Глюкоза мг/мл Glucose mg/ml СНСН16159 CHSN16159 9,9 9.9 14,8 14.8 8,7 8.7 СНСН16160 CHSN16160 1,6 1.6 18,5 18.5 17,5 17.5 СНСН16161 CHSN16161 12,8 12.8 13,7 13.7 8,6 8.6 СНСН18948-Мутант2 + СНСН16159 CHCH18948-Mutant2+ CHSN16159 6,8 6.8 19,4 19.4 12,0 12.0 СНСН18948-Мутант2 + СНСН16160 CHCH18948-Mutant2+ CHSN16160 Не выявляется Not detected 21,3 21.3 17,6 17.6 СНСН18948-Мутант2 + СНСН16161 CHCH18948-Mutant2+ CHSN16161 Не выявляется Not detected 20,5 20.5 17,1 17.1 СНСН18948-Мутант 12 + СНСН16159 CHCH18948-Mutant 12+ CHSN16159 5,0 5.0 19,3 19.3 12,1 12.1 СНСН 18948-Мутант 12 + СНСС16160 SNSN 18948-Mutant 12+ SNSS16160 1,4 1.4 21,8 21.8 16,5 16.5 СНСН 18948-Мутант 12 + СНСС16161 SNSN 18948-Mutant 12+ SNSS16161 4,2 4.2 20,2 20.2 14,6 14.6 СНСН18948-МутантЗ + СНСС16159 CHSN18948-Mutant3+ SNSS16159 1,6 1.6 19,8 19.8 13,2 13.2 СНСН18948-МутантЗ + СНСС16160 CHSN18948-Mutant3+ SNSS16160 Не выявляется Not detected 20,2 20.2 16,5 16.5 СНСН18948-МутантЗ + СНСС16161 CHSN18948-Mutant3+ SNSS16161 з,о h, o 19,5 19.5 16,5 16.5 СНСН18948-Мутант2 CHSN18948-Mutant2 Не выявляется Not detected 19,7 19.7 27,3 27.3 СНСН18948-МутантЗ CHSN18948-Mutant3 Не выявляется Not detected 19,9 19.9 27,1 27.1 СНСН 18948-Мутант 12 SNSN 18948-Mutant 12 4,7 4.7 15,1 15.1 17,0 17.0 В-молоко B-milk 42,8 42.8 Не выявляется Not detected Не выявляется Not detected

На основании приведенных выше данных, СНСН18948-Мутант3 был отобран как лучший мутант, и он был обозначен СНСС19216. Как видно из приведенных выше данных, СНСС19216 способен удалять почти всю лактозу из молока. СНСС19216 также продуцирует и секретирует в молоко высокие уровни и галактозы, и глюкозы. Принимая во внимание то, что сахароза представляет собой контроль - 100, а сладость лактозы составляет 16, сладость галактозы составляет 32, и сладость глюкозы - 74,3, ферментированный молочный продукт, полученный с использованием СНСС19216, имеет значительно усиленный сладкий вкус.Based on the above data, CHCH18948-Mutant3 was selected as the best mutant and was designated CHCC19216. As can be seen from the above data, CHCC19216 is able to remove almost all lactose from milk. CHCC19216 also produces and secretes high levels of both galactose and glucose into milk. Considering that sucrose is a control of 100, and the sweetness of lactose is 16, the sweetness of galactose is 32, and the sweetness of glucose is 74.3, the fermented dairy product obtained using CHCC19216 has a significantly enhanced sweet taste.

Пример 7. Текстурирующая способность СНСС16731 и СНСС19216.Example 7: Texturizing ability of CHCC16731 and CHCC19216.

Текстурирующую способность штаммов СНСС16731 и СНСС19216 тестировали путем измерения напряжения сдвига с использованием следующего анализа.The texturing ability of strains CHCC16731 and CHCC19216 was tested by measuring shear stress using the following assay.

Через семь суток после инкубации ферментированное молоко доводили до 13 °С и легко помешивали посредством палочки, оснащенной диском с отверстиями, до достижения гомогенности образца. Реологические свойства образца оценивали на реометре (реометр Anton Paar Physica ASC/DSR301 (автосэмплер), Anton Paar® GmbH, Австрия) с использованием следующих установок.Seven days after incubation, the fermented milk was brought to 13°C and gently stirred with a stick equipped with a disc with holes until the sample was homogeneous. The rheological properties of the sample were evaluated on a rheometer (Anton Paar Physica ASC/DSR301 rheometer (autosampler), Anton Paar® GmbH, Austria) using the following setups.

Время ожидания (для восстановления в некоторой степени исходной структуры):Waiting time (to restore to some extent the original structure):

минут без качания или вращения, качание (для измерения G' и G для расчета G*), у равно 0,3%, частота (f) равна [0,5... 8] Гц, точек измерения за 60 с (одно измерение каждые 10 с), вращение (для измерения напряжения сдвига при 300 1/с и т.д.), у = [0,2707-300] 1/с, и у = [275-0,2707] 1/с точка измерения за 210 с (одно каждые 10 с), идущего вплоть до 300 1/с, и точка измерения за 210 с (одно каждые 10 с), идущего вплоть до 0,2707 1/с.minutes without oscillation or rotation, oscillation (for measuring G' and G for calculating G*), y is 0.3%, frequency (f) is [0.5... 8] Hz, measurement points in 60 s (one measurement every 10 s), rotation (to measure shear stress at 300 1/s, etc.), y = [0.2707-300] 1/s, and y = [275-0.2707] 1/s a 210 s measurement point (one every 10 s) going up to 300 1/s, and a 210 s measurement point (one every 10 s) going up to 0.2707 1/s.

- 17 042276- 17 042276

Для дальнейшего анализа было выбрано напряжение сдвига при 300 1/с.The shear stress at 300 1/s was chosen for further analysis.

Штаммы СНСС16731 и СНСС19216 в смесях, перечисленных в табл. 4, использовали для подкисления образцов 200 мл 9,5%-ного В-молока с использованием инокулюма 0,024% до достижения рН 4,55.Strains SNCC16731 and SNCC19216 in the mixtures listed in Table. 4 was used to acidify the samples with 200 ml of 9.5% B-milk using a 0.024% inoculum until a pH of 4.55 was reached.

Результаты приведены в табл. 4.The results are shown in table. 4.

Таблица 4Table 4

№ смеси No. mixtures Содержание St по изобретению Content St by invention Содержание St СНСС 16404 Content St SNSS 16404 Содержание St СНСС 15757 Content St SNSS 15757 Содержание Lb СНСС-16159 Lb content SNSS-16159 Напряжение сдвига, Па Shear stress, Pa 1 1 72,73% СНСС16731 72.73% SNSS16731 13,64% 13.64% 4,54% 4.54% 9,09% 9.09% 41,3 41.3 2 2 72,73% СНСС 19216 72.73% SNSS 19216 13,64% 13.64% 4,54% 4.54% 9,09% 9.09% 51,5 51.5 3 3 36,36% СНСС 16731 +- 33,36% СНСС 19216 36.36% SNSS 16731 +- 33.36% SNSS 19216 13,64% 13.64% 4,54% 4.54% 9,09% 9.09% 43,3 43.3

Lb: штамм CHCC16159 L. delbruecki подвид bulgaricus, St: Streptococcus thermophilus.Lb: strain CHCC16159 L. delbruecki subsp. bulgaricus, St: Streptococcus thermophilus.

Как видно из данных результатов, штаммы СНСС16731 и СНСС19216 при использовании в культуральной смеси в качестве единственного S. thermophilus, производят ферментированный молочный продукт с напряжением сдвига 41,3 и 51,5 Па, соответственно. При использовании в комбинации штаммы СНСС16731 и СНСС19216 производят ферментированный молочный продукт с напряжением сдвига 43,3 Па.As can be seen from these results, strains CHCC16731 and CHCC19216, when used in the culture mixture as the sole S. thermophilus, produced a fermented dairy product with a shear stress of 41.3 and 51.5 Pa, respectively. When used in combination, strains CHCC16731 and CHCC19216 produce a fermented dairy product with a shear stress of 43.3 Pa.

Данный уровень напряжения сдвига является высоким по сравнению с традиционными штаммами, усиливающими сладкий вкус, как раскрыто, например, в WO2013/160413.This level of shear stress is high compared to conventional sweet taste enhancing strains as disclosed for example in WO2013/160413.

Пример 8. Вкус и рост Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus (Lb) для композиции культуры по изобретению по сравнению с культурой с лактозоположителъной глюкозоположителъной Lb.Example 8 Taste and growth of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb) for a culture composition according to the invention compared to a lactose-positive glucose-positive Lb culture.

План эксперимента.Experiment plan.

Таблица 5. Композиция протестированных культурTable 5. Composition of tested cultures

СНСС 16404 (St) г SNSS 16404 (St)g СНСС 16731 (St) Г SNSS 16731 (St) H СНСС 15757 (St) г SNSS 15757 (St)g СНСС 18944 (Lb) г SNSS 18944 (Lb) g СНСС 12813 (Lb) г SNSS 12813 (Lb) g 1: культура по изобретению 1: culture according to the invention 10,5 10.5 10,5 10.5 6 6 1,5 1.5 0 0 2: культура с традиционной Lb 2: culture with traditional Lb 10,5 10.5 10,5 10.5 6 6 0 0 1,5 1.5

Культура по изобретению состоит из трех глюкозодефицитных Streptococcus thermophilus (St) и одной лактозодефицитной Lb. Культура 2 (сравнительная культура) состоит из трех глюкозодефицитных St и одной лактозоположительной глюкозоположительной (традиционной) Lb.The culture according to the invention consists of three glucose-deficient Streptococcus thermophilus (St) and one lactose-deficient Lb. Culture 2 (comparative culture) consists of three glucose-deficient St and one lactose-positive glucose-positive (traditional) Lb.

Две культуры с композицией, указанной в табл. 5, получали и использовали в качестве заквасочной культуры при ферментации с получением йогурта при 43 °С, пока не достигался целевой рН 4,55. Две данные культуры сравнивали в отношении вкуса, роста Lb, последующего закисления, углеводов и реологии.Two cultures with the composition indicated in the table. 5 was prepared and used as a starter culture in a yogurt fermentation at 43°C until the target pH of 4.55 was reached. The two cultures were compared in terms of taste, Lb growth, subsequent acidification, carbohydrates and rheology.

Молочная основа.Milk base.

Молочная основа содержала 4,5% белка, 1,0% жира и 0,1% сахарозы.The milk base contained 4.5% protein, 1.0% fat and 0.1% sucrose.

Смешивали молоко с жирностью 0,5% и молоко с жирностью 1,5% для достижения содержания жира 1% в конечной молочной основе, и добавляли 0,1% сахарозы. Уровни белка доводили до 4,5% с использованием обезжиренного сухого молока (SMP). Гидратирование происходило при 6°С в течение 2 часов. Затем молоко гомогенизировали при 20000/5000 кПа при 65°С и пастеризовали при 95°С в течение 5 минут.0.5% fat milk and 1.5% fat milk were mixed to achieve a fat content of 1% in the final milk base, and 0.1% sucrose was added. Protein levels were adjusted to 4.5% using skimmed milk powder (SMP). Hydration took place at 6°C for 2 hours. The milk was then homogenized at 20000/5000 kPa at 65°C and pasteurized at 95°C for 5 minutes.

Параметры получения йогурта.Options for obtaining yogurt.

рН во время ферментации измеряли онлайн с использованием Intap. При достижении йогуртами рН 4,55 гель разрушали с использованием палочки с диском с отверстиями. Гель затем обрабатывали в блоке для последующей обработки (PTU) при 200 кПа при 25°С, заполняли им 120 мл чашки для йогурта и хранили при 6°С в течение 28 суток.pH during fermentation was measured online using Intap. When the yoghurts reached a pH of 4.55, the gel was broken using a stick with a holed disc. The gel was then treated in a post-treatment unit (PTU) at 200 kPa at 25° C., filled into 120 ml yoghurt dishes and stored at 6° C. for 28 days.

- 18 042276- 18 042276

Измерение напряжения сдвига.Shear stress measurement.

Использовали способ, описанный в примере 7, за исключением того, что образцы не перемешивали палочкой, оснащенной диском с отверстиями, так как гель уже был разрушен во время обработки PTU с получением гомогенности образцов.The method described in Example 7 was used, except that the samples were not agitated with a stick equipped with a perforated disk, since the gel had already been broken down during PTU treatment to obtain sample homogeneity.

Измерение колониеобразующих единиц.Measurement of colony forming units.

M17 использовали в качестве селективной среды для St. MRSIac (MRS плюс 8% лактозы) использовали в качестве селективной среды для Lb. Делали 10х серии разведения йогуртов. Каждое разведение высевали на чашки с агаром M17 и MRSIac, соответственно, и анаэробно инкубировали при 37°С в течение 2 суток. Затем подсчитывали колониеобразующие единицы.M17 was used as a selection medium for St. MRSIac (MRS plus 8% lactose) was used as selective medium for Lb. Did 10x series of dilution of yoghurts. Each dilution was plated onto M17 and MRSIac agar plates, respectively, and anaerobically incubated at 37° C. for 2 days. The colony forming units were then counted.

Закисление.acidification.

Для достижения рН 4,55 культурой 1 требовалось 10,8 часов. Для достижения рН 4,55 культурой 2 требовалось 12,1 часов.It took 10.8 hours for culture 1 to reach pH 4.55. Culture 2 required 12.1 hours to reach pH 4.55.

Последующее закисление.Subsequent acidification.

Таблица 6. Последующее закислениеTable 6. Subsequent Acidification

pH pH Сутки 0 Day 0 Сутки 1 Day 1 Сутки 7 Day 7 Сутки 14 Day 14 Сутки 21 Day 21 Сутки 28 Day 28 Культура 1 Culture 1 4,55 4.55 4,53 4.53 4,51 4.51 4,54 4.54 4,50 4.50 4,54 4.54 Культура 2 culture 2 4,55 4.55 4,51 4.51 4,50 4.50 4,51 4.51 4,50 4.50 4,54 4.54

Рост Lb.Lb growth.

Таблица 7. Рост культуры (колониеобразующие единицы (КОЕ)) в конце ферментацииTable 7. Culture Growth (Colony Forming Units (CFU)) at the End of Fermentation

Lb (КОЕ) Lb (CFU) St (КОЕ) St (CFU) Культура 1 Culture 1 ЗЕ+07 WE+07 9Е+08 9E+08 Культура 2 culture 2 9Е+05 9E+05 8Е+08 8E+08

Как видно из табл. 7, число клеток Lb культуры по изобретению было значительно более высоким, чем число Lb сравнительной культуры с традиционной Lb, т.е. лактозоположительной глюкозоположительной Lb. Таким образом, комбинация глюкозодефицитного St и лактозодефицитной Lb дает более высокий уровень Lb в конце ферментации.As can be seen from Table. 7, the number of Lb cells of the culture according to the invention was significantly higher than the number of Lb cells of a comparative culture with traditional Lb, i.e. lactose-positive glucose-positive Lb. Thus, the combination of glucose-deficient St and lactose-deficient Lb results in a higher level of Lb at the end of fermentation.

Реология.Rheology.

Культура 1 имеет напряжение сдвига 41,1 Па в конце фементации при 300 1/с.Culture 1 has a shear stress of 41.1 Pa at the end of fermentation at 300 1/s.

Культура 2 имеет напряжение сдвига 27,3 Па в конце фементации при 300 1/с.Culture 2 has a shear stress of 27.3 Pa at the end of fermentation at 300 1/s.

Углеводы.Carbohydrates.

Таблица 8. Уровень углеводов в конце ферментацииTable 8. Carbohydrate levels at the end of fermentation

Глюкоза (мг/г) Glucose (mg/g) Галактоза (мг/г) Galactose (mg/g) Лактоза (мг/г) Lactose (mg/g) Культура 1 Culture 1 15,3 15.3 13,8 13.8 31,1 31.1 Культура 2 Culture 2 15,3 15.3 13,6 13.6 13,3 13.3

Вкус.Taste.

Вкус анализировали посредством оценки группой дегустаторов. Культура 1 не имела каких-либо привкусов.Taste was analyzed by evaluation by a panel of tasters. Culture 1 did not have any off-flavours.

Пример 9. Вкус и рост Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus (Lb) для композиции культуры по изобретению по сравнению с культурой с глюкозодефицитной Lb.Example 9 Taste and growth of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb) for a culture composition according to the invention compared to a glucose-deficient Lb culture.

План эксперимента.Experiment plan.

Таблица 9. Композиция протестированных культурTable 9. Composition of tested cultures

СНСС1640 4 (St) г SNSS1640 4(St)g СНСС1673 1 (St) Г SNSS1673 1 (St) H СНСС1575 7 (St) г SNSS1575 7 (St)g СНСС18944 (Lb) г SNSS18944 (Lb) g СНСС1615 9 (Lb) г SNSS1615 9 (Lb) g 1: культура по изобретению 1: culture according to the invention 10,5 10.5 10,5 10.5 6 6 1,5 1.5 0 0 2: культура с глюкозо- дефицитной Lb 2: culture with glucose- deficient Lb 10,5 10.5 10,5 10.5 6 6 0 0 1,5 1.5

Культура по изобретению состоит из трех глюкозодефицитных St и одной лактозодефицитной Lb. Культура 2 (сравнительная культура) состоит из трех глюкозодефицитных St и одной лактозоположительной глюкозодефицитной Lb.The culture according to the invention consists of three glucose-deficient St and one lactose-deficient Lb. Culture 2 (comparative culture) consists of three glucose-deficient St and one lactose-positive glucose-deficient Lb.

Две культуры с композицией, указанной в табл. 9, получали и использовали в качестве заквасочнойTwo cultures with the composition indicated in the table. 9, received and used as a starter

- 19 042276 культуры при ферментации с получением йогурта при 43°С, пока не достигался целевой рН 4,55. Две данные культуры сравнивали в отношении вкуса (уровень аминокислот), летучих органических компонентов, углеводов и реологии.- 19 042276 yogurt fermentation cultures at 43° C. until the target pH of 4.55 is reached. The two cultures were compared in terms of taste (amino acid levels), VOCs, carbohydrates and rheology.

Молочная основа.Milk base.

Использовали две молочные основы с корректировкой либо обезжиренным сухим молоком (SMP), либо белком сыворотки (WP), и они содержали 4,5% белка, 1% жиров и 0,1% сахарозы.Two milk bases were used, adjusted with either skimmed milk powder (SMP) or whey protein (WP), and they contained 4.5% protein, 1% fat and 0.1% sucrose.

Смешивали молоко с жирностью 0,5% и молоко с жирностью 1,5% для достижения содержания 1% жира в конечной молочной основе, и добавляли 0,1% сахарозы. Уровни белка доводили до 4,5% с использованием SMP или WP. Гидратирование происходило при 6°С в течение 2 часов. Затем молоко гомогенизировали при 20000/5000 кПа при 65°С и пастеризовали при 95°С в течение 5 минут.0.5% fat milk and 1.5% fat milk were mixed to achieve a 1% fat content in the final milk base, and 0.1% sucrose was added. Protein levels were adjusted to 4.5% using SMP or WP. Hydration took place at 6°C for 2 hours. The milk was then homogenized at 20000/5000 kPa at 65°C and pasteurized at 95°C for 5 minutes.

Параметры получения йогурта.Options for obtaining yogurt.

рН во время ферментации измеряли онлайн в миникультуральных флаконах с использованием CINAC. При достижении йогуртами рН 4,55 гель разрушали и гомогенизировали с использованием палочки с диском с отверстиями. Затем йогурт хранили в миникультуральных флаконах.The pH during fermentation was measured online in mini culture flasks using CINAC. When the yoghurts reached a pH of 4.55, the gel was broken and homogenized using a stick with a holed disk. The yogurt was then stored in miniculture flasks.

Измерение напряжения сдвига.Shear stress measurement.

Использовали способ, описанный в примере 7.The method described in example 7 was used.

Реология.Rheology.

Культура 1 в молочной основе SMP имеет напряжение сдвига 46,2 Па в конце фементации при 300 1/с.Culture 1 in SMP milk base has a shear stress of 46.2 Pa at the end of fermentation at 300 1/s.

Культура 1 в молочной основе WP имеет напряжение сдвига 39,6 Па в конце фементации при 300 1/с.Culture 1 in WP milk base has a shear stress of 39.6 Pa at the end of fermentation at 300 1/s.

Культура 2 в молочной основе SMP имеет напряжение сдвига 42,0 Па в конце фементации при 300 1/с.Culture 2 in SMP milk base has a shear stress of 42.0 Pa at the end of fermentation at 300 1/s.

Культура 2 в молочной основе WP имеет напряжение сдвига 38,4 Па в конце фементации при 300 1/с.Culture 2 in WP milk base has a shear stress of 38.4 Pa at the end of fermentation at 300 1/s.

Как видно из результатов, культура 1 имеет более высокое напряжение сдвига по сравнению с культурой 2.As can be seen from the results, culture 1 has a higher shear stress compared to culture 2.

Последующее закисление.Subsequent acidification.

Таблица 10. Последующее закислениеTable 10 Post acidification

pH pH Сутки 0 Day 0 Сутки 7 Day 7 Сутки 14 Day 14 Сутки 21 Day 21 Сутки 28 Day 28 Культура 1 в молочной основе SMP Culture 1 in SMP milk base 4,55 4.55 4,51 4.51 4,56 4.56 4,39 4.39 4,49 4.49 Культура 1 в молочной основе WP Culture 1 in WP milk base 4,55 4.55 4,52 4.52 4,55 4.55 4,39 4.39 4,48 4.48 Культура 2 в молочной основе SMP Culture 2 in SMP milk base 4,55 4.55 4,45 4.45 4,50 4.50 4,32 4.32 4,43 4.43 Культура 2 в молочной основе WP Culture 2 in WP milk base 4,55 4.55 4,42 4.42 4,47 4.47 4,30 4.30 4,40 4.40

Рост Lb.Lb growth.

Таблица 11. Рост культуры (колониеобразующие единицы (КОЕ)) в конце ферментацииTable 11. Culture Growth (Colony Forming Units (CFU)) at the End of Fermentation

LB (КОЕ) LB (CFU) ST (КОЕ) ST (CFU) Культура 1 в молочной основе SMP Culture 1 in SMP milk base 1Е+07 1E+07 2Е+08 2E+08 Культура 1 в молочной основе WP Culture 1 in WP milk base 2Е+07 2E+07 5Е+07 5E+07 Культура 2 в молочной основе SMP Culture 2 in SMP milk base 2Е+08 2E+08 9Е+07 9E+07 Культура 2 в молочной основе WP Culture 2 in WP milk base 2Е+08 2E+08 1Е+08 1E+08

Как видно из табл. 11, число клеток Lb культуры по изобретению было меньше, чем число Lb сравнительной культуры с лактозоположительной глюкозодефицитной Lb. Углеводы табл. 12: уровень углеводов в конце ферментации.As can be seen from Table. 11, the number of Lb cells of the culture according to the invention was less than the number of Lb cells of the comparative culture with lactose-positive glucose-deficient Lb. Table carbohydrates. 12: Carbohydrate level at the end of fermentation.

- 20 042276- 20 042276

Таблица 12Table 12

Глюкоза (мг/г) Glucose (mg/g) Галактоза (мг/г) Galactose (mg/g) Лактоза (мг/г) Lactose (mg/g) Культура 1 в молочной основе SMP Culture 1 in SMP milk base 14,4 14.4 13,2 13.2 15,4 15.4 Культура 1 в молочной основе WP Culture 1 in WP milk base 12,0 12.0 10,2 10.2 9,2 9.2 Культура 2 в молочной основе SMP Culture 2 in SMP milk base 16,4 16.4 16,3 16.3 11,7 11.7 Культура 2 в молочной основе WP Culture 2 in WP milk base 14,6 14.6 14,1 14.1 6,1 6.1

Аминокислоты.Amino acids.

Таблица 13. Уровень аминокислотTable 13. Amino acid levels

Глутами новая кислота (млн^-1)Glutamine acid ( ^ppm ) Валин (млн^-1)Valine ( ^ppm ) Среднее значение общих свободных аминокислот (мМ) Average value of total free amino acids (mM) Культура 1 в молочной основе SMP Culture 1 in SMP milk base 77 77 9 9 5,5 5.5 Культура 1 в молочной основе WP Culture 1 in WP milk base 62 62 23 23 4,4 4.4 Культура 2 в молочной основе SMP Culture 2 in SMP milk base 137 137 22 22 7,1 7.1 Культура 2 в молочной основе WP Culture 2 in WP milk base 85 85 45 45 5,4 5.4

Образцы, содержащие глюкозоотрицательную Lb (культуры 2), имеют более высокое количество TFFA (общие свободные аминокислоты), что указывает на более высокую протеолитическую активность, что, в свою очередь, может приводить к неприятным вкусам.Samples containing glucose-negative Lb (cultures 2) have higher amounts of TFFA (total free amino acids), indicating higher proteolytic activity, which in turn can lead to off-flavours.

Кроме того, йогурты, содержащие глюкозоотрицательную Lb, содержат более высокое количество глутаминовой кислоты, которая известна за придание привкусов, описанных как бульонистые.In addition, yoghurts containing glucose-negative Lb contain higher amounts of glutamic acid, which is known for imparting off-flavors described as bouillon.

Валин, являющийся горькой аминокислотой, также присутствует в более высоких количествах в йогуртах, содержащих глюкозоотрицательную Lb.Valine, which is a bitter amino acid, is also present in higher amounts in yoghurts containing glucose-negative Lb.

Летучие органические соединения (VOC).Volatile organic compounds (VOC).

Профиль VOC может служить указанием профиля вкуса образца.The VOC profile can serve as an indication of the flavor profile of the sample.

Измеряли 51 разных летучих органических соединений. Для культуры 1 в молочной основе WP количество летучих органических соединений было ниже для 44 из 51 соединения (86%) по сравнению с культурой 2 в молочной основе WP. Для культуры 1 в молочной основе WP количество летучих органических соединений было ниже для 34 из 51 соединения (67%) по сравнению с культурой 2 в молочной основе WP. В заключение, культуры по изобретению имели значительно меньшее содержание летучих органических соединений (рассматриваемых как группа соединений) против сравнительных культур.51 different volatile organic compounds were measured. For culture 1 in WP milk base, VOCs were lower for 44 out of 51 compounds (86%) compared to culture 2 in WP milk base. For culture 1 in WP milk base, VOCs were lower for 34 out of 51 compounds (67%) compared to culture 2 in WP milk base. In conclusion, the cultures according to the invention had a significantly lower content of volatile organic compounds (considered as a group of compounds) compared to comparative cultures.

Пример 10. Рост и последующее закисление Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus (Lb) для композиции культуры по изобретению.Example 10 Growth and subsequent acidification of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb) for a culture composition according to the invention.

План эксперимента.Experiment plan.

Таблица 14. Композиция протестированной культурыTable 14. Composition of tested culture

СНСС16404 (St) % SNSS16404 (St)% СНСС 16731 (St) % SNSS 16731 (St)% СНСС15757 (St) % SNSS15757 (St)% СНСС 18944 (Lb) % SNSS 18944 (Lb) % 1: культура по изобретению 1: culture according to the invention 36,8 36.8 36,8 36.8 21,1 21.1 5,2 5.2

Культуру с композицией, указанной в табл. 14, получали и использовали в качестве заквасочной культуры при ферментации с получением йогурта при 43 °С, пока не достигался целевой рН 4,55. Данную культуру инокулировали при уровне 0,01, 0,02 и 0,03%. Полученный йогурт хранили при 5, 13 и 25 °С. Культуру тестировали в отношении роста St и Lb и последующего закисления.Culture with the composition specified in the table. 14 was prepared and used as a starter culture in a yogurt fermentation at 43°C until the target pH of 4.55 was reached. This culture was inoculated at 0.01, 0.02 and 0.03%. The resulting yoghurt was stored at 5, 13 and 25°C. The culture was tested for St and Lb growth and subsequent acidification.

- 21 042276- 21 042276

Молочные основы.Dairy bases.

Таблица 15. Композиция молочных основ 1 и 2Table 15. Composition of milk bases 1 and 2

Количество Quantity Белок Protein Углеводы Carbohydrates Жиры Fats Обезжиренное молоко Skimmed milk 884,2 г 884.2 g 1,5%-ное молоко 1.5% milk 1767,1 г 1767.1 g Промолоко 802FB Promoloko 802FB 10,9 г 10.9 g SMP SMP 73,9 г 73.9 g Сахароза sucrose 2,8 г 2.8 g Вода Water 261,0 г 261.0 g Молочная основа milk base 3000 г 3000 g 4,57% 4.57% 5,61% 5.61% 0,92% 0.92%

Таблица 16. Состав молочной основы 3 Table 16. Composition of milk base 3 Количество Quantity Белок Protein Углеводы Carbohydrates Жиры Fats Обезжиренное молоко Skimmed milk 884,2 г 884.2 g 1,5%-ное молоко 1.5% milk 1767,1 г 1767.1 g Промолоко 802FB Promoloko 802FB 10,9 г 10.9 g SMP SMP 73,9 г 73.9 g Сахароза sucrose 6,0 г 6.0 g Вода Water 257,8 г 257.8 g Молочная основа milk base 3000 г 3000 g 4,57% 4.57% 5,71% 5.71% 0,92% 0.92%

Последующее закисление.Subsequent acidification.

Таблица 17. Последующее закисление Table 17. Post Acidification Молочная основа Dairy the basis 1 1 1 1 1 1 3 3 3 3 3 3 Инокуляция Inoculation 0,01% 0.01% 0,02% 0.02% 0,03% 0.03% 0,01% 0.01% 0,02% 0.02% 0,03% 0.03% 5°С Сутки 1 5°C Day 1 4,54 4.54 4,54 4.54 4,53 4.53 4,53 4.53 4,53 4.53 4,52 4.52 5°С Сутки 7 5°C Day 7 4,50 4.50 4,50 4.50 4,49 4.49 4,51 4.51 4,51 4.51 4,51 4.51 5°С Сутки 21 5°C Day 21 4,48 4.48 4,48 4.48 4,49 4.49 4,50 4.50 4,50 4.50 4,50 4.50 5°С Сутки 42 5°C Day 42 4,43 4.43 4,42 4.42 4,45 4.45 4,43 4.43 4,45 4.45 4,42 4.42 13°C Сутки 1 13°C Day 1 4,50 4.50 4,49 4.49 4,50 4.50 4,51 4.51 4,50 4.50 4,50 4.50 13°C Сутки 7 13°C Day 7 4,46 4.46 4,46 4.46 4,45 4.45 4,50 4.50 4,49 4.49 4,50 4.50 13°C Сутки 21 13°C Day 21 4,38 4.38 4,38 4.38 4,38 4.38 4,42 4.42 4,45 4.45 4,42 4.42 25°С Сутки 1 25°C Day 1 4,43 4.43 4,43 4.43 4,43 4.43 4,45 4.45 4,46 4.46 4,45 4.45 25°С Сутки 7 25°C Day 7 4,40 4.40 4,40 4.40 4,40 4.40 4,43 4.43 4,44 4.44 4,43 4.43

Как видно из табл. 17, уровень последующего закисления является очень низким для всех протестированных уровней инокуляции и температур хранения, включая более высокие температуры хранения 13 и 25°С, где уровень роста Lb и, следовательно, последующего закисления является высоким для большинства традиционных заквасочных культур.As can be seen from Table. 17, the post-acidification rate is very low for all inoculation levels and storage temperatures tested, including the higher storage temperatures of 13 and 25°C, where the level of Lb growth and hence post-acidification is high for most conventional starter cultures.

Рост Lb и St.Growth Lb and St.

Таблица 18. Рост Lb и StTable 18. Growth of Lb and St

Молочная основа milk base 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 Инокуляция Inoculation 0,01% 0.01% 0,02% 0.02% 0,03% 0.03% 0,01% 0.01% 0,02% 0.02% 0,03% 0.03% Lb КОЕ/г Lb cfu/g 5,8Е05 5.8E05 6,5Е05 6.5E05 7,2Е05 7.2E05 3,7Е05 3.7E05 4,7Е05 4.7E05 8,8Е05 8.8E05 St КОЕ/г St cfu/g 4,2Е07 4.2E07 6,5Е07 6.5E07 7,4Е07 7.4E07 3,8Е07 3.8E07 5,6Е07 5.6E07 7,0Е07 7.0E07

Как видно из табл. 18, для всех уровней инокуляции число клеток Lb в конце ферментации находи лось на высоком уровне.As can be seen from Table. 18, for all levels of inoculation, the number of Lb cells at the end of fermentation was at a high level.

- 22 042276- 22 042276

Пример 11. Рост, последующее закисление и анализ углеводов Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus (Lb) для композиции культуры по изобретению по сравнению с традиционными заквасочными культурами.Example 11 Growth, post-acidification and analysis of carbohydrates of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb) for a culture composition according to the invention compared to traditional starter cultures.

План эксперимента.Experiment plan.

Таблица 19. Композиция протестированных культурTable 19. Composition of tested cultures

Образец Sample СНОС 16404 (St) % SNOS 16404 (St)% СНОС 16731 (St) % SNOS 16731 (St)% СНОС 15757 (St) % SNOS 15757 (St)% СНОС 18944 (Lb) % SNOS 18944 (Lb) % Добавление сахарозы после ферментации Adding sucrose after fermentation 1 1 YoFlex Premium 1.0 YoFlex Premium 1.0 6,0% 6.0% 2 2 Yoflex YF- L901 Yoflex YF- L901 6,0% 6.0% 3 3 Культура по изобретению Culture according to the invention 36,8 36.8 36,8 36.8 21,1 21.1 5,2 5.2 5,0% 5.0% 4 4 Культура по изобретению Culture according to the invention 36,8 36.8 36,8 36.8 21,1 21.1 5,2 5.2 4,5% 4.5% 5 5 Культура по изобретению Culture according to the invention 36,8 36.8 36,8 36.8 21,1 21.1 5,2 5.2 5,5% 5.5% 6 6 Культура по изобретению Culture according to the invention 36,8 36.8 36,8 36.8 21,1 21.1 5,2 5.2 4,8% 4.8%

Культуры с композицией, указанной в табл. 19, получали и использовали в качестве заквасочной культуры при ферментации с получением йогурта при 43 °С, пока не достигался целевой рН 4,55. Данную культуру инокулировали при уровне 0,02%. Полученный йогурт хранили при 5 и 13°С. Культуры тестировали в отношении роста St и Lb, последующего закисления и анализа углеводов.Cultures with the composition specified in the table. 19 was prepared and used as a starter culture in a yogurt fermentation at 43°C until the target pH of 4.55 was reached. This culture was inoculated at a level of 0.02%. The resulting yoghurt was stored at 5 and 13°C. Cultures were tested for St and Lb growth, subsequent acidification and carbohydrate analysis.

YoFlex Premium 1.0 и Yoflex YF-L901 представляют собой имеющиеся в продаже традиционные культуры, содержащие лактозоположительные и глюкозоположительные St и Lb.YoFlex Premium 1.0 and Yoflex YF-L901 are commercially available traditional cultures containing lactose positive and glucose positive St and Lb.

Молочная основа.Milk base.

Таблица 20. Композиция молочной основы 1Table 20 Milk Base Composition 1

Количество Quantity Белок Protein Углеводы Carbohydrates Жиры Fats 1,5% молоко 1.5% milk 3000 г 3000 g SMP SMP 85 г 85 g Молочная основа milk base 3085 г 3085 g 4,20% 4.20% 6,06% 6.06% 1,49% 1.49%

Последующее закисление.Subsequent acidification.

Таблица 21. Последующее закислениеTable 21. Subsequent acidification

Образец Sample 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 6°С Сутки 1 6°C Day 1 4,49 4.49 4,48 4.48 4,54 4.54 4,54 4.54 4,53 4.53 4,54 4.54 6°С Сутки 7 6°C Day 7 4,45 4.45 4,43 4.43 4,52 4.52 4,52 4.52 4,52 4.52 4,53 4.53 6°С Сутки 21 6°C Day 21 4,44 4.44 4,37 4.37 4,47 4.47 4,47 4.47 4,46 4.46 4,46 4.46

Как видно из табл. 21, культуры по изобретению имеют низкий уровень последующего закисления, который находится на том же самом уровне, что и у традиционных заквасочных культур.As can be seen from Table. 21, the cultures of the invention have a low post-acidification level that is on the same level as traditional starter cultures.

Рост Lb и St.Growth Lb and St.

Таблица 22. Рост Lb и StTable 22. Growth of Lb and St

Образец Sample 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 Lb КОЕ/г Lb cfu/g 6ДЕ04 6DE04 1,7Е05 1.7E05 3,1Е06 3.1E06 2,8Е06 2.8E06 ЗДЕ06 ZDE06 2,8Е06 2.8E06 St КОЕ/г St cfu/g 3,0Е08 3.0E08 4ДЕ08 4DE08 3,2Е08 3.2E08 ЗДЕ08 ZDE08 3,0Е08 3.0E08 ЗДЕ08 ZDE08

Как видно из табл. 22, число клеток Lb для культур по изобретению находилось на более высоком уровне в конце ферментации, чем у традиционных культур. Анализ углеводов табл. 23: анализ углеводов.As can be seen from Table. 22, the number of Lb cells for cultures according to the invention was at a higher level at the end of fermentation than conventional cultures. Analysis of carbohydrates table. 23: analysis of carbohydrates.

- 23 042276- 23 042276

Таблица 23Table 23

Образец Sample Г алактоза мг/г G alactose mg/g Глюкоза мг/г Glucose mg/g Лактоза мг/г Lactose mg/g Сахароза мг/г Sucrose mg/g 1 1 YoFlex Premium 1.0 YoFlex Premium 1.0 6,35 6.35 <LOD <LOD 34,35 34.35 46,55 46.55 2 2 Yoflex YF-L901 Yoflex YF-L901 8,05 8.05 1,00 1.00 33,05 33.05 46,60 46.60 3 3 Культура по изобретению Culture according to the invention 8,95 8.95 8,70 8.70 19,90 19.90 41,55 41.55 4 4 Культура ио изобретению Culture io invention 8,90 8.90 8,75 8.75 19,70 19.70 37,50 37.50 5 5 Культура ио изобретению Culture io invention 8,60 8.60 8,40 8.40 19,15 19.15 43,10 43.10 6 6 Культура ио изобретению Culture io invention 8,80 8.80 8,65 8.65 19,40 19.40 39,65 39.65

LOD: предел выявления.LOD: limit of detection.

Все определения углеводов делали в двойных повторностях, и в табл. 23 перечислены средние значения двух определений. Определения проводили после 7 суток хранения йогурта.All determinations of carbohydrates were made in duplicate, and in table. 23 lists the averages of the two determinations. Determinations were carried out after 7 days of storage of yogurt.

Как видно из табл. 23, культуры по изобретению продуцировали глюкозу на высоком уровне, и после 7 суток хранения глюкоза присутствовала на уровне приблизительно 8 мг/г.As can be seen from Table. 23, the cultures of the invention produced high levels of glucose, and after 7 days of storage, glucose was present at approximately 8 mg/g.

Депонирования и экспертные решения.Deposits and expert solutions.

Заявитель испрашивает, чтобы образец депонированных микроорганизмов, указанных ниже, мог быть сделан доступным только для эксперта до даты выдачи патента.The Applicant requests that a sample of the deposited microorganisms indicated below be made available only to the examiner before the date of grant of the patent.

Штамм Streptococcus thermophilus CHCC11342 был депонирован в немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7В, D-38124 Брауншвейг, Германия, 8 сентября 2009 г. под № доступа DSM 22932.Streptococcus thermophilus CHCC11342 was deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany, September 8, 2009, accession DSM 22932.

Штамм Streptococcus thermophilus CHCC12339 был депонирован в немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7В, D-38124 Брауншвейг, Германия, 14 октября 2010 г. под № доступа DSM 24090.Streptococcus thermophilus CHCC12339 was deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany, October 14, 2010, accession DSM 24090.

Штамм Streptococcus thermophilus CHCC11976 был депонирован в немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Брауншвейг, Германия, 8 сентября 2009 г. под № доступа DSM 22934.Streptococcus thermophilus CHCC11976 was deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany, September 8, 2009, accession DSM 22934.

Штамм Streptococcus thermophilus CHCC16731 был депонирован в немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Брауншвейг, Германия, 4 июня 2014 г. под № доступа DSM 28889.Streptococcus thermophilus CHCC16731 was deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany, June 4, 2014, accession DSM 28889.

Штамм Streptococcus thermophilus CHCC19216 был депонирован в немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Брауншвейг, Германия, 8 декабря 2015 г. под № доступа DSM 32227.Streptococcus thermophilus CHCC19216 was deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany, December 8, 2015, accession DSM 32227.

Штамм Streptococcus thermophilus CHCC15757 был депонирован в немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Брауншвейг, Германия, 03.04.2012 г. под № доступа DSM 25850.Streptococcus thermophilus CHCC15757 was deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany, 04/03/2012, Accession No. DSM 25850.

Штамм Streptococcus thermophilus CHCC15887 был депонирован в немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Брауншвейг, Германия, 03.04.2012 г. под № доступа DSM 25851.Streptococcus thermophilus CHCC15887 was deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany, 04/03/2012, Accession No. DSM 25851.

Штамм Streptococcus thermophilus CHCC16404 был депонирован в немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Брауншвейг, Германия, 12.12.2012 г. под № доступа DSM 26722.Streptococcus thermophilus CHCC16404 was deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany, 12/12/2012, Accession No. DSM 26722.

Штамм Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus CHCC18944 был депонирован в DSMZ - немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур GmbH, Inhoffenstr. 7В, D-38124 Брауншвейг, 12.06.2014 г. под № доступа DSM 28910.The strain Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC18944 was deposited with the DSMZ - German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, 6/12/2014 under DSM Accession No. 28910.

Штамм Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus CHCC10019 был депонирован в DSMZ - немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур GmbH, Inhoffenstr. 7В, D-38124 Брауншвейг, 03.04.2007 г. под № доступа DSM 19252.The strain Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC10019 was deposited with the DSMZ - German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, 04/03/2007 under DSM Accession No. 19252.

Штамм Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus CHCC16159 был депонирован в DSMZ - немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур GmbH, Inhoffenstr. 7В, D-38124 Брауншвейг, 06.09.2012 г. под № доступа DSM 26420.The strain Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC16159 was deposited with the DSMZ - German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, 09/06/2012 under DSM Accession No. 26420.

Штамм Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus CHCC16160 был депонирован в DSMZ - немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур GmbH, Inhoffenstr. 7В, D-38124 Брауншвейг, 06.09.2012 г. под № доступа DSM 26421.The strain Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC16160 was deposited with the DSMZ - German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, 09/06/2012 under accession number DSM 26421.

Штамм Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus CHCC12813 был депонирован в DSMZ - немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур GmbH, Inhoffenstr. 7В, D-38124 Брауншвейг, 29.09.2010 г. под № доступа DSM 24074.The strain Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC12813 was deposited with the DSMZ - German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, 09/29/2010, accession DSM 24074.

Данные депонирования были сделаны согласно Будапештскому договору по международному признанию депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.The deposit data was made in accordance with the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure.

--

Claims (10)

СсылкиLinks WO2011/026863;WO2011/026863; WO2011/092300;WO2011/092300; WO2013/160413;WO2013/160413; Pool et al. (2006) Metabolic Engineering 8(5); 456-464;Pool et al. (2006) Metabolic Engineering 8(5); 456-464; Thompson et al. (1985) J. Bacteriol. 162(1); 217-223;Thompson et al. (1985) J. Bacteriol. 162(1); 217-223; Chervaux et al. (2000). Appl and Environ Microbiol, 66, 5306-5311;Chervaux et al. (2000). Appl and Environ Microbiol, 66, 5306-5311; Cochu et al. (2003). Appl and Environ Microbiol, 69(9), 5423-5432;Cochu et al. (2003). Appl and Environ Microbiol, 69(9), 5423-5432; H0ier et al. (2010) in The Technology of Cheesemaking, 2^nd Ed. Blackwell Publishing, Oxford; 166-192.Hoier et al. (2010) in The Technology of Cheesemaking, ^2nd Ed. Blackwell Publishing, Oxford; 166-192. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM 1. Композиция для получения ферментированного молочного продукта, содержащая: (1) по меньшей мере один штамм Streptococcus thermophilus (St), где данный штамм St является галактозоферментирующим, где данный штамм несет мутацию в последовательности ДНК гена glcK, кодирующего белок глюкокиназу, где данная мутация инактивирует белок глюкокиназу или имеет отрицательное влияние на экспрессию этого гена, где галактозоферментирующую активность определяют как указано в описании изобретения, и где данная мутация уменьшает активность белка глюкокиназы по меньшей мере на 50%, и где активность глюкокиназы определяют как указано в описании изобретения, и (2) по меньшей мере один штамм Lactobacillus delbrueckii подв. bulgaricus (Lb), где данный штамм Lb является лактозодефицитным и способен метаболизировать глюкозу, где лактозодефицитность определяют по способности штамма Lb образовывать белые колонии на среде, содержащей лактозу и 5-бром-4-хлор-3-индолил-бетаD-галактопиранозид (X-Gal).1. A composition for producing a fermented dairy product, containing: (1) at least one strain of Streptococcus thermophilus (St), where this St strain is galactose-fermenting, where this strain carries a mutation in the DNA sequence of the glcK gene encoding the glucokinase protein, where this mutation inactivates the glucokinase protein or has a negative effect on the expression of this gene, where the galactose-fermenting activity is determined as indicated in the description of the invention, and where this mutation reduces the activity of the glucokinase protein by at least 50%, and where the glucokinase activity is determined as indicated in the description of the invention, and ( 2) at least one strain of Lactobacillus delbrueckii sub. bulgaricus (Lb), where this Lb strain is lactose-deficient and capable of metabolizing glucose, where lactose deficiency is determined by the ability of the Lb strain to form white colonies on a medium containing lactose and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-betaD-galactopyranoside (X- Gal). 2. Композиция по п.1, где штамм St является устойчивым к 2-дезоксиглюкозе.2. The composition of claim 1, wherein the St strain is 2-deoxyglucose resistant. 3. Композиция по п.1 или 2, где штамм St несет мутацию, которая уменьшает транспорт глюкозы в клетку.3. A composition according to claim 1 or 2, wherein the St strain carries a mutation that reduces the transport of glucose into the cell. 4. Композиция по любому из пп.1-3, где штамм St увеличивает количество глюкозы в 9,5%-ном Вмолоке до по меньшей мере 5 мг/мл при инокуляции в 9,5%-ное В-молоко в концентрации 106-10⁷ колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл и выращивании при 40°С в течение 20 ч.4. The composition according to any one of claims 1 to 3, wherein the St strain increases the amount of glucose in 9.5% B-milk to at least 5 mg/ml when inoculated into 9.5% B-milk at a concentration of 106- 10 ⁷ colony forming units (CFU)/ml and grown at 40°C for 20 hours. 5. Композиция по любому из пп.1-4, где штамм St увеличивает количество глюкозы в 9,5%-ном Вмолоке с 0,05% сахарозы до по меньшей мере 5 мг/мл при инокуляции в 9,5%-ное В-молоко с 0,05% сахарозы в концентрации 106-10⁷ КОЕ/мл и выращивании при 40°С в течение 20 ч.5. Composition according to any one of claims 1 to 4, wherein the St strain increases the amount of glucose in 9.5% B milk with 0.05% sucrose to at least 5 mg/ml when inoculated into 9.5% B - milk with 0.05% sucrose at a concentration of 106-10 ⁷ CFU/ml and grown at 40°C for 20 hours. 6. Композиция по любому из пп.1-5, где штамм Lb выбран из группы, состоящей из штамма, депонированного в немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур DSMZ, GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Брауншвейг, 12.06.2014 г. под № доступа DSM 28910, и функционально эквивалентного мутантного штамма, происходящего из DSM 28910, в котором менее 1% нуклеотидов в бактериальном геноме было заменено другим нуклеотидом или подвергнуто делеции по сравнению с материнским штаммом.6. The composition according to any one of claims 1 to 5, where the Lb strain is selected from the group consisting of a strain deposited in the German collection of microorganisms and cell cultures DSMZ, GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, 06/12/2014, accession number DSM 28910, and a functionally equivalent mutant strain derived from DSM 28910, in which less than 1% of the nucleotides in the bacterial genome were replaced by another nucleotide or subjected to a deletion compared to the parent strain . 7. Композиция по любому из пп.1-6, где штамм St выбран из группы, состоящей из штамма СНСС19216 Streptococcus thermophilus, который был депонирован в немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур под № доступа DSM 32227, штамма СНСС16731 Streptococcus thermophilus, который был депонирован в немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Брауншвейг, Германия, 4 июня 2014 г. под № доступа DSM 28889, штамма СНСС15757 Streptococcus thermophilus, который был депонирован в Немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур под № доступа DSM 25850, штамма СНСС15887 Streptococcus thermophilus, который был депонирован в Немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур под № доступа DSM 25851, штамма СНСС16404 Streptococcus thermophilus, который был депонирован в немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур под № доступа DSM 26722, и мутантного штамма, происходящего из них, где данный мутантный штамм представляет собой функционально эквивалентный штамм указанных депонированных штаммов и в котором менее 1% нуклеотидов в бактериальном геноме было заменено другим нуклеотидом или подвергнуто делеции по сравнению с материнским штаммом.7. Composition according to any one of claims 1 to 6, wherein the St strain is selected from the group consisting of the Streptococcus thermophilus strain CHCC19216, which has been deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures under Accession No. DSM 32227, the Streptococcus thermophilus strain CHCC16731, which has been deposited to the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany, June 4, 2014, Accession No. DSM 28889, Streptococcus thermophilus strain CHCC15757, which has been deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Accession No. DSM 25850, Streptococcus thermophilus strain CHCC15887, which has been deposited with German Collection of Microorganisms and Cell Cultures Accession No. DSM 25851, Streptococcus thermophilus strain CHCC16404 which has been deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures Accession No. DSM 26722, and a mutant strain derived therefrom, wherein the mutant strain is a functionally equivalent strain specified deposited strains and in which less than 1% of the nucleotides in the bacterial genome has been replaced by another nucleotide or subjected to a deletion compared to the parent strain. 8. Способ получения ферментированного молочного продукта, включающий инокулирование и ферментирование молочного субстрата композицией по любому из пп.1-7.8. A method for producing a fermented dairy product, comprising inoculating and fermenting a dairy substrate with a composition according to any one of claims 1 to 7. 9. Ферментированный молочный продукт, содержащий композицию по любому из пп.1-7.9. A fermented dairy product containing a composition according to any one of claims 1 to 7. 10. Применение композиции по любому из пп.1-7 для получения ферментированного молочного продукта.10. The use of a composition according to any one of claims 1 to 7 for the production of a fermented dairy product. --