EA042253B1 - COMBINED MEDICINE WITH ANTIVIRAL EFFECT TO PREVENT SARS-COV-2 INFECTION - Google Patents

Description

Область техникиTechnical field

Изобретение относится к медицине, фармацевтике и биотехнологии. Представлено новое комбинированное лекарственное средство (фармацевтическая композиция), обладающее противовирусным эффектом в отношении коронавируса SARS-GoV-2 и родственных вирусов, таких как SARS-CoV, MERS и др., геном которых представлен РНК, а вирионы снабжены липидной оболочкой, композиция (i) за счет разрушения генома короновируса ферментом РНКазой, композиция (ii) за счет разрушения генома короновируса ферментом РНКазой и препаратом никлозамидом, препятствующим репликации SARS-CoV-2. Предложенные композиции могут применяться амбулаторно для подавления репликации вируса SARSCoV-2, снижения вирусной нагрузки, снижения риска передачи инфекции воздушно-капельным путем.The invention relates to medicine, pharmaceuticals and biotechnology. A new combined drug (pharmaceutical composition) is presented that has an antiviral effect against the SARS-GoV-2 coronavirus and related viruses, such as SARS-CoV, MERS, etc., whose genome is represented by RNA, and the virions are provided with a lipid envelope, composition (i ) due to the destruction of the coronovirus genome by the enzyme RNase, composition (ii) due to the destruction of the coronovirus genome by the enzyme RNase and the drug niclosamide, which prevents the replication of SARS-CoV-2. The proposed compositions can be used on an outpatient basis to suppress the replication of the SARSCoV-2 virus, reduce the viral load, and reduce the risk of infection transmission by airborne droplets.

Уровень техникиState of the art

В мире разработан целый ряд профилактических вакцин, а также средств терапии для лечения коронавирусной инфекции. Имеется патент RU 2746362 (заявка 2021106335 от 11.03.2021) - Комбинированное лекарственное средство, обладающее противовирусным эффектом в отношении нового коронавируса SARS-CoV-2 [1], в котором описано блокирование передачи инфекции и уменьшение риска развития клинических осложнений за счет применения малых интерферирующих РНК (ми РНК). Основой вышеуказанного патента является получение комбинированного лекарственного средства с созданными молекулами РНК, способными опосредовать мишень-специфическое подавление репликации вируса SARS-CoV-2.The world has developed a number of preventive vaccines, as well as therapies for the treatment of coronavirus infection. There is a patent RU 2746362 (application 2021106335 dated 03/11/2021) - A combined drug with an antiviral effect against the new coronavirus SARS-CoV-2 [1], which describes blocking the transmission of infection and reducing the risk of developing clinical complications through the use of small interfering RNA (mi RNA). The basis of the above patent is the preparation of a combination drug with engineered RNA molecules capable of mediating target-specific suppression of SARS-CoV-2 virus replication.

Однако не предложено препаратов, способных уничтожать коронавирусы путем прямого разрушения их генома - одноцепочечную (+)РНК. Очевидно, что прямое разрушения генома вируса может быть осуществлено путем воздействия фермента рибонуклеазы (РНКазы) [2], способного расщеплять РНК коронавирусов или дополнительно путем подавления репликации коронавирусов под действием никлозамида - лекарственного средства, применяемого для лечения паразитарных инфекций. В настоящее время показано, что никлозамид может ингибировать репликацию вируса SARS-CoV-2 [3-6].However, no drugs have been proposed that can destroy coronaviruses by directly destroying their genome - single-stranded (+)RNA. It is obvious that the direct destruction of the virus genome can be carried out by the action of the enzyme ribonuclease (RNase) [2], which can cleave the RNA of coronaviruses, or additionally by suppressing the replication of coronaviruses under the action of niclosamide, a drug used to treat parasitic infections. It has now been shown that niclosamide can inhibit the replication of the SARS-CoV-2 virus [3-6].

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Комбинированное лекарственное средство предназначено для ингаляционного или интраназального введения.The combined drug is intended for inhalation or intranasal administration.

Внедрение в практику препаратов на основе РНКаз и никлозамида ограничивается рядом факторов, к которым относятся недостаточная эффективность и безопасность доставки РНКазы и никлозамида в вирусные частица-мишени. Применение липосом [7] для доставки вышеуказанных препаратов (РНКазы и никлозамида) решает эту проблему, так как SARS-CoV-2, а также родственные ему вирусы MERS, SARS-CoV имеют липидную оболочку, позволяющую трансфецировать (проникать) липосомам и внедрять РНКазу и никлозамид непосредственно внутрь вируса.The introduction into practice of preparations based on RNases and niclosamide is limited by a number of factors, which include insufficient efficiency and safety of delivery of RNase and niclosamide to viral target particles. The use of liposomes [7] for the delivery of the above drugs (RNase and niclosamide) solves this problem, since SARS-CoV-2, as well as related MERS and SARS-CoV viruses, have a lipid envelope that allows transfection (penetration) of liposomes and the introduction of RNase and niclosamide directly into the virus.

Таким образом, в настоящее время существует необходимость в разработке нового противовирусного средства, способного разрушать РНК коронавируса.Thus, there is currently a need to develop a new antiviral agent capable of destroying coronavirus RNA.

В состав комбинированных лекарственных средств по настоящему изобретению входит композиция (i) липосомы, осуществляющие доставку эффективного количество РНКазы, и композиция (ii) - липосомы, осуществляющие доставку эффективного количество РНКазы и эффективного количество никлозамида. Эти фармацевтические композиции обеспечивают расщепление РНК SARS-CoV-2.The composition of the combination drugs of the present invention includes composition (i) of liposomes delivering an effective amount of RNase, and composition (ii) of liposomes delivering an effective amount of RNase and an effective amount of niclosamide. These pharmaceutical compositions provide cleavage of SARS-CoV-2 RNA.

Комбинированные лекарственные средства можно употреблять в виде назальных капель или спрея, а также в виде ингаляции.Combination medicines can be used as nasal drops or spray, as well as inhalation.

Технический результат заключается в создании эффективного и безопасного противовирусного средства, обеспечивающего разрушения РНК SARS-CoV-2. Указанный технический результат поясняется следующими примерами.The technical result is to create an effective and safe antiviral agent that ensures the destruction of SARS-CoV-2 RNA. The specified technical result is illustrated by the following examples.

Для достижения вышеуказанного технического результата предложено комбинированное лекарственное средство для профилактики или лечения коронавирусной инфекции, вызываемой SARS-CoV-2, содержащее эффективное количество молекул РНКазы в липосомах.To achieve the above technical result, a combined drug for the prevention or treatment of coronavirus infection caused by SARS-CoV-2 is proposed, containing an effective amount of RNase molecules in liposomes.

Также для достижения вышеуказанного технического результата предложено комбинированное лекарственное средство для профилактики или лечения коронавирусной инфекции, вызываемой SARSCoV-2, содержащее эффективное количество молекул РНКазы и никлозамида в липосомах.Also, to achieve the above technical result, a combined drug for the prevention or treatment of coronavirus infection caused by SARSCoV-2 is proposed, containing an effective amount of RNase and niclosamide molecules in liposomes.

Согласно настоящему изобретению вышеуказанные комбинированные лекарственные средства могут быть предназначены для интраназального или ингаляционного введения.According to the present invention, the above combination drugs may be intended for intranasal or inhalation administration.

Также для достижения вышеуказанного технического результата предложен способ профилактики или лечения SARS-CoV-2 инфекции, в котором вышеуказанное(ые) комбинированное(ые) лекарственное(ые) средство(а) вводится одновременно, отдельно или последовательно с другими терапевтическими средствами.Also, to achieve the above technical result, a method for the prevention or treatment of SARS-CoV-2 infection is proposed, in which the above-mentioned combination drug(s) is administered simultaneously, separately or sequentially with other therapeutic agents.

Краткое описание чертежейBrief description of the drawings

На фиг. 1 приведены результаты эксперимента по примеру 4.In FIG. 1 shows the results of the experiment according to example 4.

На фиг. 2 приведены результаты эксперимента по примеру 5 (метод гель-электрофореза).In FIG. 2 shows the results of the experiment according to example 5 (gel electrophoresis method).

- 1 042253- 1 042253

Осуществление изобретенияImplementation of the invention

Указанный выше технический результат поясняется следующими примерами.The above technical result is illustrated by the following examples.

Пример 1. Получение липосом с РНКазой.Example 1. Obtaining liposomes with RNase.

Для получения липосом использовали фосфолипиды как растительного (соевый лецитин), так и животного происхождения (из мозга крупного рогатого скота). В качестве рибонуклеазы использовали коммерческий препарат-фермент РНКаза А с ММ-13.7 кД, рН оптимум - 5,0-6,0; 50 U/мг фирмы Mol BIO HIMEDIA, полученный из поджелудочной железы крупного рогатого скота, или рибонуклеазу из поджелудочной железы крупного рогатого скота (РНКаза А) фирмы СамсонМед (Россия).Phospholipids of both vegetable (soy lecithin) and animal origin (bovine brain) were used to obtain liposomes. As ribonuclease, a commercial preparation-enzyme RNase A with MM-13.7 kD, pH optimum - 5.0-6.0; 50 U/mg from Mol BIO HIMEDIA, obtained from the pancreas of cattle, or ribonuclease from the pancreas of cattle (RNase A) from SamsonMed (Russia).

В качестве фосфолипидов использовали экстракт из соевого лецитина, применяемого в пищевой промышленности, или фосфолипиды животного происхождения (из мозга крупного рогатого скота).As phospholipids, an extract from soy lecithin used in the food industry, or phospholipids of animal origin (from the brain of cattle) were used.

Для получения липосом - 1 г коммерческого (VEROLEC FLS, China) соевого лецитина растворяли в 20 мл хлороформ-метанольной смеси при соотношении 2:1. Смесь выдерживали в течение 10 ч при температуре 2-4°C. Затем смесь центрифугировали при 4500 об/мин в течение 5 мин. Отбирали 1 мл надосадочной жидкости и растворяли в 6 мл хлороформа. Далее растворитель отгоняли в вакууме (4±2 мм рт. ст.) при температуре +40°C. После полного удаления растворителя добавляли 50 мкл Рибонуклеазы А (Ш/мкл) и 5 мл физиологического раствора. Полученную смесь замораживали при -20°C в течение 20 мин, затем смесь размораживали при перемешивании при 23°C в течение 30 мин (процесс замораживания и оттаивания повторяли четырежды). Затем полученную смесь обрабатывали ультразвуком при 22 кГц, 30 с в 4 повторах.To obtain liposomes, 1 g of commercial (VEROLEC FLS, China) soy lecithin was dissolved in 20 ml of a chloroform-methanol mixture at a ratio of 2:1. The mixture was kept for 10 h at a temperature of 2-4°C. The mixture was then centrifuged at 4500 rpm for 5 minutes. 1 ml of the supernatant was taken and dissolved in 6 ml of chloroform. Next, the solvent was distilled off in a vacuum (4 ± 2 mm Hg) at a temperature of +40°C. After complete removal of the solvent, 50 μl of Ribonuclease A (N/μl) and 5 ml of saline were added. The resulting mixture was frozen at -20°C for 20 min, then the mixture was thawed with stirring at 23°C for 30 min (the process of freezing and thawing was repeated four times). The resulting mixture was then sonicated at 22 kHz, 30 s in 4 repetitions.

Аналогичным образом получали липосомы на основе фосфолипидов из мозга крупного рогатого скота, которые были выделены по методу [8].In a similar way, liposomes based on phospholipids from the brain of cattle were obtained, which were isolated according to the method [8].

Лекарственные формы фармацевтических композиций, приведенных в настоящем документе, могут быть получены любым известным способом и содержать другие вспомогательные вещества, способные увеличивать стабильность композиций (i) и (ii), и трансфекцию РНКазы.Dosage forms of the pharmaceutical compositions described herein may be prepared by any known method and contain other excipients capable of increasing the stability of compositions (i) and (ii) and RNase transfection.

Пример 2. Получение липосом с никлозамидом и РНКазой.Example 2 Preparation of liposomes with niclosamide and RNase.

Использовали никлозамид (кристаллическое вещество, температура плавления 227-232°C). ИКспектр тестируемого образца соответствовал ИК-спектру безводного никлозамида - стандарта, структурная формула никлозамида имеет следующий вид:Used niclosamide (crystalline substance, melting point 227-232°C). The IR spectrum of the test sample corresponded to the IR spectrum of anhydrous niclosamide - standard, the structural formula of niclosamide is as follows:

Для получения липосом, содержащих РНКазу (композиция i), и липосом, содержащих РНКазу А и никлозамид (композиция ii), 1 мл раствора лецитина (1,075 мМ) смешивали с 6 мл хлороформа. Далее растворитель отгоняли в вакууме (4±2 мм рт. ст.), при температуре +40°C. После удаления хлороформа в колбу добавляли 50 мкл Рибонуклеазы А, 30 мкл раствора никлозамида (10% раствор в ДМСО) и 5 мл физиологического раствора. Полученную смесь замораживали при -20°C в течение 20 мин, затем смесь размораживали при 23°C в течение 30 мин при перемешивании (процесс замораживания и оттаивания повторяли четырежды). Затем полученную смесь обрабатывали ультразвуком при 22 кГц, 30 с. Аналогичным образом получали липосомы на основе фосфолипидов из мозга крупного рогатого скота, которые были выделены по методу [8].To prepare RNase A-containing liposomes (composition i) and RNase A and niclosamide-containing liposomes (composition ii), 1 ml of lecithin solution (1.075 mM) was mixed with 6 ml of chloroform. Next, the solvent was distilled off in a vacuum (4 ± 2 mm Hg) at a temperature of +40°C. After removal of chloroform, 50 μl of Ribonuclease A, 30 μl of niclosamide solution (10% solution in DMSO) and 5 ml of physiological saline were added to the flask. The resulting mixture was frozen at -20°C for 20 min, then the mixture was thawed at 23°C for 30 min with stirring (the process of freezing and thawing was repeated four times). The resulting mixture was then sonicated at 22 kHz, 30 s. In a similar way, liposomes based on phospholipids from the brain of cattle were obtained, which were isolated according to the method [8].

Лекарственные формы фармацевтических композиций, приведенных в настоящем документе, могут быть получены любым известным способом и содержать другие вспомогательные вещества, способные увеличивать стабильность композиций (i) и (ii), и трансфекцию РНКазы и никлозамида.Dosage forms of the pharmaceutical compositions described herein can be obtained by any known method and contain other excipients that can increase the stability of compositions (i) and (ii), and the transfection of RNase and niclosamide.

Пример 3. Синтез праймеров на N ген SARS-CoV-2.Example 3. Synthesis of primers for the SARS-CoV-2 N gene.

Для определения возможности расщепления РНК SARS-CoV-2 использовали ПЦР метод. В качестве мишени для определения возможности расщепления РНКазой генома коронавируса SARS-CoV-2 был выбран N ген как наиболее стабильный для таких типов коронавирусов как SARS и MERS, кодирующий нуклеокапсид [9-11]. На N ген были синтезированы праймеры и флуоресцентный зонд, используя открытые международные данные CDC (Центр по контролю и профилактике заболеваний США) [12].To determine the possibility of SARS-CoV-2 RNA cleavage, the PCR method was used. As a target for determining the possibility of RNase cleavage of the SARS-CoV-2 coronavirus genome, the N gene was chosen as the most stable one for such types of coronaviruses as SARS and MERS, encoding the nucleocapsid [9-11]. Primers and a fluorescent probe were synthesized for the N gene using open international data from the CDC (US Center for Disease Control and Prevention) [12].

Синтез праймеров проводили на приборе ДНК-синтезаторе ASM-2000 фосфорамидитным твердофазным методом [13]. После синтеза олигонуклеотиды снимали с твердой фазы концентрированным 30% водным аммиаком в течение 2 ч при температуре 60°C. Раствор олигонуклеотидов выпаривали для удаления аммиака и осаждали в 70% этаноле в присутствии 0,3 М ацетата натрия и 50 мМ хлорида магния. Для осаждения олигонуклеотидов центрифугировали при 14000 об/мин в течение 20 мин. Осадок промывали дважды 70% этанолом и высушивали при комнатной температуре в течение 30 мин.Primers were synthesized on an ASM-2000 DNA synthesizer by the phosphoramidite solid phase method [13]. After synthesis, the oligonucleotides were removed from the solid phase with concentrated 30% aqueous ammonia for 2 h at 60°C. The oligonucleotide solution was evaporated to remove ammonia and precipitated in 70% ethanol in the presence of 0.3M sodium acetate and 50mM magnesium chloride. Oligonucleotides were precipitated by centrifugation at 14,000 rpm for 20 min. The precipitate was washed twice with 70% ethanol and dried at room temperature for 30 min.

После синтеза олигонуклеотиды очищали от коротких не полностью синтезированных молекул. Для этого в конце синтеза не проводили последний этап снятия ДМТ группы, в результате только полностью синтезированные олигонуклеотиды на 5’-конце содержат ДМТ группу для очистки на картриджах методом обратно-фазовой хроматографии. Обратно-фазовую хроматографию проводили в следующих условиях: промывку олигонуклеотидов проводили с помощью 5% ацетонитрила с хлоридом натрия вAfter synthesis, the oligonucleotides were purified from short incompletely synthesized molecules. To do this, at the end of the synthesis, the last step of removing the DMT group was not carried out; as a result, only fully synthesized oligonucleotides at the 5'-end contain a DMT group for purification on cartridges by reverse-phase chromatography. Reverse phase chromatography was carried out under the following conditions: oligonucleotides were washed with 5% acetonitrile with sodium chloride in

- 2 042253 концентрации 100 мг/мл. Для удаления ДМТ группы с олигонуклеотидов использовали 3% раствор дихлоруксусной кислоты. После удаления ДМТ группы для элюирования очищенных олигонуклеотидов с картриджа использовали 50% ацетонитрил в 100 мМ трис-буфере рН 8,5.- 2 042253 concentration 100 mg/ml. A 3% dichloroacetic acid solution was used to remove the DMT group from the oligonucleotides. After removal of the DMT group, 50% acetonitrile in 100 mM Tris buffer pH 8.5 was used to elute the purified oligonucleotides from the cartridge.

Очищенные олигонуклеотиды осаждали 70% этанолом в присутствии 50 мМ хлорид магния, центрифугированием при 14000 об/мин в течение 20 мин. Полученный осадок олигонуклеотидов растворяли в ТЕ буфере рН 8,0 до концентрации 20 мкМ. Полученный раствор праймеров использовали для проведения ПЦР реакции.Purified oligonucleotides were precipitated with 70% ethanol in the presence of 50 mM magnesium chloride, by centrifugation at 14,000 rpm for 20 min. The resulting precipitate of oligonucleotides was dissolved in TE buffer pH 8.0 to a concentration of 20 μM. The resulting primer solution was used to carry out the PCR reaction.

Таблица 1Table 1

Последовательность праймеров и флуоресцентного зонда на N ген SARS-CoV-2Sequence of primers and fluorescent probe for SARS-CoV-2 N gene

Наименование Name Последовательность нуклеотидов 5’ —3’ Nucleotide sequence 5' -3' Размер фрагмента амплификации Amplification fragment size N1-F N1-F GACCCCAAAATCAGCGAAAT GACCCCAAAATCAGCGAAAT 466 п.н 466 bp N3-R N3-R TGTAGCACGATTGCAGCATTG TGTAGCACGATTGCAGCATTG N1-P N1-P FAM-ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC-BHQ1 FAM-ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC-BHQ1

С помощью данных праймеров и зонда, специфичных к участку N гена РНК SARS-CoV-2, методом ПЦР определяли содержание вируса в биологических образцах и проводили гель-электрофорез образцов, как описано в примерах 4 и 5.Using these primers and a probe specific to the N region of the SARS-CoV-2 RNA gene, the content of the virus in biological samples was determined by PCR, and gel electrophoresis of the samples was performed, as described in examples 4 and 5.

Пример 4. Изучение действия липосом с РНКазой на SARS-CoV-2 методом RT-ПЦР in vitro.Example 4 Study of the effect of RNase-containing liposomes on SARS-CoV-2 by in vitro RT-PCR.

Выделение РНК и выявление вируса SARS-CoV-2 проводили по стандартному методу с помощью сертифицированных наборов реагентов ДНК-Технология [14, 15], а также с помощью праймеров и зонда, синтезированных нами. Эффективность действия липосом определяли по смещению порогового цикла (ΔΔCt) в ПЦР анализе. Пороговый цикл показывает, какое количество РНК содержится в пробах, и он обратно пропорционален логарифму начального количества копий.RNA isolation and detection of the SARS-CoV-2 virus were carried out according to the standard method using certified DNA-Technology reagent kits [14, 15], as well as using primers and a probe synthesized by us. The effectiveness of liposomes was determined by the displacement of the threshold cycle (ΔΔCt) in PCR analysis. The threshold cycle indicates how much RNA is in the samples and is inversely proportional to the logarithm of the initial copy number.

Для выделения РНК использовали как набор реагентов ДНК-Технология, так и разработанный нами сертифицированный набор ЭНКОР. Детекцию РНК в образцах проводили с синтезированными праймерами и зондом, описанных в примере 3. Для проведения ПЦР анализа использовали как набор реагентов ДНК-Технология SARS-CoV-2/SARS-CoV, так и разработанный нами ПЦР набор в следующих условиях: объем смеси 25 мкл, 1х ПЦР буфер (20 мМ трис-HCl рН 8,5, 20 мМ сульфат аммония, 20 мМ хлорид калия, 0,1 мкг/мл БСА), 3 мМ хлорид магния, 0,8 мМ дНТФ, 400 нм каждого праймера, 200 нМ зонда, 1 ед. полимеразы, 25 ед. ревертазы. Программа ПЦР: 50°C - 15 мин; 95°C - 15 мин; 40 циклов (95°C - 10 с; 60°C - 40 с, считывание сигнала по каналу FAM). Для ПЦР анализа использовали по 5 мкл РНК образца.For RNA isolation, both the DNA-Technology reagent kit and the certified ENKOR kit developed by us were used. RNA detection in the samples was carried out with the synthesized primers and probe described in example 3. For PCR analysis, both the SARS-CoV-2/SARS-CoV DNA-Technology reagent kit and the PCR kit developed by us were used under the following conditions: mixture volume 25 µl, 1x PCR buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.5, 20 mM ammonium sulfate, 20 mM potassium chloride, 0.1 µg/ml BSA), 3 mM magnesium chloride, 0.8 mM dNTP, 400 nm of each primer , 200 nM probe, 1 pc. polymerase, 25 units. revertases. PCR program: 50°C - 15 min; 95°C - 15 min; 40 cycles (95°C - 10 s; 60°C - 40 s, signal reading via FAM channel). For PCR analysis, 5 µl of RNA sample were used.

Образцы биологического материала человека (по 80 мкл мазка из носоглотки), содержащие коронавирус SARS-CoV-2, инкубировали с 20 мкл композиций (i) и (ii) (полученных, как описано в примерах 1 и 2) в течение 1 ч при 36°C. Параллельно проводили инкубирование тех же образцов с 20 мкл свободной РНКазы (1 ед./мкл), а также с пустыми липосомами, не содержащими РНКазу. Результаты экспериментов представлены в табл. 2.Samples of human biological material (80 µl each of a nasopharyngeal swab) containing SARS-CoV-2 coronavirus were incubated with 20 µl of compositions (i) and (ii) (obtained as described in examples 1 and 2) for 1 hour at 36 °C In parallel, the same samples were incubated with 20 µl of free RNase (1 U/µl), as well as with empty RNase-free liposomes. The results of the experiments are presented in table. 2.

Как видно из приведенных данных (табл. 2), под действием пустых липосом пороговый цикл (Ct) реакции RT-ПЦР практически не меняется, что свидетельствует о том, что липосомы сами по себе не могут разрушать РНК SARS-CoV-2. В то же время наибольшее воздействие и сдвиг Ct происходит под действием липосом, содержащих РНКазу на 9 циклов, и липосом, содержащих РНКазу и никлозамид на 10 циклов, что свидетельствует о том, что липосомы, содержащие РНКазу, расщепляют РНК коронавируса и снижают концентрацию РНК примерно в 10³ раз. При этом сама РНКаза в наших экспериментах сдвигает Ct на 3 цикла, по-видимому, за счет расщепления свободных РНК COVID-19. Следует отметить, что липосомы, содержащие РНКазу с никлозамидом, проявляли практически такое же действие, что и липосомы, содержащие только РНКазу, что и следовало ожидать из биологической активности никлозамида.As can be seen from the data (Table 2), under the action of empty liposomes, the threshold cycle (Ct) of the RT-PCR reaction practically does not change, which indicates that liposomes themselves cannot degrade SARS-CoV-2 RNA. At the same time, the greatest effect and shift of Ct occurs under the action of liposomes containing RNase for 9 cycles, and liposomes containing RNase and niclosamide for 10 cycles, which indicates that liposomes containing RNase cleave coronavirus RNA and reduce the concentration of RNA by about 10 ³ times. At the same time, RNase itself in our experiments shifts Ct by 3 cycles, apparently due to the cleavage of free COVID-19 RNA. It should be noted that RNase-containing liposomes with niclosamide showed almost the same effect as RNase-only liposomes, which was expected from the biological activity of niclosamide.

- 3 042253- 3 042253

Действие композиции (i) и (ii) исследовалось также методом гель-электрофореза [16], используя синтезированные нами праймеры на N ген (466 п.н.).The effect of compositions (i) and (ii) was also studied by gel electrophoresis [16] using primers synthesized by us for the N gene (466 bp).

Результаты эксперимента приведены на фиг. 1.The results of the experiment are shown in Fig. 1.

Фиг. 1. Гель-электрофорез в 3% агарозном геле [16].Fig. 1. Gel electrophoresis in 3% agarose gel [16].

Образцы амплификатов N гена:N gene amplification samples:

А - исходный образец, положительный по COVID-19;A - original sample, positive for COVID-19;

В - образец после инкубации с пустыми липосомами;B - sample after incubation with empty liposomes;

С - образец после инкубации с РНКазой;C - sample after incubation with RNase;

D - образец после инкубации с липосомами, содержащими РНКазу (композиция i);D - sample after incubation with RNase-containing liposomes (composition i);

F - образец после инкубации с липосомами, содержащими РНКазу и никлозамид (композиция ii);F - sample after incubation with liposomes containing RNase and niclosamide (composition ii);

K - отрицательный контроль - образец, не содержащий вирус SARS-CoV-2.K - negative control - a sample that does not contain the SARS-CoV-2 virus.

Гель-электрофорез (фиг. 1) ПЦР анализа выявил, что после инкубации позитивных SARS-CoV-2 образцов с композициями (i) и (ii) приводит к разложению N гена, так как продукт амплификации на гель-электрофорезе отсутствует, что свидетельствует о том, что произошло расщепление N гена SARSCoV-2.Gel electrophoresis (Fig. 1) PCR analysis revealed that after incubation of positive SARS-CoV-2 samples with compositions (i) and (ii) leads to the decomposition of the N gene, since there is no amplification product on gel electrophoresis, which indicates cleavage of the N gene of SARSCoV-2.

Пример 5. Изучение действия липосом с РНКазой на SARS-CoV-2 in vivo.Example 5 Study of the effect of RNase liposomes on SARS-CoV-2 in vivo.

Исследования проводили на 5 группах кроликов породы Великан, весом 1,6-1,8 кг, возраст 3-4 месяца, по 5 животных в каждой группе:The studies were carried out on 5 groups of rabbits of the Giant breed, weighing 1.6-1.8 kg, aged 3-4 months, 5 animals in each group:

группа 1 - отрицательный контроль (физиологический раствор);group 1 - negative control (saline);

группа 2 - положительный контроль, образец мазка, содержащий SARS-CoV-2;group 2 - positive control, swab sample containing SARS-CoV-2;

группа 3 - композиция (i);group 3 - composition (i);

группа 4 - композиция (ii);group 4 - composition (ii);

группа 5 - РНКаза (1 ед./мкл).group 5 - RNase (1 unit/µl).

В носовую полость животным в группе 1 закапывали 20 мкл физиологического раствора, животным группы 3 и 4 вводили по 20 мкл композиций (i) и (ii) соответственно, животным группы 5 вводили по 20 мкл РНКазы (1 ед/мкл). Через 1 ч всем животным (кроме группы 1) вводили по 20 мкл биологического материала, позитивного по SARS-CoV-2 с вирусной нагрузкой - Ct 20. Далее через 1 ч у всех животных был сделан забор образцов из носовой полости, как описано в [14]. Все полученные образцы анализировали методом ПЦР с набором реагентов ДНК-Технология SARS-CoV-2/SARS-CoV [15]. Результаты экспериментов представлены в табл. 3.Animals in group 1 were instilled with 20 µl of physiological saline into the nasal cavity, animals of groups 3 and 4 were injected with 20 µl of compositions (i) and (ii), respectively, animals of group 5 were injected with 20 µl of RNase (1 unit/µl). After 1 hour, all animals (except group 1) were injected with 20 μl of biological material positive for SARS-CoV-2 with a viral load of Ct 20. Then, after 1 hour, samples were taken from the nasal cavity in all animals, as described in [ 14]. All obtained samples were analyzed by PCR with a set of reagents DNA-Technology SARS-CoV-2/SARS-CoV [15]. The results of the experiments are presented in table. 3.

Таблица 3Table 3

Изучение действия in vivo композиции (i) и (ii) на ингибирование РНК SARS-CoV-2 количественным ПЦР методом с помощью гибридизационно-флуоресцентной детекцииStudy of the in vivo effect of compositions (i) and (ii) on the inhibition of SARS-CoV-2 RNA by a quantitative PCR method using hybridization-fluorescence detection

Группа 1 отрицательн ый контроль Group 1 negative control Группа 2 положительный контроль Group 2 positive control Группа 3 композиция (0 Group 3 composition (0 Группа 4 композиц ия (ii) Group 4 composition (ii) Группа 5 РНКаза Group 5 RNase Пороговы й цикл (Ct) Threshold cycle (Ct) Кролик 1 Rabbit 1 25 25 — — — — 26 26 Кролик 2 Rabbit 2 — — 27 27 — — — — 26 26 Кролик 3 Rabbit 3 — — 24 24 — — — — 24 24 Кролик 4 Rabbit 4 — — 28 28 — — — — 28 28 Кролик 5 Rabbit 5 — — 27 27 — — — — 30 thirty Среднее значение Ct. Average Ct. - - 26 26 - - - - 27 27

Как видно из табл. 3, при введении животным композиций (i) - группа 3 и композиций (ii) - группа 4, РНК SARS-CoV-2 не обнаруживается. В то же время в группе 2 и группе 5 среднее значение Ct 26-27 практически не меняется.As can be seen from Table. 3, when compositions (i) - group 3 and compositions (ii) - group 4 are administered to animals, SARS-CoV-2 RNA is not detected. At the same time, in group 2 and group 5, the average value of Ct 26-27 practically does not change.

Результаты свидетельствуют о том, что под действием композиций (i) и (ii) происходит расщепление РНК вируса SARS-CoV-2, тогда как свободная РНКаза практически не действует в условиях in vivo.The results indicate that under the action of compositions (i) and (ii) the RNA of the SARS-CoV-2 virus is cleaved, while free RNase practically does not work in vivo.

Действие композиций (i) и (ii) in vivo исследовалось также методом гель-электрофореза (фиг. 2) [16].The effect of compositions (i) and (ii) in vivo was also studied by gel electrophoresis (Fig. 2) [16].

Фиг. 2. Гель-электрофорез в 3% агарозном геле [16].Fig. 2. Gel electrophoresis in 3% agarose gel [16].

Группа 1 - отрицательный контроль (физиологический раствор).Group 1 - negative control (saline).

Группа 2 - положительный контроль, образец мазка, содержащий SARS-CoV-2.Group 2 - positive control, swab sample containing SARS-CoV-2.

Группа 3 - композиция (i).Group 3 - composition (i).

Группа 4 - композиция (ii).Group 4 - composition (ii).

Группа 5 - РНКаза (1 ед./мкл).Group 5 - RNase (1 unit/µl).

Как видно из фиг. 2, в контрольных образцах (исходный K+ - группа 2) имеется фрагмент N гена COVID-19, тогда как под действием композиций (i) и (ii) (гр. 3 и 4) происходит разрушение N гена вируса SARS-CoV-2.As can be seen from FIG. 2, in the control samples (initial K+ - group 2) there is a fragment of the N gene of COVID-19, while under the action of compositions (i) and (ii) (gr. 3 and 4) the N gene of the SARS-CoV-2 virus is destroyed.

Свободная РНКаза (гр. 5) не расщепляет РНК коронавируса in vivo (табл. 3 и гр. 5).Free RNase (gr. 5) does not cleave coronavirus RNA in vivo (Table 3 and gr. 5).

Пример 6. Стабильность липосом с РНКазой (композиция (i)).Example 6 Stability of Liposomes with RNase (composition (i)).

Для определения стабильности композицию (i) инкубировали при 36°C в течение различных интервалов времени от 1 до 6 ч (табл. 4). Затем к каждому образцу композиции (i) добавляли биологическийTo determine the stability of the composition (i) were incubated at 36°C for various time intervals from 1 to 6 hours (table. 4). Then to each sample of the composition (i) was added biological

- 4 042253 материл с коронавирусной инфекцией SARS-CoV-2 и вновь инкубировали при 36°C 1 ч. Эксперимент проводили, как описано в примере 4. Выделение РНК и выявление вируса SARS-CoV-2 проводили по стандартному методу с помощью сертифицированных наборов реагентов ДНК-Технология [15]. Эксперимент проводили в 5 повторах.- 4 042253 material with SARS-CoV-2 coronavirus infection and again incubated at 36°C for 1 hour. The experiment was carried out as described in example 4. RNA isolation and detection of the SARS-CoV-2 virus were performed according to the standard method using certified reagent kits DNA Technology [15]. The experiment was carried out in 5 repetitions.

В табл. 4 приведены данные по изучению стабильности липосом с РНКазой- композиция (i) методом RT-ПЦР.In table. 4 shows data on the study of the stability of liposomes with RNase composition (i) by RT-PCR.

Таблица 4Table 4

Исследование стабильности липосом сStudy of the stability of liposomes with

РНКазой- композиция (i) методом RT-ПЦРRNase composition (i) by RT-PCR

Положительный контроль (+) COVID-19 Positive control (+) COVID-19 Композиция (Ϊ) Composition (Ϊ) 1 ч 1 hour 2ч 2h 3 ч 3 h 6ч 6h Пороговый цикл (Ct) Threshold Cycle (Ct) 20 20 30 thirty 25 25 27 27 25 25 20 20 30 thirty 28 28 27 27 28 28 18 18 23 23 31 31 28 28 26 26 19 19 24 24 22 22 27 27 27 27 Среднее значение Ct. Average Ct. 19 19 27 27 26.5 26.5 27 27 26.5 26.5

Из приведенной таблицы видно, что под действием композиции (i) пороговый цикл (Ct) смещается на 8 циклов, что свидетельствует о том, что вирусная нагрузка уменьшается примерно в 10³ раз. При этом установлено, что среднее значение порогового цикла (Ct) при ПЦР с липосомами, содержащими РНКазу (композиция (i)), практически не меняется в интервале времени от 1 до 6 ч, что свидетельствует о стабильности липосом, содержащих РНКазу (композиция (i)) в течение 6 ч.From the above table it can be seen that under the action of composition (i) the threshold cycle (Ct) is shifted by 8 cycles, which indicates that the viral load is reduced by about 10 ³ times. It was found that the average value of the threshold cycle (Ct) during PCR with RNase-containing liposomes (composition (i)), practically does not change in the time interval from 1 to 6 h, which indicates the stability of RNase-containing liposomes (composition (i )) within 6 hours.

Пример 7. Стабильность липосом с РНКазой и никлозамидом (композиция (ii)).Example 7 Stability of Liposomes with RNase and Niclosamide (Composition (ii)).

Для определения стабильности композицию (ii) инкубировали при 36°C в течение различных интервалов времени от 1 до 6 ч (табл. 5). Затем к каждому образцу композиции (ii) добавляли биологический материл с коронавирусной инфекцией SARS-CoV-2 и вновь инкубировали при 36°C 1 ч. Эксперимент проводили, как описано в примере 4. Выделение РНК и выявление вируса SARS-CoV-2 проводили по стандартному методу с помощью сертифицированных наборов реагентов ДНК-Технология [15].To determine the stability of the composition (ii) were incubated at 36°C for various time intervals from 1 to 6 hours (table. 5). Then, biological material with SARS-CoV-2 coronavirus infection was added to each sample of composition (ii) and again incubated at 36°C for 1 hour. The experiment was carried out as described in example 4. RNA isolation and detection of the SARS-CoV-2 virus were standard method using certified DNA-Technology reagent kits [15].

Таблица 5 Исследование стабильности липосом с РНКазой и _____никлозамидом (композиция (ii)) методом RT-ПЦР_____Table 5 Stability study of liposomes with RNase and _____niclosamide (composition (ii)) by RT-PCR_____

Положительный контроль (+) Positive control (+) Композиция (и) Composition(s) 1 ч 1 hour 2ч 2h 3 ч 3 h 6 ч 6 h Пороговый цикл (Ct) Threshold Cycle (Ct) 21 21 26 26 25 25 27 27 25 25 18 18 27 27 26 26 25 25 30 thirty 18 18 30 thirty 30 thirty 26 26 27 27 19 19 25 25 24 24 27 27 27 27 Средний Ct. Middle Ct. 19 19 27 27 26 26 26 26 26.5 26.5

Как видно из табл. 5, под действием композиции (ii) пороговый цикл (Ct) смещается на 8 циклов, что свидетельствует о том, что вирусная нагрузка уменьшается примерно в 10³ раз. При этом установлено, что среднее значение порогового цикла (Ct) при ПЦР практически не меняется в интервале времени от 1 до 6 ч, что свидетельствует о стабильности липосом, содержащих РНКазу и никлозамид (композиция (ii)) в течение 6 ч.As can be seen from Table. 5, under the action of composition (ii) the threshold cycle (Ct) is shifted by 8 cycles, which indicates that the viral load is reduced by about 10 ³ times. At the same time, it was found that the average value of the threshold cycle (Ct) during PCR practically does not change in the time interval from 1 to 6 hours, which indicates the stability of liposomes containing RNase and niclosamide (composition (ii)) for 6 hours.

Пример 8. Исследование безопасности и токсичности композиций (i) и (ii) на животных in vivo (кролики и мыши), а также на культурах клеток (фибробласты и гепатоциты) in vitro.Example 8 Safety and toxicity study of compositions (i) and (ii) in animals in vivo (rabbits and mice) and in cell cultures (fibroblasts and hepatocytes) in vitro.

Клетки фибробластов были получены нами по методу [17]. Гепатоциты печени крысы получены по методу [18].Fibroblast cells were obtained by us according to the method [17]. Rat liver hepatocytes were obtained according to the method [18].

Цитотоксические свойства композиций (i) и (ii) определяли методом МТТ in vitro [19]. Данные представлены в виде среднего значения (из 3 экспериментов). Цитотоксический эффект каждого из исследуемых образцов композиций сравнивали с контролем цитостатиком Цисплатин (Teva Pharmaceutical Industries, Ltd., Израиль).The cytotoxic properties of compositions (i) and (ii) were determined by the in vitro MTT method [19]. Data are presented as mean value (from 3 experiments). The cytotoxic effect of each of the studied samples of the compositions was compared with the control cytostatic Cysplatin (Teva Pharmaceutical Industries, Ltd., Israel).

- 5 042253- 5 042253

Таблица 6Table 6

Цитотоксичность композиций на клеточной культуре фибробластовCytotoxicity of Compositions on Fibroblast Cell Culture

Образцы Samples Концентрация, Подавление роста клеток (%) Concentration, Cell Growth Inhibition (%) 10 мкг/мл 10 µg/ml 100 мкг/мл 100 µg/ml 1 мг/мл 1 mg/ml 10 мг/мл 10 mg/ml Липосомы с РНКазой (композиция (i)) Liposomes with RNase (composition (i)) 0,0±0,0 0.0±0.0 0,0±0,0 0.0±0.0 2,3±0,4 2.3±0.4 5,4±0,6 5.4±0.6 Липосомы с РНКаза с никлозамидом (композиция (ϋ)) Liposomes with RNase with niclosamide (composition (ϋ)) 0,0±0,0 0.0±0.0 0,0±0,0 0.0±0.0 3,2±0,5 3.2±0.5 8,6±0,3 8.6±0.3 РНКаза в физиологическим растворе RNase in saline 0,0±0,0 0.0±0.0 0,0±0,0 0.0±0.0 0_?5±0,10 _? 5±0.1 1,2±0,1 1.2±0.1 Цисплатин Cisplatin 10^2,1 10^2.1 51,2^1,5 51.2^1.5 100,0^0,0 100.0^0.0 100,0^0,0 100.0^0.0

Таблица 7Table 7

Цитотоксичность композиций на гепатоцитах_______Cytotoxicity of compositions on hepatocytes _______

Образцы Samples Концентрация, Подавление роста клеток (%) Concentration, Cell Growth Inhibition (%) 10 мкг/мл 10 µg/ml 100 мкг/мл 100 µg/ml 1 мг/мл 1 mg/ml 10 мг/мл 10 mg/ml Липосомы с РНКазой (композиция i) Liposomes with RNase (composition i) 0,0±0,0 0.0±0.0 0,0±0,0 0.0±0.0 1,3±0,3 1.3±0.3 3,4±0,6 3.4±0.6 Липосомы с РНКаза с никлозамидом (композиция ii) Liposomes with RNase with niclosamide (composition ii) 0,0±0,0 0.0±0.0 0,0±0,0 0.0±0.0 1,7±0,4 1.7±0.4 4,2±0,3 4.2±0.3 РНКаза в физиологическим растворе . RNase in saline. 0,0±0,0 0.0±0.0 0,0±0,0 0.0±0.0 0,3±0,1 0.3±0.1 0,8±0,2 0.8±0.2 Цисплатин Cisplatin 14,1^0,7 14.1^0.7 18,3^1,6 18.3^1.6 37,8±О,3 37.8±0.3

Как видно из полученных данных (табл. 6 и 7), в диапазоне концентраций 10-100 мкг/мл образцы не подавляли рост нормальных клеток по сравнению с препаратом сравнения (цисплатин). Таким образом, композиции (i) и (ii) не обладают цитотоксическим эффектом для нормальных клеток.As can be seen from the obtained data (Tables 6 and 7), in the concentration range of 10-100 μg/ml, the samples did not inhibit the growth of normal cells compared to the reference drug (cisplatin). Thus, compositions (i) and (ii) do not have a cytotoxic effect on normal cells.

Пример 9. Изучение общей токсичности композиций на кроликах и мышах in vivo.Example 9 An in vivo study of the general toxicity of compositions in rabbits and mice.

Исследования проводили in vivo на 4 группах животных по 5 кроликов (породы Великан, массой 1,6-1,8 кг) и беспородных мышей (массой 18-20 г) по 10 мышей в группе. Исследуемые композиции закапывали в глаза животных 2 раза в день (утром и вечером) по 50 мкл физиологического раствора в правый глаз - контроль, а в левый глаз 50 мкл - композиция - (i) и (ii) в течение 5 дней.The studies were carried out in vivo on 4 groups of animals, 5 rabbits each (Giant breed, weighing 1.6-1.8 kg) and outbred mice (weighing 18-20 g), 10 mice per group. The studied compositions were instilled into the eyes of the animals 2 times a day (morning and evening), 50 μl of saline in the right eye - control, and in the left eye 50 μl - composition - (i) and (ii) for 5 days.

Первая группа - контроль (физиологический раствор).The first group - control (physiological solution).

Вторая группа - липосомы из соевого лецитина.The second group is liposomes from soy lecithin.

Третья группа - липосомы из соевого лецитина с РНКазой (композиция (i)).The third group - liposomes from soy lecithin with RNase (composition (i)).

Четвертая группа - липосомы из соевого лецитина с РНКазой и с никлозамидом (композиция (ii)).The fourth group - liposomes from soy lecithin with RNase and niclosamide (composition (ii)).

Параллельно в каждой группе кроликов вводили интраназально по 20 мкл испытуемых образцов в каждую ноздрю.In parallel, in each group of rabbits, 20 μl of the test samples were injected intranasally into each nostril.

Через 5 дней введения вышеперечисленных растворов определяли визуальные изменения, происходящие в глазах кроликов, и общее состояние животных, а также снимали биохимические показатели крови животных (мышей и кроликов) по методу [20]. Визуальное наблюдение показало, что самочувствие экспериментальных и контрольной групп животных было одинаковым.After 5 days of administration of the above solutions, the visual changes occurring in the eyes of rabbits and the general condition of the animals were determined, and the biochemical parameters of the blood of animals (mice and rabbits) were taken according to the method [20]. Visual observation showed that the state of health of the experimental and control groups of animals was the same.

В табл. 8 и 9 приведены биохимические показатели исследованных животных.In table. 8 and 9 show the biochemical parameters of the studied animals.

Таблица 8Table 8

Биохимические показатели крови экспериментальных животных (кролики)Biochemical parameters of blood of experimental animals (rabbits)

Образцы Samples ВП VP LDG LDG ALT ALT T-Prot T Prot AST AST Choi Choi TG TG Glu Glu СК SC мг/дл mg/dl МЕ/л Chalk МЕ/л Chalk г/л g/l МЕ/л Chalk мг/дл mg/dl мг/дл mg/dl мг/дл mg/dl МЕ/л Chalk Липосома из соевого лецитина Soy lecithin liposome 0,42 ± 0,09 0.42 ± 0.09 156,8 ±1,2 156.8±1.2 28,2 ± 2,4 28.2 ± 2.4 58,0 ±3,1 58.0±3.1 15,0 ±0,4 15.0±0.4 37,5 ±0,2 37.5±0.2 125,7 ±1,6 125.7±1.6 И 5,7 ±6,6 and 5.7±6.6 152,5 ±5,3 152.5±5.3 Липосомы с РНКазой (композиция (i)) Liposomes with RNase (composition (i)) 0,34 ± 0,05 0.34±0.05 143,7 ± 4,0 143.7 ± 4.0 40,3 ± 3,0 40.3±3.0 58,6 ±1,9 58.6±1.9 16,7 ±0,9 16.7±0.9 36,2 ±0,8 36.2±0.8 132,6 ±2,9 132.6±2.9 127,9 ±8,1 127.9±8.1 165,3 ±1,7 165.3±1.7 Липосомы с РНКаза с никлозамидом (композиция (и)) Liposomes with RNase with niclosamide (composition(s)) 0,41 ± 0,03 0.41 ± 0.03 148,9 ±2,5 148.9±2.5 37,8 ± 3,6 37.8 ± 3.6 60,5 ±1,8 60.5±1.8 15,7 ±0,6 15.7±0.6 41,7 ± 0,6 41.7±0.6 128,2 ± 5,4 128.2±5.4 202,2 ± 0,4 202.2±0.4 180,7 ±3,4 180.7±3.4 РНКаза в физиологическом растворе RNase in physiological saline 0,37± 0,02 0.37 ± 0.02 154,1 ± 1,5 154.1±1.5 39,9 ±7,2 39.9±7.2 62,0 ±0,9 62.0±0.9 18,2 ±1,1 18.2±1.1 41,6 ±1,4 41.6±1.4 124,4 ±7,8 124.4±7.8 118,3 ±0,8 118.3±0.8 186,5 ±4,1 186.5±4.1 Контроль Control 0,40 ± 0,00 0.40±0.00 155,7 ±3,6 155.7±3.6 30,5 ± 1,4 30.5±1.4 60,3 ± 4,1 60.3 ± 4.1 20,1 ±1,7 20.1±1.7 37,2 ± 0,6 37.2±0.6 128,8 ±7,9 128.8±7.9 160±3,3 160±3.3 151,6± 1,5 151.6± 1.5

- 6 042253- 6 042253

Таблица 9Table 9

Биохимические показатели крови экспериментальных животных (мыши)Biochemical parameters of blood of experimental animals (mice)

Образцы Samples Tbil Tbil Dbil Dbil ALT ALT ALP ALP AST AST Choi Choi ТР TR Glu Glu Urea Urea мкМ/л µM/l сд/л sd/l мг/дл mg/dl г/дл g/dl мМ/л mm/l Липосома из соевого лецитина Soy lecithin liposome 28,6^0,5 28.6^0.5 14,6т0,2 14.6t0.2 58,2т0,4 58.2t0.4 440,0±0,1 440.0±0.1 295,ОТО,4 295, OTO, 4 62,5Т0,2 62.5Т0.2 117,7ТО,6 117.7TO.6 4Д±0,6 4D±0.6 38,5т0,3 38.5t0.3 Липосомы с РНКазой (композиция (i)) Liposomes with RNase (composition (i)) 30,0т0,4 30.0t0.4 13,ОТО,4 13, OTO, 4 61,7^0,6 61.7^0.6 438,7ТО,4 438.7TO.4 298,ОТО, 1 298, OTO, 1 60,5т0,1 60.5t0.1 106,7±0,4 106.7±0.4 4,5т 0,3 4.5t 0.3 38,5ТО,2 38.5TO.2 Липосомы с РНКаза с никлозамидом (композиция (ii)) Liposomes with RNase with niclosamide (composition (ii)) 31,2тОД 31.2tOD 14ДТ0Д 14DT0D 59,ЗтОД 59,ZtOD 427,6Т0,3 427.6Т0.3 ЗОО,7ТО,2 ZOO,7TO,2 66,2Т0,0 66.2Т0.0 109,6±0,2 109.6±0.2 4,ЗТО,4 4, ZTO, 4 39,8Т0,3 39.8Т0.3 РНКаза в физиологическом растворе RNase in saline 29,9±0,2 29.9±0.2 14ДТ0,5 14DT0.5 62,9±0,2 62.9±0.2 442,ОТО,2 442, OTO, 2 299,2ТО,3 299.2TO.3 63,6±0,4 63.6±0.4 114,8Т0Д 114.8T0D 3,9т0,3 3.9t0.3 36,5ТО,1 36,5TO,1 Контроль Control 31,8±0Д 31.8±0D 15,7±0,3 15.7±0.3 62,5±О,4 62.5±0.4 443,ЭТО, 1 443 IT 1 301.7Т0Д 301.7T0D 65,ЗТОД 65,ZTOD 118,8±0,2 118.8±0.2 4,5Т0,3 4.5Т0.3 39,б±0Д 39,b±0D

Как видно из полученных данных (табл. 8 и 9), значения основных показателей крови практически не отличаются от контрольных, что свидетельствует о не токсичности композиций (i) и (ii) на животных.As can be seen from the data obtained (Tables 8 and 9), the values of the main blood parameters practically do not differ from the control ones, which indicates the non-toxicity of compositions (i) and (ii) in animals.

Пример 10. Биомикроскопическое исследование слизистых глаз экспериментальных животных (кролики).Example 10. Biomicroscopic examination of the mucous membranes of the eyes of experimental animals (rabbits).

Действие липосом, содержащих композиции (i) и (ii) на слизистые, было изучено путем исследования динамического контроля глаз кроликов.The action of liposomes containing compositions (i) and (ii) on mucous membranes was studied by studying the dynamic control of the eyes of rabbits.

В ходе эксперимента проводился динамический контроль состояния глаз (офтальмологический статус) кроликов методом биомикроскопии. Биомикроскопическое исследование осуществляли при помощи офтальмологического биомикроскопа - щелевой лампы SL 115 фирмы Carl Zeiss (Германия) при увеличении в 10 и 16 раз ежедневно в течение всего срока наблюдения. Оценивали состояние конъюнктивы, склеры, роговицы, передней камеры, радужки и рефлекс с глазного дна. Различные степени увеличения (х 10, х 16) при биомикроскопии позволяли более детально изучить состояние структур переднего сегмента глаза.During the experiment, dynamic monitoring of the condition of the eyes (ophthalmological status) of rabbits was carried out by biomicroscopy. Biomicroscopic examination was carried out using an ophthalmic biomicroscope - slit lamp SL 115 from Carl Zeiss (Germany) at a magnification of 10 and 16 times daily during the entire observation period. The state of the conjunctiva, sclera, cornea, anterior chamber, iris, and fundus reflex were assessed. Various degrees of magnification (x 10, x 16) during biomicroscopy made it possible to study in more detail the state of the structures of the anterior segment of the eye.

Перед проведением биомикроскопических исследований всех кроликов туго пеленали, голову плотно фиксировали за щелевой лампой.Before biomicroscopic studies, all rabbits were tightly swaddled, the head was tightly fixed behind a slit lamp.

В ходе проведения биомикроскопических исследований парные глаза кроликов были приняты за норму и использовались в качестве контроля в ходе экспериментов.In the course of biomicroscopic studies, paired eyes of rabbits were taken as normal and used as a control during the experiments.

Первая проверка проводилась через сутки после закапывания композиций (i) и (ii) и липосом из соевого лецитина.The first test was carried out one day after the instillation of compositions (i) and (ii) and soy lecithin liposomes.

При осмотре методом биомикроскопии отмечалось, что глаза были спокойны без отделяемого, роговица прозрачная и гладкая, конъюнктива век бледно-розовая и блестящая, склера белая без инъекции сосудов. Влага передней камеры также была прозрачной без примеси каких-либо элементов. Радужка рельефна, зрачок круглый, реакция на свет живая. Оптические среды на всех глазах оставались прозрачными, рефлекс с глазного дна был розовый. Признаков воспаления и токсико-аллергической реакции выявлено не было.When examined by biomicroscopy, it was noted that the eyes were calm without discharge, the cornea was transparent and smooth, the conjunctiva of the eyelids was pale pink and shiny, the sclera was white without vascular injection. The moisture of the anterior chamber was also transparent without admixture of any elements. The iris is embossed, the pupil is round, the reaction to light is lively. The optical media in all eyes remained transparent, the reflex from the fundus was pink. There were no signs of inflammation or toxic-allergic reaction.

За весь период наблюдения у всех кроликов офтальмологический статус обоих глаз был идентичным без клинических признаков воспалительных и аллергических реакций.During the entire observation period, in all rabbits, the ophthalmological status of both eyes was identical without clinical signs of inflammatory and allergic reactions.

Эти данные свидетельствуют о том, что композиции (i) и (ii) не токсичны для глаз кроликов.These data indicate that compositions (i) and (ii) are not toxic to rabbit eyes.

- 7 042253- 7 042253

ЛитератураLiterature

1. Патент RU 2746362 (заявка 2021106335 от 11.03.2021) «Комбинированное лекарственное средство, обладающее противовирусным эффектом в отношении нового коронавируса SARS-CoV-2».1. Patent RU 2746362 (application 2021106335 dated March 11, 2021) "Combined drug with antiviral effect against the new coronavirus SARS-CoV-2".

2. О. Н. Ильинская, Р. Шах Махмуд. РИБОНУКЛЕАЗЫ КАК ПРОТИВОВИРУСНЫЕ АГЕНТЫ // МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, №5, с. 707-717.2. O. N. Ilyinskaya, R. Shah Mahmud. RIBONUCLEASES AS ANTIVIRAL AGENTS // MOLECULAR BIOLOGY, 2014, vol. 48, no. 5, p. 707-717.

3. Wu С, Jan J, et int., and Hsu JTA. Inhibition of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Replication by Niclosamide. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2004. doi.org/10.1128/aac.48.7.2693-2696.2004.3. Wu C, Jan J, et int., and Hsu JTA. Inhibition of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Replication by Niclosamide. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2004. doi.org/10.1128/aac.48.7.2693-2696.2004.

4. Ashlee D. Bmnaugh, Hyojong Seo, Zachary Wamken, Li Ding, Sang Heui Seo, Hugh D. C. Smyth. Development and evaluation of inhalable composite niclosamide-lysozyme particles: A broad-spectrum, patient-adaptable treatment for coronavirus infections and sequalae. Published: February 11, 2021 doi. org/10.1371 /j oumal .pone.0246803.4. Ashlee D. Bmnaugh, Hyojong Seo, Zachary Wamken, Li Ding, Sang Heui Seo, Hugh D. C. Smyth. Development and evaluation of inhalable composite niclosamide-lysozyme particles: A broad-spectrum, patient-adaptable treatment for coronavirus infections and sequalae. Published: February 11, 2021 doi. org/10.1371/j oumal.pone.0246803.

5. http://www.pmewswire.com/news-releases/hyundai-bioscienceannounced-that-its-covid-19-oral-drug-solved-niclosamides-inhibitorvconcentration-problem-3 01188126.html.5. http://www.pmewswire.com/news-releases/hyundai-bioscienceannounced-that-its-covid-19-oral-drug-solved-niclosamides-inhibitorvconcentration-problem-3 01188126.html.

6. ANA Therapeutics Begins Phase 2/3 Clinical Trial of Proprietary Oral Niclosamide Formulation to Treat COVID-19. Study is first in U.S. to test safety and efficacy of niclosamide as an antiviral for COVID-19. October 26, 2020 08:44 AM Eastern Daylight Time. .6. ANA Therapeutics Begins Phase 2/3 Clinical Trial of Proprietary Oral Niclosamide Formulation to Treat COVID-19. Study is first in U.S. to test safety and efficacy of niclosamide as an antiviral for COVID-19. October 26, 2020 08:44 AM Eastern Daylight Time. .

7. Liposomes with a large trapping capacity prepared by freezing and thawing of sonicated phospholipid mixtures. Archives of Biochemistry and Biophysics, 212(1), 186-194. doi: 10.1016/0003-9861(81)90358-1 (https://doi.org/10.1016/0003-9861(81)90358-l)7. Liposomes with a large trapping capacity prepared by freezing and thawing of sonicated phospholipid mixtures. Archives of Biochemistry and Biophysics, 212(1), 186-194. doi: 10.1016/0003-9861(81)90358-1 (https://doi.org/10.1016/0003-9861(81)90358-l)

8. Прохорова М.И. Методы биохимических исследований (Липидный и энергетический обмен). Учебное пособие. Ленинград 1982.8. Prokhorova M.I. Methods of biochemical research (Lipid and energy metabolism). Tutorial. Leningrad 1982.

9. Sergio С. Oliveira, Mariana T.Q. de Magalhaes and E. Jane Homan.9. Sergio C. Oliveira, Mariana T.Q. de Magalhaes and E. Jane Homan.

Immunoinformatic Analysis of SARS-CoV-2 Nucleocapsid Protein and Identification of COVID-19 Vaccine Targets. 2020. Front. Immunol. 11: 587615. https://doi.org/lQ.3389/fimmu.2020.587615.Immunoinformatic Analysis of SARS-CoV-2 Nucleocapsid Protein and Identification of COVID-19 Vaccine Targets. 2020 Front. Immunol. 11: 587615. https://doi.org/lQ.3389/fimmu.2020.587615.

10. Kim TW, Lee JH, Hung CF, Peng S, Roden R, Wang MC, Viscidi R, Tsai YC, He L, Chen PJ, Boyd DA, Wu TC. Generation and Characterization of DNA Vaccines Targeting the Nucleocapsid Protein of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus. 2004. J Virol. https://doi.Org/10.l 128/JVI.78.9.46384645.2004.10. Kim TW, Lee JH, Hung CF, Peng S, Roden R, Wang MC, Viscidi R, Tsai YC, He L, Chen PJ, Boyd DA, Wu TC. Generation and Characterization of DNA Vaccines Targeting the Nucleocapsid Protein of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus. 2004. J Virol. https://doi.org/10.l 128/JVI.78.9.46384645.2004.

11. Ya Peng, Ning Du, Yuqing Lei, Sonam Dorje, Jianxun Qi, Tingrong Luo, George F Gao, Hao Song. Structures of the SARS-CoV-2 nucleocapsid and their perspectives fordrug design. The EMBO Journal (2020) 39: e 105938.11. Ya Peng, Ning Du, Yuqing Lei, Sonam Dorje, Jianxun Qi, Tingrong Luo, George F Gao, Hao Song. Structures of the SARS-CoV-2 nucleocapsid and their perspectives for other design. The EMBO Journal (2020) 39: e 105938.

12. DEPARTMENT OF HEALTH & HUMAN SERVICES Public Health Service Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Atlanta, GA 3033324, Jan 2020.12. DEPARTMENT OF HEALTH & HUMAN SERVICES Public Health Service Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Atlanta, GA 3033324, Jan 2020.

13. Advances in the Synthesis of Oligonucleotides by the Phosphoramidite Approach. Твёрдофазный амидофосфитный метод или фосфорамидитный метод. Beaucage S. L., Iyer R. Р. (англ.) // Tetrahedron. 1992. Vol. 48, no. 12, P. 2223-2311. doi: 10.1016/S0040-4020(01)88752-4.13. Advances in the Synthesis of Oligonucleotides by the Phosphoramidite Approach. Solid-phase amidophosphite method or phosphoramidite method. Beaucage S. L., Iyer R. R. (English) // Tetrahedron. 1992 Vol. 48, no. 12, P. 2223-2311. doi: 10.1016/S0040-4020(01)88752-4.

14. Лабораторное тестирование случаев, подозреваемых на коронавирусную инфекцию (COVID-19). 19 марта 2020 г, ВОЗ.14. Laboratory testing of suspected cases of coronavirus infection (COVID-19). March 19, 2020, WHO.

15. ООО «НПО ДНК-Технология». Инструкция по применению набора реагентов для выявления РНК коронавирусов SARS-CoV-2 и подобных SARS-CoV методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени SARS-CoV-2/SARS-CoV.15. NPO DNA-Technology LLC. Instructions for use of the kit for the detection of SARS-CoV-2 and similar SARS-CoV RNA coronaviruses by reverse transcription and real-time polymerase chain reaction SARS-CoV-2/SARS-CoV.

16. Green M.R., Sambrook J. Molecular cloning. A laboratory manual.16. Green M.R., Sambrook J. Molecular cloning. A laboratory manual.

Fourth edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2012.Fourth edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2012.

17. Khan M., Gasser S. Generating primary fibroblast cultures from mouse Ear and Tissues / Journal of Visualized Experiment. 1/10/2016.17. Khan M., Gasser S. Generating primary fibroblast cultures from mouse Ear and Tissues / Journal of Visualized Experiment. 1/10/2016.

18. Cabral, F., Miller, C.M., Kudma, K.M., Hass, B.E., Daubendiek, J.G., Kellar, B.M., Harris, E.N. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments. 2/12/2018.18. Cabral, F., Miller, C.M., Kudma, K.M., Hass, B.E., Daubendiek, J.G., Kellar, B.M., Harris, E.N. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments. 2/12/2018.

19. Niks M., Otto M. Towards an optimized MTT assay// Journal of Immunological Methods, 1990,130, p.149-15119. Niks M., Otto M. Towards an optimized MTT assay// Journal of Immunological Methods, 1990,130, p.149-151

20. Дерюгина A.B., Корягин А. С., Копылова С. В., Таламанова Μ. H. // Методы изучения стрессовых и адаптационных реакций организма по показателям системы крови. Нижний Новгород - 2010. - стр. 11.20. Deryugina A.V., Koryagin A.S., Kopylova S.V., Talamanova M. H. // Methods for studying stress and adaptive reactions of the organism in terms of blood system parameters. Nizhny Novgorod - 2010. - p. 11.

Claims (5)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM 1. Применение лекарственного средства, содержащего в липосоме эффективное количество молекул РНКазы А с никлозамидом, для профилактики или лечения коронавирусной инфекции, вызываемой SARS-CoV-2.1. The use of a drug containing in a liposome an effective amount of RNase A molecules with niclosamide for the prevention or treatment of coronavirus infection caused by SARS-CoV-2. 2. Применение по п.1, в котором липосома получена на основе фосфолипидов из соевого лецитина или фосфолипидов животного происхождения.2. Use according to claim 1, wherein the liposome is based on phospholipids from soy lecithin or phospholipids of animal origin. 3. Применение по пп.1 и 2 для интраназального или ингаляционного введения.3. Use according to claims 1 and 2 for intranasal or inhalation administration. 4. Способ профилактики или лечения SARS-CoV-2 инфекции, в котором вводятся молекулы РНКазы А с никлозамидом, содержащиеся в эффективном количестве в липосомах.4. A method for preventing or treating SARS-CoV-2 infection, which introduces RNase A molecules with niclosamide contained in an effective amount in liposomes. 5. Способ по п.4, в котором липосомы лекарственного средства получают на основе фосфолипидов из соевого лецитина или фосфолипидов животного происхождения.5. The method of claim 4, wherein the drug liposomes are derived from phospholipids from soy lecithin or phospholipids from animal origin.