EA042163B1

EA042163B1 - GLUCAGON DERIVATIVE, GLUCAGON-BASED CONJUGATE, COMPOSITION CONTAINING THEM AND THEIR THERAPEUTIC APPLICATION

Info

Publication number: EA042163B1
Application number: EA201990011
Authority: EA
Inventors: Чон Гук КИМ; Юн Джин Пак; Ин Юнг ЧОЙ; Сун Юб Чун
Original assignee: Ханми Фарм. Ко., Лтд.
Priority date: 2016-06-29
Filing date: 2017-06-29
Publication date: 2023-01-20

Description

Область техникиTechnical field

Изобретение относится к производному глюкагона, конъюгату на его основе и содержащей их композиции, а также их применению, в частности, их терапевтическому применению в отношении метаболического синдрома, гипогликемии и врожденного гиперинсулинизма.The invention relates to a derivative of glucagon, a conjugate based on it and compositions containing them, as well as their use, in particular, their therapeutic use in relation to the metabolic syndrome, hypoglycemia and congenital hyperinsulinism.

Предшествующий уровень техникиPrior Art

В связи с наблюдаемым в последнее время экономическим ростом и изменениями привычного рациона питания и т.д. число случаев заболеваний, связанных с метаболическим синдромом, в том числе таких разнообразных заболеваний, как ожирение, гиперлипидемия, гипертензия, артериосклероз, гиперинсулинемия, диабет и заболевания печени, быстро возрастает. Эти заболевания могут возникать независимо, но, как правило, в большинстве случаев они возникают в тесной взаимосвязи друг с другом и сопровождаются различными симптомами.In connection with the recent economic growth and changes in the usual diet, etc. the number of cases of diseases associated with the metabolic syndrome, including such diverse diseases as obesity, hyperlipidemia, hypertension, arteriosclerosis, hyperinsulinemia, diabetes and liver disease, is rapidly increasing. These diseases can occur independently, but, as a rule, in most cases they occur in close relationship with each other and are accompanied by various symptoms.

Избыточный вес и ожирение ответственны за повышение кровяного давления и уровней холестерина и возникновение или усугубление различных заболеваний, таких как болезни сердца, диабет, артрит и так далее. Кроме того, проблема ожирения становится также основной причиной увеличения числа случаев артериосклероза, гипертензии, гиперлипидемии или болезней сердца не только у взрослых, но и у детей или подростков.Overweight and obesity are responsible for the increase in blood pressure and cholesterol levels and the occurrence or aggravation of various diseases such as heart disease, diabetes, arthritis, and so on. In addition, the problem of obesity is also becoming the main reason for the increase in the incidence of arteriosclerosis, hypertension, hyperlipidemia or heart disease, not only in adults, but also in children or adolescents.

Однако лечить ожирение трудно, поскольку оно представляет собой сложное заболевание, связанное с механизмами контроля аппетита и энергетического метаболизма. Соответственно, лечение ожирения требует не только усилий пациентов с ожирением, но и способа, с использованием которого можно лечить аномальные механизмы, связанные с контролем аппетита и энергетическим метаболизмом. Поэтому были предприняты усилия по разработке лекарственных средств для лечения таких аномальных механизмов.However, obesity is difficult to treat because it is a complex disease involving appetite control and energy metabolism mechanisms. Accordingly, the treatment of obesity requires not only the efforts of obese patients, but also a method by which abnormal mechanisms related to appetite control and energy metabolism can be treated. Therefore, efforts have been made to develop drugs to treat such abnormal mechanisms.

В результате этих усилий были разработаны такие лекарственные средства, как Rimonabant® (Sanofi-Aventis), Sibutramin® (Abbott), Contrave® (Takeda), Orlistat® (Roche) и т.д., но их недостатками являются серьезные неблагоприятные эффекты или очень слабые эффекты против ожирения. Например, согласно сообщению, Rimonabant® оказывает побочный эффект в виде нарушений центральной нервной системы, Sibutramine® и Contrave® оказывают сердечно-сосудистые побочные эффекты, и Orlistat® демонстрирует уменьшение массы тела лишь примерно на 4 кг при приеме в течение одного года.As a result of these efforts, drugs such as Rimonabant® (Sanofi-Aventis), Sibutramine® (Abbott), Contrave® (Takeda), Orlistat® (Roche) etc. have been developed, but their disadvantages are serious adverse effects or very weak anti-obesity effects. For example, Rimonabant® is reported to have central nervous system side effects, Sibutramine® and Contrave® have cardiovascular side effects, and Orlistat® only shows a weight loss of about 4 kg when taken for one year.

Что касается глюкагона, то он продуцируется поджелудочной железой, когда уровни глюкозы в крови падают в результате приема других лекарственных средств, или вследствие заболеваний, или дефицита гормонов либо ферментов. Глюкагон посылает сигнал для расщепления гликогена в печени и последующего высвобождения глюкозы и участвует в повышении уровней глюкозы в крови до нормального диапазона. Кроме того, показано, что глюкагон эффективен при лечении гипогликемии. Гипогликемический терапевтический эффект глюкагона является результатом стимуляции деградации гликогена до глюкозы (расщепления гликогена) или усиления выработки глюкозы (биосинтеза глюкозы), происходящей из аминокислот-предшественников, что приводит к увеличению оттока глюкозы из печени.As for glucagon, it is produced by the pancreas when blood glucose levels fall as a result of taking other drugs, or due to diseases, or hormone or enzyme deficiencies. Glucagon sends a signal for the breakdown of glycogen in the liver and subsequent release of glucose and is involved in raising blood glucose levels to the normal range. In addition, glucagon has been shown to be effective in the treatment of hypoglycemia. The hypoglycemic therapeutic effect of glucagon is the result of stimulation of glycogen degradation to glucose (glycogen breakdown) or increased production of glucose (glucose biosynthesis) derived from precursor amino acids, which leads to an increase in the outflow of glucose from the liver.

Помимо эффекта повышения уровней глюкозы в крови глюкагон снижает аппетит и активирует чувствительную к гормонам липазу адипоцитов, способствуя липолизу, и за счет этого оказывает эффект против ожирения. Однако применение глюкагона в качестве терапевтического агента ограничено, поскольку он имеет низкую растворимость и осаждается при нейтральных рН.In addition to the effect of increasing blood glucose levels, glucagon reduces appetite and activates hormone-sensitive adipocyte lipase, promoting lipolysis, and thereby has an anti-obesity effect. However, the use of glucagon as a therapeutic agent is limited because it has low solubility and precipitates at neutral pH.

Соответственно, сам глюкагон с улучшенными свойствами может быть эффективно использован для лечения тяжелой гипогликемии, неалкогольного стеатогепатита (NASH), дислипидемии и т.д. благодаря его активности в расщеплении и β-окислении жиров в печени.Accordingly, improved glucagon itself can be effectively used to treat severe hypoglycemia, non-alcoholic steatohepatitis (NASH), dyslipidemia, and the like. due to its activity in the breakdown and β-oxidation of fats in the liver.

Одно из производных глюкагона, глюкагоноподобный пептид-1 (GLP-1), находится в стадии разработки в качестве терапевтического агента для лечения гипергликемии у пациентов с диабетом. Функции GLP-1 заключаются в стимулировании синтеза и секреции инсулина, ингибировании секреции глюкагона, замедлении опорожнения желудка, усилении утилизации глюкозы и торможения всасывания питательных веществ.One glucagon derivative, glucagon-like peptide-1 (GLP-1), is under development as a therapeutic agent for the treatment of hyperglycemia in diabetic patients. The functions of GLP-1 are to stimulate insulin synthesis and secretion, inhibit glucagon secretion, slow gastric emptying, increase glucose utilization, and inhibit nutrient absorption.

Сообщалось также, что эксендин-4, получаемый из яда ящериц и имеющий гомологию аминокислотной последовательности примерно 50% с GLP-1, активирует рецептор GLP-1, тем самым контролируя гипергликемию у пациентов с диабетом (J. Biol. Chem., 1992, Apr 15, 267(11): 7402-5). Однако сообщается, что лекарственные средства против ожирения, содержащие GLP-1, оказывают такие побочные эффекты, как тошнота и рвота.Exendin-4, derived from lizard venom and having approximately 50% amino acid sequence homology with GLP-1, has also been reported to activate the GLP-1 receptor, thereby controlling hyperglycemia in diabetic patients (J. Biol. Chem., 1992, Apr. 15, 267(11): 7402-5). However, anti-obesity drugs containing GLP-1 are reported to have side effects such as nausea and vomiting.

Поэтому в качестве альтернативы GLP-1 много внимания было уделено оксинтомодулину, который может связываться с рецепторами двух пептидов, GLP-1 и глюкагона. Оксинтомодулин представляет собой пептид, полученный из предшественника глюкагона, пре-глюкагона, и имеет функции торможения всасывания питательных веществ и усиления насыщения подобно GLP-1 и обладает липолитической активностью подобно глюкагону, что повышает его эффективность в терапии, направленной против ожирения.Therefore, as an alternative to GLP-1, much attention has been paid to oxyntomodulin, which can bind to the receptors of two peptides, GLP-1 and glucagon. Oxyntomodulin is a peptide derived from the precursor of glucagon, pre-glucagon, and has the functions of nutrient absorption inhibition and satiety enhancement similar to GLP-1 and has lipolytic activity similar to glucagon, which increases its effectiveness in anti-obesity therapy.

Однако оксинтомодулин или его производные имеют серьезный недостаток, заключающийся в необходимости ежесуточного введения избыточного количества лекарственного средства, поскольку ониHowever, oxyntomodulin or its derivatives have a serious disadvantage, which consists in the need for daily administration of an excess amount of the drug, since they

- 1 042163 имеют низкую эффективность и короткий период полувыведения in vivo. Кроме того, когда в составе одного пептида имеются обе активности, GLP-1 и глюкагона, соотношение этих активностей получается неизменным, и поэтому применение агониста двойного действия с различными соотношениями становится затруднительным. Соответственно, комбинированная терапия, позволяющая использовать различные соотношения активностей путем регулирования содержания GLP-1 и глюкагона, может быть более эффективной. Однако для комбинированной терапии необходимо улучшить физические характеристики глюкагона, который образует агрегаты при нейтральных рН и со временем осаждается, демонстрируя таким образом слабую растворимость.- 1 042163 have low efficacy and a short half-life in vivo. In addition, when both activities of GLP-1 and glucagon are present in the same peptide, the ratio of these activities is unchanged, and therefore the use of a dual-acting agonist with different ratios becomes difficult. Accordingly, a combination therapy that allows different ratios of activities by regulating GLP-1 and glucagon levels may be more effective. However, for combination therapy, it is necessary to improve the physical characteristics of glucagon, which forms aggregates at neutral pH and precipitates over time, thus showing poor solubility.

Что касается врожденного гиперинсулинизма, то он является одной из наиболее общих причин тяжелой и персистирующей гипогликемии у новорожденных и детей. Инсулин представляет собой гормон, который в организме человека регулирует уровень глюкозы в крови. Он участвует в понижении уровней глюкозы в крови, когда уровень глюкозы в крови повышается вследствие всасывания питательных веществ и так далее. Однако, при врожденном гиперинсулинизме инсулин не выполняет такого действия, и поджелудочная железа секретирует инсулин независимо от уровней глюкозы в крови. В результате у пациентов развивается гипогликемия.With regard to congenital hyperinsulinism, it is one of the most common causes of severe and persistent hypoglycemia in newborns and children. Insulin is a hormone that regulates blood glucose levels in the human body. It is involved in lowering blood glucose levels when blood glucose levels rise due to absorption of nutrients and so on. However, in congenital hyperinsulinism, insulin does not do this and the pancreas secretes insulin regardless of blood glucose levels. As a result, patients develop hypoglycemia.

Если возникает гипогликемия, то уровни глюкозы, кетонов, лактозы и т.д., которые утилизируются в основном клетками головного мозга, не могут поддерживаться, и поступление энергии из белков и жиров в организме блокируется, что приводит к поражению клеток головного мозга и тем самым вызывает судороги, расстройства способности к обучению, церебральный паралич, слепоту и даже, в тяжелых случаях, смерть.If hypoglycemia occurs, then the levels of glucose, ketones, lactose, etc., which are utilized mainly by the brain cells, cannot be maintained, and the energy supply from proteins and fats in the body is blocked, which leads to damage to the brain cells and thereby causes seizures, learning disabilities, cerebral palsy, blindness and even, in severe cases, death.

Гипогликемия может возникать на какое-то время вследствие чрезмерной секреции инсулина. Кроме того, гипогликемия также возникает у младенцев, перенесших дистресс плода. Хотя в этом случае причина секреции инсулина не выяснена, показатели гипогликемии могут быть улучшены в промежутке времени от нескольких суток до нескольких месяцев. Младенцы, рожденные матерями с сахарным диабетом, могут иметь преходящую гипогликемию, если уровень сахара должным образом не регулируется, но она не рецидивирует, если кормление протекает должным образом, и тогда гипогликемия исчезает. Другой причиной является персистирующий гиперинсулинизм вследствие тяжелых генетических дефектов. Как сообщается, причины гиперинсулинизма вследствие генетических дефектов включают мутацию в гене SUR или гене Kir6.2 на хромосоме 11р15.1 или мутацию в гене глюкокиназы (GK) на хромосоме 7р15-р13, повышение активности GK, в результате чего повышается активность GK, и мутацию в гене глутаматдегидрогеназы (GDH), в результате чего повышается активность GDH и тем самым повышается содержание аденозинтрифосфата (АТФ) в островковых бета-клетках и так далее.Hypoglycemia may occur temporarily due to excessive secretion of insulin. In addition, hypoglycemia also occurs in infants who have experienced fetal distress. Although in this case the cause of insulin secretion has not been elucidated, hypoglycemia may improve over a period of several days to several months. Babies born to mothers with diabetes may have transient hypoglycemia if sugar levels are not properly regulated, but it does not recur if feeding proceeds properly, and then the hypoglycemia disappears. Another cause is persistent hyperinsulinism due to severe genetic defects. Reported causes of hyperinsulinism due to genetic defects include a mutation in the SUR gene or the Kir6.2 gene on chromosome 11p15.1 or a mutation in the glucokinase (GK) gene on chromosome 7p15-p13, an increase in GK activity resulting in increased GK activity, and a mutation in the glutamate dehydrogenase (GDH) gene, resulting in increased GDH activity and thereby increased adenosine triphosphate (ATP) content in islet beta cells, and so on.

Соответственно, для предупреждения поражения головного мозга важно провести немедленное лечение гипогликемии. Гипогликемию можно лечить путем приема углеводсодержащего напитка, но в тяжелом случае необходима инъекция глюкозы или глюкагона в вену. Цель лечения заключается в организации у детей нормального цикла питания с использованием защитного приспособления. Например, в случае младенцев в возрасте одного года можно оставлять их без пищи в течение по меньшей мере от 14 до 15 ч при одновременном приеме лекарственных средств, поскольку они спят без приема пищи в течение от 10 до 12 ч в ночное время.Accordingly, it is important to treat hypoglycemia immediately to prevent brain damage. Hypoglycemia can be treated with a carbohydrate-containing drink, but in severe cases, an injection of glucose or glucagon into a vein is necessary. The goal of treatment is to establish a normal feeding cycle for children using a protective device. For example, in the case of infants as young as one year old, it is possible to leave them without food for at least 14 to 15 hours while taking medications, since they sleep without food for 10 to 12 hours at night.

Примеры используемых лекарственных средств могут включать диазоксид, октреотид, глюкагон и так далее. Диазоксид вводят перорально два или три раза в сутки. Диазоксид ингибирует секрецию инсулина, воздействуя на АТФ-зависимый K+ (KATP) канал, и поэтому он может быть эффективным для лечения GK-опосредуемого гиперинсулинизма или GDH-опосредуемого гиперинсулинизма, но в случае аутосомно-рецессивного гиперинсулинизма, вызванного дефектом KATP-опосредованного пути, зачастую он оказывается бесполезным. Октреотид вводят путем подкожной инъекции. В случае введения октреотида сначала его эффект проявляется, но иногда этот эффект уменьшается через некоторое время. Глюкагон стимулирует высвобождение глюкозы из печени, и его вводят путем подкожной или внутривенной инъекции, которую, как известно, используют тогда, когда пероральное введение в неотложной ситуации не применимо.Examples of drugs used may include diazoxide, octreotide, glucagon, and so on. Diazoxide is administered orally two or three times a day. Diazoxide inhibits insulin secretion by acting on the ATP-dependent K+ (KATP) channel, and therefore it may be effective in the treatment of GK-mediated hyperinsulinism or GDH-mediated hyperinsulinism, but in the case of autosomal recessive hyperinsulinism caused by a defect in the KATP-mediated pathway, it is often it turns out to be useless. Octreotide is administered by subcutaneous injection. In the case of the introduction of octreotide, its effect first appears, but sometimes this effect decreases after a while. Glucagon stimulates the release of glucose from the liver, and it is administered by subcutaneous or intravenous injection, which is known to be used when oral administration is not applicable in an emergency.

Среди всего прочего, в настоящее время глюкагон применяют в виде лиофилизированной композиции вследствие его низкой растворимости и выпадения в осадок при нейтральных рН, что является неудобным, поскольку перед применением его необходимо растворить в каком-либо растворителе. Кроме того, если глюкагон используют в качестве терапевтического агента для лечения врожденного гиперинсулинизма, и при этом требуется долгосрочное лечение вследствие короткого полупериода его существования, то применение глюкагона ограничено из-за частого введения.Among other things, glucagon is currently used as a lyophilized composition due to its low solubility and precipitation at neutral pH, which is inconvenient because it must be dissolved in some solvent before use. In addition, if glucagon is used as a therapeutic agent for congenital hyperinsulinism, and long-term treatment is required due to its short half-life, the use of glucagon is limited due to frequent administration.

Описание изобретенияDescription of the invention

Техническая проблема.Technical problem.

Задача изобретения заключается в создании композиции, содержащей производное глюкагона или конъюгат, содержащий производное глюкагона, и, в частности, фармацевтической композиции для предупреждения или лечения врожденного гиперинсулинизма, гипогликемии или метаболического синдрома, содержащей производное глюкагона или конъюгат, содержащий производное глюкагона.The objective of the invention is to provide a composition containing a glucagon derivative or a conjugate containing a glucagon derivative, and in particular a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of congenital hyperinsulinism, hypoglycemia or metabolic syndrome containing a glucagon derivative or a conjugate containing a glucagon derivative.

Задача изобретения также заключается в создании производного глюкагона.The objective of the invention is also to create a derivative of glucagon.

- 2 042163- 2 042163

Задача изобретения также еще заключается в создании выделенного полинуклеотида, кодирующего производное глюкагона, вектора, включающего в себя этот полинуклеотид, и выделенной клетки, включающей в себя этот полинуклеотид или вектор.It is also an object of the invention to provide an isolated polynucleotide encoding a glucagon derivative, a vector including this polynucleotide, and an isolated cell including this polynucleotide or vector.

Задача изобретения также заключается в создании выделенного конъюгата, который содержит пептидную группировку и группировку биосовместимого вещества, ковалентно связанную с пептидной группировкой.The objective of the invention is also to create an isolated conjugate that contains a peptide moiety and a biocompatible substance moiety covalently linked to the peptide moiety.

Задача изобретения также заключается в создании набора, включающего в себя производное глюкагона или конъюгат, содержащий производное глюкагона, и, в частности, набора для предупреждения или лечения врожденного гиперинсулинизма, гипогликемии или метаболического синдрома, включающего в себя производное глюкагона или конъюгат, содержащий производное глюкагона.It is also an object of the invention to provide a kit comprising a glucagon derivative or a conjugate containing a glucagon derivative, and in particular a kit for the prevention or treatment of congenital hyperinsulinism, hypoglycemia or metabolic syndrome, including a glucagon derivative or a conjugate containing a glucagon derivative.

Задача изобретения также заключается в создании способа предупреждения или лечения врожденного гиперинсулинизма, включающего введение нуждающемуся в этом субъекту производного глюкагона или выделенного конъюгата, содержащего производное глюкагона, либо содержащей их композиции.It is also an object of the invention to provide a method for preventing or treating congenital hyperinsulinism, comprising administering to a subject in need thereof a glucagon derivative or an isolated conjugate containing a glucagon derivative, or compositions containing them.

Задача изобретения также заключается в обеспечении применения производного глюкагона или выделенного конъюгата, содержащего производное глюкагона, либо содержащей их композиции в изготовлении лекарственного средства для предупреждения или лечения врожденного гиперинсулинизма.It is also an object of the invention to provide the use of a glucagon derivative or an isolated conjugate containing a glucagon derivative or compositions containing them in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of congenital hyperinsulinism.

Задача изобретения также заключается в создании способа предупреждения или лечения гипогликемии, включающего введение нуждающемуся в этом субъекту производного глюкагона или выделенного конъюгата, содержащего производное глюкагона, либо содержащей их композиции.It is also an object of the invention to provide a method for preventing or treating hypoglycemia, comprising administering to a subject in need thereof a glucagon derivative or an isolated conjugate containing a glucagon derivative, or compositions containing them.

Задача изобретения также заключается в обеспечении применения производного глюкагона или выделенного конъюгата, содержащего производное глюкагона, либо содержащей их композиции в изготовлении лекарственного средства для предупреждения или лечения гипогликемии.It is also an object of the invention to provide the use of a glucagon derivative or an isolated conjugate containing a glucagon derivative or compositions containing them in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of hypoglycemia.

Задача изобретения также заключается в создании способа предупреждения или лечения метаболического синдрома, включающего введение нуждающемуся в этом субъекту производного глюкагона или выделенного конъюгата либо содержащей их композиции.It is also an object of the invention to provide a method for preventing or treating metabolic syndrome, comprising administering to a subject in need thereof a glucagon derivative or an isolated conjugate, or compositions containing them.

Задача изобретения также заключается в обеспечении применения производного глюкагона или выделенного конъюгата, содержащего производное глюкагона, либо содержащей их композиции в изготовлении лекарственного средства (или фармацевтической композиции) для предупреждения или лечения метаболического синдрома.It is also an object of the invention to provide the use of a glucagon derivative or an isolated conjugate containing a glucagon derivative or compositions containing them in the manufacture of a medicament (or pharmaceutical composition) for the prevention or treatment of metabolic syndrome.

Решение технической задачи.Solving a technical problem.

Согласно одному из аспектов изобретения предложена композиция, содержащая производное глюкагона или конъюгат, содержащий производное глюкагона, и, в частности, фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения врожденного гиперинсулинизма, гипогликемии или метаболического синдрома, содержащая производное глюкагона или конъюгат, содержащий производное глюкагона.According to one aspect of the invention, there is provided a composition containing a glucagon derivative or a conjugate containing a glucagon derivative, and in particular a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of congenital hyperinsulinism, hypoglycemia or metabolic syndrome, containing a glucagon derivative or a conjugate containing a glucagon derivative.

В конкретном воплощении изобретение относится к композиции, содержащей пептид, являющийся производным глюкагона, включающий аминокислотную последовательность нижеследующей общей формулы 1, и, в частности, фармацевтической композиции для предупреждения или лечения врожденного гиперинсулинизма, гипогликемии или метаболического синдрома, содержащей пептид, являющийся производным глюкагона, содержащий аминокислотную последовательность нижеследующей общей формулы 1:In a specific embodiment, the invention relates to a composition containing a glucagon-derived peptide comprising the amino acid sequence of the following general formula 1, and, in particular, a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of congenital hyperinsulinism, hypoglycemia or metabolic syndrome, containing a glucagon-derived peptide containing amino acid sequence of the following general formula 1:

X1-X2-QGTF-X7-SD-X10-S-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-F-X23-X24W-L-X27-X28-X29-X30 (общая формула 1, SEQ Ш NO: 45), где X1 представляет собой гистидин (Н), дезаминогистидил, N-диметилгистидил, β-гидроксиимидазопропионил, 4-имидазоацетил, β-карбоксиимидазопропионил, триптофан (W) или тирозин (Y) либо отсутствует;( general formula 1, SEQ III NO: 45), where X1 represents histidine (H), deaminohystidyl, N-dimethylhistidyl, β-hydroxyimidazopropionyl, 4-imidazoacetyl, β-carboxyimidazopropionyl, tryptophan (W) or tyrosine (Y) or absent;

Х2 представляет собой α-метил-глутаминовую кислоту, аминоизомасляную кислоту (Aib), Dаланин, глицин (G), Sar (N-метилглицин), серин (S) или D-серин;X2 is α-methyl-glutamic acid, aminoisobutyric acid (Aib), Dalanin, glycine (G), Sar (N-methylglycine), serine (S) or D-serine;

Х7 представляет собой треонин (Т), валин (V) или цистеин (С);X7 is threonine (T), valine (V) or cysteine (C);

X10 представляет собой тирозин (Y) или цистеин (С);X10 is tyrosine (Y) or cysteine (C);

X12 представляет собой лизин (K) или цистеин (С);X12 is lysine (K) or cysteine (C);

X13 представляет собой тирозин (Y) или цистеин (С);X13 is tyrosine (Y) or cysteine (C);

X14 представляет собой лейцин (L) или цистеин (С);X14 is leucine (L) or cysteine (C);

X15 представляет собой аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (Е) или цистеин (С);X15 is aspartic acid (D), glutamic acid (E) or cysteine (C);

X16 представляет собой глутаминовую кислоту (Е), аспарагиновую кислоту (D), серин (S), α-метилглутаминовую кислоту или цистеин (С) либо отсутствует;X16 is glutamic acid (E), aspartic acid (D), serine (S), α-methylglutamic acid or cysteine (C) or absent;

X17 представляет собой аспарагиновую кислоту (D), глутамин (Q), глутаминовую кислоту (Е), лизин (K), аргинин (R), серин (S), цистеин (С) или валин (V) либо отсутствует;X17 is aspartic acid (D), glutamine (Q), glutamic acid (E), lysine (K), arginine (R), serine (S), cysteine (C) or valine (V) or absent;

X18 представляет собой аланин (А), аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (Е), аргинин (R), валин (V) или цистеин (С) либо отсутствует;X18 is alanine (A), aspartic acid (D), glutamic acid (E), arginine (R), valine (V) or cysteine (C) or absent;

X19 представляет собой аланин (А), аргинин (R), серин (S), валин (V) или цистеин (С) либо отсутX19 is alanine (A), arginine (R), serine (S), valine (V) or cysteine (C) or absent

- 3 042163 ствует;- 3 042163 valid;

Х20 представляет собой лизин (K), гистидин (Н), глутамин (Q), аспарагиновую кислоту (D), аргинин (R), α-метил-глутаминовую кислоту или цистеин (С) либо отсутствует;X20 is lysine (K), histidine (H), glutamine (Q), aspartic acid (D), arginine (R), α-methyl-glutamic acid or cysteine (C) or absent;

Х21 представляет собой аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (Е), лейцин (L), валин (V) или цистеин (С) либо отсутствует;X21 is aspartic acid (D), glutamic acid (E), leucine (L), valine (V) or cysteine (C) or absent;

Х23 представляет собой изолейцин (I), валин (V) или аргинин (R) либо отсутствует;X23 is isoleucine (I), valine (V) or arginine (R) or absent;

Х24 представляет собой валин (V), аргинин (R), аланин (А), цистеин (С), глутаминовую кислоту (Е), лизин (K), глутамин (Q), α-метил-глутаминовую кислоту или лейцин (L) либо отсутствует;X24 is valine (V), arginine (R), alanine (A), cysteine (C), glutamic acid (E), lysine (K), glutamine (Q), α-methyl-glutamic acid or leucine (L) or absent;

Х27 представляет собой изолейцин (I), валин (V), аланин (А), лизин (K), метионин (М), глутамин (Q) или аргинин (R) либо отсутствует;X27 is isoleucine (I), valine (V), alanine (A), lysine (K), methionine (M), glutamine (Q) or arginine (R) or absent;

Х28 представляет собой глутамин (Q), лизин (K), аспарагин (N) или аргинин (R) либо отсутствует;X28 is glutamine (Q), lysine (K), asparagine (N) or arginine (R) or absent;

Х29 представляет собой лизин (K), аланин (А), глицин (G) или треонин (Т) либо отсутствует; иX29 is lysine (K), alanine (A), glycine (G) or threonine (T) or absent; And

X30 представляет собой цистеин (С) или отсутствует;X30 is cysteine (C) or absent;

при условии, что когда аминокислотная последовательность общей формулы 1 идентична SEQ ID NO: 1, тогда она исключена.provided that when the amino acid sequence of general formula 1 is identical to SEQ ID NO: 1, then it is excluded.

Далее следуют другие конкретные воплощения настоящего изобретения.Further specific embodiments of the present invention follow.

В частности, в случае фармацевтической композиции, соответствующей предшествующему конкретному воплощению:In particular, in the case of a pharmaceutical composition according to the previous specific embodiment:

в общей формуле 1in the general formula 1

X1 представляет собой гистидин (Н), триптофан (W) или тирозин (Y) либо отсутствует;X1 is histidine (H), tryptophan (W) or tyrosine (Y) or absent;

Х2 представляет собой серин (S) или аминоизомасляную кислоту (Ab);X2 is serine (S) or aminoisobutyric acid (Ab);

X15 представляет собой аспарагиновую кислоту (D) или цистеин (С);X15 is aspartic acid (D) or cysteine (C);

X16 представляет собой глутаминовую кислоту (Е), серин (S) или цистеин (С);X16 is glutamic acid (E), serine (S) or cysteine (C);

X17 представляет собой аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (Е), лизин (K), аргинин (R), серин (S), цистеин (С) или валин (V);X17 is aspartic acid (D), glutamic acid (E), lysine (K), arginine (R), serine (S), cysteine (C) or valine (V);

X18 представляет собой аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (Е), аргинин (R) или цистеин (С);X18 is aspartic acid (D), glutamic acid (E), arginine (R) or cysteine (C);

X19 представляет собой аланин (А) или цистеин (С);X19 is alanine (A) or cysteine (C);

Х20 представляет собой глутамин (Q), аспарагиновую кислоту (D), лизин (K) или цистеин (С);X20 is glutamine (Q), aspartic acid (D), lysine (K) or cysteine (C);

Х21 представляет собой аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (Е), лейцин (L), валин (V) или цистеин (С);X21 is aspartic acid (D), glutamic acid (E), leucine (L), valine (V) or cysteine (C);

Х23 представляет собой изолейцин (I), валин (V) или аргинин (R);X23 is isoleucine (I), valine (V) or arginine (R);

Х24 представляет собой валин (V), аргинин (R), аланин (А), глутаминовую кислоту (Е), лизин (K), глутамин (Q) или лейцин (L);X24 is valine (V), arginine (R), alanine (A), glutamic acid (E), lysine (K), glutamine (Q) or leucine (L);

Х27 представляет собой изолейцин (I), валин (V), аланин (А), метионин (М), глутамин (Q) или аргинин (R);X27 is isoleucine (I), valine (V), alanine (A), methionine (M), glutamine (Q) or arginine (R);

Х28 представляет собой глутамин (Q), лизин (K), аспарагин (N) или аргинин (R);X28 is glutamine (Q), lysine (K), asparagine (N) or arginine (R);

Х29 представляет собой треонин (Т); иX29 is threonine (T); And

X30 представляет собой цистеин (С) или отсутствует.X30 is cysteine (C) or absent.

В случае фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений:In the case of a pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments:

в общей формуле 1in the general formula 1

X1 представляет собой гистидин (Н), триптофан (W) или тирозин (Y);X1 is histidine (H), tryptophan (W) or tyrosine (Y);

Х7 представляет собой цистеин (С), треонин (Т) или валин (V);X7 is cysteine (C), threonine (T) or valine (V);

X17 представляет собой глутаминовую кислоту (Е), лизин (K), аргинин (R), цистеин (С) или валин (V);X17 is glutamic acid (E), lysine (K), arginine (R), cysteine (C) or valine (V);

X18 представляет собой аргинин (R) или цистеин (С);X18 is arginine (R) or cysteine (C);

Х20 представляет собой глутамин (Q) или лизин (K);X20 is glutamine (Q) or lysine (K);

Х21 представляет собой аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (Е), валин (V) или цисX21 is aspartic acid (D), glutamic acid (E), valine (V) or cis

- 4 042163 теин (С);- 4 042163 theine (C);

Х23 представляет собой валин (V);X23 is valine (V);

Х24 представляет собой валин (V) или глутамин (Q);X24 is valine (V) or glutamine (Q);

Х27 представляет собой метионин (М);X27 is methionine (M);

Х28 представляет собой аспарагин (N) или аргинин (R);X28 is asparagine (N) or arginine (R);

В случае фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений: в общей формуле 1In the case of a pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments: in general formula 1

X1 представляет собой тирозин (Y);X1 is tyrosine (Y);

Х2 представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib);X2 is aminoisobutyric acid (Aib);

X12 представляет собой лизин (K);X12 is lysine (K);

X17 представляет собой лизин (K), аргинин (R), цистеин (С) или валин (V);X17 is lysine (K), arginine (R), cysteine (C) or valine (V);

Х21 представляет собой аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (Е) или цистеин (С);X21 is aspartic acid (D), glutamic acid (E) or cysteine (C);

Х23 представляет собой валин (V);X23 is valine (V);

Х24 представляет собой глутамин (Q);X24 is glutamine (Q);

Х2 представляет собой серин (S) или аминоизомасляную кислоту (Aib);X2 is serine (S) or aminoisobutyric acid (Aib);

Х20 представляет собой глутамин (Q), аспарагиновую кислоту (D) или лизин (K);X20 is glutamine (Q), aspartic acid (D) or lysine (K);

Х21 представляет собой аспарагиновую кислоту (D) или глутаминовую кислоту (Е);X21 is aspartic acid (D) or glutamic acid (E);

Х23 представляет собой валин (V);X23 is valine (V);

Х27 представляет собой изолейцин (I) или метионин (М);X27 is isoleucine (I) or methionine (M);

X1 представляет собой тирозин (Y);X1 is tyrosine (Y);

Х7 представляет собой треонин (Т);X7 is threonine (T);

X10 представляет собой тирозин (Y);X10 is tyrosine (Y);

X12 представляет собой лизин (K);X12 is lysine (K);

X13 представляет собой тирозин (Y);X13 is tyrosine (Y);

Х14 представляет собой лейцин (L);X14 is leucine (L);

- 5 042163- 5 042163

X17 представляет собой лизин (K) или аргинин (R);X17 is lysine (K) or arginine (R);

X18 представляет собой аргинин (R);X18 is arginine (R);

X19 представляет собой аланин (А);X19 is alanine (A);

Х20 представляет собой глутамин (Q), цистеин (С) или лизин (K);X20 is glutamine (Q), cysteine (C) or lysine (K);

Х21 представляет собой аспарагиновую кислоту (D), цистеин (С), валин (V) или глутаминовую кислоту (Е);X21 is aspartic acid (D), cysteine (C), valine (V) or glutamic acid (E);

Х23 представляет собой валин (V) или аргинин (R);X23 is valine (V) or arginine (R);

Х24 представляет собой глутамин (Q) или лейцин (L);X24 is glutamine (Q) or leucine (L);

X30 отсутствует.X30 is missing.

В случае фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений пептид содержит аминокислотную последовательность нижеследующей общей формулы 2:In the case of a pharmaceutical composition according to any of the previous specific embodiments, the peptide contains the amino acid sequence of the following general formula 2:

Y-Aib-QGTF-X7-SD-X10-S-X12-Y-L-X15-X16-X17-R-A-X20-X21-F-V-X24-W-L-M-N-TХ30 (общая формула 2, SEQ ID NO: 46), где Х7 представляет собой треонин (Т), валин (V) или цистеин (С);Y-Aib-QGTF-X7-SD-X10-S-X12-Y-L-X15-X16-X17-R-A-X20-X21-F-V-X24-W-L-M-N-TX30 (general formula 2, SEQ ID NO: 46), where X7 is threonine (T), valine (V) or cysteine (C);

X16 представляет собой глутаминовую кислоту (Е) или серии (S);X16 is glutamic acid (E) or series (S);

Х24 представляет собой валин (V) или глутамин (Q); иX24 is valine (V) or glutamine (Q); And

В случае фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений пептид имеет значение изоэлектрической точки (pI), отличающееся от значения pI для нативного глюкагона (6,8), например, pI 6,5 или ниже либо pI 7,0 или выше.In the case of a pharmaceutical composition according to any of the previous specific embodiments, the peptide has an isoelectric point (pI) value different from the pI value for native glucagon (6.8), for example, pI 6.5 or lower or pI 7.0 or higher.

В случае фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений, в конкретном воплощении настоящего изобретения каждая аминокислота по меньшей мере в одной паре аминокислот из пар аминокислот X10 и X14, Х12 и Х16, Х16 и Х20, Х17 и Х21, Х20 и Х24, и Х24 и Х28 в общей формуле 1 или 2 заменена на глутаминовую кислоту или лизин, которые способны образовывать кольцо, соответственно.In the case of a pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments, in a specific embodiment of the present invention, each amino acid in at least one amino acid pair of the amino acid pairs X10 and X14, X12 and X16, X16 and X20, X17 and X21, X20 and X24, and X24 and X28 in the general formula 1 or 2 is replaced by glutamic acid or lysine, which are capable of forming a ring, respectively.

В случае фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений, в конкретном воплощении настоящего изобретения каждая аминокислота в паре аминокислот X12 и X16, или каждая аминокислота в паре аминокислот X16 и Х20, или каждая аминокислота в паре аминокислот X17 и Х21 в общей формуле 1 или 2 соответственно заменена на глутаминовую кислоту или лизин, которые способны образовывать кольцо.In the case of a pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments, in a specific embodiment of the present invention, each amino acid in the amino acid pair X12 and X16, or each amino acid in the amino acid pair X16 and X20, or each amino acid in the amino acid pair X17 and X21 in the general formula 1 or 2 respectively replaced by glutamic acid or lysine, which are capable of forming a ring.

В случае фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений, в конкретном воплощении настоящего изобретения, в соединении общей формулы 1 или 2, образовано кольцо (например, лактамное кольцо) между каждой из аминокислот по меньшей мере в одной паре аминокислот из пар аминокислот Х10 и Х14, Х12 и Х16, Х16 и Х20, Х17 и Х21, Х20 и Х24, и Х24 и Х28.In the case of a pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments, in a specific embodiment of the present invention, in the compound of general formula 1 or 2, a ring (for example, a lactam ring) is formed between each of the amino acids in at least one amino acid pair of the amino acid pairs X10 and X14 , X12 and X16, X16 and X20, X17 and X21, X20 and X24, and X24 and X28.

В случае фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений, в конкретном воплощении настоящего изобретения, в соединении общей формулы 1 или 2, X16 представляет собой глутаминовую кислоту, Х20 представляет собой лизин, и боковые цепи X16 и Х20 образуют лактамное кольцо.In the case of a pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments, in a specific embodiment of the present invention, in the compound of general formula 1 or 2, X16 is glutamic acid, X20 is lysine, and the side chains of X16 and X20 form a lactam ring.

В случае фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений С-конец пептида амидирован или не модифицирован.In the case of a pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments, the C-terminus of the peptide is amidated or unmodified.

В случае фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений пептид представляет собой производное нативного глюкагона, способное активировать рецептор глюкагона.In the case of a pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments, the peptide is a native glucagon derivative capable of activating the glucagon receptor.

В случае фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-44.In the case of a pharmaceutical composition according to any of the previous specific embodiments, the peptide contains an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2-44.

В случае фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12, 13, 15 и 36-44.In the case of a pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments, the peptide comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 12, 13, 15 and 36-44.

В случае фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощенийIn the case of a pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments

- 6 042163 пептид содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 37.- 6 042163 peptide contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37.

В случае фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений пептид находится в форме длительно действующего конъюгата, в котором группировка биосовместимого вещества соединена с пептидной группировкой и, в частности, с пептидной группировкой, содержащей аминокислотную последовательность общей формулы 1 или 2.In the case of a pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments, the peptide is in the form of a long-acting conjugate in which a group of a biocompatible substance is connected to a peptide group and, in particular, to a peptide group containing the amino acid sequence of general formula 1 or 2.

В случае фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений группировка биосовместимого вещества выбрана из группы, состоящей из полимера, жирной кислоты, холестерина, альбумина и его фрагмента, альбуминсвязывающего вещества, полимера из повторяющихся звеньев конкретной аминокислотной последовательности, антитела, фрагмента антитела, FcRn (неонатальный Fc-рецептор)-связывающего вещества, соединительной ткани in vivo или его производного, нуклеотида, фибронектина, трансферрина, сахарида, гепарина и эластина.In the case of a pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments, the grouping of the biocompatible substance is selected from the group consisting of polymer, fatty acid, cholesterol, albumin and its fragment, albumin-binding substance, polymer of repeating units of a specific amino acid sequence, antibody, antibody fragment, FcRn (neonatal Fc-receptor)-binding substance, connective tissue in vivo or its derivative, nucleotide, fibronectin, transferrin, saccharide, heparin and elastin.

В случае фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений полимер выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахарида, декстрана, поливинил-этилового эфира, биоразлагаемого полимера, липидного полимера, хитина, гиалуроновой кислоты, олигонуклеотида и их комбинации.In the case of a pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments, the polymer is selected from the group consisting of polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol-propylene glycol copolymer, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaccharide, dextran, polyvinyl ethyl ether, biodegradable polymer, lipid polymer, chitin, hyaluronic acid, oligonucleotide, and combinations thereof.

В случае фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений FcRn-связывающее вещество представляет собой полипептид, содержащий Fc-область иммуноглобулина.In the case of a pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments, the FcRn binding agent is a polypeptide containing the Fc region of an immunoglobulin.

В случае фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений пептидная группировка и группировка биосовместимого вещества связаны посредством линкера.In the case of a pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments, the peptide moiety and the biocompatible substance moiety are linked via a linker.

В случае фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений линкер выбран из группы, состоящей из пептида, жирной кислоты, сахарида, полимера, низкомолекулярного соединения, нуклеотида и их комбинации.In the case of a pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments, the linker is selected from the group consisting of a peptide, a fatty acid, a saccharide, a polymer, a small molecule, a nucleotide, and combinations thereof.

В случае фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений линкер представляет собой полиэтиленгликоль.In the case of a pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments, the linker is a polyethylene glycol.

В случае фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений Fc-область иммуноглобулина агликозилирована.In the case of a pharmaceutical composition according to any of the previous specific embodiments, the Fc region of an immunoglobulin is aglycosylated.

В случае фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений Fc-область иммуноглобулина выбрана из группы, состоящей из:In the case of a pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments, the Fc region of an immunoglobulin is selected from the group consisting of:

(а) константного домена 1 тяжелой цепи (СН1-домена), СН2-домена, CH3-домена и СН4-домена;(a) heavy chain constant domain 1 (CH1 domain), CH2 domain, CH3 domain and CH4 domain;

(б) СН1-домена и СН2-домена;(b) CH1 domain and CH2 domain;

(в) СН1-домена и CH3-домена;(c) CH1 domain and CH3 domain;

(г) СН2-домена и CH3-домена;(d) CH2 domain and CH3 domain;

(д) комбинации между одним доменом или по меньшей мере двумя доменами, выбранным(ыми) из СН1-домена, СН2-домена, CH3-домена и СН4-домена, и шарнирной областью или частью шарнирной области иммуноглобулина; и (е) димера, образованного между каждым из доменов константной области тяжелой цепи и константной области легкой цепи.(e) combinations between one domain or at least two domains selected from a CH1 domain, a CH2 domain, a CH3 domain, and a CH4 domain, and a hinge region or part of an immunoglobulin hinge region; and (e) a dimer formed between each of the domains of the heavy chain constant region and the light chain constant region.

В случае фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений полипептид, содержащий Fc-область иммуноглобулина, находится в форме димера.In the case of a pharmaceutical composition according to any of the previous specific embodiments, the polypeptide containing the Fc region of an immunoglobulin is in the form of a dimer.

В случае фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений Fc-область иммуноглобулина представляет собой производное нативной Fc-области, в котором удален участок, способный образовывать дисульфидную связь, производное нативной Fc-области, в котором удалена часть аминокислот(ы) на N-конце, производное нативной Fc-области, в котором к N-концу добавлен остаток метионина, производное нативной Fc-области, в котором удален комплементсвязывающий сайт, или производное нативной Fc-области, в котором удален сайт антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC).In the case of a pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments, the Fc region of an immunoglobulin is a derivative of the native Fc region in which a site capable of forming a disulfide bond has been removed, a derivative of the native Fc region in which a portion of the amino acid(s) at the N-terminus has been removed , a derivative of the native Fc region in which a methionine residue is added to the N-terminus, a derivative of the native Fc region in which the complement-fixing site has been removed, or a derivative of the native Fc region in which the antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) site has been removed.

В случае фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений Fc-область иммуноглобулина имеет происхождение из иммуноглобулина, выбранного из группы, состоящей из IgG, IgA, IgD, IgE и IgM.In the case of a pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments, the Fc region of an immunoglobulin is derived from an immunoglobulin selected from the group consisting of IgG, IgA, IgD, IgE and IgM.

В случае фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений Fc-область иммуноглобулина представляет собой Fc-область IgG4.In the case of a pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments, the immunoglobulin Fc region is an IgG4 Fc region.

В случае фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений Fc-область иммуноглобулина представляет собой агликозилированную Fc-область, имеющую происхождение из человеческого IgG4.In the case of a pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments, the immunoglobulin Fc region is an aglycosylated Fc region derived from human IgG4.

- 7 042163 линкер связан с остатком цистеина в пептиде, включающем аминокислотную последовательность общей формулы 1 или 2.- 7 042163 the linker is linked to a cysteine residue in a peptide comprising the amino acid sequence of general formula 1 or 2.

В случае фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений, в конкретном воплощении настоящего изобретения линкер в составе конъюгата соответственно присоединен к пептидной группировке и группировке биосовместимого вещества посредством ковалентных связей, которые образуются соответственно, когда один конец линкера взаимодействует с аминогруппой или тиоловой группой группировки биосовместимого вещества, в то время как другой конец линкера взаимодействует с аминогруппой или тиоловой группой пептидной группировки, содержащей аминокислотную последовательность общей формулы 1 или 2, соответственно.In the case of a pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments, in a specific embodiment of the present invention, the linker in the conjugate is respectively attached to the peptide moiety and the biocompatible substance moiety through covalent bonds, which are formed, respectively, when one end of the linker interacts with the amino group or thiol group of the biocompatible substance moiety , while the other end of the linker interacts with the amino group or thiol group of the peptide group containing the amino acid sequence of General formula 1 or 2, respectively.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложено производное глюкагона.According to another aspect of the present invention, a glucagon derivative is provided.

В конкретном воплощении настоящее изобретение относится к выделенному пептиду, включающему аминокислотную последовательность общей формулы 1, представленную как SEQ ID NO: 45.In a specific embodiment, the present invention relates to an isolated peptide comprising the amino acid sequence of general formula 1 shown as SEQ ID NO: 45.

В другом конкретном воплощении настоящее изобретение относится к выделенному пептиду, содержащему аминокислотную последовательность нижеследующей общей формулы 2:In another specific embodiment, the present invention provides an isolated peptide comprising the amino acid sequence of the following general formula 2:

Y-Aib-QGTF-X7-SD-X10-S-X12-Y-L-X15-X16-X17-R-A-X20-X21-F-V-X24-W-L-M-N-TХ30 (общая формула 2, SEQ ГО NO: 46), где Х7 представляет собой треонин (Т), валин (V) или цистеин (С);Y-Aib-QGTF-X7-SD-X10-S-X12-Y-L-X15-X16-X17-R-A-X20-X21-F-V-X24-W-L-M-N-TX30 (general formula 2, SEQ GO NO: 46), where X7 is threonine (T), valine (V) or cysteine (C);

В случае выделенного пептида по предшествующему конкретному воплощению пептиды, соответствующие SEQ ID NO: 19, 33, 49 и 50, могут быть исключены из числа выделенных пептидов, содержащих аминокислотную последовательность общей формулы 2.In the case of the isolated peptide according to the previous specific embodiment, the peptides corresponding to SEQ ID NOs: 19, 33, 49 and 50 may be excluded from the isolated peptides containing the amino acid sequence of the general formula 2.

В выделенном пептиде по любому из предшествующих конкретных воплощений в общей формуле 2 X16 представляет собой глутаминовую кислоту, Х20 представляет собой лизин, и боковые цепи X16 и Х20 образуют лактамное кольцо.In an isolated peptide according to any of the preceding specific embodiments in general formula 2, X16 is glutamic acid, X20 is lysine, and the side chains of X16 and X20 form a lactam ring.

В выделенном пептиде по любому из предшествующих конкретных воплощений С-конец пептида, содержащего аминокислотную последовательность общей формулы 2, амидирован или не модифицирован.In the isolated peptide according to any of the previous specific embodiments, the C-terminus of the peptide containing the amino acid sequence of general formula 2 is amidated or not modified.

В случае выделенного пептида по любому из предшествующих конкретных воплощений пептид представляет собой производное глюкагона, способное активировать рецептор глюкагона.In the case of an isolated peptide according to any of the preceding specific embodiments, the peptide is a glucagon derivative capable of activating the glucagon receptor.

В случае выделенного пептида по любому из предшествующих конкретных воплощений пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12, 13, 15 и 36-44.In the case of an isolated peptide according to any of the previous specific embodiments, the peptide comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 12, 13, 15 and 36-44.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложены выделенный полинуклеотид, кодирующий выделенный пептид (в частности, выделенный пептид, который содержит аминокислотную последовательность общей формулы 1 или 2), вектор, включающий в себя выделенный полинуклеотид, и выделенная клетка, включающая в себя полинуклеотид или вектор.According to another aspect of the present invention, there is provided an isolated polynucleotide encoding an isolated peptide (in particular, an isolated peptide that contains an amino acid sequence of general formula 1 or 2), a vector including an isolated polynucleotide, and an isolated cell including a polynucleotide or a vector.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен выделенный конъюгат, содержащий пептидную группировку и группировку биосовместимого вещества, ковалентно связанную с пептидной группировкой, в котором пептидная группировка имеет или содержит одну и ту же аминокислотную последовательность общей формулы 1 или 2.According to another aspect of the present invention, there is provided an isolated conjugate containing a peptide moiety and a biocompatible substance moiety covalently linked to the peptide moiety, in which the peptide moiety has or contains the same amino acid sequence of general formula 1 or 2.

В конкретном воплощении настоящее изобретение относится к выделенному конъюгату, содержащему пептидную группировку и группировку биосовместимого вещества, ковалентно связанную с пептидной группировкой, в котором пептидная группировка имеет или содержит одну и ту же аминокислотную последовательность общей формулы 1.In a specific embodiment, the present invention relates to an isolated conjugate containing a peptide moiety and a biocompatible substance moiety covalently linked to the peptide moiety, in which the peptide moiety has or contains the same amino acid sequence of general formula 1.

В конкретном воплощении настоящее изобретение относится к выделенному конъюгату, содержащему пептидную группировку и группировку биосовместимого вещества, ковалентно связанную с пептидной группировкой, в котором пептидная группировка имеет или содержит одну и ту же аминокислотную последовательность общей формулы 2.In a specific embodiment, the present invention relates to an isolated conjugate containing a peptide moiety and a biocompatible substance moiety covalently linked to the peptide moiety, in which the peptide moiety has or contains the same amino acid sequence of the general formula 2.

В конъюгате по предшествующему конкретному воплощению группировка биосовместимого вещества выбрана из группы, состоящей из полимера, жирной кислоты, холестерина, альбумина и его фрагмента, альбуминсвязывающего вещества, полимера из повторяющихся звеньев конкретной аминокислотной последовательности, антитела, фрагмента антитела, FcRn-связывающего вещества, соединительной ткани in vivo или его производного, нуклеотида, фибронектина, трансферрина, сахарида, гепарина иIn the conjugate of the previous specific embodiment, the biocompatible moiety is selected from the group consisting of polymer, fatty acid, cholesterol, albumin and its fragment, albumin binding agent, polymer of repeating units of a specific amino acid sequence, antibody, antibody fragment, FcRn binding agent, connective tissue in vivo or its derivative, nucleotide, fibronectin, transferrin, saccharide, heparin and

- 8 042163 эластина.- 8 042163 elastin.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений полимер выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахарида, декстрана, поливинилэтилового эфира, биоразлагаемого полимера, липидного полимера, хитина, гиалуроновой кислоты, олигонуклеотида и их комбинации.In the conjugate of any of the preceding specific embodiments, the polymer is selected from the group consisting of polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol-propylene glycol copolymer, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaccharide, dextran, polyvinyl ethyl ether, biodegradable polymer, lipid polymer, chitin, hyaluronic acid, oligonucleotide, and their combinations.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений FcRn-связывающее вещество представляет собой полипептид, содержащий Fc-область иммуноглобулина.In the conjugate of any of the preceding specific embodiments, the FcRn binding agent is a polypeptide containing the Fc region of an immunoglobulin.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений пептидная область и группировка биосовместимого вещества связаны посредством линкера.In the conjugate of any of the preceding specific embodiments, the peptide region and the biocompatible substance moiety are linked via a linker.

В случае конъюгата по любому из предшествующих конкретных воплощений линкер выбран из группы, состоящей из пептида, жирной кислоты, сахарида, полимера, низкомолекулярного соединения, нуклеотида и их комбинации.In the case of a conjugate according to any of the preceding specific embodiments, the linker is selected from the group consisting of a peptide, a fatty acid, a saccharide, a polymer, a small molecule, a nucleotide, and combinations thereof.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений линкер представляет собой полимер, выбранный из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахарида, декстрана, поливинил-этилового эфира, биоразлагаемого полимера, липидного полимера, хитина, гиалуроновой кислоты, олигонуклеотида и их комбинации.In the conjugate of any of the preceding specific embodiments, the linker is a polymer selected from the group consisting of polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol/propylene glycol copolymer, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaccharide, dextran, polyvinyl ethyl ether, biodegradable polymer, lipid polymer, chitin , hyaluronic acid, oligonucleotide and combinations thereof.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений группировка биосовместимого вещества представляет собой FcRn-связывающее вещество, и группировка биосовместимого вещества связана с пептидной группировкой посредством линкера, выбранного из группы, состоящей из пептида, жирной кислоты, сахарида, полимера, низкомолекулярного соединения, нуклеотида и их комбинации.In the conjugate of any of the preceding specific embodiments, the biocompatible moiety is an FcRn binding agent, and the biocompatible moiety is linked to the peptide moiety via a linker selected from the group consisting of a peptide, a fatty acid, a saccharide, a polymer, a small molecule, a nucleotide, and their combinations.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений линкер представляет собой полиэтиленгликоль.In the conjugate of any of the preceding specific embodiments, the linker is a polyethylene glycol.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений Fc-область иммуноглобулина не гликозилирована.In the conjugate of any of the preceding specific embodiments, the immunoglobulin Fc region is not glycosylated.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений Fc-область иммуноглобулина выбрана из группы, состоящей из: (а) СН1-домена, СН2-домена, CH3-домена и СН4-домена; (б) СН1домена и СН2-домена; (в) СН1-домена и CH3-домена; (г) СН2-домена и CH3-домена; (д) комбинации между одним доменом или по меньшей мере двумя доменами, выбранным(ыми) из СН1-домена, СН2домена, CH3-домена и СН4-домена, и шарнирной областью или частью шарнирной области иммуноглобулина; и (е) димера, образованного между каждым из доменов константной области тяжелой цепи и константной области легкой цепи.In the conjugate of any of the preceding specific embodiments, the immunoglobulin Fc region is selected from the group consisting of: (a) a CH1 domain, a CH2 domain, a CH3 domain, and a CH4 domain; (b) CH1 domain and CH2 domain; (c) CH1 domain and CH3 domain; (d) CH2 domain and CH3 domain; (e) combinations between one domain or at least two domains selected from a CH1 domain, a CH2 domain, a CH3 domain, and a CH4 domain, and a hinge region or part of an immunoglobulin hinge region; and (e) a dimer formed between each of the domains of the heavy chain constant region and the light chain constant region.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений полипептид, содержащий Fc-область иммуноглобулина, находится в форме димера.In the conjugate of any of the preceding specific embodiments, the polypeptide comprising the immunoglobulin Fc region is in the form of a dimer.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений Fc-область иммуноглобулина представляет собой производное нативной Fc-области, в котором удален участок, способный образовывать дисульфидную связь, производное нативной Fc-области, в котором удалена часть аминокислот(ы) на N-конце, производное нативной Fc-области, в котором к N-концу добавлен остаток метионина, производное нативной Fc-области, в котором удален комплемент-связывающий сайт, или производное нативной Fc-области, в котором удален сайт антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC).In the conjugate according to any of the previous specific embodiments, the immunoglobulin Fc region is a derivative of the native Fc region in which a site capable of forming a disulfide bond has been removed, a derivative of the native Fc region in which a portion of the amino acid(s) at the N-terminus has been removed, the derivative a native Fc region in which a methionine residue is added to the N-terminus, a derivative of the native Fc region in which the complement-binding site has been removed, or a derivative of the native Fc region in which the antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) site has been removed.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений Fc-область иммуноглобулина имеет происхождение из иммуноглобулина, выбранного из группы, состоящей из IgG, IgA, IgD, IgE и IgM.In the conjugate of any of the preceding specific embodiments, the immunoglobulin Fc region is derived from an immunoglobulin selected from the group consisting of IgG, IgA, IgD, IgE and IgM.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений Fc-область иммуноглобулина представляет собой Fc-область IgG4.In the conjugate of any of the preceding specific embodiments, the immunoglobulin Fc region is an IgG4 Fc region.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений Fc-область иммуноглобулина представляет собой агликозилированную Fc-область, имеющую происходение из человеческого IgG4.In the conjugate of any of the preceding specific embodiments, the immunoglobulin Fc region is an aglycosylated Fc region derived from human IgG4.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений линкер связан с остатком цистеина в пептиде.In the conjugate of any of the preceding specific embodiments, the linker is linked to a cysteine residue in the peptide.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений, в конкретном воплощении настоящего изобретения линкер в составе конъюгата соответственно присоединен к пептидной группировке и группировке биосовместимого вещества посредством ковалентных связей, которые образуются соответственно, когда один конец линкера взаимодействует с аминогруппой или тиоловой группой группировки биосовместимого вещества, в то время как другой конец линкера взаимодействует с аминогруппой или тиоловой группой пептидной группировки, включающей аминокислотную последовательность общей формулы 1 или 2, соответственно.In the conjugate of any of the preceding specific embodiments, in a specific embodiment of the present invention, the linker in the conjugate is respectively attached to the peptide group and the group of the biocompatible substance through covalent bonds, which are formed, respectively, when one end of the linker interacts with the amino group or the thiol group of the group of the biocompatible substance, in while the other end of the linker interacts with the amino group or the thiol group of the peptide group comprising the amino acid sequence of general formula 1 or 2, respectively.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения гипогликемии, содержащая производное глюкагона или конъюгат, содержащий производное глюкагона, и фармацевтически приемлемый эксципиент.According to another aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of hypoglycemia, comprising a glucagon derivative or a conjugate containing a glucagon derivative, and a pharmaceutically acceptable excipient.

- 9 042163- 9 042163

В конкретном воплощении настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для предупреждения или лечения гипогликемии, содержащей выделенный пептид или выделенный конъюгат, содержащий пептидную группировку, которая имеет такую же последовательность, как и у выделенного пептида, или включает последовательность, содержащую такую же последовательность, и группировку биосовместимого вещества, ковалентно связанную с пептидной группировкой.In a specific embodiment, the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of hypoglycemia, comprising an isolated peptide or an isolated conjugate containing a peptide moiety that has the same sequence as the isolated peptide, or includes a sequence containing the same sequence and a biocompatible moiety. substance covalently linked to the peptide group.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения метаболического синдрома, содержащая производное глюкагона или конъюгат, содержащий производное глюкагона, и фармацевтически приемлемый эксципиент.According to another aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of metabolic syndrome, comprising a glucagon derivative or a conjugate containing a glucagon derivative, and a pharmaceutically acceptable excipient.

В конкретном воплощении настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для предупреждения или лечения метаболического синдрома, которая содержит выделенный пептид; или выделенный конъюгат, содержащий пептидную группировку, которая имеет такую же последовательность, как и у выделенного пептида, или включает последовательность, содержащую такую же последовательность, и группировку биосовместимого вещества, ковалентно связанную с пептидной группировкой.In a specific embodiment, the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of metabolic syndrome, which contains an isolated peptide; or an isolated conjugate containing a peptide moiety that has the same sequence as the isolated peptide, or includes a sequence containing the same sequence and a biocompatible substance moiety covalently linked to the peptide moiety.

В случае фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений фармацевтическая композиция дополнительно содержит по меньшей мере одно соединение или вещество, обладающее терапевтической активностью в отношении метаболического синдрома.In the case of a pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments, the pharmaceutical composition further comprises at least one compound or substance having therapeutic activity against metabolic syndrome.

В фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений соединение или вещество, обладающее терапевтической активностью в отношении метаболического синдрома, выбрано из группы, состоящей из инсулинотропного пептида, агониста рецептора глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1), агониста рецептора лептина, ингибитора дипептидилпептидазы-IV (DPP-IV), антагониста Y5-рецептора, антагониста рецептора меланинконцентрирующего гормона (МСН), агониста Y2/4-рецептора, агониста меланокортинового рецептора 3/4 (МС 3/4), ингибитора желудочной/панкреатической липазы, агониста рецептора 5-гидрокситриптамина, типа 2С (5НТ2с, G-белоксвязанного), агониста в3Л-рецептора, агониста рецептора амилина, антагониста грелина, антагониста рецептора грелина, агониста рецептора-альфа, активируемого пролифератором пероксисом (PPARa), агониста рецептора-дельта, активируемого пролифератором пероксисом (ΡΡΛΚδ), агониста фарнезоидного Х-рецептора (FXR), ингибитора ацетил-СоА-карбоксилазы, пептида YY, холецистокинина (CCK), ксенина, глицентина, обестатина, секретина, несфатина, инсулина и глюкозозависимого инсулинотропного пептида (GIP).In the pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments, the compound or substance having therapeutic activity against metabolic syndrome is selected from the group consisting of an insulinotropic peptide, a glucagon-like peptide-1 (GLP-1) receptor agonist, a leptin receptor agonist, a dipeptidyl peptidase-IV inhibitor (DPP-IV), Y5 receptor antagonist, melanin-concentrating hormone (MCH) receptor antagonist, Y2/4 receptor agonist, melanocortin 3/4 receptor (MC 3/4) agonist, gastric/pancreatic lipase inhibitor, 5-hydroxytryptamine receptor agonist , type 2C (5HT2c, G-protein bound), β3L receptor agonist, amylin receptor agonist, ghrelin antagonist, ghrelin receptor antagonist, peroxisome proliferator-activated receptor-alpha (PPARa) agonist, peroxisome proliferator-activated receptor-delta agonist (PΡΛΚδ) , farnesoid X receptor (FXR) agonist, acetyl-CoA carboxylase inhibitor, YY peptide, cholecystokinin (CCK), xenin, glycentin, obestatin, secretin, nesfatin, insulin, and glucose-dependent insulinotropic peptide (GIP).

В фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений инсулинотропный пептид выбран из группы, состоящей из GLP-1, эксендина-3, эксендина-4, их агониста, их производного, их фрагмента, их варианта и их комбинации.In the pharmaceutical composition of any of the preceding specific embodiments, the insulinotropic peptide is selected from the group consisting of GLP-1, exendin-3, exendin-4, an agonist thereof, a derivative thereof, a fragment thereof, a variant thereof, and a combination thereof.

В фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений инсулинотропный пептид представляет собой производное инсулинотропного пептида, в котором N-концевой остаток гистидина инсулинотропного пептида заменен на остаток, выбранный из группы, состоящей из дезаминогистидила, N-диметилгистидила, β-гидроксиимидазопропионила, 4-имидазоацетила и βкарбоксиимидазопропионила.In the pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments, the insulinotropic peptide is an insulinotropic peptide derivative wherein the N-terminal histidine residue of the insulinotropic peptide is replaced with a residue selected from the group consisting of deaminohistidil, N-dimethylhistidil, β-hydroxyimidazopropionyl, 4-imidazoacetyl, and βcarboxyimidazopropionyl.

В фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений инсулинотропный пептид выбран из группы, состоящей из нативного эксендина-4; производного эксендина-4, в котором удалена N-концевая аминогруппа эксендина-4; производного эксендина-4, в котором Nконцевая аминогруппа эксендина-4 заменена на гидроксильную группу; производного эксендина-4, в котором N-концевая аминогруппа эксендина-4 модифицирована диметильной группой; производного эксендина-4, в котором удален а-углеродный атом 1-й аминокислоты эксендина-4, гистидина; производного эксендина-4, в котором 12-я аминокислота эксендина-4, лизин, заменена на серин, и производного эксендина-4, в котором 12-я аминокислота эксендина-4, лизин, заменена на аргинин.In the pharmaceutical composition of any of the preceding specific embodiments, the insulinotropic peptide is selected from the group consisting of native exendin-4; an exendin-4 derivative in which the N-terminal amino group of exendin-4 has been removed; a derivative of exendin-4, in which the N-terminal amino group of exendin-4 is replaced by a hydroxyl group; an exendin-4 derivative in which the N-terminal amino group of exendin-4 is modified with a dimethyl group; a derivative of exendin-4, in which the a-carbon atom of the 1st amino acid of exendin-4, histidine, has been removed; an exendin-4 derivative in which the 12th amino acid of exendin-4, lysine, is replaced with serine; and an exendin-4 derivative in which the 12th amino acid of exendin-4, lysine, is replaced with arginine.

В фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений инсулинотропный пептид находится в форме длительно действующего конъюгата, который содержит пептидную группировку, включающую ту же аминокислотную последовательность, что и последовательность инсулинотропного пептида, и группировку биосовместимого вещества, ковалентно связанную с пептидной группировкой.In the pharmaceutical composition of any of the preceding specific embodiments, the insulinotropic peptide is in the form of a long-acting conjugate that contains a peptide moiety comprising the same amino acid sequence as that of the insulinotropic peptide and a biocompatible substance moiety covalently linked to the peptide moiety.

В фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений группировка биосовместимого вещества выбрана из группы, состоящей из полимера, жирной кислоты, холестерина, альбумина и его фрагмента, альбуминсвязывающего вещества, полимера из повторяющихся звеньев конкретной аминокислотной последовательности, антитела, фрагмента антитела, FcRn-связывающего вещества, соединительной ткани in vivo или его производного, нуклеотида, фибронектина, трансферрина, сахарида, гепарина и эластина.In the pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments, the biocompatible moiety is selected from the group consisting of polymer, fatty acid, cholesterol, albumin and fragment thereof, albumin binding agent, polymer of repeating units of a particular amino acid sequence, antibody, antibody fragment, FcRn binding agent , connective tissue in vivo or its derivative, nucleotide, fibronectin, transferrin, saccharide, heparin and elastin.

В фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений полимер выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахарида, декстрана, поливинил-этилового эфира, биоразлагаемого полимера, липидного полимера, хитина, гиалуроIn the pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments, the polymer is selected from the group consisting of polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol-propylene glycol copolymer, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaccharide, dextran, polyvinyl ethyl ether, biodegradable polymer, lipid polymer, chitin, hyaluro

- 10 042163 новой кислоты, олигонуклеотида и их комбинации.- 10 042163 new acid, oligonucleotide and combinations thereof.

В фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений FcRnсвязывающее вещество представляет собой полипептид, содержащий Fc-область иммуноглобулина.In a pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments, the FcRn binding agent is a polypeptide containing the Fc region of an immunoglobulin.

В фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений пептидная группировка, содержащая аминокислотную последовательность инсулинотропного пептида, связана с группировкой биосовместимого вещества посредством линкера.In a pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments, a peptide moiety containing the amino acid sequence of an insulinotropic peptide is linked to a biocompatible substance moiety via a linker.

В фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений линкер выбран из группы, состоящей из пептида, жирной кислоты, сахарида, полимера, низкомолекулярного соединения, нуклеотида и их комбинации.In the pharmaceutical composition of any of the preceding specific embodiments, the linker is selected from the group consisting of a peptide, a fatty acid, a saccharide, a polymer, a small molecule, a nucleotide, and combinations thereof.

В фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений линкер представляет собой полимер, выбранный из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахарида, декстрана, поливинил-этилового эфира, биоразлагаемого полимера, липидного полимера, хитина, гиалуроновой кислоты, олигонуклеотида и их комбинации.In the pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments, the linker is a polymer selected from the group consisting of polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol-propylene glycol copolymer, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaccharide, dextran, polyvinyl ethyl ether, biodegradable polymer, lipid polymer, chitin, hyaluronic acid, oligonucleotide and combinations thereof.

В случае фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений метаболический синдром выбран из группы, состоящей из нарушенной толерантности к глюкозе, гиперхолестеринемии, дислипидемии, ожирения, диабета, гипертензии, неалкогольного стеатогепатита (NASH), атеросклероза, вызванного дислипидемией, атеросклероза, артериосклероза, коронарной болезни сердца, инсульта и так далее.In the case of a pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments, the metabolic syndrome is selected from the group consisting of impaired glucose tolerance, hypercholesterolemia, dyslipidemia, obesity, diabetes, hypertension, non-alcoholic steatohepatitis (NASH), dyslipidemia-induced atherosclerosis, atherosclerosis, arteriosclerosis, coronary disease heart, stroke and so on.

В фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений инсулинотропный пептид связан с группировкой биосовместимого вещества посредством линкера, выбранного из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахарида, декстрана, поливинил-этилового эфира, биоразлагаемого полимера, такого как полимолочная кислота (PLA) и полимолочная-гликолевая кислота (PLGA), липидного полимера, хитинов, гиалуроновой кислоты, жирной кислоты, полимера, низкомолекулярного соединения, нуклеотида и их комбинации.In the pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments, the insulinotropic peptide is linked to the moiety of a biocompatible substance via a linker selected from the group consisting of polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol-propylene glycol copolymer, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaccharide, dextran, polyvinyl ethyl ether, biodegradable a polymer such as polylactic acid (PLA) and polylactic-glycolic acid (PLGA), a lipid polymer, chitins, hyaluronic acid, a fatty acid, a polymer, a small molecule, a nucleotide, and combinations thereof.

В фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений группировка биосовместимого вещества представляет собой FcRn-связывающее вещество, а пептидная группировка, содержащая аминокислотную последовательность инсулинотропного пептида, присоединена к группировке биосовместимого вещества через пептидный линкер; или непептидный линкер, выбранный из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахарида, декстрана, поливинил-этилового эфира, биоразлагаемого полимера, такого как полимолочная кислота (PLA) и полимолочная-гликолевая кислота (PLGA), липидного полимера, хитинов, гиалуроновой кислоты и их комбинации.In the pharmaceutical composition of any of the preceding specific embodiments, the biocompatible moiety is an FcRn-binding agent, and the peptide moiety containing the amino acid sequence of the insulinotropic peptide is attached to the biocompatible moiety via a peptide linker; or a non-peptide linker selected from the group consisting of polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol-propylene glycol copolymer, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaccharide, dextran, polyvinyl ethyl ether, a biodegradable polymer such as polylactic acid (PLA) and polylactic-glycolic acid ( PLGA), lipid polymer, chitin, hyaluronic acid, and combinations thereof.

В случае фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений композиция может включать как (1) конъюгат, содержащий пептидную группировку, включающую аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 37, и группировку биосовместимого вещества, ковалентно связанную с пептидной группировкой; так и (2) конъюгат, который содержит группировку имидазо-ацетил-эксендина-4, где удален α-углеродный атом 1-й аминокислоты эксендина-4 (т.е. гистидина), и группировку биосовместимого вещества, ковалентно связанную с группировкой имидазо-ацетилэксендина-4.In the case of a pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments, the composition may include both (1) a conjugate containing a peptide moiety comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 and a biocompatible substance moiety covalently linked to the peptide moiety; and (2) a conjugate that contains an imidazo-acetyl-exendin-4 moiety, where the α-carbon atom of the 1st amino acid of exendin-4 (i.e., histidine) is removed, and a biocompatible substance moiety covalently linked to the imidazo- acetylexendine-4.

В фармацевтической композиции по любому из предшествующих конкретных воплощений пептидная группировка, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 37, и группировка имидазо-ацетил-эксендина-4 связаны с соответствующими им группировками биосовместимого вещества посредством линкера.In the pharmaceutical composition according to any of the preceding specific embodiments, the peptide moiety comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 and the imidazo-acetyl-exendin-4 moiety are linked to their respective biocompatible substance moieties via a linker.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ предупреждения или лечения врожденного гиперинсулинизма, включающий введение производного глюкагона или конъюгата, содержащего производное глюкагона, либо содержащей их композиции нуждающемуся в этом субъекту.According to another aspect of the present invention, there is provided a method for preventing or treating congenital hyperinsulinism, comprising administering a glucagon derivative or a conjugate containing a glucagon derivative, or a composition containing the same, to a subject in need thereof.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложено применение производного глюкагона или содержащего его конъюгата либо содержащей их композиции для приготовления лекарственного средства для предупреждения или лечения врожденного гиперинсулинизма.According to another aspect of the present invention, the use of a derivative of glucagon or a conjugate containing it or a composition containing them for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of congenital hyperinsulinism is provided.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ предупреждения или лечения гипогликемии, включающий введение производного глюкагона или конъюгата, содержащего производное глюкагона, либо содержащей их композиции нуждающемуся в этом субъекту.According to another aspect of the present invention, there is provided a method for preventing or treating hypoglycemia, comprising administering a glucagon derivative or a conjugate containing a glucagon derivative, or a composition containing the same, to a subject in need thereof.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложено применение производного глюкагона или содержащего его конъюгата либо содержащей их композиции для приготовления лекарственного средства для предупреждения или лечения гипогликемии.According to another aspect of the present invention, the use of a derivative of glucagon or a conjugate containing it or a composition containing them for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of hypoglycemia is provided.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ предупреждения или лечения метаболического синдрома, включающий введение производного глюкагона или конъюгата, соAccording to another aspect of the present invention, a method for preventing or treating metabolic syndrome is provided, comprising administering a glucagon derivative or conjugate, with

- 11 042163 держащего производное глюкагона, либо содержащей их композиции нуждающемуся в этом субъекту.- 11 042163 holding a derivative of glucagon, or a composition containing them to a subject in need.

В конкретном воплощении способ дополнительно включает введение по меньшей мере одного соединения или вещества, обладающего терапевтической активностью в отношении метаболического синдрома.In a specific embodiment, the method further comprises administering at least one compound or substance having therapeutic activity for metabolic syndrome.

В способе по любому из предшествующих конкретных воплощений производное глюкагона или конъюгат, содержащий производное глюкагона, и соединение или вещество, обладающее терапевтической активностью в отношении метаболического синдрома, вводят одновременно, раздельно или последовательно.In the method of any of the preceding specific embodiments, the glucagon derivative or conjugate containing the glucagon derivative and the compound or substance having therapeutic activity against metabolic syndrome are administered simultaneously, separately or sequentially.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложено применение производного глюкагона, или содержащего его конъюгата, либо содержащей их композиции для приготовления лекарственного средства (или фармацевтической композиции) для предупреждения или лечения метаболического синдрома.According to another aspect of the present invention, the use of a derivative of glucagon, or a conjugate containing it, or a composition containing them for the preparation of a medicament (or pharmaceutical composition) for the prevention or treatment of metabolic syndrome is provided.

Преимущественные эффекты изобретения.Advantageous Effects of the Invention.

Производные глюкагона по настоящему изобретению обладают улучшенными физическими свойствами по сравнению со свойствами нативного глюкагона и могут быть эффективно использованы для предупреждения и лечения метаболического синдрома, такого как ожирение, диабет и неалкогольный стеатогепатит (NASH), и врожденного гиперинсулинизма.The glucagon derivatives of the present invention have improved physical properties compared to those of native glucagon and can be effectively used in the prevention and treatment of metabolic syndrome such as obesity, diabetes and non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and congenital hyperinsulinism.

Краткое описание графических материалов.Brief description of graphic materials.

На фиг. 1 представлен график, иллюстрирующий изменения массы тела животных моделей ожирения (крыс), которые были получены в результате кормления кормом с высоким содержанием жиров, во время отдельного или совместного введения длительно действующего конъюгата на основе инсулинотропного пептида (именуемого длительно действующим производным эксендина-4) и длительно действующего конъюгата на основе производного глюкагона (именуемого длительно действующим производным с SEQ ID NO: 12) с использованием установленной дозы крысам с интервалами 3 суток в течение 15 суток.In FIG. 1 is a graph illustrating changes in body weight of animal models of obesity (rats) that were obtained as a result of feeding a diet with a high fat content during separate or combined administration of a long-acting insulinotropic peptide-based conjugate (referred to as long-acting exendin-4 derivative) and long acting glucagon derivative conjugate (referred to as long acting derivative of SEQ ID NO: 12) using a set dose in rats at 3 day intervals for 15 days.

На фиг. 2 представлен результат, иллюстрирующий количество брыжеечного жира животных моделей ожирения (крыс), которые были получены в результате кормления кормом с высоким содержанием жиров, во время отдельного или совместного введения длительно действующего конъюгата на основе инсулинотропного пептида (именуемого длительно действующим производным эксендина-4) и длительно действующего конъюгата на основе производного глюкагона (именуемого длительно действующим производным с SEQ ID NO: 12) с использованием установленной дозы крысам с интервалами 3 суток в течение 15 суток (*р <0,05, **р <0,01 относительно разбавителя при анализе методом однофакторного ANOVA (дисперсионный анализ)).In FIG. 2 is a result illustrating the amount of mesenteric fat in obese animal models (rats) that were obtained by feeding a high fat diet during single or co-administration of a long acting insulinotropic peptide conjugate (referred to as a long acting exendin-4 derivative) and long-acting glucagon derivative conjugate (referred to as long-acting derivative of SEQ ID NO: 12) using a set dose in rats at 3-day intervals for 15 days (*p<0.05, **p<0.01 vs. diluent at analysis by one-way ANOVA (analysis of variance)).

На фиг. 3 представлен результат, иллюстрирующий разницу в массе печени животных моделей ожирения (крыс), которые были получены в результате кормления кормом с высоким содержанием жиров, во время отдельного или совместного введения длительно действующего конъюгата на основе инсулинотропного пептида (именуемого длительно действующим производным эксендина-4) и длительно действующего конъюгата на основе производного глюкагона (именуемого длительно действующим производным с SEQ ID NO: 12) с использованием установленной дозы крысам в течение 15 суток (***р <0,01, ***р <0,001 относительно разбавителя при анализе методом однофакторного ANOVA).In FIG. 3 is a result illustrating the difference in liver weight of obese animal models (rats) that were obtained as a result of feeding a high-fat diet during single or combined administration of a long-acting insulinotropic peptide-based conjugate (referred to as a long-acting exendin-4 derivative) and a long-acting glucagon derivative conjugate (referred to as the long-acting derivative of SEQ ID NO: 12) at a stated dose in rats for 15 days (***p<0.01, ***p<0.001 vs. one-way ANOVA).

На фиг. 4 представлен график изменения массы тела (BW) животных моделей ожирения (мышей), которые были получены в результате кормления кормом с высоким содержанием жиров, после отдельного или совместного введения крысам длительно действующего конъюгата на основе инсулинотропного пептида (именуемого длительно действующим производным эксендина-4) и длительно действующего конъюгата на основе производного глюкагона (именуемого длительно действующим производным с SEQ ID NO: 20) с использованием установленной дозы мышам в течение 22 суток.In FIG. 4 is a graph of change in body weight (BW) of animal models of obesity (mice) that were obtained as a result of feeding a diet with a high fat content, after separate or joint administration to rats of a long-acting insulinotropic peptide-based conjugate (referred to as a long-acting exendin-4 derivative) and a long-acting glucagon derivative conjugate (referred to as the long-acting derivative of SEQ ID NO: 20) at a set dose in mice for 22 days.

На фиг. 5 представлен результат, иллюстрирующий изменения содержания холестерина в крови животных моделей ожирения (мышей), которые были получены в результате кормления кормом с высоким содержанием жиров, после отдельного или совместного введения длительно действующего конъюгата на основе инсулинотропного пептида (именуемого длительно действующим производным эксендина-4) и длительно действующего конъюгата на основе производного глюкагона (именуемого длительно действующим производным с SEQ ID NO: 20) с использованием установленной дозы мышам в течение 22 суток.In FIG. 5 is a result illustrating changes in blood cholesterol levels in obese animal models (mice) that were obtained by feeding a high-fat diet after single or co-administration of a long-acting insulinotropic peptide-based conjugate (referred to as a long-acting exendin-4 derivative) and a long-acting glucagon derivative conjugate (referred to as the long-acting derivative of SEQ ID NO: 20) at a set dose in mice for 22 days.

На фиг. 6 представлен результат, иллюстрирующий изменения массы тела, уровней холестерина в крови, количества жира и нарушенной толерантности к глюкозе животных моделей ожирения (мышей), которые были получены в результате кормления кормом с высоким содержанием жиров, после однократного введения лираглутида (Novo Nordisk) и длительно действующего конъюгата на основе инсулинотропного пептида (именуемого длительно действующим производным эксендина-4) или совместного введения длительно действующего конъюгата на основе инсулинотропного пептида (именуемого длительно действующим производным эксендина-4) и длительно действующего конъюгата на основе производного глюкагона (именуемого длительно действующим производным с SEQ ID NO: 37) с использованием установленной дозы мышам в течение 28 суток. Показаны эффекты по сравнению с разбавителемIn FIG. 6 is a result illustrating changes in body weight, blood cholesterol levels, fat content, and impaired glucose tolerance in obese animal models (mice) that were obtained by feeding a high-fat diet, after a single dose of liraglutide (Novo Nordisk) and for a long time. a long-acting insulinotropic peptide conjugate (referred to as long-acting exendin-4 derivative) or coadministration of a long-acting insulinotropic peptide-based conjugate (referred to as long-acting exendin-4 derivative) and a long-acting glucagon derivative conjugate (referred to as long-acting derivative with SEQ ID NO: 37) using the established dose in mice for 28 days. Effects shown compared to diluent

- 12 042163 (введенным с эксципиентом).- 12 042163 (introduced with excipient).

На фиг. 7 представлен результат, иллюстрирующий эффект уменьшения интенсивности симптомов гипогликемии после введения длительно действующего конъюгата на основе производного глюкагона с SEQ ID NO: 37 в животных моделях острой гипогликемии (крысах).In FIG. 7 is a result illustrating the effect of reducing the intensity of symptoms of hypoglycemia after administration of the long acting glucagon derivative conjugate of SEQ ID NO: 37 in animal models of acute hypoglycemia (rats).

На фиг. 8 представлен результат, иллюстрирующий эффект уменьшения интенсивности симптомов гипогликемии после введения длительно действующего конъюгата на основе производного глюкагона с SEQ ID NO: 37 в животных моделях хронической гипогликемии (крысах).In FIG. 8 is a result illustrating the effect of reducing the intensity of symptoms of hypoglycemia after administration of the long acting glucagon derivative conjugate of SEQ ID NO: 37 in animal models of chronic hypoglycemia (rats).

Наилучший вариант осуществления изобретения.The best embodiment of the invention.

Подробное описание предпочтительных воплощений.Detailed description of preferred embodiments.

Конкретные подробности настоящего изобретения могут быть разъяснены нижеследующим образом. В частности, разъяснения и воплощения, раскрытые в настоящем изобретении, применимы к другим разъяснениям и воплощениям, соответственно. То есть все комбинации различных элементов, раскрытых в настоящем изобретении, входят в объем настоящего изобретения. Кроме того, объем настоящего изобретения не следует ограничивать конкретными признаками, описанными в данной заявке ниже.Specific details of the present invention may be explained as follows. In particular, the explanations and embodiments disclosed in the present invention are applicable to other explanations and embodiments, respectively. That is, all combinations of the various elements disclosed in the present invention are within the scope of the present invention. In addition, the scope of the present invention should not be limited to the specific features described in this application below.

Кроме того, специалисты средней квалификации в данной области техники могут быть способны выявить или подтвердить, используя только традиционные методы экспериментирования, многие эквиваленты к конкретным аспектам изобретения, описанным в этой заявке. Кроме того, также подразумевается, что эти эквиваленты должны быть включены в настоящее изобретение.In addition, those of ordinary skill in the art may be able to identify or confirm, using only conventional methods of experimentation, many equivalents to the specific aspects of the invention described in this application. Moreover, these equivalents are also intended to be included in the present invention.

По всему тексту описания настоящего изобретения использованы не только общепринятые 1-буквенные коды и 3-буквенные коды для природных аминокислот, но и такие 3-буквенные коды, как Aib (α-аминоизомасляная кислота), Sar (N-метилглицин), обычно используемые для других аминокислот. Помимо этого, аминокислоты, упомянутые в сокращенном виде в описании настоящего изобретения, приведены в соответствии с правилом номенклатуры по IUPAC-IUB (Международный союз по теоретической и прикладной химии/Международный биохимический союз).Throughout the text of the description of the present invention, not only the conventional 1-letter codes and 3-letter codes for natural amino acids are used, but also 3-letter codes such as Aib (α-aminoisobutyric acid), Sar (N-methylglycine), commonly used for other amino acids. In addition, the amino acids mentioned in abbreviated form in the description of the present invention are given in accordance with the nomenclature rule according to IUPAC-IUB (International Union of Pure and Applied Chemistry/International Union of Biochemistry).

Аланин Alanine А A Аргинин Arginine R R Аспарагин Asparagine N N Аспарагиновая кислота Aspartic acid D D Цистеин Cysteine С WITH Глутаминовая кислота Glutamic acid Е E Глутамин Glutamine Q Q Глицин Glycine G G Г истидин G istidine н n Изолейцин Isoleucine I I Лейцин Leucine L L Лизин Lysine К TO Метионин Methionine М M Фенилаланин Phenylalanine F F Пролин Proline Р R Серин Serene S S Треонин Threonine т T Триптофан tryptophan W W Тирозин Tyrosine Y Y Валин Valine V V

Согласно одному из аспектов настоящего изобретения предложена композиция, содержащая производное глюкагона или конъюгат, содержащий производное глюкагона, и, в частности, предложена фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения врожденного гиперинсулинизма, гипогликемии или метаболического синдрома, содержащая производное глюкагона или конъюгат, содержащий производное глюкагона.According to one aspect of the present invention, there is provided a composition comprising a glucagon derivative or a conjugate comprising a glucagon derivative, and in particular, a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of congenital hyperinsulinism, hypoglycemia or metabolic syndrome, comprising a glucagon derivative or a conjugate comprising a glucagon derivative.

Производное глюкагона по настоящему изобретению включает пептид, имеющий по меньшей мере одно отличие в аминокислотной последовательности по сравнению с нативным глюкагоном; пептид, в котором последовательность нативного глюкагона изменена посредством модификации нативного глюкагона, и миметик нативного глюкагона, который может активировать рецепторы глюкагона подобно нативному глюкагону.The glucagon derivative of the present invention includes a peptide having at least one difference in amino acid sequence compared to native glucagon; a peptide in which the sequence of native glucagon is altered by modifying native glucagon; and a native glucagon mimetic that can activate glucagon receptors similar to native glucagon.

Таким производным глюкагона может быть производное глюкагона, имеющее улучшенные физические свойства благодаря наличию у него измененного значения pI по сравнению с нативным глюкагоном. Кроме того, производное глюкагона может представлять собой производное глюкагона с улучшенной растворимостью, обладающее при этом эффективностью в отношении активации рецепторов глюкагона, но этим не ограничено.Such a glucagon derivative may be a glucagon derivative having improved physical properties due to its altered pI value compared to native glucagon. In addition, the glucagon derivative may be a solubility-improved glucagon derivative, while being effective in activating glucagon receptors, but is not limited to this.

Кроме того, производное глюкагона может представлять собой глюкагон, не встречающийся в природе.In addition, the glucagon derivative may be a non-naturally occurring glucagon.

В частности, нативный глюкагон может иметь следующую аминокислотную последовательность: His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser- Arg-Arg- Αΐα-Gln- AspPhe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr (SEQ ID NO: 1).In particular, native glucagon may have the following amino acid sequence: - AspPhe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr (SEQ ID NO: 1).

Использованный в данном описании термин изоэлектрическая точка или pI относится к значению рН, при котором молекула, такая как полипептид или пептид, не имеет никакого суммарного зарядаAs used herein, the term isoelectric point or pI refers to the pH value at which a molecule, such as a polypeptide or peptide, has no net charge.

- 13 042163 (0). В случае полипептида с различными заряженными функциональными группами суммарный заряд полипептида в целом равен 0 в точке, где значение рН является таким же, как значение pI. Суммарный заряд полипептида при рН выше, чем pI, будет отрицательным, а суммарный заряд полипептида при рН ниже, чем pI, будет положительным.- 13 042163 (0). In the case of a polypeptide with different charged functional groups, the net charge of the polypeptide as a whole is 0 at the point where the pH value is the same as the pI value. The net charge of a polypeptide at a pH higher than pI will be negative, and the net charge of a polypeptide at a pH lower than pI will be positive.

Значения pI могут быть определены в геле с фиксированным градиентом рН, состоящем из полиакриламида, крахмала или агарозы, методом изоэлектрического фокусирования или могут быть определены, например, исходя из аминокислотной последовательности, с использованием программного обеспечения pI/MW (http://expasy.org/tools/pi_tool.html; Gasteiger et al., 2003) на сервере ExPASy.pI values can be determined in a gel with a fixed pH gradient consisting of polyacrylamide, starch or agarose by isoelectric focusing or can be determined, for example, from amino acid sequence using the pI/MW software (http://expasy.org /tools/pi_tool.html; Gasteiger et al., 2003) on the ExPASy server.

Использованный в данном описании термин измененная pI относится к pI, которая отличается от pI для нативного глюкагона вследствие замены части аминокислотной последовательности нативного глюкагона на аминокислотный остаток, имеющий отрицательный заряд или положительный заряд, т.е. к более низкому или более высокому значению pI. Пептид с такой измененной pI может проявлять улучшенную растворимость и/или высокую стабильность при нейтральных рН в виде производного глюкагона, но конкретно этим не ограничивается.As used herein, the term altered pI refers to a pI that differs from that of native glucagon due to a substitution of a portion of the amino acid sequence of native glucagon with an amino acid residue having a negative charge or a positive charge, i.e. to a lower or higher pI value. A peptide with such an altered pI may exhibit improved solubility and/or high stability at neutral pH as a glucagon derivative, but is not specifically limited to this.

Более конкретно, производное глюкагона может иметь измененное значение pI, a не значение pI (6,8) для нативного глюкагона, и еще более конкретно, может иметь значение pI меньше 6,8, конкретнее 6,7 или меньше, конкретнее 6,5 или меньше и в дополнение к этому значение pI, превышающее 6,8, 7 или больше, более конкретно 7,5 или больше, но этими значениями не ограничивается, и любое значение pI, отличающееся от значения pI для нативного глюкагона, будет входить в объем настоящего изобретения.More specifically, the glucagon derivative may have an altered pI value, rather than a pI (6.8) value for native glucagon, and even more specifically, may have a pI value of less than 6.8, more specifically 6.7 or less, more specifically 6.5 or less than and in addition, a pI value greater than 6.8, 7 or greater, more specifically 7.5 or greater, but not limited to these values, and any pI value different from the pI value for native glucagon will be within the scope of this inventions.

В частности, когда значение pI отличается от значения pI для нативного глюкагона, и поэтому проявляется улучшенная растворимость при нейтральных рН по сравнению с растворимостью нативного глюкагона, демонстрируя тем самым низкий уровень агрегации, тогда это производное тем более будет входить в объем настоящего изобретения.In particular, when the pI value is different from the pI value of native glucagon, and therefore an improved solubility at neutral pH is exhibited compared to the solubility of native glucagon, thereby showing a low level of aggregation, then this derivative will all the more be within the scope of the present invention.

Более конкретно, производное глюкагона может иметь значение pI в диапазоне от 4 до 6,5 и/или от 7 до 9,5, в частности, от 7,5 до 9,5 и конкретнее от 8,0 до 9,3, но значение pI этим не ограничивается. В этом случае благодаря более низкому или более высокому значению pI по сравнению со значением pI для нативного глюкагона, может быть продемонстрирована улучшенная растворимость и высокая стабильность при нейтральных рН по сравнению с таковыми для нативного глюкагона, но без конкретного ограничения этим.More specifically, the glucagon derivative may have a pI value ranging from 4 to 6.5 and/or from 7 to 9.5, in particular from 7.5 to 9.5 and more specifically from 8.0 to 9.3, but the pI value is not limited to this. In this case, due to the lower or higher pI value compared to the pI value of native glucagon, improved solubility and high stability at neutral pH compared to those of native glucagon can be demonstrated, but not specifically limited to this.

В частности, производное нативного глюкагона может быть модифицировано любым методом замены, вставки, делеции и модификации или их комбинации в части аминокислот нативного глюкагона.In particular, the native glucagon derivative may be modified by any method of substitution, insertion, deletion and modification, or combinations thereof, in terms of native glucagon amino acids.

Примеры производных глюкагона, полученных комбинацией вышеупомянутых методов, включают пептид, который отличается по меньшей мере одним аминокислотным остатком аминокислотной последовательности по сравнению с нативным глюкагоном, и в котором дезаминирован N-концевой аминокислотный остаток, имеющий функцию активирования рецептора глюкагона, без ограничения, и производные нативного глюкагона могут быть получены в результате осуществления комбинации различных методов получения производных.Examples of glucagon derivatives obtained by a combination of the above methods include a peptide that differs in at least one amino acid residue of an amino acid sequence compared to native glucagon, and in which an N-terminal amino acid residue having the function of activating the glucagon receptor is deaminated, without limitation, and derivatives of native glucagon can be obtained as a result of the implementation of a combination of various methods for obtaining derivatives.

Кроме того, такая модификация с целью получения производных нативного глюкагона может включать все модификации с использованием аминокислот L-типа или D-типа и/или аминокислот неприродного типа; и/или модификацию нативной последовательности, например, модификацию функциональной группы, образование межмолекулярных ковалентных связей (например, образование кольца между боковыми цепями), метилирование, ацилирование, убиквитинилирование, фосфорилирование, аминогексанирование, биотинилирование и так далее. Кроме того, модификация также может включать замены в ненативных соединениях.In addition, such modification in order to obtain derivatives of native glucagon may include all modifications using L-type or D-type amino acids and/or amino acids of non-natural type; and/or native sequence modification, eg, functional group modification, intermolecular covalent bonding (eg, ring formation between side chains), methylation, acylation, ubiquitinylation, phosphorylation, aminohexanation, biotinylation, and so on. In addition, the modification may also include substitutions in non-native compounds.

Кроме того, модификация также может включать все модификации, когда к амино- и/или карбоксиконцу нативного глюкагона добавлены одна или более аминокислот.In addition, the modification may also include all modifications where one or more amino acids are added to the amino and/or carboxy terminus of native glucagon.

В ходе замены или вставки аминокислот можно использовать не только 20 аминокислот, обычно присутствующих в белках человека, но и атипичные или не встречающиеся в природе аминокислоты. Коммерческие источники атипичных аминокислот могут включать Sigma-Aldrich, ChemPep Inc. и Genzyme Pharmaceuticals. Пептиды, содержащие эти аминокислоты, и атипичные пептидные последовательности, могут быть синтезированы и приобретены у коммерческих поставщиков, например, American Peptide Company, Bachem (США) или Anygen (Корея).In addition to the 20 amino acids commonly found in human proteins, atypical or non-naturally occurring amino acids can be used during amino acid replacement or insertion. Commercial sources of atypical amino acids may include Sigma-Aldrich, ChemPep Inc. and Genzyme Pharmaceuticals. Peptides containing these amino acids and atypical peptide sequences can be synthesized and purchased from commercial suppliers such as American Peptide Company, Bachem (USA) or Anygen (Korea).

Можно использовать производные аминокислот, которые также могут быть получены аналогичным образом, например, 4-имидазоуксусную кислоту и так далее.Derivatives of amino acids can be used, which can also be obtained in a similar way, for example, 4-imidazoacetic acid and so on.

Поскольку глюкагон имеет рН примерно 7, он не растворяется в растворе, имеющем физиологическое значение рН (рН 4-8), и имеет тенденцию осаждаться при нейтральных рН. В водном растворе с рН 3 или ниже глюкагон растворяется на начальном стадии, но осаждается через один час с образованием геля. Поскольку гелеобразный глюкагон состоит в основном из образованных β-листами фибрилл, то при введении осажденного таким образом глюкагона через инъекционную иглу или посредством внутривенной инъекции будут закупориваться кровеносные сосуды, и, следовательно, он будет непригоден для применения в качестве инъекционного агента. Для того, чтобы замедлить процесс осаждения, обычно используют кислотные (рН 2-4) препараты, и в этом случае глюкагон может оставаться в относительноSince glucagon has a pH of about 7, it does not dissolve in a solution having a physiological pH (pH 4-8) and tends to precipitate at neutral pH. In an aqueous solution of pH 3 or less, glucagon dissolves initially but precipitates after one hour to form a gel. Since gel-like glucagon consists mainly of β-sheet fibrils, administration of the thus precipitated glucagon through an injection needle or by intravenous injection will clog blood vessels and therefore be unsuitable for use as an injectable agent. In order to slow down the precipitation process, acidic (pH 2-4) preparations are usually used, in which case glucagon can remain at a relatively

- 14 042163 неагрегированном состоянии в течение короткого периода времени. Однако глюкагон может образовывать фибриллы очень быстро при низких значениях рН, и поэтому такие кислотные препараты должны быть введены инъекцией сразу же после их приготовления.- 14 042163 non-aggregated state for a short period of time. However, glucagon can form fibrils very rapidly at low pH and therefore such acid preparations must be injected immediately after preparation.

В этой связи, авторы настоящего изобретения разработали производные глюкагона, характеризующиеся профилями длительного действия, путем изменения pI нативного глюкагона посредством замены аминокислотных остатков, имеющих отрицательные заряды и положительные заряды. Производные глюкагона по настоящему изобретению, благодаря наличию у него измененной pI по сравнению с pI нативного глюкагона, характеризуются улучшенной растворимостью и/или высокой стабильностью при нейтральных рН по сравнению с нативным глюкагоном.In this regard, the authors of the present invention have developed derivatives of glucagon, characterized by long-acting profiles, by changing the pI of native glucagon by replacing amino acid residues having negative charges and positive charges. The glucagon derivatives of the present invention, due to its altered pI compared to that of native glucagon, are characterized by improved solubility and/or high stability at neutral pH compared to native glucagon.

В конкретном воплощении настоящего изобретения производное глюкагона может представлять собой пептид, который содержит аминокислотную последовательность следующей ниже общей формулы 1:In a specific embodiment of the present invention, the glucagon derivative may be a peptide that contains the amino acid sequence of the following general formula 1 below:

X1-X2-QGTF-X7-SD-X10-S-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-F-X23-X24W-L-X27-X28-X29-X30 (общая формула 1, SEQ Ш NO: 45).( general formula 1, SEQ W NO: 45).

В приведенной выше формулеIn the above formula

X1 представляет собой гистидин, дезаминогистидил, N-диметилгистидил, βгидроксиимидазопропионил, 4-имидазоацетил, β-карбоксиимидазопропионил, триптофан или тирозин либо отсутствует;X1 is histidine, deaminohistidyl, N-dimethylhistidyl, β-hydroxyimidazopropionyl, 4-imidazoacetyl, β-carboxyimidazopropionyl, tryptophan, or tyrosine, or is absent;

Х2 представляет собой α-метил-глутаминовую кислоту, аминоизомасляную кислоту (Aib), Dаланин, глицин, Sar (N-метилглицин), серин или D-серин;X2 is α-methyl-glutamic acid, aminoisobutyric acid (Aib), Dalanine, glycine, Sar (N-methylglycine), serine or D-serine;

Х7 представляет собой треонин, валин или цистеин;X7 is threonine, valine or cysteine;

X10 представляет собой тирозин или цистеин;X10 is tyrosine or cysteine;

X12 представляет собой лизин или цистеин;X12 is lysine or cysteine;

X13 представляет собой тирозин или цистеин;X13 is tyrosine or cysteine;

X14 представляет собой лейцин или цистеин;X14 is leucine or cysteine;

X15 представляет собой аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту или цистеин;X15 is aspartic acid, glutamic acid or cysteine;

X16 представляет собой глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, серин, α-метилглутаминовую кислоту или цистеин либо отсутствует;X16 is glutamic acid, aspartic acid, serine, α-methylglutamic acid, or cysteine, or is absent;

X17 представляет собой аспарагиновую кислоту, глутамин, глутаминовую кислоту, лизин, аргинин, серин, цистеин или валин либо отсутствует;X17 is aspartic acid, glutamine, glutamic acid, lysine, arginine, serine, cysteine, or valine, or is absent;

X18 представляет собой аланин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, аргинин, валин или цистеин либо отсутствует;X18 is alanine, aspartic acid, glutamic acid, arginine, valine, or cysteine, or is absent;

X19 представляет собой аланин, аргинин, серин, валин или цистеин либо отсутствует;X19 is alanine, arginine, serine, valine or cysteine, or is absent;

Х20 представляет собой лизин, гистидин, глутамин, аспарагиновую кислоту, аргинин, α-метилглутаминовую кислоту или цистеин либо отсутствует;X20 is lysine, histidine, glutamine, aspartic acid, arginine, α-methylglutamic acid, or cysteine, or is absent;

Х21 представляет собой аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, лейцин, валин или цистеин либо отсутствует;X21 is aspartic acid, glutamic acid, leucine, valine, or cysteine, or is absent;

Х23 представляет собой изолейцин, валин или аргинин либо отсутствует;X23 is isoleucine, valine, or arginine, or is absent;

Х24 представляет собой валин, аргинин, аланин, цистеин, глутаминовую кислоту, лизин, глутамин, α-метил-глутаминовую кислоту или лейцин либо отсутствует;X24 is valine, arginine, alanine, cysteine, glutamic acid, lysine, glutamine, α-methyl-glutamic acid, or leucine, or is absent;

Х27 представляет собой изолейцин, валин, аланин, лизин, метионин, глутамин или аргинин либо отсутствует;X27 is isoleucine, valine, alanine, lysine, methionine, glutamine, or arginine, or is absent;

Х28 представляет собой глутамин, лизин, аспарагин или аргинин либо отсутствует;X28 is glutamine, lysine, asparagine or arginine, or is absent;

Х29 представляет собой лизин, аланин, глицин или треонин либо отсутствует; иX29 is lysine, alanine, glycine or threonine, or is absent; And

X30 представляет собой цистеин или отсутствует;X30 is cysteine or absent;

Более конкретно, в общей формуле 1More specifically, in the general formula 1

X1 представляет собой гистидин, триптофан или тирозин либо отсутствует;X1 is histidine, tryptophan or tyrosine, or is absent;

Х2 представляет собой серин или аминоизомасляную кислоту (Aib);X2 is serine or aminoisobutyric acid (Aib);

X15 представляет собой аспарагиновую кислоту или цистеин;X15 is aspartic acid or cysteine;

X16 представляет собой глутаминовую кислоту, серин или цистеин;X16 is glutamic acid, serine or cysteine;

X17 представляет собой аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, лизин, аргинин, серин, цистеин или валин;X17 is aspartic acid, glutamic acid, lysine, arginine, serine, cysteine or valine;

X18 представляет собой аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, аргинин или цистеин;X18 is aspartic acid, glutamic acid, arginine or cysteine;

X19 представляет собой аланин или цистеин;X19 is alanine or cysteine;

- 15 042163- 15 042163

Х20 представляет собой глутамин, аспарагиновую кислоту, лизин или цистеин;X20 is glutamine, aspartic acid, lysine or cysteine;

Х21 представляет собой аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, лейцин, валин или цистеин;X21 is aspartic acid, glutamic acid, leucine, valine or cysteine;

Х23 представляет собой изолейцин, валин или аргинин;X23 is isoleucine, valine or arginine;

Х24 представляет собой валин, аргинин, аланин, глутаминовую кислоту, лизин, глутамин или лейцин;X24 is valine, arginine, alanine, glutamic acid, lysine, glutamine or leucine;

Х27 представляет собой изолейцин, валин, аланин, метионин, глутамин или аргинин;X27 is isoleucine, valine, alanine, methionine, glutamine or arginine;

Х28 представляет собой глутамин, лизин, аспарагин или аргинин;X28 is glutamine, lysine, asparagine or arginine;

Х29 представляет собой треонин; иX29 is threonine; And

X30 представляет собой цистеин или отсутствует при условии, что когда аминокислотная последовательность общей формулы 1 идентична SEQ ID NO: 1, тогда она исключена.X30 is cysteine or absent, provided that when the amino acid sequence of general formula 1 is identical to SEQ ID NO: 1, then it is excluded.

Например, пептид может представлять собой пептид, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-44, и, в частности, пептид, который (по существу) состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-44, но этим не ограничивается.For example, the peptide may be a peptide that contains an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2-44, and in particular, a peptide that (essentially) consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2-44, but not limited to.

Кроме того, хотя в настоящем изобретении пептид описан как пептид, состоящий из конкретной SEQ ID NO, такое выражение не исключает наличия мутации в пептиде, которая может иметь место в результате присоединения несмысловой последовательности вверх по течению или вниз по течению от аминокислотной последовательности с соответствующей SEQ ID NO, или наличия встречающейся в природе мутации, или наличия молчащей мутации, при условии, что пептид, имеющий такую мутацию, обладает активностью, такой же, как активность пептида, или соответствующей активности пептида, который состоит из аминокислотной последовательности с соответствующей SEQ ID NO. Даже когда имеет место присоединение последовательности или мутация, пептид очевидным образом входит в объем настоящего изобретения.In addition, although in the present invention a peptide is described as a peptide consisting of a specific SEQ ID NO, such expression does not exclude the presence of a mutation in the peptide, which may result from the addition of a non-sense sequence upstream or downstream of the amino acid sequence with the corresponding SEQ ID NO, or the presence of a naturally occurring mutation, or the presence of a silent mutation, provided that the peptide having such a mutation has the same activity as the activity of the peptide, or the corresponding activity of the peptide, which consists of the amino acid sequence with the corresponding SEQ ID NO . Even when there is a sequence addition or mutation, the peptide is clearly within the scope of the present invention.

Все описанное выше также может быть применено к другим конкретным воплощениям или аспектам настоящего изобретения, но без ограничения этим.Everything described above can also be applied to other specific embodiments or aspects of the present invention, but without limitation.

В частности, в приведенной выше общей формуле 1In particular, in the above general formula 1

X1 может представлять собой гистидин, триптофан или тирозин;X1 may be histidine, tryptophan or tyrosine;

Х2 может представлять собой серин или аминоизомасляную кислоту (Aib);X2 may be serine or aminoisobutyric acid (Aib);

Х7 может представлять собой цистеин, треонин или валин;X7 may be cysteine, threonine or valine;

X10 может представлять собой тирозин или цистеин;X10 may be tyrosine or cysteine;

X12 может представлять собой лизин или цистеин;X12 may be lysine or cysteine;

X13 может представлять собой тирозин или цистеин;X13 may be tyrosine or cysteine;

X14 может представлять собой лейцин или цистеин;X14 may be leucine or cysteine;

X15 может представлять собой аспарагиновую кислоту или цистеин;X15 may be aspartic acid or cysteine;

X16 может представлять собой глутаминовую кислоту, серин или цистеин;X16 may be glutamic acid, serine or cysteine;

X17 может представлять собой глутаминовую кислоту, лизин, аргинин, цистеин или валин;X17 may be glutamic acid, lysine, arginine, cysteine or valine;

X18 может представлять собой аргинин или цистеин;X18 may be arginine or cysteine;

X19 может представлять собой аланин или цистеин;X19 may be alanine or cysteine;

Х20 может представлять собой глутамин или лизин;X20 may be glutamine or lysine;

Х21 может представлять собой аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, валин или цистеин;X21 may be aspartic acid, glutamic acid, valine or cysteine;

Х23 может представлять собой валин;X23 may be valine;

Х24 может представлять собой валин или глутамин;X24 may be valine or glutamine;

Х27 может представлять собой метионин;X27 may be methionine;

Х28 может представлять собой аспарагин или аргинин;X28 may be asparagine or arginine;

Х29 может представлять собой треонин; иX29 may be threonine; And

X30 может представлять собой цистеин или отсутствует.X30 may or may not be cysteine.

Например, пептид может представлять собой пептид, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 11-17, 19-27, 29, 31, 33 и 35-44, и, в частности, пептид, который (по существу) состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 11-17, 19-27, 29, 31, 33 и 35-44, но этим не ограничивается.For example, the peptide may be a peptide that contains an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3, 11-17, 19-27, 29, 31, 33, and 35-44, and in particular a peptide which (essentially) consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3, 11-17, 19-27, 29, 31, 33 and 35-44, but is not limited to this.

X1 может представлять собой тирозин;X1 may be tyrosine;

Х2 может представлять собой аминоизомасляную кислоту (Aib);X2 may be aminoisobutyric acid (Aib);

X12 может представлять собой лизин;X12 may be a lysine;

- 16 042163- 16 042163

X17 может представлять собой лизин, аргинин, цистеин или валин;X17 may be lysine, arginine, cysteine or valine;

Х21 может представлять собой аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту или цистеин;X21 may be aspartic acid, glutamic acid or cysteine;

Х24 может представлять собой глутамин;X24 may be glutamine;

X30 может представлять собой цистеин или отсутствует, при условии, что когда аминокислотная последовательность общей формулы 1 идентична SEQ ID NO: 1, тогда она исключена.X30 may be cysteine or absent, provided that when the amino acid sequence of general formula 1 is identical to SEQ ID NO: 1, then it is excluded.

Например, пептид может представлять собой пептид, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12, 14, 17, 19-25, 27, 29, 33, 35-38, 40-42 и 44, и, в частности, пептид, который (по существу) состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12, 14, 17, 19-25, 27, 29, 33, 35-38, 40-42 и 44, но этим не ограничивается.For example, the peptide may be a peptide that contains an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 12, 14, 17, 19-25, 27, 29, 33, 35-38, 40-42, and 44, and in particular, a peptide that (essentially) consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 12, 14, 17, 19-25, 27, 29, 33, 35-38, 40-42 and 44, but is not limited to this.

В частности, в общей формуле 1In particular, in the general formula 1

X1 может представлять собой гистидин, триптофан или тирозин либо отсутствует;X1 may be histidine, tryptophan or tyrosine or absent;

Х7 может представлять собой треонин, валин или цистеин;X7 may be threonine, valine or cysteine;

X17 может представлять собой аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, лизин, аргинин, серин, цистеин или валин;X17 may be aspartic acid, glutamic acid, lysine, arginine, serine, cysteine or valine;

X18 может представлять собой аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, аргинин или цистеин;X18 may be aspartic acid, glutamic acid, arginine or cysteine;

Х20 может представлять собой глутамин, аспарагиновую кислоту или лизин;X20 may be glutamine, aspartic acid or lysine;

Х21 может представлять собой аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту;X21 may be aspartic acid or glutamic acid;

Х27 может представлять собой изолейцин или метионин;X27 may be isoleucine or methionine;

X30 может представлять собой цистеин или может отсутствовать, при условии, что когда аминокислотная последовательность общей формулы 1 идентична SEQ ID NO: 1, тогда она исключена.X30 may be cysteine or may be absent, provided that when the amino acid sequence of general formula 1 is identical to SEQ ID NO: 1, then it is excluded.

Например, пептид может представлять собой пептид, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-13, 15, 17, 20-24, 26-30 и 32-44, и, в частности, пептид, который (по существу) состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-13, 15, 17, 20-24, 26-30 и 32-44, но этим не ограничивается.For example, the peptide may be a peptide that contains an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2-13, 15, 17, 20-24, 26-30, and 32-44, and in particular a peptide which (essentially) consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of but not limited to SEQ ID NOs: 2-13, 15, 17, 20-24, 26-30 and 32-44.

Х7 может представлять собой треонин;X7 may be threonine;

X10 может представлять собой тирозин;X10 may be tyrosine;

X13 может представлять собой тирозин;X13 may be tyrosine;

X14 может представлять собой лейцин;X14 may be leucine;

X17 может представлять собой лизин или аргинин;X17 may be lysine or arginine;

X18 может представлять собой аргинин;X18 may be arginine;

X19 может представлять собой аланин;X19 may be an alanine;

Х20 может представлять собой глутамин, цистеин или лизин;X20 may be glutamine, cysteine or lysine;

Х21 может представлять собой аспарагиновую кислоту, цистеин, валин или глутаминовую кислоту;X21 may be aspartic acid, cysteine, valine or glutamic acid;

- 17 042163- 17 042163

Х23 может представлять собой валин или аргинин;X23 may be valine or arginine;

Х24 может представлять собой глутамин или лейцин;X24 may be glutamine or leucine;

X30 может отсутствовать.X30 may be missing.

Например, пептид может представлять собой пептид, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, 16, 18, 19, 25 и 31, и, в частности, пептид, который (по существу) состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, 16, 18, 19, 25 и 31, но этим не ограничивается.For example, a peptide may be a peptide that contains an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 19, 25, and 31, and in particular a peptide that (essentially) consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 14, 16, 18, 19, 25 and 31, but not limited to this.

Более конкретно, пептид может представлять собой пептид, который содержит аминокислотную последовательность следующей общей формулы 2:More specifically, the peptide may be a peptide that contains the amino acid sequence of the following general formula 2:

Y-Aib-QGTF-X7-SD-X10-S-X12-Y-L-X15-X16-X17-R-A-X20-X21-F-V-X24-W-L-M-N-TХЗО (общая формула 2, SEQ ID NO: 46).Y-Aib-QGTF-X7-SD-X10-S-X12-Y-L-X15-X16-X17-R-A-X20-X21-F-V-X24-W-L-M-N-TX30 (general formula 2, SEQ ID NO: 46).

В общей формуле 2In general formula 2

X16 может представлять собой глутаминовую кислоту или серин;X16 may be glutamic acid or serine;

Х24 может представлять собой валин или глутамин; иX24 may be valine or glutamine; And

X30 может представлять собой цистеин или может отсутствовать.X30 may be cysteine or may be absent.

Например, пептид может представлять собой пептид, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12, 13, 15 и 36-44, и, в частности, пептид, который (по существу) состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12, 13, 15 и 36-44, но этим не ограничивается. Более конкретно, пептид может представлять собой пептид, который содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 37, или (по существу) состоит из соответствующей аминокислотной последовательности, но этим не ограничивается.For example, a peptide may be a peptide that contains an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 12, 13, 15 and 36-44, and in particular, a peptide that (essentially) consists of an amino acid sequence, selected from the group consisting of SEQ ID NO: 12, 13, 15 and 36-44, but not limited to this. More specifically, the peptide may be a peptide that contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 20, or SEQ ID NO: 37, or (essentially) consists of the corresponding amino acid sequence, but is not limited to this.

В частности, в общей формуле 2In particular, in the general formula 2

X15 может представлять собой аспарагиновую кислоту;X15 may be aspartic acid;

Х24 может представлять собой глутамин; иX24 may be glutamine; And

X30 может представлять собой цистеин или может отсутствовать, но конкретно этим не ограничивается.X30 may be cysteine or may be absent, but is not specifically limited to this.

Например, пептид может представлять собой пептид, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12, 36-38, 40-42 и 44, и, в частности, пептид, который (по существу) состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12, 36-38, 40-42 и 44, но этим не ограничивается.For example, the peptide may be a peptide that contains an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 12, 36-38, 40-42 and 44, and in particular a peptide that (essentially) consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 12, 36-38, 40-42 and 44, but not limited to this.

Однако среди выделенных пептидов, пептиды, соответствующие SEQ ID NO: 2-11, 14, 16-35, 49 и 50, и, в частности, пептиды, соответствующие SEQ ID NO: 19, 33, 49 и 50, могут быть исключены из заявленного объема, но без конкретного ограничения этим, и все пептиды, описанные в формуле изобретения, должны входить в объем настоящего изобретения, если не указано иное.However, among the isolated peptides, peptides corresponding to SEQ ID NOs: 2-11, 14, 16-35, 49 and 50, and in particular peptides corresponding to SEQ ID NOs: 19, 33, 49 and 50, may be excluded from the stated scope, but without specific limitation to this, and all peptides described in the claims, should be included in the scope of the present invention, unless otherwise indicated.

Производное глюкагона, описанное выше, может включать внутримолекулярный мостик (например, ковалентную перекрестную сшивку или нековалентную перекрестную сшивку), и, в частности, может быть в форме, включая кольцо. Например, производное глюкагона может быть в такой форме, когда кольцо образуется между 16-й и 20-й аминокислотами производного глюкагона, но конкретно этим не ограничивается.The glucagon derivative described above may include an intramolecular bridge (eg, covalent cross-linking or non-covalent cross-linking), and in particular may be in a form including a ring. For example, the glucagon derivative may be in such a form that a ring is formed between the 16th and 20th amino acids of the glucagon derivative, but is not specifically limited to this.

Неограничивающие примеры кольца могут включать перекрестную сшивку с образованием лактама (или лактамного кольца).Non-limiting examples of the ring may include cross-linking to form a lactam (or lactam ring).

Помимо этого, производное глюкагона включает все производные, которые модифицированы посредством включения аминокислоты, способной образовывать кольцо в желаемом месте для того, чтобыIn addition, a glucagon derivative includes all derivatives that are modified to include an amino acid capable of forming a ring at the desired location in order to

- 18 042163 включать кольцо.- 18 042163 include ring.

Кольцо может быть образовано между боковыми цепями аминокислот в пределах производного глюкагона (например, в форме кольца, образованного между боковой цепью лизина и боковой цепью глутаминовой кислоты), но конкретно этим не ограничивается.A ring may be formed between amino acid side chains within a glucagon derivative (eg, in the form of a ring formed between a lysine side chain and a glutamic acid side chain), but is not specifically limited to this.

Например, пептид, содержащий аминокислотную последовательность общей формулы 1 или 2, может представлять собой пептид, в котором каждая аминокислота в каждой паре аминокислот из пар аминокислот Х10 и X14, Х12 и X16, Х16 и Х20, X17 и Х21, Х20 и Х24, и Х24 и Х28 в общей формуле 1 или 2 может быть заменена на глутаминовую кислоту или лизин, соответственно, но этим не ограничивается. В X_n (n представляет собой целое число), п относится к положению аминокислоты, начиная от N-конца предложенной аминокислотной последовательности.For example, a peptide containing an amino acid sequence of general formula 1 or 2 may be a peptide in which each amino acid in each amino acid pair of amino acid pairs X10 and X14, X12 and X16, X16 and X20, X17 and X21, X20 and X24, and X24 and X28 in the general formula 1 or 2 can be replaced by glutamic acid or lysine, respectively, but is not limited to this. In X, _n (n is an integer), n refers to the amino acid position starting from the N-terminus of the proposed amino acid sequence.

Кроме того, пептид, содержащий аминокислотную последовательность общей формулы 1 или 2, может представлять собой пептид, в котором каждая аминокислота в каждой паре аминокислот X12 и X16, или паре аминокислот X16 и Х20, или паре аминокислот X17 и Х21 соответственно заменена на глутаминовую кислоту или лизин, которые способны образовывать кольцо.In addition, the peptide containing the amino acid sequence of the general formula 1 or 2 may be a peptide in which each amino acid in each amino acid pair X12 and X16, or amino acid pair X16 and X20, or amino acid pair X17 and X21, respectively, is replaced by glutamic acid or lysine, which are able to form a ring.

Кроме того, в общей формуле 1 или 2 пептид может представлять собой пептид, в котором образовано кольцо (например, лактамное кольцо) между каждой из аминокислот в каждой паре аминокислот из пар аминокислот Х10 и X14, Х12 и X16, Х16 и Х20, X17 и Х21, Х20 и Х24, и Х24 и Х28, но этим не ограничивается.In addition, in the general formula 1 or 2, the peptide may be a peptide in which a ring (for example, a lactam ring) is formed between each of the amino acids in each amino acid pair of the amino acid pairs X10 and X14, X12 and X16, X16 and X20, X17 and X21, X20 and X24, and X24 and X28, but not limited to this.

Кроме того, в общей формуле 1 или 2, X16 может представлять собой глутаминовую кислоту, Х20 может представлять собой лизин, и боковые цепи X16 и Х20 могут образовывать лактамное кольцо, но этим они не ограничиваются.In addition, in the general formula 1 or 2, X16 may be glutamic acid, X20 may be lysine, and the side chains of X16 and X20 may form a lactam ring, but are not limited to this.

Кроме того, пептид по настоящему изобретению может быть в такой форме, где N-конец и/или Сконец не будет модифицирован, однако, в объем пептидов по настоящему изобретению также могут быть включены такие варианты, где амино-конец и/или карбокси-конец и т.д. пептида будет химически модифицирован, или защищен органическими группами, или к концу данного пептида для его защиты от протеаз in vivo будут добавлены аминокислоты, при повышении при этом его стабильности. В случае, когда С-конец не модифицирован, этот конец пептида по настоящему изобретению может иметь карбоксильную группу, но конкретно этим не ограничивается.In addition, the peptide of the present invention may be in such a form where the N-terminus and/or the C-terminus will not be modified, however, such variants may also be included in the scope of the peptides of the present invention, where the amino-terminus and/or carboxy-terminus etc. the peptide will be chemically modified, or protected by organic groups, or amino acids will be added to the end of this peptide to protect it from proteases in vivo, while increasing its stability. In the case where the C-terminus is not modified, this end of the peptide of the present invention may have a carboxyl group, but is not specifically limited to this.

В частности, в случае полученного химическим синтезом пептида его N- и С-концы обладают электрическим зарядом, и, таким образом, N- и С-концы пептида могут быть ацетилированы и/или амидированы, но пептид конкретно этим не ограничивается.In particular, in the case of a chemically synthesized peptide, its N- and C-termini have an electrical charge, and thus the N- and C-terminus of the peptide can be acetylated and/or amidated, but the peptide is not specifically limited to this.

Если в настоящем изобретении не указано иное, то описание в разделе Подробное описание или в формуле изобретения в отношении пептида по настоящему изобретению или конъюгата, в котором такой пептид ковалентно связан с биосовместимым веществом, может быть применимо к формам, которые включают не только соответствующий пептид или конъюгат, но также соли соответствующего пептида или конъюгата (например, их фармацевтически приемлемые соли) или их сольваты. Соответственно, даже в том случае, когда пептид или конъюгат описан в настоящем изобретении, такое описание также может быть в равной степени применимо к его конкретной соли, его конкретному сольвату и конкретному сольвату его конкретной соли. Эти соли, например, могут быть в форме, в которой используют любые фармацевтически приемлемые соли. Вид соли, в частности, не органичивается. Однако солью предпочтительно является соль, которая безвредна и эффективна для субъекта, например млекопитающего, но конкретно этим не ограничивается.Unless otherwise indicated in the present invention, the description in the Detailed Description section or in the claims in relation to the peptide of the present invention or a conjugate in which such a peptide is covalently linked to a biocompatible substance may be applicable to forms that include not only the corresponding peptide or conjugate, but also salts of the corresponding peptide or conjugate (eg, pharmaceutically acceptable salts thereof) or solvates thereof. Accordingly, even when a peptide or conjugate is described in the present invention, such description may also be equally applicable to its particular salt, its particular solvate, and the particular solvate of its particular salt. These salts, for example, may be in the form in which any pharmaceutically acceptable salts are used. The type of salt, in particular, is not limited. However, the salt is preferably a salt that is harmless and effective for a subject such as a mammal, but is not specifically limited to this.

Термин фармацевтически приемлемый относится к веществу, которое может быть с эффективностью использовано для предполагаемого применения в рамках фармако-медицинского заключения без вызывания чрезмерной токсичности, раздражения, аллергических реакций и так далее.The term pharmaceutically acceptable refers to a substance that can be effectively used for its intended use within the scope of pharmacological judgment without causing undue toxicity, irritation, allergic reactions, and so on.

Использованный в данном описании термин фармацевтически приемлемая соль относится к соли, происходящей из фармацевтически приемлемых неорганических кислот, органических кислот или оснований. Примеры подходящих солей могут включать соли соляной кислоты, бромноватой кислоты, серной кислоты, азотной кислоты, перхлорной кислоты, фумаровой кислоты, малеиновой кислоты, фосфорной кислоты, гликолевой кислоты, молочной кислоты, салициловой кислоты, янтарной кислоты, толуолпара-сульфоновой кислоты, винной кислоты, уксусной кислоты, лимонной кислоты, метансульфоновой кислоты, муравьиной кислоты, бензойной кислоты, малоновой кислоты, нафталин-2-сульфоновой кислоты, бензолсульфоновой кислоты и так далее. Примеры солей, происходящих из подходящих оснований, могут включать соли щелочных металлов, таких как натрий, калий и т.д.; щелочноземельных металлов, таких как магний; аммония и так далее.Used in this description, the term pharmaceutically acceptable salt refers to a salt derived from pharmaceutically acceptable inorganic acids, organic acids or bases. Examples of suitable salts may include salts of hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid, nitric acid, perchloric acid, fumaric acid, maleic acid, phosphoric acid, glycolic acid, lactic acid, salicylic acid, succinic acid, toluene parasulfonic acid, tartaric acid, acetic acid, citric acid, methanesulfonic acid, formic acid, benzoic acid, malonic acid, naphthalene-2-sulfonic acid, benzenesulfonic acid and so on. Examples of salts derived from suitable bases may include alkali metal salts such as sodium, potassium, etc.; alkaline earth metals such as magnesium; ammonium and so on.

Кроме того, использованный в данном описании термин сольват относится к комплексу, образуемому между пептидом, конъюгатом или их солью по настоящему изобретению и молекулой растворителя.In addition, as used herein, the term solvate refers to a complex formed between a peptide, conjugate, or salt thereof of the present invention and a solvent molecule.

Кроме того, пептид по настоящему изобретению может быть синтезирован методом, хорошо известным в данной области техники, сообразно его длине, например, с помощью автоматического пептидного синтезатора, и может быть получен с использованием генно-инженерной технологии.In addition, the peptide of the present invention can be synthesized by a method well known in the art, according to its length, for example, using an automatic peptide synthesizer, and can be obtained using genetic engineering technology.

В частности, пептид по настоящему изобретению может быть получен стандартным методом синтеIn particular, the peptide of the present invention can be obtained by a standard synthesis method.

- 19 042163 за, с использованием рекомбинантной экспрессионной системы или любым другим методом, известным в данной области техники. Соответственно, производное глюкагона по настоящему изобретению может быть синтезировано различными методами, включая, например, методы, описанные ниже:- 19 042163 for, using a recombinant expression system or any other method known in the art. Accordingly, the glucagon derivative of the present invention can be synthesized by various methods, including, for example, the methods described below:

(а) метод синтеза пептида с использованием постадийного твердофазного или жидкофазного метода либо с использованием сборки фрагментов с последующим выделением и очисткой конечного пептидного продукта; или (б) метод экспрессии нуклеиновокислотной конструкции, кодирующей пептид, в клетке хозяина и извлечения продукта экспрессии из культуры клеток хозяина; или (в) метод осуществления экспрессии нуклеиновокислотной конструкции, кодирующей пептид, в бесклеточной среде in vitro и извлечения из нее продукта экспрессии; или метод получения пептидных фрагментов с использованием любой комбинации методов (а), (б) и (в), с получением пептида путем присоединения пептидных фрагментов друг к другу и затем выделения пептида.(a) a method for synthesizing a peptide using a stepwise solid phase or liquid phase method, or using assembly of fragments, followed by isolation and purification of the final peptide product; or (b) a method for expressing the nucleic acid construct encoding the peptide in a host cell and extracting the expression product from the host cell culture; or (c) a method for expressing a nucleic acid construct encoding a peptide in a cell-free medium in vitro and extracting an expression product therefrom; or a method for obtaining peptide fragments using any combination of methods (a), (b) and (c), obtaining a peptide by attaching peptide fragments to each other and then isolating the peptide.

В более конкретном примере желаемое производное глюкагона может быть получено с использованием генетического преобразования, которое включает приготовление слитого гена, кодирующего слитый белок, содержащий партнера слияния и производное глюкагона, перенос полученного гена в клетку хозяина, экспрессию в форме слитого белка и отщепление производного глюкагона из слитого белка с использованием протеазы или соединения, обладающего способностью к расщеплению белка после разделения. Для этой цели, например, последовательность ДНК, кодирующая аминокислотные остатки, которые могут расщепляться под действием протеазы, такой как фактор Ха или энтерокиназа, CNBr или такого соединения, как гидроксиламин, может быть встроена между ДНК для партнера слияния и полинуклеотидом, кодирующим производное глюкагона.In a more specific example, the desired glucagon derivative can be obtained using genetic manipulation, which includes preparing a fusion gene encoding a fusion protein containing a fusion partner and a glucagon derivative, transferring the resulting gene into a host cell, expressing it in the form of a fusion protein, and cleaving the glucagon derivative from the fusion protein using a protease or a compound having the ability to cleave the protein after separation. For this purpose, for example, a DNA sequence encoding amino acid residues that can be cleaved by a protease such as factor Xa or enterokinase, CNBr, or a compound such as hydroxylamine may be inserted between the fusion partner DNA and the polynucleotide encoding the glucagon derivative.

В более конкретном воплощении производное глюкагона, например, пептид, содержащий аминокислотную последовательность общей формулы 1 или 2, может быть в форме длительно действующего конъюгата, в котором группировка биосовместимого вещества с возможностью увеличения in vivo периода полувыведения пептида присоединена к данному пептиду, но этим не ограничивается. Термин группировка биосовместимого вещества можно использовать взаимозаменяемо с термином носитель.In a more specific embodiment, a glucagon derivative, for example, a peptide containing an amino acid sequence of general formula 1 or 2, may be in the form of a long-acting conjugate in which a group of a biocompatible substance with the possibility of increasing the in vivo half-life of the peptide is attached to this peptide, but is not limited to this. . The term biocompatible substance moiety can be used interchangeably with the term carrier.

В частности, конъюгат содержит пептидную группировку и группировку биосовместимого вещества, которая ковалентно связана с пептидной группировкой, и пептидная группировка может представлять собой такую же последовательность, как и аминокислотная последовательность общей формулы 1 или 2, или последовательность, ее включающую.In particular, the conjugate contains a peptide moiety and a biocompatible substance moiety that is covalently linked to the peptide moiety, and the peptide moiety may be the same sequence as the amino acid sequence of general formula 1 or 2, or a sequence including it.

Использованный в данном описании термин длительно действующий конъюгат, находящийся в форме, когда группировка биосовместимого вещества или носителя связана с физиологически активным веществом (например, производным глюкагона, инсулинотропным пептидом и т.д.), относится к конъюгату, который демонстрирует улучшенную эффективность в отношении продолжительности действия (например, увеличение периода полувыведения in vivo) по сравнению с таковым для физиологически активного вещества, к которому группировка биосовместимого вещества или носителя не присоединена. В длительно действующем конъюгате группировка биосовместимого вещества или носителя может представлять собой группировку, которая ковалентно связана с физиологически активным веществом, но конкретно этим не ограничивается.As used herein, the term long-acting conjugate in the form where the moiety of a biocompatible substance or carrier is associated with a physiologically active substance (e.g., a glucagon derivative, an insulinotropic peptide, etc.) refers to a conjugate that exhibits improved efficacy in terms of duration action (eg, an increase in the half-life in vivo) compared with that of a physiologically active substance, to which the grouping of a biocompatible substance or carrier is not attached. In a long-acting conjugate, the biocompatible substance or carrier moiety may be a moiety that is covalently linked to the physiologically active substance, but is not specifically limited to this.

В конкретном воплощении настоящего изобретения продолжительность эффективного действия вышеупомянутого конъюгата на основе производного глюкагона может увеличиваться по сравнению с нативным глюкагоном или его производным глюкагона, к которому носитель не присоединен.In a specific embodiment of the present invention, the duration of effective action of the aforementioned glucagon derivative conjugate can be increased compared to native glucagon or its glucagon derivative to which no carrier is attached.

Использованный в данном описании термин группировка биосовместимого вещества относится к веществу, которое может быть присоединено к физиологически активному веществу (например, производному глюкагона, инсулинотропному пептида и т.д.) и тем самым может улучшить эффективность в отношении продолжительности действия по сравнению с физиологически активным веществом, к которому группировка биосовместимого вещества или носителя не присоединена. Группировка биосовместимого вещества может представлять собой группировку, которая ковалентно связана с физиологически активным веществом, но конкретно этим не ограничивается.As used herein, the grouping of a biocompatible substance refers to a substance that can be attached to a physiologically active substance (for example, a glucagon derivative, an insulinotropic peptide, etc.) and thereby can improve the efficacy in terms of duration of action compared to a physiologically active substance. to which the grouping of a biocompatible substance or carrier is not attached. The grouping of the biocompatible substance may be a grouping that is covalently linked to the physiologically active substance, but is not specifically limited to this.

Примеры группировки биосовместимого вещества могут включать полимер, жирную кислоту, холестерин, альбумин и его фрагмент, альбуминсвязывающее вещество, полимер из повторяющихся звеньев конкретной аминокислотной последовательности, антитело, фрагмент антитела, FcRn-связывающее вещество, соединительной ткани in vivo или его производное, нуклеотид, фибронектин, трансферрин, сахарид, гепарин и эластин, но этим не ограничиваются.Examples of a grouping of a biocompatible substance may include a polymer, fatty acid, cholesterol, albumin and fragment thereof, albumin binder, polymer of repeating units of a specific amino acid sequence, antibody, antibody fragment, FcRn binding substance, in vivo connective tissue or its derivative, nucleotide, fibronectin , transferrin, saccharide, heparin and elastin, but are not limited to.

Примеры полимера могут представлять собой полимер, выбранный из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахарида, декстрана, поливинил-этилового эфира, биоразлагаемого полимера, липидного полимера, хитина, гиалуроновой кислоты, олигонуклеотида и их комбинации, но конкретно этим не ограничивается.Examples of the polymer may be a polymer selected from the group consisting of polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol-propylene glycol, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaccharide, dextran, polyvinyl ethyl ether, biodegradable polymer, lipid polymer, chitin, hyaluronic acid, oligonucleotide, and combinations thereof, but is not specifically limited to this.

Полиэтиленгликоль (ПЭГ) представляет собой общий термин, включающий все формы гомополимеров этиленгликоля, сополимеры ПЭГ и монометил-замещенные полимеры ПЭГ (мПЭГ), но конкретноPolyethylene glycol (PEG) is a general term that includes all forms of ethylene glycol homopolymers, PEG copolymers, and monomethyl-substituted PEG polymers (mPEG), but specifically

- 20 042163 этим не ограничивается.- 20 042163 is not limited to this.

Кроме того, группировка биосовместимого вещества может включать полиаминокислоты, такие как поли-лизин, поли-аспарагиновая кислота и поли-глутаминовая кислота, но этим не ограничивается.In addition, the biocompatible substance moiety may include, but is not limited to, polyamino acids such as poly-lysine, poly-aspartic acid, and poly-glutamic acid.

Кроме того, жирная кислота может представлять собой кислоту, обладающую аффинностью связывания с альбумином in vivo, но конкретно этим не ограничивается.In addition, the fatty acid may be an acid having a binding affinity for albumin in vivo, but is not specifically limited to this.

В более конкретном воплощении FcRn-связывающее вещество может представлять собой Fcобласть иммуноглобулина и, более конкретно, Fc-область IgG, но конкретно этим не ограничивается.In a more specific embodiment, the FcRn binding agent may be an immunoglobulin Fc region, and more specifically an IgG Fc region, but is not specifically limited to this.

По меньшей мере одна боковая цепь аминокислоты в составе пептида по настоящему изобретению может быть связана с группировкой биосовместимого вещества для повышения его растворимости in vivo, и/или увеличения периода полувыведения, и/или повышения биодоступности. Эти модификации могут снижать выведение терапевтических белков и пептидов.At least one amino acid side chain within a peptide of the present invention may be linked to a moiety of a biocompatible substance to increase its in vivo solubility and/or increase half-life and/or increase bioavailability. These modifications can reduce the excretion of therapeutic proteins and peptides.

Группировка биосовместимого вещества может быть растворимой (амфипатической или гидрофильной), и/или нетоксичной, и/или фармацевтически приемлемой.The grouping of the biocompatible substance may be soluble (amphipatic or hydrophilic) and/or non-toxic and/or pharmaceutically acceptable.

Известным фактом для специалиста в данной области техники является то, что модифицированное таким образом производное глюкагона может проявлять лучший терапевтический эффект по сравнению с нативным глюкагоном. Соответственно, варианты производного глюкагона, описанные выше, также входят в объем настоящего изобретения.It is a known fact for a person skilled in the art that a glucagon derivative thus modified can exhibit a better therapeutic effect compared to native glucagon. Accordingly, the glucagon derivative variants described above are also within the scope of the present invention.

Группировка биосовместимого вещества может быть присоединена к производному глюкагона напрямую или связана с ним посредством линкера. Если группировка биосовместимого вещества связана с производным глюкагона напрямую или посредством линкера, такой связью может быть ковалентная связь.The biocompatible moiety can be attached to the glucagon derivative directly or linked to it via a linker. If the grouping of the biocompatible substance is linked to the glucagon derivative directly or via a linker, such a bond may be a covalent bond.

В частности, линкер может представлять собой пептидный линкер или непептидный линкер.In particular, the linker may be a peptide linker or a non-peptide linker.

Когда линкер представляет собой пептидный линкер, он может включать одну или более аминокислот, например, 1-1000 аминокислот, но конкретно этим не ограничивается. В настоящем изобретении можно использовать разные известные пептидные линкеры (например, включая линкер [GS]x, линкер [GGGS]x и линкер [GGGGS]x и т.д., где х представляет собой натуральное число, равное по меньшей мере 1), но пептидные линкеры этим не ограничиваются.When the linker is a peptide linker, it may include one or more amino acids, such as 1-1000 amino acids, but is not specifically limited to this. Various known peptide linkers can be used in the present invention (for example, including [GS]x linker, [GGGS]x linker and [GGGGS]x linker, etc., where x is a natural number of at least 1), but peptide linkers are not limited to this.

Использованный в данном описании термин непептидный линкер включает в себя биосовместимый полимер, с которым связаны по меньшей мере два повторяющихся звена. Повторяющиеся звенья связаны друг с другом любой ковалентной связью вместо пептидной связи. Непептидный линкер может представлять собой одну структуру, которая образует группировку длительно действующего конъюгата по настоящему изобретению.As used herein, the term non-peptide linker includes a biocompatible polymer to which at least two repeating units are linked. The repeating units are linked to each other by any covalent bond instead of a peptide bond. The non-peptidic linker may be a single structure that forms the moiety of the long acting conjugate of the present invention.

Использованный в данном описании термин непептидный линкер может применяться взаимозаменяемым образом с термином непептидный полимер.As used herein, the term non-peptide linker may be used interchangeably with the term non-peptide polymer.

В конкретном воплощении группировка биосовместимого вещества и пептид могут быть ковалентно связаны посредством непептидного линкера, содержащего реакционноспособную группу, которая может связываться с группировкой биосовместимого вещества (в частности, Fc-областью иммуноглобулина) и пептидом по обоим его концам, соответственно.In a specific embodiment, the biocompatible moiety and the peptide can be covalently linked via a non-peptide linker containing a reactive group that can bind to the biocompatible moiety (in particular, the immunoglobulin Fc region) and the peptide at both ends, respectively.

В частности, непептидный линкер может представлять собой линкер, выбранный из группы, состоящей из жирной кислоты, сахарида, полимера, низкомолекулярного соединения, нуклеотида и их комбинации.In particular, the non-peptide linker may be a linker selected from the group consisting of a fatty acid, a saccharide, a polymer, a small molecule, a nucleotide, and combinations thereof.

Без конкретного органичения, молекулярная масса непептидного полимера, предполагаемого для применения в настоящем изобретении, может находиться в диапазоне от более чем 0 до примерно 100 кДа или меньше, в частности, от примерно 1 до примерно 100 кДа, и более конкретно от примерно 1 до примерно 20 кДа, но этим не ограничивается.Without particular limitation, the molecular weight of the non-peptide polymer contemplated for use in the present invention may range from more than 0 to about 100 kDa or less, in particular from about 1 to about 100 kDa, and more specifically from about 1 to about 20 kDa, but not limited to this.

Без конкретного органичения, непептидный линкер может представлять собой линкер, выбранный из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахарида, декстрана, поливинил-этилового эфира, биоразлагаемого полимера, такого как полимолочная кислота (PLA) и полимолочная-гликолевая кислота (PLGA), липидного полимера, хитина, гиалуроновой кислоты, олигонуклеотида и их комбинация.Without particular limitation, the non-peptidic linker may be a linker selected from the group consisting of polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol/propylene glycol copolymer, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaccharide, dextran, polyvinyl ethyl ether, a biodegradable polymer such as polylactic acid (PLA ) and polylactic-glycolic acid (PLGA), a lipid polymer, chitin, hyaluronic acid, an oligonucleotide, and a combination thereof.

В более конкретном воплощении непептидный полимер может представлять собой полиэтиленгликоль, но этим не ограничивается. Кроме того, производные, которые уже известны в данной области техники, и производные, которые легко могут быть получены по известным в данной области технологиям, входят в объем настоящего изобретения.In a more specific embodiment, the non-peptide polymer may be, but is not limited to, polyethylene glycol. In addition, derivatives that are already known in the art, and derivatives that can be easily obtained by known technologies in the art, are included in the scope of the present invention.

Непептидный линкер, предполагаемый для применения в настоящем изобретении, может представлять собой любой полимер, обладающий устойчивостью к протеазам in vivo, без ограничения. Молекулярная масса непептидного полимера может находиться в диапазоне от более чем 0 до примерно 100 кДа или меньше, в частности, от примерно 1 до примерно 100 кДа, и более конкретно от примерно 1 до примерно 20 кДа, но этим не ограничивается. Кроме того, непептидный линкер по настоящему изобретению, который связан с полипептидом, содержащим Fc-область иммуноглобулина, может включать полимер не только одного типа, но и комбинацию полимеров разных типов.The non-peptide linker contemplated for use in the present invention may be any polymer that is protease resistant in vivo, without limitation. The molecular weight of the non-peptide polymer may range from more than 0 to about 100 kDa or less, in particular, from about 1 to about 100 kDa, and more specifically from about 1 to about 20 kDa, but is not limited to this. In addition, the non-peptide linker of the present invention, which is linked to a polypeptide containing an immunoglobulin Fc region, may include not only one type of polymer, but also a combination of polymers of different types.

- 21 042163- 21 042163

Использованный в данном описании термин примерно относится к диапазону, включающему все значения ± 0,5, ± 0,4, ± 0,3, ± 0,2, ±0,1 и т.д., и он включает в себя все значения, эквивалентные тем, которые идут непосредственно после термина примерно, или те значения, которые находятся в аналогичном диапазоне.As used herein, the term roughly refers to the range including all values of ± 0.5, ± 0.4, ± 0.3, ± 0.2, ± 0.1, etc., and it includes all values , equivalent to those that come immediately after the term approximately, or those values that are in a similar range.

В частности, линкер может представлять собой линкер, соответственно присоединенный к пептидной группировке и группировке биосовместимого вещества посредством ковалентных связей, которые образуются соответственно, когда один конец линкера взаимодействует с аминогруппой или тиоловой группой группировки биосовместимого вещества, в то время как другой конец линкера взаимодействует с аминогруппой или тиоловой группой пептидной группировки (т.е. пептидной группировки, включающей аминокислотную последовательность общей формулы 1 или 2).In particular, the linker may be a linker, respectively, attached to the peptide moiety and the moiety of the biocompatible substance through covalent bonds, which are formed respectively when one end of the linker interacts with the amino group or the thiol group of the biocompatible substance moiety, while the other end of the linker interacts with the amino group or a thiol group of a peptide group (ie a peptide group comprising the amino acid sequence of general formula 1 or 2).

В конкретном воплощении один конец непептидного линкера может быть присоединен к аминогруппе или тиоловой группе Fc-области иммуноглобулина, в то время как другой конец непептидного линкера может быть присоединен к аминогруппе или тиоловой группе производного глюкагона. В частности, непептидный полимер может включать реакционноспособную группу на обоих своих концах, соответственно, которая может быть связана с группировкой биосовместимого вещества, в частности, с Fcобластью иммуноглобулина и производным глюкагона; например, реакционноспособная группа, которая может соответственно образовывать ковалентную связь для присоединения к биосовместимому веществу и производному глюкагона путем взаимодействия с аминогруппой N-конца, или остатком лизина производного глюкагона, или тиоловой группой остатка цистеина производного глюкагона, аминогруппой Nконца, или остатком лизина биосовместимого вещества, или тиоловой группой остатка цистеина биосовместимого вещества (например, Fc-области иммуноглобулина), но этим не ограничивается.In a specific embodiment, one end of the non-peptidic linker may be attached to the amino or thiol group of the immunoglobulin Fc region, while the other end of the non-peptidic linker may be attached to the amino or thiol group of the glucagon derivative. In particular, the non-peptide polymer may include a reactive group at both of its ends, respectively, which may be linked to a biocompatible moiety, in particular an immunoglobulin Fco region and a glucagon derivative; for example, a reactive group that can respectively form a covalent bond for attachment to a biocompatible substance and a glucagon derivative by reacting with an N-terminal amino group, or a lysine residue of a glucagon derivative, or a thiol group of a cysteine residue of a glucagon derivative, an N-terminal amino group, or a lysine residue of a biocompatible substance, or a thiol group of a cysteine residue of a biocompatible substance (eg, the Fc region of an immunoglobulin), but is not limited to this.

Кроме того, реакционноспособная концевая группа непептидного полимера, который может быть присоединен к группировке биосовместимого вещества, в частности, Fc-области иммуноглобулина, и производному глюкагона, может быть выбрана из группы, состоящей из альдегидной группы, малеимидной группы и сукцинимидного производного, но этим не ограничивается.In addition, the reactive end group of the non-peptide polymer, which can be attached to the moiety of a biocompatible substance, in particular, the immunoglobulin Fc region, and the glucagon derivative, can be selected from the group consisting of an aldehyde group, a maleimide group, and a succinimide derivative, but this does not limited.

В вышеизложенном примеры альдегидной группы могут включать пропиональдегидную группу или бутиральдегидную группу, но этим не ограничиваются.In the above, examples of the aldehyde group may include, but are not limited to, a propionaldehyde group or a butyraldehyde group.

В вышеизложенном в качестве сукцинимидного производного можно использовать сукцинимидилвалерат, сукцинимидилметилбутаноат, сукцинимидилметилпропионат, сукцинимидилбутаноат, сукцинимидилпропионат, N-гидроксисукцинимид, гидроксисукцинимидил, сукцинимидилкарбоксиметил или сукцинимидилкарбонат, но без ограничения этим.In the above, as the succinimide derivative, succinimidyl valerate, succinimidyl methyl butanoate, succinimidyl methyl propionate, succinimidyl butanoate, succinimidyl propionate, N-hydroxysuccinimide, hydroxysuccinimidyl, succinimidylcarboxymethyl or succinimidyl carbonate can be used, but not limited thereto.

Кроме того, конечный продукт, полученный в результате восстановительного аминирования посредством образования альдегидной связи, является более стабильным, чем продукт с присоединением через амидную связь. Альдегидная реакционноспособная группа избирательно взаимодействует с Nконцом в условиях низких рН, в то время как при высоких рН, например, при рН 9,0, она может образовывать ковалентную связь с остатком лизина.In addition, the final product obtained by reductive amination through the formation of an aldehyde bond is more stable than the product with attachment through an amide bond. The aldehyde reactive group selectively interacts with the N-terminus at low pH conditions, while at high pH, for example at pH 9.0, it can form a covalent bond with the lysine residue.

Реакционноспособные группы на обоих концах непептидного линкера могут быть одинаковыми или могут отличаться друг от друга, например, на одном конце может находиться малеимидная реакционноспособная группа, а на другом конце может находиться альдегидная группа, пропиональдегидная группа или бутиральдегидная группа. Однако, если Fc-область иммуноглобулина и производное глюкагона могут быть конъюгированы с каждым из концов непептидного линкера, то это не является конкретным ограничением.The reactive groups at both ends of the non-peptide linker may be the same or may be different, for example, a maleimide reactive group may be present at one end and an aldehyde group, propionaldehyde group, or butyraldehyde group may be present at the other end. However, if the immunoglobulin Fc region and the glucagon derivative can be conjugated to either end of the non-peptide linker, this is not particularly limited.

Например, непептидный полимер может иметь малеимидную группу на одном конце и альдегидную группу, пропиональдегидную группу или бутиральдегидную группу на другом конце.For example, a non-peptide polymer may have a maleimide group at one end and an aldehyde group, propionaldehyde group, or butyraldehyde group at the other end.

При использовании в качестве непептидного полимера полиэтиленгликоля, имеющего реакционноспособную гидроксигруппу на обоих своих концах, эту гидроксигруппу можно активировать путем превращения ее в различные реакционноспособные группы в результате известных химических реакций, или же для получения длительно действующего конъюгата белка по настоящему изобретению можно использовать коммерчески доступный полиэтиленгликоль, имеющий модифицированную реакционноспособную группу.When used as a non-peptide polymer, polyethylene glycol having a reactive hydroxy group at both of its ends, this hydroxy group can be activated by converting it into various reactive groups by known chemical reactions, or commercially available polyethylene glycol can be used to obtain a long-acting protein conjugate of the present invention, having a modified reactive group.

В конкретном воплощении непептидный полимер может представлять собой полимер, который может быть связан с остатком цистеина производного глюкагона и конкретнее с группой -SH цистеина, но этим не ограничивается. В частности, непептидный полимер может представлять собой полиэтиленгликоль, но конкретно этим не ограничивается, и в данное описание также могут быть включены другие типы непептидных полимеров, описанных ранее.In a particular embodiment, the non-peptide polymer can be a polymer that can be linked to, but is not limited to, a cysteine residue of a glucagon derivative, and more specifically to a cysteine -SH group. In particular, the non-peptide polymer may be polyethylene glycol, but is not specifically limited to this, and other types of non-peptide polymers previously described may also be included in this specification.

В конкретном воплощении конъюгат может представлять собой конъюгат, в котором пептид, содержащий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 37, связан с Fc-областью иммуноглобулина посредством непептидного полимера, и, в частности, непептидный полимер может представлять собой полимер, который связан с остатком цистеина, находящимся в 30-м положении аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 12, остатком цистеина, находящимся в 17-м положении аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 20, или остатком цистеина, находящимся в 30-м положении аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 37, но этим не ограниIn a specific embodiment, the conjugate may be a conjugate in which a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 20, or SEQ ID NO: 37 is linked to an immunoglobulin Fc region via a non-peptide polymer, and in particular, the non-peptide polymer may be a polymer that is linked to a cysteine residue located at the 30th position of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, a cysteine residue located at the 17th position of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, or a cysteine residue, located in the 30th position of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37, but this is not limited

- 22 042163 чивается. В частности, непептидный полимер может представлять собой полиэтиленгликоль, но конкретно этим не ограничивается, и в данное описание также могут быть включены другие типы непептидных полимеров, описанных ранее.- 22 042163 is being read. In particular, the non-peptide polymer may be polyethylene glycol, but is not specifically limited to this, and other types of non-peptide polymers previously described may also be included in this specification.

При использовании малеимид-ПЭГ-альдегида малеимидная группа может быть присоединена к группе -SH производного глюкагона посредством тиоэфирной связи, а альдегидная группа может быть присоединена к -NH2 Fc-области иммуноглобулина посредством восстановительного аминирования, но этим не ограничивается, и вышеизложенное является только лишь воплощением.When using maleimide-PEG-aldehyde, the maleimide group can be attached to the -SH group of the glucagon derivative via a thioether bond, and the aldehyde group can be attached to the -NH2 Fc region of the immunoglobulin via reductive amination, but is not limited to this, and the above is only an embodiment .

Кроме того, в упомянутом выше конъюгате реакционноспособная группа непептидного полимера может представлять собой группу, которая присоединена к группе -NH2, локализованной на N-конце Fcобласти иммуноглобулина, но это является только лишь воплощением.In addition, in the above conjugate, the reactive group of the non-peptide polymer may be a group that is attached to the -NH2 group located at the N-terminus of the Fco region of the immunoglobulin, but this is only an embodiment.

В настоящем изобретении Fc-область иммуноглобулина относится к области, содержащей константную область 2 тяжелой цепи (СН2) и/или константную область 3 тяжелой цепи (CH3), за исключением вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина. Fc-область иммуноглобулина может представлять собой структуру, которая создает группировку конъюгата белка по настоящему изобретению.In the present invention, an immunoglobulin Fc region refers to a region containing a heavy chain constant region 2 (CH2) and/or a heavy chain constant region 3 (CH3), excluding the immunoglobulin heavy chain and light chain variable regions. The Fc region of an immunoglobulin may be the structure that assembles the protein conjugate of the present invention.

Fc-область иммуноглобулина может содержать шарнирную область в константной области тяжелой цепи, но этим не ограничивается. Кроме того, Fc-область иммуноглобулина по настоящему изобретению может представлять собой расширенную Fc-область, содержащую часть константной области 1 тяжелой цепи (СН1) или ее целиком и/или константную область 1 легкой цепи (CL1), за исключением вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина, при условии, что Fc-область иммуноглобулина оказывает эффект по существу такой же или улучшенный по сравнению с нативным типом. Кроме того, Fc-область иммуноглобулина по настоящему изобретению может представлять собой область, в которой удалена довольно протяженная часть аминокислотной последовательности, соответствующей СН2 и/или CH3.The Fc region of an immunoglobulin may include, but is not limited to, a hinge region in a heavy chain constant region. In addition, the Fc region of an immunoglobulin of the present invention may be an extended Fc region comprising part or all of the heavy chain constant region 1 (CH1) and/or the light chain constant region 1 (CL1), excluding the heavy chain variable regions and light chain immunoglobulin, provided that the Fc region of the immunoglobulin has an effect essentially the same or improved compared to the native type. In addition, the Fc region of an immunoglobulin of the present invention may be a region in which a fairly long portion of the amino acid sequence corresponding to CH2 and/or CH3 has been deleted.

Например, Fc-область иммуноглобулина по настоящему изобретению может представлять собой 1) СН1-домен, СН2-домен, CH3-домен и СН4-домен; 2) СН1-домен и СН2-домен; 3) ОШ-домен и CH3домен; 4) СН2-домен и СНЗ-домен; 5) комбинацию между одним доменом или двумя либо более доменами, выбранным(ыми) из СН1-домена, СН2-домена, СН3-домена и СН4-домена, и шарнирной областью (или частью шарнирной области) иммуноглобулина; и 6) димер, образованный между каждым из доменов константной области тяжелой цепи и константной области легкой цепи, но этим не ограничивается.For example, the Fc region of an immunoglobulin of the present invention may be 1) a CH1 domain, a CH2 domain, a CH3 domain, and a CH4 domain; 2) CH1 domain and CH2 domain; 3) OSH domain and CH3 domain; 4) CH2 domain and CH3 domain; 5) a combination between one domain or two or more domains selected from a CH1 domain, a CH2 domain, a CH3 domain and a CH4 domain, and a hinge region (or part of a hinge region) of an immunoglobulin; and 6) a dimer formed between each of, but not limited to, the domains of the heavy chain constant region and the light chain constant region.

Кроме того, в конкретном воплощении Fc-область иммуноглобулина может быть в димерной форме, и одна молекула производного глюкагона может быть ковалентно связана с Fc-областью в димерной форме, и, в частности, Fc-область иммуноглобулина и производное глюкагона могут быть связаны друг с другом посредством непептидного полимера. Кроме того, две молекулы производного глюкагона возможно могут быть конъюгированы симметричным образом с единственной Fc-областью в димерной форме. В частности, Fc-область иммуноглобулина и производное глюкагона или инсулинотропный пептид могут быть связаны друг с другом посредством непептидного линкера, но не ограничиваются этим описанным выше воплощением.In addition, in a specific embodiment, the immunoglobulin Fc region may be in dimeric form, and one molecule of the glucagon derivative may be covalently linked to the Fc region in dimeric form, and in particular, the immunoglobulin Fc region and the glucagon derivative may be linked to each other. the other through a non-peptide polymer. In addition, two glucagon derivative molecules can optionally be conjugated in a symmetrical fashion to a single Fc region in dimeric form. In particular, the Fc region of an immunoglobulin and a glucagon derivative or an insulinotropic peptide can be linked to each other via a non-peptide linker, but are not limited to this embodiment described above.

Кроме того, Fc-область иммуноглобулина по настоящему изобретению содержит не только нативную аминокислотную последовательность, но также производное этой последовательности. Термин производное аминокислотной последовательности относится к аминокислотной последовательности, которая отличается по меньшей мере одним аминокислотным остатком вследствие делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены либо их комбинации.In addition, the Fc region of the immunoglobulin of the present invention contains not only a native amino acid sequence, but also a derivative of this sequence. The term derivative of an amino acid sequence refers to an amino acid sequence that differs at least one amino acid residue due to a deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof.

Например, аминокислотные остатки в положениях 214-238, 297-299, 318-322 или 327-331, которые, как известно, участвуют в связывании с Fc-областью иммуноглобулина, могут быть использованы в качестве сайтов, подходящих для модификации.For example, amino acid residues at positions 214-238, 297-299, 318-322, or 327-331 known to be involved in binding to the Fc region of an immunoglobulin can be used as suitable sites for modification.

Кроме этого, возможны и другие различные производные, в том числе производное, в котором удален участок, способный образовывать дисульфидную связь, или удалены некоторые аминокислотные остатки на N-конце нативной Fc-области либо туда добавлен остаток метионина. Кроме того, для устранения эффекторных функций может быть осуществлена делеция в комплементсвязывающем сайте, таком как dq-связывающий сайт, и сайте антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC). Методы получения таких производных для последовательности Fc-области иммуноглобулина раскрыты в публикациях международных патентных заявок №№ WO 97/34631, WO 96/32478 и так далее.In addition, various other derivatives are possible, including a derivative in which a site capable of forming a disulfide bond is removed, or some amino acid residues are removed at the N-terminus of the native Fc region, or a methionine residue is added thereto. In addition, a deletion can be made at a complement-binding site, such as a dq-binding site, and an antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) site to eliminate effector functions. Methods for making such derivatives of an immunoglobulin Fc region sequence are disclosed in International Patent Application Publication Nos. WO 97/34631, WO 96/32478 and so on.

В данной области техники известны аминокислотные замены в белках и пептидах, которые обычно не изменяют активность белков или пептидов (Н. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). Наиболее часто встречающимися заменами являются Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu и Asp/Gly в обоих направлениях. Кроме того, Fc-область при необходимости может быть модифицирована путем фосфорилирования, сульфатирования, акрилирования, гликозилирования, метилирования, фарнезилирования, ацетилирования, амидирования и так далее.Amino acid substitutions in proteins and peptides are known in the art that do not normally alter the activity of the proteins or peptides (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). The most common substitutions are Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys /Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu and Asp/Gly in both directions. In addition, the Fc region can be modified by phosphorylation, sulfation, acrylation, glycosylation, methylation, farnesylation, acetylation, amidation, and so on, if necessary.

Описаныые выше производные Fc-области демонстрируют биологическую активность, идентичную активности Fc-области по настоящему изобретению, и имеют улучшенную структурную стабильность вThe Fc region derivatives described above exhibit identical biological activity to that of the Fc region of the present invention and have improved structural stability in

- 23 042163 отношении нагревания, рН и так далее.- 23 042163 regarding heating, pH and so on.

Далее, такие Fc-области иммуноглобулина могут быть получены из нативных форм, выделенных in vivo из людей или животных, таких как коровы, козы, свиньи, мыши, кролики, хомячки, крысы, морские свинки и т.д., или могут представлять собой их рекомбинантные формы или производные, полученные из трансфицированных клеток животных или из микроорганизмов. В данной заявке Fc-область может быть получена из нативного иммуноглобулина путем выделения целой молекулы иммуноглобулина из живого организма человека или животного и обработки выделенного иммуноглобулина протеазой. При обработке целой молекулы иммуноглобулина папаином она расщепляется на Fab- и Fc-области, а при обработке целой молекулы иммуноглобулина пепсином она расщепляется на фрагменты pF'c и F(ab)2. Fc или pF'c могут быть выделены методом эксклюзионной хроматографии и так далее. В более конкретном воплощении Fc-область, имеющая происхождение из человека, представляет собой рекомбинантную Fcобласть иммуноглобулина, полученную из микроорганизма.Further, such immunoglobulin Fc regions may be derived from native forms isolated in vivo from humans or animals such as cows, goats, pigs, mice, rabbits, hamsters, rats, guinea pigs, etc., or may be their recombinant forms or derivatives obtained from transfected animal cells or from microorganisms. In this application, the Fc region can be obtained from native immunoglobulin by isolating the entire immunoglobulin molecule from a living human or animal body and treating the isolated immunoglobulin with a protease. When a whole immunoglobulin molecule is treated with papain, it is cleaved into Fab and Fc regions, and when a whole immunoglobulin molecule is treated with pepsin, it is cleaved into pF'c and F(ab)2 fragments. Fc or pF'c can be isolated by size exclusion chromatography and so on. In a more specific embodiment, the human Fc region is a recombinant immunoglobulin Fc region derived from a microorganism.

Кроме того, Fc-область иммуноглобулина может иметь природные гликаны с повышенным или пониженным содержанием гликанов по сравнению с природным типом или могут быть в дегликозилированной форме. Повышение, понижение содержания или удаление гликанов Fc-области иммуноглобулина может быть достигнуто традиционными методами, такими как химический метод, ферментативный метод и метод генной инженерии с использованием микроорганизмов. Fc-область иммуноглобулина, полученная путем удаления гликанов из Fc-области, демонстрирует значительное снижение аффинности связывания с C1q-частью и снижение или утрату антителозависимой цитотоксичности или комплементзависимой цитотоксичности, и поэтому она не индуцирует нежелательные иммунные ответы in vivo. В этой связи, Fc-область иммуноглобулина в форме дегликозилированной или агликозилированной Fc-области иммуноглобулина может представлять собой более подходящую форму, отвечающую первоначальной задаче настоящего изобретения, в качестве носителя лекарственного средства.In addition, the immunoglobulin Fc region may have natural glycans with increased or decreased glycan content compared to the natural type, or may be in a deglycosylated form. The increase, decrease or removal of glycans of the Fc region of an immunoglobulin can be achieved by conventional methods such as chemical method, enzymatic method and genetic engineering method using microorganisms. The Fc region of an immunoglobulin obtained by removing glycans from the Fc region exhibits a significant reduction in binding affinity for the C1q portion and a reduction or loss of antibody-dependent cytotoxicity or complement-dependent cytotoxicity, and therefore does not induce unwanted immune responses in vivo. In this regard, an immunoglobulin Fc region in the form of a deglycosylated or aglycosylated immunoglobulin Fc region may be a more suitable form for the original purpose of the present invention as a drug carrier.

Использованный в данном описании термин дегликозилирование относится к ферментативному удалению сахарных группировок из Fc-области, а термин агликозилирование относится к негликозилированной Fc-области, продуцируемой в прокариотах, более конкретно, в Е. coli.As used herein, the term deglycosylation refers to the enzymatic removal of sugar moieties from the Fc region, and the term aglycosylation refers to the non-glycosylated Fc region produced in prokaryotes, more specifically E. coli.

В то же время, Fc-область иммуноглобулина может быть выделена из людей или других животных, включая коров, коз, свиней, мышей, кроликов, хомячков, крыс и морских свинок. В более конкретном воплощении она выделена из людей.At the same time, the Fc region of an immunoglobulin can be isolated from humans or other animals, including cows, goats, pigs, mice, rabbits, hamsters, rats, and guinea pigs. In a more specific embodiment, she is isolated from humans.

Кроме того, Fc-область иммуноглобулина (Ig) может иметь происхождение из IgG, IgA, IgD, IgE, IgM или их комбинации либо гибрида. В более конкретном воплощении она имеет происхождение из IgG или IgM, которые находятся среди самых распространенных белков в крови человека, и в еще более конкретном воплощении, она имеет происхождение из IgG, который, как известно, увеличивает период полувыведения лигандсвязывающих белков. В еще более конкретном воплощении Fc-область иммуноглобулина представляет собой Fc-область IgG4, и в наиболее конкретном воплощении Fc-область IgG4 представляет собой агликозилированную Fc-область, имеющую происхождение из человеческого IgG4, но этим не ограничивается.In addition, the Fc region of an immunoglobulin (Ig) may be derived from IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, or a combination or hybrid thereof. In a more specific embodiment, it is of IgG or IgM origin, which are among the most abundant proteins in human blood, and in an even more specific embodiment, it is of IgG origin, which is known to increase the half-life of ligand-binding proteins. In an even more specific embodiment, an immunoglobulin Fc region is an IgG4 Fc region, and in a most specific embodiment, an IgG4 Fc region is, but not limited to, an aglycosylated Fc region derived from human IgG4.

В частности, использованный в данном описании термин комбинация означает, что полипептиды, кодирующие одноцепочечные Fc-области иммуноглобулина одинакового происхождения, связаны с одноцепочечным полипептидом другого происхождения с образованием димера или мультимера. То есть, димер или мультимер может быть образован из двух или более фрагментов, выбранных из группы, состоящей из фрагментов Fc-области IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc и IgE.In particular, as used herein, the term combination means that polypeptides encoding single chain immunoglobulin Fc regions of the same origin are linked to a single chain polypeptide of a different origin to form a dimer or multimer. That is, a dimer or multimer may be formed from two or more fragments selected from the group consisting of fragments of the Fc region of IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc and IgE.

Композиция по настоящему изобретению может быть использована для предупреждения или лечения врожденного гиперинсулинизма, гипогликемии или метаболического синдрома.The composition of the present invention may be used to prevent or treat congenital hyperinsulinism, hypoglycemia, or metabolic syndrome.

Использованный в данном описании термин предупреждение относится ко всем видам действий, связанным с торможением или замедлением возникновения целевого заболевания (например, врожденного гиперинсулинизма, гипогликемии или метаболического синдрома) при введении производного глюкагона, конъюгата, содержащего производное глюкагона, или композиции, а термин лечение относится ко всем видам действий, связанным с улучшением состояния или благотворными изменениями симптомов целевого заболевания (например, врожденного гиперинсулинизма, гипогликемии или метаболического синдрома), при введении производного глюкагона, конъюгата, содержащего производное глюкагона, или композиции.As used herein, the term prevention refers to all kinds of actions associated with the inhibition or delay of the onset of the target disease (for example, congenital hyperinsulinism, hypoglycemia, or metabolic syndrome) when a glucagon derivative, a conjugate containing a glucagon derivative, or a composition is administered, and the term treatment refers to all kinds of actions associated with the improvement of the condition or beneficial changes in the symptoms of the target disease (for example, congenital hyperinsulinism, hypoglycemia or metabolic syndrome), when administering a glucagon derivative, a conjugate containing a glucagon derivative, or a composition.

Использованный в данном описании термин введение относится к введению конкретного вещества пациенту подходящим способом. Композицию можно вводить обычным путем, который обеспечивает доставку композиции в ткань-мишень in vivo, например, путем внутрибрюшинного, внутривенного, внутримышечного, подкожного, интрадермального, перорального, местного, интраназального, легочного и интраректального введения, но конкретно этим не ограничивается.As used herein, the term administration refers to the administration of a particular substance to a patient in an appropriate manner. The composition can be administered in a conventional manner that delivers the composition to the target tissue in vivo, such as, but not limited to, intraperitoneal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, oral, topical, intranasal, pulmonary, and intrarectal administration.

Использованный в данном описании термин гипогликемия относится к состоянию здоровья, при котором уровни глюкозы в крови ниже, чем у нормальных людей, и, как правило, относится к состоянию, когда уровни глюкозы в крови составляют 50 мг/дл или меньше, но конкретно этим не ограничивается. Гипогликемия часто возникает, когда лицо, которое принимает пероральный гипогликемический агент или инсулин, ест меньше, чем обычно, или выполняет какие-либо виды работ или физические упAs used herein, the term hypoglycemia refers to a health condition in which blood glucose levels are lower than in normal individuals, and generally refers to a condition in which blood glucose levels are 50 mg/dL or less, but not specifically. limited. Hypoglycemia often occurs when a person who is taking an oral hypoglycemic agent or insulin eats less than usual or performs any type of work or exercise.

- 24 042163 ражнения больше, чем обычно. Кроме того, гипогликемия может возникать из-за распития алкогольных напитков, приема лекарственных средств, понижающих уровень глюкозы, тяжелых физических заболеваний, дефицита гормонов, таких как гормоны коры надпочечников и глюкагон, из-за опухоли поджелудочной железы, продуцирующей инсулин, аутоиммунного инсулинового синдрома у пациентов, перенесших гастрэктомию, наследственного нарушения метаболизма углеводов и так далее.- 24 042163 more than usual. In addition, hypoglycemia can occur due to drinking alcoholic beverages, taking glucose-lowering drugs, severe physical illness, hormone deficiency such as adrenal cortex hormones and glucagon, due to an insulin-producing pancreatic tumor, autoimmune insulin syndrome in gastrectomy patients, hereditary disorders of carbohydrate metabolism and so on.

В настоящем изобретении гипогликемия включает как острую, так и хроническую гипогликемию.In the present invention, hypoglycemia includes both acute and chronic hypoglycemia.

Симптомы гипогликемии включают слабость, дрожь, бледную кожу, холодный пот, головокружение, возбуждение, тревогу, сердцебиение, голодный желудок, головную боль, усталость и так далее. В случае персистентной гипогликемии она может приводить к конвульсиям или судорожным припадкам и может вызывать шок и вследствие этого потерю сознания.Symptoms of hypoglycemia include weakness, trembling, pale skin, cold sweat, dizziness, agitation, anxiety, palpitations, empty stomach, headache, fatigue, and so on. In the case of persistent hypoglycemia, it can lead to convulsions or seizures and can cause shock and consequent loss of consciousness.

Более конкретно, причиной гипогликемии может быть персистирующий гиперинсулинизм вследствие тяжелого генетического дефекта. Примеры известных причин гиперинсулинизма вследствие генетического дефекта могут включать мутацию в гене SUR или гене Kir6.2, локализованном на хромосоме 11p15.1, или повышение активности глюкокиназы (GK) вследствие мутации в гене GK, локализованном на хромосоме 7р15-р13, повышение содержания АТФ в островковых клетках вследствие мутации в гене глутаматдегидрогеназы (GDH) и так далее.More specifically, persistent hyperinsulinism due to a severe genetic defect may be the cause of hypoglycemia. Examples of known causes of hyperinsulinism due to a genetic defect may include a mutation in the SUR gene or the Kir6.2 gene located on chromosome 11p15.1, or an increase in glucokinase (GK) activity due to a mutation in the GK gene located on chromosome 7p15-p13, an increase in ATP in islet cells due to a mutation in the glutamate dehydrogenase (GDH) gene, and so on.

Что касается врожденного гиперинсулинизма, то он является одной из главных причин тяжелой и персистирующей гипогликемии у новорожденных и детей. Он может быть вызван аномальным функционированием панкреатических клеток вследствие временного усиления секреции инсулина или генетической мутации у младенцев с низким весом при рождении или младенцев от матерей с диабетом и так далее. Известно, что глюкагон можно использовать для лечения врожденного гиперинсулинизма.With regard to congenital hyperinsulinism, it is one of the main causes of severe and persistent hypoglycemia in newborns and children. It can be caused by abnormal functioning of pancreatic cells due to a temporary increase in insulin secretion or a genetic mutation in low birth weight infants or infants from mothers with diabetes, and so on. It is known that glucagon can be used to treat congenital hyperinsulinism.

Кроме того, производное глюкагона или конъюгат, содержащий производное глюкагона, можно использовать для предупреждения или лечения гипогликемии.In addition, a glucagon derivative or a glucagon derivative-containing conjugate can be used to prevent or treat hypoglycemia.

Кроме того, производное глюкагона или конъюгат, содержащий производное глюкагона по настоящему изобретению, можно использовать в качестве фармацевтического лекарственного средства не только для предупреждения увеличения массы тела, стимулирования уменьшения массы тела, снижения избыточного веса и лечения ожирения, в том числе морбидного ожирения (например, путем регулирования аппетита, процесса проглатывания пищи, потребления пищи, калорийности потребляемой пищи и/или расходования энергии), но также для лечения ассоциированного с ожирением воспаления, ассоциированного с ожирением заболевания желчного пузыря и индуцированного ожирением апноэ во сне, но этим не ограничивается, и можно использовать для лечения ассоциированных с ним заболеваний или состояний здоровья. Производное глюкагона по настоящему изобретению или конъюгат, содержащий производное глюкагона, также можно применять для лечения метаболического синдрома, иного, чем ожирение, т.е. связанных с ожирением заболеваний, таких как нарушенная толерантность к глюкозе, гиперхолестеринемия, дислипидемия, ожирение, диабет, гипертензия, неалкогольный стеатогепатит (неалкогольный стеатогепатит, NASH), атеросклероз, вызванный дислипидемией, атеросклероз, артериосклероз, коронарная болезнь сердца, инсульт и так далее. Тем не менее, эффекты пептида по настоящему изобретению могут быть опосредованы полностью или частично эффектами, связанными с массой тела, описанными выше, или могут быть независимыми от них.In addition, the glucagon derivative or conjugate containing the glucagon derivative of the present invention can be used as a pharmaceutical drug not only for preventing weight gain, promoting weight loss, reducing overweight, and treating obesity, including morbid obesity (for example, by regulating appetite, food ingestion, food intake, caloric intake and/or energy expenditure), but also for the treatment of obesity-associated inflammation, obesity-associated gallbladder disease, and obesity-induced sleep apnea, but is not limited to, and can be use to treat associated diseases or health conditions. The glucagon derivative of the present invention or the glucagon derivative-containing conjugate can also be used to treat a metabolic syndrome other than obesity, i. obesity-related diseases such as impaired glucose tolerance, hypercholesterolemia, dyslipidemia, obesity, diabetes, hypertension, non-alcoholic steatohepatitis (non-alcoholic steatohepatitis, NASH), dyslipidemia-induced atherosclerosis, atherosclerosis, arteriosclerosis, coronary heart disease, stroke, and so on. However, the effects of the peptide of the present invention may be mediated in whole or in part by the body weight-related effects described above, or may be independent of them.

Использованный в данном описании термин метаболический синдром относится к симптому отдельного или комплексного возникновения различных заболеваний вследствие хронического метаболического расстройства. В частности, примеры заболеваний, относящихся к метаболическому синдрому, могут включать нарушенную толерантность к глюкозе, гиперхолестеринемию, дислипидемию, ожирение, диабет, гипертензию, неалкогольный стеатогепатит (NASH), атеросклероз, вызванный дислипидемией, атеросклероз, артериосклероз, коронарную болезнь сердца, инсульт и т.д., но этим не ограничивается ими.Used in this description, the term metabolic syndrome refers to the symptom of a single or complex occurrence of various diseases due to a chronic metabolic disorder. In particular, examples of diseases related to the metabolic syndrome may include impaired glucose tolerance, hypercholesterolemia, dyslipidemia, obesity, diabetes, hypertension, non-alcoholic steatohepatitis (NASH), dyslipidemia-induced atherosclerosis, atherosclerosis, arteriosclerosis, coronary heart disease, stroke, etc. .d., but this is not limited to them.

Использованный в данном описании термин ожирение относится к медицинскому состоянию с избыточным жиром в организме, и лица, имеющие индекс массы тела (BMI; масса тела (кг), деленная на квадрат роста (м)) 25 или выше, диагностируются как имеющие ожирение. Чаще всего причиной ожирения является энергетический дисбаланс вследствие чрезмерного потребления пищи по сравнению с расходованием энергии в течение длительного периода времени. Ожирение, являясь метаболическим заболеванием, которое поражает весь организм, повышает риск возникновения сексуальной дисфункции, артрита и сердечно-сосудистого заболевания, и в некоторых случаях оно связано с развитием рака.As used herein, the term obesity refers to a medical condition with excess body fat, and individuals having a body mass index (BMI; body weight (kg) divided by the square of height (m)) of 25 or higher are diagnosed as obese. The most common cause of obesity is an energy imbalance due to excessive food intake compared to energy expenditure over a long period of time. Obesity, being a metabolic disease that affects the whole body, increases the risk of sexual dysfunction, arthritis and cardiovascular disease, and in some cases it is associated with the development of cancer.

Производное глюкагона по настоящему изобретению имеет измененную pI и таким образом, может демонстрировать улучшенную растворимость и более высокую стабильность в условиях нейтральных рН по сравнению с нативным глюкагоном. Кроме того, производное глюкагона по настоящему изобретению может демонстрировать активность в отношении рецептора глюкагона и поэтому может с эффективностью использоваться для предупреждения или лечения целевых заболеваний, включая гипогликемию, метаболический синдром и врожденный гиперинсулинизм.The glucagon derivative of the present invention has an altered pI and thus can show improved solubility and higher stability under neutral pH conditions compared to native glucagon. In addition, the glucagon derivative of the present invention can exhibit activity at the glucagon receptor, and therefore can be effectively used to prevent or treat target diseases, including hypoglycemia, metabolic syndrome, and congenital hyperinsulinism.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель. Использованный в данном описании термин фармацевтически приемлемый относится к свойствам наличия достаточного количества, необходимого дляThe pharmaceutical composition of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent. Used in this description, the term pharmaceutically acceptable refers to the properties of having a sufficient amount necessary for

- 25 042163 проявления терапевтического эффекта без вызывания неблагоприятных эффектов, и специалист в данной области техники легко сможет определить это, основываясь на факторах, общеизвестных в области медицины, таких как тип заболевания, возраст, масса тела, состояние здоровья, пол, восприимчивость пациента к лекарственным средствам, путь введения, способ введения, частота введения, продолжительность лечения, лекарственное средство, которое смешивают или вводят одновременно в комбинации и так далее.- 25 042163 manifestation of a therapeutic effect without causing adverse effects, and a person skilled in the art can easily determine this based on factors commonly known in the field of medicine, such as type of disease, age, body weight, health status, gender, patient susceptibility to drugs means, the route of administration, the method of administration, the frequency of administration, the duration of treatment, the drug that is mixed or administered simultaneously in combination, and so on.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, содержащая пептид или конъюгат, содержащий производное глюкагона, по настоящему изобретению, может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемый носитель может включать: для перорального введения связующее вещество, глидант, разрыхлитель, эксципиент, солюбилизирующий агент, диспергирующий агент, стабилизирующий агент, суспендирующий агент, краситель, корригент и т.д.; для инъекций буферный агент, консервант, анальгезирующий агент, солюбилизирующий агент, изотонический агент, стабилизирующий агент и т.д., которые могут быть использованы совместно; и для местного введения основу, эксципиент, смазывающее вещество, консервант и т.д., хотя этим не ограничивается.The pharmaceutical composition of the present invention containing the peptide or conjugate containing a derivative of glucagon of the present invention may further contain a pharmaceutically acceptable carrier. A pharmaceutically acceptable carrier may include: for oral administration, a binder, glidant, disintegrant, excipient, solubilizing agent, dispersing agent, stabilizing agent, suspending agent, coloring agent, flavoring agent, etc.; an injectable buffering agent, a preservative, an analgesic agent, a solubilizing agent, an isotonic agent, a stabilizing agent, etc., which can be used together; and for local administration, a base, an excipient, a lubricant, a preservative, etc., although not limited to this.

Различные лекарственные формы композиции по настоящему изобретению могут быть приготовлены путем объединения с фармацевтически приемлемым носителем, который описан выше. Например, в случае перорального введения композиция может быть приготовлена в таблетках, троше, капсулах, эликсирах, суспензиях, сиропах, облатках и т.д. В случае инъекций композиция может быть приготовлена в однодозовых ампулах или многодозовых контейнерах. Композиция может быть также приготовлена в виде растворов, суспензий, таблеток, капсул и препаратов с длительным высвобождением.Various dosage forms of the composition of the present invention may be prepared by combining with a pharmaceutically acceptable carrier as described above. For example, in the case of oral administration, the composition may be formulated into tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, cachets, etc. In the case of injections, the composition may be prepared in single dose ampoules or multi-dose containers. The composition may also be formulated as solutions, suspensions, tablets, capsules and sustained release preparations.

При этом примеры подходящих носителей, эксципиентов и разбавителей могут включать лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, аравийскую камедь, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния, минеральное масло и так далее. Кроме того, композиция может дополнительно содержать наполнитель, антикоагулянт, смазывающее вещество, смачивающий агент, корригент, консервант и так далее.While examples of suitable carriers, excipients and diluents may include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum arabic, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methylcellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone , water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil and so on. In addition, the composition may further contain a filler, an anticoagulant, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, a preservative, and so on.

Кроме того, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть приготовлена в лекарственных формах любого типа, выбранных из группы, состоящей из таблеток, пилюль, порошков, гранул, капсул, суспензий, жидких лекарственных средств для употребления внутрь, эмульсий, сиропов, стерильных инъекционных растворов, неводных растворителей, лиофилизированных препаратов и суппозиториев.In addition, the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated into any type of dosage form selected from the group consisting of tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, oral liquids, emulsions, syrups, sterile injectable solutions, non-aqueous solvents, lyophilized preparations and suppositories.

Кроме того, композиция может быть приготовлена в форме однократной дозировки, подходящей для организма пациента, и, в частности, приготовлена в виде препарата, полезного для пептидных лекарственных средств, типичным способом, используемым в фармацевтической области, для введения пероральным или парентеральным путем, как например, через кожу, внутривенно, внутримышечно, интраартериально, интрамедуллярно, интратекально, интравентрикулярно, в легкие, трансдермально, подкожно, внутрибрюшинно, интраназально, в желудок, местно, сублингвально, вагинально или ректально, но без ограничения этим.In addition, the composition may be formulated into a single dosage form suitable for the body of the patient, and in particular formulated useful for peptide drugs in a typical manner used in the pharmaceutical field, for administration by the oral or parenteral route, such as for example , through the skin, intravenously, intramuscularly, intraarterially, intramedullary, intrathecally, intraventricularly, into the lungs, transdermally, subcutaneously, intraperitoneally, intranasally, into the stomach, topically, sublingually, vaginally or rectally, but without limitation.

Кроме того, пептид или конъюгат можно использовать путем смешивания с различными фармацевтически приемлемыми носителями, такими как физиологический раствор или органические растворители. Чтобы повысить стабильность или всасываемость, можно использовать углеводы, такие как глюкоза, сахароза или декстраны; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или глутатион; хелатирующие агенты; низкомолекулярные белки; или другие стабилизаторы.In addition, the peptide or conjugate can be used by mixing with various pharmaceutically acceptable carriers such as saline or organic solvents. To increase stability or absorption, carbohydrates such as glucose, sucrose, or dextrans can be used; antioxidants such as ascorbic acid or glutathione; chelating agents; low molecular weight proteins; or other stabilizers.

Дозу и частоту введения фармацевтической композиции по настоящему изобретению определяют с учетом типа активного(ых) ингредиента(ов) наряду с такими различными факторы, как подлежащее лечению заболевание, путь введения, возраст, пол и масса тела пациента и тяжесть его заболевания.The dose and frequency of administration of the pharmaceutical composition of the present invention is determined taking into account the type of active ingredient(s) along with various factors such as the disease being treated, the route of administration, the age, sex and body weight of the patient and the severity of his disease.

Хотя конкретного органичения на это не имеется, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать упомянутый выше ингредиент (активный ингредиент) в количестве от 0,01% (мас./об.) до 99% (мас./об.).Although there is no particular limitation, the pharmaceutical composition of the present invention may contain the above-mentioned ingredient (active ingredient) in an amount of 0.01% (w/v) to 99% (w/v).

Общую эффективную дозу композиции по настоящему изобретению можно вводить пациенту в однократной дозе или можно вводить в течение длительного периода времени в виде многократных доз согласно протоколу дробного лечения. В фармацевтической композиции по настоящему изобретению содержание активного(ых) ингредиента(ов) может варьировать в зависимости от тяжести заболевания. В частности, предпочтительная суммарная суточная доза пептида или конъюгата по настоящему изобретению может составлять приблизительно от 0,0001 мкг до 500 мг на 1 кг массы тела пациента. Тем не менее, эффективную дозу пептида или конъюгата определяют с учетом различных факторов, включая возраст, массу тела, состояние здоровья, пол пациента, тяжесть заболевания, диету и скорость выведения, а также путь и частоту введения фармацевтической композиции. При этом специалисты в данной области техники легко смогут определить эффективную дозу, подходящую для конкретного применения фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению не ограничена конкретной лекарственной формой, конкретным путем и способом введенияThe total effective dose of the composition of the present invention may be administered to a patient in a single dose, or may be administered over an extended period of time in multiple doses according to a divided treatment protocol. In the pharmaceutical composition of the present invention, the content of the active(s) ingredient(s) may vary depending on the severity of the disease. In particular, the preferred total daily dose of the peptide or conjugate of the present invention may be from about 0.0001 μg to 500 mg per 1 kg of patient body weight. However, the effective dose of the peptide or conjugate is determined by taking into account various factors, including age, body weight, health status, sex of the patient, disease severity, diet and elimination rate, as well as the route and frequency of administration of the pharmaceutical composition. However, those skilled in the art will readily be able to determine the effective dose appropriate for a particular application of the pharmaceutical composition of the present invention. The pharmaceutical composition of the present invention is not limited to a specific dosage form, a specific route and route of administration.

- 26 042163 при условии, что она оказывает эффекты настоящего изобретения.- 26 042163 provided that it has the effects of the present invention.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может демонстрировать in vivo превосходные продолжительность эффективного действия и титр, и поэтому число введений и частота введения могут быть значительно сокращены по сравнению с другими фармацевтическими препаратами, но без конкретного ограничения этим.The pharmaceutical composition of the present invention can exhibit excellent duration of effect and titer in vivo, and therefore the number of administrations and frequency of administration can be significantly reduced compared to other pharmaceuticals, but without being particularly limited thereto.

В частности, поскольку фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит в качестве активного ингредиента производное глюкагона, имеющее измененную pI, отличающуюся от pI для нативного глюкагона, она демонстрирует улучшенную растворимость и/или высокую стабильность в зависимости от рН данного раствора, и поэтому фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно с эффективностью использовать в получении стабильного препарата глюкагона для лечения целевого заболевания, включая врожденный гиперинсулинизм, гипогликемию или метаболический синдром.In particular, since the pharmaceutical composition of the present invention contains, as an active ingredient, a glucagon derivative having an altered pI different from that of native glucagon, it exhibits improved solubility and/or high stability depending on the pH of the solution, and therefore the pharmaceutical composition of the present The invention can be used effectively in the preparation of a stable glucagon preparation for the treatment of a target disease, including congenital hyperinsulinism, hypoglycemia, or metabolic syndrome.

С точки зрения фармацевтической композиции для предупреждения или лечения метаболического синдрома или способа терапии для предупреждения или лечения метаболического синдрома, фармацевтическая композиция может дополнительно содержать соединение или вещество, обладающее терапевтической активностью в отношении метаболического синдрома, а способ терапии может дополнительно включать применение упомянутого выше соединения или вещества.In terms of a pharmaceutical composition for preventing or treating metabolic syndrome or a method of therapy for preventing or treating metabolic syndrome, the pharmaceutical composition may further comprise a compound or substance having therapeutic activity against metabolic syndrome, and the method of therapy may further include the use of the above compound or substance .

Примеры соединения или вещества, обладающего терапевтической активностью в отношении метаболического синдрома и предполагаемого для включения при комбинированном введении или в композицию по настоящему изобретению, могут включать инсулинотропный пептид, агонист рецептора глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1), агонист рецептора лептина, ингибитор дипептидилпептидазыIV (DPP-IV), антагонист Y5-рецептора, антагонист рецептора меланинконцентрирующего гормона (МСН), агонист Y2/4-рецептора, агонист меланокортинового рецептора 3/4 (МС 3/4), ингибитор желудочной/панкреатической липазы, агонист рецептора 5-гидрокситриптамина, типа 2С (5НТ2С), агонист в3Л-рецептора, агонист рецептора амилина, антагонист грелина, антагонист рецептора грелина, агонист рецептора-альфа, активируемого пролифератором пероксисом (PPARa), агонист рецептора-дельта, активируемого пролифератором пероксисом (PPЛRδ), агонист фарнезоидного X-рецептора (FXR), ингибитор ацетил-СоА-карбоксилазы, пептид YY, холецистокинин (CCK), ксенин, глицентин, обестатин, секретин, несфатин, инсулин и глюкозозависимый инсулинотропный пептид (GIP), но этим не ограничиваться. Кроме того, могут быть включены все лекарственные средства, эффективные с точки зрения лечения ожирения, и лекарственные средства, обладающие способностью подавлять воспаление и фиброз печени.Examples of a compound or substance having therapeutic activity against metabolic syndrome and contemplated for inclusion in combination administration or in the composition of the present invention may include an insulinotropic peptide, a glucagon-like peptide-1 (GLP-1) receptor agonist, a leptin receptor agonist, a dipeptidyl peptidase IV inhibitor ( DPP-IV), Y5 receptor antagonist, melanin-concentrating hormone (MCH) receptor antagonist, Y2/4 receptor agonist, melanocortin receptor 3/4 (MC 3/4) agonist, gastric/pancreatic lipase inhibitor, 5-hydroxytryptamine receptor agonist, type 2C (5HT2C), β3L receptor agonist, amylin receptor agonist, ghrelin antagonist, ghrelin receptor antagonist, peroxisome proliferator-activated receptor-alpha (PPARa) agonist, peroxisome proliferator-activated receptor-delta agonist (PPLRδ), farnesoid X-agonist receptor (FXR), acetyl-CoA carboxylase inhibitor, peptide YY, cholecystokinin (CCK), ks but not limited to enin, glycentin, obestatin, secretin, nesfatin, insulin, and glucose-dependent insulinotropic peptide (GIP). In addition, all drugs effective in treating obesity and drugs having the ability to suppress liver inflammation and fibrosis can be included.

В частности, инсулинотропный пептид может быть выбран из группы, состоящей из GLP-1, эксендина-3, эксендина-4, их агониста, их производного, их фрагмента, их варианта и их комбинации.In particular, the insulinotropic peptide may be selected from the group consisting of GLP-1, exendin-3, exendin-4, an agonist thereof, a derivative thereof, a fragment thereof, a variant thereof, and a combination thereof.

Более конкретно, инсулинотропный пептид может представлять собой производное инсулинотропного пептида, в котором N-концевой остаток гистидина инсулинотропного пептида заменен на что-либо одно, выбранное из группы, состоящей из дезамино-гистидила, N-диметил-гистидила, β-гидроксиимидазопропионила, 4-имидазоацетила и β-карбокси-имидазопропионила, но этим не ограничивается. В частности, инсулинотропный пептид может представлять собой GLP-1, эксендин-3 или эксендин-4.More specifically, the insulinotropic peptide may be an insulinotropic peptide derivative in which the N-terminal histidine residue of the insulinotropic peptide is replaced with one selected from the group consisting of deamino-histidyl, N-dimethyl-histidyl, β-hydroxyimidazopropionyl, 4- imidazoacetyl and β-carboxy-imidazopropionyl, but not limited to this. In particular, the insulinotropic peptide may be GLP-1, exendin-3 or exendin-4.

Еще более конкретно, инсулинотропный пептид может быть выбран из группы, состоящей из нативного эксендина-4; производного эксендина-4, в котором удалена N-концевая аминогруппа эксендина4; производного эксендина-4, в котором N-концевая аминогруппа эксендина-4 заменена на гидроксильную группу; производного эксендина-4, в котором N-концевая аминогруппа эксендина-4 модифицирована диметильной группой; производного эксендина-4, в котором удален α-углеродный атом 1-й аминокислоты эксендина-4, гистидина; производного эксендина-4, в котором 12-я аминокислота эксендина-4, лизин, заменена на серин, и производного эксендина-4, в котором 12-я аминокислота эксендина-4, лизин, заменена на аргинин, но этим не ограничивается.Even more specifically, the insulinotropic peptide may be selected from the group consisting of native exendin-4; an exendin-4 derivative in which the N-terminal amino group of exendin4 has been removed; a derivative of exendin-4, in which the N-terminal amino group of exendin-4 is replaced by a hydroxyl group; an exendin-4 derivative in which the N-terminal amino group of exendin-4 is modified with a dimethyl group; an exendin-4 derivative in which the α-carbon atom of the 1st amino acid of exendin-4, histidine, has been removed; an exendin-4 derivative in which the 12th amino acid of exendin-4, lysine, is replaced with serine; and an exendin-4 derivative in which the 12th amino acid of exendin-4, lysine, is replaced with arginine, but is not limited to this.

При этом в качестве примера инсулинотропного пептида или длительно действующего конъюгата на его основе в настоящее изобретение посредством ссылки включено полное описание публикации заявки на патент США № 2010-0105877, но без ограничения этим.However, as an example of an insulinotropic peptide or a long-acting conjugate based on it, the present invention includes by reference the full description of the publication of the application for US patent No. 2010-0105877, but without limitation to this.

Кроме того, инсулинотропный пептид может быть в форме конъюгата, включающего в себя пептидную группировку, которая содержит аминокислотную последовательность вышеупомянутого инсулинотропного пептида, и группировку биосовместимого вещества, присоединенную к пептидной группировке, но этим не ограничивается. В частности, пептидная группировка, которая включает аминокислотную последовательность инсулинотропного пептида, характеризуется тем, что она находится в составе конъюгата, будучи ковалентно связанной с группировкой биосовместимого вещества посредством линкера, но конкретно этим не ограничивается. Конъюгат на основе инсулинотропного пептида может представлять собой длительно действующий конъюгат, и данное определение с точки зрения длительно действующего типа является таким же, как разъяснено выше.In addition, the insulinotropic peptide may be in the form of a conjugate including, but not limited to, a peptide moiety that contains the amino acid sequence of the aforementioned insulinotropic peptide, and a biocompatible substance moiety attached to the peptide moiety. In particular, a peptide moiety that includes the amino acid sequence of an insulinotropic peptide is characterized in that it is in the conjugate, being covalently linked to the biocompatible substance moiety via a linker, but is not specifically limited to this. The insulinotropic peptide conjugate may be a long acting conjugate and this definition in terms of long acting type is the same as explained above.

Ко всем признакам с точки зрения конъюгата, в частности, к группировке биосовместимого вещества (Fc-области иммуноглобулина) и линкеру (например, непептидный полимер), будет применимо все то, что описанного ранее. Например, линкер может представлять собой линкер, соответственно присоеAll features in terms of the conjugate, in particular, to the grouping of the biocompatible substance (the Fc-region of the immunoglobulin) and the linker (for example, non-peptide polymer), all that is described above will apply. For example, the linker may be a linker, respectively attached

- 27 042163 диненный к пептидной группировке и группировке биосовместимого вещества посредством ковалентных связей, которые образуются соответственно, когда один конец линкера взаимодействует с аминогруппой или тиоловой группой группировки биосовместимого вещества, в то время как другой конец линкера взаимодействует с аминогруппой или тиоловой группой пептидной группировки.- 27 042163 linked to the peptide group and the biocompatible substance group through covalent bonds, which are formed respectively when one end of the linker interacts with the amino group or thiol group of the biocompatible substance group, while the other end of the linker interacts with the amino group or thiol group of the peptide group.

В конкретном воплощении один конец непептидного линкера может вступать во взаимодействие с аминогруппой или тиоловой группой Fc-области иммуноглобулина, в то время как другой конец линкера вступает во взаимодействие с аминогруппой или тиоловой группой инсулинотропного пептида, и в результате этого образуется ковалентная связь, соответственно.In a specific embodiment, one end of the non-peptidic linker may interact with the amino group or thiol group of the Fc region of the immunoglobulin, while the other end of the linker interacts with the amino group or thiol group of the insulinotropic peptide, and as a result, a covalent bond is formed, respectively.

В более конкретном воплощении композиция для предупреждения или лечения вышеупомянутого метаболического синдрома или способ терапии могут представлять собой композицию или способ терапии, в которых содержится или используется пептид, содержащий аминокислотную последовательность нижеследующей общей формулы 2, или входящая в состав конъюгата группировка биосовместимого вещества, ковалентно связанная с этим пептидом, но конкретно этим не ограничивается.In a more specific embodiment, a composition for the prevention or treatment of the aforementioned metabolic syndrome or a method of therapy may be a composition or method of therapy that contains or uses a peptide containing the amino acid sequence of the following general formula 2, or a group of a biocompatible substance that is part of the conjugate covalently linked to this peptide, but is not specifically limited to this.

Y-Aib-QGTF-X7-SD-X10-S-X12-Y-L-X15-X16-X17-R-A-X20-X21-F-V-X24-W-L-M-N-TХ30 (общая формула 2, SEQ ГО NO: 46).Y-Aib-QGTF-X7-SD-X10-S-X12-Y-L-X15-X16-X17-R-A-X20-X21-F-V-X24-W-L-M-N-TX30 (general formula 2, SEQ ID NO: 46).

В общей формуле 2In general formula 2

X16 представляет собой глутаминовую кислоту или серин;X16 is glutamic acid or serine;

X17 представляет собой лизин или аргинин;X17 is lysine or arginine;

Х20 представляет собой глутамин или лизин;X20 is glutamine or lysine;

Х21 представляет собой аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту;X21 is aspartic acid or glutamic acid;

Х24 представляет собой валин или глутамин; иX24 is valine or glutamine; And

X30 представляет собой цистеин либо отсутствует.X30 is cysteine or absent.

Пептид по предшествующему конкретному воплощению, когда аминокислотная последовательность общей формулы 2 идентична любой последовательности с SEQ ID NO: 19, 33, 49 и 50, все пептиды или часть пептидов могут быть исключены.The peptide according to the previous specific embodiment, when the amino acid sequence of the general formula 2 is identical to any sequence of SEQ ID NOs: 19, 33, 49 and 50, all or part of the peptides may be omitted.

Более конкретно, композиция может включать в себя как (1) конъюгат, содержащий пептидную группировку, включающую аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 37, и группировку биосовместимого вещества, ковалентно связанную с пептидной группировкой; так и (2) конъюгат, который содержит группировку имидазо-ацетил-эксендина-4, где удален α-углеродный атом 1-й аминокислоты эксендина-4 (т.е. гистидина), и группировку биосовместимого вещества, ковалентно связанную с группировкой имидазо-ацетил-эксендина-4. Еще более конкретно, пептидная группировка, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 37, и группировка имидазо-ацетил-эксендина-4 могут быть связаны с соответствующими им группировками биосовместимого вещества посредством линкера, но конкретно этим не ограничиваются.More specifically, the composition may include both (1) a conjugate containing a peptide moiety comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 and a biocompatible substance moiety covalently linked to the peptide moiety; and (2) a conjugate that contains an imidazo-acetyl-exendin-4 moiety, where the α-carbon atom of the 1st amino acid of exendin-4 (i.e., histidine) is removed, and a biocompatible substance moiety covalently linked to the imidazo- acetyl-exendin-4. Even more specifically, the peptide moiety containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 and the imidazo-acetyl-exendin-4 moiety can be linked to their respective biocompatible substance moieties via a linker, but are not specifically limited to this.

Вводимые дозы соединения или вещества, обладающего терапевтической активностью в отношении метаболического синдрома, в частности, конъюгата, в котором инсулинотропный пептид присоединен к группировке биосовместимого вещества, могут находиться в диапазоне от примерно 0,0001 мкг до примерно 500 мг на 1 кг массы тела пациента, но конкретно этим не ограничивается.Administered doses of a compound or substance having therapeutic activity against metabolic syndrome, in particular a conjugate in which an insulinotropic peptide is attached to a biocompatible substance moiety, may range from about 0.0001 μg to about 500 mg per 1 kg of patient body weight, but is not specifically limited to this.

Кроме того, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать упомянутые выше вещества для совместного введения, то есть, соединение или вещество, обладающее терапевтической активностью в отношении метаболического синдрома, и производное глюкагона или конъюгат, содержащий производное глюкагона, (или каждый ингредиент из упомянутых выше веществ для совместного введения) в количестве от 0,01% (мас./об.) до 99% (мас./об.).In addition, the pharmaceutical composition of the present invention may contain the aforementioned substances for co-administration, i.e., a compound or substance having therapeutic activity against metabolic syndrome, and a glucagon derivative or a conjugate containing a glucagon derivative, (or each ingredient of the aforementioned substances for joint administration) in an amount of from 0.01% (w/v) to 99% (w/v).

При этом, согласно одному из аспектов, соединение или вещество, обладающее терапевтической активностью в отношении метаболического синдрома, и производное глюкагона или конъюгат, содержащий производное глюкагона, в частности, конъюгат, в котором группировка биосовместимого вещества присоединена к инсулинотропному пептиду (например, конъюгату инсулинотропный пептид-ПЭГFc-область Ig), и конъюгат, в котором группировка биосовместимого вещества присоединена к производному глюкагона, могут быть использованы в молярном соотношении от 1:0,01 до 1:50, но конкретно этим не ограничиваются.At the same time, according to one aspect, a compound or substance having therapeutic activity against metabolic syndrome, and a glucagon derivative or a conjugate containing a glucagon derivative, in particular, a conjugate in which a group of a biocompatible substance is attached to an insulinotropic peptide (for example, an insulinotropic peptide conjugate -PEGFc region of Ig) and a conjugate in which a biocompatible moiety is attached to a glucagon derivative can be used in a molar ratio of 1:0.01 to 1:50, but is not specifically limited to this.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен набор, включающий в себя производное глюкагона или конъюгат, содержащий производное глюкагона, и, в частности, набор для предупреждения или лечения врожденного гиперинсулинизма, гипогликемии или метаболического синдрома, включающий в себя производное глюкагона или конъюгат, содержащий производное глюкагона.According to another aspect of the present invention, there is provided a kit comprising a glucagon derivative or a conjugate comprising a glucagon derivative, and in particular a kit for the prevention or treatment of congenital hyperinsulinism, hypoglycemia or metabolic syndrome, comprising a glucagon derivative or a conjugate comprising a glucagon derivative.

Производное глюкагона или конъюгат, содержащий производное глюкагона, врожденный гиперинсулинизм, гипогликемия, метаболический синдром, предупреждение или лечение являются такими же, как разъяснено выше. Виды ингредиентов, которые могут дополнительно содержаться в наборе по наThe glucagon derivative or conjugate containing the glucagon derivative, congenital hyperinsulinism, hypoglycemia, metabolic syndrome, prevention or treatment are the same as explained above. Types of ingredients that may additionally be contained in a kit

- 28 042163 стоящему изобретению, могут включать все ингредиенты, которые могут содержаться в композиции, разъясненной выше.- 28 042163 of the present invention may include all the ingredients that may be contained in the composition explained above.

В частности, если набор представляет собой набор для предупреждения или лечения метаболического синдрома, то могут быть включены как (1) производное глюкагона, в частности, пептид, содержащий аминокислотную последовательность общей формулы 1 или 2, либо конъюгат, содержащий производное глюкагона, и (2) инсулинотропный пептид, в частности, GLP-1, эксендин-3, эксендин-4 или их производное, либо конъюгат, содержащий инсулинотропный пептид, но конкретно этим не ограничивается.In particular, if the kit is a kit for the prevention or treatment of metabolic syndrome, it can be included as (1) a glucagon derivative, in particular, a peptide containing the amino acid sequence of General formula 1 or 2, or a conjugate containing a glucagon derivative, and (2 ) an insulinotropic peptide, in particular GLP-1, exendin-3, exendin-4 or a derivative thereof, or a conjugate containing an insulinotropic peptide, but is not specifically limited to this.

Производное глюкагона является таким же, как разъяснено выше.The glucagon derivative is the same as explained above.

Более конкретно, это производное отличается тем, что оно представляет собой выделенный пептид, содержащий аминокислотную последовательность общей формулы 1, представленную последовательностью SEQ ID NO: 45, описанной выше. К разъяснению и комбинации в отношении выделенного пептида, включающего аминокислотную последовательность общей формулы 1, будет применимо все то, что описано выше.More specifically, this derivative is characterized in that it is an isolated peptide containing the amino acid sequence of general formula 1 represented by the sequence of SEQ ID NO: 45 described above. For clarification and combination in relation to the selected peptide comprising the amino acid sequence of General formula 1, all that is described above will apply.

Производное отличается тем, что оно представляет собой выделенный пептид, содержащий аминокислотную последовательность общей формулы 2:The derivative differs in that it is an isolated peptide containing the amino acid sequence of the general formula 2:

В общей формуле 2In general formula 2

X30 представляет собой цистеин или отсутствует.X30 is cysteine or absent.

Когда аминокислотная последовательность общей формулы 2 идентична любой из SEQ ID NO: 19, 33, 49 и 50, тогда она может быть исключена.When the amino acid sequence of general formula 2 is identical to any of SEQ ID NOs: 19, 33, 49 and 50, then it can be excluded.

Более конкретно, в пептиде, включающем аминокислотную последовательность общей формулы 2, X16 может представлять собой глутаминовую кислоту, Х20 может представлять лизин, и боковые цепи X16 и Х20 могут образовывать лактамное кольцо, но без ограничения этим.More specifically, in a peptide comprising the amino acid sequence of general formula 2, X16 may be glutamic acid, X20 may be lysine, and the side chains of X16 and X20 may form a lactam ring, but are not limited to this.

Кроме того, С-конец пептида, включающего аминокислотную последовательность общей формулы 2, может быть амидирован или не модифицирован, но этим не ограничивается.In addition, the C-terminus of the peptide comprising the amino acid sequence of the general formula 2 may be amidated or not modified, but is not limited to this.

Кроме того, пептид может представлять производное глюкагона, способное активировать рецептор глюкагона, но этим не ограничивается.In addition, the peptide may be a glucagon derivative capable of activating the glucagon receptor, but is not limited to this.

Более конкретно, пептид может включать аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12, 13, 15 и 36-44, но этим не ограничивается.More specifically, the peptide may include, but is not limited to, an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 12, 13, 15, and 36-44.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложены выделенный полинуклеотид, кодирующий производное глюкагона, вектор, включающий в себя полинуклеотид, и выделенная клетка, включающая в себя полинуклеотид или вектор.According to another aspect of the present invention, there is provided an isolated polynucleotide encoding a glucagon derivative, a vector including the polynucleotide, and an isolated cell including the polynucleotide or vector.

В частности, таким производным может быть выделенный пептид, содержащий аминокислотную последовательность общей формулы 1, представленную последовательностью SEQ ID NO: 45, описанной выше. К разъяснению и комбинации в отношении выделенного пептида, включающего аминокислотную последовательность общей формулы 1, будет применимо все то, что описано выше. Кроме того, в частности, таким производным может быть выделенный пептид, содержащий аминокислотную последовательность общей формулы 2, представленную последовательностью SEQ ID NO: 46, описанной выше. К разъяснению и комбинации в отношении выделенного пептида, включающего аминокислотную последовательность общей формулы 2, будет применимо все то, что описано выше.In particular, such a derivative may be an isolated peptide containing the amino acid sequence of general formula 1 represented by the sequence of SEQ ID NO: 45 described above. For clarification and combination in relation to the selected peptide comprising the amino acid sequence of General formula 1, all that is described above will apply. In addition, in particular, such a derivative may be an isolated peptide containing the amino acid sequence of General formula 2, represented by the sequence of SEQ ID NO: 46 described above. For clarification and combination in relation to the selected peptide comprising the amino acid sequence of General formula 2, all that is described above will apply.

Использованный в данном описании термин гомология означает сходство последовательностей по сравнению с аминокислотной последовательностью для дикого типа или нуклеотидной последовательностью для дикого типа, и сравнение гомологии может быть выполнено невооруженным глазом или с использованием коммерчески доступной программы для сравнения. Используя коммерчески доступную компьютерную программу, можно выразить гомологию между двумя или несколькими последовательностями в процентах (%), и можно вычислить % гомологии между сопоставляемыми последовательностями.As used herein, the term homology refers to sequence similarity compared to a wild-type amino acid sequence or a wild-type nucleotide sequence, and comparison of homology can be performed with the naked eye or using a commercially available comparison program. Using a commercially available computer program, the homology between two or more sequences can be expressed as a percentage (%), and the % homology between matched sequences can be calculated.

Использованный в данном описании термин рекомбинантный вектор относится к конструкцииAs used herein, the term recombinant vector refers to the construct

- 29 042163- 29 042163

ДНК, содержащей последовательность полинуклеотида, кодирующего целевой пептид, например, производное глюкагона, которая функционально связана с соответствующей регуляторной последовательностью для обеспечения экспрессии целевого пептида, например, производного глюкагона, в клетке хозяина.DNA containing a polynucleotide sequence encoding a target peptide, eg a glucagon derivative, that is operably linked to an appropriate regulatory sequence to allow expression of the target peptide, eg a glucagon derivative, in the host cell.

Регуляторная последовательность содержит промотор, способный инициировать транскрипцию, какую-либо последовательность оператора для регуляции транскрипции, последовательность, кодирующую подходящий рибосомасвязывающий домен мРНК, и последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции. Рекомбинантный вектор после его перенесения в подходящую клетку хозяина может реплицироваться, или может функционировать независимо от генома клетки хозяина, или может интегрироваться в сам геном клетки хозяина.The regulatory sequence contains a promoter capable of initiating transcription, any operator sequence for regulating transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding domain, and a sequence regulating transcription and translation termination. The recombinant vector, once transferred to a suitable host cell, may replicate, or may function independently of the genome of the host cell, or may integrate into the genome of the host cell itself.

Рекомбинантный вектор, используемый в настоящем изобретении, не может быть конкретно ограничен при условии, что этот вектор способен реплицироваться в клетке хозяина, и он может быть сконструирован с использованием любого вектора, известного в данной области техники. Примеры традиционно используемого вектора могут включать природные или рекомбинантные плазмиды, космиды, вирусы и бактериофаги. Векторы, предполагаемые для использования в настоящем изобретении, могут представлять собой любой экспрессирующий вектор, известный в данной области техники.The recombinant vector used in the present invention is not particularly limited as long as the vector is capable of replicating in the host cell, and it can be constructed using any vector known in the art. Examples of a traditionally used vector may include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses, and bacteriophages. The vectors contemplated for use in the present invention may be any expression vector known in the art.

Рекомбинантный вектор используют для трансфекции клетки хозяина с целью продуцирования производных глюкагона по настоящему изобретению. Кроме того, такие трансфицированные клетки, как часть настоящего изобретения, могут быть использованы для амплификации нуклеиновокислотных фрагментов и векторов или могут представлять собой культивированные клетки или клеточные линии, используемые для получения рекомбинантными методами производных глюкагона по настоящему изобретению.The recombinant vector is used to transfect a host cell to produce the glucagon derivatives of the present invention. In addition, such transfected cells, as part of the present invention, may be used to amplify nucleic acid fragments and vectors, or may be cultured cells or cell lines used to recombinantly produce the glucagon derivatives of the present invention.

Использованный в данном описании термин трансфекция относится к процессу введения рекомбинантного вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий целевой белок, в клетку хозяина, тем самым обеспечивая экспрессию белка, кодируемого полинуклеотидом, в клетке хозяина. Что касается используемого для трансфекции полинуклеотида, то не имеет значения, встроен ли он в хромосому клетки хозяина и локализован там или локализован вне хромосомы, в то же время он может быть экспрессирован в клетке хозяина, и включены оба эти случая.As used herein, the term transfection refers to the process of introducing a recombinant vector containing a polynucleotide encoding a target protein into a host cell, thereby allowing expression of the protein encoded by the polynucleotide in the host cell. With regard to the polynucleotide used for transfection, it does not matter whether it is integrated into the chromosome of the host cell and located there or located outside the chromosome, while it can be expressed in the host cell, and both of these cases are included.

Кроме того, полинуклеотид включает ДНК и РНК, которые кодируют целевой белок. Полинуклеотид может быть встроен в любой форме, если он может быть введен в клетку хозяина и экспрессирован в ней. Например, полинуклеотид может быть введен в клетку хозяина в форме экспрессионной кассеты, которая представляет собой генетическую конструкцию, содержащую все основные элементы, необходимые для самоэкспрессии. Экспрессионная кассета обычно может содержать промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, сигнал терминации транскрипции, рибосомасвязывающий домен и сигнал терминации трансляции. Экспрессионная кассета может быть в форме экспрессирующего вектора, способного к саморепликации. Кроме того, полинуклеотид может быть введен в клетку хозяина, когда он функционально связан с последовательностью, необходимой для его экспрессии в клетке хозяина, но этим не ограничивается.In addition, the polynucleotide includes DNA and RNA that encode the target protein. The polynucleotide may be inserted in any form as long as it can be introduced into and expressed in the host cell. For example, a polynucleotide can be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a genetic construct containing all the essential elements required for self-expression. The expression cassette may typically contain a promoter operably linked to the polynucleotide, a transcription termination signal, a ribosome binding domain, and a translation termination signal. The expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self-replication. In addition, the polynucleotide can be introduced into the host cell when it is operably linked to a sequence necessary for its expression in the host cell, but is not limited to this.

Кроме того, использованный в данном описании термин функционально связанный относится к функциональной связи между последовательностью промотора, которая инициирует и опосредует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего целевой пептид по настоящему изобретению, и упомянутой выше последовательностью гена.In addition, as used herein, the term operably linked refers to a functional relationship between a promoter sequence that initiates and mediates transcription of a polynucleotide encoding a target peptide of the present invention and the aforementioned gene sequence.

Подходящий хозяин, предполагаемый для использования в настоящем изобретении, не может быть конкретно ограничен при условии, что он может экспрессировать полинуклеотид по настоящему изобретению. Примеры подходящего хозяина могут включать бактерии рода Escherichia, такие как Е. coli; бактерии рода Bacillus, такие как Bacillus subtilis; бактерии рода Pseudomonas, такие как Pseudomonas putida; дрожжи, такие как Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae и Schizosaccharomyces pombe; клетки насекомых, такие как Spodoptera frugiperda (Sf9), и клетки животных, такие как клетки яичников китайского хомячка (СНО), COS и BSC.A suitable host contemplated for use in the present invention cannot be specifically limited, provided that it can express the polynucleotide of the present invention. Examples of a suitable host may include bacteria of the genus Escherichia such as E. coli; bacteria of the genus Bacillus such as Bacillus subtilis; bacteria of the genus Pseudomonas such as Pseudomonas putida; yeasts such as Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe; insect cells such as Spodoptera frugiperda (Sf9); and animal cells such as Chinese hamster ovary (CHO), COS and BSC cells.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен выделенный конъюгат, в котором производное глюкагона связано с группировкой биосовместимого вещества, которое способно увеличивать период полувыведения in vivo производного глюкагона. Таким конъюгатом может быть длительно действующий конъюгат.According to another aspect of the present invention, an isolated conjugate is provided wherein the glucagon derivative is linked to a biocompatible moiety that is capable of increasing the in vivo half-life of the glucagon derivative. Such a conjugate may be a long acting conjugate.

В частности, согласно настоящему изобретению предложен выделенный конъюгат, который содержит пептидную группировку и группировку биосовместимого вещества, и пептидная группировка представляет собой такую же последовательность, как и последовательность общей формулы 1 или 2, или последовательность, ее включающую.In particular, according to the present invention, an isolated conjugate is provided that contains a peptide group and a group of a biocompatible substance, and the peptide group is the same sequence as the sequence of general formula 1 or 2, or a sequence including it.

Что касается производного глюкагона, аминокислотной последовательности общей формулы 1 или 2, биосовместимого вещества и строения конъюгата, то все то, что описано выше, применимо к ним.As for the glucagon derivative, the amino acid sequence of the general formula 1 or 2, the biocompatible substance and the structure of the conjugate, everything that is described above applies to them.

В частности, таким производным может быть выделенный пептид, содержащий аминокислотную последовательность общей формулы 1, представленную последовательностью SEQ ID NO: 45, описанной выше. К признаку и комбинации в отношении выделенного пептида, включающего аминокислотную поIn particular, such a derivative may be an isolated peptide containing the amino acid sequence of general formula 1 represented by the sequence of SEQ ID NO: 45 described above. To the sign and combination in relation to the selected peptide, including the amino acid

- 30 042163 следовательность общей формулы 1, применимо все то, что описано выше.- 30 042163 sequence of general formula 1, all that is described above applies.

Кроме того, в частности, таким производным может быть выделенный пептид, содержащий аминокислотную последовательность общей формулы 2, представленную последовательностью SEQ ID NO: 46, описанной выше. К признаку и комбинации в отношении выделенного пептида, включающего аминокислотную последовательность общей формулы 2, применимо все то, что описано выше.In addition, in particular, such a derivative may be an isolated peptide containing the amino acid sequence of General formula 2, represented by the sequence of SEQ ID NO: 46 described above. All that is described above applies to the feature and combination with respect to the isolated peptide comprising the amino acid sequence of general formula 2.

В частности, группировка биосовместимого вещества может быть выбрана из группы, состоящей из полимера, жирной кислоты, холестерина, альбумина и его фрагмента, альбуминсвязывающего вещества, полимера из повторяющихся звеньев конкретной аминокислотной последовательности, антитела, фрагмента антитела, FcRn-связывающего вещества, соединительной ткани in vivo или его производного, нуклеотида, фибронектина, трансферрина, сахарида, гепарина и эластина, но этим не ограничивается.In particular, the grouping of the biocompatible substance can be selected from the group consisting of a polymer, a fatty acid, cholesterol, albumin and its fragment, an albumin binder, a polymer of repeating units of a specific amino acid sequence, an antibody, an antibody fragment, an FcRn binder, a connective tissue in vivo or its derivative, nucleotide, fibronectin, transferrin, saccharide, heparin and elastin, but not limited to this.

В частности, полимер может быть выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахарида, декстрана, поливинил-этилового эфира, биоразлагаемого полимера, липидного полимера, хитина, гиалуроновой кислоты, олигонуклеотида и их комбинации, но конкретно этим не ограничивается.In particular, the polymer may be selected from the group consisting of polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol-propylene glycol copolymer, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaccharide, dextran, polyvinyl ethyl ether, biodegradable polymer, lipid polymer, chitin, hyaluronic acid, oligonucleotide, and their combinations, but is not specifically limited to this.

Более конкретно, FcRn-связывающее вещество может представлять собой полипептид, содержащий Fc-область иммуноглобулина, но конкретно этим не ограничивается. Такое же разъяснение относительно Fc-области иммуноглобулина также применимо к этому аспекту.More specifically, the FcRn binding agent may be a polypeptide containing the Fc region of an immunoglobulin, but is not specifically limited to this. The same explanation regarding the Fc region of an immunoglobulin also applies to this aspect.

Выделенный конъюгат может представлять собой конъюгат, в котором группировка производного глюкагона, в частности, пептидная группировка, содержащая аминокислотную последовательность пептида, являющегося производным глюкагона, и группировка биосовместимого вещества связаны друг с другом посредством линкера. Такое же разъяснение относительно линкера также применимо к этому аспекту.The isolated conjugate may be a conjugate in which a glucagon derivative moiety, in particular a peptide moiety containing the amino acid sequence of a glucagon derived peptide, and a biocompatible substance moiety are linked to each other via a linker. The same explanation regarding the linker also applies to this aspect.

Кроме того, группировка производного глюкагона, в частности, пептидная группировка, содержащая аминокислотную последовательность пептида, являющегося производным глюкагона, может быть связана с группировкой биосовместимого вещества посредством линкера, выбранного из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахарида, декстрана, поливинилэтилового эфира, биоразлагаемого полимера, такого как полимолочная кислота (PLA) и полимолочнаягликолевая кислота (PLGA), липидного полимера, хитина, гиалуроновой кислоты, жирной кислоты, полимера, низкомолекулярного соединения, нуклеотида и их комбинации, но этим не ограничивается.In addition, a glucagon derivative moiety, in particular a peptide moiety containing the amino acid sequence of a glucagon-derived peptide, can be linked to the biocompatible substance moiety via a linker selected from the group consisting of polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol-propylene glycol copolymer, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaccharide, dextran, polyvinyl ethyl ether, biodegradable polymer such as polylactic acid (PLA) and polylactic glycolic acid (PLGA), lipid polymer, chitin, hyaluronic acid, fatty acid, polymer, small molecule compound, nucleotide, and combinations thereof, but these is not limited.

Кроме того, группировка биосовместимого вещества может представлять собой FcRn-связывающее вещество, и выделенный пептид может быть связан с группировкой биосовместимого вещества посредством пептидного линкера или непептидного линкера, выбранного из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахарида, декстрана, поливинил-этилового эфира, биоразлагаемого полимера, такого как полимолочная кислота (PLA) и полимолочная-гликолевая кислота (PLGA), липидного полимера, хитина, гиалуроновой кислоты и их комбинации, но этим не ограничивается.In addition, the biocompatible moiety may be an FcRn binding agent, and the isolated peptide may be linked to the biocompatible moiety via a peptide linker or a non-peptide linker selected from the group consisting of polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol-propylene glycol, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaccharide, dextran, polyvinyl ethyl ether, biodegradable polymer such as polylactic acid (PLA) and polylactic glycolic acid (PLGA), lipid polymer, chitin, hyaluronic acid, and combinations thereof.

В частности, FcRn-связывающее вещество может представлять полипептид, содержащий Fcобласть иммуноглобулина, а линкером может быть, в частности, полиэтиленгликоль, но этим не ограничивается.In particular, the FcRn-binding agent may be a polypeptide containing the Fco region of an immunoglobulin, and the linker may be, in particular, polyethylene glycol, but is not limited to this.

Кроме того, линкером может быть линкер, который присоединен к остатку цистеина производного глюкагона, но конкретно этим не ограничивается.In addition, the linker may be a linker that is attached to the cysteine residue of the glucagon derivative, but is not specifically limited to this.

Кроме того, линкер может представлять собой линкер, соответственно присоединенный к производному глюкагона и группировке биосовместимого вещества посредством ковалентных связей, которые образуются соответственно, когда один конец линкера взаимодействует с аминогруппой или тиоловой группой группировки биосовместимого вещества, в то время как другой конец линкера взаимодействует с аминогруппой или тиоловой группой пептидной группировки, но конкретно этим не ограничивается.In addition, the linker may be a linker, respectively attached to the glucagon derivative and the biocompatible substance moiety through covalent bonds, which are formed respectively when one end of the linker interacts with the amino group or the thiol group of the biocompatible substance moiety, while the other end of the linker interacts with the amino group or a thiol group of a peptide group, but is not specifically limited to this.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ предупреждения или лечения врожденного гиперинсулинизма, гипогликемии или метаболического синдрома, включающий введение субъекту производное глюкагона, конъюгата, содержащего производное глюкагона, или содержащей их композиции.According to another aspect of the present invention, there is provided a method for preventing or treating congenital hyperinsulinism, hypoglycemia, or metabolic syndrome, comprising administering to a subject a glucagon derivative, a conjugate containing a glucagon derivative, or a composition containing the same.

Производное глюкагона, конъюгат, содержащий производное глюкагона, содержащая их композиция, врожденный гиперинсулинизм, гипогликемия, метаболический синдром, предупреждение и лечение являются такими же, как разъяснено выше.Glucagon derivative, glucagon derivative conjugate, composition containing the same, congenital hyperinsulinism, hypoglycemia, metabolic syndrome, prevention and treatment are the same as explained above.

В настоящем изобретении термин субъект относится к субъекту, предположительно имеющему врожденный гиперинсулинизм, гипогликемию или метаболический синдром, и этот термин означает млекопитающих, включающих людей, мышей и домашний скот, имеющих врожденный гиперинсулинизм, гипогликемию или метаболический синдром либо имеющих риск врожденного гиперинсулинизма, гипогликемии или метаболического синдрома. Однако любой субъект, подлежащий лечению производным глюкагона по настоящему изобретению или композицией, содержащей производное глюкагона,In the present invention, the term subject refers to a subject suspected of having congenital hyperinsulinism, hypoglycemia, or metabolic syndrome, and the term means mammals, including humans, mice, and livestock, having congenital hyperinsulinism, hypoglycemia, or metabolic syndrome, or at risk of congenital hyperinsulinism, hypoglycemia, or metabolic syndrome. syndrome. However, any subject to be treated with a glucagon derivative of the present invention, or a composition containing a glucagon derivative,

- 31 042163 входит в объем изобретения без ограничения. Кроме того, субъект, предположительно имеющий врожденный гиперинсулинизм, гипогликемию или ожирение, можно эффективно лечить путем введения фармацевтической композиции, содержащей производное глюкагона по настоящему изобретению. Врожденный гиперинсулинизм, гипогликемия и ожирение являются такими, как разъяснено выше.- 31 042163 is included in the scope of the invention without limitation. In addition, a subject suspected of having congenital hyperinsulinism, hypoglycemia, or obesity can be effectively treated by administering the pharmaceutical composition containing the glucagon derivative of the present invention. Congenital hyperinsulinism, hypoglycemia and obesity are as explained above.

Способ по настоящему изобретению может включать введение фармацевтической композиции, содержащей пептид в фармацевтически эффективном количестве. Общую суточную дозу будет определять лечащий врач по результатам соответствующей медицинской оценки, и ее вводят однократно или несколько раз разделенными дозами. Что касается объектов по настоящему изобретению, то конкретную терапевтически эффективную дозу для каждого конкретного пациента предпочтительно можно применять по-разному в зависимости от различных факторов, общеизвестных в медицине, включая тип и степень ответной реакции, которую требуется достичь, конкретные композиции, содержащие в отдельных случаях другие агенты или нет, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и рацион питания пациента, время и путь введения, скорость секреции композиции, продолжительность лечения, другие лекарственные средства, использованные в комбинации или одновременно с композицией по настоящему изобретению, и подобные факторы, известные в медицине.The method of the present invention may include administering a pharmaceutical composition containing the peptide in a pharmaceutically effective amount. The total daily dose will be determined by the attending physician based on appropriate medical judgment and administered in single or multiple divided doses. With regard to the objects of the present invention, the specific therapeutically effective dose for each particular patient can preferably be used differently depending on various factors commonly known in medicine, including the type and degree of response to be achieved, specific compositions containing in individual cases other agents or not, age, body weight, general health, sex and diet of the patient, time and route of administration, rate of secretion of the composition, duration of treatment, other drugs used in combination or simultaneously with the composition of the present invention, and similar factors known in medicine.

При этом способ предупреждения или лечения метаболического синдрома может представлять собой терапию, в которой применяют совместное введение, при этом дополнительно используют по меньшей мере одно соединение или вещество, обладающее терапевтической активностью в отношении метаболического синдрома, хотя данный способ конкретно этим не ограничен.Wherein, the method for preventing or treating metabolic syndrome may be a therapy in which co-administration is used, while additionally using at least one compound or substance having therapeutic activity against metabolic syndrome, although this method is not specifically limited to this.

Следует понимать, что использованный в данном описании термин совместное введение относится к одновременному, раздельному или последовательному введению. Если введение представляет собой последовательное или раздельное введение, то интервалом для введения вторичного ингредиента должен быть интервал, благодаря которому не утрачивается полезный эффект от совместного введения.As used herein, the term co-administration should be understood to refer to simultaneous, separate or sequential administration. If the administration is sequential or separate administration, then the interval for the introduction of the secondary ingredient should be the interval due to which the beneficial effect of the joint administration is not lost.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложено применение производного глюкагона, или выделенного конъюгата, или композиции для изготовления лекарственного средства (или фармацевтической композиции) для предупреждения или лечения врожденного гиперинсулинизма, гипогликемии или метаболического синдрома.According to another aspect of the present invention, the use of a glucagon derivative or isolated conjugate or composition for the manufacture of a drug (or pharmaceutical composition) for the prevention or treatment of congenital hyperinsulinism, hypoglycemia or metabolic syndrome is provided.

Производное глюкагона, выделенный конъюгат, композиция, врожденный гиперинсулинизм, гипогликемия и метаболический синдром являются такими же, как разъяснено выше.The glucagon derivative, isolated conjugate, composition, congenital hyperinsulinism, hypoglycemia and metabolic syndrome are the same as explained above.

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на приведенные ниже примеры и экспериментальные примеры. Однако приведенные ниже примеры и экспериментальные примеры представлены только в иллюстративных целях, и объем настоящего изобретения никоим образом ими не ограничен.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples and experimental examples. However, the following examples and experimental examples are presented for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited by them in any way.

Пример 1. Получение клеточной линии, демонстрирующей цАМФ (циклический аденозинмонофосфат)-ответ на GLP-1.Example 1 Preparation of a cell line demonstrating a cAMP (cyclic adenosine monophosphate) response to GLP-1.

ПЦР (полимеразная цепная реакция) проводили, используя участок, соответствующий открытой рамке считывания (ORF) в кДНК (OriGene Technologies, Inc., USA) гена рецептора глюкагона человека, в качестве матрицы вместе с указанными ниже прямым и обратным праймерами (SEQ ID NO: 47 и 48 соответственно), каждый из которых содержит сайты рестрикции EcoRI и XhoI.PCR (Polymerase Chain Reaction) was performed using the region corresponding to the open reading frame (ORF) in cDNA (OriGene Technologies, Inc., USA) of the human glucagon receptor gene as a template along with the following forward and reverse primers (SEQ ID NO: 47 and 48, respectively), each containing EcoRI and XhoI restriction sites.

В частности, ПЦР проводили в течение в общей сложности 30 циклов в следующих условиях: денатурация при 95°C в течение 60 с, отжиг при 55°C в течение 60 с и полимеризация при 68°C в течение 30 с. Амлифицированные продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 1,0% агарозном геле, и в результате элюирования получали полосу, соответствующую 450 п.о. (пар оснований).In particular, PCR was carried out for a total of 30 cycles under the following conditions: denaturation at 95°C for 60 s, annealing at 55°C for 60 s, and polymerization at 68°C for 30 s. The amplified PCR products were electrophoresed on a 1.0% agarose gel and eluted to give a 450 bp band. (base pairs).

Прямой праймер (SEQ ID NO: 47):Forward primer (SEQ ID NO: 47):

5'-CAGCGACACCGACCGTCCCCCCGTACTTAAGGCC-3'.5'-CAGCGACACCGACCGTCCCCCCGTACTTAAGGCC-3'.

Обратный праймер (SEQ ID NO: 48):Reverse primer (SEQ ID NO: 48):

5'-CTAACCGACTCTCGGGGAAGACTGAGCTCGCC-3'.5'-CTAACCGACTCTCGGGGAAGACTGAGCTCGCC-3'.

Продукт ПЦР клонировали в известный экспрессиующий вектор для клеток животных, x0GC/dhfr (дигидрофолатредуктаза), с получением рекомбинантного вектора x0GC/GCGR.The PCR product was cloned into a known animal cell expression vector, x0GC/dhfr (dihydrofolate reductase), to obtain a recombinant x0GC/GCGR vector.

Линию клеток СНО DG44 (линия клеток яичников китайского хомячка, дефектных по dhfr), культивированную в среде DMEM/F12 (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла с питательной смесью Хэма F12) (содержащей 10% FBS (фетальная бычья сыворотка), трансфицировали рекомбинантным вектором x0GC/GCGR с использованием Lipofectamine® (липофектамин) и культивировали в селективной среде, содержащей G418 (1 мг/мл) и метотрексат (10 нМ). Из нее отбирали клеточные линии, происходящие из одного клона, используя метод предельных разведений, и из них окончательно отбирали клеточную линию, демонстрирующую превосходный цАМФ-ответ на глюкагон в зависимости от концентрации.CHO cell line DG44 (Chinese hamster ovary cell line defective in dhfr) cultured in DMEM/F12 (Dulbecco's modified Eagle's medium with Ham's F12 nutrient mixture) (containing 10% FBS (fetal bovine serum) was transfected with recombinant vector x0GC /GCGR using Lipofectamine® (lipofectamine) and cultured in a selective medium containing G418 (1 mg/ml) and methotrexate (10 nM), from which cell lines originating from one clone were selected using the method of limiting dilutions, and from them finally a cell line showing an excellent cAMP response to glucagon was selected in a concentration dependent manner.

Пример 2. Синтез производного глюкагона.Example 2 Synthesis of a glucagon derivative.

Для получения производных глюкагона с улучшенными физическими свойствами в аминокислотной последовательности нативного глюкагона с SEQ ID NO: 1 производили замены на аминокислотные остатки, имеющие положительный и отрицательный заряды, и таким образом синтезировали производные глюкагона, которые представлены в приведенной ниже табл. 1. Относительную активность in vitro,In order to obtain glucagon derivatives with improved physical properties, substitutions were made in the amino acid sequence of native glucagon with SEQ ID NO: 1 for amino acid residues having positive and negative charges, and thus glucagon derivatives were synthesized, which are shown in the following table. 1. Relative activity in vitro,

- 32 042163 указанную ниже, измеряли методом, описанным в примере 4.- 32 042163 indicated below, was measured by the method described in example 4.

Таблица 1Table 1

Аминокислотные последовательности нативного глюкагона и производных глюкагонаAmino acid sequences of native glucagon and glucagon derivatives

SEQ ID NO SEQ ID NO Пептидная последовательность Peptide sequence Образование кольца Education rings pi pi Активность in vitro (активность относительно SEQ ID NO: 1, %) Activity in vitro (activity relative to SEQ ID NO: 1, %) SEQ ГО NO: 1 SEQ GO NO: 1 HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDF VQWLMNT HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDF VQWLMNT - - 6,8 6.8 100 100 SEQ ГО NO: 2 SEQ GO NO: 2 HSQGTFTSDYSKYLDCDRAQDF VQWLMNT HSQGTFTSDYSKYLDCDRAQDF VQWLMNT - - 4,56 4.56 0,6 0.6 SEQ ГО NO: 3 SEQ GO NO: 3 HSQGTFTSDYSKYLDCERAQDF VQWLMNT HSQGTFTSDYSKYLDCERAQDF VQWLMNT - - 4,66 4.66 6,1 6.1

- 33 042163- 33 042163

SEQ ГО NO: 4 SEQ GO NO: 4 HSQGTFTSDYSKYLDSCDAQDF VQWLMNT HSQGTFTSDYSKYLDSCDAQDF VQWLMNT - - 4,13 4.13 <θ,ι <θ,ι SEQ ГО NO: 5 SEQ GO NO: 5 HSQGTFTSDYSKYLDSCEAQDF VQWLMNT HSQGTFTSDYSKYLDSCEAQDF VQWLMNT - - 4,22 4.22 о,з oh, s SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 6 HSQGTFTSDYSKYLDSCEADDF VQWLMNT HSQGTFTSDYSKYLDSCEADDF VQWLMNT - - 4,03 4.03 <0,1 <0.1 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 7 YSQGTFTSDYSKYLDSCEADDF VQWLMNT YSQGTFTSDYSKYLDSCEADDF VQWLMNT - - 3,71 3.71 <0,1 <0.1 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 8 YXQGTFTSDYSKYLDSCDAQDF VQWLINT YXQGTFTSDYSKYLDSCDAQDF VQWLINT - - 3,77 3.77 <0,1 <0.1 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 9 YXQGTFTSDYSKYLDSCDAQDF VVWLINT YXQGTFTSDYSKYLDSCDAQDF VVWLINT - - 3,77 3.77 <0,1 <0.1 SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 10 YXQGTFTSDYSKYLDSCDADDF VVWLINT YXQGTFTSDYSKYLDSCDADDDF VVWLINT - - 3,66 3.66 <0,1 <0.1 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO:11 YXQGTFTSDYSKYLDEKCAKEF VQWLMNT YXQGTFTSDYSKYLDEKCAKEEF VQWLMNT - - 4,78 4.78 4,6 4.6 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO:12 YXQGTFTSDYSKYLDEKRAKEF VQWLMNTC YXQGTFTSDYSKYLDEKRAKEF VQWLMNTC образовано кольцо a ring is formed 6,20 6.20 56,3 56.3 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO:13 YXQGTFTSDYSCYLDSRRAQDF VQWLMNT YXQGTFTSDYSCYLDSRRAQDF VQWLMNT - - 4,43 4.43 5,2 5.2 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO:14 YXQGTFTSDYSKYLDCKRAKEF VQWLMNT YXQGTFTSDYSKYLDCKRAKEF VQWLMNT - - 8,12 8.12 18,1 18.1 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO:15 YXQGTFTSDYSKYLCEKRAQDF VVWLMNT YXQGTFTSDYSKYLCEKRAQDF VVWLMNT - - 6,11 6.11 1,1 1.1 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO:16 YXQGTFTSDYSKYLDCRRAQVF VQWLMRT YXQGTFTSDYSKYLDCRRAQVF VQWLMRT - - 9,11 9.11 4,2 4.2 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO:17 YXQGTFTSDYSKYLDCVRAQDF VQWLMRT YXQGTFTSDYSKYLDCVRAQDF VQWLMRT - - 6,03 6.03 23,2 23.2 SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO:18 YXQGTFTSDYSKYLDSRRACDF RLWLMNT YXQGTFTSDYSKYLDSRRACDF RLWLMNT - - 8,15 8.15 <0,1 <0.1 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO:19 YXQGTFTSDYSKYLCEKRAKEF VQWLMNT YXQGTFTSDYSKYLCEKRAKEF VQWLMNT образовано кольцо a ring is formed 8,12 8.12 12,1 12.1

- 34 042163- 34 042163

SEQ ГО NO: 20 SEQ GO NO: 20 YXQGTFTSDYSKYLDECRAKEF VQWLMNT YXQGTFTSDYSKYLDECRAKEF VQWLMNT образовано кольцо a ring is formed 4,78 4.78 299,7 299.7 SEQ ГО NO: 21 SEQ GO NO: 21 YXQGTFTSDYSKYLDEKCAKEF VQWLMNT YXQGTFTSDYSKYLDEKCAKEEF VQWLMNT образовано кольцо a ring is formed 4,78 4.78 57,8 57.8 SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 22 YXQGTFTSDYSKYLDEKRCKEF VQWLMNT YXQGTFTSDYSKYLDEKRCKEEF VQWLMNT образовано кольцо a ring is formed 6,20 6.20 147,8 147.8 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 23 YXQGTFTSDYSKYCDEKRAKEF VQWLMNT YXQGTFTSDYSKYCDEKRAKEF VQWLMNT образовано кольцо a ring is formed 6,20 6.20 76,8 76.8 SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 24 YXQGTFTSDYSKCLDEKRAKEF VQWLMNT YXQGTFTSDYSKCLDEKRAKEF VQWLMNT образовано кольцо a ring is formed 6,21 6.21 58,0 58.0 SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 25 YXQGTFTSDYSKYLDEKRAKCF VQWLMNT YXQGTFTSDYSKYLDEKRAKCF VQWLMNT образовано кольцо a ring is formed 8,12 8.12 46,9 46.9 SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 26 WXQGTFTSDYSKYLDECRAKD FVQWLMNT WXQGTFTSDYSKYLDECRAKD FVQWLMNT образовано кольцо a ring is formed 4,68 4.68 1,0 1.0 SEQ ID NO: 27 SEQ ID NO: 27 YXQGTFVSDYSKYLDECRAKD FVQWLMNT YXQGTFVSDYSKYLDECRAKD FVQWLMNT образовано кольцо a ring is formed 4,68 4.68 93,6 93.6 SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 28 WXQGTFVSDYSKYLDECRAKD FVQWLMNT WXQGTFVSDYSKYLDECRAKD FVQWLMNT образовано кольцо a ring is formed 4,68 4.68 <0,1 <0.1 SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 29 YXQGTFTSDYSKCLDERRAKDF VQWLMNT YXQGTFTSDYSKCLDERRAKDF VQWLMNT образовано кольцо a ring is formed 6,15 6.15 61,3 61.3 SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 30 WXQGTFTSDYSKCLDERRAKD FVQWLMNT WXQGTFTSDYSKCLDERRAKD FVQWLMNT образовано кольцо a ring is formed 4,44 4.44 о,з oh, s SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO:31 YXQGTFTSDYSKYLDCKRAKEF VQWLMNT YXQGTFTSDYSKYLDCKRAKEF VQWLMNT образовано кольцо a ring is formed 8,12 8.12 6,3 6.3 SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO:32 SQGTFTSDYSKYLDECRAKEFV QWLMNT SQGTFTSDYSKYLDECRAKEFV QWLMNT образовано кольцо a ring is formed 4,78 4.78 0,7 0.7 SEQ ID NO: 33 SEQ ID NO:33 YXQGTFTSDYSKYLDSRRAQDF VQWLMNT YXQGTFTSDYSKYLDSRRAQDF VQWLMNT - - 6,04 6.04 108,2 108.2 SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO:34 WXQGTFTSDYSKYCDERRAKE FVQWLMNT WXQGTFTSDYSKYCDERRAKE FVQWLMNT образовано кольцо a ring is formed 6,21 6.21 0,2 0.2

- 35 042163- 35 042163

SEQ ГО NO: 35 SEQ GO NO:35 YXQGTFTSDYSKYCDERRAKEF VQWLMNT YXQGTFTSDYSKYCDERRAKEF VQWLMNT образовано кольцо a ring is formed 6,2 6.2 17,7 17.7 SEQID NO: 36 SEQID NO:36 YXQGTFTSDCSKYLDERRAKEF VQWLMNT YXQGTFTSDCSKYLDERRAKEF VQWLMNT образовано кольцо a ring is formed 6,21 6.21 9,9 9.9 SEQID NO: 37 SEQID NO:37 YXQGTFTSDYSKYLDERRAKEF VQWLMNTC YXQGTFTSDYSKYLDERRAKEF VQWLMNTC образовано кольцо a ring is formed 6,21 6.21 225,5 225.5 SEQID NO: 38 SEQID NO:38 YXQGTFCSDYSKYLDERRAKEF VQWLMNT YXQGTFCSDYSKYLDERRAKEF VQWLMNT образовано кольцо a ring is formed 6,15 6.15 167,3 167.3 SEQID NO: 39 SEQID NO:39 YXQGTF VSDC SKYLDERRAKD FVQWLMNT YXQGTF VSDC SKYLDERRAKD FVQWLMNT образовано кольцо a ring is formed 6,15 6.15 3,7 3.7 SEQID NO: 40 SEQID NO:40 YXQGTF VSDYSKYLDERRAKD FVQWLMNTC YXQGTF VSDYSKYLDERRAKD FVQWLMNTC образовано кольцо a ring is formed 6,15 6.15 40,8 40.8 SEQID NO: 41 SEQID NO:41 YXQGTFC SD YSKYLDERRAKD FVQWLMNT YXQGTFC SD YSKYLDERRAKD FVQWLMNT образовано кольцо a ring is formed 6,03 6.03 45,2 45.2 SEQID NO: 42 SEQID NO:42 YXQGTFC SD YSKYLD SRRAQDF VQWLMNT YXQGTFC SD YSKYLD SRRAQDF VQWLMNT - - 6,03 6.03 37,9 37.9 SEQID NO: 43 SEQID NO:43 YXQGTFTSDCSKYLD SRRAQDF VQWLMNT YXQGTFTSDCSKYLD SRRAQDF VQWLMNT - - 6,03 6.03 1,6 1.6 SEQID NO: 44 SEQID NO:44 YXQGTFTSDYSKYLDSRRAQDF VQWLMNTC YXQGTFTSDYSKYLDSRRAQDF VQWLMNTC - - 6,21 6.21 75,4 75.4

В аминокислотных последовательностях, указанных в табл. 1, аминокислота, обозначенная X, представляет собой неприродную аминокислоту, аминоизомасляную кислоту (Aib), подчеркнутые аминокислотные остатки означают образование кольца, и - в аминокислотной последовательности указывает на то, что в соответствующем положении никакого аминокислотного остатка нет. Кроме того, в строках, касающихся образования кольца, - указывает на то, что образования кольца в соответствующих последовательностях не происходит.In the amino acid sequences listed in table. 1, the amino acid indicated by X is a non-natural amino acid, aminoisobutyric acid (Aib), underlined amino acid residues indicate ring formation, and - in the amino acid sequence indicates that no amino acid residue is present at the corresponding position. In addition, in the lines relating to ring formation, - indicates that ring formation does not occur in the corresponding sequences.

Пример 3. Измерение pI производных глюкагона.Example 3 Measurement of pI of glucagon derivatives.

С целью измерения улучшенных физических свойств производных глюкагона, синтезированных так, как в примере 2, вычисляли значения pI, исходя из аминокислотных последовательностей, с использованием программного обеспечения инструмента pI/Mw (http://expasy.org/tools/pi_tool.html; Gasteiger et al., 2003) на сервере ExPASy.In order to measure the improved physical properties of glucagon derivatives synthesized as in Example 2, pI values were calculated from amino acid sequences using the pI/Mw tool software (http://expasy.org/tools/pi_tool.html; Gasteiger et al., 2003) on the ExPASy server.

Как показано в приведенной выше табл. 1, в то время как нативный глюкагон с SEQ ID NO: 1 имел pI 6,8, некоторые производные глюкагона по настоящему изобретению демонстрировали значения pI в диапазоне от примерно 4 до примерно 6. Поскольку производные глюкагона по настоящему изобретению имеют значения pI ниже или выше, чем значение pI нативного глюкагона, они могут проявлять улучшенную растворимость и более высокую стабильность в условиях нейтральных рН по сравнению с нативным глюкагоном.As shown in the above table. 1, while native glucagon of SEQ ID NO: 1 had a pI of 6.8, some of the glucagon derivatives of the present invention exhibited pI values ranging from about 4 to about 6. Because the glucagon derivatives of the present invention have pI values below or above than the pI value of native glucagon, they may exhibit improved solubility and higher stability under neutral pH conditions compared to native glucagon.

Соответственно, при использовании производных глюкагона по настоящему изобретению в качестве терапевтического агента для лечения целевого заболевания, такого как врожденный гиперинсулинизм, гипогликемия и т.д., они могут улучшать соблюдение пациентами режима и схемы лечения, а также подходят для введения в комбинации с другими агентами против ожирения или агентами против диабета, и поэтому производные глюкагона по настоящему изобретению можно эффективно применять в качестве терапевтических агентов для лечения гипогликемии и метаболических синдромов, включая ожирение, диабет, неалкогольный стеатогепатит (NASH), дислипидемию и коронарную болезнь сердца.Accordingly, when the glucagon derivatives of the present invention are used as a therapeutic agent for the treatment of a target disease such as congenital hyperinsulinism, hypoglycemia, etc., they can improve patient compliance and are also suitable for administration in combination with other agents. anti-obesity or anti-diabetic agents, and therefore, the glucagon derivatives of the present invention can be effectively used as therapeutic agents for the treatment of hypoglycemia and metabolic syndromes, including obesity, diabetes, non-alcoholic steatohepatitis (NASH), dyslipidemia, and coronary heart disease.

Пример 4. Измерение цАМФ активности производных глюкагона.Example 4 Measurement of cAMP activity of glucagon derivatives.

Активность производных глюкагона, синтезированных в примере 2, измеряли в клеточных линиях, имеющих рецепторы глюкагона человека, полученных в примере 1. Конкретно, трансфицированную клеточную линию пересевали 3-4 раза в неделю, аликвотами вносили в 384-луночный планшет в количестве 6x103 клеток на одну лунку и культивировали в течение 24 ч. Нативный глюкагон и производные глюкагона суспендировали в сбалансированном солевом буферном растворе Хенкса (HBSS), содержащем 0,5 мМ 3-изобутил-1-метилксантин (IBMX), 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 5 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновую кислоту (HEPES) с клеточными культурами, в концентрациях 200 нМ и 1600 нМ, соответственно, непрерывно подвергали 4-кратному разведению 10 раз, исThe activity of the glucagon derivatives synthesized in example 2 was measured in cell lines having human glucagon receptors obtained in example 1. Specifically, the transfected cell line was seeded 3-4 times a week, aliquoted into a 384-well plate in the amount of 6x103 cells per one well and cultured for 24 hours. Native glucagon and glucagon derivatives were suspended in Hank's balanced salt buffer solution (HBSS) containing 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 0.1% bovine serum albumin (BSA) and 5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) with cell cultures, at concentrations of 200 nM and 1600 nM, respectively, were continuously subjected to a 4-fold dilution 10 times, and

- 36 042163 пользовали набор для анализа цАМФ (набор LANCE cAMP 384, PerkinElmer), добавляли к культивированным клеткам и измеряли значение их флуоресценции. После измерения наивысшее значение флуоресценции принимали за 100% и затем, исходя из этого, рассчитывали значения EC50 (50%-ная эффективная концентрация) для производных глюкагона и сравнивали их с EC₅₀ для нативного глюкагона. Результаты представлены в приведенной выше табл. 1.- 36 042163 cAMP assay kit (LANCE cAMP 384 kit, PerkinElmer) was added to cultured cells and their fluorescence value was measured. After measurement, the highest fluorescence value was taken as 100% and then, based on this, EC50 values (50% effective concentration) for glucagon derivatives were calculated and compared with EC ₅₀ for native glucagon. The results are presented in the above table. 1.

Пример 5. Получение конъюгата, содержащего производное глюкагона и Fc-область иммуноглобулина (конъюгат SEQ ID NO: 12 или 20 и Fc-области иммуноглобулина).Example 5 Preparation of a conjugate containing a glucagon derivative and an immunoglobulin Fc region (conjugate of SEQ ID NO: 12 or 20 and an immunoglobulin Fc region).

Чтобы осуществить пэгилирование остатка цистеина производного глюкагона (SEQ ID NO: 12 или 20) с использованием ПЭГ 10 кДа, имеющего малеимидную группу и альдегидную группу, соответственно, на обоих концах (названного как малеимид-ПЭГ-альдегид, 10 кДа, NOF, Japan), производные глюкагона и малеимид-ПЭГ-альдегид приводили во взаимодействие в молярном соотношении от 1:1 до 1:5 при концентрации белка от 3 до 10 мг/мл при низкой температуре в течение 1-3 ч. В частности, реакцию проводили в среде, в которую добавляли 20-60% изопропанола. По завершении реакции реакционную смесь наносили на SP Sepharose HP (GE Healthcare, USA) для очистки производных глюкагона, монопэгилированных по остатку цистеина.To perform PEGylation of a cysteine residue of a glucagon derivative (SEQ ID NO: 12 or 20) using a 10 kDa PEG having a maleimide group and an aldehyde group, respectively, at both ends (named as maleimide-PEG-aldehyde, 10 kDa, NOF, Japan) , glucagon derivatives, and maleimide-PEG-aldehyde were reacted in a molar ratio of 1:1 to 1:5 at a protein concentration of 3 to 10 mg/ml at a low temperature for 1–3 h. In particular, the reaction was carried out in a medium , to which 20-60% isopropanol was added. After completion of the reaction, the reaction mixture was applied to SP Sepharose HP (GE Healthcare, USA) to purify glucagon derivatives mono-pegylated at the cysteine residue.

Затем очищенные монопэгилированные производные глюкагона и Fc-область иммуноглобулина приводили во взаимодействие в молярном соотношении от 1:2 до 1:10 при концентрации белка от 10 до 50 мг/мл при температуре от 4 до 8°C в течение от 12 до 18 ч. Эту реакцию проводили в среде, в которой цианоборгидрид натрия (NaCNBH₃) и от 10 до 20% изопропанола было добавлено в 100 мМ кальцийфосфатный буфер (рН 6,0). По завершении реакции реакционную смесь наносили на колонку Butyl Sepharose FF (GE Healthcare, USA) и колонку Source ISO (GE Healthcare, USA) для очистки конъюгата, содержащего производные глюкагона и Fc-область иммуноглобулина.The purified mono-pegylated glucagon derivatives and the immunoglobulin Fc region were then reacted in a molar ratio of 1:2 to 1:10 at a protein concentration of 10 to 50 mg/mL at 4 to 8°C for 12 to 18 hours. This reaction was carried out in a medium in which sodium cyanoborohydride (NaCNBH ₃ ) and 10 to 20% isopropanol were added to 100 mM calcium phosphate buffer (pH 6.0). After completion of the reaction, the reaction mixture was applied to a Butyl Sepharose FF column (GE Healthcare, USA) and a Source ISO column (GE Healthcare, USA) to purify the conjugate containing glucagon derivatives and the immunoglobulin Fc region.

После получения было показано, что чистота конъюгатов, проанализированная обращенно-фазовой хроматографией, эксклюзионной хроматографией и ионообменной хроматографией, составляет 95% или выше.After preparation, the purity of the conjugates as analyzed by reverse phase chromatography, size exclusion chromatography and ion exchange chromatography was shown to be 95% or higher.

В частности, конъюгат, в котором производное глюкагона с SEQ ID NO: 12 и Fc-область иммуноглобулина связаны посредством ПЭГ, был назван конъюгатом, содержащим производное глюкагона с SEQ ID NO: 12 и Fc-область иммуноглобулина, длительно действующим конъюгатом с SEQ ID NO: 12 или длительно действующим производным с SEQ ID NO: 12, и в настоящем изобретении эти термины можно использовать взаимозаменяемым образом.Specifically, a conjugate in which a glucagon derivative of SEQ ID NO: 12 and an immunoglobulin Fc region are linked by PEG has been termed a conjugate containing a glucagon derivative of SEQ ID NO: 12 and an immunoglobulin Fc region, a long-acting conjugate of SEQ ID NO. : 12 or long-acting derivative of SEQ ID NO: 12, and in the present invention, these terms can be used interchangeably.

В частности, конъюгат, в котором производное глюкагона с SEQ ID NO: 20 и Fc-область иммуноглобулина связаны посредством ПЭГ, был назван конъюгатом, содержащим производное глюкагона с SEQ ID NO: 20 и Fc-область иммуноглобулина, длительно действующим конъюгатом с SEQ ID NO: 20 или длительно действующим производным с SEQ ID NO: 20, и в настоящем изобретении эти термины можно использовать взаимозаменяемым образом.Specifically, a conjugate in which a glucagon derivative of SEQ ID NO: 20 and an immunoglobulin Fc region are linked by PEG has been referred to as a conjugate comprising a glucagon derivative of SEQ ID NO: 20 and an immunoglobulin Fc region, a long-acting conjugate of SEQ ID NO. : 20 or the long acting derivative of SEQ ID NO: 20, and these terms can be used interchangeably in the present invention.

Пример 6. Получение конъюгата, содержащего производное эксендина-4 и Fc-область иммуноглобулина.Example 6 Preparation of a conjugate containing an exendin-4 derivative and an immunoglobulin Fc region.

ПЭГ 3,4 кДа, имеющий пропиональдегидную группу на обоих концах, т.е. 3.4k PropionALD (2) PEG, приводили во взаимодействие с Lys CA эксендина-4, используя имидазо-ацетил-эксендин-4, где удален альфа-углеродный атом N-концевого остатка гистидина (СА эксендин-4, АР, USA), и выделяли пик изомера на самой последней части (Lys27) между двумя пиками Lys, который является довольно реакционноспособным и четко отличается от N-концевого изомера. Затем проводили реакцию сочетания, используя пэгилированный изомер пептида.PEG 3.4 kDa having a propionaldehyde group at both ends, i.e. 3.4k PropionALD (2) PEG was reacted with Lys CA exendin-4 using imidazo-acetyl-exendin-4 where the alpha carbon of the N-terminal histidine residue was removed (CA exendin-4, AP, USA), and isolated the peak of the isomer at the very last part (Lys27) between the two peaks of Lys, which is quite reactive and clearly different from the N-terminal isomer. A coupling reaction was then carried out using the pegylated peptide isomer.

Реакцию сочетания осуществляли, приводя во взаимодействие вышеупомянутый пэгилированный пептид, имидазо-ацетил-эксендин-4, и Fc-область иммуноглобулина в молярном соотношении 1:8 при концентрации общего белка 60 мг/мл при 4°C в течение 20 ч. Взаимодействие проводили в 100 мМ K-P (калий-фосфатный буфер) (рН 6,0), в который и добавляли восстанавливающий агент 20 мМ SCB (цианоборгидрид натрия). После сочетания реакционную смесь очищали путем пропускания через две колонки для очистки. Сначала удаляли большое количество Fc-области иммуноглобулина, не участвующее в реакции сочетания, используя SOURCE Q (XK 16 мл, Amersham Biosciences). После применения градиента концентрации соли с использованием 1 М раствора NaCl в 20 мМ трис-буфере (рН 7,5) сразу происходит элюирование Fc-области иммуноглобулина, которая имеет относительно слабую аффинность связывания, затем незамедлительно происходит элюирование конъюгата эксендин-4-(Fc-область иммуноглобулина). В результате этой первичной очистки Fc-область иммуноглобулина удаляется до определенной степени, однако полное разделение на ионообменной колонке не достигается из-за небольшой разницы в аффинности связывания между Fc-областью иммуноглобулина и конъюгатом эксендин-4-(Fcобласть иммуноглобулина). Соответственно, проводили вторичную очистку, используя гидрофобность этих двух разных веществ. Образец, прошедший первичную очистку, адсорбировали на SOURCE ISO (HR 16 мл, Amersham Biosciences), используя 20 мМ трис-буфер (рН 7,5) и 1,5 М сульфат аммония, и затем элюировали при постепенном понижении концентрации сульфата аммония. В результате, Fc-область иммуноглобулина, которая обладает слабой аффинностью связывания с колонкой для HIC (хроматография гидрофобного взаимодействия), элюировалась первой, затем элюировался образец, эксендин-4-(FcThe coupling reaction was carried out by bringing into interaction the aforementioned pegylated peptide, imidazo-acetyl-exendin-4, and the immunoglobulin Fc region in a molar ratio of 1:8 at a total protein concentration of 60 mg/ml at 4°C for 20 hours. The interaction was carried out in 100 mM K-P (potassium phosphate buffer) (pH 6.0), to which was added the reducing agent 20 mM SCB (sodium cyanoborohydride). After coupling, the reaction mixture was purified by passing through two purification columns. First, a large amount of the non-coupling immunoglobulin Fc region was removed using SOURCE Q (XK 16 ml, Amersham Biosciences). After applying a salt concentration gradient using 1 M NaCl solution in 20 mM Tris buffer (pH 7.5), the Fc region of the immunoglobulin, which has a relatively weak binding affinity, is immediately eluted, followed immediately by the exendin-4-(Fc- immunoglobulin region). As a result of this primary purification, the immunoglobulin Fc region is removed to a certain extent, however, complete separation on the ion exchange column is not achieved due to the small difference in binding affinity between the immunoglobulin Fc region and the exendin-4-(Immunoglobulin Fc region) conjugate. Accordingly, a secondary purification was carried out using the hydrophobicity of these two different substances. The primary purified sample was adsorbed onto SOURCE ISO (HR 16 ml, Amersham Biosciences) using 20 mM Tris buffer (pH 7.5) and 1.5 M ammonium sulfate, and then eluted with a gradual decrease in ammonium sulfate concentration. As a result, the immunoglobulin Fc region, which has a low binding affinity for the HIC (Hydrophobic Interaction Chromatography) column, was eluted first, followed by the sample, exendin-4-(Fc

- 37 042163 область иммуноглобулина), который обладает высокой аффинностью связывания к хвостовой части. Это разделение осуществлялось гораздо легче по сравнению с разделением на ионообменной колонке благодаря большему различию в гидрофобности.- 37 042163 immunoglobulin region), which has a high binding affinity for the tail. This separation was much easier compared to the separation on an ion exchange column due to the greater difference in hydrophobicity.

Колонка: SOURCE Q (XK 16 мл, Amersham Biosciences).Column: SOURCE Q (XK 16 ml, Amersham Biosciences).

Скорость потока: 2,0 мл/мин.Flow rate: 2.0 ml/min.

Градиент: А0^25% 70 мин В (А: 20 мМ трис-буфер, рН 7,5; В: А+ 1 М NaCl).Gradient: A0^25% 70 min B (A: 20 mM Tris buffer, pH 7.5; B: A+ 1 M NaCl).

Колонка: SOURCE ISO (HR 16 мл, Amersham Biosciences).Column: SOURCE ISO (HR 16 ml, Amersham Biosciences).

Скорость потока: 7,0 мл/мин.Flow rate: 7.0 ml/min.

Градиент: В 100^0% 60 мин В [А: 20 мМ трис-буфер (рН 7,5), В: А + 1,5 М сульфат аммония ((NH4)2SO4)].Gradient: B 100^0% 60 min B [A: 20 mM Tris buffer (pH 7.5), B: A + 1.5 M ammonium sulfate ((NH4)2SO4)].

Полученный таким способом конъюгат, в котором производное эксендина-4 и Fc-область иммуноглобулина связаны посредством ПЭГ, был назван длительно действующим производным эксендина-4. Кроме того, этот термин в настоящем изобретении можно использовать взаимозаменяемым образом с термином длительно действующее производное эксендина.The conjugate thus obtained, in which the exendin-4 derivative and the immunoglobulin Fc region are linked by PEG, was named the long-acting exendin-4 derivative. In addition, this term in the present invention can be used interchangeably with the term long-acting exendin derivative.

Пример 7. Получение конъюгата, содержащего производное глюкагона и Fc-область иммуноглобулина (конъюгат SEQ ID NO: 37-Fc-область иммуноглобулина).Example 7 Preparation of a Conjugate Containing a Glucagon Derivative and an Immunoglobulin Fc Region (Conjugate SEQ ID NO: 37 Immunoglobulin Fc Region).

Затем очищенные монопэгилированные производные глюкагона и Fc-область иммуноглобулина приводили во взаимодействие в молярном соотношении от 1:2 до 1:10 при концентрации белка от 10 до 50 мг/мл при температуре от 4 до 8°C в течение от 12 до 18 ч. Эту реакцию проводили в среде, в которой 10-50 мМ цианоборгидрид натрия (NaCNBH₃), являющийся восстанавливающим агентом, и от 10 до 20% изопропанола было добавлено в 100 мМ кальций-фосфатный буфер (рН 6,0). По завершении реакции реакционную смесь наносили на колонку Butyl Sepharose FF (GE Healthcare, USA) и колонку Source ISO (GE Healthcare, USA) для очистки конъюгата, содержащего производные глюкагона и Fc-область иммуноглобулина.The purified mono-pegylated glucagon derivatives and the immunoglobulin Fc region were then reacted in a molar ratio of 1:2 to 1:10 at a protein concentration of 10 to 50 mg/mL at 4 to 8°C for 12 to 18 hours. This reaction was carried out in a medium in which 10-50 mM sodium cyanoborohydride (NaCNBH ₃ ), a reducing agent, and 10 to 20% isopropanol were added to 100 mM calcium phosphate buffer (pH 6.0). After completion of the reaction, the reaction mixture was applied to a Butyl Sepharose FF column (GE Healthcare, USA) and a Source ISO column (GE Healthcare, USA) to purify the conjugate containing glucagon derivatives and the immunoglobulin Fc region.

В частности, конъюгат, в котором производное глюкагона с SEQ ID NO: 37 и Fc-область иммуноглобулина связаны посредством ПЭГ, был назван конъюгатом, содержащим производное глюкагона с SEQ ID NO: 37 и Fc-область иммуноглобулина, длительно действующим конъюгатом с SEQ ID NO: 37 или длительно действующим производным с SEQ ID NO: 37, и в настоящем изобретении эти термины можно использовать взаимозаменяемым образом.In particular, a conjugate in which a glucagon derivative of SEQ ID NO: 37 and an immunoglobulin Fc region are linked by PEG has been called a conjugate containing a glucagon derivative of SEQ ID NO: 37 and an immunoglobulin Fc region, a long-acting conjugate of SEQ ID NO. :37 or the long acting derivative of SEQ ID NO:37, and these terms can be used interchangeably in the present invention.

Экспериментальный пример 1. Эффект снижения массы тела у крыс с ожирением, вызванным кормом с высоким содержанием жиров.Experimental Example 1 Effect of weight loss in high-fat diet-induced obese rats.

В этом эксперименте использовали крыс с ожирением, вызванным кормлением кормом с высоким содержанием жиров, которые широко используются в качестве животных моделей ожирения. В частности, грызуны с ожирением, вызванным кормом с высоким содержанием жиров, являются наиболее часто используемыми животными моделями для доклинической оценки влияния агентов, применяемых для лечения ожирения, на снижение массы тела, и данные модели создавали так, как приведено ниже. Когда здоровых крыс или мышей кормили кормом с содержанием жиров 60% в течение 4 недель (для крыс) или 6 месяцев (для мышей), масса тела у крыс увеличивалась примерно на 600 г, а масса тела у мышей увеличивалась примерно на 55 г по сравнению с их массой тела до кормления, и уровни липидов в крови также возрастали, что свидетельствует о состоянии ожирения, как у людей. Масса тела крыс, использованных в этом экспериментальном примере, перед введением составляла примерно 600 г. Во время эксперимента крыс содержали по отдельности, и они имели неограниченный доступ к воде. Освещение не предоставлялось с 6 ч вечера до 6 ч утра.In this experiment, we used rats with high-fat diet-induced obesity, which are widely used as animal models of obesity. In particular, high-fat diet-induced obesity rodents are the most commonly used animal models for preclinical assessment of the effect of agents used to treat obesity on weight loss, and these models were created as follows. When healthy rats or mice were fed a 60% fat diet for 4 weeks (for rats) or 6 months (for mice), body weight in rats increased by about 600 g and body weight in mice increased by about 55 g compared to with their pre-feeding body weight, and blood lipid levels also increased, indicating a state of obesity similar to humans. The body weight of the rats used in this experimental example was about 600 g before administration. During the experiment, the rats were kept separately and had unlimited access to water. Lighting was not provided from 6 p.m. to 6 a.m.

Тестируемые группы, получавшие корм с высоким содержанием жиров, включают: группу 1, получавшую эксципиент, не содержащий длительно действующего глюкагона (введение: 2 мл/кг; инъекция один раз каждые 3 суток), - разбавитель; группу 2, получавшую длительно действующее производное эксендина из примера 6 в дозе 3,3 нмоль/кг (инъекция один раз каждые 3 суток); группу 3, получавшую длительно действующее производное с SEQ ID NO: 12 в дозе 1,6 нмоль/кг (инъекция один раз каждые 3 суток); группу 4, получавшую длительно действующее производное с SEQ ID NO: 12 в дозе 3,3 нмоль/кг (инъекция один раз каждые 3 суток); группу 5, получавшую длительно действующее производное с SEQTest groups fed a high fat diet include: group 1 fed excipient without long-acting glucagon (administration: 2 ml/kg; injection once every 3 days), diluent; group 2 receiving the long-acting exendin derivative of Example 6 at a dose of 3.3 nmol/kg (injection once every 3 days); group 3 receiving the long acting derivative of SEQ ID NO: 12 at a dose of 1.6 nmol/kg (injection once every 3 days); group 4 treated with the long-acting derivative of SEQ ID NO: 12 at a dose of 3.3 nmol/kg (injection once every 3 days); group 5 treated with a long-acting derivative with SEQ

- 38 042163- 38 042163

ID NO: 12 в дозе 6,6 нмоль/кг (инъекция один раз каждые 3 суток); группу 6, получавшую длительно действующее производное эксендина из примера 6 в дозе 3,3 нмоль/кг + длительно действующее производное с SEQ ID NO: 12 в дозе 1,6 нмоль/кг (инъекция один раз каждые 3 суток, соответственно); группу 7, получавшую длительно действующее производное эксендина из примера 6 в дозе 3,3 нмоль/кг + длительно действующее производное с SEQ ID NO: 12 в дозе 3,3 нмоль/кг (инъекция один раз каждые 3 суток, соответственно); группу 8, получавшую длительно действующее производное эксендина из примера 6 в дозе 3,3 нмоль/кг + длительно действующий производное с SEQ ID NO: 12 в дозе 6,6 нмоль/кг (инъекция один раз каждые 3 суток, соответственно); группу 9, получавшую спаренное кормление с группой 4; и группу 10, получавшую спаренное кормление с группой 7.ID NO: 12 at 6.6 nmol/kg (injection once every 3 days); group 6 treated with long-acting exendin derivative of Example 6 at 3.3 nmol/kg + long-acting derivative of SEQ ID NO: 12 at 1.6 nmol/kg (injection once every 3 days, respectively); group 7 treated with long-acting exendin derivative of Example 6 at 3.3 nmol/kg + long-acting derivative of SEQ ID NO: 12 at 3.3 nmol/kg (injection once every 3 days, respectively); group 8 treated with long-acting exendin derivative of Example 6 at 3.3 nmol/kg + long-acting derivative of SEQ ID NO: 12 at 6.6 nmol/kg (injection once every 3 days, respectively); group 9, fed in pairs with group 4; and group 10 fed in pairs with group 7.

Эксперимент останавливали на 15-е сутки, а в ходе эксперимента измеряли изменения массы тела крыс в каждой группе с интервалами 3 суток. После остановки эксперимента и аутопсии измеряли количество брыжеечного жира и массу печени. Для сравнения группы, получавшей разбавитель, и тестируемых групп выполняли статистический анализ методом однофакторного ANOVA.The experiment was stopped on the 15th day, and during the experiment, changes in the body weight of rats in each group were measured at intervals of 3 days. After stopping the experiment and autopsy, the amount of mesenteric fat and liver mass were measured. To compare the diluent-treated group and the test groups, statistical analysis was performed by one-way ANOVA.

В результате измерения изменений массы тела, что может быть подтверждено на фиг. 1, группы, которым вводили либо только длительно действующее производное эксендина, либо только длительно действующее производное с SEQ ID NO: 12, показали уменьшение массы тела на величину от -8 и -7 до 22% по сравнению с массой тела до введения, в то время как в группах с совместным введением длительно действующего производного эксендина и длительно действующего производного с SEQ ID NO: 12 эффект снижения массы тела дополнительно увеличился с -22 до -35%.As a result of measuring changes in body weight, which can be confirmed in FIG. 1, groups administered with either the long acting exendin derivative alone or the long acting derivative of SEQ ID NO: 12 alone showed a decrease in body weight of -8 and -7 to 22% compared to pre-administration body weight, while while in the co-administration groups of the long acting exendin derivative and the long acting derivative of SEQ ID NO: 12, the weight reduction effect further increased from -22 to -35%.

Кроме того, при сравнении эффекта уменьшения массы тела в группе, которой вводили только длительно действующее производное с SEQ ID NO: 12, и в группе, которой вводили комбинацию длительно действующего производного эксендина и длительно действующего производного с SEQ ID NO: 12, с уменьшением массы тела в группе спаренного кормления, соответственно, была показана разница, составляющая примерно -11% и примерно -17%, соответственно, что служит подтверждением того, что эффект снижения массы тела проявлялся при введении одного только производного глюкагона или при совместном введении в результате действий, иных чем потребление корма.In addition, when comparing the effect of reducing body weight in the group administered only the long-acting derivative of SEQ ID NO: 12 and the group administered the combination of the long-acting derivative of exendin and the long-acting derivative of SEQ ID NO: 12, with weight loss body weight in the paired feeding group, respectively, showed a difference of about -11% and about -17%, respectively, which confirms that the effect of reducing body weight was manifested when the glucagon derivative was administered alone or when co-administered as a result of actions, other than feed intake.

То есть, было подтверждено, что длительно действующее производное глюкагона по настоящему изобретению может играть дополнительную роль в снижении массы тела помимо эффекта анорексии.That is, it has been confirmed that the long-acting glucagon derivative of the present invention can play an additional role in weight loss besides the effect of anorexia.

Кроме того, в результате измерения количества брыжеечного жира и массы печени, что может быть подтверждено на фиг. 2 и 3, совместное введение длительно действующего производного эксендина и длительно действующего производного с SEQ ID NO: 12 показало значительное уменьшение жира в организме, а также уменьшение массы печени по сравнению с этими показателями в группе, которой вводили эксципиент. В частности, причиной увеличения/уменьшения массы печени обычно является увеличение/уменьшение жира, присутствующего в печени, и вышеуказанный эффект уменьшения массы печени свидетельствует об эффекте снижения жира в печени. Соответственно, измерение уменьшения жира в печени может служить способом измерения терапевтического эффекта в отношении метаболического синдрома, такого как ожирение, диабет, неалкогольный стеатогепатит и так далее.In addition, as a result of measuring the amount of mesenteric fat and liver mass, which can be confirmed in FIG. 2 and 3, the co-administration of the long-acting exendin derivative and the long-acting derivative of SEQ ID NO: 12 showed a significant decrease in body fat as well as a decrease in liver weight compared to those in the excipient group. In particular, the reason for the increase/decrease in liver weight is usually an increase/decrease in fat present in the liver, and the above effect of reducing liver weight is indicative of the effect of reducing fat in the liver. Accordingly, the measurement of liver fat reduction can serve as a way to measure the therapeutic effect on metabolic syndrome such as obesity, diabetes, non-alcoholic steatohepatitis, and so on.

Экспериментальный пример 2. Эффект снижения массы тела у мышей с ожирением, вызванным кормом с высоким содержанием жиров.Experimental Example 2 Effect of weight loss in high fat diet-induced obese mice.

В этом эксперименте использовали мышей с ожирением, вызванным кормлением кормом с высоким содержанием жиров, которые широко используются в качестве животных моделей ожирения. Масса тела мышей перед введением составляла примерно 55 г. Во время эксперимента мышей содержали по 7 мышей в каждой группе, и они имели неограниченный доступ к воде. Освещение не предоставлялось с 6 ч вечера до 6 ч утра.In this experiment, mice were used with high fat diet-induced obesity, which are widely used as animal models of obesity. The body weight of mice before administration was about 55 g. During the experiment, mice were kept in 7 mice in each group, and they had unlimited access to water. Lighting was not provided from 6 p.m. to 6 a.m.

Тестируемые группы, получавшие корм с высоким содержанием жиров, включают: группу 1, получавшую эксципиент, не содержащий длительно действующего глюкагона (введение: 5 мл/кг; инъекция один раз каждые 2 суток), - разбавитель; группу 2, получавшую длительно действующее производное эксендина из примера 6 в дозе 4,3 нмоль/кг (инъекция один раз каждые 2 суток); группу 3, получавшую длительно действующее производное с SEQ ID NO: 20 в дозе 4,4 нмоль/кг (инъекция один раз каждые 2 суток); группу 4, получавшую длительно действующее производное с SEQ ID NO: 20 в дозе 8,8 нмоль/кг (инъекция один раз каждые 2 суток); группу 5, получавшую длительно действующее производное эксендина из примера 6 в дозе 4,3 нмоль/кг + длительно действующее производное с SEQ ID NO: 20 в дозе 4,4 нмоль/кг (инъекция один раз каждые 2 суток); группу 6, получавшую длительно действующее производное эксендина из примера 6 в дозе 2,1 нмоль/кг + длительно действующее производное с SEQ ID NO: 20 в дозе 6,6 нмоль/кг (инъекция один раз каждые 2 суток); и группу 7, получавшую длительно действующее производное эксендина из примера 6 в дозе 0,8 нмоль/кг + длительно действующий производное с SEQ ID NO: 20 в дозе 8,0 нмоль/кг (инъекция один раз каждые 2 суток).Test groups fed a high fat diet include: group 1 fed excipient without long acting glucagon (administration: 5 ml/kg; injection once every 2 days), diluent; group 2 receiving the long-acting exendin derivative of Example 6 at a dose of 4.3 nmol/kg (injection once every 2 days); group 3 receiving the long acting derivative of SEQ ID NO: 20 at a dose of 4.4 nmol/kg (injection once every 2 days); group 4 treated with the long-acting derivative of SEQ ID NO: 20 at a dose of 8.8 nmol/kg (injection once every 2 days); group 5 treated with long-acting exendin derivative of Example 6 at 4.3 nmol/kg + long-acting derivative of SEQ ID NO: 20 at 4.4 nmol/kg (injection once every 2 days); group 6 treated with long-acting exendin derivative of Example 6 at 2.1 nmol/kg + long-acting derivative of SEQ ID NO: 20 at 6.6 nmol/kg (injection once every 2 days); and Group 7 treated with the long acting exendin derivative of Example 6 at 0.8 nmol/kg + the long acting derivative of SEQ ID NO: 20 at 8.0 nmol/kg (injection once every 2 days).

Эксперимент останавливали на 22-е сутки, а в ходе эксперимента измеряли изменения массы тела мышей в каждой группе с интервалами 2 суток. После остановки эксперимента и аутопсии измеряли массу печени мышей.The experiment was stopped on the 22nd day, and during the experiment, changes in the body weight of mice in each group were measured at intervals of 2 days. After stopping the experiment and autopsy, the mass of the mouse liver was measured.

В результате измерения изменений массы тела, что может быть подтверждено на фиг. 4, каждая из групп, которым вводили только длительно действующее производное с SEQ ID NO: 20 (8,8 нмоль/кг,As a result of measuring changes in body weight, which can be confirmed in FIG. 4, each of the groups administered only the long-acting derivative of SEQ ID NO: 20 (8.8 nmol/kg,

- 39 042163 инъекция один раз каждые 2 суток), показала уменьшение массы тела на -25 и -29%, соответственно, по сравнению с массой тела до введения. Кроме того, было показано, что эффект снижения массы тела еще больше возрастал при введении в комбинации с длительно действующим производным эксендина. Также было подтверждено, что совместное введение длительно действующего производного эксендина и длительно действующего производного с SEQ ID NO: 20 в соотношении 1:1, 1:3 и 1:10 еще больше усиливало эффект снижения массы тела до -50% или больше. Помимо этого, эффект снижения массы тела в зависимости от соотношения между длительно действующим производным эксендина и длительно действующим производным с SEQ ID NO: 20 не был существенным, однако, эффект анорексии повышался наряду с увеличением процентной доли длительно действующего производного эксендина, тем самым подтверждая, что длительно действующее производное глюкагона по настоящему изобретению может играть дополнительную роль в снижении массы тела помимо эффекта анорексии.- 39 042163 injection once every 2 days) showed a decrease in body weight of -25 and -29%, respectively, compared with body weight before injection. In addition, it was shown that the effect of reducing body weight was further increased when administered in combination with a long-acting exendin derivative. It was also confirmed that the co-administration of the long-acting exendin derivative and the long-acting derivative of SEQ ID NO: 20 at a ratio of 1:1, 1:3 and 1:10 further enhanced the effect of reducing body weight to -50% or more. In addition, the effect of reducing body weight depending on the ratio between the long-acting exendin derivative and the long-acting derivative of SEQ ID NO: 20 was not significant, however, the anorexia effect increased along with the increase in the percentage of the long-acting exendin derivative, thereby confirming that The long acting glucagon derivative of the present invention may play an additional role in weight loss besides the effect of anorexia.

Кроме того, в результате измерения уровней общего холестерина в крови, что может быть подтверждено на фиг. 5, каждая из групп, которым вводили длительно действующее производное эксендина (4,4 нмоль/кг, инъекция один раз каждые 2 суток) и длительно действующее производное с SEQ ID NO: 20 (8,8 нмоль/кг, инъекция один раз каждые 2 суток), показала уменьшение уровней холестерина на -35 и 71%, соответственно. На основании приведенного выше было подтверждено, что длительно действующее производное глюкагона по настоящему изобретению может играть дополнительную роль в снижении уровня холестерина в крови помимо эффекта анорексии. Для сравнения группы, получавшей эксципиент (разбавитель), и тестируемых групп выполняли статистический анализ методом однофакторного ANOVA.In addition, as a result of measuring the levels of total cholesterol in the blood, which can be confirmed in FIG. 5, each of the groups receiving the long-acting exendin derivative (4.4 nmol/kg, injection once every 2 days) and the long-acting derivative of SEQ ID NO: 20 (8.8 nmol/kg, injection once every 2 days), showed a decrease in cholesterol levels by -35 and 71%, respectively. Based on the above, it has been confirmed that the long-acting glucagon derivative of the present invention can play an additional role in lowering blood cholesterol levels besides the effect of anorexia. To compare the group treated with the excipient (diluent) and the test groups, statistical analysis was performed by one-way ANOVA.

Экспериментальный пример 3. Эффект совместного введения длительно действующего производного эксендина и длительно действующего конъюгата с SEQ ID NO: 37 мышам с ожирением, вызванным кормом с высоким содержанием жиров.Experimental Example 3 Effect of co-administration of a long-acting exendin derivative and a long-acting conjugate of SEQ ID NO: 37 to high-fat diet obese mice.

Тестируемые группы, получавшие корм с высоким содержанием жиров, включают: группу 1, получавшую эксципиент, не содержащий длительно действующего глюкагона (введение: 5 мл/кг; инъекция один раз каждые 2 суток), - разбавитель; группу 2, получавшую лираглутид (Novo Nordisk) в дозе 50 нмоль/кг (инъекция два раза в сутки (BID)); группу 3, получавшую длительно действующее производное эксендина из примера 6 в дозе 4,3 нмоль/кг (инъекция один раз каждые 2 суток); и группу 4, получавшую длительно действующее производное эксендина из примера 6 в дозе 4,3 нмоль/кг + длительно действующее производное с SEQ ID NO: 37 в дозе 2,2 нмоль/кг (инъекция один раз каждые 2 суток).Test groups fed a high fat diet include: group 1 fed excipient without long acting glucagon (administration: 5 ml/kg; injection once every 2 days), diluent; group 2 treated with liraglutide (Novo Nordisk) at 50 nmol/kg (twice daily injection (BID)); group 3 receiving the long-acting exendin derivative of Example 6 at a dose of 4.3 nmol/kg (injection once every 2 days); and group 4 treated with the long acting exendin derivative of Example 6 at 4.3 nmol/kg + the long acting derivative of SEQ ID NO: 37 at 2.2 nmol/kg (injection once every 2 days).

Эксперимент останавливали на 28-е сутки и проводили интраперитонеальный тест толерантности к глюкозе (IPGTT). После остановки эксперимента и аутопсии измеряли уровни холестерина в крови и массу печени мышей.The experiment was stopped on day 28 and an intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT) was performed. After stopping the experiment and autopsy, blood cholesterol levels and liver weight of the mice were measured.

В результате измерения изменений массы тела, что может быть подтверждено на фиг. 6, каждая из групп, которым вводили вводили только лираглутид (Novo Nordisk) в дозе 50 нмоль/кг (инъекция два раза в сутки) или только длительно действующее производное эксендина из примера 6 в дозе 4,3 нмоль/кг (инъекция один раз каждые 2 суток), показала уменьшение массы тела на на -22 и -32% по сравнению с массой тела в группе с введением разбавителя, соответственно, а группа с совместным введением длительно действующего производного эксендина в дозе 4,3 нмоль/кг (инъекция один раз каждые 2 суток) + длительно действующего производного с SEQ ID NO: 37 в дозе 2,2 нмоль/кг (инъекция один раз каждые 2 суток) показала дополнительное уменьшение массы тела на величину от -32 до -62% по сравнению с массой тела в группе с введением разбавителя.As a result of measuring changes in body weight, which can be confirmed in FIG. 6, each of the treated groups received only liraglutide (Novo Nordisk) at a dose of 50 nmol/kg (injection twice a day) or only the long-acting exendin derivative from Example 6 at a dose of 4.3 nmol/kg (injection once every 2 days), showed a decrease in body weight by -22 and -32% compared with body weight in the group with the introduction of a diluent, respectively, and the group with the joint administration of a long-acting exendin derivative at a dose of 4.3 nmol / kg (injection once every 2 days) + long-acting derivative of SEQ ID NO: 37 at a dose of 2.2 nmol/kg (injection once every 2 days) showed an additional decrease in body weight of -32 to -62% compared with body weight in diluent group.

Эффект снижения количества жира также дополнительно усиливался в группе с совместным введением длительно действующего производного эксендина в дозе 4,3 нмоль/кг (инъекция один раз каждые 2 суток) + длительно действующего производного с SEQ ID NO: 37 в дозе 2,2 нмоль/кг (инъекция один раз каждые 2 суток) на величину от -62 до -88% по сравнению с группой, которой вводили только длительно действующее производное эксендина в дозе 4,3 нмоль/кг (инъекция один раз каждые 2 суток).The fat reducing effect was also further enhanced in the co-administration group of long-acting exendin derivative at 4.3 nmol/kg (injection once every 2 days) + long-acting derivative of SEQ ID NO: 37 at 2.2 nmol/kg (injection once every 2 days) by a value of -62 to -88% compared with the group that was administered only a long-acting exendin derivative at a dose of 4.3 nmol/kg (injection once every 2 days).

Кроме того, в результате измерения уровней общего холестерина в крови, что может быть подтверждено на фиг. 6, каждая из групп, которым вводили только лираглутид (Novo Nordisk) в дозе 50 нмоль/кг (инъекция два раза в сутки) или только длительно действующее производное эксендина в дозе 4,3 нмоль/кг (инъекция один раз каждые 2 суток), показала уменьшение уровней холестерина на -40 и -49% по сравнению с уровнями холестерина в группе с введением разбавителя, соответственно, а группа с совместным введением длительно действующего производного эксендина в дозе 4,3 нмоль/кг (инъекция один раз каждые 2 суток) + длительно действующего производного с SEQ ID NO: 37 в дозе 2,2 нмоль/кг (инъекция один раз каждые 2 суток) показала дополнительное уменьшение уровней холестерина на величину от -49 до -70% по сравнению с уровнями холестерина в группе с введением разбавителя.In addition, as a result of measuring the levels of total cholesterol in the blood, which can be confirmed in FIG. 6, each of the groups that received only liraglutide (Novo Nordisk) at a dose of 50 nmol/kg (injection twice a day) or only a long-acting exendin derivative at a dose of 4.3 nmol/kg (injection once every 2 days), showed a decrease in cholesterol levels by -40 and -49% compared with cholesterol levels in the group with the introduction of a diluent, respectively, and the group with the joint administration of a long-acting exendin derivative at a dose of 4.3 nmol / kg (injection once every 2 days) + The long-acting derivative of SEQ ID NO: 37 at 2.2 nmol/kg (injection once every 2 days) showed an additional reduction in cholesterol levels of -49 to -70% compared to those in the diluent group.

В результате проведения интраперитонеального теста толерантности к глюкозе (IPGTT), как покаAs a result of the intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT), as yet

- 40 042163 зано на фиг. 6, группа с введением только длительно действующего производного эксендина в дозе 4,3 нмоль/кг (инъекция один раз каждые 2 суток) и группа с совместным введением длительно действующего производного эксендина в дозе 4,3 нмоль/кг (инъекция один раз каждые 2 суток) + длительно действующего производного с SEQ ID NO: 37 в дозе 2,2 нмоль/кг (инъекция один раз каждые 2 суток) показала аналогичные эффекты с величиной -61 и -67%, соответственно.- 40 042163 shown in FIG. 6, the 4.3 nmol/kg long-acting exendin derivative group alone (injection once every 2 days) and the co-administration group of the 4.3 nmol/kg long-acting exendin derivative (once every 2 days injection). ) + long-acting derivative of SEQ ID NO: 37 at a dose of 2.2 nmol/kg (injection once every 2 days) showed similar effects with a magnitude of -61 and -67%, respectively.

На основании приведенных выше результатов было подтверждено, что совместное введение длительно действующего производного эксендина в дозе 4,3 нмоль/кг (инъекция один раз каждые 2 суток) + длительно действующего производного с SEQ ID NO: 37 в дозе 2,2 нмоль/кг (инъекция один раз каждые 2 суток) показала аналогичный эффект в отношении регулирования уровней глюкозы в крови, демонстрируя при этом более превосходный эффект, применительно к эффектам снижения массы тела и уровней холестерина в крови, по сравнению с таковыми эффектами в случае соответствующего их введения.Based on the above results, it was confirmed that the co-administration of long-acting exendin derivative at a dose of 4.3 nmol/kg (injection once every 2 days) + long-acting derivative of SEQ ID NO: 37 at a dose of 2.2 nmol/kg ( injection once every 2 days) showed a similar effect in regulating blood glucose levels, while showing a more excellent effect in terms of the effects of reducing body weight and blood cholesterol levels, compared with those effects when they were respectively administered.

Экспериментальный пример 4. Эффект улучшения острой гипогликемии под действием длительно действующего конъюгата с SEQ ID NO: 37.Experimental Example 4 Acute Hypoglycemia Improvement Effect of Long-Acting Conjugate of SEQ ID NO: 37

Крысам Sprague Dawley (SD) не давали корма в течение 4 ч и вводили подкожной инъекцией инсулин (0,65 единиц/кг), чтобы вызвать гипогликемию. Через сорок пять минут после инъекции было подтверждено наличие у крыс гипогликемии, у крыс подкожной инъекцией вводили эксципиент (2 мл/кг; разовая инъекция, разбавитель), внутривенной инъекцией вводили длительно действующий конъюгат с SEQ ID NO: 37 (в концентрациях 5,16 нмоль/кг; 10,31 нмоль/кг и 20,63 нмоль/кг, соответственно) и подкожной инъекцией вводили нативный глюкагон (60 нмоль/кг) и измеряли изменения уровней глюкозы в крови.Sprague Dawley (SD) rats were fasted for 4 hours and injected subcutaneously with insulin (0.65 units/kg) to induce hypoglycemia. Forty-five minutes after injection, hypoglycemia was confirmed in rats, excipient (2 ml/kg; single injection, diluent) was injected subcutaneously in rats, long-acting conjugate with SEQ ID NO: 37 was administered intravenously (at concentrations of 5.16 nmol /kg; 10.31 nmol/kg and 20.63 nmol/kg, respectively) and subcutaneous injection was administered native glucagon (60 nmol/kg) and measured changes in blood glucose levels.

В результате было подтверждено, что длительно действующий конъюгат с SEQ ID NO: 37 во всех введенных дозах улучшал вызванную инсулином гипогликемию у крыс SD, как показано на фиг. 7. На основании этих результатов было подтверждено, что длительно действующий конъюгат с SEQ ID NO: 37 обладает терапевтическим эффектом в отношении связанных с гипогликемией заболеваний.As a result, it was confirmed that the long acting conjugate of SEQ ID NO: 37 at all administered doses improved insulin-induced hypoglycemia in SD rats, as shown in FIG. 7. Based on these results, the long acting conjugate of SEQ ID NO: 37 was confirmed to have a therapeutic effect on hypoglycemia related diseases.

Экспериментальный пример 5. Эффект улучшения хронической гипогликемии под действием длительно действующего конъюгата с SEQ ID NO: 37.Experimental Example 5 Chronic Hypoglycemia Improvement Effect of Long-Acting Conjugate of SEQ ID NO: 37

Оценку эффекта длительно действующего конъюгата с SEQ ID NO: 37 в качестве терапевтического агента в случае врожденного гиперинсулинизма проводили на грызунах с введенной инсулиновой помпой. Модель заболевания врожденного гиперинсулинизма создавали посредством введения инсулиновой помпы грызунам (крысам или мышам) хирургическим путем. Поскольку инсулин непрерывно секретируется из введенной грызунам помпы, индуцируется персистирующая гипогликемия, и поэтому такая модель приводит к состоянию, аналогичному врожденному гиперинсулинизму у людей.Evaluation of the effect of long-acting conjugate with SEQ ID NO: 37 as a therapeutic agent in the case of congenital hyperinsulinism was performed on rodents with an insulin pump. A disease model of congenital hyperinsulinism was created by surgically administering an insulin pump to rodents (rats or mice). Since insulin is continuously secreted from the pump administered to rodents, persistent hypoglycemia is induced and therefore this model leads to a condition similar to congenital hyperinsulinism in humans.

Конкретно, крыс SD подвергали хирургической операции подкожного введения осмотической помпы, заполненной инсулином. В течение недели у крыс SD измеряли уровни глюкозы в крови, тех крыс, которые демонстрировали персистирующую гипогликемию, отбирали и им вводили подкожной инъекцией эксципиент (разбавитель) и длительно действующий конъюгат с SEQ ID NO: 37 (в дозе 3 нмоль/кг или 6 нмоль/кг) с интервалами 3 суток (Q3D), затем в течение 2 недель измеряли изменения уровней глюкозы в крови (BG) и рассчитывали площадь под кривой для уровня глюкозы в крови (AUC_BG).Specifically, SD rats were subjected to surgery for subcutaneous injection of an osmotic pump filled with insulin. Within a week, blood glucose levels were measured in SD rats, those rats that showed persistent hypoglycemia were selected and injected subcutaneously with the excipient (diluent) and long-acting conjugate of SEQ ID NO: 37 (at a dose of 3 nmol/kg or 6 nmol /kg) at intervals of 3 days (Q3D), then within 2 weeks measured changes in blood glucose levels (BG) and calculated the area under the curve for blood glucose (AUC _BG ).

Площадь под кривой (AUC) имеет отношение к общему способу количественного определения изменения уровней глюкозы в крови при длительном приеме лекарственного средства. В результате было подтверждено, что крысы SD, которым вводили длительно действующий конъюгат с SEQ ID NO: 37, во всех введенных дозах постоянно демонстрировали значительное повышение уровней глюкозы в крови по сравнению с крысами, представляющими собой крыс с хронической гипогликемией, которым вводили эксципиент, не содержащий длительно действующего глюкагона (2 мл/кг; один раз каждые 3 суток, разбавитель), как показано на фиг. 8 (**р < 0,01, *** р <0,001 по сравнению с крысами с хронической гипогликемией, эксципиент, метод однофакторного ANOVA). На основании этих результатов было подтверждено, что длительно действующий конъюгат с SEQ ID NO: 37 обладает терапевтическим эффектом в отношении хронической гипогликемии, которая встречается у пациентов с врожденным гиперинсулинизмом.Area under the curve (AUC) refers to a general method for quantifying the change in blood glucose levels with long-term drug use. As a result, it was confirmed that SD rats administered with the long-acting conjugate of SEQ ID NO: 37, at all administered doses, consistently showed a significant increase in blood glucose levels compared to chronically hypoglycemic rats administered with the excipient did not containing long-acting glucagon (2 ml/kg; once every 3 days, diluent) as shown in FIG. 8 (**p < 0.01, *** p < 0.001 compared to chronically hypoglycemic rats, excipient, one-way ANOVA). Based on these results, the long acting conjugate of SEQ ID NO: 37 was confirmed to have a therapeutic effect on chronic hypoglycemia that occurs in patients with congenital hyperinsulinism.

Специалистам средней квалификации в данной области техники будет понятно, что настоящее изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без отклонения от его замысла или существенных признаков. Описанные воплощения должны рассматриваться во всех аспектах только как иллюстративные и не ограничительные. Таким образом, объем настоящего изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения, а не вышеизложенным описанием изобретения. Все изменения, которые возникают в пределах смыслового значения и диапазона эквивалентности формулы изобретения, следует включать в объем настоящего изобретения.Those of ordinary skill in the art will appreciate that the present invention may be embodied in other specific forms without departing from its spirit or essential features. The described embodiments are to be considered in all respects only as illustrative and not restrictive. Thus, the scope of the present invention is defined by the appended claims and not by the foregoing description of the invention. All changes that occur within the meaning and equivalence range of the claims are to be included within the scope of the present invention.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM

1. Применение пептида, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 3, 5, 11, 13-17, 19-27 и 29-44, для лечения врожденного гиперинсулинизма.1. Use of a peptide containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 3, 5, 11, 13-17, 19-27 and 29-44 for the treatment of congenital hyperinsulinism.

2. Применение по п.1, где пептид имеет значение изоэлектрической точки (pI), отличающееся от значения изоэлектрической точки нативного глюкагона (6,8).2. Use according to claim 1, wherein the peptide has an isoelectric point (pI) value different from that of native glucagon (6.8).

3. Применение по п.1, где кольцо образовано между аминокислотной парой из 16-й и 20-й аминокислот.3. Use according to claim 1, wherein the ring is formed between the amino acid pair of the 16th and 20th amino acids.

4. Применение по п.1, где С-конец пептида амидирован.4. Use according to claim 1, wherein the C-terminus of the peptide is amidated.

5. Применение по п.1, где С-конец пептида не модифицирован.5. Use according to claim 1, wherein the C-terminus of the peptide is not modified.

6. Применение по п.1, где пептид представляет собой производное нативного глюкагона, способное активировать рецептор глюкагона.6. Use according to claim 1, wherein the peptide is a native glucagon derivative capable of activating the glucagon receptor.

7. Применение по п.1, где пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13, 15 и 36-44.7. Use according to claim 1, wherein the peptide contains an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 13, 15 and 36-44.

8. Применение по п.1, где пептид содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 37.8. Use according to claim 1, wherein the peptide contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37.

9. Применение по любому из пп.1-8, где пептид находится в форме длительно действующего конъюгата, в котором группировка биосовместимого вещества связана с пептидной группировкой, выбранной из SEQ ID NO: 2, 3, 5, 11, 13-17, 19-27 и 29-44.9. Use according to any one of claims 1-8, wherein the peptide is in the form of a long-acting conjugate, wherein the biocompatible moiety is linked to a peptide moiety selected from SEQ ID NOs: 2, 3, 5, 11, 13-17, 19 -27 and 29-44.

10. Применение по п.9, где группировка биосовместимого вещества выбрана из группы, состоящей из полимера, жирной кислоты, холестерина, альбумина и его фрагмента, альбуминсвязывающего вещества, полимера из повторяющихся звеньев конкретной аминокислотной последовательности, антитела, фрагмента антитела, FcRn (неонатальный Fc-рецептор)-связывающего вещества, соединительной ткани in vivo или ее производного, нуклеотида, фибронектина, трансферрина, сахарида, гепарина и эластина.10. The use according to claim 9, wherein the grouping of the biocompatible substance is selected from the group consisting of polymer, fatty acid, cholesterol, albumin and its fragment, albumin-binding substance, polymer of repeating units of a specific amino acid sequence, antibody, antibody fragment, FcRn (neonatal Fc -receptor)-binding substance, connective tissue in vivo or its derivative, nucleotide, fibronectin, transferrin, saccharide, heparin and elastin.

11. Применение по п.10, где полимер выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахарида, декстрана, поливинилэтилового эфира, биоразлагаемого полимера, липидного полимера, хитина, гиалуроновой кислоты, олигонуклеотида и их комбинации.11. Use according to claim 10, wherein the polymer is selected from the group consisting of polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol-propylene glycol copolymer, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaccharide, dextran, polyvinyl ethyl ether, biodegradable polymer, lipid polymer, chitin, hyaluronic acid, oligonucleotide and their combinations.

12. Применение по п.10, где FcRn-связывающее вещество представляет собой полипептид, содержащий Fc-область иммуноглобулина.12. Use according to claim 10, wherein the FcRn binding agent is a polypeptide containing the Fc region of an immunoglobulin.

13. Применение по п.9, где пептидная группировка и группировка биосовместимого вещества связаны друг с другом посредством линкера.13. Use according to claim 9, wherein the peptide moiety and the biocompatible substance moiety are linked to each other via a linker.

14. Применение по п.13, где линкер выбран из группы, состоящей из пептида, жирной кислоты, сахарида, полимера, низкомолекулярного соединения, нуклеотида и их комбинации.14. Use according to claim 13, wherein the linker is selected from the group consisting of a peptide, a fatty acid, a saccharide, a polymer, a small molecule, a nucleotide, and combinations thereof.

15. Применение по п.14, где полимер выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахарида, декстрана, поливинилэтилового эфира, биоразлагаемого полимера, липидного полимера, хитина, гиалуроновой кислоты, олигонуклеотида и их комбинации.15. Use according to claim 14, wherein the polymer is selected from the group consisting of polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol-propylene glycol copolymer, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaccharide, dextran, polyvinyl ethyl ether, biodegradable polymer, lipid polymer, chitin, hyaluronic acid, oligonucleotide and their combinations.

16. Применение по п.13, где линкер представляет собой полиэтиленгликоль.16. Use according to claim 13, wherein the linker is polyethylene glycol.

17. Применение по п.12, где Fc-область иммуноглобулина агликозилирована.17. Use according to claim 12, wherein the immunoglobulin Fc region is aglycosylated.

18. Применение по п.12, где Fc-область иммуноглобулина выбрана из группы, состоящей из:18. Use according to claim 12, wherein the immunoglobulin Fc region is selected from the group consisting of:

(б) СН1-домена и СН2-домена;(b) CH1 domain and CH2 domain;

(в) СН1-домена и CH3-домена;(c) CH1 domain and CH3 domain;

(г) СН2-домена и CH3-домена;(d) CH2 domain and CH3 domain;

(д) комбинации между одним доменом или по меньшей мере двумя доменами, выбранным(и) из СН1-домена, СН2-домена, CH3-домена и СН4-домена, и шарнирной областью или частью шарнирной области иммуноглобулина; и (е) димера, образованного между каждым из доменов константной области тяжелой цепи и константной области легкой цепи.(e) combinations between one domain or at least two domains selected from a CH1 domain, a CH2 domain, a CH3 domain, and a CH4 domain, and a hinge region or part of an immunoglobulin hinge region; and (e) a dimer formed between each of the domains of the heavy chain constant region and the light chain constant region.

19. Применение по п.12, где полипептид, содержащий Fc-область иммуноглобулина, находится в форме димера.19. Use according to claim 12, wherein the immunoglobulin Fc region-containing polypeptide is in the form of a dimer.

20. Применение по п.12, где Fc-область иммуноглобулина представляет собой производное нативной Fc-области, в котором удален участок, способный образовывать дисульфидную связь, производное нативной Fc-области, в котором удалена часть аминокислот(ы) на N-конце, производное нативной Fcобласти, в котором на N-конце добавлен остаток метионина, производное нативной Fc-области, в котором удален комплементсвязывающий сайт, или производное нативной Fc-области, в котором удален сайт антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC).20. The use according to claim 12, where the immunoglobulin Fc region is a derivative of the native Fc region in which a site capable of forming a disulfide bond has been removed, a derivative of the native Fc region in which a portion of the amino acid(s) at the N-terminus has been removed, a derivative of a native Fc region in which a methionine residue is added at the N-terminus, a derivative of a native Fc region in which a complement-binding site has been removed, or a derivative of a native Fc region in which an antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) site has been removed.

21. Применение по п.12, где Fc-область иммуноглобулина имеет происхождение из иммуноглобулина, выбранного из группы, состоящей из IgG, IgA, IgD, IgE и IgM.21. Use according to claim 12, wherein the immunoglobulin Fc region is derived from an immunoglobulin selected from the group consisting of IgG, IgA, IgD, IgE and IgM.

22. Применение по п.21, где Fc-область иммуноглобулина представляет собой Fc-область IgG4.22. Use according to claim 21, wherein the immunoglobulin Fc region is an IgG4 Fc region.

23. Применение по п.12, где Fc-область иммуноглобулина представляет собой агликозилированную 23. Use according to claim 12, wherein the immunoglobulin Fc region is aglycosylated

- 42 042163- 42 042163

Fc-область, имеющую происхождение из человеческого IgG4.Fc region derived from human IgG4.

24. Применение по п.13, где линкер связан с остатком цистеина пептидной группировки.24. Use according to claim 13, wherein the linker is linked to a cysteine residue of the peptide moiety.

25. Применение по п.13, где линкер соответственно связан с пептидной группировкой и группировкой биосовместимого вещества посредством ковалентных связей, которые образуются соответственно путем взаимодействия одного конца линкера с аминогруппой или тиоловой группой группировки биосовместимого вещества и путем взаимодействия другого конца линкера с аминогруппой или тиоловой группой пептидной группировки.25. Use according to claim 13, wherein the linker is respectively linked to the peptide moiety and the biocompatible substance moiety via covalent bonds, which are formed respectively by reacting one end of the linker with the amino group or thiol group of the biocompatible substance moiety and by reacting the other end of the linker with the amino group or thiol group peptide group.